(57)【要約】  本発明は、Ｄｋｋ−１と結合する抗体およびその断片、より詳細には、Ｄｋｋ−１と結合するヒト化抗体およびその断片、さらにより詳細には、Ｄｋｋ−１と結合する完全ヒト化抗体および免疫学的に機能的な断片を提供する。また、Ｄｋｋ−１＋細胞との結合について抗マウスＤｋｋ−１モノクローナル抗体の結合と競合する、抗体およびその断片も提供される。また、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその断片をコードしている核酸、ならびに抗Ｄｋｋ−１抗体およびその断片の組換え発現のためにこれらの核酸が組み込まれている発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。また、本発明の抗体およびその断片を調製する方法も提供される。また、骨同化剤も提供する。また、本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物も提供する。さらに、骨の減少をもたらす骨障害などの疾患、状態および障害を治療する方法を提供する。また、骨量の減少を治療または予防する方法、骨量の増加を誘導する方法、およびＷｎｔ活性を誘導する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１（Ｄｋｋ−１）ポリペプチドと特異的に結合し、モノクローナル抗体ＪＣ１８と同じ、Ｄｋｋ−１上のエピトープと結合する抗原結合領域を含む、単離された抗体またはその免疫学的に機能的な断片。
【請求項２】
配列番号３０、４９もしくは５０に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３２もしくは５１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号３４もしくは５２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、またはＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、および／もしくはＶＨ  ＣＤＲ３中に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む、Ｄｋｋ−１と特異的に結合する単離された抗体。
【請求項３】
配列番号２２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３をさらに含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域が配列番号２８に示すアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号４２または３８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号４０または３６に示すアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号４０または３６のＣ末端リシンを有するまたは有さない、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号２２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号２６に示すアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、および／もしくはＶＬ  ＣＤＲ３中に１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む、Ｄｋｋ−１と特異的に結合する単離された抗体。
【請求項７】
請求項３に記載の抗体または免疫学的に活性な断片のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３をコードしている配列を含む核酸。
【請求項８】
請求項４に記載の抗体または免疫学的に活性な断片のＶＨ、ＶＬ、またはＶＨおよびＶＬの両方をコードしている配列を含む核酸。
【請求項９】
請求項５に記載の抗体または免疫学的に活性な断片の軽鎖、重鎖、または軽鎖および重鎖の両方をコードしている配列を含む核酸。
【請求項１０】
請求項６に記載の抗体または免疫学的に活性な断片のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３をコードしている配列を含む核酸。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む単離された細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞を培養するステップを含む、抗体またはその免疫学的に活性な断片を作製する方法。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれかに記載の抗体または断片と薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体とを含む組成物。
【請求項１５】
有効量の請求項１から６のいずれかに記載の抗体または断片を、それを必要としている患者に投与するステップを含む、骨量の減少を治療または予防する方法。
【請求項１６】
前記患者が、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、歯周病、関節リウマチ、および不動による骨減少を患っている患者から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
有効量の請求項１から６のいずれかに記載の抗体または断片を、それを必要としている患者に投与するステップを含む、骨量の増加を誘導する方法。
【請求項１８】
有効量の請求項１から６のいずれかに記載の抗体または断片を、それを必要としている患者に投与するステップを含む、Ｗｎｔ活性を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、いずれもその全体が本明細書中に参照により組み込まれている２００９年５月１２日に出願の米国仮出願第６１／１７７，６５０号および２００９年９月２２日に出願の米国仮出願第６１／２４４，６３８号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｄｋｋ−１と結合する抗体およびその断片、より詳細には、Ｄｋｋ−１と結合するヒト化抗体およびその断片、さらにより詳細には、Ｄｋｋ−１、特にヒトＤｋｋ−１と特異的に結合する完全ヒト化抗体および断片に関する。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその断片をコードしている核酸、ならびに抗Ｄｋｋ−１抗体の組換え発現のためにこれらの核酸が組み込まれている発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。また、骨同化剤も提供する。また、本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物も提供する。さらに、骨の減少をもたらす骨障害などの疾患、状態および障害を治療する方法を提供する。また、骨量の減少を治療または予防する方法、骨量の増加を誘導する方法、およびＷｎｔ活性を誘導する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｗｎｔとは、低密度受容体関連タンパク質（ＬＲＰ５／６）およびフリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）タンパク質が含まれる受容体複合体と結合し、それを活性化する分泌性糖タンパク質である。Ｃａｄｉｇａｎ，Ｋ．Ｍ．およびＹ．Ｉ．Ｌｉｕ（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１９、３９５〜４０２、Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３０（２２）：５２９７〜３０５、ならびにＰｉｎｓｏｎ，Ｋ．Ｉ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０７（６８０３）：５３５〜８。
【０００４】
Ｗｎｔ／ＬＲＰ５が骨量を調節すること、およびＷｎｔシグナル伝達経路の活性化が骨量の自然増加をもたらすことが開示されている。Ｂｏｙｄｅｎ，Ｌ．Ｍ．ら（２００２）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３４６：１５１３〜１５２１、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｄ．ら（２００２）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、７０：１１〜１９、およびＧｏｎｇ，Ｙ．ら（２００１）Ｃｅｌｌ、１０７：５１３〜５２３。Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１（Ｄｋｋ−１）などの分泌性分子を含めたアンタゴニストによって厳密に調節される。Ｔｉａｎ，Ｅ．ら（２００３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３４９：２４８３〜２４９４。ヒトで観察される高い骨量（ＨＢＭ）の表現型は、Ｄｋｋ−１がＬＲＰ５と結合する能力を阻害する、ＬＲＰ５中の単一の点突然変異（Ｇ１７１Ｖ）が原因であることが見出された。Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２４（１１）：４６７７〜８４。
【０００５】
骨形成および骨成長におけるＷｎｔシグナル伝達の重要な役割により、Ｄｋｋ−１は、たとえば、たとえば治療されない骨粗鬆症の結果として起こる骨折の回数を減少させることによる、増加した骨芽細胞活性（対応する骨吸収の増加を伴わない、増加した骨量密度、増加した骨形成）が患者に有利となるであろう疾患または状態の治療の有用な標的となる。ＷＯ２００６／０１５３７３（ＵＳ２００６／０１２７３９３）は、骨障害を含めた様々な疾患を治療するためのＤｋｋ−１に対する抗体を開示している。ＵＳ２００８／０１９３４４９は、Ｄｋｋ−１のＬＲＰ５との結合を阻害するＤｋｋ−１に特異的な抗体、骨成長を刺激するためのそのような抗体を含む組成物、および骨粗鬆症などの骨障害を治療するためのそのような抗体を含む組成物を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのような骨形成の増加が患者に有利となるであろう骨粗鬆症などの疾患、状態および障害を治療するための、Ｄｋｋ−１活性に拮抗することによって骨芽細胞活性を増加させる新しい骨同化剤の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ｄｋｋ−１と結合する抗体およびその断片（たとえば抗原結合部分）、より詳細には、Ｄｋｋ−１と結合するヒト化抗体およびその断片、さらにより詳細には、Ｄｋｋ−１と結合する完全ヒト化抗体および免疫学的に機能的な断片に関する。抗体およびその断片は、Ｗｎｔ活性を阻害するＤｋｋ−１の能力に拮抗する。抗体およびその免疫学的に機能的な断片は、対応する骨量の増加を伴って、骨におけるＷｎｔシグナル伝達経路を阻害するＤｋｋ−１の能力に拮抗する。抗体およびその免疫学的に機能的な断片には、天然に存在する構造を有する抗体、および抗原結合ドメイン（たとえばドメイン抗体）を有するポリペプチドが含まれる。抗体およびその免疫学的に機能的な断片は、骨粗鬆症などの、骨量の減少に関連するものを含めた、様々な疾患、状態および障害を治療するために使用することができる。また、抗体およびその免疫学的に機能的な断片は、たとえば、コルチコステロイド、アロマターゼ阻害剤、またはチアゾリジンチオン（ＴＺＤ）を用いた長期処置、無食欲症から生じるもしくはそれに付随する骨減少、または性腺機能低下症もしくは腎性骨胃栄養症に関連する骨減少などの、二次的な骨減少に関連する疾患、状態、または障害を治療するためにも使用することができる。
【０００８】
提供される抗体およびその機能的な断片の一部には、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数の軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）配列番号３０、４９もしくは５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号３２もしくは５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３４もしくは５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
が含まれる。
【０００９】
そのような抗体およびその免疫学的に機能的な断片は、Ｄｋｋ−１ポリペプチドと特異的に結合することができる。これらの抗体およびその免疫学的に機能的な断片の一部には、前述のＣＤＲのうちの１個、２個、３個、４個、５個または６個すべてが含まれる。
【００１０】
また、提供された配列の保存的修飾も提供される。
【００１１】
さらに提供された抗体およびその免疫学的に機能的な断片のＬＣおよびＨＣは、前述の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００１２】
ＣＤＲ１が配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有し、および／またはＣＤＲ３が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＬＣを有する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片がさらに提供される。
【００１３】
ＣＤＲ１が配列番号３０、４９または５０に記載のアミノ酸を有し、ＣＤＲ２が配列番号３２または５１に記載のアミノ酸配列を有し、および／またはＣＤＲ３が配列番号３４または５２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣを有する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片がさらに提供される。
【００１４】
ＣＤＲ１が配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有し、および／またはＣＤＲ３が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＬＣ、ならびにＣＤＲ１が配列番号３０、４９または５０に記載のアミノ酸を有し、ＣＤＲ２が配列番号３２または５１に記載のアミノ酸配列を有し、および／またはＣＤＲ３が配列番号３４または５２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣを有する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片がさらに提供される。
【００１５】
ＣＤＲ１が配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＬＣ、ならびにＣＤＲ１が配列番号３０、４９または５０に記載のアミノ酸を有し、ＣＤＲ２が配列番号３２または５１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３４または５２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣを有する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片がさらに提供される。
【００１６】
また、（ａ）配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ可変領域（ＶＬ）、（ｂ）配列番号２８に記載の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ可変領域（ＶＨ）、または（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨが含まれる、抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供される。
【００１７】
また、構造が類似であるが、ＶＬが配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＶＨが配列番号２８に記載の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供される。
【００１８】
また、構造が類似であるが、ＶＬが配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＶＨが配列番号２８に記載の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供される。
【００１９】
また、配列番号２０に記載の配列を有するＶＬおよび配列番号２８に記載の配列を有するＶＨが含まれる、抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供される。
【００２０】
提供される抗体およびその機能的な断片の一部は、配列番号３８または配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＬＣ、および／または配列番号３６または配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＨＣを有する。
【００２１】
提供される抗体およびその機能的な断片の一部は、配列番号３８または配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるＬＣ、および配列番号３６または配列番号４０に記載のアミノ酸配列からなるＨＣを有する。
【００２２】
Ｄｋｋ−１＋細胞との結合についてマウスＭａｂＪＣ１８と競合することができる、抗体およびその免疫学的に機能的な断片がさらに提供される。一実施形態では、本発明は、ヒトＤＫＫ−１抗原と特異的に結合し、Ｄｋｋ−１＋細胞との結合についてマウスＭａｂＪＣ１８と競合することができ、ＬＣ可変領域のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびＨＣ可変領域のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が以下のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体またはその断片を提供する：ＬＣ：（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、ＨＣ：（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）。
【００２３】
また、本発明は、ヒトＤＫＫ−１抗原と特異的に結合し、ＬＣ可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびＨＣ可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が以下のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体またはその断片も提供する：ＬＣ：（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、ＨＣ：（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、ここで、ＬＣの可変ドメインフレームワークは、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有する。
【００２４】
また、本発明は、ヒトＤＫＫ−１抗原と特異的に結合し、ＬＣ可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびＨＣ可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が以下のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体またはその断片も提供する：ＬＣ：（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、ＨＣ：（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、ここで、ＨＣの可変ドメインフレームワークは、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する。
【００２５】
また、本発明は、ヒトＤＫＫ−１抗原と特異的に結合し、ＬＣ可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびＨＣ可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が以下のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体またはその断片も提供する：ＬＣ：（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、ＨＣ：（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、ここで、ＬＣの可変ドメインフレームワークは、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有し、ＨＣの可変ドメインフレームワークは、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する。
【００２６】
本発明の抗体の１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質がさらに提供される。一実施形態では、配列番号２０に記載のＬＣ可変領域の少なくとも１０個の連続的なアミノ酸および／または配列番号２８に記載のＨＣ可変領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。
【００２７】
別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２０に記載のＬＣ可変領域および／または配列番号２８に記載のＨＣ可変領域を含む。
【００２８】
別の実施形態では、融合ポリペプチドは、
（ａ）以下からなる群から選択される、軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）配列番号３０、４９または５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号３２または５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３４または５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３
のうちの１つまたは複数を含む。
【００２９】
別の実施形態では、融合タンパク質は、ＨＣ  ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）およびＬＣ  ＣＤＲ３（配列番号２６）を含む。
【００３０】
別の実施形態では、融合タンパク質は、本発明の１つまたは複数の抗体、および、たとえば異種配列または別の領域の相同配列などの、それがネイティブ分子中では付着していないアミノ酸配列を含む。一実施形態では、異種配列は、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグから選択されるタグである。
【００３１】
また、固体支持体へのカップリングを促進する薬剤とコンジュゲートした、抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供される。一実施形態では、抗体およびその断片は、固体支持体へのカップリングを促進する薬剤と連結している。一実施形態では、固体支持体はビオチンまたはアビジンである。
【００３２】
また、標識剤と連結した、抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供される。一実施形態では、標識剤は蛍光分子または放射性分子である。
【００３３】
提供される様々な抗体およびその免疫学的に機能的な断片には、単一のＬＣもしくはＨＣ、または単一の可変軽鎖ドメインおよび／もしくは単一の可変重鎖ドメインが含まれていてもよい。提供される他の抗体および断片には、２つのＬＣおよび／または２つのＨＣが含まれていてもよく、一部の実施形態では、２つのＬＣは互いに同一であり、および／または、一部の実施形態では、２つのＨＣは互いに同一である。提供される抗体には、たとえば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体が含まれ得る。提供される抗体の免疫学的に機能的な断片には、それだけには限定されないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（ＦＡＢ’）２、またはドメイン抗体が含まれ得る。一実施形態では、抗体は、約１００ｐＭ以下のＫｄでＤｋｋ−１ポリペプチドから解離する。
【００３４】
また、抗体およびその断片をコードしている様々な核酸も提供される。たとえば、一部の核酸は、コードされているＣＤＲが、Ｄｋｋ−１ポリペプチドと特異的に結合することができる抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードしているように、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲをコードしている。たとえば、一部の核酸は、コードされているＣＤＲが、Ｄｋｋ−１ポリペプチドと特異的に結合することができる抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードしているように、配列番号３０、配列番号３２または配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲをコードしている。一部の実施形態では、核酸は、抗体のＶＬおよび／もしくはＶＨ領域またはその免疫学的に機能的な断片をコードしている配列を含み、またはそれからなり、ＶＬは、配列番号２０に記載の配列の組に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、ＶＨは、配列番号２８に記載の配列の組に対して少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、核酸には、配列番号２０に記載の配列を含む、またはそれからなるＶＬをコードしている配列、および／または配列番号２８に記載の配列を含む、またはそれからなるＶＨをコードしている配列が含まれる。他の実施形態では、核酸には、前述の配列特徴を有するＶＬおよびＶＨの両方をコードしている配列が含まれる。
【００３５】
以下のうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドがさらに提供される：（ａ）表４に示すｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体、（ｂ）表４に示す抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体の断片または領域、（ｃ）表４に示す抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体の軽鎖、（ｃ）表４に示す抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体の重鎖、（ｄ）表４に示す抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体のＬＣおよび／またはＨＣの１つまたは複数の可変領域、（ｅ）表４に示す抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体の１つまたは複数のＣＤＲ（１個、２個、３個、４個、５個または６個のＣＤＲ）、（ｆ）抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８のＨＣのＣＤＲ  Ｈ３、（ｇ）抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８のＨＣのＣＤＲ  Ｈ１、（ｈ）アミノ酸Ｇ５７がＧまたはＷである、および／またはＦ５８がＦ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｍ、またはＶである、および／またはＱ５９がＱ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｒ、またはＷである、抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８のＨＣのＣＤＲ  Ｈ２、（ｉ）アミノ酸Ｔ１００がＴまたはＳである、および／またはアミノ酸Ｌ１０２がＬまたはＹである、および／またはアミノ酸Ｅ１０３がＥ、Ｒ、Ｑ、Ｄ、またはＫである、抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８のＨＣのＣＤＲ  Ｈ３、（ｊ）アミノ酸Ｅ２７Ｅ、Ｑである、および／またはアミノ酸Ｄ３０がＤまたはＳである、および／またはアミノ酸Ｄ３１がＤまたはＳである、および／またはアミノ酸Ｆ３２がＦまたはＳである、および／またはアミノ酸Ｇ３３がＧまたはＹである、および／またはアミノ酸Ｉ３４がＩまたはＬである、および／またはアミノ酸Ｓ３５がＳまたはＡである、および／またはアミノ酸Ｆ３６がＦまたはＷである、および／またはアミノ酸Ｉ３７がＩまたはＭである、抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８のＬＣのＣＤＲ  Ｌ１、（ｋ）アミノ酸Ｇ５５がＧまたはＡである、および／またはアミノ酸Ｓ５６がＳまたはＴである、抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８のＬＣのＣＤＲ  Ｌ２、（ｌ）アミノ酸Ｑ９４がＱまたはＨである、および／またはアミノ酸Ｌ９５がＬ、Ｓ、Ａ、またはＧである、および／またはアミノ酸Ｋ９６がＫ、Ｉ、Ｌ、Ｗ、ＭまたはＳである、および／またはアミノ酸Ｅ９７がＥまたはＤである、および／またはアミノ酸Ｖ９８がＶまたはＬである、および／またはアミノ酸Ｐ９９がＰまたはＷである、および／またはアミノ酸Ｐ１００がＰ、ＳまたはＧである、および／またはアミノ酸Ｔ１０１がＴ、ＹまたはＬである、抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８のＬＣのＣＤＲ  Ｌ３、（ｍ）表４に示す抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体のＬＣの３個のＣＤＲ、（ｎ）表４に示す抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体のＨＣの３個のＣＤＲ、（ｏ）表４に示す抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８またはその変異体の、ＬＣの３個のＣＤＲおよびＨＣの３個のＣＤＲ、ならびに（ｐ）（ｂ）から（ｐ）のうちの任意の１つを含む抗体。
【００３６】
また、そのような核酸配列に相補的な任意のポリヌクレオチドも提供される。ポリヌクレオチドは一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖とすることができ、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子には、たとえば、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。追加のコードまたは非コード配列が、必ずしもではないが提供されるポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必ずしもではないが他の分子および／または支持体物質と連結していてもよい。
【００３７】
ネイティブ配列（すなわち、抗体またはその一部分をコードしている内在配列）を含むことができるか、またはそのような配列の変異体を含み得る、ポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチド変異体は、ネイティブの免疫反応性分子と比較して、コードされているポリペプチドの免疫反応性が消失しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有することができる。変異体は、好ましくは、ネイティブ抗体またはその一部分をコードしているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは約９５％の同一性を示す。
【００３８】
また、本発明は、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号３０、４９または５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号３２または５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３４または５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＬＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有する、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子も提供する。
【００３９】
また、本発明は、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号３０、４９または５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号３２または５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３４または５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＨＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子も提供する。
【００４０】
また、本発明は、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号３０、４９または５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号３２または５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３４または５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＬＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有し、ＨＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子も提供する。
【００４１】
また、本発明は、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＬＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有し、ＨＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子も提供する。
【００４２】
ＤＮＡ分子の一部の実施形態では、ＬＣ  ＣＤＲのヌクレオチド配列は以下のとおりである：
ＣＤＲ１：配列番号２１に記載のとおり
ＣＤＲ２：配列番号２３に記載のとおり
ＣＤＲ３：配列番号２５に記載のとおり。
【００４３】
ＤＮＡ分子の一部の実施形態では、ＨＣ  ＣＤＲのヌクレオチド配列は以下のとおりである：
ＣＤＲ１：配列番号２９に記載のとおり
ＣＤＲ２：配列番号３１に記載のとおり
ＣＤＲ３：配列番号３３に記載のとおり。
【００４４】
ＤＮＡ分子の一部の実施形態では、ＬＣ可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１９に記載のとおりである。
【００４５】
ＤＮＡ分子の一部の実施形態では、ＨＣ可変領域のヌクレオチド配列は配列番号２７に記載のとおりである。
【００４６】
ＤＮＡ分子の一部の実施形態では、ＬＣのヌクレオチド配列は配列番号３７または配列番号４１に記載のとおりである。
【００４７】
ＤＮＡ分子の一部の実施形態では、ＨＣのヌクレオチド配列は配列番号３５または配列番号３９に記載のとおりである。
【００４８】
抗体またはその断片（ｆｒａｍｅｎｔ）をコードしているポリヌクレオチド配列またはＤＮＡ分子のうちの任意のものを含むベクター、たとえば発現ベクターがさらに提供される。
【００４９】
一実施形態では、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号３０、４９または５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号３２または５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３４または５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＬＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有する、発現ベクターの形態の、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子が提供される。
【００５０】
一実施形態では、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号３０、４９または５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号３２または５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３４または５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＨＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する、発現ベクターの形態の、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子が提供される。
【００５１】
一実施形態では、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号３０、４９または５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号３２または５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３４または５２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＬＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有し、ＨＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する、発現ベクターの形態の、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子が提供される。
【００５２】
一実施形態では、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＬＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有し、ＨＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する、発現ベクターの形態の、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子が提供される。
【００５３】
また、本発明の発現ベクターで形質転換させた宿主も提供される。一実施形態では、
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を含み、ＬＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＫＶ３−１１生殖系列フレームワークおよびＩＧＫＪ４領域を含有し、ＨＣの可変ドメインフレームワークが、ヒトＩＧＨＶ３−０７生殖系列フレームワーク（単一の復帰突然変異：Ｒ１００からＴを有する）およびＩＧＨＪ６領域を含有する、ヒト化抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換させた宿主が提供される。
【００５４】
また、ヒトＤＫＫ−１抗原と特異的に結合し、ＬＣおよびＨＣのＣＤＲが以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を有する、ヒト化抗体（ａｎｉｔｂｏｄｙ）またはその断片の軽鎖および重鎖をコードしている組換え発現系を含む宿主細胞も提供される。
【００５５】
ヒトＤｋｋ−１抗原と特異的に結合し、ＬＣおよびＨＣのＣＤＲが以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を有する、ヒト化抗体またはその断片を調製する方法であって、（ｉ）ヒト化抗体またはその断片の軽鎖をコードしている第１の発現ベクターおよびヒト化抗体またはその断片の重鎖をコードしている第２の発現ベクター、または（ｉｉ）ヒト化抗体またはその断片の軽鎖および重鎖の両方をコードしている単一の発現ベクターのいずれかで形質転換させた宿主を提供するステップと、それぞれの鎖が発現されるような条件下で前記宿主を維持するステップと、そのようにして発現された鎖のアセンブリによって形成されたヒト化抗体またはその断片を単離するステップとを含む方法がさらに提供される。
【００５６】
ＬＣおよびＨＣのＣＤＲが以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を有する、ヒトＤＫＫ−１抗原と特異的に結合するヒト化抗体またはその断片を作製する方法であって、前記抗体またはその断片のＬＣおよびＨＣをコードしている組換え発現系を含む宿主細胞を培養するステップと、前記抗体またはその断片を回収するステップとを含む方法がさらに提供される。
【００５７】
本発明は、ヒト化抗体またはその断片の軽鎖および重鎖をコードしている組換え発現系を含む宿主細胞を培養するステップを含むヒト化抗体またはその断片であって、前記抗体または断片がヒトＤＫＫ−１抗原と特異的に結合し、ＬＣおよびＨＣのＣＤＲが以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を有し、前記抗体または断片がヒトＤｋｋ−１抗原との結合についてｍｕＭａｂＪＣ１８と競合することができる、ヒト化抗体またはその断片を提供する。
【００５８】
また、ヒトＤｋｋ−１抗原と特異的に結合し、ＬＣおよびＨＣのＣＤＲが以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を有する、ヒト化抗体またはその断片と、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体とを含む医薬組成物も提供される。
【００５９】
また、ヒトＤｋｋ−１抗原と特異的に結合し、ヒトＤＫＫ−１抗原との結合についてｍｕＭａｂＪＣ１８と競合することができ、ＬＣおよびＨＣのＣＤＲが以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を有する、ヒト化抗体またはその断片と、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体とを含む医薬組成物も提供される。
【００６０】
ヒト化抗体またはその断片を作製する方法であって、ヒト化抗体またはその断片のＬＣおよびＨＣをコードしている組換え発現系を含む宿主細胞を培養するステップであって、前記抗体または断片がヒトＤｋｋ−１抗原と特異的に結合し、ＬＣおよびＨＣのＣＤＲが以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＬＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２２）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２４）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２６）、
（ｂ）以下からなる群から選択される、１つまたは複数のＨＣ  ＣＤＲ：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号３０、４９または５０）、
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号３２または５１）、および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号３４または５２）、または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＣＤＲ
を有し、前記ヒト化抗体またはその断片が、ヒトＤｋｋ−１抗原との結合についてｍｕＭａｂＪＣ１８と競合することができるステップと、前記ヒト化抗体またはその断片を回収するステップとを含む方法がさらに提供される。
【００６１】
また、本発明は、有効量の本発明のヒト化抗体およびその断片を、それを必要としている患者に投与するステップを含む、骨量の減少を治療または予防する方法も提供する。一実施形態では、患者とは、骨に転移する癌を患っている者である。一実施形態では、患者とは、多発性骨髄腫を患っている者である。一実施形態では、患者は、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、歯周病、関節リウマチ、および不動による骨減少を患っている患者から選択される。一実施形態では、患者は骨粗鬆症を患っている。一実施形態では、患者はエストロゲン欠乏を患っている。
【００６２】
また、本発明は、有効量の本発明のヒト化抗体およびその断片を、それを必要としている患者に投与するステップを含む、骨量の増加を誘導する方法も提供する。一実施形態では、患者とは、骨に転移する癌を患っている者である。一実施形態では、患者とは、多発性骨髄腫を患っている者である。一実施形態では、患者は、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、歯周病、関節リウマチ、および不動による骨減少を患っている患者から選択される。一実施形態では、患者は骨粗鬆症を患っている。一実施形態では、患者とは、骨移植レシピエントまたは骨折を患っている者である。一実施形態では、患者は、コルチコステロイド、アロマターゼ阻害剤、またはＴＺＤを用いた長期処置、無食欲症が原因の、または性腺機能低下症もしくは腎性骨胃栄養症によって引き起こされる二次的な骨減少を有する。
【００６３】
また、本発明は、有効量の本発明のヒト化抗体またはその断片を、それを必要としている患者に投与するステップを含む、Ｗｎｔ活性を誘導する方法も提供する。
【００６４】
また、本発明は、抗Ｄｋｋ−１中和モノクローナル抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供する。一実施形態では、抗体またはその断片は、Ｋｄ＜１００ｐＭでヒトＤｋｋ−１と結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、機能的な細胞に基づくアッセイにおいて１００ｎＭより低いＩＣ５０でＤｋｋ−１の作用に拮抗する。一実施形態では、抗体またはその断片は、１カ月に１回の２５０ｍｇ以下の投薬の後に骨塩密度（ＢＭＤ）の測定値を増加させることが予想される予測ヒト曝露プロフィールを有する。
【００６５】
また、そのような増加した骨形成が患者に有利となる、骨粗鬆症、および二次的な骨減少から生じるもの（たとえば、コルチコステロイド、アロマターゼ阻害剤、またはＴＺＤを用いた長期処置、無食欲症が原因のもの、または性腺機能低下症もしくは腎性骨胃栄養症によって引き起こされるもの）などの、疾患、状態および障害の処置に有用な、Ｗｎｔ活性を阻害するＤｋｋ−１の能力に拮抗し、その結果、骨量の増加をもたらす、骨同化剤も提供される。
【００６６】
本発明の抗体およびその断片は、他の医薬剤（特に、本明細書中以下に記載する、一次的および二次的な骨減少、骨量の減少、および骨強度を弱めるものを処置または予防するために使用される薬剤）と組み合わせて投与し得る。組合せ療法は、たとえば、（ａ）本発明のヒト化抗体またはその断片、本明細書中に記載の少なくとも１つの追加の医薬剤および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、または担体を含む単一の医薬組成物として、または（ｂ）（ｉ）本発明のヒト化抗体またはその断片および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、または担体を含む第１の組成物、ならびに（ｉｉ）本明細書中に記載の少なくとも１つの追加の医薬剤および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、または担体を含む第２の組成物を含む、２つの別々の医薬組成物としてなどの、任意の適切な方法で投与し得る。医薬組成物は、同時にまたは連続的に、任意の適切な順序で投与し得る。
【００６７】
本発明によって提供される抗体および／またはその断片を含む、または本発明によって提供される医薬組成物を含むキットがさらに提供される。一実施形態では、キットには、抗体または断片を調製する方法、および／または抗体または断片を投与する方法の指示書がさらに含まれる。別の実施形態では、キットは、患者がＷｎｔシグナル伝達経路を阻害することによって骨量を増加させる能力を有するかどうかを決定するための、診断薬として使用する。
【００６８】
また、２００９年２月１８日にＡＴＣＣで行った２つの受託も提供される（ブダペスト条約に従う）。ｈｕＭａｂＪＣ１８のＨＣ可変領域を有するプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを受託した：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ、宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＵＣ２５５５３中、ＡＴＣＣ特許受託指定ＰＴＡ−９８３５。ｈｕＭａｂＪＣ１８のＬＣ可変領域を有するプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを受託した：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ、宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＵＣ２５５５４中、ＡＴＣＣ特許受託指定ＰＴＡ−９８３６。このように受託したプラスミドの、公的利用可能性に関するすべての制限は、本発明の明細書から特許が発行された際に、取り消し不能な形で取り除かれる。
【００６９】
本開示の他の特徴および利点は、限定的であると解釈されるべきでない以下の詳細な説明および実施例から明らかとなろう。本明細書全体にわたって引用したすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋのエントリー、特許および公開特許出願の内容は、その全体が本明細書中に参照により明白に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】インタクトなマウスモデルにおける抗マウスＤｋｋ−１モノクローナル抗体（ＪＣ１８）の効果を示す図である。大腿遠位の全ＢＭＤは、ＪＣ１８処置によって、すべての用量レベルにおいて有意に増加した。
【図１Ｂ】インタクトなマウスモデルにおける抗マウスＤｋｋ−１モノクローナル抗体（ＪＣ１８）の効果を示す図である。また、ＪＣ１８は、マウスにおいて６０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで骨形成速度も有意に増加させた。
【図２】インタクトなマウスモデルにおける、Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体のマウスキメラ（マウスキメラ−キメラのヒト−マウス抗体）の効果を示す図である。マウスキメラは、ビヒクルと比較して１〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で全ＢＭＤを増加させた。
【図３】ＪＣ１８が、ＯＶＸマウスモデルにおいて、エストロゲン欠乏によって誘導される骨減少を予防したことを示す図である。予想どおり、全ＢＭＤの有意な減少によって実証されるように、ビヒクルを用いて処置したマウスはＯＶＸの８週間後に骨減少症を示した。ＪＣ１８は、大腿遠位でｐＱＣＴによって測定して、ＯＶＸマウスのビヒクル処置と比較して、全ＢＭＤを用量応答的に７〜２０％増加させた。ＪＣ１８で１５ｍｇ／ｋｇ、週に２回処置したマウスでは、全ＢＭＤはビヒクルを用いて処置したＯＶＸマウスよりも高かっただけでなく、偽対照レベルで維持され、これは、この用量および投薬レジメンでは、ＪＣ１８がＯＶＸマウスにおける骨減少症の発生を完全に予防したことを示している。
【図４】ＪＣ１８とヒト相同体Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−３およびＤｋｋ−４との結合の特異性を示す図である。ＪＣ１８は、ヒトＤｋｋ−４に対して弱い結合を示し、ヒトＤｋｋ−３に対して５ｕｇ／ｍｌまで結合を示さなかった。
【図５】標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）モデルを示す図である。
【図６】１、５、１０および１００ｕｇ／ｋｇでの単一の静脈内投与後のラットにおけるＶ５−Ｈｉｓでタグ付けしたｈ−ＤＫＫ−１の血清濃度を示すグラフである。０．５時間より後の０．００１ｍｇ／ｋｇの時点、１時間より後の０．００５ｍｇ／ｋｇの時点ならびに２時間より後の０．０１および０．１ｍｇ／ｋｇの時点で、試料はアッセイ方法の定量可能な限界未満であり、プロットに含めなかった。
【図７】スプラーグ−ドーリーラットにｈｕＭａｂＪＣ１８を週に１回、静脈内投与した後の、観察されたおよびモデル予測した遊離／部分的遊離ｈｕＭａｂＪＣ１８の濃度対時間を示すグラフである。記号は平均観察データ（±ＳＤ）を表し、線はモデルからの予測されたプロフィールを表す。
【図８】Ａ〜Ｅは、スプラーグ−ドーリーラットにｈｕＭａｂＪＣ１８を週に１回、静脈内投与した後の、観察されたおよびモデル予測した遊離Ｄｋｋ−１の濃度対時間を示すグラフである。記号は平均観察データ（±ＳＥ）を表し、線はモデルからの予測されたプロフィールを表す。抗ｈｕＭａｂＪＣ１８抗体が検出された試料は分析から除去した。
【図９】Ａ〜Ｂは、カニクイザルにｈｕＭａｂＪＣ１８を単一静脈内投与した後の、観察されたおよびモデル予測した遊離／部分的遊離ｈｕＭａｂＪＣ１８の濃度対時間を示すグラフである。図９Ａは雄のサル。図９Ｂは雌のサル。記号は観察された個々のサルのデータを表し、線はモデルからの予測されたプロフィールを表す。
【図１０】Ａ〜Ｅは、カニクイザルにｈｕＭａｂＪＣ１８を単一静脈内投与した後の、観察されたおよびモデル予測した遊離Ｄｋｋ−１の濃度対時間を示すグラフである。記号は観察されたデータを表し、線はモデルからの予測されたプロフィールを表す。
【図１１】スプラーグ−ドーリーラットにｈｕＭａｂＪＣ１８を週に１回、静脈内投与した後の、最初の投薬の１．５および２．５週間後での平均オステオカルシンの濃度（±ＳＥ）を示すグラフである。＊は、ビヒクルに対するｐ＜０．０５を示す。
【図１２】ｈｕＭａｂＪＣ１８を月に１回、６カ月の間皮下投与した後の、ヒトにおける予測された遊離Ｄｋｋ−１の濃度を示すグラフである。３つの異なる用量を試験した：０．００３ｍｇ／ｋｇはＭＡＢＥＬの１／１０または効果のない用量を表し、０．０３ｍｇ／ｋｇはＭＡＢＥＬを表し、３．５７ｍｇ／ｋｇは骨粗鬆症の予測された有効な用量を表す。
【図１３】ｈｕＭａｂＪＣ１８を月に１回、６カ月の間皮下投与した後の、ヒトにおける予測された遊離ｈｕＭａｂＪＣ１８の濃度を示すグラフである。３つの異なる用量を試験した：０．００３ｍｇ／ｋｇはＭＡＢＥＬの１／１０または効果のない用量を表し、０．０３ｍｇ／ｋｇはＭＡＢＥＬを表し、３．５７ｍｇ／ｋｇは骨粗鬆症の予測された有効な用量を表す。生物分析アッセイの見込まれる定量限界（ＬＯＱ）は、予測されたＭＡＢＥＬよりも低い投薬が無益であることを表すことを示す。
【図１４】ｈｕＭａｂＪＣ１８の受容体占有率の計算対（１）定常状態平衡方法（Ｄｕｆｆ、２００６）および（２）機構的ＰＫ／ＰＤ（ＴＭＤＤ）モデルに基づく予測されたヒト用量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本開示は、Ｄｋｋ−１と特異的に結合する、単離された抗体およびその断片（たとえば抗原結合部分）、特にヒト化モノクローナル抗体およびその断片に関する。一部の実施形態では、本開示の抗体およびその断片は、特定の重鎖および軽鎖の生殖系列配列に由来する、および／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。本開示は、たとえば、単離された抗体およびその断片、そのような抗体またはその断片を作製する方法、ならびに抗体またはその断片を含有する医薬組成物を提供する。また、本開示は、Ｄｋｋ−１を検出するため、および骨の損失をもたらす骨障害などの様々な疾患、状態または障害を治療するため等の、抗体およびその断片を使用する方法にも関する。また、骨量の減少を治療または予防する方法、骨量の増加を誘導する方法、およびＷｎｔ活性を誘導する方法も提供する。
【００７２】
定義
本明細書中で別段に定義しない限りは、本発明に関連して使用する科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別段に必要とされない限りは、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。一般に、本明細書中に記載した細胞や組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、タンパク質や核酸の化学およびハイブリダイゼーション、ならびにその技法に関連して使用する学名は、当分野で周知かつ一般的に使用されるものである。本発明の方法および技法は、一般に、別段に指定しない限りは、当分野で周知の慣用方法に従って、本明細書全体にわたって引用および記述されている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように行う。たとえば、本明細書中に参照により組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９９０）を参照されたい。酵素反応および精製技法は、当分野で一般的に行われるように、または本明細書中に記載のように、製造者の仕様書に従って行う。本明細書中に記載の分析化学、合成有機化学、および医学や製薬化学、ならびにその実験室の手順および技法に関連して使用する術語は、当分野で周知かつ一般的に使用されるものである。標準の技法を、化学合成、化学分析、医薬品の調製、配合、および送達、ならびに患者の処置に使用することができる。
【００７３】
本開示中で利用する以下の用語は、別段に指定しない限りは、以下の意味を有すると理解される。
【００７４】
本明細書中で使用する「Ｄｋｋ−１」には、たとえば、ネズミおよびヒトのネイティブ型のＤｋｋ−１が含まれる。例示的なＤｋｋ−１タンパク質およびヌクレオチド配列が、たとえばＵＳ２００６／０１２７３９３号（ＷＯ２００６／０１５３７３号）およびＵＳ２００８／０１９３４４９号に開示されている。また、この用語には、これらのネイティブタンパク質と免疫学的交差反応性を有する、そのようなネイティブ配列の変異体も含まれる。これらのタンパク質は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６とＷｎｔとの間の相互作用を阻害することができる。また、用語は、抗体が特異的に結合することができるエピトープを含有する、Ｄｋｋ−１のネイティブの断片または変異体形もいうことができる。
【００７５】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のポリマーを意味する。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態とすることができる。前記修飾には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニルアデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間連結修飾が含まれる。この用語には一本鎖および二本鎖の形態の両方が含まれる。
【００７６】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０〜６０個の塩基の長さである。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０個のヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、たとえば、突然変異遺伝子の構築に使用するために、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。本発明のオリゴヌクレオチドには、検出アッセイのために、放射標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含めた標識が含まれていてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、たとえば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。
【００７７】
「単離した核酸分子」とは、単離されたポリヌクレオチドが天然で見つかるポリヌクレオチドの全体または一部分と会合していない、またはそれが天然で連結していないポリヌクレオチドと連結している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその何らかの組合せを意味する。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」にはインタクトな染色体が包含されないことを理解されたい。指定した核酸配列「を含む」単離した核酸分子には、指定した配列に加えて、１０個まで、またはさらには２０個までの他のタンパク質またはその一部分のコード配列が含まれていてもよく、または引用した核酸配列のコード領域の発現を制御する、作動可能に連結した調節配列が含まれていてもよく、および／またはベクター配列が含まれていてもよい。
【００７８】
別段に指定しない限りは、本明細書中に記述する任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向を転写方向と呼び、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側のＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流配列」と呼び、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’側のＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」と呼ぶ。
【００７９】
用語「制御配列」とは、それがライゲーションしているコード配列の発現およびプロセッシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列をいう。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれ得る。たとえば、真核生物の制御配列には、転写因子の１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、および転写終結配列が含まれ得る。本発明による「制御配列」には、リーダー配列および／または融合パートナー配列が含まれていてもよい。
【００８０】
用語「ベクター」とは、タンパク質コード情報を宿主細胞内に移すために使用する、任意の分子または実体（たとえば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【００８１】
用語「発現ベクター」または「発現構築体」とは、宿主細胞の形質転換に適しており、それに作動可能に連結した１つまたは複数の異種コード領域の発現を（宿主細胞と共に）指示および／または制御する核酸配列を含有するベクターをいう。発現構築体には、それだけには限定されないが、転写、翻訳に影響を与えるまたはそれを制御する配列、およびイントロンが存在する場合は、それに作動可能に連結したコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列が含まれ得る。
【００８２】
本明細書中で使用する「作動可能に連結した」とは、用語が適用される構成成分が、それらが適切な条件下でその固有の機能を実行することを可能にする関係性にあることを意味する。たとえば、タンパク質コード配列と「作動可能に連結した」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性に適合する条件下で達成されるように、それにライゲーションしている。
【００８３】
用語「宿主細胞」とは、核酸配列で形質転換させた、または形質転換させることができ、したがって目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語には、目的の遺伝子が存在する限りは子孫と元の親細胞との形態学または遺伝的構成が同一であるかどうかに関わらず、親細胞の子孫が含まれる。
【００８４】
用語「形質導入」とは、１つの細菌から別の細菌への、通常はバクテリオファージによる遺伝子の移行を意味する。また、「形質導入」とは、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および移行もいう。
【００８５】
用語「形質移入」とは、細胞による外来または外因性のＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に、細胞は「形質移入されている」。いくつかの形質移入技法が当分野で周知であり、本明細書中に開示されている。たとえば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、同上、Ｄａｖｉｓら、１９８６、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら、１９８１、Ｇｅｎｅ、１３：１９７を参照されたい。そのような技法は、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞内に導入するために使用することができる。
【００８６】
用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴の変化をいい、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有するように改変されている場合に、細胞は形質転換されている。たとえば、細胞は、形質移入、形質導入、または他の技法を介して新しい遺伝物質を導入することによってそのネイティブ状態から遺伝子改変されている場合に、形質転換されている。形質移入または形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体内に物理的に組み込まれることによって細胞のそれと組み換えられ得るか、または複製されずにエピソーム要素として一過的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製され得る。細胞は、形質転換ＤＮＡが細胞の分裂に伴って複製される場合に、「安定に形質転換された」とみなされる。
【００８７】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する巨大分子、すなわち、天然に存在する非組換えの細胞によって産生される、または遺伝子操作したもしくは組換えの細胞によって産生されるタンパク質を意味し、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはネイティブ配列の１つまたは複数のアミノ酸からの欠失、それへの付加、および／もしくはその置換を有する分子を含む。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」には、抗Ｄｋｋ−１抗体、または抗Ｄｋｋ−１抗体の１つまたは複数のアミノ酸からの欠失、それへの付加、および／もしくはその置換を有する配列が具体的に包含される。用語「ポリペプチド断片」とは、完全長のネイティブタンパク質と比較してアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部の欠失を有するポリペプチドをいう。また、そのような断片は、ネイティブタンパク質と比較して修飾されたアミノ酸も含有し得る。特定の実施形態では、断片は約５〜５００個のアミノ酸の長さである。たとえば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０個のアミノ酸の長さであり得る。本発明に有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含めた、抗体の免疫学的に機能的な断片が含まれる。抗Ｄｋｋ−１抗体の場合、有用な断片には、それだけには限定されないが、ＣＤＲ領域、重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部分または２つのＣＤＲを含めた単にその可変領域などが含まれる。
【００８８】
本明細書中で言及する用語「単離したタンパク質」とは、対象タンパク質が、（１）それが通常一緒に見つかる、少なくとも何らかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ供給源、たとえば同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現される、（４）それが天然で会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されている、（５）それが天然で会合していないポリペプチドと作動可能に会合している（共有または非共有的な相互作用による）、または（６）天然に存在しないことを意味する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは合成起源の他のＲＮＡ、またはその任意の組合せがそのような単離したタンパク質をコードし得る。好ましくは、単離したタンパク質は、その治療的、診断的、予防的、研究用または他の使用を妨害する可能性のあるタンパク質もしくはポリペプチドまたはその天然環境中で見つかる他の汚染物質を実質的に含まない。
【００８９】
ポリペプチド（たとえば抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列内に挿入、それから欠失および／またはそれ内に置換されているアミノ酸配列を含む。本発明の変異体には融合タンパク質が含まれる。
【００９０】
ポリペプチドの「誘導体」とは、挿入、欠失、または置換の変異体とは明確に異なる何らかの様式で、たとえば別の化学部分とのコンジュゲーションによって化学修飾されたポリペプチド（たとえば抗体）である。
【００９１】
当業者に理解される「免疫応答」には、それだけには限定されないが、任意の検出可能な抗原特異的なまたは同種のヘルパーＴ細胞活性化または細胞毒性Ｔ細胞応答、抗体の産生、Ｔ細胞媒介性のアレルギー反応の活性化などが含まれる。この用語には、浸潤性病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合は正常なヒト細胞もしくは組織の、選択的な損傷、破壊、または人体からの排除をもたらす、たとえば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、ならびに上記細胞または肝臓によって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体が含まれる）の作用が包含される。
【００９２】
「シグナル伝達経路」とは、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的な関係性をいう。本明細書中で使用する語句「細胞表面受容体」には、たとえば、シグナルを受信し、そのようなシグナルを細胞の形質膜を横切って伝達することができる、分子および分子の複合体が含まれる。
【００９３】
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的と特異的結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用するこの用語には、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体であり、サメおよびラクダ科動物の抗体が含まれ、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変立体配置も包含される。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを様々なクラスに割り当てることができる。５つの主要な免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分類し得る。様々な免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。様々な免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００９４】
本発明による抗体は、専ら単一の供給源に由来し得るか、または「キメラ」であり得る、すなわち、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来し得る。たとえば、ＣＤＲ領域がラットまたはネズミ源に由来する一方で、Ｖ領域のフレームワーク領域が、ヒトなどの異なる動物源に由来し得る。本発明の抗体または結合断片は、ハイブリドーマ中、組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断によって生成し得る。別段に指定しない限りは、用語「抗体」には、２本の完全長の重鎖および２本の完全長の軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、および突然変異体タンパク質が含まれ、その例を以下に記載する。
【００９５】
用語「軽鎖」には、完全長の軽鎖および結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。完全長の軽鎖には、可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬが含まれる。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端にある。本発明による軽鎖には、カッパ鎖およびラムダ鎖が含まれる。
【００９６】
用語「重鎖」には、完全長の重鎖および結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。完全長の重鎖には、可変領域ドメインＶＨならびに３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３が含まれる。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３がＣＯＯＨ末端に最も近い。本発明による重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプが含まれる）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプが含まれる）、およびＩｇＭを含めた任意のアイソタイプであり得る。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分類することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含めた宿主の組織または因子との結合を媒介し得る。軽鎖および重鎖内では、可変および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖には約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれる。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
【００９７】
本明細書中で使用する用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）とは、抗原と特異的に結合する能力を保持している抗体の１つまたは複数の断片をいう（たとえばα５β１）。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行うことができることが示されている。用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を用いて、これらが、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、たとえば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３を参照）、単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、結合させることができる。そのような単鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に知られている慣用技術を含めた任意の適切な技法を用いて得てよく、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングし得る。
【００９８】
本明細書中で使用する「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうことを意図する（たとえば、Ｄｋｋ−１と特異的に結合する単離された抗体は、Ｄｋｋ−１以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、Ｄｋｋ−１と特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来のＤｋｋ−１分子などの他の抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００９９】
本明細書中で使用する用語、免疫グロブリン鎖の「免疫学的に機能的な断片」（または単に「断片」）とは、完全長の鎖中に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、抗原と特異的に結合することができる、抗体の軽鎖または重鎖の一部分をいう。そのような断片は、これらが標的抗原と特異的に結合し、所定のエピトープとの特異的結合についてインタクトな抗体と競合することができるという点で、生物活性がある。本発明の一態様では、そのような断片は完全長の軽鎖または重鎖中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持しており、一部の実施形態では、単一の重鎖および／もしくは軽鎖またはその一部分を含む。これらの生物活性のある断片は、組換えＤＮＡ技法によって生成させ得るか、またはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断によって生成させ得る。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、それだけには限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体が含まれ、それだけには限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科動物またはウサギを含めた任意の哺乳動物源に由来し得る。さらに、本発明の抗体の機能的部分、たとえば１つまたは複数のＣＤＲを、第２のタンパク質または低分子と共有結合させて、身体中の特定の標的に向けられた、二機能性の治療特性を保有する、または長期的な血清半減期を有する治療剤を作製できることが企図される。
【０１００】
「Ｆａｂ断片」は、１本の軽鎖およびＣＨ１および１本の重鎖の可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【０１０１】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２本の重鎖断片を含有する。２本の重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に結合される。
【０１０２】
「Ｆａｂ’断片」は、１本の軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１本の重鎖の一部分を含有し、また、２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の領域も含有する。
【０１０３】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本の軽鎖、および２本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるようにＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部分を含有する２本の重鎖を含有する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に結合されている２つのＦａｂ’断片からなる。
【０１０４】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
【０１０５】
「単鎖抗体」とは、重鎖および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって接続されて単一のポリペプチド鎖を形成し、これが抗原結合領域を形成する、Ｆｖ分子である。単鎖抗体は、たとえば、ＷＯ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号に詳述されている。
【０１０６】
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。一部の例では、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによって共有結合されて、二価ドメイン抗体が作製される。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は同じまたは異なる抗原を標的とし得る。
【０１０７】
「二価抗体」は２つの抗原結合部位を含む。一部の例では、２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性であってもよい（以下を参照）。
【０１０８】
「多特異性抗体」とは、複数の抗原またはエピトープを標的とするものである。
【０１０９】
「二重特異性」、「二重特異的」または「二官能性」の抗体とは、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は多特異性抗体の１種であり、それだけには限定されないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた様々な方法によって生成し得る。たとえば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１、ならびにＫｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。二重特異性抗体の２つの結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープと結合する。
【０１１０】
本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る潜在的な天然に存在する突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられている。さらに、典型的には異なる決定要因（エピトープ）に向けられた異なる抗体が含まれるポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定要因に向けられている。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の特徴を実質的に均質な抗体の集団から得られたものとして示し、任意の特定の方法によって抗体を生成することを必要とすると解釈されるべきでない。たとえば、本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製し得るか、または、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているものなどの組換えＤＮＡ方法によって作製し得る。また、モノクローナル抗体は、たとえばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４に記載されている技法を用いて作製されたファージライブラリから単離してもよい。
【０１１１】
用語「ヒト抗体誘導体」とは、ヒト抗体の任意の改変された形態、たとえば抗体と別の薬剤または抗体コンジュゲートをいう。
【０１１２】
用語「ヒト化抗体」とは、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体をいうことを意図する。追加のフレームワーク領域の修飾をヒトフレームワーク配列内に行い得る。
【０１１３】
本明細書中で使用する「ヒト化」抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列など）である非ヒト（たとえばネズミ）抗体の形態をいう。好ましくは、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられている。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、輸入したＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見つからないが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために含めた残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも、最適に含む。ＷＯ９９／５８５７２号に記載のように改変されたＦｃ領域を有する抗体が好ましい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更されている１つまたは複数のＣＤＲ（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、および／またはＣＤＲ  Ｈ３）を有する。
【０１１４】
本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」には、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれることを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合は、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体またはその抗原結合部分には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞突然変異によって導入される突然変異）が含まれ得る。しかし、本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」には、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体が含まれることを意図しない。
【０１１５】
用語「ヒトモノクローナル抗体」または「完全ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体をいう。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、たとえばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞であって、不死化細胞と融合させたＢ細胞が含まれるハイブリドーマによって産生される。
【０１１６】
本明細書中で使用する用語「組換えヒト抗体」には、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック動物または染色体導入動物（たとえばマウス）またはそれから調製したハイブリドーマ（以下にさらに記載）から単離された抗体、（ｂ）たとえばトランスフェクトーマから、ヒト抗体を発現するように形質転換させた宿主細胞から単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルのヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列へとスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用した場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏの体性突然変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連する配列である一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない場合がある。
【０１１７】
本明細書中で使用する「アイソタイプ」または「クラス」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている抗体クラス（たとえばＩｇＭまたはＩｇＧ）をいう。抗体の定常ドメインは抗原との結合に関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、所定のヒト抗体または免疫グロブリンを５つの主要な免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てることができる。様々な免疫グロブリンクラスの構造および三次元立体配置は周知である。様々なヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭのみが補体を活性化することが知られている。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいてＡＤＣＣを媒介することが知られている。
【０１１８】
本明細書中で使用する「サブクラス」とは、たとえば、ＩｇＧアイソタイプ内のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスなどの、重鎖定常領域遺伝子のアイソタイプ内のさらなる特定化をいう。
【０１１９】
本明細書中で使用する用語「化合物」または「医薬化合物」には、抗体、その抗原結合部分、免疫コンジュゲート、および二重特異性分子が含まれる。
【０１２０】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」とは、本明細書中で用語「抗原と特異的に結合する抗体」と互換性があるように使用される。
【０１２１】
用語「抗体依存性細胞性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」とは、非特異的な細胞毒性細胞（たとえば、ＮＫ細胞、好中球、マクロファージなど）が標的細胞上に結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性の反応をいう。ＡＤＣＣを媒介するそのような細胞毒性細胞は、一般にＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、および／またはＦｃγＲＩＶを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２（１９９１）に要約されている。分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣアッセイを行い得る。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替として、またはそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、たとえば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価し得る。
【０１２２】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を説明するために使用し、Ｆｃ領域は、重鎖のヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。たとえば、ＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲとすることができる。ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するものとすることができ（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体にはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：２０３〜２３４（１９９７）を参照）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４（１９９４）、ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１（１９９５）に総説されている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲが、本明細書中で用語「ＦｃＲ」によって包含される。また、この用語には、母系ＩｇＧを胎児に移行することを司っている新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９（１９９４））。免疫グロブリンＦｃ断片上の主なＦｃＲ結合部位は、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間のヒンジ領域に存在する。このヒンジ領域は様々な白血球上のＦｃＲ１−３と相互作用し、これらの細胞が標的を攻撃することを始動させる（Ｗｉｎｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４：５３１３〜５３１８（２０００））。ヒンジ領域には、それだけには限定されないが、米国特許第６，１６５，４７６号に記載されている配列が包含される。
【０１２３】
用語「抗体依存性細胞性細胞傷害を誘導することができる」とは、当業者に知られているアッセイ（複数可）によって測定された、ＡＤＣＣを実証する抗体などの薬剤の能力をいう。そのような活性は、典型的には、Ｆｃ領域と様々なＦｃＲとの結合によって特徴付けられる。どのような特定の機構にも限定されずに、当業者は、ＡＤＣＣを実証する抗体の能力が、たとえば、そのサブクラス（ＩｇＧ１またはＩｇＧ３など）のおかげで、Ｆｃ領域内に導入された突然変異によって、または抗体のＦｃ領域中の炭水化物パターンへの修飾のおかげとすることができることを認識されよう。そのような修飾は、たとえば米国特許出願公開第２００７／００９２５２１号に記載されている。
【０１２４】
用語「中和抗体」とは、リガンドと結合する、リガンドとその結合パートナーとの結合を防止する、およびそうでなければリガンドとその結合パートナーとの結合の結果生じる生物学的応答を妨げる抗体をいう。抗体またはその免疫学的に機能的な断片の結合および特異性を評価するにあたって、抗体または断片は、過剰量の抗体が、リガンドと結合した結合パートナーの量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれより多く（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの競合的結合アッセイによって測定）低下させる場合に、リガンドとその結合パートナーとの結合を実質的に阻害する。Ｄｋｋ−１に対する抗体の場合、中和抗体は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６と結合するＤｋｋ−１の能力を消失させ、それにより、Ｗｎｔ活性の測定可能な増加を誘導する。
【０１２５】
用語「競合する」とは、同じエピトープについて競合する抗体のコンテキストで使用した場合は、抗体間の競合が、試験中の抗体または免疫学的に機能的な断片が参照抗体と共通抗原（たとえばＤｋｋ−１またはその断片）との特異的結合を防止または阻害するアッセイによって決定されることを意味する。数々の種類の競合的結合アッセイ、たとえば、固相の直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（たとえばＳｔａｈｌｉら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９：２４２〜２５３を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（たとえばＫｉｒｋｌａｎｄら、（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７：３６１４〜３６１９を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（たとえばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（たとえばＭｏｒｅｌら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５：７〜１５を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（たとえばＣｈｅｕｎｇら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７６：５４６〜５５２を参照）、および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら（１９９０）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：７７〜８２）を使用することができる。典型的には、そのようなアッセイは、これらのうちのいずれかを保有する固体表面または細胞と結合した精製した抗原、未標識の試験免疫グロブリンおよび標識した参照免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞と結合した標識の量を決定することによって測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰量で存在する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープと結合する抗体、および、参照抗体によって結合されるエピトープに、立体障害が起こるために十分に近位な隣接エピトープと結合する抗体が含まれる。競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例に提供される。通常、競合抗体が過剰量で存在する場合、これは、参照抗体と共通抗原との特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。一部の事例では、結合は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％それより高く阻害される。
【０１２６】
用語「抗原」とは、抗体などの選択的結合剤によって結合されることができ、さらに、動物中で使用して、その抗原と結合することができる抗体を産生させることができる、分子または分子の一部分をいう。抗原は、様々な抗体と相互作用することができる１つまたは複数のエピトープを保有し得る。
【０１２７】
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合することができる任意の決定要因が含まれる。エピトープとは、その抗原を特異的に標的とする抗体によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合は、抗体と直接接触する特異的なアミノ酸が含まれる。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、一部の例では、核酸などの他の種類の分子上に存在し得る。エピトープ決定要因には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの、化学活性のある表面の分子の群が含まれる場合があり、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な荷電特徴を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中で標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
【０１２８】
本明細書中で使用する語句「特異的に結合する」とは、特異的な分子を認識および結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない、化合物、たとえば、タンパク質、核酸、抗体などを意味する。たとえば、試料中の同族リガンド（たとえば、その同族抗原Ｄｋｋ−１と結合する抗Ｄｋｋ−１抗体）を認識および結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない、抗体またはペプチド阻害剤である。したがって、指定したアッセイ条件下では、指定した結合部分（たとえば抗体またはその断片（たとえばその抗原結合部分））は、特定の標的分子、たとえばＤｋｋ−１と優先的に結合し、試験試料中に存在する他の構成成分とは有意な量で結合しない。様々なアッセイ様式を使用して、目的の分子と特異的に結合する抗体を選択し得る。たとえば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＡＣＳ、およびウエスタンブロット分析は、Ｄｋｋ−１と特異的に反応する抗体を同定するために使用することができる多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍となり、より典型的にはバックグラウンドの１０倍を超え、さらにより具体的には、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が≦１μＭ、たとえば≦１００ｎＭ、さらにたとえば≦１０ｎＭである場合に、抗原と「特異的に結合する」といわれる。
【０１２９】
本発明の抗体は、解離定数（Ｋｄ）が好ましくは約１００ｐＭ以下、約１×１０−９以下、または１×１０−８以下である場合に、その標的抗原と「特異的に結合する」といわれる。
【０１３０】
本明細書中で使用する用語「ｋｏｎ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用のｏｎ速度すなわち会合速度をいうことを意図し、他方で、本明細書中で使用する用語「ｋｏｆｆ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用のｏｆｆ速度すなわち解離速度をいうことを意図する。本明細書中で使用する用語「ＫＤ」とは、ｋｏｆｆ対ｋｏｎの比（すなわちｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から得られる解離定数をいうことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当分野で十分に確立されている方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定する一方法は、典型的にはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いた表面プラズモン共鳴を用いることによるものである。
【０１３１】
ＩｇＧ抗体における用語「高親和性」とは、一般に、標的抗原に対して１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、または５×１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。しかし、「高親和性」結合は他の抗体アイソタイプでは変動する場合がある。たとえば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合とは、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。
【０１３２】
用語「同一性」とは、配列のアラインメントおよび比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係性をいう。「パーセント同一性」とは、比較した分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較した分子の最小のものの大きさに基づいて計算する。これらの計算には、アラインメント中のギャップ（存在する場合）を特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって対処しなければならない。アラインメントした核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）（１９８８）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）（１９９３）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）（１９９４）Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）（１９９１）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ならびにＣａｒｉｌｌｏら（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３に記載されているものが含まれる。
【０１３３】
パーセント同一性を計算する際、比較する配列を、配列間の最大の一致を与えるようにアラインメントする。パーセント同一性を決定するために使用するコンピュータプログラムは、ＧＡＰが含まれるＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、１２：３８７、遺伝子コンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを用いて、パーセント配列同一性を決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインメントする。配列は、そのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致についてアラインメントする（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開きペナルティ（これは平均対角の３×として計算され、「平均対角」とは、使用する比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」とは、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられたスコアまたは数値である）およびギャップ伸長ペナルティ（これは、通常はギャップ開きペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスをアルゴリズムと併せて使用する。特定の実施形態では、標準の比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスにはＤａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５：３４５〜３５２を参照、ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスにはＨｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５〜１０９１９を参照）もアルゴリズムによって使用される。
【０１３４】
ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチドまたはヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するための、推奨されるパラメータは以下のとおりである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３〜４５３、
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）上記からのＢＬＯＳＵＭ６２、
ギャップペナルティ：１２（ただし、末端ギャップにはペナルティを用いない）
ギャップ長ペナルティ：４
類似度の閾値：０
【０１３５】
２つのアミノ酸配列をアラインメントするための特定のアラインメントスキームでは、２つの配列の短い領域のみの一致しかもたらさない場合があり、この小さなアラインメントされた領域は、２つの完全長配列間には有意な関係性が存在しないにも関わらず、非常に高い配列同一性を有する場合がある。したがって、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、所望する場合は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続的なアミノ酸にまたがるアラインメントがもたらされるように調整することができる。
【０１３６】
本明細書中で使用する「実質的に純粋」とは、記載した分子種が存在する優勢の種である、すなわち、モル濃度に基づいて、これが同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の実施形態では、実質的に純粋な分子とは、目的の種が、存在するすべての高分子種の少なくとも５０％（モル濃度に基づいて）を構成する組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を構成する。他の実施形態では、汚染種が慣用の検出方法によって組成物中に検出されず、したがって、組成物は単一の検出可能な高分子種からなるように、目的の種を本質的に均質となるまで精製する。
【０１３７】
「アミノ酸」には、当分野におけるその通常の意味が含まれる。２０種の天然に存在するアミノ酸およびその略記は慣用の用法に従う。任意の目的のために本明細書中に参照により組み込まれているＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ（１９９１）を参照されたい。また、２０種の慣用のアミノ酸の立体異性体（たとえばＤ−アミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の慣用でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドの適切な構成成分であり得る。慣用でないアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、イプシロン−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、イプシロン−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、シグマ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（たとえば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書中で使用するポリペプチドの表示法では、標準の用法および習慣に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシル末端方向である。
【０１３８】
用語「骨減少症」とは、正常な骨塩密度（ＢＭＤ）を有するとみなされる標準の患者と比較して、少なくとも１標準偏差の骨減少を有する患者をいう。たとえば、測定値は二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）によって決定することができ、患者のＢＭＤを、年齢および性別が一致した標準（Ｚスコア）と比較する。骨減少症を決定する際、ＢＭＤの測定値は、１つまたは複数の骨から採り得る。
【０１３９】
用語「治療上有効な量」とは、哺乳動物において治療反応を生じると決定された抗Ｄｋｋ−１抗体の量をいう。そのような治療上有効な量は当業者によって容易に確認される。
【０１４０】
「糖型」とは、様々な炭水化物単位の連結を含む複雑なオリゴ糖構造をいう。そのような構造は、たとえばＥｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｒｋｉら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９９９）に記載されており、これは、標準の糖鎖生物学の命名法の総説も提供する。そのような糖型には、それだけには限定されないが、Ｇ２、Ｇ１、Ｇ０、Ｇ−１、およびＧ−２が含まれる（たとえばＷＯ９９／２２７６４号を参照）。
【０１４１】
「グリコシル化パターン」とは、タンパク質と共有結合している炭水化物単位のパターン（たとえば糖型）、および糖型（複数可）がタンパク質のペプチド主鎖、より具体的には免疫グロブリンタンパク質と共有結合している部位（複数可）として定義される。
【０１４２】
様々な細胞系によってまたはトランスジェニック動物中で発現される抗体は、互いと比較して異なる糖型および／またはグリコシル化パターンを有する可能性が高い。しかし、本明細書中に提供する核酸分子によってコードされている、または本明細書中に提供するアミノ酸配列を含むすべての抗体が、そのような抗体のグリコシル化に関わらず本開示の一部である。
【０１４３】
本明細書中で使用する用語「対象」には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、すべての脊椎動物、たとえば、哺乳動物および非哺乳動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。
【０１４４】
本明細書中で使用する「処置する」とは、患者が疾患の症状を経験する頻度を低下させることを意味する。この用語には、疾患の症状、合併症、または生化学的兆候の発症を予防もしくは遅延させる、症状を軽減させる、または疾患、状態、または障害のさらなる発達を抑止もしくは阻害するために、本開示の化合物または薬物を投与することが含まれる。処置は、予防的（疾患の発症を予防もしくは遅延させるため、またはその臨床症状もしくは無症状性症状の顕在化を予防するため）であるか、または疾患の顕在化後の症状の治療的抑制もしくは軽減であり得る。
【０１４５】
本開示の様々な一般的態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳述する。
【０１４６】
概要
本発明は、Ｄｋｋ−１に特異的な免疫グロブリンの抗体および抗原結合部位を含む新規組成物を提供する。これらの抗体および抗体断片の一部は、ラット、マウスおよびヒトのＤｋｋ−１を含めた、いくつかの哺乳動物源からのＤｋｋ−１と交差反応することができる。抗体および断片の一部は、１つの種からのＤｋｋ−１に対して、別の種よりも高い親和性を有する。また、本発明は、キメラ、ヒト化およびヒト抗体、ならびに抗体およびその免疫学的に機能的な断片を含めた、新規中和抗体も提供する。また、抗体および断片をコードしている核酸、ならびにこれらの核酸を用いて抗体を発現させる方法も開示する。別の態様では、本発明は、抗体抗原結合部位の免疫学的結合特性を示すことができる分子（たとえば、免疫学的に機能的な断片およびポリペプチド）に関する。
【０１４７】
本明細書中に開示されている抗体および免疫学的に機能的な断片は、様々な利用性を有する。たとえば、抗体および断片の一部は、特異的結合アッセイ、Ｄｋｋ−１またはそのリガンドの親和性精製、およびＤｋｋ−１活性の他のアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイに有用である。抗体のうちの特定のものを、Ｄｋｋ−１の活性に関連する様々な疾患を処置するために使用することができる。したがって、一部の抗体および断片を、ＢＭＤの増加、新しい骨の合成、全身性骨減少（たとえば骨侵食）の処置、骨修復、および様々な形態の関節炎の処置などの、骨に関連する様々な処置に使用することができる。しかし、開示されている抗体および断片のうちの特定のものは、骨疾患に関連しない様々な多様な疾患を処置するために使用することができる。
【０１４８】
抗体および断片
Ｄｋｋ−１の活性の調節に有用な様々な選択的結合剤が提供される。これらの薬剤には、たとえば、抗原結合ドメイン（たとえば、単鎖抗体、ドメイン抗体、イムノアドヘシン、および抗原結合領域を有するポリペプチド）を含有し、Ｄｋｋ−１ポリペプチド（たとえば、ヒト、ラットおよび／またはネズミのＤｋｋ−１ポリペプチド）と特異的に結合する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片が含まれる。薬剤の一部は、たとえば、Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との結合の阻害に有用であり、したがって、Ｗｎｔシグナル伝達に関連する１つまたは複数の活性を刺激するために使用することができる。
【０１４９】
天然に存在する抗体構造
提供される結合剤の一部は、典型的には天然に存在する抗体に関連する構造を有する。これらの抗体の構造単位は、典型的にはそれぞれが２つの同一のポリペプチド鎖のカプレットからなる１つまたは複数の四量体を含むが、一部の哺乳動物の種は単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。典型的な抗体では、それぞれの対またはカプレットには１本の完全長「軽」鎖（特定の実施形態では約２５ｋＤａ）および１本の完全長「重」鎖（特定の実施形態では約５０〜７０ｋＤａ）が含まれる。それぞれの個々の免疫グロブリン鎖は、それぞれが約９０〜１１０個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを発現する、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」からなる。これらのドメインが、抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。それぞれの鎖のアミノ末端部分には、典型的には、抗原認識を司っている可変ドメインが含まれる。カルボキシ末端部分は、鎖の他方の末端よりも進化的に保存されており、「定常領域」または「Ｃ領域」と呼ばれる。ヒト軽鎖は一般にカッパおよびラムダ軽鎖として分類され、これらのそれぞれが１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含有する。重鎖は典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン鎖として分類され、これらにより、抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義される。ＩｇＧは、それだけには限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含めたいくつかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプにはＩｇＭおよびＩｇＭ２が含まれる。ＩｇＡサブタイプにはＩｇＡ１およびＩｇＡ２が含まれる。ヒトでは、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは４本の重鎖および４本の軽鎖を含有し、ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは２本の重鎖および２本の軽鎖を含有し、ＩｇＭアイソタイプは５本の重鎖および５本の軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、典型的には、エフェクター機能を司っている可能性がある１つまたは複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数はアイソタイプに依存する。たとえば、ＩｇＧ重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインをそれぞれ含有する。提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのうちの任意のものを有することができる。
【０１５０】
完全長の軽鎖および重鎖では、可変および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖には、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれる。たとえばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編）（１９８９）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい（すべての目的のためにその全体が本明細書中に参照により組み込まれている）。それぞれの軽鎖／重鎖の対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。
【０１５１】
免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に同じ全体的な構造を示し、３つの超可変領域、より頻繁には「相補性決定領域」またはＣＤＲと呼ばれる領域によって結合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。上述のそれぞれの重鎖／軽鎖の対の２本の鎖のＣＤＲは、典型的にはフレームワーク領域によってアラインメントされて、標的タンパク質上の特異的エピトープ（たとえばＤｋｋ−１）と特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端に、天然に存在する軽鎖および重鎖可変領域はいずれも、典型的にはこれらの要素の以下の順序、すなわち、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４に一致する。これらのドメインのそれぞれ中の位置を占有するアミノ酸に数字を割り当てるために、付番システムが考案されている。この付番システムは、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（（１９８７および１９９１）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７８〜８８３に定義されている。本開示によって提供される軽鎖のそれぞれを、本開示によって提供される重鎖のうちの任意のものと組み合わせて、抗体を形成することができる。一部の実施形態では、抗体は、２本の同一の軽鎖および２本の同一の重鎖を含有する。提供される他の抗体は、提供される重鎖および軽鎖の組合せによって形成される抗体の変異体であり、これらの鎖のアミノ酸配列に対してそれぞれ少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有する軽鎖および／または重鎖を含む。一部の例では、そのような抗体には少なくとも１本の重鎖および１本の軽鎖が含まれる一方で、他の事例では、そのような変異体形は２本の同一の軽鎖および２本の同一の重鎖を含有する。
【０１５２】
抗体のＣＤＲ
所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２（１９９１）によって記載されている系によって同定し得る。本明細書中に開示されている特定の抗体は、提供されるＣＤＲのうちの１つまたは複数のアミノ酸配列と同一または実質的な配列同一性を有する、１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
提供される抗体および断片には、上述したＣＤＲのうちの１個、２個、３個、４個、５個または６個すべてが含まれていてもよい。一部の抗体は、表４に記載のＣＤＲ変異体形を有し、ＣＤＲのうちの１つまたは複数（すなわち、２、３、４、５または６個）は、提供される具体的なＣＤＲ配列に対してそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。
【０１５４】
競合抗体および断片
また、Ｄｋｋ−１との特異的結合について例示した抗体または機能的断片のうちの１つと競合する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供される。また、そのような抗体および断片は、例示した抗体のうちの１つと同じエピトープとも結合し得る。例示した抗体または断片と同じエピトープと競合または結合する抗体および断片は、類似の機能的特性を示すことが予想される。
【０１５５】
モノクローナル抗体
提供される抗体には、Ｄｋｋ−１と結合するモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、当分野で知られている任意の技法を用いて、たとえば、免疫化スケジュールが完了した後にトランスジェニック動物から収集した脾臓細胞を不死化させることによって、産生させ得る。脾臓細胞は、当分野で知られている任意の技法を用いて、たとえば、これらを骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生じさせることによって、不死化させることができる。ハイブリドーマ生成融合手順で使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、抗体を産生せず、高い融合効率を有し、酵素欠乏を有し、それにより、これらを、所望の融合した細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地中で成長できなくさせる。マウス融合体で使用するための適切な細胞系の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌが含まれ、ラット融合体で使用する細胞系の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合体に有用な他の細胞系は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【０１５６】
一部の例では、ハイブリドーマ細胞系は、動物（たとえばヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＤｋｋ−１免疫原で免疫化し、免疫化した動物から脾臓細胞を収集し、収集した脾臓細胞を骨髄腫細胞系と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を作製し、ハイブリドーマ細胞系をハイブリドーマ細胞から確立させ、Ｄｋｋ−１ポリペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定することによって産生させる。そのようなハイブリドーマ細胞系、およびそれによって産生される抗Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体が、本発明によって包含される。
【０１５７】
ハイブリドーマ細胞系によって分泌されたモノクローナル抗体は、当分野で知られている任意の技法を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはＭａｂは、Ｗｎｔで誘導された活性を遮断する能力などの特定の特性を有するＭａｂを同定するために、さらにスクリーニングし得る。そのようなスクリーニングの例は以下の実施例中に提供する。
【０１５８】
キメラおよびヒト化抗体
また、前述の配列に基づくキメラおよびヒト化抗体も提供される。治療剤として使用するためのモノクローナル抗体は、使用前に様々な方法で改変し得る。一例は「キメラ」抗体であり、これは、機能的な免疫グロブリンの軽鎖もしくは重鎖または免疫学的に機能的なその一部分を生じるために共有結合させた、異なる抗体からのタンパク質セグメントからなる抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方で、残りの鎖（複数可）は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である。キメラ抗体に関する方法には、たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８５）を参照されたい。ＣＤＲ移植は、たとえば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号、および第５，５３０，１０１号に記載されている。
【０１５９】
一般に、キメラ抗体を作製する目的は、意図する患者種からのアミノ酸の数が最大となるキメラを作製することである。一例は「ＣＤＲ移植した」抗体であり、これは、抗体が特定の種からまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一方で、残りの抗体鎖（複数可）は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である。ヒトでの使用には、多くの場合、げっ歯類抗体からのＶ領域または選択されたＣＤＲをヒト抗体内に移植し、ヒト抗体の天然に存在するＶ領域またはＣＤＲを置き換える。
【０１６０】
キメラ抗体の１つの有用な種類は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物中で産生させたモノクローナル抗体から生成する。このモノクローナル抗体中の特定のアミノ酸残基、典型的には抗体の抗原非認識部分からのものを、対応するアイソタイプのヒト抗体中の対応する残基に対して相同的となるように改変する。ヒト化は、たとえば、様々な方法を用いて、げっ歯類可変領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域で置換することによって行うことができる（たとえば、米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜３６を参照）。一部の実施形態では、ヒト以外の種からの定常領域をヒト可変領域（複数可）と共に使用して、ハイブリッド抗体を生成することができる。
【０１６１】
完全ヒト抗体
また、完全ヒト抗体も提供される。人間を抗原に曝露させずに所定の抗原に特異的な完全ヒト抗体を作製する方法が利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の生成を実行する一手段は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウス内にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座位を導入することが、任意の望ましい抗原で免疫化することができる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を産生させる一手段である。完全ヒト抗体を使用することで、マウスまたはマウスで誘導体化したＭａｂをヒトに治療剤として投与した際に時折引き起こされる可能性がある免疫原性およびアレルギー性の応答を最小限にすることができる。
【０１６２】
完全ヒト抗体は、内在性免疫グロブリンの産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを生じることができるトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫化することによって、産生させることができる。この目的のための抗原は、典型的には６個以上の連続的なアミノ酸を有しており、ハプテンなどの担体とコンジュゲートされていてもよい。たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８、およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら（１９９３）Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３を参照されたい。そのような方法の一例では、トランスジェニック動物は、その中にマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖がコードされている内在性マウス免疫グロブリン座位を無能にし、マウスゲノム内に、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードしている座位を含有するヒトゲノムＤＮＡの大きな断片を挿入することによって、生成される。その後、ヒト免疫グロブリン座位の完全な相補体に満たない、部分的に改変された動物を交雑させて、所望する免疫系の改変をすべて有する動物が得られる。免疫原を投与した際、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に対して免疫特異的であるが、可変領域を含めてネズミではなくヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。そのような方法のさらなる詳細には、たとえば、本明細書中に参照により組み込まれているＷＯ９６／３３７３５号およびＷＯ９４／０２６０２号を参照されたい。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第６，７１３，６１０号、第６，６７３，９８６号、第６，１６２，９６３号、第５，５４５，８０７号、第６，３００，１２９号、第６，２５５，４５８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号および第５，５４５，８０６号、ＷＯ９１／１０７４１号およびＷＯ９０／０４０３６号、ならびにＥＰ５４６０７３Ｂ１およびＥＰ５４６０７３Ａ１号に記載されている。
【０１６３】
本明細書中で「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ぶ上述のトランスジェニックマウスは、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内在性μおよびｋ鎖座位を不活性化する標的化された突然変異と共にコードしている、ヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座位を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９）。したがって、マウスは、免疫化に応答して減少したマウスＩｇＭおよびｋの発現を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラスの切り替えを受け、体細胞突然変異は高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生じる（Ｌｏｎｂｅｒｇら、上記、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３、ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、７６４：５３６〜５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：６２８７〜６２９５、Ｃｈｅｎら（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５：６４７〜６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：２９１２〜２９２０、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１１３：４９〜１０１、Ｔａｙｌｏｒら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６：５７９〜５９１、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３、ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ、１９９５、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７６４：５３６〜５４６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜８５１に詳述されており、前述の参考文献は、すべての目的のためにその全体が本明細書中に参照により組み込まれている。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、および第５，７７０，４２９号、ならびに米国特許第５，５４５，８０７号、ならびにＷＯ９３／１２２７号、ＷＯ９２／２２６４６号、およびＷＯ９２／０３９１８号を参照されたい。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を産生させる技術は、本明細書中に参照により組み込まれているＷＯ９８／２４８９３号およびＭｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：１４６〜１５６にも開示されている。たとえば、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジェニックマウス株を用いてヒト抗Ｄｋｋ−１抗体を産生させることができる。
【０１６４】
ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを、上述のものなどのトランスジェニックマウスから産生および選択することができる。そのような抗体は、適切なベクターおよび宿主細胞を用いてクローニングおよび発現させ得るか、または抗体を培養ハイブリドーマ細胞から収集することができる。
【０１６５】
また、完全ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリから誘導することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１に開示）。ファージディスプレイ技法では、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイ、続いて選択された抗原とのその結合によるファージの選択を介して、免疫選択を模倣する。１つのそのような技法は、そのような手法を用いたＭＰＬおよびｍｓｋ受容体に対する高親和性かつ機能的な作用性抗体の単離を記載している、ＷＯ９９／１０４９４号（本明細書中に参照により組み込まれている）に記載されている。
【０１６６】
二重特異性または二官能性抗体
また、提供される抗体には、上述のように１つまたは複数のＣＤＲまたは１つまたは複数の可変領域が含まれる、二重特異性および二官能性抗体も含まれる。一部の例では、二重特異性または二官能性抗体とは、２つの異なる重鎖／軽鎖の対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、それだけには限定されないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた、様々な方法によって生成し得る。たとえば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。
【０１６７】
様々な他の形態
提供される抗体または免疫学的に機能的な断片の一部は、上記開示した抗体および断片の変異体形である。天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいたクラスに分類し得る：［０１４９］１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、［０１５０］２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、［０１５１］３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、［０１５２］４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、［０１５３］５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および［０１５４］６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを同じクラスの別のメンバーで交換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には生物系中での合成によってではなく化学ペプチド合成によって組み込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得る。これらには、アミノ酸部分ペプチド模倣体および他の逆転または反転した形態が含まれる。非保存的置換は、上記クラスのうちの１つメンバーを別のクラスからのメンバーで交換することを含み得る。そのような置換された残基は、ヒト抗体と相同的な抗体の領域内、または分子の非相同的な領域内に導入し得る。
【０１６８】
特定の実施形態によれば、そのような変化を行う際に、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮し得る。タンパク質の疎水性親水性プロフィールは、それぞれのアミノ酸に数値（「疎水性親水性指標」）を割り当て、その後、これらの値をペプチド鎖に沿って繰り返し平均することによって計算する。それぞれのアミノ酸は、その疎水性および荷電特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。これらは以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）。
【０１６９】
タンパク質に相互作用性の生物学的機能を与えることにおける疎水性親水性プロフィールの重要性は、当分野で理解されている（たとえばＫｙｔｅら、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５〜１３１を参照）。特定のアミノ酸を類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換しても、類似の生物活性を依然として保持され得ることが知られている。疎水性親水性指標に基づいた変化を行う際、特定の実施形態では、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。本発明の一部の態様では、±１以内のものが含まれ、本発明の他の態様では、±０．５以内のものが含まれる。
【０１７０】
また、同様のアミノ酸の置換は、特に、本例のように、それによって作製される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが免疫学的な実施形態での使用に意図される場合に、親水性に基づいて有効に行うことができることも、当分野で理解されている。一部の実施形態では、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大の局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原結合または免疫原性、すなわちタンパク質の生物学的特性に相関している。
【０１７１】
以下の親水性値がこれらのアミノ酸に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を行う際、一部の実施形態では、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、さらに他の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。また、一部の例では、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定し得る。これらの領域は「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【０１７２】
当業者は、周知の技法を用いて本明細書中に記載したポリペプチドの適切な変異体を決定できるであろう。当業者は、活性に重要であると考えられていない領域を標的化することによって、活性を破壊せずに変化させ得る分子の適切な領域を同定し得る。また、当業者は、類似のポリペプチド間で保存されている残基および分子部分を同定することもできるであろう。さらなる実施形態では、生物活性または構造に重要であり得る領域でさえも、生物活性を破壊せずに、またはポリペプチド構造に有害な影響を与えずに、保存的アミノ酸置換に供し得る。
【０１７３】
さらに、当業者は、活性または構造に重要な類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能の研究を再調査することができる。そのような比較を考慮して、類似のタンパク質中の活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基について、化学的に類似のアミノ酸置換を選択し得る。
【０１７４】
また、当業者は、類似のポリペプチド中のその構造に関して、三次元構造およびアミノ酸配列も分析することができる。そのような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。当業者は、タンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基が他の分子との重要な相互作用に関与している可能性があるために、そのような残基に過激な変化を与えないことを選択し得る。さらに、当業者は、それぞれの所望のアミノ酸残基で単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を作製し得る。その後、これらの変異体を、Ｄｋｋ−１中和活性のアッセイ（以下の実施例を参照）を用いてスクリーニングすることができ、したがって、どのアミノ酸を変化させることができ、どれを変化してはならないかに関する情報が得られる。言い換えれば、そのようなルーチン的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、単独の、または他の突然変異と組み合わせたさらなる置換を回避すべきアミノ酸位置を容易に決定することができる。
【０１７５】
いくつかの科学出版物が二次構造の予測に向けられている。Ｍｏｕｌｔ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４２２〜４２７、Ｃｈｏｕら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２〜２４５、Ｃｈｏｕら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１３：２１１〜２２２、Ｃｈｏｕら（１９７８）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４７：４５〜１４８、Ｃｈｏｕら（１９７９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１〜２７６、およびＣｈｏｕら（１９７９）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、２６：３６７〜３８４を参照されたい。さらに、二次構造の予測を支援するためのコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する一方法は、相同性モデリングに基づく。たとえば、３０％を超える配列同一性、または４０％を超える類似度を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、多くの場合、類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発展により、ポリペプチドまたはタンパク質の構造中の潜在的な折り畳み回数を含めた、二次構造の予測能力の増大が提供されている。Ｈｏｌｍら（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２７：２４４〜２４７を参照されたい。所定のポリペプチドまたはタンパク質中には限定された折り畳み回数が存在し、臨界数の構造が解決されると、構造の予測が劇的により正確となることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７：３６９〜３７６）。
【０１７６】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７：３７７〜８７、Ｓｉｐｐｌら（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４：１５〜１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１６４〜１７０、Ｇｒｉｂｓｋｏｖら（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、１８３：１４６〜１５９、Ｇｒｉｂｓｋｏｖら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４：４３５５〜４３５８）、ならびに「進化連結」（Ｈｏｌｍ（１９９９）、上記、およびＢｒｅｎｎｅｒ（１９９７）、上記を参照）が含まれる。
【０１７７】
本発明の一部の実施形態では、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（４）リガンドまたは抗原結合親和性を変更、および／または（４）そのようなポリペプチドの他の物理化学的または機能的特性を与えるもしくは改変させる、アミノ酸置換を行う。たとえば、単一または複数のアミノ酸置換（特定の実施形態では保存的アミノ酸置換）を天然に存在する配列中に行い得る。置換は、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外に位置する抗体の部分中に行うことができる。そのような実施形態では、親配列の構造的特徴を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を使用することができる（たとえば、親またはネイティブ抗体を特徴付ける二次構造を乱さない１つまたは複数の置換アミノ酸）。当分野で認識されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編）（１９８４）Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ＢｒａｎｄｅｎおよびＴｏｏｚｅ編）（１９９１）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５４：１０５に記載されている。
【０１７８】
また、本発明には、グリコシル化部位（複数可）の数および／または種類が親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変更されている、本発明の抗体のグリコシル化変異体も包含される。特定の実施形態では、抗体タンパク質変異体は、ネイティブ抗体よりも多いまたは少ないＮ−連結グリコシル化部位の数を含む。Ｎ−連結グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられており、Ｘとして指定したアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基である。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換により、Ｎ−連結炭水化物鎖の付加のための潜在的な新しい部位が提供される。代替として、この配列を排除または変更する置換は、ネイティブポリペプチド中に存在するＮ−連結炭水化物鎖の付加を防止する。たとえば、グリコシル化は、Ａｓｎを欠失させることによって、またはＡｓｎを異なるアミノ酸で置換することによって、減らすことができる。他の実施形態では、１つまたは複数の新しいＮ−連結部位が作製される。抗体は、典型的にはＦｃ領域中に１つのＮ−連結グリコシル化部位を有する。
【０１７９】
さらなる好ましい抗体変異体には、親またはネイティブアミノ酸配列中の１つまたは複数のシステイン残基が欠失しているか、または別のアミノ酸（たとえばセリン）で置換されている、システイン変異体が含まれる。システイン変異体は、とりわけ、抗体が生物活性のあるコンホメーションへと再折り畳みされなければならない場合に有用である。システイン変異体はネイティブ抗体よりも少ない数のシステイン残基を有する場合があり、典型的には、対合していないシステインから生じる相互作用を最小限にするために、偶数を有する。
【０１８０】
開示されている重鎖および軽鎖、可変領域ドメインならびにＣＤＲを用いて、Ｄｋｋ−１ポリペプチドと特異的に結合することができる抗原結合領域を含有するポリペプチドを調製することができる。たとえば、表４に記載のＣＤＲのうちの１つまたは複数を分子（たとえばポリペプチド）内に共有的または非共有的に組み込ませて、イムノアドヘシンを作製することができる。イムノアドヘシンは、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（複数可）を組み込み得るか、ＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖と共有結合し得るか、またはＣＤＲ（複数可）を非共有的に組み込み得る。ＣＤＲ（複数可）は、イムノアドヘシンが特定の目的の抗原（たとえば、Ｄｋｋ−１ポリペプチドまたはそのエピトープ）と特異的に結合することを可能にする。
【０１８１】
また、本明細書中に記載した可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく模倣体（たとえば、ペプチド模倣体（“ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ”または“ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ”）も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチドまたはペプチドおよび非ペプチド領域の組合せとすることができる。任意の目的のために本明細書中に参照により組み込まれている、Ｆａｕｃｈｅｒｅ（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．、１５：２９、ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ、ページ３９２、ならびにＥｖａｎｓら（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３０：１２２９。治療上有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を使用して、類似の治療的または予防的効果を生じ得る。そのような化合物は、多くの場合、コンピュータ分子モデリングの支援で開発する。一般に、本発明のペプチド模倣体は、たとえば、ここでは、Ｄｋｋ−１と特異的に結合する能力を有するが、１つまたは複数のペプチド連結が、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ならびに−ＣＨ２ＳＯ−から選択される連結によって、当分野で周知の方法によって置き換えられていてもよいものなどの、所望の生物活性を示す抗体に構造的に類似のタンパク質である。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の、同じ種類のＤ−アミノ酸（たとえば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）での系統的置換を本発明の特定の実施形態で用いて、最も安定なタンパク質を作製し得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列の変動を含む束縛されたペプチドを、当分野で知られている方法によって、たとえば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、作製し得る（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１：３８７、本明細書中に参照により組み込まれている）。
【０１８２】
また、本明細書中に記載されている抗体および免疫学的に機能的な断片の誘導体も提供される。誘導体化した抗体または断片は、抗体または断片に特定の使用における増加した半減期などの所望の特性を与える任意の分子または物質を含み得る。誘導体化した抗体は、たとえば、検出可能な（または標識）部分（たとえば、放射性、比色、抗原性または酵素的分子、検出可能なビーズ（磁気または高電子密度（たとえば金）ビーズなど）、または別の分子（たとえば、ビオチンまたはストレプトアビジン）と結合する分子）、治療的または診断的部分（たとえば、放射性、細胞毒性、または医薬上活性のある部分）、または特定の使用（たとえば、ヒト対象などの対象への投与、または他のｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏの使用）における抗体の適切性を増加させる分子を含むことができる。抗体を誘導体化するために使用することができる分子の例には、アルブミン（たとえばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。抗体のアルブミン連結およびＰＥＧ化誘導体は、当分野で周知の技法を用いて調製することができる。一実施形態では、抗体は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体とコンジュゲートまたは他の様式で連結している。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、たとえば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択される化合物で化学修飾することができる。
【０１８３】
他の誘導体には、抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合した、異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現などによる、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその断片と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有的または凝集性コンジュゲートが含まれる。たとえば、コンジュゲートしたペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、たとえば酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであり得る。抗Ｄｋｋ−１抗体含有融合タンパク質は、抗Ｄｋｋ−１抗体の精製または同定を容易にするために付加するペプチド（たとえばポリ−Ｈｉｓ）を含むことができる。また、抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドは、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４（１９８８）および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているように、ＦＬＡＧペプチドと連結させることもできる。ＦＬＡＧペプチドは抗原性が高く、特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）によって可逆的にされたエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所定のポリペプチドと融合した融合タンパク質の調製に有用な試薬は市販されている（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）。
【０１８４】
１つまたは複数の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含有するオリゴマーをＤｋｋ−１アンタゴニストとして用い得る。オリゴマーは、共有結合または非共有結合した二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーの形態であり得る。２つ以上の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含むオリゴマーが使用に企図され、その一例はホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが含まれる。
【０１８５】
一実施形態は、抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドと融合したペプチド部分間の共有または非共有的相互作用によって結合された複数の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含むオリゴマーに向けられている。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであり得る。以下により詳細に記載するように、とりわけ、ロイシンジッパーおよび抗体に由来する特定のポリペプチドが、それに付着した抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドのオリゴマー化を促進することができるペプチドである。
【０１８６】
特定の実施形態では、オリゴマーは２〜４個の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含む。オリゴマーの抗Ｄｋｋ−１抗体部分は、上述の形態のうちの任意のもの、たとえば、変異体または断片であり得る。好ましくは、オリゴマーは、Ｄｋｋ−１結合活性を有する抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含む。
【０１８７】
一実施形態では、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製する。抗体由来のポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインが含まれる）と融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、たとえば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、（１９９１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８８：１０５３５、Ｂｙｒｎら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４４：６７７、およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、（１９９２）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、補遺４、ページ１０．１９．１〜１０．１９．１１によって記載されている。
【０１８８】
本発明の一実施形態は、抗Ｄｋｋ−１抗体のＤｋｋ−１結合断片を抗体のＦｃ領域と融合させることによって作製された２つの融合タンパク質を含む二量体に向けられている。二量体は、たとえば、融合タンパク質をコードしている遺伝子融合体を適切な発現ベクター内に挿入し、遺伝子融合体を、組換え発現ベクターで形質転換させた宿主細胞中で発現させ、発現された融合タンパク質を抗体分子と同様にアセンブルさせ、それにより鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間で形成させて二量体を得ることによって、作製することができる。
【０１８９】
本明細書中で使用する用語「Ｆｃポリペプチド」には、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドのネイティブおよび突然変異体タンパク質の形態が含まれる。また、二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、そのようなポリペプチドの切断された形態も含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー）は、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。
【０１９０】
ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１号ならびに米国特許第５，４２６，０４８号および第５，２６２，５２２号に記載されている１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域からネイティブＣ末端まで伸びる単鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３：３９９２〜４００１に記載されているＦｃ突然変異体タンパク質である。この突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化しており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化しており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化している以外は、ＷＯ９３／１０１５１号に提示されているネイティブＦｃ配列と同一である。突然変異体タンパク質は、Ｆｃ受容体に対して低下した親和性を示す。
【０１９１】
他の実施形態では、本明細書中に開示したものなどの抗Ｄｋｋ−１抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分で抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分を置換し得る。
【０１９２】
代替として、オリゴマーは、複数の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含み、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を有するまたは有さない融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーは、とりわけ、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されているものである。
【０１９３】
オリゴマー抗Ｄｋｋ−１抗体誘導体を調製する別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインとは、それが見つかるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質中で最初に同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１７５９）、それ以降、様々な異なるタンパク質中で見つかっている。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書中に参照により組み込まれているＷＯ９４／１０３０８号に記載されているもの、およびＨｏｐｐｅら（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３４４：１９１に記載されている肺界面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。それと融合した異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、改変されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら（１９９４）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：２６７〜７８に記載されている。一手法では、ロイシンジッパーペプチドと融合させた抗Ｄｋｋ−１抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞中で発現させ、形成される可溶性オリゴマー抗Ｄｋｋ−１抗体断片または誘導体を培養上清から回収する。
【０１９４】
核酸
また、本発明の抗体の一方もしくは両方の鎖、またはその断片、誘導体、突然変異体タンパク質、もしくは変異体をコードしている核酸、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを同定、分析、突然変異または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたは配列決定プライマーとして使用するために十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述のものの相補的配列も提供される。核酸は任意の長さとすることができる。これらは、たとえば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００個またはそれより多いヌクレオチドの長さとすることができ、ならびに／または１つまたは複数の付加配列、たとえば調節配列を含む、および／もしくはより大きな核酸、たとえばベクターの一部とすることができる。核酸は一本鎖または二本鎖とすることができ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにその人工変異体（たとえばペプチド核酸）を含むことができる。また、これらのペプチドが含まれる融合タンパク質をコードしている核酸も提供される。
【０１９５】
抗体ポリペプチド（たとえば、重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または完全長）をコードしているＤＮＡは、Ｄｋｋ−１またはその免疫原性断片で免疫化したマウスのＢ細胞から単離し得る。ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの慣用の手順によって単離し得る。ファージディスプレイは、抗体の誘導体を調製し得る既知の技法の別の例である。一手法では、目的の抗体の構成成分であるポリペプチドを任意の適切な組換え発現系中で発現させ、発現されたポリペプチドをアセンブルさせて抗体分子を形成する。
【０１９６】
抗体の軽鎖や重鎖、可変領域およびＣＤＲならびに免疫学的に機能的な断片をコードしている例示的な核酸が提供される。遺伝暗号の縮重が原因で、ポリペプチド配列のそれぞれは、記載されているもの以外の多数の他の核酸配列によってもコードされている。本発明は、本発明のそれぞれの抗体をコードしているそれぞれの縮重ヌクレオチド配列を提供する。
【０１９７】
本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸とハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせる方法は当分野で周知である。たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６を参照されたい。既知の中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例では、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または約５０％のホルムアミドを含有するものなどの他の類似のハイブリダイゼーション溶液および４２℃のハイブリダイゼーション温度）、ならびに６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの洗浄条件を使用する。既知のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６×ＳＳＣ中、４５℃でのハイブリダイズ、次いで０．１×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中、６８℃での１回または複数回の洗浄である。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作して、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズして保たれるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加または減少させることができる。
【０１９８】
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本パラメータおよび適切な条件を考案するための指針は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、第９および１１章、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、セクション２．１０および６．３〜６．４によって記載されており、たとえばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者が容易に決定することができる。
【０１９９】
核酸内への突然変異によって変化を導入することができ、それにより、それがコードしているポリペプチド（たとえば本発明の抗体または抗体誘導体）のアミノ酸配列中の変化がもたらされる。突然変異は、当分野で知られている任意の技法を用いて導入することができる。一実施形態では、１つまたは複数の特定のアミノ酸残基は、たとえば部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて変化させる。別の実施形態では、１つまたは複数のランダムに選択された残基は、たとえばランダム突然変異誘発プロトコルを用いて変化させる。それがどのように作製されるかに関わらず、突然変異体ポリペプチドを発現させて所望の特性についてスクリーニングすることができる。
【０２００】
それがコードしているポリペプチドの生物活性を顕著に変更させずに、核酸内に突然変異を導入することができる。たとえば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。代替として、それがコードしているポリペプチドの生物活性を選択的に変化させる１つまたは複数の突然変異を核酸内に導入することができる。たとえば、突然変異は、生物活性を定量的または定性的に変化させることができる。定量的変化の例には、活性の増加、低下または排除が含まれる。定性的変化の例には、抗体の抗原特異性の変化が含まれる。
【０２０１】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸配列を検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとしての使用に適した核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードしている核酸配列の一部分のみ、たとえば、プローブまたはプライマーとして使用することができる断片または本発明のポリペプチドの活性部分（たとえばＤｋｋ−１結合部分）をコードしている断片を含むことができる。
【０２０２】
本発明の核酸の配列に基づくプローブを用いて、核酸または類似の核酸、たとえば本発明のポリペプチドをコードしている転写物を検出することができる。プローブは、標識基、たとえば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含むことができる。そのようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定することができる。
【０２０３】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその一部分（たとえば、１つまたは複数のＣＤＲまたは１つまたは複数の可変領域ドメインを含有する断片）をコードしている核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例には、それだけには限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、たとえば、組換え発現ベクターが含まれる。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態の、本発明の核酸を含むことができる。組換え発現ベクターには、発現させる核酸配列と作動可能に連結した、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択された１つまたは複数の調節配列が含まれる。調節配列には、多くの種類の宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの（たとえば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（たとえば、組織特異的調節配列、その全体が本明細書中に参照により組み込まれているＶｏｓｓら（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、１１：２８７、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６：１２３７を参照）、ならびに特定の処理または条件に応答してヌクレオチド配列の誘導性発現を指示するもの（たとえば、哺乳動物細胞におけるメタロチオネインプロモーター、原核および真核系の両方におけるｔｅｔ応答性のおよび／またはストレプトマイシン応答性プロモーター（同上を参照））が含まれる。当業者には、発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの要因に依存する場合があることが理解されよう。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入して、それにより、本明細書中に記載されている核酸によってコードされている融合タンパク質またはペプチドを含めたタンパク質またはペプチドを産生させることができる。
【０２０４】
別の態様では、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞（たとえば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（たとえばＣＨＯ細胞））とすることができる。ベクターＤＮＡは、慣用の形質転換または形質移入技法によって原核または真核細胞内に導入することができる。哺乳動物細胞の安定な形質移入では、使用する発現ベクターおよび形質移入技法に応じて、細胞のわずかな割合のみが外来ＤＮＡをそのゲノム内に組み込み得ることが知られている。これらの組込み体を同定および選択するために、一般に、選択マーカー（たとえば、抗生物質に対する耐性）をコードしている遺伝子を、目的の遺伝子と共に宿主細胞内に導入する。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与えるものが含まれる。導入した核酸で安定に形質移入された細胞は、他の方法の中で、とりわけ薬物選択（たとえば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存する一方で、他の細胞は死滅する）によって同定することができる。
【０２０５】
抗体の調製
提供される非ヒト抗体は、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（サル（たとえば、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）またはアカゲザル）または類人猿（たとえばチンパンジー）など）等の任意の抗体産生動物に由来することができる。非ヒト抗体は、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養および細胞培養に基づく応用、または抗体に対する免疫応答が起こらないまたはわずかである、防止することができる、懸念されない、または所望される、任意の他の応用で使用することができる。本発明の特定の実施形態では、抗体は、完全長Ｄｋｋ−１またはＤｋｋ−１のカルボキシ末端半分を用いた免疫化によって産生させ得る。抗体は、ポリクローナル、モノクローナルであり得るか、または組換えＤＮＡを発現させることによって宿主細胞中で合成させ得る。
【０２０６】
完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位を含有するトランスジェニック動物を免疫化することによって、またはヒト抗体のレパートリーを発現しているファージディスプレイライブラリを選択することによって、上述のように調製し得る。
【０２０７】
本発明のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、慣用のモノクローナル抗体方法、たとえば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技法を含めた様々な技法によって産生させることができる。代替として、モノクローナル抗体を産生させる他の技法、たとえば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換を用いることができる。ハイブリドーマを調製するための１つの適切な動物系は、非常に十分に確立されている手順であるマウス系である。免疫化プロトコルおよび融合のために免疫化した脾細胞を単離する技法は当分野で知られている。そのような手順では、免疫化したマウスからのＢ細胞をマウス骨髄腫細胞系などの適切な不死化融合パートナーと融合させる。所望する場合は、ラットまたはそれ以外の他の哺乳動物をマウスの代わりに免疫化することができ、そのような動物からのＢ細胞をマウス骨髄腫細胞系と融合させて、ハイブリドーマを形成する。代替として、マウス以外の供給源からの骨髄腫細胞系を使用し得る。ハイブリドーマを作製するための融合手順も周知である。
【０２０８】
提供される単鎖抗体は、重鎖および軽鎖の可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を、アミノ酸橋（短いペプチドリンカー）を介して連結し、単一のポリペプチド鎖をもたらすことによって形成し得る。そのような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ペプチドリンカーをコードしているＤＮＡを、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードしているＤＮＡ間に融合させることによって調製し得る。生じるポリペプチドは、それ自体で折り畳まれて抗原結合単量体を形成することができるか、または、これらは、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、多量体（たとえば、二量体、三量体、または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔら（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１０：４２３、Ｋｏｒｔｔら（２００１）Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、１８：９５〜１０８）。様々なＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、様々なエピトープと結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら（２００１）Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、１８：３１〜４０）。単鎖抗体を作製するために開発された技法には、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９、Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５４４、ｄｅ  Ｇｒａａｆら（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、１７８：３７９〜８７に記載されているものが含まれる。
【０２０９】
１つのサブクラスのものである本明細書中で提供される抗体は、サブクラス切り替え方法を用いて、異なるサブクラスからの抗体へと変化させることができる。したがって、たとえばＩｇＧ抗体はＩｇＭ抗体に由来する場合があり、逆もそうである。そのような技法により、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を保有するが、親抗体とは異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスに関連する生物学的特性も示す、新しい抗体の調製が可能となる。組換えＤＮＡ技法を用い得る。特定の抗体ポリペプチドをコードしているクローニングしたＤＮＡ、たとえば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードしているＤＮＡを、そのような手順で用い得る。たとえばＬａｎｔｔｏら（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７８：３０３〜１６を参照されたい。
【０２１０】
さらに、様々な特性（すなわち、それらが結合する抗原に対する変動する親和性）を有する抗体を誘導体化する技法も知られている。鎖シャフリングと呼ばれる１つのそのような技法は、免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーを糸状バクテリオファージの表面上に表示させることを含み、しばしばファージディスプレイと呼ばれる。鎖シャフリングは、Ｍａｒｋｓら（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９によって記載されているように、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高親和性抗体を調製するために使用されている。
【０２１１】
保存的修飾を表１に記載の重鎖および軽鎖に行って（ならびにコードしている核酸への対応する修飾）、機能的および生化学的な特徴を有する抗Ｄｋｋ−１抗体を生成し得る。そのような修飾を達成する方法は上述されている。
【０２１２】
本発明による抗体およびその機能的な断片は、様々な方法でさらに修飾し得る。たとえば、これらを治療目的で使用する場合は、これらをポリエチレングリコールとコンジュゲートさせて（ペグ化）、血清半減期を延長させる、またはタンパク質の送達を増強し得る。代替として、対象抗体またはその断片のＶ領域を異なる抗体分子のＦｃ領域と融合させ得る。この目的のために使用するＦｃ領域は、相補体と結合しないように、したがって、融合タンパク質を治療剤として使用する場合に患者において細胞溶解が誘導される可能性が低下されるように、修飾し得る。さらに、対象抗体またはその機能的な断片は、抗体またはその断片の血清半減期を増大させるためにヒト血清アルブミンとコンジュゲートさせ得る。本発明の抗体またはその断片の別の有用な融合パートナーはトランスサイレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは四量体を形成する能力を有しており、したがって、抗体−ＴＴＲの融合タンパク質は多価抗体を形成することができ、これはその結合力を増加させ得る。
【０２１３】
代替として、本明細書中に記載する抗体および断片の機能的および／または生化学的特徴の実質的な改変は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列中に、（ａ）置換の領域中の、たとえばシートまたはヘリックスコンホメーションとしての分子主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さの維持におけるその効果が顕著に異なる置換を作製することによって、達成し得る。「保存的アミノ酸置換」は、ネイティブアミノ酸残基を、その位置でのアミノ酸残基の極性または荷電に与える効果がわずかまたは存在しない、非ネイティブ残基で置換することを含み得る。さらに、アラニン走査突然変異誘発によって以前に記載されているように、ポリペプチド中の任意のネイティブ残基をアラニンで置換してもよい。
【０２１４】
対象抗体のアミノ酸置換（保存的または非保存的に関わらず）は、当業者によって、ルーチン的な技法を適用することによって実行することができる。アミノ酸置換は、本明細書中に提供される抗体の重要な残基を同定するため、またはヒトＤｋｋ−１に対するこれらの抗体の親和性を増加もしくは減少させるため、または本明細書中に記載の他の抗Ｄｋｋ−１抗体の結合親和性を改変させるために、使用することができる。
【０２１５】
抗Ｄｋｋ−１抗体の発現
抗Ｄｋｋ−１抗体および免疫学的な機能的断片は、いくつかの慣用技術のうちの任意のものによって調製することができる。たとえば、抗Ｄｋｋ−１抗体は、組換え発現系によって、当分野で知られている任意の技法を用いて生成し得る。たとえば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｋｅｎｎｅｔら（編）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）、ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）を参照されたい。
【０２１６】
本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞系中またはハイブリドーマ以外の細胞系で発現させることができる。抗体をコードしている発現構築体を用いて、哺乳動物、昆虫または微生物の宿主細胞を形質転換させることができる。形質転換は、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号によって例示されているように、たとえば、ポリヌクレオチドをウイルスまたはバクテリオファージ中にパッケージングし、当分野で知られている形質移入手順によって、構築体を用いて宿主細胞を形質導入することを含めた、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の既知の方法を用いて行うことができる。使用する最適な形質転換手順は、形質転換させる宿主細胞の種類に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入する方法は当分野で周知であり、それだけには限定されないが、デキストラン媒介性形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中へのポリヌクレオチド（複数可）のカプセル封入、核酸と正荷電脂質との混合、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が含まれる。
【０２１７】
本発明の組換え発現構築体は、典型的には、重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、抗Ｄｋｋ−１抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数のＣＤＲのうちの１つまたは複数を含むポリペプチドをコードしている核酸分子を含む。これらの核酸配列は、標準のライゲーション技法を用いて適切な発現ベクター内に挿入する。ベクターは、典型的には、用いる特定の宿主細胞中で機能的であるように選択する（すなわち、ベクターは宿主細胞の機構と適合性があり、遺伝子の増幅および／または発現の許容が起こることを可能にする）。一部の実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを使用したタンパク質断片相補性アッセイを用いるベクターを使用する（たとえば、本明細書中に参照により組み込まれている米国特許第６，２７０，９６４号を参照）。適切な発現ベクターは、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（以前は「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」）から購入することができる。本発明の抗体および断片をクローニングおよび発現させるための他の有用なベクターには、本明細書中に参照により組み込まれているＢｉａｎｃｈｉおよびＭｃＧｒｅｗ、Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、８４（４）：４３９〜４４（２００３）に記載されているものが含まれる。さらなる適切な発現ベクターは、たとえばＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、第１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）（１９９０）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記述されている。
【０２１８】
典型的には、宿主細胞のうちの任意のもので使用する発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスを維持するためならびに外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび発現させるための配列を含有する。「フランキング配列」と総称されるそのような配列には、典型的には、以下の作動可能に連結したヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数が含まれる：プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプターのスプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードしている配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードしている核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカー要素。
【０２１９】
任意選択で、ベクターは、「タグ」のコード配列、すなわち、コード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）をコードしているオリゴヌクレオチド配列、または、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（インフルエンザウイルスからの赤血球凝集素）、もしくはｍｙｃなどの、市販の抗体が存在する別の「タグ」を含有し得る。タグは、典型的には発現の際に抗体タンパク質と融合され、抗体を宿主細胞から親和性精製する手段として役割を果たすことができる。親和性精製は、たとえば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって、達成することができる。任意選択で、タグは、続いて切断用の特定のペプチダーゼを用いることなどの様々な手段によって、精製した抗体ポリペプチドから除去することができる。
【０２２０】
発現ベクター中のフランキング配列は、相同的（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、複数の供給源由来のフランキング配列の組合せ）、合成またはネイティブであり得る。したがって、フランキング配列の供給源は、フランキング配列が宿主細胞の機構中で機能的であり、それによって活性化されることができる限りは、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎動物生物もしくは無脊椎動物生物、または任意の植物であり得る。
【０２２１】
本発明のベクター中で有用なフランキング配列は、当分野で周知のいくつかの方法のうちの任意のものによって得られ得る。典型的には、本明細書中で有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されているはずであり、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離することができる。一部の事例では、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知であり得る。ここでは、フランキング配列は、核酸を合成またはクローニングするための本明細書中に記載の方法を用いて合成し得る。
【０２２２】
フランキング配列の全体または一部分のみが知られている場合は、これは、ＰＣＲを用いて、および／またはゲノムライブラリを、同じまたは別の種からの適切なオリゴヌクレオチドおよび／またフランキング配列断片を用いてスクリーニングすることによって、得られ得る。フランキング配列が知られていない場合は、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片を、たとえば、コード配列またはさらには別の遺伝子もしくは複数の遺伝子を含有し得る、より大きなＤＮＡ片から単離し得る。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を生じさせ、次いで、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（カリフォルニア州Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ）、または当業者に知られている他の方法を用いて単離することで達成し得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかであろう。
【０２２３】
複製起点とは、典型的には、原核発現ベクター、特に購入したものの一部であり、起点は、宿主細胞中でのベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製起点部位を含有しない場合は、既知の配列に基づいてそれを化学合成し、ベクター内にライゲーションさせ得る。たとえば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）からの複製起点がほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、様々な起点（たとえば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が哺乳動物細胞中にベクターをクローニングするために有用である。一般に、哺乳動物複製起点は哺乳動物発現ベクターには必要ない（たとえば、ＳＶ４０起点は、多くの場合、これが初期プロモーターを含有することのみが理由で使用する）。
【０２２４】
本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、かつ抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードしている核酸と作動可能に連結しているプロモーターを含有する。プロモーターとは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置する（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）転写されない配列である。プロモーターは、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター２つのクラスのうちの１つへと慣習的に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の存在もしくは非存在または温度の変化などの、培養条件の何らかの変化に応答して、その制御下にあるＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始させる。他方で、構成的プロモーターは連続的な遺伝子産物の産生を開始する、すなわち、遺伝子発現の実験的制御はわずかしか存在しない、または存在しない。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、制限酵素消化によってプロモーターを供給源ＤＮＡから除去することによって、またはプロモーターをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、所望のプロモーター配列をベクター内に挿入することによって、抗Ｄｋｋ−１抗体をコードしているＤＮＡと作動可能に連結させる。
【０２２５】
また、酵母宿主で使用するための適切なプロモーターも当分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞での使用に適したプロモーターは周知であり、それだけには限定されないが、ポリオーマウイルス、家禽ポックスウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られたものが含まれる。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、たとえば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
【０２２６】
本発明の組換え発現ベクターの実施に有用な特定のプロモーターには、それだけには限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｍｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ、２９０：３０４〜１０）、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０）Ｃｅｌｌ、２２：７８７〜９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８：１４４４〜４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２）、ベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７〜３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：２１〜２５）が含まれる。また、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている、以下の動物転写制御領域も、使用が利用可能である：膵臓腺房細胞中で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら（１９８４）Ｃｅｌｌ、３８：６３９４６、Ｏｒｎｉｔｚら（１９８６）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５０：３９９４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、７：４２５〜５１５、膵臓ベータ細胞中で活性のあるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、３１５：１１５〜２２）、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞中で活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら（１９８６）Ｃｅｌｌ、４５：４８５〜９５）、肝臓中で活性のあるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．、１：２６８〜７６）、肝臓中で活性のあるアルファ−胎児タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９〜４８、Ｈａｍｍｅｒら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：５３〜５８）、肝臓中で活性のあるアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．、１：１６１〜７１）、骨髄性細胞中で活性のあるベータ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１５：３３８〜４０、Ｋｏｌｌｉａｓら（１９８６）Ｃｅｌｌ、４６：８９〜９４）、脳中のオリゴデンドロサイト細胞中で活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら（１９８７）Ｃｅｌｌ、４８：７０３〜１２）、骨格筋中で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２８３〜８６）、視床下部中で活性のある性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４：１３７２〜７８）、ならびに最も詳しくはリンパ球細胞中で活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら（１９８４）Ｃｅｌｌ、３８：６４７〜５８、Ａｄａｍｅｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、３１８：５３３〜３８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７：１４３６〜４４）。
【０２２７】
高等真核生物における、本発明の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードしている核酸の転写を増加させるために、エンハンサー配列をベクター内に挿入し得る。エンハンサーとは、ＤＮＡのシス作用性要素であり、通常約１０〜３００ｂｐの長さであり、プロモーターに作用して転写を増加させる。エンハンサーは、配向および位置に比較的非依存的である。これらは、転写単位の５’および３’側に見つかっている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（たとえば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−胎児タンパク質およびインスリン）。また、ウイルスからのエンハンサー配列も使用することができる。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが、真核プロモーターを活性化させるための例示的なエンハンサー要素である。エンハンサーは、核酸分子の５’または３’側の位置でベクター内にスプライシングされ得るが、これは典型的にはプロモーターの５’側の部位に配置される。
【０２２８】
発現ベクター中、転写終結配列が典型的にはポリペプチドコード領域の末端の３’に位置し、転写を終結させる役割を果たす。原核細胞中での発現に使用される転写終結配列は、典型的には、Ｇ−Ｃリッチな断片、次いでポリＴ配列である。配列は、ライブラリから容易にクローニングされる、またはさらにはベクターの一部として購入される一方で、本明細書中に記載のものなどの核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。
【０２２９】
選択マーカー遺伝子要素は、選択的培養培地中で成長させる宿主細胞の生存および成長に必要なタンパク質をコードしている。発現ベクター中で使用される典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞では、抗生物質または他の毒素、たとえば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を与える、（ｂ）細胞の栄養要求欠乏を補完する、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重大な栄養素を供給する、タンパク質をコードしている。選択マーカーの例には、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれる。また、細菌性ネオマイシン耐性遺伝子も、原核および真核宿主細胞のどちらにおいても選択に使用することができる。
【０２３０】
他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅させることができる。増幅とは、単一のコピーでは、特定の選択条件下で細胞の生存および成長を可能にするために十分に高いレベルで発現されることができない遺伝子を、組換え細胞の連続的な世代の染色体内で、タンデムで反復させるプロセスである。哺乳動物細胞用の適切な増幅可能な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターを持たないチミジンキナーゼが含まれる。これらのマーカーの使用において、哺乳動物細胞形質転換体を、形質転換体のみがベクター中に存在する選択遺伝子のおかげで生存するように唯一適応している選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択剤の濃度を次々に増加させる条件下で形質転換細胞を培養し、それにより、選択遺伝子が増幅された細胞のみの生存を可能にすることによって課す。これらの状況下では、本発明の抗体をコードしているＤＮＡなどの選択遺伝子に隣接するＤＮＡが選択遺伝子と共に同時増幅される。その結果、増加した量の抗Ｄｋｋ−１ポリペプチドが増幅したＤＮＡから合成される。
【０２３１】
リボソーム結合部位がｍＲＮＡの翻訳開始に通常必要であり、これはシャイン−ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。この要素は、典型的にはプロモーターの３’側および発現させるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。
【０２３２】
一部の事例、たとえばグリコシル化が真核宿主細胞発現系中に所望される場合は、グリコシル化または収率を向上させるために様々なプレ配列を操作することができる。たとえば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更するか、または、やはりグリコシル化に影響を与え得るプロ配列を付加することができる。最終タンパク質産物は、−１位置（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に、完全に除去されていない場合がある、発現に付随する１つまたは複数の追加のアミノ酸を有し得る。たとえば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に付着した、ペプチダーゼ切断部位中に見つかる１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。代替として、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合は、一部の酵素切断部位の使用により、わずかに切断されているが、それでも活性型である所望のポリペプチドがもたらされ得る。
【０２３３】
市販の発現ベクターが上述の所望のフランキング配列の一部を欠く場合は、これらの配列をベクター内に個々にライゲーションさせることによってベクターを改変することができる。ベクターを選択し、所望に応じて改変した後、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードしている核酸分子をベクターの適切な部位内に挿入する。
【０２３４】
本発明の抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードしている配列を含有する完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞内に挿入する。抗Ｄｋｋ−１抗体、その免疫学的に機能的な断片のための発現ベクターを選択された宿主細胞内に形質転換させることは、形質移入、感染症、塩化カルシウム、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン方法、または他の知られている技法などの方法を含めた、周知の方法によって達成し得る。選択された方法は、使用する宿主細胞の種類と部分的に相関関係にある。これらの方法および他の適切な方法は当業者に周知である。
【０２３５】
形質転換させた宿主細胞は、適切な条件下で培養した際に、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその機能的な断片を合成し、続いて、これを培養培地から収集するか（宿主細胞がそれを培地内に分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接収集することができる（それが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）、および生物活性のある分子への折り畳みの容易さ等の、様々な要因に依存する。
【０２３６】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当分野で周知であり、それだけには限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえばＨｅｐ  Ｇ２）、およびいくつかの他の細胞系などの、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系が含まれる。特定の実施形態では、特定のＤＮＡ構築体を発現させるための最良の細胞系は、様々な細胞系を試験して、どれが最高レベルの発現レベルを有し、構成的なＤｋｋ−１結合特性を有する抗体を産生するかを決定することによって選択し得る。
【０２３７】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、薬学的に許容できる担体と一緒に配合した、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分（複数可）のうちの１つまたは組合せを含有する組成物、たとえば医薬組成物を提供する。そのような組成物には、本開示の（たとえば２つ以上の異なる）抗体、または免疫コンジュゲートもしくは二重特異性分子の１つまたは組合せが含まれ得る。たとえば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合する、または相補的活性を有する抗体（または免疫コンジュゲートもしくは二重特異性抗体）の組合せを含むことができる。
【０２３８】
また、本開示の医薬組成物は、組合せ療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば、組合せ療法には、少なくとも１つの他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた、本開示の抗Ｄｋｋ−１抗体が含まれていてもよい。組合せ療法で使用することができる治療剤の例は、以下の本開示の抗体の使用のセクションにさらに詳述されている。
【０２３９】
本明細書中で使用する「薬学的に許容できる担体」には、生理的に適合性のある任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。典型的には、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射またはインフュージョンによる）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、その抗原結合部分、免疫コンジュゲート、または二重特異性分子は、酸および化合物を失活させ得る他の天然条件の作用から化合物を保護するために、物質でコーティングし得る。
【０２４０】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、中性の形態（双性イオン形態が含まれる）または正もしくは負荷電の種で存在し得る。一部の事例では、抗体を対イオンと複合させて、薬学的に許容できる塩を形成させ得る。したがって、本開示の医薬化合物には、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩が含まれ得る。
【０２４１】
「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物（たとえば抗体）の所望の生物活性を保持しており、望ましくない毒性効果を与えない塩をいう（たとえばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６：１〜１９を参照）。たとえば、用語「薬学的に許容できる塩」には、１つまたは複数の抗体および１つまたは複数の対イオンを含む複合体が含まれ、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基に由来する。
【０２４２】
そのような塩の例には酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リンなどの無毒性の無機酸、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０２４３】
さらに、薬学的に許容できる無機塩基には、金属イオンが含まれる。金属イオンには、それだけには限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および他の生理的に許容できる金属イオンが含まれる。無機塩基に由来する塩には、その通常の原子価のアルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレン、スズ、銅、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ルビジウム、ナトリウム、および亜鉛が含まれる。
【０２４４】
本開示の抗体の薬学的に許容できる酸付加塩は、それだけには限定されないが、ギ酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、ショウノウ酸、炭酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンジゾ酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リシン、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモン酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オロト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシ酪酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、ショウノウスルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサル５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸を含めた酸から調製することができる。
【０２４５】
薬学的に許容できる有機塩基には、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、第四級アンモニウム陽イオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コレート、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、ならびにトロメタモールが含まれる。
【０２４６】
また、本開示の医薬組成物には、薬学的に許容できる抗酸化剤も含まれ得る。薬学的に許容できる抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油可溶性抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が含まれる。
【０２４７】
本開示の医薬組成物で用い得る適切な水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング物質を使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。
【０２４８】
また、これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、ならびに様々な抗細剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって、確実にし得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物内に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射用医薬品形態の長期的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらし得る。
【０２４９】
薬学的に許容できる担体には、無菌的な注射用液剤または分散液を即時調製するための無菌的な水溶液または分散液および無菌的な粉末が含まれる。医薬上活性のある物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当分野で知られている。任意の慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合以外は、本開示の医薬組成物におけるその使用が企図される。また、補助的活性化合物も組成物内に組み込むことができる。
【０２５０】
治療的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌的かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の整った構造として配合することができる。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０２５１】
無菌的な注射用液剤は、所要量の活性化合物を適切な溶媒中、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に取り込ませ、次いで滅菌微量濾過することによって、調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記に列挙したものからの所要の他の成分を含有する無菌的なビヒクル内に取り込ませることによって調製する。無菌的な注射用液剤を調製するための無菌的な粉末の場合、調製方法には、それだけには限定されないが、以前に滅菌濾過したその溶液からの活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が含まれる。
【０２５２】
担体物質と組み合わせて単一の剤形を生じさせることができる活性成分の量は処置する対象および特定の投与様式に応じて変動する。担体物質と組み合わせて単一の剤形を生じさせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容できる担体と組み合わせて約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲となる。
【０２５３】
最適な所望の応答（たとえば治療反応）を提供するために投薬レジメンを調節する。たとえば、単一のボーラスを投与し得るか、いくつかの分割した用量を経時的に投与し得るか、または治療状況の急迫によって指示されるように用量を比例的に低下もしくは増加させ得る。投与の容易性および投薬の均質性のために、非経口組成物を単位剤形で配合することが特に有利である。本明細書中で使用する単位剤形とは、処置する対象の単位用量として適した物理的に別個の単位をいい、それぞれの単位は、所要の医薬担体と共同して所望の治療効果が生じるように計算された、事前に決定された量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特な特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体において感度を処理するための、そのような活性化合物を化合する分野に固有の制限によって指示され、それに直接依存する。
【０２５４】
抗体の投与には、用量は宿主の体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇの範囲である。たとえば、用量は、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇもしくは１０ｍｇ／体重１ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。例示的な処置レジームは、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３カ月に１回、または３〜６カ月に１回の投与を必要とする。本開示の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその抗原結合部分の投薬レジメンには、たとえば、皮下投与による１ｍｇ／体重１ｋｇまたは３ｍｇ／体重１ｋｇが含まれ、抗体は、（ｉ）４週間毎に６回の投薬、その後に３カ月毎、（ｉｉ）３週間毎、（ｉｉｉ）３ｍｇ／体重１ｋｇを１回、次いで１ｍｇ／体重１ｋｇを３週間毎の投薬スケジュールのうちの１つを用いて与える。
【０２５５】
一部の実施形態では、異なる結合特異性を有する２つ以上の抗体またはその断片を同時に投与し、その場合、投与するそれぞれの抗体の用量は示した範囲内にある。抗体は、通常、複数回数で投与する。単一投薬の間の間隔は、たとえば、週に１回、月に１回、３カ月毎または年に１回とすることができる。また、間隔は、患者中の標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって指示されるように、不規則であることもできる。一部の方法では、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、一部の方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度が達成されるように用量を調節する。
【０２５６】
代替として、抗体は持続放出配合物として投与することができ、その場合、より低い頻度の投与が必要である。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投与の用量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかに応じて変動する場合がある。予防的な応用では、比較的低い用量を比較的低い頻度の間隔で長期的に投与する。一部の患者は、その余生の間ずっと処置を受け続ける。治療的な応用では、比較的短い間隔の比較的高い用量が、場合によっては疾患の進行が低減または終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで必要である。それ以降、患者に予防的レジームを投与することができる。
【０２５７】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療反応を達成するために有効な活性成分の量を得るために、変動させ得る。選択される用量レベルは、用いる本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄率、処置の持続期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、重量、状態、全体的な健康および以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の要因を含めた、様々な薬物動態学的要因に依存する。
【０２５８】
本開示の抗Ｄｋｋ−１抗体の「治療上有効な用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および持続期間の増加、または疾患の罹患が原因の機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択した特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、そのような量を決定できるであろう。
【０２５９】
抗ＤＫＫ−１抗体の用量は、標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）ＰＫ／ＰＤモデルなどの方法を用いて計算することができる。そのようなモデルを用いて、抗体濃度応答の関係性を計算することができる。ＰＫ／ＰＤモデルを用いて、抗体の非標的媒介性排除、抗体の代謝回転ならびに複合体の形成および排除を推定することができる。ＴＭＤＤモデルを用いて、動物モデル（たとえばラットまたはサル）を用いて決定されたデータをヒトデータへと換算して、有効な用量を予測することができる。ＭＡＢＥＬモデルを用いて、発現率および代謝回転速度を決定することができる。ＰＫ／ＰＤモデルを用いて、Ｋｄ値に基づいた受容体占有率を計算することができる。標的および／または抗体−標的の複合体の代謝回転の受容体占有率を決定するために、動態学を考慮する。ＰＫ／ＰＤモデルを用いて、臨床研究の安全性および効率を予測し得る。
【０２６０】
本開示の組成物は、１つまたは複数の投与経路を介して、当分野で知られている様々な方法のうちの１つまたは複数を用いて、投与することができる。当業者によって理解されるように、経路および／または投与様式は所望の結果に応じて変動する。本開示の抗体またはその抗原結合部分のための投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、たとえば注射またはインフュージョンによるものが含まれる。本明細書中で使用する語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の投与様式、通常は注射によるものを意味し、それだけには限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射およびインフュージョンが含まれる。
【０２６１】
代替として、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、局所、表皮または粘膜の投与経路、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所などの、非経口でない経路を介して投与することができる。
【０２６２】
活性化合物は、移植片、経皮パッチ、および微量カプセル封入送達系を含めた徐放性配合物などの、化合物を迅速な放出に対して保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような配合物を調製するための多くの方法が、特許取得されている、または当業者に一般に知られている。たとえばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）を参照されたい。
【０２６３】
治療的組成物は、当分野で知られている医療装置を用いて投与することができる。たとえば、本開示治療的組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号に開示されている装置などの無針皮下注射装置を用いて投与することができる。本開示で有用な周知の移植片およびモジュールの例には、制御された速度で医薬品を分注するための埋込み型微量注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して医薬品を投与するための治療用装置を開示している米国特許第４，４８６，１９４号、医薬品を正確なインフュージョン速度で送達するための医薬品注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための可変流の埋込み型インフュージョン器具を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、複数チャンバ区画を有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。多くの他のそのような移植片、送達系、およびモジュールが当業者に知られている。
【０２６４】
一部の実施形態では、本開示の抗体またはその断片は、適切なｉｎ  ｖｉｖｏ分布を確実にするように配合することができる。たとえば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高度に親水性の化合物を排除する。本開示の治療的化合物がＢＢＢを横切ることを確実にするために（所望する場合）、これらをたとえばリポソーム中で配合することができる。リポソームを製造する方法には、たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号、第５，３７４，５４８号、および第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官内に選択的に輸送され、したがって標的化された薬物送達を増強する、１つまたは複数の部分を含み得る（たとえばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２９：６８５を参照）。例示的な標的化部分には、フォレートまたはビオチン（たとえばＬｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号を参照）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５３：１０３８）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３９：１８０）、界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２３３：１３４）、ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：９０９０）が含まれる。Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ、Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３４６：１２３、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ、Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２７３も参照されたい。
【０２６５】
本明細書中で提供するように、提供される医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。「有効量」とは、一般に、症状の重症度および／もしくは頻度の低減もしくは排除、ならびに／または損傷の向上もしくは矯正である所望の効果を達成するための、十分であるが無毒性である活性成分（すなわち、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片）の量をいう。「治療上有効な量」とは、病状または症状を救済する、または他の様式で疾患または任意の他の望ましくない症状の進行を予防、妨害、遅延もしくは逆転させるために十分な量をいう。「予防上有効な量」とは、病状または症状の発症を予防、妨害または遅延させるために有効な量をいう。
【０２６６】
一般に、抗体または断片の毒性および治療上の有効性は、たとえばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）の決定を含めた、細胞培養および／または実験動物における標準の医薬手順に従って決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい。
【０２６７】
細胞培養および／または動物研究から得られたデータを、ヒトの用量の範囲の処方に使用することができる。活性成分の用量は、典型的には、毒性がわずかしか存在ないまたは存在しないＥＤ５０が含まれる、循環濃度の範囲内にある。用いる剤形および利用する投与経路に応じて、用量はこの範囲内で変動することができる。
【０２６８】
本明細書中で言及するように、治療的または予防的に用いる、有効量の、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む医薬組成物は、たとえば、治療的コンテキストおよび目的に依存する。当業者は、したがって特定の実施形態に従った処置の適切な用量レベルが、送達する分子、抗Ｄｋｋ−１抗体を使用する適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面または器官の大きさ）および／または状態（年齢や全体的な健康）に部分的に依存して変動することを理解されよう。臨床家は、最適な治療効果を得るために用量を滴定し、投与経路を改変し得る。
【０２６９】
投薬頻度は、配合物中の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片の薬物動態学的パラメータに依存する。たとえば、臨床家は、所望の効果が達成される用量に達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単一の用量として、または経時的な２つ以上の用量（同じ量の所望の分子を含有していても、していなくてもよい）として、または移植装置またはカテーテルを介した持続注入として投与し得る。処置は経時的に連続的または断続的であり得る。適切な用量のさらなる洗練は当業者によってルーチン的に行われており、彼らによってルーチン的に行われている作業の範囲内にある。適切な用量は、適切な用量−応答のデータを用いることによって確認し得る。
【０２７０】
Ｄｋｋ−１の異常または過剰な発現によって特徴付けられる医学的障害を治療するために、対象抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む組成物を、障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標の持続的な向上を誘導するために十分な量および時間で、患者に投与し得る。向上は、患者が、少なくとも１〜７日間、または一部の例では１〜６週間によって隔てられた少なくとも２回において向上を示す場合に、「持続されている」とみなされる。適切な間隔は、どの症状を処置しているかにある程度依存する。向上が維持されているかを決定するための適切な間隔を決定することは、医師の権限範囲内にある。向上の度合は兆候または症状に基づいて決定され、また、生活の質の質問表などの患者に実施する質問表も用い得る。
【０２７１】
患者の病気の程度を反映する様々な指標を評価して、処置の量および時間が十分であるかどうかを決定し得る。選択した指標または複数の指標のベースライン値は、抗体の最初の用量を投与する前に患者を検査することによって確立する。好ましくは、ベースライン検査は、最初の用量を投与する約６０日以内に行う。抗体を、たとえば骨折を処置するためなど、急性症状を処置するために投与する場合は、最初の用量は、傷害が起こった後の、実用的に可能なできる限りすぐに投与する。
【０２７２】
向上は、対象抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を、患者が選択した指標または複数の指標についてベースラインを超える向上を現すまで投与するによって誘導する。慢性症状の処置では、この向上の度合は、この医薬品を、少なくとも１カ月以上の期間、たとえば、１、２、もしくは３カ月もしくはそれより長い期間、または無期限に繰り返し投与することによって得られる。１〜６週間の期間、またはさらには単一の用量が、急性状態を処置するために多くの場合は十分である。傷害または急性状態には、単一の用量が十分であり得る。
【０２７３】
処置後の患者の病気の程度が１つまたは複数の指標に従って向上したように見え得る場合でも、処置を無期限に同じレベルまたは低下した用量もしくは頻度で続け得る。処置を低下または中断した後、後に症状が再出現した場合は元のレベルで再開し得る。
【０２７４】
抗Ｄｋｋ−１抗体の例示的な利用
検出およびスクリーニング
対象抗Ｄｋｋ−１抗体およびその免疫学的に機能的な断片は、生体試料中のＤｋｋ−１を検出するために使用することができる。そのような使用は、このタンパク質を産生する細胞または組織の同定を可能にする、またはＤｋｋ−１が過剰産生または過少産生されている病的状態を検出するための診断材料として役割を果たす。
【０２７５】
また、提供される抗体および断片は、Ｄｋｋ−１と結合する分子をスクリーニングする方法でも使用することができる。たとえば、様々な競合的スクリーニング方法を使用することができる。一部の方法では、Ｄｋｋ−１分子または抗Ｄｋｋ−１抗体が結合するその断片を、本明細書中に開示されている抗体または断片と、別の分子（すなわち候補分子）と共に接触させる。抗体または断片とＤｋｋ−１との間の結合の低下が、分子がＤｋｋ−１と結合する指標である。抗体または断片の結合は、様々な方法、たとえばＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。抗Ｄｋｋ−１抗体または断片とＤｋｋ−１との間の結合の検出は、抗体を検出可能に標識することによって簡素化することができる。一部の方法では、初期スクリーニングで結合を示す分子をさらに分析して、これがＤｋｋ−１活性を阻害するかどうか（たとえば、分子がＷｎｔシグナル伝達を活性化するかどうか）を決定する。
【０２７６】
骨関連障害の処置
他の態様では、提供される抗体および免疫学的に機能的な断片のうちの特定のものを用いて、たとえばＤｋｋ−１活性の阻害に応答性の疾患を含めた様々な疾患に罹患している患者を処置することができる。また、これらの抗体および断片は、Ｗｎｔシグナル伝達の誘導に応答性の疾患の処置にも使用することができる。本明細書中で使用する用語「患者」には、別段に記述しない限りはヒトおよび動物対象が含まれる。そのような疾患の例には、それだけには限定されないが、低骨量状態、全身性骨減少、骨形成抑制および骨侵食を含めた、骨障害に関与する様々な疾患が含まれる。また、抗体および断片の一部は骨修復も使用することができる。
【０２７７】
一部の実施形態では、抗体または断片は、骨芽細胞活性を刺激することおよび骨塩密度または骨量を増加させることにおいて治療的使用を有する。したがって、これらの抗体および断片は、過剰の骨減少に関与する様々な医学的障害を患っている患者、または必ずしも過剰の破骨細胞活性が存在し得ない場合でも新しい骨の形成を必要とする患者の処置に有用である。Ｄｋｋ−１活性の遮断は、Ｗｎｔタンパク質によって伝達されるシグナル伝達を介した骨芽細胞の活性化をもたらす。過剰の破骨細胞活性は、骨減少症、骨粗鬆症、歯周病、パジェット病、不動による骨減少、溶解性骨転移ならびに関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎および骨侵食に関与する他の状態を含めた関節炎を含めた、提供される抗体および免疫学的に機能的な断片を用いて処置することができる数々の骨減少性障害に関連している。
【０２７８】
また、それだけには限定されないが、糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症、移植後に誘導される骨粗鬆症、化学療法に関連する骨粗鬆症（すなわち化学療法誘導性骨粗鬆症）、不動に誘導される骨粗鬆症、機械的負荷軽減が原因の骨粗鬆症、および抗痙攣剤の使用に関連する骨粗鬆症を含めた、様々な形態の骨粗鬆症を含めた様々な他の低骨量状態も処置することができる。抗体または断片の一部を用いて処置することができるさらなる骨疾患には、腎不全に関連する骨疾患ならびに栄養、胃腸管系および／または肝臓に関連する骨疾患が含まれる。
【０２７９】
また、様々な形態の関節炎も処置することができ、その例には骨関節炎および関節リウマチが含まれる。また、抗体および断片は、関節炎（たとえば関節リウマチ）に関連する全身性骨減少を治療するためにも使用することができる。関節炎の処置において、患者は、対象抗体またはその断片の病変周囲または病巣内の注射によって恩恵を被り得る。たとえば、抗体またはその断片を、炎症性の関節に隣接してまたはそれ内に直接注射し、それにより部位での損傷した骨の修復刺激することができる。
【０２８０】
乳癌および前立腺癌などの一部の癌は、破骨細胞活性を増加させ、骨吸収を誘導することが知られている。骨髄中に生じる多発性骨髄腫は骨減少にも関連しており、これは、形質細胞によるＤｋｋ−１の増加した発現に部分的に原因がある可能性があり、これは近傍の骨芽細胞の骨構築活性を抑制する。対象抗体またはその免疫学的に機能的な断片を投与することによってＤｋｋ−１活性を低減させることは、過剰の破骨細胞活性を相殺する役割を果たす骨芽細胞活性の増加をもたらす場合があり、それにより、前述の障害の重症度が低減され、骨侵食が低減され、患者において新しい骨形成が誘導される。抗Ｄｋｋ−１に特異的な抗体または免疫学的に機能的な断片のうちの特定のものを用いた処置は、骨減少性障害を患っている患者において骨塩密度の有意な増加を誘導することができる。
【０２８１】
また、本明細書中に記載の抗体または免疫学的に機能的な断片を用いたＤｋｋ−１の阻害は、様々な骨修復の応用にも使用することができる。たとえば、特定の抗体および断片は、人工関節に関連する磨耗細片骨溶解の遅延、骨折の修復の加速、および骨移植の、それを移植した周囲の生きた骨内への取り込みの増強に有用な場合がある。
【０２８２】
本明細書中に開示したように、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて、たとえば、癌治療剤、破骨細胞活性を阻害する薬剤または骨芽細胞活性を増強する他の薬剤と組み合わせて投与することができる。たとえば、本発明の抗体は、放射線療法または化学療法を受けている癌患者に投与することができる。本発明の抗体と組み合わせて使用する化学療法には、アントラサイクリン、ｔａｘｏｌ、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２−［（ピラジニルカルボニル）アミノ］プロピル］アミノ］ブチル］ボロン酸）および／または癌の処置に使用される他の低分子薬物が含まれ得る。乳癌患者は、化学療法剤および抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む組合せ処置と同時のアロマターゼ阻害剤の投与から恩恵を被るであろう。
【０２８３】
抗Ｄｋｋ−１抗体およびその免疫学的に機能的な断片は、骨量の減少をもたらす上記言及した状態を処置するために、単独で、または、それだけには限定されないが、ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２と命名されている骨形態形成因子、トランスフォーミング成長因子−βおよびＴＧＦ−βファミリーメンバー、線維芽細胞成長因子ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０、インターロイキン−１阻害剤（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１に対する抗体およびＩＬ−１受容体に対する抗体が含まれる）、ＴＮＦα阻害剤（エタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブが含まれる）、ＲＡＮＫリガンド阻害剤（可溶性ＲＡＮＫ、オステオプロテゲリンおよびＲＡＮＫまたはＲＡＮＫリガンドと特異的に結合する拮抗抗体が含まれる）、副甲状腺ホルモン、Ｅシリーズプロスタグランジン、ビスホスホネートならびにフッ化物およびカルシウムなどの骨増強ミネラルを含めた、治療上有効な量の骨成長促進（同化）剤または骨再吸収抑制剤と組み合わせて使用し得る。本発明の抗体およびその機能的な断片と組み合わせて使用することができる同化剤には副甲状腺ホルモンおよびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）が含まれ、後者の薬剤は、好ましくはＩＧＦ結合タンパク質と複合している。そのような組合せ処置に適したＩＬ−１受容体アンタゴニストはＷＯ８９／１１５４０号に記載されており、適切な可溶性ＴＮＦ受容体−１はＷＯ９８／０１５５５号に記載されている。例示的なＲＡＮＫリガンドアンタゴニストは、たとえば、ＷＯ０３／０８６２８９号、ＷＯ０３／００２７１３号、米国特許第６，７４０，５１１号および第６，４７９，６３５号に開示されている。前述の特許および特許出願はすべて本明細書中に参照により組み込まれている。
【０２８４】
さらに、抗Ｄｋｋ−１抗体は、腫瘍細胞と結合し、腫瘍増殖に対して細胞毒性および／または細胞分裂抑制性の効果を誘導する抗体と組み合わせて、患者に投与することができる。そのような抗体の例には、腫瘍細胞上に存在する細胞表面タンパク質Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖タンパク質および表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と結合し、これらのタンパク質を提示している腫瘍細胞に対して細胞分裂抑制性および／または細胞毒性の効果を誘導するものが含まれる。そのような抗体の例には、乳癌の処置にはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）および非ホジキンリンパ腫の処置にはＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）が含まれ、また、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）およびＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）などの抗体に基づく薬物も含まれる。または、組合せ療法には、癌治療剤として、腫瘍細胞においてアポトーシスを選択的に誘導するポリペプチド、たとえばＴＮＦ関連ポリペプチドＴＲＡＩＬが含まれていてもよい。
【０２８５】
対象抗体またはその免疫学的に機能的な断片は、同じ状態のために投与する他の処置および治療剤と同時に投与することができる。本明細書中で使用する「同時投与」には、同時にまたは連続的に投与する処置が包含される。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片は、初期癌（第ＩまたはＩＩ期）による骨量の減少の発症を予防または軽減するために予防的に投与することができるか、または、骨への転移が原因の既存の骨量の減少の状態を寛解させるために与えることができる。
【０２８６】
本発明の抗Ｄｋｋ−１抗体は、骨中の腫瘍細胞の成長を予防および／または処置するために使用し得る。腫瘍細胞は破骨細胞が内部の骨基質を再吸収することを刺激するため、骨に転移する癌は容易に拡大する場合がある。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を用いた処置は、増加した骨芽細胞活性を刺激することによって、そのような転移の部位での骨塩密度の維持を助ける。骨に転移する潜在性を有する任意の癌を、転移が起こる前または起こった後に投与する抗Ｄｋｋ−１抗体で予防または処置し得る。
【０２８７】
多発性骨髄腫は、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその抗原結合断片で予防および／または処置し得る癌の１種の一例である。罹患した患者は、典型的には、骨の局所的領域における増加した破骨細胞の活性化が原因で、骨量の減少を示す。骨髄腫細胞は、破骨細胞を活性化し、その結果、骨髄空間中に包埋された骨髄腫細胞を取り囲む骨の溶解をもたらすタンパク質である、ＲＡＮＫリガンドを、直接または間接的に産生させる。立ち代って、骨髄腫細胞に隣接する正常な破骨細胞がＩＬ−６を産生し、骨髄腫細胞の成長および増殖がもたらされる。さらに、多発性骨髄腫細胞はＤｋｋ−１を産生し、それにより骨芽細胞活性が阻害され、この疾患における骨再吸収活性がさらに促進される。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を用いた動物の処置は骨芽細胞活性を扇動し、それにより、腫瘍の部位での骨量の増加がもたらされる。そのような処置は骨痛の低減をもたらす場合があり、腫瘍細胞によって利用される骨栄養素を放出する再吸収活性を防止することによって、骨へのさらなる転移（ｍｅｔａｓｔｉｓｉｓ）を遮断し得る。この疾患の処置において、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的な断片は、ＲＡＮＫリガンドに向けられた拮抗抗体またはＩＬ−６に対する抗体と同時に投与することができる。
【０２８８】
他の障害の処置
骨障害に関連する前述の使用に加えて、提供される抗体および免疫学的に機能的な断片のうちの特定のものは、他の疾患の処置に使用することができる。これらの様々な疾患におけるＤｋｋ−１の役割は、様々な組織中でのその発現によって部分的に支持されている。たとえば、抗体および断片は、幹細胞の再生を促進することが望ましい疾患を処置するために使用することができる。そのような疾患には、それだけには限定されないが、糖尿病、慢性心不全ならびに筋肉の様々な疾患［たとえば、たとえば不動または安静臥床から生じる廃用性萎縮症）、加齢性虚弱（高齢者の筋肉減少症）、筋ジストロフィー、癌、ＡＩＤＳまたは炎症に関連する悪液質、腎不全／尿毒症におけるタンパク質エネルギー栄養不良、および肥満症における筋消耗］が含まれる。また、たとえば、クローン病、大腸炎、および炎症性腸疾患を含めた様々な炎症性疾患も処置することができる。また、抗体および断片は、様々な神経系疾患（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病）の処置にも使用することができる。また、眼疾患（たとえば、黄斑変性症および様々な網膜症）も、抗体および断片のうちの特定のものを用いて処置することができる。また、様々な腎臓病（たとえば、末期腎臓病、慢性腎臓病、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎およびＩｇＡ腎症）も、一部の抗体を用いて処置することができる。さらに、様々な肺疾患（たとえば、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症および嚢胞性線維症）ならびに真皮および表皮疾患を含めた様々な皮膚障害も処置することができる。処置することができる皮膚障害の例には、損傷した腸管上皮（たとえば、化学療法誘導性損傷）、ならびに腸管上皮の成長および生存を刺激することが望ましい他の疾患が含まれる。
【０２８９】
キット
また、本明細書中に記載の抗体もしくは免疫学的に機能的な断片または医薬組成物が含まれるキットも提供される。一部のキットには、容器（たとえば、バイアルまたはアンプル）中のそのような抗体、断片または組成物が含まれ、また、上記開示した様々な検出、スクリーニングおよび治療上の応用における抗体または断片の使用の説明書も含まれ得る。抗体、断片または組成物は、たとえば、溶液の一部または固体（たとえば凍結乾燥粉末）としての形態が含まれる、様々な形態とすることができる。指示書には、どのように抗体または断片を適切な流体中で調製するか（たとえば、溶解または再懸濁させる）、および／または上述の疾患（たとえば、低骨量、全身性骨減少、骨形成抑制、骨侵食などの骨障害、幹細胞の再生、炎症性疾患、神経系疾患、眼疾患、腎臓病および皮膚障害）を処置するためにどのように抗体または断片を投与するかの説明が含まれ得る。
【０２９０】
また、キットには、緩衝液、塩、錯体形成金属イオンおよび医薬組成物のセクションで上述した他の薬剤などの、様々な他の構成成分が含まれ得る。これらの構成成分は、抗体または断片と共に含まれ得るか、または別々の容器中であり得る。また、キットには、抗体または断片と共に投与するための他の治療剤も含まれ得る。そのような薬剤の例には、それだけには限定されないが、癌を処置する薬剤、骨促進剤および腫瘍細胞と結合する抗体、ならびに上述した他の薬剤が含まれる。
【０２９１】
抗Ｄｋｋ−１抗体のさらなる具体的な説明
Ｆｃγ部分への修飾
組換えヒト化抗体中、Ｆｃγ部分は、Ｆｃγ受容体との相互作用を回避し、免疫系を補完するように修飾することができる。この種類の修飾はケンブリッジ大学（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）病理学専攻（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）のＭｉｋｅ  Ｃｌａｒｋ博士によって設計され、そのような抗体を調製する技法は、たとえば１９９９年１１月１８日に公開のＷＯ９９／５８５７２号に記載されている。たとえば、人間を処置するために抗体を使用する場合は、免疫応答を回避するために、定常領域がヒト定常領域により似るようにそれを操作し得る。たとえば、米国特許第５，９９７，８６７号および第５，８６６，６９２号を参照されたい。
【０２９２】
ｈｕＭａｂＪＣ１８への修飾
ｈｕＭａｂＪＣ１８は完全ヒト化抗Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体である。本開示には、増大または減少した活性および／または親和性を有するその特性および変異体に顕著な影響を与えない機能的に等価な抗体を含めた、ｈｕＭａｂＪＣ１８への修飾体が包含される。たとえば、当業者には理解されるように、ｈｕＭａｂＪＣ１８のアミノ酸配列を突然変異させて、Ｄｋｋ−１に対する所望の結合親和性を有する抗体が得られ得る。ポリペプチドの修飾は当分野のルーチン的な実施であり、本明細書中で詳述する必要はない。ポリペプチドの修飾は実施例に例示されている。修飾ポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を顕著に有害に変化させないアミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加、または化学類似体の使用が含まれる。
【０２９３】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮもしくはＣ末端と、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドとの融合が含まれる。
【０２９４】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその代わりに挿入されている。最も関心が持たれる置換突然変異誘発の部位には超可変領域が含まれるが、フレームワーク（ＦＲ）の変更も企図される。保存的置換は、表１中、見出し「保存的置換」の下に示されている。そのような置換が生物活性の変化をもたらす場合は、表１中で「例示的な置換」命名した、または以下のアミノ酸クラスの参照でさらに記載した、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングし得る。
【０２９５】
【表１】
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【０２９６】
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域中のポリペプチド主鎖の、たとえばシートまたはヘリックスコンホメーションとしての構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持におけるその効果が顕著に異なる置換を選択することによって、達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいた以下の群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）極性、荷電なし：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０２９７】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することによって行う。
【０２９８】
また、抗体の適切なコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基も、一般にセリンで置換して、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋結合を防止し得る。逆に、システイン結合（複数可）を、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に、その安定性を向上させるために抗体に付加し得る。
【０２９９】
アミノ酸修飾は、１つまたは複数のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域などの領域の完全な再設計の範囲とすることができる。可変領域中の変化は、結合親和性および／または特異性を変更する場合がある。一部の実施形態では、ＣＤＲドメイン内で１個以下から５個の保存的アミノ酸置換が行われる。他の実施形態では、ＣＤＲドメイン内で１個以下から３個の保存的アミノ酸置換が行われる。さらに他の実施形態では、ＣＤＲドメインはＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３である。
【０３００】
ｈｕＭａｂＪＣ１８のグリコシル化
また、修飾体には、グリコシル化されたおよびグリコシル化されていないポリペプチド、ならびにたとえば様々な糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含まれる。抗体は、その定常領域中の保存的な位置でグリコシル化される（たとえば、ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８、ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９７）ＴｉｂＴＥＣＨ、１５：２６〜３２を参照）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（たとえば、Ｂｏｙｄら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１３１１〜１３１８、ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：４１７５〜４１８０を参照）、および糖タンパク質の部分間の分子内相互作用に影響を与え、これは、糖タンパク質のコンホメーションおよび提示される三次元表面に影響を与える可能性がある（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記、ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４０９〜４１６）。また、オリゴ糖は、特異的な認識構造に基づいて所定の糖タンパク質を特定の分子に標的化する役割も果たし得る。また、抗体のグリコシル化は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。具体的には、二分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節性発現を有するＣＨＯ細胞が、ＡＤＣＣ活性を向上させたことが報告されている（たとえばＵｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０を参照）。
【０３０１】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−連結またはＯ−連結のいずれかである。Ｎ−連結とは、炭水化物部分の、アスパラギン残基の側鎖への付着をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン［指揮中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である］が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着の認識配列である。したがって、ポリペプチド中でのこれらのトリペプチド配列のうちのいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ−連結グリコシル化とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの糖のうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用し得る。
【０３０２】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される（Ｎ−連結グリコシル化部位用）。また、変更は、１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基を元の抗体の配列に付加する、またはそれによって置換することによっても行うことができる（Ｏ−連結グリコシル化部位用）。
【０３０３】
また、抗体のグリコシル化パターンは、根底にあるヌクレオチド配列を変更させずに変更し得る。グリコシル化は、抗体を発現させるために使用する宿主細胞に大きく依存する。潜在的な治療剤として組換え糖タンパク質、たとえば抗体の発現に使用する細胞種がネイティブ細胞であることは稀なため、抗体のグリコシル化パターンの変動は予想することができる（たとえばＨｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
【０３０４】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中にグリコシル化に影響を与える要因には、成長様式、培地配合、培養密度、酸素化、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。オリゴ糖産生に関与する特定の酵素の導入または過剰発現を含めた、様々な方法が、特定の宿主生物中で達成されるグリコシル化パターンを変更させるために提案されている（たとえば、米国特許第５，０４７，３３５号、第５，５１０，２６１号、および第５．２７８，２９９号を参照）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化は、たとえばエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）を用いて、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定の種類の多糖のプロセッシングが欠損しているように遺伝子操作することができる。これらおよび類似の技法は当分野で周知である。
【０３０５】
カップリング技法
前述したように、他の修飾方法には、それだけには限定されないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化を含めた当分野で知られているカップリング技法の使用が含まれる。修飾は、たとえば、免疫アッセイのための標識の付着に使用することができる。修飾されたｈｕＭａｂＪＣ１８ポリペプチドは当分野の確立された手順を用いて作製することができ、その一部が以下および実施例中に記載されている、当分野で知られている標準のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。当業者には、そのような修飾体を作製およびスクリーニングする、その任意の適切な方法を理解されるであろう。
【０３０６】
修飾された定常領域
本発明の一部の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性または部分的に不活性である、たとえば、補体媒介性の溶解を始動させない、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しない、もしくはミクログリアを活性化しない、または、補体媒介性の溶解の始動、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の刺激、またはミクログリアの活性化うちの任意の１つまたは複数において低下した活性（非修飾の抗体と比較して）を有する定常領域などの、修飾された定常領域を含む。定常領域の様々な修飾を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組合せを達成し得る。たとえば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６：３１９〜３２４（１９９５）、Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７：４９６３〜９、１５７：４９６３〜４９６９（１９９６）、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：４１７８〜４１８４（２０００）、Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１（１９８９）、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６（１９９８）を参照されたい。一実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号、および／またはＵＫ特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように修飾する。
【０３０７】
一実施形態では、抗体は、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（アミノ酸の付番は野生型ＩｇＧ２ａ配列を参照）への突然変異を含むヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域を含む。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４。別の実施形態では、定常領域はグリコシル化されている。別の実施形態では、定常領域は、定常領域中のグリコシル化されたアミノ酸残基を突然変異させることによってグリコシル化する。たとえば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７をＡ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異させ得る。たとえば、Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１（１９８９）、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６（１９９８）を参照されたい。一実施形態では、定常領域を酵素的にグリコシル化する（酵素ＰＮＧａｓｅによって炭水化物を除去することなど）。
【０３０８】
エフェクタードメイン
他の抗体修飾体には、たとえば１９９９年１１月１８日に公開のＷＯ９９／５８５７２号に記載のように修飾された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全体または一部に対して実質的に相同的なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、顕著な補体依存性溶解、または標的の細胞媒介性破壊を始動させずに標的分子と結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインはＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合することができる。これらは、典型的には、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で修飾された抗体は、慢性抗体療法での使用において、慣用の抗体療法に対する炎症性および他の有害な反応を回避するために特に適している。
【０３０９】
親和性成熟
一実施形態では、抗体は親和性成熟抗体である。たとえば、親和性成熟抗体は、当分野で知られている手順によって生成することができる（たとえば、Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３、Ｂａｒｂａｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３、Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５、Ｙｅｌｔｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４、Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６）。
【０３１０】
ライブラリ走査突然変異誘発
以下の方法を、抗体の親和性の調節およびＣＤＲの特徴付けに使用し得る。「ライブラリ走査突然変異誘発」と呼ばれる、抗体のＣＤＲを特徴付けるおよび／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変更させる（向上させるなど）一方法。一般に、ライブラリ走査突然変異誘発は以下のように動作する。当分野で認識されている方法を用いて、ＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸位置を２種類およびそれ以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）種類のアミノ酸で置き換える。これによりクローンの小ライブラリが作製され（一部の実施形態では、分析するそれぞれのアミノ酸位置について１つずつ）、そのそれぞれが２つ以上のメンバーの複雑さを有する（それぞれの位置で２種類以上のアミノ酸を置換する場合）。一般に、ライブラリには、ネイティブ（非置換）のアミノ酸を含むクローンも含まれる。それぞれのライブラリからの少数のクローン、たとえば約２０〜８０個のクローン（ライブラリの複雑さに依存する）を、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングし、増加した、同じ、減少した結合を有する、または結合しない候補を同定する。
【０３１１】
結合親和性の決定
結合親和性を決定する方法は当分野で周知である。結合親和性は、約２倍以上の結合親和性の差異を検出するＢＩＡｃｏｒｅまたはＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴分析を用いて決定し得る。これらの種類の分析は、開始抗体が、既に比較的高い親和性、たとえば約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する場合に特に有用である。ＢＩＡｃｏｒｅまたはＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴を用いたスクリーニングは、本明細書中の実施例中に記載されている。
【０３１２】
結合親和性は、Ｋｉｎｅｘａバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫アッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光移行、および／または酵母ディスプレイを用いて決定し得る。また、結合親和性は適切なバイオアッセイを用いてスクリーニングしてもよい。
【０３１３】
一部の実施形態では、当分野で認識されている突然変異誘発方法（その一部は本明細書中に記載されている）を用いて、ＣＤＲ中のそれぞれのアミノ酸位置を（一部の実施形態では１個ずつ）２０種類すべての天然アミノ酸で置き換える。これによりクローンの小ライブラリが作製され（一部の実施形態では、分析するそれぞれのアミノ酸位置について１つずつ）、そのそれぞれが２０個のメンバーの複雑さを有する（それぞれの位置で２０種類すべてのアミノ酸を置換する場合）。
【０３１４】
一部の実施形態では、スクリーニングするライブラリは、同じＣＤＲ中または２つ以上のＣＤＲ中であり得る２つ以上の位置中の置換を含む。したがって、ライブラリは、１つのＣＤＲ中の２つ以上の位置での置換を含み得る。ライブラリは、２つ以上のＣＤＲ中の２つ以上の位置での置換を含み得る。ライブラリは、２、３、４、５または６個のＣＤＲ中に見つかる３、４、５、またはそれより多くの位置での置換を含み得る。置換は、冗長性の低いコドンを用いて調製し得る。たとえばＢａｌｉｎｔら（１９９３）Ｇｅｎｅ、１３７（１）：１０９〜１８の表２を参照されたい。
【０３１５】
ＣＤＲはＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３であり得る。ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、および／またはＣＤＲＨ３のうちの１つまたは複数であり得る。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、または拡張ＣＤＲであり得る。
【０３１６】
向上した結合を有する候補を配列決定し、それにより向上した親和性をもたらすＣＤＲ置換突然変異体（「向上した」置換とも呼ばれる）を同定し得る。また、結合する候補を配列決定し、それにより結合を保持するＣＤＲ置換も同定し得る。
【０３１７】
複数回のスクリーニングを実施し得る。たとえば、向上した結合を有する候補（それぞれが１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置でのアミノ酸置換を含む）は、それぞれの向上したＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が向上した結合を示すＣＤＲ中のアミノ酸位置）で少なくとも元のおよび置換されたアミノ酸を含有する第２のライブラリの設計にも有用である。このライブラリの調製、およびスクリーニングまたは選択を以下にさらに記述する。
【０３１８】
また、ライブラリ走査突然変異誘発は、向上した結合、同じ結合、減少した結合または結合しないクローンの頻度が抗体−抗原の複合体の安定性のためのそれぞれのアミノ酸位置の重要性に関する情報も提供する限りは、ＣＤＲを特徴付ける手段も提供する。たとえば、あるＣＤＲの位置が２０種類すべてのアミノ酸に変化させた際に結合を保持している場合は、その位置は抗原結合に必要である可能性が低い位置として同定される。逆に、あるＣＤＲの位置が置換の少ないパーセンテージでのみ結合を保持している場合は、その位置はＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。したがって、ライブラリ走査突然変異誘発方法は、多くの異なるアミノ酸（２０種類すべてのアミノ酸が含まれる）に変化させることができるＣＤＲ中の位置、および変化させることができないまたは数種類のアミノ酸にのみ変化させることができるＣＤＲ中の位置に関する情報を生じる。
【０３１９】
向上した親和性を有する候補は、向上したアミノ酸、その位置での元のアミノ酸が含まれ、さらに、所望されるライブラリの複雑さ次第で、または所望のスクリーニングまたは選択方法を用いて許容される、その位置でのさらなる置換がさらに含まれ得る、第２のライブラリ中で合わせ得る。さらに、所望する場合は、隣接アミノ酸位置を、少なくとも２種類以上のアミノ酸にランダム化することができる。隣接アミノ酸のランダム化は、突然変異体ＣＤＲにおけるさらなるコンホメーション柔軟性を可能にする場合があり、これは、立ち代って、より多数の向上させる突然変異の導入を可能または容易にし得る。また、ライブラリは、第１回目のスクリーニングで向上した親和性を示さなかった位置での置換も含み得る。
【０３２０】
ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いたスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含めた当分野で知られている選択のための任意の方法を用いた選択を含めた、当分野で知られている任意の方法を用いて、第２のライブラリを、向上および／または変更した結合親和性を有するライブラリメンバーについてスクリーニングまたは選択する。
【０３２１】
融合タンパク質
前述したように、本発明には、本発明の抗体（ｈｕＭａｂＪＣ１８など）またはポリペプチドからの１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含される。ｈｕＭａｂＪＣ１８融合ポリペプチドは、当分野で知られている方法、たとえば、合成または組換えによって作製することができる。典型的には、本発明のｈｕＭａｂＪＣ１８融合タンパク質は、本明細書中に記載の組換え方法を用いて、それらをコードしているポリヌクレオチドを調製および発現させることによって作製されるが、たとえば化学合成を含めた当分野で知られている他の手段によっても調製し得る。
【０３２２】
コンジュゲーション
前述したように、本発明は、固体支持体へのカップリングを促進する薬剤（ビオチンまたはアビジンなど）とのコンジュゲート（たとえば連結）したｈｕＭａｂＪＣ１８抗体またはポリペプチドを含む組成物も提供する。簡素化のために、一般にｈｕＭａｂＪＣ１８または抗体に言及するが、これらの方法が本明細書中に記載のＤｋｋ−１結合の実施形態のうちの任意のものに適用されることを理解されたい。コンジュゲーションとは、一般に、これらの構成成分を本明細書中に記載のように連結させることをいう。連結（これは一般に、少なくとも投与のためにこれらの構成成分を近位会合して固定することである）は、多数の方法で達成することができる。たとえば、薬剤と抗体との間の直接反応が、これらが互いと反応することができる置換基を保有している場合に可能である。たとえば、一方上のアミノまたはスルフヒドリル基などの求核基が、他方上の酸無水物もしくは酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基、または良好な脱離基（たとえばハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応できる場合がある。
【０３２３】
標識剤
前述したように、本発明の抗体またはポリペプチドを、たとえば、蛍光分子、放射性分子または当分野で知られている任意の他の標識などの、任意の適切な標識剤（代替として「標識」と呼ばれる）と連結させ得る。一般に（直接または間接的に）シグナルをもたらす標識が当分野で知られている。
【０３２４】
組成物
前述したように、また、本発明は、たとえば、ｈｕＭａｂＪＣ１８、または本開示が明らかにしているように、本明細書中に記載の任意またはすべての抗体および／またはポリペプチドを含む、組成物（医薬組成物が含まれる）およびキットも提供する。
【０３２５】
ポリヌクレオチド、ベクター（たとえば発現）および宿主細胞
また、提供したいくつかの具体的な実施形態を用いて前述したように、本発明は、本発明の抗体およびポリペプチド（図１に示す軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む抗体が含まれる）をコードしている単離したポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
【０３２６】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の抗体（抗体断片が含まれる）およびポリペプチドのうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを提供する。当業者には理解されるように、提供されるポリヌクレオチドは当分野で知られている手順によって作製することができる。
【０３２７】
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうちの任意のものを含む組成物（上記および下記にさらにより詳述した医薬組成物が含まれる）を提供する。一実施形態では、組成物は、本明細書中に記載のｈｕＭａｂＪＣ１８をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書中に記載の抗体またはポリペプチドのうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに別の実施形態では、組成物は、配列番号１９および配列番号２８に示すポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。発現ベクターおよびポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書中にさらに記載されている。
【０３２８】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちの任意のものを作製する方法を提供する。
【０３２９】
また、そのような配列に相補的な任意のポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であってよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。追加のコードまたは非コード配列が、必ずしもではないが本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必ずしもではないが他の分子および／または支持体物質と連結していてもよい。
【０３３０】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体またはその一部分をコードしている内在配列）を含み得るか、またはそのような配列の変異体を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、ネイティブの免疫反応性分子と比較して、コードされているポリペプチドの免疫反応性が消失しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされているポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書中に記載のように評価し得る。変異体は、好ましくは、ネイティブ抗体またはその一部分をコードしているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【０３３１】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載のように最大一致についてアラインメントした際に同じである場合に、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、比較ウィンドウにわたって配列を比較することによって行う。本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」とは、２つの配列を最適にアラインメントした後に、配列を同数の連続的な位置の参照配列と比較し得る、少なくとも約２０個の連続的な位置、通常は３０〜約７５個、または４０〜約５０個のセグメントをいう。
【０３３２】
比較のための配列の最適なアラインメントは、生物情報学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）、初期設定パラメータを使用して実施し得る。このプログラムは、以下の参考文献中に記載されているいくつかのアラインメントスキームを具現化している：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤＣ、第５巻、補遺３、ページ３４５〜３５８、Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、ページ６２６〜６４５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１〜１５３、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．、１１：１０５、Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．、４：４０６〜４２５、Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：７２６〜７３０。
【０３３３】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントした配列を少なくとも２０個の位置の比較のウィンドウにわたって比較することによって決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中で存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を参照配列中の位置の合計数（すなわちウィンドウの大きさ）で除算し、結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算する。
【０３３４】
また、または代替として、変異体は、ネイティブ遺伝子またはその一部分もしくは相補体に実質的に相同的であり得る。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中等度にストリンジェントな条件下で、ネイティブ抗体をコードしている天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）にハイブリダイズすることができる。
【０３３５】
適切な「中等度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、終夜でのハイブリダイズ、次いで、０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄が含まれる。
【０３３６】
本明細書中で使用する「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、たとえば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を用いるもの、（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド、たとえば５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドなどの変性剤および０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、４２℃を用いるもの、または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストラン、４２℃、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％のホルムアミドで５５℃での洗浄、次いで、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣで５５℃からなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものである。当業者には、必要に応じてプローブの長さなどの所望の要因に順応するために、どのように温度、イオン強度などを調節するかが認識されるであろう。
【０３３７】
当業者には、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書中に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が多く存在することが理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性しか保有しない。それにも関わらず、コドン使用頻度の相違が原因で変動するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本発明の範囲内にある。対立遺伝子とは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１つまたは複数の突然変異の結果として変更される、内在性の遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずしもではないが、変更された構造または機能を有し得る。対立遺伝子は、標準の技法（たとえば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を用いて同定し得る。
【０３３８】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学ポリヌクレオチド合成方法は当分野で周知であり、本明細書中で詳述する必要はない。当業者は、本明細書中に提供される配列および市販のＤＮＡ合成器を用いて所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
【０３３９】
組換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するためには、本明細書中でさらに記述するように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクター内に挿入することができ、立ち代って、ベクターを複製および増幅のための適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で知られている任意の手段によって宿主細胞内に挿入し得る。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、形質移入、Ｆ接合または電気穿孔によって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換させる。導入された後、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持されるか、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれることができる。そのようにして増幅したポリヌクレオチドは、当分野の周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。
【０３４０】
代替として、ＰＣＲはＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号、および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載されている。
【０３４１】
ＲＮＡは、単離したＤＮＡを適切なベクター中で使用し、それを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡへと転写される際に、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記載の当業者に周知の方法を用いてＲＮＡを単離することができる。
【０３４２】
適切なクローニングベクターは、標準の技法に従って構築し得るか、または当分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは使用を意図する宿主細胞に応じて変動し得るが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を保有し得る、および／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を保有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえばｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの市販の供給業者から入手可能である。
【０３４３】
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築体である。発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの一体部分として宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示されている。適切な発現ベクターには、それだけには限定されないが、たとえば、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターが含まれる。ベクター構成成分には、一般に、それだけには限定されないが、シグナル配列、複製起点、１つもしくは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）のうちの１つまたは複数が含まれ得る。発現（すなわち翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、およびストップコドンなどの１つまたは複数の翻訳制御要素も通常は必要である。
【０３４４】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いた形質移入、微粒子銃、リポフェクション、および感染（たとえば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含めたいくつかの適切な手段のうちの任意のものによって、宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存する。
【０３４５】
また、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちの任意のものを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子を単離する目的に使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、それだけには限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。また、たとえばＷＯ８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）またはケー・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）など）が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞中に存在する場合は対応する内在性抗体または目的のタンパク質よりも約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにはより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。宿主細胞をＡβ１〜４０との特異的結合についてスクリーニングすることは、たとえば、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって行う。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
【０３４６】
本開示を、さらに限定すると解釈されるべきでない以下の実施例によって、さらに例示する。すべての図、表ならびに本開示全体にわたって引用したすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、その全体が本明細書中に参照により明白に組み込まれている。
【実施例】
【０３４７】
（実施例１）
ｍｕＭａｂＪＣ１８の作製
調製
Ａ．免疫原
Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから得られた組換えヒトＤｋｋ−１（ｒｈｕＤｋｋ−１）（カタログ番号１０９６−ＤＫ／ＣＦ、ヒトＤｋｋ−１のアミノ酸２〜２６６に対応し、Ｃ末端で１０×Ｈｉｓタグと融合）を、ＰｉｅｒｃｅのｍｃＫＬＨを含むＩｍｊｅｃｔ免疫原ＥＤＣキット（Ｉｍｊｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ＥＤＣ  ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｍｃＫＬＨ）（カタログ番号７７６２２）を用いて、ＫＬＨとコンジュゲートさせた。ＫＬＨとコンジュゲートしたタンパク質はＧｅｎｏｖａｃ  ＧｍｂＨによって調製され、サブクローンＪＣ９Ｈ３（ＪＣ１８）を生じさせた融合体の免疫原として使用した。
【０３４８】
配列番号１、ヒトＤｋｋ１−（１０Ｈｉｓ）アミノ酸配列
（下線を付したアミノ酸は精製したタンパク質の実際のＮ末端を表す）
MALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRHHHHHHHHHH
【０３４９】
配列番号２、ヒトＤｋｋ１−（１０Ｈｉｓ）ヌクレオチド配列
（ヌクレオチド配列、Ｒ＆Ｄは配列情報を提供していないため、下線を付したヌクレオチドは配列の単なる推定である）
ATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAGCTACCCGGGTCTTTGTCGCGATGGTAGCGGCGGCTCTCGGCGGCCACCCTCTGCTGGGAGTGAGCGCCACCTTGAACTCGGTTCTCAATTCCAACGCTATCAAGAACCTGCCCCCACCGCTGGGCGGCGCTGCGGGGCACCCAGGCTCTGCAGTCAGCGCCGCGCCGGGAATCCTGTACCCGGGCGGGAATAAGTACCAGACCATTGACAACTACCAGCCGTACCCGTGCGCAGAGGACGAGGAGTGCGGCACTGATGAGTACTGCGCTAGTCCCACCCGCGGAGGGGACGCAGGCGTGCAAATCTGTCTCGCCTGCAGGAAGCGCCGAAAACGCTGCATGCGTCACGCTATGTGCTGCCCCGGGAATTACTGCAAAAATGGAATATGTGTGTCTTCTGATCAAAATCATTTCCGAGGAGAAATTGAGGAAACCATCACTGAAAGCTTTGGTAATGATCATAGCACCTTGGATGGGTATTCCAGAAGAACCACCTTGTCTTCAAAAATGTATCACACCAAAGGACAAGAAGGTTCTGTTTGTCTCCGGTCATCAGACTGTGCCTCAGGATTGTGTTGTGCTAGACACTTCTGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCCTGAAAGAAGGTCAAGTGTGTACCAAGCATAGGAGAAAAGGCTCTCATGGACTAGAAATATTCCAGCGTTGTTACTGTGGAGAAGGTCTGTCTTGCCGGATACAGAAAGATCACCATCAAGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTCACACTTGTCAGAGACACCACCATCACCACCATCACCATCATCAC
【０３５０】
Ｂ．免疫化およびハイブリドーマの作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、５０ｕｇ／用量／マウスのＫＬＨとコンジュゲートしたｒｈｕＤｋｋ−１タンパク質を用いて腹腔内で免疫化した。この用量を、４週間の期間にわたって３回繰り返した。融合の２日および１日前に、マウスに５０ｕｇのタンパク質の最終ブーストを与えた。脾臓リンパ球を非分泌性ｓｐ２／０骨髄腫細胞系と融合させ、以前に記載のようにＨＡＴ選択に供した（ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、７３、３〜４６（１９８１））。Ｄｋｋ１に特異的なＩｇＧを分泌するハイブリドーマを回収し、サブクローニングし、以下に記載のアッセイを用いて検出した。
【０３５１】
Ｄｋｋ−１特異性（ＥＬＩＳＡアッセイ）
Ａ．検出
Ｄｋｋ−１特異的抗体は、以下のＥＬＩＳＡに基づく方法を用いて検出した。ｒｈｕＤｋｋ−１タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０９６ＤＫ／ＣＦ）をコーティング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、炭酸／炭酸水素コーティング緩衝液、ｐＨ９．６、カタログ番号Ｃ−３０４１、製造者の指示書に従って構成）中で１ｕｇ／ｍｌまで希釈した。１００ｕｌのＤｋｋ−１／ウェルをＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートに加え、終夜、４℃でインキュベーションした。ウェルを、２５０ｕｌ／ウェルの洗浄バッファー（Ｃａ／Ｍｇ＋＋を含まないｄＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８５３７）中の０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ２２８７））で４×洗浄し、その後、２００ｕｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ｄＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８５３７）中の１％のＰＶＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３６３１７０）（重量／体積））を用いて２時間、室温でブロッキングした。その後、ブロッキング緩衝液を迅速なデカンテーションによって除去した。抗体をブロッキング緩衝液中での連続的な２倍段階希釈によって希釈し、それぞれのプレートに１００ｕｌ／ウェルで施用した。プレートを１時間、室温でインキュベーションした、その後、上述のように洗浄した。
【０３５２】
試験抗体とＤｋｋとの結合は、抗体種に特異的な二次抗体を加えることによって決定した。マウス抗体を試験した際は、１００ｕｌ／ウェルのＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を、ブロッキング緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０３５−１４６）中に１対４０００の希釈率で使用した。ヒト化抗体を試験した際は、１００ｕｌ／ウェルのＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２を、遮断緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−０９７）中に１対４０００の希釈率で使用した。プレートを３０分間、室温でインキュベーションし、その後、上述のように２×洗浄した。１００ｕｌ／ウェルの新しく調製した基質（ＫＰＬ  ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質２−構成成分、カタログ番号５０−６２−００、製造者の指示書に従って調製）を加え、発色させた。発色された後、プレートの吸光度を４０５および４９０ｎｍで測定した。吸光度値は、両方の波長での吸光度間の相違として提示した。ＪＣ１８は５ｕｇ／ｍｌまでｒｈｕＤＫＫ−１との結合を示した。
【０３５３】
Ｂ．他のヒトＤｋｋ相同体に対する結合の特異性
他のヒトＤｋｋタンパク質と結合するＪＣ１８の能力は、プレートを組換えヒトＤｋｋ３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１１１８−ＤＫ／ＣＦ）およびＤｋｋ４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１２６９−ＤＫ／ＣＦ）でもコーティングしたこと以外は、上述のＥＬＩＳＡプロトコルを用いて評価した。ＪＣ１８は、５ｕｇ／ｍｌまで、ヒトＤｋｋ−４に対して弱い結合を示し、ヒトＤｋｋ−３に対して結合を示さなかった。
【０３５４】
【表２】
2012526542.tif 000003
【０３５５】
Ｃ．種の交差反応性
他の種のＤｋｋタンパク質と結合するＪＣ１８の能力は、プレートを組換えラットＤｋｋ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４０１０−ＤＫ／ＣＦ）、マウスＤｋｋ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１７６５−ＤＫ／ＣＦ）、マウスＤｋｋ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４３５−ＤＫ／ＣＦ）、およびマウスＤｋｋ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３１０５−ＤＫ／ＣＦ）でもコーティングしたこと以外は、上述のＥＬＩＳＡプロトコルを用いて評価した。ＪＣ１８は、（１）５ｕｇ／ｍｌまで、マウスおよびラットのＤｋｋ−１に対してヒトＤｋｋ−１と類似の結合を示し、（２）５ｕｇ／ｍｌまで、マウスＤｋｋ−２に対して結合を示さず、（３）５ｕｇ／ｍｌまで、マウスＤｋｋ−４に対して弱い結合を示した。
【０３５６】
クローニングおよび配列決定
ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを用いて１００万個のハイブリドーマ細胞をホモジナイズし、ＱＩＡＧＥＮのＲＮＡｅａｓｙミニキットに従って全ＲＮＡを抽出した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴキットを用いてｃＤＮＡを合成した。マウスＩｇＧ重鎖遺伝子およびマウスのカッパまたはラムダ軽鎖をクローニングするための縮重プライマーからなるＮｏｖａｇｅｎのマウスＩｇＧ−プライマー組を用いて、Ｄｋｋ−１抗体からの可変領域をクローニングした。ＰＣＲサイクリング条件は、９４℃で２分間を１回のサイクル、９４℃で３０秒間、４４℃で３０秒間および６８℃で６０秒間を５回のサイクル、次いで、９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間および６８℃で６０秒間を２５回のサイクルであった。生じたＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴｏｐｏ−ＴＡクローニングベクター内にクローニングし、配列決定した。クローニングした抗体配列は、クローニングした抗体配列および腹水から生成された元の抗体の質量分析（ＭＳ）を用いた直接比較によって確認した。
【０３５７】
ＪＣ１８野生型（マウス）モノクローナル抗体の可変領域の軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を以下に提供する。
【０３５８】
配列番号３、ＪＣ１８軽鎖可変領域ヌクレオチド配列
GACATTGTGTTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATGACTTTGGCTTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAAGCAGGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGGGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTTCAGCCTCACCATCCATCCTGTGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCTCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
【０３５９】
配列番号４、ＪＣ１８軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDDFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASKQGSGVPARFRGSGSGSDFSLTIHPVEEDDTAMYFCQQSKEVPPTFGGGTKLEIK
【０３６０】
配列番号５、ＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ１ヌクレオチド配列
AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT GAC TTT GGC ATT
AGT TTT ATG AAC
【０３６１】
配列番号６、ＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列
RASESVDDFGISFMN
【０３６２】
配列番号７、ＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ２ヌクレオチド配列
GCT GCA TCC AAG CAG GGA TCC
【０３６３】
配列番号８、ＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列
AASKQGS
【０３６４】
配列番号９、ＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ３ヌクレオチド配列
CAG CAA AGT AAG GAG GTT CCT CCC ACG
【０３６５】
配列番号１０、ＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列
QQSKEVPPT
【０３６６】
配列番号１１、ＪＣ１８重鎖可変領域ヌクレオチド配列
GAAGTGAAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTGGTGGTGGTGACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCAGGAACATCCTCTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAACATCCCTTGAGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAATCACCGTCTCCTCA
【０３６７】
配列番号１２、ＪＣ１８重鎖可変領域アミノ酸配列
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVASISGGGDTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYYCATSLENYAMDYWGQGTSITVSS
【０３６８】
配列番号１３、ＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ１ヌクレオチド配列
AAT TAT GCC ATG TCT
【０３６９】
配列番号１４、ＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列
NYAMS
【０３７０】
配列番号１５、ＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ２ヌクレオチド配列
TCC ATT AGT GGT GGT GGT GAC ACC TAC TAT CCA
GAC AGT GTG AAG GGC
【０３７１】
配列番号１６、ＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列
SISGGGDTYYPDSVKG
【０３７２】
配列番号１７、ＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ３ヌクレオチド配列
TCC CTT GAG AAC TAT GCT ATG GAC TAC
【０３７３】
配列番号１８、ＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列
SLENYAMDY
【０３７４】
（実施例２）
ｍｕＭａｂＪＣ１８の突然変異によって得られたヒト化抗Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体（ｈｕＭａｂＪＣ１８）の作製および試験
ヒト化抗体およびその変異体の結合親和性の決定
この実施例中で使用した一般方法：
Ａ．クローンの特徴付けで使用した発現ベクター
抗体のＦａｂ断片の発現はＢａｒｂａｓ（２００１）Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ページ２．１０．、Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＣｏｍｂ３Ｘに記載されているものに類似のＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＺプロモーターの制御下であったが、修飾には以下の追加のドメインの付加および発現が含まれていた：ＩｇＧ２ａヒト免疫グロブリンＩｇガンマ−２鎖Ｃ領域のヒトカッパ軽鎖定常ドメインおよびＣＨＩ定常ドメイン、タンパク質受託番号Ｐ０１８５９、免疫グロブリンカッパ軽鎖（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、タンパク質受託番号ＣＡＡ０９１８１。
【０３７５】
Ｂ．小スケールのＦａｂの調製
９６ウェルプレート中でのＦａｂの小スケール発現を以下のように実施した。Ｆａｂライブラリで形質転換させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から開始して、コロニーを拾い、マスタープレート（寒天ＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコース）および作業プレート（２ｍｌ／ウェル、９６ウェル／プレート、１．５ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコースを含有）の両方に接種した。両方のプレートを３０℃で８〜１２時間成長させた。マスタープレートを４℃で保管し、作業プレートからの細胞を５０００ｒｐｍでペレット化し、１ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭのＩＰＴＧに再懸濁させて、Ｆａｂの発現を誘導した。
【０３７６】
３０℃で５時間の発現時間の後に細胞を遠心分離によって収集し、その後、５００μＬの緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０）に再懸濁させた。ＨＢＳ−ＥＰに再懸濁させた細胞の溶解は、凍結（−８０℃）、その後に３７℃で解凍の１回のサイクルによって果たした。Ｆａｂを含有する上清から細胞細片を分離するために、細胞溶解液を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。９６ウェルのマルチスクリーニングＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＭＳＦＢＮ６Ｂ５０）を用いて上清を濾過した。その後、上清をＢＩＡｃｏｒｅプラズモン共鳴装置に注入して、それぞれのＦａｂの親和性情報が得られた。Ｆａｂを発現するクローンをマスタープレートから救出して、ＤＮＡを配列決定し、以下に記載のように大スケールのＦａｂ作製および詳細な特徴付けを行った。
【０３７７】
Ｃ．大スケールのＦａｂの調製
詳細な動態学的パラメータを得るために、Ｆａｂを大きな培養物から発現させ、精製した。２００ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコースを含有するエルレンマイヤーフラスコに、選択されたＦａｂ発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンからの５ｍＬの終夜培養物を接種した。クローンを、３０℃で、１．０のＯＤ５５０ｎｍに達するまでインキュベーションし、その後、培地を２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭのＩＰＴＧで交換することによって誘導した。３０℃で５時間の発現時間の後、細胞を遠心分離によってペレット化し、その後、１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ８）に再懸濁させた。細胞の溶解は、凍結／解凍（それぞれ−８０℃および３７℃）の２回のサイクルによって得られた。
【０３７８】
細胞溶解液の上清を、ＰＢＳ、ｐＨ８で平衡化し、その後、５倍カラム体積のＰＢＳ、ｐＨ８で洗浄したＮｉ−ＮＴＡスーパーフローセファロース（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）カラム上に載せた。個々のＦａｂは、ＰＢＳ（ｐＨ８）＋３００ｍＭのイミダゾールを用いて異なる画分で溶出された。Ｆａｂを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、その後、ＥＬＩＳＡによって定量した後に親和性の特徴付けを行った。
【０３７９】
Ｄ．完全抗体の調製
完全抗体の発現には、重鎖および軽鎖可変領域を哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、一過性発現のためにリポフェクタミンを用いてＨＥＫ２９３細胞内に形質移入した。
【０３８０】
抗体は、プロテインＡを用いて、標準の方法を使用して精製した。
【０３８１】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ：
ヒト、マウスまたはラットのＤｋｋ１に対するｈｕＭａｂＪＣ１８の親和性は、ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）を備えたＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いて決定した。ｈｕＭａｂＪＣ１８−ヒトＤｋｋ１の相互作用分析には、ｈｕＭａｂＪＣ１８を３つのフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３およびＦｃ４）にアミンカップリングさせることによって反応表面を作製した。ＣＭ５チップは、供給者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化した。ｈｕＭａｂＪＣ１８  ＩｇＧを１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、３０μｇ／ｍｌの濃度で活性化したチップ上に注入した。
【０３８２】
個々のチップチャネルにわたって可変の流動時間を用いて、２００〜８００応答単位（ＲＵ）の抗体密度の範囲が達成された。その後、Ｄｋｋ−１とチップ表面との非特異的結合を防止するために、ＩｇＧおよび参照表面をヤギＦａｂ２抗ヒトＦｃ（Ｃａｐｐｅｌ、５５０５３）で飽和させた。その後、チップをエタノールアミンでブロッキングした。アッセイは、２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）＋２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ＋２ｍｇ／ｍｌのＣＭデキストランから構成されるＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液を用いて行った。３０．９ｎＭの精製したヒトＤｋｋ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質から開始する５員の３倍希釈系列を１．５分間、１００μＬ／分で注入し、解離を８時間の間監視した。動態学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いてデータを１：１のラングミュアー結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．、Ｒｏｏｓ，Ｈ．、Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．、Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６、９９〜１１０）に当てはめることにより同時に得られた。平衡解離定数（ＫＤ）値はｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。
【０３８３】
ｈｕＭａｂＪＣ１８とマウスまたはラットのＤｋｋ−１との相互作用分析には、低レベルのｈｕＭａｂＪＣ１８（典型的には１００〜４００応答単位）を、個々のフローセル上に、ＣＭ５チップ表面上に事前に固定したヤギＦａｂ２抗ヒトＦｃによって捕捉した。ヒト化抗体を含有しないヤギＦａｂ２抗ヒトＦｃ飽和フローセルが参照チャネルとして役割を果たした。マウスまたはラットのＤｋｋ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、それぞれ７０．１ｎＭまたは３０．２ｎＭを３倍希釈系列の上限濃度として使用して、チップ上で滴定した。会合および解離の段階は、１００μＬ／分でそれぞれ９０秒および３０分で監視した。再生しなかったヒトＤｋｋ−１実験で使用したアミンカップリングしたｈｕＭａｂＪＣ１８表面以外は、すべての実験の捕捉表面は、２回の３０秒間の０．７５ｍＭのＨ３ＰＯ４のパルスで再生した。
【０３８４】
結合応答を二重参照し、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン４．０ソフトウェアを用いて単純なモデルに大域的に当てはめた。親和性は、動態学的速度定数の商（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から推論した。
【０３８５】
ｈｕＭａｂＪＣ１８変異体とヒトＤｋｋ１との結合および解離速度を決定するためのスクリーニングアッセイには、ＢＩＡｃｏｒｅまたはＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．）システムのいずれかを使用した。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイには、ビオチン標識したヒトＤｋｋ１を供給者の指示書に従ってＳＡ（ストレプトアビジン）ＢＩＡｃｏｒｅチップ上に捕捉させた。ビオチン標識したヒトＤｋｋ−１タンパク質をＨＢＳ−ＥＰで希釈し、５μｇ／ｍＬの濃度でチップ上に注入した。個々のチップチャネルにわたる流動時間は、約５００〜６００応答単位（ＲＵ）の抗原密度が達成されるように選択した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液をランニング緩衝液として使用した。濾過した組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解液を高温（３７℃）で１分間、３０ｕｌ／分で注入して、１〜５分間の解離段階を許容した。表面は８ｍＭのＮａＯＨ＋８％のエタノールで再生した。再現性を評価するために、陽性対照Ｆａｂ（クローン２４）を実験の開始時に２回、およびアッセイの終わりに再度注入した。
【０３８６】
ＰｒｏｔｅＯｎアッセイには、ビオチン標識したヒトＤｋｋ−１を、１分間、様々なレベルの固定（１５０〜３０００ＲＵ）が得られると経験的に決定された段階希釈で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＮＬＣ  Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎセンサーチップの５個のチャネル上に注入した。６個目のチャネルは、参照表面として役割を果たすために修飾しないまま残した。濾過した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物中の組換えＦａｂを高温（３７℃）で５０秒間、２０μｌ／分で注入した。ランニング緩衝液はＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ＋０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０からなっていた。ＰｒｏｔｅＯｎは、それぞれの注入が５個のＤｋｋ−１チャネルおよび参照チャネルのそれぞれの上を流れ、６個のＦａｂ試料を同時に注入できるように構成されている。Ｄｋｋ−１表面からのＦａｂの解離を２０分間の間監視した。チップ表面は３０秒間の８％のＥｔＯＨ、８ｍＭのＮａＯＨの注入を用いて再生した。クローン２４Ｆａｂを対照として使用した。会合中の結合のレベル、およびそれぞれのクローンの解離速度は、異なるリガンドチャネル間で非常に一貫していた。
【０３８７】
Ｄｋｋ１に対するｈｕＭａｂＪＣ１８およびその変異体の結合親和性
ｈｕＭａｂＪＣ１８のアミノ酸配列は、配列番号４０（ＨＣ可変領域）および配列番号４２（ＬＣ可変領域）に記載されている。上述のようにＢＩＡｃｏｒｅを用いて決定された、Ｄｋｋ−１に対するｈｕＭａｂＪＣ１８  ＩｇＧの結合親和性を以下の表３に示す。
【０３８８】
【表３】
2012526542.tif 000004
【０３８９】
ｈｕＭａｂＪＣ１８変異体のＣＤＲのアミノ酸配列を以下の表４に示す。表４に示すすべてのアミノ酸置換は、ｈｕＭａｂＪＣ１８の配列に関連して記載されている。また、ｈｕＭａｂＪＣ１８およびその変異体のｈＤｋｋ−１結合親和性も表４に示されている。
【０３９０】
【表４−１】
2012526542.tif 000005
【０３９１】
【表４−２】
2012526542.tif 000006
【０３９２】
【表４−３】
2012526542.tif 000007
【０３９３】
【表４−４】
2012526542.tif 000008
【０３９４】
【表４−５】
2012526542.tif 000009
【０３９５】
【表４−６】
2012526542.tif 000010
【０３９６】
表４中、＃はその位置でのギャップを表し、ｎ．ｄ．は未検を表す。
【０３９７】
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義であるＣＤＲ  Ｈ１を除いて、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義の両方が含まれる拡張ＣＤＲである。アミノ酸残基は連続的に付番されている（Ｈ２およびＨ３の列中の残基の付番には配列番号２８、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の列中の残基の付番には配列番号２０を参照）。すべてのクローンはｈｕＭａｂＪＣ１８と同一のフレームワークおよびＣＤＲ  Ｈ１配列を有する。ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎである。ＢＩＡｃｏｒｅチップまたはＰｒｏｔｅＯｎの表面上に捕捉させたＩｇＧを横切って流した一連のｈＤｋｋ−１濃度の大域的な分析によって得られた、下線を引いたもの以外は、すべてのｋｏｆｆ値はスクリーニングモードで決定した。したがって、下線を引いたＫＤ値は、ｋｏｎを測定することによって実験によって決定した。他のＫＤ値は、１×１０６（１／ミリ秒）の推定ｋｏｎ値に基づいた、理論上のものである。すべての分析したクローンのｏｎ速度は非常に速く、したがって拡散律速されていたため（＞１×１０６、速すぎるため正確な測定不能）、親和性は示したよりもさらに高い可能性が高い。
【０３９８】
ｈｕＭａｂＪＣ１８とＤｋｋ相同体との相互作用
ＨｕＭａｂＪＣ１８を、ヒトＤｋｋ−３、ヒトＤｋｋ−４、マウスＤｋｋ−２およびマウスＤｋｋ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含めた他の入手可能なＤｋｋ相同体との結合について分析した。結果を表５に要約する。
【０３９９】
【表５】
2012526542.tif 000011
【０４００】
ｈｕＭａｂＪＣ１８とＤｋｋ−１相同体との相互作用分析は、ヤギＦａｂ２抗ヒトＦｃを事前に固定した捕捉試薬として使用して、上述のように実行した。ヒトＤｋｋ−４、マウスＤｋｋ−２、またはマウスＤｋｋ−４を、チップ上で、それぞれ７６．３ｎＭ、８８．８ｎＭ、または３２．３ｎＭを上限濃度として使用して、５倍希釈系列で滴定した。ヒトＤｋｋ−３は特異的結合応答を示さなかった。
【０４０１】
ＪＣ１８  Ｄｋｋ−１結合抗体
２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ分析によって決定された、ヒト、マウスまたはラットのＤｋｋ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に対するマウス抗体ＪＣ１８の結合親和性を以下の表６に示す。このアッセイでは、ポリクローナル抗マウスＩｇＧをＢＩＡｃｏｒｅチップとアミンカップリングさせた。抗Ｄｋｋ−１抗体ＪＣ１８は６．５３μｇ／ｍｌであり、１分間、５μｌ／分で捕捉させた。ヒト、マウスまたはラットのＤｋｋ−１の５倍段階希釈（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、０．４〜２５０ｎＭ）を１分間、５０〜１００μｌ／分で注入した。解離は３〜５分間の間監視した。チップは２回の３０秒間の１００ｍＭのＨ３ＰＯ４のパルスで再生した。
【０４０２】
【表６】
2012526542.tif 000012
【０４０３】
ｈｕＭａｂＪＣ１８の配列
配列番号１９、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖可変領域ヌクレオチド配列
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
【０４０４】
配列番号２０、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖可変領域アミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIK
【０４０５】
配列番号２１、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ１ヌクレオチド配列
CGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAAC
【０４０６】
配列番号２２、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列
RASESVDDFGISFIN
【０４０７】
配列番号２３、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ２ヌクレオチド配列
GCCGGCAGCAAGCAGGGCAGC
【０４０８】
配列番号２４、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列
AGSKQGS
【０４０９】
配列番号２５、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ３ヌクレオチド配列
CAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACC
【０４１０】
配列番号２６、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列
QQLKEVPPT
【０４１１】
配列番号２７、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA
【０４１２】
配列番号２８、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域アミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDYWGQGTTVTVSS
【０４１３】
配列番号２９、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ１ヌクレオチド配列
AGCAGCTACGCCATCAGC
【０４１４】
配列番号３０、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列
SSYAIS
【０４１５】
配列番号４９、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
SYAIS
【０４１６】
配列番号５０、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
GFTFSSY
【０４１７】
配列番号３１、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ２ヌクレオチド配列
AGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGC
【０４１８】
配列番号３２、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列
SVSGTGLGFQTYYPDSVKG
【０４１９】
配列番号５１、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
SVSGTGLGFQTY
【０４２０】
配列番号３３、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ３ヌクレオチド配列
TCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTAC
【０４２１】
配列番号３４、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列
TSLENYAFDY
【０４２２】
配列番号５２、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列（短）
SLENYAFDY
【０４２３】
配列番号３５、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列（下線部）を有する
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCCGAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGCTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
【０４２４】
配列番号３６、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖アミノ酸配列、リーダー配列（下線部）を有する（＊Δａ突然変異（Ａ３２９Ｓ、Ｐ３３０Ｓ）は*付文字で示す）
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS*S*IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
グリコシル化部位：ＨＣ、Ｎ２９６。
【０４２５】
配列番号３７、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列（下線部）を有する
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
【０４２６】
配列番号３８、ｈｕＭａｂＪＣ１８カッパ軽鎖アミノ酸配列、リーダー配列（下線部）を有する
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ｈｕＭａｂＪＣ１８のアイソタイプ：ＩｇＧ２（Δａ）＊、カッパ
ｈｕＭａｂＪＣ１８のアロタイプ：Ｇ２（ｎ−）、Ｋｍ３
【０４２７】
配列番号３９、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有さない
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGCTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
【０４２８】
配列番号４０、ｈｕＭａｂＪＣ１８重鎖アミノ酸配列、リーダー配列を有さない（＊Δａ突然変異（Ａ３２９Ｓ、Ｐ３３０Ｓ）は下線で示す）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
グリコシル化部位：ＨＣ、Ｎ２９６。
【０４２９】
配列番号４１、ｈｕＭａｂＪＣ１８軽鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有さない
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
【０４３０】
配列番号４２、ｈｕＭａｂＪＣ１８カッパ軽鎖アミノ酸配列、リーダー配列を有さない
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０４３１】
（実施例３）
ｈｕＭａｂＪＣ１８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能的活性：細胞に基づく機能的アッセイにおけるＷｎｔ活性におけるＪＣ１８の効果の決定
ＴＣＦ結合部位を有するＴＫプロモーターの制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する安定なＵ２ＯＳ細胞系（Ｕ２ＯＳ  ＴＦ）が、細胞に基づく機能的アッセイに選択された。このプロモーターは、細胞をＷｎｔ３ａ馴化培地で処理した際にＷｎｔシグナル伝達経路を介して活性化される。この活性化はＤｋｋ−１によって拮抗される。立ち代って、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ−１媒介性の阻害は、Ｄｋｋ−１中和ｍＡｂを加えることによって逆転させることができる。
【０４３２】
具体的に述べると、ＪＣ１８は、高い親和性でマウスおよびヒトのＤｋｋ−１と結合するモノクローナル抗体である。Ｄｋｋ−１によるＷｎｔ３ａシグナル伝達の阻害を逆転させるその能力を、Ｕ２ＯＳ  ＴＯＰＦｌａｓｈ細胞中で検査した。Ｕ２ＯＳ細胞をＡＴＣＣから入手し、ＴＯＰＦｌａｓｈプラスミド（Ｕｐｓｔａｔｅ）、ＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーター構築体で安定に形質移入した。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で、１０％のウシ胎児血清、１％のＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐ、および２ｍＭのグルタミンを添加したＭｃＣｏｙｓ５Ａ培地中で維持した。Ｕ２ＯＳ  ＴＯＰＦｌａｓｈ細胞を通常の増殖培地中に３１，２５０個の細胞／ｃｍ２の密度でプレートし、終夜インキュベーションした。細胞を、０．２５ｕｇ／ｍｌのｒｈＤｋｋ−１タンパク質またはビヒクル（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、およびＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）中の様々な濃度のＤｋｋ−１  ｍＡｂで処理した。終夜のインキュベーション後、細胞をレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ発現を定量した。
【０４３３】
ＨｕＭａｂＪＣ１８、完全ヒト化抗Ｄｋｋ−１  ｍＡｂは、機能的アッセイにおいて１．３ｎＭのＩＣ５０の良好な有効性を示した（表７）。
【０４３４】
【表７】
2012526542.tif 000013
【０４３５】
（実施例４）
ｍｕＭａｂＪＣ１８およびマウスキメラの骨有効性のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
雌の成体のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験Ｄｋｋ−１抗体の骨格効果の評価に使用する。動物は、２４℃で、１２時間の明所／１２時間の暗所のサイクルを用いて飼育し、水および市販の飼料（Ｐｕｒｉｎａ実験室げっ歯類飼料（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ）５００１、Ｐｕｒｉｎａ−Ｍｉｌｌｓ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を自由に摂取させる。実験はＰｆｉｚｅｒの動物飼育に認可されたプロトコルに従って実施し、動物は、ＩＬＡＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って維持した。マウスは、ビヒクルまたは抗体のいずれかを用いて、経口胃管栄養法によって、週に１回または２回、様々な週の間処置する。研究の終結時に、マウスを安楽死させ、遊離抗体および遊離Ｄｋｋ−１のレベルを測定するために血清を収集する。さらに、末梢定量的コンピュータ断層撮影（ｐＱＣＴ）、マイクロＣＴ、および組織形態計測によって骨量および骨形成の変化を評価するために骨試料を収集する。
【０４３６】
右大腿骨を、ｐＱＣＴ（Ｓｔｒａｔｅｃ  ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍ、Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ウィスコンシン州Ｆｏｒｔ  Ａｔｋｉｓｏｎ）によってソフトウェアバージョン５．４０を用いて走査する。０．１０ｍｍのボクセルの大きさで、それぞれの大腿遠位骨幹端の１ｍｍの厚さの断面を遠位末端から２．５ｍｍ近位で採取し（成長板まで約１．５ｍｍ、海綿骨が多い部位）、それぞれの大腿骨幹の１ｍｍの厚さの断面を遠位末端から８ｍｍ近位で採取する（皮質骨が多い部位）。体積骨含有率、密度および面積を全骨、骨梁および皮質骨について決定する。
【０４３７】
右大腿骨を、マイクロＣＴ機械（Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ４０、Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ａｕｅｎｒｉｎｇ６−８、スイスＢａｓｓｅｒｓｄｏｒｆ）によってソフトウェアバージョン３．１を用いて走査する。骨梁体積を決定するために、大腿遠位骨幹端の断面（それぞれ１６μｍの厚さの合計５０枚の薄片、合計の厚さ＝０．８ｍｍ）を遠位末端から２．３〜３．１ｍｍ近位（成長板から約１．３〜２．１ｍｍ）で採取する。
【０４３８】
左大腿骨を海綿骨の組織形態計測の評価のために処理する。手短に述べると、左大腿骨を段階的濃度のエタノール中で脱水し、非脱灰メチルメタクリレート中に包埋する。大腿遠位の縦方向の前面切片を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  Ｐｏｌｙｃｕｔ  Ｓミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｃｏｒｐ．、ドイツＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を用いて４および１０μｍの厚さで切断する。４μｍ切片を改変マッソン三色染色で染色し、１０μｍ切片は染色せずに残した。すべての組織形態計測の測定は、画像分析システム（Ｏｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ，Ｉｎｃ．、ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ）を用いて、成長板−骨端の接合部に０．３７５〜０．８７５ｍｍ近位の領域中の大腿遠位骨幹端の海綿骨組織において行う。骨組織領域のパーセンテージとしての海綿骨の体積および全海綿骨周囲のパーセンテージとしての破骨細胞表面を、４μｍの厚さの染色した切片において測定する。骨梁の数、厚さおよび距離を計算する。二重蛍光色素標識（鉱化表面）を有する海綿骨表面のパーセンテージ、石灰化速度、骨形成速度（骨表面および組織体積の参照対象）を含めた蛍光色素に基づく骨形成の指標は、１０μｍの厚さの染色していない切片において得られる。
【０４３９】
インタクトなマウスモデルにおける研究プロトコルおよび結果
Ａ．インタクトなマウスモデルにおける抗マウスＤｋｋ−１モノクローナル抗体（ＪＣ１８）の効果
雌の成体のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ビヒクルまたはマウスＩｇＧ１または１０、３０、および６０ｍｇ／ｋｇのＪＣ１８、週に１回を６週間の間、経口投薬した。検死時にそれぞれのマウスから右および左大腿骨をいずれも採取した。右大腿骨はｐＱＣＴを用いて分析し、左大腿骨は組織形態計測方法を用いて分析した。大腿遠位の全ＢＭＤは、ＪＣ１８処置によって、すべての用量レベルにおいて有意に増加した（図１Ａ）。また、ＪＣ１８は、マウスにおいて６０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで骨形成速度も有意に増加させた（図１Ｂ）。
【０４４０】
Ｂ．インタクトなマウスモデルにおける、Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体のマウスキメラ（マウスキメラ−キメラのヒト−マウス抗体）の効果
４カ月齢のインタクトな雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、マウスキメラを用いて、０、０．００１、０．０１、０．１、１、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ、週に１回を６週間の間処置した。マウスの１つの群は、マウスキメラを用いて、５ｍｇ／ｋｇ、週に２回を６週間の間処置した。それぞれの動物の右大腿遠位を、ｐＱＣＴを用いて分析した。図２に示すように、マウスキメラは、ビヒクル処置と比較して１〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で全ＢＭＤを増加させた。
【０４４１】
配列番号４３、キメラ抗体（ｈｕ−ｍｕ）：キメラｈｕＭａｂＪＣ１８Ｌｖａｒ−マウスカッパアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDDFGISFINWYQQKPGQAPRLLIYAGSKQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQLKEVPPTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
【０４４２】
配列番号４４、キメラ抗体（ｈｕ−ｍｕ）：キメラｈｕＭａｂＪＣ１８Ｈｖａｒ−マウスＩｇＧ１定常アミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVASVSGTGLGFQTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATSLENYAFDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
【０４４３】
配列番号４５、キメラ抗体（ｈｕ−ｍｕ）：ｈｕＭａｂＪＣ１８Ｌｖａｒヌクレオチド配列
GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACGACTTCGGCATCAGCTTCATCAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTCATCTACGCCGGCAGCAAGCAGGGCAGCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACCTTCGGCGGTGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
【０４４４】
配列番号４６、キメラ抗体（ｈｕ−ｍｕ）：マウスカッパヌクレオチド配列
GCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG
【０４４５】
配列番号４７、キメラ抗体（ｈｕ−ｍｕ）：ｈｕＭａｂＪＣ１８Ｈｖａｒヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCAGCGTGAGCGGCACCGGCCTGGGCTTCCAGACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCTCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA
【０４４６】
配列番号４８、キメラ抗体（ｈｕ−ｍｕ）：マウスＩｇＧ１  ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ヌクレオチド配列
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA
【０４４７】
Ｃ．卵巣摘出したマウスモデル
雌の成体のＣ５７ＢＬ／６マウスを、閉経後の骨減少模倣するエストロゲン欠乏状態における試験Ｄｋｋ−１抗体の骨格効果を評価するために、偽または卵巣摘出（ＯＶＸ）手術に供する。動物は、２４℃で、１２時間の明所／１２時間の暗所のサイクルを用いて飼育し、水および市販の飼料（Ｐｕｒｉｎａ実験室げっ歯類飼料（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ）５００１、Ｐｕｒｉｎａ−Ｍｉｌｌｓ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を自由に摂取させる。実験はＰｆｉｚｅｒの動物飼育に認可されたプロトコルに従って実施し、動物は、ＩＬＡＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って維持した。マウスは、ビヒクルまたは抗体のいずれかを用いて、経口胃管栄養法によって、週に１回または２回、様々な週の間処置する。研究の終結時に、マウスを安楽死させ、末梢定量的コンピュータ断層撮影（ｐＱＣＴ）、マイクロＣＴ、および組織形態計測によって骨量の変化を評価するために骨試料を収集する。これらの測定の方法は以前のセクションに記載されている。
【０４４８】
研究プロトコルおよび結果
抗マウスＤｋｋ−１モノクローナル抗体（ＪＣ１８）が、ＯＶＸマウスモデルにおいて、エストロゲン欠乏によって誘導される骨減少を予防した。
【０４４９】
４カ月齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを偽または卵巣摘出（ＯＶＸ）手術のいずれかに供し、ビヒクルまたは０．３、１、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ、週に１回のＪＣ１８、または１５ｍｇ／ｋｇ、週に２回のＪＣ１８のいずれかを用いて、手術の翌日から開始して８週間の間処置した。予想どおり、全ＢＭＤの有意な減少によって実証されるように、ビヒクルを用いて処置したマウスはＯＶＸの８週間後に骨減少症を示した（図３）。ＪＣ１８は、大腿遠位でｐＱＣＴによって測定して、ＯＶＸマウスのビヒクル処置と比較して、全ＢＭＤを用量応答的に７〜２０％増加させた。ＪＣ１８で１５ｍｇ／ｋｇ、週に２回処置したマウスでは、全ＢＭＤはビヒクルを用いて処置したＯＶＸマウスよりも高かっただけでなく、偽対照レベルで維持され、これは、この用量および投薬レジメンでは、ＪＣ１８がＯＶＸマウスにおける骨減少症の発生を完全に予防したことを示している（図３）。
【０４５０】
（実施例５）
ｈｕＭａｂＪＣ１８はインタクトなラットモデルにおいて骨量を増加させた
成体の雌のラットは、０、０．１、１、１０、または１００ｍｇ／ｋｇのｈｕＭａｂＪＣ１８を週に１回の静脈内投与で６週間の間受けた。骨形成バイオマーカーである血清オステオカルシンは、処置後２週間目に、１、１０、および１００ｍｇ／ｋｇのｈｕＭａｂＪＣ１８で処置したラットにおいてそれぞれ３０、２６、および２５％増加し、これは、処置後の４週間目での対照値を相違がなかった。骨吸収マーカーである血清ＣＴＸは、処置後に一貫性のある変化を示さなかった。血清バイオマーカーのこれらの変化は、骨に対するｈｕＭａｂＪＣ１８の同化作用を支持している。大腿遠位ＢＭＤおよび大腿骨骨幹軸ＢＭＣ（骨塩含有量）は、１０および１００ｍｇ／ｋｇの用量のｈｕＭａｂＪＣ１８で処置したラットにおいてそれぞれ１１および１６％または７および８％有意に増加し、これは、これらの動物における海綿骨および皮質骨の質量の増加を示している。
【０４５１】
（実施例６）
Ｗｎｔシグナル伝達経路のアンタゴニストである可溶性抗原Ｄｋｋ−１を標的とするモノクローナル抗体療法に関連するシステム力学を理解する方法：ＩｇＧ２抗体のヒト初回投与（Ｆｉｒｓｔ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ）（ＦＩＨ）の開始用量を選択するための、機構的前臨床薬物動態学／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）モデルの応用。
骨粗鬆症とは、骨脆弱化、続いて骨折をもたらす、低い骨塩密度によって特徴付けられた骨疾患である。ビスホスホネート、カルシトニン、ＨＲＴおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）を含めた薬理学的な骨粗鬆症の治療剤の大多数は、骨吸収を低減させることによって骨減少を予防する。骨粗鬆症を患っている患者における骨量の回復は、未だ対処されていない医学的必要性の領域である。
【０４５２】
Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５／６受容体およびＫｒｅｍｅｎ−１／２補助受容体との結合は受容体複合体の内部移行を促進し、Ｗｎｔシグナルの減衰をもたらす（Ｄｉａｒｒａら（２００７）Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１３：１５６〜１６３）。
【０４５３】
骨量の維持におけるＷｎｔ経路の中心的役割の遺伝的証拠は、Ｗｎｔ受容体ＬＲＰ５中の活性化および不活性化させる突然変異の両方の同定に由来する。ＬＲＰ５の不活性化は骨量の減少をもたらし、常染色体劣勢障害：ヒトにおける骨粗鬆症性の偽神経膠腫（ＯＰＰＧ）症候群（Ｇｏｎｇら（２００１）Ｃｅｌｌ、１０７：５１３〜５２３）およびＬＲＰ５ノックアウトマウスにおける類似の表現型（Ｈｏｌｍｅｎら（２００４）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、１９：２０３３〜２０４０）を引き起こす。
【０４５４】
ＨＢＭを有する個体は顕著に低減した骨格骨折の危険性を有する。
中和Ｄｋｋ−１抗体は、骨芽細胞による増加した骨形成が原因で骨量を増加させ、したがって骨粗鬆症性の骨折を予防すると予想されている。ＨｕＭａｂＪＣ１８は、他の障害の中でとりわけ骨粗鬆症を処置するための、ヒト化プロトタイプ抗Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体である。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルのＤｋｋ−１と高い親和性（Ｋｄ＜１００ｐＭ）で結合する。これは、インタクトなマウスにおいて骨量を増加させ、閉経後の骨減少のモデルである卵巣摘出したマウスの骨減少症の骨格に骨量を回復させる（Ｌｉら、２００９、原稿準備中）。
【０４５５】
開発中の抗体が多数存在するにも関わらず、臨床的薬物動態学または有効な抗体用量を予測するために前臨床データを使用する報告は、わずかしか公開されていない（Ｌｏｂｏら（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、９３：２６４５〜２６６８、Ａｇｏｒａｍ、（２００９）Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６７：１５３〜１６０）。線形のＰＫが見込まれる場合は、一般的に、相対パワーモデルを抗体の薬物動態学（ＰＫ）の種間スケーリングに使用する（Ｗａｎｇら（２００８）Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、８４：５４８〜５５８）。しかし、低分子とは異なり、抗体とその標的との相互作用が、しばしば抗体のＰＫに影響を与える。薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）は密接に関連しており、ＰＫ／ＰＤの理解には抗体、標的および抗体−標的の相互作用の知識が必要である。最も高い値は、ＰＫをＰＤ応答と連結させて、薬物曝露および所定の用量後の効果を予測することに由来する（Ａｇｏｒａｍら（２００７）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、１２：１０１８〜１０２４）。したがって、機構的ＰＫ／ＰＤモデリングは、ヒトＰＫおよび臨床的に有効な抗体用量の両方を予測するための合理的かつ有効な手段を提供する。
【０４５６】
この研究では、ラットおよびサルにおける抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８標的（Ｄｋｋ−１）の同時の特徴付けにより、応答の薬物動態学および薬力学の深い理解が可能となった。これを、健康な対象対疾患の対象における標的レベル、標的代謝回転速度および抗体−標的の会合／解離速度の知識と連関させて、臨床におけるＰＫ／ＰＤの機構的予測を行った。
【０４５７】
研究の目的は、以下の計算によって得られた抗Ｄｋｋ−１  ＩｇＧ２抗体（ｈｕＭａｂＪＣ１８）の予測された臨床開始用量を比較および対比することであった：（１）毒性学種における有害作用のないレベル（ＮＯＡＥＬ）、（２）古典的Ｄｕｆｆ方程式を用いた最小の見込まれる生物学的効果のレベル（ＭＡＢＥＬ）および（３）標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）モデルを用いたＭＡＢＥＬ。
【０４５８】
ラットおよびサルにおける前臨床安全性研究を用いてＮＯＡＥＬを決定した。１００倍の安全係数をＮＯＡＥＬに適用して、推奨される開始用量を生じた。古典的Ｄｕｆｆ方程式を用いて受容体占有率を計算し、ＭＡＢＥＬは、１０％の受容体占有率をもたらした用量として定義した。ＴＭＤＤモデルを用いて、ラットおよびサルの研究において遊離Ｄｋｋ−１および抗体濃度を経時的に当てはめた。このモデルをヒトに外挿し、ＭＡＢＥＬは、Ｄｋｋ−１の１０％の低減をもたらした用量である推定された。
【０４５９】
試験物質
モノクローナル抗Ｄｋｋ−１抗体は、Ｇｅｎｏｖａｃ（ドイツ）で、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを完全長の組換えヒトＤｋｋ−１タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）で免疫化することによって作製された。ライブラリ走査突然変異誘発戦略を用いて単一のマウスＩｇＧ１／カッパアイソタイプ抗体（ＪＣ１８）をヒト化および親和性成熟させた（Ｐｏｎｓら、２００９、原稿準備中）。親マウス抗体と比較して、ヒト化抗体（ｈｕＭａｂＪＣ１８）は、ヒトおよびマウスのＤｋｋ−１のどちらに対しても＞１００倍の親和性の増加を示した。
【０４６０】
Ｄｋｋ−１動態学研究で用いたｈＤｋｋ−１−Ｖ５−６Ｈｉｓ（ヒト）およびｒＤｋｋ−１−ＴＥＶ−Ｖ５−６Ｈｉｓ（ラット）をクローニングし、インハウスで発現させ、ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイによって機能的であると認定された（Ａｉら、２００５）。
【０４６１】
ＢＩＡｃｏｒｅ実験
ｈｕＭａｂＪＣ１８とヒトまたはマウスまたはラットまたはカニクイザルのＤｋｋ−１との間の相互作用は、ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）を備えたＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）システムを用いて分析した。会合および解離の段階を相互作用分析中に監視した。結合応答を二重参照し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン４．０ソフトウェアを用いて単純なモデルに大域的に当てはめた。親和性は、動態学的速度定数の商（Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から推論した。
【０４６２】
動物研究
すべての動物研究は、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって認可された動物の飼育および使用のプロトコルに従って実施した。
【０４６３】
ラットにおけるＤｋｋ−１動態学研究
ｈＤｋｋ−１−Ｖ５−６Ｈｉｓを、単一の静脈内ボーラス用量として、雄のスプラーグドーリーラット（ｎ＝３匹／用量）に、１、５、１０および１００μｇ／ｋｇで投与した。一連の血液試料を、投薬前ならびに投薬の０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８および２４時間後に採取した。ｒＤｋｋ−１−ＴＥＶ−Ｖ５−６Ｈｉｓを、単一の静脈内ボーラス用量として、雄のスプラーグドーリーラット（ｎ＝３匹／用量）に、１００μｇ／ｋｇで投与した。一連の血液試料（３００μｌ）を、投薬前ならびに投薬の０．０８３、０．１７、０．３３、０．５、１、２、４および６時間後に採取した。血清を遠心分離によって得て、分析時まで−２０℃で保管した。
【０４６４】
ラットにおける薬物動態学／薬力学的研究
実験は、雌のスプラーグドーリーラット（ｎ＝４０匹、研究の期間にわたって体重２５０〜３５０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）において実施した。ＨｕＭａｂＪＣ１８を、週に１回、静脈内経路によって、連続した６週間の間、雌のスプラーグ−ドーリーラット（ｎ＝８匹／用量）に、０．１、１、１０および１００ｍｇ／ｋｇで投与した。ラットの１つの群（ｎ＝８匹）にはビヒクル対照（２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５、１４０ｍＭのＮａＣｌを含む）を投与した。
【０４６５】
一連の血液試料を、それぞれの処置群から投薬前ならびに最初の投薬の１、３、８、２４、４８、７２、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、５７６、６７２、７４４、８４０、９１２および１００８時間後に採取。血清を遠心分離によって得て、Ｄｋｋ−１およびｈｕＭａｂＪＣ１８の濃度の分析時まで−２０℃で保管した。
【０４６６】
ラットにおける骨塩密度の決定
骨量に対する抗Ｄｋｋ−１  ｍＡｂ処置の効果を評価するために、切除した右大腿骨を末梢定量的コンピュータ断層撮影（ｐＱＣＴ、Ｓｔｒａｔｅｃ  ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍ、Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ウィスコンシン州Ｆｏｒｔ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ）によってソフトウェアバージョン５．４０を用いて走査した。０．１０ｍｍのボクセルの大きさで、それぞれの大腿遠位骨幹端の１ｍｍの厚さの断面を遠位末端から２．５ｍｍ近位、海綿骨が多い部位で走査した。体積全骨塩密度（ＢＭＤ）を以前に記載のように決定した（Ｋｅら、２００１）。
【０４６７】
カニクイザルにおける薬物動態学／薬力学的研究
この研究の動物飼育および実験の手順は、米国動物保護法（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ）およびＴｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６）に指定された条件に従って実施した。
【０４６８】
２〜５歳、重さ３．２〜５．２ｋｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ、ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、テキサス州Ｈｏｕｓｔｏｎ）の５匹の雄および５匹の雌のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をこの研究に使用した。動物（ｎ＝１匹／性別／群）を５つの群に割り当てた。ＨｕＭａｂＪＣ１８をゆっくりとした静脈内注射によって単一の用量として１匹の雄および１匹の雌のサルの群の４つに、０．１、１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与した。残りの群には同じ様式でビヒクル対照を投与した。
【０４６９】
全血試料（約２ｍｌ）を、それぞれの処置群から大腿静脈穿刺によって、処置前ならびに投薬の０．１、０．５、１、３、８、２４、４８、７２、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、５７６および６７２時間後に採取。遠心分離によって血清を全血から分離し、その後、試料を分析時まで−８０℃で保管。試料を後にＤｋｋ−１およびｈｕＭａｂＪＣ１８の濃度について分析した。
【０４７０】
遊離Ｄｋｋ−１アッセイ
製造者の指示に従って、軽微な改変［Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）の組換えヒトＤｋｋ−１（カタログ＃１０９６−ｄｋ−１０／ｃｆ）をアッセイ標準として使用した］を用いて、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ（ミシガン州Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）のヒトＤｋｋ−１  ＥＬＩＳＡシステム（カタログ＃９００−１５１）を妥当性確認してヒト血清中の全Ｄｋｋ−１を測定した。
【０４７１】
ラットおよびサルの血清中の遊離Ｄｋｋ−１（治療抗体と結合していない）をアッセイするために、抗Ｄｋｋ−１抗体を結合していない血清Ｄｋｋ−１の捕捉に使用し、また、キットの指示書に従って、改変［Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）の組換えラットＤｋｋ−１（カタログ＃４０１０−ｄｋ−１０／ｃｆ）およびヒトＤｋｋ−１（カタログ＃１０９６−ｄｋ−１０／ｃｆ）をそれぞれラットおよびサルのアッセイのアッセイ標準として使用した］を用いて、Ａｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎｓのヒトＤｋｋ−１  ＥＬＩＳＡシステム（カタログ＃９００−１５１）からの試薬を残りのステップに使用した。
【０４７２】
健康な対象および疾患の対象からのヒト血清試料はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州Ｎａｓｓａｕ）から購入した。
【０４７３】
Ｖ５でタグ付けしたＤｋｋ−１のアッセイ
Ｖ５でタグ付けしたＤｋｋ−１の血清濃度はＥＬＩＳＡ方法によって決定した。試料を、ＰＢＳ緩衝液（３％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有）で１／４〜１／４０の最終的な最小所要希釈率（ＭＲＤ）範囲まで希釈し、これは、バックグラウンドを低減させるためおよび濃度がアッセイの線形範囲内（アッセイプレート上で約０．１９５〜２５ｎｇ／ｍｌ）となるようにするために使用した。ｈＤｋｋ−１−Ｖ５−６ＨｉｓまたはｒＤｋｋ−１−ＴＥＶ−Ｖ５−６Ｈｉｓの較正および品質管理の標準を試料と同じマトリックス組成物中で希釈した。９６ウェルの免疫吸着アッセイプレート（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）を、５０μｌの２μｇ／ｍｌの抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて終夜、４℃でコーティングし、その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次いで３％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ緩衝液でブロッキングした。希釈した試料および標準をプレートに加え（５０μｌ／ウェル）、振盪しながら室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートを２回の洗浄サイクルで洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗Ｄｋｋ−１の二次抗体（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓキットからのもの、ミシガン州Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）と共に１時間インキュベーションした。洗浄後、プレートを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫＰＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いた呈色反応によって約１０分間展開させ、その後、２ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。吸光度のＯＤの読取り値を４５０ｎｍの波長で決定した（６５０ｎｍを減算して）後に、ブランクのマトリックスのＯＤ値のバックグラウンド減算を行った。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ４．８で均質な重み付けを用いた４つのパラメータの当てはめを使用して、Ｖ５でタグ付けしたＤｋｋ−１の較正標準を用いて検量線を構築した。未知の試料中のＶ５でタグ付けしたＤｋｋ−１の血清濃度をこの検量線から内挿した。
【０４７４】
オステオカルシンアッセイ
血清オステオカルシンの濃度は、ラット−ＭＩＤＴＭオステオカルシンＥＬＩＳＡキット（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ａ／Ｓ、デンマークＨｅｒｌｅｖ）を用いることによって測定した。
【０４７５】
ラットＰＫ／ＰＤ試料の遊離／部分的遊離ｈｕＭａｂＪＣ１８抗体のアッセイ
ｈｕＭａｂＪＣ１８の血清濃度は、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）システム（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いた電気化学発光（ＥＣＬ）方法によって決定した。試料を、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で１／２〜１／１５０の最終的な最小所要希釈率（ＭＲＤ）まで希釈し、次いでさらに１０〜４０００倍希釈を行い、これは、バックグラウンド干渉を低減させるためおよびアッセイの線形範囲内（アッセイプレート上で約５〜１３００ｎｇ／ｍｌ）となるようにするためであった。ＨｕＭａｂＪＣ１８の較正および品質管理の標準を試料と同じマトリックス組成物中で希釈した。９６ウェルのＭＳＤの高結合プレート（カタログ＃Ｌ１１ＸＢ−３）を、５μｇ／ｍｌのｈＤｋｋ−１−Ｖ５−６Ｈｉｓ（内部で作製）を用いて終夜、４℃でコーティングした。コーティングを除去するためにプレートを逆転させた後、プレートをＰＢＳ中の１％のＢＳＡで遮断した。希釈した試料および標準をプレートに加え（２５μｌ／ウェル）、振盪しながら室温で２時間インキュベーションした。その後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ緩衝液を用いた３回の洗浄サイクルで洗浄し、次いで、ＭＳＤのルテニウム化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（カタログ＃Ｒ３２ＡＪ−１）と共に１時間インキュベーションした。洗浄後、ＭＳＤの界面活性剤を含む読取り緩衝液Ｔ（４×）（カタログ＃Ｒ９２ＴＣ−１）をそれぞれのウェルに加え、すぐにＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ６０００で読み取った。試料値から、ブランクのマトリックス値からのバックグラウンドを減算した。ＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン３．０ソフトウェアで１／ｙ２の重み付けを用いた４つのパラメータの当てはめを使用して、抗Ｄｋｋ−１ヒト化抗体の較正標準を用いて検量線を構築した。未知の試料中の抗ＤＫＫ−１ヒト化抗体の血清濃度をこの検量線から内挿した。
【０４７６】
サル試料の遊離／部分的遊離ｈｕＭａｂＪＣ１８抗体のアッセイ
ｈｕＭａｂＪＣ１８の血清濃度はＥＬＩＳＡ方法によって決定した。試料を、ＰＢＳ緩衝液（３％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有）で１／４〜１／１００の最終的な最小所要希釈率（ＭＲＤ）まで希釈し、次いでさらに１０〜５００倍希釈を行い、これは、バックグラウンド干渉を低減させるためおよびアッセイの線形範囲内（アッセイプレート上で約８〜１００ｎｇ／ｍｌ）となるようにするためであった。ＨｕＭａｂＪＣ１８の較正および品質管理の標準を試料と同じマトリックス組成物中で希釈した。９６ウェルの免疫吸着アッセイプレートを、１．５μｇ／ｍｌのｈＤｋｋ−１−Ｖ５−６Ｈｉｓ（内部で作製）を用いて終夜、４℃でコーティングし、その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄した後にＰＢＳ（３％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０ｗ含有）でブロッキングした。希釈した試料および標準をプレートに加え（１００μｌ／ウェル）、振盪しながら室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートを３回の洗浄サイクルで洗浄し、次いで、ビオチン標識したマウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）と共に１時間インキュベーションし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）をプレートに加え、さらに３０分間インキュベーションした。洗浄後、プレートを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いた呈色反応によって約１０分間展開させ、その後、２ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。吸光度のＯＤの読取り値を４５０ｎｍの波長で決定した（６５０ｎｍを減算して）後に、ブランクのマトリックスのＯＤ値のバックグラウンド減算を行った。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ４．８で均質な重み付けを用いた４つのパラメータの当てはめを使用して、抗Ｄｋｋ−１ヒト化抗体の較正標準を用いて検量線を構築した。未知の試料中の抗Ｄｋｋ−１ヒト化抗体の血清濃度をこの検量線から内挿した。
【０４７７】
抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイ
ラットおよびサルにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォーム（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いた架橋リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を用いて測定した。アッセイ希釈剤（３％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）で１：１０に希釈した血清試料（２５μｌ）を、ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中の１μｇ／ｍｌのｈｕＭａｂＪＣ１８でコーティングした、９６ウェルのＭＳＤの高結合プレートに加えた。１時間、室温でインキュベーションした後、プレートを洗浄し、２５μｌの１μｇ／ｍｌのルテニウム標識したｈｕＭａｂＪＣ１８をそれぞれのウェルに加え、再度１時間、室温でインキュベーションした。プレートを洗浄し、１５０μｌのＭＳＤの読取り緩衝液（２×）を加えた後、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ６０００で読み取った。
【０４７８】
ノンコンパートメント薬物動態学的分析
薬物動態学的分析は、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎコンピュータソフトウェア、バージョン５．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、ノースカロライナ州Ｃａｒｙ）を用いて行った。終末速度定数（ｋｅｌ）は、ｌｏｇ血漿濃度時間プロフィールの直線回帰によって決定した。終末排出半減期（ｔ１／２）は、０．６９３／ｋｅｌから計算した。Ｃ最大、Ｔ最大およびＣ最小値は、記録されたデータから直接得た。血清−濃度時間曲線（ＡＵＣ０−ｔ最後）下の面積は、線形台形公式を用いて計算し、ｋｅｌを用いて無限大まで外挿した（ＡＵＣ０〜無限大）。クリアランス（ＣＬ）は、用量／ＡＵＣ０〜無限大の関係性を用いて計算した。分布の体積（Ｖｃ）は、ＣＬ／ｋｅｌの関係性を用いて計算した。Ｃ平均は、１回目の投薬間隔のＡＵＣ（１回目の投薬間隔）／ｔ最後として計算した。
【０４７９】
ラットにおけるＤｋｋ−１動態学研究では、ｈ−Ｄｋｋ−１について提示した排出半減期値は、５、１０および１００μｇ／ｋｇの用量レベルで決定された半減期値の平均であった。１μｇ／ｋｇの用量レベルでの排出半減期値を計算するには、入手可能なデータ点が不十分であった。ｒ−Ｄｋｋ−１では、排出半減期は、３匹のラットの、唯一の投与した用量である１００μｇ／ｋｇのナイーブなプールの分析から計算した。
【０４８０】
薬物動態学／薬力学的分析
個々のラットおよびサルの抗体濃度対時間のデータの予備ノンコンパートメント分析（Ｊｕｓｋｏ、１９９２）を実施し、これにより、抗体の非線形の薬物動態学が明らかとなった。機構的標的媒介性薬物動態モデル（ＭａｇｅｒおよびＪｕｓｋｏ、２００１）を使用して、ラットおよびサルにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８のＰＫ／ＰＤプロフィールを説明した（図５）。手短に述べると、ＴＭＤＤモデルでは、抗体（ｈｕＭａｂＪＣ１８）と標的（Ｄｋｋ−１）との飽和性の高親和性の結合が観察可能な非線形薬物動態学挙動を司っていると想定する。中心区画中の抗体（体積Ｖ１）が遊離Ｄｋｋ−１と結合して（速度定数、ｋｏｎ）、抗体−Ｄｋｋ−１受容体複合体を形成する。形成された後、複合体は解離し得る（速度定数、ｋｏｆｆ）、または抗体−Ｄｋｋ−１の複合体が排除され得る（速度定数、ｋｅｌ、複合体）。また、結合していない抗体は、一次速度（ｋｅｌ）で中心区画から直接排除される場合もある。このモデルを、非特異的な組織部位への抗体の分布を考慮するために拡張し、これらは速度定数ｋ１２およびｋ２１によって記載されている。
【０４８１】
このモデルを以下の微分方程式の組として実装した：
【０４８２】
【数１】
2012526542.tif 000014
ここで、ＣｍＡｂ血清はｈｕＭａｂＪＣ１８の遊離濃度に等しく、Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎであり、［ｍＡｂ合計］＝ＣｍＡｂ血清＋Ｃ複合体であり、［標的合計］＝Ｃ標的＋Ｃ複合体である。
【０４８３】
微分方程式の系は、Ｃｏｍｐａｑ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｆｏｒｔｒａｎバージョン６．６を利用したＷｉｎｄｏｗ  ＸＰ下のＤＯＳシェルで実行する、ＮＯＮＭＥＭソフトウェア、バージョンＶにおいて数値的に解いた。この難しい問題にはＡＤＶＡＮ８ＴＯＬ＝３を使用した。遊離Ｄｋｋ−１区画は、ｔ＝０の単位用量を用いて、Ｆ３（遊離Ｄｋｋ−１）をｔ＝０の推定遊離Ｄｋｋ−１の濃度に設定することによって初期化した。ビヒクルのサルにおけるＤｋｋ−１応答のばらつきは、四次多項式モデルを用いて特徴付けた：
Ｙ＝Ａ＊ＴＩＭＥ＾４−Ｂ＊ＴＩＭＥ＾３＋Ｃ＊ＴＩＭＥ＾２−Ｄ＊ＴＩＭＥ＋ＤＫＫ０［式中、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ビヒクルのデータから決定された定数であり、モデルにおいて固定されており、Ｄｋｋ０は、投薬前（ｔ＝０時間）のＤｋｋ−１の濃度に等しい］。これは、薬物の相加効果を用いて、ＮＯＮＭＥＭにおいて＄ＥＲＲＯＲブロックで実施された。
【０４８４】
ビヒクルのラットにおけるＤｋｋ−１応答のばらつきは、薬物の倍数的効果を用いて、単純な余弦関数を用いて特徴付けた：Ｆ＝ベースライン＋振幅＊Ｃｏｓ（（時間−ピーク時間）＊（２＊π／２４））（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら（１９９９）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ、２７：２３〜４３）。
【０４８５】
適合度は、ＮＯＮＭＥＭで＄ＣＯＶサブルーチンによって提供されたパラメータの推定および相関マトリックスの精度、時間および予測された濃度に対する重み付き残渣法のランダム拡散の目視検査、ならびに任意の時点での系統的なバイアスの欠如についての、個々の対象の予測対実際の濃度−時間のプロットの目視検査から評価した。
【０４８６】
骨粗鬆症患者におけるＤｋｋ−１およびｈｕＭａｂＪＣ１８の濃度の模擬実験は、ＴＭＤＤモデルを用いてＢｅｒｋｅｌｅｙ−Ｍａｄｏｎｎａ（バージョン８．３．９、カリフォルニア大学、カリフォルニア州Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）において行った。ヒト模擬実験で使用したパラメータを表１４に示す。ＰＫ、標的および複合体のパラメータは、相対性の原理によって、Ｙ＝ａ  ＢＷｂの形態の単純なパワーモデルを用いて、ラットおよびサルからヒトにスケーリングした［式中、Ｙは目的のパラメータであり、ＢＷは体重であり、ａは相対係数であり、ｂは相対指数である］。半減期のスケーリングには、ｂは０．２５に等しいと仮定され、排除および吸収の速度定数（ｋｅｌおよびｋｅｌ）には、ｂは−０．２５に等しいと仮定され、分布の体積には、ｂは１に等しいと仮定された（Ｗａｎｇら、２００８）。
【０４８７】
これら３つの手法から誘導した予測された臨床開始用量の推定には、５桁を超える相違が存在していた。最も高い開始用量はＮＯＡＥＬの計算から導かれたものであった（１ｍｇ／ｋｇ）。最も低い開始用量はＤｕｆｆ方程式を用いたＭＡＢＥＬの計算から導かれたものであった（０．００００３ｍｇ／ｋｇ）。ＴＭＤＤモデルを用いたＭＡＢＥＬの計算から導かれた開始用量はこの範囲の中間付近であった（０．０３ｍｇ／ｋｇ）。
ＢＩＡｃｏｒｅデータ
【０４８８】
ＢＩＡｃｏｒｅ表面結合技術を用いて決定した、ｈｕＭａｂＪＣ１８対ヒト、マウス、ラットおよびサルのＤｋｋ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＤｋｋ−１結合動態学の要約を表８に示す。ＨｕＭａｂＪＣ１８は高い親和性でヒト、マウスおよびラットのＤｋｋ−１と結合する（それぞれＫｄ＜２ｐＭ、＜３０ｐＭおよび＜１００ｐＭ）。ほとんどの場合で、ＢＩＡｃｏｒｅ機器によって正確に測定するには、ｏｎ速度（ｋｏｎ）は速すぎ、ｏｆｆ速度（ｋｏｆｆ）は遅すぎた。また、ＨｕＭａｂＪＣ１８はカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）Ｄｋｋ−１とも結合するが、Ｄｋｋ−１試料の不純が原因でＫｄを決定することができなかった。
【０４８９】
【表８】
2012526542.tif 000015
【０４９０】
閉経前、閉経後、骨減少症および骨粗鬆症の女性におけるＤｋｋ−１発現
閉経前（ｎ＝５０人）、閉経後（ｎ＝５０人）、骨減少症（ｎ＝５０人）および骨粗鬆症（ｎ＝５０人）の女性からの血清試料中のＤｋｋ−１の濃度を表９に示す。試験した試料組において閉経前と閉経後の女性との間にはＤｋｋ−１濃度の有意な差異は存在せず、これは、年齢がＤｋｋ−１濃度に影響を与えないことを示唆している。骨減少症の女性（Ｔスコアは−２．２、平均Ｄｋｋ−１は９．０ｎｇ／ｍｌ）および骨粗鬆症の女性（Ｔスコアは−３．０、平均Ｄｋｋ−１は１０．５ｎｇ／ｍｌ）からの試料と比較して、閉経前の女性におけるＤｋｋ−１レベル（平均２．２ｎｇ／ｍｌ）との間では有意な差異が存在していた（ｐ＜０．０１）。これらの値は、骨粗鬆症の女性におけるｈｕＭａｂＪＣ１８の有効な用量を予測するためにＰＫ／ＰＤモデル中に含めた。
【０４９１】
【表９】
2012526542.tif 000016
【０４９２】
ラットにおけるＤｋｋ−１標的動態学：
Ｖ５−Ｈｉｓでタグ付けしたヒト（ｈ−）Ｄｋｋ−１およびラット（ｒ−）Ｄｋｋ−１を、雄のスプラーグ−ドーリーラットに、静脈内ボーラス投与によって、１、５、１０および１００μｇ／ｋｇ（ｈ−Ｄｋｋ−１）または１００μｇ／ｋｇ（ｒ−Ｄｋｋ−１）で投与した。ｈ−Ｄｋｋ−１動態学は、試験した用量範囲にわたって線形であった。平均排出半減期は、ｈ−Ｄｋｋ−１では２２．３±６．４分間（図６）、ｒ−Ｄｋｋ−１では３４分間であった。
【０４９３】
ラットの薬物動態学および薬力学
雌のスプラーグ−ドーリーラットへの週に１回の静脈内投与後の平均遊離／部分的遊離ｈｕＭａｂＪＣ１８の濃度対時間プロフィールを図７に示す。ノンコンパートメント薬物動態学的パラメータを表１０に示す。ｈｕＭａｂＪＣ１８の薬物動態学は用量範囲にわたって非線形であり、１０ｍｇ／ｋｇまでの用量でＡＵＣが超比例的（ｓｕｐｒａ−ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ）に増加していた。これは、より高い用量（１０および１００ｍｇ／ｋｇ）と比較して、より低い用量（０．１および１ｍｇ／ｋｇ）でのクリアランスがより速いことを示している。後の時点で、ラットの一部における血清ｈｕＭａｂＪＣ１８濃度は予想よりも低かった、またはアッセイの定量限界未満であった。ラット抗ｈｕＭａｂＪＣ１８抗体がこれらの試料において定性的抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイを用いて確認され、これらのラットからのデータを分析およびプロットから除去した。
【０４９４】
【表１０】
2012526542.tif 000017
【０４９５】
同じ研究における平均遊離Ｄｋｋ−１の濃度を図８Ａ〜８Ｅにプロットする。遊離Ｄｋｋ−１の濃度は、ｈｕＭａｂＪＣ１８をラットに投与した後、迅速に減少した。最低の用量以外のすべてで、遊離Ｄｋｋ−１の濃度は研究の期間の間、抑制されたままであった。
【０４９６】
カニクイザルの薬物動態学および薬力学
カニクイザルにおける個々の遊離／部分的遊離血清ｈｕＭａｂＪＣ１８の濃度対時間プロフィールを図９Ａおよび９Ｂに示し、カニクイザルにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８のノンコンパートメント薬物動態学的パラメータを表１１に示す。ｈｕＭａｂＪＣ１８の薬物動態学は試験した用量範囲にわたって非線形であり、より低い用量で、より速いクリアランスおよびより短い半減期値が観察された。カニクイザルにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８の半減期の範囲は、用量範囲全体にわたって１〜１３日間であった。
【０４９７】
【表１１】
2012526542.tif 000018
【０４９８】
１ｍｇ／ｋｇ群における投薬後の１４日付近および１０ｍｇ／ｋｇ群の１匹のサルにおける２１日付近での曝露の損失は、抗ｈｕＭａｂＪＣ１８抗体の形成が原因である可能性が高く、これらのデータは分析およびプロットから除去した。しかし、これは定性的ＡＤＡアッセイを用いて確認することができない。
【０４９９】
カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）の同じ研究における遊離Ｄｋｋ−１の平均血清濃度を図１０Ａ〜１０Ｅに示す。遊離Ｄｋｋ−１の濃度はｈｕＭａｂＪＣ１８の投薬後に迅速に減少した。Ｄｋｋ−１抑制の持続期間は用量依存的であり、より低い用量ではベースラインまで戻った。最高の用量では、Ｄｋｋ−１は投薬間隔全体にわたって抑制されたままであった。
【０５００】
ＰＫ／ＰＤモデリング
機構的ＴＭＤＤモデル（ＭａｇｅｒおよびＪｕｓｋｏ、２００１）を用いて、サルおよびラットの両方において、経時的な遊離ｈｕＭａｂＪＣ１８および遊離Ｄｋｋ−１の濃度を同時に当てはめた（図５）。このモデルは、抗体の非標的の特異的排除、標的合成および代謝回転、ならびに複合体の形成および排除を考慮しているために選択した。ラットにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８およびＤｋｋ−１の観察対予測のＰＫ／ＰＤプロフィールを図７および８Ａ〜Ｅに示し、サルにおけるものを図９Ａ〜Ｂおよび１０Ａ〜Ｅに示す。ラットおよびサルのＴＭＤＤモデルからのパラメータの推定を表１２に示す。
【０５０１】
【表１２】
2012526542.tif 000019
【０５０２】
ラットおよびサルにおける分布の体積の推定（Ｖ１）およびＰＫ／ＰＤモデルからの半減期は、ラットおよびサルにおけるＩｇＧ２抗体の薬物動態学と矛盾がなかった（ＰｅｐｐａｒｄおよびＯｒｌａｎｓ、１９８０、Ｈｉｎｔｏｎら、２００４）。ラットのｉｎ  ｖｉｖｏの効力の推定（Ｋｄ＝３４．８ｐＭ）は、ラットにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた値と矛盾がなかった（Ｋｄ＜１００ｐＭ、上記ＢＩＡｃｏｒｅデータを参照）。Ｄｋｋ−１  ｋｅｌから決定されたＤｋｋ−１半減期の推定（サルで２６分間およびラットで１１分間）は、Ｖ５−Ｈｉｓでタグ付けしたｈ−Ｄｋｋ−１およびｒ−Ｄｋｋ−１代謝回転の研究から推定された値に類似であった（それぞれ２２．３分間および３４分間、上記標的動態学のセクションを参照）。複合体の半減期（複合体のｋｅｌから推定）は、抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８および標的Ｄｋｋ−１の推定される半減期の中間である。
【０５０３】
ラットにおける骨バイオマーカー：
標的Ｄｋｋ−１に加えて、骨形成の十分に確立されているバイオマーカーであるオステオカルシンおよび骨粗鬆症の妥当性が確認されたバイオマーカーである骨塩密度（ＢＭＤ）を含めた他のバイオマーカーをラット研究において定量した（たとえばＰｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（Ｒｏｓｅｎ  ＣＪ編）ページ１５２〜１６３および１７４〜１７９、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ワシントンＤ．Ｃ．を参照）。ラット研究における最初の投薬の１．５および２．５週間後でのオステオカルシンの濃度対用量のプロットを図１１に示す。最初の投薬の２．５週間後での１ｍｇ／ｋｇ／週の用量群ならびに投薬の１．５週間後での１０および１００ｍｇ／ｋｇ／週の用量群において、統計的に有意な（ｐ＜０．０５）オステオカルシンの濃度の増加が存在する。
【０５０４】
表１３に示すように、１０および１００ｍｇ／ｋｇ／週のｈｕＭａｂＪＣ１８で処置したラットにおいて、ビヒクル対照と比較して全骨塩密度がそれぞれ１１％および１６％有意に増加した。
【０５０５】
【表１３】
2012526542.tif 000020
【０５０６】
ヒトＰＫＰＤ模擬実験
機構に基づくＰＫ／ＰＤ（ＴＭＤＤ）モデル（図５）を用いて、ヒトにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８のＰＫ／ＰＤの模擬実験を行い、他の障害の中でとりわけ骨粗鬆症の処置に有効な用量を予測した。ＩｇＧ２抗体のＰＫパラメータ（非標的媒介性）の文献に報告された値を、サルおよびラットのＰＫ／ＰＤモデリングから得られたＤｋｋ−１標的動態学およびｈｕＭａｂＪＣ１８−Ｄｋｋ−１複合体動態学の知識（表１４）と組み合わせて、ヒトＰＫ／ＰＤ模擬実験を特徴付けた。
【０５０７】
【表１４】
2012526542.tif 000021
【０５０８】
ＯＶＸマウス疾患モデルにおける以前の実験により、統計的に有意な骨塩密度の増加にはＤｋｋ−１の５０％の低減が必要であることが示されている（データ示さず）。投薬間隔にわたってＤｋｋ−１を＞５０％低減させるための、ｈｕＭａｂＪＣ１８の予測された有効な用量は、月に１回与える３．５７ｍｇ／ｋｇである。この計画された用量は、内在性Ｄｋｋ−１の動態を取り巻く不確実性およびこのパラメータに対するＤｋｋ−１抑制（したがって用量）の高感度が原因で、不確実にその用量と関連している。最小の見込まれる生物学的効果（ＭＡＢＥＬ）を与えると予測された用量は０．０３ｍｇ／ｋｇであった。この用量は、Ｄｋｋ−１レベルを一過的に＜２０％低減させ、次いでベースラインまで戻すと予測されている。０．００３ｍｇ／ｋｇ（ＭＡＢＥＬの１／１０）の用量は効果がないと予測された。これらのＤｋｋ−１濃度のヒト模擬実験を図１２に示し、これは臨床での用量の設定において価値が高いであろう。
【０５０９】
ｈｕＭａｂＪＣ１８の非線形薬物動態学を、ＭＡＢＥＬ（０．０３ｍｇ／ｋｇ）および予測された有効な用量（３．５７ｍｇ／ｋｇ）を包含する用量範囲にわたって予測する。これはＴＭＤＤが原因であり、図１３に示す。
【０５１０】
標的の理解
マウスにおけるデータにより、Ｄｋｋ−１が骨のリモデリングの主な調節因子であり（Ｄｉａｒｒａら（２００７）Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１３：１５６〜１６３）、Ｄｋｋ−１ベースラインレベルは健康なマウスよりも病状（卵巣摘出した、ＯＶＸ）マウスで約５倍高いことが示されている（インハウスデータ）。また、Ｄｋｋ−１レベルは、骨病変を有する多発性骨髄腫患者の骨髄血漿および末梢血中で上昇していることも示されている（Ｔｉａｎら、２００３）。感度分析により、抗Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体（ｈｕＭａｂＪＣ１８）の予測されたヒト用量はＤｋｋ−１ベースラインレベルに高度に感受性であったことが示されている。ベースラインＤｋｋ−１レベルが高ければ高いほど、Ｄｋｋ−１を低減させるために必要な抗体の濃度が大きくなる。標的のベースラインレベルは以前の臨床測定から知られている場合が多いが、Ｄｋｋ−１に関するこの情報の欠如により、臨床開発の様々な段階でのより情報価値のある用量の予測に使用することができる、健康な対象ならびに患者集団（骨減少症および骨粗鬆症の患者）の両方におけるヒトＤｋｋ−１レベルの参照範囲の確立が促された。分析により、Ｄｋｋ−１レベルが、健康な女性よりも骨減少症および骨粗鬆症の女性（Ｔスコア＜−１）で高かったことが示された。
【０５１１】
標的リガンドの代謝回転の速度は数分間から数日間と変動する場合があり、これは有効な用量、さらには標的が臨床上の利点のために撹乱される潜在性に対して顕著な影響を与える場合がある。一部のリガンドは種にわたって類似の動態学を有するが、他のものでは、代謝回転は先験的に予測可能でない。Ｍｅｎｏ−Ｔｅｔａｎｇら（Ｍｅｎｏ−ＴｅｔａｎｇおよびＬｏｗｅ（２００５）Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、９６：１８２〜１９２）は、ＩｇＥの代謝回転速度の範囲はマウスで５〜８時間から人間で２．７日間であることを示し、これは、抗ＩｇＥ抗体のヒト効果の予測に顕著な影響を与えた。Ｄｋｋ−１では、感度分析により、予測された用量の抗Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体（ｈｕＭａｂＪＣ１８）がＤｋｋ−１の半減期に対して感受性を有することが確認され、より高いモル濃度の過剰量の抗体が、より高い標的の代謝回転速度で必要であった。Ｄｋｋ−１の代謝回転速度に関する情報は文献から入手可能でなく、したがって、ラットに静脈内で与えた、Ｖ５−Ｈｉｓでタグ付けしたヒトおよびラットのＤｋｋ−１を用いた実験をインハウスで完結させた。これらの実験により、Ｄｋｋ−１は高い代謝回転速度（ｈ−Ｄｋｋ−１では２２．３分間の半減期、ｒ−Ｄｋｋ−１では３４分間）を有しており、Ｄｋｋ−１のヒトおよびラットの形態がラットにおいて類似の代謝回転速度を有することが示された。後に、ＰＫ／ＰＤモデリングを用いてｈｕＭａｂＪＣ１８を投薬したラットおよびサルにおけるＤｋｋ−１半減期を推定することによって、迅速なＤｋｋ−１の代謝回転速度が確認された。
【０５１２】
ラットおよびサルにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８のＰＫ／ＰＤの理解
ラットおよびサルの研究では、ｈｕＭａｂＪＣ１８は、より低い用量で、より速いクリアランスおよびより短い排出半減期値を有する非線形の薬物動態学を示した。これは標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）を示しており、抗体とその薬理学的標的との相互作用がより低い用量での処分に影響を与えている（Ｔａｂｒｉｚｉら（２００６）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、１１：８１〜８８、Ｗａｎｇら（２００８）Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、８４：５４８〜５５８）。この経路は、標的の有限の発現が原因で、より高い用量では飽和している。標的媒介性経路が飽和した際、典型的なＩｇＧ  ＦｃＲｎ異化クリアランス機構が優勢となり、これにより、抗体に、その特徴的な長い半減期が与えられる。ＴＭＤＤは、受容体媒介性エンドサイトーシスが薬物排除をもたらす、細胞膜上で発現されるタンパク質に対するモノクローナル抗体においてより一般的である。しかし、ＴＭＤＤは可溶性標的でも観察される場合があり、非線形の排除動態学を示すオマリズマブおよびデノスマブは可溶性標的の抗体である（それぞれＩｇＥおよびＮＦｋＢの受容体活性化剤）（Ｈａｙａｓｈｉら、２００７、Ｍａｒａｔｈｅら、２００８）。
【０５１３】
ＰＤを説明するための強制関数として使用される全身性薬物濃度を説明するためのＰＫモデルからなる経験的ＰＫ／ＰＤモデルは、ＰＫおよびＰＤの相互依存性を考慮していないため、多くの場合はＴＭＤＤの特徴付けに適していない。薬物ＰＫ、標的動力学およびその相互作用を説明する単一のモデルがＭａｇｅｒらによって提案されている（ＭａｇｅｒおよびＪｕｓｋｏ（２００１）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ、２８：５０７〜５３２）。このモデルは薬物分子の特異的および非特異的な分布および排除を考慮しており、また、標的動力学を考慮するための柔軟性を提供している。ＰＫおよびＰＤが同時に分析される他の事例では、このモデルは、用量、曝露および応答の間の直接の連結を提供するために使用されている（Ｍｅｎｏ−ＴｅｔａｎｇおよびＬｏｗｅ（２００５）Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、９６：１８２〜１９２）、Ｎｇら（２００６）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、２３：９５〜１０３、Ｗｕら（２００６）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、９５：１２５８〜１２６８）。この事例では、ＴＭＤＤモデルを使用して、抗体ｈｕＭａｂＪＣ１８および標的Ｄｋｋ−１、ｈｕＭａｂＪＣ１８をいくつかの用量レベルで静脈内投与した後のラットおよびサルにおける濃度を同時に当てはめた。このモデルは、それぞれの種における典型的なＩｇＧ２薬物動態学と比較的矛盾のない、ｈｕＭａｂＪＣ１８の非標的媒介性薬物動態学の推定を与えた（ＰｅｐｐａｒｄおよびＯｒｌａｎｓ（１９８０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４０：６８３〜６８６、Ｈｉｎｔｏｎら（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：６２１３〜６２１６）。したがって、排出半減期はラットで２．５日間およびサルで１３．６日間であった。分布の体積は、サルにおける血漿体積（０．０５２Ｌ／ｋｇ）とほぼ等価であったが、ラットにおける血漿体積（０．１４７Ｌ／ｋｇ）よりも高かった。
【０５１４】
標的Ｄｋｋ−１の排出半減期は、ＰＫ／ＰＤモデリングからラットで１１分間およびサルで２６分間であると推定された。これは、ラットにおいて測定された、Ｖ５−Ｈｉｓでタグ付けしたｈ−Ｄｋｋ１の排出半減期と同じ桁数であった（半減期＝２５分間）。ｈｕＭａｂＪＣ１８−Ｄｋｋ−１複合体の半減期はｈｕＭａｂＪＣ１８の半減期およびＤｋｋ−１の半減期の中間であると推定され、これは標的媒介性クリアランス機構を反映している可能性が高い。しかし、標的と抗体との結合が、ＦｃＲｎとの抗体結合を妨害する可能性があり、この仮説を試験するためにインハウスで研究が完結されている。
【０５１５】
ラットにおいて、骨形成のバイオマーカー（オステオカルシンおよび骨塩密度）の増加を、標的バイオマーカーＤｋｋ−１の減少に加えて観察した。このデータにより、骨粗鬆症などの骨格障害を治療するためのｈｕＭａｂＪＣ１８を使用することの、さらなる支持が与えられた。
【０５１６】
ヒトの有効な用量の予測およびＭＡＢＥＬの計算
モノクローナル抗体では、ＰＫ／ＰＤモデリングに基づいた、安全なヒトで最初の用量の合理的な選択が重要であることが、広く認識されつつある（たとえば、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｐｏｌｉｃｙ  ａｎｄ  ｇｕｉｄａｎｃｅ：Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ英国政府のウェブサイトを参照）。新しいパラメータである最小の見込まれる生物学的効果のレベル（ＭＡＢＥＬ）は、ＰＫ／ＰＤモデリング手法に基づいて、観察された前臨床ＰＫ／ＰＤデータを臨床予測に外挿することを含む。最近の欧州規制指針（ＥＭＥＡ（２００７）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａｎｄ  ｍｉｔｉｇａｔｅ  ｒｉｓｋｓ  ｆｏｒ  ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．、（ＥＭＥＡ編）、ロンドン）において、危険性の高い治療剤のヒトで最初の用量レベルを設計する際に、有害作用のないレベル（ＮＯＡＥＬ）に加えて、ＭＡＢＥＬを検討することが提案されている。
【０５１７】
ｈｕＭａｂＪＣ１８の有効な用量を予測するために、ラットおよびサルにおいて前臨床データを当てはめるために使用した機構的ＴＭＤＤモデルをヒトＰＫ／ＰＤ模擬実験に適応させた。ＩｇＧ２抗体の薬物動態学的パラメータ（非標的媒介性）の文献に報告された値を、ラットおよびサルのＰＫ／ＰＤモデリングから得られたＤｋｋ−１標的動態学およびｈｕＭａｂＪＣ１８−Ｄｋｋ−１複合体動態学の知識と組み合わせた。
【０５１８】
ヒトＤｋｋ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＢＩＡｃｏｒｅ値を用いて、モデルにおける複合体の会合および解離速度（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を決定した。ｋｏｎおよびｋｏｆｆで感度分析を行い、ヒトにおいてこの抗体で予測された速いｏｎ速度および遅いｏｆｆ速度により、Ｄｋｋ−１抑制、したがって用量は、Ｋｄの比較的大きな変化に対して非感受性である。実際、＜１０ｐＭのＫｄ値では、予測された用量に変化はない。これは、ｈｕＭａｂＪＣ１８−Ｄｋｋ−１複合体の代謝回転速度が受容体からのｏｆｆ速度よりも速いからである。そのような事例では、候補選択における親和性成熟ステップが回避され得る。
【０５１９】
骨粗鬆症の患者（結果のセクションを参照）からの試料で測定した平均Ｄｋｋ−１ベースライン濃度を模擬実験で使用した。Ｄｋｋ−１は、サルまたはラットと比較して、ヒトにおいてより遅い代謝回転速度を有すると想定された。したがって、ヒトＤｋｋ−１半減期を、サルおよびラットの半減期値の相対スケーリングを用いて計算した。これにより、４９分間というヒトにおけるＤｋｋ−１の推定半減期が与えられた。Ｄｋｋ−１は迅速に代謝回転される抗原であるため、Ｄｋｋ−１の全体的な抑制、したがって用量は、模擬実験で使用したＤｋｋ−１半減期値に対して感受性が高いことに注意されたい。
【０５２０】
ヒトにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８−Ｄｋｋ−１複合体の半減期は、サルＰＫ／ＰＤモデルによって推定された複合体半減期の相対スケーリングによって、２．３日間（ｋｅｌ＝０．３日−１）であると予測された。ヒトにおけるより短い複合体半減期は、ラットＰＫ／ＰＤモデリングによって推定された複合体半減期の相対スケーリングによって予測されるであろう。しかし、感度分析を行い、Ｄｋｋ−１抑制（したがって用量）は、ラット対サルから予測された複合体半減期の変化に感受性がなかった。
【０５２１】
閉経後の骨減少のモデルであるＯＶＸマウスにおける以前の実験により、Ｄｋｋ−１レベルの約５０％の低減が骨塩密度の統計的に有意な増加に関連していたことが示された（データ示さず）。したがって、ｈｕＭａｂＪＣ１８の用量の予測は、Ｄｋｋ−１レベルは、投薬間隔（１カ月）にわたってベースラインから５０％より高く抑制する必要があるということに基づいて行った。この検討事項の下、上述の想定を用いて、ｈｕＭａｂＪＣ１８の予測された有効な用量は、１カ月に１回、皮下で与える３．５７ｍｇ／ｋｇであった。模擬実験によって、ヒトにおいて最小限の効果（ＭＡＢＥＬ）を与えると予測された用量（Ｄｋｋ−１の＜２０％の低減）は０．０３ｍｇ／ｋｇである。非線形の薬物動態学が臨床において予測されており（図１３）、ｈｕＭａｂＪＣ１８は、ＴＭＤＤが原因で、より低い用量においてより高いクリアランスおよびより短い半減期を示す。
【０５２２】
ヒト薬理学を予測することの代替手法は、平衡−薬物相互作用理論に基づいた式を用いて最大の受容体占有率（ＲＯ）を予測することである。
【０５２３】
【数２】
2012526542.tif 000022
（図１４、（Ｄｕｆｆ（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｎｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ：Ｆｉｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、英国ロンドン））。この方法を用いたＲＯの推定はＫｄのみに依存し、標的またはｍＡｂ−標的複合体の動態学を考慮しない。Ｄｋｋ−１は高い代謝回転速度を有し、ｈｕＭａｂＪＣ１８によるＤｋｋ−１の結合が標的の動態学（ＴＭＤＤ）を変化させることが示されている。これらの条件下では、ＲＯは多くの場合薬理学的平衡手法によって予測可能ではなく、単純なＫｄに基づくＲＯの計算は、特定の用量でのＲＯを相当に過剰に予測することが示されている（Ａｇｏｒａｍ（２００９）Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６７：１５３〜１６０）。Ｄｋｋ−１では、平衡式を用いて計算したＲＯは、０．００００１ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を推定する一方で、機構的ＰＫ／ＰＤモデルは、０．０１ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を推定する（図１４）。平衡計算の使用は、臨床には低すぎて、ヒトで最初の研究の進行を遅延させる用量の選択をもたらす可能性がある。それとは正反対に、ラットおよびサルにおける観察されたＮＯＡＥＬ（１００ｍｇ／ｋｇ）は、標的と抗体との１００％結合に必要なものよりも過剰量であり、これは臨床開始用量の推定の提供には推奨されない。ＭＡＢＥＬ用量の計算のＰＫ／ＰＤモデルに基づく手法が、Ｄｋｋ−１に予測的である可能性が高く、臨床研究の安全性および効率を保証すると結論づけられた。
【０５２４】
観察されたＮＯＡＥＬ（１００ｍｇ／ｋｇ）は、Ｄｋｋ−１と抗体との１００％結合に必要なものよりも過剰量である。それとは正反対に、Ｄｕｆｆ方程式に従って計算したＭＡＢＥＬは、Ｄｋｋ−１の迅速な代謝回転の考慮を欠いているために、重度に過少推定である可能性が高い。したがって、これらの方法は、この場合において開始臨床用量を設定するための許容できる手法ではない。対照的に、ＴＭＤＤモデルは前臨床データの優れた特徴付けをもたらし、これはＤｋｋ−１の％結合の決定における標的の代謝回転の役割を示している。したがって、ＴＭＤＤモデルから導かれたＭＡＢＥＬの推定（０．０３ｍｇ／ｋｇ）はＦＩＨ研究の安全性および効率の両方を保証するであろう。
【０５２５】
結論として、ｈｕＭａｂＪＣ１８は、他の障害の中でとりわけ骨粗鬆症を処置するための、ヒト化プロトタイプ抗Ｄｋｋ−１抗体である。機構的ＴＭＤＤモデルを用いて、ラットおよびサルにおけるｈｕＭａｂＪＣ１８対Ｄｋｋ−１の濃度の応答関係性を特徴付けた。標的の発現および代謝回転速度の情報を取り込むことによって、このモデルをヒトへと換算して有効な用量およびＭＡＢＥＬを予測した。これらのパラメータは、この機構において親和性よりも用量応答関係性に対してより影響を与えることが見出された。
【０５２６】
受託情報
本出願人らは、本明細書中でｈｕＭＡｂＪＣ１８と命名した抗体の重鎖および軽鎖可変領域をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０−２２０９、米国に受託している。前述したように、ｈｕＭａｂＪＣ１８のＨＣ可変領域を２００９年３月１９日に受託し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８３５と割り当てられ、ｈｕＭａｂＪＣ１８のＬＣ可変領域を２００９年３月１９日に受託し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８３６と割り当てられている。これらの受託は、特許手続き上の微生物の受託の国際承認に関するブダペスト条約の規定およびその下にある規制（ブダペスト条約）の下で行った。これらの受託は、３０年間の期間、または最新の請求後の５年間、または特許の有効期限の間のいずれか最長の間、ＡＴＣＣ受託所に制限なしに維持され、その期間中に受託物が生育不能となった場合は交換される。受託した物質の利用可能性は、任意の政府の当局の下で、その特許法に従って与えられた権利に違反して本開示の任意の態様を実施する許可として解釈されるべきでない。前述の書面の明細書は、当業者が本開示のすべての態様を実施することを可能にするために十分であるとみなされる。受託した実施形態は本開示の特定の態様の単一の例示として意図し、機能的に均等である任意の構築体が本開示の範囲内にあるため、本開示は受託した物質によって範囲が限定されない。本明細書中の物質の受託は、本明細書中の書面の説明がその最良の形態を含めた本開示の任意の態様の実施を可能にするために不十分であるという承認を構成せず、また、特許請求の範囲を、それが表す具体的な例示に限定すると解釈されるべきでない。実際、本明細書中に示し、記載したものに加えて、本開示の様々な改変が、前述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内にある。
【０５２７】
本明細書中で使用するセクションの見出しは、組織的な目的のためのみであり、いかなる様式でも、記載した主題を限定すると解釈されるべきでない。軽微なおよびわずかな逸脱が本明細書中の本教示の範囲内にあるように、本教示中に記述した温度、濃度、時間などの前には「約」が暗示されることを理解されたい。本出願中、具体的にそうでないと記述されている場合以外は、単数形の使用には複数形が含まれる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」の使用は、限定することを意図しない。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも例示的および説明的のみであり、本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【０５２８】
特許、特許出願、論文、教科書などを含めた本明細書中で引用したすべての参考文献、およびそれら中に引用されている参考文献は、それらが既にそうでない程度まで、その全体が本明細書中に参照により組み込まれている。それだけには限定されないが、定義された用語、用語の用法、記載した技法などを含めて、組み込まれた文献および類似の資料のうちの１つまたは複数が本出願と異なるまたは相反する場合は、本出願が支配する。
【受託番号】
【０５２９】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９８３５
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９８３６
【図１】
2012526542.tif 000023
【図２】
2012526542.tif 000024
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2012526542.tif 000029
【図８−１】
2012526542.tif 000030
【図８−２】
2012526542.tif 000031
【図８−３】
2012526542.tif 000032
【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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