(57)【要約】  本発明は、バレット食道に罹患した患者において異形成部位を決定するのに有用なイメージング方法を提供する。本方法は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とするベクターを含む光学イメージング剤の使用を含んでなり、かかるベクターはまたＨｅｒ２よりもＥＧＦＲに対して選択的である。かかるベクターは、５００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長の光を用いるインビボイメージングのために適した光学レポーターで標識されている。また、本方法で使用するのに適した新規な光学イメージング剤も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バレット食道に罹患した患者において潜在性異形成部位を決定するのに使用するためのインビボイメージング方法であって、
（ｉ）ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とするベクターを含むイメージング剤であって、前記ベクターが５００〜１２００ｎｍの波長の光を用いてインビボで哺乳動物体のイメージングを行うのに適した光学レポーターイメージング成分で標識されているイメージング剤を用意する段階、
（ｉｉ）段階（ｉ）からのイメージング剤を用いて前記患者の食道の少なくとも一部分の光学イメージングを行う段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）のイメージングから、患者の食道の１以上の位置においてバックグラウンドに対するイメージング剤の取込みの増加が存在するか否かについて判定を行う段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）の判定が少なくとも１つのかかる位置について取込みの増加を示す場合には、その位置を潜在性異形成部位として同定する段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
ベクターが２０ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ベクターが、以下のものから選択されるＥＧＦＲの細胞外領域に対する内因性リガンドを含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
（ｉ）ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）又はそのフラグメント、
（ｉｉ）ＴＧＦ−α又はそのフラグメント、
（ｉｉｉ）アンフィレグリン。
【請求項４】
ベクターが、以下のものから選択されるＥＧＦＲの細胞外領域に対する外因性リガンドを含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
（ｉ）ペプチド配列ＣＫＳＰＥＰＱＨＣ（ＧＥ９）を含む９〜２０マーペプチド、
（ｉｉ）ペプチド配列ＬＨＬＷＶＰＥＰＷＴＱＴ（ＧＥ１０）を含む２〜２０マーペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド配列ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＧＥ１１）を含む１２〜２０マーペプチド、
（ｉｖ）ペプチド配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫ（インヘルビン１）を含む１７〜２０マーペプチド、
（ｖ）ペプチド配列ＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴＫ（インヘルビン３）を含む１７〜２０マーペプチド、
（ｖｉ）アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標））、
（ｖｉｉ）ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｖｉｉｉ）ペプチド配列ＬＡＲＬＬＴ（Ｄ４）を含む６〜１５マーペプチド。
【請求項５】
光学レポーターが蛍光色素である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
色素がシアニン色素である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
シアニン色素が次の式Ｉａのものである、請求項６記載の方法。
【化１】
2012500191.tif 000029
（式中、
Ｙ１及びＹ２は独立に−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ６−又は−ＣＲ７Ｒ８−であり、Ｙ１及びＹ２の少なくとも一方が−ＣＲ７Ｒ８−であるように選択され、
Ｒ１及びＲ２は独立にＨ、−ＳＯ３Ｍ１（式中、Ｍ１はＨ又はＢｃであり、Ｂｃは生体適合性陽イオンである。）又はＲａであり、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキル又はＲａ基であり、
Ｒ４〜Ｒ６は独立にＣ１−５アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキル又はＲａであり、
Ｒ７はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ８はＲａ又はＣ１−６カルボキシアルキルであり、
ＲａはＣ１−４スルホアルキルであり、
Ｍ１は式Ｉで定義した通りであり、
式Ｉａのシアニン色素は１以上のＲａ基並びにＲ１、Ｒ２及びＲａ基に由来する全部で１〜６のスルホン酸置換基を有することを条件とする。）
【請求項８】
色素がベンゾピリリウム色素である、請求項５記載の方法。
【請求項９】
請求項１の段階（ｉ）のイメージング剤が医薬組成物として提供される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
イメージングが（ａ）異形成のないバレット食道、（ｂ）異形成、及び（ｃ）癌を識別するために使用される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の方法がさらに次の段階を含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
（ｖ）段階（ｉｖ）からの潜在性異形成部位に関して生検を行う段階。
【請求項１２】
イメージングが局所療法を送達すべき部位の案内に使用される、請求項１乃至請求項１1のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
イメージングが療法の効力のモニタリングに使用される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法で有用なイメージング剤であって、以下のものから選択されるイメージング剤。
（ｉ）請求項７又は請求項８で定義した光学レポーターで標識されたｈＥＧＦ又はそのフラグメント、
（ｉｉ）請求項７又は請求項８で定義した光学レポーターで標識されたＴＧＦ−α又はそのフラグメント、
（ｉｉｉ）請求項１及び請求項５乃至請求項８のいずれか１項で定義した光学レポーターで標識されたアンフィレグリン、
（ｉｖ）請求項６乃至請求項８のいずれか１項で定義した光学レポーターで標識された、アミノ酸配列ＣＫＳＰＥＰＱＨＣ（ＧＥ９）を含む９〜２０マーペプチド、
（ｖ）請求項６乃至請求項８のいずれか１項で定義した光学レポーターで標識された、アミノ酸配列ＬＨＬＷＶＰＥＰＷＴＱＴ（ＧＥ１０）又はＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＧＥ１１）を含む１２〜２０マーペプチド、
（ｖｉ）請求項１及び請求項５乃至請求項８のいずれか１項で定義した光学レポーターで標識された、アミノ酸配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫ（インヘルビン１）を含む１７〜２０マーペプチド、
（ｖｉｉ）請求項１及び請求項５乃至請求項８のいずれか１項で定義した光学レポーターで標識された、アミノ酸配列ＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴＫ（インヘルビン３）を含む１７〜２０マーペプチド、
（ｖｉｉｉ）請求項７又は請求項８で定義した光学レポーターで標識された、請求項４で定義したアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｘ）請求項６乃至請求項８のいずれか１項で定義した光学レポーターで標識された、請求項４で定義したナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標））。
【請求項１５】
光学レポーターが請求項７又は請求項８で定義したものである、請求項１４記載のイメージング剤。
【請求項１６】
請求項１４又は請求項１５記載のイメージング剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６記載の医薬組成物を製造するためのキット。
【請求項１８】
請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法における、請求項１乃至請求項８、請求項１４及び請求項１５のいずれか１項で定義したイメージング剤の使用。
【請求項１９】
請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法における、請求項１乃至請求項８、請求項１４及び請求項１５のいずれか１項で定義したイメージング剤を製造するためのキットの使用。
【請求項２０】
請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法で使用するためのイメージング剤の製造における、請求項１乃至請求項４のいずれか１項の段階（ｉ）で定義したベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バレット食道に罹患した患者において異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ）の部位を決定するのに有用なイメージング方法を提供する。本方法は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とするベクターを含む光学イメージング剤の使用を含んでなり、かかるベクターはまたＨｅｒ２よりもＥＧＦＲに対して選択的である。かかるベクターは、５００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長の光を用いるインビボイメージングのために適した光学レポーターで標識されている。また、本方法で使用するのに適した新規な光学イメージング剤も提供される。
【背景技術】
【０００２】
食道癌はすべての報告された癌症例の５％未満であるが、米国では毎年約３００００の新しいかかる症例が診断され、生存率は低い（下記参照）。食道癌は、悪性である細胞のタイプに応じて２つの主要タイプ（扁平上皮癌及び腺癌）に分類できる。バレット食道は、食道癌（特に腺癌）の発生リスクの増加と関連した前悪性状態である［Ｋｉｅｓｓｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，４，９７９−９８７（２００６）］。慢性逆流はバレット食道のリスクを増加させ、したがって胃食道逆流（ＧＥＲＤ）は食道癌の危険因子であることが示唆されてきた。
【０００３】
米国及び西欧では、食道の腺癌は扁平上皮癌より多い。食道癌は治療可能な疾患であり得るが、滅多に治癒しない。総合５年生存率は５〜３０％である。食道癌の早期診断は患者の生存率を向上させる。主な治療法には、手術のみ又は放射線と組み合わせた化学療法がある。食道癌の治療で使用される化学療法には、５−フルオロウラシル及びシスプラチンがある。正確な手術前ステージングのないことが臨床上の大きな問題である。
【０００４】
バレット食道における低グレードの異形成（即ち、異常な組織増殖）の存在は食道癌発生の危険因子であるが、監視は現在では組織病理学に頼っている［Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ，３９，５８１−７（２００７）］。バレット食道における異形成の診断は、現在では１〜２ｃｍごとのランダム４象限生検（シアトルプロトコル）によるが、これは多大の時間及び費用がかかる［ＤａＣｏｓｔａ ｅｔ ａｌ，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２０（１），４１−５７（２００６）］。バレット食道における異形成は、常用内視鏡検査中に見えないのが普通である［Ｅｎｄｌｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｕｔ，４８，３１４−３１９（２００１）］。
【０００５】
米国特許第６，０３５，２２９号（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）には、カテーテルの末端にある照明及びイメージング用プローブを用いてバレット食道を検出するためのシステムが記載されている。この文書には、光学造影剤は開示されていない。
【０００６】
高度の異形成組織又は悪性組織の検出に際してメチレンブルー色素を使用することで、インビボでのバレット食道組織の染色がインビトロでの生検試料の染色と比較された［Ｃａｎｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ，３３，３９１−４００（２００１）］。
【０００７】
Ｋｉｅｓｓｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ［Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，４，９７９−９８７（２００６）］は、共焦点レーザー内視鏡検査を用いたバレット上皮及び関連する新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）の検出を助けるためにフルオレセインを使用することを報告した。
【０００８】
国際公開第２００５／０５８３７１号には、インビボでの食道癌及びバレット食道のイメージングのための光学イメージング用造影剤が開示されている。かかる造影剤は、バレット食道において異常に発現される生物学的標的に対して親和性を有している。国際公開第２００５／０５８３７１号の造影剤は、好ましくは次の式を有する。
【０００９】
Ｖ−Ｌ−Ｒ
式中、
Ｖは食道癌又はバレット食道において異常に発現される標的に対して親和性を有する１以上のベクター部分であり、
Ｌはリンカー部分又は化学結合（ｂｏｎｄ）であり、
Ｒは光学イメージングにおいて検出可能な１以上のレポーター部分である。
【００１０】
バレット食道、扁平上皮癌又は腺癌において過剰発現又はダウンレギュレートされる広範囲の標的が記載されている。標的は、好ましくはＥ−カドヘリン、ＣＤ４４、Ｐ６２／ｃ−ｍｙｃ（ＨＧＦレセプター）、Ｐ５３及びＥＧＦＲ／ｅｒＢ−２から選択される（請求項５）。ベクター（Ｖ）は、好ましくはペプチド、ペプトイド成分、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、脂肪関連化合物及び旧来の有機薬物様小分子から選択されると述べられている。レポーター（Ｒ）は、好ましくは電磁スペクトルの紫外部から近赤外部までの波長領域の光と相互作用する色素である。
【００１１】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）及びＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）はリガンド−レセプター対である。ヒト上皮増殖因子レセプター（ＨＥＲ）ファミリーは、次のような４種の密接に関連したＥｒｂＢレセプターチロシンキナーゼからなっている。
ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１又はＨＥＲ−１としても知られる）、
ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２又はＮｅｕとしても知られる）、
ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ−３としても知られる）、及び
ＥｒｂＢ−４（ＨＥＲ−４としても知られる）。
【００１２】
ＥＧＦＲは細胞表面に位置する１７０ｋＤａのタンパク質であって、アミノ末端細胞外リガンド結合ドメイン、単一の疎水性トランスメンブランヘリックス、並びにチロシンキナーゼドメイン及び重要なチロシン残基とレセプター調節モチーフを含むカルボキシ末端領域を含んだ細胞内ドメインからなっている。ＥＧＦのようなリガンドが細胞外ドメインに結合すると、いくつかのＣ末端チロシン残基においてレセプター二量化、活性化及びレセプター自己リン酸化が生じる。これらのリン酸化チロシンは、多数の細胞質シグナル伝達分子に対する結合部位として役立つ。ＥＧＦＲの下流にあるこれらの経路の活性化は、細胞増殖、分化、移動／運動、付着、アポトーシスからの保護、生存の強化、及び遺伝子転写をもたらす。ＥＧＦＲは、多くの上皮腫瘍において異常に活性化することが知られている［Ｍｅｎｄｏｌｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３３（４），３６９−３８５（２００６）］。
【００１３】
Ｃａｉ ｅｔ ａｌ［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，３５，１８６−２０８（２００８）］は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、光学及びＭＲＩに基づくヒトＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４）のマルチモダリティーイメージングのためのアプローチを総説している。
【００１４】
バレット食道は、扁平食道上皮が円柱上皮で置き換えられたこと（化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ））を特徴とする状態である。一定割合のバレット食道患者は食道腺癌を発生し、この過程での臨界段階は異形成を生じることである。したがって、異形成を診断された患者は、疾患の程度に応じ、抗逆流投薬、内視鏡粘膜切除及び外科的切除を含み得る治療を受ける（図１：“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ Ｃｏｌｕｍｎａｒ−ｌｉｎｅｄ Ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ”，ＵＫ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ａｕｇｕｓｔ ２００５；ｗｗｗ．ｂｓｇ．ｏｒｇ．ｕｋからの要約）。
【００１５】
治療された患者を６ヶ月間隔で追跡することで、療法に対する応答が評価される。応答者（即ち、療法が有効であることを示す証拠が得られた患者）は低リスク患者と見なされる一方、非応答者に対しては治療の継続／追加が考慮される。
【００１６】
Ｃｕｒｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ［Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１３４，６７０−６７９（２００８）］は、各種の診断イメージング技法（即ち、拡大白色光内視鏡検査（ＷＬＥ）、狭帯域イメージング（ＮＢＩ）、インジゴカルミン色素内視鏡検査（ＩＣＣ）及び酢酸色素内視鏡検査（ＡＡＣ））をバレット食道において比較した。彼等は、一部の技法は向上した画像品質を与えるものの、観察者が異形成領域を異形成のない領域から識別する能力を向上させることはないという結論を下した。したがって、食道腺癌を発症するリスクのあるバレット食道患者の部分集合の一層信頼できる早期診断法、特に異形成部位を正常組織から識別する早期診断法に対するニーズが存在している。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、バレット食道に罹患した患者において異形成部位を決定するのに有用なイメージング方法を提供する。本方法は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とするベクターを含む光学イメージング剤の使用を含んでいる。かかるベクターは、５００〜１２００ｎｍの緑色乃至近赤外波長の光を用いるインビボイメージングのために適した光学レポーターで標識されている。
【００１８】
本発明は、バレット食道患者の異形成部位ではＥＧＦＲ発現が顕著なアップレギュレーションを示すことを示している。発現の程度は、異形成の程度と相関することが判明した。したがって、本発明のイメージング方法は生検（即ち、異常が良性であるか癌性であるかをインビトロで確認するために異形成部位から組織試料を得ること）を誘導するために使用できる。それはまた、患者の診断及び層別化を助けると共に、治療（例えば、組織切除）を誘導及び／又はモニターするためにも使用できる。本発明は、疾患の早期段階において「リスクのある」患者の診断を容易にし、かくして必要に応じて治療を開始するための早期臨床介入を可能にする。
【００１９】
また、本方法で使用するのに適した新規な光学イメージング剤も提供される。細胞内ＥＧＦＲではなく細胞外ＥＧＦＲを標的とすることは、イメージング剤が細胞膜を通過する必要がなく、したがって所望の標的へのアクセスが細胞膜を横切っての輸送プロセス及びイメージング剤の透過性によって支配されないという利点を有している。光学イメージングは、（ｉ）現行の診断手続きに矛盾しないと共に、（ｉｉ）患者の放射線被曝を最小にするという２つの理由で好ましい。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
第１の態様では、本発明は、バレット食道に罹患した患者において潜在性異形成部位を決定するのに使用するためのインビボイメージング方法であって、
（ｉ）ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とするベクターを含むイメージング剤であって、前記ベクターが５００〜１２００ｎｍの波長の光を用いてインビボで哺乳動物体のイメージングを行うのに適した光学レポーターイメージング成分で標識されているイメージング剤を用意する段階、
（ｉｉ）段階（ｉ）からのイメージング剤を用いて前記患者の食道の少なくとも一部分の光学イメージングを行う段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）のイメージングから、患者の食道の１以上の位置においてバックグラウンドに対するイメージング剤の取込みの増加が存在するか否かについて判定を行う段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）の判定が少なくとも１つのかかる位置について取込みの増加を示す場合には、その位置を潜在性異形成部位として同定する段階
を含んでなる方法を提供する。
【００２１】
「判定」という用語は、食道組織バックグラウンドに対してイメージング剤の取込みが増加した部位の位置及び範囲を確認することを意味する。
【００２２】
「患者」という用語は、生きている哺乳動物被験体、好ましくはヒト被験体を意味する。
【００２３】
「バレット食道に罹患した」という用語は、患者が既にバレット食道に罹患していると診断或いはバレット食道に罹患している疑いがあることを意味する。診断は、臨床的症状に加えて、通例は第一選択内視鏡検査を用いた確認に基づいて行われてきた。かかる第一選択内視鏡検査は、ランダム４象限生検試料を集めるため、現在では白色光を用いて実施される。これらの生検試料の組織学的評価により、疾患の程度が確認される。
【００２４】
「イメージング剤」という用語は、インビボで人体のイメージングを行うために適した化合物を意味する。イメージングは侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であってもよいし、或いは非侵襲的であってもよい。好ましいイメージング方法は内視鏡検査である。これは、食道の表面を光で照射するのを可能にすると共に、組織から放出される光を減衰させる介在組織なしに、したがってイメージングを容易にするための外科的介入の必要なしに蛍光の検出を可能にするからである。かくして、イメージングは介入を最小限に抑えながら患者のインタクトな身体に関して実施するのが好ましい。
【００２５】
「異形成」という用語は、それの通常の意味を有し、即ち異常な組織増殖を意味する。かかる増加は良性、前癌性又は癌性であり得る。本発明の方法は、好ましくは前癌段階で、即ち以前に食道腺癌と診断されていない患者に関して使用される。「潜在性異形成」という語句は、イメージングのみによって検出された疑似異常をいう。真の異形成は、通例、（例えば生検による）組織試料採取及びインビトロでの組織試料の詳細な試験によって確認される。このように、本発明のイメージング剤及び方法は診断を助ける手段である。
【００２６】
「ベクター」という用語は、インビボ診断イメージングの分野におけるそれの通常の意味を有し、即ちレセプター又は酵素のような特定の生物学的部位を標的とする化合物を意味する。
【００２７】
「ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とする」という用語は、ベクターがバックグラウンド組織及び他の潜在的標的又は結合パートナーに比べてＥＧＦＲに対する実質的に高い親和性を有することを意味する。ベクターは、高い親和性（０〜５０ｎＭの範囲内、好ましくは１〜２０ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ未満のＫｉ値）をもって標的に結合できる。ベクターはまた、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対して特異的であり、したがってＥＧＦＲのトランスメンブランドメイン又は細胞内ドメインに対してほとんど又は全く親和性を有しない。ＥＧＦＲは好ましくはヒトＥＧＦＲである。
【００２８】
「で標識されている」という用語は、ベクターの官能基が光学レポーターにコンジュゲートされていることを意味する。好ましくは、コンジュゲーションは共有化学結合による。
【００２９】
「光学レポーターイメージング成分」（ＩＭ）という用語は、緑色ないし近赤外波長（５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）の光を用いる光学イメージング方法で直接又は間接に検出できる蛍光色素又は発色団を意味する。好ましくは、レポーターは蛍光性を有し、さらに好ましくは蛍光色素である。光学レポーターはインビボでの哺乳動物体のイメージングのために適するものでなければならないので、それはまた生体適合性でなければならない。「生体適合性」という用語は、無毒性であり、したがって副作用或いは投与時の苦痛又は不快感なしに哺乳動物体（特に人体）に投与するのに適していることを意味する。
【００３０】
光学レポーターは、光学イメージング方法で直接又は間接に検出できる任意の成分である。レポーターは、光散乱剤（例えば、着色又は無着色粒子）、吸光剤又は発光剤であり得る。さらに好ましくは、レポーターは発色団又は蛍光化合物のような色素である。色素は、紫外域乃至近赤外域の波長をもった電磁スペクトル中の光と相互作用する任意の色素であり得る。最も好ましくは、レポーターは蛍光性を有する。
【００３１】
光学レポーターは、任意にはリンカー基（Ｌ）を介してベクターにコンジュゲートすることができる。ここで、Ｌは式−(Ａ)ｍ−の合成リンカー基である。式中、各Ａは独立に−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ(Ｃ＝Ｏ)ＮＲ−、−ＮＲ(Ｃ＝Ｓ)ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基又はＣ３−１２ヘテロアリーレン基、或いはアミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシアルキル及びＣ１−４ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。
【００３２】
光学イメージングモダリティー及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。
【００３３】
段階（ｉ）のイメージング剤は、当技術分野で公知の通り、静脈内投与又は経口投与のような通常の患者投与経路によって送達できる。食道への一層効率的な送達のために薬物を製剤化する方法は当技術分野で公知であり［Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．，２２（２），１７５−１８１（２００５］及びＣｏｌｌａｕｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．，１２３，２０３−２１０（２００７）］、したがって本発明の段階（ｉ）のイメージング剤を任意にはかかる製剤を介して送達することができる。
【００３４】
ベクターは、ＥＧＦＲの細胞外領域に対する内因性又は外因性リガンドを含み得るが、好ましくは合成品である。
【００３５】
好ましい態様
イメージング剤の分子量は、好ましくは２００００ダルトン（２０ｋＤａ）以下、さらに好ましくは１５ｋＤａ以下、最も好ましくは１２ｋＤａ以下であり、６ｋＤａ以下が理想的である。抗体のような大きい分子は、顕著に高い分子量（インタクトな抗体に関しては約１５０ｋＤａ、ＦＡｂフラグメントに関しては約６０ｋＤａ、ｓｃＦｖフラグメントに関しては約３０ｋＤａ）を有している。かかる化学種の薬物動態は、遅いクリアランス及び不良な組織浸透のため、イメージングのためにはあまり適さないと考えられる。
【００３６】
ベクターは、好ましくはＨｅｒ２よりもＥＧＦＲに対して選択的である。「Ｈｅｒ２よりもＥＧＦＲに対して選択的」という用語は、Ｈｅｒ２に比べてＥＧＦＲに対するベクターの結合親和性が、内視鏡検査に際してＥＧＦＲの選択的イメージングを可能にする倍率だけ高いことを意味する。
【００３７】
ＥＧＦＲの細胞外領域に対する内因性リガンドを含むベクターは、好ましくは以下のものから選択される。
（ｉ）ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）又はそのフラグメント、
（ｉｉ）ＴＧＦ−α又はそのフラグメント、
（ｉｉｉ）アンフィレグリン。
【００３８】
ＥＧＦは、約１ｎＭのＫＤをもってＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する６ｋＤａのタンパク質である。組換えヒトＥＧＦは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手できる。ＥＧＦは、光学レポーターとのコンジュゲーションに適するいくつかのアミン部位を有している。したがって、ＥＧＦを標識する場合、標識部位は特異的に標的化されるわけではなく、様々な位置に生じ得る。ｈＥＧＦは２つのリシン残基、５つのグルタミン酸残基及び７つのアスパラギン酸残基を含んでいる。したがって、光学レポーターは２つのリシン残基のアミノ基又はＮ末端にコンジュゲートできる。ＥＧＦは、シアニン色素Ｃｙ５．５に関してＫｅ ｅｔ ａｌ［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，７８７０−７８７５（２００３）］により記載されたような光学レポーター、又はシアニン色素Ｃｙ５．５及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ−ＮＨＳに関してＡｄａｍｓ ｅｔ ａｌ［Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．，１２（２）０２４０１７（２００７）］により記載されたような光学レポーターで標識することができる。ＥＧＦは強いマイトジェン活性及び血管新生活性を有するものとして記載されており、したがって本発明にとってあまり好ましくないベクターである。ＥＧＦＲの細胞外領域に結合するＥＧＦの１０〜１５マーフラグメント（例えば、ＥＧＦ２１−３１）［Ｌｕｔｓｅｎｋｏ，Ｎｅｗ Ｒｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍｅｄ．，２１１−２２０（２００６）］もまた、本発明の技術的範囲内にある。
【００３９】
ＴＧＦ−αは、高い親和性（約１ｎＭのＫＤ）をもってＥＧＦＲに結合する５０アミノ酸ペプチド（分子量５．５ｋＤａ）である。ＥＧＦＲの細胞外領域に結合するＴＧＦ−αの１０〜１５マーフラグメント（例えば、ＴＧＦ２２−３１）もまた、本発明の技術的範囲内にある。組換えヒトＴＧＦ−αは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手できる。ＴＧＦ−αは、好ましくはＮ末端又は４−Ｌｙｓ残基のアミノ基において光学レポーターで標識される。
【００４０】
アンフィレグリン（ＡＲ；ケラチノサイト自己分泌因子としても知られる）は、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）に対して選択的な内因性リガンドである。天然のＡＲタンパク質は７８又は８４のアミノ酸残基を含み、Ｎ結合及びＯ結合したオリゴ糖を有する。メチオニンの代わりにロイシン−８６残基を有し、ＡＲ１−９０（ｌｅｕ８６）と名付けられたＣ末端延長形のＡＲ（分子量約９．４ｋＤａ）は、天然のＡＲ１−８４に比べて向上したＥＧＦＲに対する結合親和性を有する［Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６６，８３−９０（１９９５）］。
【００４１】
９８アミノ酸残基（ロング形）のＡＲは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から商業的に入手できる。本発明の好ましいＡＲはＡＲ１−９０（ｌｅｕ８６）である。
【００４２】
ＥＧＦＲの細胞外領域に対する外因性リガンドを含むベクターは、好ましくは以下のものから選択される。
（ｉ）ペプチド配列ＣＫＳＰＥＰＱＨＣ（ＧＥ９）を含む９〜２０マーペプチド、
（ｉｉ）ペプチド配列ＬＨＬＷＶＰＥＰＷＴＱＴ（ＧＥ１０）を含む１２〜２０マーペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド配列ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＧＥ１１）を含む１２〜２０マーペプチド、
（ｉｖ）ペプチド配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫ（インヘルビン１）を含む１７〜２０マーペプチド、
（ｖ）ペプチド配列ＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴＫ（インヘルビン３）を含む１７〜２０マーペプチド、
（ｖｉ）アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標））、
（ｖｉｉ）ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｖｉｉｉ）ペプチド配列ＬＡＲＬＬＴ（Ｄ４）を含む６〜１５マーペプチド。
【００４３】
本発明のペプチドは、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されているような通常の固相ペプチド合成法によって得ることができる。ＧＥ９は好ましくは（２つのシステイン残基を介して）環化されるが、これは環状形が開鎖形に比べて安定性の増加を示すと予想されるからである。ＧＥ９に関しては、光学レポーターはリンカー基を介してＣ末端又はＮ末端に結合できる。ペプチドＧＥ１１は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ［ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１９，１９７８−１９８５（２００５）］によって記載されている。ＧＥ１１に関しては、光学レポーターのコンジュゲーションのために好適な部位は、（フルオレセインイソチオシアネートに関してＬｉ ｅｔ ａｌにより記載されているように）ペプチドのＮ末端のアミン基である。また、光学レポーターをＧＥ１１のＣ末端にコンジュゲートすること、或いはＧＥ１１のＣ末端又はＮ末端に結合したリンカーにコンジュゲートすることも可能である。しかし、１２〜２０マーペプチド又はリンカー基に追加のリシン又はシステイン残基を含め、リシン残基のアミンブチル側鎖又はシステイン残基のチオール側鎖に光学レポーターをコンジュゲートすることも可能である。ペプチドＧＥ９又はＧＥ１０を標識するための好ましい部位は、ＧＥ１１に関して記載したようなＮ末端又はリシン残基である。
【００４４】
ペプチドであるインヘルビン１及びインヘルビン３は、国際公開第２００７／１１５５７１号（Ｅｎｋａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａ／Ｓ）に記載されている。インヘルビン１及びインヘルビン３を光学レポーターで標識するための好ましい部位は、ＧＥ１１に関して記載したようなＮ末端、リシン残基又はシステイン残基である。
【００４５】
外因性リガンド（ｉ）〜（ｖ）のペプチドの残りのアミノ酸残基は、任意のアミノ酸からなっていてよい。「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを包含する［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。
【００４６】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（上記で定義したような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。
【００４７】
アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標））分子は、ブドウ球菌タンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインの１つから導かれる５８アミノ酸残基ドメインに基づいている。アフィボディは単量体又は二量体の形態で使用でき、Ｎｙｇｒｅｎ［ＦＥＢＳ Ｊ．，２７５，２６６８−２６７６（２００８）］及びＮｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１０，１６７−１７５（２００７）］によって総説されている。Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対して特異的に結合するアフィボディ二量体分子(ＺＥＧＦＲ：９５５)２を報告している［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔ．，２０（４），１８９−１９９（２００７）］。Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌはまた、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対して選択的に結合する３種の選択された単量体アフィボディ（ＺＥＧＦＲ：９４２、ＺＥＧＦＲ：９４８及びＺＥＧＦＲ：９５５）も記載している。色素標識されかつ放射性ヨウ素化された(ＺＥＧＦＲ：９５５)２に関するさらなる研究がＮｏｒｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ［Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３４，６０９−６１８（２００７）］によって報告された。Ｎｏｒｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌは、ＥＧＦＲに基づく放射性核種イメージング用としてアフィボディ分子(ＺＥＧＦＲ：９５５)２を検討すべきであると結論づけた。向上したＥＧＦＲ結合親和性（約２０倍の向上、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によれば５．３ｎＭのＫＤ）を有する第二世代のアフィボディ単量体ＺＥＧＦＲ：１９０７が、Ｏｒｌｏｖａ ｅｔ ａｌ［Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２２（５），５７３−５８４（２００７）；Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，５０（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７０（２００７）］によって報告されている。
【００４８】
これらのアフィボディの比較的小さいサイズは、１０〜２０倍大きい抗体（約１５０ｋＤａ）に比べて良好な標的組織浸透及び血中クリアランスを可能にするはずである。アフィボディはまた、一定範囲のｐＨ条件（ｐＨ５．５〜１１）下で安定であるという利点も有している。アフィボディは、好ましくは［(ＺＥＧＦＲ：９５５)２に関して上記のＦｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌにより記載されたように］Ｃ末端システイン残基の位置におけるマレイミド官能化レポーターとのコンジュゲーション、或いはレポーターとの共有アミド結合によって光学レポーターで標識される。本発明の好ましいアフィボディは、単量体又は二量体形態のＺＥＧＦＲ：９４２、ＺＥＧＦＲ：９４８、ＺＥＧＦＲ：９５５及びＺＥＧＦＲ：１９０７であり、特にＺＥＧＦＲ：１９０７である。
【００４９】
ラクダ科の動物は、単一のＮ末端ドメインが完全な抗原結合を可能にする、Ｌ鎖の欠落した機能性抗体を産生する。これらの単一ドメイン抗体フラグメント（ＶＨＨ又はナノボディ）は、バイオテクノロジー用途に関していくつかの利点を有している。ナノボディは、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ［Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７７−３０２（２００１）］によって総説されている。その製造及び用途は、さらに最近になってＨａｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ［Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７，１３−２２（２００７）］により総説されている。細胞外ＥＧＦＲに対して特異的なナノボディは、Ｇａｉｎｋａｍ ｅｔ ａｌ［Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４９，７８８−７９５（２００８）］；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．，１０，１６７−１７５（２００８）］及びＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５６，３０３−３１７（２００７）］によって記載されている。Ｇａｉｎｋａｍ ｅｔ ａｌは、９９ｍＴｃ標識７Ｃ１２が有望な腫瘍イメージング剤であると結論づけた。本発明で使用するための好ましいナノボディは、７Ｃ１２、７Ｄ１２及び８Ｂ６と名付けられたものである。
【００５０】
Ｄ４ペプチドは、Ｓｏｎｇ［ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２３（５），１３９６−１４０４（２００９）及び国際公開第２００９／０５９４５０号］によって記載されている。
【００５１】
本発明のさらに好ましいベクターは、ＴＧＦ−α、ＥＧＦＲに対して特異的なアフィボディ、並びにペプチドであるＧＥ９、ＧＥ１０、ＧＥ１１、Ｄ４、インヘルビン１及びインヘルビン３から選択される。本発明の最も好ましいベクターは、アフィボディ並びにペプチドであるＧＥ９、ＧＥ１０、ＧＥ１１、インヘルビン１及びインヘルビン３から選択される。
【００５２】
好ましい有機発色性及び発蛍光性レポーターには、広範な非局在化電子系を有する群、例えばシアニン類、メロシアニン類、インドシアニン類、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、トリフェニルメチン類、ポルフィリン類、ピリリウム色素、チアピリリウム色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、アズレニウム色素、インドアニリン類、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン類、ナフトキノン類、インダスレン類、フタロイルアクリドン類、トリスフェノキノン類、アゾ色素、分子内及び分子間電荷移動色素及び色素錯体、トロポン類、テトラジン類、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、ヨードアニリン色素、ビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体がある。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの変種のような蛍光タンパク質も有用である。特定の状況においてはある種の希土類金属（例えば、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の錯体が使用され、蛍光ナノ結晶（量子ドット）についても同様である。好ましくは、本発明の光学レポーターは金属錯体を含まず、好ましくは合成有機色素である。
【００５３】
使用できる発色団の具体例には、フルオレセイン、スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーン、シアニン色素であるＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、テトラメチルローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０がある。
【００５４】
イメージング成分は、好ましくは光学レポーター、さらに好ましくは蛍光性の緑色乃至近赤外色素である。かかるＮＩＲ色素は、好適には緑色乃至近赤外波長５００〜１２００ｎｍ中に吸収極大を有している。ＮＩＲ色素は、好ましくはシアニン色素又はベンゾピリリウム色素である。発蛍光団である好ましいシアニン色素は、次の式Ｉのものである。
【００５５】
【化１】
2012500191.tif 000002
【００５６】
式中、
各Ｘ’は独立に−Ｃ(ＣＨ３)２、−Ｓ−、−Ｏ−及び−Ｃ[(ＣＨ２)ａＣＨ３][(ＣＨ２)ｂＭ]−（式中、ａは０〜５の値を有する整数であり、ｂは１〜５の値を有する整数であり、ＭはＧ基であるか、或いはＳＯ３Ｍ１及びＨから選択される。）から選択され、
各Ｙ’は独立にＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＳＯ３Ｍ１、−ＣＨ２ＣＯＯＭ１、−ＮＣＳ、Ｆ及びＧ基からなる群から選択される１〜４の基を表し、Ｙ’基は芳香環の任意の位置に配置されており、
Ｑ’は独立にＨ、ＳＯ３Ｍ１、ＮＨ２、ＣＯＯＭ１、アンモニウム、エステル基、ベンジル及びＧ基からなる群から選択され、
Ｍ１はＨ又はＢｃ（ここに、Ｂｃは生体適合性陽イオンである。）であり、
ｌは１〜３の整数であり、
ｍは１〜５の整数であり、
Ｘ’、Ｙ’及びＱ’の少なくとも１つはＧ基からなり、
Ｇはベクターへの結合のために適した反応基又は官能基である。
【００５７】
「生体適合性陽イオン」（Ｂｃ）という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００５８】
Ｇ基はベクターの相補的な基と反応して、シアニン色素発蛍光団とベクターとの間に共有結合を形成する。Ｇはペプチドの相補的な官能基と反応し得る反応基であってもよいし、或いは別法としてベクターの反応基と反応し得る官能基を含んでいてもよい。反応基及び官能基の例には、活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、ホスホラミダイト、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボン酸及びチオホスフェートがある。好ましくは、Ｇは活性エステルである。
【００５９】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計された関連カルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール、ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＰｙＢＯＰ（即ち、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）である。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステル、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００６０】
さらに好ましいシアニン色素は、次の式Ｉａのものである。
【００６１】
【化２】
2012500191.tif 000003
【００６２】
式中、
Ｙ１及びＹ２は独立に−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ６−又は−ＣＲ７Ｒ８−であり、Ｙ１及びＹ２の少なくとも一方が−ＣＲ７Ｒ８−であるように選択され、
Ｒ１及びＲ２は独立にＨ、−ＳＯ３Ｍ１又はＲａであり、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキル又はＲａ基であり、
Ｒ４〜Ｒ６は独立にＣ１−５アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキル又はＲａであり、
Ｒ７はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ８はＲａ又はＣ１−６カルボキシアルキルであり、
Ｒａは独立にＣ１−４スルホアルキルであり、
Ｍ１は式Ｉで定義した通りであり、
式Ｉａのシアニン色素は１以上のＲａ基並びにＲ１、Ｒ２及びＲａ基に由来する全部で１〜６のスルホン酸置換基を有することを条件とする。
【００６３】
「スルホン酸置換基」という用語は、式−ＳＯ３Ｍ１（式中、Ｍ１は上記で定義した通りである。）の置換基を意味する。式Ｉａの好ましい色素は、３〜６のスルホン酸置換基を有している。−ＳＯ３Ｍ１置換基は炭素原子に共有結合しており、炭素原子はアリール（即ち、Ｒ１又はＲ２基）又はアルキル（即ち、Ｒａ基）であり得る。式Ｉａ中では、Ｒａ基は好ましくは式−(ＣＨ２)ｋＳＯ３Ｍ１を有する。式中、Ｍ１は上記で定義した通りであり、ｋは１〜４の値を有する整数である。ｋは好ましくは３又は４である。
【００６４】
特に好ましいシアニン色素は、次の式Ｉｂのものである。
【００６５】
【化３】
2012500191.tif 000004
【００６６】
式中、
Ｒ９及びＲ１０は独立にＨ又はＳＯ３Ｍ１であって、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも一方はＳＯ３Ｍ１であり、
Ｒ１１及びＲ１２は独立にＣ１−４アルキル又はＣ１−６カルボキシアルキルであり、
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は独立にＲｂ基（式中、ＲｂはＣ１−４アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキル又は−(ＣＨ２)ｑＳＯ３Ｍ１であり、ｑは３又は４の値を有する整数である。）であり、
Ｍ１は式Ｉ及び式Ｉａに関して定義した通りであり、
シアニン色素はＲ９、Ｒ１０及びＲｂ基中に全部で１〜４のＳＯ３Ｍ１置換基を有することを条件とする。
【００６７】
式Ｉｂの好ましいシアニン色素は、ベクターへのコンジュゲーションを容易にするため、１以上のＣ１−６カルボキシアルキル基が存在するように選択される。
【００６８】
式Ｉｂの好ましい個別シアニン色素を表１にまとめて示す。
【００６９】
【表１】
2012500191.tif 000005
【００７０】
特に好ましいシアニン色素は、下記式Ｉｃのものである。
【００７１】
【化４】
2012500191.tif 000006
【００７２】
式中、
Ｒｃは独立にＲａ基又はＣ１−６カルボキシアルキルであり、
Ｒ１７〜Ｒ２０は独立にＣ１−５アルキル又はＲｃ基であり、Ｒ１７＝Ｒ１８＝Ｒｃ又はＲ１９＝Ｒ２０＝Ｒｄ（式中、ＲｄはＣ１−２アルキルである。）であるように選択され、
Ｒａ及びＭ１は式Ｉに関して上記で定義した通りである。
【００７３】
式Ｉｂ及び式Ｉｃの特に好ましいシアニン色素はＣｙ５＊＊及びＡｌｅｘａ ６４７であり、Ｃｙ５＊＊が理想的である。
【００７４】
「ベンゾピリリウム色素」という用語は、その通常の意味を有する。本発明の好適なベンゾピリリウム色素はＢｚｐＭで表され、次の式ＩＩを有する。
【００７５】
【化５】
2012500191.tif 000007
【００７６】
式中、
Ｙ１は次の式Ｙａ又は式Ｙｂの基であり、
【００７７】
【化６】
2012500191.tif 000008
【００７８】
Ｒ２１〜Ｒ２４及びＲ２９〜Ｒ３３は独立にＨ、−ＳＯ３Ｍ１、Ｈａｌ、Ｒｇ及びＣ３−１２アリールから選択され、
Ｒ２５はＨ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキル、Ｃ３−１２アリールスルホニル又はＣｌであり、或いはＲ２５は任意にはＲ２６、Ｒ３４、Ｒ３５又はＲ３６の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成でき、
Ｒ２６及びＲ３６は独立にＲｇ基であり、
Ｒ２７及びＲ２８は独立にＣ１−４アルキル、Ｃ１−４スルホアルキル又はＣ１−６ヒドロキシアルキルであり、或いは任意にはＲ２９及び／又はＲ３０の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成でき、
Ｘは−ＣＲ３４Ｒ３５−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ３６−又は−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ３４〜Ｒ３６は独立にＲｇ基である。）であり、
ＲｇはＣ１−４アルキル、Ｃ１−４スルホアルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキル又はＣ１−６ヒドロキシアルキルであり、
ｗは１又は２であり、
Ｊは生体適合性陰イオンであり、
Ｍ１は式Ｉに関して定義した通りであり、
ＢｚｐＭはＲ２１〜Ｒ３６基から選択される１以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。
【００７９】
「生体適合性陰イオン」（Ｊ）という用語は、イオン化して正に帯電した基（この場合にはインドリニウム基）と共に塩を形成する負に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記負に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。対イオン（Ｊ−）は、モル相当量で存在することでＢｚｐＭ色素上の正電荷をバランスさせる陰イオンを表す。電荷をバランスさせる量が存在する限り、陰イオン（Ｊ）は好適には単一又は複数の電荷を有する。陰イオンは好適には無機酸又は有機酸から導かれる。好適な陰イオンの例には、塩化物イオン又は臭化物イオンのようなハロゲン化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、クエン酸イオン、酢酸イオン、リン酸イオン及びホウ酸イオンがある。好ましい陰イオンは塩化物イオンである。
【００８０】
式ＩＩのベンゾピリリウム色素（ＢｚｐＭ）は、緑色乃至近赤外波長（５００〜１２００ｎｍ、好ましくは５５０〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは６００〜８００ｎｍ）の光を用いる光学イメージング方法で直接又は間接に検出できる蛍光色素又は発色団である。好ましくは、ＢｚｐＭは蛍光性を有する。
【００８１】
本発明の好適なイメージング剤は、ＢｚｐＭが次の式ＩＩａ又は式ＩＩｂを有するものである。
【００８２】
【化７】
2012500191.tif 000009
【００８３】
式中、Ｘ、ｗ、Ｊ及びＲ２１〜Ｒ３３は式ＩＩに関して定義した通りである。
【００８４】
Ｒ２５がＲ２６／Ｒ３４〜Ｒ３６の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成する場合、好適なかかる芳香環には、フェニル、フラン、チアゾール、ピリジル、ピロール及びピラゾール環がある。好適な不飽和環は、少なくともＲ２５が結合したＣ＝Ｃを含んでいる。
【００８５】
Ｒ２７及び／又はＲ２８がＲ２９及び／又はＲ３０の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成する場合、好適なかかる環には、チアゾール、ピリジル、ピロール及びピラゾール環並びにこれらの部分水素化変種がある。好ましくは、ピリジル又はジヒドロピリジルである。
【００８６】
ベンゾピリリウム色素の好ましい特徴
ベクターは、好ましくは式ＩＩのＢｚｐＭのＲ２５、Ｒ２６、Ｒ３４、Ｒ３５又はＲ３６の位置、さらに好ましくはＲ２６、Ｒ３４、Ｒ３５又はＲ３６の位置、最も好ましくはＲ２６、Ｒ３４又はＲ３５の位置に結合している。結合を容易にするため、関連するＲ２５、Ｒ２６、Ｒ３４、Ｒ３５又はＲ３６置換基は好ましくはＣ１−６カルボキシアルキル、さらに好ましくはＣ３−６カルボキシアルキルである。
【００８７】
ベンゾピリリウム色素（ＢｚｐＭ）は、好ましくは２以上のスルホン酸置換基、さらに好ましくは２〜６のスルホン酸置換基、最も好ましくは２〜４のスルホン酸置換基を有する。好ましくは、スルホン酸置換基の少なくとも１つはＣ１−４スルホアルキル基である。かかるスルホアルキル基は、好ましくは式ＩＩのＲ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ３４、Ｒ３５又はＲ３６の位置にあり、さらに好ましくはＲ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ３４又はＲ３５の位置にあり、最も好ましくはＲ２７及びＲ２８の一方又は両方と共にＲ２６の位置にある。式ＩＩのスルホアルキル基は、好ましくは式−(ＣＨ２)ｋＳＯ３Ｍ１（式中、Ｍ１はＨ又はＢｃであり、ｋは１〜４の値を有する整数であり、Ｂｃは（上記で定義したような）生体適合性陽イオンである。）を有する。ｋは好ましくは３又は４である。
【００８８】
式ＩＩ中、ｗは好ましくは１である。Ｒ２５は好ましくはＨ又はＣ１−４カルボキシアルキルであり、最も好ましくはＨである。Ｘは好ましくは−ＣＲ３４Ｒ３５−又は−ＮＲ３６−であり、最も好ましくは−ＣＲ３４Ｒ３５−である。
【００８９】
好ましいＢｚｐＭ色素は次の式ＩＩＩを有する。
【００９０】
【化８】
2012500191.tif 000010
【００９１】
式中、Ｙ１、Ｒ２１〜Ｒ２４、Ｒ２６、Ｒ３４、Ｒ３５及びＪは式ＩＩに関して定義した通りである。
【００９２】
式ＩＩＩの好適な色素は、次の式ＩＩＩａ又は式ＩＩＩｂを有する。
【００９３】
【化９】
2012500191.tif 000011
【００９４】
式ＩＩＩ、式ＩＩＩａ及び式ＩＩＩｂの好ましいＲ２１〜Ｒ２４及びＲ２６〜Ｒ３３基は、式ＩＩａ及び式ＩＩｂに関して上記で定義した通りである。式ＩＩＩ、式ＩＩＩａ及び式ＩＩＩｂ中、Ｒ３４及びＲ３５は好ましくは一方がＲｊ基でありかつ他方がＲｋ基であるように選択される。ＲｊはＣ１−２アルキル、最も好ましくはメチルである。ＲｋはＣ１−４アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキル又はＣ１−４スルホアルキル、好ましくはＣ３−６カルボキシアルキル又は−(ＣＨ２)ｋＳＯ３Ｍ１（式中、ｋは３又は４であるように選択される。）である。
【００９５】
好ましくは、式ＩＩＩの色素は、ベクターへの容易な共有結合を可能にするためにＣ１−６カルボキシアルキル置換基を有する。
【００９６】
式ＩＩ又は式ＩＩＩ中、Ｒ２７及び／又はＲ２８がＲ２９及び／又はＲ３０の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成する場合、好ましいかかる環はピリジル又はジヒドロピリジルである。Ｒ２８基がＲ３０と共に環化された好ましいかかるＹ１基は、次の式Ｙｃを有する。
【００９７】
【化１０】
2012500191.tif 000012
【００９８】
Ｒ２７及びＲ２８基の両方が環化された好ましいかかるＹ１基は、次の式Ｙｄを有する。
【００９９】
【化１１】
2012500191.tif 000013
【０１００】
式中、
Ｒ２７、Ｒ２９及びＲ３１〜Ｒ３３は上記で定義した通りであり、
各Ｘ１は独立にＨ又はＣ１−４アルキルである。
【０１０１】
式Ｙｃ中、好ましくは下記の通りである。
各Ｘ１はＣＨ３であり、
Ｒ９＝Ｒ３１＝Ｈであり、
Ｒ３２はＨであり、
Ｒ３３はＣＨ３又は−Ｃ(ＣＨ３)３、さらに好ましくは−Ｃ(ＣＨ３)３である。
【０１０２】
式Ｙｄ中、好ましくは下記の通りである。
Ｒ２９はＨであり、
Ｒ３２はＨであり、
Ｒ３３は好ましくはＣＨ３又は−Ｃ(ＣＨ３)３、さらに好ましくは−Ｃ(ＣＨ３)３である。
【０１０３】
式ＩＩの−ＮＲ２７Ｒ２８基は下記のいずれかであることが好ましい。
（ｉ）この基は開鎖形態にある。即ち、Ｒ２７／Ｒ２８基はＲ２９／Ｒ３０の一方又は両方と共に環化されていない。好ましいかかるＲ２７及びＲ２８基は、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４スルホアルキルから独立に選択され、最も好ましくはエチル及びＣ３−４スルホアルキルから独立に選択される。
（ｉｉ）この基は環化されて、式Ｙｃ又は式Ｙｄ、さらに好ましくは式Ｙｃの環状Ｙ１置換基を生じる。
開鎖形態（ｉ）が最も好ましい。
【０１０４】
式ＩＩＩの特に好ましい色素は、次の式ＩＩＩｃ、式ＩＩＩｄ又は式ＩＩＩｅを有する。
【０１０５】
【化１２】
2012500191.tif 000014
【０１０６】
式中、
Ｍ１及びＪは上記で定義した通りであり、
Ｒ３７及びＲ３８は独立にＣ１−４アルキル及びＣ１−４スルホアルキルから選択され、
Ｒ３９はＨ又はＣ１−４アルキルであり、
Ｒ４０はＣ１−４アルキル、Ｃ１−４スルホアルキル又はＣ１−６カルボキシアルキルであり、
Ｒ４１はＣ１−４スルホアルキル又はＣ１−６カルボキシアルキルであり、
Ｒ４２はＣ１−４アルキル、Ｃ１−４スルホアルキル又はＣ１−６カルボキシアルキルであり、
Ｘ２，Ｘ３及びＸ４は独立にＨ又はＣ１−４アルキルである。
式ＩＩＩｄ、式ＩＩＩｅ及び式ＩＩＩｆの色素は、好ましくはＲ４０〜Ｒ４２の１以上がＣ１−４スルホアルキルであるように選択される。
【０１０７】
式ＩＩＩｄの好ましい特定の色素は、次式のＤＹ−６３１及びＤＹ−６３３である。
【０１０８】
【化１３】
2012500191.tif 000015
【０１０９】
式ＩＩＩｅの好ましい特定の色素は、次式のＤＹ−６５２である。
【０１１０】
【化１４】
2012500191.tif 000016
【０１１１】
好ましい特定の色素はＤＹ−６３１及びＤＹ−６５２であり、ＤＹ−６５２が最も好ましい。
【０１１２】
存在する場合、リンカー基−(Ａ)ｍ−の役割の１つは、光学レポーターをベクターの活性部位から遠ざけることにあると想定されている。これは、レポーターが比較的バルキーであり、したがって有害な立体的相互作用が起こり得る場合に特に重要である。これは、レポーターが活性部位から離れて位置する自由を与えるたわみ性（例えば、単純アルキル鎖）及び／又はレポーターを活性部位から離すように定位させる剛性（例えば、シクロアルキル又はアリールスペーサー）を組み合わせることで達成できる。リンカー基の性質はまた、イメージング剤の生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。−(Ａ)ｍ−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位又は１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでイメージング剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排泄経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排泄）を有利にするためにも使用できる。
【０１１３】
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。任意には、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸にコンジュゲートすることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手できる）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
【０１１４】
【化１５】
2012500191.tif 000017
【０１１５】
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、それは好ましくはベクター及び光学レポーターへのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含む。Ｌが１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンから選択される。ＬがＰＥＧ部分からなる場合、それは好ましくは次の式Ｂｉｏ１又は式Ｂｉｏ２の単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で導かれる単位を含む。
【０１１６】
【化１６】
2012500191.tif 000018
【０１１７】
かかるＰＥＧ様構造は、式Ｂｉｏ１（式中、ｐは１〜１０の整数である。）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸であり得る。別法として、式Ｂｉｏ２のプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
【０１１８】
【化１７】
2012500191.tif 000019
【０１１９】
式中、ｐは式Ｂｉｏ１に関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式Ｂｉｏ２中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【０１２０】
リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖からなっていない場合、好ましいＬ基は、２〜１０の原子、最も好ましくは２〜５の原子、特に好ましくは２又は３の原子を含む−(Ａ)ｍ−部分を構成する結合原子の主鎖を有している。２つの原子を含む最小リンカー基主鎖は、いかなる望ましくない相互作用も最小限に抑えられるように光学レポーターを十分に引き離すという利点を与える。
【０１２１】
第１の態様のイメージング剤は、好ましくは医薬組成物として提供される。かかる組成物は、イメージング剤を生体適合性キャリヤーと共に哺乳動物への投与に適した形態で含んでいる。「生体適合性キャリヤー」とは、組成物が生理学的に許容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解できる流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、生体適合性対イオンを有する血漿陽イオンの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水又は等張食塩水である。
【０１２２】
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び／又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの変更又は溶液のガス抜きのために）所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ３の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したように適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【０１２３】
かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【０１２４】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容される範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容される緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容される塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【０１２５】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容される増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【０１２６】
かかる医薬組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【０１２７】
かかる医薬組成物はまた、第４の態様（下記）に記載するように、キットから製造することもできる。
【０１２８】
第１の態様の方法は、好ましくは、下記に記載するように（ａ）異形成のないバレット食道、（ｂ）異形成、及び（ｃ）癌を識別するために使用される。その判定は蛍光強度による。本方法は、主として異形成のないバレット食道を異形成又は腺癌から識別するため、好ましくは（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の各々を識別するため、最も好ましくはさらに（ｂ）において「低グレード」又は「高グレード」異形成を識別するために使用される。ここで、これらの用語は図１（上記）に関係するものである。
【０１２９】
第１の態様の方法は、好ましくは、さらに（ｖ）段階（ｉｖ）からの潜在性異形成部位に関して生検を行う段階を含む。このようにすれば、組織試料を採取してエクスビボで詳細に試験することで任意の疾患の性質及び程度を確認することができる。生検は標準的な技法によって実施される［例えば、Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ，ＭｅｄＧｅｎＭｅｄ，８，６６−８８（２００６）を参照されたい］。
【０１３０】
生検段階を含んでも含まなくても、第１の態様の方法は好ましくは局所療法を送達すべき部位の案内に使用される。任意の疾患の性質及び程度に関する一層正確な知識は、個々の患者に対する最も適切な療法の決定を可能にする。かかる療法は、プロトンポンプ阻害剤による化学療法、内視鏡粘膜切除及び外科的切除を含むことがある（図１参照）。疾患が検出されて療法が開始された場合、第１の態様の方法は、例えば適当な時間間隔で追跡反復イメージングを行うことで、療法の効力をモニターするために有利に使用できる。
【０１３１】
光学レポーターは、通常の方法によってベクターにコンジュゲートすることができる。これに関しては、Ａｃｈｉｌｅｆｕ［Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３，３９３−４０９（２００４）］，Ｌｉ ｅｔ ａｌ［Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，８（１７），３６２３−２６（２００６）及びＢｕｌｌｏｋ ｅｔ ａｌ［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４８，５４０４−５４０７（２００５）］を参照されたい。シアニン色素を生物学的分子にコンジュゲートするための一般的方法は、Ｌｉｃｈａ ｅｔ ａｌ［Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］によって記載されている。本発明で使用するためのペプチド、タンパク質及びオリゴヌクレオチドベクターは、末端位置で標識することもできるし、或いは別法として１以上の内部位置で標識することもできる。蛍光色素標識試薬を用いるタンパク質標識の総説及び例に関しては、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ − Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌｔｄ．（１９９８）を参照されたい。合成ペプチドにおいて部位特異的標識を達成するためのプロトコルが利用できる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
【０１３２】
好適な光学レポーター、特に色素をアミノ酸及びペプチドにコンジュゲートする方法は、Ｌｉｃｈａ（上記参照）並びにＦｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ［ｉｂｉｄ，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をベクターにコンジュゲートする方法は、色素のみをコンジュゲートする方法と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。
【０１３３】
ペプチドへのコンジュゲーションに適するように官能化された光学レポーター色素は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ社、Ｄｙｏｍｉｃｓ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社などから商業的に入手できる。かかる色素の多くはＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）活性化エステルとして入手できる。ベクターへのコンジュゲーションに適するように官能化されたベンゾピリリウム色素（ＢｚｐＭ）は、Ｄｙｏｍｉｃｓ社（Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｗｉｎｚｅｒｌａｅｒ Ｓｔｒ．２Ａ、Ｄ−０７７４５ Ｊｅｎａ、ドイツ、ｗｗｗ．ｄｙｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）から商業的に入手できる。この場合、反応性官能基はＮＨＳエステル、マレイミド、アミノ又はカルボン酸である。
【０１３４】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の方法で有用なイメージング剤であって、以下のものから選択されるイメージング剤を提供する。
（ｉ）式Ｉａのシアニン色素又はベンゾピリリウム色素である光学レポーターで標識されたｈＥＧＦ又はそのフラグメント、
（ｉｉ）式Ｉａのシアニン色素又はベンゾピリリウム色素である光学レポーターで標識されたＴＧＦ−α又はそのフラグメント、
（ｉｉｉ）第１の態様で定義した光学レポーターで標識されたアンフィレグリン、
（ｉｖ）シアニン色素又はベンゾピリリウム色素である光学レポーターで標識された、アミノ酸配列ＣＫＳＰＥＰＱＨＣ（ＧＥ９）を含む９〜２０マーペプチド、
（ｖ）シアニン色素又はベンゾピリリウム色素である光学レポーターで標識された、アミノ酸配列ＬＨＬＷＶＰＥＰＷＴＱＴ（ＧＥ１０）又はＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＧＥ１１）を含む１２〜２０マーペプチド、
（ｖｉ）第１の態様で定義した光学レポーターで標識された、アミノ酸配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫ（インヘルビン１）を含む１７〜２０マーペプチド、
（ｖｉｉ）第１の態様で定義した光学レポーターで標識された、アミノ酸配列ＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴＫ（インヘルビン３）を含む１７〜２０マーペプチド、
（ｖｉｉｉ）式Ｉａのシアニン色素又はベンゾピリリウム色素である光学レポーターで標識された、第１の態様で定義したアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｘ）シアニン色素又はベンゾピリリウム色素である光学レポーターで標識された、第１の態様で定義したナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標））。
【０１３５】
第２の態様のイメージング剤の光学レポーターの好ましい態様は、第１の態様（上記）に定義された通りである。特に（ｉ）〜（ｖｉｉ）のベクターは、好ましくは式Ｉａのシアニン色素又はベンゾピリリウム色素である光学レポーターで標識される。シアニン色素及びベンゾピリリウム色素の好ましい態様は、第１の態様に定義された通りである。
【０１３６】
第３の態様では、本発明は、第２の態様のイメージング剤を含んでなる医薬組成物を提供する。医薬組成物及びその好ましい実施形態は、第１の態様（上記）に記載された通りである。第３の態様の医薬組成物の好ましい態様は、第２の態様に記載された通りである。
【０１３７】
第４の態様では、本発明は、第３の態様の医薬品組成物を製造するためのキットを提供する。好適なキットは第１の態様のイメージング剤を無菌固体形態で含んでいて、生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬品組成物が得られる。
【０１３８】
その場合、イメージング剤及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。イメージング剤は、次いで所望の生体適合性キャリヤーを用いて再構成することで、哺乳動物への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬品組成物を与えるように設計されている。「生体適合性キャリヤー」という用語及びその好ましい実施形態は、第１の態様（上記）に記載された通りである。
【０１３９】
イメージング剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬組成物に関して（上記に）記載されたような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を任意に含むことができる。
【０１４０】
第５の態様では、本発明は、第１の態様のインビボイメージング方法における、第１又は第２の態様で定義したイメージング剤の使用を提供する。このような使用のためのイメージング剤の好ましい態様は、第１及び第２の態様に記載された通りである。
【０１４１】
第６の態様では、本発明は、第１の態様の方法における、第１の態様のイメージング剤を製造するためのキットの使用を提供する。
【０１４２】
第７の態様では、本発明は、第１の態様の方法で使用するためのイメージング剤の製造における、第１の態様の段階（ｉ）で定義したベクターの使用を提供する。
【実施例】
【０１４３】
以下の実施例によって本発明を例証する。本発明の化合物を表２（下記）に示す。化合物１〜３はＧＥ１１類似体である。化合物４〜７はＴＧＦα２２−３１フラグメント類似体であり、化合物８〜１１はＥＧＦ２１−３１フラグメント類似体である。
【０１４４】
実施例１は、本発明の好ましいシアニン色素であるＣｙ５**の合成法を示す。実施例２は、Ｃｙ５**の活性化エステルの合成法を示す。実施例３は、シアニン色素（Ｃｙ５**）をコンジュゲートした本発明のペプチドの合成法を示す。実施例４は、シアニン色素（Ｃｙ５**）をコンジュゲートした本発明のタンパク質（抗ＥＧＦＲアフィボディを含む）の合成法を示す。実施例５は化合物１〜１４に関するＨＰＬＣ精製条件を示し、実施例６は化合物１〜１４の特性決定を示す。実施例７は本発明の化合物に関する結合アッセイデータを示し、適当な光学レポーターで標識された本発明のベクターがなおもＥＧＦＲへの結合を維持することを示している。
【０１４５】
実施例８は、組織マイクロアッセイ方法によって得られた、バレット食道患者からの患者組織試料中におけるＥＧＦＲの発現に関するデータを示す。実施例８は、ＥＧＦＲ発現がバレット組織では低く、低グレード異形成から高グレード異形成、さらに腺癌となるに従って次第に増加することを実証している。ＥＧＦＲ発現はまた、異形成／腺癌の部位に隣接したバレット組織中でも増加している。扁平上皮組織中でのＥＧＦＲ発現は、この標的の適性に影響を及ぼさない。その理由は、扁平上皮組織が食道の正常な内張りであると共に、広い表面積を占めるバレット組織が真のバックグラウンドであり、白色光の下では扁平上皮組織から容易に識別されるからである（バレット組織はピンク色であり、したがって容易に識別できる）。結果は、「リスクのある」患者（バレット組織を超えて進行した患者）におけるＥＧＦＲ発現の有意なアップレギュレーションを示しており、生検案内のためのＥＧＦＲ標的化を支持している。所見は異形成におけるＥＧＦＲ発現の増加である。
【０１４６】
実施例９は、食道癌において、高ＥＧＦＲ発現患者では生存期間が短い傾向を示している。これは、その病態のマーカーとしてのＥＧＦの重要性を実証している。
【０１４７】
略語
通常の一文字又は三文字アミノ酸略語を使用する。
Ａｃｍ：        アセトアミドメチル
ＡＣＮ：        アセトニトリル
Ｂｏｃ：        ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｃｙ５＊＊：      実施例１参照
ＤＢＵ：        １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデス−７−エン
ＤＣＭ：        ジクロロメタン
ＤＩＥＡ：      ジイソプロピルエチルアミン
ＤＣＣ：        Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド
ＤＭＳＯ：      ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ：      ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＢＴＵ：      Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチ                ルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：      １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＳＰｙＵ：    Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレン                ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ：      高速液体クロマトグラフィー
ｉｖＤｄｅ：    １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３                −メチルブチル
ＬＣ−ＭＳ：    液体クロマトグラフィー質量分析法
ＮＨＳ：        Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＭ：        Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ：        １−メチル−２−ピロリジノン
Ｐｂｆ：        ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホ                ニル
ＰｙＡＯＰ：    ７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）                ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ｒｈＥＧＦ：    組換えヒトＥＧＦ
ｒｈＴＧＦα：  組換えヒトＴＧＦα
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相ＨＰＬＣ
ｔＢｕ：        ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ：        トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：        トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ：        トリチル
【０１４８】
【表２】
2012500191.tif 000020
【０１４９】
実施例１：シアニン色素２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（Ｃｙ５＊＊）の合成
【０１５０】
【化１８】
2012500191.tif 000021
【０１５１】
（1ａ）５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸
【０１５２】
【化１９】
2012500191.tif 000022
【０１５３】
水素化ナトリウム（鉱油中６０％ＮａＨの１２．０ｇ）のＤＭＦ（１００ｍｌ）懸濁液に、氷浴で冷却しながらエチル２−メチルアセトアセテート（５０ｇ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を１時間かけて滴下した（内部温度０〜４℃）。この混合物を撹拌しながら４５分間放置して周囲温度まで温めた後に再冷却した。次いで、１，４−ブタンスルトン（４５ｇ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を１５分かけて滴下した。最終混合物を６０℃で１８時間加熱した。溶媒を回転蒸発によって除去し、残留物を水とジエチルエーテルとの間に分配した。水性層を集め、新鮮なジエチルエーテルで洗浄し、回転蒸発させて粘着性の泡状物を得た。この中間体を水（１００ｍｌ）に溶解し、撹拌しながら水酸化ナトリウム（１７．８ｇ）を１５分かけて添加した。混合物を９０℃で１８時間加熱した。冷却した反応混合物を濃塩酸（約４０ｍｌ）の添加で約ｐＨ２に調整した。溶液を回転蒸発させ、真空下で乾燥した。黄色の固体を、２％の塩酸を含むエタノール（３×１５０ｍｌ）で洗浄した。エタノール溶液を濾過し、回転蒸発させ、真空下で乾燥して黄色の固体を得た。収量７０ｇ。
【０１５４】
（１ｂ）２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二カリウム塩
【０１５５】
【化２０】
2012500191.tif 000023
【０１５６】
４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（４０ｇ）、（１ａからの）５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（６０ｇ）及び酢酸（５００ｍｌ）を混合し、還流させながら６時間加熱した。溶媒を濾過し、回転蒸発させ、真空下で乾燥した。固体をメタノール（１Ｌ）に溶解した。これに水酸化カリウムの２Ｍメタノール溶液（３００ｍｌ）を添加した。混合物を３時間撹拌し、次いで回転蒸発を用いて溶媒の体積を５０％減少させた。得られた沈殿を濾別し、メタノールで洗浄し、真空下で乾燥した。収量６０ｇ。ＭＳ（ＬＣＭＳ）：ＭＨ＋ ３６２。正確な質量：実測値３６２．０７２９。ＭＨ＋＝Ｃ１４Ｈ２０ＮＯ６Ｓ２はｍ／ｚ ３６２．０７３２（−０．８ｐｐｍ）を要求する。
【０１５７】
（１ｃ）２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート二カリウム塩
【０１５８】
【化２１】
2012500191.tif 000024
【０１５９】
（１ｂからの）２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸（６０ｇ）を１，４−ブタンスルトン（１８０ｇ）及びテトラメチレンスルホン（１４６ｍｌ）と共に１４０℃で１６時間加熱した。得られた赤色固体をジエチルエーテルで洗浄し、粉砕して粉末にし、真空下で乾燥した。収量６０ｇ。
【０１６０】
（１ｄ）ＴＦＡ塩としてのＣｙ５＊＊
１−（５’−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−インドレニウムブロミド−５−スルホン酸Ｋ＋塩（２．７ｇ）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（９６０ｍｇ）、無水酢酸（３６ｍｌ）及び酢酸（１８ｍｌ）を１２０℃で１時間加熱して暗赤褐色の溶液を得た。反応混合物を周囲温度に冷却した。（１ｃからの）２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（８．１ｇ）及び酢酸カリウム（４．５ｇ）を混合物に添加し、混合物を周囲温度で１８時間撹拌した。得られた青色の溶液を酢酸エチルを用いて沈殿させ、真空下で乾燥した。粗色素を液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ１８、水＋０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ勾配）によって精製した。主色素ピークを含む画分を集め、プールし、真空下で蒸発させることで、２ｇの標記化合物を得た。ＵＶ／Ｖｉｓ（水＋０．１％ＴＦＡ）：６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋ ８８７．１。ＭＨ＋＝Ｃ３８Ｈ５０Ｎ２Ｏ１４Ｓ４はｍ／ｚ ８８７．１を要求する。
【０１６１】
実施例２：２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネートジイソプロピルエチルアミン塩（Ｃｙ５＊＊のＮＨＳエステル）の合成
【０１６２】
【化２２】
2012500191.tif 000025
【０１６３】
Ｃｙ５＊＊（実施例１、１０ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（３ｍｌ）に溶解し、これにＨＳＰｙＵ（２０ｍｇ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（８０μｌ）を添加した。得られた溶液を３時間混合したところ、ＴＬＣ（ＲＰＣ１８、水／ＭｅＣＮ）が反応の完了を示した。酢酸エチル／ジエチルエーテル中での沈殿によって色素を単離し、濾別し、酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥した。ＵＶ／Ｖｉｓ（水）６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＨ＋ ９８３．５。ＭＨ＋＝Ｃ４２Ｈ５３Ｎ３Ｏ１６Ｓ４はｍ／ｚ ９８４．１６を要求する。
【０１６４】
実施例３：化合物１〜１１の合成
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製、典型的充填量０．７２ｍｍｏｌ／ｇ、１、２、３、５、６、７、９、１０及び１１の合成）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製、充填量０．５２ｍｍｏｌ／ｇ、４の合成）又はＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓａｓｒｉｎ樹脂（Ｂａｃｈｅｍ社製、充填量０．４５ｍｍｏｌ／ｇ、８の合成）上において、標準的な固相ペプチド化学［Ｂａｒａｎｙ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３０，７０５−７３９（１９８７）］により表２中の化合物１〜１１の配列に対応するペプチジル樹脂をアセンブルした。５０％ＤＣＭ：ＤＭＦ中でＰｙＡＯＰ／コリジン活性化を用いて、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂上にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを手作業でロードした（６及び１０の合成）。すべての他のアミノ酸は、マイクロ波支援ペプチド合成機（ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ社）を用いて、固相で手作業によりアセンブルした。（カルボキシル末端からの）残基は、通例、０．４５ｍｍｏｌのＨＢＴＵ及びＨＯＢｔ（ＤＭＦ中における両試薬の０．４５Ｍ溶液）を添加し、次いで１ｍｍｏｌのＤＩＥＡ（ＮＭＰ中の２Ｍ溶液）を添加することで活性化した０．５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−アミノ酸（ＮＭＰ中の０．２Ｍ溶液）の単一カップリングサイクル（７５℃で５分間）を用いて０．１ｍｍｏｌスケールでカップリングした。Ｈｉｓ及びＡｒｇ残基は、二重カップリング手法を用いて組み込んだ。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンを用いて達成した。洗浄溶媒はＮＭＰであった。使用したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基であるＦｍｏｃ−アミノＰＥＧジグリコール酸はＰｏｌｙｐｕｒｅ社から入手した（３の合成）。すべての他のアミノ酸はＣＥＭ社から入手した。使用したアミノ酸側鎖保護基は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒに関してはｔＢｕであり、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ及びＨｉｓに関してはＢｏｃであり、Ａｓｎ、Ｃｙｓ及びＧｌｎに関してはトリチルであり、７中のＬｙｓ２９及び１１中のＬｙｓ２８に関してはｉｖＤｄｅであった。
【０１６５】
ｂ）化合物５ａ、７ａ、９ａ及び１１ａのペプチド樹脂前駆体のクロロアセチル化
５ａ、７ａ、９ａ及び１１ａのペプチド樹脂前駆体を０．１ｍｍｏｌスケールでクロロアセチル化した。クロロ酢酸（５ｅｑ）及びＤＣＵ（２．５ｅｑ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、混合物を３０分間撹拌した。生じた固体尿素を濾過によって除去し、濾液を減圧下で蒸発乾固させた。残留物（対称無水物）をＮＭＰ（５ｍＬ）に溶解し、窒素バブラー装置に入れたペプチド樹脂に添加した。２時間後、陰性のＫａｉｓｅｒ試験によって反応の完了が確認された。
【０１６６】
ｃ）脱保護及び樹脂からの切断
手動窒素バブラー装置［Ｗｅｌｌｉｎｇｓ，Ｄ．Ａ．，Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．（１９９７）ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｅｄ），２８９，ｐ．５３−５４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］を用いて、２．５％ＴＩＳ及び２．５％水を含むＴＦＡでペプチド樹脂を２時間処理した。８、９、１０及び１１の場合、エタンジチオールがＴＦＡ切断混合物の追加成分であった。これらの条件下では、ペプチドが樹脂から切断され、それと同時にｉｖＤｄｅ基及びＦｍｏｃ基を除くすべての側鎖保護基がペプチドから除去された。切断混合物を濾過し、少量のニートＴＦＡで洗浄した。濾液及び洗液を合わせ、回転蒸発によって濃縮し、次いでジエチルエーテルでトリチュレートして粗ペプチドを得た。沈殿を遠心分離によって単離し、エーテルで洗浄し、次いで５０％ＡＣＮ−０．１％ＴＦＡ水溶液から凍結乾燥して粗生成物を得た。Ｔｒｐ残基を含む化合物１ａ、２ａ及び３ａは、Ｔｒｐ脱保護段階を完了させるため、凍結乾燥に先立って５０％ＡＣＮ−水中で一晩撹拌した。
【０１６７】
ｄ）化合物５ａ、７ａ、９ａ及び１１ａの環化
ペプチドを脱気した６０％ＡＣＮ−水に溶解し、ｐＨを２５％アンモニア水で７．５〜８に調整した。アルゴンブランケット下で環化を２．５時間進行させ、混合物を酸性化して凍結乾燥することで、５ｂ、７ｂ、９ｂ及び１１ｂを得た。
【０１６８】
ｅ）Ｃｙ５＊＊コンジュゲーション
化合物１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、５ｂ、７ｂ、８ａ、９ｂ及び１１ｂは、Ｎα−アミノ酸（１ａ、４ａ及び８ａ）又はＣ末端Ｌｙｓ側鎖残基のＮε−アミノ酸（２ａ、３ａ、５ｂ、７ｂ、９ｂ及び１１ｂ）の位置でＣｙ５＊＊にコンジュゲートした。Ｃｙ５＊＊（実施例１、３ｅｑ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、固体ＨＢＴＵ（２．７ｅｑ）を添加し、次いでＮＭＭ又はＤＩＥＡ（２０ｅｑ）を添加して約１０〜２５分間反応させた。予備活性化色素を固体ペプチド（０．０１ｍｍｏｌ）に添加した。ＬＣ−ＭＳモニタリングは１．５〜２時間後にコンジュゲーションの完了を示し、生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（条件下記）により精製して純粋な１ｂ、４ｂ、５ｃ及び９ｃを得た。純粋な２ｂ及び３ｂは、続いてＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＤＢＵ（５ｅｑ）及びＮ−（２−メルカプトエチル）アミノメチルポリスチレン樹脂（１０ｅｑ）を用いてＦｍｏｃ脱保護を１時間行い、最後にＲＰ−ＨＰＬＣ精製（条件下記）を行った後に得られた。純粋な７ｃ及び１１ｃは、続いてＤＭＦ（１ｍＬ）中の２％ヒドラジンを用いてｉｖＤｄｅ脱保護を１５分間行い、次いで酸性化し、最後にＲＰ−ＨＰＬＣ精製（条件下記）を行った後に得られた。
【０１６９】
化合物６ａ及び１０ａは、Ｃ末端Ｃｙｓ側鎖残基のチオール基の位置でＣｙ５＊＊にコンジュゲートした。テトラスルホン化シアニン色素Ｃｙ５＊＊−Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドを使用した。これは、対応する遊離酸（１．１ｅｑ）をＤＭＦ中のＨＢＴＵ（１ｅｑ）及び対称コリジン（５ｅｑ）で活性化し、予備活性化した色素をＮ−（２−アミノエチル）マレイミドと反応させ、次いで分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することで製造した。ＤＭＦ−０．０５Ｍ ＰＢＦ緩衝液（１：２、３ｍＬ）中における６ａ又は１０ａ（０．００４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）（５ｅｑ）の溶液を固体Ｃｙ５＊＊−Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド（３ｅｑ）に添加した。ＬＣ−ＭＳモニタリングは１．５〜２時間後にコンジュゲーションの完了を示し、反応混合物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１７０】
ｆ）精製
粗ペプチドを分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄクロマトグラフィーシステム）によって精製した。４０分、６０分又は８０分にわたる勾配（表２）を用いて、カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ５μ、２２×２５０ｍｍ）を１０ｍＬ／分で溶出した。使用した溶離剤は、０．１％ＴＦＡ、０．０５％ＴＦＡ又は０．１％ギ酸（ＦＡ）を含む水（溶媒Ａ）、及び０．１％ＴＦＡ、０．０５％ＴＦＡ又は０．１％ＦＡを含むＡＣＮ（溶媒Ｂ）であった。溶出液はλ＝２１４ｎｍでモニターした。所望のピーク画分をプールし、凍結乾燥して純生成物を得た。個々の化合物に関して使用した条件は表３を参照されたい。
【０１７１】
ｇ）特性決定
化合物の特性決定はＬＣ−ＭＳによって行った（表４）。ＬＣ−ＭＳデータは以下の３種の計測器の１つを用いて記録した。１）エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いるＬＣＤ ＤＥＣＡ ＸＰ ＭＡＸ計測器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ社）。これは、５５００Ｄａ／ｓの走査速度をもって４．５ｋＶのポジティブモードで操作されると共に、下記の条件下で運転されるＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＰＤＡクロマトグラフィーシステムに結合されている。運転条件は、５分勾配を用いる溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、０．０５％ＴＦＡ又は０．１％ＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、０．０５％ＴＦＡ又は０．１％ＦＡ、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μｍ Ｃ１８（２） ２０×２ｍｍ、検出：ＰＤＡである。２）ＥＳＩを用いるＱｕａｔｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ計測器（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｗａｔｅｒｓ ＵＫ社）。これは、２０００Ｄａ／ｓの走査速度をもって３．０ｋＶのポジティブモードで操作されると共に、１５２５□バイナリーＨＰＬＣポンプ、２７７７ｃ Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ及び２９９６ ＰＤＡ検出器を備えかつ上記に記載されたのと同じ条件下で運転されるＷａｔｅｒｓクロマトグラフィーシステムに結合されている。３）下記の条件下で運転されるＡｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅクロマトグラフィーシステム（Ｗａｔｅｒｓ社）に結合されたＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＥＳＩ飛行時間計測器（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｗａｔｅｒｓ ＵＫ社）。運転条件は、１０分勾配を用いる上記の溶媒Ａ及び溶媒Ｂ、流量：０．５ｍＬ／分、カラム：Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−ＡＱ ３．５ｍｍ，３×１００ｍｍ、ＰＤＡ検出である。データの取得及び処理は、Ｘｃａｌｉｂｅｒ（計測器１）又はＭａｓｓｌｙｎｘ ４．０（計測器２及び３）データシステムを用いて実施した。個々の条件及び結果については表４を参照されたい。
【０１７２】
実施例４：化合物１２〜１４の合成
ａ）ｒｈＥＧＦのＣｙ５＊＊標識（化合物１２）
組換えヒトＥＧＦ（ｒｈＥＧＦ、約０．５ｍｇのＥＧＦを含む約４ｍｇのＰＢＳ塩、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を水（０．４ｍＬ）に溶解し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（０．０５ｍＬ）に添加した。Ｃｙ５＊＊−ＮＨＳエステル（実施例２）の４ｍｇ／ｍＬ水溶液（５ｅｑ、０３２５ｍＬ）を添加し、ｐＨを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３で８．３に調整した。ＬＣ−ＭＳモニタリングは、約２時間後に約７０〜８０％のＥＧＦ消費を示した。この時点で、２０％ＡＣＮ−０１％ＴＦＡ水溶液の添加によって反応混合物を奪活し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例３ ｆ）及び表２に記載した条件を参照）によって精製した。ＬＣ−ＭＳ分析によってモノ標識ｒｈＥＧＦ １２として確認された主ピークの画分を凍結乾燥した（実施例３ ｇ）及び表３に記載した条件を参照）。
【０１７３】
ｂ）ｒｈＴＧＦαのＣｙ５＊＊標識（化合物１３）
組換えヒトＴＧＦα（ｒｈＴＧＦα、約０．５ｍｇ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を水に溶解し（１．２５ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍＬ、１ｅｑ）、０．０５ｍＬの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３を添加して約８．５のｐＨにした。Ｃｙ５＊＊−ＮＨＳエステル（実施例２）の水溶液（４ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ、５ｅｑ）をＴＧＦα溶液に添加し、ｐＨを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３で約８．２に調整した。９０分後のＬＣ−ＭＳ分析は良好な反応進行を示し、モノ色素標識生成物への転化率は約６０％であった。３時間後に反応を完了近くまで推進するためには、追加のＣｙ５＊＊−ＮＨＳエステル（２．５ｅｑ）が必要であった。次いで、２０％ＡＣＮ−０１％ＴＦＡ水溶液の添加によって反応物を奪活し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例３ ｆ）及び表３に記載した条件を参照）によって精製した。ＬＣ−ＭＳ分析によって所望のモノ標識ｒｈＴＧＦα １３として確認された主ピークの画分を凍結乾燥した（実施例３ ｇ）及び表４に記載した条件を参照）。
【０１７４】
ｃ）抗ＥＧＦＲアフィボディＨｉｓ６−ＺＥＧＦＲ：１９０７−ＣｙｓのＣｙ５＊＊標識
Ｈｉｓ６−ＺＥＧＦＲ：１９０７−Ｃｙｓアフィボディを０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４（０．２ｍｌ）に溶解し、ＴＣＥＰのＰＢＳ緩衝液溶液（１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍＬ）を添加し、混合物を冷蔵庫内に２時間入れてＣｙｓ残基を完全に還元した。テトラスルホン化Ｃｙ５＊＊−Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド（１．３ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液（０．２ｍＬ）に溶解した溶液を添加し、反応の進行をＬＣ−ＭＳによってモニターした。６時間後、所望生成物への全転化が認められ、０．０５％ＴＦＡに基づく溶離剤を用いる分取ＲＰ−ＨＰＬＣ精製（実施例３ ｆ）及び表３に記載した条件を参照）によってＣｙ５＊＊コンジュゲーテッドアフィボディを単離した。１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液を受けバイアルに添加して溶出液を中和した。これは、アフィボディが４．５未満のｐＨで凝集しやすいからである。ＬＣ−ＭＳ分析によって所望のモノ標識抗ＥＧＦＲアフィボディ１４として確認された主ピークの画分を凍結乾燥した（実施例３ ｇ）及び表４に記載した条件を参照）。
【０１７５】
実施例５：化合物１〜１４のＲＰ−ＨＰＬＣ精製
詳細を表３にまとめて示す。
【０１７６】
【表３】
2012500191.tif 000026
【０１７７】
実施例６：化合物１〜１４の特性決定
詳細を表４にまとめて示す。
【０１７８】
【表４】
2012500191.tif 000027
【０１７９】
実施例７：蛍光偏光結合アッセイ
化合物１２、１３及び１４をヒトＥＧＦＲに対する蛍光偏光結合アッセイで試験した。
【０１８０】
蛍光偏光結合測定は、ｅｘ６４６／ｅｍ６７８ｎｍでＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ蛍光偏光プレートリーダーを使用しながら、３８４ウェルマイクロプレート中において結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）中４０μＬの体積で三重反復試験として実施した。
色素標識リガンドの濃度を一定（５ｎＭ）に保つと共に、標的（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社からのヒト組換えＥＧＦＲ／Ｆｃキメラ、カタログ番号３４４−ＥＲ）の濃度を０〜２５８ｎＭの範囲内で変化させた。結合混合物をマイクロプレート中において３０℃で１０分間平衡させた。観察された異方性の変化を次の式に当てはめた。
【０１８１】
【数１】
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【０１８２】
式中、ｒｏｂｓは観察された異方性、ｒｆｒｅｅは遊離ペプチドの異方性、ｒｂｏｕｎｄは結合ペプチドの異方性、ＫＤは解離定数、ｃＴは総標的濃度、Ｐは総色素標識ペプチド濃度である。この式は、リガンド及びレセプターが溶液中において１：１の化学量論比で可逆複合体を形成することを仮定している。ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア（バージョン１０）を用いて非線形回帰によりデータ当てはめを行うことでＫＤ値を得た。
【０１８３】
結果は化合物１２及び１３に関してそれぞれ１１．９±１．４ｎＭ及び２２．１±３．７ｎＭのＫＤを示している一方、化合物１４はヒトＥＧＦＲに対して４．１±０．４ｎＭのＫＤ値を有している。
【０１８４】
実施例８：組織マイクロアレイ
一定範囲の組織学的所見を有するバレット食道患者から新鮮な生検組織試料を集めた。２０の胃対照、７の扁平上皮対照、２０のバレット化生、２０の低グレード異形成、２０の高グレード異形成及び２０の腺癌を含む全部で１０７の試料を得た。上記組織試料について組織マイクロアレイを実施したが、各コアは約０．６ｍｍの直径を有し、深さは可変であった。組織マイクロアレイ用のプロトコルは、Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ［“Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ”．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０，１９４３−１９４９（２０００）］によって記載されている。コアを得たのと同じパラフィンブロックから全切片スライドを作成した。すべての組織は患者の生検からのものであり、いずれの患者も食道の異形成／腺癌に対して特異的な化学療法は受けていなかった。
【０１８５】
生物学的マーカーＥＧＦＲの発現は、ＥＧＦＲ標的化抗体を用いた免疫組織化学的染色によって測定し、次いで０〜３基準のスコアリングを行った。さらに、−／＋／＋＋／＋＋＋／＋＋＋＋／＋＋＋＋＋スコアリング方法を用いて、同じ分析を全切片スライドで行った。結果を下記に記載する。化生とは組織の性質の異常な変化（食道化生では、正常な扁平上皮が円柱上皮に置き換わること）をいうのに対し、異形成とは異常な組織増殖（食道異形成では、化生円柱上皮が増殖の抑制を失い始めること）をいう。
【０１８６】
ＥＧＦＲ発現
組織アレイ又は全組織スライドを用いて、食道発癌の様々な段階におけるＥＧＦＲ発現を免疫組織化学分析によって評価した。結果を図２に示す。
【０１８７】
実施例９：ＥＧＦＲ発現及び診断後患者生存期間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線分析
原始患者生存期間データ（利用可能な場合）を用いてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線分析を実施した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析は、パラメーターを患者生存期間と相関させるための公知臨床ツールである。生存期間が個体のＥＧＦＲ発現（即ち、低ＥＧＦＲレベル（緑色群）又は高ＥＧＦＲレベル（青色群））と相関するかどうかを確かめるため、食道癌患者を長期にわたって調べた。観察初日である０日目には、両群ともすべての患者が生きていた。約３００日目には、両群とも４０％の患者が生きていた。即ち、ＥＧＦＲ発現の影響はまだ見られなかった。しかし、約７００日目までには、強いＥＧＦＲレベルを示した患者のすべてが死んだのに対し、低いＥＧＦＲ発現を示した患者は一層長い生存期間を有していた（最後の１人はそれから約２年後に死んだ）。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】バレット患者の管理に関する現行のガイドラインを示す図。
【図２】組織アレイ又は全組織スライドを用いて、食道発癌の様々な段階におけるＥＧＦＲ発現を免疫組織化学分析によって評価した結果を示す図。
【国際調査報告】
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