(57)【要約】  本発明は、慢性ウイルス感染の、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）拮抗剤での治療又は予防、それによって免疫回避及びウイルスの持続性を回避することに関する。本発明はまた、子宮頸部異形成の試料におけるＴＳＬＰ発現によって子宮頸部異形成の進行の予後を診断する方法を供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性ウイルス感染を治療又は予防するためのＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項２】
前記慢性ウイルス感染がＴＳＬＰ発現の増加と関連する、請求項１に記載のＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項３】
前記慢性ウイルス感染がＴｈ２サイトカインの分泌と関連する、請求項１又は２に記載のＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項４】
前記慢性ウイルス感染が、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス（HBV, HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、及び伝染性軟属腫ウイルス（MCV）の感染から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項５】
前記慢性ウイルス感染が、ＨＰＶの高リスクのサブタイプ、好適にはＨＰＶ１６型又はＨＰＶ１８型の感染である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項６】
前記ＴＳＬＰ拮抗剤が、ＴＳＬＰ又はＴＳＬＰＲ、複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖、或いは複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖のＴＳＬＰＲ又はＩＬ−７Ｒαサブユニットに選択的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項７】
前記ＴＳＬＰ拮抗剤が、ＴＳＬＰに結合する抗体又はアプタマー、ＴＳＬＰＲ、複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖、又は複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖のＴＳＬＰＲ若しくはＩＬ−７Ｒαのサブユニットに結合する抗体又はアプタマー、可溶性ＴＳＬＰ受容体、可溶性ＩＬ−７Ｒα鎖から成る群から選択される、請求項６に記載のＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項８】
前記ＴＳＬＰ拮抗剤が、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ又は複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖の発現を減少又は防止する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項９】
前記ＴＳＬＰ拮抗剤が、メッセンジャーＲＮＡ又はリボザイムを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項８に記載のＴＳＬＰ拮抗剤。
【請求項１０】
医薬としての、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤及び少なくとも１つの免疫賦活性剤の組合せ、又はこの組成物であって、ここでＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤が、同時に又は連続して投与されることが意図される組合せ。
【請求項１１】
慢性ウイルス感染を治療又は予防するための、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１２】
前記慢性ウイルス感染が、ヒトパピローマウイルス（HPV）、好適にはＨＰＶの高リスクのサブタイプ、肝炎ウイルス（HBV, HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、及び伝染性軟属腫ウイルス（MCV）の感染から成る群から選択される、請求項１１に記載の組合せ。
【請求項１３】
前記免疫賦活性剤が、Ｔｈ１サイトカイン又はＴｈ１サイトカインの産生の誘発因子である、請求項１１又は１２に記載の組合せ。
【請求項１４】
前記免疫賦活性剤が、インターフェロン（IFN）、ＩＦＮの誘発因子、腫瘍壊死因子（TNF）、ＴＮＦの誘発因子、インターロイキン−２（IL-2）、及びＴｏｌｌ様受容体（TLR）のリガンドから成る群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項１５】
子宮頸部異形成においてＴＳＬＰが発現されているかを決定する方法であって、子宮頸部異形成の試料においてＴＳＬＰ発現を検出する段階を含んでなる方法。
【請求項１６】
対照試料においてＴＳＬＰ発現を検出する段階、及び対照試料において発現されたＴＳＬＰのレベルと子宮頸部異形成の試料において発現されたＴＳＬＰのレベルを比較する段階をさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
子宮頸部異形成の進行を診断する方法であって、
子宮頸部異形成の試料におけるＴＳＬＰ発現を検出することからなる段階であって、ここでＴＳＬＰ発現が検出される場合には、その後子宮頸部異形成が持続するか、あるいは子宮頸部上皮内腫瘍及び子宮頸癌に進行する可能性があり、ＴＳＬＰ発現が検出されない場合には、その後子宮頸部異形成が退縮する可能性がある段階、
を含んでなる方法。
【請求項１８】
子宮頸癌及び子宮頸癌に進行する可能性がある子宮頸部異形成を診断する方法であって：
ａ）患者の試料において、ＴＳＬＰ発現を検出する段階；
ｂ）健康な子宮頸部を示している少なくとも１つの対照試料においてＴＳＬＰ発現を検出する段階、及び
ｃ）段階（a）で検出されたＴＳＬＰ発現のレベルを、段階（b）で検出されたＴＳＬＰ発現のレベルと比較する段階、
を含んでなり、ここで、段階（b）において検出されたＴＳＬＰ発現のレベルと比較した、段階（a）において検出されたＴＳＬＰ発現のレベルの有意な増大が、患者が子宮頸癌に罹患している又は罹患するリスクにあることを示す方法。
【請求項１９】
子宮頸部異形成の予後を診断するため及び／又は子宮頸癌を診断するためのキットであって、ここでキットが、ＴＳＬＰ発現を検出するための手段、及び任意に：
ａ）ＴＳＬＰ発現の検出を行うための少なくとも１つの生化学試薬；
ｂ）子宮頸部異形成の予後を診断する又は子宮頸癌を診断するためのキットの使用のための説明書；又は
ｃ）健康な子宮頸部、子宮頸部異形成又は子宮頸癌を示している少なくとも１つの対照試料、
を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）拮抗剤での慢性ウイルス感染の治療又は予防、それによって免疫回避及びウイルスの持続性を回避することに関する。本発明はまた、子宮頸部異形成の試料におけるＴＳＬＰ発現を検出することによる子宮頸部異形成の進行の予後診断方法を供する。
【背景技術】
【０００２】
慢性ウイルス感染は、宿主の免疫応答を回避し、従ってクリアランスを回避しそして宿主において長期感染を確立する持続性ウイルスの確立を生じる。宿主の免疫応答を害する様々なストラテジーを介した慢性ウイルス感染の原因である多数の持続性ウイルスの中で、限定的なリストには：ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、伝染性軟属腫ウイルス（MCV）；Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルス（HBV, HCV）が含まれる（Xu X-N et al., Immunity, 2001 , vol 15, 867-870 ; Alcami et al., EMBO Rep. 2002; 3(10）: 927-932 Kanodia et al., Curr Cancer Drug Targets, 2007; 7, 79-89 ; WoIfI et al., J Immunol. 2008 November 1; 181 （9）: 6435-6446.）。
【０００３】
慢性ウイルス感染の原因である持続性ウイルスは、宿主の免疫応答に抵抗するため、及び／又はこれを回避するために多様なストラテジーを発達させてきた。
【０００４】
本発明の１つの目的は、慢性ウイルス感染の原因である持続性ウイルスによって宿主の免疫応答を回避するために誘発されるＴＳＬＰの産生を阻害する新たなストラテジーをハイライトすることである。本発明のさらなる目的は、ＴＳＬＰ拮抗剤を使用した、慢性ウイルス感染を治療又は予防するための分子の新たな使用及び新たな方法を供することである。
【０００５】
外部環境とのインターフェースにおいて体表をカバーする上皮の完全性は、有毒因子及び病原体からの最適な宿主の保護に必須である。
【０００６】
ヒトパピローマウイルス（HPV）は、皮膚及び粘膜の重層扁平上皮の基底細胞層に感染する、非溶解性の、二本鎖ＤＮＡウイルスである。大抵のＨＰＶ病変は、更なる結果を宿主に生じることなく自然に退縮する。しかしながら、ＨＰＶは、免疫適格性のある宿主において、複製サイクルを介して免疫原性タンパク質を産生するにもかかわらず、数ヶ月又は数年間の持続性疾患を生じる可能性がある。場合によっては、感染は、最終的に子宮頸部上皮内腫瘍及び子宮頸癌に進行する可能性のある永続的な病変を起こす。肛門生殖器及び皮膚細胞腫はまた、ＨＰＶ感染症と関連付けられてきた。
【０００７】
より具体的には、非発癌性（低リスク）ＨＰＶサブタイプは、良性病変、例えば疣贅（いぼ）、コンジローマ又は咽頭乳頭腫症を起こすかもしれず、一方発癌性（高リスク）サブタイプ、特にＨＰＶ１６型（HPV-16）及びＨＰＶ１８型（HPV-18）は、子宮頸部異形成及び癌の病原体である（Kanodia et al., Curr Cancer Drug Targets, 2007; 7, 79-89, Stanley, Vaccine, 2006; 24, S16-S22）。
【０００８】
従って、ＨＰＶの高リスクの発癌型に関連した感染症の慢性的性質は、細胞形質転換及び悪性病変のリスクの増加を生じる。
【０００９】
従って、ＨＰＶ感染症は、世界的に主要な公衆衛生の問題となっており、ＨＰＶ関連性病態の診断、経過観察、治療及び予防を最適化するために、この生理病理を一層理解することが重要である。
【００１０】
ＨＰＶ感染症への免疫応答は、理解が不完全の状態である。ウイルスの持続性は、様々な免疫回避メカニズムに起因する。生殖器病変において、ＨＰＶ感染及び複製は上皮細胞に制限され、従ってウイルス血症、及びウイルスと真皮に存在する自然免疫細胞、例えば樹状細胞（DC）との接触を制限している。ＨＰＶは、細胞溶解性ではなく、上皮細胞による「危険」シグナル及び炎症性サイトカインの放出を誘発しない。さらに、高リスクのＨＰＶは、感染細胞による１型ＩＦＮの産生及び１型ＩＦＮ誘導遺伝子の発現を抑制するメカニズムを発達させてきた。結果として、宿主が病原体の存在に気付かない状態であることが示されてきた（Stanley, Vaccine, 2006; 24, S16-S22）。
【００１１】
しかしながら、一部の証拠から、免疫応答がＨＰＶ感染症において起こることが示されている：
１）これらは、自然治癒的であり、多くは自然に退縮する；
２）これらの発生及び進行は、免疫抑制患者において増大される；
３）ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答の徴候は、インサイツ（in situ）で（Coleman, Am. J. Clin. Pathol. 1994; 102(6) :768-74）及び全身で（van Poelgeest Ml, Int. J. Cancer. 2006;118（3）:675-83）退縮している病変において観察されている。
【００１２】
しかしながら、現在のウイルスの免疫回避メカニズムは、このような免疫応答がどのように開始され得るのか説明していない。ＨＰＶは表皮角化細胞においてウイルス複製が可能なだけなので、免疫系に影響する当該ウイルスの能力は感染した表皮の局所環境に制限されるに違いない。
【００１３】
ランゲルハンス細胞（LC）は、常在上皮性ＤＣであり、皮膚において一次抗原提示細胞（APC）を構成する。未熟のＬＣは、上皮を介して近接ネットワークを形成する。ランゲルハンス細胞は、抗原を捕らえることができ、いくつかの刺激に応答して皮膚流入領域リンパ節へ遊走する。従って、ＬＣは表皮内で遭遇するウイルス性抗原に対する適応性免疫応答の開始に必須であり、これらの細胞数が減少される又はこれらの細胞が皮膚から消失する場合に、疾患に対する感受性が増加することが説明されている。特に、ＬＣは、ウイルス感染、例えばＨＩＶ及び単純ヘルペスウイルス（HSV）の感染に対する防御において重大な役割を果たすことが示されている。
【００１４】
安定状態の条件下で、ＬＣの数は恒常的に維持されているが、上皮性ウイルス感染の後に恒常性は乱される。マウス皮膚のワクシニアウイルス感染症に関して、ＬＣの純増加が、皮膚由来の抗原負荷されたＬＣの遊出の増加を均衡している、炎症性サイトカインに応答したＬＣの皮膚中への移行の増加の結果として、恒常性のかく乱を反映する感染表皮において観察される。
【００１５】
一方で、頸部ＨＰＶ関連病変において、直接的にウイルス感染によって生じる、ＨＰＶ感染表皮におけるＬＣの純減少が観察されている（Tay et al., Br. J. Obstet. Gynaecol. 1987, 94（11）:1094-7; Matthews et al., J. Virol., 2003, 77（15）:8378-8385）。上皮からのＬＣの減少は、宿主の免疫応答を回避するための関連ストラテジーと見なされてきた（Stanley, Vaccine, 2006, 24, S16-S22）。しかしながら、ＬＣの遊出のトリガーとなる因子は不明のままである。
【００１６】
当該因子がＤＣを活性化する段階が適応性免疫応答の誘発及び形成に重大な意味を持つので、ＨＰＶに対する自然免疫応答を精査する試みの中で、本発明者は当該因子に着目することに決めた。
【００１７】
本発明者は、上皮細胞がアレルギー誘発性サイトカインＴＳＬＰをＨＰＶ感染病変中に発現し、そしてＴＳＬＰ産生がＬＣ減少と相関することを発見した。
【００１８】
ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）は、上皮細胞によって産生されるＩＬ−７ファミリーのサイトカインである。ＴＳＬＰ産生は、アトピー性皮膚炎において上方制御され、インビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）における炎症促進性Ｔｈ２応答を誘発するためのＤＣの活性に関与する。ＴＳＬＰの直接的な役割は正式には証明されていないが、ＤＣの遊走中におけるＴＳＬＰの役割は、アトピー性皮膚炎に関して示されている（Soumelis et al., Nature Immunology, 2002, 3, 673-680; Soumelis, Medecine/Sciences, 2007, 23（8-9）, 692-694; Ebner et al., J. Allergy Clin. Immunol., 1 19,（4）, 982-990）。実際、ＴＳＬＰが、上皮性移植片培養から遊走性ＬＣの遊出を増加することが報告されたが（Ebner et al., J. Allergy Clin. Immunol., 119,（4）, 982-990）、このモデルは上皮シート上に存在するケラチノサイトによって産生される他の因子の関与を排除することはできない。その上、これらの病変中のＴＳＬＰの存在にもかかわらず、ＬＣはアトピー性皮膚炎病変において枯渇されない。
【００１９】
本発明者は、ＴＳＬＰは、ＤＣの微小管及びアクトミオシン（actinomyosin）細胞骨格のいずれをも極性化する能力によって、任意のケモカインとは独立して、エクスビボ（ex vivo）において、直接ＤＣ遊走のトリガーとなることを顕著に証明した。この結果は、ＨＰＶ感染症におけるＴＳＬＰの重大な機能を示しており、局所性免疫応答の再指示のためにＴＳＬＰを標的とすることができることを示唆している。
【００２０】
全体として、本発明者は、以下を通じてＨＰＶ感染中にアレルギー誘発性サイトカインＴＳＬＰが免疫回避を促進することを証明した：（1）Ｔｈ２表現型への免疫偏向及び（2）ランゲルハンス細胞（LC）の上皮からの減少。
【００２１】
局所性危険シグナル（danger signal）の欠如のために、免疫系がＨＰＶウイルスに無知の状態で存在し得ることは既に示されていた（Stanley, Vaccine, 2006, 24, S16-S22）。しかしながら、このモデルは、数ヶ月又は数年後であっても、大抵のＨＰＶ感染がどのように自然治癒し且つ自然に退縮するかを説明することはできず（Stanley, Vaccine, 2006, 24, S16-S22）、ＨＰＶ特異的免疫応答がどのように開始され得るのかを説明することはできない。本明細書中に記載されるＴＳＬＰ由来のモデルは、これらの見解を調和させる。初期には、ＴＳＬＰは常在ＬＣを活性化し抗ＨＰＶ免疫の開始を可能にする（Offringa et al., Curr Top Microbiol Immunol, 2003, 276, 215-240）。長期には、慢性のＬＣ減少及びＴｈ２応答への免疫偏向を促進することによってＴＳＬＰは免疫応答を破壊し、これは効率的なウイルス性クリアランスに適当でない。免疫と免疫破壊メカニズムとの間のバランスは、通常のいぼに関して観察されるように最終的に病変の予後、あるいは子宮頸部病変の場合のように数ヶ月又は数年間の持続を決定する。ＴＳＬＰは、さらに他のウイルス、ボックスウイルス伝染性軟属腫ウイルス（MCV）による感染と関連した皮膚病変において発現されることが認められた。重度に免疫抑制されていない患者において、ＭＣＶによって生じる病変は、典型的には、通常６ヶ月〜５年内に自然に退縮する。しかしながら、伝染性軟属腫ウイルスは、免疫抑制性患者、例えばＨＩＶ患者においてより持続性が高いかもしれない。
【００２２】
従って、これらの結果は、ＴＳＬＰがウイルス感染への宿主の応答の一部となり、不適当な免疫応答に寄与し、その結果ウイルスの免疫回避及び持続性へとつながることを初めて証明する。
【００２３】
従って、慢性活動性ウイルス感染を予防又は治療するためにＴＳＬＰ活性をブロックすることが提案される。
【００２４】
定義
「ＴＳＬＰ」は、「胸腺間質性リンパ球新生因子」を意味する。ＴＳＬＰは、元々胎児の肝臓造血前駆細胞由来のマウスＩｇＭ＋Ｂ細胞の成長を支える胸腺間質細胞株の条件培地において同定された（Friend et al., Exp. Hematol., 1994, 22:321-328）。胸腺間質細胞株由来のマウスＴＳＬＰのクローニングは、Ｓｉｍｓ等によって記載された（J. Exp. Med. 2000, 192(5）, 671-680）。ヒトＴＳＬＰのクローニング及び配列決定は、Ｑｕｅｎｔｍｅｉｅｒ等において記載された（Leukemia, 2001 , 15:1286-1292）。ヒトＴＳＬＰのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列番号１及び２にそれぞれ示す。
【００２５】
ＴＳＬＰは、低親和性でヘマトポエチン受容体ファミリー由来の受容体鎖（「ＴＳＬＰ受容体」又は「ＴＳＬＰＲ」）に結合することがわかった。マウス及びヒトＴＳＬＰ受容体は、Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ：２００２／００６８３２３に記載されている。ＴＳＬＰＲのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は、配列番号３及び４にそれぞれ示される。ＴＳＬＰＲの可溶性ドメインは、配列番号４のおよそ２５〜２３１個のアミノ酸である。さらに、ＴＳＬＰは、高親和性で胸腺間質性リンパ球新生因子受容体及びＩＬ−７Ｒα鎖から成るヘテロ二量体受容体複合体に結合する（Park et al., J. Exp. Med., 2000, 192(5):659-70）（「ＴＳＬＰＲ複合体」）。ヒトＩＬ−７受容体α鎖のアミノ酸配列は、配列番号５に示される。ＩＬ−７受容体αの可溶性ドメインの配列は、配列番号５の２１〜２３９個のアミノ酸から成る。
【００２６】
ＴＳＬＰ結合上で、ＴＳＬＰＲはシグナルをＳＴＡＴ活性へ向けて伝達する。特に、ＴＳＬＰは、ヤヌスキナーゼの関与なしにＳＴＡＴ−３及びＳＴＡＴ−５の活性化及びリン酸化反応を誘発することが示されている（Sebastian et al. Cell Commun Signal. 2008; 6: 5）。
【００２７】
明細書で使用する場合、用語「対象」又は「宿主」は、ヒト又は非ヒト哺乳類、例えばげっ歯類、ネコ科動物、イヌ科動物、又は霊長類を意味する。
【００２８】
本発明に関して、用語「治療（treating）」、又は「治療（treatment）」は、明細書で使用する場合、（1）このような用語が適用される疾患又は状態の発生の遅延又は予防；（2）このような用語が適用される病態又は症状の進行、悪化、又は増悪の減速又は停止；（3）このような用語が適用される病態又は症状の軽減又は改善をもたらすこと；及び／或いは（4）このような用語が適用される病態又は症状の回復又は治療、を目的とする方法又はプロセスを特徴づけるために使用する。治療は、予防（prophylactic）又は予防（preventive）行為のために、疾患の発生の前に行われてよい。あるいは、又はさらに、治療は治療作用のために疾患又は症状の発生後に行われてよい。
【発明の概要】
【００２９】
ＴＳＬＰの活性をブロックすることによる慢性ウイルス感染の治療
ウイルス感染への不適当な応答である、Ｔｈ２表現型への免疫応答を偏向することによって、ウイルス感染後にＴＳＬＰが免疫回避を促進し、その結果活性ウイルスは感染宿主において持続することができることが、本発明者によって初めて証明された。
【００３０】
免疫応答は完全に感染細胞を除去しウイルス複製をブロックするのに十分ではないので、ウイルスは生物中で持続する。ウイルスの持続性の２つのモード：不顕性感染及び慢性感染。
【００３１】
不顕性感染は、例えばヘルペスウイルス科（HSV, CMV, EBV, VZV）の場合で観察される。一部のメカニズムは、ウイルスのゲノム再活性を引き起こし、その結果新たなウイルス複製を宿主において誘発し、再発性感染を生じる。
【００３２】
「慢性感染」の場合は、ウイルスは持続し、推定（putative）免疫応答にもかかわらず複製し続ける。従って、慢性感染において、ウイルスは活性し続ける。明細書で使用する場合、及び急性ウイルス感染と比較して、ウイルス感染が少なくとも１ヶ月間持続する場合、感染は「慢性」である。慢性感染を生じる可能性があるウイルスの例には、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス（特にHBV, HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、伝染性軟属腫ウイルス（MCV）が含まれる。
【００３３】
従って、本発明は、ＴＳＬＰ拮抗剤又はこの組成物を、それを必要としている対象に投与することを含んでなる慢性ウイルス感染の治療又は予防方法を供する。
【００３４】
本発明はまた、慢性ウイルス感染の治療又は予防が意図される医薬の製造のための、ＴＳＬＰ拮抗剤、又はこの組成物の使用に関する。
【００３５】
さらに、本発明は、慢性ウイルス感染の治療又は予防のためのＴＳＬＰ拮抗剤又はこの組成物に関する。
【００３６】
好適な実施形態において、慢性ウイルス感染は宿主の免疫応答を回避することができる持続性ウイルスの感染である。実際、本発明者は驚いたことに、ＴＳＬＰはＨＰＶでのウイルス感染への宿主の応答の一部となり、不適当な免疫応答、すなわちＴｈ１プロファイルよりもむしろＴｈ２プロファイルへの免疫偏向に寄与することを発見した。このようなＴｈ２プロファイルへの免疫偏向は、細胞内の病原体に対する適当な応答ではない。結果として、免疫回避及びＨＰＶの持続性が観察される。この新たなメカニズムは、宿主の免疫応答を回避することができる全持続性ウイルスについて観察される免疫回避及び持続性に関する説明を供する。従って、ＴＳＬＰ拮抗剤は、宿主の免疫応答を回避し感染への宿主の応答の一部としてのＴＳＬＰ産生を誘発することが可能な任意の持続性ウイルスの感染の治療又は予防のために好適に使用することができる。
【００３７】
従って、好適には、慢性ウイルス感染は、ＴＳＬＰ発現の増加と関係する。言いかえると、このような慢性ウイルス感染において、ＴＳＬＰは、健康な細胞又は組織より感染細胞又は組織中で高レベルに発現される。
【００３８】
より好適には、慢性ウイルス感染は、Ｔｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３の分泌と関連する。このようなＴｈ２サイトカインの分泌は、Ｔｈ１プロファイルよりもむしろＴｈ２プロファイルへの免疫偏向が起こっていることを示す。
【００３９】
この慢性ウイルス感染は、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス（HBV, HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、及び伝染性軟属腫ウイルス（MCV）での感染から成る群から選択されてよい。これらのウイルスは、宿主の免疫応答を回避することができる持続性ウイルスの例である。
【００４０】
本発明者はまた、ＨＰＶ感染症中に、ＴＳＬＰはランゲルハンス細胞（LC）の上皮からの減少に関与することを発見し、この関与はウイルスが宿主の免疫応答を回避するのに関連したストラテジーと見なされる。従って、ＨＰＶ感染症に関して、ＴＳＬＰは、２つの異なる作用メカニズムによって免疫回避及びウイルスの持続性を引き起こすかもしれない。
【００４１】
従って、好適な実施形態によれば、ウイルスはヒトパピローマウイルスである。好適には、本発明に従って治療又は予防されるＨＰＶ感染症は、ＨＰＶ、特にＨＰＶ１６型又はＨＰＶ１８型の高リスクのサブタイプの感染である。「ＨＰＶの高リスクのサブタイプ」は、子宮頸部異形成及び癌の病原体となり得るＨＰＶ株を意味する。あるいは、本発明に従って治療又は予防することができるＨＰＶ感染症は、子宮頸部上皮内腫瘍（CIN）、外陰上皮内腫瘍（VIN）、咽頭乳頭腫症、いぼ及びコンジローマから成る群から選択される。
【００４２】
明細書で使用する場合、本発明の用語ＴＳＬＰ「拮抗剤（antagonist）」又は「拮抗剤（antagonistic agent）」は、ＴＳＬＰの活性を抑制又はブロックする剤（すなわち、分子）を意味する。用語「拮抗剤」は、用語「抑制剤」と同義語として使用される。本発明の拮抗剤は、ＴＳＬＰ機能活性をブロック又は減少することによって作用する。これは、その受容体に結合しているＴＳＬＰを阻害することによって、又はＴＳＬＰ又はその受容体の発現を減少又は防止することによって達成され、これらはいずれも最終的にＴＳＬＰシグナル伝達をブロック又は減少することとなり、それ故ＴＳＬＰ機能活性をブロック又は低下することとなる。
【００４３】
明細書中で言及する場合、「ＴＳＬＰ機能活性」は、特に、（i）活性マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ８３の上方制御を検出することによって測定されるような、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の活性、（ii）Ｂ細胞成長因子活性、並びに（iii）Ｔｈ２型サイトカイン（IL-4, IL-5, IL-6, IL-10及びIL-13）の分泌の誘発を意味する。
【００４４】
本発明のＴＳＬＰ拮抗剤は、インビボ（in vivo）及び／又はインビトロ（in vitro）において、ＴＳＬＰの機能活性を抑制又は除去することができる。拮抗剤は、ＴＳＬＰの機能活性を、少なくとも約１０％、好適には少なくとも約３０％、好適には少なくとも約５０％、好適には少なくとも約７０、７５又は８０％、さらに好適には８５、９０、９５又は１００％まで抑制する。
【００４５】
ＴＳＬＰの機能活性は、周知の方法に従って、当業者によって容易に評価される。例えば、ＴＳＬＰ活性は、ヒトＴＳＬＰＲを発現しているＢＡＦ細胞（BAF/HTR）を使用してアッセイ中で測定することができ、ＰＣＴ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ０３／０３２８９８に記載されるように、これには増殖のために活性ＴＳＬＰを必要とする。ＢＡＦ／ＨＴＲバイオアッセイは、ヒトＴＳＬＰ受容体をトランスフェクトしたマウスプロＢリンパ球株（Steven F. Ziegler, Benaroya Research Center, Seattle, Washから得られた細胞株）を利用する。ＢＡＦ／ＨＴＲ細胞は、成長に関してヒトＴＳＬＰ（ｈｕＴＳＬＰ）に依存しており、テスト試料に添加した活性ｈｕＴＳＬＰに応答して増殖する。インキュベーション時間の後、アラマーブルー色素Ｉの添加によって細胞増殖が測定される。代謝的に活性ＢＡＦ／ＨＲＴ細胞は、アラマーブルーを取り込み減少し、色素の蛍光特性に変化を引き起こす。ｈｕＴＳＬＰ活性のためのさらなるアッセイは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５５５，５２０に記載されるようなＴＳＬＰによるヒト骨髄由来のＴ細胞の成長の誘発を測定するアッセイを含む。他のＴＳＬＰ活性は、Ｌｅｖｉｎ等の，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６７７〜６８３（1999）の参考文献及びＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ０３／０３２８９８に記載されるように、ＳＴＡＴ５を活性化することができる。
【００４６】
ＴＳＬＰシグナル伝達のブロック又は減少は、ＳＴＡＴリン酸化反応、特にＳＴＡＴ−３又はＳＴＡＴ−５リン酸化反応の測定を通してアッセイされてよい。基本条件下で細胞の細胞質中に存在するＳＴＡＴは、タンパク質のカルボキシ末端側へ位置した単一のチロシン残基上のリン酸化反応（STAT3の場合には、Tyr705上のリン酸化反応）によって活性化される。従って、抑制剤は、抑制剤がない場合にＴＳＬＰで刺激された細胞中で測定されるＳＴＡＴリン酸化反応のレベルと比較して、ＴＳＬＰＲ又は複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖（ＴＳＬＰＲ複合体）を発現している細胞のＴＳＬＰ刺激の、ＳＴＡＴリン酸化反応のレベルを減少する剤として同定されてよい。細胞中のＳＴＡＴリン酸化反応は、免疫細胞化学、免疫組織化学及び／又はフローサイトメトリーによって、この修飾を特異的に認識する抗体を使用して容易に検出することができる。例えばチロシン７０５上のＳＴＡＴ３のリン酸化反応は、リン酸化Ｔｙｒ７０５−Ｓｔａｔ３に対して作られた市販のモノクローナル又はポリクローナル抗体を使用して、免疫細胞化学、免疫組織化学及び／又はフローサイトメトリーによって検出することができる。
【００４７】
ＴＳＬＰ拮抗剤は、当業者に周知であり、例えば、ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ＷＯ２０００／０２９５８１、ＷＯ ２００２／０００７２４、ＷＯ ２００６／０２３７９１、ＷＯ ２０００／０１７３６２、ＷＯ ２００２／０６８６４６、ＷＯ ２００３／０６５９８５、ＷＯ ２００５／００７１８６、ＷＯ ２０００／０３９１４９、ＷＯ ２００６／０２３２２６、ＷＯ ２００７／０９６１４９及びＷＯ ２００７／１１２１４６、ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＵＳ ２００６１７１９４３に記載されるもの、並びに抗ヒトＩＬ−７Ｒα抗体、抗ヒトＴＳＬＰ抗体及び抗ヒトＴＳＬＰ−Ｒ抗体、例えば抗ヒトＩＬ−７Ｒαモノクローナル抗体ＭＡＢ３０６（R&D Systems）、抗ヒトＩＬ−７Ｒαポリクローナル抗体ＡＦ−３０６−ＰＢ（R&D Systems）、抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体ＭＡＢ１３９８（R&D Systems）、抗ヒトＴＳＬＰポリクローナル抗体ＡＦ１３９８（R&D Systems）、抗ヒトＴＳＬＰ−Ｒモノクローナル抗体ＭＡＢ９８１（R&D Systems）、抗ヒトＴＳＬＰポリクローナル抗体ＡＦ９８１（R&D Systems）、及び抗ＴＳＬＰ−Ｒ抗体Ｍ５０５又はＭ３８（Amgen）を含む。本発明のＴＳＬＰ拮抗剤は、ＴＳＬＰ或いはＴＳＬＰ受容体の１又は複数のサブユニット（すなわち、ＴＳＬＰＲ, 複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖, 若しくは複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖のＴＳＬＰＲ又はＩＬ−７Ｒαサブユニット）に選択的に結合するものを含み、その結果ＴＳＬＰシグナル伝達を減少又はブロックする。このタイプのＴＳＬＰ拮抗剤は、ＴＳＬＰに結合する抗体又はアプタマー、ＴＳＬＰ受容体の１又は複数のサブユニットに結合する抗体又はアプタマー、例えばサイトカインに結合する可溶性受容体（すなわち、可溶性ＴＳＬＰ受容体若しくは可溶性ＩＬ−７Ｒα鎖）或いは受容体に結合する可溶性リガンドのようなペプチド（例えば、２０個以下のアミノ酸長のペプチド）又はポリペプチド、融合ポリペプチド、低分子、化学物質並びにペプチド模倣薬を含む。
【００４８】
明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」又は「ペプチド」は、長さ又は翻訳後の修飾に関係なく、ペプチド結合によって結合された任意のアミノ酸鎖を意味する。ポリペプチドは、天然のタンパク質、合成又は組換えポリペプチド及びペプチド並びにハイブリッド、翻訳後修飾のポリペプチド、並びにペプチド模倣薬を含む。明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、２０個の標準的なαアミノ酸及び天然発生及び合成の誘導体を意味する。ポリペプチドは、Ｌ又はＤアミノ酸或いはこれらの組合せを含む。明細書で使用する場合、用語「ペプチド模倣薬」は、置換された非アミノ酸構造を有するが、ペプチドの化学構造を模倣し且つペプチドの機能特性を保持するペプチド様構造を意味する。ペプチド模倣薬は、ペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、溶解性等を増大するためにデザインされる。
【００４９】
好適な実施形態によれば、ＴＳＬＰ拮抗剤は、ＴＳＬＰ又はこの断片、或いはこの断片のＴＳＬＰ受容体を特異的に認識し結合する抗体である。
【００５０】
明細書で使用する場合、用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、同様の意味を有し、本発明において区別なく使用される。抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子、すなわち、免疫特異的に抗原を結合する抗原結合部位を含む分子の免疫学的に活性のある部分を意味する。この場合、用語「抗体」は、抗体分子全体だけでなく、抗体断片並びに抗体及び抗体断片の（誘導体を含む）変異体もまた含む。
【００５１】
天然の抗体において、２つのＨ鎖は、ジスルフィド結合によって互いに結合され、各Ｈ鎖はジスルフィド結合によってＬ鎖に結合される。各鎖は、別々の配列ドメインを含む。Ｌ鎖は、２つのドメイン、可変ドメイン（VL）及び定常ドメイン（CL）を含む。Ｈ鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（VH）及び３つの定常ドメイン（CH1, CH2及びCH3, まとめてCHと呼ぶ）を含む。Ｌ鎖（VL）及びＨ鎖（VH）のいずれの可変領域も、結合認識及び抗原への特異性を決定する。
【００５２】
抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の構造上の相補性に存在する。抗体結合部位は、主として超可変又は相補性決定領域（CDR）に由来する残基で構成されている。これらは、アミノ酸配列を意味すると共に、天然の（native）免疫グロブリン結合部位の天然の（natural）Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を規定する。免疫グロブリンのＬ鎖及びＨ鎖は各々、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３とそれぞれ命名される３つのＣＤＲを有する。従って、抗原結合部位は、Ｈ鎖及びＬ鎖のそれぞれのＶ領域由来のＣＤＲセットを含んでなる６個のＣＤＲを含む。
【００５３】
「フレームワーク領域（FR）」は、Ｋａｂａｔ等, １９９１によって定義されるように、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち、単一種において異なる免疫グロブリンの間で比較的保存される免疫グロブリンＬ鎖及びＨ鎖可変領域のそれらの部分を意味する（Kabat et al., 1991 , Sequences of Proteins Of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md）。明細書で使用する場合、「ヒトフレームワーク領域」は、自然に生じるヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約85%, より好適には, 特に, 90%, 95%又は100%）であるフレームワーク領域である。
【００５４】
明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、単一アミノ酸組成物の抗体分子を意味し、これらは特異的な抗原に対して作られ、Ｂ細胞又は雑種細胞の単一クローンによって、或いは組換え方法によって産生される。
【００５５】
「ヒト化抗体」は、マウス抗体（「ドナー抗体」）由来のＣＤＲがヒト抗体（「アクセプター抗体」）に移植された、キメラ、遺伝子改変抗体である。従って、ヒト化抗体は、ドナー抗体由来のＣＤＲ並びにヒト抗体由来の可変領域フレームワーク及び定常領域を有している抗体である。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用は、マウス定常領域の免疫原性と関連した潜在的な問題を取り除く。
【００５６】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、好適にはインタクト抗体の抗原結合領域又は可変領域を含んでなる。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｄ、ｄＡｂ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＣＤＲ、二重特異性抗体及び抗体断片から形成された多選択性抗体が含まれる。
【００５７】
用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有し、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る抗体一価断片を意味する。
【００５８】
Ｆｖ断片は、Ｆａｂ断片のＮ末端部分であり、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖の可変部分から成る。
【００５９】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有し、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含んでなる抗体二価断片を意味する。
【００６０】
用語「Ｆａｂ’」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有し、Ｆ（ａｂ’）２断片のヒンジ領域のジスルフィド結合のカットによって得られる抗体断片を意味する。
【００６１】
用語「Ｆｄ」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成る抗体断片を意味する。
【００６２】
用語「ｄＡｂ」（Ward et al., 1989 Nature 341 :544-546）は、単一可変ドメイン抗体、すなわちＶＨ又はＶＬドメインから成る抗体断片を意味する。
【００６３】
単一鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーによって結合されたＶＨ及びＶＬをコードしている遺伝子を含む遺伝子融合から通常発現される共有結合的に結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価及び多価抗体断片は、一価のｓｃＦｖｓの結合によって自然に形成することができるか、又はペプチドリンカー、例えば二価Ｓｃ（Ｆｖ）２で一価のｓｃＦｖｓをカップリングすることによって生成することができる。
【００６４】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する低分子の抗体断片を意味し、当該断片は同一ポリペプチド鎖中のＶＬドメインに結合されたＶＨドメイン（ＶＨ-ＶＬ）を含んでなる。同鎖上の２つのドメイン間で対合するには短かすぎるリンカーを使用することによって、ドメインは他方の鎖の相補性ドメインとペアを形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位を生じる。
【００６５】
本発明の抗体は、当技術分野で周知の任意の技術、例えば、任意の化学的、生物学的、遺伝的又は酵素的技術単独或いはこれらの組合せによって産生され、技術はこれらに限定されない。本発明の抗体は、雑種細胞を産生及び培養することによって得られる。
【００６６】
当業者はまた、市販のＴＳＬＰ又はＴＳＬＰ受容体に対する抗体を使用する。これらには、例えば、抗ヒトＩＬ−７Ｒα抗体、抗ヒトＴＳＬＰ及び抗ヒトＴＳＬＰ−Ｒ抗体が含まれる。例えば、抗ヒトＩＬ−７Ｒαモノクローナル（MAB306）及びポリクローナル（AF-306-PB）抗体、抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル（MAB1398）及びポリクローナル（AF1398）抗体、抗ヒトＴＳＬＰ−Ｒモノクローナル（MAB981）及びポリクローナル（AF981）抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓで入手できる。抗ＴＳＬＰ−Ｒ（M505; Amgen）；又は抗ＴＳＬＰ（M385; Amgen）もまた、当技術分野で言及されてきた。
【００６７】
アプタマーは、分子認識の点から抗体の代替物を表す分子のクラスである。アプタマーは、高親和性及び特異性を有する標的分子の任意のクラスを実質的に認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Ｔｕｅｒｋ Ｃ．及びＧｏｌｄ Ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９（4968）：５０５〜１０に記載されるように、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（SELEX）を通して分離される。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡの組み合わせの化学的合成によって得られる。このライブラリーにおいて、各メンバーは、最終的には化学的に修飾された、特有の配列の直線オリゴマーである。この分子のクラスの可能な修飾、使用及び利点は、Ｊａｙａｓｅｎａ Ｓ．Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，４５（９）：１６２８〜５０において概説されてきた。ペプチドアプタマーは、プラットフォームタンパク質、例えば２つのハイブリッド方法によって組み合わせライブラリーから選択される大腸菌チオレドキシンＡによって示される立体構造的に制限された抗体可変領域から成る（Colas et al., Nature, 1996,380, 548-50）。
【００６８】
本発明のＴＳＬＰ拮抗剤はまた、ＴＳＬＰ又はその受容体（ＴＳＬＰＲ若しくは複合受容体ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒα鎖）、例えば、標的ｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し、且つメッセンジャーＲＮＡ、又はリボザイムを阻害することができる一本鎖ポリヌクレオチド配列（RNA若しくはDNA）を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を減少又は防止する分子を含む。例えば、９−ｃｉｓ−レチノイン酸（9-cis-RA）及びＮＦ−κＢ抑制キナゾリンは、ＴＳＬＰ発現の負の制御因子であることが示されている（Lee et al. The Journal of Immunology, 2008, 181, 5189-5193; Ma et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci..2009; 50: 2702-2709）。従って、これらの化合物は、本発明のＴＳＬＰ拮抗剤として使用することができる。
【００６９】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＳＬＰ又はその受容体をコードする標的ポリヌクレオチド配列の断片を含んでなる。このような断片は、通常少なくとも約１４個のヌクレオチド、典型的には約１４〜約３０個のヌクレオチドを含んでなる。所定のタンパク質をコードする核酸配列に基づくアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの抽出は、例えば、Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ（Cancer Res., 1988, 48:2659）、並びにｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ等（Bio Techniques, 1988, 6:958）に記載される。
【００７０】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、ＲＮＡ分解酵素ＨによるｍＲＮＡの増大した分解、スプライシングの抑制、転写又は翻訳の中途終止を含む１又は複数の手段によって、或いは他の手段によって、タンパク質発現をブロック又は抑制する二本鎖の形成を生じる。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現をブロックするために使用される。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、さらに修飾糖ホスホジエステル骨格（若しくは他の糖結合, 例えばWO 91/06629に記載されるもの）を有するオリゴヌクレオチドを含んでなり、ここでこのような糖結合は内在性ヌクレアーゼに抵抗性を有する。このような抵抗性糖結合を有するオリゴヌクレオチドは、インビボ（in vivo）で安定である（すなわち、酵素分解に抵抗できる）が、標的ヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性を保持する。
【００７１】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、標的核酸配列、例えばポリ−（L）−リジンに対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大する部分に、共有結合的に結合されたオリゴヌクレオチド含む。さらに、挿入剤、例えばエリプチシン、及びアルキル化剤又は金属複合体は、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列に関する結合特異性を修飾するために、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合される。
【００７２】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、任意の遺伝子導入方法、例えば、電気穿孔、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はリポフェクションによって、或いは遺伝子導入ベクター、例えばエプスタイン・バーウイルス又はアデノウイルスを使用することによって、標的核酸を含む細胞中に導入されてよい。
【００７３】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、リガンド結合分子との複合体の形成によって、標的核酸を含む細胞中に導入されてよい。適当なリガンド結合分子には、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好適には、リガンド結合分子の結合は、その対応分子又は受容体へ結合するリガンド結合分子の能力を実質的に阻害しない、或いはセンス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその結合バージョンの細胞中への移行を実質的にブロックしない。
【００７４】
ＴＳＬＰ又はＴＳＬＰ受容体の発現を防止するためのさらなる方法は、例えばＢｏｓｈｅｒ等のＮａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２，Ｅ３１〜Ｅ３６（2000）記載されるように、特異的な低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）の導入によって生じるＲＮＡ干渉（RNAi）である。
【００７５】
リボザイムはまた、本発明における使用のためのＴＳＬＰ又はＴＳＬＰ受容体発現の抑制剤として機能し得る。リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することが可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用メカニズムは、ヌクレオチド鎖切断開裂に続く、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションを含む。従って、ＴＳＬＰ又はＴＳＬＰ受容体ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断的開裂を特異的且つ効率的に触媒する、操作されたヘアピン又はハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム開裂部位は、リボザイム開裂部位のための標的分子のスキャンによって、初期に認識され、これは典型的には次の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含む。一旦認識されると、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応した、約１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、予想された構造上の特性、例えば、オリゴヌクレオチド配列を不適当なものにし得る二次構造に関して評価することができる。候補標的の適合性はまた、相補的オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションへのこれらの到達性をテストすることによって、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用することによって評価することができる。
【００７６】
好適には、免疫賦活性剤は、Ｔｈ１型応答への宿主の免疫応答を再指示し且つウイルスを除去するために、ＴＳＬＰ拮抗剤と共に同時に又は連続して投与してよい。
【００７７】
従って、本発明はまた、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤及び少なくとも１つの免疫賦活性剤の組合せ、又はこの組成物を、医薬として供する。当該組合せにおいて、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤及び少なくとも１つの免疫賦活性剤は、同時に又は連続して投与することが意図される。
【００７８】
従って、本発明は、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤及び少なくとも１つの免疫賦活性剤、又はこれらの組成物を、それを必要としている対象に投与することを含んでなり、ここで少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤及び少なくとも１つの免疫賦活性剤は同時に又は連続して投与される、慢性ウイルス感染を治療又は予防する方法を供する。
【００７９】
本発明はまた、医薬の製造のための、特に慢性ウイルス感染を治療又は予防することが意図される医薬のための、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤及び少なくとも１つの免疫賦活性剤、又はこれらの組成物の組合せの使用に関する。当該使用において、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤は、少なくとも１つの免疫賦活性剤と共に同時に又は連続して投与することが意図される。従って、ＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤を同時に投与することができる場合、当該医薬は免疫賦活性剤を含んでよい。
【００８０】
用語「免疫賦活性剤」は、当技術分野で一般的に使用され、従って当業者に周知である（例えば, Lackmann et al. Eur J Pediatr. 2003 162:725-6; Collet et al. Can Respir J. 2001 8:27-33を参照されたい）。これは、個体（宿主）の免疫応答を刺激及び／又は誘発することができる化合物を意味する。本発明の範囲において、免疫賦活性剤は、好適には個体のＴｈ１免疫応答を刺激及び／又は誘発する。
【００８１】
用語「組合せ」は、明細書で使用する場合、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤及び少なくとも１つの免疫賦活性剤を含んでなるキットの形態であってよく；キットの成分は、同時に又は連続して投与されてよい。用語「組合せ」はまた、ＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤を、同時に又は連続して投与されてよい別々の生成物として指定してよい。あるいは、ＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤を同時に投与することが可能な場合、ＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤を含んでなる組成物を提供してよい。
【００８２】
別々の生成物としての、当該ＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤の組合せ、キット、組成物は、慢性ウイルス感染の治療が意図される。
【００８３】
本発明はさらに、ＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤の組合せであって、ここで慢性ウイルス感染の治療又は予防のために、ＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤が同時に又は連続して投与されることが意図される組合せの提供に関する。組合せは、上記のように、別々の生成物としての、キット、組成物、並びにＴＳＬＰ拮抗剤及び免疫賦活性剤の形態であってよい。
【００８４】
免疫賦活性剤は、Ｔｈ−１サイトカインであってよい。「Ｔｈ−１サイトカイン」は、Ｔｈ−０細胞のＴｈ−１細胞への分化において分泌されたサイトカイン、例えば、インターフェロン（IFN; 特にIFN-γ）、腫瘍壊死因子（TNF; 特にTNF-α若しくはTNF-β）、及びインターロイキン−２（IL-2）、又はＴｈ−１サイトカインの産生誘発因子を意味する。
【００８５】
好ましくは、免疫賦活性剤は、ＩＦＮ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ（特にIFN-γ）の誘発因子、ＴＮＦ、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ（特にＴＮＦ−β）の誘発因子、ＩＬ−２、及びＴｏｌｌ様受容体（TLR）のリガンドから成る群から選択される。
【００８６】
化合物の「誘発因子」は、化合物の分泌を促進及び／又は増強する分子を意味する。Ｔｈ−１サイトカインの誘発因子、特にＩＦＮ又はＴＮＦの誘発因子は、当技術分野で周知であり、例えば、短い干渉ＲＮＡ、例えばＨｏｒｎｕｎｇ等によって記載されるもの（Nature Medicine 11, 263-270 2005）、リポ多糖（Fultz et al. International Immunology, 5:1383-92,1993）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（Sato et al. European Journal of Immunology, 2001 , 31 :3138-46）及びインターロイキン−１２（Lau et al. Pediatric Research, 1996, 39:150-55）を含む。
【００８７】
ＴＬＲは、パターン認識受容体（PRR）の一種であり、病原体に広く共有されるが宿主分子から識別可能な認識分子である。Ｔｏｌｌ様受容体のリガンドは、免疫応答にアジュバント効果を有する。例えば、ＴＬＲ３は、ウイルス起源のリガンドによって、特に、通常は細胞中に非常に少量存在する、非常に大量の二本鎖ＲＮＡ（dsRNA）によって活性化され、ＩＦＮの産生を誘発する。ＴＬＲ３のリガンドは、例えば、高分子量合成二本鎖ＲＮＡである、ポリイノシンポリシチジン酸（Poly IC, [(2R,3S,4R,5R）-5-（4-アミノ-2-オキソピリミジン-1-イル）-3,4-ジヒドロキシオキソラン-2-イル]メチルリン酸二水素; [(2R,3S,4R,5R）-3,4-ジヒドロキシ-5-（6-オキソ-3H-プリン-9-イル）オキソラン-2-イル]メチルリン酸二水素）、及び合成ポリリボヌクレオチドの二本鎖複合体である、ポリアデニル−ポリウリジン酸（Poly AU, [(2R,3S,4R,5R）-5-（6-アミノプリン-9-イル）-3,4-ジヒドロキシオキソラン-2-イル]メチルリン酸二水素; [(2R,3S,4R,5R）-5-（2,4-ジオキソピリミジン-1-イル）-3,4-ジヒドロキシオキソラン-2-イル]メチルリン酸二水素）を含む。これらのＴＬＲ３リガンドは、ＩＦＮ誘発因子である。ＩＦＮはまた、ＴＬＲ７によって、例えばリガンドを有するＴＬＲ７、例えばイミダゾキノリン、ロキソリビン及びブロピリミンの活性によって誘発することができる。
【００８８】
さらに、ＣｐＧ−ＯＤＮ、すなわち、非メチル化ＣｐＧモチーフ（グアノシンに続くシトシン）を含む、オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）は、ＴＬＲ−９を介してＩＦＮ（１型IFN）及びＴＮＦを誘発する。
【００８９】
本発明の他の目的は、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤、そして究極的には少なくとも１つの免疫賦活性剤を含んでなる組成物に関する。従って、本発明の他の目的は、少なくとも１つのＴＳＬＰ拮抗剤、そして究極的には少なくとも１つの免疫賦活性剤を含んでなる、医薬的に許容される賦形剤との組合せでの医薬組成物を含んでなる。任意には、当該医薬組成物は、治療組成物を形成するために、徐放性マトリックス、例えば生分解性ポリマーをさらに含んでよい。
【００９０】
「医薬的に許容される」は、堅実な医学的判断（sound medical judgment）の範囲内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等なく、ヒト及び下等動物の細胞との接触における使用に適当であり、妥当なベネフィット／リスク比と釣り合っていることを意味する。
【００９１】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所性又は直腸投与用の、本発明の医薬組成物において、活性成分単独又は他の活性成分と組合せた活性成分は、ユニット投与形態で、従来の医薬担体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。このようなユニット投与形態は、それ自体が本発明の他の目的である。適当なユニット投与形態は、経口経路形態、例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒及び経口懸濁剤又は溶液、舌下及び頬投与形態、噴霧剤、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含んでなる。
【００９２】
好適には、医薬組成物は、注射可能な製剤用の医薬的に許容される溶媒を含む。これらは、特に等張、無菌、塩類溶液（1ナトリウムリン酸塩若しくは2ナトリウムリン酸塩, ナトリウム, カリウム, カルシウム若しくはマグネシウムクロライド等又はこれらの塩の混合物）、又は乾燥、特に凍結乾燥させた組成物であり、さらに、滅菌水又は生理的食塩水の場合、注射用溶液の構成が可能である。
【００９３】
注射の使用に適当な医薬形態には、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は含水プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。通常、当該形態は無菌且つ注射針通過可能容易性（syringability）が存在する程度まで流動性を有する。これは製造及び保管条件下で安定であり、通常微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用から保存される。
【００９４】
遊離塩基又は医薬的に許容される塩として本発明の化合物を含んでなる溶液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合された水の中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物並びに油中で調製することができる。保管及び使用の通常の条件下で、微生物の成長を防止するために、これらの調製は防腐剤を含んでよい。
【００９５】
ＴＳＬＰ拮抗剤は、中性又は塩形態で組成物中に製剤することができる。医薬的に許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノで形成された）酸付加塩を含み、これらは無機酸、例えば、塩化水素又はリン酸、或いは有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は鉄水酸化物、及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等由来とすることができる。
【００９６】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール, プロピレングリコール, 及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物、並びに植物油を含む溶剤又は分散媒とすることができる。適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えばレシチンの使用によって、分散の場合の必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらすことができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好適である。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中における吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【００９７】
無菌注射用溶液は、濾過滅菌後に必要に応じて、上記に列挙した様々な他の成分と共に、適当な溶剤中で活性ポリペプチドを必要量取り込むことによって調製される。通常、分散液は、塩基性分散媒及び上記で列挙したものに由来する必須の他の成分を含む無菌溶媒への、様々な無菌活性成分の取り込みによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合に、好適な調製方法は、これらの既に無菌濾過した溶液から活性成分及び任意のさらなる目的の成分の粉末を得る、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【００９８】
製剤化において、溶液は投与製剤と両立する様式で且つ治療上有効量で投与される。製剤は、様々な剤形、例えば上記の注射用溶液のタイプで容易に投与され、薬剤放出カプセル等もまた、使用することができる。
【００９９】
水溶液中の非経口投与のために、必要ならば、例えば溶液は適当に緩衝し、液体希釈剤はまず十分な生理食塩水又はグルコースで等張とすべきである。これらの特定水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に適当である。これに関して、現在の開示を踏まえると、使用することができる無菌水媒体は当業者に周知であろう。例えば、１投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され、１０００ｍｌの皮下点滴療法流体に添加又は点滴の予定の部位に注射することができる。投与量中の多少の変動は、治療されている対象の条件次第で必然的に生じるであろう。投与に関与する人間は、いずれの場合も、個々の対象への適当な用量を決定するであろう。
【０１００】
好適には、ＴＳＬＰ拮抗剤、及び任意に免疫賦活性剤は、治療上有効量で投与される。
【０１０１】
「治療上有効量」は、任意に治療に適用できる妥当なベネフィット／リスク比で、治療効果を供する、特に慢性ウイルス感染治療及び／又は予防するための、ＴＳＬＰ拮抗剤、任意に免疫賦活性剤の十分な量を意味する。
【０１０２】
本発明の拮抗剤及び組成物の日々の使用の総量は、医師を参加させることによる堅実な医学的判断の範囲内で決定されることは理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特異的な治療上有効量レベルは、治療されている疾患及び疾患の重症度；使用された特異的化合物の活性；使用された特異的組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事；投与時間、投与経路、及び使用された特異的化合物の排出率；治療の持続時間；組合せで使用された又は使用された特異的ポリペプチドと同時に使用された薬物；並びに医術で周知の因子等、を含む様々な因子次第である。例えば、目的の治療効果の達成に必要なものより低いレベルで化合物の投与を開始し、目的の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、十分に当業者の範囲内である。しかしながら、生成物の１日投与量は、１日成人１人当たり０．０１〜１，０００ｍｇの広範囲にわたって変化してよい。好適には、組成物は、治療を施す患者に対する投与量の症候性調節（symptomatic adjustment）のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００ｍｇの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分、好適には１ｍｇ〜約１００ｍｇの活性成分を含む。薬剤の有効量は、１日あたり０．０００２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、特に約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで通常供給される。
【０１０３】
ＨＰＶ感染症と関連した子宮頸部異形成の予後を診断するための方法
本発明者は、ＨＰＶ感染症と関連した検査した全てのいぼ（尋常性疣贅, 足底疣贅及び扁平疣贅）はＴＳＬＰ発現を示した一方で、ＴＳＬＰ発現は全子宮頸部異形成において検出することができなかったことを観察した（図2Aを参照されたい）。
【０１０４】
従って、本発明は、子宮頸部異形成においてＴＳＬＰが発現されているかを決定する方法であって、子宮頸部異形成の試料においてＴＳＬＰ発現を検出する段階を含んでなる方法に関する。当該方法はさらに対照試料中のＴＳＬＰ発現を検出する段階、及び子宮頸部異形成の試料中の発現されたＴＳＬＰのレベルを対照試料における発現されたＴＳＬＰのレベルと比較する段階を含んでなる。
【０１０５】
ＴＳＬＰはＨＰＶ感染症中の免疫回避に関与するので、子宮頸部異形成でＴＳＬＰ発現を検出することは、子宮頸部異形成が持続する又は子宮頸部上皮内腫瘍及び子宮頸癌に進行する可能性があることを示しているはずである。
【０１０６】
従って、本発明はまた、子宮頸部異形成の進行の予後診断のための方法であって、子宮頸部異形成の試料におけるＴＳＬＰ発現を検出する段階であって、ここでＴＳＬＰ発現が検出される場合には、子宮頸部異形成が持続するかあるいは子宮頸部上皮内腫瘍及び子宮頸癌に進行する可能性があり、ＴＳＬＰ発現が検出されない場合には、子宮頸部異形成は退縮する可能性がある段階を含んでなる方法を供する。
【０１０７】
子宮頸部異形成の試料は、任意の適当な手段、例えば、子宮頸部の組織診に従って、特にＨＰＶ、さらに特にＨＰＶ１６型又はＨＰＶ１８型に感染した対象において得られてよい。
【０１０８】
対照試料は、未分化のケラチノサイトの基底層及び真皮の試料から成る。対照試料は、子宮頸部異形成の試料を得るために、子宮頸部組織診を受けた対象、又は他の対象から得た。
【０１０９】
用語「ＴＳＬＰ発現を検出すること」は、任意の定量的、半定量的、又は定性的な、ＴＳＬＰタンパク質又はｍＲＭＡを検出する或いはＴＳＬＰ活性を検出する方法を意味する。
【０１１０】
明細書で使用する場合、ＴＳＬＰ発現が検出される場合には、好適には、対照試料において測定されたＴＳＬＰのレベルと比較してＴＳＬＰのレベルが有意に増大される場合、ＴＳＬＰは子宮頸部異形成において発現されていると考える。このような場合には、子宮頸部異形成は「ＴＳＬＰ陽性」と呼ぶ。ＴＳＬＰ発現レベルにおける有意な増大は、好適には少なくとも１０％、好適には少なくとも２０％、より好適には少なくとも３０％、より好適には少なくとも４０％、さらに好適には少なくとも５０％の増大を意味する。
【０１１１】
ＴＳＬＰ発現を検出することができない場合、好適にはＴＳＬＰのレベルが対照試料において測定されるＴＳＬＰのレベルと有意に相違しない場合、子宮頸部異形成は「ＴＳＬＰ陰性」である。
【０１１２】
ＴＳＬＰ発現は、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を検出又は測定することによって、例えばインサイツ（in situ）における免疫組織化学又は免疫蛍光法によって、当技術分野でありふれた方法に従って当業者によって容易に検出することができる。
【０１１３】
例えば、ＴＳＬＰタンパク質は、抗ＴＳＬＰ抗体、好適には検出可能標識に結合された抗ＴＳＬＰ抗体で、エクスビボ（ex vivo）において検出することができる。
【０１１４】
用語「標識」は、担体物質又は分子（例えば、抗体若しくはオリゴヌクレオチド）に付着されることができ、ＴＳＬＰを検出するために使用することができる同定タグを意味する。標識は、結合又は架橋部分によって直接又は間接的にその担体物質に付着されてよい。適当な標識は、酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ、蛍光化合物、例えばローダミン、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン（PE）、テキサスレッド、ペリジニンクロロフィルタンパク質（PerCP）又はＦＩＴＣ、発光化合物、例えば；ジオキセタン、ルシフェリン、放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、タンパク質結合パートナー、例えば、ビオチン等を含むがこれらに限定されない。
【０１１５】
本実施形態のＴＳＬＰタンパク質を検出する方法は、子宮頸部異形成試料を抗ＴＳＬＰ抗体と接触させる段階、当該抗体をＴＳＬＰに結合する段階、及び抗体及びＴＳＬＰによって形成された複合体を検出する段階を含んでなる。
【０１１６】
子宮頸部異形成試料の細胞、組織においてＴＳＬＰを同定するためにプローブとして使用される抗体が蛍光色素で標識される場合、抗体及びＴＳＬＰによって形成された複合体を検出するために免疫蛍光顕微鏡を使用してよい。組織切片においてＴＳＬＰタンパク質を検出するための免疫蛍光法の代替物は免疫組織化学法であり、この方法において特異的抗体は、無色の基質を不溶性である有色の反応産物に変える酵素に化学的に結合され、インサイツ（in situ）で、すなわちこの結合が形成される場所で沈殿する。抗体が結合した有色生成物の局在性析出は、光学顕微鏡下で直接観察することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼは、これらの適用において最も一般的に使用される２つの酵素である。西洋ワサビペルオキシダーゼは、基質ジアミノベンジジンを酸化して茶色沈殿を生成し、一方アルカリホスファターゼは、使用される基質次第で赤色又は青色染色を生成することができ；通常の基質は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸＋ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT）であり、紺青色又は紫色染色を生じる。
【０１１７】
免疫ブロッティング（ウエスタンブロッティング）は、細胞可溶化物中のＴＳＬＰタンパク質又はｍＲＮＡの存在を同定するために使用してよい。全細胞タンパク質を可溶化するために非標識細胞を洗浄剤中に置き、可溶化液のタンパク質を、例えば、可溶化液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流すことによって分離し、安定な担体、例えばニトロセルロース膜へ移す。抗体及び結合抗体での処理によってＴＳＬＰタンパク質を検出し、放射性同位元素又は酵素で標識された抗免疫グロブリン抗体によって明らかにする。
【０１１８】
同様に、サイズ分離されたＲＮＡにおいてＴＳＬＰ ｍＲＮＡを検出するために、特異的にハイブリッド形成することが可能な、例えば、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡに相補的な検出可能プローブを使用して、ノーザンブロッティングを利用してよい。
【０１１９】
子宮頸癌を診断する方法
本発明はまた、子宮頸癌及び／又は子宮頸癌に進行する可能性がある子宮頸部異形成を診断する方法であって、患者の試料におけるＴＳＬＰ発現を検出する段階を含んでなる方法に関する。当該方法は、少なくとも１つの対照試料においてＴＳＬＰ発現を検出する段階、及び子宮頸癌又は子宮頸部異形成を患いやすい患者の試料において発現されたＴＳＬＰのレベルを、対照試料において発現されたＴＳＬＰのレベルと比較する段階をさらに含んでよい。対照試料は、好適には健康な子宮頸部を示しているものである。
【０１２０】
試料は、好適には子宮頸部試料、例えば、子宮頸部の未分化ケラチノサイトの基底層及び真皮を含んでなる又はから成る試料を示している。
【０１２１】
対照試料は、（患者由来又は患者由来でない）健康な子宮頸部の試料に相当し得る。このような対照試料は、子宮頸部の未分化ケラチノサイトの基底層及び真皮を含んでなる又はから成る試料か、或いは精製及び／又は分離されたＴＳＬＰの既知量であって、健康な子宮頸部を示している既知量を含んでなる試料に相当し得る。
【０１２２】
明細書中で記載するように、ＴＳＬＰ発現は良性子宮頸部異形成において検出することができない。これに対して、ＴＳＬＰは子宮頸部上皮内腫瘍又は子宮頸癌に進行する可能性がある子宮頸部異形成で発現されることが示されており、子宮頸癌において発現されることもまた期待される。従って、試料においてＴＳＬＰ発現を検出することは、患者が子宮頸癌を患う又は子宮頸癌に罹患するリスクにあることを示しているであろう。
【０１２３】
好適な実施形態において、健康な子宮頸部を示している対照試料において検出されたＴＳＬＰのレベルと比較した、患者由来の子宮頸部試料におけるＴＳＬＰ発現のレベルの有意な増大は、患者が子宮頸癌を患う又は子宮頸癌に罹患するリスクがあることを示す。ＴＳＬＰ発現のレベルにおける有意な増大は、好適には少なくとも１０％、好適には少なくとも２０％、より好適には少なくとも３０％、より好適には少なくとも４０％、さらに好適には少なくとも５０％の増大を意味する。
【０１２４】
ＴＳＬＰ発現は、当技術分野でありふれた方法に従って、例えば、「ＨＰＶ感染症と関連した、子宮頸部異形成の予後を診断するための方法」とタイトル付けした段落で記載したように、当業者によって容易に検出することができる。
【０１２５】
本発明のキット
本発明は、さらに子宮頸部異形成の予後を診断するため、及び／又は子宮頸癌を診断するためのキットであって、ＴＳＬＰ発現を検出するための手段を含んでなるキットに関する。
【０１２６】
キットは：
−少なくとも１つの、ＴＳＬＰ発現の検出を行うための生化学試薬（例えば、PCR mix若しくは標識された抗TSPL抗体の標識を検出するための試薬）；及び／又は、
−子宮頸部異形成の予後を診断する並びに／又は子宮頸癌及び／若しくは子宮頸癌に進行する可能性がある子宮頸部異形成を診断するためのキットの使用のための説明書；並びに／或いは、
−少なくとも１つの、健康な子宮頸部、子宮頸部異形成、若しくは子宮頸癌を示している対照試料、
をさらに含んでなる。
【０１２７】
ＴＳＬＰ発現を検出するための手段は、当技術分野で周知であり、例えば、抗体及びオリゴヌクレオチド、例えばプライマー及びプローブを含む。例えば、キットは、インサイツ（in situ）免疫組織化学法、免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーによってＴＳＬＰ発現を検出するのに適当な抗ＴＳＬＰ抗体、ノーザンブロッティングによってＴＳＬＰ発現を検出するのに適当なプローブ、ＰＣＲによってＴＳＬＰ発現を検出するのに適当なプライマー、或いはＲＴ−ｑＰＣＲによってＴＳＬＰ発現を検出するためのプライマー及びプローブを含んでよい。
【０１２８】
「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオシド（アデノシン, グアノシン, ウリジン 若しくはシチジン; 「RNA分子」）又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン, デオキシグアノシン, デオキシチミジン, 若しくはデオキシシチジン; 「DNA分子」）のリン酸エステル重合体形態、或いは一本鎖形態、又は二本鎖らせん状のこれらの任意のリン酸エステル類似体、例えばホスホロチオエート及びチオエステル、を意味する。
【０１２９】
用語「プライマー」は、プライマーと標的核酸鎖との間でハイブリッドを形成するために、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的核酸分子とアニーリングすることができる、短い核酸分子、例えばＤＮＡオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、ポリメラーゼ酵素によって標的核酸分子に沿って伸展することができる。従って、プライマーは標的核酸分子を増幅するために使用することができる。プライマー対は、例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、又は当技術分野で周知の他の核酸増幅方法による、核酸配列の増幅のために使用することができる。プライマーを調製及び使用するための方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York）において記載される。
【０１３０】
用語「プローブ」は、標的核酸とハイブリッド形成することができる分離された核酸を意味する。検出可能標識又はレポーター分子は、プローブに付着することができる。典型的な標識は、放射性同位元素、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素を含む。様々な目的に適当な標識のための方法及び標識の選択におけるガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（1989 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor）において考察される。
【０１３１】
プライマー及びプローブは、好適には少なくとも１２、１５、２０、２５、３０又は５０のヌクレオチド長である。
【０１３２】
プライマー及びプローブは、例えば、以下の５００、２５０、２００、１５０、１００、又は５０ヌクレオチド長とすることができる。
【０１３３】
このようなプライマー及びプローブは、当技術分野で周知である。例えば、ＴＳＬＰの発現を測定するめに適当なプライマー及びプローブは、配列番号１の配列、又はこれらに相補的な配列の断片を含んでなる又はから成ってよい。当該断片は、当該配列の少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００のヌクレオチド断片でよい。
【０１３４】
ＴＳＬＰ発現を検出するのに適当な抗体はまた当業者に周知であり、例えば、「ＨＰＶ感染症と関連した、子宮頸部異形成の予後を診断するための方法」とタイトル付けした段落において記載した、検出可能標識に結合された抗ＴＳＬＰ抗体を含む。
【０１３５】
本発明を、次の図及び実施例の点からさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１Ａ】図１は、上皮由来のＬＣに対するＨＰＶ感染症の影響を示す。図１Ａは、組織切片上でＬＣをカウントしたデータを示し、示されるデータは、健康な皮膚（n=6）、プールされたＨＰＶ病変（n=31）、足底疣贅（n=8）、尋常性疣贅（n=6）、扁平疣贅（n=7）、尖形コンジローマ（n=10）、及びアトピー性皮膚炎（n=5）に関して、平均値＋／−ＳＤとして示す。（*p < 0.05）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＤＣのＨＰＶ又はＦｌｕでの感染中の、又はＴＳＬＰとの接触による、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０の細胞表面発現に基づくＤＣ活性のレベルを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、様々なサイトカイン及びケモカインの発現に対するＨＰＶ感染症の影響を示す（NS: 正常な皮膚, CA: コンジローマ罹患皮膚）。
【０１３７】
【図２Ａ】図２は、ＬＣ細胞遊走に対するＴＳＬＰの影響を示す。図２Ａは、ＬＣを健康な子宮頸部上皮（n=9）、ＴＳＬＰ陽性（n=35）及びＴＳＬＰ陰性（n=12）ＣＩＮ１病変においてカウントしたデータを示し、データは、平均値＋／−ＳＤとして示される（* p < 0.05）。子宮頸部のＴＳＬＰ陽性病変は、子宮頸部及び健康な子宮頸部のＴＳＬＰ陰性病変と比較して、ＬＣカウントの減少を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＴＳＬＰのＬＣ遊走に対する用量依存的影響を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＤ１ａ＋遊走細胞の表面マーカー発現を示す。
【０１３８】
【図３Ａ】図３は、ＴＳＬＰがＤＣ細胞にどのように作用するかを示す。図３Ａは、「自由移動」又は「三次元移動」を再現するための、コーティングされていないフィルター又はコラーゲンコーティングしたフィルターにおける、ＴＳＬＰ、ＴＮＦ、ＴＬＲ、ＬＰＳ又はインフルエンザウイルスでの活性後のＤＣの遊走性能力を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＴＳＬＰでの処理後に遊走を開始するのに、ＤＣによって必要とされる時間を示す。
【０１３９】
【図４Ａ】図４は、ＴＳＬＰ誘発されたＤＣ極性がミオシンＩＩ依存的であることを示す。図４Ａは、ＴＳＬＰ、ＴＮＦ、Ｆｌｕ又はＬＰＳでの感染又は処理後に、ＤＣの極性を、細胞におけるアクチン細胞骨格の位置及び細胞表面にわたるポドソームの位置から評価したデータを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ブレビスタチン、ミオシンＩＩ抑制剤の、ＤＣ細胞極性を誘発するＴＳＬＰ、Ｍｉｐ３α（CCL20）、ＴＮＦ、Ｆｌｕ又はＬＰＳの能力に対する影響を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＴＳＬＰ誘発された細胞極性を抑制するのに必要なブレビスタチンの用量を示す。
【０１４０】
【図５Ａ】図５は、閉鎖環境におけるＤＣ運動性に対するＴＳＬＰの効果を説明する。図５Ａは、マイクロチャネルシステムにおいて、非ＴＳＬＰ活性化ＤＣと比較して、ＴＳＬＰ活性はＤＣの速度に影響しなかったことを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ブレビスタチン（50nM）の非存在又は存在下で細胞を前培養した場合に、３時間の微速度撮影中にチャネルに進入するＤＣの数の定量化したデータを示す。対照培地と比較して、ＴＳＬＰはマイクロチャネルに進入するＤＣの量の４倍増加を誘発した。ブレビスタチンは、この効果を有意に抑制した。データは、平均値＋／−ＳＤ、ｎ＝３として示される（* P < 0.05）。
【０１４１】
【図６Ａ】図６は、ＨＰＶの存在下でさえＴＳＬＰがＴＨ２応答を誘導することを示す。図６Ａは、２４時間の培養後、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の表面レベルに基づいて、ＨＰＶは任意のＤＣ活性を誘発しなかったことを示す。ＴＳＬＰは、これらの３つの成熟マーカーの強度の上方制御を誘発し、ＨＰＶに影響されなかった。ＭＦＩ：平均蛍光強度。
【図６Ｂ】図６Ｂは、４８時間の培養後、ＴＳＬＰは、ＤＣ上の表面ＯＸ４０−リガンド（OX40L）発現（左側パネル）及びＯＸ４０Ｌを発現しているＤＣの比率（右側パネル）の上方制御を誘発したことを示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＨＰＶ、ＴＳＬＰ又はＨＰＶ＋ＴＳＬＰによって活性化された、ＤＣで誘発されたＴ細胞によるＩＮＦ−γ、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＮＦの産生を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＦＡＣＳによる、ＨＰＶ、ＴＳＬＰ又はＨＰＶ＋ＴＳＬＰによって活性化された、ＤＣで誘発されたＴ細胞によるＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＮＦ、ＩＮＦ−γの産生を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、極性化サイトカインの存在下又は非存在下で、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で未処理のヘルパーＴ細胞を５日間培養し、そして続く２４時間のポリクローナル再刺激後に測定したＴｈサイトカインＴＮＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１０を示す。ＴＨ０：極性化サイトカインの添加なし；Ｔｈ１：ＩＬ−１２；Ｔｈ２：ＩＬ−４。各ドットは独立した実験に由来する値を表す。バーは平均値を表す。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：ＬＣの減少は、ＨＰＶ感染症の固有の特性である。
あらゆるタイプのＨＰＶ感染症においてＬＣ減少が一般的特徴であるかを決定するために、異なるタイプのいぼ（尋常性、足底及び扁平疣贅）及びコンジローマにおけるＬＣの数を、正常な皮膚と比較して定量化した。
試験したすべての皮膚病変において、ＬＣのプールはほとんど消失した（図1A）。従って、ＬＣの減少は、ＨＰＶ感染症の固有の特性である。よって、ＨＰＶ微小環境に存在する因子は、ＬＣの活性及び遊走を誘発すると仮定した。
【０１４３】
実施例２：ＨＰＶは、直接ＤＣに感染する且つ／又はＤＣを活性化することはできない。
直接ＤＣに感染する且つ／又はＤＣを活性化するＨＰＶの能力を分析した。細胞数制限のため、健康なドナーの血液から直接分離した初代ＤＣを使用した。これらはＬＣと多くの類似性を共有する。使用する可能性のある全ウイルスＨＰＶ−１並びにウイルス様粒子（VLP）１６及びＶＬＰ１８を利用した。
【０１４４】
全初代ＨＰＶ−１ビリオンを、Ｏｒｔｈ等（J Virol, 1977, 24, 108-120）に記載されるように、足底いぼから精製した。ＶＬＰ１６及びＶＬＰ１８は、Ｇｌａｘｏ−Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅから寄贈されたものであった。ＤＣへのＨＰＶ移行を評価するために、１０７ＨＰＶ−１ウイルス粒子／ｍｌ或いは１０μｇ／ｍｌ ＶＬＰ１６又はＶＬＰ１８と共に細胞を２４時間インキュベートした。続いてＤＣを洗浄し、７０００×１０分間サイトスピンした（cytospin）。続いてスライスをドライアイス上で凍結させ、冷アセトン（-20℃）中で１０分間固定し、免疫蛍光法によるウイルス検出のための使用まで−８０℃で保存した。ＨＰＶ及びウイルス粒子を、マウス抗Ｌ１タンパク質抗体（Visoactiv & Virofem）を使用することによって、続いてＣｙ３蛍光色素に結合する抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Lab）によって検出した。
【０１４５】
２４時間のインキュベーション後に、ＨＰＶ−１はＤＣに進入することができたが、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の細胞表面発現に基づくＤＣ活性を誘発しなかった（図1B）。エクスビボ（ex vivo）又はインビトロ（in vitro）において生成されたＬＣで又はＶＬＰを使用して、同様のデータが得られた。従って、ＨＰＶによるＤＣの直接の活性は、排除することができた。
【０１４６】
実施例３：ＨＢＶ感染中のサイトカイン発現
次に、ＬＣ活性及び遊走は、ＨＰＶ感染組織の微小環境に存在する炎症性サイトカインによって誘発することができると仮定した（Cumberbatch et al., Clin. Exp. Dermatol. 2000, 25（5）:413-8, Cumberbatch et al., Br. J. Dermatol., 1999, 141 （2）:192-200）。ＨＰＶ病変モデルとしてコンジローマを使用し、炎症性サイトカイン及びケモカインの遺伝子発現を分析した。
【０１４７】
正常な皮膚と比較して、同程度のＴＮＦ−ａ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２が観察されたが、一方ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＩＬ−２３は有意に減少した（図1C）。従って、これらのプロファイルにおいてＤＣ活性を確認することができたサイトカイン候補はなかった。
【０１４８】
様々なケモカインの非存在又は、特にＣＣＬ２０産生レベルの低下もまた、免疫組織化学によって確認した（図1C）。ＣＣＬ２０の下方制御はまた、子宮頸部病変において示され、ＬＣ前駆体の補充不良に関与するかもしれない。興味深いことに、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０及びＴＧＦ−βもまた正常な皮膚と比較して下方制御され、これらがＨＰＶに対する免疫回避に関与しないことを示しており、以前の報告と対照をなしている。  
【０１４９】
皮膚及び子宮頸部のＨＰＶ感染病変において、著しく、高レベルのＴＳＬＰを確認した。アトピー性皮膚炎において既に観察したように、ＴＳＬＰ産生は未分化ケラチノサイトの基底層において存在せず、真皮においてＴＳＬＰ染色はなかった。
【０１５０】
実施例４：ＤＣ遊走におけるＴＳＬＰの関与
ＨＰＶ感染症に関するＬＣ遊走におけるＴＳＬＰの役割を検討するために、組織診の際に約３０％のＣＩＮ−１病変がＴＳＬＰを発現しなかったという事実を利用した。ＴＳＬＰ発現は、上皮性ＬＣの数と相関し、ＴＳＬＰを欠如した感染子宮頸部だけがＬＣのプールを維持することができることが分かった（図2A）。これは、ＴＳＬＰがＬＣ遊走のトリガーであるかもしれないこと示した。
【０１５１】
次に、ＬＣの遊出を試験するために、上皮性外植片を包括的なモデルとして使用した。ＴＳＬＰは、ＣＤ１ａ＋ランゲリン＋ＴＳＬＰ受容体＋ＣＤ８０＋細胞の遊出を有意に増大した（図2B及びC）。この点で、ＴＳＬＰはＴＮＦａより効率的であり、ＬＣ遊走を誘発するのに非常に強力なサイトカインと見なした（Cumberbatch et al., Clin. Exp. Dermatol., 2000, 25（5）:413-8; Cumberbatch et al., Br. J. Dermatol. 1999, 141 （2）:192-200）。
【０１５２】
皮膚外植片モデルにおいて、ＴＳＬＰの影響は、間接的であるか又はケラチノサイトによって産生される因子によって支持され得る。ＴＳＬＰ活性化ＤＣ（TSLP-DC）の遊走する能力を詳細に分析するために、インビトロ（in vitro）におけるトランスウェル実験（transwell experiment）を行った。２つのタイプの移動：（i）コーティングされていないフィルターを通して細胞が遊走することができる場合の「自由移動」、及び（ii）コラーゲン１コーティングしたフィルターを使用した、インビボ（in vivo）における状況により近い「三次元移動」、を再現することを試みた。
【０１５３】
そのために、コーティングされていない又はコラーゲン１型（5μg/ml ラットテールコラーゲン１型, BD Biosciences）コーティングしたトランスウェル（Costar, 3μｍ pore）を２００μｌのＤＣ培地で満たされた９６ウェルプレート中に置いた。
【０１５４】
健康な成人ボランティアドナーの血液（Crozatier blood bank, Paris, France）のバフィーコートから、既に記載したようにＦａｃＳｏｒｔｉｎｇで（Soumelis et al., Nat Immunol, 2002, 3, 673-680）、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを９９％まで精製した。１０％ウシ胎仔血清、１％ピルビン酸、１％ＨＥＰＥＳ及び１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中で、フレッシュな状態で選別したＣＤ１１ｃ＋ＤＣを培養した。５０ｎｇ／ｍｌ ＴＳＬＰ（R&D Systems）、１０７ＨＰＶ粒子、２．５ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ（R&D）、２０μｇ／ｍｌインフルエンザウイルス（H1N1 , A/PR/8/34 strain, Charles River Lab.）、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Sigma）、又は１００ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦ（BruCells）の非存在（未処理細胞）又は存在下で、平底の９６ウェルプレート中に１×１０６／ｍｌで細胞を播種した。
オーバーナイトでＴＳＬＰ、ＴＮＦ、ＬＰＳ、インフルエンザウイルス又はＧＭ−ＣＳＦで処理したＤＣ（1x106/ml）を再懸濁し、この溶液の５０μｌをトランスウェルの上部のチャンバーに添加し、３７℃で６時間インキュベートした。ＭＩＰ−３α／ＣＣＬ２０（500ng/ml）（R&D）を、ＤＣ遊走を誘発する陽性対照として下部チャンバーに添加した。６時間後、トランスウェルの上部及び下部チャンバー中の細胞をカウントした。一部の実験において、遊走時間２４時間及び／又は６時間、ＤＣを２００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素で前処理した。結果は、総ＤＣの％として表した。
【０１５５】
ＴＳＬＰ−ＤＣは、いずれのシステムにおいても遊走に関して非常に効率が高かった（図3A）。ＴＳＬＰ−ＤＣの遊走性能力はＴＮＦ−ＤＣより高かった。２つのＴｏｌｌ様受容体（TLR）リガンド、ＬＰＳ及びインフルエンザウイルスは、ＤＣ遊走を誘発することができなかった（図3A）。ＴＳＬＰ誘発された遊走は、培養中のヒトＤＣによるＴＳＬＰ受容体の発現と調和し、ＴＳＬＰ曝露の３時間後位に開始した（図3B）。従って、ケモカインとは独立して、直接ＤＣに作用することによって、ＴＳＬＰは強力に遊走を誘発することができる。
【０１５６】
実施例５：ＴＳＬＰは、ヒトＤＣのミオシンＩＩ依存的極性を、細胞骨格の重要な再構築と共に誘発した。
基礎をなす分子メカニズムを検討するために、細胞極性を、移動の獲得のために制御されなければならない細胞活性及び遊走の特徴として分析した。アクチン細胞骨格は、細胞増殖及びアクチン再構築に必要な機構であり、細胞極性及び移動に必須である。
【０１５７】
細胞骨格構造を決定するために、ポリリジンコーティングしたカバーガラス上でＤＣを２４時間培養し、落射蛍光顕微鏡によって調べた。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の４％ＰＦＡの中で２０分間細胞を室温で固定し、ＰＢＳ中の１％トリソンＸ−１００で５分間透過処理し、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（BSA）で２０分間室温でブロックした。繊維状アクチンの局在化のために、細胞をＣｙ３−ファロイジン（Molecular Probes）で３０分間インキュベートした。５人の異なるドナー由来の極性化したＤＣの数をカウントすることで、極性指標を評価した。極性を、細胞の総数に対する極性化した細胞の比率として表した。α−チューブリンの局在化を、ラット抗ヒトα−チューブリン抗体（Serotec）での１時間のインキュベーションによって達成した。ウサギ抗ヒトミオシンＩＩ Ｈ鎖抗体（BTI）によってミオシンＩＩを検出し、その後３０分間Ａｌｅｘａ ４８８ヤギ抗ウサギ（Molecular Probes）でインキュベーションした。ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ抗フェード試薬（Invitrogen）中でカバーガラスを載せた。適当なフィルターセットを取り付けた落射蛍光顕微鏡（Leica）によって、蛍光画像が得られた。
【０１５８】
ポリリジンコーティングしたカバーガラス中の刺激されていないヒトＤＣは、細胞周辺において構築され細胞表面にわたり散在的に分布されたポドソーム中で強化されたアクチン細胞骨格と共に、非極性状態であるように見えた。インフルエンザウイルスによって活性化される場合、同一の非極性形態が維持された。ＬＰＳは、ポドソームの減少と共に複数の樹状伸展の形成を誘発し、細胞は「星」形状を獲得した。興味深いことに、細胞は、ＴＳＬＰ処理後、核が置換されたよく発達した先端及び他の細胞極の長く非常に薄いウロポッド（uropod）を有した状態で非常に極性化した（図4A）。ポドソームは、主に伸展領域に密集し且つ／又はアクチンフィラメントは核周辺で増強された。ＴＮＦ−ｍＤＣは、極性はあまり明らかではなかったが、極性化した形状をとった（図4A）。微小管の極性化した成長はまた、細胞極性に重大である。アクチン細胞骨格と同様に、微小管は、培地で培養したヒトＤＣ中に非極性化状態で構築され、この形状はインフルエンザウイルスの存在下で変化しなかった。ＬＰＳ処理は樹状増殖の微小管の再構築を誘発した。細胞形状は、微小管骨格に関してもまた、ＴＳＬＰ及びＴＮＦ−ａ−刺激ＤＣにおいて極性化した。結論として、ＴＳＬＰは、ヒトＤＣの極性を細胞骨格の重要な再構築と共に誘発した。
【０１５９】
非筋細胞ミオシンファミリーのミオシンＩＩのメンバーは、アクチンを結合できるモータータンパク質であり、直接細胞増殖及び細胞移動に関与する。ミオシンＩＩは、Ｎ末端がアクチン及びＡＴＰ結合部位と球状頭部を形成する２つのＨ鎖、及び２つのＬ鎖に存在する。アクチン結合後に、ミオシンＩＩは、アクチンフィラメントのプラス端へ移動することができ、アクチンフィラメント収縮を誘発する。培地又はＬＰＳ−ＤＣではなく、ＴＳＬＰ−ＤＣにおいて、細胞退縮を示しているアクチンフィラメントと共に、ミオシンＩＩは先端に蓄積した。結論として、ＴＳＬＰ処理は、遊走性能力と共に、ｍＤＣ成熟、極性及びアクチン−ミオシンＩＩ再局在化を誘導した。
【０１６０】
アクトミオシン細胞骨格の著しい再構築を考慮すると、ＴＳＬＰ誘発性ＤＣ遊走がミオシンＩＩ依存的かどうかの疑問が生じた。ブレビスタチンは、アクチン脱離部位においてミオシンＩＩの先端をブロックする低分子抑制剤である。
【０１６１】
ＴＳＬＰ−ＤＣの形態のミオシンＩＩの役割を試験するために、細胞極性を可能にするため、ポリリジンコーティングしたスライドガラス上で、２０ｎＭブレビスタチンと共に又はなしに細胞をＴＳＬＰ中で１２時間インキュベートした。ブレビスタチンの毒性効果を回避するために、低濃度を選択した。
【０１６２】
ミオシンＩＩの不活性化は、ＴＳＬＰによって誘発された極性及び遊走を抑制した（図4B）。ＤＣ遊走は、２０ｎＭほど低用量のブレビスタチンで抑制された（図4C）。遊走の減少は、十分に構築された極性化形態の減少を伴った。ブレビスタチン処理は、非生理的なものとして既に記載した非常に伸長した細胞形状をもたらした。従って、ＴＳＬＰ誘発されたＤＣ遊走及び細胞骨格の極性は、ミオシンＩＩ依存的である。
【０１６３】
実施例６：ＴＳＬＰは、閉鎖環境においてＤＣ運動性を促進する。
組織は、細胞遊走に関して閉鎖環境を表す（Irimia et al., Lab Chip, 2007, 7, 1783-1790）。細胞は、狭小な空間に「トラップされ」ており、多様な密度の領域を通過せざるを得ない。このようなインビボ（in vivo）状況を再現するために、マイクロチャネルシステムを使用した。このシステムによって、細胞移動を規定し且つ移動性細胞の方向を制限するための多様なパラメーターを定量化することができる。
【０１６４】
マイクロ流体デバイスをＰＤＭＳ中で製作した（Whitesides G. M., E., O., Takayama S., X., J. & E, I. D. Ann Rev Biomed Eng, 2001 3, 335）。包埋したマイクロチャネル並びに入口及び出口のための穴を有するＰＤＭＳ部分、並びにガラス製イワキチャンバー（Milian）を、プラズマクリーナー（PDC-32G Harrick）中で活性化し、互いに結合させた。チャンバーをプラズマクリーナー中で強真空下に５分間置き、ＰＤＭＳの上層及び入口及び出口穴を親水性状態とするために、プラズマをオンにした。５０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン溶液を入口及び出口の上部に置いた。当該溶液はチャネルに自然に浸潤し、上記の真空処理によって全ての気泡はＰＤＭＳの中に再吸収された。フィブロネクチンを１時間室温でインキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄し、細胞培地と取り換えた。細胞を濃縮し、細胞を含むマイクロピペットチップを入口に挿入した。細胞は入口の中に移動し、底のカバーガラスに結合し、遊走を開始した。これらは、機械的又は化学的刺激なしに、チャネルに自然に進入した。
【０１６５】
チャンバー中の様々な位置における位相差イメージを、６時間中、〜２分の微速度で、温度、湿度、及びＣＯ２用環境チャンバー（Life Imaging Services）を備えた自動顕微鏡（Marzhauserのモーター駆動ステージ及びHQ2 Roperカメラが装備された、Nikon ECLIPSE TE1000-E, 及びOlympus X71）を使用して記録した。記録の全期間中、細胞は生存し且つ運動性のある状態であった。
【０１６６】
ＤＣ遊走におけるミオシンＩＩの重要性を分析するために、５０ｎＭブレビスタチンで細胞を前処理し、続いて濃縮しマイクロチャネルに挿入した。
【０１６７】
まず、ＤＣの中央速度を測定し、培地で前培養したＤＣ又はＴＳＬＰで前培養したＤＣとの間で、有意な違いは確認されなかった（図5A）。同様の結果が、最高及び最低ＤＣ速度に関して得られた。これは、トランスウェルシステムにおいてＴＳＬＰで観察された増大された遊走が増加した速度に起因しないことを示した。ＤＣ遊走のライブ映像を観察することによって、ＴＳＬＰ−ＤＣが境界に達しマイクロチャネルに進入することにより優れていることが認められた。結果的に、ＴＳＬＰ前処理後の所定の時間に、培地と比較して多くのＤＣがチャネルの中に移動していた。チャネル中へのＤＣ進入のＴＳＬＰ誘発増加は、ミオシンＩＩ依存的であり（図5B）、他のＤＣ活性条件下で観察されなかった。
【０１６８】
これは、ＴＳＬＰが閉鎖環境においてＤＣの運動性を促進することを示し、そしてマウス白血球の三次元移動におけるミオシンＩＩに関する役割を説明している最近の報告と合致し（Lammermann et al., Nature 2008; 453(7191):51-5）、ＤＣの運動性は狭小な間隙を通した移動の開始及び通り道を好むことを示す。これは、ＤＣの移動の速度及び種類に影響するが、同様のマイクロチャネル中への進入には影響しないＤＣの運動性のインバリアント鎖の対照と対照的である。
【０１６９】
実施例７：ＴＳＬＰのトリガーは、Ｔｈ２応答を誘導するかもしれない。
ここに記載される結果は、ＨＰＶ感染症で観察され且つ局所性免疫抑制に寄与しているＬＣ減少に関する分子基盤を供する。しかしながら、重要な問題は、遊走しているＴＳＬＰ活性化ＤＣの運命及び抗ウイルス性Ｔ細胞応答を誘発するこの能力である。ＴＳＬＰは、アレルギー誘発性Ｔｈ２応答を誘発することが知られる。ＨＰＶはＴＳＬＰ誘発ＤＣ活性及びそれに続くＴ細胞プライミングを調節することができるかが、疑問であった。
【０１７０】
ＴＳＬＰは、同時刺激の分子の細胞表面発現に基づき、ＤＣの強力な活性を誘発し、これはＨＰＶの存在下で変更されなかった（図6A及び6B）。
ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、健康な成人ボランティア血液ドナーのバフィーコート（Crozatier blood bank, Paris, France）から、上述のように（Soumelis et al., Nat Immunol, 2002, 3, 673-680）ＦａｃＳｏｒｔｉｎｇによって９９％まで精製した。フレッシュに選別したＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、１０％ウシ胎仔血清、１％ピルビン酸、１％ＨＥＰＥＳ及び１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中で培養した。５０ｎｇ／ｍｌ ＴＳＬＰ（R&D Systems）、１０７ＨＰＶ粒子、ＴＳＬＰ＋ＨＰＶの存在下又は非存在下で（未処理細胞）、平底９６ウェルプレート中で１×１０６／ｍｌで細胞を播種した。
培養の２４時間後、刺激されたＣＤ１１ｃ＋ＤＣを採取し、洗浄し、そして１０％ＦＣＳ（Hyclone）を含むＹｓｓｅｌの培地（kind gift of Hans Yssel）中で、１：５ ＤＣ：Ｔ細胞の割合で丸底型プレート９６ウェル培養プレート（Falcon）中で同種異系間の未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。ＣＤ４Ｔ細胞分離キットＩＩ（Miltenyi Biotec）を使用し、続いて、ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ、ＣＤ４−ＡＰＣの染色、及びＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ−細胞のＦＡＣＳＡｒｉａ（BD Bioscience）での細胞選別（純度>99%）をすることによって、末梢血の未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞エキスパンダー（1ビーズ per 細胞）（Invitrogen）及びＴｈ１のための１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１２（R&D Systems）、Ｔｈ２のための２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４（R&D Systems）の存在下、且つＴｈ０のための任意の極性化サイトカインの非存在下で、標準Ｔｈサブセットを生じた。
【０１７１】
５〜６日後、細胞を回収し、広範囲に洗浄し、トリパンブルー排除試験によって生存率を測定した。１×１０６細胞／ｍｌを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３−ＣＤ２８Ｔ細胞エキスパンダー（1ビース per 細胞）で２４時間再刺激（ELISA）又は１００ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ及び１ｍｇ／ｍｌ ロノマイシンで６時間再刺激（FACS細胞内染色）した。培養上清中のサイトカインを、製造説明書に従って細胞数測定ビーズアッセイ（cytometric bead assay）（CBA）Ｆｌｅｘ Ｓｅｔｓ（BD Bioscience）によって測定した。再刺激の最後の３時間中、１０μｇ／ｍｌブレフェルジンの添加後、ＩＦＮ−γ−、ＩＬ−４−、ＩＬ−１０−、ＴＮＦ−産生細胞を細胞内サイトカイン染色によって分析した。Ｃｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ試薬（BD Biosciences）を使用して、細胞を透過処理した。細胞を抗ＩＦＮ−γ ＦＩＴＣ、抗ＩＬ−４ ＰＥ、抗ＩＬ−１０ ＰＥ、抗ＴＮＦ ＰＥ（BD Pharmingen）で染色し洗浄し、続いてフローサイトメトリー（FACScan Becton Dickinson）で分析した。
【０１７２】
ＴＳＬＰ−ＤＣを未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞をインビトロ（in vitro）で刺激するために使用した場合、ＴＮＦ−αと一緒にＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３の産生と共にＴｈ２プロファイルを観察し、一方ＨＰＶ−ＤＣによって誘発されたＴ細胞サイトカインプロファイルは培地と同様であった（図6C及びD）。ＤＣを活性化するためにＴＳＬＰ及びＨＰＶを結合した場合、それに続くＴ細胞サイトカインプロファイルはＴＳＬＰ−ＤＣと同様であり、ＴＳＬＰがＨＰＶより優位であることを示している。これは、ＴＳＬＰのトリガー後の流入領域リンパ節へ遊走している残りのＬＣ又はＤＣが、ウイルス性クリアランスに適当でないＴｈ２応答を誘導することを示した。
【０１７３】
結論として、本明細書に供する結果は、初めてＴＳＬＰをウイルス感染の生理病理と結び付けた。この生理状況は、ＴＳＬＰ由来のＤＣ活性及びそれに続くＴｈ２プロファイルへの免疫応答の配向の結果に非常に影響を及ぼすと考えられる。アレルギーに関して、このような免疫系の活性は、炎症促進状態を引き起こし、一方、ＨＰＶ感染症に関して、Ｔｈ２プロファイルへの免疫応答の不適当な極性はウイルス性免疫回避を促進する。
【０１７４】
重要なことに、ＨＰＶは、ウイルス性クリアランスに適当でないＴｈ２応答のためのプライミングからＴＳＬＰを保護しなかった（Kawai and Akira, Nature Immunol, 2006, 7, 131-137）。
【０１７５】
これは、防御Ｔｈ１応答及び感染の根絶を引き起こす、他のウイルス、例えばインフルエンザウイルス又はＨＳＶによって誘発された直接のＴＬＲ依存的ＤＣ活性と対照的である（Kawai and Akira, Nature Immunol, 2006, 7, 131-137）（Alcami, Nat Rev Immunol, 2003, 3, 36-50）。
【０１７６】
ランゲルハンス細胞（LC）、常在上皮性ＤＣは、ウイルス感染、例えばＨＩＶ及び単純ヘルペスウイルス（HSV）に対する防御に重大な役割を果たす。ＬＣがＨＰＶ感染子宮頸部上皮から激減されることは既に示されており、これによって局所性免疫抑制状態が作出され、そしてこれは免疫回避ストラテジーと見なされてきた（Stanley, Vaccine, 2006, 24, S16-S22）。しかしながら、ＬＣの遊出をトリガーする因子は、未知のままである。ＬＣ減少が皮膚及び粘膜のＨＰＶ感染症の一般的特徴であり、このプロセスにおけるＴＳＬＰの重大な役割の証拠を供することを示している。
【０１７７】
本明細書に記載のデータは、ＤＣ遊走の誘発が、炎症性状況とは独立した、ＴＳＬＰの内在特性であることを示す。興味深いことに、アトピー性皮膚炎及びＨＰＶ感染症両方のタイプの病変においてＴＳＬＰが存在するにもかかわらず、ＬＣはアトピー性皮膚炎ではなくＨＰＶ感染症においてのみ激減される。これは、新たなＬＣ又はＬＣ前駆物質の上皮への補充に重要である、ケモカイン、例えば、ＣＣＬ２０の発現差異に起因し得る。子宮頸部異形成において、ＣＣＬ２０は欠如しており（MIP-3α）（Guess and McCance, J Virol, 2005, 79, 14852-14862）、一方このケモカインはＡＤにおいて上方制御される（Dieu-Nosjean et al. J Exp Med, 2000, 192, 705-718）。従って、免疫応答の全体的な予後に対するＴＳＬＰの影響は、部分的に生理的状況に依存的である。
【０１７８】
細胞運動性は、抗原誘発後にＤＣ自体が末梢組織から遊走し、第二のリンパ器官に到達することを可能とするＤＣの基本特性である。ＴＳＬＰは、ＨＰＶ感染症の経過中、閉鎖環境においてＤＣ遊走を直接トリガーすることができる新規因子として認識された。制限された皮膚の間質腔中のＤＣが遭遇する微小環境を再現するマイクロチャネルシステムを使用した。さらに、ＴＳＬＰ誘発されたヒトＤＣ遊走の細胞特性により、ミオシンＩＩに依存的なサイトカイン誘発の遊走の新規の分子メカニズムが明らかとなった。これらの結果から、閉鎖環境におけるＤＣ遊走の基本的なメカニズム間の強いリンクの、ヒトウイルス感染の生理病理との関係が供される。
【０１７９】
重要なことに、これらの結果からＨＰＶ特異的免疫応答の開始に対する説明がなされ、これにより長期にわたる逆説と折り合いが付けられている。実際、本願のモデルによって、数ヶ月又は数年後にＨＰＶ感染症がどの位自然治癒し、且つ自然に退縮するか、及びＨＰＶ特異的免疫応答がどのように開始されるかを説明することが可能である。
【０１８０】
最初、ＴＳＬＰは常在ＬＣを活性化し、抗ＨＰＶ免疫の開始を可能にする一方で、長期にわたって、慢性ＬＣ減少及びＴｈ２応答への免疫偏向を促進することによってＴＳＬＰは免疫応答を破壊し、これは効率的なウイルス性クリアランスに適当でない。免疫と免疫破壊メカニズムとの間のバランスによって最終的に、通常のいぼに関して観察されるように病変の予後、或いは子宮頸部病変の場合のように数ヶ月又は数年間の持続性が決定される。
【０１８１】
従って、ＨＰＶ感染患者においてＴＳＬＰの機能を標的にすることが、感染防御性Ｔｈ１応答への免疫応答を再指示するのに役立つことが期待される。
【図１Ａ】
2012516310.tif 000002
【図１Ｂ】
2012516310.tif 000003
【図１Ｃ】
2012516310.tif 000004
【図２Ａ】
2012516310.tif 000005
【図２Ｂ】
2012516310.tif 000006
【図２Ｃ】
2012516310.tif 000007
【図３Ａ】
2012516310.tif 000008
【図３Ｂ】
2012516310.tif 000009
【図４Ａ】
2012516310.tif 000010
【図４Ｂ】
2012516310.tif 000011
【図４Ｃ】
2012516310.tif 000012
【図５Ａ】
2012516310.tif 000013
【図５Ｂ】
2012516310.tif 000014
【図６Ａ】
2012516310.tif 000015
【図６Ｂ】
2012516310.tif 000016
【図６Ｃ】
2012516310.tif 000017
【図６Ｄ】
2012516310.tif 000018
【図６Ｅ】
2012516310.tif 000019
【配列表】
2012516310000001.app
【国際調査報告】
2012516310.tif 000020
2012516310.tif 000021
2012516310.tif 000022
2012516310.tif 000023
2012516310.tif 000024
2012516310.tif 000025