(57)【要約】本発明は、細胞培養技術の分野に関する。それは、ＵＢＦをコードする核酸の導入又はＮｏＲＣタンパク質、特にＴＩＰ−５の発現の低下を通じて達成されるリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の増加発現を伴う産生宿主細胞系に関する。それらの細胞系は、コントロール細胞系と比較して、改善した分泌及び成長特徴を有する。本発明は、さらに、記載する方法により生成された細胞を使用してタンパク質を産生する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法であって、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること、
ｃ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させることにより増加させること、及び
ｄ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む、方法。
【請求項２】
組換えタンパク質発現が、低下したｒＤＮＡサイレンシングを伴わない細胞と比較して、前記細胞中で増加し、好ましくは、前記増加は、２０%〜１００%、より好ましくは２０%〜３００%、最も好ましくは２０%を上回る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）が、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分のノックダウン又はノックアウトを含み、工程ｃ）が、転写因子の過剰発現を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
転写因子が上流結合因子（ＵＢＦ）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ＮｏＲＣ成分が、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ＴＩＰ−５をノックアウトする、請求項１〜５記載の方法。
【請求項７】
ＴＩＰ−５サイレンシングベクターが以下：
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号８、もしくは配列番号９のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．配列番号３、配列番号４、配列番号１０、もしくは配列番号１１のｍｉＲＮＡ
を含む、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
工程ｂが、ＴＩＰ−５のアセチル化を、欠失もしくは突然変異のいずれかにより、又は、アセチル化することができないＴＩＰ−５バリアントの過剰発現により、好ましくはＴＩＰ−５のＫ６３３又はＫ６４９リシン突然変異体の過剰発現により防止することを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
ＳＮＦ２Ｈをノックアウトする、請求項１〜５記載の方法。
【請求項１０】
ＴＩＰ−５を工程ｂ）においてノックダウンし、ＵＢＦを工程ｃ）において過剰発現させる、請求項１〜３記載の方法。
【請求項１１】
ＴＩＰ−５のアセチル化を、欠失もしくは突然変異のいずれかにより、又は、アセチル化することができないＴＩＰ−５バリアントの過剰発現により、好ましくは工程ｂ）においてＴＩＰ−５のＫ６３３又はＫ６４９リシン突然変異体の過剰発現により防止し、ＵＢＦを工程ｃ）において過剰発現させる、請求項１、２、又は８記載の方法。
【請求項１２】
加えて、セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現が前記細胞中で増加され、ＣＥＲＴが、好ましくは、ＣＥＲＴ野生型又はＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ突然変異体である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
目的のタンパク質を細胞中で産生するための方法であって、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること、
ｃ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させることにより増加させること、及び
ｄ．前記細胞を、目的の前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること
を含む、方法。
【請求項１４】
方法が、加えて、以下：
ｅ．目的の前記タンパク質を精製すること
を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
組換えタンパク質発現が、低下したｒＤＮＡサイレンシングを伴わない細胞と比較して、前記細胞中で増加し、好ましくは、前記増加は、２０%〜１００%、より好ましくは２０%〜３００%、最も好ましくは２０%を上回る、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
工程ｂ）が、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分のノックダウン又はノックアウトを含み、工程ｃ）が、転写因子の過剰発現を含む、請求項１３〜１５記載の方法。
【請求項１７】
転写因子が上流結合因子（ＵＢＦ）である、請求項１３又は１６記載の方法。
【請求項１８】
ＮｏＲＣ成分が、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ＴＩＰ−５をノックダウンし、ＵＢＦを過剰発現させる、請求項１３〜１６記載の方法。
【請求項２０】
組換えタンパク質の産生のための宿主細胞を生成する方法であって、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること、
ｃ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させることにより増加させること、
ｄ．場合により、単一細胞クローンを選択すること、及び
ｅ．宿主細胞を得ること
を含む、方法。
【請求項２１】
工程ｂ）が、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分のノックダウン又はノックアウトを含み、工程ｃ）が、転写因子の過剰発現を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＮｏＲＣ成分が、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５であり、転写因子が、上流結合因子（ＵＢＦ）である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項２０〜２２記載の方法のいずれかに従って生成された細胞。
【請求項２４】
細胞が、真核細胞、好ましくは哺乳動物、齧歯類、又はハムスター細胞である、請求項１〜２２記載の方法のいずれか又は請求項２３記載の細胞。
【請求項２５】
ハムスター細胞が、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１など、好ましくはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
工程ｂ）及びｃ）の順番を逆転させることができる、請求項１〜２２、２４又は２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法であって、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で、好ましくはＴＩＰ−５のノックダウンにより又はＴＩＰ−５のアセチル化の防止により低下させること、
ｃ．セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現を前記細胞中で増加させること、
ｄ．場合により、リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子、好ましくはＵＢＦの発現を増加させることにより増加させること、及び
ｅ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む、方法。
【請求項２８】
組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法であって、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子、好ましくはＵＢＦの発現を増加させることにより増加させること、
ｃ．セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現を前記細胞中で増加させること、
ｄ．場合により、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で、好ましくはＴＩＰ−５のノックダウンにより又はＴＩＰ−５のアセチル化の防止により低下させること、及び
ｅ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、細胞培養技術の分野に関する。それは、ＵＢＦをコードする核酸の導入又はＮｏＲＣタンパク質、特にＴＩＰ−５の発現の低下を通じて達成されるリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の増加発現を伴う産生宿主細胞系に関する。それらの細胞系は、コントロール細胞系と比較して、改善した分泌及び成長特徴を有する。
【０００２】
背景
哺乳動物の高産生細胞系の選択は、生物医薬品製造工業にとって主要な課題のままである。ＤＮＡから産物への途中で、翻訳が、哺乳動物産生細胞系での特異的な産生性を限定しうる主要なボトルネックである。細胞は、存在するリボソームの翻訳効率を増加させることにより又は新たなリボソームの産生（リボソーム生合成）を通じて翻訳の能力を増加させることによりタンパク質合成の速度をアップレギュレーションすることができる。全核転写の約８０%がリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の合成に使われ、リボソーム生合成は、哺乳動物細胞での主要な代謝活性の１つである。リボソーム組み立てが核内で生じ、４つのｒＲＮＡ（４５ＳプレｒＲＮＡ（その後に、１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓ、及び５Ｓ  ｒＲＮＡにプロセッシングされる））及び約８０のリボソームタンパク質（ｒタンパク質）の協調発現を要求する。４５ＳプレｒＲＮＡは、核小体中で、ポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ  Ｉ）により転写され、５Ｓ  ＲＮＡは、Ｐｏｌ  ＩＩＩにより、核小体周辺で転写され、次に、核小体中に輸送され、ｒタンパク質は、Ｐｏｌ  ＩＩにより転写される。このように、リボソーム生合成では、異なる区画中で動作する異なるポリメラーゼによる転写の組織化が要求される。哺乳動物細胞において、これらのプロセスは大部分が未知である（Santoro,R. and Grummt, I. (2001). Molecular mechanisms mediating methylation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. Mol Cell 8, 719-725）。
【０００３】
４５ＳプレｒＲＮＡの転写は、リボソーム生合成の鍵となる段階である。哺乳動物の一倍体ゲノムは、約２００のリボソームＲＮＡ遺伝子を含み、その内の一部だけが任意の所与の時間に転写され、残りはサイレントなままである（Santoro, R., Li, J., and Grummt,I. (2002). The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet. 32, 393-396）。活性な及びサイレントな遺伝子は、クロマチン配置に関して異なる：活性な遺伝子が真正染色質の構造を有するのに対し、サイレントな遺伝子は異質染色質である。活性なｒＲＮＡ遺伝子のプロモーターにはＣｐＧメチル化はなく、アセチル化ヒストンと会合する。反対のことがサイレントな遺伝子に当てはまる。
【０００４】
転写的にサイレントなｒＲＮＡ遺伝子の存在は、ｒＲＮＡの合成及びリボソームの産生についての限定因子を表す。細胞が、各遺伝子の転写活性を変化させることにより及び／又は活性な遺伝子の数を変化させることによりｒＤＮＡ転写レベルを調節することができると仮定されてきた。しかし、４５ＳプレｒＲＮＡ合成レベルとｒＲＮＡ遺伝子の数の間での満足な相関は見出されていない。例えば、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ｒＲＮＡ遺伝子の数を約３分の２だけ低下させることによっては、全ｒＲＮＡ産生は影響を受けなかった。同様に、トウモロコシ近交系及び異数体鶏細胞（異なるｒＲＮＡコピー数を含む）は、同じレベルのｒＲＮＡ転写を呈した。
【０００５】
ｒＤＮＡは、リボソームの主要な成分を表すため、これらの遺伝子のサイレンシングは、リボソーム生合成及びそれによりタンパク質翻訳における限定をもたらし、このように、究極的には、低下したタンパク質合成に導く。
【０００６】
生物医薬品産生細胞において、これは、細胞の完全産生能力において限定を作り、治療用タンパク質産物の低下した特異的産生性を意味する。それは、それにより、工業的産生プロセスにおいて低下した全タンパク質収量に導きうる。
【０００７】
プロセス収量（Ｙ）を決定する特異的な産生性（Ｐｓｐｅｃ）の次の他の因子は、ＩＶＣ（所望のタンパク質を産生する生細胞の経時的な積分）である。この相関は、以下の式により表現される：Ｙ  ＝  Ｐｓｐｅｃ  ＊  ＩＶＣ。従って、細胞成長を改善することによりバイオリアクター中での宿主細胞の産生能力又は生細胞密度のいずれか、理想的には両方のパラメーターを同時に増加させる緊急の必要性がある。
【０００８】
発明の概要
本願は、上に記載する問題を解決し、ＴＩＰ−５（ＮｏＲＣ（核小体リモデリング複合体；McStay, B. and Grummt, I. (2008). The epigenetics of rRNA genes: from molecular to chromosome biology. Annu. Rev Cell Dev. Biol 24, 131-157）のサブユニット）のノックダウンによって、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数が減少し、ｒＲＮＡ転写がアップレギュレーションされ、リボソーム合成が増強され、組換えタンパク質の産生が増加することを示す。
【０００９】
本願は、上に記載する問題を解決し、転写因子ＵＢＦの導入によってｒＲＮＡ転写がアップレギュレーションされ、それによって増強したリボソーム合成及び組換えタンパク質の増加した産生に導かれうることを示す。
【００１０】
本願のデータは、転写能力のあるｒＲＮＡ遺伝子の数がリボソーム合成を限定することを実証する。リボソームＲＮＡ遺伝子のエピジェネティック操作は、生物医薬品製造を改善するための新たな可能性を与え、翻訳機構を支配する複雑な調節ネットワークに新たな洞察を提供する。
【００１１】
本願は、ＴＩＰ−５のノックダウンが、ｒＤＮＡリピートでの抑制クロマチンマークの喪失を誘導し、ｒＤＮＡ転写を増強し、核小体構造を変化させ、細胞の成長及び増殖を促進することを示す。
【００１２】
ＴＩＰ−５活性は、アセチルトランスフェラーゼＭＯＦ（ｍａｌｅｓ  ａｂｓｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ）及びデアセチラーゼＳＩＲＴ１（サーチュイン１）により媒介される可逆的アセチル化により制御される。リシン残基でのＴＩＰ−５のアセチル化（マウス中のＫ６３３、ヒトＴＩＰ−５中のＫ６４９）は、ｒＤＮＡ遺伝子への増強した結合、増強したヘテロクロマチン形成、及びｒＤＮＡサイレンシングをもたらす。逆に、このリシン残基の突然変異（例、アルギニンへの）は、低下したｒＤＮＡメチル化及び増強したｒＲＮＡ転写をもたらす（Zhou et al. (2009) Nat. Cell Biol., (8) 11; 1010-1017）。このリシン残基を突然変異させること又は前記突然変異を持つＴＩＰ−５バリアントの過剰発現によって、本発明の別の実施態様として、上に記載する問題が解決される。具体的には、ＴＩＰ−５のこのリシン残基を突然変異させることの組み合わせ（転写因子ＵＢＦの導入と組み合わせて）によって、ｒＲＮＡ転写がアップレギュレーションされ、それは、増強したリボソーム合成及び組換えタンパク質の増加した産生に導く。
【００１３】
増加数の活性なｒＲＮＡ遺伝子が細胞の成長及び増殖に影響を与えるか否かを決定するために、本発明者らは、いくつかのｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析した。
【００１４】
驚くべきことに、初めて、本発明者らは、本願において、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数における操作された減少が、ｒＲＮＡ及びリボソームの増強した産生と、及び、結果的に、哺乳動物細胞のより高い産生性と相関しうることを示す。
【００１５】
予想外に、本願は、加えて、異なる哺乳動物細胞系におけるＴＩＰ−５のノックダウンが、より速い細胞周期進行及び増加した細胞増殖に導くことを示すデータを提供する。
【００１６】
この知見は、先行技術（ＷＯ２００９／０１７６７０）に記載されるものとは対照的である。ＴＩＰ−５は、以前に、網羅的ｍｉＲＮＡスクリーンにおいて、ＦａｓについてのＲａｓ媒介性エピジェネティックサイレンシングエフェクター（ＲＥＳＥ）として機能するものと同定されている（ＷＯ２００９／０１７６７０）。Ｒａｓは、細胞の形質転換及び腫瘍形成に関与する周知のオンコジーンであり、ヒトのがんにおいて頻繁に突然変異又は過剰発現する。従って、先行技術は、Ｒａｓエフェクター（例えばＴＩＰ−５など）に対する低下発現が、細胞増殖の阻害をもたらすことを主張する。
【００１７】
これを検証するために、本発明者らは、両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析した。図４Ａ、Ｂに示す通り、しかし、Ｓ期中のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ−５細胞の数は、コントロール細胞と比較して、ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞において有意に高い。これらの結果と一致して、ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞は、新生ＤＮＡ中への５ブロモデオキシウリシン（ＢｒｄＵ）の増加した取り込み及びより高いレベルのサイクリンＡを示した（図４Ｃ）。
【００１８】
加えて、本発明者らは、ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５、ｓｈＲＮＡコントロールおよび親ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞の間で細胞増殖速度を比較した（図４Ｄ、Ｆ）。驚くべきことに、先行技術の報告とは対照的に、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方が、コントロール細胞よりも速い速度で増殖する。このように、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数における減少は、細胞代謝に対して影響を有する。本発明は、驚くべきことに、ＴＩＰ−５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングにおける結果的な減少が、細胞増殖を増強することを示す。
【００１９】
本願は、コントロール細胞系と比較した、ＴＩＰ−５枯渇細胞中でのタンパク質産生における有意な増加を実証する（実施例６及び以下の図６を参照のこと）。ＴＩＰ−５枯渇細胞中でのタンパク質産生における増加は、コントロール細胞系と比較して、２倍を上回る、４倍を上回る、５倍を上回る、６倍を上回る、１０倍を上回る、２〜１０倍の間である。これらのデータは、ＴＩＰ−５枯渇が異種タンパク質産生を増加させることを示す。本願は、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数における減少が、リボソーム合成を増強し、組換えタンパク質を産生する細胞の潜在力を増加することを示す。
【００２０】
本発明において、本発明者らは、ＴＩＰ−５を低下させる及び／又はＵＢＦを過剰発現させることによりｒＲＮＡ転写、リボソーム生合成、及び翻訳を増加させるための新たな方法を提供し、究極的に、組換えタンパク質の分泌を増強する利益を伴う。さらに、本発明者らは、ＴＩＰ−５の枯渇は、より速い細胞周期進行及び改善された細胞成長に導くことを実証する。
【００２１】
あるいは、同じ効果を、ＴＩＰ−５アセチル化の阻害を通じて、例えば、ＳＩＲＴ１によりアセチル化することができないＴＩＰ−５突然変異体の過剰発現により、又は、内因性ＴＩＰ−５遺伝子内のアセチル化アクセプター部位を欠失させることにより達成することができる。
【００２２】
本発明の特定の実施態様は、ＳＩＲＴ１によりアセチル化することができないＴＩＰ−５突然変異体又は内因性ＴＩＰ−５遺伝子内のアセチル化アクセプター部位の欠失であり、両方が、好ましくは、転写因子ＵＢＦの導入と組み合わされる。これは、アップレギュレーションされたｒＲＮＡ転写をもたらし、それは、次に、増強したリボソーム合成及び組換えタンパク質の増加した産生に導く。特に適したＴＩＰ−５突然変異体は、マウスＴＩＰ−５中のリシン残基Ｋ６３３又はヒトＴＩＰ−５中のＫ６４９に突然変異を伴うＴＩＰ−５である。
【００２３】
増強した細胞成長は、生物医薬品産生プロセスの複数の局面に対して著しい影響を有する：
−  細胞のより短い世代時間（細胞系開発における短縮した時系列をもたらす）。世代時間は、好ましくは、２４時間より短く、好ましくは２０〜２４時間、より好ましくは１５〜２４時間又は１５〜２２時間、最も好ましくは１０〜２４時間である。
−  単一細胞クローニング後でのより高い効率及びその後のより速い成長。
−  スケールアップの間でのより短い時間枠（特に大規模バイオリアクターのための接種の場合において）。
−  ＩＶＣと産物収量の間での比例相関に起因する発酵時間当たりのより高い産物収量。
【００２４】
逆に、低いＩＶＣは、より低い収量及び／又はより長い発酵時間を起こす。好ましくは、収量は、１０%だけ、より好ましくは２０%だけ、最も好ましくは３０%だけ増加される。
【００２５】
これによって、真核細胞に基づく産生プロセスにおいてタンパク質収量を増加することができる。それは、それにより、そのようなプロセスでの物品のコストを低下させ、同時に、研究試験、診断、臨床試験、又は治療用タンパク質の市場供給のために必要とされる材料を生成するために産生する必要があるバッチ数を低下させる。本発明は、さらに、薬物開発をスピードアップさせる。なぜなら、しばしば、前臨床試験のための十分量の材料の生成が、時系列に関して、決定的なワークパッケージであるからである。
【００２６】
本発明を使用して、診断目的、研究目的（標的同定、リード同定、リード最適化）、又は市場でのもしくは臨床開発のいずれかにおける治療用タンパク質の製造のいずれかのための１つ又は複数の特定のタンパク質の生成のために使用される全ての真核細胞の特性を増加させることができる。
【００２７】
本発明により提供される細胞系／宿主細胞は、真核細胞に基づく産生プロセスにおいてタンパク質収量を増加させるために役立つ。これは、そのようなプロセスでの物品のコストを低下させ、同時に、それは、研究試験、診断、臨床試験、又は治療用タンパク質の市場供給のために必要とされる材料を生成するために産生する必要があるバッチ数を低下させる。
【００２８】
本発明は、さらに、薬物開発をスピードアップさせる。なぜなら、しばしば、前臨床試験のための十分量の材料の生成が、時系列に関して、決定的なワークパッケージであるからである。
【００２９】
ＴＩＰ−５の低下発現及び／又はＵＢＦの増強レベルを伴う最適化された宿主細胞系を、診断目的、研究目的（標的同定、リード同定、リード最適化）、又は市場でのもしくは臨床開発のいずれかにおける治療用タンパク質の製造のいずれかのための１つ又は複数の特定のタンパク質の生成のために使用することができる。
【００３０】
それらは、同じ分泌経路を共有し、脂質小胞中で等しく輸送される分泌又は膜結合タンパク質（例えば表面受容体、ＧＰＣＲ、メタロプロテイナーゼ、又は受容体キナーゼなど）を発現又は産生するために等しく適用可能である。タンパク質を、次に、細胞表面受容体の機能を特徴付けることを目標とする研究目的のために、例えば、表面タンパク質の産生及びその後の精製、結晶化、及び／又は分析のために使用することができる。これは、新たなヒト薬物治療の開発のために決定的に重要である。なぜなら、細胞表面受容体は、薬物標的の支配的なクラスであるからである。さらに、これは、細胞表面受容体と会合した細胞内シグナル伝達複合体の試験のために又は同じもしくは別の細胞上での可溶性の成長因子とそれらの対応する受容体との相互作用により部分的に媒介される細胞間コミュニケーションの分析のために有利である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１（Ａ）】齧歯類及びヒト細胞系中でのＴＩＰ−５のノックダウン。（Ａ、Ｂ）ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定的に発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ａ）ならびにｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｂ）のＴＩＰ５  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ。データをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルについて正規化する。（Ｃ）安定なｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＴＩＰ５  ｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。コントロールとして、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図１（Ｂ）】齧歯類及びヒト細胞系中でのＴＩＰ−５のノックダウン。（Ａ、Ｂ）ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定的に発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ａ）ならびにｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｂ）のＴＩＰ５  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ。データをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルについて正規化する。（Ｃ）安定なｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＴＩＰ５  ｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。コントロールとして、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図１（Ｃ）】齧歯類及びヒト細胞系中でのＴＩＰ−５のノックダウン。（Ａ、Ｂ）ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定的に発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ａ）ならびにｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２配列を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｂ）のＴＩＰ５  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ。データをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルについて正規化する。（Ｃ）安定なｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５−１／２  ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＴＩＰ５  ｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。コントロールとして、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図２（Ａ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、低下したｒＤＮＡメチル化に導く。（Ａ〜Ｃ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化を減少させる。上パネル：ＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を含む（Ａ）マウス、（Ｂ）ヒト、及び（Ｃ）チャイニーズハムスターｒＤＮＡプロモーター領域の図表を分析する。黒丸はＣｐＧジヌクレオチドを示す。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。下パネル：ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを、ｓｈＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡＴＩＰ５−１／２ならびにコントロール配列を安定的に発現する（Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で測定する。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化ＤＮＡを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。（Ｄ、Ｅ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを減少させる。分析したのは、（Ａ）転写開始部位（＋１）を含むｒＤＮＡ遺伝子間及びプロモーター領域ならびに（Ｂ）コード領域内の２つの領域である。単一のマウスｒＤＮＡリピート及び分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を表す模式図。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマーを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡ及び未消化ＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。
【図２（Ｂ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、低下したｒＤＮＡメチル化に導く。（Ａ〜Ｃ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化を減少させる。上パネル：ＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を含む（Ａ）マウス、（Ｂ）ヒト、及び（Ｃ）チャイニーズハムスターｒＤＮＡプロモーター領域の図表を分析する。黒丸はＣｐＧジヌクレオチドを示す。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。下パネル：ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを、ｓｈＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡＴＩＰ５−１／２ならびにコントロール配列を安定的に発現する（Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で測定する。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化ＤＮＡを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。（Ｄ、Ｅ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを減少させる。分析したのは、（Ａ）転写開始部位（＋１）を含むｒＤＮＡ遺伝子間及びプロモーター領域ならびに（Ｂ）コード領域内の２つの領域である。単一のマウスｒＤＮＡリピート及び分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を表す模式図。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマーを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡ及び未消化ＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。
【図２（Ｃ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、低下したｒＤＮＡメチル化に導く。（Ａ〜Ｃ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化を減少させる。上パネル：ＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を含む（Ａ）マウス、（Ｂ）ヒト、及び（Ｃ）チャイニーズハムスターｒＤＮＡプロモーター領域の図表を分析する。黒丸はＣｐＧジヌクレオチドを示す。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。下パネル：ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを、ｓｈＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡＴＩＰ５−１／２ならびにコントロール配列を安定的に発現する（Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で測定する。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化ＤＮＡを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。（Ｄ、Ｅ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを減少させる。分析したのは、（Ａ）転写開始部位（＋１）を含むｒＤＮＡ遺伝子間及びプロモーター領域ならびに（Ｂ）コード領域内の２つの領域である。単一のマウスｒＤＮＡリピート及び分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を表す模式図。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマーを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡ及び未消化ＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。
【図２（Ｄ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、低下したｒＤＮＡメチル化に導く。（Ａ〜Ｃ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化を減少させる。上パネル：ＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を含む（Ａ）マウス、（Ｂ）ヒト、及び（Ｃ）チャイニーズハムスターｒＤＮＡプロモーター領域の図表を分析する。黒丸はＣｐＧジヌクレオチドを示す。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。下パネル：ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを、ｓｈＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡＴＩＰ５−１／２ならびにコントロール配列を安定的に発現する（Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で測定する。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化ＤＮＡを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。（Ｄ、Ｅ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを減少させる。分析したのは、（Ａ）転写開始部位（＋１）を含むｒＤＮＡ遺伝子間及びプロモーター領域ならびに（Ｂ）コード領域内の２つの領域である。単一のマウスｒＤＮＡリピート及び分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を表す模式図。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマーを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡ及び未消化ＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。
【図２（Ｅ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、低下したｒＤＮＡメチル化に導く。（Ａ〜Ｃ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化を減少させる。上パネル：ＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を含む（Ａ）マウス、（Ｂ）ヒト、及び（Ｃ）チャイニーズハムスターｒＤＮＡプロモーター領域の図表を分析する。黒丸はＣｐＧジヌクレオチドを示す。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。下パネル：ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを、ｓｈＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡＴＩＰ５−１／２ならびにコントロール配列を安定的に発現する（Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で測定する。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマー及び未消化ＤＮＡを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。（Ｄ、Ｅ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＤＮＡ  ＣｐＧメチル化レベルを減少させる。分析したのは、（Ａ）転写開始部位（＋１）を含むｒＤＮＡ遺伝子間及びプロモーター領域ならびに（Ｂ）コード領域内の２つの領域である。単一のマウスｒＤＮＡリピート及び分析されたＨｐａＩＩ（Ｈ）部位を表す模式図。矢印は、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡを増幅するために使用されたプライマーを表す。データは、ＨｐａＩＩ部位を欠くＤＮＡ配列を包含するプライマーを用いた増幅により算出された全ｒＤＮＡ及び未消化ＤＮＡに対して正規化されたＨｐａＩＩ耐性ｒＤＮＡの量を表す。
【図３（Ａ）】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞中での増加したｒＲＮＡレベル。（Ａ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＲＮＡ合成を増強する。安定なＮＩＨ／３Ｔ３及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞系のｑＲＴ−ＰＣＲベースの４５ＳプレｒＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化する。（Ｂ）ｒＤＮＡ転写を、同じ曝露時間後でのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＢｒＵＴＰ取り込みにより検出する。ＢｒＵＴＰシグナル（左パネル）は、ＴＩＰ−５枯渇細胞中でより高く、核小体（位相差画像（右パネル）中で見られる通りの核内の暗い領域）中で特異的に検出される。
【図３（Ｂ）】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞中での増加したｒＲＮＡレベル。（Ａ）ＴＩＰ５の枯渇は、ｒＲＮＡ合成を増強する。安定なＮＩＨ／３Ｔ３及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞系のｑＲＴ−ＰＣＲベースの４５ＳプレｒＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化する。（Ｂ）ｒＤＮＡ転写を、同じ曝露時間後でのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＢｒＵＴＰ取り込みにより検出する。ＢｒＵＴＰシグナル（左パネル）は、ＴＩＰ−５枯渇細胞中でより高く、核小体（位相差画像（右パネル）中で見られる通りの核内の暗い領域）中で特異的に検出される。
【図４（Ａ）】ＴＩＰ５枯渇は、増加した増殖及び細胞成長に導く。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞のＦＡＣＳ解析。（Ｂ）個々の細胞周期段階における細胞のパーセンテージ。Ｓ期中の細胞のパーセンテージ又は数が増加するのに対し、Ｇ１期中の細胞のパーセンテージ又は数はＴＩＰ５枯渇細胞において減少する。増殖が増強される。（Ｃ）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ。細胞を１０μMのＢｒｄＵと３０分間にわたりインキュベーションし、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて染色し、Ｓ期中の細胞のパーセンテージを推定する。ＢｒｄＵアッセイは、ＴＩＰ５細胞中での増加したＤＮＡ合成を示す。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及びコントロール配列を安定的に発現する（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖曲線。増殖曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が、コントロール細胞と少なくとも同じくらい速く（ＨＥＫ２９３）又はさらにより速く（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）成長することを実証する。
【図４（Ｂ）】ＴＩＰ５枯渇は、増加した増殖及び細胞成長に導く。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞のＦＡＣＳ解析。（Ｂ）個々の細胞周期段階における細胞のパーセンテージ。Ｓ期中の細胞のパーセンテージ又は数が増加するのに対し、Ｇ１期中の細胞のパーセンテージ又は数はＴＩＰ５枯渇細胞において減少する。増殖が増強される。（Ｃ）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ。細胞を１０μMのＢｒｄＵと３０分間にわたりインキュベーションし、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて染色し、Ｓ期中の細胞のパーセンテージを推定する。ＢｒｄＵアッセイは、ＴＩＰ５細胞中での増加したＤＮＡ合成を示す。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及びコントロール配列を安定的に発現する（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖曲線。増殖曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が、コントロール細胞と少なくとも同じくらい速く（ＨＥＫ２９３）又はさらにより速く（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）成長することを実証する。
【図４（Ｃ）】ＴＩＰ５枯渇は、増加した増殖及び細胞成長に導く。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞のＦＡＣＳ解析。（Ｂ）個々の細胞周期段階における細胞のパーセンテージ。Ｓ期中の細胞のパーセンテージ又は数が増加するのに対し、Ｇ１期中の細胞のパーセンテージ又は数はＴＩＰ５枯渇細胞において減少する。増殖が増強される。（Ｃ）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ。細胞を１０μMのＢｒｄＵと３０分間にわたりインキュベーションし、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて染色し、Ｓ期中の細胞のパーセンテージを推定する。ＢｒｄＵアッセイは、ＴＩＰ５細胞中での増加したＤＮＡ合成を示す。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及びコントロール配列を安定的に発現する（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖曲線。増殖曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が、コントロール細胞と少なくとも同じくらい速く（ＨＥＫ２９３）又はさらにより速く（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）成長することを実証する。
【図４（Ｄ）】ＴＩＰ５枯渇は、増加した増殖及び細胞成長に導く。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞のＦＡＣＳ解析。（Ｂ）個々の細胞周期段階における細胞のパーセンテージ。Ｓ期中の細胞のパーセンテージ又は数が増加するのに対し、Ｇ１期中の細胞のパーセンテージ又は数はＴＩＰ５枯渇細胞において減少する。増殖が増強される。（Ｃ）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ。細胞を１０μMのＢｒｄＵと３０分間にわたりインキュベーションし、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて染色し、Ｓ期中の細胞のパーセンテージを推定する。ＢｒｄＵアッセイは、ＴＩＰ５細胞中での増加したＤＮＡ合成を示す。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及びコントロール配列を安定的に発現する（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖曲線。増殖曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が、コントロール細胞と少なくとも同じくらい速く（ＨＥＫ２９３）又はさらにより速く（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）成長することを実証する。
【図４（Ｅ）】ＴＩＰ５枯渇は、増加した増殖及び細胞成長に導く。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞のＦＡＣＳ解析。（Ｂ）個々の細胞周期段階における細胞のパーセンテージ。Ｓ期中の細胞のパーセンテージ又は数が増加するのに対し、Ｇ１期中の細胞のパーセンテージ又は数はＴＩＰ５枯渇細胞において減少する。増殖が増強される。（Ｃ）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ。細胞を１０μMのＢｒｄＵと３０分間にわたりインキュベーションし、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて染色し、Ｓ期中の細胞のパーセンテージを推定する。ＢｒｄＵアッセイは、ＴＩＰ５細胞中での増加したＤＮＡ合成を示す。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及びコントロール配列を安定的に発現する（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖曲線。増殖曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が、コントロール細胞と少なくとも同じくらい速く（ＨＥＫ２９３）又はさらにより速く（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）成長することを実証する。
【図４（Ｆ）】ＴＩＰ５枯渇は、増加した増殖及び細胞成長に導く。（Ａ）ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞のＦＡＣＳ解析。（Ｂ）個々の細胞周期段階における細胞のパーセンテージ。Ｓ期中の細胞のパーセンテージ又は数が増加するのに対し、Ｇ１期中の細胞のパーセンテージ又は数はＴＩＰ５枯渇細胞において減少する。増殖が増強される。（Ｃ）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ。細胞を１０μMのＢｒｄＵと３０分間にわたりインキュベーションし、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて染色し、Ｓ期中の細胞のパーセンテージを推定する。ＢｒｄＵアッセイは、ＴＩＰ５細胞中での増加したＤＮＡ合成を示す。（Ｄ〜Ｆ）ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５及びコントロール配列を安定的に発現する（Ｄ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｆ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖曲線。増殖曲線は、ＴＩＰ−５枯渇細胞が、コントロール細胞と少なくとも同じくらい速く（ＨＥＫ２９３）又はさらにより速く（ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＨＯ−Ｋ１）成長することを実証する。
【図５（Ａ）】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム解析。（Ａ〜Ｃ）（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中での細胞質ＲＮＡ／細胞の相対量。データは、３通りに実施された２回の実験での平均を表す。（Ｄ）安定なＨＥＫ２９３Ｔのリボソームプロファイル及び（Ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系。より多くのリボソームがＴＩＰ５ノックダウン細胞中に存在する。
【図５（Ｂ）】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム解析。（Ａ〜Ｃ）（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中での細胞質ＲＮＡ／細胞の相対量。データは、３通りに実施された２回の実験での平均を表す。（Ｄ）安定なＨＥＫ２９３Ｔのリボソームプロファイル及び（Ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系。より多くのリボソームがＴＩＰ５ノックダウン細胞中に存在する。
【図５（Ｃ）】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム解析。（Ａ〜Ｃ）（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中での細胞質ＲＮＡ／細胞の相対量。データは、３通りに実施された２回の実験での平均を表す。（Ｄ）安定なＨＥＫ２９３Ｔのリボソームプロファイル及び（Ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系。より多くのリボソームがＴＩＰ５ノックダウン細胞中に存在する。
【図５（Ｄ）】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム解析。（Ａ〜Ｃ）（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中での細胞質ＲＮＡ／細胞の相対量。データは、３通りに実施された２回の実験での平均を表す。（Ｄ）安定なＨＥＫ２９３Ｔのリボソームプロファイル及び（Ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系。より多くのリボソームがＴＩＰ５ノックダウン細胞中に存在する。
【図５（Ｅ）】ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム解析。（Ａ〜Ｃ）（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞中での細胞質ＲＮＡ／細胞の相対量。データは、３通りに実施された２回の実験での平均を表す。（Ｄ）安定なＨＥＫ２９３Ｔのリボソームプロファイル及び（Ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系。より多くのリボソームがＴＩＰ５ノックダウン細胞中に存在する。
【図６（Ａ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、レポータータンパク質の増強産生に導く。（Ａ〜Ｃ）恒常的ＳＥＡＰ発現ベクターｐＣＡＧ−ＳＥＡＰを用いて操作された（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系でのＳＥＡＰ発現。（Ｄ、Ｅ）恒常的ルシフェラーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いて操作された（Ｄ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系及び（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系でのルシフェラーゼ発現。
【図６（Ｂ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、レポータータンパク質の増強産生に導く。（Ａ〜Ｃ）恒常的ＳＥＡＰ発現ベクターｐＣＡＧ−ＳＥＡＰを用いて操作された（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系でのＳＥＡＰ発現。（Ｄ、Ｅ）恒常的ルシフェラーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いて操作された（Ｄ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系及び（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系でのルシフェラーゼ発現。
【図６（Ｃ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、レポータータンパク質の増強産生に導く。（Ａ〜Ｃ）恒常的ＳＥＡＰ発現ベクターｐＣＡＧ−ＳＥＡＰを用いて操作された（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系でのＳＥＡＰ発現。（Ｄ、Ｅ）恒常的ルシフェラーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いて操作された（Ｄ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系及び（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系でのルシフェラーゼ発現。
【図６（Ｄ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、レポータータンパク質の増強産生に導く。（Ａ〜Ｃ）恒常的ＳＥＡＰ発現ベクターｐＣＡＧ−ＳＥＡＰを用いて操作された（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系でのＳＥＡＰ発現。（Ｄ、Ｅ）恒常的ルシフェラーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いて操作された（Ｄ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系及び（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系でのルシフェラーゼ発現。
【図６（Ｅ）】ＴＩＰ−５ノックダウンは、レポータータンパク質の増強産生に導く。（Ａ〜Ｃ）恒常的ＳＥＡＰ発現ベクターｐＣＡＧ−ＳＥＡＰを用いて操作された（Ａ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系、（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、及び（Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系でのＳＥＡＰ発現。（Ｄ、Ｅ）恒常的ルシフェラーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いて操作された（Ｄ）安定なＮＩＨ／３Ｔ３細胞系及び（Ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系でのルシフェラーゼ発現。
【図７（Ａ）】ＵＢＦの過剰発現は、ｒＲＮＡ合成を増強する。（Ａ、Ｂ）増加量のＵＢＦ（ｐＣＭＶ−ＵＢＦ）の発現に続く（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｂ）ＨｅＬａ中での４５Ｓ  ｒＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ。ｒＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量に対して正規化する。
【図７（Ｂ）】ＵＢＦの過剰発現は、ｒＲＮＡ合成を増強する。（Ａ、Ｂ）増加量のＵＢＦ（ｐＣＭＶ−ＵＢＦ）の発現に続く（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ及び（Ｂ）ＨｅＬａ中での４５Ｓ  ｒＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ。ｒＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量に対して正規化する。
【００３２】
発明の詳細な説明
ＴＩＰ−５のノックダウン：
組換えタンパク質の増加合成のために細胞を操作することを目標に、本発明者らは、サイレントなｒＲＮＡの数における減少が、４５ＳプレｒＲＮＡ合成を増強し、結果として、また、リボソーム生合成を刺激し、翻訳能力のあるリボソームの数を増加させるか否かを決定する。従って、本発明者らはＲＮＡ干渉を使用して、ＴＩＰ５発現をノックダウンし、安定的なトランスジェニックｓｈＲＮＡ発現ＮＩＨ／３Ｔ３又はｍｉＲＮＡ発現ＨＥＫ２９３Ｔ及びＣＨＯ−Ｋ１を、ＴＩＰ５の２つの異なる領域（ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２）に特異的なｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ配列を使用して構築する。スクランブルｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ配列を発現する安定的な細胞系を、コントロールとして使用する。ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５又はｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現するプラスミドを用いた一過性トランスフェクションを実施するよりもむしろ、安定な細胞系を産生することについて２つの理由がある。第１に、抑制性エピジェネティックマーク（ＣｐＧメチル化など）の喪失は、受動機構であり、複数の細胞分裂を要求する。第２に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を比較的簡単にトランスフェクションすることができるにもかかわらず、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の不良なトランスフェクション効率によって、内因性ｒＲＮＡ、リボソームレベル、及び細胞成長特性のその後の分析が損なわれうる。選択されたクローンにおいてＴＩＰ５ノックダウンの効率を決定するために、本発明者らは、定量的及び半定量的な逆転写酵素媒介性ＰＣＲによりＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルを測定する（図１）。ＴＩＰ５発現は、コントロール細胞と比較した場合、ＮＩＨ／３Ｔ３／ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及び−２細胞中で約７０〜８０%減少する（図１Ａ）。ＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルにおける同様の低下が、安定的なＨＥＫ２９３Ｔ中で観察される（図１Ｂ）。ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞中でのＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルを、半定量的ＰＣＲによって測定することができるが（図１Ｃ）、しかし、ＴＩＰ５  ｍＲＮＡの低下は、安定的なＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞のそれと同様である。これらの結果は、樹立された細胞系が低レベルのＴＩＰ５を含むことを実証する。
【００３３】
ＴＩＰ−５ノックダウンは、低下したｒＤＮＡメチル化に導く：
マウスｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化は、基礎転写因子ＵＢＦの結合を損ない、前開始複合体の形成が妨げられる（Sanij, E., Poortinga, G., Sharkey, K., Hung, S., Holloway, T.P., Quin, J., Robb, E., Wong, L.H., Thomas, W.G., Stefanovsky, V., Moss, T., Rothblum, L., Hannan, K.M., McArthur, G.A., Pearson, R.B., and Hannan, R.D. (2008). UBF levels determine the number of active ribosomal RNA genes in mammals. J. Cell Biol 183, 1259-1274）。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、ｒＲＮＡ遺伝子の約４０%〜５０%がＣｐＧメチル化配列を含み、転写的にサイレントである。ヒト、マウス、及びチャイニーズハムスターにおけるｒＤＮＡプロモーターの配列及びＣｐＧ密度は、有意に異なる。ヒトにおいて、ｒＤＮＡプロモーターは２３のＣｐＧを含み、マウス及びチャイニーズハムスターにおいて、それぞれ３及び８のＣｐＧがある（図２Ａ〜Ｃ）。ＴＩＰ５ノックダウンがｒＤＮＡサイレンシングに影響を与えることを検証するために、本発明者らは、ＣＣＧＧ配列中のｍｅＣｐＧの量を測定することによりｒＤＮＡメチル化レベルを決定する。ゲノムＤＮＡをＨｐａＩＩ消化し、消化に対する耐性（即ち、ＣｐＧメチル化）を、ＨｐａＩＩ配列（ＣＣＧＧ）を包含するプライマーを使用した定量的リアルタイムＰＣＲにより測定する。全てのＴＩＰ５ノックダウン細胞系においてｒＲＮＡ遺伝子の大半のプロモーター領域内でのＣｐＧメチル化において減少があり、ｒＤＮＡサイレンシングを促進する際でのＴＩＰ５の鍵となる役割を強調する（図２）。
【００３４】
顕著には、ＴＩＰ５結合及びデノボメチル化はｒＤＮＡプロモーター配列に制限されるが、ＴＩＰ−５が低下したＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＣｐＧメチル化量は、ｒＤＮＡ遺伝子全体にわたり減弱し（遺伝子間、プロモーター、及びコード領域；図２Ｄ、Ｅ）、ＴＩＰ５が、一旦、ｒＤＮＡプロモーターに結合すると、ｒＤＮＡ遺伝子座の全体にわたり、サイレントなエピジェネティックマークの確立のための拡大機構を開始することを示す。
【００３５】
Ｔｉｐ−５ノックダウン細胞中での増加したｒＲＮＡレベル：
サイレントな遺伝子の数における減少が、ｒＲＮＡ転写物の量に影響を与えるか否かを決定するために、本発明者らは、第１のｒＲＮＡプロセシング部位を包含するプライマーを使用したｑＲＴ−ＰＣＲにより（図３Ａ）及びｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢｒＵＴＰ取り込みにより（図３Ｂ）４５ＳプレｒＲＮＡ合成を測定する。ＴＩＰ５枯渇ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方において、コントロール細胞系と比較したｒＲＮＡ産生の増強を、両方の解析により検出する。
【００３６】
ＴＩＰ５枯渇は、増加した増殖及び細胞成長に導く：
Ｒａｓは、細胞の形質転換及び腫瘍形成に関与する周知のオンコジーンであり、ヒトのがんにおいて頻繁に突然変異又は過剰発現する。Green et al.は、ＷＯ２００９／０１７６７０において、ＴＩＰ−５が、網羅的ｍｉＲＮＡスクリーンにおいて、ＦａｓのＲａｓ媒介性エピジェネティックサイレンシングエフェクター（ＲＥＳＥ）として機能するとして同定したことを記載する。この刊行物では、Ｒａｓエフェクター（例えばＴＩＰ−５など）の低下発現が、細胞増殖の阻害をもたらすことが記載されている。
【００３７】
本発明者らは、両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析する。図４Ａ、Ｂに示す通り、Ｓ期中の細胞の数は、コントロール細胞と比較して、両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞において有意に高い。同様のプロファイルが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、ＴＩＰ５配列に対して向けられたｍｉＲＮＡを発現するレトロウイルスを用いた感染後１０日目に得られる。これらの結果と一致して、ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞は、新生ＤＮＡ中への５ブロモデオキシウリシン（ＢｒｄＵ）の増加した取り込み及びより高いレベルのサイクリンＡを示す（図４Ｃ）。
【００３８】
最後に、本発明者らは、ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５、ｓｈＲＮＡコントロール及び親ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞の間で細胞増殖速度を比較する（図４Ｄ−Ｆ）。驚くべきことに、先行技術の報告とは対照的に、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方が、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現し、コントロール細胞よりも速い速度で増殖し、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数における減少が細胞代謝に対して影響を有することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ中でのＴＩＰ５枯渇は、細胞増殖に有意な影響を与えない。なぜなら、これらの細胞は、それらの最高増殖速度に既に達しているからである。これらのデータは、驚くべきことに、ＴＩＰ−５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングにおける結果的な減少が、細胞増殖を増強することを示す。
【００３９】
ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム解析：
哺乳動物細胞培養において、タンパク質合成の速度が重要なパラメーターであり、それは、産物収量に直接的に関連する。ＴＩＰ５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングにおける結果的な減少が、細胞中の翻訳能力のあるリボソームの数を増加させるか否かを決定するために、本発明者らは、最初に、細胞質ｒＲＮＡのレベルを測定する。細胞質中では、ＲＮＡの大半が、リボソーム中にアセンブルされたプロセシングされたｒＲＮＡからなる。図５Ａ〜Ｃに示す通り、全てのＴＩＰ５枯渇細胞系が、より多くの細胞質ＲＮＡを細胞当たりに含み、これらの細胞がより多くのリボソームを産生することを示す。また、ポリソームプロファイルの分析は、ＴＩＰ５枯渇ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞が、コントロール細胞と比較して、より多くのリボソームサブユニット（４０Ｓ、６０Ｓ、及び８０Ｓ）を含むことを示す（図５Ｄ）。
【００４０】
Ｔｉｐ−５ノックダウンは、レポータータンパク質の増強産生に導く：
ＴＩＰ５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングにおける減少が、異種タンパク質産生を増強するか否かを決定するために、本発明者らは、安定なＴＩＰ５枯渇ＮＩＨ／３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ、及びＣＨＯ−Ｋ１派生物に、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼＳＥＡＰ（ｐＣＡＧ−ＳＥＡＰ；ＦＩＧＵＲＥ  ６Ａ−Ｃ）又はルシフェラーゼ（ｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の恒常的発現を促進する発現ベクターを用いてトランスフェクションする（図６Ｄ、Ｅ）。４８時間後でのタンパク質産生の定量化は、コントロール細胞系と比較して、ＴＩＰ５枯渇細胞中でのＳＥＡＰ及びルシフェラーゼの両方の産生における２〜４倍の増加を明らかにし、ＴＩＰ５枯渇が異種タンパク質産生を増加することを示す。全てのこれらの結果は、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数における減少が、リボソーム合成を増強し、組換えタンパク質を産生する細胞の潜在力を増加することを示す。
【００４１】
ＴＩＰ−５ノックアウトは、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の生物医薬品産生を増加させ、治療的抗体産生を増強する：
（ａ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）又は治療用抗体を分泌するＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）又はＴＩＰ−５発現をノックダウンするように設計された小型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）を用いてトランスフェクションする。最も高いＭＣＰ−１力価が、最も効率的なＴＩＰ−５枯渇を伴う細胞プールにおいて見られるのに対し、タンパク質濃度は、偽トランスフェクションされた細胞又は親細胞系において顕著により低い。
【００４２】
ｂ）ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、短いＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）を用いて最初にトランスフェクションし、ＴＩＰ−５発現を低下させ、安定なＴＩＰ−５枯渇宿主細胞系を生成する。その後、これらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）又は治療用抗体を目的の遺伝子としてコードするベクターを用いてトランスフェクションする。最も高いＭＣＰ−１力価及び産生性が、最も効率的なＴＩＰ−５枯渇を伴う細胞プールにおいて見られるのに対し、タンパク質濃度は、偽トランスフェクションされた細胞又は親細胞系において顕著により低い。
【００４３】
ｃ）ａ）又はｂ）に記載される同じ細胞を、バッチ発酵又は流加発酵に供する場合、全ＭＣＰ−１力価又は抗体力価における差はさらにより明白になる：ＴＩＰ−５の低下発現を伴うトランスフェクションされた細胞は、より速く成長し、また、細胞当たり及び時間当たりより多くのタンパク質を産生するため、それらは、より高いＩＶＣを示し、同時により高い産生性を示す。両方の特性は、全プロセス収量に対してポジティブな影響を有する。従って、ＴＩＰ−５欠失細胞は、有意により高いＭＣＰ−１又は抗体収集力価を有し、より効率的な産生プロセスに導く。
【００４４】
また、ＳＮＦ２Ｈ欠失細胞は、有意により高いＩｇＧ収集力価を有し、より効率的な産生プロセスに導く。
【００４５】
ＴＩＰ−５遺伝子のノックアウトは、ｒＲＮＡ転写を増加させ、増殖を最も効率的に増強する：
ＴＩＰ−５発現の一定に低下したレベルを伴う改善された産生宿主細胞系を生成するための最も効率的な方法は、ＴＩＰ−５遺伝子の完全ノックアウトを生成することである。この目的のために、相同組換えを使用する又はＺｉｎｋ−Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）技術を利用し、Ｔｉｐ−５遺伝子を破壊する又はその発現を防止することができる。相同組換えはＣＨＯ細胞において効率的ではないため、本発明者らはＴＩＰ−５遺伝子内に二本鎖切断を導入するＺＦＮを設計し、それにより機能的に破壊する。ＴＩＰ−５の効率的なノックアウトを制御するために、ウエスタンブロットを、抗ＴＩＰ−５抗体を使用して実施する。メンブレン上で、ＴＩＰ−５発現がＴＩＰ−５ノックアウト細胞中で検出されないのに対し、親ＣＨＯ細胞系はＴＩＰ−５タンパク質に対応する明かなシグナルを示す。
【００４６】
次に、ｒＲＮＡ転写を、ＴＩＰ−５ノックアウトＣＨＯ細胞及び親ＣＨＯ細胞系中で分析する。このアッセイによって、親細胞と比較して、及び、また、低下したＴＩＰ−５発現レベルだけを伴う細胞と比較して、ＴＩＰ−５ノックアウト細胞中でのより高いレベルのｒＲＮＡ合成及び増加したリボソーム数が確認される。
【００４７】
さらに、ＴＩＰ−５について欠損した細胞は、より速く増殖し、ＴＩＰ−５野生型細胞及びＴＩＰ−５発現が干渉ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉなど）の導入により低下しただけの細胞系と比較して、流加プロセスにおいてより高い細胞数を示す。
【００４８】
ＵＢＦの過剰発現はｒＲＮＡ合成を増強する：
リボソーム産生は、ｒＲＮＡ及びｒタンパク質の協調発現及びアセンブリを要求する。ＵＢＦは活性なｒＲＮＡ遺伝子に結合し、転写開始を促進し、伸長速度を調節する。図７に示す通り、ＵＢＦは、４５ＳプレｒＲＮＡ合成を、用量依存的な様式で、ＨＥＫ２９３細胞系及びＨｅＬａ細胞系の両方において刺激する。
【００４９】
このように、ＵＢＦ過剰発現及びＴＩＰ−５のノックダウンは、増加するｒＲＮＡ合成の効果を共有する。ＵＢＦ過剰発現は、また、リボソーム生合成及びタンパク質産生を増強する。
【００５０】
ＵＢＦの過剰発現は、抗体の生物医薬品タンパク質産生を増加する：
（ａ）ヒト化抗ＣＤ４４ｖ６  ＩｇＧ抗体ＢＩＷＡ  ４を分泌する抗体産生ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）中での最も高い特異的な産生性が、ＵＢＦ過剰発現細胞プールにおいて見られ、そこでは、ＩｇＧ発現が、ＭＯＣＫ細胞又は非トランスフェクション細胞と比較して、顕著に増強される。非常に類似の結果を、安定トランスフェクタントをバッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。これらの設定の各々において、ＵＢＦの過剰発現は、増加した抗体分泌に導き、ＵＢＦが、連続培養中で又はバイオリアクターバッチ培養もしくは流加培養中で成長された細胞の特異的な産生能力を増強することができることを示す。
【００５１】
ｂ）ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、ＵＢＦをコードするベクターを用いて最初にトランスフェクションし、選択圧力に供し、ＵＢＦの異種発現が実証される細胞系を選ぶ。その後に、これらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、ヒト化抗ＣＤ４４ｖ６  ＩｇＧ抗体ＢＩＷＡ  ４を目的の遺伝子としてコードするベクターを用いてトランスフェクションする。再び、ＩｇＧ力価が、コントロールと比較して、ＵＢＦ過剰発現培養物中で顕著に増強される。また、流加培養において、ＵＢＦの異種発現は、増加したＩｇＧ産生をもたらす。合わせると、これらのデータは、ＵＢＦの過剰発現が、連続培養中で又はバイオリアクターバッチ培養もしくは流加培養中で成長された細胞の特異的な産生能力を増強することができることを示す。
【００５２】
ＴＩＰ−５のノックアウト及びＵＢＦの過剰発現は、相乗的に作用し、ｒＲＮＡ合成及び治療用タンパク質産生を増強する：
本発明において、本発明者らは、ＴＩＰ−５の低下発現及びＵＢＦの過剰発現が、増強したｒＲＮＡ合成をもたらすとの証拠を提供する。本発明者らは、また、ＴＩＰ−５枯渇がｒＤＮＡ遺伝子の低下したメチル化をもたらすことを示す。脱メチル化が、クロマチン修飾因子（例えばヒストンアセチラーゼなど）及び結合転写因子（例えばＵＢＦなど）の動員のために必須であるため、本発明者らは、両方のアプローチがｒＲＮＡ合成に相乗的に作用し、それにより、メチル化のＴＩＰ−５枯渇媒介性低下が、その後のＵＢＦ動員及び結合のためにｒＲＮＡ遺伝子の接触性を提供するか否かを仮定した。
【００５３】
（Ａ）この仮定をテストするために、本発明者らは、組み合わせたＴＩＰ−５枯渇及びＵＢＦの過剰発現を伴う細胞系を生成する。ｒＲＮＡ合成をそれらの細胞系、ＵＢＦを過剰発現する又はＴＩＰ−５中に欠失を有する細胞、及び非改変親細胞系において比較した場合、ｒＲＮＡ合成は、再び、ＴＩＰ−５枯渇細胞中で、また、ＵＢＦ過剰発現細胞系中で、コントロールと比較してより高い。重要なことに、組み合わせたＴＩＰ−５の欠失及びＵＢＦ過剰発現は、さらにより高いｒＤＮＡ遺伝子転写ならびにより高いリボソーム合成をもたらす。これは、両方のアプローチ（ＴＩＰ−５の枯渇及びＵＢＦ過剰発現）の組み合わせが、驚くべきことに、ｒＲＮＡ合成に対して相乗効果を有することを示す。
【００５４】
（Ｂ）（Ａ）において生成された細胞を、目的のタンパク質をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションし、前記タンパク質の濃度をそれらの細胞の培養液中で比較する場合、最も高い力価が、同時のＵＢＦの過剰発現及びＴＩＰ−５のノックアウトを伴う細胞の培養中で測定される。次に、ランキング中にＴＩＰ−５枯渇又はＵＢＦ過剰発現のいずれかを有する細胞があるのに対し、目的のタンパク質の力価は非改変親細胞系中で最も低い。
【００５５】
エピジェネティック操作及び分泌操作の組み合わせによるタンパク質産生の相乗的な改善：
本発明において記載するアプローチ、即ち、ＴＩＰ−５又はＳＮＦＨ２の枯渇及びＵＢＦの過剰発現は、全てが、ｒＲＮＡ合成、リボソーム生合成、及びそれによりタンパク質翻訳を増強することにより組換えタンパク質産生を増強する。しかし、タンパク質産生は、最適化された翻訳機構だけでなく、しかし、また、タンパク質の輸送及び分泌の翻訳後段階における効率も要求する。従って、本発明者らは、両方の機構（翻訳及び輸送）を、細胞中でのＴＩＰ−５遺伝子の欠失及び分泌増強遺伝子ＣＥＲＴの過剰発現により同時に操作することを試みる。
【００５６】
この目的のために、破壊されたＴＩＰ−５発現を伴うＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ヒトＣＥＲＴタンパク質の突然変異体バリアント（ＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ）をコードするトランスジーンを用いてトランスフェクションする。第２のトランスフェクション段階において、モノクローナルＩｇＧサブタイプ抗体をコードする発現コンストラクトをこれらの細胞中に導入し、安定な細胞集団を生成する。次に、結果として得られる安定な細胞集団を、接種培養及び流加培養に供し、特異的なＩｇＧ産生性ならびに得られた全抗体力価を分析する。
【００５７】
興味深いことに、最も高い抗体力価及び特異的な産生性が、二重操作細胞において達成される。ＴＩＰ−５欠失及びＣＥＲＴ過剰発現の両方を持つ細胞により産生される抗体濃度は、単一操作細胞においてよりも顕著により高い。これは、分泌経路中での両方の段階の組み合わせ操作、即ち、ＴＩＰ−５欠失による翻訳操作及びＣＥＲＴを介した分泌操作が、分泌タンパク質産生をさらに増強し、最適な産生能力を伴う哺乳動物宿主細胞を生成するための手段であることを示す。同様に、相乗効果を、ＵＢＦ及びＣＥＲＴ、好ましくはＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａの組み合わせ発現により達成することができる。
【００５８】
一般的な実施態様「含む」又は「含まれる」は、より具体的な実施態様「からなる」を包含する。さらに、単数形及び複数形は、限定的な方法で使用されない。
【００５９】
本発明の過程において使用される用語は、以下の意味を有する。
【００６０】
用語「エピジェネティック操作」は、核酸配列に影響を与えることなくクロマチンのエピジェネティック修飾に影響を及ぼすことを意味する。エピジェネティック修飾は、ヒストン又はＤＮＡヌクレオチドのメチル化又はアセチル化ならびにアルキル化における変化を含む。本発明において、「エピジェネティック操作」は、主に、ＤＮＡメチル化における操作を指す。
【００６１】
「ＮｏＲＣ」（核小体リモデリング複合体）は、ｒＤＮＡサイレンシングの鍵となる決定因子であり、それは、ＴＩＰ−５（ＴＴＦ−１相互作用タンパク質５）及びＡＴＰａｓｅ  ＳＮＦ２ｈからなる。ＮｏＲＣは、サイレントな遺伝子のｒＤＮＡプロモーターに結合し、ｒＤＮＡ転写を、ヒストン修飾活性及びＤＮＡメチル化活性を通じて抑制する。
【００６２】
「ＴＩＰ−５」又は「ＴＩＰ５」（転写終結因子１（ＴＴＦ１）相互作用タンパク質５）は、２００kDを上回る核小体タンパク質であり、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ならびに他のクロマチン修飾因子と相互作用することにより、ヒストンデアセチラーゼ活性をｒＤＮＡに動員するために役立つ。さらなる同義語は以下である：ＢＡＺ２Ａ、ＷＡＬｐ３；ＦＬＪ１３７６８；ＦＬＪ１３７８０；ＦＬＪ４５８７６；ＫＩＡＡ０３１４、及びＤＫＦＺｐ７８１Ｂ１０９。
【００６３】
「ＳＮＦ２ｈ」は、タンパク質のＳＷＩ／ＳＮＦファミリーのメンバーであり、ヘリカーゼ活性及びＡＴＰａｓｅ活性を有する。ＳＮＦ２ｈは、閉じた異質染色質クロマチン状態を確立するためのヌクレオソーム滑走に関与するＮｏＲＣの成分である。ＳＮＦ２ｈの正式名称はＳＭＡＲＣＡ５（クロマチン、サブファミリーａ、メンバー５のＳＷＩ／ＳＮＦ関連、マトリクス会合、アクチン依存性調節因子）である。さらなる別名は、ＩＳＷＩ；ｈＩＳＷＩ；ｈＳＮＦ２Ｈ及びＷＣＲＦ１３５である。
【００６４】
上流結合因子（「ＵＢＦ」）は、ＤＮＡ結合ドメイン及びトランスアクチベーションドメインの両方を伴う核小体リン酸化タンパク質であり、それは、１８Ｓ、５．８Ｓ、及び２８ＳリボソームＲＮＡの発現のために要求される転写因子として機能する。ＵＢＦは、また、ＵＢＴＦ又はＮＯＲ−９０として公知である。
【００６５】
表現「リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを低下させる」は、リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ又はこの特定領域中のクロマチンのメチル化及び／又はアセチル化に影響を及ぼし、ｒＲＮＡ遺伝子転写の脱抑制をもたらすことを意味する。より具体的には、本発明において、この用語は、ｒＲＮＡ遺伝子のメチル化を低下させるアプローチを指し、転写因子についての遺伝子のより良好な接近性ひいてはそれぞれの遺伝子からのより多くのｒＲＮＡの合成に導く。
【００６６】
「ｒＤＮＡサイレンシング」は、本明細書において、具体的には、ｒＲＮＡ遺伝子のサイレンシングを指す。それは、非特異的なゲノム規模のサイレンシング機構（ＮｏＲＣにより媒介されない）を含まない。
【００６７】
ｒＤＮＡサイレンシングは、以下のアッセイにより測定／モニターすることができる：
ｒＤＮＡのサイレンシングは、ｒＲＮＡの低下した転写をもたらし、それは、定量的又は半定量的ＰＣＲ（例、４５ＳプレＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、材料及び方法に記載する通り）により分析することができる。
【００６８】
ｒＤＮＡ遺伝子プロモーターのメチル化を、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化及びその後のサザンブロッティングにより分析することができ、メチル化及び非メチル化状態について異なるバンドパターンをもたらす。
【００６９】
あるいは、メチル化誘導性ｒＤＮＡサイレンシングは、また、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化及び切断の部位にわたるプライマーを使用したその後のｑＰＣＲ（材料及び方法に記載する通り、及び、図２に示す通り）により定量化することができる。
【００７０】
用語「ノックダウン」又は「枯渇」は、遺伝子発現に関連して、本明細書において使用される通り、コントロール細胞中での発現と比較した、所与の遺伝子の低下発現に導く実験的アプローチを指す。遺伝子のノックダウンは、種々の実験的手段、例えば、遺伝子のｍＲＮＡの部分とハイブリダイズし、その分解に導く核酸分子（例、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ）を細胞中に導入すること、又は、遺伝子の配列を、低下した転写、低下したｍＲＮＡ安定性、又は消失したｍＲＮＡ翻訳に導く方法で変化させることなどにより達成することができる。
【００７１】
所与の遺伝子の発現の完全阻害は、「ノックアウト」と呼ばれる。遺伝子のノックアウトは、機能的な転写物が、前記遺伝子から合成されず、この遺伝子により通常提供される機能の喪失に導くことを意味する。遺伝子ノックアウトは、ＤＮＡ配列を変化させ、遺伝子又はその調節配列の破壊又は欠失に導くことにより達成する。ノックアウト技術は、決定的な部分又は全遺伝子配列を置換、中断、又は欠失させるための相同組換え技術の使用又は標的遺伝子のＤＮＡ中に二本鎖切断を導入するためのＤＮＡ修飾酵素（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼなど）の使用を含む。
【００７２】
遺伝子のノックダウン又はノックアウトをモニター／証明するためのアッセイは多様である：
例えば、選択された遺伝子から転写されたｍＲＮＡの低下／は喪失を、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡへのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、又はＰＣＲにより定量化することができる。選択された遺伝子によりコードされる対応するタンパク質の低下した存在量／喪失を、種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡにより、ウエスタンブロッティングにより、ラジオイムノアッセイにより、免疫沈降により、タンパク質の生物学的活性についてのアッセイにより、タンパク質の免疫染色それに続くＦＡＣＳ解析により、又は均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイにより定量化することができる。
【００７３】
用語「派生物」は、本発明で使用される通り、元の配列又はその相補配列と配列において少なくとも７０%同一であるポリペプチド分子又は核酸分子を意味する。好ましくは、ポリペプチド分子又は核酸分子は、元の配列又はその相補配列と配列において少なくとも８０%同一である。より好ましくは、ポリペプチド分子又は核酸分子は、元の配列又はその相補配列と配列において少なくとも９０%同一である。最も好ましいのは、元の配列又はその相補配列と配列において少なくとも９５%同一であり、分泌に対して元の配列と同じ又は同様の効果を呈するポリペプチド分子又は核酸分子である。
【００７４】
配列の違いは、異なる生物からの相同配列中の違いに基づきうる。それらは、また、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の置換、挿入、又は欠失による配列の標的修飾に基づきうる。欠失、挿入、又は置換突然変異体を、部位特異的突然変異生成及び／又はＰＣＲベースの突然変異生成技術を使用して生成してもよい。対応する方法が、（Lottspeich and Zorbas, 1998）により、３６．１章において、追加の参考文献を伴って記載されている。
【００７５】
「宿主細胞」は、本発明の意味において、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくは齧歯類細胞（例えばハムスター細胞など）である。好ましい細胞は、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ  ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞又はそのような細胞系のいずれかの派生体／子孫である。特に好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１、及びＢＨＫ２１であり、さらにより好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。最も好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である。本発明の特定の実施態様において、宿主細胞は、マウスミエローマ細胞、好ましくはＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞又はそのような細胞系のいずれかの派生物／子孫を意味する。本発明の意味において使用することができるマウス細胞及びハムスター細胞の例を、また、表１にまとめる。しかし、そのような細胞の派生物／子孫、他の哺乳動物細胞（しかし、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、サル、及び齧歯類の細胞系を含む）、又は真核細胞（しかし、限定はされないが、酵母、昆虫、及び植物の細胞を含む）を、また、本発明の意味において、特に生物医薬品タンパク質の産生のために使用することができる。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
宿主細胞が、無血清条件下で、場合により、動物由来の任意のタンパク質／ペプチドを含まない培地中で樹立され、適応され、完全に培養される場合に最も好ましい。商業的に利用可能な培地、例えばハムＦ１２（Sigma, Deisenhofen, Germany）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、最小必須培地（ＭＥＭ；Sigma）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma）、ＣＤ−ＣＨＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、CHO-S-Invtirogen）、無血清ＣＨＯ培地（Sigma）、及び無タンパク質ＣＨＯ培地（Sigma）などが、例示的で適切な栄養溶液である。培地のいずれかに、必要に応じて、種々の化合物を用いて添加してもよい。それらの例は、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、インスリン様成長因子など）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸など）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジンなど）、グルタミン、グルコース又は他の等価のエネルギー供給源、抗生物質、微量元素である。任意の他の必要な添加剤が、また、当業者に公知でありうる適切な濃度で含まれてもよい。本発明において、無血清培地の使用が好ましいが、しかし、適量の血清が添加された培地も、宿主細胞の培養のために使用することができる。選択可能な遺伝子を発現する遺伝子改変細胞の成長及び選択のために、適した選択薬剤を培養液に加える。
【００７８】
用語「タンパク質」を、アミノ酸残基配列又はポリペプチドと互換的に使用し、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語は、また、しかし、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、又はタンパク質プロセシングを含む反応を通じて翻訳後に修飾されるタンパク質を含む。改変及び変化、例えば、他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失、又は挿入をポリペプチドの構造中に作製することができ、分子はその生物学的な機能活性を維持する。例えば、特定のアミノ酸配列の置換を、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列中に作製することができ、タンパク質を、同様の特性を伴い得ることができる。
【００７９】
用語「ポリペプチド」は、１０を上回るアミノ酸を伴う配列を意味する。用語「ペプチド」は、１０までのアミノ酸長の配列を意味する。
【００８０】
本発明は、生物医薬品ポリペプチド／タンパク質の産生のための宿主細胞を生成するために適する。本発明は、特に、増強した細胞産生性を示す細胞による、目的の多数の異なる遺伝子の高収量発現のために適する。
【００８１】
「目的の遺伝子」（ＧＯＩ）、「選択された配列」、又は「産物遺伝子」は、本明細書において同じ意味を有し、目的の産物又は「目的のタンパク質」（また、用語「所望の産物」により言及される）をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。選択された配列は、完全長遺伝子又は切断遺伝子、融合遺伝子又はタグ付き遺伝子でありうる、及び、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＤＮＡフラグメント、好ましくは、ｃＤＮＡでありうる。それは、天然配列、即ち、自然発生形態でありうる、又は、突然変異されうるもしくは別の方法で所望の通りに改変されうる。これらの改変は、選択された宿主細胞中でのコドン使用を最適化するためのコドン最適化、ヒト化、又はタギングを含む。選択された配列は、分泌ポリペプチド、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合ポリペプチド、又は細胞表面ポリペプチドをコードしうる。
【００８２】
「目的のタンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、そのフラグメント、ペプチドを含み、その全てを、選択された宿主細胞において発現させることができる。所望のタンパク質は、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体、及びその派生物又はフラグメント、ならびに、アゴニストもしくはアンタゴニストとしての役割を果たしうる及び／又は治療的もしくは診断的使用を有しうる任意の他のポリペプチドでありうる。所望のタンパク質／ポリペプチドについての例も以下に与える。
【００８３】
より複雑な分子（例えばモノクローナル抗体など）の場合において、ＧＯＩは、２つの抗体鎖の１つ又は両方をコードする。
【００８４】
「目的の産物」は、また、アンチセンスＲＮＡでありうる。
【００８５】
「目的のタンパク質」又は「所望のタンパク質」は、上に言及するものである。特に、所望のタンパク質／ポリペプチド又は目的のタンパク質は、例えば、しかし、限定はされないが、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）など、例、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮオメガ又はＩＦＮタウ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦアルファ及びＴＮＦベータ、ＴＮＦガンマ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、及びＶＥＧＦである。また、含まれるのは、エリスロポエチン又は任意の他のホルモン成長因子の産生である。本発明の方法は、また、抗体又はそのフラグメントの産生のために有利に使用することができる。そのようなフラグメントは、例えば、Ｆａｂフラグメント（フラグメント抗原結合＝Ｆａｂ）を含む。Ｆａｂフラグメントは、隣接する定常領域により一緒に保持される両鎖の可変領域からなる。これらは、プロテアーゼ消化により（例、パパインを用いて）、従来の抗体から形成されうるが、しかし、類似のＦａｂフラグメントもこの間に遺伝子操作により産生されうる。さらなる抗体フラグメントはＦ（ａｂ‘）２フラグメントを含み、それは、ペプシンを用いたタンパク質分解的切断により調製されうる。
【００８６】
目的のタンパク質は、好ましくは、培養液から分泌ポリペプチドとして回収される、又は、それは、分泌シグナルを伴わずに発現された場合、宿主細胞ライセートから回収することができる。目的のタンパク質を、他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質から、目的のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られる方法で精製することが必要である。最初の工程として、細胞及び／又は粒状細胞片を培養液又はライセートから除去する。目的の産物を、その後、混入する可溶性タンパク質、ポリペプチド、及び核酸から、例えば、免疫親和性カラム又はイオン交換カラム上での分画、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、セファデックスクロマトグラフィー、シリカ上又は陽イオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥなど）上でのクロマトグラフィーにより精製する。一般的に、宿主細胞により異種性に発現されたタンパク質をどのように精製するのかを当業者に教示する方法は、当技術分野において周知である。
【００８７】
遺伝子操作方法を使用し、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域だけからなる短縮した抗体フラグメントを産生することが可能である。これらは、Ｆｖフラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ＝可変部分のフラグメント）と呼ばれる。これらのＦｖフラグメントは定常鎖のシステインによる２つの鎖の共有結合を欠くため、Ｆｖフラグメントはしばしば安定化される。重鎖の及び軽鎖の可変領域を、短いペプチドフラグメント（例、１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸の）により連結することが有利である。この方法において、単一のペプチド鎖を得る（ＶＨ及びＶＬからなり、ペプチドリンカーにより連結されている）。この種類の抗体タンパク質は、単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｖ）として公知である。この種類のｓｃＦｖ抗体タンパク質の例は、先行技術から周知である。
【００８８】
近年、種々の戦略が、ｓｃＦｖを多量体派生物として調製するために開発されてきた。これは、特に、改善された薬物動態及び体内分布特性を伴うならびに増加した結合アビディティーを伴う組換え抗体に導くことが意図される。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、ｓｃＦｖを、多量体化ドメインを伴う融合タンパク質として調製する。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域又はコイルドコイル構造（ヘリックス構造）、例えばロイシンジッパードメインなどでありうる。しかし、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域の間での相互作用を多量体化（例、ダイア、トリ、及びペンタボディ）のために使用する戦略もある。ダイアボディにより、当業者は二価ホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。ｓｃＦｖ分子中のリンカーの５〜１０アミノ酸への短縮は、ホモ二量体化の形成に導き、それにおいて鎖内ＶＨ／ＶＬの重ね合わせが起こる。ダイアボディは、加えて、ジスルフィド架橋の取り込みにより安定化されうる。ダイアボディ−抗体タンパク質の例は、当技術分野から周知である。
【００８９】
ミニボディにより、当業者は、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。それは、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を、二量体化領域として含む融合タンパク質からなり、それは、ヒンジ領域（例、また、ＩｇＧ１から）及びリンカー領域を介してｓｃＦｖに結合される。ミニボディ−抗体タンパク質の例は、当技術分野から周知である。
【００９０】
トリアボディにより、当業者は、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。ＶＨ−ＶＬがリンカー配列を伴わずに直接的に融合されるＳｃＦｖ派生物は、三量体の形成に導く。
【００９１】
「スキャフォールドタンパク質」により、当業者は、遺伝子クローニングにより又は同時翻訳プロセスにより、別のタンパク質又は別の機能を有するタンパク質の部分と共役されるタンパク質の任意の機能的ドメインを意味する。
【００９２】
当業者は、また、二、三、又は四価構造を有し、ｓｃＦｖに由来する、いわゆるミニ抗体に精通しうる。多量体化は、二、三、又は四量体コイルドコイル構造により行われる。
【００９３】
定義により、宿主細胞中に導入された任意の配列又は遺伝子は、宿主細胞に関して、「異種配列」又は「異種遺伝子」又は「トランスジーン」と呼ばれる（導入された配列又は遺伝子が、宿主細胞中の内因性配列又は遺伝子と同一の場合でさえ）。
【００９４】
「異種」タンパク質は、このように、異種配列から発現されるタンパク質である。
【００９５】
用語「組換え」は、本発明の明細書を通して、特にタンパク質発現に関連して、用語「異種」と互換的に使用される。このように、「組換え」タンパク質は、異種配列から発現されるタンパク質である。
【００９６】
異種遺伝子配列を、標的細胞中に、「発現ベクター」、好ましくは真核生物の、及びさらにより好ましくは哺乳動物の発現ベクターを使用することにより導入することができる。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知であり、種々の刊行物中に記載されている。特に、適したベクターを構築するための技術（機能的成分、例えばプロモーター、エンハンサー、終結シグナル及びポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、及びスプライシングシグナルなどの記載を含む）が、（Sambrook et al., 1989）及びその中で引用される参考文献においてかなり詳細に概説されている。ベクターは、しかし、限定はされないが、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体（例、ＡＣＥ）、又はウイルスベクター（例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペス単純ウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージなど）を含みうる。真核生物発現ベクターは、典型的には、細菌中でのベクターの増殖を促進する原核生物配列（例えば複製起点及び細菌中での選択のための抗生物質耐性遺伝子など）も含みうる。種々の真核生物発現ベクター（ポリヌクレオチドを操作的に連結することができるクローニング部位を含む）が、当技術分野において周知であり、一部が、企業、例えばStratagene（La Jolla, CA）、Invitrogen（Carlsbad, CA）、Promega（Madison, WI）、又はBD Biosciences Clontech（Palo Alto, CA）などから商業的に利用可能である。
【００９７】
好ましい実施態様において、発現ベクターは、目的のペプチド／ポリペプチド／タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写及び翻訳のために必要な調節配列である少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００９８】
用語「発現」は、本明細書で使用される通り、宿主細胞内での異種核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。宿主細胞中での目的の所望の産物／タンパク質の発現のレベルを、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は、本発明の実施例の通り、選択された配列によりコードされる目的の所望のポリペプチド／タンパク質の量のいすれかに基づいて決定してもよい。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡを、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、又はＰＣＲにより定量化することができる。選択された配列によりコードされるタンパク質を、種々の方法により、例えば、ＥＬＩＳＡにより、ウエスタンブロッティングにより、ラジオイムノアッセイにより、免疫沈降により、タンパク質の生物学的活性についてのアッセイにより、タンパク質の免疫染色それに続くＦＡＣＳ解析により、又は均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイにより定量化することができる。
【００９９】
ポリヌクレオチド又は発現ベクターを用いた真核生物宿主細胞の「トランスフェクション」は、遺伝子改変細胞又はトランスジェニック細胞をもたらし、当技術分野において周知の任意の方法により実施することができる。トランスフェクション方法は、しかし、限定はされないが、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、ポリカチオン（例えばＤＥＡＥデキストランなど）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染、及びマイクロインジェクションを含む。好ましくは、トランスフェクションは安定トランスフェクションである。特定の宿主細胞系及び型において最適なトランスフェクション頻度及び異種遺伝子の発現を提供するトランスフェクション方法が好ましい。適した方法を、ルーチン手順により決定することができる。安定トランスフェクタントのために、コンストラクトは、宿主細胞のゲノムもしくは人工染色体／ミニ染色体中に組み込まれる、又は、エピソームとして位置づけられ、宿主細胞内に安定的に維持される。
【０１００】
本発明は、タンパク質、好ましくは組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で増加させること、及び
ｃ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１０１】
特定の実施態様において、工程ｂ）は、リボソームＲＮＡ転写を前記宿主細胞中で、好ましくは、転写因子を導入する（その発現を増加させる）ことにより、及び、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること（少なくとも１つのリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のエピジェネティック操作）によりアップレギュレーションすることを含む。
【０１０２】
本発明は、具体的には、タンパク質、好ましくは組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させることにより増加させること、及び
ｃ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させること（過剰発現）により増加させること、
ｄ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１０３】
特定の実施態様において、工程ｂ）は、少なくとも１つのＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のエピジェネティック操作を含む。
【０１０４】
本発明は、好ましくは、タンパク質、好ましくは組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること、及び
ｃ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の増加発現（過剰発現）により増加させること、
ｄ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１０５】
本発明の特定の実施態様において、組換えタンパク質発現は、低下したｒＤＮＡサイレンシングを伴わない細胞と比較して、前記細胞中で増加する。好ましくは、前記増加は、２０%〜１００%、より好ましくは２０%〜３００%、最も好ましくは２０%を上回る。好ましい実施態様において、工程ｃ）は、リボソームＲＮＡ転写を前記細胞において、転写因子を導入することにより増加させることを含む。
【０１０６】
本発明の目的のために、工程ｂ）及びｃ）の順番を逆転させることができる。
【０１０７】
本発明の特定の実施態様において、方法の工程ｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分のノックダウン又はノックアウトを含み、工程ｃ）は、転写因子の過剰発現を含む。具体的には、工程ｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分の発現を低下させることを含む。本発明の好ましい実施態様において、転写因子は上流結合因子（ＵＢＦ）である。本発明の別の好ましい実施態様において、ＮｏＲＣ成分は、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５である。本発明の非常に好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５をノックアウトする。本発明の方法の特定の実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウン又はノックアウトし、それによりＴＩＰ−５サイレンシングベクターは以下：
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号８、もしくは配列番号９のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．配列番号３、配列番号４、配列番号１０、もしくは配列番号１１のｍｉＲＮＡ
を含む。
【０１０８】
本発明のさらなる実施態様において、ＴＩＰ−５のアセチル化を、ＴＩＰ−５の欠失もしくは突然変異のいずれかにより、又は、アセチル化することができないＴＩＰ−５バリアントの過剰発現により防止する。本発明の特定の実施態様において、ＴＩＰ−５突然変異体は、ＳＩＲＴ１によりアセチル化することができない。本発明のさらなる実施態様は、（内因性）ＴＩＰ−５遺伝子内のアセチル化アクセプター部位の欠失である。好ましくは、前記の突然変異体又は欠失を、転写因子、好ましくはＵＢＦの導入と組み合わせる。これは、アップレギュレーションされたｒＲＮＡ転写をもたらし、それは、次に、増強したリボソーム合成及び組換えタンパク質の増加した産生に導く。特に適したＴＩＰ−５突然変異体は、マウスＴＩＰ−５中のリシン残基Ｋ６３３又はヒトＴＩＰ−５中のＫ６４９に突然変異を伴うＴＩＰ−５である。同様に、適したＴＩＰ−５欠失は、マウスＴＩＰ−５中のリシン残基Ｋ６３３又はヒトＴＩＰ−５中のＫ６４９に位置づけられる。
【０１０９】
このように、本発明の好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５のアセチル化を、ＴＩＰ−５のＫ６３３突然変異体又はＴＩＰ−５のＫ６４９突然変異体を発現させることにより防止する。好ましい実施態様は、前記ＴＩＰ−５のＫ６３３又はＫ６４９リシン突然変異体の発現／過剰発現及び転写因子、好ましくはＵＢＦの過剰発現の組み合わせである。本発明の別の実施態様において、ＳＮＦ２Ｈをノックアウトする。本発明の最も好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５を工程ｂ）においてノックダウンし、ＵＢＦを工程ｃ）において過剰発現させる。本発明のさらなる実施態様において、ＴＩＰ−５のアセチル化を、欠失もしくは突然変異のいずれかにより、又は、アセチル化することができないＴＩＰ−５バリアントの過剰発現により、好ましくは工程ｂ）においてＴＩＰ−５のＫ６３３又はＫ６４９リシン突然変異体の過剰発現により防止し、ＵＢＦを工程ｃ）において過剰発現させる。
【０１１０】
本発明は、さらに、目的のタンパク質を産生するための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で増加させること、
ｃ．前記細胞を、目的の前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１１１】
本発明の特定の実施態様において、方法は、加えて、以下：
ｄ．目的の前記タンパク質を精製すること
を含む。
【０１１２】
特定の実施態様において、工程ａ）の細胞は、空の宿主細胞である。別の実施態様において、工程ａ）の前記細胞は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換え細胞である。さらなる特定の実施態様において、工程ｂ）は、リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で、以下により増加させることを含む（リボソームＲＮＡ転写のアップレギュレーション）：ｉ）リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること（少なくとも１つのｒＤＮＡのエピジェネティック操作）、及び、ｉｉ）リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させること（導入／過剰発現）により増加させること。
【０１１３】
本発明は、具体的には、目的のタンパク質を産生するための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること（少なくとも１つのｒＤＮＡのエピジェネティック操作）、及び
ｃ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させること（過剰発現させること）により増加させること、
ｄ．前記細胞を、目的の前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１１４】
本発明の特定の実施態様において、方法は、加えて、以下
ｅ．目的の前記タンパク質を精製すること
を含む。
【０１１５】
工程ｂ）及びｃ）の順番を逆転させてもよい。特定の実施態様において、工程ｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分のノックダウン又はノックアウトを含み、工程ｃ）は、転写因子の過剰発現を含む。別の実施態様において、工程ｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分の発現を低下させることを含む。好ましい実施態様において、工程ｃ）における転写因子は、上流結合因子（ＵＢＦ）である。本発明の非常に好ましい実施態様において、ＮｏＲＣ成分は、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、最も好ましくはＴＩＰ−５である。本発明の最も好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウンし、ＵＢＦを過剰発現させる。
【０１１６】
タンパク質を産生するための上の方法の特定の実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウン又はノックアウトし、それによりＴＩＰ−５サイレンシングベクターは以下：
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号８、もしくは配列番号９のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．配列番号３、配列番号４、配列番号１０、もしくは配列番号１１のｍｉＲＮＡ
を含む。
【０１１７】
目的のタンパク質を産生するための本発明の方法のさらなる実施態様において、ＴＩＰ−５のアセチル化を、欠失もしくは突然変異のいずれかにより、又は、アセチル化することができないＴＩＰ−５バリアントの過剰発現により、好ましくは工程ｂ）においてＴＩＰ−５のＫ６３３又はＫ６４９リシン突然変異体の過剰発現により防止し、ＵＢＦを工程ｃ）において過剰発現させる。
【０１１８】
本発明は、さらに、好ましくは組換え／異種タンパク質の産生のための、宿主細胞を生成する方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で増加させること
を含む。
【０１１９】
本発明は、具体的には、好ましくは組換え／異種タンパク質の産生のための、宿主細胞を生成する方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で増加させること、
ｃ．宿主細胞を得ること
を含む。
【０１２０】
本発明は、さらに、好ましくは組換え／異種タンパク質の産生のための、単一細胞クローンを生成する方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で増加させること、
ｃ．単一細胞クローンを選択すること
を含む。
【０１２１】
本発明は、さらに、好ましくは組換え／異種タンパク質の産生のための、宿主細胞系を生成する方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で増加させること、
ｃ．単一細胞クローンを選択すること
を含む。
【０１２２】
本発明の特定の実施態様において、方法は、加えて、以下：
ｄ．宿主細胞系を前記単一細胞クローンから得ること
を含む。
【０１２３】
本発明は、さらに、好ましくは組換え／異種タンパク質の産生のための、モノクローナル宿主細胞系を生成する方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で増加させること、
ｃ．モノクローナル宿主細胞系を選択すること
を含む。
【０１２４】
上の方法の特定の実施態様において、工程ｂ）は、リボソームＲＮＡの量を前記細胞中で、以下により増加させることを含む（リボソームＲＮＡ転写のアップレギュレーション）：ｉ）リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること（少なくとも１つのｒＤＮＡのエピジェネティック操作）、及び、ｉｉ）リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させること（導入／過剰発現）により増加させること。
【０１２５】
本発明は、具体的には、好ましくは組換え／異種タンパク質の産生のための、宿主細胞（系）を生成する方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること（少なくとも１つのｒＤＮＡのエピジェネティック操作）、及び
ｃ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させること（過剰発現させること）により増加させること
を含む。
【０１２６】
場合により、前記方法は、加えて、以下：
ｄ．単一細胞クローンを選択すること
を含む。
【０１２７】
好ましくは、前記方法は、加えて、以下：
ｅ．宿主細胞（系）を得ること
を含む。
【０１２８】
工程ｂ）及びｃ）の順番を逆転させてもよい。
【０１２９】
特定の実施態様において、工程ｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分のノックダウン又はノックアウトを含み、工程ｃ）は、転写因子の過剰発現を含む。別の実施態様において、工程ｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分の発現を低下させることを含む。好ましい実施態様において、工程ｃ）における転写因子は、上流結合因子（ＵＢＦ）である。本発明の非常に好ましい実施態様において、ＮｏＲＣ成分は、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、最も好ましくはＴＩＰ−５である。本発明の最も好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウンし、ＵＢＦを過剰発現させる。
【０１３０】
宿主細胞を生成する上の方法の特定の実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウン又はノックアウトし、それによりＴＩＰ−５サイレンシングベクターは以下：
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号８、もしくは配列番号９のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．配列番号３、配列番号４、配列番号１０、もしくは配列番号１１のｍｉＲＮＡ
を含む。
【０１３１】
宿主細胞（系）を生成する上の方法のさらなる実施態様において、ＴＩＰ−５のアセチル化を、欠失もしくは突然変異のいずれかにより、又は、アセチル化することができないＴＩＰ−５バリアントの過剰発現により、好ましくは工程ｂ）においてＴＩＰ−５のＫ６３３又はＫ６４９リシン突然変異体の過剰発現により防止し、ＵＢＦを工程ｃ）において過剰発現させる。
【０１３２】
本発明は、さらに、上の方法のいずれかに従って生成された細胞に関する。好ましくは、組換えタンパク質の発現は、低下したｒＤＮＡサイレンシングを伴わない細胞と比較して、前記細胞において増加する。好ましくは、前記増加は、２０%〜１００%、より好ましくは２０%〜３００%、最も好ましくは２０%を上回る。
【０１３３】
好ましくは、前記細胞又は上に記載する方法のいずれかにおける細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物、齧歯類、又はハムスター細胞である。好ましくは、前記ハムスター細胞は、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１など、好ましくはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である。本発明は、さらに、前記細胞の、好ましくは目的のタンパク質の産生のための使用に関する。
【０１３４】
本発明の特定の実施態様において、上に記載する方法のいずれかにおける工程ｂ）及びｃ）の順番を逆転させる。
【０１３５】
セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）過剰発現と組み合わせたエピジェネティック操作：
本発明は、さらに、組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、及び
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること、及び
ｃ．セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現を前記細胞中で増加させること、及び
ｄ．場合により、リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させることにより増加させること、及び
ｅ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１３６】
本発明の特定の実施態様において、組換えタンパク質発現は、低下したｒＤＮＡサイレンシングを伴わない細胞と比較して、前記細胞中で増加する。好ましくは、前記増加は、２０%〜１００%、より好ましくは２０%〜３００%、最も好ましくは２０%を上回る。本発明の目的のために、工程ｂ）及びｃ）の順番を逆転させることができる。
【０１３７】
本発明の特定の実施態様において、方法の工程ｂ）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分のノックダウン又はノックアウトを含み、工程ｄ）は、転写因子、好ましくはＵＢＦの過剰発現を含む。本発明の別の好ましい実施態様において、ＮｏＲＣ成分は、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、好ましくはＴＩＰ−５である。本発明の非常に好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５をノックアウトする。本発明の方法の特定の実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウン又はノックアウトし、それによりＴＩＰ−５サイレンシングベクターは以下：
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号８、もしくは配列番号９のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．配列番号３、配列番号４、配列番号１０、もしくは配列番号１１のｍｉＲＮＡ
を含む。
【０１３８】
本発明のさらなる実施態様において、ＴＩＰ−５のアセチル化を、ＴＩＰ−５の欠失もしくは突然変異のいずれかにより、又は、アセチル化することができないＴＩＰ−５バリアントの過剰発現により防止する。本発明の特定の実施態様において、ＴＩＰ−５のアセチル化を、ＴＩＰ−５のＫ６３３突然変異体又はＴＩＰ−５のＫ６４９突然変異体を発現させることにより防止する。好ましい実施態様は、前記ＴＩＰ−５のＫ６３３又はＫ６４９リシン突然変異体の発現／過剰発現及びＣＥＲＴ（好ましくは、ＣＥＲＴ野生型又はＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ突然変異体）の過剰発現及び、場合により、転写因子、好ましくはＵＢＦの過剰発現の組み合わせである。本発明の別の実施態様において、ＳＮＦ２Ｈをノックアウトする。本発明の最も好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５を工程ｂ）においてノックダウンし、ＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ突然変異体を工程ｃ）において過剰発現させる。
【０１３９】
本発明は、具体的には、組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、及び
ｂ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で、好ましくはＴＩＰ−５のノックダウンにより又はＴＩＰ−５のアセチル化の防止により低下させること、及び
ｃ．セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現を前記細胞中で増加させること、及び
ｄ．場合により、リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子、好ましくはＵＢＦの発現を増加させることにより増加させること、及び
ｅ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１４０】
本発明は、さらに、組換えタンパク質発現を細胞中で増加させるための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、及び
ｂ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子、好ましくはＵＢＦの発現を増加させることにより増加させること、及び
ｃ．セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現を前記細胞中で増加させること、及び
ｄ．場合により、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で、好ましくはＴＩＰ−５のノックダウンにより又はＴＩＰ−５のアセチル化の防止により低下させること、及び
ｅ．前記細胞を、タンパク質発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１４１】
本発明の特定の実施態様において、組換えタンパク質発現は、低下したｒＤＮＡサイレンシングを伴わない細胞と比較して、前記細胞中で増加する。好ましくは、前記増加は、２０%〜１００%、より好ましくは２０%〜３００%、最も好ましくは２０%を上回る。本発明の目的のために、工程ｂ）及びｃ）の順番を逆転させることができる。本発明の好ましい実施態様において、ＵＢＦを工程ｂ）において過剰発現させ、野生型ＣＥＲＴ又はＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ  突然変異体を工程ｃ）において過剰発現させる。
【０１４２】
本発明は、さらに、目的のタンパク質を細胞中で産生するための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、及び
ｂ．セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現を前記細胞中で増加させること、及び
ｃ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること（少なくとも１つのｒＤＮＡのエピジェネティック操作）、及び
ｄ．場合により、リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子、好ましくはＵＢＦの発現を増加させること（過剰発現させること）により増加させること、及び
ｅ．前記細胞を、目的の前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１４３】
本発明の特定の実施態様において、方法は、加えて、以下：
ｆ．目的の前記タンパク質を精製すること
を含む。
【０１４４】
工程ｂ）、ｃ）、及びｄ）の順番を再配置／逆転させてもよい。
【０１４５】
本発明は、さらに、目的のタンパク質を細胞中で産生するための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、及び
ｂ．セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現を前記細胞中で増加させること、及び
ｃ．リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させること（少なくとも１つのｒＤＮＡのエピジェネティック操作）、及び
ｄ．前記細胞を、目的の前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１４６】
本発明の特定の実施態様において、方法は、加えて、以下：
ｅ．目的の前記タンパク質を精製すること
を含む。
【０１４７】
本発明は、さらに、目的のタンパク質を細胞中で産生するための方法に関し、以下：
ａ．細胞を提供すること、
ｂ．セラミドトランスファータンパク質（ＣＥＲＴ）の発現を前記細胞中で増加させること、及び
ｃ．リボソームＲＮＡ転写を前記細胞中で、転写因子の発現を増加させること（過剰発現させること）により増加させること、
ｄ．前記細胞を、目的の前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること
を含む。
【０１４８】
本発明の特定の実施態様において、方法は、加えて、以下：
ｅ．目的の前記タンパク質を精製すること
を含む。
【０１４９】
タンパク質を産生する上の方法の特定の実施態様において、工程ａ）の細胞は、空の宿主細胞である。別の実施態様において、工程ａ）の前記細胞は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換え細胞である。
【０１５０】
用語「ＣＥＲＴ」は、セラミドトランスファータンパク質ＣＥＲＴを指し、それはグッドパスチャー抗原結合タンパク質としても公知である。ＣＥＲＴは、セラミドの、小胞体（ＥＲ）でのその産生部位からゴルジ膜への非小胞送達のために必須の細胞質タンパク質であり、そこで、スフィンゴミエリン（ＳＭ）の変換が起こる。
【０１５１】
工程ｂ）及びｃ）の順番を逆転させてもよい。
【０１５２】
好ましくは、工程ｂ）におけるＣＥＲＴタンパク質は、野生型ＣＥＲＴであり、より好ましくは、それは、ＣＥＲＴ突然変異体ＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａである。さらに好ましい実施態様において、工程ｃ）における転写因子は、上流結合因子（ＵＢＦ）である。この方法の別の好ましい実施態様において、ＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ突然変異体及びＵＢＦの両方が過剰発現される。上の方法のいずれかの特定の実施態様において、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させる工程（少なくとも１つのｒＤＮＡのエピジェネティック操作）は、核小体リモデリング複合体（ＮｏＲＣ）の成分の発現を低下させること、例えばＮｏＲＣ成分のノックダウン又はノックアウトなどを含む。本発明の好ましい実施態様において、ＮｏＲＣ成分は、ＴＩＰ−５又はＳＮＦ  ２Ｈ、最も好ましくはＴＩＰ−５である。本発明の別の好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウンし、ＵＢＦを過剰発現させる。本発明の別の好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウン又はノックアウトし、ＣＥＲＴを過剰発現させる（好ましくは、ＣＥＲＴ野生型又はＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ突然変異体）。本発明の別の好ましい実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウン又はノックアウトし、ＣＥＲＴを過剰発現させ（好ましくは、ＣＥＲＴ野生型又はＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ突然変異体）、転写因子ＵＢＦを過剰発現させる。
【０１５３】
目的のタンパク質を産生する方法の上の方法の特定の実施態様において、ＴＩＰ−５をノックダウン又はノックアウトし、それによりＴＩＰ−５サイレンシングベクターは以下：
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号８、もしくは配列番号９のｓｈＲＮＡ、又は
ｂ．配列番号３、配列番号４、配列番号１０、もしくは配列番号１１のｍｉＲＮＡ
を含む。
【０１５４】
目的のタンパク質を産生する上の方法のさらなる実施態様において、ＴＩＰ−５のアセチル化を、欠失もしくは突然変異のいずれかにより、又は、アセチル化することができないＴＩＰ−５バリアントの過剰発現により、好ましくはリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）サイレンシングを前記細胞中で低下させる工程（少なくとも１つのｒＤＮＡのエピジェネティック操作）においてＴＩＰ−５のＫ６３３又はＫ６４９リシン突然変異体の過剰発現により防止し、ＣＥＲＴ（好ましくは、ＣＥＲＴ野生型又はＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ突然変異体）を過剰発現させ、場合によりＵＢＦを過剰発現させる。
【０１５５】
さらなる好ましい実施態様において、リボソームＲＮＡ転写を、前記細胞中で、転写因子の発現を増加させること（過剰発現させること）により増加させる工程における転写因子は、上流結合因子（ＵＢＦ）の過剰発現を含む。
【０１５６】
好ましくは、上の方法のいずれかにおける前記細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物、齧歯類、又はハムスター細胞である。好ましくは、前記ハムスター細胞は、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、又はＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１など、好ましくはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である。
【０１５７】
本発明の実行では、別に示さない場合、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの従来技術を用い、それらは当業者の技術内にある。これらの技術は、本発明の文献中に完全に開示されている。
【０１５８】
材料及び方法
プラスミド
ｐＣＭＶ−ＵＢＦは、Ingrid Grummtにより、ご厚意で提供される。ｐＣＭＶ−ＴＡＰ−ｔａｇは、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下で転写されるＴＡＰ−ｔａｇ配列を含む。
【０１５９】
安定細胞系
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、
【化１】
2012526536.tif 000003
配列をＨ１プロモーターの制御下で発現するプラスミドを用いて安定的にトランスフェクションする。
【０１６０】
転写されたｓｈＲＮＡ配列は：
【化２】
2012526536.tif 000004
である。
【０１６１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞を、コントロールｍｉＲＮＡ又はＴＩＰ５
【化３】
2012526536.tif 000005
を標的化するｍｉＲＮＡ配列を発現するプラスミドを用いて、Ｂｌｏｃｋ−ｉＴ  Ｐｏｌ  ＩＩ  ｍｉＲ  ＲＮＡｉシステム（Invitrogen）に従い安定的にトランスフェクションする。感染は、製造者の指示に従って実施される。細胞を、感染後１０日目に分析する。
【０１６２】
転写されたｍｉＲＮＡ配列は、
【化４】
2012526536.tif 000006
である。
【０１６３】
転写解析
４５ＳプレｒＲＮＡ転写を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、標準的な手順に従い、Universal Masterミックス（Diagenode）を使用して測定する。マウス及びヒトの４５ＳプレｒＲＮＡ及びＧＡＰＤＨを検出するために使用されるプライマー配列が、以前に記載されている。
【０１６４】
ＣｐＧメチル化分析
マウス及びヒトｒＤＮＡのメチル化を、以前に記載された通りに測定する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞中でのｒＤＮＡメチル化の分析のために使用されるプライマーは、
【化５】
2012526536.tif 000007
である。
【０１６５】
ＢｒＵＴＰ取り込み
ＢｒＵＴＰ取り込みのために、ｓｈＲＮＡコントロールならびにＴＩＰ５−１及び２細胞を用いて播種したカバーガラスを、１０mM  ＢｒＵＴＰを含むＫＨバッファーを用いて１０分間にわたりインキュベーションする。次に、ＢｒＵＴＰ  ＫＨバッファーを除去し、細胞を、３０分間、２０%  ＦＣＳを含む増殖培地中でインキュベーションし、転写物を固定前に追跡する。細胞を１００%メタノール中で２０分間にわたり−２０℃で固定し、５分間にわたり風乾し、ＰＢＳを用いて５分間にわたり再水和する。ＢｒＵＴＰ取り込みを、次に、モノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（Sigma-Aldrich）を使用して検出する。
【０１６６】
増殖曲線
１０５個の細胞を、６ウェルプレートの１ウェル当たりに播種し、各日、細胞をトリプシン処理し、回収し、Casy（登録商標）Cell Counter（Schaerfe System）を用いてカウントする。実験を２通りに実施し、２回繰り返す。
【０１６７】
ポリソームプロファイル
細胞を、シクロヘキシミド（１００μg/ml、１０分）を用いて処理し、２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５mM  ＭｇＣｌ２、１００mM  ＫＣｌ、２．５mM  ＤＴＴ、１００μg/mlシクロヘキシミド、０．５%  ＮＰ４０、０．１mg/mlヘパリン、及び２００U/ml  ＲＮＡｓｅ阻害剤中で、４℃で溶解する。８，０００gで５分間にわたる遠心分離後、上清を、１５%〜４５%ショ糖勾配上に添加し、４時間にわたり２８，０００rpmで、４℃で遠心する。２００μlの分画を回収し、個々の分画での最適密度を２６０nmで測定する。
【０１６８】
タンパク質産生
タンパク質産生を、恒常的ＳＥＡＰ（ｐＣＡＧ−ＳＥＡＰ）発現ベクター又はルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）のトランスフェクション後４８時間目に評価する。ＳＥＡＰ産生を、ｐニトロフェニルリン酸ベース光吸収の時間的経過により測定する。ルシフェラーゼプロファイリングを、製造者の指示（Applied biosystems, Tropix（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキット）に従って実施する。値を、細胞数及びトランスフェクション効率に対して正規化する。トランスフェクション効率を、ＧＦＰ発現ベクター（GFP-C1, Clontech）を用いてトランスフェクションされた細胞のフローサイトメトリー分析により測定する。全ての実験を３通りに実施し、３回繰り返す。
【０１６９】
浮遊細胞の細胞培養
産生及び開発スケールで使用される全ての細胞系を、インキュベーター（Thermo, Germany）中の表面エアレーションＴフラスコ（Nunc, Denmark）又は振盪フラスコ（Nunc, Denmark）中の連続シードストック培養において、温度３７℃で及び５%  ＣＯ２を含む雰囲気中で維持する。シードストック培養物を、２〜３日ごとに播種密度１−３Ｅ５個細胞/mLで継代培養する。細胞濃度を、全ての培養物中で、血球計を使用することにより決定する。生存率をトリパンブルー色素排除方法により評価する。
【０１７０】
流加培養
細胞を、３Ｅ０５個細胞/mlで、１２５ml振盪フラスコ中に、３０mlのＢＩ専売産生培地（抗生物質又はＭＴＸ（Sigma-Aldrich, Germany）を伴わない）中に播種する。培養物を１２０rpmで３７℃及び５%  ＣＯ２（続く３日目に２%に低下させる）において撹拌する。ＢＩ専売フィード溶液を毎日加え、ｐＨを、必要に応じてＮａＣＯ３を使用してｐＨ  ７．０に調整する。細胞密度及び生存率を、トリパンブルー色素排除方法により、自動CEDEX細胞定量化システム（Innovatis）を使用して決定する。
【０１７１】
抗体産生細胞の生成
ＣＨＯ−Ｋ１細胞又はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Urlaub et al., Cell 1983）を、ＩｇＧ１型抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを用いて安定的にトランスフェクションする。選択は、発現プラスミドによりコードされるそれぞれの抗生物質の存在におけるトランスフェクションされた細胞の培養により行う。約３週間の選択後、安定細胞集団を得て、さらに、２〜３日ごとの継代培養を伴う標準的なストック培養計画に従って培養する。次の（任意の）工程において、安定的にトランスフェクションされた細胞集団のＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングを行い、モノクローナル細胞系を生成する。
【０１７２】
組換え抗体濃度の決定
トランスフェクションされた細胞における組換え抗体産生を評価するために、細胞上清からのサンプルを、標準的な接種培養から、３回連続の継代について各継代の終わりに回収する。産物濃度を、次に、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により分析する。分泌されたモノクローナル抗体産物の濃度を、ヒトＦｃフラグメント（Jackson Immuno Research Laboratories）及びヒトカッパ軽鎖（Sigma）に対するＨＲＰコンジュゲーションされた抗体を使用して測定する。
【０１７３】
実施例
実施例１：ＴＩＰ−５のノックダウン
組換えタンパク質の増加合成のために細胞を操作することを目標に、本発明者らは、サイレントなｒＲＮＡの数における減少が、４５ＳプレｒＲＮＡ合成を増強し、結果として、また、リボソーム生合成を刺激し、翻訳能力のあるリボソームの数を増加させるか否かを決定する。従って、本発明者らはＲＮＡ干渉を使用して、ＴＩＰ５発現をノックダウンし、安定的なトランスジェニックｓｈＲＮＡ発現ＮＩＨ／３Ｔ３又はｍｉＲＮＡ発現ＨＥＫ２９３Ｔ及びＣＨＯ−Ｋ１を、ＴＩＰ５の２つの異なる領域（ＴＩＰ５−１及びＴＩＰ５−２）に特異的なｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ配列を使用して構築する。スクランブルｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ配列を発現する安定的な細胞系を、コントロールとして使用する。ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５又はｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現するプラスミドを用いた一過性トランスフェクションを実施するよりもむしろ、安定な細胞系を産生することについて２つの理由がある。第１に、抑制性エピジェネティックマーク（ＣｐＧメチル化など）の喪失は、受動機構であり、複数の細胞分裂を要求する。第２に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を比較的簡単にトランスフェクションすることができるにもかかわらず、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の不良なトランスフェクション効率によって、内因性ｒＲＮＡ、リボソームレベル、及び細胞増殖特性のその後の分析が損なわれうる。選択されたクローンにおいてＴＩＰ５ノックダウンの効率を決定するために、本発明者らは、定量的及び半定量的な逆転写酵素媒介性ＰＣＲによりＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルを測定する（図１）。ＴＩＰ５発現は、コントロール細胞と比較した場合、ＮＩＨ／３Ｔ３／ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５−１及び−２細胞中で約７０〜８０%減少する（図１Ａ）。ＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルにおける同様の低下が、安定的なＨＥＫ２９３Ｔ中で観察される（図１Ｂ）。ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞中でのＴＩＰ５  ｍＲＮＡレベルを、半定量的ＰＣＲによって測定することができるが（図１Ｃ）、しかし、ＴＩＰ５  ｍＲＮＡの低下は、安定的なＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞のそれと同様である。これらの結果は、樹立された細胞系が低レベルのＴＩＰ５を含むことを実証する。
【０１７４】
実施例２：ＴＩＰ−５ノックダウンは、低下したｒＤＮＡメチル化に導く。
マウスｒＤＮＡプロモーターのＣｐＧメチル化は、基礎転写因子ＵＢＦの結合を損ない、前開始複合体の形成が妨げられる。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、ｒＲＮＡ遺伝子の約４０%〜５０%がＣｐＧメチル化配列を含み、転写的にサイレントである。ヒト、マウス、及びチャイニーズハムスターにおけるｒＤＮＡプロモーターの配列及びＣｐＧ密度は、有意に異なる。ヒトにおいて、ｒＤＮＡプロモーターは２３のＣｐＧを含み、マウス及びチャイニーズハムスターにおいて、それぞれ３及び８のＣｐＧがある（図２Ａ〜Ｃ）。ＴＩＰ５ノックダウンがｒＤＮＡサイレンシングに影響を与えることを検証するために、本発明者らは、ＣＣＧＧ配列中のｍｅＣｐＧの量を測定することによりｒＤＮＡメチル化レベルを決定する。ゲノムＤＮＡをＨｐａＩＩ消化し、消化に対する耐性（即ち、ＣｐＧメチル化）を、ＨｐａＩＩ配列（ＣＣＧＧ）を包含するプライマーを使用した定量的リアルタイムＰＣＲにより測定する。全てのＴＩＰ５ノックダウン細胞系においてｒＲＮＡ遺伝子の大半のプロモーター領域内でのＣｐＧメチル化において減少があり、ｒＤＮＡサイレンシングを促進する際でのＴＩＰ５の鍵となる役割を強調する（図２）。
【０１７５】
顕著には、ＴＩＰ５結合及びデノボメチル化はｒＤＮＡプロモーター配列に制限されるが、ＴＩＰ−５が低下したＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＣｐＧメチル化量は、ｒＤＮＡ遺伝子全体にわたり減弱し（遺伝子間、プロモーター、及びコード領域；図２Ｄ、Ｅ）、ＴＩＰ５が、一旦、ｒＤＮＡプロモーターに結合すると、ｒＤＮＡ遺伝子座の全体にわたり、サイレントなエピジェネティックマークの確立のための拡大機構を開始することを示す。
【０１７６】
実施例３：ＴＩＰ−５ノックダウン細胞中での増加したｒＲＮＡレベル
サイレントな遺伝子の数における減少が、ｒＲＮＡ転写物の量に影響を与えるか否かを決定するために、本発明者らは、第１のｒＲＮＡプロセシング部位を包含したプライマーを使用したｑＲＴ−ＰＣＲにより（図３Ａ）及びｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢｒＵＴＰ取り込みにより（図３Ｂ）４５ＳプレｒＲＮＡ合成を測定する。予測通り、ＴＩＰ５枯渇ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方において、コントロール細胞系と比較したｒＲＮＡ産生の増強を、両方の解析により検出する。
【０１７７】
実施例４：ＴＩＰ５枯渇は、増加した増殖及び細胞成長に導く。
Ｒａｓは、細胞の形質転換及び腫瘍形成に関与する周知のオンコジーンであり、ヒトのがんにおいて頻繁に突然変異又は過剰発現する。Green et al., 2009: WO2009/017670は、ＴＩＰ−５が、網羅的ｍｉＲＮＡスクリーンにおいて、ＦａｓのＲａｓ媒介性エピジェネティックサイレンシングエフェクター（ＲＥＳＥ）として機能するとして同定したことを記載する。この刊行物では、Ｒａｓエフェクター（例えばＴＩＰ−５など）の低下発現が、細胞増殖の阻害をもたらすことが記載されている。
【０１７８】
本発明者らは、両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析する。図４Ａ、Ｂに示す通り、Ｓ期中の細胞の数は、コントロール細胞と比較して、両方のｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５細胞において有意に高い。同様のプロファイルが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、ＴＩＰ５配列に対して向けられたｍｉＲＮＡを発現するレトロウイルスを用いた感染後１０日目に得られる。これらの結果と一致して、ｓｈＲＮＡ  ＴＩＰ５細胞は、新生ＤＮＡ中への５ブロモデオキシウリシン（ＢｒｄＵ）の増加した取り込み及びより高いレベルのサイクリンＡを示す（図４Ｃ）。
【０１７９】
最後に、本発明者らは、ｓｈＲＮＡ−ＴＩＰ５、ｓｈＲＮＡコントロール及び親ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞の間で細胞増殖速度を比較する（図４Ｄ−Ｆ）。驚くべきことに、先行技術の報告とは対照的に、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方が、ｍｉＲＮＡ−ＴＩＰ５配列を発現し、コントロール細胞よりも速い速度で増殖し、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数における減少が細胞代謝に対して影響を有することを示唆する。ＨＥＫ２９３Ｔ中でのＴＩＰ５枯渇は、細胞増殖に有意な影響を与えない。なぜなら、これらの細胞は、それらの最高増殖速度に既に達しているからである。これらのデータは、驚くべきことに、ＴＩＰ−５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングにおける結果的な減少が、細胞増殖を増強することを示す。
【０１８０】
実施例５：ＴＩＰ−５ノックダウン細胞におけるリボソーム解析
哺乳動物細胞培養において、タンパク質合成の速度が重要なパラメーターであり、それは、産物収量に直接的に関連する。ＴＩＰ５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングにおける結果的な減少が、細胞中の翻訳能力のあるリボソームの数を増加させるか否かを決定するために、本発明者らは、最初に、細胞質ｒＲＮＡのレベルを測定する。細胞質中では、ＲＮＡの大半が、リボソーム中にアセンブルされたプロセシングされたｒＲＮＡからなる。図５Ａ〜Ｃに示す通り、全てのＴＩＰ５枯渇細胞系が、より多くの細胞質ＲＮＡを細胞当たりに含み、これらの細胞がより多くのリボソームを産生することを示す。また、ポリソームプロファイルの分析は、ＴＩＰ５枯渇ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞が、コントロール細胞と比較して、より多くのリボソームサブユニット（４０Ｓ、６０Ｓ、及び８０Ｓ）を含むことを示す（図５Ｄ）。
【０１８１】
実施例６：ＴＩＰ−５ノックダウンは、レポータータンパク質の増強産生に導く。
ＴＩＰ５の枯渇及びｒＤＮＡサイレンシングにおける減少が、異種タンパク質産生を増強するか否かを決定するために、本発明者らは、安定なＴＩＰ５枯渇ＮＩＨ／３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ、及びＣＨＯ−Ｋ１派生物に、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼＳＥＡＰ（ｐＣＡＧ−ＳＥＡＰ；ＦＩＧＵＲＥ  ６Ａ−Ｃ）又はルシフェラーゼ（ｐＣＭＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の恒常的発現を促進する発現ベクターを用いてトランスフェクションする（図６Ｄ、Ｅ）。４８時間後でのタンパク質産生の定量化は、コントロール細胞系と比較して、ＴＩＰ５枯渇細胞中でのＳＥＡＰ及びルシフェラーゼの両方の産生における２〜４倍の増加を明らかにし、ＴＩＰ５枯渇が異種タンパク質産生を増加することを示す。全てのこれらの結果は、サイレントなｒＲＮＡ遺伝子の数における減少が、リボソーム合成を増強し、組換えタンパク質を産生する細胞の潜在力を増加することを示す。
【０１８２】
実施例７：ＴＩＰ−５ノックアウトは、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の生物医薬品産生を増加する。
（ａ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を分泌するＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）は、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）又はＴＩＰ−５発現をノックダウンするように設計された小型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）を用いてトランスフェクションする。細胞をその後に選択に供し、安定細胞プールを得る。６回のその後の継代の間に、上清を、両方（偽及びＴＩＰ−５枯渇安定細胞プール）のシードストック培養から採取し、ＭＣＰ−１力価をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。最も高いＭＣＰ−１力価が、最も効率的なＴＩＰ−５枯渇を伴う細胞プールにおいて見られるのに対し、タンパク質濃度は、偽トランスフェクションされた細胞又は親細胞系において顕著により低い。
【０１８３】
ｂ）ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、短いＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）を用いて最初にトランスフェクションし、ＴＩＰ−５発現を低下させ、安定なＴＩＰ−５枯渇宿主細胞系を生成する。その後、これらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を目的の遺伝子としてコードするベクターを用いてトランスフェクションする。２回の選択後、上清を、全ての安定細胞プールのシードストック培養から４回のその後の継代の期間にわたり採取し、ＭＣＰ−１力価をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。最も高いＭＣＰ−１力価及び産生性が、最も効率的なＴＩＰ−５枯渇を伴う細胞プールにおいて見られるのに対し、タンパク質濃度は、偽トランスフェクションされた細胞又は親細胞系において顕著により低い。
【０１８４】
ｃ）ａ）又はｂ）に記載される同じ細胞を、バッチ発酵又は流加発酵に供する場合、全ＭＣＰ−１力価における差はさらにより明白になる：ＴＩＰ−５の低下発現を伴うトランスフェクションされた細胞は、より速く成長し、また、細胞当たり及び時間当たりより多くのタンパク質を産生するため、それらは、より高いＩＶＣを示し、同時により高い産生性を示す。両方の特性は、全プロセス収量に対してポジティブな影響を有する。従って、Ｔｉｐ５欠失細胞は、有意により高いＭＣＰ−１収集力価を有し、より効率的な産生プロセスに導く。
【０１８５】
実施例８：ＴＩＰ−５遺伝子のノックアウトは、ｒＲＮＡ転写を増加させ、増殖を最も効率的に増強する。
ＴＩＰ−５発現の一定に低下したレベルを伴う改善された産生宿主細胞系を生成するための最も効率的な方法は、ＴＩＰ−５遺伝子の完全ノックアウトを生成することである。この目的のために、相同組換えを使用する又はＺｉｎｋ−Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）技術を利用し、Ｔｉｐ−５遺伝子を破壊する又はその発現を防止することができる。相同組換えはＣＨＯ細胞において効率的ではないため、本発明者らはＴＩＰ−５遺伝子内に二本鎖切断を導入するＺＦＮを設計し、それにより機能的に破壊する。ＴＩＰ−５の効率的なノックアウトを制御するために、ウエスタンブロットを、抗ＴＩＰ−５抗体を使用して実施する。メンブレン上で、ＴＩＰ−５発現がＴＩＰ−５ノックアウト細胞中で検出されないのに対し、親ＣＨＯ細胞系はＴＩＰ−５タンパク質に対応する明かなシグナルを示す。
【０１８６】
次に、ｒＲＮＡ転写を、ＴＩＰ−５ノックアウトＣＨＯ細胞及び親ＣＨＯ細胞系中で分析する。このアッセイによって、親細胞と比較して、及び、また、低下したＴＩＰ−５発現レベルだけを伴う細胞と比較して、ＴＩＰ−５ノックアウト細胞中でのより高いレベルのｒＲＮＡ合成及び増加したリボソーム数が確認される。
【０１８７】
さらに、ＴＩＰ−５について欠損した細胞は、より速く増殖し、ＴＩＰ−５野生型細胞及びＴＩＰ−５発現が干渉ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉなど）の導入により低下しただけの細胞系と比較して、流加プロセスにおいてより高い細胞数を示す。
【０１８８】
実施例９：ＴＩＰ−５欠失細胞における増強した治療用抗体産生
（ａ）ヒトモノクローナルＩｇＧサブタイプ抗体を分泌するＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）又はＴＩＰ−５発現をノックダウンするように設計された小型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）を用いてトランスフェクションする。細胞をその後に選択に供し、安定細胞プールを得る。あるいは、ＴＩＰ−５を、ＴＩＰ−５遺伝子の欠失（ノックアウト）により枯渇させる。６回のその後の継代の間に、上清を、両方（偽及びＴＩＰ−５枯渇安定細胞プール）のシードストック培養から採取し、抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。最も高いＩｇＧ力価が、ＴＩＰ−５枯渇細胞の培養において測定されるのに対し、タンパク質濃度は、偽トランスフェクションされた細胞又は親細胞系において顕著により低い。
【０１８９】
ｂ）ＴＩＰ−５を、ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）において、ＴＩＰ−５配列にハイブリダイズする短いＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）を用いたトランスフェクションにより又はＴＩＰ−５遺伝子の安定的なノックアウトにより枯渇させる。その後、これらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、抗体の重鎖及び軽鎖を目的の遺伝子としてコードする発現コンストラクトを用いてする。安定的にトランスフェクションされた細胞集団を生成し、上清を、全ての安定細胞プールのシードストック培養から４回のその後の継代の期間にわたり採取する。培養上清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。ＴＩＰ−５枯渇細胞に由来する細胞プールは、ＭＯＣＫコントロール及び親未改変ＤＧ４４細胞系（顕著により低いＩｇＧ量を産生する）と比較して、最も高い抗体力価及び産生性を示す。ｃ）ａ）又はｂ）に記載される同じ細胞を、バッチ発酵又は流加発酵に供する場合、全抗体力価における差はさらにより明白になる：ＴＩＰ−５枯渇細胞は、より速く成長し、また、細胞当たり及び時間当たりより多くのタンパク質を産生するため、それらは、より高いＩＶＣを示し、同時により高い産生性を示す。両方の特性は、全プロセス収量に対してポジティブな影響を有する。従って、ＴＩＰ−５欠失細胞は、有意により高いＩｇＧ収集力価を有し、より効率的な産生プロセスに導く。
【０１９０】
実施例１０：ＳＮＦ２Ｈのノックダウンは、増加したタンパク質産生及び改善した細胞成長に導く。
（ａ）ヒトモノクローナルＩｇＧサブタイプ抗体を分泌するＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）は、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）又はＳＮＦ２Ｈ発現をノックダウンするように設計された小型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）を用いてトランスフェクションする。細胞をその後に選択に供し、安定細胞プールを得る。あるいは、ＳＮＦ２Ｈを、ＳＮＦ２Ｈ遺伝子の欠失／破壊（ノックアウト）により枯渇させる。６回のその後の継代の間に、上清を、両方（偽及びＳＮＦ２Ｈ枯渇安定細胞プール）のシードストック培養から採取し、抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。最も高いＩｇＧ力価が、ＳＮＦ２Ｈ枯渇細胞の培養において測定されるのに対し、タンパク質濃度は、偽トランスフェクションされた細胞又は親細胞系において顕著により低い。
【０１９１】
ｂ）ＳＮＦ２Ｈを、ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）において、ＳＮＦ２Ｈ配列にハイブリダイズする短いＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡｉ）を用いたトランスフェクションにより又はＳＮＦ２Ｈ遺伝子のノックアウトにより枯渇させる。その後、これらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、抗体の重鎖及び軽鎖を目的のタンパク質としてコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする。安定的にトランスフェクションされた細胞集団を生成し、上清を、全ての安定細胞プールのシードストック培養から４回のその後の継代の期間にわたり採取する。培養上清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。ＳＮＦ２Ｈ枯渇細胞に由来する細胞プールは、ＭＯＣＫコントロール及び親未改変ＤＧ４４細胞系（顕著により低いＩｇＧ量を産生する）と比較して、最も高い抗体力価及び産生性を示す。
【０１９２】
ｃ）ａ）又はｂ）に記載される同じ細胞を、バッチ発酵又は流加発酵に供する場合、全抗体力価における差はさらにより明白になる：ＳＮＦ２Ｈ枯渇細胞は、より速く成長し、また、細胞当たり及び時間当たりより多くのタンパク質を産生するため、それらは、より高いＩＶＣを示し、同時により高い産生性を示す。両方の特性は、全プロセス収量に対してポジティブな影響を有する。従って、ＳＮＦ２Ｈ欠失細胞は、有意により高いＩｇＧ収集力価を有し、より効率的な産生プロセスに導く。
【０１９３】
実施例１１：ＵＢＦの過剰発現は、ｒＲＮＡ合成を増強する。
リボソーム産生は、ｒＲＮＡ及びｒタンパク質の協調発現及びアセンブリを要求する。基礎ｒＲＮＡ転写因子である上流結合因子（ＵＢＦ）の過剰発現が、また、４５ＳプレｒＲＮＡ転写の速度における増加ならびに結果的に増強したリボソーム産生及び異種タンパク質合成に導くか否かを決定するために、本発明者らは、ＳＥＡＰ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞を、ＵＢＦをコードする恒常的発現ベクター又は親コントロールベクターを用いてトランスフェクションする。ＵＢＦは活性なｒＲＮＡ遺伝子に結合し、転写開始を促進し、伸長速度を調節する。図７に示す通り、ＵＢＦは、４５ＳプレｒＲＮＡ合成を、用量依存的な様式で、ＨＥＫ２９３細胞系及びＨｅＬａ細胞系の両方において刺激する。
【０１９４】
このように、ＵＢＦ過剰発現及びＴＩＰ−５のノックダウンは、増加するｒＲＮＡ合成の効果を共有する。ＵＢＦ過剰発現は、また、リボソーム生合成及びタンパク質産生を増強する。
【０１９５】
実施例１２：ＵＢＦの過剰発現は、抗体の生物医薬品タンパク質産生を増加する。
（ａ）ヒト化抗ＣＤ４４ｖ６  ＩｇＧ抗体ＢＩＷＡ  ４を分泌する抗体産生ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）又は上流結合因子（ＵＢＦ）をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションし、全てのサンプルをその後に選択に供し、安定細胞プールを得る。６回のその後の継代の間に、上清を、全ての安定細胞プールのシードストック培養から採取し、ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。最も高い値が、ＵＢＦ過剰発現細胞プールにおいて見られ、そこでは、ＩｇＧ発現が、ＭＯＣＫ細胞又は非トランスフェクション細胞と比較して、顕著に増強される。非常に類似の結果を、安定トランスフェクタントをバッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。これらの設定の各々において、ＵＢＦの過剰発現は、増加した抗体分泌に導き、ＵＢＦが、連続培養中で又はバイオリアクターバッチ培養もしくは流加培養中で成長された細胞の特異的な産生能力を増強することができることを示す。
【０１９６】
ｂ）ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、ＵＢＦをコードするベクターを用いて最初にトランスフェクションし、選択圧力に供し、ＵＢＦの異種発現が実証される細胞系を選ぶ。その後に、これらの細胞系及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、ヒト化抗ＣＤ４４ｖ６  ＩｇＧ抗体ＢＩＷＡ  ４を目的の遺伝子としてコードするベクターを用いてトランスフェクションする。２回の選択後、上清を、全ての安定細胞プールのシードストック培養から６回のその後の継代の期間にわたり採取し、ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。再び、ＩｇＧ力価が、コントロールと比較して、ＵＢＦ過剰発現培養物中で顕著に増強される。また、流加培養において、ＵＢＦの異種発現は、増加したＩｇＧ産生をもたらす。合わせると、これらのデータは、ＵＢＦの過剰発現が、連続培養中で又はバイオリアクターバッチ培養もしくは流加培養中で成長された細胞の特異的な産生能力を増強することができることを示す。
【０１９７】
実施例１３：ＴＩＰ−５のノックアウト及びＵＢＦの過剰発現は、相乗的に作用し、ｒＲＮＡ合成及び治療用タンパク質産生を増強する。
本発明において、本発明者らは、ＴＩＰ−５の低下発現及びＵＢＦの過剰発現が、増強したｒＲＮＡ合成をもたらすとの証拠を提供する。本発明者らは、また、ＴＩＰ−５枯渇がｒＤＮＡ遺伝子の低下したメチル化をもたらすことを示す。脱メチル化が、クロマチン修飾因子（例えばヒストンアセチラーゼなど）及び結合転写因子（例えばＵＢＦなど）の動員のために必須であるため、本発明者らは、両方のアプローチがｒＲＮＡ合成に相乗的に作用し、それにより、メチル化のＴＩＰ−５枯渇媒介性低下が、その後のＵＢＦ動員及び結合のためにｒＲＮＡ遺伝子の接触性を提供するか否かを仮定する。
【０１９８】
（Ａ）この仮定をテストするために、本発明者らは、組み合わせたＴＩＰ−５枯渇及びＵＢＦの過剰発現を伴う細胞系を生成する。ｒＲＮＡ合成をそれらの細胞系、ＵＢＦを過剰発現した又はＴＩＰ−５中に欠失を有する細胞、及び非改変親細胞系において比較した場合、ｒＲＮＡ合成は、再び、ＴＩＰ−５枯渇細胞中で、また、ＵＢＦ過剰発現細胞系中で、コントロールと比較してより高い。重要なことに、組み合わせたＴＩＰ−５の欠失及びＵＢＦ過剰発現は、さらにより高いｒＤＮＡ遺伝子転写ならびにより高いリボソーム合成をもたらす。これは、両方のアプローチ（ＴＩＰ−５の枯渇及びＵＢＦ過剰発現）の組み合わせが、ｒＲＮＡ合成に対して相乗効果を有することを示す。
【０１９９】
（Ｂ）（Ａ）において生成された細胞を、目的のタンパク質をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションし、前記タンパク質の濃度をそれらの細胞の培養液中で比較する場合、最も高い力価が、同時のＵＢＦの過剰発現及びＴＩＰ−５のノックアウトを伴う細胞の培養中で測定される。次に、ランキング中にＴＩＰ−５枯渇又はＵＢＦ過剰発現のいずれかを有する細胞があるのに対し、目的のタンパク質の力価は非改変親細胞系中で最も低い。
【０２００】
実施例１４：エピジェネティック操作及び分泌操作の組み合わせによるタンパク質産生の相乗的な改善。
本発明において記載するアプローチ、即ち、ＴＩＰ−５又はＳＮＦＨ２の枯渇及びＵＢＦの過剰発現は、全てが、ｒＲＮＡ合成、リボソーム生合成、及びそれによりタンパク質翻訳を増強することにより組換えタンパク質産生を増強する。しかし、タンパク質産生は、最適化された翻訳機構だけでなく、しかし、また、タンパク質の輸送及び分泌の翻訳後段階における効率も要求する。従って、本発明者らは、両方の機構（翻訳及び輸送）を、細胞中でのＴＩＰ−５遺伝子の欠失及び分泌増強遺伝子ＣＥＲＴの過剰発現により同時に操作することを試みる。
【０２０１】
この目的のために、破壊されたＴＩＰ−５発現を伴うＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ヒトＣＥＲＴタンパク質の突然変異体バリアント（ＣＥＲＴ  Ｓｅｒ１３２→Ａｌａ）をコードするトランスジーンを用いてトランスフェクションする。第２のトランスフェクション段階において、モノクローナルＩｇＧサブタイプ抗体をコードする発現コンストラクトをこれらの細胞中に導入し、安定な細胞集団を生成する。次に、結果として得られる安定な細胞集団を、接種培養及び流加培養に供し、特異的なＩｇＧ産生性ならびに得られた全抗体力価を分析する。
【０２０２】
興味深いことに、最も高い抗体力価及び特異的な産生性が、二重操作細胞において達成される。ＴＩＰ−５欠失及びＣＥＲＴ過剰発現の両方を持つ細胞により産生される抗体濃度は、単一操作細胞においてよりも顕著により高い。これは、分泌経路中での両方の段階の組み合わせ操作、即ち、ＴＩＰ−５欠失による翻訳操作及びＣＥＲＴを介した分泌操作が、分泌タンパク質産生をさらに増強し、最適な産生能力を伴う哺乳動物宿主細胞を生成するための手段であることを示す。
【０２０３】
【表２】
2012526536.tif 000008
【図１（Ｃ）】
2012526536.tif 000009
【図１（Ａ）】
2012526536.tif 000010
【図１（Ｂ）】
2012526536.tif 000011
【図２（Ａ）】
2012526536.tif 000012
【図２（Ｂ）】
2012526536.tif 000013
【図２（Ｃ）】
2012526536.tif 000014
【図２（Ｄ）】
2012526536.tif 000015
【図２（Ｅ）】
2012526536.tif 000016
【図３（Ａ）】
2012526536.tif 000017
【図３（Ｂ）】
2012526536.tif 000018
【図４（Ａ）】
2012526536.tif 000019
【図４（Ｂ）】
2012526536.tif 000020
【図４（Ｃ）】
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【図４（Ｄ）】
2012526536.tif 000022
【図４（Ｅ）】
2012526536.tif 000023
【図４（Ｆ）】
2012526536.tif 000024
【図５（Ａ）】
2012526536.tif 000025
【図５（Ｂ）】
2012526536.tif 000026
【図５（Ｃ）】
2012526536.tif 000027
【図５（Ｄ）】
2012526536.tif 000028
【図５（Ｅ）】
2012526536.tif 000029
【図６（Ａ）】
2012526536.tif 000030
【図６（Ｂ）】
2012526536.tif 000031
【図６（Ｃ）】
2012526536.tif 000032
【図６（Ｄ）】
2012526536.tif 000033
【図６（Ｅ）】
2012526536.tif 000034
【図７（Ａ）】
2012526536.tif 000035
【図７（Ｂ）】
2012526536.tif 000036
【配列表】
2012526536000001.app
【国際調査報告】
2012526536.tif 000037
2012526536.tif 000038
2012526536.tif 000039
2012526536.tif 000040
2012526536.tif 000041
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