(57)【要約】  本発明は、細胞シグナル伝達経路に関与する細胞内タンパク質(バイオマーカー)のリン酸化状態を測定するステップを含む、サンプルの所定細胞集団の細胞活性化状態の、全血サンプルについてのELISAアッセイ方法に関する。本発明による細胞内タンパク質のリン酸化状態のアッセイ方法の特定の適用は、全血サンプル中に存在する細胞集団の細胞活性化に対するアゴニスト作用剤又はアンタゴニスト作用剤のフォローアップに関する。このような適用は、患者の治療フォローアップの一助となることができ、又は薬物のスクリーニングに使用され得る。これに関連して、この適用は特に、全血サンプル中に含まれる血小板の活性化の観察による止血、特に血液凝固の精査に関する。
2012529642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞シグナル伝達経路に関与する細胞内タンパク質(バイオマーカー)のリン酸化状態を測定するステップを含む、サンプルの所定細胞集団の細胞活性化状態の、全血サンプルについて実施されるELISAによるアッセイ方法。
【請求項２】
アッセイする細胞活性化状態が血小板の活性化状態である、請求項1に記載のELISAによるアッセイ方法。
【請求項３】
リン酸化状態を試験する細胞内タンパク質が、キナーゼファミリーのタンパク質又はキナーゼ基質タンパク質である、請求項1又は2に記載のELISAによるアッセイ方法。
【請求項４】
細胞内タンパク質が、キナーゼPKA、PKG、AKT、ERK、JAK2、BCR-ABLから選択されるキナーゼの基質タンパク質又はキナーゼ自体である、請求項2に記載のELISAによるアッセイ方法。
【請求項５】
細胞内タンパク質が、タンパク質VASP若しくはSTAT5などの血小板キナーゼ基質、又はタンパク質AKT、P38若しくはERKなどのキナーゼである、請求項2から4のいずれか一項に記載のELISAによるアッセイ方法。
【請求項６】
全血のサンプルについて実施される以下のステップ:
a)全血サンプルの1つのアリコート部分を、所定細胞内タンパク質のリン酸化の活性化によって前記サンプルの所定細胞集団の細胞活性に対して作用する第1化合物、有利には生理的化合物によって活性化し、且つもう1つのアリコート部分を前記第1化合物、及び細胞受容体との相互作用の経路を経て又は細胞シグナル伝達酵素との相互作用の経路を経て前記リン酸化を阻害又は変更する第2化合物によって活性化するステップと、
b)活性化サンプルの細胞を、非リン酸化細胞内タンパク質とリン酸化状態の前記タンパク質との平衡を保持できる条件下で溶解させ、前記平衡が前記サンプルの前記所定細胞集団の細胞活性の証拠を示すステップと、
c)溶解生成物を除去するために洗浄するステップと、
d)処理サンプルを、そのリン酸化状態に関係なく細胞内タンパク質を特異的に認識する抗体を含む捕捉プローブと共にインキュベートするステップと、
e)リン酸化細胞内タンパク質とリン酸化状態の前記細胞内タンパク質を特異的に認識する可視化抗体との免疫複合体の形成を可視化するステップと
を含み、前記抗体を必要に応じて標識する、請求項1から5のいずれか一項に記載のELISAによるアッセイ方法。
【請求項７】
所定細胞内タンパク質(第2化合物と称する)のリン酸化に変更を加えることによって血小板活性化と相互作用する化合物が投与された患者から採血した全血サンプルについて実施される以下のステップ:
a)全血サンプルのアリコート部分を、所定細胞内タンパク質のリン酸化の活性化によって前記サンプルの所定細胞集団の細胞活性に対して作用する第1化合物によって活性化するステップと、
b)活性化サンプルの細胞を、非リン酸化細胞内タンパク質とリン酸化状態の前記タンパク質との平衡を保持できる条件下で溶解させ、前記平衡が前記サンプルの前記所定細胞集団の細胞活性の証拠を示すステップと、
c)溶解生成物を除去するために洗浄するステップと、
d)処理サンプルを、そのリン酸化状態に関係なく細胞内タンパク質を特異的に認識する抗体を含む捕捉プローブと共にインキュベートするステップと、
e)リン酸化細胞内タンパク質とリン酸化状態の前記細胞内タンパク質を特異的に認識する可視化抗体との免疫複合体の形成を可視化するステップと
を含み、前記抗体を必要に応じて標識する、請求項1から5のいずれか一項に記載のELISAによるアッセイ方法。
【請求項８】
前記第2化合物による活性化が、前記第1化合物による活性化に先行する、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
ステップa)において、リン酸化を阻害又は変更する前記第2化合物による活性化が、細胞活性に対する効果を試験する物質、例えば、生物活性又は治療活性を有する物質であることを特徴とする、請求項6に記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
洗浄ステップの後に、サンプルを保存するための凍結ステップを行う、請求項6から9のいずれか一項に記載のELISAによるアッセイ方法。
【請求項１１】
前記免疫複合体の形成の可視化を、抗体のマーカーの基質を用いて行い、且つ前記可視化が、処理サンプルの2つのアリコート部分の光学濃度を測定するステップ、及び必要に応じてそれに続く、PRIを算出するステップを含む、請求項6から10のいずれか一項に記載のELISAによるアッセイ方法。
【請求項１２】
リン酸化状態を測定する細胞内タンパク質がVASPタンパク質であり、活性化を測定する細胞集団が血小板集団であり、前記サンプルの1つのアリコート部分を、VASPリン酸化のアゴニストである第1化合物によって活性化し、サンプルのもう1つのアリコート部分を、同一第1化合物によって、及び更に、生物活性又は治療活性を試験する物質に対する標的血小板受容体と相互作用する第2化合物によって活性化する、請求項1から11のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１３】
VASPリン酸化の生理的アゴニストが、アデニリルシクラーゼを活性化する酵素、例えば、プロスタグランジンPGE1、PGI2、及びグアニリルシクラーゼを活性化する物質、例えば、NO供与物質又はナトリウム利尿ペプチドから選択される、請求項12に記載のアッセイ方法。
【請求項１４】
リン酸化を阻害又は変更する化合物が、ADPによって刺激される受容体P2Y12などの血小板受容体と及び/又は細胞シグナル伝達酵素、例えば、アデニリルシクラーゼ、グアニリルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ(例えば、PDE2、PDE3若しくはPDE5) 又はキナーゼタンパク質(例えば、PKA若しくはPKG)と相互作用する物質である、請求項13に記載のアッセイ方法。
【請求項１５】
リン酸化状態を測定する細胞内タンパク質がVASPタンパク質であり、活性化を測定する細胞集団が血小板集団であり、サンプルの1つのアリコート部分を、VASPリン酸化の第1生理的アゴニスト、例えば、PGE1、PDG2又はPGI2によって活性化し、サンプルのもう1つのアリコート部分を、同一第1アゴニストによって、及び更に、細胞受容体と相互作用する、例えば、ヌクレオチドADPによって刺激される受容体P2と相互作用する第2化合物によって活性化し、前記第2化合物がVASPリン酸化を阻害するか又は前記第2化合物を試験することによってその阻害特性を検査する、請求項1から13のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１６】
リン酸化状態の細胞内タンパク質を特異的に認識する抗体が、モノクローナル抗体、例えば、セリン239がリン酸化されているVASPタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体、又はセリン473がリン酸化されているAKTタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体である、請求項1から15のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１７】
溶解用緩衝液が、以下の混合物:
最終濃度0.0002〜10%、好ましくは0.02〜2%、好ましくは0.2%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS);
最終濃度0.002〜10%、好ましくは0.2〜5%、好ましくは2%のTriton X-100(オクチルフェノキシポリエトキシフェノール);
最終濃度0.000002〜10%、好ましくは0.004〜1%、好ましくは0.04%の、活性成分として5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン及び2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンを含む殺菌剤型の広域スペクトル殺菌剤
を含むか又は前記混合物によって構成される、請求項1から14のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１８】
全てのインキュベーションステップを周囲温度又は約37℃の温度において実施し、且つ溶解ステップを、周囲温度又は約37℃の温度において10〜30分間、好ましくは10分間実施する、請求項1から17のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項１９】
血液サンプルを、活性を試験する細胞集団の完全性を保つ条件下で、特に、採取中の前記細胞集団の活性化を防ぐ条件下で採取し、次いで、採取サンプルを抗凝血剤、例えば、クエン酸ナトリウム、好ましくは0.109M又は0.129Mクエン酸三ナトリウムによって、抗凝血剤1容量に対して血液9容量の割合で処理する、請求項1から18のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項２０】
サンプル中に含まれる所定細胞集団の活性に対するアゴニスト作用剤又はアンタゴニスト作用剤によって治療されている患者から既に採取された全血サンプルに適用される、請求項1から18のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項２１】
アゴニスト作用剤又はアンタゴニスト作用剤が血小板凝集に作用する、請求項19に記載のアッセイ方法。
【請求項２２】
血小板活性化のアンタゴニストが、ADPに対するP2Y12受容体のアンタゴニスト、例えば、クロピドグレル若しくはチクロピジンなどのチエノピリジンであるか、又は細胞シグナル伝達酵素、例えば、アデニリルシクラーゼ、グアニリルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ(例えば、PDE2、PDE3若しくはPDE5) 又はキナーゼタンパク質(例えば、PKA若しくはPKG)と相互作用する物質である、請求項20に記載のアッセイ方法。
【請求項２３】
例えば、患者が前記アンタゴニスト作用剤によく応答するか又はあまり応答しないかを判定するために、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法に従ってアッセイし、血小板反応性指数(PRI)を算出し、PRIを解釈することを特徴とする、血小板活性化のアンタゴニスト作用剤で治療されている患者の凝血障害を監視するためのインビトロ法。
【請求項２４】
請求項17において定義された溶解用緩衝液;
洗浄溶液;
必要ならば標識された、リン酸化状態の細胞内タンパク質を特異的に認識する抗体
を含むことを特徴とする、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血サンプルについて実施する、細胞シグナル伝達経路に関与する細胞内バイオマーカーのインビトロアッセイ方法に関する。本発明はまた、血液サンプル中に含まれる所定細胞集団の細胞の活性化測定における前記方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、血液中に存在する細胞の活性化時に起こり得る生理的プロセスの精査に関する。このような細胞は、特定の生理的状態、特に病的状態の結果として血液循環に見られる血液又は細胞中に自然に存在する細胞であることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ヨーロッパ特許EP1042368
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hollopeter Gら、Nature 2001:409:202〜7
【非特許文献２】Czernik A Jら(1991)、Methods Enzymol 201:264
【非特許文献３】http://www.immunoglobe.com
【非特許文献４】http://www.carbomer.com
【非特許文献５】http://www.sigmaaldrich.com
【非特許文献６】http://www.roche-applied-science.com
【非特許文献７】http://www.biozyme.com
【非特許文献８】http://www.nanotools.de
【非特許文献９】http://www.kem-en-tec.com
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞活性化が、ある種の細胞内タンパク質の状態の変更(modification)、特に細胞シグナル伝達経路に属するタンパク質のリン酸化状態の変更に付随して起こることが観察された。本発明は、細胞集団活性化のバイオマーカーとして役立つ、このようなタンパク質及びそれらのリン酸化状態の解析に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本出願は、細胞シグナル伝達経路、特にシグナルトランスダクションに関与する細胞内タンパク質が、リン酸化によって発現調節されるタンパク質であるアッセイ方法を対象とする。よって、リン酸化状態が観察されるタンパク質が、細胞活性の結果としての、細胞活性化のバイオマーカーである。
【０００７】
本発明による、細胞内タンパク質のリン酸化状態のアッセイ方法の特定の適用は、全血サンプル中に存在する細胞集団の細胞活性化に対するアゴニスト作用剤(agonistic agent)又はアンタゴニスト作用剤(antagonistic agent)の監視に関する。このような適用は、特に患者の治療監視に役立つか、又は薬物スクリーニングに有用であると考えられる。
【０００８】
詳細には、本出願は、全血サンプル中に含まれる細胞集団の活性化の観察による止血、特に血液凝固の精査に関連する。細胞活性化は、実際には、血液凝固の原因となる反応がトリガーされる場合に起こるプロセスである。詳細には、インビボでの血小板の内皮下構造への接着、又はインビトロでの外部刺激(ADP、トロンビン、コラーゲンなど)の作用の後に観察される血小板の活性化は、血小板の凝集を引き起こすことができ、これらの条件下で、凝固カスケードの反応を正常に発生させて、フィブリル網状構造による血小板凝集塊の安定化により血栓を形成できる。
【０００９】
したがって、本発明はより詳細には、血小板の活性化状態を測定するために、より一般的には血小板活性の精査に役立つように、全血サンプル中に含まれる血小板(トロンボサイト)において発現される細胞内タンパク質のリン酸化状態の解析に適用できる。
【００１０】
本発明は、血管系の疾患に関連する医療分野において、特に活性物質の検査又は血管系の疾患の予防又は治療に効果的な物質の監視に特に有用である。よって、本発明の方法の特定の適用は、血小板凝集抑制剤として知られているか又はその可能性のある作用剤に対する血小板の応答を監視することからなる。したがって、本発明の方法は、例えば、血小板凝集抑制剤に対する生物学的耐性又は他の耐性をスクリーニングするために、投与される血小板凝集抑制剤の投与量を患者に適合させるために、又は治療を中断すべきか若しくは継続すべきかの判断への寄与に、使用できる。
【００１１】
血小板において発現される細胞内タンパク質のリン酸化状態のアッセイとの関連において、治療又は制御のための化合物の同定を含む病態の診断又は監視に関して本発明の方法が有効であり得る病態の特定例は、冠動脈アテローム性動脈硬化の結果としての急性冠動脈症候群(例えば、心筋梗塞、冠動脈血栓、冠動脈閉塞)、虚血性脳血管障害、2型糖尿病、鎌状赤血球症(drepanocytosis)などである。
【００１２】
血小板の活性化は、例えば、血管病変又は動脈プラークの破裂後の血栓形成プロセスがトリガーされた結果である。活性化された血小板は血管壁に接着した後、可逆的に、次いで不可逆的に凝集し、血管内皮の病変を生理的に修復するか、又は病的状態では、血管を閉塞させる。
【００１３】
血小板活性化プロセスにおいて同定される、本発明の実施形態(implementation)において重要な分子パートナー(molecular partner)のうち、損傷細胞において分泌された後に又はトロンビンなどの凝固因子に応答して、血小板の密顆粒によって放出されるヌクレオチドADP(アデノシン二リン酸)の役割が観察された。ADPによる血小板の刺激は、不安定な血小板凝集塊を形成させる。血小板ADP受容体の1つは、P2Y12に命名されているプリンP2受容体(Hollopeter Gら、Nature 2001:409:202〜7)であり、細胞内シグナルトランスダクションのいくつかの経路(カスケード)の選択的活性化に関与している。P2Y12受容体は、形成された血小板凝集体の安定に関与している。
【００１４】
血小板の活性化は、プロスタグランジンPGE(特にPGE1若しくはPGE2)などの生理的アゴニストによって、プロスタグランジンPGI(例えば、PGI2)又はプロスタグランジンPGD(例えば、PGD2)によって刺激され得る。PGE1による血小板の活性化により、タンパク質VASP(血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質)のリン酸化が活性化される。VASPのリン酸化は、セリン239(NCBIによって2009年5月10日付バージョンにおいて受託番号NP003361.1が発行された配列中のセリン)において、例えば、活性化がPGE1によって開始される場合にはcAMP(環状アデノシン一リン酸)の細胞内濃度に比例した量で及び/又は例えば、活性化がNO(一酸化窒素)-供与化合物によって開始される場合にはcGMP(環状グアノシン一リン酸)の細胞内濃度に比例した量で起こる。
【００１５】
cAMP又はcGMPの細胞内濃度はそれぞれ、アデニリルシクラーゼ又はグアニリルシクラーゼとホスホジエステラーゼとの協奏作用(concerted action)によって調節される。キナーゼは、細胞活性化調節の重要な酵素である。このようなキナーゼは多種存在し、タンパク質基質のセリン、スレオニン又はチロシン残基へのATPのリン酸基の転移によって、膜又は細胞内タンパク質のリン酸化に関与している。この翻訳後修飾により、細胞周期の多くの活性が調節され、異常なリン酸化は多くの病的状態に関与する可能性がある。ある種のキナーゼは、生物活性分子、特に薬物の組成の一部を形成する活性物質、又は治療活性成分若しくは診断上重要な分子を決定する可能性のある候補の直接的又は間接的な標的となる。このようなキナーゼとしては、キナーゼAKT(場合によってはPKBと称する)、ERK、JAK2、BCR-ABL(主にある種の白血病腫瘍細胞中に存在する)、PKA、PKGが挙げられる。結果として、本発明において、キナーゼ又はこのようなキナーゼの基質を形成する細胞内タンパク質が、キナーゼの活性変化の追跡において重要なバイオマーカーとなることが明白であると考えられる。
【００１６】
血小板のVASPタンパク質は、いくつかのこのようなキナーゼ、特にPKA(cAMP依存性プロテインキナーゼ)及びPKG(cGMP依存性プロテインキナーゼ)の基質である。VASPは、血小板細胞骨格の動態調節において中心的な役割を果たし、まさにこの場合には、PKA及び/又はPGKの活性のバイオマーカーと考えられるが、上流で起こっている細胞シグナル伝達カスケード全体のバイオマーカーとも考えられる。
【００１７】
更に、VASPタンパク質のリン酸化が、循環血中の別の分子、ヌクレオチドADPによっても制御される。ADPが血小板受容体P2Y12と相互作用すると、P2Y12が占有され、結果として、生理的アゴニストによって誘発されるVASPタンパク質(血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質)のリン酸化が阻害又は制限される。
【００１８】
VASPリン酸化の阻害又は制限/変更は、リン酸化のアゴニストによって既に誘発されたVASPタンパク質の完全若しくは部分的脱リン酸化、又は前記リン酸化の完全若しくは部分的阻止を含む。
【００１９】
タンパク質AKTは、アミノ酸Ser473(NCBIデータベースにおいて2009年5月22日付バージョンの受託番号NP001014431.1で同定される配列中の473位のセリン)の活性部位のリン酸化状態に酵素発現が直接依存するキナーゼである。AKTはまた、細胞伝達物質(cellular mediator)又は細胞シグナル伝達タンパク質であると考えられる。血小板において、トロンビンによる受容体PAR-1の活性化が、AKTのリン酸化を誘発する。同様に、ADPによる受容体P2Y12の活性化が、アミノ酸Ser473のリン酸化を誘発すると思われる。結果として、セリン473のリン酸化状態は、トロンビン受容体(par1)又はADP受容体P2Y12の状態のバイオマーカーと考えられる。
【００２０】
したがって、血管病態リスクを示す患者又はこのような病態を患っている患者及びまた、このような病態の治療を受けている患者の血液中の血液細胞集団、特に血小板の活性化状態を測定すること、詳細には、血小板活性化プロセスに対する投与活性物質の干渉を評価することが重要である。また、血小板活性化のアゴニスト又はアンタゴニストの設計を目的として候補物質を試験するために、全血からのサンプル中の血小板の活性化状態を、特に血小板受容体との特異的相互作用によって、測定することも重要である。
【００２１】
この目的で、本発明は、血小板において発現される細胞内タンパク質のリン酸化の観察に基づく手段を提供する。
【００２２】
血小板において発現される細胞内タンパク質のリン酸化状態の変更の測定によって血小板の活性化を解析する手段は、先行技術において既に記載されている。Biocytex(マルセイユ、フランス)製のPLT VASP/P2Y12と命名されているキットは、例えば、細胞内タンパク質VASP(血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質)のリン酸化状態の測定によって血小板の活性化状態を測定することからなる、全血サンプルについて実施されるインビトロ試験を行う。この試験においては、2つの試験条件(サンプルの一部分については、プロスタグランジンPGE1を用いてVASPを活性化し、別の部分についてはPGE1及びADPを用いてVASPを活性化する)を比較するために、二色フローサイトメトリーを用いてタンパク質VASPのリン酸化を測定する。解析は、螢光の検出及び血小板反応性指数の算出によって行う。血液の他の細胞群又は細胞片が測定を妨げないように、血小板を含む細胞クラウド(cellular cloud)をサイトグラムにおいて単離することが、フローサイトメトリー解析には必要である。しかし、サイトメトリー解析の実施条件の決定及びその解析の実施は、問題を引き起こすおそれがある。
【００２３】
本発明は、細胞内タンパク質、特に血小板VASPタンパク質のリン酸化状態の全血サイトメリー解析の実施代替手段を提供する。この代替手段に従って、ELISA型免疫酵素試験を用いて解析を実施する。
【００２４】
この目的で、本発明者らは、所定の血小板受容体によって媒介される血小板活性化の特異的測定を実施できる、全血中の血小板の活性化条件及び阻害条件を決定した。
【００２５】
したがって、本発明において、本発明者らは、ELISA解析のシグナルが常に、サンプルの他の成分及び細胞から分離された均一細胞集団又は解析の唯一の標的と検証された均一細胞集団(例えば、培養腫瘍細胞株又は精製リンパ球若しくは血液から単離されたリンパ球)からの受容体の活性化後に測定される生化学的及び細胞原理とは区別される試験を明示した。
【００２６】
したがって、本発明者らは、この必要性を省くことによって、PRP(多血小板血漿)の作製における血小板活性の監視試験の使用を制限する理由を克服できることを明らかにした。
【００２７】
本発明は、細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞内タンパク質(バイオマーカー)のリン酸化状態を測定するステップを含む、全血サンプルに関するELISAの実施による、サンプルの所定の細胞集団の細胞活性化状態のアッセイ方法に関する。
【００２８】
したがって、本発明は、ELISA解析において、全血サンプル、特に血小板中の所定細胞集団において発現される細胞内タンパク質のリン酸化状態を測定するための手段を提供する。血小板の活性化状態のマーカーとしてこのように使用される細胞内タンパク質の1つは、タンパク質VASPである。もう1つのこのようなタンパク質は、タンパク質AKTである。
【００２９】
本出願において、用語「全血サンプル」は、人又は動物対象から採取される血液サンプルに使用し、本発明の方法の実施前にはこのサンプルを分画しない。本発明のアッセイを実施するための血液サンプルの容量は有利なことにわずかであり、例えば、80μL程度であり、2つのアリコート部分に分割される。
【００３０】
血液サンプルを対象から採取する場合には、活性化状態を測定しようとする細胞集団の完全性を、例えばサンプルの撹拌及び熱衝撃を回避することによって、保持できる条件を選択することが重要である。特に、血小板の完全性は保たなければならない。
【００３１】
本発明のELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)試験は、下記段落に記載し且つ実施例中で更に詳述する操作条件を使用する。この試験は、周知のELISA原理に従い、手動で又は自動的に実施できる。この試験は、タンパク質のリン酸化状態の測定のためには定性試験であり、血小板反応性指数を測定する場合には半定量試験であり、又は較正標準の測定を含む場合には定量試験であることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の特定の実施形態において、活性を測定する細胞集団は、血小板集団である。
【００３３】
本発明の特定の実施形態において、リン酸化状態を試験する細胞内タンパク質は、キナーゼファミリーのタンパク質又はキナーゼ基質タンパク質である。
【００３４】
したがって、本発明の方法を用いてリン酸化状態を測定する細胞内タンパク質は、例えば、キナーゼPKA、PKG、AKT、ERK、JAK2、BCR-ABLから選択されるキナーゼの基質タンパク質又はキナーゼ自体から選択される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、リン酸化状態を試験する細胞内タンパク質は、タンパク質VASP又はSTAT5である。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、リン酸化状態を試験できる細胞内タンパク質は、AKT、p38及びERKから選択される。
【００３７】
本発明のELISAアッセイには、リン酸化状態の測定の標的となるバイオマーカータンパク質とこのタンパク質のこのリン酸化状態を特異的に認識する抗体との免疫複合体(immunological complex)を形成することが必要である。対象抗体が対象リン酸化状態の当該タンパク質を認識するが、非リン酸化状態の同一タンパク質をそれほど認識しない場合に、認識を特異的と称する。この抗体はまた、当該リン酸化状態の当該タンパク質を本質的に認識するが、処理されたサンプル中に含まれる他のタンパクをそれほど認識しない。
【００３８】
本発明のELISA試験は、1又は2ステップで実施できる。本発明のELISA試験を2ステップで(既知の標準方式で)実施する場合は、最初に、処理された血液サンプルを、リン酸化状態に関係なく、被験細胞内タンパク質を特異的に認識する抗体(捕捉抗体)と接触させる。次に、捕捉された抗原を、リン酸化された形態になった後の被験細胞内タンパク質を特異的に認識する抗体(可視化抗体(revealing antibody))と接触させることによって、可視化する。
【００３９】
本発明のELISA試験を1ステップで実施する場合は、被験細胞内タンパク質を、ウェル中で捕捉抗体と同時に可視化抗体と接触させる。
【００４０】
リン酸化状態に依存する抗体又はこのリン酸化状態に特異的な抗体は、種々のタンパク質から、例えば、Czernik A Jら(1991)、Methods Enzymol 201:264によって記載された技術を用いて得た。この目的で、動物、例えば、ウサギを、リン酸化タンパク質、又は標的タンパク質中の対象リン酸化部位を構成するアミノ酸配列を示す合成ホスホペプチドで免疫化することができる。これらのペプチドは、エピトープを構成するのに十分でなければならない。これらのペプチドは、例えば、6〜20個、6〜15個、好ましくは6〜10個のアミノ酸残基を含むことができる。好ましくは、作製抗体は、リン酸化タンパク質によって構成される抗原に対して高い親和性及び良好な特異性を有するものから選択される。
【００４１】
リン酸化VASPタンパク質を検出するための抗体、特にモノクローナル抗体の作製については、ヨーロッパ特許EP1042368に記載されており、この特許を参照によって本明細書中に組み入れる。詳細には、この特許において、効果的なモノクローナル抗体は、DSM Collectionに受託番号ACC2330で寄託されているハイブリドーマ16C2(クローン16C2)によって産生される抗体である。この特許EP1042368の実施例1は、リン酸化抗VASP抗体(P-VASP)の回収を記載している。本発明においては、ペプチド配列KLRKVS239KQ又はペプチド配列RKVS239KQEを用いて、他の抗P-VASP抗体を作製できる。抗P-VASP抗体はまた、市販されている。前記抗体の他に、US Biologicalによって供給されるマウスモノクローナル抗体(クローン4i67)又はヤギポリクローナル抗P-VASP(Ser239)抗体(Santa Cruz、sc-23507)などを挙げることができる。
【００４２】
必要ならば、ELISAは、特異性を向上させるために、第1抗体を認識する第2抗体を用いて実施する。
【００４３】
用語「抗体」は、適切な場合には重鎖及び軽鎖の全てを含む抗体、又は標的抗原の認識部位を含むか若しくは標的抗原の認識部位によって構成される抗体のフラグメント、例えば、重鎖によって若しくは重鎖の会合によって構成されるフラグメント、例えば、(Fab’)2フラグメント又はFabフラグメントを意味する。
【００４４】
本発明の特定の実施形態によれば、免疫複合体の形成は、抗体マーカーの基質、例えば、着色基質又は螢光マーカーによって可視化され、光学濃度を測定するためのステップを含む。ペルオキシダーゼなどのマーカーを使用できる。
【００４５】
特に抗体のマーカーがペルオキシダーゼである場合には、光学濃度は、例えば、450nmにおいて測定する。
【００４６】
詳細には、本発明は、セリン239位がリン酸化されているVASPタンパク質などのキナーゼ血小板基質、或いはセリン473位がリン酸化されているAKTタンパク質、チロシン694位がリン酸化されているSTAT5、スレオニン180位若しくはチロシン182位がリン酸化されているp38、又はスレオニン202位若しくはチロシン204位がリン酸化されているERKなどのキナーゼである細胞内タンパク質のリン酸化状態の測定に使用できる。
【００４７】
これらのタンパク質のリン酸化型に対する特異抗体は市販されているか、又は本出願中で言及された方法によって作製できる。
【００４８】
例えば、以下の抗体が入手可能である:
参照番号:9351L PAb(Cell Signaling)、クローンC71E5 MAb(Cell Signaling)、クローンC11C5 MAb(Cell Signaling)で、若しくは参照番号:クローン47 BD、クローン5G4-MCF-7(Nanotools)、クローン14H2(Cell Signaling)、クローンST5P4A9(Zymed)で販売されているウサギ抗p-STAT5(Tyr 694)抗体、又はウサギ抗P-AKT抗体、クローン193H12(Cell Signalingによって販売)。
【００４９】
前記タンパク質の非リン酸化型を認識する抗体(捕捉抗体を構成する)も市販されている:STAT5として挙げられるのは、ウサギ抗体(クローンC-17、Pab Santa Cruz)若しくはマウス抗体(クローン89BD、クローンST5-8F7(Invitrogen)、クローンA-9(Santa Cruz))であり、AKTとしては、ウサギ抗体がCell Signalingによって供給され(クローン193H12)、リン酸化ERKとしては、特異抗体が、例えば、Cell Signaling(参照クローン197G2)、Calbiochem(参照クローン12D4)又はLifespan Biosciences(参照番号LS-C16383)によって販売されている。p38としては、Cell Signalingがまた、参照番号9228、9212、9215などの抗体を提供しており、Santa Cruzが参照番号sc-7972の抗体(p38クローンA-12マウスMab)を提供している。
【００５０】
本発明のELISAを実施するために、患者から採取した血液サンプルを処理して、凝固しないようにする。詳細には、標準的な抗凝血剤、例えば、ヘパリン又はクエン酸三ナトリウム(例えば0.109M又は0.129Mクエン酸三ナトリウム)などのクエン酸ナトリウムを血液サンプルに、抗凝血剤1容量に対して血液9容量の割合で添加して、血液について実施されるインビトロアッセイを実施する。
【００５１】
詳細には、本発明のELISAアッセイ方法は、
a)全血サンプルの1つのアリコート部分を、所定細胞内タンパク質のリン酸化の活性化によって前記サンプルの所定細胞集団の細胞活性に対して作用する第1化合物、有利には生理的化合物によって活性化し、且つもう1つのアリコート部分を前記第1化合物、及び細胞受容体との相互作用の経路を経て又は細胞シグナル伝達酵素との相互作用の経路を経て前記リン酸化を阻害又は変更する第2化合物によって活性化するステップと、
b)活性化サンプルの細胞を、非リン酸化細胞内タンパク質とリン酸化状態の前記タンパク質との平衡を保持できる条件下で溶解させ、前記平衡が前記サンプルの前記所定細胞集団の細胞活性の証拠を示すステップと、
c)溶解生成物を除去するために洗浄するステップと、
d)処理サンプルを、そのリン酸化状態に関係なく細胞内タンパク質を特異的に認識する抗体であって、IgG型の免疫グロブリン又はF(ab’)2若しくはFabフラグメントである抗体を含む捕捉プローブと共にインキュベートするステップと、
e)リン酸化細胞内タンパク質とリン酸化状態の前記細胞内タンパク質を特異的に認識する可視化抗体との免疫複合体の形成を可視化するステップと
の実施を含む。
【００５２】
試薬及びサンプルは有利には、マイクロプレートのウェル中に入れる。試薬及びサンプルは、単一のウェル中に入れ、移動の必要がない。
【００５３】
本発明の特定の実施形態において、前記ステップは、第2化合物がリン酸化状態の阻害若しくは変更に関して検査される物質であって、サンプル採取前に患者に投与されるだけであるか又は前記第1生理的化合物による活性化前に採取された全血サンプルと接触させられる点で、変更されている。
【００５４】
本発明の特定の実施形態において、免疫複合体の形成を可視化するステップの後に、血小板反応性指数(PRI)を算出するステップを行う。PRIは、詳細には、抗体のマーカーの可視化と関連する光学濃度を読み取ることによって免疫複合体が検出される場合に、得ることができる:
【００５５】
【数１】
2012529642.tif 000003
【００５６】
[式中、
C1=第1化合物、例えば、リン酸化活性化剤;
C2=第2化合物、例えば、リン酸化阻害剤]。
【００５７】
アッセイ方法の特定の実施形態において、リン酸化状態が測定する細胞内タンパク質はVASPタンパク質であり、活性化を測定する細胞集団は血小板集団であり、サンプルの1つのアリコート部分は、第1VASPリン酸化アゴニストによって活性化し、サンプルのもう1つのアリコート部分は、同一第1化合物によって、及び更に、被験物質の標的血小板受容体と相互作用して生物活性又は治療活性を生じる第2化合物によって活性化する。
【００５８】
アッセイ方法の別の特定の実施形態において、VASPのリン酸化の生理的アゴニストは、アデニリルシクラーゼを活性化するプロスタグランジン、例えば、PGE1、PGI2、PDG2及びグアニリルシクラーゼを活性化する物質、例えば、NO供与物質(例えば、SNP:ニトロプルシドナトリウム)、又はナトリウム利尿ペプチド(例えば、ANP:動脈ナトリウム利尿ペプチド;BNP:B型ナトリウム利尿ペプチド)から選択される。
【００５９】
特定の実施形態において、リン酸化を阻害又は変更する化合物は、ADPによって刺激される受容体P2Y12などの血小板受容体と相互作用する物質、例えば、クロピドグレル若しくはチクロピジンなどのチエノピリジン、及び/又は細胞シグナル伝達酵素、例えば、アデニリルシクラーゼ、グアニリルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ(例えば、PDE2、PDE3又はPDE5)若しくはキナーゼタンパク質(例えば、PKA又はPKG)と相互作用する物質である。
【００６０】
以下の実施例は、細胞内タンパク質のリン酸化に関して活性を有する物質によって得られた結果を示している。これらの物質は、単独で又は別の生理的化合物(例えば、観察されるシグナル伝達経路がP2Y12を含む場合には、ADP)と併用される場合に、前記第2化合物の代表例である。
【００６１】
本発明の特定の実施形態において、前記ステップの他に、アッセイ方法は、洗浄ステップ後に実施される、サンプルを保存するために、例えば-20℃又は-80℃におい凍結させるステップを含むことができる。本発明者らは、このようにして保存された後のサンプルは、安定性を変化させることなく試験できることを観察した。これは、採取(collection)後2ヶ月を超える期間の凍結による保存後に信頼性の高い結果が得られることを意味する。
【００６２】
本発明者らはまた、サンプリング後48時間までは、血小板の安定性が依然として保たれるので、サンプルは凍結をしなくても試験できることを観察した。
【００６３】
この試験によれば、血小板活性化との相互作用を観察する化合物(被験化合物)は、「第2化合物」に関して前記ステップで示されるように、血液サンプルの採取後に添加する必要はなく、サンプルの採取前に患者に投与されていてもよい。この場合には、前記第2化合物の投与は、被験化合物がリン酸化を含む経路によって直接相互作用する場合には、採取された全血のサンプルについて実施されていなくてもよいし、又は患者に投与される化合物の活性の立証が必要な場合には特に、リン酸化を調節する細胞シグナル伝達経路の生理的化合物の投与からならなくてもよい。
【００６４】
被験化合物が患者に投与された化合物である場合には、本発明の解析は、前記化合物の有効性又は患者の治療抵抗性の程度を測定する目的で行うことができる。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、アッセイは、
・  最終濃度0.02〜2%、好ましくは0.2%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS);
・  最終濃度0.2〜5%、好ましくは2%のTriton X-100(オクチルフェノキシポリエトキシフェノール);
・  最終濃度0.004〜1%、好ましくは0.04%の、活性成分として5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン及び2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンを含む殺菌剤型の広域スペクトル殺菌剤
の混合物又は機能的に同等の混合物を含むか又はそれによって構成される溶解用緩衝液を使用する。
【００６６】
機能的に同等な混合物は、SDSをコレート又はデオキシコレートなどの別の陰イオン洗剤に置き換えることによって、及び/又はTriton X-100をNonidet P-40若しくはTween 80などの別の非イオン洗剤に置き換えることによって調製できる。イオン洗剤及び非イオン洗剤は、5〜0.005%の濃度で使用できる。
【００６７】
本発明の溶解用緩衝液の調製に適した殺菌剤は、ProClin(登録商標)(Rohm and Haas)、ProClin 150又はProClin 300である。これは、微生物の増殖を阻害し且つ細胞死を引き起こすことができる別の広域スペクトル殺菌剤に置き換えることができる。
【００６８】
有利には、ELISAを実施する場合には、インキュベーションステップの全てを周囲温度又は37℃の温度において実施し、溶解ステップを周囲温度又は37℃の温度において1〜30分間、好ましくは10分間実施する。
【００６９】
本発明の他の特徴及び利点は、図及び実施例から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】VASPリン酸化調節経路(カスケード)の簡易図である。
【図２】細胞内タンパク質リン酸化経路との相互作用による血小板活性化に対する種々の活性物質の効果を示すグラフである。
【図３】細胞内タンパク質リン酸化経路との相互作用による血小板活性化に対する種々の活性物質の効果を示すグラフである。
【図４】細胞内タンパク質リン酸化経路との相互作用による血小板活性化に対する種々の活性物質の効果を示すグラフである。
【図５】細胞内タンパク質リン酸化経路との相互作用による血小板活性化に対する種々の活性物質の効果を示すグラフである。
【図６】細胞内タンパク質リン酸化経路との相互作用による血小板活性化に対する種々の活性物質の効果を示すグラフである。
【図７】細胞内タンパク質リン酸化経路との相互作用による血小板活性化に対する種々の活性物質の効果を示すグラフである。
【図８】細胞内タンパク質リン酸化経路との相互作用による血小板活性化に対する種々の活性物質の効果を示すグラフである。
【図９Ａ】処理、溶解及び凍結の前後の血小板安定性試験を示すグラフである。
【図９Ｂ】処理、溶解及び凍結の前後の血小板安定性試験を示すグラフである。
【図１０】処理、溶解及び凍結の前後の血小板安定性試験を示すグラフである。
【図１１】1ステップ又は2ステップで実施したELISAの結果を示すグラフである。
【実施例】
【００７１】
I.VASPリン酸化状態の対するP2Y12受容体の活性化の影響を立証するための、全血ELISA試験におけるVASPタンパク質リン酸化による血小板活性化の解析
血小板中において、VASPのリン酸化(P-VASP)が、機能的ADP受容体(P2Y12)の活性化状態を反映し得ることが十分に確証されているにもかかわらず、P2Y12によって媒介される血小板活性化に対する、全血に含まれる全血液細胞(赤血球+白血球)の溶解の影響は、これまで文献に記載されていない。
【００７２】
詳細には、受容体(例えば、P2Y12)と、バイオマーカーを構成する、リン酸化され得る物質(例えば、VASP)との間のシグナル伝達の全レベルに関与する酵素の、媒体への放出は、バイオマーカー←→リン酸化バイオマーカーの平衡(例えば、VASP←→P-VASP又は任意のシグナル伝達バイオマーカー、例えば、AKT、STAT5、p38、ERKなどの平衡)を場合によっては乱す可能性がある。細胞溶解の作用によって媒体中に遊離されるユビキタス酵素のうち、タンパク質キナーゼ(PKA、PKG)及びホスファターゼが、VASPのリン酸化又はその脱リン酸化に関与する。したがって、これらの酵素の作用が、細胞溶解ステップにおいて平衡(VASP←→P-VASP)を直接変更でき、それによって測定結果の関連性を変え得ることがすぐに予想できる。
【００７３】
したがって、本発明者らはELISA解析を、
1)細胞溶解に同調して媒体中に放出される細胞酵素の活性を固定し;
2)細胞溶解の作用によって遊離されるヌクレオチド(ADP、ATP、AMP、cAMP、GMP、cGMPなど)を無効にする
ように設計した。例えば、赤血球がADPリザーバーであり、細胞活性化、特に血小板に即座に影響を与えることはよく知られている。
【００７４】
本発明者らは、本出願において設計されたELISA解析によって、詳細には以下の例中で示されるように、解析へのこれらの干渉のリスクを克服することができることを観察した。
【００７５】
マイクロウェルプレート操作手順
ADPによって活性化される活性化剤PGE1及び受容体P2Y12の制御下におけるVASPのリン酸化状態のELISA解析のために、以下のステップ及び条件を使用した:
1)クエン酸ナトリウム(0.109M又は0.129M)などの抗凝血剤を含むサンプル管中に血液を採取し;
2a)必要ならば、血小板活性との相互作用が測定される化合物を、全血サンプルを含むウェルの一部に入れ;
2b)マイクロプレートの相当するウェル中に、PGE1又はPGE1+ADP活性化剤(40μL)を入れ;
3)血液(40μL)を加え、次いで出し入れを繰り返すことによって撹拌し;
4)混合物を周囲温度で10分間インキュベートし;
5)活性化血液を含むウェル中に溶解用緩衝液(100μL)を加え、出し入れを繰り返すことによって全体を撹拌し;「ブランク」ウェル中にも溶解用緩衝液(180μL)を入れ;
6)反応媒体を周囲温度で30分間インキュベートし;
7)次いで、プレートを希釈洗浄溶液で3回洗浄し(3×300μL、20倍濃縮として供給);
8)20倍濃縮抗P-VASP抗体を含むペルオキシダーゼプローブを希釈用緩衝液中で希釈し;
9)希釈ペルオキシダーゼプローブを、全てのウェルに入れ(200μL);
10)それを周囲温度で30分間インキュベートし;
11)プレートを希釈洗浄溶液で3回洗浄し(3×300μL、20倍濃縮として供給);
12)次いで、TMB可視化用基質を全てのウェルに入れ(200μL);
13)それを周囲温度で5分間インキュベートし;
14)次いで、全てのウェルに停止液を加え(100μL);
15)プレートを数分間放置し;
16)プレートリーダーを用いてOD450nmを測定し;
17)血小板反応性指数を、下記式:
【００７６】
【数２】
2012529642.tif 000004
【００７７】
を用いて算出した。
【００７８】
前記手順で用いた試薬の組成は、以下の通りであった:
【００７９】
1.ELISAプレート:
immunoGlobe(ドイツ)(http://www.immunoglobe.com)製の総抗VASP F(ab’)2(クローンIE273)がコーティングされたNUNC「Maxisorp」プレート。
【００８０】
2.凍結乾燥PGE1活性化剤:
Carbomer(http://www.carbomer.com)製のプロスタグランジンE1(5μM)
+添加剤。
【００８１】
3.凍結乾燥PGE1+ADP活性化剤:
Carbomer(http://www.carbomer.com)製のプロスタグランジンE1(5μM)(モル濃度は、5pM〜5mMの範囲内で変更可能)
+Sigma(http://www.sigmaaldrich.com)製のADP(20μM)(モル濃度は、5pM〜5mMの範囲内で変更可能)
+添加剤。
【００８２】
4.溶解用緩衝液
・  Triton X-100(Sigma、http://www.sigmaaldrich.com)2%(濃度は0.002〜10%の範囲内で変化可能)
・  SDS(Sigma、http://www.sigmaaldrich.com)0.2%(濃度は0.0002〜10%の範囲内で変更可能)
・  ProClin 300(Sigma, http://www.sigmaaldrich.com)0.4%(濃度は0.000002〜10%の範囲内で変更可能)
を含むPBS緩衝液。
【００８３】
5.20倍洗浄溶液
【００８４】
【表１】
2012529642.tif 000005
【００８５】
最終pH=6.65±0.05
最終濃度:1.14
【００８６】
6.希釈用緩衝液
調製済み希釈用緩衝液(1リットル当たりの量)
NaCl              8.8g
NaH2P04          3.9g
Tween 20          1g
ウシアルブミン      1g
Acid blue 25        12.5mg
proClin            0.5g
pH:目標値7.50(7.30〜7.70)
【００８７】
7.ペルオキシダーゼ20×プローブ
これは、HRPペルオキシダーゼ酵素:Roche(スイス)(http://www.roche-applied-science.com)又はBBI Enzyme(旧Biozyme) (http://www.biozyme.com)から入手可能なペルオキシダーゼ(POD)が結合された、NanoTools(ドイツ)(http://www.nanotools.de)から入手可能な、ヨーロッパ特許EP1042368に記載のマウスモノクローナルリン酸化抗VASP抗体(クローン16C2)であった。
【００８８】
8.TMB
Kem-En-Tec(デンマーク)(http://www.kem-en-tec.com)製の「TMB ONE、調製済み基材」。
【００８９】
9.停止液
H2SO4=0.2M
モル濃度は0.0002〜10Mの範囲内で変化させることができた。
【００９０】
採取したサンプルの解析は、同時に標準サンプルの解析を含むことができた。
【００９１】
II.VASPリン酸化経路の受容体及び/又は酵素に対して作用する物質の影響を評価するための、全血ELISA試験におけるVASPタンパク質リン酸化による血小板活性化の解析
II.1 PDE3阻害試験
糖尿病などの病態に関連した血小板活性化の監視に使用される、ホスホジエステラーゼPDE3に対して活性な活性成分、シロスタゾール(Angilillo、USA)を、ヒト全血について試験した。
【００９２】
全血100μL及び100μ/Lのシロスタゾール希釈溶液を用いた。インキュベーションは37℃において2時間30分実施した。
【００９３】
図4に示される結果は、異なる量のシロスタゾールの存在下におけるVASPのリン酸化状態の変化を示している。
【００９４】
他の分子も同様に試験できる。
【００９５】
II.2 PGE2活性化剤試験のEP3受容体
プロスタグランジンPGE2のEP3受容体に対して作用する活性成分スルプロストンを、ELISA試験を用いて全血について試験した。
【００９６】
全血10μL(FACS)及び40μL(ELISA)並びにスルプロストン希釈溶液10μL(FACS)及び40μL(ELISA)を用いた。インキュベーションは周囲温度において10分間実施した。
【００９７】
VASPリン酸化に対するその効果を図5に示す。
【００９８】
II.3 PGD2受容体活性化剤試験
PGD2のDP1受容体に対して作用する、BW245cと命名されている化合物を、FACS及びELISAを用いて全血について解析した。
【００９９】
全血10μL(FACS)及び40μL(ELISA)並びにBW245c希釈溶液10μL(FACS)及び40μL(ELISA)を用いた。インキュベーションは周囲温度において10分間実施した。
【０１００】
結果を図7に報告する。
【０１０１】
III.VASPリン酸化経路の受容体及び/又は酵素に対して作用する物質の影響を評価するための、全血ELISA試験におけるVASPタンパク質リン酸化による血小板活性化の解析
1)クエン酸ナトリウム(0.109M又は0.129M)などの抗凝血剤を含むサンプル管中に血液を採取し;
2a)必要ならば、血小板活性との相互作用が測定される化合物を、全血サンプルを含むウェルの一部に入れ;
2b)マイクロプレートの相当するウェル中に、PGE1又はPGE1+TRAP14活性化剤(40μL)を入れ;
3)血液を加え(40μL)、次いで出し入れを繰り返すことによって撹拌し;
4)混合物を周囲温度で10分間インキュベートし;
5)活性化血液を含むウェル中に溶解用緩衝液(100μL)を加え、出し入れを繰り返すことによって全体を撹拌し;「ブランク」ウェル中にも溶解用緩衝液(180μL)を入れ;
6)反応媒体を周囲温度で30分間インキュベートし;
7)次いで、プレートを希釈洗浄溶液で3回洗浄した(3×300μL、20倍濃縮として供給)。
【０１０２】
試薬の組成は、項目IIに示されている。
【０１０３】
トロンビン受容体(PAR-1)のTRAP14アゴニストを、一方ではELISAを用いて、他方ではFACSを用いて全血について試験することにより、VASPタンパク質のリン酸化状態に対する間接的な効果を評価した。結果を図6に示す。
【０１０４】
化合物C1(第1化合物)はPGE1であり、化合物C2(第2化合物)はTRAP14であった。
【０１０５】
IV.活性化後(PGE1+ADP+ MRS2395による)の全血サンプルの保存
図9及び10は、PGE1+ADP+MRS2395で処理された全血サンプル(WB)の血小板安定性を、処理後48時間まで、又は溶解とそれに続く凍結後22日間までについて示している。ELISA及びフローサイトメトリーを用いて得られたPRIの結果を示している。
【図１】
2012529642.tif 000006
【図２】
2012529642.tif 000007
【図３】
2012529642.tif 000008
【図４】
2012529642.tif 000009
【図５】
2012529642.tif 000010
【図６】
2012529642.tif 000011
【図７】
2012529642.tif 000012
【図８】
2012529642.tif 000013
【図９Ａ】
2012529642.tif 000014
【図９Ｂ】
2012529642.tif 000015
【図１０】
2012529642.tif 000016
【図１１】
2012529642.tif 000017
【国際調査報告】
2012529642.tif 000018
2012529642.tif 000019
2012529642.tif 000020
2012529642.tif 000021
2012529642.tif 000022
2012529642.tif 000023