(57)【要約】  本発明は、オリザ・サティバ（栽培品種Ｒａｓｉ）から単離されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）遺伝子配列および植物における改善された窒素利用効率という形質を付与するそれらの対応するコードポリペプチドに関する。本発明はさらに、改善された窒素利用効率を有するトランスジェニック植物、植物細胞、植物材料、または植物の種子の作製におけるこれらの核酸分子およびポリペプチドの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大した窒素含有量または窒素利用効率を示す形質転換植物を作製するための方法であって、機能的なグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）酵素をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトを植物のゲノムに組み込むことを含む、方法。
【請求項２】
前記機能的なグルタミン酸デカルボキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列が配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターが、配列番号１に示すヌクレオチド配列に機能的に連結された構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、および細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択されたプロモーターが誘導性プロモーター由来であり、かつ栄養枯渇、機械的衝撃、湛水、塩、渇水、暑さ、寒さ、損傷、酸素欠乏、病原菌、紫外線Ｂ、開花シグナル、結実シグナル、細胞特化、およびそれらの組合せからなる群から選択されるシグナルに応答する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
選択されたプロモーターが組織特異的プロモーター由来であり、葉、茎、根、花、花弁、葯、胚珠など、およびそれらの組合せからなる群から選択される植物組織で発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
選択されたプロモーターが細胞型特異的プロモーター由来であり、柔組織、葉肉、木部、師部、孔辺細胞、気孔細胞など、およびそれらの組合せからなる群から選択される植物細胞で発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼ酵素が配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記配列番号２に示すアミノ酸配列が、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）への反応を触媒するのに効果的である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記形質転換植物が、同じ種の形質転換されていない植物によって同じ条件下で発現されるＧＡＤ遺伝子のレベルよりも高いレベルで配列番号１に示すグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）遺伝子を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的植物が、単子葉植物、双子葉植物、穀草類、飼料作物、マメ科植物、豆類、野菜、果物、油糧種子、繊維作物、観賞用草花、園芸植物、薬用植物、および芳香植物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡコンストラクトを植物のゲノムに組み込むことが、
（ｉ）宿主植物由来の細胞、組織、または器官を前記ＤＮＡコンストラクトで形質転換すること、
（ｉｉ）前記ＤＮＡコンストラクトを含む形質転換細胞、細胞カルス、体細胞胚、または種子を選択すること；
（ｉｉｉ）前記選択された形質転換細胞、細胞カルス、体細胞胚、または種子から全植物を再生すること；および
（ｉｖ）ポリヌクレオチドを発現する再生された全植物を選択すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
宿主植物由来の細胞組織または器官が、パーティクルガン、バイオリスティック、またはアグロバクテリウムを用いて伝達されるＤＮＡコンストラクトで形質転換される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の得られた形質転換植物およびその子孫。
【請求項１４】
前記配列番号１に示すＤＮＡコンストラクトが、ヘテロ接合またはホモ接合の状態で植物に組み込まれている、請求項１３に記載の形質転換植物。
【請求項１５】
前記植物が、栄養枯渇、機械的衝撃、湛水、塩、渇水、暑さ、寒さ、損傷、酸素欠乏、病原菌、およびそれらの組合せからなる群から選択される環境ストレス下で顕著に増大した窒素含有量または窒素利用効率を示す、請求項１〜１４に記載の形質転換植物。
【請求項１６】
ＧＡＤ酵素をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された構成的プロモーターを含むベクターで形質転換した植物、またはその子孫であって、前記植物が前記ポリヌクレオチドを発現し、前記植物が、形質転換されていない植物と比較して、顕著に改善された窒素含有量、窒素利用効率、成長特性、収量、生殖機能、または他の形態学的もしくは農学的特徴を示す、植物、またはその子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）から単離されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）遺伝子配列および植物の窒素摂取と窒素利用効率を強化する方法。
【背景技術】
【０００２】
作物用植物は過去１万年にわたって開発されてきたが、この間ほとんど多量施肥されなかった。しかしながら、ここ５０年で、世界中の作物用植物の窒素施肥が２０倍を超えて増加している。この肥料の使用は、一般に非効率的であり、約５０％しか収穫される作物中に回収されない。作物用植物は、窒素栄養が高い条件下で進化したものではなく、その機構の多くは、必ずしもそのような栄養下での成長に適しているとは限らない。それゆえ、我々の知識や今日我々に利用可能な実験技術に基づいて、作物用植物による窒素利用の効率を改善することができるのかという疑問が生じる。２つの方法が可能であるように思われる。１つ目は、遺伝子プール中の利用可能な窒素利用特性の変異を最大限に利用すること、２つ目は、その変異を増大させ得る新たな遺伝子を導入することである。
【０００３】
植物による窒素利用効率の増加は、いくつかの有益な効果を有するであろう。例えば、窒素利用効率の高い植物は、貧窒素土壌で従来の植物よりも良好に成長し、収穫をあげることができるであろう。窒素効率の高い植物を使用すれば、作物に窒素肥料を添加する必要性が減るであろう。施肥は作物生産に伴う費用のかなりの割合を占めるので、そのような肥料使用の減少は、直接的な金銭的節約となるであろう。
【０００４】
施肥の減少はまた、大々的な窒素肥料使用によって生じる環境被害を軽減させるであろう。こうした窒素肥料使用の環境への有害な影響は、富栄養化の増加、酸性雨、土壌酸性化、および温室効果という形で現れる。
【０００５】
従来技術
基礎的な植物生化学と植物生理学によって、Ｎ供給との関連で作物生産システムをより良く理解する手段が提供されている。二酸化炭素（ＣＯ２）および硝酸（ＮＯ３−）の同化とそれらの動態の相互作用は、作物生産に決定的に重要である。ＮＯ３−の十分な供給、そのアミノ酸への同化（これには光合成炭素化合物が必要とされる）、およびそれらのタンパク質合成への利用可能性は、代謝に必要不可欠である。ＮＯ３−の十分な供給により、葉の成長と光合成が刺激されるが、前者は細胞の成長と分裂によって、後者は光反応のより多くの構成要素と、ＣＯ２同化および関連プロセスのより多くの構成要素とによって行なわれる。しかしながら、代謝と収量の関連性は定量化しにくい。肥料Ｎの適用、Ｎの利用効率、および収量を改善するためには、生化学的特徴とシミュレーションモデルをよりうまく利用し、組み合わせなければならない。Ｎが十分にあり、遺伝的能力が十分に発揮されれば、単位Ｎ当たりより多くのＣ同化によって、バイオマスが増加するであろう。
【０００６】
遺伝的潜在能力は、環境的制約が取り除かれたときに、植物がバイオマスを形成するまたは収穫をあげる全能力として定義し得る。育種家および農学者は生産力と呼ぶことが多いが、いかにして作物の潜在的成長を増加させ得るかを考える場合は、総生産量の方がより関連性がある。生産力は、タンパク質の特性を特定する遺伝情報、それが決定する構造、成長や発達、およびその系が成長できる大きさの関数である。成長周期を通したこの最大限の大きさを遺伝的潜在能力と呼び得る。
【０００７】
本質的な点は、遺伝的潜在能力に達するのに必要とされるよりもＮ供給が少ないとき、より多くのバイオマスを得るために増加させなければならないのはＮ摂取であるということである。あるいは、蓄積したＮの単位当たりのＣ同化を増加させることができ、その結果として、より少ないＮ蓄積からより多くのバイオマスが得られるであろう。バイオマスの遺伝的潜在能力を高めるのは、理論的には、Ｃ／Ｎ比の増加を犠牲にして、蓄積したＮ当たりのＣ同化を増加させることによって達成することができる。これは、十分な光エネルギーが利用可能であることを前提としたものである。Ｃ同化とのバランスを変化させずに、より多くのＮが同化されるならば、これによって、理論的には、バイオマスが増加し、かつ現在のＣ／Ｎ比が維持されることになるであろう。
【０００８】
植物学者は、栄養をより効率的に吸収および利用する作物を開発する必要性を長く認識してきた。作物用植物での栄養利用効率（ＮＵＥ）を増加させるために２つのアプローチが用いられている。１つ目は、伝統的な育種と、関与する遺伝子を同定するためのマーカー利用選抜の両方を含む。２つ目は、ＮＵＥの特定の側面を改善するように設計された新規の遺伝子コンストラクトを使用する。
【０００９】
硝酸還元酵素
窒素同化経路の２つの連続する酵素段階によって、硝酸がアンモニアに還元される。硝酸は、硝酸還元酵素（ＮＲ）によってまず亜硝酸に変換され、その後、亜硝酸は細胞質から葉緑体に移され、そこで亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ）によってアンモニアに還元される。ＮＲ遺伝子の発現は、植物中のいくつかの内在性因子と環境因子により影響を受け、転写レベル、翻訳レベル、および翻訳後レベルで高度に調節される。要するに、ＮＲの過剰発現は、解析される組織中の硝酸のレベルを低下させるように思われる。植物中でのＮＲ遺伝子またはＮｉＲ遺伝子のいずれかの過剰発現は、ｍＲＮＡレベルを増加させることが示唆されており、Ｎ摂取に影響を及ぼすことが多い。 しかしながら、Ｎ摂取の増加は、利用可能な窒素源が何であれ、植物の生産量または成長を増加させないように思われる。これは、１つには、ＮＲおよびその経路の調節が全体として複雑であることが原因であると考えられる。
【００１０】
グルタミン合成酵素およびグルタミン酸合成酵素
高等植物のアンモニア同化におけるグルタミン合成酵素（ＧＳ）とグルタミン酸合成酵素（ＧＯＧＡＴ）という酵素対の主な役割の発見［Ｍｉｆｌｉｎ  ＆  Ｌｅａ，１９７６］の後、いくつかの研究室が、この経路の調節を制御するメカニズムを理解することに焦点を当てている［Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００］。さらに、これらのタンパク質の植物発達への影響を明らかにするために、およびＧＳ多重遺伝子ファミリーの異なるメンバーの発現を研究するために、ＧＳ／ＧＯＧＡＴのレベルを変化させた突然変異体またはトランスジェニック植物が作製されている。いくつかの研究から、トランスジェニック植物におけるＧＳ活性の増強とバイオマスまたは収量の直接的相関が示されている。ＧＳに比べ、ＧＯＧＡＴ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物の産生を記載した報告はわずかしかない。アルファルファＧＯＧＡＴ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物は、ＧＯＧＡＴタンパク質含有量の増加を示したが、 この形質と関連する表現型を少しも示さなかった。
【００１１】
ＧＡＢＡシャント
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、細菌から植物および脊椎動物まで保存されている４炭素非タンパク質アミノ酸である。ＧＡＢＡは遊離アミノ酸プールの重要な成分である。ＧＡＢＡは、α−炭素上ではなくγ−炭素上にアミノ基を有し、非結合形態で存在する。ＧＡＢＡは水によく溶け、構造的には、プロリンに似た環状構造を含む、いくつかの立体構造を溶液中でとることができる柔軟な分子である。ＧＡＢＡは、生理的ｐＨ値（ｐＫ値４．０３および１０．５６）で双性イオンとなる（正負両方の電荷を持つ）。
【００１２】
ＧＡＢＡは半世紀余り前に植物で発見されたが、ＧＡＢＡが脳で高レベルに生じ、神経伝達において大きな役割を果たすことが明らかになったとき、ＧＡＢＡへの関心は動物に移った。それ以来、脊椎動物のＧＡＢＡに関する研究は、特に神経伝達における、シグナル伝達分子としてのその役割に主に焦点が当てられた。植物および動物において、ＧＡＢＡは、ＧＡＢＡシャントと呼ばれる、３つの酵素から構成される短い経路を介して主に代謝されるが、それは、この経路がトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の２つの段階を迂回するからである。この経路は、細胞質酵素のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）ならびにミトコンドリア酵素のＧＡＢＡトランスアミナーゼ（ＧＡＢＡ−Ｔ）およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）から構成されている。この保存された代謝経路の調節は、植物の独自の特徴を有しているように思われる。
【００１３】
ＧＡＢＡを介してグルタミン酸をコハク酸に変換する経路はＧＡＢＡシャントと呼ばれる。このシャントの第１の段階は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、ＥＣ  ４．１．１．１５）による直接的かつ不可逆的なグルタミン酸のα−脱カルボキシル化である。インビトロでのＧＡＤ活性は、多くの植物種および植物組織からの粗抽出物で特徴解析されている（Ｂｒｏｗｎ  ＆  Ｓｈｅｌｐ，１９８９）。ＧＡＤは、Ｌ−グルタミン酸に特異的であり、リピドキサル５’−リン酸依存的であり、スルフヒドリル基と反応することが知られている試薬によって阻害され、カルモジュリン結合ドメインを有し、約５．８のはっきりとした酸性至適ｐＨを示す。ペチュニア（Ｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、トマト（Ｇａｌｌｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、タバコ（Ｙｕ  ＆  Ｏｈ，１９９８）、およびアラビドプシス（Ｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）由来のＧＡＤ遺伝子が同定されている。ＧＡＢＡシャントに関与する第２の酵素であるＧＡＢＡトランスアミナーゼ（ＧＡＢＡ−Ｔ；ＥＣ  ２．６．１．１９）は、ピルビン酸またはα−ケトグルタル酸のいずれかをアミノ酸受容体として用いて、ＧＡＢＡのコハク酸セミアルデヒドへの可逆的変換を触媒する。粗抽出物では、インビトロでのＧＡＢＡ−Ｔ活性は、α−ケトグルタル酸よりもピルビン酸を好むように見える。しかしながら、別個のピルビン酸依存的活性とα−ケトグルタル酸依存的活性とがタバコ葉の粗抽出物中に存在しており、これらはイオン交換クロマトグラフィーで互いに分離することができる（Ｖａｎ  Ｃａｕｗｅｎｂｅｒｇｈｅ  ＆  Ｓｈｅｌｐ）。両活性とも、８〜１０の幅広い至適ｐＨを示す。約１０００倍に精製された、タバコ由来のピルビン酸特異的ミトコンドリアＧＡＢＡ−Ｔのミカエリス定数（Ｋｍ）は、ＧＡＢＡについては１．２ｍＭ、ピルビン酸については０．２４ｍＭである（Ｖａｎ  Ｃａｕｗｅｎｂｅｒｇｈｅ  ＆  Ｓｈｅｌｐ）。
【００１４】
ＧＡＢＡシャントの最後の段階は、コハク酸セミアルデヒドをコハク酸に不可逆的に酸化する、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ；ＥＣ  １．２．１．１６）によって触媒される。部分精製された植物酵素は、約９のアルカリ性至適ｐＨを有し、活性は、ＮＡＤを用いる方がＮＡＤＰを用いるよりも最大２０倍大きい（Ｓｈｅｌｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【００１５】
実際のところ、植物のＧＡＢＡシャントへの関心は、主に、ＧＡＢＡが生物ストレスと非生物ストレスに応答して大量にかつ速やかに産生されるという実験的観察から起こった。それ以来、ＧＡＢＡシャントは、細胞質ｐＨの調節、ＴＣＡ回路への炭素移動、窒素代謝、虫の抑止、酸化ストレスからの保護、浸透圧調節、およびシグナル伝達をはじめとする様々な生理的応答と関連付けられている。
【００１６】
本発明において、本発明者らは、植物でＧＡＢＡが発見されて以来今日まで蓄積されてきたこれらのおよび他の知見と、主にアラビドプシスの機能ゲノミクスアプローチから得られた、植物でのシグナル分子としてのＧＡＢＡの果たし得る役割、ならびに植物のストレス応答における役割および炭素：窒素（Ｃ：Ｎ）バランスにおける役割を指摘した最近の証拠とを結び付けている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のアグロバクテリウム媒介性形質転換によって植物（単子葉植物および双子葉植物）における窒素利用効率を増加させる方法に関する。さらに、本発明は、植物を改変して窒素利用効率に関する遺伝子を発現させる方法、およびこの方法を用いて産生された植物に関する。
【００１８】
今回初めて、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を用いて植物の窒素摂取と窒素利用効率を増加させる方法が示されている。さらに、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵素、グルタミン合成酵素、またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼのような遺伝子が用いられている。ＧＡＢＡシャント経路に関与する遺伝子、特にグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いて植物の窒素利用効率を増加させる試みは今日まで行なわれていない。多くの研究が、植物の炭素・窒素バランスや窒素同化におけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素の作用に焦点を当てており、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの重要性が見直されている（Ｍｉｆｌｉｎ  ＆  Ｈａｂａｓｈ  ２００２）。しかしながら、過去の試みは、イネ由来の２つのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子であるＯｓＧＡＤ１とＯｓＧＡＤ２に対して行なわれたものであり、これらの遺伝子がアグロバクテリウムを介してイネカルスに同時に導入され、矮小発育、黄化葉、および不稔などの異常な表現型を有するイネ植物を産生するトランスジェニック細胞株が樹立された（Ａｋａｍａ  ＆  Ｔａｋａｉｗａ，２００７）。
【００１９】
それゆえ、低窒素条件下で成長するときに効率的に窒素を利用する必要性が存在する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を有する植物形質転換ベクターを示す。
【図２】アグロバクテリウム媒介性遺伝子導入を介したＧＡＤ遺伝子によるタバコ葉の形質転換の様々な段階を示す。
【図３】様々なプライマー組合せ、すなわち、ａ）ＨｙｇＲ遺伝子フォワードおよびリバースプライマー；ｂ）遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマー、ならびにｃ）遺伝子フォワードおよびＮＯＳリバースプライマーを用いて、ＧＡＤ遺伝子で形質転換され、再生されたタバコのＴ０苗のＰＣＲによる確認を示す。
【図４】ＧＡＤ遺伝子特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型とするＲＴ-ＰＣＲを用いて解析されたＧＡＤ遺伝子を有するタバコのＴ０苗における導入遺伝子（ＧＡＤ）の発現確認を示す。
【図５】対照植物と比較したＴ０世代の様々なトランスジェニック植物の葉における全体の窒素含有量パーセントを示す。
【図６】Ｎ源を含まないが、一方で、Ｎが様々な濃度の硝酸アンモニウム（２、４、および８ｍＭ）として個別に与えられる１／１０  ＭＳ培地を補充して温室で成長させ、クロロフィル含有量について野生型と比較した３つのＧＡＤトランスジェニック体（Ｄ１Ａ、Ｅ２、およびＨ１）由来のＴ１苗の植物Ｎ状態を示す。ミノルタＳＰＡＤメーターを用いて測定し、ＳＰＡＤ単位として表した。これらの値は、５本の苗（生物学的試料）と各々の苗（実験試料）に対する３回の測定とから得られたものである。
【図７】Ｎ源を含まないが、一方で、Ｎが様々な濃度の硝酸カリウム（２、４、および８ｍＭ）として個別に与えられる１／１０  ＭＳ培地を補充して温室で成長させ、クロロフィル含有量について野生型と比較した３つのＧＡＤトランスジェニック体（Ｄ１Ａ、Ｅ２、およびＨ１）由来のＴ１苗の植物Ｎ状態を示す。ミノルタＳＰＡＤメーターを用いて測定し、ＳＰＡＤ単位として表した。これらの値は、５本の苗（生物学的試料）と各々の苗（実験試料）に対する３回の測定とから得られたものである。
【図８】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の草高の比較を示す。
【図９】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の節間距離の比較を示す。
【図１０】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の枝の数の比較を示す。
【図１１】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の葉の数の比較を示す。
【図１２】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の茎の周囲長の比較を示す。
【図１３】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の葉面積の比較を示す。
【図１４】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の乾燥重量ベースでの総バイオマス（葉、茎、および根）の比較を示す。
【図１５】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の単位乾燥重量ベースでの葉の総Ｎ％の比較を示す。
【図１６】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の単位乾燥重量ベースでの窒素利用効率（ＮＵＥ）の比較を示す。
【図１７】様々なレベルのＮ肥料（１００％推奨用量（ＲＤ）、５０％ＲＤ、および１０％ＲＤ）と一定レベルのＰ肥料およびＫ肥料とを含む温室の植木鉢で成長させたときのハイグロマイシン耐性陽性のＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗と野生型苗の総穀粒収量の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の本発明の詳細な説明は、当業者が本発明を実施するのに役立つように提供されている。それでも、本明細書で論じられる実施形態の変更および改変が、本発明の精神または範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得るので、以下の本発明の詳細な説明は、本発明を過度に限定するものとみなされるべきではない。
【００２２】
本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼの特徴を有する精製および単離されたＤＮＡ配列に関する。
【００２３】
本発明によれば、この精製および単離されたＤＮＡ配列は、通常、グルタミン酸デカルボキシラーゼのヌクレオチド配列またはその断片からなる。
【００２４】
任意の手段で産生することができる、上記の配列または断片の相補配列も同様に、本発明に含まれる。
【００２５】
上記の配列の変異体、すなわち、１つ以上のヌクレオチドが同じ特徴を有する別のヌクレオチドにより置換される保存的ヌクレオチド置換によって参照配列と異なっているヌクレオチド配列が本発明に包含される。
【００２６】
本発明によれば、上記のヌクレオチド配列は、発現ベクター内でプロモーターと目的の遺伝子とを含む配列の５’末端と３’末端の両方に位置することができる。
【００２７】
本発明に含まれるのは、本発明の産生される植物の窒素利用効率を増加させるときの上記の配列の使用である。「窒素利用効率」とは、好適な条件下で宿主植物にＤＮＡ配列を導入した後、この配列が、該ＤＮＡ配列をトランスフェクトしていない対照植物と比較して、植物中の窒素レベルを増大させることができることを意味する。
【００２８】
以下の定義は本発明の理解を助けるために用いられる。
【００２９】
「染色体」とは、細胞の内部に見られるＤＮＡとタンパク質の組織化された構造体のことである。
【００３０】
「クロマチン」とは、真核細胞の核の内部に見られるＤＮＡとタンパク質の複合体のことであり、これによって染色体が構成されている。
【００３１】
「ＤＮＡ」またはデオキシリボ核酸は、遺伝情報を含む。これは、様々なヌクレオチドで構成されている。
【００３２】
「遺伝子」とは、所与の成熟タンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列のことである。「遺伝子」は、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーター、またはエンハンサーなどの、非翻訳隣接領域を含まないものとする。
【００３３】
「プロモーター」とは、遺伝子の発現を制御する核酸配列のことである。
【００３４】
「エンハンサー」とは、遺伝子の位置または方向とは無関係に遺伝子の転写を開始するように働く遺伝子の配列を指す。
【００３５】
本明細書における「ベクター」の定義は、その中に外来ＤＮＡ断片を挿入し得るＤＮＡ分子を指す。ベクターは、通常、プラスミドから得られるが、これは、ＤＮＡ断片を宿主細胞内に運ぶ「分子キャリア」のように機能する。
【００３６】
「プラスミド」とは、細菌やいくつかの他の生物に見られる小さいＤＮＡ環のことである。プラスミドは、宿主細胞染色体とは独立に複製することができる。
【００３７】
「転写」とは、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を指す。
【００３８】
「翻訳」とは、メッセンジャーＲＮＡからのポリペプチドの合成を意味する。
【００３９】
「方向」とは、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの順序を指す。
【００４０】
「遺伝子増幅」とは、他の遺伝子のコピー数を比例的に増加させることなく、特定の遺伝子を繰り返し複製することを指す。
【００４１】
「形質転換」とは、任意の導入手段によって外来遺伝物質（ＤＮＡ）を植物細胞に導入することを意味する。様々な形質転換方法には、遺伝子銃による衝撃（バイオリスティック）、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム媒介性形質転換などが含まれる。
【００４２】
「形質転換植物」とは、外来ＤＮＡが該植物に導入されている植物を指す。このＤＮＡは宿主染色体の一部となる。
【００４３】
「安定な遺伝子発現」とは、目的の遺伝子を永久に発現する安定な形質転換植物の調製が、プラスミドの宿主染色体への安定な組込みに依存することを意味する。
【００４４】
本発明は、広く上で定義された通りのものであるが、本発明はそれらのものに限定されるものではないこと、および本発明は以下の説明によって例が示される実施形態も含むことが当業者には理解されるであろう。
【実施例】
【００４５】
実施例１
イネ由来のＧＡＤ遺伝子ヌクレオチド配列の単離および精製ならびに植物形質転換ベクターの構築
ＧＡＤ遺伝子を３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターの下流にクローニングし、ＮＯＳターミネーターで終結させる。これらのプロモーターおよびターミネーターは全て機能的に連結されている。
【００４６】
植物材料
オリザ・サティバ（栽培品種Ｒａｓｉ）を核酸の調製に使用した。発芽した後、種子を培養室の水耕溶液中で成長させた。苗を１５０ｍＭのＮａＣｌで７〜１６時間処理した。
【００４７】
ＲＮＡ抽出およびＥＳＴライブラリー構築
ＲＮＡを苗全体から抽出した。塩ストレスを与えたＲａｓｉのｃＤＮＡのＥＳＴライブラリーを構築した。グルタミン酸デカルボキシラーゼとの同一性を示すＥＳＴをＥＳＴライブラリーから同定した。
【００４８】
ＧＡＢＡシャント内の遺伝子の同定および単離
高等植物では、酸性化、酸素欠乏、低温、熱ショック、機械的刺激、病原菌による攻撃、渇水、および塩ストレスなどの種々のストレスの発生後にＧＡＢＡが蓄積する。ＧＡＢＡシャント内の遺伝子であるグルタミン酸デカルボキシラーゼは、塩ストレスを与えたＯ．サティバのライブラリーから単離された。
【００４９】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子をクローニングベクターにクローニングし、構成的プロモーターの下にある植物形質転換ベクター（バイオリスティックおよびバイナリー）にもクローニングした。グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の完全なコード配列をコードするｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位およびＥｃｏＲＩ制限酵素部位（下線を付したヌクレオチド配列）でタグを付けた以下のプライマー対を用いてインディカイネ（栽培品種Ｒａｓｉ）のｃＤＮＡから増幅した。
フォワード：５'−ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴＣＴＣ−３'
リバース：５'−ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＴＴＧＧＴＣＣＴＣＴＴＧ−３'
【００５０】
以下のＰＣＲ条件を用いる。９４℃、１分；９４℃、３０秒；７５℃、３分（５サイクル）；９４℃、３０秒；６８℃、３分（３０サイクル）、最後の伸張は６８℃、７分。
【００５１】
増幅されたｃＤＮＡは１４７９塩基対のヌクレオチドからなり、成熟グルタミン酸デカルボキシラーゼ酵素をコードする。
【００５２】
増幅された断片をｐＧＥＭＴ  ｅａｓｙベクターにクローニングした。遺伝子をＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位で制限消化し、バイオリスティックベクターｐＶ１に連結した。このバイオリスティックベクターをＢｇｌＩＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位で切り出し（ＢｇｌＩＩ酵素とＢａｍＨＩ酵素はアイソシゾマーである）、遺伝子の存在を確認した。遺伝子をシーケンシングでも確認した。得られたベクター（ｐＶ１−ＧＡＤ）は、選択マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子とともに、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓ  ＣａＭＶ）プロモーターで駆動されるＧＡＤ遺伝子（１．４７９ｋｂ）とＮＯＳターミネーターとを有する。
【００５３】
３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーターで駆動され、ＮＯＳターミネーターによって終結させられる、ｐＶ１−ＧＤ由来のＧＡＤ遺伝子の遺伝子カセットをＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位で制限消化した。この遺伝子カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位で制限消化したｐＣＡＭＢＩＡ  １３９０  ｐＮＧ１５に連結した。得られたベクター（ｐＡＰＴＶ  １３９０−ＧＡＤ）は、選択マーカーとしてのｎｐｔＩＩ（カナマイシン耐性）遺伝子およびｈｐｈ遺伝子（ハイグロマイシン耐性）とともに、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓ  ＣａＭＶ）プロモーターで駆動され、ＮＯＳターミネーターによって終結させられるＧＡＤ遺伝子（１．４７９ｋｂ）を有する（図１）。
【００５４】
実施例２
変化したＧＡＤ遺伝子を有し、より高いＮ含有量を有する植物の作製
植物形質転換
遺伝子が同定されたという考えを証明するために、アグロバクテリウムを介してグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子をタバコ（モデル植物）に形質転換した。
【００５５】
ＧＡＤ遺伝子を含むバイナリーベクターによるタバコ葉外植片のアグロバクテリウム媒介性形質転換に関わる詳細な工程：
１．ベクター骨格がＫａｎ耐性遺伝子とＲｉｆ耐性遺伝子（これらは１回で終わる二重選択としても機能する）からなるので、アグロバクテリウムの陽性コロニーを、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｋａｎ）と１０ｍｇ／Ｌのリファマイシン（Ｒｉｆ）を含むＬＢブロスに播種した。
２．次に、このブロスを、シェーカー上で、２８℃でインキュベートした。
３．午前中に、一晩成長させたコロニーを、５０ｍｇ／ＬのＫａｎと１０ｍｇ／ＬのＲｉｆを含む５０ｍＬのＬＢブロスに播種し、２８℃で３〜４時間インキュベートし、６００ｎｍでＯＤをチェックし、ＯＤが０．６〜１になるまで成長させ続けた。
４．ブロスが所要のＯＤに達した時点で、このブロスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
５．上清を捨て、細胞ペレットをＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇｅ（ＭＳ）液体培地（Ａｇｒｏ−ＭＳブロス）に溶かした。
６．タバコの葉を、中肋を取らずに四角い小片（これは外植片の役割を果たした）に切り、注意を払って、播種物の中心部分にあまり傷をつけないようにして、葉の四方に傷をつけた。
７．これらの葉試料をＢＯＤインキュベーター内のＭＳ無添加培地中に２日間置いた。播種の２日後、これらの葉試料に、形質転換したアグロバクテリウム細胞（この時、これはＡｇｒｏ−ＭＳブロス中に入れられている）を感染させた。
８．葉の外植片をこのＡｇｒｏ−ＭＳブロス中に３０分間置いた後、それらを共栽培培地（これは、ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌ  ６−ベンジルアミノプリン塩酸塩（ＢＡＰ）＋０．２ｍｇ／Ｌ  ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）＋２５０ｍｇ／Ｌ  セフォタキシムからなる）上に２日間置いた（図２ａ）。
９．共栽培の後、外植片を第１の選択培地（これは、ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ＋０．２ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ＋４０ｍｇ  Ｈｙｇ＋２５０ｍｇ／Ｌ  セフォタキシムからなる）中で１５日間維持し、カルスが隆起し始めたとき、カルスを十分成熟させるために、これらの外植片を第１の選択培地上で再び継代培養した（図２ｂ）。
１０．カルスが成熟したことが分かった時点で、これらのカルスを第２の選択培地（これは、ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ＋０．２ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ＋５０ｍｇ  Ｈｙｇ＋２５０ｍｇ／Ｌ  セフォタキシムからなる）上に播種した。ハイグロマイシン濃度が増加しているので、第１の選択を逃れたものが抑制されるようになり、形質転換カルスのみがこの培地上で生存し始める。
１１．その後、この第２の培地上で継代培養を１０日間で１回行なった。
１２．この時までに、小植物体がカルスから隆起し始めた。第２の選択から得た小植物体を採取し、発根培地（これは、１／２  ＭＳ＋０．２ｍｇ／Ｌ  インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）からなる）上に置いた。ここで、これらの小植物体は１２〜１５日までに根を突き出し始めた。逃れたものをこの段階でも同定することができるので、成熟根が形成された時点で、２０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む発根培地上で植物を継代培養した（図２ｃ）。
１３．この段階の植物を、植物がその成長室環境に適応するように瓶の蓋を２日間開けたままにして、環境に順応させた。その後、寒天培地から得た植物を取って、１／４  ＭＳ液体培地中に２日間置いた。これらの植物をさらにバーミキュライト上に移し、１週間毎日水をやった。
１４．植物の状態に応じて、好適な植物を温室に移した。
１５．植物を温室に移す前の環境順応期に、植物から古い葉を採集した。
１６．それぞれの葉試料からＤＮＡを抽出し、遺伝子特異的プライマーと、選択マーカー遺伝子、すなわち、ハイグロマイシンのプライマーとを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲで確認した陽性植物をさらに温室に移した。
【００５６】
導入ＧＡＤ遺伝子を有する植物の確認
ＧＡＤタバコトランスジェニック株のゲノムＤＮＡ抽出
トランスジェニックＧＡＤタバコ植物の葉試料を採集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５７】
ゲノムＤＮＡ抽出の手順：
・約１ｇｍの葉を各植物から採集した。
・液体窒素を用いて乳棒と乳鉢で試料をすりつぶした。
・１ｍｌの抽出バッファー（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｃｌ  ｐＨ８．０；２Ｍ  ＮａＣｌ；０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ；２％  ＣＴＡＢ）を試料に加え、１３０００ｒｐｍで１０分間回転させた。
・上清を回収した。ＲＮアーゼ［１ｍｌに対して３μｌ（１ｍｇ／ｍＬ）］を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
・次に、等量のクロロホルム−イソアミルアルコールを加え、１３０００ｒｐｍで１０分間回転させた。上清を新しいチューブに回収し、等量の冷イソプロパノールを加え、１３０００ｒｐｍで１０分間回転させた。
・ペレットを７０％アルコールで洗浄し、ペレットを乾燥させ、オートクレーブした温水３０μｌに溶かした。
・１μｌのＤＮＡを充填し、ゲル上でチェックした。
【００５８】
トランスジェニック植物を、様々なプライマー組合せを用いるＰＣＲによって確認した：
１．ハイグロマイシンフォワード（Ｈｙｇ  Ｆ）プライマーとハイグロマイシンリバース（Ｈｙｇ  Ｒ）プライマーを用いるＰＣＲ：
【００５９】
【表１】
2012507262.tif 000002
ＰＣＲ条件：（エッペンドルフ装置）
【００６０】
【表２】
2012507262.tif 000003
図３ａに示すように、増幅産物を０．８％アガロースゲルで可視化した。
【００６１】
２．遺伝子特異的プライマーのＧＡＤフォワード（ＧＤ  Ｆ）とＧＡＤリバース（ＧＤ  Ｒ）を用いるＰＣＲ：
【００６２】
【表３】
2012507262.tif 000004
ＰＣＲ条件：（エッペンドルフ装置）
【００６３】
【表４】
2012507262.tif 000005
増幅産物を０．８％アガロースゲルで可視化した（図３ｂ）。
【００６４】
３．ＧＤ  ＦとＮｏｓ  ＭＲを用いるＰＣＲ：
【００６５】
【表５】
2012507262.tif 000006
ＰＣＲ条件：（エッペンドルフ装置）
【００６６】
【表６】
2012507262.tif 000007
図３ｃに示すように、増幅産物を０．８％アガロースゲルで可視化した。
【００６７】
様々なＰＣＲ反応で使用されるプライマー配列を以下に列挙する：
Ｈｙｇ  Ｆ：５'−ＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＧＴＣＴ−３'
Ｈｙｇ  Ｒ：５'−ＣＣＡＣＴＡＴＣＧＧＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣ−３'
ＧＤ  Ｆ：５'−ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴＣＴＣ−３'
ＧＤ  Ｒ：５'−ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＴＴＧＧＴＣＣＴＣＴＴＧ−３'
ＮＯＳ  ＭＲ：５'−ＧＡＴＡＡＴＣＡＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣ−３'
【００６８】
トランスジェニック植物における導入ＧＡＤ遺伝子発現の確認
導入ＧＡＤ遺伝子発現の確認は、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および逆転写ＰＣＲのような工程を含んだ。
【００６９】
対照植物（野生型）とともにトランスジェニックＧＡＤタバコ植物のＲＮＡを単離した。
【００７０】
ＲＮＡ抽出に関わる詳細な工程：
１．５００ｍｇの葉組織を予冷した乳鉢にとり、液体窒素中ですり潰して、細かい粉末にした。
２．冷やしたスパチュラを用いて、粉末を予冷したエッペンドルフチューブに移した。
３．ホモジナイズした試料に１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。よく混合し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。
４．これに２００μｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく振盪させ、室温で５分間インキュベートした。
５．試料を１３０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離した。
６．上部の水相を新しいチューブに回収した（約６０％、すなわち、６００μｌ）。
７．回収した上部相に５００μｌの冷イソプロパノールを加え、ＲＴで１０分間インキュベートした。
８．試料を１３０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離した。
９．上清をデカントで捨て、ペレットを５００ｕｌの７０％アルコール（ＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ）で洗浄し、１００００ｒｐｍで５分間、４℃にて遠心分離した。
１０．上清をデカントで捨て、ペレットをＲＴで１５分間乾燥させた。
１１．ペレットを、５５℃に設定された加熱式のウォーターバスまたはドライバス中で２０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶かした。
１２．２μｌの試料をゲルに充填した。試料をさらに使用するまで−８０℃で保存した。
【００７１】
ｃＤＮＡ合成に関わる詳細な工程：
野生型とともにトランスジェニックＧＡＤタバコ植物のｃＤＮＡ合成を行なった。
１．構成要素を以下に示す順序で加えた。
トータルＲＮＡ                                ：４ｕｌ（１ｕｇ）
オリゴｄＴ                                    ：０．５ｕｌ
０．１％ＤＥＰＣ／ヌクレアーゼフリー水        ：６．５ｕｌ
合計                                          ：１１ｕｌ
２．内容物を７０℃で５分間、ＰＣＲ装置で加熱し、氷中で素早く冷却した。
３．一方、以下の構成要素を別のチューブに加えることにより、次の混合物を調製した。
５×反応バッファー                            ：４ｕｌ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                          ：２ｕｌ
ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ／ｕｌ）              ：０．５ｕｌ
０．１％ＤＥＰＣ／ヌクレアーゼフリー水        ：２ｕｌ
合計                                          ：８．５ｕｌ
４．この８．５ｕｌの混合物を、素早く冷却したＰＣＲチューブ中の内容物に加え、穏やかにタッピングして混合した。
５．内容物を、ＰＣＲチューブ中、３７℃で５分間、ＰＣＲ装置でインキュベートした。
６．０．５ｕｌのＭ−ＭｕＬＶ  ＲＴ酵素をチューブに加え、ＰＣＲ装置で設定されたプログラムを継続した（２５℃、１０分；３７℃、６０分、および７０℃、１０分）。
７．ＰＣＲでさらに使用するまでｃＤＮＡを−２０℃で保存した。
【００７２】
ＲＴ−ＰＣＲによるトランスジェニックタバコ植物における導入ＧＡＤ遺伝子発現の解析
タバコにおける導入ＧＡＤ遺伝子の発現をチェックするために、ＧＡＤトランスジェニックタバコおよび野生型植物由来のｃＤＮＡ試料を、遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲで解析した。
【００７３】
遺伝子特異的プライマーを用いるｃＤＮＡのＰＣＲ：
【００７４】
【表７】
2012507262.tif 000008
ＰＣＲ条件：（エッペンドルフ装置）
【００７５】
【表８】
2012507262.tif 000009
図４に示すように、増幅産物を０．８％アガロースゲルで可視化した。
【００７６】
Ｔ０植物中の窒素の測定
葉の窒素含有量について、野生型とともにＴ０  ＧＡＤタバコ植物の解析を行なった。成熟植物から葉を採集し、熱風炉で乾燥させた。乾燥した葉を粉末にし、ケルダール法を用いてＮ２含有量を測定した。ケルダール法は標準的な窒素測定法である。この方法は、３つの基本的な工程、すなわち、１）触媒による硫酸中での試料の消化（これにより、窒素がアンモニアに変換される）；２）アンモニアのトラッピング溶液への蒸留；および３）標準溶液を用いた滴定によるアンモニアの定量からなる。
【００７７】
手順
消化
１．挽いて粉末にした約０．２００ｇの葉試料を消化フラスコに量り入れ、０．１ｍｇ単位まで四捨五入して、重量（Ｗ）を記録した。
２．３．５ｇの消化混合物を加え、その後、１０ｍｌの硫酸を加えた。４２℃のＢＩＯＫＪＥＬの予熱バーナーの上にフラスコを置いた。
３．ＢＩＯＳＣＲＵＢユニットのチューブを消化フラスコに連結し、加熱しながら煙を回収した。  
４．消化混合物の色が薄緑色に変わるまで、チューブ／フラスコ内の混合物を約６０〜９０分間加熱した。
５．消化後、冷却するために、消化チューブをスタンドに置いた。
【００７８】
蒸留および滴定
１．消化チューブを蒸留装置のＢＩＯＤＩＳＴに移し、受ける側に三角フラスコを置いて、蒸留を実行した。
２．薄いピンク色が現れて色が変化しなくなるまで、三角フラスコの内容物を０．１Ｎ  ＨＣＬで滴定した。
【００７９】
計算
窒素（Ｎ）パーセントを以下のように計算した。
％Ｎ＝［Ｓ−Ｂ］×０．１×１４×１００
Ｗ×１０００
（式中、Ｓ＝試料の滴定値；Ｂ＝ブランクの滴定値；１４＝窒素の当量；０．１＝ＨＣＬの規定度；Ｗ＝試料のグラム量である。）
【００８０】
全１０種のトランスジェニック体は、対照と比較してより高いＮ含有量レベルを示した（図５）。最も高いＮ含有量はＨ２（３．４％）で観察されたが、これは、野生型よりも４１％多かった。最も少ないＮ含有量の増加はＪ２（２．５％）で観察され、これは、野生型よりも４．１％多かった。このように、よく似た栄養含有量の土壌で成長させたとき、ＧＡＤ遺伝子を有するＴ０トランスジェニック体は、（ＧＡＤ導入遺伝子を持たない）野生型と比較したとき、Ｎ含有量の増加を示した。
【００８１】
この性質が世代を超えて安定であるかどうかを明らかにするために、窒素摂取を次世代（Ｔ１）でさらに研究した。植物の幼苗期と全生活環の両方での効果を研究するために実験を行なった。
【００８２】
実施例３
ＧＡＤトランスジェニック植物がＴ１世代でより良好なＮ状態を示す証拠
トランスジェニック体に対する成長培地中の様々な窒素レベルの効果を研究するために、２つの異なる窒素源、すなわち、硝酸アンモニウムと硝酸カリウムを、２、４、および８ｍＭ濃度で使用し、一方、成長培地中の他の栄養素（ＰおよびＫ）または微量栄養素のレベルは変化させなかった。
【００８３】
植物材料
Ｔ１トランスジェニックタバコＧＡＤ植物を、異なる窒素源（硝酸アンモニウムおよび硝酸カリウム）の下でのそれらの窒素状態について解析した。
【００８４】
ハイグロマイシンを含むペトリ皿の上にＴ１種子を播き、様々なレベルの窒素を用いるＮ２摂取研究のような、温室でのさらなる研究のために陽性植物を前もって採取した。
【００８５】
様々なレベルの硝酸アンモニウム下での植物Ｎ状態
ハイグロマイシン処理培地上で生き残った３つのＧＡＤトランスジェニック体（Ｄ１Ａ、Ｅ２、およびＨ１）由来のＴ１苗を取り、Ｎ源を含まない１／１０  ＭＳ培地を補充した温室内の小さいカップに移植した。Ｎを様々な硝酸アンモニウム濃度（２、４、および８ｍＭ）で個別に与え、クロロフィル含有量について野生型と比較した。Ｍｉｎｏｌｔａ  ＳＰＡＤメーターを用いて記録し、ＳＰＡＤ単位として表した（図６）。成長培地中の窒素レベルが低下するにつれて、野生型植物は、その成長にとってのＮ欠乏の指標となる、植物Ｎ含有量のレベルの低下を示した。しかしながら、トランスジェニック植物は、より低い窒素利用可能性の下で植物Ｎ状態のわずかな低下を確かに示したが、Ｎ含有量は、野生型植物よりも高く、野生型と比較してより良好な成長状態を示した。
【００８６】
様々なレベルの硝酸カリウム下での植物Ｎ状態
ハイグロマイシン処理培地上で生き残った３つのＧＡＤトランスジェニック体（Ｄ１Ａ、Ｅ２、およびＨ１）由来のＴ１苗を取り、Ｎ源を含まない１／１０  ＭＳ培地を補充した温室内の小さいカップに移植した。Ｎを様々な硝酸カリウム濃度（２、４、および８ｍＭ）で個別に与え、クロロフィル含有量について野生型と比較した。Ｍｉｎｏｌｔａ  ＳＰＡＤメーターを用いて記録し、ＳＰＡＤ単位として表した（図７）。トランスジェニック植物は、様々な硝酸カリウム濃度の全てにおいて野生型と比較してより高い植物Ｎ含有量を示し、野生型と比較してより良好な窒素摂取を示した。
【００８７】
ＧＡＤ遺伝子を有するトランスジェニック植物は、供給された様々な窒素源の下だけでなく、Ｎ欠乏条件の下でもより良好な植物Ｎ状態を示した。
【００８８】
実施例４
ＧＡＤトランスジェニック植物が、Ｎ欠乏土壌条件下におけるより良好な窒素利用効率（ＮＵＥ）とより高い収穫指数を示す証拠
【００８９】
トランスジェニック体の成長と発達に対する土壌中の様々な窒素レベルの効果を研究するために、様々な窒素レベル、すなわち、１００％推奨用量、５０％推奨用量、および１０％推奨用量を使用し、一方、土壌中の他の栄養素（ＰおよびＫ）または微量栄養素のレベルは変化させなかった。尿素か、硝酸アンモニウムカルシウム（ＣＡＮ）か、リン酸二アンモニウム（ＤＡＰ）のいずれかを適用することによって、様々レベルのＮを外部から供給した。
【００９０】
野生型タバコとトランスジェニックタバコを用いて実験を行なった。ハイグロマイシン処理培地上で生き残った３つのＧＡＤトランスジェニック体（Ｈ１）由来のＴ１苗を取り、温室内の小さいカップに移植した。苗を温室で、野外土壌と堆肥（ＦＹＭ）の混合物を含む植木鉢の中で栽培した。肥料の外部適用なしで、植物に普通の水をやった（肥料スケジュールは表１に記載されている）。２つの遺伝子型（野生型とＨ１トランスジェニックタバコ）で３つの処理と３つの複製を伴って実験を行なった（表２）。必要な肥料の用量は以下の通りに計算された。様々な肥料を用いた実際の用量を表３、４、および５に示す。
【００９１】
ＧＡＤトランスジェニック体タバコに対する肥料適用
ＦＣＶタバコに対するＮ推奨用量  ２０Ｋｇ  Ｎ／Ｈａ
Ｂｉｄｉタバコに対するＮ推奨用量  １８０Ｋｇ  Ｎ／Ｈａ
−  ローム質土壌の場合、６０Ｋｇ  Ｎ、８０Ｋｇ  Ｐ２Ｏ５、８０〜１００Ｋｇ  Ｋ２Ｏ、および１５Ｋｇ  ＭｇＯ／ｈａ
−  砂質土壌の場合、７０Ｋｇ  Ｎ、６０Ｋｇ  Ｐ２Ｏ５、１００〜１２０Ｋｇ  Ｋ２Ｏ、および１５Ｋｇ  ＭｇＯ／ｈａが推奨される。
表１：単肥が適用される場合のタバコ植物用の肥料スケジュール
【００９２】
【表９】
2012507262.tif 000010
【００９３】
１０，０００〜１２，０００苗／Ｈａ、したがって、１苗／ｍ２（１Ｈａ＝１０，０００ｍ２）の植え付け密度がタバコ栽培に推奨され、それゆえ、植物当たりのＮの推奨用量は、６ｇｍ  Ｎ／苗（６０，０００ｇｍ  Ｎ／Ｈａ（１０，０００ｍ２）、すなわち、６０，０００ｇｍ  Ｎ／１０，０００苗）である。したがって、様々な肥料を用いる用量は、以下のように計算された。
【００９４】
尿素（Ｎ含有量４６％）：
尿素肥料（Ｎ ４６％）、すなわち、４６Ｋｇ  Ｎ／１００Ｋｇ尿素（４．６ｇｍ  Ｎ／１０ｇｍ尿素）
１３ｇｍ尿素／植物（推奨用量の通り、６ｇｍ  Ｎ／植物を供給することになる）
２５％の第１用量（３．２５ｇｍ尿素）（１０  ＤＡＴ）
５０％の第２用量（６．５ｇｍ尿素）（２〜３週間  ＤＡＴ）
２５％の第３用量（３．２５ｇｍ尿素）（４０  ＤＡＴ）
【００９５】
ＣＡＮ（Ｎ含有量２５％）：
６０，０００ｇｍ  Ｎ／Ｈａ（１０，０００ｍ２）、すなわち、６０，０００ｇｍ  Ｎ／１０，０００苗
６ｇｍ  Ｎ／苗（推奨用量）
ＣＡＮ肥料（Ｎ  ２５％）、すなわち、２５Ｋｇ  Ｎ／１００Ｋｇ  ＣＡＮ（２．５ｇｍ  Ｎ／１０ｇｍ  ＣＡＮ）
２５ｇｍ  ＣＡＮ／植物（推奨用量の通り、６ｇｍ  Ｎ／植物を供給することになる）
２５％の第１用量（６．２５ｇｍ尿素）（１０  ＤＡＴ）
５０％の第２用量（１２．５ｇｍ尿素）（２〜３週間  ＤＡＴ）
２５％の第３用量（６．２５ｇｍ尿素）（４０  ＤＡＴ）
【００９６】
ＳＳＰ（Ｐ２Ｏ５含有量１８％）：
８０，０００ｇｍ  Ｐ２Ｏ５／Ｈａ（１０，０００ｍ２）、すなわち、８０，０００ｇｍ  Ｐ２Ｏ５／１０，０００苗
８ｇｍ  Ｐ２Ｏ５／苗（推奨用量）
ＳＳＰ肥料（Ｐ２Ｏ５  １８％）、すなわち、１８Ｋｇ  Ｐ２Ｏ５／１００Ｋｇ  ＳＳＰ（１．８ｇｍ  Ｎ／１０ｇｍ  ＳＳＰ）
４４．５ｇｍ  ＳＳＰ／植物（推奨用量の通り、８ｇｍ  Ｐ２Ｏ５／植物を供給することになる）
１００％の第１用量（４４．５ｇｍ  ＳＳＰ）（１０  ＤＡＴ）
【００９７】
ＤＡＰ：（Ｎ含有量１８％およびＰ含有量４６％）
８０，０００ｇｍ  Ｐ２Ｏ５／Ｈａ（１０，０００ｍ２）、すなわち、８０，０００ｇｍ  Ｐ２Ｏ５／１０，０００苗
８ｇｍ  Ｐ２Ｏ５／苗（推奨用量）
ＤＡＰ肥料（Ｐ２Ｏ５  ４６％）、すなわち、４６Ｋｇ  Ｐ２Ｏ５／１００Ｋｇ  ＳＳＰ（４．６ｇｍ  Ｎ／１０ｇｍ  ＤＡＰ）
１７．４ｇｍ  ＤＡＰ／植物（推奨用量の通り、８ｇｍ  Ｐ２Ｏ５／植物を供給することになる）
１００％の第１用量（１７．４ｇｍ  ＤＡＰ）（１０  ＤＡＴ）
これはまた、６ｇｍ／苗が推奨用量とされる場合、３．１ｇｍ  Ｎを供給することになる、すなわち、尿素から３ｇｍ補充する必要がある
尿素肥料（Ｎ  ４６％）、すなわち、４６Ｋｇ  Ｎ／１００Ｋｇ尿素（４．６ｇｍ  Ｎ／１０ｇｍ尿素）
６．５ｇｍ尿素／植物（推奨用量の半分である、３ｇｍ  Ｎ／植物を供給することになる）
第１用量（ＤＡＰを与える場合、尿素なし）（１０  ＤＡＴ）
２５％の第２用量（３．２５ｇｍ尿素）（２〜３週間  ＤＡＴ）
２５％の第３用量（３．２５ｇｍ尿素）（４０  ＤＡＴ）
【００９８】
ＭＯＰ（Ｋ２Ｏ含有量６０％）：
１００，０００ｇｍ  Ｋ２Ｏ／Ｈａ（１０，０００ｍ２）、すなわち、１００，０００ｇｍ  Ｋ２Ｏ／１０，０００苗
１０ｇｍ  Ｋ２Ｏ／苗（推奨用量）
ＭＯＰ肥料（Ｋ２Ｏ  ６０％）、すなわち、６０Ｋｇ  Ｋ２Ｏ／１００Ｋｇ  ＭＯＰ（６ｇｍ  Ｋ２Ｏ／１０ｇｍ  ＭＯＰ）
１６ｇｍ  ＭＯＰ／植物（推奨用量の通り、１０ｇｍ  Ｋ２Ｏ／植物を供給することになる）
５０％の第１用量（８ｇｍ  ＭＯＰ）（１０  ＤＡＴ）
５０％の第２用量（８ｇｍ  ＭＯＰ）（２〜３週間  ＤＡＴ）
表２：窒素摂取研究の実験設計。比較のために、２つの遺伝子型について３つの処理と３つの複製を用いた。
【００９９】
【表１０】
2012507262.tif 000011
表３：尿素、ＳＳｐ、およびＭＯＰを肥料として用いた場合、以下の用量に従った
【０１００】
【表１１】
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表４：尿素、ＤＡＰ、およびＭＯＰを肥料として用いた場合、以下の用量に従った
【０１０１】
【表１２】
2012507262.tif 000013
表４：ＣＡＮ、ＳＳＰ、およびＭＯＰを肥料として用いた場合、以下の用量に従った
【０１０２】
【表１３】
2012507262.tif 000014
【０１０３】
表現型評価：
表現型の特徴を観察し、草高、節間距離、枝の数、葉の数、葉面積、茎の太さ（周囲長）、総バイオマス、穀粒収量などのようなパラメータを記録した。
【０１０４】
草高
トランスジェニック植物と野生型植物（導入されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない植物）で植物の高さを測定した。定規を用いて地面から花と枝を含む植物の先端までの草高を測定した。トランスジェニック体は、より低い土壌Ｎレベル（１０％ＲＤ）で草高の増加を示した（図８）。
【０１０５】
節間距離
トランスジェニック植物と野生型植物（導入されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない植物）で茎上の２つの節間の距離を測定した。第５葉および第６葉と第６葉および第７葉の間で節間距離を測定した。完全に広がった葉を葉番号１とみなして、先端から葉を計数した。スレッドを用いて距離を測定し、その後、定規でスレッド長を測定して、ｃｍで表した。トランスジェニック体は、より低い土壌Ｎレベル（１０％ＲＤ）で節間距離の増加を示した（図９）。
【０１０６】
枝の数
トランスジェニック体は、十分な土壌Ｎ条件（１００％ＲＤ）だけでなく、土壌Ｎが欠乏した条件（５０％ＲＤ）でも枝の数の増加を示した（図１０）。
【０１０７】
葉の数
十分な土壌Ｎ条件（１００％ＲＤ）下での葉の数の増加は、野生型と比較したとき、トランスジェニック体においてほぼ２倍であった。一方、土壌Ｎが欠乏した条件（５０％および１０％ＲＤ）下でも、トランスジェニック体は、野生型植物よりも多くの葉の数を有することが観察された（図１１）。
【０１０８】
茎の周囲長（外周または茎の太さ）
トランスジェニック植物と野生型植物（導入されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない植物）で茎の太さを測定した。地面から５〜６ｃｍの高さで茎の周囲長を測定した。スレッドを用いて、適当な高さで茎の周りを囲み、その後、定規でスレッドの長さを測定して、ｃｍで表した。トランスジェニック体は、１００％ＲＤ条件下でより太い茎を示したが、５０％および１０％ＲＤ条件下では、茎の太さに有意な差は観察されなかった（図１２）。
【０１０９】
葉面積
トランスジェニック植物と野生型植物（導入されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない植物）で葉の大きさを測定した。葉を節から葉の先端まで垂直に測定し、葉の長さとみなした。葉の幅を、最も幅が広い位置で水平に測定し、葉の幅とみなした。葉面積を長さ×幅（ｃｍ−２単位で表す）として計算した。十分な土壌Ｎ条件（１００％ＲＤ）下で、トランスジェニック体と野生型の間に葉面積の差はないが、土壌Ｎが欠乏した条件（５０％および１０％ＲＤ）下では、トランスジェニック体は野生型と比較して葉面積の増加を示した（図１３）。
【０１１０】
植物バイオマス
トランスジェニック植物と野生型植物（導入されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない植物）で生成されるバイオマスを測定した。植物バイオマスを植物の総乾燥重量として測定した。植物バイオマスを様々な窒素処理下で測定した。トランスジェニック体の総バイオマスは、Ｎが十分な（１００％ＲＤ）条件とＮが欠乏した（５０％ＲＤ）条件の両方で、野生型と比較して有意により高かった（Ｐ≦０．００５）（図１４）。
【０１１１】
純窒素摂取
植物による総窒素摂取(％葉の乾燥重量)を測定した。通常の条件と様々な環境ストレス条件下で、対照植物とトランスジェニック植物の純摂取を比較した。
【０１１２】
Ｔ１植物での窒素測定
葉の窒素含有量について、野生型とともにＴ１  ＧＡＤタバコ植物の解析を行なった。成熟植物から葉を採集し、熱風炉で乾燥させた。乾燥した葉を粉末にし、先に記載したケルダール法を用いてＮ２含有量を測定した。トランスジェニック体由来の総植物Ｎ含有量は、Ｎが十分な（１００％ＲＤ）条件で、野生型と比較して有意により高かったが（Ｐ≦０．００５）、Ｎが欠乏した（５０％および１０％ＲＤ）条件では、野生型とトランスジェニック体の植物Ｎ含有量に有意な差はなかった（図１５）。
【０１１３】
窒素利用効率（ＮＵＥ）
窒素利用効率（ＮＵＥ）を以下のように計算した。
【０１１４】
窒素利用効率は、組織中に存在するＮの単位当たりに産生される乾燥物質の量として表される。栄養効率値は、葉組織のＮ含有量から次の方程式によって導き出される：
窒素利用効率（ｍｇ乾燥物質／ｍｇ  Ｎ）＝      １０００      
ｍｇ  Ｎ／ｇ乾燥ｗｔ  
または
ＮＵＥ＝総バイオマス（ｍｇ単位での乾燥重量）／バイオマス中のＮの量（ｍｇ単位）
または
ＮＵＥ＝産生されたバイオマス／土壌に適用された窒素  
【０１１５】
光合成によるＮ利用効率は、単位葉面積または単位葉質量中のＮの単位当たりに固定されるＣＯ２と定義される。
【０１１６】
トランスジェニック体の窒素利用効率（総バイオマスとバイオマス中のＮ含有量の関数）は、Ｎが欠乏した（５０％ＲＤ）条件で野生型と比較したとき、より高かった（図１６）。
【０１１７】
穀粒収量
総穀粒収量は、Ｎが十分な（１００％ＲＤ）条件とＮが欠乏した（１０％ＲＤ）条件の両方で、野生型よりもトランスジェニック体で高かった（図１７）。これは、バイオマスの増加が実際に、植物の収量の増加の一因にもなっており、またバイオマスの増加による収量ペナルティーがないことを示している。
【０１１８】
ＧＡＤトランスジェニック植物は、植物の様々な農学的状態および栄養状態について、Ｎが欠乏した条件下で野生型植物よりも優れた性能を発揮し、したがって、Ｎが欠乏した条件下でのトランスジェニック植物の優れた性能に対するＧＡＤ遺伝子の役割が示された。これは、野生型よりもトランスジェニック体による、適用されたＮの摂取または同化が増加したことが原因である可能性があった。
【０１１９】
配列番号１は、オリザ・サティバのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の核酸配列を示す。開始コドンと終止コドンは、イタリック体で示されている。
【０１２０】
配列番号２は、オリザ・サティバのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のアミノ酸配列を示す。アステリスクは終止コドンを表す。
【図１】
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【図２ａ）】
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【図２ｂ）】
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【図２ｃ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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