(57)【要約】  本発明は、無細胞体液試料中のＮＰＭ１核酸を検出し、その核酸が挿入および欠失を含む１つまたは複数の変異を含有するかどうかを決定する方法に関する。本方法は、ＮＰＭ１遺伝子中に変異を有する細胞を有するＡＭＬ患者の予後を予測するのに有用である。
2012505655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診察された個体の予後を決定する方法であって、
ＮＰＭ１核酸中の１つまたは複数の変異の有無を決定し、ここで、前記ＮＰＭ１核酸は前記個体の無細胞体液から取得されたものであり、そして
前記個体の予後を提供し、ここで、前記ＮＰＭ１遺伝子中の１つまたは複数の変異の存在はＡＭＬと診断されたが前記１つまたは複数の変異をもたない個体と比べて、前記個体の予後が良好であることを示す、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
前記無細胞体液は、血清または血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数の変異の有無は、配列番号１と比べて決定される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＰＭ１核酸はゲノムＤＮＡである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＰＭ１核酸はｍＲＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＰＭ１核酸中の前記変異の１つはＣＴＣＴ挿入を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記挿入は、配列番号１の１０１８位に対応するヌクレオチドの後ろに存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＰＭ１核酸中の前記変異の少なくとも１つは、図２Ａまたは図２Ｂから選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＦＬＴ３遺伝子中の１つまたは複数の変異の有無を検出することをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＬＴ３遺伝子中の前記１つまたは複数の変異は、遺伝子内縦列反復の重複である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＰＭ１遺伝子中に１つまたは複数の変異が存在し、かつＦＬＴ３遺伝子中に１つまたは複数の変異が存在しないことは、ＡＭＬと診断された前記個体のより良好な予後を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記個体の細胞遺伝学的特性を決定することをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＭＬ患者の無細胞体液から得られたＮＰＭ１核酸を増幅し、そして前記増幅されたＮＰＭ１核酸を、ハイブリダイズ条件下で少なくともＮＰＭ１核酸の変異の存在を特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、前記ＮＰＭ１核酸の少なくとも一部のサイズを決定することを含み、ここで、サイズの増加は挿入変異の存在を示す、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記予後は寛解率に関連する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＭＬ患者の前記予後は、全生存率に関連する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＭＬと診察された個体の予後を決定する方法であって、
ＮＰＭ１核酸中の挿入変異の有無を決定し、ここで、前記ＮＰＭ１核酸は前記個体の無細胞体液から取得されたものであり、そして
前記個体の予後を提供し、ここで、前記挿入変異の存在は、ＡＭＬと診断されたが前記挿入変異をもたない個体と比べて、前記個体の予後が良好であることを示す、
の各工程を含む方法。
【請求項１８】
前記挿入変異は、配列番号１の１０１８位に対応するヌクレオチドの後に挿入されているＣＴＣＴ挿入を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＬＴ３遺伝子中の１つまたは複数の変異の有無を検出することをさらに含む、請求項１７から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＬＴ３遺伝子中の前記１つまたは複数の変異は、遺伝子内縦列反復の重複である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記挿入変異が存在し、かつ前記ＦＬＴ３遺伝子中に変異が存在しないことは、ＡＭＬと診断された前記個体の予後がより良好であることを示す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記予後は、寛解率または全生存率に関連する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法は、前記ＮＰＭ１核酸の少なくとも一部のサイズを決定することを含み、サイズの増加は挿入変異の存在を示す、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号３または配列番号４の配列を含む増幅プライマーを使用して、前記ＮＰＭ１核酸を増幅することを含む、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号３および配列番号４の配列を含む一対の増幅プライマーを使用して、前記ＮＰＭ１核酸を増幅することを含む、請求項１７から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
個体を血液疾患について診断する方法であって、
ＮＰＭ１核酸中の転座の有無を決定し、ここで、前記ＮＰＭ１核酸は前記個体の無細胞体液から取得されたものであり、そして
ＮＰＭ１核酸中の転座が検出された場合には、前記個体が血液疾患を有すると診断する、の各工程を含む方法。
【請求項２７】
前記血液疾患は、未分化大細胞リンパ腫、急性前骨髄球性白血病、および急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記転座は、ＮＰＭ１遺伝子と、未分化大細胞リンパ腫キナーゼ、レチノイン酸受容体α、および骨髄異形成症／骨髄性白血病第一因子からなる群から選択される第２の遺伝子との間にある、請求項２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＮＰＭ１核酸中の１つまたは複数の変異の有無を検出することをさらに含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
１つまたは複数の変異の有無は、配列番号１と比べて決定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＮＰＭ１核酸中の前記変異の１つはＣＴＣＴ挿入を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記挿入は、配列番号１の１０１８位に対応するヌクレオチドの後に存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＮＰＭ１核酸中の前記変異の少なくとも１つは、図２Ａまたは図２Ｂから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＮＰＭ１核酸はゲノムＤＮＡである、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＮＰＭ１核酸はｍＲＮＡである、請求項２６から３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第６１／１０６，５３２号、２００８年１１月３日に出願された米国特許出願第６１／１１０，９４１号、および２００８年１２月１６日に出願された米国特許出願第１２／３３６，４７５号に基づく優先権を請求するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
開示される発明は、癌の診断および治療を含む腫瘍学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景技術に関する以下の考察は、読み手が本発明を理解するのを支援するために提供されているに過ぎず、本発明に対する従来技術を記述またはそれを構成すると認めるものではない。
【０００４】
ヌクレオフォスミンは、Ｂ２３、ヌマトリン（ｎｕｍａｔｒｉｎ）、およびＮＯ３８としても知られており、核と細胞質との間を絶え間なく行き来する遍在的発現性の核小体リンタンパク質である。ヌクレオフォスミンの機能には、核酸の結合、中心体複製およびリボソーム機能の制御、ならびにＡＲＦ−ｐ５３腫瘍抑制因子経路の制御が含まれる。
【０００５】
ヌクレオフォスミンをコードする遺伝子は、ＮＰＭ１である。ＮＰＭ１遺伝子は、染色体５ｑ３５に位置している。染色体相互転座によるＮＰＭ１の分断は、いくつかの血液リンパ球悪性疾患（ｈｅｍａｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）に関与する（Ｆａｌｉｎｉら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００７年；９２巻（４号）：５１９〜５３２頁）。これら転座は、ヌクレオフォスミンのＮ末端を保持する種々の融合タンパク質の形成に帰着し、未分化大細胞リンパ腫のＮＰＭ−未分化大細胞リンパ腫キナーゼ（ＮＰＭ−ＡＬＫ）（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４年；２６３巻：１２８１〜１２８４頁）、急性前骨髄球白血病のＮＰＭ−レチノイン酸受容体α（ＮＰＭ−ＲＡＲα）（Ｒｅｄｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．１９９６年；８７巻：８８２〜８８頁）、およびＡＭＬ／骨髄異形成症候群のＮＰＭ−骨髄異形成症／骨髄性白血病第１因子（ＮＰＭ−ＭＬＦｌ）（Ｙｏｎｅｄａ−Ｋａｔｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９６年；１２巻：２６５〜２７５頁）を含む新生物状態と関連づけられてきた。
【０００６】
ＮＰＭ１遺伝子のヘテロ接合変異は、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）を有する成人患者のおよそ３５％、ならびに小児の６．５％で同定されている（Ｆａｌｉｎｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００５年；３５２巻：２５４〜２６６頁；Ｃａｚｚａｎｉｇａら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：１４１９〜１４２２頁）。現在までＮＰＭ１変異の多数の分子変異体が、ＡＭＬ患者で記述されており、その大多数がエキソン１２の中にある（Ｆａｌｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ．２００７年；１０９巻：８７４〜８５号）。ＡＭＬで同定されているＮＰＭ１変異の多くは、単純なテトラヌクレオチド１個または２個の挿入、９ｂｐ挿入と組み合わされた４塩基対（ｂｐ）もしくは５ｂｐ欠失、または１４ｂｐ挿入と組み合わされた９ｂｐ欠失を特徴とする（Ｆａｌｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ．２００７年：１０９巻：８７４〜８５頁；Ｃｈｅｎら、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２００６年；１３０巻：１６８７〜１６９２頁）。ＮＰＭ１遺伝子のエキソン１２の変異は、フレームシフトを起こすことが多く、細胞質中に保持される長いタンパク質を産生する。
【０００７】
ＮＰＭ１変異は、高レベルの骨髄芽細胞、高い白血球（ＷＢＣ）数および血小板数、ならびにｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３の遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）と関連している（Ｔｈｉｅｄｅら、Ｂｌｏｏｄ．２００６年；１０７巻：４０１１〜４０２０頁）。ＦＬＴ３変異を有していないＮＰＭ１変異を表す患者は、この研究では、有意に良好な全体的な無病の生存率を示した（Ｔｈｉｅｄｅら、Ｂｌｏｏｄ．２００６年；１０７巻：４０１１〜４０２０頁）。ＮＰＭ１変異は、正常な核型を有するＡＭＬにおいて一般的である（Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：３７３３〜３７３９頁）。種々の研究によると、正常核型を有するＡＭＬの患者群内では、ＮＰＭ１変異ＡＭＬの患者は、野生型ＮＰＭ１  ＡＭＬの患者の完全寛解率と類似しているかまたはそれより有意に高い完全寛解率を有したことが示されている（Ｂｏｉｓｓｅｌら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：３６１８〜３６２０頁；Ｆａｌｉｎｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００５年；３５２巻：２５４〜２６６頁；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：２８５４〜２８６１頁；Ｄｏｈｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：３７４０〜６頁）。
【０００８】
本発明は、無細胞体液中のＮＰＭ１核酸を検出する方法を提供する。ある種の態様では、本発明は、ＮＰＭ１核酸が、１つまたは複数の変異を含むかどうかを決定することを含む。本発明は、ＮＰＭ１遺伝子変異（複数可）の有無を決定することに基づいて、ＡＭＬを有すると診断された個体の診断または予後を決定する方法も提供する。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、ある個体の無細胞体液中のＮＰＭ１核酸の有無を検出する方法を提供する。個体は、悪性疾患（例えば、ＡＭＬまたはＭＤＳ）を有すると診断されていてもよく、またはその発症が疑われていてもよい。
【００１０】
別の態様では、本発明は、血液障害（例えば、ＡＭＬまたはＭＤＳ）と診断された個体の予後を決定する方法であって、該個体の無細胞体液から取得されたＮＰＭ１核酸中の１つまたは複数の変異の有無を決定するステップと、前記個体の予後を示すステップであり、該ＮＰＭ１遺伝子中に１つまたは複数の変異が存在することが、ＡＭＬと診断されたが１つまたは複数の変異をもたない個体と比べて、該個体のより良好な予後を示すステップとを含む方法を提供する。好適な無細胞体液には、例えば、血清および血漿が含まれる。単離および／または評価される好適なＮＰＭ１核酸には、例えば、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）が含まれる。
【００１１】
好ましい実施形態では、ＮＰＭ１変異は、配列番号１のＮＰＭ１配列と比べて決定される。幾つかの実施形態では、評価されるＮＰＭ１変異の１つまたは複数は、図２Ａまたは２Ｂの変異から選択される。他の実施形態では、ＮＰＭ１変異は、例えば、配列番号１の１０１８位に対応するヌクレオチド後の挿入を含む挿入変異である。他の実施形態では、挿入は、ＣＴＣＴまたはＣＴＣＧ挿入である。挿入変異を含むＮＰＭ１変異の存在は、予後の向上（つまり、血液疾患と診断されＮＰＭ１変異をもたない個体よりも良好な予後）と関連する。好ましい実施形態では、予後の向上は、血液障害を有すると診断されＮＰＭ１変異をもたない個体と比べた、寛解率の向上または全生存率の向上である。
【００１２】
他の実施形態では、無細胞体液から得られた核酸は、ＦＬＴ３遺伝子中の１つまたは複数の変異の有無について、さらに評価される。幾つかの実施形態では、ＦＬＴ３遺伝子変異は、遺伝子内縦列反復の重複である。１つの解釈に基づくと、ＦＬＴ３変異をもたず、さらにＮＰＭ１変異を含有する個体は、血液疾患をもち、ＮＰＭ１変異およびＦＬＴ３変異のいずれかまたは両方を有すると診断された個体と比べて、予後の向上を示す。
【００１３】
他の実施形態では、本方法は、個体の細胞遺伝学的特性を決定するステップをさらに含む。１つの解釈に基づくと、中程度の細胞遺伝学的特性を有し、ＮＰＭ１変異をさらに含む個体は、ＮＰＭ１変異をもたず、中程度、正常、または不良な細胞遺伝学的特性を有する個体と比べて、予後の向上を示す。別の解釈に基づくと、正常な細胞遺伝学的特性を有し、ＮＰＭ１変異をさらに含む個体は、正常な細胞遺伝学的特性を有し、ＮＰＭ１変異をもたない個体と比べて、予後の向上を示す。
【００１４】
他の実施形態では、ＮＰＭ１変異の有無は、ＮＰＭ１核酸の少なくとも一部分のヌクレオチド配列を決定することにより評価される。別の実施形態では、ＮＰＭ１変異の有無は、ＮＰＭ１核酸の少なくとも一部分のサイズを決定することにより評価される。任意に、ＮＰＭ１核酸を増幅してもよい。増幅は、配列番号３および／または配列番号４のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを使用して実施することができる。任意に、個体の接合状態を決定してもよい。
【００１５】
別の態様では、本発明は、個体が血液疾患を有すると診断する方法であって、無細胞体液から得られたＮＰＭ１核酸中の転座の有無を決定し、ＮＰＭ１核酸中の転座が検出される場合に、前記個体が血液疾患と診断することを特徴とする方法を提供する。ある種の実施形態では、血液疾患は、未分化大細胞リンパ腫、急性前骨髄球性白血病、および急性骨髄性白血病である。他の実施形態では、転座は、ＮＰＭ１遺伝子と、未分化大細胞リンパ腫キナーゼ、レチノイン酸受容体α、または骨髄異形成症／骨髄性白血病第一因子遺伝子の遺伝子との間に生じる。任意に、個体は、先述の態様に記述されているように、ＮＰＭ１遺伝子および／またはＦＬＴ３遺伝子中の１つまたは複数の変異について評価してもよい。
【００１６】
「試料」または「患者試料」という用語は、本明細書で使用される場合、組織および体液などの生体試料を含む。「体液」には、これらに限定されないが、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、胸膜液、涙、乳管液（ｌａｃｔａｌ  ｄｕｃｔ  ｆｌｕｉｄ）、リンパ、痰、尿、羊水、および精液が含まれていてもよい。試料は、「無細胞」である体液を含んでいてもよい。「無細胞体液」は、約１％（重量／重量）未満の全細胞物質を含んでいる。血漿または血清は、無細胞体液の例である。試料は、天然または合成由来（つまり、無細胞となるよう調製された細胞試料）の標本を含んでいてもよい。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「血漿」は、血液中に見出される無細胞液体を指す。「血漿」は、当技術分野で公知の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により、血液から全細胞物質を除去することにより、血液から得ることができる。本明細書で使用される場合、「末梢血血漿」は、末梢血試料から得られた血漿を指す。
【００１８】
「血清」は、本明細書中で使用される場合、血漿または血液を凝固させ、凝固画分を除去した後に得られる血漿の画分を含む。
【００１９】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および類似体を任意の組合せで含有する、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むことが意図されている。核酸は三次元構造を有していてもよく、既知または未知の任意の機能を果たしてもよい。核酸という用語には、二本鎖、一本鎖、部分的二本鎖、ヘアピン、および三重らせん分子が含まれる。別様の指示がない限りまたは要求されていない限り、核酸である本明細書に記述されている本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッド分子のいずれかの二本鎖形態を形成することが知られているかまたは予測される２つの相補的形態の各々とを両方とも包含する。核酸は、増幅されてもよく、組換えでもよく、または天然供給源から直接単離されてもよい。核酸は、増幅された核酸（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して）を含んでいてもよい。核酸の特定の例には、遺伝子または遺伝子断片、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｒＲＮＡを含むＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ならびにベクターが含まれる。核酸は、天然のものであってもよく、または合成であってもよい。
【００２０】
「ゲノムの核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、その生物の細胞の種々のタンパク質をコードする遺伝子を含有する生物の細胞染色体（複数可）に存在する細胞の核酸を指す。好ましいタイプのゲノム核酸は、真核生物細胞の核に存在するタイプである。好ましい実施形態では、ゲノム核酸はＤＮＡである。ゲノムの核酸は、二本鎖もしくは一本鎖の、または部分的に二本鎖の、または部分的に一本鎖の、またはヘアピン状の分子であってもよい。ゲノム核酸は、完全であってもよく、または断片化されていてもよい（例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化、または超音波処理により、または当技術分野で公知の方法による剪断力の適用により）。ある場合には、ゲノム核酸は、単一の遺伝子または複数の遺伝子のすべてまたは部分に由来する配列、１つまたは複数の染色体に由来する配列、または細胞の全染色体に由来する配列を含んでいてもよい。周知のように、ゲノム核酸には、遺伝子コード領域、イントロン、５’および３’非翻訳領域、５’および３’隣接ＤＮＡ、ならびにテロメアおよびセントロメアＤＮＡ、複製起点、および遺伝子間ＤＮＡなどの構造セグメントが含まれる。ゲノム核酸とは、ゲノムの全核酸であり、「全ゲノム核酸」と呼ばれる。
【００２１】
当技術分野で周知のように、ゲノム核酸は、無細胞体液から抽出／精製する方法により得ることができる。ゲノム核酸の最終的な供給源は、正常細胞であってもよく、またはゲノムの核酸中に１つまたは複数の変異、例えば、重複、欠失、転座、および塩基転換を含有する細胞であってもよい。ゲノム核酸の意味には、ゲノム核酸中の他の核酸配列と比較して、検出が求められている目的の標的配列の量を増加させる増幅ステップに供されたゲノム核酸が含まれる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ｃＤＮＡ」という用語は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性（例えば、逆転写酵素）の作用によりＲＮＡテンプレートから産生される相補的または複製ポリヌクレオチドを指す。ｃＤＮＡは、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖であってもよい。ｃＤＮＡは、非天然ヌクレオチドを含有していてもよい。ｃＤＮＡは、合成後に修飾することができる。ｃＤＮＡは、検出可能な標識を含んでいてもよい。
【００２３】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、自然には結合している細胞高分子から実質的に分離されている分子を指す。ある分子が、自然には結合している細胞高分子の少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、または９９％を組成物中で占める場合に、その分子は単離されているという。
【００２４】
「遺伝子」は、ＲＮＡの産生に必要な制御配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列を指し、これは非コード機能を有していてもよく（例えば、リボソームまたはトランスファーＲＮＡ）、またはポリペプチドもしくはポリペプチド先駆体を含んでいてもよい。ＲＮＡまたはポリペプチドは、全長コード配列によりコードされてもよく、または所望の活性または機能が保持される限り、コード配列の任意の部分によりコードされてもよい。
【００２５】
「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された場合、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、ある集団中で最も頻繁に観察される遺伝子であり、したがって任意に「正常」形態または「野生型」形態と呼ばれる。「野生型」は、特定のヌクレオチド位置（複数可）の配列、特定のコドン位置（複数可）の配列、または特定のアミノ酸位置（複数可）の配列を表していてもよい。本明細書で使用される場合、「変異体」、「改変された」、または「多形性」は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して、配列または機能的特性の改変（つまり、特徴の変更）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。「変異体」、「改変された」、または「多形性」は、特定のヌクレオチド位置（複数可）の配列、特定のコドン位置（複数可）の配列、または特定のアミノ酸位置（複数可）の配列も指す。
【００２６】
「変異」は、正常な配列と比較して、ヌクレオチド配列における少なくとも１つのヌクレオチド変異を包含することを意味する。変異は、置換、欠失、逆位、または挿入を含んでいてもよい。コードされたポリペプチドに関して、変異は、「サイレント」であって、コードされたポリペプチド配列に変化をもたらさないものであってもよく、または変異は、コードされたポリペプチド配列に変化をもたらすしてもよい。例えば、変異は、コードされたポリペプチド配列に置換をもたらしてもよい。変異は、コードされたポリペプチド配列に関して、フレームシフトをもたらしてもよい。
【００２７】
「相同性」または「相同的」という用語は、同一性の度合いを指す。部分的な相同性または完全な相同性があってもよい。部分的に相同的な配列とは、別の配列と比較して、１００％未満の配列同一性を有するものである。
【００２８】
「ヘテロ接合性」は、相同染色体セグメントの１つまたは複数の遺伝子座に、異なる対立遺伝子を有することを指す。本明細書で使用される場合、「ヘテロ接合性」は、１つまたは複数の遺伝子座にある異なる対立遺伝子が検出される可能性のある試料、細胞、細胞集団、または生物を指すことができる。ヘテロ接合性試料は、例えば核酸塩基配列決定などの当技術分野で公知の方法により決定することができる。例えば、塩基配列決定用電気泳動図が、単一の遺伝子座に２つのピークを示し、両ピークがほぼ同じサイズである場合、その試料は、ヘテロ接合性であると特徴付けることができる。または、１つのピークが、もう１つのピークより小さいが、より大きなピークのサイズの少なくとも約２５％である場合、その試料は、ヘテロ接合性であると特徴付けることができる。幾つかの実施形態では、より小さなピークは、より大きなピークの少なくとも約１５％である。幾つかの実施形態では、より小さなピークは、より大きなピークの少なくとも約１０％である。幾つかの実施形態では、より小さなピークは、より大きなピークの少なくとも約５％である。他の実施形態では、最小量のより小さなピークが検出される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、およびその断片または部分を指し、それらは一本鎖または二本鎖であってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖であってもよい。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてもよく、天然または合成由来であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を任意の組合せで含有していてもよい。
【００３０】
ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子または遺伝子断片、ゲノムＤＮＡ、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、合成核酸、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。ポリヌクレオチドは、天然のものであってもよく、または合成であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチド、ウラシル基、フルオロリボースおよびチオラートなどの他の糖および連結基、ならびにヌクレオチド分岐を含んでいてもよい。核酸は、結合などにより標識成分で修飾されていてもよい。この定義に含まれる他のタイプの修飾は、キャップ構造、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数を類似体で置換すること、およびタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体などの他の分子にポリヌクレオチドを結合させるための化学物質の導入である。核酸は、増幅された核酸（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して）を含んでいてもよい。
【００３１】
核酸の断片は、一般的に、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００個以上のヌクレオチドを含有する。より大きな断片は可能であり、約２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、７，５００、または１０，０００塩基を含んでいてもよい。
【００３２】
「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、高度な相補性を共有する２つの核酸配列間のハイブリダイゼーション相互作用を指し、このハイブリダイゼーションは、目的の核酸と他の関連核酸との間のハイブリダイゼーションを排除する。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容的アニーリング条件下で形成され、その後の任意の洗浄ステップ後でもハイブリダイズしたままである。核酸配列のアニーリングの許容的条件は、当業者であれば日常的に決定可能であり、例えば、約６×ＳＳＣの存在下、６５℃で発現し得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的に、洗浄ステップが実施される温度を基準にして表すことができる。そのような温度は、典型的には、明確なイオン強度およびｐＨにおける特異的配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃〜２０℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全一致プローブにハイブリダイズする温度である（明確なイオン強度およびｐＨ下で）。核酸ハイブリダイゼーションのＴｍおよび条件を計算するための数式は、当技術分野で公知である。
【００３３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも下記と同じ程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および５×デンハルト溶液中、終夜４２℃でのハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる４５℃での洗浄；および０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる４５℃での洗浄。別の例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２０個の一連の隣接ヌクレオチドにわたって３個以上の塩基が異なる２つの核酸のハイブリダイゼーションを可能にすべきでない。
【００３４】
標的核酸を特異的に増幅する（つまり、特定の標的核酸配列を増幅する）か、または特異的に検出する（つまり、特定の標的核酸配列を検出する）ためのプライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、一般的に、標的核酸と特異的にハイブリダイズすることが可能である。
【００３５】
本明細書で使用される場合、増幅用の「プライマー」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの存在下で、プライマー伸長が開始され（例えば、ＰＣＲなどの応用に伴うプライマー伸長）、プライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加に結び付く条件下に置かれると、合成の開始点として作用することが可能である、標的ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、プライマーの３’−ヌクレオチドは、最適な発現および増幅のためには、対応するヌクレオチド位置の標的配列に相補的である。「プライマー」は、精製された制限酵素消化物のように天然に生じてもよく、または合成的に生成されてもよい。「プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド核酸プライマー、ロックド核酸プライマー、ホスホロチオアート修飾プライマー、および標識プライマーなどを含む、合成し得るすべての形態のプライマーを含む。プライマーは、典型的には、長さが、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多いヌクレオチドである。特定のプライマー応用に最適な長さは、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９８９年）に記述されている様式で、容易に決定することができる。
【００３６】
「プローブ」は、ハイブリダイゼーションにより標的核酸と相互作用する核酸を指す。プローブは、オリゴヌクレオチド、人工染色体、断片化人工染色体、ゲノム核酸、断片化ゲノム核酸、ＲＮＡ、組換え核酸、断片化組換え核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、環式ヘテロ環のオリゴマー、または核酸の結合体であってもよい。プローブは、修飾核酸塩基および修飾糖部分を含んでいてもよい。プローブは、標的核酸配列に対して完全に相補的であってもよく、または部分的に相補的であってもよい。プローブは、標的核酸の有無を検出するために使用することができる。プローブ（複数可）は、例えば、標的の配列特徴に基づいて、核酸配列における変異の有無を検出するために使用することができる。プローブは、当技術分野で周知の多数の方法のいずれかで、標識化または非標識化、または修飾することができる。プローブは、特異的に標的核酸とハイブリダイズすることができる。プローブは、典型的には、長さが、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはそれより多いヌクレオチドである。好ましい実施形態では、ＮＰＭ１プローブは、ヌクレオチド１０１８位および１０１９位を包含する配列番号１の領域と実質的に同一である少なくとも２０個のヌクレオチドを含む核酸と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、プローブは、野生型ＮＰＭ１配列または挿入変異を含むＮＰＭ１配列のいずれかと特異的にハイブリダイズする。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、目的の標的分子を同定するために使用される分子または化合物または一群の分子（例えば、検出系）を指す。典型的には、検出可能な標識は、検出系の成分であり、標的分子と特異的に結合する別の分子に結合されている。ある場合には、検出可能な標識は、直接的に検出することができる。他の場合では、検出可能な標識は、結合対の一部であってもよく、その後それを引き続き検出することができる。検出可能な標識に由来するシグナルは、種々の手段により検出することができ、検出可能な標識の性質に依存する。検出可能な標識を検出する手段の例には、これらに限定されないが、蛍光、化学蛍光、または化学ルミネセンスなどの、分光法的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁気的、放射化学的、または化学的手段、または他の適切な手段が含まれる。
【００３８】
「標的核酸」および「標的配列」という用語は、本明細書では同義的に使用されており、同定しようとする核酸配列を指す。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。「標的配列」は、ゲノム核酸であってもよい。標的配列には、野生型配列、点突然変異、欠失、または重複を含有する核酸配列、単一の遺伝子または複数の遺伝子のすべてまたは部分に由来する配列、１つまたは複数の染色体に由来する配列、または任意の他の目的配列が含まれていてもよい。標的配列は、特定の遺伝子の選択的配列または対立遺伝子であってもよい。標的配列は、二本鎖もしくは一本鎖の、または部分的に二本鎖の、または部分的に一本鎖の、またはヘアピン状の分子であってもよい。標的配列は、約１〜５塩基、約１０塩基、約２０塩基、約５０塩基、約１００塩基、または約５００塩基以上であってもよい。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「増幅」または、「増幅する」という用語は、標的核酸を複製し、それにより選択された核酸配列の複製数を増加させるための方法を含む。増幅は、指数関数的であってもよく、または線形であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。このようにして増幅された配列は、「アンプリコン」または「増幅産物」を形成する。以降に記述されている例示的方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅に関連するが、核酸増幅のための多数の他の方法（例えば、等温法、ローリングサークル法など）が、当技術分野で公知である。当業者であれば、これら他の方法は、ＰＣＲ法の代わりに使用されても、またはＰＣＲ法と一緒に使用されてもいずれでもよいことを理解されよう。例えば、Ｓａｉｋｉ、“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ”ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９０年）、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、１３〜２０頁；Ｗｈａｒａｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００１年）、１月１日；２９巻（１１号）：Ｅ５４〜Ｅ５４頁；Ｈａｆｎｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００１年）、４巻：８５２〜６頁、８５８頁、８６０頁を参照されたい。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、量的な関係でプラスまたはマイナス１０％を意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「正常核型」という用語は、これらに限定されないが、転座、逆位、およびマイクロサテライトＤＮＡなどの追加的な染色体エレメントの存在を含む染色体異常を有していない細胞を意味する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「接合状態」という用語は、当技術分野で公知であり、本明細書に記述されている試験方法により、ヘテロ接合性、ホモ接合性、または半接合性と考えられる試料、細胞集団、または生物を指す。「核酸の接合状態」という用語は、核酸の供給源が、ヘテロ接合性、ホモ接合性、または半接合性と考えられるかどうかを決定することを意味する。「接合状態」は、配列の単一のヌクレオチドの違いを表すことができる。幾つかの方法では、単一変異に関連する試料の接合状態は、ホモ接合性野生型、ヘテロ接合性（つまり、１つの野生型対立遺伝子および１つの変異対立遺伝子）、ホモ接合性変異、または半接合性（つまり、野生型または変異対立遺伝子のいずれかの単一コピー）として分類することができる。臨床検査室で日常的に実施されるような血漿または細胞サンプルの直接配列決定では、半接合性とホモ接合性との区別は確実ではなく、幾つかの実施形態では、これらのクラスは、グループ化されている。例えば、野生型核酸が全く検出されないか、または最小限の量で検出される試料は、「半接合性／ホモ接合性変異体」と称される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「予後を決定すること」という語句は、患者の状態の経過または転帰が予測されるプロセスを指す。「予後」という用語は、状態の経過または転帰を１００％の確実性で予測する能力を指してはいない。そうではなく、この用語は、所与の状態／マーカーを示す患者において、ある種の経過または転帰が生じる可能性が、その状態を示さない個体と比較して増加するかまたは減少するかを同定することを指す。予後の性質は、評価されている特異的疾患および状態／マーカーに依存する。例えば、予後は、患者の生存を期待することができる時間の長さ、その疾患が寛解に至る可能性、その疾患が寛解したままであることが期待できる時間の長さとして表すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）遺伝子、およびヌクレオフォスミンタンパク質、ＮＰＭ１の遺伝子産物の略図である。「ＮＥＳ」、「ＮＬＳ」、および「ＮｏＬＳ」という用語は、それぞれヌクレオフォスミンタンパク質の核外輸送シグナル、核局在化シグナル、および核小体局在化シグナルを示す。「＊＊」は、ＮＰＭ１遺伝子およびヌクレオフォスミンタンパク質の変異部位を示す。
【図２Ａ】ＡＭＬ患者で同定されたエキソン１２における種々のＮＰＭ−１変異のヌクレオチド配列を示す図である。ＮＰＭ１変異配列は、野生型（「ＷＴ」）ＮＰＭ１配列に対して示されている。
【図２Ｂ】図２Ａで同定された変異から生じるヌクレオフォスミンタンパク質の核小体局在化シグナルの一部（配列番号２のアミノ酸２８６から始まる）を示す図である。
【図３】骨髄細胞、血漿、および末梢血細胞に存在するＮＰＭ１変異の検出結果を示す図である。パネルＡは、１人のＡＭＬ患者に由来する末梢血細胞（ＰＢ細胞；最上段）、骨髄細胞（ＢＭ細胞；中段）、および末梢血血漿（最下段）のＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を表す図である。ＷＴ  ＮＰＭ１（２１２ｂｐ）は各試料タイプに存在するが、４ｂｐ挿入（２１６ｂｐ）を含有するＮＰＭ１変異体は、骨髄および血漿のみで検出される。最も左側のピークは、２００ｂｐ標準物質を表す。パネルＢは、ＷＴ患者と比較した、ヘテロ接合性患者におけるＮＰＭ１の変異の配列分析を表す。挿入部位は黒線で囲まれており、その結果生じるＲＮＡにおけるフレームシフトの開始位置を示す（挿入地点から、左から右に向かって解読される）。
【図４】サイズ分析によるＮＰＭ１変異の結果を示す図である。分析は、ＡＭＬ患者の血漿について実施された。結果は、新規の４ｂｐ欠損変異体を明らかにする。ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析により、ＷＴ  ＮＰＭ１（２１２ｂｐ；最下段）、以前に記述されている４ｂｐ挿入変異（２１６ｂｐ；中段）、およびＮＰＭ１の新規の４ｂｐ欠損変異体（２０８ｂｐ；最上部）が区別される。最も左側のピークは、２００ｂｐ標準物質を表す。
【図５】ＡＭＬ患者におけるＮＰＭ１挿入変異の存在と臨床転帰の向上との相関性を示す図である。ＮＰＭ１変異は、治療に応答するのが遅いＡＭＬ患者に、有意な生存優位性を付与する。カプラン−マイヤープロットでは、週単位での患者の生存率が、治療に対する応答を示すのに３５日を超えてかかったＡＭＬ患者の集団の割合として示されている。このプロットでは、ＮＰＭ１変異陽性と変異陰性患者とが比較され、ＮＰＭ１変異を保持する患者の有意な生存優位性を示している（Ｐ＝０．０２７）（Ｅ、全事象、Ｎ、死亡数）。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、いくつかの血液悪性疾患の根底にあるＮＰＭ１遺伝子中の変異が、患者から取得される無細胞体液（例えば、血清または血漿）から単離される核酸を使用して確実に検出することができるという発見に基づく。特に、末梢血血漿が、ＡＭＬ患者のＮＰＭ１変異を検出するための信頼性の高い試料タイプであることを発見した。骨髄細胞および血漿を比較試験した際には、対試料に完全な一致があった。さらに、血漿分析は、末梢血細胞を使用したＮＰＭ１変異分析より高い感度を示した。
【００４６】
理論により束縛されることは全く望まないが、正常細胞と比べて腫瘍細胞の代謝回転速度がより高いことは、末梢血細胞と比べてＮＰＭ１変異検出血漿の感度がより増加されることの根底をなすと考えられている。この代謝回転のため、腫瘍細胞は、それらのＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を循環中に注ぎ込み、それらのすべては検査対象の基質となり得る。ＡＭＬおよびＭＤＳなどの血液悪性疾患では、腫瘍細胞の大部分は骨髄に存在する。しかしながら、一部の患者では、比較的少数の白血病細胞が末梢血中で循環するに過ぎず、したがって末梢血解析は、一部の患者のＮＰＭ１変異を検出するには信頼性が低いことが判明した。
【００４７】
血漿および／または血清検査は、骨髄腫瘍細胞に由来する核酸を含有しているため、有利である。さらに、血漿／血清検査は、取得測定値に対する残留正常細胞の寄与を最小限に抑え、したがって残留正常細胞で骨髄試料が「希釈」されることにより時々引き起こされる過小評価を回避するのに役立つ。これは、血漿中では、正常細胞のプログラム細胞死により生成される残屑は、細網内皮系により速やかに除去されるが、白血病細胞の代謝回転に起因する残骸の除去は、はるかに効率が悪いという事実によると考えられる。
【００４８】
本明細書に記載されているように、血漿は、細胞に基づく検査の８％が偽陰性結果をもたらす末梢血細胞より感度が高いことが判明した。末梢血細胞での偽陰性結果は、主に骨髄疾患が白血病細胞を循環させないためである可能性があるが、血漿は、骨髄で死滅していた可能性がある悪性細胞に由来する遺伝物質を含有し、したがって陽性結果をもたらした。加えて、血漿は、末梢血細胞と同じように収集が容易であり、有痛性で侵襲性の骨髄試料採取の必要性を回避する。
【００４９】
変異結果は、骨髄検査を実施した際に報告された結果に類似した臨床観察と相関しており、血漿を検査する臨床的価値をさらに確認した。中程度の細胞遺伝学的特性を有し、寛解を達成するのに３５日を超える治療が必要であるＮＰＭ１変異陽性患者において、より良好な生存率の有意な相関性があった。この観察は、寛解の徴候を示さずに３５日間の治療を生存するＡＭＬ患者は、ＮＰＭ１変異を内包する場合、高リスクとみなされるべきでないことを示す。
【００５０】
ヌクレオフォスミン遺伝子（ＮＰＭ１）
ヌクレオフォスミン遺伝子（ＮＰＭ１）のヘテロ接合性変異は、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）で最も頻度が高い遺伝子病変の１つであることが最近になって記述されている。ＮＰＭ１遺伝子は、ヒトの染色体５ｑ３５に位置している。ＮＰＭ１遺伝子は、１２個のエキソンを含有している。ＮＰＭ１遺伝子の略図は、図１に示されている。ＮＰＭ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの例示的な配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋの受入番号ＮＷ＿００１８３８９５４に見出すことができる。その配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５１】
ＮＰＭ１  ｍＲＮＡのいくつかの変異体は、当技術分野で公知である。既知配列の多くは、全長ｃＤＮＡ配列であり、いくつかは、部分的ｃＤＮＡ配列である。例示的なＮＰＭ１  ｃＤＮＡ配列には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００２５２０、ＮＭ＿１９９１８５、ＮＭ＿００１０３７７３８、ＢＣ００２３９８、ＢＣ０５０６２８、ＢＣ０２１９８３、ＢＣ０２１６６８、ＢＣ０１６８２４、ＢＣ０１６７６８、ＢＣ０１６７１６、ＢＣ０１４３４９、ＢＣ０１２５６６、ＢＣ００８４９５、ＤＱ３０３４６４、ＢＣ００９６２３、ＢＣ００３６７０、ＡＹ７４０６４０、ＡＹ７４０６３９、ＡＹ７４０６３８、ＡＹ７４０６３７、ＡＹ７４０６３６、ＡＹ７４０６３５、ＡＹ７４０６３４、Ｍ２８６９９。上記に示されているＮＰＭ１変異体の配列はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。ＮＰＭ１遺伝子の１つの例示的ｃＤＮＡ配列は、配列番号１に提供されている（図６）。
【００５２】
ＡＭＬで同定されている最も一般的なＮＰＭ１変異は、テトラヌクレオチド１個または２個の挿入、９ｂｐ挿入と組み合わされた４塩基対（ｂｐ）もしくは５ｂｐ欠失、または１４ｂｐ挿入と組み合わされた９ｂｐ欠失である。これら変異の大多数は、エキソン１２に位置しており、図２Ａに示されている。
【００５３】
ＮＰＭ１は、２つの選択的スプライスアイソフォームで存在する。Ｂ２３．１、優勢アイソフォームは、すべての組織に存在しており、２９４個のアミノ酸を含有している一方で、Ｂ２３．２、切断型タンパク質は、Ｂ２３．１の最後の３５個のＣ末端アミノ酸を欠失しており、非常に低レベルで発現される。ＮＰＭ１分子（図１に概略的に示されている）は、ＮＰＭ二量体および六量体の形成に必要なＮ末端ホモオリゴマー化ドメイン、ヌクレオリンおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ１４／選択的リーディングフレーム（ｐ１４ＡＲＦ、以降ＡＲＦと称する）などの他のタンパク質の標的化に関与するヘテロダイマー化ドメイン、およびリボソームＲＮＡプロセシングに関与するＲＮＡとの結合に不可欠なＣ末端核酸結合ドメインを含む別個の機能的ドメインを含有している。Ｂ２３．１  ＮＰＭ１アイソフォームのアミノ酸配列は、配列番号２に提供されている（図７）。
【００５４】
ほとんどのＮＰＭ１は核小体に存在するが、それは核と細胞質を行き来する。ＮＰＭ１がその核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）により核小体に転位置される場合は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）が、ＮＰＭ１を細胞質から核質まで駆動する。ＮｏＬＳの特に重要な残基は、配列番号２のトリプトファン２８８およびトリプトファン２９０残基である。ＮＰＭ１は、たとえそれが、ＮＰＭ１を核外へと駆動する配列番号２の残基９４〜１０２および４２〜４９内の高度に保存された疎水性のロイシンに富む核外輸送シグナル（ＮＥＳ）モチーフを含有していても、核小体にとどまる。
【００５５】
ＮＰＭ１変異体の最も独特な特徴の１つは、白血病細胞の細胞質中にそれらの異常が局在化していることである。これは、白血病変異体Ｃ末端の２つの変化：（ｉ）追加的なロイシンに富むＮＥＳモチーフの産生および（ｉｉ）ＮＰＭ１核小体局在化に重要である配列番号２のトリプトファン２８８および２９０位の一方または両方のトリプトファン残基の欠失と因果関係がある。両トリプトファンの変異は、高度に共通しているＮＥＳモチーフ、Ｌ−ｘｘｘ−Ｖ−ｘｘ−Ｖ−ｘ−Ｌと関連しており、トリプトファン２８８の維持は、２位のバリンが、ロイシン、フェニルアラニン、システイン、またはメチオニンと置換されている希少ＮＥＳ変異体と関連している（Ｆａｌｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ．２００６年；１０７巻：４５１４〜２３頁）。ＮＰＭ１変異体の大多数は、最後の５個のアミノ酸残基ＶＳＬＲＫを共有している。
【００５６】
ＡＭＬのＮＰＭ１変異体は、正常な細胞遺伝学的特性およびＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）と関連していることが多い。種々の研究によると、正常核型を有するＡＭＬ患者群内では、ＮＰＭ１変異を有する患者は、野生型のＮＰＭ１  ＡＭＬの患者の完全寛解率と類似しているかまたはそれより有意に高い完全寛解率を有していたことが示されている（Ｂｏｉｓｓｅｌら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：３６１８〜３６２０頁；Ｆａｌｉｎｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００５年；３５２巻：２５４〜２６６頁；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：２８５４〜２８６１頁；Ｄｏｈｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：３７４０〜６頁）。
【００５７】
ほとんどの研究では、無再発生存率および全生存率が好ましい転帰へと向かう統計学的傾向が示されている。他の分子的異常に関するさらなる分析により、ＮＰＭ１変異を有し、ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ３の遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）を随伴しない患者が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するＡＭＬ患者より好ましい予後さえ示し、より若い患者では５年でおよそ６０％の生存可能性と関連することが示されている（Ｄｏｈｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６巻：３７４０〜６）。
【００５８】
ＦＬＴ３遺伝子
ＦＬＴ３遺伝子は、ヒトでは染色体１３に位置している。ヒト染色体のＦＬＴ３遺伝子の例示的な配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿００７０６６に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＦＬＴ３遺伝子の例示的なｃＤＮＡ配列は、図８に示されている。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明は、無細胞体液中のＦＬＴ３遺伝子を、単独でまたはＮＰＭ１と同時に検出する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ＦＬＴ３遺伝子の１つまたは複数の変異を、単独でまたはＮＰＭ１遺伝子の１つまたは変異の検出と同時に検出する方法を提供する。
【００６０】
生体試料の収集および調製
本発明の方法および組成物は、個体から得られる生体試料を使用して、ＮＰＭ１核酸（例えば、ゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）中の変異を検出するために使用することができる。核酸は、当業者に周知である任意の方法により試料から単離することができる。必要に応じて、試料は、遠心分離などにより収集または濃縮することができる。試料の細胞は、無細胞体液を調製するために、酵素、熱、界面活性剤、超音波処理、またはそれらの組合せによる処理などの溶解にかけることができる。あるいは、ＮＰＭ１遺伝子中の変異は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２４８９６１号明細書に記述されている方法により、無細胞体液を使用して検出することができる。
【００６１】
血漿または血清調製方法
血漿および血清を調製する方法は、当技術分野で周知である。「新鮮」な血漿もしくは血清、または冷凍（保存）され、その後解凍された血漿もしくは血清のいずれかを使用することができる。冷凍（保存）血漿または血清は、解凍および使用されるまで最適には−２０〜−７０℃の保存条件で維持されるべきである。「新鮮」な血漿または血清は、使用するまで冷却または氷上で維持し、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または全核酸）抽出をできるだけ早く実施するべきである。例示的な方法が、下記に記述されている。
【００６２】
血液は、標準的方法により、血清の調製には抗凝血剤を含まない、または血漿の調製にはＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、もしくは類似の抗凝血剤を含んだ収集管、好ましくはシリコーン処理ガラスに採取してもよい。保管用に血漿または血清を調製する場合、好ましい方法は、必ずしも必要とされる訳ではないが、血漿または血清を、凍結する前に全血から最初に分画することである。これは、ポルフィリンおよびヘマチンなどのＰＣＲ阻害剤を放出することにより、増幅アッセイの感度を低減するかまたは増幅アッセイを妨害する場合もある凍結解凍細胞の溶解から放出される外来の細胞内ＲＮＡの負荷を低減する。「新鮮」な血漿または血清は、好ましくは重力の３００〜８００倍で穏やかに５〜１０分間遠心分離することを使用する遠心分離により全血から分画してもよく、または他の標準的方法により分画してもよい。アポトーシス小体を分画可能な高遠心分離速度は、回避されるべきである。ヘパリンは、ＲＴ−ＰＣＲを妨害する場合があるため、ヘパリン処理血液を使用するには、ヘパリナーゼで前処理し、その後、逆転写の前にカルシウムを除去することが必要である。Ｉｍａｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６巻：１８１〜１８４頁（１９９２年）。したがって、ＥＤＴＡは、ＰＣＲ増幅が計画されている血液標本用の好ましい抗凝血剤である。
【００６３】
核酸抽出および増幅
無細胞体液の核酸は、変異分析を容易にするために、任意に増幅することができる。
【００６４】
種々の抽出法が、ＤＮＡまたはＲＮＡを単離するのに好適である。好適な方法には、フェノールおよびクロロホルム抽出が含まれる。Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１６．５４頁（１９８９年）を参照されたい。多数の市販のキットも、これらに限定されないが、ＱＩＡａｍｐ（商標）ミニ血液キット、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製Ｇｅｎｆｉｎｄ（商標）、Ｒｏｃｈｅ社製Ｃｏｂａｓ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ社製ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ（登録商標）、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌｓ（登録商標）を使用するフェノール：クロロホルム抽出、およびＮｕｃｌｉＳｅｎｓ抽出キット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社製、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）を含め、好適なＤＮＡおよびＲＮＡを生じる。他の方法では、ｍＲＮＡは、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ｍＲＮＡ  ＨＳキットおよびＭａｇ  ＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ機器（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、インディアナポリス、イリノイ州）を使用して、患者の血液／骨髄試料から抽出することができる。
【００６５】
組織、細胞、血漿、または血清から抽出された核酸は、当技術分野で周知の核酸増幅技術を使用して増幅することができる。これら増幅方法の多くは、特異的な様式で特定の標的配列と相互作用またはハイブリダイズするようにオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを単に設計することにより、変異の存在を検出するために使用することもできる。限定ではなく一例として、これら技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応が含まれていてもよい。Ａｂｒａｖａｙａ．  Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３巻：６７５〜６８２頁（１９９５年）、ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｕｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．ら、ＡＩＤＳ  ７巻（ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｓ１１〜Ｓ１４頁、（１９９３年）、増幅可能なＲＮＡリポーター、Ｑ−ベータ複製、転写に基づく増幅、ブーメランＤＮＡ増幅（ｂｏｏｍｅｒａｎｇ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、鎖置換活性化、サイクリングプローブ技術（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、等温性の核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）を参照されたい。Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５巻  ２７３〜２８６頁、（１９９１年）、Ｉｎｖａｄｅｒ技術または他の配列複製アッセイまたはシグナル増幅アッセイを参照されたい。
【００６６】
血清および血漿ＲＮＡは、感度が高く、特異的で豊富であり、（ゲノム）ＤＮＡに基づく検査の代わりに使用することができる。ＲＮＡは、Ｂｏｏｍ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２８巻  ４９５〜５０３頁、（１９９０年）の方法または適応のように、シリカ粒子、ガラスビーズ、または珪藻を使用して血漿または血清から抽出することができる。Ｃｈｅｕｎｇ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．３２巻：２５９３〜２５９７、（１９９４年）により適応されたこの方法の応用が記述されている。
【００６７】
例えば、サイズ分画されたシリカ粒子を、５００ミリリットルの脱塩滅菌再蒸留水中に、６０グラムの二酸化ケイ素（ＳｉＯ２、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製、セントルイス、ミズーリ州）を懸濁することにより調製する。その後懸濁物を、室温で２４時間沈降させる。４３０ミリリットルの上清を、吸引により取り除き、粒子を、５００ミリリットルの容積と等しくなるように加えられた脱塩滅菌再蒸留水に再懸濁する。さらに５時間沈降させた後、４４０ミリリットルの上清を吸引により取り除き、６００マイクロリットルのＨＣｌ（３２％、重量／容積）を添加して、懸濁物をｐＨ２に調整する。懸濁物を等分して暗所に保管する。
【００６８】
溶解緩衝液は、１２０グラムのチオシアン酸グイニジン（ｇｕｉｎｉｄｉｎｅ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＧｕＳＣＮ、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、ブックス、スイス）を、１００ミリリットルの０．１Ｍトリス塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ６．４）、およびＮａＯＨでｐＨ８．０に調整された２２ミリリットルの０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、および２．６グラムのトリトンＸ−１００（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．社製、ダウナーズグローヴ、イリノイ州）に溶解することにより調製する。その後、この溶液をホモジナイズする。洗浄緩衝液は、１２０グラムのチオシアン酸グイニジン（ＧｕＳＣＮ）を１００ミリリットルの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．４）に溶解することにより調製する。
【００６９】
１００マイクロリットル〜２５０マイクロリットル（疾患が最小限の場合は、より大量に必要とされる）の血漿または血清を、上記のように調製した４０マイクロリットルのシリカ懸濁液、および上記のように調製した９００マイクロリットルの溶解緩衝液と、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製５４３２型ミキサーを使用して室温で１０分間にわたって混合する。その後、混合物を１２，０００×ｇで１分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄した。その後、シリカ−ＲＮＡペレットを、上記のように調製した４５０マイクロリットルの洗浄緩衝液で２回洗浄する。その後、ペレットを、１ミリリットルの７０％（容積／容積）エタノールで２回洗浄する。その後、ペレットを、１ミリリットルのアセトンで最終洗浄し、５６℃のヒートブロックで１０分間乾燥する。ペレットを、２０〜５０マイクロリットルのジエチルプロカルボネート（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理水に１０分間５６℃で再懸濁して、ＲＮＡを溶出する。あるいは、試料は、Ｂｏｏｍ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２９巻：１８０４〜１８１１頁、（１９９１年）により記述されているように、ＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ、０．５Ｕ／マイクロリットル、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を有し、プロテイナーゼＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）を有するか、または有していない１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ミリモルのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で構成されるＴＥ緩衝液により、１０分間５６℃で溶出することができる。その後、溶出した後で、試料を１２，０００×ｇで３分間遠心分離し、ＲＮＡ含有上清を回収する。
【００７０】
代替的な方法として、ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ，Ｎ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６２巻：１５６〜１５９頁、（１９８７年）に記述されているチオシアン酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出法、またはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５巻：５３２〜５３７頁、（１９９３年）に記述されているような改良法を使用して、血漿または血清から抽出することができ、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
また、腫瘍由来の細胞外ＤＮＡを含む循環細胞外ＤＮＡも、血漿および血清中に存在する。このＤＮＡは、上記で記述されているＲＮＡ抽出法の実施中に、様々な程度でさらに抽出されるため、さらなるＲＮＡ分析に移行する前に、ＲＮＡ抽出物をさらに精製して、微量ＤＮＡを除去することが望ましいまたは必要とされる場合がある（臨床の目的に応じて）。これは、例えば、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，Ａ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．４巻：Ｓ８３〜Ｓ９１頁、（１９９４年）により記述されているような方法により、ＤＮａｓｅを使用して達成することができる。
【００７２】
あるいは、ＲＮＡのスプライスジャンクションをまたぐプライマー、またはイントロンをまたぐプライマーなどを使用することにより、夾雑ＤＮＡではなくＲＮＡ産物の増幅に好ましい、さらなるＲＮＡ分析用プライマーを構築することができる。ＲＮＡを増幅するが夾雑ＤＮＡは増幅しない代替的な方法には、Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８巻：１９２１頁、（１９９１年）により記述されているような方法、およびアダプタープライマーとしてｄＵ含有オリゴヌクレオチドを使用するＢｕｃｈｍａｎ，Ｇ．Ｗ．ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．３巻：２８〜３１頁、（１９９３年）により記述されているような方法が含まれる。
【００７３】
ＲＮＡは、日常的な処理および分析の間、相対的に不安定であるため、ＤＮＡを分析することではなく、ＲＮＡを抽出することが望ましい場合がある。単離されたＲＮＡ配列は、逆転写を使用しＤＮＡとして再生することができ、逆転写は、これまでに発表されている手順に従って実施することができる。以下のものを含むが、それらに限定されない種々の逆転写酵素を使用することができる：ＭＭＬＶ  ＲＴ、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）などのＭＭＬＶ  ＲＴのＲＮａｓｅ  Ｈ変異体、ＡＭＶ  ＲＴ、およびサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する熱安定性逆転写酵素。例えば、血漿または血清から抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換するために使用することができる１つの方法は、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，Ａ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．４巻：Ｓ８３〜Ｓ９１頁、（１９９４年）により記述されているような、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ前増幅システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州；カタログ番号１８０８９−０１１）を適応したプロトコールであるが、それが唯一の方法ではない。
【００７４】
変異の検出
核酸（例えば、全核酸）は、任意の適切な方法を使用して、患者の生体試料から抽出および増幅することができる。その後、増幅産物を、例えばゲル精製により精製することができ、その結果生じた精製産物を配列決定することができる。核酸配列決定法は、当技術分野で公知であり、例示的な配列決定法には、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ３．１サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、フォスターシティ、カリフォルニア州）が含まれる。その後、配列決定データを、標的核酸（例えば、ＮＰＭ１またはＦＬＴ３核酸）中の１つまたは複数の変異の有無を分析することができる。配列決定データを分析して、試料中に存在する変異核酸に対する野生型の割合を決定することもできる。
【００７５】
増幅または変異検出の代替的方法は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）である。ＡＳＰＣＲでは、当技術分野で周知である、テンプレートとプライマーの３’末端塩基との間の適正または不適正が使用される。例えば、米国特許第５，６３９，６１１号明細書を参照されたい。
【００７６】
変異検出の別の方法は、核酸配列決定である。配列決定は、当分野で公知である任意の数の方法、キット、またはシステムを使用して実施することができる。１つの例は、染料ターミネーター化学およびＡＢＩ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用することである。配列決定は、また、単一ヌクレオチドプライマー伸長（「ＳＮａｐＳｈｏｔ」配列決定法）などの単一塩基決定法、または対立遺伝子もしくは変異特異的ＰＣＲを伴っていてもよい。
【００７７】
他の実施形態では、標的核酸変異は、検出可能な標識を任意に含むポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションにより評価することができる。プローブは、当技術分野で公知の方法により、検出可能に標識化することができる。有用な標識には、例えば、蛍光染料（例えば、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタミド（ｌａｎｔｈａｍｉｄｅ）リン光体、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＦＡＭ、ＪＯＥ、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ６１０（登録商標）、Ｑｕａｓａｒ６７０（登録商標）、放射性同位元素（例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、高電子密度の試薬（例えば、金）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、比色定量用標識（例えば、コロイド金）、磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、ビオチン、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、またはその抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質が含まれる。他の標識には、それぞれ、対応する受容体またはオリゴヌクレオチド相補体との複合体を形成可能なリガンドまたはオリゴヌクレオチドが含まれる。標識は、検出しようとする核酸に直接組み込まれていてもよく、または標識は、検出しようとする核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）または抗体に結合されていてもよい。
【００７８】
他の実施形態では、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコン、およびＳｃｏｒｐｉｏｎ（例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブ）である。これらタイプのプローブは、蛍光消光の原理に基づいており、供与蛍光体および消光部分が関与している。「蛍光体」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の波長（励起周波数）の光を吸収し、その後でより長い波長（発光周波数）の光を発光する分子を指す。「供与蛍光体」という用語は、本明細書で使用される場合、消光体部分に近接近していると、発光エネルギーを消光体に供与または転移させる蛍光体を意味する。消光体部分にエネルギーを供与した結果として、供与蛍光体それ自体は、近くに位置する消光体部分がなければ有すると思われる、特定の発光周波数の光をそれほど発光しなくなろう。
【００７９】
「消光体部分」という用語は、本明細書で使用される場合、供与蛍光体のすぐ近くで、供与体により生成された発光エネルギーを吸収し、エネルギーを熱として消散させるか、または供与体の発光波長より長い波長の光を発光するかのいずれかである分子を意味する。後者の場合、消光体は、受容蛍光体であるとみなされる。消光部分は、近接（つまり、衝突）消光により、またはフェルスターもしくは蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）により作用することができる。ＦＲＥＴによる消光は、一般的にＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブで使用され、近接消光は、分子ビーコンおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）タイプのプローブで使用される。好適な消光体は、特定の蛍光体の蛍光スペクトルに基づいて選択される。有用な消光体には、例えば、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）消光体  ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）、およびＡＴＴＯシリーズの消光体（ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、およびＡＴＴＯ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ  ＧｍｂＨ社製）が含まれる。
【００８０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ６巻：９８６〜９９４頁、１９９６年）では、Ｔａｑポリメラーゼの蛍光発光性５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して、ｃＤＮＡ試料中の標的配列の量を測定する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、通常は５’塩基にまたは５’塩基付近に供与蛍光体を含有し、典型的には３’塩基にまたは３’塩基付近に消光部分を含有するオリゴヌクレオチドである。消光体部分は、ＴＡＭＲＡなどの染料であってもよく、または４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）などの非蛍光性分子であってもよい。Ｔｙａｇｉら、１６巻  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４９〜５３頁（１９９８年）を参照されたい。照射されると、励起した蛍光性供与体は、蛍光を発するのではなくＦＲＥＴにより近くの消光部分にエネルギーを転移させる。したがって、プローブが完全である間は、供与体および消光体がすぐ近くにあることにより、供与体蛍光の発光が防止される。
【００８１】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＣＲ産物の内部領域にアニーリングするように設計される。ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合しているテンプレートを複製する際に、その５’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが切断される。これにより、消光体の活性が終了し（ＦＲＥＴではない）、供与蛍光体は蛍光を発光し始め、この発光は、各サイクルにおいてプローブ切断速度に比例して増加する。ＰＣＲ産物の蓄積は、リポーター染料の蛍光増加をモニターすることにより検出される（プライマーは標識化されていないことに留意されたい）。消光体が受容蛍光体である場合、ＰＣＲ産物の蓄積は、受容蛍光体の蛍光の減少をモニターすることにより検出することができる。
【００８２】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーを用いる場合、配列特異的プライマー結合およびＰＣＲ産物検出は、単一の分子を使用して達成される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、ハイブリダイズされていない状態ではステムーループ構造を維持する。蛍光体は、５’末端に結合されており、３’末端に結合されている部分により消光されるが、好適な実施形態では、この配置は切替えられていてもよい。ステムの３’部分は、プライマーの伸長産物に相補的な配列も含有する。この配列は、非増幅可能なモノマーを介して、特異的プライマーの５’末端に結合される。プライマー部分が伸長された後、特異的プローブ配列は、伸長された増幅産物内のその相補体に結合することができ、したがってヘアーピンループを解消する。これにより、蛍光の消光が妨げられ、シグナルが観察される。特異的標的は、逆方向プライマーおよびＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーのプライマー部分により増幅され、その結果として伸長産物がもたらされる。蛍光シグナルは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーのプローブエレメント（例えば、ＪＡＫ２プローブ）が伸長産物に結合する結果として、消光体と蛍光体とが分離されることにより生成される。
【００８３】
接合状態、および試料中の変異体核酸に対する野生型比率は、配列特異的で定量的な検出方法を含む、当技術分野で公知の方法で決定することができる。他の方法には、ＡＢＩ配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して生成された配列決定電気泳動図などの、標準的な配列決定電気泳動図の配列決定ピークの曲線下面積を決定することが含まれていてもよい。例えば、電気泳動図で、特定のヌクレオチドを示す位置に「Ｇ」などの単一のピークのみが存在することは、試料中の核酸が、その位置「Ｇ」において１つのヌクレオチドのみを含有していることを示す。その後試料は、１つの対立遺伝子のみが検出されているため、ホモ接合と分類することができる。電気泳動図の同じ位置に、２つのピーク、例えば「Ｇ」ピークおよび「Ｔ」ピークが存在することは、試料が、核酸の２つの種を含有していることを示し、１つの種は、問題のヌクレオチド位置に「Ｇ」を保持しており、他方は、問題のヌクレオチド位置に「Ｔ」を保持している。その後試料は、１つを超える対立遺伝子が検出されているため、ヘテロ接合と分類することができる。
【００８４】
２つのピークのサイズを決定することができ（例えば、各々の曲線下面積を決定することにより）、２つの異なる核酸種の比率を計算することができる。変異体核酸に対する野生型の比率を使用して、疾患進行をモニターすること、治療を決定すること、または診断を行うことができる。例えば、特定の変異を保持する癌細胞の数は、疾患または療法の経過中に変化する場合がある。基線比率がその疾患の初期に確立されている場合、野生型核酸に対する変異体核酸の比率がより高くなっていると後に決定されることは、その疾患がより悪化しつつあるか、または治療が効果的でないことを示している可能性があり、変異を保持する細胞の数が、患者の中で増加している可能性がある。野生型核酸に対する変異体の比率がより低いことは、治療が順調であるか、その疾患が進行していないことを示している可能性があり、変異を保持する細胞の数が、患者の中で減少している可能性がある。
【００８５】
ある種の実施形態では、ＮＰＭ１核酸は、挿入変異または欠失変異を含んでいる。これら変異は、患者から単離されたＮＰＭ１核酸の少なくとも一部のサイズを決定することにより、便利に同定することができる。様々なサイズのポリヌクレオチドの存在または量を検出する方法は、当技術分野で周知であり、それらはいずれも、本明細書に記述されている方法で使用することができる。使用されるサイズ分離／検出技術は、核酸の少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なっている限り、核酸の分離を可能にするはすである。分離は、変性条件下、または非変性条件下、または天然条件下で実施することができ、つまり分離は、一本鎖または二本鎖核酸で実施することができる。分離および検出は、１個のヌクレオチドまでの小さな長さの違いの検出を可能にすることが好ましい。サイクル反応中に得られる複数の反応等量中の核酸含有量のリアルタイムまたは同時決定を可能にするハイスループット形式で、分離および検出を行うことができることがさらに好ましい。増幅産物を分離および分析するための有用な方法は、これらに限定されないが、電気泳動法（例えば、アガロースゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ））、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および質量分析が含まれる。
【００８６】
１つの実施形態では、ＣＥは、少なくとも１０〜１，０００塩基対の範囲のポリヌクレオチドを単一塩基対の分解能で非常に良好に分離することがもたらされるため、好ましい分離手段である。ＣＥは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１７，７３１号明細書、第６，００１，２３０号明細書、および第５，９６３，４５６号明細書に開示されているように、当技術分野で周知の方法により実施することができる。ハイスループットＣＥ装置は市販されており、例えば、Ｓｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製（ステートカレッジ、ペンシルベニア州）のＨＴＳ９６１０型ハイスループット分析システムおよびＳＣＥ９６１０型全自動９６キャピラリー電気泳動法遺伝子分析システム、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ社製（フラートン、カリフォルニア州）のＰ／ＡＣＥ５０００シリーズおよびＣＥＱシリーズ、ならびにＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００型遺伝子分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、フォスターシティ、カリフォルニア州）である。これらデバイスのＣＥカラムの端部の付近で、増幅ＤＮＡ断片は、蛍光性標識のシグナルを測定する蛍光検出器を通過する。これら装置は、蛍光標識化ＰＣＲ産物検出用の自動ハイスループットを供給する。
【００８７】
本明細書に記述されている方法におけるＣＥの使用は、従来のスラブゲル電気泳動法と比較して、高い生産性を可能にする。毛細管ゲルを使用することにより、分離速度は従来のスラブゲルシステムより約１０倍に増加する。
【００８８】
ＣＥを用いると、同時に複数の試料を分析することもでき、それはハイスループットに不可欠である。これは、例えば、多毛細管システムを使用することにより達成される。いくつかの場合、ＤＮＡ塩基からの蛍光検出は、多孔性マトリックスおよび毛細管壁からの光散乱により困難になる場合がある。しかしながら、共焦点蛍光スキャナーを使用して、光散乱による問題を回避することができる（Ｑｕｅｓａｄａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９１年）、１０巻：６１６〜２５頁）。
【００８９】
いくつかの実施形態では、核酸は、アガロースゲル電気泳動を使用して、サイズにより分析および検出することができる。アガロースゲル電気泳動を実施する方法は、当技術分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）（１９８９年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州を参照されたい。
【００９０】
１つの実施形態では、検出は、標識プローブを用いたサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションによる。サザンブロッティングに関わる技術は、当業者に周知であり、分子プロトコールに関する多くの標準的な本に見出すことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）を参照されたい。手短に言えば、増幅産物を、ゲル電気泳動法により分離する。その後、ゲルをニトロセルロースなどの膜と接触させ、核酸の転写および非共有結合を可能にする。その後、膜を、標的増幅産物とハイブリダイズ可能な、発色団が結合されたプローブと共にインキュベートする。検出は、Ｘ線フィルムまたはイオン放射検出デバイスに膜を曝露させることによる。
【実施例１】
【００９１】
血漿由来核酸中のＮＰＭ１変異の検出
変異分析用の遺伝物質源としての血漿の実用性を評価するために、３１人の新しく診断されたＡＭＬの患者に由来する骨髄細胞、末梢血細胞、および末梢血血漿を、ＮＰＭ１変異について同時に分析し、結果を３種の試料タイプ間で比較した。
【００９２】
ゲノムＤＮＡを、ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺｌ血液ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して、患者の骨髄または全血試料から抽出した。全核酸を、ＥａｓｙＭａｇシステム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、ダーラム、ノースカロライナ州）でＮｕｃｌｉＳｅｎｓ抽出キットを使用して、血漿から抽出した。すべての試料タイプのＮＰＭ１遺伝子ＰＣＲ増幅を、ＮＰＭ１イントロン１１にハイブリダイズするＮＰＭ１順方向プライマー、およびＮＰＭ１エキソン１２にハイブリダイズする逆方向プライマーを使用して実施した。順方向および逆方向プライマーを、６−カルボキシフルオセイン（６−ＦＡＭ；Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製、サンディエゴ、カリフォルニア州）で標識する。ＮＰＭ１変異型または野生型対立遺伝子は、ＡＢＩ３１００型遺伝子分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して、ＰＣＲ産物のサイズを決定することにより検証した。順方向および逆方向プライマーの配列は下記に示されている。
順方向プライマー：５’−ｔｔａ  ａｃｔ  ｃｔｃ  ｔｇｇ  ｔｇｇ  ｔａｇ  ａａｔ  ｇａａ−３’（配列番号３）。
逆方向プライマー：５’−ｔｇｔ  ｔａｃ  ａｇａ  ａａｔ  ｇａａ  ａｔａ  ａｇａ  ｃｇｇ−３’（配列番号４）。
【００９３】
これら増幅プライマーを使用すると、野生型（ＷＴ）ＮＰＭ１核酸は、２１２ｂｐピークを示すが、ＮＰＭ１挿入変異体は、ＮＰＭ１  ＷＴピークに加えて追加的な２１６ｂｐピークを示した（例えば、図３Ａを参照）。図３Ｂは、野生型と比較して４つの塩基挿入／フレームシフト変異も、ヘテロ接合性患者で同定可能であり、変異がＣＴＣＴ挿入の結果であることを実証している。これらの結果は、先述の方法がロバストであり、骨髄細胞、末梢血細胞、および血漿を含む検査されたすべての供給源から単離された野生型と４ｂｐ挿入ＮＰＭ１変異体核酸とを区別できることを実証している。
【００９４】
３１人の患者に由来する血漿は、骨髄細胞では完全な一致を示したが、末梢血細胞では不一致が観察された。変異ＮＰＭ１核酸は、３１対の末梢血血漿および骨髄細胞試料のうち６対で検出された。しかしながら、末梢血細胞を評価した場合、変異ＮＰＭ−１核酸を含有する６つの試料の１つは（骨髄細胞および血漿中で評価されたように）、末梢血細胞分析を使用すると、野生型のＮＰＭ−１を含有すると誤って同定された。（図３Ａ）。この単一の患者では、末梢血細胞のＮＰＭ１核酸の変異評価は、不正確であることが判明したが、骨髄細胞および血漿試料を使用した評価は、挿入による変異を間違いなく示した。血漿に基づくＮＰＭ１変異検査の正確性をさらに支持するものとして、血漿をアッセイした場合、変異陽性末梢血または骨髄細胞試料は、偽陰性を示さなかった。これらデータにより、血漿核酸サンプル中のＮＰＭ１変異を検出するための血漿に基づくアッセイの使用が認証された。
【実施例２】
【００９５】
ＡＭＬおよびＭＤＳ患者のＮＰＭ１変異および新規変異の同定
ＮＰＭ１核酸分析は、テキサス大学ＭＤアンダーソン癌センターで治療されたＡＭＬ患者（９８試料）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の患者（２８試料）に由来する無作為収集した血漿および末梢血細胞の試料対で実施した。療法を開始する前に、試料はすべて、以前に治療を受けていない患者から収集した。ＭＤＳの患者はみな、分析用の試料を取得した時点でいかなる種類の治療も受けていなかった。試料はすべて、施設内治験審査委員会が承認したプロトコールを使用して収集し、患者はみなインフォームドコンセントを提供し、研究は、世界医師会（ヘルシンキ宣言）の倫理綱領を遵守した。臨床データは、カルテ審査により収集し、ＭＤアンダーソン癌センターの白血病データベースの一部だった。診断は、完全な形態学的分析、免疫表現型分析、細胞遺伝学的分析、および分子的分析に基づいており、分類は、フランス−アメリカ−英国（ＦＡＢ）分類によるものだった。ＭＤＳ患者はすべて、少なくとも２つの系統において異形成の証拠を必要とした。細胞遺伝学的特性の状態を、好ましい（ｔ（１５；１７）、ｔ（８、２１）、またはｉｎｖ１６））、好ましくない（−５、−７、または複合（≧３）異常）、または中程度（他のすべて）と分類した。一般状態（ＰＳ）を、Ｚｕｂｒｏｄ採点法で決定し、良好（０または１）または不良（２〜４）と分類した。応答者とは、ＣＲの国際ワーキンググループ基準に従って、完全応答（ＣＲ）を達成した患者である。
【００９６】
この研究に含まれていたＡＭＬおよびＭＤＳ患者の特徴は、表１に列挙されている。中央値年齢は、ＡＭＬ患者の場合は６２（範囲、１８〜８２）、ＭＤＳ患者の場合は６８（範囲、４３〜８１）だった。ほとんどのＡＭＬ患者は、中程度（３４％）または不良（５９％）な細胞遺伝学的状態のいずれかを示した。フランス−アメリカ−英国（ＦＡＢ）分類によると、ＭＤＳ患者の半分は、移行型の芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ−Ｔ）を有すると分類され、４６％は、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）を有していた。患者の３％のみが、急性前顆粒球白血病（ＡＰＬ）を有し、その一方で２４％は、単球様分化を伴う白血病を有していた（表１）。ＡＭＬおよびＭＤＳ患者の分類は、世界保健機構（ＷＨＯ）分類ではなく、ＦＡＢ分類に基づいていた。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
ＮＰＭ１核酸中の変異は、９８個のＡＭＬ血漿試料のうち２４個（２４％）で検出されたが、細胞サンプルのうち２２個のみ（２２％）が変異を明らかにした（表２）。したがって、末梢血細胞を分析した際に、陽性試料の８％が、偽陰性結果をもたらした。ＮＰＭ１変異が血漿ＤＮＡで検出されたが、末梢血細胞ＤＮＡでは検出されなかった２つのＡＭＬ症例は、循環芽球細胞を有していないと特徴付けした。しかしながら、芽球細胞を欠如するＡＭＬ末梢血でＮＰＭ１変異を検出できないことは、普遍的ではなかった。循環芽球細胞が報告されなかった他の症例では、末梢血細胞ＤＮＡでＮＰＭ１変異が検出された。
【００９９】
【表２】
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【０１００】
ＮＰＭ１変異の最も高い割合は、ＦＡＢ分類によりＭ２と分類されたＡＭＬ患者で検出された（Ｍ２の３８％）。症例数は少ないが、Ｍ４／Ｍ５群も、高い割合のＮＰＭ１変異を示した（表２）。ＡＭＬ患者に加えて、ＮＰＭ１変異について以前に治療を受けていない２８人のＭＤＳ患者に由来する血漿も、検査した。これら患者のうち１人の患者のみ（４％）が、ＮＰＭ１変異を内包すると見出した。ＮＰＭ１変異を有するこのＭＤＳ患者はＲＡＥＢを有していたが（表２）、比較的限定的な血球減少（４．５×１０９／ｍＬの白血球数）を示し、これは骨髄異形成疾患ではなく初期白血病の可能性を示唆する。患者はみな、ＦＡＢ分類に従って分類した。世界保健機構（ＷＨＯ）の分類を使用したならば、ＲＡＥＢ−ＴはすべてＡＭＬとして分類され、ＮＰＭ１変異の有病率は、２４％ではなく２１％になったことであろう。ＲＡＥＢ−Ｔを有する患者にＮＰＭ１変異が欠如していることは、これら症例が、急性白血病よりＭＤＳとより一致する特徴を有するという概念を裏付ける。
【０１０１】
ほとんどの患者では、ＮＰＭ１変異は、図３に示されているようなＣＴＣＴの４ｂｐ挿入を含んでいた。単一の患者では、新規の４塩基欠失が、ＮＰＭ１のエキソン１２で検出された（図４）。この患者は、急性前顆粒球白血病（ＡＰＬ）を有し、短縮形態のＲＡＲα−ＰＭＬ融合転写物を発現し、療法に応答した。
【実施例３】
【０１０２】
ＮＰＭ１変異の存在下または非存在下におけるＡＭＬ患者の臨床および病理学的特徴の比較
実施例２において特徴付けられた９８個のＡＭＬ患者試料を、それらの血液学的組成に基づいてさらに特徴付けた。ＮＰＭ１変異を有する患者は、変異をもたない患者と比較して、有意に高い白血球（ＷＢＣ）数を有することが見出された（表３）。これら患者は、より高い割合の芽球を末梢血および骨髄中に有してもいた。加えて、変異ＮＰＭ１を有する患者の芽球は、有意に低レベルのＨＬＡＤＲ、ＣＤ１３、ＣＤ３４、および有意に高いレベルのＣＤ３３を発現した（表３）。
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
ＮＰＭ１変異患者とＷＴ  ＮＰＭ１  ＡＭＬ患者との間には、それらの細胞遺伝学的異常およびＦＬＴ３遺伝子における変異の存在に関連する相異も存在した（表４）。一般的に、ＮＰＭ１変異を有する患者は、より良好な細胞遺伝学的プロファイルと関連しており、野生型ＮＰＭ１群の４１％に対し、１２％が不良な細胞遺伝学的特性を有していた。
【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
治療に対する応答は、変異を有していないＡＭＬ患者よりもＮＰＭ１変異を有するＡＭＬ患者においてわずかに高かったことがさらに観察されたが、違いは全く有意ではなかった（Ｐ＝０．０６）。これらデータは、ＮＰＭ１変異が、ＡＭＬの特徴であり、導入化学療法に対する患者の反応性を示すことを実証する以前のより大きな研究と一致している。例えば、Ｆａｌｉｎｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ（２００５年）３５２巻：２５４〜２６６頁を参照されたい。すべての患者を考慮した場合、ＮＰＭ１変異を有する患者と、変異を有しない患者との間で、生存率に有意差はなかった。しかしながら、中程度の細胞遺伝学的特性を有する患者のみを考慮した場合、ＮＰＭ１変異を有する患者は、変異を有していない患者より比較的長い無再発生存率を実証した（Ｐ＝０．０５６）。Ｐ値が低いのは、研究した患者が少数であったことによる可能性が考えられる。生存率の最も有意な相異は、治療に応答するのに３５日超を必要とした、中程度の細胞遺伝学的特性を有する変異陽性患者に見出された。これら患者では、生存率は、ＮＰＭ１変異をもたない患者よりも有意に長かった（図５）。
【０１０７】
本明細書で言及されている出版物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、あたかも各々が参照により個々に組み込まれているのと同じ程度に、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。矛盾が生じた場合は、定義を含む本明細書が優先される。
【０１０８】
本発明は、例示的および代替的な実施形態に関して記述されているが、当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、形態および詳細に変更を加え得ることを認識されよう。例えば、１つまたは複数の利点を有する１つまたは複数の特徴を含む異なる例示的および代替的な実施形態が記述されていてもよいが、記述されている特徴は、記述されている例示的実施形態または他の代替的な実施形態において互いに交換可能であるか、またはその代わりに互いに組み合わされてもよいことが企図される。本発明の技術は比較的複雑であるため、本技術における変更はすべてが予測可能であるとは限らない。例示的および代替的な実施形態に関して説明し、以下の特許請求の範囲に提示した本発明は、可能な限り幅広いことを明白に意図している。例えば、具体的にそうでないと指示されていない限り、単一の特定のエレメントを説明する請求項は、複数のそのような特定のエレメントも包含する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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