(57)【要約】本発明は、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーを使用してオリゴヌクレオチドを検出するための方法に関する。前記オリゴヌクレオチドに相補的な蛍光標識されたペプチド核酸オリゴマーを、前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる。次いで、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーを行ない、そしてハイブリダイゼーションしている部分を検出および定量する。本発明はまた、１つの試料から並行してオリゴヌクレオチドの両鎖を同時に検出するための方法、並びにオリゴヌクレオチドの１本または２本の鎖の定性的および定量的な検出において使用するためのキットにも関する。
2012505644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）オリゴヌクレオチドを含むかまたは含むことが疑われる試料を選択する工程、
（ｂ）前記試料を、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１０以上のヌクレオチドに対して完全に相補的である蛍光標識されたペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブと接触させることによって、ハイブリダイゼーション混合物を形成する工程、
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドと前記ＰＮＡプローブとの間に形成されたハイブリダイゼーションしている部分を、ハイブリダイゼーションしていない部分から、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離する工程、および
（ｄ）前記のハイブリダイゼーションしている部分を蛍光分光法によって定性的または定量的に検出する工程
を含む、前記オリゴヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の後に第２の蛍光標識されたＰＮＡプローブを添加、およびその後、工程（ｃ）から（ｄ）を実施することを含む、１つの試料から並行してオリゴヌクレオチド二本鎖の両鎖を検出するための、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡおよびその誘導体の定量的分析または定量的分析のための、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
治療的ｓｉＲＮＡおよびその誘導体のin vivoにおける代謝の定量的分析または定性的分析のための、請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
細胞外および細胞内に送達されたｓｉＲＮＡの定量的分析または定性的分析のための、請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
検出されるべき既知濃度のオリゴヌクレオチドを試料に加える、請求項１〜５記載の方法。
【請求項７】
ＰＮＡプローブが、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ４２５またはＡｔｔｏ５２０で標識される、請求項１〜６記載の方法。
【請求項８】
試料が組織溶解液または血漿溶解液である、請求項１〜７記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の方法の全ての構成要素が加えられているプレート標品からなる、オリゴヌクレオチドの１本または２本の鎖の定性的および定量的な検出において使用するためのキット。
【請求項１０】
プレート標品が、自動化プレート標品である、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
プレート標品が、自動９６ウェルプレート標品または３８４ウェルプレート標品である、請求項９記載のキット。
【請求項１２】
特に前記の実施例を参照にして、本明細書において実質的に前記した方法およびキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび混合オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマーおよびまたスピーゲルマーを含む、オリゴヌクレオチドを検出するための新規で簡単な方法に関する。さらに、本発明は、例えばｓｉＲＮＡについての、１回の測定で二本鎖オリゴヌクレオチドの両鎖を同時に検出するための方法に関する。
【０００２】
既知配列のオリゴヌクレオチドは、多種多様な化学的および生物学的な適用において一般的に使用され、そしてまた疾病の診断および処置において高い重要性を得ている。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびアプタマーは、有望な薬理学的ツールおよび治療剤である。細胞、組織、血液または血漿のような試料中のこれらのオリゴヌクレオチドの定性的および定量的検出は、その治療使用を評価するためのおよびin vivoにおけるその安定性をモニタリングするための必要条件である。
【０００３】
オリゴヌクレオチドの検出のための異なる方法が文献において引用されており、そして公開特許出願、例えばWO/2008/046645において開示されている。オリゴヌクレオチドの定量的および定性的な検出のための大半の確立されている手順は、ワトソンクリック塩基対形成を介した相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づく。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖骨格がＮ−アミノエチルグリシンモノマーの疑似ペプチド鎖によって置換されているオリゴヌクレオチド模倣体である。それらは、高い親和性、特異性および安定性で相補的ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列に結合するので、プローブに基づいたオリゴヌクレオチド検出法に使用されることが多い(US Pat 6,395,474)。WO/2008/046645は、ＲＴ−ＰＣＲに基づいたオリゴヌクレオチド検出アッセイにおけるＰＮＡプローブの使用を記述している。US Pat 6,045,995は、キャピラリーゲル電気泳動によるオリゴヌクレオチドの定性的および定量的な検出を記載している。Rossi et alは、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）におけるＰＮＡプローブによるＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドの同定を記載している(J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 2509-2516)。
【０００４】
しかしながら、生体試料中のオリゴヌクレオチドを決定するための既存のアッセイの殆どは、代謝物を検出することができないか、または代謝物シグナルをインタクトなオリゴヌクレオチドにより発生したシグナルから分離することができない。例えば、ＰＣＲに基づいた方法において、シグナルは、通常、インタクトな薬物のみから、またはインタクトな薬物と様々な代謝物との合計として発生する。蛍光による検出を伴うキャピラリーゲル電気泳動により、インタクトなオリゴヌクレオチドがその代謝物から定量的に分離されるが、この方法には試料調製中の抽出工程および脱塩工程が必要である。さらに、分析物分子の回収率は変動し、そして正規化のために内部標準が必要とされる。現在使用されているオリゴヌクレオチド検出法の別の主要な限界は、２本の鎖の一方しか１回の測定で検出することができないことであり、これはオリゴヌクレオチド二本鎖の決定（例えばｓｉＲＮＡ）には特に不都合である。
【０００５】
従って、試料中のオリゴヌクレオチドおよびその代謝物を分析することのできる、試料中のオリゴヌクレオチドの検出のための再現性がありかつ迅速な方法を有することは非常に有益である。さらに、療法および診断におけるｓｉＲＮＡおよびその誘導体の重要性が高まっていることから、１回の測定でオリゴヌクレオチドおよびその代謝物の両鎖を検出することのできる再現性がありかつ迅速な方法が必要である。
【０００６】
オリゴヌクレオチドを含むかまたは含むことが疑われる試料を選択する工程、前記試料を、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１０以上のヌクレオチドに対して完全に相補的である蛍光標識されたペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブと接触させることによってハイブリダイゼーション混合物を形成する工程、前記オリゴヌクレオチドと前記ＰＮＡプローブとの間に形成されたハイブリダイゼーションしている部分を、ハイブリダイゼーションしていない部分から、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ａＩＥＸ−ＨＰＬＣ）によって分離する工程、および前記のハイブリダイゼーションしている部分を蛍光分光法によって定性的および／または定量的に検出する工程を含む、前記オリゴヌクレオチドの定性的および定量的な検出のための方法を開示する。他のオリゴヌクレオチド検出法を上回る本発明の主要な利点は、検出前の簡単な試料調製であり、例えば精製手順、増幅工程または抽出工程が全く必要とされない。それ故、分析物の回収率に関する変動が回避される。好ましい態様において、試料を、ＳＤＳを含む緩衝液中でプロテイナーゼＫを用いて処理し、その後、飽和ＫＣｌ溶液でＳＤＳを沈降させる。これにより試料中のオリゴヌクレオチドの分解が効率的に防止される。
【０００７】
過剰なハイブリダイゼーションしていないＰＮＡプローブがＨＰＬＣの空隙容量に溶出し、そして勾配による分離中にプローブからの干渉シグナルは全く予期されない。それ故、大過剰のＰＮＡプローブを使用して、試料からの過剰なプローブを抽出する工程を確立することなく、ハイブリダイゼーションプロセスを動態学的に制御することができる。ＰＮＡプローブの使用はまた、ＰＮＡプローブがａＩＥＸ−ＨＰＬＣの空隙容量に溶出するので、生体マトリックスからの完全なバックグラウンド蛍光を排除する。また、生体マトリックスに由来するＲＮＡまたはＤＮＡとＰＮＡプローブとの非特異的ハイブリダイゼーションから発生したシグナルも、ＨＰＬＣ勾配の洗浄工程で別々に溶出される。それ故、ＨＰＬＣ勾配中に分析物に特異的なシグナルのみを高い選択性で検出することができる。従って、ａＩＥＸ−ＨＰＬＣ装置は高い生物学的バックグラウンドがローディングされた場合でさえも非常に頑強に作動する。
【０００８】
ＰＮＡの非荷電な骨格のために、ＰＮＡは対応するオリゴヌクレオチド鎖に対して高い親和性を示し（ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡの二本鎖のような静電的反発が全くない）、これによりｓｉＲＮＡ二本鎖の場合のような競合するＲＮＡ鎖の存在下でさえも熱力学的に制御されたハイブリダイゼーションがもたらされる。他の方法を上回る本方法の別の主要な改良点は、代謝物を検出することができること、そして代謝物のシグナルを、インタクトなオリゴヌクレオチドによって発生したシグナルから分離することができることである。代謝物についてのより高度な分離力は、ＰＮＡプローブの非荷電骨格の別の結果である。溶出は、代謝物の長さに強く依存し、代謝物がより短くなればなるほど、勾配内でＨＰＬＣカラムからより早く溶出される。また、５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを、同じ長さのリン酸化されていない同一配列から分離することもできる。５’−リン酸化は細胞内にｓｉＲＮＡが送達された後にのみ起こるので、これを使用して、組織中の細胞内に送達されたｓｉＲＮＡから細胞外に送達されたｓｉＲＮＡを区別することができる。よって、細胞内５’−リン酸化ｓｉＲＮＡは、臓器に送達された薬物の全体量と比較した組織中における活性薬物の量のマーカーとして作用することができる。
【０００９】
本明細書において記載したオリゴヌクレオチド検出法の感度および再現性：モデル配列（ＲＤ−１００３）について血漿中の定量下限濃度（ＬＬＯＱ）は、ストック検量アプローチを用いて約２５０amolのオリゴヌクレオチドである。このアッセイは高い再現性（変動は５％未満）で作動する。
【００１０】
他の公開されているＨＰＬＣに基づいたオリゴヌクレオチド定量法を上回る本発明の主要な利点は、迅速かつ簡単な試料調製、検出前の増幅工程がないこと、高い感度および再現性、アッセイの頑強さ、ハイスループット能、並びに１回の測定でオリゴヌクレオチドおよびその代謝物の両鎖を検出することができることである。Rossi et alは、陰イオン交換ＨＰＬＣにおけるオリゴヌクレオチドの同定を記載している(J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 2509-2516)。本発明とは対照的に、追加の試料調製工程およびＰＣＲによるオリゴヌクレオチドの増幅が検出前に必要とされる。さらに、両鎖の同時検出は不可能である。なぜなら、ハイブリダイゼーションプロトコールが一方の鎖の核酸分解的切断を必要とするからである。
【００１１】
以前に記載のアッセイの殆どは、異なる組織または血漿に由来する変動性の非特異的なバックグラウンドに因り、個々の検量曲線を必要とする。これに対し、非特異的バックグラウンドシグナルは本発明のアッセイに干渉しない。従って、本発明の好ましい態様において、緩衝液中の連続希釈液から作成した検量曲線を、組織および血漿の試料のために使用することができる。
【００１２】
本発明の別の局面において、オリゴヌクレオチドを含むかまたは含むことが疑われる試料を選択する工程、前記試料を、前記オリゴヌクレオチドのセンス鎖の少なくとも１０以上のヌクレオチドに対して完全に相補的である蛍光標識されたペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブと接触させることによってハイブリダイゼーション混合物を形成する工程、ハイブリダイゼーション混合物を、前記オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の少なくとも１０以上のヌクレオチドに対して完全に相補的である第２の蛍光標識されたＰＮＡプローブと接触させる工程、前記オリゴヌクレオチド鎖と前記ＰＮＡプローブとの間に形成されたハイブリダイゼーションしている部分を、ハイブリダイゼーションしていない部分から、ａＩＥＸ−ＨＰＬＣによって分離する工程、前記のハイブリダイゼーションしている部分を蛍光分光法によって定性的および／または定量的に検出する工程を含む、１つの試料から並行してオリゴヌクレオチド二本鎖の両鎖を定性的および定量的に検出するための方法が提供される。これは、１つの試料から並行してオリゴヌクレオチド二本鎖の両鎖の検出を可能とする初めての手順である。
【００１３】
最も好ましい態様において、２つの蛍光標識されたＰＮＡプローブが、オリゴヌクレオチド二本鎖の検出のために使用される。各プローブは、オリゴヌクレオチドのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに特異的にハイブリダイゼーションする。１つの態様において、同じ蛍光標識を両鎖の検出のために使用する。二本鎖は、異なる長さを有する２本の鎖から設計されるか、または２つのプローブは、ハイブリダイゼーションによりａＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析において２本の一本鎖の異なる保持時間が得られるように設計される。別の態様において、両鎖を検出するために２つの異なる蛍光標識が、１つのＨＰＬＣ装置において２つの蛍光検出器と共に使用される。
【００１４】
これは、生体試料からの定量のためだけではなく、オリゴヌクレオチド二本鎖のＣＭＣ特徴付けのための、例えば個々の鎖のピーク面積の比としてｓｉＲＮＡ二本鎖中の２本の一本鎖の比を直接的に特徴付けるための新たな可能性を開拓する。シグナル強度はハイブリダイゼーション手順後の蛍光シグナルのみに依存し、そして一本鎖特異的ＵＶ吸光係数から独立している。
【００１５】
好ましい態様において、検出されるべき既知濃度のオリゴヌクレオチドを未知の試料に加え、そして検量試料およびブランク試料にも加える。このいわゆるストック検量アプローチは、実施例の章において詳述したようにアッセイの感度を向上させる。
【００１６】
別の好ましい態様において、試料は血漿であり、さらに別の好ましい態様において試料は組織である。
【００１７】
別の好ましい態様において、前記方法は、ｓｉＲＮＡおよび誘導体の定量的および定性的な検出のために使用される。さらに別の態様において、前記方法は、治療的または診断的ｓｉＲＮＡのin vivoにおける代謝の定量的および定性的な検出のために使用することができる。
【００１８】
１つの態様において、前記ｓｉＲＮＡは、前記ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションされたin vitro細胞培養液から検出される。
【００１９】
１つの態様において、前記方法は、ミクロＲＮＡおよび誘導体の定量的および定性的な検出のために使用される。好ましくは前記ミクロＲＮＡは組織溶解液から検出される。
【００２０】
別の態様において、前記方法は、アプタマーの定量的および定性的な検出のために使用される。好ましくは、前記アプタマーは、Ｌ−リボース（Ｌ−ＲＮＡ）またはＬ−デオキシリボース（Ｌ−ＤＮＡ）を有するスピーゲルマーである。１つの態様において、前記アプタマーはＰＥＧ化されている。
【００２１】
さらに別の態様において、前記方法を使用して、組織中の細胞内に送達されたｓｉＲＮＡから細胞外に送達されたｓｉＲＮＡを区別することができる。
【００２２】
オリゴヌクレオチドを蛍光標識するための多くのダイが記載されている。好ましい蛍光標識としては、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ４２５およびＡｔｔｏ５２０が挙げられるが、当業者に公知の任意の他の蛍光標識も前記方法において使用することができる。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、試料中のオリゴヌクレオチドおよびその代謝物の１本または２本の鎖の存在、不在または数を検出するアッセイを実施するのに適したキットに関する。本発明のキットは、１つ以上のＰＮＡプローブおよびアッセイを実施するのに必要な全ての他の試薬または組成物を含む、すぐに使用できるプレート標品を含む。キットの使用はアッセイの実施を簡単にし、そしてアッセイの再現性を向上させる。本発明の好ましいキットはオリゴヌクレオチド検出のために完全に自動化されたロボットシステムを使用し、全ての試薬がピペッティングロボットによって添加される。従って、アッセイの再現性はさらに向上する。さらに、この装置を、異なる試料中のオリゴヌクレオチドのハイスループット分析に使用することができる。１つの好ましい態様において、前記キットは、９６ウェルプレート標品を含み、さらに別の態様において前記キットは３８４ウェルプレート標品を含む。
【００２４】
簡便性のために、明細書、実施例および特許請求の範囲において使用される特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の使用と、本章において提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合には、本章において提供される定義が優先する。
【００２５】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれかのオリゴマーまたはポリマー、並びに、天然に存在しないオリゴヌクレオチドをいう。天然に存在しないオリゴヌクレオチドは、天然に存在しな核酸塩基配列を含むオリゴマーもしくはポリマー、または天然に存在する核酸塩基、糖、糖間結合の機能的等価体を含む種、例えばアプタマー、スピーゲルマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）もしくはグリセロール核酸（ＧＮＡ）である。この用語は、天然に存在する核酸の核酸塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含むオリゴマー、並びに塩基類似体または改変された核酸塩基を含むオリゴマーを含む。それ故、当業者は、「オリゴヌクレオチド」という用語が、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび混合オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマーおよびまたスピーゲルマーを含むがそれらに限定されないことを理解する。
【００２６】
オリゴヌクレオチドは、ウイルス、細菌および真核生物のＤＮＡおよびＲＮＡなどの多種多様な天然源に由来し得る。他のオリゴヌクレオチドは合成源に由来してもよく、そして研究試薬、診断剤、または潜在的および確定的な治療剤として使用するために製造された複数のオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。この用語は、一本鎖核酸または二本鎖核酸を含むオリゴマーを含む。二本鎖核酸の２本の鎖は「センス鎖」および「アンチセンス鎖」として定義される。
【００２７】
本明細書において使用する「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドをいう。しかしながら、本明細書において詳述したこのような「配列を含む鎖」はまた、改変されたヌクレオチドのような、改変も含み得る。本明細書において使用する「相補的」という用語は第２ヌクレオチド配列と比較して第１ヌクレオチド配列を説明するために使用される場合、特記しない限り、当業者によって理解されているように、第１ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下において、第２ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションしそして二本鎖構造を形成することができることをいう。本明細書において使用する「相補的」配列はまた、ハイブリダイゼーションするその能力に関して前記の必要条件が満たされている限りにおいて、ワトソンクリックではない塩基対および／または非天然ヌクレオチドおよび改変ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、あるいは完全にそれから形成され得る。
【００２８】
これは、第１および第２ヌクレオチド配列の全長におよぶ、第１ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対形成を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的」ということができる。
【００２９】
「ハイブリダイゼーションしている部分」という用語は、ＰＮＡプローブにハイブリダイゼーションした任意のオリゴヌクレオチドまたはそのいずれかの代謝物をいい、一方、「ハイブリダイゼーションしていない部分」とは、ＰＮＡプローブにハイブリダイゼーションしていない任意のオリゴヌクレオチドまたはそのいずれかの代謝物をいう。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節機序において遺伝子の発現を遮断することのできる二本鎖ＲＮＡ分子をいう。
【００３０】
従って「治療的ｓｉＲＮＡ」という用語は、特定の疾病または疾患に関連した遺伝子の発現を遮断することによって、被験体の疾患および疾病を処置、予防または管理するための化合物として使用される二本鎖ＲＮＡ分子をいう。好ましくは、このような被験体は哺乳動物、最も好ましくはヒト患者である。
【００３１】
「オリゴヌクレオチド代謝物」という用語は、１つ以上のヌクレオチドが３’末端および／または５’末端から欠失したオリゴヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド代謝物」という用語はさらに、任意の天然的にまたは合成的に改変されたオリゴヌクレオチド、例えばリン酸化３’末端または５’末端を含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００３２】
特に以下の実施例を参照して本明細書において前記したような方法およびキットも特許請求される。以下の実施例、参考文献、配列表および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に改変を行なうことができることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡの１本の鎖の検出のためのクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、同じダイを含む２つのＰＮＡプローブを使用する両鎖の同時分析を示す。
【図３】図３は、同じダイを含む２つのＰＮＡプローブを使用する両鎖の同時分析のための検量曲線を示す。
【図４】図４は、異なる蛍光標識を含む２つのＰＮＡプローブ、２つの蛍光検出器を用いての検出を使用する両鎖の同時分析を示す。
【図５】図５は、薬物代謝物の分離を示す。
【図６】図６は、ｍｉＲＮＡの検出のためのクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、肺組織中のスピーゲルマーの検出のためのクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、３’伸長されたアンチセンス鎖配列による保持時間のシフトを示す。
【図９】図９は、より多量の組織のローディングによる感度の上昇を示す。
【００３４】
実施例
実施例１：ＰＮＡプローブＨＰＬＣによるＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの検出
この材料および方法の章は、生体試料からＧＦＰ−ｓｉＲＮＡをどのように決定するかのアッセイ手順を説明する。さらにまた、この手順を少し変更して、ワトソンクリック塩基対を形成することのできる全ての他のオリゴヌクレオチドのために使用することができる。手順は、一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドの場合には１本の鎖のみの決定、並びに、二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡからの並行的な両鎖の定量を可能とする。ダイ−プローブは、定量すべきオリゴヌクレオチドの少なくとも１０以上のヌクレオチドに完全に相補的である蛍光標識されたＰＮＡ（ペプチド核酸）鎖である（相補性は、完全なワトソンクリック塩基対形成として定義される）。
【００３５】
血漿、血清または組織の試料はドライアイス上で出荷され、そして使用まで−８０℃で保存される。分析前に血漿試料を氷上で解凍し、そしてEpicentre社製の細胞および組織溶解溶液中においてプロテイナーゼＫにより６５℃で２５分間処理する。プロテイナーゼＫによる処理のために、３０μlの血漿を３０μlのEpicentre社製の細胞および組織溶解溶液、４μlのプロテイナーゼＫ溶液および３６μlのＨ２Ｏと混合し、最終容量を１００μlとする。
【００３６】
組織試料を凍結状態で粉砕し、そして１００mgまでの凍結粉末を１mLのEpicentre社製の細胞および組織溶解溶液中に懸濁し、超音波棒で処理し、続いて、６５℃でのプロテイナーゼＫによる処理で溶解した。全てのプロテイナーゼＫで処理した試料をさらにEpicentre社製の細胞および組織溶解溶液で希釈し、その後、ＨＰＬＣ試料調製工程に使用する。
【００３７】
プロテイナーゼＫによる処理後、２０μlの３Ｍ ＫＣｌ溶液を２００リットルの血漿または組織試料に加え、ＳＤＳを沈降させる。続いて試料を１５分間遠心分離にかけ、そして上清をｓｉＲＮＡの決定のためにさらに使用する。
【００３８】
ハイブリダイゼーションのために、０．５〜２５０fmolのｓｉＲＮＡを含む１００μlの希釈上清を、９６ウェルＰＣＲプレート中で、アンチセンス鎖をターゲティングする５μlの１μMのＡｔｔｏ６１０−ＰＮＡ−プローブ溶液と混合する。ハイブリダイゼーション緩衝液を加えて最終容量を２００μlとする（ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖も検出すべき場合には１９０μlとする）。プレートを密閉し、そしてＰＣＲ機器中で９５℃で１５分間インキュベーションする。
【００３９】
ＰＣＲ機器の温度を５０℃まで下げる。ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖を検出すべき場合には、センス鎖をターゲティングする１０μlの１μMのＡｔｔｏ４２５−ＰＮＡ−プローブ（またはＡｔｔｏ６１０−ＰＮＡ−プローブ）を各ウェルに加え、最終容量を２００μlとする。さらに１５分間５０℃で振とうした後、室温まで冷却し、そして試料をＨＰＬＣオートサンプラーに入れる。
【００４０】
検量曲線を、同一条件下においてｓｉＲＮＡ連続希釈液から作成する。オリゴヌクレオチドの両鎖の分析に使用される検量曲線の代表的なクロマトグラムを図３に提供する。
【００４１】
【表１】
2012505644.tif 000003
【００４２】
プローブ／アンチセンス鎖の二本鎖の蛍光による検出を伴うＨＰＬＣ分析
１００μlの各々のハイブリダイゼーションした試料（１／２）を、Dionex RF2000蛍光検出器に接続されたＨＰＬＣシステムに注入する。２つの異なる蛍光ダイを含む両方のｓｉＲＮＡ鎖の検出のために、第２のDionex RF2000蛍光検出器を第１の検出器の後に並べて接続して使用する。クロマトグラフィーを、溶出塩としてＮａＣｌＯ４を用いてネイティブな条件下において５０℃でDionex DNA Pac PA100カラムで実施する。
【００４３】
１本の鎖の検出のための典型的なクロマトグラムを図１に示し、同じダイを含む２つのＰＮＡプローブを使用する両鎖の同時分析のための典型的なクロマトグラムを図２に提供する。オリゴヌクレオチドの両鎖の分析に使用される検量曲線の代表的なクロマトグラムを図３に提供する。図４において、異なる蛍光標識を含む２つのＰＮＡプローブおよび２つの蛍光検出器を用いたその検出を使用する両鎖の同時分析の典型的なクロマトグラムを示す。
【００４４】
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Dionex DNAPac PA100 (４×２５０mmの分析カラム）
温度：５０℃
流速：１mL／分
注入：１００μl
検出：励起：６１２nm；発光：６４２nm（第１検出器）
励起：４３６nm；発光：４８４nm（必要であれば第２検出器）
【００４５】
【表２】
2012505644.tif 000004
【００４６】
血漿試料および組織試料中のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの濃度をイオン交換ＨＰＬＣを使用して決定し、蛍光の検出により分析物を分離し、そしてピーク下の面積を定量する。使用するネイティブなＩＥＸ−ＨＰＬＣ条件下においては、干渉するマトリックス化合物並びに過剰の蛍光標識されたプローブがカラムの空隙容量に溶出する。蛍光標識プローブとマトリックスＲＮＡ／ＤＮＡとのハイブリダイゼーションに由来する非特異的なシグナルはより長い保持時間にシフトするため、同時溶出するバックグラウンドを殆ど伴うことなく、シグナルを良好に分割することが可能となる。蛍光標識プローブおよび対応するインタクトなｓｉＲＮＡ鎖からなる二本鎖によって発生する特異的なシグナルは、典型的には５〜７分に溶出する。
【００４７】
前記のようにハイブリダイゼーションしそして分析される標準的なｓｉＲＮＡ連続希釈液（０．５〜２５０fmolのｓｉＲＮＡ）から作成した外部検量曲線に基づいて定量を行なう。このアッセイの直線範囲は、カラム上において０．５〜２５０fmolのｓｉＲＮＡであり、１mLの血漿中におけるＬＬＯＱは約０．６ngのｓｉＲＮＡであり、組織中におけるそれは約５ngのｓｉＲＮＡである。
【００４８】
試薬：
・５０μMの標準ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡストック溶液（社内調製）
・ハイブリダイゼーション緩衝液：５０mMトリス−Ｃｌ；１０％ＡＣＮ（社内調製）
・プロテイナーゼＫ（２０mg/ml）：Peqlab No. 04-1075; Lot: 11024
・溶解緩衝液：Epicentre社製の細胞および組織溶解溶液（MTC096H番）
・ミリＱ水：１８．２ＭΩ
・ＰＮＡ−プローブ：表１参照
・ＫＣｌ：３ＭのＨ２Ｏ溶液（社内調製）
・蛍光検出のためのＨＰＬＣ−システムＡ：
・ＨＰＬＣ溶出液Ａ：２５mMトリス−ＨＣｌ；１mM ＥＤＴＡ；５０％ＡＣＮ；ｐＨ＝８
・ＨＰＬＣ溶出液Ｂ：Ａ中８００mM ＮａＣｌＯ４
【００４９】
材料：
・超音波棒、Bandelin Sonoplus (Berlin)、UW 2070を含むHD 2070 MS72
・１．５mlのエッペンドルフチューブ
・エッペンドルフtwin.tec PCRプレート96 (951020389番)
・エッペンドルフマスターサイクラーグラジエント
・ウルトラクリアーキャップストリップ、Peqlab (82-0866-A番)
・Dionex Ultimate3000 HPLC：溶媒ラック
究極３０００デュアルポンプ
究極３０００オートサンプラー
１０ポートスイッチ弁を有する究極３０００カラムオーブン
ＵＶ検出器ＶＷＤ３０００
蛍光検出器ＲＦ２０００
【００５０】
あるいは、以下のＨＰＬＣ条件を、オリゴヌクレオチドの検出のために、特にｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの検出のために使用した：
・カラム：Dionex DNA Pac PA100 (２５０×４mm)
・温度：５０℃
・溶出液Ａ：１０mMリン酸ナトリウム；１００mM ＮａＣｌ；５％ＡＣＮ
・溶出液Ｂ：１０mMリン酸ナトリウム；１Ｍ ＮａＣｌ；５％ＡＣＮ
・溶出液Ｃ：９０％ＡＣＮ
【００５１】
【表３】
2012505644.tif 000005
【００５２】
実施例２：自動９６ウェルプレート標品
この章は、マイクロタイタープレートを使用した新たな試料調製プロトコールを説明する。ここでは、アッセイの再現性を向上させるために、手作業の取扱い工程を最小限に減少させている。ハイブリダイゼーション緩衝液、ダイ−プローブおよびｓｉＲＮＡスパイクを含む混合物の全成分をピペッティングロボットにより９６ウェルプレートに加える。また、試料の事前のＳＤＳ沈降を、マイクロタイタープレートに基づいた装置において実施することができる。
【００５３】
前記手順を用いると、規定のオリゴヌクレオチドのためのストックされた９６ウェルプレートを調製することが可能であり、試料溶液だけを加えなければならない。従って、このすぐに使用できる標品はキットのように作動し、これを、規定のオリゴヌクレオチドを含むかまたは含むことが疑われる試料の迅速なハイスループット分析のために使用することができる。
【００５４】
プレート標品
９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、ウェルは、８つの行（ＡからＨと標識）および１２の列（１から１２と標識）の長方形格子を形成する。自動９６ウェルプレート標品のために、マスターミックスを表４に従って手作業で調製し、そして１００μlをプレートの各ウェルにピペッティングロボットによって加える。第１〜第１０行のウェルに、５０μlの水を加える。第１〜９の行は試料分析のために作用し、第１０の行は１fmolのスパイクのための対照として作用し、そして第１〜１２の行は検量曲線のために作用する。第１１〜１２のウェルに、５０μlの培地および５０μlのｓｉＲＮＡ希釈液を加える。ｓｉＲＮＡ希釈液を、１００nMのｓｉＲＮＡ溶液から開始してピペッティングロボットによって調製し、そしてこれを以下に列挙する。この９６ウェルプレートはさらに「調製プレート」ともいわれる。
【００５５】
【表４】
2012505644.tif 000006
【００５６】
検量曲線のためのｓｉＲＮＡの希釈
２０nM（５００fmol）
１０nM（２５０fmol）
４nM（１００fmol）
２nM（５０fmol）
１nM（２５fmol）
０．４nM（１０fmol）
０．２nM（５fmol）
０．１nM（２．５fmol）
０．０２nM（０．５fmol）
０．０１nM（０．２５fmol）
【００５７】
調製プレートへの試料の添加／ＳＤＳ沈降工程
１００μlのアリコートの試料を、予め冷却した９６ウェルマイクロタイタープレートの第１〜９の列の全ての行（Ａ〜Ｈ）のウェルにピペットで入れ、そしてこれらのウェルに１０μlの３Ｍ ＫＣｌをピペッティングロボットによって添加する。３８００Ｕ／分および４℃で１５分間遠心分離した後、５０μlの上清を、調製プレートの相応の列にピペッティングロボットによって移す。
【００５８】
対照のために、溶解緩衝液または培地を３Ｍ ＫＣｌを用いて沈降させ、そして５０μlの上清を、調製プレートの第１０〜１２の列に加える。各ウェルの１００μlをａＩＥＸ−ＨＰＬＣに注入する。
【００５９】
実施例３：薬物代謝物の分離
異なる薬物代謝物の分離のために、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の精製された３’末端（３’ｎ−２、３’ｎ−４、３’ｎ−５、３’ｎ−６）および５’末端（５’ｎ−１、５’ｎ−２、５’ｎ−３）代謝物（１〜６個のヌクレオチドが３’末端または５’末端からそれぞれ欠失した）を、実施例１記載のアッセイ手順に従って分析した。代謝物を表５に示し、代謝物の分離についての典型的なクロマトグラムを図５に示す。
【００６０】
【表５】
2012505644.tif 000007
【００６１】
実施例４：ｍｉＲＮＡの検出
標準的な条件下においてアッセイを使用して、組織溶解液からｍｉＲＮＡを検出する可能性を評価した。一例として、マウス肝特異的ｍｉＲＮＡ−１２２を、マウス組織溶解液（陽性対照）から、空腸（陰性対照）から、および合成的に作製したｍｉＲＮＡ−１２２鎖(Lagos-Quintana, et al. Current Biology, Vol. 12, 735-739.)を用いてスパイクした溶解液から検出した。文献から、マウスの肝臓において、３つの異なるタイプのｍｉＲＮＡ−１２２配列が発現されることが知られている：
【表６】
2012505644.tif 000008
【００６２】
全ての合成標準物質は、５’−ＯＨとして、および５’−リン酸配列として合成された。３つの種が３’末端において小さな相違を示したので、ＰＮＡ−プローブは、ｍｉＲＮＡ−１２２の５’末端の３番目の塩基から始まり、１７塩基長を有し、３つ全てのｍｉＲＮＡ−１２２配列と完全に一致するように設計された：
【表７】
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【００６３】
ＨＰＬＣを、実施例１に詳述しそして表３に示した代替的なプロトコールに記載したような条件で実施した。合成的に作製したｍｉＲＮＡ−１２２を用いてスパイクされたマウス肺溶解液（ｍｉＲＮＡ１２２陰性組織）から作成したＨＰＬＣチャートは、３つの分離したピークを示した。このピークの保持時間は、肝臓に由来する溶解液（１mgの肝臓を注入）に見られたシグナルと完全に一致していた。全ピーク面積の定量および肝臓中の全ｍｉＲＮＡ−１２２濃度の計算により、約３５ng/gが得られた。空腸または肺組織試料からのｍｉＲＮＡ−１２２陰性対照は、予期されたようにｍｉＲＮＡ−１２２についてのシグナルを全く示さなかった（図６）。
【００６４】
実施例５：ＰＥＧ化を含むおよび含まないスピーゲルマー−ＤＮＡ（Ｌ−ＤＮＡ）の検出
スピーゲルマーは、天然Ｄ−オリゴヌクレオチドとのワトソンクリック塩基対相互作用を全く示さない、非天然Ｌ−リボース（Ｌ−ＲＮＡ）またはＬ−デオキシリボース（Ｌ−ＤＮＡ）糖骨格を有するアプタマー分子である。ＰＮＡはワトソンクリック塩基対特性を有するキラルではないオリゴヌクレオチド模倣体であるので、この非天然オリゴヌクレオチド種を検出するためにも、ＰＮＡ−プローブを使用することができることが期待された。スピーゲルマーまたはアプタマーの循環中半減期を増加させるために、この分子は、この複合体分子の分析を通常は妨害する、４０kDaの分岐ＰＥＧを用いてＰＥＧ化されていることが多い。
【００６５】
この治療的に興味深い分子クラスの検出のための概念証明として、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化バージョンの以下のＬ−ＤＮＡ配列を合成し、そしてマウスへの経口気管内投与後に本明細書において記載したアッセイを用いて分析した。
【００６６】
非ＰＥＧ−スピーゲルマー：
【表８】
2012505644.tif 000010
【００６７】
ＰＥＧ−スピーゲルマー：
【表９】
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【００６８】
以下の１７ｍｅｒ−ＰＮＡ−プローブを、血漿、肺、肝臓、および腎臓の試料からのスピーゲルマーのハイブリダイゼーションおよび検出のために使用した：
【表１０】
2012505644.tif 000012
【００６９】
勾配条件を、ｓｉＲＮＡ鎖と比較してより長いオリゴヌクレオチド配列に調整して、ＨＰＬＣ法の勾配内でスピーゲルマー−ＰＮＡ−二本鎖を溶出させた。
【００７０】
以下のＨＰＬＣ条件を適用した：
・カラム：Dionex DNA Pac PA100 (２５０×４mm)
・温度：５０℃
・溶出液Ａ：１０mMリン酸ナトリウム；１００mM ＮａＣｌ；５％ＡＣＮ
・溶出液Ｂ：１０mMリン酸ナトリウム；１Ｍ ＮａＣｌ；５％ＡＣＮ
・溶出液Ｃ：９０％ＡＣＮ
【００７１】
【表１１】
2012505644.tif 000013
【００７２】
【表１２】
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【００７３】
ＰＥＧ化スピーゲルマーについての前記方法の感度は、４０kDaのＰＥＧ部分の多分散性によって誘導されるピーク拡大に因り幾分損なわれた。検出の下限は、カラム上で約１fmolのＬ−ＤＮＡまで増加した。より短い不純物の分割は試験しなかったが、より短いｓｉＲＮＡ鎖またはｍｉＲＮＡ鎖と比較してより低いと予測された。
【００７４】
試料の調製は標準的なプロトコールに従って行なった。スピーゲルマーを、図７に示したように生物学的なバックグラウンド干渉がほぼ含まれない鋭い単一のピークとして、試験した血漿および全ての組織からこの手順によって容易に検出することができた。
【００７５】
実施例６：in vitroのトランスフェクション実験からのｓｉＲＮＡの検出
in vitroにおける細胞培養実験からの非標識ｓｉＲＮＡの検出は、高い感度が必要とされるという事実によって限定され、それ故、改変されていない分子に対しては、ＰＣＲのような増幅工程を有するアプローチしか成功しなかった。
【００７６】
ＰＮＡ−ＨＰＬＣのアッセイ感度は、細胞培養実験からｓｉＲＮＡを測定する範囲内であった。両鎖の３’末端において２ｎｔのオーバーハングを有する１９塩基対のｓｉＲＮＡを、３０nMのｓｉＲＮＡ濃度で、初代肝細胞のトランスフェクションに使用した。アンチセンス鎖のその５’末端のみが異なる同一配列を有するこの二本鎖の種々のバージョンをトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、溶解液１μLあたり約２５００個の細胞の濃度でプロテイナーゼＫ処理によって溶解した。
【００７７】
細胞培養溶解液をＰＮＡ−ＨＰＬＣアッセイ手順のために使用し、そして１回のＨＰＬＣの実行につき約５００００個の細胞を、相補的なアンチセンス鎖ＰＮＡ−プローブとハイブリダイゼーションさせた後にカラムに注入した。このアッセイ条件下において、インタクトなアンチセンス鎖およびまたアンチセンス鎖の５’−リン酸化種は、１個の細胞あたり約８０００個まで減少したｓｉＲＮＡコピーを検出することができた（データは提示せず）。
【００７８】
実施例７：正規化のための内部標準の使用（より高い正確性）
前記方法の正確性をさらに増加させるために、特にＧｘＰ環境において使用する場合、正規化のために内部標準を実行することがおそらく必要である。概念証明として２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖をその３’末端において３〜８個のデスオキシ−Ｔヌクレオチドを用いて伸長した。この正規化標準を、２１ｍｅｒおよびその５’−リン酸化種と共に、血漿中にスパイクし、その後、標準的なアッセイ条件およびＨＰＬＣ条件下で（実施例１、特にＨＰＬＣについての代替的なプロトコールおよび表３を参照されたい）ｓｉＲＮＡについて分析した。
【００７９】
全ての伸長された標準物質は、より長い保持時間でもって、２１ｍｅｒ並びに５’−リン酸化２１ｍｅｒとは完全に基線から分割されて溶出した。いくつかの伸長鎖の合成不純物が５’−リン酸化２１ｍｅｒと同時に溶出したように、いくつかのピーク干渉が、３−ｄＴ−ヌクレオチド伸長配列および５’−リン酸化２１ｍｅｒにおいて観察された。
【００８０】
ここに示した例は、その５’末端に３個、４個および５個のデスオキシチミジンヌクレオチドを有する３’伸長アンチセンス鎖と混合された、アンチセンス鎖および５’−リン酸化アンチセンス鎖を含む試料のクロマトグラムの重ね合わせである（図８参照）。以下の配列を例示的なクロマトグラムのために使用した（大文字はＲＮＡヌクレオチドを示し、小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」および「ｕ」は２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを示し、「ｓ」はホスホロチオエートを示し、そして「ｄＴ」はデオキシチミジンを示す）：
【表１３】
2012505644.tif 000015
【００８１】
【表１４】
2012505644.tif 000016
【００８２】
また、この実験を用いて、標準的なｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのアッセイ条件下において、１ヌクレオチド長しか違わない２９ｍｅｒまでのオリゴヌクレオチドについて基線分割を達成することができることが証明された。
【００８３】
実施例８：組織中のアッセイ感度の増加
前記したアッセイの感度は、組織１ｇあたり約２ngまでのｓｉＲＮＡに限定された。この限界は、基線ノイズがより多量の組織のローディングで増加するので、カラム上にローディングされる組織の最大量が、１回の注入あたり２〜３mgであったという事実によりもたらされた。Ａｔｔｏ６１０ダイからＡｔｔｏ４２５ダイへの切り替えは、シグナル感度の低下およびクロマトグラフィーの分割力の低下を伴うことなく、カラムへの１１mgまでのはるかにより多量のローディングを可能とする。ｓｉＲＮＡの検出限界の絶対量は依然としてカラム上で２５０amolのオリゴヌクレオチドである。これにより、ｓｉＲＮＡの組織中濃度に関する検出下限は約４００pg/gとなる（図９）。
【００８４】
以下の表９において、同じ組織試料であるが２つの別々の組織調製物の２つのクロマトグラフィー実行間の比較が示されている。上のクロマトグラムにおいては、３mgの肝臓がＨＰＬＣカラム上にローディングされ、下のクロマトグラムにおいては１１．２mgがローディングされた。
【００８５】
結果は２つの異なる組織溶解液から作成されたが、計算された組織中ｓｉＲＮＡおよび代謝物の濃度は、小さな相違しか示さない：
【００８６】
【表１５】
2012505644.tif 000017
【図１】
2012505644.tif 000018
【図２】
2012505644.tif 000019
【図３】
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【図４】
2012505644.tif 000021
【図５】
2012505644.tif 000022
【図６】
2012505644.tif 000023
【図７】
2012505644.tif 000024
【図８】
2012505644.tif 000025
【図９】
2012505644.tif 000026
【配列表】
2012505644000001.app
【国際調査報告】
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