(57)【要約】  本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を発現し、独特な生物学的物質製造パターンを示す特定の不死化鳥類細胞系に関する。より詳しくは、本発明は、フラビウイルス科を増幅可能であるが、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は増幅不能であるか、またはフラビウイルス科およびポックスウイルス科を両方とも増幅可能であるかのいずれかである不死化鳥類細胞系に関する。本発明は、前記不死化鳥類細胞系の使用、ならびにウイルスおよびタンパク質を含む生物学的物質を製造するための関連方法に更に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを製造する方法であって、
（ａ）不死化鳥類細胞系を準備し、
（ｂ）前記不死化鳥類細胞系を、製造しようとするウイルスに感染させ、かつ
（ｃ）前記感染鳥類細胞系を、ウイルス増幅を可能にする条件下で培養すること
を含んでなり、
前記不死化鳥類細胞系が、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系、ＥＣＡＣＣに受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
少なくとも１つのフラビウイルス科株を増幅することができ、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を増幅することができない、不死化鳥類細胞系。
【請求項３】
欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託されてなる、請求項２に記載の不死化鳥類細胞系およびその誘導体。
【請求項４】
前記フラビウイルス科株が、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択される、請求項２に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項５】
（ｉ）少なくとも１つのフラビウイルス科株、および（ｉｉ）少なくとも１つのポックスウイルス科株を増幅することができる、不死化鳥類細胞系。
【請求項６】
欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託されてなる、請求項５に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項７】
（ｉ）前記フラビウイルス科株が、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶＮａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択され、（ｉｉ）前記ポックスウイルス科株が、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）からなる群から選択される、請求項５に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項８】
前記不死化鳥類細胞系が、付着細胞系である、請求項２または５に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項９】
前記不死化鳥類細胞系が、懸濁状態で、（マイクロ）キャリアの存在下または非存在下で増殖する非付着細胞系である、請求項２または５に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項１０】
ウイルスおよびタンパク質を製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系の使用。
【請求項１１】
ウイルスおよびタンパク質を製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系の使用。
【請求項１２】
前記ウイルスが、フラビウイルス科、ポックスウイルス科、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、コロナウイルス、アルファウイルス、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ウイルスが、野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性ウイルスである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記ウイルスが、好ましくは、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択されるフラビウイルス科である、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記ウイルスが、好ましくは、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）からなる群から選択されるポックスウイルス科である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記タンパク質が、抗体、受容体リガンド、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、血液凝固因子、酵素、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群、より詳しくはサイトカイン、抗体、およびホルモンからなる群、更により詳しくはＩＬ−２、リツキシマブ、およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１７】
ウイルスを製造するための方法であって、
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系を、ウイルスに感染させ、かつ／または
（ｂ）ウイルス増幅を可能にする条件下で、前記感染鳥類細胞系を培養すること
を含む、方法。
【請求項１８】
ウイルスを製造する方法であって、
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系を、ウイルスに感染させ、かつ／または
（ｂ）ウイルス増幅を可能にする条件下で、前記感染鳥類細胞系を培養すること
を含む、方法。
【請求項１９】
前記ウイルスが、野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性ウイルスである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスが、好ましくは、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択されるフラビウイルス科である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが、好ましくは、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）からなる群から選択されるポックスウイルス科である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質を製造する方法であって、
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系を、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターと接触させ、かつ／または
ｂ）前記タンパク質の製造を可能にする条件下で、前記鳥類細胞系を培養すること
を含む、方法。
【請求項２３】
タンパク質を製造する方法であって、
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系を、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターと接触させ、かつ／または
ｂ）前記タンパク質の製造を可能にする条件下で、前記鳥類細胞系を培養すること
を含む、方法。
【請求項２４】
前記タンパク質が、抗体、受容体リガンド、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、血液凝固因子、酵素、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群、より詳しくはサイトカイン、抗体、およびホルモンからなる群、更により詳しくはＩＬ−２、リツキシマブ、およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、ウイルスおよびタンパク質を含む生物学的物質を製造するための細胞系の分野に関係する。詳しくは、本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を発現し、独特な生物学的物質製造パターンを示す特定の不死化鳥類細胞系に関する。より詳しくは、本発明は、フラビウイルス科を増幅可能であるが、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は増幅不能であるか、またはフラビウイルス科およびポックスウイルス科を両方とも増幅可能であるかのいずれかである不死化鳥類細胞系に関する。本発明は、前記不死化鳥類細胞系の使用、ならびにウイルスおよびタンパク質を含む生物学的物質を製造するための関連方法に更に関する。
【背景技術】
【０００２】
鳥類細胞は、ウイルスワクチンの生産に長年使用されてきた。例えば、有胚ニワトリ卵は、特に、ヒトまたは哺乳動物細胞において複製能力を損なわせた弱毒化ウイルスを含む広範囲のヒトおよび動物ウイルスの複製を支援することができる。ヒトウイルスワクチン生産に使用される有胚ニワトリ卵は、規定された一組のウイルスおよび細菌に汚染されていないことを証明しければならない（特定病原体未感染またはＳＰＦ）。有胚ニワトリ卵は高価であり、ウイルスワクチンコストの最大４０％を占める場合がある。ワクチンロットを製造するために使用される有胚ニワトリ卵用の親ニワトリが、あらゆる疾患に全く罹患していないことをＳＰＦ製造業者が検証するまで、ワクチンロットを出荷することができない。この不確実性により、多大のコストがこれらワクチン調製に上乗せされる。加えて、卵を感染させウイルス増殖を維持するための大規模プロセスは、時間がかかり、ワクチンバッチが異なると一貫性を欠くことがある。
【０００３】
細胞培養技術の発達と共に、ワクチン製造業者は、有胚ニワトリ卵を単離ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に切り替えている。例えば、ほとんどのフラビウイルス科ワクチンは、ＣＥＦから製造されている。世界保健機構（ＷＨＯ）が推奨するフラビウイルス科黄熱病ウイルスワクチンは、１７Ｄ株および亜株に由来しており、それらは、ヌクレオチド配列にわずかな違いがあり、同様の免疫原性を有する（CAMACHO L.A.B. et al., Rev Saude Publica 38(5):671-8 (2004)；DOS SANTOS CN., Virus Res. 35:35-41 (1995)）。フラビウイルス科ウイルスの生産プロセスに関する実験により、１７ＤＤウイルス株を使用してＣＥＦで黄熱病ウイルスワクチンを生産するための効率的方法の確立がもたらされている（FREIRE M.S., Vaccine 23, 2501-2512 (2005)）。ＣＥＦの使用は、製造プロセスの安全特性、効率性、および信頼性を向上させるが、非常に時間がかかり、コストも更に増加する。ＣＥＦの製造は、実際にはＳＰＦ卵の入手可能性に依存する。ＣＥＦは、生細胞を確立および増幅するために胚を細かく刻むことにより、ＳＰＦ卵から調製される。初代動物細胞に典型的なように、線維芽細胞は老化を被り、倍加時間は継代と共に増加し、最終的には全ての細胞が死滅する。このプロセスは、約２０継代後に生じる。このように生存期間が制限されていることは、ＣＥＦの各ロットの安全性試験を完全に一通り実施するための制約となっている。
【０００４】
上記に記載の有胚ニワトリ卵およびＣＥＦは、ウイルスワクチン製造に制限があるため、新しい細胞培養系の探求は、過去数十年間にわたって大きな関心を集めてきた。この点で、不死化細胞系は非常に魅力的である。不死化細胞系は、生産現場でバッチからバッチに維持または凍結することができ、新しい生産プロセスに常に利用可能である。更に、不死化細胞系は生産工場に封じ込められているため、外来性夾雑物による汚染に曝される可能性がより少ない。不死化細胞系を使用することにより、生産プロセスに必要とされる手作業操作の劇的な低減が可能になる。これらの特性は全て、価格および生産プロセス期間の低減並び潜在的な汚染の減少に結び付く。更に、不死化細胞系は完全に特徴付けることができ、従って医薬品安全性試験実施基準および様々な医学機関の要求に完全に準拠することができる。例として、ベロ細胞系は、認可された有胚ニワトリ卵に代わる、フラビウイルス科ワクチン生産の代替的候補として記述されている。生弱毒化日本脳炎ウイルスワクチンであるＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ（商標）−ＪＥＶは、ウシ胎仔血清で補完された培地中で培養されたベロ細胞中で増殖された（MONATH et al., Biologicals, 33:131-144 (2005)）。同様に、MATEUら（Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 101 (3):289-98 (2007)）およびTORINIWAら（Vaccine, 4;26(29-30):3680-9 (2008)）は、それぞれ黄熱病ウイルスワクチンおよび日本脳炎ウイルスワクチンをベロ細胞系で製造させた。更に、不死化細胞系の応用は、不死化細胞系がそのために考案されているウイルスワクチンに限定されず、組換えタンパク質に拡張することができる。例えば、抗体およびインフルエンザウイルスワクチンは両方とも、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系（ＥＣＡＣＣ番号９６０２２９４０）、アデノウイルス５型のＥ１ミニ遺伝子での形質移入により不死化されたヒト胎児網膜芽細胞細胞系で増殖させることができる（FALLAUX F. J. et al., Hum. Gene Ther. 9 :1909-17 (1998)；PAU M. G. et al., Vaccine 19, 2716-2721 (2001)；YALLOP C. et al., Animal Cell Technology meets Genomics, 533-536 (2005)）。 
【０００５】
しかしながら、代替的な不死化細胞系も依然として必要とされている。国際公開第２００７／０７７２５６号には、ノバリケン（Cairina moschata）初代鳥類細胞ゲノムにＴＥＲＴ核酸分子を標的挿入するかまたは無作為挿入するかのいずれかによるノバリケンテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）核酸分子での形質移入により初代鳥類細胞を不死化するための方法が提供されている。特に無作為挿入による前記方法に基づき、本発明者らは、今や互いに特性が異なる新しい不死化鳥類細胞系を特定した。
【発明の概要】
【０００６】
本出願の全体にわたって使用されているように、単数についての言及（「ａ」および「ａｎ」）
は、状況が明白にそうではないと示さない限り、参照する要素またはステップの「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１つまたは複数」、または「複数」を意味するという意味で使用される。
【０００７】
本出願の全体にわたって使用されているように、「および／または」は、本明細書の何処で使用されようとも、「および」、「または」、および「前記用語により接続される要素の全てまたは任意の他の組合せ」の意味を含む。
【０００８】
本出願の全体にわたって使用されているように、「含んでいる」および「含む」は、産物、組成物、および方法が、参照されている成分またはステップを含むが、他のものを排除しないことを意味することが意図されている。「から本質的になる」が、産物、組成物、および方法を規定するために使用される場合、あらゆる本質的重要性を有する他の成分またはステップが除外されることを意味するものとする。従って、列挙された成分から本質的になる組成物は、微量夾雑物および薬学的に許容される担体を除外しないだろう。「からなる」は、他の成分またはステップの微量を超える要素を除外することを意味するものとする。
【０００９】
本出願の全体にわたって使用されているように、「約」または「およそ」は、本明細書で使用される場合、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内であることを意味する。
【００１０】
本出願の全体にわたって使用されているように、「不死化鳥類細胞系」は、ヘイフリック限界を超えて培養中で増殖する鳥類細胞系を指す（HAYFLICK L., Clin. Geriatr. Med. 1(1):15-27 (1985)）。より詳しくは、「不死化鳥類細胞系」は、３０継代を超えて培養中で増殖が可能であり、約１〜約２日間の培養で倍加時間を維持し、約６か月間を超えて連続培養される鳥類細胞系を指す。鳥類細胞系は、培養で約２０〜約２５継代後に不死化であるとみなされる。形質転換細胞とは異なり、不死化鳥類細胞は、増殖が停止されており（つまり、鳥類細胞はコンフルエントであり、接触阻止の影響下にある）、均質な線維芽細胞様形態を示すという点で、不死化鳥類細胞は形質転換細胞と区別される。
【００１１】
本出願の全体にわたって使用されているように、用語「ウイルス増幅が可能な不死化鳥類細胞系」は、本発明の不死化鳥類細胞系が、ウイルスによる感染後に、感染細胞での生産的ウイルス複製により前記ウイルスの量を増加させることができることを意味する。用語「再生産的複製」は、入力ウイルスに対する出力ウイルスの比が１を超えて感染性子孫ウイルスが製造される程度まで、前記ウイルスが、不死化鳥類細胞系で複製するという事実を指す。言いかえれば、「ウイルス増幅が可能である」は、入力ウイルスに対する出力ウイルスの比が１を超えるべきであることを意味する。
【００１２】
本出願全体にわたって使用されているように、「フラビウイルス科」には、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、ＧＢウイルスＡ、ＧＢウイルスＡ様物質、ＧＢウイルス−Ｂ、およびＧＢウイルス−Ｃ（Ｇ型肝炎ウイルスとも呼ばれる）が含まれる。フラビウイルス科の分類、ゲノム構成、および複製サイクルは、十分に記述されている（LINDENBACH B. D. et al., in D. M. Knipe and P.M. Howley, Fields Virology 5th Edition, Eds. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia (2007)）。
【００１３】
本出願全体にわたって使用されているように、「フラビウイルス」には、「蚊媒介性ウイルスクラスター」、「ダニ媒介性ウイルスクラスター」、および「無ベクタークラスター（no-vector cluster）」が含まれる（KUNO G. et al., J. Virol. 72, 73-83 (1998)）。
【００１４】
「蚊媒介性ウイルスクラスター」には、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、クンジンウイルス、ロシオウイルス、およびイルヘウスウイルスが含まれる。
【００１５】
デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）株は、４つの血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、およびＤＥＮ−４に分類される。ＤＥＮＶゲノムのヌクレオチド配列に関する情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから得ることもできる：ＤＥＮ−１ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２３０２７）；ＤＥＮ−２ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１９１９７；ＮＣ−００１４７４）；ＤＥＮ−３ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９３１３０）；ＤＥＮ−４ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４９３１）。
【００１６】
日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）には、以下の株が含まれる：Ｐ３、ＳＡ１４、Ｓ８９２、ＧＰ７８、ＴｈＣＭＡｒ４４９２、ＴｈＣＭＡｒ６７９３、ＪａＧＡｒ０１、Ｊａｏａｒｓ９８２、Ｓｕｂｉｎ、ＫＥ−０９３／８３、Ｎａｋａｙａｍａ野生株、Ｎａｋａｙａｍａ−ＲＦＶＬ、Ｎａｋａｙａｍａ−Ｙｏｋｅｎ、ＬＮＤＧ０７−０２、ＬＮＤＧ０７−１６、およびＫ９４Ｐ０５。ＪＥＶゲノムのヌクレオチド配列に関する情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから得ることもでき、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４５５５１がある。
【００１７】
西ナイルウイルス（ＷＮＶ）株は、遺伝子型ＮＹ９９およびＷＮ０２を含む。ＷＮＶゲノムのヌクレオチド配列に関する情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから得ることもでき、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２２９４、ＮＣ−００１５６３がある。
【００１８】
黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）株には、以下の株が含まれる：Ａｓｉｂｉ、フランス向多臓器ウイルス（ＦＶＶ、French viscerotropic virus）、Ｂ４．１、Ｒｅｎｄｕ、Ｄａｋ１２７９、１７Ｄ、１７ＤＤ、１７Ｄ−２０４、Ｃｏｌｏｍｂｉａ８８、Ｆ−２０４、およびＣ−２０４（HAHN et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84, 2019-2023 (1987)；WANG et al., J. of Gen. Virol. 76, 2749-2755 (1995)；BALLINGER-CRABTREE & MILLER, J. of Gen. Virol. 71, 2115-2121 (1990)；WANG H. et al., J. of Gen. Virol. 78, 1349-1352 (1997)；CAMACHO L.A.B. et al., Rev Saude Publica 38(5):671-8 (2004)；DOS SANTOS CN., Virus Res. 35:35-41 (1995)；GALLER R. et al., Braz. J. Med. Biol. Res. volume 30(2), 157-168 (1997)）。黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）は、遺伝子レベルで研究されており（RICE et al., Science 229:726-733 (1985)）、遺伝子型および表現型に関連する情報は確立されている（MARCHEVSKY et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:75-80 (1995)）。ＹＦＶゲノムのヌクレオチド配列に関する情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから得ることもでき、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３７００、ＮＣ−００２０３１がある。
【００１９】
「ダニ媒介性ウイルスクラスター」は、３つの亜型：西欧亜型（中欧脳炎ウイルスとも呼ばれる）、極東亜型（ロシア春／夏脳炎ウイルスとも呼ばれる）、およびシベリア亜型を含むダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）（ダニ媒介性髄膜脳炎ウイルスとも呼ばれる）を指す（KAISER and REINHARD, Infectious Disease Clinics of North America. 22(3):561-575 (2008)）。ＴＢＥＶゲノムのヌクレオチド配列に関する情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから得ることもでき、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２７４９５、ＮＣ−００１６７２がある。ＴＢＥＶには、病原性極東ロシアＴＢＥＶのＣ−ｐｒｅＭ−ＥまたはｐｒｅＭ−Ｅ構造タンパク質遺伝子を、残りの非構造タンパク質遺伝子およびＤＥＮ４に由来する５’−および３’−非コード配列と共に含有するように構築された生キメラワクチン［それぞれＴＢＥＶ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４およびＴＢＥＶ（ＭＥ）／ＤＥＮ４］も含まれる（PLETNEV et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10532-10536, (1992)）。
【００２０】
「無ベクタークラスター」には、アポイウイルス、細胞融合媒介ウイルス（cell fusing agent virus）、サンペーリタウイルス（San Perlita virus）、フティアパウイルス（Jutiapa virus）、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス（Montana myotis leukoencephalitis virus）、モドックウイルス（Modoc virus）、カウボーンリッジウイルス（Cowbone Ridge virus）、サルビエジャ（Sal Vieja virus）、ブカラサコウモリウイルス（Bukalasa bat virus）、ダカールコウモリウイルス（Dakar bat virus）、リオブラボーウイルス（Rio Bravo virus）、ケアリー島ウイルス（Carey Island virus）、プノンペンコウモリウイルス（Phnom Penh bat virus）、およびバツー洞窟ウイルス（Batu Cave virus）が含まれる（KUNO G. et al., J. Virol., 72 73-83 (1998)）。無ベクターウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関する情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから得ることもできる。例えば、アポイウイルスについては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１６０１９３、ＮＣ−００３６７６がある。
【００２１】
本出願全体にわたって使用されているように、「ペスチウイルス」には、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、および古典的なブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）が含まれる。ＢＤＶには、３つの遺伝子型ＢＤＶ−１〜３が含まれる（BECKER et al. Virology 311 96-104 (2003)）。ＢＶＤＶには、ＢＶＤＶ１型（ＢＶＤＶ−１）およびＢＶＤＶ２型（ＢＶＤＶ−２）が含まれる（HEINZ et al. in Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, 859-868, Edited by M. H. V. Van Regenmortel, C. M. Fauquet, D. H. L. Bishop & 8 other editors. San Diego: Academic Press (2000)）。
【００２２】
本出願全体にわたって使用されているように、「ヘパシウイルス」には、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が含まれる。ＨＣＶ単離株は、広範な系統発生解析により、様々な亜型（ａ、ｂ、ｃ等）を含む６つの主な遺伝子型（１〜６）に分類されている（SIMMONS et al., Hepatology 42, 962-973 (2005)）。遺伝子型１ａの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−１（CHOO et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455 (1991)）、−Ｊ１(OKAMOTO et al., Nucleic Acids Res. 20, 6410-6410 (1992)）、および−Ｈ（INCHAUSPE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10292-10296 (1991)）が含まれる。遺伝子型１ｂの例示的ＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ―ＪＡ（KATO et al., Proc. Natl. Acad., Sci. 87, 9524-9528 (1990)）およびＢＫ（TAKAMIZAWA et al., J. Virol. 65, 1105-1113 (1991)）が含まれる。遺伝子型１ｃの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−Ｇ９（OKAMOTO et al., J. Gen. Virol. 45, 629-635 (1994)）が含まれる。遺伝子型２ａの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−Ｊ６（OKAMOTO et al., J. Gen. Virol. 72, 2697-2704 (1991)）が含まれる。遺伝子型２ｂの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−Ｊ８（OKAMOTO et al..Virology 188, 331-341 (1992)）が含まれる。遺伝子型２ｃの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−ＢＥＢＥ１（NAKO et al., J. Gen. Virol. 141, 701-704 (1996)）が含まれる。
遺伝子型３ａの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−ＮＺＬ１（SAKAMOTO et al., J. Gen. Virol. 75, 1761-1768 (1994)）が含まれる。遺伝子型３ｂの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−Ｔｒ（CHAYAMA et al., J. Gen. Virol. 75, 3623-3628 (1994)）が含まれる。遺伝子型４ａの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−ＥＤ４３（CHAMBERLAIN et al., J. Gen. Virol. 78, 1341-5 1347 (1997)）が含まれる。遺伝子型５ａの例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−ＥＵＨ１４８０（CHAMBERLAIN et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 44-49 (1997)）が含まれる。遺伝子型６の例示的なＨＣＶ単離株には、限定ではないが、ＨＣＶ−ＥＵＨＫ２（ADAMS et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 393-396 (1997)）が含まれる。
【００２３】
本出願全体にわたって使用されているように、「ポックスウイルス科」には、オルソポックスウイルス、カプリポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、およびレポリポックスウイルス、およびそれらの誘導体が含まれる。
【００２４】
オルソポックスウイルスには、水牛痘ウイルス、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、サル痘ウイルス、ウサギ痘ウイルス、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＶ）、および例えば修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）等のその誘導体が含まれる。
【００２５】
カプリポックスウイルスには、ヒツジ痘ウイルス、ヤギ痘ウイルス、およびランピースキン病ウイルスが含まれる。
【００２６】
アビポックスウイルスには、カナリア痘ウイルスおよび鶏痘ウイルスが含まれる。
【００２７】
パラポックスウイルスには、偽牛痘、アラポックスウイルス（arapoxvirus）ｏｖｉｓ、およびオルフウイルスが含まれる。
【００２８】
レポリポックスウイルスには、粘液腫ウイルスが含まれる。
【００２９】
種々のポックスウイルス科のゲノム配列は、当技術分野で入手可能であり、例えば、ＶＶ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＶＶ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ、牛痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、粘液腫ウイルスのゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋで入手可能である（それぞれ、受託番号ＮＣ＿００６９９８、Ｍ３５０２７、Ｕ９４８４８、ＮＣ＿００３６６３、ＮＣ＿００５３０９、ＮＣ＿００４１０５、ＮＣ＿００１１３２）。
【００３０】
本出願全体にわたって使用されているように、「ワクシニアウイルス」（ＶＶ）には、以下のＶＶ株が含まれる：Ｄａｉｒｅｎ  Ｉ、ＩＨＤ−Ｊ、Ｌ−ＩＰＶ、ＬＣ１６Ｍ８、ＬＣ１６ＭＯ、Ｌｉｓｔｅｒ、ＬＩＶＰ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、ＷＲ６５−１６、Ｗｙｅｔｈ、Ａｎｋａｒａ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＣＯＰ）（GOEBEL et al. (1990)、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７．１）、Ｔｉａｎ、Ｔａｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）、修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、欠陥Ｊ２Ｒ遺伝子を含むＶＶ（WEIR and MOSS 1983を参照、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ４８０８２）、欠陥Ｆ２Ｌ遺伝子を含むＶＶ（国際公開第２００９／０６５５４７号を参照）、欠陥Ｉ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子（複数可）を含むＶＶ（国際公開第２００９／０６５５４６号を参照）、およびそれらの誘導体。
【００３１】
本出願全体にわたって使用されているように、「修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）」は、ＶＶ株ＡｎｋａｒａをＣＥＦで連続継代することにより生成された高度に弱毒化されたＶＶ（MAYR A. et al., Infection 3, 6-14 (1975)）およびその誘導体を指す。ＭＶＡウイルスは、フランス国立微生物収集機関（ＣＮＣＭ、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）に寄託番号ＮＯ  Ｉ−７２１で寄託された。ＭＶＡは、SUTTER et MOSS（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851 (1992)）に十分に記述されている。ＭＶＡのゲノムは、マッピングおよび配列決定されている（ANTOINE et al., Virol. 244, 365-396 (1998)、および受託番号Ｕ９４８４８でＧｅｎｂａｎｋにて入手可能である）。
【００３２】
第１の態様によれば、本発明は、ウイルスを製造する方法であって、
（ａ）不死化鳥類細胞系を準備し、
（ｂ）前記不死化鳥類細胞系を、製造しようとするウイルスに感染させ、
（ｃ）ウイルス増幅を可能にする条件下で、前記感染鳥類細胞系を培養することを含み、
前記不死化鳥類細胞系が、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ、European Collection of Cell Cultures）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系、ＥＣＡＣＣに受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系、およびそれらの誘導体からなる群から選択される方法に関する。
【００３３】
別の態様によれば、本発明は、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系、ＥＣＡＣＣに受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を発現する不死化鳥類細胞系に関する。これら細胞系は、鳥類ＴＥＲＴ核酸分子（配列番号１）をノバリケン初代鳥類細胞ゲノムに無作為挿入することにより、国際公開第２００７／０７７２５６号に開示されている初代ノバリケン細胞から生成されている。驚くべきことに、トリテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を発現するこれら不死化鳥類細胞系は、独特な特性を有しており、より詳しくは、それらのウイルス株増幅特徴により互いに区別される。
【００３４】
１つの特別の態様によれば、本発明の不死化鳥類細胞系は、少なくとも１つのフラビウイルス科株を増幅することができるが、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）（GOEBEL et al. 1990；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７．１）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（フランス国立微生物収集機関（ＣＮＣＭ）の寄託番号ＮＯ  Ｉ−７２１）を増幅ことができない。
【００３５】
不死化鳥類細胞系が１つの特定のウイルス株を増幅することができるかどうかを決定するために使用されるアッセイに関する詳細な情報は、下記で更に示される。
【００３６】
好ましい態様によれば、少なくとも１つのフラビウイルス科株を増幅することができるが、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を増幅することができない本発明の不死化鳥類細胞系は、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された、トリテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を発現する不死化鳥類細胞系またはその誘導体である。
【００３７】
好ましい態様によれば、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系またはその誘導体は、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株（例えば、ＨＰＡ培養コレクションの参照番号５０７）およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株（例えば、ＨＰＡ培養コレクションの参照番号５０２）からなる群から選択される少なくとも１つのフラビウイルス科株を増幅することができる。
【００３８】
好ましい態様によれば、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系またはその誘導体は、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）を増幅することができる。
【００３９】
別の特別な態様によれば、本発明の不死化鳥類細胞系は、（ｉ）少なくとも１つのフラビウイルス科株、および（ｉｉ）少なくとも１つのポックスウイルス科株を増幅することができる。
【００４０】
好ましい態様によれば、少なくとも１つのフラビウイルス科株および少なくとも１つのポックスウイルス科株を増幅することができる本発明の不死化鳥類細胞系は、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された、トリテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を発現する不死化鳥類細胞系またはその誘導体である。
【００４１】
好ましい態様によれば、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系またはその誘導体は、（ｉ）黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株（例えば、ＨＰＡ培養コレクションの参照番号５０７）およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株（例えば、ＨＰＡ培養コレクションの参照番号５０２）からなる群から選択される少なくとも１つのフラビウイルス科株、および（ｉｉ）ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）（GOEBEL et al. 1990；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７．１）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（フランス国立微生物収集機関（ＣＮＣＭ）の寄託番号ＮＯ  Ｉ−７２１）からなる群から選択される少なくとも１つのポックスウイルス科株を増幅することができる。
【００４２】
好ましい態様によれば、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系またはその誘導体は、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）、および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を増幅することができる。
【００４３】
本発明の寄託ノバリケン不死化鳥類細胞系の誘導体は、例えば、以下により、寄託細胞系から誘導されたノバリケン不死化鳥類細胞系を指す：
・前記寄託ノバリケン不死化鳥類細胞系（ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２またはＥＣＡＣＣ０８０６０５０１）をサブクローニングすること、
・前記寄託ノバリケン不死化鳥類細胞系（ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２またはＥＣＡＣＣ０８０６０５０１）を、特定の培地（例えば、懸濁状態で細胞系の増殖を可能にする培地）および／または特定の培養条件（例えば、温度、ＣＯ２％）に順応させること、
・非フコシル化タンパク質、より詳しくは非フコシル化抗体を製造するために、サッカライドフコース修飾に関与するノバリケンの１つまたは複数の遺伝子（HARUE IMAI-NISHIYA et al., BMC Biotechnology (2007)）を欠失または突然変異させること（好ましい態様によれば、寄託ノバリケン不死化鳥類細胞系の前記誘導体は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）および／またはＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）遺伝子の欠失または突然変異により得られる）、
・細胞系の免疫応答を低減させるために、インターフェロン耐性に関与するノバリケンの１つまたは複数の遺伝子（HARUE IMAI-NISHIYA et al., BMC Biotechnology (2007)）を欠失または突然変異させること（好ましい態様によれば、寄託ノバリケン不死化鳥類細胞系の前記誘導体は、ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ２遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、およびＳＴＡＴ５遺伝子からなる群から選択される遺伝子（複数可）の欠失または突然変異により得られる）、
・細胞系を培養条件に対してより抵抗性にするために、特にコンフルエンスを維持するために、１つまたは複数のノバリケン抗アポトーシスの遺伝子（複数可）を過剰発現させること、または１つまたは複数の外来性抗アポトーシス遺伝子（複数可）で形質転換すること（好ましい態様によれば、前記抗アポトーシス遺伝子（複数可）は、ｐ１９Ｅ１Ｂヒトアデノウイルス遺伝子、ｂｃｌ−２遺伝子、ｍｃｌ−１遺伝子、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子、Ｂｃｌ−ｗ遺伝子、ａ１遺伝子、ＩＣＰ３４．５単純ヘルペスウイルス遺伝子、およびｐ３５バキュロウイルス遺伝子からなる群から選択される）、
・増殖速度を増加させるのに好適なベクターを使用して、細胞周期の制御に関与する１つまたは複数のノバリケン遺伝子を過剰発現させること（好ましい態様によれば、細胞周期の制御に関与する前記遺伝子は、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ２７遺伝子、およびｐ５７遺伝子からなる群から選択されている）、
・これらウイルスを増殖させるために、目的ウイルスの受容体をコードする１つまたは複数の遺伝子で形質転換することにより細胞系のウイルス感受性範囲を修飾すること（好ましい態様によれば、目的ウイルスの受容体をコードする前記遺伝子（複数可）は、はしかウイルスＣＤ４６受容体をコードする遺伝子（複数可）である）。
【００４４】
好ましい態様によれば、前記ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２誘導体は、少なくとも１つのフラビウイルス科株を増幅することできるが、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を増幅することができない。
【００４５】
好ましい態様によれば、前記ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１誘導体は、（ｉ）少なくとも１つのフラビウイルス科株および（ｉｉ）少なくとも１つのポックスウイルス科株を増幅することができる。
【００４６】
好ましい態様によれば、本発明の不死化鳥類細胞系は、付着細胞系である。
【００４７】
別の好ましい態様によれば、本発明の不死化鳥類細胞系は、懸濁状態で、（マイクロ）キャリアの存在下で、または（マイクロ）キャリアの非存在下で増殖する非付着細胞系である。本発明により使用される（マイクロ）キャリアは、デキストラン、コラーゲン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ゼラチン、ガラス、セルロース、ポリエチレン、および／またはプラスチックで作られていてもよい。（マイクロ）キャリアは、例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）マイクロキャリア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商標）マイクロキャリア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｈｉｌｌｅｘ（商標）マイクロキャリア（ＳｏｌｏＨｉｌｌ  Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ社製）、Ｎｕｎｃ社製２Ｄ  ＭｉｃｒｏＨｅｘ（商標）マイクロキャリア、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）マイクロキャリア（ＳｏｌｏＨｉｌｌ  Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ社製）、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ（商標）ディスク（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＢｉｏＮｏｃｌｌ（商標）マイクロキャリア（Ｃｅｓｃｏ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）、およびＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ−Ｓ（商標）マイクロキャリア（Ｐｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）等が市販されている。
【００４８】
本発明は、ウイルスおよびタンパク質を製造するための本発明の不死化鳥類細胞系の使用にも関する。
【００４９】
本出願の全体にわたって使用されているように、「ウイルス」には、フラビウイルス科、ポックスウイルス科、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス等）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２等）、レオウイルス（例えば、ロタウイルス等）、コロナウイルス（例えば、ヒトＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３等）、およびアルファウイルス（例えば、チクングニヤ、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）等）からなる群から選択されるウイルスが含まれる。ウイルスは、野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性ウイルスであってもよい。
【００５０】
フラビウイルス科およびポックスウイルス科は、上記に規定されている。
【００５１】
本発明によると、フラビウイルス科は、野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性フラビウイルス科である。
【００５２】
本発明によると、ポックスウイルス科は、野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性ポックスウイルス科である。
【００５３】
本出願の全体にわたって使用されているように、「弱毒化ウイルス」は、目的対象体におけるその病原性が実質的に低減されるように修飾されたあらゆるウイルスを指す。好ましくは、ウイルスは、それが臨床的見地から非病原性となるまで、つまりウイルスと接触した対象体が、対照対象体と比べて統計的に有意な病理レベルの増加を示さなくなるまで弱毒化されている。野生型フラビウイルス科病原体を弱毒化するための実験手法は、幾つか記述されている（例えば、PUGACHEV et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582 (2003)を参照）。例えば、ＹＦＶのカプシドおよび非構造タンパク質、ならびにＪＥＶ、ＤＥＮＶ、または西ナイルウイルスの膜およびエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルス科のエンベロープタンパク質のあるアミノ酸における突然変異は、内臓親和性を減少させることが見出されている（例えば、国際公開第２００３／１０３５７１号および国際公開第２００４／０４５５２９号を参照）。
【００５４】
本出願の全体にわたって使用されているように、「組換えウイルス」は、そのゲノムに挿入された外来性配列を含むウイルスを指す。本明細書で使用される場合、「外来性配列」は、親ウイルスに天然では存在しない核酸分子を指す。「組換えウイルス」は、１つまたは複数の構造タンパク質が、真核生物、原核生物、ウイルス（例えば、第２のウイルスの構造タンパク質（複数可））由来の外来性核酸配列で置換されているウイルスからなるウイルスを指す場合がある。従って、本発明によると、「組換えウイルス」は、「キメラウイルス」または「ハイブリッドウイルス」と同義的に呼ばれる場合もある。特に、フラビウイルス科の場合、キメラフラビウイルス科は、ｐｒＭおよびＥタンパク質が、第２のウイルス（例えば、上記に記載のＪＥＶ、ＷＮＶ、ＤＥＮＶ、セントルイス脳炎ウイルス、またはＴＢＥＶ）のｐｒＭおよびＥタンパク質と置換された第１のフラビウイルス科（例えば、上記に記載のＹＦＶ  １７Ｄ株等のＹＦＶ）からなる場合がある。ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ（商標）技術を使用して、医学的に重要なフラビウイルス科に対するキメラワクチン候補が生み出されている。この技術では、ｐｒＭ−Ｅ遺伝子が、ＪＥＶ、ＤＥＮＶ、ＷＮＶ、またはセントルイス脳炎ウイルス等の異種性フラビウイルス科に由来するｐｒＭ−Ｅ遺伝子と置換されたベクターとしてＹＦＶ  １７Ｄワクチンウイルスが使用される（MONATH et al., Vaccine 20:1004-1018 (2002)；PUGACHEV et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582 (2003)；GUIRAKHOO et al., J. Virol. 78:4761-4775 (2004)）。ＳＡ１４−１４−２ウイルスに由来するｐｒＭ−Ｅ遺伝子を含むＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ（商標）−ＪＥＶワクチン（つまり、中国で使用される生弱毒化ＪＥＶワクチン）は、前臨床および第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験での試験に成功した。同様に、弱毒化を増加させるために３つの特定のアミノ酸変化がＥタンパク質に組み込まれた、ＷＮＶ（つまり、ＮＹ９９株）に由来するｐｒＭ−Ｅ配列を含むＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ（商標）−ＷＮＶワクチン候補を用いて実施された第Ｉ相臨床試験が成功している（ARROYO et al., J. Virol. 78:12497-12507 (2004)）。他の例として、キメラフラビウイルス科は、国際公開第２００６／０６８３０７号、国際公開第２００２／１０２８２８号、欧州特許第０９７７５８７号、国際公開第９８／３７９１１号、国際公開第９３／０６２１４号、米国特許第７５６９３８３号、および国際公開第０１／３９８０２号に記載のキメラフラビウイルス科であってもよい。
【００５５】
有利には、組換えウイルスは、外来性配列（複数可）の発現に必要なエレメントを更に含むことができる。発現に必要なエレメントは、ヌクレオチド配列のＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にする一組のエレメント、特に組換えウイルスが細胞に感染するために効果的なプロモーター配列および／または制御配列、および随意に前記ポリペプチドが分泌または細胞表面に発現されることを可能にするのに必要な配列で構成される。これらエレメントは、誘導可能であってもよくまたは構成的であってもよい。勿論、プロモーターは、選択された組換えウイルスおよび宿主細胞に適用される。文献には、そのようなプロモーター配列に関する大量の情報が提供されている。加えて、必要なエレメントには、宿主細胞での外来性配列の発現またはその維持を向上させる追加的なエレメントが含まれていてもよい。特に、イントロン配列、分泌シグナル配列、核局在化配列、ＩＲＥＳ型の翻訳再開始用内部部位、転写終止のポリＡ配列に言及することができる。
【００５６】
本出願の全体にわたって使用されているように、「温度感受性ウイルス」は、野生型が正常な増殖を示すある温度以上で増殖障害を示すウイルス誘導体を指す。例として、BOYD O.ら（Virology Apr 10;399(2):221-30 (2010)）、欧州特許０  １５７  ５２８号（天然痘温度感受性ウイルス）、およびDRILLIEN R.ら（Virology 119, 372-381 (1982)）に記載の温度感受性ウイルスを引用することができる。
【００５７】
本発明によると、「フルーウイルス（Flu virus）」（インフルエンザウイルスとも呼ばれる）には、Ａ型インフルエンザウイルスおよびその亜型、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスが含まれる。「Ａ型インフルエンザウイルスの亜型」には、考え得るＨＡおよびＮＡタンパク質の様々な組合せが含まれる。１９種のＮＡタンパク質（Ｈ１〜Ｈ１５に分類される）および９種のＮＡタンパク質（Ｎ１〜Ｎ９に分類される）が、Ａ型インフルエンザウイルスで特定されている。例として、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、Ｈ１Ｎ１ウイルス、Ｈ１Ｎ２ウイルス、Ｈ３Ｎ２ウイルス、Ｈ３Ｎ８ウイルス、Ｈ５Ｎ１ウイルス、Ｈ７Ｎ２ウイルス、Ｈ７Ｎ３ウイルス、Ｈ７Ｎ７ウイルス、およびＨ９Ｎ２ウイルスであってもよい。インフルエンザウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関する更なる情報は、ｗｗｗ．ｆｌｕｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから得ることができる。Ａ型インフルエンザウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関する更なる情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、またはＬＡＮＬ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから取得することもでき、例えば、Ｊ０２１４４、Ｊ０２１４６、Ｊ０２１４８、Ｊ０２１５１、Ｖ００６０３、Ｖ０１０９９、Ｖ０１１０４、Ｖ０１１０６がある。Ｂ型インフルエンザウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関する更なる情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、またはＬＡＮＬ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから取得することもでき、例えば、Ｊ０２０９４、Ｊ０２０９５、Ｊ０２０９６、Ｋ００４２３、Ｋ０１３９５、Ｍ２０１６８、Ｍ２０１７０、Ｍ２０１７２がある。Ｃ型インフルエンザウイルスゲノムのヌクレオチド配列に関する更なる情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、またはＬＡＮＬ等の公的にアクセス可能な遺伝子データベースから取得することもでき、例えば、Ｋ０１６８９、Ｍ１００８７、Ｍ１７７００がある。弱毒化インフルエンザウイルスワクチンに関する更なる情報は、HICKLING J.（A review of production for influenza virus vaccines, and their suitability for deployment in developing countries for influenza pandemic preparedness, Initiative for vaccine research、World Health Organisation (WHO) (2006)；www.who.int/vaccine）およびRUDENKO L. G.ら（Vaccine 19(2-3), 308-318 (2000)）に見出すことができる。例えば、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社製ワクチン）等の、弱毒化低温適応および温度感受性インフルエンザウイルスワクチンに関する更なる情報は、GLEZEN W.（Expert Rev. Vaccines 3(2):131-9 (2004)）に見出すことができる。
【００５８】
本発明によると、「パラミクソウイルス」には、アブラウイルス、ヘニパウイルス、麻疹ウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、およびメタニューモウイルスが含まれる。アブラウイルスには、トリパラミクソウイルスウイルス１（ＡＰＭＶ−１）とも呼ばれるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）が含まれる。ヘニパウイルスには、ヘンドラウイルス（ＨｅＶ）およびニパウイルス（ＮｉＶ）が含まれる。麻疹ウイルスには、以下の株のはしかウイルス（ＭＶ）が含まれる：Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ  Ｂ株（ENDERS J. F. and T. C. PEEBLES, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286 (1954)）、ＥｄｍｏｎｓｔｏｎＡおよびＢ弱毒化株（GRIFFIN D. and Bellini W., in B. Fields, D. Knipe et al. (ed.), Virology, vol. 2., 1267-1312, Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia (1996)）、Ｓｃｈｗａｒｚ／Ｍｏｒａｔｅｎ弱毒化株（GRIFFIN D. and Bellini W., Measles virus, in B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.), Virology, vol. 2., 1267-1312, Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia (1996)；Ｒｏｕｖａｘ（商標）の名称でＡｖｅｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ社により商業化されている）、および欧州特許第０５４０１３５号、国際公開第２００８／０８６０４２号、または国際公開第９９／４９０１７号に記載の弱毒化ＭＶ株。レスピロウイルスには、センダイウイルス（ＳｅＶ、マウスパラインフルエンザウイルス１とも呼ばれる）、ウシパラインフルエンザウイルス３（ＢＰＩＶ−３）、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ−１）、およびヒトパラインフルエンザウイルス３（ＨＰＩＶ−３）が含まれる。ルブラウイルスには、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＨＰＩＶ−２）、ヒトパラインフルエンザウイルス４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）、ヒトパラインフルエンザウイルス４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）、およびおたふくかぜウイルスが含まれる。ニューモウイルスには、ヒトＲＳウイルスＡ２（ＨＲＳＶ−Ａ２）、ヒトＲＳウイルスＢ１（ＨＲＳＶ−Ｂ１）、およびヒトＲＳウイルスＳ２（ＨＲＳＶ−Ｓ２）が含まれる。メタニューモウイルスには、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）が含まれる。
【００５９】
本出願の全体にわたって使用されているように、「タンパク質」には、以下のもの、それらの断片、およびそれらの組合せが含まれる：
・抗体（例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、ミラツズマブ、エクリズマブ、トシリズマブ、ニモツズマブ、ゴリムマブ、ラムシルマブ、バピネオズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、ラニビズマブ、パリビズマブ、オマリズマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、アブシキシマブ、エファリズマブ、セルトリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ（ustenkinumab））、
・受容体リガンド（例えば、ホルモン、サイトカイン、増殖因子）、
・ホルモン（例えば、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ、バソプレシン）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、カルシトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、グルカゴン、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、オキシトシン、セクレチン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、インスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、トロンボポエチン（thrombopoitin）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、テストステロン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、アンドロステンジオン（andostenedione）、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、テストステロン、カルシフェロール、カルシトリオール、エストラジオール、コルチゾール、アルドステロン、プロゲステロン、アドレナリン（エピネフリン）、ドーパミン、メラトニン、ノルアドレナリン（ノルエピネフリン、ＮＥ）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、チロキシン（Ｔ４）、セロトニン）、
・サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３）、ケモカイン（ＣＣケモカインリガンド１（ＣＣＬ−１）、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３（マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ−１α）とも呼ばれる）、ＣＣＬ−４（マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ−１β）とも呼ばれる）、ＣＣＬ−５（ＲＡＮＴＥＳとも呼ばれる）、ＣＣＬ−６、ＣＣＬ−７、ＣＣＬ−８、ＣＣＬ−９、ＣＣＬ−１０、ＣＣＬ−１１、ＣＣＬ−１２、ＣＣＬ−１３、ＣＣＬ−１４、ＣＣＬ−１５、ＣＣＬ−１６、ＣＣＬ−１７、ＣＣＬ−１８、ＣＣＬ−１９、ＣＣＬ−２０、ＣＣＬ−２１、ＣＣＬ−２２、ＣＣＬ−２３、ＣＣＬ−２４、ＣＣＬ−２５、ＣＣＬ−２６、ＣＣＬ−２７、ＣＣＬ−２８、ＣＸＣケモカイン１（ＣＸＣＬ−１）、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−３、ＣＸＣＬ−４（血小板第４因子（ＰＦ４）とも呼ばれる）、ＣＸＣＬ−５、ＣＸＣＬ−６、ＣＸＣＬ−７、ＣＸＣＬ−８、ＣＸＣＬ−９、ＣＸＣＬ−１０、ＣＸＣＬ−１１、ＣＸＣＬ−１２、ＣＸＣＬ−１３、ＣＸＣＬ−１４、ＣＸＣＬ−１５、ＣＸＣＬ−１６、ＣＸＣＬ−１７、Ｃケモカイン１（ＸＣＬ−１）、ＸＣＬ−２、ＣＸ３Ｃケモカイン１（ＣＸ３ＣＬ−１）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮ−ガンマ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ））、
・増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ヒト多能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈＰＧ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、抗原（例えば、ＭＨＣの抗原、白血球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１））、
・細胞接着分子（例えば、細胞間細胞接着分子（ＩＣＡＭ−１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）、ネクチン、シナプス細胞接着分子（ＳｙｎＣＡＭ））、
・血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ｔＰＡ）、
・酵素（例えば、アルファアミラーゼ、ベータアミラーゼ、セルロース、ベータグルカナーゼ、ベータグルコシダーゼ、デキストラナーゼ、デキストリナーゼ、グルコアミラーゼ（dlucoamylase）、ヘミセルラーゼ（hemmicellulase）、ペントサナーゼ（pentosanase）、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンギナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、酸プロテイナーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、ペプシン、アミノペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、サブチリシン、アミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ、イソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ヒスチダーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ）。
【００６０】
一つの特定の態様によれば、本発明は、ウイルスおよびタンパク質を製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系およびその誘導体の使用に関する。
【００６１】
好ましい態様によれば、本発明は、ウイルスを製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系およびその誘導体の使用に関し、前記ウイルスは、好ましくは、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択されるフラビウイルス科である。実施例３には、ＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株を製造するための好ましい方法が記載されている。
【００６２】
別の好ましい態様によれば、本発明は、例えば、サイトカイン、抗体、およびホルモンからなる群、更により詳しくはＩＬ−２、リツキシマブ、およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択されるもの等のタンパク質を製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系およびその誘導体の使用に関する。ＩＬ−２を製造するための好ましい方法は、実施例５に記載されている。リツキシマブを製造するための好ましい方法は、実施例６に記載されている。ＥＰＯを製造するための好ましい方法は、実施例７に記載されている。
【００６３】
別の特別な態様によれば、本発明は、ウイルスおよびタンパク質を製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系およびその誘導体の使用に関する。
【００６４】
好ましい態様によれば、本発明は、ウイルスを製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系およびその誘導体の使用に関し、前記ウイルスは、好ましくは、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択されるフラビウイルス科である。実施例３には、ＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株を製造するための好ましい方法が記載されている。
【００６５】
別の好ましい態様によれば、本発明は、ウイルスを製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系およびその誘導体の使用に関し、前記ウイルスは、好ましくは、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ)および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）からなる群から選択されるポックスウイルス科である。実施例４には、ＶＶ−ＣＯＰおよびＭＶＡを製造するための好ましい方法が記載されている。
【００６６】
別の好ましい態様によれば、本発明は、例えば、サイトカイン、抗体、およびホルモンからなる群、更により詳しくはＩＬ−２、リツキシマブ、およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択されるもの等のタンパク質を製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系およびその誘導体の使用に関する。ＩＬ−２を製造するための好ましい方法は、実施例５に記載されている。リツキシマブを製造するための好ましい方法は、実施例６に記載されている。ＥＰＯを製造するための好ましい方法は、実施例７に記載されている。
【００６７】
本発明は、以下のステップを含むウイルスを製造する方法にも関する：
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系を、ウイルスに感染させるステップ、および
（ｂ）ウイルス増幅を可能にする条件下で、感染鳥類細胞系を培養するステップ。
【００６８】
本発明は、野生型、弱毒化、および／または組換えオルソポックスウイルスを製造および精製する方法であって、
ａ）パッケージング細胞の培養を準備し、
ｂ）パッケージング細胞培養をオルソポックスウイルスに感染させ、
ｃ）子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで、感染パッケージング細胞を培養し、
ｄ）１つまたは複数のヌクレアーゼの存在下でインキュベーションし、
ｅ）培養液上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収し、
ｆ）好適な条件下にてステップｅ）で回収されたオルソポックスウイルスに一価塩を添加して、ヌクレアーゼ（複数可）活性を阻害し、前記オルソポックスウイルスがステップｇ）で陰イオン交換吸着剤に吸着することを回避し、
ｇ）ステップｆ）で得られた混合物を、核酸捕捉を可能にする好適な条件下で陰イオン交換吸着剤と接触させ、
ｈ）ステップｇ）で得られた混合物を好適な条件下で清澄化して、細胞残屑の除去を可能にし、
ｉ）陰イオン交換吸着剤を、好適な条件下で一価塩を含む溶液で洗浄して、通過画分に残留するオルソポックスウイルスを回収し、
ｊ）工程ｈ）で得られた通過画分、および工程ｉ）で得られた通過画分を濃縮し、
ｋ）工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含む画分をダイアフィルトレーションすることを含み、
前記パッケージング細胞が、国際公開第２００７／０７７２５６号により包含されるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含むノバリケン不死化鳥類細胞系であり、特に、以下の不死化鳥類細胞系：
欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託されているＴ３−１７４９０（図２、３、および４を参照）またはその誘導体、
欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託されているＴ６−１７４９０（図５、６、および７を参照）またはその誘導体が好ましい方法に更に関する。
【００６９】
好ましい態様によれば、ウイルスは、好ましくは、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択されるフラビウイルス科である。実施例３には、ＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株を製造するための好ましい方法が記載されている。
【００７０】
別の特別な態様によれば、本発明は、以下の工程を含むウイルスを製造するための方法に関する：
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系を、ウイルスに感染させる工程、および
（ｂ）ウイルス増幅を可能にする条件下で、感染鳥類細胞系を培養する工程。
【００７１】
好ましい態様によれば、製造されるウイルスは、好ましくは、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択されるフラビウイルス科である。実施例３には、ＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株を製造するための好ましい方法が記載されている。
【００７２】
別の好ましい態様によれば、製造されるウイルスは、好ましくは、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）からなる群から選択されるポックスウイルス科である。実施例４には、ＶＶ−ＣＯＰおよびＭＶＡを製造するための好ましい方法が記載されている。
【００７３】
本発明の鳥類細胞系は、好ましくは、実施例３および４に記載のように、３０℃〜３７℃を含む温度で、より好ましくは３７℃で感染する。本発明の細胞系をウイルスに感染させる工程ａ）は、適切な細胞培地中で実施される。例えば、細胞培地は、例えば血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ））および／またはアミノ酸（複数可）（例えば、Ｌ−グルタミン）で随意に補完されていてもよいダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）または基本培地イーグル（ＢＭＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）であってもよい。また、細胞培地は、動物産物が含まれていない培地であってもよい。動物産物を含まない多くの培地が既に記述されており、例えば、２９３ＳＦＭ  ＩＩ；２９３−Ｆ細胞、ＳＦＭ適合；２９３−Ｈ細胞、ＳＦＭ適合；２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）形質移入試薬；ＣＤ２９３ＡＧＴ（商標）；ＣＤ２９３培地；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培地；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞、ＳＦＭ適合；ＶＰ−ＳＦＭ；ＶＰ−ＳＦＭ  ＡＧＴ（商標）；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞用アデノウイルス発現培地（ＡＥＭ）増殖培地；ＣＤ２９３  ＡＧＴ（商標）；ＣＤ２９３培地；ＣＯＳ−７Ｌ細胞、ＳＦＭ適合；ＥＰＩＳＥＲＦ（登録商標）培地；ＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）等、それらの幾つかは市販されている。実施例３および実施例４に記載のように、本発明の鳥類細胞系の感染に使用される好ましい細胞培地は、ＦＣＳおよびＬ−グルタミンで補完されたＢＭＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）である。
【００７４】
本発明の細胞系は、製造されるウイルスに応じた感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスに感染させる。例えば、フラビウイルス科は、好ましくは約０．００１〜０．１を含むＭＯＩで本発明の鳥類細胞系に接種される。より詳しくは、製造されるフラビウイルス科がＹＦＶまたはＪＥＶである場合、ＭＯＩは、より好ましくは、実施例３、図７Ａ、図８Ａ、図９Ａ、および図１０Ａに記載のように約０．００１である。別の例として、ポックスウイルス科は、好ましくは約０．００１〜０．１を含むＭＯＩで本発明の鳥類細胞系に接種される。より詳しくは、製造されるポックスウイルス科がＶＶ−ＣＯＰである場合、ＭＯＩは、より好ましくは、実施例４、図１１Ｂに記載のように約０．００１である。製造されるポックスウイルス科がＭＶＡである場合、ＭＯＩは、より好ましくは、実施例４、図１１Ａに記載のように約０．０５である。
【００７５】
その後、感染細胞系は、ウイルス増幅を可能にする条件下で培養され（つまり、工程ｂ））、これは、ウイルスゲノムが転写され、ウイルスタンパク質に翻訳され、感染性ウイルス粒子へとパッケージングされることを意味する。
【００７６】
感染細胞系は、表面への付着細胞としてまたは懸濁状態で、（マイクロ）キャリア（上記で規定されている）の存在下または非存在下で培養することができる。細胞系培養は、例えば、シャーレ、ローラーボトル、またはバッチ、流加バッチ、連続式、および中空繊維等を使用するバイオリアクターで実施することができる。本発明の感染鳥類細胞系は、好ましくは、実施例３および４に記載のように、３０℃〜３７℃を含む温度で、より好ましくは３７℃で培養される。感染鳥類細胞系を培養する工程ｂ）は、鳥類細胞系の感染に（工程ａ）で）使用された細胞培地と同じであってもよくまたは異なっていてもよい適切な細胞培地中で実施される。感染鳥類細胞系は、ウイルスに応じて、好ましくは１〜６日間培養される。例えば、製造されるウイルスがＹＦＶである場合、感染鳥類細胞系は、より好ましくは、図７Ａおよび図９Ａに示されているように１〜３日間培養される。別の例として、製造されるウイルスがＪＥＶである場合、感染鳥類細胞系は、より好ましくは、図８Ａおよび図１０Ａに示されているように１〜４日間培養される。別の例として、製造されるウイルスがＶＶ−ＣＯＰまたはＭＶＡである場合、感染鳥類細胞系は、より好ましくは、図１１（Ａ〜Ｂ）に示されているように１〜４日間培養される。
【００７７】
本発明によると、工程ａ）の感染前に、鳥類細胞系の感染に（工程ａ）で）使用された細胞培地、および感染鳥類細胞系の培養に（工程ｂ）で）使用された細胞培地と同じであってもよくまたは異なっていてもよい適切な細胞培地中で、本発明の細胞系を培養する工程を実施してもよい。鳥類細胞系は、実施例３および４に記載のように、感染前に好ましくは１〜３日間、より好ましくは１日間、３０〜３７℃を含む温度で、より好ましくは３７℃で培養される。
【００７８】
本発明によると、工程ｂ）の感染細胞系の培養の後で、溶液中に存在する核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を分解するために、１つまたは複数のヌクレアーゼ（つまり、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）の存在下でインキュベーションする工程を実施してもよい。本発明により好ましく使用されるヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。本発明により使用することができるエンドヌクレアーゼは、それらの基質に基づいて以下のように分類することができる：ＤＮＡを分解するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、およびＤＮＡおよびＲＮＡを分解するエンドヌクレアーゼ。エンドヌクレアーゼＤＮａｓｅｓには、これらに限定されないが、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  ＩｌおよびエンドデオキシリボヌクレアーゼＩＶが含まれる。エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅには、これらに限定されないが、ＲＮａｓｅ  Ｉ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮＡｓｅ  Ｅ、ＲＮＡｓｅ  Ｆ、およびＲＮＡｓｅ  Ｐが含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡを分解するエンドヌクレアーゼには、これらに限定されないが、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）が含まれる。本発明により好ましく使用されるエンドヌクレアーゼは、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）である。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することにより核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を分解する。完全に消化されると、溶液中に存在する遊離核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）は全て、長さが３〜８個の塩基である５’末端が一リン酸のオリゴヌクレオチドに低減される。Ｂｅｎｚｏｎａｚｅ（登録商標）は、タンパク質分解活性を有しない。本発明により使用されるＢｅｎｚｏｎａｚｅ（登録商標）は、好ましくは薬学的に許容される。薬学的に許容されるＢｅｎｚｏｎａｚｅ（登録商標）は、市販されている（例えば、参照番号ＭＥ−０２８０−１０のＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製；例えば、参照番号１．０１６５３．０００１のＭｅｒｃｋ社製）。本発明によると、使用されるヌクレアーゼ（複数可）の濃度は、５〜１００Ｕ／ｍｌの範囲、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌの範囲、より好ましくは１０Ｕ／ｍｌである。
【００７９】
その後、製造されたウイルスは、上清および／または細胞から回収される。製造されたウイルスを細胞から（つまり、細胞のみから、または細胞からおよび上清から）回収する場合、製造されたウイルスを回収する工程の前に、細胞膜の破壊を可能にする工程を実施してもよい。この工程は、細胞からウイルスを遊離させることに結び付く。細胞膜の破壊は、当業者に周知の種々の技術により引き起こすことができる。それら技術には、これらに限定されないが、凍結／融解、低浸透圧性溶解、超音波処理（ソニケーターの使用による）、および高速剪断流動処理（microfluidization）（高速剪断流動処理装置（microfluidizer）の使用による）が含まれる。ソニケーターは、例えば、Ｈｅｒａｅｕｓ  ＰＳＰ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、Ｍｉｓｏｎｉｘ社、またはＧｌｅｎＭｉｌｌｓ社から市販されている。本発明により使用される好ましいソニケーターは、ＳＯＮＩＴＵＢＥ  ２０ｋＨｚ  ＳＭ２０−１２０−３型、およびＳＯＮＩＴＵＢＥ  ３５ｋＨｚ  ＳＭ３５−４００−３型（Ｈｅｒａｅｕｓ  ＰＳＰ社製）である。高速剪断流動処理装置は、例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から市販されている。鳥類細胞膜は、ＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ社製フレンチプレスを使用することにより破壊することもできる。細胞膜は、高速ホモジナイザーを使用することにより破壊することもできる。高速ホモジナイザーは、例えば、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ社またはＩｋａ−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ社から市販されている。
【００８０】
本発明の特別の態様によれば、回収されたウイルスは、その後精製される。製造されたウイルスの精製は、例えば、以下の工程の１つまたは複数を含んでいてもよい：
・好適な条件下で細胞残屑の除去を可能にする清澄化工程。前記清澄化は、例えば、深層ろ過により実施することができる。深層ろ過には、これらに限定されないが、以下のもの等の１つまたは複数の市販製品の使用が含まれる：Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｐｕｒｅ（登録商標）フィルター（例えば、Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ（登録商標）ＰＰ２）、ＣＵＮＯ社製Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ＡＰシリーズ深層フィルター（例えば、ＡＰ０１）、ＣＵＮＯ社製Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ＣＰシリーズ深層フィルター（例えば、ＣＰ１０、ＣＰ３０、ＣＰ５０、ＣＰ６０、ＣＰ７０、ＣＰ９０）、ＣＵＮＯ社製Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ＨＰシリーズ深層フィルター（例えば、ＨＰ１０、ＨＰ３０、ＨＰ５０、ＨＰ６０、ＨＰ７０、ＨＰ９０）、ＣＵＮＯ社製Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃａｌｉｆ．シリーズ深層フィルター（例えば、ＣＡ１０、ＣＡ３０、ＣＡ５０、ＣＡ６０、ＣＡ７０、ＣＡ９０）、ＣＵＮＯ社製Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ＳＰシリーズ深層フィルター（例えば、ＳＰ１０、ＳＰ３０、ＳＰ５０、ＳＰ６０、ＳＰ７０、ＳＰ９０）、ＣＵＮＯ社製ＤｅｌｉｐｉｄおよびＤｅｌｉｐｉｄ  Ｐｌｕｓフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製ＣＥシリーズ深層フィルター（例えば、ＣＥ１５、ＣＥ２０、ＣＥ２５、ＣＥ３０、ＣＥ３５、ＣＥ４０、ＣＥ４５、ＣＥ５０、ＣＥ７０、ＣＥ７５）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製ＤＥシリーズ深層フィルター（例えば、ＤＥ２５、ＤＥ３０、ＤＥ３５、ＤＥ４０、ＤＥ４５、ＤＥ５０、ＤＥ５５、ＤＥ５６０、ＤＥ６５、ＤＥ７０、ＤＥ７５）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製ＨＣフィルター（例えば、Ａ１ＨＣ、Ｂ１ＨＣ、ＣＯＨＣ）、ＣＵＮＯ社製ＰｏｌｙＮｅｔ（商標）フィルター（例えば、ＰｏｌｙＮｅｔ（商標）ＰＢ  Ｐ０５０、Ｐ１００、Ｐ２００、Ｐ３００、Ｐ４００、Ｐ５００、Ｐ７００）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製ＣｌａｒｉｇａｒｄおよびＰｏｌｙｇａｒｄフィルター、ＣＵＮＯ社製Ｌｉｆｅ  Ａｓｓｕｒｅ  フィルター、ＭａｎＣｅｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製深層フィルター（例えば、ＰＲ１２ＵＰ、ＰＲ１２、ＰＲ５ＵＰ）、およびＰＡＬＬ社製またはＳｅｉｔｚＳｃｈｅｎｋ社製Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄフィルター。入手可能な深層ろ過ユニットの清澄化能力を向上させるためには、細孔径が減少する２つ以上のユニットを結合させることが有用である場合がある。この実施形態では、混合物は、第１の深層ろ過ユニットを通過して清澄化され、そこに最も大きな夾雑物が残留し、その後第２の深層ろ過ユニットに通される。この点で、清澄化は、好ましくは深層ろ過により、より好ましくは、５μｍの細孔径を有するフィルターに結合された８μｍの細孔径を有するフィルターで実施される。本発明により使用される８μｍおよび５μｍの細孔径を有する好ましいフィルターは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社から市販されているＳａｒｔｏｐｕｒｅ（登録商標）フィルター（Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ（登録商標）ＰＰ２）である。深層ろ過は、好ましくは１Ｌ／分の流速で実施される。
・例えば、精密ろ過または限外ろ過により実施することができる濃縮工程。精密ろ過は、大型分子を濃縮および精製する圧力駆動膜プロセスである。より具体的には、溶液は、ウイルスが残留画分に残留し、小型分子（例えば、タンパク質）がフィルターを通過して透過画分に達することを可能にするように、その細孔径が選択されたフィルターに通される。精密ろ過は、抽出溶液の容積を低減する。本発明により使用されるフィルターは、好ましくは、例えばＰｒｏｓｔａｋ精密ろ過モジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）等の、オートクレーブ可能な市販のフィルターである。
・精密ろ過（上記に記載のような）を向上させ、ウイルスを含む前記画分を溶液で希釈して、前記画分中の不純物濃度の低減を達成すること伴うダイアフィルトレーション工程。ウイルスを含む画分を希釈することにより、前記画分に由来する不純物をより多く洗い流すことが可能になる。ダイアフィルトレーションは、バッチ法、半連続法、または連続法で実施することできることが理解される。有利には、ダイアフィルトレーションを使用して、ウイルスが含まれる緩衝液を変更することができる。例えば、精製プロセスで使用される緩衝液を、薬学的に許容される緩衝液に交換することが有用である場合がある。本発明によりダイアフィルトレーションに使用されるフィルターは、ウイルスが残留画分に残留し、小型分子（例えば、タンパク質）がフィルターを通過して透過画分に達することを可能にする。そのようなフィルターは、好ましくは、例えばＰｒｏｓｔａｋ精密ろ過モジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）等の、オートクレーブ可能な市販のフィルターである。
・陽イオンまたは陰イオン交換吸着剤、好ましくは陰イオン交換吸着剤を使用するクロマトグラフィー工程。陰イオン交換吸着剤の官能基は、例えば、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、−Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｎ＋−（ＣＨ３）３基（Ｑ基とも称される；Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（登録商標）レジン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製を参照）、または例えば７．０〜９．０のｐＨ範囲で形式陽電荷を既に有しているかもしくは有することになるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等の他の基等の、一級、二級、三級、または四級アミノ基であってもよい。陰イオン交換吸着剤は、これらに限定されないが、例えば、ビーズ形態のマトリックスまたは膜で構成されていてもよい。陰イオン交換吸着剤がビーズ形態のマトリックスで構成されている場合、マトリックスは、例えば、アガロース、親水性ポリマー、セルロース、デキストラン、またはシリカであってもよい。鎖（例えば、デキストラン鎖）は、マトリックスに結合されている。上記に記載のような官能基は、化学的に安定した結合（例えば、エーテル結合）で鎖に結合されている。本発明により使用されるビーズ形態のマトリックスで構成される陰イオン交換吸着剤は、例えば、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（登録商標）Ｑ（ＢｉｏＲａｄ社製）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（登録商標）Ｓ（ＢｉｏＲａｄ社製）、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、またはＢｉｏＳｅｐｒａ（登録商標）Ｑ  ｈｙｐｅｒＺ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）等、好ましくはオートクレーブ可能である。陰イオン交換吸着剤が膜で構成されている場合、使用される膜は、ウイルスのサイズより小さな細孔径を有する。
【００８１】
製造された野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性ウイルスは、外側ビリオンコートは無傷のままであるが複製機能が破壊されるように、更に不活化することができる。前記「全死滅ウイルス」の調製は、加熱または化学薬品により実施することができる。使用される化学薬品には、ホルムアルデヒドまたはベータ−プロビオラクトン、およびホルマリンが含まれる（CHERTOVA E. et al., AIDS Vaccine (2001)）。
【００８２】
１つの特別な態様によれば、本発明は、以下の工程を含む、タンパク質を製造するための方法に関する：
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系を、少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換えベクターと接触させる工程、および
ｂ）タンパク質の製造を可能にする条件下で鳥類細胞系を培養する工程。
【００８３】
別の特別な態様によれば、本発明は、以下の工程を含む、タンパク質を製造するための方法に関する：
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系を、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターと接触させる工程、および
ｂ）タンパク質の製造を可能にする条件下で鳥類細胞系を培養する工程。
【００８４】
本発明によると、組換えベクターは、プラスミドまたはウイルス由来であってもよく、それが適切な場合は、形質移入効率および／またはベクターの安定性を向上させる１つまたは複数の物質と混合されてもよい。これら物質は、当業者が入手可能な文献に広く記載されている（例えば、FEIGNER et al., Proc. West. Pharmacol. Soc. 32,115-121 (1987)；HODGSON and SOLAIMAN, Nature Biotechnology 14, 339-342 (1996)；REMY et al., Bioconjugate Chemistry, 5, 647-654 (1994)を参照）。本発明によると、組換えベクターは、発現ベクターである。一般的に、それらは当業者に公知であり、それらの多くは市販されており、遺伝子操作の技術を使用して、それらを構築または修飾することも可能である。
【００８５】
本発明の好ましい態様によれば、組換えベクターは、プラスミドである。好ましくは、本発明の状況で使用されるプラスミドは、複製開始点を含有している。プラスミドは、形質移入された細胞の選択または識別を可能にする選択遺伝子を更に含むことができる（栄養素要求性突然変異、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子の補完）。プラスミドは、本発明の不死化鳥類細胞系中でのその維持および／またはその安定性を向上させる更なるエレメントを含有することができる。プラスミドの例は、実施例５、６、および７に記載されている。
【００８６】
本発明の好ましい態様によれば、製造されるタンパク質は、サイトカイン、より詳しくはインターロイキン、更により詳しくはＩＬ−２である。ＩＬ−２を製造するための好ましい方法は、実施例５に記載されている。
【００８７】
本発明の別の好ましい態様によれば、製造されるタンパク質は、抗体、より詳しくはリツキシマブである。リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）またはＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））は、キメラマウス／ヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。リツキシマブを製造するための好ましい方法は、実施例６に記載されている。
【００８８】
本発明の別の好ましい態様によれば、製造されるタンパク質は、ホルモン、より詳しくはエリトロポイエチン（ＥＰＯ）である。ＥＰＯを製造するための好ましい方法は、実施例７に記載されている。
【００８９】
本発明の好ましい態様によれば、タンパク質およびウイルスを製造するための方法は、動物産物（本発明の鳥類細胞系を除く）を含んでおらず、ワクチンの無菌性に関する規制要件の完全な遵守を保証する無菌工業規模製造プロセスに好適である。本出願の全体にわたって使用されているように、「動物産物」は、生物の動物細胞中でまたは動物細胞により製造される任意の化合物または一群の化合物を指す。
【００９０】
本発明は、上記に記載の方法により得られる、精製された野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性ウイルスにも関する。
【００９１】
本発明は、上記に記載の方法により得られる、精製された全死滅ウイルスに関する。
【００９２】
本発明は、上記に記載の方法により得られる、精製されたタンパク質に関する。
【００９３】
本発明は、医薬組成物、より詳しくは、上記に記載の方法により得られる、精製された野生型、弱毒化、組換え、温度感受性、および／または全死滅ウイルスを含むワクチンにも関する。
【００９４】
本発明は、上記に記載の方法により得られる精製されたタンパク質を含む医薬組成物にも関する。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体を含む組成物を指す。前記薬学的に許容される担体は、好ましくは、等張性、低張性、または弱高張性であり、例えばスクロース溶液等、比較的低いイオン強度を有する。更に、そのような担体は、任意の溶媒、または非発熱性滅菌水等の水性または部分的に水性の液体を含有してもよい。加えて、医薬組成物のｐＨは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用要件を満たすように調整および緩衝化されている。また、医薬組成物には、薬学的に許容される希釈液、アジュバント、または賦形剤、ならびに可溶化剤、安定化剤、および保存剤が含まれていてもよい。注射可能な投与の場合、水性、非水性、または等張性溶液中の製剤が好ましい。製剤は、使用時に適切な希釈液で再構成することができる液体または乾燥形態（粉末および凍結乾燥物等）で単用量または複数用量で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（継代３９）の光学顕微鏡画像を示す図である。
【図２】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２の増殖曲線（継代７〜継代７５）を示す図である。
【図３】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２の集団倍加時間推移（継代７〜継代７５）を示す図である。
【図４】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（継代４５）の光学顕微鏡画像を示す図である。
【図５】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１の増殖曲線（継代１５〜継代５１）を示す図である。
【図６】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１の集団倍加時間推移（継代１６〜継代５１）を示す図である。
【図７Ａ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（図７Ａ）およびベロ細胞系（図７Ｂ）のフラビウイルス科製造特性（黄熱病ウイルス１７Ｄ（ＭｏＩ  ０．００１））を示す図である。
【図７Ｂ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（図７Ａ）およびベロ細胞系（図７Ｂ）のフラビウイルス科製造特性（黄熱病ウイルス１７Ｄ（ＭｏＩ  ０．００１））を示す図である。
【図８Ａ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（図８Ａ）およびベロ細胞系（図８Ｂ）のフラビウイルス科製造特性（日本脳炎ウイルスＮａｋａｙａｍａ野生株（ＭｏＩ  ０．００１））を示す図である。
【図８Ｂ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（図８Ａ）およびベロ細胞系（図８Ｂ）のフラビウイルス科製造特性（日本脳炎ウイルスＮａｋａｙａｍａ野生株（ＭｏＩ  ０．００１））を示す図である。
【図９Ａ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図９Ａ）およびベロ細胞系（図９Ｂ）のフラビウイルス科製造特性（黄熱病ウイルス１７Ｄ（ＭｏＩ  ０．００１））を示す図である。
【図９Ｂ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図９Ａ）およびベロ細胞系（図９Ｂ）のフラビウイルス科製造特性（黄熱病ウイルス１７Ｄ（ＭｏＩ  ０．００１））を示す図である。
【図１０Ａ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図１０Ａ）およびベロ細胞系（図１０Ｂ）のフラビウイルス科製造特性（日本脳炎ウイルスＮａｋａｙａｍａ野生株（ＭｏＩ  ０．００１））を示す図である。
【図１０Ｂ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図１０Ａ）およびベロ細胞系（図１０Ｂ）のフラビウイルス科製造特性（日本脳炎ウイルスＮａｋａｙａｍａ野生株（ＭｏＩ  ０．００１））を示す図である。
【図１１Ａ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１のポックスウイルス科製造特性（ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）（図１１Ｂ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（図１１Ａ））を示す図である。
【図１１Ｂ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１のポックスウイルス科製造特性（ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）（図１１Ｂ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（図１１Ａ））を示す図である。
【図１２Ａ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図１２Ｃ）およびＣＨＯ  Ｋ１細胞系（図１２Ａ）およびＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系（図１２Ｂ）からのリツキシマブ製造を示す図である。
【図１２Ｂ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図１２Ｃ）およびＣＨＯ  Ｋ１細胞系（図１２Ａ）およびＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系（図１２Ｂ）からのリツキシマブ製造を示す図である。
【図１２Ｃ】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図１２Ｃ）およびＣＨＯ  Ｋ１細胞系（図１２Ａ）およびＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系（図１２Ｂ）からのリツキシマブ製造を示す図である。
【図１３】ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（Ｔ３）およびＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（Ｔ６）からのエリトロポイエチン（ＥＰＯ）製造を示す図である。
【００９７】
本発明を例示するために、以下の例を提供する。これら例は、いかなる点でも本発明の範囲を制限するとは意図されていない。
【実施例】
【００９８】
実施例１：不死化ノバリケン細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２
ノバリケン細胞ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（継代３９）は、均質な線維芽細胞様形態を示す（図１）。静的単層は、１００％コンフルエンスまで安定しており、接触阻止の影響下にある。細胞を検査し、マイコプラズマ汚染は陰性であり、同様に微生物汚染も陰性だった。細胞系増殖曲線（継代７〜継代７５）（図２）は、継代１９から継代７５まで連続的な指数増殖期を示す。集団倍加時間（ＰＤＴ）の推移に注目すると、漸進的な安定化および減少が観察され、特にＰＤＴが、最後の１０継代中は４８時間の目盛より低く安定していることに留意することができる（図３）。対応する集団倍加数（集団倍加レベル、ＰＤＬ）を、２つの指数増殖期を累積することにより計算し、７５継代中、細胞は少なくとも１４７回の集団倍加（ＰＤ）を起こした。初代細胞が老化状態に入る前に起こすことができる集団倍加数は、組織および種に依存する上限は５０〜６０ＰＤであることが一般的に認められている。従って、ノバリケン細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２は、ヘイフリック限界をはるかに超えており、従って不死化細胞系とみなされる。
【００９９】
Ｎ．Ｂ．:
・集団倍加レベル（ＰＤＬ）は、細胞世代（生物量２倍増）の回数を指す。ＰＤＬ計算：ＰＤＬ＝Ｌｎ（最終／初期細胞数）／Ｌｎ（２）；
・集団倍加時間（ＰＤＴ）は、世代時間とも呼ばれ、１回の集団倍加に必要な時間である。ＰＤＴ計算：ＰＤＴ＝Δｔ＊Ｌｎ（２）／Ｌｎ（最終／初期細胞数）。
【０１００】
実施例２：不死化ノバリケン細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１
ノバリケン細胞ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（継代４５）は、均質な線維芽細胞様形態を示す（図４）。静的単層は、１００％コンフルエンスまで安定しており、接触阻止の影響下にある。細胞を検査し、マイコプラズマ汚染び陰性であり、同様に微生物汚染にも陰性だった。細胞系増殖曲線（継代１５〜継代５１）（図５）は、継代１９から連続的な指数増殖期を示す。この期間中、測定された集団倍加時間（ＰＤＴ）は、次第に減少した。平均ＰＤＴは、９４時間（継代２０〜３５）から５２時間（継代３６〜５１）へと推移した（図６）。５１継代に対応する計算集団倍加数（ＰＤＬ）は、少なくとも７１回の集団倍加である。従って、ノバリケン細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１は、ヘイフリック限界をはるかに超えており、従って不死化細胞系とみなされる。
【０１０１】
Ｎ．Ｂ．:
・集団倍加レベル（ＰＤＬ）は、細胞世代（生物量２倍増）の回数を指す。ＰＤＬ計算：ＰＤＬ＝Ｌｎ（最終／初期細胞数）／Ｌｎ（２）；
・集団倍加時間（ＰＤＴ）は、世代時間とも呼ばれ、１回の集団倍加に必要な時間である。ＰＤＴ計算：ＰＤＴ＝Δｔ＊Ｌｎ（２）／Ｌｎ（最終／初期細胞数）。
【０１０２】
実施例３：フラビウイルス科の製造
３．１  黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）の製造
ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１のＹＦＶ増幅能力を評価し、フラビウイルス科増殖の基準であるベロ細胞系と比較した。ノバリケン細胞系を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および４ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補完された基本培地イーグル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で増殖させ、ベロ細胞系を、５％ＦＣＳで補完されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で増殖させる。感染は、同じ培地中で実施した。黄熱１７Ｄワクチン株（ＹＦＶ  １７Ｄ）（Ｓｔａｍａｒｉｌ（商標）、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ社製）を、この実験で評価した。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１ならびにベロを、それぞれ４．１０５、２．１０５、および６．１０５細胞で６穴プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の多湿雰囲気で２４時間培養した。その後、培地を除去し、培地で希釈された２５０μＬのＹＦＶ  １７Ｄウイルスを細胞にＭＯＩ  ０．０００１で感染させた。１時間の吸収工程後、残存ウイルス懸濁液を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２ｍＬの培地を各ウエルに添加した。ウイルスを、３７℃、５％ＣＯ２で感染の２４、４８、および７２時間後に上清から回収し、滴定のために清澄化した。感染細胞層をトリプシンで分離し、洗浄し、スライド上で固定した。感染細胞の割合を決定するために、間接免疫蛍光分析をスライド上で実施した。
【０１０３】
滴定は、対数的ウイルス希釈物で感染させたベロ細胞に対する免疫組織化学的アッセイにより実施した。感染の５日後、細胞を固定し、特異的ポリクローナルＩＡ（免疫腹水）と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体で検出した。ＤＡＢ基質を使用して比色定量反応を得た。感染の染色フォーカスを観察および計数し、ウイルス力価を、１ｍｌ当たりのフォーカス形成単位（ＦＦＵ）として計算した。
【０１０４】
結果：図７（Ａ〜Ｂ）に示されているように、わずか２４時間後にノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（図７Ａ）を用いてＹＦＶ  １７Ｄについて得られたウイルス性力価は、ベロ細胞系（図７Ｂ）で得られたウイルス力価より、３ｌｏｇを超えて高い。図９（Ａ〜Ｂ）に示されているように、わずか２４時間および４８時間後にノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図９Ａ）を用いてＹＦＶ  １７Ｄについて得られたウイルス性力価は、ベロ細胞系（図９Ｂ）で得られたウイルス力価より４ｌｏｇ高い。
【０１０５】
３．２  日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）の製造
ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１のＪＥＶ増幅能力を評価し、フラビウイルス科増殖の基準であるベロ細胞系と比較した。ノバリケン細胞系を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および４ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補完された基本培地イーグル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で増殖させ、ベロ細胞系を、５％ＦＣＳで補完されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で増殖させる。感染は、同じ培地中で実施した。日本脳炎Ｎａｋａｙａｍａ野生株（フランス国立科学研究センター（ＣＮＲＳ）のコレクション）を、この実験で評価した。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１ならびにベロを、それぞれ４．１０５、２．１０５、および６．１０５細胞で６穴プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の多湿雰囲気で２４時間培養した。その後、培地を除去し、培地で希釈された２５０μＬのＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株に細胞をＭＯＩ  ０．０００１で感染させた。１時間の吸収工程後、残存ウイルス懸濁液を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２ｍＬの培地を各ウエルに添加した。ウイルスを、３７℃、５％ＣＯ２で感染の２４、４８、および７２時間後に上清から回収し、滴定のために清澄化した。感染細胞層をトリプシンで分離し、洗浄し、スライド上で固定した。感染細胞の割合を決定するために、間接免疫蛍光分析をスライド上で実施した。
【０１０６】
滴定は、対数的ウイルス希釈物で感染させたベロ細胞に対する免疫組織化学的アッセイにより実施した。感染の５日後、細胞を固定し、特異的ポリクローナルＩＡ（免疫腹水）と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体で検出した。ＤＡＢ基質を使用して比色定量反応を得た。感染の染色フォーカスを観察および計数し、ウイルス力価を、１ｍｌ当たりのフォーカス形成単位（ＦＦＵ）として計算した。
【０１０７】
結果：図８（Ａ〜Ｂ）に示されているように、９６時間後にノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２（図８Ａ）を用いてＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株について得られたウイルス性力価は、ベロ細胞系（図８Ｂ）で得られたウイルス力価より３ｌｏｇを超えて高い。図１０（Ａ〜Ｂ）に示されているように、７２時間および９６時間後にノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図１０Ａ）を用いてＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株について得られたウイルス性力価は、ベロ細胞系（図１０Ｂ）で得られたウイルス力価より、それぞれ１ｌｏｇおよび４ｌｏｇ高い。
【０１０８】
実施例４：ポックスウイルス科の製造
４．１  修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の製造
ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１のＭＶＡ増幅能力を評価し、ＭＶＡ製造の基材として通常使用される初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）と比較した。ウイルス増殖を促進するために、ｅＧＦＰを発現するＭＶＡ（フランス国立微生物収集機関（ＣＮＣＭ）にＮ６０２  Ｉ−７２１で寄託）を選択し、経過を観察し、滴定した。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１ならびにＣＥＦを、２．１０６細胞で２５ｃｍ２のＴフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の多湿雰囲気で２４時間培養した。その後、培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および４ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補完された基本培地イーグル（ＢＭＥ））を除去し、細胞を、ＰＢＳ  １％陽イオン、１％ＦＣＳで希釈された５００μＬのＭＶＡウイルスにＭＯＩ  ０．０５で感染させた。３０分の吸着工程後、残存ウイルス懸濁液を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後５ｍＬのＢＭＥ  １０％ＦＣＳを各フラスコに添加した。３７℃、５％ＣＯ２で感染の０、２４、４８、７２、および９６時間後に、凍結融解工程により細胞および上清からウイルスを回収した。凝集体を回避するために、回収されたウイルス懸濁液を滴定前に超音波処理した。
【０１０９】
滴定は、６ｃｍの培養皿に播種されたＣＥＦに対して三重反復で実施し、対数的ウイルス希釈物で感染させ、寒天で表面を覆った。ｅＧＦＰを発現するＭＶＡのプラーク形成単位は、蛍光双眼顕微鏡で視覚化し、７２時間後に計数した。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２は、ＭＶＡを増幅しなかった。
【０１１０】
結果：図１１Ａに示されているように、ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１は、古典的ＣＥＦ基材で得られたものと同等のＭＶＡ増幅を可能にする。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１およびＣＥＦは両方とも、感染の４８時間後に最も高いウイルス力価に達した。それと一致して、明らかな細胞変性効果が、両細胞で観察された（データ非表示）。
【０１１１】
４．２  ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）の製造
ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１のＶＶ−ＣＯＰ増幅能力を評価し、ＶＶ−ＣＯＰ製造の基材として通常使用される初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）と比較した。欠陥Ｊ２Ｒ遺伝子（WEIR and MOSS 1983を参照；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ４８０８２）を含むＶＶ−ＣＯＰ株（GOEBEL et al. 1990；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７．１）を、この実験に使用した。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１ならびにＣＥＦを、１４．１０６細胞で１７５ｃｍ２のＴフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の多湿雰囲気で２４時間培養した。その後、培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および４ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補完された基本培地イーグル（ＢＭＥ））を除去し、細胞を、ＰＢＳ  １％陽イオン、１％ＦＣＳで希釈された５ｍＬのＶＶ−ＣＯＰウイルスにＭＯＩ  ０．０００１で感染させた。３０分間の吸着工程後、３５ｍＬのＢＭＥ  １０％ＦＣＳを各フラスコに添加した。３７℃、５％ＣＯ２で感染の２４、４８、７２、および９６時間後に、凍結融解工程により細胞および上清からウイルスを回収した。凝集体を回避するために、回収されたウイルス懸濁液を滴定前に超音波処理した。
【０１１２】
滴定は、６穴プレートに接種されたＢＨＫ２１細胞に対して三重反復で実施した。対数的ウイルス希釈物で細胞を感染させ、１時間のウイルス吸収後に液体培地を添加した。２４時間後に培地を除去し、クリスタルバイオレットおよびレッドナチュラル（red neutral）の混合物で細胞の表面を覆った。細胞を後染した色、ウイルスのプラーク形成単位を双眼顕微鏡で視覚化し、計数した。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２は、ＶＶ−ＣＯＰを増幅しなかった。
【０１１３】
結果：図１１Ｂに示されているように、ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１は、古典的ＣＥＦ基材で得られた増幅と比較してあまり効率的でないとしても、ＶＶ−ＣＯＰ増幅を可能である。
【０１１４】
実施例５：ＩＬ−２の製造
ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１に由来する上清を、ＩＬ−２（ＣＭＶプロモーター）発現プラスミド（ｐＴＧ８３６３：ｐＣｉＮｅｏプラスミドにクローニングされたヒトＩＬ２、ＣＭＶプロモーター）で一過性に形質移入した。２４、４８、７２、および９６時間後に上清を収集した。ＩＬ−２は、ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で定位量化し、機能性はＣＴＬＬアッセイで決定した。
【０１１５】
結果：細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１は両方とも、機能的なＩＬ−２を製造した。量的には両細胞系とも同様だった。更に、製造レベルは、使用した形質移入の方法とは無関係であり、４８６５ＩＵ／ｍＬ（ＣＴＬＬ）および２３．１ＩＵ／ｎｇの比活性に相当する２１１ｎｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡ）〜５６７２ＩＵ／ｍＬ（ＣＴＬＬ）および１８．４ＩＵ／ｎｇの比活性に相当する３０８ｎｇ／ｍＬの範囲であった。従って、この細胞系で製造されたＩＬ−２の測定比活性は、少なくとも、ＩＬ−２のＷＨＯ国際基準である１３．１６ＩＵ／ｎｇ（ヒト、ジャーカット由来）と同等である。
【０１１６】
実施例６：リツキサンの製造
重鎖および軽鎖をＧｅｎｅＡｒｔで合成し、ｐＣＩ−Ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に基づいて、対応する発現プラスミドを構築した。一過性の遺伝子発現は、特定の「低ＩｇＧ  ＦＣＳ」で実施した。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１を、古典的ＦＣＳと対比して１０％低ＩｇＧ  ＦＣＳで５日間増殖した。細胞増殖に対する負の効果は観察されなかった。細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１に由来する上清を収集し、モノクローナル抗体の量を、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（全ヒトＩｇＧ、Ｂｅｔｈｙｌ社製）を使用して評価した。
【０１１７】
結果：一過性の非最適化条件下で、最大０．５μｇ／ｍｌが、細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２で製造され、最大２．５μｇ／ｍｌが、細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１で製造された。ＣＨＯ標準細胞系（ＣＨＯ  Ｋ１（図１２Ａ）およびＣＨＯ  ＤＧ４４（図１２Ｂ）、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯクローン）、または細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１（図１２Ｃ）のいずれかで一過性に製造されたリツキサンを、対応するグリコシル化パターンを分析および比較するために精製した。質量分析（図１２（Ａ〜Ｃ））は、ＣＨＯで発現されたリツキサンと、細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０１で発現されたリツキサンとの間で、フコシル化に違いがないことを示す。
【０１１８】
実施例７：エリトロポイエチン（ＥＰＯ）の製造
発現一過性アッセイを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得られた市販のプラスミド（ＧｅｎｅＳｔｏｒｍ（登録商標）ヒトクローン、参照番号ＨＫ１０００  ＲＧ００１７２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して実施し、このプラスミドでは、ヒトＥＰＯはｐＣＭＶプロモーターの制御下にあった。
３つの形質移入試薬：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、およびＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）、ならびにエレクトロポレーション装置（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、基本線維芽細胞キット、Ａｍａｘａ社製）を、製造業者の説明書に従って評価した。ノバリケン不死化鳥類細胞系ＥＣＡＣＣ０８０６０５０２および０８０６０５０１に由来する上清を、４８、７２、および９６時間後に収集し、ＥＬＩＳＡによりヒトＥＰＯを定量化した。
【０１１９】
結果：両細胞系では、最大発現レベルは、Ｆｕｇｅｎｅ６形質移入試薬を使用し、その後Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを使用して、９６時間後に得られた（図１３）。一過性の非最適化条件下で、最大０．５μｇ／ｍｌが製造された。
【０１２０】
上記の明細書に引用された文書（例えば、特許、特許出願、出版物）は全て、引用することにより本明細書の一部とされる。当業者であれば、本発明の範囲および趣旨から逸脱しない、本発明の種々の改変および変異は、明白であろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記述されているが、特許請求された発明は、そのような特定の実施形態に不当に制限されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者にとって明白である、本発明を実施するために記載した様式の種々の改変は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月11日(2012.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを製造する方法であって、
（ａ）不死化鳥類細胞系を準備し、
（ｂ）前記不死化鳥類細胞系を、製造しようとするウイルスに感染させ、
（ｃ）前記感染鳥類細胞系を、ウイルス増幅を可能にする条件下で培養すること
を含み、
前記不死化鳥類細胞系が、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系、ＥＣＡＣＣに受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
少なくとも１つのフラビウイルス科株を増幅することでき、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を増幅することができない、不死化鳥類細胞系。
【請求項３】
欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された、請求項２に記載の不死化鳥類細胞系およびその誘導体。
【請求項４】
前記フラビウイルス科が、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択される、請求項２に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項５】
（ｉ）少なくとも１つのフラビウイルス科株、および（ｉｉ）少なくとも１つのポックスウイルス科株を増幅することができる、不死化鳥類細胞系。
【請求項６】
欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託されてなる、請求項５に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項７】
（ｉ）前記フラビウイルス科株が、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶＮａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択され、（ｉｉ）前記ポックスウイルス科株が、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）からなる群から選択される、請求項５に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項８】
前記不死化鳥類細胞系が、付着細胞系である、請求項２または５に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項９】
前記不死化鳥類細胞系が、懸濁状態で、（マイクロ）キャリアの存在下または非存在下で増殖する非付着細胞系である、請求項２または５に記載の不死化鳥類細胞系。
【請求項１０】
ウイルスおよびタンパク質を製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系またはその誘導体。
【請求項１１】
ウイルスおよびタンパク質を製造するための、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系またはその誘導体。
【請求項１２】
前記ウイルスが、フラビウイルス科、ポックスウイルス科、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、コロナウイルス、アルファウイルス、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の不死化鳥類細胞系、またはその誘導体。
【請求項１３】
前記ウイルスが、野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性ウイルスである、請求項１２に記載の不死化鳥類細胞系またはその誘導体。
【請求項１４】
前記ウイルスが、好ましくは、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択されるフラビウイルス科である、請求項１０または１１に記載の不死化鳥類細胞系またはその誘導体。
【請求項１５】
前記ウイルスが、好ましくは、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）からなる群から選択されるポックスウイルス科である、請求項１１に記載の不死化鳥類細胞系またはその誘導体。
【請求項１６】
前記タンパク質が、抗体、受容体リガンド、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、血液凝固因子、酵素、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群、より詳しくはサイトカイン、抗体、およびホルモンからなる群、更により詳しくはＩＬ−２、リツキシマブ、およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の不死化鳥類細胞系またはその誘導体。
【請求項１７】
ウイルスを製造する方法であって、
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系を、ウイルスに感染させ、かつ／または
（ｂ）ウイルス増幅を可能にする条件下で、前記感染鳥類細胞系を培養することを含む、方法。
【請求項１８】
ウイルスを製造するための方法であって、
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系を、ウイルスに感染させ、および／または
（ｂ）ウイルス増幅を可能にする条件下で、前記感染鳥類細胞系を培養すること
を含む、方法。
【請求項１９】
前記ウイルスが、野生型、弱毒化、組換え、および／または温度感受性ウイルスである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスが、好ましくは、黄熱病ウイルス株（ＹＦＶ）および日本脳炎ウイルス株（ＪＥＶ）からなる群、より詳しくはＹＦＶ  １７Ｄ株およびＪＥＶ  Ｎａｋａｙａｍａ野生株からなる群から選択されるフラビウイルス科である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが、好ましくは、ワクシニアウイルス株Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＶＶ−ＣＯＰ）および修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）からなる群から選択されるポックスウイルス科である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質を製造する方法であって、
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２で寄託された不死化鳥類細胞系を、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターと接触させ、かつ／または
ｂ）前記タンパク質の製造を可能にする条件下で、前記トリ細胞系を培養すること
を含む、方法。
【請求項２３】
タンパク質を製造する方法であって、
ａ）欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０１で寄託された不死化鳥類細胞系を、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターと接触させ、かつ／または
ｂ）前記タンパク質の製造を可能にする条件下で、前記トリ細胞系を培養すること
を含む、方法。
【請求項２４】
前記タンパク質が、抗体、受容体リガンド、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、血液凝固因子、酵素、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群、より詳しくはサイトカイン、抗体、およびホルモンからなる群、更により詳しくはＩＬ−２、リツキシマブ、およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【国際調査報告】
2012526532.tif 000022
2012526532.tif 000023
2012526532.tif 000024