(57)【要約】治療有効量のＴＷＥＡＫ受容体アゴニストを用いて、被験体または培養物中の膵臓細胞の集団を増大させる方法、または膵臓前駆細胞の産生を誘導する方法を開示する。これらの方法は、例えば、糖尿病および膵臓の全部または一部分の喪失をもたらす病状を含めた、細胞置換療法のための膵臓前駆細胞の増強が望ましい疾患または病状を処置するのに用いることができる。本発明は、ＴＮＦファミリーメンバーであるＴＷＥＡＫが、ヒトおよび齧歯動物の膵臓細胞の集団を増大させることができ、膵臓において内分泌系統に方向付けされた前駆細胞の出現を誘導することができるという発見に、少なくとも部分的に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において膵臓組織の再生を誘導する方法であって、膵臓組織の再生を誘導するのに十分な治療有効量のＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）アゴニストを、膵臓組織の再生の誘導を必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
膵臓組織が膵臓島組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膵臓島組織が島ベータ細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が膵臓組織を喪失している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が糖尿病を有し、前記方法がインスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するのに有効な量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを前記被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
糖尿病が１型糖尿病である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
糖尿病が２型糖尿病である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体が膵臓組織の除去を受けている、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体ががんを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記がんが膵臓がんである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体が膵臓において細胞または組織の移植片を受容しており、前記移植片が膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記移植片が、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記膵臓前駆細胞が、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記膵臓前駆細胞が膵管上皮細胞または導管隣接細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記移植片が本質的に膵管上皮細胞のみからなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記前駆細胞が、膵臓細胞に分化することができる、胚性幹細胞、成体幹細胞、全能性幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与する前に、前記移植片を投与する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記移植片および前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが同時に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
被験体において糖尿病を処置する方法であって、ｉ）膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む、細胞または組織の移植片、およびｉｉ）膵臓組織の再生を誘導するのに十分な治療有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニスト、を糖尿病を有する被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
部分的膵除去術を受けている被験体において膵臓組織を再生する方法であって、前記被験体において膵臓前駆細胞の再生を誘導するのに有効な量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを前記被験体に投与する工程を含み、前記前駆細胞は前記被験体中に存在するか、または前記被験体に移植される、方法。
【請求項２１】
前記被験体に抗炎症薬または免疫調節薬を共投与する工程をさらに含む、請求項１、１９、または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が炎症状態を有していない、請求項１、１９、または２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、膵臓または膵臓領域の中または近傍に投与される、請求項１、１９、または２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１、１９、または２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体がヒトである、請求項１、１９、または２０に記載の方法。
【請求項２６】
膵臓細胞の集団を増大させる方法であって、少なくとも１つの膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含む膵臓細胞の集団をＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストと接触させて膵臓細胞の増大した集団を得る工程を含む、方法。
【請求項２７】
前記膵臓細胞の集団が本質的に膵臓前駆細胞からなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記膵臓前駆細胞が、膵管上皮細胞および／または導管隣接細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記膵臓前駆細胞が、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記膵臓細胞の集団が本質的に膵管上皮細胞のみからなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記膵臓細胞の増大した集団がインスリン陽性細胞の増大した集団を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記膵臓細胞の増大した集団が、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞の増大した集団を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記膵臓細胞の集団がインビトロである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記膵臓細胞の集団は被験体から得られた、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
被験体から得られた膵臓細胞を前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストと接触させる工程がインビトロで起こる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記膵臓細胞の集団が、膵臓細胞に分化する本質的に非膵臓細胞の集団から得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記本質的に非膵臓細胞の集団が、全能性幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、および成体幹細胞の１つまたは複数を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
糖尿病を処置する方法であって、
ａ）糖尿病を有する被験体から単離された膵臓前駆細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、または胚性幹細胞である前駆細胞をインビトロで培養する工程と、
ｂ）前記培養された前駆細胞の増殖を有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで誘導して前記前駆細胞の増大した集団を産生する工程と、
ｃ）前記前駆細胞の増大した集団を、前記糖尿病を有する被験体の膵臓中に移植する工程と
を含み、インスリン生成性膵臓細胞は、前記被験体において、前記移植された前駆細胞から再生される、方法。
【請求項３９】
前記被験体が哺乳動物である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体がヒトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリペプチドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＴＷＥＡＫが、配列番号１のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸４６から２４９を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸１０４から２４９を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ＴＷＥＡＫが、配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫ類似体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＴＷＥＡＫ類似体がＴＷＥＡＫ融合タンパク質である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１のポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記アゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記アゴニスト抗体がヒト化抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記アゴニスト抗体がキメラ抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
膵臓組織の再生を必要とする被験体において膵臓組織の再生を誘導するための、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを含む薬学的組成物。
【請求項５８】
膵臓組織が膵臓島組織である、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
膵臓島組織が島ベータ細胞を含む、請求項５８に記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
前記被験体が膵臓組織を喪失している、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
糖尿病に罹患している被験体においてインスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するための、請求項６０に記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
糖尿病が１型糖尿病である、請求項６１に記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
糖尿病が２型糖尿病である、請求項６１に記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
膵臓組織の除去を受けている被験体を処置するための、請求項６０に記載の薬学的組成物。
【請求項６５】
前記被験体ががんを有する、請求項６４に記載の薬学的組成物。
【請求項６６】
前記がんが膵臓がんである、請求項６５に記載の薬学的組成物。
【請求項６７】
前記被験体が、膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片を受容している、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項６８】
前記移植片が、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる、請求項６７に記載の薬学的組成物。
【請求項６９】
前記膵臓前駆細胞が、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である、請求項６８に記載の薬学的組成物。
【請求項７０】
前記膵臓前駆細胞が、膵管上皮細胞または導管隣接細胞である、請求項６９に記載の薬学的組成物。
【請求項７１】
前記移植片が本質的に膵管上皮細胞のみからなる、請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７２】
前記前駆細胞が、膵臓細胞に分化することができる、胚性幹細胞、成体幹細胞、全能性幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項６７に記載の薬学的組成物。
【請求項７３】
前記移植片を投与した後に前記被験体に投与される、請求項６７に記載の薬学的組成物。
【請求項７４】
前記移植片を投与するのと同時に前記被験体に投与される、請求項６７に記載の薬学的組成物。
【請求項７５】
被験体において糖尿病を処置するためのＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを含む薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は糖尿病を有する被験体に投与され、前記被験体は膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片も投与される、薬学的組成物。
【請求項７６】
部分的膵除去術を受けている被験体において膵臓組織を再生するためのＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを含む薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は膵臓前駆細胞の再生を誘導するために前記被験体に投与され、ここで、前記前駆細胞は前記被験体中に存在するか、または前記被験体に移植される、薬学的組成物。
【請求項７７】
前記被験体に抗炎症薬または免疫調節薬と共投与される、請求項５７または７６に記載の薬学的組成物。
【請求項７８】
前記被験体が炎症状態を有していない、請求項５７または７６に記載の薬学的組成物。
【請求項７９】
膵臓または膵臓領域の中または近傍に投与するための、請求項５７または７６に記載の薬学的組成物。
【請求項８０】
前記被験体が哺乳動物である、請求項５７または７６に記載の薬学的組成物。
【請求項８１】
前記被験体がヒトである、請求項５７または７６に記載の薬学的組成物。
【請求項８２】
前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、請求項５７から８１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項８３】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫである、請求項８２に記載の薬学的組成物。
【請求項８４】
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリペプチドである、請求項８３に記載の薬学的組成物。
【請求項８５】
ＴＷＥＡＫが配列番号１の配列の部分を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有する、請求項８３に記載の薬学的組成物。
【請求項８６】
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸４６から２４９を含む、請求項８５に記載の薬学的組成物。
【請求項８７】
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸１０４から２４９を含む、請求項８５に記載の薬学的組成物。
【請求項８８】
ＴＷＥＡＫが、配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、請求項８３に記載の薬学的組成物。
【請求項８９】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫ類似体である、請求項８２に記載の薬学的組成物。
【請求項９０】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、請求項８９に記載の薬学的組成物。
【請求項９１】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項８９に記載の薬学的組成物。
【請求項９２】
前記ＴＷＥＡＫ類似体がＴＷＥＡＫ融合タンパク質である、請求項８９に記載の薬学的組成物。
【請求項９３】
前記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１のポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項９２に記載の薬学的組成物。
【請求項９４】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体である、請求項８２に記載の薬学的組成物。
【請求項９５】
前記アゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、請求項９４に記載の薬学的組成物。
【請求項９６】
前記アゴニスト抗体がヒト化抗体である、請求項９４に記載の薬学的組成物。
【請求項９７】
前記アゴニスト抗体がキメラ抗体である、請求項９４に記載の薬学的組成物。
【請求項９８】
被験体において膵臓組織の再生を誘導するための医薬の処方におけるＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの使用。
【請求項９９】
膵臓組織が膵臓島組織である、請求項９８に記載の使用。
【請求項１００】
膵臓島組織が島ベータ細胞を含む、請求項９９に記載の使用。
【請求項１０１】
前記被験体が膵臓組織を喪失している、請求項９８に記載の使用。
【請求項１０２】
前記被験体が糖尿病を有し、前記医薬がインスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するためのものである、請求項１０１に記載の使用。
【請求項１０３】
糖尿病が１型糖尿病である、請求項１０２に記載の使用。
【請求項１０４】
糖尿病が２型糖尿病である、請求項１０２に記載の使用。
【請求項１０５】
前記被験体が膵臓組織の除去を受けている、請求項１０１に記載の使用。
【請求項１０６】
前記被験体ががんを有する、請求項１０５に記載の使用。
【請求項１０７】
前記がんが膵臓がんである、請求項１０６に記載の使用。
【請求項１０８】
前記被験体が膵臓において細胞または組織の移植片を受容しており、前記移植片が膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含んでいる、請求項９８に記載の使用。
【請求項１０９】
前記移植片が、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１０】
前記膵臓前駆細胞が、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である、請求項１０９に記載の使用。
【請求項１１１】
前記膵臓前駆細胞が膵管上皮細胞または導管隣接細胞である、請求項１１０に記載の使用。
【請求項１１２】
前記移植片が本質的に膵管上皮細胞のみからなる、請求項１１１に記載の使用。
【請求項１１３】
前記前駆細胞が、膵臓細胞に分化することができる、胚性幹細胞、成体幹細胞、全能性幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１４】
前記医薬を、前記移植片を投与した後に前記被験体に投与する、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１５】
前記医薬および前記移植片が同時に投与される、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１６】
被験体において糖尿病を処置するための医薬の処方におけるＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの使用であって、前記医薬は糖尿病を有する被験体に投与され、前記被験体は膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片も投与される、使用。
【請求項１１７】
部分的膵除去術を受けている被験体において膵臓組織を再生するための医薬の処方におけるＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの使用であって、前記医薬は、膵臓前駆細胞の再生を誘導するために前記被験体に投与され、ここで、前記前駆細胞は前記被験体中に存在するか、または前記被験体に移植される、使用。
【請求項１１８】
前記医薬は、前記被験体に抗炎症薬と共投与される、請求項９８または１１７に記載の使用。
【請求項１１９】
前記被験体が炎症状態を有していない、請求項９８または１１７に記載の使用。
【請求項１２０】
前記医薬は、膵臓または膵臓領域の中または近傍に投与するためのものである、請求項９８または１１７に記載の使用。
【請求項１２１】
前記被験体が哺乳動物である、請求項９８または１１７に記載の使用。
【請求項１２２】
前記被験体がヒトである、請求項９８または１１７に記載の使用。
【請求項１２３】
糖尿病を処置するためのＴＷＥＡＫアゴニストの使用であって、前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを、培養された前駆細胞または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞の増殖を誘導するのに用いて前駆細胞の増大した集団を産生し、前記前駆細胞は、糖尿病を有する被験体から単離された膵臓前駆細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、または胚性幹細胞であり、前記前駆細胞の増大した集団は、前記糖尿病を有する被験体の膵臓に移植され、インスリン生成性膵臓細胞が前記移植された前駆細胞から前記被験体において再生される、使用。
【請求項１２４】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１２３に記載の使用。
【請求項１２５】
前記被験体がヒトである、請求項１２４に記載の使用。
【請求項１２６】
前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、請求項９８から１２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２７】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫである、請求項１２６に記載の使用。
【請求項１２８】
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリペプチドである、請求項１２７に記載の使用。
【請求項１２９】
ＴＷＥＡＫが配列番号１の配列の部分を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有する、請求項１２７に記載の使用。
【請求項１３０】
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸４６から２４９を含む、請求項１２９に記載の使用。
【請求項１３１】
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸１０４から２４９を含む、請求項１２９に記載の使用。
【請求項１３２】
ＴＷＥＡＫが配列番号２の配列の部分を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有する、請求項１２７に記載の使用。
【請求項１３３】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫ類似体である、請求項１２６に記載の使用。
【請求項１３４】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、請求項１３３に記載の使用。
【請求項１３５】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項１３３に記載の使用。
【請求項１３６】
前記ＴＷＥＡＫ類似体がＴＷＥＡＫ融合タンパク質である、請求項１３３に記載の使用。
【請求項１３７】
前記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１のポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項１３６に記載の使用。
【請求項１３８】
前記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体である、請求項１２６に記載の使用。
【請求項１３９】
前記アゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３８に記載の使用。
【請求項１４０】
前記アゴニスト抗体がヒト化抗体である、請求項１３８に記載の使用。
【請求項１４１】
前記アゴニスト抗体がキメラ抗体である、請求項１３８に記載の使用。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓細胞の集団を増大させるための方法および膵臓組織の再生を誘導するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病を有する患者におけるインスリン生成性β細胞の数は不十分であり、また膵臓がんは膵臓前駆細胞の非制御的な増殖から生じ得る可能性があるという理由から、膵臓細胞の再生のプロセスはとりわけ関心が高い。新しいベータ細胞を生成すると提唱されている機序には、既存のベータ細胞の複製およびベータ細胞の新生が含まれ、この場合インスリン陽性細胞は前駆細胞から分化する。新生の機序において、分化した導管上皮細胞は膵臓前駆細胞として働くことが示唆されている（非特許文献１；非特許文献２）。マウスにおける最近の証拠はこの仮説を強力に支持している：導管特異的炭酸脱水素酵素レポーター遺伝子で遺伝的に標識化した、分化した導管細胞は、生後および傷害後の両方で、新しい島および膵臓の腺房（消化酵素分泌性組織）の両方を生じる膵臓前駆細胞として働く（非特許文献３）。新生の機序は、細胞のインスリン陽性細胞への分化を指示する、例えばＮｇｎ３およびＰｄｘ−１を含めた、系統特異化マーカーを発現することができる常在性の前駆細胞も伴うことがある。Ｎｇｎ３陽性前駆体がインスリン陽性細胞を生じさせる能力を支持する証拠は、膵臓の管結紮傷害のモデルにおいて最近報告された（非特許文献４）。このように、Ｎｇｎ３−および／またはＰｄｘ１−陽性前駆体が、インスリン陽性細胞の新生のプロセスにおける中間体である、脱分化した導管上皮細胞に由来する可能性がある。あるいは、Ｎｇｎ３−および／またはＰｄｘ１を発現することができる前駆体が成体膵臓中に存在する可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Bonner-Weirら、PediatricDiabetes、（２００５年）５巻、１５〜２２頁
【非特許文献２】Sharmaら、Diabetes、（１９９９年）４８巻、５０７〜５１３頁
【非特許文献３】Inadaら、Proc.Nat. Acad. Sci. USA、（２００８年）１０５巻（５０号）、１９９１５〜９頁
【非特許文献４】Xuら、Cell、（２００８年）１３２巻、１９７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
真性糖尿病は、米国においておよそ７５０万人が罹患している疾患である。この疾患の基礎的な原因は、膵臓のランゲルハンス島におけるベータ細胞によるインスリン生成の低減または不在である。糖尿病治療における主目的は、インスリン生成性ベータ細胞を再生または置き換える能力を再獲得することである。ランゲルハンス細胞の島の移植は効果的な処置であり得るが、この治療の適用は、臓器提供によって得ることができる島の供給が不足することによって制限される。１型または２型いずれかの糖尿病を処置するための代わりのベータ細胞を得る２つの代替手段は、インビボにおける内因性前駆体からのベータ細胞の再生、ならびに移植治療用のインビトロのベータ細胞前駆体の増大および分化である。両取組みとも非常に有望ではあるものの、ベータ細胞前駆体を効果的に増大し、分化することができる要因を欠いているために制約がある。細胞移植ベースの治療法は、未分化状態における稀な前駆細胞のエクスビボの増大がとりわけ非常に困難であること、およびこれらはインビボでの送達に際し細胞死を受ける傾向があることに直面している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、ＴＮＦファミリーメンバーであるＴＷＥＡＫが、ヒトおよび齧歯動物の膵臓細胞の集団を増大させることができ、膵臓において内分泌系統に方向付けされた（committed）前駆細胞の出現を誘導することができるという発見に、少なくとも部分的に関するものである。したがって、本発明は、ＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）のアゴニストを用いて膵臓組織を再生し、インビボおよびインビトロで膵臓細胞の集団を増大させるための方法を提供する。これらの方法は、例えば、糖尿病、および膵臓の全部または一部分の喪失をもたらす病状を含めた、細胞置換療法のための膵臓前駆細胞の増強が望ましい疾患または病状を処置するのに用いることができる。
【０００６】
本発明の態様は、被験体における膵臓組織の再生を誘導するためのＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの使用を包含する。例示の実施形態において、膵臓組織は膵臓島組織である。いくつかの実施形態において、膵臓島組織は島ベータ細胞を含む。
【０００７】
例示の実施形態において、被験体は膵臓組織を喪失している。いくつかの実施形態において、被験体は糖尿病を有し、方法は、インスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するのに有効な量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを被験体に投与することを含む。糖尿病は、１型糖尿病でも、または２型糖尿病でもよい。
【０００８】
いくつかの実施形態において、被験体は膵臓組織の除去を受けている。例示の実施形態において、被験体は癌性の膵臓組織の除去を受けている。
【０００９】
いくつかの実施形態において、被験体は膵臓において細胞または組織移植片を受容しており、移植片は、膵臓細胞に脱分化することができる前駆細胞を含んでいる。例示の実施形態において、移植片は、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる。膵臓前駆細胞は、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞であってよい。膵臓前駆細胞は、膵管上皮細胞、または導管隣接細胞であってよい。例示の実施形態において、移植片は本質的に膵管上皮細胞からなる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、膵臓前駆細胞は、膵臓細胞に分化することができる、胚性幹細胞、成体幹細胞、全能性幹細胞、または多能性幹細胞である。いくつかの実施形態において、方法は、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与する前に移植片を投与することを含む。いくつかの実施形態において、移植片およびＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは同時に投与される。
【００１１】
本発明の態様は、糖尿病を有する被験体に、ｉ）膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片、およびｉｉ）膵臓組織の再生を誘導するのに十分な治療有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与することを含む、被験体における糖尿病を処置する方法を包含する。
【００１２】
本発明の態様は、被験体における膵臓前駆細胞の再生を誘導するのに有効な量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを被験体に投与することを含み、前駆細胞が被験体中に存在するか、または被験体に移植される、部分的膵除去術を受けている被験体において膵臓組織を再生する方法をさらに包含する。
【００１３】
ある実施形態において、本発明の方法は、例えば、１型糖尿病を有する患者における潜在的な自己免疫反応を阻害するために、被験体にＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストおよび抗炎症薬または他の免疫調節薬を共投与すること（co-administering）を含む。例示の免疫調節薬には、それだけには限定されないが、抗−ＣＤ３モノクローナル抗体およびリツキサンが含まれる。免疫調節薬は、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの投与と同時に、またはそれに引き続いて投与することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、膵臓または膵臓領域の中または近傍に投与される。例示の実施形態において、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体はヒトである。
【００１５】
本発明の態様は、少なくとも１つの膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる少なくとも１つの細胞を含む膵臓細胞の集団をＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストと接触させて膵臓細胞の増大した集団を得ることを含む、膵臓細胞の集団を増大させるための方法を包含する。例示の実施形態において、膵臓細胞の集団は本質的に膵臓前駆細胞からなる。いくつかの実施形態において、膵臓前駆細胞は、膵管上皮細胞および／または導管隣接細胞である。いくつかの実施形態において、膵臓前駆細胞は、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である。いくつかの実施形態において、膵臓細胞の集団は本質的に膵管上皮細胞のみからなる。いくつかの実施形態において、脾臓細胞の増大した集団はインスリン陽性細胞の増大した集団を含む。いくつかの実施形態において、膵臓細胞の増大した集団は、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞の増大した集団を含む。
【００１６】
例示の実施形態において、膵臓細胞はインビトロで増大される。いくつかの実施形態において、膵臓細胞の集団は被験体から得られたものである。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、インビトロで被験体から得られた膵臓細胞に投与される。例示の実施形態において、膵臓細胞の集団は、本質的に膵管上皮細胞の集団から得られる。他の実施形態において、膵臓細胞の集団は、膵臓細胞に分化する非膵臓細胞の集団から得られる。いくつかの実施形態において、本質的に非膵臓細胞の集団は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、および成体幹細胞の１つまたは複数を含む。
【００１７】
本発明の態様は、ａ）糖尿病を有する被験体から単離された膵臓前駆細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、および／または胚性幹細胞である、前駆細胞または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞をインビトロで培養するステップと、ｂ）有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで前記培養した前駆細胞の増殖を誘導して、前記前駆細胞の増大した集団を産生するステップと、ｃ）前記前駆細胞の増大した集団を、糖尿病を有する被験体の膵臓中に移植するステップとを含み、インスリン生成性膵臓細胞が、被験体において前記移植された前駆細胞から再生される、糖尿病を処置する方法をさらに包含する。いくつかの実施形態において、糖尿病を有する被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態において糖尿病を有する被験体はヒトである。
【００１８】
本発明の例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物（mimetic）、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストはＴＷＥＡＫである。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫは、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリペプチドである。例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫは、配列番号１のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫは配列番号１のアミノ酸４６から２４９を含む。さらなる実施形態において、ＴＷＥＡＫは配列番号１のアミノ酸１０４から２４９を含む。またさらなる実施形態において、ＴＷＥＡＫは、配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである。
【００２０】
例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストはＴＷＥＡＫ類似体である。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ類似体は、配列番号１に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ類似体は、配列番号１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである。
【００２１】
例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ類似体はＴＷＥＡＫ融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ融合タンパク質は、配列番号１のポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む。
【００２２】
さらなる例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストはアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体である。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体はキメラ抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、アデノウイルスのベクターからＴＷＥＡＫ（右パネル）または対照のタンパク質（左パネル）を過剰発現するマウスからの膵臓組織切片を示す図である。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片を上パネルに示し、増殖マーカーＫｉ−６７に対して染色した切片を下パネルに示す。
【図２】図２は、左パネルで、ヒト膵臓腫瘍組織マイクロアレイの免疫組織化学染色によって測定した、膵臓腺癌におけるＴＷＥＡＫ−Ｒの高頻度の発現を示す図である。中央パネルおよび右パネルは、膵臓腫瘍組織試料におけるＴＷＥＡＫ−Ｒ染色を示す図である。
【図３】図３は、断面で見ることができる、導管、島、血管、および腺房（標識化）を有する膵臓組織の構造を示す、代表的なマウス膵臓のＨ＆Ｅ染色切片を示す図である。
【図４】図４は、対照のタンパク質Ｐ１．１７またはＴＷＥＡＫで処置後のマウスからの代表的な膵臓組織の切片を示す図である。図４Ａおよび４Ｂは、Ｐ１．１７（図４Ａ）またはＴＷＥＡＫ（図４Ｂ）で処置３日後のマウスからのＫｉ−６７染色した切片を示す。図４Ｃおよび４Ｄは、対照のタンパク質（図４Ｃ）またはＴＷＥＡＫ（図４Ｄ）で４日間処置後、管上皮マーカーＣＫおよびＫｉ−６７に対して同時免疫染色した切片を示す。
【図５】図５は、増殖マーカーＫｉ−６７に対して免疫染色した、対照のタンパク質Ｐ１．１７（左）、急性処置レジメン下Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ（中央）、または、慢性処置レジメン下Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ（右）のいずれかで処置４日後のマウスからの代表的な膵臓切片を示す図である。示した結果はすべて、処置群あたり４匹のマウスの代表である。
【図６】図６は、慢性処置レジメン下、Ｐ１．１７またはＦｃ−ＴＷＥＡＫを投与したマウスの膵臓切片においてＫｉ−６７陽性である導管上皮細胞のパーセンテージのプロットを示す図である。
【図７】図７は、急性処置レジメン下、Ｐ１．１７またはＦｃ−ＴＷＥＡＫを投与したマウスの膵臓切片においてＫｉ−６７陽性である導管上皮細胞のパーセンテージを示す図である。
【図８】図８は、慢性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置下、マウスの膵臓切片においてＫｉ−６７陽性である導管隣接領域における細胞のパーセンテージを示す図である。
【図９】図９は、急性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置下、マウスの膵臓切片においてＫｉ−６７陽性である導管隣接領域における細胞のパーセンテージを示す図である。
【図１０】図１０は、ＣＤ３およびＦ４／８０に対して染色した、対照のタンパク質で処置したマウス（図１０Ａおよび１０Ｃ）ならびにＴＷＥＡＫ処置したマウス（図１０Ｂおよび１０Ｄ）からの膵臓の連続切片を示す図である。
【図１１】図１１は、３日または１０日の期間、１週間に２回対照のタンパク質Ｐ１．１７またはＴＷＥＡＫで処置したＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウスおよび野生型マウスからの膵臓切片において計数した、Ｋｉ−６７陽性導管細胞（図１１Ａ）または導管隣接細胞（図１１Ｂ）の数を示す図である。図１１Ｄは、ＴＷＥＡＫで３日間処置したマウスからの膵臓切片におけるＴＷＥＡＫ−Ｒ免疫蛍光染色を示す（イソ型の対照を図１１Ｃに示す）。
【図１２】図１２は、対照のタンパク質Ｐ１．１７で処置した細胞と比べた、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ２０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ導入後２４時間および９６時間のヒト導管細胞の数の増加を示す代表的な写真である。
【図１３】図１３は、マウスの胚発生中のＮｇｎ３およびＰｄｘ１の動的発現を示す図である。
【図１４】図１４は、慢性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置４日後、マウスからのＮｇｎ３染色した膵臓組織を示す図である。導管隣接細胞におけるＮｇｎ３に対する染色は、丸で強調されている。
【図１５】図１５は、Ｎｇｎ３、管上皮マーカーＣＫ、およびＤＡＰＩに対して染色した、急性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置４日後のマウスからの膵臓組織を示す図である。
【図１６】図１６は、急性または慢性投与レジメンのいずれかの下で、対照のＩｇ処置（Ｐ１．１７注射）またはＦｃ−ＴＷＥＡＫでの処置のいずれかの４日後にマウスから採取した膵臓組織におけるＮｇｎ３陽性細胞の頻度を示す図である。Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって決定したように、１個の切片上のＮｇｎ３陽性細胞の数を合計細胞数で除すことによって、Ｎｇｎ３陽性細胞の頻度を算出する。
【図１７】図１７は、急性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置（右パネル、矢印）、または対照タンパク質Ｐ１．１７処置（左パネル）４日後の膵管上皮細胞におけるＰｄｘ１の染色を示す図である。
【図１８】図１８は、部分的膵除去後、ＴＷＥＡＫ−Ｒ（Ｆｎ１４、図１８Ａおよび１８Ｃ）、またはＣＫ、インスリン（ＩＮＳ）、ならびにＤＮＡ（ＤＡＰＩ）（図１８Ｂおよび１８Ｄ）に対して染色した膵臓の連続切片を示す図である。Ｔ細胞マーカーＣＤ３（図１８Ｅおよび１８Ｇ）ならびにマクロファージマーカーＦ４／８０（図１８Ｆおよび１８Ｈ）で染色した、偽手術したマウスから（図１８Ｅおよび１８Ｆ）、ならびに部分的膵除去４日後のマウスから（図１８Ｇおよび１８Ｈ）の膵臓の連続切片を示す。
【図１９】図１９は、１８日間ＴＷＥＡＫで処置したマウスからの膵臓切片における再生中心を示す図である。
【図２０】図２０は、部分的膵除去４日後の野生型マウス（白バー）およびＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウス（黒バー）における、早期（「未熟」）、中間、および成熟段階の再生中心のパーセンテージを示す図である。
【図２１】図２１は、部分的膵除去４日後の野生型（Ａ）およびＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯ（Ｂ）マウスからの、ＣＫおよびＫｉ−６７に対して同時染色した膵臓切片を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（詳細な説明）
本発明は、治療有効量のＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）のアゴニストを用いて、膵臓組織を再生し、インビトロまたはインビボで膵臓細胞の集団を増大させる方法を提供する。これらの方法は、例えば、糖尿病および膵臓の全部または一部分の喪失をもたらす病状を含めた、細胞置換療法のための膵臓前駆細胞の増強が望ましい疾患または病状を処置するのに用いることができる。
【００２５】
本発明は、ＴＮＦファミリーメンバーのＴＷＥＡＫは、ヒトおよび齧歯動物の膵臓細胞の集団を増大させることができ、膵臓において内分泌系統に方向付けされた前駆細胞の出現を誘導することができるという発見に、少なくとも部分的に関するものである。したがって、ＴＷＥＡＫは、ｉ）膵臓細胞、例えば、膵管上皮細胞の、方向付けされた膵臓細胞系統の細胞への脱分化が可能である細胞への脱分化、ｉｉ）細胞集団の刺激、ならびにｉｉｉ）細胞接着、細胞凝集、および／または細胞の生存の増強、の１つまたは複数に関与する。
【００２６】
「膵臓細胞」という用語は、膵臓の島、腺房、導管細胞、または発達中の、もしくは成熟した膵臓における組織の成分であるあらゆる他の細胞を意味する。膵臓島細胞は、アルファ、ベータ、デルタ、ＰＰ、およびイプシロン細胞を含む。
【００２７】
（ＴＷＥＡＫの生理学的役割）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのリガンドおよび受容体は、生存、増殖、および分化を含めた細胞の運命を決定する重要な調節因子である（Wareら、Cytokine Growth Factor Rev.、１４巻、１８１〜４頁（２００３年））。これらは、骨、毛髪および歯などの皮膚付属器官、ならびにリンパ組織を含めた複数の系の器官形成およびホメオスタシスにおいて本質的な役割を果たす。これらはまた、例えば、宿主の防御、炎症反応、ならびに適応免疫の正および負の調節において複雑な免疫調節性の役割を果たす。
【００２８】
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバーであるＴＷＥＡＫ（ＴＮＦ様アポトーシス弱誘導因子（TNF-like weak inducer of apoptosis））は、切断されて可溶性サイトカインとして機能することができ、炎症細胞によって高度に発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質である（Chicheporticheら、J.Biol. Chem.、２７２巻、３２４０１〜１０頁（１９９７年））。ＴＷＥＡＫ受容体であるＴＷＥＡＫ−Ｒ（Ｆｎ１４とも呼ばれる）は、非リンパ系細胞型によって発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＴＷＥＡＫは最初、アポトーシスの弱い誘導因子として記載され（Chicheporticheら、J.Biol. Chem.、２７２巻、３２４０１〜１０頁（１９９７年））、その同族の受容体であるＴＷＥＡＫ−Ｒを介して増殖から細胞死の範囲の複数の細胞反応を誘導することが見出されている。ＴＷＥＡＫ−Ｒの発現は高度に誘導性である（Meighan-Manthaら、J.Biol. Chem.、２７４巻、３３１６６〜７６頁（１９９９年）；Fengら、Am. J. Pathol.、１５６巻、１２５３〜６１頁（２０００年））。マウスおよびヒトの両方における、正常対傷害および疾患の組織におけるＴＷＥＡＫおよびＴＷＥＡＫ−Ｒ発現の包括的な調査は、最近、両方の種においてＴＷＥＡＫ、とりわけＴＷＥＡＫ−Ｒの発現は正常組織では比較的低いが、組織の傷害および疾患の状況では劇的な上方制御に供されることを実証した。この研究は、ＴＷＥＡＫ−Ｒが多くの組織存在性前駆細胞によって発現されることも示していた（Girgenrathら、EMBOJ.、２５巻、５８２６〜３９頁（２００６年）；Jakubowskiら、J. Clin. Invest,１１５巻、２３３０〜４０頁（２００５年）；Perperら、J.Immunol.、１７７巻、２６１０〜２０頁（２００６年））。
【００２９】
急性傷害後、炎症性サイトカインはスカベンジャー細胞の流入を誘導して死滅細胞および組織の残骸を除去し、細胞の制御された増殖、遊走、および細胞外マトリックスの交替によって創傷の閉鎖および治癒を促進する。より最近では、炎症細胞はまた、組織の前駆細胞に対する作用によって組織の再生を調節するという概念が示唆されている（Duffieldら、Clin. Sci. (Lond)、１０４巻、２７〜３８頁（２００３年））。しかし、慢性疾患の状況において、これらの多面的な活性は調節不全であり、病原性であることが多い。ＴＷＥＡＫが、この点においてその同種のＴＮＦ同様、多機能性のサイトカインであることは今や明白である。ＴＷＥＡＫは、急性傷害の後に生理的に、および慢性炎症疾患の状況において病理学的に機能する。ＴＮＦとは対照的に、ＴＷＥＡＫは発達またはホメオスタシスにおいて明らかな役割を果たさない。
【００３０】
ＴＷＥＡＫは、ＴＷＥＡＫ−Ｒを発現するある種の前駆細胞型の細胞運命の決定を強力に制御することができるという、新しい証拠が最近出現している。ＴＷＥＡＫは肝臓前駆細胞に選択的な成長因子として働くと思われる（Jakubowskiら、J. Clin. Invest.、１１５巻、２３３０〜４０頁（２００５年））。ＴＷＥＡＫは間葉系統の前駆体において、生存促進性の遺伝子および細胞周期関連遺伝子を上方制御することができ（Girgenrathら、EMBOJ.、２５巻、５８２６〜３９頁（２００６年））、分化の条件下で培養した筋芽細胞における筋管の形成および筋肉特異的転写因子の発現を阻害する（Girgenrathら、EMBOJ.、２５巻、５８２６〜３９頁（２００６年）；Dograら、J. Biol. Chem.、２８１巻、１０３２７〜３６頁（２００６年））。ＴＷＥＡＫによって妨害される分化は、３Ｔ３Ｌ１脂肪形成（Burklyら、Cytokine、４０巻、１〜１６頁（２００７年）；Tillerら、Endocrinology、１５０巻、５３７３〜５３８３頁（２００９年）；Alexakiら、J.Immunol、１８３巻、５９４８〜５９５６頁（２００９年））、ヒト間葉系幹細胞からの軟骨の分化、ヒト一次骨芽前駆細胞からの骨芽細胞形成（Perperら、J.Immunol.、１７７巻、２６１０〜２０頁（２００６年）；Vincentら、J. Bone Min Res、２４巻、１４３４〜１４４９頁（２００９年））、およびマウス造骨性ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞最終分化（Andoら、ArthritisRes. Ther.、８巻、Ｒ１４６頁（２００６年））を含めた、インビトロの他の細胞系において再現されている。しかし、他の研究は、いくつかの細胞においてＴＷＥＡＫは逆の作用を有することがあると指摘している。例えば、ＴＷＥＡＫは、ヒト単球細胞系ＴＨＰ−１からの破骨細胞の分化を阻害するのではなく誘導することが示されている（Polekら、J.Biol. Chem.、２７８巻、３２３１７〜２３頁（２００３年））。ＴＷＥＡＫは、骨芽細胞上のＲＡＮＫＬを上方制御することによって間接的に破骨細胞形成を促進することも示されている（Andoら、ArthritisRes. Ther.、８巻、Ｒ１４６頁（２００６年））。ニューロン前駆体に対して、ＴＷＥＡＫは発達の段階に応じて異なる作用を有することが示されており、胎生期の前駆体においてＴＷＥＡＫはこれらの増殖に影響を及ぼさずに神経突起の伸長を促進するが、出生後の前駆体の増殖を低減させ神経突起の伸長に対する作用はない（Hamillら、J.Neurosci. Res.、（２００７年））。赤血球前駆細胞に対して、ＴＷＥＡＫは成長および分化を阻害すると思われる（Felliら、J. Immunol.、１７５巻、１４６４〜７２頁（２００５年））。このように、ＴＷＥＡＫが前駆細胞の増殖を誘導し分化を阻害する能力は、様々な組織および発達段階において変化し得る。
【００３１】
（膵臓細胞の増大）
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、１つまたは複数の膵臓細胞を含む第１の細胞の集団をＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストと接触させて、それによって第２の細胞の集団を得ることを含む。第２の細胞の集団は、より多数の、例えば、第１の細胞の集団における数より少なくとも約５０％多い、２倍多い、５倍多い、１０倍多い、２５倍多い、５０倍多い、１００倍多い、または１００倍を超えて多い、膵臓細胞を含むことができる。第２の細胞の集団は、より多数の膵臓前駆細胞（例えば、方向付けされた膵臓の細胞型の細胞に分化する能力を有する細胞）を含むことができる。第２の集団は、より多数の分化した膵臓細胞（例えば、島細胞、腺房細胞、または導管細胞）を含むこともできる。例えば、第２の細胞の集団は、第１の細胞の集団に比べてより多数のベータ細胞（例えば、インスリン分泌細胞）を含む。第１の細胞の集団はインビトロでも、またはインビボでもよい。第１の細胞の集団は、インビトロでＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処理するか、または接触させ、次いで被験体に投与することができる。第１の細胞の集団は被験体から得ることができる。一実施形態において、第１の細胞の集団を被験体から得、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストとインビトロまたはエクスビボで接触させ、第１の細胞の集団が得られた被験体と同じかまたは異なる被験体に投与する。
【００３２】
第１の細胞の集団は１つまたは複数の細胞からなっていてよい。例えば、第１の細胞の集団は、少なくとも約１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８個の細胞からなっていてよい。第１の細胞の集団は、約１個から約１０２個の細胞、約１０個から約１０３個の細胞、約１０２個から約１０４個の細胞、約１０３個から約１０５個の細胞、約１０４個から約１０６個の細胞、約１０５個から約１０７個の細胞、または約１０６個から約１０８個の細胞を含むことができる。第１の細胞の集団は、本質的に１タイプの細胞、またはいくつかのタイプの細胞からなっていてよい。第１の細胞の集団は、膵臓細胞、例えば、膵管上皮細胞中でエンリッチされることがある。ある実施形態において、第１の細胞の集団における、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の細胞は膵臓細胞、例えば、膵管上皮細胞である。ある実施形態において、第１の細胞の集団は、第１の細胞の集団に存在する場合第２の細胞の集団において優勢となる細胞を含まず、またはそれらが本質的にない。ある細胞が「本質的にない」細胞の集団は、約０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満のこれらの望ましくない細胞を含む細胞の集団を意味する。例えば、一実施形態において、第１の細胞の集団には、実質的に間葉系細胞および／または結合組織細胞がない。
【００３３】
第１の細胞の集団を、望ましい数および型の膵臓細胞を増大させるのに十分な時間、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストとインキュベートすることができる。例えば、第１の細胞の集団を、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストと約５、１０、１８、２４、３０、３６、４２、または４８時間インキュベートすることができる。
【００３４】
ある実施形態において、第１の細胞の集団をインビトロでＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処理し、被験体に投与する。第１の細胞の集団を被験体に投与し、被験体をＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処置してもよい。ある実施形態において、第１の細胞の集団をインビトロでＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処理し、集団を被験体に投与し、被験体をＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処置する。ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを被験体に投与する場合、膵臓細胞の望ましい集団が再生、または増大するのに十分な量および時間投与する。
【００３５】
例示の実施形態において、方法は、治療有効量のＴＷＥＡＫ受容体アゴニストを被験体に投与して、被験体の膵臓における膵臓前駆細胞の増殖または出現を誘導することを含む。「膵臓前駆細胞」という用語は、方向付けされた膵臓の細胞型（または系統）の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。さらなる実施形態において、方法は、単離された膵臓細胞の培養物を、膵臓前駆細胞の生存、表面接着、および／または増殖を増強するのに効果的なある量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処理することによって、インビトロで膵臓前駆細胞の増大を誘導することを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、膵臓前駆細胞を、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを用いてエクスビボで増大させて培養物中の細胞の増殖を誘導する。培養物中で増大した膵臓前駆細胞を、それを必要とする被験体に移植してもよい。インビトロで増大させられるべき膵臓前駆細胞は、後にその中に移植される個体から外科的に得られた膵臓組織から単離された膵臓前駆細胞であってよい。インビトロで増大させられるべき他の細胞は、死体の膵臓組織、成体幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）、全能性幹細胞、および／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ、多能性の状態に再プログラムされた体細胞）に由来する膵臓前駆細胞であってよい。例示のｉＰＳＣは、TakahashiおよびYamanaka（Cell、１２６（４）巻、６６３〜７６頁（２００６年））によって記載されている通り、その中にＯＣＴ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆの遺伝子が形質導入されている成体起源の幹細胞である。他の例示のｉＰＳＣは、その中にＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８が形質導入されている成体幹細胞である（Yuら、Science、３１８巻、１９１７〜１９２０頁（２００７年））。培養物中で増大させられるべき膵臓細胞の集団は、ＣＫ−、Ｋｉ−６７、−Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞を含むことができる。個体から外科的に得られた組織から単離した前駆細胞を、本発明の方法に従ってＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを用いてインビトロで増大させた後、同じ個体中に移植して戻してもよい。いくつかの実施形態において、膵臓細胞の増大は細胞の増殖を伴う。細胞の集団の「増大」は、細胞の集団またはその亜集団の付着、凝集、および／または生存の促進などの、さらなる事象も含むことができる。「増大」という用語は、培養物中で細胞の集団を増大させることを意味し、例えば、細胞の集団を少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍増大させることを含む。例えば、一実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処理しなかった同様または等しい細胞の集団（例えば、同じ割合の細胞型）に比べて、より多くの膵臓細胞が、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処理した細胞の集団から回収される。
【００３７】
インビトロで増大させられるべき膵臓細胞を、Yatohら、（Diabetes、５６巻、１８０２〜９頁（２００７年））によって記載されている通り、例えば、Linetskyら、（Diabetes、４６巻、１１２０〜２３頁（１９９７年））の標準化されている方法または同様の方法を用いて、外科的に得られた膵臓組織試料または提供された臓器組織から単離し、培養することができる。Ｙａｔｏｈらによって記載されている通り、島を単離および精製した後、例えば、トリプシンに曝露することによって、任意選択で４０μｍの細胞ろ過器などでろ過し、その後、マイクロビーズ、免疫磁気ビーズ、または他の同様の免疫親和性バルク分別用ツールを用いて免疫学的に分別することによって、島細胞を酵素的に分散させて細胞をさらに精製してもよい。例えば、膵管ツリーにわたって見出される細胞表面マーカーであるＣＡ１９−９（Lefebvreら、Diabetes、４７巻、１３４〜１３７頁（１９９８年）；Bouwensら、Diabetologia、４１巻、６２９〜６３３頁（１９９８年）；Gmyrら、BiochemBiophys Res.Com.、３２０巻、２７〜３３頁（２００４年））、またはプロミニンＩ（ＣＤ１３３；Horiら、Stem Cells、２６巻（１１号）、２９１２〜２０頁（２００８年））に対する抗体などの膵臓特異的な細胞マーカーを認識する抗体を、免疫親和性の分別において用いることができる。粗製の、または精製した細胞を、例えば、フラスコの表面積２５ｃｍ２あたり細胞１０６個、またはその他の好適な細胞密度でＣＭＲＬ培地（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｉｂｃｏＴＭＣＭＲＬ  Ｍｅｄｉｕｍ−１０６６）中で、非組織培養物処理細胞培養フラスコ中で培養してもよい。ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを、培養細胞の増殖培地に加える。ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを提供しなかった細胞に比べて、膵臓細胞の生存、接着、および／または増殖を増強する濃度で存在することができる。ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの例示の濃度は、例えば、１から１００ｐｇ／ｍｌもしくはそれ未満、１００から１０００ｐｇ／ｍｌ、１から１００ｎｇ／ｍｌ、または１００から１０００ｎｇ／ｍｌもしくはそれを超える範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの濃度は、例えば、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００ｎｇ／ｍｌを含めた、１ｎｇ／ｍｌと１００ｎｇ／ｍｌとの間であってよい。
【００３８】
（糖尿病および他の医学的使用）
いくつかの実施形態において、本方法は糖尿病の処置に有用である。例示の実施形態において、被験体を、被験体における膵臓前駆細胞の数を増加させることによってインスリン分泌性膵臓細胞の再生を誘導するのに十分なある量（すなわち、治療有効量）のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処置することができる。いくつかの実施形態において、被験体は、糖尿病または関連の病状と診断され、次いでＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与される。糖尿病関連の病状には、それだけには限定されないが、シンドロームＸ（メタボリックシンドローム）、インスリン抵抗性、腎症、ケトアシドーシス、高浸透圧性高血糖性非ケトン性症候群、胃不全麻痺、糖尿病性腎疾患、および他の糖尿病関連の病状が含まれる。いくつかの実施形態において、糖尿病を処置する方法は、移植した前駆細胞からインスリン分泌性膵臓細胞の再生を誘導するのに効果的なある量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを、インスリン分泌性膵臓細胞を生じさせることができる前駆細胞移植片を受容している糖尿病を有する被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、被験体は、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含む、死体の、または外科的に得られた細胞移植片を受容しており、続けてＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与することにより、移植された島組織における膵臓前駆細胞の再生が誘導される。さらなる実施形態において、被験体は、膵臓における幹細胞移植を受けており、続けてＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与することにより、移植された幹細胞の再生が誘導される。いくつかの実施形態において、膵臓幹細胞の移植片およびＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは同時に投与される。これらの、およびさらなる実施形態において、上記に記載した、膵臓前駆細胞の様々な可能な供給源を移植し、続けてＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与して膵臓組織の再生を促進してもよい。
【００３９】
本発明の一実施形態は、ａ）前駆細胞が、糖尿病を有する被験体、または生存するドナーもしくは死体のドナーから単離された膵臓前駆細胞、前記被験体からの成体幹細胞、胚性幹細胞、あるいは人工多能性幹細胞である、前駆細胞をインビトロで培養すること、ｂ）有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで処理して、前駆細胞の増大した集団を産生すること、およびｃ）前駆細胞の増大した集団を、糖尿病を有する被験体の膵臓に移植することを含み、インスリン生成性膵臓細胞が、移植された前駆細胞から被験体において再生される、糖尿病を処置する方法を含む。いくつかの実施形態において、方法は、移植の後に、有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与して、移植された細胞、およびそれに由来する細胞の生存、増大、および／または遊走をインビボで促進することをさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与して、ベータ細胞を標的とした病理学的自己免疫反応の結果として機能的なこれらの細胞を喪失した、１型糖尿病（インスリン依存性真性糖尿病；ＩＤＤＭ；Ｔ１Ｄ；若年性糖尿病）を有する被験体における膵臓前駆細胞の増殖、および／または出現を誘導する。他の実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与して、２型糖尿病を有する被験体における膵臓前駆細胞の増殖、および／または出現を誘導する。２型糖尿病（非インスリン依存性真性糖尿病；ＮＩＤＤＭ；Ｔ２Ｄ；成体発症型糖尿病）は、インスリンに対する感受性の低下を伴う複雑な代謝疾患であり、膵臓における機能の低下したベータ細胞の塊を伴うことがある。いくつかの実施形態において、２型糖尿病へのＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの投与を、インスリン感受性を改善するための治療法と組合わせる。いくつかの実施形態において、被験体は若年の成体発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、膵臓前駆細胞の増殖を誘導するためのＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与する被験体は、炎症状態を有する。例示の炎症状態には、それだけには限定されないが、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、血管炎、移植片拒絶、再灌流傷害、骨盤炎症性疾患、糸球体腎炎、慢性前立腺炎、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、アテローム性動脈硬化、および骨関節炎が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを抗炎症薬と共投与してもよい。抗炎症薬には、免疫抑制剤、ＴＮＦ阻害薬、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）などが含まれ得る。例示の抗炎症薬には、例えば、プレドニゾン、メチルプレニゾロン（methylprenisolone）（Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））、トリアムシノロン、メトトレキセート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（登録商標））、スルファサルジン（sulfasalzine）（Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ（登録商標））、レフルノミド（Ａｒａｖａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、インターロイキン−１、アナキンラ（ＫｉｎｅｒｅｔＴＭ）、イブプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、ナプロキセン、アスピリン、アセトミノフェン（acetominophen）、インドメタシン、スリンダク、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、ロルノキシカム、ケトロラク、エトドラク、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、ジクロフェナク、オキサプロジン、アパゾン、ニメスリド、ナブメトン、テニダップ、エタネルセプト、トルメチン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、ジフルニサル、サルサレート、オルサラジン、またはスルファサラジンなどが含まれる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与すべき被験体は、炎症状態を有さない。
【００４３】
いくつかの実施形態において、膵臓組織の再生は、膵臓組織を損傷した疾病、外傷、または化学的処置により膵臓細胞の再生を必要とする被験体において、有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを用いて誘導することができる。いくつかの実施形態において、被験体は、疾病または外傷の結果として膵除去を受けている。いくつかの実施形態において、疾病は膵臓がんである。膵臓がんには、腺癌、漿液性嚢胞腺腫、腺房細胞がん、およびインスリノーマなどの膵臓の神経内分泌腫瘍が含まれる。いくつかの実施形態において、被験体は、膵除去を受けたか、または慢性膵炎に付随する膵臓の慢性炎症の結果として機能的な膵臓組織を喪失した慢性膵炎を有する患者である。いくつかの実施形態において、被験体は、膵臓の遺伝性障害、長期かつ大量のアルコール消費、嚢胞性線維症、高カルシウム血症（血中高カルシウムレベル）、高脂血症、高トリグリセリド血症（高レベルの血中脂肪）、ある種の薬物に対する反応、自己免疫状態、または未知の原因の結果として慢性膵炎を有する。嚢胞性線維症は、最も一般的な遺伝性の膵疾患であり、最終的には膵臓のひどい瘢痕および収縮がもたらされる。したがって、一実施形態は、嚢胞性線維症に付随する膵臓障害を処置することを含む。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与して、それだけには限定されないが膵臓がんを有する被験体を含む、膵除去を受けた被験体における膵臓細胞の再生を誘導し、この場合、膵臓細胞は、移植した膵臓前駆細胞または幹細胞から再生する。膵臓の再生を必要とする被験体は、例えば、前糖尿病性の病状、インスリン抵抗性、耐糖能障害などを有する被験体を含めた、１つもしくは複数の膵臓の細胞、または１つもしくは複数の膵臓の機能を喪失している被験体も含む。
【００４４】
被験体におけるインスリン生成性膵臓細胞の再生は、Ｃペプチド、膜貫通タンパク質２７（Ｔｍｅｍ２７）の血清レベルの増加、グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の低減などを検出することによって、または正常血中グルコースレベルを維持する上でのインスリン要求の低減を検出することによって測定することができる。Ｃペプチドは、インスリンがベータ細胞から分泌される前に、インスリンを形成するためにプロインスリンがタンパク分解性に切断されるときに放出されるペプチドである。Ｔｍｅｍ２７はコレクトリンとしても知られており、ベータ細胞の原形質膜から切断され、脱落される、細胞表面のグリコシル化タンパク質である。この切断プロセスはベータ細胞特異的であり、他の細胞型では起こらないと思われる（Akpinarら、Cell Metab.、２巻（６号）、３８５〜９７頁（２００５年））。ＨｂＡ１ｃは、長期間にわたって平均血漿グルコース濃度を同定するのに主に用いられるグリコシル化型のヘモグロビンである。これは、ヘモグロビンを高血漿レベルのグルコースに通常曝露することによって、非酵素的な経路において形成される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、膵臓または膵臓領域の中または近傍に投与される。「膵臓領域」という用語は、自分の膵臓をいくらか、または殆んど喪失した患者について、膵臓が別なように存在する領域を意味する。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、肝臓中および／または肝臓付近に投与される。
【００４６】
例示の実施形態において、膵臓前駆細胞は導管上皮細胞である。さらなる実施形態において、前駆細胞は導管隣接領域における細胞である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、内因性の、または移植した前駆細胞の活性化のためにＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与する被験体は、哺乳動物である。例示の実施形態において、被験体はヒトである。代替の実施形態において、被験体は、例えば、マウスまたはラットなどの齧歯動物である。
【００４８】
（ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニスト）
「ＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）アゴニスト」および「ＴＷＥＡＫ−Ｒ活性化薬」という用語は、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４）のシグナル伝達を増強することができるか、または受容体のシグナルが細胞内で解釈される方法に影響を及ぼすことができるあらゆる物質を意味する。ＴＷＥＡＫ受容体タンパク質であるＦｎ１４は、その全文が参照によって本明細書に援用される国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０２８４５１号において特徴付けられている。このＩ型膜貫通タンパク質に対するヒトおよびマウスのアミノ酸配列を、それぞれ本明細書中に配列番号３および４として提供する。例示のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストには、ＴＷＥＡＫ、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫなどのＴＷＥＡＫ融合タンパク質、ＴＷＥＡＫ類似体、および可溶性抗ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニスト抗体が含まれる。「ＴＷＥＡＫ−Ｒのシグナル伝達」という用語は、ＴＷＥＡＫ−Ｒ経路に付随する分子反応すべて、およびそれらに起因するその後の分子反応を意味する。
【００４９】
（ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストとしてのＴＷＥＡＫ）
例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストはＴＷＥＡＫである。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫはヒトＴＷＥＡＫ（配列番号１）である。代替の実施形態において、ＴＷＥＡＫはマウスＴＷＥＡＫ（配列番号２）である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫは膜結合性であり、リポソーム、または他の細胞性もしくは偽細胞性の送達系を含む薬学的組成物において送達され得る。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の一部分を含み、ここでポリペプチドは可溶性ＴＷＥＡＫである。ＴＮＦファミリーのリガンドにおけるタンパク質は、通常短い親水性アミノ酸の短いＮ末端の一続きによって特徴付けられ、移入停止配列（stop transfer sequence）として働くと考えられるいくつかのリジン残基またはアルギニン残基を含むことが多い。このＮ末端領域には膜貫通領域が続き、次いで、Ｃ末端受容体結合性ドメインを膜から分離する可変の長さの細胞外領域が続く。この領域は「ストーク（stalk）」と呼ばれることがある。ＴＷＥＡＫは小胞体においてＩＩ型膜貫通タンパク質として合成されるが、ＴＷＥＡＫはまた、トランスゴルジネットワークを横切る間に、フューリンプロテアーゼファミリーのメンバーによるそのストーク領域内でのタンパク分解性の切断後に可溶性サイトカインとして分泌される（Chicheporticheら、J.Biol. Chem.、２７２巻、３２４０１〜１０頁（１９９７年））。
【００５１】
可溶性ＴＷＥＡＫポリペプチドは、ポリペプチドが生成される細胞から分泌されるのであれば、ストーク配列のすべてまたは部分を含むことができる。したがって、ＴＷＥＡＫの可溶性の分泌型を作り出すために、ＤＮＡレベルでＮ末端膜貫通領域およびストーク領域のいくらかの部分を取り除き、選択された発現系における使用に好適である、Ｔｅｖプロテアーゼ切断部位などのタンパク切断性部位を含むリーダー配列でこれらを任意選択で置換する。当業者であれば、受容体結合性の性質および分泌効率の両方を最適化するために、分泌発現構築物において保持されているストーク領域の量を変化させることができる。例えば、ヒトＴＷＥＡＫ（配列番号１）のアミノ酸４６と１０４とを含むこれらの間の位置で開始するポリペプチドがもたらされるように、可能なストーク長をすべて含む構築物、すなわちＮ末端切断を調製することができる。いくつかの実施形態において、可溶性のＴＷＥＡＫポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸４６から２４９を含むか、またはこれらからなる。他の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１０４から２４９を含むか、またはこれらからなる。他の例示の実施形態において、可溶性のＴＷＥＡＫポリペプチドは、配列番号１の４６から１０４までのアミノ酸からの任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１の２４９位にカルボキシ末端を有する。さらなる実施形態において、ＴＷＥＡＫは、配列番号２のアミノ酸４６と１０４とを含むこれらの間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号２の２４９位にカルボキシ末端を有する、可溶性のマウスＴＷＥＡＫポリペプチドである。可溶性型のＴＷＥＡＫは効果的にシグナル伝達をすることができ、したがって天然に分泌される型、および膜繋留型の細胞外ドメインを模倣する薬物として投与することができる。本発明において有用であるＴＷＥＡＫポリペプチドおよびこの可溶性のバージョンは、その全文が参照によって本明細書に援用される、米国特許第７，１０９，２９８号に記載されている。
【００５２】
所望の可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ポリペプチドを生成するための発現ベクター中にサブクローニングしてもよく、または所望のコードＤＮＡフラグメントを化学合成してもよい。組換えの宿主細胞からのポリペプチドの精製は、ポリペプチドが分泌されるという事実によって促進され、可溶性タンパク質は、本発明のいくつかの実施形態に従って非経口投与するのに一般的に適している。分泌される可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離によって、所望のポリペプチドを発現するインタクトな細胞を培地から分離し、培地（上清）を所望のポリペプチドの存在についてアッセイすることによって同定され得る（そして、非可溶性の膜結合型の対応物から区別され得る）。
【００５３】
（ＴＷＥＡＫ類似体）
「ＴＷＥＡＫ類似体」という用語は、天然のＴＷＥＡＫポリペプチドに由来するが、そのアミノ酸配列が異なるポリペプチドを意味する。そのアミノ酸配列における変更を有するＴＷＥＡＫポリペプチドは、変異型のＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ融合タンパク質、およびＴＷＥＡＫフラグメントであってよい。ＴＷＥＡＫ類似体はＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニスト活性を有する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ類似体は、野生型配列と比べた場合に１個から５個、５個から１０個、１０個から１５個、１５個から２０個、２０個から２５個、２５個から３０個、３０個から３５個、または３５個から４０個の異なるアミノ酸を含む変異型のＴＷＥＡＫである。このタイプのＴＷＥＡＫ類似体は、例えば、配列番号１のポリペプチド、配列番号１のアミノ酸４６から２４９、および配列番号１のアミノ酸１０４から２４９など、天然のＴＷＥＡＫに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、ＴＷＥＡＫ類似体は、配列番号１または配列番号２に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである。他の特定の実施形態において、ＴＷＥＡＫ類似体は、配列番号１または配列番号２に少なくとも８５％同一であるポリペプチドである。他の実施形態において、ＴＷＥＡＫ類似体は、配列番号１に少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であり、または配列番号２に少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドである。
【００５５】
一般的に、天然のＴＷＥＡＫポリペプチド中に存在する１つまたは複数のアミノ酸の保存的置換は、ポリペプチドの活性に有害な影響を及ぼさずに行うことができる。保存的置換の例には、種間（例えば、ヒトとマウスのＴＷＥＡＫ間）に保存されているＴＷＥＡＫの領域の外のアミノ酸置換、ならびにＴＷＥＡＫの２次構造および／または３次構造を変更しないアミノ酸置換が含まれる。具体的な例として、ある脂肪族残基での別の脂肪族残基に対する置換（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａの相互間）、またはある極性残基での別の極性残基に対する置換（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、もしくはＧｌｎとＡｓｎ間）、またはある芳香族残基での別の芳香族残基に対する置換（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、もしくはＴｙｒの相互間）が含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性の特徴を有する領域全体の置換が当技術分野では公知であり、本発明の方法において企図される。変異型のＴＷＥＡＫを産生する方法は分子生物学の技術分野において周知であり、ランダム変異導入法、部位特異的変異誘発、欠失、および切断によるＤＮＡ分子の変更が含まれる。具体的な技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発、飽和（すなわち、化学的もしくは放射線）変異誘発、化学的ＤＮＡ合成、アラニンスキャニング変異誘発、オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発（インビトロでＤＮＡテンプレートにハイブリダイズした後、酵素的に伸長する）、カセット（組換え）変異誘発、およびコンビナトリアル変異誘発（ＴＷＥＡＫ  ＤＮＡ中にランダムに変性した配列を導入する）が含まれる。
【００５６】
ある例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ類似体はＴＷＥＡＫ融合タンパク質である。「融合タンパク質」という用語は、２つまたはそれを超える異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を意味する。いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ融合タンパク質は、ＴＷＥＡＫの他に、インビボの安定性、インビボの半減期、取込み／投与、組織局在もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製の１つもしくは複数を増強するポリペプチド部分を１つまたは複数含む。融合タンパク質は、当技術分野において周知である分子クローニング技術を用いて、組換えで産生することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１の配列を含むか、またはそれからなるポリペプチド、配列番号２の配列を有するポリペプチド、または本明細書に記載するそれらの可溶性型を含めた、上記に記載したＴＷＥＡＫポリペプチドを含む。ある実施形態において、ＴＷＥＡＫ融合タンパク質は、上記に記載した変異型のＴＷＥＡＫを含むことができる。他の例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、またはＧＳＴポリペプチドなどの精製サブシーケンスを含む。
【００５７】
ある例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンのＦｃドメインを含むＴＷＥＡＫ融合タンパク質である（「Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ」）。本明細書で用いられる、免疫グロブリンのＦｃ部分は、免疫学の分野においてこの語に通常与えられる意味を有する。具体的に、この語は、抗体からの２つの抗原結合性領域（Ｆａｂフラグメント）を含まない抗体フラグメントを意味する。Ｆｃ部分は、非共有性の相互作用およびジスルフィド結合を介して会合する、両方の重鎖からの抗体の定常領域からなる。Ｆｃ部分はヒンジ領域を含むことができ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを通って抗体のＣ末端に及ぶことができる。Ｆｃ部分は、１つまたは複数のグリコシル化部位をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、米国特許第７，４５２，９６６号に記載されているように、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ部分は、不必要なエフェクター機能を除去し、かつ／または繰返し、長期に投与された後、免疫反応を誘導するリスクを低減するようにデザインされた変異を含む。融合タンパク質は、例えば、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、６×Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグなどを含むことができ、かつ／またはポリエチレングリコールに結合体化して（例えば、ペグ化）、例えば免疫原性を低減し、かつ／もしくは融合タンパク質の循環半減期を延長することができる。
【００５８】
（ＴＷＥＡＫ模倣物）
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、ＴＷＥＡＫ模倣物またはＴＷＥＡＫペプチド模倣物である。「ＴＷＥＡＫ模倣物」または「ペプチド模倣物」という用語は、テンプレートペプチドに類似する性質を有する薬物として製薬業界において通常用いられているタイプの非ペプチド類似体を意味する（参照によって本明細書に援用される、Fauchere、J. Adv. Drug Res.、１５巻、２９頁（１９８６年）；VeberおよびFreidinger、TINS、３９２頁（１９８５年）；ならびにEvansら、J.Med. Chem.、３０巻、１２２９頁（１９８７年））。模倣物は、しばしばコンピュータ分子モデリングの助けで開発される。治療上有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物を用いて、同等の治療効果または予防効果を生成してもよい。一般的に、模倣物は、ＴＷＥＡＫフラグメントなど、パラダイムポリペプチド（例えば、所望の生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、当技術分野において周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ならびに−ＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される結合によって任意選択で置換されるペプチド結合を１つまたは複数有する。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の、同じ型のＤ−アミノ酸での系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いてより安定なペプチドを産生してもよい。さらに、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を加えることによって、コンセンサス配列、または実質的に同一のコンセンサス配列の改変体を含む制限ペプチドを、当技術分野において公知の方法によって産生してもよい（参照によって本明細書に援用される、RizoおよびGierasch、Ann.Rev. Biochem.、６１巻、３８７頁（１９９２年））。ＴＷＥＡＫ類似体は、本明細書に記載する通り、天然に存在するＴＷＥＡＫリガンドのアミノ酸配列と配列が異なってもよく、または配列に関与しない方法において異なってもよく、またはその両方でもよい。
【００５９】
（アゴニスト抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体）
ＴＮＦリガンドおよびＴＮＦリガンド受容体ファミリーの他のメンバー同様、ＴＷＥＡＫおよびＴＷＥＡＫ−Ｒの結合複合体は、３つのＴＷＥＡＫ−Ｒモノマーに対称に結合しているＴＷＥＡＫホモ３量体からなる。歴史的に、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、受容体モノマーのリガンド誘導性３量体化によって活性化されると考えられてきた。しかし、最近の証拠は、ＴＮＦ受容体は細胞表面上に予め組み立てられたオリゴマーとして存在することがあり、予め形成された受容体オリゴマーによってリガンド誘導性のシグナル伝達が送られることを示している（Chan、Cytokine.、３７巻（２号）、１０１〜７頁（２００７年）において概観）。ＴＮＦファミリー受容体に対する抗体は、受容体−リガンド相互作用を阻止するアンタゴニストとして働くことができるが、オリゴマー形成、受容体のクラスター形成を誘導し、かつ／または他の方法で受容体のシグナル伝達を活性化するアゴニストとして働くこともできる（Pukacら、Br.J. Cancer.、９２巻、１４３０〜１４４１頁（２００５年）；DesbaratsおよびNewell、Nat. Med.、６巻（８号）、９２０〜３頁（２０００年））。結合し、受容体の活性を誘導するＴＷＥＡＫ−Ｒに特異的な抗体が記載されている（例えば、その全文が参照によって本明細書に援用される、米国特許第７，２０８，１５１号、および国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００４９７４号を参照されたい）。さらなる例示の抗体は、その全文が本明細書に参照によって援用される、米国特許公開第２００９０３２４６０２号に記載されている。受容体の活性を誘導するＴＷＥＡＫ−Ｒに特異的な例示の抗体の重鎖および軽鎖の配列を、それぞれ配列番号５および配列番号６に提供する。
【００６０】
ＴＷＥＡＫ−Ｒに結合し、ＴＷＥＡＫ−Ｒオリゴマー形成／クラスター形成を増強することによって、または他の方法でＴＷＥＡＫ−Ｒを活性化することによってＴＷＥＡＫ−Ｒの活性を誘導するＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体が、本発明の方法において特に企図される。いくつかの実施形態において、本方法は、単一の抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体を含む、単一の抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体の使用を含む。他の実施形態において、本方法は、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストとして働く、溶液における複数の抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体の使用を含む。ＴＷＥＡＫ−Ｒの様々なエピトープに対するポリクローナル抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体を用いることができる。ＴＷＥＡＫ−Ｒの様々な、非オーバーラップのエピトープに対する複数の抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体も用いることができる。
【００６１】
「抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体」という用語は、ＴＷＥＡＫ−Ｒの単一のエピトープを認識し、それに結合するあらゆるモノクローナル抗体を意味する。ＴＷＥＡＫ−Ｒ架橋剤としての抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体の使用は、１つのエピトープ、または２つもしくはそれを超える非オーバーラップのエピトープを認識するモノクローナル抗体の使用に頼っている。さらなるエピトープ（新しいモノクローナル抗体によって規定される）を、ＴＷＥＡＫ−Ｒまたはそのフラグメントで免疫化したマウスの脾臓細胞からの新しいハイブリドーマを産生し続けることによって、様々な種の動物を免疫化することによって、および様々な免疫化経路を用いることによって同定してもよい。
【００６２】
エピトープを、また、表面プラズモン共鳴と連結されたクロマトグラフィー技術を用いて、様々なモノクローナル抗体の、ＴＷＥＡＫ−Ｒへの結合に対して相互に競合する能力を評価することによって、直接マッピングしてもよい（Pharmacia BIAtechnology Handbook、「Epitope Mapping」、セクション６．３．２、（１９９４年５月）；Johneら、J.Immunol. Methods、１６０巻（２号）、１９１〜８頁（１９９３年）も参照されたい）。
【００６３】
（ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストとしての抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＩｇＭモノクローナル抗体）
通常の２つを超えるＩｇＧ抗原結合性部位を含む抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体はまた、多価の、細胞表面ＴＷＥＡＫ−Ｒ架橋剤として溶液中で機能し、したがって本発明によるＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの定義に含まれる。「多価リガンド」という用語は、１つを超える受容体結合部位を有し、少なくとも２つの受容体分子に非常に接近して同時に結合および架橋することができる分子または複合体を意味する。例えば、抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体の抗原結合性部位を、標準の組換えＤＮＡおよびハイブリドーマの技術を用いて、ＩｇＭ分子中（抗原結合性部位１０個を有する）に構築することができる。
【００６４】
あるいは、抗原で単一免疫化した後、ハイブリドーマ融合技術によって単離した完全なマウス（または他の動物）のＩｇＭ分子を収集し、エンリッチしてもよい。ＩｇＭ分子をエンリッチする一方法は、ＣＤ４０シグナル伝達欠損マウスを免疫化することである（Kawabeら、Immunity、１巻、１６７〜７８頁（１９９４年）；Xuら、Immunity、１巻、４２３〜３１頁（１９９４年））。これらのマウスはＩｇＧを効率的に生成することができず、したがって抗原によるチャレンジに対するこれらの反応はＩｇＭイソ型についてエンリッチされる。
【００６５】
抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＩｇＭ抗体は、その結合価の増加によって、膜の面内でＴＷＥＡＫ−Ｒ分子を効果的に凝集することができ、それによって、抗原結合性部位を２つ有するＩｇＧの対応物に比べてＴＷＥＡＫ−Ｒのシグナル伝達を増強する。受容体のクラスター形成における多価抗体の高い能力の印象的な例はＦａｓ受容体に対する抗体に見られ、この場合ＩｇＭの型は非常に強力であり、通常の２価ＩｇＧは溶液中で効果的ではない（YoniharaおよびYonihara、J. Exp. Med.、１６９巻、１７４７〜５６頁（１９８９年）；Aldersonら、Int.Immunol.、６巻、１７９９〜１８０６頁（１９９４年））。
【００６６】
同様に、Ｆａｓ受容体に対するａｐｏ−１モノクローナル抗体は、ＩｇＧ３モノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体はＦａｓ受容体を強力に活性化し、これは、より大型の多価の型に凝集する、ＩｇＧ３亜型に独特なＦｃ相互作用に頼っている。Ｆｃ領域を除去すると、より大型の凝集物に会合することができず、不活性であるＦ（ａｂ）２型が作り出される（Dheinら、J. Immunol.、１４９巻、３１６６〜７３頁（１９９２年））。このように類推によって、抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体のＩｇＭバージョンはＴＷＥＡＫ−Ｒの強力な活性化物質であることが予想される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、架橋結合している抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体の複合体である。「架橋結合している抗ＴＷＥＡＫ−Ｒモノクローナル抗体」という用語は、抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体もしくはモノクローナル抗体架橋剤を用いて相互に分子間架橋結合して溶液中に抗体の凝集物を形成したか、または表面上もしくはマイクロビーズなどのマトリックス上で相互に非常に接近して固定化された、ＴＷＥＡＫ−Ｒに対する抗体を意味する。「抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体（またはモノクローナル抗体）架橋剤」という用語は、抗体が標的の細胞表面ＴＷＥＡＫ−Ｒに結合し、そのシグナル伝達を増強することができるように、溶液中で抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体を共有性に、または非共有性に凝集することができるあらゆる物質を意味する。このような架橋剤には、それだけには限定されないが、化学的架橋剤、抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体またはモノクローナル抗体の部分と反応する２次抗体、および抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体に結合することができる、可溶性または表面結合Ｆｃ受容体（内因性のもの、もしくは外因的に加えられるもののいずれか）が含まれる。
【００６８】
本明細書で用いられる、「抗体」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン、または免疫グロブリン可変ドメインの配列を提供するアミノ酸配列）を含むタンパク質を意味する。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）を含むことができる。別の一例において、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合性フラグメント（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、およびｄＡｂフラグメント）、ならびに、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびこれらの亜型）型のインタクトおよび全長の免疫グロブリンを含めた完全抗体を包含する。この語は二重特異性抗体、二重特異性抗体のフラグメント、多量体抗体、および多量体抗体のフラグメントも包含する。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダ型であってよい。いくつかの実施形態において、抗体はグリコシル化されている。
【００６９】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域に散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超過変性の領域にさらに細分され得る。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は正確に規定されている（Kabat,E.A.ら、（１９９１年）「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第５版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH Publication 第９１〜３２４２；およびChothia, C.ら、J.Mol. Biol.、１９６巻、９０１〜９１７頁（１９８７年）を参照されたい）。Ｋａｂａｔの定義が本明細書において用いられる。各ＶＨおよびＶＬは、典型的に、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシル末端まで配列されている、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている。
【００７０】
抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、それぞれ、重鎖または軽鎖の定常領域の全部または部分をさらに含むことができ、それによって免疫グロブリンの重鎖または軽鎖を形成する。一実施形態において、抗体は、免疫グロブリン重鎖２個および免疫グロブリン軽鎖２個の４量体である。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖はジスルフィド結合によって連結され得る。重鎖定常領域は、典型的に、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、典型的に、ＣＬドメインを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体の１つまたは複数の領域は、ヒトの領域、実質的にヒトの領域、またはヒト化領域であってよい。「実質的にヒト」の免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性反応を誘導しないように、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸の位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「実質的にヒト」の抗体は、抗体が正常なヒトにおいて免疫原性反応を誘導しないように、十分な数のヒトアミノ酸の位置を含む抗体である。「ヒト化」の免疫グロブリン可変領域は、修飾型が、非修飾型ほどヒトにおける免疫反応を誘導しないように修飾されている、免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」の免疫グロブリンの記述は、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号および同第５，６９３，７６２号を含む。例えば、１つまたは複数の可変領域は、ヒトまたは実質的にヒトであってよい。１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３はヒトであってよい。各軽鎖ＣＤＲはヒトであってよい。ＶＨ  ＣＤＲ３はヒトであってよい。１つまたは複数のフレームワーク領域、例えば、重鎖または軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４はヒトであってよい。いくつかの実施形態において、フレームワーク領域はすべてヒトである。一実施形態において、ヒトの配列は生殖系列配列（生殖系列の核酸によってコードされる配列）である。１つまたは複数の定常領域は、ヒト、実質的にヒト、またはヒト化であってよい。他の実施形態において、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３をまとめて、もしくはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４をまとめて含む）の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、または９８％、または抗体全体は、ヒト、実質的にヒト、またはヒト化であってよい。ある場合には、ヒト化免疫グロブリンは、１つまたは複数のフレームワークアミノ酸の位置で非ヒトのアミノ酸を含むことがある。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３はまとめて、ヒト生殖系列セグメントによってコードされるヒト配列に、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、もしくは９９％同一、または完全に同一であってよい。
【００７２】
抗体は、例えば、免疫原性を低減するために、かつ／または抗体の循環半減期を延長するために、部分に結合体化していてよく、例えば、ポリ（エチレングリコール）に結合体化していてよい（例えば、ペグ化）。
【００７３】
（抗体の産生）
ＴＷＥＡＫ−Ｒに結合する抗体は、免疫化を含む様々な手段によって、例えば、動物を用いて、またはファージディスプレイなどのインビトロの方法で、標準のプロトコールに従って産生することができる（例えば、「Antibodies: A Laboratory Manual」、HarlowおよびLane編集、Cold Spring Harborpress:１９８８年を参照されたい）。ＴＷＥＡＫ受容体の全部もしくは一部分、またはＴＷＥＡＫ受容体を発現する細胞を、免疫原として、または選択用の標的として用いてもよい。例えば、ＴＷＥＡＫ受容体、もしくはそのフラグメント、またはＴＷＥＡＫ受容体発現性細胞を免疫原として用いることができる。一実施形態において、免疫化された動物は、天然の、ヒトの、または部分的にヒトの免疫グロブリンの遺伝子座を有する免疫グロブリン生成細胞を含んでいる。一実施形態において、非ヒト動物は、少なくとも一部分のヒト免疫グロブリン遺伝子を含んでいる。例えば、マウス抗体の生成を欠き、ヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントを有するマウス系統を遺伝子工学的に作製するのは可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する、抗原特異的モノクローナル抗体を生成および選択してもよい。例えば、XENOMOUSEＴＭ、Greenら、Nat.Gen.、７巻、１３〜２１頁（１９９４年）；米国特許公開第２００３／００７０１８５号；米国特許第５，７８９，６５０号； および国際特許公開第ＷＯ９６／３４０９６号を参照されたい。
【００７４】
ＴＷＥＡＫ受容体に対する非ヒト抗体は、例えば、齧歯動物において生成することもできる。非ヒト抗体を、ヒト化し（例えば、ＥＰ  ２３９  ４００；米国特許第６，６０２，５０３号；同第５，６９３，７６１号；および同第６，４０７，２１３号において記載されている通りに）、脱免疫化し（deimmunized）、または他の方法で修飾して、上記に記載したように実質的にヒトにすることができる。
【００７５】
ＥＰ２３９  ４００（Winterら）は、ある種に対する相補性決定領域（ＣＤＲ）の、別の種からの相補性決定領域での置換（所与の可変領域内）によって抗体を変更することを記載している。典型的には、非ヒト（例えば、マウス）の抗体のＣＤＲを、所望の置換されている抗体をコードする配列を生成するための組換え核酸技術を用いることによって、ヒト抗体における対応する領域中に置換する。所望のイソ型のヒト定常領域遺伝子セグメント（通常ＣＨについてガンマＩ、ＣＬについてカッパ）を加えることができ、ヒト化の重鎖および軽鎖の遺伝子を哺乳動物細胞において共発現させて可溶性のヒト化抗体を生成することができる。抗体をヒト化するための他の方法も用いることができる。例えば、他の方法は抗体の３次構造、結合性決定因子に対して３次元的に接近しているフレームワークポジション、および免疫原性ペプチドの配列からなっていてもよい。例えば、国際出願第ＷＯ９０／０７８６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，５３０，１０１号；および同第６，４０７，２１３号；ならびにTempestら、Biotechnology、９巻、２６６〜２７１頁（１９９１年）を参照されたい。
【００７６】
ＴＷＥＡＫ受容体に結合する完全なヒトモノクローナル抗体を、Boernerら、J.Immunol.、１４７巻、８６〜９５頁（１９９１年）によって記載されている通り、例えば、インビトロで刺激したヒト脾細胞を用いて生成してもよい。これらは、Perssonら、Proc.Nat. Acad. Sci. U. S. A、８８巻、２４３２〜２４３６頁（１９９１年）によって、またはHuangおよびStollar、J.Immunol. Methods、１４１巻、２２７〜２３６頁（１９９１年）によって、または米国特許第５，７９８，２３０号において記載されている通り、レパートリークローニングによって調製することができる。大型の非免疫化のヒトファージディスプレイライブラリーを用いて、標準のファージ技術を用いるヒトの治療法として開発され得る高親和性抗体を単離することもできる（例えば、Hoogenboomら、Immunotechnology、４巻、１〜２０頁（１９９８年）；Hoogenboomら、ImmunolToday、２巻、３７１〜３７８頁（２０００年）；および米国特許公開第２００３／０２３２３３３号を参照されたい）。
【００７７】
（抗体およびタンパク質の生成）
本明細書に記載する抗体および他のタンパク質は、原核細胞および真核細胞において生成され得る。一実施形態において、抗体はＰｉｃｈｉａ（例えば、Powersら、J. Immunol. Methods、２５１巻、１２３〜３５頁（２００１年）を参照されたい）、Ｈａｎｓｅｕｌａ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの酵母菌細胞において発現される。
【００７８】
抗体、とりわけ全長の抗体、例えばＩｇＧは、哺乳動物細胞において生成され得る。組換え発現のための例示の哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A、７７巻、４２１６〜４２２０頁（１９８０年）に記載されているｄｈｆｒＣＨＯ細胞を含み、組換え構築物は、KaufmanおよびSharp、Mol.Biol.、１５９巻、６０１〜６２１頁（１９８２年）に記載されているＤＨＦＲ選択マーカーを含んでいる）、リンパ細胞系、例えば、ＮＳＯミエローマ細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ならびにトランスジェニック哺乳動物などのトランスジェニック動物からの細胞が含まれる。例えば、細胞は哺乳動物の上皮細胞である。
【００７９】
免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列の他に、組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）、および選択マーカー遺伝子など、さらなる核酸配列を保有することができる。選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例示の選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセートの選択／増幅を有するｄｈｆｒ宿主細胞において使用するため）、およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【００８０】
抗体または抗体フラグメントの組換え発現のための一例示の系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによってｄｈｆｒＣＨＯ細胞中に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子は、各々エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来するもの、例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント）に作動可能に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も保有しており、ＤＨＦＲ遺伝子は、メトトレキセートの選択／増幅を用いてベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体の宿主細胞を培養して抗体の重鎖および軽鎖の発現を可能にし、培地からインタクトの抗体を収集する。標準の分子生物学の技術を用いて組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体に対して選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を収集する。例えば、いくつかの抗体を、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを用いてアフィニティクロマトグラフィーによって単離することができる。
【００８１】
抗体（およびＦｃ融合物）は、例えば、Ｆｃ機能を変更する修飾を含む、修飾を含むこともできる。このような修飾には、Ｆｃ受容体との相互作用、もしくはＣ１ｑとの相互作用、またはその両方を低減または除去する変更が含まれる。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域は、米国特許第５，６４８，２６０号におけるナンバリングに従って、例えば、残基２３４および２３７の１つまたは複数を含めた、１つまたは複数の残基が変異されていてよい。他の例示の修飾には、米国特許第５，６４８，２６０号に記載されているものが含まれる。
【００８２】
アゴニスト抗体、およびＦｃドメインを含むいくつかのＴＷＥＡＫ融合タンパク質に対して、抗体／タンパク質生成系をデザインしてグリコシル化されたＦｃ領域を有する融合タンパク質または抗体を合成してもよい。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインを、ＣＨ２ドメインにおけるアスパラギン２９７でグリコシル化する。Ｆｃドメインは他の真核生物の翻訳後修飾も含むことができる。他の場合には、タンパク質は、グリコシル化されていない型で生成される。
【００８３】
抗体および他のタンパク質はトランスジェニック動物によって生成することもできる。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現するための方法を記載している。ミルクに特異的なプロモーター、ならびに目的の抗体（例えば、本明細書に記載する抗体）、および分泌のためのシグナル配列をコードする核酸配列を含む導入遺伝子を構築する。このような雌性のトランスジェニック哺乳動物によって生成されるミルクは、その中に分泌される目的のタンパク質、例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質を含んでいる。タンパク質はミルクから精製することができ、またはいくつかの応用では直接用いることができる。
【００８４】
（処方物および投与経路）
本発明の方法は、有効投与量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを被験体に投与して膵臓組織の再生を誘導することを含む。所与の被験体に対する好ましい薬剤処方物および治療有効投与量のレジメンの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度、ならびに処置に対する患者の耐性を考慮に入れて、当該分野の技術の範囲内に十分ある。
【００８５】
ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを、アゴニストに適合するあらゆる投与経路によって投与することができ、投与経路に好適なあらゆる薬学的に許容されるキャリアと共に処方することができる。このようなキャリアは当業者には周知である。投与は、例えば、静脈内に、腹腔内に、経口的に、埋め込みによって、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、および皮下に行うことができる。好ましい投与経路は非経口、とりわけ静脈内、腹腔内、および嚢内である。処置は、外来患者ベースで長期間にわたって行うことができる。治療薬の１日量は、約０．０１から１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約１０から３００μｇ／ｋｇ体重の範囲であると予想されるが、正確な投与量は用いられる特定の治療薬、ならびに特定の被験体の医学的状況および病歴に応じて変化する。
【００８６】
数々の日常的に用いられるキャリアを用いる以下の送達系は、本発明の方法に従ってＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与するのに想定される多くの実施形態の代表に過ぎない。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを、注射可能な薬物送達システムによって投与する。このようなシステムは、溶液、懸濁物、ゲル、ミクロスフェア、およびポリマー注射物を含むことができ、ならびに溶解性改変剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、およびショ糖を含む）、およびポリマー（例えば、ポリカプリラクトン（polycaprylactone）およびポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含む）などの賦形剤を含むことができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは移植可能な系によって投与される。移植可能な系はロッドおよびディスクを含むことができ、ＰＬＧＡおよびポリカプリラクトンなどの賦形剤を含むことができる。
【００８９】
ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストについての経口送達系は、錠剤およびカプセルを含む。これらは、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（pyrilodone）、他のセルロース材料、およびデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、デンプン、リン酸二カルシウム、およびセルロース材料）、崩壊剤（例えば、デンプンポリマーおよびセルロース材料）、ならびに潤滑剤（例えば、ステアレートおよびタルク）などの賦形剤を含むことができる。
【００９０】
ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストについての経粘膜の送達系は、パッチ、錠剤、坐剤、ペッサリー、ゲルおよびクリームを含み、可溶化剤およびエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、およびアミノ酸）、ならびに他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性ポリマー）などの賦形剤を含むことができる。
【００９１】
皮膚送達系は、例えば、水性および非水性のゲル、クリーム、多層エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベース、ならびに粉末を含み、可溶化剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含むことができる。
【００９２】
溶液、懸濁物、および再構成可能な送達系のための粉末は、懸濁化剤（例えば、ゴム、ザンタン（zanthan）、セルロース、および糖）、湿潤剤（例えば、ソルビトール）、可溶化剤（例えば、エタノール、水、ＰＥＧ、およびプロピレングリコール）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｐａｎ、Ｔｗｅｅｎ、およびセチルピリジン）、保存剤および抗酸化剤（例えば、パラベン、ビタミンＥおよびＣ、およびアスコルビン酸）、固化防止剤、コーティング剤、ならびにキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などのビヒクルを含む。
【００９３】
ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストは、例えば、取込みまたは安定性を刺激する補助因子と一緒に、またはそれらなしで、無菌の、等張の処方物中に入れてもよい。処方物は好ましくは液体であり、または凍結乾燥粉末であってもよい。例えば、ＴＷＥＡＫアゴニストを、クエン酸一水和物５．０ｍｇ／ｍｌ、クエン酸三ナトリウム２．７ｍｇ／ｍｌ、マンニトール４１ｍｇ／ｍｌ、グリシン１ｍｇ／ｍｌ、およびポリソルベート２０  １ｍｇ／ｍｌを含む処方物で希釈してもよい。この溶液を凍結乾燥し、冷蔵下で貯蔵し、投与前に注射用蒸留水（Ｕ．Ｓ．Ｐ）で再構成することができる。
【００９４】
本発明の薬学的組成物を、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達系、あるいは罹患している組織もしくは血流中、これらの付近、またはそうでなければこれらと連絡するように配置される徐放処方物を用いて投与してもよい。徐放用キャリアの適切な例には、坐剤またはマイクロカプセルなどの成形された物品の形態の、半透性のポリマーマトリックスが含まれる。移植可能な、またはマイクロカプセルの徐放マトリックスには、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９号、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Sidmanら、Biopolymers、２２巻、５４７〜５６頁（１９８５年））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはエチレン酢酸ビニル（Langerら、J.Biomed. Mater. Res.、１５巻、１６７〜２７７頁（１９８１年）；Langer、Chem. Tech、１２巻、９８〜１０５頁（１９８２年））が含まれる。
【００９５】
本発明の方法は、有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを、単離し、培養した膵臓細胞に送達して、インビトロで前記細胞の増大を誘導することも含む。
【００９６】
本発明の方法、処方物、および投与量を、糖尿病の公知のモデルにおいて評価してもよい。これらの方法には、以下の実施例において記載するマウスモデルなどの動物モデルが含まれる。本発明の組成物を動物モデルにおいて試験する場合、生物学的治療薬は動物において活性を有するであろう。例えば、マウスアゴニスト抗ＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体は、ヒト抗体がマウスＴＷＥＡＫ−Ｒと交差反応をしない場合、ヒト抗体の代わりに用いることができる。
【００９７】
以下の実施例は、本発明の例示の実施形態を提供するものである。当業者であれば、本発明の精神または範囲を変更せずに行うことができる数々の修飾および改変を認める。このような修飾および改変は、本発明の範囲内に包含される。実施例は、決して本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９８】
（実施例１  ＴＷＥＡＫの過剰発現は膵管細胞の過形成を誘導する）
膵臓において前駆細胞を増大させる新規戦略は、インスリン生成性β細胞の量が不十分であることに起因する糖尿病の処置に対する大幅な前進となる。ＴＷＥＡＫは、その受容体であるＴＷＥＡＫ−Ｒ（ＦＧＦ誘導性分子１４；Ｆｎ１４）を介して、炎症誘導活性、血管形成、ならびに細胞の生存、増殖、および死の調節を含めた多面的な効果を媒介するＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインのメンバーである。ＴＷＥＡＫ−Ｒは、上皮細胞および間葉系細胞によって発現され、ならびにＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫ、およびＡＫＴ経路を介したシグナル伝達を行う。興味深いことに、ＴＷＥＡＫ−Ｒの発現は、通常、比較的低レベルで発現され、組織の傷害および再生、ならびに慢性炎症性疾患の状況では高度に上方制御され、このことは急性炎症および組織の修復の調整におけるこの経路についての生理学的役割、ならびに慢性炎症性疾患における病理学的役割を支持している。ＴＷＥＡＫ−Ｒは、胆管に関連する肝臓前駆細胞、間葉系幹細胞、ならびに骨格筋、軟骨、骨、脂肪細胞、およびニューロン前駆細胞を含めた様々な前駆細胞型によって発現される。肝臓において、ＴＷＥＡＫは、導管に関連する前駆細胞の増大を誘導した。膵臓前駆細胞の正体は依然として不明であるが、以前のいくつかの研究は膵臓前駆細胞が導管上皮に由来することを示唆している。本発明者らは、ＴＷＥＡＫ／ＴＷＥＡＫ−Ｒ経路が、膵臓前駆細胞および再生を調節する上で重要な役割を果たすか否かを現在調査中である。
【００９９】
上昇したレベルのＴＷＥＡＫが膵臓細胞の再生に対して作用を有するか否かを決定するために、アデノウイルスの発現ベクターを用いてＴＷＥＡＫをマウス中で過剰発現させ、次いで、マウスからの膵臓試料を組織学的に観察した。可溶性ＴＷＥＡＫをコードする配列を構成的ＣＭＶプロモーターの制御下で複製欠損アデノウイルスベクター中に挿入することによって、マウスのＴＷＥＡＫについてのコード配列を含むアデノウイルスを構築した。「アデノ−ＴＷＥＡＫ」と呼ばれる、構成的ＣＭＶプロモーターの制御下でＴＷＥＡＫ  ＯＲＦを含む組換えアデノウイルス粒子を、標準的な方法によって作成した（Ng, P.ら、Hum. Gene Ther.、１１巻、６９３〜６９９頁（２０００年）；およびNg, P.ら、Hum. GeneTher.、１０巻、２６６７〜２６７頁（１９９９年））。簡潔に述べると、可溶性のマウスＴＷＥＡＫを発現する初代アデノウイルスベクター（Ｅ１、Ｅ３欠損、血清型５）を、２９３細胞において標準的な方法によって作製した（同書）。二重塩化セシウム密度平衡勾配遠心分離を用いてベクターを精製し、次いで−８０℃に貯蔵した（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＩ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ  グリセロール、ｐＨ８．０中）。このベクターからのマウスのＴＷＥＡＫの発現を、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を用いてインビトロで、およびベクターを静脈内投与したマウスを用いてインビボで、の両方で酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価した。「アデノ−ＧＦＰ」と呼ばれる、ＧＦＰのコード配列を含む対照のアデノウイルスを同じ方法で構築した。ＴＷＥＡＫをコードするアデノウイルスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  ＦａｒｍｓまたはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した６〜８週齢の野生型Ｃ５７Ｂｌ／６雌性マウスに送達した。形質導入の良好な効率を確実にするために、ウイルス粒子１０１１個の全投与量のアデノウイルスベクターを、対照および実験用マウスの両方に用いた。血清ＴＷＥＡＫレベルは、典型的に、注射８日後に約３００ｎｇ／ｍｌ、注射１４日後に５０ｎｇ／ｍｌ、および注射２７日後に２７ｎｇ／ｍｌであった。注射３週間後、安楽死させたマウスからの膵臓を単離し、固定し、切片にし、増殖に対する細胞マーカーであるＫｉ−６７タンパク質に対して染色した。
【０１００】
図１に示すように、膵臓の導管周囲領域における増殖細胞の数は、アデノ−ＧＦＰに感染させた対照のマウスよりも、アデノ−ＴＷＥＡＫに感染させたマウスのほうがはるかに多い。
【０１０１】
（実施例２  ＴＷＥＡＫ−Ｒは膵管由来細胞上に発現される）
ＴＷＥＡＫ−Ｒの発現レベルを、正常ラット膵臓、または部分的膵除去後２と３／４日から単離した膵管細胞におけるｍＲＮＡマイクロアレイ分析によって測定した。マイクロアレイ分析は標準の手順を用いて行った（Flamezら、Diabetes、５１巻、２０１８〜２０２４頁（２００２年）；およびWebbら、Proc Natl Acad Sci US A、９７巻、５７７３〜５７７８頁（２０００年）を参照されたい）。正常な膵臓および膵除去後の導管細胞は検出可能なＴＷＥＡＫ−Ｒ  ｍＲＮＡを生成したが、単離した膵島は生成しなかった。
【０１０２】
ＴＷＥＡＫ−Ｒは、導管細胞を起源とすると考えられている膵臓腺癌上に、高頻度で発現される（Hanら、Cancer Res.、６２巻（１５号）、４５３２頁（２００２年））。図２は、ヒト膵臓腫瘍組織マイクロアレイの免疫組織学的染色によって検出された、ヒト膵臓腫瘍におけるＴＷＥＡＫ−Ｒの発現を示す。組織試料４２個中１６個（４２％）がＴＷＥＡＫ−Ｒ陽性であった。
【０１０３】
（実施例３  Ｆｃ−ＴＷＥＡＫは膵管上皮および導管隣接領域における細胞の増殖を誘導する）
８週齢から１０週齢の成体Ｃ５７Ｂｌ／６雌性マウスに、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ２００μｇまたは対照のタンパク質Ｐ１．１７を、単回注射（急性処置）、または最初の注射後１週間に２回（慢性処置；０、３、７、１０、および１４日に注射を行った）のいずれかにおいて注射した。膵臓組織を、ケタミン／キシラジン麻酔したマウスから様々な時間点において外科的に得て、膵臓組織を取り出した直後にマウスを屠殺した。屠殺の日には、マウスにＦｃ−ＴＷＥＡＫまたはＰ．１．１７の注射は行わなかった。組織試料を固定し、切片にし、増殖マーカーであるＫｉ−６７に対して免疫染色した。
【０１０４】
図３は、代表的な、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色したマウス膵臓断面を示す。膵臓は、腺房、導管、および島からなる。腺房、島、または血管細胞の典型的な構造を示さない膵管の周囲の細胞は、導管隣接細胞と呼ばれる。
【０１０５】
図４は、Ｋｉ−６７染色によって証明される、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置３日後の膵管領域における細胞の増殖の増加を示す代表的な画像を含んでいる（スケールバー＝２００μｍ）。図４Ａは、対照のタンパク質Ｐ１．１７で処置後、導管領域に存在する増殖を示し、図４Ｂは、同じ長さの時間、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫを投与したマウスにおける同じ領域において、増殖細胞の数の増加があることを示す。図４ＣおよびＤは、対照（図４Ｃ）またはＦｃ−ＴＷＥＡＫ（図４Ｄ）処置後４日目に、管上皮マーカーＣＫおよびＫｉ−６７に対して共染色された（constained）膵臓組織を示す。ＴＷＥＡＫ処置した細胞におけるＣＫおよびＫｉ−６７染色のオーバーラップは、導管上皮細胞の増殖を実証している。
【０１０６】
導管領域における増殖細胞の増加は、急性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置または慢性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置いずれかの後４日目に同様であった（図５）。これらの結果は、１処置群あたり４匹のマウスの代表である。
【０１０７】
１、３、４、５、１０、および１８日間のＦｃ−ＴＷＥＡＫまたはＰ１．１７処置後Ｋｉ−６７に対して陽性であった導管細胞のパーセンテージを、各動物個体についての所与の切片の複数の視野における、Ｋｉ−６７陽性導管細胞の数および導管細胞の合計数を計数することによって算出した。これらのパーセンテージを、対照のＩｇタンパク質であるＰ１．１７での処置と比べて、慢性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置を施したマウスについて図６に、急性のＦｃ−ＴＷＥＡＫ処置を施したマウスについて図７に示す（データは、平均値±平均値の標準誤差として示す［ＳＥＭ；ｎ＝４］）。両方の処置レジメンで、Ｋｉ−６７陽性導管上皮細胞の数は、対照Ｉｇの処置マウスに対して、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置マウスにおいて増加した。Ｋｉ−６７に対して陽性に染色された導管隣接領域における細胞のパーセンテージを、各動物個体についての所与の切片の複数の視野における、導管１つあたりのＫｉ−６７陽性導管隣接細胞の数および導管細胞の総数を計数することによってやはり定量し、慢性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置を施したマウスについて図８に、急性処置を施したマウスについて図９に示す（図６および７同様、データを平均値±ＳＥＭ［ｎ＝４］として示す）。導管上皮細胞について観察したのと同様、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置により、対照のＩｇでの処置に比べて、導管隣接領域における増殖細胞の数は増加した。慢性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置は、より長期の時間点での導管関連領域における細胞の持続的な増殖に必要とされた（１０日目および１８日目）。図６〜９において、それぞれの対照に比べて有意な増殖の誘導（ｐ＜０．０５）を示す測定値を、アスタリスクによって示す。
【０１０８】
ＴＷＥＡＫ処置は全身性の膵臓の炎症を誘導しない。図１０は、被験体に比べて慢性ＴＷＥＡＫ処置後４日目のマウスからの膵臓切片上で、ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）およびＦ４／８０（マクロファージマーカー）の免疫染色は増加しなかったことを示す代表的な画像を含む（スケールバー＝２００μｍ）。同様の結果が、急性または慢性いずれかの処置レジメン下、行ったすべての時間点において（１、３、４、５、１０、および１８日目）得られた。
【０１０９】
（実施例４  導管領域における膵臓細胞の増殖に対するＴＷＥＡＫの分裂促進的効果はＴＷＥＡＫ−Ｒによって媒介される）
ＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウスの産生は記載されていた（Jakubowskiら、J.Clin. Invest.、１１５巻、２３３０〜４０頁（２００５年））。簡潔に述べると、マウスＴＷＥＡＫ−Ｒの全遺伝子を含む１０−ｋｂ  Ｋｐｎ１ゲノムＤＮＡフラグメントを単離し、ＴＷＥＡＫ−Ｒの細胞外リガンド結合性ドメインすべてを含む最初の２エキソンを欠失するように標的ベクターをデザインした。標的ベクターを、Ｊ１  １２９ＥＳ細胞系中にトランスフェクトし、Ｇ４１８で選択した。ＥＳ細胞のクローンを、サザンブロットを用いて相同的組換えに対してスクリーニングし、正しいクローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞中に注入してキメラを産生した。標的とするＴＷＥＡＫ−Ｒの対立遺伝子についてヘテロ接合性のマウスをさらなる交配によって得、サザンブロットまたはＰＣＲを用いて同定した。ノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲの両方によってヌル変異が確認された。マウスを、１２９のバックグラウンドにおいてホモ接合性に交配させた。ＴＷＥＡＫ−Ｒ変異を、ＳＰＦ条件下、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対して５回戻し交配した。
【０１１０】
ＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウスおよび野生型のマウスを、３日または１０日の期間、１週間あたり２回、対照のタンパク質Ｐ１．１７またはＴＷＥＡＫで処置した。マウスからの膵臓切片をＫｉ−６７に対して免疫染色した。図１１は、切片において計数した、Ｋｉ−６７陽性導管細胞（図１１Ａ）の数または導管隣接細胞の数（図１１Ｂ）の数を示す。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示す。アスタリスクは、ＴＷＥＡＫ処置試料と対照の試料との間でｐ値が０．０５未満であったことを示す。Ｋｉ−６７陽性導管細胞および導管隣接細胞のパーセンテージは、対照のタンパク質で処置したマウスよりも、ＴＷＥＡＫで処置したＷＴマウスからの膵臓切片において大きかったが、対照のタンパク質で処置したマウスに比べて、ＴＷＥＡＫで処置したＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウスにおけるＫｉ−６７陽性細胞の増加はなかった。このように、ＴＷＥＡＫ−Ｒは膵管上皮細胞に対するＴＷＥＡＫの増殖効果に必要とされる。
【０１１１】
さらに、ＴＷＥＡＫ処置後３日目のマウスからの、ＴＷＥＡＫ−Ｒ免疫染色した（図１１Ｄ）、またはイソ型の対照で免疫染色した（図１１Ｃ）膵臓切片上で明らかである通り、ＴＷＥＡＫ−Ｒは、ＴＷＥＡＫ処置マウスにおける膵管上皮において特異的に発現される（スケールバー＝１００μｍ）。
【０１１２】
（実施例５  ＴＷＥＡＫは培養したヒト膵管細胞の増大を誘導する）
組換えＴＷＥＡＫを、単離後の増殖の増大期中、精製したヒト導管細胞（膵臓がんの血清学的マーカーであるＣＡ１９−９に対して陽性）の培養物に加えた。ヒト導管細胞を、Yatohら、（Diabetes、５６巻、１８０２〜９頁（２００７年））によって記載されている通りに単離した。簡潔に述べると、ヒト膵臓組織を消化し、島をRicordi（E.Linetskyら、Diabetes、４６巻、１１２０〜２３頁（１９９７年））の標準的方法によって単離し、その後、残りの組織をコニカルチューブ中で静置した。次いで、上清を吸引して、死細胞を含む低密度の構成成分を除去し、残りの細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で分散させて、「粗製」または未精製の導管細胞と呼ばれる単一の細胞を得た。次いで、ヒト導管ツリーにわたって細胞上に存在する炭水化物マーカーであるＣＡ１９−９に特異的な抗体で免疫磁気的に分別することによって、この粗製細胞調製物からの導管細胞の精製を実現した。精製した導管細胞を非組織培養Ｔフラスコ中に入れ、そこで、培養開始時に加える組換えの可溶性ＴＷＥＡＫあり、またはなしの培地中で増大させた。ＴＷＥＡＫは先に記載されている通りに調製した（Jakubowskiら、J.Cell Science、１１５巻、２６７〜７４頁（２００２年））。３日目に細胞培地を、ＴＷＥＡＫあり、またはなしの新しい培地に交換し、１日目および４日目に細胞を写真撮影し、血球計算法によって計数し、さらなる試験用にｍＲＮＡを抽出した。図１２の代表的な写真において明らかなように、４個の膵臓からの組織において、ＴＷＥＡＫ（２０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ）に曝露した試料は、ＴＷＥＡＫに曝露しなかった同じ膵臓よりも堅調な細胞数を有していた。
【０１１３】
この発見は、精製されたヒトの導管の少なくともいくつかの集団はＴＷＥＡＫ反応性であり、免疫磁気的な分別後、おそらくＴＷＥＡＫ−Ｒによって媒介されることを示している（これは、臓器ドナーから膵臓を取り出して３６時間後まで）。免疫染色によって、またはＲＴ−ＰＣＲによって試験した通り、精製されたＣＡ１９−９陽性細胞の集団は選別後、インスリン陽性細胞を含まない。しかし、これらの細胞は、ＮＯＤｓｃｉｄマウスの腎臓被膜下に移植４週間後、１％のインスリン陽性細胞を有する小管（ductal tubule）になることができ（Yatohら、Diabetes、５６巻、１８０２〜１８０９頁（２００７年））、膵臓前駆細胞がこれらの細胞集団中に存在することを示している。
【０１１４】
（実施例６  Ｆｃ−ＴＷＥＡＫは膵臓前駆体マーカーの発現を誘導する）
図１３は、マウスの胚発生の間、膵臓前駆体の系統特異化を調節する、転写因子Ｎｇｎ３およびＰｄｘ１の動的発現を示す。Ｐｄｘ１は膵臓前駆細胞において低レベルで、島β細胞において高レベルで発現され、Ｎｇｎ３は内分泌前駆細胞において一過性に発現されるが出生後消失する。Ｆｃ−ＴＷＥＡＫで処置した成体マウスからの膵臓組織試料を、実施例３に記載した通りに得、Ｎｇｎ３、管上皮マーカーＣＫ、およびＤＮＡ（ＤＡＰＩ）に対して免疫組織学的に染色した。導管領域における慢性（図１４）または急性（図１５）いずれかのＦｃ−ＴＷＥＡＫ処置後４日目に、まばらなＮｇｎ３陽性細胞のクラスターが明らかであった（図１５ＡはＮｇｎ３染色を示し、図１５ＢはＣＫ染色を示し、図１５ＣはＮｇｎ３およびＣＫ共染色を示し、図１５ＤはＮｇｎ３およびＤＡＰＩ共染色を示す）。図１６は、単一の切片において観察されたＮｇｎ３陽性細胞数を、その切片において計数された細胞数の合計で除すことによって決定された、これらの試料におけるＮｇｎ３陽性細胞の頻度を示す。図１６における各点は、個々の動物からの膵臓切片の２つのランダムな完全なフットプリントの平均であり、水平バーは１群あたりマウス４匹の平均値を示す。図１７に示す通り、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫはまた、導管上皮細胞において低発現レベルのＰｄｘ１を誘導した。Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置による内分泌系統の特異化因子を発現する細胞の誘導は、ＴＷＥＡＫが膵臓前駆体の潜在性を有する細胞の頻度を増加させることを示すものである。
【０１１５】
（実施例７  １８日間の慢性Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置は部分的膵除去に対する反応を模倣する）
８週齢のマウスに部分的膵除去を施し、手術４日後に膵臓を取り出した。図１８は、ＴＷＥＡＫ−Ｒ（図１８ＡおよびＣ）またはＣＫ、インスリン、およびＤＮＡ（ＤＡＰＩ）（図１８ＢおよびＤ）染色した部分的膵除去後４日目のマウス８匹からの膵臓連続切片の代表的画像を示す。図１８ＡおよびＢは未熟な再生中心の代表的画像を示し、図１８ＣおよびＤは成熟した中心の代表的画像を示す。偽手術したマウスからの（図１８ＥおよびＦ）、ならびにＰｘ４日後のマウスからの（図１８ＧおよびＨ）膵臓の連続切片をＴ細胞マーカーＣＤ３（図１８ＥおよびＧ）ならびにマクロファージマーカーＦ４／８０（図１８ＦおよびＨ）で染色した。偽手術した膵臓においてＣＤ３およびＦ４／８０が低発現であるのに比べて、部分的膵除去後にＣＤ３陽性Ｔ細胞およびＦ４／８０陽性マクロファージが再生中心において特異的に誘導された。
【０１１６】
再生中心は、１週間に２回ＴＷＥＡＫ処置した後１８日目に、４／４の動物においてやはり同定された（図１９Ａ、低倍率の代表的なＨ＆Ｅ染色した膵臓切片は再生領域全体を示す）。再生中心は対照のマウスでは観察されなかった。ＴＷＥＡＫ処置したマウスの連続切片を、Ｋｉ−６７（図１９Ｂ）、ＣＫ（図１９Ｃ）、インスリン（図１９Ｄ）、グルカゴン（図１９Ｅ）に対して染色した。別のＦｃ−ＴＷＥＡＫ処置した膵臓からの連続切片を、Ｈ＆Ｅ（図１９Ｆ）、ＣＤ３（図１９Ｇ）、Ｆ４／８０（図１９Ｈ）で染色し、他の連続切片をＴＷＥＡＫ−Ｒ（図１９Ｊ）およびイソ型の対照（図１９Ｉ）で染色した。島を「ｉ」と標識した。スケールバー＝５０μｍ。したがって、１８日間の慢性ＴＷＥＡＫ処置によって誘導された再生の中心領域（focal area）は、間葉系細胞によって取り囲まれる高度に増殖性の小管、いくつかのホルモン発現性導管細胞および散在するホルモン発現細胞（インスリンまたはグルカゴン）、ならびに増加するＣＤ３およびＦ４／８０発現を含めて、部分的膵除去後に観察されるものを模倣する。
【０１１７】
（実施例８  ＴＷＥＡＫ−Ｒ／ＴＷＥＡＫ経路は部分的膵除去後の膵臓の再生に重要である）
膵除去後の膵臓の再生におけるＴＷＥＡＫ−Ｒ／ＴＷＥＡＫ経路の役割を調べるために、膵除去後４日目に野生型およびＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウスにおいて再生を調べた。図２０は、部分的膵除去４日後の野生型マウス（白バー）およびＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウス（黒バー）の、初期（「未熟」）、中間、および成熟段階の再生中心のパーセンテージを示す。再生中心の数および段階を、動物１匹あたり少なくとも２つの切片上で評価した。切片は少なくとも２００μｍ離れており、各群における動物は６匹であった。偽手術したマウスにおいて再生中心は同定されなかった（図２０におけるデータは平均値±ＳＥＭとして示し、アスタリスクは、ＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウスを野生型マウスと比べてｐ値が０．０５未満であることを示す）。未熟な段階の再生中心の数は、野生型マウスに比べてＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウスにおいて増加した。部分的膵除去４日後ＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウスおよび野生型マウスからのＣＫおよびＫｉ−６７に対して共染色した膵臓切片は、Ｋｉ−６７陽性導管上皮細胞の出現が、野生型マウス（図２１Ａ、スケールバー＝２００μｍ）に比べてＴＷＥＡＫ−Ｒ  ＫＯマウス（図２１Ｂ）において低減したことを示していた。
【０１１８】
（実施例９  ＴＷＥＡＫ処置は前駆細胞の潜在性を有する細胞に由来する、分化している膵臓細胞型および／または完全に分化した膵臓細胞型を生じさせることができることの決定）
Ｋｉ−６７および様々な細胞系統マーカーに対して二重染色した切片を用いて、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫで処置したマウスの膵臓組織内の特異的な細胞型の増殖を分析することで、増殖性の細胞型の正体が決定される。Ｋｉ−６７と膵臓前駆体マーカーが共発現されれば、ＴＷＥＡＫが前駆細胞の増大を誘導することを示す。しかし、Ｋｉ−６７は細胞周期の間にしか発現されないので、Ｋｉ−６７陽性細胞から分化する前駆細胞は前駆体マーカーを発現することがあり、Ｋｉ−６７はもはや発現しないだろう。したがって、実施例６に示すように、Ｆｃ−ＴＷＥＡＫ処置したマウスの膵臓組織において膵臓前駆体マーカーを発現する細胞の数が増加することは、ＴＷＥＡＫ処置により膵臓前駆体の潜在性を有する細胞の頻度が増加することを示している。
【０１１９】
さらに、ＴＷＥＡＫ誘導性細胞が分化する能力は、通常は様々な細胞型に特有なマーカーを共発現し、ある細胞型から別の細胞型への移行を示す「移行細胞」を同定することによって決定される。このようなマーカーの例には、それだけには限定されないが、共発現される導管および前駆細胞のマーカー、導管およびホルモンのマーカー、例えばインスリン、ならびに前駆体およびホルモンのマーカーが含まれる。ＴＷＥＡＫ誘導性細胞が分化する能力は、増殖している小管の新しく形成された中心領域（その中にホルモン陽性細胞またはホルモン陽性細胞のクラスター、例えばインスリン陽性細胞が散在する領域が見出される）の出現によって決定することもできる。ＴＷＥＡＫ誘導性細胞が島β細胞などの成熟した膵臓細胞型に分化する能力は、系統追跡試験によって決定することもできる。
【０１２０】
本分析において用いるための例示のマーカーには、例えば、膵臓のすべての細胞型の発生に必要とされ（Jonssonら、Nature、３７１巻、６０６〜６０９頁（１９９４年）；Offieldら、Development、１２２巻、９８３〜９８５頁（１９９６年））、正常の成体動物において島および複製している導管において発現している（Sharmaら、Diabetes、４８巻、５０７〜５１３頁（１９９９年））初期前腸および膵臓前駆体のマーカーであるＰｄｘ−１；ネスチン（Seabergら、NatBiotechnol、２２巻、１１１５〜１１２４頁（２００４年））；ｃ−ｍｅｔ（Suzukiら、Diabetes、５３巻、２１４３〜２１５２頁（２００４年））；Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、ならびにノッチ成分（Jensenら、Gastroenterology、１２８巻、７２８〜７４１頁（２００５年））；房心細胞およびいくつかの導管細胞によって正常成体膵臓中に発現される初期膵臓前駆細胞のマーカーであるＨｅｓ−１（Stangerら、CancerCell、８巻、１８５〜１９５頁（２００５年））；内分泌性ホルモンを発現しない膵臓前駆細胞中のみに検出される一過性に発現される転写因子であるＮｇｎ３（Gradwohlら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A、９７巻、１６０７〜１６１１頁（２０００年））等の前駆体マーカーが含まれる。
【０１２１】
他の適切なマーカーには、（１）導管マーカー、例えば、総胆管／膵管から房心細胞まで導管ツリー全体およびいくつかの胚性膵臓前駆細胞を示すＤｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓのアグルチニン（ＤＢＡ）レクチン；サイトケラチンＣＫ−１９およびＣＫ−２０；炭酸脱水素酵素ＩＩ；およびムチン１など；（２）腺房マーカー、例えば、アミラーゼなど；（３）内分泌細胞マーカー、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓のポリペプチドなど；（４）卵形細胞マーカー、例えば、アルファフェトプロテイン、サイトケラチン１９、アルブミン、およびｃ−キットなど；ならびに（５）非膵臓の細胞マーカー、例えば、ＣＤ４５（造血細胞）およびアルファ−ＳＭＡ（間質細胞）などが含まれる。
【０１２２】
本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の説明を提供するものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。当業者であれば、本発明によって他の多くの実施形態が包含されることを容易に認める。本開示に引用される出版物および特許はすべて、その全文が参照によって援用される。参照によって援用される材料が本明細書に矛盾するか、または相反する範囲では、本明細書はあらゆるそのような材料に取って代わる。いかなる参照が本明細書に引用されていても、このような参照が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【０１２３】
別段の指摘がなければ、特許請求の範囲を含めて本明細書において用いられる、成分、反応条件などの量を表す数はすべて、あらゆる場合において「約」という用語によって修飾されるものと理解されたい。したがって、別段の反対の指摘がなければ、数のパラメータは概算であり、本発明によって得ようとする所望の性質に応じて変化してよい。控えめに言っても、また特許請求の範囲に等価である理論の適用を制限しようとするものではないが、数のパラメータは各々、有効数字および通常の丸め方を考慮に入れて解釈されるべきである。
【０１２４】
別段の指摘がなければ、一連のエレメントに先行する「少なくとも」という用語は、一続きのあらゆるエレメントを意味すると理解されたい。当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を、日常の実験のみを用いて認識し、または確認することができよう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとされる。
【図２】
2012516712.tif 000002
【図４Ａ】
2012516712.tif 000003
【図４Ｂ】
2012516712.tif 000004
【図４Ｃ】
2012516712.tif 000005
【図４Ｄ】
2012516712.tif 000006
【図１０】
2012516712.tif 000007
【図１２】
2012516712.tif 000008
【図１４】
2012516712.tif 000009
【図１５Ａ】
2012516712.tif 000010
【図１５Ｂ】
2012516712.tif 000011
【図１５Ｃ】
2012516712.tif 000012
【図１５Ｄ】
2012516712.tif 000013
【図１７】
2012516712.tif 000014
【図１８】
2012516712.tif 000015
【図２１】
2012516712.tif 000016
【図１】
2012516712.tif 000017
【図３】
2012516712.tif 000018
【図５】
2012516712.tif 000019
【図６】
2012516712.tif 000020
【図７】
2012516712.tif 000021
【図８】
2012516712.tif 000022
【図９】
2012516712.tif 000023
【図１１】
2012516712.tif 000024
【図１３】
2012516712.tif 000025
【図１６】
2012516712.tif 000026
【図１９】
2012516712.tif 000027
【図２０】
2012516712.tif 000028
【配列表】
2012516712000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月27日(2011.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
さらなる例示の実施形態において、ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストはアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体である。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体はキメラ抗体である。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
被験体において膵臓組織の再生を誘導する方法であって、膵臓組織の再生を誘導するのに十分な治療有効量のＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）アゴニストを、膵臓組織の再生の誘導を必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２）
膵臓組織が膵臓島組織である、項目１に記載の方法。
（項目３）
膵臓島組織が島ベータ細胞を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記被験体が膵臓組織を喪失している、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記被験体が糖尿病を有し、上記方法がインスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するのに有効な量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを上記被験体に投与する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
糖尿病が１型糖尿病である、項目５に記載の方法。
（項目７）
糖尿病が２型糖尿病である、項目５に記載の方法。
（項目８）
上記被験体が膵臓組織の除去を受けている、項目４に記載の方法。
（項目９）
上記被験体ががんを有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記がんが膵臓がんである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記被験体が膵臓において細胞または組織の移植片を受容しており、上記移植片が膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含んでいる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記移植片が、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記膵臓前駆細胞が、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記膵臓前駆細胞が膵管上皮細胞または導管隣接細胞である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記移植片が本質的に膵管上皮細胞のみからなる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記前駆細胞が、膵臓細胞に分化することができる、胚性幹細胞、成体幹細胞、全能性幹細胞、または多能性幹細胞である、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与する前に、上記移植片を投与する工程を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１８）
上記移植片および上記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが同時に投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
被験体において糖尿病を処置する方法であって、ｉ）膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む、細胞または組織の移植片、およびｉｉ）膵臓組織の再生を誘導するのに十分な治療有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニスト、を糖尿病を有する被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２０）
部分的膵除去術を受けている被験体において膵臓組織を再生する方法であって、上記被験体において膵臓前駆細胞の再生を誘導するのに有効な量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを上記被験体に投与する工程を含み、上記前駆細胞は上記被験体中に存在するか、または上記被験体に移植される、方法。
（項目２１）
上記被験体に抗炎症薬または免疫調節薬を共投与する工程をさらに含む、項目１、１９、または２０に記載の方法。
（項目２２）
上記被験体が炎症状態を有していない、項目１、１９、または２０に記載の方法。
（項目２３）
上記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、膵臓または膵臓領域の中または近傍に投与される、項目１、１９、または２０に記載の方法。
（項目２４）
上記被験体が哺乳動物である、項目１、１９、または２０に記載の方法。
（項目２５）
上記被験体がヒトである、項目１、１９、または２０に記載の方法。
（項目２６）
膵臓細胞の集団を増大させる方法であって、少なくとも１つの膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含む膵臓細胞の集団をＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストと接触させて膵臓細胞の増大した集団を得る工程を含む、方法。
（項目２７）
上記膵臓細胞の集団が本質的に膵臓前駆細胞からなる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記膵臓前駆細胞が、膵管上皮細胞および／または導管隣接細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記膵臓前駆細胞が、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記膵臓細胞の集団が本質的に膵管上皮細胞のみからなる、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
上記膵臓細胞の増大した集団がインスリン陽性細胞の増大した集団を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
上記膵臓細胞の増大した集団が、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞の増大した集団を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
上記膵臓細胞の集団がインビトロである、項目２６に記載の方法。
（項目３４）
上記膵臓細胞の集団は被験体から得られた、項目２６に記載の方法。
（項目３５）
被験体から得られた膵臓細胞を上記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストと接触させる工程がインビトロで起こる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記膵臓細胞の集団が、膵臓細胞に分化する本質的に非膵臓細胞の集団から得られる、項目２６に記載の方法。
（項目３７）
上記本質的に非膵臓細胞の集団が、全能性幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、および成体幹細胞の１つまたは複数を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
糖尿病を処置する方法であって、
ａ）糖尿病を有する被験体から単離された膵臓前駆細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、または胚性幹細胞である前駆細胞をインビトロで培養する工程と、
ｂ）上記培養された前駆細胞の増殖を有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで誘導して上記前駆細胞の増大した集団を産生する工程と、
ｃ）上記前駆細胞の増大した集団を、上記糖尿病を有する被験体の膵臓中に移植する工程と
を含み、インスリン生成性膵臓細胞は、上記被験体において、上記移植された前駆細胞から再生される、方法。
（項目３９）
上記被験体が哺乳動物である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記被験体がヒトである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、項目１から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリペプチドである、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ＴＷＥＡＫが、配列番号１のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸４６から２４９を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸１０４から２４９を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
ＴＷＥＡＫが、配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫ類似体である、項目４１に記載の方法。
（項目４９）
上記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
上記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
上記ＴＷＥＡＫ類似体がＴＷＥＡＫ融合タンパク質である、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
上記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１のポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体である、項目４１に記載の方法。
（項目５４）
上記アゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
上記アゴニスト抗体がヒト化抗体である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
上記アゴニスト抗体がキメラ抗体である、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
膵臓組織の再生を必要とする被験体において膵臓組織の再生を誘導するための、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを含む薬学的組成物。
（項目５８）
膵臓組織が膵臓島組織である、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目５９）
膵臓島組織が島ベータ細胞を含む、項目５８に記載の薬学的組成物。
（項目６０）
上記被験体が膵臓組織を喪失している、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目６１）
糖尿病に罹患している被験体においてインスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するための、項目６０に記載の薬学的組成物。
（項目６２）
糖尿病が１型糖尿病である、項目６１に記載の薬学的組成物。
（項目６３）
糖尿病が２型糖尿病である、項目６１に記載の薬学的組成物。
（項目６４）
膵臓組織の除去を受けている被験体を処置するための、項目６０に記載の薬学的組成物。
（項目６５）
上記被験体ががんを有する、項目６４に記載の薬学的組成物。
（項目６６）
上記がんが膵臓がんである、項目６５に記載の薬学的組成物。
（項目６７）
上記被験体が、膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片を受容している、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目６８）
上記移植片が、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる、項目６７に記載の薬学的組成物。
（項目６９）
上記膵臓前駆細胞が、ＣＫ−、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である、項目６８に記載の薬学的組成物。
（項目７０）
上記膵臓前駆細胞が、膵管上皮細胞または導管隣接細胞である、項目６９に記載の薬学的組成物。
（項目７１）
上記移植片が本質的に膵管上皮細胞のみからなる、項目７０に記載の薬学的組成物。
（項目７２）
上記前駆細胞が、膵臓細胞に分化することができる、胚性幹細胞、成体幹細胞、全能性幹細胞、または多能性幹細胞である、項目６７に記載の薬学的組成物。
（項目７３）
上記移植片を投与した後に上記被験体に投与される、項目６７に記載の薬学的組成物。
（項目７４）
上記移植片を投与するのと同時に上記被験体に投与される、項目６７に記載の薬学的組成物。
（項目７５）
被験体において糖尿病を処置するためのＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを含む薬学的組成物であって、上記薬学的組成物は糖尿病を有する被験体に投与され、上記被験体は膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片も投与される、薬学的組成物。
（項目７６）
部分的膵除去術を受けている被験体において膵臓組織を再生するためのＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを含む薬学的組成物であって、上記薬学的組成物は膵臓前駆細胞の再生を誘導するために上記被験体に投与され、ここで、上記前駆細胞は上記被験体中に存在するか、または上記被験体に移植される、薬学的組成物。
（項目７７）
上記被験体に抗炎症薬または免疫調節薬と共投与される、項目５７または７６に記載の薬学的組成物。
（項目７８）
上記被験体が炎症状態を有していない、項目５７または７６に記載の薬学的組成物。
（項目７９）
膵臓または膵臓領域の中または近傍に投与するための、項目５７または７６に記載の薬学的組成物。
（項目８０）
上記被験体が哺乳動物である、項目５７または７６に記載の薬学的組成物。
（項目８１）
上記被験体がヒトである、項目５７または７６に記載の薬学的組成物。
（項目８２）
上記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、項目５７から８１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目８３）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫである、項目８２に記載の薬学的組成物。
（項目８４）
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリペプチドである、項目８３に記載の薬学的組成物。
（項目８５）
ＴＷＥＡＫが配列番号１の配列の部分を含むポリペプチドであり、上記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有する、項目８３に記載の薬学的組成物。
（項目８６）
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸４６から２４９を含む、項目８５に記載の薬学的組成物。
（項目８７）
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸１０４から２４９を含む、項目８５に記載の薬学的組成物。
（項目８８）
ＴＷＥＡＫが、配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、項目８３に記載の薬学的組成物。
（項目８９）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫ類似体である、項目８２に記載の薬学的組成物。
（項目９０）
上記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、項目８９に記載の薬学的組成物。
（項目９１）
上記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、項目８９に記載の薬学的組成物。
（項目９２）
上記ＴＷＥＡＫ類似体がＴＷＥＡＫ融合タンパク質である、項目８９に記載の薬学的組成物。
（項目９３）
上記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１のポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、項目９２に記載の薬学的組成物。
（項目９４）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体である、項目８２に記載の薬学的組成物。
（項目９５）
上記アゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、項目９４に記載の薬学的組成物。
（項目９６）
上記アゴニスト抗体がヒト化抗体である、項目９４に記載の薬学的組成物。
（項目９７）
上記アゴニスト抗体がキメラ抗体である、項目９４に記載の薬学的組成物。
（項目９８）
被験体において膵臓組織の再生を誘導するための医薬の処方におけるＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの使用。
（項目９９）
膵臓組織が膵臓島組織である、項目９８に記載の使用。
（項目１００）
膵臓島組織が島ベータ細胞を含む、項目９９に記載の使用。
（項目１０１）
上記被験体が膵臓組織を喪失している、項目９８に記載の使用。
（項目１０２）
上記被験体が糖尿病を有し、上記医薬がインスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するためのものである、項目１０１に記載の使用。
（項目１０３）
糖尿病が１型糖尿病である、項目１０２に記載の使用。
（項目１０４）
糖尿病が２型糖尿病である、項目１０２に記載の使用。
（項目１０５）
上記被験体が膵臓組織の除去を受けている、項目１０１に記載の使用。
（項目１０６）
上記被験体ががんを有する、項目１０５に記載の使用。
（項目１０７）
上記がんが膵臓がんである、項目１０６に記載の使用。
（項目１０８）
上記被験体が膵臓において細胞または組織の移植片を受容しており、上記移植片が膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含んでいる、項目９８に記載の使用。
（項目１０９）
上記移植片が、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる、項目１０８に記載の使用。
（項目１１０）
上記膵臓前駆細胞が、Ｋｉ−６７−、Ｐｄｘ１−、および／またはＮｇｎ３−陽性細胞である、項目１０９に記載の使用。
（項目１１１）
上記膵臓前駆細胞が膵管上皮細胞または導管隣接細胞である、項目１１０に記載の使用。
（項目１１２）
上記移植片が本質的に膵管上皮細胞のみからなる、項目１１１に記載の使用。
（項目１１３）
上記前駆細胞が、膵臓細胞に分化することができる、胚性幹細胞、成体幹細胞、全能性幹細胞、または多能性幹細胞である、項目１０８に記載の使用。
（項目１１４）
上記医薬を、上記移植片を投与した後に上記被験体に投与する、項目１０８に記載の使用。
（項目１１５）
上記医薬および上記移植片が同時に投与される、項目１０８に記載の使用。
（項目１１６）
被験体において糖尿病を処置するための医薬の処方におけるＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの使用であって、上記医薬は糖尿病を有する被験体に投与され、上記被験体は膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片も投与される、使用。
（項目１１７）
部分的膵除去術を受けている被験体において膵臓組織を再生するための医薬の処方におけるＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの使用であって、上記医薬は、膵臓前駆細胞の再生を誘導するために上記被験体に投与され、ここで、上記前駆細胞は上記被験体中に存在するか、または上記被験体に移植される、使用。
（項目１１８）
上記医薬は、上記被験体に抗炎症薬と共投与される、項目９８または１１７に記載の使用。
（項目１１９）
上記被験体が炎症状態を有していない、項目９８または１１７に記載の使用。
（項目１２０）
上記医薬は、膵臓または膵臓領域の中または近傍に投与するためのものである、項目９８または１１７に記載の使用。
（項目１２１）
上記被験体が哺乳動物である、項目９８または１１７に記載の使用。
（項目１２２）
上記被験体がヒトである、項目９８または１１７に記載の使用。
（項目１２３）
糖尿病を処置するためのＴＷＥＡＫアゴニストの使用であって、上記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを、培養された前駆細胞または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞の増殖を誘導するのに用いて前駆細胞の増大した集団を産生し、上記前駆細胞は、糖尿病を有する被験体から単離された膵臓前駆細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、または胚性幹細胞であり、上記前駆細胞の増大した集団は、上記糖尿病を有する被験体の膵臓に移植され、インスリン生成性膵臓細胞が上記移植された前駆細胞から上記被験体において再生される、使用。
（項目１２４）
上記被験体が哺乳動物である、項目１２３に記載の使用。
（項目１２５）
上記被験体がヒトである、項目１２４に記載の使用。
（項目１２６）
上記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、項目９８から１２５のいずれか一項に記載の使用。
（項目１２７）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫである、項目１２６に記載の使用。
（項目１２８）
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２の配列を有するポリペプチドである、項目１２７に記載の使用。
（項目１２９）
ＴＷＥＡＫが配列番号１の配列の部分を含むポリペプチドであり、上記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有する、項目１２７に記載の使用。
（項目１３０）
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸４６から２４９を含む、項目１２９に記載の使用。
（項目１３１）
ＴＷＥＡＫが配列番号１のアミノ酸１０４から２４９を含む、項目１２９に記載の使用。
（項目１３２）
ＴＷＥＡＫが配列番号２の配列の部分を含むポリペプチドであり、上記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有する、項目１２７に記載の使用。
（項目１３３）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがＴＷＥＡＫ類似体である、項目１２６に記載の使用。
（項目１３４）
上記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、項目１３３に記載の使用。
（項目１３５）
上記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、項目１３３に記載の使用。
（項目１３６）
上記ＴＷＥＡＫ類似体がＴＷＥＡＫ融合タンパク質である、項目１３３に記載の使用。
（項目１３７）
上記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１のポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、項目１３６に記載の使用。
（項目１３８）
上記ＴＷＥＡＫ−ＲアゴニストがアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体である、項目１２６に記載の使用。
（項目１３９）
上記アゴニスト抗体がモノクローナル抗体である、項目１３８に記載の使用。
（項目１４０）
上記アゴニスト抗体がヒト化抗体である、項目１３８に記載の使用。
（項目１４１）
上記アゴニスト抗体がキメラ抗体である、項目１３８に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において膵臓組織の再生を誘導するための医薬の調製におけるＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）アゴニストの使用。
【請求項２】
膵臓組織が、膵臓島組織および島ベータ細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記被験体が１型糖尿病または２型糖尿病を有し、前記医薬がインスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するためのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記被験体が、シンドロームＸ（メタボリックシンドローム）、インスリン抵抗性、腎症、ケトアシドーシス、高浸透圧性高血糖性非ケトン性症候群、胃不全麻痺、および糖尿病性腎疾患からなる群より選択される糖尿病関連の病状を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記被験体が膵臓組織の除去を受けている、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記被験体が膵臓がんを有する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記被験体が膵臓において細胞または組織の移植片を受容しており、前記移植片が、膵臓細胞に分化することができる前駆細胞、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記被験体が、部分的膵除去術を受けている、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
被験体において糖尿病を処置するための医薬の調製におけるＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストの使用であって、前記処置は、前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを投与すること、および膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片を投与することを含む、使用。
【請求項１０】
前記処置が、ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストおよび抗炎症薬または免疫調節薬の投与を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
糖尿病を処置するための医薬を調製するための方法であって、前記方法は：
ａ）糖尿病を有する被験体から単離されるか、全能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、または胚性幹細胞である膵臓前駆細胞をインビトロで培養するステップと、
ｂ）有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで前記培養した前駆細胞の増殖を誘導して、前記前駆細胞の増大した集団を産生するステップとを含み、
前記医薬は、前記前駆細胞の増大した集団が、糖尿病を有する前記被験体の膵臓中に移植され、インスリン生成性膵臓細胞が、前記被験体において前記移植された前駆細胞から再生されることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ融合タンパク質、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１または配列番号２に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１または配列番号２に少なくとも８０％同一であるポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ融合タンパク質、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１または配列番号２に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１または配列番号２に少なくとも８０％同一であるポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）アゴニストを含む、被験体において膵臓組織の再生を誘導するための組成物。
【請求項２１】
膵臓組織が、膵臓島組織および島ベータ細胞からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記被験体が１型糖尿病または２型糖尿病を有し、前記組成物がインスリン分泌性膵臓組織の再生を誘導するためのものである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記被験体が、シンドロームＸ（メタボリックシンドローム）、インスリン抵抗性、腎症、ケトアシドーシス、高浸透圧性高血糖性非ケトン性症候群、胃不全麻痺、および糖尿病性腎疾患からなる群より選択される糖尿病関連の病状を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記被験体が膵臓組織の除去を受けている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記被験体が膵臓がんを有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記被験体が膵臓において細胞または組織の移植片を受容しており、前記移植片が、膵臓細胞に分化することができる前駆細胞、膵臓前駆細胞、または膵臓前駆細胞に脱分化することができる細胞を含んでいる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記被験体が、部分的膵除去術を受けている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを含む、被験体において糖尿病を処置するための組成物であって、前記組成物は、膵臓細胞に分化することができる前駆細胞を含む細胞または組織の移植片とともに投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２９】
ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストを含み、かつ抗炎症薬または免疫調節薬とともに投与されることを特徴とする、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
糖尿病を処置するための組成物であって、前記組成物は前駆細胞の増大した集団を含み、前記前駆細胞の増大した集団は、以下：
ａ）糖尿病を有する被験体から単離されるか、全能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、または胚性幹細胞である膵臓前駆細胞をインビトロで培養することと、
ｂ）有効量のＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストで前記培養した前駆細胞の増殖を誘導して、前記前駆細胞の増大した集団を産生することと
を含むステップによって調製され、
ここで、前記組成物は、糖尿病を有する前記被験体の膵臓中に移植され、インスリン生成性膵臓細胞が、前記被験体において前記移植された前駆細胞から再生されることを特徴とする、組成物。
【請求項３１】
前記ＴＷＥＡＫ−Ｒアゴニストが、ＴＷＥＡＫ、ＴＷＥＡＫ融合タンパク質、ＴＷＥＡＫ類似体、ＴＷＥＡＫ模倣物、およびアゴニストＴＷＥＡＫ−Ｒ抗体からなる群より選択される、請求項２０〜２８および３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
ＴＷＥＡＫが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸４６と１０４との間の任意の位置にアミノ末端を有し、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２４９にカルボキシ末端を有するポリペプチドである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ＴＷＥＡＫ類似体が、配列番号１または配列番号２に少なくとも８０％同一であるポリペプチドである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ＴＷＥＡＫ融合タンパク質が、配列番号１または配列番号２に少なくとも８０％同一であるポリペプチドおよび免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項３１に記載の組成物。
【国際調査報告】
2012516712.tif 000036
2012516712.tif 000037