(57)【要約】  上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び薬剤学的に許容可能な担体を含む気道粘液過分泌または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防用または治療用の薬剤組成物を提供する。また、該組成物及び化学療法剤をそれぞれ個別的に投与できるように含む複合製剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び薬剤学的に許容可能な担体を含む気道粘液過分泌の予防用または治療用の薬剤組成物。
【請求項２】
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び薬剤学的に許容可能な担体を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防用または治療用の薬剤組成物。
【請求項３】
前記慢性閉塞性肺疾患は、慢性気管支炎または肺気腫である請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記上皮細胞増殖因子は、化学合成または組換え技術により合成されたものである、または天然源に由来したものである請求項１または請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記薬剤学的に許容可能な担体は、生理食塩水または緩衝溶液を含むる請求項１または請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
吸入器デバイス及び当該吸入器中に含まれる薬理活性のある上皮細胞増殖因子を含有する流動性調合物を含む、気道粘液過分泌の予防または治療に使用するためのパッケージ。
【請求項７】
前記上皮細胞増殖因子は、化学合成または組換え技術により合成されたものである、または天然源に由来したものである請求項６に記載のパッケージ。
【請求項８】
前記吸入器デバイスは、メーター容量吸入器であり、前記上皮細胞増殖因子は、高圧ガスと共に調製される請求項６または請求項７に記載のパッケージ。
【請求項９】
前記吸入器は、噴霧器であり、前記上皮細胞増殖因子は、生理食塩水または緩衝溶液と共に調製されることを特徴とする請求項６または請求項７に記載のパッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患の予防用または治療用の薬剤組成物に係り、特に、気道粘液過分泌または慢性閉塞性肺疾患の予防用または治療用の上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を活性成分として含む薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、直接的／間接的喫煙や、カドミウム（Ｃｄ）およびシリカ（ＳｉＯ2）のような環境汚染源を直接扱う職業群で発生し、まれには、α１−アンチトリプシン遺伝子の異常によって発生しうる。
【０００３】
ＣＯＰＤは、肺に発生した炎症から組織を保護するために生成された粘液質（ｍｕｃｕｓ）が過度に生成された後、消失（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）に問題が発生して気道が閉塞され、肺胞細胞（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｅｌｌ）の破壊によって誘発された低酸素症で死亡にまで至りうる致命的な疾患である。
【０００４】
ＣＯＰＤは、発生組織とメカニズムとによって：慢性気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）及び肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）に分類される。慢性気管支炎の最も大きい特徴は、気道上皮細胞で過発現された粘液質が除去されずに、継続的に過発現され、結果的に蓄積された粘液質によって気道が閉塞することが特徴であり、肺気腫は、肺胞細胞（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｅｌｌ）が破壊され、低酸素症または心臓疾患、及び非可逆的な細気管支（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅ）閉塞性を示すことが特徴である。特に、肺気腫は、炎症細胞によって活性化されたエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）による加水分解によって、肺胞細胞が不可逆的に破壊され、組織病理学的に、ＣＤ8+、Ｔリンパ球、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）及び好中性白血球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）が増加する。
【０００５】
気道の粘液は、一般的に人体の気道を介して吸入された粒子または感染因子の除去を促進する。しなしながら、粘液の過分泌は、進行性気道閉塞症を引き起こす。末梢気道での咳嗽は、粘液の除去に効果がない。さらに、多くの杯細胞（ｇｌｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を含む狭い気道は、特に粘液による気道閉塞が起こりやすい。従って、ＣＯＰＤのような慢性気管支炎での粘液過発現だけでなく、気管支拡張、嚢胞性繊維症、急性喘息のような種々の肺疾患で発生する粘液過分泌も予防しつつ治療する必要がある。
【０００６】
ＥＧＦは、上皮細胞増殖を促進させる蛋白質であり、現在まで上皮細胞の再生、細胞分裂の促進などの傷治療と関連した効能が広く知られている（米国特許６，５８９，５４０号明細書など）。しかしながら、ＥＧＦがＣＯＰＤｓあるいは気道の粘液過発現の予防または治療に効果があるとの報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤｓ）あるいは気道の粘液過発現の予防または治療に使われうる薬物を開発するために研究した結果、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）が、慢性気管支炎及び肺気腫を含んだＣＯＰＤの予防及び治療に使われうるだけではなく、気道の粘液過発現を抑制する効果があり、広範囲な肺疾患で慢性的な問題になっている気道粘液過分泌を予防しつつ治療するのに効果があるということを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
従って、本発明の目的は、気道粘液過分泌の予防用または治療用の薬剤組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤｓ）の予防用または治療用の薬剤組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、吸入器デバイス及び当該吸入器の中に流動性調合液を含む気道粘液過分泌の予防または治療のためのパッケージを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一側面は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び薬剤学的に許容可能な担体を含む気道粘液過分泌の予防用または治療用の薬剤組成物を提供する。
【００１２】
本発明の他の側面は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び薬剤学的に許容可能な担体を含む慢性閉塞性肺疾患の予防用または治療用の薬剤組成物を提供する。
【００１３】
吸入器デバイス及び当該吸入器中に含まれる薬理活性のある上皮細胞増殖因子を含有する流動性調合液を含む、気道粘液過分泌の予防または治療に使用するためのパッケージを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
以上で説明した通り、本発明によれば、活性成分としてＥＧＦを含み、ＣＯＰＤｓまたは気道粘液過分泌の予防または治療に使用できる薬剤組成物を提供できる。また、本発明によれば、吸入投与容器中にＥＧＦを含む調製物を含み、気道粘液過分泌の予防または治療に便利に使われうる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明に係る上記およびその他の特徴および効果を、以下に添付した図面を参照してそれらの一例を詳細に説明することで明らかにする：
【図１】ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞に、ＰＡ−ＬＰＳとＴＧＦ−αを６時間処理してＭＵＣ５ＡＣ遺伝子を過発現させた後、５０および１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦをそれぞれ処理し、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現量をｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲで測定した結果、およびＰＡ−ＬＰＳおよびＴＧＦ−α単独処理したコントロール群を比較して示したグラフであり；
【図２】ＭＬＥ−１２細胞に、０．１Ｕ／ｍＬのエラスターゼと１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦとを処理した後、ＩＣＡＭ−１遺伝子の発現をｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲで測定した結果、およびエラスターゼ単独、および培地単独で処理したコントロール群を比較して示したグラフ及び表であり；。
【図３】ＭＬＥ−１２細胞に、２Ｕ／ｍＬのエラスターゼとＥＧＦとを濃度別にそれぞれ混合した後で２４時間処理した後、生存細胞をニュートラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ）で染色した細胞毒性の割合と、エラスターゼ単独、および培地単独処理したコントロール群の細胞毒性の割合と比較したものであり；
【図４】ＰＰＥ誘発肺気腫モデルにおけるＥＧＦの病変緩和効果を確認するために、肺気腫なしの群から分離した気管組織を、光学顕微鏡（Ｘ４０）で観察して撮影した写真であり（Ｂ：細気管支）；
【図５】ＰＰＥ誘発肺気腫モデルにおけるＥＧＦの病変緩和効果を確認するために、肺気腫および賦形剤のコントロール群の気管組織を、光学顕微鏡（Ｘ４０）で観察して撮影した写真であり（「＊」：肺胞拡張及び崩壊）；
【図６】ＰＰＥ誘発肺気腫モデルにおけるＥＧＦの病変緩和効果を確認するために、ＥＧＦ  ０．１ｍｇ／ｋｇで処理した群の気管組織を、光学顕微鏡（Ｘ４０）で観察して撮影した写真であり（「＊」：肺胞拡張及び崩壊）；
【図７】ＰＰＥで誘発した肺気腫モデルで、ＥＧＦの投与による病変の緩和効果を確認した実験における、気管及び肺の組織病理学的検査結果を示すものであり；
【図８】図７の実験結果の詳細に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１７】
本発明で、「上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」とは、正常人の十二指腸または唾液腺で合成され、人間の母乳で発現すると知られている５３アミノ酸蛋白質である。人間のＥＧＦアミノ酸配列は、次の通りである：
Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【００１８】
本明細書の実施例の実験で使われた蛋白質は、前述の配列を有する。人間において、ＥＧＦとして作用する非人間ＥＧＦ配列も、前記ＥＧＦに含まれる。前記ＥＧＦには、ＥＧＦの種変異体も含まれ、例えば、マウス、ラット及び豚といったＥＧＦ（４９−５２）；米国特許出願２００３−００５９８０２号で開示されている牛のＥＧＦ；異なるＥＧＦ受容体リガンドのいわゆる相作用剤キメラ（５３）などが含まれる。前記ＥＧＦはまた、精製された天然ＥＧＦのものと実質的に同じ配列と活性とを有するポリペプチドを指すものでもある。ここには、組換え技術的あるいは化学的に合成されたペプチドや蛋白質が含まれる。このＥＧＦはまた、本発明で必要とされるＥＧＦの生物学的活性が実質的に保持される限り、天然配列から一つ以上のアミノ酸が挿入または欠失によって置換変更された蛋白質を含むものでもある。また、本発明で必要とされるＥＧＦの生物学的活性が実質的に保持される限り、ＥＧＦの断片、ペプチド類似体及びペプチド摸写体も本発明に使用することができる。２００１年２月２０日付けで登録された米国特許６，１９１，１０６号明細書で説明されているようなＥＧＦの突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）も、本発明で必要とされるＥＧＦ活性を有する限り、本発明でのＥＧＦに属する。
【００１９】
本発明者らは、このようなＥＧＦが気道粘液過分泌及びＣＯＰＤの予防または治療に効果があるということを明らかにして、本発明を完成するに至った。
【００２０】
従って、一側面において、本発明は、ＥＧＦ及び薬剤学的に許容可能な担体を含む気道粘液過分泌の予防用または治療用の薬剤組成物を提供する。
【００２１】
また、他の一側面において、本発明は、ＥＧＦ及び薬剤学的に許容可能な担体を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防用または治療用の薬剤組成物を提供する。前記ＣＯＰＤは、慢性気管支炎または肺気腫でありうる。
【００２２】
前記ＥＧＦは、先に定義したような化学合成または組換え技術で合成されたものであったり、天然源由来の任意のＥＧＦであり、望ましくは、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１）から分離精製されたものを使用できる。この場合、ＥＧＦは、組換え大腸菌を半回分培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）で４８ないし７２時間発酵させた後、発酵上澄み液をアンバークロムＣＧ７１クロマトグラフィ（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ７１  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）方式とＱ−セファロース・クロマトグラフィ（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）方法とで純粋分離することによって分離される（米国特許５，６５２，１２０号明細書、日本特許２６０９５１５号公報、ＥＰ  Ｏ６５２９５４号、韓国特許１０２９９３号公報、韓国特許１０７０２３号公報、韓国特許１１０１２３号公報、韓国特許１１４８５６号公報）。組換え大腸菌から分離精製されたＥＧＦが同一であるということは、米国特許５，６５２，１２０号明細書、日本特許２６０９５１５号公報、ＥＰ  ０６５２９５４号、韓国特許１０２９９３号公報、韓国特許１０７０２３号公報、韓国特許１１０１２３号公報、韓国特許１１４８５６号公報などですでに確認されている。
【００２３】
本発明者らは、前記ＥＧＦが粘液質過発現の低下、炎症の低減及び細胞死滅の低減に効果があるということをｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで確認し、ＣＯＰＤに係るｉｎ  ｖｉｖｏモデルで病理学的所見を観察することによって、ＥＧＦが気道の粘液過分泌及びＣＯＰＤの予防または治療に効果があるということを明らかにした。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、下記実施例で具体的に説明する。
【００２４】
前記薬剤組成物において、薬剤学的に許容可能な担体は、前記組成物の投与方法による製剤の形態によって変わりうる。前記薬剤組成物は、静脈内投与、皮下投与、気管内投与、または吸入による投与方法によって投与されうる。従って、前記薬剤組成物は、注射剤または吸入のための液剤、スプレー剤、懸濁剤またはコロイド剤などの形態でもって製剤化され、生理食塩水または緩衝溶液などが主な薬剤学的担体として利用されうる。前記製剤は必要によって、粘度調節剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、芳香剤、着色剤、防腐剤のような添加剤を含有できる。このような製剤化に必要な技術、及び薬剤学的に適切な担体、添加剤などについては、当該製剤学分野で当業者に広く知られており、これと関連して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版，１９９５）を参照することができる。
【００２５】
本発明の薬剤組成物において、前記ＥＧＦは、気道粘液過分泌やＣＯＰＤの予防または治療に有効な量で投与でき、前記治療学的に有効な量は、気道粘液過分泌やＣＯＰＤの程度、患者の年齢、性別、感受性などによって異なりうる。本発明の組成物は、気道の粘液過分泌の予防または治療、およびＣＯＰＤの予防または治療のために、例えば、ＥＧＦ  ０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを、週１〜５回投与することを１〜８週間行ってもよい。製剤の種類に応じて治療に有効な量を調整しうる。
【００２６】
本発明によるＥＧＦを含む薬剤組成物は、粘液過分泌の予防または治療に用いやすい吸入に適切な容器内に含有させてもよい。
【００２７】
従って、本発明は、さらに他の側面において、吸入器デバイス及び当該吸入器デバイスの中に有するＥＧＦを含有する流動性調製物を含む、気道粘液過分泌治療に使用するためのパッケージを提供する。
【００２８】
前記吸入器デバイスは、当該技術分野で一般的に気道に吸入投与するのに適切なものであると知られている任意の容器を使用することができ、メーター容量吸入器または噴霧器を利用してもよい。当該メーター容量吸入器が利用される場合は、前記ＥＧＦは、高圧ガスと共に製剤化されて前記調製物を形成できる。前記高圧ガスとしては、当該技術分野で公知されている適切な任意の高圧ガスが利用され、例えば、炭化水素類の高圧ガスが利用されうる。前記噴霧器が利用される場合には、前記ＥＧＦは、生理食塩水または緩衝溶液と共に製剤化されて前記調製物を形成できる。噴霧器を利用して投与すれば、ガス内で実質的に均一サイズの、非常に微細な液体粒子状で気道内に投与できる。このような吸入器を利用した製剤化も、当該製剤学分野で当業者に周知されており、これと関連して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９版，１９９５）を参照することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明について、下記実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、それら実施例は、本発明への理解の一助とするものであり、いかなる意味でも、本発明の範囲がそれらによって制限されるものではない。
【００３０】
実施例１：ＣＯＰＤ及び気道粘液過分泌に係るＥＧＦの効能試験
１．材料及び方法
１−１．粘液質発現抑制の効果
１ウェル当たり１０6のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１８４８）となるように６ウェルプレートに滴定した。、３７℃、５％ＣＯ2培養器で１日培養した。無血清培地で１日培養した後、１００ｍｇ／ｍＬのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａリポポリサッカライド（以下、ＰＡ−ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ  Ｌ８６４３）および１０ｎｇ／ｍＬ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ（以下、ＴＧＦ−α、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ２３９−ａ−１００）で６時間同時に処理し、ＭＵＣ５ＡＣ粘液質の過発現を誘導した。前記ＰＡ−ＬＰＳおよび前記ＴＧＦ−αを除去した状態で、濃度別のＥＧＦを前記ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞に加えた。そして、  リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ法）を使用し、誘発された粘液質（ＭＵＣ５ＡＣ）遺伝子の発現を確認した。
【００３１】
本実験で使用したあらゆるＥＧＦは、すでに知られた天然ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）とアミノ酸配列は同じであるが、韓国特許０１０７０２３号公報及びＷＯ  ９４／０２５５９２号に開示された遺伝子配列と、発現ベクターとを利用して製造される組換え蛋白質である。
【００３２】
１−２．抗炎症効果の確認
１ウェル当たり５ｘ１０4のＭＬＥ−１２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２１１０  ｍｕｒｉｎｅ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）となるように１２ウェルプレート滴定した。３７℃、５％ＣＯ2培養器で３〜４日間培養した。無血清培地で１２時間培養した後、ＥＧＦとＫＧＦとでそれぞれ１時間処理した。前記ＭＬＥ−１２細胞を０．１Ｕ／ｍＬエラスターゼ（Ｓｉｇｍａ  、Ｅ１２５０）で１８時間処理して炎症を誘発させた。誘発された炎症は、リアルタイムＰＣＲ法を使用し、ＩＣＡＭ−１（ＩｎｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）遺伝子の発現を確認した。
【００３３】
１−３．細胞保護の効果
１ウェル当たり５ｘ１０5のＭＬＥ−１２細胞となるように９６ウェルプレートに滴定した。３７℃、５％ＣＯ2培養器で一日培養した。２Ｕ／ｍＬエラスターゼとＥＧＦとを含む培養培地で当該ＭＬＥ−１２細胞を培養した。細胞死滅程度は、生きている細胞だけを染色するニュートラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ）を使用して、ＮＲＵ（ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）アッセイを実施した。エラスターゼとＥＧＦとで処理した各ウェルに、１００ｍｇ／ｍＬのニュートラルレッド染色試薬を添加して、３時間静置して、生きている細胞を染色した。固定溶液（１％ホルムアルデヒド、１％  ＣａＣｌ2）で当該細胞を１分間固定した後、発色溶液（５０％エタノール、１％氷酢酸）で染色試薬を抽出した後、５４０ｎｍ波長で吸光を測定した。
【００３４】
１−４．肺気腫動物モデルでのＥＧＦ効果
１−４−１．実験動物
平均体重が２００〜２５０ｇである６週齢オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（日本・ＳＬＣ，Ｉｎｃ）を１週間ならし、７週齢ラットとして準備した。当該ラットは、恒温、恒湿（温度２２±３℃、相対湿度５５±１５％、蛍光灯照明１２時間、０８：００点灯〜２０：００消灯）である飼育場の個別に換気されたケージ（ＩＶＣ）ラック（ＧＲ９００  ｐｌｕｓ  ラットケージ、ポリスルホン酸、３５５Ｗｘ４０５Ｉｘ２３０Ｈｍｍ）で飼育され、食餌と水は、自由に摂食させた（固形飼料５Ｌ７９、（株）オリエント）。
【００３５】
１−４−２．豚の膵エラスターゼ（ＰＰＥ）を利用した肺気腫モデル
ラットに対して、イソフルラン麻酔下において、１２０Ｕ／ｋｇの豚膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ、Ｍｅｒｃｋ  ３２４６８２）１ｍＬ／ｋｇを、気道内注入で１回投与した。肺気腫未誘発群のラットに対して、０．９％の生理食塩水１ｍＬ／ｋｇを、気道内注入で１回投与した。試験物質の肺腔内に均一投与するため、気道内注入する間に、投与物質の量と同一に空気を共に注入した。
【００３６】
ＰＰＥ投与後４週目、０、０．１、および１ｍｇ／ｋｇのＥＧＦをそれぞれラットに気道内注入で投与した。ＰＰＥ投与後の３週間の間週１回、合計で３回ＥＧＦを気道内注入で投与した。ＰＰＥ投与後７週目にイソフルランで麻酔し、肺と器官とを摘出した後、１０％中性ホルマリンを用いて固定した。その後、器官組織を顕微鏡で観察して撮影し、器官及び肺の組織病理学的検査を行った。
【００３７】
１−４−３．統計解析
実験結果は、平均値±標準偏差で表示した。陰性対照群と、統計的に有意性ある試験群とを見つけるために、ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを利用して統計処理を実施し、多重比較法を利用して有意性を分析した。
【００３８】
１−５．遺伝子発現の試験方法
前記試験で行った遺伝子発現確認試験は、次のような方法で行った。
【００３９】
１−５−１．総ＲＮＡ分離
ＲＮＡを分離するために、ＱＩＡＧＥＮ社キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキットト、７４１３４）を利用し、メーカーが提供した実験方法に従ってＲＮＡを分離した。分離されたＲＮＡは、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を利用して、２６０ｎｍの波長で吸光度を測定してＲＮＡを定量した。
【００４０】
抽出したＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８
０−０４４）を使用して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。逆転写反応を、ＲＮＡ試料１μｇ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー１．２５μＭ、ランダムヘキサマー２５ｎｇ、ｄＮＴＰ５ｍＭ、ＭｇＣｌ2５ｍＭ、および２００Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩを用い
て行った。５０℃で３０分間逆転写反応させてｃＤＮＡを合成した後、８５℃で５分間熱を加えて当該反応を中止させた。合成されたｃＤＮＡは、少量に分けて−７０℃で保管した。
【００４１】
１−５−２．プライマーの調製
ヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の内在性コントロールとして使用するヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子（ＡＪ００１４０２）およびベータ−アクチン（β−ＡＣＴ、ＮＭ００１１０１）のプライマーと、ｍｕｒｉｎｅ  ＩＣＡＭ−１遺伝子の内在性コントロールとして使用するｍｕｒｉｎｅ  ＩＣＡＭ−１遺伝子（ＮＭ０１０４９３）、およびリボソーム蛋白質Ｌ１３（ＲＰＬ１３、ＮＭ０１６７３８）のプライマーは、ＮＣＢＩのＧｅｎｅＢａｎｋで検索したｍＲＮＡ塩基配列を基にデザインした。プライマーセットは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社が提供するＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓプログラムを利用し、一般的にＰＣＲプライマーの条件に関係するが、増幅産物の長さが１００ｂｐ前後であり、Ｔｍ値が８０℃前後になるようにデザインした。遺伝子別に使用したプライマーは、下記表１の通りである。
【００４２】
【表１】
2012505207.tif 000003
【００４３】
１−５−３．反応条件の確立
ＳＹＢＲグリーンアッセイは、合計で２５ｍＬになるよう、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３０９１５５）１２．５ｍＬに、ｃＤＮＡ、フォワード・プライマー、リバース・プライマーをそれぞれ添加した。
【００４４】
ｃＤＮＡは、ＲＴＰＣＲに使用する総ＲＮＡ基準として、５０ｎｇの量になるように添加した。プライマーは、フォワード・プライマー、リバース・プライマーに対する１００ｎＭ、３００ｎＭ、９００ｎＭの３×３の濃度組み合わせのうち、非特異的な合成なしに遺伝子増幅が最も良好とされる濃度を決定して使用した。ＭＵＣ５ＡＣ、ＩＣＡＭ−１、ＲＰＬ１について決定されたプライマーの濃度は、いずれも９００ｎＭであり、β−ＡＣＴは、３００ｎＭであった。全てのプ試験サンプルは、ｃＤＮＡを入れていない陰性対照群試料と比較し、非特異的増幅が行われているかの有無を確認した。また、同一実験を２回から３回反復し、ピペット当たり誤差（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｅｒｒｏｒ）、ウェル間変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）などによる実験的誤差を減らした。初期のＰＣＲ反応は、５０℃１分、９５℃１０分行い、９５℃１５秒、６０℃１分のＰＣＲ周期を４０回から５０回反復した。当該ＰＣＲ反応後に、機器から提供するプロトコルによって、分離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）実験を行って非特異的増幅の有無を確認した。
【００４５】
１−５−４．相対的遺伝子発現量の測定
テストする臨床試料の閾値（Ｃｔ）が検量線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）を外れないように、適切なｃＤＮＡ濃度を測定した。検量線は、試料から抽出したＲＮＡを混合した後、ｃＤＮＡを合成したものから得られた。反応ごとに同一プレート内で３回反復し、かつ、顕著な差を示すものを除外した残りの２〜３回の実験から得られた平均Ｃｔ値を利用して、検量線を描いた。このとき、検量線の相関係数Ｒ２値が１に近似し、かつ傾き値が３．３と近くなるように、閾値を調整した。
【００４６】
スタンダードとして使用したｃＤＮＡ内の特定遺伝子の正確な量が分からないために、本アッセイにより測定された遺伝子量を、スタンダード試料に基づく相対的な発現量であるとすることができる。まず、検量線を描くときに決定した閾値を使用して、各試料別のＣｔ値を決定した。前記Ｃｔ値を検量線と比較して、遺伝子量を求めた。試料別ｃＤＮＡ濃度差を補正し、各試料の相対的遺伝子発現量を決定した。
【００４７】
各試料間ｃＤＮＡ濃度差は、主に逆転写反応効率の差に起因する。すなわち、同じ条件で逆転写反応を行ったとしても、ＰＣＲ機器のウェル間のばらつきのために合成されるｃＤＮＡ量が若干ずつ異なる。逆転写後にｃＤＮＡだけを分離したり、その濃度を測定を行っていないため、ＲＴ効率による試料間ｃＤＮＡ濃度差は、内在性コントロールを使用して補正した。当該        内在性コントロールは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３を使用した。内在性コントロールの発現量は、同じであると仮定したので、各ｃＤＮＡの相対的な量は、内在性コントロールの発現量に比例する。従って、ｃＤＮＡ差を補正するための正常化倍数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｌｄ）は、内在性コントロールの相対的発現量の逆数となる。
【００４８】
ｃＤＮＡの濃度差を補正するときには、求められた検量線を利用して求められた遺伝子量に正常化倍数を乗じて、相対的遺伝子発現量を求めた。
【００４９】
２．結果
２−１．慢性気管支炎ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでのＥＧＦ効果
１００ｍｇ／ｍＬのＰＡ−ＬＰＳと１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−αとでＮＣｌ−Ｈ２９２細胞を同時に処理することで、粘液質遺伝子であるＭＵＣ５ＡＣを過発現させた後、当該ＮＣｌ−Ｈ２９２細胞を５０，１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦで処理した。そして、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡ発現を調べた結果を図１に示す。
【００５０】
図１から分かるように、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦによって、ＭＵＣ５ＡＣ発現が６５％に低減し、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦによって、６０％までＭＵＣ５ＡＣ発現が低減し、ＥＧＦによる粘液質発現の抑制効果を確認することができた。
【００５１】
２−２．肺気腫ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでのＥＧＦ効果
２−２−１．ＥＧＦの抗炎症効果
ＴＭＬＥ−１２細胞に０．１Ｕ／ｍＬのエラスターゼを単独処理した群と、ＴＭＬＥ−１２細胞に１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと０．１Ｕ／ｍＬのエラスターゼとを混合して処理した群と、のＩＣＡＭ−１遺伝子発現を比較した結果を図２に示す。ＩＣＡＭ−１は、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）と好中性白血球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）と肺の傷部位にを引き込み、炎症反応を悪化させると知られている。ＴＭＬＥ−１２細胞ＥＧＦで１時間前処理した後、エラスターゼで１８時間処理して、ＥＧＦによる抗炎症効果を調べた。
【００５２】
図２に示すように、エラスターゼを処理すれば、陰性対照群に比べて、ＩＣＡＭ−１の発現が２倍増加し、ＥＧＦを前処理した群では、６０％以上ＩＣＡＭ−１発現が低減し、ＥＧＦによる抗炎症効果を確認することができた。
【００５３】
２−２−２．肺胞細胞保護の効果
ＭＬＥ−１２細胞に２Ｕ／ｍＬのエラスターゼを単独処理した群と、さまざまな濃度のＥＧＦをＭＬＥ−１２細胞に混合して処理した群と、の細胞毒性を比較した結果を図３に示す。
【００５４】
図３に示すように、エラスターゼ単独処理グループを１００％、培養培地だけを処理した群を０％の細胞毒性であると設定した後、ＥＧＦの細胞保護効果を調べた結果、１６０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを添加した場合、細胞毒性が１０％ほど低減し、１００μｇ／ｍＬでは、１５％ほど毒性が低下し、エラスターゼによる細胞死滅から細胞を保護する効果を確認することができた。
【００５５】
２−２−３．ＰＰＥ誘発肺気腫モデル
ＰＰＥで誘発したラットの肺気腫モデルにおけるＥＧＦの効能を確認すべく、気管及び肺の組織病理学的検査を実施した。ノーマル群（Ｇ１）、ＰＰＥ誘発肺気腫モデルのコントロール群（Ｇ２）、およびＥＧＦ  ０．１ｍｇ／ｋｇで処理したＰＰＥ誘発肺気腫モデル群（Ｇ３）それぞれの気管組織について、光学顕微鏡（Ｘ４０）で観察して撮影した写真を、それぞれ、図４、図５及び図６に示す（図４：個体数＝５、図５：個体数＝２０、および図６：個体数＝１１）。また、気管及び肺の組織病理学的検査結果を、図７及び図８に表により示す。
【００５６】
組織病理学的検査の結果、ノーマル群（Ｇ１）では、肺胞拡張、組織球症及び杯状細胞の過剰形成がそれぞれ２例、３例及び１例であった。
【００５７】
ＰＰＥ誘発肺気腫モデルの群（Ｇ２及びＧ３）の主要所見としては、気腫性病変として、肺胞拡張（ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｖｅｏｌｉ）及び肺胞崩壊（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ａｌｖｅｏｌｉ）が観察された。一部の肺では、肺胞腔内空胞を含んだ細胞質が豊富な組織球が観察される肺胞組織球症（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ）及び局所的な出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）が観察された。
【００５８】
ＰＰＥ誘発肺気腫モデルのコントロール群（Ｇ２）は、肺胞拡張及び肺胞崩壊の所見が、軽度から顕著なほどまで多様であった。Ｇ２の病変は、他の群と比べてると深刻な状態である。肺胞拡張は、顕著な程度、中等及び軽度がそれぞれ１例、４例及び１例であり、肺胞崩壊は、中等及び軽度がそれぞれ３例であった。組織球症は、２例が観察されたが、その程度が微弱なレベルであった。
【００５９】
ＥＧＦ  ０．１ｍｇ／ｋｇで処理したＰＰＥ誘発肺気腫モデル群（Ｇ３）では、肺胞拡張は、中等、軽度及び極微な程度が、それぞれ１例、３例及び２例であり、肺胞崩壊は、中等、軽度及び極微な程度が、１例、３例及び１例確認された。組織球症は、極微な程度であり、１例観察された。
【００６０】
３．結論及び考察
慢性気管支炎と肺気腫とに対する治療効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価法で確認した結果、ＰＡ−ＬＰＳとＴＧＦ−αとによって過発現された粘液蛋白質（Ｍｕｃｉｎ）のうち、代表的であるＭＵＣ５ＡＣ遺伝子は、ＥＧＦによって発現が相対的に低減することを確認し、ＥＧＦ処理後にＩＣＡＭ−１発現が炎症を誘発させる肺胞細胞を低減するということを確認した。これにより、ＥＧＦが気道粘液の過剰分泌を抑制する効果があるということが分かった。
【００６１】
エラスターゼを使用して肺気腫の兆候のある肺胞細胞破壊を誘発させ、細胞死滅をニュートラルレッドで生存細胞を染色した。エラスターゼによって誘発された細胞死滅は、ＥＧＦの添加によって低減する傾向が現れた。これにより、ＥＧＦの肺胞細胞であるＭＬＥ−１２細胞に対する細胞保護効果が確認された。
【００６２】
ＰＰＥ誘発肺気腫モデルにおけるＥＧＦの効果を調べるべく、気管および肺における組織病理学的検査を行った。組織病理学的検査の結果、肺胞腔拡張及び肺胞壁崩壊といった肺気腫性の病変が主に観察されたが、肺の出血及び炎症または気道上皮（ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）のような異常性変体についてはは、ＰＰＥ誘発肺気腫モデルでは注目すべきレベルで確認されなかった。
【００６３】
ヒト好中球エラスターゼで誘発された肺の病変は、肺出血及び好中球浸潤を示す急性期、およびの過剰膨脹、弾性収縮力の低下及び空隙拡張を示す慢性期を備えていることを示す既存の報告とも類似していた。
【００６４】
本試験の結果、ノーマル群（Ｇ１）は、４ケースとも、ＰＰＥ誘発肺気腫モデル群とは異なり、病変の分布及び程度の観点から極微な肺胞拡張が観察された。このような極微な肺胞拡張は、物質自体の影響より、むしろ当該物質の気管内投与による物理的刺激が原因であると考えられる。ＰＰＥ誘発肺気腫モデルのコントロール群において、深刻な気腫性病変が確認された。は、当該気腫性病変は、エラスターゼによって誘発されたことを確認した。ＥＧＦで処理された肺気腫群（Ｇ３）では、肺胞拡張と肺胞崩壊とが、ＰＰＥ誘発肺気腫モデル群に比べて、病変の程度及び数が低減した。従って、本組織病理学的な検査の結果、ＰＰＥ誘導肺気腫モデルでのＥＧＦ投与によって、気腫病変が緩和されると判断された。
【００６５】
要約すれば、ＥＧＦは、粘液質過剰発現抑剤、肺胞細胞保護効果を有し、かつ肺気腫モデルでの組織病理学的所見の改善などの効果を有するということが確認された。そのため、ＥＧＦは、慢性気管支炎、肺気腫のようなＣＯＰＤにおいて効果があるだけではなく、広範囲な慢性肺疾患での気道粘液過分泌に対する予防効果及び治療効果があるということが分かる。
【００６６】
本発明について実施形態を用いて説明したが、それらは例示的なものに過ぎず、本技術分野の当業者であるならば、本発明の範囲および趣旨から外れない範囲で多様な変更および変形が可能であるということを理解することができるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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