(57)【要約】本発明は、新規な下記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像｛きょうぞう｝異性｛いせい｝体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を提供する。【化１】2012507509.tif 000033また、前記化学式１の化合物は、造骨細胞の分化能に優れており、肥満細胞の分化抑制能及び肝臓における脂肪酸の合成抑制能を有するため骨粗鬆症、脂肪肝及び肥満治療に画期的な役割を果たすことができる。
2012507509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩：
［化学式１］
2012507509.tif 000027
前記式においてＷはＣＯ又はＣＨＯＲ１であり、ＸはＮ３、ＮＨＲ２、ＯＲ２、ＳＲ２、ＳｅＲ２又はＴｅＲ２であり、前記Ｒ１及びＲ2はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０のアリール、Ｃ４〜Ｃ２０のヘテロアリール又は
2012507509.tif 000028
の中から選ばれ、ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ４であり、Ｚは単結合、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０のアリール又はＣ４〜Ｃ２０のヘテロアリールの中から選ばれ、ＭとＮはそれぞれ独立に水素、ＯＨ又は存在せず、この際Ｍ又はＮに連結された炭素は他の炭素と単結合又は二重結合を形成し、各炭素における二重結合は一つ以下で形成される。
【請求項２】
ＷはＣＯ又はＣＨＯＲ１であり、ＸはＮ３、ＮＨＲ２、ＯＲ２、ＳＲ２、ＳｅＲ２又はＴｅＲ２であり、前記Ｒ１及びＲ2はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、又は
2012507509.tif 000029
の中から選ばれ、前記ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ４であり、Ｚは単結合、ＮＨ、Ｏ又はＳであり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニルの中から選ばれ、ＭとＮはそれぞれ独立に水素、ＯＨ又は存在せず、この際Ｍ又はＮに連結された炭素は他の炭素と単結合又は二重結合を形成し、各炭素における二重結合は一つ以下で形成されることを特徴とする請求項１に記載の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩。 
【請求項３】
ＷはＣＯ又はＣＨＯＲ１であり、ＸはＮ３、ＯＲ２、又はＳＲ２であり、前記Ｒ１及びＲ2はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、又は
2012507509.tif 000030
の中から選ばれ、前記ＹはＯ又はＳであり、Ｚは単結合であり、Ｒ３は水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、又はＣ２〜Ｃ８のアルキニルの中から選ばれ、ＭとＮはそれぞれ独立に水素、ＯＨ又は存在せず、この際Ｍ又はＮに連結された炭素は他の炭素と単結合又は二重結合を形成し、各炭素における二重結合は一つ以下で形成されることを特徴とする請求項２に記載の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩。 
【請求項４】
前記化学式１の化合物が、
2012507509.tif 000031
2012507509.tif 000032
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項３に記載の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩。
【請求項５】
（ａ）海綿動物Ｐｈｏｒｂａｓ ｓｐ.を切断して乾燥させた後、Ｃ１〜Ｃ４のアルコールで抽出する段階；
（ｂ）前記（ａ）の段階から得た抽出物を水と塩化メチレンを用いて分配させた後、有機層の溶媒を取り除き、またノルマルヘキサンと、メタノール及び水の混合溶液を用いて分配させる段階；及び
（ｃ）前記（ｂ）の段階から得たメタノール分液層の溶媒を取り除いた後、固定相としてシリカを用い、溶離液として溶離液の総重量に対して２０重量％以下の水を含むか含まないメタノール溶液を用い、クロマトグラフィーを行って分液を得る段階を含む請求項１の化学式１の化合物の製造方法。
【請求項６】
（ａ）の段階において、乾燥は凍結乾燥の方式を用い、Ｃ１〜Ｃ４のアルコールとしては、メタノールを用いることを特徴とする請求項５に記載の化学式１の化合物の製造方法。
【請求項７】
（ｂ）の段階において、メタノールと水の混合溶液は溶液の総重量に対してメタノール６０〜９０重量％と水１０〜４０重量％とを含むことを特徴とする請求項５に記載の化学式１の化合物の製造方法。
【請求項８】
（ｃ）の段階において、溶離液として総重量に対して２０重量％以下の水を含むか含まないメタノール溶液を用いる前に、それより極性の高い水とメタノールの混合溶液を溶離液として用い、高い極性を有する溶離液から低い極性を有する溶離液の順に１又は２回以上クロマトグラフィーを行うことを特徴とする請求項５に記載の化学式１の化合物の製造方法。
【請求項９】
製造方法は、（ｄ）前記（ｃ）の段階から得た分液を精製する段階をさらに含み、前記精製は高性能の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行い、溶離液として、溶離液の総重量に対してアセトニトリル（ＡＣＮ）５０〜８０重量％と水２０〜５０重量％の混合液を用いることを特徴とする請求項５に記載の化学式１の化合物の製造方法。
【請求項１０】
薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として請求項１の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする骨粗鬆症治療用の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として請求項１の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする脂肪肝治療用の薬剤学的組成物。
【請求項１２】
薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として請求項１の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする肥満治療用の薬剤学的組成物。
【請求項１３】
薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として請求項１の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする肝臓‐Ｘ‐受容体（ＬＸＲ）拮抗用の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スピロキラルの炭素骨格を有する新規化合物、その製造方法及びそれを含む薬剤学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の急速な経済成長と医学の発展は、過栄養及び老齢人口の増加をもたらし、肥満とこれによる脂肪肝患者の急激な増加とともに高齢化による骨粗鬆症患者の増加の原因となった。
【０００３】
長い間、脂肪組織は、生体組織を保護し、体温を維持する機能とともに、身体活動のためのエネルギーの貯蔵所のみとして考えられてきたが、最近多くの研究結果は、脂肪組織が人体の生理や発生においても重要な役割を果たすことを証明している。特に、脂肪細胞で、ａｄｉｐｓｉｎ、ＴＮＦａ、ｌｅｐｔｉｎ等のように、エネルギーの均衡、血糖調節、インスリン感受性の調節、血管生成等の色々な生理活性が調節できる物質を分泌するという事実が次々に発見されることにより脂肪細胞を人体の代謝調節の中心軸として考えるようになった。
【０００４】
一方、肥満により深刻な社会的疾患が生じることにより脂肪細胞の形成を抑制する薬物の開発も活発に行われている。しかし、肥満による非アルコール性脂肪性肝炎患者の急激な増加は、現代人の健康に深刻な危険として作用しているにもかかわらず、これを治療するための効果的な薬物はまだ開発されていない。
【０００５】
骨粗鬆症は、骨形成のバランス、即ち、造骨細胞による骨形成能と破骨細胞による骨吸収能とが崩れて生じた結果である。造骨細胞及び破骨細胞の生成調節は、ホルモン、外部栄養、遺伝的な側面から行われると知られているが、直接的に骨疾患の原因となる遺伝子はあまり知られていない。
【０００６】
現在、治療方法として行われて方法は、ほとんど骨細胞の吸収能を抑制することで骨細胞のバランスを取る方法である。しかし、そのような薬物は副作用が酷いか微細な臨床効果を示すだけであるため、新しい概念の薬物開発が要求されている。したがって、多くの研究者が、直接的に骨細胞の形成、即ち、造骨細胞の活性化が促進できる薬物を開発しようと試みているが、良い効果を示す新しい薬物は、まだ開発されていない。 
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、第一に、大変優れた造骨細胞の分化能を有する新規化合物を提供することを目的とする。
【０００８】
第二に、優れた脂肪細胞の分化抑制能を有する新規化合物を提供することを目的とする。
【０００９】
第三に、肝臓‐Ｘ‐受容体（ＬＸＲ）に対して選択的かつ優秀な拮抗活性を有する新規化合物を提供することを目的とする。
【００１０】
第四に、肝における脂肪生合成及び脂肪吸収を抑制する新規化合物を提供することを目的とする。
【００１１】
第五に、前記の新規化合物を有効成分として含む骨粗鬆症、脂肪肝又は肥満治療用の薬剤学的組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、新規な下記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を提供する：
【００１３】
［化学式１］
2012507509.tif 000003
【００１４】
前記式においてＷはＣＯ又はＣＨＯＲ１であり、ＸはＮ２、ＮＨＲ２、ＯＲ２、ＳＲ２、ＳｅＲ２、又はＴｅＲ２であり、前記Ｒ１及びＲ2はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０のアリール、Ｃ４〜Ｃ２０のヘテロアリール又は
2012507509.tif 000004
の中から選ばれ、前記ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ４であり、Ｚは単結合、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０のアリール又はＣ４〜Ｃ２０のヘテロアリールの中から選ばれ、ＭとＮはそれぞれ水素、ＯＨ又は存在せず、この時Ｍ又はＮに連結された炭素は他の炭素と単結合又は二重結合を形成し、各炭素における二重結合は一つ以下で形成される。
【００１５】
また、本発明は、（ａ）海綿動物Ｐｈｏｒｂａｓ ｓｐ.を切断して乾燥させた後、Ｃ１〜Ｃ４のアルコールで抽出する段階；
【００１６】
（ｂ）前記（ａ）の段階から得た抽出物を水と塩化メチレンを用いて分配させた後、有機層の溶媒を取り除き、またノルマルヘキサンと、メタノール及び水の混合溶液を用いて分類させる段階；及び
【００１７】
（ｃ）前記（ｂ）の段階から得たメタノール分液層の溶媒を取り除いた後、固定相としてシリカを用い、溶離液として溶離液の総重量に対して２０重量％以下の水を含むか含まないメタノール溶液を用い、クロマトグラフィーを行って分液を得る段階を含む前記化学式１の化合物の製造方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として、前記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする骨粗鬆症治療用の薬剤学的組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として、前記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする脂肪肝治療用の薬剤学的組成物を提供する。
【００２０】
また、本発明は、薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として、前記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする肥満治療用の薬剤学的組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として、前記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする肝臓‐Ｘ‐受容体（ＬＸＲ）拮抗用の薬剤学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の化学式１の化合物は、大変優れた造骨細胞の分化能を有するため、骨粗鬆症の治療に画期的な役割を果たすことが期待される。また、前記化学式１の化合物は、肝臓‐Ｘ‐受容体（ＬＸＲ）に対して強い拮抗作用を示し、肝臓における脂肪生合成及び脂肪吸収を抑制するため、脂肪肝の治療にも大変効果的に用いられることが期待される。また、前記化学式１の化合物は優れた脂肪細胞の分化抑制能を有するため、肥満治療にも大変効果的に用いられることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、（ａ）ＣＯＳＹ実験から得た水素との相関性（太い線）とＨＭＢＣ相関性（矢印は水素核における炭素核との相関結合を示す）を図示したものであり、（ｂ）本発明の化合物１〜４の構造を図示したものである。
【図２】図２は、本発明の化合物１及び２が示す円二色性スペクトルである。
【図３】図３は、本発明の抽出分液１１６Ｖと化合物１乃至４の造骨細胞分化能の測定結果を示した写真である（試験例１）。
【図４】図４は、本発明の化合物１乃至４でＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株を六日間処理した後、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）を通じて造骨細胞の分化マーカー（Ｒｕｎｘ２，Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ，Ｍｓｘ２等）の転写程度を確認した結果を示すＲＴＰＣＲデータである（試験例１）。
【図５】図５は、本発明の化合物１乃至４でＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株を六日間処理した後、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）を通じて造骨細胞の分化マーカーであるＴＡＺのタンパク質発現を確認したウェスタンブロットデータである（試験例１）。
【図６】図６は、本発明の化合物１乃至４でＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株を六日間処理した後、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）を通じて造骨細胞の分化マーカーであるＴＡＺ及びＲｕｎｘ２のタンパク質発現を確認したウェスタンブロットデータである（試験例１）。
【図７】図７は、前記試験例１で実施した本発明の化合物５の造骨細胞分化能の測定結果を示した写真である。
【図８】図８は、前記試験例２で実施した本発明の抽出分液１１６Ｖと化合物１乃至４の脂肪細胞（Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２）分化能の測定結果を示した写真である。
【図９】図９は、前記試験例２で実施した本発明の化合物１の脂肪細胞（３Ｔ３‐Ｌ１）分化抑制能の測定結果を示した写真である。
【図１０】図１０は、前記試験例３で実施した本発明の化合物１のＬＸＲ核受容体の拮抗活性の測定結果を示したグラフである。
【図１１】図１１は、前記試験例３で実施した本発明の化合物１の各種の核受容体に対する選択活性の測定結果を示したグラフである。
【図１２】図１２は、前記試験例３で実施した本発明の化合物１のＬＸＲ核受容体のタンパク質に対する直接結合の測定結果を示したグラフである。
【図１３】図１３は、試験例４で実施した本発明の化合物１のマウスの脾臓細胞に対する細胞毒性の測定結果を示したグラフである。
【図１４】図１４は、前記試験例５で実施した本発明の化合物１の肝細胞（ＡＭＬ１２及びＨｅｐＧ２細胞）における遺伝子発現調節機能の測定結果を示したグラフである。
【図１５】図１５は、前記試験例６で実施した本発明の化合物１のマウスへの投与実験において、投与期間の間、処理群及び対照群間の体重変化を示したグラフである。
【図１６】図１６は、前記試験例６で実施した本発明の化合物１の疾患動物モデルにおける脂肪肝抑制効能の結果を示したグラフ及び写真である。
【図１７】図１７は、前記試験例６で実施した本発明の化合物１の疾患動物モデルにおける効能の立証後、この動物モデルにおいて化合物１により現れる遺伝子発現調節効能の測定結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、新規な下記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内における加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩に関するものである。 
【００２５】
［化学式１］
2012507509.tif 000005
【００２６】
前記式においてＷはＣＯ又はＣＨＯＲ１であり、ＸはＮ３、ＮＨＲ２、ＯＲ２、ＳＲ２、ＳｅＲ２、又はＴｅＲ２であり、Ｒ１及びＲ2はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０のアリール、Ｃ４〜Ｃ２０のヘテロアリール又は
2012507509.tif 000006
の中から選ばれ、前記ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ４であり、Ｚは単結合、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０のアリール又はＣ４〜Ｃ２０のヘテロアリールの中から選ばれ、ＭとＮはそれぞれ水素、ＯＨ又は存在せず、この際Ｍ又はＮに連結された炭素は他の炭素と単結合又は二重結合を形成し、各炭素における二重結合は一つ以下で形成される。
【００２７】
前記化学式１の化合物は、国内で生息する海綿動物Ｐｈｏｒｂａｓ ｓｐ.の抽出物（ＫＮＵＥ１１６）から分離されたり、前記の分離された化合物を出発物質として合成できるものであり、スピロキラル（ｓｐｉｒｏ  ｃｈｉｒａｌ）炭素骨格を有する新規化合物である。前記化学式１の化合物は造骨細胞分化を画期的に促進し、脂肪細胞の分化能を顕著に抑制し、肝臓における脂肪生成及び脂肪吸収を抑制するため、骨粗鬆症の治療、脂肪肝治療及び肥満治療に画期的な役割を果たすと期待される。
【００２８】
前記化学式１の化合物を具体的に例示すると次のとおりである：
【００２９】
2012507509.tif 000007
2012507509.tif 000008
【００３０】
前記化学式において、Ｘ１は、Ｎ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ又はＴｅＨであり、
【００３１】
Ｘ２は、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであり、
【００３２】
Ｚは、単結合、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであり、
【００３３】
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０のアリール、Ｃ４〜Ｃ２０のヘテロアリール又は
2012507509.tif 000009
であり、
【００３４】
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０のアリール、又はＣ４〜Ｃ２０のヘテロアリールである。
【００３５】
前記化学式１の化合物のうち、より好ましい化合物としては、前記ＷはＣＯ又はＣＨＯＲ１であり、ＸはＮ３、ＮＨＲ２、ＯＲ２、ＳＲ２、ＳｅＲ２又はＴｅＲ２であり、前記Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル又は
2012507509.tif 000010
の中から選ばれ、前記ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ４であり、Ｚは単結合、ＮＨ、Ｏ又はＳであり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニルの中から選ばれ、ＭとＮはそれぞれ水素、ＯＨ又は存在せず、この際Ｍ又はＮに連結された炭素は他の炭素と単結合又は二重結合を形成し、各炭素における二重結合は一つ以下で形成される化合物が挙げられる。
【００３６】
前記化学式１の化合物のうち、より好ましい化合物としては、ＷはＣＯ又はＣＨＯＲ１であり、ＸはＮ３、ＯＲ２、又はＳＲ２であり、前記Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニル又は
2012507509.tif 000011
の中から選ばれ、前記ＹはＯ又はＳであり、Ｚは単結合であり、Ｒ３は水素、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖又は分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ８のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８のアルキニルの中から選ばれ、ＭとＮはそれぞれ水素、ＯＨ又は存在せず、この際Ｍ又はＮに連結された炭素は他の炭素と単結合又は二重結合を形成し、各炭素における二重結合は一つ以下で形成される化合物が挙げられる。
【００３７】
前記化学式１の化合物をより具体的に例示すると次のとおりである。
【００３８】
2012507509.tif 000012
2012507509.tif 000013
【００３９】
また、本発明は、前記化学式１の化合物の製造方法を提供する。
【００４０】
本発明の製造方法は、
【００４１】
（ａ）海綿動物Ｐｈｏｒｂａｓ ｓｐ.を切断して乾燥させた後、Ｃ１〜Ｃ４のアルコールで抽出する段階；
【００４２】
（ｂ）前記（ａ）の段階から得た抽出物を水と塩化メチレンを用いて分配させた後、有機層の溶媒を取り除き、またノルマルヘキサンと、メタノール及び水の混合溶液を用いて分配させる段階；及び
【００４３】
（ｃ）前記（ｂ）の段階から得たメタノール分液層の溶媒を取り除いた後、固定相としてシリカを用い、溶離液として溶離液の総重量に対して２０重量％以下の水を含むか含まないメタノール溶液を用い、クロマトグラフィーを行って分液を得る段階を含む。
【００４４】
また、前記製造方法は、前記（ｃ）の段階の後、（ｄ）前記（ｃ）の段階から得た分液を精製する段階をさらに含むことができる。
【００４５】
前記（ａ）の段階において、乾燥は凍結乾燥の方式を用いるのが好ましく、Ｃ１〜Ｃ４のアルコールのうち、メタノールを用いるのが好ましい。また、抽出は室温で行うことができ、２時間以上行うのが好ましい。
【００４６】
前記（ｂ）の段階において、前記メタノールと水の混合溶液は、溶液の総重量に対してメタノール６０〜９０重量％と水１０〜４０重量％を含むことが好ましい。
【００４７】
前記（ｃ）の段階においては、逆相のフラッシュクロマトグラフィーを行うのが好ましく、溶離液として総重量に対して２０重量％以下の水を含むか含まないメタノール溶液を用いる前に、それより極性の高い水とメタノールの混合溶液を溶離液として用い、高い極性有する溶離液から低い極性を有する溶離液の順に１回以上のクロマトグラフィーを行うのが好ましい。特に、前記溶離液としては、水とメタノールの混合液を用いるのが好ましい。
【００４８】
前記（ｄ）の段階における精製は、高性能の液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｐｈａｓｅｄ  ｓｅｍｉｐｒｅｐ  ＨＰＬＣ）により行うことができ、溶離液としては溶離液の総重量に対してアセトニトリル（ＡＣＮ）５０〜８０重量％と水２０〜５０重量％の混合液を用いるのが好ましい。
【００４９】
一方、本発明の化学式１の化合物は、前記のような方法により分離された化合物を出発物質として、エステル反応、アジド置換反応、エーテル化反応等の方法により合成され得る。
【００５０】
本発明は、また、薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として、前記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする骨粗鬆症治療、脂肪肝治療及び肥満治療用の薬剤学的組成物に関するものである。
【００５１】
本発明は、また、薬剤学的に許容できる担体及び活性成分として、前記化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩を含むことを特徴とする肝臓‐Ｘ‐受容体（ＬＸＲ）拮抗用の薬剤学的組成物を提供する。
【００５２】
前記薬剤学的組成物において薬剤学的に許容できる担体は、薬剤投与に利用できるビヒクル又は媒体であり、本分野において通常使用されるものを制限なく使用することができる。例えば、溶媒、分散媒、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等が挙げられる。 
【００５３】
本発明の薬剤学的組成物は、通常の方法により、散剤、粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口剤、外用剤、座剤、滅菌注射溶液等の形に剤形化され得る。
【００５４】
本発明の化学式１の化合物、その立体異性体、その鏡像異性体、生体内で加水分解可能なその前駆体又は薬剤学的に許容できるその塩の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路及び期間により異なるが、当業者によって適切に選択することができる。例えば、１日に０．０１ｍｇ／ｋｇ乃至２００ｍｇ／ｋｇに投与することができる。投与は一日一度投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。従って、前記投与量はどのような面からみても発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
本発明の薬剤学的組成物は、ラット、マウス、家畜、人間等の哺乳動物に様々な経路で投与できる。既存に知られている投与の全ての方式が適用できるが、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内膜又は脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射により投与することができる。
【００５６】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明は下記の実施例により限定されず、多様に修正及び変更することができる。
【実施例１】
【００５７】
新規化合物の分離及び精製 
国内に生息する海綿動物Ｐｈｏｒｂａｓ ｓｐ.をスキューバダイビングで採集した後、約１０ｃｍ以下の大きさに切断し、三日間凍結乾燥させて乾燥重量として約１ｋｇを準備した。乾燥生物にメタノール３．０Ｌを加え、室温で二日間計２回に分けて抽出した。前記抽出物は、水と塩化メチレン溶媒を用いて分配した後、減圧濃縮により有機層から溶媒を取り除いた後、またノルマルヘキサンとメタノール８５重量％及び水１５重量％の混合溶液を用いて分配した。このうち８５重量％のメタノール分液層から溶媒を取り除いた後、約５ｇの分液を得た。これらの分液を対象に逆相シリカフラッシュクロマトグラフィーを行った。この際、固定相は、逆相シリカＣ１８を用い、溶離液は高い極性から低い極性の溶媒の順に使用した。その順序は、５０％水／５０％メタノール、４０％水／６０％メタノール、３０％水／７０％メタノール、２０％水／８０％メタノール、１０％水／９０％メタノール、１００％メタノール、１００％アセトンがあった。各層に該当する物質を対象に造骨細胞の分化能を測定した結果、１０％水／９０％メタノール分液（１１６Ｖ）と１００％メタノール分液（１１６VI）においてその効能を確認し、二つの分液をそれぞれ１ｇ内外に得た。
【００５８】
活性を有した二つの分液に対して化合物を精製するために、高性能の液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｐｈａｓｅｄ  ｓｅｍｉｐｒｅｐ  ＨＰＬＣ）を行った。先ず、分液１１６Ｖに対して次のような条件でクロマトグラフィーを行い、化合物１、９及び１０を得た。
【００５９】
[カラム：ＹＭＣ  ＯＤＳＣ１８、粒径：５μｍ、カラムの大きさ：２５０×１０ｍｍ（長さ×直径）、溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：屈折率検出器、溶離液：６５重量％アセトニトリル（ＡＣＮ）と３５重量％の水混合液]
【００６０】
この分液５０ｍｇを注入したとき、保持時間３３分（化合物１）、１５分（化合物９）、４０分（化合物１０）程度で、オレンジ色のオイル状の成分が、それぞれ約２５ｍｇ、１．５ｍｇ、１．０ｍｇに分離された。次の分液１１６VIに対しても同じＨＰＬＣを用いたが、追加的な成分を分離するために展開溶媒の条件を異にした。この場合には、７０重量％アセトニトリルと３０重量％の水の混合液を使用した。１回の総展開時間は１時間３０分程度かかり、そのうち１時間１０分ごろ、オレンジ色のオイル状の化合物２、１時間４０分ごろ化合物３、最後に、１時間５７分ごろ化合物４が分液５ｍｇを１回を注入した際、それぞれ０．５ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．００４ｍｇの量に分離精製され、取得された。
【実施例２】
【００６１】
新規化合物の化学構造の分析
前記分液１１６Ｖと１１６VIから得た化合物１‐４また９、１０に対して、先ず、水素核磁気共鳴分光法で測定し、純度を検査した後、次のような機器を用いて分光学的なデータを得た。先ず、各化合物に対する分子量を測定するために、質量分析器（Ｊｅｏ社のＪＭＳ７００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用い、精密な化学構造の分析は、核磁気共鳴分光器（Ｖａｒｉａｎ社のＶＮＭＲＳ５００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を活用して行われた。その他の分子の紫外線吸収帯及び赤外線吸収帯の測定のために、Ｖａｒｉａｎ社のＣａｒｙ５０とＪＡＣＳＯ社のＦＴ＿ＩＲ４１００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒをそれぞれ用い、偏光角はＪＡＣＳＯ社のＰ１０１０偏光器を用いた。
【００６２】
化合物１は淡いオレンジ色のオイル状に分離され、高性能のＦＡＢ質量分析データ（[Ｍ＋Ｈ]＋ｍ／ｚ３９９．２５３３）から前記化合物１を分子式がＣ２５Ｈ３４Ｏ４であることが確認された。赤外線スペクトル分析による特徴的な吸収帯が３４３３ｃｍ−１と１６８０ｃｍ−１から現れるため、前記化合物１は水酸基と、カルボニル官能基を有していることが推定された、また、Ｃ１３ＮＭＲとＨＮＭＲにより化合物の構造を明らかにした。
【００６３】
前記化合物１に対する化学シフト値は下記の表１に整理した。
【００６４】
【表１】
2012507509.tif 000014
2012507509.tif 000015
【００６５】
一方、この化合物に対する相対的な立体構造を決定するために、ＲＯＥＳＹ実験を行った。特に、４．４９ｐｐｍと２．５９ｐｐｍにある二つの水素間のＮＯＥから鎖ＡとＢがｃｉｓ状に連結されており、５．２８ｐｐｍにある水素は５．５４ｐｐｍと２．４３ｐｐｍの二つの水素とのＮＯＥ情報から鎖Ｃの立体的な配向を決定することができた。
【００６６】
最後に、１６番の炭素に結合した水素の空間的配向は、隣の水素間の対相関関数（１１.３、７.８、３．４Ｈｚ）から推定することができ、また、１９番のメチル水素が、５番また６番水素とのＮＯＥ関係を有しているため、これを間接的に証明している。
【００６７】
化合物１の絶対的立体化学構造は、円二色性スペクトル（ＣＤ）分析を通じて決定された。シクロヘキサノン内のキラル中心の絶対立体配向は、Ｓｎａｔｚｋｅの区域法則（ｓｅｃｔｏｒ  ｒｕｌｅ）によって決定された。鎖Ａのシクロヘキサノンにある７番炭素のキラル中心がＳの絶対立体配向を有する場合、化合物１は円二色性スペクトルのｎπ＊転移領域（３３０ｎｍ、３５０ｎｍ）において正の吸光を示す。化合物１は３３０ｎｍ３５０ｎｍにおいて正の吸光を示し、これを通じて前記化合物１乃至７番炭素周りの絶対立体配向をＳに決定した（図２）。
【００６８】
他の五つの化合物に対しても前記のような方法で化学構造を解釈した。三つの化合物に対するそれぞれの炭素ＮＭＲデータと水素ＮＭＲデータは、下記の表２乃至４にそれぞれ示し、その他の物理的及び分光的データは、表５に整理した。
【００６９】
【表２】
2012507509.tif 000016
2012507509.tif 000017
【００７０】
【表３】
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【００７１】
【表４】
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2012507509.tif 000021
【００７２】
【表５】
2012507509.tif 000022
【実施例３】
【００７３】
化合物Ｉのエステル化反応誘導体の合成
2012507509.tif 000023
【００７４】
本発明の化合物１をテトラヒドロフランに溶かした。温度を０〜５℃に下げた後、ジイソプロピルエチルアミンとブチリルクロライドを順に添加した。０〜５℃で１時間攪拌した後、エチルアセテートと水を添加して抽出し、有機溶媒層を分離して蒸留した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｆｌａｓｈ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製し化合物５を得た。
【００７５】
化合物５（Ｃ２９Ｈ４１Ｏ５）の[Ｍ＋Ｈ]＋＝４６９.２９
【実施例４】
【００７６】
化合物１アジド置換反応誘導体の合成
2012507509.tif 000024
【００７７】
本発明の化合物１を塩化メチレンに溶かした後、０〜５℃に温度を下げた。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルピリジンとトリフルオロメタンスルホン無水物を順に添加し、３０分間攪拌した。塩化メチレンと水を添加して抽出した後、有機溶媒層を分離して蒸留した。溶媒を全て飛ばした後、ジメチルホルムアミドに再度溶かした。アジ化ナトリウムを添加した後、３時間の間常温にて攪拌し、塩化メチレンを添加して希釈させた後、水で何度も洗浄した。有機溶媒層を分離して蒸留した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｆｌａｓｈ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製し化合物６を得た。
【００７８】
化合物６（Ｃ２５Ｈ３４Ｎ３Ｏ３）の[Ｍ＋Ｈ]＋＝４２４.２６
【実施例５】
【００７９】
化合物１のエーテル誘導体の合成
2012507509.tif 000025
【００８０】
本発明の化合物１とジ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルピリジンを塩化メチレンに溶かした。メタントリフルオロスルホン酸塩を添加した後、常温にて３時間攪拌した。溶媒を飛ばした後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｆｌａｓｈ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製し化合物７を得た。
【００８１】
化合物７（Ｃ２６Ｈ３７Ｏ４）の[Ｍ＋Ｈ]＋＝４１３.２７
【実施例６】
【００８２】
化合物１の炭酸塩誘導体の合成
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【００８３】
本発明の化合物１を塩化メチレンに溶かした後、温度を０〜５℃に下げた。ピリジンとクロロギ酸ビニルを順に添加した後、常温にて１時間攪拌した。塩化メチレンで希釈した後、水で洗浄した。有機溶媒層を分離して蒸留した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｆｌａｓｈ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製し化合物８を得た。
【００８４】
化合物８（Ｃ２８Ｈ３７Ｏ６）の[Ｍ＋Ｈ]＋＝４６９.２６
【００８５】
［試験例１］新規化合物に対する造骨細胞の形成能測定（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）
【００８６】
ＡＴＣＣから購入したマウスの間葉前駆細胞であるＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２を５．９５８ｇ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、３.７ｇ／Ｌ重曹（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地に希釈し、２４ウェル培養皿に４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にして３７℃、５％ＣＯ２の存在下で二日間培養した。培養された細胞が培養皿に９０〜１００％に育つと、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、１０ｍＭ βグリセロリン酸塩（βｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５０μ／ｍｌアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の存在下で六日間培養して造骨細胞への分化を誘導した。また、分化する間、培地は二日に一度ずつ変更した。造骨細胞への分化を誘導したＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で一回洗浄し、７０％エタノールで２０℃にて一時間固定させた。固定が終わった細胞を冷たいＰＢＳで３度洗浄し、４０ｍＭ  Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ染色溶液で常温にて２０分間染色した。造骨細胞に分化された細胞のみを選択的に観察するために、染色液を取り除き、蒸留水で３度洗浄した。
【００８７】
海綿で抽出、分配した分液（１１６Ｖ）と分液（１１６VI）をＤＭＳＯ溶液に溶かした後、 間葉前駆細胞であるＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株に１、２.５、５、１０、２０ｕｇ／ｍｌの濃度で処理した結果、濃度依存的に顕著に増加した造骨細胞分化能を示し、２０ｕｇ／ｍｌの濃度においては弱い細胞毒性が観察された。その後、分液１１６Ｖと１１６VIを純粋に分離した化合物１（１１６３）、化合物２（１１６２）、化合物３（１１６１）及び化合物４（１１６４）に対して同一の実験を行った結果、化合物１、３及び４で増加した造骨細胞の分化能が確認できた。最大活性を示す濃度は少ずつ相違した。化合物３（１１６‐１）２．５μｇ／ｍｌで最大活性を示し、その後の濃度では細胞毒性が観察できた。化合物１（１１６‐３）は純粋に分離されていない分液（１１６Ｖ）の活性と類似に、濃度依存的に１０μｇ／ｍｌの濃度まで顕著に増加した活性を示し、２０μｇ／ｍｌの濃度において細胞毒性を示した。化合物４は、５μｇ／ｍｌ濃度において最大活性を示した後、その以上では細胞毒性が観察された（図３）。造骨細胞の分化能を示す作用機構に対する研究のために、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株を化合物１及び化合物４でそれぞれ六日間処理した後、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）を通じて造骨細胞の分化マーカー（Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、Ｍｓｘ２等）の転写程度が顕著に増加することを究明した（図４）。また、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株を化合物１及び化合物４でそれぞれ六日間処理した後、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）を通じてＲｕｎｘ２とＴＡＺのタンパク質発現が増加することを確認した（図５及び６）。従って、本発明の化合物はＲｕｎｘ２とＴＡＺタンパク質の転写後、調節段階を通じてその量的増加が行われ、これを通じて造骨細胞の分化が促進され得るということが分かった。また、これとともに、化合物の処理を通じてＴＡＺとＲｕｎｘ２との結合が増加し、これに伴うＲｕｎｘ２を媒介とした転写活性の増加が確認できた。より生理活性の良い物質を形成するために、化合物１（１１６３）のエステル誘導体である化合物５を合成し、このように形成された化合物５の構造もまた究明した。さらに形成された誘導体の生理活性（造骨細胞の分化能）をカルシウム沈着分析（ｃａｌｃｉｕｍ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を通じて確認した結果、化合物１の誘導体である化合物５もまた類似した程度で造骨細胞の分化を促進することが確認された（図７）。従って、本発明の化合物及びこれらの誘導体は、造骨細胞の分化を促進することにより骨粗鬆症の治療に画期的な役割を果たすことが期待される。
【００８８】
［試験例２］新規化合物に対する脂肪細胞分化抑制能の測定
【００８９】
ＡＴＣＣから購入したマウスの間葉前駆細胞であるＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞を５．９５８ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、３.７ｇ／Ｌ重曹（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地に希釈し、２４ウェル培養皿に４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にして３７℃、５％ＣＯ２の存在下で二日間培養した。培養された細胞が培養皿に９０〜１００％に育つと、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に５μ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ）、５μＭトログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の存在下で八日間培養して脂肪細胞の分化を誘導した。また、分化する間、培地は二日に一度ずつ変更した。脂肪細胞に分化を誘導したＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株を３．７％ホルムアルデヒドで常温にて３０分間固定させた。イソプロパノールに０．５％になるように溶かしたＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ溶液を６：４の割合で蒸留水に希釈し、０．２μｍのフィルタでろ過させ、固定された細胞株に分株けし、常温にて一時間の間染色した。脂肪細胞に分化された細胞のみを観察するために、染色液を取り除き、蒸留で二度洗浄した。
【００９０】
海綿で抽出した１１６Ｖ試料をＤＭＳＯ溶液に溶かした後、間葉前駆細胞であるＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞株に１、２.５、５、１０、２０μｇ／ｍｌの濃度で処理した結果、濃度依存的に顕著に減少された脂肪細胞の分化能を示した。その後、１１６Ｖと１１６VIの試料を純粋に分離した化合物１（１１６３）、化合物２（１１６２）、化合物３（１１６１）及び化合物４（１１６４）の試料を確保した後、同一の実験を行った結果、同一の１０μｇ／ｍｌの濃度において顕著に減少された脂肪細胞の分化能が確認できた。特に、化合物１（１１６‐３）試料は、低濃度（１μｇ／ｍｌ）においても他の試料と比較して顕著な脂肪細胞の分化抑制能を示した。脂肪細胞の分化過程において各試料から顕著な細胞毒性は観察されなかった（図８）。化合物１は、３Ｔ３‐Ｌ１細胞に対する効能検証の結果、この細胞においても大変優れた脂肪細胞分化抑制能を示した（図９）。
【００９１】
［試験例３］新規化合物に対する肝臓‐Ｘ‐受容体（ＬＸＲ）拮抗効能及び選択性の測定
【００９２】
トランスフェクション検索には、動物細胞株ＣＶ‐１を用いた。細胞は、５％の二酸化炭素が含まれた３７℃細胞培養器からＤＭＥＭ培地に培養された。培地には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンまた１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが含まれた。実験最初の日、ＣＶ‐１細胞を９６ウェル（ｗｅｌｌ）プレート（ｐｌａｔｅ）に５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種した。二日目に接種された細胞にＧＡＬ‐ｈＬＸＲを発現するプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミドまた、β-ガラクトシダーゼを発現するプラスミドをトランスフェクション試薬であるＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてトランスフェクションした。１６時間後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶けている化合物１を効能剤であるＴＯ９０１３１７（２．５μＭ）とともにトランスフェクションされた細胞に濃度別に処理した。陰性対照群としてはジメチルスルホキシドを最終濃度１％になるように処理した。陽性対象群としてはＴＯ９０１３１７を最終濃度５００ｎＭになるように処理した。２４時間培養した後、細胞溶解試薬（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて細胞を溶解し、照度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）でルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を添加してルシフェラーゼ活性を測定した。β-ガラクトシダーゼ活性はＯＮＰＧ試薬を添加した後、 ＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ）で測定された。測定されたルシフェラーゼ数値をβ-ガラクトシダーゼ活性数値に補正した。この実験の結果、化合物１はＬＸＲα及びβに対してそれぞれＩＣ５０値１８.７及び２０.４ｎＭを示した（図１０）。また、様々な核受容体に対する選択性を測定するために、同一の方法にて各種の核受容体に対する活性を測定した。しかし、化合物１は他の核受容体に対しては全く活性を示さなかった（図１１）。また、化合物１はＢｉａｃｏｒｅ実験を通じてＬＸＲタンパク質に直接結合することを立証した（図１２）。
【００９３】
［試験例４］新規化合物に対する細胞毒性の測定
【００９４】
マウスの脾臓細胞を正常細胞における毒性を測定することに用いた。マウスの脾臓細胞は、次のように準備された。５〜６週齢のマウスから脾臓を取り出して細かく刻んだ後、１００μｍの孔の大きさを有する網を通して浮遊された脾臓細胞のみをろ過した。脾臓細胞と混ざっている赤血球は赤血球溶解試薬を用いて溶解させた後、細胞を遠心分離し沈殿させて洗浄する過程を通じて取り除いた。準備された脾臓細胞は、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェル（ｗｅｌｌ）プレート（ｐｌａｔｅ）に接種した。この際、毒性測定を行おうとする化学式１の化合物で、濃度別に分離された脾臓細胞を処理した。次の日、１６〜１８時間の間培養された細胞に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を処理した後、１０分後に照度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で細胞の生存率を測定した。化合物１はマウスの脾臓細胞に対して細胞毒性ＩＣ５０値は６３μＭを示し、ＬＸＲに対する拮抗濃度に比べて１，０００倍以上高い値を示していることで正常細胞に対する細胞毒性はほとんどないことが判明された（図１３）。
【００９５】
［試験例５］新規化合物に対する肝細胞における遺伝子発現機能の確認
【００９６】
開発された肝臓‐Ｘ‐受容体拮抗剤の効能を確認するために、マウス及び人間の肝細胞における遺伝子発現調節機能を確認した、本実験においては、マウスの肝細胞であるＡＭＬ１２細胞と、人間の肝細胞であるＨｅｐＧ２細胞が用いられた。ＡＬＭ１２細胞は５％の二酸化炭素が含まれた３７℃の細胞培養器からＤＭＥＭ培地に培養された。培地には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンまた１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが含まれた。実験最初の日、ＡＭＬ１２細胞を６ウェル（ｗｅｌｌ）プレート（ｐｌａｔｅ）に接種した。二日目に８０％程度育った細胞の培地を血清が含まれていないＤＭＥＭ培地に交換した後、ＴＯ９０１３１７と開発された肝臓‐Ｘ‐受容体拮抗剤を処理群当り３つのｗｅｌｌに処理した。陰性対照群としては、ジメチルスルホキシドを最終濃度０.２％になるように処理し、陽性対照群としてはＴＯ９０１３１７を最終濃度５００ｎＭになるように処理した。拮抗剤の効能を知るために開発された化合物１を１μＭの濃度で単独処理したり、５００ｎＭのＴＯ９０１３１７とともに処理した。１８時間培養した後、肝細胞の全てのＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。抽出されたＲＮＡは定量してｃＤＮＡ合成に各サンプル当り１μｇずつ使用した。ｃＤＮＡの合成にはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。合成された肝細胞のｃＤＮＡはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を通じて遺伝子分析が行われた。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のために合成されたｃＤＮＡにＡＣＣＩ又はＡｃｔｉｎ遺伝子に選択的なプライマーとＱｕａｎｔｉＴｅｃｈ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）を混合した。ポリメラーゼ連鎖反応は、９５度１０秒、６０度１５秒、また７２度２０秒の反応を４５回繰り返して行った。全てのｃＤＮＡサンプルはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで反応を行った。各遺伝子の処理群当り発現量の比較のために、各サンプル当りのＣｔ値をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の分析ソフトウェアを用いて得た。各処理群当りのＣｔ値は陰性対照群のＣｔ値と比較され、遺伝子発現量の差が計算された。各処理群当りの関心がある遺伝子の発現量の差は、ＧＡＤＰＨ遺伝子発現量の差で補正された。この実験の結果、化合物１は、脂肪肝発病の原因となる脂肪酸生合成遺伝子ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＡＣＣ及びＦＡＳの発現を大変効果的に抑制すると判明された（図１４）。
【００９７】
［試験例６］新規化合物に対する実験動物モデルにおける脂肪肝の抑制効能の測定
【００９８】
本発明で開発された化合物１の脂肪肝の抑制効能を検証するために、Ｃ５７ＢＬ／６背景のマウスで実験が行われた。１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを一般飼料を与えながら脂肪肝を発生させるＴ０９１３１７物質を投与し、脂肪肝モデルを構築した。化合物１による脂肪肝抑制効能は、この化合物を経口投与して観察した。陰性対照群としては、薬物伝達体である０.７５％カルボキシメチルセルロースのみを与えたマウスが用いられ、陽性対照群としては、Ｔ０９０１３１７物質のみを与えたマウスが用いられた。また、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓の遺伝子発現を分析するために、陰性対照群、陽性対照群及び処理群のマウスの肝臓を摘出し、Ｔｒｉｚｏｌを用いてＲＮＡを得た。得られたＲＮＡは、吸光分光計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて定量化され、各グループ間の同一の量のＲＮＡからｏｌｉｇｏ  ｄＴとｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いたＲＴ−ＰＣＲ方法を通じてｃＤＮＡが得られた。グループ間のｍＲＮＡ変化を分析するために得られたｃＤＮＡをｔｅｍｐｌａｔｅにし、脂肪合成と肝臓への脂肪流入に関する遺伝子（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）のプライマーを用いるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応が行われた。この実験の結果、化合物１は脂肪肝が誘導されたマウスに投与する際、処理群と対象群との間に体重の差はなく、実験動物モデルにおいても大変優れた脂肪肝抑制効能を示した（図１５及び１６）。また、遺伝子発現を分析した結果、脂肪肝発病の原因となる脂肪酸生合成遺伝子と肝臓に脂肪を移送するトランスポータの遺伝子発現を大変効果的に抑制すると判明された（図１７）。従って、本発明の化合物及びこれらの誘導体は、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝、ウイルス感染による脂肪肝の治療に大変画期的な役割をすることが期待される。
【図１０】
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【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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