(57)【要約】  本発明は、標的タンパク質の細胞内トラフィッキングを調節する方法およびキットに関する。保持される状態では、前記標的タンパク質は、フックタンパク質との相互作用により最初のコンパートメントに保持される。放出される状態では、相互作用が破壊され、標的タンパク質は標的コンパートメントへトラフィックする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節する方法であって、
ａ）宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定の細胞内コンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターを用意するステップと、
ｃ）式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを用意するステップと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、方法。
【請求項２】
ＡとＢの間の条件的相互作用がリガンドＬの添加により破壊される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節するキットであって、
式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定のコンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターと、
式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、キット。
【請求項４】
前記第１および第２の発現ベクターで形質転換可能な宿主細胞をさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
トランスフェクション試薬をさらに含む、請求項３または４に記載のキット。
【請求項６】
リガンドＬをさらに含む、請求項３から５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
ドナーコンパートメントから標的タンパク質Ｙを選択的に保持および放出するための、
式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定のコンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクター、ならびに
式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクター
の使用であって、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、使用。
【請求項８】
ＡとＢの間の相互作用がリガンドの存在下でのみ生じる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法またはキットまたは使用。
【請求項９】
ＡとＢの間の相互作用がリガンドの非存在下でのみ生じる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法またはキットまたは使用。
【請求項１０】
Ｂ−Ｙが検出可能な部分Ｚをさらに含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞から成る群から選択される真核宿主細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項１２】
ＡおよびＢが、それぞれ、ＦＫＰＢ１２およびＦＲＡＰ、または、ＦＲＡＰおよびＦＫＢＰ１２である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項１３】
ＡおよびＢが、それぞれ、ＳＢＰおよびストレプトアビジン、または、ストレプトアビジンおよびＳＢＰである、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項１４】
Ｘが、ＥＲに存在するインバリアント鎖のアイソフォーム（Ｉｉ３３）；リボホリンＩまたはＩＩ；ＳＥＣ６１、シトクロムｂ５；ジアンチン；ＭａｎＩＩ（α−１，３−１，６マンノシダーゼ）、ＴＧＮ３８／４６などのゴルジ酵素；メンケス受容体；シアリルトランスフェラーゼ（β−ガラクトサミドα−２，６シアリルトランスフェラーゼ１）、およびＧａｌＴ（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１）；ならびにＴｈｙ−１およびＰＲＮＰなどのＧＰＩアンカータンパク質から成る群から選択される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項１５】
Ｙが、成長因子、受容体、原形質膜マーカーおよび主要組織適合性（ＭＨＣ）分子、接着分子、リソソーム酵素、ゴルジ酵素、ウイルス糖タンパク質、４回膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質；合成膜貫通ドメイン；多剤耐性タンパク質ＡＢＣＢ１様の輸送体タンパク質；ＧＰＩアンカータンパク質；ホルモン；ホルモン受容体；およびアミロイドペプチドなどの病的分子から成る群から選択される、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項１６】
第１の融合タンパク質Ａ−Ｘをコードするために、前記第１の発現ベクターが、Ａをコードするヌクレオチド配列、およびＸをコードするヌクレオチド配列のインフレーム挿入を可能にするマルチプルクローニングサイトを含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項１７】
式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質をコードするために、前記第２の発現ベクターが、Ｂをコードするヌクレオチド配列、およびＹのインフレーム挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項１８】
第１および第２のベクターが単一のベクターであって、前記単一のベクターが２シストロン性発現カセットを含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質の細胞内トラフィッキングを調節する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴルジ複合体は、真核細胞恒常性において中心的な役割を果たす。ゴルジ複合体は、小胞体（ＥＲ）で合成されたタンパク質および脂質を処理および選別し、順行性および逆行性トラフィッキング経路（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）を結ぶ中心的プラットフォームとして役割を果たす。これらの活動は、独特の超微細構造的特徴と結び付いている。ゴルジ装置は、シスからトランスへの極性を示す偏平な付着性の槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ）の層板（ｓｔａｃｋ）から成る（ＲａｍｂｏｕｒｇおよびＣｌｅｒｍｏｎｔ、１９９７年；Ｌａｄｉｎｓｋｙら、１９９９年）。ある種の真核生物、特にヒトでは、数百の層板が側方につながって、微小管形成中心に隣接する拡張したリボン状構造を形成する。
【０００３】
定常状態で生じる膜およびタンパク質の大きい連続した流動にも関わらず、ゴルジ装置の組織全体、超微細構造的形状および極性は著しく安定である。各ゴルジ槽は、グリコシル化酵素など、特定のセットの「レジデント（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）」タンパク質を含有するが、これがどのように維持されているかが論議されてきた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｅｎａｒｇｕｅｚら、２００１年；Ｃｏｓｓｏｎら、２００２年；Ａｌｔａｎ−Ｂｏｎｎｅｔら、２００４年；ＰｕｔｈｅｎｖｅｅｄｕおよびＬｉｎｓｔｅｄｔ、２００５年；Ｓｔｏｒｒｉｅ、２００５年）。このような構造がどのように動的に維持されるかを説明するのに両極端のモデルが提唱されている。「静的槽（ｓｔａｔｉｃ  ｃｉｓｔｅｒｎａ）」モデルによれば、積み荷は、小胞に包まれてまたは伸長した小管を用いて、安定な層板構造を通って進む（Ｐｅｌｈａｍ、２００１年）。レジデントタンパク質は、膜またはマトリックスとの相互作用を通じて、特異的シグナルを用いて特定の槽に安定に局在化される。ゴルジマトリックスは、ゴルジ複合体を維持するためのテンプレートとして機能している可能性がある安定な遺伝性の外骨格であることが提唱された。このマトリックスは、有糸分裂停止（ｍｉｔｏｓｉｓ  ｅｘｉｔ）時に特に重要である（ＳｈｏｒｔｅｒおよびＷａｒｒｅｎ、２００２年）が、ゴルジ構造を維持するための間期に役割を果たすことも提唱されている（Ｇｌｉｃｋ、２００２年に概説）。「槽成熟（ｃｉｓｔｅｒｎａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」モデルによれば、ゴルジ装置は、自己組織化能力に恵まれ、この構造を構築および維持するのに外部マトリックスに依存しない。積み荷は成熟槽内で輸送され、レジデントタンパク質は、逆行性輸送を通じて定常局在化を達成する。（Ｇｌｉｃｋ、２００２年；ＳｈｏｒｔｅｒおよびＷａｒｒｅｎ、２００２年；Ｂａｒｒ、２００４年に概説）。該モデルとは独立に、（積み荷またはレジデントタンパク質それぞれの）槽間輸送は、小胞または小管連絡（ｔｕｂｕｌａｒ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を介して生じる可能性がある（概説はＭｉｒｏｎｏｖら、２００５年；ＲａｂｏｕｉｌｌｅおよびＫｌｕｍｐｅｒｍａｎ、２００５年を参照のこと）。最近のモデルは、ゴルジ体間輸送が極めて迅速な小管ベースの拡散を通じて行われることすら示唆している（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、２００８年）。
【０００４】
現在では、複数の経路がゴルジ装置を横断しており、これが基本および応用された結果の両方を有することが明らかになっている。さまざまな病態、およびとりわけ癌の分子研究は、疾患発症の鍵となる調節因子としての受容体およびホルモンを同定した。これらのタンパク質は、特定の分泌経路を辿ると考えられる。さらに、大規模なゲノムプロジェクトが、分泌経路の調節に関与している可能性のある多くのタンパク質で、まだ機能的な特徴付けがなされていないタンパク質を同定した。このように、タンパク質のこれらの大きなファミリーを機能的に注釈付けることは、一方で新たな治療エントリーを特定するのに役立ち、他方で細胞分泌経路の全般図を描くのに役立つ可能性がある。
【０００５】
複数の分泌経路を総合的に眺めるには、このように、トラフィッキングおよび分泌アッセイのコレクションを拡大することが不可欠である。定量的データをもたらすことができ、および大規模プロジェクトに適合することができる方法は、当技術分野にわずかにしか存在しない。しかし、これらはさまざまな短所に悩まされている。
【０００６】
標的タンパク質のトラフィッキングを定量化するのに使用される最良の方法はひとえに、集団レベルで観察可能な読み出しを持つように、細胞における前記標的タンパク質の全ての分子の分泌が同期することにかかっている。
【０００７】
この２０年の間に、多くの研究が、口内炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質（ＶＳＶＧ−ｔｓ０４５）の温度感受性バリアントをモデルに用いて分泌経路における膜タンパク質選別の我々の理解を大幅に拡大した。この変異体は、高温（３９．５°Ｃ）でＥＲに封鎖され、許容温度（３２°Ｃ）で原形質膜に輸送される（Ｌａｆａｙ、１９７４年；Ｋｒｅｉｓ、１９８６年）。このモデルは、単純な温度シフトにより分泌経路を通じたＶＳＶＧの同期輸送およびプロセシングを可能にすることから、強力である。この同期化されたトラフィッキングは、生細胞で研究することもできる（Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９８４年；Ｐｒｅｓｌｅｙら、１９９７年；Ｓｃａｌｅｓら、１９９７年）。
【０００８】
しかし、この強力なシステムは、幾つかの限界により妨害される。３９．５°Ｃの高温は、生理的ではない（より低い許容温度の３２°Ｃも生理的ではない）。これは、回復不能な損傷を誘導する可能性があり、例えばキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）などの他の多細胞生物で使用することができない。第二に、ＶＳＶＧ−ｔｓＯ４５を用いて、単一の膜貫通ドメインを有する１つのカテゴリーのタンパク質のトラフィッキングのみを分析することができる。しかし、幾つかの結果は、細胞表面を目的地とする可溶性タンパク質およびＧＰＩアンカータンパク質などの幾つかのカテゴリーのタンパク質が、ゴルジ装置でＶＳＶＧ−ｔｓＯ４５から分離されることを示唆している（Ｋｅｌｌｅｒら、２００１年）。第三に、ＶＳＶＧ−ｔｓＯ４５は、ＥＲから原形質膜への分泌経路の研究のみを可能にする。ＶＳＶＧ−ｔｓＯ４５は、例えばエンドソームおよびリソソーム、または頂端膜または軸索など、ある種の原形質膜ドメインへの輸送の研究を可能にしない。さらに、分泌経路の中間ステップの研究（中間コンパートメントからゴルジ、またはトランスゴルジ網から原形質膜など）は、不可解な温度ブロックを用いて行い得るのみである。
【０００９】
他の研究は、標的タンパク質の産生および分泌を同期させるために誘導性プロモーターを使用した。実際、Ｂａｒｄら（２００６年）は、Ｃｕ２＋誘導性プロモーターの制御下でシグナル配列に融合された西洋ワサビペルオキシダーゼの分泌を研究した。このシステムを用いた誘導は、かなりゆっくりでありおよび一連の経路（ＥＲにおける転写、翻訳、転座）に依存し、分析を複雑にする。これもまた、ＥＲからのトラフィッキングの研究を可能にするのみである。
【００１０】
さらに他の研究は、標的タンパク質の分子集団のフォトコンバージョン（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）および／または光退色の使用に依存する。しかし、この方法の主な短所は、スクリーニング目的に適さない細胞ごとの分析を必要とすることである。また、細胞生理を撹乱させる悪影響が、フォトコンバージョンまたは光退色処理により誘発される可能性もある。
【００１１】
所与の標的タンパク質のトラフィッキングを調節する別の方法は、Ａｒｉａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社に対する特許出願ＷＯ００／２３６０２で提唱されている。この文献は、少なくとも１つの条件的保持ドメイン（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）およびこれと異種の少なくとも１つの別のドメインを含む融合タンパク質をコードする組換え核酸を、細胞に導入することを含む、標的タンパク質の分泌を制御することができるように細胞を遺伝子操作する方法を開示している。前記条件的保持ドメインは、典型的には条件的凝集ドメイン（ＣＡＤ）、すなわち小分子可逆的様式で凝集するタンパク質である。この技術は、例えばインスリンおよび成長ホルモンなどの標的タンパク質の分泌の調節に使用された（Ｒｉｖｅｒａら  ２０００年）。この研究では、著者らは、ＣＡＤ（リガンドの非存在下で自らと相互作用し、および故にリガンドの非存在下でＥＲに保持されるドメイン）および標的タンパク質を含む融合タンパク質を作製した。
【００１２】
この技法は、小分子の添加によりｉｎ  ｖｉｖｏでの分泌タンパク質の制御された分泌を可能にする。しかし、この技法は、可逆的凝集に依存することから、ドナーコンパートメントとしてのＥＲからのトラフィッキングの研究を可能にするのみである。この技法は、他の細胞内コンパートメントからのトラフィッキングの研究、特に逆行性トラフィッキングの研究に使用することができない。さらに、この凝集システムは、細胞生理に影響するであろう折畳まれていないタンパク質応答経路を誘導する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
故に、前記標的タンパク質の迅速および同期放出を可能にすることで宿主細胞における標的タンパク質のトラフィッキングを研究するための、ハイスルーアウト（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ）および生細胞分析の両方に適用できる汎用的方法に対する未解決のニーズが当技術分野には依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
故に、本発明者らは、タンパク質の分泌経路を研究するための新たなシステムを構築した。これは積み荷の選択的保持および放出に基づくことから、本発明者らはこれをＲＵＳＨ（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｈｏｏｋｓ（選択的フックを用いた保持））と命名した。該方法の原則は、どちらかといえば一般的である。これは、２つの状態、すなわち、レジデントタンパク質（フック）との特異的相互作用によりドナーコンパートメントに「保持された」、封鎖された状態、および標的コンパートメントに向かって自由にトラフィックする、相互作用から「放出された」状態の標的タンパク質を提供する。これらの２つの状態を制御するため、標的タンパク質とフックの間の特異的相互作用は、２つの相互作用ドメイン間の可逆的相互作用により媒介される。１つの実施形態では、相互作用は、所与のリガンドの存在下でのみ生じる（「分子依存的」設定（“ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ”  ｓｅｔ−ｕｐ）、「ＭＤ」）。別の実施形態では、相互作用はデフォルトで生じ、および特定のリガンドにより破壊され得る（「デフォルトでの相互作用」設定（“ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−ｂｙ−ｄｅｆａｕｌｔ”  ｓｅｔｕｐ）、「ＩＤ」）。
【００１５】
リガンドの除去または添加は、スイッチのように作用してドナーコンパートメントからの標的タンパク質の同期放出を可能にする。
【００１６】
本発明は、宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節する方法であって、
ａ）宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定の細胞内コンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターを用意するステップと、
ｃ）式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを用意するステップと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）をすることができる、方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節するキットであって、
式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定のコンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターと、
式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、キットにも関する。
【００１８】
本発明はまた、ドナーコンパートメントから標的タンパク質Ｙを選択的に保持および放出するための、
式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定の細胞内コンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクター、ならびに
式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクター
の使用であって、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、使用にも関する。
【００１９】
好ましい実施形態では、ドナーコンパートメントからの標的タンパク質の同期放出は、リガンドＬの添加により制御され、ＡとＢの間の相互作用を破壊する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＲＵＳＨシステムの一般的スキームを示す図である。  ａ、ｂ：ＲＵＳＨシステムの２つのトポロジー。ＲＵＳＨシステムは２状態の分泌アッセイである。１つの状態（「保持」）では、レポータータンパク質Ｂ−Ｙは、標的タンパク質Ｙおよび保持ドメインＸにそれぞれ融合された２つのドメインＡおよびＢの特異的相互作用を通じて、フックタンパク質Ａ−Ｘによりドナーコンパートメントに安定に保たれる。第２の状態（「放出」）では、ドメイン間の相互作用は元に戻され、およびレポーターが放出され、天然のトラフィッキング経路を自由に辿る。相互作用ドメインは、コンパートメントの内腔（ＲＵＳＨＬ、ａ）または細胞質面（ＲＵＳＨＣ、ｂ）に位置することができる。  ｃ、ｄ：ＲＵＳＨシステムの２つの可逆的相互作用設定を示す図である。フックおよびレポータータンパク質の可逆的相互作用は、デフォルトでの相互作用（ＲＵＳＨ  ＩＤ）、または分子依存的相互作用（ＲＵＳＨ  ＭＤ）に起因することができる。ＩＤモードの例がｃに示され、レポーターは、デフォルトでＳＢＰタグと相互作用するストレプトアビジンドメインを示す。ビオチンを添加すると、この相互作用が競合され、レポーターは自由に輸送される。ｄでは、フックは、レポーター分子に融合されたＦＫＢＰ１２ドメインと相互作用するＦＲＡＰドメインに融合される。この相互作用は、ラパマイシンの存在下でのみ生じる。ラパマイシンを除去（放出を加速するためにＦＫ５０６と競合）すると、相互作用は元に戻され、およびレポーターは自由に輸送される。  ｅ：フックおよびレポーターの幾つかの例  ｆ：実施例で使用された２シストロン性構築物の略図
【図２】ＦＫＰＢ１２とＦＲＡＰの間の可逆的相互作用を用いたゴルジ酵素ＳＴのトラフィッキングの分析を示す図である（ＲＵＳＨＬ［ＭＤ］）。レポーターＦＫＢＰ１２−ＧＦＰ−ＳＴは、フックＩｉ−ＦＲＡＰを発現する細胞中のＥＲにおいて、およびラパマイシンの存在下で保持される（左のパネル）。競合相手ＦＫ５０６の存在下でラパマイシンを洗い出すと、レポーターが放出され、標的ゴルジコンパートメントに到達する（右のパネル）。レポーターは、検出ドメインとしてＧＦＰを用いて可視化される。標的コンパートメント、ゴルジは、抗ジアンチン抗体を用いて染色される。
【図３】コアストレプトアビジンとＳＢＰタグの間の可逆的相互作用を用いたゴルジ酵素ＳＴのトラフィッキングの分析を示す図である（ＲＵＳＨＬ［ＩＤ］）。レポーターＳＴ−ＳＢＰ−ＧＦＰは、フックＩｉ−コアストレプトアビジンを発現する細胞中のＥＲに保持される（右のパネル）。ビオチンを添加すると、レポーターが放出され、標的ゴルジコンパートメントに到達する（左のパネル）。レポーターは、検出ドメインとしてＧＦＰを用いて可視化される。標的コンパートメント、ゴルジは、抗ジアンチン抗体を用いて染色される。
【図４】コアストレプトアビジンとＳＢＰタグの間の可逆的相互作用を用いたゴルジ酵素ＳＴのトラフィッキングのタイムラプス分析を示す図である（ＲＵＳＨＬ［ＩＤ］）。レポーターＳＴ−ＳＢＰ−ＧＦＰは、フックＩｉ−コアストレプトアビジンを発現する細胞中のＥＲに保持される。ビオチンは時間００：００（分：秒）で添加され、レポーターの放出は、３７℃で回転ディスク搭載共焦点顕微鏡を用いてタイムラプス蛍光イメージングにより追跡される。レポーターは、極めて短時間にゴルジ装置内に見えはじめ（９：３０）、３０分までゴルジ装置を大規模に標識する。
【図５】コアストレプトアビジンとＳＢＰタグの間の可逆的相互作用を用いたゴルジ酵素ＳＴおよびＭａｎＩＩのトラフィッキングのタイムラプス分析を示す図である（ＲＵＳＨＬ［ＩＤ］）。レポーターＳＴ−ＳＢＰ−ＧＦＰ（この緑蛍光を用いて検出）およびＭａｎＩＩ−ＳＢＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ（この赤蛍光を用いて検出）は、フックＩｉ−コアストレプトアビジンを発現する細胞中のＥＲに両方とも保持される。ビオチンを添加すると、これらは両方ともゴルジ装置に到達し、および両方ともリアルタイムに追跡することができる。
【図６】コアストレプトアビジンとＳＢＰタグの間の可逆的相互作用を用いたウイルス糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇのトラフィッキングの分析を示す図である（ＲＵＳＨＬ［ＩＤ］）。レポーターＳＢＰ−ＧＦＰ−ＶＳＶ−Ｇは、フックＩｉ−コアストレプトアビジンを発現する細胞中のＥＲに保持される（右のパネル）。細胞表面で発現されたＧＦＰタグ化ＶＳＶ−Ｇの分画は、細胞透過性の非存在下でＧＦＰに対する抗体を用いて標識される（表面抗ＧＦＰ）。フックは抗Ｉｉモノクローナル抗体を用いて染色され、ゴルジ複合体は抗ジアンチン抗体を用いて標識される。ビオチンを添加すると、レポーターが放出され、この標的原形質膜コンパートメントに到達する（左のパネル）。レポーターは、検出ドメインとしてＧＦＰを用いて可視化される。ごく微量のレポーターが、保持された状態で細胞表面で見える間は、極めて大きな量が放出時に発現される。
【図７】コアストレプトアビジンとＳＢＰタグの間の可逆的相互作用を用いた原形質膜タンパク質Ｅ−カドヘリンのトラフィッキングの分析を示す図である（ＲＵＳＨＬ［ＩＤ］）。レポーターＳＢＰ−ＧＦＰ−Ｅカドヘリンは、フックＩｉ−コアストレプトアビジンを発現する細胞中のＥＲに保持される（右のパネル）。細胞表面で発現されたＧＦＰタグ化Ｅ−カドヘリンの分画は、細胞透過性の非存在下でＧＦＰに対する抗体を用いて標識される（表面抗ＧＦＰ）。ビオチンを添加すると、レポーターが放出され、この標的原形質膜コンパートメントに到達する（左のパネル）。レポーターは、検出ドメインとしてＧＦＰを用いて可視化される。ごく微量のレポーターが、保持された状態で細胞表面で見える間は、極めて大きな量が放出時に発現される。
【図８】コアストレプトアビジンとＳＢＰタグの間の可逆的相互作用を用いた原形質膜タンパク質Ｅ−カドヘリンのトラフィッキングのタイムラプス分析（ＲＵＳＨＬ［ＩＤ］）。レポーターＳＢＰ−ＧＦＰ−Ｅカドヘリンは、フックＩｉ−コアストレプトアビジンを発現する細胞中のＥＲに保持される。ビオチンは時間００：００（分：秒）で添加され、レポーターの放出は、３７℃で回転ディスク搭載共焦点顕微鏡を用いてタイムラプス蛍光イメージングにより追跡される。レポーターは、検出ドメインとしてＧＦＰを用いて可視化される。かなりの量のレポーターが０３：３０からゴルジ装置で見え、および増え続ける。レポーターは、３０：００頃に原形質膜で見え始める。輸送中間体（点状染色の形態での）が初期（ＥＲからゴルジへ）および後期（ゴルジから原形質膜へ）時点で見えることに留意されたい。
【図９】コアストレプトアビジンとＳＢＰタグの間の可逆的相互作用を用いた合成原形質膜タンパク質ＴＭＤ２２のトラフィッキングの分析（ＲＵＳＨＣ［ＩＤ］）。レポーターＳＢＰ−ＧＦＰ−ＴＭＤ２２は、フックＴＭＢ１７−ストレプトアビジンを発現する細胞中のＥＲに保持される（右のパネル）。この設定（ＲＵＳＨＣ）では、保持ドメインはフックおよびレポーターの細胞質部分に位置する。ビオチンを添加すると、レポーターが放出され、この標的原形質膜コンパートメントに到達する（左のパネル）。レポーターは、検出ドメインとしてＧＦＰを用いて可視化される。ごく微量のレポーターが、保持された状態で細胞表面で見える間は、極めて大きな量が放出時に発現される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１つの態様では、本発明は、宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節する方法であって、
ａ）宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定の細胞内コンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターを用意するステップと、
ｃ）式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを用意するステップと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、方法に関する。
【００２２】
本明細書では、表現「宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節する」とは、リガンドＬの存在または非存在により標的タンパク質の細胞内局在化を制御する事実を指す。保持された状態では、標的タンパク質Ｙは、特定の細胞内コンパートメントに保持されている。リガンドを添加または除去すると、標的タンパク質Ｙが放出される。前記標的タンパク質Ｙの放出は、標的タンパク質Ｙの全ての分子について迅速でありかつ同期している。
【００２３】
したがって、本発明は、前記標的タンパク質Ｙの同期放出を可能にして宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節する方法であって、
ａ）宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定の細胞内コンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターを用意するステップと、
ｃ）式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを用意するステップと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、方法に関する。
【００２４】
本発明はまた、宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節する方法であって、
ａ）宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定の細胞内コンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターを用意するステップと、
ｃ）式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを用意するステップと、
ｄ）前記リガンドＬの除去または添加それぞれにより標的タンパク質Ｙを放出するステップと、
ｅ）場合により、ステップｄ）後に異なる時点で標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを分析するステップと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、方法にも関する。
【００２５】
本発明の方法は、多くの利点を有する：１）この方法は、温度ブロックの使用を回避する、２）この方法は、大規模なセットのトラフィッキングステップを研究することを可能にする、３）この方法は、動態および定量的研究に適用できる、４）この方法は、さまざまなレポーター分子の分泌経路を研究すること、ならびにレポーター分子の最終目的地への送達に関与する機構およびシグナルを理解することを可能にする、５）このシステムはハイスループットスクリーニングに適用できる。これは、大規模ｓｉＲＮＡライブラリーをスクリーニングする可能性を開く。細胞内トラフィッキングの多くの潜在的調節因子が同定されたが、注釈付けされる必要がある（ゴルジマトリックスタンパク質のように）ポストゲノム時代において、これは特に重要である。重要なことには、特殊化された経路、特に、癌（例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ）またはウイルス感染（例えばＨＩＶ）などのヒト疾患に関与する分子を輸送する経路の特異的阻害因子またはエンハンサーを見出すのに、このアッセイを用いて化学ライブラリーをスクリーニングすることもできる。
【００２６】
好ましい実施形態では、ドナーコンパートメントからの標的タンパク質の同期放出は、リガンドＬの添加により制御され、ＡとＢの間の相互作用を破壊する。
【００２７】
本発明はしたがって、宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節する方法であって、
ａ）宿主細胞を用意するステップと、
ｂ）式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定の細胞内コンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターを用意するステップと、
ｃ）式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを用意するステップと、
ｄ）前記リガンドＬの添加により標的タンパク質Ｙを放出するステップと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの非存在下で条件的相互作用をすることができる、方法に関する。
【００２８】
１つの態様では、本発明はまた、ドナーコンパートメントから標的タンパク質Ｙを選択的に保持および放出するための、
式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定の細胞内コンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクター、ならびに
式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクター
の使用であって、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、使用にも関する。
【００２９】
また本明細書に記載されているのは、本発明の方法を実施するのに適切なキットである。
【００３０】
本発明はしたがって、宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節するキットであって、
式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質（式中、Ａは相互作用ドメインであり、Ｘは特定のコンパートメントに式Ａ−Ｘの第１の融合タンパク質を保持することができるドメインである）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターと、
式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質（式中、Ｂは相互作用ドメインであり、Ｙは標的タンパク質である）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターと
を含み、ＡおよびＢがリガンドＬの存在または非存在による条件的相互作用をすることができる、キットにも関する。
【００３１】
上記に示されたように、表現「宿主細胞における標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングを調節する」とは、特定の細胞内コンパートメントからの前記標的タンパク質の同期放出を可能にする事実を指す。
【００３２】
１つの実施形態では、キットは、キットの成分が、ドナーコンパートメントからの前記標的タンパク質Ｙの同期放出を可能にするのに、および前記標的タンパク質Ｙの細胞内トラフィッキングをこの後に分析するのに有用であることを説明する説明リーフレットをさらに含む。
【００３３】
当業者に知られた種々の技法が使用され得る（細胞分画後の蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法および生化学分析など。ただし、これらに限定されない）。
【００３４】
１つの実施形態では、キットは、前記第１および第２の発現ベクターでトランスフェクトされることができる宿主細胞をさらに含む。
【００３５】
１つの実施形態では、キットは、トランスフェクション試薬をさらに含む。
【００３６】
前記トランスフェクション試薬は、当技術分野における多くの利用可能なトランスフェクション試薬から選択することができる。
【００３７】
適切なトランスフェクション試薬は、例えばリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、フュージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）６（Ｒｏｃｈｅ社）または単純なリン酸カルシウム自家製溶液であってもよい。
【００３８】
１つの実施形態では、キットは、リガンドＬをさらに含む。
【００３９】
１つの実施形態では、第１の発現ベクターは、第１の融合タンパク質Ａ−Ｘをコードするために、Ａをコードするヌクレオチド配列、およびＸをコードするヌクレオチド配列のインフレーム挿入を可能にするマルチプルクローニングサイトを含む。
【００４０】
有利には、前記キットは、保持ドメインＸを変化させることで、さまざまなドナーコンパートメントからの特定の標的タンパク質Ｙのトラフィッキングの徹底的な研究を可能にする。
【００４１】
１つの実施形態では、第２の発現ベクターは、式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質をコードするために、Ｂをコードするヌクレオチド配列、およびＹのインフレーム挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含む。
【００４２】
有利には、前記キットは、標的タンパク質Ｙを変化させることで、および特定の保持ドメインＸを用いて、特定のドナーコンパートメントからの多数の異なる標的タンパク質Ｙのトラフィッキングの研究を可能にする。
【００４３】
１つの実施形態では、キットは、
第１の融合タンパク質Ａ−Ｘをコードするために、Ａをコードするヌクレオチド配列、およびＸをコードするヌクレオチド配列のインフレーム挿入を可能にするマルチプルクローニングサイトを含む第１の発現ベクター、ならびに
式Ｂ−Ｙの第２の融合タンパク質をコードするために、Ｂをコードするヌクレオチド配列、およびＹのインフレーム挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含む第２の発現ベクター
を含む。
【００４４】
本明細書では表現「インフレーム挿入」は、その結果得られるヌクレオチド配列の発現によって、第１のタンパク質と第２のタンパク質との融合体の発現がもたらされるような様式における、第１のタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列への、第２のタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列の挿入を指す。マルチプルクローニングサイトを含有する特定のヌクレオチド配列から始めて、前記マルチプルクローニングサイトに挿入される適切な制限酵素および配列を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００４５】
本出願を通じて、融合タンパク質Ａ−Ｘと言う場合、前記融合タンパク質は、いずれの順番でもＡのアミノ酸配列およびＸのアミノ酸配列を含むことが理解される。例えば、Ｘは、このＣ末端で、Ａの下流に融合されることができ、またはＡはＸの下流に融合されることができる。融合タンパク質Ａ−Ｘは、ＡおよびＸにより定義されたもの以外のアミノ酸を含むこともできる。前記アミノ酸は、ＡとＸの間に位置するリンカー配列、および／または頭部配列（ＡおよびＸ両方のＮ末端における）および／または尾部配列（ＡおよびＸ両方のＣ末端における）であってもよい。
【００４６】
同様に、表現「融合タンパク質Ｂ−Ｙ」は、前記配列の配置が何であれ、ＢおよびＹの配列を含む任意のタンパク質を対象とする。
【００４７】
本明細書では、用語「発現ベクター」は、発現制御配列またはプロモーターに作動可能に連結される特定の核酸配列の発現を指示することができる核酸分子を指す。特に、本発明による発現ベクターは、真核宿主細胞において前記核酸配列によりコードされたタンパク質への特定の核酸配列の発現を可能にするベクターである。前記発現ベクターのプロモーターは、典型的には真核プロモーターである。
【００４８】
本発明の発現ベクター（複数可）は、プラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、自己複製が可能な環状二本鎖ＤＮＡループである。ウイルスベクターは、ウイルス粒子にパッケージングすることができるウイルス配列を含む核酸分子である。例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルス、ハイブリッドアデノ−ＡＡＶ、レンチウイルス等を含む、さまざまなウイルスベクターが当技術分野で知られており、および本発明の実践に適合され得る。日常的な実験を実施して、当業者は、さまざまな利用可能なベクターから、本発明の方法を実施するのに適切なものを選択することができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、第１および第２の発現ベクターは、単一の発現ベクターであってもよく、前記単一のベクターは、２シストロン性発現カセットを含む。２シストロン性発現カセットを含有するベクターは、当技術分野でよく知られている。有利には、２シストロン性発現カセットは、単一のプロモーターから両方の融合タンパク質の発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有する。故に、この実施形態では、第１の融合タンパク質Ａ−Ｘおよび第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙが、宿主細胞において同レベルで発現される。
【００５０】
適切な市販の２シストロン性ベクターには、ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＢｕｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＶｉｔａｌｉｔｙ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）シリーズのプラスミドが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００５１】
好ましい実施形態では、相互作用ドメインＡおよびＢは、別個のタンパク質ドメインである。言い換えれば、ＡとＢの間、およびしたがってＡ−ＸとＢ−Ｙの間の相互作用は、ホモ複合体または自己集合体（ａｕｔｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）というよりむしろ、ヘテロ複合体である。
【００５２】
１つの実施形態では、Ａ−ＸとＢ−Ｙの間の相互作用は、コンパートメントの内腔面／外細胞質面（ｅｘｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆａｃｅ）で生じる（「内腔ＲＵＳＨ」、またはＲＵＳＨＬ）。
【００５３】
別の実施形態では、Ａ−ＸとＢ−Ｙの間の相互作用は、細胞質面で生じる（「細胞質ＲＵＳＨ」、またはＲＵＳＨＣ）。
【００５４】
１つの実施形態では、Ａ−ＸとＢ−Ｙの間の相互作用は、リガンドＬの存在下で分子依存的様式で生じ（「分子依存的」または「ＭＤ」設定）、およびリガンドＬの洗い出しにより逆にすることができる。
【００５５】
この実施形態によれば、ＡとＢの間、およびしたがってＡ−ＸとＢ−Ｙの間の相互作用は、特定のリガンドの存在下でのみ生じる。この実施形態は「ＭＤ」モードと呼ばれる。
【００５６】
第２の融合タンパク質Ａ−Ｘ（フックＡを含む）からの第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙ（標的タンパク質Ｙを含む）の放出をもたらす相互作用の調節は、ＡとＢの間の相互作用を誘導することなくＡまたはＢのどちらかとの結合をＬと競合する競合相手Ｃによる競合の有無に関わらず、リガンドＬの洗い出しにより実施することができる。
【００５７】
好ましい実施形態では、ＭＤ相互作用対（Ａ／Ｂ、またはＢ／Ａ）は、ＦＫＢＰ−ＦＫ５０６結合ドメイン１２／ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ）である。ＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ１Ａとしても知られる）は、１２ｋＤのＦＫ５０６およびラパマイシン結合タンパク質である（Ｓｔａｎｄａｅｒｔら、１９９０年；Ｍａｋｉら、１９９０年）。ＦＲＡＰは、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合タンパク質に結合する２４５ｋＤである（Ｂｒｏｗｎら、１９９４年）。ＲＵＳＨシステムの好ましい実施形態では、ラパマイシン結合ドメインのみが使用される。
【００５８】
この実施形態では、相互作用は、リガンドＬとしてのラパマイシンまたはこの類似体の存在下でのみ生じる。
【００５９】
リガンドＬは、ＦＫＢＰ１２とＦＲＡＰの間の相互作用を媒介することができる任意のリガンドであってもよく、および特に、ＦＫ１０１２、ＦＫ−ＣｓＡおよびラパマイシンから成る群から選択されてもよい。ラパマイシンの類似体（Ｒａｐａｌｏｇ）は、ＦＫＢＰ１２およびＦＲＡＰドメインの変異体と併用して使用することもできる（ＡＰ２１９６７など、ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．社）。
【００６０】
これらのリガンドは、転写レベルで遺伝子発現を制御するシステムで広く使用されている（概説はＣｌａｃｋｓｏｎ  １９９７年を参照のこと）。
【００６１】
ラパマイシン（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されている）は、１．５ｎＭから２００ｎＭ、好ましくは１．５２ｎＭから１２．２ｎＭの範囲の濃度、さらにより好ましくは約３．１ｎＭで使用することができる。
【００６２】
ＦＫ５０６は、競合相手Ｃとして使用することができ、したがってＦＫＰＢ１２とＦＲＡＰの間の相互作用を破壊するために、ラパマイシンが除去されるときに添加することができる。ＦＫ５０６（例えばＣａｙｍａｎ社から市販されている）は、３９０μＭから１．２５μＭの範囲の濃度、好ましくは約３．３μＭで使用することができる。１２．５μＭから１．６μＭの範囲の濃度、好ましくは約３．３μＭでのアスコマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、または２８．６μＭから３．６μＭの範囲の濃度、および好ましくは約５μＭでのＳＬＦ（Ｃａｙｍａｎ社）など、他の競合相手を使用することができる。
【００６３】
あるいは、ＭＤ相互作用対（Ａ／Ｂ、またはＢ／Ａ）は、ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合ドメイン１２／ラパマイシン依存的様式でＦＫＢＰ１２に結合するタンパク質である。この実施形態では、相互作用は、リガンドＬとしてのラパマイシンまたはこの類似体の存在下でのみ生じる。文献ＵＳ  ６，４９２，１０６は、ラパマイシン依存的様式でＦＫＢＰ１２に結合するようなタンパク質を同定する方法を開示している。
【００６４】
別の実施形態では、Ａ−ＸとＢ−Ｙの間の相互作用は、リガンドＬの非存在下でデフォルトで生じ（「デフォルトでの相互作用」または「ＩＤ」設定）、およびリガンドＬの存在下で阻害される。
【００６５】
この実施形態では、ＡとＢの間、およびしたがってＡ−ＸとＢ−Ｙの間の相互作用は、任意のリガンドの非存在下でデフォルトで生じる。相互作用は、リガンドＬの存在により破壊される。
【００６６】
適切なＩＤ相互作用ドメイン対（Ａ／ＢまたはＢ／Ａ）は、例えばストレプトアビジン／ＳＢＰタグ、Ｆｔｓｚ／ＺｉｐＡ、ＨＰＶ  Ｅ１／Ｅ２、組換え抗体／エピトープ、組換えエピトープ／ハプテン、タンパク質Ａ／ＩｇＧドメイン、Ｆｏｓ／Ｊｕｎから成る群から選択することができる。相互作用を阻害する分子（リガンドＬ）が既に知られている相互作用ドメイン対が好ましい。
【００６７】
１つの実施形態では、ＩＤ相互作用ドメイン対（Ａ／ＢまたはＢ／Ａ）は、ＦｔｓＺ／ＺｉｐＡである。
【００６８】
ＦｔｓＺおよびＺｉｐＡは、ある種のグラム陰性細菌の複製中に形成する隔壁リングの一部を形成する細菌タンパク質である。これらの相互作用は、リガンドＬとして「化合物１」と名付けられた小分子の添加により破壊することができる（概説はＷｅｌｌｓら  ２００７年を参照のこと）。
【００６９】
化合物１（Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＹ、ＵＳＡ））は、１０から１００μＭの間の範囲の濃度で使用することができる。
【００７０】
別の実施形態では、ＩＤ相互作用ドメイン対（Ａ／ＢまたはＢ／Ａ）は、ストレプトアビジン／ＳＢＰであり、遊離ビオチンがリガンドＬとして使用される。ストレプトアビジンは、ビタミンＤ−ビオチンへの極めて高い親和性により結合する細菌タンパク質である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択アプローチは、ストレプトアビジンに結合し、およびビオチンにより競合され得る合成ペプチドの発見をもたらした。
【００７１】
ストレプトアビジンに対する高親和性結合剤、ＳＢＰタグ（配列番号１に示されたような）は、Ｗｉｌｓｏｎ、ＫｅｅｆｅおよびＳｚｏｓｔａｋ（２００１年）により同定されている（特許ＵＳ  ２００２／０１５５５７８  Ａ１を参照のこと）：
配列番号１：ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ。
【００７２】
ステプトアビジン（Ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）のより小さなバージョン、コアストレプトアビジンは、特許ＵＳ  ５６７２６９１で同定されている（配列番号２）。
配列番号２:
MDPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ
単量体コアストレプトアビジンも、ＷｕおよびＷｏｎｇ（２００５年）により構築されている（特許ＵＳ  ７，２６５，２０５  Ｂ２および配列番号３を参照のこと）。
配列番号３:
MDPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYTLTGRYDSAPATDGSGTALGWRVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWTLTSGTTEANAWKSTLRGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ
本明細書では、「ストレプトアビジン」は、ストレプトアビジンの全形態（４量体、コアまたは単量体）を指すことができる。好ましい実施形態では、ストレプトアビジンは、配列番号２もしくは配列番号３に示されたようなアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号３と少なくとも８０％同一性、配列番号２もしくは配列番号３と好ましくは８５％、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％同一性を有するこのバリアントを含む。
【００７３】
「ストレプトアビジン」は、アビジンまたはリズアビジン（ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）など、他の種由来のストレプトアビジン相同体を包含することもできる。これらの天然ビオチン結合タンパク質の変異体も使用することができる。
【００７４】
ビオチンは、１００ｎＭから１００μＭ、好ましくは約１から１０μＭの範囲の濃度でリガンドＬとして使用することができる。
【００７５】
保持ドメインＸ（すなわち「フック」）は、特定の細胞内コンパートメントのレジデントである任意のタンパク質またはタンパク質ドメインであってもよい。
【００７６】
用語「レジデント」は、特定のタンパク質またはドメインおよび特定のコンパートメントに適用され本明細書で使用される場合、前記タンパク質またはドメインは大半が特定のコンパートメントに位置することを意味することが意図される。典型的には、前記タンパク質またはドメインの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が、宿主細胞において定常状態で前記コンパートメントに位置する。
【００７７】
本明細書では、用語「コンパートメント」または「細胞内コンパートメント」は、細胞生物学の技術分野で一般的な意味を有する。該用語は、真核細胞の特定のサブドメインを指す。典型的には、コンパートメントは、オルガネラ（小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソーム等）、またはオルガネラのエレメント（エンドソームの多胞体；ゴルジ装置のシス、中間またはトランス槽等）または原形質膜もしくは原形質膜のサブドメイン（頂端、側底、軸索、樹状等）またはさらにマイクロドメイン（トリトン不溶性ドメイン、接着点、密着結合等）であってもよい。
【００７８】
本明細書では、表現「ドナーコンパートメント」および「アクセプターコンパートメント」は、当技術分野で一般的な意味を有し、それぞれ、特定の標的タンパク質が由来するコンパートメントおよび特定の標的タンパク質が標的にされるコンパートメントと関係する。
【００７９】
目的とするドナーコンパートメントに従って、異なるタンパク質またはドメインが保持ドメインとして使用され得る。
【００８０】
ＥＲにおける適切な保持ドメインＸは、ＥＲに存在するインバリアント鎖のアイソフォーム（Ｉｉ３３）、リボホリンＩもしくはＩＩ（Ｓｔｒｕｂｉｎら、１９８６年；Ｓｔｒｕｂｉｎら、１９８４年；Ｓｃｈｕｔｚｅら、１９９４年；Ｆｕら  ２０００年）、ＳＥＣ６１、シトクロムｂ５（Ｂｕｌｂａｒｅｌｌｉら、２００２年）または局在化ドメインを含むこのフラグメントであるが、これらに限定されない。ＥＲ局在化ドメインの例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０６０５５６．１下で利用可能なリボホリンＩＩのＥＲ局在化である。
【００８１】
ゴルジ装置における適切な保持ドメインＸは、ジアンチン（ジアンチン）（ＧｏｌｇＢ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４８７．３）、ＴＧＮ３８／４６、メンケス受容体、およびＭａｎＩＩ（α−１，３−１，６マンノシダーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００８５４９下で利用可能）、シアリルトランスフェラーゼ（β−ガラクトサミドα−２，６シアリルトランスフェラーゼ１、ＮＭ＿００３０３２）、ＧａｌＴ（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１、ＮＭ＿００１４９７）または局在化ドメインを含むこのフラグメントなどのゴルジ酵素であるが、これらに限定されない。
【００８２】
原形質膜保持ドメインＸの例は、Ｔｈｙ−１およびＰＲＮＰ（Ｔａｎｙａら、２００６年；ＳｃｈｕｃｋおよびＳｉｍｏｎｓ、２００６年；Ｈａｒｒｉｓ、２００３年；Ｂａｒｄら、２００６年；ＨｅｎｎｅｃｋｅおよびＣｏｓｓｏｎ、１９９３年；Ａｃｈｏｕｒ  Ｌら、２００９年；ＲａｙｎｅｒおよびＰｅｌｈａｍ、１９９７年；Ａｍａｒａｌ、２００５年）などのＧＰＩアンカータンパク質であるが、これらに限定されない。
【００８３】
好ましい実施形態では、保持ドメインＸはＥＲに存在するインバリアント鎖のアイソフォーム、Ｉｉ３３である。
【００８４】
本発明による標的タンパク質Ｙは、特定のドナーコンパートメントから最終標的コンパートメントへの細胞内トラフィッキングを研究するのに望ましい任意のタンパク質であってもよい。
【００８５】
標的タンパク質Ｙの例は、
上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの成長因子（これらの全ては正常または変異されていてもよい）、
ＣＣＲ５およびＣＦＴＲなどのＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）などの受容体、
ＣＤ４、ＣＤ８およびモデル膜貫通タンパク質ＴＭ２１などの原形質膜マーカーおよび主要組織適合性（ＭＨＣ）分子、
Ｅ−カドヘリンなどの接着分子、
リソソーム酵素、
ＭａｎＩＩ（α−１，３−１，６マンノシダーゼ）、シアリルトランスフェラーゼ（β−ガラクトサミドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１）、ＧａｌＴ（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１）などのゴルジ酵素、
ＶＳＶＧおよびＨＡなどのウイルス糖タンパク質、
ＣＤ９などの４回膜貫通（ｔｅｔｒａｓｐａｎｎｉｎｇ）タンパク質、
シグナル伝達タンパク質、
多剤耐性タンパク質ＡＢＣＢ１などの輸送体タンパク質、
合成膜貫通ドメイン（例えばＴＭＤ２２）、
Ｔｈｙ−１およびＰｒｐなどのＧＰＩアンカータンパク質、
ホルモン（インスリン、プロラクチン）またはホルモン受容体、
病的分子（アミロイドペプチド）
であってもよいが、これらに限定されない。
【００８６】
標的タンパク質Ｙは、治療効果を得るために細胞内トラフィッキングをきっちりと調整することが望ましい、治療的目的の任意の分子であってもよい。逆に、標的タンパク質Ｙは、病理学的作用が細胞内トラフィッキングとつながりのある病的分子であってもよい。
【００８７】
好ましい実施形態では、標的タンパク質Ｙは、シアリルトランスフェラーゼ、Ｅ−カドヘリンおよびＴＭＤ２２から成る群から選択される。
【００８８】
シアリルトランスフェラーゼおよびＥ−カドヘリンは、ＲＵＳＨＬ設定に好ましい標的タンパク質であるのに対し、ＴＭＤ２２は、ＲＵＳＨＣ設定に好ましい標的タンパク質である。
【００８９】
特定のタンパク質は、幾つかの実施形態では、保持強度との相対に応じて保持ドメインＸまたは標的タンパク質Ｙになることができる。特定のタンパク質Ｐ１は、タンパク質Ｐ２よりも適正な位置で安定に保持される場合があり、これは、保持ドメインすなわちフック（Ｘ）とみなされるであろう。同じタンパク質Ｐ１は、タンパク質Ｐ３よりも強く保持されない場合がある。タンパク質Ｐ３は、タンパク質Ｐ３の最終コンパートメントにタンパク質Ｐ１を運ぶであろう。Ｐ３は、このケースでは、保持ドメインすなわちフック（Ｘ）となるであろう。
【００９０】
したがって、本発明の方法は、異なる局在化ドメインの強度を「ランク付け」するのに使用することもできる。
【００９１】
標的タンパク質Ｙの検出は、当業者に知られている任意の手段により実施することができる。
【００９２】
１つの実施形態では、標的タンパク質Ｙは検出可能な部分Ｚを含む。
【００９３】
別の実施形態では、第２の融合タンパク質は、検出可能な部分Ｚを標的タンパク質と共にフレーム中に含む。
【００９４】
適切な検出手段には、蛍光タンパク質、検出可能な部分に対する抗体、ｐＨ感受性プローブ、フルオロフォア結合剤および酵素検出（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）の使用が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００９５】
好ましい実施形態では、標的タンパク質Ｙは、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および赤蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質に融合される。有利には、この実施形態は、生細胞においてリアルタイムに標的タンパク質Ｙを追跡できるようにする。
【００９６】
別の実施形態では、標的タンパク質Ｙは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に融合される。有利には、この実施形態は、輸送中間体の電子顕微鏡観察を可能にする。
【００９７】
探求される特定の目標に従って適切な検出部分を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００９８】
本明細書では、用語「宿主細胞」は、本発明の第１および第２の融合タンパク質を発現するのに遺伝子操作することができる任意の真核細胞を指す。典型的には、本発明による宿主細胞は、酵母細胞または昆虫細胞またはげっ歯類もしくは霊長類もしくはヒト細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、ヒト起源のＨｅＬａおよびＲＰＥ−１細胞系である。
【００９９】
本発明によれば、宿主細胞は、生きている生物内のｉｎ  ｖｉｔｒｏ宿主細胞、培養、またはｉｎ  ｖｉｖｏ宿主細胞であってもよい。
【０１００】
本発明の方法は、（１）フックとして使用することができる、選択されたドナーコンパートメントに安定に局在化されたタンパク質を見出すことができること、および（２）宿主細胞が相互作用ドメインの相互作用を可能にし、リガンド分子に浸透することから、選択された宿主により課せられたいずれの起源のおよびいずれの生理的温度での任意の細胞モデルにおいて実施することができる。
【０１０１】
本発明による一般的方法：
本発明の２成分系では、第１の融合タンパク質Ａ−Ｘ（フック）および第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙ（レポーター）の両方とも、同じ宿主細胞で発現される必要がある。
【０１０２】
これは、さまざまな方法により達成することができ、これらには以下が挙げられる：
２つの別個のプラスミドを用いた細胞のトランスフェクション
２シストロン性発現カセットを有するプラスミドを用いた単一トランスフェクション。
【０１０３】
あるいは、プラスミドを使用する代わりに、ウイルス送達も使用することができる。あるいは、一方または両方の構築物を発現する安定な細胞系（単一または複数の発現ベクターを用いた）も、当技術分野における一般的な手順により生成することができる。
【０１０４】
生理的温度で細胞を維持するとき、レポーターはフック含有コンパートメントに封鎖される。デフォルトでの相互作用実施形態を用いる場合、これは自然に生じるであろう。しかし、分子依存的実施形態を用いる場合、架橋分子として作用する、および２つのドメインＡおよびＢの相互作用を確実にするリガンドが、このステップで添加されなければならない。当業者は、過剰な実験をすることなくドナーコンパートメントに全レポーター分子を封鎖するために必要な時間を作ることができるであろう。
【０１０５】
典型的には、ドナーコンパートメントに全レポーター分子を封鎖するために必要な時間は、２から２４時間の間、好ましくは６から１６時間の間、さらにより好ましくは約１６時間（一終夜）を含むことができる。
【０１０６】
典型的には、約６時間がＥＲにゴルジ酵素を封鎖するのに十分である。
【０１０７】
レポーターの分泌の測定を開始するため、封鎖が解除される。［ＩＤ］−ＲＵＳＨを用いる場合、リガンドＬはこのステップで添加され、［ＭＤ］−ＲＵＳＨを用いる場合、架橋分子リガンドＬは洗い流され、および必要であれば競合相手Ｃが添加されるであろう。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明の方法は、標的タンパク質のトラフィッキングを撹乱する条件または分子を同定するのに使用することができる。例えば、本発明の方法は、標的タンパク質のトラフィッキングを撹乱する化合物をスクリーニングするのに使用することができる。
【０１０９】
典型的には、前記化合物はｓｉＲＮＡであってもよい。例えば、本発明の方法は、極めて多様な調節遺伝子を不活化するため、多くのプロバイダー（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ社、Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ社）から利用可能なｓｉＲＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。
【０１１０】
典型的には、前記化合物は、化学薬剤ライブラリーの分子などの小分子であってもよい。これらのライブラリーは、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ社、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社またはＭａｙＢｒｉｄｇｅ社などの多くのプロバイダーから利用可能である。
【０１１１】
本発明の方法およびキットは、時間における厳格な管理により、正常もしくは変異された成長因子（例えばＥＧＦ、ＶＥＧＦ）、ホルモン（インスリン、プロラクチン）またはこの受容体、または病的分子（アミロイドペプチド）の輸送の調節などのｉｎ  ｖｉｖｏ適用に使用することもできる。このような動物モデルの使用の例には、動物の生涯の後期における腫瘍発生、ヒト疾患に似た症状を呈する生理的変化の発達異常の作製が含まれる。
【０１１２】
本発明は、特許請求の範囲により規定された保護の範囲を限定するものではない以下の図および実施例によりさらに記載されるであろう。
【実施例】
【０１１３】
材料および方法
レポーターアッセイ構築（表１を参照のこと）
ＩＲＥＳベクターの開発：
ＲＵＳＨシステムは、同じ細胞中にフックタンパク質およびレポータータンパク質の両方の同時存在を必要とする。
【０１１４】
コトランスフェクションまたは重感染を使用することができるであろうが、本発明者らは先ず、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）ベースのベクターを開発して同時発現を可能にした。全てのレポーター分子を保持するのに十分なフックが発現されるのを確実にするため、フックはＩＲＥＳの前、レポーターはＩＲＥＳの後で挿入する。
【０１１５】
ＩＲＥＳベクターは、ｐＩＲＥＳｎｅｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ−Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ社、サンジェルマンアンレ、フランス）に基づく。フックは、ベクターのＭＣＳを用いて挿入する。レポーターを挿入するため、本発明者らは、８ベースカッター認識部位ＡｓｃＩ、ＳｆｉＩおよびＰａｃＩを含有するマルチクローニングサイトにネオカセットを置換してベクターを修飾した。
【０１１６】
ＲＵＳＨＬＩｉ−ＦＲＡＰ［フック］／［レポーター］ｐＩＲＥＳベクターの構築：
最初の検証として、本発明者らは、本発明者らがソース配列を入手したＶ．Ｍａｌｈｏｔｒａ博士｛Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ｝により既に使用されたタンパク質のペア（Ｐｅｃｏｔ、２００４年；Ｐｅｃｏｔ、２００６年）を実行した。フックは、ダブルアルギニンシグナルのためＥＲから逃れることができないインバリアント鎖Ｉｉｐ３３である。フックは、ＨＡエピトープでタグ付けし、ＦＲＡＰタンパク質のラパマイシン結合ドメイン（ＡＡ  ２０２６−２１１４）に融合させる。
【０１１７】
使用した第１のレポーターは、ＳＴ−ＦＫＢＰ−ＧＦＰ構築物であり、およびＡｓｃＩおよびＳｆｉＩ部位にクローン化した。該レポーターは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、これに続いて緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合されたシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）のゴルジ局在化ドメインから成る。
【０１１８】
他のゴルジ酵素レポーターまたは分泌マーカーも同様にサブクローン化し、レポーターとして使用した。
【０１１９】
同じ構築物を基に、発明者らは、ＶＳＶＧタンパク質配列をＧＦＰおよびＦＫＢＰ１２に融合させた。
【０１２０】
ｐＩＲＥＳベクターでのＲＵＳＨＬストレプトアビジン／ＳＢＰベースの［フック］／［レポーター］システムの構築：
Ｉｉ−ＦＲＡＰ／ＳＴ−ＦＫＢＰ１２対のＦＫＢＰ１２およびＦＲＡＰドメインは、コアストレプトアビジンおよびＳＢＰドメインにより置換した。２つの立体配置（１）Ｉｉ−ストレプトアビジン／ＳＴ−ＳＢＰおよび（２）Ｉｉ−ＳＢＰ／ＳＴ−ストレプトアビジンを構築し、評価した。立体配置（１）は、小さなタグでレポーター分子をタグ付けする利点があるのに対し、立体配置（２）は、ストレプトアビジンでレポーターをタグ付けするため、放出中に蛍光ビオチンでレポーターを標識する可能性のある機会を提供する利点がある。ＦＲＡＰのストレプトアビジンによる置換は、同じ制限酵素を用いて挿入し易い合成遺伝子を用いて行う。ＦＫＢＰ１２のＳＢＰタグによる置換は、ＥｃｏＲＩ−ＳｂｆＩ部位に挿入されたＰＣＲ増幅されたＳＢＰタグを用いて行う。フック、ＩＲＥＳおよびレポーターを含有するカセット全体を、次いでｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターのＭｆｅＩ−ＡｇｅＩ部位にクローン化する。
【０１２１】
同じ構築物を基に、発明者らはＶＳＶＧおよびＥ−カドヘリンをＧＦＰおよびＳＢＰタグに融合させた。
【０１２２】
【表１】
2012529278.tif 000002
【０１２３】
【表２】
2012529278.tif 000003
ＲＵＳＨＣ  Ｉｉ−ＦＲＡＰ［フック］／［レポーター］ｐＩＲＥＳベクターの構築：
このシステムではＦＲＡＰドメインを、ｍｙｃタグおよびフック配列に融合させる。このフックは、ラットシトクロムｂ５の１７ＡＡ長の膜貫通ドメインから成る（ＴＭＤ１７）。実際、ＧＦＰタンパク質に融合されたこのドメインは、ＧＦＰのＥＲにおける保持を媒介できることが示されている（Ｂｕｌｂａｒｅｌｌｉら、２００２年）。ＦＲＡＰ−ｍｙｃ−ＴＭＤ１７は合成遺伝子（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ社）として調製し、およびベクターＭＣＳのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ部位におけるＩＲＥＳの５’でクローン化した。レポーター部分は、ＩＲＥＳ後にＡｓｃＩ−ＳｆｉＩ部位にクローン化する。ラットシトクロムｂ５の２２ＡＡ長の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ２２）に融合されたＦＫＢＰドメインから成る第２の合成遺伝子を調製した（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ社）。ＧＦＰの挿入を可能にするため、Ｓｂｆｉ−ＦｓｅＩ部位をＦＫＢＰとＴＭＤ２２の間に添加した。このＴＭＤ２２ドメインは、原形質膜へのＧＦＰを標的にできることが示されている（Ｂｕｌｂａｒｅｌｌｉら、２００２年）。
【０１２４】
ｐＩＲＥＳベクターでのＲＵＳＨＣストレプトアビジン／ＳＢＰベースの［フック］／［レポーター］システムの構築：
フック部分では、ＦＲＡＰドメインを、ＰＣＲにより増幅しおよびＮｈｅＩ−ＡｇｅＩ部位に挿入したコアストレプトアビジンにより置換する。レポーター部分では、ＦＫＢＰ１２を、ＰＣＲにより増幅しおよびＥｃｏＲＩ−ＳｂｆＩ部位に挿入したＳＢＰタグ配列により置換する。
【０１２５】
試薬
ラパマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を原液（エタノール中）として最終２００ｍＭで希釈した。原液を、１０００倍および次いで６４倍に希釈して（両方とも培地で）３．１ｎＭの最終モル濃度を得た。希釈の各ステップで、溶液は強くボルテックスした。
【０１２６】
ＦＫ５０６（Ｃａｙｍａｎ社）をＤＭＳＯで希釈して２４．８ｍＭでの原液を得た。原液を室温（ＲＴ）、ＤＭＳＯで５０倍に希釈し、大規模にボルテックスし、次いで強くボルテックスしながらＲＴの培地で１２０倍に再び希釈して４．１μＭの最終モル濃度を得た。この最終希釈を３７℃で数分間温め、次いで細胞に添加する前に再びボルテックスした。
【０１２７】
Ｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ社）を原液として０．２ｍｇ／ｍＬ（０．８ｍＭ）で水で調製する。８０μＭから１００ｎＭの範囲の濃度、および好ましくは１０μＭを使用してフックからレポーターを放出させる。ビオチンを含有しないまたは極めて低レベル（０．２μＭ以下）のビオチンを含有する培養培地を使用する。
【０１２８】
細胞培養およびトランスフェクション：
Ｈｅｌａ細胞を、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよび１０％ウシ胎仔血清を追加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３７℃で増殖させた。一過性のトランスフェクションのため、細胞を１５０ｍｍ培養皿でカバースリップに播種し、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳの存在下、リン酸カルシウム沈殿方法を用いてプラスミドフック−ＩＲＥＳ−レポーター２５μｇをトランスフェクトした。４時間後、細胞を新鮮培地で洗い流し、３．１ｎＭラパマイシン（Ｓｉｇｍａ社）の存在下、一終夜インキュベートした。次いで細胞を培地で３回洗浄し、幾つかの時点で３．３μＭ  ＦＫ５０６（Ｃａｙｍａｎ社）および１００ｍｇ／ｍＬシクロヘキシミド（ＣＨＸ）と共に予め温めた培地でインキュベートした。各時点で、ＦＫ５０６およびＣＨＸ含有培地１ｍＬを、１２ウェルプレートの１つのウェルに添加した。次いで細胞を４％ＰＡＦで固定し、蛍光顕微鏡法のため処理した。ストレプトアビジン／ＳＢＰ設定では、トランスフェクションを同様に行うが、トランスフェクション後に細胞を洗浄する場合添加は行わない。１時間後、ビオチン（１０μＭ）を添加してレポーター放出を誘導する。次いで、細胞を次いでＭＤ設定でのように処理する。
【０１２９】
免疫蛍光：
細胞をパラホルムアルデヒド３％で１５分間固定し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）および遊離アルデヒドで洗浄し、ＮＨ４Ｃｌ  ５０ｍＭで５分間クエンチングした。細胞は、次いでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ  ０．５％）およびサポニン（Ｓａｐｏ  ０．０５％）を含有するＰＢＳ［ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｓａｐｏ］で２０分間透過処理し、１次抗体（ヒト抗ジアンチン、Ｎｉｚａｋら  ２００３年、Ｍｏｕｔｅｌら、２００９年）と共に同じ緩衝液で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、および蛍光標識した２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）と共にＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｓａｐｏで２０分間インキュベートした。核はＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で対比染色した。細胞は最後に、モウィオール（Ｍｏｗｉｏｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）にマウントする前にＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡法により観察した。
【０１３０】
＜実施例１＞
ＦＲＡＰとＦＫＢＰ１２の間の分子依存的相互作用およびゴルジ酵素、シアリルトランスフェラーゼのトラフィッキング（図２）
概要
フック構築物：Ｉｉ−ＦＲＡＰ−ＨＡ
レポーター構築物：シアリルトランスフェラーゼ−ＦＫＢＰ１２−ＧＦＰ
この例では、フックは、ＥＲから出ていくことができないインバリアント鎖のバリアントに基づく。フックは、第１の融合タンパク質を形成するラパマイシン結合タンパク質ＦＲＡＰ、および免疫染色のためのＨＡタグに融合される。レポーターは、第２の融合タンパク質を形成するラパマイシンおよびＦＫ５０６結合タンパク質ＦＫＢＰ１２に融合されたゴルジ酵素配列（シアリルトランスフェラーゼ）の標的配列である。このトラフィッキングを追跡するため、レポーターも蛍光ＧＦＰタンパク質に融合させた。ドナーコンパートメントはＥＲであり、標的コンパートメントはゴルジ装置である。レポーターおよびフックは両方とも、単一プロモーターの制御下で発現される。
【０１３１】
ＥＲでのレポーターの保持は、ラパマイシンの存在下で生じた。ラパマイシンを洗い流すと、およびＦＫＢＰ１２に結合しているラパマイシンと競合するＦＫ５０６の存在下で、レポーターが放出され、標的ゴルジコンパートメントへトラフィックした。
【０１３２】
プロトコルおよび結果
細胞を一終夜、低ラパマイシン濃度でインキュベートして、ＦＲＡＰドメインとＦＫＢＰ１２ドメインの間の安定な相互作用を誘導した。免疫蛍光により示されるようなこれらの状態では、ＦＫＢＰ１２−ＧＦＰ−ＳＴはジアンチン抗体を用いて標識されたゴルジ装置に到達することはできなかった（図２、上のパネル、保持された状態）。
【０１３３】
ＦＫ−５０６の存在下でラパマイシンを洗い出すと（図２、下のパネル、放出された状態）、レポーター分子は、ＥＲを効率的に出てゴルジ装置に到達することができた。
【０１３４】
故に、ＲＵＳＨシステムは、２つの融合タンパク質を用いて宿主細胞における標的タンパク質Ｙ（本ケースではＳＴ）の細胞内トラフィッキングを同期させる方法を提供する。第１の融合タンパク質Ｘ−Ａはフックとして役割を果たし、リガンドＬとしてのラパマイシンの存在下で第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙを小胞体に保持することができる。ラパマイシンを洗い出し、および競合相手Ｃを添加すると、レポーターＢ−ＹはがＥＲを出てゴルジに向かって移行するのを見ることができる。
【０１３５】
このシステムは、ラパマイシンの存在下または非存在下でＦＲＡＰおよびＦＫＢＰ１２の可逆的相互作用に基づく。
【０１３６】
＜実施例２＞
ストレプトアビジン／ＳＢＰタグ間のデフォルトでの相互作用およびゴルジ酵素、シアリルトランスフェラーゼのトラフィッキング（図３および４）
概要
フック：Ｉｉ−ＦＲＡＰ
レポーター：シアリルトランスフェラーゼ−ＦＫＢＰ１２−ＧＦＰ
この例では、フックは、ＥＲから出ていくことができないインバリアント鎖のバリアントに基づく。フックは、第１の融合タンパク質を形成するコアストレプトアビジン、および免疫染色のためのＨＡタグに融合される。レポーターは、第２の融合タンパク質を形成するストレプトアビジン相互作用ＳＢＰペプチドに融合されたゴルジ酵素配列（シアリルトランスフェラーゼ）の標的配列である。このトラフィッキングを追跡するため、レポーターも蛍光ＧＦＰタンパク質に融合させた。ドナーコンパートメントはＥＲであり、標的コンパートメントはゴルジ装置である。レポーターおよびフックは両方とも、単一プロモーターの制御下で発現される。
【０１３７】
ＥＲでのレポーターの保持は、ＳＢＰとコアストレプトアビジンの間の相互作用によりデフォルトで生じた。ビオチンを添加すると、レポーターが放出され、標的ゴルジコンパートメントへトラフィックした。
【０１３８】
プロトコルおよび結果
フックは、単量体ストレプトアビジン（配列番号３）に融合されたＩｉ３３に局在化したＥＲを用いて構築した（実施例１からの構築物のＦＲＡＰが単量体ストレプトアビジンにより置換される）。レポーターは、実施例１で使用されるようなシアリルトランスフェラーゼのゴルジ局在化ドメインであった。フックおよびレポーターは細胞で共発現され、２つのドメイン、ストレプトアビジンおよびＳＢＰ−タグはデフォルトで相互作用し、ゴルジ装置へのＳＴ輸送を妨げる。ＳＴの放出は、遊離ビオチンの中程度の濃度（約１〜１０μＭ）を用いて達成された。
【０１３９】
この例では、ＲＵＳＨシステムのＩＤモードを説明する。
【０１４０】
リガンドの非存在下では、ＳＢＰ−タグとストレプトアビジンの間の相互作用が生じ、レポーターはＥＲに閉じ込められる。リガンド、ビオチンを添加すると、相互作用は破壊された。レポータータンパク質（ここではＳＴの標的ドメイン）が放出され、および標的コンパートメント、すなわちゴルジに向かってトラフィックするためにＥＲを出ることができた（図３）。
【０１４１】
このシステムで観察された速度は極めて速く、ストレプトアビジンとＳＢＰの間の相互作用の阻害が律速段階ではなかったことを示唆する。実際、図４に示されているように、染色はわずか数分後にゴルジで観察され、レポーター分子の全てではなくともほとんどが、放出後１８分から３０分までにゴルジコンパートメントに到達した。
【０１４２】
これは、ゴルジ酵素のトラフィックを定量的および速度論的に研究し、分子的に記載し、および潜在的に撹乱する独自の方法を提供する。
【０１４３】
＜実施例３＞
ストレプトアビジン／ＳＢＰタグ間のデフォルトでの相互作用およびゴルジ酵素マンノシダーゼＩＩのトラフィッキング（図５）
実施例２と同様（ただし、レポーター分子としてマンノシダーゼＩＩ標的ドメインを用いる）。この例は、分析される別の種類のゴルジ酵素を提供する。該酵素を赤蛍光タンパク質に融合することで、２つのゴルジ酵素（もしくはゴルジ酵素および別の積み荷）を同じドナーおよびアクセプターコンパートメント間で同時に観察することができた。
【０１４４】
＜実施例４＞
ストレプトアビジン／ＳＢＰタグ間のデフォルトでの相互作用およびウイルスタンパク質ＶＳＶ−Ｇのトラフィッキング（図６）
例２と同様（ただし、レポーター分子としてウイルス糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇを用いる）。これは、ＥＲと原形質膜の間のトラフィックを研究および定量化するのにこの感熱性バージョンで通常使用される極めて古典的なレポーターである。ＲＵＳＨシステムを用いて、同じ分析を、温度ブロックを使用せずに行った。細胞を故に常温、生理的温度で研究することができる。
【０１４５】
＜実施例５＞
ストレプトアビジン／ＳＢＰタグ間のデフォルトでの相互作用および原形質膜タンパク質Ｅ−カドヘリンのトラフィッキング（図７および８）
例２と同様（ただし、レポーター分子として接着分子Ｅ−カドヘリンを用いる）。この例は、ＥＲから原形質膜への輸送を同期的およびリアルタイムに追跡することができたことを示す。タイムラプス分析は、輸送中間体（ＥＲからゴルジへおよびゴルジから原形質膜へ）の同定を可能にした（図８）。ＲＵＳＨシステムは故に、原形質膜局在化タンパク質のトラフィックを定量的および速度論的に研究し、分子的に記載し、および潜在的に撹乱するのに使用することができる。
【０１４６】
＜実施例６＞
細胞質トポロジーにおけるストレプトアビジン／ＳＢＰタグ間のデフォルトでの相互作用（図９）
概要
フック：ＴＭＤ１７（シトクロムｂ５）
レポーター：ＴＭＤ２２−ＧＦＰ
この例では、フックは、ＥＲのレジデントタンパク質として挙動するシトクロムｂ５の膜貫通ドメインに基づく。フックは、第１の融合タンパク質を形成するコアストレプトアビジン、および免疫染色のためのｍｙｓタグに融合される。レポーターは、合成膜貫通ドメインであり、第２の融合タンパク質を形成するストレプトアビジン相互作用ＳＢＰペプチドに融合された原形質膜に向かってトラフィックするシトクロムｂ５に基づく。このトラフィッキングを追跡するため、レポーターも蛍光ＧＦＰタンパク質に融合させた。ドナーコンパートメントはＥＲであり、標的コンパートメントは原形質膜である。レポーターおよびフックは両方とも、単一プロモーターの制御下で発現される。
【０１４７】
ＥＲでのレポーターの保持は、ＳＢＰとコアストレプトアビジンの間の相互作用によりデフォルトで生じる。ビオチンを添加するとレポーターが放出され、標的ゴルジコンパートメントへトラフィックする。この設定（ＲＵＳＨＣ）は、積み荷の保持および膜の細胞質面からの放出を可能にする。
【０１４８】
プロトコルおよび結果
ＲＵＳＨＣ設定の例として本発明者らは、フックとしてのシトクロムＢ５の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ１７）およびシトクロムｂ５に基づくより長い合成ドメイン、ＴＭＤ２２を使用した。定常状態では、保持は広範囲に及んだ。ビオチンを添加すると、放出が観察され、レポーターＴＭＤ２２は原形質膜に向かってトラフィックし続けた。これは、いずれの内腔ドメインも有さない、または内腔部分にタグ付けできないタンパク質も、ＲＵＳＨシステムを用いて研究することができることを示している。
【０１４９】
ＥＲではなくゴルジコンパートメントに目的とするタンパク質を保持するフックとしてジアンチンを用いて、同様の実験を行った。
【０１５０】
参考文献：
本明細書を通じ、様々な参考文献が、本発明が関連する先行技術を記載する。これら参考文献の開示は参照により本発明の開示に組み込まれる。
【０１５１】
【表３】
2012529278.tif 000004
【０１５２】
【表４】
2012529278.tif 000005
【０１５３】
【表５】
2012529278.tif 000006
【０１５４】
【表６】
2012529278.tif 000007
【図１ａ】
2012529278.tif 000008
【図１ｂ】
2012529278.tif 000009
【図１ｃ】
2012529278.tif 000010
【図１ｄ】
2012529278.tif 000011
【図１ｅ】
2012529278.tif 000012
【図１ｆ】
2012529278.tif 000013
【図２】
2012529278.tif 000014
【図３】
2012529278.tif 000015
【図４】
2012529278.tif 000016
【図５】
2012529278.tif 000017
【図６】
2012529278.tif 000018
【図７】
2012529278.tif 000019
【図８】
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【図９】
2012529278.tif 000021
【配列表】
2012529278000001.app
【国際調査報告】
2012529278.tif 000022
2012529278.tif 000023
2012529278.tif 000024
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