(57)【要約】本発明は、細胞培養技法の分野に関する。本発明は、ＮｏＣＲタンパク質、特にＴＩＰ−５の発現を低下させることによって達成された、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の発現が増大した生産ホスト細胞系に関する。それらの細胞系は、対照細胞系に比べて改良された分泌及び成長特性を有する。本発明は、さらに記載された方法によって生成された細胞を使用してタンパク質を生産する方法に関する。
2012526535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるリコンビナントタンパク質の発現を増大させる方法であって、
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させること、及び
ｃ．  タンパク質の発現を可能にする条件で該細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項２】
ｒＤＮＡのサイレンシングが低下していない細胞に比べて、細胞においてリコンビナントタンパク質の発現が増大しており、好ましくは該増大が、２０％〜１００％、さらに好ましくは２０％〜３００％であり、最も好ましくは２０％よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）が、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素のノックダウン又はノックアウトを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＮｏＲＣ構成要素が、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＴＩＰ−５が、ノックアウトされている、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ＴＩＰ−５サイレンシングベクターが：
ａ．  配列番号１、配列番号２、配列番号８もしくは配列番号９記載のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．  配列番号３、配列番号４、配列番号１０もしくは配列番号１１記載のｍｉＲＮＡ
を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＳＮＦ２Ｈがノックアウトされている、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
細胞において関心が持たれるタンパク質を生産する方法であって、
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させること、
ｃ．  関心が持たれる該タンパク質の発現を可能にする条件で該細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項９】
ｄ．  関心が持たれるタンパク質を精製すること
を追加的に含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）が、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素のノックダウン又はノックアウトを含む、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
ＮｏＲＣ構成要素が、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
リコンビナントタンパク質の生産のためにホスト細胞を生成させる方法であって、
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させること、
ｃ．  場合により単一細胞クローンを選択すること、
ｄ．  ホスト細胞を得ること
を含む方法。
【請求項１３】
ステップｂ）が、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素のノックダウン又はノックアウトを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＮｏＲＣ構成要素が、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４記載の方法のいずれかにより生成された細胞。
【請求項１６】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、好ましくはＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１、最も好ましくはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である、請求項１５記載の細胞。
【請求項１７】
ａ．  配列番号１、配列番号２、配列番号８もしくは配列番号９記載のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．  配列番号３、配列番号４、配列番号１０もしくは配列番号１１記載のｍｉＲＮＡ
を含む、ＴＩＰ−５サイレンシングベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載のＴＩＰ−５サイレンシングベクター及び場合により関心が持たれるタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを有するベクターを含む細胞。
【請求項１９】
ＴＩＰ−５がノックアウトされた細胞であって、場合により関心が持たれるタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを包含するベクターを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、細胞培養技法の分野に関する。それは、ＮｏＲＣタンパク質、特にＴＩＰ−５の発現低下により達成されたリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の発現増大を有する生産ホスト細胞系に関する。それらの細胞系は、対照細胞系に比べて改良された分泌特性及び成長特性を有する。
【０００２】
背景
哺乳動物高生産細胞系の選択は、バイオ医薬品製造工業にとって相変わらず大きな課題である。ＤＮＡから産物翻訳までの途中に哺乳動物生産細胞系の比生産性を限定しうる大きなボトルネックがある。既存のリボソームの翻訳効率を上げること又は新しいリボソーム生産（リボソームのバイオジェネシス）により翻訳能力を高めることのいずれかによって、細胞はタンパク質の合成速度をアップレギュレーションすることができる。合計核転写の約８０％がリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の合成専用であることから、リボソームのバイオジェネシスは、哺乳動物細胞の主要な代謝活性の一つである。リボソームの集合は、核小体の中で起こり、４種のｒＲＮＡ（その後１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓにプロセシングされる４５ＳプレｒＲＮＡ、及び５Ｓ  ｒＲＮＡ）及び約８０種のリボソームタンパク質（ｒ−タンパク質）の調和した発現を必要とする。４５ＳプレｒＲＮＡはポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ  Ｉ）によって核小体内で転写され、５Ｓ  ＲＮＡは核小体周辺でＰｏｌ  ＩＩＩによって転写され、次に核小体に搬入され、そしてｒ−タンパク質はＰｏｌ  ＩＩによって転写される。したがって、リボソームのバイオジェネシスは異なる区画において作動する、異なるポリメラーゼによる転写の編成を必要とする。哺乳動物細胞において、これらの過程は大部分が未知である（Santoro,R. and Grummt,I. (2001). Molecular mechanisms mediating methylation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. Mol Cell 8, 719-725）。
【０００３】
４５ＳプレｒＲＮＡの転写は、リボソームバイオジェネシスの重要なステップである。哺乳動物半数体ゲノムは、約２００個のリボソームＲＮＡ遺伝子を含み、その一部だけが任意の与えられた時間に転写され、残りはサイレントなままである（Santoro,R., Li,J., and Grummt,I. (2002). The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet. 32, 393-396）。活性遺伝子及びサイレントな遺伝子は、クロマチン配置に関して異なり：活性遺伝子は真正染色質の構造を有するが、サイレントな遺伝子は異質染色質である。活性ｒＲＮＡ遺伝子のプロモーターはＣｐＧメチル化を有さず、アセチル化ヒストンと結合している。サイレントな遺伝子には正反対のことが当てはまる。
【０００４】
転写的にサイレントなｒＲＮＡ遺伝子の存在は、ｒＲＮＡの合成及びリボソーム生産のための制限因子に相当する。細胞は、各遺伝子の転写活性を変更することによって、かつ／又は活性遺伝子の数を変更することによってｒＤＮＡの転写レベルをモデュレーションすることができると仮定されている。しかし、４５ＳプレｒＲＮＡの合成レベルとｒＲＮＡ遺伝子数との間に満足な関係は見出されていない。例えば、S. cerevisiaeでは、ｒＲＮＡ遺伝子数を約３分の２だけ減少させても合計ｒＲＮＡ生産に影響しなかった。同様に、異なる数のｒＲＮＡコピーを有するトウモロコシ近交系及び異数体ニワトリ細胞は、同レベルのｒＲＮＡ転写を示した。
【０００５】
ｒＤＮＡはリボソームの主要構成要素に相当することから、これらの遺伝子のサイレンシングは、リボソームのバイオジェネシスを制限する結果としてタンパク質翻訳に制限を招き、したがって最終的にタンパク質合成の低下につながる。
【０００６】
バイオ医薬品生産細胞において、これは、細胞の全生産能力に制限を生み出すものであり、治療用タンパク質生産の比生産性の低下を意味する。その結果、工業生産プロセスではそれが全体的なタンパク質収量の減少につながるであろう。
【０００７】
比生産性（Ｐｓｐｅｃ）に次いでプロセス収量（Ｙ）を決定する他の因子は、所望のタンパク質を生産する生存細胞の時間積分であるＩＶＣである。この関係は、次式：Ｙ＝Ｐｓｐｅｃ×ＩＶＣによって表される。したがって、細胞成長を改良することによりホスト細胞の生産能力もしくはバイオリアクター中の生存細胞密度のいずれかを増大させる、又は理想的には両パラメーターを同時に増大させる、差し迫った必要がある。
【０００８】
発明の概要
本発明は、上記問題を解決するものであり、ＮｏＲＣ（核小体リモデリング複合体；McStay,B. and Grummt,I. (2008). The epigenetics of rRNA genes: from molecular to chromosome biology. Annu. Rev Cell Dev. Biol 24, 131-157）の一サブユニットであるＴＩＰ−５のノックダウンがサイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数を減少させ、ｒＲＮＡの転写をアップレギュレーションし、リボソーム合成を高め、リコンビナントタンパク質の生産を増大させることを示す。
【０００９】
本出願のデータは、転写的にコンピテントなｒＲＮＡ遺伝子の数がリボソームの合成を限定することを実証している。リボソームＲＮＡ遺伝子のエピジェネティク操作は、バイオ医薬品の製造を改良するための新たな可能性を与え、翻訳機構を支配する複雑なレギュレーションネットワークに新規な洞察を提供する。
【００１０】
本出願は、ＴＩＰ−５のノックダウンがｒＤＮＡリピートでの抑制性クロマチンマークの消失を誘導し、ｒＤＮＡの転写を高め、核小体の構造を変更し、細胞の成長及び増殖を促進することを示す。
【００１１】
活性ｒＲＮＡ遺伝子の数を増大させることが細胞の成長及び増殖に影響するかどうかを判定するために、本発明者らは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によっていくつかのｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞を分析した。
【００１２】
驚くべきことに初めて本発明者らは、本出願においてサイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の操作された減少が、ｒＲＮＡ及びリボソームの生産強化と、そして結果として哺乳動物細胞のさらに高い生産性と関係しうることを示す。
【００１３】
予想外に本出願は、異なる哺乳動物細胞系におけるＴＩＰ−５のノックダウンがより速い細胞周期の進行及び細胞増殖の増大へと導くことを示すデータを追加的に提供する。
【００１４】
この結果は、先行技術（国際公開公報第２００９／０１７６７０号）に記載されたものと対照的である。以前にＴＩＰ−５は、包括的ｍｉＲＮＡ選別においてＦａｓに関するＲａｓ介在性エピジェネティックサイレンシングエフェクター（ＲＥＳＥ）として機能することが同定されている（国際公開公報第２００９／０１７６７０号）。Ｒａｓは、細胞トランスフォーメーション及び腫瘍形成に関与する周知のガン遺伝子であり、ヒトのガンでしばしば突然変異又は過剰発現される。したがって、先行技術は、ＴＩＰ−５などのＲａｓエフェクター上の発現減少が細胞増殖の阻害を招くことを主張している。
【００１５】
これを検証するために、本発明者らは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞を分析する。しかしながら図４Ａ、Ｂに示すように、Ｓ期におけるｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ−５細胞数は、対照細胞よりもｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞の方が顕著に高い。これらの結果に一致して、ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞は、新生ＤＮＡへの５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込み増大及びより高レベルのサイクリンＡを示す（図４Ｃ）。
【００１６】
追加的に本発明者らは、ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５、ｓｈＲＮＡ対照及び親のＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の間で細胞増殖速度を比較する（図４Ｄ、Ｆ）。驚くことに、そして先行技術の報告とは対照的に、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現しているＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方が、対照細胞よりも速い速度で増殖する。したがって、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の減少は、細胞代謝に影響を及ぼす。本発明は、驚くことにＴＩＰ５の枯渇及び結果としてのｒＤＮＡサイレンシングの減少が細胞増殖を高めることを示す。
【００１７】
本出願は、対照細胞系に比べてＴＩＰ５枯渇細胞の方が、タンパク質生産が顕著に増大することを実証する（実施例６、図６参照）。ＴＩＰ５枯渇細胞におけるタンパク質生産増大は、対照細胞系に比べて２倍よりも大きい、４倍よりも大きい、５倍よりも大きい、６倍よりも大きい、１０倍よりも大きい、又は２〜１０倍である。これらのデータは、ＴＩＰ５の枯渇が異種タンパク質の生産を増大させることを示す。本出願は、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の減少がリボソーム合成を高め、細胞のリコンビナントタンパク質生産能力を増大させることを示す。
【００１８】
本発明において本発明者らは、最終的にリコンビナントタンパク質の分泌を高める利点を有する、ＴＩＰ−５低下によりｒＲＮＡ転写、リボソームバイオジェネシス及び翻訳を増大させる新しい方法を提供する。
【００１９】
さらに本発明者らは、ＴＩＰ−５の枯渇がより速い細胞周期の進行及び改良された細胞成長へと導くことを実証する。
【００２０】
細胞成長の強化は、バイオ医薬品の生産プロセスの複数局面に大きな影響を及ぼす：
−  細胞系の発達における時間の短縮を招く、より短い細胞世代時間。世代時間は、好ましくは２４時間、好ましくは２０〜２４時間、さらに好ましくは１５〜２４時間又は１５〜２２時間、最も好ましくは１０〜２４時間である。
−  単一細胞クローニング後のより高い効率及びその後のより速い成長。
−  特に大規模バイオリアクターに接種する場合に、より短いスケールアップ時間。
−  ＩＶＣと産物収量との間の比例関係が原因の、より高い発酵時間あたりの産物収量。逆に低いＩＶＣは、より低い収量及び／又はより長い発酵時間を引き起こす。収量は、好ましくは１０％、より好ましくは２０％、最も好ましくは３０％増大する。
【００２１】
これは、真核細胞ベースの生産プロセスにおいてタンパク質の収量増大を容易にする。それによって、そのようなプロセスの製品コストが減少し、それと同時に治療用タンパク質の研究調査、診断、臨床試験又は市場供給に必要なバッチ数が減少する。さらに、多くの場合に前臨床試験に十分な量の製品を生成させることがスケジュールについて重大なワークパッケージであることから、本発明は薬開発をスピードアップする。
【００２２】
本発明は、診断目的、研究目的（ターゲットの同定、先導物の同定、先導物の最適化）又は市販されているもしくは臨床開発中の治療用タンパク質を製造するためのいずれかの１種又は数種の特異的タンパク質を生成させるために使用される全ての真核細胞の性質を強めるために使用することができる。
【００２３】
本発明によって提供される細胞系／ホスト細胞は、真核細胞ベースの生産プロセスにおいてタンパク質の収量を増大させることに役立つ。これは、そのようなプロセスの製品コストを低下させ、同時に治療用タンパク質の研究調査、診断、臨床試験又は市場供給に必要な材料を生成させるために生産する必要のあるバッチ数を低下させる。
【００２４】
さらに、多くの場合に前臨床試験に十分な量の材料を生成させることがスケジュールについて重大なワークパッケージであることから、本発明は薬開発をスピードアップする。
【００２５】
ＴＩＰ−５の発現が低下した、最適化されたホスト細胞系を、診断目的、研究目的（ターゲットの同定、先導物の同定、先導物の最適化）又は市販されているもしくは臨床開発中のいずれかの治療用タンパク質を製造するためのいずれかの１種又は数種の特異的タンパク質を生成させるために使用することができる。
【００２６】
同じ分泌経路を共有し、脂質小胞の中に等しく輸送される分泌型又は膜結合型タンパク質（表面レセプター、ＧＰＣＲ、メタロプロテアーゼ又はレセプターキナーゼなど）を発現又は生産するために、それらは等しく適用可能である。次にそれらのタンパク質は、細胞表面レセプターの機能を特徴づけることを目指す研究目的に、例えば表面タンパク質の生産及びその後の精製、結晶化及び／又は分析のために使用することができる。細胞表面レセプターが主要なクラスの薬物ターゲットであることから、これは、新しいヒト薬物療法を開発するために決定的に重要である。さらにこれは、細胞表面レセプターに関連する細胞内シグナル伝達複合体の研究のために、又は可溶性成長因子と、同じ細胞もしくは別の細胞上のそれらの対応するレセプターとの相互作用によって部分的に仲介される細胞間コミュニケーションの分析のために有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】げっ歯類及びヒト細胞系におけるＴＩＰ−５のノックダウンを示す図である。（Ａ）ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定発現しているＮＩＨ／３Ｔ３細胞ならびに（Ｂ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＴＩＰ５  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ。データをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して基準化する。
【図１Ｂ】げっ歯類及びヒト細胞系におけるＴＩＰ−５のノックダウンを示す図である。（Ａ）ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定発現しているＮＩＨ／３Ｔ３細胞ならびに（Ｂ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＴＩＰ５  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ。データをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して基準化する。
【図１Ｃ】げっ歯類及びヒト細胞系におけるＴＩＰ−５のノックダウンを示す図である。（Ｃ）安定なｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＮＩＨ／３Ｔ３、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＨＥＫ２９３Ｔ及びｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＴＩＰ５  ｍＲＮＡの半定量ＲＴ−ＰＣＲ。対照として、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図２Ａ】ＴＩＰ−５のノックダウンは、ｒＤＮＡメチル化の低下へと導くことを示す図である。（Ａ〜Ｃ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化を減少させる。上欄：分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を含む、（Ａ）マウス、（Ｂ）ヒト及び（Ｃ）チャイニーズハムスターのｒＤＮＡプロモーター領域の略図。黒丸はＣｐＧジヌクレオチドを示す。矢印は、ＨｐａＩＩで消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。下欄：ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２及び／又はｍｉＲＮＡ  ＴＩＰ５−１／２及び対照配列を安定発現している（Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞からｒＤＮＡ  ＣｐＧのメチル化レベルを測定する。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠如するＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化のＤＮＡを用いた増幅により計算された、合計ｒＤＮＡに対して基準化されたＨｐａＩＩ抵抗性ｒＤＮＡの量を表す。
【図２Ｂ】ＴＩＰ−５のノックダウンは、ｒＤＮＡメチル化の低下へと導くことを示す図である。（Ａ〜Ｃ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化を減少させる。上欄：分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を含む、（Ａ）マウス、（Ｂ）ヒト及び（Ｃ）チャイニーズハムスターのｒＤＮＡプロモーター領域の略図。黒丸はＣｐＧジヌクレオチドを示す。矢印は、ＨｐａＩＩで消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。下欄：ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２及び／又はｍｉＲＮＡ  ＴＩＰ５−１／２及び対照配列を安定発現している（Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞からｒＤＮＡ  ＣｐＧのメチル化レベルを測定する。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠如するＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化のＤＮＡを用いた増幅により計算された、合計ｒＤＮＡに対して基準化されたＨｐａＩＩ抵抗性ｒＤＮＡの量を表す。
【図２Ｃ】ＴＩＰ−５のノックダウンは、ｒＤＮＡメチル化の低下へと導くことを示す図である。（Ａ〜Ｃ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化を減少させる。上欄：分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を含む、（Ａ）マウス、（Ｂ）ヒト及び（Ｃ）チャイニーズハムスターのｒＤＮＡプロモーター領域の略図。黒丸はＣｐＧジヌクレオチドを示す。矢印は、ＨｐａＩＩで消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。下欄：ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２及び／又はｍｉＲＮＡ  ＴＩＰ５−１／２及び対照配列を安定発現している（Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞からｒＤＮＡ  ＣｐＧのメチル化レベルを測定する。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠如するＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化のＤＮＡを用いた増幅により計算された、合計ｒＤＮＡに対して基準化されたＨｐａＩＩ抵抗性ｒＤＮＡの量を表す。
【図２Ｄ】ＴＩＰ−５のノックダウンは、ｒＤＮＡメチル化の低下へと導くことを示す図である。（Ｄ、Ｅ）ＴＩＰ５の枯渇はｒＤＮＡ  ＣｐＧのメチル化レベルを減少させる。（Ａ）ｒＤＮＡの遺伝子間領域及び転写開始部位（＋１）を含むプロモーター領域ならびに（Ｂ）コード領域内の二つの領域を分析する。単一のマウスｒＤＮＡリピート及び分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を表す模式図。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠如するＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化のＤＮＡを用いた増幅により計算された、合計ｒＤＮＡに対して基準化されたＨｐａＩＩ抵抗性ｒＤＮＡの量を表す。
【図２Ｅ】ＴＩＰ−５のノックダウンは、ｒＤＮＡメチル化の低下へと導くことを示す図である。（Ｄ、Ｅ）ＴＩＰ５の枯渇はｒＤＮＡ  ＣｐＧのメチル化レベルを減少させる。（Ａ）ｒＤＮＡの遺伝子間領域及び転写開始部位（＋１）を含むプロモーター領域ならびに（Ｂ）コード領域内の二つの領域を分析する。単一のマウスｒＤＮＡリピート及び分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を表す模式図。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠如するＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化のＤＮＡを用いた増幅により計算された、合計ｒＤＮＡに対して基準化されたＨｐａＩＩ抵抗性ｒＤＮＡの量を表す。
【図３Ａ】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるｒＲＮＡレベルの増大を示す図である。（Ａ）ＴＩＰ５の枯渇はｒＲＮＡの合成を高める。安定なＮＩＨ／３Ｔ３及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞系のｑＲＴ−ＰＣＲベースの４５ＳプレｒＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して基準化する。
【図３Ｂ】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるｒＲＮＡレベルの増大を示す図である。（Ｂ）ｒＤＮＡ転写を同じ曝露時間後のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＢｒＵＴＰ取込みによって検出する。ＢｒＵＴＰシグナル（左欄）はＴＩＰ−５枯渇細胞の方が高く、核小体（位相差画像に見られる核内のより暗い区域）に特異的に検出される（右欄）。
【図４Ａ】ＴＩＰ−５枯渇は増殖及び細胞成長の増大へと導くことを示す図である。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞のＦＡＣＳ分析。
【図４Ｂ】ＴＩＰ−５枯渇は増殖及び細胞成長の増大へと導くことを示す図である。（Ｂ）個別の細胞周期の段階における細胞のパーセンテージ。ＴＩＰ５枯渇細胞において細胞の数又はパーセンテージはＳ期で増大するが、Ｇ１期細胞の数又はパーセンテージは減少する。増殖は高まる。
【図４Ｃ】ＴＩＰ−５枯渇は増殖及び細胞成長の増大へと導くことを示す図である。（Ｃ）ＢｒｄＵの取込みアッセイ。細胞を１０μM  ＢｒｄＵと共に３０分間インキュベーションし、ＢｒｄＵに対する抗体で染色し、Ｓ期細胞のパーセンテージを評価する。ＢｒｄＵアッセイは、ＴＩＰ５細胞におけるＤＮＡ合成増大を示す。
【図４Ｄ】ＴＩＰ−５枯渇は増殖及び細胞成長の増大へと導くことを示す図である。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及び対照配列を安定発現している（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の成長曲線。これらの成長曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が（ＨＥＫ２９３）と少なくとも同じ速さで、又は対照細胞（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）よりもなお速く成長することを実証している。
【図４Ｅ】ＴＩＰ−５枯渇は増殖及び細胞成長の増大へと導くことを示す図である。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及び対照配列を安定発現している（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の成長曲線。これらの成長曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が（ＨＥＫ２９３）と少なくとも同じ速さで、又は対照細胞（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）よりもなお速く成長することを実証している。
【図４Ｆ】ＴＩＰ−５枯渇は増殖及び細胞成長の増大へと導くことを示す図である。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及び対照配列を安定発現している（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の成長曲線。これらの成長曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が（ＨＥＫ２９３）と少なくとも同じ速さで、又は対照細胞（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）よりもなお速く成長することを実証している。
【図５Ａ】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム分析を示す図である。（Ａ〜Ｃ）（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞における細胞質ＲＮＡ／細胞の相対量。データは、３回の重複で行われた２回の実験の平均を表す。
【図５Ｂ】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム分析を示す図である。（Ａ〜Ｃ）（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞における細胞質ＲＮＡ／細胞の相対量。データは、３回の重複で行われた２回の実験の平均を表す。
【図５Ｃ】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム分析を示す図である。（Ａ〜Ｃ）（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞における細胞質ＲＮＡ／細胞の相対量。データは、３回の重複で行われた２回の実験の平均を表す。
【図５Ｄ】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム分析を示す図である。（Ｄ）安定なＨＥＫ２９３Ｔのリボソームプロファイル。さらに多くのリボソームがＴＩＰ５ノックダウン細胞に存在する。
【図５Ｅ】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム分析を示す図である。（Ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系のリボソームプロファイル。さらに多くのリボソームがＴＩＰ５ノックダウン細胞に存在する。
【図６Ａ】ＴＩＰ−５のノックダウンはレポータータンパク質の生産強化へと導くことを示す図である。（Ａ〜Ｃ）構成的ＳＥＡＰ発現ベクターｐＣＡＧ−ＳＥＡＰで操作された（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系のＳＥＡＰ発現。
【図６Ｂ】ＴＩＰ−５のノックダウンはレポータータンパク質の生産強化へと導くことを示す図である。（Ａ〜Ｃ）構成的ＳＥＡＰ発現ベクターｐＣＡＧ−ＳＥＡＰで操作された（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系のＳＥＡＰ発現。
【図６Ｃ】ＴＩＰ−５のノックダウンはレポータータンパク質の生産強化へと導くことを示す図である。（Ａ〜Ｃ）構成的ＳＥＡＰ発現ベクターｐＣＡＧ−ＳＥＡＰで操作された（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系のＳＥＡＰ発現。
【図６Ｄ】ＴＩＰ−５のノックダウンはレポータータンパク質の生産強化へと導くことを示す図である。（Ｄ、Ｅ）構成的ルシフェラーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−ルシフェラーゼを用いて操作された（Ｄ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３及び（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系のルシフェラーゼ発現。
【図６Ｅ】ＴＩＰ−５のノックダウンはレポータータンパク質の生産強化へと導くことを示す図である。（Ｄ、Ｅ）構成的ルシフェラーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−ルシフェラーゼを用いて操作された（Ｄ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３及び（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系のルシフェラーゼ発現。
【００２８】
発明の詳細な説明
ＴＩＰ−５のノックダウン：
リコンビナントタンパク質の合成増大のために細胞を操作することを目指して、本発明者らは、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の減少が４５ＳプレｒＲＮＡの合成を高め、結果としてリボソームバイオジェネシスも刺激し、翻訳コンピテントリボソームの数を増大させるかどうかを判定する。したがって本発明者らは、ＴＩＰ５発現をノックダウンするためにＲＮＡ干渉を使用し、ＴＩＰ５の二つの異なる領域（ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２）に特異的なｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ配列を使用して、トランスジェニックｓｈＲＮＡを安定発現しているＮＩＨ／３Ｔ３又はｍｉＲＮＡを発現しているＨＥＫ２９３Ｔ及びＣＨＯ−Ｋ１を構築する。スクランブルされたｓｈＲＮＡ（scrambled shRNA）配列及びｍｉＲＮＡ配列を発現している安定細胞系を対照として使用する。ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５配列又はｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現しているプラスミドの一過性トランスフェクションを行うよりもむしろ安定細胞系を生産するのには二つの理由がある。第一に、ＣｐＧメチル化のような抑制的なエピジェネティックのマークの消失は、複数の細胞分裂を必要とする受動的なメカニズムである。第二に、たとえＨＥＫ２９３Ｔ細胞を比較的容易にトランスフェクションすることができるとしても、ＮＩＨ／３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の低いトランスフェクション効率は、内因性ｒＲＮＡ、リボソームレベル及び細胞成長の性質のその後の分析を損なうであろう。選択されたクローンにおけるＴＩＰ５のノックダウン効率を決定するために、本発明者らは、定量及び半定量逆転写酵素介在性ＰＣＲによってＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルを測定する（図１）。ＴＩＰ５の発現は、対照細胞に比べてＮＩＨ／３Ｔ３／ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３／ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−２細胞の方が約７０〜８０％減少する（図１Ａ）。ＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルにおける類似の低下が、安定なＨＥＫ２９３Ｔで観察される（図１Ｂ）。ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞におけるＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルは、半定量ＰＣＲによってのみ測定することができるが（図１Ｃ）、ＴＩＰ５  ｍＲＮＡの低下は、安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞に類似している。これらの結果は、樹立細胞系が低レベルのＴＩＰ５を有することを実証している。
【００２９】
ＴＩＰ−５のノックダウンはｒＤＮＡメチル化の低下へと導く：
マウスｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化は、基本転写因子ＵＢＦの結合を障害し、開始前複合体の形成は阻止される（Sanij,E., Poortinga,G., Sharkey,K., Hung,S., Holloway,T.P., Quin,J., Robb,E., Wong,L.H., Thomas,W.G., Stefanovsky,V., Moss,T., Rothblum,L., Hannan,K.M., McArthur,G.A., Pearson,R.B., and Hannan,R.D. (2008). UBF levels determine the number of active ribosomal RNA genes in mammals. J. Cell Biol 183, 1259-1274）。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、約４０％〜５０％のｒＲＮＡ遺伝子がＣｐＧ−メチル化配列を有し、転写的にサイレントである。ヒト、マウス及びチャイニーズハムスターにおけるｒＤＮＡプロモーターの配列及びＣｐＧ密度は、顕著に異なる。ヒトでは、ｒＤＮＡプロモーターは２３個のＣｐＧを有し、一方マウス及びチャイニーズハムスターではそれぞれ３個及び８個のＣｐＧがある（図２Ａ〜Ｃ）。ＴＩＰ５のノックダウンがｒＤＮＡのサイレンシングに影響することを検証するために、本発明者らは、ＣＣＧＧ配列におけるｍｅＣｐＧの量を測定することによってｒＤＮＡメチル化のレベルを決定する。ゲノムＤＮＡをＨｐａＩＩで消化し、消化に対する抵抗性（すなわちＣｐＧメチル化）を、ＨｐａＩＩ配列（ＣＣＧＧ）を包含するプライマーを使用する定量的リアルタイムＰＣＲによって測定する。全てのＴＩＰ５ノックダウン細胞系における大部分のｒＲＮＡ遺伝子のプロモーター領域内でＣｐＧメチル化の減少があり、ｒＤＮＡサイレンシングの促進に果たすＴＩＰ５が重要な役割を強調している（図２）。
【００３０】
特に、ＴＩＰ５の結合及びｄｅ  ｎｏｖｏメチル化は、ｒＤＮＡプロモーター配列に限定されるものの、ＴＩＰ−５低下ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＣｐＧメチル化の量は、ｒＤＮＡ遺伝子全体（遺伝子間領域、プロモーター領域及びコード領域；図２Ｄ、Ｅ）にわたり減少し、ＴＩＰ５がいったんｒＤＮＡプロモーター上に結合すると、ｒＤＮＡローカスにわたりサイレントなエピジェネティックマークを樹立する拡散メカニズムを開始することを示している。
【００３１】
Ｔｉｐ−５ノックダウン細胞におけるｒＲＮＡレベルの増大：
サイレントな遺伝子の数の減少がｒＲＮＡ転写物の量に影響するかどうかを判定するために、本発明者らは、第一ｒＲＮＡプロセシング部位を包含したプライマーを使用するｑＲＴ−ＰＣＲ（図３Ａ）及びｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢｒＵＴＰ取込み（図３Ｂ）によって、４５ＳプレｒＲＮＡの合成を測定する。両方の分析によって、ＴＩＰ５を枯渇したＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方において、対照細胞系に比べてｒＲＮＡ生産の強化が検出される。
【００３２】
ＴＩＰ−５の枯渇は、増殖及び細胞成長の増大へと導く：
Ｒａｓは、ヒトのガンにおいて多くの場合に突然変異又は過剰発現している、細胞トランスフォーメーション及び腫瘍形成に関与する周知のガン遺伝子である。Greenらは、国際公開公報第２００９／０１７６７０号において包括的ｍｉＲＮＡ選別においてＴＩＰ−５がＦａｓのＲａｓ介在性エピジェネティックサイレンシングエフェクター（ＲＥＳＥ）として機能することを確認したと記載している。その公報は、ＴＩＰ−５などのＲａｓエフェクターの発現低下が細胞増殖阻害を招くことを記載している。
【００３３】
本発明者らは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞を分析する。図４Ａ、Ｂに示すように、Ｓ期の細胞数は、対照細胞に比べて両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞の方が顕著に高い。ＴＩＰ５配列に対するｍｉＲＮＡを発現しているレトロウイルスを感染させてから１０日後のＮＩＨ３Ｔ３細胞で類似のプロファイルが得られる。これらの結果に一致して、ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞は、新生ＤＮＡへの５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込み増大及びより高いレベルのサイクリンＡを示す（図４Ｃ）。
【００３４】
最終的に本発明者らは、ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５、ｓｈＲＮＡ対照及び親のＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の間で細胞増殖速度を比較する（図４Ｄ〜Ｆ）。驚くことに、そして先行技術の報告と対照的に、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現しているＮＩＨ／３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方は、対照細胞よりも速い速度で増殖し、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の減少が細胞の代謝に実際に影響を有することを示している。ＨＥＫ２９３Ｔは、すでにその最大増殖速度に達していることから、これらの細胞におけるＴＩＰ５枯渇は細胞増殖にあまり影響しない。これらのデータは、驚くことにＴＩＰ５の枯渇及び結果としてのｒＤＮＡサイレンシングの減少が細胞増殖を高めることを示す。
【００３５】
ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム分析：
哺乳動物細胞培養において、タンパク質合成速度は重要なパラメーターであって、産物収量に直接関係する。ＴＩＰ５の枯渇及び結果としてのｒＤＮＡサイレンシングの減少が細胞における翻訳コンピテントなリボソームの数を増大させるかどうかを判定するために、本発明者らは、最初、細胞質ｒＲＮＡのレベルを測定する。細胞質で大部分のＲＮＡは、リボソームに集合したプロセシング済みのｒＲＮＡから成る。図５Ａ〜Ｃに示すように、全てのＴＩＰ５枯渇細胞系は、細胞１個あたりより多くの細胞質を有し、これらの細胞がより多くのリボソームを生産することを示している。同様に、ポリソームプロファイルの分析は、ＴＩＰ５を枯渇したＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞が対照細胞に比べて多くのリボソームサブユニット（４０Ｓ、６０Ｓ及び８０Ｓ）を有することを示す（図５Ｄ）。
【００３６】
Ｔｉｐ−５のノックダウンは、レポータータンパク質の生産強化へと導く：
ＴＩＰ５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングの減少が異種タンパク質の生産を高めるかどうかを判定するために、本発明者らは、ＴＩＰ５を枯渇した安定なＮＩＨ／３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＣＨＯ−Ｋ１誘導体に、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼＳＥＡＰ又はルシフェラーゼの構成的発現を促進している発現ベクター（それぞれｐＣＡＧ−ＳＥＡＰ；図６Ａ〜Ｃ又はｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ；図６Ｄ、Ｅ）をトランスフェクションする。４８時間後のタンパク質生産の定量から、対照細胞系に比べてＴＩＰ５枯渇細胞の方がＳＥＡＰ及びルシフェラーゼの両方の生産が２〜４倍に増大することが明らかとなり、ＴＩＰ５の枯渇が異種タンパク質の生産を増大させることを示している。これらの結果の全ては、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の減少が、リボソーム合成を高め、細胞がリコンビナントタンパク質を生産する能力を増大させることを示す。
【００３７】
ＴＩＰ−５のノックアウトは、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）のバイオ医薬品生産を増大させ、治療用抗体の生産を高める：
（ａ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）又は治療用抗体を分泌しているＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）に、空のベクター（模擬対照）又はＴＩＰ−５発現をノックダウンするように設計された小ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）をトランスフェクションする。最高のＭＣＰ−１力価は、最も効率的にＴＩＰ−５を枯渇した細胞プールで認められ、一方でタンパク質濃度は、模擬トランスフェクションされた細胞又は親細胞系の方が顕著に低い。
ｂ）ＣＨＯホスト細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）に最初に短いＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）をトランスフェクションしてＴＩＰ−５の発現を低下させ、安定なＴＩＰ−５枯渇ホスト細胞系を生成させる。続いてこれらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ４４野生型細胞に、関心が持たれる遺伝子として単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）又は治療用抗体をコードするベクターをトランスフェクションする。最高のＭＣＰ−１力価及び生産性は、最も効率的にＴＩＰ−５を枯渇した細胞プールで認められ、一方でタンパク質濃度は、模擬トランスフェクションされた細胞又は親細胞系の方が顕著に低い。
ｃ）ａ）又はｂ）に記載されたその細胞が回分発酵又は流加発酵に供する場合、全体的なＭＣＰ−１力価又は抗体力価における差は、なおいっそう顕著になる。ＴＩＰ−５の発現が低下した、トランスフェクションされた細胞が細胞及び時間あたりより速く成長し、より多くのタンパク質も生産することから、それらは、より高いＩＶＣを示し、同時により高い生産性を示す。両方の性質は、全体的なプロセス収量に正の影響を与える。したがってＴｉｐ５枯渇細胞は、顕著に高いＭＣＰ−１又は抗体収集物力価を有し、より効率の高い生産プロセスへと導く。
【００３８】
また、ＳＮＦ２Ｈ欠失細胞は、顕著に高いＩｇＧ収集物力価を有し、より効率的な生産プロセスへと導く。
【００３９】
ＴＩＰ−５遺伝子のノックアウトはｒＲＮＡの転写を増大させ、最も効率的に増殖を高める：
ＴＩＰ−５の発現が常に低下したレベルの、改良されたホスト生産細胞系を生成させる最も効率的な方法は、ＴＩＰ−５遺伝子の完全なノックアウトを生成させることである。このために、Ｔｉｐ−５遺伝子を破壊してその発現を阻止するために相同組換えを利用するか、又はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技法を使用するかのいずれかを行うことができる。相同組換えはＣＨＯ細胞において効率的ではないことから、本発明者らは、ＴＩＰ−５遺伝子内に二本鎖切断を導入することによりそれを機能的に破壊するＺＦＮを設計する。ＴＩＰ−５の効率的なノックアウトを確認するために、抗ＴＩＰ−５抗体を使用してウエスタンブロットを行う。ＴＩＰ−５ノックアウト細胞では膜上にＴＩＰ−５の発現は検出されず、一方で親ＣＨＯ細胞系は、ＴＩＰ−５タンパク質に対応する明瞭なシグナルを示す。
【００４０】
次に、ＴＩＰ−５ノックアウトＣＨＯ細胞及び親ＣＨＯ細胞系においてｒＲＮＡの転写を分析する。このアッセイは、両方の親細胞に比べて、そしてまたＴＩＰ−５発現レベルだけが低下した細胞に比べて、ＴＩＰ−５ノックアウト細胞の方が高いレベルのｒＲＮＡ合成及び増大したリボソーム数であることを確認する。
【００４１】
さらに、ＴＩＰ５野生型細胞及びＴＩＰ−５の発現だけが干渉性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉなど）の導入によって低下した細胞系に比べて、ＴＩＰ−５欠損細胞の方が流加プロセスにおいて速く増殖し、高い細胞数を示す。
【００４２】
全般的な態様「含んでいる」又は「含まれる」は、より具体的な態様「から成る」を包含する。さらに、単数形及び複数形は限定的な方法で使用されない。
【００４３】
本発明の過程で使用される用語は、以下の意味を有する。
【００４４】
「エピジェネティック操作」という用語は、核酸配列に影響せずにクロマチンのエピジェネティック改変に影響を及ぼすことを意味する。エピジェネティック改変には、ヒストン又はＤＮＡヌクレオチドのメチル化又はアセチル化、さらにはアルキル化における変化が含まれる。本発明において、「エピジェネティック操作」は、主にＤＮＡメチル化における操作を表す。
【００４５】
「ＮｏＲＣ」（核小体リモデリング複合体）は、ｒＤＮＡサイレンシングの重要な決定因子であり、ＴＩＰ−５（ＴＴＦ−１相互作用タンパク質５）及びＡＴＰａｓｅ  ＳＮＦ２ｈから成る。ＮｏＲＣは、サイレントな遺伝子のｒＤＮＡプロモーターに結合し、ヒストン改変活性及びＤＮＡメチル化活性によりｒＤＮＡの転写を抑制する。
【００４６】
「ＴＩＰ−５」又は「ＴＩＰ５」（転写終結因子１（ＴＴＦ１）相互作用タンパク質５）は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）及び他のクロマチン改変因子と相互作用することによって、ｒＤＮＡにヒストンデアセチラーゼ活性をリクルートするように作用する、２００kDよりも大きな核小体タンパク質である。さらなる同義語は、：ＢＡＺ２Ａ、ＷＡＬｐ３；ＦＬＪ１３７６８；ＦＬＪ１３７８０；ＦＬＪ４５８７６；ＫＩＡＡ０３１４及びＤＫＦＺｐ７８１Ｂ１０９である。
【００４７】
「ＳＮＦ２ｈ」は、ＳＷＩ／ＳＮＦファミリータンパク質のメンバーであって、ヘリカーゼ活性及びＡＴＰａｓｅ活性を有する。ＳＮＦ２ｈは、閉鎖型ヘテロクロマチンのクロマチン状態を樹立するためのヌクレオソームグライディング（nucleosome gliding）に関与するＮｏＲＣの一構成要素である。ＳＮＦ２ｈの公式名はＳＭＡＲＣＡ５である（ＳＷＩ／ＳＮＦ関係、マトリックス関連アクチン依存性クロマチンレギュレータースーパーファミリーａメンバー５）。さらなる別名は、ＩＳＷＩ；ｈＩＳＷＩ；ｈＳＮＦ２Ｈ及びＷＣＲＦ１３５である。
【００４８】
「リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させる」という表現は、リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ又はこの特定領域におけるクロマチンのメチル化及び／又はアセチル化に影響してｒＲＮＡ遺伝子転写の抑制解除を招くことを意味する。さらに具体的には、本発明においてこの用語は、ｒＲＮＡ遺伝子のメチル化を低下させ、転写因子が遺伝子とアクセスする可能性をより大きくすることに繋げ、それによってそれぞれの遺伝子からより多くのｒＲＮＡを合成することへと導くアプローチを表す。
【００４９】
本明細書における「ｒＤＮＡサイレンシング」は、具体的にはｒＲＮＡ遺伝子のサイレンシングを表す。それには、ＮｏＲＣによって仲介されない非特異的な全ゲノムサイレンシングメカニズムは含まれない。
【００５０】
ｒＤＮＡサイレンシングは、以下のアッセイによって測定／モニターすることができる：
ｒＤＮＡのサイレンシングは、（例えば、材料及び方法に記載されるように、４５ＳプレＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドプライマーを使用した）定量又は半定量ＰＣＲにより分析することのできるｒＲＮＡの転写減少を招く。
【００５１】
ｒＤＮＡ遺伝子プロモーターのメチル化は、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化、ならびにそれに続くメチル化及び非メチル化状態について異なるバンドパターンを招くサザンブロットによって分析することができる。
【００５２】
又は、メチル化誘導性ｒＤＮＡサイレンシングは、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化及びそれに続く切断部位にわたるプライマーを使用するｑＰＣＲによっても定量することができる（材料及び方法に記載し、図２に示す）。
【００５３】
本明細書に使用されるような遺伝子発現の文脈における「ノックダウン」又は「枯渇」という用語は、対照細胞における発現に比べた所与の遺伝子の発現低下に至る実験アプローチを表す。遺伝子のノックダウンは、その遺伝子のｍＲＮＡの部分とハイブリダイゼーションしてそれを分解へと導く核酸分子（例えばｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ）を細胞に導入すること、又は転写低下、ｍＲＮＡの安定性低下又はｍＲＮＡの翻訳減少へと導く方法で遺伝子配列を変更することなどの、様々な実験手段によって達成することができる。
【００５４】
所与の遺伝子の発現の完全阻害は、「ノックアウト」と呼ばれる。遺伝子のノックアウトは、その遺伝子から機能的転写物が合成されず、この遺伝子によって普通は提供される機能の消失へと導くことを意味する。遺伝子ノックアウトは、ＤＮＡ配列を変更することによって達成され、遺伝子又はその調節配列の破壊又は欠失へと導く。ノックアウト技法には、重大な部分もしくは遺伝子配列全体を交換、妨害もしくは欠失させる相同組換え技法の使用又はターゲット遺伝子のＤＮＡに二本鎖切断を導入するジンクフィンガーヌクレアーゼなどのＤＮＡ改変酵素の使用が含まれる。
【００５５】
遺伝子のノックダウン又はノックアウトをモニター／証明するためのアッセイは多種多様である：
例えば、選択された遺伝子から転写されたｍＲＮＡの低下／損失は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡの保護、細胞性ＲＮＡへの又はＰＣＲによるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって定量することができる。選択された遺伝子によってコードされる、対応するタンパク質の存在量低下／損失は、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物学的活性のアッセイ、タンパク質の免疫染色に続くＦＡＣＳ分析又はホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって定量することができる。
【００５６】
本発明に使用されるような「誘導体」という用語は、本来の配列又はその相補的配列と配列が少なくとも７０％同一のポリペプチド分子又は核酸分子を意味する。好ましくはそのポリペプチド分子又は核酸分子は、本来の配列又はその相補的配列と配列が少なくとも８０％同一である。さらに好ましくは、そのポリペプチド分子又は核酸分子は、本来の配列又はその相補的配列と配列が少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、本来の配列又はその相補的配列と配列が少なくとも９５％同一であって、分泌に対して本来の配列と同じ又は類似の効果を示すポリペプチド分子又は核酸分子である。
【００５７】
配列の差は、異なる生物からの相同配列における差に基づくことがある。それらは、また、１個又は複数個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入又は欠失による配列のターゲット改変に基づくこともあろう。欠失、挿入又は置換突然変異体は、部位特異的突然変異誘発及び／又はＰＣＲベースの突然変異誘発技法を使用して生成させることができる。対応する方法は、追加的な参考文献と共に（Lottspeich and Zorbas, 1998）によって第３６．１章に記載されている。
【００５８】
本発明の意味における「ホスト細胞」は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはハムスター細胞などのげっ歯類細胞である。好ましい細胞は、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ  ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞又はそのような任意の細胞系の誘導体／後代である。特に好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１及びＢＨＫ２１であり、なおいっそう好ましくはＣＨＯ−ＤＧ４４及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。最も好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である。本発明の特定の態様では、ホスト細胞は、マウス骨髄腫細胞、好ましくはＮＳ０及びＳｐ２／０ｆ細胞又はそのような任意の細胞系の誘導体／後代を意味する。本発明の意味において使用することのできるマウス及びハムスター細胞の例を、表１にも要約する。しかしながら、それらの細胞の誘導体／後代、非限定的にヒト、マウス、ラット、サル、及びげっ歯類細胞系を含む他の哺乳動物細胞、又は非限定的に酵母、昆虫及び植物細胞を含む真核細胞もまた、本発明の意味において、特にバイオ医薬品タンパク質の生産のために使用することができる。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
ホスト細胞は、無血清条件下で、そして場合により動物起源のタンパク質／ペプチドを全く有さない培地中で樹立、適応、及び完全に培養される場合が最も好ましい。ハムＦ１２（Sigma, Deisenhofen, Germany）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、最小必須培地（ＭＥＭ；Sigma）、イソコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma）、ＣＤ−ＣＨＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、ＣＨＯ−Ｓ−Invtirogen）、無血清ＣＨＯ培地（Sigma）、及び無タンパク質ＣＨＯ培地（Sigma）などの市販の培地は、適切な栄養溶液の一例である。必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、インスリン様成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン、チミジンなど）、グルタミン、グルコース又は他の等価のエネルギー源、抗生物質、微量元素を例とする多様な化合物を任意の培地に補充することができる。任意の他の必要な補助剤もまた、当業者に公知であろう適切な濃度で包含させることができる。本発明においてホスト細胞の培養に無血清培地の使用が好ましいが、適切な量の血清が補充された培地もまた使用することができる。選択可能な遺伝子を発現している遺伝的に改変された細胞の成長及び選択のために、適切な選択薬が培養培地に添加される。
【００６１】
「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基配列又はポリペプチドと互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを表す。これらの用語には、また、非限定的にグリコシル化、アセチル化、リン酸化又はタンパク質プロセシングが含まれる反応によって翻訳後修飾されたタンパク質が含まれる。ポリペプチドの分子がその生物学的機能活性を維持する限り、改変及び変化、例えば他のタンパク質との融合、アミノ酸配列の置換、欠失又は挿入をそのポリペプチドの構造に加えることができる。例えば、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列に、あるアミノ酸配列置換を加えることができ、類似の性質を有するタンパク質を得ることができる。
【００６２】
「ポリペプチド」という用語は、１０個よりも多いアミノ酸を有する配列を意味し、「ペプチド」という用語は、最大１０個のアミノ酸長の配列を意味する。
【００６３】
本発明は、バイオ医薬品ポリペプチド／タンパク質の生産のためのホスト細胞を生成させるために適する。特に本発明は特に、強化された細胞生産性を示している細胞による、関心が持たれる多数の異なる遺伝子の高収量発現に適する。
【００６４】
「関心が持たれる遺伝子」（ＧＯＩ）、「選択された配列」、又は「産物遺伝子」は、本明細書において同じ意味を有し、関心が持たれる産物又は「関心が持たれるタンパク質」をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を表し、「所望の産物」という用語でも述べられる。選択された配列は、完全長の又は短縮された遺伝子、融合遺伝子又はタグ付き遺伝子のことがあり、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＤＮＡフラグメント、好ましくは、ｃＤＮＡのことがある。それは、ネイティブな配列、すなわち天然型のことがあるか、又は所望により突然変異又はその他の方法で改変されていることがある。これらの改変には、選択されたホスト細胞におけるコドン使用頻度を最適化するためのコドン最適化、ヒト化又はタグ付けが含まれる。選択された配列は、分泌型、細胞質、核、膜結合型又は細胞表面ポリペプチドをコードすることがある。
【００６５】
「関心が持たれるタンパク質」には、その全てが選択されたホスト細胞に発現することができるタンパク質、ポリペプチド、そのフラグメント、ペプチドが含まれる。所望のタンパク質は、例えば抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、レセプター及びその誘導体又はフラグメント、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストとして役立つことができ、かつ／又は治療もしくは診断用途を有する任意の他のポリペプチドのことがある。所望のタンパク質／ポリペプチドの例もまた下記に示す。
【００６６】
モノクローナル抗体などのより複雑な分子の場合、ＧＯＩは、２本の抗体鎖の一方又は両方をコードする。
【００６７】
「関心が持たれる産物」は、また、アンチセンスＲＮＡのことがある。
【００６８】
「関心が持たれるタンパク質」又は「所望のタンパク質」は、上述のタンパク質である。特に、所望のタンパク質／ポリペプチド又は関心が持たれるタンパク質は、例えば非限定的にインスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω又はＩＦＮτ、ＴＮＦα及びＴＮＦβ、ＴＮＦγなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦなどのサイトカインである。同様に含まれるのは、エリスロポエチン又は他の任意のホルモン性成長因子の生産である。本発明による方法は、また、抗体又はそのフラグメントの生産に有利に使用することができる。そのようなフラグメントには、例えばＦａｂフラグメント（抗原結合フラグメント＝Ｆａｂ）が含まれる。Ｆａｂフラグメントは、隣接する定常領域によって一緒につながった、両方の鎖の可変領域から成る。これらは、従来の抗体からプロテアーゼ消化によって、例えばパパインを用いて形成させることができるが、類似のＦａｂフラグメントを、遺伝子操作によっても生産することができる。さらなる抗体フラグメントには、ペプシンを用いたタンパク質分解切断によって調製することのできるＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。
【００６９】
関心が持たれるタンパク質は、好ましくは分泌型ポリペプチドとして培地から回収されるか、又は分泌シグナルなしに発現される場合はホスト細胞溶解物から回収することもできる。他のリコンビナントタンパク質及びホスト細胞タンパク質から、関心が持たれるタンパク質の実質的に均一な調製物が得られる方法で、関心が持たれるタンパク質を精製することが必要である。第一ステップとして、細胞及び／又は粒子状細胞破片を培養液又は溶解物から取り出す。その後、混入可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から、例えばイムノアフィニティーカラム又はイオン交換カラム、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、Sephadexクロマトグラフィー、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーを用いた分画によって、関心が持たれる産物を精製する。一般に、ホスト細胞によって異種発現されたタンパク質を精製する方法を技術者に教示している方法は、当技術分野において周知である。
【００７０】
遺伝子操作法を使用して、重鎖（ＶＨ）の可変領域及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域のみから成る短縮化抗体フラグメントを生産することが可能である。これらは、Ｆｖフラグメント（可変フラグメント＝可変部フラグメント）と呼ばれる。これらのＦｖフラグメントは、定常鎖のシステインによる二つの鎖の共有結合を欠如しているので、Ｆｖフラグメントは安定化されていることが多い。重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を短いペプチドフラグメント、例えば１０〜３０個のアミノ酸、好ましくは１５個のアミノ酸のフラグメントによって連結することが有利である。このようにして、ＶＨ及びＶＬがペプチドリンカーによって連結したものから成るペプチド１本鎖が得られる。この種の抗体タンパク質は、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。この種のｓｃＦｖ−抗体タンパク質の例は、当技術分野において周知である。
【００７１】
近年、ｓｃＦｖを多量体性誘導体として調製するために様々な戦略が開発された。これは、特に改良された薬物動態性質及び生体分布性質と、さらには増大した結合アビディティーを有するリコンビナント抗体へと導くことが意図されている。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、ｓｃＦｖは、多量体化ドメインを有する融合タンパク質として調製される。多量体化ドメインは、例えばＩｇＧのＣＨ３領域又はロイシンジッパードメインなどのコイルドコイル構造（ヘリックス構造）のことがある。しかし、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域の間の相互作用が多量体化のために使用される戦略もある（例えばダイアボディー、トリボディー及びペンタボディー）。ダイアボディーによって、技術者は、２価ホモ二量体性ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ｓｃＦｖ分子のリンカーが５〜１０個のアミノ酸に短縮化することで、鎖内ＶＨ／ＶＬ重ね合わせが起こるホモ二量体の形成に至る。ダイアボディーは、追加的に、ジスルフィド架橋の組み入れによって安定化することができる。ダイアボディー−抗体タンパク質の例は、当技術分野において周知である。
【００７２】
ミニボディーによって、技術者は２価ホモ二量体性ｓｃＦｖ誘導体を意味する。それは、二量体化領域として免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域が、ヒンジ領域（例えば同じくＩｇＧ１由来）及びリンカー領域を介してｓｃＦｖと結合したものを有する融合タンパク質から成る。ミニボディー−抗体タンパク質の例は、当技術分野から周知である。
【００７３】
トリアボディーによって、技術者は３価ホモ三量体性ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ＶＨ−ＶＬがリンカー配列なしに直接融合しているｓｃＦｖ誘導体が、三量体の形成へと導く。
【００７４】
「足場タンパク質」によって、技術者は遺伝子クローニング又は別のタンパク質もしくは別の機能を有するタンパク質の部分との共翻訳過程によって結合した、タンパク質の任意の機能的ドメインを意味する。
【００７５】
技術者は、また、２、３又は４価構造を有し、ｓｃＦｖ由来のいわゆるミニ抗体を熟知しているであろう。多量体化は、二、三又は四量体性コイルドコイル構造によって実施される。
【００７６】
たとえ導入された配列又は遺伝子がホスト細胞における内因性配列又は遺伝子と同一であっても、ホスト細胞に導入された配列又は遺伝子は、定義によってホスト細胞に関して「異種配列」又は「異種遺伝子」又は「導入遺伝子」と呼ばれる。
【００７７】
したがって、「異種」タンパク質は、異種配列から発現されたタンパク質である。
【００７８】
「リコンビナント」という用語は、本発明の明細書にわたり、特にタンパク質の発現の文脈において「異種」という用語と互換的に使用される。したがって、「リコンビナント」タンパク質は、異種配列から発現されたタンパク質である。
【００７９】
異種遺伝子配列は、「発現ベクター」、好ましくは真核生物発現ベクター、なおさらに好ましくは哺乳動物発現ベクターを使用することによってターゲット細胞に導入することができる。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知であり、様々な刊行物に記載されている。特に、プロモーター、エンハンサー、終結及びポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、及びスプライシングシグナルなどの機能的構成要素の記載を含む、適切なベクターを構築するための技法は、（Sambrook et al., 1989）及びそこに引用された参考文献にかなり詳細に概説されている。ベクターには、非限定的にプラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体（例えばＡＣＥ）、又はバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージなどのウイルスベクターが含まれることがある。真核生物発現ベクターは、典型的には複製起点及び細菌での選択用の抗生物質抵抗性遺伝子などの、細菌におけるベクターの増殖を促進する原核生物配列も有するであろう。ポリヌクレオチドが作動可能に連結されうるクローニング部位を有する多様な真核生物発現ベクターは、当技術分野において周知であり、そのいくつかは、Stratagene, La Jolla, CA；Invitrogen, Carlsbad, CA；Promega, Madison, WI又はBD Biosciences Clontech, Palo Alto, CAなどの企業から市販されている。
【００８０】
好ましい態様では、発現ベクターは、関心が持たれるペプチド／ポリペプチド／タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写及び翻訳に必要な調節配列である、少なくとも一つの核酸配列を含む。
【００８１】
本明細書に使用されるような「発現」という用語は、ホスト細胞内の異種核酸配列の転写及び／又は翻訳を表す。ホスト細胞における関心がもたれる所望の産物／タンパク質の発現レベルは、この実施例のように、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量又は選択された配列によってコードされる関心が持たれる所望のポリペプチド／タンパク質の量のいずれかをベースに決定することができる。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞性ＲＮＡとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又はＰＣＲによって定量することができる。選択された配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物学的活性のアッセイ、タンパク質の免疫染色に続くＦＡＣＳ分析又はホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって定量することができる。
【００８２】
遺伝的に改変された細胞又はトランスジェニック細胞を生じる、ポリヌクレオチド又は発現ベクターを用いた真核ホスト細胞の「トランスフェクション」は、当技術分野において周知の任意の方法によって行うことができる。トランスフェクション法には、非限定的にリポソーム介在トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ポリカチオン（ＤＥＡＥ−デキストランなど）介在性トランスフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染及びマイクロインジェクションが含まれる。好ましくは、トランスフェクションは安定トランスフェクションである。特定のホスト細胞系及び種類において異種遺伝子の最適なトランスフェクション頻度及び発現を提供するトランスフェクション法が、有利である。適切な方法は、常用の手順によって決定することができる。安定トランスフェクタントのために、構築物は、ホスト細胞内に安定的に維持されるようにホスト細胞のゲノムもしくは人工染色体／ミニ染色体に組み込まれるか、又はエピソームとして位置するかのいずれかである。
【００８３】
本発明は、以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること、及び
ｃ．  タンパク質の発現が可能な条件で該細胞を培養すること
を含む、細胞におけるタンパク質、好ましくはリコンビナントタンパク質の発現を増大させる方法に関する。
【００８４】
特定の態様では、ステップｂ）は、該ホスト細胞におけるリボソームＲＮＡ転写を、好ましくは該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを低下させること（少なくとも１種のリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のエピジェネティック操作）によってアップレギュレーションすることを含む。
【００８５】
本発明は、具体的には以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を、該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させることによって増大させること、及び
ｃ．  タンパク質の発現が可能な条件で該細胞を培養すること
を含む、タンパク質を、好ましくはリコンビナントタンパク質の発現を増大させる方法に関する。
【００８６】
具体的な態様では、ステップｂ）は、少なくとも１種のリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のエピジェネティック操作を含む。
【００８７】
本発明は、好ましくは以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ  該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させること、及び
ｃ．  タンパク質の発現が可能な条件で該細胞を培養すること
を含む、細胞におけるタンパク質、好ましくはリコンビナントタンパク質の発現を増大させる方法に関する。
【００８８】
本発明の特定の態様では、ｒＤＮＡのサイレンシングが低下していない細胞に比べて該細胞においてリコンビナントタンパク質の発現が増大している。好ましくは、該増大は、２０％〜１００％、さらに好ましくは２０％〜３００％であり、最も好ましくは２０％よりも大きい。
【００８９】
本発明の方法のさらに特定の態様では、ステップｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素のノックダウン又はノックアウトを含む。
【００９０】
具体的には、ステップｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素の発現を低下させることを含む。
【００９１】
本発明の別の好ましい態様では、ＮｏＲＣ構成要素はＴＩＰ−５又はＳＮＦ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５である。
【００９２】
本発明の非常に好ましい態様は、ＴＩＰ−５がノックアウトされている。
【００９３】
本発明の別の態様では、ＳＮＦ２Ｈがノックアウトされている。
【００９４】
本発明の方法の特定の態様では、ＴＩＰ−５がノックダウン又はノックアウトされており、ここで、ＴＩＰ−５サイレンシングベクターは以下：
ａ．  配列番号１、配列番号２、配列番号８もしくは配列番号９記載のｓｈＲＮＡ又は
ｂ．  配列番号３、配列番号４、配列番号１０もしくは配列番号１１記載のｍｉＲＮＡ
を含む。
【００９５】
本発明の最も好ましい態様では、ＴＩＰ−５は、ステップｂ）においてノックダウンされる。
【００９６】
本発明は、以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること、
ｃ．  関心が持たれる該タンパク質の発現を可能にする条件で該細胞を培養すること
を含む、関心が持たれるタンパク質を生産する方法に関する。
【００９７】
本発明の特定の態様では、その方法は、追加的に以下：
ｄ．  関心が持たれる該タンパク質を精製すること
を含む。
【００９８】
特定の態様では、ステップａ）の細胞は、空のホスト細胞である。別の態様では、ステップａ）の該細胞は、関心が持たれるタンパク質をコードする遺伝子を含むリコンビナント細胞である。
【００９９】
さらに特定の態様では、ステップｂ）は、該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させること（少なくとも１種のｒＤＮＡのエピジェネティック操作）によって、該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること（リボソームＲＮＡ転写をアップレギュレーションすること）を含む。
【０１００】
本発明は、具体的には以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させること（少なくとも１種のｒＤＮＡのエピジェネティック操作）、及び
ｃ．  関心が持たれる該タンパク質の発現を可能にする条件で該細胞を培養すること
を含む、関心が持たれるタンパク質を生産する方法に関する。
【０１０１】
本発明のさらなる態様では、その方法は、追加的に以下：
ｄ．  関心が持たれる該タンパク質を精製すること
を含む。
【０１０２】
特定の態様では、ステップｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素のノックダウン又はノックアウトを含む。別の態様では、ステップｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素の発現を低下させることを含む。
【０１０３】
本発明の非常に好ましい態様では、ＮｏＲＣ構成要素は、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、最も好ましくはＴＩＰ−５である。
【０１０４】
タンパク質を生産する上記方法の特定の態様では、ＴＩＰ−５はノックダウン又はノックアウトされ、ここで、ＴＩＰ−５サイレンシングベクターは、以下：
ａ．  配列番号１、配列番号２、配列番号８もしくは配列番号９記載のｓｈＲＮＡ又は
ｂ．  配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１１記載のｍｉＲＮＡ
を含む。
【０１０５】
本発明は、さらにまた以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること
を含む、好ましくはリコンビナント／異種タンパク質の生産のために、ホスト細胞を生成させる方法に関する。
【０１０６】
本発明は、具体的には以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること、
ｃ．  ホスト細胞を得ること
を含む、好ましくはリコンビナント／異種タンパク質の生産のために、ホスト細胞を生成させる方法に関する。
【０１０７】
本発明は、さらに以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること、
ｃ．  単一細胞クローンを選択すること
を含む、好ましくはリコンビナント／異種タンパク質の生産のために、単一細胞クローンを生成させる方法に関する。
【０１０８】
本発明は、さらに以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること、
ｃ．  単一細胞クローンを選択すること
を含む、好ましくはリコンビナント／異種タンパク質の生産のために、ホスト細胞系を生成させる方法に関する。
【０１０９】
本発明の特定の態様では、その方法は、追加的に以下：
ｄ．  該単一細胞クローンからホスト細胞系を得ること
を含む。
【０１１０】
本発明は、さらに以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること、
ｃ．  モノクローナルホスト細胞系を選択すること
を含む、好ましくはリコンビナント／異種タンパク質の生産のために、モノクローナルホスト細胞系を生成させる方法に関する。
【０１１１】
上記方法の特定の態様では、ステップｂ）は、ｉ）該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させること（少なくとも１種のｒＤＮＡのエピジェネティック操作）によって、該細胞におけるリボソームＲＮＡの量を増大させること（リボソームＲＮＡの転写をアップレギュレーションすること）を含む。
【０１１２】
本発明は、具体的には以下：
ａ．  細胞を提供すること、
ｂ．  該細胞におけるリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のサイレンシングを低下させること（少なくとも１種のｒＤＮＡのエピジェネティック操作）
を含む、好ましくはリコンビナント／異種タンパク質の生産のために、ホスト細胞（系）を生成させる方法に関する。
【０１１３】
場合により、該方法は、追加的に以下：
ｃ．  単一細胞クローンを選択すること。
ｄ．  好ましくは該方法は、追加的にホスト細胞（系）を得ることを含む
を含む。
【０１１４】
特定の態様では、ステップｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素のノックダウン又はノックアウトを含む。別の態様では、ステップｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の構成要素の発現を低下させることを含む。
【０１１５】
本発明の非常に好ましい態様では、ＮｏＲＣ構成要素はＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈであり、最も好ましくはＴＩＰ−５である。
【０１１６】
ホスト細胞を生成させる上記方法の特定の態様では、ＴＩＰ−５がノックダウン又はノックアウトされ、ここで、ＴＩＰ−５サイレンシングベクターは、以下：
ａ．  配列番号１、配列番号２、配列番号８もしくは配列番号９記載のｓｈＲＮＡ又は
ｂ．  配列番号３、配列番号４、配列番号１０もしくは配列番号１１記載のｍｉＲＮＡ
を含む。
【０１１７】
本発明は、さらに上記方法のいずれかにより生成された細胞に関する。
【０１１８】
好ましくは、リコンビナントタンパク質の発現は、ｒＤＮＡのサイレンシングが低下していない細胞に比べて該細胞において増大しており、好ましくは該増大は、２０％〜１００％、さらに好ましくは２０％〜３００％であり、最も好ましくは２０％よりも大きい。
【０１１９】
好ましくは、該細胞又は上記方法のいずれかにおける細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物、げっ歯類又はハムスター細胞である。好ましくは、該ハムスター細胞は、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、好ましくは該細胞はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である。
【０１２０】
本発明は、さらに、好ましくは関心が持たれるタンパク質の生産のための該細胞の使用に関する。
【０１２１】
本発明は、さらに、以下：
ａ．  配列番号１、配列番号２、配列番号８もしくは配列番号９記載のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．  配列番号３、配列番号４、配列番号１０もしくは配列番号１１記載のｍｉＲＮＡ
を含むＴＩＰ−５サイレンシングベクターに関する。
【０１２２】
さらに、本発明は、ＴＩＰ−５サイレンシングベクターを含む細胞に関する。好ましくはそのような細胞は、追加的に関心が持たれるタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを有するベクターを含む（有する）。
【０１２３】
本発明は、さらに、ＴＩＰ−５がノックアウトされた細胞であって、場合により関心が持たれるタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを包含するベクターを含む細胞に関する。好ましくは、該ノックアウト細胞は、完全ノックアウトである。別の態様では、本発明は、ＴＩＰ−５を欠失した細胞であって、場合により関心が持たれるタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを包含するベクターを含む細胞に関する。
【０１２４】
本発明は、さらに、ＴＩＰ−５サイレンシングベクターを備えるキットに関する。好ましくはそのようなキットは、関心が持たれるタンパク質を製造するために使用される。好ましくはそのようなキットは、追加的に細胞（上記のようなホスト細胞）を備える。好ましくはそのようなキットは、上記のようなＴＩＰ−５ノックアウト細胞を備える。場合により該キットは、細胞培養培地及び／又はトランスフェクション剤を備える。
【０１２５】
本発明の実施は、特に示さない限り細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの当業者の技術の範囲内の従来技法を採用するであろう。これらの技法は、最新の文献に十分に開示されている。
【０１２６】
材料及び方法
プラスミド
ｐＣＭＶ−ＴＡＰ−タグは、サイトメガロウイルス前初期プロモーターのコントロール下で転写されるＴＡＰ−タグ配列を有する。
【０１２７】
安定細胞系
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に、Ｈ１プロモーターのコントロール下でｓｈＲＮＡ
【０１２８】
【化１】
2012526535.tif 000004
【０１２９】
配列を発現しているプラスミドを安定トランスフェクションする。
【０１３０】
転写されたｓｈＲＮＡ配列は：ｓｈＲＮＡ
【０１３１】
【化２】
2012526535.tif 000005
【０１３２】
である。
ＨＥＫ２９３Ｔ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞に、対照ｍｉＲＮＡ又は
【０１３３】
【化３】
2012526535.tif 000006
【０１３４】
をターゲティングしているｍｉＲＮＡ配列を発現しているプラスミドをＢｌｏｃｋ−ｉＴ  Ｐｏｌ  ＩＩ  ｍｉＲ  ＲＮＡｉシステム（Invitrogen）に基づいて安定トランスフェクションする。感染は、製造業者の説明書にしたがって行う。感染の１０日後に細胞を分析する。
【０１３５】
転写されたｍｉＲＮＡ配列は：ｍｉＲＮＡ
【０１３６】
【化４】
2012526535.tif 000007
【０１３７】
である。
【０１３８】
転写分析
標準手順によるｑＲＴ−ＰＣＲによって、そしてUniversal Master mix（Diagenode）を使用して４５ＳプレｒＲＮＡ転写を測定する。マウス及びヒト４５ＳプレｒＲＮＡ及びＧＡＰＤＨを検出するために使用されるプライマー配列は、以前に記載されている。
【０１３９】
ＣｐＧメチル化分析
マウス及びヒトｒＤＮＡのメチル化を前記のように測定する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるｒＤＮＡメチル化分析のために使用されるプライマーは：
【０１４０】
【化５】
2012526535.tif 000008
【０１４１】
である。
【０１４２】
ＢｒＵＴＰの取込み
ＢｒＵＴＰ取込みのために、ｓｈＲＮＡ対照ならびにＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２細胞を蒔いたカバーガラスを、１０mM  ＢｒＵＴＰを含有するＫＨ緩衝液と共に１０分間インキュベーションする。次に、ＢｒＵＴＰ  ＫＨ緩衝液を除去し、２０％  ＦＣＳを含有する成長培地中で細胞を３０分間インキュベーションし、転写物をチェイス（chase）してから固定する。細胞を１００％メタノール中で−２０℃で２０分間固定し、５分間風乾し、ＰＢＳで５分間再水和させる。次に、モノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（Sigma-Aldrich）を使用してＢｒＵＴＰの取込みを検出する。
【０１４３】
成長曲線
６ウェルプレートのウェル１個あたり１０５個の細胞を蒔き、毎日細胞をトリプシン処理し、採取し、Casy（登録商標）細胞カウンター（Schaerfe System）で計数する。実験をウェル２組の重複で行い、２回繰り返す。
【０１４４】
ポリソームプロファイル
細胞をシクロヘキシミド（１００μg/ml、１０分間）で処理し、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５mM ＭｇＣｌ２、１００mM ＫＣｌ、２．５mM ＤＴＴ、１００μg/mlシクロヘキシミド、０．５％ ＮＰ４０、０．１mg/mlヘパリン及び２００U/ml ＲＮＡｓｅ阻害剤中で４℃で溶解させる。８０００ｇで５分間遠心分離後に、上清を１５％〜４５％スクロース勾配にロードし、２８０００rpm、４℃で４時間遠心分離する。２００μlの画分を採取し、個別の画分の吸光度を２６０nmで測定する。
【０１４５】
タンパク質の生産
構成的ＳＥＡＰ（ｐＣＡＧ−ＳＥＡＰ）又はルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ）のトランスフェクションの４８時間後にタンパク質の生産を評価する。ＳＥＡＰ生産をｐ−ニトロフェニルリン酸（nitrophenyphospate）ベースの吸光度の経時変化によって測定する。製造業者の説明書（Applied biosystems、Tropix（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキット）にしたがってルシフェラーゼのプロファイリングを行う。値を細胞数及びトランスフェクション効率に対して基準化する。ＧＦＰ発現ベクター（ＧＦＰ−Ｃ１、Clontech）をトランスフェクションされた細胞のフローサイトメトリー分析によってトランスフェクション効率を測定する。全ての実験を３組の重複で行い、３回繰り返す。
【０１４６】
懸濁細胞の細胞培養
生産及び開発規模で使用される全ての細胞系を、インキュベーター（Thermo, Germany）に入れた表面通気Ｔ−フラスコ（Nunc, Denmark）又は振盪フラスコ（Nunc, Denmark）中で、温度３７℃で５％  ＣＯ２含有雰囲気中で接種用保存継代培養物の状態で維持する。接種用保存培養物を細胞１〜３×１０５個/mLの播種密度で２〜３日毎に継代培養する。血球計数器を使用することによって、細胞濃度を全ての培養物において決定する。トリパンブルー排除法によって生存率を評価する。
【０１４７】
流加培養
１２５ml振盪フラスコに入れた、抗生物質もＭＴＸも有さないＢＩ専売の生産培地（Sigma-Aldrich, Germany）３０mlに細胞を３×１０５個/mlで蒔く。培養物を３７℃及び５％  ＣＯ２中で１２０rpmで撹拌し、３日目以降はＣＯ２を２％に低下させる。ＢＩ専売の流加液を毎日加え、必要に応じてｐＨをＮａＣＯ３を用いてｐＨ７．０に調整する。ＣＥＤＥＸ自動細胞定量システム（Innovatis）を使用して、トリパンブルー排除によって細胞密度及び生存率を決定する。
【０１４８】
抗体生産細胞の生成
ＩｇＧ１型抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドをＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Urlaub et al., Cell 1983）に安定トランスフェクションする。発現プラスミドによってコードされるそれぞれの抗生物質の存在下でトランスフェクションされた細胞を培養することによって選択を実施する。約３週間選択した後で、安定な細胞集団を得て、２〜３日毎に継代培養しながら標準的な保存培養方式によりさらに培養する。次の（随意の）ステップでは、安定トランスフェクションされた細胞集団のＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングを実施して、モノクローナル細胞系を生成させる。
【０１４９】
リコンビナント抗体濃度の決定
トランスフェクションされた細胞におけるリコンビナント抗体生産を評価するために、３回の連続する継代の各継代の終了時に標準接種培養物から、細胞上清由来試料を採取する。次に、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって産物濃度を分析する。ヒト−Ｆｃフラグメントに対する抗体（Jackson Immuno Research Laboratories）及びＨＲＰコンジュゲーション型ヒトκ軽鎖に対する抗体（Sigma）を使用して、分泌型モノクローナル抗体産物の濃度を測定する。
【０１５０】
実施例
実施例１：ＴＩＰ−５のノックダウン
リコンビナントタンパク質の合成増大のために細胞を操作することを目指して、本発明者らは、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の減少が４５ＳプレｒＲＮＡ合成を高め、その結果としてリボソームバイオジェネシスも刺激し、翻訳コンピテントリボソームの数を増大させるかどうかを判定する。したがって、本発明者らは、ＴＩＰ５の発現をノックダウンするＲＮＡ干渉を使用し、二つの異なる領域のＴＩＰ５（ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２）に特異的なｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ配列を使用して、安定なトランスジェニックｓｈＲＮＡ発現ＮＩＨ／３Ｔ３又はｍｉＲＮＡ発現ＨＥＫ２９３Ｔ及びＣＨＯ−Ｋ１を構築した。スクランブル設計したｓｈＲＮＡ配列及びｍｉＲＮＡ配列を発現している安定細胞系を対照として使用する。ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５配列又はｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現しているプラスミドの一過性トランスフェクションを行うことよりもむしろ安定細胞系を生産させることには二つの理由がある。第一に、ＣｐＧメチル化のような抑制的なエピジェネティックマークの消失は、複数の細胞分裂を必要とする受動的なメカニズムである。第二に、たとえＨＥＫ２９３Ｔ細胞を比較的容易にトランスフェクションすることができるとしても、ＮＩＨ／３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の低いトランスフェクション効率は、内因性ｒＲＮＡ、リボソームレベル及び細胞成長の性質のその後の分析を損なうであろう。選択されたクローンにおけるＴＩＰ５ノックダウンの効率を決定するために、本発明者らは、定量及び半定量逆転写酵素介在性ＰＣＲによってＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルを測定する（図１）。ＴＩＰ５の発現は、対照細胞に比べてＮＩＨ／３Ｔ３／ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＮＩＨ／３Ｔ３／ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−２細胞の方が約７０〜８０％減少する（図１Ａ）。ＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルにおける類似の低下が安定なＨＥＫ２９３Ｔで観察される（図１Ｂ）。ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞におけるＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルは、半定量ＰＣＲによってのみ測定することができる（図１Ｃ）が、ＴＩＰ５  ｍＲＮＡの低下は、安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞に類似している。これらの結果は、樹立細胞系が低レベルのＴＩＰ５を含有することを実証している。
【０１５１】
実施例２：ＴＩＰ−５のノックダウンはｒＤＮＡメチル化の低下へと導く
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、約４０％〜５０％のｒＲＮＡ遺伝子がＣｐＧ−メチル化配列を有し、転写的にサイレントである。ヒト、マウス及びチャイニーズハムスターにおけるｒＤＮＡプロモーターの配列及びＣｐＧ密度は顕著に異なる。ヒトでは、ｒＤＮＡプロモーターは２３個のＣｐＧを有し、一方マウス及びチャイニーズハムスターではそれぞれ３個及び８個のＣｐＧがある（図２Ａ〜Ｃ）。ＴＩＰ５のノックダウンがｒＤＮＡのサイレンシングに影響することを検証するために、本発明者らは、ＣＣＧＧ配列におけるｍｅＣｐＧの量を測定することによってｒＤＮＡメチル化のレベルを決定する。ゲノムＤＮＡをＨｐａＩＩで消化し、消化に対する抵抗性（すなわちＣｐＧメチル化）を、ＨｐａＩＩ配列（ＣＣＧＧ）を包含するプライマーを使用する定量リアルタイムＰＣＲによって測定する。全てのＴＩＰ５ノックダウン細胞系における大部分のｒＲＮＡ遺伝子のプロモーター領域内にＣｐＧメチル化の減少があり、ｒＤＮＡサイレンシングの促進に果たすＴＩＰ５の重要な役割を強調している（図２）。
【０１５２】
特に、ＴＩＰ５の結合及びｄｅ  ｎｏｖｏメチル化はｒＤＮＡプロモーター配列に限定されるものの、ＴＩＰ−５低下ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＣｐＧメチル化の量は、ｒＤＮＡ遺伝子全体（遺伝子内領域、プロモーター領域及びコード領域；図２Ｄ、Ｅ）にわたり減少し、ＴＩＰ５がいったんｒＤＮＡプロモーターに結合すると、ｒＤＮＡローカスに全体にサイレントなエピジェネティックのマークを樹立する拡散メカニズムを開始することを示している。
【０１５３】
実施例３：ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるｒＲＮＡレベルの増大
サイレントな遺伝子数の減少がｒＲＮＡ転写物の量に影響するかどうかを判定するために、本発明者らは、第一ｒＲＮＡプロセシング部位（図３Ａ）を包含したプライマーを使用するｑＲＴ−ＰＣＲ及びｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢｒＵＴＰ取込み（図３Ｂ）によって、４５ＳプレｒＲＮＡ合成を測定する。予想通り、両方の分析によって、ＴＩＰ５枯渇ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＴＩＰ５枯渇ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方において、対照細胞系に比べてｒＲＮＡ生産の強化が検出される。
【０１５４】
実施例４：ＴＩＰ−５の枯渇は増殖及び細胞成長の増大へと導く
Ｒａｓは、ヒトのガンで多くの場合に突然変異又は過剰発現している、細胞トランスフォーメーション及び腫瘍形成に関与する周知のガン遺伝子である。Greenら、２００９；国際公開公報第２００９／０１７６７０号は、包括的ｍｉＲＮＡ選別からＴＩＰ−５がＦａｓのＲａｓ介在性エピジェネティックサイレンシングエフェクター（ＲＥＳＥ）として機能することを確認したと記載している。その公報は、ＴＩＰ−５などのＲａｓエフェクターの発現低下が細胞増殖阻害を招くことを記載している。
【０１５５】
本発明者らは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞を分析する。図４Ａ、Ｂに示すように、Ｓ期の細胞数は、対照細胞に比べて両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞の方が顕著に高い。ＴＩＰ５配列に対するｍｉＲＮＡを発現しているレトロウイルスを感染させた１０日後のＮＩＨ３Ｔ３細胞から、類似のプロファイルが得られる。これらの結果に一致して、ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞は、新生ＤＮＡへの５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込み増大及びさらに高レベルのサイクリンＡを示す（図４Ｃ）。
【０１５６】
最終的に本発明者らは、ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５、ｓｈＲＮＡ対照及び親のＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の間で細胞増殖速度を比較する（図４Ｄ〜Ｆ）。驚くことに、そして先行技術の報告と対照的に、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現しているＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方が、対照細胞よりも速い速度で増殖し、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の減少が実際に細胞代謝に影響を有することを示唆している。ＨＥＫ２９３ＴにおけるＴＩＰ５枯渇は、あまり細胞増殖に影響しない。それは、これらの細胞がすでにその最大増殖速度に達していたからである。これらのデータは、驚くことにＴＩＰ５の枯渇及びその結果のｒＤＮＡサイレンシングの減少が細胞増殖を高めることを示す。
【０１５７】
実施例５：ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム分析
哺乳動物細胞培養において、タンパク質合成速度は、産物の収量に直接関係する重要なパラメーターである。ＴＩＰ５の枯渇及び結果としてのｒＤＮＡサイレンシングの減少が細胞における翻訳コンピテントなリボソーム数を増大させるかどうかを判定するために、本発明者らは、最初、細胞質ｒＲＮＡレベルを測定する。細胞質において、大部分のＲＮＡは、リボソームに集合したプロセシング済みｒＲＮＡから成る。図５Ａ〜Ｃに示すように、全てのＴＩＰ５枯渇細胞系は、細胞あたり、より多くの細胞質ＲＮＡを含有し、これらの細胞がより多くのリボソームを生産することを示している。また、ポリソームプロファイルの分析は、ＴＩＰ５枯渇ＨＥＫ２９３細胞及びＴＩＰ５枯渇ＣＨＯ−Ｋ１細胞が対照細胞に比べて多くのリボソームサブユニット（４０Ｓ、６０Ｓ及び８０Ｓ）を含有することを示す（図５Ｄ）。
【０１５８】
実施例６：ＴＩＰ−５のノックダウンはレポータータンパク質の生産強化へと導く
ＴＩＰ５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングの減少が異種タンパク質の生産を高めるかどうか判定するために、本発明者らは、安定なＴＩＰ５枯渇ＮＩＨ／３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＣＨＯ−Ｋ１誘導体に、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼＳＥＡＰ又はルシフェラーゼの構成的発現を促進する発現ベクター（それぞれｐＣＡＧ−ＳＥＡＰ；図６Ａ〜Ｃ又はｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ；図６Ｄ、Ｅ）をトランスフェクションする。４８時間後のタンパク質生産の定量から、対照細胞に比べてＴＩＰ５枯渇細胞の方がＳＥＡＰ及びルシフェラーゼの両方の生産が２〜４倍に増大することが明らかとなり、ＴＩＰ５の枯渇が異種タンパク質の生産を増大させることを示している。これら結果の全ては、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数の減少が、リボソーム合成を高め、細胞がリコンビナントタンパク質を生産する能力を増大させることを示す。
【０１５９】
実施例７：ＴＩＰ−５のノックアウトは単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）のバイオ医薬品生産を増大させる
（ａ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を分泌しているＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）に、空のベクター（疑似対照）又はＴＩＰ−５の発現をノックダウンするように設計された小ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）をトランスフェクションする。続いて、細胞を選択に供し、安定な細胞プールを得る。続く６回の継代の間に、疑似細胞プール及びＴＩＰ−５枯渇安定細胞プールの両方の接種用保存培養物から上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってＭＣＰ−１力価を決定し、平均細胞数で除算し、比生産性を計算する。最高のＭＣＰ−１力価は、最も効率的にＴＩＰ−５を枯渇した細胞プールで認められ、一方でタンパク質濃度は、疑似トランスフェクション細胞又は親細胞系の方が顕著に低い。
【０１６０】
ｂ）ＣＨＯホスト細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）に最初に短いＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）をトランスフェクションし、ＴＩＰ−５の発現を低下させ、安定なＴＩＰ−５枯渇ホスト細胞系を生成させる。続いてこれらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ４４野生型細胞に、関心が持たれる遺伝子として単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）をコードするベクターをトランスフェクションする。２ラウンドの選択後に、その後４回の継代期間にわたり全ての安定な細胞プールの接種用保存培養物から上清を採取し、ＭＣＰ−１力価をＥＬＩＳＡによって決定し、平均細胞数で除算し、比生産性を計算する。最高のＭＣＰ−１力価及び生産性は、最も効率的にＴＩＰ−５を枯渇した細胞プールで認められ、一方でタンパク質濃度は、疑似トランスフェクション細胞又は親細胞系の方が顕著に低い。
【０１６１】
ｃ）ａ）又はｂ）に記載されたまさにその細胞を回分発酵又は流加発酵に供する場合、全体的なＭＣＰ−１力価の差はなおいっそう顕著になる。ＴＩＰ−５の発現が低下した、トランスフェクションされた細胞が細胞及び時間あたり、より速く成長し、より多くのタンパク質も生産することから、それらはより高いＩＶＣを示し、同時により高い生産性を示す。両方の性質は、全体的なプロセス収量に正の影響を与える。したがって、ＴＩＰ−５欠失細胞は、顕著に高いＭＣＰ−１収集物力価を有し、より効率的な生産プロセスへと導く。
【０１６２】
実施例８：ＴＩＰ−５遺伝子のノックアウトはｒＲＮＡの転写を増大させ増殖を最も効率的に高める
ＴＩＰ−５の発現が常に低下したレベルの、改良された生産ホスト細胞系を生成させる最も効率的な方法は、ＴＩＰ−５遺伝子の完全ノックアウトを生成させることである。このために、ＴＩＰ−５遺伝子を破壊してその発現を阻止するために相同組換えを使用するか、又はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技法を採用するかのいずれかを行うことができる。相同組換えはＣＨＯ細胞において効率的ではないことから、本発明者らは、ＴＩＰ−５遺伝子内に二本鎖切断を導入することによりそれを機能的に破壊するＺＦＮを設計する。ＴＩＰ−５の効率的なノックアウトを確認するために、抗ＴＩＰ−５抗体を使用してウエスタンブロットを行う。ＴＩＰ−５ノックアウト細胞では膜上にＴＩＰ−５の発現は検出されず、親ＣＨＯ細胞系は、ＴＩＰ−５タンパク質に対応する明瞭なシグナルを示す。
【０１６３】
次に、ＴＩＰ−５ノックアウトＣＨＯ細胞及び親ＣＨＯ細胞系においてｒＲＮＡ転写を分析する。このアッセイは、両方の親細胞に比べて、そしてまたＴＩＰ−５発現レベルだけが低下した細胞に比べて、ＴＩＰ−５ノックアウト細胞の方が高いレベルのｒＲＮＡ合成及び増大したリボソーム数であることを確認する。
【０１６４】
さらに、ＴＩＰ５野生型細胞及びＴＩＰ−５の発現だけが干渉性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉなど）の誘導によって低下した細胞系に比べて、ＴＩＰ−５欠損細胞の方が流加プロセスにおいて速く増殖し、高い細胞数を示す。
【０１６５】
実施例９：ＴＩＰ−５枯渇細胞における治療用抗体の生産強化
（ａ）ヒトＩｇＧサブタイプモノクローナル抗体を分泌しているＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）に空のベクター（模擬対照）又はＴＩＰ−５発現をノックダウンするように設計された小ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）をトランスフェクションする。続いて細胞を選択に供し、安定な細胞プールを得る。又は、ＴＩＰ−５遺伝子の欠失（ノックアウト）によってＴＩＰ−５を枯渇させる。続く６回の継代の間に、疑似細胞プール及びＴＩＰ−５枯渇安定細胞プールの両方の接種用保存培養物から上清を採取し、抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定し、細胞の平均数で除算し、比生産性を計算する。最高のＩｇＧ力価をＴＩＰ−５枯渇細胞の培養物から測定し、一方でタンパク質濃度は、疑似トランスフェクションされた細胞又は親細胞系の方が顕著に低い。
【０１６６】
ｂ）ＴＩＰ−５配列にハイブリダイゼーションする短いＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）のトランスフェクション又はＴＩＰ−５遺伝子の安定ノックアウトのいずれかによって、ＣＨＯホスト細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）からＴＩＰ−５を枯渇させる。続いてこれらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ４４野生型細胞に、関心が持たれる遺伝子として抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現構築物をトランスフェクションする。安定トランスフェクションされた細胞集団を生成させ、その後４回の継代期間にわたり全ての安定細胞プールの接種保存培養物から上清を採取する。培養上清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、平均細胞数で除算し、比生産性を計算する。ＴＩＰ−５枯渇細胞から得られた細胞プールは、顕著に低いＩｇＧ量を生産する疑似対照及び親の非改変ＤＧ４４細胞系に比べて最高の抗体力価及び生産性を示す。
ｃ）ａ）又はｂ）に記載されたその細胞が回分発酵又は流加発酵に供される場合、抗体力価全体における差は、なおいっそう顕著になる：ＴＩＰ−５枯渇細胞は、細胞及び時間あたりより速く成長し、より多くのタンパク質も生成することから、それらは、より高いＩＶＣを示し、同時により高い生産性を示す。両方の性質は、全体的なプロセス収量に正の影響を与える。したがって、ＴＩＰ−５枯渇細胞は、顕著に高いＩｇＧ収集物力価を有し、より効率の高い生産プロセスへと導く。
【０１６７】
実施例１０：タンパク質の生産増大及び細胞成長の改良へと導くＳＮＦ２Ｈのノックダウン
（ａ）ヒトモノクローナルＩｇＧサブタイプ抗体を分泌しているＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）に空のベクター（疑似対照）又はＳＮＦ２Ｈの発現をノックダウンするように設計された小ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）をトランスフェクションする。続いて細胞を選択に供し、安定な細胞プールを得る。又は、ＳＮＦ２Ｈ遺伝子の欠失／破壊によってＳＮＦ２Ｈを枯渇させる（ノックアウト）。続く６回の継代の間に、疑似細胞プール及びＳＮＦ２Ｈ枯渇安定細胞プールの両方の接種用保存培養物から上清を取り出し、ＥＬＩＳＡによって抗体力価を決定し、平均細胞数で除算して比生産性を計算する。ＳＮＦ２Ｈ枯渇細胞の培養物から最高のＩｇＧ力価を測定するが、タンパク質濃度は、疑似トランスフェクションされた細胞又は親細胞系の方が顕著に低い。
【０１６８】
ｂ）ＳＮＦ２Ｈ配列にハイブリダイゼーションする短鎖ＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）のトランスフェクション又はＳＮＦ２Ｈ遺伝子の安定ノックアウトのいずれかによって、ＣＨＯホスト細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）からＳＮＦ２Ｈを枯渇させる。続いてこれらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ４４野生型細胞に、関心が持たれるタンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現構築物をトランスフェクションする。安定的にトランスフェクションされた細胞集団を生成させ、その後４回の継代期間にわたり全ての安定細胞プールの接種用保存培養物から上清を取り出す。培養上清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、平均細胞数で除算し、比生産性を計算する。ＳＮＦ２Ｈ枯渇細胞から得られた細胞プールは、顕著に低いＩｇＧ量を生産する疑似対照及び親の非改変ＤＧ４４細胞系に比べて最高の抗体力価及び生産性を示す。
【０１６９】
ｃ）ａ）又はｂ）に記載されたその細胞が回分発酵又は流加発酵に供される場合、抗体力価全体における差は、なおいっそう顕著になる。ＳＮＦ２Ｈ枯渇細胞は、細胞及び時間あたりより速く成長し、より多くのタンパク質も生成することから、それらは、より高いＩＶＣを示し、同時により高い生産性を示す。両方の性質は、全体的なプロセス収量にプラスの影響を有する。したがって、ＳＮＦ２Ｈ枯渇細胞は、顕著に高いＩｇＧ収集物力価を有し、より効率の高い生産プロセスへと導く。
【０１７０】
【表２】
2012526535.tif 000009
【図１Ｃ】
2012526535.tif 000010
【図１Ａ】
2012526535.tif 000011
【図１Ｂ】
2012526535.tif 000012
【図２Ａ】
2012526535.tif 000013
【図２Ｂ】
2012526535.tif 000014
【図２Ｃ】
2012526535.tif 000015
【図２Ｄ】
2012526535.tif 000016
【図２Ｅ】
2012526535.tif 000017
【図３Ａ】
2012526535.tif 000018
【図３Ｂ】
2012526535.tif 000019
【図４Ａ】
2012526535.tif 000020
【図４Ｂ】
2012526535.tif 000021
【図４Ｃ】
2012526535.tif 000022
【図４Ｄ】
2012526535.tif 000023
【図４Ｅ】
2012526535.tif 000024
【図４Ｆ】
2012526535.tif 000025
【図５Ａ】
2012526535.tif 000026
【図５Ｂ】
2012526535.tif 000027
【図５Ｃ】
2012526535.tif 000028
【図５Ｄ】
2012526535.tif 000029
【図５Ｅ】
2012526535.tif 000030
【図６Ａ】
2012526535.tif 000031
【図６Ｂ】
2012526535.tif 000032
【図６Ｃ】
2012526535.tif 000033
【図６Ｄ】
2012526535.tif 000034
【図６Ｅ】
2012526535.tif 000035
【配列表】
2012526535000001.app
【国際調査報告】
2012526535.tif 000036
2012526535.tif 000037
2012526535.tif 000038
2012526535.tif 000039