(57)【要約】  化学的に定義された培地における未分化のヒト胚幹細胞の培養を支援することができる合成表面は、膨潤性の（メタ）アクリレート層および前記膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役したペプチドを含む。膨潤性の（メタ）アクリレート層は、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートを含む組成物におけるモノマーを重合することによって形成されうる。共役ペプチドは、ＸａａnＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏのアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、ｎは０〜３の整数であり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。さらに、本明細書では、ガンマ線照射により滅菌することができる、膨潤性の（メタ）アクリレート合成表面も開示する。
2012516159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−カルボキシエチルアクリレート、
テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、および、
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートまたは３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムのうちの１つ
を含む組成物から形成される、膨潤性の（メタ）アクリレート層と、
ＸａａnＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏのアミノ酸配列（配列番号：１）を含むペプチドと、
を含む細胞培養製品であって、
Ｘａａは任意のアミノ酸であり；
前記ペプチドが前記膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役しており、
前記細胞培養製品がガンマ線照射によって滅菌されている
ことを特徴とする細胞培養製品。
【請求項２】
前記膨潤性の（メタ）アクリレート層が、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートを含む組成物から形成されることを特徴とする請求項１記載の細胞培養製品。
【請求項３】
未分化の幹細胞を培養する方法であって、
未分化のヒト幹細胞を、請求項２記載の製品の前記ペプチドが共役した膨潤性の（メタ）アクリレート層と接触させ；
前記細胞を細胞培養培地で培養して前記細胞を未分化の状態に維持する、
各工程を有してなる方法。
【請求項４】
請求項１記載の細胞培養製品を製造する方法であって：
前記細胞培養製品の基板表面にモノマーを配置し、ここで、前記モノマーが、
（ｉ）２−カルボキシエチルアクリレート、
（ｉｉ）テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、および
（ｉｉｉ）ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートまたは３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムのうちの１つ
を含み；
前記モノマーを前記基板表面上で重合して膨潤性の（メタ）アクリレート層を形成し；
ＸａａＧｌｙＧｌｙＰｒｏＱｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏ−ＮＨ2（配列番号：１）のアミノ酸配列を含むペプチドを、前記膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役させ、
ガンマ線照射を使用して前記細胞培養製品を滅菌する、
各工程を有してなる方法。
【請求項５】
前記ペプチドを前記膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役させる工程が、
前記膨潤性の（メタ）アクリレート層を、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む組成物と接触させて、活性化した膨潤性の（メタ）アクリレート層を生成し、
前記活性化した膨潤性の（メタ）アクリレート層を前記ペプチドと接触させる
ことを含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、「化学的に定義された培地における未分化の幹細胞の培養のための合成表面（Synthetic Surfaces for Culturing Undifferentiated Stem Cell in Chemically Defined Media）」、という発明の名称で２００８年１月３０日に出願した米国仮特許出願第６１／０６２，８９０号、「幹細胞製品およびスクリーニング(Stem Cell Article and Screening」という発明の名称で２００８年１月３０日に出願した米国仮特許出願第６１／０６２，９３７号、および「化学的に定義された培地で細胞培養するための膨潤性（メタ）アクリレート表面（Swellable (Meth)Acrylate Surfaces for Culturing Cells in Chemically Defined Media）」という発明の名称で２００９年１月３０日に出願した米国特許出願第１２／３６２，９７４号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は細胞培養製品に関し、さらに具体的には、化学的に定義された培地における未分化の幹細胞の培養を支援するための合成表面および製品に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）などの多能性幹細胞は、３つの胚葉のいずれかに分化して、ヒトの体内に成熟細胞型を生じさせる能力を有する。この特異的性質は、糖尿病、脊髄損傷、心臓疾患など、多くの深刻な細胞変性疾患にとって新しい治療法を開発する可能性を提供する。しかしながら、このようなｈＥＳＣ系の治療法の開発には依然として障害が存在する。このような障害には、細胞および組織培養における未分化のｈＥＳＣの適正な数を獲得かつ維持し、特異的細胞型を生み出すためにそれらの分化を調節することが含まれる。ｈＥＳＣ細胞の培養などの幹細胞培養は、典型的には、セル・バンクまたはストックから少数の細胞を播種し、次に、所定の治療用途にとって分化が好ましくなるまで、未分化の状態で増幅させる。これを達成するために、ｈＥＳＣまたはそれらの分化した細胞は、これまで、支持細胞層、ウシ胎仔血清、またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）などの動物由来成分を含む表面または培地の存在下で培養されている。培養環境へのこれらの動物由来成分の添加は、患者にうつる可能性のある、潜在的に有害なウイルスまたは他の感染性因子に細胞を曝露するか、あるいは、ｈＥＳＣの一般的な培養および維持管理を危険にさらす。加えて、このような生物学的製剤は、バッチ変動、免疫応答、および限られた保存寿命に対して脆弱である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
今日まで、未分化の幹細胞の長期培養を支持するための、化学的に定義された培地および合成表面を使用した完全に動物性生産物を含まないシステムは、未だ確認されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施の形態では、本発明の合成表面は、化学的に定義された培地の存在下、５代以上継代するための未分化のヒト胚幹細胞または他の細胞の培養を提供するのに有用でありうる。追加の実施の形態では、本発明の合成表面は、ガンマ線照射およびＥ−ビーム照射を含めた照射法を用いて滅菌可能でありうる。
【０００６】
本発明の実施の形態では、化学的に定義された培地の、ガンマ線照射によって滅菌した合成培養表面上で、未分化のヒト胚幹細胞の個体群を培養する方法が提供される。追加の実施の形態では、単離した未分化のヒト胚幹細胞の培養は、少なくとも５代の継代の間、生存可能でありうる。
【０００７】
細胞培養製品は、表面を有する基板を備える。本発明の実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層が細胞培養基板の表面に配置される。膨潤性の（メタ）アクリレート層は、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートを含む組成物から形成されうる。追加の実施の形態では、ポリペプチドは、膨潤性のアクリレート層に共役しうる。ポリペプチドは、ＸａａnＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏのアミノ酸配列（配列番号：１）を含んで差し支えなく、ここで、ｎは０〜３の整数であり、Ｘａａnは任意のアミノ酸である。実施の形態では、ＸａａnはＬｙｓＧｌｙＧｌｙであってもよい（ＬｙｓＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏ（配列番号：５））。実施の形態では、細胞培養製品は、ガンマ照射の滅菌技術を用いて滅菌可能でありうる。追加の実施の形態では、細胞培養製品は、化学的に定義された培地におけるヒト胚幹細胞などの未分化の幹細胞の培養および維持を支持しうる。
【０００８】
さまざまな実施の形態では、細胞培養製品を製造する方法は、前記細胞培養製品の基板表面にモノマーを配置する工程を有してなる。表面に配されたモノマーは、２−カルボキシエチルアクリレート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、および、次のうちの１つを含む：ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートまたは３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウム。本方法はさらに、モノマーを基板表面上で重合して膨潤性の（メタ）アクリレート層を形成する工程も含む。本方法はまた、ＸａａＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏのアミノ酸配列（配列番号：２）を含むポリペプチドをアクリレート層に共役させる工程も含み、ここでＸａａは任意のアミノ酸でありうる。実施の形態では、ＸａａはＬｙｓＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｕＰｒｏＡｒｇＧｌｙＡｓｐＴｈｒＴｙｒＡｒｇＡｌａＴｙｒ（配列番号：６）である。
【０００９】
本明細書で提示されるさまざまな実施の形態の１つ以上は、幹細胞、特に未分化の幹細胞を培養するための従前の表面に対し、１つ以上の利点を提供する。例えば、合成表面は、動物源から得た、または誘導した成分を有する表面に関する潜在的な汚染問題を低減する。これらの表面はまた、生物学的成分を有する表面と比較して改善された保存寿命も提供しうる。本発明の合成表面の実施の形態は、ｅ−ビームまたはガンマ線照射を含めた照射による滅菌処理に耐えて存続しうる。
【００１０】
追加の実施の形態では、化学的に定義された培地における未分化の幹細胞を培養する能力は、さらに、潜在的な汚染問題も低減する。加えて、恐らくは合成表面および化学的に定義された培地におけるバッチ間変動が少なく、培養結果の再現性および期待値が改善されよう。これらおよび他の利点は、添付の図面とともに読む場合に、以下の詳細な説明から容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の膨潤性の（メタ）アクリレート層の選択される実施の形態の平衡含水率を示すグラフ。
【図２】架橋剤濃度を増大させた本発明の膨潤性の（メタ）アクリレート層の選択される実施の形態の平衡含水率を示すグラフ。
【図３Ａ】合成の膨潤性のアクリレートでコーティングした製品の実施の形態の側面の概略図。
【図３Ｂ】合成の膨潤性のアクリレートでコーティングした製品の実施の形態の側面の概略図。
【図４Ａ】表面をコーティングしていないウェルを有する細胞培養製品の断面の概略図。
【図４Ｂ】表面をコーティングしたウェルを有する細胞培養製品の断面の概略図。
【図４Ｃ】表面および側壁をコーティングしたウェルを有する細胞培養製品の断面の概略図。
【図５Ａ】本発明の合成の膨潤性（メタ）アクリレート・コーティングのある実施の形態でコーティングした６ウェルプレートの写真。
【図５Ｂ】ウェル全体にわたり均一なコーティングを示す、クリスタルバイオレットで染色した６ウェルプレートの２つのウェルの吸光画像。
【図６】本発明のコーティング表面のさまざまな実施の形態における照射滅菌法の効果を示すグラフ。
【図７Ａ】滅菌処理後の本発明のコーティング表面の実施の形態における増殖した細胞の位相差画像。ＳＡＰ−ＢＳＰ表面で増殖した細胞を示している。
【図７Ｂ】滅菌処理後の本発明のコーティング表面の実施の形態における増殖した細胞の位相差画像。ＳＡＰ−ＢＳＰ表面で増殖した細胞を示している。
【図７Ｃ】滅菌処理後の本発明のコーティング表面の実施の形態における増殖した細胞の位相差画像。ＳＡＰ−ＶＮ表面で増殖した細胞を示している。
【図７Ｄ】滅菌処理後の本発明のコーティング表面の実施の形態における増殖した細胞の位相差画像。ＳＡＰ−ＶＮ表面で増殖した細胞を示している。
【図８】本発明のコーティング表面の実施の形態に対する細胞の接着の用量依存性を示すグラフ。
【図９】異なる組成が明らかな培地の存在下、本発明のＳＡＰ表面の実施の形態上で増殖したｈＥＳＣ細胞のＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光発光を示すグラフ。
【図１０】異なる本発明のＳＡＰ表面の実施の形態上で増殖するｈＥＳ細胞のＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光発光（「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」対照のパーセンテージで表す）を示すグラフ。
【図１１】本発明のＳＡＰ表面の実施の形態上で増殖するｈＥＳ細胞の倍加時間を示すグラフ。
【図１２】本発明のＳＡＰ表面の実施の形態上で増殖するｈＥＳ細胞の遺伝子発現のフローサイトメトリーのデータ。
【図１３】「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」対照表面と比較した、本発明のＳＡＰ表面の実施の形態上で増殖するｈＥＳ細胞の蛍光画像。
【図１４】「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」対照表面と比較した、本発明のＳＡＰ表面の実施の形態上で増殖する細胞の画像。
【００１２】
図３〜４に示される図面は、必ずしも一定の縮尺ではない。図３〜４で用いられる同様の数字は同様の要素を称している。しかしながら、所定の図における要素について言及するための数字の使用は、同一の数字で標識された他の図における要素を制限することは意図されていないことが理解されよう。加えて、要素について言及するための異なる数字の使用は、異なる番号が付された要素が同一または同様であり得ないことを意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を構成し、装置、システム、および方法の幾つかの特定の実施の形態の例証の目的で示される、添付の図面について言及する。他の実施の形態も意図されており、それらは本開示の範囲または精神から逸脱することなくなされることも理解されるべきである。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で捉えられるべきではない。
【００１４】
本明細書で用いられるすべての科学および技術用語は、他に特に規定されない限り、当技術分野で通常用いられる意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書で頻繁に用いられるある特定の用語の理解を促進するためのものであって、本開示の範囲を限定することは意味していない。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、用語「または」は、内容が明確に別のことを示唆しない限り、「および／または」を含む意味で一般に用いられる。
【００１６】
本明細書では「有する」、「有している」、「含む」、「含んでいる」、「備える」、「備えている」などの語句は、制約のない意味で用いられ、一般に、「含むが、限定はしない」ことを意味する。
【００１７】
細胞培養表面を説明するために「ヒドロゲル」という用語が用いられている。「ヒドロゲル」は、３０％以上または乾燥重量の１０，０００％までの量の水を吸収することができるゲルまたはゼラチンを含むように、さまざまに定義されている。ヒドロゲルは水分含量に従って分類されている。例えば、ヒドロゲルは３０％以上の水を吸収すると説明されている。ヒドロゲルは水と接触すると膨張するが溶解はしない。「ヒドロゲル」という用語は非常に幅広い用語であり、広範な水膨潤および水吸収特性を有する、広範な材料を説明するものである。
【００１８】
本明細書では「膨潤性の（メタ）アクリレート」または「ＳＡ」とは、少なくとも１種類のエチレン性不飽和モノマー（アクリレートまたはメタクリレートモノマー）から作られる、少なくともある程度の架橋結合を有し、かつ水吸収または水膨潤特性も有するポリマー・マトリクスを意味する。実施の形態では、本発明の膨潤性の（メタ）アクリレートは合成品であって差し支えない。言い換えれば、それらは、動物または動物抽出物に由来する成分を含まない。膨潤性の（メタ）アクリレートの実施の形態は、ペプチドまたはタンパク質と共役しうる（「膨潤性の（メタ）アクリレート−ペプチド」または「ＳＡＰ」）。ペプチドまたはタンパク質を動物由来ではない合成の材料にする遺伝子組換え技術を通じて、ペプチドまたはタンパク質を合成または入手してもよい。このＳＡおよびＳＡＰ材料は、細胞培養に適した表面を表すことを目的として、層、コーティング、表面、材料、または当技術分野で知られている任意の他の用語で呼ばれる場合がある。特定のペプチド配列は、さらに識別されうる。例えば、ＳＡＰ表面は、ビトロネクチンのペプチド配列と共役し、ＳＡＰ−ＶＮとして識別されうる。本発明の実施の形態では、「膨潤性の（メタ）アクリレート」という用語は、水を吸収し、水に膨潤するが、水に溶解はしない、さまざまな架橋結合したアクリレートまたはメタクリレート材料を表す。この水吸収特性は、式１に示す平衡含水率（ＥＷＣ）によって説明および測定することができる：
式１：ＥＷＣ（％）＝（Ｗgel−Ｗdry）／（Ｗgel×１００）
【００１９】
本発明の膨潤性の（メタ）アクリレートの実施の形態のＥＷＣは、水中、５％〜７０％の範囲にあり、ｐＨ依存性でありうる。ＥＷＣはまた、緩衝液（例えばリン酸緩衝液，ｐＨ７．４）などの他の液体に曝露した後に測定することもできる。追加の実施の形態では、本発明のＳＡのＥＷＣ（水中）は、水中、５％〜７０％、５％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜４０％、５％〜３５％、１０％〜３５％、または１５％〜３５％の範囲でありうる。さらなる実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレートがペプチドと共役（ＳＡＰ）した後、本発明のＳＡＰの実施の形態のＥＷＣは、例えば、水中、１０〜４０％でありうる（データ示さず）。
【００２０】
図１は、水に曝露したときのＳＡの実施の形態の選択のＥＷＣの測定結果を例証している。ＥＷＣの測定結果は、水よりもｐＨ７．４の緩衝液で大きかった（データ示さず）。図１で試験したＳＡの成分を表１に示す。ＩＢＡは、陰性対照のイソブチルアクリレートである。図２は、架橋剤のパーセンテージを増加させたＳＡの追加の実施の形態のＥＷＣの測定結果を例証している。図２は、架橋剤のパーセンテージを増加させるにつれて、ＳＡ表面の平衡含水率が低下することを説明している。さらに高度に架橋結合したＳＡ表面は膨潤性が低下し、硬くなる。
【００２１】
細胞培養において、調製した表面を水性環境に曝露する際、表面が水を吸収する度合いは細胞培養表面の性質に影響を及ぼすであろう。例えば、相当量の水を吸収する表面、非常にヒドロゲル様の表面は、水性環境に曝露される場合に、基板から層間剥離する傾向が強いであろう。層間剥離は、ヒドロゲルを細胞培養表面として使用する場合の深刻な問題とされている。一部の研究者は、この層間剥離の問題は、ヒドロゲル構造におけるポリマーの相互侵入網目構造を提供することによって解決できると示唆している（例えば、In Interpenetrating Networks, Xie et al., American Chemical Society, Washington DC, 1 994, Vol. 239, 557を参照）。
【００２２】
本発明の実施の形態では、低いＥＷＣ測定結果を有し、したがって、水を多分には吸収しないＳＡおよびＳＡＰ層は、細胞培養のための材料に適しているであろう。これは、多くの要因に起因しうる。低いＥＷＣを有する表面は、高いＥＷＣを有する表面のように容易に剥離しないであろう。しかしながら、この特性は、細胞培養コーティングを成功に導く多くの特性のうちの１つでありうる。例えば、表面化学におけるわずかな変化、電荷、モジュラス、ＥＷＣ、または表面の疎水性または親水性も、細胞培養表面としての表面の成功に関係する。実施の形態では、４０％未満のＥＷＣを有するＳＡ表面は、培養においてｈＥＳ細胞を支持するのに特に適しているであろう。
【００２３】
本開示は、とりわけ、未分化の幹細胞を培養するための合成表面を有する製品について説明する。表面は、化学的に定義された培地における未分化の幹細胞の増殖および維持を支持しうる。
【００２４】
細胞培養製品
図３Ａを参照すると、細胞を培養するための製品１００の側面の概略図が示されている。製品１００は、表面１５を有する基材基板１０を備える。膨潤性の（メタ）アクリレートまたはＳＡコーティング層２０が、基材１０の表面１５上に配置される。図には示されていないが、ＳＡコーティング２０は、基材１０の一部分に配置されて差し支えないことが理解されよう。基材１０は、細胞の培養に適した任意の材料であって差し支えなく、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーまたはコポリマー、それらの任意の組合せ、または１つの材料の上に別の材料をコーティングしたものなどが挙げられる。基材は、平坦であるか、または成形されていてもよい。このような基材１０としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）・ガラス、バイコールガラス、石英ガラスなどのガラス材料；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（酢酸ビニル−無水マレイン酸共重合体）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フッ化炭素ポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹枝状ポリマーを含めたプラスチックまたはポリマー；ポリ（酢酸ビニル−無水マレイン酸共重合体）、ポリ（スチレン−無水マレイン酸共重合体）、ポリ（エチレン−アクリル酸共重合体）またはこれらの誘導体などの共重合体が挙げられる。
【００２５】
本明細書では「環状オレフィン共重合体」とは、２種類以上のモノマー種から形成されるポリマーであることを意味し、ここで、モノマー種の少なくとも１種類は環状オレフィンモノマーであり、他のモノマー種のうち少なくとも１種類は環状オレフィンモノマー種ではない。多くの実施の形態では、環状オレフィン共重合体は、エチレンおよびノルボルネンモノマーから形成される。環状オレフィン共重合体樹脂は、ＴＯＰＡＳ（登録商標）という商品名でＢｏｅｄｅｋｅｒ Ｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．社から市販されている。
【００２６】
細胞培養に適切な製品１００の例としては、単一ウェルプレートおよび、６、１２、９６、３８４、および１５３６ウェルプレートなどのマルチウェルプレート、広口瓶、ペトリ皿、フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、単一チャンバー化および多重チャンバー化した培養スライドなどのスライド、管、カバーガラス、袋、膜、中空糸、ビーズおよびマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバー、バイオリアクター、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社製）および発酵槽などが挙げられる。
【００２７】
実施の形態では、ＳＡは、アクリレートまたはメタクリレートモノマー、およびアクリレートまたはメタクリレートの架橋剤から重合されうる。「（メタ）アクリレート」という用語は、アクリレートまたはメタクリレート基を含む化合物のことをいう。実施の形態では、（メタ）アクリレートモノマーとして、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−カルボキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコール・メチルエーテルメタクリレート、３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウム内塩およびこれらの混合物が挙げられる。テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートは架橋剤として作用して差し支えない。実施の形態では、ポリペプチドは、架橋剤としてコーティングに導入されない。本発明の代表的な膨潤性の（メタ）アクリレートを表１に示す。
【００２８】
ＳＡコーティング２０は、１つ以上のポリペプチド７０が共役する表面２５を提供する。本明細書では「共役した」とは、共有結合していることを意味する。ポリペプチド７０のＳＡ２０への共有結合は、リンカー８０を通じて生じうる。さまざまな実施の形態では、ＳＡ表面２０として、重合したアクリレートモノマー；すなわち、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートが挙げられる。非常に多くの実施の形態では、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートの比（体積による）は、それぞれ約８０／２０／３（ｖ／ｖ／ｖ）である。非常に多くの実施の形態では、ＳＡは、それぞれ、次のモノマーの液体等分量（体積による）を使用して調合される：ヒドロキシエチルメタクリレート（〜６０から９０）、２−カルボキシエチルアクリレート（〜１０から４０）、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート（〜１から５）。非常に多くの実施の形態では、ＳＡ層２０は、本質的に、重合したヒドロキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートモノマーからなる。さまざまな実施の形態では、ＳＡ層２０は、実質的にポリペプチド架橋剤を含まない。
【００２９】
非常に多くの実施の形態では、ＳＡは、モノマー（液体モノマーの体積または固体モノマーの重量による）を用いて調合される：モノマーＸ（８０）、２−カルボキシエチルアクリレート（２０）、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート（３）。モノマーＸは、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートまたは３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムである。
【００３０】
さまざまな実施の形態では、ポリペプチド７０は、ペプチドまたはポリペプチドを含む。本開示の目的では、ペプチドまたはポリペプチドは、化学的に合成された、または組換え法によって作られたアミノ酸配列である。しかしながら、本開示の目的では、ペプチドまたはポリペプチドはタンパク質の断片であり、完全タンパク質ではない。加えて、ペプチドまたはポリペプチドは、動物源から単離されたものではない。実施の形態では、ポリペプチド７０は、ＸａａnＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏ（配列番号：１）のアミノ酸配列、ビトロネクチンのペプチド配列を含んで差し支えなく、ここで、ｎは０〜３の整数であり、Ｘａａは任意のアミノ酸であってもよく、あるいは、例えばリジンでありうる。Ｘａａのアミノ酸配列は、例えば、ペプチドをＳＡ表面に共役させるためにリジンアミノ酸に官能基を提供する、ＬｙｓＧｌｙＧｌｙまたはＬｙｓＴｙｒＧｌｙの結合配列でありうる。加えて、ペプチドは、安定性を提供し、小さいアミノ酸を開裂から保護するために、アセチル化またはアミド化されうる。追加の実施の形態では、ペプチド７０は、ＸａａＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｕＰｒｏＡｒｇＧｌｙＡｓｐＴｈｒＴｙｒＡｒｇＡｌａＴｙｒ−ＮＨ2のアミノ酸配列（配列番号：２）である、ＢＳＰペプチド配列を含み、ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸であって差し支えなく、あるいは、例えばリジンでありうる。あるいは、実施の形態では、ペプチドは（配列番号：１）と（配列番号：２）の組合せであってもよい。
【００３１】
例えばポリ（エチレングリコール）の繰り返しリンカーまたは任意の他の適切なリンカーなどのリンカーまたはスペーサ８０は、ポリペプチド７０からＳＡ層２０の表面２５までの距離を増大させるのに用いられうる。リンカー８０を介してポリペプチド７０のすべてまたは一部がＳＡ層２０に共役してもよく、あるいは、いずれも共役していなくてもよい。共役基を提供するアクリレート鎖は、共役ペプチドのスペーサとして作用しうる。
【００３２】
ポリペプチド７０は、任意の密度、好ましくは未分化の幹細胞の培養の支持に適した密度でＳＡ層２０に共役し、膨潤性の（メタ）アクリレート−ペプチドまたはＳＡＰ表面を形成してもよい。ポリペプチド７０は、膨潤性の（メタ）アクリレート・コーティング２０の表面２５の約１ｐｍｏｌ／ｍｍ2〜約５０ｐｍｏｌ／ｍｍ2の密度でＳＡ層２０に共役して差し支えなく、これは、表面１５が膨潤性の（メタ）アクリレート層２０によって均一にコーティングされた実施の形態では、コーティングされた基材基板１０の表面１５の領域によって評価することができる。例えば、ポリペプチドは、ＳＡコーティング２０の表面２５に、１ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、５ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、６ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、７ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、８ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、９ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、１０ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、１２ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、１５ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい、または、２０ｐｍｏｌ／ｍｍ2より大きい密度で存在しうる。ポリペプチド７０の存在量は、ＳＡ層２０の組成、ＳＡ層２０の厚さ、およびポリペプチド７０自体の性質に応じて変化しうることが理解されよう。下記実施例で論述するように、ポリペプチド７０の高密度は、化学的に定義された培地における未分化の幹細胞の付着および増殖をさらに良好に支持することができうる。
【００３３】
アクリレートおよびメタクリレートモノマーは、当技術分野で既知のように合成してもよく、あるいは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．社、およびＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．社などの商業的供給業者から入手して差し支えない。ポリペプチド７０は、当技術分野で既知のように合成（または分子生物学的手法を通じて別の方法で製造）して差し支えなく、あるいは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなどの商業的供給業者から入手してもよい。リンカー８０は、当技術分野で既知のように合成して差し支えなく、あるいは、Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｌｔｄ．社から市販される離散ポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ）リンカーなど、商業的供給業者から入手してもよい。
【００３４】
図３Ｂに示すように、基材１０の表面１５とＳＡコーティング２０との間に中間層３０が配置されてもよい。中間層３０は、コーティング２０の基板１０への結合を向上し、モノマーの拡散を促進し、コーティングされていない細胞忌避性の表面１０の部分がコーティングした領域における細胞増殖を促すようにし、モノマーまたは溶媒が基材１０に不適合である場合に、モノマーまたは溶媒と適合する基板を提供し、必要に応じて、例えばパターン印刷などを通じて地形的特徴を提供するように構成される。例えば、基板１０がガラス基板の場合には、ガラス基板の表面をエポキシコーティングまたはシランコーティングを用いて処理することが望ましいであろう。さまざまなポリマー基材１０では、ポリアミド、ポリイミド、ポリプロピレン、ポリエチレン、またはポリ（メタ）アクリレートの中間層３０を提供することが望ましいであろう。図には示していないが、ＳＡコーティング２０は、中間層３０の一部に配置されて差し支えないことが理解されよう。中間層３０は、基材１０の一部に配置されて差し支えないことも理解されよう。
【００３５】
さまざまな実施の形態では、基材１０の表面１５は、表面１５に望ましい特性または特徴を与えるように、物理的または化学的に処理される。例えば、以下に論述するように、表面１５はコロナ放電処理またはプラズマ処理されて差し支えない。真空プラズマまたは大気圧プラズマの例としては、ＲＦプラズマおよび１次および２次の両方のマイクロ波プラズマ、誘電体バリア放電、および、空気、酸素、窒素、アルゴン、二酸化炭素、亜酸化窒素、または水蒸気を含めた分子ガスまたは混合ガス中で発生するコロナ放電が挙げられる。
【００３６】
ＳＡコーティング層２０は、中間層３０または基材１０に配置されるか否かにかかわらず、下地基板を均一にコーティングすることが好ましい。「均一にコーティングする」とは、例えば培養プレートのウェル表面など、層２０の所定の領域が、約５ｎｍ以上の厚さで、その領域を完全にコーティングすることを意味する。実施の形態では、均一にコーティングした表面の厚さは表面上で変化しうるが、下地層（中間層３０または基材１０のいずれか）が曝露される均一にコーティングした表面領域は存在しない。不均一な表面上での細胞応答は、均一な表面上での細胞応答よりも変化し易い傾向にある。
【００３７】
ＳＡＰコーティング層２０は任意の望ましい厚さを有していて差し支えない。さまざまな実施の形態では、コーティング層２０の平均厚さは、約１０マイクロメートル未満である。例えば、平均厚さは、約５マイクロメートル未満、約２マイクロメートル未満、約１マイクロメートル未満、約０．５マイクロメートル未満であって差し支えなく、例えば約０．１マイクロメートルなどである。
【００３８】
ＳＡ層２０を形成するポリマー材料は、任意の適切な度合いに架橋されうる。架橋の度合いが低いと、水への膨潤性の（メタ）アクリレートの部分的または完全な溶解、および低い重合反応効率を生じる結果となりうる。さまざまな実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層２０の架橋密度は約０．９％〜約９％である。
【００３９】
非常に多くの実施の形態において、製品１００は、ペトリ皿、マルチウェルプレート、フラスコ、ビーカー、またはウェルを備えた他の容器など、ウェルを有する細胞培養製品である。図４を参照すると、基材１０から形成される製品１００は、１つ以上のウェル５０を含みうる。ウェル５０は、側壁５５および表面１５を備える。図４Ｂ〜Ｃを参照すると、ペプチド共役した膨潤性の（メタ）アクリレート（ＳＡＰ）コーティング２０は、表面１５または側壁５５またはそれらの一部に配置されうる（もしくは、図１に関して上述したように、１つ以上の中間層３０が表面１５または側壁５５と合成ポリマーコーティング２０の間に配置されてもよい）。図４Ｃに示すように、５５はＳＡＰ層２０でコーティングされてもよい。
【００４０】
さまざまな実施の形態では、製品１００は、面積が約５ｍｍ2を超える表面２５を有する、均一にコーティングされた層２０を備える。胚性幹細胞などの一部の細胞は、細胞のコロニーまたは集団（例えば、直径約０．５ｍｍ）として播種されることから、表面１５の面積が小さすぎる場合には、確実な細胞応答は容易に観察できない可能性があり、定量的な細胞応答を生成するのに十分な数のコロニーの付着を確実にするためには、適正な表面が望ましい。非常に多くの実施の形態では、製品１００は均一にコーティングした表面１５を有するウェル５０を有し、ここで、表面１５は、約０．１ｃｍ2を超える、約０．３ｃｍ2を超える、約０．９ｃｍ2を超える、または約１ｃｍ2を超える、面積を有する。
【００４１】
２．合成ＳＡ層のコーティング
合成のＳＡ層は、任意の既知の方法または今後開発される方法を経て細胞培養製品の表面に配置されて差し支えない。合成のＳＡ層は、典型的な細胞培養条件の間に剥離しない均一層を提供することが好ましい。合成のＳＡ表面は、共有結合性または非共有結合性の相互作用を通じて基材基板に付着させて差し支えない。合成のＳＡ表面を基板と結び付けうる非共有結合性の相互作用の例としては、化学吸着、水素結合、表面の相互浸透、イオン結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用、双極子間相互作用、機械的インターロック、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００４２】
非常に多くの実施の形態では、モノマーは、細胞培養製品の表面に配置され、その場（in situ）重合される。これらの実施の形態では、基材は合成のＳＡ材料を堆積する「基板」と称される。重合は溶液相またはバルク相で行って構わない。
【００４３】
モノマーは粘性でありうることから、表面に堆積させる前に、モノマーを適切な溶媒で希釈して、粘度を低下させることが望ましいであろう。粘度の低下は、形成される合成のＳＡ材料のより薄くさらに均一な層を可能にしうる。溶媒は、細胞培養製品を形成する材料およびモノマーと相溶性であることが好ましい。培養する細胞に対して毒性のない、かつ、重合反応を妨げない溶媒を選択することが望ましいであろう。あるいは、または加えて、実質的に完全に除去できる、または、毒性がない、あるいは重合を妨げない程度まで除去することができる溶媒を選択することが望ましいであろう。こうした状況下では、溶媒は、真空または極めて高温などの厳しい環境を用いずに、容易に除去できることが望ましいであろう。揮発性溶媒は、このような容易に除去できる溶媒の例である。ある程度
本明細書に記載されるようなコーティング製品のためのさまざまな状態に適しうる一部の溶媒として、エタノール、イソプロパノール、アセチルアセテート、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。同時係属出願番号第____________に記載されるように、エタノールは、重合の前に溶媒を除去することが望ましい場合には、特に適切な溶媒でありうる。しかしながら、実施の形態では、アセトン、メタノール、酢酸エチル、ブタノン、アセトニトリル、２−プロパノールおよび２−ブタノールを含めた他の溶媒も適用することができる。
【００４４】
モノマーは、所望の粘度およびモノマー濃度を達成するのに適切な任意の量の溶媒で希釈して差し支えない。一般に、本明細書に提示される教示に従って用いられるモノマー組成物は、約０．１％〜約９９％のモノマーを含有する。例として、モノマーは、約０．１％〜約５０％のモノマー、約０．１体積％〜約１０体積％のモノマー、または約０．１体積％〜約１体積％のモノマーを有する組成物を提供するように、エタノール溶媒または他の溶媒で希釈されうる。モノマーは、ＳＡ層が所望の厚さを達成するように、溶媒で希釈されて差し支えない。上述のように、堆積したモノマーが厚すぎる場合には、不均一な表面を生じる場合があり、コーティングは水性培地と接触した後に剥離する可能性が高いであろう。
【００４５】
さまざまな実施の形態では、合成のＳＡ層は、直接、または１つ以上の追加の中間層（図示せず）を介して、共有結合性または非共有結合性の相互作用を通じて基材に付着させた中間層の表面に堆積される。これらの実施の形態では、中間層は、本明細書では、その上に合成のＳＡ層が堆積する「基板」と称される。
【００４６】
さまざまな実施の形態では、基材の表面は処理される。表面は、基材表面におけるモノマーの拡散などを促進することを目的として、合成のＳＡ層の基材表面への結合を改善するために処理されうる。当然ながら、基材は、中間層に関しても類似目的で処理されうる。さまざまな実施の形態では、表面はプラズマ処理される。このような処理から得られる高い表面エネルギーは、モノマーの拡散および均一なコーティングを促進しうる。
【００４７】
ＳＡ層を形成するモノマーに加えて、層を形成する組成物は、界面活性剤、湿潤剤、光開始剤、熱開始剤、触媒および活性剤などの１つ以上の追加の化合物を含んでもよい。
【００４８】
任意の適切な重合開始剤を使用して差し支えない。当業者は、モノマーと共に使用するのに適した、例えば、ラジカル開始剤またはカチオン開始剤など、適切な開始剤を容易に選択することができよう。さまざまな実施の形態では、フリーラジカルのモノマーを発生させて連鎖重合を開始させるために、紫外線が用いられる。
【００４９】
任意の適切な開始剤を使用して差し支えない。重合開始剤の例としては、有機過酸化物、アゾ化合物、キノン、ニトロソ化合物、ハロゲン化アシル、ヒドラゾン、メルカプト化合物、ピリリウム化合物、イミダゾール、クロロトリアジン、ベンゾイン、ベンゾインアルキルエーテル、ジケトン、フェノン、またはそれらの混合物が挙げられる。適切な市販の、紫外線で活性化および可視光線で活性化される光開始剤の例は、米国ニューヨーク州タリタウン所在のＣｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から市販されるＩＲＧＡＣＵＲＥ６５１、ＩＲＧＡＣＵＲＥ１８４、ＩＲＧＡＣＵＲＥ３６９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ８１９、ＤＡＲＯＣＵＲ４２６５およびＤＡＲＯＣＵＲ１１７３、およびＢＡＳＦ社（米国ノースカロライナ州シャーロット所在）から市販されるＬＵＣＩＲＩＮ ＴＰＯおよびＬＵＣＩＲＩＮ ＴＰＯ−Ｌなどの商品名を有する。
【００５０】
光線感作物質も適切な開始剤系に含めて差し支えない。代表的な光線感作物質は、カルボニル基または第３級アミノ基またはそれらの混合物を有する。カルボニル基を有する光線感作物質としては、ベンゾフェノン、アセトフェノン、ベンジル、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、キサントン、チオキサントン、９，１０−アントラキノン、および他の芳香族ケトンが挙げられる。第３級アミンを有する光線感作物質としては、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、フェニルメチル−エタノールアミン、および安息香酸ジメチルアミノエチルが挙げられる。市販の光線感作物質としては、Ｂｉｄｄｌｅ Ｓａｗｙｅｒ Ｃｏｒｐ．社から市販されるＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＩＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＱＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＰＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＥＰＤが挙げられる。
【００５１】
一般に、光線感作物質または光開始剤系の量は、約０．０１〜１０重量％まで変化させて差し支えない。
【００５２】
カチオン開始剤の例としては、アリールスルホニウム塩などのオニウムカチオンの塩、ならびにイオンアレーン系などの有機金属塩が挙げられる。
【００５３】
モノマーを基板表面に堆積させる前に溶媒で希釈したさまざまな実施の形態では、溶媒は重合前に除去される。溶媒は任意の適切な機構または方法で除去されうる。同時係属出願番号第__________に記載されるように、硬化前に実質的にすべての溶媒を除去することで、硬化速度論および変換したモノマーの量についての良好な調節を可能にすることが判明した。モノマーの変換速度が増大すると、廃棄物の発生および細胞毒性は低減される。これらの方法を用いて得られたＳＡ層は網目構造を形成するが、相互侵入の網目構造ではない。
【００５４】
合成のＳＡ表面を形成するため、モノマーは重合される。バルク相（実質的に溶媒が存在しない）で重合されるか溶媒相で重合されるかにかかわらず、モノマーは、適切な開始機構を経て重合される。このような機構の多くは当技術分野で知られている。例えば、温度を上昇させて、熱開始剤を活性化して差し支えなく、光開始剤を適切な波長の光などに曝露することによって活性化してもよい。非常に多くの実施の形態によれば、モノマーまたはモノマー混合物は、紫外線を使用して硬化させる。硬化は、窒素保護など、不活性ガス保護下で行い、酸素阻害を防ぐことが好ましい。適切な紫外線を、ガス保護と組み合わせることにより、ポリマーの転化を増大させ、コーティングの完全性を確実にし、細胞毒性を低減させうる。
【００５５】
硬化した合成のＳＡ層を溶媒で１回以上洗浄し、未反応のモノマーまたは低分子量ポリマー種などの不純物を除去して構わない。さまざまな実施の形態では、層は、エタノールまたはエタノール水溶液、例えば７０％エタノール、９０％を超えるエタノール、９５％を超えるエタノールまたは約９９％を超えるエタノールで洗浄される。７０％のエタノール溶媒を用いた洗浄は、細胞毒性でありうる不純物を除去する役割だけでなく、細胞を培養する前に表面を滅菌する役割も果たすことができる。
【００５６】
ポリペプチドを、任意の適切な技法によって、重合したＳＡ層に共役させ、ＳＡＰ表面を形成して差し支えない。ポリペプチドは、アミノ末端アミノ酸、カルボキシ末端アミノ酸、または内部アミノ酸を介して、重合したＳＡ層２０に共役されうる。適切な技法の１つは、一般に当技術分野で知られるように、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の化学を包含する。ＥＤＣおよびＮＨＳまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）は、ＳＡ層のカルボキシル基と反応して、アミン反応性のＮＨＳエステルを生成することができる。本発明の実施の形態では、ペプチドと共役するためのカルボキシル基を有するＳＡ層におけるモノマーの導入は重要である。ＥＤＣは、ＳＡ層のカルボキシル基と反応して、加水分解の影響を受けやすいアミン反応性のＯ−アシルイソウレア中間体を生成する。ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの添加は、アミン反応性のＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに転換することにより、アミン−反応性のＯ−アシルイソウレア中間体を安定化し、２段階法を可能にする。ＳＡ層の活性化の後、ポリペプチドを添加し、ポリペプチドの末端アミンをアミン反応性のエステルと反応させて、安定なアミド結合を形成し、したがって、ポリペプチドをＳＡ層に共役させることができる。ＥＤＣ／ＮＨＳの化学を用いてポリペプチド２０をＳＡ層に共役させる場合には、Ｎ−末端アミノ酸は、リジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸などのアミン含有アミノ酸であることが好ましい。当然ながら、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドロキシルなど、任意の許容される求核試薬を使用して差し支えない。
【００５７】
ＥＤＣ／ＮＨＳの化学は、結果的に、ポリペプチド７０の、ＳＡ層２０へのゼロ長の架橋を生じる。末端アミンを有するポリ（エチレングリコール）リンカー（例えば、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｌｔｄ．社から市販される）などのリンカーまたはスペーサをポリペプチド７０のＮ−末端アミノ酸に加えてもよい。Ｎ−末端アミノ酸にリンカーを加える場合、リンカーはＮ−ＰＧ−アミド−ＰＥＧX−酸が好ましく、ここで、ＰＧは、Ｆｍｏｃ基、ＢＯＣ基、ＣＢＺ基またはペプチド合成に従う他の任意の基などの保護基であり、Ｘは、２、４、６、８、１２、２４または任意の他の利用可能な離散ＰＥＧである。
【００５８】
さまざまな実施の形態では、溶液、懸濁液など、１μＭ〜２５００μＭのポリペプチド流体組成物を、活性化したＳＡ層と接触させて、ポリペプチドを共役させる。例えばポリペプチド濃度は、約１００μＭ〜約２０００μＭ、約５００μＭ〜約１５００μＭ、または約１０００μＭでありうる。ポリペプチド組成物の体積および濃度は、ＳＡ層と共役したポリペプチドの所望の密度を達成するように変化させて差し支えないことが理解されよう。一般には、１〜５０ｐｍｏｌ／ｍｍ2のペプチド密度、一部の実施の形態では、３〜８ｐｍｏｌ／ｍｍ2のペプチド密度が、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」などの既知の細胞培養表面に匹敵する表面に提供されうる。
【００５９】
３．合成のＳＡＰ層の滅菌
市販の細胞培養製品は滅菌を必要とする。滅菌は、無菌条件下（無菌製造設備内）での滅菌構成要素のアセンブリまたは最終滅菌、すなわち、アセンブリ後に、紫外線、化学物質（エタノール、エチレンオキシド）または電離放射（ガンマまたは電子）などの滅菌手段への曝露を含めた、さまざまな方法で行うことができる。無菌製造を大規模で行うのは非常に効果であり、汚染問題が継続される傾向にあることから、最終滅菌は、無菌製造よりも望ましい。ガンマ周波数帯域（＞３×１０ １９Ｈｚ）での放射は包装材料を貫通し、周囲温度において、広域に適用されうる。電子線照射は、ガンマよりも高線量の照射を供給することから、数秒から数分以内に完了でき、それによって材料を通過する酸素をより少なくでき、ガンマ処理よりも損傷が少なくて済むであろう。ガンマ照射は、典型的には、包装後に細胞培養容器を滅菌するために用いられる。各方法および製品のバイオバーデンに応じて、細胞培養製品には典型的には１０〜３の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）が期待される。しかしながら、Ｅ−ビームまたはＥＢ処理も利点を有し、本発明の実施の形態では、これらも予定されている。
【００６０】
配列番号：１および配列番号：２などのペプチドは、高分子タンパク質の小区画であり、照射法によって損傷されることが知られている。ほとんどの照射に基づく滅菌法は、これらの小分子の実体の断片化を生じ、それらを生物学的に特異的な細胞付着の促進において無効化する。したがって、ペプチド含有細胞培養表面製品を、商品の正常な流通において、製造、包装、滅菌、保管、および流通させることは困難である。驚くべきことに、本発明の実施の形態では、配列番号：１として識別されるペプチド配列に共役させた膨潤性の（メタ）アクリレート表面は、機能を損失することなく照射滅菌に耐える（図７参照）。本発明の膨潤性の（メタ）アクリレート表面の実施の形態と共役した他のペプチドは、照射滅菌後に機能を失った。
【００６１】
４．合成のＳＡＰ層上での細胞の培養
上述のＳＡＰ層を有する細胞培養製品には、細胞が播種されうる。細胞は、任意の細胞型であって差し支えない。例えば、細胞は、結合組織細胞、上皮および内皮細胞、肝細胞、骨格（skeletal）細胞または平滑筋細胞、心筋細胞、腸細胞、腎細胞、または他の器官に由来する細胞、幹細胞、島細胞、血管細胞、リンパ球、癌細胞などでありうる。細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞でありうるが、細菌性細胞、酵母細胞、または植物細胞などの非哺乳動物細胞であってもよい。
【００６２】
非常に多くの実施の形態では、細胞は幹細胞であり、幹細胞とは、当技術分野で一般に理解されるように、連続的に分割（自己再生）する能力を有し、さまざまな特異性細胞へと分化する能力のある細胞のことをいう。一部の実施の形態では、幹細胞は、被験体の器官または組織から単離されうる、多能性、分化全能性、または多分化性の幹細胞である。このような細胞は、完全に分化したまたは成熟した細胞型を生じる能力がある。幹細胞は、骨髄由来の幹細胞、自己移植のまたはほかの、ニューロン幹細胞、または胚幹細胞でありうる。幹細胞はネスチン陽性であってもよい。幹細胞は造血幹細胞であってもよい。幹細胞は、上皮組織および脂肪組織、臍帯血、肝臓、脳または他の器官に由来する多系列（multi- lineage）細胞でありうる。さまざまな実施の形態では、幹細胞は、哺乳動物から単離された多能性の胚幹細胞などの多能性幹細胞である。適切な哺乳動物としては、マウスまたはラットなどの齧歯動物、ヒトおよびヒト以外の霊長類を含めた霊長類が挙げられる。これらの細胞は、細胞療法、組織修復、薬剤開発、および、発生生物学の研究における用途を有する。これらの細胞系の多くは、分化を阻害するためにマウスまたはヒト支持細胞の利用を必要とする。「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」（米国ニュージャージー州フランクリンレイクス所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販される、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび他のタンパク質の混合物を含む、マウス肉腫に由来する市販製品）などの腫瘍抽出マトリクスが利用可能である。
【００６３】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、未分化の状態で、培養における継続的に増殖する能力を有することから、本発明に使用するためのｈＥＳＣは、確立された細胞系から入手して差し支えない。確立されているヒト胚性幹細胞系の例としては、限定はしないが、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３またはＨ１４（ウィスコンシン大学によって確立されたＷｉＣｅｌｌから入手可能）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．社（米国ジョージア州アセンズ所在））；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．社（シンガポール所在））；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（カリフォルニア大学（米国カリフォルニア州サンフランシスコ所在））；Ｉ３、Ｉ３．２、Ｉ３．３、Ｉ４、Ｉ６、Ｉ６．２、Ｊ３、Ｊ３．２（テクニオン−イスラエル工科大学（イスラエル国ハイファ所在））；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｃｅｖら，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．８３（５）：１５１７−２９，２００５）；細胞系ＨＵＥＳ１−１７（Ｃｏｗａｎら，ＮＥＪＭ ３５０（１３）：１３５３−５６，２００４）；および細胞系ＡＣＴ−１４（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら，Ｌａｎｃｅｔ，３６５（９４７１）：１６３６−４１，２００５）が挙げられる。本発明に用いられる胚幹細胞はまた、初期胚組織から直接入手して差し支えない。典型的には、これは、インビトロで凍結した、そうでなければ廃棄されるであろう胚盤胞期の受精卵を使用して行われる。
【００６４】
多能性幹細胞の他の起源としては、誘発した霊長類の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。ｉＰＳ細胞とは、それらがｈＥＳＣなどの多能性幹細胞の表現型を獲得するように再プログラミングされるように、例えば、１つ以上の適切なベクターを用いてトランスフェクションすることにより遺伝子操作された、ヒトなどの幼若期または成熟期の哺乳動物から入手される細胞のことをいう。これらの再プログラミングされた細胞によって獲得される表現型形質としては、形態が類似した、胚盤胞から単離される幹細胞、ならびに、表面抗原発現、遺伝子発現およびテロメラーゼ活性が類似した、胚盤胞由来の胚幹細胞が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、典型的には、初期胚葉、すなわち外胚葉、内胚葉および中胚葉のそれぞれから少なくとも１種類の細胞型へと分化する能力を有する。ｈＥＳＣのようなｉＰＳ細胞はまた、例えばＳＣＩＤマウスなどの免疫不全マウスに注入すると奇形腫を形成する（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，（２００７）Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１；Ｙｕら，（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：５８５８）。
【００６５】
胚幹細胞（ＥＳＣ）およびヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）を含めた幹細胞は、特に未分化の多能性の状態においては、培養するのが困難である。これらの細胞を培養において調節し、未分化の状態に維持し、その後、信頼できる、再現可能な方法で分化に導くことは困難であった。幹細胞は、培養において生存するために、細胞培養表面（例えば、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」）内または上、または培地（例えば血清または馴化培地）、またはその両方に、天然由来成分を必要とした。しばしば、培養において、自然発生的な分化が生じるが、これは、恐らくは可溶性因子、細胞間接触、および／または細胞−基質間のシグナル伝達からもたらされる。これらの細胞が動物起源の因子の存在下で培養される場合には、これらの因子のすべては予測不可能であり、培養における予測および制御が困難になる。天然起源に由来するタンパク質製品は、バッチ間に組成および機能の差異が見られる、バッチ変動性を示す。例えば、異種生成物へのＥＳＣまたはｈＥＳＣの曝露は、偶発性の感染性因子による汚染の危険性を取り込んでしまう。さらには、動物由来の基板または血清製品を用いて培養したＥＳＣは、ｎｅｕ５Ｇｃ（非ヒトシアル酸）を取り込み、発現し、それによって、移植における免疫反応の重大な危険性を及ぼしうる。定義された培地における未分化の幹細胞の培養を可能にする、幹細胞培養のための純粋な合成表面が望まれている。
【００６６】
細胞を播種する前に、細胞を採取し、増殖培地などの適切な培地に懸濁して差し支えなく、ここで、細胞は、表面に播種された後に培養される。例えば、細胞は、血清含有培地、馴化培地、または化学的に定義された培地に懸濁され、培養されうる。本明細書では「化学的に定義された培地」とは、未知の組成物の構成成分を含まない、細胞培地を意味する。化学的に定義された培地は、さまざまな実施の形態において、未知の組成物のタンパク質、加水分解物、またはペプチドを含まないであろう。本発明の実施の形態では、化学的に定義された培地は、動物由来の原料を含まない。ウシ胎仔血清などの定義されていない動物由来の原料、「馴化」培地に認められるような細胞抽出物、またはウシ血清アルブミンなどの動物由来の原料は、本発明の実施の形態では、化学的に定義された培地の許容される構成成分ではない。一部の実施の形態では、化学的に定義された培地は、既知の組成のポリペプチドまたはタンパク質を含む。これらのポリペプチドまたはタンパク質は合成または遺伝子組み換えでありうる。例えば、化学的に定義された培地は、遺伝子組み換え成長ホルモンを含んでもよい。化学的に定義された培地のすべての構成成分は既知の化学構造を有し、既知量で培地に導入されることから、培養条件の変動性を低減し、したがって細胞応答を低減することができ、再現性を向上させる。加えて、定義されていない構成成分、および動物由来の構成成分に由来する汚染の可能性が排除される。さらには、少なくともある程度は、上述の要因に起因して、規模拡大の能力を容易に発揮できるようになる。例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国９２００８カリフォルニア州カールズバッド、１６００Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ所在，ＰＯ Ｂｏｘ ６４８２））から市販される化学的に定義された細胞培地、ヒト胚性幹細胞の増殖および拡大のために特別に調合された完全に血清およびフィーダーを含まない培地（ＳＦＭ）、およびヒト胚性幹細胞のためのｍＴｅＳＲ（商標）１維持培地としてＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社から市販されているものがある。
【００６７】
１つ以上の増殖因子または他の因子を、細胞を合成のＳＡＰ層と共にインキュベートする培地に加えてもよい。因子は、細胞の増殖、付着、自己再生、分化などを促進しうる。培地に添加してよい、または含まれていて差し支えない因子の例としては、筋肉形態形成因子（ＭＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、アクチビン（ＡＣＴ）、造血成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）、インターフェロン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの線維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ペプチド増殖因子、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、腫瘍壊死因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、形質転換増殖因子−β１（ＴＧＦβ１）などの形質転換増殖因子、およびコロニー刺激因子が挙げられる。
【００６８】
細胞は、任意の適切な濃度で播種して差し支えない。典型的には、細胞は、基板に、約１０，０００細胞／ｃｍ2〜約５００，０００細胞／ｃｍ2の濃度で播種される。例えば、細胞は、基板に、約５０，０００細胞／ｃｍ2〜約１５０，０００細胞／ｃｍ2の濃度で播種されうる。しかしながら、これより高い濃度および低い濃度も簡便に用いて差し支えない。培養時間および、温度、ＣＯ2およびＯ2レベル、増殖培地などの条件は、培養される細胞の性質によって決まり、容易に変更することができる。細胞を表面上でインキュベートする時間量は、所望の細胞応答に応じて変動しうる。
【００６９】
培養細胞は、（ｉ）調査研究または治療用途の開発用に、化学的に定義された培地において合成表面上で培養した十分な量の未分化の幹細胞を得ること、（ｉｉ）培養における細胞の調査研究のため、（ｉｉｉ）治療用途の開発、（ｉｖ）治療目的、（ｖ）ｃＤＮＡライブラリを創出することによる遺伝子発現研究、および（ｖｉ）薬物および毒性スクリーニング研究を含めた、任意の適切な目的に使用されうる。
【００７０】
以下に、上述の製品および方法のさまざまな実施の形態を説明する、非限定的な例を提示する。
【実施例】
【００７１】
実施例１：化学的に定義された培地における未分化のヒト胚幹細胞を培養するための合成表面の識別
１．コーティングの調製−９６ウェルプレート
親水性モノマー、カルボキシル基含有モノマー、および架橋モノマーを含む、ＵＶ硬化性モノマーからＳＡコーティング表面を調製した。表１は、本発明の実施の形態で使用した膨潤性の（メタ）アクリレートモノマーを示している。
【表１】
2012516159.tif 000003
【００７２】
簡潔に言えば、モノマーをエタノールで０．１体積％の濃度まで希釈し、Ｄｕｒｏｃｕｒ１１７３（３％体積／モノマー体積）およびＩＲＧＡＣＵＲＥ８１９（０．１％体積／モノマー体積）の光開始剤を加えた。希釈したモノマー配合物を、プラズマ処理された適切な寸法の細胞培養容器形式（例えば９６または６ウェルプレート）の環状オレフィン共重合体（Ｃｏｒｎｉｎｇ社のライフサイエンス開発グループ提供）に加えた。適正な量の混合物を加えて、適正な厚さのコーティングを形成した。例えば、２μｍ未満のコーティングの厚さは、共役反応および細胞培養アッセイの間のコーティングの安定性に役立つ。例えば、ＢｉｏＴｅｋ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、２μＬ〜５μＬの体積を９６ウェルプレートに加え、適切なコーティングの厚さを形成した。
【００７３】
各ウェル（一部のウェルを陽性対照として「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」でコーティングした）に、所定の膨潤性の（メタ）アクリレート配合物を入れた。別に記載されない限り、得られたＳＡコーティングは約０．１マイクロメートルの平均厚さを有していた。ＳＡ配合物でコーティングしたウェルでは、室温で３時間、ドラフト内で蒸発させることによってエタノール溶媒を除去した。溶媒を除去した後、１３ｍＷ／ｃｍ2パルス（１００Ｈｚ）の紫外線（Ｘｅｎｏｎ ＲＣ−８０１）で１分間、Ｎ2パージボックス（溶融シリカ窓付き）内で、コーティングを硬化させた。
【００７４】
２．コーティングの調製−大型表面
ペプチド・アクリレートコーティングの合成のための配合物および一般の方法（上述した）は、すべての形式に対して普遍的である。これらの配合物を６ウェルプレートおよびＴ−７５フラスコなどの大型の細胞培養表面に施用するため、スピンコーティング法を使用した。このスピンコーティング法は、粘性の物質を表面に施用可能にした。例えば、実施の形態では、分配方法は、モノマーの溶液を溶媒に希釈して、分配した液体が表面上に分散可能にすることを必要とする。分配方法では、９９％エタノール溶液で希釈した１％のモノマー溶液が適切な希釈でありうる。しかしながら、実施の形態では、スピンコーティング法は、溶媒中、０．１％〜９９．９％のモノマー範囲で表面に施用可能にする。実施の形態では、スピンコーティング法を使用して、エタノールキャリア溶媒中のアクリレートモノマーのパーセンテージを変動させて、幅広い、所望のコーティングの厚さを達成することができる。加えて、スピンコーティングは、これらのコーティングを、６ウェルプレート、Ｔ１７５フラスコまたはより大きいフラスコ形態を含めた、より大型の表面に施用可能にする。層間剥離、空洞部分または他の欠陥に関して、欠陥のない均一なコーティングを施すため、回転速度および回転時間のパラメータを調節して、これらのコーティングの再現可能な施用を確実にした。
【００７５】
Ｚｅｎｏｒ ＺＦ−１６−１８８膜（Ｚｅｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を、１３秒間、Ｏ2マイクロ波プラズマ下に置いた（Ｐｌａｓｍａｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）。処理後、薄膜をスピンコーティングの心棒の真空の多孔質チャックに組み込んだ。次に、チャックをＬａｕｒｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のスピンコーター（ＷＳ６５０−１５ＮＰＰ／ＡＳ／１０Ｋ）に装着した。約３ｍｌのアクリレート配合物を手動で薄膜上に塗布した。表３は、コーティングを５インチ（１２．７ｃｍ）×５インチ（１２．７ｃｍ）の膜上に均一に広げることができるようにするために用いたパラメータを示している。アクリレート配合物を膜に施用し、溶媒を蒸発させた後、膜をＵＶチャンバーに入れ、窒素パージし、１分間硬化させた。次いでスピンコーティングした膜を６ウェルプレートおよびＴ−７５フラスコ内に積層した（インモールドラベリング法による）。
【表２】
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【００７６】
３．膨潤性の（メタ）アクリレート表面へのポリペプチド共役
上述のように調整した膨潤性の（メタ）アクリレートコーティングに対するポリペプチド共役の評価用に設計した一連の実験では、ポリペプチド（ＡｒｇＧｌｙＧｌｙＳｅｒＡｓｐＰｒｏＩｌｅＴｙｒＬｙｓ（配列番号：３）／Ｒｈｏｄ−ＧｌｙＡｒｇＧｌｙＡｓｐＳｅｒＰｒｏＩｌｅＩｌｅＬｙｓ（配列番号：４））を、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の化学を用いて、配合ＳＡ０２の膨潤性の（メタ）アクリレート・コーティングに共役させた（表１および２参照）。簡潔に言えば、ＤＭＦ中、５０μＬの０．１ＭのＥＤＣおよび０．０５ＭのＮＨＳ溶液を、膨潤性の（メタ）アクリレート配合物でコーティングした９６−ウェル環状オレフィンプレートのウェル内に分配した。カルボキシル基の活性化を１〜１．５時間行い、次に、活性化溶液を吸引した。その後すぐに、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、５０μＬのポリペプチド溶液をウェル内に分配し、ウェル表面のＮＨＳエステルとペプチドの第１級アミン基との反応を、周囲条件下で１．５時間行った。次に、ペプチド溶液を吸引した。ペプチド共役の後、コーティング上の残りのＮＨＳエステルを１Ｍ、ｐＨ８．１のエタノールアミンまたはアミノプロピルモルホリン溶液でブロックし、ウェルを、リン酸緩衝液、１％のＳＤＳ溶液、最後に脱イオン水で洗浄した。Ｔｅｃａｎマイクロアレイスキャナ（Tecan microarray scanner）を用いて蛍光発光を定量した。もう１つの方法として、ポリペプチドを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されるＱｕａｎｔｉＰｒｏ ＢＣＡアッセイキットを用いて定量した。ペプチド溶液は、１０００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、または０μＭの合計ペプチドを含んでいた。
【表３】
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【００７７】
コーティングの均一性を示すため、ＳＡＰコーティングしたプレート（スピンコーティングした）を、水中、室温で２分間、１：５希釈したグラムクリスタルバイオレット染料（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製、カタログ番号２１２５２５）で染色した。インキュベーション後、表面を脱イオン水で３回すすいだ。プレート・リーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ３ １４２０マルチチャネルカウンター）上で５７０ｎｍにおける吸光度を得た。図５Ａは、本発明の合成の膨潤性（メタ）アクリレート・コーティングの実施の形態でコーティングした、クリスタルバイオレットで染色した６ウェルプレートの写真である（ペプチド共役前）。図５Ｂは、ウェル上の均一なコーティングを示す、クリスタルバイオレットで染色した６ウェルプレートの２つのウェルの吸光画像である。
【００７８】
４．滅菌
空気の不存在下、スピンコーティングしたＳＡＰプレート（６ウェルプレート）をアルミニウムパウチで包装した。包装したプレートを、室温で箱に入れるか、またはドライアイスの層の上に置いた。次に、包装プレートを、滅菌サービス業者（米国ニューヨーク州チェスター所在のガンマ滅菌ＳＴＥＲＩＳ、米国イリノイ州リバティービル所在のｅ−ビーム滅菌ＳＴＥＲＩＳ）に送った。図６は、本発明のＳＡＰ表面の実施の形態についての細胞応答における、エタノール滅菌と比較した、ガンマおよびｅ−ビーム照射滅菌処理の効果を例証するグラフである。低Ｇおよび高Ｇは、それぞれ、低線量（１０〜１５ｋＧｙ）または高線量（１５〜２５ｋＧｙ）のガンマ照射処理した基板を表す。低ＥＢおよび高ＥＢは、それぞれ、低（１５〜２５ｋＧｙ）または高（２５〜４０ｋＧｙ）線量の電子ビーム照射で処理した基板を表している。ＲＴおよびＤＩは、それぞれ、室温で、またはドライアイス上で保管したサンプルを表している。「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」をコーティングしたプレートに加えて、使用直前に７０％エタノール（ＥｔＯＨ）を用いて滅菌した膨潤性の（メタ）アクリレートでコーティングしたプレートも、滅菌の効果を評価するための対照として使用した。
【００７９】
滅菌したサンプルを、４または５日間の培養後に、Ｈ７ ｈＥＳ細胞接着および増殖について評価した。自動細胞カウンターＷｉＣｅｌｌを使用して、細胞数を確立した。図６は、ペプチドがＢＳＰ配列（ＳＡＰ−ＢＳＰ）（配列番号：２または配列番号：６）、および、ペプチドがビトロネクチン（ＶＮ）配列（ＳＡＰ−ＶＮ）（配列番号：１または配列番号：５）であるＳＡＰ表面（表１におけるＳＡ０２）を例証している。ＳＡＰ表面は、ＥｔＯＨ滅菌後のＨ７ ｈＥＳ細胞の接着および増殖に適した表面を提供したが、ＳＡＰ−ＶＮ表面は、室温（ＲＴ）で、およびドライアイス（ＤＩ）上で処理した場合に、低および高ｅ−ビーム（ＥＢ）およびガンマ（Ｇ）滅菌処理後に接着特性を保持していた。ＳＡＰ−ＢＳＰ表面は滅菌処理によって損傷した。
【００８０】
図７Ａ〜Ｄは、ガンマ滅菌したＳＡＰ ＢＳＰまたはＶＮ表面上で５日間培養した細胞の光学顕微鏡写真を示している。図７Ａは、１０〜１８ｋＧｙのガンマ線照射滅菌処理（室温）後にＢＳＰペプチド配列（配列番号：２または配列番号：６）と共役したＳＡＰ表面上で増殖した細胞を示している。図７Ｂは、１５〜２５ｋＧｙのガンマ線照射滅菌処理（室温）後にＢＳＰペプチド配列（配列番号：２または配列番号：６）と共役したＳＡＰ表面上で増殖した細胞を示している。図７Ｃは、１０〜１８ｋＧｙのガンマ線照射滅菌処理（室温）後にＶＮペプチド配列（配列番号：１または配列番号：５）と共役したＳＡＰ表面上で増殖した細胞を示している。図７Ｄは、１５〜２５ｋＧｙのガンマ線照射滅菌処理（室温）後にＶＮペプチド配列（配列番号：１または配列番号：５）と共役したＳＡＰ表面上で増殖した細胞を示している。細胞数の低減がＢＳＰ共役表面上でのみ観察されたことからも分かるように、ＢＳＰ共役コーティングは、ガンマおよびＥ−ビーム法に対し、より感受性であった（図６）。ＢＳＰ共役アクリレート表面における細胞数の低減は、非常に嚢胞性の細胞コロニー形態とも関連していた（図７）。このコロニー形態における変化は、未分化のｈＥＳ細胞の細胞表面マーカーの損失に関係しているかもしれない。
【００８１】
５．ＳＷＡＰ表面におけるＨＴ１０８０細胞の接着
細胞の接着および増殖を支持するＶＮ共役アクリレート表面（配列番号：１または配列番号：５）の能力を評価するため、ＨＴ１０８０細胞を用いて接着アッセイを行った。簡潔に言えば、対照ウェルを、室温で１時間、フィブロネクチン（ＦＮ、５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）でコーティングした。すべてのウェルを、３７℃で１時間、ＰＢＳ中、１％のＢＳＡを用いてブロックした。簡潔に言えば、ウェルをＰＢＳで洗浄し、細胞の播種前にＩＭＤＭ中０．１％のＢＳＡを用いてインキュベーションした。ＨＴ−１０８０ヒト線維肉腫細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１２１）を、１０％のＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ社製）を含むＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ社製）において、標準的な細胞培養条件で９０％の密集度まで増殖させた。細胞をトリプシン化し、１０％のＦＢＳを含むＩＭＤＭにおいて、３７℃、５％ＣＯ2下で３０分間、回収した。回収後、細胞を洗浄し、ＩＭＤＭ中０．１％のＢＳＡに再懸濁し、ペプチド共役したアクリレートでコーティングしたプレート、およびＦＮでコーティングした対照ウェルに、３０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。標準的な細胞培養条件で１時間、細胞接着を生じさせた。培地をウェルから吸引し、付着細胞を固定し、室温で８分間、２０％メタノール中、０．２％クリスタルバイオレット５０μＬで染色した。５７０ｎｍにおける吸光測定の前に、５分間、Ｈ2Ｏ中、１％のＳＤＳの添加を通じて、クリスタルバイオレットの細胞吸収を定量した。
【００８２】
図８は、ペプチドがさまざまな濃度で存在するフィブロネクチンタンパク質（ＦＮ）またはビトロネクチン配列（配列番号：１または配列番号：５）であるＳＡＰ−ＶＮ表面におけるＨＴ１０８０細胞の接着を例証するグラフである。フィブロネクチンでコーティングしたウェルを陽性対照とした。図８は、ＨＴ１０８０細胞が、濃度依存性の方式で本発明のＳＡＰ表面の実施の形態に付着することを例証している。
【００８３】
６．増殖培地
本発明のＳＡＰ表面の実施の形態を、幾つかの市販の化学的に定義された培地の存在下で幹細胞の生存能力について試験した。図９は、８０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号２３４−ＦＳＥ／ＣＦ）および０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号２４０ｂ）を補充した組成の明らかなＸ−Ｖｉｖｏ−１０培地（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．社（米国カリフォルニア州メンロパーク所在）製，（Ｌｏｎｚａ，カタログ番号０４−７４３Ｑ））の存在下、ＸａａnＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏ（配列番号：１）（ＶＮ）ＳＡＰ（ＳＡＰ−ＶＮ）、ＸａａＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｕＰｒｏＡｒｇＧｌｙＡｓｐＴｈｒＴｙｒＡｒｇＡｌａＴｙｒ（配列番号：２）（ＢＳＰ）（ＳＡＰ−ＢＳＰ）および対照「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」の各表面上で４８時間培養後のＨ７ ｈＥＳ細胞から得た、ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光発光（「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」のパーセンテージで表す）測定の比較を示すグラフである。ｍＴｅＳＲ−１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）およびＳＲ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールズバッド所在）製）。ＳＲ培地は、ＫＯ−ＤＭＥＭ、２０％のＫＯ−ＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号１０８２８）、１ｍＭのＬ−グルタミン酸、１％のＮＥＡＡ、０．１ｍＭの２−ＭＥならびに８０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦおよび０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦｂ１からなる。図９は、複数の合成培地を使用したＨ７細胞培養性能の比較を示している。
【００８４】
細胞を、標準的な細胞培養条件（３７℃、５％ＣＯ2）下、９６ウェルプレートで４８時間培養し、ＡｔｔｏＰｈｏｓアッセイ（または上述の他のアッセイ）を行った。合成表面での長期培養の間、ｈＥＳＣを、少なくとも１０代以上の連続した継代の期間、８０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号２３４−ＦＳＥ／ＣＦ）および０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号２４０ｂ）を補充した化学的に定義された培地であるＸ−Ｖｉｖｏ−１０（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．社（米国カリフォルニア州メンロパーク所在）製、Ｌｏｎｚａ社から市販、カタログ番号０４−７４３Ｑ））において、６ウェルプレートにおける上記表面で培養した。細胞は、典型的には、酵素による継代培養手法（コラゲナーゼＩＶ処理）を使用して４〜５日毎に継代し（約７５％の密集度）、その後、ＤＰＢＳで洗浄し、剥離して、化学的に定義された培地に再懸濁した。「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」表面と並行して培養した細胞に関する細胞コロニー形態、細胞数、生存能力およびｈＥＳＣ特異的マーカー発現プロファイルを各継代において評価した（後述する）。
【００８５】
７．Ｈ７ ｈＥＳＣ細胞増殖アッセイ
ｈＥＳ細胞接着および増殖を可能にするこれらの共役法を用いて、これらの膨潤性の（メタ）アクリレートに共役させたポリペプチドの能力を評価するため、ＳＡＰ表面上にさまざまなペプチド密度を生じさせるために、インプットペプチド濃度を０〜１０００マイクロモルまで変化させて、ＳＡＰ−ＶＮ表面を調製した。これらの表面をＳＡＰ−ＢＳＰ表面と比較した。両方のペプチド配列を、８０％のヒドロキシエチルメタクリレート、２０％の２−カルボキシエチルアクリレートおよび３％のテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートを有する膨潤性の（メタ）アクリレートＳＡ０２に共役させ（上述のように）、ＥｔＯＨを用いて表面を滅菌した。実験プレートは、７０％ＥＴＯＨを噴霧することによって滅菌し、ラミナーフード（laminar hood）内で乾燥させ、２００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で５回洗浄した。Ｈ７ ｈＥＳ細胞を、８０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号２３４−ＦＳＥ／ＣＦ）および０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号２４０Ｂ）を補充した化学的組成の明らかなＸｖｉｖｏ培地（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．社製）において、これらの表面で４８時間培養した。次に、細胞を固定し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のアッセイ（カタログ番号Ｓ１０００）を使用してＡｔｔｏＰｈｏｓ活性について処理し、未分化のｈＥＳ細胞の既知のマーカーであるアルカリホスファターゼ活性を測定した。
【００８６】
ＡｔｔｏＰｈｏｓスクリーニングを次のように行った。簡潔に言えば、培養時間の終了時に、細胞を１５０μｌのＤＰＢＳですすぎ、４％のパラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した（９６ウェルプレートの１ウェルあたり７０μｌ／ウェル）。細胞を１５０μｌのＤＰＢＳで１回洗浄し、遮光してアルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）（ＤＰＢＳで１：３希釈した）について１００μｌのＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基板を用いて１０分間処理した。Ｖｉｃｔｏｒ３マイクロプレート・リーダー（Ｐｅｒｋｌｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、４８５／５３５ｎｍにおけるＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度を得た。実験表面のＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度を「ＭＡＴＲＩＧＥＬ」対照のパーセンテージとして表した。
【００８７】
すべてのスクリーニングされた表面における細胞のＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光強度（ＦＩ）を、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」上の細胞のＦＩに対して正規化した。図１０に見られるように、１００マイクロモルを超えるインプットペプチド濃度と共役した表面は、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」対照と比較して遜色のない細胞付着を示した。
【００８８】
８．未分化幹細胞の培養のためのアッセイ
倍加時間−Ｈ７ ｈＥＳ細胞を、ＳＡＰ−ＶＮおよびＳＡＰ−ＶＮ／ＢＳＰ（ＶＮ配列（配列番号：１または配列番号：５）とＢＳＰ配列（配列番号：２または配列番号：５）の組合せ）でコーティングした細胞培養基板および対照として「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」でコーティングした細胞培養基板上で増殖させた。これらの細胞を、細胞培養で１０継代増殖させた。各継代の倍加時間（細胞の数が倍になるのに必要とされる時間）を測定した。図１１は、本発明のＳＡＰの実施の形態についての倍加時間を示している。これらの倍加時間は、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」上で増殖させた細胞のものに匹敵する。
【００８９】
遺伝子発現−各継代の最後に、フローサイトメトリーを用いて、ＳＡＰ−ＶＮ表面における既知の遺伝子Ｏｃｔ４、Ｔｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ４の発現を測定し、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」と比較した。全染色手順を４℃で行った。簡潔に言えば、各サンプルにつき５×１０5個の細胞（Ｏｃｔ４については固定化および透過処理細胞、またはＴｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ４については生存細胞）を５０マイクロリットルのブロッキング溶液（ＤＰＢＳ中、１０％のＨＩヤギ血清）に再懸濁し、１５分間インキュベートし、その後、ブロッキング溶液中で３０分間、５０マイクロリットルのマーカー特異性一次抗体（０．５マイクログラム／サンプル）または対応するアイソタイプ対照（０．５マイクログラム／サンプル）を加えた。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販される２ｍｌの染色緩衝液（ＳＢ）で洗浄後、ＳＢ中、３０分間、遮光して、対応する二次抗体（０．２５マイクログラム／サンプル）を用いて、細胞を培養した。ＳＢで洗浄後、生存能力を評価するため、ＰＩ（ＳＢ中、２マイクログラム／ｍｌ）を用いて細胞を５分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、各サンプルについて、３０，０００のゲート事象を得た（ＰＩ陰性の生存細胞数についてゲートを設定した）。すべての分析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ社製）を使用して行った。図１２は、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」上で増殖したＨ７ ｈＥＳ細胞とＳＡＰ−ＶＮ上で増殖したＨ７ ｈＥＳ細胞の遺伝子発現が同様であったことを示している。
【００９０】
細胞染色−合成表面または「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」上で４〜５日間培養後、細胞培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、４％のＰＦＡを用いて室温で１０分間固定した。ＤＰＢＳで洗浄した後、細胞を１００％のＥｔＯＨで２分間（室温）透過処理し、ＤＰＢＳ中、１０％の加熱不活化（ＨＩ）ＦＢＳで１時間ブロッキングし（室温）、その後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、Ｏｃｔ４一次抗体（１μｇ／ｍｌの、ＤＰＢＳ中２％のＨＩ ＦＢＳ［Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、カタログ番号ＭＡＢ４４０１］）、または対応するアイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１）を用いて室温で１時間処理した。次に、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、対応する二次抗体ＧＡＭ ＩｇＧ１−ＡＦ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号ａ２１１２１）ＤＰＢＳ中２％のＨＩ ＦＢＳで１：１０００希釈）に、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色を加え、３７℃で３０分間、遮光して培養した。最後に、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で検査するか、または４℃で保管した。図１３は、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」およびＳＡＰ−ＶＮ（ＶＮ−ＡＣ）表面上で増殖したＨ７ ｈＥＳ細胞の蛍光発光（Ｏｃｔ４）および光学顕微鏡画像（位相）を示している。ＳＡＰ−ＶＮ表面上で増殖したＨ７ ｈＥＳ細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ」上で増殖した細胞に対する同様の形態およびタンパク質発現を示している。
【００９１】
図１４Ａは、ＳＡＰ−ＶＮコーティングでコーティングしたＴ７５フラスコ上で増殖したＨ７ ｈＥＳ細胞の光学像を示している。図１４Ｂは、１５％のＳＡＰ−ＶＮでコーティングしたＴ７５フラスコにおける（４日間培養後）２．５倍の倍率の代表的なＨ７コロニーの顕微鏡写真である。図１４Ｃは、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」でコーティングしたフラスコ上で増殖した、同一規模の代表的なＨ７コロニーを示している。
【００９２】
実施の形態では、本発明は、
照射によって滅菌された合成培養表面を提供し；
未分化の幹細胞を前記合成培養表面に提供し；
未分化の幹細胞を化学的に定義された培地で培養し；
少なくとも５代の継代の期間、化学的に定義された培地における未分化の幹細胞の培養を維持する、
各工程を有してなる、未分化の幹細胞の個体群の培養方法を提供する。実施の形態では、幹細胞は、Ｈ１またはＨ７細胞でありうる未分化のヒト胚幹細胞を含む。
【００９３】
実施の形態では、合成表面は、
２−カルボキシエチルアクリレート、
テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、および、
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートまたは３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムのうちの１つ
を含む、組成物から形成される膨潤性の（メタ）アクリレート層；および
ＸａａnＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏのアミノ酸配列（配列番号：１）を含み、ｎが０〜３の整数であり、Ｘａａが任意のアミノ酸である、ポリペプチド
を含み、ここで、前記ペプチドは、前記膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役している。実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層はポリペプチド架橋剤を含まない。さらなる実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層は、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートを含む組成物から形成される。実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層は、約６０〜９０体積％のヒドロキシエチルメタクリレート、約１０〜４０体積％の２−カルボキシエチルアクリレート、および約１〜５体積％のテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートを含む組成物から形成される。実施の形態では、ヒドロキシエチルメタクリレート／２−カルボキシエチルアクリレート／テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートの体積比は約８０／２０／３である。さらなる実施の形態では、溶媒中のヒドロキシエチルメタクリレート／２−カルボキシエチルアクリレート／テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートのパーセンテージは０．１％〜９９．５％である。さらなる実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層は、約８０／２０／３の体積比のヒドロキシエチルメタクリレート／２−カルボキシエチルアクリレート／テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートから本質的になる組成物から形成される。
【００９４】
実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層は均一層である。実施の形態では、ペプチドは、膨潤性の（メタ）アクリレートの表面１平方ミリメートルあたり約５ピコモルより大きい密度で膨潤性の（メタ）アクリレートに共役する。実施の形態では、ペプチドは、ＬｙｓＧｌｙＧｌｙＰｒｏＱｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏのアミノ酸配列（配列番号：６）を含む。
【００９５】
実施の形態では、化学的に定義された培地は、塩基性線維芽細胞成長因子および形質転換成長因子−β１を含む。化学的に定義された培地は約８０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子および約０．５ｎｇ／ｍｌの形質転換成長因子−β１を含みうる。実施の形態では、少なくとも１つの未分化のヒト胚幹細胞は、少なくとも１０代の継代の期間、化学的に定義された培地における培養において維持される。実施の形態では、ガンマ線照射は１０〜２５ｋＧｙの処理を含む。
【００９６】
さらなる実施の形態では、本発明は、
２−カルボキシエチルアクリレート、
テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、および、
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートまたは３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムのうちの１つ
を含む組成物から形成される膨潤性の（メタ）アクリレート層；および、
ＸａａnＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏのアミノ酸配列（配列番号：１）を含み、Ｘａａが任意のアミノ酸であるペプチド；
を含み、
前記ペプチドが前記膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役し；
前記細胞培養製品がガンマ線照射によって滅菌されている、
細胞培養製品を提供する。実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層はポリペプチド架橋剤を含まない。実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層は、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、およびテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートを含む組成物から形成される。実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層は、約６０〜９０体積％のヒドロキシエチルメタクリレート、約１０〜４０体積％の２−カルボキシエチルアクリレート、および約１〜５体積％のテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートを含む組成物から形成される。実施の形態では、ヒドロキシエチルメタクリレート／２−カルボキシエチルアクリレート／テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートの体積比は約８０／２０／３である。実施の形態では、膨潤性の（メタ）アクリレート層は、約８０／２０／３の体積比のヒドロキシエチルメタクリレート／２−カルボキシエチルアクリレート／テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートから本質的になる組成物から形成される。
【００９７】
実施の形態では、本発明は、膨潤性の（メタ）アクリレート層が均一層である細胞培養製品を提供する。追加の実施の形態では、ポリペプチドは、膨潤性の（メタ）アクリレート層の表面１平方ミリメートルあたり約５ピコモルより大きい密度で膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役する。実施の形態では、ガンマ線照射は１０〜２５ｋＧｙの処理を含む。
【００９８】
追加の実施の形態では、本発明は、
２−カルボキシエチルアクリレート、
テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、および
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートまたは３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムのうちの１つ
を含む組成物からなる膨潤性の（メタ）アクリレート層；
ＸａａnＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏのアミノ酸配列（配列番号：１）を含み、ｎが０〜３の整数であり、Ｘａａが任意のアミノ酸であり、前記ペプチドが前記膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役しているペプチド；
化学的に定義された培地；および
１つ以上の未分化のヒト幹細胞であって、前記細胞が培地に存在し、前記ペプチドと接触している、１つ以上の未分化のヒト幹細胞
を含む、細胞培養システムを提供する。実施の形態では、化学的に定義された培地は、塩基性線維芽細胞成長因子および形質転換成長因子−β１を含む。
【００９９】
実施の形態では、本発明は、
未分化のヒト幹細胞を、細胞培養製品のペプチドが共役した膨潤性の（メタ）アクリレート層と接触させ；
前記細胞を細胞培地で培養して前記細胞を未分化の状態で維持する、
各工程を有してなる、未分化の幹細胞を培養する方法を提供する。実施の形態では、培地は、塩基性線維芽細胞成長因子および形質転換成長因子−β１を含みうる、化学的に定義された培地である。実施の形態では、培地は約８０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子および約０．５ｎｇ／ｍｌの形質転換成長因子−β１を含む。
【０１００】
実施の形態では、本発明は、
（ｉ）２−カルボキシエチルアクリレート、
（ｉｉ）テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、および
（ｉｉｉ）ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、１−ビニル−２−ピロリドン、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート、アクリルアミド、エチレングリコールメチルエーテルメタクリレートまたは３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピル−アンモニウムのうち１つ、
を含むモノマーを、細胞培養製品の基板表面に配置し；
前記モノマーを前記基板表面上で重合して膨潤性の（メタ）アクリレート層を形成し；
ＸａａＧｌｙＧｌｙＰｒｏＱｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏ−ＮＨ2（配列番号：１）のアミノ酸配列を含むペプチドを前記膨潤性の（メタ）アクリレート層と共役させ；
ガンマ線照射を使用して前記細胞培養製品を滅菌する、
各工程を有してなる、細胞培養製品を製造する方法を提供する。
【０１０１】
追加の方法の実施の形態では、前記ペプチドを前記膨潤性の（メタ）アクリレート層に共役させる工程は、前記膨潤性の（メタ）アクリレート層を１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む組成物と接触させて活性化した膨潤性の（メタ）アクリレート層を生成し、前記活性化した膨潤性の（メタ）アクリレート層を前記ペプチドと接触させることを含む。実施の形態では、組成物はさらに、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む。
【０１０２】
追加の方法の実施の形態では、本方法はさらに、モノマーを溶媒で希釈する工程をさらに含み、ここで、基板表面上にモノマーを配置する工程は、前記モノマーを前記基板表面に配置することを含む。前記モノマーを前記溶媒で希釈する工程は、前記溶媒を用いて、前記モノマーを約０．１体積％〜約０．２５体積％の濃度で希釈することを含みうる。実施の形態では、ガンマ滅菌工程は１０〜２５ｋＧｙの処理を含む。
【０１０３】
このように、化学的に定義された培地で細胞培養するための膨潤性（メタ）アクリレート表面の実施の形態が開示される。当業者は、本明細書に記載される配列、組成物、キットおよび方法が開示された以外の実施の形態で実施できることを認識するであろう。本開示の実施の形態は、例証の目的で提示され、限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2012516159.tif 000013
【図５Ｂ】
2012516159.tif 000014
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2012516159.tif 000022
【図１１】
2012516159.tif 000023
【図１２】
2012516159.tif 000024
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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