(57)【要約】  本発明は、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低減するように改変されたヤロウィア属に属する酵母を用いてコハク酸を製造する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤロウィア属に属する酵母であって、コハク酸を生成し、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低減されている酵母。
【請求項２】
ＳＤＨ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１ｌ３７４ｇ）、ＳＤＨ２（ＹＡＬＩ０Ｄ２３３９７ｇ）、ＳＤＨ３（ＹＡＬＩ０Ｅ２９６６７ｇ）、ＳＤＨ４（ＹＡＬＩ０Ａ１４７８４ｇ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される遺伝子の発現が減弱するように改変されている、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
ＳＤＨ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１１３７４ｇ）への温度感受性変異の導入により前記ＳＤＨ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１１３７４ｇ）の発現が減弱されている、請求項２に記載の酵母。
【請求項４】
ＳＤＨ２（ＹＡＬＩ０Ｄ２３３９７ｇ）の不活化により前記ＳＤＨ２（ＹＡＬＩ０Ｄ２３３９７ｇ）の発現が減弱されている、請求項２に記載の酵母。
【請求項５】
前記酵母がヤロウィア・リポリティカである、請求項１に記載の酵母。
【請求項６】
前記酵母がヤロウィア・リポリティカＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４である、請求項１に記載の酵母。
【請求項７】
コハク酸を製造する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養する工程及び前記培養培地からコハク酸を回収する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記培養の少なくとも一部がｐＨ４未満で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地がグリセロールを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
コハク酸含有ポリマーを製造する方法であって、請求項７に記載の方法によりコハク酸を生成する工程及び得られたコハク酸を重合化する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物利用産業に関係し、具体的には、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低減されたヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に属する酵母を用いてコハク酸を製造する方法である。
【背景技術】
【０００２】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、クエン酸、イソクエン酸等のトリカルボン酸回路中間体を初めとする種々の有機酸を生成し、培地中に分泌する能力を有する点で特徴的な酵母である。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｎ  １は、連続培養中に培地中の鉄濃度に応じて、生育、及びクエン酸合成に必要な酸素の量が異なることが分かっている。酸素濃度、及び鉄濃度の組合せがＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
Ｎ  １のミトコンドリア電子伝達系の機能に影響することが証明されている。連続培養の結果に基づき、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｎ  １を用いたバッチ培養でのクエン酸を生成させる条件が提唱されている（非特許文献１）。
【０００３】
コハク酸はＣ4ジカルボン酸ファミリーの一つであり、食品、医薬品、及び生分解性プラスチックの製造に広く用いられている。従来、コハク酸は再生不能な石油化学原料から化学合成により製造されており、これらの化学的プロセスは環境汚染を引き起こす。したがって、微生物等、効率的な自然界由来のコハク酸生産生物の利用に大きな注目が集めてられてきた。
【０００４】
産業的価値があり、特殊化学品であるコハク酸の生成を向上させる取り組みの多くは、大腸菌を嫌気条件下で、混合酸発酵で行って来た。好気条件で、大腸菌が効率的にコハク酸を生成、及び蓄積する為のコハク酸生産システムが戦略的に設計されており、このシステムは、好気的に働く中央代謝経路を新たに創出することにより、大腸菌での好気的コハク酸生成を促進する最初のプラットフォームを提供する（非特許文献２）。
【０００５】
好気条件下でコハク酸を生成するように設計された種々の大腸菌変異株がケモスタット（恒成分培養）を用いて解析されている。代謝産物プロフィール、酵素活性、及び遺伝子発現プロフィールが研究され、これらの変異株中で作動している代謝ネットワークの理解が深まった。最も効率的なコハク酸生成変異ＨＬ２７６５９ｋ株は以下の５つの変異を有する：ｓｄｈＡＢ、（ａｃｋＡ−ｐｔａ）、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲ、及びｐｔｓＧ。ＨＬ２７６５９ｋ株で操作されたコハク酸合成経路は非常に効率的であり、好気条件下でコハク酸を唯一の主要産物として生じることが示されている（非特許文献３）。
【０００６】
高レベルのコハク酸生成能を確認、及び実証するために、好気条件下でＨＬ２７６５９ｋ（ｐＫＫ３１３）株の流加培養反応実験が行われた。その結果、この設計されたＨＬ２７６５９ｋ（ｐＫＫ３１３）株を用いた好気的コハク酸生産システムは従来の嫌気的コハク酸生産システムよりも実用的であることが示された。これは工業規模でのコハク酸製造、及びプロセス最適化の大きな可能性を秘めている（非特許文献４）。
【０００７】
酸化還元の不均衡により嫌気下でグルコースからの発酵能が失われたＮＺＮ１１１のｐｆｌＢ ｌｄｈＡ二重変異体の２段階培養がコハク酸生産のために行われた。ＮＺＮ１１１を酢酸で好気培養するとグルコースからの発酵能が回復し、その後の嫌気培養では、コハク酸を主要な産物として生成することが見出された。主要酵素の活性解析により、酢酸で増殖させた細胞中において、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、リンゴ酸酵素、及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼの活性が大幅に上昇し
ており、ピルビン酸キナーゼ、及びＰＥＰカルボキシラーゼの活性が低下していることが示された。これらの結果は、代謝改変された大腸菌株でコハク酸生産能を向上させるには、細胞制御機構の利用が有意義であることを示唆している（非特許文献５）。
【０００８】
嫌気発酵での代謝を理解し、最終的には副生物を生成しない改変株を開発する為に、完全ゲノム配列を基にコハク酸生産能を有する好二酸化炭素性ルーメン細菌、マンヘイミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）の遺伝子欠損株の解析が行われた。ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、及びリンゴ酸酵素により触媒される３つの異なるＣＯ2固定代謝反応のうち、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓの嫌気下での増殖、及びコハク酸生成にはＰＥＰカルボキシキナーゼが最も重要であった。ＰＥＰのカルボキシル化により形成されるオキサロ酢酸はリンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、及びフマル酸還元酵素により触媒される３つの連続する反応でコハク酸に変換されることが分かっている。ｌｄｈＡ、ｐｆｌＢ、ｐｔａ、及びａｃｋＡ遺伝子を破壊することで副産物生成につながる主要な代謝経路を除去することに成功している。代謝改変されたＬＰＫ７株は酢酸、ギ酸、及び乳酸をほとんど、もしくは全く形成せずにグルコースからコハク酸を生成することが可能である（非特許文献６）。
【０００９】
アナエロビオスピリルム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）の生育、並びにグルコースからの乳酸生成量に対するコハク酸生成量は、利用可能な二酸化炭素レベル、及び培養ｐＨにより制御された。グルコース１モル当たりのコハク酸、並びにＡＴＰ収量はＣＯ2−ＨＣＯ3-が過剰な生育環境下で有意に増加し、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓのコハク酸生成の増加には、ＣＯ2閾値レベルが存在することが示唆された。プロピオン酸も形成する他のコハク酸生成能を有する嫌気性細菌とは異なり、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓはｐＨ６．２のＣＯ2−ＨＣＯ3-過剰存在下で電子受容代謝を制御することにより急速に増殖することができ、最終的に高収量のコハク酸を形成できることが示された（非特許文献７）。
【００１０】
化学合成培地を使うことで非合成培地では不可能であった、種々の代謝解析が可能となる。コハク酸を生成するアクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）の発酵代謝を解析する機会を増やすために合成培地、ＡＭ３、が作製された。ＡＭ３培地での発酵、及び富栄養培地での発酵におけるＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの増殖傾向、及び最終産物分布が比較された。Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓはグルコースからα−ケトグルタル酸を合成できないことから、トリカルボン酸回路に関連する少なくとも２つの酵素の活性を有さないことが示唆されている（非特許文献８）。
【００１１】
ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ｉｃｌＲ、ａｒｃＡ、及び／又はａｃｋ−ｐｔａ遺伝子が破壊された大腸菌を用いて、嫌気条件下で多量のコハク酸を生成する方法が開示されている（特許文献１）。
【００１２】
ｐｔｓＧ、ｐｆｌＢ、及びｌｄｈＡ遺伝子に変異を含む生物（大腸菌、クレブシエラ、エルウィニア、ラクトバチルス）を供給し、この生物にバイオマスを蓄積させて加水分解産物を代謝させることで工業グレードの加水分解産物からコハク酸を製造する方法が開示されている（特許文献２）。
【００１３】
コハク酸生産量の多くない株をセレクションし、通常の糖代謝制御を破壊し、嫌気条件中で変異株を選択された糖と組み合わせてコハク酸生成を促すことでコハク酸を生成する発酵プロセスが開示されている。また、ホスホトランスフェラーゼ系を有する株をセレク
ションし、ホスホトランスフェラーゼ系を改変させた株が異なる糖を同時に代謝できるようにすることで、低収量コハク酸生産菌を高収量コハク酸生産菌に変化させる方法も開示されている（特許文献３）。
【００１４】
サッカロミセス・セレビシエのコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）はＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４遺伝子にコードされる４つのサブユニットを含む。ＳＤＨ活性の完全な消失にはＳＤＨ１及びＳＤＨ２、又はＳＤＨ１ｂ（ＳＤＨ１ホモログ）遺伝子の二重破壊が必要であり、ＳＤＨ１ｂ遺伝子がＳＤＨ１遺伝子の機能を補償することが明らかにされている。ｓｄｈ１ とｓｄｈ１ｂ遺伝子を欠損した株では、振盪条件下で野生株に比べてリンゴ酸生成が低減されており、コハク酸生成は最大１．９倍だけ増加していた（非特許文献９）。
【００１５】
ＴＣＡ回路に必要な酵素をコードする種々の遺伝子が破壊された一連のサッカロミセス・セレビシエ株を好気条件及び嫌気条件下において高濃度グルコース（１５％）存在下で液体培養することでコハク酸が蓄積される経路を調べた。その結果、コハク酸が２つの経路、すなわちＴＣＡ回路を介したα−ケトグルタル酸酸化、及び嫌気条件下でのフマル酸還元により合成され得ることが示された（非特許文献１０）。
【００１６】
リンゴ酸酵素Ｂ（ｍａｅＢ）、フマル酸ヒドラターゼＣ（ｆｕｍＣ）、又はギ酸脱水素酵素Ｄ及びＥ（ｆｄｈＤ及びｆｄｈＥ）をコードする遺伝子を含む組換えベクターで形質転換した微生物を用いたコハク酸生成法が開示されている（それぞれ特許文献４、５、及び６）。
【００１７】
コハク酸生成と微生物の増殖の共役に関わる代謝改変のセットには、以下の遺伝子の一つ、又は複数の破壊が含まれる：（ａ）ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ；（ｂ）ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ａｃｋａ−ｐｔａ；（ｃ）ｐｆｌ、ｌｄｈＡ；（ｄ）ｐｆｌ、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ；（ｅ）ａｃｋａ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ａｔｐＦ、ｓｄｈＡ；（ｆ）ａｃｋａ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ｐｔｓＧ、又は（ｇ）ａｃｋａ−ｐｔａ、ｐｙｋＦ、ｐｔｓＧ、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ（特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００４６２８８（Ａ１）号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／００１７５５９（Ａ１）号明細書
【特許文献３】米国特許第６１５９７３８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００７／００４２４７６（Ａ１）号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００７／００４２４７７（Ａ１）号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００８／００２０４３６（Ａ１）号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００７／０１１１２９４号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Kamzolova S.V. et al, FEMS Yeast Res.;3(2):217-22(2003)
【非特許文献２】Lin H. et al., Biotechnol Bioeng;89(2): 148-56(2005)
【非特許文献３】Lin H. et al., Metab Eng.;7(5-6):337-52(2005)
【非特許文献４】Lin H. et al., Biotechnol Bioeng;90(6):775-9(2005)
【非特許文献５】Wu H. et al., Appl Environ Microbiol.;73(24):7837- 43(2007)
【非特許文献６】Lee S.J. et al., Appl Environ Microbiol.;72(3):1939- 48(2006)
【非特許文献７】Samuelov N.S. et al., Appl Environ Microbiol.;57(10):3013-9(1991)
【非特許文献８】McKinlay J.B. et al., Appl Environ Microbiol.; 71(11): 6651-6(2005)
【非特許文献９】Kubo Y. et al., J Biosci Bioeng;90(6):619-24(2000)
【非特許文献１０】Arikawa Y. et al., J Biosci Bioeng;87(1):28-36(1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
しかし、現在、コハク酸生成を目的としたヤロウィア属に属する酵母のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の低減に関する報告はされていない。
【００２１】
本発明の態様には、ヤロウィア属に属する酵母におけるコハク酸の生産性を向上させること、及びコハク酸を製造する方法を提供することが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記態様は、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低減させることでコハク酸の生成を顕著に向上させることができるという発見により達成された。
【００２３】
本発明の一態様は、コハク酸を生成し且つコハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低減されているヤロウィア属に属する酵母を提供することである。
【００２４】
本発明の別の態様は、ＳＤＨ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１１３７４ｇ）、ＳＤＨ２（ＹＡＬＩ０Ｄ２３３９７ｇ）、ＳＤＨ３（ＹＡＬＩ０Ｅ２９６６７ｇ）、ＳＤＨ４（ＹＡＬＩ０Ａ１４７８４ｇ）、及びその組合せからなる群から選択される遺伝子の発現が減弱されるように改変されている前記酵母を提供することである。
【００２５】
本発明の別の態様は、ＳＤＨ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１１３７４ｇ）への温度感受性変異の導入により前記ＳＤＨ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１ｌ３７４ｇ）の発現が減弱されている前記酵母を提供することである。
【００２６】
本発明の別の態様は、ＳＤＨ２（ＹＡＬＩ０Ｄ２３３９７ｇ）の不活化により前記ＳＤＨ２（ＹＡＬＩ０Ｄ２３３９７ｇ）の発現が減弱されている前記酵母を提供することである。
【００２７】
本発明の別の態様は、ヤロウィア・リポリティカである前記酵母を提供することである。
【００２８】
本発明の別の態様は、ヤロウィア・リポリティカＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４である前記酵母を提供することである。
【００２９】
本発明の別の態様は、前記酵母を培地中で培養する工程、及び培養培地からコハク酸を回収する工程を含む、コハク酸製造方法を提供することである。
【００３０】
本発明の別の態様は、前記培養の少なくとも一部がｐＨ４未満で行われる前記方法を提供することである。
【００３１】
本発明の別の態様は、前記培養培地がグリセロールを含む前記方法を提供することである。
【００３２】
本発明の別の態様は、上記の方法によりコハク酸を生成する工程、及び得られたコハク酸を重合化する工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＳＤＨ１遺伝子中に温度感受性（ｔｓ−）変異を有する株の構築スキームを示す図である。
【図２】Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４株の生育曲線、ｐＨ、及びコハク酸濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下に本発明を詳細に記載する。
【００３５】
「コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ；ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）」という用語は、ｐＨ及びイオン状態に応じて、遊離のコハク酸であってもよく、その塩であってもよい。コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）および（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）という用語は、ここでは、どちらを使っても変わりはない。
【００３６】
１．酵母
本開示の酵母はヤロウィア属に属し、コハク酸を生成し、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低減されている。
【００３７】
「ヤロウィア属に属する酵母」という表現は、微生物学分野の当業者に公知の分類に従って酵母がヤロウィア属に分類されることを意味する。ヤロウィア属に属する酵母の例としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が含まれる。「前記酵母がコハク酸を生成する」という表現は、培地中で培養した時に、酵母がコハク酸を生成し、培地に分泌する能力を有することを意味する。
【００３８】
「前記酵母がコハク酸を生成する」という表現はまた、酵母が、野生株、非改変株、又は親株よりも多くの量のコハク酸を生成、及び蓄積する能力を有することを意味し、好ましくは、酵母が１．０ｇ／Ｌ以上、５．０ｇ／Ｌ以上、又は１０．０ｇ／Ｌ以上の量のコハク酸を培地中に蓄積させることができることを意味する。
【００３９】
「（前記酵母）のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性が低減されている」という表現は、細胞中のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株、野生株、又は親株よりも低減されるように酵母が改変されていることを意味する。
【００４０】
コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）は、クレブス回路中でコハク酸のフマル酸への酸化を触媒しユビキノンプールに電子を供給する呼吸鎖複合体ＩＩの成分である。進化の過程で高度に保存されてきたこの複合体は、ミトコンドリア内膜中にあり、２つの触媒サブユニット及び２つの構造的サブユニットを含み、これらは全て核遺伝子にコードされている。サッカロミセス・セレビシエでは、ＳＤＨをコードする４つの遺伝子（ＳＤＨ１〜ＳＤＨ４）が単離及び解析されている。コハク酸のフマル酸への酸化に関与するフラビンタンパク質サブユニットは２つのパラロガス遺伝子、ＳＤＨ１及びＳＤＨ１ｂにコードされているが、炭素源で、呼吸を伴う生育に必要なのはＳＤＨ１だけである。ＳＤＨ２は３つの異なる鉄−硫黄中心を含む鉄−タンパク質サブユニットをコードし、このサブユニットはタンパク質Ｓｄｈ１ｐと共にＳＤＨ複合体の触媒コアを構成し、触媒コアは、共有結合されたＳｄｈ１ｐのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）から電子を最初に鉄−硫黄中心に伝達し、次いでユビキノンに伝達する。ＳＤＨ３及びＳＤＨ４は２つの小さな疎水性ペプチドをコードし、これらのペプチドはミトコンドリア内膜に複合体を固定する（Saliola M. et al., Eukaryot Cell; 3(3): 589-97(2004)）。
【００４１】
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＣＬＩＢ１２２のゲノム配列が解析されており（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）、ＹＡＬＩ０Ｄ１１３７４ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ２３３
９７ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ２９６６７ｇ、及びＹＡＬＩ０Ａ１４７８４ｇのＯＲＦがそれぞれＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４遺伝子と相同であることが分かっている。これらのＯＲＦはそれぞれＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４と命名された。ＳＤＨ１遺伝子のヌクレオチド配列、及びＳＤＨ１遺伝子にコードされるＳＤＨ１のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。ＳＤＨ２遺伝子のヌクレオチド配列、及びＳＤＨ２遺伝子にコードされるＳＤＨ２のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。ＳＤＨ３遺伝子のヌクレオチド配列及びＳＤＨ３遺伝子にコードされるＳＤＨ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５、及び配列番号６に示す。ＳＤＨ４遺伝子のヌクレオチド配列、及びＳＤＨ４遺伝子にコードされるＳＤＨ４のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７、及び配列番号８に示す。
【００４２】
ヤロウィア属の異なる株の間でＤＮＡ配列が幾分異なることがあり得るので、改変されるＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４遺伝子は配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７に限定されず、ＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４タンパク質のバリアントタンパク質をそれぞれコードする配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７に相同な遺伝子も含まれ得る。「バリアントタンパク質」という用語は、配列中に変化を有するタンパク質を意味し、変化がアミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであれ、ＳＤＨ１／ＳＤＨ２／ＳＤＨ３／ＳＤＨ４タンパク質としての産物の活性は維持されている。バリアントタンパク質中の変化の数はタンパク質の三次元構造中の位置又はアミノ酸残基の種類に応じて異なる。変化の数は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８中の１〜３０個、別の例では１〜１５個、別の例では１〜５個であり得る。バリアント中のこれらの変化は、タンパク質の機能に必須ではないタンパク質領域に起こり得る。これは、いくつかのアミノ酸が互いに高い相同性を有しているためにそのような変化により三次元構造又は活性が影響されないことによる。したがって、ＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４遺伝子にコードされるタンパク質バリアントは、改変前のＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、又はＳＤＨ４タンパク質の活性が維持されてさえいれば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８に示す全アミノ酸配列に対して例えば８０％以上、別の例では９０％以上、別の例では９５％以上、別の例では９８％以上の相同性を有するものであってよい。
【００４３】
２つのアミノ酸配列間の相同性は、周知の方法、例えばスコア、同一性、及び類似性の３つのパラメータを計算するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ２．０を用いて決定することができる。
【００４４】
１つ、又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるような保存的変異であり得る。代表的な保存的変異としては保存的置換を挙げることができる。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐへの置換、ＧＩｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又は、Ａｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換が含まれる。
【００４５】
更に、ＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４遺伝子は、不活化前の機能的タン
パク質をコードしてさえいれば、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７に示す配列に相補的なヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするバリアントであってよい。「ストリンジェントな条件」には、特異的なハイブリッド、例えば、７０％以上、別の例では８０％以上、別の例では９０％以上、別の例では９５％以上、別の例では９８％以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば上記より相同性の低いハイブリッドが形成されない条件が含まれる。例えば、ストリンジェントな条件の例としては、塩濃度１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、別の例では０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６０℃で１回以上の洗浄、別の例では２回又は３回の洗浄が挙げられる。洗浄時間はブロッティングに用いるメンブレンの種類によって変わり、原則としてメーカーが推奨する通りであってよい。例えば、Ｈｙｂｏｎｄ（商標）  Ｎ＋ナイロンメンブレン（アマシャム社製）のストリンジェントな条件下での推奨される洗浄時間は１５分である。好ましくは、洗浄は２〜３回行われ得る。プローブの長さはハイブリダイゼーション条件に応じて好適に選択することができ、通常、１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。
【００４６】
ＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４遺伝子の１又は複数の発現を減弱させることで酵母のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させることができる。遺伝子の発現を減弱させるために、酵母は、遺伝子にコードされるタンパク質の細胞中の量が非改変酵母に比べて少なくなるように、又は遺伝子にコードされるタンパク質を細胞が合成できないように、改変され得る。そのような酵母の改変は、プロモーター、シャイン・ダルガノ（ＡＤ）配列等の遺伝子発現調節配列を変化させることでなされ得る。更に、ＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、又はＳＤＨ４遺伝子の発現は、遺伝子にコードされるタンパク質の細胞内活性が非改変株に比べて低減されるように染色体上の遺伝子に変異を導入することでも減弱され得る。そのような遺伝子上の変異は、薬剤耐性遺伝子の挿入又は遺伝子の一部、若しくは遺伝子全体の欠失であってよい（Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997)；Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)）。遺伝子にコードされるタンパク質の活性は、遺伝子中の１又は複数の塩基を置換してタンパク質中のアミノ酸置換を生じさせること（ミスセンス変異）、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、１又は２個の塩基を欠失させてフレームシフトを生じさせることでも低減され得る。
【００４７】
例えば、以下の方法を用いて遺伝子組み換えにより変異を導入することができる。活性が低減された変異タンパク質をコードする変異遺伝子を作製し、改変する酵母を変異遺伝子を含むＤＮＡ断片で形質転換し、染色体上の在来遺伝子が相同組換えにより変異遺伝子で置換された後、得られた（染色体上の在来遺伝子が変異遺伝子で置換された）株のセレクションが行われ得る。相同組換えを用いた遺伝子置換によるそのような部位特異的変異は既に確立されている。後述する実施例では、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｐｏｌｆ（ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−２６１３）の染色体上のＳＤＨ１遺伝子に温度感受性変異を導入している。この変異により、得られたＰｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−０１３４）株及びＰｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−２００７）株では高温（３２℃）でＳＤＨ１遺伝子の発現が減弱され且つコハク酸デヒドロゲナーゼ活性が低減されている。
【００４８】
ＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、又はＳＤＨ４遺伝子の発現は遺伝子を不活化することでも減弱することができる。「遺伝子を不活化する」という表現は、改変遺伝子が完全に不活性なタンパク質をコードすることを意味し得る。遺伝子の一部又は全体の欠失、遺伝子の読み枠のシフト、ミスセンス／ナンセンス変異の導入、又は例えばプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等の遺伝子発現を調節する配列を含む遺伝子隣接領域の改変により、改変ＤＮＡ領域が天然に遺伝子を発現できないこともあり得る。
【００４９】
前述の遺伝子置換は以下のように行うことができる。すなわち、変異遺伝子を含む組換えＤＮＡで酵母を形質転換して変異遺伝子と対応する染色体遺伝子の間で組換えを生じさせる。そうすると、組換えＤＮＡに挿入されているマーカー遺伝子により、宿主の栄養要求性等の特徴に基づき、操作が容易になる。更に、例えば制限酵素を用いた切断により、前述の組換えＤＮＡを線状化し、更に酵母中で機能する複製制御領域を組換えＤＮＡから除去することで、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率的に生じさせることができる。後述する実施例では、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｐｏｌｆ（ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−２６１３）の染色体上のＳＤＨ２遺伝子を不活化させることで、コハク酸を生成し且つコハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低減されているＰｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）を得ている。Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）の変異株の中から、コハク酸生成能力が高いＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４を選択した。
【００５０】
紫外線照射、及びニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、又はメトキシルアミンを用いた突然変異誘発処理等の従来の方法を用いるか、遺伝子のコード領域にトランスポゾン又はＩＳ因子を挿入する（米国特許第５，１７５，１０７号）ことでも、遺伝子発現を減弱させる、若しくは遺伝子を不活化することができる。
【００５１】
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化、及びライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は当業者に周知の通常の方法であってよい。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。酵母の形質転換には、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等の酵母の形質転換に従来用いられている方法を使用することができる。
【００５２】
２．方法
本明細書に記載の酵母を培地中で培養してコハク酸を生成させて培地中に分泌させる工程及び培地からコハク酸を回収する工程を含むコハク酸製造方法を記載する。
【００５３】
培養、回収、及び培地からのコハク酸の精製等は、微生物を用いてコハク酸を製造する従来の発酵法と同様に行うことができる。
【００５４】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、ミネラル、及び必要に応じて酵母の生育に必要な適切な量の栄養素を含む培地であれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、グルコース、スクロース等の種々の炭水化物及び種々の有機酸が含まれ得る。使用する微生物の同化様式に応じて、エタノール、グリセロール等のアルコールを用いてもよい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等の種々のアンモニウム塩、アミン等のその他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解産物、消化された発酵微生物等の天然窒素源を用いることができる。ミネラルとしては、モノリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を用いることができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を用いることができる。
【００５５】
培養は、２０〜４０℃、別の例では２４〜３２℃の温度で、振盪培養及び通気しながらの撹拌培養等の好気条件下で行われ得る。培養ｐＨは通常２〜９であり、別の例では３〜７．５である。培養ｐＨはアンモニア、炭酸カルシウム、種々の塩基、及びバッファーで調整され得る。あるいは、培地のｐＨを低下させ、主なコハク酸蓄積が起こる酸性条件を維持しながらｐＨを調整せずに培養を行ってもよい。培養の少なくとも一部は、より多くのコハク酸が生成されるようにｐＨ４未満に維持され得る。通常、１〜７日間の培養で液体培地中にコハク酸が蓄積される。
【００５６】
培養後、細胞等の固形物は遠心分離又は膜濾過により液体培地から除去され、その後、イオン交換、濃縮、及び／又は結晶化法によりコハク酸を回収及び精製することができる。
【００５７】
更に、コハク酸生成後、得られたコハク酸を原材料として用いて重合化反応を行い、コハク酸含有ポリマーを生成してもよい。近年、環境に優しい工業製品の数が増加しており、植物起源の原材料を用いて製造されたポリマーが注目を集めている。生成されたコハク酸はその後、ポリエステル、ポリアミド等のポリマーに加工してもよい。コハク酸含有ポリマーの具体例としては、ブタンジオール又はエチレングリコール等のジオールとコハク酸との重合化により得られるコハク酸ポリエステル及びヘキサメチレンジアミン等のジアミンとコハク酸との重合化により得られるコハク酸ポリアミドが含まれる。更に、コハク酸又はコハク酸を含む組成物は食品添加物、医薬品、化粧品等に用いることができる。
【実施例】
【００５８】
以下に非限定的な実施例を用いて本発明をより具体的に説明する。
【００５９】
実施例１．ＳＤＨ１遺伝子中に温度感受性（ｔｓ−）変異を有する株の構築
１．プラスミドｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨ１の構築
まず、ＰＣＲでＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。プライマーＰ１（配列番号９）及びＰ２（配列番号１０）をＰＣＲに使用した。Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（1994 Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory）に記載の方法を用いて、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９（ＣＬＩＢ（フランス、７８８５０、ティヴェルヴァル＝グリニョンのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  Ｌｅｖｕｒｅｓ  ｄ’Ｉｎｔｅｒｅｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｑｕｅ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ））アクセッション番号ＣＬＩＢ８９）の全ゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９株はＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ２０４６０）からも入手可能である。
【００６０】
１９７２ｂｐのＰＣＲ産物を得、１％アガロースゲル中で精製した。このＰＣＲ産物（０.５μｇ）を、Ｅｃｌ３６ＩＩエンドヌクレアーゼで予め処理したｐＵＣ１９（０．２μｇ）にライゲーションした。得られたプラスミドを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.(1989)）に記載されているように、大腸菌株ＸＬ−１（Ｂｌｕｅ）（ストラタジーン社製、カタログ番号２００２２８）のエレクトロポレーションに用いた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天培地にプレーティングし、β−ガラクトシダーゼ活性がないことを調べることで、標的のインサートを含むクローンをセレクションした。セレクションしたクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により試験した。得られたプラスミド（４６５８ｂｐ）はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＵＲＡ３遺伝子及びその調節領域を含んでいた。このプラスミドをｐＵＣ−ＵＲＡ３と命名した。
【００６１】
一部、欠損の入ったＳＤＨ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るために、ＰＣＲを用いて２つのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ反応はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９の全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＰ３（配列番号１１）及びＰ４（配列番号１２）並びにＰ５（配列番号１３）及びＰ６（配列番号１４）を用いて行い、それぞれ１２２３ｂｐ及び１７６８ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲにはＰｆｕポリメラーゼを用いた。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル中で精製した後、ＤＮＡ断片（それぞれ０．０５μｇ）を、Ｐｆｕポリメラーゼ並びにプライマーＰ３及びＰ６を用いたＰＣＲの鋳型として用いた。２９６８ｂｐの産物が得られ、これを１％アガロースゲル中で精製した。ＰＣＲ産物（０．５μｇ）をエンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、その後、予めエ
ンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理してアルカリホスファターゼＣＩＡＰで脱リン酸化したｐＵＣ−ＵＲＡ３にライゲーションした。得られたプラスミドを大腸菌株ＸＬ−１（Ｂｌｕｅ）のエレクトロポレーションに用いた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天プレートにプレーティングして形質転換体のクローンを選択した。選択したクローンからプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミド（７６０８ｂｐ）は、１９５ｂｐの領域及び調節領域を欠失したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＳＤＨ１遺伝子を含んでいた。このプラスミドをｐＵＣ−ＵＲＡ３−ｄＳＤＨ１と命名した。
【００６２】
プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３−ｄＳＤＨ１（０．０５μｇ）をエンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＸｍａＪＩで処理した。得られたＤＮＡ断片の大きい方を１％アガロースゲル中で精製した。リガーゼＴ４処理後に得られた６３９４ｂｐのＤＮＡ断片を大腸菌株ＸＬ−１（Ｂｌｕｅ）のエレクトロポレーションに用いた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天プレートにプレーティングして形質転換体のクローンを選択した。選択したクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により試験した。得られたプラスミド（６３９４ｂｐ）はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＳＤＨ１遺伝子のＯＲＦの大部分及びターミネーターを含んでいた。このプラスミドをｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨ１を命名した。
【００６３】
２．Ｐｏｌｆ／ｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨ−ｔｓ  Ｎｏ．２００７株及びＰｏｌｆ／ｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨ−ｔｓ  Ｎｏ．０１３４株の構築
Kadonaga J.T and Knowles J.R., N.A.R.,13(5), 1733-45 (1985)に記載されているように、プラスミドｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨ１（１５μｇ）をインビトロでメトキシルアミン処理した。透析後の溶液から得られたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、洗浄し、大腸菌株ＸＬ−１（Ｂｌｕｅ）のエレクトロポレーションに用いた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天プレートにプレーティングして形質転換体のクローンを選択した。
【００６４】
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した２００ｍｌのＬＢ培地中で１０７個の形質転換体を一晩増殖させた。培養液はＤＮＡの単離に用いた。得られた突然変異誘発プラスミドｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨ１ライブラリーをエンドヌクレアーゼＥｃｏ９１Ｉで処理し、Current Genetic, 1989, vol 16, pp.253-260に記載されているようにＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｐｏｌｆ（ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−２６１３）の形質転換に用いた。このＰｏｌｆ株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（米国、２０１０８、バージニア州マナッサス、私書箱１５４９）から入手可能である。グルコース（２％）、ロイシン（０．０１％）、及びカザミノ酸（０．２％）を添加したＹＮＢ最少寒天培地にプレーティングして形質転換体のクローンをセレクションした。グルコース（０．１％）、ロイシン（０．０１％）、及びコハク酸ナトリウム（２％）を添加したＹＮＢ液体最少培地中で、２０℃、ｐＨ６．８、１２００ｒｐｍで通気しながら、３０００個の形質転換体を３日間増殖させた。増殖したクローンを、ロイシン（０．０１％）及びコハク酸ナトリウム（１％）を添加したＹＮＢ寒天（ｐＨ６．８）上に（各クローンを２つのプレートに）プレーティングした。２つの群のプレートを２０℃及び３２℃で３日間並行して培養した。３２℃よりも２０℃で有意に良く増殖したクローンを、温度感受性の確認と同様な方法で試験した。図１に示すように、プラスミドｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨが染色体に組み込まれた後、残ったＳＤＨ１遺伝子のコピーだけが発現可能である。この遺伝子コピーの一部（Ｅｃｏ９１Ｉ部位の下流）は挿入されたプラスミドに固有のものなので、変異を含み得る。したがって、得られた形質転換体は変異ＳＤＨ１遺伝子ライブラリーに相当する。
【００６５】
プラスミドｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨが染色体上の適切な遺伝子座に組み込まれていることを検証するために、Ｔａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。遺伝子座特異的プライマーＰ７（配列番号１５）及びＰ８（配列番号１６）並びにセレクションした形質転換体から単離した全ゲノムＤＮＡをＰＣＲに用いて検証した。これにより、２つの形質転換体、すなわち、ＳＤＨ１遺伝子中にそれぞれＳｅｒ６７５Ｐｈｅ及びＧｌｕ４８３Ｌｙｓの
変異を有するＰｏｌｆ／ｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨ−ｔｓ  Ｎｏ．０１３４及びＰｏｌｆ／ｐＵＲＡ−ｄｄＳＤＨ−ｔｓ  Ｎｏ．２００７が更なる実験に選択された。これらの株をそれぞれＰｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−０１３４）及びＰｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−２００７）と命名した。
【００６６】
実施例２．不活性型ＳＤＨ２遺伝子を有する菌株の構築
まず、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９（ＡＴＣＣ  ２０４６０）の全ゲノムＤＮＡ、並びにプライマー対Ｐ９（配列番号１７）及びＰ１０（配列番号１８）、Ｐ１１（配列番号１９）及びＰ１２（配列番号２０）、並びにＰ１３（配列番号２１）及びＰ１４（配列番号２２）を用いてＰＣＲにより、それぞれＳＤＨ２遺伝子のプロモーター領域（１１２５ｂｐ）、ＵＲＡ３遺伝子（１２２９ｂｐ）、及びＳＤＨ２遺伝子のターミネーター領域（１０１８ｂｐ）を含む３つのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル中で精製した。ＳＤＨ２遺伝子のプロモーター領域（１１２５ｂｐ）及びＵＲＡ３遺伝子（１２２９ｂｐ）を含むＰＣＲ産物を、Ｐｆｕポリメラーゼ並びにプライマーＰ９及びＰ１２を用いたＰＣＲの鋳型として用いた。このＰＣＲ産物（２３３３ｂｐ）を１％アガロースゲル中で精製した。次いで、精製したＰＣＲ産物（２３３３ｂｐ）及びＳＤＨ２遺伝子のターミネーター領域（１０１８ｂｐ）を含むＰＣＲ産物を、Ｐｆｕポリメラーゼ並びにプライマーＰ９及びＰ１４を用いたＰＣＲの鋳型として用いた。このＰＣＲ産物（３３３０ｂｐ）を１％アガロースゲル中で精製した後、酢酸リチウムを用いた方法によるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｐｏｌｆの形質転換にＰＣＲ産物１μｇを用いた。グリセロール（５ｖ／ｖ％）、ロイシン（０．０１％）、及びカザミノ酸（０．２％）を添加したＹＮＢ寒天最少培地上にプレーティングして形質転換体のクローンをセレクションした。次いで、セレクションした形質転換体のコハク酸を唯一の炭素源として含む培養培地中での増殖能について調べた。ＰＣＲによりＳＤＨ２遺伝子座への挿入を確認した。確認のためのＰＣＲには、Ｔａｑポリメラーゼ、鋳型として、セクションした形質転換体から単離した全ゲノムＤＮＡ、並びに遺伝子座特異的プライマーＰ１５（配列番号２３）及びＰ１６（配列番号２４）を用いた。１つの形質転換体を選択し、Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）と命名し、更なる実験に用いた。
【００６７】
実施例３．Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＰｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−０１３４）株、Ｐｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−２００７）株、及びＰｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）株によるコハク酸の生成
コハク酸生成に対する遺伝子ＳＤＨ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１１３７４ｇ）又はＳＤＨ２（ＹＡＬＩ０Ｄ２３３９７ｇ）の発現減弱の影響を調べるために、Ｐｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−０１３４）株、Ｐｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−２００７）株、Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）株及びＰｏｌｆ株の生産性を比較した。
【００６８】
Ｐｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−０１３４）株、Ｐｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−２００７）株、及びＰｏｌｆ株（細胞の初発濃度は１〜５×１０5細胞／ｍｌであった）のそれぞれを、５０ｍｌの試験管を用いて、グリセロール（５％（ｖ／ｖ））、ウラシル、及びロイシン（０．０１％）を添加した５ｍｌのＹＮＢ最少培地（ハイメディア社（Ｈｉｍｅｄｉａ）製；ｐＨ６．８；５０ｍＭリン酸バッファーで調整）中で２４℃にて培養した。２日間インキュベートした後、２．５％のＣａＣＯ3を培地に添加してｐＨを調整した。細胞濃度が（０．８〜１）×１０7に達した時、試験管を３２℃と２４℃でそれぞれ培養した。５日間インキュベートした後、培地中に蓄積されたコハク酸、α−ケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、及び酢酸の量、並びに培養ブロス中のグリセロールの濃度をＨＰＬＣで測定した。２つの独立した試験管発酵の結果を表１に示す。表１に示すように、Ｐｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−０１３４）及びＰｏｌｆ（ＳＤＨ１−ｔｓ−２００７）は培養温度が３２℃の時により多量のコハク酸を生成した。Ｐｏｌｆはこの温度では少量のコハク酸しか生成しなかった。
【００６９】
Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）株及びＰｏｌｆ株（１０5細胞／ｍｌ）のそれぞれを、５０ｍｌの試験管を用いて、グリセロール（５％（ｖ／ｖ））、ロイシン（０．０１％）、ウラシル（０．０１％）（Ｐｏｌｆのみ）を添加した１０ｍｌのＹＮＢ最少培地（ハイメディア社製；ｐＨ６．８；５０ｍＭリン酸バッファーで調整）中で３０℃にて培養した。３日間インキュベートした後、２．５％のＣａＣＯ3を培地に添加してｐＨを調整した。培養７日後、培地中に蓄積されたコハク酸、α−ケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、及び酢酸の量、並びに培養ブロス中のグリセロールの濃度をＨＰＣＬにより測定した。試験管発酵の結果を表１に示す。表１に示すように、Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）はＰｏｌｆよりも多くの量のコハク酸を生成した。
【００７０】
Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）株及びＰｏｌｆ株のそれぞれを、７５０ｍｌのフラスコを用いて５０ｍｌのＹＰＧ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、５％（ｖ／ｖ）グリセロール）中で３０℃にて培養した。２日間インキュベートした後、２．５％のＣａＣＯ3を培地に添加した。培養５日後、培地中に蓄積されたコハク酸、α−ケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、及び酢酸の量、並びに培養ブロス中のグリセロールの濃度をＨＰＣＬにより測定した。フラスコ発酵の結果を表２に示す。表２に示すように、Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）はＰｏｌｆよりも多くの量のコハク酸を生成した。
【００７１】
【表１】
2012516135.tif 000002
ＳＡ−コハク酸、ＫＧ−αケトグルタル酸、ＣＡ−クエン酸、ＰＡ−ピルビン酸、ＡＡ−酢酸
【００７２】
【表２】
2012516135.tif 000003
ＳＡ−コハク酸、ＫＧ−αケトグルタル酸、ＣＡ−クエン酸、ＰＡ−ピルビン酸、ＡＡ−酢酸
【００７３】
実施例４．Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４株の選択
Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）株の増殖を向上させるために、以下のように突然変異誘発を行った。Ｐｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）株の細胞を細胞の濃度が１０9細胞／ｍｌに達するまでＹＰＧ培地（実施例３参照）中で増殖させ、その後、遠心分離により細胞を回収し、生理溶液で３回洗浄し、細胞の濃度が１〜３×１０8細胞／ｍｌになるように５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）に再懸濁した。この懸濁液１ｍｌをＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（４０μｇ／ｍｌ）を用いて３０℃で２時間処理した。その後、細胞を生理溶液で３回洗浄し、ロイシン（０．１ｇ／ｌ）及びグリセロール（２ｖ／ｖ％）を含むＹＮＢ培地にプレーティングした（細胞の濃度は１０8又は１０9細胞／ｍｌ）。生存率は２．８％であった。５日間増殖させた後、通常のサイズのコロニーの中にいくつか大きなサイズのコロニーがあった（１０4個に１〜２個）。５０個の大サイズコロニーを選び、同じ培地に再度プレーティングした。
【００７４】
選んだ５０株全て並びに対照としてのＰｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）株及びＰｏｌｆ株のそれぞれ５ｍｌのＹＰＧ培地に接種し、細胞の濃度を約５×１０5細胞／ｍｌにした。バッファーを用いず、ＣａＣＯ3を添加せずに３０℃で７日間培養した後、コハク酸、α−ケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、及び酢酸の量をＨＰＬＣで測定した。試験管発酵の結果を表３に示す。表３に示すように、ほとんどの変異体がＰｏｌｆ（ｄＳＤＨ２）株及びＰｏｌｆ株よりも多くの量のコハク酸を生成した。発酵３〜４日後に培養培地のｐＨが３．２〜３．５に達していることが観察された。最もコハク酸を生成する変異株Ｎｏ．１８を以降の実験に選択した。この株をロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｕｓ；ロシア、１１７５４５、モスクワ、１  Ｄｏｒｏｚｈｎｙ  ｐｒｏｅｚｄ  １）にアクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４で２００７年１１月１５日に寄託した。その後、この寄託をブダペスト条約の条項に基づき２００９年１２月２３日に国際寄託に変更した。
【００７５】
【表３】
2012516135.tif 000004
ＳＡ−コハク酸、ＫＧ−α−ケトグルタル酸、ＣＡ−クエン酸、ＰＡ−ピルビン酸、ＡＡ−酢酸
【００７６】
実施例５．Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４株によるコハク酸の生成
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４株を、５０ｍｌの試験管を用いて種々のメーカーのグリセロール（５ｖ／ｖ％）を含む５ｍｌのＹＰＧ培地中で培養した。初発細胞濃度は約５×１０5細胞／ｍｌであった。第１の実験群は、培養３日目にＣａＣＯ3（２．５％）を添加して行った。第２の実験群はＣａＣＯ3を添加せずに行った。培地のｐＨ並びに有機酸及び残留グリセロールの濃度を、第１実験群は表４、第２実験群は表５に示す。表４及び５に示すように、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４株は、種々のメーカーのグリセロールを用いた両実験群でコハク酸を生成した。
【００７７】
また、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４株を、７５０ｍｌのフラスコを用いてグリセロール（５ｖ／ｖ％）を含む５０ｍｌのＹＰＧ培地中でも培養した。初発細胞濃度は、約２．５×１０5細胞／ｍｌであった。発酵中、２４時間毎に、サンプルを採り、サンプル中の細胞の濃度、培地のｐＨ、及びコハク酸の濃度を測定した。結果を図２に示す。図２に示すように、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＶＫＰＭ  Ｙ−３３１４株の細胞はｐＨ４未満の低ｐＨでコハク酸を生成した。
【００７８】
【表４】
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ＳＡ−コハク酸、ＫＧ−α−ケトグルタル酸、ＣＡ−クエン酸、ＰＡ−ピルビン酸、ＡＡ−酢酸
【００７９】
【表５】
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ＳＡ−コハク酸、ＫＧ−α−ケトグルタル酸、ＣＡ−クエン酸、ＰＡ−ピルビン酸、ＡＡ−酢酸
【００８０】
本発明をその好ましい実施形態に関連付けて詳細に説明したが、当業者には、本発明の範囲から逸脱せずに種々の変更及び同等物の使用が可能であることが明らかである。本明細書に挙げた全ての参考文献を参照により本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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