(57)【要約】  本発明は、プロリンから誘導され、最終的にポリエステルの熱重縮合（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）反応を行う２段階法により合成される連続ポリ（エステルアミド）を提供する。この方法により調製されるポリマーの分子量は、１４，０００Ｄａ〜約７７，０００Ｄａである。本発明のプロリンベースのＰＥＡの熱的特性を解明したところ、、そのガラス転移温度は、内部に水素結合がないため、他のα−アミノ酸ベースのポリ（エステルアミド）より低かった。こうしたプロリンベースのＰＥＡは水溶液中でナノ粒子として集まり、疎水性小分子薬剤および生物学などの様々なカチオンおよび生物学と錯体を形成する。このため本発明のプロリンベースのＰＥＡは、分子量が１４，０００Ｄａ〜約７７，０００Ｄａの範囲のポリマーを必要とする薬物送達分野、および疎水性薬剤を送達するためのナノ粒子の製造に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般構造式（Ｉ）に記載される化学式を持つ少なくとも１種の生分解性ポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）ポリマー、
【化１】
2012505957.tif 000016
（式中、ｎは約３０〜約１７０の値をとり；Ｒ１は独立に（Ｃ４〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニレンまたはこれらの組み合わせから選択され；Ｒ２は独立に（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記ポリマーの両末端基はヒドロキシル基である）；
または下記構造式（ＩＩ）に記載される化学式を持つＰＥＡコポリマー：
【化２】
2012505957.tif 000017
（式中、ｎは約３０〜約１７０の値をとり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり；ｐは約０．９〜０．１の範囲であり；Ｒ１は独立に（Ｃ４〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ４〜Ｃ１２）アルケニレンまたはこれらの組み合わせから選択され；Ｒ２は各々独立に（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され；ｍモノマーのＲ３は各々独立に水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからなる群から選択され、前記コポリマーの両末端基はヒドロキシル基である）
を含む組成物。
【請求項２】
前記Ｒ１は独立に（Ｃ６〜Ｃ８）アルキレンから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＥＡポリマーの平均分子量（Ｍｗ）は約１４，０００Ｄａ〜約７７，０００Ｄａの範囲にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＡポリマーは緩衝液溶液中でＺｎ２＋およびＣａ２＋と錯体形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物はナノ粒子として製造される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
疎水性薬剤、および前記疎水性薬剤を封入するナノ粒子としての水溶液中の前記組成物の微小沈殿物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＰＥＡポリマーは式（Ｉ）で表され、式中、Ｒ１は（Ｃ）８アルキレン、Ｒ２は（Ｃ）６アルキレン、ｎは１１０〜１５０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ナノ粒子は緩衝液溶液中でＺｎ２＋およびＣａ２＋を封入する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリマーの末端基はエチレンジアミン四酢酸と反応して前記ポリマーをエンドキャップする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記エンドキャップされたポリマーはさらにポリ（エチレングリコール）ポリマーと反応して金属キレートＡＢＡ−トリブロックポリマーを形成する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記疎水性薬剤は前記ナノ粒子の３０〜４０重量％のドセタキセルまたは２０〜３０重量％のラパマイシンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
疎水性薬剤を被検体に投与する方法であって、
請求項６に記載のＰＥＡポリマーのナノ粒子に前記疎水性薬剤を封入すること、および
前記ナノ粒子を前記被検体に投与すること
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の少なくとも１種のＰＥＡポリマーを合成する方法であって：
エステル交換反応に好適な条件下、水溶液中でα，ωＣ２〜Ｃ２０二酸クロリドまたはその活性ジ−エステルとＣ４〜Ｃ２０ジオールの熱縮合から誘導されたモノマーとを２つのプロリン分子と接触させること、および
前記エステル交換反応により形成された前記ＰＥＡポリマーを前記水溶液から分離すること
を含む、方法。
【請求項１４】
前記エステル交換反応の前記条件は真空下での約２２０℃〜約２４０℃の範囲の温度を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジオールはＨＯ（ＣＨ２）６〜８ＯＨである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
形成された前記ＰＥＡポリマーの平均分子量（Ｍｗ）は約１４，０００Ｄａ〜約７７，０００Ｄａの範囲にある、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[0001]バイオマテリアルを埋入または注入すると著しい炎症および免疫学的問題に直面するため、これまで、生物学的に永久的に不活性なポリマーの同定に焦点が当てられてきた。一方、治療薬剤および生物学的製剤の送達など多くの分野においては、十分に再吸収可能なポリマーが求められている。特性が十分に解明されたポリエステル、たとえばポリ（乳酸−コ−グリコール酸）は過去３０年間、分解性ポリマーのゴールドスタンダードであったが、最近になって、酵素的に分解されるタンパク質様ポリマーの設計および開発を利用した新しいアプローチが有望とされている。
【０００２】
[0002]アミノ酸残基が二官能性炭化水素スペーサーで隔てられた、アミノ酸ベースの合成コポリマーにポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）があり、二酸およびジオールから誘導される。こうしたアミノ酸に富んだポリマーは、天然タンパク質に似た特性を有しており、その結果、ポリマー鎖間、およびポリマーと内包された治療薬との間、またはポリマーと水との間の水素結合能が高い。リジン、チロシンまたはアスパラギン酸などの三官能性アミノ酸がそうしたポリマー骨格内の側面に取り込まれると、その後、治療用化合物または他の基とコンジュゲートして所望の構造または機能特性を与える遊離のカルボキシラート部分が得られる。さらに、炭化水素スペーサーを用いれば、ＰＥＡに望ましい溶解性プロファイル、機械的特性および加工性も与えられる。
【０００３】
[0003]様々な長さおよび柔軟性のジオールまたは二酸単位を適切に導入すると、ＰＥＡに非常に広範囲の機械的および熱的特性を与えることができる（Ｚ．ゴムラシビリ（Ｚ．Ｇｏｍｕｒａｓｈｖｉｌｉ）ら：生物医学用途のポリマー（Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａ．マハパトロ（Ａ．Ｍａｈａｐａｔｒｏ）ら編、米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントンＤ．Ｃ．（２００８年）、ｐ．１０−２６）。こうした特性を利用すれば、ＰＥＡコポリマーを、たとえば薬剤溶出ステント用のエラストマーコーティングとして、さらには親油性薬剤および生物学的巨大分子など様々なマトリックス型治療薬の送達用の微粒子およびナノ粒子として製造することが可能になる。たとえば、抗原の遊離アミノ基と標準的なＰＥＡコポリマーのカルボキシラートコンジュゲーション点との間でアミド結合を形成して、防御免疫応答の惹起を目的としたタンパク質またはペプチドとコポリマーとをコンジュゲートすることができる。
【０００４】
[0004]一般に、標準的なＰＥＡポリマーは、二酸クロリド（または活性ジ−エステル）、および２つのアミノ酸を持つ特定のジオールの縮合から得られたモノマーの界面または溶液活性重縮合により調製することができる。しかしながら、界面重縮合は、考慮する必要がある因子が多いため、制御および最適化しにくい場合があることがよく知られている。さらに、生成物のスケールアップおよび精製には、直鎖および高分子量ポリマーの最適収率など個々の目的を達成するための正確な制御も必要となる。
【０００５】
[0005]アミノ酸残基の主鎖の水素結合ポテンシャルを小さくすることは十分に確立した科学技術であり、一般的な例として、アルコールによるカルボニル酸素の可逆的キャッピング、Ｈｍｂなどの好適な脱離基によるアミド窒素の可逆的キャッピング、またはメチル基によるアミド窒素の不可逆的保護（いわゆる「Ｎ−メチル化」）がある。こうしたキャッピングまたは保護戦略により第二級アミンは第三級になり、したがって非反応性になる。
【０００６】
[0006]２０種の一般的な天然アミノ酸の中で遊離アミノ酸のプロリンのアミンだけが二級であるため、アミノ酸残基が重合すると三級になる。このためプロリンは本質的に、他の１９種の一般的な天然アミノ酸に比べて水素結合ポテンシャルが小さい。こうした作用を得る際に、遊離プロリンアミノ酸またはプロリン残基を誘導体化する必要はない。
【０００７】
[0007]しかしながら、プロリンの第二級アミンの反応性はロイシン、グリシンなどのようなアミノ酸の第一級アミンの反応性に比べて低いため、上記の方法を用いて合成されたＰＥＡポリマーの骨格に組み込むアミノ酸としてプロリンを使用することは、困難であることが立証されている。
【０００８】
[0008]それ故、当該技術分野においては、ＰＥＡポリマーの製造において第二級アミン、特にプロリンを含むアミノ酸を組み込む新規な改良された方法と、製造過程でプロリンの環構造が破壊されないようなポリマーとが求められている。さらに、当該技術分野においては、金属イオンをキレートし、したがって生物学的製剤と錯体を形成して、ポリマー送達組成物に使用できる新規な改良された生分解性ポリマーも求められている。
【０００９】
［発明の概要］
[0009]本発明は、Ｌ−またはＤ−プロリン、および他の疎水性α−アミノ酸を含むＰＥＡコポリマーをベースにしたポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）ポリマーを提供する。本発明のポリマーは、従来のポリ（α−アミノ酸）と異なり、有利な水溶液挙動、および他のキレート剤の基または巨大分子に結合部位を与えるのに適した決められた末端基を有する。
【００１０】
[0010]したがって、一実施形態では、本発明は、下記一般構造式（Ｉ）に記載される化学式を持つＰＥＡポリマー、
【化１】
2012505957.tif 000002
（式中、ｎは約３０〜約１７０の値をとり；Ｒ１は独立に（Ｃ４〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニレンまたはこれらの組み合わせから選択され；Ｒ２は独立に（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され、ポリマーの両末端基はヒドロキシル基である）；
または下記構造式（ＩＩ）に記載される化学式を持つＰＥＡコポリマー：
【化２】
2012505957.tif 000003
（式中、ｎは約３０〜約１７０の値をとり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり；ｐは約０．９〜０．１の範囲であり；Ｒ１は独立に（Ｃ４〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ４〜Ｃ１２）アルケニレンまたはこれらの組み合わせから選択され；Ｒ２は各々独立に（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され；ｍモノマーのＲ３は各々独立に水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからなる群から選択され、コポリマーの両末端基はヒドロキシル基である）
を含む生分解性ポリマー組成物を提供する。
【００１１】
［発明の詳細な説明］
[0011]本発明は、線状ポリマーにおいて十分な鎖長を得るのに限界があること、および第二級アミンを含むジアミンモノマーの精製が困難であることが、２段階のポリエステルの熱重縮合（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）法を利用することにより解決され得るという発見に基づく。具体的には、プロリンベースのＰＥＡの合成において、ビス（Ｌ−プロリン）−α，ω−ジオールジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩を使用することができる。このプロセスを、以下のスキーム１に模式的に示す：
【化３】
2012505957.tif 000004
ポリエステル重縮合反応は溶融プロセスであり、真空下で２２０℃〜２４０℃の高温を必要とする。本発明により形成されたＰＥＡポリマーおよび、特に、プロリンベースのＰＥＡのプロリン環が、この高温ポリエステル重縮合反応に必要な高温に耐えるというのは、本発明の驚くべき結果である。
【００１２】
[0012]本発明は、Ｌ−またはＤ−プロリンをベースにしたポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）ポリマー、および他の疎水性α−アミノ酸を含むそのコポリマーを提供する。本発明のポリマーは、従来のポリ（α−アミノ酸）と異なり、有利な水溶液挙動、および他のキレート剤の基または巨大分子に結合部位を与えるのに適した決められた末端基を有する。
【００１３】
[0013]したがって、一実施形態では、本発明は、一般構造式（Ｉ）に記載される化学式を持つＰＥＡポリマー、
【化４】
2012505957.tif 000005
（式中、ｎは約５〜約１５０の値をとり；Ｒ１は独立に（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレンまたはこれらの組み合わせから選択され；Ｒ２は独立に（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され；ポリマーの両末端基はヒドロキシル基である）；
または下記構造式（ＩＩ）に記載される化学式を持つＰＥＡコポリマー：
【化５】
2012505957.tif 000006
（式中、ｎは約５〜約１５０の値をとり、ｍは約０．１〜０．９の範囲であり；ｐは約０．９〜０．１の範囲であり；Ｒ１は独立に（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレンまたはこれらの組み合わせから選択され；Ｒ２は各々独立に（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ４）アルキルオキシ（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され；ｍモノマーのＲ３は各々独立に水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからなる群から選択され；ＰＥＡコポリマーの両末端基はヒドロキシル基である）
を含む生分解性ポリマー組成物を提供する。
【００１４】
[0014]ポリエステルの熱重縮合（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）反応を用いてＰＥＡポリマーおよびコポリマーを調製する本発明の方法では、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）に記載する化学式を持ち、ポリマーの両末端基が以下の式（ＩＩＩ）に示すようにヒドロキシル基である、線状（すなわち連続）ＰＥＡポリマーが得られることを強調しておく必要がある。こうしたヒドロキシ末端基はその後、他のキレート剤分子および生物学的製剤などの薬剤または巨大分子と容易にコンジュゲートすることができる。
【化６】
2012505957.tif 000007
【００１５】
[0015]一実施形態では、本発明のプロリンベースのＰＥＡポリマーは分子量が約１４，０００Ｄａ〜約７７，０００Ｄａの範囲である。
【００１６】
[0016] 本明細書の構造式について使用する場合、「アリール」という用語は、フェニル基、または環原子数が約９〜１０のオルト融合した二環式の炭素環式基で、少なくとも１つの環が芳香族であるものを示す。ある種の実施形態では、環原子の１つまたは複数がニトロ、シアノ、ハロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシの１つまたは複数で置換されていてもよい。アリールの例として、フェニル、ナフチルおよびニトロフェニルがあるが、これに限定されるものではない。
【００１７】
[0017]本明細書で使用する場合、「アルケニレン」という用語は、主鎖または側鎖中に少なくとも１つの不飽和結合を含む、二価の分枝または非分枝の炭化水素鎖を意味する構造式をいう。
【００１８】
[0018]本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は、１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基をいう。
【００１９】
[0019]本明細書で使用する場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基をいう。
【００２０】
[0020]本明細書で使用する場合、「アリール」とは、炭素原子数が６〜１４の範囲の芳香族基をいう。
【００２１】
[0021]本発明の組成物に使用される本発明のプロリンベースのＰＥＡポリマーは、ポリエステルの熱重縮合（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によるポリマーである。こうしたポリ−エステル化ポリマーを説明する際の式（ＩＩ）の「ｍ」と「ｐ」との比率は、無理数と定義される。また、「ｍ」および「ｐ」が各々任意のポリ−エステル化ポリマー内のある範囲を占める場合、その範囲は、一対の整数により定義することができない。ポリマー鎖はそれぞれ、ビス（Ｌ−プロリン）−α，ω−ジオールジエステル（ｉ）および方向性のないアミノ酸（たとえばリジン）モノマー残基（ｉｉ）がすべてポリアミノ酸モノマー残基（ｉｉｉ）によりそれ自体に、あるいは、相互に結合するという規則により結合されたモノマー残基の列である。したがって、ｉ−ｉｉｉ−ｉ；ｉ−ｉｉｉ−ｉｉ（またはｉｉ−ｉｉｉ−ｉ）およびｉｉ−ｉｉｉ−ｉｉという直線的な組み合わせしか形成されない。その結果、これらの組み合わせはそれぞれ二酸モノマー残基（ｉｉｉ）によりそれ自体に、あるいは、相互に結合している。このため、各ポリマー鎖は、モノマーｉ、ｉｉおよびｉｉｉの整数からなるモノマー残基の、統計的だが非ランダムの列である。しかしながら、一般に、任意の実際の平均分子量（すなわち、差し支えない平均的な長さ）のポリマー鎖の場合、式（ＩＩ）のモノマー残基「ｍ」および「ｐ」の比率は整数（有理整数）にはならない。さらに、多分散ポリマー鎖をすべてエステル化する場合、鎖全体を平均した（すなわち平均鎖長に補正した）モノマーｉ、ｉｉおよびｉｉｉの数も整数にはならない。つまり、この比率は無理数（すなわち、有理数ではない任意の実数）しかとれないことになる。本明細書に使用する用語としての無理数は、ｎおよびｊが整数であるｎ／ｊという形をとらない比率から導かれる。
【００２２】
[0022]本明細書で使用する場合、「アミノ酸」および「α−アミノ酸」という用語は、アミノ基、カルボキシル基および本明細書に定義されるＲ３基などのペンデントのＲ基を含む化学化合物を意味する。本明細書で使用する場合、「生物学的α−アミノ酸」という用語は、フェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニンまたはこれらの混合物から選択され、合成に使用されるアミノ酸（類）を意味する。本明細書で使用する場合、「方向性のないアミノ酸」という用語は、Ｒ基（たとえば式ＩＩのＲ５）をポリマー骨格に挿入するように、α−アミノ酸から得られるポリマー鎖内の化学部分を意味する。
【００２３】
[0023]式ＩおよびＩＩの本発明のプロリンベースのＰＥＡは、アミノ酸プロリンに基づくポリマー骨格に、２つのペンダント基−（ＣＨ２）３−が環化して下記構造式（ＩＶ）に記載する化学構造を形成している構造を含む。
【化７】
2012505957.tif 000008
このため、環化したペンダント基は、ピロリジン−２−カルボン酸（プロリン）に類似したα−イミノ酸を形成している。
【００２４】
[0024]本発明のプロリンベースのポリマーは、スキーム２に概説された２段階のポリエステルの熱重縮合（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）反応を用いて調製することができ、この場合、エステル交換反応に好適な条件下、非プロトン性溶媒を含む水溶液中、たとえば真空下、２２０℃〜２４０℃温度でα，ωＣ２〜Ｃ２０二酸クロリドまたはその活性ジ−エステルを、２つのプロリン分子とＣ４〜Ｃ２０ジオールとの熱縮合から誘導したモノマーと接触させる。次いで当該技術分野において公知の方法を用いて、本明細書の実施例に記載されているように、エステル交換反応により形成された生成物のプロリンベースのＰＥＡポリマーを水溶液から分離する。
【００２５】
[0025]ビス（プロリン−アシル）−ジエステルモノマーおよびそれから誘導されたポリマーに内在するエステル結合は、生体酵素により加水分解され、α−アミノ酸およびプロリンを含む無毒の分解生成物を形成することができる。
【００２６】
[0026]別の一形態では、式ＩＩの本発明のポリマーの合成に使用するコモノマーの製造に際し、プロリンの他に生物学的α−アミノ酸を使用してもよい。たとえば、式ＩＩのＲ３がＣＨ２Ｐｈである場合、合成に使用する生物学的α−アミノ酸はＬ−フェニルアラニンである。Ｒ３がＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である別の形態では、ポリマーは生物学的α−アミノ酸Ｌ−ロイシンを含む。本明細書に記載するようなモノマー内のＲ３を変化させることにより、たとえば、グリシン（Ｒ３がＨである場合）、アラニン（Ｒ３がＣＨ３である場合）、バリン（Ｒ３がＣＨ（ＣＨ３）２である場合）、イソロイシン（Ｒ３がＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である場合）、フェニルアラニン（Ｒ３がＣＨ２Ｃ６Ｈ５である場合）、メチオニン（Ｒ３が−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３である場合）、Ｌ−リジン（Ｒ３が（ＣＨ２）４ＮＨ２である場合）、Ｄ−またはＬ−アルギニン（Ｒ３が（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である場合）、Ｌ−ヒスチジン（Ｒ３が４−メチレンイミダゾールである場合）、アスパラギン酸（Ｒ３がＣＨ２ＣＯＯＨである場合）、グルタミン酸（Ｒ３が（ＣＨ２）２ＣＯＯＨである場合）およびこれらの組み合わせなど、他の生物学的α−アミノ酸を使用してもよい。なお別の代替の実施形態では、式（ＩＩ）の本発明のプロリンベースのポリマーおよびその組成物の製造に使用されるα−アミノ酸はすべてプロリンで、Ｒ３は−（ＣＨ２）３−であり、そのＲ３は環化して、本明細書に記載するような構造式（ＩＩＩ）に記載される化学構造を形成している。
【００２７】
[0027]なお別の実施形態では、本発明は、疎水性薬剤または生物学的製剤など１つまたは複数の治療用カーゴ分子を被検体の体内部位に送達する方法を提供する。この実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つのカーゴ分子が封入されているポリマーナノ粒子の分散液として製剤化した発明の組成物を被検体体内のインビボ部位に注射する。注射されたナノ粒子は、組成物が酵素作用により生分解するにつれ、複合型の治療用カーゴ分子をゆっくりと放出する。本発明のナノ粒子は、緩衝液溶液のＺｎおよびＣａイオンを封入することもできる。
【００２８】
[0028]本発明のナノ粒子の分散液は、非経口的に、たとえば皮下、筋肉内に注射しても、器官などの体内部位に注射してもよい。生分解性ナノ粒子は、全身性の標的化した徐放放出ができるよう、少なくとも１種、たとえば２種類のカーゴ分子を循環血液に送るキャリアとして働く。こうした目的のため、サイズ範囲が約１０ｎｍ〜約５００ｎｍの本発明のポリマー粒子であれば、血液中に入ると考えられる。
【００２９】
[0029]本発明の組成物に使用される生分解性ポリマーは、ポリマーのビルディングブロック、特に本発明の組成物に含ませるアミノ酸の選択によりポリマーの生分解速度を調整して、カーゴ分子を所定の期間持続的に送達することができる。
【００３０】
[0030]プロリンベースのＰＥＡポリマーに使用するのに好適な保護基として、トシル塩（たとえばＴｏｓ−ＯＨ）または当該技術分野において公知の別のものが挙げられる。一般式（ＩＩＩ）の好適な１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールは、Ｄ−グルシトール、Ｄ−マンニトールまたはＬ−イジトールなどの糖アルコールから得られるものを含む。本発明のプロリンベースのポリマー送達組成物の製造に使用される１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの、現時点で好ましいの二環式フラグメントとして、ジアンヒドロソルビトールが挙げられる。
【００３１】
[0031]別の一実施形態では、式ＩＩのＲ３がＣＨ２Ｐｈであれば、合成に使用されるα−アミノ酸はＬ−フェニルアラニンである。Ｒ３がＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２である別の実施形態では、ポリマーはα−アミノ酸ロイシンを含む。Ｒ３を変化させることにより、たとえば、グリシン（Ｒ３がＨである場合）、アラニン（Ｒ３がＣＨ３である場合）、バリン（Ｒ３がＣＨ（ＣＨ３）２である場合）、イソロイシン（Ｒ３がＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３である場合）、フェニルアラニン（Ｒ３がＣＨ２−Ｃ６Ｈ５である場合）、リジン（Ｒ３が−（ＣＨ２）４−ＮＨ２である場合）；またはメチオニン（Ｒ３が−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３である場合）など、他のα−アミノ酸を使用してもよい。
【００３２】
[0032]本発明のプロリンベースのＰＥＡは、他のアミノ酸ポリマーで見られるような水素結合が存在しないため独特なものである。このため、こうしたポリマーはガラス転移温度（Ｔｇ）が低い。さらに、水溶液挙動も普通と異なる。本発明のプロリンベースのポリマーは水溶液中で安定なナノ粒子を形成し、ナノ粒子が沈殿すると水溶液中に存在するカチオンおよび疎水性薬剤と結合したり、これを封入したりする。たとえば、緩衝液溶液中にＺｎ２＋またはＣａ２＋が存在すると、本発明のポリマーから水溶液中に沈殿したポリマーナノ粒子に結合するか、これに封入される可能性がある。
【００３３】
[0033]また、ナノ粒子については他のアミノ酸ベースのＰＥＡポリマーからも製造できるものの、本明細書の実施例２および３に記載する８−Ｐｒｏ（６）ポリマーなど、加熱エステル化（ｔｈｅｒｍａｌ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により形成される本発明のプロリンベースのＰＥＡは、疎水性薬剤の取り込み効率が著しく向上することが明らかになっている。たとえば、直鎖状のアミノ酸列にプロリンを含まない標準的なＰＥＡを本発明のポリマーの代わりに用いてドセタキセルナノ粒子の製造を試みたが、式Ｖａ（ＰＥＡ  Ｉ．Ａｃ．Ｈ）およびＶｂ（ＰＥＡ−ＩＶ．Ｈ）の標準的なＰＥＡでは、水溶液からのドセタキセルの回収率が＜３０％となり、本明細書の実施例２に記載されているような８−Ｐｒｏ（６）で得られた約８０％を大きく下回った。
【化８】
2012505957.tif 000009
式中、ｍ＝０．７５、ｐ＝０．２５、ｎ＝１５〜４５；
【００３４】
[0034]ビス−Ｌ−プロリン含有ジオールジエステルモノマーを含む本発明のポリマーの場合、ポリマーの製造に使用する直鎖状のα−アミノ酸列（式ＩＩのＲ３の選択を含む）およびジオールにどれを選択するかにより、本発明のプロリンベースのポリマーの電気特性が決定される。たとえば、得られるポリマーを水溶性にすることができる。モル分率１：１（カチオン：プロリン）でカチオンをキレート化すると、直鎖状のイミン基が中性になるため、カチオン結合ポリマーは疎水性部と中性極性部とを交互に有して一列に並ぶ。得られるカチオン結合ポリマーは、緩衝水溶液中で容易にナノ粒子に縮合される。
【００３５】
[0035]以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００３６】
［実施例１］
生成物の特徴付け
[0036]以下の標準的な化学的方法によりモノマーおよびポリマーの化学構造の特徴付けを行った；ＮＭＲスペクトルは、ブルカ（Ｂｒｕｋｅｒ）ＡＭＸ−５００スペクトロメーター（カリフォルニア州、サンディエゴのヌメガ・Ｒ．ラブス・インク製（Ｎｕｍｅｇａ  Ｒ．Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用い、１Ｈ  ＮＭＲ分光法用に５００ＭＨｚで運転して記録した。溶媒としてＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−ｄ６（マサチューセッツ州アンドーバーのケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ・インク（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）製）を使用し、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準とした。
【００３７】
[0037]合成したモノマーの融点は、メトラ−トレド（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）ＦＰ６２自動融点測定装置（オハイオ州コロンバス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ））を用いて測定した。合成したモノマーおよびポリマーの熱的特性については、示差走査熱量計（ＤＳＣ）メトラ−トレドＤＳＣ  ８２２ｅを用いて特徴付けを行った。サンプルはアルミニムパンに入れた。測定は窒素気流下、昇温速度１０℃／ｍｉｎで行った。
【００３８】
[0038]合成したポリマーの数平均分子量および重量平均分子量（ＭｗおよびＭｎ）と分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）とを、高圧液体クロマトグラフィーポンプ、ウォーターズ２４１４屈折率検出器を備えたモデル（Ｍｏｄｅｌ）５１５ゲル浸透クロマトグラフィー（マサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ・アソシエート・インク（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）製）により測定した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）に溶かした０．１％のＬｉＣｌ溶液を溶離液（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）として使用した。Ｓｔｙｒａｇｅｌ（登録商標）ＨＲ  ５Ｅ  ＤＭＦ型カラム（ウォーターズ製）を２つ連結し、ポリスチレン標準品で校正した。ポリマーの低分子画分の質量スペクトルは、アプライド・バイオシステムズ・ボイジャー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ）ＤＥ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置（カリフォルニア州サンディエゴのスクリプス・センター・オブ・マス・スペクトロスコピー（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用いて測定した。マトリックスとして２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）または３−インドールを使用した。
【００３９】
[0039]粒度およびゼータ電位は、動的光散乱装置ゼータナノサイザー（Ｚｅｔａｎａｎｏｓｉｚｅｒ）（英国のマルバーン・インストルメンツ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，（ＵＫ）製）を用いて測定した。
【００４０】
モノマーの合成
[0040]ビス（Ｌ−プロリン）−α，ω−ジオールジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩、式ＶＩ；
【化９】
2012505957.tif 000010
α−アミノ酸について以前記載されたのと同様の手順（Ｒ．カツァラバ（Ｒ．Ｋａｔｓａｒａｖａ）らジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス・パートＡ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：ポリマー・ケミストリー（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９９９年）第３７巻：ｐ．３９１−４０７）を用いてＬ−プロリンと脂肪族ジオールとのエステル化反応を行った。
【００４１】
[0041]Ａ）ビス（Ｌ−プロリン）−１，６−ヘキサンジオールジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩の合成（ｎ＝６、式４）。Ｄｒｉｅｒｉｔｅ（登録商標）乾燥チューブ、ディーンスターク冷却器およびオーバーヘッドスターラーを備えた３口丸底フラスコに、１，６−ヘキサンジオール（１７．８ｇ、０．１５２ｍｏｌ）、Ｌ−プロリン（３６．８１ｇ、０．３２ｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（６４ｇ、０．３３５ｍｏｌ）およびトルエン（１．５Ｌ）を仕込んだ。この反応混合物を水が蒸留されなくなるまで２４時間還流させた。次いでこれを室温まで冷却し、トルエン層をデカンテーションで除き、油層を２００ｍＬのエーテルでリンスし、真空乾燥させた。次いで様々なモノマーをイソプロパノール（１：１、ｗ／ｗ）に再溶解し、３Ｌのエーテルに注いだ。最後に、吸湿性生成物を水に溶解し、凍結乾燥器で乾燥させ、続いてＰ２Ｏ５を用いて真空オーブンで乾燥させた。収率：６２％、ＭＳ：Ｃ３０Ｈ４４Ｎ２Ｏ１０Ｓ２［６５６．２］；（−Ｑ１）：６５５．７。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ  ７．６６（ｄ，４Ｈ，Ａｒ），７．３０（ｄ，４Ｈ，Ａｒ），４．３９（ｔ，２Ｈ，＝ＮＨ２＋−ＣＨ−ＣＯ），４．１７（ｍ，４Η，ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−），３．３７（ｍ，４Η，＝ＮＨ２＋−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．３６−２．０７（ｍ，ｍ，４Ｈ，ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−），２．３３（ｓ，６Η，Ｍｅ），１．９９（ｍ，４Ｈ，＝Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２），１．５９（ｍ，４Η，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−），１．２９（ｔ，４Η，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【００４２】
[0042]Ｂ）ビス−（Ｌ−プロリン）−１，３−プロパンジオールジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩の合成物（ｎ＝３、式ｘ）を上述のＡ）に記載したのと同様の手順を用いて調製した。吸湿性の白色結晶材料を収率９８％で回収した；１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ  ７．６８（ｄ，４Ｈ，Ａｒ），７．３６（ｄ，４Ｈ，Ａｒ），４．４８（ｔ，２Ｈ，＝ＮＨ２＋−ＣＨ−ＣＯ），４．３３（ｍ，４Η，ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−），３．４１（ｍ，４Η，＝ＮＨ２＋−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．４３−２．１５（ｍ，ｍ，４Ｈ，ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−），２．３８（ｓ，６Η，Ｍｅ），２．０８（ｍ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），２．０５（ｍ，４Ｈ，＝ＮＨ２＋−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）。
【００４３】
溶液重縮合のための脂肪族ジカルボン酸の活性ジ−エステルの合成（スキーム１の化合物２）
[0043]活性エステルジ−オキシスクシンイミジルセバカートを以前記載されたように調製（Ｒ．Ｄ．カツァラバら  ジカルボン酸の活性ビス−オキシスクシンイミドエステルを用いたポリアミドの合成した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙａｍｉｄｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｃｉｖａｔｅｄ  ｂｉｓ−ｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ｏｆ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）。ヴィソコモレクリャーリニィ・ソエディニーニェ・セリアＡ（Ｖｙｓｏｋｏｍｏｌｅｋｕｌｙａｒｎｙｅ  Ｓｏｅｄｉｎｅｎｉｙａ，Ｓｅｒｉｙａ  Ａ）（１９８４年）第２７巻（７）：ｐ．１４８９−１４９７）。
【００４４】
[0044]Ａ）ジ−ペンタフルオロフェニルセバカートの合成：２１．７ｇ（０．１１８ｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールおよび１６．４３ｍＬ（０．１１８ｍｏｌ）のトリエチルアミンを１２０ｍＬの酢酸エチルに溶かした冷却溶液（０℃）に、セバコイルクロリド１２ｍＬ（０．０５６ｍｏｌ）の溶液を３０分かけて滴下して加えた。その後、この反応混合物を室温（ｒ．ｔ．）まで加温し、８時間撹拌し、濾過した。酢酸エチル溶液を蒸発させ、得られた固体生成物をエーテルで洗浄し、乾燥させた。アセトンで再結晶後の収量は１０．７ｇ、Ｍｐ＝６２．６℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６）：δ  ２．７７（ｔ，４Ｈ），１．６７（ｑ，４Ｈ）１．３８−１．３２（ｍ，８Ｈ）。元素分析（Ｅｌｅｍ．Ａｎａｌ．）Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ１６Ｆ１０Ｏ４（５３４．３４）：Ｃ，４９．４５；Ｈ，３．０２；Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，４９．２１  Ｈ，２．５７。
【００４５】
ポリエステルの熱重縮合（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）のためのモノマーの合成：
【化１０】
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[0045]ビス−（Ｌ−プロリル）−セバカミドのジ−メチルエステルの合成、（式ＶＩＩ、ｎ＝８）。添加漏斗およびマグネチックスターラーを備えた２５０ｍＬの丸底フラスコをアルゴンガスでパージし、Ｌ−プロリンメチルエステルヒドロクロリド８．６２ｇ（６６．７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１９ｍＬ（０．１３６ｍｏｌ）および４０ｍＬのクロロホルムを仕込み、氷浴に浸した。次いで７．０９ｍＬ（３３．２ｍｍｏｌ）のセバコイルクロリドを８ｍＬのクロロホルムで希釈し、４５分間ゆっくりと加えて反応温度を＜８℃に維持した。この反応を室温でさらに１２時間継続した。クロロホルム溶液を１００ｍＬの水で、次いでブライン２×１００ｍＬおよび無水Ｎａ２ＳＯ４で抽出し、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた粘稠液を、酢酸エチル／ヘキサン４：６ｖ／ｖ、次いで８：２ｖ／ｖを用いてシリカカラムで精製した。２〜３日冷蔵庫に静置後、淡黄色の結晶が形成され、最終収量は７．９１ｇ（５６％）であった；Ｍ．ｐ．４４．７℃（ＤＳＣ，２°／ｍｉｎ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ４．２６（ｄｄ，２Ｈ，＝Ｎ−ＣＨ−ＣＯ），３．５９（ｓ，６Η，Ｍｅ），３．４９（ｍ，４Ｈ，＝Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ−），２．２５（ｍ，４Ｈ，ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２），２．１４−１．８０（ｍ，ｍ，４Ｈ，ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−），１．８９（ｍ，４Η，＝Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２），１．４６（ｍ，４Η，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ），１．２５（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ）。
【００４６】
[0046]ビス−（Ｌ−プロリル）−アジパミドのジ−メチルエステルの合成、（式５、ｎ＝４）：アジポイルクロリドを用いて、以前記載された手順と同様のクロロホルム中で合成を行った。ヘキサン／酢酸エチル溶離液を６：４ｖ／ｖから２：８ｖ／ｖに変化させて、形成された橙色の油をカラムで精製した。冷蔵庫に保存してから３〜４日後、黄色の結晶が形成された；Ｍｐ＝６２℃、（ＤＳＣ，２℃／ｍｉｎ）。生成物収率は６０〜６７であった（ＤＭＳＯ−Ｊｄ６）：δ  ５４．２６（ｑ，２Ｈ，＝Ｎ−ＣＨ−ＣＯ），３．５９（ｓ，６Η，Ｍｅ），３．５０（ｍ，４Ｈ，＝Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ−），２．２７（ｍ，４Ｈ，ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２），２．１５−１．８１（ｍ，ｍ，４Ｈ，ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−），１．８９（ｍ，４Η，＝Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２），１．５１（ｍ，４Η，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ）。Ｅｌ．Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ１８Ｈ２８Ｎ２Ｏ６（３６８．１９）Ｃ，５８．６８；Ｈ，７．６６；Ｎ，７．６０；Ｆｏｕｎｄ  Ｃ，５８．５２；Ｈ，７．７１。
【００４７】
重合
界面でのポリアミド化（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｐｏｌｙａｍｉｄａｔｉｏｎ）
[0047]Ａ）ＰＥＡ  ８−Ｐｒｏ（６）の合成；（式Ｉ、Ｒ１＝（ＣＨ）８、Ｒ２＝（ＣＨ２）６、５．０ｇスケール）：炭酸ナトリウムの０．３２Ｍ水溶液２１．８ｍＬに、４．５７ｇ（６．９６６ｍｍｏｌ）のジエステル−ジアミン（ｎ＝６、式４）を溶解した。溶解したら、形成されたモノマー溶液をホモジナイザーに加え、１４ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶かした１．４８９ｍＬ（６．９６ｍｍｏｌ）のセバコイルクロリド溶液を加えた。過剰塩基（８当量）を使用したため反応物の均一撹拌を行わなかった。さらに５ｍＬのＤＣＭおよび５ｍＬの水を加え、この溶液を合計３０分間撹拌した。その後、有機層を酢酸で抽出した。この抽出をＤＣＭ層が清澄で透明になるまで繰り返した。次いで有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、定性濾紙で濾過した。次いでこのポリマー溶液を濃縮した。この粗生成物の重量平均Ｍｗは１３，４８１Ｄａ、多分散度は１．０４６であった。次いでこのポリマーを濃縮乾固し、さらに週末にかけて真空オーブンで乾燥させた。回収量は１．９６ｇ（３０．７％）であった。
【００４８】
[0048]長時間のジクロリドの添加によるポリマー、８−Ｐｒｏ（６）（５．０ｇスケール）の合成：溶液を合計５０分間撹拌したのと、最初の３０分間に０．５ｍＬのセバコイルクロリドを１０分間隔で加えた以外は、上記のＡ）に記載したのと同様の手順を用いた。その後有機層を酢酸で抽出して有機層から過剰な炭酸ナトリウムを除去した。この抽出をＤＣＭの曇りがなくなるまで繰り返し、清澄で透明な有機層を得、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、定性濾紙で濾過した。次いでポリマー溶液を濃縮して過剰なＤＣＭを除去した。次いでポリマーをＨ２Ｏに溶解し、透析バッグに入れて週末にかけてさらに精製を行った。粗生成物の重量平均Ｍｗは２００６０、多分散度は１．１７１であった。
【００４９】
溶液活性重縮合
[0049]式４のジアミンモノマーおよびセバシン酸の活性エステルの重縮合を行った。
【００５０】
[0050]一般的な手順：６ｍｍｏＬの上記の化合物１および６ｍｍｏＬの上記の化合物２を４．１２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かした撹拌混合物に、０．８８ｍＬ（６．３ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン（全量５．０ｍＬ、ｃ＝１．２ｍｏｌ／Ｌ）を乾燥窒素下で加え、６５℃で４８時間加熱した。すべての場合において、反応は均一に進行した。形成されたポリマーのおおよその分子量をＧＰＣにより測定した。得られた粘稠反応液を氷水に注ぎ、沈殿した生成物を濾別し、水で十分に洗浄した。得られた固体生成物を４０℃で真空乾燥させた。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
表１にまとめた結果から確認できるように、Ｌ−Ｐｒｏ（６）．ＴｏｓＯＨ（ｎ＝６、式４）モノマーとセバシン酸誘導体とを低温溶液重縮合させると、低ＭｗおよびＭｎのポリマーが得られるか（二酸誘導体がジ−ペンタ−フルオロフェニルセバカートの場合）、あるいは、ポリマーがまったく得られなかった（二酸誘導体がジ−オキシ−フルオロフェニルセバカートの場合）。
【００５３】
ポリエステルの熱重縮合（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）
[0051]ポリエステルの熱重縮合（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により合成されるプロリンベースのＰＥＡのプロセスおよび特性を説明するため、以下の実験を行い、ＰＥＡ−８−Ｐｒｏ（６）（式Ｉ、式中、（Ｒ１＝Ｃ８アルキレンおよびＲ２＝Ｃ６アルキレン、ｎ＝１１０〜１６０）を製造した。
【００５４】
[0052]マグネチックスターラーおよびアルゴンの出入口を備えた２５０ｍＬの３口丸底フラスコに、２．５９ｇ（２２ｍｍｏｌ、２．３当量）の１，６−ヘキサンジオール、ビス−（Ｌ−プロリル）−セバカミドの、４．０５ｇ（９．５４ｍｍｏｌ）のジ−メチルエステル（式５、ｎ＝８）および３２ｕＬのチタンブトキシド（０．０９５ｍｍｏｌ、０．０１当量）を仕込んだ。フラスコを、ゆっくりとしたアルゴン気流下、油浴中で１６０℃〜１９０℃にて２．５時間加熱した。次いでアルゴン出口を閉じ、浴の温度を２２５℃まで上昇させながら真空ポンプ（０．５ｍｍＨｇ）を取り付けた。ジオールを除去しやすくするため、反応を室温まで冷却して周期的に停止させ（３時間ごと）、次いでフラスコ壁に凝縮したジオールを取り除いた。重合の進行は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によりモニターした。
【００５５】
[0053]ジオールが留去されなくなるまで反応を延長させた（８時間）。次いで形成されたポリマーを１５ｍＬのクロロホルムに溶解し、２００ｍＬの酢酸エチル／エーテル１：１ｖ／ｖに沈殿させた。粘稠性の油生成物を集め、２０ｍＬのメタノールに再溶解し、０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターで濾過してから、テフロントレーにキャストし、真空乾燥させた。収量は３．６９ｇ（８１％）；Ｔｇ＝５℃（ＤＳＣ、１０°／ｍｉｎ）であった。
【００５６】
［実施例２］
金属キレート剤の末端基を用いたＰＥＡ  ８−Ｐｒｏ（６）ポリマーの合成
[0054]本発明のポリマーのヒドロキシル末端基に金属キレート分子が共有結合すると、本発明のＰＥＡポリマーの、様々なカチオン（たとえばＺｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋）との結合能力が変化する。こうした金属キレート化された末端基を持つ製剤は、金属結合アミノ酸、たとえばＨｉｓタグ付きタンパク質を含む様々な生物学的製剤に結合する。本発明のポリマーをエンドキャップするのに使用できる金属キレート分子の群として、たとえば、イミド酢酸、たとえば：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）がある。
【００５７】
[0055]ＰＥＡ  ８−Ｐｒｏ（６）ポリマーに対するＥＤＴＡの結合は、以下のスキーム３に図示するように達成された：
【化１１】
2012505957.tif 000013
ＰＥＡ  ８−Ｐｒｏ（６）−ＥＤＴＡ（５ｇスケール）：４０ｍＬのバイアル中で５．１ｇのＰＥＡ  ８−Ｐｒｏ（６）（Ｍｗ＝２８，０００Ｄａ）をアルゴン下で１５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。溶解したら、この溶液に４９ｕｌ（１当量）のＴＥＡを加えた。別の４０ｍＬのバイアル中で１０ｍＬのＤＭＦを０．９０６６ｇ（１０当量）のＥＤＴＡ−二無水物（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）製）に加えた。ＥＤＴＡ−ＤＡにポリマー溶液を撹拌しながら加え、この反応物をアルゴンでパージし、撹拌を一晩室温で続けた。次いで反応を４５℃で１時間加熱し、２００ｍＬの蒸留水に沈殿させた。この水をデカントし、ポリマーを２０ｍＬのメタノールに再溶解し、３ｇのＣａＣｌ２を含む１００ｍＬの水に沈殿させた。このポリマーは白色の粘着性固体として凝集沈殿し、その上清は最初濁っていたが、撹拌から約３０分後に清澄になった。この沈殿物を脱イオン水でリンスし、ＭｅＯＨに再溶解し、１．０ｕｍのＰＴＦＥフィルターでテフロントレーに濾過し、オーブンで６５℃にて乾燥させた。Ｍｗ＝３２，０００Ｄａ。収量は２．３ｇであった。エンドキャップしたポリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、ＥＤＴＡ末端が存在することが確認された。
【００５８】
[0056]活性ジ無水物末端基を含む、スキーム３のＰＥＡ  ８−Ｐｒｏ（６）−ＥＤＴＡ−ＤＡ中間体生成物は、別の親水性ポリマー、たとえば多糖類およびポリエチレングリコール：ｍＰＥＧ−ＯＨまたはｍＰＥＧ−ＮＨ２とｉｎ−ｓｉｔｕでさらにコンジュゲートさせ、スキーム４に示すように金属キレートＡＢＡブロックコポリマーを形成することができる。
【化１２】
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【００５９】
[0057]あるいは、本発明のＰＥＡ  ８−Ｐｒｏ（６）ポリマーは最初にコハク酸リンカーを介してＰＥＧ−ジオールと共有結合させてもよく、その後スキーム５に示すようにキレート剤分子でエンドキャップすることもできる：
【化１３】
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【００６０】
［実施例３］
ドセタキセルナノ粒子の調製
[0058]４．２９ｍｇのドセタキセルおよび１０．０ｍｇのＰＥＡ−８−Ｐｒｏ（６）、（式Ｉ、式中、（Ｒ１＝（ＣＨ２）８およびＲ２＝（ＣＨ２）６、ｎ＝１１０〜１６０）を１．００ｍＬのエタノールに共溶解した。このドセタキセル／ポリマー溶液を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む９．００ｍＬの撹拌水性緩衝液（この場合シトラート、ｐＨ  ７．０）にゆっくりと加えたところ、沈殿によりナノ粒子が形成された。このナノ粒子の半透明の分散液を再生セルロース透析チューブ（ＭＷＣＯ３５００Ｄａ）に移し、水性緩衝液（１００×ｖ／ｖ）に対して室温で１６時間透析して残留エタノールを除去した。ドセタキセル／ポリマー粒子の標準的な直径は２００〜２４０ｎｍ（ＰＤＩ＜０．１５）、ゼータ電位は−１７〜−２１ｍＶ（マルバーン製ゼータサイザーにより測定）であった。粒子の製造過程で本発明のＰＥＡポリマーを使用しなかった対照製剤では、ミクロンスケールの結晶しか得られなかった。
【００６１】
[0059]処理後にドセタキセルの７７％およびポリマーの７０％をそれぞれＲＰ−ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析（ＡＡＡ）により回収した。１μｍのフィルターによる濾過後に除去されたドセタキセルおよびポリマーは８％未満であったことから、製剤は実質的にサブミコンであることが明らかになった。一方、ポリマーを用いずに調製した対照製剤では、濾過後にドセタキセルは検出されなかった。
【００６２】
[0060]微量沈降により形成された８−Ｐｒｏ（６）ナノ粒子への疎水性薬剤の最終内包率を、薬剤の質量（ＡＰＩ）をポリマーおよび薬剤の合計質量で割った商、すなわち（ＡＰＩ）／（ポリマー＋ＡＰＩ）として算出した。この式を用いたドセタキセルの内包率は、３１％と算出された。
【００６３】
ラパマイシンナノ粒子の調製
[0061]１．２５ｍｇのラパマイシンおよび５．０ｍｇのＰＥＡ−８−Ｐｒｏ（６）、（式Ｉ、式中、（Ｒ１＝（ＣＨ２）８およびＲ２＝（ＣＨ２）６、ｎ＝１１０〜１６０）を０．７００ｍＬのジメチルスルホキシドＤＭＳＯに共溶解した。ラパマイシン／ポリマー溶液を９．３０ｍＬの撹拌水性緩衝液（たとえばＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）にゆっくりとした加えたところ、ナノ粒子が形成された。この半透明の分散液を再生セルロース透析チューブ（ＭＷＣＯ３５００Ｄａ）に移し、水性緩衝液（１００×ｖ／ｖ）に対して室温で１６時間透析して残留ＤＭＳＯを除去した。ラパマイシン／ポリマー粒子の直径は１０６ｎｍ（ＰＤＩ＜０．１０）、ゼータ電位は−４１ｍＶであった（マルバーン製ゼータサイザー）。これに対し、製造の過程でＰＥＡを使用しなかった場合、ミクロンスケールの粒子が得られた。ポリマー製剤では５μｍのフィルターによる濾過後、ＲＰ−ＨＰＬＣに基づき７２％のラパマイシンが回収されたのに対し、ポリマーを含まない対照で回収されたのは６％であった。微量沈降により形成された８−Ｐｒｏ（６）ナノ粒子への疎水性薬剤ラパマイシンの最終内包率は、上記の実施例２に記載した式を用いて２０％と算出された。
【００６４】
[0062]刊行物、特許および特許文書はすべて、参照によって個々に援用しているかのように参照によって本明細書に援用する。具体的で好ましい様々な実施形態および技法を参照しながら、本発明について記載してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲内で多くの変形および修正が可能であることを理解されたい。
【００６５】
[0063]本発明について上記の例を参照しながら記載してきたが、当然のことながら、修正および変形は本発明の精神および範囲内に包含される。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【国際調査報告】
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