(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病などの疾患、および虚血性発作などの状態を含む神経変性から保護するためにキナーゼ活性を阻害するための組成物および方法を含み、この方法は、対象に治療有効量の１，４−ベンゾキサジン化合物およびその誘導体を提供するステップを含む。【選択図】図１
2012500220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）の化合物であって、
【化１】
2012500220.tif 000016
式中、
Ａは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；
Ｂは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；
Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、エーテル基、エステル基、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基であり；
Ｒ９〜Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル、カルボニル、炭酸エステル、アセトキシ基、アセチル基、エーテル、エステル、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される、化合物。
【請求項２】
Ａは、Ｏから選択され；
Ｂは、Ｎから選択され；
Ｒ２〜Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；
Ｒ７は、オキソ基であり；
Ｒ８は、Ｃ１アルケニル基であり；
Ｒ９およびＲ１３は、ハロゲンであり；
Ｒ１０〜Ｒ１２は、水素であり；
Ｒ１１は、アセトキシ基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（Ｚ）−２，６−ジブロモ−４−（(３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Η−ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］オキサジン−２−イリデン)メチル）フェニルアセタートと、
（Ｚ）−２−（３，５−ジブロモベンジリデン）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンと、
を含む、化合物。
【請求項４】
対象において神経学的状態から保護する方法であって、
前記神経学的状態から保護する必要がある対象を特定するステップと、
前記対象に以下の式を含む組成物を提供するステップと、を含み、
【化２】
2012500220.tif 000017
式中、
Ａは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；
Ｂは、Ｃ、Ｎ、Ｓ，Ｏから選択され；
Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、エーテル基、エステル基、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基であり；
Ｒ９〜Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル、カルボニル、炭酸エステル、アセトキシ基、アセチル基、エーテル、エステル、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される、方法。
【請求項５】
Ａは、Ｏから選択され；
Ｂは、Ｎから選択され；
Ｒ２〜Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；
Ｒ７は、オキソ基であり；
Ｒ８は、Ｃ１アルケニル基であり；
Ｒ９およびＲ１３は、ハロゲンであり；
Ｒ１０〜Ｒ１２は、水素であり；
Ｒ１１は、アセトキシ基である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記神経学的状態は、これらに限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、発作、および、虚血性発作を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記対象は、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、雄ウシ、ラット、マウス、および、ハエから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記神経学的状態からの前記保護は、１以上のニューロンの死、１以上のニューロンの損失、１以上のニューロンにおける毒性の防止、改善された自発運動遂行、あるいは、アミロイド前駆体タンパク質および他の部分の毒性効果からの保護を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
神経学的状態から対象を保護する方法であって、
前記対象に治療有効量の（Ｚ）−２，６−ジブロモ−４−（(３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Η−ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］オキサジン−２−イリデン)メチル）フェニルアセタート、（Ｚ）−２−（３，５−ジブロモベンジリデン）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンを提供するステップを含む、方法。
【請求項１０】
神経学的状態から対象を保護する方法であって、
前記神経学的状態から保護する必要のある前記対象を特定するステップと、
前記対象に治療有効量の以下の式を有する組成物を提供するステップと、を含み、
【化３】
2012500220.tif 000018
式中、
Ａは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；
Ｂは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；
Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、エーテル基、エステル基、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基であり；
Ｒ９〜Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル、カルボニル、炭酸エステル、アセトキシ基、アセチル基、エーテル、エステル、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される、方法。
【請求項１１】
前記神経学的状態は、これらに限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、発作、および、虚血性発作を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象は、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、雄ウシ、ラット、マウス、および、ハエから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経学的状態からの前記保護は、１以上のニューロンの死、１以上のニューロンの損失、１以上のニューロンにおける毒性の防止、改善された自発運動遂行、あるいは、アミロイド前駆体タンパク質および他の部分の毒性効果からの保護を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
対象においてキナーゼを阻害する方法であって、
増加したキナーゼ活性から保護する必要のある前記対象を特定するステップと、
前記対象においてキナーゼ活性を減少させるのに有効な量の以下の式を含む組成物を前記対象に提供するステップと、を含み、
【化４】
2012500220.tif 000019
式中、
Ａは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；
Ｂは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；
Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、エーテル基、エステル基、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基であり；
Ｒ９〜Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル、カルボニル、炭酸エステル、アセトキシ基、アセチル基、エーテル、エステル、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される、方法。
【請求項１５】
前記対象においてキナーゼ活性のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
キナーゼ活性の増加から保護する必要のある前記対象は、神経学的状態を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記神経学的状態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、発作、または、虚血性発作を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記キナーゼ活性の減少は、神経学的状態から保護することであり、１以上のニューロンの死、１以上のニューロンの損失、１以上のニューロンにおける毒性の防止、改善された自発運動遂行、あるいは、アミロイド前駆体タンパク質および他の部分の毒性効果からの保護を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象はガンを患っている、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記阻害されたキナーゼは、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８β、および、Ｂ−Ｒａｆのうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記阻害されたキナーゼは、ＣＤＫ１，ＣＤＫ２、ＲＯＣＫ１、ＪＮＫ２、ＭＬＫ３、および、ｃ−Ｒａｆのうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記阻害剤は、１００〜５００ｎＭの間で提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象に前記化合物を提供して処置後の活性を決定する前に、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８α、ｐ３８β、Ｂ−Ｒａｆ、ＣＤＫｌ、ＣＤＫ２、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、および、ＭＬＫ３のうちの少なくとも１つの活性を決定するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記状態は、ウイルス感染を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に神経変性障害の分野に関し、より詳細にはアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはハンチントン病などの疾患、ならびに虚血性発作および外傷性脳損傷などの状態を含む、神経変性から保護するための新規の組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景は、アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン病、および虚血性発作などの状態を含む神経変性病態に対する神経保護薬として作用する新規の治療化合物に関連して説明される。
【０００３】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳまたはハンチントン病などの疾患、ならびに虚血性発作および外傷性脳損傷などの状態は、年間で何百万もの人々を冒し、社会に莫大な経済的負担を与えている。これら状態の特徴は、ニューロンの異常で過度な損失である。これら病態におけるニューロン死を防ぐための有効な戦略は現在のところない。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害は、神経原線維変化、神経突起斑、および神経細胞死によって特徴付けられる。アルツハイマー病は、変性末期疾患であり、そのための治療法は知られておらず、脳における斑および錯綜によって特徴付けられる。その最も一般的な形態において、アルツハイマー病は６５歳を超える人々を悩ましており、発症率は低いが早期発症型も存在する。
【発明の概要】
【０００５】
〔発明の開示〕
本発明者は、神経変性の組織培養範例を使用してニューロン死を防ぐ能力のために小分子化合物を合成しスクリーニングした。これらの調査は、強力な神経保護活性を有する化合物として２−ベンジリデン−２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３−（４Ｈ）−オンの特定を導いた。本明細書において、２−ベンジリデン−２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３−（４Ｈ）−オンおよびその誘導体は、脳内の感受性の高いニューロン集団を保護することができ、ゆえに神経変性状態を治療するための治療アプローチを表すことができるということが証明される。現在のところ神経変性疾患を治癒、軽減、または治療する有効な戦略はない。１，４−ベンゾキサジン−３−（４Ｈ）−オン類の化合物が、神経変性から保護するということはこれまで示されていなかった。これらの化合物は、新規の治療ツールであることを表している。
【０００６】
本発明は、これらに限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症、ならびに、虚血性発作および外傷性脳損傷などの神経学的状態を含む神経変性疾患の治療における新規の治療ツールとして、ＨＳＢ１３およびその誘導体などの１，４−ベンゾキサジン化合物を含む。本発明は、多くの異なる１，４−ベンゾキサジン化合物およびその誘導体を含む組成物を作製し使用するための組成物および方法を含む。１，４−ベンゾキサジン化合物およびその誘導体は、神経変性の組織培養モデルにおいて評価された。これらの化合物は、神経変性の異なる組織培養モデルにおいて保護性である。
【０００７】
本発明は、神経変性の組織培養モデルにおいて高度に神経保護性である１，４−ベンゾキサジン類の幾つかの化合物を説明する。仮定のためで決して本発明の限定ではなく、薬理学的阻害剤を使用して、これらの化合物の作用機構はＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫまたはＰＩ  ３キナーゼ−Ａｋｔシグナル経路も、あるいは、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、カルシウムカルモジュリンキナーゼＡ（ＣａＭＫ）およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）などの他の生存促進分子も含まないということが提案されるということが見出された。
【０００８】
１，４−ベンゾキサジン化合物およびその誘導体は、線条体変性を減少し、ハンチントン病を化学的に誘導されたマウスモデルにおいて行動遂行を改善するということが見出された。ＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−２２およびＡＳＫ−２などの化合物を含む幾つかの１，４−ベンゾキサジンは、培養小脳顆粒ニューロンを低カリウム処置により誘導される死から保護した。ＨＳＢ−１３は、ＨＴ−２２神経芽腫細胞をホモシステイン酸（ＨＣＡ）誘導神経毒性から保護した。また、ＡＳＫ−２は、一次皮質ニューロンをＨＣＡ誘導神経毒性から保護することも見出された。ＨＳＢ−１３は、線条体変性を減少した。ＨＳＢ−１３は、ハンチントン病の３−ニトロプロピオン酸マウスモデルにおける行動遂行を改善する。
【０００９】
本発明は、これらの化合物のうちの１つである、ＨＳＢ−１３として表示される、（Ｚ）−６−アミノ−２−（３，’５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシベンジリデン）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンの、ハンチントン病の３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）誘導マウスモデルにおける研究を説明する。ＨＳＢ−１３は、線条体変性を減少し、３−ＮＰが投与されたマウスにおける行動遂行を改善した。本発明者は、化合物ＨＳＢ−１３は、ハンチントン病のよく特徴付けられ受け入れられているモデルシステム、およびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）毒性のショウジョウバエモデルにおいて保護性であることを見出した。本発明のＨＳＢ−１３ファミリーの化合物および新しく作られるそれらの誘導体は、神経変性疾患の治療における新規の治療ツールであることを表している。
【００１０】
本発明は、これらに限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症、ならびに、虚血性発作および外傷性脳損傷などの神経学的状態を含む神経変性疾患の治療における新規の治療ツールとして、ＨＳＢ１３およびその誘導体などの１，４−ベンゾキサジン化合物を含む。本発明において説明される化合物は、対象、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、ラット、マウス、およびハエに神経保護を提供する。本発明は、多くの異なる１，４−ベンゾキサジン化合物およびその誘導体を含む組成物を作製し使用するための組成物および方法を含む。１，４−ベンゾキサジン化合物およびその誘導体は、神経変性の組織培養モデルにおいて評価された。驚いたことに、これらの化合物は、神経変性の異なる組織培養モデルにおいて保護性であるということが見出された。
【００１１】
本発明の化合物は、対象における１以上のニューロンの死、異常または過度な損失を調節すること、神経毒性、対象における自発運動遂行、および／または、アミロイド前駆体タンパク質および他の部分の毒性効果に影響を及ぼすことによって、神経学的状態の調節を提供する。
【００１２】
１，４−ベンゾキサジン化合物およびその誘導体は、線条体変性を減少し、ハンチントン病を化学的に誘導されたマウスモデルにおける行動遂行を改善するということが見出された。ＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−２２およびＡＳＫ−２などの化合物を含む幾つかの１，４−ベンゾキサジンは、培養小脳顆粒ニューロンを低カリウム処置により誘導される死から保護した。ＨＳＢ−１３は、ＨＴ−２２神経芽腫細胞をホモシステイン酸（ＨＣＡ）誘導神経毒性から保護した。ＨＳＢ−１３はまた、よく特徴付けられ一般的に使用されるアルツハイマー病の組織培養モデルである、βアミロイド（Ａβ）誘導ニューロン死から皮質ニューロンを保護する。ＡＳＫ−２は、一次皮質ニューロンをＨＣＡ誘導神経毒性から保護する。ＨＳＢ−１３は、線条体変性を減少し、ハンチントン病の３−ニトロプロピオン酸マウスモデルにおける行動遂行を改善した。
【００１３】
本発明は、以下の式の化合物を含む。
【化１】
2012500220.tif 000003
式中、ＡおよびＢは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される。Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される。Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、エーテル基、エステル基、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基である。Ｒ９〜Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル、カルボニル、炭酸エステル、アセトキシ基、アセチル基、エーテル、エステル、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される。
【００１４】
本発明はまた、神経学的状態の調節が必要な対象を特定すること；およびその対象に組成物を提供することによって、対象における神経学的状態から保護するか、その神経学的状態を治療するか、減少させるか、または調節する方法を提供する。この組成物は、以下の構造を有する。
【化２】
2012500220.tif 000004
式中、Ａは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；Ｂは、Ｃ、Ｎ、Ｓ，Ｏから選択され；Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、エーテル基、エステル基、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基であり；ならびに、Ｒ９〜Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル、カルボニル、炭酸エステル、アセトキシ基、アセチル基、エーテル、エステル、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される。
【００１５】
本発明は、神経変性状態に対する保護を必要とする対象を特定すること、および、以下の式を有する組成物の治療有効量をその対象に提供することによって、対象における神経変性状態を減少させるか、改善するか、治療するか、または、その神経変性状態から保護する方法を提供する。
【化３】
2012500220.tif 000005
式中、Ａは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；Ｂは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、エーテル基、エステル基、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基であり；ならびに、Ｒ９〜Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル、カルボニル、炭酸エステル、アセトキシ基、アセチル基、エーテル、エステル、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される。
【００１６】
別の実施形態において、本発明はまた、対象においてキナーゼを阻害するための組成物および方法を含み、この方法は、増加したキナーゼ活性から保護する必要がある対象を特定するステップと；対象においてキナーゼ活性を低下させるのに有効な組成物の量を対象に提供するステップとを含み、この組成物は以下の式を含む。
【化４】
2012500220.tif 000006
式中、Ａは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；Ｂは、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択され；Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択され；Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、エーテル基、エステル基、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基であり；ならびに、Ｒ９〜Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロ、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル、カルボニル、炭酸エステル、アセトキシ基、アセチル基、エーテル、エステル、アルキルアルカノアート基、アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基から独立して選択される。
【００１７】
一態様において、本方法はさらに、対象におけるキナーゼ活性レベルを測定するステップを含む。別の態様において、キナーゼ活性の増加に対する保護を必要とする対象は、神経学的状態、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、発作、または、虚血性発作を患っているものである。一態様において、その状態は、ウイルス感染、例えばＨＩＶなどのレトロウイルス感染を含む。別の態様において、キナーゼ活性の低下は神経学的状態から保護し、１以上のニューロンの死、１以上のニューロンの損失、１以上のニューロンにおける毒性を防止、改善された自発運動遂行、あるいは、アミロイド前駆体タンパク質および他の部分の毒性効果からの保護を含む。一態様において、対象は、ガンを患っている。さらに別の態様において、阻害されるキナーゼは、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８β、およびＢ−Ｒａｆのうちの少なくとも１つを含む。別の関連態様において、阻害されるキナーゼは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＲＯＣＫ１、ＪＮＫ２、ＭＬＫ３、および、ｃ−Ｒａｆのうちの少なくとも１つを含む。阻害剤は、例えば１００ｎＭ〜５００ｎＭまでの間で提供されうる。本方法はさらに、対象に化合物を提供してから治療後の活性を決定する前に、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８α、ｐ３８β、Ｂ−Ｒａｆ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、および、ＭＬＫ３のうちの少なくとも１つの活性を決定するステップを含みうる。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、ガン、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、および免疫系の他の疾患を含むアポトーシスの規制緩和を含む疾患を治療するために使用される方法および組成物を提供する。同様に、当該発明は、キナーゼによる影響を受ける状態を治療すること、例えば活性がニューロン生存にとって有害であるキナーゼの阻害に使用される方法および組成物を提供する。本発明は、例えばＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８βおよびＢ−Ｒａｆのキナーゼ活性に影響を及ぼすために使用される方法および組成物を提供する。
【００１９】
本発明の特徴および利点のより完全な理解のために、ここで添付の図面と共に本発明の詳細な説明を述べる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＬＫ誘導ニューロン死から保護する１，４−ベンゾキサジン化合物を示す画像である。小脳顆粒ニューロンの培養物は、ＨＫ培地、ＬＫ培地、または、５種類の１，４−ベンゾキサジン化合物、すなわちＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−５、ＨＳＢ−２２、ＡＳＫ−２ａ、およびＨＳＢ−２０のうちの１種類を含有するＬＫ培地に交換された。全ての化合物は、２５μＭ濃度で使用された。生存能が、位相差顕微鏡検査、ＤＡＰＩ染色（アポトーシスニューロンが、凝縮した核または断片化した核によって検出される）、あるいは、ＴＵＮＥＬ染色（アポトーシス核が緑色に標識付けされる）によって２４時間後に評価された。ＤＡＰＩおよびＴＵＮＥＬ染色画像は、同じ場からのものである。ＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−５、ＨＳＢ−２２、およびＡＳＫ−２ａは保護性であったが、ＨＳＢ−２０は保護性ではなかった。
【図２】４種類の神経保護ベンゾキサジンの構造のうちの幾つかの概略図である。ＨＳＢ−１３、ＡＳＫ−２、ＡＳＫ−２ａ、および、ＨＳＢ−１３の構造が示されている。本文に説明されているように、ＡＳＫ−２ａは、ＡＳＫ２よりもはるかに高い神経保護性を示した。ＨＳＢ−１３は、最も高い神経保護性を示した。
【図３】１，４−ベンゾキサジンによる神経保護におけるシグナル伝達経路の阻害の効果を示すプロットである。小脳顆粒ニューロンの培養物は、ＬＫ培地、ＨＳＢ−１３を含有するＬＫ培地、または、ＨＳＢ−１３と、ＰＤ９８０５９（４０μＭ）、Ｕ０１２６（１０μＭ）、ワートマニン（１００ｎｍ）、Ａｋｔ阻害剤−Ｘ（５μＭ）、ＫＮ−６２（１０μＭ）、Ｈ８９（１０μＭ）およびＴＳＡ（１μＭ）のうちのいずれかとを含有するＬＫ培地に交換された。生存能は、ＤＡＰＩ染色によって２４時間後に定量化された。ＨＫ培地に交換された対照培養における生存能に結果を標準化した。
【図４】保護性１，４−ベンゾキサジン化合物で処理されたニューロン培養物におけるシグナル伝達タンパク質のウェスタンブロット解析を示す画像である。小脳顆粒ニューロンの培養物は、ＨＫ培地、ＬＫ培地、あるいは、ＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−２２、またはＡＳＫ−２ａを含有するＬＫ培地に３時間交換された。全細胞溶解物が、リン酸Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３)、リン酸ＭＥＫ、リン酸ＥＲＫ、および、リン酸ＧＳＫ３に対する抗体を使用してウェスタンブロット法によって調製され分析された。αチューブリンに対する抗体も使用されて、同様量の溶解物が各レーンに装填されたことを示した。
【図５】ｃ−ｊｕｎおよびＡＴＦ−３発現におけるベンゾキサジンの効果を示す画像である。小脳ニューロン培養は、３時間、ＨＫ、ＬＫ、あるいは、２５μＭのＨＳＢ−１３、２５μＭのＡＳＫ−２ａ、または２５μＭのＨＳＢ−２２を含有するＬＫ培地で処理した。全細胞溶解物が次に調製され、ｃ−ｊｕｎおよびＡＴＦ−３に対する抗体を使用してウェスタンブロット解析された。αチューブリンに対する抗体も使用されて、同様量の溶解物が各レーンに装填されたことを示した。
【図６Ａ】ＨＴ−２２細胞でのＨＳＢ−１３の効果、および細胞死の定量化を示している。図６Ａは、ＨＣＡ誘導毒性に対するＨＴ−２２細胞でのＨＳＢ−１３の保護効果を示している。ＨＴ−２２細胞は、添加剤を用いない（無）、１．５ｍＭのＨＣＡ、あるいは、２５μＭのＨＳＢ−１３、２５μＭのＡＳＫ−２ａ、および２５μＭのＨＳＢ−２２を加えた１．５ｍＭのＨＣＡで処理された。図６Ａにおいて、処理後２４時間の培養物の様子が、位相差顕微鏡検査（位相）によって視覚化された。細胞死は、ＤＡＰＩおよびＴＵＮＥＬ染色を使用して評価された。図６Ｂは、ＤＡＰＩ染色によるニューロン生存能の定量化を示している。生存能は無処理培養（対照）の％として表現された。
【図６Ｂ】ＨＴ−２２細胞でのＨＳＢ−１３の効果、および細胞死の定量化を示している。図６Ａは、ＨＣＡ誘導毒性に対するＨＴ−２２細胞でのＨＳＢ−１３の保護効果を示している。ＨＴ−２２細胞は、添加剤を用いない（無）、１．５ｍＭのＨＣＡ、あるいは、２５μＭのＨＳＢ−１３、２５μＭのＡＳＫ−２ａ、および２５μＭのＨＳＢ−２２を加えた１．５ｍＭのＨＣＡで処理された。図６Ａにおいて、処理後２４時間の培養物の様子が、位相差顕微鏡検査（位相）によって視覚化された。細胞死は、ＤＡＰＩおよびＴＵＮＥＬ染色を使用して評価された。図６Ｂは、ＤＡＰＩ染色によるニューロン生存能の定量化を示している。生存能は無処理培養（対照）の％として表現された。
【図７】神経保護および運動性活性におけるＨＳＢ−１３の効果を示している。図７Ａは、生体内における３−ＮＰ神経毒性に対するＨＳＢ−１３の保護効果を示すプロットである。図７Ａにおける組織学的解析。対照、３−ＮＰ、および、３−ＮＰ＋ＨＳＢ−１３で処理されたマウスからの冠状切片４０μｍのクレシルバイオレット染色。上パネル：低倍率で線条体における細胞の選択的損失を示している。下パネル：背外側部分の線条体の高倍率画像。図７Ｂは、生理食塩水（対照）、３−ＮＰ、および３−ＮＰ＋ＨＳＢ−１３が投与されたマウスの自発運動活性測定を要約するグラフを示している。投与量および投与条件は、方法において詳述されている。活性は１５分間を超えて測定された。ａ）総運動時間；ｂ）総運動距離；ｃ）運動ごとの平均距離；ｄ）平均速度が示されている。棒は、平均±ＳＤを示す。＊は、３−ＮＰ値と３−ＮＰ＋ＨＳＢ−１３値との間の統計的有意性を示す（Ｐ値＜０．０５）。統計的解析は、独立両側スチューデントｔ検定（unpaired, two-tailed Student's T test）を使用して行われた。
【図８】ＨＳＢ−１３はショウジョウバエにおいてＡＰＰ６９５誘導毒性から保護するということを示す画像である。ヒトＡＰＰ６９５を発現するハエの生存を対照と比較した。ＨＳＢ−１３での処理は、ＡＰＰ発現ハエの生存率を著しく増加した。ｎ＝１５〜２０匹のハエの群を用いた独立研究の数。棒は、平均±ＳＥＭを示す。図８は、ＨＳＢ−１３がＨＣＡ誘導毒性に対してＨＴ−２２細胞を保護するということを示す画像である。ＨＴ−２２細胞は、添加物を用いない（対照）、２ｍＭのＨＣＡ、あるいは、２ｍＭのＨＣＡ＋２５μＭのＨＳＢ−１３で処理された。処理後２４時間の培養物の様子が示されている。
【図９】ＨＳＢ−１３がＨＣＡ誘導毒性に対してＨＴ−２２細胞を保護するということを示す画像である。ＨＴ−２２細胞は、添加物を用いない（対照）、２ｍＭのＨＣＡ、または、２ｍＭのＨＣＡ＋２５μＭのＨＳＢ−１３で処理された。処理後２４時間の培養物の様子が示されている。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは３−ＮＰが生体内において３−ＮＰ神経毒性に対して保護性であるということを示す画像である。図１０Ａ：組織学的解析。対照、３−ＮＰ、および、３−ＮＰ＋ＨＳＢ−１３で処理されたマウスからの冠状切片５０μｍのクレシルバイオレット染色。投与量および投与条件は、方法において詳述されている。上パネル：低倍率で線条体における細胞の選択的損失を示している。下パネル：背外側部分の線条体の高倍率画像。図１０Ｂ：自発運動活性の分析。生理食塩水（対照）、３−ＮＰ、および３−ＮＰ＋ＨＳＢ−１３が投与されたマウスの自発運動活性測定。投与量および投与条件は、方法において詳述されている。活性は１５分間を超えて測定された。Ａ）全運動エピソード；Ｂ）総運動距離；Ｃ）平均速度；Ｄ）垂直面進入が示されている。棒は、平均±ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔発明の説明〕
本発明の様々な実施形態の作製および使用は、以下で詳細に論じられるが、本発明は、多様な特定情況において具現化されうる多くの適用可能な発明概念を提供するということが認識されるべきである。本明細書において論じられる特定実施形態は、本発明を作製し使用するための特定方法の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を定めるものではない。
【００２２】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語が以下で定義される。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する分野の通常の技術者によって一般的に理解されるとおりの意味を有する。「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの用語は、単一実体にのみ言及するように意図されず、例示のために使用されうる特定例の一般的分類を含む。本明細書における用語法は、本発明の特定実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲で概説されている場合を除き、本発明の範囲を定めるものでない。
【００２３】
アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患は、患者の生活の質を損ない、家族の介護者に多大な負担を負わせ、年間何十億ドルも社会的コストがかかっている。神経変性疾患の発症に対する最も一貫した危険因子は、加齢である。平均余命の劇的な増加のため、加齢に関連する障害に悩まされる人々の発生率が上昇傾向にあり、主要な健康問題を示している。この多様な障害の組の間で共有される共通点は、ある特定集団のニューロンの進行性かつ止むことのない損失である。神経変性疾患に対する現在の薬物療法は、これらの疾患に関連する症状のみを緩和し、しかし根底にある原因、例えばニューロンの変性には影響を及ぼさない。ニューロンの損失が弱まることなく継続するので、そのような緩和治療は、疾患進行に効果を及ぼさない。ゆえにニューロン死の小分子阻害剤の特定は、緊急で決定的に重要である。
【００２４】
アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害は、神経原線維変化、神経突起斑、および神経細胞死によって特徴付けられる。アルツハイマー病は、変性末期疾患であり、そのための治療法は知られておらず、脳における斑および錯綜によって特徴付けられる。その最も一般的な形態において、アルツハイマー病は６５歳を超える人々を悩ましており、発症率は低いが早期発症型も存在する。神経変性状態は、毎年ますます多くの人々を襲っており、これら状態の多くのための従来治療は、治療という点ではほんのわずかしか提供しない。いくつかの例では、神経変性状態は、多発性硬化症などの特定の疾患に特異的に関連し、一方で、他の例では、これら状態は、加齢、または例えば遺伝的障害および自己免疫疾患などの身体の他の何らかの状態もしくはプロセスに、より全般的に関連する。しかしながらこれらの状態は、衰弱および低下した身体機能によって、時には低下した精神機能によっても特徴付けられる。
【００２５】
本発明者は、ＧＷ５０７４と呼ばれるｃ−Ｒａｆの細胞透過性化学阻害剤｛５−ヨード−３−［（３’，５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２−インドリノン｝が、様々な異なるアポトーシス刺激によって誘導された培養ニューロンの死を完全に阻害するということを先に証明している（チン（Chin）ら、２００４年）。ＧＷ５０７４はまた、一般的に使用されるハンチントン病の生体内範例である、３−ニトロプロピオン酸が投与されたマウスにおいて、線条体変性を防ぎ、行動遂行を改善する。ＧＷ５０７４は、３’置換インドロンである（チンら、２００４年）。多くの他の３置換インドロンもまた、ニューロン死を阻害することが見出されている（ジョンソン（Johnson）ら、２００５年；チェン（Chen）ら、２００８年）。ＧＷ５０７４ならびに多くの他の３−置換インドロンは、高度に保護性であるが、より高い濃度で使用された場合に毒性を示す（チンら、２００４年；ジョンソンら、２００５年；チェンら、２００８年）。構造活性相関の研究が、追加の３置換インドロンは神経保護性であると同時に、高用量であっても培養ニューロンへの毒性がないということを特定している（バルデラモス（Balderamos）ら、２００８年）。他の研究者は、ｃ−ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ)、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ３）、およびｐ５３を含む様々な異なるアポトーシス促進タンパク質を標的にする多くのニューロンアポトーシス化学阻害剤を同様に特定している（デメロ（D'Mello）ら、２００５年）。
【００２６】
本発明は、治療価値を有し、かつ、カリウム欠乏によりアポトーシスを起こすよう誘導された培養小脳顆粒ニューロンにおいて神経保護性である、幾つかの１，４ベンゾキサジン誘導体を提供する。これら化合物のうちの幾つかはまた、酸化ストレスおよびＡβ誘導ニューロン死に対して試験されて、無毒性レベルで有効であることを見出された。
【００２７】
ＨＳＢ−１３として指定される、これらの化合物の１つは、ハンチントン病の３−ニトロプロピオン酸モデルにおいて生体内で試験された。ＨＳＢ−１３は、神経変性に対するかなりの保護を提供し、マウスにおいて自発運動遂行を改善した。ＨＳＢ−１３はまた、ショウジョウバエにおいてアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）誘導毒性に対して保護性であった。これらの研究は、１，４−ベンゾキサジン化合物を、神経変性に対する治療価値を有する新規の神経保護剤として特定する。
【００２８】
幾つかの神経変性疾患に関連する症状を改善するための薬物療法は利用可能であるが、しかしながら、これらの種類の療法は、ニューロンの止むことのない変性を阻止しないので、疾患進行の速度を緩めるものではない。神経変性病態におけるニューロンの異常損失を阻止するための戦略は現在のところない。幾つかの候補化合物は、先に特定されており、これらの多くは、前臨床治験にある。幾つかはヒト治験でも試験されたが、失敗であった。２−ベンジリデン−２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３−（４Ｈ）−オンの化合物は、神経変性病態の治療の候補薬物として試験されたことはない。
【００２９】
用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、および「アルキレン」は、典型的には長さが約１〜約１２の範囲の炭素原子、好ましくは１〜約６原子の炭化水素鎖を指し、直鎖および分枝鎖を含む。特に断りのない限り、本明細書で言及される任意のアルキルまたはアルキレンの好ましい実施形態は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである（例えばメチルまたはエチル）。
【００３０】
「シクロアルキル」は、飽和または不飽和の環状炭化水素鎖を指し、架橋、融合、またはスピロ環状化合物を含み、好ましくは３〜約１２炭素原子、より好ましくは３〜約８原子を含む。
【００３１】
「アリール」は、１つ以上の芳香環を意味し、その各々は５または６のコア炭素原子からなる。多重アリール環は、ナフチルの場合のように融合されるか、または、ビフェニルの場合のように融合されていなくてもよい。アリール環はまた、１以上の環状炭化水素、ヘテロアリールまたは複素環と融合されていても、あるいは非融合であってもよい。
【００３２】
「ヘテロアリール」は、１〜４のヘテロ原子、好ましくはＮ、ＯもしくはＳ、またはそれらの組み合わせを含むアリール基であり、そのヘテロアリール基は、炭素原子または窒素原子を、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−−ＣＦ３、フェニル、ベンジル、もしくはチエニルで任意に置換されるか、または、ヘテロアリール基の炭素原子が酸素原子とともに、カルボニル基を形成するか、あるいは、そのヘテロアリール基は、フェニル環と任意に融合される。ヘテロアリール環はまた、１以上の環状炭化水素、複素環、アリール、またはヘテロアリール環と融合されうる。ヘテロアリールは、１つのヘテロ原子を有する５員ヘテロアリール（例えばチオフェン、ピロール、フラン）；２つのヘテロ原子を１，２位または１，３位に有する５員へテロアリール（例えば、オキサゾール、ピラゾール、イミダゾール、チアゾール、プリン）；３つのヘテロ原子を有する５員ヘテロアリール（例えばトリアゾール、チアジアゾール）；３つのヘテロ原子を有する５員ヘテロアリール；１つのヘテロ原子を有する６員ヘテロアリール（例えば、ピリジン、キノリン、イソキノリン、フェナントリン（phenanthrine）、５，６−シクロヘプテノピリジン（5,6-cycloheptenopyridine））；２つのヘテロ原子を有する６員へテロアリール（例えばピリダジン、シンノリン、フタラジン、ピラジン、ピリミジン、キナゾリン）；３つのヘテロ原子を有する６員ヘテロアリール（例えば、１，３，５−トリアジン）；および、４つのヘテロ原子を有する６員ヘテロアリールを含むが、これらに限定されない。
【００３３】
「複素環」または「複素環式の」は、不飽和または芳香族の特徴を有するか、または有しない、５〜１２原子、好ましくは５〜７原子の１以上の環を意味し、その少なくとも１つの環原子は、炭素ではない。好ましいヘテロ原子は、硫黄、酸素、および、窒素を含む。多重環も融合されうる。
【００３４】
「ヘテロ原子」は、炭化水素類似化合物の任意の非炭素原子を意味する。例とし酸素、硫黄、窒素、燐、砒素、珪素、セレン、テルル、スズ、およびホウ素を含む。
【００３５】
用語「アルキレン」は、メチレン(−ＣＨ２−)、プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、クロロエチレン(−ＣＨＣｌＣＨ２−)、２−チオブテン−ＣＨ２ＣＨ（ＳＨ)ＣＨ２ＣＨ２、１−ブロモ−３−ヒドロキシル−４−メチルペンテン（−ＣＨＢｒＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２−）などの上記で定義されたような二価アルキル基を指す。
【００３６】
用語「アルケニル」は、１以上の炭素−炭素二重結合を含む、分岐または非分岐の炭化水素鎖を表す。
【００３７】
用語「アルキニル」は、１以上の炭素−炭素三重結合を含む、分岐または非分岐の炭化水素鎖を指す。
【００３８】
用語「アリール」は、フェニルおよびナフチルなどの、好ましくは約６〜１４の間の炭素原子を有する少なくとも１つの芳香環を形成する炭素原子鎖を指し、これら炭素原子は、そのような鎖に一般的に結合される１以上の官能基、例えばヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、シアノアミド、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル（carbalkoyl）、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミドなどで置換されて、ビフェニル、ヨードビフェニル、メトキシビフェニル、アントリル、ブロモフェニル、ヨードフェニル、クロロフェニル、ヒドロキシフェニル、メトキシフェニル、ホルミルフェニル、アセチルフェニル、トリフルオロメチルチオフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、アルキルチオフェニル、トリアルキルアンモニウムフェニル、アミドフェニル、チアゾリルフェニル、オキサゾリルフェニル、イミダゾリルフェニル、イミダゾリルメチルフェニルなどのアリール基を形成しうる。
【００３９】
用語「アルコキシ」は、−−ＯＲ−−を指し、ここでＲはアルキルである。
【００４０】
用語「アミド」は、アミド結合：−−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ（ここでＲは水素またはアルキルである）を指す。
【００４１】
用語「アミノ」は、アミン結合：−−ＮＲ−−を指し、ここでＲは、水素またはアルキルである。用語「カルボキシル」は、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−を指し、用語「カルボニル」は、−−Ｃ（Ｏ）−−を指す。
【００４２】
用語「アルキルカルボキシル」は、上記で定義されたようなアルキル基がＣ（Ｏ）Ｏ基、例えばＣＨ３Ｃ(Ｏ)Ｏ−−、ＣＨ３ＣＨ２Ｃ(Ｏ)Ｏ−−などで置換されたものを指す。
【００４３】
用語「炭素環」は、シクロペンチル、シクロヘキシルなど約５〜約８の環炭素を有する環状炭化水素鎖を意味する。これらの基は、上記の「アルキル」で定義されたような１以上の官能基で任意に置換されうる。
【００４４】
用語「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、およびそれらの混合物を含む。
【００４５】
用語「複素環」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択された０〜４のヘテロ原子を含みうる直鎖または環系を意味し、ここで窒素原子および硫黄原子は任意に酸化され、窒素原子は任意に四級化される。
【００４６】
用語「カルバモイル」は、基−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。
【００４７】
用語「ヒドロキシアルキル」は、上記で定義されたようなアルキル基がヒドロキシ基によって置換されたものを意味する。
【００４８】
用語「アルキルカルボニル」は単独または組み合わせで、アルカンカルボン酸から誘導されたアシル基、すなわちアルキル−Ｃ(Ｏ)−−を意味し、例えばアセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、４−メチルバレリルなどがある。
【００４９】
特に指定されない限り、全ての細胞培養培地および試薬は、インビトロゲン（Invitrogen）（カリフォルニア州カールズバッド）から購入され、全ての化学薬品はシグマ−アルドリッチ（Sigma- Aldrich）（ミズーリ州セントルイス）から得た。無水溶媒は、フィッシャー・サイエンティフィック（Fischer Scientific）（ペンシルベニア州ピッツバーグ）から購入された。ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ワートマニン、Ａｋｔ阻害剤−Ｘ、トリコスタチン酸Ａ（ＴＳＡ）、ＫＮ６２、Ｈ８９は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）から購入された。この論文で使用される抗体は、以下のとおりであった：抗リン酸ＭＥＫ（９１２１Ｓ）、抗リン酸ＡＫＴ４７３（９２７１Ｓ）、抗リン酸ＧＳＫ３α／β（９３３１Ｓ）、ｃ−Ｊｕｎ（２３１５Ｓ）は、セル・シグナリング・テクノロジー（Cell Signaling Technology）（米国マサチューセッツ州ベバリー）から得た；抗ＡＴＦ−３（Ｃ−１９、ｓｃ−１８８）、抗リン酸ＥＲＫ（Ｅ−４０、ｓｃ−７３８３）、抗−α−チューブリン（ＴＵ−０２  ｓｃ−８０３５)は、サンタクルスバイオテクノロジー（Santa CruzBiotechnology）（米国カリフォルニア州サンタクルス）から得た。全ての抗体は、１：１０００希釈で使用された。
【００５０】
１，４−ベンゾキサジン化合物の合成。化合物ＨＳＢ−１−７、ＨＳＢ−１１、ＨＳＢ−１２、ＨＳＢ−１４、ＨＳＢ−１５、ＡＳＫ−１、およびＡＳＫ−２：適切なアルデヒド（１５ｍｍｏｌ）を適切に置換された２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３（４Ｈ）−オン（１０ｍｍｏｌ）、無水酢酸（４ｍＬ）、およびトリエチルアミン（２ｍＬ）の混合物に加えた。反応混合物を７時間還流し、一晩室温で放置して、砕いた氷に注いだ。得た固体を濾過によって収集しアセトニトリルで洗浄した（７０〜８８％収率）。粗生成物をエタノールによる再結晶によって精製した。化合物ΗＳＢ−８、ΗＳＢ−１１、ＨＳＢ−１２、ＨＳＢ１４−１９、ＨＳＢ−２４、ＡＳＫ−１、およびＡＳＫ−２：適切なアルデヒド(１５ｍｍｏｌ)を適切に置換された２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３（４Ｈ）−オン（１０ｍｍｏｌ）、無水酢酸（４ｍＬ）、およびトリエチルアミン（２ｍＬ）の混合物に加えた。反応混合物を７時間還流し、一晩室温で放置して、砕いた氷に注いだ。得た固体を濾過によって収集しアセトニトリルで洗浄した（７０〜８８％収率）。粗生成物をエタノールによる再結晶によって精製した。
【００５１】
ＨＳＢ−１３：触媒量のラネーニッケルを少量ずつ攪拌しながら、エタノール（２０ｍＬ）中のＨＳＢ−１（２ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（１ｍＬ）の混合物に加えた。反応混合物を３時間還流し、次いで濾過した。濾液を減圧下で蒸発乾固させた。粗生成物をエタノールによる再結晶によって精製した（７０％収率）。
【００５２】
ＨＳＢ−２３、ＨＳＢ−２５、およびＡｓｋ−２ａ：これら化合物のそれぞれのエステル（ＨＳＢ−２、ＨＳＢ−２４、およびＡＳＫ−２）（１ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）中、０℃で炭酸カリウム（３ｍｍｏｌ）を用いて処理し、３時間室温で攪拌して、それぞれのアルコールＨＳＢ−２３、ＨＳＢ−２５、およびＡＳＫ−２ａを得た（７０〜７５％収率）。
【００５３】
ＨＳＢ−２２：ナトリウムメトキシドを一部分、無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３（４Ｈ）−オン（１０ｍｍｏｌ）およびピロール−２−カルボキアルデヒド（１６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。反応混合物を４８時間還流し、次いで室温まで冷却して、砕いた氷に注ぎ、一晩４℃で放置した。沈殿した固体を濾過によって収集し、水で洗浄して、乾燥させた。沈殿物をエタノール（１５０ｍＬ）とともに沸騰させて、不純物を除去するために熱いうちに濾過した。濾液を減圧下で蒸発乾固させて、移動相として（９５：５）のトルエン：酢酸エチルを使用してシリカゲルカラム上で残渣をクロマトグラフィーにかけた（２１％収率）。
【００５４】
ＨＳＢ−９およびＨＳＢ−１０：ナトリウムメトキシドを一部分、無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３（４Ｈ）−オン（１０ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（１６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。反応混合物を一晩還流し、次いで室温まで冷却して砕いた氷に注ぎ、冷却装置内に一晩放置した。沈殿した固体を濾過によって収集し、水で洗浄し乾燥させた。粗生成物をそれぞれエタノールによる再結晶（３０％収率）、およびＤＭＦエタノールによる再結晶（４０％収率）によって精製した（４０％収率）。
【００５５】
ＨＳＢ−２０およびＨＳＢ−２１：ナトリウムメトキシドを一部分、無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３（４Ｈ）−オン（１０ｍｍｏｌ）およびインドール−３−カルボキアルデヒド（１６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。反応混合物を２４時間還流し、次いで室温まで冷却して砕いた氷に注ぎ、冷却装置内に一晩放置した。沈殿した固体を濾過によって収集し、水で洗浄し乾燥させた。粗生成物を（９：１）のトルエン：酢酸エチルを使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけた（２５〜３０％収率）。
【００５６】
ＡＳＫ−８、ＡＳＫ−９およびＡＳＫ−１１：無水ベンゼン（１０ｍＬ）中、２Ｈ−１，４−ベンゾチアジン−３（４Ｈ）−チオン（2H-1, 4-benzothazin-3(4H)-thione）（２．７ｍｍｏｌ）、適切なアルデヒド（３．３ｍｍｏｌ）、および触媒量のピペリジンを含有する反応混合物を、９０℃で４時間攪拌し、次いで室温まで冷却した。冷却中に沈殿した粗生成物を真空濾過によって収集し、ベンゼンで洗浄し、乾燥させて、酢酸エチル−ヘキサン（１：４容量／容量）を使用してシリカゲル上でカラム・クロマトグラフィーによって精製した（８６〜９０％収率）。
【００５７】
【化５】
2012500220.tif 000007
（Ｚ）−２，６−ジブロモ−４−（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Η−ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］オキサジン−２−イリデン）メチル）フェニルアセタート：（０．５ｇ、３．３５ｍｍｏｌ）の２Ｈ−ｌ，４−ベンゾキサジン−３（４Ｈ）−オン、１．４ｇの４−ヒドロキシ−３，５−ジブロモベンズアルデヒド、１．６８ｍＬ（１７．７２９ｍｍｏｌ）の無水酢酸、および０．７ｍＬ（５ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンの撹拌混合物を７時間還流し、一晩室温で放置し、砕いた氷に注いだ。沈殿した固体を濾過によって収集し、アセトニトリルで洗浄した。粗生成物をＤＭＦ：エタノールによる再結晶によって精製した。
【００５８】
実施例２．反応−２：（Ｚ）−２−（３，５−ジブロモベンジリデン）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン
【化６】
2012500220.tif 000008
（Ｚ）−２−（３，５−ジブロモベンジリデン）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン。化学合成は、実施例１、反応−１の場合と同じであった。
【００５９】
小脳顆粒ニューロンの培養および処理：顆粒ニューロン培養物を先に説明されたように生後６〜７日のウィスターラットの分離した小脳から得た（デメロら、１９９３年）。ポリ−Ｌ−リジン被覆２４ウェル皿の中の、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのグルタミン（インビトロゲン）、および１００μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補ったイーグルの基礎培地（ＢＭＥ）に、細胞を１×１０６細胞／皿の密度でプレーティングした。非ニューロン細胞の複製を防ぐために、プレーティングの１８〜２２時間後に、シトシンアラビノフラノシド（１０μＭ）を培養培地に加えた。我々の研究室および他の研究者による先の免疫細胞化学的解析は、これらの培養物は９５％を超える顆粒ニューロンを含有する高純度を有するということを示している（Ｔｈａｎｇｎｉｐｏｎら、２００３年；キングズバリ（Kingsbury）ら、２００５年）。
【００６０】
ニューロン培養を処理前７〜８日間維持した。処理のために、細胞を一度すすぎ、次いで低Ｋ＋培地中（無血清ＢＭＥ培地；ＬＫと呼ぶ）、あるいは対照培養の場合、高Ｋ＋培地中（２０ｍＭのＫＣｌを補った無血清ＢＭＥ培地；ＨＫと呼ぶ）に維持した。処理のために、（ジメチルスルホキシド中に溶解した）化合物を、ＨＫからの交換時に１μＭ、５μＭまたは２５μＭの濃度でＬＫ培地に直接加えた。４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドールハイドロクロライド（ＤＡＰＩ）染色によって、生存能を２４時間アッセイした（以下を参照のこと）。各化合物を（各々の濃度で）二つ組にして試験し、実験を少なくとも３回繰り返した。
【００６１】
ＨＫ培地、ＬＫ培地、または、様々な化合物を補ったＬＫ培地で処理したニューロン培養の生存能状態を、位相差顕微鏡検査で評価し、先に説明されたようなＤＡＰＩで細胞核を染色することによって定量化した（ヤルチン（Yalcin）ら、２００３年；モリソン（Morrison）ら、２００６年；Ｍａｊｚａｄｅｈら、２００７年）。簡潔に言えば、細胞を４％パラホルムアルデヒドに２０分間４℃で固定した。リン酸緩衝食塩水中で洗浄した後、ジアミジノ−２−フェニルインドールハイドロクロライド（ＤＡＰＩ；リン酸緩衝食塩水中１μｇ／ｍＬ）を１５分間室温で加えて、紫外線（２６０ｎｍ）下で見た。凝縮または断片化した核を有する細胞を死亡として評点を付けた。生存能をＨＫ培地に交換した対照培養物のパーセントとして表した。独立両側スチューデントｔ検定を使用して統計的解析を行い、ＬＫ処理を受けた対照培養の平均ニューロン生存と比較した。
【００６２】
マウスＨＴ−２２神経芽腫細胞株をＡＴＣＣ（米国バージニア州マナッサス）から購入し、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補った４．５ｇ／Ｌのグルコース（ピルビン酸ナトリウムを含まない）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。培養物をＨＣＡ処理のために〜３０％集密でプレーティングした。ＨＣＡをｐＨ７．５に調節した１５０ｍＭの貯蔵液として作製し、最終濃度１．５ｍＭで使用した。
【００６３】
初代培養の皮質ニューロンを胎生期１８日のラットから培養した。培養物を５ｕＭの熟成Ａβペプチド（Ａβ２５−３５；シグマ−アルドリッチから購入した）で１〜２日後、処理した。ニューロン生存能を２４時間後にアッセイした。
【００６４】
ニューロン培養物のＴＵＮＥＬアッセイを、プロメガ（Promega）（ウィスコンシン州マディソン）からのＤＥＡＤＥＮＤ（商標）蛍光分析ＴＵＮＥＬシステム（DEADEND(TM) Fluorometric TUNEL System）を製造業者の指示に従って使用して、培養物処理の２４時間後に行った。活性型カスパーゼ３の免疫細胞化学的解析のために、ニューロン培養細胞を固定し５分間０．２％トリトンで処理した。３０の間ＰＢＳ中の５％ＢＳＡおよび５％ヤギ血清を含有するＰＢＳでブロッキングした後、カバーガラスを一晩４℃で活性型カスパーゼ−３一次抗体とともにインキュベートした。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、細胞を二次抗体と共に４５分間２５℃でインキュベートし、その後細胞をＰＢＳで洗浄した。核を視覚化するために、細胞をＤＡＰＩで１５分間２５℃で染色した。
【００６５】
培養培地を除去し、細胞を氷冷のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、溶解緩衝液中［１％トリトン、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロリン酸、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍＬのロイペプチン、および、１プロテアーゼ阻害剤の混合物］に溶解した。ブラッドフォードタンパク質アッセイ試薬（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのＢｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、タンパク質濃度を測定し標準化した。標準化に続いて、４０μｇのタンパク質をウェスタンブロット法にかけた。高めた化学発光によって免疫反応性を検査した（米国ニュージャージー州ピスカタウェイのアマシャム・バイオサイエンス（Amersham Bioscience））。
【００６６】
ＨＳＢ−１３（２ｍｇ／ｋｇ)を用いるか、または用いずに、３−ＮＰを１０回の腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇを１日２回、５日間）で投与した生後８週のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールズ・リバー・ラボラトリーズ社（Charles River Laboratories, Inc））に対して３−ニトロプロピオン酸投与および行動評価を行った。ＨＳＢ−１３の注射は、３−ＮＰ投与の３０分前に行った。対照動物は生理食塩水注射を受けた。５日間の注射の後日、先に説明されたような（チンら、２００４年；チェンら２００８ｂ年）ＴＲＵ−ＳＣＡＮ（登録商標）活動監視システム（ペンシルベニア州のクールバーン・インストルメンツ（Coulborn Instruments））を使用して自発運動活性をアッセイした。以下の行動パラメータを選択した：（１）総運動時間、（２）総運動距離：床面における全てのベクトルＸ−Ｙ座標変化の合計、（３）運動毎の平均距離、（４）平均速度：全てのＸ−Ｔ座標変化を定めた運動の平均速度。行動評価に続いて、マウスに深く麻酔をかけて脳を取り除いた。脳を０．１Ｍのリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド内で固定し、０．１Ｍのリン酸緩衝液中の２０％スクロース内で凍結保護した。冠状切片をクリオスタット上で４０ミクロンに切断し、先に説明されたように（チンら、２００４年；チェンら、２００８ｂ年）クレシルバイオレット（シグマ−アルドリッチ）で染色した。
【００６７】
ヒトＡＰＰ６９５の発現を、ＵＡＳ−ＡＰＰ６９５カセットを保有する遺伝子導入ハエ（フォスグリーン（Fossgreen）ら、１９９８年）を、ＵＡＳ／ＧＡＬ４システムを使用してアクチン−ＧＡＬ４プロモーターを含むハエ（ブランド（Brand）およびペリモン（Perrimon）、１９９３年）と交雑させることによって遍在的に誘導した。ハエを、２５℃の暗所で、異なる濃度のＨＳＢ−１３（０μＭ、２．５μＭ、５μＭ、および５０μＭ）を含有する１０％酵母ペーストで飼養した。生存しているＡＰＰ６９５発現後代のパーセンテージを、それらを同一交雑種から得たプロモーターを含まないカセットを保有する、したがって先に説明された（グリーブ（Greeve）ら、２００４年）のと全く同じ条件下で飼養した対照後代と比較することによって決定した。
【００６８】
培養小脳顆粒ニューロンをＨＫ培地からＬＫ培地に交換すると、約５０％の細胞が２４時間以内にアポトーシスを起こした（デメロら、１９９３年）。本発明者は、この広く使用され認識されているモデルを利用して、ＬＫ誘導ニューロン死から保護する能力について、計２０種類の異なる１，４−ベンゾキサジン誘導体を試験した。各化合物を３つの異なる投与量、すなわち１μＭ、５μＭおよび２５μＭで試験し、生存能をＤＡＰＩ染色によって定量化した。最も高い投与量は、化合物の潜在的な毒性効果について試験するために含めた。重要な結果は、アポトーシスの別の信頼性のあるアッセイである、ＴＵＮＥＬ染色を使用して確証した（図１）。表１および図１に示すように、本発明は、重要な神経保護効果を有する幾つかの化合物を特定する。２つの最も保護性のある化合物は、ＨＳＢ−１３およびＨＳＢ−２２であり、双方ともＡｒ＝３’，５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシフェニルである（図１）。これらの化合物は、１μＭで頑強な保護を提供し、保護はこの研究で使用されるより高い２つの投与量で維持される。高レベルの神経保護を示す別の化合物は、ＡＳＫ−２ａである（Ａｒ＝３’，５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）。この化合物による保護は、より低い２つの投与量でのＨＳＢ−１３およびＨＳＢ−２２で観察される保護よりも低い。ＨＳＢ−４、ＨＳＢ−９、ＡＳＫ−８、およびＡＳＫ−９を含む幾つかの化合物は、１μＭ投与量で、最大または最大に近い効力を示した。より高いレベルの保護を１μＭよりも低い投与量で観察することができるかどうか調べるために、これらの化合物の分析を０．５μＭ、０．２５μＭ、および０．１μＭの投与量まで広げた。全ての場合で、保護は、これらの投与量において１μＭで観察された保護よりも低かった。ゆえに、１，４−ベンゾキサジン化合物は、培養ニューロンをアポトーシスから保護した。
【００６９】
化合物の構造、およびそれらが与える神経保護の程度に基づき、以下の結論を引き出すことができる：（ａ）ＡＳＫ−２ａと比較した場合にＨＳＢ−１３およびＨＳＢ−２２で幾分より高いレベルの保護が観察され、これは、６位に置換基がないことに関係しているかもしれない、（ｂ）ＨＳＢ−１３およびＨＳＢ−２２の４’−ＯＨの重要性が、４’−ＯＨ基の代わりに４’−ＯＡｃ基を有する（図２）ＡＳＫ２による保護の減少、ならびに、３’，５’−ジブロモ（ＡＳＫ−１）および３’，４’，５’−トリメトキシ（ＨＳＢ−６）誘導体による神経保護の欠如によって、示される、（ｃ）５μＭで保護性であったＨＳＢ−７（ピリジン−２−イル）を例外として、複素環誘導体、すなわちＨＳＢ−１１（チオフェン−２−イル）、ＨＳＢ−１２（チオフェン−３−イル）、ＨＳＢ−４（チオフェン−３−イル）は不活性であった、そして（ｄ）４’−ＯＨから４’−ＯＣＯＣＨ３エステルへの変換が入り混じった結果を与えた。例えば、化合物ＨＳＢ−２（６−Ｃｌ)、ＨＳＢ−５（６−Ｆ）およびＨＳＢ−３（６−メチル）は、２５μＭで高度に保護性であり、また、ＨＳＢ−１（６−ニトロ）は、５μＭで有効であったが他の２つの試験濃度では有効ではなかった。相対的に、４’−ＯＨ化合物である、ＨＳＢ−１３（６−ＮＨ２）、ＨＳＢ−２２（６−Ｃｌ）、およびＡＳＫ−２ａ（６−Ｈ)は、３つ全ての濃度で有効であった。
【００７０】
３−置換インドロンを用いた先の研究が、２位のＣ＝ＯをＣ＝Ｓで置換することは、神経保護活性を完全に破壊することを明らかにした（バルデラモスら、２００８年）。しかしながら、本発明に含まれるベンゾキサジンの場合、ＡＳＫ−９（ピロール−２−イルおよびＮ−Ｍｅ）ならびにＡＳＫ−１１（２’，５’−ジメトキシフェニル）は、かなりのレベルの保護を示した。しかしながら、ＡＳＫ−８（チオフェン−２−イル）は不活性であった。
【００７１】
表１：２１種の化合物の各々を３つの濃度（１μＭ、５μＭ、および２５μＭ）で試験し、ＬＫ培地に加えた。生存を、ＨＫ培地を受けた対照培養における％生存で表す。データは、少なくとも３つの研究からの平均値を表し、それら研究の各々は、二つ組にして行われた。いかなる添加物も含まないＬＫ培地において、平均生存は４８％であった。
【化７】
2012500220.tif 000009
【表１】
2012500220.tif 000010
【表２】
2012500220.tif 000011
【００７２】
Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫおよびＰＩ−３キナーゼ−Ａｋｔシグナル伝達は、多くの神経栄養ポリペプチド、薬理学的剤、および神経保護化合物の保護性効果を媒介する、哺乳動物細胞における２つのよく確立された強力な抗アポトーシス経路である（デメロおよびチン、２００５年；ヘトマン（Hetman）ら、２００６年）。これら経路のいずれも１，４−ベンゾキサジンの神経保護効果に関与するかどうかを決定するために、本発明者は、これらの経路の薬理学的阻害がそれらの神経保護性効力に影響を及ぼすかどうかを研究した。図３に示すように、構造的に異なるが高度に選択的な２つのＭＥＫ阻害剤である、ＰＤ９８０５９もＵ０１２５も、ＨＳＢ−１３により神経保護性を減少しなかった。同様に、試験した化合物（ＰＩ−３キナーゼ阻害剤、ワートマニン、Ａｋｔ阻害剤Ｘ、または、市販のＡｋｔの阻害剤）のいずれも、ＬＫ誘導アポトーシスに対してニューロンを保護するＨＳＢ−１３の能力を減少しなかった（図３）。これらの研究で利用した投与量において、これらの阻害剤は、ＨＫ処理の結果生じるＥＲＫまたはＡｋｔ刺激を完全に阻害する。ＨＳＢ−１３で観察されたように、ＭＥＫ−ＥＲＫおよびＰＩ−３Ｋ−Ａｋｔ経路の薬理学的阻害は、ＡＳＫ−２ａまたはＨＳＢ−２２の神経保護作用に効果を及ぼさなかった。
【００７３】
ウェスタンブロット解析を行って１，４−ベンゾキサジンによる神経保護がＭＥＫ−ＥＲＫまたはＰＩ３キナーゼ−Ａｋｔシグナル伝達の活性化に関与しないことを確証した。ＭＥＫ、ＥＲＫ、およびＡｋｔの活性化は、それらのリン酸化を必要とし、リン酸化は、リン酸化部位特異的抗体を使用して検出することができる（チンら、２００４年；ジョンソンら、２００５年；Ｍａｊｄｚａｄｅｈら、２００８年）。本発明者および他の者によって先に報告されたように（チンら、２００４年；ジョンソンら、２００５年；Ｍａｊｄｚａｄｅｈら、２００８年）、ＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化は、小脳顆粒ニューロンのＬＫ処理に続いて減少する。この減少は、ＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−２２、またはＡＳＫ−２ａによって妨げられない（図４）。ＡｋｔのＳｅｒ４７３でのリン酸化はまた、ＬＫ処理の６時間後わずかに減少される（チンら、２００４年；ジョンソンら、２００５年；Ｍａｊｄｚａｄｅｈら、２００８年）。このことも、ＡＳＫ−２ａまたはＨＳＢ−２２を用いた処理による影響を受けない（図４）。しかしながら、ＨＳＢ−１３はＬＫにおいて見られるものよりもさらに多くのＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）リン酸化を阻害する。ＨＳＢ−１３と他の２つの神経保護化合物との間のリン酸化パターンの顕著な相違は、ＨＳＢ−１３がＨＳＢ−２２およびＡＳＫ−２ａとは違ったようにシグナル伝達分子に影響を及ぼすということを示唆する。
【００７４】
Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路およびＰＩ−３キナーゼ−Ａｋｔ経路は、ＨＳＢ−１３による神経保護に必要ではないので、ニューロン生存を促進することが知られている他のシグナル伝達分子の関与が決定された。ＧＳＫ３βは、多くのニューロン系および非ニューロン系におけるアポトーシスの間に活性化されるアポトーシス促進分子である。生存促進条件下で、ＧＳＫ３βを、Ａｋｔおよび他のキナーゼによって誘導されうる修飾である、阻害部位でのリン酸化によって不活性化された状態に保つ。図４に示すように、ＧＳＫ３βの脱リン酸化は、ＨＳＢ−１３によって阻害されない。相対的に、ＨＳＢ−２２およびＡＳＫ−２ａはＧＳＫ３βの脱リン酸化を阻害する。
【００７５】
小脳顆粒ニューロンのＨＫを用いた処理は、カルシウム−カルモジュリンキナーゼ（ＣａＭＫ）を活性化し、ＫＮ−６２などの薬理学的阻害剤を用いたＣａＭＫの阻害は、ＨＫ媒介生存を阻害する（シー（See）ら、２００１年；リスマン（Linseman）ら、２００３年；モリソンら、２００６年）。しかしながら、ＨＳＢ−１３による神経保護は、ＫＮ−６２処理によって減少されない（図３）。本発明者は、幾人かの研究者がサイクリックＡＭＰ類似体およびプロテインキナーゼＡの薬理学的活性化因子は、他の生存促進刺激がない場合に小脳顆粒ニューロンおよび他のニューロンタイプの生存を促進するということを示していることを認識した（ライデル（Rydel）およびグリーン（Greene）、１９８８年；デメロら、１９９３年；ハンソン（Hanson）ら、１９９８年）。ＰＫＡ媒介ニューロン生存は、強力で選択的なＰＫＡ阻害剤である、Ｈ８９を用いた処理によってブロッキングされる（リー（Li）ら、２０００年；バーヴェ（Bhave）およびホフマン（Hoffman）、２００４年）。図３に示すように、Ｈ８９を用いた処理は、ＨＳＢ−１３媒介神経保護に影響を及ぼさない。本発明者は、トリコスタチンＡなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、小脳顆粒ニューロンの生存を維持するＨＫの能力をブロッキングするということを先に報告している（サルミネン（Salminen）ら、１９９８年；Ｂｏｕｔｉｌｌｉｅｒら、２００２年；モリソンら、２００６年）。しかしながら、ＴＳＡ処理もまた、ＨＳＢ−１３の神経保護効力を著しく阻害するものではなかった（図３）。
【００７６】
Ｃ−ｊｕｎ発現は、様々な組織培養、および、ニューロンアポトーシスの生体内範例において誘導される（シェンケル（Schenkel）ら、２００４年）。この転写因子の活性化は、ＬＫ誘導小脳顆粒ニューロンにおけるニューロン死、ならびに他のモデルのニューロン死に必要であることが示されている（エスタス（Estus）ら、１９９４年；ハム（Ham）ら、１９９５年；ワトソン（Watson）ら、１９９８年）。図５に示すように、ＬＫによるｃ−ｊｕｎ発現の誘導は、ＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−２２、およびＡＳＫ−２ａによって阻害される。ＨＳＢ−１３を用いた処理は、ｃ−ｊｕｎ発現を阻害し、それはＨＫ処理培養で見られるものより低くさえある。発現がアポトーシスの間にニューロンにおいて刺激される別の転写因子は、ＣＲＥＢファミリータンパク質のメンバーである、ＡＴＦ−３であり、これは、異なるモデルにおいてニューロン死を促進することが示されている（ハイ（Hai）ら、１９９９年；Ｖｌｕｇら、２００５年；チェンら２００８ａ年）。ｓｉＲＮＡを使用したＡＴＦ−３発現の抑制は、小脳顆粒ニューロンのＬＫ媒介死を阻害し、このことは本発明者によって先に説明されている（チェンら、２００８ａ年）。図５に示すように、ＡＴＦ−３のＬＫ媒介増加は、３つ全ての神経保護性ベンゾキサジンによって阻害される。ｃ−ｊｕｎで観察されるように、この抑制は、ＨＳＢ−１３で最も頑強であった。結果として、これらの組成物は、ｃ−ｊｕｎおよびＡＴＦ−３の活性を阻害することができ、ひいてはガン、およびｃ−ｊｕｎのようなオンコプロテインを処置することにおいて役割を果たす。
【００７７】
マウス神経芽腫ＨＴ−２２細胞株のホモシステイン酸（ＨＣＡ）を用いた処理は、グルタチオン欠乏および酸化ストレスを通してアポトーシスを誘導する（マーフィ（Murphy）ら、１９９０年；ラタン（Ratan）ら、１９９４ａ年、１９９４ｂ年）。本発明者は、ＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−２２、およびＡＳＫ−２ａが、この酸化ストレス誘導ニューロン死の範例において保護性であるかどうかを研究した。図６Ａおよび図６Ｂに示すように、ＨＳＢ−１３は、ＨＣＡ誘導細胞死を防ぐ。最も高い保護は、２５μＭ濃度で観察されたが、ＨＳＢ−１３は、５μＭでも頑強な保護をもたらした。驚くことに、それらの構造的類似性を鑑みて、ＡＳＫ−２ａおよびＨＳＢ−２２は、検査された３つの投与量のいずれにおいても保護しなかった（データ示さず）。３つ全てのベンゾキサジンはＬＫ媒介ニューロン死から保護するが、ＨＳＢ−１３のみがＨＣＡ誘導アポトーシスに対して保護性であるという研究結果は、これら２つの範例におけるアポトーシスの根底にある分子機構が異なるということを示唆する。さらに、この結果は、６位のアミノ基は（図２を参照のこと）ＨＣＡ毒性に対する保護に必要であるということを示唆する。また我々は、ＨＳＢ−１３はＡβ毒性に対して初代培養または皮脂ニューロンを保護するということ見出した。ゆえに、ＨＳＢ−１３は酸化ストレス誘導ニューロン死に対して保護性であるが、ＡＳＫ−２ａおよびＨＳＢ−２２はそうではない。
【００７８】
小脳顆粒ニューロン培養物、およびＨＴ−２２細胞は、ＨＳＢ−１３が組織培養範例において強力で多用途の神経保護効力を有するということを示した。げっ歯類およびヒト以外の霊長類におけるニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）投与は、選択的線条体変性、自発舞踏病様運動、およびジストニー運動を含む、ＨＤの臨床的および病態生理学的特徴の大部分を再現する。ゆえにこの神経毒の投与は、ＨＤのための有用なモデルとして働く（Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔら、１９９９年）。本発明者は、この生体内範例においてＨＳＢ−１３の効力を調査した。図７Ａに示すように、３−ＮＰを投与したマウスは、広範囲の線条体損傷を示した。この変性は、２ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与された場合にＨＳＢ−１３によって大幅に減少される（図７Ａ）。３−ＮＰ誘導の線条体神経変性に対するＨＳＢ−１３による保護は、自発運動遂行の著しい改善と相関した（図７Ｂ）。具体的には、全て３−ＮＰ投与によって損なわれた、総運動時間：総運動距離；運動ごとの平均距離、および、運動の平均速度は、ＨＳＢ−１３を受けた動物において顕著により高まり、ＨＳＢ−１３がハンチントン病（ＨＤ）の生体内モデルにおいて神経保護性であるということが証明された。
【００７９】
本発明者はまた、遍在的にＡＰＰ６９５を発現するハエモデルを使用することによって、ＡＰＰ誘導毒性に対するＨＳＢ−１３の有益な効果を研究した（グリーブら、２００４年）。図８に示すように、無処置のハエは、ＡＰＰ６９５を発現しない同一条件下で飼養された対照ハエと比較して、たった約５％の生存率しか示さない。増加した濃度のＨＳＢ−１３を含有する餌でこれらのハエを飼養することによって結果として、ＡＰＰ発現ハエの生存率において、等しく処置された対照ハエと比較して、５０μＭでの６５％から５０μＭでの４４％までの範囲と、著しく増加した。これらの生存率は、無処置ハエと比較してほぼ１０倍高く（全てのｐ値＜０．０５）、このことは、ＨＳＢ−１３はまた、ショウジョウバエ生体内モデルにおいてＡＰＰ誘導毒性から保護するということを示す。
【００８０】
ゆえに本発明は、小脳顆粒ニューロンのＬＫ誘導アポトーシスに対して保護性である幾つかの新規の化合物を説明する。本発明の焦点は、３つのこれら化合物、つまりＨＳＢ−１３、ＨＳＢ−２２、およびＡＳＫ−２ａであった。構造的に類似しているが、これらの化合物のうちの１つである、ＨＳＢ−１３だけが、海馬の神経芽腫ＨＴ２２細胞のＨＣＡ誘導毒性に対して保護性である。ＡＳＫ−２ａおよびＨＳＢ−２２は、一次顆粒ニューロンにおいて優れた神経保護を提供し、このことは、ＡＳＫ−２ａおよびＨＳＢ−２２は、酸化ストレスが決定的な要素でないニューロン死の他の範例において効果的であり得るということを示唆する。ＬＫおよびＨＣＡ誘導細胞死に加えて、ＨＳＢ−１３は、Ａβ誘導毒性およびＨＣＡ毒性に対して一次皮質ニューロンを保護する。ＨＳＢ−１３の増加した多用途性は、単一置換基、すなわち６位のアミノ基の存在に起因すると考えられる。
【００８１】
本明細書で提供されているデータは、ＨＳＢ−１３はまた、２つの別個の神経変性生体内モデルにおいて保護性であるということも証明している。実際、ＨＳＢ−１３は線条体変性を減少し、化学的に誘導されたハンチントン病のマウスモデルにおいて行動遂行を改善し、ハエにおいてＡＰＰ毒性から保護する。組織培養、および神経変性の生体内範例におけるＨＳＢ−１３の有効性は、ＨＳＢ−１３またはその誘導体が、ヒト神経変性状態の治療における治療薬としての価値を有することができるということを示唆する。
【００８２】
本発明者による研究は、ＰＩ−３キナーゼ−ＡｋｔおよびＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路、または、ＣａＭＫ、ＰＫＡおよびＨＤＡＣなどのＨＫ媒介ニューロン生存に関与する他の分子が、これら化合物の保護する能力に関与しないということを示唆し、異なる作用機構を示唆する。しかしながら、これらの研究は、これらの化合物がＡＴＦ−３およびｃ−ｊｕｎの活性化を阻害するが、このことが媒介される上流機構はまだ詳細に説明されないでいるということを示している。ＨＣＡ誘導毒性から保護するその能力について観察したように、シグナル伝達分子のうちの幾つかにおけるＨＳＢ−１３の効果は、ＨＳＢ−２２またはＡｓｋ−２ａ処理によって誘発された効果とは質的に異なる。例えば、ＡＴＦ−３およびｃ−ｊｕｎの抑制は、ＨＳＢ−２２およびＡＳＫ−２ａで見られるものと比較して、ＨＳＢ−１３でははるかにより頑強である。ＨＳＢ−１３はまた、ＡｋｔのＳｅｒ４７３のリン酸化を阻害する唯一の化合物である。そしてＧＳＫ３活性化の程度は、その脱リン酸化によって判断すると、ＨＳＢ−２２およびＡＳＫ−２ａよりもＨＳＢ−１３でより高まる。これらの相違点の幾つかは、何故ＨＳＢ−１３がＨＣＡ誘導毒性に対して保護性であるのに、ＨＳＢ−２２またはＡＳＫ−２ａはそうではないのかを説明することを可能にし得る。
【００８３】
本発明の化合物の作用機構をより良く理解するために、限定目的ではなく、２０種の異なるキナーゼに対するＨＳＢ−１３およびＡＳＫ−２ａの効果を生体外で調べた。この研究の結果は、表２および表３に提示されている。５００ｎＭ濃度で、ＡＳＫ−２ａは、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８α、ｐ３８β、ＪＮＫ３、ＭＬＫ３、および、Ｂ−Ｒａｆのキナーゼ活性を実質的に阻害した。上述のキナーゼを阻害することに加えて、ＨＳＢ−１３は、５００ｎＭで使用された場合、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、および、ＲＯＣＫ１をも阻害した。双方の化合物とも、ｐ３８βに対して最も強力な阻害を示した。上記で説明したように、ＡＳＫ−２ａは、ＬＫ誘導死に対して小脳顆粒ニューロンを保護するが、ＨＴ−２２細胞のＨＣＡ誘導毒性に対して無効性である。対照的に、ＨＳＢ−１３は、双方の範例において保護性である。これは、ＨＣＡ処理ＨＴ−２２培養におけるＨＳＢ−１３の保護効果が、ＣＤＫへのその阻害効果に起因するということを示す。先の研究が、ＣＤＫ阻害剤は多くの異なるアポトーシス刺激に対してニューロンを保護することができるということを確立している。
【００８４】
１００ｎＭでＨＳＢ−１３は、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８β、および、Ｂ−Ｒａｆを阻害することにおいて、相当により選択的である。強力な神経保護効果を有する３置換インドロンである、ＧＷ５０７４も、Ｂ−Ｒａｆを阻害する。ＧＷ５０７４はＧＳＫ３βを弱く阻害するが、Ｂ−Ｒａｆが構造的に異なる神経保護化合物によって阻害されるという研究結果は、このキナーゼの阻害を、神経保護の根底にある分子機構における重要事象として関係づける。
【００８５】
表２：生体外で測定した２０種の異なるキナーゼに対する５００ｎＭのＡＳＫ−２ａの効果。キナーゼ活性を（ＡＳＫ−２ａを用いない）対照アッセイにおける活性のパーセンテージとして表す。値は、二つ組にして行ったアッセイの平均である。キナーゼ活性の実質的な阻害（＞２０％）は、太字になっている。
【００８６】
表２：生体外で測定した２０種の異なるキナーゼに対する１００ｎＭおよび５００ｎＭのＡＳＫ−２ａの効果。
【表３】
2012500220.tif 000012
【００８７】
各キナーゼの活性を１００ｎＭまたは５００ｎＭいずれかのＡＳＫ−２ａの存在下、生体外で測定した。キナーゼ活性は、（ＡＳＫ−２ａを用いない）対照アッセイにおける活性のパーセンテージとして表す。値は、二つ組にして行ったアッセイの平均である。キナーゼ活性の実質的な阻害（＞２０％）は、太字になっている。
【００８８】
ＨＳＢ−１３により、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８β、および、Ｂ−Ｒａｆは効果的に阻害されるということが見出された（１００ｎＭ濃度で）。また、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＲＯＣＫ１、ＪＮＫ２、ＭＬＫ３、および、ｃ−Ｒａｆも阻害された（これら全ては５００ｎＭで阻害される）。ＡＳＫ２ａを使用して、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８α、ｐ３８β、ＪＮＫ３、および、Ｂ−Ｒａｆは効果的に阻害されるが（１００ｎＭで）、ＭＬＫ３はより低い効率で阻害されるということが見出された。したがって、１，４−ベンゾキサジンの標的であるキナーゼは、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８α、ｐ３８β、Ｂ−Ｒａｆ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、および、ＭＬＫ３を含む。
【００８９】
表３：生体外で測定した２０種の異なるキナーゼに対する５００ｎＭのＨＳＢ−１３の効果。キナーゼ活性を（ＨＳＢ−１３を用いない）対照アッセイにおける活性のパーセンテージとして表す。値は、二つ組にして行ったアッセイの平均である。キナーゼ活性の実質的な阻害（＞２０％）は、太字になっている。
【００９０】
表３：生体外で測定した２０種の異なるキナーゼに対する１００ｎＭおよび５００ｎＭのＨＳＢ−１３の効果。
【表４】
2012500220.tif 000013
１，４−ベンゾキサジン化合物は、アポトーシスから培養ニューロンを保護するということを見出した。培養小脳顆粒ニューロンがＬＫ培地に交換されると、約５０％の細胞が２４時間以内にアポトーシスを起こす。この研究では、図１に示された構造の合計２０種の異なる１，４−ベンゾキサジン誘導体を、小脳顆粒ニューロンのＬＫ誘導死から保護するそれらの能力について試験した。各化合物を３つの異なる投与量、すなわち１μＭ、５μＭ、および、２５μＭで試験した。ニューロン生存能を、アポトーシス細胞死の一般的で信頼性のあるアッセイである、ＤＡＰＩ染色によって定量化した。ニューロン死に対する効果の結果を表４にまとめた。幾つかの場合において、ＤＡＰＩ染色から得た結果を、２つの他のアポトーシスアッセイ、すなわちＴＵＮＥＬ染色および活性型カスパーゼ−３免疫細胞化学によって確証した。
【００９１】
【表５】
2012500220.tif 000014
【００９２】
表４は、２０種の化合物を提供しており、それら各々が３つの濃度（１μＭ、５μＭ、および２５μＭ）で試験されＬＫ培地に加えられた。生存を、ＨＫ培地を受けた対照培養における生存の％で表す。データは少なくとも３回の実験からの平均値を表し、その実験の各々は二つ組にして行われた。いかなる添加物も含まないＬＫ培地において、平均生存は４８．１６±８．４４％であった。化合物は、表４に記載された置換を伴う以下に記載された基本構造を有した。
【化８】
2012500220.tif 000015
【００９３】
詳細な構造活性相関は行わなかったが、２０種の化合物の我々の分析は、以下のことを示唆する。（１）親化合物（コア構造については表４を参照のこと）、最も有効な神経保護化合物はＡＳＫ−２（Ａｒ＝３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）である。表４に示すように、ＡＳＫ−２は２５μＭおよび５μＭで高度に保護的であるが（それぞれ１０２．５％および９２．１％）、１μＬでは中程度に保護的なだけである（８０．３％）。４−ＯＨの重要性は、３，５−ジブロモ（ＡＳＫ−１）、および３，４，５−トリメトキシ（ＨＳＢ−６）誘導体による神経保護の欠如によって示される。５μＭで中程度に活性（８８％）であったＨＳＢ−７（ピリジル−３−イル）を例外として、親複素環誘導体、すなわちＡＳＫ−９（チオフェン−２−イル）、ＨＳＢ−４（チオフェン−３−イル）は不活性であった。（２）ＡＳＫ−２の６位をアミノ基または塩素原子で置換することにより［ＨＳＢ−１３またはＨＳＢ−２２］、ある特定濃度で改善した活性がもたらされる。例えば、ＨＳＢ−２２は、全ての濃度で高度に保護的であり、すなわち１μＭ、５μＭ、および、２５μＭで、それぞれ９２％、９７％、および、９０．６％である。化合物ＨＳＢ−１３は、５μＭのＡＳＫ−２（９２．２）よりもかなり有効であり（１００．８％）、２５μＭのＡＳＫ−２（１０２．５）とほぼ同じくらい有効（９９．５）であった。（３）表題の化合物の神経保護能力への７位での置換は、６−置換と比較した場合はるかに不明白である。たった１つの濃度のみが高度に有効である。例えば、化合物ＨＳＢ−２（７−Ｃｌ）、ＨＳＢ−５（７−Ｆ）、およびＨＳＢ−（７−メチル）は、２５μＭの溶液において高度に保護性であり（〜９７％）、ＨＳＢ−１（７−ニトロ）は、５μＭで有効であった。４つ全てが、他の２つの試験溶液において有効というわけではなかった。（４）Ｃ＝ＯのＣ＝Ｓによる置換は入り混じった結果を与えた。この研究では、ＡＳＫ−９（ピロール−２−イルおよびＮ−Ｍｅ）は１μＭで中程度の活性（８４．５％）であり、ＡＳＫ−１１（２，５−ジメトキシフェニル）は、５μＭで高度に活性（９０．７％）であった。しかしながら、ＡＳＫ−８（チオフェン−２−イル）は不活性であった。
【００９４】
培養小脳顆粒ニューロンの分析により、ＨＳＢ−１３は強力な神経保護効力を有するものとして特定された。したがって、我々はＨＳＢ−１３を選択して、その保護効果が他のニューロンタイプおよびアポトーシス刺激にまで及ぶかどうかを調べた。海馬由来神経芽腫細胞株であるＨＴ−２２をホモシステイン酸（ＨＣＡ）で処理することは、アポトーシスを導くグルタチオン欠乏に起因する酸化ストレスを引き起こす（マーフィら、１９９０年；ラタンら、１９９４ａ年、１９９４ｂ年）。図９に示すように、２ｍＭのＨＣＡでの処理は、２４時間でほぼ完全な細胞死をもたらし、これは２５ｕＭ濃度のＨＳＢ−１３によって妨げられた。ＨＳＢ−１３はこの範例において５ｕＭで使用された場合は保護性ではなかった。
【００９５】
ＨＳＢ−１３は、ハンチントン病（ＨＤ）の生体内モデルにおいて神経保護性である。げっ歯類およびヒト以外の霊長類におけるニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）投与は、選択的線条体変性、自発舞踏病様運動、およびジストニー運動を含む、ＨＤの臨床的および病態生理学的特徴の大部分を再現する。ゆえにこの神経毒の投与は、ＨＤのための有用なモデルとして働く（Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔら、１９９９年に概説されている）。ＨＳＢ−１３の効力が決定された。図１０Ａに示すように、Ｓ−ＮＰを投与したマウスは、広範囲の両側線条体損傷を示す。この変性は、２．５ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与された場合にＨＳＢ−１３によって大幅に減少される（図１０）。３−ＮＰ誘導の線条体神経変性に対するＨＳＢ−１３による保護は、自発運動遂行の著しい改善と相関した。具体的には、全て３−ＮＰ投与によって損なわれた、全運動エピソード、総運動距離、および、運動の平均速度は、ＨＳＢ−１３を受けた動物において顕著により高まった（図１０Ｂ）。
【００９６】
３−ニトロプロピオン酸投与および行動評価。生後８週のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールズ・リバー・ラボラトリーズ社）に、ＨＳＢ−１３（９２．５ｍｇ／ｋｇ)を用いるか、または用いずに、１０回の腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇを１日２回、５日間）で３−ＮＰを投与した。ＨＳＢ−１３の注射は、３−ＮＰ投与の３０分前までに行った。対照動物は生理食塩水注射を受けた。５日間の注射の後日、先に説明されたように（チンら、２００４年）ＴＲＵ−ＳＣＡＮ（登録商標）活動監視システム（ペンシルベニア州のクールバーン・インストルメンツ）を使用して自発運動活性をアッセイした。以下の行動パラメータを選択した：（i）全運動エピソード：床面における各運動とは、少なくとも１つのサンプル間隔の間で静止状態がない一連の座標変化である、（２）総運動距離：床面における全てのベクトルＸ−Ｙ座標変化の合計、および、（３）平均速度：全てのＸ−Ｔ座標変化を定めた運動の平均速度。行動評価に続いて、マウスに深く麻酔をかけて脳を取り除いた。脳を０．１Ｍのリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド内で固定し、０．１Ｍのリン酸緩衝液中の２０％スクロース内で凍結保護した。冠状切片をクリオスタット上で５０ミクロンに切断し、クレシルバイオレット（シグマ）で染色した。
【００９７】
本発明は、神経保護剤としての１，４ベンゾキサジンの初めての実証であり、このクラスの化合物がヒト神経変性障害の治療のための新規治療薬になるという素晴しい可能性をもたらす。
【００９８】
細胞のｃ−Ｒａｆおよび／またはＢ−Ｒａｆ活性に対する化合物の効果の評価。ｃ−ＲａｆまたはＢ−Ｒａｆの活性を、細胞溶解物による免疫沈降に続いて評価する。簡潔に言えば、約２５０μｇのタンパク質を、（ｃ−ＲａｆまたはＢ−Ｒａｆのいずれかに対する）１．０μｇの一次抗体、および、１２μＬのタンパク質Ａ／Ｇプラス・アガロースビーズとともに一晩インキュベートする。免疫沈降物を３０秒間６０００ｒｐｍで遠心分離することによって収集し、溶解緩衝液で２回、３５０ｍＭのＮａＣｌを補った溶解緩衝液で２回、そしてキナーゼ緩衝液（２５ｍＭのｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ、および、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）で２回、洗浄する。精製した組換えＧＳＴ−ＭＥＫ１  Ｋ９７Ｍタンパク質を基質として、８５μＭのＡＴＰを補ったキナーゼ緩衝液に３５分間３０℃で加える。生体外キナーゼアッセイのために、化合物をキナーゼ緩衝液に加え、ＡＴＰ添加によるキナーゼ反応が始まる前に、３０℃で５分間インキュベートする。キナーゼ反応を６×ＳＤＳサンプル緩衝液の添加によって停止し、５分間沸騰させる。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウェスタンブロット法にかける。キナーゼ活性のレベルを、ウェスタンブロット法にしたがい、リン酸−ＭＥＫ抗体により検出する。
【００９９】
昆虫細胞から精製した化合物ｃ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆの効果。生体外キナーゼアッセイを、アップステイト・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）のキナーゼ・プロファイリング・サービス（Kinase
Profiling service）を使用して、標準条件下で、精製キナーゼ（Ｓｆ９昆虫細胞のバキュロウイルスによって発現される）、および、合成基質を使用して行った。簡潔に言えば、各アッセイについて、５〜１０ｍＵの精製キナーゼを、８ｍＭのｐＨ７．２のＭＯＰＳ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および、［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］を含有する緩衝液中の化合物（０．１〜１ｕＭ濃度）と共に４０分間室温でインキュベートする。ＭＢＰを基質として使用する。キナーゼ活性は、３３Ｐの取り込みを、Ｐ３０フィルター上に一定分量を付け、５０ｍＭのリン酸中で洗浄してシンチレーション計数することによる測定によって定量化する。
【０１００】
幾つかの場合、ｃ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆへの効果を、以下のようにＳｉｇｎａｌＣｈｅｍによってアッセイする。プロテインキナーゼアッセイを（二つ組または三つ組で）、周囲温度で２０〜４０分間、２５μＬの最終容量で行った。アッセイを３３Ｐ−ＡＴＰの添加によって開始し、反応混合物を周囲温度でプロテインキナーゼ標的に応じて２０〜４０分間インキュベートした。インキュベーション期間の後、１０μＬの反応混合物をマルチスクリーン・ホスホセルロースＰ８１プレート上に置くことによってアッセイを終了した。マルチスクリーン・ホスホセルロースＰ８１プレートを１％リン酸溶液中でそれぞれ約１５分間３回洗浄した。
【０１０１】
Ｐ８１プレート上の放射能をＴｒｉｌｕｘシンチレーションカウンター内でシンチレーション流体の存在下で計数した。適切な基質の添加を除いて、ブランク対照を全てのアッセイ要素に含め（同量のアッセイ希釈緩衝液で置き換える）、各プロテインキナーゼ標的に対して据えた。各プロテインキナーゼ標的に対する修正した活性を、ブランク対照値を除くことによって決定した。
【０１０２】
本明細書において論じられた任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬、または組成物に関して実施されうる、あるいはその逆についても同様であることが企図されている。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用されうる。
【０１０３】
本明細書において説明された特定の実施形態は、例示目的で示されており、本発明の限定として示されているのではないことは理解されるであろう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく様々な実施形態において利用されうる。当業者は、本明細書において説明された具体的な手順に対する多数の同等物を認識する、あるいは、単なる日常の実験を使用して、それらを確認することができるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内にあると見なされ、特許請求の範囲によって含まれる。
【０１０４】
本明細書において言及された全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の通常の技術者の技術レベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、個々の各刊行物または特許出願が具体的に個々に示されて参照により組み込まれたかのような程度に、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１０５】
語「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む（comprising）」と関連して使用される場合、「１つ」を意味することができるが、「１以上」、「少なくとも１つ」、および、「１または２以上」の意味とも一致する。特許請求の範囲において用語「または」の使用は、二者択一のみに言及するか、またはその二者択一は相互に排他的であるように明らかに指示されていない限り「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、二者択一ならびに「および／または」のみに言及する定義を支持する。本出願の全体にわたって、用語「約」が、値が装置の誤差による固有の変動、この値を決定するために利用される方法、または、研究対象の中に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【０１０６】
本明細書および請求項に使用されるように、語「含む（comprising）」（およびcomprisingの任意の形態、例えば「comprise」および「comprises」など）、語「有する（having）」（およびhavingの任意の形態、例えば「have」および「has」など）、語「含む（including）」（およびincludingの任意の形態、例えば「includes」および「include」など）、あるいは、語「含有する（containing）」（およびcontainingの任意の形態、例えば「contains」および「contain」など）は包含的であり、すなわち制限がなく、追加の列挙されていない要素または方法ステップを排除するものではない。
【０１０７】
本明細書において使用される用語「またはその組み合わせ」は、この語の前に列挙されている項目の全ての並べ替えおよび組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣもしくはＡＢＣ、また特定の文脈で順番が重要な場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣもしくはＣＡＢ：のうちの少なくとも１つを含むように意図される。この例を続けると、１以上の項目もしくは用語の繰り返しを含む組み合わせ、例えばＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどがはっきりと含まれる。当業者は、典型的には、文脈から特に明らかでない限り、項目または任意の組み合わせの項目の数に制限はないということを理解するであろう。
【０１０８】
本明細書において開示され主張された組成物および／または方法の全ては、本開示を考慮すると過度な実験をすることなく作製され遂行されうる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態によって説明されたが、変動が、組成物および／または方法に、ならびに、本明細書において説明された方法のステップもしくはステップのシーケンスにおいて、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、適用されうるということが当業者には明らかであろう。当業者にとって明らかなそのような類似の置換および修正の全ては、添付の特許請求の範囲によって定められる本明細書の精神、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【０１０９】
〔参照〕
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lateral sclerosis-SODl transgenic mice and correlates with c-Jun
phosphorylation, CHOP expression, somato-dendritic ubiquitination and Golgi
fragmentation）。ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス  ２２，１８８１〜１８９４。
ワトソン（Watson）Ａ．、エイラーズ（Eilers）Ａ．、ルラルマンＤ．、Ｋｙｒｉａｋｉｓ  Ｊ．、ルビンＬ．Ｌ．、および、ハムＪ．（１９９８年）ｃ−Ｊｕｎのリン酸化は、小脳顆粒ニューロンにおける生存シグナル伝達中止により誘導されるアポトーシスに必要である。（Phosphorylation of c-Jun is necessary for apoptosis induced by
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hyperphosphorylation and reduced interaction between CBP and NF-KB）ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー  ８４：３９７〜４０８。
【図１】
2012500220.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月15日(2011.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）の化合物であって、
【化１】
2012500220.tif 000031
式中、
Ａｒは、フェニル、置換されたフェニル、ナフチル、置換されたナフチル、ビフェニル、ヨードビフェニル、メトキシビフェニル、アントリル、ブロモフェニル、ヨードフェニル、クロロフェニル、ヒドロキシフェニル、メトキシフェニル、ホルミルフェニル、アセチルフェニル、トリフルオロメチルチオフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、アルキルチオフェニル、トリアルキルアンモニウムフェニル、アミドフェニル、チアゾリルフェニル、オキサゾリルフェニル、イミダゾリルフェニル、イミダゾリルメチルフェニル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、３，５−ジブロモフェニル、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル、３，５−ジブロモ−４−アセトキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、チオフェン−３−イル、チオフェン−２−イル、ピロール−２−イル、ピリジン−２−イルおよび、３−インドリルからなる群から選択され、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
Ｒは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、および、オキソ基からなる群から選択され、
Ｇは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル基、ハロ基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたＣ１〜Ｃ６アルケニル基、カルボニル基、炭酸エステル基、Ｃ１〜Ｃ６エーテル基、Ｃ１〜Ｃ６エステル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルカノアート基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケト基、オキソ基、ＮＯ２含有基、および、アミン含有基からなる群から選択される、化合物。
【請求項２】
Ａｒは、２，５−ジメトキシフェニル、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、および、３，５−ジブロモ−４−アセトキシフェニル、ピリジン−２−イル、チオフェン−３−イル、および、ピロール−２−イルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｇは、ハロゲン、メチル基、アミン含有基、および、ＮＯ２含有基からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ａｒは、３，５，ジブロモ−４−アセトキシフェニルであり、Ｇは、ハロゲン、メチル基、アミン基、および、ＮＯ２基からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の化合物の薬物としての使用。
【請求項６】
Ａｒは、２，５−ジメトキシフェニル、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、および、３，５−ジブロモ−４−アセトキシフェニル、ピリジン−２−イル、チオフェン−３−イル、および、ピロール−２−イルからなる群から選択される、請求項５に記載の化合物の使用。
【請求項７】
Ｇは、ハロゲン、メチル基、アミン含有基、および、ＮＯ２含有基からなる群から選択される、請求項５に記載の化合物の使用。
【請求項８】
Ａｒは、３，５，ジブロモ−４−アセトキシフェニルであり、Ｇは、ハロゲン、メチル基、アミン基、および、ＮＯ２基からなる群から選択される、請求項５に記載の化合物の使用。
【請求項９】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、発作、および、虚血性発作からなる群から選択される状態を治療するための、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１０】
増加したキナーゼ活性に関連する状態を治療するための、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
前記キナーゼは、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ３８β、および、Ｂ−Ｒａｆからなる群から選択される、請求項１０に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
前記キナーゼは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＲＯＣＫ１、ＪＮＫ２、ＭＬＫ３、および、ｃ−Ｒａｆからなる群から選択される、請求項１０に記載の化合物の使用。
【国際調査報告】
2012500220.tif 000032
2012500220.tif 000033
2012500220.tif 000034