(57)【要約】【解決手段】本発明は、機能性作用基を物質の表面に導入する方法に関する。本発明によれば、機能性作用基を有する化合物を脂質と混合し、物質の表面に導入する方法が提供される。本発明による方法は、例えば、機能性作用基を有する化合物を脂質と混合し、リポソームを形成する段階；及び上記リポソームを上記物質の表面に導入する段階を含む。本発明により機能性作用基を物質の表面に導入する方法は、従来の化学的な表面処理方法に比べて工程が簡便であり、時間を短縮できるだけでなく、物質の表面に受容体を固定するにおいて、効率及び再現性が高い効果がある。また、複数類の試薬を用いる必要がなく、簡単で、化学専攻者でない人も容易に活用できる。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性作用基を物質の表面に導入する方法において、
機能性作用基を有する化合物を脂質と混合し、物質の表面に導入することを特徴とする機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項２】
上記方法は、機能性作用基を有する化合物を脂質と混合し、リポソームを形成する段階；及び
上記リポソームを上記物質の表面に導入する段階
を含むことを特徴とする請求項１に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項３】
上記機能性作用基は、受容体の固定に必要な作用基であるか、またはそれ自体で受容体の機能をすることが可能な作用基であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項４】
上記方法は、上記物質の表面に上記リポソームを単分子層または二分子層として導入することを特徴とする請求項２に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項５】
上記機能性作用基を有する化合物は、機能性作用基を有する脂質または機能性作用基を有する長鎖炭化水素で構成される群のうちのいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項６】
上記物質は、金属、セラミック、リポソーム、半導体、高分子のうちのいずれか一つであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項７】
上記機能性作用基を有する長鎖炭化水素は、オクタデシルビオチン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ｂｉｏｔｉｎ）、オクタデシルヒドラジド（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、オクタデシルマレイミド（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、オクタデシルＮＴＡ（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ＮＴＡ）のうちのいずれか一つまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項５に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項８】
上記物質は、バイオセンサーまたはガスセンサーのうちのいずれか一つの表面を構成する物質であることを特徴とする請求項６に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項９】
上記物質は、クロマトグラフィー媒質であることを特徴とする請求項６に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項１０】
上記物質は、ナノ物質であることを特徴とする請求項６に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【請求項１１】
上記方法は、上記物質の表面に自己集合単分子層（ＳＡＭ）を形成させる段階；上記機能性作用基を含む化合物を脂質と混合し、リポソームを形成する段階；及び上記リポソームと上記自己集合単分子層を結合させる段階を含むことを特徴とする請求項６に記載の機能性作用基を物質の表面に導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面化学技術に関し、より具体的には、物質の表面に機能性作用基を導入する方法に関する。ここで、機能性作用基は、受容体の固定に必要な作用基であるか、それ自体で受容体の機能をすることが可能な作用基に代表されると言える。
【背景技術】
【０００２】
物質（例えば、固体または粒子）の表面に特定機能を有する機能性作用基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）を導入することは、バイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）、ガスセンサー（ｇａｓ  ｓｅｎｓｏｒ）、ナノ粒子を用いた診断または薬物伝達（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を用いた診断または薬物伝達、クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などの多様な分野で非常に重要である。このような作用基は、受容体として作用する生物高分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を固定させるのに使われるか、または、それ自体で分子認識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）に用いられることもできる。
【０００３】
リポソームの表面に受容体を固定させる場合、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＰＥ）という脂質に特定の作用基を導入する方法がよく使われる。ＰＥは、上部の基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）にアミノ基（ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ）を有しており、化学反応を起こしやすいためである。例えば、ＰＥを含むリポソームを作り、該当リポソームをＮ−スクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）のような化合物と反応させると、ジチオピリジル基（ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｙｌ  ｇｒｏｕｐ）が生成される（図１参照）。ここにチオール基を有している受容体を反応させれば、二酸化結合により受容体が固定される。しかし、このように表面で化学反応を起こす方法は、反応の効率が低く、煩わしくかつ再現性の低い短所がある。
【０００４】
バイオセンサーの金属表面に受容体を固定させる場合、その金属表面に自己集合単分子層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ，ＳＡＭ）を形成する方法が一般によく使われる。一端部にチオール基を有するアルカンチオール化合物は、硫黄原子と金属表面との間の化学吸着結合と炭化水素鎖間の疎水性引力により、金属表面に自発的に自己集合単分子層を形成する。このとき、アルカンチオール化合物が、チオール基のある端部の反対側端部に特定の作用基を有していれば、その作用基を用いて他の分子を固定させることができる。
【０００５】
例えば、１１−メルカプト−１−ウンデカン酸（１１−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，ＭＵＡ）のような化合物で自己集合単分子層を設けた後、上記自己集合単分子層の表面にあるカルボキシ基に、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド［Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ；ＥＤＣ］とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；ＮＨＳ）とを順に反応させれば、カルボキシ基のあったところにＮＨＳ基が導入され、ここにアミノ基を有する受容体分子を反応させることができる（図２参照）。
【０００６】
受容体分子がチオール基を有している場合には、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール（１１−ａｍｉｎｏ−１−ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）のような化合物で自己集合単分子層を設け、自己集合単分子層の表面にあるアミノ基に、Ｎ−［−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミド｛Ｎ−［−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｔｌｏｘｙ］ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；ＧＭＢＳ｝を反応させる。すると、アミノ基のあったところにマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）基が導入され、チオール基を有する受容体分子を固定させることができる。
【０００７】
一方、抗体を固定させるときは、抗体をメタ過よう素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｍ−ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）（または、よう素酸ナトリウム）と反応させ、抗体にある炭水化物にアルデヒド基が形成されるようにする。金属表面には、アミノ基を用いて固定させるときと同様の方法でＮＨＳ基を導入し、カルボヒドラジド（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｚｉｄｅ）を反応させ、アジド基（ａｚｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）を導入する。ここにアルデヒド基を含む抗体を反応させれば、シッフ塩基（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ  ｂａｓｅ）が形成されるが、これをさらにシアノボロヒドリド（ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）で反応させ、結合を安定化させる（図３参照）。
【０００８】
このように従来の方式によりヒドラジド（ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）作用基を用いて抗体を固定させる場合、ＳＡＭが形成されたセンサーチップから始めれば、ＥＤＣ／ＮＨＳ反応、カルボヒドラジド（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｚｉｄｅ）反応、エタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）反応、抗体固定反応、シアノボロヒドリド反応の５段階を経なければならず、総時間は約３〜４時間が要される。
【０００９】
このようにＳＡＭに化学反応を起こす方法は、リポソームに化学反応を起こす場合と同様に反応性が低く、煩わしくかつ再現性の低い問題を有しているため、固定に必要な作用基を有するアルカンチオール化合物も用いられている。例えば、端部にＮＨＳ基を有しているジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）［ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）］（図４参照）のような化合物を混ぜてＳＡＭを形成すれば、追加の反応なしにＳＡＭの表面に直接アミノ基を有する分子を反応させることができるＮＨＳ基が導入される。しかし、このように特定の作用基を有するアルカンチオール化合物は合成が難しいため、価格が高いだけでなく、安全性が低く、広く使われていない。
【００１０】
化学的な固定方法のこのような短所を解決するために、従来、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）蛋白質を固定させたセンサーチップを用いることもある。アビジンは、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）と強く、そして選択的に結合する特性があるが、受容体分子にビオチンを化学的に結合させるのは、比較的簡単なことであるだけでなく、抗体の場合には、予めビオチンを結合させた抗体を購入することもできる。
【００１１】
従って、アビジンが固定されたセンサーチップにビオチンを結合させた受容体を加えれば、短時間で簡単に受容体を固定させることができる。しかし、アビジンは、比較的容易に変成されるため、アビジンを含むセンサーチップは保管が難しく、また、価格が非常に高いという短所がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の主な目的は、上記のような従来技術の限界を克服するために、物質の表面に機能性作用基を導入するにおいて複数の段階の化学的な反応を経ることなく、簡単に作用基を導入する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、従来の化学的な反応による導入が不可能であるか、または困難であった作用基を容易に導入できるようにするだけでなく、より安価の材料を用いて物質の表面に機能性作用基を導入することにより、該当表面化学技術の経済性を高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、本発明は、機能性作用基を物質の表面に導入する方法において、機能性作用基を有する化合物を脂質と混合し、物質の表面に導入する方法を提供する。
【００１５】
本発明による方法は、例えば機能性作用基を有する化合物を脂質と混合し、リポソームを形成する段階；及び上記リポソームを上記物質の表面に導入する段階を含むことを特徴とする。
【００１６】
上記本発明による「物質」は、金属、セラミック、リポソーム、半導体、高分子のうちのいずれか一つであるのが普通である。そしてこのような物質は、バイオセンサー、ガスセンサー、ナノ物質、クロマトグラフィー媒質、半導体、高分子、リポソームなどの表面を構成する物質を指すものであり得る。
【００１７】
ここで、機能性作用基は、物質に特定の機能を付与するために必要な作用基であるという広い意味に解釈されなければならない。機能性作用基は、受容体の固定に必要な作用基であるか、またはそれ自体で受容体の機能をすることが可能な作用基に代表され得る。
【００１８】
また、上記本発明による「受容体」は、物質の表面に直接または間接に連結され、ターゲット物質と相互作用できる物質であるという広い意味に解釈されなければならない。
【００１９】
このような受容体は、バイオセンサー、ガスセンサー、ナノ粒子を用いた診断または薬物伝達、リポソームを用いた診断または薬物伝達、クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などの多様な分野に用いられる生物高分子または有機作用基に代表される。生物高分子としては、抗体やホルモンのような蛋白質だけでなく、核酸や炭水化物など、いかなる物質でも使用可能である。有機作用基としては、簡単なカルボキシ基やアミノ基から複雑なビオチンや葉酸（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）に至るまで、いかなる形態の作用基も可能である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によるリポソームを用いた固体または粒子の表面に機能性作用基を導入させる方法は、従来の方法に比べて簡便であり、時間が短縮され、また、受容体の固定において効率及び再現性が高くなる効果があるだけでなく、従来の方法により導入できなかった作用基の導入を可能にすることもできる。このような効果のため、本発明による方法は、例えばバイオセンサー、ガスセンサー、クロマトグラフィー媒質、薬物伝達用ナノ物質、診断用ナノ物質などの表面に機能性作用基を導入するにおいて非常に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、従来技術により、ＰＥを含むリポソームを作り、該当リポソームにＳＰＤＰを反応させ、ジチオピリジル基（ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を生成する方法を示すものである。
【図２】図２は、従来技術により、ＥＤＣとＮＨＳの連続反応によりＳＡＭのカルボキシル基をＮＨＳ基に切り替えた後、蛋白質のアミノ基と反応させて蛋白質を固定する方法を示すものである。
【図３】図３は、従来技術により、図２で形成されたＮＨＳ基をヒドラジド基に切り替えて抗体を固定する方法を示すものである。
【図４】図４は、従来技術によるジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）の化学式を示すものである。
【図５】図５は、本発明を説明するために、脂質（ｌｉｐｉｄ）の構造を図式化して示すものである。
【図６】図６は、本発明を説明するために、脂質二分子層（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ）とリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の構造を図式化したものである。
【図７】図７は、本発明を説明するために、センサーの金属表面にアルカンチオール化合物を加えるときに形成される自己集合単分子層の構造を図式化したものである。
【図８】図８は、本発明を説明するために、センサー表面の疎水性自己集合単分子層の上にリポソームを加えるときに形成される脂質単分子層の構造を図式化したものである。
【図９】図９は、本発明を説明するために、ビオチン−ＰＥ（ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥ；１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−Ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌ）の構造式を示すものである。
【図１０】図１０は、本発明を説明するために、ベース脂質に受容体の固定に必要な作用基を有する脂質を混ぜてリポソームを作り、そのリポソームを疎水性自己集合単分子層の上に加えるときに形成される脂質単分子層の構造を図式化したものである。
【図１１】図１１は、本発明の望ましい実施例による各用途に用いることができる機能性作用基を有する脂質の構造を示すものである。
【図１２】図１２は、本発明の望ましい実施例による各用途に用いることができる複数の機能性作用基を有する長鎖炭化水素の構造を示すものである。
【図１３】図１３は、本発明の望ましい実施例により、ベース脂質に機能性作用基を有する炭化水素化合物を混ぜてリポソームを作り、そのリポソームを疎水性自己集合単分子層の上に加えるときに形成される脂質単分子層の構造を図式化したものである。
【図１４】図１４は、本発明の望ましい実施例による自己集合が可能な３種類の機能性分子を示すものであって、（ａ）機能性作用基を有する炭化水素化合物、（ｂ）機能性作用基を有するアルカンチオール化合物、（ｃ）機能性作用基を有する脂質であり、機能性作用基は、Ｒで表されている。
【図１５】図１５は、本発明の望ましい実施例により、特定の作用基を有する脂質をベース脂質と混ぜてリポソームを作った後、そのリポソームを用いてコーティングしたガスセンサーの表面構造を示すものである。
【図１６】図１６は、本発明の望ましい実施例により、特定の作用基を有する炭化水素化合物をベース脂質と混ぜてリポソームを作った後、そのリポソームを用いてコーティングしたガスセンサーの表面構造を示すものである。
【図１７】図１７は、本発明の望ましい実施例により、特定の作用基を有する脂質のみで構成されたリポソームを用いてコーティングしたガスセンサーの表面構造を示すものである。
【図１８】図１８は、本発明の望ましい実施例により、オクタノイックヒドラジドを用いて酸化した抗体を固定する過程での周波数の変化を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明の望ましい実施例による図１８の結果と比較するために、従来技術による酸化した抗体を固定する過程での周波数の変化を示すグラフである。
【図２０】図２０は、本発明の望ましい実施例により、オクタノイックヒドラジドを用いて酸化した抗体を固定させて作られた免疫センサーチップにおける抗原の濃度に応じた周波数の変化値を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の望ましい実施例により、オクタノイックヒドラジドを用いて酸化した抗体を固定させて作られた免疫センサーチップにおいて、同一の濃度の抗原を繰り返して注入する時の周波数の変化値を示すグラフである。
【図２２】図２２は、本発明の望ましい実施例により、ＭＢＰ−ＰＥを用いてチオール基を有する抗体を固定させて作られた免疫センサーチップにおける抗原の濃度に応じた周波数の変化値と、同一の濃度の抗原を繰り返して注入する時の周波数の変化値とを示すグラフである。
【図２３】図２３は、本発明の望ましい実施例により、オクタデシルマレイミドを用いてチオール基を有する抗体を固定させて作られた免疫センサーチップにおいて、同一の濃度の抗原を繰り返して注入する時の周波数の変化を示すグラフである。
【図２４】図２４は、本発明の望ましい実施例により、ビオチン−ＰＥを用いてアビジンを固定させ、さらにその上にビオチン基を付着した抗体を固定させて作られた免疫センサーチップにおいて、抗原の濃度に応じた周波数の変化値を示すグラフである。
【図２５】図２５は、本発明の望ましい実施例により、ベース脂質であるＤＰＰＣでのみコーティングしたガスセンサーと、ベース脂質にビオチン−ＰＥ、ＭＢＰ−ＰＥまたはＮＢＤ−ＰＥを混ぜてコーティングした３種類のガスセンサーとの気体状態の有機化合物に対する反応の比較を示すグラフである。
【図２６】図２６は、本発明の望ましい実施例により、ベース脂質であるＤＰＰＣに３−ドデシルチオフェノンまたはドデカンニトリルを混ぜて作ったリポソームでコーティングした２種類のガスセンサーの有機ガスに対する反応を比較したグラフであって、エチルアセテートは、エチル３−クロロプロピオネートである。
【図２７】図２７は、本発明の望ましい実施例により、オクタデシルＮＴＡを用いてバイオセンサーの表面にＮｉ２＋イオンを固定させ、さらにここに（Ｈｉｓ）６−ｔａｇｇｅｄ  ＭＢＰを結合させる時の周波数の変化値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の具体的な方法を、実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明の権利範囲は、これらの実施例にのみ限定されるものではない。まず、本発明の実施例と関連して脂質層の形成に係る基本的な事項を、図５〜図１０を参照して説明する。
【００２３】
図５に示すように、脂質は、極性の頭部と非極性の尾部からなっており、極性の頭部に２つの非極性の尾部を有する構造で表すことができる。このような脂質の構造的特性により、脂質が水溶液の環境に置かれれば、疎水性の尾部を内部に隠すために、図６に示すように、脂質二分子層（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ）を形成し、結果としてリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）が作られるようになる。
【００２４】
オクタデカンチオール（ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）で作られた自己集合単分子層は、図７に示すように、疎水性表面を有しており、脂質二分子層を形成しているリポソームをこれに反応させれば、図８に示すように、リポソーム内の脂質の疎水性尾部が疎水性表面と接触し、脂質単分子層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成することができる。このような脂質のうち機能性作用基を有する脂質を混合すれば、効果的にバイオセンサーの表面に機能性作用基を導入することができる。例えば、ビオチン−ＰＥ（ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥ）（図９参照）のような脂質をベース脂質と混合してリポソームを形成すれば、図１０に示すように、その作用基を脂質単分子層の表面に現すようにすることにより、その上にアビジンを固定させることができる。ここで「ベース脂質」とは、機能性作用基のない脂質であって、機能性作用基を有する化合物と混合されてリポソームを形成できる物質をいう。
【００２５】
本発明の実施例による機能性作用基を有する化合物は、「機能性作用基を有する脂質」と「機能性作用基を有する長鎖炭化水素化合物」とで構成される群のうちのいずれか一つ以上であり得る。機能性作用基を有する化合物は、受容体の固定反応に用いられるか、または他の分子との相互作用に直接用いられ得る作用基を有し、かつ疎水性尾部により脂質と混合されて層（ｌａｙｅｒ）を形成することができる。このような機能性作用基を有する化合物の例としては、ビオチン−ＰＥの他に、図１１に示すように、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド｛１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［４−（ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｍｉｄｅ；ＭＢＰ−ＰＥ］や１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−｛［Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸］スクシニル｝｛１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−｛［Ｎ（５−ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）ｉｍｉｎｏ  ｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ］ｓｕｃｃｉｎｙｌ；ＤＯＧＳ−ＮＴＡ｝などの機能性作用基を有する脂質がある。
【００２６】
また、図１２に示すように、オクタデシルビオチン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ｂｉｏｔｉｎ）、オクタデシルヒドラジド（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、オクタデシルマレイミド（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、オクタデシルＮＴＡ（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  Ｎ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）などの機能性作用基を有する長鎖炭化水素も、機能性作用基を有する化合物の代表的な例であると言える。機能性作用基を有する長鎖炭化水素は、脂質と混合されてリポソームを形成することができる。従って、機能性作用基を有する長鎖炭化水素を備えるリポソームを用い、自己集合単分子層の上に脂質単分子層を形成すれば、物質の表面に機能性作用基を導入することができる（図１３）。
【００２７】
図１４には、本発明の望ましい実施例による機能性作用基を有する３種類の化合物を図式的に示されている。図１４において、特に機能性作用基を有する炭化水素（ａ）は、機能性作用基を有するアルカンチオール化合物（ｂ）や機能性作用基を有する脂質（ｃ）に比べ、単純な構造を有しているため、脂質やアルカンチオール化合物に比べて次のような長所を有する。第一に、脂肪族鎖の単純な構造により合成反応に制約が少なく、長い炭化水素鎖を有する多様な化合物が既に存在するため、ほぼ無限な種類の機能性作用基を有する化合物を活用することができる。第二に、飽和した脂肪族鎖は、反応性が低いため、安定で保管が容易である。第三に、このような理由により、経済性が非常に高い。
【００２８】
本発明のうちリポソームの製造時に、望ましくはベース脂質及び機能性作用基を有する化合物を１つのバイアル（ｖｉａｌ）に１つのセンサーチップをコーティングできる量だけフィルム状に乾燥して保管し、これを用いてリポソームを製造することができる。または、予めリポソームを作り、それを１つのセンサーチップをコーティングできる量に分け、冷凍させた状態に保管して用いることもできる。この場合、用いる前に超音波を若干加え、リポソームを再度ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に切り替えることが望ましい。
【００２９】
また、上述したように、機能性作用基を有する化合物を脂質と混合して物質の表面に導入する本発明による方法は、既に疎水性表面を有している物質、表面を疎水性に切り替えることができるあらゆる物質、リポソームのような脂質粒子、そして脂質二分子層を結合できるあらゆる物質などの表面化学に適用することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）の原理を用いるバイオセンサーや水晶振動子微小天秤（ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）バイオセンサーの表面を構成する物質（普通、金属である）に適用が可能である。
【００３０】
上記水晶振動子微小天秤のように金属表面を有するセンサーの他にも、炭素ナノチューブガスセンサー、半導体方式ガスセンサー、ナノワイヤーＦＥＴ（ｎａｎｏｗｉｒｅ  ＦＥＴ）ガスセンサー、電気化学式ガスセンサーなどの多様な方式のセンサーの表面も脂質層でコーティングすることができる。従って、機能性作用基を有する化合物を含むリポソームでコーティングすることにより、図１５または図１６に示すように、表面の化学的特性が互いに異なる数多くのガスセンサーを作ることができる。このように表面の化学的特性が異なるセンサーは、有機ガスに対して互いに異なる反応を見せるため、特異的なガスセンサーとして用いられ得る。
【００３１】
また、ガスセンサーの場合、分析対象物質が分子量の小さな有機化合物であるため、センサー表面の化学的特性を均一化するために、図１７に示すように、一種の機能性作用基を有する脂質でのみコーティングすることができる。窮極的にはこのような多様なガスセンサーを適切に組み合わせることにより、電子鼻（ｅ−ｎｏｓｅ）の構成が可能になる。
【００３２】
Ｃ１８シリカゲルは、その表面が疎水性を帯びるので、脂質層でコーティングすることができる。従って、本発明の方法を適用して多様な作用基を導入したクロマトグラフィー媒質（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍｅｄｉａ）として機能することができる。例えば、オクタデシルＮＴＡをリポソームに混ぜてコーティングすれば、ヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）を有する蛋白質を分離可能な物質を作ることができる。
【００３３】
また、リポソームは、脂質二分子層からなっているため、機能性作用基を有する化合物を直接導入することができる。リポソームを製造するとき、適当な機能性作用基を有する化合物を含ませて作れば、リポソームに抗体をはじめとした目標指向性リガンド（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）を容易に導入することができる。このような目標指向性リガンドを備えたリポソームは、治療物質の伝達や診断に用いられ得る。
【００３４】
疎水性ポリ（ジメチルシロキサン）［ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）；ＰＤＭＳ］の表面は、脂質単分子層でコーティングできる反面、ＰＤＭＳの表面をプラズマで酸化させ、親水性に切り替えれば、脂質二分子層でコーティングすることができる。従って、上記のように多様な方法でＰＤＭＳの表面に機能性作用基を導入することができる。
【００３５】
ナノ物質は、超高感度バイオセンサー、診断、治療物質の伝達、生命科学の研究などに応用できるが、そのような応用のための核心技術が生体機能性の付与（ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）である。本発明による方法は、ナノ物質の生体機能性の付与にも用いられ得る。
【００３６】
例えば、トリオクチルホスフィンオキサイド（ｔｒｉｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ；ＴＯＰＯ）で安定化したカンタムドット（ＴＯＰＯ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）の場合、ＴＯＰＯが疎水性表面を有する性質を用い、その上に直接脂質単分子層を形成することができる。特にこの方法は、ＴＯＰＯ層に取って代わることなく、その上に層をさらに加える方式であるため、カンタムドットの敏感な表面を露出させないという長所がある。金または銀ナノ粒子は、ＱＣＭやＳＰＲ表面と同一の方法により、アルカンチオールを用いて疎水性ＳＡＭを形成し、その上に脂質単分子層を設けることができ、最近は、直接脂質で囲まれたナノ粒子を合成する方法も報告されている。炭素ナノチューブは、疎水性表面を有しており、その表面に脂質層が形成され得る。従って、本発明の方法により上記物質の表面に機能性作用基を導入し、結果としてナノ物質に生体機能性を付与することが可能である。
【００３７】
以下では、上記の説明に基づき、本発明の望ましい実施例により機能性作用基を物質の表面に導入する多様な実験例を、図１８〜図２６を参照して詳細に説明する。
【００３８】
実施例１：オクタノイックヒドラジドを用いたバイオセンサーの表面への抗体固定
バイオセンサー用測定機の準備
水晶振動子微小天秤（ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ，ＱＣＭ）は、日本クリスタルサンライフ（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｕｎｌｉｆｅ）社で購入した。四角形の水晶振動子微小天秤の大きさは、８×８ｍｍであり、円形の金電極の直径は、５ｍｍであり、また、水晶振動子微小天秤の固有振動数は、約１０ＭＨｚである。水晶振動子微小天秤の振動数は、質量の増加に比例して減少するため、水晶振動子微小天秤の表面に分析対象物質が結合できる受容体が固定されていれば、分析対象物質が結合することによって周波数が変わる原理を用い、バイオセンサーとして用いられ得る。水晶振動子微小天秤バイオセンサーシステムは、本研究室で製作されたものを使用した。
【００３９】
本発明では、水晶振動子微小天秤の電極上に溶液を加えることができる井戸を有している井戸型セル（ｗｅｌｌ  ｃｅｌｌ）と、溶液がチューブを通じて流れ、水晶振動子微小天秤の電極と接触するようになっている流れ型セル（ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ）とを共に使用した。まず、井戸型セルで検出物質と特異的結合をする受容体蛋白質を固定させた後、流れ型セルに入れ替えて緩衝溶液をポンプで注入し、検出しようとする試料は、注入バルブ（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖａｌｖｅ）により注入する。分析物質が流れ型セルに装着されたＱＣＭの表面を通過しながら抗体に結合すれば、質量が変わって振動周波数に変化が起こるようになり、周波数測定機でこの振動数を測定してコンピュータへ送ることにより、データを分析できるようにした。
【００４０】
自己集合単分子層（ＳＡＭ）の形成
水晶振動子微小天秤の電極表面を洗浄するために、水晶振動子微小天秤を１分間６０℃のピラニア溶液（ｐｉｒａｎｈａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２＝７：３）に浸漬した後、蒸溜水とエタノールで洗浄し、窒素ガスで乾燥させた。次に、１−オクタデカンチオール（１−ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）をエタノールに２ｍＭで溶かした溶液に水晶振動子微小天秤を入れ、１２〜１５時間攪拌し、電極表面に自己集合単分子層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ，ＳＡＭ）が形成されるようにした。ＳＡＭが形成されたセンサーチップを取り出してエタノールで洗浄し、窒素ガスで乾燥させた後、セル（ｃｅｌｌ）に装着した。
【００４１】
このようにオクタデカンチオール（ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）のようなチオール基（ｔｈｉｏｌ  ｇｒｏｕｐ）を含む炭化水素化合物、即ちアルカンチオール分子を加えれば、硫黄原子が金属表面に化学吸着をし、疎水性炭化水素鎖間に引力が作用し、図７に示すように、ＳＡＭが作られる。
【００４２】
リポソームの製造
上記ＳＡＭと結合させるリポソームを製造した。本実施例では、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎ；ＤＰＰＣ）にオクタノイックヒドラジドを２：１のモル比で混合し、リポソームを作った。ここでＤＰＰＣは、リポソームを形成するベース脂質として用いられ、オクタノイックヒドラジドは、このリポソームにヒドラジド基が示されるようにするための機能性作用基を有する炭化水素化合物として用いられた。オクタノイックヒドラジドは、図１２に示されたオクタデシルヒドラジドと同一の作用基を有していながら炭化水素鎖の長さのみ短い構造を有している。
【００４３】
一つのセンサーチップに受容体を固定できる分量のリポソームを作ることができるように、脂質を予めフィルム状に乾燥しておいたバイアルを用いる場合、脂質フィルムバイアルに、ｐＨを７．０に合わせた０．１Ｍの４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＥＰＥＳ］緩衝溶液１２０μＬを加え、穏やかに伸ばす。窒素ガスで充填した後、上部を閉鎖して超音波を加え、小さな一枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ  ｖｅｓｉｃｌｅ；ＳＵＶ）になるようにする。
【００４４】
超音波を加える方法は、２つを用いることができる。第一の方法では、水の温度を約５０〜６０℃に合わせた超音波洗浄器に、バイアルを約１時間浮かばせる。第二の方法では、５００ｍＬのビーカーに水を３分の２程度入れ、バイアルを浮かばせた状態で、超音波均質機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で約２０分間超音波を加える。ＳＵＶになるのは、不透明な白色が若干濁った澄んだ色に変わることから分かる。脂質フィルムバイアルに緩衝溶液を入れれば、最初は脂質が複数層に重なっている多重層リポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａ  ｖｅｓｉｃｌｅ；ＭＬＶ）が形成され、不透明な白色を帯びるようになる。ここに超音波エネルギーを加えれば、脂質分子間の引力が破壊され、再配置が起こりながら平衡に到達する。その結果、小さなリポソームであるＳＵＶが形成され、若干濁った透明な色を帯びるようになる。
【００４５】
上記リポソームと自己集合単分子層の結合
上記製造されたリポソームを、自己集合単分子層が形成されているセンサーチップと次のような方法により反応させた。１−オクタデカンチオールでＳＡＭを形成したＱＣＭを井戸型セルに装着した。１−オクタデカンチオールで形成されたＳＡＭの表面を、４０ｍＭのオクチルグルコシド（ｏｃｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）１００μＬで３回洗った後、直ちにリポソーム溶液１００μＬを入れ、５０℃に３０〜６０分間放置した。上記井戸型セルを周波数測定機に連結し、リポソーム溶液を除去した後、０．１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を１００μＬ入れ、３０秒間放置した。そして、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で３回洗浄した。このように製造された抗体固定用バイオセンサーの抗体固定如何を確認した。
【００４６】
抗体の酸化
抗体（ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  Ａｂ）をＱＣＭの表面に固定させる前に、抗体に含まれた炭水化物の部分に酸化反応を通じてアルデヒド基が形成されるようにした。アルデヒド基は、ヒドラジド基と反応して共有結合を形成するため、抗体を一定の方向に固定させることができる。ＰＢＳに０．５ｍｇ／ｍＬになるように溶かした抗体（ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  Ａｂ）に、５０ｍＭのメタ過よう素酸ナトリウム溶液０．２ｍＬを混ぜ、暗い所で３０分間反応させた。反応していないメタ過よう素酸ナトリウムは、緩衝液Ａ（１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．５）に対して透析して除去した。
【００４７】
抗体の固定と確認
自己集合単分子層と脂質単分子層とが順に結合しているＱＣＭの表面をｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ソディウム緩衝溶液で３回洗った後、メタ過よう素酸ナトリウムで酸化させた抗体を加え、１時間反応させた。超純水で３回洗浄した後、二重結合の還元のために、０．１Ｍのシアノボロヒドリド（ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）１００μＬを加えて１時間反応させ、アルデヒド基を有する受容体の固定を安定化させた。最後に蛋白質の非特異的吸着を防止するために、ＱＣＭの表面を遮断緩衝液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．２５％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，  ０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ，  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳ）で３０分間処理した。
【００４８】
図１８は、抗体を固定する過程の周波数の変化をグラフで示す図面である。ここから、酸化した抗体を入れて反応させるとき、周波数が漸進的に減少するのが分かるが、これは、抗体の結合によりＱＣＭ表面の質量が増加していることを意味する。しかし、ＮａＣＮＢＨ３を入れて反応させる場合、質量の変化が殆どないため、周波数も変わらないことが分かる。この方法では、２段階の化学反応と非特異的吸着を抑制するためにＢＳＡでコーティングする過程とまで合わせて１５０分が要された。
【００４９】
しかし、図１８から分かるように、抗体固定反応は、３０分以内にほぼ完了し、ＮａＣＮＢＨ３による還元反応も非常に速いため、脂質単分子層を形成する時間まで含めて全体として９０分以内に短縮することができる。それに対し、図２と図３に示されている既存の方法の場合は、図１９に示されているように、５段階の化学反応が必要であって、時間を最大限短縮させても３時間以上要される。それだけでなく、既存の方法では、４段階の反応が必要であるのに対し、本発明者らが考案した方法は、２段階の反応のみ必要であるため、固定効率や再現性がさらに高まることができる。また、複数類の試薬を用いる必要がなく、化学に習熟していない使用者が容易に接近できる。
【００５０】
次に、上記の方法で固定された抗体（ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が受容体として機能を発揮するかを確認するために、互いに異なる濃度の抗原（ｇｏａｔ  ＩｇＧ）を順に注入した結果、図２０に示すように、濃度に比例する周波数の変化が観察された。このとき、ある濃度の抗原を注入して周波数の変化を観察した後には、解離溶液（０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ２．３＋１％ＤＭＳＯ）を注入し、結合した抗原を完全に除去した後、次の濃度の抗原を注入した。また、抗原を５μｇ／ｍＬの同一の濃度で繰り返して注入し、周波数の変化を測定した結果、図２１から分かるように、高い再現性を見ることができた。
【００５１】
このように水晶振動子微小天秤が濃度に比例して周波数が変わるだけでなく、反復使用が可能なのは、受容体である抗体が化学結合を通じて安定して固定されたことを意味する。ここにはオクタノイックヒドラジドの実験結果のみを提示したが、炭素鎖の長さがさらに長いドデカノイックヒドラジドやオクタデシルヒドラジドを用いたときにも、同一の結果が得られた。
【００５２】
実施例２：ＭＢＰ−ＰＥを用いたバイオセンサーの表面への抗体固定
バイオセンサー用測定機の準備
バイオセンサー用測定機は、実施例１と同一のものを使用した。
【００５３】
自己集合単分子層（ＳＡＭ）の形成
自己集合単分子層の形成は、実施例１と同一の方法により行った。
【００５４】
リポソームの製造
上記ＳＡＭと結合させるリポソームを製造した。本実施例では、ＤＰＰＣとＭＢＰ−ＰＥの２種類の脂質を混合してリポソームを作った。ここでＤＰＰＣは、リポソームを形成するベース脂質として用いられ、ＭＢＰ−ＰＥは、このリポソームにマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）基が現れるようにするために用いられた。クロロホルム：メタノール（１：２）溶媒を用い、ＤＰＰＣ溶液を１２ｍｇ／ｍＬの濃度で作った。ＭＢＰ−ＰＥをクロロホルムに８．２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした。ＤＰＰＣ溶液２００μＬにＭＢＰ−ＰＥ溶液２００μＬを混ぜ、その中で４０μＬをガラスバイアルの底に満遍なく広げた。窒素ガスを穏やかに吹き込みながら脂質溶液を乾かし、フィルムが形成されるようにした。直ちに使用しないバイアルは、窒素気体で満たした後、−２０℃または−７０℃の低温で保管した。残りは、実施例１と同一の方法を用いた。
【００５５】
上記リポソームと自己集合単分子層の結合
上記リポソームと自己集合単分子層の結合は、実施例１と同一の方法により行った。
【００５６】
チオール基を有する受容体の固定如何の確認
ペプチドには、システイン残基を追加することにより、簡単にチオール基を導入することができる。蛋白質の場合には、トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ；２−ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ−ＨＣｌ）と反応させることにより、チオール基を導入することができる。このようにトラウト試薬によりチオール基を導入した抗体（ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、濃度は５０μｇ／ｍＬ）１００μＬを、自己集合単分子層と脂質単分子層とが順に結合しているＱＣＭの表面に加え、１時間反応させた。抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。５０μｇ／ｍＬ濃度のウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）溶液を１００μＬ加え、３０分間反応させた。このような方法により、水晶振動子微小天秤にチオール基を含む抗体を固定させた後、互いに異なる濃度の抗原（ｇｏａｔ  ＩｇＧ）を順に注入した結果、図２２の実線グラフのように、濃度に比例する周波数の変化が観察された。
【００５７】
このとき、ある濃度の抗原を注入して周波数の変化を観察した後には、解離溶液を注入して結合した抗原を完全に除去し、次の濃度の抗原を注入した。また、２５μｇ／ｍＬの同一の濃度で繰り返して抗原を注入したとき、図２２の点線グラフのように、一定の周波数の変化値が維持された。このように水晶振動子微小天秤が濃度に比例して周波数が変わるだけでなく、反復使用が可能なのは、受容体である抗体が化学結合を通じて安定して固定されたことを意味する。
【００５８】
実施例３：オクタデシルマレイミドを用いたバイオセンサーの表面への抗体固定
バイオセンサー用測定機の準備
バイオセンサー用測定機は、実施例１と同一のものを使用した。
【００５９】
自己集合単分子層（ＳＡＭ）の形成
自己集合単分子層の形成は、実施例１と同一の方法により行った。
【００６０】
リポソームの製造
オクタノイックヒドラジドの代わりにオクタデシルマレイミドを用いたこと以外には、実施例１と同一の方法により行った。オクタデシルマレイミドの構造は、図１２に示されている。
【００６１】
上記リポソームと自己集合単分子層の結合
上記リポソームと自己集合単分子層の結合は、実施例１と同一の方法により行った。
【００６２】
チオール基を有する受容体の固定如何の確認
実施例２と同一の方法により、水晶振動子微小天秤にチオール基を含む抗体（ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を固定させた後、抗体の固定如何の確認のために抗原（ｇｏａｔ  ＩｇＧ）を１００μｇ／ｍＬの一定の濃度で繰り返して注入した。このとき、抗原を注入して周波数の変化を観察した後には、解離溶液を注入して結合した抗原を完全に除去した後、さらに抗原を注入した。その結果、図２３から分かるように、周波数の変化値が一定に維持されることが確認できた。
【００６３】
実施例４：アビジン蛋白質が固定されたバイオセンサーの製造
自己集合単分子層（ＳＡＭ）の形成
自己集合単分子層の形成は、実施例１と同一の方法により行った。
【００６４】
リポソームの製造
リポソームの製造は、ＭＢＰ−ＰＥ溶液の代わりにクロロホルムに溶かした０．５ｍｇ／ｍＬビオチン−ＰＥを用い、また、ベース脂質としてＤＰＰＣの代わりに卵レシチン（ｅｇｇ  ｌｅｃｉｔｈｉｎ）を用いたこと以外には、実施例１と同一の方法により行った。リポソームを作り、一回分量に分けて−８０℃で保管して用いた。
【００６５】
上記リポソームと自己集合単分子層の結合
実施例１と同一の方法により行った。
【００６６】
アビジン固定如何の確認
自己集合単分子層と脂質単分子層が順に結合しているＱＣＭの表面に、５０μｇ／ｍＬアビジン蛋白質溶液を加え、１０分間反応させた。このような方法により、水晶振動子微小天秤にアビジンを固定させた後、そのアビジンにさらにビオチンを結合させた抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を加えた。アビジン蛋白質には、４つのビオチンが結合できるため、水晶振動子微小天秤の表面のビオチンに結合したアビジンは、さらに抗体に結合したビオチンと結合することにより、抗体を水晶振動子微小天秤の表面に固定させることができる。
【００６７】
このように抗体が固定された水晶振動子微小天秤に、互いに異なる濃度の抗原（ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）を順に注入した。このとき、ある濃度の抗原を注入して周波数の変化を観察した後には、解離溶液を注入して結合した抗原を完全に除去した後、次の濃度の抗原を注入した。その結果、図２４に示されているように、抗原濃度に比例する周波数の変化が観察された。従って、抗体が安定した形態に固定されたと判断される。
【００６８】
実施例５：脂質を用いたガスセンサーの製造
自己集合単分子層（ＳＡＭ）の形成
自己集合単分子層の形成は、実施例１と同一の方法により行った。
【００６９】
リポソームの製造
ＤＰＰＣをベース脂質とした４種類のガスセンサー用リポソームを製造した。１種はベース脂質だけでリポソームを作り、残りの３種は、ベース脂質にビオチン−ＰＥ、ＭＢＰ−ＰＥ、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンズオキサジアゾール−４−イル）｛１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−Ｇｌｙｃｅｒｏ−３−Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏ−２−１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）｝（ＮＢＤ−ＰＥ）をそれぞれ２４：１の質量比で混ぜて作った。リポソームを作る方法は、実施例１と同一に行った。
【００７０】
上記リポソームと自己集合単分子層の結合
実施例１と同一の方法により行った。
【００７１】
電子鼻（ｅ−ｎｏｓｅ）の製造
上記方法により製造された多様な作用基を有するセンサーをアレイで配列し、電子鼻を製造した。
【００７２】
＊本実施例で行った方法以外にも、当業者の観点から１つのガスセンサーのみを用いることができ、また、別の多数のセンサーを配列して多様な化合物を分析するための電子鼻を製造することもできる。多数のガスセンサーは、互いに異なる有機化合物に対して互いに異なるパターンで反応するため、このようなパターンを分析することにより有機化合物の種類を把握できるようになる。
【００７３】
本実験では、４つの水晶振動子微小天秤を、ＤＰＰＣ、ビオチン−ＰＥ、ＭＢＰ−ＰＥ及びＮＢＤ−ＰＥの４つの脂質でそれぞれコーティングし、４種類のガスセンサーを製造し、気体状態の有機化合物に対する反応を測定した。その結果、図２５に示すように、ガスの種類に応じて互いに異なって反応することが確認できた。
【００７４】
実施例６：２種類の機能性作用基を有する長鎖炭化水素を用いたＱＣＭガスセンサー
自己集合単分子層（ＳＡＭ）の形成
自己集合単分子層の形成は、実施例１と同一の方法により行った。
【００７５】
リポソームの製造
卵レシチンをベース脂質として２種類のガスセンサー用リポソームを製造した。１つは、ベース脂質に３−ドデシルチオフェノンを２：１（モル比）の割合で混ぜ、もう一つは、ドデカンニトリルを２：１で混ぜた。リポソームを作る方法は、実施例１と同一に行った。
【００７６】
上記リポソームと自己集合単分子層の結合
実施例１と同一の方法により行った。
【００７７】
互いに異なる有機ガスに対する反応の調査
上記方法により製造された２種類のガスセンサーを１つのチャンバに入れ、互いに異なる有機ガスを順に流しながら周波数の変化を測定した。このとき、運搬ガスには窒素を用い、流速は１００ｃｃｍ（ｃｃ  ｐｅｒ  ｍｉｎ）であった。有機ガスを流してから窒素ガスを流し、センサー表面に結合した有機ガスの分子が離れていき、ベースラインが回復するようにした。有機ガスの濃度は、室温で該当物質の蒸気圧とした。
【００７８】
その結果、２種類のガスセンサーは、水とヘキサンには類似の反応を示しているが、トルエン、エチルアセテート、エチル３−クロロプロピオネートの３種類の気体に対しては、互いに異なる反応を示すことが確認できた（図２６参照）。このような結果は、ＱＣＭ表面のコーティングに用いたＦＡＣの作用基の種類に応じて、特定の有機ガスに対する反応が異なるようになることを意味する。従って、このような方法により、ＱＣＭをはじめとした複数類のセンサー表面をコーティングすることにより、数多くの多様な種類のガスセンサーを作ることができる。
【００７９】
実施例７：オクタデシルＮＴＡを用いた、バイオセンサーの表面への融合蛋白質の固定
自己集合単分子層（ＳＡＭ）の形成
自己集合単分子層の形成は、実施例１と同一の方法により行った。
【００８０】
リポソームの製造
リポソームの製造は、オクタノイックヒドラジドの代わりにオクタデシルＮＴＡを用い、ベース脂質としては、ＤＰＰＣの代わりにｅｇｇ  ｌｅｃｉｔｈｉｎを用いたこと以外には、実施例１と同一の方法により行った。
【００８１】
上記リポソームと自己集合単分子層の結合
実施例１と同一の方法により行った。
【００８２】
バイオセンサーの表面における融合蛋白質結合の確認
自己集合単分子層と脂質単分子層とが順に結合しているＱＣＭの表面に、０．１ＭのＮｉＣｌ２溶液を流すことにより、Ｎｉ２＋イオンがＮＴＡにある３つのカルボキシ基と配位結合により固定されるようにした。次に、６つのヒスチジン残基が連続している（Ｈｉｓ）６−ｔａｇを有するマルトース結合蛋白質（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＢＰ）を、２０ｇ／ｍｌの濃度で注入した。その結果、図２７に示すように、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇｇｅｄ  ＭＢＰの結合により周波数の変化が起こることを観察することができた。しかし、ＮｉＣｌ２溶液を流さずに（Ｈｉｓ）６−ｔａｇｇｅｄ  ＭＢＰを注入したときは、周波数の変化が殆ど起こらなかった。このような結果は、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇｇｅｄ  ＭＢＰがバイオセンサーの表面のＮＴＡに配位結合をしているＮｉ２＋イオンを通じて固定されたことを意味し、さらにはバイオセンサーの表面にＮＴＡ作用基が導入されたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図６】
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【国際調査報告】
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