(57)【要約】本発明は、細胞培養系において高レベルの感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子を産生する新規方法を提供する。培養細胞中で完全なウイルスサイクルを受けることのできるＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス（世界の大半の地域において肝疾患に主に関連している）を入手できることは、ＨＣＶの処置のための新規療法の発見および開発にとって有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
適応的突然変異Ｑ１０６７Ｒ、Ｖ１６５５Ｉ、Ｋ１６９１Ｒ、Ｋ２０４０Ｒ、Ｓ２２０４Ｉを含む複製能を有するＨＣＶ遺伝子型１型のポリヌクレオチドを用いて、培養細胞をトランスフェクションすること；
２〜１０％のヒト血清の存在下においてトランスフェクションされた培養細胞をインキュベーションすること；
感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子を含むトランスフェクションされた培養細胞からの培地を回収すること
を含む、培養細胞中の感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子の産生を増加させるための方法。
【請求項２】
トランスフェクションされた培養細胞が、Ｈｕｈ−７細胞系に由来する、請求項１の方法。
【請求項３】
トランスフェクションされた培養細胞を１０％ヒト血清の存在下においてインキュベーションする、請求項１または請求項２の方法。
【請求項４】
適応的突然変異Ｑ１０６７Ｒ、Ｖ１６５５Ｉ、Ｋ１６９１Ｒ、Ｋ２０４０Ｒ、Ｓ２２０４Ｉを含み、そしてＨＣＶ遺伝子型１型の感染被験体の試料に由来するＮＳ５Ｂポリヌクレオチド配列をさらに含む、複製能を有するＨＣＶ遺伝子型１型ポリヌクレオチドを用いて、培養細胞をトランスフェクションすること；
２〜１０％のヒト血清の存在下においてトランスフェクションされた培養細胞をインキュベーションすること；
感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子を含むトランスフェクションされた培養細胞からの培地を回収すること
を含む、培養細胞中の感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子の産生を増加させるための方法。
【請求項５】
トランスフェクションされた培養細胞が、Ｈｕｈ−７細胞系に由来する、請求項４の方法。
【請求項６】
トランスフェクションされた培養細胞を１０％ヒト血清の存在下においてインキュベーションする、請求項４または請求項５の方法。
【請求項７】
適応的突然変異Ｑ１０６７Ｒ、Ｖ１６５５Ｉ、Ｋ１６９１Ｒ、Ｋ２０４０Ｒ、Ｓ２２０４Ｉを含む複製能を有するＨＣＶ遺伝子型１ａ型のポリヌクレオチドを用いて、培養細胞をトランスフェクションすること；
２〜１０％のヒト血清の存在下においてトランスフェクションされた培養細胞をインキュベーションすること；
感染性ＨＣＶ遺伝子型１型のウイルス粒子を含むトランスフェクションされた培養細胞からの培地を回収すること；
ＨＣＶ阻害活性についてスクリーニングされる分子の存在下または非存在下において、ネイティブな培養細胞を、感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子を用いて感染させること；および
前記分子の非存在下と比較して前記分子の存在下におけるＨＣＶレベルの減少が、前記分子がＨＣＶ遺伝子型１型阻害剤であることを示す、感染培養細胞中に存在するＨＣＶのレベルを測定すること
を含む、ＨＣＶ遺伝子型１型阻害剤についてのスクリーニング方法。
【請求項８】
複製能を有するＨＣＶ遺伝子型１型のポリヌクレオチドが、さらに、ＨＣＶ遺伝子型１型感染被験体の試料に由来するＮＳ５Ｂ配列を含む、請求項７の方法。
【請求項９】
トランスフェクションされた培養細胞および感染培養細胞が、Ｈｕｈ−７細胞系に由来する、請求項７または請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養液中において感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルスを産生する新規方法に関し、そして種々のＨＣＶ阻害剤をスクリーニング、試験および評価するのに有用である。
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は世界中で主要な健康問題であり、慢性肝疾患の主要原因である。(Boyer, N. et al. J. Hepatol. 2000 32:98-112)。ＨＣＶに感染した患者は、肝硬変および続く肝細胞癌を発症するリスクがあり、従って、ＨＣＶは肝移植の主要な適応症である。
【０００３】
世界保健機関によると、世界中に２億人を超える感染個体が存在し、毎年少なくとも３００万人から４００万人の人々が感染している。一旦感染すると、約２０％の人がウイルスを排除するが、残りの人は生涯ＨＣＶを保有し得る。慢性感染個体の１０〜２０％が最終的に肝破壊性の硬変または肝癌を発症する。ウイルス疾患は、汚染した血液および血液製剤、汚染針、または性的に、並びに感染母体もしくはキャリアー母体からその子孫へと垂直的に、非経口的に伝染する。ＨＣＶ感染のための現在の処置は、インターフェロン−α単独またはヌクレオシド類似体のリバビリンと組み合わせた免疫療法に限定され、これは特に遺伝子型１型に対して限定的な臨床的有益性しかない。慢性ＨＣＶ感染を効果的に治す改良された治療剤が緊急に必要とされる。
【０００４】
ＨＣＶは、フラビウイルス属、ペスチウイルス属、およびヘパシウイルス属（これはＣ型肝炎ウイルスを含む）を含む、フラビウイルス科のウイルスの一員として分類されている(Rice, C. M., Flaviviridae: The viruses and their replication, in: Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa., Chapter 30, 931-959, 1996)。ＨＣＶは、約９．４ｋｂのプラスのセンス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを含むエンベロープを有するウイルスである。ウイルスゲノムは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、約３０１１アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする長いオープンリーディングフレーム、および短い３’ＵＴＲからなる。５’ＵＴＲは、ＨＣＶゲノムの最も高度に保存された部分であり、そしてポリタンパク質の翻訳の開始および制御に重要である。
【０００５】
ＨＣＶの遺伝子解析は、ＤＮＡ配列の３０％超の相違を示す６つの主要な遺伝子型を同定した。各遺伝子型は、ヌクレオチド配列の２０〜２５％の相違を示す、一連のより密接に関連したサブタイプを含む(Simmonds, P. 2004 J. Gen. Virol. 85:3173-88)。３０を超えるサブタイプが識別されている。米国では感染個体の約７０％が１ａ型および１ｂ型の感染を有する。１ｂ型はアジアで最も広まっているサブタイプである。(X. Forns and J. Bukh, Clinics in Liver Disease 1999 3:693-716; J. Bukh et al., Semin. Liv. Dis. 1995 15:41-63)。残念なことに、１型感染は、２型または３型の遺伝子型のいずれよりも現行の療法に対して応答性がより低い(N. N. Zein, Clin. Microbiol. Rev., 2000 13:223-235)。
【０００６】
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＯＲＦの非構造タンパク質部分の遺伝子構成およびポリタンパク質プロセシングは非常に類似している。これらのプラス鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルス複製に必要な全てのウイルスタンパク質をコードする単一の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。これらのタンパク質は、成熟なウイルスタンパク質を生じるために、細胞性プロテイナーゼおよびウイルスによりコードされるプロテイナーゼの両方によって翻訳と同時におよび翻訳後にプロセシングされる、ポリタンパク質として発現される。ウイルスゲノムＲＮＡの複製に関与するウイルスタンパク質はカルボキシ末端の方に位置する。ＯＲＦの３分の２は非構造（ＮＳ）タンパク質と称される。ペスチウイルスおよびヘパシウイルスの両方について、成熟した非構造（ＮＳ）タンパク質は、非構造タンパク質コード領域のアミノ末端からＯＲＦのカルボキシ末端へと、順に、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂからなる。
【０００７】
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳタンパク質は、特異的なタンパク質の機能に特徴的である配列ドメインを共有する。例えば、両群のウイルスのＮＳ３タンパク質は、セリンプロテイナーゼおよびヘリカーゼに特徴的なアミノ酸配列モチーフを有する(Gorbalenya et al. Nature 1988 333:22; Bazan and Fletterick Virology 1989 171:637-639; Gorbalenya et al. Nucleic Acid Res. 1989 17.3889-3897)。同様に、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ５Ｂタンパク質は、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼに特徴的なモチーフを有する(Koonin, E. V. and Dolja, V. V. Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1993 28:375-430)。
【０００８】
ウイルスの生活環におけるペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳタンパク質の実際の役割および機能は、直接的に類似している。どちらの場合においても、ＮＳ３セリンプロテイナーゼは、ＯＲＦのその位置の下流におけるポリタンパク質前駆体の全てのタンパク質分解プロセシングに関与している(Wiskerchen and Collett Virology 1991 184:341-350; Bartenschlager et al. J. Virol. 1993 67:3835-3844; Eckart et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993 192:399-406; Grakoui et al. J. Virol. 1993 67:2832-2843; Grakoui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 90:10583-10587; Ilijikata et al. J. Virol. 1993 67:4665-4675; Tome et al. J. Virol. 1993 67:4017-4026)。どちらの場合においてもＮＳ４Ａタンパク質は、ＮＳ３セリンプロテアーゼの補因子として作用する(Bartenschlager et al. J. Virol. 1994 68:5045-5055; Failla et al. J. Virol. 1994 68: 3753-3760; Xu et al. J Virol. 1997 71:53 12-5322)。両方のウイルスのＮＳ３タンパク質もまたヘリカーゼとして作用する(Kim et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995 215: 160-166; Jin and Peterson Arch. Biochem. Biophys. 1995, 323:47-53; Warrener and Collett J. Virol. 1995 69:1720-1726)。最後に、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ５Ｂタンパク質は、予測されるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する(Behrens et al. EMBO 1996 15:12-22; Lechmann et al. J. Virol. 1997 71:8416-8428; Yuan et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997 232:231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong et al. J. Virol. 1998 72:9365-9369)。
【０００９】
現在、ＨＣＶ感染の処置に現在利用できる認可されている療法の数は限られている。ＨＣＶの処置およびＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害に対する新規および既存の治療アプローチが概説されている：R. G. Gish, Sem. Liver. Dis., 1999 19:5; Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. R., Scientific American, October: 1999 80-85; G. Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease, Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003 3(3):247-253; P. Hoffmann et al., Recent patents on experimental therapy for hepatitis C virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13(11):1707-1723; F. F. Poordad et al. Developments in Hepatitis C therapy during 2000-2002, Exp. Opin. Emerging Drugs 2003 8(1):9-25; M. P. Walker et al., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investig. Drugs 2003 12(8):1269-1280; S.-L. Tan et al., Hepatitis C Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1:867-881; R. De Francesco et al. Approaching a new era for hepatitis C virus therapy: inhibitors of the NS3-4A serine protease and the NS5B RNA-dependent RNA polymerase, Antiviral Res. 2003 58:1-16; Q. M. Wang et al. Hepatitis C virus encoded proteins: targets for antiviral therapy, Drugs of the Future 2000 25(9):933-8-944; J. A. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B-Dependent RNA Polymerase for Anti-HCV Chemotherapy Cur. Drug Targ.-Inf. Dis .2003 3:207-219。
【００１０】
ウイルスのゲノム構成およびウイルスタンパク質の機能の解明の進歩にも関わらず、ＨＣＶの複製および病態形成の基本的な局面は依然として分かっていない。ＨＣＶ複製に実験的なアクセスを得る際の主要な課題は、感染性ウイルス粒子の産生を可能とする効率的な細胞培養系がないことである。初代細胞培養および特定のヒト細胞系の感染は報告されているが、そうした系において産生されたウイルスの量およびＨＣＶ複製レベルは、詳細な分析を許容するには低すぎる。このことは、５つの細胞培養適応的突然変異の組合せを含むＨＣＶ ＲＮＡを使用した低いレベルの感染性遺伝子型１ａ型ウイルスの産生を詳述した近年の報告にも関わらず(Yi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006 103(7):2310-2315)、遺伝子型１ａ型のＨＣＶウイルス粒子については特に当てはまる。
【００１１】
２つのグループが、Ｈｕｈ−７ヒト肝臓癌細胞の高度に許容的な亜系統を使用した遺伝子型１ａ型の複製系の作製を報告した。Blight et al. (J. Virol. 2003 77:3181-3190)は、サブゲノムＣｏｎ１レプリコン（replicon）ＲＮＡを使用して選択された、Ｇ４１８耐性のサブゲノムＣｏｎ１レプリコンＲＮＡレプリコン樹立細胞系を、インターフェロン−αでの処置によって治療することによって作製された、超許容性のＨｕｈ−７の亜系統であるＨｕｈ−７．５において、遺伝子型１ａ型由来のサブゲノムレプリコンの複製を支持するＧ４１８耐性コロニーを選択することができた(Blight et al., J. Virol. 2002 76:13001-13014)。このような選択された細胞系の内側で複製しているＨＣＶ ＲＮＡの配列解析は、最も一般的な重要な突然変異が、ＮＳ３ヘリカーゼのドメインＩＩ内のＮＳ３のアミノ酸４７０位（Ｐ１４９６Ｌ）、およびＮＳ５Ａ突然変異（Ｓ２２０４Ｉ）に位置することを示した。別の場合では、Grobler et al. (J. Biol. Chem. 2003 278:16741-16746)が体系的な突然変異アプローチを使用して、Ｐ１４９６ＬおよびＳ２２０４Ｉの両方の組合せが、独立しているがしかし類似している様式で選択された高度に許容性のＨｕｈ−７亜系統において遺伝子型１ａ型の複製を得るのに必要であったという同様の結論に達した。しかしながら、これらの２つの増強された突然変異を有する遺伝子型１ａ型ＲＮＡはＨｕｈ−７細胞系中では複製を受けず、このことはこの系の限定的な有用性を示唆する。
【００１２】
本発明は、細胞培養系において感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子の産生を向上させるためにヒト血清を使用する驚くべき効果に基づく。培養細胞中で完全なウイルスサイクルを受けることのできるＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス（世界の大半の地域において肝疾患に主に関連している）を入手できることは、ＨＣＶの処置のための新規療法の発見および開発にとって有益である。
【００１３】
従って、本発明は、適応的突然変異Ｑ１０６７Ｒ、Ｖ１６５５Ｉ、Ｋ１６９１Ｒ、Ｋ２０４０Ｒ、Ｓ２２０４Ｉを含む複製能を有するＨＣＶ遺伝子型１型のポリヌクレオチドを用いて、培養細胞をトランスフェクションすること、２〜１０％のヒト血清の存在下においてトランスフェクションされた培養細胞をインキュベーションすること、および感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子を含むトランスフェクションされた培養細胞からの培地を回収することを含む、培養細胞中においてＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子の産生を増加させるための方法を提供する。本発明はさらに、適応的突然変異Ｑ１０６７Ｒ、Ｖ１６５５Ｉ、Ｋ１６９１Ｒ、Ｋ２０４０Ｒ、Ｓ２２０４Ｉを含む複製能を有するＨＣＶ遺伝子型１型のポリヌクレオチドを用いて、培養細胞をトランスフェクションすること；２〜１０％のヒト血清の存在下においてトランスフェクションされた培養細胞をインキュベーションすること；感染性ＨＣＶ遺伝子型１型のウイルス粒子を含むトランスフェクションされた培養細胞からの培地を回収すること；ＨＣＶ阻害活性についてスクリーニングされる分子の存在下または非存在下において、ネイティブな培養細胞を、感染性ＨＣＶ遺伝子型１型ウイルス粒子を用いて感染させること；および前記分子の非存在下と比較して前記分子の存在下におけるＨＣＶレベルの減少が、前記分子がＨＣＶ遺伝子型１型阻害剤であることを示す、感染培養細胞中に存在するＨＣＶのレベルを測定することを含む、ＨＣＶ遺伝子型１型阻害剤についてスクリーニングする方法を提供する。
【００１４】
本発明の前記および他の利点並びに特徴、並びにそれが達成される方法は、例示的な態様を説明する添付の実施例と併せて本発明の以下の詳細な説明を考察すればより容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト血清はＨＣＶ複製を増強しない。Ｒｏｆ−４００ｃ細胞を、ＨＣＶ Ｈ７７Ｓ株または複製欠損突然変異体（ＧＮＤ）をコードするin vitroで転写されたＲＮＡを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後の指定した時間に、細胞内ＲＮＡを精製し、その後これを使用してＨＣＶ ＲＮＡの量を決定した。
【図２】ヒト血清は感染性ＨＣＶの産生を増強する。Ｒｏｆ−４００ｃ細胞を、ＨＣＶ Ｈ７７Ｓ株または複製欠損突然変異体（ＧＮＤ）をコードするin vitroで転写されたＲＮＡを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後の指定した時間に、培地を回収し、そしてこれを使用してナイーブ細胞を感染した。３日後、細胞内ＲＮＡを精製し、その後これを使用してＨＣＶ ＲＮＡの量を決定した。
【図３】免疫蛍光分析による感染細胞中のＨＣＶコアタンパク質の検出。ＨＣＶ Ｈ７７Ｓ株をコードするin vitroで転写されたＲＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞から回収した培地を使用してナイーブ細胞を感染した。４日後、ＨＣＶコアタンパク質の発現を免疫蛍光によって分析した。
【図４】イムノペルオキシダーゼ分析による感染細胞中のＨＣＶコアタンパク質の検出。ＨＣＶ Ｈ７７Ｓ株をコードするin vitroで転写されたＲＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞から回収した培地を使用してナイーブ細胞を感染した。４日後、ＨＣＶコアタンパク質の発現をイムノペルオキシダーゼ染色後に分析した。
【図５】Ｈ７７ＳおよびＨ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂについての感染性ウイルス産生の動態。Ｒｏｆ−０ｃ細胞を、ＨＣＶ Ｈ７７Ｓ株またはＨ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂキメラ株をコードするin vitroで転写されたＲＮＡを用いてトランスフェクションした。指定した時点において、培地を回収し、そしてこれを使用してナイーブ細胞を感染し、感染細胞を含むウェルが５０％となる終点希釈として測定した感染性ウイルス力価を決定した（組織培養感染量ＴＣＩＤ５０）。
【図６】ＧＴ１ａ感染性ウイルスに対するＮＳ５Ｂ阻害剤およびＨＣＶエントリー阻害剤の効力。Ｒｏｆ−０ｃ細胞を、Ｈ７７ＳまたはキメラＨ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂのいずれかを用いて感染させた。感染時において、細胞を、ＮＳ５Ｂ阻害剤のＨＣＶ−７９６またはＨＣＶエントリー阻害剤のＪＳ８１のいずれかの連続希釈液を用いて処理した。３日後、細胞内ＲＮＡを精製し、そしてこれを使用してＨＣＶ ＲＮＡの量を決定した。
【００１６】
本明細書において使用する「複製能を有するポリヌクレオチド」という用語は、細胞中に存在する場合に複製するポリヌクレオチドをいう。例えば、相補的ポリヌクレオチドが合成される。本明細書において使用する「in vitroで複製する」という用語は、ポリヌクレオチドが、培養液中で成長している細胞中で複製することを示す。培養細胞は、例えば、不死化細胞または形質転換細胞を含む、培養液中で成長するように選択されたものであり得る。あるいは、培養細胞は、動物から移植されたものであってもよい。「in vivoで複製する」とは、ポリヌクレオチドが、例えば、霊長類（チンパンジーを含む）またはヒトなどの動物の体内の細胞中で複製することを示す。本発明のいくつかの局面において、細胞中の複製は、「感染性」ウイルス粒子、すなわち、細胞に感染することができそしてより感染性の高いウイルス粒子の産生をもたらすウイルス粒子の産生を含み得る。
【００１７】
複製能を有するポリヌクレオチドは、少なくとも１つの適応的突然変異を含む。本明細書において使用する「適応的突然変異」は、適応的突然変異を有さない複製能を有するポリヌクレオチドと比較して、複製能を有するポリヌクレオチドの複製能を向上させる、ポリタンパク質のアミノ酸配列の変化である。
【００１８】
本発明において言及された、複製能を有するポリヌクレオチドが含む１つの適応的突然変異は、アミノ酸約１０６７位でのアルギニンであり、これはＮＳ３のアミノ酸約４１位である。最も臨床的なＨＣＶ単離株および分子的にクローニングされた実験用のＨＣＶ株は、この位置においてグルタミンを含み、従って、この突然変異はＱ１０６７Ｒと称することができる。２つ目の適応的突然変異はアミノ酸約１６５５位におけるイソロイシンであり、これはＮＳ３のアミノ酸約６２９位である。最も臨床的なＨＣＶ単離株および分子的にクローニングされた実験用のＨＣＶ株は、この位置においてバリンを含み、従って、この突然変異はＶ１６５５Ｉと称することができる。３つ目の適応的突然変異はアミノ酸約１６９１位におけるアルギニンであり、これはＮＳ４Ａのアミノ酸約３４位である。最も臨床的なＨＣＶ単離株および分子的にクローニングされた実験用のＨＣＶ株は、この位置においてリジンを含み、従って、この突然変異はＫ１６９１Ｒと称することができる。４つ目の適応的突然変異はアミノ酸約２０４０位におけるアルギニンであり、これはＮＳ５Ａのアミノ酸約６８位である。最も臨床的なＨＣＶ単離株および分子的にクローニングされた実験用のＨＣＶ株は、この位置においてリジンを含み、従って、この突然変異はＫ２０４０Ｒと称することができる。本発明において言及された、複製能を有するポリヌクレオチドが含む５つ目の適応的突然変異は、アミノ酸約２２０４位においてイソロイシンであり、これはＮＳ５Ａのアミノ酸約２３２位である。最も臨床的なＨＣＶ単離株および分子的にクローニングされた実験用のＨＣＶ株は、この位置においてセリンを含み、そしてこの突然変異は当技術分野においてＳ２２０４Ｉと称される。
【００１９】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの多量体形をいい、そして、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、コード配列、並びに非コード配列、例えば調節配列および／または非翻訳領域などを含む、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含み得る。ポリヌクレオチドは天然源から直接的に得られても、または組換え技法、酵素的技法もしくは化学的技法の助けを得て調製してもよい。ポリヌクレオチドは、トポロジー的に直線状または環状であり得、そして例えば、発現ベクターまたはクローニングベクターなどのベクターの一部またはフラグメントであり得る。
【００２０】
「コード領域」および「コード配列」という用語は、同義語として使用され、そして、ポリペプチドをコードし、そして適切な調節配列の制御下に配置された場合にコードポリペプチドを発現する、ポリヌクレオチド領域をいう。コード領域の境界は、一般に、その５’末端における翻訳開始コドンおよびその３’末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード領域は、１つ以上のポリペプチドをコードすることができる。例えば、コード領域は、その後２つ以上のポリペプチドへとプロセシングされるポリペプチドをコードすることができる。調節配列または調節領域は、それが作動可能に連結されているコード領域の発現を調節するヌクレオチド配列である。調節配列の非限定的な例としては、プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、配列内リボソーム進入部位、翻訳終止部位、および転写終結因子が挙げられる。「作動可能に連結」とは、こうして記載された構成因子が、その目的とする様式で機能することを許容する関係にある並列をいう。コード領域の発現が、調節配列と適合する条件下において達成されるように、調節配列が、接続されている場合、調節配列は、コード領域に「作動可能に連結」されている。
【００２１】
本明細書において使用する「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーをいい、そしてアミノ酸のポリマーの具体的な長さには言及しない。従って、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、ポリタンパク質、プロテイナーゼ、および酵素という用語は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などの、ポリペプチドの発現後の修飾も含む。「Ｃ型肝炎ウイルスポリタンパク質」は、翻訳後に切断されて１個を超えるポリペプチドを生じるポリペプチドをいう。
【００２２】
「５’非翻訳ＲＮＡ」、「５’非翻訳領域（non-translated region）」、「５’非翻訳領域（untranslated region）」および「５’非コード領域」という用語は同義語として使用され、そして当技術分野の用語である(Bukh et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1992 89: 4942-4946を参照されたい)。この用語は、複製能を有するポリヌクレオチドの５’末端であるヌクレオチドをいう。
【００２３】
「３’非翻訳ＲＮＡ」、「３’ 非翻訳領域（non-translated region）」、「３’ 非翻訳領域（untranslated region）」という用語は同義語として使用され、そして当技術分野の用語である。この用語は、複製能を有するポリヌクレオチドの３’末端であるヌクレオチドをいう。
【００２４】
細胞は、外来性または異種性のＤＮＡまたはＲＮＡが細胞内に導入された場合に、このようなＤＮＡまたはＲＮＡによって「形質転換」または「トランスフェクション」されている。形質転換またはトランスフェクションするＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞のゲノムを作る染色体ＤＮＡ中に組み込まれて（共有結合して）いてもいなくてもよい。例えば、原核細胞、酵母および哺乳動物細胞において、形質転換するＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメント上に維持されていてもよい。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞とは、形質転換するＤＮＡが、染色体の複製を通して娘細胞に遺伝されるように染色体中に組み込まれるようになったものである。この安定性は、形質転換するＤＮＡを含む娘細胞の個体群を含む細胞系またはクローンを真核細胞が樹立できる能力によって実証されている。
【００２５】
本明細書において使用する「被験体」という用語は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーをいい、そしてこれらは、げっ歯類、ウサギ、トガリネズミおよび霊長類（後者はヒトを含む）を含むがそれらに限定されない。
【００２６】
「試料」という用語は、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外切片、呼吸器、腸管および泌尿生殖器、涙液、唾液、乳汁、血球、腫瘍、臓器を含むがそれらに限定されない、被験体から単離された組織または体液の試料、並びにまたin vitro細胞培養構成成分の試料（培養細胞、推定ウイルス感染細胞、組換え細胞の増殖物から得られた馴化培地および細胞成分を含むがそれらに限定されない）をいう。
【００２７】
「ＨＣＶ遺伝子型１型阻害剤」という用語は、ＨＣＶ遺伝子型１型の任意の機能を阻害する分子をいい、そして最初の付着およびエントリーから放出までのウイルスの生活環におけるいかなる段階においても作用し得、そして付着阻害剤、エントリー阻害剤、融合阻害剤、輸送阻害剤、複製阻害剤、翻訳阻害剤、タンパク質プロセシング阻害剤、または放出阻害剤を含み得るがそれらに限定されない。前記分子は広範囲に由来し得、そして有機分子、ペプチド、ポリペプチド（例えば抗体）、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、またはその組合せを含み得るがそれらに限定されない。
【００２８】
実施例
以下の調製および実施例は、当業者が本発明をより明瞭に理解しそして実践できるように記載されている。それらは本発明の範囲を制限するものと捉えるべきではなく、単にその説明および代表例と捉えるべきである。
【００２９】
材料および方法
細胞培養
Ｒｏｆ−０細胞は、Ｈｕｈ−７細胞系から誘導されたヒト肝細胞癌の細胞系である。Ｒｏｆ−０細胞は安定にＨＣＶ遺伝子型（ＧＴ）１ｂ型レプリコンを維持する。４００単位／mlのＩＦＮ−α２ａ(Roferon（登録商標）, Hoffmann-LaRoche Inc.)並びにレプリコンの選択を維持するためのＧ４１８（ジェネティシン（登録商標）、Invitrogen）の存在下においてＲｏｆ−０細胞を維持することによって、インターフェロン−αに対する応答性が消失した細胞系を作製した。得られた細胞系はＲｏｆ−４００と呼ばれる。Ｒｏｆ−０およびＲｏｆ−４００細胞を２’−Ｃ−メチルアデノシンの存在下において維持することによって前記細胞由来のＨＣＶレプリコンを治療し、そしてＲｏｆ−０ｃおよびＲｏｆ−４００ｃ細胞系が得られた。細胞系を、Glutamax（商標）および１００mg/mlのピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)の補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。培地にさらに１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Invitrogen）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充する。
【００３０】
プラスミド
５つの細胞培養適応的突然変異を有する完全長ＧＴ１ａＨ７７株をコードするプラスミドを以下のように操作した。ＴＱ−１プラスミド（ＧＴ１ａＨ７７サブゲノムレプリコンをコードする）およびＴＸ−２プラスミド（Ｈ７７サブゲノムレプリコンもコードし、そしてＮＳ５Ｂコード配列にフランキングするＡｓｉＳＩおよびＲｓｒＩＩ制限酵素部位をコードする）を、制限酵素のＡｇｅＩおよびＮｓｉＩを用いて消化した。消化から得られた６４００塩基対のフラグメントを精製した。プラスミドＨＣＶ１ａＨ７７をＡｇｅＩおよびＮｓｉＩを用いて消化し、そして得られた５１００塩基対のフラグメントを精製した。ＴＱ−１およびＴＸ−２の消化からの精製フラグメントを、別々にＨＣＶ１ａＨ７７消化産物とライゲーションして、プラスミドｐＵＣ ＨＣＶ１ａＨ７７（これは３つの適応的突然変異（Ｋ１６９１Ｒ、Ｋ２０４０ＲおよびＳ２２０４Ｉ）を含む）およびｐＵＣ ＨＣＶ１ａ−Ｈ７７.ＡｓｉＳＩＲｓｒＩＩ（これは同じ３つの適応的突然変異と、ＮＳ５Ｂ配列にカセットするためのＡｓｉＳＩおよびＲｓｒＩＩ制限酵素部位とを含む）を得る。２つの追加の適応的突然変異（Ｑ１０６７ＲおよびＶ１６５５Ｉ）を、クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キットを使用して製造業者の指示(Stratagene)に従って、両方のベクター中に導入した。これにより、プラスミドｐＵＣ Ｈ７７Ｓ（配列番号１）およびｐＵＣ Ｈ７７Ｓ.ＡｓｉＳＩＲｓｒＩＩ（配列番号２）が得られた。クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キットを使用して製造業者の指示(Stratagene)に従って、ＮＳ５Ｂ活性部位に突然変異（Ｄ２７３８Ｎ）を導入することによって複製欠損構築物を作製し、構築物ｐＵＣ Ｈ７７Ｓ ＧＮＤを得た。
【００３１】
ｐＵＣ Ｈ７７Ｓ.ＡｓｉＳＩＲｓｒＩＩおよび臨床単離株ＲＯ−５１ ＮＳ５Ｂ配列についてのＰＣＲ産物をＡｓｉＳＩおよびＲｓｒＩＩを用いて消化することによって、臨床分離株由来のＮＳ５Ｂ配列をコードするキメラＨ７７Ｓウイルスを作製した。フラグメントを共にライゲーションして、プラスミドｐＵＣ Ｈ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂ（配列番号３）を得た。
【００３２】
ウイルス産生
完全長ＨＣＶゲノムをコードするプラスミドを制限酵素ＳｐｅＩを用いて直線化し、その後、マングビーンヌクレアーゼを用いて処理した。直線化した鋳型を、in vitroＲＮＡ転写反応においてＴ７Ribomax Expressキット(Promega)を使用して製造業者の指示に従って使用した。ＲＮＡトランスフェクションのために、４００万個のＲｏｆ−０ｃまたはＲｏｆ−４００ｃ細胞に２〜１０μgのin vitro転写ＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳまたは２％〜１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清（ＨＳ、Bioreclamation）のいずれかを含むＤＭＥＭ中に再懸濁した。指定した時点において培地を回収し、３０００ＲＰＭで遠心分離にかけ、そしてアリコート化して、感染性ウイルスの産生についてアッセイした。
【００３３】
感染性ウイルスのアッセイ
トランスフェクションしたＲｏｆ−０ｃまたはＲｏｆ−４００ｃ細胞から回収した培地を、ナイーブＲｏｆ−０ｃまたはＲｏｆ−４００ｃと共にインキュベーションすることによって感染性ウイルスについてアッセイした。ナイーブ細胞を７２〜９６時間インキュベーションした後、細胞性ＲＮＡを抽出してＨＣＶ ＲＮＡを定量するか、または細胞を固定してＨＣＶタンパク質の発現について分析するかのいずれかを行なった。
【００３４】
ＨＣＶ ＲＮＡの存在を、全細胞性ＲＮＡの精製後に、製造業者の指示に従ってPerfectPure RNA 96細胞キット（5 Prime)を使用して調べた。ＨＣＶ ＲＮＡの量を定量するために、ｃＤＮＡを、Taqman Universal PCR mix (Applied Biosystems)またはTaqMan EZ RT-PCRキット(Applied Biosystems)のいずれかを使用して、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の領域に相補的な１セットのプライマーおよびプローブを用いて増幅した。プライマーおよびプローブの配列は、
【表１】
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である。
【００３５】
感染細胞中のＨＣＶタンパク質の発現を、免疫蛍光アッセイまたはイムノペルオキシダーゼアッセイのいずれかによって検査および定量した。細胞を２％ホルムアルデヒド中で１時間室温でインキュベーションすることによって固定した。固定後、細胞に、０．２％ＴＸ−１００および０．１％クエン酸ナトリウムを含むＰＢＳ中における５分間のインキュベーションによって透過処理を行なった。蛍光画像撮影のために、透過処理された細胞を、３％正常ヤギ血清および０．５％ウシ血清アルブミンを使用して３０分間かけてブロックし、その後、ＨＣＶコアに特異的なマウスモノクローナル抗体（ａｂ２７４０、Abcam）を用いて２０分間かけて染色した。洗浄後、細胞を、二次抗体（Ａ１１０３２、Invitrogen）と共に２０分間インキュベーションした。細胞を、１滴のPermafluor (Thermo Scientific)を使用してマウントし、そして画像撮影した。感染フォーカス数を計測して、フォーカス形成単位/mlで感染力価を決定した。
【００３６】
感染力価はまた、イムノペルオキシダーゼアッセイを使用しても決定することができた。細胞を前記のように固定および透過処理した。その後、細胞を、ImmPRESS抗マウスＩｇペルオキシダーゼキット（ＭＰ−７４０２、Vector Labs）を使用して製造業者の指示に従ってブロックした。細胞を、ブロックしながら、ＨＣＶコアに特異的なマウスモノクローナル抗体(ａｂ２７４０、Abcam)を用いて１時間かけて染色した。洗浄後、細胞を、ImmPRESSペルオキシダーゼ：抗マウスコンジュゲートと共に３０分間インキュベーションした。染色した細胞を、ImmPACT DAB基質(ＳＫ−４１０５、Vector Labs)と共に１０分間インキュベーションし、続いてＤＡＢ増強後(Ｈ−２２００、Vector Labs)、可視化した。感染力価を、感染細胞を含むウェルが５０％となる終点希釈として決定した（組織培養感染量ＴＣＩＤ５０）。
【００３７】
ＨＣＶ感染性ウイルスのＥＣ５０の決定
抗ウイルス剤に対する感染性ＨＣＶの感度を、遺伝子型１ａ型Ｈ７７Ｓ株またはＨ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂ株を使用して決定した。完全長ゲノムをＲｏｆ−０ｃ細胞中にトランスフェクションし、前記細胞を２〜１０％ＨＳを含むＤＭＥＭ中で培養し、そしてトランスフェクションの７日後に培地を回収することによってウイルスストックを作製した。ＥＣ５０の決定のために、Ｒｏｆ−０ｃ細胞を、１ウェルあたり１０，０００個の細胞で、９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンでコーティングされたプレート(BD Biosciences)中に蒔いた。蒔いてから２４時間後、培地を除去し、そして１ウェルあたり９０μlのウイルスストックを加えた。その後、３倍連続希釈の阻害剤を加えた。感染から３日後、ＨＣＶ ＲＮＡを前記のように定量した。ＥＣ５０値を、定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定したところＨＣＶ ＲＮＡのレベルの５０％の減少が観察された濃度として定義した。
【００３８】
結果
ヒト血清はＨＣＶ ＲＮＡの複製に影響を及ぼさない。in vitroにおける感染性ＧＴ１ａ株の複製の研究は、産生される低いウイルス力価のために現在制限されている。感染性ウイルスの産生を向上させるために、ヒト血清の効果を調べた。治療されたＨｕｈ−７細胞系であるＲｏｆ−４００ｃを、完全長ＧＴ１ａウイルス株Ｈ７７Ｓを用いてトランスフェクションし、そして細胞を、１０％ＦＢＳまたは１０％ＨＳのいずれかを含む培地中で培養した。細胞内ＨＣＶ ＲＮＡの量を５日間にわたり決定した。ＨＳ中またはＦＢＳ中のいずれかで培養した細胞は、試験した全ての時点を通して同様の量のＨＣＶ ＲＮＡを含んでいた（図１）。トランスフェクション細胞へのＨＳの添加は、ＨＣＶ ＲＮＡの複製を増加させないようである。
【００３９】
ヒト血清は感染性ＨＣＶの産生を増加させる。前記した同じ実験において、感染性ＨＣＶ粒子の産生に対するヒト血清の効果を調べた。培地をトランスフェクション後２４時間毎に５日間除去し、その後、ナイーブ細胞上に接種して、感染性ウイルスの産生を測定した。感染性ウイルスの存在を、指定した時点に回収した上清の存在下において７２時間インキュベーションした後にナイーブ細胞内の細胞内ＨＣＶ ＲＮＡの量を定量することによって決定した。感染ナイーブ細胞において検出された細胞内ＨＣＶ ＲＮＡの量は、Ｈ７７Ｓまたは複製欠損突然変異体のいずれかでトランスフェクションしそしてＦＢＳ中で培養された細胞から回収した上清を用いて感染させた細胞間で等価であった（図２）。このことは、ＦＢＳ中で培養した細胞から放出された感染性ＨＣＶの量は、トランスフェクションから取り残された残存ＨＣＶ ＨＣＶとは区別できなかったことを示す。しかしながら、ＨＳと共に培養したトランスフェクション細胞からの培地を用いて接種された感染ナイーブ細胞から回収した細胞内ＨＣＶ ＲＮＡの量は増加していた（図２）。ＨＳ中で培養されたトランスフェクション細胞は感染性ＨＣＶを放出し、そしてその量は５日間のアッセイを通して増加した。これらの実験は、ＨＳはＨＣＶ ＲＮＡの複製を増加させないが、感染性ウイルスの産生は増加させることを実証する。
【００４０】
感染性粒子が、ＨＳ中で培養されたトランスフェクション細胞から放出されたことを確証するために、ナイーブ細胞に種々の時点において回収した上清を用いて接種し、その後、ＨＣＶコアタンパク質の発現について分析した。ＨＣＶコアタンパク質の存在が、免疫蛍光およびイムノペルオキシダーゼ分析について染色された細胞中で確認された（図３および図４）。これらの結果は、ＨＳと共に培養したトランスフェクション細胞からの培地を用いて感染させたナイーブ細胞において検出されたＨＣＶ ＲＮＡの増加は（図２）、産生性ＨＣＶ感染の結果であることを実証した。
【００４１】
感染性ＨＣＶのピークにおける産生。前記の実験は、ＨＳ中で培養されたトランスフェクション細胞が、５日間の期間にわたって感染性粒子を放出したことを実証した。ウイルス産生についてのピークの時点を決定するために、トランスフェクション細胞を１１日間までの間、ＨＳ中で培養した。培地をトランスフェクション細胞から回収し、そしてこれを使用してナイーブ細胞を接種した。感染性粒子の存在を、ＴＣＩＤ５０/mlを決定する終点希釈アッセイによって定量した。Ｒｏｆ−０ｃ細胞をＨ７７Ｓを用いてトランスフェクションし、そしてトランスフェクションから７日後に、感染力価は約６０００ＴＣＩＤ５０/mlでピークに達した（図５）。ＨＳ中で培養したトランスフェクション細胞から得られたピークのＨＣＶ感染力価は、ＦＢＳ中で培養した細胞について以前に報告されたものよりも６０倍高かった(Yi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006 103(7):2310-2315)。
【００４２】
ＮＳ５Ｂキメラウイルスの作製。ＮＳ５Ｂカセットシステムが、あらゆるＮＳ５Ｂ配列のクローニングおよび分析を容易にするＨＣＶレプリコンを使用して確立されている(Le Pogam et al., J. Antimicrob. Chemother. 2008 61:1205-1216)。ＮＳ５Ｂカセットは、種々の非ヌクレオシド阻害剤およびヌクレオシド阻害剤に対する、ＮＳ５Ｂ単離株のパネルからの表現型応答を分析するのに使用されている。ＮＳ５Ｂ配列のクローニングに使用されるＡｓｉＳＩおよびＲｓｒＩＩ制限酵素部位を、完全長Ｈ７７Ｓゲノムにクローニングした。Ｈ７７カセットレプリコン内で複製することが知られる臨床単離株からの共通配列をＨ７７Ｓ ＮＳ５Ｂカセットにクローニングし、キメラウイルスＨ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂを得た。Ｈ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂトランスフェクション細胞からの感染性ウイルスの産生を調べた。Ｈ７７Ｓと同様に、感染性ウイルスの産生についてのピークの時点は７日目であったが、Ｈ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂの力価はＨ７７Ｓと比較して３倍減少した（図５）。このデータは、ＮＳ５Ｂカセットシステムを使用してキメラ感染性ウイルスを作製することができることを実証する。
【００４３】
ＧＴ１ａウイルスに対するＨＣＶ阻害剤の効力。ＨＳの存在下において培養した細胞からトランスフェクションの７日後に培地を回収することによってウイルスストックを作製した。ＨＣＶストックを分析して、それらがＨＣＶ阻害剤の効力を測定するのに十分であるかどうかを決定した。Ｒｏｆ−０ｃ細胞を９６ウェルプレートに蒔き、Ｈ７７ＳまたはＨ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂのいずれかで感染させ、その後、既知の非ヌクレオシド阻害剤（ＨＣＶ−７９６）または既知のエントリー阻害剤（ＪＳ８１）のいずれかを用いて処理した。感染性Ｈ７７Ｓに対するＨＣＶ−７９６の効力は３２±４nMであり、これは報告されていたものと同様である（図６）。Ｈ７７Ｓ ＲＯ−５１−５Ｂに対するＪＳ８１の効力は１３９±２３ng/mlであり、これもまた報告されたデータと同様である（図６）。これらの実験は、ＨＳの存在下において成長したＧＴ１ａ感染性ウイルスを使用して、ＨＣＶ阻害剤の効力を測定できるという証拠を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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