(57)【要約】本発明は、封入体が粒子形態であることを特徴とする、ポリペプチドを含む単離された封入体に関する。本発明はまた、前記封入体を含む細菌細胞に関する。本発明はさらに、前記封入体および真核細胞を含む組成物に関する。本発明はまた、前記封入体および動物または植物組織を含む組成物に関する。本発明はまた、前記封入体の、細胞増殖および組織再生の医薬および刺激物質としての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入体が粒子形態であることを特徴とする、ポリペプチドを含む単離された封入体。
【請求項２】
粒子形態が２４〜１５００ｎｍの粒径を有する、請求項１に記載の単離された封入体。
【請求項３】
粒子が水和非晶質形態である、請求項１または２に記載の単離された封入体。
【請求項４】
ポリペプチドが、レポータータンパク質に翻訳可能に融合しているウイルスタンパク質を含むキメラポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された封入体。
【請求項５】
ウイルスタンパク質がカプシドタンパク質である、請求項４に記載の単離された封入体。
【請求項６】
レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項４または５に記載の単離された封入体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の封入体、および真核細胞を含む、組成物。
【請求項８】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の封入体、および動物または植物組織を含む、組成物。
【請求項１０】
封入体が、組織培養培地で処理されたプレート上に付着している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された封入体。
【請求項１１】
封入体が、シリコン基板上に付着している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された封入体。
【請求項１２】
封入体が、合成または天然の３次元フレームワーク内に組み込まれている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された封入体。
【請求項１３】
請求項１〜６および１０〜１２のいずれか一項に記載の単離された封入体の、真核細胞増殖の刺激物質としての使用。
【請求項１４】
請求項１〜６および１０〜１２のいずれか一項に記載の単離された封入体の、組織再生物質としての使用。
【請求項１５】
医薬として使用される、請求項１〜６および１０〜１２のいずれか一項に記載の単離された封入体。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に規定された封入体を含む、細菌細胞。
【請求項１７】
細菌細胞が大腸菌である、請求項１６に記載の細菌細胞。
【請求項１８】
大腸菌が、野生株または変異株の大腸菌から選択される、請求項１７に記載の細菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、封入体、これを含有する細菌細胞および組成物、ならびにこれらの、細胞増殖および組織再生の医薬および刺激物質としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌封入体（ＩＢ）は、組換え細菌において産生される高度に純粋なタンパク質沈着物である１。水に不溶性であり、これらは数百ナノメーター範囲の大きさの高度に水和化された多孔性非晶質粒子として観察される。ＩＢを構成するポリペプチド鎖は、その天然構造に対応するアミロイド型分子構造に折り畳まれ、これにより封入されたポリペプチドの生物学的活性（例えば、蛍光または酵素活性）を維持する。したがって、これを適切に操作すれば、ＩＢは、機能性および生体適合性物質として広く利用できる可能性がある。これらタンパク様粒子の生物物理学的特徴、例えば活性およびサイズなどの操作は、遺伝条件および産生条件を調節することにより理論的には可能であるにも拘わらず、いまだに行われていない。本研究においては、新規な粒子状物質としてのＩＢのナノスケールの特性を明らかにし、産生された粒子がシンプルな戦略によってどの程度まで設計できるかを検討する。さらに、概念の重要な証拠として、哺乳動物細胞の増殖を有意に刺激する封入体によって修飾された表面を得ており、これは、他の期待される生物医学的用途の中でも組織マニピュレーションおよび再生医学における、ＩＢの可能性を実証するものである。
【０００３】
遺伝子操作された細菌中で産生される組換えポリペプチドの多くは、ＩＢとして凝集する。これらのタンパク質沈着物は、細菌の細胞質に２、またはいくつかの場合においてはペリプラズムに３見出される、高度に水和化された粒子として現れる。ＩＢは組換えタンパク質が主要成分で、総タンパク質のおよそ９５％までを占めているため、化学的に純粋である２，４，５。他の細胞分子、例えばＲＮＡ、ＤＮＡおよび脂質は、ＩＢの形成の間に捕捉されて、少量のみが存在する６。ＩＢの形成は迅速で効果的なプロセスであり、これは、遺伝子発現の誘導の数分後には観察することができる。数時間後、これらは容易に全細胞生物量の約５０％を占めることができる５。過去には、ＩＢが、折り畳みなしまたは実質的に折り畳みの少ないポリペプチド鎖により形成され、したがって生物学的に不活性であると考えられていたが、最近の観察では、これらの粒子が正確に折り畳まれたタンパク質で形成され、したがって生体機能的であると記されている８。ＩＢの分子構造は特定のアミロイド型機構に基づいており９，１０、これは、正確に折り畳まれたタンパク質のドメインと共存するための、架橋βシート相互作用を許容する１１。
【０００４】
したがって、酵素により形成されたＩＢは、β−ガラクトシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、シアル酸アルドラーゼおよびポリリン酸キナーゼなどのタンパク質について最近観察された種々のタイプのバイオプロセスにおいて、有用な触媒となり得る１１〜１５。ＩＢのin vivoでの形成は、核生成中心近くの配列に依存したタンパク質の沈着を意味するが、これは、種々の細胞遺伝子（機能性ネットワークとして作用するプロテアーゼおよびシャペロンを主にコードし、ナノスケールレベルでのこれらの特性の操作を可能としている）によって制御される１６，１７。本発明は、ナノ粒子としてのＩＢの最も重要な特徴を決定し、ＩＢが遺伝子操作により、および産生細菌における適切なプロセスの操作により設計可能であることを実証する。完全に生体適合性かつ機械的に安定な物質であるため、ＩＢはまた、哺乳動物細胞増殖の刺激のために表面の粗さを改変するためのナノ粒子としても用いられている。実質的に任意のタンパク質種が細菌ＩＢとして産生可能であり、そのナノスケールでの特性が容易に調節できるとすれば、これらの新規な物質の機能的可能性は、ここに組織マニピュレーションの文脈において示されているもの以外にも、著しい範囲の追加の生物医学的用途を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、封入体、これを含有する細菌細胞および組成物、ならびに細胞増殖および組織再生の刺激物質としてのこれらの使用に関する。
本発明の第１の目的は、封入体が粒子形態であることを特徴とする、ポリペプチドを含む単離された封入体に関する。
本発明の第２の目的は、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面を含む、細菌細胞に関する。
【０００６】
本発明の第３の目的は、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面および真核細胞を含む、組成物に関する。
本発明の第４の目的は、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面および動物または植物組織を含む、組成物に関する。
本発明の第５の目的は、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的および配置的な側面の、細胞増殖および組織再生の医薬および刺激物質としての使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】ＩＢの形態学的および機能的特徴付け。図１Ａ：ＧＦＰ融合タンパク質により形成されるＩＢを産生する野生型細菌細胞の共焦点顕微鏡画像。上から下へ、ＩＢ産生の誘導の１時間後、２時間後、３時間後に採取した細胞試料。
【図１Ｂ】ＩＢの形態学的および機能的特徴付け。図１Ｂ：ＧＦＰ融合タンパク質により形成される、野生型細菌細胞、ＩｂｐＡＢ−、ＣｌｐＡ−、ＣｌｐＰ−およびＤｎａＫ−が産生するＩＢの、形成２時間後のMetamorphパレットを用いた共焦点顕微鏡画像（上部）。これらの株からの精製３時間後のＩＢの共焦点顕微鏡画像（下部）。ＡおよびＢにおけるバーは１μｍを示す。
【図１Ｃ】ＩＢの形態学的および機能的特徴付け。図１Ｃ：異なる細菌株から産生された形成３時間後のＩＢの、動的光散乱により測定した粒径の分布曲線。ＩｂｐＡＢ欠損細胞のＩＢは、超粒子複合体として凝集するそれらの特定の傾向のために、この試験からは除外した（結果は示さず）。曲線は、粒子体積のパーセンテージで表す。粒子体積サイズの分布はＤ［ｖ，０．５］として記載し、これは、これより下の値に全系の体積の５０％が含まれる粒子直径（ｎｍ）である。Ｄ［ｖ，０．５］は、体積での平均粒子直径（ｎｍ）である。多分散性指標（ＰｄＩ）は、［Ｄ（ｖ，０．１）／Ｄ（ｖ，０．９）］＊１００として定義される。
【図１Ｄ】ＩＢの形態学的および機能的特徴付け。図１Ｄ：Ｄ大腸菌株ＩｂｐＡＢ−、ＣｌｐＡ−、ＣｌｐＰ−およびＤｎａＫ−から精製した粒子について、フローサイトメトリ分析による、ＩＢが発光した蛍光。
【０００８】
【図２Ａ−２Ｂ】ＧＦＰを有するＩＢの微細構造および安定性。図２Ａ−２Ｂは、上の図において、ＧＦＰ融合タンパク質で作製されたＩＢの形成３時間後の、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）による特徴を示す：Ａ．表面上にランダムに沈着したＩＢの２．５×２．５μｍの局所画像。Ｂ．Ａ図の画像中の２つのＩＢを示す、６００×６００ｎｍの３Ｄ画像。
【図２Ｃ】ＧＦＰを有するＩＢの微細構造および安定性。図２Ｃは、単離されたＩＢ（Ａにおいて青色の線で示す）の粒子の局所的断面図であり、内部構造の結果として、ＩＢ表面上に１．８９ｎｍの一定のＲＭＳ固有粗さの存在を示し、これは微細な表面組織をもたらしている。
【図２Ｄ】ＧＦＰを有するＩＢの微細構造および安定性。図Ｄにおいて、野生型細胞（上部）およびＤｎａＫ−細胞（下部）において産生された、形成３時間後のＩＢのＳＥＭ画像。白色のバーは５００ｎｍを示す。
【図２Ｅ】ＧＦＰを有するＩＢの微細構造および安定性。図Ｅにおいて、３７℃、２５℃、および４℃の水性緩衝液中の、または、凍結乾燥（Ｌ）およびその後２５℃または４℃で貯蔵された、ＩＢの安定性を示す。
【図２Ｆ】ＧＦＰを有するＩＢの微細構造および安定性。図Ｆは、２５℃、４℃、および−８０℃で１ヶ月間緩衝液中に維持された精製ＩＢ、および凍結乾燥／再構築（Ｌ）後の精製ＩＢの、共焦点顕微鏡画像。
【０００９】
【図３Ａ−３Ｂ】ＩＢにより刺激された、哺乳動物細胞の増殖。図３Ａ：天然細胞で産生された、ＧＦＰを有する２４０μｇのＩＢで被覆された３５ｍｍポリスチレンプレートの共焦点画像。図３Ｂ：同一の視野について、細胞沈着の７５時間後の０．６μｍセクションによるＢＨＫ細胞の被覆、およびＧＦＰ融合タンパク質により形成されたＩＢのｘｚｙ投影（上部）および細胞被覆（下部）。
【図３Ｃ】ＩＢにより刺激された、哺乳動物細胞の増殖。図３Ｃ：３連続チャネルの共焦点レーザー走査顕微鏡法により解析する直前の、Hoechst 3342で染色した細胞核およびCellMaskで染色した細胞膜。
【図３Ｄ】ＩＢにより刺激された、哺乳動物細胞の増殖。図３Ｄ：ＩＢで被覆したプレート上（ＩＢ）、ビトロネクチンで被覆したプレート上（Ｖ）、およびコントロールプレート上（Ｃ）での、異なるインキュベーション時間におけるＢＨＫ細胞の増殖。
【図３Ｅ】ＩＢにより刺激された、哺乳動物細胞の増殖。図３Ｅ：ビトロネクチンで被覆したプレート（Ｖ）およびコントロールプレート（Ｃ）と比較した、ＩＢの異なる濃度で被覆したプレート上でのＢＨＫ細胞の増殖。実験は、培養物で処理したポリスチレンプレート（黒のバー）および未処理のプレート（灰色バー）上で平行して行った。
【図３Ｆ】ＩＢにより刺激された、哺乳動物細胞の増殖。図３Ｆ：Isosurfaceモジュールの適用によりImaris３Ｄソフトウェアで処理した、２２のセクションのｘｙｚ共焦点スタック。
【図３Ｇ】ＩＢにより刺激された、哺乳動物細胞の増殖。図３Ｇ：５０μｍのＩＢの被覆によりスタンプしたアミノ末端化シリコンの、従来の顕微鏡法（上部）および共焦点顕微鏡法（中部）による表面画像、および表面上での４８時間の増殖後のＢＨＫ細胞の分布（下部）。
【００１０】
本発明の説明
本発明は、封入体、これを含有する細菌細胞および組成物、ならびに細胞増殖および組織再生の刺激物質としてのこれらの使用に関する。
用語「封入体」は、本発明においては「ＩＢ」とも呼ぶが、これは前記発明の背景の節に示されているものとして、またはより簡潔には、細胞の細胞質に見出される、凝集タンパク質を含有する非晶質細胞内沈着物として理解される。
本発明の第１の目的は、封入体が粒子形態であることを特徴とする、ポリペプチドを含む単離された封入体に関する。
【００１１】
好ましい態様において、粒子形態は、２４〜１５００ｎｍの粒径を有する。
さらに好ましい態様において、粒子は、水和非晶質形態である。
本発明の第１の目的による封入体を含むポリペプチドについて、これは、レポータータンパク質に翻訳可能に融合しているウイルスタンパク質を含むキメラポリペプチドであることができる。
好ましい態様において、前記ウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質である。
さらに、他の好ましい態様において、レポータータンパク質は蛍光タンパク質である。特に、前記蛍光タンパク質はＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）である。
【００１２】
特定の態様において、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面は、組織培養培地で処理したプレート上に付着されている。
その他の特定の態様において、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面は、シリコン基板上に付着されている。
さらに他の特定の態様において、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面は、３次元の合成または天然フレームワーク内に組み込まれている。
【００１３】
本発明の第２の目的は、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面を含む、細菌細胞に関する。
好ましい態様において、前記細菌細胞は、大腸菌（E. Coli）である。
さらに好ましい態様において、大腸菌である前記細菌細胞は、野生型株（ＷＴ）または変異株である。
本発明の第３の目的は、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面および真核細胞を含む、組成物に関する。
【００１４】
好ましい態様において、前記真核細胞は哺乳動物細胞である。
本発明の第４の目的は、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的側面および動物または植物組織を含む、組成物に関する。
本発明の第５の目的は、本発明の第１の目的による封入体およびその異なる構造的および配置的な側面の使用に関する。
前記封入体の第１の使用は、真核細胞の増殖の刺激物質としてのものである。
【００１５】
前記封入体の第２の使用は、組織再生物質としてのものである。
前記封入体の第３の使用は、医薬としてのものである。特に、医薬としての前記の使用は、細胞増殖および組織再生において観察される利点を考慮に入れている（実験の節を参照）。
以下の例は説明目的のために提供されており、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００１６】
材料および方法
細菌細胞、プラスミド、および封入体の産生
ＩＢは、大腸菌の異なる株において、特にＭＣ４１００（タンパク質の折り畳みおよび分解についての野生株、araD139 Δ(argF-lac) U169 rpsL150 relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR）１８およびその派生物であるＪＧＴ４（コプロテアーゼClpA欠損、clpA::kan）、ＪＧＴ１７（熱ショック小タンパク質IbpAB欠損、Δibp::kan）、ＪＧＴ１９（コプロテアーゼClpP欠損、clpP::cat）、およびＪＧＴ２０（主要シャペロンDnaK欠損、dnak756 thr::Tn10）１９において産生される。これらの産生株を、ＶＰ１（口蹄疫ウイルスのカプシドタンパク質の五量体形態）のアミノ末端に融合する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現ベクターｐＴＶＰ１ＧＦＰ（ＡｐＲ）を用いて、形質転換した２０。このウイルスタンパク質は高度に疎水性であり、融合タンパク質をＩＢとして付着させる９。組換え遺伝子は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導性ｒｔｃプロモーターの制御下で発現される。
細菌細胞はＬＢが豊富な培地で培養され１８、融合遺伝子は、前に記載した標準条件下で発現された１７。ＩＢは、ＩＰＴＧ添加の１時間後に明らかに検出された（図１Ａ）。
【００１７】
封入体の精製
４℃で２００ｍｌの細菌培養物の試料を５０００ｇで５分間遠心分離し、５０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させた。氷中に維持した試料を振幅４０％、周期０．５秒で超音波処理した（２５〜４０分間）。超音波処理の後、１００ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）２８μｌおよび５０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム２３μｌを試料に加え、これを３７℃で攪拌しつつ４５分間インキュベートした。次に、４０μｌのNonidet P40（ＮＰ−４０）を加え、混合物を４℃で１時間攪拌した。１２０μｌの１ｍｇ／ｍｌＤＮＡアーゼおよび１２０μｌの１ＭのＭｇ２ＳＯ４を用いて、３７℃で４５分間攪拌しつつ、ＤＮＡを除去した。最後に試料を４℃、１５，０００ｇで１５分間遠心分離し、純粋なＩＢを含む残留物を０．５％Triton X-100を含む溶解緩衝液で洗浄し、分析まで−２０℃で維持した。
【００１８】
細菌およびＩＢの顕微鏡分析
試料を、Leica TSC SP2 AOBS（Leica Microsystems Heidelberg GMBH, Manheim, Germany）共焦点蛍光顕微鏡を用いて、４８８ｎｍの波長での励起後に分析し、画像を５００〜６００ｎｍの発光波長で（６３×、１．４ＮＡオイル）、Plan-Apochromat対物レンズ（ズーム８；１０２４×１０２４ピクセル）を用いて記録した。蛍光ＩＢを産生する細菌細胞の分析には、ＩＰＴＧによる誘導の１時間、２時間、および３時間後に試料を採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．２％ホルムアルデヒドで固定し、使用するまで４℃で維持した。単離されたＩＢを、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）については、試料をＦＥＧ（電界放出ガン）−ＥＳＥＭ（環境走査電子顕微鏡）を用いる従来の手順により分析した。
【００１９】
フローサイトメトリ
精製したＩＢをＰＢＳに再懸濁させ、０．５秒周期で４分間超音波処理し、FACS Calibur（Becton Dickinson）システム中で、空冷１５ｍＷアルゴンイオンレーザーを４８８ｎｍの励起波長で用いるフローサイトメトリにより分析した。ＩＢの蛍光発光を、ＦＬ−１チャネル（５３０／３０ｎｍ帯域フィルター）で対数モードを用いて測定した。
【００２０】
原子間力顕微鏡法による特徴付け
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）分析を、空気中で市販の原子間力顕微鏡（PicoScan/PicoSPM：Molecular Imaging Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USAより）により音響モードで行った。０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁させたＩＢを、雲母表面に付着させ、測定前に空気乾燥した。音響モードでの測定には、ＰＰＰ−ＮＨＣ（Nanosensors, Inc.）モノリシックシリコンプローブを、公称ばね定数４２Ｎ／ｍおよび共振周波数３３０ｋＨｚで用いた。
【００２１】
動的光散乱測定
ＩＢの体積でのサイズ分布およびゼータ電位の測定を、動的光散乱（ＤＬＳ）分析器を６３３ｎｍの波長にて、非侵襲的後方散乱（ＮＩＢＳ）技法（Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Limited, Malvern, United Kingdom）と組み合わせて用いて行った。０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中の３時間寿命のＩＢの分散物を、短時間超音波処理（室温で１分間）により調製した。得られた分散物の２０℃、３ｍｌのアリコートを、測定前のフィルタリングなしで測定した。強度データは、０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４を参照標準として用いて正規化した。３つの異なる測定値の平均値を、ＩＢの平均の流体力学的径とした。
【００２２】
アミノ末端化単分子層の調製
１辺を研磨した１×１ｃｍのシリコン基板（１００）を、アミノ末端化単分子層の調製に用いた。単分子層の形成前に、基板をＲＣＡ−１酸化溶液（ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏを１：１：５の割合）で８０℃で３０分間処理し、１８．２ＭΩより高い伝導率の超純水／MilliQ水でゆっくりすすいだ。続いて、基板をpyranha溶液（濃縮Ｈ２ＳＯ４（Panreac）および水溶性の３３％Ｈ２Ｏ２（Aldrich）を３：１の割合）に１５分間導入し、豊富な純水ですすいで、窒素流中で乾燥した。この処理により、後の反応用にヒドロキシル基で末端化した基板の新しい表面が提供される。アミノ末端化単分子層は、制御雰囲気下で、基板を無水トルエン中の５ｍＭのＮ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（ＴＰＥＤＡ）（９７％Aldrich）溶液に３時間暴露することにより、形成した。
【００２３】
単分子層の形成後、基板をトルエンおよびエタノールですすいで余分なシランを除去し、窒素流中で乾燥した。アミノ末端化基板の接触角を、ＣＣＤカメラおよび角度決定用のＳＣＡ２０ソフトウェアを備えた、ＯＣＡ１５＋（Data Physics Instruments GMBH, Germany）接触角測定装置中、３μｌの超純水（１８．２ＭΩｃｍのMilliQ）の滴を用いて測定した。ＸＰＳスペクトルを、３５０Ｗで動作する単色Ａｌ  Ｋ−アルファＸ線源を備えたPHI ESCA-500（Perkin Elmer）装置により得た。スペクトルは、２８４．８ｅＶで観察される主要Ｃｌｓピークを参照した。
【００２４】
アミノ末端化シリコン基板上でのＩＢのミクロ接触プリンティング（μＣＰ）
アミノ末端化シリコン基板上のＩＢのμＣＰを、ＰＤＭＳスタンピング（Sylgard 184, Dow Corning, United States）を用いて行った。スタンピングの作製は、ＰＤＭＳと硬化剤（Sylgard 184, Dow Corning）の１０：１（ｖ／ｖ）混合物をフォトリソグラフィーパターンのシリコンベースに対して溶融し、６０℃で１時間硬化させて行い、これをこの硬化温度で抜き出した。ＰＤＭＳスタンピングは６０℃のオーブン中に少なくとも１８時間置いて、確実に完全に硬化させた。μＣＰでプリントしたＩＢについて、ＰＤＭＳスタンピングをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中のＩＢの懸濁物に４０分間含浸させ、窒素流中で乾燥して、清浄なアミノ末端化シリコン基板の表面に置いた。１分間の接触時間の後、スタンピングを注意して取り除いた。
プリントした試料の蛍光を、Leica TSC SPE（Leica Microsystems Heidelberg GMBH, Manheim, Germany）共焦点蛍光顕微鏡を４８８ｎｍの波長での励起で用い、５００〜６００ｎｍの発光を測定して（×１０、空気）分析した。
【００２５】
安定性解析
ＤｎａＫ−細胞中で形成された５時間後のＩＢを、４０ｍｇ／ｌのゲンタマイシンの存在下、１０ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および６０ｇ／ｌサッカロースを有するＰＢＳで希釈し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよびアリコートを、異なる温度（３７℃、２５℃、または４℃）でインキュベートした。試料を、蛍光測定のために−８０℃で異なる時間凍結した。蛍光は、４５０ｎｍの励起波長を用いるCary Eclipse（Variant, Inc., Palo Alto, CA）蛍光分光計で、５１０ｎｍにおいて記録した。結果は、完全に安定な−８０℃に維持された対照試料と比較して、活性パーセンテージまたは残留蛍光により示した。試料の別の群は、Telstar Cryodos-80凍結乾燥機中で凍結乾燥し、分析まで４℃または２５℃で貯蔵した。
【００２６】
細胞増殖試験
上記のＧＦＰを含む単離された封入体を、産生３時間後に、２５３ｎｍ波長の殺菌ＵＶランプに４時間暴露することにより殺菌した。これらを次にＰＢＳ中に再懸濁させ、ＩＢタンパク質の異なる量、具体的にはウェル当たり０．０８μｇ、０．８μｇおよび８μｇを用いて、組織培養培地（Becton Dickinson）で処理したFalcon 3072の９６ウェルポリスチレンプレート、または未処理のCostar 3370プレートを覆い、４℃で一晩インキュベートした。ビトロネクチン（Calbiochem）を、製造業者の指示に従って５０ｎｇ／ｃｍ２の濃度で参照として用いた。ウェルはＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロックした。新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株の１．５×１０２細胞を次に各ウェルに加え、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）に非必須アミノ酸、５％ウシ胎児血清、ゲンタマイシンおよび抗カビ剤を補足したものの中で、３７℃にて異なる時間インキュベートした。対照ウェルでは上記と正確に同じ処理を行ったが、ただしＩＢは除いた。
【００２７】
インキュベーション後、細胞増殖を製造業者の指示に従ってＥＺ４Ｕキット（Biomedica, GMBH）を用いて決定し、VICTOR3 V Multilabel Counter model 1420（Perkin Elmer）で分析した。吸光度の読取りは４５０ｎｍおよび６２０ｎｍを参照として、得た値は、培地のみを含むウェルに対して標準化した。予備試験を行って、キット試薬による飽和の前のインキュベーション時間を選択した；最適時間は、２４時間培養に対して３時間、４８時間培養に対して２時間、および７２時間培養に対して３０分であった。全ての試験はトリプリケートで行った。データは、各条件について行った３回の実験値の平均±ＳＥＭで表し、ＡＮＯＶＡ試験および、事後ボンフェローニ解析により統計的に評価した。有意水準はｐ＜０．０５であった。シリコン上の細胞増殖については、ＩＢグラフトを有する表面を適切なサイズに切り、ＵＶ照射し、組織培養培地を有するFalcon２４ウェルポリスチレンプレートに付着させ、ここで細胞は従来の手順で播種して培養した。
【００２８】
共焦点顕微鏡法による細胞培養物の分析
細胞培養物は、Leica TCS SP5 AOBS共焦点スペクトル顕微鏡（Leica Microsystems, Manheim, Germany）で、Plan-Apochromat６３×１．４ＮＡレンズを用いて試験した。全ての画像は、ガラス底ディッシュ上（MatTek Corporation, Ashland, MA, USA）で増殖した生細胞から得た。細胞は、１０％ウシ胎児アルブミンを補足したＤＭＥＭ＋Glutamax 1（Gibco）中での培養および収集の７２時間前に、ＧＦＰ含有封入体の密度４×１０４／ウェルで播種した。核および原形質膜の標識のために、細胞をそれぞれ５μｇ／ｍｌのHoechst 33342および５μｇ／ｍｌのCellMask（両者ともMolecular Probes, Inc., Eugene, OR, United Statesより）を用いて室温で５分間インキュベートし、共焦点検出の前に２回洗浄した。核は４０５ｎｍのレーザーダイオード光で励起し、４１４〜４６１ｎｍ（青チャネル）で観察した；原形質膜は、６３３ｎｍのヘリウムおよびネオンレーザー光による励起により検出し、蛍光を６５６〜７８９ｎｍで観察した（赤外線チャネル）；最後に、アルゴンレーザーからの４８８ｎｍの線を用いて、ＩＢ画像を得た（緑チャネル、５００〜５３７ｎｍでの発光）。２２の光学セクションのゼータ系列を、LAS AF（Leica Microsystems）ソフトウェアにより得て、３次元モデルをImarisソフトウェア（Bitplane, Zurich, Switzerland）を用いて作製した。
【００２９】
結果および考察
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）により形成されるＩＢは高度に蛍光性であるため、その生物学的産生の動態解析および機能解析のための便利なモデルである２０。ラクトース類似体であるＩＰＴＧを細菌培養物に添加後、ＩＢは、ＧＦＰ遺伝子の発現誘導の１時間後に、共焦点顕微鏡法により明白に見ることができ（図１Ａ）、組換えＧＦＰの合成の間約３時間まで容積的に増殖するので、広いサイズ範囲のＩＢの収集が可能である。実験室での、最適化の試みなしの細菌増殖の標準条件下において、産生は３時間後に５ｍｇ／ｌより高く（結果は示さず）、実際的なスケールについて非常に期待できる収率である。さらに、シャペロンまたはプロテアーゼの欠損した異なる大腸菌株は、in vivoでのタンパク質沈着の動態が異なるため、異なるサイズのＩＢ（図１Ｂ）を同じ収率で産生する。
【００３０】
天然の細胞から精製した成熟したＩＢは平均直径３４０ｎｍを示したが（独立した推定値と対応２１）、この値は突然変異細胞の使用により、５００ｎｍを越えるまで次第に増加させることができ（ＤｎａＫ−欠損細胞において）（図１Ｃ）、これと共に全ての分析試料において、比較的低い多分散性指標を示す。粒子の蛍光発光もまた、精製されたＩＢにおいてフローサイトメトリにより決定され、低蛍光のナノ粒子（天然株）から高蛍光のナノ粒子（ＣｌｐＰ−変異株）までの、規定の間隔が観察された（図１Ｄ）。次に、産生プロセスの間の収集時間（ＩＢの増殖のステージを決定する）と、産生株（生物学的活性とサイズの上限を決定する）との適切な組み合わせは、異なる用途に対して最適化可能な粒子の大きさおよび具体的な蛍光を規定する。例えば、ＣｌｐＡ−およびＣｌｐＰ−細胞において得られたＩＢで、よく似た粒径のもの（それぞれ０．４３５および０．４５９ｎｍ）は、異なる蛍光発光レベル（それぞれ、粒子当たり平均７１および１８４ＦＬ１単位）を示した。しかし、ＧＦＰを有するＩＢの蛍光のマッピングは、全ての株で類似しており、共通の中心同質な蛍光パターンを示す（図１Ｂ）。
【００３１】
ＩＢのナノスケール形態の特徴をさらに明らかにするために、これらをＡＦＭおよびＳＥＭで調査した。図２Ａ、Ｂ、Ｃに示すように、ＧＦＰを有する天然のＩＢのＡＦＭは、平均して長さ３００ｎｍ、直径１７０ｎｍおよび高さ２００ｎｍの、球状または円筒状の単離された粒子の存在を示す。実施した断面測定により、ＤＬＳ測定から得た統計データが確認された（図１Ｃ）。ＳＥＭ観察は、ＡＦＭ画像と一致して、ＩＢが粗い表面を有することを示し、天然とＤｎａＫ−細胞で得たＩＢの間の大きさの違いを強調する（図２Ｄ）。新鮮なＩＢ懸濁液中で実施したゼータ電位の測定は−９．８ｍＶを示し、これは、やや負に荷電された表面を示し、凝集物を形成するタンパク質の傾向と一致する。一方、生物学的試料を貯蔵するために一般に用いられる条件下での、ＩＢの安定性も調査した。ＩＢは、−８０℃、４℃、２５℃、およびまた３７℃での蛍光発光および構造の両方について、長期間完全に安定であることが見出され（図２Ｅ、Ｆ）、これは、貯蔵のみでなく、生理学的試験条件下でのＩＢの便利な使用および操作を可能とする。興味深いことには、ＩＢはまた、凍結乾燥（および、種々の追加の貯蔵条件下で、図２Ｆ）および超音波処理（示されず）の間も機械的および機能的に安定であり、多様な実験条件下でのその使用の可能性を拡大する。
【００３２】
細菌性ＩＢが容易に操作可能で、完全に生体適合物質であるので、これらの生物医学的目的に対する潜在的用途を簡単な演習により調査した。再生医療のための組織生成において、細胞結合および増殖は、物質の性質に依存して、プリンティング、リソグラフィおよび類似の手順による物質表面の特性の局所的改変により、刺激可能である。近年、物質による表面の機能化に基づくその他の戦略２２、２３、２４、２５、またはナノ粒子による表面の装飾もまた、細胞結合を刺激するために用いる物質の性質に依存することなく、表面組織および粗さの精密な調節を可能とする２６、２７。この文脈において、直径２４〜１５００ｎｍのシリカナノ粒子およびセラミクスは、細胞増殖機能に影響を及ぼし、装飾された表面での細胞増殖を正に調節することができる２４、２６。我々は、このサイズ間隔で現れる細菌ＩＢもまた、表面のナノ操作に有用であるかどうかを見出したいため、組織培養培地で処理したポリスチレンプレート上に沈着したＧＦＰを有するＩＢの（図３Ａ）、ＢＨＫ２１細胞の増殖に及ぼす効果を試験した（図３Ｂ、Ｃ）。
【００３３】
０．０５粒子／μｍ２の密度において、ＩＢは、５５．９ｎｍの二乗平均平方根（ＲＭＳ）粗さを有した。前記修飾表面において、ＢＨＫ２１細胞はＧＦＰを有する沈着したＩＢに密接に結合して増殖し、これは、細胞膜（赤）での染色が見られること、およびＩＢの蛍光（緑）が黄色のシグナルをもたらすことにより観察される（図３Ｂ）。驚くべきことには、細胞付着および増殖について広く最適化されているポリスチレン表面上で、従来の細胞結合剤、例えばビトロネクチンは、細胞増殖に対して検出可能な効果を示さなかった（図３Ｄ、Ｅ）。しかし、これらの有利な条件下で、ＩＢは、用量に依存して２倍以上も（図３Ｅ）顕著に細胞増殖を刺激した（図３Ｄ）。この効果は、他のナノ粒子で観察されるわずかなまたはゼロの効果よりも、大幅に顕著で生物学的に有意であり、他のナノ粒子では、規定のサイズにおいていくつかの細胞株が、刺激効果の代わりに阻害効果を示すようであった２６、２８、２９。興味深いことには、細胞変性または毒性症状は、ＩＢで処理した表面での増殖後の培養細胞では観察されなかった。共焦点３Ｄ画像の解析（図３Ｆ）は、ポリスチレンに結合したＩＢが完全に細胞膜内に組み込まれていることを示し、細胞表面と、細胞増殖表面を修飾しているＩＢナノ粒子との間の密接な相互作用を示唆する。
【００３４】
ＩＢの、細胞増殖の刺激物質としての有効性をさらに実証するために、ＩＢの微細構造化（microstructuration）を、アミノ末端化シリコン基板上で３０、３１、ミクロ接触プリンティング技法（μＣＰ）を用いて行った；μＣＰは、エラストマースタンプをＩＢの懸濁液に含浸させることを含む。図３Ｇは、ＩＢにより、密度０．０４ＩＢ／μｍ２およびＲＭＳ粗さ３２．４ｎｍでスタンプされたシリコン表面、および、これによる、ＩＢで線形に修飾された領域での細胞増殖の刺激を示す。これは、ＩＢにより誘導された細胞増殖に対する選好および、これらナノ粒子の、もともとは細胞増殖に適切でない表面において細胞増殖を刺激する能力を示す。
【００３５】
要約すると、細菌内で産生されたＩＢは、ナノスケールレベルでの重要な特徴について、生物学的産生の間に精密に設計することができ、ＩＢは、生物系において経済的なプロセスにより産生される、魅力あるナノ粒子物質である。もともと生体機能的であるため、またそれらが形成されるタンパク質が選択でき、その生物学的活性を産生細胞の遺伝子改変により調節できるため、ＩＢの操作は、異なるナノ医療分野においても広範囲で深遠な重要性を有し得る。特に、生物医学的適用性の第１の概念実証として、ＩＢは表面を効果的に機能化して、結合した哺乳動物細胞の増殖を顕著に促進する。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
【表２】
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【００３８】
【表３】
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【００３９】
【表４】
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【００４０】
【表５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【国際調査報告】
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