(57)【要約】  本発明は、単一の組換えイベントによって組換えポックスウイルスの産生を許容する修飾されたポックスウイルスベクターを対象とする。相同組換えのため二つのフランキング配列の間に配置された少なくとも一つのレポーター遺伝子を備える修飾ポックスウイルスベクターが開示される。さらに、前記ベクターを備える宿主細胞、及び前記ベクターを用いた組換えポックスウイルスの産生のための方法が提供される。
2012513208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対を成すフランキング配列の間に配置され相同組換えを許容するレポーター遺伝子を備えることを特徴とする修飾ポックスウイルスベクター。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子が蛍光蛋白質をコードするものであることを特徴とする請求項１に記載の修飾ポックスウイルスベクター。
【請求項３】
対を成すフランキング配列の間に配置された少なくとも一つの選択性要素をさらに具備することを特徴とする請求項１に記載の修飾ポックスウイルスベクター。
【請求項４】
前記選択性要素が、宿主細胞においてポックスウイルスの複製を抑制又は低速化する、又は宿主細胞に対して細胞障害性である選択性遺伝子を含んでなることを特徴とする請求項３に記載の修飾ポックスウイルスベクター。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子と選択性要素とが、相同性組換えを許容する一つの対を成すフランキング配列の間に配置されていることを特徴とする請求項３に記載の修飾ポックスウイルスベクター。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子と選択性要素とが、相同性組換えを許容する一以上の対を成すフランキング配列の間に配置されていることを特徴とする請求項３に記載の修飾ポックスウイルスベクター。
【請求項７】
前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルス又は修飾されたワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）ウイルスであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の修飾ポックスウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の前記修飾ポックスウイルスベクターを具備していることを特徴とする細胞。
【請求項９】
組換えポックスウイルスを産生するための請求項１乃至７のいずれかに記載の修飾ポックスウイルスベクター又は請求項８に記載の細胞の使用。
【請求項１０】
請求項１乃至７のいずれかに記載の前記修飾ポックスウイルスベクターで許容宿主細胞を感染させる第１段階と、
前記ベクターと前記プラスミドとの間で相同組換えを許容する条件下、組換えポックスウイルスが産生されることによって興味対象の遺伝子を有して成るプラスミドで前記感染された許容宿主細胞に形質移入する第２段階と、を備えることを特徴とする興味対象の遺伝子の発現を可能とする組換えポックスウイルスの産生方法。
【請求項１１】
前記選択性要素の存在に対して選択することによって、組換えポックスウイルスの産生を増強する段階をさらに備えることを特徴とする請求項１０に記載の組換えポックスウイルスの産生方法。
【請求項１２】
前記興味対象の遺伝子を有する前記ベクターで相同組換えが起きていない前記修飾ポックスウイルスベクターを具備する許容宿主細胞から、組換えポックスウイルスを具備する許容宿主細胞を分離する段階をさらに備えることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の組換えポックスウイルスの産生方法。
【請求項１３】
以前に感染されていない許容宿主細胞で前記組換えウイルスを具備する少なくとも一代さらに継代された許容宿主細胞を用いる段階をさらに備えることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれかに記載の組換えポックスウイルスの産生方法。
【請求項１４】
前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルス又は修飾されたワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）ウイルスであることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれかに記載の組換えポックスウイルスの産生方法。
【請求項１５】
請求項１０乃至１４のいずれかに記載の組換えポックスウイルスの産生方法によって産生された組換えポックスウイルスを具備することを特徴とする細胞。
【請求項１６】
組換えポックスウイルスを産生するための請求項１０乃至１４のいずれかに記載の組換えポックスウイルスの産生方法又は請求項１５に記載の細胞の使用。
【請求項１７】
請求項１０乃至１４のいずれかに記載の組換えポックスウイルスの産生方法又は請求項１５に記載の細胞を用いて産生されたことを特徴とする組換えポックスウイルス。
【請求項１８】
薬物としての請求項１乃至７のいずれかに記載の修飾ポックスウイルス、又は請求項８に記載の細胞又は請求項１７に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１９】
癌、インフルエンザ、肝炎、後天性免疫不全症候群、流行性耳下腺炎、狂犬病、脳炎、胃又は十二指腸潰瘍、マラリア、睡眠病、ライム病、反応性関節炎、肺炎、ハンセン病、ジフテリア、カンジダ症、及び／又はトキソプラズマ症の処置又は予防のための治療用又は予防用ワクチンとしての請求項１乃至７のいずれかに記載の修飾ポックスウイルス、又は請求項８に記載の細胞又は請求項１７に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２０】
断片が夫々の核酸の少なくとも４０％の長さを有して少なくとも４０％の配列相同性を有している配列番号１５乃至２３の配列群から選ばれた核酸又はその相補体、又は断片又は相同的な核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾ポックスウイルスベクターにおける単一の組換えイベント（事象、ｅｖｅｎｔ）による組換えポックスウイルスのクローニングための単一組換え系に関する。さらには、修飾ポックスウイルスベクター、その用途及び組換えポックスウイルスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、組換えポックスウイルスに基づく技術の開発や改善について多大な努力が注がれている。ポックスウイルスに基くベクターは、新しいワクチン療法の開発においてワクチンを介して免疫応答を生じさせたり、遺伝子治療への適用などのような多くの用途に有益であることが確認されている。組換えポックスウイルスベクターに関する利点は周知であり、多くの種類の細胞型への遺伝物質の効率的な送達；寛大な蛋白質発現量；及び抗体を基礎とする応答に加えて細胞媒介免疫応答を誘発する能力を含む。
【０００３】
ポックスウイルスは周知の細胞質ウイルスであり、従って、そのようなウイルスベクターにより輸送された如何なる遺伝物質も、宿主細胞ゲノムへの偶発的な組込みの不利無しで正常に細胞質に留まっている。ポックスウイルスは、例えば、相同組換えのようなクローニング技術を用いて、それらのゲノムに挿入された外来遺伝子を含有及び発現するように容易に遺伝子改変することが可能である。これらの外来遺伝子は、一以上の感染病原体からの保護作用を誘導する抗原、共刺激性分子群（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）のような免疫性を調節する蛋白質又は酵素蛋白質のような広範な蛋白質をコード化できる。組換えポックスウイルスは、例えば、ヘルペスウイルス、インフルエンザ、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の免疫抗原を発現するように設計されている。
【０００４】
ベクターとしてのポックスウイルスの主要な利点の一つは、例えば同義遺伝子（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｓ、すなわち、多価ベクターとしての）を含む大量の異種遺伝物質の挿入を許容する大きなゲノムサイズである。しかし、異種遺伝物質は、組換えウイルスが生存可能のままであるようにポックスゲノム内の適切な部位（ｓｉｔｅ）に挿入されなければならない。従って、遺伝物質は、非必須（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ）であるウイルスＤＮＡの部位に挿入されなければならない。
【０００５】
組換えポックスウイルスのクローニングのために確立されているアプローチは、二つの別個の組換えイベントに基づく。第１の組換えステップの間に、興味対象の遺伝子及びレポーター及び／又はマーカーカセットがウイルスゲノムに組み込まれる。選択プロセスのため、抗生物質耐性遺伝子が一般的に用いられる。組換えポックスウイルスが、例えば、ヒトのワクチンとしての使用が対象とされているならば、選択／マーカーカセットを用いる組換え及び非組換えポックスウイルスのプールからの組換えポックスウイルスの分離に引き続き、選択及びマーカーカセットが除去されるべきである。この目的のため、組換えポックスウイルスのさらなる継代及びプラーク精製を含む第２の組換えイベントが実行されなければならない。その結果、特に他のタイプの組換え発現ベクターのクローニングのために一般的に用いられているそれらの手順と比べると、組換えポックスウイルスのクローニングための現在知られている技術は、通常、時間がかかり、骨の折れる試みである。
【０００６】
以上のように、組換えポックスウイルスの効率的な産生のための改善されたクローニング系及び方法のための技術が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、単一の組換えイベントによる組換えポックスウイルスの産生を許容する修飾ポックスウイルスベクターに基づいている。本発明の修飾ウイルスベクターは、興味対象の遺伝子を挿入して組換えが成功裏に起こるときに除去されるレポーター遺伝子を含み構成されている。
【０００８】
第１の局面において、本発明は、相同組換えのため二つのフランキング配列の間に配置された少なくとも一つのレポーター遺伝子を備える修飾されたポックスウイルスベクターを対象とする。一つの形態において、修飾ポックスウイルスベクターは、許容宿主細胞における相同組換えのため、二つのフランキング領域の間に配置された少なくとも一つの選択性要素（選択性コンポーネント、ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）をさらに有する。別の形態において、選択性要素は、宿主細胞内でポックスウイルスの複製を抑制するか又は低速化するか、又は宿主細胞に対して細胞障害性である選択性遺伝子から構成される。別の形態において、レポーター遺伝子及び選択性要素は、相同組換えを許容するように、対を成すフランキング配列の間に配置されている。また別の形態において、レポーター遺伝子及び選択性要素は、相同組換えを許容するように、一以上の対を成すフランキング配列の間に配置されている。さらに別の形態において、選択性要素は、発現が誘導性である選択性遺伝子から構成される。特異的な形態において、レポーター遺伝子は、蛍光性蛋白質、例えば、緑色蛍光性蛋白質をコードする。さらに特異的な形態において、選択性要素は、デオキリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、又はプロテアーゼをコードする遺伝子から選ばれた選択性遺伝子から成る。さらに特異的な形態において、選択性遺伝子の発現は、制御配列、好ましくはプロモーターの制御下にある。別の特異的な形態において、選択性遺伝子は、誘導性発現系、例えば、テトラサイクリンオペレーター／リプレッサー（ＴｅｔＯ２／ＴｅｔＲ）系により調節される。
【０００９】
別の局面において、本発明は、本発明の修飾ポックスウイルスベクターを用いて産生された組換えポックスウイルスを対象とする。
【００１０】
別の局面において、本発明は、本発明の修飾ポックスウイルスベクターから構成される宿主細胞を対象とする。さらなる局面において、本発明は、本発明の修飾ポックスウイルスベクターを用いて産生された組換えポックスウイルスから構成される宿主細胞を対象とする。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、組換えポックスウイルスを産生する修飾ポックスウイルスベクターを用いる方法を提供する。別の局面において、本発明は、本発明による修飾ポックスウイルスベクターで許容宿主細胞を感染させて成る組換えポックスウイルスを産生するための方法、及び、ベクターとプラスミドとの間の相同組換えを許容する条件下、異種の興味対象の遺伝物質から構成されるプラスミドでの宿主細胞の引き続く形質移入（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を対象とする。一つの形態において、前記方法は、選択性遺伝子の発現を誘導することで成る。さらなる形態において、前記方法は、非組換えポックスウイルスで構成される宿主細胞から、組換えポックスウイルスで構成される宿主細胞を分離することを含んで成る。さらなる形態において、前記方法は、以前には感染されていなかった許容宿主細胞において少なくともさらに一代の継代のために組換えポックスウイルスで構成される許容宿主細胞を用いることを含んで成る。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、組換えポックスウイルスの産生のための本発明による修飾ポックスウイルスベクターの利用を対象とする。
【００１３】
特定の形態において、本発明による修飾ポックスウイルスベクターは、ワクシニアウイルスである。さらなる特定の形態において、本発明による修飾ポックスウイルスベクターは、修飾されたワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ  ｖｉｒｕｓ）である。さらなる局面において、本発明は、本発明による修飾ポックスウイルス、本発明による組換えポックスウイルス、及び、薬物としての修飾又は組換えポックスウイルスで成る本発明による細胞を対象とする。特異的な形態において、本発明は、癌、インフルエンザ、肝炎、後天性免疫不全症候群、流行性耳下腺炎、狂犬病、脳炎、胃又は十二指腸潰瘍、マラリア、睡眠病、ライム病、反応性関節炎、肺炎、ハンセン病、ジフテリア、カンジダ症、及び／又はトキソプラズマ症の処置又は予防のための治療用又は予防用ワクチンとしての、本発明による修飾ポックスウイルス、本発明による組換えポックスウイルス、及び修飾又は組換えポックスウイルスで成る細胞を対象とする。特異的な形態において、前記薬物は、治療用又は予防用ワクチンである。別の特異的な形態において、前記薬物は、癌の処置のための治療用又は予防用ワクチンである。本発明の他の形態は、詳細な説明、実施例、及び付け加えた請求の範囲によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明による好適な修飾ポックスウイルスベクターのレポーター／選択カセットを示す。前記ベクターは、レポーター／選択カセット（ｒｅｐｏｒｔｅｒ／ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）が挿入部位（Ｄｌｅｔｉｏｎ  ＩＩＩ）に導入されたＭＶＡゲノム（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  アクセッション＃Ｕ９４８４８；  Ａｎｔｏｉｎｅ、  Ｇ．Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ、  Ｆ．Ｄｏｒｎｅｒ、  Ｆ．ａｎｄ  Ｆａｌｋｎｅｒ、  Ｆ．Ｇ．「修飾されたワクシニアウイルスアンカラ株の完全ゲノム配列：他のオルソポックスウイルス属との比較（Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ  ｓｔｒａｉｎ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４４  （２）、３６５−３９６  （１９９８））に基づく。Ｆｌａｎｋ１  Ｄｅｌ３＝ＭＶＡゲノムのＤｌｅｔｉｏｎ  ＩＩＩ部位の上流のフランキング配列；Ｐｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ＝強力合成プロモーター；ＴｅｔＯ２＝テトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＲに対する結合部位）；ＴｅｔＲ＝テトラサイクリンリプレッサー；Ｆｌａｎｋ２  Ｄｅｌ３＝ＭＶＡゲノムのＤｅｌｅｔｉｏｎ  ＩＩＩ部位の下流のフランキング配列。
【図２】ポックスウイルスを許容する宿主細胞における相同組換えプロセスの模式図である。ＭＶＡポックスウイルスのためのそのような宿主細胞は、例えば、鶏胚線維芽細胞（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｍｂｒｙｏ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＣＥＦ）を含む。本発明の修飾ポックスウイルスベクターによる細胞の感染に続いて、前記細胞は、相同組換え（Ｆｌａｎｋ１／２  Ｄｅｌ３）のために二つのフランキング配列の間に位置している興味対象遺伝物質（例えばＬａｃＺ）を含むプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）により形質移入される。組換えポックスウイルスは、興味対象遺伝物質（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）の組込み、及びレポーター／選択カセットの除去の結果、隣接相同部の組換えで産生される。
【図３】興味対象遺伝物質をＭＶＡゲノムに挿入するために用いられた（図２に模式的に示した）好適なプラスミド（ｖＥＭ０７；配列番号１）のマップである。ＬａｃＺ  ＝βガラクトシダーゼをコードする細菌遺伝子。
【図４】ＰＣＲにより得られたＤＮａｓｅ遺伝子へのテトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）の融合結果を模式的に示す図である。
【図５】ＴｅｔＯ２−ＤＮａｓｅ断片へのＰｓプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の融合結果を模式的に示す図である。
【図６】組換えＭＶＡのクローニングに用いられた標準組換えプラスミドｖＥＭｌｌを示すマップである。
【図７】組換えプラスミドｖＥＭ１２のマップを示す。Ｐｓ−ＴｅｔＯ２−ＤＮａｓｅカセットは、ＳａｃＩ及びＳｐｅＩ制限酵素部位を介してｖＥＭｌｌプラスミドにクローン化された。ＢｓｄＲ＝ブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅ）耐性遺伝子。
【図８】テトラサイクリンリプレッサーコード領域（ＴｅｔＲ）のへのＰｓプロモーターの融合を模式的に示す図である。
【図９】組換えプラスミドｖＥＭ３１のマップを示す図である。Ｐｓ−ＴｅｔＲカセットは、ＳａｃＩ及びＮｈｅＩ制限酵素部位を介してプラスミドｖＥＭ１２にクローン化された。
【図１０】ＭＶＡの複製における誘導性ＤＮａｓｅ発現の効果を示す。ＣＥＦ細胞は、組換えＭＶＡのｍＥＭ０７（７．５＝７．５プロモーター）、ｍＥＭＯ６（Ｐｓ＝Ｐｓプロモーター）、ｍＥＭ０８（Ｈ５＝Ｈ５プロモーター）で感染され、また、種々の濃度のテトラサイクリン（Ｔｅｔ０＝テトラサイクリン無し；Ｔｅｔ２５＝ｍＬ当り２５μテトラサイクリン）を含む培地で培養（インキュベート）された。コントロールとして、ＣＥＦ細胞は、ＭＶＡの空ベクター（ＭＶＡ）で感染された。１セットのサンプルが、ｖＥＭ１２（ＭＶＡ＋ＤＮａｓｅ）で引き続きトランスフェクション（形質移入）された。３７℃、５％ＣＯ２、４８時間の培養の後に、細胞が収集され、ウイルス力価（ｖｉｒｕｓ  ｔｉｔｅｒ）が測定された。ＭＶＡの空ベクターで感染したＣＥＦ細胞も同様にテトラサイクリン（ＭＶＡ＋Ｔｅｔ）により培養した。ＴＣＩＤ５０＝組織培養感染用量５０（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｏｓｅ  ５０）。
【図１１】Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ＩＩＩ部位のＰＣＲ分析結果を示す。ＭＶＡゲノム（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ３）における外来遺伝子の挿入部位がＰＣＲを用いて検討された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、単一の組換えイベントによって組換えポックスウイルスの産生を許容するポックスウイルスから得られた修飾（改変）ベクターに基づいている。本発明の修飾されたウイルスベクターは、興味対象遺伝子の挿入に伴い組換えが成功裏に起こる場合に除去されるレポーター遺伝子を備える。従って、本発明の修飾ウイルスベクターは、レポーター／選択カセットを除去すると同時に、組換えウイルスベクターに異種の興味対象遺伝物質を挿入する単一組換えイベントの検出を提供する。
【００１６】
［定義（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ）］
ここで用いられる用語「ベクター」は、許容宿主細胞におけるポックスウイルスの再生を許容する充分な遺伝情報を含んでいるポックスウイルスのゲノム或はその一部又は断片の何れをも意味する。本発明によるベクターは、ポックスウイルスから得られる一部のみ含むような、又は得られるポックスウイルスの全ての要素、及び／又は付加的遺伝的要素を含むような遺伝子工学的改変ベクターであリ得る。特異的な実施形態において、本発明によるベクターは、修飾されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスのゲノム又はその一部又は断片である。さらに特異的な実施形態において、本発明によるベクターは、ＭＶＡ−Ｆ６（例えばＬｏｔｚら、「マウスと人間のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性細胞障害性Ｔリンパ球による部分チロシナーゼ固有の自己寛容（Ｐａｒｔｉａｌ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｌｆ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｍａｎ）」、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；１０８（４）：５７１−７９）、ＭＶＡ５７５（ＥＣＡＣＣ  供託番号  Ｖ００１２０７０７）、ＭＶＡ−Ｍ４（Ｏｂｅｒら、「欠陥ワクシニアウイルスリスタの免疫原性と安全：修飾ワクシニアウイルスアンカラとの比較（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｌｉｓｔｅｒ：  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ２００２；７６（１５）：７７１３−２３）、Ａｃａｍ３０００（アクセッション番号  ＡＹ６０３３５５）、ＭＶＡ−ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５０８）、ＭＶＡＴＧＮ３３．１（アクセッション番号  ＥＦ６７５１９１）、ＭＶＡ−Ｉ７２１（アクセッション番号  ＤＱ９８３２３６）から成るグループから選ばれたＭＶＡウイルスのゲノム又はその一部である。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、本発明によるベクターは、ゲノムまたはそれのワクシニアウイルスウエスタンリザーブ（アクセッション番号  ＮＣ００６９９８）、ワクシニアウイルスワイス（例えばＦｏｇｇら、「細胞内及び細胞外ビリオンの複数の組換え外膜蛋白による予防接種によって誘導されたウイルス（Ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｉｒｉｏｎｓ）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８  （１９）：１０２３０−３７）、ワクシニアウイルスリスター（アクセッション番号ＤＱ１９１３２４）、ＮＹＣＢＨ（ニューヨーク市保健局、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）；ＣＤＣ（疾病管理・予防センター、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、免疫化習慣諮問委員会（ＡＣＩＰ）推薦ワクシニア（天然痘）ワクチン、Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｅｋｙｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  、４０（Ｒ１４）：１−１０、１９９１．）、カナリア痘（アクセッション番号  ００５３０９及びＡＹ３１８８７１）、鶏痘（アクセッション番号  ５８１５２７）、ワクシニアウイルスコペンハーゲン（アクセッション番号  Ｍ３５０２７）ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、「高減衰ポックスウイルスベクター：ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ（Ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ＮＹＶＡＣ，  ＡＬＶＡＣ，  ＴＲＯＶＡＣ）」、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．１９９５、８４：１５９−６３）から成るグループから選ばれたポックスウイルスの一部である。
【００１８】
ここで用いられる用語「レポーター遺伝子」は、速やかに検出、同定、又は測定することが可能であるそれらを発現して細胞又は生物体に明確な特性を与える遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、興味対象の遺伝子が組込まれているか、或は発現されているかを細胞又は生物体の数によって決定するために一般的に用いられる。本発明の構成において、レポーター遺伝子からの発現産物の検出は、相同組換えが起こっておらず、また、興味対象の遺伝子がウイルスベクターに順調に挿入されていないことを示す。一般に、如何なるレポーター遺伝子も、本発明の元来（オリジナル、ｏｒｉｇｉｎａｌ）のベクターで構成される細胞と相同組換えが生じたベクターで構成される細胞との分離を許容するために利用することができる。本発明における使用に好適なレポーター遺伝子の非限定例は、視覚的に確認可能な特性（例えば、蛍光を含む）を誘導することができるレポーター遺伝子を含み、その特性によって分離可能とする。例えば、ＦＡＣＳ及びクラゲの緑色発光性蛋白質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＲＦＰｌ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＹＦＰ（Ｔｓｉｅｎ）、Ｊ−Ｒｅｄ、ＡｃｅＧＦＰ、ＣｏｐＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ−ｔａｎｄｅｍ、ＰｈｉＹＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ―ｍｏｎｏｍｅｒ、ＥＧＦＰＡｃＧＦＰｌ、ＡｍＣｙａｎｌ、ＡｓＲｅｄ２、ＥＢＦＰ、ＨｃＲｅｄｌ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｍＫＯ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡＧ、Ｋａｅｄｅ、ＭｉＣｙ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｌ．）、Ｖｅｎｕｓ（Ｍｉｙａｗａｋｉ）、Ｙｐｅｔ、ＣｙＰｅｒ（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ）、ＥＹＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（Ｐｒｉｓｔｏｎ）Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ）、ＡＱ１４３（Ｌｕｋｙａｎｏｖ）、ｃＯＦＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｅｑＦＰ６１１（Ｗｅｉｄｅｎｍａｎｎ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰｓ（様々な供給元、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ルシフェラーゼ遺伝子又はｌａｃＺ遺伝子をコードする遺伝子などである。本発明の一つの実施形態において、レポーター遺伝子は、蛍光をコードする遺伝子である。
【００１９】
レポーター遺伝子のさらなる非限定例は、特異的な抗体が存在しており、また、宿主細胞の表面に表れる蛋白質をコードする遺伝子を含む。そのようなレポーター遺伝子は、親和性精製、例えば、抗体で覆われた樹脂又は前記抗体で覆われた磁気ビーズで構成されたカラムによって、本発明のオリジナルベクターで構成された細胞と相同組換えが起こったベクターで構成された細胞との分離を許容する。ここで前記抗体は、レポーター遺伝子によってコード化された蛋白質に対して特異的なものである。特異的な実施形態において、前記レポーター遺伝子は、細胞表面の受容体と細胞表面に表れるような親和性タグとの融合遺伝子をコードする。当業者は、一般的に用いられる様々な親和性タグ及び対応するリガンドを良く知っている。さらに特異的な実施形態において、前記遺伝子は、細胞表面の受容体の融合遺伝子をコードし、融合親和性タグは、ＦＬＡＧ−タグ（Ｎ−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−Ｃ）、エピトープ−タグ、Ｖ５−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、及び／又はＨＡ−タグから成る群から選定される。さらなる実施形態において、前記レポーター遺伝子は、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）Ｅ１及びＥ２、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）Ｅ１及びＥ２、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）Ｓ、ＨＥ、Ｍ及びＥ、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）ＧＰ、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）Ｇ、フィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＰ、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）Ｆ、ＨＮ、Ｈ及びＧ、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）Ｍ２、ＮＡ、ＨＡ及びＨＥＦ、ブンヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）Ｇｎ及びＧｃ、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）ＧＰ、ボルナウイルス（Ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ）Ｇ、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）Ｅｎｖ、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）Ｓ、Ｍ、及びＬから成る群から選定された小さなウイルス表面蛋白質をコードする。
【００２０】
ここで用いられる用語「選択性要素（選択性コンポーネント、ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、そのような選択性要素で構成される宿主細胞に淘汰圧（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を発揮するために利用され得る如何なる核酸をも指す。一つの実施形態において、淘汰圧は、宿主細胞においてウイルス複製を抑制するか、又は遅延させる選択性遺伝子の発現によって発揮される。別の実施形態において、淘汰圧は、宿主細胞を死滅に導く選択性遺伝子の発現によって発揮される。一つの実施形態において、選択性要素は、その発現が誘導性である少なくとも一つの選択性遺伝子を備える。特異的な実施形態において、前記発現の誘導は、制御配列、例えば、プロモーターによって制御される。さらなる実施形態において、前記選択性要素は、前記選択性遺伝子の発現を調節する細菌誘導系（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ）をさらに備える。一つの特異的な実施形態において、細菌誘導系は、選択性遺伝子がリプレッサー結合部位に融合されるプロモーターの制御下にあり、選択性要素がリプレッサー結合部位に結合するリプレッサーをコードする遺伝子をさらに備えることを特徴としている。さらに特異的な実施形態において、前記リプレッサー結合部位は、テトラサイクリンリプレッサー結合部位／オペレーター（ＴｅｔＯ２）であり、また、リプレッサーをコードする前記遺伝子は、ｐｃＤＮＡ６ＴＲプラスミド（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能である）から分離され得るテトラサイクリンリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ）である。さらなる実施形態において、選択性要素は、選択性遺伝子の発現を調節する哺乳類誘導系（システム）をさらに備える。特異的な実施形態において、前記哺乳類誘導系は、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（ニューイングランドバイオラボ社、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）システムである。さらに特異的な実施形態において、前記誘導系は、ＬｅｎｔｉＸシステム（クロンテック社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｑ−メイトシステム（Ｑ−ｍａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｋｒａｃｋｅｌｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｃｕｍａｔｅ誘導性発現システム（Ｃｕｍａｔｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、ＮＲＣカナダ）、及び／又はＧｅｎｏｓｔａｔシステム（Ｕｐｓｔａｔｅ）から成る群から選定される。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態において、選択性遺伝子は細胞障害性の遺伝子である。ここで用いられる用語「細胞障害性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｇｅｎｅ）」は、その発現が宿主細胞の損失又は完全なアポトーシスを導き、前記宿主細胞の損失又は完全なアポトーシスは、発現した遺伝子自体によって、及び、発現された遺伝子産物と宿主細胞に天然に存在するコンポーネント（例えば、宿主細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、プロテアソーム、細胞膜、又は代謝産物）との直接の相互作用にただ関与することによって引き起こされる如何なる遺伝子をも指す。特異的な実施形態において、細胞障害性の遺伝子は、ＤＮａｓｅ（例えばインビトロジェンから入手可能である；ＯＲＦクローンｐＥＮＴＲ２２１、クローンＩＤ  ＩＯＨ２３１４９）、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ、イオンチャンネル、又はカスパーゼ及び／又はＲＯＳのようなアポトーシス誘導因子をコードする。
【００２２】
ここで用いられる用語「挿入（物）」又は「興味対象物の挿入（ｉｎｓｅｒｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」は、相同組換えによって本発明のベクターに導入される如何なる核酸も指す。一つの実施形態において、挿入物は、本発明のベクターで相同組換えが起きることを許容する、フランキング配列に隣接する少なくとも一つの異種遺伝子を備える。本発明の特異的な実施形態において、少なくとも一つの異種遺伝子が、制御配列、好ましくはプロモーターの制御下にある。
【００２３】
興味対象物の挿入の例を図２に示した。ここで、挿入物は、宿主細胞を形質移入するために用いられ、ｌａｃプロモータの制御下で二つのフランキング領域とＬａｃＺ遺伝子から成るプラスミドベクターで構成されている。特異的な実施形態において、異種遺伝子は、少なくとも一つの抗原、好ましくは、患者に免疫応答を引き起こすことが可能な抗原をコードする。特異的な実施形態において、異種遺伝子は、異種ウイルスの抗原、細菌の抗原、原核生物の抗原、真菌類の抗原、及び／又は蠕虫類（ｈｅｌｍｉｎｔｈ）の抗原から成る群から選ばれた抗原をコードする。特定の実施形態において、異種遺伝子は、下記から成る群から選ばれた種の抗原をコードする。すなわち、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ）Ａ，Ｂ，Ｃ，肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ），ルベラウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ），ムンプスウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ），ラビースウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ），ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ），エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ），チックボーンウイルス  （Ｔｉｃｋｂｏｒｎｅ  ｖｉｒｕｓ），クリミアコンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ  Ｋｏｎｇｏ  Ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ），エボラ出血熱ウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ），ニパーウイルス（Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ），デングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ），チクングニヤウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ），エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ），西ナイルウィルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ），リフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ），日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ），ハンタウイルス（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ），ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ），ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ），ニューエマージングウイルス（Ｎｅｗ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ），クラミジア  トラコーマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ），クロストリジウム  ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ），クロストリジウム  テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ），バチルス  アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ），レジオネラ  ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ），ナイセリア  メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  （メニゴコッカス、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃｕｓ），エルシニア  ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ），マイコバクテリウム  ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ），マイコバクテリウム  レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ），サルモネラ  チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ），リステリア  モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），ビブリオ  コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏ��ｅｒａｅ），ヘモフィラス  インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ），ボルデテラ  パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ），ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ），ボレリア属ｓｐｐ．（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．）（レカレンティス：ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ヒスパニカ：ｈｉｓｐａｎｉｃａ、パーケリ：ｐａｒｋｅｒｉ、ブルグドルフェリ：ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ  インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ），リケッチア属ｓｐｐ．（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．），コクシエラ  ブルネッティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉｉ），マイコプラズマ  ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ），コリネバクテリウム  ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ），トレポネーマ  パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ），プラスモジウム  ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ），プラスモジウム  ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ），プラスモジウム  オバーレ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ），プラスモジウム  マラリエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ），エントアメーバ  ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ），ジアルジア  インテステナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ），トリパノソーマ  ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ），リーシュマニア属ｓｐｐ．（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．），ヒストプラズマ  カプスラータム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ），アスペルギルス属ｓｐｐ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．），カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ），クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ），ニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ），ウケレリア  バンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ），シストソーマ  マンソーニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）  及び／又は  トキソプラズマ  ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）である。
【００２４】
さらに特異的な実施形態において、異種遺伝子は、感染症（例えば、ウイルスと細菌の表面蛋白）に対して、又は癌細胞（例えば子宮頚癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、及び／又は腎臓癌の細胞）に対して防御、又は治療できる免疫応答を引き起こす少なくとも一つの抗原をコードする。
【００２５】
［本発明のベクター］
第１の局面において、本発明は相同組換えのために二つのフランキング配列の間に配置されている少なくとも一つのレポーター遺伝子で構成された修飾ポックスウイルスベクターに関する。レポーター遺伝子は、修飾ポックスウイルスベクターで感染された宿主細胞において、相同組換えを介して興味対象物の挿入によって置き換えられるであろう。従って、相同組換えが起こった本発明の修飾ポックスウイルスベクターを備えた宿主細胞は、そのような相同組換えが起こらなかった修飾ポックスウイルスベクターで構成されたそれらの宿主細胞と区別することができる。これは、レポーター遺伝子によってコードされた蛋白質を検出することによって遂行することができる。例えば、レポーター遺伝子がＧＦＰまたはａｚａｍｉ緑色蛋白質をコード化するならば、ＧＦＰまたはａｚａｍｉ緑色蛋白質のための遺伝情報がベクターから相同組換え事象によって除去され、興味対象物の挿入で置き換えられているので、相同組換えが起こった本発明の修飾ポックスウイルスベクターで構成された宿主細胞は、ＧＦＰまたはａｚａｍｉ緑色蛋白質を産生しないこととなる。以上のように、そのような宿主細胞は励起における蛍光を示さないこととなり、例えば、活性化された蛍光セルソーター（ＦＡＣＳ）によって、蛍光を発する細胞から分離することができる。
【００２６】
一つの実施形態において、レポーター遺伝子は、プロモーター、好ましくはウイルスプロモーター、さらに好ましくはワクシニアウイルスプロモーター、または合成のプロモーターの制御下にある。別の実施形態において、プロモーターは、強力なプロモーター、好ましくは、強力な合成のプロモーターである。特異的な実施形態において、プロモーターは、ＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡの配列を有しているＰｓプロモーターである（Ｓｅｋｈａｒ  Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｊｅｒｒｙ  Ｒ．Ｓｉｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｍｏｓｓ，「  蛋白質発現のための、コンパクトな合成のワクシニアウイルス初期／後期プロモーター〔Ｃｏｍｐａｃｔ，ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅａｒｌｙ／Ｌａｔｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．〕  」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１０９４−１０９７，１９９７）。
別の特異的な実施形態において、プロモーターは、ＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴ  ＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴの配列を有している修飾（改変）されたＨ５プロモーターである；Ｒｏｓｅｌ  ＪＬ，Ｅａｒｌ  ＰＬ，Ｗｅｋ  ＪＰ，Ｍｏｓｓ  Ｂ，「  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｈ  ゲノムフラグメントの構造及び機能解析により推定されたワクシニアウイルス後期遺伝子の転写及び翻訳開始部位における保存されたＴＡＡＡＴＧ配列〔Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＴＡＡＡＴＧ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｇｅｎｅｓ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ〕  」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０（２）：２３６−２４９，１９８６。
【００２７】
さらなる実施形態において、レポーター遺伝子は、蛍光性の蛋白質をコード化する。
「空」ベクター（すなわち、如何なる組換えイベントも生じなかったベクター）は、レポーター遺伝子を発現し、従って、そのようなベクターで構成された細胞は蛍光を発することができる。許容細胞における相同組換えはレポーター遺伝子の除去を導き、この手順は、宿主細胞において蛍光を発することがない興味対象物の挿入を含んでいる組換えベクターが結果として生じる。特異的な実施形態において、蛍光性の蛋白質は、ＧＦＰ、強化されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、またはａｚａｍｉ緑色蛋白質（ＭＢＬインターナショナル社、ウォバーン、マサチューセッツ、米国から入手可能で、また、ＭｏＢｉＴｅｃ社、Ｇｏｅｔｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツによって供給される）である。
【００２８】
さらなる局面において、本発明のベクターは、同様に相同組換えのために二つのフランキング配列の間に位置している少なくとも一つの選択性要素をさらに含む。一つの実施形態において、レポーター遺伝子と選択性要素は、相同組換えを許容する一以上の対を成すフランキング配列の間に位置している。別の実施形態において、選択性要素は、発現が誘導性の選択性遺伝子から成っている。さらなる実施形態において、選択性要素は、選択性遺伝子の発現を調節する細菌誘導系（細菌の誘導性のシステム）をさらに含む。一つの特異的な実施形態において、細菌誘導系は、リプレッサー結合部位に融合するプロモーターの制御下で、選択性要素が、リプレッサー結合部位に結合するリプレッサーをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする。さらなる特異的な実施形態において、リプレッサー結合部位はテトラサイクリンリプレッサー結合部位／オペレーター（ＴｅｔＯ２）であり、リプレッサーをコードする遺伝子は、ｐｃＤＮＡ６ＴＲプラスミド（インビトロジェンから入手可能である）から分離することができるテトラサイクリンリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ）である。宿主細胞の形質移入において、リプレッサーは細胞内で発現され、また、選択性遺伝子の発現を抑制するために選択性遺伝子の上流で選択性要素のリプレッサー結合部位に結合する。さらに特異的な実施形態において、リプレッサー結合部位は、テトラサイクリンリプレッサー結合部位／オペレーター（ＴｅｔＯ２）であり、また、リプレッサーをコードする前記遺伝子は、ｐｃＤＮＡ６ＴＲプラスミド（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能である）から分離され得るテトラサイクリンリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ）である。テトラサイクリンがシステムに添加されたら、テトラサイクリンがテトラサイクリンリプレッサーに結合し、次々、選択性遺伝子の発現を引き起こしているＤＮＡ上の結合部位から直ちに脱離する。選択性遺伝子の発現がテトラサイクリンの添加に依存しているので、その結果として、選択性遺伝子の発現は誘導性を与える。さらなる実施形態において、選択性遺伝子とリプレッサーをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターは、ウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーターであり、最も好ましくは、Ｐｓプロモーターまたは修飾されたＨ５プロモーターのような強力な合成のプロモーターである。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態において、選択性要素は、発現によって、宿主細胞内でウイルス複製を抑制するか、又は遅らせる選択性遺伝子から成っている。選択性遺伝子が誘導される場合、これは、相同組換えが生じた本発明のベクターから成っているウイルスの改善された選択を可能にし、選択性要素とレポーター遺伝子は、興味対象挿入物で置き換えられた。その結果、相同組換えが生じたベクターから成っている宿主細胞は、相同組換えが起こらなかった宿主細胞より多くの複製された組換えウイルスを内部に保有する。さらに、ウイルス複製の抑制物が発現されて、ウイルス複製の減少、又は、完全な禁止さえも導いている。従って、興味対象の挿入物なしのゲノムで構成されたウイルスに対して興味対象の挿入物を含むゲノムで構成されたウイルスを産生する比率は、前者を有利とするように著しくシフトされる。従って、システムは、パーセンテージとして、興味対象の挿入物を有して成るウイルスを改善された収率で産生するように処理し得る。特定の実施形態において、選択性遺伝子は、ＲＮａｓｅ、イオンチャンネル又はＤＮＡａｓｅ（インビトロジェン社から入手可能である；ＯＲＦクローンｐＥＮＴＲ２２１、クローンＩＤ  ＩＯＨ２３１４９））である。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態において、選択性要素は、細胞障害性遺伝子（すなわち、発現すると、宿主細胞の減少又は完全なアポトーシスを引き起こす何れかの遺伝子）である。特異的な実施形態において、細胞障害性遺伝子は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、プロテアーゼ、イオンチャンネル、又はアポトーシス誘導物（ｉｎｄｕｃｅｒ）をコードする。
【００３１】
本発明によれば、興味対象挿入物を含んで成る本発明の組換えベクターを内部に保有している宿主細胞はレポーター遺伝子だけによって選択、分離し得ることから、選択性要素は本発明の任意選択的な（ｏｐｔｉｏｎａｌ）実施形態である。一方、レポーター遺伝子はそのような組換えベクターの検出、及び／又は選択に必須であり、選択性要素の任意選択的な誘導性の発現は、例えば、ベクター産生の一代、又は複数代の継代のために使用し得る。
【００３２】
特定の実施形態において、興味対象物の挿入で構成されている本発明の組換えベクターを内部に保有していない宿主細胞が選択性要素の誘導によってウイルスの産生を低減又は全く無くする（又は、完全に死滅される）ように、選択性要素は、例えば、興味対象物の挿入で構成されている組換えポックスウイルスの産生を顕著に促進し得る。この場合に、レポーター遺伝子及び選択性要素を含有している本発明の組換えベクターは、テトラサイクリンに対して感受性の「空」ベクターの発現により結果的に蛍光を生じ、そして、テトラサイクリン非感受性の組換えベクターは如何なる蛍光も欠いている。換言すれば、空ベクターを含有している細胞のみが蛍光を発し、従って、プラーク採取（ｐｌａｑｕｅ  ｐｉｃｋｉｎｇ）又はＦＡＣＳソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）を含む技術により、非組換え体を分離し得る。予め選択性要素の発現が誘導される場合には、空ベクターを内部に保有している細胞の数が、分離に先がけて、劇的且つ有利に減らされることから、分離は顕著に改善された方法で実行し得ることとなる。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態において、フランキング領域は相同組換えを許容する。相同組換えは、一般的には、核酸鎖の間の物質交換の結果生じ、類似配列の整列化（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ホリデイジャンクションの形成、及び核酸の破壊や修復（修復能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）として知られる）に関与している。従って、相同組換えを許容するために充分類似する如何なるフランキング領域も本発明に包含される。特異的な実施形態において、フランキング領域同士は同等である。さらに特異的な実施形態において、フランキング領域は、５０〜１０００塩基対（ｂｐ）のサイズを有し、好ましくは１００〜１０００ｂｐのサイズを有する。
【００３４】
特定の実施形態において、組換えポックスウイルスベクターのフランキング領域は、ＭＶＡゲノムの除去部位（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）の上流と下流に隣接する領域である。特異的な実施形態において、フランキング領域は、ＭＶＡゲノムの除去部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、又はＶＩの上流と下流に隣接する５０〜１０００ｂｐ、好ましくは１００〜１０００ｂｐの領域である（ＭＶＡ  ゲノムポジション：Ｄｅｌ  Ｉ：７６０８／７６０９，Ｄｅｌ  ＩＩ：２０７１８／２０７１９；Ｄｅｌ  ＩＩＩ：１４９３４１／１４９３４２；Ｄｅｌ  ＩＶ：１７０４８０；Ｄｅｌ  Ｖ：１９７５４／１９７５５；Ｄｅｌ  ＶＩ  ９８３１／９８３２）。配列番号２〜７は、夫々、除去部位Ｉ〜ＶＩのフランキング領域を示し、前記除去部位を中心とする周囲が本発明に使用し得る。一例として、配列番号２は、２００２ｂｐの配列であり、ＭＶＡゲノムの除去部位Ｉの周囲が中央に位置されている（ポジション  ７６０８／７６０９）。したがって、配列番号２のポジション１００１／１００２は、ＭＶＡゲノムのポジション７６０８／７６０９と一致している。したがって、本発明の一つの特異的な実施形態におけるフランキング領域は、配列番号２のポジション１００１の上流５０〜１０００ｂｐ及び配列番号２のポジション１００２の下流５０〜１０００ｂｐである。
【００３５】
別の特異的な実施形態において、組換えポックスウイルスベクターのフランキング領域は、挿入部位がポックスウイルスの非コード領域内に位置するように選択される。ポックスウイルスの非コード領域は、様々な長さであり、約１００ｂｐから１０００ｂｐ以上で構成し得る。そのような非コード領域の夫々のヌクレオチドは、挿入部位として選択することができる。本発明によるフランキング領域は、５０〜１０００ｂｐ、好ましくは１００〜１０００ｂｐであり、非コード領域内に位置する選択された挿入部位の上流及び下流である。例えば、非コード領域が１０００ｂｐの長さを有し、挿入部位がポジション５００と５０１との間に選定される場合、本発明によるフランキング領域は、ポジション５００から上流５０〜１０００ｂｐ及びポジション５０１から下流５０〜１０００ｂｐとすることができる。特異的な実施形態において、非コード領域はＭＶＡの非コード領域である。さらに特異的な実施形態において、非コード領域は、ＭＶＡの以下に示す何れかの遺伝子間のヌクレオチド配列である（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  アクセッション＃  Ｕ９４８４８）：００１Ｌ−００２Ｌ、００２Ｌ−００３Ｌ、００５Ｒ−００６Ｌ、００６Ｌ−００７Ｒ、００７Ｒ−００８Ｌ、０１７Ｌ−０１８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０２０Ｌ−０２１Ｌ、０２３Ｌ−０２４Ｌ、０２４Ｌ−０２５Ｌ、０２５Ｌ−０２６Ｌ、０２８Ｒ−０２９Ｌ、０３０Ｌ−０３１Ｌ、０３１Ｌ−０３２Ｌ、０３２Ｌ−０３３Ｌ、０３５Ｌ−０３６Ｌ、０３６Ｌ−０３７Ｌ、０３７Ｌ−０３８Ｌ、０３９Ｌ−０４２Ｌ、０４３Ｌ−０４４Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０４６Ｌ−０４７Ｌ、０４９Ｌ−０５０Ｌ、０５０Ｌ−０５１Ｌ、０５１Ｌ−０５２Ｌ、０５２Ｒ−０５３Ｒ、０５３Ｒ−０５４Ｒ、０５４Ｒ−０５５Ｒ、０５５Ｒ−０５６Ｌ、０５６Ｌ−０５７Ｒ、０６１Ｌ−０６２Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、０６５Ｌ−０６６Ｌ、０６６Ｌ−０６７Ｌ、０７７Ｌ−０７８Ｒ、０７８Ｒ−０７９Ｌ、０８０Ｒ−０８１Ｌ、０８５Ｒ−０８６Ｒ、０８６Ｒ−０８７Ｒ、０８８Ｒ−０８９Ｌ、０８９Ｌ−０９０Ｒ、０９４Ｌ−０９５Ｒ、０９６Ｒ−０９７Ｒ、０９７Ｒ−０９８Ｒ、１０１Ｒ−１０２Ｒ、１０３Ｒ−１０４Ｒ、１０５Ｌ−１０６Ｒ、１０８Ｌ−１０９Ｌ、１０９Ｌ−１１０Ｌ、１１０Ｌ−１１１Ｌ、１１３Ｌ−１１４Ｌ、１１４Ｌ−１１５Ｌ、１１５Ｌ−１１６Ｒ、１１７Ｌ−１１８Ｌ、１１８Ｌ−１１９Ｒ、１２３Ｌ−１２４Ｌ、１２４Ｌ−１２５Ｌ、１２５Ｌ−１２６Ｌ、１３３Ｒ−１３４Ｒ、１３４Ｒ−１３５Ｒ、１３７Ｌ−１３８Ｌ、１４１Ｌ−１４２Ｒ、１４３Ｌ−１４４Ｒ、１４４Ｒ−１４５Ｒ、１４５Ｒ−１４６Ｒ、１４６Ｒ−１４７Ｒ、１４７Ｒ−１４８Ｒ、１４８Ｒ−１４９Ｌ、１５２Ｒ−１５３Ｌ、１５３Ｌ−１５４Ｒ、１５４Ｒ−１５５Ｒ、１５６Ｒ−１５７Ｌ、１５７Ｌ−１５８Ｒ、１５９Ｒ−１６０Ｌ、１６０Ｌ−１６１Ｒ、１６１Ｒ−１６２Ｒ、１６５Ｒ−１６６Ｒ、１６６Ｒ−１６７Ｒ、１７０Ｒ−１７３Ｒ、１７３Ｒ−１７４Ｒ、１７４Ｒ−１７５Ｒ、１７５Ｒ−１７６Ｒ、１７６Ｒ−１７７Ｒ、１７８Ｒ−１７９Ｒ、１７９Ｒ−１８０Ｒ、１８０Ｒ−１８１Ｒ、１８３Ｒ−１８４Ｒ、１８４Ｒ−１８５Ｌ、１８５Ｌ−１８６Ｒ、１８６Ｒ−１８７Ｒ、１８７Ｒ−１８８Ｒ  及び／又は１８８Ｒ−１８９Ｒ．
【００３６】
別の特異的な実施形態において、組換えポックスウイルスベクターのフランキング領域は、挿入部位がポックスウイルスの非必須遺伝子内に位置するように選択される。与えられたポックスウイルスの生産的な複製のために、それ（遺伝子）が必要とされていない場合、遺伝子は、非必須遺伝子であると考えられる。特異的な実施形態において、非必須遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子（＝Ｔｋ；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，「高度に弱毒化されたワクシニアＭＶＡ株における挿入部位としてのチミジンキナーゼローカスの評価〔Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  （ｔｋ）ｌｏｃｕｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ＭＶＡ  ｓｔｒａｉｎ〕  」，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６，１４１（３−４）：６６３−９．）、赤血球凝集素遺伝子（＝ＨＡ；Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，「ワクシニアＭＶＡ赤血球凝集素遺伝子ローカス及び外来性遺伝子の挿入部位としての評価〔Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ＭＶＡ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ〕  」，Ｇｅｎｅ，１９９６  Ｏｃｔ  ２４；１７７、（１−２）：４３−６）、Ｉ４Ｌをコードするリボヌクレオチド還元酵素（Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．，「ＧＵＳ  レポーター遺伝子を用いＩ４Ｌローカスに挿入されたワクシニアウイルストランスファーベクター〔Ａ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＧＵＳ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｉ４Ｌ  ｌｏｃｕｓ〕  」，Ｇｅｎｅ，１９９６  Ｊｕｎ  ２６；１７２（２）：２３３−７）、Ｅ３Ｌ（Ｌａｎｇｌａｎｄ  ＪＯ＆Ｊａｃｏｂｓ  ＢＬ，  「ＰＫＲ−抑制性遺伝子、Ｅ３Ｌ及びＫ３Ｌの、ワクシニアウイルス宿主域の決定における役割〔Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＫＲ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ，Ｅ３Ｌ  ａｎｄ  Ｋ３Ｌ，ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ〕  」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００２  Ｊｕｌ  ２０；２９９（１）：１３３−４１），  ＫｌＬ（Ｓｔａｉｂ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，「組換えＭＶＡ及びその産生方法〔Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＭＶＡ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ〕  」，ＥＰｌ５９４９７０，２００５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １６）及びＡＴＩ遺伝子（Ｗｉｎｔｅｒｓｐｅｒｇｅｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，「ポックスウイルスゲノムへの異種配列組み込みのためのベクター〔Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｏｘｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ〕  」，２００２  Ｆｅｂ  ２０）から成る群から選ばれる。さらに特異的な実施形態において、非必須遺伝子は、ＭＶＡからの遺伝子であり、０３２Ｌ（リボヌクレオチド還元酵素）、１３７Ｌ（機能未知）、１６６Ｒ（グアニル酸塩キナーゼ断片）、１��０（機能未知）、１８８Ｒ（機能未知）、及び１８９Ｒ（機能未知）から選ばれる。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、ポックスウイルスはワクシニアウイルスである。さらなる実施形態において、ポックスウイルスはＭＶＡである。
【００３８】
さらなる局面において、本発明は本発明の修飾ポックスウイルスベクターを内部に保有している細胞に関する。一般に、全ての細胞は、本発明が包含する修飾ポックスウイルスベクターの受け入れを許容し得る。好ましくは、細胞は真核細胞である。特定の実施形態において、細胞は哺乳動物又は鳥類の細胞である。特異的な実施形態において、細胞は鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞である。さらなる実施形態において、細胞は単離されたヒト細胞である。
【００３９】
さらなる局面において、本発明は本発明による修飾ポックスウイルスベクターの産生に用いられる新規プラスミド及びベクターを対象とする。従って、本発明は、配列番号１５〜２３より成る群から選ばれた核酸又はその相補体、或は、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列相同性を有する断片又は相同的な核酸をもまた包含する。ここで、前記断片は、配列番号１５〜２３より成る群から選ばれた夫々の核酸の少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の長さを有する。
【００４０】
［本発明の方法］
さらなる局面において、本発明は組換えポックスウイルスを産生するための方法を対象とし、ここで本発明の修飾ポックスウイルスベクターを許容する宿主細胞が、前記ベクターで形質移入され、さらには、宿主細胞内でベクターとプラスミドの間で相同組換えを許容する条件下、興味対象の異種遺伝物質を備えて成るプラスミドによって形質移入される。前記修飾ポックスウイルスベクターとプラスミドの両方は、必ず、そのような相同組換えが生じることを許容するために充分類似しているフランキング配列を備えて成る。さらに、修飾ポックスウイルスベクターは、レポーター遺伝子を運び、ある実施形態において、上述のような選択性要素は前記フランキング領域の間に、一方、プラスミドは前記興味対象の異種遺伝物質を前記フランキング領域の間に運ぶ。したがって、興味対象の異種遺伝物質によるレポーター遺伝子（そして、存在するならば選択性要素）の置き換えを介し、修飾ポックスウイルスベクターとプラスミドの間の相同組換えが本発明の組換えベクターを産生する。
【００４１】
ある実施形態において、前記方法は、選択性要素を備えて成る本発明の修飾ポックスウイルスベクターを利用し、宿主細胞内において選択性遺伝子の発現を誘導する追加の段階（ステップ）をさらに含む。選択性遺伝子発現の誘導は、使用される誘導性の選択性要素に依存する。一例として、そして特異的な実施形態において、選択性要素は、上述のような細菌誘導性のテトラサイクリンリプレッサー結合部位／オペレーター（ＴｅｔＯ２）の調節制御下で発現されるＤＮａｓｅ蛋白質をコード化する選択性遺伝子を備えている。誘導は、直ちにＤＮＡ上の結合部位から脱離するテトラサイクリンリプレッサーと結合するテトラサイクリンの添加により実行され、これがウイルス複製を抑制するＤＮａｓｅの発現を次々に許容する。この誘導は、興味対象の挿入遺伝子を備えていない修飾ポックスウイルスベクターを有して成る宿主細胞に関連する組換えベクターを備えている宿主細胞の望ましい選択をもたらす。
【００４２】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、非組換えの修飾ポックスウイルスベクターを有して成る宿主細胞から組換えベクターを備えている宿主細胞を分離する付加的段階（ステップ）をさらに含む。特定の実施例において、この分離は発現されたレポーター遺伝子の遺伝子産物によって実行される。一つの実施形態において、レポーター遺伝子は蛍光性蛋白質をコードし、分離はＦＡＣＳ及び付属のセルソーターを用いて実行される。別の実施形態において、レポーター遺伝子は、細胞表面上で発現され、抗体が存在している任意の蛋白質である。分離は、そのとき、磁気ビーズを前記抗体でコーティングし、二つの細胞集団を分離するため前記磁気ビーズに細胞を接触させることによって達成される。別の実施形態において、抗体は、樹脂に付着され、二つの細胞集団を分離するためにカラム内で用いられる。
【００４３】
また別の実施形態において、分離されており組換えベクターを有して成る宿主細胞は、新鮮な宿主細胞で少なくとも一代を追加継代するように用いられる。したがって、組換えベクターを内部に保有している細胞の数、それから産生された組換えポックスウイルス粒子の数は顕著に増大する。特定の実施形態において、組換えポックスウイルスの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０代のさらなる継代が実行される。特異的な実施形態において、組換えポックスウイルスの６代のさらなる継代が実行される。さらなる実施形態において、前記方法は、選択性遺伝子の発現を誘導する段階（ステップ）を含む。
【００４４】
本発明による方法のさらなる実施形態において、ポックスウイルスはワクシニアウイルス又はＭＶＡである。
【００４５】
産生された組換えポックスウイルスは、平均的な当業者に知られている如何なる適切な手法、例えば、遠心分離によって分離し得る。
【００４６】
［本発明の医学的利用］
さらなる局面において、本発明は、本発明による修飾されたポックスウイルス、本発明による組換えポックスウイルス、又は、本発明による修飾された或は組換えのポックスウイルスを有して成る細胞の薬物（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）としての使用を対象とする。特異的な実施形態において、インスタントの（ｉｎｓｔａｎｔ）本発明の薬物は、治療又は予防用ワクチンとしての使用に有利である。
【００４７】
別の実施形態において、本発明は、本発明による修飾されたポックスウイルス、本発明による組換えポックスウイルス、又は、本発明による修飾された或は組換えのポックスウイルスを有して成る細胞について、下記から成る群から選ばれた種による感染の処置及び／又は予防のための薬物としての使用を対象とする。すなわち、群は、インフルエンザウイルスＡ，Ｂ，Ｃ，肝炎ウイルスＡ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，ヒト免疫不全ウィルス，ルベラウイルス，ムンプスウイルス，ラビースウイルス，ヒトパピローマウイルス，エプスタインバーウイルス，チックボーンウイルス，クリミアコンゴ出血熱ウイルス，エボラ出血熱ウイルス，ニパーウイルス，デングウイルス，チクングニヤウイルス，エンテロウイルス，西ナイルウィルス，リフトバレー熱ウイルス，日本脳炎ウイルス，ハンタウイルス，ロタウイルス，ＳＡＲＳコロナウイルス，エマージングウイルス，クラミジア  トラコーマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ），クロストリジウム  ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ），クロストリジウム  テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ），バチルス  アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ），レジオネラ  ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ），ナイセリア  メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  （メニゴコッカス、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃｕｓ），エルシニア  ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ），マイコバクテリウム  ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ），マイコバクテリウム  レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ），サルモネラ  チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ），リステリア  モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），ビブリオ  コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ），ヘモフィラス  インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ），ボルデテラ  パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ），ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ），ボレリア属ｓｐｐ．（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．）（レカレンティス：ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ヒスパニカ：ｈｉｓｐａｎｉｃａ、パーケリ：ｐａｒｋｅｒｉ、ブルグドルフェリ：ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ  インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ），リケッチア属ｓｐｐ．（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．），コクシエラ  ブルネッティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉｉ），マイコプラズマ  ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ），コリネバクテリウム  ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ），トレポネーマ  パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ），プラスモジウム  ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ），プラスモジウム  ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ），プラスモジウム  オバーレ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ），プラスモジウム  マラリエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ），エントアメーバ  ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ），ジアルジア  インテステナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ），トリパノソーマ  ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ），リーシュマニア属ｓｐｐ．（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．），ヒストプラズマ  カプスラータム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ），アスペルギルス属ｓｐｐ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．），カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ），クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ），ニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ），ウケレリア  バンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ），シストソーマ  マンソーニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）  及び／又は  トキソプラズマ  ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）。
さらに特異的な実施形態において、前記薬物は、これらの種の何れかによって引き起こされた疾患又は徴候の処置に用いられる。特定の実施形態において、疾患は、インフルエンザ、肝炎、後天性免疫不全症候群、流行性耳下腺炎、狂犬病、脳炎、胃又は十二指腸潰瘍、マラリア、睡眠病、ライム病、反応性関節炎、肺炎、ハンセン病、ジフテリア、カンジダ症、及び／又はトキソプラズマ症である。
【００４８】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明による修飾されたポックスウイルス、本発明による組換えポックスウイルス、又は、本発明による修飾された或は組換えのポックスウイルスを有して成る細胞について、癌の処置及び／又は予防のための薬物としての使用を対象とする。特異的な実施形態において、前記癌は、子宮頚癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、及び／又は腎臓癌から成る群から選ばれる。
【００４９】
本発明の一つの実施形態において、前記薬物は、ワクチン接種を要する患者を処置するために用いられる。本発明の別の実施形態において、抗原をコードする少なくとも一つの遺伝子を有して成る本発明による組換えポックスウイルス又は前記組換えポックスウイルスを備えている細胞はワクチン接種を要する患者において免疫応答を誘導することが可能である。特異的な実施形態において、抗原は、異種ウイルスの抗原、細菌の抗原、原核生物の抗原、真菌類の抗原、及び／又は蠕虫類の抗原から成る群から選ばれる。特定の実施形態において、抗原は、下記から成る群から選ばれた種の抗原である。すなわち、インフルエンザウイルス  Ａ，Ｂ，Ｃ，肝炎ウイルス  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，ヒト免疫不全ウィルス，ルベラウイルス，ムンプスウイルス，ラビースウイルス，ヒトパピローマウイルス，エプスタインバーウイルス，チックボーンウイルス，クリミアコンゴ出血熱ウイルス，エボラ出血熱ウイルス，ニパーウイルス，デングウイルス，チクングニヤウイルス，エンテロウイルス，西ナイルウィルス，リフトバレー熱ウイルス，日本脳炎ウイルス，ハンタウイルス，ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ），ＳＡＲＳコロナウイルス，エマージングウイルス，クラミジア  トラコーマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ），クロストリジウム  ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ），クロストリジウム  テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ），バチルス  アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ），レジオネラ  ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ），ナイセリア  メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  （メニゴコッカス、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃｕｓ），エルシニア  ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ），マイコバクテリウム  ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ），マイコバクテリウム  レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ），サルモネラ  チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ），リステリア  モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），ビブリオ  コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ），ヘモフィラス  インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ），ボルデテラ  パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ），ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ），ボレリア属ｓｐｐ．（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．）（レカレンティス：ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ヒスパニカ：ｈｉｓｐａｎｉｃａ、パーケリ：ｐａｒｋｅｒｉ、ブルグドルフェリ：ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ  インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ），リケッチア属ｓｐｐ．（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．），コクシエラ  ブルネッティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉｉ），マイコプラズマ  ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ），コリネバクテリウム  ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ），トレポネーマ  パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ），プラスモジウム  ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ），プラスモジウム  ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ），プラスモジウム  オバーレ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ），プラスモジウム  マラリエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ），エントアメーバ  ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ），ジアルジア  インテステナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ），トリパノソーマ  ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ），リーシュマニア属ｓｐｐ．（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．），ヒストプラズマ  カプスラータム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ），アスペルギルス属ｓｐｐ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．），カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ），クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ），ニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ），ウケレリア  バンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ），シストソーマ  マンソーニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）  及び／又は  トキソプラズマ  ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）。さらなる特異的な実施形態において、前記抗原は癌細胞によって発現された蛋白質である。別の特異的な実施形態において、前記抗原は、癌細胞によって発現され、癌細胞の表面に表れる蛋白質である。
【００５０】
さらに特異的な実施形態において、本発明の組換えポックスウイルス、又は前記組換えポックスウイルスを備える細胞は癌性の細胞によって発現された抗原を有して成る。癌性の細胞によって発現されたそのような抗原の例は、限定されないが、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；ジシアロシルＬＥＡ（ｄｉｓｉａｌｏｓｙｌ  ＬＥＡ）抗原；Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ＳＡＲＴ３；多剤耐性関連蛋白質  ３（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、ＭＲＰ３）；ポリコーム群蛋白質ｚｅｓｔｅホモログ２（ＥＺＨ２）；アルデヒド脱水素酵素  １（ＡＬＤＨｌ）；ヒト上皮成長因子受容体  ２（Ｈｅｒ２）；ネクチン−４（Ｎｅｃｔｉｎ−４）；ｇｐ９６ヒートショック蛋白質；ｇｐ１００；チロシナーゼ；ＧＭ２；ＭＡＧＥ−Ａ３；及びＮＹ−ＥＳＯ−１を含む。さらなる実施形態において、本発明の組換えポックスウイルス、又は前記組換えポックスウイルスを備える細胞は、抗体をコード化する遺伝子を有して成る。特異的な実施形態において、そのような抗体は腫瘍細胞上発現された細胞マーカーに特異的である。
【００５１】
本発明の薬物は当業者に公知の方法によって患者に投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、前記薬物は注射によって投与される。
【実施例】
【００５２】
本発明の修飾ポックスウイルスベクターの有効性を評価するために、数種の基礎的なＭＶＡベクターを創製した。これらのＭＶＡベクターは、強力ワクシニアウイルスプロモーターの制御下にあり、蛍光体をコードするレポーター遺伝子と、強力ワクシニアウイルスプロモーターの制御下にあり、ＤＮａｓｅ選択性遺伝子で構成される選択性要素と、異なるプロモーターの制御下にあり、テトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）要素及びテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）をコードする遺伝子とを含んでいる。
【００５３】
図１に示すとおり、基礎的なＭＶＡゲノムは、ＭＶＡゲノムの挿入部位（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ＩＩＩ又はＤｅｌ３）へのレポーター遺伝子／選択性要素カセットの導入によって修飾された：Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ＩＩＩ（Ｆｌａｎｋｌ  Ｄｅｌ３）の上流フランキング領域に隣接しており、レポーターシステムとしての強力合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｐｓ）の制御下、レポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子が、挿入された。このレポーター、例えば、ＧＦＰは、挿入カセットを含むＭＶＡの検出を至適に許容する。レポーター遺伝子（Ｆｌａｎｋ２  Ｄｅｌ３  に隣接する）の下流で、選択性要素はゲノムに挿入された。これは、リプレッサー（ＴｅｔＲ）と相互作用する細菌性オペレーター要素（ＴｅｔＯ２）によって制御される強力合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｐｓ）の制御下にある、例えば、ＤＮａｓｅ遺伝子から成る。リプレッサー相互作用は、テトラサイクリンによって順次制御される。テトラサイクリンの非存在において、ＴｅｔＲはＴｅｔＯ２制御配列に結合し、これによりＤＮａｓｅ遺伝子の発現を抑制する。しかしながら、テトラサイクリンの存在において、ＴｅｔＲはＴｅｔＯ２部位から脱離し、これによりＤＮａｓｅ遺伝子の発現を許容する。発現したＤＮａｓｅ蛋白質は、そのとき、感染された細胞の細胞質においてウイルスＤＮＡの増幅を抑制する。
【００５４】
興味対象の異種遺伝物質（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を有して成る組換えＭＶＡの分離のため、レポーター遺伝子／選択性要素カセットは相同組換えにより除去される。その後に、結果として生じるウイルスはテトラサイクリンの存在で継代される。非組換えの修飾ＭＶＡを有して成る細胞は、蛍光により検出可能であり、また、ＤＮａｓｅ発現がＭＶＡ細胞の増殖を抑制する。組換えＭＶＡを有して成る細胞は、レポーター遺伝子／選択性要素カセットを欠失しており、したがって、蛍光を示すことはなく、また、ＤＮａｓｅ発現が起こらないことからＭＶＡの増殖が抑制されない。組換え及び非組換えＭＶＡの分離は、蛍光及び非蛍光細胞の分離によって行ない得る。
【００５５】
ＭＶＡ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ＩＩＩのフランキング配列を含む細菌プラスミドは、修飾ＭＶＡベクターへの興味対象の異種遺伝物質の挿入のためのシャトルとして用いられる（図２及び３）。前記プラスミドは、複数の単一切断制限酵素部位によって隣接されたＬａｃＺ発現カセットをさらに含んで成る。修飾ＭＶＡベクターに挿入されるべき興味対象の異種遺伝物質が、一以上の単一切断制限酵素部位によって細菌性ベクターｖＥＭ０７（配列番号１）でクローン化される。ＬａｃＺ遺伝子が除去され、また、興味対象の異種遺伝物質を含むプラスミドは、Ｘ−Ｇａｌを用い青白選択によって検出し得る。結果として得られたプラスミドは、その後、、相同組換えによって修飾ＭＶＡベクターへの興味対象異種遺伝物質の挿入のために用いられる。
【００５６】
〔実施例１：修飾ＭＶＡベクター選択性要素のクローニング〕
レポーター遺伝子／選択性要素カセットは、相同組換えによってＭＶＡゲノムに挿入された。この目的のために、（ｉ）レポーター遺伝子、（ｉｉ）Ｐｓ−ＴｅｔＯ２−ＤＮＡｓｅ、及び（ｉｉｉ）ＴｅｔＲの単一要素は、細菌プラスミドに段階的方法にてクローン化された。
【００５７】
［ＤＮａｓｅ遺伝子のクローニング］
ＤＮａｓｅ断片（ＳｐｅＩ−Ｐｓ−ＴｅｔＯ２−ＤＮａｓｅ−ＳａｃＩ）は、２ステップＰＣＲプロセスにより合成され、ベクターｖＥＭ１１（ＳｐｅＩ／ＳａｃＩ）（配列番号１５）にクローン化され、結果としてｖＥＭ１２（配列番号１６）が産生された。
第１のＰＣＲステップのために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
１）  ｏＥＭ１６７：ＴｅｔＯ２−ＤＮａｓｅ  ｓｔａｒｔ；  ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧ  （配列番号８）。
２）  ｏＥＭ１６８：ＤＮａｓｅ  ｅｎｄ−ＳａｃＩ；  ＧＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣ  （配列番号９）。
【００５８】
このＰＣＲプロセスのためのテンプレートは、ヒトＤＮａｓｅオープンリーディングフレームを含んだプラスミドｐＥＮＴＲ−ＤＮａｓｅ（インビトロジェン  ＯＲＦクローンコレクション、クローンＩＤ  ＩＯＨ２３１４９）であった。この第１のＰＣＲステップの結果として図４に示した断片が生じた。
【００５９】
ＰＣＲの第２ステージのために、第１のＰＣＲステップの精製されたＰＣＲ産物と、以下のオリゴヌクレオチドが用いられた。
１）  ｏＥＭ１６９：ＳｐｅＩ−Ｐｓ−ＴｅｔＯ２；ＧＡＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＩＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧ（配列番号１０）。
２）  ｏＥＭ１６８：ＤＮａｓｅ  ｅｎｄ−ＳａｃＩ；ＧＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣ（配列番号９）。
この第２のＰＣＲステップは、結果として図５に示した断片を産生した。
断片は、そこでＳｐｅＩ及びＳａｃＩ制限酵素部位の利用により組換えベクターｖＥＭｌｌ（図６）にクローン化された。このクローニングステップは、結果としてベクターｖＥＭ１２（図７）を産生した。
【００６０】
［ＴｅｔＲのクローニング］
次のクローニングステップ中で、ＴｅｔＲコード領域はベクターｖＥＭ１２に挿入された。発現されたＴｅｔＲの量は、重要な実験パラメータであり、それは、細胞（１細胞当り約２００個のコピー）に存在する全てのＴｅｔＯ２配列をカバーするために十分に発現されるべきであるが、ＤＮａｓｅの発現誘導のために過剰のテトラサイクリンを要するので過剰に発現されるべきではないからである。したがって、ＴｅｔＲ発現は、３つの異なるプロモーターの制御下で評価された：Ｐｓ（強発現）、Ｈ５（中間発現）、及びｐ７．５（低発現）。
【００６１】
［ＰｓプロモーターでのＴｅｔＲのクローニング］
Ｐｓ−テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）カセットはＰＣＲによって合成された。テンプレートは、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲプラスミド（インビトロジェン）であり、以下のオリゴヌクレオチドがＰｓプロモーターの融合及び増幅に用いられた。
１）  ｏＥＭ１６３：ＳａｃＩ−Ｐｓ−ＴｅｔＲ  ｓｔａｒｔ；ＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧ（配列番号１１）。
２）  ｏＥＭ１６４：ＴｅｔＲ  ｅｎｄ−ＮｈｅＩ；ＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣ（配列番号１２）。
結果産物であるＰＣＲ断片（図８）は、ベクターｖＥＭ１２にＳａｃＩとＮｈｅＩを用いて、クローン化された。このクローニングステップは、結果としてベクターｖＥＭ３１、配列番号１７（図９）を産生した。
【００６２】
［ｐ７．５／Ｈ５プロモーターでのＴｅｔＲのクローニング］
ｐ７．５及びＨ５プロモーターはプラスミドｐＶＩＶ０６（配列番号１８）及びｐＶＩＶ０７（配列番号１９）に存在している。そして、ＴｅｔＲは、これらのベクターへの挿入のために、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅された。
１）  ｏＥＭ１６５：ＸｈｏＩ−ＴｅｔＲ  ｓｔａｒｔ；ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧ（配列番号１３）。
２）  ｏＥＭＩ６６：ＴｅｔＲ  ｅｎｄ−ＡｐａＩ；ＣＣＧＧＧＣＣＣＴＴＡＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣ（配列番号１４）。
プロモーターへのＴｅｔＲコード領域の適切な融合のため、ＰＣＲ断片はベクターｐＶＩＶ０６（ｐ７．５）及びベクターｐＶＩＶ０７（Ｈ５）にＡｐａＩ及びＸｈｏＩによりクローン化された。
【００６３】
ｐＶＩＶ０６におけるＴｅｔＲのクローニングは、結果としてベクターｐＥＭ１２（ｐ７．５）（配列番号２０）を産生し、ｐＶＩＶ０７におけるクローニングは、結果としてベクターｐＥＭ１３（Ｈ５）（配列番号２１）を産生した。その後ＴｅｔＲ発現カセットは、ＳａｃＩ及びＡｐａＩを用いて引き出され、それからｖＥＭ１２においてクローン化された。これは、結果としてベクターｖＥＭ３２（ｐ７．５）（配列番号２２）及びベクターｖＥＭ３３（Ｈ５）（配列番号２３）を産生し、これらはＴｅｔＲ遺伝子を発現するために用いられるプロモーターを除いてベクターｖＥＭ３１（図９）と同等であった。
【００６４】
〔実施例２：修飾ＭＶＡベクターのクローニング〕
ｖＥＭ３１、３２及び３３は、修飾ＭＶＡベクターを創製するためそれぞれ使用された。この目的のために、ＣＥＦ細胞はＭＶＡ（ｍｏｉ  ０．０５）で感染され、それからｖＥＭ３１、３２、又は３３で夫々個別に形質移入された。組換えＭＶＡ（すなわち修飾ＭＶＡベクター）を含む細胞はこの抗生物質に耐性であるため、感染したＣＥＦ細胞によりリリースされたＭＶＡ粒子は、それから新鮮なＣＥＦ細胞を用いて選択的な条件下（例えばブラストサイジン含有培地；５μｇ／ｍＬ）で三代継代された。組換えＭＶＡ粒子は、引き続き、プラーク精製によりＦＡＣＳユニット（蛍光活性化セルソーター、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）を用いて精製された。
【００６５】
ＭＶＡとｖＥＭ３１（ｍＥＭ０６、Ｐｓ−ＴｅｔＲ）、ＭＶＡとｖＥＭ３２（ｍＥＭ０７、７．５−ＴｅｔＲ）、及びＭＶＡとｖＥＭ３３（ｍＥＭ０８、Ｈ５−ＴｅｔＲ）の組換えによる結果産物である修飾ＭＶＡベクターの増幅及び評価に続いて、テトラサイクリン／デオキシリボヌクレアーゼ系（テトラサイクリン／ＤＮａｓｅシステム、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ／ＤＮａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）が試験のために用いられた。
【００６６】
〔実施例３：テトラサイクリン／ＤＮａｓｅシステムの評価〕
誘導性逆選択性システムを試験するために、細胞は夫々個別に修飾ＭＶＡウイルスｍＥＭ０６、０７、及び０８で感染され、テトラサイクリン含有培地中でインキュベートされた。異なる濃度のテトラサイクリン（０〜５００μｇ／ｍＬ）が、分析のために用いられた。
【００６７】
未修飾ＭＶＡの複製における誘導性ＤＮａｓｅ発現の影響を評価するため、ＭＶＡ感染細胞は、ＤＮａｓｅの一過性発現を促進するために（ｖＥＭ１２）で形質移入された。さらに、未修飾ＭＶＡの複製におけるテトラサイクリンの影響は、テトラサイクリンのみによるＭＶＡ感染細胞のインキュベートにより分析された。追加的に、細胞の増殖及び状態におけるテトラサイクリンの影響をモニターするため、ＭＶＡ感染及び非感染のＣＥＦ細胞は、修飾ウイルスベクターの試験のために用いられた同一のテトラサイクリン濃度でインキュベートされた。
【００６８】
短時間内に、ＣＥＦ細胞は、修飾ＭＶＡウイルスｍＥＭ０７（７．５＝７．５プロモーター）、ｍＥＭ０６（Ｐｓ＝Ｐｓプロモーター）、ｍＥＭ０８（Ｈ５＝Ｈ５プロモーター）で感染され、異なる濃度のテトラサイクリン（Ｔｅｔ０＝テトラサイクリン無し；Ｔｅｔ２５＝２５μｇテトラサイクリン／ｍＬ）を含有する培地でインキュベートされた。コントロールのために、ＣＥＦ細胞は、未修飾ＭＶＡの空ベクター（ＭＶＡ）で感染され、続いて幾つかのＭＶＡ感染細胞もまた、ｖＥＭ１２（ＭＶＡ＋ＤＮａｓｅ）で形質移入された。また、未修飾ＭＶＡの空ベクターで感染されたＣＥＦ細胞は、テトラサイクリン（ＭＶＡ＋Ｔｅｔ）でインキュベートされた。３７℃（５％ＣＯ２）、４８時間のインキュベートの後に、細胞は収集され、ウイルス力価が測定された。図１０は、得られた結果の概要を提供する。
【００６９】
未修飾ＭＶＡのコントロール（図１０、ＭＶＡ）は、８．７５Ｅ＋０６  ＴＣＩＤ５０の力価であった。結果的に、これは、如何なる抑制物質の如何なる存在も無いこれらの条件下、未修飾ＭＶＡでの感染によって達成し得る力価である。ＤＮａｓｅの発現は、結果として２ログスケール（図１０、ＭＶＡ＋Ｄｎａｓｅ、６．５６Ｅ＋０４  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）低減された力価をもたらした。しかしながら、ＭＶＡ感染が未修飾ＭＶＡの１．００Ｅ＋０５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬでの接種によって確証されたことから、この処置は、結果としてウイルスの量の増加を生じることがなく（すなわち生産的複製無し）、したがって、ＤＮａｓｅ発現はウイルス複製を効果的に抑制する。
【００７０】
未修飾ＭＶＡで感染され、テトラサイクリンでインキュベートされた細胞は、テトラサイクリン自体がＭＶＡ複製における影響を有し、細胞障害性作用による可能性が高いことを実証した。２５〜５０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンが用いられた場合にはＭＶＡ複製への影響が確認されなかったが、一方、１００μｇ／ｍＬの濃度を用いることでＭＶＡの複製を１ログ低減した；さらに、２５０μｇ／ｍＬの濃度は、一過性に発現されたＤＮａｓｅ（図１０、ＭＶＡ＋Ｔｅｔ）で観察された効果に匹敵するウイルス複製を抑制した。
７５μｇ／ｍＬテトラサイクリンにて修飾ＭＶＡベクターｍＥＭ０６及びｍＥＭ０８によって感染された細胞の処理は、ＤＮａｓｅ発現誘導（図１０、ｍＥＭ０６及びｍＥＭ０８）を介したウイルス複製の減少をもたらし、これは、ウイルス力価がより顕著に低減されたとおり、直接テトラサイクリンのみによるものではなかった。この同じ効果は、１００μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを用いて観察される。１５０μｇ／ｍＬの濃度は、結果的に、修飾ＭＶＡウイルスが全く増殖しないような、テトラサイクリンの明確な細胞傷害性をもたらす。したがって、さらなる試験目的のために、７５〜１００μｇ／ｍＬテトラサイクリンの狭い濃度枠が用いられた。修飾ＭＶＡベクターｍＥＭ０７は弱いｐ７．５プロモーターでＴｅｔＲを発現し、如何なる定量的な量においてもＤＮａｓｅ発現を抑制するためには明らかに不十分な量のＴｅｔＲを産生する。従って、ウイルス複製は全ての実験設定において顕著に低減されており、このウイルス自体は単一組換えベクターでの組換えウイルスのクローニングのために基本的なウイルスとして適用できない。
【００７１】
〔実施例４：単一組換え系を用いる組換えポックスウイルスベクターのクローニング〕
修飾ＭＶＡウイルスｍＥＭ０６及びｍＥＭ０８が同様な複製パターンを示したので、ｍＥＭ０６を用いて追加の実験を行なった。
細胞は修飾ＭＶＡウイルスｍＥＭ０６で感染され、ｖＥＭ０７（図３）で形質移入された。相同組換えのため、ＬａｃＺ遺伝子は選択修飾ＭＶＡウイルスゲノムに挿入され、レポーター／選択性カセットは除去された。リリースされたウイルス粒子は、新鮮なＣＥＦ細胞でテトラサイクリン（１００μｇ／ｍＬ）含有培地において継代され、その後選択的な条件なしで細胞の連続希釈により継代された。感染された細胞は、非蛍光細胞を選ぶためにＦＡＣＳを用いてソートされた。一旦ソーティングプロセスのための設定が至適化されると、ソートされた細胞はホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）され、ＣＥＦ細胞で再び継代された。感染細胞はソートされ、ウイルスは新鮮なＣＥＦ細胞でもう一度増幅された。細胞は明らかに感染されており蛍光を示さず、これはそれらが精製された組換えＭＶＡウイルスを含んでいたことを意味している。組換えウイルスの純度は、修飾ＭＶＡベクター（図１１）の挿入部位を増幅したＰＣＲ法により確認された。ＰＣＲは、修飾ＭＶＡベクターのための３．０ｋｂのシグナル、及び相同組換えによってレポーター／選択カセットで置き換えられたＬａｃＺを含む組換えＭＶＡのためのより小さな０．７６ｋｂの断片を生成した。
【００７２】
組換えＭＶＡウイルスサンプルは、０．７６ｋｂ（図１１、ｒｅｃ  ＭＶＡ）の明確ななシグナルを与えたが、修飾ＭＶＡ（ｍＥＭ０６）又は未修飾ＭＶＡ（ＭＶＡ）については何のシグナルも与えなかった。組換えベクターｖＥＭ０７もまた０．７６ｋｂ（図１１、ｖＥＭ０７）の期待されるシグナルを生成した。除去部位内に選択性／レポーターカセットを含む修飾ＭＶＡは、コントロールとして用いられ、これは３．０ｋｂの期待されるシグナルを示した（ｍＥＭ０６）。未修飾ＭＶＡベクターもまた結果として約２００塩基対の期待されているシグナルを生じた（ＭＶＡ）。
【００７３】
本システムにより達成された堅牢性の結果を確認するために、上述の手順を用いてクローニングプロセスが繰り返された。組換えＭＶＡは、上述の単一組換え系（単一組換えシステム、ｓｉｎｇｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて直ちに再度分離された。
【００７４】
〔実施例５：単一組換え系を用いたさらなる組換えポックスウイルスベクターのクローニング〕
組換えポックスウイルスは、相同組換えの使用を許容する対を成すフランキング配列の間に配置されているレポーター遺伝子を有して成る修飾ポックスウイルスベクターを用いる本発明による単一組換え系を利用してクローン化される。
細胞は修飾ＭＶＡウイルスで感染され、それからｖＥＭ０７（図３）で形質移入される。相同組換えのため、ＬａｃＺ遺伝子が選択修飾ＭＶＡウイルスゲノムに挿入され、その結果、レポーターカセットが除去される。リリースされたウイルス粒子は、その後テトラサイクリン含有培地内（１００μｇ／ｍＬ）新鮮なＣＥＦ細胞で少なくとも一回継代される。
【００７５】
感染された細胞は、その後上述のように非蛍光細胞を選択するためＦＡＣＳを用いてソートされる。感染細胞がソートされた後に、ウイルスがさらに一回新鮮なＣＥＦ細胞で増幅される。
【００７６】
組換えウイルスの純度は、修飾ＭＶＡベクターの挿入部位を増幅するＰＣＲ法により確認された（図１１）。ＰＣＲ法は、相同組換えによってレポーターカセットが置き換えられたＬａｃＺを含む組換えＭＶＡのための断片を生成する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2012513208.tif 000015
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