(57)【要約】シェーグレン症候群患者において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの同定が本明細書に開示されている。本明細書で同定された少なくとも１種の示差的に発現されるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することによって、被験体がシェーグレン症候群を有すると診断する方法が提供される。被験体の生体試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの、対照と比較した変化により、その被験体がシェーグレン症候群を有することが示される。シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤を患者に投与することによって、または、シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して下方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を患者に投与することによって、シェーグレン症候群を有する患者を治療する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体がシェーグレン症候群を有すると診断するため、かつ／またはシェーグレン症候群を有する前記被験体を治療するための、前記被験体の生体試料中の少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）遺伝子産物の発現レベルの使用であって、前記少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物であり、ここで、
（ｉ）前記被験体の前記生体試料における、対照と比較したｍｉＲ−１５０の前記レベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３の前記レベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−７６８−３ｐの前記レベルの上昇、ｍｉＲ−５７４の前記レベルの低下、ｍｉＲ−５１３の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−１８８の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−２０２の前記レベルの上昇、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−５６５の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−５０９の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−１５４の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−９９ｂの前記レベルの上昇、ｍｉＲ−５６４の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−３０ｂの前記レベルの上昇またはｍｉＲ−４０９−３ｐの前記レベルの上昇、またはそれらの組合せにより、前記被験体がシェーグレン症候群を有することが示され、ここで前記上昇または低下が診断上有意な量であり；かつ／または
（ｉｉ）シェーグレン症候群を有する前記患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する作用剤を治療有効量で前記患者に投与する、またはシェーグレン症候群を有する前記患者において対照と比較して下方制御される単離されたｍｉＲ遺伝子産物を治療有効量で前記患者に投与することによる、
使用。
【請求項２】
前記（ｉ）に記載の通りであって、前記ｍｉＲ遺伝子産物の前記レベルにおける前記診断上有意な上昇または低下が少なくとも２倍である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記対照と比較して、シェーグレン症候群を有する前記被験体の前記生体試料において、ｍｉＲ−１５０が少なくとも３２倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３が少なくとも７倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９が少なくとも４５倍増加する、ｍｉＲ−７６８−３ｐが少なくとも３倍増加する、ｍｉＲ−５７４が少なくとも４倍減少する、ｍｉＲ−５１３が少なくとも６倍増加する、ｍｉＲ−１８８が少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−２０２が少なくとも２倍増加する、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４が少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−５６５が少なくとも６倍増加する、ｍｉＲ−５０９が少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−１５４が少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−９９ｂが少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−５６４が少なくとも６倍増加する、ｍｉＲ−３０ｂが少なくとも３倍増加する、またはｍｉＲ−４０９−３ｐが少なくとも２倍増加する、またはそれらの組合せである、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記対照と比較して、シェーグレン症候群を有する前記被験体の前記生体試料において、ｍｉＲ−１５０が少なくとも３８倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３が少なくとも２１倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９が少なくとも９２倍増加する、ｍｉＲ−７６８−３ｐが少なくとも３倍増加する、ｍｉＲ−５７４が少なくとも２倍減少する、ｍｉＲ−５１３が少なくとも１６倍増加する、ｍｉＲ−１８８が少なくとも７倍増加する、ｍｉＲ−２０２が少なくとも５倍増加する、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４が少なくとも６倍増加する、ｍｉＲ−５６５が少なくとも７倍増加する、ｍｉＲ−５０９が少なくとも１８倍増加する、ｍｉＲ−１５４が少なくとも３倍増加する、ｍｉＲ−９９ｂが少なくとも５倍増加する、ｍｉＲ−５６４が少なくとも２９倍増加する、ｍｉＲ−３０ｂが少なくとも４倍増加する、またはｍｉＲ−４０９−３ｐが少なくとも３倍増加する、またはそれらの組合せである、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記生体試料が唾液腺である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記唾液腺が小唾液腺である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記唾液腺が耳下腺唾液腺である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記生体試料が唾液である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記生体試料が血液、血清または血漿である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
シェーグレン症候群と診断された前記被験体に対する適切な療法または第２の適切な療法を提供することをさらに含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記療法が、唾液産生を促進する作用剤を投与することを含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記療法がコルチコステロイドを投与することを含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
前記療法が、免疫抑制薬を投与することを含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
前記療法が、非ステロイド系抗炎症薬を投与することを含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１５】
シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤、またはシェーグレン症候群を有する前記患者において対照と比較して下方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物の使用であって、シェーグレン症候群を有する患者を治療するための薬剤の調製における使用。
【請求項１６】
前記上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する前記作用剤が、前記ｍｉＲ遺伝子産物に特異的なアンチセンス化合物である、請求項１５または請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−５ｐまたはｍｉＲ−９遺伝子産物である、請求項１５に記載の使用。
【請求項２０】
前記下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−５７４遺伝子産物である、請求項１５に記載の使用。
【請求項２１】
前記治療が、シェーグレン症候群を有する前記被験体における唾液の流れを回復させることを含む、請求項１５から２０までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
病巣スコアが高いことまたは病巣スコアが低いことを診断するための、シェーグレン症候群患者の生体試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルの使用であって、前記少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１４２−５ｐまたはｍｉＲ−６５０遺伝子産物であり；
（ｉ）シェーグレン症候群を有する前記患者の前記生体試料における、対照と比較した、ｍｉＲ−１５０の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−７６８−３ｐの前記レベルの上昇、ｍｉＲ−５７４の前記レベルの低下、ｍｉＲ−５１３の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−１８８の前記レベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−５０１の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−１２６＊の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−３４２の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−３３０の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−１３５ｂの前記レベルの上昇、ｍｉＲ−１４２−５ｐの前記レベルの上昇、またはｍｉＲ−６５０の前記レベルの上昇、またはそれらの組合せにより、前記シェーグレン症候群患者の病巣スコアが高いことが示される；または
（ｉｉ）シェーグレン症候群を有する前記患者の前記生体試料における、対照と比較した、ｍｉＲ−１５０の前記レベルの低下、ｍｉＲ−７６８−３ｐの前記レベルの低下、ｍｉＲ−５７４の前記レベルの上昇、ｍｉＲ−５１３の前記レベルの低下、ｍｉＲ−１８８の前記レベルの低下、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９の前記レベルの低下、ｍｉＲ−５０１の前記レベルの低下、ｍｉＲ−１２６＊の前記レベルの低下、ｍｉＲ−３４２の前記レベルの低下、ｍｉＲ−３３０の前記レベルの低下、ｍｉＲ−１３５ｂの前記レベルの低下、ｍｉＲ−１４２−５ｐの前記レベルの低下、またはｍｉＲ−６５０の前記レベルの低下、またはそれらの組合せにより、前記シェーグレン症候群患者の病巣スコアが低いことが示され；
前記上昇または低下が、診断上有意な量の上昇または低下である、
使用。
【請求項２３】
前記少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−７６８−３ｐ遺伝子産物、ｍｉＲ−５７４遺伝子産物、またはその両方であり、前記対照と比較した、ｍｉＲ−７６８−３ｐの前記レベルの上昇、ｍｉＲ−５７４の前記レベルの低下、またはその両方により、前記シェーグレン症候群患者の病巣スコアが高いことが示される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記対照が健康な被験体由来の生体試料である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
シェーグレン症候群を治療するための方法、またはシェーグレン症候群患者における唾液の流れを回復させるための方法で使用するための、シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤、またはシェーグレン症候群を有する前記患者において対照と比較して下方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物。
【請求項２６】
シェーグレン症候群を治療するための治療剤をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、（ｉ）細胞培養物を候補作用剤と接触させるステップと；（ｉｉ）ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物から選択される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定するステップを含み、対照と比較して、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよび／またはｍｉＲ−４０９−３ｐのレベルの低下、および／またはｍｉＲ−５７４のレベルの上昇により、候補作用剤がシェーグレン症候群を治療するための治療剤であると同定される方法。
【請求項２７】
表１〜６および表１６〜２１のいずれか１つに列挙されているｍｉＲ遺伝子産物から選択されるｍｉＲ遺伝子産物と特異的にハイブリダイズする少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項２８】
ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４０９−３ｐからなる群から選択されるｍｉＲ遺伝子産物と特異的にハイブリダイズする少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む請求項２７に記載のアレイ。
【請求項２９】
被験体がシェーグレン症候群を有すると診断するための、またはシェーグレン症候群を有する被験体に対する適切な療法を選択するための、請求項２７または請求項２８に記載のアレイの使用。
【請求項３０】
表１〜６および表１６〜２１のいずれか１つに列挙されているｍｉＲ遺伝子産物から選択されるｍｉＲ遺伝子産物に特異的な少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプローブを含むキット。
【請求項３１】
ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４０９−３ｐからなる群から選択されるｍｉＲ遺伝子産物に特異的な少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００９年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１４５，１４２号の利益を主張し、この米国仮特許出願は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は、健常人と比較して、シェーグレン症候群患者において示差的に発現されるマイクロＲＮＡ、およびシェーグレン症候群を診断および治療するための、上記開示マイクロＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
シェーグレン症候群は、免疫細胞によって涙および唾液を産生する腺が攻撃され、破壊される自己免疫障害である。この障害の顕著な特徴である症状は、口内乾燥およびドライアイである。シェーグレン症候群は、皮膚、鼻および膣の乾燥も引き起こす可能性があり、腎臓、血管、肺、肝臓、膵臓および脳を含めた体内の他の器官に影響を及ぼす可能性がある。シェーグレン症候群は、米国の１〜４百万人に影響を及ぼしており、女性は９倍この疾患を発症しやすい。シェーグレン罹患者の大多数は、診断される時点で４０歳以上である。シェーグレン症候群は、一次状態として、または、全身性エリテマトーデス（「ループス」）または関節リウマチなどの他の自己免疫疾患に付随する二次障害として発生し得る。
【０００４】
シェーグレン症候群により、生命維持に必要な体の器官が損傷する可能性があり、症状は、安定した状態が保たれ得る、悪化し得る、または寛解の状態になり得る。一部の患者がドライアイおよび口内乾燥の軽度の症状のみを経験する一方、他の患者は良好な健康状態の後に重篤な疾患が続く周期を経験する。多くの患者が問題を症候的に治療することができる一方、他の患者は霧視、持続性の目の不快感、再発性の口腔感染症、耳下腺腫大、嗄声、ならびに嚥下および摂食における困難を生じる。消耗性疲労および関節痛により、生活の質が重篤に損なわれる可能性がある。シェーグレン症候群の診断は、乾燥の主観的根拠および客観的根拠、ならびに自己免疫（自己抗体）および／または唾液腺の炎症のマーカーの存在の種々の組合せに基づいて行われる。シェーグレン症候群の診断の正確度を改善するために、より客観的な診断用バイオマーカーが非常に望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、シェーグレン症候群に対する公知の治癒も、腺分泌を回復させるための普遍的に有効な治療もない。治療は、一般に、眼および口内乾燥の症状を軽減するための水分補充療法を含め、症候的かつ支持的である。患者のサブセットは、唾液の産生を刺激する、経口的に利用可能な薬物（ピロカルピンおよびセビメリン）に対していくらかの応答を有するが、その応答は通常限られていて、多くの患者は副作用のせいで薬物に対して耐容性を示さない。非ステロイド系抗炎症薬を使用して筋骨格の症状を治療することができる。重篤な合併症を伴う個体に対して、多くの場合コルチコステロイドまたは免疫抑制薬が処方される。これらの薬物は重大な副作用を有する可能性がある。したがって、シェーグレン症候群患者を正確に診断するだけでなく、疾患を治療するための実現可能な治療標的を同定する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、遺伝子発現を制御する小さな一本鎖ＲＮＡ分子である。シェーグレン症候群患者が、健康な対照の被験体と比較して示差的なｍｉＲ遺伝子発現を示すことが本明細書に開示されている。いくつものｍｉＲが、唾液の流れが不十分な患者と比較して唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者において、ならびに病巣スコアが高い（高度の炎症）シェーグレン症候群患者と病巣スコアが低い（低度の炎症）シェーグレン症候群患者において、示差的に発現されることも本明細書に開示されている。
【０００７】
したがって、本明細書で同定された少なくとも１種の示差的に発現されるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することによって、被験体がシェーグレン症候群を有すると診断する方法が本明細書で提供される。方法は、シェーグレン症候群患者の生体試料（唾液腺生検材料または唾液など）中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。被験体の生体試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの、対照と比較した変化により、その被験体がシェーグレン症候群を有することが示される。一部の実施形態では、方法は、シェーグレン症候群と診断された被験体に対して適切な療法を提供することも含む。
【０００８】
シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤を患者に投与することによって、シェーグレン症候群を有する患者を治療する方法も提供される。シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して下方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を患者に投与することによって、シェーグレン症候群を有する患者を治療する方法がさらに提供される。
【０００９】
シェーグレン症候群を有する患者における唾液の流れを回復させる方法も提供される。方法は、患者に、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者と比較して、唾液の流れが正常な患者において上方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物（またはｍｉＲ遺伝子産物の組合せ）を投与することを含む。あるいは、方法は、患者に、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者と比較して、唾液の流れが正常な患者において下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤を投与することを含む。
【００１０】
被験体の生体試料中の、病巣スコアが高いことまたは病巣スコアが低いことに関連付けられる少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することによって、シェーグレン症候群患者を病巣スコアが高いまたは病巣スコアが低いと診断する方法がさらに提供される。
【００１１】
前述および他の本発明の目的、特徴および利点は、添付の図面を参照して進める以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、マイクロアレイ発現解析に使用した小唾液腺（ＭＳＧ）クラスの概略図である。全部で２４検体のＭＳＧを使用し、そのうち８検体は正常な対照（ＮＣ）から生検し、１６検体はシェーグレン症候群（ＳＳ）患者から得た。ＳＳ生検材料１６検体のうち８検体の病巣スコアが高く（１２）、ＳＳ生検材料８検体の病巣スコアが低かった（≦２）。
【図２Ａ】図２Ａは、マイクロアレイデータを正規化するために使用したハウスキーピングマイクロＲＮＡの表である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、すべてのマイクロアレイにわたるマイクロＲＮＡの対すべての発現に対するピアソン相関係数の分布を、示したハウスキーピングマイクロＲＮＡに対して正規化する前と後で比較したボックスプロットを示すグラフである。すべてのマイクロアレイにおいて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって存在するとしてスコア化されたマイクロＲＮＡのみを算出に含めた。
【図３】図３は、全２４検体のハイブリダイズした試料の主成分分析（ＰＣＡ）の結果を示す一連の３次元プロットである。試料は、それらの最初の３主成分に沿ってプロットされている。ＰＣＡプロットの３つの向きを示している。非ＳＳの小唾液腺を中サイズの円で表し、病巣スコアが低いＭＳＧを大きな円で表し、病巣スコアが高いＭＳＧを小さな円で表している。プロットは、ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（商標）からエクスポートした。
【図４】図４は、マイクロＲＮＡアレイの階層クラスタリングを示すデンドログラムである。ＳＳ試料と正常な対照とが明白に分離されており、また、病巣スコアが高いＳＳ試料と病巣スコアが低いＳＳ試料との間が分離されており、ただ一人病巣スコアが高い患者（１Ｃ−１）が、病巣スコアが低い試料にクラスタリングされている。高病巣スコア群では、唾液の流れが不十分である、または唾液の流れが保たれている患者は異なるクラスターを形成する：１Ａ−病巣スコアが低く、唾液の流れが保たれているＳＳ患者；１Ａ、１Ｂ−病巣スコアが低いＳＳ患者；１Ｃ、１Ｄ−病巣スコアが高いＳＳ患者；２Ａ−健康な対照。デンドログラムはＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓからエクスポートした。
【図５】図５は、小唾液腺病巣スコアと相関させた、選択されたマイクロＲＮＡの相対的な発現を示すグラフである。正規化されたデータセットから、正常試料、病巣スコアが低い試料および病巣スコアが高い試料の間で別個の反対の発現パターンを有する２種のマイクロＲＮＡが同定された；病巣スコアが上昇すると、ｍｉＲ−７６８−３ｐは増加するが、一方ｍｉＲ−５７４は減少する。これら２種のマイクロＲＮＡの発現パターンを、リアルタイム定量ＰＣＲにより、種々の病巣スコアを有する独立した試料セット（ｎ＝１５）において、全く同じ試料におけるそれらの相対的な発現レベルを周期の差異（Ｃｔ  ｄｉｆｆ）を決定することを通してモニタリングすることによって検証した。病巣スコアが低い試料（ＦＳ：０〜２）、病巣スコアが中程度の試料（ＦＳ：５〜７）および病巣スコアが高い試料（ＦＳ：１２）間のＣｔ差異に統計的有意差があった（ｐ＝０．０００３、一元配置分散分析に基づく）。
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓによる、表２０からの非炎症性マイクロＲＮＡ群（Ａ）および炎症性マイクロＲＮＡ群（Ｂ）の標的となる遺伝子についての１０種の最も重要な生物学的機能を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓによる、表２０からの非炎症性マイクロＲＮＡ群（Ａ）および炎症性マイクロＲＮＡ群（Ｂ）の標的となる遺伝子についての１０種の最も重要な生物学的機能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
Ｉ．略称
ｅｂｖ  エプスタイン・バール・ウイルス
ＦＳ  病巣スコア
ｈｃｍｖ  ヒトサイトメガロウイルス
ｈｉｖ１  ヒト免疫不全ウイルス１
ｈｓａ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
ｈｓｖ１  単純ヘルペスウイルス１
ｋｓｈｖ  カポジ肉腫ヘルペスウイルス
ｍｉＲ  マイクロＲＮＡ
ｍｉＲＮＡ  マイクロＲＮＡ
ＭＳＧ  小唾液腺
ＮＣ  正常対照
ＮＰＶ  陰性適中率
ＮＳＡＩＤ  非ステロイド系抗炎症薬
ＰＣＡ  主成分分析
ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応
ＰＰＶ  陽性適中率
ＲＮＡ  リボ核酸
ｓｉＲＮＡ  低分子干渉ＲＮＡ
ＳＳ  シェーグレン症候群
ＩＩ．用語および方法
特に記載のない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用されている。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＩＸ、Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓより出版、２００７年（ＩＳＢＮ  ０７６３７４０６３２）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．より出版、１９９８年；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．より出版、１９９５年（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）において見ることができる。
【００１４】
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する：
投与：被験体に、治療剤などの作用剤を任意の有効な経路で提供または付与することである。典型的な投与経路としては、注射経路（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内など）、経口経路、管内経路、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
作用剤：任意のタンパク質、核酸分子（化学的に修飾された核酸を含む）、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物または対象とする他の分子である。作用剤は、治療剤、診断剤または医薬品を含んでよい。治療剤もしくは医薬品は、単独で、または追加の化合物と一緒に（被験体に投与された際に治療効果または予防効果を誘導するなど）所望の応答を誘導する治療剤もしくは医薬品である。
【００１６】
唾液産生を促進する作用剤：被験体（例えば、シェーグレン症候群を有する被験体）において産生される唾液の量を上昇させる任意の化合物である。場合によっては、唾液産生を促進する作用剤は、ピロカルピン（Ｓａｌａｇｅｎ（商標））またはセビメリン（Ｅｖｏｘａｃ（商標））などの医師によって処方される治療剤である。一部の実施例では、唾液産生を促進する作用剤は、健康な被験体と比較して、シェーグレン症候群患者において下方制御される、または、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者と比較して、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において下方制御される遺伝子産物などのマイクロＲＮＡ遺伝子産物である。
【００１７】
発現の変化：ｍｉＲ遺伝子産物の発現の変化は、生体試料（シェーグレン症候群患者由来の試料など）において検出可能なｍｉＲ遺伝子産物のレベルの、対照（健康な被験体など）と比較した変化を指す。発現の「変化」は、発現の増加（上方制御）または発現の減少（下方制御）を含む。
【００１８】
アンチセンス化合物：それがハイブリダイズする（ｍｉＲ遺伝子産物などの）標的核酸分子領域と少なくとも部分的に相補的なオリゴマー化合物を指す。本明細書で使用される、標的核酸分子に「特異的」なアンチセンス化合物は、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズし、その発現を調節するアンチセンス化合物である。本明細書で使用される、「標的」核酸は、アンチセンス化合物が特異的にハイブリダイズし、その発現を調節するように設計される核酸分子である。一部の実施例では、標的核酸分子はｍｉＲ遺伝子産物である。
【００１９】
アンチセンス化合物の非限定的な例としては、プライマー、プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムが挙げられる。そのように、これらの化合物を、一本鎖、二本鎖、環状、分枝状、またはヘアピンの化合物として導入することができ、また、これらの化合物は、内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含有してよい。二本鎖アンチセンス化合物は、ハイブリダイズして二本鎖化合物を形成する２つの鎖であってよく、またはハイブリダイゼーションし、完全にまたは部分的に二本鎖の化合物を形成できるようにするために十分な自己相補性を有する一本鎖であってよい。本明細書の特定の実施例では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムである。
【００２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド：本明細書で使用される、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、核酸ベースのオリゴマーである一本鎖アンチセンス化合物である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖、塩基、および／またはヌクレオシド間結合に対する１つまたは複数の化学修飾を含んでよい。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子にハイブリダイズしたとき、二重鎖がＲＮａｓｅ  Ｈ（ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を認識する酵素）に認識され、その結果ＲＮＡが切断されるように、「ＤＮＡ様」である。
【００２１】
アレイ：基板上または基板内のアドレス可能な場所における生物学的な巨大分子（核酸分子など）などの分子の配列である。「マイクロアレイ」は、評価または分析するための顕微鏡検査が必要になる、または顕微鏡検査が助けとなるように小型化されたアレイである。アレイは、時にはＤＮＡチップまたはバイオチップと称される。
【００２２】
分子（「フィーチャー」）のアレイにより、試料について非常に多くの解析を一度に行うことが可能になる。ある特定例のアレイでは、１種または複数種の分子（オリゴヌクレオチドプローブなど）を、例えば内部対照を提供するために、複数回（２回など）アレイに生じさせる。アレイ上のアドレス可能な場所の数は変動してよく、例えば少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも５００個、少なくとも５５０個、少なくとも６００個、少なくとも８００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、またはそれ以上からである。特定の実施例では、アレイは、例えば１０〜１００個のアドレス可能な場所など、５〜１０００個のアドレス可能な場所を含む。特定の実施例では、アレイは、表１〜６および表１６〜２１の１つまたは複数に列挙されているｍｉＲ遺伝子産物に特異的なプローブまたはプライマー（増幅を可能にするプローブまたはプライマーなど）から本質的になる。
【００２３】
アレイ内で、整列させた試料のそれぞれは、その場所をアレイの少なくとも２次元以内で確実にかつ一貫して決定することができるという点で、アドレス可能である。アレイ上のフィーチャーの適用場所としては、種々の形状を想定することができる。例えば、アレイは規則的（均一な行と列に配列されるなど）または不規則であってよい。したがって、規則正しいアレイでは、各試料の場所は、試料がアレイに適用された時点で試料に割り当てられ、各場所を適切な標的またはフィーチャーの位置と相関させるためにキーを提供することができる。多くの場合、規則正しいアレイは、対称な格子型に配列されるが、試料は他の型（放射状に分布した線、らせん状の線、または規則正しいクラスターなど）に配列することができる。アドレス可能なアレイは、アレイ上の特定のアドレスとその位置の試料についての情報（例えばシグナル強度を含めた、ハイブリダイゼーションまたは結合のデータなど）を相関させるためにコンピュータをプログラムすることができるという点で、通常コンピュータ可読である。一部のコンピュータ可読の形式例では、アレイ内の個々のフィーチャーは規則的に、例えばデカルト格子型に配列されていて、コンピュータによってアドレス情報と相関させることができる。
【００２４】
生体試料：被験体から得られた、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含む）、タンパク質、またはそれらの組合せを含有する生物検体である。例としては、唾液、末梢血、尿、組織生検材料、手術検体および剖検材料が挙げられるが、これらに限定されない。一実施例では、試料は、シェーグレン症候群患者または健康な対照の被験体由来などの唾液腺生検材料を含む。他の実施形態では、生体試料は唾液試料である。一部の実施例では、エキソソームが唾液から単離され、ｍｉＲＮＡの供給源として使用される。他の実施形態では、生体試料は血液、または血漿または血清などのその成分である。
【００２５】
血液：心臓、動脈、毛細血管および静脈を循環し、体内の輸送（ガス、代謝産物および老廃物輸送など）の主要手段である流体である。血液は、主に血漿（流体部分）ならびに血液細胞および血小板（固形部分）で構成されている。「血漿」は、血液細胞が懸濁している、血液の流体部分を指す。血漿は大部分が水であり、血漿タンパク質、無機塩、栄養分、ガス、細胞からの廃物および種々のホルモン、分泌物および酵素を含有する。「血清」は、フィブリノーゲンまたは血液細胞を含有せず、血液凝固後に流体のままである、透明な淡黄色の血漿の液体部分を指す。
【００２６】
対照：「対照」は、シェーグレン症候群患者から得られた唾液腺試料などの実験試料と比較するために使用される試料または標準物質を指す。一部の実施形態では、対照は、健康な患者から得られた試料である（本明細書では「正常な」対照とも称される）。一部の実施形態では、対照は、歴史的な対照または標準値（すなわち、基線値または正常値を表す、予め試験された対照試料または試料群）である。
【００２７】
コルチコステロイド：副腎皮質で産生されるステロイドホルモンである。コルチコステロイドは、ストレス応答、免疫応答および炎症の制御、炭水化物の代謝、タンパク質の異化、血液の電解質レベル、および挙動などの幅広い生理系に関与している。コルチコステロイドの例としては、コルチゾールおよびプレドニゾンが挙げられる。
【００２８】
診断：疾患をその徴候、症状および／または種々の試験の結果から同定するプロセスである。そのプロセスを通して到達した結果も「診断」と称される。一般に実施される試験形態としては、血液試験、医用画像、遺伝子解析、尿検査および生検が挙げられる。
【００２９】
診断上有意な量：本明細書で使用される「診断上有意な量」は、一方の患者集団と他方（シェーグレン症候群患者集団と健常人群など）を区別することを可能にするために十分な、生体試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの上昇または低下を指す。一部の実施形態では、診断上有意な上昇または低下は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍である。一部の実施例では、診断上有意な量は、表１〜６に示されているｍｉＲ遺伝子発現における倍率変化である。診断上有意な量は、表１６、１９または２０のいずれか１つに示されている、２種類の試料間（対照の被験体とシェーグレン症候群患者との間、または、病巣スコアが高いシェーグレン症候群患者と病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者との間など）の特定のｍｉＲの発現における倍率変化を算出することによっても決定することができる。マイクロアレイ解析は、本明細書では、ｍｉＲ遺伝子産物の発現をどのように検出することができるかについての１つの例として提供される。しかし、遺伝子発現を測定するための他の方法（本明細書に記載の方法の１つなど）が存在し、使用された方法に応じて、検出される発現レベルが変動し得ることが当業者には理解されよう。したがって、診断上有意な量は、ＲＴ−ＰＣＲなどの別の検出方法が使用された場合、変動する可能性がある。
【００３０】
マイクロＲＮＡの示差的な発現または発現の変化：マイクロＲＮＡ遺伝子にコードされている情報がマイクロＲＮＡ遺伝子産物に転換されるときの増加または減少などの差異である。一部の実施例では、差異は健康な対照の被験体由来の試料におけるマイクロＲＮＡの発現量などの対照値または参照値と相対的である。
【００３１】
下方制御されるまたは減少する：核酸分子（マイクロＲＮＡなど）の発現に関して使用される場合、遺伝子産物の産生の減少をもたらす任意のプロセスを指す。本開示において、遺伝子産物は、一次転写物マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）または成熟マイクロＲＮＡであってよい。遺伝子の下方制御は、マイクロＲＮＡ遺伝子産物の産生における任意の検出可能な減少を含む。ある特定の実施例では、マイクロＲＮＡの産生は、対照と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも４０倍減少する。一部の実施例では、対照は、シェーグレン症候群を有さない１体または複数体の被験体におけるマイクロＲＮＡの発現の相対量である。
【００３２】
エキソソーム：多小胞体と血漿膜の融合から生じた、約３０〜１００ｎｍの小さな、表が上の細胞分泌小胞である。エキソソームは、もっと大きく（およそ１ミクロン）、代わりに血漿膜をつまみとることから生じる分泌微小胞とは形態学的に別個である。微小胞およびエキソソームはどちらも細胞質内容物を保持しているが、エキソソームは、他の分泌小胞集団には見出されないＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１およびＴＳＧ１０１を含めた特徴的な表面マーカーを有する。エキソソームは、幅広い細胞、網状赤血球、血小板、樹状細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、ならびにマクロファージなどの主要な造血細胞から生じる。しかし、エキソソームは、種々の上皮細胞（肺胞組織、ネフロン由来の細管細胞および有足細胞、ならびに腸細胞など）および腫瘍細胞からも分泌される。
【００３３】
病巣スコア：シェーグレン症候群の診断において頻繁に使用される炎症の尺度である。病巣スコアは、４ｍｍ２の腺切片内のリンパ性病巣（少なくとも５０個の炎症性細胞を含有する）の数を測定することによって決定する。一部の実施形態では、低病巣スコアはスコア０〜４である。特定の実施例では、低病巣スコアはスコア０〜２である。一部の実施形態では、高病巣スコアはスコア８以上である。特定の実施例では、高病巣スコアはスコア１２以上である。
【００３４】
遺伝子発現プロファイル（またはフィンガープリントまたはサイン）：示差的な遺伝子発現または遺伝子発現の変化を、遺伝子発現の検出可能な量（ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡなど）の変化によって、またはそれらの遺伝子によって発現されるタンパク質の検出可能な量の変化によって検出することができる。遺伝子発現プロファイルは、遺伝子発現の明確なまたは同定可能なパターン、例えば定義された遺伝子セットの高発現および低発現のパターンである。一部の実施例では、わずか１種または２種の遺伝子または遺伝子産物によりプロファイルがもたらされるが、より多く、例えば、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種または少なくとも５０種の遺伝子または遺伝子産物をプロファイルに使用することができる。遺伝子発現プロファイル（フィンガープリントまたはサインとも称される）は、組織もしくは細胞型（唾液腺など）、疾患の特定の病期、または予測可能に遺伝子発現に影響を及ぼす任意の他の明確なもしくは同定可能な状態と関連付けることができる。遺伝子発現プロファイルは、特定の遺伝子の相対的な発現レベルならびに絶対的な発現レベルを含んでよく、基線または対照試料のプロファイル（シェーグレン症候群を有さない被験体由来の試料など）と比較して試験試料に照らして考察することができる。一部の実施例では、被験体における遺伝子発現プロファイルは、アレイ（核酸アレイなど）において読み取られる。
【００３５】
健康な対照の被験体：適切な検査の後にシェーグレン症候群と臨床的に診断されない被験体である。
【００３６】
ハイブリダイゼーション：ＤＮＡ、ＲＮＡの２本の鎖の相補性領域間、またはＤＮＡとＲＮＡとの間に塩基対を形成し、それによって二重鎖分子を形成することである。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質およびハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変動する。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（Ｎａ＋濃度など）により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定される。特定の程度のストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する算出については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（第９章および第１１章）で考察されている。下記は、典型的なハイブリダイゼーション条件のセットであり、限定的なものではない：
非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列を検出）
ハイブリダイゼーション：６５℃で１６時間、５×ＳＳＣ
２回洗浄：それぞれ、室温（ＲＴ）で１５分間、２×ＳＳＣ
２回洗浄：それぞれ、６５℃で２０分間、０．５×ＳＳＣ
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列を検出）
ハイブリダイゼーション：６５℃〜７０℃で１６〜２０時間、５×〜６×ＳＳＣ
２回洗浄：それぞれ、ＲＴで５〜２０分間、２×ＳＳＣ
２回洗浄：それぞれ、５５℃〜７０℃で３０分間、１×ＳＳＣ
低いストリンジェンシー（少なくとも６０％の同一性を共有する配列を検出）
ハイブリダイゼーション：ＲＴ〜５５℃で１６〜２０時間、６×ＳＳＣ
少なくとも２回洗浄：それぞれ、ＲＴ〜５５℃で２０〜３０分間、２×〜３×ＳＳＣ
免疫抑制薬：体の免疫系応答を低下させる能力を有する任意の作用剤または化合物を含む。一部の実施形態では、免疫抑制薬はコルチコステロイドである。他の実施形態では、免疫抑制薬は、小分子（シクロスポリンなど）またはモノクローナル抗体（サイトカイン遮断薬など）である。
【００３７】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸分子、タンパク質または細胞など）は、その成分が天然に存在する生物体の細胞もしくは組織または生物体自体の他の生物学的成分、例えば他の染色体のおよび染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞などから離れて実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準の精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質も包含する。
【００３８】
発現レベルの測定：本明細書で使用される、特定のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルの測定は、試料中に存在するｍｉＲ遺伝子産物の量を定量化することを指す。定量化は、数値的または相対的のいずれかであってよい。ｍｉＲ遺伝子産物の発現の検出は、ＲＴ−ＰＣＲによってなど、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の方法を用いて実現することができる。ｍｉＲ遺伝子産物の発現を検出することは、ｍｉＲの発現と相関性があるｍｉＲの成熟型または前駆体型（すなわち、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）のいずれかの発現を検出することを含む。一般には、ｍｉＲの検出方法は、ＲＴ−ＰＣＲによってなど、配列特異的な検出を伴う。ｍｉＲ特異的なプライマーおよびプローブを、当技術分野で公知の前駆体ｍｉＲ核酸配列および成熟ｍｉＲ核酸配列を使用して設計することができる（ｍｉＲＢａｓｅマイクロＲＮＡデータベースがＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇのオンラインで利用可能である）。
【００３９】
主要な実施形態では、検出される変化は、参照値または健康な対照の被験体などの対照と比較した、発現の増加または減少である。一部の実施例では、検出される増加または減少は、対照と比較して少なくとも２倍の増加または減少である。他の実施例では、検出される増加または減少は、表１〜６のいずれかにおいてｍｉＲについて示されている倍率変化の端数を切り捨てて最も近い整数にした（２．０５および２．６７はどちらも端数を切り捨てて２にするように）、または最も近い整数に丸めた（２．０５は２になり、２．６７な３になるように）変化である。方法の他の実施形態では、増加または減少は、診断上有意な量の増加または減少であり、診断の統計的確率をもたらすのに十分な大きさの変化を指す。特定の実施例では、変化は、表１〜６のいずれかに示されている変化の大きさ、または表１６、１９、または２０に示されている２種の試料間の強度の幾何平均の倍率変化である。
【００４０】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）：植物、動物およびウイルスにおいて遺伝子発現を制御する一本鎖ＲＮＡ分子である。マイクロＲＮＡをコードする遺伝子は転写されて一次転写物マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を形成し、それがプロセシングされて前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と名付けられた短いステムループ分子を形成し、その後ヌクレオチド鎖切断されて成熟マイクロＲＮＡを形成する。成熟マイクロＲＮＡは、およそ２１〜２３ヌクレオチドの長さであり、１種または複数種の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡｓ）の３’ＵＴＲと部分的に相補的である。「マイクロＲＮＡ遺伝子産物」という用語は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡおよび成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ＊と称される小型成熟ｍｉＲＮＡ種を含む）を含む。
【００４１】
マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの切断を促進することによって、または細胞転写物の翻訳を遮断することによって遺伝子発現を調節する。これまで、９００種を超える特有のヒトマイクロＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲと称される）が同定されている。エプスタイン・バール・ウイルス由来のｍｉＲ（ｅｂｖ−ｍｉＲ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス由来のｍｉＲ（ｋｓｈｖ−ｍｉＲ）、単純ヘルペスウイルス１由来のｍｉＲ（ｈｓｖ１−ｍｉＲ）、ヒト免疫不全ウイルス１由来のｍｉＲ（ｈｉｖ１−ｍｉＲ）およびヒトサイトメガロウイルス由来のｍｉＲ（ｈｃｍｖ−ｍｉＲ）を含めた多数のヒトウイルスｍｉＲも同定されている。ウイルスｍｉＲはヒト細胞において同定されており、場合によっては癌などのヒト疾患に関連付けられている。
【００４２】
新規のマイクロＲＮＡが同定されると、研究者らは、研究を発表する前に配列を登録して、特有のマイクロＲＮＡのそれぞれに公式な番号が割り当てられることを確実にし（ｍｉＲＢａｓｅ  ＲｅｇｉｓｔｒｙはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいてオンラインで利用可能である）、特定のマイクロＲＮＡの同一性に関して文献中でどんな多義性も排除する。ｍｉＲＢａｓｅ登録番号によって参照されるすべてのｍｉＲは、本出願の出願日時点でｍｉＲＢａｓｅ登録されているので、参照により本明細書に組み込まれる。ｍｉＲＢａｓｅ登録は既知のｍｉＲについての配列情報も提供する。
【００４３】
非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）：プロスタグランジンの産生を阻害することによって機能する抗炎症剤の１種である。ＮＳＡＩＤＳは、抗炎症作用、鎮痛作用および解熱作用を発揮する。ＮＳＡＩＤＳの例としては、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、スリンダク、アスピリン、次サリチル酸コリン、ジフルニサル、フェノプロフェン、インドメタシン、メクロフェナム酸、サルサラート、トルメチンおよびサリチル酸マグネシウムが挙げられる。
【００４４】
作動可能に連結：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は近接していて、２つのタンパク質コード領域を結びつける必要がある場合、同じ読み枠内にある。
【００４５】
患者：本明細書で使用される、「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。治療するために好ましい患者はヒトである。「患者」および「被験体」は本明細書では互換的に使用される。
【００４６】
薬学的に許容できるビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容できる担体（ビヒクル）は従来のものである。Ｅ．  Ｗ．  ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５年）に、１種または複数種の治療用化合物、治療用分子または治療剤の医薬送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００４７】
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与様式に左右される。例えば、非経口的な製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、ブドウ糖液、グリセリンまたは同種のビヒクルなどの薬学的および生理的に許容できる流体を含む注射用流体を含む。固形組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤またはカプセルの形態）に対しては、従来の無毒性固形担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性な担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料およびｐＨ緩衝剤および同類のもの、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの少量の無毒性補助物質を含有してよい。
【００４８】
疾患を予防すること、治療することまたは寛解させること：疾患（シェーグレン症候群など）を「予防すること」は、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「治療すること」は、疾患または病的な状態の徴候または症状を、それが発症し始めたあとに寛解させる治療介入を指す。「寛解させること」は、疾患の徴候または症状の数または重症度を低下させることを指す。
【００４９】
予後：特定の疾患または障害に苦しんでいる被験体に対する臨床転帰の可能性である。シェーグレン症候群に関しては、予後は、被験体において疾患が進行する（悪化する）（疾患の重篤な徴候および／または症状が発症する）可能性（確率）を表す。例えば、予後不良により、口内乾燥、嚥下困難、齲歯、歯肉疾患、口がひりひりすること、および口の腫大、耳下腺の感染症ならびに口唇乾燥につながる可能性がある唾液腺の炎症の増加が示され得る。場合によっては、予後不良により、呼吸通路を裏打ちしている腺（肺感染症につながる）および膣（反復性の膣感染症につながる）などの他の腺の腫大が示される。予後不良により、関節痛または炎症（関節炎）、レイノー病、肺炎症、リンパ節腫脹、腎疾患、神経疾患または筋疾患、または血管の炎症（血管炎）などの腺外の症状も示される。
【００５０】
組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有する、または２つの別の分離した配列のセグメントを人工的に組み合わせることによって作製した配列を有する核酸分子である。この人工的な組合せは、化学合成によって、または単離された核酸分子セグメントを人工的に操作することによって、例えば遺伝子工学技術によって実現することができる。
【００５１】
唾液の流れを回復させること：例えばシェーグレン症候群に起因し得る、唾液の流れが縮小した被験体における唾液産生を増加させるプロセスを指す。一部の実施形態では、唾液の流れを回復させることは、治療剤を投与することによって実現することができる。一部の実施例では、治療剤はピロカルピン（Ｓａｌａｇｅｎ（商標））またはセビメリン（Ｅｖｏｘａｃ（商標））などの医薬である。他の実施例では、治療剤は、健常人と比較してシェーグレン症候群患者において下方制御される、または唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者と比較して唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において下方制御される単離されたｍｉＲ遺伝子産物である。
【００５２】
リボザイム：触媒作用をするＲＮＡ分子である。場合によっては、リボザイムは、他のＲＮＡ分子の特異的部位に結合し、そのＲＮＡ分子のリン酸ジエステル結合の加水分解を触媒することができる。
【００５３】
唾液腺：唾液を産生する外分泌腺である。本明細書で使用される、「唾液腺」は、例えば、耳下腺、小唾液腺、顎下線、舌下腺およびフォンエブネル腺を含めた、ヒト被験体の任意の唾液腺を含む。特定の実施例では、唾液腺は、小唾液腺または耳下腺である。口腔全体を通して６００を超える小唾液腺が位置している。小唾液腺は直径１〜２ｍｍである。耳下腺は、下顎枝ならびに外耳の前側および下方を覆う顔の皮下組織に位置する一対の腺である。
【００５４】
配列の同一性／類似性：２つ以上の核酸配列間、または２つ以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、配列間の同一性または類似性によって表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性によって測定することができる；パーセンテージが高いほど、配列の同一性が高い。配列類似性は、パーセンテージ類似性によって測定することができる（保存的なアミノ酸置換を考慮に入れる）；パーセンテージが高いほど、配列の類似性が高い。核酸またはアミノ酸配列の相同体またはオルソログは、標準の方法を用いて整列化すると、比較的高度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、遠縁種（ヒト配列とＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列など）と比較して、近縁種（ヒト配列とマウス配列など）由来である場合に著しい。
【００５５】
比較するために配列を整列化する方法は当技術分野で周知である。種々のプログラムおよび整列化アルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２巻：４８２頁、１９８１年；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁、１９７０年；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁、１９８８年；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３巻：２３７〜４４頁、１９８８年；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５巻：１５１〜３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６巻：１０８８１〜９０頁、１９８８年；ＨｕａｎｇらＣｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ２４巻：３０７〜３１頁、１９９４年に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年に、配列の整列化方法および相同性の算出について詳しい考察が提示されている。
【００５６】
配列解析プログラムのｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびインターネットを含めたいくつかの供給源から入手可能である。追加の情報はＮＣＢＩのウェブサイトで見ることができる。
【００５７】
唾液分泌促進医薬：ムスカリン性アセチルコリン受容体を刺激することによって唾液産生を上昇させる経口的に利用可能な医薬である。現在、ピロカルピン（Ｓａｌａｇｅｎ（商標））およびセビメリン（Ｅｖｏｘａｃ（商標））が、米国においてこの表示の認可を受けている。
【００５８】
シェーグレン症候群：涙および唾液を産生する腺を攻撃し、破壊する免疫細胞を特徴とする自己免疫障害である。シェーグレン症候群は、生命にはかかわらない、または寿命を短縮しないが、生活の質を著しく低下させる可能性がある。この障害の顕著な特徴である症状は、口内乾燥およびドライアイである。シェーグレン症候群は、皮膚、鼻および膣の乾燥も引き起こす可能性があり、腎臓、血管、肺、肝臓、膵臓および脳を含めた体内の他の器官に影響を及ぼす可能性がある。シェーグレン症候群は、米国の１〜４百万人に影響を及ぼしており、女性は９倍この疾患を発症しやすい。シェーグレン罹患者の大多数は、診断される時点で４０歳以上である。シェーグレン症候群は、一次状態として、または全身性エリテマトーデス（「ループス」）、関節リウマチまたは強皮症などの結合組織疾患に付随する二次障害として発生し得る。
【００５９】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：ＲＮＡｉ経路を通じて遺伝子発現を調節する二本鎖核酸分子である（例えば、Ｂａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４２８〜９頁、２００１年；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１巻：４９４〜８頁、２００１年；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／４４８９５；ＷＯ  ０１／３６６４６；ＷＯ  ９９／３２６１９；ＷＯ  ００／０１８４６；ＷＯ  ０１／２９０５８；ＷＯ  ９９／０７４０９；およびＷＯ  ００／４４９１４を参照されたい）。ｓｉＲＮＡ分子は、一般に２０〜２５ヌクレオチドの長さであり、それぞれの３’末端に２ヌクレオチドの突出を有する。しかし、ｓｉＲＮＡは平滑末端であってもよい。一般に、ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖は標的ｍＲＮＡなどの標的核酸と少なくとも部分的に相補的である。ｓｉＲＮＡは、「低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）」、「低分子干渉ＲＮＡ」または「短い阻害性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）」とも称される。本明細書で使用される、ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡのみを含有するｓｉＲＮＡ分子に限定する必要はないがＲＮＡｉの能力または活性を有する化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。ある実施例では、ｓｉＲＮＡ分子は、生物活性またはｍｉＲ遺伝子産物の発現を低下させるまたは阻害する分子である。
【００６０】
被験体：生きている多細胞性の脊椎動物生物体、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーである。
【００６１】
治療の、または療法：診断および治療の両方を含む総称である。治療は、障害の通常の過程を変化させるために処方される方策（治療剤の投与を含む）を指す。
【００６２】
治療剤：被験体に適切に投与されたときに所望の治療効果または予防効果を誘導することができる、アンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカインなどの化合物、小分子または他の組成物である。
【００６３】
治療有効量：特定の医薬品または治療剤で治療される被験体または細胞において所望の効果を実現するために十分なその医薬品または治療剤の量である。作用剤の有効量は、これらに限定されないが、治療される被験体または細胞および治療組成物の投与様式を含めたいくつかの因子に左右される。
【００６４】
上方制御されるまたは活性化される：核酸分子（マイクロＲＮＡなど）の発現に関して使用される場合、遺伝子産物の産生の増加をもたらす任意のプロセスを指す。本開示において、遺伝子産物は、一次転写物マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）または成熟マイクロＲＮＡであってよい。遺伝子の上方制御は、マイクロＲＮＡ遺伝子産物の産生における任意の検出可能な増加を含む。ある特定の実施例では、マイクロＲＮＡの産生は、対照と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも４０倍増加する。一部の実施例では、対照は、シェーグレン症候群を有さない１体または複数体の被験体におけるマイクロＲＮＡの発現の相対量である。
【００６５】
ベクター：ベクターは、ベクターの、宿主細胞において複製し、かつ／または組み込む能力を妨害することなく外来核酸を挿入することを可能にする核酸分子である。ベクターは、複製開始点などの、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含んでよい。ベクターは、１種または複数種の選択マーカー遺伝子および他の遺伝因子も含んでよい。発現ベクターは、挿入された遺伝子（単数または複数）の転写および翻訳を可能にするために必要な制御配列を含有するベクターである。本明細書の一部の実施形態では、ベクターはプラスミドベクターである。他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【００６６】
他に特に説明がなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または（もしくは）」は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、「および」を含むものとする。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、もしくはＢ、または、ＡおよびＢを含めて示す。さらに、核酸またはポリペプチドについて示したすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子の質量値はおよそであり、説明のために提供していることを理解されたい。本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは等価の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載している。本明細書で言及したすべての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。矛盾する場合には、用語の説明を含めた本明細書に従うものとする。さらに、材料、方法および実施例は、例示のみであり、限定するものではない。
【００６７】
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
健康な対照の被験体と比較して、シェーグレン症候群患者において示差的に発現されるマイクロＲＮＡを同定することが本明細書に記載されている。唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者と比較して、正常な唾液の流れを示すシェーグレン症候群患者において上方制御されるマイクロＲＮＡも開示されている。４７０種のヒトマイクロＲＮＡおよび６４種のヒトウイルスマイクロＲＮＡのマイクロアレイ発現解析を使用して、対照と比較して、シェーグレン症候群患者において少なくとも２倍、上方制御または下方制御される多数のマイクロＲＮＡを同定した。場合によっては、マイクロＲＮＡ遺伝子産物の発現は４５倍または９２倍と同程度に変化した。したがって、被験体における１種または複数種の示差的に発現されるマイクロＲＮＡの発現を測定することにより、被験体がシェーグレン症候群を有すると診断することができる。
【００６８】
被験体の生体試料中の少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）遺伝子産物のレベルを測定することによって、被験体がシェーグレン症候群を有すると診断する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、表１〜６および表１６〜２１のいずれか１つに列挙されている任意のｍｉＲ遺伝子産物を含む。特定の実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物である。被験体の生体試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の、対照と比較したレベルの変化により、被験体がシェーグレン症候群を有することが示される。本明細書に記載の通り、シェーグレン症候群を有する被験体の生体試料における、対照と比較したｍｉＲ−１５０のレベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３のレベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９のレベルの上昇、ｍｉＲ−７６８−３ｐのレベルの上昇、ｍｉＲ−５７４のレベルの低下、ｍｉＲ−５１３のレベルの上昇、ｍｉＲ−１８８のレベルの上昇、ｍｉＲ−２０２のレベルの上昇、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４のレベルの上昇、ｍｉＲ−５６５のレベルの上昇、ｍｉＲ−５０９のレベルの上昇、ｍｉＲ−１５４のレベルの上昇、ｍｉＲ−９９ｂのレベルの上昇、ｍｉＲ−５６４のレベルの上昇、ｍｉＲ−３０ｂのレベルの上昇またはｍｉＲ−４０９−３ｐのレベルの上昇、またはそれらの組合せにより、被験体がシェーグレン症候群を有することが示される。一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの上昇または低下は、診断上有意な量の上昇または低下である。
【００６９】
方法の一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物の発現の診断上有意な増加または減少は少なくとも２倍である。他の実施形態では、診断上有意な増加または減少は少なくとも３倍である。一部の実施例では、対照と比較して、シェーグレン症候群を有する被験体の生体試料において、ｍｉＲ−１５０が少なくとも３２倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３が７倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９が４５倍増加する、ｍｉＲ−７６８−３ｐが３倍増加する、ｍｉＲ−５７４が４倍減少する、ｍｉＲ−５１３が６倍増加する、ｍｉＲ−１８８が少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−２０２が少なくとも２倍増加する、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４が少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−５６５が６倍増加する、ｍｉＲ−５０９が少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−１５４が少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−９９ｂが少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−５６４が６倍増加する、ｍｉＲ−３０ｂが３倍増加する、またはｍｉＲ−４０９−３ｐが少なくとも２倍増加する、またはそれらが組み合わされる。
【００７０】
他の実施例では、対照と比較して、シェーグレン症候群を有する被験体の生体試料において、ｍｉＲ−１５０が３８倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３が２１倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９が９少なくとも２倍増加する、ｍｉＲ−７６８−３ｐが３倍増加する、ｍｉＲ−５７４が２倍減少する、ｍｉＲ−５１３が１６倍増加する、ｍｉＲ−１８８が７倍増加する、ｍｉＲ−２０２が５倍増加する、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４が６倍増加する、ｍｉＲ−５６５が７倍増加する、ｍｉＲ−５０９が１８倍増加する、ｍｉＲ−１５４が３倍増加する、ｍｉＲ−９９ｂが５倍増加する、ｍｉＲ−５６４が２９倍増加する、ｍｉＲ−３０ｂが４倍増加する、またはｍｉＲ−４０９−３ｐが３倍増加する、またはそれらが組み合わされる。
【００７１】
診断上有意な増加または減少は、倍率変化を算出するために用いることができる、ｍｉＲ発現における特異的な倍率変化、またはシェーグレン症候群患者と正常な対照（または病巣スコアが高いシェーグレン症候群患者と病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者）との間の強度の幾何平均のいずれかを提供する表１〜６、表１６、表１９または表２０のいずれか１つから決定することもできる。
【００７２】
診断方法の他の実施例では、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３またはｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９遺伝子産物である。本明細書に記載の通り、対照と比較して、シェーグレン症候群を有する被験体において、ｍｉＲ−１５０のレベルが上昇し、ｍｉＲ−１８３のレベルが低下し、ｍｉＲ−４９４のレベルが上昇し、ｍｉＲ−５１３のレベルが上昇し、ｍｉＲ−５４８ｃのレベルが低下し、ｍｉＲ−５６４のレベルが上昇し、ｍｉＲ−５６５のレベルが上昇し、ｍｉＲ−５８５のレベルが低下し、ｍｉＲ−７６８−５ｐのレベルが低下し、ｍｉＲ−８０１のレベルが上昇し、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３のレベルが上昇し、かつ／またはｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９のレベルが上昇する。
【００７３】
場合によっては、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１４８ａまたはｍｉＲ−３２遺伝子産物であり；シェーグレン症候群を有する被験体の生体試料における、対照と比較したｍｉＲ−１５０のレベルの上昇、ｍｉＲ−１８３のレベルの低下、ｍｉＲ−４９４のレベルの上昇、ｍｉＲ−５１３のレベルの上昇、ｍｉＲ−５４８ｃのレベルの低下、ｍｉＲ−５６４のレベルの上昇、ｍｉＲ−５６５のレベルの上昇、ｍｉＲ−５８５のレベルの低下、ｍｉＲ−７６８−５ｐのレベルの低下、ｍｉＲ−８０１のレベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３のレベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９のレベルの上昇、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄのレベルの低下、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅのレベルの低下、ｍｉＲ−１２５ａのレベルの低下、ｍｉＲ−１４８ａのレベルの低下またはｍｉＲ−３２のレベルの低下、またはそれらの組合せにより、被験体がシェーグレン症候群を有することが示される。
【００７４】
一部の実施形態では、方法は、１種または複数種の追加のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することをさらに含む。したがって、一部の実施例では、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−７６８−３ｐまたはｍｉＲ−９遺伝子産物、またはそれらの組合せをさらに含む。本明細書で教示される通り、対照と比較して、シェーグレン症候群を有する被験体においてｍｉＲ−１２６のレベルが上昇し、ｍｉＲ−１８９が低下し、ｍｉＲ−２００ｃが低下し、ｍｉＲ−２１２が上昇し、ｍｉＲ−２２が低下し、ｍｉＲ−３０ｂが上昇し、ｍｉＲ−３２６が低下し、ｍｉＲ−３２８が低下し、ｍｉＲ−５７４が低下し、ｍｉＲ−５７５が上昇し、ｍｉＲ−７６８−３ｐが上昇し、かつ／またはｍｉＲ−９が低下する。
【００７５】
方法の一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物の発現の診断上有意な増加または減少は、少なくとも２倍である。他の実施形態では、診断上有意な増加または減少は少なくとも３倍である。特定の実施例では、対照と比較して、シェーグレン症候群を有する被験体の生体試料において、ｍｉＲ−１５０が少なくとも３２倍増加する、ｍｉＲ−１８３が７倍減少する、ｍｉＲ−４９４が６倍増加する、ｍｉＲ−５１３が６倍増加する、ｍｉＲ−５４８ｃが７倍減少する、ｍｉＲ−５６４が６倍増加する、ｍｉＲ−５６５が６倍増加する、ｍｉＲ−５８５が１０倍減少する、ｍｉＲ−７６８−５ｐが８倍減少する、ｍｉＲ−８０１が７倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３が７倍増加する、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９が４５倍増加する、ｍｉＲ−１２６が４倍増加する、ｍｉＲ−１８９が４倍減少する、ｍｉＲ−２００ｃが３倍減少する、ｍｉＲ−２１２が４倍増加する、ｍｉＲ−２２が３倍減少する、ｍｉＲ−３０ｂが３倍増加する、ｍｉＲ−３２６が３倍減少する、ｍｉＲ−３２８が４倍減少する、ｍｉＲ−５７４が４倍減少する、ｍｉＲ−５７５が４倍増加する、ｍｉＲ−７６８−３ｐが３倍増加するまたはｍｉＲ−９が３倍減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄが２倍減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅが２倍減少する、ｍｉＲ−１２５ａが２倍減少する、ｍｉＲ−１４８ａが２倍減少する、またはｍｉＲ−３２が２倍減少する、またはそれらが組み合わされる。
【００７６】
本明細書に開示されている方法が、表１〜６または表１６〜２１に列挙されている任意の単一のｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物の任意の組合せもしくは部分的組合せのレベルを測定することを含むことが理解される。特定の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物の組合せは、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４０９−３ｐ、または任意のその部分的組合せを含む。他の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物の組合せは、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−６５０、または任意のその部分的組合せを含む。他の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物の組合せは、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−５８５およびｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、または任意のその部分的組合せを含む。他の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物の組合せは、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３およびｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、または任意のその部分的組合せを含む。他の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物の組合せは、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３およびｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、または任意のその部分的組合せを含む。他の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物の組合せは、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｍｉＲ−９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３およびｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、または任意のその部分的組合せを含む。他の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物の組合せは、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１４８ａおよびｍｉＲ−３２、または任意のその部分的組合せを含む。
【００７７】
場合によっては、方法は、単一のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。一実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−５７４である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ−１３である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５０である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−７６８−３ｐである。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−５７４である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−５１３である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１８８である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２０２である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−５６５である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−５０９である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５４である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−９９ｂである。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−５６４である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−３０ｂである。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−４０９−３ｐである。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１８３である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−５４８ｃである。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−５８５である。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−７６８−５ｐである。別の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−８０１である。
【００７８】
ｍｉＲ発現を検出し測定する方法は、当技術分野で周知であり、以下に詳細が記載されている。一部の実施例では、単一のｍｉＲ遺伝子産物を分析するときなど、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定するためにＲＴ−ＰＣＲを使用する。他の場合では、多数のｍｉＲ遺伝子産物を測定するとき、マイクロアレイ解析を使用することが望ましい。
【００７９】
測定されるｍｉＲ遺伝子産物は、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）または成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ＊と表される小型成熟ｍｉＲＮＡ産物を含む）であってよい。
【００８０】
方法の一部の実施形態では、生体試料は小唾液腺または耳下腺唾液腺などの唾液腺である。場合によっては、この種類の腺に対する生検手順は侵入性が低いので、小唾液腺から試料を得ることが望ましい。他の実施形態では、生体試料は唾液である。マイクロＲＮＡを唾液中に見出されるエキソソームから単離できることが決定されている（Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．  １６巻：３４〜３８頁、２０１０年）。したがって、一部の実施例では、唾液試料のエキソソームからマイクロＲＮＡを単離する。一部の実施形態では、生体試料は、血液、または、血漿もしくは血清などのその成分である。
【００８１】
一部の実施形態では、方法は、シェーグレン症候群と診断された被験体に対して適切な療法を提供することをさらに含む。一部の実施例では、療法は、唾液産生を促進する作用剤を投与することを含む。そのような作用剤は、当技術分野で公知であり、それらとしてピロカルピンまたはセビメリンが挙げられる。他の実施例では、療法は、コルチゾールまたはプレドニゾンなどのコルチコステロイドを投与することを含む。他の実施例では、療法は、小分子（例えばシクロスポリン）またはモノクローナル抗体（例えばサイトカイン遮断薬）などの免疫抑制薬を投与することを含む。他の実施例では、療法は、対照と比較して、シェーグレン症候群患者において下方制御される、または、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者と比較して、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において下方制御されると同定されたｍｉＲ遺伝子産物などの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を投与することを含む。他の実施例では、療法は、対照と比較して、シェーグレン症候群患者において上方制御される、または、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者と比較して、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において上方制御されると同定されたｍｉＲ遺伝子産物を阻害する作用剤などのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する作用剤を投与することを含む。
【００８２】
シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤を患者に投与することによって、またはシェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して下方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を患者に投与することによってシェーグレン症候群患者を治療する方法も本明細書で提供される。
【００８３】
一部の実施形態では、シェーグレン症候群患者において上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、表１または表２に列挙されている、制御の列で「下方」（正常な被験体において発現が減少していることを示す）に分類されている任意遺伝子産物である。一部の実施形態では、上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、表３に列挙されている、制御の列で「上方」（健康な被験体と比較して、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において発現が増加していることを示す）と分類されている任意のｍｉＲ遺伝子産物である。一部の実施形態では、シェーグレン症候群患者において上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、表１６、表１９または表２０に列挙されている任意遺伝子産物であり、シェーグレン症候群患者における強度値の幾何平均は正常対照における値よりも大きい。特定の実施形態では、上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂ、またはｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物である。他の実施例では、上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３またはｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９遺伝子産物である。作用剤は、１種または複数種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害することができる核酸分子、ポリペプチド、小分子または他の化合物などの任意の化合物であってよい。一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する作用剤は、ｍｉＲ遺伝子産物に特異的なアンチセンス化合物である。一部の実施例では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムである。
【００８４】
一部の実施形態では、シェーグレン症候群患者において下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、表１または表２に列挙されている、制御の列で「上方」（正常な被験体において発現が増加していることを示す）と分類されている任意の遺伝子産物である。一部の実施形態では、下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、表３に列挙されている、制御の列で「下方」（健康な被験体と比較して、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において発現が減少していることを示す）に分類されている任意のｍｉＲ遺伝子産物である。一部の実施形態では、シェーグレン症候群患者において下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、表１６、表１９または表２０に列挙されている任意の遺伝子産物であり、シェーグレン症候群患者の強度値の幾何平均は正常対照の値よりも小さい。特定の実施形態では、下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−５ｐまたはｍｉＲ−９遺伝子産物である。特定の実施例では、下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−５７４遺伝子産物である。一部の実施例では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物を投与することは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターなどのｍｉＲ遺伝子産物をコードするベクターを投与することを含む。他の実施形態では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、例えば、ネイキッドｍｉＲとして、またはリポソーム製剤（例えばｍｉＲはリポソーム中にカプセル化することができる）、陽イオン性脂質またはポリペプチド担体を使用して送達することができる。
【００８５】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物を治療有効量で患者に投与することによってシェーグレン症候群患者における唾液の流れを回復させる方法が、本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物は、表４または表５に列挙されている、制御の列で「上方」（唾液の流れが不十分な患者と比較して、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者において上方制御されることを示す）に分類されている任意のｍｉＲ遺伝子産物である。特定の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物である。他の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３３０またはｍｉＲ−３４０遺伝子産物である。一部の実施形態では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどのｍｉＲ遺伝子産物をコードするベクターを投与することを含む。他の実施形態では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、例えば、ネイキッドｍｉＲとして、またはリポソーム製剤（例えばｍｉＲをリポソーム中にカプセル化することができる）、陽イオン性脂質またはポリペプチド担体を使用して送達することができる。
【００８６】
被験体の生体試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルの使用であって、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物であり、（ｉ）被験体の生体試料における、対照と比較したｍｉＲ−１５０のレベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３のレベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９のレベルの上昇、ｍｉＲ−７６８−３ｐのレベルの上昇、ｍｉＲ−５７４のレベルの低下、ｍｉＲ−５１３のレベルの上昇、ｍｉＲ−１８８のレベルの上昇、ｍｉＲ−２０２のレベルの上昇、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４のレベルの上昇、ｍｉＲ−５６５のレベルの上昇、ｍｉＲ−５０９のレベルの上昇、ｍｉＲ−１５４のレベルの上昇、ｍｉＲ−９９ｂのレベルの上昇、ｍｉＲ−５６４のレベルの上昇、ｍｉＲ−３０ｂのレベルの上昇、またはｍｉＲ−４０９−３ｐのレベルの上昇、またはそれらの組合せにより、被験体がシェーグレン症候群を有することが示され、ここで上昇または低下は診断上有意な量の上昇または低下であり；かつ／または（ｉｉ）シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤を患者に投与する、またはシェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して下方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を患者に投与することによる、被験体がシェーグレン症候群を有すると診断するため、および／またはシェーグレン症候群を有する被験体を治療するための使用がさらに提供される。一部の実施形態では、使用は、シェーグレン症候群と診断された被験体に対して適切な療法または第２の適切な療法を提供することをさらに含む。
【００８７】
シェーグレン症候群患者を治療するための薬剤の調製における、シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤、またはシェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して下方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物の使用も提供される。
【００８８】
シェーグレン症候群を治療する方法またはシェーグレン症候群患者における唾液の流れを回復させるための方法において使用するための、シェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する治療有効量の作用剤、またはシェーグレン症候群を有する患者において対照と比較して下方制御される治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物がさらに提供される。
【００８９】
シェーグレン症候群患者における唾液の流れを回復させるための薬剤の調製における、治療有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物の使用であって、ｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物である、使用も提供される。
【００９０】
シェーグレン症候群患者について、炎症の尺度である病巣スコアが高い、または低いと診断する方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、被験体の生体試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、表６、表１９または表２０のいずれか１つに列挙されている任意のｍｉＲ遺伝子産物であってよい。例えば、表６には、病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者と病巣スコアが高いシェーグレン症候群患者との間で示差的に発現されるｍｉＲが示されている。表１９および表２０は、病巣スコアが高いシェーグレン症候群患者、病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者および正常な対照の間の、示されたｍｉＲについての強度の幾何平均を提供する。
【００９１】
一部の実施例では、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、またはｍｉＲ−６５０遺伝子産物である。シェーグレン症候群患者の生体試料における、対照と比較したｍｉＲ−１５０のレベルの上昇、ｍｉＲ−７６８−３ｐのレベルの上昇、ｍｉＲ−５７４のレベルの低下、ｍｉＲ−５１３のレベルの上昇、ｍｉＲ−１８８のレベルの上昇、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９のレベルの上昇、ｍｉＲ−５０１のレベルの上昇、ｍｉＲ−１２６＊のレベルの上昇、ｍｉＲ−３４２のレベルの上昇、ｍｉＲ−３３０のレベルの上昇、ｍｉＲ−１３５ｂのレベルの上昇、ｍｉＲ−１４２−５ｐのレベルの上昇、またはｍｉＲ−６５０のレベルの上昇、またはそれらの組合せにより、シェーグレン症候群患者の病巣スコアが高いことが示される。それに加えてまたはその代わりに、シェーグレン症候群患者の生体試料における、対照と比較したｍｉＲ−１５０のレベルの低下、ｍｉＲ−７６８−３ｐのレベルの低下、ｍｉＲ−５７４のレベルの上昇、ｍｉＲ−５１３のレベルの低下、ｍｉＲ−１８８のレベルの低下、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９のレベルの低下、ｍｉＲ−５０１のレベルの低下、ｍｉＲ−１２６＊のレベルの低下、ｍｉＲ−３４２のレベルの低下、ｍｉＲ−３３０のレベルの低下、ｍｉＲ−１３５ｂのレベルの低下、ｍｉＲ−１４２−５ｐのレベルの低下、またはｍｉＲ−６５０のレベルの低下、またはそれらの組合せにより、そのシェーグレン症候群患者の病巣スコアが低いことが示される。
【００９２】
一部の実施形態では、上昇または低下は、診断上有意な量の上昇または低下である。一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける診断上有意な上昇または低下は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍である。
【００９３】
他の実施形態では、方法は、被験体の生体試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの測定であって、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−３７５またはｍｉＲ−３７７遺伝子産物である、測定を含む。シェーグレン症候群患者の生体試料における、対照と比較したｍｉＲ−１４２−３ｐのレベルの上昇、ｍｉＲ−１４２−５ｐのレベルの上昇、ｍｉＲ−１４６ｂのレベルの上昇、ｍｉＲ−１５０のレベルの上昇、ｍｉＲ−１５５のレベルの上昇、ｍｉＲ１８１ａのレベルの上昇、ｍｉＲ−２００ａのレベルの低下、ｍｉＲ−２１９のレベルの低下、ｍｉＲ−２２３のレベルの上昇、ｍｉＲ−２９９−３ｐのレベルの低下、ｍｉＲ−３３８のレベルの低下、ｍｉＲ−３７５のレベルの低下、ｍｉＲ−３７７のレベルの低下、またはｍｉＲ−６５０のレベルの上昇、またはそれらの組合せにより、そのシェーグレン症候群患者の病巣スコアが高いことが示される。対照的に、シェーグレン症候群患者の生体試料における、対照と比較したｍｉＲ−１４２−３ｐのレベルの低下、ｍｉＲ−１４２−５ｐのレベルの低下、ｍｉＲ−１４６ｂのレベルの低下、ｍｉＲ−１５０のレベルの低下、ｍｉＲ−１５５のレベルの低下、ｍｉＲ１８１ａのレベルの低下、ｍｉＲ−２００ａのレベルの上昇、ｍｉＲ−２１９のレベルの上昇、ｍｉＲ−２２３のレベルの低下、ｍｉＲ−２９９−３ｐのレベルの上昇、ｍｉＲ−３３８のレベルの上昇、ｍｉＲ−３７５のレベルの上昇、ｍｉＲ−３７７のレベルの上昇、またはｍｉＲ−６５０のレベルの低下、またはそれらの組合せにより、シェーグレン症候群患者の病巣スコアが低いことが示される。
【００９４】
本明細書に記載の診断方法および治療方法のために、対照は、参照値などの任意の適切な対照であってよい。例えば、参照値（または、２種以上のｍｉＲ遺伝子産物を測定する場合は、複数の値）は、病巣スコアが高い、または病巣スコアが低いことが既知であるシェーグレン症候群患者を含めたシェーグレン症候群患者における平均のｍｉＲ遺伝子産物の発現に基づいた歴史的な値であってよい。対照は、健康な被験体（シェーグレン症候群と診断されていない被験体）由来の生体試料であってもよい。
【００９５】
シェーグレン症候群を治療するための治療剤をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるプロセスであって、（ｉ）細胞培養物を候補作用剤と接触させるステップと、（ｉｉ）ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物から選択される少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定するステップであって、対照と比較した、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよび／またはｍｉＲ−４０９−３ｐのレベルの低下、および／またはｍｉＲ−５７４のレベルの上昇により、候補作用剤が、シェーグレン症候群を治療するための治療剤であると同定されるステップとを含むプロセスも、本明細書において提供される。
【００９６】
シェーグレン症候群患者を治療するための治療剤をスクリーニングするための、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルの使用であって、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４０９−３ｐ遺伝子産物であり、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４０９−３ｐのレベルを低下させる、かつ／またはｍｉＲ−５７４のレベルを上昇させる作用剤がシェーグレン症候群を治療するための治療剤である、使用も提供される。
【００９７】
表１〜６および表１６〜２１のいずれか１つに列挙されているｍｉＲ遺伝子産物から選択されるｍｉＲ遺伝子産物と特異的にハイブリダイズする少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含むアレイも提供される。一部の実施形態では、アレイは、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４０９−３ｐからなる群から選択されるｍｉＲ遺伝子産物と特異的にハイブリダイズする少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む。シェーグレン症候群を有する被験体に対する適切な療法を選択するためのそのようなアレイの使用がさらに提供される。アレイは、選択された療法の経過をモニターして、本明細書に開示されている通り、シェーグレン症候群に関連する１種または複数種のｍｉＲのレベルの上昇または低下から明らかなように、その療法がシェーグレン症候群の治療に有効であるかを決定するためにも使用することができる。
【００９８】
表１〜６および表１６〜２１のいずれか１つに列挙されているｍｉＲ遺伝子産物から選択されるｍｉＲ遺伝子産物に特異的な少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプローブを含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、ｍｉＲ−１５０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４０９−３ｐからなる群から選択されるｍｉＲ遺伝子産物に特異的な少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００９９】
ＩＶ．マイクロＲＮＡの命名法およびヌクレオチド配列
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲとしても公知である）は、動物、植物およびウイルスならびに少なくとも１種の単細胞真核生物のゲノムにおいて見出されるより長い転写物から発現される短いＲＮＡ配列である（Ｍｏｌｎａｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４７巻：１１２６〜１１２９頁、２００７年；Ｚｈａｏら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２１巻：１１９０〜１２０３頁、２００７年）。マイクロＲＮＡは、標的遺伝子転写物の相補的部位に結合して翻訳抑制または転写物の分解を引き起こすことによって標的遺伝子の発現を制御する（Ｐｉｌｌａｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １７巻：１１８〜１２６頁、２００７年）。これらの低分子ＲＮＡ分子は、発生、細胞増殖、アポトーシス、代謝、形態形成および疾患（とりわけ、癌）に関連するいくつもの生物学的なプロセスに結びつけられている（ＫｌｏｏｓｔｅｒｍａｎおよびＰｌａｓｔｅｒｋ、Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １１巻：４４１〜４５０頁、２００６年）。
【０１００】
マイクロＲＮＡをコードする遺伝子は転写されて一次転写物マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を形成し、それがプロセシングされて前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と名付けられた短いステムループ分子を形成し、その後ヌクレオチド鎖切断されて成熟マイクロＲＮＡを形成する。成熟マイクロＲＮＡは、およそ２１〜２３ヌクレオチドの長さであり、１種または複数種の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡｓ）の３’ＵＴＲと部分的に相補的である。
【０１０１】
マイクロＲＮＡに対する命名法のスキームが十分に確立されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３４巻：Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁、２００６年；Ａｍｂｒｏｓら、ＲＮＡ  ９巻：２７７〜２７９頁、２００３年；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２巻：Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁、２００４年）。例えば、マイクロＲＮＡの名称は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに対する「ｈｓａ」などの３つまたは４つの文字種の接頭辞、および「１５０」などの数字の接尾辞を含み、「ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０」という完全な名称になる。２つ以上のヘアピン前駆体分子から発現される成熟ｍｉＲＮＡ配列は、「−１」および「−２」によって区別する（ｍｉＲ−６−１およびｍｉＲ−６−２など）。関連成熟マイクロＲＮＡ配列を発現する関連ヘアピン遺伝子座は文字入りの接尾辞を有する（ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂなど）。場合によっては、ヘアピン前駆体の５’アームと３’アームの両方から成熟ｍｉＲＮＡが同定され、「３ｐ」または「５ｐ」と称される（ｍｉＲ−７６８−３ｐおよびｍｉＲ−７６８−５ｐなど）。ウイルスマイクロＲＮＡの名称は、マイクロＲＮＡが由来する遺伝子座に関連する（例えば、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１は、エプスタイン・バール・ウイルスＢＡＲＴ遺伝子座由来である）。
【０１０２】
マイクロＲＮＡ遺伝子産物の配列は、科学文献および特許文献を通じて十分記載されており、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒによって提供される（以前はＳａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供されていた）ｍｉＲＢａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。ｍｉＲＢａｓｅ登録により、公開されたすべての動物、植物およびウイルスのマイクロＲＮＡヌクレオチド配列が提供される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６巻：Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁、２００８年）。ｍｉＲＢａｓｅにより、前駆体マイクロＲＮＡ（ステムループｍｉＲＮＡ）、成熟ｍｉＲＮＡおよび小型マイクロＲＮＡ種（ｍｉＲ＊）の配列が提供される。前駆体ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡと称されるｍｉＲＮＡの１種を主に発現する。しかし、小型ｍｉＲＮＡ配列も検出されていて、ｍｉＲ＊と称される。
Ｖ．マイクロＲＮＡの発現を検出および測定する方法
マイクロＲＮＡは、種々の疾患を診断し、予後判定するためのバイオマーカーとして見込みがある非翻訳ＲＮＡ分子である（Ｃａｌｉｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３巻：１７９３〜８０１頁、２００５年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  １２０巻：６３５〜４７頁、２００５年；Ｖｏｌｉｎｉａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３巻：２２５７〜６１頁、２００６年；Ｙａｎａｉｈａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９巻：１８９〜９８頁、２００６年；Ｃｕｍｍｉｎｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３巻：３６８７〜９２頁、２００６年）。多数の予後バイオマーカーを組み合わせることにより、個々のバイオマーカーと比較して、シェーグレン症候群などの特定の疾患を診断し、治療する能力が改善される可能性がある。したがって、本明細書において提供される方法の一部の実施形態では、シェーグレン症候群を診断するため、およびシェーグレン症候群患者に対して予後を予測し、見込みのある治療を開発するためにマイクロＲＮＡの発現プロファイルを使用する。
【０１０３】
前駆体マイクロＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡの配列は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒによる、以前はＳａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって維持されていたオンラインで利用可能なｍｉＲＢａｓｅデータベースを通してなど、公的に入手可能である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６巻：Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁、２００８年；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３４巻：Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁、２００６年；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２巻：Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁、２００４年を参照されたい）。
【０１０４】
マイクロＲＮＡの発現の検出および定量化は、当技術分野で周知のいくつもの方法のいずれか１つによって実現することができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２１１０００号および同第２００７／０２９９０３０号を参照されたい）。必要に応じて、対象とするマイクロＲＮＡに対する既知配列を使用して、本明細書に記載の検出方法において使用するために特異的なプローブおよびプライマーを設計することができる。
【０１０５】
場合によっては、マイクロＲＮＡの検出方法は、細胞、生体液試料または組織試料（例えば、唾液腺または唾液）などの試料から核酸を単離することを必要とする。ＲＮＡ、とりわけｍｉＲＮＡを含めた核酸は、当技術分野で公知の任意の適切な技法を用いて単離することができる。例えば、フェノールに基づく抽出が、ＲＮＡを単離するための一般的な方法である。フェノールに基づく試薬は、細胞および組織を破壊し、その後ＲＮＡを汚染物質から分離するための変性剤およびＲＮａｓｅ阻害剤の組合せを含有する。フェノールに基づく単離手順により、１０〜２００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ種を回収することができる（例えば前駆体ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡ、５ＳリボソームＲＮＡおよび５．８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、およびＵ１核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ））。さらに、ＴＲＩＺＯＬ（商標）またはＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（商標）を使用した抽出などの抽出手順により、高分子および低分子すべてのＲＮＡが精製され、これらの抽出手順は、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含有する生体試料から全ＲＮＡを単離するための効率的な方法である。
【０１０６】
マイクロＲＮＡのマイクロアレイ解析は、当技術分野で公知の任意の方法に従って実現することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００８／０５４８２８；Ｙｅら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻（４号）：４１６〜４２３頁、２００３年；Ｃａｌｉｎら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５３巻（１７号）：１７９３〜１８０１頁、２００５年を参照されたい）。一実施例では、細胞試料または組織試料からＲＮＡを抽出し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して全ＲＮＡから低分子ＲＮＡ（１８〜２６ヌクレオチドのＲＮＡ）をサイズ選択する。オリゴヌクレオチドリンカーを低分子ＲＮＡの５’末端および３’末端に結合させ、生じたライゲーション産物を、１０サイクルの増幅を伴うＲＴ−ＰＣＲ反応の鋳型として使用する。センス鎖ＰＣＲプライマーの５’末端にフルオロフォアを結合させ、それによってＰＣＲ産物のセンス鎖を蛍光標識する。ＰＣＲ産物を変性させ、次いでマイクロアレイにハイブリダイズさせる。アレイ上の対応するマイクロＲＮＡ捕獲プローブ配列と相補的な、標的核酸と称されるＰＣＲ産物が、塩基対合を介して、捕獲プローブが付着しているスポットにハイブリダイズする。次いでそのスポットを、マイクロアレイレーザースキャナーを使用して励起させると蛍光が発生する。次いで、各スポットの蛍光強度を、いくつもの陽性対照および陰性対照およびアレイデータの正規化法を用いて、特定のｍｉＲＮＡのコピー数によって評価し、それにより特定のｍｉＲＮＡの発現レベルが査定される。
【０１０７】
代替的な方法では、細胞、生体液または組織試料から抽出された低分子ＲＮＡ画分（ｍｉＲＮＡを含む）を含有する全ＲＮＡを、低分子ＲＮＡのサイズ選択をせずに直接使用し、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび蛍光標識した短いＲＮＡリンカーのどちらかを使用して３’末端を標識する。ＲＮＡ試料を、３０℃で２時間インキュベートし、続いて８０℃で５分間Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを熱失活させることによって標識する。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕獲プローブ配列と相補的なフルオロフォア標識されたｍｉＲＮＡが、塩基対合を介して、捕獲プローブが付着しているスポットにハイブリダイズする。マイクロアレイのスキャンおよびデータ処理を上記の通り行う。
【０１０８】
対象とする遺伝子（マイクロＲＮＡを含む）の発現を検出するための当技術分野で公知のいくつもの方法のいずれか１つを用いて、マイクロＲＮＡの発現を検出することができる。ｑＲＴ−ＰＣＲ、アレイ、マイクロアレイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ＳＡＧＥを含めたいくつものこれらの方法は、以下にさらに詳細を記載している。ｍｉＲＮＡの検出は、当技術分野で公知の方法に従って、大規模配列決定（ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によっても実現することができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら、Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．  １０巻（５号）：４９０〜２００９頁  Ｍａ４９７、２００９年）。
Ａ．ＲＴ−ＰＣＲ
マイクロＲＮＡを含めたＲＮＡを定量化するための方法は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、方法は、ＲＴ−ＰＣＲを利用する。一般に、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの最初のステップは、ＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに逆転写することであり、続いてそのｃＤＮＡをＰＣＲ反応において指数関数的に増幅させることである。一般的に使用される２種の逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。しかし、当技術分野で公知の任意の適切な逆転写酵素をＲＴ−ＰＣＲに使用することができる。逆転写ステップは、一般に、状況および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的なプライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを使用してプライミングする。例えば、抽出されたＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用して逆転写することができる。次いで、得られたｃＤＮＡをその後のＰＣＲ反応における鋳型として使用することができる。
【０１０９】
ＰＣＲのステップに種々の熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、多くの場合５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが３’−５’校正エンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが使用される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲでは、標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズさせるために、一般にはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用するが、等価の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ反応に特有のアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブを設計して２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出する。プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長できないものであり、また、それをレポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識する。２つの色素がプローブ上ですぐ近くに位置すると、レポーター色素からレーザー誘起されたどんな放射もクエンチャー色素によってクエンチされる。増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、プローブが鋳型依存的な様式で切断される。生じたプローブ断片は溶液中で分離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは第２のフルオロフォアのクエンチング作用を受けない。合成される新しい分子のそれぞれに対してレポーター色素の１つの分子が遊離し、クエンチされていないレポーター色素を検出することにより、データの定量化を解釈するための基礎がもたらされる。
【０１１０】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの市販の装置を使用して行うことができる。一実施例では、５’ヌクレアーゼ手順は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）などのリアルタイム定量ＰＣＲデバイスで実行する。システムは、サーマルサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータを含む。システムにより、サーマルサイクラーにおいて９６ウェル形式で試料が増幅される。増幅の間、９６ウェルすべてに対して、レーザー誘起された蛍光シグナルが繊維光学ケーブルを通じてリアルタイムに収集され、ＣＣＤで検出される。システムは、機器を運転するため、およびデータを解析するためのソフトウェアを含む。
【０１１１】
エラーおよび試料間の変動の影響を最小にするために、内部標準を使用してＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定のレベルで発現し、実験処理によって影響を受けない。遺伝子発現パターンを正規化するために通常使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータアクチン、および１８ＳリボソームＲＮＡに対するｍＲＮＡである。
【０１１２】
ＲＮＡの単離、精製、プライマーの伸長および増幅を含めた、ＲＮＡ供給源として固定化パラフィン包埋組織を使用する、遺伝子発現を定量化するための代表的なプロトコールのステップは、種々の出版された学術論文に示されている（Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉａｇ．  ２巻：８４〜９１頁、２０００年；Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５８巻：４１９〜２９頁、２００１年を参照されたい）。簡単に述べると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋組織試料を約１０μｍの厚さの切片に切ることから開始する。次いでＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを取り除く。あるいは、組織、細胞または流体の試料から直接ＲＮＡを見つける。ＲＮＡ濃度を分析した後、必要であれば、ＲＮＡの修復および／または増幅ステップを含めることができ、遺伝子特異的プロモーターを使用してＲＮＡを逆転写し、その後ＲＴ−ＰＣＲを行う。増幅に使用するプライマーは、マイクロＲＮＡなどの対象とする遺伝子の特有のセグメントを増幅させるために選択される。特定のマイクロＲＮＡを増幅させるために使用することができるプライマーは、市販されている（場合によっては）、または周知の方法に従って、公的に入手可能なマイクロＲＮＡ配列を用いて設計し、合成することができる。
Ｂ．遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）
ＳＡＧＥは、数多くの遺伝子転写物を、各転写物に対して個々のハイブリダイゼーションプローブを供給する必要なく同時かつ定量的に分析することを可能にする別の方法である。まず、転写物を一義的に同定するために十分な情報を含有する短い配列タグ（約１０〜１４塩基対）が各転写物特有の位置から得られれば、そのタグを生成する。次いで、多くの転写物を互いに連結して、配列決定することができる長い連続的な分子を形成し、多数のタグのアイデンティティを同時に明らかにする。転写物の任意の集団の発現パターンを、個々のタグの存在量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる（例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０巻：４８４〜７頁、１９９５年；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ  ８８巻：２４３〜５１頁、１９９７年を参照されたい）。
【０１１３】
Ｃ．Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）
ＩＳＨは、対象とする遺伝子の発現を検出し、比較するための別の方法である。ＩＳＨでは、核酸ハイブリダイゼーションの技術を単一細胞レベルまでに適用し、推定の基礎とし、細胞化学、免疫細胞化学および免疫組織化学の分野と組み合わせて、維持し同定されるべき細胞マーカーの形態を維持し同定することを可能にし、組織および血液の試料などの集団中の特異的な細胞に配列を局在化させることができる。ＩＳＨは、相補的な核酸を使用して、組織の一部分または一切片に（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、または組織が十分小さければ、組織全体に（ホールマウントＩＳＨ）１種または複数種の特異的な核酸配列を局在化させる、ハイブリダイゼーションの１種である。ＲＮＡ  ＩＳＨを使用してマイクロＲＮＡの発現などの組織中の発現パターンをアッセイすることができる。
【０１１４】
試料細胞または組織を処理して、マイクロＲＮＡに特異的なプローブなどのプローブが細胞に進入することができるよう、透過性を上昇させる。処理した細胞にプローブを加え、妥当な温度でハイブリダイゼーションさせ、過剰なプローブを洗い流す。相補的なプローブを放射性タグ、蛍光タグまたは抗原性タグで標識して、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡または免疫測定を使用して組織中のプローブの場所および量を決定することができるようにする。試料は、唾液腺試料などの本明細書に記載の任意の試料であってよい。対象とするマイクロＲＮＡの配列が既知であるので、対象とする遺伝子に特異的に結合するようにプローブを設計することができる。
【０１１５】
Ｄ．Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＣＲ
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、ＩＳＨの前の、ＰＣＲに基づく標的核酸配列の増幅である。ＲＮＡを検出するために、細胞内逆転写ステップを導入して、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前にＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡを生成する。これにより、低コピーのＲＮＡ配列を検出することができる。
【０１１６】
Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前に、細胞または組織試料を固定し、透過処理して形態を保存し、増幅される細胞内配列にＰＣＲ試薬が接近できるようにする。次に標的配列のＰＣＲ増幅を、懸濁液中に保持されたインタクトな細胞において、または直接細胞遠心分離調製物もしくはスライドグラス上の組織切片においてのいずれかで行う。前者の手法では、ＰＣＲ反応混合物中に懸濁させた固定化細胞を、従来のサーマルサイクラーを使用して熱サイクルさせる。ＰＣＲ後、細胞を細胞遠心分離してスライドグラスにのせ、ＩＳＨまたは免疫組織化学によって細胞内ＰＣＲ産物を視覚化する。そのあと反応混合物の蒸発を防ぐために密封するカバーガラスの下、試料をＰＣＲ混合物でおおうことによってスライドグラス上でＩｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲを行う。従来のもしくは特別に設計されたサーマルサイクラーの加熱ブロックの上部に直接スライドグラスを置くことによって、または熱サイクル乾燥器を使用することによってのいずれかで熱サイクルを行う。
【０１１７】
細胞内ＰＣＲ産物の検出は、一般に、ＰＣＲ産物に特異的なプローブを用いたＩＳＨによる間接的なｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、または熱サイクルの間にＰＣＲ産物に取り込まれる標識したヌクレオチド（ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、３Ｈ−ＣＴＰまたはビオチン−１６−ｄＵＴＰなど）を直接検出することによる、ＩＳＨを伴わない直接的なｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの２つの異なる技法の一方によって実現される。
【０１１８】
Ｅ．マイクロＲＮＡの発現をプロファイリングするためのアレイ
本明細書で提供される特定の実施形態では、アレイを使用してマイクロＲＮＡの発現を評価すること、例えばシェーグレン症候群を診断または予知することができる。特定のマイクロＲＮＡのセット（ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｍｉＲ−９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３およびｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９など）に特異的なプローブまたはプライマーを含むアレイについて述べる場合、そのようなアレイは、列挙したマイクロＲＮＡに特異的なプローブまたはプライマーを含み、対照プローブ（例えば、インキュベート条件が十分であるかを確認するため）および場合によって追加のマイクロＲＮＡに対するプローブをさらに含んでよい。典型的な対照プローブとしては、ＧＡＰＤＨ、アクチンおよびＹＷＨＡＺが挙げられる。一実施例では、アレイはマルチウェルプレート（例えば９８ウェルプレートまたは３６４ウェルプレート）である。
【０１１９】
一実施例では、アレイは、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５６５、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−８０１、ｍｉＲ−９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３およびｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９を認識することができるプローブまたはプライマーを含む、それらから実質的になる、またはそれらからなる。オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーは、プローブと標的配列（本明細書に開示されているマイクロＲＮＡの１つなど）との間のハイブリダイゼーションシグナルを検出可能にするために、１種または複数種の検出可能な標識をさらに含んでよい。
【０１２０】
ｉ．アレイの基板
アレイの固体支持体は、有機ポリマーから形成することができる。固体支持体の適切な材料としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルロエチレン、ポリ二フッ化（ｄｉｆｌｕｒｏｉｄｅ）ビニリデン、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン（ｐｏｌｙｃｈｏｌｏｒｏｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ポリスルホン、水酸化二軸延伸ポリプロピレン、アミノ化二軸延伸ポリプロピレン、チオール化二軸延伸ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、エチレン（ｔｈｙｌｅｎｅ）メタクリル酸、およびそれらのコポリマーの混合物が挙げられるが、これらに限定されない（米国特許第５，９８５，５６７号を参照されたい）。
【０１２１】
一般に、固体支持体表面を形成するために使用することができる材料の適切な特性としては、活性化すると支持体の表面にオリゴヌクレオチドなどの生体分子が共有結合可能になるように表面を活性化しやすいこと；生体分子を「ｉｎ  ｓｉｔｕ」合成しやすいこと；オリゴヌクレオチドまたはタンパク質（抗体など）に占有されていない支持体の領域において非特異的に結合しにくいように、または非特異的な結合が生じた場合に、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質（抗体など）を除去することなくそのような材料を容易に表面から除去することができるように、化学的に不活性であることが挙げられる。
【０１２２】
一実施例では、固体支持体の表面はポリプロピレンである。ポリプロピレンは、化学的に不活性であり、疎水性である。一般に、非特異的な結合は回避可能であり、検出感度は向上する。ポリプロピレンは種々の有機酸（ギ酸など）、有機作用剤（アセトンまたはエタノールなど）、塩基（水酸化ナトリウムなど）、塩（塩化ナトリウムなど）、酸化剤（過酢酸など）および鉱酸（塩酸など）に対して良好な耐薬品性を有する。ポリプロピレンも、低蛍光バックグラウンドをもたらし、それによりバックグラウンド干渉が最小になり、対象とするシグナルの感度が増す。
【０１２３】
別の実施例では、表面活性化有機ポリマーは固体支持体の表面として使用される。表面活性化有機ポリマーの一例は、高周波プラズマ放電によってアミノ化されたポリプロピレン材料である。そのような材料は、ヌクレオチド分子を結合させるために容易に利用される。活性化有機ポリマーのアミン基は、ヌクレオチド分子がポリマーに結合することができるようにヌクレオチド分子と反応性である。カルボキシル化された基、ヒドロキシル化された基、チオール化された基または活性エステル基などの他の反応性基も使用することができる。
【０１２４】
ｉｉ  アレイの形式
多種多様なアレイの形式を、本開示に従って使用することができる。一例としては、当技術分野で一般にディップスティックと称されるオリゴヌクレオチドバンドの直線状アレイが挙げられる。別の適切な形式としては、別々の細胞の二次元パターン（６４×６４アレイの４０９６個のます目など）が挙げられる。当業者に理解されている通り、これらに限定されないが、スロット（長方形）アレイおよび環状アレイを含めた他のアレイの形式が、同様に使用に適している（米国特許第５，９８１，１８５号を参照されたい）。一部の実施例では、アレイはマルチウェルプレートである。一実施例では、アレイは、糸、膜またはフィルムであるポリマー媒体上に形成される。有機ポリマー媒体の例は、厚さ約１ミル（０．００１インチ）〜約２０ミルのポリプロピレンシートであるが、フィルムの厚さは重要ではなく、相当広範囲にわたって変動してよい。アレイは、耐久性に加え、低バックグラウンドの蛍光を示す二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）フィルムを含んでよい。
【０１２５】
本開示のアレイの形式は、種々の異なる種類の形式に含まれてよい。「形式」は、例えばマイクロタイタープレート（例えば、マルチウェルプレート）、試験管、無機シート、ディップスティックなどの、固体支持体を付加することができる任意の形式を含む。例えば、固体支持体がポリプロピレンの糸である場合、１種または複数種のポリプロピレンの糸をプラスチックのディップスティック型デバイスに付加することができる；ポリプロピレンの膜をスライドグラスに付加することができる。特定の形式は、それ自体は重要でない。固体支持体またはそこに吸収される任意のバイオポリマーの機能的挙動に影響を与えることなく固体支持体を付加することができること、および形式（ディップスティックまたはスライドなど）が、デバイスが導入される任意の材料（臨床試料およびハイブリダイゼーション溶液など）に対して安定であることが必要なだけである。
【０１２６】
本開示のアレイは、種々の手法によって調製することができる。一実施例では、オリゴヌクレオチド配列を別々に合成し、次いで固体支持体に結合させる（米国特許第６，０１３，７８９号を参照されたい）。別の実施例では、配列を支持体上に直接合成して所望のアレイをもたらす（米国特許第５，５５４，５０１号を参照されたい）。オリゴヌクレオチドを固体支持体に共有結合させるため、およびオリゴヌクレオチドを支持体上に直接合成するための適切な方法は、当業者に公知である；適切な方法の概要は、Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１７巻：３０６〜１０頁、１９９４年において見ることができる。一実施例では、オリゴヌクレオチドは、固体支持体上にオリゴヌクレオチドを調製するための従来の化学的技法を用いて支持体上に合成される（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ  ８５／０１０５１およびＷＯ  ８９／１０９７７または米国特許第５，５５４，５０１号を参照されたい）。
【０１２７】
適切なアレイは、４種の塩基の前駆体を所定のパターンに置くことによってアレイのウェル中でオリゴヌクレオチドを合成するための自動手段を使用して作製することができる。簡単に述べると、マルチチャネル自動化学送達系を使用してオリゴヌクレオチドプローブ集団を、基板にわたって平行列（総計で送達系のチャネルの数に対応する）に創出する。第１の方向にオリゴヌクレオチドの合成が完了した後、次いで基板を９０°回転させて、その時第１のセットに対して垂直になった第２の（２°）セットの列での合成の進行を可能にすることができる。このプロセスにより、その交差によって複数の別々の細胞が生成するマルチチャネルアレイが創出される。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端、またはオリゴヌクレオチドの５’末端のいずれかでポリプロピレンの支持体に結合させることができる。一実施例では、オリゴヌクレオチドは、３’末端で固体支持体に結合している。しかし、当業者は、固体支持体に結合させるためにオリゴヌクレオチドの３’末端の使用または５’末端の使用のどちらが適切であるかを決定することができる。一般に、３’末端領域および５’末端領域におけるオリゴヌクレオチドプローブの内部相補性により、支持体への結合が決定される。
【０１２９】
特定の実施例では、アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ：標的配列ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする１種または複数種の標識を含む。
【０１３０】
Ｆ．ｍｉＲ遺伝子発現解析結果の出力
遺伝子発現は、上記の任意の技法、または当技術分野で公知の任意の他の方法を用いて評価することができる。本明細書に記載の通り、遺伝子発現は、例えば、標準の装置を使用して検出することができる標識したプローブを使用して測定することができる。例えば、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲ（一般には遺伝子産物に特異的な標識したプローブを使用する）を用いた遺伝子発現の測定は、マイクロアレイスキャナーまたは標識を検出するための他の適切なスキャナーを使用して定量化することができる。一部の実施形態では、遺伝子発現を測定するために使用するデバイスはマイクロアレイスキャナーである。マイクロアレイスキャナーは周知であり、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＭｏｄｅｌ  Ｇ２５０ＧＢ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒなど、市販されている。
【０１３１】
遺伝子発現解析の結果は、いくつもの出力デバイスまたは当技術分野で公知の形式のいずれか１つを使用して伝達することができる。例えば、出力デバイスはコンピュータスクリーンまたは印刷された紙などの視覚的な出力デバイスであってよい。他の実施例では、出力デバイスは、スピーカーなどの聴覚的な出力デバイスであってよい。他の実施例では、出力デバイスはプリンターである。場合によっては、データは患者の電子カルテに記録される。
【０１３２】
ＶＩ．シェーグレン症候群を治療するためのマイクロＲＮＡの発現の調節
多くのマイクロＲＮＡがシェーグレン症候群患者において示差的に発現されることが本明細書に開示されている。そのように、シェーグレン症候群患者において下方制御される１種または複数種のマイクロＲＮＡのレベルが上昇すること、またはシェーグレン症候群患者において上方制御される１種または複数種のマイクロＲＮＡのレベルが低下することが、シェーグレン症候群の発症もしくは進行を阻害するため、および／またはシェーグレン症候群の１つまたは複数の徴候または症状（例えば、唾液の流れが低下すること）を軽減するために有益であり得る。
【０１３３】
理論に縛られることを望むものではないが、細胞における１種または複数種のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化により、シェーグレン症候群の発症または進行をまねく可能性があるこれらのｍｉＲに対する１種または複数種の目的の標的が調節解除される可能性があると考えられている。したがって、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを変化させること（例えばシェーグレン症候群において上方制御されるｍｉＲのレベルを低下させることによって、またはシェーグレン症候群において下方制御されるｍｉＲのレベルを上昇させることによって）により、シェーグレン症候群の１つまたは複数の徴候または症状が首尾よく治療されるまたは寛解する可能性がある。
【０１３４】
Ａ．上方制御されるマイクロＲＮＡを阻害する作用剤の使用
シェーグレン症候群患者を、対照（健康な対照の被験体など）と比較してシェーグレン症候群患者において上方制御される、または、対照（唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者など）と比較して唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において上方制御されるｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する作用剤を治療有効量で患者に投与することによって治療する方法が本明細書で提供される。
【０１３５】
本明細書で使用される、「ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害すること」は、治療後のｍｉＲ遺伝子産物の前駆体型および／または活性型、成熟型の産生が、治療前に産生された量よりも少ないことを意味する。当業者は、当技術分野で公知の、および本明細書に記載の技法を使用して、ｍｉＲ発現が被験体において阻害されているかどうかを容易に決定することができる。阻害は、遺伝子発現のレベル（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することによる）またはプロセシングのレベル（例えばｍｉＲ前駆体から成熟ｍｉＲへのプロセシングを阻害することによる）で起こり得る。
【０１３６】
本明細書で使用される、ｍｉＲ発現を阻害する化合物の治療有効量は、生物学的効果（シェーグレン症候群の１つまたは複数の徴候または症状を軽減することなど）をもたらすために十分な量である。例えば、作用剤により、標的ｍｉＲの発現レベルを対照または参照値と比較して、所望の量、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも４０倍低下させることができる。一部の実施例では、診断上有意な量は、表１〜６に示されているｍｉＲ遺伝子発現における倍率変化である。
【０１３７】
当業者は、被験体のサイズおよび体重；疾患の進行の程度；被験体の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに、投与が局部的であるか全身的であるかなどのいくつかの因子を考慮することにより、所与の被験体に投与される作用剤の治療有効量を容易に決定することができる。当業者は、ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する作用剤を被験体に投与するための適切な投薬レジメンも容易に決定することができる。
【０１３８】
一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する単一の作用剤を、治療を必要とする被験体に投与する。他の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する２種以上の作用剤（２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種またはそれ以上など）を被験体に投与する。２種以上の作用剤を被験体に投与する場合、作用剤は同時に（もしくは互いに数分以内など、立て続けに）投与することができ、または別の時間に投与することができる。例えば、２種以上の作用剤は、１時間、１２時間、１日、２日、５日、１週間、２週間または１カ月の間を開けて投与することができる。
【０１３９】
一部の実施形態では、ｍｉＲ発現を阻害する作用剤はシェーグレン症候群に対する１種または複数種の追加の治療と組み合わせて被験体に投与することができる。典型的なシェーグレン症候群の治療としては、唾液産生を促進する作用剤（ピロカルピンまたはセビメリンなど）を投与すること、水分補充療法（点眼薬など）、またはＮＳＡＩＤＳまたはコルチコステロイドまたは他の免疫抑制薬もしくは免疫調節薬を投与することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する作用剤は、これらに限定されないが、１種または複数種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害することができる核酸分子、ポリペプチド、抗体または小分子などの任意の種類の化合物であってよい。一部の実施形態では、作用剤はアンチセンス化合物である。
【０１４１】
標的ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するために、ｍｉＲ遺伝子産物を特異的に標的とする任意の種類のアンチセンス化合物を使用することが企図されている。一部の実施例では、作用剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムから選択されたアンチセンス化合物である。アンチセンス化合物を設計し、調製し、使用する方法は、当業者の能力の範囲内である。さらに、開示されているｍｉＲ遺伝子産物についての配列は公的に入手可能である。シェーグレン症候群において示差的に発現されるｍｉＲ（または他の標的核酸）を特異的に標的とするアンチセンス化合物は、ｐｒｉ−マイクロＲＮＡ配列、ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ配列または成熟マイクロＲＮＡ配列などの標的ヌクレオチド配列と相補的な化合物を設計することによって調製することができる。アンチセンス化合物は、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズするために、標的核酸分子と１００％相補的である必要はない。例えば、二本鎖化合物の場合、化合物のアンチセンス化合物またはアンチセンス鎖は、選択された標的核酸配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％相補的であってよい。アンチセンス化合物を特異性についてスクリーニングする方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許出願公開第２００３−０２２８６８９号を参照されたい）。
【０１４２】
一般に、アンチセンス技術の後ろにある原理は、アンチセンス化合物が標的核酸とハイブリダイズし、遺伝子発現の活性または機能の調節に影響を与えることである。遺伝子発現の調節は、例えば、標的ＲＮＡの分解または占有率に基づく阻害によって実現することができる。分解による標的ＲＮＡ機能の調節の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＤＮＡ様アンチセンス化合物とハイブリダイゼーションしたときのＲＮａｓｅ  Ｈに基づく標的ＲＮＡの分解である。
【０１４３】
標的の分解による遺伝子発現の調節の別の例は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用したＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡｉは、標的の内在性ｍＲＮＡレベルの配列特異的な低下をまねく二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ様オリゴヌクレオチドの導入を伴うアンチセンス媒介遺伝子サイレンシングの一形態である。多くの場合アンチセンス化合物と分類される他の化合物は、リボザイムである。リボザイムは、他のＲＮＡ分子の特異的な部位に結合し、そのＲＮＡ分子のリン酸ジエステル結合の加水分解を触媒することができる、触媒作用をするＲＮＡ分子である。リボザイムは、ｍｉＲ遺伝子産物などの標的核酸を直接切断することによって遺伝子発現を調節する。
【０１４４】
上記のアンチセンス化合物のそれぞれが、配列特異的な標的遺伝子制御をもたらす。この配列特異性により、アンチセンス化合物が、ｍｉＲ遺伝子産物などの対象とする標的核酸を選択的に調節するための有効なツールになる。
【０１４５】
一部の実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ｍｉＲ遺伝子産物に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションおよび遺伝子発現の調節を可能にする任意の適切な長さであってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは変動してよいが、一般には１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドを含めた、約１５〜約４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約２０〜約３５ヌクレオチドの長さである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその類似体であってよい。さらに本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは修飾されていなくてよい、または、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された糖部分、修飾された塩基、またはそれらの組合せなどの１つまたは複数の修飾を含んでよい。オリゴヌクレオチドの修飾については以下に詳細を記載している。
【０１４６】
他の実施形態では、アンチセンス化合物はｓｉＲＮＡ分子である。開示されている方法に有用なｓｉＲＮＡとしては、長さ約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド、好ましくは長さ約１９〜約２５ヌクレオチド、例えば長さ約２１〜約２３ヌクレオチドなどの短い二本鎖ＲＮＡが挙げられる。ｓｉＲＮＡは、標準のワトソン・クリック塩基対合相互作用によって互いにアニーリングしたセンスＲＮＡ鎖および相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖で構成されている。センス鎖は、標的ｍｉＲ遺伝子産物内に含有される核酸配列と実質的に同一な核酸配列を含む。本明細書で使用される、標的配列と「実質的に同一」なｓｉＲＮＡ核酸配列は、標的配列と同一である、または標的配列と１ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドが異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含んでよく、または一本鎖「ヘアピン」領域により分離された、２つの相補的部分（塩基対合している）を有する単一分子であってよい。
【０１４７】
ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化によって天然に存在するＲＮＡとは異なる、変化したＲＮＡであってもよい。そのような変化は、例えばｓｉＲＮＡの一方の末端もしくは両末端に、またはｓｉＲＮＡの１つまたは複数の内部ヌクレオチドに、非ヌクレオチド材料を付加すること；ヌクレアーゼ消化に対して抵抗性のｓｉＲＮＡを生じる修飾；またはｓｉＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することを含んでよい。ｓｉＲＮＡの一方の鎖または両方の鎖は、３’突出も含んでよい。本明細書で使用される、「３’突出」は、二重鎖ＲＮＡ鎖の３’末端から伸長している少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。したがって、特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さ１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）、長さ１〜約５ヌクレオチド、長さ１〜約４ヌクレオチド、または長さ２〜約４ヌクレオチドの３’突出を少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、３’突出はｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチドの長さである。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’突出を含んでよい。
【０１４８】
他の実施形態では、アンチセンス化合物はリボザイムである。リボザイムは、ｍｉＲ遺伝子産物の近接する核酸配列と相補的な基質結合領域を有する核酸分子であり、ｍｉＲ遺伝子産物を特異的に切断することができる。基質結合領域は、標的ｍｉＲ遺伝子産物と１００％相補的である必要はない。例えば、基質結合領域は、例えば、ｍｉＲ遺伝子産物の近接する核酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％または少なくとも約９５％相補的であってよい。酵素性の核酸は、塩基、糖、および／またはリン酸基における修飾も含んでよい。
【０１４９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムなどのアンチセンス化合物は、化学的もしくは生物学的に作出することができる、または、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の発現に関して以下にさらに詳細を説明する通り、組換えプラスミドベクターまたは組換えウイルスベクターから発現させることができる。アンチセンス化合物を作出し、試験するための典型的な方法は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号および同第４，９８７，０７１号；米国特許出願公開第２００２／０１７３４７８号および同第２００４／００１８１７６号；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻：１００４頁、１９９３年；ＷｅｒｎｅｒおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：２０９２〜２０９６頁、１９９５年；Ｈａｍｍａｎｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ９巻：２５〜３１頁を参照されたい）。
【０１５０】
一部の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物に特異的なアンチセンス化合物は、ヌクレアーゼ抵抗性を増大させ、かつ／または化合物の活性を増加させるための１つまたは複数の修飾を含有する。修飾されたアンチセンス化合物は、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むアンチセンス化合物を含む。本明細書で定義された通り、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、主鎖にリン原子を保持しているオリゴヌクレオチドおよび主鎖にリン原子を有さないオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５１】
修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖の例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含めたホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキル−ホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が、３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’に結合している逆の極性を有するボラノホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。上記のリン含有結合の調製について教示している代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
リン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖の例は、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または１種または複数種の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間結合によって形成される主鎖である。これらの主鎖としては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有する主鎖；シロキサン主鎖；スルフィド主鎖、スルホキシド主鎖およびスルホン主鎖；ホルムアセチル主鎖およびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル主鎖およびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ主鎖およびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート主鎖およびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有する他の主鎖が挙げられる。上記のオリゴヌクレオシドの調製について教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物のヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方が新しい基と置き換わる。そのような修飾された化合物の１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称されるオリゴヌクレオチド模倣物である。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖主鎖がアミド含有主鎖、具体的にはアミノエチルグリシン主鎖と置き換わっている。塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製について教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４巻、１４９７〜１５００頁、１９９１年）において見ることができる。
【０１５４】
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換された糖部分も含有してよい。一部の実施例では、オリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含んでよい：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルもしくはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニルもしくはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルもしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換された、または置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびＣ２〜Ｃ１０アルキニルであってよい。他の実施形態では、アンチセンス化合物は、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的な性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的な性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基。一実施例では、修飾は２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知である）を含む（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ．、７８巻、４８６〜５０４頁、１９９５年）。他の実施例では、修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（２’−ＤＭＡＯＥとしても公知である）または２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても当技術分野で公知である）を含む。
【０１５５】
同様の修飾を、化合物の他の位置において生じさせることもできる。アンチセンス化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有してもよい。修飾された糖構造の調製について教示している代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
オリゴヌクレオチドは、塩基の修飾または置換も含んでよい。本明細書で使用される、「非修飾」または「天然の」塩基としては、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾された塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（擬似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−ハログアニン、８ーアミノアデニン、８ーアミノグアニン、８−チオールアデニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルアデニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、具体的には５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルシトシンおよび他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成塩基および天然塩基が挙げられる。別の修飾された塩基が記載されている（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号；およびＳａｎｇｈｖｉ、Ｙ．  Ｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．  Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ、Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年を参照されたい）。
【０１５７】
これらの修飾塩基のいくつかは、アンチセンス化合物の結合親和性を上昇させるために有用である。これらの修飾塩基としては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびに、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めたＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリンおよびＯ−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換により、核酸二重鎖の安定性が０．６〜１．２℃上昇することが示されている。修飾塩基の調製について教示している代表的な米国特許としては、米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；および同第５，７５０，６９２号が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｂ．下方制御されるマイクロＲＮＡをコードする核酸分子の使用
シェーグレン症候群患者を、対照（健康な被験体など）と比較して、シェーグレン症候群患者において下方制御される、または、対照（唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者など）と比較して、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において下方制御される単離されたマイクロＲＮＡ遺伝子産物を治療有効量で患者に投与することによって治療する方法も提供される。対照（唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者など）と比較して、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者において下方制御される単離されたｍｉＲ遺伝子産物を治療有効量で投与することによってシェーグレン症候群患者における唾液の流れを回復させる方法がさらに提供される。本明細書に記載の通り、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたは成熟ｍｉＲＮＡであってよい。
【０１５８】
開示されている方法は、少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、または単離されたその変異体もしくは生物活性のある断片を有効量で投与することを含む。被験体に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、シェーグレン症候群患者において下方制御される内在性の野生型ｍｉＲ遺伝子産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたは成熟ｍｉＲＮＡなど）と同一であってよい、または、その変異体または生物活性のある断片であってよい。本明細書で定義された通り、ｍｉＲ遺伝子産物の「変異体」は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物と１００％未満の同一性を有し、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の生物活性の１つまたは複数を有するｍｉＲＮＡを指す。そのような生物活性の例としては、標的ＲＮＡ分子の発現阻害（例えば、標的ＲＮＡ分子の翻訳を阻害すること、標的ＲＮＡ分子の安定性を調節すること、または標的ＲＮＡ分子のプロセシングを阻害すること）ならびにシェーグレン症候群に関連する細胞性プロセスの阻害（例えば、唾液の産生）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの変異体は、種変異体およびｍｉＲ遺伝子における１つまたは複数の突然変異（例えば、置換、欠失、挿入）の結果である変異体を含む。ある特定の実施形態では、変異体は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約９９％同一である。
【０１５９】
本明細書で使用される、ｍｉＲ遺伝子産物の「生物活性のある断片」は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の生物活性の１つまたは複数を有する、ｍｉＲ遺伝子産物のＲＮＡ断片を指す。上記の通り、そのような生物活性の例としては、標的ＲＮＡ分子の発現阻害およびシェーグレン症候群に関連する細胞性プロセスの阻害が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、生物活性のある断片は、少なくとも約９ヌクレオチド、少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１３ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチドまたは少なくとも約１９ヌクレオチドの長さである。
【０１６０】
単離された遺伝子産物の治療有効量は、例えば、シェーグレン症候群の１つまたは複数の徴候または症状を軽減するために必要な量、および／または疾患の進行を遅延させるために必要な量であってよい。当業者は、治療有効性のために必要な単離されたｍｉＲ遺伝子産物の量を決定することができる。
【０１６１】
一部の実施形態では、単一の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を、治療を必要とする被験体に投与する。他の実施形態では、２種以上のｍｉＲ遺伝子産物（２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種またはそれ以上など）を被験体に投与する。２種以上のｍｉＲ遺伝子産物を被験体に投与する場合、ｍｉＲ遺伝子産物は、同時に（もしくは互いに数分以内など、立て続けに）投与することができ、または別の時間に投与することができる。例えば、２種以上のｍｉＲ遺伝子産物は、１時間、１２時間、１日、２日、５日、１週間、２週間または１カ月の間を開けて投与することができる。
【０１６２】
一部の実施形態では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、シェーグレン症候群に対する１種または複数種の追加の治療と組み合わせて被験体に投与するこができる。典型的なシェーグレン症候群の治療としては、唾液産生を促進する作用剤（ピロカルピンまたはセビメリンなど）を投与すること、水分補充療法（点眼薬など）、またはＮＳＡＩＤＳまたはコルチコステロイドを投与することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
本明細書で使用される、「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物は、合成された、またはｍｉＲが天然に存在する細胞または組織の他の生物学的成分から離れて精製されたｍｉＲ遺伝子産物である。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、またはｍｉＲ遺伝子産物の天然の状況の他の生物学的成分から部分的にまたは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物が、「単離された」と見なされる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、いくつもの標準の技法を用いて得ることができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は、化学的に合成することができる、または当技術分野で公知の方法を用いて組換えで作出することができる。一実施形態では、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用してｍｉＲ遺伝子産物を化学的に合成する。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の市販供給業者としては、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＳ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）が挙げられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、方法は、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするベクターを投与することを含む。ベクターは、非ウイルス由来（例えば、プラスミド）またはウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス）由来であってよい。遺伝子療法ベクターなどの適切なベクターは当技術分野で周知である。
【０１６５】
一部の実施例では、ｍｉＲ遺伝子産物は、任意の適切なプロモーターを使用して、組換え環状ＤＮＡプラスミドまたは組換え直線状ＤＮＡプラスミドから発現させる。プラスミドからＲＮＡを発現させるための適切なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ  プロモーター配列またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ  プロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技能の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための誘導性プロモーターまたは制御可能なプロモーターも含んでよい。
【０１６６】
２種以上のｍｉＲ遺伝子産物を発現させる場合、ｍｉＲ遺伝子産物は、別々の組換えプラスミドからそれぞれ発現させることができる、または同じ組換えプラスミドから発現させることができる。一実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物は、単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、その前駆体分子が標的細胞内でプロセシングされて機能性ｍｉＲ遺伝子産物になる。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるために適切なプラスミドの選択、核酸配列をプラスミドに挿入して遺伝子産物を発現させるための方法、および組換えプラスミドを対象とする細胞に送達するための方法は、当技術分野の技術の範囲内である（例えば、Ｚｅｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ９巻：１３２７〜１３３３頁、２００２年；Ｔｕｓｃｈｌ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：４４６〜４４８頁、２００２年；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｒｒｎｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６巻：５５０〜５５３頁、２００２年；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：４９７〜５００頁、２００２年；Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６巻：９４８〜９５８頁、２００２年；Ｌｅｅら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：５００〜５０５頁、２００２年；およびＰａｕｌら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：５０５〜５０８頁、２００２年を参照されたい）。一実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ中初期プロモーターに作動可能に連結されたｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。
【０１６７】
ｍｉＲ遺伝子産物は、組換えウイルスベクターから発現させることもできる。２種以上のｍｉＲ遺伝子産物を投与する場合、ｍｉＲ遺伝子産物は、２つの別々の組換えウイルスベクターから、または同じウイルスベクターから発現させることができることが考察されている。組換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準の技法によって培養細胞発現系から単離することができる、またはシェーグレン症候群患者の標的細胞または標的組織において直接発現させることができる。
【０１６８】
開示されている方法に有用である組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列およびＲＮＡ配列を発現させるための任意の適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターとしては、Ｕ６  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ  プロモーター配列もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ  プロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なプロモーターの選択は、当技術分野の技術の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための誘導性プロモーターまたは制御可能なプロモーターも含んでよい。
【０１６９】
適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アデノウイルスベクターは、第１世代、第２世代、第３世代および／または第４世代のアデノウイルスベクターまたはガットレスアデノウイルスベクターであってよい。アデノウイルスベクターは、力価が非常に高い感染性粒子に生成することができ；幅広い種類の細胞に感染し；分裂していない細胞に遺伝子を効率的に移し；かつ宿主ゲノムにめったに組み込まれず、それにより挿入変異によって細胞が形質転換される危険性を回避する（Ｄｏｕｇｌａｓ  ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９７年３月／４月、４４〜５３頁；Ｚｅｒｎ  ａｎｄ  Ｋｒｅｓｉｎａｍ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２５巻（２号）、４８４〜４９１頁、１９９７年）。本明細書で提供される方法に使用することができる代表的なアデノウイルスベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９０巻：６２６〜６３０頁、１９９２年）；Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７巻：１０９〜１２８頁、１９９１年）；およびＢａｒｒら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：１５１〜１５５頁、１９９５年）に記載されている。
【０１７０】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも、ＨＣＣ関連遺伝子を投与するために適している。ＡＡＶベクターを生成する方法、ＡＡＶベクターを投与する方法およびそれらの使用は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，９５１，７５３号；米国付与前公開第２００７−０３６７５７号、同第２００６−２０５０７９号、同第２００５−１６３７５６号、同第２００５−００２９０８号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００５／１１６２２４およびＷＯ  ２００６／１１９４５８を参照されたい）。
【０１７１】
レンチウイルスを含めたレトロウイルスベクターも、本明細書に記載の方法で使用することができる。レンチウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２など）、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他のレトロウイルスとしては、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、サルＴリンパ球向性ウイルス、マウス白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルスおよびネコ白血病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを生成する方法およびそれらの使用は当技術分野で十分に記載されている（例えば、米国特許第７，２１１，２４７号；同第６，９７９，５６８号；同第７，１９８，７８４号；同第６，７８３，９７７号；および同第４，９８０，２８９号を参照されたい）。
【０１７２】
適切なヘルペスウイルスベクターは、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、ＨＳＶ−２およびリスザルヘルペスウイルスを含めたいくつもの異なる種類のヘルペスウイルスのいずれか１種から導くことができる。組換えヘルペスウイルスベクター、それらの構築および使用は、当技術分野で十分に記載されている（例えば、米国特許第６，９５１，７５３号；同第６，３７９，６７４号；同第６，６１３，８９２号；同第６，６９２，９５５号；同第６，３４４，４４５号；同第６，３１９，７０３号；および６，２６１，５５２号；および米国特許出願公開第２００３−００８３２８９号を参照されたい）。
【０１７３】
本明細書で使用される、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の「治療有効量」は、生物学的効果（シェーグレン症候群の１つまたは複数の徴候または症状を軽減することなど）をもたらすために十分な量である。当業者は、被験体のサイズおよび体重；疾患の進行の程度；被験体の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに、投与が局部的であるか全身的であるかなどの因子を考慮することにより、所与の被験体に投与するべきｍｉＲ遺伝子産物の治療有効量を容易に決定することができる。
【０１７４】
例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療される被験体のおよその体重に基づいてよい。そのような有効量を、例えば、非経口的に、または経腸的になど、任意の適切な経路で投与することができる。一部の実施例では、被験体に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の治療有効量は、約５〜約３０００マイクログラム／体重１ｋｇ、約７００〜約１０００マイクログラム／体重１ｋｇ、または約１０００マイクログラム／体重１ｋｇの範囲にわたってよい。
【０１７５】
当業者は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物を所与の被験体に投与するための適切な投薬レジメンも容易に決定することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は、被験体に１回投与することができる（例えば単回の注射またはデポジション）。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は、約３〜２８日間、より具体的には約７〜１０日間、毎日１回または２回、被験体に投与することができる。特定の投薬レジメンでは、ｍｉＲ遺伝子産物は、１日１回、７日間投与される。投薬レジメンが多数回の投与を含む場合、被験体に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、投薬レジメン全体を通して投与される遺伝子産物の総量を含んでよいことが理解される。
【０１７６】
Ｃ．治療剤の投与
治療剤は、治療を必要とする被験体に、当技術分野で公知の任意の適切な手段を用いて投与することができる。投与方法としては、管内投与、皮内投与、筋肉内、腹腔内投与、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、膣投与、直腸投与、鼻腔内投与、吸入投与、経口投与または遺伝子銃による投与が挙げられるが、これらに限定されない。鼻腔内投与は、片方の鼻孔または両方の鼻孔を通して鼻および鼻腔内に組成物を送達することを指し、噴霧機構もしくは液滴機構によって送達すること、または核酸またはウイルスをエアロゾル投与することによって送達することを含んでよい。吸入による組成物の投与は、噴霧機構または液滴機構による送達を介して鼻または口を通すことができる。挿管を介して呼吸器系の任意の領域に直接送達することができる。非経口投与は、一般に注射によって実現される。注射剤は、従来の形態で、溶液もしくは懸濁液として、注射前の懸濁溶液に適した固形として、または乳剤としてのいずれかで調製することができる。注射溶液および注射懸濁液は、滅菌粉末、滅菌顆粒および滅菌錠剤から調製することができる。投与は、全身的または局所的であってよい。
【０１７７】
治療剤は、任意の適切な様式で、好ましくは薬学的に許容できる担体と一緒に投与することができる。薬学的に許容できる担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用する特定の方法によって一部決定される。したがって、本開示の医薬組成物の多種多様な適切な製剤がある。
【０１７８】
非経口的に投与するための調製物としては、滅菌水溶液もしくは滅菌非水溶液、滅菌懸濁液および滅菌乳剤が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝化媒体を含めた、水、アルコール溶液／水溶液、乳剤または懸濁液が挙げられる。非経口的なビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、体液および栄養の補充液、電解質補充液（リンゲルのブドウ糖に基づいた補充液など）などが挙げられる。保存料および他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなども存在してよい。
【０１７９】
局所投与するための製剤としては、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、噴霧剤、液体剤および粉末剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要であること、または望ましいことがある。
【０１８０】
経口投与するための組成物としては、粉末もしくは顆粒、懸濁液もしくは水中溶液もしくは非水媒体、カプセル、サシェまたは錠剤が挙げられる。増粘剤、調味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましいことがある。
【０１８１】
組成物の一部は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノアルキル、ジアルキル、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換されたエタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容できる酸付加塩または塩基付加塩として投与される可能性があり得る。
【０１８２】
投与は、単回投与または多回投与によって実現することができる。必要な用量は、被験体の種、年齢、体重および全身状態、使用される特定の治療剤およびその投与様式に応じて被験体毎に変動する。適切な用量は、当業者が常用の実験法のみを用いて決定することができる。
【０１８３】
一部の実施形態では、治療剤は、ｍｉＲ遺伝子産物、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするベクター、アンチセンス化合物またはアンチセンス化合物をコードするベクターなどの核酸分子である。核酸に基づく治療剤は、任意の適切な経路で被験体に投与することができる。一部の実施例では、作用剤は、経腸投与経路または非経口投与経路を用いて投与される。適切な経腸投与経路としては、例えば、経口送達、直腸送達または鼻腔内送達が挙げられる。適切な非経口投与経路としては、例えば、血管内投与（静脈内ボーラス注射、静脈内点滴、動脈内ボーラス注射、動脈内点滴および脈管構造へのカテーテルによる滴下注入など）；皮下点滴（浸透圧ポンプによるものなど）を含めた皮下注射または皮下デポジション；例えば、カテーテルまたは他の設置デバイス（例えば、坐薬または多孔質材料、非多孔質材料もしくはゼラチン質材料を含む移植片）による、対象とする組織への直接適用；および吸入が挙げられる。特に適した投与経路は、注射、点滴および標的組織への直接注射である。
【０１８４】
本開示の関連において、ｍｉＲ遺伝子産物またはアンチセンス化合物は、ネイキッドＲＮＡまたはネイキッドＤＮＡのいずれかとして、送達試薬と組み合わせて被験体に投与することができる、または、組換えプラスミドベクターまたは組換えウイルスベクターにコードさせることができる。組換えプラスミドおよび組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子産物またはアンチセンス化合物を発現する配列を含み、そのようなプラスミドおよびベクターを標的細胞に送達するための技法は当技術分野で周知である。
【０１８５】
一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物またはアンチセンス化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を被験体に送達するために、リポソームを使用する。リポソームにより、遺伝子産物または核酸の血中半減期を上昇させることもできる。本発明において使用するための適切なリポソームは、一般に中性または負に帯電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含む標準のベシクル形成脂質から形成することができる。脂質の選択は、一般に、所望のリポソームサイズおよび血流中でのリポソームの半減期などのいくつかの因子を考慮することによって導かれる。リポソームを調製するための種々の方法が当技術分野で公知である（例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９巻：４６７頁、１９８０年；および米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；および同第５，０１９，３６９号を参照されたい）。一部の実施形態では、ｍｉＲ遺伝子産物またはアンチセンス化合物を被験体に送達するためにポリマーを使用することができる。治療用ＲＮＡ分子を送達するために使用することができる陽イオン性の脂質およびポリマーが記載されている（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  １２３巻（１号）：１〜１０頁、２００７年；Ｖｏｒｈｉｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８０巻：１１〜２９頁、２００９年；および米国特許出願公開第２００９／０３０６１９４号を参照されたい）。ポリペプチド担体も、ｍｉＲ遺伝子産物を被験体に送達するために使用することができる（例えば、Ｒａｈｂｅｋら、Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  １０巻：８１〜９３頁、２００８年を参照されたい）。
【０１８６】
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供する。これらの実施例は、記載されている特定の特徴または実施形態に本開示を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１８７】
（実施例１）
シェーグレン症候群患者において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの同定
材料および方法
試料の取得およびマイクロＲＮＡの単離
小唾液腺試料を、原発性シェーグレン症候群のコーカサス人種の女性から、および正常なボランティアから得た。すべての被験体は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにおいて完全なリウマチ検査、口内検査および眼科検査ならびに実験室評価を受けた。すべてのシェーグレン症候群患者が原発性シェーグレン症候群に対する欧州−米国診断基準を満たした。生検時の患者の年齢中央値は、対照群については４３．５歳（２１〜５８歳の範囲にわたる）、病巣スコアが低い群については５８歳（２３〜６７歳の範囲にわたる）、および病巣スコアが高い群については５１．５歳（３７〜７０歳の範囲にわたる）であった。
【０１８８】
下唇から小唾液腺を切除し、余分な検体はマイクロＲＮＡを単離するために急速凍結した。組織をホモジナイズし、マイクロＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離した。ｍｉＲＮＡの品質を、２１００  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおけるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて査定した。
【０１８９】
マイクロアレイ
４７０種のヒトｍｉＲＮＡおよび６４種のヒトウイルスｍｉＲＮＡに特異的なプローブを用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Ｖ１）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（スライドあたり８アレイ）を使用して小唾液腺ｍｉＲＮＡをプロファイリングした。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｃｈｉｐにおける最適ｍｉＲＮＡ曲線である（製造者の説明書により決定された）Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ＣｈｉｐにおいてＲＮＡ完全性の数値（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ）が７を超え、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００における２６０／２８０比および２６０／２３０比が２．００を超えた試料のみをマイクロアレイ解析に使用した。各アレイに対して、全ＲＮＡ１００ｎｇを使用した。アレイを製造者のプロトコールに従って実行した。マイクロアレイを、Ｍｏｄｅｌ  Ｇ２５０５Ｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してスキャンし、データを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してアレイの品質管理を行った。
【０１９０】
患者の４カテゴリーを互いに（ｎ＝１６）、および正常なボランティア（ｎ＝８）と比較した。患者の半数が、小唾液腺において低度の炎症を有し（低病巣スコア、１または２）、半数が小唾液腺において広範な炎症を有した（高病巣スコア、１２）。患者の各群において、半数は唾液の流れが保たれ（≧１．５ｍＬ／１５分；「高流動性」）、半数は唾液の流れが不十分であった（＜１．５ｍＬ／１５分；「低流動性」）（図１）。
【０１９１】
解析
正規化。マイクロＲＮＡアレイデータを、以下の通り、小唾液腺アレイにおいて同定された（推定）ハウスキーパーマイクロＲＮＡのセットを使用して正規化した。ハウスキーパーマイクロＲＮＡは、定義によれば、すべての組織試料において一定のレベルで発現される。したがって、２種のハウスキーパーの強度比は、正規化と無関係にデータセット内のすべてのアレイにわたって同じであるはずである。このような挙動をする可能性のあるハウスキーパーマイクロＲＮＡを探索するために、すべてのアレイにおいて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって存在するとしてスコア化された「候補」マイクロＲＮＡ（すなわち、すべてのアレイにおいてｇＩｓＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔｅｄ＝１であるマイクロＲＮＡ；そのようなマイクロＲＮＡが全部で１３２種あった）について考察した。アレイデータを、これらの候補マイクロＲＮＡのそれぞれの強度に対して順々に正規化した。各場合において、正規化されたアレイにわたって、他の候補マイクロＲＮＡすべてについて平均および変動係数（ＣＶ）を算出し、ＣＶ＜０．２２である候補マイクロＲＮＡの数、すなわち、アレイを正規化するために使用したマイクロＲＮＡに同調して発現が変動すると思われる他の候補マイクロＲＮＡの数を係数した。
【０１９２】
次いで、これらのスコアが７以上の候補マイクロＲＮＡを予備のハウスキーパーのセットとして使用した。次に、各アレイを、そのアレイ上の予備のハウスキーパーの強度の幾何平均に対して正規化した。次いで、これらの正規化されたアレイ上のすべての候補マイクロＲＮＡについて平均およびＣＶを算出し、ＣＶ＜０．２２の候補マイクロＲＮＡを予備のハウスキーパーの次のセットとして使用した。このプロセスを、算出によって得られるハウスキーパーのセットが、それを得るのに使用されるハウスキーパーのセットと同じになるまで（すなわち、自己一致した結果が得られるまで）繰り返した。次いで、アレイをこれらの最終的なハウスキーパーマイクロＲＮＡの幾何平均の０．００１倍に対して正規化した（幾何平均は一般には約１０００であり、したがってこれにより約１の正規化因子が得られる）。この最終的な正規化されたデータセットにおいて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって非存在であるとスコア化された（すなわち、ｇＩｓＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔｅｄ＝０の）マイクロＲＮＡの強度を１．０と同じに設定した。
【０１９３】
データ解析およびソフトウェア。本明細書で報告されているマイクロアレイ解析は、ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（商標）プログラム、１０．０版（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行った主成分分析（ＰＣＡ）を除いて、すべて、Ｄｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ  ＳｉｍｏｎおよびＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ開発チームによって開発されたＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ（３．７．０版）を使用して行った。上記の正規化されたマイクロＲＮＡアレイデータを、ＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓにローディングし、そこで１．０を閾値とし、ｌｏｇ２変換し、フィルタリングして変動性が低いマイクロＲＮＡ（詳細には、すべてのアレイにわたる分散が、そのような分散すべての中央値よりも有意に大きくない（ｐ＞０．０１）マイクロＲＮＡ）を取り除いた。
【０１９４】
アレイ上のマイクロＲＮＡ５３４種のうち２３９種がフィルタリング基準を通過した。得られたフィルタリングされたデータセットを、後の解析すべてに使用した。マイクロＲＮＡ標的を予測するために、ＲＮＡ２２アルゴリズムを使用した（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ３’ＵＴＲの事前にコンパイルされた予測）（Ｍｉｒａｎｄａら、Ｃｅｌｌ  １２６巻：１２０３〜１２１７頁、２００６年）。データを、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用することによっても解析した。ｍＲＮＡ識別子を含有するデータセットをアプリケーションにアップロードした。対象とする群のそれぞれにおいて、少なくとも２０％のマイクロＲＮＡの標的となったｍＲＮＡのみを下流の解析に使用した。
【０１９５】
各識別子を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｂａｓｅにおいて対応する遺伝子目的物にマッピングした。このソフトウェアでは「フォーカス遺伝子」と称されるこれらの遺伝子を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｂａｓｅに含有される情報から発展させた広範囲の分子ネットワーク上にオーバーレイさせた。次いで、これらのフォーカス遺伝子のネットワークを、それらの連結性に基づいてアルゴリズム的に生成した。ネットワークを機能解析することにより、ネットワーク内の遺伝子についての最も重要な生物学的機能および／または疾患が同定された。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｂａｓｅにおいて生物学的機能および／または疾患に関連付けられるネットワーク遺伝子が解析のために検討された。フィッシャーの正確確率検定を用いて、ネットワークに割り当てられた生物学的機能および／または疾患のそれぞれが偶然のみに起因する確率を決定するｐ値を算出した。正準経路解析（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）により、正準経路のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓライブラリーから、データセットについての最も重要な経路が同定された。データセットと正準経路との間の関連の有意性を２方式で測定した：（１）経路に位置する発現値カットオフに適合したデータセットからの遺伝子の数を正準経路に存在する分子の総数で割った比を示す；および（２）フィッシャーの正確確率検定を用いて、データセット内の遺伝子と正準経路内の遺伝子との間の関連が偶然のみで説明される確率を決定するｐ値を算出した。
【０１９６】
リアルタイム定量ＰＣＲ
炎症性スコアが様々である１５検体の小唾液腺試料に対して、ＴａｑＭａｎ（商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してリアルタイム定量ＰＣＲ分析を行った；これらの試料は、本明細書に記載のマイクロＲＮＡマイクロアレイ解析において使用した試料とは独立したものであった。出発材料１０ｎｇ（感度限界内で確実に検出されるように最適化試験分析に基づいて決定された）を使用して、製造者の説明書に従って逆転写を行った。どちらもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから取得した（それぞれ製品番号４３９５１８８および４３９５４６０）マイクロＲＮＡｈｓａ−ｍｉｒ−７６８−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉｒ−５７４−３ｐを検出するために、特異的なマイクロＲＮＡプライマーを使用した。簡単に述べると、逆転写させるために、Ｖｅｒｉｔｉ  ９６ウェルサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間、１５μＬのＲＴ反応を行った。リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。各ＰＣＲ反応を３連で行った。２０μＬのＰＣＲ反応を、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間の変性ならびに６０℃で６０秒間のアニーリングおよび伸長を４０サイクルのサイクル条件で行った。
【０１９７】
ＰＣＲ試料のそれぞれに対して３つの複製物ができた。各試料に対して、内在性低分子ＲＮＡ、ＲＮＵ４８を対照とした。各試料のレベルを、２−ΔΔＣＴ法（Ｌｉｖａｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  （Ｄｕｌｕｔｈ）２５巻：４０２〜４０８頁、２００１年）を用いて対照のレベルと比較した。
【０１９８】
（実施例２）
マイクロＲＮＡマイクロアレイデータの解析
解析方法
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（商標）プログラム９版および１０版、ならびにＢＲＢ  Ａｒｒａｙツールパッケージ安定リリース３．７．０版を用いて統計分析を行った。ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（商標）を用いて分析するためにアレイの製造者の説明書に従ってデータをインポートし、正規化した。
【０１９９】
患者カテゴリーと正常なボランティアカテゴリーとの間で、示差的に発現されるｍｉＲＮＡを、独立Ｔ検定およびベンジャミニ・ホッホバーグ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）補正を用いて検出した。独立Ｔ検定において補正して統計的有意性があり（ｐ＜０．０５）、倍率変化が２を超えたｍｉＲＮＡを、示差的に発現されるｍｉＲＮＡと見なした。データを以下の５カテゴリーに比較収集した：
１）すべてのシェーグレン症候群の試料対正常なボランティア（表１および表２）
２）病巣スコアが低いシェーグレン症候群の試料と正常なボランティアの比較（表３）
３）病巣スコアが高い試料の中で、唾液の流れが正常な試料対唾液の流れが不十分な試料（表４）
４）病巣スコアが低い試料の中で、唾液の流れが正常な試料対唾液の流れが不十分な試料（表５）
５）病巣スコアが高い試料対病巣スコアが低い試料（表６）
結果
表１は、正常な健康なボランティアの小唾液腺と比較して、シェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの一覧を提供する。発現が２倍以上増加または減少するマイクロＲＮＡが示されている（ｐ＝０．０１に設定した統計的有意性）。マイクロＲＮＡの発現における倍率変化（真ん中の列）、および、シェーグレン症候群患者由来の唾液腺と比較して、正常な唾液腺においてマイクロＲＮＡが上方制御される（「上方」）か、下方制御される（「下方」）か（右側の列）についても列挙されている。この表において、シェーグレン症候群患者由来の小唾液腺は、それらの病巣スコア（炎症の尺度）または唾液の流れと関係なく一緒に分類されている。すべての正常なボランティアの小唾液腺の病巣スコアは０であった。
【０２００】
表１
健康な対照の被験体と比較して、シェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡ（ｐ＝０．０１）
【０２０１】
【表１−１】
2012522508.tif 000002
【０２０２】
【表１−２】
2012522508.tif 000003
同様に、表２は、統計的有意性をｐ＝０．０５に設定した、正常な健康なボランティアの小唾液腺と比較して、シェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの一覧を提供する。
【０２０３】
表２
健康な対照の被験体と比較して、シェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡ（ｐ＝０．０５）
【０２０４】
【表２−１】
2012522508.tif 000004
【０２０５】
【表２−２】
2012522508.tif 000005
表３は、正常な健康なボランティアの小唾液腺と比較して、病巣スコア（炎症の尺度）が低いシェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの一覧を提供する。発現が２倍以上増加または減少するマイクロＲＮＡが示されている（ｐ＝０．０１に設定した統計的有意性）。マイクロＲＮＡの発現における倍率変化（真ん中の列）、および、正常な被験体由来の唾液腺と比較して、病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者においてマイクロＲＮＡが上方制御される（「上方」）か、下方制御される（「下方」）か（右側の列）についても列挙されている。
【０２０６】
表３
健康な対照の被験体と比較して、病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡ
【０２０７】
【表３−１】
2012522508.tif 000006
【０２０８】
【表３−２】
2012522508.tif 000007
表４は、病巣スコアが高く、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者と比較して、病巣スコアが高く、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの一覧を提供する。発現が２倍以上増加または減少するマイクロＲＮＡが示されている（ｐ＝０．０５に設定した統計的有意性）。マイクロＲＮＡの発現における倍率変化（真ん中の列）、および、病巣スコアが高く、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者と比較して、病巣スコアが高く、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者においてマイクロＲＮＡが上方制御される（「上方」）か、下方制御される（「下方」）か（右側の列）についても列挙されている。この表では、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者由来の病巣スコアが高い小唾液腺と比較して、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者由来の病巣スコアが高い小唾液腺においてすべてのマイクロＲＮＡが過剰発現される。
【０２０９】
表４
病巣スコアが高く、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者（低）と比較して、病巣スコアが高く、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者（正常）の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡ
【０２１０】
【表４】
2012522508.tif 000008
表５は、病巣スコアが低く、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者と比較して、病巣スコアが低く、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの一覧を提供する。発現が１．５倍以上増加または減少するマイクロＲＮＡが示されている（ｐ＝０．０５に設定した統計的有意性）。マイクロＲＮＡの発現における倍率変化（真ん中の列）、および、病巣スコアが低く、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者と比較して、病巣スコアが低く、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者においてマイクロＲＮＡが上方制御される（「上方」）か、下方制御される（「下方」）か（右側の列）についても列挙されている。この表では、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０が、病巣スコアが低く、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者と比較して、病巣スコアが低く、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者において２倍下方制御される。さらに、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４０が、病巣スコアが低く、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者と比較して、病巣スコアが低く、唾液の流れが正常なシェーグレン症候群患者において１．６倍上方制御される。
【０２１１】
表５
病巣スコアが低く、唾液の流れが不十分なシェーグレン症候群患者（低）と比較して、病巣スコアが低く、唾液の流れが正常な  シェーグレン症候群患者（正常）の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡ
【０２１２】
【表５】
2012522508.tif 000009
表６は、病巣スコアが高いシェーグレン症候群患者と比較して、病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの一覧を提供する。発現が２倍以上増加または減少するマイクロＲＮＡが示されている（ｐ＝０．０５に設定した統計的有意性）。マイクロＲＮＡの発現における倍率変化（真ん中の列）、および、病巣スコアが高いシェーグレン症候群患者と比較して、病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者においてマイクロＲＮＡが上方制御される（「上方」）か、下方制御される（「下方」）か（右側の列）についても列挙されている。
【０２１３】
表６
病巣スコアが高いシェーグレン症候群患者に対して、病巣スコアが低いシェーグレン症候群患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡ
【０２１４】
【表６】
2012522508.tif 000010
（実施例３）
示差的に発現されるマイクロＲＮＡのクラス予測分析
本実施例は、健康な対照の被験体と比較して、シェーグレン症候群患者において示差的に発現されるマイクロＲＮＡのクラス予測分析について記載している。
【０２１５】
問題の詳細
クラスの数：２
フィルタリング基準を通過した遺伝子の数：２４３
クラスの変数を定義する実験記述子：ＳＳ（シェーグレン症候群）対Ｎ（正常なボランティア）
各クラス内のアレイの数：クラス標識Ｎ内に８、クラス標識Ｓ内に１６
特徴選択基準
クラス間で０．００１の有意性レベルで有意に異なる遺伝子をクラス予測に使用した。
交差検証法
リーブワンアウト（Ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）交差検証法を使用して、誤分類率をコンピュータで計算した。（ベイズの）複合共変量予測に使用したＴ値を、ａｂｓ（ｔ）＝１０レベルで切り捨てた。同等のクラス分布率をベイズの複合共変量予測において使用する。ベイズの複合共変量予測からクラスに予測される試料についての予測確率の閾値は０．８である。
【０２１６】
表７
交差検証中の分類器の性能
【０２１７】
【表７】
2012522508.tif 000011
表８
クラス（Ｎ）に属する各試料が、交差検証中にベイズの複合共変量から予測される確率
【０２１８】
【表８】
2012522508.tif 000012
交差検証中の分類器の性能：
仮にあるクラスＡに対して、
ｎ１１＝Ａであると予測されたクラスＡの試料の数
ｎ１２＝Ａでないと予測されたクラスＡの試料の数
ｎ２１＝Ａであると予測されたＡでない試料の数
ｎ２２＝Ａでないと予測されたＡでない試料の数
次に、以下のパラメータによって分類器の性能を特徴付けることができる：
感度＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ１２）
特異性＝ｎ２２／（ｎ２１＋ｎ２２）
陽性適中率（ＰＰＶ）＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ２１）
陰性適中率（ＮＰＶ）＝ｎ２２／（ｎ１２＋ｎ２２）
感度は、クラスＡ試料について、クラスＡであると正しく予測される確率である。特異性は、クラスＡでない試料について、Ａでないと正しく予測される確率である。ＰＰＶは、クラスＡであると予測された試料が実際にクラスＡに属する確率である。ＮＰＶは、クラスＡでないと予測された試料が実際にクラスＡに属さない確率である。各分類方法および各クラスについて、これらのパラメータが以下の表９〜表１５に列挙されている。
【０２１９】
【表９】
2012522508.tif 000013
【０２２０】
【表１０】
2012522508.tif 000014
【０２２１】
【表１１】
2012522508.tif 000015
【０２２２】
【表１２】
2012522508.tif 000016
【０２２３】
【表１３】
2012522508.tif 000017
【０２２４】
【表１４】
2012522508.tif 000018
【０２２５】
【表１５】
2012522508.tif 000019
表１６
ｔ値でソートした分類器の構成
（クラス１：  Ｎ；  クラス２：  Ｓ）
【０２２６】
【表１６−１】
2012522508.tif 000020
【０２２７】
【表１６−２】
2012522508.tif 000021
線形予測からの予測規則
予測規則は、有意な遺伝子の重量（ｗｉ）および発現（ｘｉ）の内部合計によって定義される。発現は、デュアルチャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値（すなわち、Σｉｗｉｘｉ閾値）を超えるとクラスＮに分類される。複合共変量予測に対する閾値は−２２３７．０４１であり；対角線形判別予測に対する閾値は−１２２６．３７４であり；サポートベクターマシン予測に対する閾値は−３．９３３である。
【０２２８】
表１７
遺伝子の重量
【０２２９】
【表１７−１】
2012522508.tif 000022
【０２３０】
【表１７−２】
2012522508.tif 000023
【０２３１】
【表１８−１】
2012522508.tif 000024
【０２３２】
【表１８−２】
2012522508.tif 000025
（実施例４）
シェーグレン症候群患者の小唾液腺のマイクロＲＮＡプロファイリング
試料およびアレイハイブリダイゼーション
全部で２４検体の小唾液腺由来の試料を、マイクロＲＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。これらの腺のうち８検体は健康な対照に由来し、１６検体は原発性シェーグレン症候群（ＳＳ）患者に由来した。原発性シェーグレンの試料の半数は病巣スコアが１２の広範な炎症を有し、半数は病巣スコアが１または２の低度の炎症を有した。病巣スコアが高い群と病巣スコアが低い群の両方の中で、患者の半数が、唾液の流れが不十分であり、半数が唾液の流れが保たれていた（図１）。これらの臨床パラメータを有する患者を選択して、正常な対照とＳＳ患者との間だけでなく、炎症の程度が異なる患者間、または炎症のレベルが同様の患者の機能低下した唾液腺と機能が保たれている唾液腺との間で特異的なマイクロＲＮＡのパターンに差異があるかどうかを試験するために、マイクロＲＮＡの変化を探査することを可能にした。
【０２３３】
データの正規化
正規化は、生物学的な変動ではなく技術的な変動を表す試料間の系統的な差異を取り除くことができるので、マイクロアレイデータ解析において重要なステップである。マイクロＲＮＡアレイデータの解釈における主要な制限は、種々の正規化法の有用性および妥当性に明確な一致を欠くことである。ｍＲＮＡマイクロアレイを解析するために開発された伝統的な正規化法の多くは、マイクロＲＮＡデータセットとｍＲＮＡデータセットとの間に著しい差異があるので、マイクロＲＮＡプロファイリングには適さない可能性がある（Ｐｒａｄｅｒｖａｎｄら、ＲＮＡ  １５巻：４９３〜５０１頁、２００９年）。例えば、ｍＲＮＡと比較して、マイクロＲＮＡの多くは非常に低いレベルで発現する、または全く発現せず、アレイ当たりのマイクロＲＮＡがｍＲＮＡよりもずっと少ない（何万ものｍＲＮＡと比較してマイクロＲＮＡは何百）。多くの正規化法では、ｍＲＮＡの強度分布は疾患または実験条件にわたって不変であると想定されているが、この想定がマイクロＲＮＡにあてはまるかは全く明白でない。
【０２３４】
ｍＲＮＡマイクロアレイを正規化するための広く認められ、十分に検証された方法は、ハウスキーピング遺伝子、すなわち、すべての試料において一定のレベルで発現される遺伝子を使用することである。しかし、マイクロＲＮＡアレイに対して同様の方式で使用することができる、十分に確立されたハウスキーピングマイクロＲＮＡはない。定量ＰＣＲなどのアプリケーション用に、核小体ＲＮＡなどの他の非翻訳ハウスキーピング遺伝子が使用されているが、異なる条件下でのそれらの変動性は著しく、それらを「ハウスキーパー」として使用することを可能にするにはその前に広範な試験を行う必要がある。この問題を克服するために、本開示のデータセットにおいてハウスキーパーとしての機能を果たすことができるマイクロＲＮＡを同定するための方法を考案した。この方法は、実施例１に詳細を記載しており、基本的に、その挙動がハウスキーピングの役割と一致するマイクロＲＮＡ；詳細には、その発現レベルが一定であった場合に予測される通り、発現レベルがすべてのアレイにわたって同調して変動するマイクロＲＮＡを探索することを伴う。探索をすべてのアレイ（全部で１３２）に存在するとスコア化されたこれらのマイクロＲＮＡに限定して、そのようなマイクロＲＮＡの２７種のセットが見出された（図２Ａ）。このように挙動するそのように多数のマイクロＲＮＡのセットが存在することは、それらのハウスキーパーとしての役割と一致し、他のどんな機構によっても説明することは難しい。
【０２３５】
この正規化法の有効性を確認するために、Ｐｌｏｎｅｒら（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６巻：８０頁、２００５年）により提唱された相関試験を行って、ｍＲＮＡアレイに対する正規化法を査定した。この試験は、無作為に２種の遺伝子を選択した場合、それらの発現レベルが互いに相関する可能性はきわめて低いという仮定に基づいている。言い換えると、一部の遺伝子対は確かに生物学的に関連しているが、大部分の対は生物学的に関連していない。これは、すべてのマイクロアレイにわたって遺伝子対のすべての発現レベルについてピアソン相関係数を算出した場合、適切に正規化されたデータセットにより、ゼロ付近に集中した相関係数の分布がもたらされることを意味する。正規化が不十分なアレイの存在により、この分布を歪める人為的結果の相関が導入される（すべてのシグナルが一斉に上昇または低下するので）。図２Ｂは、本開示のマイクロＲＮＡアレイについて、ハウスキーパーマイクロＲＮＡを用いて正規化する前と正規化した後にそのような算出をした結果を例示している。正規化により、約ゼロのこの分布の対称性および中心性が明らかに改善され、図２Ａに列挙されているマイクロＲＮＡはハウスキーパーとして挙動するという仮説と一致する。
【０２３６】
健康サブセットおよび疾患サブセットの分類
ｉ）主成分分析
主成分分析（ＰＣＡ）は、変動のほとんどを保持しながらデータセットの次元を縮小するための数学的方法である。マイクロアレイデータの場合、第１主成分は、データ内の最大量の変動性を説明する、発現パターンの線形結合である。第２主成分は第１主成分とは独立しており、残りの最大量の変動性などを説明する。したがって、ＰＣＡにより、実験変動性の大半を保持する２次元または３次元の多次元データセットの視覚化を可能にする教師なし分析がもたらされる。図３に唾液のマイクロＲＮＡアレイのＰＣＡ分析結果を示す。各点は、最初の３主成分に沿った座標に従ってプロットしたアレイを表す。この分析により、すべてのＳＳ試料（小さな円および大きな円）と健康な対照（中くらいの円）とが明白に分離し、ならびに病巣スコアが低い試料（大きな円）および病巣スコアが高い試料（小さな円）が互いに分離していることが示されている。したがって、この分析により、これらの種々の群を、それらのマイクロＲＮＡプロファイルによって区別することができることの強力な証拠がもたらされる。
【０２３７】
ｉｉ）階層クラスタリング
次に、正規化したマイクロアレイ発現データの階層クラスタリングを行った。階層クラスタリングは、別の教師なし分類法であり、マイクロＲＮＡの発現の対での類似性の定義済みの尺度によって決定された試料を合併することによってクラスターを同定する。２つのクラスター間の距離を、すべての要素対の間の距離の平均として算出する、平均連結クラスタリングを使用した。ＰＣＡと同様に、健康な対照由来の小唾液腺試料と、病巣スコアが高いＳＳ試料および病巣スコアが低いＳＳ試料の両方とが明確に分離された（図４）。健康な組織と病巣スコアが高い試料とが分離したことは、それらが、細胞組成が非常に異なる組織を表すので、驚くべきことではなかった。しかし、健康な組織と病巣スコアが低い組織とが明白に区別されたことにより、マイクロＲＮＡプロファイルが、組織学的差異が最小である小唾液腺間を区別するために十分な感度であることが示されている。さらに、ｍｉＲＮＡプロファイルにより、炎症の程度が異なる試料間が良好に区別されただけでなく、病巣スコアが高い試料の中で、唾液の流れが保たれている試料と唾液の流れが低下した試料とが明白に分離された。
【０２３８】
ｉｉｉ）示差的に発現されるマイクロＲＮＡを使用したクラス予測
次に、示差的に発現されるマイクロＲＮＡにより、健康なクラスのメンバーであること対ＳＳクラスのメンバーであることを予測することができるかどうかを試験した。種々の予測アルゴリズム（すなわち、複合共変量予測、対角線形判別分析、１−最近傍、３−最近傍、最も近いセントロイド、サポートベクターマシンおよびベイズの複合共変量予測）のすべてにより、被験体が患者である、または健康な対照であると正確に分類され、事例の１００％で１．０の感度および１．０の特異性の両方が得られた（表７）。分類器は、有意性のレベル０．００１で、クラス間で有意に異なる５８種のマイクロＲＮＡで構成された。リーブワンアウト交差検証法を使用して誤分類率をコンピュータで計算した。
【０２３９】
ｉｖ）潜在的なバイオマーカーの検証
マイクロアレイで観察された差異を確認するため、およびシェーグレン患者のサブグループ間を区別するために選択されたマイクロＲＮＡを使用することの潜在性を査定するために、正常群、病巣スコアが低い群および病巣スコアが高い群の間で反対方向に変化した２種のマイクロＲＮＡを同定した。病巣スコアが上昇すると、これらのマイクロＲＮＡの一方（ｈｓａ−ｍｉＲ−７６８−３ｐ）は上昇し、他方（ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４）は低下した。図５に例示した実験では、これらの２種のマイクロＲＮＡの発現パターンを病巣スコアの予測子として使用することの実現可能性を、マイクロアレイの試験に使用した試料とは独立した１５の試料のセットにおいて試験した。ＴａｑＭａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲを用いて同じ試料において同時に決定したこれらの２種のマイクロＲＮＡ間のＣｔ差異が示されている。病巣スコアが低い試料（ＦＳ：０〜２）、病巣スコアが中程度の試料（ＦＳ：５〜７）および病巣スコアが高い試料（ＦＳ：１２）の間でこれらのＣｔ差異に統計的有意差が見られた。Ｃｔ差異は、これらの２種のマイクロＲＮＡの発現比の尺度であり、したがって試料の正規化とは無関係であることを示すことが重要である。
【０２４０】
正常クラス、病巣スコアが低いＳＳクラスおよび病巣スコアが高いＳＳクラスの間を識別する示差的に発現されるマイクロＲＮＡの生物学的標的
診断、疾患の活動性または組織損傷などの臨床的特性との強い関連を示すことに加えて、信頼性のあるバイオマーカーは、根底にある重要な生理学的プロセスを反映しなければならない。したがって、これらの知見の潜在的な生物学的重要性を、示差的に発現されるマイクロＲＮＡに影響を受ける可能性がある生理学的プロセスを同定することによって査定した。まず、種々の臨床群の中で最も有意に示差的に発現されるマイクロＲＮＡを同定した。これは、信頼水準７５％で最大で１つの偽陽性を許容するように設定したＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓのクラス比較アルゴリズムを使用して実現した。これにより、健康群、病巣スコアが低いＳＳ群および病巣スコアが高いＳＳ群の間で示差的に発現される９４種のマイクロＲＮＡが得られた（ｐ＜０．０１）（表１９）。
【０２４１】
表１９
種々の臨床群の間で有意に示差的に発現したマイクロＲＮＡの一覧（ｐ＜０．０１）
【０２４２】
【表１９−１】
2012522508.tif 000026
【０２４３】
【表１９−２】
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ＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓクラス比較アルゴリズムを、偽発見７５％の信頼水準で最大１つの偽陽性を許容するように設定して使用した。一変量のＦ検定を実行し、多変量の並べ替え検定を、１０００回の並べ替えに基づいてコンピュータで行った。ＨＦ、病巣スコアが高い群；ＬＦ、病巣スコアが低い群；ＮＣ、正常対照。
【０２４４】
炎症に関連するｍｉＲＮＡと、リンパ性病巣の数と無関係に変化するｍｉＲＮＡとを分離するために、２つの主要なパターンを最初に評価した（表２０）：
Ａ．非炎症性パターン（ｎ＝１３）：この群のマイクロＲＮＡは、健康群と低病巣スコア群との間で＞５倍に増加したが、病巣スコアが低い群と病巣スコアが高い群との間では基本的に変化しなかった（＜５０％の増加または減少）（すなわち、それらの発現レベルは炎症と相関しなかった）。
【０２４５】
Ｂ．炎症性パターン（ｎ＝１０）：この群のマイクロＲＮＡは、健康な対照と低病巣スコアとの間で＞５０％増加し、病巣スコアが低い群と病巣スコアが高い群との間でも＞２．５倍に増加した（すなわち、それらの発現レベルが炎症と一貫して上昇した）。
【０２４６】
表２０
正常な試料、ＳＳの病巣スコアが低い試料（低ＦＳ）、およびＳＳの病巣スコアが高い試料（高ＦＳ）の間のクラス比較
【０２４７】
【表２０】
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示差的に発現されるマイクロＲＮＡを、ＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓクラス比較アルゴリズムを偽発見７５％の信頼水準で最大１つの偽陽性を許容するように設定して使用して同定した。ｐ＜０．０１の９４種の示差的に発現されるマイクロＲＮＡの完全なセットが表１９に列挙されている。各試料群についての幾何平均が示されている。
【０２４８】
非炎症性パターンからのマイクロＲＮＡは、ＳＳにおける炎症の増加に関連しないが、疾患プロセスの他の態様に関連する経路を標的とするだろうことが仮定された。この仮定を検定するために、これらのマイクロＲＮＡの予測されるｍＲＮＡ標的を、ＲＮＡ２２標的予測アルゴリズム（Ｍｉｒａｎｄａら、Ｃｅｌｌ  １２６巻：１２０３〜１２１７頁、２００６年）を用いて同定し、次いでＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、これらのマイクロＲＮＡの標的となっている可能性がある生理学的なネットワークおよび機能を予測した。複数のマイクロＲＮＡ標的から生じる偽の経路が同定される可能性を減らすために、少なくとも３種の非炎症性群のマイクロＲＮＡの標的となることが予測されたｍＲＮＡのみを含めた。得られた最も高い統計的に有意な生物学的機能は、循環器疾患、細胞周期、細胞形態および細胞発生に関連する経路を含んだ（図６Ａ）。炎症性群のマイクロＲＮＡを使用した同様の分析により、免疫疾患、神経疾患、遺伝疾患および精神疾患ならびに細胞の集合および組織化に関連する経路が同定された（図６Ｂ）。
【０２４９】
病巣スコアが高い唾液腺において唾液の流れが保たれていることと唾液の流れが不十分なこととを識別する、示差的に発現されるマイクロＲＮＡ
特異的なマイクロＲＮＡが、炎症が激しい状況における機能低下に関連するかどうかをさらに探索するために、病巣スコアが高い患者を、唾液の流れが保たれているか、または唾液の流れが不十分であるかのいずれかと比較した。階層クラスター解析から予測された通り（図４）、病巣スコアが高い群において、唾液の流れが正常なものと唾液の流れが保たれているものとの間でいくつものｍｉＲＮＡが示差的に発現された（表２１）。
【０２５０】
表２１
病巣スコアが高く、唾液機能が保たれているか、唾液機能が低いかのいずれかの患者の小唾液腺において示差的に発現されるマイクロＲＮＡ
【０２５１】
【表２１】
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興味深いことに、これらの２４種のマイクロＲＮＡすべてが、機能が低下した群において下方制御され、このことはそれらの標的の過剰発現が上皮細胞に対して負の効果を有する可能性があることが示唆している。これらの示差的に発現されるマイクロＲＮＡのうち４種が炎症細胞の特異的なサブセットに関連するｍｉｒ−１７−９２クラスターに属することも興味深い。
【０２５２】
（実施例５）
マイクロＲＮＡバイオマーカーの供給源としてのヒト唾液由来エキソソーム
本実施例には、ヒト唾液由来のエキソソームからｍｉＲＮＡを単離するための典型的なプロトコールが記載されている（Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．  １６巻：３４〜３８頁、２０１０年も参照されたい）。
【０２５３】
方法
研究の被験体
被験体は、健康なボランティアに対するプロトコールまたはシェーグレン症候群の自然経過の研究において登録された。
【０２５４】
唾液の採取
腺の唾液の流れを刺激するために、患者に、舌の後外側表面に２％クエン酸溶液を、両側に綿棒で３０秒毎に５秒塗布することを受けさせた。採取手順の間中、クエン酸刺激を３０秒間隔で続けた。耳下腺の唾液を、以下の通り採取した。Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎの耳下腺採取器を、上顎第２大臼歯の反対側の頬側粘膜のＳｔｅｎｓｏｎの管開口部の開口に両側的に置いた。耳下腺採取器を、内輪が管開口を囲むように粘膜に置いた。圧迫することによって真空を創出し、外輪からの吸引により採取器を粘膜に保持し、管開口部全面に設置する間、圧縮されたバルブを保持し、その後カップが適切な位置になったときにバルブをはずした。顎下の唾液／舌下の唾液を以下の通り採取した。耳下腺管の開口部を採取器で覆い、２％クエン酸を少なくとも５回舌に塗布した後、口底を乾燥させ、２０秒間穏やかに吸引して氷上のチューブに唾液を採取した。次いで採取を停止し、２×２のガーゼを顎下腺管の開口部の全面に置き、舌に２％クエン酸を塗布した。唾液を穏やかに吸引して同じチューブに採取し、ガーゼを用いて再度採取を停止した。プロセス全体を最大８回繰り返した。
【０２５５】
唾液中のエキソソームの単離
唾液中のエキソソームを単離するためのプロトコールを、尿中のエキソソームを単離するための先行の方法から適合させ、改変した（Ｚｈｏｕら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ７４巻：６１３〜６２１頁、２００８年）。採取した直後に唾液を氷上に置き、研究室に移して４℃で１０分間、１５００ｇで遠心分離した。次いで上清を取り出し、別のチューブに入れて４℃で１５分間、１７，０００ｇで遠心分離して不必要な細胞小器官および細胞断片をさらに取り除いた。最初の遠心分離ステップの後、上清を滅菌チューブに移して、４℃で１時間、１６０，０００ｇで超遠心分離した。超遠心分離した後、全唾液試料において粘性である水層を取り除き、エキソソームを含有するペレットをＰＢＳで洗浄し、４℃で１時間、１６０，０００ｇで再度超遠心分離した。２回目の超遠心分離の後、上清を取り除き、ペレットを簡単に乾燥させた。次いで試料を、タンパク質またはＲＮＡを単離する準備をした。
【０２５６】
タンパク質の単離およびウェスタンブロット
エキソソームのタンパク質を分析する前に、１０ｍＭのトリエタノールアミン、２５０ｍＭのショ糖および脱イオン水を混合することによって単離緩衝液の保存溶液を作製した。次いで、１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて単離緩衝液のｐＨをｐＨ７．６に調整した。脱イオン水を加えて単離緩衝保存溶液の総体積を５０ｍＬにした。溶液を−２０℃で保管した。使用する直前に、単離緩衝液１ｍＬにプロテアーゼ阻害剤を加えた（フッ化フェニルメチルスルホニル５０マイクロリットル（２ｍｇ／ｍｌ）およびロイペプチン１０マイクロリットル（１ｍｇ／ｍｌ）、どちらも−２０℃で保管）。エキソソームを単離した後、ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する単離緩衝液１００マイクロリットルに再懸濁させた。同体積の２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を加え、試料を６０℃で１０分間変性させた。ウェスタンブロットを用いてＴＳＧ１０１の存在を決定した。試料をＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）に供した。セミドライ転写ユニットを使用してタンパク質を膜に転写した。１：７５００希釈したＴＳＧ１０１抗体（Ａｂｃａｍ、（ａｂ８３）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いてウェスタンブロットを行った。
【０２５７】
ＲＮＡの単離および分析
エキソソームを単離した後、検出されたＲＮＡがすべてエキソソーム由来であることを確実にするために、ペレットをＲＮａｓｅ  Ａで処理して、いかなる残存細胞ＲＮＡも分解した。一部の試料を、ＲＮａｓｅ  Ａ（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ−Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、４ｍｇ／ｍｌの溶液、脱イオン水中０．４ｍｇ／ｍｌの作用濃度を用いて、３７℃で１０分間処理した。次いで、試料のエキソソームをｍｉＲＮｅａｓｙ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）６００マイクロリットルで溶解させ、後で使用するために−８０℃で保管した、またはＱｉａｇｅｎのｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを製造者のプロトコールに従って使用してすぐに処理した。すべてのＲＮＡ試料を、ＲＮａｓｅを含まない水５０マイクロリットル中に溶出させた。エキソソームＲＮＡの濃縮および沈殿の助けになるように、Ｎｏｖａｇｅｎのペレットペイントを製造者のプロトコールに従って、軽微な改変をして使用した；ＲＮＡ試料に２マイクロリットルのペレットペイントを加えた。ペレットペイントを加えた後、体積０．１の３Ｍ酢酸ナトリウムを試料に加え、試料を１０秒間混合した。混合した後、体積２．５の１００％エタノールを試料に加え、簡単にボルテックスした。次いで、試料を室温で２分間インキュベートし、４℃で５分間遠心分離した。遠心分離した後、エキソソームＲＮＡを含有するペレットを７０％エタノール２００マイクロリットルで洗浄し、ＲＮａｓｅを含まない水に再懸濁させる前に風乾させた。次いでＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ８０００）を使用してＲＮＡを定量化し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、品質を査定し、ＲＮａｓｅ処理した試料と未処理試料の両方において低分子ＲＮＡの存在を検証した。
【０２５８】
エキソソームＲＮＡを単離し、定量化した後、ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた逆転写反応のために５ナノグラムの入力ＲＮＡを使用した。ｈｓａ−ｍｉｒ−２０３、ｈｓａ−ｍｉｒ−７６８−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉｒ−５７４−３ｐに対する遺伝子特異的なプライマーを、別々の反応において使用した。核小体ＲＮＡ  Ｕ４８を用いた陽性対照の逆転写反応を、特異的なプライマーを使用して行った。各反応と並んで、ＲＮＡの代わりに水５マイクロリットルを使用した陰性対照を行った。逆転写反応から得られたｃＤＮＡを−２０℃で保管した、またはすぐにリアルタイム定量ＰＣＲに使用した。リアルタイム定量ＰＣＲを使用して対象とするマイクロＲＮＡを検出し、定量化した。すべての試料について、製造者のプロトコールに記載されている通り、各反応に対して５ｎｇのｃＤＮＡを使用して３連で実行した。
【０２５９】
マイクロアレイ試験
Ｅｘｉｑｏｎ  ｍｉＲＮＡマイクロアレイシステム（ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｒｒａｙ、１０．０版）を使用して、耳下腺の唾液および顎下腺の唾液から単離されたエキソソームｍｉＲＮＡ、ならびにシェーグレン症候群患者の耳下腺の唾液中のエキソソームｍｉＲＮＡに対してマイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。使用した出発材料がアレイの製造者の推奨よりも下限にあったことを除いて製造者のプロトコールに記載の通りに試料の標識およびハイブリダイゼーションを行った。簡単に述べると、対照にスパイクしたｍｉＲＮＡを２５０ｎｇの唾液中のエキソソームマイクロＲＮＡに加え、仔ウシ腸ホスファターゼで処理した。次いで、試料をＨｙ３またはＨｙ５のいずれかで標識し、変性させ、５６℃で１６時間、アレイ上でハイブリダイズさせ、洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナー（Ｍｏｄｅｌ  Ｇ２５０５Ｂ）でスキャンした。データをＡｇｉｌｅｎｔのＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎアルゴリズムで処理した。
【０２６０】
結果
２００μｌから最大５ｍＬまでの体積範囲の唾液試料により、定量ＰＣＲに適した量のエキソソームＲＮＡが得られた。マイクロＲＮＡは実に小体積の唾液から単離されたが、ＲＮＡの収量は少数の定量ＰＣＲ反応に十分なだけのものであった。７日間−２０℃で凍結させた唾液からエキソソームを単離することも可能であった。腺の唾液および全唾液の両方からエキソソームを単離することが可能であるが、全唾液は、その粘性および細胞のコンタミネーションにより、エキソソームを単離するための理想に満たない媒体になる。したがって、この試験は主に腺の唾液のみを焦点とした。
【０２６１】
一連の遠心分離の後、ペレット中のエキソソームの存在を検証するために、顎下腺の唾液および耳下腺の唾液の両方からペレットを溶解させ、ウェスタンブロットによって標準のエキソソームマーカーであるＴＳＧ１０１の存在を確認した。エキソソームのマイクロＲＮＡ含有量を査定するため、および単離されたｍｉＲＮＡがエキソソーム内に由来することを確実にするために、エキソソームペレットを上記の通りＲＮａｓｅＡで処理し、次いで、同様にｍＲＮＡを保存したキットを用いてエキソソーム溶解物からｍｉＲＮＡを単離した。単離されたＲＮＡの総濃度は個々で変動し、採取された耳下腺に対して、平均で１００μｌ当たり２０．９ｎｇであり、採取された顎下の唾液１００μｌ当たり２７．４ｎｇであった。採取時間を増やしてもＲＮＡ濃度は直線的に上昇しなかった；連続した唾液採取では、採取された最初の１００μｌでは、続く１００μｌよりも一貫してＲＮＡ濃度が高かった。細胞に存在するエキソソームは、刺激されると即座に唾液中に放出され、この方法により直ちに採取されることが仮定される。現存の供給が一度枯渇すると、エキソソームの新規合成には唾液採取時間よりも長い期間が必要になる。
【０２６２】
エキソソーム内のマイクロＲＮＡの存在を確認するために、小唾液腺、ならびに全唾液に存在することが予め同定された３種のマイクロＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６８−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ）についてＴａｑＭａｎ（商標）マイクロＲＮＡ定量ＰＣＲ増幅を行った。陰性対照および陽性対照を用いたＰＣＲ反応により、エキソソーム中にマイクロＲＮＡが存在することが実証された。いかなるマイクロＲＮＡがエキソソーム中に存在する可能性があるかについて包括的に考察するために、２種のｍｉＲＮＡマイクロアレイを実行した：一方のマイクロアレイは、耳下腺の唾液由来のマイクロＲＮＡを、同じ正常なボランティアからの顎下唾液由来のマイクロＲＮＡに対してハイブリダイズさせ、もうひとつのマイクロアレイは、正常なボランティアからの耳下腺の唾液由来のｍｉＲＮＡを、シェーグレン症候群患者の唾液試料由来のｍｉＲＮＡに対してハイブリダイズさせた。
【０２６３】
本明細書に記載の結果により、エキソソームを唾液から容易に単離することができること、およびこれらのエキソソームが、ｑＰＣＲおよびマイクロアレイハイブリダイゼーションのどちらにも適した量のマイクロＲＮＡを含有することが実証されている。
【０２６４】
開示されている発明の原理を適用することができる多くの可能性のある実施形態を考慮して、例示した実施形態は単に本発明の好ましい実施例であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが理解されるべきである。もっと正確に言えば、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、これらの請求項の範囲および主旨の範囲内に入るすべてを本発明として特許請求する。
【図１】
2012522508.tif 000030
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2012522508.tif 000035
【図６Ａ】
2012522508.tif 000036
【図６Ｂ】
2012522508.tif 000037
【国際調査報告】
2012522508.tif 000038
2012522508.tif 000039
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