(57)【要約】  本発明は、ペプチド化合物及び陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を用いるインビボイメージングでのそれの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は肝線維症のインビボイメージング方法でのかかるペプチド系化合物の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の肝臓における線維形成組織の存在、位置及び／又は量を決定するための方法であって、当該方法は
（ｉ）式Ｉの陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）トレーサーを前記被験体に検出可能な量で投与する段階、
（ｉｉ）段階（ｉ）で投与されたＰＥＴトレーサーを前記肝臓中の線維形成組織に結合させる段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で結合させたＰＥＴトレーサーから放出される信号をＰＥＴによって検出する段階、並びに
（ｉｖ）前記信号の位置及び／又は量を表す画像を形成する段階
を含んでなり、前記ＰＥＴトレーサーは次の式Ｉを有する、方法。
【化１】
2012529471.tif 000013
（式中、
Ｚ1及びＺ2の一方は18Ｆを含む基であり、Ｚ1及びＺ2の他方は水素であり、
Ｗ1及びＷ2の各々は独立に次の式Ｉａの二価リンカー部分である。
【化２】
2012529471.tif 000014
（式中、
ｎは１〜１０の整数であり、
Ｒ1はＣ1-5アルキレン、Ｃ2-5オキソアルキレン、Ｃ1-5オキサアルキレン又はＣ2-5カルボニル置換オキサアルキレンであり、
点線はＺ1又はＺ2への結合点を表す。））
【請求項２】
式Ｉの18Ｆを含む前記基が［18Ｆ］フルオロフェニルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
式ＩのＺ1が18Ｆを含む前記基である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
式Ｉａのｎが３〜５である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｗ1が、ｎが５である式Ｉａの二価リンカーである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
式ＩａのＲ1がＣ1-5オキサアルキレンである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
Ｒ1がＣ1-3オキサアルキレンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｒ1が−ＣＨ2−Ｏ−である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｗ2が、ｎが３である式Ｉａの二価リンカーである、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
式ＩａのＲ1がＣ2-5カルボニル置換オキサアルキレンである、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ1がＣ2-4カルボニル置換オキサアルキレンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ1が−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記式ＩのＰＥＴトレーサーが、それを哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含む放射性医薬組成物として供給される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体がインタクトな哺乳動物生体である、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
２つの分離した時点で実施される、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記２つの分離した時点の中間で前記被験体に抗線維形成治療が施される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法を含み、さらに（ｖ）信号の位置及び／又は量を特定の臨床像に帰属させる追加段階を含んでなる診断方法。
【請求項１８】
請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法で使用するための、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の式ＩのＰＥＴトレーサー。
【請求項１９】
請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法を実施するための薬剤の製造に使用するための、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の式ＩのＰＥＴトレーサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド化合物及び陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を用いるインビボイメージングでのそれの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は肝線維症のインビボイメージング方法でのかかるペプチド系化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビボイメージング技法である陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）は優れた感度及び分解能を与える結果、病変部における比較的小さい変化でも経時的に観察できる。ＰＥＴで使用するための好ましい陽電子放出核種は18Ｆであり、これは約１１０分の半減期を有し、陽電子放出によって９７％崩壊し、０．６９ＭｅＶの最大エネルギーを有する。特定の病態を表すバイオマーカーを標的化する18Ｆ標識ペプチドは、その病態の検出及び特徴づけに使用できる。
【０００３】
肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝臓における主要なフィブロコンピテント（ｆｉｂｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞と広く見なされている（Ｂｅｄｏｓｓａ  ａｎｄ  Ｐａｒａｄｉｓ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００３；２００：５０４−５１５）。進行性肝線維症中には、ＨＳＣは活性化して増殖するが、線維症の消散時には、肝臓瘢痕の分解と同時に起こる広範囲のＨＳＣアポトーシスが存在する。このような進行性ステージは線維症の初期段階を表し、「線維形成」と呼ばれる。線維形成に関連する活性化ＨＳＣはαvβ3インテグリンのアップレギュレート発現を有している（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４；  ２７９（２３）：  ２３９９６−２４００６）。したがって、αvβ3は肝線維形成のインビボイメージング用のバイオマーカーとして使用可能である。
【０００４】
これまで、αvβ3を標的化するＰＥＴトレーサーに対する主な関心は、血管新生関連疾患（主として腫瘍、特に転移性腫瘍）の診断に集中していた。例えば、国際公開第２００５／０１２３３５号には、αvβ3インテグリンに結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含む18Ｆ標識ペプチド系インビボイメージング剤が血管新生に関連する疾患又は病態のインビボ診断又はイメージングに有用であると教示されている。国際公開第２００６／０３０２９１号にはまた、特定の18Ｆ標識ＲＧＤペプチド系化合物が血管新生に関連する疾患又は病態のインビボイメージングのために有用であると教示されている。ＲＧＤペプチド系インビボイメージング剤はまた、肝線維症をはじめとする、コラーゲン沈着に関連する病態のインビボイメージング及び診断のためにも有用であることが示唆されている（国際公開第２００６／０５４９０４号）。国際公開第２００６／０５４９０４号には、18Ｆをはじめとする一連のインビボイメージング成分が開示されている。しかし、さらに最近になって提示されたインビボデータは、18Ｆ標識ＲＧＤペプチドの特性が肝臓の最適インビボイメージングのために適さないことを実証している。健常ヒト志願者におけるＰＥＧリンカーを含む18Ｆ標識ＲＧＤペプチドの生体分布に関する報告は、肝臓への初期取込みが約１５％であり、注射から４時間後には約８％に減少することを示した（ＭｃＰａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２００８；４９（１０）。同じ18Ｆトレーサーについて、転移性乳癌患者での腫瘍検出能力が評価された（Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２００８；４９：８７９−８８６）。この研究では、肝臓でのバックグラウンド取込みが非常に高いため、肝臓転移は低強度（ｈｙｐｏｉｎｔｅｎｓｅ）病巣として現れた。
【０００５】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とは、単純脂肪肝（脂肪症）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、さらには肝硬変（肝臓の不可逆的な進行した瘢痕形成）にまでわたる広範囲の肝臓疾患をいう。米国人口の約２４％がＮＡＦＬＤを有すると考えられており、これは低い頻度でＮＡＳＨへと進行する。ＮＡＦＬＤはメタボリックシンドロームに関連しており、これは肥満、高脂血症、高血圧及びＩＩ型糖尿病と関係がある。米国ではおよそ４７００万人がメタボリックシンドロームを有すると考えられている。米国人口のうち推定８６０万人がＮＡＳＨを有していて、これは線維症及び肝硬変を伴う恐れがあり、ＮＡＳＨ患者の２０〜２８％が１０年間で肝硬変を発症すると考えられている。したがって、ＮＡＦＬＤはごく一般的であり、ＮＡＳＨへ、ひいては肝硬変へと進行しかねない疾患範囲の軽症側末端を表している。肝線維症はＮＡＳＨから肝硬変へと進行するリスクの指標である。
【０００６】
肝線維症の検出のために現在用いられているアプローチは、いくつかの重大な欠点を有している。コラーゲン沈着のパターンに関して組織学的に分析された肝生検は、肝疾患ステージ及び肝線維症を評価するための最も信頼できる基準とみなされている。しかし、この方法は、若干の病的状態、偶発的な死亡率、高いコスト、サンプリング誤差及び線維症の程度を分類する際の肝臓病理学者間での高い観察者間変動を伴う。生検での肝臓のサンプリングは評価すべき肝臓の５万分の１にすぎないので、ステージ診断の誤りを招く恐れがある。さらに、疾患の進行を適時にモニターするためには、３〜５年毎に繰返して生検を行うことが推奨されている。血液検査のような低侵襲性の方法も利用可能であるが、肝線維症を検出するための現行の血液検査は臨床的価値が限られている。これは、線維症の程度又は線維症と肝硬変との識別に使用できないからである。現在、ＮＡＦＬＤをＮＡＳＨから識別し、或いはＮＡＳＨにおける線維症を十分に定量化し特徴づけることができる方法は存在しない。したがって、肝線維症を非侵襲的方法で効果的に特徴づけてモニターすることができる手段は存在しない。このことは、肝線維症の進行を遅らせ又は停止させ得る早期治療介入の提供に悪影響を及ぼしている。線維症の初期段階を検出できるインビボイメージング方法は、ＮＡＦＬＤ疾患プロセスの臨床管理において有用であろう。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は活性化ＨＳＣの存在、位置及び／又は量を評価するのに有用であって、線維形成の指標を与える。これが特に有利であるのは、線維形成組織が線維症組織よりも早期活動性疾患の優れたマーカーであり、線維症組織は疾患プロセスが消散しつつある場合にも存在するからである。したがって、疾患プロセスの確認を、治療の実施が最も有効であり得るステージで行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１及び図２は、肝線維形成の動物モデルにおけるＰＥＴイメージング試験の結果を示している。
【図１】図１は、胆管結紮（ＢＤＬ）又は偽手術後の様々な日数において、ラット肝臓及び参照組織（筋肉）中での％ＩＤ／ｃｃ（組織１立方センチメートル当たりのパーセント注射量）を示している。すべてのイメージングデータは、ＰＥＴトレーサー１の静脈内注射から６０〜９０分後に取得された。
【図２】図２は、手術の開始後２日目乃至３０日目において、ＢＤＬ（上列）及び偽手術（下列）を受けたラットの肝臓（参考のため左端の画像中に「Ｌ」とマークした）及び腎臓（参考のため左端の画像中に「Ｋ」とマークした）におけるＰＥＴトレーサー１の取込みを注射量に対して基準化して示す代表的な同時記録ＰＥＴーＣＴ（陽電子放出断層撮影−コンピューター断層撮影）画像を示している。
【０００９】
これらの図は、偽手術動物に比べてＢＤＬ動物の肝臓へのＰＥＴトレーサー１の取込みの有意差を明確に示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一態様では、本発明は、被験体の肝臓における線維形成組織の存在、位置及び／又は量を決定するための方法であって、当該方法は
（ｉ）式Ｉの陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）トレーサーを前記被験体に検出可能な量で投与する段階、
（ｉｉ）段階（ｉ）で投与されたＰＥＴトレーサーを前記肝臓中の線維形成組織に結合させる段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で結合させたＰＥＴトレーサーから放出される信号をＰＥＴによって検出する段階、並びに
（ｉｖ）前記信号の位置及び／又は量を表す画像を形成する段階
を含んでなり、前記ＰＥＴトレーサーは次の式Ｉを有する方法に関する。
【００１１】
【化１】
2012529471.tif 000002
式中、
Ｚ1及びＺ2の一方は18Ｆを含む基であり、Ｚ1及びＺ2の他方は水素であり、
Ｗ1及びＷ2の各々は独立に次の式Ｉａの二価リンカー部分である。
【００１２】
【化２】
2012529471.tif 000003
式中、
ｎは１〜１０の整数であり、
Ｒ1はＣ1-5アルキレン、Ｃ2-5オキソアルキレン、Ｃ1-5オキサアルキレン又はＣ2-5カルボニル置換オキサアルキレンであり、
点線はＺ1又はＺ2への結合点を表す。
【００１３】
本明細書中で使用する「線維形成組織」という用語は、特に線維形成が起こっている組織に関する。「線維形成」という用語は、とりわけ肝星細胞（ＨＳＣ）が活性化されてインテグリンを発現している、線維症の活動性かつ進行性のステージをいう。ＨＳＣは、肝臓における主要なフィブロコンピテント細胞と広く見なされている。線維形成中には、ＨＳＣは活性化して増殖するが、線維症の消散時には、肝臓瘢痕の分解と同時に起こる広範囲のＨＳＣアポトーシスが存在する。さらに、線維形成中には、コラーゲンのような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の沈着はまだ起こらない。このように、ＥＣＭ成分の存在は線維症の後期段階及び線維症の消散の特徴である。したがって、線維形成中の疾患プロセスを標的にすることは、治療の適用が最も適切である活動性疾患の一層良好な指標を提供する。
【００１４】
本発明の「被験体」は、肝臓を有する動物である。「肝臓」という用語は、公知の生理学的意味で理解すべきである。即ち、脊椎動物及び若干の他の動物に存在する生きた器官であって、解毒、タンパク質合成、及び消化のために必要な生物化学物質の産生を含む広範囲の機能を有するものである。好ましい実施形態では、前記被験体はインタクトな哺乳動物生体であり、最も好ましくはインタクトなヒト生体である。
【００１５】
式ＩのＰＥＴトレーサーを被験体に検出可能な量で「投与する」段階は、前記被験体における前記ＰＥＴトレーサーの全身的存在をもたらす方法として理解できる。投与は好ましくは非経口的に実施され、最も好ましくは静脈内に実施される。静脈内経路は、ＰＥＴトレーサーを被験体の身体全域に送達するための最も効率的な方法であると共に、被験体の身体に対して実質的な物理的介入を及ぼさない。「実質的な」という用語は、実施するために職業的な医学専門技術を必要とするか、或いは所要の職業的医療及び専門技術をもって実施した場合でも実質的な健康リスクを伴う介入を意味する。ＰＥＴトレーサーは、好ましくは本明細書中に記載される放射性医薬組成物として投与される。本発明の方法はまた、ＰＥＴトレーサーを予め投与した被験体に関して実施される上述の段階（ｉｉ）〜（ｉｖ）を含むものとしても理解できる。
【００１６】
式ＩのＰＥＴトレーサーの「検出可能な量」とは、ＰＥＴによって検出可能な信号を生み出すのに十分な前記ＰＥＴトレーサーの量を意味する。例えば、通常、体重７０ｋｇ当たりで通例０．０３７ＭＢｑ〜３．７０ＧＢｑ（０．０１〜１００ｍＣｉ）、好ましくは３．７ＭＢｑ〜１．８５ＧＢｑ（０．１〜５０ｍＣｉ）、最も好ましくは３７〜７４０ＭＢｑ（１〜２０ｍＣｉ）が十分であろう。
【００１７】
本発明の文脈中における「ＰＥＴトレーサー」という用語は、陽電子放出型放射性同位体を含む化合物をいう。かかるＰＥＴトレーサーは、特定の細胞成分（例えば、細胞表面受容体）と結合する結果、陽電子放出型放射性同位体から放出される信号の検出がその細胞成分の位置及び量を表すように設計される。
【００１８】
ＰＥＴトレーサーを前記被験体の肝臓中の線維形成組織に「結合させる」段階は、投与段階に後続し、検出段階に先行する。前記結合段階中に実際に起こることは、ＰＥＴトレーサーが前記被験体の全身を動的に移動して体内の様々な組織に接触することである。本発明の方法の成功のためには、結合段階の時間は、ＰＥＴトレーサーと肝臓中の線維形成細胞との間で特異的な相互作用が起こり得ると共に、好ましくは非特異的に結合したＰＥＴトレーサーの少なくとも一定割合が肝臓から排出されるように選択されることが重要である。ある時点に達すると、線維形成細胞に結合したＰＥＴトレーサーと非線維形成細胞に結合したＰＥＴトレーサーとの比の結果として、肝臓中の線維形成細胞に特異的に結合したＰＥＴトレーサーの検出が可能となる。理想的なかかる比は、２：１以上である。
【００１９】
次に、被験体をＰＥＴスキャナー内に配置して、18Ｆから放出される陽電子が最大数ミリメートルまで進行し、電子に出会って消滅する場合に生じる消滅光子対を検出することにより、「検出」段階が実施される。これらの消滅光子は、ＰＥＴトレーサーから放出される「信号」である。
【００２０】
本発明の方法の「形成」段階はコンピューターによって実施され、検出された信号に再構成アルゴリズムを適用してデータセットを得る。次に、このデータセットを操作して、被験体の肝臓を示す画像を形成する。得られた画像は、被験体の肝臓における線維形成組織の存在、位置及び／又は量を表している。
【００２１】
「18Ｆを含む基」は、18Ｆそれ自体を意味することもあれば、18Ｆを含む化学基を意味することもある。好適には、前記式ＩのＰＥＴトレーサーに関しては、18Ｆを含む前記基は血中で容易に代謝を受けない化学基である。これは、かかる代謝により、ＰＥＴトレーサーが所望のインビボ標的部位（即ち、肝臓）に到達する前に、18ＦがＰＥＴトレーサーから開裂してしまうからである。例えば、18Ｆは［18Ｆ］フルオロアルキル基又は［18Ｆ］フルオロアルコキシ基の一部をなすことができるが、これはアルキルフルオリドがインビボでの代謝に耐えるからである。別法として、18Ｆは直接共有結合によって芳香環に結合することもできる。
【００２２】
「アルキレン」という用語は、−ＣＨ2−基の二価鎖を意味する。ここで、−ＣＨ2−基の数は１〜５である。
【００２３】
「オキソアルキレン」という用語は、上記に定義したアルキレンにおいて、さらに１以上のカルボニル基を鎖中に含むものをいう。「カルボニル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）−基をいう。２以上のカルボニル基が互いに結合した鎖は包含されない。当業者には、かかる配列が化学的に不可能であることが理解されよう。
【００２４】
「オキサアルキレン」という用語は、上記に定義したアルキレンにおいて、さらに１以上の酸素原子（即ち、−Ｏ−基）を鎖中に含むものをいう。２以上の酸素原子が互いに結合した鎖（−Ｏ−Ｏ−）は包含されない。当業者には、かかる基が極めて不安定であり、したがって本発明に関しては適さないことが理解されよう。好ましくは、酸素原子はエーテル結合（即ち、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−）として存在している。
【００２５】
「Ｃ2-5カルボニル置換オキサアルキレン」という用語は、上記に定義したオキサアルキレンにおいて、さらにカルボニル基を鎖中に含むものをいい、この場合のカルボニルは上記に定義した通りである。この定義中にはエステル結合が包含され、「エステル結合」という用語は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−をいう。また、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−及び−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−のような基も包含される。特に除外されるのは、酸無水物基（即ち、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）のような反応基である。当業者には、かかる反応基が本発明に関しては適さないことが理解されよう。
【００２６】
式ＩのＰＥＴトレーサーのペプチド部分は、標準的なペプチド合成法、例えばＡｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９に記載されているような固相ペプチド合成法によって製造できる。アミノキシ基の組込みは、ペプチドアミン官能基と活性化酸との反応によって形成されかつペプチド合成中又は合成後に導入される安定なアミド結合を形成することで達成できる。式ＩのＰＥＴトレーサーのペプチド部分を得るための方法の一層詳細な説明については、Ｉｎｄｒｅｖｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００６；１６：６１９０−３）を参照されたい。
【００２７】
18Ｆラベルの付加は、放射化学の分野で公知の技法によって実施できる。例えば、18Ｆ（ＣＨ2）3ＯＭｓ（式中、ＯＭｓはメシレートである。）のような標識化合物でアミン前駆体化合物をＮ−アルキル化してＮ−（ＣＨ2）318Ｆを得ることで18Ｆを導入できる。第一アミン含有前駆体化合物は、Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００２；４５：１０４５−１０５３）及びＢｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７１；９３：２８９７）によって教示されているように、標識化合物18Ｆ−Ｃ6Ｈ4−ＣＨＯを用いた還元アミノ化によっても18Ｆで標識できる。このアプローチは、Ｐｏｅｔｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．，２００４；４５：８９２−９０２）によって教示されているように、ペプチドのアミノキシ誘導体にも適用できる。アミン含有前駆体化合物は、次式のような18Ｆ標識活性エステル標識化合物と反応させてアミド結合連結生成物を得ることによっても18Ｆで標識できる。
【００２８】
【化３】
2012529471.tif 000004
上記に示したＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びペプチド標識のためのその使用は、Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９９２；１９（３）：２７５−２８１）及びＪｏｈｎｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．，２００２；１０３（Ｓｕｐｐｌ．４８）：４５−８５）によって教示されている。18Ｆ標識誘導体への合成経路のさらなる詳細は、Ｂｏｌｔｏｎ（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，２００２；４５：４８５−５２８）によって記載されている。
【００２９】
本発明のペプチドに類似したペプチドの合成法については、国際公開第０３／００６４９１号、同第２００５／０１２３３５号及び同第２００６／０３０２９１号も参照されたい。
【００３０】
18Ｆを組み込むための上述した方法のいずれもが、次の式ＩＩの対応する前駆体化合物から式ＩのＰＥＴトレーサーを製造するために適用できる。
【００３１】
【化４】
2012529471.tif 000005
式中、Ｗ3及びＷ4はそれぞれ式ＩのＷ1及びＷ2に関して上記に定義した通りであり、Ｚ3及びＺ4は共に水素である。
【００３２】
本発明の好ましい18Ｆ標識化合物は次に式ＩＩａを有する。
【００３３】
【化５】
2012529471.tif 000006
式中、
ｐは０〜２０の整数であり、
ｑは０〜１０の整数であり、
Ｙは水素、Ｃ1-6アルキル（例えば、メチル）又はフェニルである。
したがって、好ましい実施形態では、式Ｉの18Ｆを含む前記基は芳香族基であり、最も好ましくは［18Ｆ］フルオロフェニルである。18Ｆを含む基が存在する式Ｉ上の好ましい位置はＺ1である。
【００３４】
式ＩＩａの標識化合物は、次の式ＩＩｂの対応する出発化合物又はその保護誘導体から製造できる。
【００３５】
【化６】
2012529471.tif 000007
式中、Ｌは脱離基である。好ましくは、ｐ≧１である場合、Ｌはｐ−トルエンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネート或いはメタンスルホネート又はハライドであり、ｐが０である場合、Ｌはｐ−トリアルキルアンモニウム塩又はｐ−ニトロである。Ｙ及びｑは式ＩＩａの標識化合物に関して上記に定義した通りである。式ＩＩｂの出発化合物を、サイクロトロンで生成した水性［18Ｆ］フッ化物を好適には塩基（例えば、テトラブチルアンモニウム又はＫ2ＣＯ3／Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ−２２２）からの蒸発によって予備活性化したものと、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドのような適当な溶媒中において、通例は周囲温度又は高温（例えば、最高１４０℃までの温度）で反応させる。式ＩＩａの化合物のアルデヒド又はケトン官能基は、放射性フッ素化に続く簡単な酸処理により、その保護バージョン（例えば、アセタール又はケタール）から迅速に生成させることもできる。
【００３６】
式ＩのＰＥＴトレーサーは、例えば式ＩＩの前駆体化合物及び式ＩＩａの標識化合物を含むキットによって製造できる。キットの使用に際しては、水性緩衝液（ｐＨ１〜１１）に適宜に溶解し得る式ＩＩの前駆体化合物に式ＩＩａの標識化合物を添加する。極端でない温度で１〜７０分間反応させた後、例えば固相抽出（ＳＰＥ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって標識ペプチドを精製し、回収することができる。
【００３７】
二価リンカー部分Ｗ1又はＷ2の性質は、式ＩのＰＥＴトレーサーの生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中のエーテル基は、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。二価リンカー部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む場合、リンカー基はインビボでＰＥＴトレーサーの薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排泄経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排泄）を有利にするためにも使用できる。
【００３８】
式ＩのＰＥＴトレーサーにおいて、式Ｉａの二価リンカー部分のｎは３〜５であることが好ましい。Ｗ1に関しては、好ましいｎは５であり、Ｗ2に関しては、好ましいｎは３である。Ｗ1に関しては、Ｒ1は好ましくはＣ1-5アルコキシアルケニル、最も好ましくはＣ1-3アルコキシアルケニル、特に好ましくは−ＣＨ2−Ｏ−である。Ｗ2に関しては、Ｒ1は好ましくはＣ2-5カルボキシアルコキシアルケニル、最も好ましくはＣ2-4カルボキシアルコキシアルケニル、特に好ましくは−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−である。
【００３９】
本発明の方法で使用するための好ましいＰＥＧトレーサーの例は、次式のものである。
【００４０】
【化７】
2012529471.tif 000008
上記のＰＥＴトレーサーは、本明細書中では「ＰＥＴトレーサー１」と呼ばれ、Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２００８；４９：８７９−８６）によって記載された方法で得ることができる。ＰＥＴトレーサー１は、（下記実施例１〜３に記載されるように）インビトロ及びインビボの両方で分析した。肝線維形成の動物モデルと対応する陰性対照動物モデルとの間において、ＰＥＴトレーサー１の取込みに有意差が見出され、これはこのＰＥＴトレーサーが線維形成のイメージングし得ることを示唆している。
【００４１】
本発明の方法は、好ましくは前記ＰＥＴトレーサーを放射性医薬組成物として供給することで実施される。「放射性医薬組成物」は、本発明においては、式ＩのＰＥＴトレーサーを哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含む組成物として定義される。「生体適合性キャリヤー」は、組成物が生理学的に認容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）式ＩのＰＥＴトレーサーを懸濁又は溶解するための流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性又は非低張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。生体適合性キャリヤーはまた、エタノールのような生体適合性有機溶媒を含んでいてもよい。かかる有機溶媒は、親油性の高い化合物又は配合物を可溶化するために有用である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水、等張食塩水又はエタノール水溶液である。静脈内注射用生体適合性キャリヤーのｐＨは好適には４．０〜１０．５の範囲内にある。かかる放射性医薬組成物は、緩衝剤、薬学的に許容される可溶化剤（例えば、シクロデキストリン或いはＰｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｗｅｅｎ又はリン脂質のような界面活性剤）、薬学的に許容される安定剤又は酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、ゲンチジン酸又はｐ−アミノ安息香酸）或いは凍結乾燥用増量剤（例えば、塩化ナトリウム又はマンニトール）のような追加成分を任意に含み得る。
【００４２】
かかる放射性医薬組成物は、ＰＥＴトレーサーに関して記載したようにして製造できるが、無菌製造条件下で製造すれば所望の無菌生成物が得られる。別法として、かかる放射性医薬組成物を非無菌条件下で製造し、次いで例えばγ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる終末滅菌を施すこともできる。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の方法は、前記被験体内における線維形成の進行をモニターするために使用できる。この場合、本発明の方法は２つの分離した時点で実施される。例えば、本方法は、２つの分離した時点間の間隔が１〜６年、好ましくは３〜５年の範囲内にあるようにして実施できる。２つの分離した時点間の間隔中には、抗線維形成治療を被験体に施すことができる。このようにすれば、抗線維形成治療の効力を評価することができる。線維形成を阻害するための公知薬物療法の例には、必須リン脂質（ＥＰＬ）、シリマリン及びウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）がある（Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１“Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ”ｂｙ  Ｈａｎｚ−Ｄｉｅｔｅｒ  Ｋｕｎｔｚ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，２００６、特にアジュバント療法に関する５８７頁の議論を参照されたい）。ＥＰＬの主成分であるポリエンホスファチジルコリン（ＰＰＣ）は、ヒヒにおけるアルコール性肝線維症を予防した（Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００９；５０（６）：１２３６−４６）。Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００３；３７（４）：３３６−９）による研究は、シルマリンがヒヒにおけるアルコール誘発肝線維症の進行を遅らせることを報告している。ＵＤＣＡは原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）に対する認可された治療法である。ＵＤＣＡ療法はＰＢＣにおける肝線維症の進行を顕著に遅らせることが開示されている（Ｃｏｒｐｅｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００１；３２（６）：１１９６−９）。
【００４４】
追加の態様では、本発明は、本明細書中で好適に及び好ましく記載された本発明の方法を含み、さらに（ｖ）信号の位置及び／又は量を特定の臨床像に帰属させる追加段階を含んでなる診断方法を提供する。具体的には、信号の量と線維形成の程度との間には直接の相関関係が存在する。
【００４５】
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載された本発明の方法又は本発明の診断方法で使用するための、本明細書中に記載された式ＩのＰＥＴトレーサーを提供する。本発明のこの態様に関しては、ＰＥＴトレーサー及びその好ましい実施形態は、本発明の方法に関して上記に記載した通りである。
【００４６】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書中に記載された本発明の方法又は本発明の診断方法を実施するための薬剤の製造に使用するための、本明細書中に記載された式ＩのＰＥＴトレーサーを提供する。本発明のこの態様に関しては、ＰＥＴトレーサー及びその好ましい実施形態は、本発明の方法に関して上記に記載した通りである。
【実施例】
【００４７】
実施例の簡単な説明
実施例１は、ＥＡ−Ｈｙ９２６細胞から調製した膜との結合を評価するために使用したインビトロアッセイを記載する。
【００４８】
実施例２は、肝線維形成のインビボモデル、胆管結紮（ＢＤＬ）モデル並びに対応する陰性対照モデル又は「偽手術」を記載している。
【００４９】
実施例３は、ＰＥＴトレーサー１を用いて実施した縦方向イメージング試験を記載している。
【００５０】
実施例で使用する略語のリスト
℃            摂氏度
μｍ          マイクロメートル
％ＩＤ／ｃｃ  組織１立方センチメートル当たりのパーセント注射量
ＢＤＬ        胆管結紮
ｃｍ3         立方センチメートル
ＣＴ          コンピューター断層撮影法
ｇ            グラム
ｉ．ｄ．      注射量
ｉ．ｖ．      静脈内
ｋｅＶ        キロ電子ボルト
ｋＶｐ        キロボルトピーク
ＭＢｑ        メガベクレル
ｍｇ／ｋｇ    ミリグラム／キログラム
ｍｌ          ミリリットル
ｍｍ          ミリメートル
ｎＭ          ナノモル濃度
ｎｓｅｃ      ナノ秒
ＰＥＴ        陽電子放出断層撮影法
ＲＯＩ        検査対象領域
ｓ．ｃ．      皮下
実施例１：ＥＡ−Ｈｙ９２６細胞から調製した膜との結合
以前の報文に記載された膜結合アッセイ（Ｉｎｄｒｅｖｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ  ＆  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２００６，１６，６１９０−６１９３）を用いて阻害定数を測定した。
【００５１】
簡単に述べれば、ヒト内皮腺癌細胞株ＥＡ−Ｈｙ９２６からの膜を調製し、精製した膜画分についてＫdを計算した。次に、競合的結合アッセイを確立して阻害定数を測定した。125Ｉ−エキスタチン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、コードＩＭ３０４）を標識リガンドとして使用し、非放射性エキスタチンを参照標準として使用した。
【００５２】
非放射性の試験化合物（非放射性エキスタチン又は非放射性ＰＥＴトレーサーのいずれか）の全部で１６段階の希釈液を調製し、125Ｉ−エキスタチンと膜の組合せと混合してから３７℃で１時間インキュベートした。数回の洗浄後、Ｓｋａｔｒｏｎマイクロハーベスターを用いて結合した材料をフィルター上に回収した。最後に、フィルタースポットを切り取り、Ｐａｃｋａｒｄ  γ−カウンター内でカウントした。
【００５３】
（Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２００８；４９：８７９−８６に記載された方法によって製造した）ＰＥＴトレーサー１は、上述のアッセイで評価した場合、５〜１０ｎＭの親和性を示した。
【００５４】
実施例２：胆管結紮（ＢＤＬ）及び偽手術動物
２（ｉ）  動物モデルの準備
すべての胆管結紮（ＢＤＬ）及び偽手術試験において、非近交系雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１８０〜２００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）を使用した。６日間の馴化後、ラットを２つの群（ＢＤＬ群及び偽手術群）に分けた。
【００５５】
ＢＤＬ動物に関しては、腹部を剪毛し、ベタジン溶液で消毒し、次いで５ｍｇ／ｋｇのカルプロフェン（ｃａｒｐｒｏｆｅｎ）及び５ｍｇ／ｋｇのブプロノルフィン（ｂｕｐｒｏｎｏｒｐｈｉｎｅ）を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。イソフルラン麻酔下で、正中開腹術を実施し、総胆管の位置を見つけた。胆管を二重結紮し、第１の結紮は肝管の接合部の間で行い、第２の結紮は膵管の入口の上方で行った。
【００５６】
第２の群（偽手術動物）では、腹部を剪毛し、ベタジン溶液で消毒し、次いで５ｍｇ／ｋｇのカルプロフェン及び５ｍｇ／ｋｇのブプロノルフィンをｓ．ｃ．投与した。動物は、胆管を操作し、縫合糸を胆管の下に通す偽手術を受けた。
【００５７】
閉じる前に、２〜３ｍｌの食塩水を各動物の腹膜中に投与した。筋膜及び皮膚を閉じ、動物に２ｍｇ／ｋｇのメタクロプロミド（ｍｅｔａｃｌｏｐｒｏｍｉｄｅ）、５ｍｇ／ｋｇのバイトリル（Ｂａｙｔｒｉｌ）及び約２ｍｌの食塩水をｓ．ｃ．投与した。必要に応じ、カルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を続く２日間投与した。実験の期間中、動物を綿密にモニターした。
【００５８】
２（ｉｉ）  試験化合物の投与及び生体分布
術後の適当な日に、ＢＤＬ及び偽手術動物を取り出し、イソフルラン麻酔下に置き、次いで各動物に尾静脈を介して０．３ｍｌ（約３ＭＢｑ）を静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。試験品目の注射後の適当な時点で、各動物をイソフルランで再麻酔し、頸椎脱臼により屠殺して秤量し、バーコード走査システムを介して体重を記録した。各動物を解剖し、下記の器官及び組織を摘出し、ＢＡＳＩＬカウンタープロトコル４０又は手動カウンティングを用いてカウントした。検査した器官及び組織は、
骨*、筋肉*、血液*、腎臓、膀胱及び尿（Ｂ／Ｕ）、肺、肝臓*、脾臓、胃及び内容物、小腸及び大腸（ＳＩ及びＬＩ）、心臓、甲状腺、皮膚*、屠殺体並びに注射部位であった（*秤量した試料）。
【００５９】
器官全体（例えば、肝臓）で記録された放射能はバックグラウンド放射能及び放射性崩壊に関して補正し、放射能の生体分布は次の式１に従って計算した。
【００６０】
【数１】
2012529471.tif 000009
式中、
Ａ＝器官で測定された毎秒カウント数。
Ｂ＝（注射部位を除く）全器官で測定された毎秒カウント数。
【００６１】
秤量した組織試料における注射放射能の百分率を計算することで、次の式２に従って組織全体における％ｉ．ｄ．を求めた。
【００６２】
【数２】
2012529471.tif 000010
式中、
Ｚs＝試料での毎秒カウント数。
Ｗs＝試料の重量（グラム）。
Ｗb＝屠殺直後の動物の重量（グラム）。
Ｂ＝（注射部位を除く）全器官で測定された毎秒カウント数。
Ｆ＝組織の質量を動物の全体重に対する割合として表す組織特異的係数。
【００６３】
【表１】
2012529471.tif 000011
実施例３：ＰＥＴトレーサー１の縦方向イメージング試験
ＢＤＬラットモデルにおけるＰＥＴトレーサー１の評価のため、胆管結紮手術又は偽手術後２、５、９、１５及び３０日目に静止ＰＥＴ画像を縦方向に沿って取得した（注射から６０〜９０分後にイメージングを行った）。ＰＥＴ画像は対応するＣＴ画像と同時記録した。
【００６４】
ＰＥＴイメージングの開始に先立ち、ヒストグラム及び取得パラメーターをｍｉｃｒｏＰＥＴ  Ｍａｎａｇｅｒ（データ取得及び処理を制御するソフトウェア）に入力した。再構成パラメーターは下記のように設定した。
・フーリエリビニングアルゴリズム。
・ランプフィルターによる２Ｄフィルターバック投影。
・画像ズームを２とした。
・散乱補正を選択した。
・生の画像リストモードデータをＩｎｔｅｌ／ＶＡＸ−４バイト浮動小数点フォーマットで保存した。再構成データは．ｉｍｇフォーマット（ネイティブ）で保存した。
【００６５】
画像取得のためには、パラメーターを下記のように設定した。
・１８００秒の取得（注射から６０〜９０分後の静止画像）。
・ベッド位置はただ１つであった。
・エネルギー窓は３５０〜７５０ｋｅＶに設定した。
・タイミング窓は６ｎＳｅｃに設定した。
【００６６】
イメージング試験のためには、情報を追加収集し、１つのリストモードファイルとして保存した。画像は１つの静止フレーム（１×３０分）として再構成した。画像の再構成後、ＲＯＩを適当な領域上に抜き出し、Ａｍｉｄｅソフトウェアを用いて放射能／ｃｍ3データを生成した。
【００６７】
イメージング試験の開始に先立ち、麻酔した動物を、基準マーカーを取り付けた特注のＰＥＴ動物ベッドに固定した。動物は、腹臥ヘッドファーストの姿勢で動物ベッド内に固定された状態で配置した。肝臓の中心をレーザーのクロスヘアと整列させ、ベッドを水平状態でカメラ中に１００ｍｍだけ移動させた。データはＡｓｉｐｒｏ及びＡｍｉｄｅソフトウェアを用いて解析した。
【００６８】
ＰＥＴイメージング段階の完了後、まだ麻酔がかかっていてベッドに固定された動物をＣＴカメラに移した。動物の位置を変えることなく、レーザーのクロスヘアを用いて、動物の胸部及び腹部が視野内に存在するようにベッドを配置した。ｍｉｃｒｏＣａｔ  ＩＩ画像取得ソフトウェアを用いて、カメラ及びＣＴ走査パラメーターを下記のように設定した。
・総回転量は３６０°に設定した。
・回転ステップの総数は２００に設定した。
・較正照射の総数は２５に設定した。
・（約２００μｍの分解能が得られるように）ビニングを４×４に設定した。
・照射時間は４００ｍｓに設定した。
・カメラは５００μＡで７０ｋＶｐの電圧に設定した。
【００６９】
取得したデータは、画像再構成、可視化及び解析プログラム（ＲＶＡ２）を用いて再構成した。
【００７０】
Ｓｈｅｐｐ−Ｌｏｇａｎフィルターを適用しながら、Ｖｏｌｕｍｅ−３Ｄ（フェルドカンプコーンビーム）アルゴリズムを用いて全データセットを再構成した。これにより、トランスアキシャル（ｔｒａｎｓａｘｉａｌ）スライスを個別のＣＴファイルとして生成し、観察し、保存することができた。Ａｍｉｄｅでのさらなる解析のため、生の３Ｄデータセットをヘッダーファイルと共に保存した。
【００７１】
ＢＤＬ動物と偽手術動物との間には、術後２〜１５日目においてＰＥＴトレーサー１の肝臓保持量に有意差が示された。データは表１に示すと共に、図１及び図２に図示されている。
【００７２】
ＢＤＬ及び偽手術ラットにおける肝臓取込みの最大の差は９日目に認められ、偽手術での肝臓取込みが０．２７±０．０２％ＩＤ／ｃｃ（ｎ＝３）であるのに比べてＢＤＬでの肝臓取込みは０．８４±０．１０％ＩＤ／ｃｃ（ｎ＝３）であった。１５日目には、ＢＤＬで０．５３±０．０８％ＩＤ／ｃｃ（ｎ＝２）及び偽手術で０．２３±０．０２％ＩＤ／ｃｃ（ｎ＝２）が認められた。３０日目には、偽手術での０．２６±０．０２％ＩＤ／ｃｃ（ｎ＝４）に対してＢＤＬでは０．３６±０．１１％ＩＤ／ｃｃ（ｎ＝４）が認められ、ＰＥＴトレーサー１の取込みに有意差は存在しなかった（データは下記表１に要約されている）。
【００７３】
【表２】
2012529471.tif 000012
要するに、これらのデータは、ＰＥＴトレーサー１の取込みが術後２日目からＢＤＬ動物の肝臓のみにおいて有意に高いことを示しており、ＢＤＬ線維症モデルが肝臓におけるＰＥＴトレーサー１の結合の増加をもたらすことを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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