(57)【要約】EPO受容体断片LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV（SEQ ID NO：1）、CSSALASKPSPEGASAASFEY（SEQ ID NO：2）、またはGGLSDGPYSNPYENSLIPAAEP（SEQ ID NO：3）への特異的な結合に特徴付けられる、ヒトEPO受容体に結合する抗体は、ヒト組織におけるEPO受容体の解析に関して有用である。2012500818.tif 000012
2012500818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
EPO受容体断片
2012500818.tif 000011
に特異的に結合することに特徴付けられる、ヒトEPO受容体に結合する抗体。
【請求項２】
重鎖可変ドメインCDR3領域として、SEQ ID NO：4または12のCDR3領域を含むことに特徴付けられる、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：4のCDR3領域、SEQ ID NO：5のCDR2領域およびSEQ ID NO：6のCDR1領域、またはSEQ ID NO：12のCDR3領域、SEQ ID NO：13のCDR2領域およびSEQ ID NO：14のCDR1領域を含むことに特徴付けられる、請求項2記載の抗体。
【請求項４】
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：4のCDR3領域、SEQ ID NO：5のCDR2領域およびSEQ ID NO：6のCDR1領域を含むこと、ならびに軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：7のCDR3領域、SEQ ID NO：8のCDR2領域およびSEQ ID NO：9のCDR1領域を含むことに特徴付けられる、請求項3記載の抗体。
【請求項５】
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：12のCDR3領域、SEQ ID NO：13のCDR2領域およびSEQ ID NO：14のCDR1領域を含むこと、ならびに軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：15のCDR3領域、SEQ ID NO：16のCDR2領域およびSEQ ID NO：17のCDR1領域を含むことに特徴付けられる、請求項4記載の抗体。
【請求項６】
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：10または18を含むことに特徴付けられる、請求項1記載の抗体。
【請求項７】
重鎖可変ドメインがSEQ ID NO：10を含むこと、および軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO：11を含むことに特徴付けられる、請求項1記載の抗体。
【請求項８】
重鎖可変ドメインがSEQ ID NO：18を含むこと、および軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO：19を含むことに特徴付けられる、請求項1記載の抗体。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体を含む診断キットの製造のための方法。
【請求項１０】
ヒト組織試料におけるEPO受容体の解析のための、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項１１】
試料がヒト組織の溶解産物であることに特徴付けられる、請求項10記載の使用。
【請求項１２】
解析が免疫化学解析または免疫組織化学的解析によって遂行されることに特徴付けられる、請求項10または11記載の使用。
【請求項１３】
解析がウェスタンブロットによって遂行されることに特徴付けられる、請求項10または11記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ヒトエリスロポエチン（EPO）は、赤血球前駆細胞の増殖および分化に関与する166-aaの糖タンパク質である。これらの細胞応答は、508-aaの糖タンパク質であるヒトEPO受容体（EPO受容体、EPO-R）によって媒介される。EPO-Rは、単一の膜貫通ドメインを含む508アミノ酸長のタンパク質であり（Swiss Prot P19235）、かつクラスIサイトカイン受容体の成長ホルモンサブファミリーのメンバーとして分類されている。EPO-Rは、例えば、Winkelmann, J. C., et al., Blood 76 (1990) 24-30、およびJones, S. S., et al., Blood 76 (1990) 31-35に記載されている。
【０００２】
EPO-Rに対する抗体は、例えば、D’Andrea, A. D., Blood 82 (1993) 46-52；Elliott, S., Blood 107 (2006) 1892-1895；Kirkeby, A., J. Nerosci. 164 (2007) 50-58；Miura, O., Arch. Biochem. 306 (1993) 200-208；およびEP1 146 056号、EP 1 327 681号、EP 0 773 962号、EP 0 776 370号、US 2002／0031806号、US 2003／0215444号、US 2004／0058393号、US 2004／0071694号、US 2004／0175379号、US 2005／0227289号、US 2005／0244409号、US 2006／0018902号、US 6,998,124号、US 7,053,184号、US 7,081,523号、WO 1995／005469号、WO 1996／003438号、WO 2000／061637号、WO 2004／035603 A2号、WO 2005／100403 A2号より公知である。しかしながら、EPO-Rに対する公知の抗体が特異性を欠如しているため、組織試料においてEPORの発現および局在を調査する研究は、多岐的でかつ往々にして人為現象的な結果を産み出す（Jelkmann, W., et al., Crit. Rev. Onc／Hematol. 67 (2008) 39-61；Elliott, S., et al., Blood 107 (2006) 1892-1895；Jelkmann, W. and Laugsch, M., J. Clin. Oncol. 25 (2007) 1627-1628；Kirkeby, A., et al., J. Neurosci. Methods 164 (2007) 50-58；Laugsch, M. et al., Int. J. Cancer 122 (2008) 1005-1011を参照のこと）。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、とりわけヒト組織（例えば、生検または組織）においてEPO-Rの特異的な解析を可能にするEPO-Rに結合する抗体を含む。
【０００４】
本発明は、ヒトEPO受容体断片
2012500818.tif 000003
への特異的な結合に特徴付けられる、ヒトEPO受容体に結合する抗体を含む。
【０００５】
抗体は、好ましくはモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体である。
【０００６】
好ましくは、本発明に係る抗体は、重鎖可変ドメインCDR3領域として、SEQ ID NO：4または12のCDR3領域を含むことに特徴付けられる。
【０００７】
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：4のCDR3領域、SEQ ID NO：5のCDR2領域、およびSEQ ID NO：6のCDR1領域、またはSEQ ID NO：12のCDR3領域、SEQ ID NO：13のCDR2領域、およびSEQ ID NO：14のCDR1領域を含むことに特徴付けられる。
【０００８】
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：4のCDR3領域、SEQ ID NO：5のCDR2領域、およびSEQ ID NO：6のCDR1領域を含むこと、ならびに軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：7のCDR3領域、SEQ ID NO：8のCDR2領域、およびSEQ ID NO：9のCDR1領域を含むことに特徴付けられる。
【０００９】
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：12のCDR3領域、SEQ ID NO：13のCDR2領域、およびSEQ ID NO：14のCDR1領域を含むこと、ならびに軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO：15のCDR3領域、SEQ ID NO：16のCDR2領域、およびSEQ ID NO：17のCDR1領域を含むことに特徴付けられる。
【００１０】
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO：10または18を含むことに特徴付けられる。
【００１１】
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO：10を含むこと、および軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO：11を含むことに特徴付けられる。
【００１２】
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO：18を含むこと、および軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO：19を含むことに特徴付けられる。
【００１３】
本発明に係る抗体は、ELISA、ウェスタンブロット、免疫細胞化学的アッセイおよび免疫組織化学的アッセイにおいて、EPO受容体に特異的に結合する。
【００１４】
本発明に係る抗体は、内在的または組換え的にEPO受容体を発現するUT7細胞において、EPO受容体に特異的に結合する。
【００１５】
好ましくは、本発明に係る抗体は、少なくとも10-8M-1〜10-12M-1の結合親和性で、EPO-Rに結合することに特徴付けられる。
【００１６】
抗体が、マウス、ウサギまたはヒト起源であることが、さらに好ましい。
【００１７】
本発明は、EPO受容体を保持する／発現する細胞を解析するための、本発明に係る抗体の使用をさらに含む。
【００１８】
好ましくは、本発明に係る抗体は、ヒト組織試料においてEPO受容体を解析するために使用される。好ましくは、そのような解析は、ウェスタンブロット、免疫細胞化学法、または免疫組織化学法によって遂行される。
【００１９】
そのような解析は、定性的に（例えば、細胞がEPO受容体を含むか否かを検出するため）、または定量的に（例えば、EPO受容体の発現を検出するため）遂行され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ELISAにより決定される、ビオチン化EPORペプチドに対する、MabおよびPabの特異的結合を示す。0.1μg／mlでの、Maxisorpマイクロタイタープレート上に固定されたビオチン化ペプチド347-371（成熟EPORに対応する）に対するPAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの結合を示す。Mab Cl.21.3.1は、使用した条件下でELISAに適さないため、示していない。Maxisorpマイクロタイタープレート上に固定されたビオチン化ペプチド382-402（成熟EPORに対応する）に対するMab Cl.19.1.2、Cl.19.3.7およびPAK＜EPOR（382-402）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの結合を示す。Maxisorpマイクロタイタープレート上に固定されたビオチン化ペプチド454-475（成熟EPORに対応する）に対するPAK＜EPOR（454-475）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの結合を示す。
【図２】HELAwt、HELA-EPORおよびUT-7細胞由来の溶解産物のWB解析を示す（特異性を示すため）。（a）Mab Cl.21.3.1（エピトープaa347位〜371位）およびPAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの特異的結合を示す。（b）Mab Cl. 19.3.7、およびMab Cl.19.1.2（エピトープaa382位〜402位）、およびPAK＜EPOR（382-402）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの特異的結合を示す。（c）PAK＜EPOR（454-475）＞K-IgG（IS）Ch01bSW（エピトープaa454位〜475位）の特異的結合を示す。
【図３】HELAwtおよびHELA-EPORの免疫細胞化学的解析を示す。組換えヒトEPOR-GFP（緑色）および抗体免疫反応性（赤色）の二重免疫蛍光を示す。赤色シグナルおよび緑色シグナルの共局在によって、特異的標識が示される。HELAwtはEPORを発現せず、かつ陰性対照として使用される。（a）Mab Cl.21.3.1.（aa347位〜371位）、（b）Mab Cl.19.1.2（aa382位〜402位）、（c）Mab Cl. 19.3.7（aa382位〜402位）を用いた染色を示す。
【図４】HELAwtおよびHELA-EPORの免疫組織化学的解析、および市販抗体C-20（SantaCruz）との比較を示す。（a）Santa-Cruz製のポリクローナル抗体C-20を示す；（b）親和精製されたポリクローナル抗体PAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSWを示す。
【図５】比較ウェスタンブロット解析を示す。1レーン当たり、2.5×104細胞をローディングした。抗体濃度は：（A）PAK＜EPOR（347-371）（10 ng／ml）；（B）C-20（0.4μg／ml）；（C）ABIN98954（0.4μg／ml）；（D）M-20（0.4μg／ml）；（E）ab10653（0.4μg／ml）および（F）BAF307（0.4μg／ml）であった。レーンは左から右へ：Hela親細胞（1）、未処置（2）、OptiMem（3）、非コードsiRNA（4）、EPO-R siRNA（5）、EPO-R siRNA（6）であった。
【図６】MAB307のウェスタンブロット解析を示す。1レーン当たり、2.5×104細胞の全タンパク質をローディングし、一次抗体を0.4μg／mlの濃度で使用した。変性条件（A）および未変性条件（B）下で、解析を遂行した。レーンは左から右へ：Hela親細胞（1）、未処置（2）、OptiMem（3）、非コードsiRNA（4）、EPO-R siRNA（5）、EPO-R siRNA（6）であった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに抗体全体および抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な形態の抗体構造を包含する。
【００２２】
「抗体断片」とは、全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例は、ダイアボディ、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。scFv抗体は、例えば、Houston, J. S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。さらに、抗体断片は、VHドメインの特性、すなわちVLドメインと共に集合することが可能であること、またはEPO-Rに結合するVLドメインの特性、すなわちVHドメインと共に機能的抗原結合部位に集合することが可能であること、という特性を有する単鎖ポリペプチドを含み、それによりヒトEPO-Rに特異的に結合する特徴を有する抗体を提供する。
【００２３】
本明細書において使用される、「ヒトEPO受容体断片
2012500818.tif 000004
に特異的に結合する」という用語は、0.1μg／mlの抗体濃度で、10またはより大きいS／N比で、ELISAにおけるそのような断片への結合を意味する。
【００２４】
本明細書において使用される「EPO-Rに結合する抗体」という用語は、細胞当たり100,000〜500,000受容体の量で組換え的にEPO-Rを発現する細胞（EPO-R発現細胞）を使用して、顕微鏡解析により測定される細胞結合アッセイにおける、ヒトEPO-Rへの抗体の結合を意味する。0.1μg／mlの抗体濃度で、抗体が400（またはより大きい）のS／N（シグナル／ノイズ）比を引き起こす場合、結合が見出される。
【００２５】
本明細書において使用される「EPO受容体へのEPOの結合」という用語は、EPO-Rを発現する細胞を使用する顕微鏡解析により測定される細胞結合アッセイにおいての、ヒトEPO-RへのEPOの結合を意味する。0.1μg／mlのEPO濃度で、EPOが400またはより大きいS／N（シグナル／ノイズ）比を引き起こす場合、結合が見出される。
【００２６】
本明細書において使用される「本発明に係る抗体の、細胞化合物へのいかなる非特異的結合もない」という用語は、EPO-Rを発現しない細胞を使用する顕微鏡解析により測定される細胞結合アッセイにおいて、本発明に係る抗体が細胞化合物に結合しないことを意味する。化合物が、0.1μg／mlの抗体濃度で10を超えないS／N（シグナル／ノイズ）比を引き起こす場合、いかなる結合も見出されない。
【００２７】
EPO-R発現細胞を使用する顕微鏡解析によって測定される細胞結合アッセイにおいて、0.1μg／mlの抗体濃度で、抗体が400のS／N（シグナル／ノイズ）比を引き起こし、かつ細胞がEPO-Rを発現しない状態（細胞当たり、1,000またはそれより少ない受容体、例えば100またはそれより少ない受容体等）の細胞を使用する顕微鏡解析によって測定される細胞結合アッセイにおいて、0.1μg／mlの抗体濃度で、抗体が10を超えないS／N（シグナル／ノイズ）比を引き起こす場合、EPO-Rへの抗体の特異的結合が見出される。
【００２８】
顕微鏡解析の免疫蛍光シグナルは、陽性蛍光試料と陰性（対照、ノイズシグナル）蛍光試料との重複領域を、形態計測学的に測定することによって定量される。有用な手段は、MetaMorph Imagingソフトウェア（www.moleculardevices.com）の「Measuring Colocalization」アルゴリズムである。
【００２９】
本発明に係る抗体は、EPO受容体へのEPOの結合を阻害しない。本発明に係る抗体は、ヒト細胞および組織試料におけるEPO受容体を特異的に決定することが可能である。本発明に係る抗体のEpo-Rへの結合は、EPO-Rを活性化（リン酸化）しない。
【００３０】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することが可能なタンパク質決定因子を表す。エピトープは通常、分子の化学的に活性な表面群類、例えばアミノ酸または糖側鎖等からなり、かつ通常エピトープは、特異的な三次元構造特性、および特異的な電荷特性を有する。高次構造的エピトープおよび非高次構造的エピトープは、前者への結合は変性溶媒の存在下において喪失されるが、後者ではそうでないという点で区別される。
【００３１】
本発明は、ヒト細胞、組織または生検におけるEPO-Rの検出のための、本発明に係る抗体の使用をさらに含む。
【００３２】
別の局面において、本発明は、ヒト細胞、組織または生検におけるEPO-Rの検出のための、本発明に係る抗体を含む診断組成物を提供する。
【００３３】
配列の説明
SEQ ID NO：1  合成ペプチド
SEQ ID NO：2  合成ペプチド
SEQ ID NO：3  合成ペプチド
SEQ ID NO：4  重鎖CDR3クローン21.3.1
SEQ ID NO：5  重鎖CDR2クローン21.3.1
SEQ ID NO：6  重鎖CDR1クローン21.3.1
SEQ ID NO：7  軽鎖CDR3クローン21.3.1
SEQ ID NO：8  軽鎖CDR2クローン21.3.1
SEQ ID NO：9  軽鎖CDR1クローン21.3.1
SEQ ID NO：10  重鎖クローン21.3.1
SEQ ID NO：11  軽鎖クローン21.3.1
SEQ ID NO：12  重鎖CDR3クローン19.1.2
SEQ ID NO：13  重鎖CDR2クローン19.1.2
SEQ ID NO：14  重鎖CDR1クローン19.1.2
SEQ ID NO：15  軽鎖CDR3クローン19.1.2
SEQ ID NO：16  軽鎖CDR2クローン19.1.2
SEQ ID NO：17  軽鎖CDR1クローン19.1.2
SEQ ID NO：18  重鎖クローン19.1.2
SEQ ID NO：19  軽鎖クローン19.1.2
【実施例】
【００３４】
実施例1
ヒトEPORの細胞内ドメインに対して指向された（directed）モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の生成
Mab Cl.21.3.1およびPAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSW：成熟ヒトエリスロポエチン受容体の残基347位〜371位に対応する25アミノ酸の合成ペプチド
2012500818.tif 000005
を、免疫抗原（EPOR前駆体のaa371位〜395位に対応）として使用した。
【００３５】
Mab Cl.19.3.7、Mab Cl.19.1.2、およびPAK＜EPOR（382-402）＞K-IgG（IS）Ch01bSW：成熟ヒトエリスロポエチン受容体の残基382位〜402位に対応する21アミノ酸の合成ペプチド
2012500818.tif 000006
を、免疫抗原（EPOR前駆体のaa406位〜426位に対応）として使用した。
【００３６】
PAK＜EPOR（454-475）＞K-IgG（IS）Ch01bSW：成熟ヒトエリスロポエチン受容体の残基454位〜475位に対応する22アミノ酸の合成ペプチド
2012500818.tif 000007
を、免疫抗原（EPOR前駆体のaa478位〜499位に対応）として使用した。
【００３７】
免疫処置のため、C末端システインを介して、ペプチドをKLHに共役した。ウサギおよびBalb／cマウスを、4週間毎に3〜5回に渡って、タンパク質で免疫処置した。さらにBalb／cマウスは、融合4日前に静脈内注射で免疫処置を受け、脾細胞を収集し、Ag8ミエローマ細胞と融合させた。タンパク質で被覆されたELISAマイクロタイタープレートで試験することによって、特異的抗体についてスクリーニングを遂行した（図1）。細胞溶解産物のウェスタンブロット上のEPORに対応する一つの特異的バンドの検出に基づいて、Mabクローンおよびウサギのポリクローナル血清を選択した。
【００３８】
実施例2
EPOR過剰発現HELA細胞の生成
組換えEPORを発現する安定に形質移入されたHELA細胞を生成するため、EPORまたはEPOR／EGFPをコードする（細胞内C末端への融合タンパク質として、Invitrogen）レトロウイルス発現ベクター、およびpVSV-G（ラブドウイルス水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質をコードする発現ベクター）で一過的に形質移入されたGP2-293細胞（Clontech Laboratories, Inc）由来の上清を用いて、細胞を形質導入した。形質導入後2日目に、0.2 mg／mlゼオシンを含む新鮮補足（fresh supplemented）RPMIと、培地を交換した。
【００３９】
一過的形質移入実験に関して、Fugene Transfection試薬（Roche Molecular Biochemicals Cat. No. 1815075）を使用して、12ウェルプレート中でカバースリップ上に、1mlの培地中で8×10E4 HELA細胞をプレーティングした。詳細には、FCSを含まない97μlのRPMI 1640に3μlのFugene 6を添加し、RTで5分間に渡って保温した。続いて、1μgのDNA混合物を添加し、RTで15分間に渡って保温した。最終的に、カバースリップ上の細胞を含む1 mlの細胞培養培地に、50μlのDNA／FuGene 6溶液を添加した。
【００４０】
実施例3
EPOR過剰発現UT7細胞の生成
UT-7細胞株は、長期増殖のためにEPOを要するヒト因子依存性赤血球白血球細胞株（ヒト骨髄急性骨髄性白血病細胞株DSMZ：ACC 137）である。L-グルタミン（2 mM）、非必須アミノ酸（1×）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）、10％ウシ胎児血清および10 U／mlのGM-CSFを添加したRPMI培地中で、UT7細胞を維持した。形質導入された細胞（UT7／EPOR）を、非形質導入細胞と同一の培地（10 U／mlの代わりに25 U／mlのGM-CSF）に、0.4 mg／mlのゼオシンを添加して維持した。各刺激の前に、L-グルタミン（2 mM）、非必須アミノ酸（1×）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）、および0.1％ウシ胎児血清を添加したRPMI培地中で一晩保温することによって、細胞を飢餓させた。
【００４１】
EPO-Rをコードするレトロウイルス発現ベクター、およびpVSV-G（ラブドウイルス水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質をコードする発現ベクター）で一過的に形質移入されたGP2-293細胞（Clontech Laboratories, Inc）由来の上清を用いて、UT-7細胞を形質導入した。形質導入後2日目に、0.4 mg／mlのゼオシンおよび25 U／ml GM-CSFを含む新鮮補足RPMIと培地を交換した。選択後、その表面にEPORを安定に発現するUT-7細胞の細胞株を得た。
【００４２】
実施例4
免疫沈降
氷冷溶解緩衝剤［Tris 20 mM (pH7.4), NaCl 137 mM、グリセロール10％、Nonidet P-40 1％、プロテアーゼ阻害剤1×（Pierce、＃78410）、ホスファターゼ阻害剤1×（Pierce、＃78420）］中で、30分間に渡って4℃でUT7細胞を溶解し、続いて13000 rpmで10分間に渡って4℃で遠心分離した（Eppendorf遠心分離）。事前処理された（precleared）溶解産物の上清を、MAB307抗体（マウスモノクローナル抗ヒトEPO-R細胞外ドメイン、R＆D Systems）およびプロテインGアガロースビーズと共に、4℃で一晩保温した。溶解緩衝剤中でビーズを3回洗浄し、還元条件においてNupageサンプル緩衝剤（Invitrogen）中で、70℃で10分間に渡って加熱した。
【００４３】
実施例5
SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング
標準的手法およびInvitrogenのNupageゲルシステムに従って、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを遂行した。Nupage Novex 4-12％ Bis-Trisゲルの各ライン中に、異なる細胞数に対応する抽出産物をローディングした。続いてタンパク質をPVDFメンブレン上に移し、各々の抗体と共に4℃で一晩保温した。洗浄後、コンジュゲート抗マウスIgG-PODまたは抗ウサギIgG-PODと共にメンブレンを保温し、ECL試薬（Lumi-Light（登録商標）PLUSウェスタンブロッティング基質、Roche Diagnostics GmbH）を使用して現像した：結果を図2に示す。
【００４４】
実施例6
BIACORE解析
25℃で、HBS-EP-緩衝剤、pH 7.4（10 mM HEPES、150 mM NaCl、3.4 mM EDTA、0.005％ポリソルベート20（w／v））において、BIACORE 3000で測定を行った。非特異的結合を減少させるため、1.0 mg／mlのCMDを添加した。結果を表1に示す。
【００４５】
【表１】
2012500818.tif 000008
表1：BIACORE解析による結合親和性／結合力の決定。固定されたビオチン化ペプチドへの結合により決定される結合力。全ての抗体（21.3.1を除く）は、対応するEPORペプチドに対して、ナノモル／ナノモルより少ない結合力を呈する。
【００４６】
実施例7
免疫細胞化学法および免疫組織化学法
免疫蛍光研究に関して、RPMI1640、10％FCS中、ガラスカバースリップ（170μmの厚さ）上で、細胞を80％の集密度まで増殖させた。10μg／mlの抗体試料と培養液を45分間に渡って保温し、洗浄し、4％PFAで固定した。Alexa Fluor 488ヤギ抗ヒトIgG二次抗体によって、結合した抗体を検出した。Alexa Fluor 488およびAlexa Fluor 633に関して、各々488 nmおよび633 nmの励起を使用して、LEICA共焦点レーザー走査顕微鏡SP2で検体を画像解析した。結果を図3および図4に示す。
【００４７】
一過的に形質移入されたHELA_EPOR細胞についての、EPORに対して指向された親和精製ポリクローナル抗体PAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSW（A）およびPAK＜EPOR（454-475）＞K-IgG（IS）Ch01bSW（B）の免疫細胞化学的解析を、以下のように遂行した：EPOR-GFPを一過的に発現させるため、ガラスカバースリップ上で培養されたHELA細胞を形質移入し、PFAで固定し、EPORに対して指向された1.0μg／mlのPAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの精製IgGで染色した。抗EPOR抗体の免疫反応性は、緑色蛍光の組換えEPORに密接して共局在することを見出した。抗体はまた、ER／ゴルジ領域に限定される新規に合成されたEPORも認識する。形質移入されていない細胞においては、いかなる検出可能な標識も欠如していることによっても、抗EPOR抗体PAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSWおよびPAK＜EPOR（454-475）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの高い特異性が確認される。
【００４８】
実施例8
PAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの特異性の定量的評価
EPOR-GFPを一過的に発現させるため、ガラスカバースリップ上で培養されたHELA細胞を形質移入し、PFAで固定し、EPORに対して指向された1.0μg／mlのPAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの精製IgGで染色した。抗EPOR抗体免疫反応性と緑色蛍光組換えEPORの密接した共局在に注目されたい。抗体はまた、ER／ゴルジ領域に限定される新規に合成されたEPORも認識する。視野中の形質移入されていない細胞において、いかなる検出可能な標識も欠如していること（DAPIで標識される青色細胞核により示される）によっても、抗EPOR抗体PAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSW、およびPAK＜EPOR（454-475）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの高い特異性が確認される。PAK＜EPOR（347-371）＞K-IgG（IS）Ch01bSWの免疫反応性と、組換えEPOR-GFPの蛍光との重複のパーセンテージを、MetaMorph Imagingソフトウェアの「Measuring Colocalization」アルゴリズムを使用して、97％超と決定する（図5）。
【００４９】
実施例9
EPORに対する市販抗体との比較
表2の抗体を調査した。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
図8は、EPO-R RNA干渉に基づいて、5つの市販抗体が約60 kDのサイズでEPORを検出することを示す（C-20、ABIN98954、M-20、ab10653およびBAF307）。類似のEPORバンド強度で、4つの抗体（C-20、ABIN98954、ab10653およびM-20）は、腫瘍細胞株において、60 kDaバンドの他に、さらなるウェスタンブロットのバンドを検出した。4つの抗体は、EPOR siRNAにより影響される約60 kDの分子量を有するタンパク質バンドを検出しない（H-194、ab54659、ab56310、ABIN170186およびABIN166173）。抗体Ww-12およびPA1-20180は、IgGの存在にも関わらず、0.4μg／mlの抗体濃度でいかなる検出可能な化学発光シグナルも示さなかった。
【００５２】
図6は、HeLa細胞溶解産物およびHeLa-EpoR細胞溶解産物中で、変性条件下または未変性条件下で、MAB307が60 kDaバンドをもたらさなかったことを示す。抗体は、変性条件下で、約80 kDaの非特異的タンパク質を検出する。未変性試料中で、抗体は、20 kDaのタンパク質を認識する。
【００５３】
加えて、抗体C-20は、Hsp70タンパク質に有意な交差反応性を示す。ウェスタンブロットアッセイを使用して（2.5×104細胞由来の全タンパク質および10 ng／ml抗体）、試験された全ての市販抗体と対照的に、PAK＜EPOR（347-371）＞は、約60 kDaの顕著なEPOR特異的バンドを特異的に検出する。
【００５４】
様々なEPOR抗体を使用するウェスタンブロットアッセイの感度の調査に関して、1レーン当たり1×105細胞の全細胞数までHeLa親細胞を添加した減少性（decending）細胞数で、HeLa-EpoR細胞のマトリックスを確立した。細胞数の減少は、1レーン当たり1×105、3×104、1×104、3×103、1×103、および0のHeLa-EpoR細胞で段階的に生じる。抗体濃度は、0.4μg／mlであって、かつ1.5分間に渡って光曝露した（Lumi Imager（商標））。結果を表3に示す。
【００５５】
【表３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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