(57)【要約】  抗原を含み、且つ塩化ナトリウム濃度又はイオン強度が１００ｍＭ未満である免疫原性組成物と、それらの医学での使用とを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を含む免疫原性組成物であって、塩化ナトリウム濃度又は前記組成物のイオン強度が１００ｍＭ未満である、前記免疫原性組成物。
【請求項２】
前記抗原又は抗原製剤が、５ｍＭ超、１０ｍＭ超、１５ｍＭ超、２０ｍＭ超、３０ｍＭ超、４０ｍＭ超、５０ｍＭ超、６０ｍＭ超、７０ｍＭ超、８０ｍＭ超、９０ｍＭ超、又は１００ｍＭ超の塩化ナトリウム濃度を含むか又はイオン強度を有する溶液中に溶解後に、沈殿、凝固、又は凝集する任意の抗原である、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭ未満であり、前記抗原がＰＲＡＭＥ又はその断片若しくは誘導体である、請求項１又は２記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭ未満であり、前記抗原がＮＹ−ＥＳＯ−１又はその断片若しくは誘導体である、請求項１又は２記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記塩化ナトリウム濃度又はイオン強度が、約１００ｍＭ未満、約９０ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、約６０ｍＭ未満、約５０ｍＭ未満、約４０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、又は約１５ｍＭ未満である、請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記塩化ナトリウム濃度又はイオン強度が１０ｍＭ未満である、請求項５記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記塩化ナトリウム濃度又はイオン強度が５ｍＭ未満である、請求項６記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
実質的に塩化ナトリウムを含まない、請求項７記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
非イオン性等張性剤を更に含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記非イオン性等張性剤がポリオールである、請求項９記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記ポリオールがソルビトールである、請求項１０記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ソルビトールの濃度が約３％〜約１５％（ｗ／ｖ）である、請求項１１記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記ソルビトールの濃度が約４％〜約１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１２記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
約５ｍＭの塩化ナトリウム及び５％〜６％ｗ／ｖのソルビトールを含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
１種又は複数種の免疫刺激剤を含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記免疫刺激剤がサポニン及び／又はＴＬＲ−４アゴニストである、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
１種又は複数種の前記免疫刺激剤がリポソームの形態である、請求項１６記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記サポニンがＱｕｉｌＡ又はその誘導体である、請求項１６又は１７記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記ＱｕｉｌＡ誘導体がＱＳ２１である、請求項１８記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記ＴＬＲ−４アゴニストが３Ｄ−ＭＰＬである、請求項１６〜１９のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項１６〜２０のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
医学で使用するための、請求項１〜２１のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
癌の治療で使用するための、請求項１〜２１のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜２１のいずれか１項記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２５】
ａ．任意に免疫刺激性オリゴヌクレオチドと一緒に、抗原を凍結乾燥する工程；及び、
ｂ．工程ａ）の前記凍結乾燥組成物を、ＮａＣｌ濃度又はイオン強度が１００ｍＭ未満、９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、又は１０ｍＭ未満である水性アジュバント組成物によって再構成する工程、
を含む、請求項１〜２２のいずれか１項記載の免疫原性組成物を製造する方法。
【請求項２６】
ａ．任意にＣｐＧと一緒に共凍結乾燥された凍結乾燥抗原；及び、
ｂ．ＮａＣｌ濃度又はイオン強度が１００ｍＭ未満、９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、又は１０ｍＭ未満である水性アジュバント組成物、
を含むキット。
【請求項２７】
前記水性アジュバント組成物が、ＴＬＲ−４アゴニスト、及びリポソーム製剤中のサポニン、及び非イオン性等張性剤を含む、請求項２５記載の方法又は請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
前記非イオン性等張性剤がソルビトールである、請求項２７記載の方法又はキット。
【請求項２９】
前記ソルビトールの濃度が、約３％〜１５％（ｗ／ｖ）、約４％〜１０％（ｗ／ｖ）、又は約５％〜６％（ｗ／ｖ）である、請求項２８記載の方法又はキット。
【請求項３０】
前記サポニンがＱＳ２１である、請求項２７又は２８記載の方法又はキット。
【請求項３１】
前記ＴＬＲ−４アゴニストが３Ｄ−ＭＰＬである、請求項２７〜３０のいずれか１項記載の方法又はキット。
【請求項３２】
前記水性アジュバント組成物における前記ＮａＣｌ濃度が約５ｍＭである、請求項２５〜３１のいずれか１項記載の方法又はキット。
【請求項３３】
前記抗原が、ある濃度の塩化ナトリウムを含む溶液、又はイオン強度が１０ｍＭ超、２０ｍＭ超、３０ｍＭ超、４０ｍＭ超、５０ｍＭ超、６０ｍＭ超、７０ｍＭ超、８０ｍＭ超、９０ｍＭ超もしくは１００ｍＭ超である溶液中に溶解後に沈殿、凝固、又は凝集する、請求項２５〜３２のいずれか１項記載の方法又はキット。
【請求項３４】
前記抗原がＰＲＡＭＥ又はＮＹ−ＥＳＯ−１から選択される、請求項２５〜３３のいずれか１項記載の方法又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク抗原を含み、且つ、１００ｍＭ以下の塩化ナトリウム濃度を有する免疫原性組成物に関する。また、本発明は、抗原又は抗原製剤を含み、そして更に、１種もしくは複数種の免疫刺激剤を含む前記免疫原性組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク抗原の製剤は、確実に免疫原性を維持するために、極めて重要である。免疫刺激剤は、任意の所与の抗原に対する免疫応答を改善するために使用されることがある。しかしながら、ワクチン又は免疫原性組成物中へアジュバントを含有させることは、成分の調製の複雑性ならびにワクチン組成物の分配及び製剤化の複雑性を増大させる。調剤者は、アジュバント成分ならびに抗原成分のそれぞれの調製を考慮しなければならない。特に、抗原成分とアジュバント成分との適合性を考慮すべきである。それは、特に、凍結乾燥抗原又は抗原製剤がアジュバント製剤と一緒に再構成されることが意図される場合である。係る場合では、アジュバント製剤のバッファが、抗原又は抗原製剤に適していて、且つ、抗原の免疫原性又は溶解性がアジュバントから影響を受けないことが重要である。
【０００３】
タンパク抗原ＰＲＡＭＥ及びＮＹ−ＥＳＯ−１（それぞれ、米国特許第５８３０７５３号及び米国特許第５８０４３８１号に記載されている）又はそれらの断片若しくは誘導体は、癌の治療に関して潜在的な利点を有するタンパク抗原である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者は、ＰＲＡＭＥ及びＮＹ−ＥＳＯ−１のようないくつかの抗原は、塩化ナトリウムなどのような塩による飽和によって溶液からタンパク質が沈殿すると定義できる「塩析」として知られている現象に特に敏感であることを見出した。本発明者は、これらの抗原は、１５０ｍＭもの低い塩化ナトリウム濃度で凝集し沈殿することを見出した。
【０００５】
従って、一つの実施態様では、抗原又は抗原製剤は、５ｍＭ超、１０ｍＭ超、１５ｍＭ超、２０ｍＭ超、３０ｍＭ超、４０ｍＭ超、５０ｍＭ超、６０ｍＭ超、７０ｍＭ超、８０ｍＭ超、９０ｍＭ超、又は１００ｍＭ超の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度を含むか又はイオン強度を有する溶液中に溶解後に、沈殿、凝固、又は凝集する任意の抗原である。
【０００６】
本発明は、ＰＲＡＭＥ又はＮＹ−ＥＳＯ−１を含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、前記組成物における塩化ナトリウムの濃度は１００ｍＭ未満である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＱＳ２１の溶解活性曲線を示している図である。
【図２】異なるＡＳＡ製剤における各３Ｄ−ＭＰＬ同族体の％を示している図である。
【図３】ＰＲＡＭＥ／ＣｐＧの凍結乾燥のために使用される凍結・乾燥サイクルを示している図である。
【図４】ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）及びＡＳＡ（ソルビトール）中で再構成されたＰＲＡＭＥとＮＹＥＳＯ−１の画像による比較を示している図である。
【図５】実験１において異なるアジュバント組成物と一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスの体液性応答を示しているグラフである。
【図６】実験１において異なるアジュバント組成物と一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスの腫瘍防御を示しているグラフである。
【図７】実験２においてＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＡＳＡ（ソルビトール）、又は液体製剤ＡＳＡと一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスの体液性応答を示しているグラフである。
【図８】実験２においてＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＡＳＡ（ソルビトール）、又は液体製剤ＡＳＡと一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスのＣＤ４＋応答を示しているグラフである。
【図９】実験２においてＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＡＳＡ（ソルビトール）、又は液体製剤ＡＳＡと一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスの腫瘍防御を示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、本明細書記載の抗原を含む免疫原性組成物を提供し、塩化ナトリウムの濃度は１００ｍＭ未満である。特に、本発明は、抗原を含む免疫原性組成物を提供し、塩化ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭ未満であり、例えば約９０ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、約６０ｍＭ未満、約５０ｍＭ未満、約４０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、又は約１５ｍＭ未満である。特定の実施態様では、免疫原性組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、１０ｍＭ未満又は５ｍＭ以下である。更なる特定の実施態様では、免疫原性組成物は、塩化ナトリウムを実質的に含有していない。実質的に含有していないとは、塩化ナトリウムの濃度が、０ｍＭか又は殆ど０ｍＭに近いという意味である。
【０００９】
当業者は、公知の技術及びキットを使用して、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）及び塩化物イオン（Ｃｌ−）の両方の濃度を容易に検査できる。例えば、ナトリウムは、Ｂｉｏｓｕｐｐｌｙから市販されているＳｏｄｉｕｍ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号：ＢＱ０１１ＥＡＥＬ）のようなキットを使用して測定できる。塩化物は、Ｂｉｏｓｕｐｐｌｙから市販されているＣｈｌｏｒｉｄｅ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号：ＢＱ００６ＥＡＥＬ）のようなキットを使用して測定できる。
【００１０】
本発明の更なる実施態様では、本明細書記載の抗原を含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、イオン強度は、１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満である。特定の実施態様では、免疫原性組成物のイオン強度は、１０ｍＭ未満又は５ｍＭ以下である。更なる特定の実施態様では、免疫原性組成物は、０ｍＭか又は殆どゼロに近いイオン強度（すなわち、１、２、３ｍＭ）を有する。
【００１１】
本発明のアジュバント又は免疫原性組成物のイオン強度は、当業者に公知の技術を使用して、例えば導電率計を使用して、測定できる。
【００１２】
従って、一つの実施態様では、抗原又は抗原製剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度を含む溶液中に溶解後に、又は、前記溶液のイオン強度が、５ｍＭ超、１０ｍＭ超、１５ｍＭ超、２０ｍＭ超、３０ｍＭ超、４０ｍＭ超、５０ｍＭ超、６０ｍＭ超、７０ｍＭ超、８０ｍＭ超、９０ｍＭ超、又は１００ｍＭを超えている溶液中に溶解後に、沈殿、凝固、又は凝集する任意の抗原である。当業者は、前記溶液中に抗原を溶解させることによって且つ／又は混合することによって、抗原が、この定義を満たすかどうかを決定できる。この定義を満たさない抗原は、溶解され且つ／又は混合されてから２４時間後に、依然として溶液中に存在する。すなわち液体は沈殿が無く依然として明澄である。１００ｍＭの塩化ナトリウム濃度を含む溶液中に溶解後に、沈殿、凝固、又は凝集する抗原は、２４時間又はそれに満たない時間後に、溶液の曇りによって、沈殿していることを確認できる抗原である。更に、視覚的に確認できない凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを含むが、これに限定されない、当業者に公知の方法を使用して観察し得る。
【００１３】
一つの実施態様では、抗原を含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、塩化ナトリウムの濃度は、１００ｍＭ未満であり、例えば約９０ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、約６０ｍＭ未満、約５０ｍＭ未満、約４０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、約１５ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、又は約５ｍＭ未満であり、そして、前記抗原は、ＰＲＡＭＥ（ＤＡＧＥとしても公知である）、又はその断片若しくは誘導体である。
【００１４】
本発明の更なる実施態様では、抗原を含む免疫原性組成物を提供する。その場合、前記組成物のイオン強度は、１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満であり、そして、前記抗原は、ＰＲＡＭＥ（ＤＡＧＥとしても公知である）、又はその断片若しくは誘導体である。特定の実施態様では、免疫原性組成物のイオン強度は、１０ｍＭ未満又は５ｍＭ以下であり、その場合、前記抗原は、ＰＲＡＭＥ又はその断片若しくは誘導体である。
【００１５】
前記抗原及びその調製は、米国特許第５，８３０，７５３号に記載されている。ＰＲＡＭＥは、アクセッション番号：Ｕ６５０１１．１、ＢＣ０２２００８．１、ＡＫ１２９７８３．１、ＢＣ０１４９７４．２、ＣＲ６０８３３４．１、ＡＦ０２５４４０．１、ＣＲ５９１７５５．１、ＢＣ０３９７３１．１、ＣＲ６２３０１０．１、ＣＲ６１１３２１．１、ＣＲ６１８５０１．１、ＣＲ６０４７７２．１、ＣＲ４５６５４９．１、及びＣＲ６２０２７２．１で、Ａｎｎｏｔａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｈ−ＩｎｖＤＢにおいて見出される。
【００１６】
ＰＲＡＭＥ抗原を含む融合タンパク質を用いることもできる。ＰＲＡＭＥ又はその断片若しくは誘導体は、任意に異種融合パートナーとの融合タンパク質の形態で、使用し得る。特に、ＰＲＡＭＥ抗原は、Ｂ型インフルエンザ菌に由来するＤタンパク質（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ）との又はその一部分との又はその誘導体との融合タンパク質の形態で、好適に使用され得る。好適に使用され得るＤタンパク質の一部分は、分泌配列又はシグナル配列を含んでいない。好適には、前記融合パートナータンパク質は、融合タンパク質配列のＮ末端基に又はＮ末端基内にアミノ酸Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを含み、そして、前記融合パートナータンパク質は、Ｄタンパク質の分泌配列又はシグナル配列を含んでいない。例えば、融合パートナータンパク質は、おおよそ又は正確には、１７〜１２７アミノ酸、１８〜１２７アミノ酸、１９〜１２７アミノ酸、又は２０〜１２７アミノ酸のＤタンパク質を含み得るか又はから成り得る。Ｄタンパク質を有する融合タンパク質を主成分とする好適なＰＲＡＭＥ抗原は、その内容が参照により本明細書に完全に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８／０８７１０２号に記載されている。
【００１７】
一つの実施態様では、抗原を含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、塩化ナトリウムの濃度は、１００ｍＭ未満であり、例えば約９０ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、約６０ｍＭ未満、約５０ｍＭ未満、約４０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約２０  ｍＭ未満、約１５ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、又は約５ｍＭ未満であり、そして、前記抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、又はその断片若しくは誘導体である。
【００１８】
本発明の更なる実施態様では、抗原を含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、前記組成物のイオン強度は、１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満であり、そして、前記抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、又はその断片若しくは誘導体である。特定の実施態様では、免疫原性組成物のイオン強度は、１０ｍＭ未満であるか又は５ｍＭ以下であり、そして、抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、又はその断片若しくは誘導体である。
【００１９】
完全長又は断片又は誘導体であり得るＮＹ−ＥＳＯ−１は、任意に異種融合パートナーとの融合タンパク質の形態で、使用し得る。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、その内容が参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第５８０４３８１号に記載されている。タンパク質ＮＹ−ＥＳＯ−１は、長さは約１８０アミノ酸であり、次の３つの領域から構成されていると説明できる：（ａ）約１〜７０アミノ酸のＮ末端領域、（ｂ）約７１〜１３４アミノ酸の中央領域、及び（ｃ）約１３５〜１８０アミノ酸のＣ末端領域。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、融合タンパク質として、例えば、ＬＡＧＥ−１又はその断片との融合タンパク質として使用し得る。参照により本明細書にその内容が完全に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８／０８９０７４号を参照されたい。ＮＹ−ＥＳＯ−１の断片を使用する場合、これらは、好適には、１個又は複数個のＭＨＣクラス１エピトープ又はＭＨＣクラス２エピトープを、例えばＡ３１、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＰ４、Ｂ３５、Ｂ５１、Ｃｗ３、Ｃｗ６、及びＡ２として公知の前記エピトープを含む（国際公開第ＷＯ２００８／０８９０７４号を参照されたい）。
【００２０】
ＮａＣｌそれ自体に対して敏感ではないが、本発明に従って使用し得る更なる抗原は、ＭＡＧＥ抗原、例えばＭＡＧＥ−３ファミリーのＭＡＧＥ抗原、例えばＭＡＧＥ−Ａ３である。ＭＡＧＥ−３抗原は、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１と組み合わせて配合するのに適していると記載されてきた。参照により本明細書にその内容が完全に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００５／１０５１３９号を参照されたい。
【００２１】
ＭＡＧＥ−Ａ３のようなＭＡＧＥ抗原は、そのままで、又は誘導体の形態で、例えば、化学的に修飾された誘導体の形態で且つ／又は異種融合パートナーとの融合タンパク質の形態で使用し得る。例えば、ＭＡＧＥ抗原は、例えばカルボキサミド基又はカルボキシメチル基によって誘導体化されてきた遊離チオールを生成するジスルフィド架橋を低減させた状態で含み得る。参照により本明細書にその内容が完全に組み込まれる国際公開第ＷＯ９９／４０１８８号を参照されたい。特に、ＭＡＧＥ抗原は、Ｂ型インフルエンザ菌に由来するＤタンパク質又はその一部分又はその誘導体との融合タンパク質の形態で、好適に使用され得る。例えば、Ｄタンパク質の約１／３又はＤタンパク質のＮ末端１００〜１１０アミノ酸を、融合パートナーとして使用し得る。国際公開第ＷＯ９９／４０１８８を参照されたい。
【００２２】
更なる実施態様では、抗原又は抗原性組成物は、本明細書記載の抗原のいずれかの誘導体であり得る。本明細書で使用される用語「誘導体」とは、その天然形態と比較して修飾された抗原を指す。本発明の誘導体は、天然抗原と十分に類似しており、抗原特性を保持し、天然抗原に対して引き起こされる免疫応答を可能にする能力を維持している。所与の誘導体が生じるかどうかに関わらず、そのような免疫応答は、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーなどの好適な免疫学的アッセイにより測定できる。
【００２３】
本明細書で使用される用語「断片」とは、少なくとも１個のエピトープ、例えば、ＣＴＬエピトープ、典型的には、少なくとも８アミノ酸のペプチドを含む腫瘍関連抗原の断片又は前記抗原の誘導体を指している。少なくとも８、例えば、８〜１０アミノ酸長又は最大で２０、５０、６０、７０、１００、１５０若しくは２００のアミノ酸長の断片は、その断片が抗原性を示す限り、すなわち、主要なエピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）が前記断片により保持され、そして前記断片が天然の腫瘍関連抗原と交差反応する免疫応答を誘導できる限り、本発明の範囲内にあると考えられる。断片の例は、長さ８〜１０、１０〜２０、２０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００アミノ酸の残基であり得る（これらの範囲内の任意の値を含む）。
【００２４】
免疫原性組成物は、１種若しくは複数種の更なる抗原を含み得る。
【００２５】
非経口投与にとって、溶液は、細胞の変形又は溶解を回避するために、生理的に等張であるべきである（すなわち、薬学的に許容可能な浸透圧重量モル濃度を有するべきである）ことは公知である。「等張性剤」とは、生理的に許容され、且つ、製剤（例えば本発明の免疫原性組成物）に対して適当な張性を付与して製剤と接触している細胞膜全体にわたる水の純流動を防止する化合物である。
【００２６】
一般的に、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、等張性剤として使用される。本発明者は、特定の抗原が、本明細書記載の本発明の免疫原性組成物を等張にするための別の手段であって、溶液中に高濃度の塩を含む時に溶液中のタンパク質が凝集又は凝固するプロセスである「塩析」に対して特に敏感であることを示している。
【００２７】
特定の実施態様では、非イオン性等張性剤を更に含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物で使用するための適当な非イオン性等張性剤は、ヒトでの使用に適している必要があり、且つ、抗原性組成物中の抗原と適合性である必要があり、そして更に免疫刺激剤（１種若しくは複数種）のような他の成分とも適合性である必要がある。
【００２８】
本発明の一つの実施態様では、好適な非イオン性等張性剤は、ポリオール、糖（特にスクロース、フルクトース、デキストロース、若しくはグルコース）、又はアミノ酸、例えばグリシンである。一つの実施態様では、ポリオールは、糖アルコール、特にＣ３〜Ｃ６糖アルコールである。糖アルコールの例としては、グリセリン、エリスリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール、及びイジトールが挙げられる。この実施態様の特定の例では、適切な非イオン性等張性剤は、ソルビトールである。本発明の特定の実施態様では、本発明組成物における非イオン性等張性剤は、スクロース又はソルビトールである。
【００２９】
一つの実施態様では、免疫原性組成物中のポリオールの好適な濃度は、約３〜約１５％（ｗ／ｖ）、特に約３〜約１０％（ｗ／ｖ）、例えば約３〜約７％（ｗ／ｖ）、例えば約４〜約６％（ｗ／ｖ）である。この実施態様の特定の例では、ポリオールは、ソルビトールである。
【００３０】
本発明の特定の実施態様では、免疫原性組成物は、１種又は複数種の免疫刺激剤を含む。
【００３１】
一つの実施態様では、この免疫刺激剤は、サポニンであり得る。本発明の使用に適するサポニンは、Ｑｕｉｌ  Ａ及びその誘導体である。Ｑｕｉｌ  Ａは、南米の木Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａから単離されるサポニン製剤であり、Ｄａｌｓｇａａｒｄ  ら  によって、アジュバント活性を有すると１９７４年にはじめて記載された（"Ｓａｐｏｎｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ"， Ａｒｃｈｉｖ．  ｆｕｅｒ  ｄｉｅ  ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ， Ｖｏｌ．  ４４，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  ｐ２４３−２５４）。Ｑｕｉｌ  Ａ、例えばＱＳ７及びＱＳ２１（ＱＡ７及びＱＡ２１としても公知である）と関連のある毒性を有していないアジュバント活性を保持しているＱｕｉｌ  Ａの精製断片を、ＨＰＬＣで単離した（欧州特許第０  ３６２  ２７８号）。ＱＳ−２１は、Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮から誘導される天然サポニンであり、そしてそれは、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞、及び優勢なＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導する。ＱＳ２１は、本発明の文脈において好適なサポニンである。
【００３２】
本発明の好適な形態では、免疫原性組成物中のサポニンアジュバントは、ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｍｏｌｉｎａ  ｑｕｉｌ  Ａの誘導体、好ましくはＱｕｉｌ  Ａ、例えばＱＳ−１７又はＱＳ−２１、好適にはＱＳ−２１の免疫学的に活性な断片である。
【００３３】
特定の実施態様では、ＱＳ２１は、外因性ステロール、例えばコレステロールによってクエンチされる、より反応源性が低いＱＳ２１組成物として提供される。外因性コレステロールによってＱＳ２１がクエンチされる反応源性が更に低い組成物のいくつかの特定の形態が、存在する。特定の実施態様では、サポニン／ステロールは、リポソーム構造の形態である（国際公開第ＷＯ９６／３３７３９号、実施例１）。その実施態様では、リポソームは、好適には室温で非晶質である中性脂質、例えば、ホスファチジルコリン、例えば卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、又はジラウリルホスファチジルコリンを好適に含む。リポソームは、飽和脂質から成るリポソームのためのリポソーム−ＱＳ２１構造の安定性を増加させる荷電脂質（ｃｈａｒｇｅｄ  ｌｉｐｉｄ）も含み得る。これらの場合、荷電脂質の量は、好適には１〜２０％ｗ／ｗ、好ましくは５〜１０％である。リン脂質に対するステロールの比率は、１〜５０％（モル／モル）、好適には２０〜２５％である。
【００３４】
適当なステロールとしては、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、及びコレステロールが挙げられる。一つの特定の実施態様では、免疫原性組成物は、ステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは、当業において公知であり、例えば、コレステロールは、動物脂肪中に見出される天然ステロールとしてＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，  第１１版，第３４１頁に開示されている。
【００３５】
活性サポニン断片がＱＳ２１である場合、ＱＳ２１対ステロールの比は：典型的には１：１００〜１：１で（ｗ／ｗ）、好適には１：１０〜１：１（ｗ／ｗ）、そして好ましくは１：５〜１：１（ｗ／ｗ）のオーダーである。好適には、過剰なステロールが存在し、Ｑ２１：ステロールの比は、少なくとも１：２（ｗ／ｗ）である。一つの実施態様では、ＱＳ２１：ステロールの比は、１：５（ｗ／ｗ）である。ステロールは、好適にはコレステロールである。
【００３６】
別の実施態様では、免疫原性組成物は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストである免疫刺激剤を含む。「ＴＬＲアゴニスト」とは、直接リガンドとして、又は内因性若しくは外因性リガンドの生成を介して間接的に、ＴＬＲシグナリング経路を介してシグナル応答を引き起こすことができる成分を意味している（Ｓａｂｒｏｅら、ＪＩ  ２００３  ｐ１６３０−５）。ＴＬＲ４アゴニストは、ＴＬＲ−４シグナリング経路を介してシグナル応答を引き起こすことができる。ＴＬＲ４アゴニストの好適な例は、リポポリサッカライド、好適にはリピドＡの無毒性誘導体、特にモノホスホリルリピドＡ、又は更に特に３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。
【００３７】
３Ｄ−ＭＰＬは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｎ．Ａ．によりＭＰＬの名称で販売されており、本明細書全体においてＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬと称する。例えば、米国特許第４，４３６，７２７号、第４，８７７，６１１号、第４，８６６，０３４号、及び第４，９１２，０９４号を参照されたい。３Ｄ−ＭＰＬは、主にＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１）表現型を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞性応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、英国特許第ＧＢ２２２０２１１Ａ号に開示された方法に従って製造できる。化学的には、３Ｄ−ＭＰＬは、３、４、５、又は６位がアシル化された鎖を有する３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。本発明の組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用して免疫原性組成物を調製し得る。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターを通して濾過滅菌できる粒子径を有する。そのような調製物は、国際公開第ＷＯ９４／２１２９２号に記載されている。好ましくは、粉末状の３Ｄ−ＭＰＬを使用して、本発明の免疫原性組成物を調製する。
【００３８】
使用できる他のＴＬＲ４アゴニストは、アルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）、例えば国際公開第ＷＯ９８／５０３９９号又は米国特許第６，３０３，３４７号（ＡＧＰの調製法も開示されている）で開示されているＡＧＰ、好適にはＲＣ５２７又はＲＣ５２９又は米国特許第６，７６４，８４０号に開示されているＡＧＰの薬学的に許容可能な塩である。ＴＬＲ４アゴニストであるＡＧＰもあれば、ＴＬＲ４アンタゴニストであるＡＧＰもある。両方とも、免疫刺激剤として有用であると考えられる。
【００３９】
他の適当なＴＬＲ−４アゴニストは、国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号及び国際公開第ＷＯ２００３／０９９１９５号に記載されており、例えば国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号の４〜５ページ又は国際公開第ＷＯ２００３／０９９１９５号の３〜４ページに化合物Ｉ、化合物ＩＩ、及び化合物ＩＩＩとして開示されており、そして、特に、ＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７ｍ、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０、及びＥＲ８０４７６４として国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号で開示されている。例えば、１つの適当なＴＬＲ−４アゴニストは、ＥＲ８０４０５７である。
【００４０】
特定の実施態様では、免疫原性組成物は、サポニン及びＴＬＲ４アゴニストの両方を含む。特定の例では、免疫原性組成物は、ＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬを含む。
【００４１】
例えばリポポリサッカライド、例えば３Ｄ−ＭＰＬなどのようなＴＬＲ−４アゴニストは、免疫原性組成物のヒト１用量当たり１〜１００μｇの量で使用できる。３Ｄ−ＭＰＬは、約５０μｇのレベルで、例えば、４０〜６０μｇ、好適には４５〜５５μｇ、又は４９〜５１μｇ、又は５０μｇのレベルで使用し得る。更なる実施態様では、免疫原性組成物のヒト用量は、約２５μｇのレベルで、例えば２０〜３０μｇ、好適には２１〜２９μｇ、又は２２〜２８μｇ、又は２８〜２７μｇ、又は２４〜２６μｇ、又は２５μｇのレベルで、３Ｄ−ＭＰＬを含む。
【００４２】
ＱＳ２１などのようなサポニンは、免疫原性組成物のヒト１用量当たり１〜１００μｇの量で使用できる。ＱＳ２１は、約５０μｇのレベルで、例えば、４０〜６０μｇ、好適には４５〜５５μｇ、又は４９〜５１μｇ、又は５０μｇのレベルで使用し得る。更なる実施態様では、免疫原性組成物のヒト用量は、約２５μｇのレベルで、例えば２０〜３０μｇ、好適には２１〜２９μｇ、又は２２〜２８μｇ、又は２８〜２７μｇ、又は２４〜２６μｇ、又は２５μｇのレベルで、ＱＳ２１を含む。
【００４３】
ＴＬＲ４アゴニスト及びサポニンの両方が免疫原性組成物中に存在する場合、ＴＬＲ４アゴニスト対サポニンの重量比は、好適には１：５〜５：１、好適には１：１である。例えば、３Ｄ−ＭＰＬが５０μｇ又は２５μｇの量で存在する場合、好適には、ＱＳ２１も、免疫原性組成物のヒト１用量当たりそれぞれ５０μｇ又は２５μｇの量で存在し得る。
【００４４】
一つの実施態様では、免疫刺激剤は、例えば国際公開第ＷＯ２００８／１４２１３３号に記載されているように、ＴＬＲ９アゴニストである。特定の例では、前記ＴＬＲ９アゴニストは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、特に、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである。前記オリゴヌクレオチドは、公知であり、例えば国際公開第ＷＯ９６／０２５５５号、国際公開第ＷＯ９９／３３４８８号及び米国特許第５，８６５，４６２号に記載されている。本明細書記載の免疫原性組成物で使用するための好適なＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、少なくとも３つ、好適には少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって分離された２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを任意に含む。ＣｐＧモチーフは、シトシンヌクレオチドと、それに続くグアニンヌクレオチドを含む。
【００４５】
一実施形態においては、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート、又はおそらくホスホロチオエート結合であるが、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドなどの、ホスホジエステル及び他のヌクレオチド間結合を用いることもできる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオエートを製造する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、第５，２７８，３０２号、及びＷＯ９５／２６２０４に記載されている。様々なヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチド、例えば、混合ホスホロチオエートホスホジエステルが企図される。オリゴヌクレオチドを安定化する他のヌクレオチド間結合を使用し得る。
【００４６】
本明細書記載の免疫原性組成物に含有させるのに適するＣｐＧオリゴヌクレオチドの例は、次の配列を有する。一つの実施態様では、これらの配列は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含む：
オリゴ１（配列番号１）：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ（ＣｐＧ  １８２６）  
オリゴ２（配列番号２）：ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ（ＣｐＧ  １７５８）  
オリゴ３（配列番号３）：ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ  
オリゴ４（配列番号４）：ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（ＣｐＧ  ２００６）
オリゴ５（配列番号５）：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ（ＣｐＧ  １６６８）
代替的なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、それらがその中に重要でない欠失又は付加を有する上記配列を含んでいてもよい。
【００４７】
一つの実施態様では、免疫刺激剤はトコールである。トコールは、当業において公知であり、欧州特許第ＥＰ０３８２２７１号に記載されている。特定の実施態様では、トコールは、α−トコフェロール又はその誘導体であり、例えばα−トコフェロールスクシネート（ビタミンＥスクシネートとしても公知）である。
【００４８】
本発明は、以下の工程を含む、本発明の免疫原性組成物を作る方法も提供する：
ａ．任意に本明細書記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドと一緒に、本明細書記載の抗原を凍結乾燥する工程；及び
ｂ．水性アジュバント組成物によって工程ａ）の凍結乾燥組成物を再構成する工程。
【００４９】
その場合、ＮａＣｌの濃度又は水性アジュバント組成物のイオン強度は、１００ｍＭ未満、９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、又は１０ｍＭ未満である。
【００５０】
特定の実施態様では、凍結乾燥抗原は、１０ｍＭ超、２０ｍＭ超、３０ｍＭ超、４０ｍＭ超、５０ｍＭ超、６０ｍＭ超、７０ｍＭ超、８０ｍＭ超、９０ｍＭ超、又は１００ｍＭ超の、塩化ナトリウム濃度を含む溶液中に又はイオン強度を有する溶液中に溶解後に、沈殿、凝固、又は凝集する任意の抗原である。更なる実施態様では、凍結乾燥抗原は、ＰＲＡＭＥ又はＮＹ−ＥＳＯ−１の群から選択される。
【００５１】
一つの実施態様では、工程ｂ）のアジュバント組成物（上記）は、本明細書記載のサポニン及び／又はＴＬＲ−４アゴニスト、例えばＱＳ２１及び／又は３Ｄ−ＭＰＬを含む。更なる実施態様では、サポニン及び／又はＴＬＲ４アゴニストは、リポソーム製剤中に存在する。一つの実施態様では、アジュバント組成物は、リポソーム製剤の形態でＴＬＲ４アゴニスト及びサポニンを含み、そして更に、本明細書記載の非イオン性等張性剤を含む。
【００５２】
特に、本発明のアジュバント組成物は、ソルビトールを含み得る。
【００５３】
本発明の更なる実施態様では：
ａ．任意にＣｐＧと一緒に共凍結乾燥された凍結乾燥抗原；及び
ｂ．ＮａＣｌ濃度又はイオン強度が１００ｍＭ未満、９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、又は１０ｍＭ未満である水性アジュバント組成物
を含むキットを提供する。
【００５４】
本発明の特定の実施態様では、本明細書記載のキット中の抗原は、ＰＲＡＭＥ又はＮＹ−ＥＳＯ−１、及びそれらの断片且つ／又は誘導体を含む。
【００５５】
代替実施態様では、ＣｐＧが抗原と一緒に共凍結乾燥されないキットを提供する。ＣｐＧは、水性アジュバント組成物と混合してもよいか、又は、水性形態若しくは凍結乾燥形態で別々のバイアルに入れておいてもよい。
【００５６】
本発明のキットで使用される水性アジュバントは、本明細書で規定されるアジュバント組成物のいずれかであり得る。本発明の特定の実施態様では、水性アジュバント組成物は、リポソームの形態でＴＬＲ４アゴニスト及び／又はサポニンを含む。特定の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは３Ｄ−ＭＰＬであり、サポニンはＱＳ２１である。本発明で使用される水性アジュバントは、等張性剤、例えばソルビトールなどのようなポリオールを含んでいてもよい。
【００５７】
本発明は、更に、癌の免疫療法治療で使用するために、本明細書記載の免疫原性組成物を提供する。
【００５８】
この実施態様の具体例では、本発明は、前立腺、胸部、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、卵巣、又は黒色腫の癌から成る群より選択される１種以上の癌の免疫療法治療で使用するために、本明細書記載の免疫原性組成物を提供する。
【００５９】
本発明は、更に、本明細書記載の免疫原性組成物の有効量を個人(個体)に提供する工程を含む、必要な個人(個体)における癌の治療法又は予防法を提供する。
【００６０】
この実施態様の具体例では、本発明は、前立腺、胸部、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、卵巣、又は黒色腫の癌から成る群より選択される癌の治療法又は予防法を提供する。
【実施例】
【００６１】
以下の非限定な実施例によって本発明を更に説明する。
【００６２】
実施例１：アジュバント組成物ＡＳＡ（ソルビトール）の調製
リポソーム製剤の形態で３−脱アシル化ＭＰＬ及びＱＳ２１を含むアジュバント組成物を調製した。それは以下のようにして調製した。
【００６３】
Ａ．リポソームの調製法：
有機溶媒中、脂質（例えば、合成ホスファチジルコリン）、コレステロール、及び３―Ｏ脱アシル化ＭＰＬの混合物を、真空下で乾燥させた。次いで、水溶液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水［１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  リン酸塩  ｐＨ６．１］）を添加し、全ての脂質が懸濁液になるまで、容器を撹拌した。次いで、その懸濁液を、高剪断ミキサーでプレホモジナイズし、そして、ＤＬＳで測定した場合にリポソームサイズがおおよそ９０ｎｍ＋／−１０ｎｍに低下するまで、高圧ホモジナイズした。次いで、リポソームを濾過滅菌した。
【００６４】
Ｂ．ＡＳＡ製剤：
工程１：濃縮リポソームの希釈
Ｎａ２／Ｋリン酸塩バッファ１００ｍＭ  ｐＨ６．１を、注射用水に加えて１０倍に希釈し、リン酸塩バッファ濃度を最終製剤において１０ｍＭにした。次いで、注射用水（ＷＦＩ）中３０％（ｗ／ｖ）ソルビトール溶液を加えて、最終製剤において４．７％の濃度にし、そしてそれを、室温で、１５〜４５分間撹拌した。
【００６５】
次いで、濃縮リポソーム（それぞれ４０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、及び２ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、コレステロール、及びＭＰＬで作られている）を混合物に加えて、最終製剤におけるＭＰＬの濃度を１００μｇ／ｍｌにした。
【００６６】
続いて、その混合物を、室温で、１５〜４５分間、撹拌した。
【００６７】
工程２：ＱＳ２１の添加
蠕動ポンプを使用して、ＱＳ２１バルク貯蔵品（２００ｍｌを、室温で２４時間又は４℃で２日で解凍した）を、２００ｍｌ／分の速度で、磁気撹拌しながら、希釈リポソームに加えて、最終製剤における濃度を１００μｇ／ｍｌにした。その混合物を、１５〜４５分間、撹拌した。
【００６８】
最終的なＡＳＡ製剤は、１ｍｌ当たりＭＰＬを１００μｇ及びＱＳ２１を１００μｇ含んでいた。
【００６９】
工程３：６．１＋／−０．３であるようにｐＨをチェックした。
【００７０】
工程４：濾過滅菌
濾過滅菌法は、ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）フィルターによって、４００ｍｌ／分の一定速度で行った。
【００７１】
工程５：＋２℃〜＋８℃で貯蔵
リポソーム製剤の形態で３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ及びＱＳ２１を含み、且つソルビトール（ＡＳＡ（ソルビトール）と呼ぶ）を含有するアジュバント組成物を得た。次いで、それを４℃で貯蔵した。
【００７２】
実施例２：アジュバント組成物ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）の調製
Ａ．リポソームの調製法：
有機溶媒中、脂質（例えば、合成ホスファチジルコリン）、コレステロール、及び３−脱アシル化ＭＰＬ（３Ｄ−ＭＰＬ）の混合物を、真空下で乾燥させた。次いで、リン酸塩緩衝生理食塩水を加え、全ての脂質が懸濁液になるまで、容器を撹拌した。次いで、その懸濁液ＷＡｓを、高剪断ミキサーでプレホモジナイズし、そして、ＤＬＳで測定した場合にリポソームサイズがおおよそ９０ｎｍ＋／−１０ｎｍに低下するまで、高圧ホモジナイズした。次いで、リポソームを、０．２２μｍのＰＥＳ膜で濾過滅菌した。
【００７３】
Ｂ．ＡＳＡ製剤：
工程１：濃縮リポソームの希釈
Ｎａ２／Ｋリン酸塩バッファ１００ｍＭ  ｐＨ６．４５及びＮａＣｌ １.５Ｍを、注射用水に加えて１０倍に希釈し、最終製剤においてリン酸塩濃度を１０ｍＭ及びＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭにした。この混合物を、室温で５分間、攪拌した。次いで、濃縮リポソーム（それぞれ４０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、及び２ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、コレステロール、及びＭＰＬで作られている）を混合物に加えて、最終製剤におけるＭＰＬの濃度を１００μｇ／ｍｌにした。続いて、その混合物を、室温で、５〜１５分間、撹拌した。
【００７４】
工程２：ＱＳ２１の添加
ＱＳ２１バルク貯蔵品（２００ｍｌを、室温で２４時間又は４℃で２日で解凍した）を、磁気撹拌しながら、希釈リポソームに加えて、最終製剤における濃度を１００μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で撹拌した。
【００７５】
工程３：６．１＋／−０．１であるようにｐＨをチェックした。
【００７６】
工程４：濾過滅菌
濾過滅菌法は、ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）フィルターによって行った。
【００７７】
工程５：＋２℃〜＋８℃での貯蔵
ＡＳＡの最終組成物は、１ｍｌ当たり、２ｍｇのＤＯＰＣ、５００μｇのコレステロール、１００μｇの３−Ｏ脱アシル化ＭＰＬ、１００μｇのＱＳ２１であった。
【００７８】
実施例３：ＱＳ２１溶解活性
ＱＳ２１は、赤血球（ＲＢＣ）を溶解することが知られている。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む等価なアジュバント組成物（ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ））に関して認められるのと同じ方法で確実にＱＳ２１溶解活性をクエンチするために、実施例１で調製したＡＳＡ（ソルビトール）アジュバント組成物を試験した。
【００７９】
ＱＳ２１溶解活性は、ニワトリ赤血球（ＲＢＣ）を使用する溶血作用分析で測定した。ＲＢＣを、４℃で５５０ｇで遠心分離した。上清を除去した。ペレットを注意深くＰＢＳバッファ中に再懸濁させて、初期の体積にした。同じ操作を、上精が赤くならなくなるまで繰り返した（一般的に３回）。直ちに使用しない場合、ペレットは、４℃で最大３〜４日間貯蔵した（使用する日には再び洗浄した）。又は、同じ日に使用する場合は、バッファで約１０倍に希釈した。
【００８０】
ＱＳ２１用量範囲曲線を、ＡＳＡバッファで（試験したＡＳＡサンプルの後には塩バッファで又はソルビトールバッファで）用事作製し、そして、アジュバントサンプル（５００μｌ又は９００μｌのＡＳＡを意味する５０μｇ又は９０μｇ当量のＱＳ２１を含む）を調製した。最終体積は、（試験されるサンプルのバッファの役割としてソルビトールを含む又は含まない）十分なバッファによって、標準とサンプルを９００μｌに調整した。その蛋白光に起因して、ＡＳＡは、光学密度（ＯＤ）に干渉する。そこで、ＡＳＡ「ブランク」を調製し、そしてそれらのＯＤを、ＡＳＡ試験サンプルのＯＤから減じた。それらのブランクは、サンプルにおいて試験される体積と同じＡＳＡ体積と一致するが、バッファで１ｍｌに調整した。ＲＢＣは、これらのブランクには加えなかった。次いで、標準及びサンプルを、室温で、３０分間、ＲＢＣ（９００μｌの標準及びサンプルに１００μｌの希釈ＲＢＣを加えた）と一緒にインキュベートした。次いで、サンプルを、９００ｇで５分間、遠心分離した。５４０ｎｍにおける光学密度を、遠心分離後に測定した。
【００８１】
溶解活性の測定は、限度試験によって実施した。
【００８２】
１．検出限界（ＬＯＤ）は、ＯＤを導くＱＳ２１の最低濃度と定義した：
−  ベースレベル（ＯＤ＞０．１）に比べて高い
−  ＯＤのバッファ（「０μｇ」ＱＳ２１）に比べて約３倍高い
−  曲線の上昇部分において
−  各試験について測定した。
【００８３】
２．アジュバントサンプルに関するＯＤがＯＤＬＯＤに比べて大きい場合、ＱＳ２１溶解活性は、アジュバントサンプルにおいて陽性であるように保たれた。
【００８４】
ＱＳ２１曲線の例：
【表１】
2012529465.tif 000002
【００８５】
＊５０μｇ当量のＱＳ２１を試験した。１５０ｍＭの塩化ナトリウムバッファ。
【００８６】
このアッセイにおける検出限界は、０．９μｇ  ＱＳ２１であり、０．１２のＯＤである。
【００８７】
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むアジュバント組成物におけるＱＳ２１のクエンチングは、試験された５０μｇ当量のＱＳ２１に関して９８．２％を超えていると評価された。試験された９０μｇ当量の場合、判定は、９９％を超えている。
【００８８】
次いで、ＱＳ２１クエンチングを、ソルビトールと、わずか５ｍＭの塩化ナトリウムとを含む等価なアジュバント組成物と比較した。データは、４℃でＡＳＡを貯蔵した後又は安定性を促進させた後に（３７℃で７日）、得た。ソルビトール中ＡＳＡに関しては、ＱＳ２１標準曲線を、ソルビトール含有バッファにおいて得た。
【表２】
2012529465.tif 000003
【００８９】
＊９０μｇ当量のＱＳ２１を試験した以外は、５０μｇ当量のＱＳ２１を試験した。
【００９０】
ＱＳ２１は、低濃度の塩化ナトリウムバッファで十分にクエンチされた。
【００９１】
実施例４：ＭＰＬ同族体
化学的には、３Ｄ−ＭＰＬは、４、５又は６位がアシル化された鎖を有する３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。各異なる３Ｄ−ＭＰＬ分子は、同族体と呼ぶ。同族体組成は、一定のままであり、同族体割合間のシフトはないことが重要である。使用されるいかなるバッファも、アジュバント組成物を作るために使用される濃縮リポソーム中における組成と同族体組成を同じにできることも重要である。
【００９２】
図２に示してあるように、同族体組成を、３Ｄ−ＭＰＬ濃縮リポソーム（濃縮リポソームＬＩＰ０７−２１７、図２の第１カラム）、１５０ｍＭのＮａＣｌバッファ中３Ｄ−ＭＰＬリポソームとＱＳ２１とを含むアジュバント組成物（アジュバント１５０ｍＭのＮａＣｌ、又はＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、第２カラム）、及びソルビトールと５ｍＭのＮａＣｌバッファ中３Ｄ−ＭＰＬリポソームとＱＳ２１とを含むアジュバント組成物（アジュバントソルビトール、又はＡＳＡ（ソルビトール）、カラム３〜７）において、検討した。
【００９３】
調製後０日のＡＳＡ（ソルビトール）アジュバントと、時間の経過に伴う漸進的な変化が起こらないことを保証するために調製してから３７℃に維持した７日後のＡＳＡ（ソルビトール）アジュバントとの２つのロットにおいても、同族体組成を検討した（図２の最後の４つのカラムを参照されたい）。
【００９４】
濃縮リポソーム又はＡＳＡ（ソルビトール）サンプルにおけるＭＰＬのテトラ−、ペンタ−、及びヘキサ−アシル化同族体の相対的な分配を、ＩＰ−ＨＰＬＣ−Ｆｌｕｏ検出（ＡＲＤ）で測定した。標準及びサンプルの両方を、ダンシルヒドラジンによって誘導体化し、二糖骨格上にＦｌｕｏ活性発色団を導入する。誘導体化したサンプルを、イオン対試薬としてテトラブチルアンモニウム水酸化物（ＴＢＡＯＨ）を使用しているＣ１８逆相カラムで分析した。同数の脂肪族アシル基を含む同族体を、異なる基（テトラアシル、ペンタアシル、及びヘキサアシル）で溶出させた。同族体の分配は、各基のピーク面積を、すべてのＭＰＬ同族体の総ピーク面積と比較することによって、推論される。
【００９５】
図２は、各同族体のパーセントを示している。同族体組成の有意差は、アジュバントバッファ間ではなんら見出せず、そして同族体組成は、ソルビトールバッファでは、時間が経過しても一定であった。
【００９６】
実施例５：実施例６及び７で使用する組成物の調製
５．１  ＣｐＧ（ＣｐＧ  ２００６を、すべての実施例で使用する）を有するＰＲＡＭＥの調製
５．１．１  実施例６及び実施例７で使用する、ＡＳＡ（１５０ｍｍのＮａＣｌ）と一緒にＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
実験１及び実験２
３０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液（注射用水中で調製した）を、注射用水に加え、５％のスクロース濃度にした。次いで、トリス−ＨＣｌバッファ１００ｍＭ  ｐＨ９．５を加えて、トリスバッファ濃度を７５ｍＭにした。次いで、ホウ酸塩バッファ１００ｍＭ  ｐＨ９．８を加えて、ホウ酸塩バッファ濃度を５ｍＭにした。１０％（ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８  溶液（注射用水中で調製した）を注射用水に加えて、０．３１３％の濃度にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度の（注射用水中）ＣｐＧ溶液を加えて、最終製剤において、１０５０μｇ／ｍｌの濃度にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原を加えて、タンパク質濃度を１２５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で１５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。ｐＨをチェックした（９．５１）。得られた混合物を、３ｍｌのガラスバイアルの中に０．５ｍｌだけ入れ、次いで凍結乾燥させた。
【００９７】
図３は、ＰＲＡＭＥに関して使用した凍結乾燥サイクルを例示している（所要時間＝４０時間）。
【００９８】
実施例２で調製した１５０ｍＭのＮａＣｌを含む水性アジュバント組成物６２５μｌで、得られた凍結乾燥ケーキを再構成した。その凍結乾燥ケーキは、１６ｍＭのトリス、４ｍＭのホウ酸塩、４％のスクロース、０．２４％のＰｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、８４０μｇ／ｍｌのＣｐＧ、及び１０００μｇ／ｍｌのＰＲＡＭＥから成る最終組成物による再構成の後、適正な抗原／アジュバント比を有する１．２５倍過剰の抗原用量を含んでいた。
【００９９】
５．１．２  実施例７の実験１における「液体製剤」（７０ｍＭのＮａＣｌ）のための、ＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
濃縮アジュバント製剤
１０倍濃縮されたｐＨ６．１のＰＢＳ  ｍｏｄを、注射用水に加えて１０倍に希釈し、最終製剤において１倍濃縮バッファにした。リポソームと、４００μｇ／ｍｌに予備希釈されたＱＳ２１から作られた予備混合溶液を、別々に調製した。そのプレミックスを、室温で、１５分間、磁気混合した。プリミックスで使用した濃縮リポソームは、４０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１０ｍｇ／ｍｌのコレステロール、及び２ｍｇ／ｍｌの３−脱アシル化ＭＰＬで作られている。そのプリミックスを、ＰＢＳに加えて、最終製剤において、ＭＰＬ濃度を２００μｇ／ｍｌ及びＱＳ２１濃度を２００μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で、１５〜３０分間、磁気撹拌した。次いで、約２３ｍｇ／ｍｌでＣｐＧを加えて、最終濃度を１６８０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で、１５〜３０分間、磁気撹拌した。６．１＋／−０．１であるようにｐＨをチェックした。ＡＳを、０．２２μｍのＰＥＳフィルターで濾過し、使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１００】
最終製剤
２５％のスクロース、２５ｍＭ  ｐＨ９．８のホウ酸塩、及び１０％のＬｕｔｒｏｌを、ＷＦＩに加えて、それぞれ、最終製剤において、９．２５％、５ｍＭ、及び０．２４％とした。２倍濃縮  ＡＳ＋ＣｐＧ製剤を加えて、最終製剤では１倍濃縮にした。混合物を室温で５分間攪拌した。スクロース３．１５％とホウ酸塩５ｍＭ中ＰＲＡＭＥ抗原を加え、そしてその混合物を室温で５分間撹拌した。
【０１０１】
５．１．３  実施例７の実験２における「液体製剤」のための、ＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
濃縮アジュバント製剤
液体製剤用のＡＳＡを、以下のようにして調製した。リン酸塩バッファ１Ｍ（ｐＨ６．１、１００倍希釈する場合）を、磁気撹拌しながら、ＷＦＩに加えて、濃縮リポソームにおける５０ｍＭのリン酸塩濃度を考慮しながら、最終濃度を４５ｍＭにした。次いで、ソルビトール３５％を、最終的には２１．１５％の濃度にした。その混合物に対して、４０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１０ｍｇ／ｍｌのコレステロール、及び２ｍｇ／ｍｌの３−脱アシル化ＭＰＬで作られた濃縮リポソームを加えて、最終ＭＰＬ濃度を４５０μｇ／ｍｌにした。ＱＳ２１バルク（５０００μｇ／ｍｌ程度で）を加えて、ＱＳ２１の最終濃度を４５０μｇ／ｍｌにした。混合物を室温で１５分間撹拌する。ｐＨをチェックし、ｐＨ６．１＋／−０．１に調整した。このＡＳＡの最終濃度は、それぞれ、ＭＰＬが４５０μｇ／ｍｌ、ＱＳ２１が４５０μｇ／ｍｌ、リン酸塩が４５ｍＭ、ＮａＣｌが２２．５ｍＭ、ソルビトールが２１．１５％であった。
【０１０２】
最終製剤
３０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液（注射用水中で調製した）を、注射用水に加えて、最終製剤におけるスクロース濃度を４％にした。次いで、トリス−ＨＣｌバッファ１Ｍ  ｐＨ９．０を加えて、最終製剤におけるトリスバッファ濃度を１６ｍＭにした。次いで、ホウ酸塩バッファ１００ｍＭ  ｐＨ９．８を加えて、最終製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を４ｍＭにした。次いで、１０％（ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８  溶液（注射用水中で調製した）を加えて、最終製剤における濃度を０．２４％にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度の（注射用水中）ＣｐＧ溶液を加えて、最終製剤における濃度を８４０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原バッファ（ホウ酸塩５ｍＭ  −  スクロース３．１５％  ｐＨ  ９．８）を加えて、ＰＲＡＭＥ抗原濃度を１０００μｇ／ｍｌに調整した。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を８μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で１５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。ソルビトール中４．５倍濃縮ＡＳを加えて、ＭＰＬ及びＱＳ２１の最終濃度を１００μｇ／ｍｌにした。ｐＨはをチェックした（＋／−８．０）。
【０１０３】
５．１．４  実施例７の実験１におけるＡＳＡ（ソルビトール）及びＡＳＡ（スクロース）のための、ＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
３０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液（注射用水中で調製した）を、注射用水に加えて、製剤におけるスクロース濃度を５％にし、次いで、ホウ酸塩バッファ１００ｍＭ  ｐＨ９．８を加えて、この製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を５ｍＭにし、次いで、トリス−ＨＣｌバッファ１Ｍ  ｐＨ９．０を加えて、２０倍希釈し、この製剤におけるトリスバッファ濃度を５ｍＭにした。次いで、１０％（ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８  溶液（注射用水中で調製した）を加えて、製剤における濃度を０．３％にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度の（注射用水中）ＣｐＧ溶液を加えて、製剤における濃度を１０５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を１２５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で１５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。ｐＨを９．４に調整した。得られた混合物を、３ｍｌのガラスバイアルの中に０．５ｍｌだけ入れ、次いで、凍結乾燥させた。
【０１０４】
ＡＳＡ（ソルビトール）を、実施例１に記載したようにして調製したが、以下の点がわずかに異なる：すなわち、ソルビトール濃度は４．６％であり、そしてＱＳ２１を、希釈した濃縮リポソームに添加する前に、４００μｇ／ｍｌに予備希釈した。
【０１０５】
ＡＳＡ（スクロース）を、実施例１に記載したようにして調製したが、以下の点が異なる：すなわち、ソルビトールの代わりにスクロースを使用し（３０％ｗ／ｖスクロース溶液の原液を使用し、そして最終的なスクロース濃度は８．３％である）、そしてＱＳ２１を、希釈された濃縮リポソームに添加する前に、４００μｇ／ｍｌに予備希釈した。
【０１０６】
その得られた凍結乾燥ケーキを、６２５μｌの水性アジュバント組成物で再構成した。最終組成物は、４ｍＭのトリス、４ｍＭのホウ酸塩、４％のスクロース、０．２４％のＰｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、８４０μｇ／ｍｌのＣｐＧ、及び１０００μｇ／ｍｌのＰＲＡＭＥを含んでいた。
【０１０７】
５．１．５  実施例７の実験２におけるＡＳＡ（ソルビトール）のための、ＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
３０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液（注射用水中で調製した）を、注射用水に加えて、製剤におけるスクロース濃度を５％にした。次いで、トリス−ＨＣｌバッファ１Ｍ  ｐＨ９．０を加えて、５０倍に希釈し、この製剤におけるトリスバッファ濃度を２０ｍＭにした。次いで、ホウ酸塩バッファ１００ｍＭ  ｐＨ９．８を加えて、２０倍に希釈し、この最終製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を５ｍＭにした。次いで、１０％（ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８  溶液（注射用水中で調製した）を加えて、製剤における濃度を０．３％にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度の（注射用水中）ＣｐＧ溶液を加えて、製剤における濃度を１０５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を１２５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で１５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。ｐＨは９．１に調整した。得られた混合物を、３ｍｌのガラスバイアルの中に０．５ｍｌだけ入れ、次いで、凍結乾燥させた。
【０１０８】
ＡＳＡソルビトールを、実施例１記載のようにして調製した。その得られた凍結乾燥ケーキを、６２５μｌの水性アジュバント組成物で再構成した。最終組成物は、１６ｍＭのトリス、４ｍＭのホウ酸塩、４％のスクロース、０．２４％のＰｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、８４０μｇ／ｍｌのＣｐＧ、及び１０００μｇ／ｍｌのＰＲＡＭＥを含んでいた。
【０１０９】
５．２  ＣｐＧを有するＮＹ−ＥＳＯ１の調製
５．２．１  実施例６における、ＣｐＧを有するＮＹ−ＥＳＯ１の調製
Ｎａ／Ｋ２リン酸塩バッファ２００ｍＭ  ｐＨ  ６．３を、磁気撹拌しながら、注射用水に加えて２０倍に希釈して、最終製剤において１２．５ｍＭにした。次いで、その混合物に対して、以下の賦形剤を、以下の順序で加えた：すなわち、１０％ｗ／ｖのモノチオグリセロールを最終的に０．３１２５％に、５％ｗ／ｖのＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を０．０６２５％に、２５％のスクロースを最終的に５％に、そして２８７ｍＭのＬ−アルギニンベースを６．２５ｍＭにする。次いで、この混合物に対して約２０ｍｇ／ｍｌのＣｐＧバルクを加えて、最終製剤において１０５０μｇ／ｍｌの濃度にした。その混合物を、室温で、磁気撹拌（約１５０回転／分）しながら、１０分間保持した。ｐＨを、チェックし、７．１＋／−０．３であるようにした。磁気撹拌を増加させて渦巻きを起こした。次いで、ＮＹ−ＥＳＯ１を加えて、最終濃度を７５０μｇ／ｍｌにした。次いで、磁気撹拌を約１５０回転／分まで低下させ、混合物を室温で５分間撹拌した。アリコートを採取して、最終的なｐＨ（それは、７．０２でなければならない）をチェックした。次いで、最終バルクを凍結乾燥した。
【０１１０】
得られた凍結乾燥ケーキを、６２５μｌのＡＳＡバッファ（１５０ｍＭのＮａＣｌ及びソルビトール）で、再構成した。
【０１１１】
実施例６．バッファとしてソルビトールを含むアジュバント組成物における「塩析」の防止
図４は、塩濃度を５ｍＭに低減し且つアジュバント組成物中にソルビトールを含有させると、（それぞれ実施例５．１．１及び５．２．１で調製された）免疫原性組成物におけるＰＲＡＭＥ及びＮＹ−ＥＳＯ−１の両方の「塩析」が防止されることを示している。図４において：
１．ＡＳＡ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファにおいて再構成されたＰＲＡＭＥ抗原。 
２．ＡＳＡソルビトールバッファにおいて再構成されたＰＲＡＭＥ抗原。 
３．ＡＳＡ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファにおいて再構成されたＮＹＥＳＯ−１抗原。 
４．ＡＳＡソルビトールバッファにおいて再構成されたＮＹＥＳＯ−１抗原。
【０１１２】
図４は、ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）及びＡＳＡ（ソルビトール）において再構成されたＰＲＡＭＥとＮＹＥＳＯ−１の画像による比較である。以上のように、ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）において再構成されたＰＲＡＭＥは、ＡＳＡ（ソルビトール）において再構成されたＰＲＡＭＥと比較して、濁っているように見える。同様に、ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）において再構成されたＮＹ−ＥＳＯは、ＡＳＡ（ソルビトール）において再構成されたＮＹ−ＥＳＯ抗原と比較して、濁っているように見える。
【０１１３】
実施例７  Ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル
実験１：
６〜８週齢の２０匹の雌のＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＢａｌｂ／Ｃマウスとの雑種）から成る７つの群を、ヒト用量の１／１０に相当するＡＳＡ＋ＣｐＧの一定用量（５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、及び４２μｇのＣｐＧ７９０９を含む５０μＬ）中に配合したＰＲＡＭＥタンパク質の筋注（二週間ごとに、左右の腓腹筋中に交互に注射）で２回免疫した。下記のように、最後の免疫化から１４日後に、マウスの４つの群（各群ｎ＝８）に対して、１０ｅ５  ＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ腫瘍細胞を皮下に接種した。マウスの７つの群は：
−第１群：バッファ
−第２群：ＰＲＡＭＥタンパク質が沈殿する「典型的な」ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ  ＋  ＣｐＧ
−第３群：ＡＳＡ（スクロース）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ＋ＣｐＧ
−第４群：ＡＳＡ（スクロース  −  ２５℃で４８時間インキュベーション）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ＋ＣｐＧ
−第５群：ＡＳＡ（ソルビトール）中に再懸濁させた共凍結乾燥ＰＲＡＭＥ＋ＣｐＧ
−第６群：ＰＲＡＭＥ＋ＡＳＡ  −  ７０ｍＭのＮａＣｌ＋ＣｐＧを含む「液体」製剤
−第７群：ＰＲＡＭＥ＋ＡＳＡ  −  ７０ｍＭのＮａＣｌ＋ＣｐＧ（＋ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）を含む「液体」製剤
であった。
【０１１４】
最後の免疫化から７日後に、サイトカインを分泌するＴ細胞の能力による細胞性応答を分析した（３匹のマウスのｎ＝４群）。
【０１１５】
すべてのマウスは、ＡＳＡ＋ＣｐＧアジュバント系（５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、及び４２μｇのＣｐＧ）のヒト用量の１／１０中０．４μｇのＰＲＡＭＥを受容した。
【０１１６】
結果：
腫瘍成長
１群当たり、表面（ｍｍ２）（＋標準偏差（ＳＤ））によって測定された、時間経過に対する平均腫瘍成長が、図６に示してある。ＰＲＡＭＥを配合したＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧ、及びＡＳＡ液体製剤中ＰＲＡＭＥは、ＰＲＡＭＥ  ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧに比べて、腫瘍防御がより低い（腫瘍成長がより大きい）。
【０１１７】
細胞性応答（２回目の免疫化の７日後  −  １群処理当たり３匹のマウスから成るｎ＝４群）：
ＰＲＡＭＥ  ＡＳＡ−ＣｐＧ腫瘍抗原によるマウスの免疫化の後にＩＦＮγ及びＴＮＦαのようなサイトカインを産生できるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の頻度を使用して、機能的な細胞性応答を誘導する異なる製剤の能力を示す。第２免疫化の７日後に、サイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を産生するＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを、免疫マウスの脾臓細胞に関する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定した。
【０１１８】
図５には、ＩＦＮγ及びＴＮＦαを産生するＣＤ４の％（平均＋／―標準偏差）が示してある。
【０１１９】
この実験では、測定可能なＣＤ８反応は、見出されなかった。
【０１２０】
ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧに配合されたＰＲＡＭＥタンパク質は、沈殿することが示され、また、ＡＳＡ（ソルビト−ル）＋ＣｐＧ中に配合されたＰＲＡＭＥと比較して、より低い特異的なＴ細胞応答を誘導する。同様に良好なＰＲＡＭＥ特異的ＣＤ４応答は、ＰＲＡＭＥタンパク質を、ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧ中に、また、及びＡＳＡ「液体」製剤（７０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧ中に配合する時に得られた（統計的に差はない）。体液性免疫応答も試験したが、２つの注射後のデータは解釈できなかった。
【０１２１】
実験２：
６〜８週齢の２４匹の雌のＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＢａｌｂ／Ｃマウスとの雑種）から成る４つの群を、ヒト用量の１／１０に相当するＡＳＡ＋ＣｐＧの一定用量（５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、及び４２μｇのＣｐＧ７９０９を含む５０μＬ）中に配合したＰＲＡＭＥタンパク質の筋注（二週間ごとに、左右の腓腹筋中に交互に注射）で４回免疫した。下記のように、最後の免疫化から１４日後に、マウスの４つの群（各群ｎ＝１２）に対して、１０ｅ５  ＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ腫瘍細胞を皮下に接種した。マウスの４つの群は：
−第１群：バッファ
−第２群：ＰＲＡＭＥタンパク質が沈殿する「典型的な」ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ  ＋  ＣｐＧ
−第３群：ＡＳＡ（ソルビトール）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ＋ＣｐＧ
−第４群：ＰＲＡＭＥ＋ＡＳＡ  −  「液体」製剤＋ＣｐＧ（＋ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）
であった。
【０１２２】
最後の免疫化の１４日後に、免疫応答を、以下の通りに異なる読み出しを使用して分析した：
−体液性応答（ｎ＝１２）
−サイトカインを分泌するＴ細胞の能力による細胞性応答（３匹のマウスから成るｎ＝４群）
−腫瘍接種に対する防御効果（ｎ＝１２）。
【０１２３】
すべてのマウスは、ＡＳＡ＋ＣｐＧアジュバント系（５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、及び４２μｇのＣｐＧ）のヒト用量の１／１０中０．４μｇのＰＲＡＭＥを受容した。
【０１２４】
結果：
腫瘍成長
１群当たりの、表面（ｍｍ２）（＋ＳＤ）によって測定された時間経過に対する平均腫瘍成長を、図９に示してある。ＰＲＡＭＥ配合ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧは、ＰＲＡＭＥ  ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧに比べて、より低い腫瘍防御（より大きい腫瘍成長）を誘導する。同様な防御は、ＰＲＡＭＥ  ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧと、ＡＳＡ液体製剤＋ＣｐＧ中ＰＲＡＭＥとに関しても観察された。
【０１２５】
サンプル分析：体液性応答：
後述するように、マウス血清（ｎ＝１２）を、４回の免疫化の最後から１４日後に、ＰＲＡＭＥ特異的抗体の存在に関して、ＥＬＩＳＡによって試験した。抗体応答（総Ｉｇ）を、被覆抗原として精製組換えＰＲＡＭＥタンパク質を使用するＥＬＩＳＡによって、評価した。免疫動物からの血清を、ＰＲＡＭＥ特異的抗体の存在に関して分析した。４回の免疫化後に得られた標準力価の幾何平均（ｎ＝１２匹のマウス）＋／−９５％信頼区間が、図７に示してある。典型的なＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）を含むＰＲＡＭＥ／ＡＳＡ＋ＣｐＧは、非常に小さい抗体応答を誘導し、一方、ＡＳＡ（ソルビトール）を含むＰＲＡＭＥ／ＡＳＡ＋ＣｐＧは、非常に高い抗体力価を誘導する。この応答は、液体製剤ＡＳＡによって誘導される応答と同様である。
【０１２６】
細胞性応答（４回目の免疫化から１４日後  −  １群処理当たり３匹のマウスから成るｎ＝４群）：
ＰＲＡＭＥ  ＡＳＡ−ＣｐＧ腫瘍抗原によるマウスの免疫化の後にＩＦＮγ及びＴＮＦαのようなサイトカインを産生できるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の頻度を使用して、機能的な細胞性応答を誘導する異なる製剤の能力を示す。４回目の免疫化から１４日後に、サイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を産生するＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを、免疫マウスの脾臓細胞に関する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定した。
【０１２７】
図８には、ＩＦＮγ及びＴＮＦαを産生するＣＤ４の％（平均＋／―標準偏差）が示してある。ｐ値は、０．０５より大幅に低く、第２群と、第３群及び第４群との間の有意差を証明している。
【０１２８】
この実験では、測定可能なＣＤ８反応は、見出されなかった。
【０１２９】
ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧに配合されたＰＲＡＭＥタンパク質は、沈殿することが示され、また、ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧに配合されたＰＲＡＭＥと比較して、統計的により低い特異的なＴ細胞応答を誘導する。対照的に、同様に良好なＰＲＡＭＥ特異的ＣＤ４応答は、ＰＲＡＭＥタンパク質を、ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧ中に、また、ＡＳＡ「液体」製剤＋ＣｐＧ中に配合する時に得られた。
【０１３０】
方法
ＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ腫瘍モデル及び腫瘍成長
ＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ細胞系は、ＰＲＡＭＥのｃＤＮＡをコードする哺乳類細胞発現プラスミドｐＣＤＮＡ３（カリフォルニア州カールズバッドにあるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＣＴ２６結腸癌細胞系に形質導入することによって、発生させた。Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）による選択及び限界希釈クローニングにより、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定されるＰＲＡＭＥ（ＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ）を発現するクローンを得た（１０ｅ−３  ＰＲＡＭＥ  ｍＲＮＡコピー／ヒト腫瘍によるＰＲＡＭＥ発現レベルの範囲内にあるマウスβアクチンのコピー）。
【０１３１】
ＣＴ２６  ＰＲＡＭＥ細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン−ステプトマイシン、１％非必須アミノ酸、１％ピルピン酸ナトリウム、及び０．１％β−メルカプトエタノールを有するＲＰＭＩ培地において、５％ＣＯ２の存在下で３７℃で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。細胞を、トリプシン処理し、無血清培地で２度洗浄し、そして、２００μｌのＲＰＭＩ培養液の中に入れて注射剤とし、上記したようにＰＲＡＭＥで最後に免疫した１４日後に、４つの群のＣＢ６Ｆ１マウスの右側腹部の皮下に注入した。個々の腫瘍成長を、週２回測定した。各腫瘍の２つの主直径の積を時間の経過とともに記録し、そして、そのデータを、動物の各群における平均腫瘍表面（ｍｍ２）として示す。
【０１３２】
サンプル分析：体液性応答
血清を添加する前に、イムノプレートを、４℃で一晩、ＰＲＡＭＥ抗原で被覆した。３７℃で９０分間、血清と反応させた後、マウス免疫グロブリンに対するビオチン化ウサギ完全抗体を、３７℃で９０分間、加えた。抗原抗体複合体は、３７℃で３０分間、ストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体と一緒にインキュベートすることによって、可視化された。次いで、この複合体は、室温で１０分間、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加することによって、可視化され、そして、その反応を０．２ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。光学密度は、４５０ｎｍで記録した。
【０１３３】
サンプル分析法：細胞性応答（ＩＦＮｇ／ＴＮＦａ産生）
ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞によるＩＦＮｇ及びＴＮＦａ産生は、ＰＲＡＭＥタンパク質配列全体をカバーするオーバーラップしている１５ｍｅｒペプチドのプールで２時間刺激した後、免疫マウス（１群当たり３匹のマウスから成る４つの群）の脾臓細胞に関して細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用してフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手されるＬＳＲ２）で測定した。
【０１３４】
Ｔ細胞の刺激：
−ＰＲＡＭＥ配列全体をカバーする、１１アミノ酸だけオーバーラップしている１２３種の１５ｍｅｒペプチドのプールによって、免疫動物の脾臓細胞を再刺激した。前記ペプチド（１μｇ／ｍｌ／ペプチド）を、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄ及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８を含む、最終体積２００μｌのＲＰＭＩ  ５％ＦＣＳ中で、９６穴プレート（Ｕ）において３７℃で２時間、１０＋６個のＴ細胞（脾臓細胞）と混合する。 
−培養の後、５０μｌのブレフェルジン（１／１０００）を、ＲＰＭＩ  ５％ＦＣＳ中に加えた。
【０１３５】
細胞内の染色：
・ＣＤ４／ＣＤ８染色：
−細胞を、９６穴プレート（円錐形ウェル）に移した。 
−４℃で５分間、１０００回転／分で遠心分離
−２５０μｌのＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ１％ＦＣＳ）で洗浄
−細胞のペレットを、４℃で１０分間、５０μｌのＦＡＣＳバッファ中２．４Ｇ２  １／５０を使用してインキュベートした。 
−５０μｌのＦＡＣＳバッファ中Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ＣＤ４−ＰＥ（希釈Ｍａｂ：１／２００）及びＣＤ８ＰｅｒＣＰ（希釈  Ｍａｂ：１／２００）を、４℃で３０分間にわたって添加した。 
−ＦＡＣＳバッファ（１２００回転／分  −  １０分間）中での洗浄。
【０１３６】
・細胞の透過処理：
−４℃で２０分間にわたって２００μｌのｃｙｔｏＦｉｘ−ｃｙｔｏＰｅｒｍ溶液を使用して、ペレットをインキュベートした。 
−ｐｅｒｍＷＡＳＨで１回洗浄し（１２００回転／分−１０分間）そのｐｅｒｍＷＡＳＨ溶液を１０倍に濃縮し、滅菌水で希釈する。
【０１３７】
・ＩＦＮγ及びＴＮＦα細胞内染色：
−５０μｌのｐｅｒｍＷＡＳＨ１ｘ溶液中Ｍｉｘ  ＩＦＮγ  ＡＰＣ（希釈Ｍａｂ：１／５０）及びＴＮＦα  ＦＩＴＣ（希釈Ｍａｂ：１／５０）を使用して、４℃で２時間、ペレットをインキュベートした。 
−ｐｅｒｍＷＡＳＨ  １Ｘ  （１２００回転／分  −  １０分間）で洗浄
−ペレットを、ＦＡＣＳバッファ中に再懸濁させた。 
−ＦＡＣＳ分析。
【０１３８】
Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  （Ｇｏｌｏｇｉ  Ｐｌｕｇ）：ＢＤ  カタログ番号５５５０２９
Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  （ＢＤ）  カタログ番号  ５５４７２２
Ｐｅｒｍ／ｗａｓｈバッファ：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ）  カタログ番号  ５５４７２３
ラット抗マウスＣＤ４９ｄ  精製ＮＡ  ＬＥ：ＢＤ  カタログ番号  ５５３１５４
ラット抗マウスＣＤ２８  精製ＮＡ  ＬＥ：ＢＤ  カタログ番号  ５５３２９５
ラット抗マウスＣＤ８ａ  ｐｅｒＣｐ：ＢＤ  カタログ番号５５３０３６
ラット抗マウスＣＤ４  ＰＥ：ＢＤ  カタログ番号５５６６１６
ラット抗マウスＩＦＮγ  ＡＰＣ：ＢＤ  カタログ番号５５４４１３
ラット抗マウスＴＮＦα  ＦＩＴＣ：ＢＤ  カタログ番号５５４４１８
抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２  （２．４Ｇ２）  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  カタログ番号５５３１４２（０．５ｍｇ／ｍｌ）。
【図１】
2012529465.tif 000004
【図２】
2012529465.tif 000005
【図３】
2012529465.tif 000006
【図４】
2012529465.tif 000007
【図５】
2012529465.tif 000008
【図６】
2012529465.tif 000009
【図７】
2012529465.tif 000010
【図８】
2012529465.tif 000011
【図９】
2012529465.tif 000012
【配列表】
2012529465000001.app
【国際調査報告】
2012529465.tif 000013
2012529465.tif 000014
2012529465.tif 000015
2012529465.tif 000016