(57)【要約】病原性細菌に引き続いて曝露される脊椎動物宿主における予防的免疫応答の産生に用いるため、細胞の微生物の免疫原性を高めるため、またはベクターとして使用し外因性抗原を発現して他の感染物質もしくは癌細胞に対する反応を誘発するための全細胞ワクチンおよび方法。本発明は、ワクチンの有効性を改善する方法で細胞内細菌により抗原提示を高めるさらなる方法に関する。細胞内微生物に感染した宿主細胞上の抗アポトーシス性効果を有する酵素を同定後、この細胞内微生物によって引き起こされた酵素の活性が酵素の変異体複製を発現することにより低下し、その結果、微生物が免疫原性を高めるようにこの微生物を修飾する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌を遺伝学的に変えて抗アポトーシス酵素のドミナントネガティブ変異体を発現し、それによって前記細菌が対象の免疫原性を高めることを含む、前記細菌を修飾して前記細菌の免疫原性を高める方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法に従い作製した修飾細菌。
【請求項３】
請求項２に記載の修飾細菌を含む、免疫原組成物。
【請求項４】
細菌を遺伝学的に変えて抗アポトーシス酵素のドミナントネガティブ変異体を発現させ、それによって前記細菌が対象の免疫原性を高めることを含む、弱毒化細菌を修飾して前記弱毒化細菌の免疫原性を高める方法。
【請求項５】
前記細菌がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ株ＢＣＧ、ＢＣＧ亜株、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、および他のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からなる群から選択される、請求項１および４に記載の方法。
【請求項６】
前記ドミナントネガティブ変異体がＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体であり、そこで天然核酸ヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が、生物のＳＯＤ活性と干渉する分子をコードする、請求項１および４に記載の方法。
【請求項７】
前記ドミナントネガティブ変異体がグルタミンシンターゼのドミナントネガティブ変異体であり、そこで天然核酸ヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が、生物のグルタミンシンターゼ活性と干渉する分子をコードする、請求項１および４に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌がＢＣＧである、請求項６および７に記載の方法。
【請求項９】
さらなるプロアポトーシス性修飾を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記さらなるプロアポトーシス性修飾がＳｉｇＨの不活性化、ｓｉｇＥの不活性化、ＳｅｃＡ２の不活性化、チオレドキシン活性の低下、チオレドキシン還元酵素活性の低下、グルタレドキシン活性の低下、チオールペルオキシダーゼ活性の低下、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン還元酵素Ｒｖ３３０３ｃ活性の低下からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンまたは７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ドミナントネガティブ変異体が５４位のグルタミン酸を欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ドミナントネガティブ変異体が５４位のグルタミン酸を欠失しており、２８位のヒスチジンがアルギニンと置換している変異体ＳｏｄＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌が、ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｉｇＨの不活性化を含む、請求項１０、１１、１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌が、ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｅｃＡ２の不活性化を含む、請求項１０、１１、１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が、ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体、ｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化を含む、請求項１０、１１、１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌が、ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体、ｇｌｎＡ１のドミナントネガティブ変異体、ｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化を含む、請求項１０、１１、１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌が、ｇｌｎＡ１のドミナントネガティブ変異体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記グルタミンシンターゼのドミナントネガティブ変異体が、アミノ酸５４位のアスパラギン酸およびアミノ酸３３５位のグルタミン酸の欠失を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記グルタミンシンターゼのドミナントネガティブ変異体が、アミノ酸５４位のアスパラギン酸またはアミノ酸３３５位のグルタミン酸の欠失を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌がｓｅｃＡ２の不活性化をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌がＳｏｄＡの不活性化をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌がｓｉｇＨの活性低下変異およびｓｅｃＡ２の不活性化をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌がＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｉｇＨの不活性化をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ドミナントネガティブ変異体が５４位のグルタミン酸を欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌がＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｅｃＡ２の不活性化をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記ドミナントネガティブ変異体が５４位のグルタミン酸を欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記細菌がｓｉｇＨの不活性化を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌がｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌が弱毒化している、請求項２に記載の修飾細菌。
【請求項３５】
前記細菌がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ株ＢＣＧ、ＢＣＧ亜株、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、および他のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からなる群から選択される、請求項２に記載の修飾細菌。
【請求項３６】
前記ドミナントネガティブ変異体が、
ａ）天然核酸ヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が、生物のＳＯＤ活性を低下させる分子をコードするＳｏｄＡ；ならびに
ｂ）天然核酸ヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が、生物のグルタミンシンターゼ活性を低下させる分子をコードするグルタミンシンターゼ
からなる群から選択されるドミナントネガティブ変異体である、請求項２に記載の修飾細菌。
【請求項３７】
前記細菌がＢＣＧである、請求項３６に記載の修飾細菌。
【請求項３８】
さらなるプロアポトーシス性修飾を含む、請求項３７に記載の修飾細菌。
【請求項３９】
前記さらなるプロアポトーシス性修飾が、ＳｉｇＨの不活性化、ｓｉｇＥの不活性化、ＳｅｃＡ２の不活性化、チオレドキシン活性の低下、チオレドキシン還元酵素活性の低下、グルタレドキシン活性の低下、チオールペルオキシダーゼ活性の低下、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン還元酵素Ｒｖ３３０３ｃ活性の低下からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求項３８に記載の修飾細菌。
【請求項４０】
前記ドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項３７に記載の修飾細菌。
【請求項４１】
前記ドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンまたは７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項３７に記載の修飾細菌。
【請求項４２】
前記ドミナントネガティブ変異体が５４位のグルタミン酸を欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項３７に記載の修飾細菌。
【請求項４３】
前記ドミナントネガティブ変異体が５４位のグルタミン酸を欠失しており、かつ、２８位のヒスチジンがアルギニンと置換している変異体ＳｏｄＡである、請求項３７に記載の修飾細菌。
【請求項４４】
前記細菌が、ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｉｇＨの不活性化を含む、請求項３９に記載の修飾細菌。
【請求項４５】
前記細菌が、ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｅｃＡ２の不活性化を含む、請求項３９に記載の修飾細菌。
【請求項４６】
前記細菌がＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体、ｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化を含む、請求項３９に記載の修飾細菌。
【請求項４７】
前記細菌がＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体、ｇｌｎＡ１のドミナントネガティブ変異体、ｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化を含む、請求項３９に記載の修飾細菌。
【請求項４８】
前記細菌がｇｌｎＡ１のドミナントネガティブ変異体を含む、請求項３９に記載の修飾細菌。
【請求項４９】
前記グルタミンシンターゼのドミナントネガティブ変異体が、アミノ酸５４位のアスパラギン酸およびアミノ酸３３５位のグルタミン酸の欠失を含む、請求項４８に記載の修飾細菌。
【請求項５０】
前記グルタミンシンターゼのドミナントネガティブ変異体が、アミノ酸５４位のアスパラギン酸またはアミノ酸３３５位のグルタミン酸の欠失を含む、請求項４８に記載の修飾細菌。
【請求項５１】
前記細菌がｓｅｃＡ２の不活性化をさらに含む、請求項４９に記載の修飾細菌。
【請求項５２】
前記細菌がＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体をさらに含む、請求項５１に記載の修飾細菌。
【請求項５３】
前記ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項５２に記載の修飾細菌。
【請求項５４】
前記細菌がｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化をさらに含む、請求項４９に記載の修飾細菌。
【請求項５５】
前記細菌がＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｉｇＨの不活性化をさらに含む、請求項４９に記載の修飾細菌。
【請求項５６】
前記ドミナントネガティブ変異体が５４位のグルタミン酸を欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項５５に記載の修飾細菌。
【請求項５７】
前記ドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項５５に記載の修飾細菌。
【請求項５８】
前記細菌がＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｅｃＡ２の不活性化をさらに含む、請求項４９に記載の修飾細菌。
【請求項５９】
前記ドミナントネガティブ変異体が５４位のグルタミン酸を欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項５８に記載の修飾細菌。
【請求項６０】
前記ドミナントネガティブ変異体が２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである、請求項５８に記載の修飾細菌。
【請求項６１】
前記細菌がｓｉｇＨの不活性化を含む、請求項２に記載の修飾細菌。
【請求項６２】
前記細菌がｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化を含む、請求項２に記載の修飾細菌。
【請求項６３】
プロアポトーシスＢＣＧ（ｐａＢＣＧ）を、膀胱癌を呈する対象へ投与することを含む、膀胱癌を治療する方法。
【請求項６４】
前記投与が膀胱内への点滴である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ｐａＢＣＧを、前記固形腫瘍を呈する対象へ投与することを含む、固形腫瘍を治療する方法。
【請求項６６】
前記投与が前記固形腫瘍内への病巣内注射である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記投与が腫瘍に供給する動脈内への動脈内注入である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記固形腫瘍が皮膚癌、脳癌、咽頭癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、胆管癌、膵臓癌、肛門癌、腎臓癌、前立腺癌、および肉腫からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
ａ）前記皮膚癌が黒色腫もしくは扁平上皮細胞癌であり；
ｂ）前記脳癌が神経膠芽腫、アストロチトームもしくは乏突起膠腫であり；
ｃ）前記肺癌が原発腫瘍もしくは他の腫瘍の肺転移であり；または
ｄ）前記肝臓癌が原発腫瘍（ヘパトーマ）もしくは他の腫瘍の肝転移である
請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記固形腫瘍が黒色腫であり、かつ、前記投与が前記黒色腫内への病巣内注射である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
癌を呈する対象に抗癌ワクチンおよびｐａＢＣＧを投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項７２】
前記抗癌ワクチンとｐａＢＣＧとが別々に投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗癌ワクチンとｐａＢＣＧとが別々におよび実質的に同時に投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗癌ワクチンとｐａＢＣＧとが混合される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
抗癌ワクチンとｐａＢＣＧとを含む組成物。
【請求項７６】
前記抗癌ワクチンが癌抗原を含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記抗癌ワクチンが自己由来癌細胞を含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７８】
ドミナントネガティブ変異体ＳｏｄＡ、変異体ＳｏｄＡ、またはＳｏｄＡペプチドを発現するｐａＢＣＧ、および医薬上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項７９】
ドミナントネガティブ変異体ＳｏｄＡ、変異体ＳｏｄＡ、またはＳｏｄＡペプチドを発現するｐａＢＣＧを含む組成物で対象を免疫化することを含む、活動性肺結核の発生を予防する方法。
【請求項８０】
ドミナントネガティブ変異体ＳｏｄＡ、変異体ＳｏｄＡ、またはＳｏｄＡペプチドを発現するｐａＢＣＧを含む組成物で対象を免疫化することを含む、活動性肺結核者の肺損傷を減少させる方法。
【請求項８１】
ドミナントネガティブ変異体ＳｏｄＡ、変異体ＳｏｄＡ、またはＳｏｄＡペプチドを発現するｐａＢＣＧを含む組成物で対象を免疫化することを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種感染者における肺線維症を減少させる方法。
【請求項８２】
対象にｐａＢＣＧを投与することを含む、癌を呈する対象を延命する方法。
【請求項８３】
対象にｐａＢＣＧを投与することを含む、対象が癌を発症する可能性を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００８年８月２９日に出願された第６１／０９２９４２号の利益を主張し、かかる出願は参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、ＳＥＲＣＥＢ（Ｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）ＮＩＨによって授与されたＵ５４Ａ１０５７１５７下の合衆国政府の財政的援助により行われ、本研究の一部では退役軍人医療センター局（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎ’ｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）研究施設が使用された。本発明において、合衆国政府は一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、強力な免疫応答の誘発ならびに感染疾患および癌の予防および治療を含むワクチン接種分野に関する。具体的には、本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、グルタミンシンターゼ、および他の抗アポトーシス酵素の活性を低下させることにより細菌の免疫原性を高める方法に関する。これは酵素のドミナントネガティブ変異体を発現させることによって、標的酵素の発現または分泌を調節する遺伝子を不活性化することによって、対立遺伝子の不活性化によって、および他の方法によって成し遂げ得る。本発明は、さらに、安全かつ有効なワクチンを産生する方法、および細菌性病原体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染に引き続いて曝露される宿主動物における効果的な免疫応答を高める方法に関する。これらの方法を用いて構築された免疫原ワクチンは外因性抗原発現ベクターでもあり得、非関連感染物質および癌に対する免疫応答を誘発するために使用することができる。最後に、マイコバクテリアのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるの免疫回避能および鉄排除能を軽減するための方法に関する。これらの方法は、癌の免疫療法として投与されたマイコバクテリアの効能を高めるため、潜伏結核感染または活性結核を呈する者を治療するため、ならびに他のマイコバクテリア感染（線維化肺疾患に関連したものを含む）を治療するために適用し得る。
【背景技術】
【０００３】
米国において膀胱癌は全固形腫瘍の約２％を占め、毎年５０，０００人を超える症例が新たに診断されている。膀胱癌罹患のピークは６０〜７０歳の個人であり、喫煙および工業化学物質への曝露を含むいくつかの病因要素が示唆されている。病理的に、膀胱癌は病期（通常Ｉ〜ＩＶ）および悪性度（表在性、侵襲性、または転移膀胱癌のいずれか）によって分類される。膀胱上皮に限られる表在性膀胱癌は、通常、乳頭腫瘍（病期ＴａまたはＴ１）またはｉｎ−ｓｉｔｕ癌腫として存在する。膀胱癌の診断は細胞検査および生検による。診断時、患者の約７０％は表在性疾患のみ、２５％は局所侵襲疾患を呈し、５％は既に遠位転移を呈している。
【０００４】
表在性膀胱癌は経尿管切除（ＴＵＲＢＴ）および／または高周波療法で治療される。細胞検査は、通常、経尿管切除できない腫瘍のために保留される。ＴＵＲＢＴ後、５０％の患者は無疾患のままである；しかしながら残りの半分は複数の再発を経験し、約１０％が３〜４年以内に侵襲的または転移疾患を発現する。表在性再発はＴＵＲＢＴで治療し、しばしば、膀胱内化学療法を続けて行い、任意のさらなる再発を予防または遅延化させる。初回ＴＵＲＢＴ後の再発リスクが高いとみなされる患者（例えば高グレード、多病巣、および／または大腫瘍）、またはＣＩＳ合併患者には、再発予防法として膀胱内補助療法を頻繁に行う。膀胱内ＢＣＧ投与はこの補助療法用に選択される治療である。
【０００５】
ＴＩＣＥ（登録商標）ＢＣＧは米国で１９８９年、癌腫ｉｎ−ｓｉｔｕ治療用（ただし乳頭病巣ＴａまたはＴ１用ではない）に認可された。ＴＩＣＥ亜株を用いたｉｎ−ｓｉｔｕ癌腫治療のための認可を得るため、後援者は検討可能な生検確定ＣＩＳ患者１１９例の有効性データを提出した。このデータは６件の第ＩＩ相非対照試験から得られた。第ＩＩＩ相対照試験は行われなかった。検討された主要評価項目は完全奏効（ＣＲ）の発現であった。２年間のフォローアップに基づく初回奏効率は７５．６％であった。中央値４７ヶ月間のフォローアップ期間後、４５件のＣＲがあり、全体の長期奏効率３８％に至った。その時点で、患者８５例（７１％）が生存しており、患者１８例（１５％）が膀胱癌にて死亡し、１３例（１２％）が他の原因で死亡していた。諮問委員会は、膀胱内ＢＣＧの使用前に得られた歴史的データによりＣＩＳ患者の３４％が５年間でこの疾患により死亡したことが示されたと述べた。
【０００６】
本出願は、マイコバクテリウムにおける抗アポトーシス性微生物酵素の活性を低下させる方法を開示する。また、開示した方法に従い作製された、抗癌効果の高まった修飾細菌を開示する。
【０００７】
悪性胸膜中皮腫患者３０例がＢＣＧワクチン免疫療法で治療されており、症候的にのみ治療された患者と比較して生存率の改善が認められている。非特許文献１を参照されたい。
【０００８】
ＢＣＧが膀胱治療に有益である機序は、免疫細胞（特に、天然キラー（ＮＫ）細胞および多形核白血球（ＰＭＮ）などの感染に対する先天性免疫応答に関連する細胞）を動員および活性化するＢＣＧの能力に関連すると思われる。ＢＣＧは腫瘍環境でフィブロネクチンに結合してから、上皮細胞（悪性細胞を含む）内に入るという証拠がある。ＮＫ細胞、ＰＭＮ、および他の免疫細胞がＢＣＧ桿菌に反応すると、腫瘍細胞上で細胞傷害効果を発揮する。
【０００９】
ＢＣＧの元々の使用は結核（ＴＢ）に対してであった。ＴＢはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにより引き起こされる感染疾患である。世界人口の３分の１、約２０億人がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染しており、この巨大な病原体保有者集団のうち年間約９百万の活性ＴＢの新規症例がある。感染しているが疾患活性のない者は潜在性ＴＢ感染保因者とみなされ、残りの生涯、活性ＴＢ発現リスクが残る。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）はＭ．ｂｏｖｉｓ毒性株から生成され、１９２０年代にＴＢ予防ワクチンとして最初に投与された。ＢＣＧは散在型ＴＢ（初期小児期におけるＴＢ髄膜炎および粟粒性ＴＢを含む）の予防に効果的であり、世界で毎年約１億人の新生児に対するＢＣＧ投与が年間約４０，０００症例の散在ＴＢを予防している。残念ながら、疾患の世界的な負担の大半を引き起こす肺感染型ＴＢの予防においてはＢＣＧの効果は弱い。さらに、マイコバクテリア抽出体による免疫療法は活性ＴＢ者における補助療法として使用されているが、この恩恵はあまり大きくない。さらに、潜在性ＴＢ感染者に投与時にはＢＣＧの恩恵はなく、かかる潜在性ＴＢ感染者において価値を示す代替的なワクチンまたは免疫療法はない。
【００１０】
最後に、マイコバクテリウム種感染が他の肺疾患（サルコイドーシスを含む）の病理発生の一因であるという証拠が増大している。一部の者では、サルコイドーシスは進行性肺線維症を続発する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＧ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ３０  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．  Ｓ  Ａｆｒ  Ｍｅｄ  Ｊ．  １９８２  Ｆｅｂ  ２０；６１（８）：２７７−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はマイコバクテリウムを修飾して先天性免疫細胞の動員および活性化を高める方法に関する。先天性免疫細胞の一部、特にＮＫ細胞およびＰＭＮは、修飾マイコバクテリウム株により活性化されると、バイスタンダー細胞（腫瘍細胞を含む）を殺す顆粒を放出する。さらに、先天性免疫応答の上昇は、免疫記憶を誘発してワクチンの有効性を改善するように、抗原提示を高め、ＣＤ４＋リンパ細胞に関連する強力な適応的免疫応答を発現させる。高まった記憶免疫応答は、マイコバクテリウムならびにマイコバクテリウムに固有の抗原へ挿入される外因性抗原（腫瘍抗原を含む）を指向とすることができる。プロアポトーシス表現型を発現するマイコバクテリウムの修飾を提供し、それ以外に、アポトーシスの代わりに細胞壊死に至り得るマクロファージによるトランスフェリン受容体の発現および鉄の細胞内取り込みを減らす修飾も同様に提供される。
【００１３】
また、通常、現在のワクチン接種戦略で強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘発を成し遂げることは困難であるため、本明細書の修飾微生物はこの免疫系のアームを利用する非常に効果的な方法を提供する。この微生物は、ウイルス、細菌、原生動物、および真菌を含む他の病原性微生物由来の免疫優性抗原をコードする外因性ＤＮＡを付加することにより、または癌抗原をコードするＤＮＡにより、さらに改変して、宿主動物の接種に用いることができる。従って、本明細書の弱毒化細菌は、ＭＨＣクラスＩ経路およびＭＨＣクラスＩＩ経路によるプロセシングのために抗原を提示するワクチン送達ビヒクルとして使用できる。また宿主細胞上のＴｏｌｌ様受容体と相互作用するワクチンベクター中の微生物成分によって誘発される強力な共刺激シグナルに起因し、これは、免疫忍容性を獲得するのではなく、宿主免疫系を外因性抗原に対して反応するようにさせる。さらに、樹状細胞によるＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ経路による抗原の同時提示は、ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）反応のために「役立つ」ＣＤ４の発現を促進することにより、抗原提示の外因性（例えば、多くの細菌ベクター、食胞関連）または内因性（例えば、多くのウイルスベクター、細胞質およびプロテアソーム関連）経路のいずれかを利用するように設計されている現在のベクターによる抗原提示の限界を克服する。
【００１４】
本発明は、宿主内マイコバクテリウムを標的とし、マイコバクテリウムのトランスフェリン受容体の発現およびマクロファージによる鉄の細胞内取り込み誘発能力を低下させる方法も提供する。マイコバクテリウムの抗酸化酵素による非感染または感染宿主の免疫化、特に鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼ（ＳｏｄＡ）による免疫化は、マイコバクテリウム酵素の活性を低下させる細胞免疫応答および抗体の産生を生成する。かかる免疫化は、膀胱癌または他の悪性腫瘍者にＢＣＧを治療的に投与する前に実施できる。免疫化は、ＢＣＧをアジュバントとして癌ワクチンと併用使用する者に対して、生ＢＣＧ桿菌からのアジュバント効果の効能を高める方法でも行うことができる。さらに、潜在性ＴＢ感染者、活性ＴＢを有する者、またはマイコバクテリウムによって引き起こされる線維化肺疾患者を酵素で免疫化することができる。続いて、宿主を感染させるマイコバクテリウムの、マクロファージによる鉄の取り込みを促進し、肉芽腫肺病理、肺腔の発現、または肺疾患の線維化のいずれかとして明白な肺組織損傷を引き起こす可能性が軽減する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ＢＣＧの鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼ（ＳｏｄＡ）の図を示す。（Ａ）本明細書のＳｏｄＡ変異体における欠失アミノ酸の位置を示すＳｏｄＡモノマー。さらなるドミナントネガティブＳｏｄＡ変異体を産生するために、他の欠失、付加、および／または置換を使用できる。（Ｂ）は、２つの活性部位の鉄イオンの位置を示す各長方形のＳｏｄＡ四量体を示す。矢印は同一モノマーの活性部位の鉄およびＥ５４位を特定する。図は国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ＆ｉｔｏｏｌ＝ｔｏｏｌｂａｒ）よりダウンロードし、修正して特徴を例示した。
【図１Ｂ】Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ＢＣＧの鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼ（ＳｏｄＡ）の図を示す。（Ａ）本明細書のＳｏｄＡ変異体における欠失アミノ酸の位置を示すＳｏｄＡモノマー。さらなるドミナントネガティブＳｏｄＡ変異体を産生するために、他の欠失、付加、および／または置換を使用できる。（Ｂ）は、２つの活性部位の鉄イオンの位置を示す各長方形のＳｏｄＡ四量体を示す。矢印は同一モノマーの活性部位の鉄およびＥ５４位を特定する。図は国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ＆ｉｔｏｏｌ＝ｔｏｏｌｂａｒ）よりダウンロードし、修正して特徴を例示した。
【図２Ａ】マイコバクテリア染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）、ならびにＢＣＧにおける変異体ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６を発現するプラスミドベクターｐＭＰ３４９のマップ（Ｃ）および特性（Ｄ）を提供する。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ＢＣＧ中の鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子名はｓｏｄＡである。ｓｏｄＡは誘発性ａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろに発現する。Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点（ｏｒｉＥ）はＥ．ｃｏｌｉ内でのプラスミド複製を可能にする。アプラマイシン耐性遺伝子（ａａｃＣ４１）ならびにベクターｐＭＰ３９９およびｐＭＰ３４９はＣｏｎｓａｕｌ  ａｎｄ  Ｐａｖｅｌｋａにより開発された。アプラマイシン耐性遺伝子は、異なる抗生物質耐性遺伝子により置換でき、またはベクターは細菌株中のアミノ酸栄養要求性を補足する生合成遺伝子を含むことができ、その結果、成功した組換え体を同定するために選択可能なマーカーとして使用される、必須因子（例えば、アミノ酸）を欠いた培地上の増殖を可能にする。
【図２Ｂ】マイコバクテリア染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）、ならびにＢＣＧにおける変異体ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６を発現するプラスミドベクターｐＭＰ３４９のマップ（Ｃ）および特性（Ｄ）を提供する。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ＢＣＧ中の鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子名はｓｏｄＡである。ｓｏｄＡは誘発性ａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろに発現する。Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点（ｏｒｉＥ）はＥ．ｃｏｌｉ内でのプラスミド複製を可能にする。アプラマイシン耐性遺伝子（ａａｃＣ４１）ならびにベクターｐＭＰ３９９およびｐＭＰ３４９はＣｏｎｓａｕｌ  ａｎｄ  Ｐａｖｅｌｋａにより開発された。アプラマイシン耐性遺伝子は、異なる抗生物質耐性遺伝子により置換でき、またはベクターは細菌株中のアミノ酸栄養要求性を補足する生合成遺伝子を含むことができ、その結果、成功した組換え体を同定するために選択可能なマーカーとして使用される、必須因子（例えば、アミノ酸）を欠いた培地上の増殖を可能にする。
【図２Ｃ】マイコバクテリア染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）、ならびにＢＣＧにおける変異体ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６を発現するプラスミドベクターｐＭＰ３４９のマップ（Ｃ）および特性（Ｄ）を提供する。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ＢＣＧ中の鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子名はｓｏｄＡである。ｓｏｄＡは誘発性ａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろに発現する。Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点（ｏｒｉＥ）はＥ．ｃｏｌｉ内でのプラスミド複製を可能にする。アプラマイシン耐性遺伝子（ａａｃＣ４１）ならびにベクターｐＭＰ３９９およびｐＭＰ３４９はＣｏｎｓａｕｌ  ａｎｄ  Ｐａｖｅｌｋａにより開発された。アプラマイシン耐性遺伝子は、異なる抗生物質耐性遺伝子により置換でき、またはベクターは細菌株中のアミノ酸栄養要求性を補足する生合成遺伝子を含むことができ、その結果、成功した組換え体を同定するために選択可能なマーカーとして使用される、必須因子（例えば、アミノ酸）を欠いた培地上の増殖を可能にする。
【図２Ｄ】マイコバクテリア染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）、ならびにＢＣＧにおける変異体ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６を発現するプラスミドベクターｐＭＰ３４９のマップ（Ｃ）および特性（Ｄ）を提供する。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ＢＣＧ中の鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子名はｓｏｄＡである。ｓｏｄＡは誘発性ａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろに発現する。Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点（ｏｒｉＥ）はＥ．ｃｏｌｉ内でのプラスミド複製を可能にする。アプラマイシン耐性遺伝子（ａａｃＣ４１）ならびにベクターｐＭＰ３９９およびｐＭＰ３４９はＣｏｎｓａｕｌ  ａｎｄ  Ｐａｖｅｌｋａにより開発された。アプラマイシン耐性遺伝子は、異なる抗生物質耐性遺伝子により置換でき、またはベクターは細菌株中のアミノ酸栄養要求性を補足する生合成遺伝子を含むことができ、その結果、成功した組換え体を同定するために選択可能なマーカーとして使用される、必須因子（例えば、アミノ酸）を欠いた培地上の増殖を可能にする。
【図３】親ＢＣＧ株のＳＯＤ活性と比較した、変異体ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）を発現するＢＣＧの上清および溶解物中のＳＯＤ活性を示す。（Ａ）および（Ｂ）は２件の別々の実験の結果を示す。このアッセイは、上清および溶解物の段階２倍希釈を用いて、固定時点のシトクロムＣ還元量をモニタリングして実施する。ＳＯＤ活性単位はシトクロムＣ還元を（最大阻害測定値の）５０％阻害する。各調製においてシトクロムＣ還元を５０％阻害する希釈（ＩＣ５０値）を矢印で示す。ＳｏｄＡはＢＣＧにより分泌され、従ってＢＣＧ上清のＳＯＤ活性はＢＣＧ溶解物のＳＯＤ活性を超える。
【図４】親ＢＣＧ株のＳＯＤ活性と比較した変異体ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）を発現するＢＣＧの上清および溶解物におけるＳＯＤ活性を示す。
【図５Ａ】ＢＣＧ対ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤの相対的なワクチンの有効性を示す。これらの実験に使用したＳＤ−ＢＣＧ（ＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ）株を、アンチセンス技術を用いて構築し（アンチセンスのＳＯＤ活性低下の教示のため参照により本明細書に組み込まれる「Ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」という題名のＷＯ０２／０６２２９８号を参照されたい）、親ＢＣＧ株のＳＯＤ活性の約１％を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＢＣＧまたはＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤでＩＶ接種し、７ヶ月間休薬してから、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性Ｅｒｄｍａｎ株のアクリフラビン−Ｒ変異体３０ｃｆｕをエアゾール投与した。投与後１４週目、非接種およびＢＣＧ接種マウスは高密度の細胞の実質肺炎症の病巣領域を示した（Ａ、×２および×１０に示される代表切片）。対照的に、ＳＤ−ＢＣＧ接種マウスでは肺に関わる細胞領域密度はあまり高くなかった（Ｂ、×２および×１０）。Ｂのさらに高倍率像（Ｃ）は、肺胞（左パネル）および多核巨細胞（右パネル）に取りこまれたアポトーシス性破片を示す核断片を含む泡沫細胞を示す。投与後６ヶ月目の最終採集時、ＳＤ−ＢＣＧレシピエントにおけるＥｒｄｍａｎのｃｆｕ数はＢＣＧレシピエントと比較して低かった（Ｄ）。ボックスプロット内の線は、中央値を示し、ボックスの両端は第２５百分位数と第７５百分位数を示し、ひげは第１０百分位数と第９０百分位数を表す。群間差は統計的に有意であった（Ｐ＝．０４、二標本ｔ検定）。また、この時点で、各群マウスの最終平均重量は、ＢＣＧ［元の１２匹のマウス中８匹生存、皮膚問題のため４匹安楽死］およびＳＤ−ＢＣＧ［１０匹生存］でそれぞれ２８．３および３１．０ｇであった（Ｐ＝．０４、二標本ｔ検定）。従って、ＢＣＧによるＳｏｄＡ産生の減少は、ワクチンとしてのその有効性を高めた。
【図５Ｂ】ＢＣＧ対ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤの相対的なワクチンの有効性を示す。これらの実験に使用したＳＤ−ＢＣＧ（ＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ）株を、アンチセンス技術を用いて構築し（アンチセンスのＳＯＤ活性低下の教示のため参照により本明細書に組み込まれる「Ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」という題名のＷＯ０２／０６２２９８号を参照されたい）、親ＢＣＧ株のＳＯＤ活性の約１％を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＢＣＧまたはＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤでＩＶ接種し、７ヶ月間休薬してから、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性Ｅｒｄｍａｎ株のアクリフラビン−Ｒ変異体３０ｃｆｕをエアゾール投与した。投与後１４週目、非接種およびＢＣＧ接種マウスは高密度の細胞の実質肺炎症の病巣領域を示した（Ａ、×２および×１０に示される代表切片）。対照的に、ＳＤ−ＢＣＧ接種マウスでは肺に関わる細胞領域密度はあまり高くなかった（Ｂ、×２および×１０）。Ｂのさらに高倍率像（Ｃ）は、肺胞（左パネル）および多核巨細胞（右パネル）に取りこまれたアポトーシス性破片を示す核断片を含む泡沫細胞を示す。投与後６ヶ月目の最終採集時、ＳＤ−ＢＣＧレシピエントにおけるＥｒｄｍａｎのｃｆｕ数はＢＣＧレシピエントと比較して低かった（Ｄ）。ボックスプロット内の線は、中央値を示し、ボックスの両端は第２５百分位数と第７５百分位数を示し、ひげは第１０百分位数と第９０百分位数を表す。群間差は統計的に有意であった（Ｐ＝．０４、二標本ｔ検定）。また、この時点で、各群マウスの最終平均重量は、ＢＣＧ［元の１２匹のマウス中８匹生存、皮膚問題のため４匹安楽死］およびＳＤ−ＢＣＧ［１０匹生存］でそれぞれ２８．３および３１．０ｇであった（Ｐ＝．０４、二標本ｔ検定）。従って、ＢＣＧによるＳｏｄＡ産生の減少は、ワクチンとしてのその有効性を高めた。
【図５Ｃ】ＢＣＧ対ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤの相対的なワクチンの有効性を示す。これらの実験に使用したＳＤ−ＢＣＧ（ＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ）株を、アンチセンス技術を用いて構築し（アンチセンスのＳＯＤ活性低下の教示のため参照により本明細書に組み込まれる「Ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」という題名のＷＯ０２／０６２２９８号を参照されたい）、親ＢＣＧ株のＳＯＤ活性の約１％を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＢＣＧまたはＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤでＩＶ接種し、７ヶ月間休薬してから、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性Ｅｒｄｍａｎ株のアクリフラビン−Ｒ変異体３０ｃｆｕをエアゾール投与した。投与後１４週目、非接種およびＢＣＧ接種マウスは高密度の細胞の実質肺炎症の病巣領域を示した（Ａ、×２および×１０に示される代表切片）。対照的に、ＳＤ−ＢＣＧ接種マウスでは肺に関わる細胞領域密度はあまり高くなかった（Ｂ、×２および×１０）。Ｂのさらに高倍率像（Ｃ）は、肺胞（左パネル）および多核巨細胞（右パネル）に取りこまれたアポトーシス性破片を示す核断片を含む泡沫細胞を示す。投与後６ヶ月目の最終採集時、ＳＤ−ＢＣＧレシピエントにおけるＥｒｄｍａｎのｃｆｕ数はＢＣＧレシピエントと比較して低かった（Ｄ）。ボックスプロット内の線は、中央値を示し、ボックスの両端は第２５百分位数と第７５百分位数を示し、ひげは第１０百分位数と第９０百分位数を表す。群間差は統計的に有意であった（Ｐ＝．０４、二標本ｔ検定）。また、この時点で、各群マウスの最終平均重量は、ＢＣＧ［元の１２匹のマウス中８匹生存、皮膚問題のため４匹安楽死］およびＳＤ−ＢＣＧ［１０匹生存］でそれぞれ２８．３および３１．０ｇであった（Ｐ＝．０４、二標本ｔ検定）。従って、ＢＣＧによるＳｏｄＡ産生の減少は、ワクチンとしてのその有効性を高めた。
【図５Ｄ】ＢＣＧ対ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤの相対的なワクチンの有効性を示す。これらの実験に使用したＳＤ−ＢＣＧ（ＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ）株を、アンチセンス技術を用いて構築し（アンチセンスのＳＯＤ活性低下の教示のため参照により本明細書に組み込まれる「Ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」という題名のＷＯ０２／０６２２９８号を参照されたい）、親ＢＣＧ株のＳＯＤ活性の約１％を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＢＣＧまたはＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤでＩＶ接種し、７ヶ月間休薬してから、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性Ｅｒｄｍａｎ株のアクリフラビン−Ｒ変異体３０ｃｆｕをエアゾール投与した。投与後１４週目、非接種およびＢＣＧ接種マウスは高密度の細胞の実質肺炎症の病巣領域を示した（Ａ、×２および×１０に示される代表切片）。対照的に、ＳＤ−ＢＣＧ接種マウスでは肺に関わる細胞領域密度はあまり高くなかった（Ｂ、×２および×１０）。Ｂのさらに高倍率像（Ｃ）は、肺胞（左パネル）および多核巨細胞（右パネル）に取りこまれたアポトーシス性破片を示す核断片を含む泡沫細胞を示す。投与後６ヶ月目の最終採集時、ＳＤ−ＢＣＧレシピエントにおけるＥｒｄｍａｎのｃｆｕ数はＢＣＧレシピエントと比較して低かった（Ｄ）。ボックスプロット内の線は、中央値を示し、ボックスの両端は第２５百分位数と第７５百分位数を示し、ひげは第１０百分位数と第９０百分位数を表す。群間差は統計的に有意であった（Ｐ＝．０４、二標本ｔ検定）。また、この時点で、各群マウスの最終平均重量は、ＢＣＧ［元の１２匹のマウス中８匹生存、皮膚問題のため４匹安楽死］およびＳＤ−ＢＣＧ［１０匹生存］でそれぞれ２８．３および３１．０ｇであった（Ｐ＝．０４、二標本ｔ検定）。従って、ＢＣＧによるＳｏｄＡ産生の減少は、ワクチンとしてのその有効性を高めた。
【図６】ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤによるワクチン接種は、病原性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓをエアゾール投与後のマウス肺におけるリコールＴ細胞応答を変えることを示す。マウスにＢＣＧ、ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤ、またはリン酸緩衝生理食塩水（非接種）のいずれかを２×１０６ｃｆｕで皮下接種し、１００日間休薬してから、Ｅｒｄｍａｎ  ３００ｃｆｕをエアゾール投与した。値は、投与後４、１０、および１８日間のマウス右肺から採集した指定の表面抗原（左カラム）を発現する細胞数を表す。両肺を対照マウスから採集した。各値は対照値用に使用した３匹のマウスを除き、４匹のマウスの平均を示す。ＢＣＧ接種群は、ＢＣＧまたはＣ−ＢＣＧのいずれかを投与したマウスを含む。ＳＤ−ＢＣＧレシピエントは感染後４日目までにＣＤ４４＋／ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞数が多いことを示した。これらの細胞は正散布により他のＴ細胞集団より大きく、クローン性増殖中のＴ細胞を表し得る。１８日目までに、ＢＣＧよりもＳＤ−ＢＣＧレシピエントにおいて末端分化型ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ４５ＲＢｎｅｇ）数が多いことを観察した。＊Ｐ＝．０２；¶Ｐ＜．０５、ＢＣＧ対ＳＤ−ＢＣＧ、二標本ｔ検定。
【図７】ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤ接種マウスにおいて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性Ｅｒｄｍａｎ株のアクリフラビン−Ｒ変異体３００ｃｆｕをエアゾール投与後での加速したゴーン病巣形成を示す。投与後１８日目の左肺の低倍率（×２）と中倍率（×２０）顕微鏡写真を示す。投与後１０日目〜１８日目、ＳＤ−ＢＣＧ接種では肺柔組織細胞の多数の小さな病巣凝結が発現した（右パネル）。１０日目〜１８日目の変化はＢＣＧ接種マウスでは少なく、非接種マウスでは観察されなかった。ＳＤ−ＢＣＧマウスにおける小さな病巣細胞堆積はＢＣＧ接種マウスにおける肉芽腫炎症の拡大領域と外見上異なり、薄い細胞質および初期泡沫変化を伴うより大きな単核細胞（しばしばアポトーシス性細胞破片を示す核断片を含む）を示す。
【図８Ａ】ＢＣＧの染色体上のｓｉｇＨを不活性化してＳＩＧ−ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨ）を構築するために使用したベクターのマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を示す。
【図８Ｂ】ＢＣＧの染色体上のｓｉｇＨを不活性化してＳＩＧ−ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨ）を構築するために使用したベクターのマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を示す。
【図９】エアゾール投与後６ヶ月目の肺ｃｆｕ数を示す。マウスはＢＣＧまたはＢＣＧΔｓｉｇＨの皮下ワクチン接種後１００日間休薬してから、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性Ｅｒｄｍａｎ株のアクリフラビン−Ｒ変異体を３００ｃｆｕ投与した。ボックスプロット内の線は中央値を示し、ボックスの両端は第２５百分位数と第７５百分位数を示し、ひげは第１０百分位数と第９０百分位数を表す。群間差は統計的に有意であった（Ｐ＝．０１９、二標本ｔ検定）。
【図１０】Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性Ｅｒｄｍａｎ株のアクリフラビン−Ｒ変異体を３００ｃｆｕ投与後６ヶ月目のプラセボ（生理食塩水）、ＢＣＧ、またはＢＣＧΔｓｉｇＨを接種したマウス肺切片の顕微鏡写真を示す。各群２匹のマウス肺を１０％緩衝ホルマリンおよびパラフィン包埋により膨張させた。顕微鏡用スライド上で示された肺組織切片の約８０％を映した３つの低倍率顕微鏡写真を示し、ＢＣＧΔｓｉｇＨ接種マウスにおける疾患の少ない肺を示す。ボックスは図１１の高倍率下で示された領域を示す。
【図１１】Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性Ｅｒｄｍａｎ株のアクリフラビン−Ｒ変異体３００ｃｆｕをエアゾール投与後２２日、２ヶ月、および６ヶ月目のマウスのゴーン病巣（矢印）の形成および発達を示す。マウスにプラセボ（生理食塩水）、ＢＣＧ、またはＢＣＧΔｓｉｇＨを皮下接種し、エアゾール投与前１００日間休薬した。ゴーン病巣はＢＣＧΔｓｉｇＨ接種マウスにて早く発現し、少ない肉芽腫炎症を伴い発達することにより、肺損傷度は最小限となる。対照的に、非接種およびＢＣＧ接種マウスの肺には、リンパ細胞およびマクロファージ浸潤による高密度の実質性炎症領域が発現する。６ヶ月目の顕微鏡写真は図１０の囲み領域に相当する。
【図１２】免疫活性化における逐次過程を例示説明し、微生物抗酸化物が初期の免疫応答活性化にどのように干渉し得るかを示す。微生物抗酸化物の活性の低下は、ワクチン接種中のアポトーシスおよび他の免疫機能を支持する。これは記憶Ｔ細胞応答を強め、予防を高める。
【図１３】複数遺伝子において遺伝子欠失とドミナントネガティブ変異体を組み合わせ、より強力なプロアポトーシスＢＣＧ株を徐々に得、結核ワクチンとしておよび外因性抗原発現ベクターとして用いる戦略を示す。このプロアポトーシスワクチン株は、１代目が単独の遺伝子不活性化またはドミナントネガティブ変異体酵素発現を含むＢＣＧ修飾に関し、２代目が２つの修飾を連合し、３代目が３つの修飾を連合し、４代目が４つの修飾を連合する「世代」アプローチを用いて構築される。
【図１４Ａ】ＳＩＧ−ＢＣＧおよびＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧの上清および溶解物中のＳＯＤ活性を示す。ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ｓｉｇＨ−欠失ＢＣＧ」、または「ＢＣＧΔｓｉｇＨ」とも称される）はこの図でＢＣＧ  ｄＳｉｇＨと示す。ＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨ［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ］」とも称される）は、どちらのドミナントネガティブ変異体を試験したかによってＢＣＧ  ｄＳｉｇＨ  Ｈ２８Ｈ７６（パネルＡおよびＢ）またはＢＣＧ  ｄＳｉｇＨ  Ｅ５４（パネルＣ）と示す。「ｓｕｐｅ」は上清の略語である。このアッセイを上清および溶解物の段階２倍希釈を用いて実施し、固定時点のシトクロムＣ還元量をモニタリングする。ＳＯＤ活性単位はシトクロムＣ還元を（最大阻害測定値の）５０％阻害する。各調製においてシトクロムＣ還元を５０％阻害する希釈（ＩＣ５０値）を矢印で示す。
【図１４Ｂ】ＳＩＧ−ＢＣＧおよびＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧの上清および溶解物中のＳＯＤ活性を示す。ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ｓｉｇＨ−欠失ＢＣＧ」、または「ＢＣＧΔｓｉｇＨ」とも称される）はこの図でＢＣＧ  ｄＳｉｇＨと示す。ＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨ［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ］」とも称される）は、どちらのドミナントネガティブ変異体を試験したかによってＢＣＧ  ｄＳｉｇＨ  Ｈ２８Ｈ７６（パネルＡおよびＢ）またはＢＣＧ  ｄＳｉｇＨ  Ｅ５４（パネルＣ）と示す。「ｓｕｐｅ」は上清の略語である。このアッセイを上清および溶解物の段階２倍希釈を用いて実施し、固定時点のシトクロムＣ還元量をモニタリングする。ＳＯＤ活性単位はシトクロムＣ還元を（最大阻害測定値の）５０％阻害する。各調製においてシトクロムＣ還元を５０％阻害する希釈（ＩＣ５０値）を矢印で示す。
【図１４Ｃ】ＳＩＧ−ＢＣＧおよびＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧの上清および溶解物中のＳＯＤ活性を示す。ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ｓｉｇＨ−欠失ＢＣＧ」、または「ＢＣＧΔｓｉｇＨ」とも称される）はこの図でＢＣＧ  ｄＳｉｇＨと示す。ＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨ［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ］」とも称される）は、どちらのドミナントネガティブ変異体を試験したかによってＢＣＧ  ｄＳｉｇＨ  Ｈ２８Ｈ７６（パネルＡおよびＢ）またはＢＣＧ  ｄＳｉｇＨ  Ｅ５４（パネルＣ）と示す。「ｓｕｐｅ」は上清の略語である。このアッセイを上清および溶解物の段階２倍希釈を用いて実施し、固定時点のシトクロムＣ還元量をモニタリングする。ＳＯＤ活性単位はシトクロムＣ還元を（最大阻害測定値の）５０％阻害する。各調製においてシトクロムＣ還元を５０％阻害する希釈（ＩＣ５０値）を矢印で示す。
【図１５】「ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２」と称するＤＤ−ＢＣＧ（「二重欠失ＢＣＧ」）の構築を検証するサザンハイブリダイゼーション結果を示す。４つの分離株由来の染色体ＤＮＡをＤｒａＩＩＩで消化し、レーン１〜４に適用してから、遺伝子プローブとハイブリッド形成した。この遺伝子プローブをｓｅｃＡ２、ｓｉｇＨ、およびｈｙｇＲ（挿入したｓｉｇＨ不活性化に使用したハイグロマイシン耐性カセットをコードする遺伝子）に対して方向付けた。ベクターと染色体間の二重交差イベントがｓｉｇＨを除去し、従ってさらなる成功の保証が提供された場合（ｓｉｇＨバンドの欠如を超える）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇＲ）は２．９２および１．６７ｋｂ断片を得ると予想される内部制限部位を有した。ＤＤ−ＢＣＧ構築における一連のイベントは下記の工程を含んだ：ＢＣＧ  Ｔｉｃｅ株（レーン１）で開始し、病原性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株中のｓｅｃＡ２を不活性化する先に使用された方法［ｓｅｃＡ２を不活性化する方法の教示のため参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００２；  Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００３］を用いてＢＣＧ  Ｔｉｃｅ中のｓｅｃＡ２遺伝子を不活性化することによりＢＣＧΔｓｅｃＡ２（レーン２）を産生すること。図８に示す対立遺伝子の不活性化ベクターを使用してＢＣＧ内のｓｉｇＨを不活性化し、ＢＣＧΔｓｉｇＨ（レーン３）を得、ＢＣＧΔｓｅｃＡ２内のｓｉｇＨも削除することによりＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２（レーン４、ＤＤ−ＢＣＧ）を得た。
【図１６Ａ】ｓｉｇＨ−ｓｅｃＡ２欠失ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２、二重欠失ＢＣＧ［「ＤＤ−ＢＣＧ」］とも称される）ならびに変異体ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）または変異体ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）を発現するＤＤ−ＢＣＧ株（３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）とも称される）および３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）の溶解物におけるＳＯＤ活性を示す。これらの３Ｄ−ＢＣＧ株の例はｐＭＰ３９９生成ベクターに関連し、（ＤＤ−ＢＣＧの）染色体中に挿入したｍｕｔ  ｓｏｄＡを有する。パネル（Ａ）は上清および溶解物の結果を示す。ＳｏｄＡおよびカタラーゼのための分泌チャネルをコードするｓｅｃＡ２不活性化のため、上清は溶解物より弱いＳＯＤ活性を示す。パネルＢ〜Ｄは、各分離株の非独立培養を用いて異なる日に調製した溶解物に関連する３つの別々の実験からのＳＯＤ活性結果を示す。このアッセイを上清および溶解物の段階２倍希釈を用いて実施し、固定時点のシトクロムＣ還元量をモニタリングする。ＳＯＤ活性単位はシトクロムＣ還元を（最大阻害測定値の）５０％阻害する。各調製においてシトクロムＣ還元を５０％阻害する希釈（ＩＣ５０値）を矢印で示す。
【図１６Ｂ】ｓｉｇＨ−ｓｅｃＡ２欠失ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２、二重欠失ＢＣＧ［「ＤＤ−ＢＣＧ」］とも称される）ならびに変異体ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）または変異体ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）を発現するＤＤ−ＢＣＧ株（３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）とも称される）および３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）の溶解物におけるＳＯＤ活性を示す。これらの３Ｄ−ＢＣＧ株の例はｐＭＰ３９９生成ベクターに関連し、（ＤＤ−ＢＣＧの）染色体中に挿入したｍｕｔ  ｓｏｄＡを有する。パネル（Ａ）は上清および溶解物の結果を示す。ＳｏｄＡおよびカタラーゼのための分泌チャネルをコードするｓｅｃＡ２不活性化のため、上清は溶解物より弱いＳＯＤ活性を示す。パネルＢ〜Ｄは、各分離株の非独立培養を用いて異なる日に調製した溶解物に関連する３つの別々の実験からのＳＯＤ活性結果を示す。このアッセイを上清および溶解物の段階２倍希釈を用いて実施し、固定時点のシトクロムＣ還元量をモニタリングする。ＳＯＤ活性単位はシトクロムＣ還元を（最大阻害測定値の）５０％阻害する。各調製においてシトクロムＣ還元を５０％阻害する希釈（ＩＣ５０値）を矢印で示す。
【図１６Ｃ】ｓｉｇＨ−ｓｅｃＡ２欠失ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２、二重欠失ＢＣＧ［「ＤＤ−ＢＣＧ」］とも称される）ならびに変異体ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）または変異体ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）を発現するＤＤ−ＢＣＧ株（３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）とも称される）および３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）の溶解物におけるＳＯＤ活性を示す。これらの３Ｄ−ＢＣＧ株の例はｐＭＰ３９９生成ベクターに関連し、（ＤＤ−ＢＣＧの）染色体中に挿入したｍｕｔ  ｓｏｄＡを有する。パネル（Ａ）は上清および溶解物の結果を示す。ＳｏｄＡおよびカタラーゼのための分泌チャネルをコードするｓｅｃＡ２不活性化のため、上清は溶解物より弱いＳＯＤ活性を示す。パネルＢ〜Ｄは、各分離株の非独立培養を用いて異なる日に調製した溶解物に関連する３つの別々の実験からのＳＯＤ活性結果を示す。このアッセイを上清および溶解物の段階２倍希釈を用いて実施し、固定時点のシトクロムＣ還元量をモニタリングする。ＳＯＤ活性単位はシトクロムＣ還元を（最大阻害測定値の）５０％阻害する。各調製においてシトクロムＣ還元を５０％阻害する希釈（ＩＣ５０値）を矢印で示す。
【図１６Ｄ】ｓｉｇＨ−ｓｅｃＡ２欠失ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２、二重欠失ＢＣＧ［「ＤＤ−ＢＣＧ」］とも称される）ならびに変異体ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）または変異体ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）を発現するＤＤ−ＢＣＧ株（３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）とも称される）および３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）の溶解物におけるＳＯＤ活性を示す。これらの３Ｄ−ＢＣＧ株の例はｐＭＰ３９９生成ベクターに関連し、（ＤＤ−ＢＣＧの）染色体中に挿入したｍｕｔ  ｓｏｄＡを有する。パネル（Ａ）は上清および溶解物の結果を示す。ＳｏｄＡおよびカタラーゼのための分泌チャネルをコードするｓｅｃＡ２不活性化のため、上清は溶解物より弱いＳＯＤ活性を示す。パネルＢ〜Ｄは、各分離株の非独立培養を用いて異なる日に調製した溶解物に関連する３つの別々の実験からのＳＯＤ活性結果を示す。このアッセイを上清および溶解物の段階２倍希釈を用いて実施し、固定時点のシトクロムＣ還元量をモニタリングする。ＳＯＤ活性単位はシトクロムＣ還元を（最大阻害測定値の）５０％阻害する。各調製においてシトクロムＣ還元を５０％阻害する希釈（ＩＣ５０値）を矢印で示す。
【図１７】ＤＤ−ＢＣＧ（レーン３）、３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＥ５４）（レーン４）、および３Ｄ−ＢＣＧ−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）（レーン５）の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンハイブリダイゼーションを示す。これらの３Ｄ−ＢＣＧ株の例は、ＤＤ−ＢＣＧの染色体に挿入したｍｕｔ  ｓｏｄＡを有する。ウェスタンハイブリダイゼーションゲルはＤＤ−ＢＣＧおよび２つの３Ｄ−ＢＣＧ構築物の溶解物中において同程度の量のＳｏｄＡを示す。（下の）実施例のための方法に記載されたように、ＰＡＧＥおよびウェスタン用の未希釈溶解物を調製した。ＢＳＡはブロス培地中の顕著な成分であるウシ血清アルブミンである。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＯＤ（レーン２）はＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＳｏｄＡに対する抗体に応答しない。これらのゲルに適用した未希釈溶解物は、図１６Ｄに示すＳＯＤ活性アッセイに使用された溶解物と同じである。従って、変異体ＳｏｄＡ遺伝子の発現によりＳＯＤ活性は著しく低下したが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン上で示されたＳｏｄＡタンパク質の量は同等であると思われる。これらのデータは変異体ＳｏｄＡの発現により得られた「ドミナントネガティブ」効果と一致する。
【図１８】６つのモノマーからなるｇｌｎＡ１六量体環の図を示す。この図はＮＣＢＩウェブサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ＆ｉｔｏｏｌ＝ｔｏｏｌｂａｒ）よりダウンロードし、修正して特徴を例示した。ＧｌｎＡ１モノマーは、２つの六量体環を含む十二量体を形成する。四角は、隣接モノマー間に位置し、隣接モノマー由来の触媒作用ループおよびマンガンイオンからなる活性部位の位置を示す。変異体ｇｌｎＡ１における欠失アミノ酸は、アミノ酸５４位においてアスパラギン酸およびアミノ酸３３５位においてグルタミン酸（ＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５）を含み、これらは活性部位にあってＳａｌｍｏｎｅｌｌａグルタミンシンターゼのＤ５０およびＧ３２７に対応する。
【図１９Ａ】ＢＣＧ中のドミナントネガティブ変異体ｇｌｎＡ１を発現するプラスミドベクターｐＨＶ２０３−ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を提供する。
【図１９Ｂ】ＢＣＧ中のドミナントネガティブ変異体ｇｌｎＡ１を発現するプラスミドベクターｐＨＶ２０３−ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を提供する。
【図２０Ａ】プラスミドベクターｐＭＰ３４９のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）、ならびにＢＣＧ中の変異体ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６および変異体ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５を発現するマイコバクテリア染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９のマップ（Ｃ）および特性（Ｄ）を提供する。
【図２０Ｂ】プラスミドベクターｐＭＰ３４９のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）、ならびにＢＣＧ中の変異体ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６および変異体ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５を発現するマイコバクテリア染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９のマップ（Ｃ）および特性（Ｄ）を提供する。
【図２０Ｃ】プラスミドベクターｐＭＰ３４９のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）、ならびにＢＣＧ中の変異体ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６および変異体ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５を発現するマイコバクテリア染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９のマップ（Ｃ）および特性（Ｄ）を提供する。
【図２０Ｄ】プラスミドベクターｐＭＰ３４９のマップ（Ａ）および特性（Ｂ）、ならびにＢＣＧ中の変異体ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６および変異体ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５を発現するマイコバクテリア染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９のマップ（Ｃ）および特性（Ｄ）を提供する。
【図２１】プロアポトーシスＢＣＧによる外因性抗原発現の例を示す。抗ＢＬＳ抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上パネル）およびウェスタンハイブリダイゼーション（下パネル）はＤＤ−ＢＣＧにより、組換えＢｒｕｃｅｌｌａルマジンシンターゼ（ｒＢＬＳ）の発現を検証し、これは誘発条件下でレーン５の１８ｋＤａバンドとして見られる。ｒＢＬＳはａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろにクローン化された。ＢＳＡはブロス培地中に存在したウシ血清アルブミンであり、レーン４〜６における他のバンドはＤＤ−ＢＣＧまたはｒＢＬＳタンパク質を表す。レーン５および６は、ａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーター、従ってｒＢＬＳ産生を誘発（＋、酢酸塩の添加）および抑制（−、コハク酸塩の添加）する条件下で増殖したＤＤ−ＢＣＧｒＢＬＳを表す。
【図２２Ａ】ＢＣＧの染色体上のチオレドキシン（ｔｒｘＣ）およびチオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ２）を不活性化するために使用されたベクターのマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を示す。
【図２２Ｂ】ＢＣＧの染色体上のチオレドキシン（ｔｒｘＣ）およびチオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ２）を不活性化するために使用されたベクターのマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を示す。
【図２３Ａ】ＢＣＧの染色体上のチオレドキシン（ｔｒｘＣ）およびチオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ２）のための野生型対立遺伝子を活性部位に対応する各酵素の６個のアミノ酸が除去されている変異体対立遺伝子で置き換えるベクターのマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を示す。
【図２３Ｂ】ＢＣＧの染色体上のチオレドキシン（ｔｒｘＣ）およびチオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ２）のための野生型対立遺伝子を活性部位に対応する各酵素の６個のアミノ酸が除去されている変異体対立遺伝子で置き換えるベクターのマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を示す。
【図２４Ａ】ＢＣＧの染色体上のｓｉｇＥを不活性化するために使用されたベクターのマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を示す。
【図２４Ｂ】ＢＣＧの染色体上のｓｉｇＥを不活性化するために使用されたベクターのマップ（Ａ）および特性（Ｂ）を示す。
【図２５Ａ】実施例８に記載されたｇｌｎＡ１のΔＤ５４ΔＥ３３５ドミナントネガティブ変異体を発現する修飾ＢＣＧ株において低下したグルタミンシンテターゼ活性を示す。パネル（Ａ）はＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧの溶解物（Ｌ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上）およびウェスタンハイブリダイゼーションブロット（下）ならびに硫酸アンモニウム（ＡＳ）沈殿後に部分的に精製した溶解物を示す。プラスミドｐＨＶ２０３−ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（表１）を３Ｄ−ＢＣＧに電気穿孔することによって４Ｄ−ＢＣＧを構築した。ＧｌｎＡ１モノマーは５０ｋＤａ〜３７ｋＤａマーカー間を移動し、ＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧによって産生した同等量のＧｌｎＡ１を示す。パネル（Ｂ）は、（Ａ）に示したものと同じＡＳ調製物を表す３Ｄ−ＢＣＧおよび４Ｄ−ＢＣＧのＡＳで処理した溶解物中のグルタミンシンターゼ活性を示す。経時的な吸光度をモニタリングすることにより反応を分光学的に追跡調査した。３Ｄ−ＢＣＧ  ＡＳ溶解物：○、未希釈；□、２倍希釈；■、４倍希釈；白菱形、８倍希釈。４Ｄ−ＢＣＧ  ＡＳ溶解物：●、未希釈；■、２倍希釈。（Ａ）に示される同等量のＧｌｎＡ１タンパク質にもかかわらず、３Ｄ−ＢＣＧｐｒｅｐの８倍希釈と同等の活性を示す未希釈４Ｄ−ＢＣＧｐｒｅｐの４Ｄ−ＢＣＧでは酵素活性がほとんど検出されなかった。これは、ΔＤ５４ΔＥ３３５モノマー発現が酵素活性にドミナントネガティブ効果を発揮することを示す。パネル（Ｃ）は、ｐＨＶ２０３−ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５型の４Ｄ−ＢＣＧの２つの培養調製物に関連する反復酵素活性アッセイを示す。さらに、ｐＭＰ３９９型の４Ｄ−ＢＣＧは染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６、ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（表１）をＤＤ−ＢＣＧ中に電気穿孔することにより構築された。ｐＭＰ３９９型の４Ｄ−ＢＣＧは、ｐＨＶ２０３型ほどグルタミンシンテターゼ活性の低下を強力に成し遂げず、これは、おそらく、それぞれ、染色体由来のＤ５４ΔＥ３３５  ＧｌｎＡ１変異体発現からもたらされる複製数効果（すなわち、単一複製）と多複製プラスミドの差異に関連する。
【図２５Ｂ】実施例８に記載されたｇｌｎＡ１のΔＤ５４ΔＥ３３５ドミナントネガティブ変異体を発現する修飾ＢＣＧ株において低下したグルタミンシンテターゼ活性を示す。パネル（Ａ）はＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧの溶解物（Ｌ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上）およびウェスタンハイブリダイゼーションブロット（下）ならびに硫酸アンモニウム（ＡＳ）沈殿後に部分的に精製した溶解物を示す。プラスミドｐＨＶ２０３−ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（表１）を３Ｄ−ＢＣＧに電気穿孔することによって４Ｄ−ＢＣＧを構築した。ＧｌｎＡ１モノマーは５０ｋＤａ〜３７ｋＤａマーカー間を移動し、ＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧによって産生した同等量のＧｌｎＡ１を示す。パネル（Ｂ）は、（Ａ）に示したものと同じＡＳ調製物を表す３Ｄ−ＢＣＧおよび４Ｄ−ＢＣＧのＡＳで処理した溶解物中のグルタミンシンターゼ活性を示す。経時的な吸光度をモニタリングすることにより反応を分光学的に追跡調査した。３Ｄ−ＢＣＧ  ＡＳ溶解物：○、未希釈；□、２倍希釈；■、４倍希釈；白菱形、８倍希釈。４Ｄ−ＢＣＧ  ＡＳ溶解物：●、未希釈；■、２倍希釈。（Ａ）に示される同等量のＧｌｎＡ１タンパク質にもかかわらず、３Ｄ−ＢＣＧｐｒｅｐの８倍希釈と同等の活性を示す未希釈４Ｄ−ＢＣＧｐｒｅｐの４Ｄ−ＢＣＧでは酵素活性がほとんど検出されなかった。これは、ΔＤ５４ΔＥ３３５モノマー発現が酵素活性にドミナントネガティブ効果を発揮することを示す。パネル（Ｃ）は、ｐＨＶ２０３−ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５型の４Ｄ−ＢＣＧの２つの培養調製物に関連する反復酵素活性アッセイを示す。さらに、ｐＭＰ３９９型の４Ｄ−ＢＣＧは染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６、ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（表１）をＤＤ−ＢＣＧ中に電気穿孔することにより構築された。ｐＭＰ３９９型の４Ｄ−ＢＣＧは、ｐＨＶ２０３型ほどグルタミンシンテターゼ活性の低下を強力に成し遂げず、これは、おそらく、それぞれ、染色体由来のＤ５４ΔＥ３３５  ＧｌｎＡ１変異体発現からもたらされる複製数効果（すなわち、単一複製）と多複製プラスミドの差異に関連する。
【図２５Ｃ】実施例８に記載されたｇｌｎＡ１のΔＤ５４ΔＥ３３５ドミナントネガティブ変異体を発現する修飾ＢＣＧ株において低下したグルタミンシンテターゼ活性を示す。パネル（Ａ）はＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧの溶解物（Ｌ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上）およびウェスタンハイブリダイゼーションブロット（下）ならびに硫酸アンモニウム（ＡＳ）沈殿後に部分的に精製した溶解物を示す。プラスミドｐＨＶ２０３−ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（表１）を３Ｄ−ＢＣＧに電気穿孔することによって４Ｄ−ＢＣＧを構築した。ＧｌｎＡ１モノマーは５０ｋＤａ〜３７ｋＤａマーカー間を移動し、ＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧによって産生した同等量のＧｌｎＡ１を示す。パネル（Ｂ）は、（Ａ）に示したものと同じＡＳ調製物を表す３Ｄ−ＢＣＧおよび４Ｄ−ＢＣＧのＡＳで処理した溶解物中のグルタミンシンターゼ活性を示す。経時的な吸光度をモニタリングすることにより反応を分光学的に追跡調査した。３Ｄ−ＢＣＧ  ＡＳ溶解物：○、未希釈；□、２倍希釈；■、４倍希釈；白菱形、８倍希釈。４Ｄ−ＢＣＧ  ＡＳ溶解物：●、未希釈；■、２倍希釈。（Ａ）に示される同等量のＧｌｎＡ１タンパク質にもかかわらず、３Ｄ−ＢＣＧｐｒｅｐの８倍希釈と同等の活性を示す未希釈４Ｄ−ＢＣＧｐｒｅｐの４Ｄ−ＢＣＧでは酵素活性がほとんど検出されなかった。これは、ΔＤ５４ΔＥ３３５モノマー発現が酵素活性にドミナントネガティブ効果を発揮することを示す。パネル（Ｃ）は、ｐＨＶ２０３−ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５型の４Ｄ−ＢＣＧの２つの培養調製物に関連する反復酵素活性アッセイを示す。さらに、ｐＭＰ３９９型の４Ｄ−ＢＣＧは染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６、ｍｕｔＧｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（表１）をＤＤ−ＢＣＧ中に電気穿孔することにより構築された。ｐＭＰ３９９型の４Ｄ−ＢＣＧは、ｐＨＶ２０３型ほどグルタミンシンテターゼ活性の低下を強力に成し遂げず、これは、おそらく、それぞれ、染色体由来のＤ５４ΔＥ３３５  ＧｌｎＡ１変異体発現からもたらされる複製数効果（すなわち、単一複製）と多複製プラスミドの差異に関連する。
【図２６Ａ】ＢＣＧおよびｐａＢＣＧでワクチン接種後のＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の産生を示す。（Ａ）ＩＮＦ−γおよびＩＬ−２を産生するＣ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞％をＢＣＧ、ＤＤ−ＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧでＩＶワクチン接種後の日数に対してプロットした。各パネルにおける各データポイントは単独のマウスを表し、ＢＣＧ感染マクロファージ上で一晩再刺激後にＩＮＦ−γまたはＩＬ−２を産生するＣＤ４＋脾細胞％から非感染マクロファージ上で再刺激後にＩＮＦ−γまたはＩＬ−２を産生する細胞％を差し引いたものを示す。斜線部分は類似した方法で分析したＰＢＳ接種マウス由来の脾細胞における平均値＋２標準偏差を示し、ＩＦＮ−γアッセイにおいて非常に低いバックグラウンドおよびＩＬ−２において相対的に高いバックグラウンドを示す。（Ｂ）ＩＦＮ−γ値≧０．５％の部分集合のマウスのみ用いた、ＢＣＧ対ｐａＢＣＧ接種マウス由来のＩＮＦ−γ＋％およびＩＬ−２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞％の概要を示す。これは、主なＴ細胞応答の発現前に採集したマウスからの結果、ならびにサイトカイン産生が主な増殖後にほぼベースライン値まで迅速に低下したが（パネルＡ）、次いで再感染中に迅速にリコールした、より高度の３Ｄ−および４Ｄ−ＢＣＧワクチンレシピエントからの結果を除去した（図２７参照）。ドット−プロットは、中央値、２５〜７５百分位数（ボックス）、および１０〜９０百分位数（ひげ）値を示す。ＢＣＧは典型的に、ＩＦＮ−γ産生をより多く誘発したのに対し、ＩＬ−２値はｐａＢＣＧワクチン接種マウスにおいて有意に高かった、Ｐ＝．００２４。
【図２６Ｂ】ＢＣＧおよびｐａＢＣＧでワクチン接種後のＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の産生を示す。（Ａ）ＩＮＦ−γおよびＩＬ−２を産生するＣ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞％をＢＣＧ、ＤＤ−ＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧでＩＶワクチン接種後の日数に対してプロットした。各パネルにおける各データポイントは単独のマウスを表し、ＢＣＧ感染マクロファージ上で一晩再刺激後にＩＮＦ−γまたはＩＬ−２を産生するＣＤ４＋脾細胞％から非感染マクロファージ上で再刺激後にＩＮＦ−γまたはＩＬ−２を産生する細胞％を差し引いたものを示す。斜線部分は類似した方法で分析したＰＢＳ接種マウス由来の脾細胞における平均値＋２標準偏差を示し、ＩＦＮ−γアッセイにおいて非常に低いバックグラウンドおよびＩＬ−２において相対的に高いバックグラウンドを示す。（Ｂ）ＩＦＮ−γ値≧０．５％の部分集合のマウスのみ用いた、ＢＣＧ対ｐａＢＣＧ接種マウス由来のＩＮＦ−γ＋％およびＩＬ−２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞％の概要を示す。これは、主なＴ細胞応答の発現前に採集したマウスからの結果、ならびにサイトカイン産生が主な増殖後にほぼベースライン値まで迅速に低下したが（パネルＡ）、次いで再感染中に迅速にリコールした、より高度の３Ｄ−および４Ｄ−ＢＣＧワクチンレシピエントからの結果を除去した（図２７参照）。ドット−プロットは、中央値、２５〜７５百分位数（ボックス）、および１０〜９０百分位数（ひげ）値を示す。ＢＣＧは典型的に、ＩＦＮ−γ産生をより多く誘発したのに対し、ＩＬ−２値はｐａＢＣＧワクチン接種マウスにおいて有意に高かった、Ｐ＝．００２４。
【図２７】ＢＣＧ、ＤＤ−ＢＣＧ、および３Ｄ−ＢＣＧワクチン接種に対する、接種後２５日目および３１日目のＴ細胞応答を示す。接種２５日および３１日のマウス由来の脾細胞によるＢＣＧ特異的サイトカイン産生はより早い。ワクチン用量は５×１０５ｃｆｕで静脈内投与した。ＩＦＮ−γで処理した非感染骨髄生成マクロファージ（ＢＭＤＭ）またはＩＦＮ−γで処置したＢＣＧ感染ＢＭＤＭ上で脾細胞を一晩インキュベートした。次いで、細胞内サイトカイン染色技術によって、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−２産生についてフローサイトメトリーによりＴ細胞を評価した。ＩＦＮ−γ産生およびＩＬ−２産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞％をボックス領域内に示す。バックグラウンドのサイトカイン産生を非刺激値（非感染マクロファージ）から決定した。注意：図２６Ａに示すデータとは異なり、ここに示した％値は再刺激後のＢＣＧ感染ＢＭＤＭ値からベースライン値（非感染ＢＭＤＭ）を差し引かない総ＣＤ４集団％を表す。このプロットからの未加工データを図２６Ａ内に組み込むために変換した。例えば、２５日目および３１日目のＩＦＮ−γ産生に対するそれぞれ．７３％（．８６〜．１３）および１．４７％（１．５２〜．０５）のデータポイント、ならびにＩＬ−２に対するそれぞれ−．０３％（．１５〜．１８）および．１８％（．２８〜．１０）がこの実験から得られる。
【図２７−１】ＢＣＧ、ＤＤ−ＢＣＧ、および３Ｄ−ＢＣＧワクチン接種に対する、接種後２５日目および３１日目のＴ細胞応答を示す。接種２５日および３１日のマウス由来の脾細胞によるＢＣＧ特異的サイトカイン産生はより早い。ワクチン用量は５×１０５ｃｆｕで静脈内投与した。ＩＦＮ−γで処理した非感染骨髄生成マクロファージ（ＢＭＤＭ）またはＩＦＮ−γで処置したＢＣＧ感染ＢＭＤＭ上で脾細胞を一晩インキュベートした。次いで、細胞内サイトカイン染色技術によって、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−２産生についてフローサイトメトリーによりＴ細胞を評価した。ＩＦＮ−γ産生およびＩＬ−２産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞％をボックス領域内に示す。バックグラウンドのサイトカイン産生を非刺激値（非感染マクロファージ）から決定した。注意：図２６Ａに示すデータとは異なり、ここに示した％値は再刺激後のＢＣＧ感染ＢＭＤＭ値からベースライン値（非感染ＢＭＤＭ）を差し引かない総ＣＤ４集団％を表す。このプロットからの未加工データを図２６Ａ内に組み込むために変換した。例えば、２５日目および３１日目のＩＦＮ−γ産生に対するそれぞれ．７３％（．８６〜．１３）および１．４７％（１．５２〜．０５）のデータポイント、ならびにＩＬ−２に対するそれぞれ−．０３％（．１５〜．１８）および．１８％（．２８〜．１０）がこの実験から得られる。
【図２８】ＢＣＧ  ４×１０７ｃｆｕを気管内投与後５日目のＢＣＧ接種マウスおよび３ＤＢＣＧ接種マウスにおける続発性（リコール）Ｔ細胞応答を示す。３ヶ月前にマウスを５×１０５ｃｆｕのワクチン株と併用して皮下接種し、ワクチン接種後４〜８週間にＩＮＨおよびリファムピンで処置してワクチン株を除去した。ＩＦＮ−γの抗原特異的産生は、２匹のＢＣＧ接種マウスにおいて１．３５％（１．５８〜０．２３）および０．８５％（２．０９〜１．２４％）であったのに対し、２匹の３ＤＢＣＧ接種マウスにおいて７．８８％（８．０９〜０．２１）および３．８５％（４．０９〜．０２４）であった。ＩＦＮ−γとＩＬ−２の抗原特異的共産生は、ＢＣＧマウスにおいて０．２９％（０．２９〜０．０）および０．１０％（０．１５〜０．０３）であったのに対し、３ＤＢＣＧマウスにおいて２．０１％（２．０２〜０．０１）および１．０９％（１．１５〜０．０６）であった。
【図２８−１】ＢＣＧ  ４×１０７ｃｆｕを気管内投与後５日目のＢＣＧ接種マウスおよび３ＤＢＣＧ接種マウスにおける続発性（リコール）Ｔ細胞応答を示す。３ヶ月前にマウスを５×１０５ｃｆｕのワクチン株と併用して皮下接種し、ワクチン接種後４〜８週間にＩＮＨおよびリファムピンで処置してワクチン株を除去した。ＩＦＮ−γの抗原特異的産生は、２匹のＢＣＧ接種マウスにおいて１．３５％（１．５８〜０．２３）および０．８５％（２．０９〜１．２４％）であったのに対し、２匹の３ＤＢＣＧ接種マウスにおいて７．８８％（８．０９〜０．２１）および３．８５％（４．０９〜．０２４）であった。ＩＦＮ−γとＩＬ−２の抗原特異的共産生は、ＢＣＧマウスにおいて０．２９％（０．２９〜０．０）および０．１０％（０．１５〜０．０３）であったのに対し、３ＤＢＣＧマウスにおいて２．０１％（２．０２〜０．０１）および１．０９％（１．１５〜０．０６）であった。
【図２９】ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、ＢＣＧ、３ｄＢＣＧ、および対照（ブロス希釈液）でＩＶワクチン接種後７２時間のマウス脾臓由来のｍＲＮＡの相対的発現を示す。接種原は１．５×１０７ＣＦＵであった。対照群の平均値を１．０に設定し、各ワクチン接種群における６匹のマウスの相対発現をプロットする。＊はＰ＜．０５を示し、＊＊はＰ＜．００１を示す。結果は、ＢＣＧはＴｆＲ（トランスフェリン受容体）発現を上方制御するのに対し、３ｄＢＣＧは上方制御しないことを示す。この差異は、ＩＬ−４またはＩＦＮ−γ発現における差異のためとは思われない。それらの発現はＢＣＧと３ｄＢＣＧで同等であった。
【図３０】毒性酸素ラジカルの形成および肺組織損傷に至る、マクロファージの鉄過剰負荷をＳｏｄＡが促進する、１つの考えられる機序の図表を示す。マイコバクテリウム種（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、およびＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧを含む）の鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼであるＳｏｄＡは、Ｏ２−を不均化してＨ２Ｏ２を形成する。これらの酸化物は、ＩＲＰ１（鉄調節タンパク質１）のｍＲＮＡ結合活性に対して逆効果を示す。鉄枯渇に類似して、Ｈ２Ｏ２はＩＲＰ１を活性化し、それに対してＯ２−はＩＲＰ１がＴｆＲ  ｍＲＮＡの鉄調節因子と結合してその安定性を促進し、翻訳促進する能力を妨害する。これにより、不活性化するか組織損傷能の低い耐久性酸化物（タウリンクロラミンなど）へ変換するかのいずれかの代わりに宿主生成Ｈ２Ｏ２の高い割合が毒性酸素中間体に変換するようにマクロファージの鉄過剰負荷に至る。マクロファージの鉄過剰負荷はまた、マクロファージのサイトカイン（ＩＦＮ−γなど）産生能またはサイトカイン（ＩＦＮ−γなど）応答能を弱める。これはワクチン接種に対する全般的な先天性応答欠如を引き起こす。ＳｏｄＡの活性および分泌を低下させることにより、修飾細菌は相対的に高い初期の免疫活性化（ＮＫ細胞および多形核好中球などの殺腫瘍性反応において重要な免疫細胞の高い活性化および動員を含む）を誘発する。
【図３１Ａ】組換えＳｏｄＡ（ＭＶｒＳｏｄＡ）を発現するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ  ５×１０６ｃｆｕの気管内接種後のＣ５７Ｂｌ／６マウス由来のＨ＆Ｅ染色肺組織を示す。接種後１ヶ月、２ヶ月、および３ヶ月目の肺組織の低倍率および中倍率を示す（Ａ）。接種後２ヶ月目の肺の高倍率の像は、ヘモシデリン（鉄）負過マクロファージを示す複数の暗細胞を示す（Ｂ）。
【図３１Ｂ】組換えＳｏｄＡ（ＭＶｒＳｏｄＡ）を発現するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ  ５×１０６ｃｆｕの気管内接種後のＣ５７Ｂｌ／６マウス由来のＨ＆Ｅ染色肺組織を示す。接種後１ヶ月、２ヶ月、および３ヶ月目の肺組織の低倍率および中倍率を示す（Ａ）。接種後２ヶ月目の肺の高倍率の像は、ヘモシデリン（鉄）負過マクロファージを示す複数の暗細胞を示す（Ｂ）。
【図３２】組換えＳｏｄＡ（ＭＶｒＳｏｄＡ）を発現するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ  ５×１０６ｃｆｕを気管内接種して１６週間後のＣ５７Ｂｌ／６マウスの実質肺組織の線維症を示す。コラーゲンをトリクローム青色染色法により染色し、びまん性線維症を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲内で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明確にそれ以外であると示さない限り、複数形の指示対象を含むことに留意されたい。従って、例えば、「酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」と述べる時は、この酵素の複数複製を含み、２つ以上の特定の種類の酵素も含み得る。
【００１７】
微生物を修飾してこの微生物の免疫原性を高める方法を提供し、この方法はドミナントネガティブ変異体酵素の過剰発現および／または抗アポトーシス酵素の産生を制御する調節遺伝子の不活性化により微生物が産生した抗アポトーシス酵素の活性を低下させ、それによってこの細菌が対象中の免疫原性を高めることを含む。活性の低下した抗アポトーシス酵素がマイコバクテリウム種（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、およびＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧなど）のＳＯＤ、特に分泌鉄補因子ＳＯＤ（ＳｏｄＡと呼ばれる）である時、感染宿主細胞上のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）発現の減少によって宿主細胞の鉄含量が低下することにより、免疫シグナル伝達に対する応答性が高まり、壊死が軽減するといったさらなる利点が得られる。ＳｏｄＡまたはグルタミンシンターゼのドミナントネガティブ変異体は、細菌により発現されると、細菌の総ＳＯＤまたはグルタミンシンターゼ活性を低下させる変異体酵素である。修飾細菌は、調節遺伝子の活性を低下させるまたは調節遺伝子を不活性化する変異を調節遺伝子中に含むこともできる。本明細書で使用される時、活性を低下させる変異（活性低下変異）は不活性化する変異を含む。従って、微生物の抗アポトーシス酵素の活性を低下させるために修飾した細胞内微生物も提供する。本発明は、弱毒化微生物を修飾して弱毒化微生物の免疫原性を高める方法も提供し、この方法はドミナントネガティブ変異体酵素の過剰発現および／または抗アポトーシス酵素の産生を制御する調節遺伝子の不活性化により弱毒化微生物が産生した抗アポトーシス酵素の活性を低下させ、それによってこの弱毒化細菌が対象中の免疫原性を高めることを含む。従って、微生物の抗アポトーシス酵素の活性を低下させるためにさらに修飾した、弱毒性細胞内微生物も提供する。
【００１８】
本発明はさらに、免疫療法として対象に投与されているもしくは投与することができる細菌（例えば、ＢＣＧ）、または対象における感染を既に引き起こしている細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の酵素活性を修飾する方法を提供し、この方法は微生物酵素で哺乳類対象を免疫化して微生物酵素のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を軽減する抗体または細胞免疫応答を誘発し、それによって細菌が免疫原性を高め、酵素がＳｏｄＡの時、対象におけるトランスフェリン受容体の発現を促進する能力を低下させることを含む。従って、微生物の抗アポトーシス酵素の活性を低下させる免疫応答を誘発するために作り出された酵素も提供する。
【００１９】
微生物は、本明細書に記載されている任意のマイコバクテリウム種であることができる。マイコバクテリウム種の例としては、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ株ＢＣＧ（ＢＣＧ亜株、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓおよびＭ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。鉄−マンガンＳＯＤ分泌は多くの病原性のマイコバクテリア種の一般的かつ明確な属性であるため、本明細書のＳＯＤ軽減ＢＣＧワクチンと類似の方法で、これらの種のＳＯＤ軽減変異体の構築により両弱毒化を成し遂げ、強力な細胞免疫応答の発現を高めるプロアポトーシス性質を付与できる。従って、これらの他のマイコバクテリア種のＳＯＤ軽減ワクチンは非常に効果的なワクチン株であり得、マイコバクテリア細胞壁の免疫向上特性のために、癌におけるアジュバントおよび免疫療法として有用である。
【００２０】
従って、本発明の具体的な１つの実施形態において、ドミナントネガティブ変異体の鉄−マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）酵素を過剰発現することによりＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株またはＢＣＧにおけるＳＯＤ活性を軽減することにより得られる、結核に対する生ワクチンを提供する。
【００２１】
本発明は、微生物によって産生される抗アポトーシス酵素の活性を低下させ、ここで抗アポトーシス酵素活性の低下は微生物を弱毒化し、それによって微生物ワクチンを産生することを含む、微生物ワクチンの作製方法を提供する。
【００２２】
本発明は、弱毒化微生物において、微生物により産生される抗アポトーシス酵素の活性を低下させ、それによって微生物ワクチンを産生することを含む、微生物ワクチンの作製方法を提供する。
【００２３】
本発明は、本発明の方法により修飾した酵素を含む微生物を含む組成物を提供する。この組成物は医薬上許容可能な担体または適切なアジュバントをさらに含むことができる。かかる組成物は、感染疾患、癌、および線維化肺疾患に対するワクチンとしてまたは免疫療法として使用できる。
【００２４】
修飾細菌は、ａ）天然核酸ヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が、生物のＳＯＤ活性を低下させる分子をコードするＳｏｄＡ；およびｂ）天然核酸ヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が、生物のグルタミンシンターゼ活性を低下させる分子をコードするグルタミンシンターゼからなる群から選択されるドミナントネガティブ変異体を含有できる。１つの実施形態において、修飾細菌はＢＣＧであることができる。従って、低下したＳＯＤ活性を発現するように修飾したＢＣＧを提供する。
【００２５】
修飾細菌は、他の微生物酵素（チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、グルタミンシンテターゼ、およびグルタチオン還元酵素（グルタレドキシン）などの他の酸化還元関連酵素、他のチオレドキシン様タンパク質、他のチオレドキシン還元酵素様タンパク質、他のグルタレドキシン様タンパク質、他のチオール還元酵素、および他のタンパク質ジスルフィド酸化還元酵素を含む）の活性を低下させることに関連するプロアポトーシス性修飾をさらに含むことができる。マイコバクテリアにおけるさらなる酸化還元関連酵素の具体例としては、チオールペルオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン還元酵素Ｒｖ３３０３ｃ（ｌｐｄＡ）、およびチオレドキシン様酵素のｗｈｉＢファミリーが挙げられるが、これらに限定されない。さらなるプロアポトーシス性修飾は抗アポトーシス性微生物酵素の産生または分泌のいずれかに影響を与える遺伝子に影響を与え、ＳｉｇＨの不活性化、ｓｉｇＥの不活性化、およびＳｅｃＡ２の不活性化からなる群から選択される１つ以上の修飾を含むことができる。従って、低下したＳＯＤ活性を発現し、ＳｉｇＨは発現しないように修飾したＢＣＧを提供する。低下したＳＯＤ活性を発現し、ＳｉｇＨおよびｓｉｇＥは発現しないように修飾したＢＣＧを提供する。低下したＳＯＤ活性を発現し、ＳｉｇＨ、ｓｉｇＥ、およびＳｅｃＡ２は発現しないように修飾したＢＣＧも提供する。
【００２６】
修飾細菌の具体例を実施例および表１に記載する。例えば、修飾細菌は２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡ、２８位のヒスチジンまたは７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡ、５４位のグルタミン酸を欠失している変異体ＳｏｄＡ、５４位のグルタミン酸を欠失し、２８位のヒスチジンがアルギニンと置換している変異体ＳｏｄＡを含むことができる。さらなる例では、修飾細菌はＳｏｄＡの変異体およびｓｉｇＨの不活性化；ＳｏｄＡの変異体およびｓｅｃＡ２の不活性化；ＳｏｄＡの変異体、ｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化；ならびにＳｏｄＡの変異体、ｇｌｎＡ１のドミナントネガティブ変異体、ｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化からなる群から選択される修飾を含むことができる。
【００２７】
修飾細菌のさらなる例として、細菌は、アミノ酸５４位のアスパラギン酸およびアミノ酸３３５位のグルタミン酸の欠失；ならびにアミノ酸５４位のアスパラギン酸またはアミノ酸３３５位のグルタミン酸の欠失からなる群から選択されるｇｌｎＡ１の変異体を含むことができる。低下したｇｌｎＡ１活性を有する細菌はさらにｓｅｃＡ２の不活性化を含むことができる。低下したｇｌｎＡ１活性を有する細菌はさらにＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体を含むことができる。低下したｇｌｎＡ１活性およびＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体を有する細菌において、この変異体ＳｏｄＡは、２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンの欠失を含むことができる。低下したｇｌｎＡ１活性を有する細菌はｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化をさらに含むことができる。低下したｇｌｎＡ１活性を有する細菌はＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｉｇＨの不活性化をさらに含むことができる。低下したｇｌｎＡ１活性およびＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体を有する細菌において、このドミナントネガティブ変異体は５４位のグルタミン酸を欠失している変異体ＳｏｄＡである。低下したｇｌｎＡ１活性およびＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体を有する細菌において、このドミナントネガティブ変異体は２８位のヒスチジンおよび７６位のヒスチジンを欠失している変異体ＳｏｄＡである。低下したｇｌｎＡ１活性およびＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体を有する細菌において、この細菌はＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体およびｓｅｃＡ２の不活性化をさらに含むことができる。この細菌の作製方法を本明細書、表１、実施例および図に記載して提示する。
【００２８】
本発明の修飾細菌は、ｓｉｇＨの不活性化を含むことができる。この修飾細菌は、ｓｉｇＨの不活性化およびｓｅｃＡ２の不活性化を含むことができる。
【００２９】
本発明は、本発明の任意の組成物（医薬上許容可能な担体を含む組成物、および本明細書に教示された方法により修飾されているｉｎ  ｖｉｖｏ生存能に必要な酵素を含む微生物など）を対象に投与することにより対象の免疫応答を生成する方法もさらに提供する。この組成物は、本明細書に説明する適切なアジュバントをさらに含むことができる。この対象は哺乳動物であることができ、好ましくはヒトである。
【００３０】
本発明は、有効量の本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における感染疾患を予防する方法を提供する。細菌性疾患（例えば、結核）を予防することに加えて、本発明は、真菌、ウイルスおよび原生動物病因の感染疾患を予防し得ることが意図される。この対象は哺乳動物であることができ、好ましくはヒトである。
【００３１】
上記の本発明の組成物は、対象または対象の細胞に投与して、治療的利益または免疫性を付与して感染を予防し得ることが意図される。従って、本発明は、対象の免疫細胞において免疫応答を生成する方法をさらに提供し、この方法は、本発明の組成物（ｉｎ  ｖｉｖｏ生存能に必要な酵素が本明細書に教示する任意の方法により修飾されている微生物を含む）と細胞とを接触させることを含む。この細胞はｉｎ  ｖｉｖｏであることもｅｘ  ｖｉｖｏであることもでき、ＭＨＣＩ発現抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージまたは単球など）であることもできるが、これに限定されない。本明細書の全体を通して使用される「対象」とは、個体を意味する。従って、「対象」は、飼育動物（ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および鳥類を含むことができる。好ましくは、対象は哺乳動物（霊長類など）であり、より好ましくは、ヒトである。
【００３２】
従って、本発明は、細菌によって産生される抗アポトーシス酵素の活性を低下させ、それによって細菌が対象の免疫原性を高めることを含む、弱毒化細菌の免疫原性を高める方法を提供する。抗アポトーシス酵素の活性を低下させることにより修飾された細菌は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、および他のマイコバクテリウム種からなる群から選択できる。
【００３３】
微生物抗アポトーシス酵素（ＳＯＤ、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、グルタミンシンテターゼ、およびグルタチオン還元酵素（グルタレドキシン）などの他の酸化還元関連酵素、他のチオレドキシン様タンパク質、他のチオレドキシン還元酵素様タンパク質、他のグルタレドキシン様タンパク質、他のチオール還元酵素、および他のタンパク質ジスルフィド酸化還元酵素を含む）の産生を低下させることにより作製される、プロアポトーシスワクチンの構築を介して抗原提示を促進する方法を提供する。これらの酵素の多くはすべての細胞生物において高度に保存されており、多くは、アポトーシスの誘因としての活性酸素（ＲＯＳ）の中心的役割のために、反応性酸素中間体を解毒する酵素と重複するか、または同一である。プロアポトーシスワクチンを作製するための決定は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性株と同様に、病原体が宿主細胞内にある時、アポトーシスをブロックするための細胞内病原体由来の酵素の能力に関する。例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって産生されたＳｏｄＡは、免疫細胞のファゴサイトオキシダーゼ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）によって生成される、プロアポトーシス性生体効果を有する酸化物であるスーパー酸化物（Ｏ２−）を解毒する。従って、宿主免疫細胞によって産生された酸化物を不活性化するＳｏｄＡおよび他の微生物酵素の活性を低下させることにより、微生物を同時に弱毒化でき、樹状細胞および他の免疫細胞が微生物抗原を含むアポトーシス性食細胞（例えば、好中球、単球および／またはマクロファージ）を処理する際、その抗原提示を高めることができる。
【００３４】
一部の抗アポトーシス性微生物酵素は、ワクチン株として微生物を培養する能力に悪影響を及ぼすことなく除去することができ、かかる酵素のために、従来の分子遺伝子技術（対立遺伝子の不活性化を含む）を使用して修飾微生物を構築することができる。しかしながら、一部の酵素は、微生物の生存能にとって絶対に必須であり、それらは完全に除去することができない。これらの酵素のため、抗アポトーシス酵素活性の完全な低下ではなく一部の低下を伴う変異体により遺伝子操作技術が構築される。アンチセンスＲＮＡの過剰発現が、部分的な表現型により変異体株を構築するための１つのかかる戦略としてＷＯ０２／０６２２９８号に記載されており、プロアポトーシス表現型を付与するためにどの必須酵素を減少し得るかのスクリーニングおよび同定手段としてのその有用性も強調されている。
【００３５】
本発明は、抗アポトーシス性微生物酵素の活性の部分的な低下を成し遂げるためのさらなる戦略を３つ概説する。１つ目の戦略は、酵素のドミナントネガティブ変異体の過剰発現を含む。２つ目の戦略は、抗アポトーシス酵素の発現を支配する調節遺伝子の対立遺伝子の不活性化を含む。両戦略は、微生物を安定的に修飾して部分的な表現型を与え、それによってこの微生物が対象において免疫原性を保持または向上するが、病原性を喪失または減少し、この微生物によって産生した酵素の活性を低下させるが除去はせず、それによってこの酵素活性を低下させることがこの微生物を弱毒化またはこの微生物をさらに弱毒化することを含む、さらなる方法を表す。３つ目の戦略は抗アポトーシス酵素に対する免疫応答を誘発してｉｎ  ｖｉｖｏで酵素活性を妨害することに焦点を置く。この戦略は酵素のドミナントネガティブ変異体を発現する細菌で接種することにより、または代替的に変異体酵素で直接接種することにより成し遂げ得る。このドミナントネガティブ変異体は免疫原であるが、野生型酵素の免疫抑制特性を欠く。例えば、ＳｏｄＡのドミナントネガティブ変異体は抗ＳｏｄＡ抗体と反応するが（図１７）、軽減したＳＯＤ活性を示す（図１６）。この方法は、酵素の軽減した活性を伴う安定的に修飾された微生物の投与と併用でき、または代替的に、プライム・ブースト法における親の非改変微生物の投与と併用できる。例えば、宿主には最初に現在の親ＢＣＧワクチン（例えば、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１、ＢＣＧ  Ｔｏｋｙｏ１７２）または安定的に修飾したプロアポトーシスＢＣＧ（ｐａＢＣＧ）ワクチンを接種し、続いてｐａＢＣＧまたはドミナントネガティブ変異体ＳｏｄＡ酵素を含むワクチンを追加接種することができる。これらのワクチンは病原性微生物、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染既往者に投与して感染の病的予後を弱めることもできる。
【００３６】
ドミナントネガティブ酵素変異体は、部分的な酵素活性を伴う修飾酵素を得る変異または酵素活性を完全に欠いた不活性化酵素を得る変異のいずれかを含むことができる。野生型酵素も発現する細胞内変異体酵素の共発現効果は典型的には全細胞の酵素活性の完全な除去ではなく低下であるため、この戦略はこの微生物の生存能に必須の遺伝子に向けることができる。
【００３７】
ドミナントネガティブ技術を用いて抗アポトーシス酵素の活性を低下させる戦略を、野生型細菌株に対し、その菌株を部分的にまたは完全に弱毒化しつつその免疫原性を向上する手段として使用できる。例えば、現在の結核ワクチンであるＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）の免疫原性を高めるために、既に弱毒された菌株および／または現在のワクチン株に対して適用することもできる。
【００３８】
本明細書に提示した構築物の例、および本明細書の構築物を作製するために使用した構築物の例を表１に提示する。
【００３９】
本発明の組成物は、組成物を細胞集団と接触させる方法で組成物を投与するために一般に使用される方法により、それを必要とする対象にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することができる。本発明の組成物は、経口、非経口、筋肉内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、皮内、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、皮下、体外、局所などで投与することができるが、経口または非経口投与が典型的には好ましい。血循環もしくは体腔への注入により、経口摂取により、または吸入により送達することもできる。このワクチン株は、水性または部分的に水性である医薬上許容可能な液体担体（発熱性物質を含まない水、生理食塩水、または緩衝液を含む）と共に動物に注射するかそうでなければ送達する。例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓワクチンは、ＵＳ  ＢＣＧ  Ｔｉｃｅ株で使用された方法に類似して、滅菌された多数穴のあるディスクを経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与することができる。
【００４０】
本発明の修飾されたプロアポトーシスＢＣＧ（ｍＢＣＧ、ｐａＢＣＧ）ワクチンを使用した方法および組成物は、皮膚癌、脳癌、咽頭癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、胆管癌、膵臓癌、肛門癌、腎臓癌、前立腺癌、および肉腫からなる群から選択される固形腫瘍を治療または予防するために使用できる。皮膚癌は、黒色腫もしくは扁平上皮細胞であることができ；脳癌は、神経膠芽腫、アストロチトームもしくは乏突起膠腫であることができ；肺癌は、原発腫瘍もしくは他の腫瘍の肺転移であることができ；ならびに肝臓癌は、原発腫瘍（ヘパトーマ）もしくは他の腫瘍の肝転移であることができる。ｐａＢＣＧまたはｐａＢＣＧと併用した他のワクチンの使用により治療または予防し得る動物の癌としては、ウマのサルコイド、ウシの眼の扁平上皮細胞癌、およびウシの外陰癌が挙げられる。開示した方法は、一態様では、プロアポトーシスＢＣＧを対象に投与することにより癌を治療することを含み、ここで癌の治療は、癌を呈する対象を延命することを含むことが理解される。予防方法は、対象にｐａＢＣＧを投与することを含む、対象において癌を発現する可能性を低下させる方法も含むことができることがさらに理解される。
【００４１】
治療は、この疾患を呈している対象の疾患状態における任意の好変化を含むことができることがさらに理解される。例えば、治療は、疾患もしくは病態（癌または結核など）の症状または原因の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれらの間の任意の量の減少を含むことができる。従って、治療としては、疾患の完全な除去ならびにより穏やかな変化が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、治療は、悪い転帰の遅延化（対象が最終的にこの疾患で死亡するとしても、延命など）を含むことができる。従って、１つの方法は癌を呈する対象へプロアポトーシスＢＣＧを投与することを含み、このプロアポトーシスＢＣＧの投与は癌を呈する対象を延命する。
【００４２】
この組成物は、ＮＫ細胞、ＰＭＮ、および先天性免疫応答の他の細胞を動員および活性化するために癌または癌腫ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫療法として投与時、直接腫瘍中に一針の注射により投与することができる。皮膚表面上の病巣（例えば、黒色腫）または粘膜上の可視病巣（例えば、口腔腫瘍、直腸腫瘍）は注射部位を決定するために直接可視化できる。あるいは、この組成物は放射線画像の補助（例えば、肺、肝臓、腎臓、膵臓または他の臓器における腫瘍内へのＣＴガイドによる針の配置）により送達できる。この組成物を投与するために内視鏡的技術も使用できる。膀胱腫瘍に対する免疫療法のため、ＵＳ  ＢＣＧ  Ｔｉｃｅ株に類似した方法を用いて膀胱内へのカテーテルを介してこの組成物を直接投与することができる。
【００４３】
本発明の組成物は、別のワクチンにより誘発される免疫応答を強めるためのアジュバントとして投与時、典型的には最初に他のワクチン調製物（例えば、組換え癌抗原を含むワクチン）と混合する。次いでこの配合剤を対象に非経口投与する。
【００４４】
この技術を用いて構築した修飾ＢＣＧ（ｐａＢＣＧ）ワクチンは、男性における膀胱癌および黒色腫に対する免疫療法を含むがこれに限定されない、ＢＣＧが現在使用されているすべての癌適応において、男性における自己由来結腸癌細胞と併合したアジュバントとして、ならびに動物の腫瘍に対する免疫療法として、現在入手可能なＢＣＧワクチンより優れている。さらに、ｐａＢＣＧワクチンは、ＮＫ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、および他の免疫細胞を動員および活性化する、ならびに抗腫瘍サイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−２１、ｐａＢＣＧを含む）産生を誘発する優れた能力のため、現在の適応を超えた抗腫瘍活性を示す。可能性がある使用の一部を以下に論じる。
【００４５】
癌ワクチン／アジュバント
ｐａＢＣＧを用いた本明細書の方法および組成物は、ワクチンと癌ワクチン（例えば、自己由来腫瘍細胞ワクチンまたは組換え癌抗原ワクチン）のためのアジュバントの両方として、癌を治療または予防するために使用できる。癌ワクチンとは、既存の癌を治療する（治療ワクチン）か癌発現を予防する（予防ワクチン）ことのいずれかを意図する。両タイプのワクチンは癌負担を減らすために使用されている。処置または治療ワクチンが癌患者に投与され、既に発現している癌に対する体の天然予防力を強めるために設計される。これらのタイプのワクチンは、既存の癌のさらなる増殖を予防し、治療した癌の再発を予防し、または前治療で死滅しなかった癌細胞を除去する。一方、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）ワクチンは健常個人に投与され、癌誘発性ウイルスを標的とするため、およびウイルス感染を予防するために設計される。
【００４６】
現時点で、癌に至り得るウイルス感染を予防する２つのワクチンが米国食品医薬品局の認可を受けている。それは、一部の形態の肝臓癌に関連した感染物質であるＢ型肝炎ウイルス感染を予防するＢ型肝炎ワクチン；ならびに世界の子宮頚癌症例の７０％を合わせて引き起こす２タイプのヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）であるＨＰＶ１６とＨＰＶ１８感染を予防するＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）である。Ｇａｒｄａｓｉｌは陰部疣贅症例の９０％を占めるＨＰＶタイプ６と１１感染も予防する。
【００４７】
癌を治療するために使用されるワクチンは、癌細胞表面上の特定の分子が正常または非癌細胞上で見出される分子よりも独特であるかより豊富であるかのいずれかであるという事実を利用する。これらの分子（タンパク質または炭水化物のいずれか）は、抗原として作用する、すなわち免疫系を刺激して特異的免疫応答を起こすことができる。癌特異的抗原を含むワクチンを患者に注射すると、これらの抗原は免疫系を刺激して正常細胞を傷付けずに癌細胞を攻撃することが理解される。
【００４８】
研究者らは腫瘍に対する免疫応答を刺激するいくつかの戦略を開発している。１つは正常細胞上ではめったに存在しない異常なまたは独特な癌細胞抗原を同定することである。他の技術は、例えば、（ａ）そのアミノ酸構造をわずかに変えること、（ｂ）ウイルスベクター（遺伝子材料を標的細胞に送達するビヒクルとして使用できる無害のウイルス）中に腫瘍抗原のための遺伝子を入れること、および（ｃ）腫瘍抗原のための遺伝子と共に、１つ以上の免疫刺激分子のための遺伝子をベクター中に付加することなどの、腫瘍関連抗原をより免疫原性にすること、または免疫応答を引き起こしやすくすることが含まれる。別の技術は、腫瘍分子に対して明らかに外来物であるもの（アジュバントとして知られる）に結合することである。アジュバントを誘引物として用いることにより、免疫系を「ごまかして」、抗原／アジュバント複合体（ワクチン）と患者の腫瘍の両方に攻撃を仕掛けさせることができる。
【００４９】
以下に列挙したワクチンのタイプは、治験担当医が体の免疫系に対する癌抗原を提示するために考案した様々な方法を表す。このリストは包括的であることを意図しない。
【００５０】
抗原／アジュバントワクチン
抗原ワクチンは、調査された最初の癌ワクチンの一部であった。抗原ワクチンは一般に特異的タンパク質断片、またはペプチドを使用して、免疫系を刺激して、腫瘍細胞と戦わせる。１つ以上の癌細胞抗原が、アジュバントとして知られる免疫応答を引き起こす物質と併用される。癌患者はこの混合物で接種される。従って、免疫系は、抗原保因アジュバントに対する応答する際、その抗原を発現する腫瘍細胞に対しても応答する。
【００５１】
全細胞の腫瘍ワクチン
患者自身の腫瘍（自己由来）または１人もしくは複数の他の患者由来の腫瘍細胞（同種異系）のいずれかから採取した、これらの全細胞のワクチン調製物は、免疫応答を刺激するために使用される癌抗原を含む。
【００５２】
樹状細胞（ＤＣ）ワクチン
白血球除去血輸血と呼ばれる処理を介して、分化した白血球（樹状細胞（ＤＣ）として知られる）を患者の血液から採取する。実験室において、ＤＣを患者自身の癌抗原で刺激し、ペトリ皿で増殖させて、患者に再注射する。いったん注射後、ＤＣワクチンは免疫系のＴ細胞を活性化する。ＤＣによる活性化は、Ｔ細胞を増殖させ、その抗原を発現する腫瘍細胞を攻撃させることができる。
【００５３】
ウイルスベクターおよびＤＮＡワクチン
ウイルスベクターおよびＤＮＡワクチンは、腫瘍抗原の核酸配列を使用して癌抗原タンパク質を産生する。抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる免疫細胞により取り込まれた処理できるように、特異的癌抗原のための遺伝子を含むＤＮＡを実験室において操作する。次いでＡＰＣ細胞は細胞表面上の別の分子と共に抗原部分を示す。これらの抗原発現ＡＰＣ細胞を人に注射すると、免疫系はＡＰＣ細胞のみではなく、同一抗原を含む腫瘍細胞も攻撃することによって応答する。ベクターベースおよびＤＮＡワクチンは一部の他のワクチンよりも製造が容易であるため、魅力的である。
【００５４】
イディオタイプワクチン
抗体はタンパク質と炭水化物を含むため、それ自体が抗原として作用して抗体応答を誘発することができる。特定の癌細胞（すなわち、Ｂ細胞リンパ腫および骨髄腫）によって産生したイディオタイプ抗体と呼ばれる抗体は各患者に固有であり、抗原ワクチンに類似した方法で免疫応答を引き起こすために使用できる。
【００５５】
癌細胞抗原は、個々の腫瘍に独特であり得、いくつかのタイプの腫瘍に共有され得、または腫瘍が増殖する正常組織により発現し得る。１９９１年、最初のヒト癌抗原が、皮膚癌の致死的形態の可能性がある転移黒色腫患者の細胞に見出された。この発見により、他の癌のための抗原を同定する研究騒ぎに至った。
【００５６】
治療ワクチン
患者特異的ワクチンは患者自身の腫瘍細胞を使用して、個々の患者の悪性細胞に対する強力な免疫応答を刺激することを意図したワクチンを生成する。各療法は腫瘍特異的であるため、理論上、腫瘍細胞以外の細胞は影響を受けない。患者自身の腫瘍細胞由来の抗原を用いて、いくつかのタイプの患者特異的ワクチンが調査されている。
【００５７】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、血液中で循環して、ならびに前立腺癌細胞上で見出すことができる前立腺特異的タンパク質抗原である。ＰＳＡは通常は癌を呈さない男性に少量存在するが、ＰＳＡ量は通常は前立腺癌を発現時に上昇する。男性のＰＳＡ値が高いほど癌を呈している可能性が高いが、高ＰＳＡ値の考えられる理由は他にも多くある。患者のＰＳＡに対するＴ細胞応答は上昇することが示されている。
【００５８】
シアリルＴｎ（ＳＴｎ）は特定の癌細胞上で見出されるムチン分子（粘液に存在する主要分子）を模倣する小さな合成炭水化物である。
【００５９】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（例えば、ｇｐ９６）は熱、低糖値および他のストレスシグナルに応答して細胞内で産生される。これらの分子は、ストレスに対する防御に加えて、細胞内タンパク質の適切な処理、折り畳み、および集合にも関与する。実験室での実験において、マウス腫瘍由来のＨＳＰは、低ペプチドと共に、マウスにおける癌発現を予防した。ヒトワクチンは、熱ショックタンパク質と患者の腫瘍から単離された関連ペプチド錯体からなる。ＨＳＰは、いくつかの癌（肝臓、皮膚、結腸、肺、リンパ腫および前立腺癌を含む）の治療において調査されている。
【００６０】
ガングリオシド分子（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２、およびＧＤ３）は炭水化物および脂質を含む複合体分子である。ガングリオシド分子が細胞外膜に組み込まれる際、ガングリオシド分子により細胞は抗体により容易に認識されるようになる。ＧＭ２はいくつかのヒト癌の細胞表面上で発現される分子である。ＧＤ２およびＧＤ３はヒト癌細胞により発現された炭水化物抗原を含む。
【００６１】
癌胎児抗原（ＣＥＡ）は結腸直腸、肺、乳および膵臓癌を呈する者における腫瘍において、正常組織と比較し高値で見出される。ＣＥＡは腫瘍により血流に放出されると思わる。患者のＣＥＡに対するＴ細胞応答は上昇することが示されている。
【００６２】
ＭＡＲＴ−１（メラン−Ａとしても知られる）は、メラニンを産生する細胞であるメラニン形成細胞により発現される抗原であり、この分子は皮膚および毛髪の色に関与する。それは、Ｔ細胞により認識される特異的黒色腫癌マーカーであり、正常細胞より黒色腫細胞上で豊富である。
【００６３】
チロシナーゼはメラニン産生の初期に関連する主要酵素である。チロシナーゼは黒色腫の特異的マーカーであり、正常細胞より黒色腫細胞上で豊富であることが試験により示されている。
【００６４】
予防ワクチン
癌誘発性ウイルスの外殻上のウイルスタンパク質は一般に抗原として使用され、免疫系を刺激してウイルス感染を予防する。
【００６５】
アジュバント
癌抗原に対する免疫応答を高めるために、研究者らは通常は、身体が外来物と認識する誘引物質、つまりアジュバントを付着させる。アジュバントは、誘引物と腫瘍細胞の両方に対して攻撃を仕掛けるように免疫系を「ごまかす」弱体化タンパク質または細菌である。アジュバントのいくつかは下記のとおりである。
【００６６】
スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）は、カリフォルニアとメキシコの海岸沿いで見られる、スカシガイとして知られる有殻の海の生物により形成されるタンパク質である。ＫＬＨは、免疫応答を引き起こし、かつ癌細胞抗原の担体として作用する高タンパク質である。癌抗原は、しばしば免疫系にとって不可視であり得る相対的に小さなタンパク質である。ＫＬＨは、Ｔヘルパー細胞として知られる免疫細胞のさらなる認識部位を提供し、細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）として知られる他の免疫細胞の活性化を増大できる。
【００６７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）は結核細菌に密接に関係するＭ．ｂｏｖｉｓ、マイコバクテリウム種の弱毒生形態である。ＢＣＧを一部の癌ワクチンに追加し、ワクチン抗原に対する免疫応答を増大する。ＢＣＧは免疫応答を誘発する上で特に効果的であり、それは天然キラー（ＮＫ）細胞、多形核白血球（ＰＭＮ）、および先天性免疫応答の他の細胞を動員および活性化するＢＣＧの能力が関与しうる。ＢＣＧは結核ワクチンとして数十年間使用されている。
【００６８】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、天然キラー細胞と呼ばれる特定の分化した免疫系細胞の癌を殺す能力を増大できる身体の免疫系によって形成されるタンパク質である。ＩＬ−２は免疫系を活性化することができるが、多くの研究者らがＩＬ−２単独では癌再発を予防するために十分ではないと確信している。いくつかの癌ワクチンはＩＬ−２を使用して特異的癌抗原に対する免疫応答を増大する。
【００６９】
顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は抗原提示細胞の増殖を刺激するタンパク質である。
【００７０】
ＱＳ２１は、一部のワクチンに添加時、体の免疫応答を改善し得る植物抽出体である。
【００７１】
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１は、免疫応答を増大することを意図する油性液体である。
【００７２】
ＦＤＡに承認されたＢ型肝炎ワクチンおよびＨＰＶワクチンに加えて、癌リスクを減らす可能性がある他のワクチンが現在調査されている。これらのワクチンは、他の疾患を引き起こす感染物質（ポリオまたは麻疹を引き起こすものなど）を標的とする従来の予防ワクチンに類似して、癌を引き起こす感染物質を標的とする。癌を引き起こすウイルスの非感染性成分、一般にウイルスの殻タンパク質（ウイルスの外側のタンパク質）は、これらのワクチンのための抗原として働く。これらの抗原は将来、免疫系を刺激して癌を引き起こすウイルスを攻撃し、次いで関連した癌リスクを減らすことができる。
【００７３】
下記は継続中または未公開の第ＩＩＩ相試験の概要である。この情報は合衆国政府のデータベース（国立癌研究所の臨床試験データベース、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ／ｓｅａｒｃｈ、および国立衛生研究所の臨床試験ウェブサイト、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを含む）から得られる。各試験に関する情報は表の一番右端の列中のリンクをクリックすることによっても得られる。
【表１−１】
2012501189.tif 000002
【表１−２】
2012501189.tif 000003
【表１−３】
2012501189.tif 000004
【００７４】
癌患者に対するＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕeｒｉｎによる免疫療法が他国で行われている（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕeｒｉｎ：  ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ．  Ｔｏｒｉｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  １９７６；２７７（００）：１６０−８６）。この試験において、様々なタイプの癌患者９８例に対して生ＢＣＧによる活性免疫療法が実施された。この療法の候補は４〜５８ヶ月のフォローアップで結腸直腸、肝臓、乳、胆管、肺、および他の臓器の残余または手術不能の癌患者であった。９８例中１１例（１１％）がこの治療により３７〜５８ヶ月まで（平均生存期間４２．５ヶ月）生存でき、本明細書執筆現在でまだ生存していた。別の患者１１例も、治療開始後２４ヶ月超生存した。しかしながら、患者３７例がＢＣＧ免疫療法を受けたにもかかわらず１２ヶ月以内に死亡した。一方、この期間中に同じ臨床的状態を共有してＢＣＧ療法を受けなかった対照群の患者３７例は、２〜１２ヶ月（平均生存期間８．７ヶ月間）で死亡した。次の免疫学パラメーター：末梢血中のＴ細胞亜集団、ＰＨＡの刺激指数、ならびにＤＮＣＢ、ＫＬＨ、ＰＰＤ、およびＰＨＡに対する皮膚試験により測定して、これらの患者９８例の治療前の免疫応答性は抑制されていた。これらのパラメーターはすべて２４ヶ月超生存した患者２２例においてＢＣＧ注射開始直後に改善した。対照的に、１２ヶ月以内に死亡した患者において、免疫応答性は治療過程を通して抑制されたままであった。従って、ＢＣＧ効果と免疫応答性の間には明らかな相関関係があり、これは免疫原性のより高いｐａＢＣＧワクチンは、進行性の手術不能な癌患者に投与時にさらにより効果的であり得ることを示す所見である。さらに、ＢＣＧ注射部位における炎症反応期間と臨床的予後の間に良好な相関関係が観察された。さらに、これらの末期癌患者の免疫能力に対する十分に高い効果を得るためには相対的に高いＢＣＧ量（初回投与量として２０〜８０ｍｇ）と生ＢＣＧの反復注射が必要であったことを示した。ＢＣＧ追加注射の最適時間を決定するために使用された最も従来型の基準はＢＣＧ注射部位におけるＰＰＤ誘発性皮膚反応の測定であり、すなわち、遅発型のツベルクリン超感受性の証拠であった。２．５×２．５ｃｍ超の寸法の顕著な突発的反応を観察された時、ＢＣＧ効果は持続しているとみなされ、さらなる追加注射は不要であった。ＢＣＧ注射の一回目と二回目の間隔は、２年超生存した患者において平均６．２±．１ヶ月であった。対照的に、無効症例においてこの反応の持続期間は一時的のみであった。この療法の最も高頻度の副作用は発熱と倦怠感であり、これらの合併症は症例６２％に生じた。この試験では、生ＢＣＧを総投与量２００ｍｇ超注射した患者においても、播種性、アナフィラキシー性ショック、または肉芽腫肝炎などの重度の副作用は報告されなかった。
【００７５】
ＢＣＧを用いた上記の方法（例えば、投与方法、投与量および投与の時間経過）、および実施例に記載されたものはｐａＢＣＧを用いた癌治療に適用可能であることを認識されたい。さらなる投与方法および投与量が本明細書に記載されており、本明細書の方法に適用可能である。
【００７６】
本発明の組成物の非経口投与において、使用する場合、通常は注射を特徴とする。注射剤は、溶液または懸濁液、注射前の液体中の懸濁液に適した固体形態、またはエマルションのいずれかの従来の形態で調製できる。本明細書で使用される時、「非経口投与」は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、関節内および気管内経路を含む。
【００７７】
組成物の投与量は、体重、年齢、性別、および投与方法に応じて異なる。１つの実施形態において、化合物の投与量は、生存可能な弱毒生微生物株の．５×１０２コロニー形成単位〜５×１０８コロニー形成単位である。より好ましくは、化合物は生存可能な弱毒生微生物株の約１×１０６コロニー形成単位〜５×１０７コロニー形成単位量でｉｎ  ｖｉｖｏ投与される。この投与量は個々の医師により特定の状況に基づいて要されるように調整可能である。
【００７８】
組成物は、要される医薬上許容可能な担体または希釈液（すなわち、担体またはビヒクル）と共に所望の治療的効果または免疫学的効果を生むために計算された所定量の活性材料としての活性組成物を含むワクチンとして従来的に投与することができる。「医薬上許容可能な」とは、生物学的に、またはそれ以外で望ましくないことのない物質、すなわち、望ましくない生体効果を何も引き起こさず、または含有される医薬品組成物の他のいずれの成分とも有害な相互作用を起こすことなく、選択された組成物と共に個体に投与することができる物質を意味する。
【００７９】
下に提示する実施例は現在の結核ワクチンであるＢＣＧの修飾に関するが、本発明は、抗アポトーシス性細菌酵素のドミナントネガティブ変異体を発現することによって他の細胞内病原体ワクチンがいかに発現し得るかを教示する。
【００８０】
微生物抗アポトーシス酵素のドミナントネガティブ変異体の発現
抗アポトーシス性微生物酵素の活性を低下させるための対立遺伝子の不活性化に対するドミナントネガティブアプローチの主な有用性は、微生物が培養される培地を豊富にする試みにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ微生物の生存に遺伝子が必須と思われる時である。これらの状況において、対立遺伝子の不活性化は変異体細菌の培養と干渉し、ワクチン株として不適切にし、微生物がまだ増殖することを可能にする必須酵素の活性が低下した部分的な表現型をもたらす方法が好ましい。アンチセンス技術および標的とした付加的弱毒化についてはＷＯ０２／０６２２９８号に既に記載されており、必須微生物酵素の活性を低下させるために使用できる。ドミナントネガティブ酵素変異体の発現は、標的とした付加的弱毒化を実施するための記載された多くの方法を共有するがいくつかの重要な態様において異なる代替戦略を表す。
【００８１】
工程１．抗アポトーシス性微生物酵素の同定
必須および抗アポトーシス性微生物酵素を同定するための詳細な方法についてはＷＯ０２／０６２２９８号に記載されている。微生物酵素活性の低下がプロアポトーシス性効果をもたらすことを検証するため、宿主細胞アポトーシスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養技術（例えば、感染マクロファージ）またはｉｎ  ｖｉｖｏでの感染動物の細胞もしくは組織の採集のいずれかを用いることによってモニタリングできる。アポトーシスをモニタリングするために使用される多数の技術（当業者にとって周知であるフローサイトメトリー、ＴＵＮＥＬ染色、およびＤＮＡ断片化アッセイを含む）がある。
【００８２】
標的とした付加的弱毒化と比較してドミナントネガティブ戦略を実施するための抗アポトーシス酵素の選択に関して重要な差異が２つある。
【００８３】
１つ目は、ドミナントネガティブアプローチのためには既知の多量体構造を有する酵素を選択することが最適であるのに対して、これは標的とした付加的弱毒化を実施する上では重要ではない。これは、前者における低下した酵素活性の機序が、酵素活性に悪影響を及ぼす酵素活性多量体の形成または第三配置における変化のいずれかを伴う変異体酵素モノマーによる干渉により媒介されると信じられるためである。既刊文献の本文では、宿主生成酸化物を不活性化し、従って抗アポトーシス性効果を有する可能性が高いいくつかの細菌酵素は、それらの生体活性形態の多量体（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｂｏｖｉｓ／ＢＣＧ、チオレドキシン、グルタミンシンターゼ、および細菌性グルタレドキシン（グルタチオン還元酵素）の鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼが挙げられるが、これらに限定されない）であることを示す。
【００８４】
従って、これらの酵素のそれぞれにより、本発明に教示されたようにドミナントネガティブアプローチを用いて酵素活性を低下させることができる。記載のアンチセンス技術を用いてＳｏｄＡ活性を低下させることは、感染に対する宿主免疫応答を強め、ワクチン誘発性予防を高める。ドミナントネガティブ戦略によってＳｏｄＡ活性を低下させることは、類似した効果を有する。
【００８５】
２つ目は、ドミナントネガティブ戦略および標的とした付加的弱毒化の実施は必須微生物遺伝子に限定されないが、その遺伝子が必須である時、それは単純な対立遺伝子の不活性化に対して標的とした付加的弱毒化が好まれる主な理由である。対照的に、一部の微生物において、対立遺伝子の不活性化に対して、非必須遺伝子に対してであっても、ドミナントネガティブ戦略を利用する潜在的な利点がいくつかある。第一に、時間的考慮と遺伝子修飾の容易さがあり、これは、対立遺伝子の不活性化に必要な相同組換えを成し遂げることは困難であるが遺伝子の過剰発現はプラスミドまたは他のベクター上で成し遂げ得る種にとって特に当てはまる。対立遺伝子の不活性化に対するドミナントネガティブ酵素変異体の過剰発現を選択する別の理由は、酵素が重要な免疫原である場合である。この場合、ワクチン株に継続して酵素を産生させることが重要である。なぜならそれは免疫応答が向けられ得る標的となり得るためである。従って、ワクチンにより予防されることが意図される疾患を引き起こす病原体に宿主が後で感染した場合、この宿主は病原体に対する直接的な免疫応答のより完全なレパートリーを有す。この「抗原レパートリー」の考慮は、プロアポトーシス性弱毒生ワクチン株が外因性抗原発現ベクターとしてのみ使用され、所望される免疫応答は外因性抗原に対するものである状況下では重要ではない。
【００８６】
上記に挙げた既知のまたは疑わしい抗アポトーシス性効果を伴うマイコバクテリア酵素間において、ＳｏｄＡおよびＧｌｎＡ１（グルタミンシンターゼ）は細菌増殖において絶対に必須と思われる。従って、それらはワクチンを作製するための対立遺伝子の不活性化の好候補ではないが、アンチセンス技術、標的とした付加的弱毒化、またはドミナントネガティブアプローチのいずれかを介して酵素活性の部分的な低下を成し遂げるために操作できる。ＳｏｄＡとＧｌｎＡ１は両方ともＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる免疫回避に関連付けられており、ＢＣＧによっても産生するため、ＢＣＧの免疫原性を高めるための好ましい標的である。以下の実施例は、ＢＣＧ中のＳｏｄＡ軽減表現型は、高まったワクチンの有効性にも関連していることを示す。
【００８７】
工程２．抗アポトーシス酵素変異体の生成
ドミナントネガティブ戦略を実施するための抗アポトーシス酵素変異体を生成させる方法はＷＯ０２／０６２２９８号に記載されたものを含むが、重要な差異も含まれる。標的とした付加的弱毒化の戦略において、変異体酵素は酵素活性の唯一の源である。これらの変異体は、親の天然酵素の活性の、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％などのみの酵素活性を示し得る。活性の低下がこの範囲内に収まる活性を有する一連の変異体酵素を産生できる。従って、標的とした付加的弱毒化の実施がその最大有用性を有する必須酵素において、変異体酵素は一部の活性を有する。
【００８８】
対照的に、ドミナントネガティブ戦略において、変異体酵素は、０％活性を示す完全な不活性化であることができる。これは、ドミナントネガティブ戦略が、親遺伝子にコードされた野生型酵素モノマーと、発現した変異体酵素モノマーとの間の干渉に基づくためである。この干渉により総酵素活性は低下する。
【００８９】
この差異は、標的とした付加的弱毒化に対してドミナントネガティブ戦略を実施するための酵素変異体の設計と密接に関係する。最も顕著であるのは、１つの戦略では単に酵素の活性部位を無効にするため、ドミナントネガティブ戦略に使用される変異体酵素の設計は潜在的に容易である。ＷＯ０２／０６２２９８号に記載されているように、宿主酸化物を不活性化する（活性部位残基の同定を含む）多くの細菌酵素のためのＸ線結晶データが入手可能である。従って、活性部位残基が除去されたまたは置換された酵素変異体の構築ガイドに役立つ情報が入手可能である。この戦略を、ＳｏｄＡの活性部位鉄をキレート化する２つのヒスチジンが除去されているＳｏｄＡのΔＨ２８ΔＨ７６変異体の構築に使用した（図２、実施例１）。
【００９０】
また、多量体酵素（例えば十二量体構造であるグルタミンシンターゼ）において、活性部位はモノマー間に高頻度で存在し、２つ以上のモノマー成分により形成される。これにより、２つ以上の活性部位に影響を及ぼすアミノ酸の欠失、挿入、または置換を有するモノマーの変異体酵素を設計することが可能になる。この戦略を、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＢＣＧの主なグルタミンシンターゼをコードするｇｌｎＡ１のΔＤ５４ΔＥ３３５変異体の構築に使用した（図１４）。
【００９１】
しかしながら、標的とした付加的弱毒化を実施するために構築された変異体酵素の一部は、ドミナントネガティブ戦略を実施するために用いることもできる。例えば、組換えＢＣＧ株がＳＯＤ活性を低下させたことが認められる時、ＷＯ０２／０６２２９８号に記載された標的とした付加的弱毒化のための技術を用いて、ｐＬｏｕ１−ｍｕｔ−ＳｏｄＡ上のｓｏｄＡ変異体対立遺伝子（表１）をＢＣＧ中に入れてＢＣＧ（ｐＬｏｕ１−ｍｕｔ  ＳｏｄＡ）（表１）を構築した（実施例１）。
【００９２】
酵素活性の低下した変異体酵素をコードする遺伝子は、野生型遺伝子と比較して、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、および／または置換に至る１つ以上のヌクレオチドの差異を有することができる。ヌクレオチドの差異は、野生型遺伝子を基質として用いて、および当業者に知られている部位特異的変異誘発（ＰＣＲベースの方法を含む）を成し遂げるための種々の技術を用いて誘発できる。あるいは、所望の変異を含む遺伝子を新規に合成できる。
【００９３】
既に生マイコバクテリウムに感染している者に本発明を使用する際、または代替的に癌に対する免疫療法として生マイコバクテリウムの続く投与のために対象を調製するために本発明を使用する時、工程３へ進む必要はない。この場合、抗アポトーシス酵素または酵素変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ生細菌によって産生した抗アポトーシス酵素の活性に干渉する抗体または細胞免疫応答を誘発するために対象に直接投与することができる。
【００９４】
工程３：微生物による変異体酵素の発現
本発明が、癌に対する免疫療法として、または別のワクチンと混合するアジュバントとして直接的に高まった免疫原性を有する安定的に修飾した弱毒生細菌の使用に関する場合、工程３と４も実施する。次に、細菌の染色体に組込まれるかまたは細菌内プラスミドとして安定して維持できるかのいずれかのベクターに変異体酵素をコードする遺伝子を組み込む。１９８７年以降、ＢＣＧおよび他のマイコバクテリアにおいてＤＮＡを発現させる方法は利用可能であり、当業者にとって周知であり、Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ（ＤＮＡを発現させる方法に関する教示のため参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５０４，００５号、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ；米国特許第５，８５４，０５５号および米国特許第６，３７２，４７８号、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）に教示される技術を含む。
【００９５】
工程４：ワクチンとして、異種抗原を発現するための宿主株として、癌免疫療法として、またはマイコバクテリウム種感染に誘発された線維化肺疾患の治療として用いる変異体細菌の同定
変異体細菌を同定してワクチンとして用いる方法はＷＯ０２／０６２２９８号に詳述されており、主に、高まったワクチン誘発性予防と相関する動物モデルにおける反応（例えば、高まった免疫応答）を観察することに関する。
【００９６】
変異体細菌株を、ワクチン株として、または外因性抗原を送達するためのベクターとしての機能を検討する別の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素活性の低下度を決定するアッセイを含む。抗アポトーシス性効果を宿主に正常にもたらす酵素の活性の低下は、宿主動物を接種するために細菌を使用する時に宿主細胞アポトーシスを増大し、親細菌より免疫原性のワクチンである。従って、親細菌および変異体細菌の溶解物および／または上清中の酵素活性の測定は、特異的変異体酵素のドミナントネガティブ発現が総酵素活性の所望の低下を引き起こしたか否かを示すために使用できる。総酵素活性はドミナントネガティブ戦略により低下し、先の観察は別の技術（例えばアンチセンス技術）により成し遂げられた低下した酵素活性の高まったワクチンの有効性に関連し、従ってドミナントネガティブ酵素減少を伴う細菌はより有効なワクチン株である。
【００９７】
酵素が重要な免疫原である場合、上記のように、ドミナントネガティブ酵素変異体が過剰発現しているワクチンは対立遺伝子の不活性化より好ましい。この場合、酵素活性が軽減しているとしても、免疫応答が向けられ得る標的であるため、ワクチン株に継続して酵素を産生させることが重要である。トランスフェリン受容体の発現下におけるマイコバクテリアＳｏｄＡの効果（図２９）および肺の組織損傷を促進するマクロファージによる鉄の取り込み効果（図３０）を考慮すると、この考慮は潜伏結核の活動性肺結核への変換を予防するため、または他のマイコバクテリウム種による肺感染の合併症としての肺線維症を予防するためにｐａＢＣＧがワクチンとして使用される時、特に重要である。
【００９８】
微生物抗アポトーシス酵素の産生を支配するシグマ因子および他の調節遺伝子の除去
工程１．抗アポトーシス性微生物酵素の調節遺伝子の同定
一部の微生物抗アポトーシス酵素の産生は、プロモーター領域への効果を介して複数の遺伝子の転写を支配するシグマ因子を含む、調節遺伝子の制御下にある。従って、かかる遺伝子の対立遺伝子の不活性化は、いくつかの抗アポトーシス酵素の活性が１つの遺伝子操作により低下する多面的な効果の可能性を有する抗アポトーシス性微生物酵素の産生を減らすためのさらなる方法を表す。
【００９９】
調節遺伝子は、他の微生物因子（抗アポトーシス酵素を含む）の発現に対する効果により同定できる。感染細胞のアポトーシスを高める変異体のトランスポゾンスクリーニングおよび他の無作為な変異生成ライブラリーは、抗アポトーシス酵素に直接的な欠陥がある変異体を得るだけでなく、鍵となる抗アポトーシス性微生物酵素の産生に影響を及ぼす調節遺伝子における変異の同定もできる。異なる種の調節因子間に強い相同性があり、一部の研究者はＤＮＡまたはアミノ酸配列により既知のシグマ因子に対する相同性に基づく新規シグマ因子を同定した。
【０１００】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのシグマ因子Ｈ（ｓｉｇＨ）をコードする遺伝子の対立遺伝子の不活性化が記載されている［ｓｉｇＨを不活性化する方法の教示のため参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｕｓｈａｌ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００２；  Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００２；  Ｒａｍａｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００１］。ｓｉｇＨの不活性化はいくつかのマイコバクテリア酵素（チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、およびグルタレドキシン相同体を含む）に対する効果により成し遂げられた。下記のようにＢＣＧの染色体にｓｉｇＨ欠失を誘発した。ワクチンとしてのＢＣＧΔｓｉｇＨの高まった有効性を以下に記載する。
【０１０１】
ＢＣＧワクチンの有効性を高める別の修飾はｓｉｇＥの不活性化である。これは単独で行うこともできるし、ｓｉｇＨの不活性化に加えて行うこともできる。ｓｉｇＥの不活性化は酸化ストレスに対するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ耐性においても役割を担い、ｓｉｇＥを不活性化する方法はＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［ｓｉｇＥを不活性化する方法の教示のため参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００１；  Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００４ｂ；  Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００４ａ］に記載されている。
【０１０２】
工程２．抗アポトーシス性微生物酵素の調節遺伝子の不活性化
調節およびシグマ因子遺伝子の不活性化は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミド複製能、およびマイコバクテリア宿主の溶原化能のある結核菌ファージ生成遺伝子手段または自殺プラスミドベクターが関与する対立遺伝子の不活性化技術を用いて実施できる。これらの方法および手段は当業者にとって周知である。
【０１０３】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおけるｓｉｇＨおよびｓｉｇＥを不活性化する特異的方法は、上記の研究者のいくつかのグループにより既に記載されている。ＢＣＧ中のｓｉｇＨの対立遺伝子の不活性化において本明細書で使用される方法を下記に示す。
【０１０４】
これらの実施例は、調節遺伝子を不活性化することにより細菌の免疫原性の向上を示し、抗アポトーシス性微生物酵素の活性を低下させる。
【０１０５】
プロアポトーシスＢＣＧワクチンの例
変異体ＳＯＤの過剰発現により作製された微生物の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：スーパーオキシドジスムターゼ５４位のグルタミン酸が欠失している変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ；スーパーオキシドジスムターゼ５４位のグルタミン酸が欠失しており、２８位のヒスチジンがアルギニンによって置換されている変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ；スーパーオキシドジスムターゼ２８位のヒスチジンが欠失している変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ；スーパーオキシドジスムターゼ７６位のヒスチジンが欠失している変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ；スーパーオキシドジスムターゼ２８位および７６位のヒスチジンが欠失している変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ、スーパーオキシドジスムターゼ２８位および７６位のヒスチジンが欠失しており、カルボキシ末端のグリシンがセリンに置換している変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ。
【０１０６】
グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ１）の過剰発現により作製した微生物の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グルタミンシンターゼ５４位のアスパラギン酸が欠失している変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ；グルタミンシンターゼ３３５位のグルタミン酸が欠失している変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ；グルタミンシンターゼ５４位のアスパラギン酸が欠失しており３３５位のグルタミン酸が欠失している変異体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＢＣＧ。
【０１０７】
開示した方法および組成物の微生物は、開示した細菌修飾への世代的アプローチを用いて構築できる（図１３）。下記のリストは、高まった免疫原性を伴うプロアポトーシス表現型をＢＣＧへ導入するために好ましい修飾のさらなる組み合わせを示す。
１代目：
ａ．  ＳＡＤ−ＢＣＧ（「ＳＤ−ＢＣＧ［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ］」とも称される）
ｂ．  ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨ」とも称される）
ｃ．  ＳＥＣ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｅｃＡ２」とも称される）
ｄ．  ＧＬＡＤ−ＢＣＧ（「ＧＳＤ−ＢＣＧ［ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１］とも称される）
２代目：
ａ．  ＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨ［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ］」とも称される）
ｂ．  ＳＡＤ−ＳＥＣ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｅｃＡ２［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ］」とも称される）
ｃ．  ＤＤ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２」、「二重欠失ＢＣＧ」とも称される）
ｄ．  ＧＬＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨ［ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１］」とも称される）
ｅ．  ＧＬＡＤ−ＳＥＣ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｅｃＡ２［ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１］」とも称される）
ｆ．  ＧＬＡＤ−ＳＡＤ−ＢＣＧ（「ＢＣＧ［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ、ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１］とも称される）
３代目：
ａ．  ３Ｄ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ］」、「３代目ＢＣＧ」とも称される）。発現して総ＳＯＤ活性を低下させるドミナントネガティブ変異体ＳｏｄＡの性質に基づく複数の意図された３Ｄ−ＢＣＧ株がある。ドミナントネガティブ変異体ｓｏｄＡ遺伝子は、ＤＤ−ＢＣＧの染色体に挿入することもでき、プラスミド上で発現することもできる。
ｂ．  ＧＬＡＤ−ＤＤ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２［ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１］」とも称される）
ｃ．  ＧＬＡＤ−ＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨ［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ、ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１］」とも称される）
ｄ．  ＧＬＡＤ−ＳＡＤ−ＳＥＣ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｅｃＡ２［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ、ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１］」とも称される）
４代目：
４Ｄ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２［ｍｕｔ  ｓｏｄＡ、ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１］」、「４代目ＢＣＧ」とも称される）。４Ｄ−ＢＣＧには４つの主なタイプがある。すべてが、ドミナントネガティブｓｏｄＡおよびｇｌｎＡ１変異体をＤＤ−ＢＣＧに添加することが含まれるが、遺伝子の挿入箇所が異なる。
・形態１−変異体ｓｏｄＡおよびｇｌｎＡ１対立遺伝子が染色体に挿入される
・形態２−変異体ｓｏｄＡおよびｇｌｎＡ１対立遺伝子がプラスミド上で発現される
・形態３−変異体ｓｏｄＡ対立遺伝子が染色体に挿入され、する変異体ｇｌｎＡ１対立遺伝子がプラスミド上で発現される
・形態４−変異体ｓｏｄＡ対立遺伝子がプラスミド上で発現され、変異体ｇｌｎＡ１対立遺伝子染が色体に挿入される
【０１０８】
ｓｉｇＨの不活性化は複数の細菌因子の発現に影響を与え、これらの一部は免疫応答の重要な標的であるため、ｓｉｇＨの不活性化を、発現がｓｉｇＨにより制御される１つ以上の抗酸化物の不活性化（またはドミナントネガティブ変異体酵素の発現）と置換する利点がある。これらには、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、グルタレドキシン相同体、および哺乳類グルタチオンに類似した低分子量還元剤であるマイコチオール産生に関与する生合成酵素が挙げられる。この操作は、結核に対して宿主を接種するためにプロアポトーシスＢＣＧ株が使用される時、ｓｉｇＨ不活性化よりも有利な点を有することができる。なぜなら、宿主を免疫標的としてｓｉｇＨ制御因子に反応させる利益はアポトーシスを阻害する能力が低いワクチン株を有する利益より勝り得るためである。対照的に、本明細書に記載されているｓｉｇＨの不活性化ワクチンは、免疫細胞を癌部位に引き寄せる強力な先天性反応を誘発する上で、アジュバントとして使用されるＢＣＧの免疫原性を改善する上で、および外因性抗原を発現するベクターとして理想的である。なぜなら、修飾ＢＣＧ株が主に外因性抗原に対する免疫応答を誘発するため（例えば、他の感染物質または癌抗原に対して免疫化するため）に使用される時、ＢＣＧの完全またはほぼ完全な抗原レパートリーの存在は重要ではないためである。ｓｉｇＨ不活性化の代わりにｓｉｇＨ調節抗アポトーシス遺伝子の不活性化の置換をどのように実施するかをさらに教示するために、チオレドキシンおよびチオレドキシン還元酵素を不活性化するように設計された変異体対立遺伝子を図２２と図２３に示す。このアプローチはＢＣＧ以外のＭ．ｂｏｖｉｓ株に適用可能である。
【０１０９】
本明細書に開示したｐａＢＣＧワクチンは親ＢＣＧワクチン株より免疫原性である。さらに、各ワクチン世代は免疫原性の段階的な向上を示す。ＢＣＧと比較し、それらは下記の特色を示す。
【０１１０】
１．それらは、最初のワクチン接種中、ＩＬ−２産生ピークが高くＩＦＮ−γ放出が短い、定性的および定量的に異なるパターンのＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発する（実施例１３、図２６および２７）。これらの差異は両方とも、記憶Ｔ細胞を生成する上で重要であり得る。第一に、ＩＬ−２は抗原特異的Ｔ細胞の生存を高めて、続発反応のロバストを引き起こすために必要とされる。第二に、ＩＦＮ−γは一般に測定された、ＭΦ（マクロファージ）を活性化するエフェクターＴ細胞のエフェクター機能であるが、主な増殖の収縮相中にＴ細胞アポトーシスを促進する。
【０１１１】
２．それらは第二曝露に対してより急速なリコールＴ細胞応答を誘発する。既に３ＤＢＣＧによりｓｕｂＱ接種をしたマウスにおいて投与後５日以内に強力なＴ細胞応答が検出される（実施例１４、図２８）。これはピークが１１〜１４日目であるＢＣＧ接種マウスにおけるリコール反応と比べて優れている。
【０１１２】
３．上記（１）および（２）に概説したように適応的免疫応答の上昇は先天性免疫応答の上昇（特記すべきは、投与３日以内のＮＫ細胞およびＰＭＮの動員および活性化）のためと思われる（実施例１５、図２９）。
【０１１３】
癌または癌腫部位において先天性免疫細胞をＩＮ  ＳＩＴＵで動員および活性化するためのプロアポトーシスＢＣＧ株の使用
癌におけるＢＣＧの現在の使用の多くはＢＣＧの腫瘍部位への局所適用が含まれ、ＮＫ細胞を含む 先天性免疫応答の細胞を動員および活性化するＢＣＧの能力に基づく。続いて、適応的リンパ細胞応答を発現し、これらの細胞は、腫瘍付近に残存するＢＣＧ桿菌ならびに局所リンパ管にも引き寄せられる。ＢＣＧに対する反応過程において、免疫細胞は、腫瘍細胞上でバイスタンダーを殺す効果を示す。実施例に示されるように、ｐａＢＣＧは親ＢＣＧワクチンと比較してＮＫ細胞およびＰＭＮの動員および活性化を多く誘発する。従って、この技術を用いて構築された修飾ＢＣＧ（ｐａＢＣＧ）黒色腫および他の固形腫瘍に対する膀胱癌および病巣内注射を含む、ワクチンは局所適用において現在入手可能なＢＣＧワクチンより優れている。実際に、ｐａＢＣＧは既に承認された適応のための現在のＢＣＧワクチンに代わり、さらなる癌に対する免疫療法の効果を増大できる。
【０１１４】
アジュバントとしてのプロアポトーシスＢＣＧ株の使用
親ＢＣＧワクチンと比較してｐａＢＣＧのＮＫ細胞およびＰＭＮの高まった動員および活性化は、別のワクチンにより誘発される免疫応答を強めるアジュバントとしてのｐａＢＣＧの有用性も高める。この場合、ｐａＢＣＧは典型的には他のワクチン調製物（例えば、組換え癌抗原を含むワクチン）と最初に混合する。次いでこの配合剤を対象に非経口投与する。
【０１１５】
外因性抗原を発現するためのプロアポトーシスＢＣＧ株の使用
ドミナントネガティブ変異体酵素の戦略を用いて構築されたプロアポトーシスＢＣＧおよび他のプロアポトーシス性細菌ワクチンは、単独で、またはシグマ因子遺伝子の不活性化、アンチセンス技術、もしくは標的とした付加的弱毒化のいずれかによりもたらされたプロアポトーシス性修飾細菌と併用して外因性抗原を発現するために使用できる。外来ＤＮＡは、他の感染物質由来のＤＮＡ（例えば、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ由来の免疫優性Ｔ細胞抗原であるＢｒｕｃｅｌｌａルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）をコードするＤＮＡ）であることができる。ＤＤ−ＢＣＧｒＢＬＳの構築を以下に記載する。外来ＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、麻疹ウイルス、他のウイルス、細菌、真菌、または原生動物種の抗原をコードするＤＮＡであることができる。外来ＤＮＡは、癌抗原であることができる。
【０１１６】
プロアポトーシスＢＣＧ内で外来ＤＮＡを発現するため、目的の遺伝子は細菌の染色体内に融合するかまたは細菌内プラスミドとして安定的に維持できるかのいずれかのベクターに組み込まれる。ＢＣＧおよび他のマイコバクテリア内で外来ＤＮＡを発現する方法は１９８７年以降利用可能であり［Ｊａｃｏｂｓ，  Ｗ．  Ｒ．，  Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ，  １９８７］、Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５０４，００５号、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ；米国特許第５，８５４，０５５号および米国特許第６，３７２，４７８号、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）に教示される技術など、当業者にとって周知である。
【０１１７】
抗原提示のアポトーシス関連クロスプライミング経路への侵入を促進するプロアポトーシス性細菌ワクチンにおいて外来抗原を発現することにより、外来抗原をこの抗原提示経路に取り入れる。さらに、忍容性の誘導ではなく予防的反応を促進する方法で樹状細胞により抗原提示に影響を及ぼす細菌宿主からの非常に強力な共刺激シグナルとの関連で外来抗原は提示される。従って、この実施は、抗原提示の外因性または内因性経路へ接触するように設計されたベクターを用いて成し遂げることは困難であった、ＣＤ４とＣＤ８の両方のＴ細胞を含む非常に強力な適応的Ｔ細胞応答の発現を可能にし、ＣＤ４はＣＤ８  Ｔ細胞応答のために役立つ。
【０１１８】
本発明は、異種抗原をさらに発現する、本発明の弱毒化微生物をさらに提供する。本発明のプロアポトーシス性、弱毒化細菌は任意に１つ以上の異種抗原を発現し得る。具体例として、異種抗原は本発明のＳＯＤ軽減ＢＣＧ細菌において発現する。弱毒生ワクチンは他の病原種由来の異種抗原の発現ベクターとして働く可能性がある（Ｄｏｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，９８０，９０７号；  Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，５０４，００５号）。従って、抗アポトーシス性または必須酵素の発現または活性を低下させた本発明の微生物を、異なる微生物由来の抗原を発現するようにさらに修飾できる。かかる抗原は、ウイルス、細菌、原生動物または真菌微生物由来であることができる。次いで、組換えプロアポトーシス微生物は、二価または多価ワクチンの基盤を形成する。こうして、単一のワクチン株は複数の病原体を標的化することができる。本発明は、本発明のプロアポトーシス微生物を、異種抗原をコードする核酸と形質転換することを含む、多価ワクチンの作製方法を提供する。例えば、免疫優性のＣＤ４＋およびＣＤ８＋エピトープを含む麻疹ウイルスの抗原は、Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５０４，００５号）に教示された技術を用いて、目的の麻疹抗原をコードするＤＮＡを本発明のプロアポトーシスＢＣＧのゲノムＤＮＡ中に安定的に組込むことにより成し遂げた発現で、ＳＯＤ軽減ＢＣＧ内で発現し得る。あるいは、当業者にとって周知である組換え抗原を発現するための標準技術を用いて、プラスミドベクター上（例えば、ｐＨＶ２０３の６５ｋＤａ熱ショックタンパク質プロモーターの後ろまたは任意の染色体組込みもしくはプラスミドベクター上のａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろ）で抗原をコードする遺伝子を発現し得る。この抗原は全抗原からなる必要はないが、タンパク質または糖タンパク質のペプチドに相当し得る。
【０１１９】
麻疹抗原を発現する組換えプロアポトーシスＢＣＧは、乳幼児の麻疹による死亡率が高い発展途上国で誕生時にワクチンとして投与される正規のＢＣＧに代わることができる。組換えワクチンは、麻疹抗原に対する細胞免疫応答を刺激し、麻疹による死亡率が最も高い生涯最初の数年間において乳幼児を予防する。母体抗体の存在は６ヶ月齢前のワクチン接種と干渉し、生涯で麻疹による死亡リスクが高い一定期間において乳幼児は麻疹に感染しやすくなるため、麻疹抗原を発現する組換えプロアポトーシスＢＣＧは、現在の弱毒生麻疹ワクチンより有利である。代わりに、麻疹抗原を発現する組換えプロアポトーシスＢＣＧは母体抗体によって不活性化せず、生涯初期に保護的な細胞免疫応答を誘発できる。本発明の意図する異種麻疹ウイルス抗原としては、Ｈ糖タンパク質（血球凝集素）、Ｆ糖タンパク質、およびＭタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明の意図する感染病原体の他の異種抗原としては、マラリアスポロゾイト抗原、マラリアメロゾイト抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原、およびリーシュマニア抗原が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種マラリア抗原としては、スポロゾイト周囲抗原、ＴＲＡＰ抗原、肝臓病期抗原（ＬＳＡ１、ＬＳＡ３）、血液病期分子（ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３）、ＰｆＥＭＰ１抗原、ＳＰ１６６、ＥＢＡ１７５、ＡＭＡ１、Ｐｆｓ２５、およびＰｆｓ４５−４８が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）抗原としては、ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ（ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ２４、ｐ１７、ｐ７、プロテアーゼ、インテグラーゼ、および逆転写物ならびに付属遺伝子産生物（ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｓｐｕ、およびｎｅｆなど）によりコードされたタンパク質および糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。異種ＨＩＶ抗原は、異なるＨＩＶ分岐群由来の抗原を含む。異種ＨＩＶ抗原は、天然野生型ウイルスに見出されないが、免疫系の選択的圧力下に出現することが示されている細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）エスケープエピトープも含む。こうして、ワクチン接種はウイルスが免疫抑制から免れることを可能にし、ＨＩＶ配列多様性の主な駆動力を表す変異を先制して予防し得る。異種Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ抗原は、任意のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ、Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、およびＬ．ｍａｊｏｒが挙げられるが、これらに限定されない）由来の抗原を含む。本発明の意図する異種Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ抗原としては、ｇｐ６３、ｐ３６（ＬＡＣＫ）、３６ｋＤａヌクレオシド加水分解酵素および他のフコース−マンノース−リガンド（ＦＭＬ）抗原の成分、グルコース調節タンパク質７８、酸性リボソームＰ０タンパク質、キネトプラスチド膜タンパク質−１１、システインプロテイナーゼタイプＩおよびＩＩ、Ｔｒｐ−Ａｓｐ（ＷＤ）タンパク質、Ｐ４ヌクレアーゼ、ｐａｐＬｅ２２、ＴＳＡ、ＬｍＳＴＩ１ならびにＬｅＩＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明の意図する感染性原虫病原体の他の異種抗原としては、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉの抗原が挙げられるが、これらに限定されない。異種Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ抗原としては、任意のＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉを含む）由来の抗原が挙げられる。本発明の意図する異種Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ抗原としては、パラフラゲラロッドタンパク質（ＰＦＲ）、微小管関連タンパク質（マップｐ１５）、トランス−シアリダーゼファミリー（ｔｓ）遺伝子ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、およびＴＳＡ−１、７５〜７７ｋＤａ寄生抗原および可変面翼糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。異種Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ抗原としては、任意のＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種（Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｓ．ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓ．ｍｅｋｏｎｇｉ、およびＳ．ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍが挙げられるが、これらに限定されない）由来の抗原が挙げられる。本発明の意図する異種Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ抗原としては、細胞質スーパーオキシドジスムターゼ、組込み膜タンパク質Ｓｍ２３、カルパインの大サブユニット（Ｓｍ−ｐ８０）、三炭糖−リン酸異性化酵素、フィラミン、パラミオシン、ＥＣＬ、ＳＭ１４、ＩＲＶ５、およびＳｍ３７−ＧＡＰＤＨが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ抗原としては、ＧＲＡ１、ＧＲＡ３、ＧＲＡ４、ＳＡＧ１、ＳＡＧ２、ＳＲＳ１、ＲＯＰ２、ＭＩＣ３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ３０、Ｐ３０、および分泌された２３キロダルトン主要抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
本発明の意図する感染性ウイルス病原体の他の異種抗原としては、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびフラビウイルス（黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、および日本脳炎ウイルスを含む）の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種インフルエンザウイルス抗原としては、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、およびＭタンパク質（ＨＡおよびＮＡの異なる抗原性サブタイプを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種ＨＣＶ抗原としては、２１ｋＤａコア（Ｃ）タンパク質、被膜糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、ならびに非構造タンパク質ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５が挙げられるが、これらに限定されない。異種ＨＣＶ抗原は、異なる遺伝子型のＨＣＶ由来の抗原を含む。本発明の意図する異種フラビウイルス抗原としては、カプシド（Ｃ）タンパク質、被膜（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、および非構造（ＮＳ）タンパク質が挙げられる。
【０１２３】
本発明の意図する感染性ウイルス病原体の他の異種抗原としては、ヘルペスウイルスファミリーの構造および非構造タンパク質ならびに糖タンパク質（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）、およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種ヘルペス抗原としては、スパイク、被膜、外被、ヌクレオカプシド、およびコアにおける構造タンパク質および糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。また、チミジンキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド還元酵素、およびエキソヌクレアーゼを含む非構造タンパク質も意図する。
【０１２４】
本発明の意図する感染性ウイルス病原体の他の異種抗原としては、ロタウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス、狂犬病ウイルス、αウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、乳頭腫ウイルス、天然痘、出血熱ウイルス（マールブルクおよびエボラを含む）、ハンタウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、およびコロナウイルス（ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）物質を含む）の構造および非構造タンパク質ならびに糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明の意図する感染病原体の他の異種抗原としては、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔｉｃｉ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａおよびＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む）の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種Ｃｈｌａｍｙｄｉａ抗原としては、大外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）、外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）、外膜タンパク質２（Ｏｍｐ２）、およびｐｇｐ３が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ抗原としては、熱ショックタンパク質Ｐ４２が挙げられるが、これに限定されない。
【０１２６】
本発明の意図する感染病原体の他の異種抗原としては、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ種（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉおよび斑点熱群を含む）の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の意図する異種Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ抗原としては、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＢ、ｖｉｒＢ遺伝子ファミリー、ｃａｐ、ｔｌｙＡ、ｔｌｙＣ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉの５６ｋＤ外膜タンパク質、および４７ｋＤａ組換えタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明の意図する感染病原体の他の異種抗原としては、細菌性病原体（Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、他のＮｏｃａｒｄｉａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、他のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、他のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、他のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、他のＢｒｕｃｅｌｌａ種、Ｃｏｗｄｒｉａ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、他のＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、他のＴｒｅｐｏｎｅｍａ種、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、Ｂｏｒｒｅｌｉａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ、および他のＹｅｒｓｉｎｉａ種を含む）のタンパク質および糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
また、本発明の微生物は、悪性新生物に対する免疫療法としての使用用の癌抗原を発現するようにさらに修飾することができる。本発明の意図する異種癌抗原としては、チロシナーゼ、癌検査抗原（ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−１２）、Ｇ−２５０、ｐ５３、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＨＳＰ１０５、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７腫瘍性タンパク質、７０７アラニンプロリン（７０７−ＡＰ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９７  Ａｕｇ；３（８）：１３６３−７０）；アルファ（α）−胎児タンパク質（ＡＦＰ）（寄託番号ＣＡＡ７９５９２（アミノ酸）、寄託番号Ｚ１９５３２（核酸））；Ｔ細胞４により認識される腺癌抗原（ＡＲＴ−４）（寄託番号ＢＡＡ８６９６１（アミノ酸）、寄託番号ＡＢ０２６１２５（核酸））；Ｂ抗原（ＢＡＧＥ）（寄託番号ＮＰ＿００１１７８（アミノ酸）、寄託番号ＮＭ＿００１１８７（核酸））；ｂ−カテニン／変異（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｍｅｌａｎｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９６  Ｍａｒ  １；１８３（３）：１１８５−９２．）；切断点クラスター領域エーベルソン（Ｂｃｒ−ａｂｌ）（寄託番号ＣＡＡ１０３７７（アミノ酸）、寄託番号ＡＪ１３１４６７（核酸））；黒色腫上のＣＴＬ認識抗原（ＣＡＭＥＬ）（寄託番号ＣＡＡ１０１９７（アミノ酸）、寄託番号ＡＪ０１２８３５（核酸））；癌胎児抗原ペプチド−１（ＣＡＰ−１）（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ，  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９７  Ｄｅｃ；３（１２  Ｐｔ  １）：２４３９−４９）；カスパーゼ−８（ＣＡＳＰ−８）（寄託番号ＮＰ＿００１２１９（アミノ酸）、寄託番号ＮＭ＿００１２２８（核酸））；細胞−分裂周期２７変異（ＣＤ２７ｍ）；サイクリン依存キナーゼ４変異（ＣＤＫ４／ｍ）；癌胎児抗原（ＣＥＡ）（寄託番号ＡＡＢ５９５１３（アミノ酸）、寄託番号Ｍ１７３０３（核酸）；癌／精巣（抗原）（ＣＴ）；シクロフィリンＢ（Ｃｙｐ−Ｂ）（寄託番号Ｐ２３２８４（アミノ酸））；分化抗原黒色腫（ＤＡＭ）（ＤＡＭ−６とＤＡＭ−１０のエピトープは同じであるが、遺伝子配列は異なる）（ＤＡＭ−６／ＭＡＧＥ−Ｂ２−寄託番号ＮＰ＿００２３５５（アミノ酸）、寄託番号ＮＭ＿００２３６４（核酸））（ＤＡＭ−１０／ＭＡＧＥ−Ｂ１−寄託番号ＮＰ＿００２３５４（アミノ酸）、寄託番号ＮＭ＿００２３６３（核酸））；伸長因子２変異（ＥＬＦ２ｍ）；Ｅ−２６形質転換特異的（Ｅｔｓ）変異型遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子ＥＴＳ（ＥＴＶ６−ＡＭＬ１）；糖タンパク質２５０（Ｇ２５０）；Ｇ抗原（ＧＡＧＥ）（寄託番号ＡＡＡ８２７４４（アミノ酸））；Ｎ−アセチ���グルコサミニル転移酵素Ｖ（ＧｎＴ−Ｖ）；糖タンパク質１００ｋＤ（Ｇｐ１００）；ヘリカーゼ抗原（ＨＡＧＥ）；ヒト上皮受容体−２／神経性（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）（寄託番号ＡＡＡ５８６３７（アミノ酸）およびＭ１１７３０（核酸）；ＨＬＡ−Ａ２遺伝子ａ２領域αらせんの残基１７０位のアルギニン（Ｒ）からイソロイシン（Ｉ）への変換（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ−Ｅ７）；熱ショックタンパク質７０−２変異（ＨＳＰ７０−２Ｍ）；ヒト印環細胞癌−２（ＨＳＴ−２）；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴまたはｈＴＲＴ）；腸カルボキシルエステラーゼ（ｉＣＥ）；ＫＩＡＡ０２０５；Ｌ抗原（ＬＡＧＥ）；低密度脂質受容体／ＧＤＰ−Ｌ−フコース（ＬＤＬＲ／ＦＵＴ）：ｂ−Ｄ−ガラクトシダーゼ２−ａ−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ；黒色腫抗原（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞−１／黒色腫抗原Ａにより認識された黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ）（寄託番号Ｑ１６６５５（アミノ酸）およびＢＣ０１４４２３（核酸）；メラノコルチン１受容体；ミオシン／ｍ；ムチン１（ＭＵＣ１）（寄託番号ＣＡＡ５６７３４（アミノ酸）Ｘ８０７６１（核酸））；黒色腫ユビキタス変異１、２、３（ＭＵＭ−１、−２、−３）；患者Ｍ８８のＮＡ  ｃＤＮＡクローン（ＮＡ８８−Ａ）；ニューヨーク食道１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；タンパク質１５（Ｐ１５）；１９０ＫＤ  ｂｃｒ−ａｂｌのタンパク質；前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体ａ（Ｐｍｌ／ＲＡＲａ）、黒色腫の選択的に発現した抗原（ＰＲＡＭＥ）（寄託番号ＡＡＣ５１１６０（アミノ酸）およびＵ６５０１１（核酸））；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（寄託番号ＡＡＡ５８８０２（アミノ酸）およびＸ０７７３０（核酸））；前立腺特異的膜抗原（（ＰＳＭ）（寄託番号ＡＡＡ６０２０９（アミノ酸）およびＡＦ００７５４４（核酸））；腎臓抗原（ＲＡＧＥ）（寄託番号ＡＡＨ５３５３６（アミノ酸）およびＮＭ＿０１４２２６（核酸））；腎臓ユビキタス１または２（ＲＵ１またはＲＵ２）（ＲＵ１寄託番号ＡＡＦ１９７９４（アミノ酸）およびＡＦ１６８１３２（核酸）またはＲＵ２寄託番号ＡＡＦ２３６１０（アミノ酸）ＡＦ１８１７２１（核酸））；肉腫抗原（ＳＡＧＥ）（寄託番号ＮＰ＿００５４２４（アミノ酸）およびＮＭ＿０１８６６６（核酸））；Ｔ細胞１または３により認識された扁平上皮抗原（ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３）（ＳＡＲＴ−１寄託番号ＢＡＡ２４０５６（アミノ酸）およびＮＭ＿ＯＯ５１４６（核酸）またはＳＡＲＴ−３寄託番号ＢＡＡ７８３８４（アミノ酸）ＡＢ０２０８８０（核酸））；転座Ｅｔｓ−ファミリー白血病／急性骨髄性白血病１（ＴＥＬ／ＡＭＬ１）；三炭糖リン酸異性化酵素変異（ＴＰＩ／ｍ）；チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）（寄託番号ＮＰ＿０００５４１（アミノ酸）およびＮＭ＿０００５５０（核酸））；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）（寄託番号ＣＡＡ０４１３７（アミノ酸）およびＡＪ０００５０３（核酸））；ＴＲＰ−２／イントロン２；ならびに、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）（寄託番号ＣＡＣ３９２２０（アミノ酸）およびＢＣ０３２８６１（核酸））（参照により���明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
要約すると、この結果は、修飾ＢＣＧ株が親ＢＣＧワクチンよりも強力な先天性および適応的免疫応答を誘発することを示す。
【０１３０】
ＷＯ０２／０６２２９８号に記載された遺伝子操作を実施するための方法、細菌分離株、プラスミド、および他の手段は、これらの組成物および方法の教示のため参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
悪性腫瘍における一般の腫瘍抑制剤としてのプロアポトーシスＢＣＧの使用
上記ｐａＢＣＧの使用（すなわち、アジュバントとして、癌抗原発現ベクターとしての腫瘍に対する局所適用）は生細菌が免疫細胞を動員および活性化する能力に大いに依存する。かかる使用に加えて、ＢＣＧは一般の腫瘍抑制効果も有する。従って、癌の発現を抑制する活性結核に関するものがあり、高用量のＢＣＧ投与は癌を既に発現している一部の対象の生存において有益な効果を発揮する。利益の機序は決定されていないが、可能性の高い候補は抗腫瘍特性を有するマイコバクテリウム誘発性サイトカインである。以下の実施例において、ｐａＢＣＧワクチン３ｄＢＣＧ投与後、ＩＬ−２（図２８）、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２１を含むいくつかのかかる抗腫瘍サイトカインの産生が、親ＢＣＧ  Ｔｉｃｅと比較して高まることを示す。従って、この技術を用いて構築されたｐａＢＣＧワクチンは、一般の腫瘍抑制効果をもたらす能力において現在入手可能なＢＣＧワクチンより優れている。
【０１３２】
既に潜在性ＴＢ感染を保因する者における活動性肺結核の発現を予防するためのＳＯＤ−Ａ、変異体ＳＯＤ−Ａ、またはＳＯＤ−Ａペプチドを発現するプロアポトーシスＢＣＧの使用
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＳｏｄＡに対する活性免疫化の理論的根拠は、宿主細胞によりトランスフェリン受容体の発現を促進し（図２９）、その結果、鉄の取り込みを促進して肺組織を損傷する毒性酸素誘導体の産生を増大する（図３０）ことにより、潜在性ＴＢ感染の活動性肺結核への変換において中心的役割を果たす可能性である。従って、ＳｏｄＡを標的とすることによりＳｏｄＡの酵素活性を低下させる免疫介入は、潜在性ＴＢ感染が活動性肺結核に進行することを予防する上で役立ち得る。
【０１３３】
ドミナントネガティブＳｏｄＡを発現するｐａＢＣＧを含む組成物、変異体ＳｏｄＡを含む組成物、またはＳｏｄＡペプチドを含む組成物により対象を免疫化することを含む、活動性肺結核の発現を予防する方法を提供する。
【０１３４】
また、ドミナントネガティブＳｏｄＡを発現するｐａＢＣＧを含む組成物、変異体ＳｏｄＡを含む組成物、およびＳｏｄＡペプチドを含む組成物により対象を免疫化することを含む、活動性肺結核者における肺損傷を減少させる方法も提供する。
【０１３５】
マイコバクテリウム種感染者における肺線維症の発現を予防するためのＳＯＤ−Ａ、変異体ＳＯＤ−Ａ、またはＳＯＤ−Ａペプチドを発現するプロアポトーシスＢＣＧの使用。
マイコバクテリウム種はサルコイドーシスを含む他の肺損傷疾患の病原にも関連付けられている。肺線維症は組換えＳｏｄＡ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来）を発現するように遺伝工学的処理した腐生性マイコバクテリウム種（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）を有するＣ５７Ｂｌ／６マウスを感染させることによりサルコイドーシスに類似した組織病理学的特徴を有して誘発された。これらの結果は、マイコバクテリウム生成スーパーオキシドジスムターゼは、おそらくは宿主細胞によるトランスフェリン受容体の発現を促進することにより（図２９）、その結果、鉄の取り込みを促進して毒性酸素誘導体の産生を増大することにより（図３０）、肺損傷の一因となることの理解を実証する。従って、マイコバクテリウム種のＳｏｄＡを標的とすることによりその酵素活性を低下させる免疫介入は、サルコイドーシスの肺線維化合併症、およびおそらくは特発性肺線維症（ＩＰＦ）を含む他の肺線維化疾患を予防する上で役立ち得る。
【０１３６】
また、ドミナントネガティブＳｏｄＡを発現するｐａＢＣＧを含む組成物、変異体ＳｏｄＡを含む組成物、またはＳｏｄＡペプチドを含む組成物により対象を免疫化することを含む、マイコバクテリウム種感染者における肺線維症を減少させる方法も提供する。
【０１３７】
ドミナントネガティブＳｏｄＡを発現するｐａＢＣＧを含む医薬品組成物、変異体ＳｏｄＡを含む組成物、およびＳｏｄＡペプチドを含む組成物も提供する。
【０１３８】
本発明は、下記の実施例においてより具体的に記載されるが、その多数の修正および変形が当業者にとって明らかであるため、例示のみとして意図される。
【実施例】
【０１３９】
一般方法。
細菌分離株、プラスミド、化学物質、および培地：使用した細菌分離株およびプラスミドを表１に示す。別段の指示のない限り、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ  １０をクローニングＰＣＲ産生物の宿主として使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αを他の分子遺伝子操作の宿主として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ株はＬＢ培地内で増殖した（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）。でＢＣＧ  Ｔｉｃｅを、０．２％グリセロール、１０％Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ＯＡＤＣ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）、および．０５％Ｔｗｅｅｎ８０で補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９液体培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）で増殖させた。あるいは、ＢＣＧ  Ｔｉｃｅは、グリセロールとＯＡＤＣで補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天（Ｄｉｆｃｏ）上で増殖させた。５０μｇ／ｍｌもしくは２５μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシン、５０μｇ／ｍｌの濃度のアプラマイシン、または１００μｇ／ｍｌもしくは５０μｇ／ｍｌの濃度のハイグロマイシンをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αもしくはＢＣＧ内に使用してプラスミドもしくは染色体組込み型ベクターを含む形質転換体を選択した。
【０１４０】
遺伝子変異生成。鉄補因子スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄＡ）およびグルタミンシンターゼ（ｇｌｎＡ１）遺伝子をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｈ３７ＲＶの染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製するプラスミドにおいてクローン化した。ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ／ｓｉｔｅ）に保存されたＤＮＡ配列データ（遺伝子バンクにも保存されている）を使用してＤＮＡプライマーの構築をガイドした。ヌクレオチドを除去、置換、または付加するために、ＰＣＲベースのプライマー重複伸長方法または他の方法を用いた部位特異的変異誘発が使用される。これはアミノ酸の欠失、置換、または付加を有する変異体酵素をコードする変異体遺伝子を産生する。遺伝子配列はＤＮＡ配列決定によって確定される。あるいは、所望の配列を有する遺伝子を産生するために遺伝子合成技術を使用できる。
【０１４１】
ＢＣＧにおける変異体酵素遺伝子の発現。変異体酵素をコードする遺伝子を、下記のベクター、すなわちｐＭＨ９４、ｐＨＶ２０２、ｐＭＰ３４９、およびｐＭＰ３９９のうちの１つ以上の中に連結させた。他のベクターも本発明の実施に使用できる。染色体組込み−熟練ベクターｐＬｏｕ１における変異体ＳｏｄＡの発現を、ＷＯ０２／０６２２９８号に記載されたように、標的とした付加的弱毒化を実施するための代替戦略の一部として、クローン化された野生型ｓｏｄＡプロモーターを用いて成し遂げた。この代替戦略は、最初に、軽減したＳＯＤ活性を示す酵素をコードする変異体ｓｏｄＡ対立遺伝子をマイコバクテリア染色体上のａｔｔＢファージ組込み部位に挿入することが含まれる。ｐＭＨ９４−ｍｕｔ  ｓｏｄＡの形質転換体は親ＢＣＧ株よりも増殖が遅かった。これらの菌株の遅い増殖は、ＳＯＤ活性を低下させるためにアンチセンス過剰発現技術が使用されているＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＢＣＧ株に観察された増殖の遅い表現型に類似した。これは変異体ＳｏｄＡ発現のドミナントネガティブ効果を表したことを認識し、変異体ＳｏｄＡは次いでｐＭＰ３４９およびｐＭＰ３９９に発現させた。これらの構築物において、ｓｏｄＡプロモーターが除去され、変異体ＳｏｄＡオープンリーディングフレームをａｃｅＡ（ｉｃｌとも呼ばれる）プロモーターを含む３５０超の塩基対領域の後ろに入れた。ｋｐｎ１制限部位をライゲーションに使用した。プロモーターＫｐｎ１部位変異体ＳｏｄＡリーディングフレームの完全配列を実施例１に示す。ａｃｅＡプロモーターはマクロファージ誘発性であり、発現はｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節もでき、これは発現している遺伝子が細菌増殖と干渉する場合に潜在的な利点を与える特徴である。ｐＭＰ３９９に発現した変異体ＳｏｄＡに関連する結果を実施例および図に示す。クローン化されたｇｌｎＡ１プロモーターを用いて、ｐＭＰ３４９およびｐＭＰ３９９における変異体ｇｌｎＡ１の発現を実施した。
【０１４２】
ベクターは標準の方法を用いてＢＣＧ  Ｔｉｃｅ中に電気穿孔した。ただし、マイコバクテリア培養物のＡ６００が０．６に達した場合、電気穿孔の効率を高めるために、その培養物を１．５％グリシンおよび５０μｇ／ｍｌのｍ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニン（ＭＦＰ）と共に５％ＣＯ２中で３７℃で４８時間インキュベートした。このマイコバクテリアを２回洗浄、氷冷した１０％グリセロール中で再懸濁した。すべての電気穿孔において、Ｐｕｌｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒアクセサリを備えたＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、１０００オームに設定したパルスコントローラーを用いて、２５Ｆおよび２．５ｋＶで用いた。電気穿孔後、１ｍｌのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地を試料に添加し、形質転換体を３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートさせた。必要に応じてカナマイシン、アプラマイシン、またはハイグロマイシンのいずれかを含むＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天上で形質転換体をプレートした。形質転換の成功を、ベクター構築物に固有のＤＮＡのＰＣＲにより確認した。
【０１４３】
酵素の量および活性のアッセイ。ドミナントネガティブ変異体酵素戦略は、細菌が産生した酵素の総活性を低下させる方法で、細菌自体の染色体的にコードした野生型酵素モノマーと干渉する細菌における変異体酵素モノマーの発現を含む。従って、ドミナントネガティブ戦略における成功を確認する情報を得るために、酵素量を測定する非酵素アッセイ（例えば、ウェスタンハイブリダイゼーション）ならびに酵素活性アッセイを実施した。結果は、親ＢＣＧ株と比較して、変異体ＢＣＧ株の酵素量は同等あるいは多いが（図１７）、酵素活性は軽減する（図１６）ことを示した。
【０１４４】
酵素活性アッセイ用の上清および溶解物を調製するため、ＯＡＤＣを含有する２５ｍｌの７Ｈ９ブロス中で洗浄細胞ペレットを再懸濁することによって、Ａ６００値が０．５に達するように、各ＢＣＧ株の新規培養を調製した。ブロスを撹拌せずに７２時間増殖させた。ブロス培養を遠心して、上清を細胞ペレットから分離した。１０，０００ｋＤＡ膜の遠心分離ベースの分離器を用いて２５ｍｌ上清を１．０ｍｌに濃縮することにより、酵素活性決定用の濃縮上清を調製した。１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に細胞ペレットを再懸濁し、ミクロビーズ叩解装置により溶解して、酵素活性の検査用の溶解物を調製した。比較のために、異なる菌株由来の溶解物を標準Ａ２８０値に調節した。
【０１４５】
ウェスタンハイブリダイゼーションを使用してＳＯＤ量を定量した。上記のように調製した未希釈の細胞溶解物からなる試料を標準Ａ２８０値に調節し、１２％ＰＡＧＥゲルに適用して電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）に移した。Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現したＰＡＧＥ精製組換えＳｏｄＡに対して上昇したウサギポリクローナル抗血清と共に膜をハイブリッド形成した。抗体を生成するために使用した組換えＳｏｄＡをニッケル親和性カラムクロマトグラフィーにより精製した。ニトロセルロース膜を最初に上記のように希釈した抗血清と共にインキュベート後、１：１０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ）と共にインキュベートした。免疫ブロットをＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で発現させた。
【０１４６】
ＳＯＤ活性の測定は、シトクロムＣ還元に干渉するその能力により、キサンチンオキシダーゼ生成スーパー酸化物を利用する市販のキットを用いたスーパー酸化物により、ならびにＭｃＣｏｒｄおよびＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法に基づいて分光学的に行った。１ＳＯＤ単位はシトクロムＣ還元を５０％阻害するＳｏｄＡ量（ＩＣ５０値）として定義した。
【０１４７】
グルタミンシンターゼ活性をＷｏｏｌｆｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ［Ｗｏｏｌｆｏｌｋ，  Ｃ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  １９６６］の方法を用いて分光学的に測定した。
【０１４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与−予防試験。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対する注射用にワクチン株接種原を調製するため、１０％ＯＡＤＣ（Ｄｉｆｃｏ）含有の修飾Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０ブロス（マラカイトグリーンおよび寒天欠失を伴う７Ｈ１０寒天製剤）でＢＣＧ  ＴｉｃｅおよびプロアポトーシスＢＣＧワクチン株を増殖させた。Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｋｌｅｔｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，  Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，  ＮＹ）上で１００Ｋｌｅｔｔ単位の測定値（約５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）に達するよう懸濁液を希釈した。バックカウントのため、接種原の一定量を順次希釈し、１０％ＯＡＤＣ含有７Ｈ１０寒天に直接プレートして正確な接種原寸法を決定した。
【０１４９】
Ｃ５７ＢＬ／６の雌マウス５〜６週齢をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅから購入した。感染および非感染対照マウスを、Ｓｙｒａｃｕｓｅ  ＶＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの病原体のないＢｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｌｅｖｅｌ−３施設で維持した。動物実験はＳｙｒａｃｕｓｅ  ＶＡＭＣ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓにより承認され、ＡＡＬＡＣ承認施設で実施した。
【０１５０】
他に特記されていない限り、ワクチン接種投与実験のための実験設計はワクチン株５×１０６ｃｆｕの皮下接種、１００日間の休薬、次いでＥｒｄｍａｎもしくはａｃｒＲ−Ｅｒｄｍａｎ株３００ｃｆｕの接種原のエアゾール投与を含んだ。ＣＯ２吸入により安楽死を成し遂げた。脾臓および右肺を滅菌除去し、Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｔｅ，  ＩＮ）に取り付けた密閉した細砕アセンブリー（ＩｄｅａＷｏｒｋｓ！  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｓｙｒａｃｕｓｅ，  ＮＹ）に組織を置き、均質化した。生存能力のある細胞数を１０％ＯＡＤＣ含有７Ｈ１０寒天プレート上で滴定して決定した。
【０１５１】
組織病理学的評価：マウスから左肺を採集し、１０％ホルマリン（Ａｃｃｕｓｔａｉｎ，  Ｓｉｇｍａ）固定した。肺をパラフィン包埋し、４μｍ切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。
【０１５２】
フローサイトメトリーおよび組織染色。Ｍａｃ  ＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎによるＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータ上で細胞集団を分析した。データをリスト方式で採集し、ＰＣプラットフォームＷｉｎｌｉｓｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ，  Ｔｏｐｓｈａｍ  Ｍａｉｎｅ）を用いてオフライン分析を実施した。フローサイトメトリー用の抗体をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。バックグラウンドを減らすため、ラット抗マウス抗ＣＤ１６／ＣＤ３２クローン２．４Ｇ２（Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ，  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に試料を１５分間インキュベートした。各標本中の計１０，０００ゲートイベントを採集し、ゲート分析は、実験間でゲート寸法を一定に保ち、細胞寸法および粒状に基づくリンパ細胞ゲートおよび非リンパ細胞ゲートを含んだ。
【０１５３】
（実施例１）
ＳＡＤ−ＢＣＧΔＨ２８ΔＨ７６［「ＢＣＧ（ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６）」、または「ドミナントネガティブΔＨ２８ΔＨ７６変異体ＳｏｄＡを発現するＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ」とも称される］の構築および低下したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＯＤ活性の考証。
ＳＡＤ−ＢＣＧΔＨ２８ΔＨ７６を構築するため、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ由来の染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅した野生型ｓｏｄＡ対立遺伝子上でＰＣＲベースの部位特異的変異誘発を実施することにより、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中のΔＨ２８ΔＨ７６  ｓｏｄＡ変異体を作製した。ΔＨ２８ΔＨ７６変異体ＳｏｄＡ対立遺伝子のオープンリーディングフレームを下記に示す。開始および停止コドンは太字で、配列番号１は酵素のアミノ酸２８とアミノ酸７６に対応する２つの欠失ＣＡＣ（ヒスチジン−コード）コドン位置を示す。主要αらせん体、β鎖、およびＳｏｄＡモノマーの活性部位Ｆｅ（ＩＩＩ）との関連で、これらのアミノ酸欠失の位置を図１に示す。
【０１５４】
２つのＣＡＣ（ヒスチジン）コドンの欠失を記録提供しているＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔワールドワイドウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ／）のＢＬＡＳＴサーバーを用いて、完全Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ配列のヌクレオチド配列に対するこのＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴＮクエリーを実施した。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ｜ｎｕｌｌ  Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｓ  Ｈ３７ＲＶ（４４１１５３２ｂｐ）同一性＝６１８／６２４（９９％）、ギャップ＝６／６２４（０％）
【化１】
2012501189.tif 000005
【化２】
2012501189.tif 000006
欠失したヒスチジン部位を示すＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ  ＢＬＡＳＴサイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ／）で、翻訳されたヌクレオチド配列データに対してもＴＢＬＡＳＴＮクエリーを実施した。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ｜ｎｕｌｌ  Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｓ  Ｈ３７ＲＶ（４４１１５３２ｂｐ）  同一性＝２０５／２０７（９９％）、陽性＝２０５／２０７（９９％）、ギャップ＝２／２０７（０％）
クエリー配列：１  ＶＡＥＹＴＬＰＤＬＤＷＤＹＧＡＬＥＰＨＩＳＧＱＩＮＥＬＨ−ＳＫＨＨＡＴＹＶＫＧＡＮＤＡＶＡＫＬＥＥＡＲＡＫＥＤＨＳＡＩＬ  ５９
データベース配列：４３２０７０４  ＶＡＥＹＴＬＰＤＬＤＷＤＹＧＡＬＥＰＨＩＳＧＱＩＮＥＬＨＨＳＫＨＨＡＴＹＶＫＧＡＮＤＡＶＡＫＬＥＥＡＲＡＫＥＤＨＳＡＩＬ  ４３２０８８３
クエリー配列：６０  ＬＮＥＫＮＬＡＦＮＬＡＧＨＶＮ−ＴＩＷＷＫＮＬＳＰＮＧＧＤＫＰＴＧＥＬＡＡＡＩＡＤＡＦＧＳＦＤＫＦＲＡＱＦＨＡＡＡＴＴＶ  １１８
データベース配列：４３２０８８４  ＬＮＥＫＮＬＡＦＮＬＡＧＨＶＮＨＴＩＷＷＫＮＬＳＰＮＧＧＤＫＰＴＧＥＬＡＡＡＩＡＤＡＦＧＳＦＤＫＦＲＡＱＦＨＡＡＡＴＴＶ  ４３２１０６３
クエリー配列：１１９  ＱＧＳＧＷＡＡＬＧＷＤＴＬＧＮＫＬＬＩＦＱＶＹＤＨＱＴＮＦＰＬＧＩＶＰＬＬＬＬＤＭＷＥＨＡＦＹＬＱＹＫＮＶＫＶＤＦＡＫＡ  １７８
データベース配列：４３２１０６４  ＱＧＳＧＷＡＡＬＧＷＤＴＬＧＮＫＬＬＩＦＱＶＹＤＨＱＴＮＦＰＬＧＩＶＰＬＬＬＬＤＭＷＥＨＡＦＹＬＱＹＫＮＶＫＶＤＦＡＫＡ  ４３２１２４３
クエリー配列：１７９  ＦＷＮＶＶＮＷＡＤＶＱＳＲＹＡＡＡＴＳＱＴＫＧＬＩＦＧ  ２０５（配列番号４）
データベース配列：４３２１２４４  ＦＷＮＶＶＮＷＡＤＶＱＳＲＹＡＡＡＴＳＱＴＫＧＬＩＦＧ  ４３２１３２４（配列番号５）
Ｓａｎｇｅｒ  ＣｅｎｔｒｅのＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｍ＿ｂｏｖｉｓ）におけるヌクレオチド配列データに対してもＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＮクエリーを実施した。Ｓａｎｇｅｒ  ＣｅｎｔｒｅはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｐａｓｔｅｕｒの配列を決定中で、仮のＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧアセンブリーを使用した。（下の）結果は、２つのＣＡＣコドン欠失に加えて、ＢＣＧには２０３位のＩ→Ｔアミノ酸置換を生じるさらなるＴ−Ｃヌクレオチド差異があることを示す。
ＢＬＡＳＴＮ結果：＞ＢＣＧ  ７９ｃ０８．ｓ１ｋ  １９１５１ｂｐ、１６０リード、３６．２５同一性＝６１７／６２４（９８％）、陽性＝６１７／６２４（９８％）、鎖＝＋／＋
【化３】
2012501189.tif 000007
【化４】
2012501189.tif 000008
ＴＢＬＡＳＴＮ結果：＞ＢＣＧ  ７９ｃ０８．ｓ１ｋ  １９１５１ｂｐ、１６０リード、３６．２５同一性＝２０４／２０７（９８％）、陽性＝２０４／２０７（９８％）、フレーム＝＋２
クエリー配列：１  ＶＡＥＹＴＬＰＤＬＤＷＤＹＧＡＬＥＰＨＩＳＧＱＩＮＥＬＨ−ＳＫＨＨＡＴＹＶＫＧＡＮＤＡＶＡＫＬＥＥＡＲＡＫＥＤＨＳＡＩＬ  ５９
データベース配列：１１１５６  ＶＡＥＹＴＬＰＤＬＤＷＤＹＧＡＬＥＰＨＩＳＧＱＩＮＥＬＨＨＳＫＨＨＡＴＹＶＫＧＡＮＤＡＶＡＫＬＥＥＡＲＡＫＥＤＨＳＡＩＬ  １１３３５
クエリー配列：６０  ＬＮＥＫＮＬＡＦＮＬＡＧＨＶＮ−ＴＩＷＷＫＮＬＳＰＮＧＧＤＫＰＴＧＥＬＡＡＡＩＡＤＡＦＧＳＦＤＫＦＲＡＱＦＨＡＡＡＴＴＶ  １１８
データベース配列：１１３３６  ＬＮＥＫＮＬＡＦＮＬＡＧＨＶＮＨＴＩＷＷＫＮＬＳＰＮＧＧＤＫＰＴＧＥＬＡＡＡＩＡＤＡＦＧＳＦＤＫＦＲＡＱＦＨＡＡＡＴＴＶ  １１５１５
クエリー配列：１１９  ＱＧＳＧＷＡＡＬＧＷＤＴＬＧＮＫＬＬＩＦＱＶＹＤＨＱＴＮＦＰＬＧＩＶＰＬＬＬＬＤＭＷＥＨＡＦＹＬＱＹＫＮＶＫＶＤＦＡＫＡ  １７８
データベース配列：１１５１６  ＱＧＳＧＷＡＡＬＧＷＤＴＬＧＮＫＬＬＩＦＱＶＹＤＨＱＴＮＦＰＬＧＩＶＰＬＬＬＬＤＭＷＥＨＡＦＹＬＱＹＫＮＶＫＶＤＦＡＫＡ  １１６９５
クエリー配列：１７９  ＦＷＮＶＶＮＷＡＤＶＱＳＲＹＡＡＡＴＳＱＴＫＧＬＩＦＧ  ２０５（配列番号８）
データベース配列：１１６９６  ＦＷＮＶＶＮＷＡＤＶＱＳＲＹＡＡＡＴＳＱＴＫＧＬＴＦＧ  １１７７６（配列番号９）
【０１５５】
次に、変異体ｓｏｄＡ対立遺伝子を、ａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろの染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９およびプラスミドベクターｐＭＰ３４９に連結させて、ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６（配列番号３０）（ＢＣＧ中の変異体ｓｏｄＡを発現するために使用された、染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６の完全なヌクレオチド配列）およびｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６を得た（表１）。それはプロアポトーシスＢＣＧの１代目、および２代目、および３代目変異体に添加して、それぞれ、２代目、３代目、および４代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンを得ることもできる。プラスミドのマップを図２に示す。下記の配列番号１０に示す配列は、変異体ｓｏｄＡオープンリーディングフレームを通してのａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターのヌクレオチド配列を強調する。主な特徴は：［ａ］ａｃｅＡ（ｉｃｌ）関連プロモーターをコードする配列（塩基５０４４〜塩基５３８５）、［ｂ］ｓｏｄＡ（ΔＨ２８ΔＨ７６）変異体のオープンリーディングフレーム（塩基９〜塩基６２６）、および［ｃ］［ａ］と［ｂ］を結ぶために使用したＫｐｎ１制限部位（塩基１〜塩基８）である。
【０１５６】
次に、ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６をＢＣＧ  Ｔｉｃｅ内に電気穿孔してＳＡＤ−ＢＣＧΔＨ２８ΔＨ７６（ＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ、ＢＣＧ（ｍｕｔ  ｓｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６）とも呼ばれる）を産生した。アプラマイシン含有寒天上で形質転換体を選択した。ｐＭＰ３９９ベクター固有のヌクレオチド配列を用いた染色体ＤＮＡのＰＣＲを使用して、ＢＣＧ染色体内へのベクター組込みの成功を検証した。
【０１５７】
全細菌のＳＯＤ活性に対する変異体ΔＨ２８ΔＨ７６  ＳｏｄＡ発現効果を決定するため、ＢＣＧおよびＳＡＤ−ＢＣＧΔＨ２８ΔＨ７６の上清および溶解物を上記のように調製し、キサンチンオキシダーゼ生成スーパー酸化物（Ｏ２−）によるシトクロムＣ還元との（ＳＯＤによる）干渉をモニタリングすることによりＳＯＤ活性を比較した。結果を図３に示す。この結果は、ほとんどの活性を上清に見出すことができ、ドミナントネガティブ戦略によりＳＯＤ活性が約８〜１６倍低下することを示す。
【０１５８】
（実施例２）
ＳＡＤ−ＢＣＧΔＥ５４［別名ＢＣＧ（ｍｕｔ  ｓｏｄＡΔＥ５４）、またはドミナントネガティブΔＥ５４変異体ＳｏｄＡを発現するＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ］の構築および低下したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＯＤ活性の考証
記載の技術を用いて、ΔＥ５４欠失を含むさらなるドミナントネガティブｓｏｄＡ変異体を構築した。ＳｏｄＡモノマーの主要αらせん体、β鎖、および活性部位Ｆｅ（ＩＩＩ）との関連で、このアミノ酸欠失の位置を図１に示す。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯの遺伝子のＤＮＡ配列決定により、２８位でヒスチジン→アルギニン置換を誘発したさらなるヌクレオチド置換が同定された。
【０１５９】
変異体ΔＥ５４  ｓｏｄＡ対立遺伝子を、ａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろの染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９およびプラスミドベクターｐＭＰ３４９に連結させ、ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４（配列番号２９）およびｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４（配列番号２４）を得た（表１）。ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４をＢＣＧ  Ｔｉｃｅ内に電気穿孔してＳＡＤ−ＢＣＧΔＥ５４（ＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ、ＢＣＧ（ｍｕｔ  ｓｏｄＡΔＥ５４）とも呼ばれる）を産生した。これらのベクターはプロアポトーシスＢＣＧの１代目、および２代目、および３代目変異体に添加して、それぞれ、２代目、３代目、および４代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンを構築することもできる。
【０１６０】
細菌全体のＳＯＤ活性に対する変異体ΔＥ５４  ＳｏｄＡ発現効果を決定するため、ＢＣＧおよびＳＡＤ−ＢＣＧΔＥ５４の上清および溶解物を上記のように調製し、ＳＯＤ活性を比較した。結果を図４に示す。この結果は、総ＳＯＤ活性はＳＡＤ−ＢＣＧΔＨ２８ΔＨ７６で観察されたほど顕著に低下しなかったことを示す。
【０１６１】
（実施例３）
ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤのワクチン有効性−ドミナントネガティブＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ株の有用性に関する意義。
ＢＣＧによるＳｏｄＡ産生の減少結果として起こるワクチンの有効性の改善量を定量化するため、ＢＣＧとＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤ（ＷＯ０２／０６２２９８号に既に記載されているアンチセンス技術を用いて構築したＳｏｄＡ軽減ＢＣＧ）を比較した。実験の詳細および結果を図５に示す。これらは、病原性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓをエアゾール投与後６ヶ月目、ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤ接種のＣ５７Ｂｌ／６マウスの肺ｃｆｕ数および肺損傷はＢＣＧ接種マウスよりも少ないことを示す。
【０１６２】
別のワクチン接種投与実験において、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを皮下接種し、１００日間休薬し、病原性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓをエアゾール投与後４、１０、および１８日目に肺におけるＴ細胞応答の分析用に採集した。ＢＣＧ接種マウスと比較して、ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤ接種マウスでは投与後４日目でＣＤ４４＋／ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈであったＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数がより多く、１８日目でＣＤ４４＋／ＣＤ４５ＲＢｎｅｇであったＣＤ４＋Ｔ細胞数がより多かったことを示した（図６）。Ｔ細胞応答におけるこれらの差異は、投与後初期の肺の組織病理学的外見における差異（ゴーン病巣のより急速な発現を含む）に関連した（図７）。
【０１６３】
これらの結果および本明細書の他で報告した結果に基づき、同等なワクチンの有効性の向上が、上記のようにドミナントネガティブ変異体ＳｏｄＡ発現を用いて構築されたＳＡＤ−ＢＣＧ株により起こる。
【０１６４】
（実施例４）
ＳＩＧ−ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨとも称される）の構築およびワクチン評価。
ＢＣＧによって産生した他の抗酸化物の軽減のワクチンの有効性に対する効果を評価した。上に論じたように、ｓｉｇＨは酸化ストレスに対する細菌反応に関係するシグマ因子であり、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、およびグルタレドキシン相同体の産生を調節する。
【０１６５】
Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊａｃｏｂｓ，  Ｊｒ．  ｆｒｏｍ  Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのファスミド系を用いて、マイコバクテリアの遺伝子を不活性化するためにこの系の適用に公開された方法を用いて、ＢＣＧ  Ｔｉｃｅ染色体上のＳｉｇＨを不活性化した。ｓｉｇＨの上流および下流領域をｐＹＵＢ８５４内にクローン化して対立遺伝子の不活性化ベクターを構築した。ｐＹＵＢ８５４−ｓｉｇＨのＤＮＡ配列を配列番号３４に示し、このベクターのマップおよび特性を図８に示す。ファスミド系を用いてｓｉｇＨの不活性化ベクターをＢＣＧに添加してＢＣＧΔｓｉｇＨを構築し、ＢＣＧΔｓｅｃＡ２に添加してＤＤ−ＢＣＧを構築する。それは１代目、２代目、および３代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンをそれぞれ２代目、３代目、および４代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンに修飾するために使用できる。
【０１６６】
ＳＩＧ−ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨ）を構築するための代替戦略は上に記載し参照しているように自殺プラスミドベクターの使用に関連し、それらの使用は当業者間で周知である。
【０１６７】
ＳＩＧ−ＢＣＧをワクチンとして試験した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＢＣＧまたはＳＩＧ−ＢＣＧのいずれかで皮下接種し、１００日間休薬してから、病原性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＡｃｒＲ−Ｅｒｄｍａｎ株をエアゾール投与した。投与後６ヶ月目、ＳＩＧ−ＢＣＧ接種マウスにおける病原性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの肺ｃｆｕ数はＢＣＧ接種マウスより少なく（図９）、肺損傷は少なかった（図１０）。病原性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを投与したＳＩＧ−ＢＣＧ接種マウスの肺の経時的な組織病理学的外見は、上記に示すＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤ接種マウスの結果（実施例４）との類似を示した。最も顕著であったのは、ＳＩＧ−ＢＣＧ接種マウスにおけるゴーン病巣の早期発現および少ない肺ｃｆｕ数と対応したそれらの経時的な明らかな消散（図１１）であった。
【０１６８】
（実施例５）
ＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧ、「２代目プロアポトーシスＢＣＧワクチン」の構築および低下したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＯＤ活性の考証。
実施例３および４に例示するように、２つの異なるプロアポトーシスＢＣＧワクチン（ＳＤ−ＢＣＧ−ＡＳ−ＳＯＤおよびＳＩＧ−ＢＣＧ）の向上したワクチンの有効性は、宿主生成酸化物が宿主免疫応答において重要な機能を有することを示す。微生物抗酸化物は酸化物のこれらの重要な機能に干渉し（図１２）、その結果、強力な予防的免疫応答の発現に必要とされる初期シグナル伝達を中断する。
【０１６９】
それぞれ単独の遺伝子修飾を有する２つのプロアポトーシスＢＣＧワクチンに関連する実施例３および４の観察により、ＢＣＧによる抗酸化物の産生における２つ以上の欠陥の誘発は、より強力なワクチンをもたらすことが示される。例えば、ＢＣＧによる抗酸化物の産生における欠陥の誘発は、ＢＣＧの肺結核の予防能を高める。上に論じたように、微生物は抗アポトーシス酵素の多様な配列を産生し、それらの多くは宿主酸化物の不活性化に関連する。図１３は、ＢＣＧ（およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中の遺伝子修飾を併合して、抗酸化物の産生を減らす１、２、３、または４つの遺伝子操作を誘発し、それぞれ、１代目、２代目、３代目、および４代目プロアポトーシスワクチンを得るための戦略を示す。
【０１７０】
「２代目」プロアポトーシスＢＣＧワクチンを産生するため、ドミナントネガティブ変異体ｓｏｄＡ発現ベクター（ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６（配列番号３０）；ｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６（配列番号２５）；ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４（配列番号２９）；およびｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４（配列番号２４））をＳＩＧ−ＢＣＧ内に電気穿孔してＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧを得た。これらの菌株の溶解物および上清上のＳＯＤ活性アッセイの結果を図１４に示す。これは、１代目ＳＡＤ−ＢＣＧワクチンで示されたものと類似したＳＯＤ活性の低下を示す。ドミナントネガティブΔＨ２８ΔＨ７６  ｓｏｄＡ変異体の過剰発現により、ΔＥ５４  ｓｏｄＡ変異体の過剰発現（約４倍）よりも多くＳＯＤ活性が低下した（約８倍）。
【０１７１】
（実施例６）
ＤＤ−ＢＣＧ（ＢＣＧΔｓｉｇＨΔｓｅｃＡ２とも称される）の構築
実施例４に概説する方法を用いて、別の「２代目」プロアポトーシスＢＣＧワクチンを産生し、ＳＥＣ−ＢＣＧ（「ＢＣＧΔｓｅｃＡ２」とも称される）の染色体上のｓｉｇＨを不活性化してＤＤ−ＢＣＧ（「二重欠失ＢＣＧ」の略語）を産生した。図１５は、ＤＤ−ＢＣＧの構築の成功を考証するサザンハイブリダイゼーション膜を示す。ＤＤ−ＢＣＧは、不活性化したｓｅｃＡ２およびｓｉｇＨを含む。
【０１７２】
（実施例７）
３Ｄ−ＢＣＧの構築および低下したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＯＤ活性の考証。
「３代目」プロアポトーシスＢＣＧワクチンを産生するため、ドミナントネガティブ変異体ｓｏｄＡ発現ベクター（ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６；ｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６；ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４；およびｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４）をＤＤ−ＢＣＧ内に電気穿孔して３Ｄ−ＢＣＧを得た。
【０１７３】
これらの菌株の溶解物および上清に対するＳＯＤ活性アッセイの結果を図１６に示す。ＳＯＤ活性の大部分が上清にあったＳＡＤ−ＢＣＧおよびＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧが関与する結果（図３、４、１４）と対照的に、図１６Ａの結果は、ＤＤ−ＢＣＧおよび３Ｄ−ＢＣＧ中のＳＯＤ活性は大部分が細胞溶解物にあることを示す。この逆転は、ＢＣＧ中のｓｅｃＡ２の不活性化によりＳｏｄＡの分泌チャネルが中断され、ＳｏｄＡは細胞外に分泌される代わりに細菌内にとどまるために生じる。
【０１７４】
これらの菌株の溶解物中のＳｏｄＡのこの局在化は、ＳｏｄＡ量の定量化における他の技術の使用を促進した。図１７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の２３ｋＤａ  ＳｏｄＡバンドの直接的観察により、およびウサギポリクローナル抗ＳｏｄＡ抗体を用いたハイブリダイゼーション（ウェスタン）後に決定したＳｏｄＡ量を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンハイブリダイゼーション結果を示す。これらの結果により、ΔＨ２８ΔＨ７６とΔＥ５４  ＳｏｄＡ変異体が過剰発現している３Ｄ−ＢＣＧ分離株に示されたＳＯＤ活性の顕著な低下にもかかわらず、ＳｏｄＡタンパク質量は同等であることが示される。これは、ΔＨ２８ΔＨ７６とΔＥ５４  ＳｏｄＡ変異体の過剰発現は、ＳｏｄＡタンパク質の総量（野生型＋変異体）が同等であるにもかかわらずＳｏｄＡの生体活性と干渉するドミナントネガティブ効果を誘発することを示す。
【０１７５】
これらの結果は、対立遺伝子のｓｅｃＡ２の不活性化と併用したドミナントネガティブ変異体ＳｏｄＡ戦略の実施に利点があり得ることも示す。ｓｅｃＡ２欠失を含む菌株における総ＳＯＤ活性の全体的な低下はこの欠失を伴わない菌株と比較して大きいと思われる。例えば、ドミナントネガティブΔＨ２８ΔＨ７６  ＳｏｄＡ変異体を過剰発現したＳＡＤ−ＢＣＧおよびＳＡＤ−ＳＩＧ−ＢＣＧ分離株は総ＳＯＤ活性の８〜１６倍低下を示したが（図３、１４）、この低下はΔＨ２８ΔＨ７６  ＳｏｄＡ変異体をＤＤ−ＢＣＧに添加時に３２倍以上であるようであった（図１６）。同様に、ＳＯＤ活性の低下は、ΔＥ５４  ＳｏｄＡ変異体をＢＣＧまたはＳＩＧ−ＢＣＧ内よりも（図４、１４；２〜４倍低下）、ＤＤ−ＢＣＧ内に入れた時（図１６；１６倍低下）に大きかった。
【０１７６】
（実施例８）
４Ｄ−ＢＣＧワクチンを得るためのドミナントネガティブグルタミンシンターゼの３Ｄ−ＢＣＧへの添加。
グルタメートおよびグルタミンは、哺乳類細胞上でそれぞれプロおよび抗アポトーシス性効果を発揮する。グルタミンシンターゼ（「グルタミンシンテターゼ」とも呼ばれる）は、グルタメートとアンモニア間の反応を触媒してグルタミンを産出する。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＢＣＧは、グルタミンシンターゼまたは相同体をコードする染色体上にいくつかの対立遺伝子を有する。これらの１つであるｇｌｎＡ１は大量に産生されて細胞外に分泌される。
【０１７７】
４Ｄ−ＢＣＧを構築するため、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ由来の染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅されている野生型ｇｌｎＡ１対立遺伝子上でＰＣＲベースの部位特異的変異誘発を実施することにより、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯのドミナントネガティブｇｌｎＡ１変異体を構築した。ΔＤ５４ΔＥ３３５変異体ｇｌｎＡ１対立遺伝子のオープンリーディングフレームを以下に示す。開始および停止コドンは太字で、配列番号１１は酵素のアミノ酸５４およびアミノ酸３３５に対応する２つの欠失コドンの位置を示す。
【０１７８】
六量体ｇｌｎＡ１環の活性部位マンガンイオンとの関連でこれらのアミノ酸欠失位置を図１８に示す。隣接モノマー由来のＤ５４およびＥ３３５はモノマー間にある活性部位の形成に関与するため、単一モノマーへの両欠失の導入により、それが会合して野生型モノマーと環になる際にモノマーの各側の活性部位を分離する。従って、それはドミナントネガティブ効果を誘発する。
【０１７９】
２つのコドンの欠失を記録提供するＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔワールドワイドウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ／）のＢＬＡＳＴサーバーを用いて、完全Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ配列のヌクレオチド配列に対してこのＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴＮクエリーを実施した。
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ｜ｎｕｌｌ  Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｓ  Ｈ３７ＲＶ（４４１１５３２ｂｐ）同一性＝１４３１／１４３７（９９％）、ギャップ＝６／１４３７（０％）
【化５】
2012501189.tif 000009
【化６】
2012501189.tif 000010
【化７】
2012501189.tif 000011
【化８】
2012501189.tif 000012
【０１８０】
欠失アスパラギン酸およびグルタミン酸の位置を示すＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ  ＢＬＡＳＴサイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ／）の翻訳されたヌクレオチド配列データに対してもＴＢＬＡＳＴＮクエリーを実施した。
【０１８１】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ｜ｎｕｌｌ  Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｓ  Ｈ３７ＲＶ（４４１１５３２ｂｐ）、同一性＝４７６／４７８（９９％）、陽性＝４７６／４７８（９９％）、ギャップ＝２／４７８（０％）
クエリー配列：１  ＶＴＥＫＴＰＤＤＶＦＫＬＡＫＤＥＫＶＥＹＶＤＶＲＦＣＤＬＰＧＩＭＱＨＦＴＩＰＡＳＡＦＤＫＳＶＦＤＤＧＬＡＦ−ＧＳＳＩＲＧ  ５９
ＶＴＥＫＴＰＤＤＶＦＫＬＡＫＤＥＫＶＥＹＶＤＶＲＦＣＤＬＰＧＩＭＱＨＦＴＩＰＡＳＡＦＤＫＳＶＦＤＤＧＬＡＦ  ＧＳＳＩＲＧ
データベース配列：２４８７６１５  ＶＴＥＫＴＰＤＤＶＦＫＬＡＫＤＥＫＶＥＹＶＤＶＲＦＣＤＬＰＧＩＭＱＨＦＴＩＰＡＳＡＦＤＫＳＶＦＤＤＧＬＡＦＤＧＳＳＩＲＧ  ２４８７７９４
クエリー配列：６０  ＦＱＳＩＨＥＳＤＭＬＬＬＰＤＰＥＴＡＲＩＤＰＦＲＡＡＫＴＬＮＩＮＦＦＶＨＤＰＦＴＬＥＰＹＳＲＤＰＲＮＩＡＲＫＡＥＮＹＬＩ  １１９
ＦＱＳＩＨＥＳＤＭＬＬＬＰＤＰＥＴＡＲＩＤＰＦＲＡＡＫＴＬＮＩＮＦＦＶＨＤＰＦＴＬＥＰＹＳＲＤＰＲＮＩＡＲＫＡＥＮＹＬＩ
データベース配列：２４８７７９５  ＦＱＳＩＨＥＳＤＭＬＬＬＰＤＰＥＴＡＲＩＤＰＦＲＡＡＫＴＬＮＩＮＦＦＶＨＤＰＦＴＬＥＰＹＳＲＤＰＲＮＩＡＲＫＡＥＮＹＬＩ  ２４８７９７４
クエリー配列：１２０  ＳＴＧＩＡＤＴＡＹＦＧＡＥＡＥＦＹＩＦＤＳＶＳＦＤＳＲＡＮＧＳＦＹＥＶＤＡＩＳＧＷＷＮＴＧＡＡＴＥＡＤＧＳＰＮＲＧＹＫＶ  １７９
ＳＴＧＩＡＤＴＡＹＦＧＡＥＡＥＦＹＩＦＤＳＶＳＦＤＳＲＡＮＧＳＦＹＥＶＤＡＩＳＧＷＷＮＴＧＡＡＴＥＡＤＧＳＰＮＲＧＹＫＶ
データベース配列：２４８７９７５  ＳＴＧＩＡＤＴＡＹＦＧＡＥＡＥＦＹＩＦＤＳＶＳＦＤＳＲＡＮＧＳＦＹＥＶＤＡＩＳＧＷＷＮＴＧＡＡＴＥＡＤＧＳＰＮＲＧＹＫＶ  ２４８８１５４
クエリー配列：１８０  ＲＨＫＧＧＹＦＰＶＡＰＮＤＱＹＶＤＬＲＤＫＭＬＴＮＬＩＮＳＧＦＩＬＥＫＧＨＨＥＶＧＳＧＧＱＡＥＩＮＹＱＦＮＳＬＬＨＡＡＤ  ２３９
ＲＨＫＧＧＹＦＰＶＡＰＮＤＱＹＶＤＬＲＤＫＭＬＴＮＬＩＮＳＧＦＩＬＥＫＧＨＨＥＶＧＳＧＧＱＡＥＩＮＹＱＦＮＳＬＬＨＡＡＤ
データベース配列：２４８８１５５  ＲＨＫＧＧＹＦＰＶＡＰＮＤＱＹＶＤＬＲＤＫＭＬＴＮＬＩＮＳＧＦＩＬＥＫＧＨＨＥＶＧＳＧＧＱＡＥＩＮＹＱＦＮＳＬＬＨＡＡＤ  ２４８８３３４
クエリー配列：２４０  ＤＭＱＬＹＫＹＩＩＫＮＴＡＷＱＮＧＫＴＶＴＦＭＰＫＰＬＦＧＤＮＧＳＧＭＨＣＨＱＳＬＷＫＤＧＡＰＬＭＹＤＥＴＧＹＡＧＬＳＤ  ２９９
ＤＭＱＬＹＫＹＩＩＫＮＴＡＷＱＮＧＫＴＶＴＦＭＰＫＰＬＦＧＤＮＧＳＧＭＨＣＨＱＳＬＷＫＤＧＡＰＬＭＹＤＥＴＧＹＡＧＬＳＤ
データベース配列：２４８８３３５  ＤＭＱＬＹＫＹＩＩＫＮＴＡＷＱＮＧＫＴＶＴＦＭＰＫＰＬＦＧＤＮＧＳＧＭＨＣＨＱＳＬＷＫＤＧＡＰＬＭＹＤＥＴＧＹＡＧＬＳＤ  ２４８８５１４
クエリー配列：３００  ＴＡＲＨＹＩＧＧＬＬＨＨＡＰＳＬＬＡＦＴＮＰＴＶＮＳＹＫＲＬＶＰＧＹ−ＡＰＩＮＬＶＹＳＱＲＮＲＳＡＣＶＲＩＰＩＴＧＳＮＰ  ３５８
ＴＡＲＨＹＩＧＧＬＬＨＨＡＰＳＬＬＡＦＴＮＰＴＶＮＳＹＫＲＬＶＰＧＹ  ＡＰＩＮＬＶＹＳＱＲＮＲＳＡＣＶＲＩＰＩＴＧＳＮＰ
データベース配列：２４８８５１５  ＴＡＲＨＹＩＧＧＬＬＨＨＡＰＳＬＬＡＦＴＮＰＴＶＮＳＹＫＲＬＶＰＧＹＥＡＰＩＮＬＶＹＳＱＲＮＲＳＡＣＶＲＩＰＩＴＧＳＮＰ  ２４８８６９４
クエリー配列：３５９  ＫＡＫＲＬＥＦＲＳＰＤＳＳＧＮＰＹＬＡＦＳＡＭＬＭＡＧＬＤＧＩＫＮＫＩＥＰＱＡＰＶＤＫＤＬＹＥＬＰＰＥＥＡＡＳＩＰＱＴＰ  ４１８
ＫＡＫＲＬＥＦＲＳＰＤＳＳＧＮＰＹＬＡＦＳＡＭＬＭＡＧＬＤＧＩＫＮＫＩＥＰＱＡＰＶＤＫＤＬＹＥＬＰＰＥＥＡＡＳＩＰＱＴＰ
データベース配列：２４８８６９５  ＫＡＫＲＬＥＦＲＳＰＤＳＳＧＮＰＹＬＡＦＳＡＭＬＭＡＧＬＤＧＩＫＮＫＩＥＰＱＡＰＶＤＫＤＬＹＥＬＰＰＥＥＡＡＳＩＰＱＴＰ  ２４８８８７４
クエリー配列：４１９  ＴＱＬＳＤＶＩＤＲＬＥＡＤＨＥＹＬＴＥＧＧＶＦＴＮＤＬＩＥＴＷＩＳＦＫＲＥＮＥＩＥＰＶＮＩＲＰＨＰＹＥＦＡＬＹＹＤＶ  ４７６（配列番号１４）
ＴＱＬＳＤＶＩＤＲＬＥＡＤＨＥＹＬＴＥＧＧＶＦＴＮＤＬＩＥＴＷＩＳＦＫＲＥＮＥＩＥＰＶＮＩＲＰＨＰＹＥＦＡＬＹＹＤＶ（配列番号３９）
データベース配列：２４８８８７５  ＴＱＬＳＤＶＩＤＲＬＥＡＤＨＥＹＬＴＥＧＧＶＦＴＮＤＬＩＥＴＷＩＳＦＫＲＥＮＥＩＥＰＶＮＩＲＰＨＰＹＥＦＡＬＹＹＤＶ  ２４８９０４８（配列番号１５）
【０１８２】
Ｓａｎｇｅｒ  ＣｅｎｔｒｅのＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｍ＿ｂｏｖｉｓ）におけるヌクレオチド配列データに対してもＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＮクエリーを実施した。Ｓａｎｇｅｒ  ＣｅｎｔｒｅはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｐａｓｔｅｕｒの配列を決定中で、仮のＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧアセンブリーを使用した。結果は、ＢＣＧ  ＰａｓｔｅｕｒのｇｌｎＡ１ヌクレオチド配列はＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲｖのｇｌｎＡ１ヌクレオチド配列と同じであることを示す。
【０１８３】
ＢＬＡＳＴＮ結果：ＢＣＧ２６０ｃ１１．ｑ１ｋ  ３８９１ｂｐ、２３リード、３５．４２ＡＴ同一性＝１４３１／１４３７（９９％）、陽性＝１４３１／１４３７（９９％）、鎖＝−／＋
【化９】
2012501189.tif 000013
【化１０】
2012501189.tif 000014
【化１１】
2012501189.tif 000015
【０１８４】
ＴＢＬＡＳＴＮ結果：ＢＣＧ２６０ｃ１１．ｑ１ｋ  ３８９１ｂｐ、２３リード、３５．４２ＡＴ同一性＝４７６／４７８（９９％）、陽性＝４７６／４７８（９９％）、フレーム＝−１
クエリー配列：１  ＶＴＥＫＴＰＤＤＶＦＫＬＡＫＤＥＫＶＥＹＶＤＶＲＦＣＤＬＰＧＩＭＱＨＦＴＩＰＡＳＡＦＤＫＳＶＦＤＤＧＬＡＦ−ＧＳＳＩＲＧ  ５９
ＶＴＥＫＴＰＤＤＶＦＫＬＡＫＤＥＫＶＥＹＶＤＶＲＦＣＤＬＰＧＩＭＱＨＦＴＩＰＡＳＡＦＤＫＳＶＦＤＤＧＬＡＦＧＳＳＩＲＧ
データベース配列：１８１２  ＶＴＥＫＴＰＤＤＶＦＫＬＡＫＤＥＫＶＥＹＶＤＶＲＦＣＤＬＰＧＩＭＱＨＦＴＩＰＡＳＡＦＤＫＳＶＦＤＤＧＬＡＦＤＧＳＳＩＲＧ  １６３３
クエリー配列：６０  ＦＱＳＩＨＥＳＤＭＬＬＬＰＤＰＥＴＡＲＩＤＰＦＲＡＡＫＴＬＮＩＮＦＦＶＨＤＰＦＴＬＥＰＹＳＲＤＰＲＮＩＡＲＫＡＥＮＹＬＩ  １１９
ＦＱＳＩＨＥＳＤＭＬＬＬＰＤＰＥＴＡＲＩＤＰＦＲＡＡＫＴＬＮＩＮＦＦＶＨＤＰＦＴＬＥＰＹＳＲＤＰＲＮＩＡＲＫＡＥＮＹＬＩ
データベース配列：１６３２  ＦＱＳＩＨＥＳＤＭＬＬＬＰＤＰＥＴＡＲＩＤＰＦＲＡＡＫＴＬＮＩＮＦＦＶＨＤＰＦＴＬＥＰＹＳＲＤＰＲＮＩＡＲＫＡＥＮＹＬＩ  １４５３
クエリー配列：１２０  ＳＴＧＩＡＤＴＡＹＦＧＡＥＡＥＦＹＩＦＤＳＶＳＦＤＳＲＡＮＧＳＦＹＥＶＤＡＩＳＧＷＷＮＴＧＡＡＴＥＡＤＧＳＰＮＲＧＹＫＶ  １７９
ＳＴＧＩＡＤＴＡＹＦＧＡＥＡＥＦＹＩＦＤＳＶＳＦＤＳＲＡＮＧＳＦＹＥＶＤＡＩＳＧＷＷＮＴＧＡＡＴＥＡＤＧＳＰＮＲＧＹＫＶ
データベース配列：１４５２  ＳＴＧＩＡＤＴＡＹＦＧＡＥＡＥＦＹＩＦＤＳＶＳＦＤＳＲＡＮＧＳＦＹＥＶＤＡＩＳＧＷＷＮＴＧＡＡＴＥＡＤＧＳＰＮＲＧＹＫＶ  １２７３
クエリー配列：１８０  ＲＨＫＧＧＹＦＰＶＡＰＮＤＱＹＶＤＬＲＤＫＭＬＴＮＬＩＮＳＧＦＩＬＥＫＧＨＨＥＶＧＳＧＧＱＡＥＩＮＹＱＦＮＳＬＬＨＡＡＤ  ２３９
ＲＨＫＧＧＹＦＰＶＡＰＮＤＱＹＶＤＬＲＤＫＭＬＴＮＬＩＮＳＧＦＩＬＥＫＧＨＨＥＶＧＳＧＧＱＡＥＩＮＹＱＦＮＳＬＬＨＡＡＤ
データベース配列：１２７２  ＲＨＫＧＧＹＦＰＶＡＰＮＤＱＹＶＤＬＲＤＫＭＬＴＮＬＩＮＳＧＦＩＬＥＫＧＨＨＥＶＧＳＧＧＱＡＥＩＮＹＱＦＮＳＬＬＨＡＡＤ  １０９３
クエリー配列：２４０  ＤＭＱＬＹＫＹＩＩＫＮＴＡＷＱＮＧＫＴＶＴＦＭＰＫＰＬＦＧＤＮＧＳＧＭＨＣＨＱＳＬＷＫＤＧＡＰＬＭＹＤＥＴＧＹＡＧＬＳＤ  ２９９
ＤＭＱＬＹＫＹＩＩＫＮＴＡＷＱＮＧＫＴＶＴＦＭＰＫＰＬＦＧＤＮＧＳＧＭＨＣＨＱＳＬＷＫＤＧＡＰＬＭＹＤＥＴＧＹＡＧＬＳＤ
データベース配列：１０９２  ＤＭＱＬＹＫＹＩＩＫＮＴＡＷＱＮＧＫＴＶＴＦＭＰＫＰＬＦＧＤＮＧＳＧＭＨＣＨＱＳＬＷＫＤＧＡＰＬＭＹＤＥＴＧＹＡＧＬＳＤ  ９１３
クエリー配列：３００  ＴＡＲＨＹＩＧＧＬＬＨＨＡＰＳＬＬＡＦＴＮＰＴＶＮＳＹＫＲＬＶＰＧＹ−ＡＰＩＮＬＶＹＳＱＲＮＲＳＡＣＶＲＩＰＩＴＧＳＮＰ  ３５８
ＴＡＲＨＹＩＧＧＬＬＨＨＡＰＳＬＬＡＦＴＮＰＴＶＮＳＹＫＲＬＶＰＧＹ−ＡＰＩＮＬＶＹＳＱＲＮＲＳＡＣＶＲＩＰＩＴＧＳＮＰ
データベース配列：９１２  ＴＡＲＨＹＩＧＧＬＬＨＨＡＰＳＬＬＡＦＴＮＰＴＶＮＳＹＫＲＬＶＰＧＹＥＡＰＩＮＬＶＹＳＱＲＮＲＳＡＣＶＲＩＰＩＴＧＳＮＰ  ７３３
クエリー配列：３５９  ＫＡＫＲＬＥＦＲＳＰＤＳＳＧＮＰＹＬＡＦＳＡＭＬＭＡＧＬＤＧＩＫＮＫＩＥＰＱＡＰＶＤＫＤＬＹＥＬＰＰＥＥＡＡＳＩＰＱＴＰ  ４１８
ＫＡＫＲＬＥＦＲＳＰＤＳＳＧＮＰＹＬＡＦＳＡＭＬＭＡＧＬＤＧＩＫＮＫＩＥＰＱＡＰＶＤＫＤＬＹＥＬＰＰＥＥＡＡＳＩＰＱＴＰ
データベース配列：７３２  ＫＡＫＲＬＥＦＲＳＰＤＳＳＧＮＰＹＬＡＦＳＡＭＬＭＡＧＬＤＧＩＫＮＫＩＥＰＱＡＰＶＤＫＤＬＹＥＬＰＰＥＥＡＡＳＩＰＱＴＰ  ５５３
クエリー配列：４１９  ＴＱＬＳＤＶＩＤＲＬＥＡＤＨＥＹＬＴＥＧＧＶＦＴＮＤＬＩＥＴＷＩＳＦＫＲＥＮＥＩＥＰＶＮＩＲＰＨＰＹＥＦＡＬＹＹＤＶ  ４７６（配列番号１８）
ＴＱＬＳＤＶＩＤＲＬＥＡＤＨＥＹＬＴＥＧＧＶＦＴＮＤＬＩＥＴＷＩＳＦＫＲＥＮＥＩＥＰＶＮＩＲＰＨＰＹＥＦＡＬＹＹＤＶ（配列番号１９）
データベース配列：５５２  ＴＱＬＳＤＶＩＤＲＬＥＡＤＨＥＹＬＴＥＧＧＶＦＴＮＤＬＩＥＴＷＩＳＦＫＲＥＮＥＩＥＰＶＮＩＲＰＨＰＹＥＦＡＬＹＹＤＶ  ３７９（配列番号２０）
【０１８５】
次に、それ自体のプロモーター領域を含む変異体ｇｌｎＡ１対立遺伝子を、ｐＨＶ２０３中のｓｐｅＩ部位に連結させてｐＨＶ２０３−ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５を得、また、染色体組込み型ベクターｐＭＰ３９９およびプラスミドベクターｐＭＰ３４９プロモーターにも連結させてｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（配列番号３１）およびｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（配列番号２６）を得た（表１）。このｐＨＶ２０３−ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（配列番号２８）プラスミドマップを図１９に示す。ｐＨＶ２０３−ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５プラスミドを３Ｄ−ＢＣＧワクチン内に電気穿孔して４Ｄ−ＢＣＧワクチンを得た。ベクターｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５を使用してＢＣＧ中の変異体ｇｌｎＡ１を発現させ、ＧＬＡＤ−ＢＣＧ（染色体発現）を作製した。それはプロアポトーシスＢＣＧの１代目、および２代目、および３代目変異体に添加して、それぞれ、２代目、３代目、および４代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンを得ることもできる。これらのベクターは、ＢＣＧならびに１代目、２代目、および３代目プロアポトーシスＢＣＧワクチン内に誘導して、それぞれ、１代目、２代目、３代目、および４代目ワクチンを得ることができる。
【０１８６】
同一ベクター上の変異体ｓｏｄＡ対立遺伝子および変異体ｇｌｎＡ１対立遺伝子を併合した、さらなるプラスミドおよび染色体組込み型ベクターを組み立てた。これらには、ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６  ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（図２０）、ｐＭＰ３９９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４  ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５、ｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＨ２８ΔＨ７６  ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５（図２０）、およびｐＭＰ３４９−ｍｕｔ  ＳｏｄＡΔＥ５４  ｍｕｔ  ｇｌｎＡ１ΔＤ５４ΔＥ３３５が挙げられる（表１）。これらのベクターをＢＣＧならびに１代目および２代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンに誘導し、それぞれ、２代目、３代目、および４代目ワクチンを得た。
【０１８７】
（実施例９）
プロアポトーシスＢＣＧによる外因性抗原の発現。
上記のプロアポトーシスＢＣＧワクチンを使用して外因性抗原（他の感染物質および癌抗原由来の抗原を含む）を発現することができる。
【０１８８】
組換えＢｒｕｃｅｌｌａルマジンシンターゼ、つまりＢｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓの免疫優性Ｔ細胞抗原がＤＤ−ＢＣＧにより発現しているＤＤ−ＢＣＧｒＢＬＳを構築した。このｂｌｓ遺伝子をｐＭＰ３４９中のａｃｅＡ（ｉｃｌ）プロモーターの後ろに連結させ、ｐＭＰ３４９−ｒＢＬＳ（配列番号３８）を産生した（表１）。このプラスミドをＤＤ−ＢＣＧ中に電気穿孔してＤＤ−ＢＣＧｒＢＬＳを得た。ＤＤ−ＢＣＧｒＢＬＳによるｒＢＬＳ発現を図２１に示す。それはアポトーシス関連クロスプライミング経路を介して抗原提示を高めるＢＣＧまたは１代目、２代目、３代目もしくは４代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンに添加できる。
【０１８９】
これらの結果により、外来抗原はプロアポトーシスＢＣＧ中で発現し得ることが示される。この能力により、抗原提示のアポトーシス関連クロスプライミング経路に接触するためのビヒクルとしてプロアポトーシス性細胞内細菌を用いて強力なＴ細胞応答を誘発するワクチンの新規世代の構築できる。このようにして、外因性抗原を樹状細胞に送達して強力なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発することができる。例えば、組換えＢｒｕｃｅｌｌａ抗原を発現する本明細書に示したＤＤ−ＢＣＧｒＢＬＳ株または他のプロアポトーシス性細胞内細菌ワクチンを使用して、ウシまたは他の哺乳類宿主を免疫化できる。この技術を使用して、ウシにおいてウシ結核とブルセラ症を同時に予防し得る。
【０１９０】
異なる種間のコドン使用頻度の差異のため、マイコバクテリア中の発現のために外来遺伝子においてコドンを最適化することが助けとなる。これは、部位特異的変異誘発を用いて遺伝子を改変するか、マイコバクテリアのコドン使用頻度の嗜好に従う合成遺伝子を構築するかのいずれかにより日常的に行うことができる。かかる改変は当業者にとって周知である。
【０１９１】
（実施例１０）
チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、およびグルタレドキシンの対立遺伝子の不活性化を含むｓｉｇＨ欠失の代替物。
ｓｉｇＨの不活性化は、複数の微生物因子の産生に影響を与え、これらのいくつかは宿主免疫応答の重要な標的である。しかしながら、ｓｉｇＨ欠失変異体により発現した低値のｓｉｇＨ調節タンパク質はこれらのタンパク質に対して強力なＴ細胞応答を誘発するのに十分であることが現在のデータにより示される。しかしながら、結核予防の誘発に使用されたプロアポトーシスＢＣＧワクチンのためのｓｉｇＨ不活性化の代替物として、ストレス関連プロテオームに対する効果を最小限にするようにｓｉｇＨを制御下、主要な抗アポトーシス酵素の活性を直接低下させる利点がある。プロアポトーシスＢＣＧワクチンが主に他の感染物質または癌抗原由来の外因性抗原を発現するために使用される状況下では、ｓｉｇＨ欠失は好ましく、複数の抗アポトーシス性抗酸化物の産生を減少するための機序を提供する。
【０１９２】
チオレドキシン（ｔｒｘＣ、また、ｔｒｘ、ＭＰＴ４６とも言う）とチオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ２、また、ｔｒｘｒとも言う）は、酸化ストレスに対する細菌反応の顕著な部分であるｓｉｇＨ調節遺伝子である。それらはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ＢＣＧ染色体上で互いに隣接して位置する（ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔウェブサーバーの完全ゲノム配列につき、Ｈ３７Ｒｖ染色体の塩基４，４０４，７２８〜４，４０２，７３５のｔｒｘＢ２および４，４０２，７３２〜４，４０３，０８２のｔｒｘＣ）。ｔｒｘＢ２とｔｒｘＣの両方を同時にノックアウトするファスミドベースのベクター（ｐＹＵＢ８５４−ｔｒｘ−ｔｒｘｒ）（配列番号３５）が構築されており、この配列データを表１に提示する。このベクターのマップおよび特性を図２２に示す。ｐＹＵＢ８５４−ｔｒｘ−ｔｒｘｒをＢＣＧ内に電気穿孔してＢＣＧΔｔｒｘΔｔｒｘｒを構築できる。それは１代目、２代目、および３代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンをそれぞれ２代目、３代目、および４代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンに修飾するためにも使用できる。
【０１９３】
ＴＲＸ−ＴＲＸＲ−ＢＣＧ（ＢＣＧΔｔｒｘＣΔｔｒｘＢ２）を構築するための代替戦略は、上に記載および参照された自殺プラスミドベクターの使用を含み、これの使用は当業者間で周知である。プラスミドベース系の１つの潜在的な利点は、対立遺伝子が抗生物質耐性決定因子によって遮断されているのではなく不活性変異体によって置換されている非標識欠失を成し遂げることがより容易である点である。チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、および多くの他の酸化還元修復酵素の活性部位は、酸化された時にジスルフィド架橋を形成する活性システインを含む。「チオレドキシン活性部位モチーフ」はＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃ配列であり、式中ＣはシステインおよびＸは任意のアミノ酸である。この特徴は、酸化還元活性酵素の活性部位を同定すること日常的なものにする。次いでこの遺伝子を変異または合成して活性部位を除去することができる。
【０１９４】
チオレドキシンおよびチオレドキシン還元酵素の下記のアミノ酸配列は、ＣＸＸＣモチーフを太字で、それぞれ残基３７〜４０および１４５〜１４８を示す：
＞Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ｜Ｒｖ３９１４｜ＴｒｘＣ：  １１６  ａａ  −  ＴＨＩＯＲＥＤＯＸＩＮ  ＴＲＸＣ  （ＴＲＸ）  （ＭＰＴ４６）
【化１２】
2012501189.tif 000016
＞Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ｜Ｒｖ３９１３｜ＴｒｘＢ２：  ３３５  ａａ  −  ＰＲＯＢＡＢＬＥ  ＴＨＩＯＲＥＤＯＸＩＮ  ＲＥＤＵＣＴＡＳＥ  ＴＲＸＢ２  （ＴＲＸＲ）  （ＴＲ）
【化１３】
2012501189.tif 000017
【０１９５】
重複プライマーが関与するＰＣＲベースの遺伝子変異生成技術を用いて、不活性変異体をコードする遺伝子を構築した。ｔｒｘＣ対立遺伝子は「ＷＣＧＰＣＫ」活性部位を欠いた不活性チオレドキシン変異体をコードし、ｔｒｘＢ２対立遺伝子は「ＳＣＡＴＣＤ」活性部位を欠いた不活性チオレドキシン還元酵素配列をコードする。「非標識化」を誘発するために、Ｐａｒｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒに記載されているｐ２ＮＩＬ−ｐＧＯＡＬ１９対立遺伝子の不活性化ベクター系にこれらの変異体対立遺伝子を組み込み（すなわち、最終構築物は抗生物質耐性遺伝子を欠く）、ｐ２ＮＩＬ／ＧＯＡＬ１９−ｍｕｔ  ｔｒｘＣ−ｍｕｔ  ｔｒｘＢ２（配列番号３７）を産生した（図２３および表１）。残存する抗生物質耐性を残さず、チオレドキシン活性部位を不活性化するベクター（ｔｒｘＣ、また、ｔｒｘとも言う）およびチオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ２、また、ｔｒｘｒとも言う）。それはＢＣＧ中に電気穿孔してＢＣＧΔｔｒｘΔｔｒｘｒを構築することができる。それは１代目、２代目、および３代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンをそれぞれ２代目、３代目、および４代目プロアポトーシスＢＣＧワクチンに修飾するためにも使用できる。
【０１９６】
この戦略は他のｓｉｇＨ調節遺伝子に適用もできる。例えば、ＲＶ２４６６ｃはｓｉｇＨ調節され、グルタレドキシン相同体であり、およびＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフを有する：
＞Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ｜Ｒｖ２４６６ｃ｜Ｒｖ２４６６ｃ：  ２０７  ａａ  −
【化１４】
2012501189.tif 000018
【０１９７】
（実施例１１）
ＢＣＧによる抗アポトーシス性微生物酵素の産生をさらに減らすためのシグマ因子Ｅ（ｓｉｇＥ）の欠失。
上記のとおり、他のシグマ因子がストレス刺激反応に重要な微生物因子の産生を調節する。Ｓｉｇｍａ因子Ｅ（ｓｉｇＥ）はＳｏｄＡおよびｇｌｎＡ１の産生において効果を有することが示されている。従って、ｓｉｇＥの不活性化は上記の他の欠陥に類似した微生物抗アポトーシス酵素の産生における欠陥を誘発し、従ってより強力なプロアポトーシスＢＣＧ株を作製するために単独または他の変異と併用して使用できる。
【０１９８】
ｓｉｇＥを不活性化するファスミドベースのベクター（ｐＹＵＢ８５４−ｓｉｇＥ）（配列番号３６）が構築されている。この配列データを表１に提示する。このベクターのマップおよび特性を図２４に示す。
【０１９９】
（実施例１２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける４Ｄ−ＢＣＧにより低下したグルタミンシンターゼ活性の考証。
全細菌のグルタミンシンテターゼ活性に対する変異体ΔＤ５５ΔＥ３３５  ＧｌｎＡ１発現効果を決定するため、変異体ΔＤ５５ΔＥ３３５  ＧｌｎＡ１のプラスミドまたは染色体発現のいずれかに関連するＤＤ−ＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧおよび２形態の４Ｄ−ＢＣＧの溶解物を調製し、グルタミンシンテターゼ活性を比較した。Ｗｏｏｌｆｏｌｋ  ｅｔ  ａｌにより記載されている移行反応を用いて、吸光度５４０ｎｍでγ−グルタミン酸ヒドロキサメートの形成を検出するモニタリングにより活性アッセイを実施した。結果を図２５に示す。これは、ドミナントネガティブ戦略はグルタミンシンターゼ活性を４〜８倍低下することを示す。
【０２００】
（実施例１３）
ＤＤ−ＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧ接種マウス由来の脾細胞は、親ＢＣＧ株接種マウスと比較して高まったＩＬ−２産生を示す。
選択したプロアポトーシスＢＣＧ（ｐａＢＣＧ）ワクチンおよび親ＢＣＧ  Ｔｉｃｅワクチン株に対する免疫応答を検討するため、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいてＩＶワクチン接種モデルを使用した。それは単用量として約５×１０５ｃｆｕのワクチン株を投与することを含んだ。脾臓を採集し、脾細胞を一晩、細菌抗原提示を促進するためにＩＦＮ−γで刺激されているこれらのマウス株由来の非感染性またはＢＣＧ感染骨髄生成マクロファージ（ＢＭＤＭ）上で再刺激する。従って、これは、リンパ細胞が接種マウスから採集されてから、ｉｎ  ｖｉｖｏ感染との多く類似するｉｎ  ｖｉｔｒｏのマクロファージ感染モデルに対する反応におけるサイトカイン作製能を試験する非常に生理的なアッセイである。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８表面抗体、ならびに抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ２および抗ＴＮＦ−α細胞内抗体で実施する。次いで標本をＦＡＣＳａｒｉａ選別機上で分析する。ＢＣＧ感染ＢＭＤＭ上で一晩再刺激した脾細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、および時折のＴＮＦ−α産生を、非感染ＢＭＤＭ上で一晩インキュベートしたサイトカイン産生と比較して、ＢＣＧ抗原特異的反応を決定する。
【０２０１】
免疫応答を決定するため、ＢＣＧ、ＤＤ−ＢＣＧ、３Ｄ−ＢＣＧ、および４Ｄ−ＢＣＧを比較する複数の実験を実施した（図２６）。ＢＣＧおよびＤＤ−ＢＣＧでワクチン接種後、持続したサイトカイン産生を観察した。ワクチン接種後７０日目に抗原刺激に応答して、マウス脾臓中の約０．７％のＣＤ４  Ｔ細胞がＩＦＮ−γを産生できた。ワクチン接種後２５９日目、０．３０％および０．２７％の脾臓ＣＤ４細胞は依然としてそれぞれＢＣＧおよびＤＤ−ＢＣＧワクチン中でＩＦＮ−γを作製した。これらの結果はＣ５７Ｂｌ／６マウス脾臓中のＢＣＧとＤＤ−ＢＣＧの両方の長期生存と相関し、その「ＢＣＧ感受性」が周知である菌株は変異体Ｎｒａｍｐ１遺伝子座に関連した。
【０２０２】
特異的サイトカインの産生における差異も認められた。ＢＣＧ接種マウスは優勢なＩＦＮ−γ反応を示し、ＢＣＧ接種マウスにおけるＩＬ−２産生はこのアッセイにおける天然の変動度（すなわち、斜線部分で指定の、リン酸緩衝生理食塩水接種マウス［偽接種対照］において観察されたＩＬ−２値範囲）を確実には超えなかった。ＢＣＧ接種マウスにおけるＩＬ−２産生を観察時、ＩＬ−２は低値であり、４週目の主なＴ細胞応答のピーク時近傍で検出された。対照的に、ＤＤ−ＢＣＧ接種マウスではＢＣＧ接種マウスと比較してＩＦＮ−γ産生ＣＤ４細胞は少ないが、ＩＬ−２産生細胞は多かった。ＩＬ−２産生ＣＤ４＋Ｔ細胞％はおおよそ、評価下のｐａＢＣＧワクチン「世代」と相関し、ＩＬ−２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘発は４Ｄ−ＢＣＧ＞３Ｄ−ＢＣＧ＞ＤＤ−ＢＣＧ＞ＢＣＧで多かった（図２６Ａ、下パネル）。これらの結果から、プロアポトーシス性修飾はさらなる効果を有し、併合時に主なワクチン接種中のＩＬ−２産生の段階的上昇を生むことが示される。
【０２０３】
同一脾臓におけるＩＦＮ−γ産生ＣＤ４細胞のＩＬ−２産生ＣＤ４細胞に対する比率はＢＣＧおよびｐａＢＣＧワクチンレシピエントで、それぞれ典型的に平均約１０：１および３：１であった（図２６Ｂ、非感染ＢＭＤＭからのＩＬ−２＋バックグラウンド値が差し引かれている）。下記に示す他の差異と併せて、この観察により、ＢＣＧに誘発された免疫応答と比較してｐａＢＣＧワクチンにより誘発された免疫応答は定性的に向上することが示される。
【０２０４】
サイトカイン産生の差異は、主なＴ細胞応答のピーク近傍で結果を比較することによって最も良く例示される。図２７は、ＢＣＧ、ＤＤ−ＢＣＧ、および３Ｄ−ＢＣＧとの比較実験におけるワクチン接種後２５日目および３１日目の結果を示す。ＣＤ４  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生における差異（ＢＣＧ＞＞ＤＤ−ＢＣＧ＞３Ｄ−ＢＣＧ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２産生における差異（３Ｄ−ＢＣＧ＞＞ＤＤ−ＢＣＧ＞ＢＣＧ）に加えて、この結果は、２５日目の３Ｄ−ＢＣＧ接種マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞により増大したＩＦＮ−γ産生も示す（．３０％）。ＣＤ４とＣＤ８のＩＦＮ−γ産生細胞パーセンテージは同一であったが、これらのマウスでは循環ＣＤ８細胞数がより多く、従って絶対的には、２５日目におけるＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞数はＣＤ４  ＩＦＮ−γ＋細胞数より多かった。ＤＤ−ＢＣＧ対３Ｄ−ＢＣＧに関連した値の差異もやはり、各プロアポトーシス性修飾がＢＣＧの免疫原性向上においてさらなる効果を有することを示す。
【０２０５】
要約すると、最初のワクチン接種中のｐａＢＣＧワクチンにより誘発されたＴ細胞エフェクターサイトカインのパターンはＢＣＧにより誘発されたＴ細胞エフェクターサイトカインのパターンとは異なる。下で示すように、ワクチン接種投与実験との関連で実施したさらなる免疫学試験において、最初のワクチン接種中のこれらの差異は、接種宿主が感染に対して迅速に反応することを可能にする記憶反応の発現を促進する。主なＴ細胞応答の収縮相中のＩＬ−２の存在は抗原特異的Ｔ細胞、特に記憶Ｔ細胞の生存を高めるため、ｐａＢＣＧワクチン株によるＩＬ−２産生の大きな誘発はＴ細胞増殖を促進する。
【０２０６】
（実施例１４）
先にＢＣＧ接種したマウスと比較して先に３Ｄ−ＢＣＧ接種したマウスの気管内投与後の高まったリコールＴ細胞応答。
ワクチン接種の目的は、免疫化した宿主において、感染物質を指向とし感染に対して活発に反応できる記憶リンパ細胞集団を生成することである。リコールＴ細胞応答の反応速度および規模を決定するため、マウスに５×１０５ｃｆｕのＢＣＧまたは３Ｄ−ＢＣＧを皮下接種した。対照マウスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で偽接種した。ワクチン接種から３０日後、マウスを抗生物質で処置して残存する任意のワクチン桿菌を根絶した。予備データでは、３Ｄ−ＢＣＧおよび４Ｄ−ＢＣＧワクチンは適応的免疫応答が発現する際になくなることを示すが、ＢＣＧはＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて無期限に、脾臓においてｓｕｂＱワクチン接種後少なくとも５ヶ月間残存することを示す。従って、残存ＢＣＧによる干渉を避けるため、ワクチン接種後１ヶ月目、全マウスにおいて飲料水中のイソニアジドおよびリファムピンによる処置を開始することによりワクチン株を除去した。これは脾臓のＢＣＧ数を検出下限未満まで減少させる上で効果的であることを見出した。処置の１ヶ月および休薬の追加４週間後、マウスにＢＣＧ  ４×１０７ｃｆｕを気管内投与した（初回ワクチン株を問わず、マウス全群）。投与前のベースライン（０日目）のサイトカイン＋Ｔ細胞数は低値であった。投与後５日目、これらのマウスを安楽死し、肺を採集してＴ細胞応答を決定した。結果を図２８に示す。これは、３Ｄ−ＢＣＧ接種マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答はＢＣＧ接種マウスと比較してはるかに強力であることを示す。３Ｄ−ＢＣＧ接種マウス由来のＩＬ−２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞％はＢＣＧ接種マウス由来の１０倍高く、最初のワクチン接種中に見られたより多いＩＬ−２産生を再現する（図２６および２７）。この実験に使用された投与用量はＴＢ感染のための高／非生理的であるが、この設計は、相対的に高い抗原負荷条件下で続発性Ｔ細胞応答の迅速性を評価することを可能にする。従って、この結果は、接種直後に高滴定量に上昇できる感染物質抗原（例えば、ウイルス病原体、マラリア）を送達するためのｐａＢＣＧのベクター機能を支持する。
【０２０７】
要約すると、３Ｄ−ＢＣＧ接種マウスの投与後に観察された続発性Ｔ細胞応答は、ＢＣＧ接種マウスに観察された続発性Ｔ細胞応答より強力である。この結果は、続発性（リコール）反応中に投与に迅速に反応し得る記憶Ｔ細胞集団の誘発においてｐａＢＣＧはＢＣＧよりも優れていることを示す。現在のＢＣＧワクチンよりも高い結核予防を誘発する能力と高い弱毒化とを併合し、免疫学試験は他の重要な感染疾患に対する外因性抗原を送達するため、および癌を標的とするためのプラットフォーム技術としてのｐａＢＣＧの使用を強調する。
【０２０８】
（実施例１５）
ｐａＢＣＧは好中球およびＮＫ細胞の動員および活性化を高める
本発明は、反復投与中にリコールされ得る強力な抗原特異的適応的Ｔ細胞応答を誘発する能力により、結核に対して非常に効果的なワクチンを提供する。強力な適応的免疫の発現は、細菌を殺してそれらの抗原を提示するための先天性免疫応答の鍵細胞の動員および活性化を含む効果的な初期の宿主反応を必要とする。ＢＣＧおよびｐａＢＣＧ（３ｄＢＣＧ）への先天性免疫応答を検討するため、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを静脈内に１．５×１０７ＣＦＵ接種し、脾臓組織上で７２時間後に遺伝子マイクロアレイを実施した（ワクチン接種群につきマウス６匹、およびさらにリン酸緩衝生理食塩水を接種した対照マウス６匹）。
【０２０９】
下表は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘを用いた決定により、脾臓での発現がＢＣＧ接種マウスと比較して、３ｄＢＣＧ接種マウスにおいて異なることが示された選択された遺伝子を示す。一般に、異なるプライマーセットの結果は、（特定プライマーにより評価された）非常に低い遺伝子発現状況を除いて一致度が高かった。ワクチン接種群の遺伝子発現間の関係は比率とチップトゥチップ比較として表示される。遺伝子は機能に基づき分類され、いくつかの主題が認められる。簡単に述べると、これらの主題は下記のとおりである。
１．ＢＣＧ接種マウスよりも３ｄＢＣＧ接種マウスにおける高い記憶免疫性に関連したサイトカインおよびインターロイキン（ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１８を含む）の発現。
２．ＢＣＧ接種マウスよりも３ｄＢＣＧ接種マウスにおけるマクロファージおよび樹状細胞の高い活性化および抗原提示に関連した遺伝子の発現（ＣＩＩＴＡ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１ｄ１、ＣＤ８０、およびＣＤ２８を含む）。
３．ＢＣＧ接種マウスよりも３ｄＢＣＧ接種マウスにおける好中球（カテプシンＧ、カテリシジン、ミエロペルオキシダーゼ、およびリポカリン２を含む）およびＮＫ細胞を含む細胞傷害性リンパ細胞（Ｌｙ４９ファミリーのパーフォリン、ＣＣＬ５、ＮＫ１．１、ＳＬＡＭファミリー受容体、およびキラー細胞レクチン様受容体を含む）の高い動員および／または活性化。
４．ＢＣＧ接種マウスよりも３ｄＢＣＧ接種マウスにおいて減少したトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の発現。
【０２１０】
（１）と（２）はワクチンの有効性を明らかに示唆するが、一方、癌に対する免疫療法としてのＢＣＧの抗腫瘍効果は先天性免疫細胞を動員および活性化する能力から引き出されるため、（３）も魅力的である。観察（４）は驚くべきことだが、以下に論じる重要な意義を有する。
【０２１１】
それは免疫治療の組成物として、およびＢＣＧによる抗アポトーシス酵素の産生が減少する際の、その改善された結果が、高い初回先天性宿主反応の存在（すなわち、宿主細胞のアポトーシスとの炎症細胞の多い急速な浸潤）によるものである、ワクチンアジュバントとしても効果的である。さらに、直接的な殺腫瘍性効果を示す先天性免疫細胞タイプ（例えば、好中球および天然キラー細胞）の動員および活性化においてｐａＢＣＧはＢＣＧよりも優れている。ｐａＢＣＧに対する先天性反応は、投与／ワクチン接種後の最初の数日間におけるＮＫおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞からの顆粒の非特異的活性化および放出を含む。また、次いで腫瘍抗原を提示して強力な適応的Ｔ細胞応答を誘発することができるマクロファージおよび樹状細胞の動員および活性化に優れている。
【表２−１】
2012501189.tif 000019
【表２−２】
2012501189.tif 000020
【表２−３】
2012501189.tif 000021
【表２−４】
2012501189.tif 000022
【表２−５】
2012501189.tif 000023
【０２１２】
選択された遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによりさらに分析した（図２９）。この結果により、親ＢＣＧ  Ｔｉｃｅワクチンのレシピエントと比較してｐａＢＣＧワクチン３ｄＢＣＧのレシピエントにおける抗腫瘍サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−２１の高い発現が示された。一般に、マウス全群を含むプールした標本によるマイクロアレイを用いて決定した結果は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて個々の標本上で決定した結果を高度に予測する。
【０２１３】
注目すべきは、親ＢＣＧワクチンのレシピエントにおけるトランスフェリン受容体の増大した発現の結果としてのマクロファージの鉄過剰負荷は（図２９）、全身の免疫抑制効果を誘発できる。なぜなら、これらの細胞はサイトカイン産生能およびサイトカイン応答能が低いためである。これは上記（１）および（２）に要約した差異を部分的に説明し得る。
【０２１４】
（実施例１６）
膀胱癌を治療するためのｐａＢＣＧの使用
Ｉｎ  Ｓｉｔｕ膀胱癌のための膀胱内使用。
ｐａＢＣＧの膀胱内点滴は下記の状況における膀胱ｉｎ−ｓｉｔｕ癌（ＣＩＳ）治療に指定されている：
１．関連した乳頭腫瘍を併発する、または併発していない膀胱ＣＩＳの一次治療（経尿管切除後）。
２．他の膀胱内薬剤で治療し、再発したまたは無効であった患者における膀胱ＣＩＳの二次治療。
３．  根治手術が禁忌である患者におけるＣＩＳの一次または二次治療。
【０２１５】
ＴａＴｌ膀胱癌のための膀胱内使用。
ｐａＢＣＧの膀胱内点滴は、再発リスクの高い膀胱の病期ＴａまたはＴｌ乳頭腫瘍の経尿管切除後アジュバント治療に指定されている。
【０２１６】
投与量形態、投与経路、および推奨投与量
ｐａＢＣＧは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓのＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）の弱毒性生培養調製物のプロアポトーシス性修飾を含む。ｐａＢＣＧ製剤は本明細書および（米国特許第２００４０１０９８７５号）に記載されている。
【０２１７】
ｐａＢＣＧ生物が増殖する凍結乾燥塊の調製用の培地は以下からなる：グリセリン、アスパラギン、クエン酸、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、およびクエン酸鉄アンモニウム。凍結乾燥前の最終調製物はラクトースも含む。防腐剤は添加しない。
【０２１８】
ｐａＢＣＧは凍結乾燥粉末剤として、バイアル１本の入った１つの箱で供給される。各バイアルは、基本的に５０ｍｇ（湿重量）相当である１〜８×１０８コロニー形成単位を含む。ＣＩＳの膀胱内治療および乳頭腫瘍の再発予防法のための用量は、防腐剤を含まない生理食塩水５０ｍｌ中で懸濁したｐａＢＣＧの１バイアルからなる。
【０２１９】
ＢＣＧ懸濁液を調製するため、滅菌防腐剤を含まない生理食塩水１ｍｌ（０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ）を小さなシリンジ中に入れてから、ｐａＢＣＧの１バイアルに添加する。穏やかに混合後、ｐａＢＣＧ懸濁液を、このシリンジから生理食塩水希釈液４９ｍｌを含む別のシリンジまたは５０ｍｌ点滴用生理食塩水プラスチックバックのいずれかに分配する。懸濁ｐａＢＣＧは調製直後に使用でき、２時間後に廃棄する。
【０２２０】
ｐａＢＣＧは膀胱生検後７〜１４日に投与する。患者は治療前４時間に液体を摂取せず、ｐａＢＣＧ投与前の膀胱を空にする。再構築したｐａＢＣＧを、カテーテルを用いて重力流により膀胱内に設置する。ｐａＢＣＧを膀胱内に２時間保持してから排泄する。ｐａＢＣＧを膀胱内に保持中、１５分毎に患者を左側から右側、背面側から腹部側に位置を変えて、薬に対する表面曝露を最大化する。
【０２２１】
ｐａＢＣＧの標準治療スケジュールは週１回で、６週間の小胞内点滴からなる。このスケジュールは、腫瘍寛解が得られず、臨床状況が保証される場合に１回反復できる。その後、ｐａＢＣＧ投与を６〜１２ヶ月間隔で継続できる。
【０２２２】
（実施例１７）
黒色腫を治療するためのｐａＢＣＧの使用。
適格性
病巣内ｐａＢＣＧは、通常、より毒性の全身療法の代わりに、局所的アプローチが効果的な一時的緩和と偶発的治癒を提供できる局所（ｌｏｃａｌ）または局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）転移疾患に対して考慮される。かかる患者の一般状態は良好である（ＥＣＯＧ≦３）。大きな病巣（＞２ｃｍ）が奏効する可能性は低い。この治療は数日または数週間にわたり多くの皮膚病巣が見られる急速に進行する疾患に対しては有効である可能性は低い。
【０２２３】
調製
ｐａＢＣＧは１．５ｍｇの凍結乾燥粉末剤および生理食塩水１．５ｍｌを含むさらなる希釈用バイアルとして供給する。低用量には、防腐剤を含まない生理食塩水の別の供給を必要とする。
【０２２４】
容積の条件により、低用量（０．００５〜０．０５ｍｇ）には二重希釈を必要とする。小さな希釈用バイアルを使用して、添付文書の指示どおりに初回希釈を行い、１ｍｇ／ｍＬの濃度にする。二重希釈を行うためには、防腐剤を含まない生理食塩水０．９ｍｌを空になった小さな希釈用バイアル中に導入する。次いでこれに初回希釈物０．１ｍｌを添加して最終二重希釈濃度０．１ｍｇ／ｍＬとする。次いで０．００５、０．０１、０．０２および０．０４ｍｇの用量をそれぞれ０．０５、０．１、０．２および０．４ｍｌ溶液で送達できる。高用量（０．１ｍｇから開始）は、凍結乾燥ＢＣＧに添加する希釈液の適切な調節により単回希釈のみで送達できる。これを下表に要約する。
【表３】
2012501189.tif 000024
【０２２５】
病巣内投与：
ｐａＢＣＧを２５測定針付きツベルクリンシリンジで送達する。小さな病巣の中心または大きな病巣の複数箇所に注射する。皮内病巣は直接注射した液体を保持しない。そのような場合は、針を病巣から若干遠くに挿入して深端から中心部に進ませる方が良い。
【０２２６】
偶発的アレルギー性反応（下記を参照されたい）を考慮するため、５０ｍｇのジフェンヒドラミン（ＢＥＮＡＤＲＹＬ（登録商標））を筋肉内投与して３０分後に０．００５ｍｇの初回用量を投与する。抗ヒスタミンは定期的に継続用量で反復しないが、各注射後３０分間、患者の観察を続ける。
【０２２７】
漸増は、通常、「低」用量と「高」用量について上に詳述した連続である。いずれの場合にも、漸増は用量間で約２倍の変化である。局所炎症反応または全身症状を引き起こす用量を決定するまで週１回の注射の漸増を継続する。さらに、２つの用量を同用量で隔週注射し、次いで毎月注射することができる。局所または全身反応の有意な増大により、減量が指示され得る。総用量は、２つ以上が治療されているいくつかの病巣間で分割できる。
【０２２８】
４〜６週間、応答が明らかでない場合がある。その後、疾患進行の明らかな証拠によりｐａＢＣＧの使用を再検討する。
【０２２９】
ＣＴガイダンス下で、他の任意の固形腫瘍において同一または類似したアプローチを取ることができる。すなわち、現在の介入的放射線技術により、他の固形腫瘍、例えば肺癌、腎臓癌、または肝転移に対してｐａＢＣＧを投与することができる。
【０２３０】
原発腫瘍または転移病巣を先に外科的切除した場合、ｐａＢＣＧを除去した腫瘍部位またはその隣接部に投与することができる。これは腫瘍細胞が拡大する可能性があったリンパ管およびリンパ節へのｐａＢＣＧの送達を促進するために行われる。
【０２３１】
（実施例１８）
癌ワクチン活性を高めるためのアジュバントとしての修飾ＢＣＧの使用。
本プロトコールはｐａＢＣＧ生物と癌ワクチンとの混合を必要とする。例えば、治療される患者は、約１０７の生存可能な照射自己由来腫瘍細胞および１０７の生存可能な新鮮凍結ｐａＢＣＧ生物を２週間週１回皮内接種される。このプロトコールの例として、結腸癌を治療するためにＢＣＧを実施する。
【０２３２】
（実施例１９）
殺した腫瘍細胞ワクチンの活性を高めるアジュバントとしての修飾ＢＣＧの使用。
自己由来癌細胞を患者から採集し、放射線により治療して（殺して）再導入時の転移疾患の拡大を予防する。殺した自己由来腫瘍細胞をｐａＢＣＧと混合し、皮内注射により投与する（例えば、実施例１８との関連で引用されたプロトコール）。このプロトコールの例として、結腸癌を治療するためにＢＣＧを実施する。ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３  （２００５）  ２３７９−２３８７を参照されたい。
【０２３３】
自己由来黒色腫細胞またはＢＣＧと混合したＭＶＡＸを含む黒色腫ワクチンはＡＶＡＸにより施行中の試験であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃａｌｎｅｗｓｔｏｄａｙ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／９１４４２．ｐｈｐに記載されている。そこに記載されているプロトコールはｐａＢＣＧを用いた本明細書の方法に適している。
【０２３４】
（実施例２０）
潜在性ＴＢ感染から活性肺ＴＢへの変換を予防するため、または活性肺ＴＢにおける肺損傷量を減らすため、または他のマイコバクテリウム種により引き起こされる肺感染における肺線維症を減らすためのＳｏｄＡに対する抗血清生成
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよび他の細胞内病原体に対する宿主反応は、マイコバクテリア酵素の補因子である鉄の阻止を含む。宿主輸送機序は、鉄のエンドサイトーシス経路を枯渇させるが、病原体は鉄と競合する因子を発現する。非病原性または病原性マイコバクテリアに感染したマクロファージは鉄含量の点で異なる。例えば、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに感染したＭΦの食胞は徐々に鉄を枯渇させるのに対し、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭ．ａｖｉｕｍに感染した細胞内では鉄は蓄積する。さらに、病原性マイコバクテリアはリソソームと食胞の融合を阻害し、トランスフェリンリサイクリング経路を維持する小胞に滞留し、それにより細菌への鉄の継続的な送達を確実にする。
【０２３５】
上に示すように、抗酸化物−分泌マイコバクテリアのトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）発現を上方制御する能力はマクロファージの鉄過剰負荷において中心的役割を担うことができ、その結果、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（および特定の宿主内のＢＣＧ）による肺病理を誘発する機序を提供する。ＳｏｄＡはＯ２−を不均化してＨ２Ｏ２を形成し、これら２つの酸化物は鉄調節タンパク質１（ＩＲＰ１）のＴｆＲ  ｍＲＮＡ結合／安定化活性に対する極性効果を有する。従って、本結果は肺ＴＢ中に生じる肺損傷の分子機序の新規モデルを示す、すなわち、ＳｏｄＡ分泌により、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓはＭΦ内の鉄過剰負荷を促進し、宿主生成酸化物を、肺組織を損傷する毒性酸素ラジカルへ変換する。別の言い方をすれば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）発現を鉄濃度に不適切な値に増大するためにＳｏｄＡを用いることによって、細菌はマクロファージに過剰の鉄を得させる。次いで、宿主はＮＡＤＰＨオキシダーゼアセンブリーおよび反応性酸素中間体（ＲＯＩ）の産生を促進するＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、および他の因子との感染に反応するため、ＲＯＩはＦｅｎｔｏｎおよびＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ化学を介して組織損傷ヒドロキシルラジカルに変換される（図３０）。実際に、細菌は宿主をごまかして健常組織に対する「バイスタンダー損傷」を誘発する毒性酸化物を生成させる。
【０２３６】
マイコバクテリアＳｏｄＡが宿主マクロファージによる鉄の取り込みを促進し、肺組織損傷に至らせることを決定するため、腐生性マイコバクテリウム種Ｍ．ｖａｃｃａｅの組換え株中にＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＳｏｄＡを発現して、ＭＶｒＳｏｄＡを得た。次いでＭＶｒＳｏｄＡをＣ５７Ｂｌ／６マウスの肺に気管内投与した。初期炎症反応後、感染から２ヶ月後までにヘモジデリン負過マクロファージは顕著であった（図３１）。感染後１６週目までに、肺実質中にびまん性線維化反応が観察された（図３２）。
【０２３７】
かかる結果により、ｅスーパーオキシドジスムターゼ媒介性の鉄の取り込みは、マイコバクテリウム種感染に対する応答における肺損傷病理においておそらく重要であるという理解が支持される。これは、潜在性ＴＢ感染から活性肺ＴＢへの変移を含み、マイコバクテリウム種感染に関連付けられている病因不明の疾患であるサルコイドーシスによる肺線維症も含み得る。潜在性ＴＢ感染（ＬＴＢＩ）は臨床的にサイレントであるのに対し、肺ＴＢは肺組織損傷を引き起こす。実際に、ＬＴＢＩから活性肺ＴＢに対する変移が、マクロファージによる鉄の取り込みおよび毒性酸素ラジカル生成に至るＴｆＲ発現増大を伴って開始する。マイコバクテリアＳｏｄＡは、非感染細胞内のＴｆＲ発現を誘発し、潜伏時間の維持は、マイコバクテリアＳｏｄＡ効果に拮抗してＴｆＲ発現を制限する宿主の能力に部分的に依存する。このバランスは、ＴｆＲ発現を制限する宿主の能力を制限する条件によって、桿菌の利益になるように傾き得る。次いで、鉄過剰負荷細胞はサイトカイン（ＩＦＮ−γを含む）の産生能およびサイトカイン（ＩＦＮ−γなど）応答能が低いため、細胞の増大した鉄は細菌複製を高めて全身の免疫抑制効果を誘発する。
【０２３８】
従って、ＳｏｄＡ活性と干渉することにより、潜在性ＴＢ感染者における肺ＴＢ発現を予防することが可能である。これは、マイコバクテリウムから直接精製した変異体ＳｏｄＡ、または別の細菌種もしくは発現系、またはＳｏｄＡ由来のペプチドによって産生した組換え変異体ＳｏｄＡに対する抗血清を生成することにより行うことができる。理想的には、抗血清はＳｏｄＡ酵素活性を中和する特性を有する；しかしながら、宿主による除去を促進するためのＳｏｄＡとの単なる結合が有益な効果を有し得る。かかる抗血清を潜在性ＴＢ感染者に消極的に投与してＭΦ培養およびｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｆＲ発現および鉄の取り込みを減らすことができる。あるいは、潜在性ＴＢ感染者は、抗ＳｏｄＡ抗体または細胞免疫応答の産生を誘発するために、ｄｎＳｏｄＡ、組換えＳｏｄＡもしくは変異体ＳｏｄＡを発現するｐａＢＣＧまたはＳｏｄＡペプチドにより活性的に免疫化され得る。活性肺ＴＢ者または肺を損傷する他のマイコバクテリウム種による感染者を同様に治療して肺の損傷度を減らすことができる。
【０２３９】
弱毒生ワクチンは、通常、未投与宿主における複数の抗原に対する免疫を誘発するために投与される。しかしながら、感染既往者における免疫ベース療法も緊急に必要とされている。潜在性ＴＢ感染から活性ＴＢへの変移を特異的に標的とするワクチンが代わりに悪質疾患（すなわち、コッホ現象）を引き起こす可能性はごくわずかである。先在する細菌耐性により通常の抗微生物剤で治療することが困難であるＭＤＲ−およびＸＤＲ−ＴＢ株感染者数が増加しており、ＬＴＢＩの免疫療法がさらに緊急に必要とされている。
【表４−１】
2012501189.tif 000025
【表４−２】
2012501189.tif 000026
【表４−３】
2012501189.tif 000027
【表４−４】
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【表４−５】
2012501189.tif 000029
【表４−６】
2012501189.tif 000030
【０２４０】
本出願を通じて、様々な刊行物を参照する。これらの刊行物の開示は、本発明が属する当該技術の状態をより十分に述べるために、参照によりそれらの全体が本出願に組み込まれる。
【０２４１】
本発明の範囲または真意から逸脱せずに、本発明において様々な修飾および変形を行い得ることが当業者にとって明らかであろう。本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮すること、および本明細書に開示した本発明の実施から当業者にとって明らかであろう。本明細書および実施例は例示のみであるとみなされるべきであり、本発明の真の範囲および真意は下記の特許請求の範囲により示されることが意図される。
Ａｌｂｅｒｔ  ＭＬ，  Ｓａｕｔｅｒ  Ｂ，  Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｎ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｑｕｉｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＴＬｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；  ３９２：８６−９．
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Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ，  Ｓｍｅｄｅｇａａｒｄ  Ｂ．  ＣＤ４＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２０００；  ６８：６２１−９．
Ｂａｌｃｅｗｉｃｚ−Ｓａｂｌｉｎｓｋａ  ＭＫ，  Ｋｅａｎｅ  Ｊ，  Ｋｏｒｎｆｅｌｄ  Ｈ，  Ｒｅｍｏｌｄ  ＨＧ．  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｅｖａｄｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ｒ２，  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ−  ａｌｐｈａ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９８；  １６１：２６３６−４１．
Ｂａｒｄａｒｏｖ  Ｓ，  Ｋｒｉａｋｏｖ  Ｊ，  Ｃａｒｒｉｅｒｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １９９７；  ９４：１０９６１−６．
Ｂａｒｎｅｓ  ＰＦ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：  ｗａｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｒ  ｔｉｌｔｉｎｇ  ａｔ  ｗｉｎｄｍｉｌｌｓ？  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２００３；  １６８：１４２−３．
Ｂｅｈｒ  ＭＡ，  Ｓｍａｌｌ  ＰＭ．  Ｈａｓ  ＢＣＧ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｔｏ  ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ？  Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；  ３８９：１３３−４．
Ｂｅｒｔｈｅｔ  ＦＸ，  Ｌａｇｒａｎｄｅｒｉｅ  Ｍ，  Ｇｏｕｎｏｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｅｒｐ  ｇｅｎｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８；  ２８２：７５９−６２．      
Ｂｅｙｅｒ  ＷＦ，  Ｊｒ．，  Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ  Ｉ．  Ａｓｓａｙｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：  ｓｏｍｅ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｍｉｎｏｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８７；  １６１：５５９−６６．
Ｂｌａｔｔｍａｎ  ＪＮ，  Ｇｒａｙｓｏｎ  ＪＭ，  Ｗｈｅｒｒｙ  ＥＪ，  Ｋａｅｃｈ  ＳＭ，  Ｓｍｉｔｈ  ＫＡ，  Ａｈｍｅｄ  Ｒ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ２００３；  ９：５４０−７．
Ｂｒａｎｄａｕ  Ｓ，  Ｓｕｔｔｍａｎｎ  Ｈ，  Ｒｉｅｍｅｎｓｂｅｒｇｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｒｆｏｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０００；  ６：３７２９−３８．
Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ  Ｍ，  Ｂａｒｄａｒｏｖ  ＳＳ，  Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，  Ｊｒ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２００２；  ３５８：６７−９９．
Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ  Ｍ，  Ｅｓｐｉｎｏｓａ  ＢＪ，  Ｃｈａｎ  Ｊ，  Ｂｅｌｉｓｌｅ  ＪＴ，  Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，  Ｊｒ．  ＳｅｃＡ２  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  Ａ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００３；  ４８：４５３−６４．
Ｃａｒｌｉｓｌｅ  Ｊ，  Ｅｖａｎｓ  Ｗ，  Ｈａｊｉｚａｄｅｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７；  １５０：４６０−８．
Ｃｈｏ  Ｓ，  Ｍｅｈｒａ  Ｖ，  Ｔｈｏｍａ−Ｕｓｚｙｎｓｋｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２０００；  ９７：１２２１０−５．
Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｊ，  Ｇｒｅｅｎ  ＰＪ，  Ｉｎｏｕｙｅ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＲＮＡｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍＲＮＡｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｓ．  Ｃｅｌｌ  １９８４；  ３７：４２９−３６．
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Ｃｏｏｐｅｒ  ＪＢ，  ＭｃＩｎｔｙｒｅ  Ｋ，  Ｂａｄａｓｓｏ  ＭＯ  ｅｔ  ａｌ．  Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｒｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｔ  ２．０  Ａｎｇｓｔｒｏｍｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９９５；  ２４６：５３１−４４．
Ｄｕｓｓｕｒｇｅｔ  Ｏ，  Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｇ，  Ｎｅｙｒｏｌｌｅｓ  Ｏ，  Ｐｅｓｃｈｅｒ  Ｐ，  Ｙｏｕｎｇ  Ｄ，  Ｍａｒｃｈａｌ  Ｇ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｐｐｅｒ−ｚｉｎｃ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２００１；  ６９：５２９−３３．
Ｅｄｄｉｎｅ  ＡＮ，  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＢＣＧ．  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．  ２００５；  ７：９３９−４６．
Ｅｄｗａｒｄｓ  ＫＭ，  Ｃｙｎａｍｏｎ  ＭＨ，  Ｖｏｌａｄｒｉ  ＲＫ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｒｏｎ−ｃｏｆａｃｔｏｒｅｄ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２００１；  １６４：２２１３−９．
Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ，  Ｇｉｌｌ  ＨＳ，  Ｐｆｌｕｅｇｌ  ＧＭ，  Ｒｏｔｓｔｅｉｎ  ＳＨ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２０００；  １４７７：１２２−４５．
Ｆｉｎｅ，  Ｐ．  Ｅ．  Ｍ．，  Ｃａｒｎｅｉｒｏ，  Ｉ．  Ａ．  Ｍ．，  Ｍｉｌｓｔｉｅｎ，  Ｊ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｉｓｓｕｅｓ  ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＢＣＧ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ａ  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ．  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ＷＨＯ／Ｖ＆Ｂ／９９．２３．  １９９９．  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．    Ｒｅｆ  Ｔｙｐｅ：  Ｐａｍｐｈｌｅｔ
Ｇｅｎｅ  １９９５；  １６６：１８１−２．
Ｇｉｌｌ  ＨＳ，  Ｐｆｌｕｅｇｌ  ＧＭ，  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  １９９９；  ５５  （  Ｐｔ  ４）：８６５−８．
Ｇｏｖｏｎｉ  Ｇ，  Ｖｉｄａｌ  Ｓ，  Ｇａｕｔｈｉｅｒ  Ｓ，  Ｓｋａｍｅｎｅ  Ｅ，  Ｍａｌｏ  Ｄ，  Ｇｒｏｓ  Ｐ．  Ｔｈｅ  Ｂｃｇ／Ｉｔｙ／Ｌｓｈ  ｌｏｃｕｓ：  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ｍｉｃｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｒａｍｐ１  Ｇｌｙ１６９  ａｌｌｅｌｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  １９９６；  ６４：２９２３−９．
Ｇｒａｈａｍ  ＪＥ，  Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＪＥ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＲＮＡｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  （ＳＣＯＴＳ）．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １９９９；  ９６：１１５５４−９．
Ｇｒｏｄｅ  Ｌ，  Ｓｅｉｌｅｒ  Ｐ，  Ｂａｕｍａｎｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ２００５；  １１５：２４７２−９．
Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９８３；  １６６：５５７−８０．
Ｈａｒｍｅｌ  ＲＰ，  Ｊｒ．，  Ｚｂａｒ  Ｂ，  Ｒａｐｐ  ＨＪ．  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｃｏｌｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ，  ｓｔｒａｉｎ  ＢＣＧ．  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  １９７５；  ５４：５１５−７．
Ｈｅｓｓ  Ｊ，  Ｍｉｋｏ  Ｄ，  Ｃａｔｉｃ  Ａ，  Ｌｅｈｍｅｎｓｉｅｋ  Ｖ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＧ，  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ．  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １９９８；  ９５：５２９９−３０４．
Ｈｉｌｌ  ＦＷ，  Ｒｕｔｔｅｎ  ＶＰ，  Ｈｏｙｅｒ  ＭＨ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｃａｌ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｕｌｖａｌ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  １９９４；  ３９：４９−５２．
Ｈｉｎｄｓ  Ｊ，  Ｍａｈｅｎｔｈｉｒａｌｉｎｇａｍ  Ｅ，  Ｋｅｍｐｓｅｌｌ  ＫＥ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９；  １４５  （  Ｐｔ  ３）：５１９−２７．
Ｈｏ  ＳＮ，  Ｈｕｎｔ  ＨＤ，  Ｈｏｒｔｏｎ  ＲＭ，  Ｐｕｌｌｅｎ  ＪＫ，  Ｐｅａｓｅ  ＬＲ．  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅ  １９８９；  ７７：５１−９．
Ｈｏｎｄａｌｕｓ  ＭＫ，  Ｂａｒｄａｒｏｖ  Ｓ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｒ，  Ｃｈａｎ  Ｊ，  Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，  Ｊｒ．，  Ｂｌｏｏｍ  ＢＲ．  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２０００；  ６８：２８８８−９８．
Ｈｏｒｗｉｔｚ  ＭＡ，  Ｈａｒｔｈ  Ｇ，  Ｄｉｌｌｏｎ  ＢＪ，  Ｍａｓｌｅｓａ−Ｇａｌｉｃ’  Ｓ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  （ＢＣＧ）  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ３０−ｋＤａ  ｍａｊｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｇｒｅａｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｔｈａｎ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＢＣＧ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２０００；  ９７：１３８５３−８．
Ｈｏｗａｒｄ  ＮＳ，  Ｇｏｍｅｚ  ＪＥ，  Ｋｏ  Ｃ，  Ｂｉｓｈａｉ  ＷＲ．  Ｃｏｌｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ．  
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍ，  Ｐｈａｌｅｎ  ＳＷ，  Ｌａｇｒａｎｄｅｒｉｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  １９９９；  ６７：２８６７−７３．
Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，  Ｊｒ．，  Ｔｕｃｋｍａｎ  Ｍ，  Ｂｌｏｏｍ  ＢＲ．  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｐｈａｓｍｉｄ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９８７；  ３２７：５３２−５．
Ｋａｕｓｈａｌ  Ｄ，  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ＢＧ，  Ｔｙａｇｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｉｎ  ａ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ，  ＳｉｇＨ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２００２；  ９９：８３３０−５．
Ｋｅａｎｅ  Ｊ，  Ｒｅｍｏｌｄ  ＨＧ，  Ｋｏｒｎｆｅｌｄ  Ｈ．  Ｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｅｖａｄｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００；  １６４：２０１６−２０．
Ｋｅｌｌｅｙ  ＪＪ，  ＩＩＩ，  Ｃａｐｕｔｏ  ＴＭ，  Ｅａｔｏｎ  ＳＦ，  Ｌａｕｅ  ＴＭ，  Ｂｕｓｈｗｅｌｌｅｒ  ＪＨ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｎｄ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｌｕｔａｒｅｄｏｘｉｎ−１  ｕｓｉｎｇ  １５Ｎ  ＮＭＲ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ）．  １９９７；  ３６：５０２９−４４．
Ｋｅｒｎｏｄｌｅ，  Ｄ．  Ｓ．，  Ｃｙｎａｍｏｎ，  Ｍ．  Ｈ．，  Ｈａｇｅｒ  ＣＣ，  Ｄｅｓｔｅｆａｎｏ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｔｈａｍ，  Ｋ．，  Ｂｏｃｈａｎ，  Ｍ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｋ．  Ｍ．  Ａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｎｇ  ａｎ  ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３３，  １１５４．  ２００１  （Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２００１  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）．
Ｋｅｒｎｏｄｌｅ，  Ｄ．，  Ｓｈｏｅｎ，  Ｃ．，  ＶａｎＨｏｏｋ，  Ｓ．，  Ｃｒｏｚｉｅｒ，  Ｉ．，  ＤｅＳｔｅｆａｎｏ，  Ｍ．，  Ｈａｇｅｒ，  Ｃ．，  Ｐｒｉｃｅ，  Ｊ．，  Ｔｈａｍ，  Ｋ−Ｔ．，  ａｎｄ  Ｃｙａｎａｍｏｎ，  Ｍ．  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ＳｏｄＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｃ５７Ｂｌ／６  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃２０４５，  ｐ．  ８０，  ｉｎ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｈｏｓｔ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ，  Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  Ｃａｎａｄａ，  Ａｐｒｉｌ  ２−７，  ２００５．  
Ｋｕｒｏｄａ  Ｋ，  Ｂｒｏｗｎ  ＥＪ，  Ｔｅｌｌｅ  ＷＢ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＧ，  Ｒａｔｌｉｆｆ  ＴＬ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １９９３；  ９１：６９−７６．
Ｌａｋｅｙ  ＤＬ，  Ｖｏｌａｄｒｉ  ＲＫ，  Ｅｄｗａｒｄｓ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｕｓａｇｅ  ｃｏｄｏｎｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２０００；  ６８：２３３−８．
Ｌｅｅ  ＭＨ，  Ｐａｓｃｏｐｅｌｌａ  Ｌ，  Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，  Ｊｒ．，  Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ．  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌ５：  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ，  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １９９１；  ８８：３１１１−５．
Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ  Ｒ，  Ｆａｔｔｏｒｉｎｉ  Ｌ，  Ｔａｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｘｔｒａ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｍａ（Ｅ）  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２００４ａ；  ７２：３０３８−４１．
Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ  Ｒ，  Ｐｒｏｖｖｅｄｉ  Ｒ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅ  Ｓ，  Ｂｅａｕｃｈｅｒ  Ｊ，  Ｇａｕｄｒｅａｕ  Ｌ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｉ．  Ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ２００４ｂ；  １８６：８９５−９０２．
Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ  Ｒ，  Ｖｏｓｋｕｉｌ  ＭＩ，  Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ  ＧＫ，  Ｄｕｂｎａｕ  Ｅ，  Ｇｏｍｅｚ  Ｍ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｉ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｍａ（Ｈ）  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００２；  ４５：３６５−７４．
Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ  Ｒ，  Ｖｏｓｋｕｉｌ  ＭＩ，  Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ  ＧＫ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｉ．  Ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＥＣＦ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｍａＥ：  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００１；  ４１：４２３−３７．
ＭｃＣｏｒｄ  ＪＭ，  Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ  Ｉ．  Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ．  Ａｎ  ｅｎｚｙｍｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｕｐｒｅｉｎ  （ｈｅｍｏｃｕｐｒｅｉｎ）．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９６９；  ２４４：６０４９−５５．
ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ＪＤ，  Ｈｏｎｅｒ  ｚｕ  Ｂｅｎｔｒｕｐ  Ｋ．，  Ｍｕｎｏｚ−Ｅｌｉａｓ  ＥＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ｓｈｕｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２０００；  ４０６：７３５−８．
ＭｃＭｕｒｒａｙ  ＤＮ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．  ２００１；  ３３：１７５−８．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＢＨ，  Ｓｈｉｎｎｉｃｋ  ＴＭ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２０００；  ６８：３８７−９０．
Ｍｏｓｏｌｉｔｓ  Ｓ，  Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｍｅｌｌｓｔｅｄｔ  Ｈ．  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  ２００５；  ４：３２９−５０．
Ｍｏｓｔｏｗｙ  Ｓ，  Ｔｓｏｌａｋｉ  ＡＧ，  Ｓｍａｌｌ  ＰＭ，  Ｂｅｈｒ  ＭＡ．  Ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＣＧ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００３；  ２１：４２７０−４．
Ｍｕｒｒａｙ  ＰＪ，  Ａｌｄｏｖｉｎｉ  Ａ，  Ｙｏｕｎｇ  ＲＡ．  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １９９６；  ９３：９３４−９．
Ｏｌｓｅｎ  ＡＷ，  Ｂｒａｎｄｔ  Ｌ，  Ａｇｇｅｒ  ＥＭ，  ｖａｎ  Ｐｉｎｘｔｅｒｅｎ  ＬＡ，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｌｉｖｅ  ＢＣＧ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｍｉｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００４；  ６０：２７３−７．
Ｏｔｓｕｋｉ  Ｙ，  Ｌｉ  Ｚ，  Ｓｈｉｂａｔａ  ＭＡ．  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ−−ｆｒｏｍ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｇｅｎｅ．  Ｐｒｏｇ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ２００３；  ３８：２７５−３３９．
Ｐａｒｉｓｈ  Ｔ，  Ｓｔｏｋｅｒ  ＮＧ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｕｎｍａｒｋｅｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｔｌｙＡ  ｐｌｃＡＢＣ  ｍｕｔａｎｔ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００；  １４６：１９６９−７５．
Ｐａｖｅｌｋａ  ＭＳ，  Ｊｒ．，  Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，  Ｊｒ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｍａｒｋｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ，  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ，  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ  ｂｙ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９９；  １８１：４７８０−９．
Ｐｅｌｉｃｉｃ  Ｖ，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍ，  Ｒｅｙｒａｔ  ＪＭ，  Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，  Ｊｒ．，  Ｇｉｃｑｕｅｌ  Ｂ，  Ｇｕｉｌｈｏｔ  Ｃ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １９９７；  ９４：１０９５５−６０．
Ｒａｍａｎ  Ｓ，  Ｓｏｎｇ  Ｔ，  Ｐｕｙａｎｇ  Ｘ，  Ｂａｒｄａｒｏｖ  Ｓ，  Ｊａｃｏｂｓ  ＷＲ，  Ｊｒ．，  Ｈｕｓｓｏｎ  ＲＮ．  Ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＳｉｇＨ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｈｅａｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ２００１；  １８３：６１１９−２５．
Ｒｅｈｓｅ  ＰＨ，  Ｋｕｍｅｉ  Ｍ，  Ｔａｈｉｒｏｖ  ＴＨ．  Ｃｏｍｐａｃｔ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２００５．
Ｒｅｐｉｑｕｅ  ＣＪ，  Ｌｉ  Ａ，  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＦＭ，  Ｍｏｒｒｉｓ  ＳＬ．  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｏｎ  ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２００２；  ７０：３３１８−２３．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ａ，  Ｒｅｇｎａｕｌｔ  Ａ，  Ｋｌｅｉｊｍｅｅｒ  Ｍ，  Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ−Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ  Ｐ，  Ａｍｉｇｏｒｅｎａ  Ｓ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９９；  １：３６２−８．
Ｒｕｔｔｅｎ  ＶＰ，  Ｋｌｅｉｎ  ＷＲ，  Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｏｃｕｌａｒ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  （ＢＣＧ）  ｏｒ  ＢＣＧ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  １９９１；  ３４：１８６−９０．
Ｓａｍｂａｎｄａｍｕｒｔｈｙ  ＶＫ，  Ｗａｎｇ  Ｘ，  Ｃｈｅｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ２００２；  ８：１１７１−４．
Ｓｃｈａｉｂｌｅ  ＵＥ，  Ｗｉｎａｕ  Ｆ，  Ｓｉｅｌｉｎｇ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＭＨＣ−Ｉ  ａｎｄ  ＣＤ１  ｉｎ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ２００３；  ９：１０３９−
Ｓｅｄｅｒ  ＲＡ，  Ｈｉｌｌ  ＡＶ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２０００；  ４０６：７９３−８．
Ｓｅｒｂｉｎａ  ＮＶ，  Ｆｌｙｎｎ  ＪＬ．  Ｅａｒｌｙ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｉｍｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  １９９９；  ６７：３９８０−８．
Ｓｅｒｂｉｎａ  ＮＶ，  Ｌｉｕ  ＣＣ，  Ｓｃａｎｇａ  ＣＡ，  Ｆｌｙｎｎ  ＪＬ．  ＣＤ８＋  ＣＴＬ  ｆｒｏｍ  ｌｕｎｇｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｌｙｓｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００；  １６５：３５３−６３．
Ｓｉｌｖａ  ＣＬ，  Ｂｏｎａｔｏ  ＶＬ，  Ｌｉｍａ  ＶＭ，  Ｆａｃｃｉｏｌｉ  ＬＨ，  Ｌｅａｏ  ＳＣ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｏｒｙ／ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｏｒ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９；  ９７：５７３−８１．
Ｓｍｉｔｈ  ＤＡ，  Ｐａｒｉｓｈ  Ｔ，  Ｓｔｏｋｅｒ  ＮＧ，  Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＧＪ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２００１；  ６９：１１４２−５０．
Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｊ，  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｃ，  Ｇｒａｎｇｅ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２００４；  ９：１７０１−１９．
Ｓｔｅｅｎｓｍａ  ＤＰ，  Ｔｉｍｍ  Ｍ，  Ｗｉｔｚｉｇ  ＴＥ．  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．  ２００３；  ８５：３２３−３２．
Ｓｔｅｅｒｅｎｂｅｒｇ  ＰＡ，  Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＷＨ，  Ｅｌｇｅｒｓｍａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  （ｔｉｌｓ）  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ＢＣＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｃｌ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．  １９９０；  ５９：１８５−９４．
Ｓｔｕｒｇｉｌｌ−Ｋｏｓｚｙｃｋｉ  Ｓ，  Ｓｃｈａｉｂｌｅ  ＵＥ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＧ．  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ  ａｒｅ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｔｏ  ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｆｌｅｃｔ  ａ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９６；  １５：６９６０−８．
Ｓｕｒｅｄａ  Ａ，  Ｈｅｂｌｉｎｇ  Ｕ，  Ｐｏｎｓ  Ａ，  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｓ．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈ２Ｏ２  ａｎｄ  ｎｏｔ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １．  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．  ２００５；  ３９：８１７−２４．
Ｓｕｔｔｍａｎｎ  Ｈ，  Ｊａｃｏｂｓｅｎ  Ｍ，  Ｒｅｉｓｓ  Ｋ，  Ｊｏｃｈａｍ  Ｄ，  Ｂｏｈｌｅ  Ａ，  Ｂｒａｎｄａｕ  Ｓ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ．Ｕｒｏｌ．  ２００４；  １７２：１４９０−５．
Ｓｕｔｔｍａｎｎ  Ｈ，  Ｒｉｅｍｅｎｓｂｅｒｇｅｒ  Ｊ，  Ｂｅｎｔｉｅｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｍｅｔｔｅ−ｇｕｅｒｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ  ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００６；  ６６：８２５０−７．
Ｔａｎ  ＪＫ，  Ｈｏ  ＶＣ．  Ｐｏｏｌｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  （ＢＣＧ）  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．  １９９３；  １９：９８５−９０．
Ｔｒｕｎｚ  ＢＢ，  Ｆｉｎｅ  Ｐ，  Ｄｙｅ  Ｃ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＢＣＧ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｍｉｌｉａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：  ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ．  Ｌａｎｃｅｔ  ２００６；  ３６７：１１７３−８０．
Ｔｕｌｌｉｕｓ  ＭＶ，  Ｈａｒｔｈ  Ｇ，  Ｈｏｒｗｉｔｚ  ＭＡ．  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ＧｌｎＡ１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＴＨＰ−１  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２００３；  ７１：３９２７−３６．
Ｖａｎｓｅｌｏｗ  ＢＡ，  Ａｂｅｔｚ  Ｉ，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＡＲ．  ＢＣＧ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｑｕｉｎｅ  ｓａｒｃｏｉｄ．  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔ．Ｊ．  １９８８；  ２０：４４４−７．
Ｖｅｌｉｋｏｖｓｋｙ  ＣＡ，  Ｃａｓｓａｔａｒｏ  Ｊ，  Ｇｉａｍｂａｒｔｏｌｏｍｅｉ  ＧＨ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｌｕｍａｚｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ２００２；  ７０：２５０７−１１．
Ｗａｇｎｅｒ  Ｄ，  Ｍａｓｅｒ  Ｊ，  Ｌａｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−，  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−，  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ’ｓ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５；  １７４：１４９１−５００．
Ｗａｎｇ  ＰＦ，  Ａｒｓｃｏｔｔ  ＬＤ，  Ｇｉｌｂｅｒｇｅｒ  ＴＷ，  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｓ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＣＨ，  Ｊｒ．  Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｄｉｔｈｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ）．  １９９９；  ３８：３１８７−９６．
Ｗｉｎａｕ  Ｆ，  Ｈｅｇａｓｙ  Ｇ，  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ，  Ｓｃｈａｉｂｌｅ  ＵＥ．  Ｎｏ  ｌｉｆｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｅａｔｈ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓ  ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  ２００５；  １０：７０７−１５．
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図２０Ａ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２４Ａ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２７−１】
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【図２８】
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【図２８−１】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１７】
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【図２１】
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【図３１Ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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