(57)【要約】  本発明は、一般的に、心不全に、そして特に、心不全のリスクを減少させる方法、特に確立された心筋疾患を有する患者における方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓トロポニンＩ相互作用キナーゼ（Ｔｎｎｉ３ｋ）活性の候補阻害剤を同定する方法であって：
ｉ）Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片を試験化合物とインキュベーションし、そして
ｉｉ）前記試験化合物の前記Ｔｎｎｉ３ｋまたは前記その断片への結合に関してアッセイする
工程を含み、
ここで、前記Ｔｎｎｉ３ｋまたは前記その断片に結合する試験化合物は、Ｔｎｎｉ３ｋ活性の候補阻害剤である
前記方法。
【請求項２】
前記断片が、Ｔｎｎｉ３ｋのチロシンキナーゼドメインまたはアンキリン・リピートを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉ）において、Ｔｎｎｉ３ｋまたは前記その断片を含む融合タンパク質を、前記試験化合物とインキュベーションする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記試験化合物が非タンパク質性である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記試験化合物が検出可能標識を所持する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記標識が放射性または蛍光標識である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔｎｎｉ３ｋまたは前記その断片が固体支持体に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔｎｎｉ３ｋ活性がキナーゼ活性である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記方法が細胞不含法である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔｎｎｉ３ｋまたは前記その断片が細胞中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がヒトＴｎｎｉ３ｋを発現している細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞がヒト心臓細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記心臓細胞が心筋細胞である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞がヒトＴｎｎｉ３ｋまたは前記その断片を発現するよう操作されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞を培養する培地に、前記試験化合物を添加する、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
Ｔｎｎｉ３ｋ活性の候補阻害剤を同定する方法であって、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片を、Ｔｎｎｉ３ｋおよび試験化合物と相互作用することが知られる化合物とインキュベーションし、そして前記試験化合物が、Ｔｎｎｉ３ｋと相互作用することが知られる前記化合物と、前記Ｔｎｎｉ３ｋまたは前記その断片への結合に関して、競合する能力を決定する
工程を含み、
ここで、Ｔｎｎｉ３と相互作用することが知られる前記化合物と、前記Ｔｎｎｉ３ｋまたは前記その断片への結合に関して競合する試験化合物は、Ｔｎｎｉ３ｋ活性の候補阻害剤である
前記方法。
【請求項１７】
前記Ｔｎｎｉ３ｋと相互作用することが知られる前記化合物が、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｔｎｎｉ３ｋと相互作用することが知られる前記化合物が、検出可能標識を所持する、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
Ｔｎｎｉ３ｋ活性の阻害剤を同定する方法であって、Ｔｎｎｉ３ｋ、またはＴｎｎｉ３ｋ活性を有するその断片を発現する細胞を、試験化合物の存在下および非存在下で培養し、そして前記Ｔｎｎｉ３ｋまたは前記その断片が、前記試験化合物の存在下および非存在下でターゲット分子をリン酸化する能力を決定する工程を含み、ここで、前記試験化合物の存在下での前記ターゲット分子のリン酸化レベルの減少が、前記試験化合物がＴｎｎｉ３ｋ活性の阻害剤であることを示す、前記方法。
【請求項２０】
前記ターゲット分子が、Ｔｎｎｉ３ｋ、心臓特異的タンパク質またはＭＢＰである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
Ｔｎｎｉ３ｋ／ＣＳＱトランスジェニック動物。
【請求項２２】
心不全に対して防御するか、または心不全のリスクを減少させる必要がある哺乳動物において、心不全に対して防御するか、または心不全のリスクを減少させる方法であって、前記哺乳動物に、Ｔｎｎｉ３ｋの活性またはＴｎｎｉ３ｋの発現を阻害する化合物を、前記防御または前記リスク減少を達成するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物が心筋疾患を有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
Ｔｎｎｉ３ｋの発現を阻害するｓｉＲＮＡ分子またはアンチセンス分子を投与する工程を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
請求項１または請求項１６の方法によって同定可能な、Ｔｎｎｉ３ｋ活性の候補阻害剤。
【請求項２６】
請求項２５の候補阻害剤および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む、組成物。
【請求項２７】
請求項１９の方法によって同定可能な、Ｔｎｎｉ３ｋ活性の阻害剤。
【請求項２８】
請求項２７の阻害剤および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が本明細書に援用される、２００８年１０月３１日出願の米国仮出願第６１／１１０，３２３号に優先権を請求する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第Ｒ０１  ＨＬ０８３１５５号、第Ｒ０１  ＨＬ６８９６３号および第５  Ｆ３２ＨＬ０７９８６３号のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的に、心不全に、そして特に、心不全のリスクを減少させる方法、特に確立された心筋疾患を有する患者における方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
心臓疾患の進行および重症度に寄与する遺伝的因子は、主に、ヒト集団における臨床的転帰を標準化することが課題となるため、同定が困難であった。したがって、前向きの（ｆｏｒｗａｒｄ）遺伝的アプローチでは、新規療法ターゲットを同定する際の成功が限定されていた。
【０００４】
心筋疾患のカルセクエストリン（ＣＳＱ）トランスジェニックマウスモデル（Ｊｏｎｅｓら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１：１３８５−１３９３（１９９８）、Ｃｈｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２２２５１−２２２５６（１９９９））は、遺伝的バックグラウンドに依存して、表現型進行の広い変動を示す（Ｓｕｚｕｋｉら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：１８２４−１８２９（２００２）、Ｌｅ  Ｃｏｒｖｏｉｓｉｅｒら，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １２：３０９７−３１０７（２００３））。ＣＳＱトランスジェニック増感因子（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を用いた定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）マッピングは、疾患進行および転帰を修飾する７つの心不全修飾因子（Ｈｒｔｆｍ）遺伝子座を生じた（Ｓｕｚｕｋｉら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：１８２４−１８２９（２００２）、Ｌｅ  Ｃｏｒｖｏｉｓｉｅｒら，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １２：３０９７−３１０７（２００３）、Ｗｈｅｅｌｅｒら，  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １６：４１４−４２３（２００５））。２つの異なる交雑種中にマッピングされるＨｒｔｆｍ２（Ｓｕｚｕｋｉら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：１８２４−１８２９（２００２）、Ｗｈｅｅｌｅｒら，  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １６：４１４−４２３（２００５））は、生存の表現型変動の２８〜３０％、および心機能の表現型変動の２２〜４２％を説明した。
【０００５】
本発明は、少なくとも部分的に、Ｈｒｔｆｍ２の根底にある遺伝子としてのＴｎｎｉ３ｋ（心臓トロポニンＩ相互作用キナーゼ）の同定から生じる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１：１３８５−１３９３（１９９８）
【非特許文献２】Ｃｈｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２２２５１−２２２５６（１９９９）
【非特許文献３】Ｓｕｚｕｋｉら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：１８２４−１８２９（２００２）
【非特許文献４】Ｌｅ  Ｃｏｒｖｏｉｓｉｅｒら，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １２：３０９７−３１０７（２００３）
【非特許文献５】Ｗｈｅｅｌｅｒら，  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １６：４１４−４２３（２００５）
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、一般的に、心不全に関する。より具体的には、本発明は、心筋疾患を有する患者において、心不全に対して防御し、そして／またはそのリスクを減少させる方法に関する。本発明はまた、特に確立された心筋疾患を有する患者において、心不全に対して防御するよう設計された療法戦略において使用するのに適した剤を同定する方法、方法にも関する。
【０００８】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ。Ｔｎｎｉ３ｋ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現は、マウス系統間で有意に異なる。（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ分析は、Ｂ６、ＡＫＲおよびＤＢＡ間の有意な発現変化を伴う、唯一の遺伝子をネズミ染色体３上で同定した。すべての系統で類似のレベルで発現される、Ｔｎｎｉ３ｋに隣接する２つの遺伝子（ＣｒｙｚおよびＬｒｒｃ４４）、ならびに２つの対照遺伝子、Ａｃｔｂ（β−アクチン）およびＧａｐｄｈを示す。（Ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより、マイクロアレイ分析によって同定される発現相違が確認される。各系統由来の５つの野生型マウス心臓由来のＴｎｎｉ３ｋのＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲによって、ＤＢＡに比較して、Ｂ６およびＡＫＲにおいて、転写レベルがより高い（およそ２５倍）ことが確認される（＊＊ｐ＞０．０００１および＊ｐ＞０．００１）。ＤＢＡ遺伝子バックグラウンド上、Ｔｎｎｉ３ｋ遺伝子座に、ＡＫＲアレルを宿するＨｒｔｆｍ２コンジェニック系統（ＤＢＡ．ＡＫＲ−Ｈｒｔｆｍ２）由来の３つの心臓は、Ｂ６およびＡＫＲ心臓と類似の転写物レベルを示し、これはＤＢＡ心臓で観察されるものより有意により高い（＊＊ｐ＞０．０００１）。Ａｃｔｂは内因性対照として働いた。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。（Ｃ）ウェスタンブロット分析によって、Ｔｎｎｉ３ｋでＤＢＡハプロタイプを共有する３つの系統が、検出可能なＴｎｎｉ３ｋタンパク質を示さない一方、Ｂ６ハプロタイプを有する３つの系統は、中程度から高い発現を示すことが示される。ＤＢＡ．ＡＫＲ−Ｈｒｔｆｍ２コンジェニックマウスは、ＲＮＡ発現に基づいて予測されるように、高発現を示す。心臓において中程度の発現を示す受容体チロシンキナーゼＴｅｋ（ｈｔｔｐ：／／ｓｙｍａｔｌａｓ．ｇｎｆ．ｏｒｇ／ＳｙｍＡｔｌａｓ／）を、タンパク質装填対照として用いた（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ）。
【図２】Ｔｎｎｉ３ｋゲノム領域由来のコーディングおよび代表的なノンコーディング多型ＳＮＰは、２つの別個のハプロタイプ群を示す。２つのＳＮＰハプロタイプは、Ｔｎｎｉ３ｋ転写物レベルと相関する。第１群（ＤＢＡ、Ｃ３Ｈ、およびＢａｌｂ／ｃ）は、低レベルのＴｎｎｉ３ｋを示し、一方、第２群（Ｂ６、ＡＫＲ、および１２９Ｓｖ）は、高レベルのＴｎｎｉ３ｋを示す。
【図３】Ｃ末端マウスＴｎｎｉ３ｋペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体のウェスタンブロット分析。マウスＴｎｎｉ３ｋ発現ベクターまたは空ベクター対照で一過性にトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞由来の溶解物を示す対照ブロット。Ｔｎｎｉ３ｋタンパク質は、予測されるように、およそ９０ｋＤａのサイズで、陽性対照溶解物中で可視である。ＤＢＡ、ＡＫＲおよびＢ６マウス由来の心臓溶解物もまた示す。ＤＢＡはＴｎｎｉ３ｋタンパク質を示さず、一方、ＡＫＲおよびＢ６は強いタンパク質発現を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｄ。ＤＢＡマウス由来の心臓におけるＴｎｎｉ３ｋの異常なスプライシング。（Ａ）配列決定クロマトグラムは、Ｂ６およびＤＢＡ心臓由来のＴｎｎｉ３ｋ  ｃＤＮＡにおけるエクソン１９〜２０境界を示す。点線は、イントロン１９由来の４ヌクレオチドｃＤＮＡ挿入（ＧＴＴＴ）の最初の塩基を示す。ＤＢＡにおいて適切にスプライシングされるわずかな比率の転写物が、点線の後の重複配列として見られうる。（Ｂ）Ｂ６（第一の部位／正常）およびＤＢＡ（第二の部位／異常）両方に関する、アミノ酸翻訳を伴う、隣接イントロン配列を含むエクソン１９および２０の配列。４ヌクレオチドＧＴＴＴ挿入を太字で示す。（Ｃ）蛍光断片分析（ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＤＢＡにおける異常なスプライシングの割合を決定した。ＤＢＡにおける総メッセージのほぼ７０％がミススプライシングされ、一方、Ｂ６およびＡＫＲでは異常なスプライシングは観察されなかった。（Ｄ）単純付加数学的モデルを用いて、異なるスプライスドナー部位の荷重マトリックススコアを計算した（Ｓｔａｄｅｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：５０５−５１９（１９８４）、Ｂｕｒｓｅｔら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：４３６４−４３７５（２０００））。多様なドナー部位の計算された強度を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂ。ｒｓ５７９５２６８６での配列は、異常なＴｎｎｉ３ｋスプライシングの原因である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を用い、Ｂ６に比較して、ＤＢＡにおいて、エクソン１９および２０の間の異常なスプライシングにおけるイントロン１９  ＳＮＰ（ｒｓ５７９５２６８６）の役割を試験した。（Ａ）異常なスプライシングを試験するのに用いた、Ｔｎｎｉ３ｋエクソン１８〜２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシング構築物の略図。エクソン１８、１９および２０を含むＤＢＡおよびＢ６由来のゲノム断片（４ｋｂ）を増幅し、そしてｐＳＰＬ３スプライシングベクター内にクローニングした。さらに、部位特異的突然変異誘発を用いて、両方の構築物において、ｒｓ５７９５２６８６で配列を改変した。スプライシング構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、そして４８時間後にＲＮＡを採取した。（Ｂ）Ｔｎｎｉ３ｋスプライシングの分析によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＢＡ構築物の異常なスプライシングが、野生型ＤＢＡ心臓におけるスプライシングとよく似ているが、Ｂ６  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ構築物には異常な転写物が存在しないことが明らかになる。イントロン１９中、＋９位の非常に重要なヌクレオチドを構築物間で交換すると、スプライシングパターンはＳＮＰの配列にしたがい、ｒｓ５７９５２６８６での配列がスプライシング欠陥の原因であることが立証される。
【図６】図６Ａおよび６Ｂ。ナンセンス変異依存分解機構は、Ｔｎｎｉ３ｋ転写物レベルの減少の原因である。ＨＬ−１心筋細胞をエメチンまたはシクロヘキシミドで処理して、ＮＭＤを遮断した。処理２４時間後に細胞からＲＮＡを単離した。蛍光ＲＴ−ＰＣＲ断片分析を用いて、異常な転写物対野生型転写物の比を測定し、そしてｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、ａｃｔｂに対するＴｎｎｉ３ｋメッセージレベルを決定した。モック処理した細胞が対照として作用した。（Ａ）エメチンまたはシクロヘキシミドのいずれかでの処理は、正常にスプライシングされるメッセージに比較して、異常にスプライシングされるメッセージのレベルを優先的に増加させる（＊ｐ＞０．０１）。（Ｂ）エメチンまたはシクロヘキシミドのいずれかでの処理は、モック処理細胞よりもおよそ１６倍高く、Ｔｎｎｉ３ｋメッセージの総レベルを増加させた（＊＊ｐ＞０．００１）。
【図７】図７Ａおよび７Ｂ。ＡＫＲ系統由来のＨｒｔｆｍ２遺伝子座を含むコンジェニック系統間の交雑は、ＣＳＱトランスジェニック増感系統（Ｃ＋）に交雑した際、トランスジェニック増感系統に交雑したＤＢＡと比較して、心機能の減少を示す。左心室拡張期および収縮期直径は、ＤＢＡマウスに比較して、コンジェニックマウスにおいて増加する。これは、コンジェニック系統における、短縮率減少を生じる。ＤＢＡ系統は、検出可能なＴｎｎｉ３ｋタンパク質を発現せず、一方、コンジェニック系統はＡＫＲで見られるレベルのおよそ１／２を発現する。これらのデータは、マウスＴｎｎｉ３ｋ発現の天然レベルが、タンパク質を検出可能に発現しない系統に比較して、劣った心機能を生じることを示す。
【図８】中程度から高レベルのＴＮＮＩ３Ｋ発現は、心筋疾患のＣＳＱトランスジェニックモデルにおいて、早死を導く。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存グラフは、ＴＮＮＩ３Ｋ（Ｔ）およびＣＳＱ（Ｃ）トランスジェニック動物間の交雑、ならびにＡＫＲ由来のＨｒｔｆｍ２遺伝子座を１コピーしか生じない（１／２コンジェニックである）、コンジェニックＨｒｔｆｍ２系統（図２に記載する）およびＣＳＱ（Ｃ）トランスジェニック系統間の交雑から生じる、異なる遺伝子型群の転帰を示す。トランスジェニック系統との交雑に関しては、二重陽性トランスジェニック（Ｔ＋／Ｃ＋）に関して、生存は、平均１７日にひどく減少し、１５〜２１日の範囲であった。単一陽性（Ｔ＋／Ｃ−、Ｔ−／Ｃ＋）両方を含む他の遺伝子型を持つマウスのほぼすべてが、１５０日の終点をはるかに超えて生存した。３つの他の群に比較して、Ｔ＋／Ｃ＋の生存は、有意に減少した（ｐ＜０．００００１）。Ｈｒｔｆｍ２のＡＫＲゲノムセグメントを含有するコンジェニック動物およびＣＳＱトランスジェニックの交雑に関しては、マウスはやはり、対照に比較して生存減少を示す。これらのマウスにおけるＴｎｎｉ３ｋの発現レベルは、Ｂ６またはＡＫＲのものの１／２であり、そしてＴｎｎｉ３ｋトランスジェニックよりおよそ５〜２０倍低い。各群の動物数は、以下の通りである：Ｔ＋／Ｃ＋、ｎ＝１２；Ｔ＋／Ｃ−、ｎ＝１８；Ｔ−／Ｃ＋、ｎ＝１４；Ｔ−／Ｃ−、ｎ＝１８、１／２コンジェニック／Ｃ＋、ｎ＝８。
【図９】図９Ａおよび９Ｂ。Ｃ末端ヒトＴＮＮＩ３Ｋペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体のウェスタンブロット分析。（Ａ）ヒトＴＮＮＩ３Ｋ発現ベクターまたは空ベクター対照で一過性にトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞由来の溶解物を示す対照ブロット。ＴＮＮＩ３Ｋタンパク質は、タンパク質配列から予測されるように、およそ９０ｋＤａのサイズで、ＴＮＮＩ３Ｋ溶解物中でのみ可視である。（Ｂ）いくつかのＴＮＮＩ３Ｋトランスジェニックマウス由来の心臓溶解物を用いたウェスタンブロット。３つの系統由来の動物は、遺伝子型決定によって、導入遺伝子に関して陽性反応が出た（系統９、２３および２６）。ウェスタンブロットによって、トランスジェニックＴＮＮＩ３Ｋタンパク質に関して陽性反応が出た、系統９の３世代由来のマウスおよび系統２６の２世代由来のマウスを示す。各世代由来の心臓溶解物を調べて、トランスジェニックタンパク質の発現が連続していることを保証した。トランスジェニック転写物のＳＹＢＲグリーンｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって、Ｂ６心臓ＲＮＡにおいて測定される内因性Ｔｎｎｉ３ｋよりも、ＴＮＮＩ３ＫトランスジェニックマウスにおけるＴＮＮＩ３Ｋ導入遺伝子発現レベルが、５〜２０倍高い範囲であることが示された。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂ。ＴＮＮＩ３Ｋ発現は、心筋疾患のＣＳＱトランスジェニックモデルにおいて、非常に損なわれた収縮機能を導く。ＴＮＮＩ３ＫおよびＣＳＱトランスジェニック動物間の交雑由来の１４日齢マウスに対して、Ｍモード心エコーを行った。（Ａ）代表的な心エコーは、二重陽性トランスジェニックマウスが、重度の左心室収縮機能不全および心室拡張を示すことを示す。疾患進行のこの早期段階で予期されるように、ＴＮＮＩ３Ｋ−／ＣＳＱ＋動物は、低レベルの拡張しか示さず、一方、ＴＮＮＩ３Ｋ＋／ＣＳＱ−およびＴＮＮＩ３Ｋ−／ＣＳＱ−動物は、正常な心機能を示す。（Ｂ）４つのありうる遺伝子型を持つマウス由来の心エコーデータの表。ＬＶＥＤｄ、ＬＶＥＤｓ、心拍数、短縮率（ＦＳ）およびｍＶＣＦｃを示す。２匹の二重トランスジェニックマウスのみが、第１４日、意識下心エコーで生き残り；他の３匹は処置中に死亡した。処置を生き延びた２匹に関して、個々のデータを別個に示す。データは、Ｔ−／Ｃ−、Ｔ＋／Ｃ−およびＴ−／Ｃ＋群に関する平均±Ｓ．Ｄ．によって表される。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂ。ＴＮＮＩ３Ｋ発現は、心筋疾患の外科的に誘導したモデルにおいて、収縮機能不全を導く。大動脈縮窄術（ＴＡＣ）前、ならびにＴＡＣ手術の４週後および８週後、心エコーを行った。ＴＡＣの４週後および８週後、ＴＮＮＩ３Ｋ＋マウス（ｎ＝１１）およびＴＮＮＩ３Ｋ−同腹仔（ｎ＝１３）間で、ＬＶＥＤｓ（Ａ）およびＦＳ（Ｂ）を比較した。ＬＶＥＤｓは、４週および８週のＴＮＮＩ３Ｋ＋マウスにおいて、有意により高かったが、手術前と統計的には異ならなかった。同様に、手術の４週後および８週後の短縮率はどちらも、ＴＮＮＩ３Ｋ＋マウスにおいて有意に減少した。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図１２Ａ】ヒトＴｎｎｉ３ｋのアミノ酸配列および該タンパク質をコードする核酸配列。
【図１２Ｂ】ヒトＴｎｎｉ３ｋのアミノ酸配列および該タンパク質をコードする核酸配列。
【図１２Ｃ】ヒトＴｎｎｉ３ｋのアミノ酸配列および該タンパク質をコードする核酸配列。
【図１２Ｄ】ヒトＴｎｎｉ３ｋのアミノ酸配列および該タンパク質をコードする核酸配列。
【図１３】ＴＮＮＩ３Ｋ（赤）および他のサルコメア・タンパク質に対する抗体を用いて、ＴＮＮＩ３Ｋトランスジェニックマウス心臓切片に対して、同時免疫染色を行った。ＴＮＮＩ３Ｋは、ミオシン（緑）との相互染色パターンを示す。ＴＮＮＩ３Ｋ染色は、部分的にＦ−アクチン（ファロイジン、緑）と重なり、そして長軸方向切片において、サルコメアＺ板タンパク質デスミン（緑）と独占的に共局在する。横断面において、ＴＮＮＩ３Ｋは、デスミン環構造内に局在する。各バーは５μｍに相当する。
【図１４】マウスＴＮＮＩ３Ｋ（赤）およびデスミン（緑）に対する抗体を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＤＢＡ／２Ｊ近交系マウス由来の心臓切片に対して、同時免疫染色を行った。先のｑＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット結果（Ｗｈｅｅｌｅｒら，  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｓｅｐ；  ５（９）：ｅ１０００６４７（２００９）．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｓｅｐ  １８）と一致して、ＴＮＮＩ３Ｋ  Ｚ板発現パターンは、Ｃ５７ＢＬ／２Ｊでのみ検出されるが、ＤＢＡ／２Ｊマウスでは検出されない。ＴＮＮＩ３Ｋはまた、核周辺でも検出される（矢じり）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、少なくとも部分的に、Ｔｎｎｉ３ｋレベルが、心筋疾患のマウスモデルにおける心臓疾患進行速度の大きな決定要因であることを立証する研究から生じる（以下の実施例を参照されたい）。この研究は、Ｔｎｎｉ３ｋのキナーゼ活性が、疾患進行の修飾に必要であることをさらに立証する。本発明は、心筋疾患患者におけるＴｎｎｉ３ｋによる早発性心不全の誘導を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｎｎｉ３ｋの影響を阻害するのに使用可能な化合物を同定するための方法を提供する。本発明はまた、こうして同定される化合物に、そして該化合物を用いて、心筋疾患患者における心不全に対して防御するか、またはそのリスクを減少させる方法にも関する。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、Ｔｎｎｉ３ｋに結合し、そしてそれによって、潜在的にＴｎｎｉ３ｋアンタゴニストとして機能する能力に関して、化合物をスクリーニングする方法に関する。Ｔｎｎｉ３ｋには、２つの認識可能なタンパク質モチーフ：アミノ末端の一連のアンキリン・リピートおよびカルボキシ末端のチロシンキナーゼドメインが含まれる。全Ｔｎｎｉ３ｋ分子を本発明のスクリーニング法（アッセイ）で用いてもよいし、またはその断片、例えばチロシンキナーゼドメインを用いてもよく、同様に、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片を含む融合タンパク質を用いてもよい。
【００１２】
この態様発明の結合アッセイには、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片（あるいはこれらを含有する融合タンパク質）を、好適に検出可能標識（例えば放射性または蛍光標識）を所持する試験化合物（タンパク質性または非タンパク質性）とインキュベーションする、細胞不含アッセイが含まれる。インキュベーション後、任意の多様な技術を用いて、試験化合物に結合したＴｎｎｉ３ｋまたはその断片（あるいは融合タンパク質）を未結合試験化合物から分離してもよい（例えば、Ｔｎｎｉ３ｋ（またはその断片あるいは融合タンパク質）を固体支持体（例えばプレートまたはカラム）に結合させて、そして未結合試験化合物を洗い流してもよい）。次いで、用いた標識を検出するのに適した技術を用いて（例えば放射標識試験化合物の場合は液体シンチレーション計測およびガンマ計測、または蛍光測定分析によって）、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片（あるいは融合タンパク質）に結合する試験化合物の量を測定してもよい。Ｔｎｎｉ３ｋ（またはその断片あるいは融合タンパク質）に結合する試験化合物は、Ｔｎｎｉ３ｋ活性（例えばキナーゼ活性）の候補阻害剤である。
【００１３】
本態様の結合アッセイはまた、細胞不含競合結合アッセイの形を取ってもよい。こうしたアッセイにおいて、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片、あるいはこれらを含有する融合タンパク質を、Ｔｎｎｉ３ｋと相互作用する（例えば結合する）ことが知られる化合物（例えば心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ））とインキュベーションしてもよく、こうした既知の化合物は、好適に、検出可能標識（例えば放射性または蛍光標識）を所持する。試験化合物（タンパク質性または非タンパク質性）を反応に添加して、そして既知の（標識）化合物と、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片（あるいは融合タンパク質）への結合に関して競合する能力についてアッセイする。未結合の既知の（標識）化合物を、結合した既知の化合物から分離し、そして結合した既知の化合物の量を測定して、試験化合物が競合する能力を評価してもよい。未結合反応物質を容易に洗い流せるように、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片（あるいは融合タンパク質）を固体支持体に連結することによって、多数の試験化合物のスクリーニングが容易になるように、このアッセイの形式を整えてもよい。プラスチック支持体、例えばプラスチックプレート（例えば９６ウェルディッシュ）が好ましい。
【００１４】
上述の細胞不含アッセイで使用するのに適したＴｎｎｉ３ｋを天然供給源から単離してもよい。Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片（あるいは融合タンパク質）を組換え的または化学的に調製してもよい。例えば既知の組換え技術を用いて、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片を融合タンパク質として調製してもよい。好ましい融合タンパク質には、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）部分、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）部分（細胞分布研究に有用）またはＨｉｓタグ（アフィニティ精製に有用）が含まれる。非Ｔｎｎｉ３ｋ部分は、融合タンパク質中で、Ｔｎｎｉ３ｋ部分に対してＮ末端またはＣ末端に存在してもよい。
【００１５】
上に示すように、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片、あるいは融合タンパク質は、プラスチックまたはガラスプレートまたはビーズ、クロマトグラフィー樹脂（例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ）、フィルターあるいは膜を含む、固体支持体に連結して存在していてもよい。こうした支持体にタンパク質を付着させる方法が当該技術分野に周知である。
【００１６】
本発明の結合アッセイにはまた、細胞に基づくアッセイも含まれる。こうしたアッセイで使用するのに適した細胞には、Ｔｎｎｉ３ｋを天然に発現する細胞、およびＴｎｎｉ３ｋ（またはその断片あるいはこれらを含む融合タンパク質）を発現するように操作されている細胞が含まれる。好適には、ヒトＴｎｎｉ３ｋを発現している細胞を用いる。適切な細胞の例には、心臓細胞（例えばヒト心臓細胞（心筋細胞など））が含まれる。
【００１７】
プロモーターに機能可能であるように連結されたＴｎｎｉ３ｋ（例えば図１１に示すコード配列）またはその断片あるいは融合タンパク質をコードする配列を含む発現構築物を、選択した宿主細胞内に導入することによって、Ｔｎｎｉ３ｋ（好適にはヒトＴｎｎｉ３ｋまたはその断片、あるいはこれらを含む融合タンパク質）を発現するように細胞を操作してもよい。多様なベクターおよびプロモーターを用いてもよい（例えばｐＣＭＶ５発現ベクター）。
【００１８】
試験化合物（好適には、検出可能（例えば放射性または蛍光）標識を所持する）を、Ｔｎｎｉ３ｋ（またはその断片あるいはこれらを含有する融合タンパク質）発現細胞を培養する培地に添加し、結合に好ましい条件下で細胞と試験化合物をインキュベーションし、そして次いで、未結合試験化合物を除去し、そして細胞と会合している試験化合物の量を測定することによって、細胞に基づく本発明の結合アッセイを行ってもよい。細胞不含アッセイの場合におけるように、Ｔｎｎｉ３ｋ（またはその断片あるいは融合物）に結合する試験化合物は、Ｔｎｎｉ３ｋ活性（例えばキナーゼ活性）の候補阻害剤である。
【００１９】
細胞に基づくアッセイはまた、Ｔｎｎｉ３ｋに結合することが知られる（そして好ましくは検出可能標識で標識されている）化合物を、Ｔｎｎｉ３ｋ（またはその断片あるいはこれらを含む融合タンパク質）発現細胞と、試験化合物の存在下および非存在下でインキュベーションする、競合アッセイの形を取ってもよい。試験化合物の非存在下で細胞と会合する量に比較した際の、試験化合物の存在下でインキュベーションした細胞と会合した既知の化合物の量を測定することによって、Ｔｎｎｉ３ｋ（または断片あるいは融合物）に対する試験化合物のアフィニティを評価してもよい。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片（あるいはこれらを含む融合タンパク質）を発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がＴｎｎｉ３ｋ活性を阻害する能力を決定する、細胞に基づくアッセイに関する。細胞は哺乳動物起源であってもよく、例えば心臓細胞（好ましくはヒト）であってもよい。試験化合物がＴｎｎｉ３ｋ活性を阻害する能力の測定は、例えばＴｎｎｉ３Ｋ自己リン酸化、あるいは心臓特異的タンパク質またはＭＢＰのＴｎｎｉ３Ｋリン酸化を監視することによって達成可能である。
【００２１】
好ましい態様において、試験化合物がＴｎｎｉ３ｋ活性を阻害する能力の測定は、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片（あるいは融合タンパク質）がターゲット分子をリン酸化する能力（例えばＴｎｎｉ３Ｋの自己リン酸化、あるいは心臓特異的タンパク質またはＭＢＰのリン酸化）を測定することによって達成可能である。
【００２２】
任意の特定の試験化合物（Ｔｎｎｉ３ｋに結合する能力に基づいて選択された試験化合物を含む）のいかなる特定の影響も測定するため、例えば心機能に対する、選択した試験化合物の多様な濃度の影響を測定するアッセイを行ってもよい。
【００２３】
本発明にはまた、本明細書記載のＴｎｎｉ３ｋ／ＣＳＱトランスジェニック、および療法有効性に関して化合物をスクリーニングする際にこれらを用いる方法も含まれる。トランスジェニックを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの結果として選択された化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を検証してもよい。例えば心機能（例えば心エコーを用いる）または寿命を監視することによって、有効性を測定してもよい。
【００２４】
別の態様において、本発明は、上記アッセイを用いて、Ｔｎｎｉ３ｋに結合し、そして／または細胞生物活性に対するＴｎｎｉ３ｋの影響（例えばキナーゼの影響）を阻害することが可能であると同定された化合物に関する。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、Ｔｎｎｉ３ｋの活性（例えばキナーゼ活性）を阻害する化合物を哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）に投与して、特に、哺乳動物が心筋疾患を有する際に、心不全に対して防御するか、またはそのリスクを減少させることも可能である。この態様にしたがって、こうした防御またはリスクの減少を提供するのに十分な量で阻害剤を投与してもよい。投与量および投薬措置は、例えば、阻害剤、哺乳動物の状態および求める効果に応じて多様でありうることが認識されるであろう。以下の実施例に記載する研究に基づいて、Ｔｎｎｉ３ｋの阻害は、通常の病理には、事実上、重要でないようである。したがって、Ｔｎｎｉ３ｋ活性の阻害剤の投与は、最小限の副作用しか持たないと予期されうる。
【００２６】
上記アッセイにしたがって同定されるＴｎｎｉ３ｋ阻害剤を、薬学的組成物として配合してもよい。こうした組成物は、阻害剤および薬学的に許容されうる希釈剤またはキャリアーを含む。阻害剤は、投薬単位型中で（例えば錠剤またはカプセルとして）または溶液として存在してもよく、特に注射による投与が予期される場合には、好ましくは無菌である。上に指摘されるように、用量および投薬措置は、例えば、患者、化合物および求める効果に応じて多様でありうる。最適用量および措置は、当業者によって容易に決定可能である。
【００２７】
また、Ｔｎｎｉ３ｋの発現を阻害する技術（例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンス戦略）を療法的に用いて、心不全のリスクを減少させてもよい。
Ｔｎｎｉ３Ｋレベルを予後的に用いてもよい。上昇したレベルのＴｎｎｉ３Ｋを有する患者は、心不全のリスクがより高いと予期されうる。
【００２８】
さらにさらなる態様において、本発明は、キット、例えば本明細書記載のアッセイを実行するのに適したキットに関する。こうしたキットには、Ｔｎｎｉ３ｋまたはその断片あるいはこれらを含む融合タンパク質、例えば検出可能標識を所持するものが含まれてもよい。キットには、Ｔｎｎｉ３ｋ特異的抗体が含まれてもよい。キットにはさらに、アッセイで使用するための補助的試薬（例えば緩衝剤）が含まれてもよい。キットには、１以上の容器手段内に配置された任意の上記構成要素が含まれてもよい。
【００２９】
本発明の特定の側面が、以下の限定されない実施例に、より詳細に記載される（米国特許第６，２６１，８１８号、第６，５００，６５４号、第６，６６０，４９０号、第６，９８７，０００号、第７，３７１，３８０号、Ｆｅｎｇら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）７２：１１９９−２０４（２００７）、Ｗａｎｇら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １６，  ２００７（出版前に電子公開）、Ｆｅｎｇら，  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２６：１０４−１０９（２００７）、およびＫａｒａｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１２７−１３２（２００８）もまた参照されたい）。
【実施例】
【００３０】
実施例１
実験詳細
動物の世話および取り扱い。デューク大学医療センターの施設内倫理委員会に認可されたプロトコルおよび動物保護規制にしたがって、すべてのマウスを取り扱った。本研究の過程で用いたすべての近交系マウス系統を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から得た。ＣＳＱを過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｊｏｎｅｓら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１：１３８５−１３９３（１９９８）、Ｃｈｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２２２５１−２２２５６（１９９９））をＤＢＡ／２Ｊ遺伝子バックグラウンドで維持した。
【００３１】
ＤＢＡ．ＡＫＲ−Ｈｒｔｆｍ２コンジェニックマウス。ＤＢＡ／２Ｊに繰り返し戻し交雑することによって、ＤＢＡ遺伝子バックグラウンド中、Ｈｒｔｆｍ２遺伝子座でＡＫＲゲノム配列を宿するコンジェニックマウスを生成した。世代Ｎ２で、Ｈｒｔｆｍ２でヘテロ接合体であり、そして他のマッピングされた修飾因子遺伝子座でホモ接合体ＤＢＡであるブリーダーを選択した（Ｗｈｅｅｌｅｒら，  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １６：４１４−４２３（２００５））。１４４９のＳＮＰを含むマウスＭＤ連鎖パネル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、ゲノム全体のＳＮＰ遺伝子型決定を実行した。世代Ｎ６までに、動物は、ゲノム全体でＤＢＡアレルに関してホモ接合体であり、そして染色体３上のＨｒｔｆｍ２を含有する領域であるおよそ１０Ｍｂの区間に関してのみ、ヘテロ接合性を示した。戻し交雑が世代Ｎ１０に達したら、ＤＢＡ．ＡＫＲ−Ｈｒｔｆｍ２マウスを交雑によって維持した。
【００３２】
マウスＲＮＡ単離、マイクロアレイ分析およびｑＲＴ−ＰＣＲ。３つの初代系統（Ｂ６、ＤＢＡ、ＡＫＲ）の各々由来の、年齢および性別がマッチした野生型動物から除去した心臓全体を用いて、ＲＮＡ転写物レベルを調べた。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、総ＲＮＡを単離した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマウスプローブセット（マウス４３０  ２．０アレイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）上で、マイクロアレイ分析を行った。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ＊  ７．３発現分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて分析を行った。ＴａｑＭａｎ発現分析に関しては、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、マウス心臓全体から総ＲＮＡを抽出した。高性能ｃＤＮＡアーカイブキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、１μｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、そしてｑＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとして用いた。あらかじめ設計した遺伝子発現アッセイ（ＴａｑＭａｎ、ＡＢＩ、アッセイＩＤ：  Ｍｍ０１３１８６３３＿ｍｌ）を用いて、Ｔｎｎｉ３ｋ  ｃＤＮＡを増幅した。ベータ−アクチン（Ａｃｔｂ）を内因性対照として用いた（ＴａｑＭａｎ、ＡＢＩ、カタログ番号４３５２３４１Ｅ）。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００リアルタイムＰＣＲ系上で、すべての増幅を３つ組で（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行い、そしてＡＢＩソフトウェアで分析した。塩基対合のない両側Ｔ検定を用いて、すべての統計分析を行った。
【００３３】
Ｔｎｎｉ３ｋタンパク質発現の分析。プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液中に再懸濁した瞬間凍結心臓組織を用いて、心臓全体のタンパク質溶解物を調製した。標準的方法で行うＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって、溶解物を分析した。マウスＴｎｎｉ３ｋタンパク質のＣ末端１４アミノ酸（ＬＨＳＲＲＮＳＧＳＦＥＤＧＮ）に対して、ポリクローナルペプチド抗血清を発展させた。２匹のウサギ由来の抗血清をプロテインＡカラム（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で精製した。５％粉乳を含むＴＢＳＴ中、Ｔｎｎｉ３ｋ抗体を１：１０００希釈で用いた。ＨＲＰにコンジュゲート化された二次抗ウサギ抗体を用い、その後、Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）とインキュベーションし、そしてＸ−ＯＭＡＴフィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露して、タンパク質バンドを視覚化してもよい。ウェスタンブロット分析を用いて、抗体の特異性を確認した。予期されるように、ｍＴｎｎｉ３ｋ抗体は、全長Ｔｎｎｉ３ｋ発現ベクターで一過性にトランスフェクションした２９３Ｔ細胞から調製した溶解物から、そして野生型マウス心臓由来のタンパク質溶解物において、９０ｋＤａタンパク質を検出する（図３）。
【００３４】
蛍光ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。１１６ｂｐまたは１２０ｂｐいずれかのｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を検出するよう設計されたプライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲにｃＤＮＡを供した。順方向プライマーは、予測される４塩基挿入の２５ｂｐ上流をターゲットとし、そして蛍光標識された：５’−６ＦＡＭ−ＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴ−３’であり、一方、非標識逆方向プライマーは、配列：５’−ＡＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＧ−３’を持ち、予測される４塩基挿入の４８ｂｐ下流をターゲットとした。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７３０  ＤＮＡ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上のＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ分析プログラムを用いて、両方の断片の集積を定量化した。両方のｃＤＮＡ産物の相対的増幅に基づいて、適切にスプライシングされた産物およびミススプライシングされた産物の比を計算した。
【００３５】
Ｔｎｎｉ３ｋスプライシング構築物のクローニング、細胞培養およびトランスフェクション。Ｔｎｎｉ３ｋゲノムスプライシング構築物を生成するため、ＤＢＡゲノムＤＮＡおよびＢ６  ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８００２３をテンプレートとして用いて、イントロン１７、エクソン１８、イントロン１８、エクソン１９、イントロン１９、エクソン２０、およびイントロン２０の一部を含む、ゲノム４ｋｂ断片を生成した。順方向ＰＣＲプライマーの配列は、５’−ＡＣＴＴＡＣＴＴＡＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＧＴＴＡＴＧＴＧＣ−３’であり；逆方向プライマーは、５’−ＧＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＴＧＴＧＴＡＣＣＴＡＡＴＴＧＴ−３’であった。ＰＣＲ産物をｐＳＰＬ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングした。直接配列決定によって、クローンを検証した。ヒト胚性腎ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）を、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で、５％ＣＯ２中、３７℃で維持した。細胞を３５ｍｍ２プレート上で増殖させ、そして製造者のプロトコルにしたがってＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を用いて、１μｇプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後にＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＲＮＡを抽出し、そして標準法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート中、およそ８０％集密まで増殖させ、次いで、ＦｕＧｅｎｅ試薬と混合した１μｇのＤＢＡまたはＢ６−ｐＳＰＬ３プラスミドを用いてトランスフェクションした。すべてのトランスフェクションを３つ組で行った。トランスフェクション２０時間後、ＴＲＩｚｏｌで総ＲＮＡを抽出した。標準法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。上述の蛍光ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、Ｔｎｎｉ３ｋ構築物に関して、適切にスプライシングされた産物およびミススプライシングされた産物の比を決定した。
【００３７】
部位特異的突然変異誘発。Ｐｆｕ  ＴｕｒｂｏプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼとともに、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて、ＤＢＡ−ｐＳＰＬ３構築物（Ｇ→Ａ）およびＢ６−ｐＳＰＬ３構築物（Ａ→Ｇ）において、ｒｓ４９８１２６１１（ＩＶＳ１９＋９）で、一塩基を変化させた。すべてのクローンを配列決定して、ＳＮＰの適切な取り込みを検証した。
【００３８】
心筋細胞の培養およびＮＭＤ遮断実験。ＨＬ−１心筋細胞（Ｃｌａｙｃｏｍｂら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：２９７９−２９８４（１９９８））を、ウシ胎児血清１０％、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、および１００μＭファンギゾンを補ったＣｌａｙｃｏｍｂ培地（ＳＡＦＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カンザス州レネクサ）中で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＨＬ−１心筋細胞は、混合Ｂ６−ＤＢＡマウスから単離した心臓より得られたが（Ｃｌａｙｃｏｍｂら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：２９７９−２９８４（１９９８））、該細胞株由来のゲノムＤＮＡの直接配列決定によって、これは、Ｔｎｎｉ３ｋ遺伝子座で、ＤＢＡアレルに関してホモ接合体であることが示された。ＨＬ−１細胞を５．７ｘ１０−２ｍＭシクロヘキシミドまたは３．３ｘ１０−２ｍＭエメチンで処理した。各処理を３つ組で行い、そして処理２４時間後に、細胞からＲＮＡを単離した。ＮＭＤ遮断薬剤で処理した細胞および未処理対照から単離したＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。上述のように、蛍光ＲＴ−ＰＣＲスプライシングアッセイを用いて、適切にスプライシングされた産物およびミススプライシングされた産物の比を測定した。上述のように、Ｔｎｎｉ３ｋ  ＴａｑＭａｎアッセイを用いて、総転写物レベルを測定した。
【００３９】
ＴＮＮＩ３Ｋトランスジェニックマウスの生成および試験。正常ヒト心臓ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ後に全長２．５ｋｂ  ＴＮＮＩ３Ｋ  ｃＤＮＡを増幅し、そしてネズミα−ミオシン重鎖（αＭＨＣ）プロモーターの下流でベクター内にクローニングした。人工的ｍｉｎｘイントロンをＴＮＮＩ３Ｋ開始コドンの上流に挿入した。構築物を直線化し、そしてαＭＨＣプロモーター、ｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する８ｋｂ断片を精製し、そしてマイクロインジェクションに用いた。Ｂ６ＳＪＬＦ１／Ｊ胚盤胞に、直線化した導入遺伝子をインジェクションし、そして続いて、代理マウス内に植え付けた。αＭＨＣプロモーター中の５’プライマーおよびＴＮＮＩ３Ｋ導入遺伝子中の３’プライマーを用いて、ＴＮＮＩ３Ｋ導入遺伝子の存在に関して、生じた創始動物の遺伝子型を決定した。ＤＢＡ系統に戻し交雑するために、３つのトランスジェニック系統を選択した。ヒトＣ末端ＴＮＮＩ３Ｋペプチド（ＦＨＳＣＲＮＳＳＳＦＥＤＳＳ）に対して作製したポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、テキサス州モンゴメリー）を用いた心臓溶解物のウェスタンブロット分析によって、各系統において、ＴＮＮＩ３Ｋ導入遺伝子の発現は類似のレベルであることが確認された（図７）。これをＤＢＡに戻し交雑する数世代に関して反復した。創始動物および続く世代（Ｎ２〜Ｎ３）由来のＤＮＡのサザンブロット分析によって、２つの創始系統が、１０〜２０コピーの導入遺伝子を所持する一方、第三の系統は、＞１００コピーを有するようであることが示された。いくつかのトランスジェニックマウス由来の心臓ｃＤＮＡに対して、ＳＹＢＲグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｑＲＴ−ＰＣＲを実行して、内因性Ｔｎｎｉ３ｋおよびトランスジェニックＴＮＮＩ３Ｋ発現間の相対発現相違を決定した。
【００４０】
Ｍモード心エコー。Ｖｅｒｏ  ７７０心エコー検査装置（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ、カナダ・トロント）または１５ＭＨｚ周波数プローブを備えたＨＤＩ  ５０００心エコー検査装置（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、ワシントン州ボセル）のいずれかを用いて、意識がある、１２〜１８週齢の間のマウスにおいて、経胸腔的２次元Ｍモード心エコーを行った。心機能の測定には、心拍、後壁および隔壁の厚さ、左心室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）および駆出時間（ＥＴ）が含まれる。式：ＦＳ＝（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤを用いて、短縮率（ＦＳ）を計算した。先に記載されるように心拍補正線維短縮平均速度（ｒａｔｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｍｅａｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｂｅｒ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）（ｍＶＣＦｃ）を計算した（Ｃｈｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２２２５１−２２２５６（１９９９））。
【００４１】
大動脈縮窄術。マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２．５ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔し、そして先に記載されるように、大動脈縮窄術（ＴＡＣ）を行った（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８２７７−８２８１（１９９１））。１４匹のＴＮＮＩ３Ｋ導入遺伝子陽性動物および１４匹の導入遺伝子陰性動物（野生型）同腹仔に対して、１０週齢でＴＡＣを行った。１匹の導入遺伝子陰性対照および３匹の導入遺伝子陽性動物が手術後に死亡し、これはこの処置の通常の合併症である。次いで、手術４週後および８週後に、心エコー（上記の通り）によって、残った２４匹のマウスを分析した。
【００４２】
結果
Ｈｒｔｆｍ遺伝子座に関する候補遺伝子を同定する努力の一部として、これらの研究で用いた系統由来の心臓組織のマイクロアレイ分析を行って、転写物レベルの相違を示す遺伝子を同定した。Ｈｒｔｆｍ２連鎖ピーク下、共有ハプロタイプブロック内の２１の遺伝子マッピングのうち（Ｗｈｅｅｌｅｒら，  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １６：４１４−４２３（２００５））、１つの遺伝子のみが、防御系統ＤＢＡ／２Ｊ（ＤＢＡ）、ならびに感受性系統Ｃ５７／ＢＬ６（Ｂ６）およびＡＫＲ間で２倍より大きい発現相違を示した。Ｔｎｎｉ３ｋの転写物レベルは、ＤＢＡに比較して、Ｂ６およびＡＫＲで１２倍上昇しており、一方、区間内のすべての他のものの例として、隣接遺伝子は、有意には上昇していなかった（図１Ａ）。ＤＢＡに比較して、Ｂ６およびＡＫＲ系統において２５倍より高いメッセージレベルを示すｑＲＴ−ＰＣＲによって、これらの相違を検証した（図１Ｂ）。ゲノム全体の転写物レベル研究と平行して、Ｈｒｔｆｍ２に渡ってＡＫＲアレルを、そして残りのゲノム全体に渡って、ＤＢＡアレルを所持するコンジェニック系統を生成することによって、Ｈｒｔｆｍ２遺伝子座を遺伝的に単離した。定量的ＲＴ−ＰＣＲによれば、ＤＢＡ．ＡＫＲ−Ｈｒｔｆｍ２コンジェニックマウス由来の心臓におけるＴｎｎｉ３ｋ転写物レベルは、Ｂ６およびＡＫＲ（Ｈｒｔｆｍ２遺伝子座の供給源）で観察されるレベルに匹敵し、そしてＤＢＡ（ゲノムバックグラウンド）で見られるものには匹敵しないことが示され、Ｔｎｎｉ３ｋ発現相違は、ゲノムの別の場所にマッピングされるトランス作用因子よりも、Ｈｒｔｆｍ２遺伝子座でのシス作用配列要素によって駆動されることが示唆された。
【００４３】
６匹の近交系マウス系統から調製された心臓組織を分析して、Ｔｎｎｉ３ｋ転写物のレベルの相違が、タンパク質レベルで観察されるかどうかを決定した。Ｔｎｎｉ３ｋでＤＢＡまたはＢ６ハプロタイプいずれかを共有する、３つのさらなる系統を選択した（図２）。転写物レベルによって予期されるように、Ｂ６ハプロタイプを共有するＢ６、ＡＫＲ、１２９Ｘ１／ＳｖおよびＤＢＡ．ＡＫＲ−Ｈｒｔｆｍ２コンジェニックにおいては、強いレベルのＴｎｎｉ３ｋタンパク質が検出されたが、ＤＢＡハプロタイプを共有するＤＢＡ、Ａ／ＪおよびＢａｌｂ／ｃに関しては、タンパク質はまったく検出されなかった（図１Ｃ）。したがって、抗血清検出限界内で（図３において検証）、Ｔｎｎｉ３ｋタンパク質は、遺伝子に渡ってＤＢＡハプロタイプを共有する系統の心臓には存在しない。後者の系統は、有効にＴｎｎｉ３ｋヌル遺伝子型を示し、該遺伝子型は発生または生存に見かけの影響はまったく示さず、そして明らかな病的結果を示さない。
【００４４】
Ｔｎｎｉ３ｋは関連する系統間で、１つの非同義および２つの同義ＳＮＰ（ｒｓ３０７１２２３３、Ｔ６５９Ｉ；  ｒｓ３０７０９７４４、Ｄ５９８Ｄ；およびｒｓ３０７１２２３０、Ｔ６３９Ｔ）を含有する。Ｔｎｎｉ３ｋ  ｃＤＮＡを配列決定することによって、別の系統特異的配列改変が注目された。Ｂ６ハプロタイプを持つすべての系統は、公表されるｃＤＮＡと同一の主要転写物を示した。対照的に、ＤＢＡハプロタイプを持つすべての系統は、２つの転写物の混合物を示し；公表される転写物とともに、エクソン１９および２０の間に４ヌクレオチド挿入を含有する第二の転写物があった（図４Ａ）。この挿入は、ゲノムＤＮＡには存在せず、そしてイントロン１９からエクソン１９への４ヌクレオチドの付加に相当する（図４Ｂ）。フレームシフトした転写物は、ＤＢＡ心臓ｍＲＮＡのメッセージのおよそ７０％を占めるが、Ｂ６またはＡＫＲには存在しないことが決定された（図４Ｃ）。マウスまたはいかなる他の種に関するＥＳＴデータベースのいずれにもこれは見られず、これが、正常ドナー部位の４ヌクレオチド下流の第二の「ｇｔ」スプライスドナー部位の使用によって引き起こされる欠陥スプライシングによって生成される異常なメッセージに相当することが示唆される。
【００４５】
エクソン１９および２０の周囲のゲノム領域は、５０を超えるＳＮＰを宿する。これらはいずれも異常なスプライシングを引き起こしうるが、スプライスドナー接合部に最も近いＳＮＰに焦点を当てた。Ｂ６および関連系統（ＡＫＲ、１２９Ｘ１／ＳｖＪ、ＭＲＬ）は、ｒｓ４９８１２６１１で「ａ」を示す一方、ＤＢＡおよび関連系統（Ａ／Ｊ、Ｃ３Ｈ、Ｂａｌｂ／ｃ）は「ｇ」を示す。このＳＮＰは、正常スプライス部位の＋９位にあるが、異常なスプライス部位の＋５位にある。したがって、ＤＢＡおよび関連系統は、異常な部位の＋５位に、コンセンサス「ｇ」配列を宿する。ありうるスプライスドナー部位各々に関する、スプライスドナー強度に関する荷重マトリックススコア（Ｓｔａｄｅｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：５０５−５１９（１９８４）、Ｂｕｒｓｅｔら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：４３６４−４３７５（２０００））によって、ｒｓ４９８１２６１１に「ｇ」ヌクレオチドが存在する場合のみ、第二の（異常な）スプライス部位が、領域中で最強のスプライス部位であることが確認される（図４Ｄ）。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシング系において、ｒｓ４９８１２６１１が異常なスプライシングの原因であるという仮説を試験した。Ｂ６およびＤＢＡ両方に由来するエクソン１８〜２０に渡るゲノムＤＮＡ断片をサブクローニングし、そして２９３Ｔ細胞内にトランスフェクションした。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ構築物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されるスプライシングパターンを反復し、スプライシング欠陥が、クローニングされた４ｋｂ断片上に存在するシス作用配列によって引き起こされることが確認された（図５Ｂ）。部位特異的突然変異誘発を用いて、異常なスプライシングにおけるｒｓ４９８１２６１１の役割を調べた。このＳＮＰでの単一変化は、スプライシングパターンを完全に逆転させた。「ａ」アレルを所持するように改変されたＤＢＡゲノムＤＮＡは、異常なスプライス産物をまったく作製せず、一方、「ｇ」アレルを所持するＢ６  ＤＮＡは、異常な産物を作製する（図５Ｂ）。これらの結果によって、ｒｓ４９８１２６１１が、異常なスプライシングメッセージの存在または非存在の原因であるが、異常なスプライシングは、全体としては、他の配列相違によっても調節されうることが示される。
【００４７】
Ｔｎｎｉ３ｋは、元来、系統間の転写物レベルにおける相違による位置候補遺伝子として同定されたため、ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）が、ＤＢＡにおけるフレームシフトしたメッセージレベルの劇的な減少の原因であると仮定された。これは、マウス心筋細胞株、ＨＬ−１で試験され（Ｃｌａｙｃｏｍｂら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：２９７９−２９８４（１９９８））、該系統は、Ｔｎｎｉ３ｋで、ＤＢＡハプロタイプを共有する。ＨＬ−１細胞が、野生型ＤＢＡ心臓に匹敵するレベルの異常なＴｎｎｉ３ｋおよび正常Ｔｎｎｉ３ｋの両方を発現し、大部分のメッセージが４ヌクレオチド挿入を所持することが、まず確認された。次いで、ＨＬ−１心筋細胞を、ＮＭＤを遮断する２つの薬剤、シクロヘキシミドおよびエメチンで処理した（Ｃａｒｔｅｒら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：２８９９５−２９００３（１９９５））。いずれの薬剤での処理も、正常にスプライシングされたメッセージに比較して、異常にスプライシングされた転写物のレベルを増加させた（図６Ａ）。予期されるように、これらの処理は、総Ｔｎｎｉ３ｋ  ｍＲＮＡレベルを１６倍増加させ（図６Ｂ）、ＮＭＤが転写物レベルで観察される相違において、主要な役割を果たしていることが確認された。
【００４８】
これらの実験は、Ｔｎｎｉ３ｋ転写物レベルにおいて観察される相違の根底にある分子機構を決定するが、これらは、心筋疾患の進行におけるＴｎｎｉ３ｋのｉｎ  ｖｉｖｏの役割に取り組んでいなかった。次いで、Ｔｎｎｉ３ｋが、Ｈｒｔｆｍ２遺伝子座の根底にある遺伝子であるかどうかに関して、研究を行った。Ｈｒｔｆｍ２コンジェニック系統（ＤＢＡ．ＡＫＲ−Ｈｒｔｆｍ２）をまず、ＣＳＱトランスジェニック増感系統に交雑した。この系統は、染色体３を除くすべての染色体でＤＢＡゲノムバックグラウンドを保持し、染色体３は、Ｔｎｎｉ３ｋ遺伝子に渡るＡＫＲハプロタイプを含めて、Ｈｒｔｆｍ２を含むＡＫＲゲノムバックグラウンドのおよそ１０Ｍｂを含有する。この交雑から生じるＦ１動物は、Ｔｎｎｉ３ｋでＡＫＲアレルを１コピーしか持たず、親ＡＫＲ系統に比較して、Ｔｎｎｉ３ｋ発現レベルが半分まで、有効に減少している。Ｔｎｎｉ３ｋの通常（ＡＫＲ）用量の半分を発現するコンジェニック系統は、ＤＢＡ対照に比較して、より拡張した心臓および減少した心機能（短縮率の減少）を示す（図７）。これらのデータは、Ｔｎｎｉ３ｋの通常用量の１／２であってさえ、心疾患の背景において、拡張の加速および心機能不全を生じることを示す。
【００４９】
ＣＳＱ導入遺伝子の存在下で、ＤＢＡ．ＡＫＲ−Ｈｒｔｆｍ２コンジェニックマウスはまた、対照マウスに比較して、生存の減少も示す。コンジェニックマウスは１００日までに死亡し、ＡＫＲで見られたＴｎｎｉ３ｋ発現レベルの１／２が、心不全のより早期の開始によって、生存減少を引き起こすことが示される（図８）。
【００５０】
Ｔｎｎｉ３ｋがこの影響の原因であることを検証するため、心臓においてヒトＴＮＮＩ３Ｋを発現する３つのトランスジェニックマウス系統を生成した（図９）。定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト導入遺伝子が、内因性Ｂ６またはＡＫＲマウス転写物より５〜２０倍高いレベルで発現されることが示された。ＴＮＮＩ３Ｋ導入遺伝子をＤＢＡバックグラウンド（検出可能なネズミＴｎｎｉ３ｋタンパク質なし）内に遺伝子移入して、ＣＳＱトランスジェニック増感因子の存在下で、ＴＮＮＩ３Ｋ発現増加が、疾患進行を加速させるという仮説を試験した。３つの系統すべてのＦ１世代マウスは、１年より長く生存し、そして第１２週および２１週のトランスジェニック動物における心機能は、野生型動物と区別不能であった。したがって、ＴＮＮＩ３Ｋ発現のみでは、明白な心筋疾患または心不全を生じない。これは、ＣＳＱ導入遺伝子の非存在下では、Ｂ６が強いレベルのＴｎｎｉ３ｋを発現する一方、ＤＢＡが検出可能なタンパク質を示さないにもかかわらず、Ｂ６およびＤＢＡ動物間の心機能には測定可能な相違がないため、予期されないことではなかった。
【００５１】
対照的に、ＣＳＱ増感因子の背景におけるＴＮＮＩ３Ｋの発現は、早死につながる、重度の心筋疾患を生じる（図８）。ＣＳＱ（増感因子）およびＴＮＮＩ３Ｋ（修飾因子）間の交雑から生じるありうる４つの遺伝子型のうち、二重トランスジェニックのみが、生存の劇的な減少を示した。他の遺伝子型はすべて、平均、少なくとも１５０日（実験終点）まで生存する一方、ＣＳＱおよびＴＮＮＩ３Ｋを発現する動物は、２１日以内に死亡した。この早死の表現型は、ＣＳＱ導入遺伝子をＢ６（強いレベルの内因性Ｔｎｎｉ３ｋ）内に遺伝子移入しようとする試みの際に、以前観察されたものと類似であった。ＤＢＡバックグラウンドにおける増感因子から出発すると（Ｃｈｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２２２５１−２２２５６（１９９９））、Ｎ２動物が３０日〜４０日で死亡したため、第二世代以降にＣＳＱ導入遺伝子を持ち越すことは不可能であった（Ｓｕｚｕｋｉら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：１８２４−１８２９（２００２））。
【００５２】
早死が心機能不全に関連するかどうかを決定するため、再現可能なデータが得られる最も早い時期である第１４日、４つのありうる遺伝子型すべてを持つ動物に対して、心エコーを行った。二重トランスジェニックマウスのみが、重度の収縮期機能不全、心室拡張、および心拍数減少によって特徴付けられる異常な心機能を示す（図１０）。心機能が非常に損なわれており、そして処置中に心不全のリスクがあるため、生存測定に用いた二重トランスジェニック動物は、同時に心エコー表現型を決定するには使用不能であった。この遺伝子型の５匹の動物のうち３匹は、心エコー中に死亡した。したがって、二重トランスジェニック動物は、１４日（またはより早く）までに心筋疾患を発展させ、そしてその後まもなく死亡する。
【００５３】
これらのデータは、ＴＮＮＩ３Ｋ発現が、心筋疾患のＣＳＱトランスジェニックモデルにおいて、早発性心不全を誘導することを示す。次に、カルセクエストリン過剰発現に関連しない心筋疾患のモデルにおいて、ＴＮＮＩ３Ｋが疾患修飾効果を有するかどうかに関する研究を行った。大動脈縮窄術（ＴＡＣ）は、圧過負荷に反応して、左心室肥大を誘導する（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８２７７−８２８１（１９９１））。ＴＮＮＩ３Ｋトランスジェニック動物および野生型同腹仔対照に対してＴＡＣを行った。ＴＡＣ手術の４週後および８週後、心エコーによって、心機能を分析した。導入遺伝子陽性マウスは、手術の４週後および８週後、収縮期機能不全（ＬＶＥＤｓ増加）および有意に減少した短縮率を示した（図１１）。これによって、ＴＮＮＩ３Ｋ過剰発現が、ＣＳＱ増感因子の背景外で、心機能に有害な影響を有することが確認される。
【００５４】
ＴＮＮＩ３Ｋは、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）と相互作用する心臓特異的プロテインキナーゼとして同定された（Ｚｈａｏら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ８１：２９７−３０４（２００３））。しかし、今日まで、ｃＴｎＩは、リン酸化ターゲットとして確立されてきておらず、そしてＴＮＮＩ３Ｋのｉｎ  ｖｉｖｏ機能は不明なままである。この新規キナーゼのターゲットに関わらず、このタンパク質の発現が、２つの独立な心筋疾患モデルにおいて、疾患進行を加速するため、ＴＮＮＩ３Ｋレベルは、心疾患進行速度の主な決定要因であることが示された。多くの近交系マウス系統は、この遺伝子に関して、事実上ヌルであるが、重要なことに、ヌル表現型は防御性である。このタンパク質のレベルを、ほぼ存在しない程度まで、劇的に減少させると、正常な発生または長期生存にはまったく影響がないようであり、このキナーゼ活性の阻害が、病的副作用をほとんどまたはまったく持たないと示唆された。プロテインキナーゼは、非常に重要な細胞周期制御因子であるため、キナーゼ阻害剤は、新規癌療法の発展の大きな手段となってきている。ＴＮＮＩ３Ｋは、心疾患の背景において、類似の小分子キナーゼ阻害剤を発展させるための理想的な候補になりうる。Ｔｎｎｉ３ｋ相同分子種のヌル・アレルは、ヒト集団に存在するとは予期されず、したがって、ほとんどすべてのヒト心筋疾患患者は、原則として、キナーゼ阻害レベルで介入するのに適した被験体であろう。ＴＮＮＩ３Ｋの選択的阻害は、疾患進行を遅らせ、そして迅速に進行する心疾患を持つ個体を治療するのに有益であると証明されうるため、特に有用であろう。これらの疾患モデルの背景におけるキナーゼ阻害のさらなる研究は、心疾患の新規治療につながりうる。
【００５５】
実施例２
正常心筋細胞におけるＴｎｎｉ３ｋタンパク質の機能を決定する最初の段階として、マウス心組織内のその位置を調べた。ヒトＴｎｎｉ３ｋタンパク質に特異的な抗血清を用いて、Ｔｎｎｉ３ｋトランスジェニックマウスにおける外因性（トランスジェニック）タンパク質の位置を探査した（ｐｒｏｂｅ）。これらのマウスは、心臓特異的心臓ミオシン重鎖プロモーターからヒトＴｎｎｉ３ｋタンパク質を発現する。重要なことに、これらのトランスジェニックマウスは、内因性マウスＴｎｎｉ３ｋタンパク質を検出可能に発現しない、ＤＢＡ／２Ｊバックグラウンドに戻し交雑されている。したがって、いかなる染色も、マウス組織中に存在するヒトタンパク質による。Ｔｎｎｉ３ｋ染色（赤）は、心臓サルコメアの構造構成要素であることと一致する、線状の染色パターンを示す（図１３）。これはＴｎｎｉ３ｋを構造タンパク質とする最初の記載である。サルコメアは、心筋および骨格筋両方の基礎的な構造単位であり、そして筋収縮に直接関与する。
【００５６】
Ｔｎｎｉ３ｋが複雑なサルコメア構造内に位置するかどうかを決定するため、心臓組織切片をサルコメアの多様な構成要素に特異的な他のタンパク質に対する抗血清と共染色した。Ｔｎｎｉ３ｋは、サルコメアのＺ板（Ｚ線とも呼ばれる）の古典的なマーカーであるデスミン（合わせた画像中、黄色）とのみ共局在する。Ｚ板は、サルコメアの非常に重要な構成要素の付着部位であり、これには、ミオシンおよびアクチンフィラメントが含まれる。図１４は、正常マウスＴｎｎｉ３ｋタンパク質がまた、デスミンと同一の線状染色パターンを示し、そして共局在することを示す。ヒト・トランスジェニックタンパク質の局在データは、正常マウスタンパク質のものに匹敵し、トランスジェニックデータがアーチファクトでないことを示す。重要なことに、ＤＢＡ／２Ｊマウスは、この線状染色パターンを示さず、ＤＢＡ／２Ｊマウス（および関連系統）がこのタンパク質を発現しないというデータと一致する。これは、Ｔｎｎｉ３ｋをサルコメアＺ板タンパク質とする最初の記述である。ウェスタンブロットで示すように、ＤＢＡ／２ＪおよびマウスＴｎｎｉ３ｋ遺伝子座で同じ遺伝子ハプロタイプを持つ他の系統が、可視であるいかなるＴｎｎｉ３ｋタンパク質も発現せず、そしてなお、表現型が完全に正常であるため、このタンパク質は、見かけ上、完全に不要である。したがって、Ｔｎｎｉ３ｋは、不要であり、そして正常な心機能に必要とされないため、キナーゼ阻害の合理的なターゲットを提供する。
【００５７】
上に引用するすべての文献および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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