(57)【要約】  本発明は、  （ａ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む少なくとも１つの第１のリンカーと、（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの第１の基とが、そこに共有結合している第１の成分を準備すること；  （ｂ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることが可能な少なくとも１つの第２のリンカーと、（ｉｉ）第１の基と共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの第２の基とが、そこに共有結合している第２の成分を準備すること；  （ｃ）第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が成分とハイブリダイズして成分を連結させることが可能な条件下で、第１および第２の成分を接触させること；および  （ｄ）連結した成分を、第１および第２の基の間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること；を含む、２つ以上の成分を共有結合させる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む少なくとも１つの第１のリンカーと、（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの第１の基が共有結合する、第１の成分を準備することと；
ｂ）（ｉ）前記第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズ可能な第２のハイブリダイズ可能な領域を含む少なくとも１つの第２のリンカーと、（ｉｉ）前記第１の基と共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの第２の基が共有結合する、第２の成分を準備することと；
ｃ）前記第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が前記成分とハイブリダイズし、前記成分を連結することを可能にする条件下で、前記第１および第２の成分を接触させることと；
ｄ）前記連結した成分を、前記第１および第２の基の間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること；
を含む、２つ以上の成分を共有結合させる方法。
【請求項２】
ａ）前記少なくとも１つの第１の基が、前記第１の成分と直接的に共有結合しているか、または、別のリンカーを介して前記第１の成分と結合しており；かつ／または、
ｂ）前記少なくとも１つの第２の基が、第２の成分と直接的に共有結合しているか、または、別のリンカーを介して第２の成分と結合している、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの第１の基が、前記第１のリンカーを介して前記第１の成分と共有結合しており；かつ／または、前記少なくとも１つの第２の基が、前記第２のリンカーを介して前記第２の成分と共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の成分は、２、３または４つの第１のリンカーが、そこに共有結合し、かつ、前記第２の成分は、対応する数の第２のリンカーが、そこに結合し、前記リンカーは、第１および第２のリンカーの１つ以上の対を形成し、各対におけるハイブリダイズ可能な領域は、互いに特異的にハイブリダイズするが、その他の対におけるハイブリダイズ可能な領域のいずれともハイブリダイズしない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む第１のリンカー、（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な第１の基、（ｉｉｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域を含む第３のリンカー、および（ｉｖ）共有結合を形成することが可能な第３の基が共有結合する、第１の成分を準備することと；
（ｂ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズ可能な第２のハイブリダイズ可能な領域を含む第２のリンカー、（ｉｉ）第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基、（ｉｉｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズ可能な第４のハイブリダイズ可能な領域を含む第４のリンカー、および（ｉｖ）第３の基と共有結合を形成することが可能な第４の基が共有結合する、第２の成分を準備することと；
（ｃ）前記第１および第２のハイブリダイズ可能な領域がハイブリダイズし、かつ、前記第３および第４のハイブリダイズ可能な領域がハイブリダイズして、前記成分を連結することが可能な条件下で、前記第１および第２の成分を接触させることと;
（ｄ）前記連結した成分を、前記第１および第２の基と前記第３および第４の基との間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること；
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の成分は、（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む第１のリンカー、（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な第１の基、（ｉｉｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域を含む第３のリンカー、および（ｉｖ）共有結合を形成することが可能な第３の基が共有結合し、かつ、前記第２の成分は、（ｉ）前記第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域と、前記第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第４のハイブリダイズ可能な領域とを含む、第２のリンカー、（ｉｉ）前記第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基、および（ｉｉｉ）前記第３の基と共有結合を形成することが可能な第４の基が共有結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
各成分が、（ｉ）異なる成分におけるリンカーのハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができるハイブリダイズ可能な領域を含む少なくとも１つのリンカー、および（ｉｉ）異なる成分における基と共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの共有結合基が共有結合する、３、４または５つの成分を結合させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ａ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む第１のリンカー、および（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な第１の基が共有結合する、第１の成分を準備することと；
ｂ）（ｉ）前記第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域を含む第２のリンカー、（ｉｉ）前記第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基、（ｉｉｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域を含む第３のリンカー、および（ｉｖ）共有結合を形成することが可能な第３の基が共有結合する、第２の成分を準備することと；
ｃ）（ｉ）前記第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第４のハイブリダイズ可能な領域を含む第４のリンカー、および（ｉｉ）前記第３の基と共有結合を形成することが可能な第４の基が共有結合する、第３の成分を準備することと；
ｄ）前記第１、第２および第３の成分を、前記ハイブリダイズ可能な領域が前記成分とハイブリダイズし、連結させることが可能な条件下で、接触させることと；
ｅ）前記連結した成分を、前記基の間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること；
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記基が、前記１つ以上のハイブリダイズ可能な領域を含むリンカーを介して、それぞれの各成分と共有結合する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基のいずれも、それら自体とは反応しない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の成分および／または前記第２の成分が、ポリペプチド、タンパク質、核酸、化学基、色素、アフィニティータグ、ポリマー、ビーズ、抗体、支持体、固定化金属アフィニティーマトリックス、グルタチオンセファロース、デキストリンセファロース、アフィニティーマトリックス、ＩｇＧセファロース、活性化チオール−セファロース、金属フィルム、ナノ粒子、ガラス、処理ガラス、プラスチック、樹脂表面、固体ナノ細孔、センサー表面および単一分子検出器である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の成分が、タンパク質であり、前記第２の成分が、タンパク質、核酸、レポーター基、アフィニティータグまたは支持体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の成分が、核酸結合タンパク質であり、前記第２の成分が、膜貫通タンパク質細孔である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸結合タンパク質が、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヘリカーゼまたはトポイソメラーゼから得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記エキソヌクレアーゼが、配列番号６またはその変異体のいずれかに示される配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記エキソヌクレアーゼが、配列番号６、５２、５４および５６、または、その変異体のいずれかに示される配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記膜貫通タンパク質細孔が、α−ヘモリジン（α−ＨＬ）である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細孔が、配列番号２または４またはその変異体のいずれかに示される配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１および第２の基が、それぞれの成分から０．０５ｎｍ〜１０ｎｍの距離にある、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合した第１の成分と第２の成分との間の距離が、０．１ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が、核酸を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸が、６〜１５ヌクレオチド長である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が、１ｐＭ〜１ｍＭの濃度で、０．１ｆＭ〜０．１μＭの親和性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のハイブリダイズ可能な領域が、配列番号５７の５’末端から初めの１５、２５または３５ヌクレオチドに相当する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が、それぞれ、以下の配列：
（ａ）配列番号５８および６１に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５９および６２に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号６０および６３に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号６４および６５に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号６６および６８に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号６７および６９に示されるヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号７０および７３に示されるヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号７１および７４に示されるヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号７２および７５に示されるヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号７６および７７に示されるヌクレオチド配列；または、
（ｋ）配列番号７８および６７に示されるヌクレオチド配列；
を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１および第２の基が、クリック化学により共有結合を形成する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の基が、アジド基であり、前記第２の基が、アルキン基である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１および第２の基が、ジスルフィド結合、ヨードアセトアミド結合、またはメタセシス反応を介した結合を形成する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法を用いて結合した第１および第２の成分。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１および第２のリンカーを用いて、第２の成分と結合した第１の成分。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の第１および第２のリンカーの対。
【請求項３２】
第１の成分を第２の成分と結合させるための、請求項３１に記載の一対のリンカーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つ以上の成分を共有結合させる方法に関する。本発明は、それぞれがハイブリダイズ可能な領域を含む２つ以上のリンカーの使用と、共有結合を形成することが可能な２つ以上の基の使用を含む。リンカーにおけるハイブリダイズ可能な領域は、成分とハイブリダイズし、成分を連結する。連結した成分は、次に、基間の共有結合の形成を介して結合する。
【背景技術】
【０００２】
２つ以上の成分の共有結合は、化学および生化学において多くの用途を有する。化学的結合方法を用いる場合、成分同士の反応速度は、反応するために利用可能な成分の濃度に依存する。成分の濃度が低い場合には、結果として、反応速度は、成分濃度に律速され得る。多くの用途について、成分の濃度は低くてもよく、したがって、速度または反応を促進する方法（あるいは、必要とされる成分の濃度を下げる方法）を作り出すことが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
自己集合して、より大きく、より複雑な構造を形成するように、特定の分子、または分子の集団を作ることができることは、よく知られており、これらの例としては、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、液晶、ポリマーなどが挙げられる。これらの種の分子成分は、低濃度で非常に高い親和性を有し、自己集合する場合が多い。自己集合系にとっての欠点は、それらが、非共有結合的相互作用によって凝集するので、安定性が制限されることが多い点である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は、驚くべきことに、高親和性の自己集合系を利用して、低濃度で、２つ以上の成分を共有結合させ得ることを実証した。より具体的には、本発明者等は、驚くべきことに、互いに共有結合反応し得る化学基を用いてそれらが結合する前に、２つ以上の高親和性ハイブリダイゼーションリンカーを用いて、２つ以上の成分を結合させ得ることを実証した。得られる複合体は、単なる高親和性ハイブリダイゼーションリンカーを用いて形成された同等の非共有結合性複合体よりも安定性がずっと高い。
【０００５】
したがって、本発明は、以下の工程を含む、２つ以上の成分を共有結合させる方法を提供する：
（ａ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む少なくとも１つの第１のリンカーと、（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの第１の基とが共有結合している第１の成分を準備すること；
（ｂ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることが可能な少なくとも１つの第２のリンカーと、（ｉｉ）第１の基と共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの第２の基とが共有結合している第２の成分を準備すること；
（ｃ）第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が成分とハイブリダイズして成分を連結させることが可能な条件下で、第１および第２の成分を接触させること；および
（ｄ）連結した成分を、第１および第２の基の間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること。
【０００６】
本発明はまた、以下を提供する：
‐本発明の方法を用いて結合させた第１および第２の成分；
‐本発明の第１および第２のリンカーを用いて第２の成分に結合させた第１の成分；
‐本発明の第１および第２のリンカーの対；および
‐第１の成分を第２の成分に結合させるための、本発明のリンカーの対の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、天然のシステインの位置および残基の数を示すＥｃｏＥｘｏＩの構造の略図を示す（結晶構造から取得）。
【図２】図２は、接近可能なシステインの位置を示すＥｃｏＥｘｏＩの表面図を示す（結晶構造から取得）。
【図３】図３は、野生型と比較した場合のＥｘｏＩ変異体の相対活性を示す。
【図４】図４は、タンパク質ナノ細孔と結合させるために単一のシステインを導入し得る位置を示すＥｃｏＥｘｏＩの図式を示す。
【図５ａ】図５ａは、野生型と比較した場合のＥｘｏＩ変異体の相対活性を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、野生型と比較した場合のＥｘｏＩ変異体の相対活性を示す。
【図６】図６は、エキソヌクレアーゼＩアッセイの概略図を示す。
【図７】図７は、エキソヌクレアーゼＩアッセイからのデータの例を示す。
【図８】図８は、リンカーのＥｘｏ−ＡＴＴＴＴ−Ａ８３Ｃへの結合が、酵素活性に影響しないことを示す。Ｙ軸は相対活性である。左側のカラムのペアは、ＯＮＬＰ１４０３であり、右側のカラムのペアは、ＯＮＬＰ１４０５である。各ペアにおいて、左側の（暗色の）カラムは、リンカーを有する酵素であり、右側の（明色の）カラムは、リンカーを有しない酵素である。
【図９】図９は、ＰＮＡのＥｘｏ−ＡＴＴＴＴ−Ａ８３Ｃへの結合が、酵素活性に影響しないことを示す。Ｙ軸は相対活性である。左側のカラムは、ＯＮＬＰ１４９８であり、右側のカラムは、ＯＮＬＰ１４９９である。
【図１０】図１０は、ＰＥＧのＥｘｏ−ＡＴＴＴＴまたはＥｘｏ−ＡＴＴＴＴ−Ｍ１８４Ｃへの結合が、酵素活性に影響しないことを示す。Ｙ軸は相対活性である。左側のカラムのペアは、Ｅｘｏ−ＡＴＴＴＴであり、右側のカラムのペアは、Ｅｘｏ−ＡＴＴＴＴ−Ｍ１８４Ｃである。各ペアにおいて、左側の（暗色の）カラムは、リンカーを有する酵素であり、右側の（明色の）カラムは、リンカーを有しない酵素である。
【図１１】図１１は、実施例において使用された銅（Ｉ）結合リガンドを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
配列表の説明
配列番号１は、野生型α−ヘモリジン（α−ＨＬ）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【０００９】
配列番号２は、野生型α−ＨＬの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。アミノ酸２〜６、７３〜７５、２０７〜２０９、２１４〜２１６、および２１９〜２２２は、α−ヘリックスを形成する。アミノ酸２２〜３０、３５〜４４、５２〜６２、６７〜７１、７６〜９１、９８〜１０３、１１２〜１２３、１３７〜１４８、１５４〜１５９、１６５〜１７２、２２９〜２３５、２４３〜２６１、２６６〜２７１、２８５〜２８６、および２９１〜２９３は、β−鎖を形成する。全てのその他の非末端アミノ酸、すなわち、７〜２１、３１〜３４、４５〜５１、６３〜６６、７２、９２〜９７、１０４〜１１１、１２４〜１３６、１４９〜１５３、１６０〜１６４、１７３〜２０６、２１０〜２１３、２１７、２１８、２２３〜２２８、２３６〜２４２、２６２〜２６５、２７２〜２７４、および２８７〜２９０は、ループ領域を形成する。アミノ酸１および２９４は、末端アミノ酸である。
【００１０】
配列番号３は、α−ＨＬ  Ｌ１３５Ｃ／Ｎ１３９Ｑ（ＨＬ−ＣＱ）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１１】
配列番号４は、α−ＨＬ  Ｌ１３５Ｃ／Ｎ１３９Ｑ（ＨＬ−ＣＱ）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。野生型α−ＨＬにおいて、α−ヘリックス、β−鎖およびループ領域を形成する同じアミノ酸が、このサブユニットにおいて対応する領域を形成する。
【００１２】
配列番号５は、大腸菌由来のｓｂｃＢ遺伝子から得られた、コドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。それは、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）をコードする。
【００１３】
配列番号６は、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、５’〜３’の方向で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）から５’一リン酸ヌクレオシドの前進性消化（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行う。アミノ酸６０〜６８、７０〜７８、８０〜９３、１０７〜１１９、１２４〜１２８、１３７〜１４８、１６５〜１７２、１８２〜２１１、２１３〜２２１、２３４〜２４１、２６８〜２８６、３１３〜３２４、３２６〜３５２、３６２〜３７０、３７３〜３９１、４０１〜４５４、および４５７〜４７５は、α−ヘリックスを形成する。アミノ酸１０〜１８、２８〜２６、４７〜５０、９７〜１０１、１３３〜１３６、２２９〜２３２、２４３〜２５１、２５８〜２６３、２９８〜３０２、および３０８〜３１１は、β−鎖を形成する。全てのその他の非末端アミノ酸１９〜２７、３７〜４６、５１〜５９、６９、７９、９４〜９６１０２〜１０６、１２０〜１２３、１２９〜１３２、１４９〜１６４、１７３〜１８１、２１２、２２２〜２２８、２３３、２４２、２５２〜２５７、２６４〜２６７、２８７〜２９７、３０３〜３０７、３１２、３２５、３５３〜３６１、３７１、３７２、３９２〜４００、４５５、および４５６は、ループを形成する。アミノ酸１〜９は、末端アミノ酸である。本酵素の全体的な折り畳みは、３つの領域が組み合わさってＣの文字の外観を有する分子を形成するような状態であるが、残基３５５〜３５８は結晶構造において不規則であり、このＣが事実上Ｏのような形状に変化する。アミノ末端（１〜２０６）は、エキソヌクレアーゼドメインを形成し、ＤｎａＱスーパーファミリーに対するホモロジーを有し、それに続く残基（２０２〜３５４）はＳＨ３−様ドメインを形成し、カルボキシルドメイン（３５９〜４７５）は、エキソヌクレアーゼドメインを延長して、分子のＣ文字様の形状を形成する。ＥｃｏＥｘｏＩにおける４つの酸性残基は、ＤｎａＱスーパーファミリーの活性部位の残基（Ｄ１５、Ｅ１７、Ｄ１０８およびＤ１８６に相当する）と共に保存されている。単金属イオンが残基Ｄ１５および１０８に結合することが示唆される。ＤＮＡの加水分解は、切断を受けやすいリン酸が活性化された水分子により攻撃されることにより、触媒されるようであり、Ｈ１８１が触媒残基となり、かつ、ヌクレオチド基質を整列させるようである。
【００１４】
配列番号７は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ５１Ａ（ＯＮＬＤ０３９３）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
配列番号８は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ５１Ａ（ＯＮＬＤ０３９３）を示す。
【００１６】
配列番号９は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ１４４Ｍ（ＯＮＬＤ０４０３）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００１７】
配列番号１０は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ１４４Ｍ（ＯＮＬＤ０４０３）を示す。
【００１８】
配列番号１１は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ１４４Ｔ（ＯＮＬＤ０４０４）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００１９】
配列番号１２は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ１４４Ｔ（ＯＮＬＤ０４０４）を示す。
【００２０】
配列番号１３は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｍ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｖ４２Ｃ（ＯＮＬＤ０４１５）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００２１】
配列番号１４は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｍ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｖ４２Ｃ（ＯＮＬＤ０４１５）を示す。
【００２２】
配列番号１５は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｖ４２Ｃ（ＯＮＬＤ０４１６）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００２３】
配列番号１６は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｖ４２Ｃ（ＯＮＬＤ０４１６）を示す。
【００２４】
配列番号１７は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｍ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｍ１８４Ｃ（ＯＮＬＤ０４１７）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００２５】
配列番号１８は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｍ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｍ１８４Ｃ（ＯＮＬＤ０４１７）を示す。
【００２６】
配列番号１９は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｍ１８４Ｃ（ＯＮＬＤ０４１８）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００２７】
配列番号２０は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｍ１８４Ｃ（ＯＮＬＤ０４１８）を示す。
【００２８】
配列番号２１は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４１１）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００２９】
配列番号２２は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４１１）を示す。
【００３０】
配列番号２３は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４３２）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００３１】
配列番号２４は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４３２）を示す。
【００３２】
配列番号２５は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｔ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４３３）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００３３】
配列番号２６は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｔ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４３３）を示す。
【００３４】
配列番号２７は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｍ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５１）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００３５】
配列番号２８は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｍ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５１）を示す。
【００３６】
配列番号２９は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｍ／Ｃ３０６Ｔ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５２）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００３７】
配列番号３０は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｍ／Ｃ３０６Ｔ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５２）を示す。
【００３８】
配列番号３１は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｇ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５３）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００３９】
配列番号３２は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｇ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５３）を示す。
【００４０】
配列番号３３は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｄ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４９１）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００４１】
配列番号３４は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｄ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４９１）を示す。
【００４２】
配列番号３５は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｋ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５４）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００４３】
配列番号３６は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｋ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５４）を示す。
【００４４】
配列番号３７は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｌ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５５）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００４５】
配列番号３８は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｌ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５５）を示す。
【００４６】
配列番号３９は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｖ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５６）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００４７】
配列番号４０は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｖ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４５６）を示す。
【００４８】
配列番号４１は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｖ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｔ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４７６）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００４９】
配列番号４２は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｖ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｔ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４７６）を示す。
配列番号４３は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｍ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４７７）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００５０】
配列番号４４は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｍ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４７７）を示す。
【００５１】
配列番号４５は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｎ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４７８）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００５２】
配列番号４６は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｎ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４７８）を示す。
【００５３】
配列番号４７は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｄ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４７９）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００５４】
配列番号４８は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ｄ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４７９）を示す。
【００５５】
配列番号４９は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ａ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４８０）をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。
【００５６】
配列番号５０は、ＥｃｏＥｘｏ  Ｉのアミノ酸配列Ｃ５１Ａ／Ｃ９８Ｔ／Ｃ１４４Ｔ／Ｃ３０６Ａ／Ｃ３３０Ｔ（ＯＮＬＤ０４８０）を示す。
【００５７】
配列番号７〜５０に記載される変異体の全てにおいて、野生型ＥｃｏＥｘｏ  Ｉで、α−ヘリックス、β−鎖およびループ領域を形成する同じアミノ酸が、この変異体で、対応する領域を形成する。
【００５８】
配列番号５１は、大腸菌由来のｘｔｈＡ遺伝子から得られた、コドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示す。それは、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードする。
【００５９】
配列番号５２は、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、３’〜５’の方向で、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から５’一リン酸ヌクレオシドの分配性消化（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行う。ＤＮＡ鎖における酵素作用の開始には、５’における約４ヌクレオチドの突出部を必要とする。アミノ酸１１〜１３、１５〜２５、３９〜４１、４４〜４９、８５〜８９、１２１〜１３９、１５８〜１６０、１６５〜１７４、１８１〜１９４、１９８〜２０２、２１９〜２２２、２３５〜２４０、および２４８〜２５２は、α−ヘリックスを形成する。アミノ酸２〜７、２９〜３３、５３〜５７、６５〜７０、７５〜７８、９１〜９８、１０１〜１０９、１４６〜１５１、１９５〜１９７、２２９〜２３４、および２４１〜２４６は、β−鎖を形成する。全てのその他の非末端アミノ酸８〜１０、２６〜２８、３４〜３８、４２、４３、５０〜５２、５８〜６４、７１〜７４、７９〜８４、９０、９９、１００、１１０〜１２０、１４０〜１４５、１５２〜１５７、１６１〜１６４、１７５〜１８０、２０３〜２１８、２２３〜２２８、２４７、および２５３〜２６１は、ループを形成する。アミノ酸１、２６７、および２６８は、末端アミノ酸である。酵素活性部位は、β１-α１、β３-β４、β５-β６、βＩＩＩ-αＩ、βＩＶ-αＩＩおよびβＶ-βＶＩ（それぞれ、アミノ酸８-１０、５８-６４、９０、１１０-１２０、１５２-１６４、１７５-１８０、２２３-２２８、および２５３-２６１から構成される）を連結するループ領域によって形成される。単一の二価金属イオンが、残基Ｅ３４にて結合しており、Ｄ２２９およびＨ２５９のヒスチジン−アスパラギン酸塩触媒対によるホスホジエステル結合における求核攻撃に対して役立つ。
【００６０】
配列番号５３は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のｒｅｃＪ遺伝子から得られた、コドンが最適化されたポリヌクレオチド配列を示す。それは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードする。
【００６１】
配列番号５４は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、５’〜３’の方向で、ｓｓＤＮＡから５’一リン酸ヌクレオシドの前進性消化を行う。アミノ酸１９〜３３、４４〜６１、８０〜８９、１０３〜１１１、１３６〜１４０、１４８〜１６３、１６９〜１８３、１８９〜２０２、２０７〜２１７、２２３〜２４０、２４２〜２５２、２５４〜２８７、３０２〜３１８、３３８〜３５０、および３６５〜３８２は、α−ヘリックスを形成する。アミノ酸３６〜４０、６４〜６８、９３〜９６、１１６〜１２０、１３３〜１３５、２９４〜２９７、３２１〜３２５、３２８〜３３２、３５２〜３５５、および３５９〜３６３は、β−鎖を形成する。全てのその他の非末端アミノ酸３４、３５、４１〜４３、６２、６３、６９〜７９、９０〜９２、９７〜１０２、１１２〜１１５、１２１〜１３２、１４１〜１４７、１６４〜１６８、１８４〜１８８、２０３〜２０６、２１８〜２２２、２４１、２５３、２８８〜２９３、２９８〜３０１、３１９、３２０、３２６、３２７、３３３〜３３７、３５１〜３５８および３６４は、ループを形成する。アミノ酸１〜１８および３８３〜４２５は、末端アミノ酸である。結晶構造は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪのコアドメイン（残基４０〜４６３）についてのみ解析されている。ＲｅｃＪのコアドメインにおける翻訳開始およびインビボ発現を確実にするために、メチオニン残基がそのアミノ末端に付加された。このものは、結晶構造情報を欠いている。解析された構造は、長いα−ヘリックス（２５４〜２８７）で連結された２つのドメインであるアミノ（２〜２５３）およびカルボキシル（２８８〜４６３）領域を示す。触媒残基（Ｄ４６、Ｄ９８、Ｈ１２２、およびＤ１８３）は、ホスホジエステル結合における求核攻撃のために、単一の二価金属イオンを配位する。Ｄ４６およびＨ１２０は、触媒対であることが提案されているが、大腸菌ＲｅｃＪにおいてこれらの保存されている残基を何らか変異させることは、活性を失うことが示された。
【００６２】
配列番号５５は、バクテリオファージ・ラムダエキソ（ｒｅｄＸ）遺伝子から得られた、コドンが最適化されたポリヌクレオチド配列を示す。それは、バクテリオファージ・ラムダエキソヌクレアーゼをコードする。
【００６３】
配列番号５６は、バクテリオファージ・ラムダエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。この配列は、集合して３量体を形成する３つの同じサブユニットの１つである。この酵素は、３’〜５’の方向で、ｄｓＤＮＡの一本の鎖から非常に前進性のヌクレオチド消化を行う。鎖における酵素作用の開始には、好ましくは、５’リン酸を有する約４ヌクレオチドの突出部を５’に必要とする。アミノ酸３〜１０、１４〜１６、２２〜２６、３４〜４０、５２〜６７、７５〜９５、１３５〜１４９、１５２〜１６５および１９３〜２１６は、α−ヘリックスを形成する。アミノ酸１００〜１０１、１０６〜１０７、１１４〜１１６、１２０〜１２２、１２７〜１３１、１６９〜１７５および１８４〜１９０は、β−鎖を形成する。全てのその他の非末端アミノ酸１１〜１３、１７〜２１、２７〜３３、４１〜５１、６８〜７４、９６〜９９、１０２〜１０５、１０８〜１１３、１１７〜１１９、１２３〜１２６、１３２〜１３４、１５０〜１５１、１６６〜１６８、１７６〜１８３、１９１〜１９２、２１７〜２２２は、ループを形成する。アミノ酸１、２および２２６は、末端アミノ酸である。ラムダエキソヌクレアーゼＩは、ｄｓＤＮＡが一方の末端で入り、ｓｓＤＮＡのみ他方の末端で出るために中程度に、明らかに十分な大きさである、先細のチャンネルを有するトロイド構造を形成するホモ三量体である。触媒残基は決定されていないが、単一の二価金属イオンが、残基Ｄ１１９、Ｅ１２９およびＬ１３０によって各サブユニットに結合していると思われる。
【００６４】
配列番号５７は、好ましい核酸リンカーを作製し得る核酸配列を示す。
【００６５】
配列番号５８は、好ましい核酸リンカーを示す。ＭＡＬはマレイミドである。このリンカーは、配列番号６１と一緒に使用される。
【００６６】
配列番号５９は、好ましい核酸リンカーを示す。ＭＡＬはマレイミドである。このリンカーは、配列番号６２と一緒に使用される。
【００６７】
配列番号６０は、好ましい核酸リンカーを示す。ＭＡＬはマレイミドである。このリンカーは、配列番号６３と一緒に使用される。
【００６８】
配列番号６１は、好ましい核酸リンカーを示す。ＭＡＬはマレイミドである。このリンカーは、配列番号５８と、相補的であり、一緒に使用される。
【００６９】
配列番号６２は、好ましい核酸リンカーを示す。ＭＡＬはマレイミドである。このリンカーは、配列番号５９と、相補的であり、一緒に使用される。
【００７０】
配列番号６３は、好ましい核酸リンカーを示す。ＭＡＬはマレイミドである。このリンカーは、配列番号６０と、相補的であり、一緒に使用される。
【００７１】
配列番号６４は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号６５と一緒に使用される。
【００７２】
配列番号６５は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号６４と一緒に使用される。
【００７３】
配列番号６６は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号６８と一緒に使用される。
【００７４】
配列番号６７は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号６９と一緒に使用される。
【００７５】
配列番号６８は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号６６と、相補的であり、一緒に使用される。
【００７６】
配列番号６９は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号６７と、相補的であり、一緒に使用される。
【００７７】
配列番号７０は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号７３と、相補的であり、一緒に使用される。
【００７８】
配列番号７１は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号７４と、相補的であり、一緒に使用される。
【００７９】
配列番号７２は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号７５と一緒に使用される。
【００８０】
配列番号７３は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号７０と一緒に使用される。
【００８１】
配列番号７４は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号７１と一緒に使用される。
【００８２】
配列番号７５は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号７２と、相補的であり、一緒に使用される。
【００８３】
配列番号７６は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号７７と一緒に使用される。
【００８４】
配列番号７７は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号７６と一緒に使用される。
【００８５】
配列番号７８は、好ましい核酸リンカーを示す。このリンカーは、配列番号６７と、相補的であり、一緒に使用される。
【００８６】
発明の詳細な説明
開示された生成物および方法の異なる応用が、当技術分野における特定のニーズに応じて提供され得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的で用いられるが、限定されることを意図しないことも理解されるべきである。
【００８７】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で用いられるものに加えて、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は他に明確に言及がない限り、複数の指示対象を含む。すなわち、例えば、「リンカー」には「複数のリンカー」を含み、「膜貫通タンパク質細孔」という記載には２つ以上のそのような細孔を含み、「成分」という記載には、２つ以上のそのような成分を含む、等である。
【００８８】
上掲または下掲によらず、本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【００８９】
方法
本発明は、２つ以上の成分を結合させる方法を提供する。本発明は、（１）ハイブリダイズ可能な領域をそれぞれが含む２つ以上のリンカー、および（２）共有結合を形成することが可能な２つ以上の基、の使用を含む。リンカーにおけるハイブリダイズ可能な領域は、成分とハイブリダイズし、連結させる。次に、連結した成分は、基間の共有結合の形成を介して結合する。
【００９０】
本発明の方法は、２つ以上の成分を共有結合させる。この方法は、（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む少なくとも１つの第１のリンカーと、（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの第１の基をそれに共有結合させる、第１の成分を提供することを含む。この方法はまた、（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることが可能な第２のハイブリダイズ可能な領域を含む少なくとも１つの第２のリンカーと、（ｉｉ）第１の基と共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの第２の基をそれに共有結合させる、第２の成分を提供することを含む。第１および第２の成分は、第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が成分とハイブリダイズし、連結させる条件下で、接触させる。ハイブリダイゼーション反応の高い親和性は、成分が低濃度で結合することを可能にする。このことについては、以下により詳細に考察される。次に、連結された成分を、第１および第２の基間の共有結合の形成が可能となる条件に曝露される。１つ以上の共有結合の形成が、２つの成分間の連結を強め、単なるハイブリダイゼーションを用いて得られるものよりも安定な複合体を生じる。
【００９１】
本発明において使用される基のいずれも、それ自体とは反応しないことが好ましい。２つ以上の異なる成分を結合させる場合、結合するべき異なる成分とよりも、別のバージョンのそれ自体と成分が結合することを防ぐことから、このことは、本方法の収率を向上させる。
【００９２】
１実施形態において、少なくとも１つの第１の基は、第１の成分と直接的に共有結合するか、または、別のリンカー（すなわち、第１のリンカーとは異なるリンカー）を介して第１の成分と結合し、かつ／または、少なくとも１つの第２の基は、第２の成分と直接的に共有結合するか、または、別のリンカー（すなわち、第２のリンカーとは異なるリンカー）を介して第２の成分と結合する。別のリンカーは任意のタイプのリンカーであることができる。好適なリンカーは、当技術分野において公知であり、以下により詳細に考察される任意のリンカーであることができる。
【００９３】
別の、より好ましい、実施形態において、少なくとも１つの第１の基は、第１のリンカーを介して、第１の成分と共有結合しており、かつ／または、少なくとも１つの第２の基は、第２のリンカーを介して、第２の成分と共有結合する。この実施形態において、第１の成分は、好ましくは、第１のハイブリダイズ可能な領域と、共有結合を形成することが可能な第１の基の両方とを含む少なくとも１つの第１のリンカーが、そこに共有結合し、かつ／または、第２の成分は、好ましくは、第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域と、第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基とを含む第２のリンカーが、そこに共有結合する。最も好ましい実施形態において、第１および第２の基は、それぞれ第１および第２のリンカーを介して、第１および第２の成分と共有結合する。したがって、好ましい実施形態において、本方法は、（ａ）第１のハイブリダイズ可能な領域と、共有結合を形成することが可能な第１の基とを含む少なくとも１つの第１のリンカーが、そこに共有結合する、第１の成分を準備することと；（ｂ）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域と、第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基とを含む第２のリンカーが、そこに共有結合する、第２の成分を準備することと；（ｃ）第１および第２の成分を、第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が、成分とハイブリダイズし、連結させることが可能な条件下で、接触させることと；（ｄ）連結した成分を、第１および第２の基の間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること、を含む。
【００９４】
各成分は、少なくとも１つのリンカーが、そこに共有結合する。リンカーを成分に共有結合させる方法は、当技術分野において周知である。例えば、リンカーは、ジスルフィド結合を介して、タンパク質成分のシステイン残基と結合することができる。このことは、以下でより詳細に考察される。各成分は、それに共有結合する、１つより多いリンカー、例えば、２、３、４つ以上のリンカーを有し得る。そのような実施形態において、結合する２つ以上の成分は、典型的には、同じ数のリンカーが、そこに共有結合する。しかしながら、結合する２つ以上の成分はそれぞれ、異なる数のリンカーが、そこに共有結合することもできる。このことも、以下でより詳細に考察される。
【００９５】
成分あたり１つより多いリンカーが用いられる場合、各成分におけるリンカーは、ともに結合する対を形成することが好ましい。言い換えれば、各成分における２つのリンカーのハイブリダイズ可能な領域は、好ましくは、互いに特異的にハイブリダイズすることができる。このことを達成する最も直接的な方法は、それらのみが互いにハイブリダイズし、本発明において使用される任意のその他のハイブリダイゼーション領域とは反応しないように、２つのリンカーのハイブリダイズ可能な領域を設計することである。第１および第２の基を第１および第２のリンカーと結合させる場合、リンカーの対は、以下に記載されるようなクリック化学を用いて形成させることもできる。
【００９６】
好ましい実施形態において、第１の成分は、２、３または４つの第１のリンカーが、そこに共有結合し、かつ、第２の成分は、対応する数の第２のリンカーが、そこに結合し、リンカーは、第１および第２のリンカーの１つ以上の対を形成し、各対におけるハイブリダイズ可能な領域は、互いに特異的にハイブリダイズするが、その他の対におけるハイブリダイズ可能な領域のいずれともハイブリダイズしない。この実施形態において、成分は、２、３または４つの共有結合によって結合し得るから、安定した複合体を形成し得る。この実施形態はまた、２つの成分を所望の方向で固定するために、使用することができる。
【００９７】
より好ましい実施形態において、成分は２つのリンカーと結合し、この方法は、（ａ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む第１のリンカー、（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な第１の基、（ｉｉｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域を含む第３のリンカー、および（ｉｖ）共有結合を形成することが可能な第３の基が、そこに共有結合する、第１の成分を準備することと；（ｂ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域を含む第２のリンカー、（ｉｉ）第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基、（ｉｉｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第４のハイブリダイズ可能な領域を含む第４のリンカー、および（ｉｖ）第３の基と共有結合を形成することが可能な第４の基が、そこに共有結合する、第２の成分を準備することと；（ｃ）第１および第２の成分を、第１および第２のハイブリダイズ可能な領域がハイブリダイズし、かつ、第３および第４のハイブリダイズ可能な領域がハイブリダイズして、成分を連結することが可能な条件下で、接触させることと；（ｄ）連結した成分を、第１および第２の基と第３および第４の基との間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること、を含む。より好ましい実施形態において、本方法は、（ａ）（１）第１のハイブリダイズ可能な領域と、共有結合を形成することが可能な第１の基とを含む第１のリンカー、および（２）第３のハイブリダイズ可能な領域と共有結合を形成することが可能な第３の基とを含む第３のリンカーが、そこに共有結合する、第１の成分を準備することと；（ｂ）（１）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域と、第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基とを含む第２のリンカー、および（２）第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第４のハイブリダイズ可能な領域と、第３の基と共有結合を形成することが可能な第４の基とを含む第４のリンカーが、そこに共有結合する、第２の成分を準備することと；（ｃ）第１および第２の成分を、第１および第２のハイブリダイズ可能な領域がハイブリダイズし、かつ、第３および第４のハイブリダイズ可能な領域がハイブリダイズして、成分を連結することが可能な条件下で、接触させることと；（ｄ）連結した成分を、第１および第２の基と前記第３および第４の基との間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること、を含む。
【００９８】
第１のハイブリダイズ可能な領域が第３および第４のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズしないこと、第２のハイブリダイズ可能な領域が第３および第４のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズしないこと、第３のハイブリダイズ可能な領域が第１および第２のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズしないこと、および第４のハイブリダイズ可能な領域が第１および第２のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズしないことが好ましい。
【００９９】
各成分において異なる数のリンカーを用いて、２つ以上の成分を結合させる利点も存在する。例えば、成分の相対的方向を調節することができる。１実施形態において、成分の１つは、２、３または４つのリンカーを有し、その他の成分は、唯一のリンカーを有する。単一または個々のリンカーは当然、対応する成分における複数のリンカーのハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる２、３または４つのハイブリダイズ可能な領域を含む必要がある。複数のリンカーとのハイブリダイゼーションは、単一または個々のリンカーを曲げるまたは屈曲させ得る。好ましい実施形態において、第１の成分は、（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む第１のリンカー、（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な第１の基、（ｉｉｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域を含む第３のリンカー、および（ｉｖ）共有結合を形成することが可能な第３の基が、そこに共有結合し、第２の成分は、（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域と、第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第４のハイブリダイズ可能な領域とを含む第２のリンカー、（ｉｉ）第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基、および（ｉｉｉ）第３の基と共有結合を形成することが可能な第４の基が、そこに共有結合する。より好ましい実施形態において、第１の成分は、第１のリンカーおよび第３のリンカーがそこに共有結合し、第２の成分は、第２のリンカーがそこに共有結合し、この場合、第１のリンカーは、第１のハイブリダイズ可能な領域および共有結合を形成することが可能な第１の基を含み、第３のリンカーは、第３のハイブリダイズ可能な領域および共有結合を形成することが可能な第３の基を含み、かつ、第２のリンカーは、第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域、第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第４のハイブリダイズ可能な領域、ならびに、第１および第３の基と共有結合を形成することが可能な第２および第４の基を含む。
【０１００】
各成分は、少なくとも１つの基が、そこに共有結合する。基を成分またはリンカーに共有結合させるための方法は、当技術分野において周知である。このことは、以下でより詳細に考察される。各成分は、１つより多い基、例えば、２、３、４つ以上の基が、そこに共有結合する。このことは、成分を含む強力な複合体の形成を可能にする。リンカーおよび基はまた、互いに比較して所望の空間的配置で成分を固定するように設計することもできる。互いに比較して成分の可動性を制約するために、複数の基を使用することもできる。例えば、１つの成分が回転する自由またはその他の成分から離れるその能力を制約するために、複数の基を使用することもできる。
【０１０１】
２つより多い成分、例えば、３、４、５、６つ以上の成分を、本発明にしたがって結合させてもよい。このことは、複数の成分を含む複合体を製造することを可能にする。特定の配置にある複数の成分を含む複合体を製造することも可能にする。例えば、リンカーのハイブリダイズ領域または基は、それらが特定の配置で成分と結合するように設計することができる。例えば、３つの成分が使用される場合（Ａ、ＢおよびＣ）、それらは、それぞれの特定の配置で、すなわち、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｃ−Ｂ、Ｂ−Ａ−Ｃ、Ｂ−Ｃ−Ａ、Ｃ−Ａ−ＢおよびＣ−Ｂ−Ａで結合させることができる。これらの任意の配置の末端成分はまた、成分の「ループ」を形成するようにともに結合させることができる。
【０１０２】
当業者であれば、成分を連結させることが可能となる、好適な成分とリンカーの組み合わせを設計し得るであろう。例えば、上記したように３つの成分が使用される場合（Ａ、ＢおよびＣ）、Ａ−Ｂ−Ｃは、Ｂに、そこに共有結合する２つのリンカーを提供することによって形成させることができ、その一方は、Ａの単一のリンカーを介して結合することを可能にし、その他方は、Ｂの単一のリンカーを介して結合することを可能にする。あるいは、各成分は、２つのリンカーがそこに共有結合してもよい。Ａにおけるリンカーの１つが、Ｂにおけるリンカーの１つを介して結合することを可能にする場合、Ｂのその他のリンカーは、Ｃのリンカーの１つを介して結合することを可能にし、Ｃのその他のリンカーは、Ａの残りのリンカーを介して結合することを可能にし、３つの成分は「ループ」状で結合することができる。上記で考察した各成分を結合させるために、複数のリンカーを使用してもよい。
【０１０３】
さらにさらなる実施形態において、リンカーは、自己集合して成分と共有結合する構造となるように設計することができる。合成オリゴヌクレオチド、すなわち、ハイブリダイゼーションによってそれらが形成する構造の間の相互作用は、単純な規則（ジャンクション、Ｇ−四重体、ｉ−モチーフなどの構造モチーフを示す規則により補足される、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合）を用いるそれらのヌクレオチド配列の設計によって制御することができる。例えば、Ｓｅｅｍａｎらは、様々な三次元ＤＮＡ格子を調製した（例えば、ＮＣ  Ｓｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．９９，２３７（１９８２））。自己集合構造は、リンカーにおける基の間の共有結合によって結合している。
【０１０４】
好ましい実施形態において、本方法は、３、４または５つの成分を結合させることを含み、各成分は、（ｉ）異なる成分におけるリンカーのハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができるハイブリダイズ可能な領域を含む少なくとも１つのリンカー、および（ｉｉ）異なる成分における基と共有結合を形成することが可能な少なくとも１つの共有結合基が、そこに共有結合する。より好ましい実施形態において、本方法は、３、４または５つの成分を結合させることを含み、各成分は、別のリンカーのハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができるハイブリダイズ可能な領域と、別のリンカーの基と共有結合を形成することが可能な共有結合基を含む少なくとも１つのリンカーが、そこに共有結合する。
【０１０５】
さらにより好ましい実施形態において、本方法は、ａ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む第１のリンカー、および（ｉｉ）共有結合を形成することが可能な第１の基が、そこに共有結合する、第１の成分を準備することと；ｂ）（ｉ）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズ可能な第２のハイブリダイズ可能な領域を含む第２のリンカー、（ｉｉ）第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基、（ｉｉｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域を含む第３のリンカー、および（ｉｖ）共有結合を形成することが可能な第３の基が、そこに共有結合する、第２の成分を準備することと；ｃ）（ｉ）第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第４のハイブリダイズ可能な領域を含む第４のリンカー、および（ｉｉ）第３の基と共有結合を形成することが可能な第４の基が、そこに共有結合する、第３の成分を準備することと；ｄ）第１、第２および第３の成分を、ハイブリダイズ可能な領域が成分とハイブリダイズして連結させることが可能な条件下で、接触させることと；ｅ）連結した成分を、基の間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること、を含む。
【０１０６】
さらにより好ましい実施形態において、本方法は、（ａ）第１のハイブリダイズ可能な領域を含む第１のリンカーと、共有結合を形成することが可能な第１の基が、そこに共有結合する、第１の成分を準備することと；（ｂ）（１）第１のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることができる第２のハイブリダイズ可能な領域を含む第２のリンカーと第１の基と共有結合を形成することが可能な第２の基、および（２）第３のハイブリダイズ可能な領域を含む第３のリンカーと共有結合を形成することが可能な第３の基が、そこに共有結合する、第２の成分を準備することと；（ｃ）第３のハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイズすることが可能な第４のハイブリダイズ可能な領域と、第３の基と共有結合を形成することが可能な第４の基を含む第４のリンカーが、そこに共有結合している第３の成分を準備することと；（ｄ）第１、第２および第３の成分を、ハイブリダイズ可能な領域が成分とハイブリダイズして連結させることが可能な条件下で、接触させることと；（ｅ）連結した成分を、基の間で共有結合の形成が可能となる条件に曝露すること、を含む。
【０１０７】
成分
２つ以上の成分は、リンカーを使用して共有結合させ得る任意の物質または表面であり得る。好ましい成分としては、限定するものではないが、ポリペプチド、タンパク質、核酸、化学基、色素、アフィニティータグ、ポリマー、ビーズ、抗体、支持体、固定化金属アフィニティーマトリックス、グルタチオンセファロース、デキストリンセファロース、アフィニティーマトリックス、ＩｇＧセファロース、活性化チオール−セファロース、金属フィルム、ナノ粒子、ガラス、処理ガラス、プラスチック、樹脂表面、固体ナノ細孔、センサー表面、および単一分子検出器が挙げられる。
【０１０８】
好適な固体細孔としては、限定するものではないが、窒化シリコン細孔、二酸化シリコン細孔、およびグラフェン細孔が挙げられる。その他の好適な固体細孔およびそれらの製造方法は、米国特許第６，４６４，８４２号、国際特許公開第ＷＯ  ０３／００３４４６号、同第ＷＯ  ２００５／０６１３７３号、米国特許第７，２５８，８３８号、同第７，４６６，０６９号、同第７，４６８，２７１号、および同第７，２５３，４３４号に記載されている。
【０１０９】
２つ以上の成分は、同じであっても、異なっていてもよい。
【０１１０】
第１の成分が、タンパク質であり、第２の成分が、タンパク質、核酸、レポーター基、アフィニティータグまたは支持体であるのが好ましい。２つ以上の成分は、任意の立体配置で結合させ得る。例えば、それらがタンパク質であるならば、それらは、末端の（すなわち、アミノまたはカルボキシ末端の）アミノ酸を介して結合させ得る。
【０１１１】
第１の成分が、核酸結合タンパク質であり、第２の成分が、膜貫通タンパク質細孔であるのがより好ましい。好適な立体配置としては、限定するものではないが、核酸結合タンパク質のアミノ末端が、膜貫通タンパク質細孔のカルボキシ末端と結合しているもの、またはその逆が挙げられる。あるいは、２つの構成成分は、それらの配列内のアミノ酸を介して結合させてもよい。例えば、核酸結合タンパク質は、成分のループ領域内の１つ以上のアミノ酸と結合することができる。好ましい実施形態において、核酸結合タンパク質の末端アミノ酸は、成分のループ領域内の１つ以上のアミノ酸と結合する。末端アミノ酸およびループ領域については、以下で考察される。
【０１１２】
第１の成分が核酸結合タンパク質であり、第２の成分が膜貫通タンパク質細孔である場合、第１および第２の基は、それぞれの成分から、好ましくは、０．０５ｎｍ〜１０ｎｍ、より好ましくは、０．０５ｎｍ〜５ｎｍ、最も好ましくは、約０．１ｎｍ、または３ヌクレオチドにある。第１の成分が核酸結合タンパク質であり、第２の成分が膜貫通タンパク質細孔である場合、結合させた第１および第２の成分間の距離は、好ましくは、０．１ｎｍ〜１００ｎｍ、より好ましくは、０．１ｎｍ〜２５ｎｍ、より好ましくは、０．１ｎｍ〜５ｎｍ、最も好ましくは、０．５ｎｍである。約０．５ｎｍの成分間の距離を達成するためには、結合したリンカーが「ヘッドトゥーヘッド」配置を有することが必要となり得る。リンカーが「ヘッドトゥーテール」配置で使用される場合、十分なハイブリダイゼーションを提供するために、各リンカーにおいて最小で５または６つのヌクレオチドは必要とされる。より短いリンカーは適切にハイブリダイズし得ず、もしそうであっても、すなわち、より短い成分間距離は、異なる立体構造を用いて達成することができる。
【０１１３】
好ましい実施形態において、共有結合部位は、成分が細孔である場合、標的配列中の一定の割合のヌクレオチドが細孔と相互作用するよう、核酸結合タンパク質が標的核酸を処理するように、選択される。次に、相互作用時に細孔を通じて流れる電流に影響を与える様式の違いに基づいて、ヌクレオチドは識別される。
【０１１４】
核酸分子を配列決定するために細孔を使用し得る多数の方法が存在する。１つの方法は、エキソヌクレアーゼ酵素、例えば、デオキシリボヌクレアーゼの使用を伴う。この方法において、エキソヌクレアーゼ酵素は、標的核酸鎖からヌクレオチドを連続的に分離させるために使用される。次に、ヌクレオチドは感知され、そして、それらの分離順で細孔によって識別され、したがって、元の鎖の配列が読み取られる。そのような実施形態のために、エキソヌクレアーゼ酵素は、好ましくは、標的核酸から遊離した一定の割合のヌクレオチドが、サブユニットを含む細孔のバレルまたはチャンネルに入り、相互作用し得るように、細孔サブユニットと結合する。エキソヌクレアーゼは、好ましくは、細孔のバレルまたはチャンネルの開口部を形成するサブユニット部分に近接近する部位にあるサブユニットと結合する。エキソヌクレアーゼ酵素は、より好ましくは、そのヌクレオチド排出経路部位が、細孔の開口部を形成するサブユニットの部分に配向されるように、サブユニットと結合する。
【０１１５】
核酸の配列決定をする別の方法は、付加電位とともに、細孔を通じて標的核酸鎖を押したり引いたりする酵素の使用を伴う。この方法において、イオン電流は、標的鎖中のヌクレオチドが細孔を通過する時に変動する。電流の変動は、鎖の配列の指標である。そのような実施形態のために、酵素は、好ましくは、それが、サブユニットを含む細孔のバレルまたはチャンネルを通じて標的核酸を押したり引いたりすることができ、細孔を通るイオン電流の流れは妨げないように、細孔サブユニットと結合する。酵素は、好ましくは、細孔のバレルまたはチャンネルの開口部を形成するサブユニット部分に近接近する部位にあるサブユニットと結合する。酵素は、より好ましくは、その活性部位が、細孔の開口部を形成するサブユニットの部分に配向されるように、サブユニットと結合する。
【０１１６】
核酸鎖を配列決定する第３の方法は、細孔検出器に近接近するポリメラーゼの副生成物を検出することである。この方法において、ヌクレオシドリン酸（ヌクレオチド）は、ポリメラーゼをヌクレオチド鎖に添加した時に遊離されるリン酸標識された種が細孔によって検出されるように、標識される。リン酸種は、各ヌクレオチドに対して特定の標識を含む。ヌクレオチドが核酸鎖に連続的に付加される時、塩基付加の副生成物が検出される。リン酸標識された種が検出される順番は、核酸鎖の配列を決定するために使用することができる。
【０１１７】
核酸結合タンパク質は、好ましくは、細孔のシス側の部分を形成する細孔または細孔サブユニットの部分と結合する。電気生理学において、シス側が、慣例により、接地されている。ヘモリジン細孔が、正確に、電気生理学装置に挿入された場合、Ｃａｐ領域はシス側にある。正電位条件下で、ヌクレオチドは細孔のシス側からトランス側へ移動し得ることが、確率論的センシングを用いて、周知である。細孔のシス側に核酸結合タンパク質を配置すると、配列中の一定の割合のヌクレオチドが、細孔のバレルまたはチャンネルに入り、それと相互作用するように、核酸結合タンパク質が標的核酸を処理することが可能になる。好ましくは、配列中のヌクレオチドの、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、細孔のバレルまたはチャンネルに入り、それと相互作用する。
【０１１８】
共有結合の部位および方法は、好ましくは、核酸結合タンパク質の可動性が制約されるように選択される。このことは、標的配列中の一定の割合のヌクレオチドが細孔と相互作用するように、タンパク質が標的核酸配列を確実に処理することに役立つ。例えば、核酸結合タンパク質が動く能力を制約することは、その活性部位が持続的に、細孔のバレルまたはチャンネルの開口部分を形成する細孔または細孔サブユニットに向かって配向され得ることを意味する。核酸結合タンパク質の可動性は、タンパク質が成分と結合する点の数および／または特定のリンカーの使用を増加させることにより、制約され得る。
【０１１９】
生物学的に活性な成分は、典型的には、それらが生物学的活性を保持するように結合する。本明細書において記載される任意の成分の生物学的活性は、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。核酸結合タンパク質および膜貫通タンパク質細孔をともに結合させた場合、両方のタンパク質は、好ましくはそれぞれ、それらの結合特性および細孔特性を保持する。
【０１２０】
１つ以上の成分がタンパク質である場合、少なくとも１つの天然の接近可能なシステイン残基は、米国特許出願第６１／１４８，７２６号からの優先権を主張し、本願と同時に出願された同時係属中の国際出願［Ｊ  Ａ  Ｋｅｍｐ  ＆  Ｃｏ  Ｒｅｆ：Ｎ．１０６５６６Ａ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｒｅｆ：ＯＮＬ  ＩＰ  ００７］中に記載されるように、タンパク質から除去することができる。しかし、タンパク質は、１つ以上の接近可能なシステイン残基を含み、それらの残基を介して別の成分と結合することができる。限定的な数の接近可能なシステイン残基の存在は、成分間の制御された結合を可能にする。
【０１２１】
システイン残基のイオン化可能な側鎖は、付加反応にたずさわる強力な求核基なので、バイオコンジュゲーション技術において使用するための人気の高い選択である。しかしながら、これらの技術の効率的な使用に対する共通の障害は、野生型タンパク質中に存在する天然のシステイン残基である。１つ以上の天然のシステイン残基の修飾は、不明確な酵素活性と制御されない連結を生じ得る。
【０１２２】
本発明は、タンパク質成分由来のシステイン残基の部位特異的突然変異誘発を伴うことができる。１つ以上の他の全てアクセス可能なシステイン残基は、除去することができる。あるいは、全てのアクセス可能なシステイン残基は除去することができ、１つ以上のシステイン残基をタンパク質に導入することができる。特定のアクセス可能なシステイン残基の存在は、結合タンパク質の別の成分、例えば、別のタンパク質、固体支持体または化学試薬の結合を促進する。
【０１２３】
天然のシステイン残基の除去および単一または複数のシステイン残基の目的とされた付加は、タンパク質が互いに相互作用し、望ましくない表面のチオールを介して、二量体、三量体等を形成する可能性を最小限にしながら、結合を制御する能力を有するので、これまでの方法を改良する。タンパク質が、その構造中、意図された位置に唯一のシステイン残基を含む場合、結果として、その残基のチオール基は、その他のスルフヒドリル基と直接的なジスルフィド結合を形成するか、または、反応性リンカーによって介在され得る結合を形成するために使用することができる。これらの意図されたシステイン残基は、一定の割合の好ましい立体配置（例えば、活性部位を最適に配向させ得る）も提供しながら、所望の数の酵素分子のみが所望の数の標的分子と架橋することを確実にする。
【０１２４】
野生型タンパク質中に存在する天然のシステイン残基は、チオール反応性基、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、またはオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）を含む特定のリンカーの使用を容易には認めない。任意の構造的または触媒的に重要なシステイン残基との反応の可能性は、タンパク質の活性に影響を及ぼし得、これは、単一の分子への適用における使用のために特に重要である。バイオコンジュゲーションのためのリンカーの使用は、タンパク質活性が、別の成分、例えば、タンパク質または表面と近接近にあることにより影響されないよう、いくらかの空間的隔離状態を確実にするために重要である。
【０１２５】
核酸結合タンパク質
成分の１つは好ましくは、核酸結合タンパク質である。そのようなタンパク質の例としては、限定するものではないが、核酸処理酵素、例えば、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼおよびヘリカーゼ、ならびに、非触媒性結合タンパク質、例えば、ＳＣＯＰ（タンパク質の構造分類）によって分類される核酸結合タンパク質スーパーファミリー（５０２４９）のもの、等が挙げられる。核酸処理酵素は、上記中、ならびに、米国特許出願第６１／１４８，７２６号からの優先権を主張し、本願と同時に出願された同時係属中の国際出願［Ｊ  Ａ  Ｋｅｍｐ  ＆  Ｃｏ  Ｒｅｆ：Ｎ．１０６５６６Ａ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏ細孔  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｒｅｆ：ＯＮＬ  ＩＰ  ００７］中に記載されるように、システイン残基を除去および／または置換するために修飾される。少なくとも１つの天然の接近可能なシステイン残基は、好ましくは、核酸結合タンパク質から除去される。しかし、核酸結合タンパク質は、１つ以上の接近可能なシステイン残基を含み、それらの残基を介して別の成分と結合する。限定的な数の接近可能なシステイン残基の存在は、別の成分への制御された結合を可能にする。
【０１２６】
核酸は２つ以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。タンパク質と結合する核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組み合わせを含んでもよい。ヌクレオチドは、天然であっても、合成であってもよい。ヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、および少なくとも１つのリン酸基を含む。核酸塩基は、典型的には、複素環式である。核酸塩基としては、限定するものではないが、プリンおよびピリミジン、より好ましくは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシン、が挙げられる。糖は、典型的には、五炭糖である。ヌクレオチド糖としては、限定するものではないが、リボースおよびデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、一リン酸、二リン酸または三リン酸を含む。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に結合され得る。
【０１２７】
ヌクレオチドとしては、限定するものではないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられる。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択される。
【０１２８】
核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であることができる。核酸は、当技術分野において公知の任意の合成核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または、ヌクレオチド側鎖を有するその他の合成ポリマーであってもよい。タンパク質と結合する核酸は、好ましくは、一本鎖、例えば、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＬＮＡである。タンパク質と結合する核酸は、好ましくは、二本鎖、例えば、ＤＮＡである。タンパク質と結合する前に、二本鎖ＤＮＡが一本鎖へと解離するならば、一本鎖核酸と結合するタンパク質を、二本鎖ＤＮＡを配列決定するために使用してもよい。
【０１２９】
核酸結合タンパク質の三次構造は公知であることが好ましい。結合タンパク質の三次元構造に関する知識は、結合した構造体においてその機能を促進するようにタンパク質に修飾を行うことを可能にする。
【０１３０】
このタンパク質は、任意のサイズであり、任意の構造を有することができる。例えば、タンパク質は、オリゴマー、例えば、ダイマーまたはトリマーであってもよい。タンパク質は、好ましくは、１つのモノマーから形成された小さな球状ポリペプチドである。このようなタンパク質は、操作しやすく、また、その他の成分を妨害しにくい。例えば、そのようなタンパク質は、細孔サブユニットの細孔形成能を妨害しにくい。
【０１３１】
タンパク質の活性部位の位置および機能が公知であることも好ましい。このことは、タンパク質の活性が損なわれる修飾が活性部位に対して行われるのを防ぐ。それはまた、タンパク質が標的核酸配列と特定の方法で結合できるように、そのタンパク質がその他の成分と結合することを可能にする。例えば、配列決定目的のために、本タンパク質を膜貫通タンパク質細孔と結合させた場合、以下に記載されるように、標的核酸中の一定の割合のヌクレオチドが細孔と相互作用することが可能となる。そのような実施形態において、本タンパク質自体が電流の障害となることなく、細孔チャンネルのバレル開口部分の可能な限り近くに、タンパク質の活性部位を配置することが有益である。タンパク質が核酸を配向し得る方法に対する知識はまた、効率的に結合する構造体が設計されることを可能にする。
【０１３２】
本発明の方法によって作製された構造体は、精製する必要がある場合もある。核酸結合タンパク質は、構造体を精製するために用いられる条件に耐え得ることが好ましい。
【０１３３】
その他の成分は細孔を含むことができる。そのような細孔を用いて、核酸の配列決定をすることができる。標的核酸中のヌクレオチドの多くを、確率学的センシングにより正確に同定するために、ヌクレオチドの識別と適合し得るバッファーバックグラウンド中で本タンパク質は核酸と結合するのが好ましい。本タンパク質は、好ましくは、通常の生理学的レベルよりもずっと高い塩濃度、例えば、１００ｍＭ〜２０００ｍＭで、少なくとも残存する活性を有する。本タンパク質は、より好ましくは、高い塩濃度でのその活性を増大させるために修飾されている。本タンパク質はまた、その処理性、安定性および保存期間を向上させるために修飾してもよい。
【０１３４】
好適な修飾は、好極限性微生物、例えば、好塩性、中度好塩性細菌、好熱性および中度好熱性生物の特性決定、ならびに、中度好熱性または好熱性エキソヌクレアーゼの耐塩性、安定性および温度依存性を変化させる指向性進化手法から決定することができる。
【０１３５】
この酵素はまた、好ましくは、１０℃〜６０℃の温度、例えば、室温にて、少なくとも部分的な活性を保持する。このことは、様々な温度、例えば、室温にて、核酸が配列決定されることを可能にする。
【０１３６】
核酸結合タンパク質は、好ましくは、核酸処理酵素である。核酸処理酵素は、核酸相互作用することができ、核酸の少なくとも１つの特性を修飾することができるポリペプチドである。この酵素は、核酸を切断することにより、個々のヌクレオチド、またはより短いヌクレオチド鎖、例えば、ジもしくはトリヌクレオチドを形成するように、核酸を修飾し得る。この酵素は、核酸を配向させるか、または特定の位置に移動させることにより、核酸を修飾し得る。
【０１３７】
核酸処理酵素は、核酸分解酵素に由来するのが好ましい。核酸処理酵素は、酵素分類（ＥＣ）グループ３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０、および３．１．３１のいずれかのメンバーに由来するのがより好ましい。核酸処理酵素は、以下の酵素のいずれか１つに基づくのがより好ましい：
・  ３．１．１１．−  ５’−  ホスホモノエステル産生エキソデオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．１１．１  エキソデオキシリボヌクレアーゼＩ．
３．１．１１．２  エキソデオキシリボヌクレアーゼＩＩＩ．
３．１．１１．３  エキソデオキシリボヌクレアーゼ（ラムダ−誘導性）．
３．１．１１．４  エキソデオキシリボヌクレアーゼ（ファージＳＰ３−誘導性）．
３．１．１１．５  エキソデオキシリボヌクレアーゼＶ．
３．１．１１．６  エキソデオキシリボヌクレアーゼＶＩＩ．
・  ３．１．１３．−  ５’−ホスホモノエステル産生エキソリボヌクレアーゼ．
３．１．１３．１  エキソリボヌクレアーゼＩＩ．
３．１．１３．２  エキソリボヌクレアーゼＨ．
３．１．１３．３  オリゴヌクレオチダーゼ．
３．１．１３．４  ポリ（Ａ）−特異的リボヌクレアーゼ．
３．１．１３．５  リボヌクレアーゼＤ．
・  ３．１．１４．−  ３’−ホスホモノエステル産生エキソリボヌクレアーゼ．
３．１．１４．１  酵母リボヌクレアーゼ．
・  ３．１．１５．−  ５’−ホスホモノエステル産生性の、リボ−またはデオキシリボ核酸のいずれかと活性を示すエキソヌクレアーゼ
３．１．１５．１  毒液エキソヌクレアーゼ．
・  ３．１．１６．−  ３’−ホスホモノエステル産生性の、リボ−またはデオキシリボ核酸のいずれかと活性を示すエキソヌクレアーゼ
３．１．１６．１  脾臓エキソヌクレアーゼ．
・  ３．１．２１．−  ５’−ホスホモノエステル産生エンドデオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．２１．１  デオキシリボヌクレアーゼＩ．
３．１．２１．２  デオキシリボヌクレアーゼＩＶ（ファージ−Ｔ（４）−誘導性）．
３．１．２１．３  タイプＩ部位特異的デオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．２１．４  タイプＩＩ部位特異的デオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．２１．５  タイプＩＩＩ部位特異的デオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．２１．６  ＣＣ−選択性エンドデオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．２１．７  デオキシリボヌクレアーゼＶ．
・  ３．１．２２．−  ５’−ホスホモノエステル以外を産生するエンドデオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．２２．１  デオキシリボヌクレアーゼＩＩ．
３．１．２２．２  アスペルギルス  デオキシリボヌクレアーゼＫ（１）．
３．１．２２．３  登録分類変更：３．１．２１．７．
３．１．２２．４  交差分岐エンドデオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．２２．５  デオキシリボヌクレアーゼＸ．
・  ３．１．２５．−  改変塩基に対して特異的な、部位特異的エンドデオキシリボヌクレアーゼ．
３．１．２５．１  デオキシリボヌクレアーゼ（ピリミジンダイマー）．
３．１．２５．２  登録分類変更：４．２．９９．１８．
・  ３．１．２６．−  ５’−ホスホモノエステル産生エンドリボヌクレアーゼ．
３．１．２６．１  モジホコリ（Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）リボヌクレアーゼ．
３．１．２６．２  リボヌクレアーゼα．
３．１．２６．３  リボヌクレアーゼＩＩＩ．
３．１．２６．４  リボヌクレアーゼＨ．
３．１．２６．５  リボヌクレアーゼＰ．
３．１．２６．６  リボヌクレアーゼＩＶ．
３．１．２６．７  リボヌクレアーゼＰ４．
３．１．２６．８  リボヌクレアーゼＭ５．
３．１．２６．９  リボヌクレアーゼ（ポリ−（Ｕ）−特異的）．
３．１．２６．１０  リボヌクレアーゼＩＸ．
３．１．２６．１１  リボヌクレアーゼＺ．
・  ３．  １．２７．−  ５’−ホスホモノエステル以外を産生するエンドリボヌクレアーゼ．
３．１．２７．１  リボヌクレアーゼ  Ｔ（２）．
３．１．２７．２  バチルス・ズブチリス  リボヌクレアーゼ．
３．１．２７．３  リボヌクレアーゼ  Ｔ（１）．
３．１．２７．４  リボヌクレアーゼ  Ｕ（２）．
３．１．２７．５  膵リボヌクレアーゼ．
３．１．２７．６  エンテロバクターリボヌクレアーゼ．
３．１．２７．７  リボヌクレアーゼＦ．
３．１．２７．８  リボヌクレアーゼＶ．
３．１．２７．９  ｔＲＮＡ−イントロンエンドヌクレアーゼ．
３．１．２７．１０  ｒＲＮＡ  エンドヌクレアーゼ．
・  ３．１．３０．−  ５’−ホスホモノエステル産生性の、リボ−またはデオキシリボ核酸のいずれかと活性を示すエンドヌクレアーゼ
３．１．３０．１  アスペルギルスヌクレアーゼＳ（１）．
３．１．３０．２  セラチア・マルセセンスヌクレアーゼ．
・  ３．１．３１．−  ３’−ホスホモノエステル産生性の、リボ−またはデオキシリボ核酸のいずれかと活性を示すエンドリボヌクレアーゼ
３．１．３１．１  微生物ヌクレアーゼ．
【０１３８】
酵素は、最も好ましくは、核酸を切断して、個々のヌクレオチドを形成する、エキソヌクレアーゼ、例えば、デオキシリボヌクレアーゼである。エキソデオキシリボヌクレアーゼの利点は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの両方に活性を示し、５’-３’または３’-５’の方向のいずれかで塩基を加水分解する点である。
【０１３９】
個々のヌクレオチドとは、単一のヌクレオチドである。個々のヌクレオチドは、任意の結合、例えば、ホスホジエステル結合によって、別のヌクレオチドまたは核酸と結合していないものである。ホスホジエステル結合は、ヌクレオチドのリン酸基の１つが別のヌクレオチドの糖基と結合していることを伴う。個々のヌクレオチドは、典型的には、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００ヌクレオチドの別の核酸配列といかなる様式でも結合していないものである。
【０１４０】
本方法において使用するための好ましい酵素としては、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（配列番号５２）、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ（配列番号５４）、およびバクテリオファージ・ラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号５４）、およびそれらの変異体が挙げられる。配列番号５６の３つ同じサブユニットは相互作用して、三量体エキソヌクレアーゼを形成する。大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）に基づく酵素が最も好ましい。
【０１４１】
核酸処理酵素は、好ましくは、配列番号６、５２、５４および５６に示される配列またはその変異体のいずれかを含むエキソヌクレアーゼ酵素に由来する。言い換えれば、本酵素は、好ましくは、そのシステイン残基が上記のように修飾される前に、配列番号６、５２、５４および５６に示される配列またはその変異体のいずれかを含む。
【０１４２】
配列番号６、５２、５４または５６の変異体は、配列番号６、５２、５４または５６とは異なり、核酸処理能力を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。核酸を処理する変異体の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、核酸を処理する変異体の能力は、実施例に記載されるようにしてアッセイすることができる。変異体はまた、実施例に記載されるようなその発現能を保持している必要がある。
【０１４３】
この変異体は、核酸の処理を促進し、かつ／または、高い塩濃度および／または室温にてその活性を促進する修飾を含んでもよい。
【０１４４】
変異体は、生物によって、例えば、大腸菌によって発現される、天然の変異体であってもよい。変異体はまた、組み換え技術により作製される非天然の変異体を含む。配列番号６、５２、５４または５６のアミノ酸配列の全長に亘り、変異体は、好ましくは、アミノ酸同一性に基づく配列に対して、少なくとも５０％相同であり得る。より好ましくは、変異体ポリペプチドは、配列全体に亘って、配列番号６、５２、５４または５６のアミノ酸配列に対して、アミノ酸同一性に基づき、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および、より好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。２００個以上、例えば、２３０、２５０、２７０または２８０個以上連続するアミノ酸の幅に亘り、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が存在し得る（「高相同性（ｈａｒｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」）。
【０１４５】
当技術分野における標準的方法を用いて、相同性を決定することができる。ＵＷＧＣＧパッケージは、例えば、その既定の設定を使用して、相同性を計算するために使用し得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されるように、それを用いることにより、相同性を計算または配列を整列させることができる（例えば、同じ残基または対応する配列の同定（典型的には、それらの既定の設定における））。
【０１４６】
ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公然と入手することができる。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）内の長さがＷの短いワードであって、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした際に、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすワードを特定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記参照）。これら最初の近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとして作用する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積アラインメントスコアが最高到達値から数量Ｘだけ低下した場合；負のスコアを有する残基アラインメントが１つ以上累積したことにより累積スコアが０以下になった場合；または、いずれかの配列の末端に達した場合には、各方向におけるワードヒットの伸長が停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、アラインメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴプログラムは、既定値としてワード長（Ｗ）１１を用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），ＰＲＯＣ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を既定値として用いる。
【０１４７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析を行う。例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのアミノ酸配列間の一致が偶然起こり得る確率の指標を提供する。例えば、第１の配列と第２の配列を比較した際に、最小合計確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合に、ある配列はもう一方の配列と類似していると見なされる。
【０１４８】
上記で考察したものの他に、配列番号５２、５４または５６のアミノ酸配列に対して、アミノ酸置換を、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０または３０個までの置換を、行うことができる。保存的置換は、例えば、以下の表１にしたがって、実施することができる。
【０１４９】
【表１】
2012516145.tif 000002
【０１５０】
配列番号６、５２、５４または５６のアミノ酸配列の１個以上のアミノ酸残基を、上記したポリペプチドからさらに欠失させてもよい。１、２、３、４、５、１０、２０または３０個までの残基を欠失させてもよく、それ以上であってもよい。
【０１５１】
変異体は、配列番号６、５２、５４または５６の断片であってもよい。そのような断片は、核酸処理活性を保持する。断片は、少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸長であることができる。断片は、好ましくは、配列番号６、５２、５４または５６の核酸処理ドメインを含む。
【０１５２】
１個以上のアミノ酸を、上記したポリペプチドに対して、代替的または付加的に付加してもよい。配列番号６、５２、５４または５６またはその変異体または断片のアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端において、伸長させてもよい。伸長は、かなり短くてもよく、例えば、１〜１０個のアミノ酸長であってもよい。あるいは、伸長は、より長くてもよく、例えば、最大５０個または１００個のアミノ酸であってもよい。担体タンパク質を、サブユニットまたは変異体に融合させてもよい。
【０１５３】
上記で考察したように、配列番号６、５２、５４または５６の変異体は、配列番号６、５２、５４または５６のアミノ酸配列から変化しており、その核酸処理能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質である。変異体は、典型的には、核酸処理に関与する配列番号６、５２、５４または５６の領域を含む。配列番号６、５２、５４および５６の触媒ドメインは、配列表の説明において上記で考察されている。配列番号６、５２、５４または５６の変異体は、好ましくは、関連する触媒ドメインを含む。配列番号６、５２、５４または５６の変異体は、典型的には、関連する触媒ドメイン外に、１個以上の修飾、例えば、置換、付加または欠失を含む。配列番号６の特定の変異体については、以下でより詳細に考察される。
【０１５４】
変異体は、例えば、その同定または精製を支援するために、ヒスチジンまたはアスパラギン酸残基を付加することにより、または、ポリペプチドがそのような配列を天然には含まない場合に、細胞からそれらの分泌を促進するためにシグナル配列を付加することにより、修飾してもよい。
【０１５５】
細孔を通って標的核酸配列を押したり引いたりすることができる好ましい酵素としては、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、およびトポイソメラーゼ、例えば、ジャイレースが挙げられる。核酸処理酵素は、これらのタイプの酵素のいずれかに由来し得る。ポリメラーゼは、好ましくは、酵素分類（ＥＣ）グループ２．７．７．６、２．７．７．７、２．７．７．１９、２．７．７．４８および２．７．７．４９のいずれかのメンバーである。ポリメラーゼは、好ましくは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ヘリカーゼは、好ましくは、酵素分類（ＥＣ）グループ３．６．１．−および２．７．７．−のいずれかのメンバーである。ヘリカーゼは、好ましくは、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼ（ＥＣグループ３．６．１．８）、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ（ＥＣグループ３．６．１．８）またはＡＴＰ非依存性ＲＮＡヘリカーゼである。トポイソメラーゼは、好ましくは、酵素分類（ＥＣ）グループ５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０１５６】
本酵素は明示用標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）を用いて標識してもよい。明示用標識は、細孔が検出され得る任意の好適な標識であり得る。好適な標識としては、限定するものではないが、蛍光分子、ラジオアイソトープ、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、およびリガンド、例えば、ビオチンが挙げられる。
【０１５７】
核酸結合タンパク質は、結合タンパク質産生生物、例えば、大腸菌、Ｔ．サーモフィルスまたはバクテリオファージから単離することができ、または、合成もしくは組み換え手段により作製することもできる。例えば、核酸結合タンパク質は、インビトロ翻訳および転写により合成することができる。核酸結合タンパク質のアミノ酸配列は、非天然のアミノ酸を含ませるために、または、タンパク質の安定性を増大させるために、修飾してもよい。核酸結合タンパク質が合成的手段により作製された場合、そのようなアミノ酸は、作製時に導入してもよい。核酸結合タンパク質はまた、合成または組み換え作製のいずれかの後で改変してもよい。
【０１５８】
核酸結合タンパク質はまた、Ｄ−アミノ酸を用いて作製してもよい。例えば、核酸結合タンパク質は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含んでもよい。このようなタンパク質またはペプチドを作製するために、このことは、当技術分野において、従来続けられている。
【０１５９】
核酸結合タンパク質はまた、それら修飾がその核酸処理能力またはその他の成分への結合を妨害しない限り、その他の非特異的な化学修飾を含んでもよい。多数の非特異的な側鎖修飾は、当技術分野において公知であり、細孔の側鎖に対して行ってもよい。そのような修飾としては、例えば、アルデヒドとの反応に続く、ＮａＢＨ４との還元によるアミノ酸の還元アルキル化、メチルアセトイミデートによるアミジン化、または無水酢酸によるアシル化が挙げられる。核酸結合タンパク質に対する修飾は、核酸結合タンパク質の発現後に行うこともできるし、本発明の方法において、核酸結合タンパク質が使用された後に行うこともできる。
【０１６０】
核酸結合タンパク質は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて、作製することができる。核酸結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて、単離および複製することができる。そのような配列は、以下により詳細に考察される。核酸結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて、細菌宿主細胞中で発現させてもよい。核酸結合タンパク質は、組み換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイチュ発現により、細胞中で作製してもよい。発現ベクターは、任意に、ポリペプチドの発現を制御するための誘導性プロモーターを担持する。
【０１６１】
核酸結合タンパク質は、細孔生成生物から、任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製後に、または、以下に記載されるような組み換え発現後に、大規模で作製してもよい。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムとしては、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムが挙げられる。
【０１６２】
核酸処理酵素は、好ましくは、配列番号６に示される配列またはその変異体を含むエキソヌクレアーゼ酵素に由来する。言い換えれば、本酵素は、好ましくは、そのシステイン残基が上記のように修飾される前に、配列番号６に示される配列またはその変異体を含む。配列番号６の変異体については、上記で考察されている。
【０１６３】
配列番号６は、５１、９８、１４４、３０６および３３０位に５つの天然のシステイン残基を有する。これらの位置にある５つのシステイン残基全ては、接近可能である。配列番号６の変異体は、好ましくは、本発明にしたがってそれが修飾される前に、５つのこれらの残基全てを含む。
【０１６４】
１実施形態において、５１、９８、１４４、３０６および３３０位の５つのシステイン全てが配列番号６から除去され、１つ以上の天然のシステイン以外の残基が導入される。
【０１６５】
別の実施形態において、５１、９８、１４４、３０６および３３０位の５つのシステイン残基のうちの１つ以上を除き、配列番号６から除去される。５１、９８、１４４、３０６および３３０位の５つのシステイン残基のうちの１つ以上の任意の組み合わせは、突然変異誘発後に、配列番号６由来の酵素中で残存し得る。好ましい組み合わせとしては、限定するものではないが、１４４および３３０が挙げられる。好ましい実施形態において、配列番号６の１４４位または３３０位に、唯一の天然のシステイン残基が残存している。
【０１６６】
配列番号６における５つのシステイン残基のうちの１つ以上は、好ましくは、アラニン、セリン、メチオニンまたはスレオニンで置換されている。配列番号６における５１位のシステイン残基は、より好ましくは、アラニンで置換されている。配列番号６における９８位のシステイン残基は、より好ましくは、セリンまたはスレオニンで置換されている。配列番号６における１４４位のシステイン残基は、より好ましくは、メチオニンまたはスレオニンで置換されている。配列番号６における３０６位のシステイン残基は、より好ましくは、セリンまたはスレオニンで置換されている。配列番号６における３３０位のシステイン残基は、より好ましくは、スレオニンで置換されている。最も好ましい実施形態において、配列番号６における５１位のシステイン残基は、アラニンで置換されており、配列番号６における９８位のシステイン残基は、スレオニンで置換されており、配列番号６における１４４位のシステイン残基は、スレオニンで置換されており、配列番号６における３０６位のシステイン残基は、スレオニンで置換されており、配列番号６における３３０位のシステイン残基は、スレオニンで置換されている。
【０１６７】
核酸処理酵素は、好ましくは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０のうちのいずれか１つに示される配列またはその変異体を含む。配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０の変異体は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０の配列とは異なるアミノ酸配列を有し、その核酸処理能力を保持するタンパク質である。上記で考察したように、配列番号６の変異体が配列番号６とは異なるのと同じ程度に、変異体は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０と異なり得る。しかしながら、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０の変異体は、野生型酵素と比較して行われた変更を含む必要がある。例えば、配列番号８、１０および１２の変異体は、配列番号８、１０および１２と同じ残基を、９８、１４４、３０６および３３０位に含む必要がある。配列番号１４および１６の変異体は、配列番号１４および１６と同じ残基を、４２、５１、９８、１４４、３０６および３３０位に含む必要がある。配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０の変異体は、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０と同じ残基を、５１、９８、１４４、１８４、３０６および３３０位に含む必要がある。
【０１６８】
核酸処理酵素は、典型的には、好ましい方向性の側鎖を有するその表面接近可能な１つ以上の残基を介して、成分と結合する。配列番号６における以下の残基は、それらが覆い隠されてしまい、溶媒と接近することができないか、または、リンカーとの結合がタンパク質球状構造の重大な妨害をもたらし得ることから、結合点として使用されるべきでない：１３、１０１、１０４、１１１、１１４、１１５、１１７、１９０、１９４、１９７、２０８、２３２、２３３、２３６、２４６、２４７、２４８、２５８、２５９、２６１、２６２、２８３、２９８、３０９、３１０、３４７、４０６、および２６７。配列番号６における以下の残基は、ＤＮＡ結合溝部と接近しているので、それらが表面接近可能であったとしても、リンカーと結合するためには良好な場所とはなり得ない：２１、２２、１０３、１０５、１０６、１０７、１０９、１１０、１１４、１１５、１１７、１１８、２３１、２４２、２５２、２５６、２５７、２８５、２８７、２８８、２８９、３００、３０１、３０２、３０４、３０５、３０７、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６８、３６９および３７１。配列番号６における全ての残りの残基は、結合点として潜在的に使用され得る。
【０１６９】
配列番号６における以下の残基は、それらが側鎖を提供し、曝露されて溶媒が接近可能であり、側鎖の変異を予測することにより、タンパク質構造全体の妨害を少なくすることにつながり得ることから、好ましい：８、９、３７、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４７、７６、７７、９６、１５０、１５１、１５３、１５６、１５９、１６１、１７１、１７３、１７６、１７８、１７９、１８４、１９５、１９８、１９９、２００、２０３、２０９、２１８、２２２、２２５、２２７、２５６、２７３、２７５、２７７、２７８、２８０、２８１、２８２、２８５、２９２、２９３、３１１、３１３、３１６、３１８、３２１、３２６、３２７、３２８、３３２、３３５、３３８、３３９、３４０、３４２、３４５、３５３、３７４、３８１、３８５、３８７、３８９、３９０、３９５、３９７、４０１、４１７、４２０、４２３、４２４、４２９、４３２、４３７、４３８、４４１、４４５、４４８、４５２、４５６、４５８、４５９、４６５、４５８、４５９、４６２、４６６および４６７。以下の残基は、結合点として最も好ましい：１８４、８３、４２、９４、９０、１８８、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２および２２３。好ましい結合残基のいずれも、置換により修飾することができる。好ましくは、１つ以上の好ましい結合残基は、システインで置換されている。配列番号６またはその変異体の好ましい置換としては、限定するものではないが、Ｍ１８４Ｃ、Ａ８３Ｃ、Ｖ４２Ｃ、Ｖ９４Ｃ、Ｓ９０Ｃ、Ｙ１８８Ｃ、Ｙ１８８Ｃ、Ａ２１９Ｃ、Ａ２１９Ｃ、Ｍ２１８ＣおよびＭ２１８Ｃが挙げられる。以下でより詳細に考察されるように、本酵素は、１つより多い残基を介して成分と結合することができる。
【０１７０】
核酸結合タンパク質は、１ヶ所、例えば、１、２、３または４ヶ所で、別の成分と結合することができる。核酸結合タンパク質は、好ましくは、１または２ヶ所で結合する。核酸結合タンパク質から天然のシステイン残基を除去した後、１つ以上のシステイン残基を、結合のための特別の部位でタンパク質に取り込ませることができる。２ヶ所での結合は、複合体の柔軟性を低減することができ、選択された特定の方向で、成分上に核酸結合タンパク質を固定することができる。
【０１７１】
好ましい実施形態において、本方法は、（１）大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）または置換Ｍ１８４ＣおよびＶ９４Ｃを有するその変異体を、（２）α−ＨＬ（配列番号２）または置換Ｎ１７ＣおよびＥ２８７Ｃを有するその変異体と結合させることを含む。配列番号６またはその変異体におけるＭ１８４Ｃ位は、配列番号２またはその変異体におけるＮ１７Ｃ位と結合する。配列番号６またはその変異体におけるＶ９４Ｃ位は、異なるリンカーにより、配列番号２またはその変異体におけるＥ２８７Ｃ位と結合する。
【０１７２】
【表２】
2012516145.tif 000003
【０１７３】
膜貫通タンパク質細孔
成分の１つは、好ましくは、膜貫通タンパク質細孔である。膜貫通タンパク質細孔は、付加電位により作動されるイオンが膜の片側から膜のもう一方の側へと流れることを可能にするひとつのポリペプチドまたはポリペプチドのコレクションである。細孔は、好ましくは、ヌクレオチドが、付加電位に沿って、膜の片側から膜のもう一方の側へと流れることを可能にする。細孔は、好ましくは、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡが細孔を通じて押したり引いたりされることを可能にする。
【０１７４】
細孔は、モノマーまたはオリゴマーであり得る。細孔は、好ましくは、６、７または８サブユニット等のいくつかの繰り返しサブユニットから形成される。細孔は、より好ましくは７量体の細孔である。細孔は、典型的には、バレルまたはチャンネルを含み、そこを通じてイオンが流れることができる。細孔のサブユニットは、典型的には、中心軸を取り囲み、膜貫通βバレルまたはチャンネル、もしくは膜貫通α−ヘリックスバンドルまたはチャンネルへと鎖を導く。
【０１７５】
細孔のバレルまたはチャンネルは、典型的には、ヌクレオチドまたは核酸との相互作用を促すアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、好ましくは、バレルまたはチャンネルの狭窄部の近傍に位置する。細孔は、典型的には、１つ以上の、アルギニン、リジンまたはヒスチジン等の正に荷電したアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的には、細孔とヌクレオチドまたは核酸の間の相互作用を促す。ヌクレオチドの検出は、アダプターにより促され得る。このことは以下に、詳細に考察する。
【０１７６】
本発明に関して使用するための細孔は、β−バレル細孔、α−ヘリックスバンドル細孔または固体細孔であり得る。β−バレル細孔は、β−鎖から形成されるバレルまたはチャンネルを含む。好適なβ−バレル細孔としては、限定するものではないが、α−ヘモリジン、炭疽菌毒素およびロイコシジン等のβ−毒素、および、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのポーリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ポーリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポーリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａオートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）等の細菌の外膜タンパク質／ポーリンが挙げられる。α−ヘリックスバンドル細孔は、α−ヘリックスから形成されるバレルまたはチャンネルを含む。好適なα−ヘリックスバンドル細孔としては、限定するものではないが、ＷＺＡ等の内膜タンパク質およびα外膜タンパク質が挙げられる。
【０１７７】
成分は細孔自体であってもよい。あるいは、細孔がオリゴマーである場合、成分は細孔サブユニットであってもよい。成分は、上記したように、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製することができる。
【０１７８】
細孔またはサブユニットは、好ましくは、α−ヘモリジン（α−ＨＬ）に由来する。野生型α−ＨＬの細孔は、７つの同一のモノマーまたはサブユニットから形成される（すなわち、７量体である）。α−ヘモリジンの１つの野生型モノマーまたはサブユニットの配列が、配列番号２に示される。成分は、好ましくは、配列番号２に示される配列またはその変異体を含む。配列番号２のアミノ酸１、７〜２１、３１〜３４、４５〜５１、６３〜６６、７２、９２〜９７、１０４〜１１１、１２４〜１３６、１４９〜１５３、１６０〜１６４、１７３〜２０６、２１０〜２１３、２１７、２１８、２２３〜２２８、２３６〜２４２、２６２〜２６５、２７２〜２７４、２８７〜２９０、および２９４は、ループ領域を形成する。配列番号２の残基１１３および１４７は、α−ＨＬのバレルまたはチャンネルの狭窄（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）部分を形成する。核酸結合タンパク質は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０および５１位のうちの１つ以上と結合している。
【０１７９】
配列番号２の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列とは異なり、その細孔形成能力を保持するアミノ酸配列を有するサブユニットである。変異体の細孔形成能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、変異体をその他の適当なサブユニットと一緒に膜内に挿入してもよく、オリゴマー化して細孔を形成するその能力を測定してもよい。サブユニットを膜、例えば、脂質二重層に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、サブユニットは、それが脂質二重層に拡散し、脂質二重層と結合することにより挿入され、機能し得る状態で集合するように、脂質二重層を含む溶液中、精製された形態で懸濁させてもよい。あるいは、 サブユニットを、Ｍ．Ａ．Ｈｏｌｄｅｎ，Ｈ．Ｂａｙｌｅｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，６５０２−６５０３および国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載される「ピックアンドプレース（ｐｉｃｋ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅ）」法を用いて、膜中に直接挿入してもよい。
【０１８０】
変異体は、核酸結合タンパク質との共有結合または相互作用を促す修飾を含んでもよい。変異体は、好ましくは、核酸結合タンパク質との結合を促す１つ以上の反応性システイン残基を含む。例えば、変異体は、８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７位の１ヶ所以上に、および／または、配列番号２のアミノまたはカルボキシ末端に、システイン残基を含んでもよい。好ましい変異体は、配列番号２の８、９、１７、２３７、２３９および２８７位の残基とシステインの置換を含む（Ｋ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。
【０１８１】
変異体はまた、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促すか、または、以下に記載される分子アダプターの配向を促す、修飾を含んでもよい。変異体はまた、分子アダプターの共有結合を促す修飾を含んでもよい。
【０１８２】
特に、変異体は、好ましくは、配列番号２の１３９位にグルタミンを有する。変異体は、好ましくは、配列番号２の１１９、１２１または１３５位にシステインを有する。配列番号４は、１３５位にアルギニン（Ｌ１３５Ｃ）と１３９位にグルタミン（Ｎ１３９Ｑ）を有していること以外は、配列番号２の配列を示す。配列番号４またはその変異体を用いて、本発明の細孔を形成させてもよい。変異体は、配列番号２の１１３位にアルギニンを有してもよい。
【０１８３】
変異体は、生物によって、例えば、ブドウ球菌によって、天然において発現される天然の変異体であっても、大腸菌などの細菌によって組み換え的に発現されてもよい。変異体はまた、組み換え技術により作製される非天然の変異体を含む。配列番号２または４のアミノ酸配列の全長に亘り、変異体は、好ましくは、アミノ酸同一性に基づく配列に対して、少なくとも５０％相同であり得る。より好ましくは、変異体ポリペプチドは、配列全体に亘って、配列番号２または４のアミノ酸配列に対して、アミノ酸同一性に基づき、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および、より好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。２００個以上、例えば、２３０、２５０、２７０または２８０個以上連続するアミノ酸の幅に亘り、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が存在し得る（「高相同性（ｈａｒｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」）。相同性は、上記のようにして測定することができる。
【０１８４】
上記で考察したものの他に、配列番号２または４のアミノ酸配列に対して、アミノ酸置換を、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０または３０個までの置換を、行うことができる。保存的置換は、例えば、上記表１にしたがって、実施することができる。
【０１８５】
配列番号２のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を、上記したポリペプチドからさらに欠失させてもよい。１、２、３、４、５、１０、２０または３０個までの残基を欠失させてもよく、それ以上であってもよい。
【０１８６】
変異体は、配列番号２または４の断片であってもよい。そのような断片は、細孔形成活性を保持する。断片は、少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸長であり得る。断片は、好ましくは、配列番号２または４の細孔形成ドメインを含む。断片は、典型的には、配列番号２または４の残基１１９、１２１、１３５．１１３および１３９を含む。
【０１８７】
１つ以上のアミノ酸を、上記したポリペプチドに代替的にまたは付加的に追加してもよい。配列番号２または４またはその変異体または断片のアミノ末端またはカルボキシ末端を、伸長させ得る。伸長は、かなり短くても、例えば、１〜１０アミノ酸長であってもよい。あるいは、伸長は、より長くても、例えば、５０または１００アミノ酸までであってもよい。担体タンパク質を、細孔または変異体に融合させてもよい。
【０１８８】
上記で考察したように、配列番号２または４の変異体は、配列番号２または４のアミノ酸配列とは異なり、その細孔形成能力を保持するアミノ酸配列を有するサブユニットである。変異体は、典型的には、細孔形成に関与する配列番号２または４の領域を含む。β−バレルを含むα−ＨＬの細孔形成能力は、各サブユニットにおけるβ−鎖によって提供される。配列番号２または４の変異体は、典型的には、β−鎖を形成する配列番号２の領域を含む。β−鎖を形成する配列番号２または４のアミノ酸については、上記で考察されている。得られた変異体がその細孔形成能力を保持している限り、β−鎖を形成する配列番号２または４の領域に対して１つ以上の修飾を行うことができる。配列番号２または４のβ−鎖領域に対して行うことができる特定の修飾については、上記で考察されている。
【０１８９】
配列番号２または４の変異体は、好ましくは、そのα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に、１つ以上の修飾、例えば、置換、付加または欠失を含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸については、上記で考察されている。
【０１９０】
変異体は、例えば、その同定または精製を支援するために、ヒスチジンまたはアスパラギン酸残基を付加することにより、または、ポリペプチドがそのような配列を天然には含まない場合に、細胞からそれらの分泌を促進するためにシグナル配列を付加することにより、修飾してもよい。
【０１９１】
変異体はまた、核酸結合タンパク質について上記で考察した、非特異的修飾のいずれかを含んでもよい。サブユニットまたは細孔は、上記で考察したようにして作製することができる。
【０１９２】
リンカーおよび基
２つ以上の成分は、それらに共有結合している、上記で規定されるような少なくとも１つのリンカーおよび少なくとも１つの基を有する。リンカーおよび基を成分に結合させる方法は、当技術分野において周知である。リンカーおよび基は、好ましくは、成分と化学的に融合されている。好適な方法としては、限定するものではないが、一級アミン／カルボン酸結合、チオール間反応、非天然アミノ酸間反応、およびシステイン結合が挙げられる。
【０１９３】
本発明の方法は、各成分に、少なくとも１つのリンカーおよび／または少なくとも１つの基を結合させるステップをさらに含んでもよい。
【０１９４】
第１の成分は、好ましくは、１ヶ所以上の位置、例えば、２、３または４ヶ所の位置でリンカーを使用して、第２の成分と結合している。各リンカーのその関連する成分との結合の位置は、成分の相対的可動性を制約するように設計してもよい。成分と結合する位置の数は、最終的な複合体の剛性に影響を及ぼすことになる。
【０１９５】
リンカーおよび／または基は、成分における１つ以上の反応基、例えば、システイン残基、反応性リジン残基または非天然アミノ酸にと結合させてもよい。好ましくは、リンカーおよび／または基は、成分の１つ以上の接近可能なシステイン残基に結合させてもよい。典型的には、リンカーおよび／または基は、１つのシステイン残基から別の残基へのジスルフィド架橋を介して結合している。
【０１９６】
リンカーは、高い親和性のハイブリダイゼーションリンカーである。それらは、少なくとも１つのハイブリダイズ可能な領域を含み、好ましくは、共有結合を形成させることが可能な少なくとも１つの基を含む。特に好ましいのは、低濃度、例えば、ナノモルレベルの親和性で有効であるリンカーである。リンカーの長さ、柔軟性および親水性は、典型的には、それらが、結合する成分の機能を妨げないように設計される。ハイブリダイゼーションリンカーを使用する利点は、成分の不必要なホモダイマーの形成を最小限にすることである。
【０１９７】
ハイブリダイズ可能な領域は、別のリンカーのハイブリダイズ可能な領域とハイブリダイゼーションすることが可能な領域である。ハイブリダイズ可能な領域は、好ましくは、核酸を含む。核酸ハイブリダイゼーションリンカーは、上記した核酸のいずれかを含むことができる。例えば、それらは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、または当技術分野において公知のいずれかの合成核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有するその他の合成ポリマーを含み得る。２つのリンカーをハイブリダイズさせる核酸は、同じであっても、異なっていてもよい。最も好ましいのは、リンカーがＤＮＡを含む。典型的には、各リンカーがＤＮＡを含む場合、少なくとも１つのリンカーは、一本鎖ＤＮＡを含む必要がある。好ましくは、両方のリンカーが一本鎖ＤＮＡを含む。
【０１９８】
ハイブリダイゼーションは、２つ以上のリンカー間、好ましくは、２つまたは３つのリンカー間で有り得る。３つのリンカーが使用される場合、それらはトリプレックスを形成する。リンカーは、様々な立体構造で、例えば、「ヘッドトゥーヘッド」構造または「ヘッドトゥーテール」構造でハイブリダイズすることができる。「ヘッドトゥーヘッド」構造の場合、ハイブリダイズしたリンカーの同じ端部で成分が近接するように、リンカーは整列する。「ヘッドトゥーテール」構造の場合、ハイブリダイズしたリンカーの反対の端部に成分が位置するように、リンカーは整列する。リンカーは任意の好適な三次元立体構造を有することができる。典型的には、リンカーは線状であるが、三角形、または、別の幾何学的立体構造（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の形状であることもできる。
【０１９９】
好ましい核酸ハイブリダイゼーションリンカーは、配列番号５７の５’末端から最初の１５、２５または３５ヌクレオチドに相当する。リンカーはまた、好ましくは、特別な柔軟性を提供するために、３’末端にＴＴを有する。３’末端に、リンカーは、基、例えば、マレイミドまたはチオールを有し、この基は、リンカーが成分と結合することを可能にする。マレイミドまたはチオール修飾されたオリゴヌクレオチドが、市販で、例えば、ＡＴＤＢｉｏから取得することができる。より好ましいリンカーは、配列番号５８、５９および６０に示される。相補的リンカーは、配列番号６１、６２および６３に示される。配列番号５８、５９または６０は、成分の１つと結合させることができ、相補的リンカー（それぞれ、配列番号６１、６２または６３）は、その他の成分と結合する。次に、成分は、リンカーとハイブリダイズさせることにより結合させることができる。
【０２００】
ハイブリダイゼーションの安定性は、ハイブリダイズするリンカーの融点に依存する。用途および必要とされる安定性に応じて、これは、リンカーの配列（例えば、リンカーをよりＧＣリッチに変更すると、それらの融点を上昇させ、したがって、安定性を増大させる）、リンカーの長さ（すなわち、それらの長さを増大させると、安定性を増大させる）、または反応条件（例えば、それらの濃度を増大させると、安定性を増大させる）を変更することにより、最適化することができる。
【０２０１】
ハイブリダイゼーションの最大の安定性のためには、高融点の長いハイブリダイゼーションリンカー、例えば、１５ヌクレオチド長より長い、特に１５〜４５ヌクレオチド長、例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５ヌクレオチド長のリンカーを有することが望ましい。しかしながら、長いリンカーの使用は成分間の距離を増大させる。成分間の相互作用が妨害されることから、あるいは、もう一方の成分から遊離される基質を検出するためには、一方の成分の近接性が要求されることから、このことは、欠点となり得る。凝集または静電的相互作用を防ぐことができ、屈曲することを可能とし得る場合には、増大させた距離は利点となり得る。増大させた距離の欠点は、核酸の結合の向きを変化させることにより克服することができる。最も好ましくは、リンカーは、６〜１５ヌクレオチド長、例えば、６、８または１０ヌクレオチド長である核酸を含む。
【０２０２】
第１および第２のハイブリダイズ可能な領域は、好ましくは、１ｐＭ〜１ｍＭの濃度で、１ｆＭ〜１μＭの親和性を有する。第１および第２のハイブリダイズ可能な領域は、より好ましくは、１ｐＭ〜１μＭの濃度で、１ｆＭ〜１０ｎＭの親和性を有する。第１および第２のハイブリダイズ可能な領域は、最も好ましくは、１００ｐＭ〜１０ｎＭの濃度で、１ｐＭ〜１００ｐＭの親和性を有する。
【０２０３】
好ましい配列は、配列番号６４に示される。このリンカーの３’末端は、表面上のシステイン残基と結合させることができる。リンカーはまた、好ましくは、高い柔軟性を提供するために、３’末端にＴＴＴＴＴを有する。次に、配列番号６５の５’末端は、核酸結合タンパク質と結合させることができる。この例において、配列番号６４の３’末端は、配列番号６５の５’末端において、ある幅の配列に対して相補的である。
【０２０４】
一旦、リンカーが互いにハイブリダイズしたら、２つのリンカー間で持続的な結合が存在しないならば、特定の条件の下（例えば、高温またはより少ない塩という条件の下）、それらは融解する（バラバラになる）。持続的結合を形成させるために、一旦それらがハイブリダイズしたら、それらが互いに反応するように、成分は修飾される。各成分は、別の成分中の基と共有結合を形成することが可能な、それに共有結合している基を有する。上記で考察したように、基は、好ましくは、ハイブリダイゼーションリンカーを介して成分と結合する。１対の成分は、１つ以上の共有結合、例えば、１、２または３つの共有結合によって連結させることができる。
【０２０５】
典型的には、結合は、２つの成分間の単純なジスルフィド結合であることができる。成分またはハイブリダイゼーションリンカーはまた、１ヶ所以上、例えば、２ヶ所でチオール基を取り込ませるように修飾することができる。用途および好みに応じて、チオール基は、内部または末端のいずれかに、リンカー中に取り込ませることができる。
【０２０６】
成分またはハイブリダイゼーションリンカーはまた、１つ以上、例えば、２つのヨードアセトアミド基を含むように修飾することもできる。この場合も、ヨードアセトアミド基は、内部または末端のいずれかに、リンカー中に取り込ませることができる。１つ以上のヨードアセトアミド基を有する成分またはハイブリダイゼーションリンカーは、相補的成分またはハイブリダイゼーションリンカー上のチオールと共有結合することができる。
【０２０７】
成分またはハイブリダイゼーションリンカーは、アルケン基で修飾することもできる。ハイブリダイゼーションリンカー中に取り込ませた場合、アルケン基は内部または末端になり得る。好ましい位置にある１つ以上のアルケン基は、成分またはハイブリダイゼーションリンカーにおけるアルケン間で共有結合を形成するように、オレフィンメタセシスを受け得る。
【０２０８】
必要な場合には、成分またはハイブリダイゼーションリンカーと、反応性基、例えば、チオール基、ヨードアセトアミド基およびアルケン基との間に、成分またはハイブリダイゼーションリンカー間の効率的な共有結合を形成するのに必要な適当な距離を得るために、小さなリンカーを加えることができる。
【０２０９】
好ましい実施形態において、成分またはハイブリダイゼーションリンカー間の共有結合は、クリック化学を用いて形成させることができる。クリック化学とは、小規模および大規模用途の両方において確実に機能する、強力で、選択的、かつモジュール式の広範なビルディングブロック群を表すために、Ｋｏｌｂらによって、２００１年に最初に導入された用語である（Ｋｏｌｂ  ＨＣ，Ｆｉｎｎ，ＭＧ，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆｅｗ  ｇｏｏｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０（２００１）２００４-２０２１）。それらは、以下の通りに、クリック化学のための厳しい基準を規定している：「反応は、モジュール式であって、範囲が広く、非常に高い収率を得、クロマトグラフィー以外の方法で除去し得る無害の副生成物のみを生成し、かつ立体特異的である必要がある（しかし、エナンチオマー選択的である必要はない）」。要求されるプロセス特性としては、単純な反応条件（理想的には、プロセスは、酸素および水に対して非感受性である必要がある）、容易に入手可能な出発物質および試薬、溶媒の不使用または無害である（例えば、水）か、容易に除去される溶媒の使用、および単純な生成物の単離が挙げられる。要求される場合には、精製は、クロマトグラフィー以外の方法、例えば、結晶化または蒸留による必要があり、生成物は、生理学的条件下で安定である必要がある。
【０２１０】
クリック化学の好適な例としては、限定するものではないが、以下：
（ａ）１，３双極子環状付加反応の銅不含変法、この場合、アジドが、緊張状態（ｕｎｄｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）、例えば、シクロオクタン環のアルキンと反応する；
（ｂ）１つのリンカーにおける酸素求核基の他のリンカーにおけるエポキシドまたはアジリジン反応性成分の反応；および
（ｃ）シュタウディンガー連結反応、この場合、アルキン成分はアリールホスフィンと置換することができ、これにより、アジドと特定の反応をし、アミド結合を生じる。
【０２１１】
好ましくは、クリック化学反応は、Ｃｕ（Ｉ）によって触媒されるアルキンとアジドとの間の１，３双極子環状付加反応である。好ましい実施形態において、第１の基はアジド基であり、第２の基はアルキン基である。核酸塩基は、アジドおよびアルキン基を好ましい位置に取り込ませることによって、これまでに合成されている（例えば、Ｋｏｃａｌｋａ  Ｐ，Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒ  ＡＨ，Ｂｒｏｗｎ  Ｔ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｙ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００８．９（８）：１２８０−５）。アルキン基はＢｅｒｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）から市販で入手することができ、アジド基はＡＴＤＢｉｏによって合成されている。
【０２１２】
リンカーの核酸領域内のヌクレオチドが、共有結合を形成し得る基を含むように修飾された場合、修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、連結を達成するために、１つのヌクレオチドで互いに埋め合わされる。このことは、Ｔｏｍ  Ｂｒｏｗｎの発表された仕事へとつながる（Ｋｏｃａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ  ９  ８  １２８０−１２８５）。
【０２１３】
好ましい実施形態において、単一のアジド基（配列番号６６）またはそれ以上、例えば、２つのアジド基（配列番号６７）を、１５塩基デオキシリボ核酸配列内の特定の場所のウラシル塩基に取り込ませることができる。次に、成分のシステイン残基を、５’末端のチオール基（配列番号６６および６７）を用いるこれらのアジドハイブリダイゼーションリンカーで修飾することができる。アルキン基もまた、配列番号６６および６７に対して相補的な配列（それぞれ、配列番号６８および６９）の好ましい位置のウラシル塩基に取り込ませることができる。これらの配列は、成分の１つにおけるシステインと結合させることができる。ＤＮＡハイブリダイゼーション、それに続くアジドとアルキン基との間の「クリック化学」を用いることにより、ハイブリダイゼーションリンカーを共有結合的に架橋させることができる。成分間の距離をハイブリダイゼーションリンカーの長さを変化させることによって調節した場合、アジドおよびアルキンが修飾された塩基の場所を、それに応じて変化させる必要がある。
【０２１４】
好ましい実施形態において、２つのウラシル塩基がアジド基で修飾されている６量体（配列番号７０）、８量体（配列番号７１）または１０量体（配列番号７２）ＤＮＡは、成分のシステインと結合することができる。２つのウラシル塩基がアルキン基で修飾されている６量体（配列番号７３）、８量体（配列番号７４）または１０量体（配列番号７５）ＤＮＡの相補配列は、ＤＮＡ結合タンパク質などの成分のシステインと結合することができる。これらのハイブリダイゼーションリンカーを用いることにより、本発明のその他の好ましいハイブリダイゼーションリンカー、例えば、配列番号６７および６９を用いるよりも、成分を互いにより接近させ得る。アジドおよびアルキン基のＤＮＡのウラシル塩基単位への取り込みは、ＡＴＤＢｉｏによって開発された。
【０２１５】
本発明において使用するためのその他の好ましい基は、以下の表３に示される。
【０２１６】
【表３】
2012516145.tif 000004
【０２１７】
条件
成分は、初めに、第１および第２のハイブリダイズ可能な領域が成分とハイブリダイズし、連結させることが可能な条件下で、接触させる。ハイブリダイゼーションが可能となる条件は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；および、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９５））。ハイブリダイゼーションは、例えば、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌおよび１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液の存在下、３７℃にて行い、次に、１Ｘ（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）〜２Ｘ（０．３３Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）、５０℃にて洗浄することによる、低ストリンジェンシー条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌおよび１％  ＳＤＳの緩衝溶液の存在下、３７℃にて行い、次に、０．５Ｘ（０．０８２５Ｍ  Ｎａ＋）〜１Ｘ（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣ、５５℃にて洗浄することによる、中度ストリンジェンシー条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳの緩衝溶液の存在下、３７℃にて行い、次に、０．１Ｘ（０．０１６５Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣ、６０℃にて洗浄することによる、高ストリンジェンシー条件下で行うことができる。好ましい条件は、実施例１に記載されるものである。
【０２１８】
連結した成分を、次に、第１および第２の基の間の共有結合の形成が可能となる条件に曝露する。これらの条件は、当然、用いられる基に依存する。反応は、好ましくは、ｐｈ７．０未満で行われる。好ましい条件は、実施例１に記載されるものである。
【０２１９】
１つ以上の成分が酵素、例えば、核酸結合タンパク質である場合、酵素の活性は、好ましくは、結合および連結反応時に阻害される。マグネシウム依存性酵素、例えば、エキソヌクレアーゼＩは、ＥＤＴＡにより、またはＣａＣｌ２により阻害され得る（Ｌｅｈｍａｎ（１９６０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５  ５  １４７９−１４８７および内部データ）。
【０２２０】
好ましい成分の組み合わせ
好ましい実施形態において、第１の成分はタンパク質であり、第２の成分はレポーター基である。好適なレポーター基としては、限定するものではないが、光学的または蛍光標識、立体タグ、質量の増加、電荷の変化、スピン標識、放射標識、磁気基、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２２１】
別の好ましい実施形態において、第１の成分はタンパク質であり、第２の成分はアフィニティータグである。アフィニティータグの例は、当技術分野において周知である。好適なアフィニティータグとしては、限定するものではないが、Ｈｉｓ−ＮＴＡ、ＦＬＡＧ−抗体−Ｍ２、ｍｙｃ、ＳＴｒＥＰ−ストレプトアビジン、ＮＡＮＯ−ストレプトアビジンおよびビオチン−アビジンが挙げられる。
【０２２２】
別の好ましい実施形態において、第１の成分はタンパク質であり、第２の成分は支持体である。支持体の例は、当技術分野において周知である。好適な支持体としては、限定するものではないが、金属表面、ポリマービーズ、磁気ビーズ、ガラス、修飾ガラスおよびシリカゲルが挙げられる。
【０２２３】
好ましい実施形態において、第１の成分は、少なくとも１つの天然の接近可能なシステイン残基を有する大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）またはその変異体を含み、第２の成分は、α−ＨＬ（配列番号２）またはその変異体を含む。より好ましい実施形態において、第１の成分は、その天然の接近可能な全てのシステイン残基が除去されている大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）または全てのその変異体を含み、第２の成分は、α−ＨＬ（配列番号２）またはその変異体を含む。より好ましい実施形態において、第１の成分は、１４４位および／または３３０位に唯一の天然のシステイン残基を有する大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）またはその変異体を含み、第２の成分は、α−ＨＬ（配列番号２）またはその変異体を含む。より好ましい実施形態において、第１の成分は、全てのその天然の接近可能なシステイン残基は除去されていて、Ａ８３Ｃを有する大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）またはその変異体を含み、第２の成分は、Ｅ２８７Ｃを有するα−ＨＬ（配列番号２）またはその変異体を含む。
【０２２４】
好ましい実施形態において、第１の成分は、少なくとも１つの天然の接近可能なシステイン残基が除去されている大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）またはその変異体を含み、第２の成分は、Ｌ１３５ＣおよびＮ１３９Ｑ（例えば、配列番号４）を有するα−ＨＬまたはその変異体を含む。より好ましい実施形態において、第１の成分は、全てのその天然の接近可能なシステイン残基が除去されている大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）またはその変異体を含み、第２の成分は、Ｌ１３５ＣおよびＮ１３９Ｑ（例えば、配列番号４）を有するα−ＨＬまたはその変異体を含む。より好ましい実施形態において、第１の成分は、１４４位および／または３３０位に唯一の天然の接近可能なシステイン残基を有する大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）またはその変異体を含み、第２の成分は、Ｌ１３５ＣおよびＮ１３９Ｑ（例えば、配列番号４）を有するα−ＨＬまたはその変異体を含む。より好ましい実施形態において、第１の成分は、全てのその天然の接近可能なシステイン残基は除去されていて、Ａ８３Ｃを有する大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）またはその変異体を含み、第２の成分は、Ｌ１３５Ｃ、Ｎ１３９ＱおよびＥ２８７Ｃを有するα−ＨＬまたはその変異体を含む。
【０２２５】
生成物
本発明はまた、本発明の方法を用いて結合させた第１および第２の成分と、上記で規定される第１および第２のリンカーを用いて第２の成分と結合させた第１の成分を提供する。本発明はさらに、上記で規定される第１および第２のリンカーの対を提供する。リンカーは、好ましくは、共有結合を形成することが可能な基を含む。本発明の方法に関連して上記された実施形態のいずれも、本発明の生成物に対して同様に適用することができる。
以下の実施例で本発明を説明する：
【実施例】
【０２２６】
１．  実施例１
１．１  材料および方法
この明示において、アジド官能基およびアルキン官能基が、銅（Ｉ）触媒存在下で互いに反応し、銅により触媒されるアルキンアジド付加環化反応（ＣｕＡＡＣ）においてトリアゾール環を形成する。
【０２２７】
硫酸銅（ＩＩ）、アスコルビン酸ナトリウム、ＭＯＰＳ遊離酸、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウムおよびＥＤＴＡは、例えば、Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ社等の標準的な研究室の供給業者から最高級のものを入手した。銅（Ｉ）結合リガンド（図１１に示す）。
【０２２８】
チオール末端基または、内部アジドまたはアルキン基を伴うオリゴヌクレオチド、は、ＡｔｄＢｉｏ（Ｓｏｕｔｈａｎｐｔｏｎ、ＵＫ）から得られ；非修飾オリゴヌクレオチドはＡｔｄＢｉｏまたはＩＤＴＤＮＡ（Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得た。オリゴヌクレオチドの配列は配列番号６４〜７８で示される。全ての相補的なオリゴヌクレオチドの場合、修飾塩基は、１塩基ずつ順に相互に補完されて連結を達成する。
【０２２９】
１．２  ハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションするとき、このハイブリダイゼーションは、緩衝液中でオリゴヌクレオチドを、４℃で少なくとも１時間インキュベーションすることにより行った。１５塩基長のオリゴヌクレオチドに対しては、この緩衝液は、１００ｍＭのＭＯＰＳ，ｐＨ６．８または１００ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０であり得た。これより短いオリゴヌクレオチドに対しては、１０００ｍＭのＮａＣｌを含有させた。酵素阻害剤（１０ｍＭのＥＤＴＡまたは２０ｍＭのＣａＣｌ２）を加える場合、これは１００ｍＭのリン酸，ｐＨ６．８（ＥＤＴＡに対して）または１００ｍＭのＭＯＰＳ，ｐＨ６．８（ＥＤＴＡまたはＣａＣｌ２のいずれか）中に含有させた。
【０２３０】
１．３  連結反応
４℃にて一晩（１５ｂｐ以上の二本鎖について）、または１時間の（６〜１０ｂｐの二本鎖について）のハイブリダイゼーション後に、連結反応を実施した。連結反応は、第１の予め混合した銅（ＩＩ）イオン、アスコルビン酸還元剤、および銅（Ｉ）結合リガンドにより達成した。３つの成分を適当な濃度で混合し、最終的な状態を達成した。例えば、最終的に必要とされる状態が、１００μｌの反応容量中に１ｍＭの銅、２ｍＭのアスコルビン酸、１ｍＭのリガンドである場合、相当する容量の１００ｍＭの硫酸銅（水溶液）、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（ｐＨ＜７．０である緩衝溶液）、および１００ｍＭのリガンド（水溶液）を特定の順序で混合し、次いで、３μｌの得られた混合物を１００μｌの反応へと添加した。この添加後に、反応液を４℃、暗所にて少なくとも６０分間放置した。
【０２３１】
【表４】
2012516145.tif 000005
【０２３２】
１．４  結合反応
オリゴヌクレオチドをタンパク質へと結合するために、オリゴヌクレオチドをまず活性化する必要がある。この手順は、供給されるオリゴヌクレオチドの化学的特性を、タンパク質に対して不活性なものから、タンパク質に対して活性なものへと変化させる。この工程は、連結反応に何ら差異を生じない。
【０２３３】
必要であれば、オリゴヌクレオチドは、ジスルフィド結合を通じてタンパク質へと結合した。これは、活性化させた５倍過剰量のオリゴヌクレオチドを、還元したてのタンパク質と１時間、３７℃（エキソヌクレアーゼに対して）、または室温で一晩（ナノ細孔に対して）インキュベーションすることにより達成した。全ての場合において、アジド塩基を含有するオリゴヌクレオチドは、ナノ細孔に結合（モノマーにおけるＥ２８７Ｃを介して）し、アルキン塩基を含有するオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに結合（Ａ８３Ｃを介して）した。ストレプトアビジン親和性ビーズ上で精製を行うことにより、未反応のＤＮＡを除去した。
【０２３４】
１．５  タンパク質の結合
精製された修飾タンパク質は、オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを促進するために、設計された条件下で共にインキュベートした。１５塩基以上のオリゴヌクレオチドに対しては、この緩衝液は１００ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ６．８または１００ｍＭのナトリウムリン酸  ｐＨ７．０であり得た。酵素阻害剤が必要とされる場合、１００ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ６．８に２０ｍＭのＣａＣｌ２を添加した。６〜１０塩基のオリゴに対しては、緩衝液は１００ｍＭのＭＯＰＳ、１０００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＣａＣｌ２  ｐＨ６．８であった。
【０２３５】
連結反応は、上述の通りに行い、これらの条件は酵素活性と両立するものであることが示されている。
【０２３６】
【表５】
2012516145.tif 000006
【０２３７】
２．  実施例２
２．１      材料および方法
２．１．１  概説
確率的センシングを用いて核酸の配列決定を行う１つの方法は、α−ＨＬ細孔へと結合させたエキソヌクレアーゼの使用である。これは、２つのタンパク質間に化学的な連結を導入することによりなされ得る。化学的連結は、エキソヌクレアーゼ上の１つのシステインを、ヘモリジン上の１つのシステインへと、直接的に（ジスルフィド結合）、または２つのシステイン残基間にリンカー分子を介して、結合させる。
【０２３８】
制御され、方向付けられたアプローチで化学的連結を導入するためには、エキソヌクレアーゼＩ内部に見出される５つの天然システイン残基を、別の残基へと置換することが必要であった。そこで、システイン残基の結合点を導入するために、付加的な変異が作製されることとなった。好適な結合位置を同定するために、コンピューターモデリングを使用した（下記参照）。
【０２３９】
２．１．２  Ｅｘｏ  Ｉ  ＣＹＳノックアウト変異モデリング
分子モデリングは、大腸菌Ｅｘｏ  Ｉの５つの野生型システイン残基における、タンパク質の安定性と両立する変異を予測するための試みにおいて用いられている。この目的を達成するため、錬金術的な自由エネルギーの摂動シミュレーションが行われ、これらの変異に関し行われた場合におけるそれらの相対的安定性に関する予測を可能にする。これらの予測が実験作業の手引きとして用いられた。
【０２４０】
ＮＡＭＤと組み合わせたＶＭＤが、野生型における錬金術的な自由エネルギーの摂動計算を実施するためのＣＨＡＲＭＭ２７  ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄと組み合わせて用いられた。
【０２４１】
大腸菌Ｅｘｏ  Ｉタンパク質構造（ＰＤＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｄｅ：  １ｆｘｘ［１４］）においてＣＹＳをＸＸＸに置換する変異が決定された。得られたラムダｖｓ．  デルタＧ曲線が、変異における自由エネルギー変化および、その計算が収束しているかどうかを決定するために用いられた。
【０２４２】
２．１．３  発現および精製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ遺伝子であるｓｃｓＢ（配列番号：５および６）のコドンを最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手した。適合された様式でＰＣＲ産物のインビボ相同組換え（Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．  Ｈ．  ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  （１９９４）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３．  ｐｐ１４１−１４８）を行うことにより、システイン残基の部位特異的突然変異誘発を行った。対象遺伝子を含有するプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと形質転換した。２リットルの冷却つき震盪フラスコ中に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈを含む培養液に、寒天プレートから得たコロニーを接種して、０．２ｍＭのＩＰＴＧにより低温（１８℃）下で誘導を行う前にＯＤ６００＝２となるまで（約６時間）生育させた。４Ｋにおける遠心分離によって細胞を収穫し、次いで、ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて溶菌した。細胞残渣を１０Ｋにおける遠心分離によって除去し、上清をＨｉｓＴｒａｐ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へと載せた。溶出したタンパク質をさらにゲル濾過により精製した。
【０２４３】
２．１．４  酵素アッセイ
エキソヌクレアーゼＩ（Ｅｘｏ  Ｉ）アッセイは、ｄＴを１５番目の位置でフルオレセイン色素（「Ｆｌｕｏｒ」）にて、および、１番目の位置でフルオレセインの消光剤（「ＢＨＱ１」）にて標識したオリゴデオキシヌクレオチド（ＤＮＡテンプレート）を利用する。テンプレートは、最初には、フルオレセインと消光剤が近傍に存在することにより消光状態で存在する。Ｅｘｏ  Ｉを導入することにより、ＤＮＡテンプレートは、３′末端から前進的に消化され、最終的にｄＴ−Ｆｌｕｏｒを溶液中に遊離して、色素が消光剤から拡散することにより、結果として蛍光が増加することを導く（図６）。
【０２４４】
アッセイを実施するために、ＤＮＡテンプレートをキュベット中に移し、Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ中に設置して、所望の温度で平衡化させる。一方、ウォーターバスを用いてＥｘｏ  Ｉを別個に平衡化し、次いで、テンプレートを含有するキュベットに添加する。その結果増加する蛍光シグナルを、抽出される初速度の増加によって経時的にモニターする（実験データについては図７参照）。蛍光に基づく速度を分子としての速度に変換するために、テンプレートが完全に消化された後のエンドポイント蛍光を、ＤＮＡテンプレートの初発量で補正する
【０２４５】
２．２      結果
２．２．１  Ｅｘｏ  Ｉ  ＣＹＳノックアウト変異モデリング
変異モデリングの結果を下表にまとめる。
【０２４６】
【表６】
2012516145.tif 000007
【０２４７】
【表７】
2012516145.tif 000008
【０２４８】
【表８】
2012516145.tif 000009
【０２４９】
これらの部位のそれぞれにおける明白な変異（ＣｙｓからＳｅｒ）が、エネルギー的に優位である（肯定的に予測されるデルタＧ）とは推測されないことが、上述の表から明確である。タンパク質を安定化することが予測される変異は、それらの異なる位置環境の結果として、非常に多様である。
【０２５０】
我々は活性および発現データの両方を保持してはいるが、このことが直接的にはこれらの表におけるデルタＧと関連していないことは留意されるべきである。デルタＧ値は、変異がタンパク質のフォールディング経路を顕著に変化させないと仮定される場合には、（ＤＳＣから得られるもの等の）熱力学的データと関連し得るものである（文字通りの錬金術的なＦＥＰにおける多くの適用において当てはまることが見出されている）。発現とデルタＧ変異または活性との間に直接的な関連は存在しない。
【０２５１】
ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片およびＥｃｏＥｘｏ  Ｉ［１４］の結晶構造の比較は、タンパク質触媒および金属結合に関与する残基がＡｓｐ１５、Ｇｌｕ１７、Ａｓｐ１０８、Ａｓｐ１８６およびＨｉｓ１８１であることを示唆する。
【０２５２】
Ａｓｐ［１，２］、Ｇｌｕ［１，２］、Ｌｙｓ［３，４，５］、Ａｒｇ［６，７，８］、Ｈｉｓ［９，１０］、Ｔｙｒ［１１，１２］、Ｔｒｐ［１１，１２］およびＭｅｔ［１３］を含む、Ｃｙｓ以外の残基タイプも、化学的に修飾され得る。したがって、Ｅｘｏ  Ｉの方向付けされた化学的修飾を可能にするためにこれらの残基を変異させることは、我々が競合する化学反応を取り除くことを可能にする。
【０２５３】
実験作業（下記参照）は、これらの変異の多くが、それらの活性を保持するタンパク質中にもたらされ、いくつかのケースにおいては、単変異または突然変異の組み合わせのいずれかとして、活性を向上させるように見えることを示す。大腸菌Ｅｘｏ  Ｉ配列と、他の関連するＥｘｏ  Ｉタンパク質配列との比較、および、これらの配列のホモロジーモデルの構築により、これらのＣｙｓ残基の多くが、配列および構造の両方において保存されていることを示唆する。このことは、大腸菌Ｅｘｏ  ＩのＣｙｓ変異体の特性が、関連するＥｘｏ  Ｉ酵素の同様の変異体に対し、あてはまり得ることを示唆する。
【０２５４】
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースにおける、Ｅｘｏ  Ｉ酵素の配列アラインメントは、Ｃ５１、Ｃ９８、Ｃ１４４およびＣ３０６が保存されていることを示す。
【０２５５】
２．２．２  ５つのシステイン残基の同定
エキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）は、５つの天然のシステイン残基を含む（図１）。システイン残基のうちのいくつかは、大腸菌のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｃｏＥｘｏＩ）のその他のホモログ内で保存されている（以下参照）。エキソヌクレアーゼＩ内のシステイン残基のいずれも、内部ジスルフィド結合は形成しない。
【０２５６】
２．２．３  セリンへの変異による全ての５つのシステインの除去
セリン（Ｓｅｒ）アミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）と構造において最も類似しており、Ｓ原子がＯにより置換されている。したがって、最も自明な変異はＣｙｓ（Ｃ）からＳｅｒ（Ｓ）である。この変異体における活性を試験するために、全ての５つのシステイン残基をセリンに変異させ、タンパク質発現を試みた。
【０２５７】
ＯＮＬＤ０２１７（Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ５１Ｓ／Ｃ９８Ｓ／Ｃ１４４Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｓ）の発現により、低収量、乏しい発現、および不安定なタンパク質がもたらされた。タンパク質は精製することができなかった。このことは、全てのＣｙｓがＳｅｒへと置換された場合には、タンパク質が安定ではないことを立証する。システインを含まないＥｃｏＥｘｏ  Ｉを設計するためには、タンパク質構造のさらなる研究が必要とされた。このことは、部分的には、コンピューターモデリングにより手引きされた。
【０２５８】
２．２．４  セリンへの変異による、個々のシステインの置換
置換を容認し得るシステインの位置を同定するために、個々のシステイン残基をセリン残基で順に置き換えた。
【０２５９】
構築物ＯＮＬＤ０２３３（Ｃ５１Ｓ）、ＯＮＬＤ０２３４（Ｃ９８Ｓ）、ＯＮＬＤ０２３５（Ｃ１４４Ｓ）、ＯＮＬＤ０２３６（Ｃ３０６Ｓ）、ＯＮＬＤ０２３７（Ｃ３３０Ｓ）を発現させた。変異体Ｃ９８Ｓは十分なレベルまで発現した。数回の試みの後に、十分なレベルのＣ３０６Ｓもまた達成された。しかし、その他の全ての位置における発現レベルは、かなり低減した。
【０２６０】
したがって、エキソヌクレアーゼ活性を試験され得るように、十分な発現レベルを産生するための別の変異が考慮された。システインを、高度に接触可能な位置  （Ｃ９８、Ｃ３０６、Ｃ３３０；図２）と、より埋没された残基（Ｃ５１、Ｃ１４４）へとグループ分けした。
【０２６１】
２．２．５  セリン代替物によるＣ３０６およびＣ３３０の置換
３０６および３３０の位置におけるシステイン残基の置換を、以下の変異体における実験によって調べた。
Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ３０６  →Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ
Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ３３０  →Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｑ
ＯＮＬＤ０３３５（Ｃ３０６Ｔ）の発現レベルは最も高かった。この位置におけるその他の変異はＳ、ＤおよびＮであった。
ＯＮＬＤ０３４２（Ｃ３３０Ｔ）の発現レベルは最も高かった。この位置におけるその他の変異はＨ、Ｑおよび、より低い程度ではＤ、Ｎ、ＬおよびＹであった。
【０２６２】
２．２．６  Ｃ３０６ＳおよびＣ３３０ＴとＣ９８Ｓの組み合わせ
互いに悪影響を及ぼす二重および三重変異において、以下の組み合わせを調査した。
【０２６３】
【表９】
2012516145.tif 000010
【０２６４】
ＯＮＬＤ０３６６の組み合わせは、最も高い発現を与え、次いでＯＮＬＤ０３６８であった。ＯＮＬＤ０３６５およびＯＮＬＤ０３６３の組み合わせのみが、発現しなかった。ＯＮＬＤ０３６７、ＯＮＬＤ０３６４からの収量は、より低かった。
【０２６５】
活性アッセイ（方法を参照）は、Ｅｘｏ  Ｉ変異体の相対活性が野生型よりも高いことを示した（３）。
【０２６６】
２．２．７  システイン結合点の導入
結合点は、エキソヌクレアーゼＩの相当するシステインに対して直接的に、または、リンカーを介して、α−ＨＬからの共有結合を形成するように設計された。モデリングを介して予測された結合点（Ｖ４２Ｃ、Ａ８３Ｃ、Ｓ９０Ｃ、Ｖ９４Ｃ、Ｍ１８４Ｃを図４に示す。
【０２６７】
上記のシステインを変異体  Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ、Ｃ３０６Ｓ、Ｃ３３０Ｔへと導入することにより、以下の構築物が与えられる：
【０２６８】
【表１０】
2012516145.tif 000011
【０２６９】
シゲルシフト試薬として作用するマレイミド−ＰＥＧと反応させることにより、ステインの活性を調べた。得られるゲルは、各タンパク質が反応性のシステインを有することを示した。このデータは、Ｃ１４４およびＣ５１におけるシステインが、先に仮定された以上に接近しやすく、マレイミド−ＰＥＧと反応することを示した。タンパク質が１つの位置のみで反応することを促すようにＣ１４４およびＣ５１を置換するために、さらなる回の変異が実行された。
【０２７０】
２．２．８  セリン代替物によるＣ１４４の置換
合計１８の変異体（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｙ）から、分子モデリングを用いて、可能性がある変異を調べた。モデリングから予測される、残基１４４における６つの最も安定な変異体が得られた：
Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ、Ｃ３０６Ｓ、Ｃ３３０Ｓ、Ｃ１４４→Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｍ
【０２７１】
試験された６つの変異体のうち、（ＯＮＬＤ０４０３）  Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ１４４Ｍおよび（ＯＮＬＤ０４０４）  Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ１４４Ｔが良好に発現した。その他の変異体における発現レベルは低減されていた。
【０２７２】
２．２．９  セリン代替物による残基Ｃ５１の置換
合計１７の変異体（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）．から、分離モデリングを用いて、可能性がある変異体を調べた。モデリングから予測される、残基５１における８つの最も安定な変異体を作製した：
Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ、Ｃ３０６Ｓ、Ｃ３３０Ｓ、Ｃ５１→Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｗ
試験した８つの変異体の中で、（ＯＮＬＤ０３９３）  Ｅｘｏ  Ｉ  Ｃ９８Ｓ／Ｃ３０６Ｓ／Ｃ３３０Ｔ／Ｃ５１Ａのみが発現した。
【０２７３】
２．２．１０  ５つのシステイン置換の組み合わせと付加的な結合点
以下の組み合わせを調べた。これらは、５つのシステイン置換とシステイン結合点結合を含むものだった。結合は、Ｎ末端またはＣ末端に付加されたシステインに対して形成され得るものであった。
【０２７４】
【表１１】
2012516145.tif 000012
【０２７５】
Ｎ−末端のシステイン残基を有する（２つの変異体ＯＮＤ０４１３、ＯＮＬＤ０４１４）は、発現しなかった。全てのその他の組み合わせは、発現し、活性を有するエキソヌクレアーゼであった。ＯＮＬＤ０４１５およびＯＮＬＤ０４１７の組み合わせは、ＯＮＬＤ０４１６およびＯＮＬＤ０４１８よりも発現が低かった。活性の結果を図５に示す。
【０２７６】
以下の組み合わせについても評価した。
【０２７７】
【表１２】
2012516145.tif 000013
【０２７８】
２．２．１１  タンパク質のＤＳＣ分析
示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ（ＤＳＣ））は、サンプル内の熱遷移の測定を可能にする手法である。その主要な用途は、生分子の、遷移中点としての熱安定性の測定である。遷移中点は、熱安定性のマーカーとして用いられる。
【０２７９】
５つのシステインが全て置換された初期の変異体（Ｅｘｏ−ＡＳＴＳＴ）は、非常に不安定であり、時間とともに、活性が高損失することがわかった。Ｔｍは、野生型の４９℃に対し、３５℃であると決定された。
【０２８０】
さらなる回の変異体スクリーニングに続いて、Ｔｍが４０℃で、長期に渡る安定性が非常に向上した酵素Ｅｘｏ−ＡＴＴＴＴが同定された。別の組み合わせ、例えばＥｘｏ−ＡＴＴＭＴとＥｘｏ−ＡＶＴＡＴは、同様であるが向上はされていない４０℃のＴｍを有していた。
【０２８１】
変異体ＡＶＴＭＴは、ほんのすこし高いＴｍを有することが見出されたが、同様の条件下で、より凝集しやすい傾向を有することがわかった。
【０２８２】
結合の目的で付加される、好ましい非天然システインの付加（Ａ８３Ｃ）は、安定性において悪影響を有するようには見受けられない。
【０２８３】
【表１３】
2012516145.tif 000014
【０２８４】
２．２．１２  対象となるその他の変異：Ｃ１４４ＩおよびＣ３３０Ｉ
Ｃ１４４は、Ｅｘｏ−ＩのＤＮＡ結合部位および触媒部位の両方に隣接する。最適な組み合わせを見出すために、残基Ｃ１４４およびＣ３３０はその他のシステイン残基ほどは変異されていない。タンパク質配列の解析および既知のモデリング作業に基づいて、以下の２つのタンパク質（ＡＴＴＴＴおよびＡＴＩＴＩ）のモデルを構築した。
【０２８５】
ＡＴＴＴＴおよびＡＴＩＴＩを比較するモデリング作業は、Ｔ３３０側鎖はタンパク質の２次構造をほとんど崩壊させないことを示唆する。しかし、Ｔ１４４は、このＴ１４４側鎖が反転するときには破壊されるとみられる疎水性のコアを伴ってパッキングされ、コアに対し顕著な破壊をもたらす。ＡＴＩＴＩモデルシミュレーションはＴ１４４周辺における同程度の破壊を示さない。
【０２８６】
２．２．１３  酵素活性
調べられた構築物は、Ｅｘｏ−ＡＴＴＴＴ−Ａ８３Ｃであった。これらの試験で用いたリンカーは、５’末端がフリーであり３’末端に酵素が結合しているｓｓＤＮＡリンカーである。結合したｓｓＤＮＡリンカーを用いてＥｘｏ−ＡＴＴＴＴ−Ａ８３Ｃの活性を測定し、次いで、ＤＴＴを添加することによりリンカーを除去して、活性を再度測定した。活性における変化は観察されず、リンカーの存在が活性に対して有害な影響を与えていないことが確認された（図８）。この実験において、Ｅｘｏ−ＡＴＴＴＴ−Ａ８３Ｃの活性を、遊離の酵素およびＰＮＡ修飾酵素で比較した。ＰＮＡリンカーの添加により、活性の損失は観察されなかった（図９）。Ｅｘｏ  ＡＴＴＴＴ−Ｍ１８４Ｃ（ＰＥＧを伴う）。対照はＰＥＧ存在下でのＥｘｏ  ＡＴＴＴＴであった。ＰＥＧリンカーの添加により、活性の損失は観察されなかった（図１０）。
【０２８７】
２．３      結論
我々は、全てのシステインが除去されている一定範囲のＥｃｏＥｘｏ  Ｉ変異体を創出した。さらに、ＥｘｏＥｃｏ  Ｉの結合親和性を制御するために、単独のシステインを導入した。いくぶん驚いたことに、変異体のいくつかにおける活性は、野生型よりも高かった。
【図１】
2012516145.tif 000015
【図２】
2012516145.tif 000016
【図３】
2012516145.tif 000017
【図４】
2012516145.tif 000018
【図５ａ】
2012516145.tif 000019
【図５ｂ】
2012516145.tif 000020
【図６】
2012516145.tif 000021
【図７】
2012516145.tif 000022
【図８】
2012516145.tif 000023
【図９】
2012516145.tif 000024
【図１０】
2012516145.tif 000025
【図１１】
2012516145.tif 000026
【配列表】
2012516145000001.xml
【国際調査報告】
2012516145.tif 000043
2012516145.tif 000044
2012516145.tif 000045
2012516145.tif 000046
2012516145.tif 000047