(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶ−１の存在についての簡易的、特異的および／または高感度検査のためのＨＩＶ−１のｇａｇ領域をコードする遺伝子配列に由来するオリゴヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、ＨＩＶ−１の検査用のオリゴヌクレオチドを提供する。検査にて有用なプローブおよび／またはプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを含むキットも提供される。
2012532606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号３、その断片、誘導体および相補的な配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド配列が、長さ１３〜３５の間の連結されたヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号２または配列番号３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１〜配列番号３、その断片、誘導体および相補的な配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列からなる単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に結合することが可能であり、および／またはそれから増幅することが可能である請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１つの順方向プライマーと少なくとも１つの逆方向プライマーを含む一対のオリゴヌクレオチドであって、前記順方向プライマーは、配列番号１、その断片、誘導体、または相補的な配列を含み、前記逆方向プライマーは、配列番号２、その断片、誘導体、または相補的な配列を含む一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも１つの順方向プライマーと少なくとも１つの逆方向プライマーを含む一対のオリゴヌクレオチドであって、前記順方向プライマーは、配列番号１、その断片、誘導体、または相補的な配列からなり、前記逆方向プライマーは、配列番号２、その断片、誘導体、または相補的な配列からなる一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５または６のいずれかに記載の一対のオリゴヌクレオチドと少なくとも１つのプローブを含む１組のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記プローブは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む請求項７に記載の１組のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの順方向プライマーと配列番号２のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの逆方向プライマーとを用いてヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）から増幅されるアンプリコン。
【請求項１０】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのプローブがアンプリコンに結合することが可能である請求項９に記載のアンプリコン。
【請求項１１】
生体試料におけるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の存在を検出するおよび／または定量する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供する工程と、
（ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、前記生体試料における少なくとも１つの核酸と、および／または前記生体試料から抽出、精製および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）における前記接触の結果生じた結合を検出しおよび／または定量し、それによって結合が検出されると前記ウイルスが存在する工程と、
を含む方法。
【請求項１２】
生体試料におけるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の存在を検出する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供する工程と、
（ｂ）請求項７または８のいずれか１項に記載の１組のオリゴヌクレオチドを、前記生体試料における少なくとも１つの核酸と、および／または前記生体試料から抽出、精製および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）における前記接触の結果生じた結合を検出し、それによって結合が検出されると前記ウイルスが存在する工程と、
を含む方法。
【請求項１３】
工程（ａ）の後で、内部分子（ＩＣ）と前記ＩＣに特異的なプローブを前記生体試料に混合する工程をさらに含む請求項１１または１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＣが配列番号４のヌクレオチド配列を含み、前記ＩＣに特異的な前記プローブが配列番号５のヌクレオチド配列を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の核酸を増幅する方法であって、当該方法は、配列番号１と配列番号２を用いたポリメラーゼ鎖反応を実施することを含む方法。
【請求項１６】
前記方法がさらに、配列番号３の核酸を含む少なくとも１つのプローブを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の検出のためのキットであって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１８】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の検出のためのキットであって、請求項５または６のいずれかに記載の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１９】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の検出のためのキットであって、請求項７または８のいずれかに記載の少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の存在を検出するためのプライマー、プローブ、ならびにそのようなプライマーおよび／またはプローブを用いた方法およびキットに関する。
【発明の背景】
【０００２】
ＨＩＶは、世界で最も深刻な感染性疾患の１つであり、２００９年１１月の最も最近の世界保健機関の報告によると、２００８年には世界で３３４０万人の感染者と約２００万人の死亡が推定されている地球規模の流行病である。ＷＨＯはまた、第６回のミレニアム開発目標として「ＨＩＶ／ＡＩＤＳと闘う」も列記している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｄｇ／ｅｎ／）。
【０００３】
特に低収入および中収入の開発途上国に対し治療を利用可能にするための前例のない尽力によって、この地球規模の流行病に対処している。２００７年１２月までに、これらの国々でＨＩＶ−１と共に生きる平均３００万人の人々が抗レトロウイルス療法を受けたが、それは、抗レトロウイルス療法を必要とする全ての人のほんの３１％である。ＨＩＶ−１症例の年々の増加および検査を受ける人々の数の緩やかな増加に伴って、開発途上国では推定７００万人が２０１０年までに治療に入ることが予想される。
【０００４】
治療を早期に開始するためには、ＨＩＶ−１感染の早期発見が重要である。ＨＩＶ−１ウイルスの検出は、ウイルスの母子感染を早期に診断する唯一の手段でもある。ＨＩＶ−１ウイルスの定量（すなわち、ウイルス負荷）は、代理マーカーがウイルス負荷を置き換えることができないので、治療の応答をモニターするため、治療に対する長期の応答の最も感度の良い予後マーカーである。検出不能レベルまでのウイルス抑制は、ほとんどの症例において、多くの無作為化治療試験の主要な終点であり、また多くの治療指針の主な目標である。ウイルス抑制は治療への耐性発現のリスクを最小化する。
【０００５】
ＨＩＶ−１感染者の大半が、広大な研究施設、訓練を受けた人材および財務費用を必要とするためにウイルス負荷モニタリングへのアクセスが制限される開発途上国に住んでいるので、ＨＩＶ−１感染者の多くは感染に気付かないため治療を求めることなく感染と共に生活する。リアルタイムＰＣＲアッセイもまた、ウイルス負荷モニタリングへのアクセスをさらに阻む、試薬の冷却、汚染を防ぐ複数の部屋、および様々なプロセスのための多くの高価な機器を必要とする。
【０００６】
たとえば、アッセイ当たりの費用はおよそ１５０米ドルであり、遺伝子型判定の費用は試料当たり約５５０米ドルである。ウイルス負荷モニタリングの平均頻度は、患者当たり年間０．７ウイルス負荷であり、本質的な治療モニタリングツールを全く活用していない。いくつかのセンターでは、処理能力を改善し費用を下げるために、自前のＨＩＶ定量アッセイを開発している。多数の研究が実施され、自前のウイルス負荷定量と遺伝子型判定が実現可能であり、著しく安価であることを明らかにしている。たとえば、ウイルス負荷定量の費用は、２０ユーロ程度の安価で、遺伝子型判定は１ラン当たりさらに３５ユーロであると報告されている。しかしながら、この戦略の潜在的な限界の１つは、内部標準用のウイルス培養のためのバイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ３）のレベルの研究室の必要性である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、添付の独立請求項において定義される。本発明のいくつかの任意選択の特徴は、添付の従属請求項において定義される。特に、本発明は、上記の課題に対処し、患者の検体でさらに効率的にＨＩＶ−１を検出し定量する方法において有用な、高感度で特異性の高いオリゴヌクレオチド、その断片および／または誘導体を提供する。プライマーおよび／またはプローブは、ＨＩＶ−１の検出において感受性であり、特異的であることができ、ＨＩＶ−１による感染および／またはそれに関連した疾患状態を判定するための迅速で費用効果のある診断用および予後用の試薬を提供する。これらのプライマーは、安価で、迅速、およびより正確なＨＩＶ−１検査の手段を提供する。特に、これらのプライマーは、所定の改善されたＢＳＬ２施設の使用のみで現在の市販のキットに匹敵し、それによってさらに手頃なキットによるウイルス負荷検査へのアクセスを増やす、手頃な医療現場での（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）ＨＩＶ−１定量アッセイを提供する。
【０００８】
第１の態様によれば、本発明は、配列番号１〜配列番号３、その断片、誘導体、変異、および相補的な配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１に結合することが可能であり、および／またはＨＩＶ−１から増幅することが可能であり得る。
【０００９】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの順方向プライマーと少なくとも１つの逆方向プライマーとを含む、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを提供し、順方向プライマーは、配列番号１、その断片、誘導体、変異または相補的な配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、逆方向プライマーは、配列番号２、その断片、誘導体、変異または相補的な配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる。
【００１０】
別の態様によれば、本発明は、本発明のいずれかの態様に係る一対のオリゴヌクレオチドと少なくとも１つのプローブを含む少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
さらなる態様によれば、本発明は、配列番号１、その断片、誘導体、変異または相補的な配列のヌクレオチド配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる少なくとも１つの順方向プライマーと、配列番号２、その断片、誘導体、変異または相補的な配列のヌクレオチド配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる少なくとも１つの逆方向プライマーとを用いてＨＩＶ−１から増幅される少なくとも１つのアンプリコンを提供する。
【００１２】
一態様によれば、本発明は、生体試料におけるＨＩＶ−１の存在を検出する少なくとも１つの方法を提供し、
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供する工程と、
（ｂ）本発明のいずれかの態様に係る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドまたは１組のオリゴヌクレオチドを、前記生体試料における少なくとも１つの核酸と、および／または前記生体試料から抽出、精製および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）における前記接触の結果生じた結合を検出し、それによって結合が検出されると前記ＨＩＶ−１が存在する工程と、
を含む。
【００１３】
一態様によれば、本発明は、ＨＩＶ−１核酸を増幅する少なくとも１つの方法を提供し、当該方法は、配列番号１、その断片、誘導体、変異または相補的な配列と、配列番号２、その断片、誘導体、変異または相補的な配列とを用いたポリメラーゼ鎖反応を実施することを含む。
別の態様によれば、本発明は、ＨＩＶ−１の検出のための少なくとも１つのキットを提供し、該キットは、本発明のいずれかの態様に係る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドまたは１組のオリゴヌクレオチドを含む。
【００１４】
特定の態様によれば、患者の検体においてＨＩＶ−１のＤＮＡを検出することが可能なＰＣＲの方法で有用な、高感度で特異性の高いプライマー、その断片および／または誘導体が提供される。この検査を用いて、ＨＩＶ−１患者からの検体を調べてもよい。プライマーは、感受性であり、特異的であることができる。さらに、少なくとも１つのＩＣ分子を各反応に含め、ＰＣＲの性能をモニターしてもよい。大規模な検証では、阻害率が３．７％と高いので、ＩＣは重要な特徴であると考え得る。
【００１５】
本発明のいずれかの態様に係るオリゴヌクレオチドは、患者のモニタリングにおける臨床使用に好適な自前のアッセイに用いてもよい。それは、３００以上の患者試料の定量において現在の市販のアッセイに匹敵し得る。特に、本発明のいずれかの態様に係るオリゴヌクレオチドは、現在臨床で使用されている近年大規模に評価されている自前のアッセイに匹敵する臨床成績であり得る。
【００１６】
プロトタイプの可搬式プラットホームにＳｉｎｇ−ＩＨが適用されている。このリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いたプロトタイプの装置は、南アフリカにおける、２００９年国際エイズ学会の会議で提示された（Ｎｇら、２００９年）。手短にいうと、ここで記載されるプロトコルを用いた可搬式のクレジットカード大のリアルタイム装置は、ベンチトップサイズのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００ＰリアルタイムＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国、ラホヤ）に比べて、１．００のｒ２値にてＨＩＶ−１のｃＤＮＡを正確に定量することが明らかにされた。
【００１７】
Ｓｉｎｇ−ＩＨアッセイは、治療への応答の信頼できるモニタリングに対するアクセスを増やすための、信頼できる、使い易い、手頃なアッセイであると考え得る。特に、亜型ＢおよびＡＥが優勢な地域では、それが有用でありうる。全試薬の総費用は、反応当たり１０米ドル未満である。また、それは、５０コピー／ｍＬ〜４００コピー／ｍＬにおよぶより低い検出限界を有しうるので、ＨＩＶ−１の検出に対する高感度アッセイになっている。
【００１８】
以下の記載から明らかなように、本発明の好適な実施形態により、必要に応じ高感度で特異的なＨＩＶ−１検出のためのプライマーおよび／またはプローブの最適な使用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】逆転写酵素阻害剤への耐性と関連するＨＩＶ−１の逆転写酵素遺伝子における変異のリストの表である（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００９年）。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、（Ａ）プロテアーゼ阻害剤への耐性に関連するＨＩＶ−１のプロテアーゼ遺伝子、（Ｂ）進入阻害剤への耐性に関連するＨＩＶ−１のエンベロープ遺伝子、（Ｃ）インテグラーゼ阻害剤への耐性に関連するＨＩＶ−１のインテグラーゼ遺伝子、における変異のリストの表である（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００９年）。
【図３】本発明の自前のアッセイを用いたサイクル数（Ｃｔ）と連続希釈したプラスミド標準（１０１〜１０８コピー）との間の線形関係を示すＨＩＶ−１の標準曲線である。
【図４】実施例１の自前のアッセイ（点線は９５％信頼区間を示す）の検出限界を示すプロビット回帰のグラフである。
【図５】実施例１で実施した臨床血漿試料についての有効な定量結果のブランド・アルトマンプロットである。グラフＡは、自前のアッセイ（ＩＨ）とＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１検査（ＣＴＭ）（ｎ＝１１８）の比較を示す。グラフＢは、自前のアッセイ（ＩＨ）とＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１検査（ＡＲＴ）（ｎ＝９７）の比較を示す。
【図６】実施例１で実施した自前のアッセイ、ＣＴＭアッセイおよびＡＲＴアッセイについてのｌｏｇ１０ウイルス負荷値のヒストグラムである。グラフＡは、自前とＣＴＭ（ｎ＝１１８）の比較を示す。グラフＢは、自前とＡＲＴ（ｎ＝９７）の比較を示す。
【図７】実施例２の自前のアッセイ（点線は９５％信頼区間を示す）の検出限界を示すプロビット回帰のグラフである。
【図８】実施例２で実施した臨床血漿試料についての有効な定量結果のブランド・アルトマンプロットである。グラフＡは、自前のアッセイ（すなわち、Ｓｉｎｇ−ＩＨ）とＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１検査（ｎ＝１１９）の比較を示す。グラフＢは、自前のアッセイ（すなわち、Ｓｉｎｇ−ＩＨ）とＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１検査（ｎ＝１０８）の比較を示す。
【図９】実施例２で実施した自前のアッセイ、ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１アッセイおよびＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１アッセイついてのｌｏｇ１０ウイルス負荷値のヒストグラムである。グラフＡは、Ｓｉｎｇ−ＩＨとＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１検査（ｎ＝１１９）の比較を示す。グラフＢは、Ｓｉｎｇ−ＩＨとＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１検査（ｎ＝１０８）の比較を示す。
【好ましい実施形態の詳細な説明】
【００２０】
本明細書で言及される書誌参照は、便宜上参考文献リストの形態で列記し、実施例の末尾に追加する。そのような書誌参照の内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２１】
定義
用語「生体試料」は、本明細書では、少なくとも１種の動物および／または植物からの組織および／または流体の試料として定義される。生体試料は、ヒトを含む動物、流体、固形物（たとえば、糞便）または組織、ならびにたとえば、乳製品、野菜、肉および肉副産物のような液状・固形の食品・飼料産物および原料、そして廃棄物であってもよい。生体試料は、様々な科のあらゆる家畜、ならびにたとえば、有蹄類、クマ、魚類、ウサギ類、げっ歯類などの動物を含むがこれらに限定されない野生の動物から得られてもよい。環境試料には、たとえば、表面物、土壌、水、空気および工業試料のような環境物質、ならびに食品および乳加工用の機器、装置、装備、用具、使い捨て用品および非使い捨て用品から得られる試料が挙げられる。これらの例は、本明細書で開示される方法に適用可能な試料の種類を限定するものとして解釈されるべきではない。特に、生体試料は、少なくともヒトからの組織および／または流体であってもよい。
【００２２】
用語「相補的な」は、本明細書では、塩基対合則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸のようなヌクレオチドの配列）に関して使用される。たとえば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」と相補的である。核酸の鎖間の相補性の程度は、核酸の鎖間のハイブリッド形成の効率および強度に重大な影響を与える。これは、核酸間の結合に依存する検出方法と同様に、増幅反応において特に重要である。特に、「相補的な配列」は、一方の配列の５’末端が、他方の配列の３’末端と対をなすように核酸配列と並んだ場合「逆平行関係」にあるオリゴヌクレオチドを指す。天然の核酸には一般的に見られない特定の塩基が、本明細書で開示される核酸に含まれてもよく、それには、たとえば、イノシンおよび７−デアザグアニンが挙げられる。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基対またはマッチしない塩基を含有してもよい。核酸技術の当業者は、たとえば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成と配列、イオン強度およびミスマッチ塩基対の発生率を含む多数の変数を考慮して二本鎖の安定性を経験的に決定することができる。第１のオリゴヌクレオチドが標的核酸のある領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドが同一領域（またはこの領域の一部）に相補的である場合、標的核酸に沿って「重なり合う領域」が存在する。重なり合う程度は、相補性の程度によって異なってもよい。
【００２３】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書では、「主に含む、であるが、単独で含むとは限らない」と定義される。さらに、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を含むものとして当業者によって自動的に読み取られるであろう。たとえば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」のような、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の変形は、対応して変化した意味を有する。
用語「誘導体」は、本明細書では、本発明のオリゴヌクレオチドの、または該オリゴヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配列の化学的修飾体として定義される。ポリヌクレオチド配列の化学的修飾体には、たとえば、アルキル基、アシル基またはアミノ基による水素の置換を含むことができる。
【００２４】
用語「断片」は、本明細書では、オリゴヌクレオチドの特徴および機能を持つ配列を付与する活性部位／結合部位を含むオリゴヌクレオチドの全配列の不完全部分または単離された部分として定義される。特に、それは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも１つ分だけ短くてもよい。さらに特に、断片は、オリゴヌクレオチドがＨＩＶ−１に結合するのを可能にする結合部位を含む。特に、順方向プライマーの断片は、配列番号１の少なくとも１０、１２、１５、１８または１９の連続したヌクレオチドを含んでもよく、および／または逆方向プライマーは、配列番号２の少なくとも１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２または２４の連続したヌクレオチドを含んでもよい。さらに特に、プライマーの断片は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであってもよい。
【００２５】
用語「内部対照（ＩＣ）分子」は、本明細書では、本発明の方法で使用されるＨＩＶ−１と同じプライマーの組によって同時増幅されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されるオリゴヌクレオチドとして定義される。特に、ＩＣは、ＰＣＲの性能をモニターして偽陰性の結果を回避するために反応混合物に混合されてもよい。このＩＣ分子を検出するためのプローブは、この分子の内部部分に特異的であってもよい。この内部部分は、人工的に設計されてもよく、自然に発生しなくてもよい。
【００２６】
用語「変異」は本明細書では、ヌクレオチドの長さの核酸配列における変化として定義される。当業者は、小さな変異、特に置換、欠失および／または挿入の点突然変異は、特に核酸がプローブとして使用される場合、ヌクレオチドのストレッチにほとんど影響しないことを認識するであろう。従って、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入の変異を包含する。さらに、本発明に係るオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、プローブとして機能してもよいので、本明細書で言及されるオリゴヌクレオチドはその変異および誘導体も包含する。
【００２７】
用語「生体試料における核酸」は、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含有する試料を指す。特に、核酸の供給源は、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、喀痰および精液を含むがこれらに限定されない生体試料である。
【００２８】
一態様によれば、本発明は、配列番号１または配列番号２、その断片、誘導体、変異または相補的な配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる少なくとも１つの単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１に結合することが可能であってもよく、および／またはＨＩＶ−１から増幅することが可能であってもよい。ＨＩＶ−１は、Ｍ群であってもよく、さらに亜群Ａ〜Ｋに分けられてもよく、あるいは群Ｎ、Ｏ若しくはＰであってもよい。
【００２９】
ＨＩＶ−１の遺伝子型は薬剤耐性株を含んでもよい。薬剤耐性は、ＨＩＶ−１の逆転写酵素遺伝子、エンベロープ遺伝子、プロテアーゼ遺伝子および／またはインテグラーゼ遺伝子に見られる。特に、ＨＩＶ−１の薬剤耐性株は、アバカビル、アタザナビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、エファビレンツ、エントリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、フォサムプレナビル、インジナビル、ラミブジン、ロピナビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ラルテグラビル、リトナビル、サキナビル、スタブジン、テノフォビル、チプラナビル、およびジドブジンからなる群から選択される１以上の薬剤に耐性を有してもよい。ＨＩＶ−１の様々な遺伝子の変異の非限定リストは、図１および図２に見られる。ＨＩＶ−１の薬剤耐性株は、アタザナビル、ダルナビル、フォサムプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、サキナビル、チプラナビル、およびリトナビルからなる群から選択される複数の薬剤に耐性を有しうる多剤耐性株であってもよい。本発明のいずれかの態様に係るオリゴヌクレオチドは、これらの変異の１以上を伴うＨＩＶ−１に結合してもよい。
【００３０】
オリゴヌクレオチド配列が、長さ１３〜３５の間の連結されたヌクレオチドであってもよく、配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を含んでもよい。当業者は、増幅反応にて相補的な核酸の鎖の合成を効果的にプライミングするために、所与のプライマーは１００％の相補性でハイブリッド形成する必要はないことを認識するであろう。プライマーは、介在断片または隣接断片がハイブリッド形成事象に関与しないように、１以上の断片を越えてハイブリッド形成してもよい（たとえば、ループ構造またはヘアピン構造）。特に、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１、配列番号２または配列番号３と８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有してもよい。
【００３１】
配列同一性の、７０％〜１００％程度、またはその中での任意の範囲での変動の程度は、開示される特定のプライマー配列に関して可能である。配列同一性の決定は以下の例に記載される。すなわち、長さ２０ヌクレオチドのプライマーで、２つの非同一残基を有する長さ２０ヌクレオチドの別のプライマーに同一であるものは、２０のうち１８の同一残基を有する（１８／２０＝０．９または９０％の配列同一性）。別の例では、長さ２０ヌクレオチドのプライマーの１５ヌクレオチド断片に同一の全残基を有する長さ１５ヌクレオチドのプライマーは、２０ヌクレオチドのプライマーと１５／２０＝０．７５または７５％の配列同一性を有する。
【００３２】
パーセント相同性、配列同一性または相補性は、たとえば、当該技術で周知のスミス及びウォーターマンのアルゴリズムを用いる、初期設定を用いたＧａｐプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、ＵＮＩＸ用バージョン８、ウィスコンシン州、マディソンのユニバーシティリサーチパーク、ジェネティックスコンピュータグループ）によって決定することができる。当業者は、パーセント配列同一性またはパーセント配列相同性を計算することができ、過度の実験を行うことなく、増幅産物の製造のための核酸の相補鎖の合成をプライミングする役割におけるプライマーの機能に対するプライマーの配列同一性の変動の影響を決定することができる。
【００３３】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの順方向プライマーと少なくとも１つの逆方向プライマーを含む少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを提供し、前記順方向プライマーは、配列番号１、その断片、誘導体、変異、および相補的な配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり、前記逆方向プライマーは、配列番号２、その断片、誘導体、変異、および相補的な配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる。
【００３４】
別の態様によれば、本発明は、本発明のいずれかの態様に係る一対のオリゴヌクレオチドと少なくとも１つのプローブを含む少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。該プローブは、配列番号３を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなってもよい。
【００３５】
前記プローブは、その５’末端および３’末端にて蛍光色素で標識されてもよい。５’標識される蛍光色素の例には、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ−ｏ−カルボキシフルオレセインおよびシアニン−５（Ｃｙ５）が含まれてもよいが、これらに限定されない。３’標識される蛍光色素の例には、５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびブラックホールクエンチャー−１、２、３（ＢＨＱ−１，２，３）が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明のいずれかの態様に係るオリゴヌクレオチドは、臨床試料または培養試料のいずれかからＨＩＶ−１を検出する方法に使用されてもよく、前記臨床試料は、血液、血清、血漿、喀痰、尿、糞便、皮膚、脳脊髄液、唾液、胃液、精液、母乳、涙、口腔咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、咽頭スワブ、鼻吸引物、鼻洗浄液、耳、眼、口、気道、脊髄組織または脊髄液から回収される流体、脳脊髄液、三叉神経節試料、仙骨神経節試料、脂肪組織、リンパ系組織、胎盤組織、上部生殖器官などから選択されてもよいが、これらに限定されない。
【００３７】
さらなる態様によれば、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる、少なくとも１つの順方向プライマーと、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる、少なくとも１つの逆方向プライマーとを用いて、ＨＩＶ−１から増幅される少なくとも１つのアンプリコンを提供する。本発明のいずれかの態様に係るプローブは、前記アンプリコンに結合することが可能でありうる。特に、前記プローブは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。
【００３８】
一態様によれば、本発明は、生体試料におけるＨＩＶ−１の存在を検出する少なくとも１つの方法を提供し、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供する工程と、
（ｂ）本発明のいずれかの態様に係る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドまたは１組のオリゴヌクレオチドを、前記生体試料における少なくとも１つの核酸と、および／または前記生体試料から抽出、精製および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）における前記接触の結果生じた結合を検出し、それによって結合が検出されるとＨＩＶ−１が存在する工程と、
を含む。
【００３９】
試料中のＨＩＶ−１の同一性および量を決定するのに前記方法を用いてもよく、その方法は、本発明のいずれかの態様に係る一対のプライマーと較正配列を含む既知の量の較正ポリヌクレオチドに前記試料を接触させること、前記一対のプライマーで前記試料中の前記ＨＩＶ−１に由来する核酸を増幅すると同時に、前記一対のプライマーで前記試料中の前記較正ポリヌクレオチドに由来する核酸を増幅し、ＨＩＶ−１同定アンプリコンを含む第１の増幅産物と較正アンプリコンを含む第２の増幅産物を得ること、前記ＨＩＶ−１同定アンプリコンと前記較正アンプリコンの前記５’末端と前記３’末端が前記一対のプライマーまたはその相補体の前記配列である前記ＨＩＶ−１同定アンプリコンと前記較正アンプリコンの分子質量と存在度のデータを得ること、そのそれぞれの分子質量に基づいて前記ＨＩＶ−１同定アンプリコンと前記較正アンプリコンを区別することとを含み、前記ＨＩＶ−１同定アンプリコンの分子質量は、前記ＨＩＶ−１の同一性を示し、ＨＩＶ−１同定アンプリコンの存在度データと較正アンプリコンの存在度データの比較は、前記試料におけるＨＩＶ−１の量を示す。
【００４０】
一態様によれば、本発明は、ＨＩＶ−１核酸を増幅する少なくとも１つの方法を提供し、当該方法は、配列番号１と配列番号２を用いたポリメラーゼ鎖反応を実施することを含む。
【００４１】
本発明のいずれかの態様に係る方法はさらに、内部分子（ＩＣ）とＩＣに特異的なプローブを生体試料に混合する工程を含んでもよい。ＩＣは、配列番号４のヌクレオチド配列を含んでもよく、本質的にそれからなってもよく、またはそれからなってもよい。ＩＣプローブは、配列番号５のヌクレオチド配列を含んでもよく、本質的にそれからなってもよく、またはそれからなってもよい。ＩＣの使用によりＨＩＶ−１診断の効率を改善でき、結果の精度を高めうる。
【００４２】
本発明のいずれかの態様に係る方法は、ＨＩＶ−１関連の状態または疾患の特定の診断のためのＰＣＲ増幅に使用されてもよく、ここで、非限定的ＨＩＶ−１関連の状態または疾患は、ＡＩＤＳ、カポジ肉腫、非ホジキンリンパ腫、ニューモシスティス・カリニ肺炎、ニューモシスティス・ジロヴェチ肺炎、カンジダ食道炎、カンジダ・アルビカンス感染、緑膿菌感染、黄色ブドウ球菌感染、化膿レンサ球菌感染、アシネトバクター・バウマニ感染、トキソプラズマ感染、トキソプラズマ脳炎、アスペルギルス感染、クリプトスポリジウム症、微胞子虫症、クリプトコッカス・ネオフォルマンス感染、トリ型結核菌複合体播種性感染、エプスタイン・バーウイルス感染、サイトメガロウイルス網膜炎、ＪＣウイルス感染による進行性多巣性白質脳症、ＨＩＶ関連の認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）悪性腫瘍、口腔カンジダ症、無菌性髄膜脳炎、消化管の障害、内分泌機能異常、代謝障害、消耗症候群、貧血、好中球減少症、リウマチ性症候群、子宮頚癌、肛門癌、直腸癌、バーキットリンパ腫、ペニシリウム症、結核、ヘルペスウイルス８型感染、単純ヘルペスウイルス１型感染、ヒトパピローマウイルス感染、サイトメガロウイルス感染、マイコバクテリア感染、ロタウイルス感染、アデノウイルス感染、アストロウイルス感染、食道炎、サルモネラ、シゲラ、リステリア若しくはカンピロバクターによる慢性の下痢、または腎症などである。
【００４３】
別の態様によれば、本発明は、ＨＩＶ−１の検出のための少なくとも１つのキットを提供し、該キットは、本発明のいずれかの態様に係る少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドまたは１組のオリゴヌクレオチドを含む。
【００４４】
本発明のいずれかの態様に係るオリゴヌクレオチドを、ウイルス培養施設がない場合に、ＢＳＬ２施設を用いた自前のアッセイに用いてもよく、その結果は、参照の市販のアッセイに匹敵しうる。これらの自前のアッセイはまた、さらに手頃で、信頼でき、かつ使い易いので、ＨＩＶ−１患者における治療への応答の信頼できるモニタリングへのアクセスを増やすのに使用されうる。
【００４５】
以下の実施例を参照することによって、同様のことがさらに容易に理解されるであろう。なお、以下の実施例は説明目的で提供され、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００４６】
当該技術で周知であり、特別に記載されているのではない標準的な分子生物学の技法は、一般的に、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、「分子クローニング：実験室マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（２００１年）の記載に従う。
【００４７】
実施例１
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００  ＱＰＣＲ方式を用いた自前のアッセイ（すなわち、Ｓｉｎｇ−ＩＨ）の評価。自前のアッセイの結果を、（ｉ）１７８人の患者試料におけるＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１アッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社、米国、デス・プレーンズ）の結果、および（ｉｉ）１５１人の患者試料におけるＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１検査（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、ニュージャージー州、ブランチバーグ）の結果と比較することによって、アッセイの臨床評価を行った。国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）から入手した遺伝子型パネルに対して、ＨＩＶ−１亜型の検出を評価した。
【００４８】
方法および材料
リアルタイム定量のための外部標準品
ｇａｇ領域を標的とするプライマーｇａｇ１８３Ｕ（配列番号１）とｇａｇ１８７Ｌ（配列番号２）を用いたＨＩＶ−１陽性患者の試料（亜型ＡＥ）のＲＴ−ＰＣＲ増幅から、ウイルスＲＮＡコピーの定量のための外部標準品（ＥＳ）を合成した。ｇａｇ１８３Ｕ／１８７Ｌプライマーによって生成したアンプリコンは、従来のゲル電気泳動によって検証し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ、カタログ番号２８１０６）を用いて３％のアガロースゲルから精製した。プライマーｇａｇ１８３Ｕ／１８７Ｌ（それぞれ配列番号１と配列番号２）を用い、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒミックスキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ、カタログ番号２０３４４３）を用いてゲル精製した産物をさらに増幅した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いてアンプリコンを精製し、その後、製造元のプロトコルに従って、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）配列決定キット（ｐＣＲ（登録商標）４  ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カタログ番号４５−００３０）によってクローニングした。得られたプラスミドを精製し、０．１ｎｇ／μＬのｓｓＤＮＡにて連続希釈し、その後のアッセイのために−３０℃で保存した。
【００４９】
Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター（バージョン３．１）サイクル配列決定キットを用いたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社、米国）にて実施した配列決定によって挿入物を確認した。輸入されたＷＨＯのＨＩＶ−１のＲＮＡ第２次国際標準品（国立生物学的製剤研究所、英国、ポッターズバー）に対してＥＳを較正した。
【００５０】
プライマー／オリゴヌクレオチドの設計
２００８年のロスアラモス国立研究所のデータベース（ロスアラモス国立研究所、ニューメキシコ州、ロスアラモス）を参照した配列データを用いて、自前のプライマーとプローブを設計した。ＨＩＶ−１ウイルスで相対的に良く保存されるため、ｇａｇ遺伝子を選択した。特に、増幅と検出に用いたプライマーやプローブのセットは、ＨＩＶ−１の遺伝子型ＢおよびＡＥのｇａｇ領域をコードする遺伝子配列に由来した。遺伝子型Ｂについてのものは、相当するＨＸＢ２参照株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ０３４５５）から選択した。遺伝子型ＡＥについてのものは、相当するＵＳＡ株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２５９９５５）から選択した。
【００５１】
自前のプライマーとプローブの配列を、「ＨＩＶ配列概論２００８」（２００８年１２月３１日）で列記された遺伝子型／群すべてと比較し、ＯとＣＰＺを除いたＢとＡＥを含む群すべてと結合し得ることを見い出した。遺伝子型ＢおよびＡＥは、シンガポールにおいて優勢である。検出用のオリゴヌクレオチドプローブは、５’末端に連結したレポーターフルオレセイン色素（ＦＡＭ、６−カルボキシフルオレセイン）と３’末端に連結したＢＨＱ−１クエンチャーを有した。
【００５２】
使用したプライマーとプローブは、
ＨＩＶ−１用の順方向プライマー配列、３５７−ｇａｇ１８３Ｕ（ｇａｇ１８３Ｕ）
（５’−３’）ＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧ（配列番号１）
ＨＩＶ−１用の逆方向プライマー配列、２９２−ｇａｇ１８７Ｌ（ｇａｇ１８７Ｌ）
（５’−３’）ＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＣＴＣＣＧＣＴＡＧＴＣＡ（配列番号２）
ＨＩＶ−１用のプローブ配列、３５４−ｇａｇ１８７ＰＦ（ｇａｇ１８７Ｐ）
（ＦＡＭ）５’−ＴＣＴＣＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧ−３’（ＢＨＱ１）（配列番号３）
である。
【００５３】
内部対照（ＩＣ）
ＨＩＶ−１標的分子の結合部位とは異なる固有のプローブ結合部位を組み入れるように競合内部対照（ＩＣ）の無作為配列を設計した。この競合ＩＣ分子を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたオリゴヌクレオチド分子を表し、それをプライマーｇａｇ１８７Ｕ／１８７Ｌ（それぞれ配列番号１および配列番号２）によって増幅した。ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ  Ｐｈｉｒｅ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、フィンランド、カタログ番号Ｆ−１２０Ｓ）を用いて増幅を行った。ＨＩＶ−１に対する特異的なプライマーｇａｇ１８３Ｕとｇａｇ１８７Ｌについて分子の両端でハイブリッド形成部位を保持するこのキメラの一本鎖ＤＮＡを同時に増幅して、偽陰性の結果を排除した。１ｎｇ／μＬのｔＲＮＡを用いてＩＣ分子を１００コピー／μＬに希釈し、それをリアルタイムＰＣＲアッセイの反応ウエルのそれぞれに加え（すなわち、ＩＣの１００コピーをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの各反応に加えた）、ＰＣＲ阻害のチェックとして役立たせた。較正実験は、標的ＨＩＶ−１検出の妨害を示さなかった。
【００５４】
ＩＣ分子の配列：３５２−ｇａｇ１８７ＩＣ−Ｃ４：（５’−３’）
５’ＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＴＡＴＣＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＡＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＴＣＧＴＴＡＧＴＴＴＣＧＴＴＴＴＧＧＧＴＧＡＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＴ３’（配列番号４）
ＩＣについてのプローブ配列：３６１−ｇａｇ１８７ＩＣＰ２：
（Ｔｅｘａｓ）５’−ＡＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＴＣＧＴＴＡ−３’（ＢＨＱ２）（配列番号５）
【００５５】
ＷＨＯ  ＮＩＢＳＣの国際ＨＩＶ−１標準品
ＷＨＯ国際標準試薬（国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ））：それぞれ５．５６ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ、４．５６ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ、２．５６ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬのＨＩＶ−１を含有するＨＩＶ−１  ＲＮＡ第２次国際標準品（ＮＩＢＳＣコード：９７／６５０）、ＨＩＶ−１  ＲＮＡワーキング試薬２（ＮＩＢＳＣコード：９９／６３６）およびＨＩＶ−１  ＲＮＡワーキング試薬３（ＮＩＢＳＣコード：０５／１５８）を参照血漿として用い、外部ＨＩＶ−１標準プラスミドを較正した。外部ＨＩＶ−１を算出し、１ＩＵ＝０．５５コピーの変換係数を出した。ＨＩＶ−１遺伝子型Ｍ群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＥ、Ｆ、Ｇ、ＡＡ−ＧＨ）、Ｎ群およびＯ群を含むＨＩＶ−１  ＲＮＡ遺伝子型第１次国際参照パネル（ＮＩＢＳＣコード：０１／４６６）を用いて、自前のアッセイの特異性を決定した。
【００５６】
使用した市販のＨＩＶ−１ウイルス負荷キット
ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１（ＡＲＴ）（Ａｂｂｏｔｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社）については、磁気粒子技法を用いて１ｍＬの血漿から抽出した核酸を捕捉するＡｂｂｏｔｔ  ｍ１０００ｓｐ自動試料調製システムを用いて血漿ＲＮＡを抽出した。Ａｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔ機器にて増幅を行ったが、それはＨＩＶ−１のインテグラーゼ領域を標的とした。
【００５７】
ＣＯＢＡＳ  Ａｍｐｌｉｐｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｓ  ＨＩＶ−１検査（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）は、一般のシリカに基づいた捕捉法を用いた、ＣＯＢＡＳ  Ａｍｐｌｉｐｒｅｐ機器での核酸の単離に、ＨＩＶ−１のｇａｇ領域を標的とする、自動増幅とＡＭＰＬＩＬＩＮＫ３．１．１ソフトウエアを用いたＣＯＢＡＳ（登録商標）Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アナライザにおける検出とを組み合わせた。双方のアッセイの作動域は、４０〜１０７コピー／ｍＬである。
【００５８】
ＨＩＶ患者の試料
患者の試料は、シンガポール国立ＨＩＶリファレンスセンターの感染症センターの同意したＨＩＶ−１感染患者（治療中および新たに診断された者の両方）から得た。採血から６時間以内に全血を３０００ｇにて１５分間遠心し、得られた血漿を使用まで−８０℃で保存した（すなわち、市販のアッセイおよび自前のアッセイによってバッチ処理した）。
【００５９】
タントクセン病院（シンガポール）の微生物学研究室および国立大学病院（シンガポール）の分子診断センターそれぞれによって実施されたＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１検査（ＡＲＴ）およびＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｓ  ＨＩＶ−１検査（ＣＴＭ）により、ＨＩＶ−１ウイルス負荷をモニターし、それらの検査は製造元のプロトコルに基づいて行った。
【００６０】
ＲＮＡの抽出
抽出に先立って４℃にて２４，０００×ｇで６０分間超遠心した凍結（−８０℃）血漿１ｍＬから、ウイルスＲＮＡを抽出した。８００μＬの上清を廃棄し、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ、ヒルデン、カタログ番号５２９０６）を用い、製造元のプロトコルに従って、ウイルスのペレットを含有する血漿の残りの２００μＬをＲＮＡの抽出に使用した。５０μＬのＡＶＥ緩衝液にて精製ＲＮＡを溶出し、−８０℃で保存した。
【００６１】
リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲアッセイ）
サーマルサイクラーにて、１０μＬのＲＮＡ試料と、１００コピーのＩＣ分子（配列番号４）と、最終濃度０．３μＭの順方向／逆方向のプライマー（それぞれ、配列番号１および配列番号２）と、各０．１μＭでの双方のプローブ（配列番号３と５）を含有する合計２５μＬの反応容量で、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ワンステップ定量ＲＴ−ＰＣＲシステムマスターミックス試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カタログ番号１１７３２）を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。以下の工程を用い、つまり、５５℃にて３０分間の逆転写および９５℃にて２．５分間の最初の変性の後、９５℃にて１７秒間の変性、６５℃にて３１秒間のアニーリング、および６８℃にて３２秒間の伸長を行い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国、ラホヤ）によって熱サイクリングを行った。サイクルは４８回繰り返した。各サイクルの６５℃の工程にて蛍光検出を読み取った結果、陽性試料を示した。
標的とＩＣの双方のデータ解析のサイクル閾値（Ｃｔ）の決定に、適応ベースラインモードを用いた。必要に応じてサイクル閾値の手動調整を行いバックグラウンド蛍光を考慮した。日常における臨床使用を模倣するため、単回決定を行った。各試料ランには２つの陰性対照を含め、汚染を排除した。
【００６２】
ＨＩＶウイルス負荷の定量化
臨床試料をアッセイする際、較正曲線として合成プラスミド標準希釈物を用いた。各プラスミド希釈レベルの複製を用いてサイクル数、Ｃｔ値に対するμＬ当たりのコピーの較正曲線を生成して反応当たりのＨＩＶ−１  ＲＮＡのコピーを決定した。較正曲線に対して生成したＣｔ値を外挿することによって臨床試料のウイルス負荷を決定した。溶出容量から使用される試料容量を考慮して各試料についてのｍＬ当たりのウイルスＲＮＡコピーの最終濃度を算出した。ＩＣの決定したＣｔ値を用いてＰＣＲの阻害を検査した。同等のＥＳに比べて２サイクル分を超えて遅延したＩＣのＣｔ値を持つ試料は、ＰＣＲ阻害のため無効とみなし、反復した。
【００６３】
自前のアッセイの評価
Ｓｉｎｇ−ＩＨの予備評価には、線形の作動域、分析感度および精度をＥＳを用いて決定する実験を伴った。臨床的に関連する亜型を検出する能力を、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ遺伝子型に関する第１次国際参照パネル（国立生物学的製剤研究所、英国、ハートフォードシャー州）に対して評価した。
【００６４】
製造元のプロトコルを用いて、シンガポールの２つの異なった研究室において、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１アッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社、米国、デス・プレーンズ）とＣＯＢＡＳ  Ｔａｑｍａｎ  ＨＩＶ−１検査（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、ニュージャージー州、ブランチバーグ）によって、患者試料におけるＨＩＶ−１ウイルスの負荷を決定した。市販のアッセイの製造元によって提供された定量化範囲は、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１（４０〜１０７コピー／ｍＬ）およびＣＯＢＡＳ  Ｔａｑｍａｎ  ＨＩＶ−１（４８〜１０７コピー／ｍＬ）であった。
【００６５】
統計的解析
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ  ２０００（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国）およびＳｔａｔａ／ＩＣ  １１．０（Ｓｔａｔａ社、米国、カレッジステーション）を統計的解析に用いた。臨床試料については、比較ヒストグラムを用いて、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１とＣＯＢＡＳ  Ｔａｑｍａｎ  ＨＩＶ−１のアッセイと比較してＳｉｎｇ−ＩＨで観察されたｌｏｇ１０変換ウイルス負荷の分布を評価した。ブランド・アルトマンプロットを用いて、ＩＨアッセイと市販キットとの一致を判定した。ブランド・アルトマン解析は、連続尺度で測定する２つの手段の間の一致の測定である。手短にいうと、データ対のｌｏｇ１０変換値の差異は、横軸上のｌｏｇ１０変換値の平均値に対して縦軸上にグラフ表示された。偏りを反映するｌｏｇ１０対の差異の平均値、および一致の限界（平均値±２標準偏差）を図にプロットした。プロビット回帰解析を用いて、定量の理論的下限を決定した。
【００６６】
結果
作動域の線形性
希釈レベル当たり６回の反復アッセイから決定されたＣｔ値の平均値に基づいて自前のアッセイ（Ｓｉｎｇ−ＩＨ）の作動域の線形性を確定した。標的として用いた３つの異なるロットからの８つの１０倍連続希釈したＥＳプラスミドに６回アッセイのそれぞれを適用した。対数にてこれらの値をＥＳプラスミドの初期濃度に対してプロットした。１０コピー／μＬ〜１０８コピー／μＬの作動域の線形回帰の係数（ｒ２）は、図３に示すようにｒ２＝０．９９９であった。このことは、アッセイが定量範囲にわたって線形であることを示している。この定量の作動域については、ＲＴ−ＰＣＲの効率は、９５．６％の高さである。
【００６７】
解析感度
それぞれＷＨＯのＨＩＶ−１  ＲＮＡ第２次国際標準品４０，０００、１２，５００、４，０００、１，２５０、４００、１２５、４０および１２コピー／ｍＬのそれぞれと同等である１．６×１０４コピー／ｍＬ〜５コピー／ｍＬのプラスミド標準（ＥＳプラスミド）の連続希釈物を用いて、自前のアッセイの解析感度を確定した。希釈したＥＳプラスミドを、１ラン内で４回の反復でテストし、４回の個別ランを行った。プロビット回帰を用いて、用量反応モデルに従って予測反応率を決定した。図４に示すように、６１．５コピー／ｍＬの濃度で、検出確率は９５％以上（９５％信頼区間、４９．５〜８９．５コピー／ｍＬ）であった。自前の検出限界は、１００％の検出確率で１００コピー／ｍＬである。
【００６８】
精度
単一バッチ実験でテストした既知の７ｌｏｇ１０コピー／μＬを含有する合成プラスミド標準についての８回の反復結果によって、アッセイ内精度を評価した。算出したウイルス負荷の平均値は、６．９２ｌｏｇ１０コピー／μＬであり、ＣＶは０．８２５％で、ＳＤは０．０４ｌｏｇ１０であった。自前のアッセイが、検出限界に近いウイルス負荷の正確な定量化を確実に行えるよう、プラスミド標準を１．０ｌｏｇ１０コピー／μＬに希釈し、単一実験設定で８回の反復でアッセイした。測定された値の平均値は、０．５ｌｏｇ１０コピー／μＬであり、ＣＶは２．２％、ＳＤは０．２３ｌｏｇ１０であった。
【００６９】
６つの異なった実験を用いて、アッセイ間の再現性を得たが、表１に示すように、１０コピー／反応〜１０８コピー／反応の標準プラスミドスカラー希釈すべてについて、４．２％未満のＣｔ値のＣＶ％を示した。
【表１】
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表１．外部プラスミド標準を用いた自前のアッセイのアッセイ間の変動性
【００７０】
特異性（ＨＩＶ−１の群および／または亜型の検出）
ＨＩＶ−１  ＲＮＡ遺伝子型に関する第１次国際参照パネル（国立生物学的製剤研究所、英国、ハートフォードシャー州）を定性的にアッセイすることによって、ＨＩＶ−１亜型の範囲を検出する能力を評価した。ＮＣＢＩＳ遺伝子型パネルの遺伝子型のうちで、自前のアッセイは、Ｍ群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＥ、Ｆ、Ｇ、ＡＡ−ＧＨ）、およびＮ群を３３．６〜３８．５の間のＣｔ読み取り値で検出することができた。Ｏ群はパネルからは検出されなかった。このパネルは定量的標準ではないので、定量的比較は行わなかった。
【００７１】
３２９人の患者試料による自前のアッセイの評価
３２９人のＨＩＶ−１陽性患者の血漿の無作為群を用いて、市販キット、ＡＲＴおよびＣＴＭに対する自前のアッセイの性能を比較した。市販のアッセイおよび自前のアッセイに５０コピー／ｍＬの定量化可能なレベルのカットオフを用いて、自前のアッセイと市販のアッセイ（ＡＲＴ：ｎ＝９７；ＣＴＭ：ｎ＝１１８）の双方による５０コピー／ｍＬを超えるウイルス負荷によって２１５試料を定量化した。図５に示すように、アッセイ間の一致は、ブランド・アルトマンモデル（Ｂｌａｎｄ、１９９９年）を用いて評価した。自前とＣＴＭ、自前とＡＲＴによるｌｏｇ１０ウイルス負荷の間の平均差異は、それぞれ、−０．４８（−１．６１〜１．４１の限界）および−０．２２（−１．３４〜０．９５の限界）であった。
【００７２】
ブランド・アルトマン解析に従って、ｌｏｇ１０対差異の間で、６１％（自前／ＡＲＴ）および４３％（自前／ＣＴＭ）は、絶対値０．５ｌｏｇ１０未満であり；３３％（自前／ＡＲＴ）および４２％（自前／ＣＴＭ）は、絶対値０．５〜１．０ｌｏｇ１０の区間の範囲内であり、６％（自前／ＡＲＴ）および１５％（自前／ＣＴＭ）は、１．０ｌｏｇ１０を越えるものであった。以前発表された研究において、−０．２４〜０．５１におよぶＡＲＴとＣＴＭの間の平均差異が示されていた（Ｂｒａｕｎ、２００７年；Ｆｏｕｌｏｎｇｎｅ、２００６年；Ｇｕｅｕｄｉｎ、２００７年）ので、自前／ＣＴＭと自前／ＡＲＴの間の不一致は驚くべきことではない。さらに、ブランド・アルトマンプロットの双方で、漏斗効果は認められなかった。このことは、自前のアッセイが、ＣＯＢＡＳ  Ｔａｑｍａｎ  ＨＩＶ−１検査に比べてＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１検査とより良好に相関することを示した。このことは、ｒ値がそれぞれ０．８７と０．７９であった自前／ＡＲＴと自前／ＣＴＭのウイルス負荷定量の線形回帰解析からもさらに分かる。
【００７３】
頻度分布を用いて、自前とＣＴＭのウイルス負荷の読み取り値分布の間にいくらかの差異があった。３．５３〜３．７９ｌｏｇ１０の自前とＣＴＭのウイルス負荷の読み取り値の間のモーダルピークにシフトがあった。１０５コピー／ｍＬにおけるウイルスの読み取りで不一致が認められ、ＣＴＭは、試料が１０３〜１０４コピー／ｍｌの範囲で分布する自前の定量に比べてそのように高いウイルス負荷の読み取りを伴ったさらに多い試料を示した。一方で、図６ｂは、自前のアッセイとＡＲＴアッセイによって得られるＨＩＶ−１ウイルス負荷値の頻度分布における類似性を明らかにした。２つのアッセイは、３．４ｌｏｇ１０にて類似のモーダルピークを示した。
【００７４】
臨床的に関連する２００コピー／ｍｌのカットオフでの感度および特異性
それぞれ、１７８人と１５１人の患者の試料における２００コピー／ｍｌの臨床カットオフでのＡｂｂｏｔｔアッセイとＲｏｃｈｅアッセイに対して、自前のアッセイの性能を評価した。標準としてのＡｂｂｏｔｔアッセイに対して、自前のアッセイは９６．８％の感度と９６．４％の特異性を有した。標準としてのＲｏｃｈｅにおいては、感度は９９．１％で、特異性は１００％であった。Ａｂｂｏｔｔアッセイでは、２００コピー／ｍｌを超えるのは９５の陽性試料中３つであり、それらは、自前のアッセイでは２００コピー／ｍＬ未満であると報告された（７１、９７、および１８６コピー／ｍｌ）。Ｒｏｃｈｅアッセイによって２００コピー／ｍｌを超えると報告された１１８の試料中たった１つの試料は、自前のアッセイにより２００コピー／ｍｌ未満であると報告された（１９１コピー／ｍｌ）。
【００７５】
自前のＨＩＶ−１ウイルス負荷アッセイ検査の低費用化
ＨＩＶ患者は、およそ３ヵ月ごとに実施されるＨＩＶ−１ウイルス負荷検査を受ける必要がある。自前のアッセイは、ＨＩＶ患者の金銭的負担を軽くする主な利益をもたらした。現在、シンガポールの病院では、市販のＨＩＶ−１キット検査は一回の検査につき約２００シンガポールドル（１３４米ドル）かかる。表２は、患者の試料１つのランを実行するための自前のＨＩＶ−１ウイルス負荷アッセイの試薬費と消耗品費の内訳を示す。完全なライセンスと研究室費用と共に、自前のアッセイの実行費用は、およそ２０シンガポールドル（すなわち、１３米ドル）であろう。これにより、患者にとってさらに安価な選択可能検査が確かに提供されるであろう。
【表２】
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表２．自前のＨＩＶ−１ウイルス負荷アッセイの費用の内訳
【００７６】
自前のアッセイは、反応当たりｌｏｇ１〜８の範囲にわたって一貫した結果を示し、プロビット解析による検出の良好な下限、最少限のラン間変動、およびＲｏｃｈｅ  ＣＯＢＡＳ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ（Ｖｅｒ  １．５）の限界である（Ｄｒｏｓｔｅｎ  Ｃら、２００６年）Ｏ群を除いて、あらゆる亜型の定量化も認められた。ブランド・アルトマン解析は、ベースラインから約１ｌｏｇである２つのＳＤ限界と共に匹敵する結果を示した。自前のアッセイは、２００コピー／ｍｌの臨床的に関連するカットオフにおいて正確であった。このカットオフで不一致を示す小数の試料は、さらに低い値にもかかわらず、自前のアッセイによってすべて検出された。
【００７７】
実施例２
実施例１で実質的に説明したような実験を実施例２で繰り返し、結果を提供した。
【００７８】
解析感度
それぞれ、ＷＨＯのＨＩＶ−１  ＲＮＡ第２次国際標準品４０，０００、１２，５００、４，０００、１，２５０、４００、１２５、４０および１２コピー／ｍＬと同等である、１．６×１０４コピー／ｍｌ〜５コピー／ｍｌのプラスミド標準（ＥＳプラスミド）の連続希釈を用いて、自前のアッセイの解析感度を確定した。希釈したＥＳプラスミドを１ラン内で４回の反復でテストし、希釈物当たり４回のランを行った。プロビット回帰分析を以下に示す。図７に見られるように、１５４コピー／ｍｌの濃度で、検出確率は９５％以上（９５％信頼区間、１２３．３〜２２３．３コピー／ｍｌ）であった。Ｓｉｎｇ−ＩＨの検出限界は、１００％の検出確率で２００コピー／ｍｌである。
【００７９】
３２９人の患者の試料による自前のアッセイの評価
積極的に経過観察している３２９人のＨＩＶ−１患者の血漿試料を、ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１アッセイおよびＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１アッセイとの比較で評価した。市販のアッセイおよび自前のアッセイに５０コピー／ｍｌの定量化可能レベルのカットオフを用いて、自前のアッセイと市販のアッセイ（ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１：ｎ＝１１９、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１：ｎ＝１０８）の双方による５０コピー／ｍＬを超えるウイルス負荷によって２２７試料を定量化した。
【００８０】
ブランド・アルトマン解析を行った（図８Ａおよび図８Ｂ）。Ｓｉｎｇ−ＩＨとＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１のｌｏｇ１０変換値の間の平均差異は、−０．０９４（−１．１８〜０．９９の間の値の９５％）であった。Ｓｉｎｇ−ＩＨとＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１の間の相当する値は、０．０５６（−０．８３〜０．９４の間の値の９５％）であった。ブランド・アルトマン解析によれば、ｌｏｇ１０対差異のうちで、双方の比較における値の６９％は０．５ｌｏｇ１０の範囲内であった。Ｓｉｎｇ−ＩＨ／ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１の値の２５％およびＳｉｎｇ−ＩＨ／ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１の値の３０％は、絶対値０．５〜１．０ｌｏｇ１０の区間の範囲内であった。Ｓｉｎｇ−ＩＨ／ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１の値の６％およびＳｉｎｇ−ＩＨ／ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１の値の１％は、絶対値１．０ｌｏｇ１０の差異より大きいことを示した。ブランド・アルトマンプロットの双方で漏斗効果は認められなかった。Ｓｉｎｇ−ＩＨ／ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１とＳｉｎｇ−ＩＨ／ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１の比較の線形回帰の値はそれぞれ０．７９および０．９０であった。平均ｌｏｇ１０値に対するｌｏｇ１０ウイルス負荷の差異の線形回帰解析は有意な相関を示さなかった。Ｓｉｎｇ−ＩＨ／ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１の比較については、傾き−０．０３〜０．１７の９５％信頼区間、およびＳｉｎｇ−ＩＨ／ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１については、傾き−０．０６〜０．１１の９５％信頼区間。
【００８１】
平均差異は、平均値の範囲にわたって均一に分布し、それによって高い定量化値と低い定量化値の間での差異に偏りがないことを裏付ける。回帰解析は、ブランド・アルトマンプロットにおける平均Ｌｏｇ１０値を伴ったｌｏｇ１０変換値における差異間に統計的に有意な相関がないことを示した。
【００８２】
ＳＩＮＧ−ＩＨ、ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１およびＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１のウイルス負荷読み取りの頻度分布は、ペアワイズ比較における類似の単峰型分布を反映した（図９Ａおよび９Ｂ）。ＳＩＮＧ−ＩＨとＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１アッセイを比較する１１９の試料については、モーダルピークはそれぞれ３．６８と３．７９ｌｏｇ１０であった。ＳＩＮＧ−ＩＨとＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１アッセイを比較する１０８の試料については、モーダルピークはそれぞれ３．４９と３．４０ｌｏｇ１０であった。
【００８３】
臨床的に関連する２００コピー／ｍｌのカットオフでの感度と特異性
臨床的な感度を評価するために、２００コピー／ｍｌのカットオフにてＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１アッセイおよびＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１アッセイに対して、ＩＨ−アッセイの性能を評価した。
【００８４】
臨床的な感度と特異性の分析について、２００コピー／ｍＬのＳｉｎｇ−ＩＨの下限を選択した。分析は、幅広く遺伝的という視点において、「完全な」ＨＩＶ−１  ＲＮＡウイルス負荷アッセイはないということは当該技術で周知であるが、市販のアッセイを「最も理想的な標準」と仮定した。
【００８５】
ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１に対して、感度は９９．１％であり、特異性は１００％であった。Ｒｏｃｈｅアッセイによって２００コピー／ｍｌを超えると報告された１１８の試料中たった１つの試料は、自前のアッセイによって２００コピー／ｍｌ未満であると報告された。
【００８６】
標準としてのＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１アッセイに対して、ＩＨ−アッセイは９６．８％の感度と９６．４％の特異性を有した。双方のアッセイによって９２の試料が２００コピー／ｍＬを超えるウイルス負荷と共に報告された。このカットオフにて４つの試料が自前のアッセイで陽性と報告されたが、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１では陰性であり、自前のアッセイによって陰性であった３試料が、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＨＩＶ−１によっては陽性であった。アッセイ阻害は、１つの臨床試料のみで検出され、この解析では反復結果を用いた。
【００８７】
Ｓｉｎｇ−ＩＨと市販のアッセイを比較するｌｏｇ１０変換のウイルス負荷の平均差異は、０．５ｌｏｇ１０未満であった。全体として、９６％の試料が、Ｓｉｎｇ−ＩＨと競合アッセイの間で１ｌｏｇ１０の差異の範囲内であった。２００コピー／ｍｌの臨床的に関連するカットオフでは、Ｓｉｎｇ−ＩＨは、市販のアッセイと０．９５カッパにて優れた一致を有した。
【００８８】
参考文献
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６．Ｇｕｅｕｄｉｎ，Ｍ．、Ｊ．Ｃ．Ｐｌａｎｔｉｅｒ、Ｖ．Ｌｅｍｅｅ、Ｍ．Ｐ．Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｌ．Ｃｈａｒｔｉｅｒ、Ｔ．Ｂｏｕｒｌｅｔ、Ａ．Ｒｕｆｆａｕｌｔ、Ｆ．Ｄａｍｏｎｄ、Ｍ．ＶｒａｙおよびＦ．Ｓｉｍｏｎ、２００７年、「ＨＩＶ−１亜型のためのＲｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ＴａｑＭａｎ方式とＡｂｂｏｔｔリアルタイム抽出定量化方式の評価」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、４４：５００〜５０５頁。
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８．Ｒｅｋｈｖｉａｓｈｖｉｌｉ  Ｎ、Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｗ、Ｍａｒｉｎｄａ  Ｅ、Ｇｏｎｉｎ  Ｒ、Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｇ、Ｍｃｌｎｔｙｒｅ  Ｊ、Ｗｏｏｄ  Ｒ、「ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の定量のための蛍光性ＬＵＸプライマーを用いた自前のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの臨床性能」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７年１２月、１４６（１−２）：１４〜２１頁）。
９．Ｓｃｈｕｔｔｅｎ，Ｍ．、Ｄ．Ｐｅｔｅｒｓ、Ｎ．Ｋ．Ｂａｃｋ、Ｍ．Ｂｅｌｄ、Ｋ．Ｂｅｕｓｅｌｉｎｃｋ、Ｖ．Ｆｏｕｌｏｎｇｎｅ、Ａ．Ｍ．Ｇｅｒｅｔｔｉ、Ｌ．Ｐａｎｄｉａｎｉ、Ｃ．Ｔｉｅｍａｎｎ、およびＨ．Ｇ．Ｎｉｅｓｔｅｒｓ、２００７年、「ヒト免疫不全ウイルス１型およびＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡの定量的検出のための新Ａｂｂｏｔｔリアルタイムアッセイの多施設評価」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４５：１７１２〜１７１７頁。
１０．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｄｇ／ｅｎ／
１１．「ＨＩＶ配列の概要」、２００８年、Ｋｕｉｋｅｎ  Ｃら、編集、理論生物学および生物物理学グループ発行、ロスアラモス国立研究所、ニューメキシコ州、ＬＡ−ＵＲ  ０６−０６８０。
１２．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｖ．Ａ．ら、Ｔｏｐｉｃｓ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００９年；１７（５）：１３８〜１４５頁。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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