(57)【要約】【課題】例えばインフルエンザなどの様々な疾患および状態を診断、治療するためのエピトープ、当該エピトープの特定、当該エピトープに基づいた免疫応答の調節、および当該エピトープに基づく化合物を提供する。【解決手段】本発明の化合物は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示増強能または阻害能を有するハイブリッドポリペプチドである。このハイブリッドは、哺乳類Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチド：ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）またはその改変物を含むＮ末端と、抗原性エピトープを含むＣ末端とを有し、さらに、これらを共有結合で結ぶ介在的化学構造を有する。この抗原性エピトープは、任意の疾患、特には、インフルエンザウイルス、より詳細には、Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルスのエピトープとされる。【選択図】図１
2012516350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定のＴリンパ球または当該Ｔリンパ球由来のクローン細胞を刺激する、特異的なインフルエンザ抗原性エピトープを、ペプチド合成コンビナトリアルケミストリーの手法によって特定する方法であって、
ａ）Ｔリンパ球、または当該Ｔリンパ球由来のクローン細胞を用意するステップと、
ｂ）インフルエンザ抗原性エピトープの候補化合物のライブラリを用意するステップであって、前記ライブラリ内の候補化合物の各々は、そのＮ末端で、哺乳類のＩｉ−ｋｅｙにおいて抗原提示増強能を保持するペプチド：ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）またはその改変物と介在的化学構造を介して共有結合することでハイブリッドポリペプチドを形成しているステップと、
ｃ）前記ｂ）ステップで得られるハイブリッドのうち、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した状態で提示された際に前記ａ）ステップのＴリンパ球を刺激するハイブリッドを特定するステップと、
を含み、
前記介在的化学構造は、直線状に並べられると最大２０個のアミノ酸の長さにまで伸張する可撓性の鎖を形成する、結合原子群であり、
このようにして特定された特異的なハイブリッドに含まれる候補化合物は、前記Ｔ細胞を刺激する特異的な抗原性エピトープに相当する、
特異的なインフルエンザ抗原性エピトープの特定方法。
【請求項２】
請求項１において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来するものである、特異的なインフルエンザ抗原性エピトープの特定方法。
【請求項３】
請求項１において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに由来するものである、特異的なインフルエンザ抗原性エピトープの特定方法。
【請求項４】
請求項１において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、および配列番号：５９の配列からなる群から選択されるいずれかである、特異的なインフルエンザ抗原性エピトープの特定方法。
【請求項５】
配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、および配列番号：５９からなる群から選択されるいずれかである、ペプチド配列。
【請求項６】
請求項５に記載のいずれか１つの配列であって、
そのＮ末端で、哺乳類のＩｉ−ｋｅｙにおいて抗原提示増強能を保持するペプチド：ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）またはその改変物と介在的化学構造を介して共有結合することでハイブリッドポリペプチドを形成しており、前記介在的化学構造は、直線状に並べられると最大２０個のアミノ酸の長さにまで伸張する可撓性の鎖を形成する、結合原子群である、配列。
【請求項７】
配列番号：６１〜配列番号：７６からなる群から選択されるいずれかであるペプチド配列であって、
そのＮ末端で、哺乳類のＩｉ−ｋｅｙにおいて抗原提示増強能を保持するペプチド：ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）またはその改変物と介在的化学構造を介して共有結合することでハイブリッドポリペプチドを形成しており、前記介在的化学構造は、直線状に並べられると最大２０個のアミノ酸の長さにまで伸張する可撓性の鎖を形成する、結合原子群である、ペプチド配列。
【請求項８】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の、サイトカインに対する応答を調節する方法であって、
ａ）ＰＢＭＣを用意するステップと、
ｂ）ＭＨＣクラスＩＩのインフルエンザ抗原性エピトープを用意するステップであって、前記エピトープは、そのＮ末端で、哺乳類のＩｉ−ｋｅｙにおいて抗原提示増強能を保持するペプチド：ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）またはその改変物と介在的化学構造を介して共有結合させて形成したハイブリッドポリペプチドを形成しており、前記介在的化学構造は、直線状に並べられると最大２０個のアミノ酸の長さにまで伸張する可撓性の鎖を形成する、結合原子群であるステップと、
ｃ）前記ｂ）ステップのＩｉ−ｋｅｙハイブリッドを、前記ａ）ステップの前記ＰＢＭＣに接触させるステップと、
を含む、
ＰＢＭＣのサイトカイン応答の調節方法。
【請求項９】
請求項８において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来するものである、ＰＢＭＣのサイトカイン応答の調節方法。
【請求項１０】
請求項８において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに由来するものである、ＰＢＭＣのサイトカイン応答の調節方法。
【請求項１１】
請求項８において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、および配列番号：５９の配列からなる群から選択されるいずれかである、ＰＢＭＣのサイトカイン応答の調節方法。
【請求項１２】
請求項８において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、配列番号：６１〜配列番号：７６からなる群から選択されるいずれかである、ＰＢＭＣのサイトカイン応答の調節方法。
【請求項１３】
請求項８において、前記サイトカインがＩＦＮ−γである、ＰＢＭＣのサイトカイン応答の調節方法。
【請求項１４】
対象の免疫応答を調節する方法であって、
ａ）対象を用意するステップと、
ｂ）ＭＨＣクラスＩＩのインフルエンザ抗原性エピトープを用意するステップであって、前記エピトープは、そのＮ末端で、哺乳類のＩｉ−ｋｅｙにおいて抗原提示増強能を保持するペプチド：ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）またはその改変物と介在的化学構造を介して共有結合させて形成したハイブリッドポリペプチドを形成しており、前記介在的化学構造は、直線状に並べられると最大２０個のアミノ酸の長さにまで伸張する可撓性の鎖を形成する、結合原子群であるステップと、
ｃ）前記ｂ）ステップのＩｉ−ｋｅｙハイブリッドを、前記ａ）ステップの前記対象に投与するステップと、
を含む、
免疫応答の調節方法。
【請求項１５】
請求項１４において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来するものである、免疫応答の調節方法。
【請求項１６】
請求項１４において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに由来するものである、免疫応答の調節方法。
【請求項１７】
請求項１４において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、および配列番号：５９の配列からなる群から選択されるいずれかである、免疫応答の調節方法。
【請求項１８】
請求項１４において、前記インフルエンザ抗原性エピトープが、配列番号：６１〜配列番号：７６からなる群から選択されるいずれかである、免疫応答の調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
免疫系は、「異物」や「異常な」構造物を抗原と認識することで、外部の病原体、腫瘍細胞、自己免疫疾患誘発プロセス、アレルゲン、移植片などに応答する。これらの抗原の大部分は、宿主細胞または病原体が合成するタンパク質である。そのような抗原は、（タンパク質分解によって）ペプチド断片にプロセシングされた後、抗原提示細胞の表面上のペプチド提示構造体を介して免疫系の応答性リンパ球に提示される。このペプチド提示構造体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれる。当該分子の名前は、近交系マウス間での移植片拒絶を制御する、ＭＨＣ遺伝子座の対立遺伝子多型の産物として最初に見出されたことに由来する。
【０００２】
動物は、「自己」の分子に由来するペプチドを、「非自己」の分子に由来するペプチドと区別するために、このように抗原を提示・認識する複雑な方法を発達させてきた。本発明は、免疫応答の初期段階であるこの基礎的な過程を利用した物および方法に関する。本明細書には、選択された抗原性ペプチドを特定のＭＨＣ分子にチャージする能力を増強することを利用した、免疫系のワクチン処置を行うための化合物および方法が開示されている。このようなワクチン処置により、外部から侵入した病原体の異物性や腫瘍に対する毒性応答を増強することができる。本発明の化合物を用いた他の方法として、自己の認識を増強する方法、または自己免疫疾患、アレルギー、もしくは移植片拒絶を制御する方法が挙げられる。
【０００３】
特定の抗原に対する免疫応答は、ＭＨＣ分子内に配された当該抗原のペプチド断片を認識するＴリンパ球によって調節される。抗原提示細胞（ＡＰＣ）内では、タンパク質分解によってプロセシングされた抗原のペプチド断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の抗原性ペプチド結合部位に結合する。このペプチド−ＭＨＣの複合体は細胞表面へと送られ、（その外部からのペプチドおよび当該ペプチド周辺のＭＨＣ分子表面が）応答性Ｔリンパ球のＴ細胞受容体（レセプター）によって認識される。これらのＴリンパ球は、免疫制御機能（免疫応答を促進または抑制する機能）を有していたり、エフェクター機能（例えば細胞傷害性免疫応答などによって、病原体や腫瘍を除去する機能）を有していたりする。このような抗原特異的な認識事象による免疫応答のカスケード（cascade）の際には、防御免疫応答が生じたり、あるいは、自己免疫プロセスの場合には有害な免疫応答が生じたりする。
【０００４】
二種類のＭＨＣ分子が、抗原性ペプチドをＴ細胞に提示する免疫応答提示体として機能する。ＭＨＣクラスＩ分子は、それが合成される時をほぼ同じくして、生体内で合成されたタンパク質に由来するペプチド、例えば、感染性ウイルスなどを、小胞体において受け取る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合した抗原性ペプチドは、細胞表面上でＣＤ８陽性傷害性Ｔリンパ球に提示される。すると、ＣＤ８陽性傷害性Ｔリンパ球は活性化され、ウイルス発現細胞を直接殺傷することができる。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞体において合成され、その抗原性ペプチド結合部位をインバリアント鎖タンパク質（Ｉｉ）によってブロックされる。ＭＨＣクラスＩＩ分子とＩｉタンパク質との複合体は、小胞体からポストゴルジ区画へと送られ、そこでＩｉがタンパク質分解によって放出されて特異的な抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７）。
【０００５】
特許文献１および特許文献２（いずれの教示内容も参照をもって本願に取り入れたものとする）には、Ｉｉタンパク質が切断されてその過程で切断断片が放出されることに起因する、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位への抗原性ペプチドの結合・固定の制御メカニズムが開示されている（非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０）。Ｉｉタンパク質の一断片であるＩｉ（77-92）は、抗原性ペプチドのＮ末端を保持する抗原性ペプチド結合部位端部付近の、当該抗原性ペプチド結合部位の外側に位置するアロステリック部位（allosteric site）に作用することが判明している。前述の特許文献には、さらに、免疫応答におけるこの初期の調節的な抗原性ペプチド認識事象を、３種類の機序を経由して制御する新規治療用化合物および治療方法が開示されている。第１の機序では、当該特許文献の発明の化合物の作用により、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子から抗原性ペプチドが放出される。
【０００６】
第２の機序では、当該特許文献の発明の化合物により、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位のチャージ能力が増強され、当該抗原性ペプチド結合部位に対する別の合成ペプチドの結合が容易となる。このような挿入されたペプチド配列は、抗原性エピトープでも非抗原性ペプチド配列でもあり得る。いずれにせよ、そのようなペプチド配列は、抗原性ペプチド結合部位に強固に結合して当該部位をブロックする。第３の機序では、複合体からの抗原性ペプチドの結合・解離速度の変化、ＭＨＣ分子／抗原性ペプチド／Ｔ細胞受容体の三分子複合体の各成分間の相互作用の変化、ならびに当該三分子複合体と細胞間相互作用補助分子との相互作用の変化により、応答性Ｔリンパ球の分化・機能が抑制される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５５５９０２８号明細書（R. Humphreys (1996)）
【特許文献２】米国特許第５９１９６３９号明細書（Humphreys, et al.(1999)）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Blum, et al , Proc. Natl Acad. ScI USA85: 3975 (1988)
【非特許文献２】Riberdy, et al., Nature 360: 474 (1992)
【非特許文献３】Daibata, et al., Mol. Immunol. 31: 255 (1994)
【非特許文献４】Xu, et al., Mol. Immunol. 31; 723 (1994)
【非特許文献５】Xu, et al., Antigen Processing and Presentation; Academic Press, NY p227 (1994)
【非特許文献６】Kropshofer, el at., Science 270; 1357 (1995)
【非特許文献７】Urban, et al., J. Exp. Med. 180: 751 (1994)
【非特許文献８】Adams, et al., Eur. J. Immunol. 25: 1693 (1995)
【非特許文献９】Adams, et al., Arzneim. Forsch. Drug Research 47; 1069 (1997)
【非特許文献１０】Xu, et al., Arzneim. Forsch. Drug Research in press (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明では、驚くべきことに、Ｉｉ−Ｋｅｙにおけるペプチドのホモログと抗原性ペプチドとを共有結合させることにより、その抗原性ペプチド提示の力価が大幅に増強されることを見出した。また、そのようなＩｉ−Ｋｅｙにおけるペプチドの生物学的に活性なコア断片を結合するためのリンカーは、Ｉｉタンパク質由来の特定のペプチド配列である必要はなく、可撓性の単純なリンカー、例えば、メチレン（−ＣＨ２−）基の繰り返し単位で構成されたリンカーで十分であり且つ好適である。
【００１０】
本発明の化合物および方法は、様々な疾患（diseases）および状態（conditions）、例えば、インフルエンザなどの治療用および診断用の新規の化合物としても適用可能である。これらの化合物は、免疫応答の初期の調節的な抗原性ペプチドを認識する事象に働きかけるので、種々の毒性副作用を有する他種の治療薬よりも好適である。
【００１１】
本発明の化合物および方法は、特定の用途において、対象の（例えば、インフルエンザに対する）初接種または追加接種に有効な（天然由来および合成由来の）抗原性ペプチドを特定するのに利用することができる。
【００１２】
本明細書は、１）感染性疾患、悪性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、および移植片拒絶における抗原性エピトープの特定、２）このようなエピトープの、診断目的の使用、ならびに３）このようなエピトープの、治療目的の使用、特に、インフルエンザの治療目的の使用を開示する。
【００１３】
本発明は米国特許第６４３２４０９号明細書（R. Humphreys, et al.）の研究をさらに進めたものであり、当該米国特許の教示内容は参照をもって本明細書に取り入れたものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一構成は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示増強能を有するハイブリッドポリペプチドに関する。このハイブリッドは、抗原提示増強能を保持する、哺乳類Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチドであるＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）およびその改変物を含むＮ末端と、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドまたはペプチド模倣構造体の形態の抗原性エピトープを含むＣ末端とを有し、さらに、当該ハイブリッドのＮ末端構成要素とＣ末端構成要素とを共有結合で結ぶ介在的化学構造を有し、当該介在的化学構造は、直線状に並べられると最大２０個のアミノ酸の長さにまで伸張する可撓性の鎖を形成する、共有結合原子群である。好ましい実施形態において、介在的化学構造は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して空間的（立体的）に顕著な変化を伴う水素結合を形成することができない。また、好ましくは、介在的化学構造は、直線状に並べられると４〜６個のアミノ酸の長さを有する。ハイブリッドに使用されるＩｉ−ｋｅｙのペプチドの改変には、Ｎ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失、Ｃ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失、Ｎ末端の保護、アミノ酸の置換や、環誘導体の生成などが含まれる。一実施形態において、ハイブリッドに使用されるＩｉ−ｋｅｙのペプチドは、Ｃ末端切断によってＬＲＭＫ（配列番号：３）に改変されてもよい。本発明の好ましいハイブリッドには、Ａｃ（アセチル化）−ＬＲＭＫ（配列番号：３）−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号：８）−ＮＨ２；Ａｃ−ＬＲＭＫ（配列番号：３）−５−アミノペンタノイル−５−アミノペンタノイル−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号：８）−ＮＨ２；Ａｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ２（配列番号：９）；Ａｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ２（配列番号：１０）；またはＡｃ−ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ２（配列番号：１１）；が含まれる。ハイブリッドに使用されるＩｉ−ｋｅｙのペプチドの他の好ましい改変物として、ペプチド模倣構造体、Ｄ−異性体アミノ酸、Ｎ−メチル化アミノ酸、Ｌ−異性体アミノ酸、修飾Ｌ−異性体アミノ酸、または環誘導体による１つ以上のアミノ酸の置換物が挙げられる。なお、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示増強能を有するハイブリッドに組み込み可能な、Ｉｉ−ｋｅｙのペプチドと等価的に機能する分子を特定する方法も提供する。
【００１５】
本発明の他の構成は、Ｔ細胞に対するＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性エピトープの提示能を増強する方法に関し、当該方法は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性エピトープを、本発明のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示増強能を有するハイブリッドポリペプチドに組み込むことと、その後、生理学的条件下で、前記ハイブリッドポリペプチドと、ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による前記抗原性エピトープの提示に応答するＴ細胞とを接触させることと、を含む。この方法は、前記組み込まれた抗原性エピトープに対する、ＭＨＣクラスＩＩの対立遺伝子の応答を増強するので有用である。また、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の所定のパターンのＴｈ１刺激およびＴｈ２刺激を引き起こす抗原性エピトープを特定するにあたって、そのような抗原性エピトープは、本発明のハイブリッドに組み込むことによって容易に特定することができる。さらに、本発明のハイブリッドは、ある個体の特定のＴリンパ球に対する特定の分子の抗原性エピトープのＭＨＣクラスＩＩ分子提示能を増強可能なので、当該特定の分子に対するその個体の免疫応答を調節するにあたって有用である。インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の方法、およびエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）の方法の両方を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる他の構成は、Ｔリンパ球に対するＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性エピトープの提示を実質的に阻害する方法に関する。当該方法は、生理学的条件下で、以下の成分を接触させることを含む：ＭＨＣクラスＩＩを発現し、かつ、表面上にＴリンパ球提示用の抗原性エピトープを出現させる抗原提示細胞；前記抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による前記抗原性エピトープの提示に応答するＴリンパ球；および抗原提示を阻害するハイブリッドポリペプチド。前記抗原提示を阻害するハイブリッドポリペプチドは、ｉ）抗原提示増強能を保持する、哺乳類Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチドであるＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）およびその改変物を含むＮ末端と、ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合する、抗原結合部位リガンドまたはペプチド模倣構造体を含むＣ末端と、さらに、ｉｉｉ）当該ハイブリッドのＮ末端構成要素とＣ末端構成要素とを共有結合で結ぶ介在的化学構造を有し、当該介在的化学構造は、直線状に並べられると最大２０個のアミノ酸の長さにまで伸張し得る鎖を形成する、共有結合原子群である。この方法は、個体の抗原提示細胞によるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を実質的に阻害するので、当該個体を、有害な免疫応答の発生に関連する疾患について治療するのに有用である。本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を実質的に阻害する化合物を同定する方法についても、提供する。
【００１７】
本発明のさらなる他の構成は、Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッドに組み込まれることで例えばＴリンパ球またはＴリンパ球由来のクローン細胞などの刺激を介して免疫応答を刺激可能な、ウイルスエピトープ（例えば、インフルエンザのエピトープなど）および合理的に設計されたエピトープ（例えば、コンビナトリアルケミストリーなどによって）を特定する方法に関する。本発明は、さらに、例えば、Ｔリンパ球またはＴリンパ球由来のクローン細胞などを刺激することによって免疫応答を刺激するのに効果的であることが特定された、Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッドに組み込まれる任意の配列に関する。本発明は、さらに、上述のようにして特定され、Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッドに組み込まれた配列を対象または個体に投与することによって当該対象または個体の免疫応答を調節する方法およびキットに関する。
【００１８】
Ｈ５Ｎ１の世界的流行の懸念から、そのような集団発生に対して万全の準備を整えるための努力が継続的に行われている。ワクチン接種が、何百万もの生命を奪いかねないパンデミックを抑える最も効果的な手段と考えられている。現在米国ではＦＤＡ（米国食品医薬品局）によって認可されたサブビリオンワクチンが備蓄されており、欧州では別の種類のワクチンが用意されているが、いずれのワクチンも最適な免疫原性ではないことが臨床試験で判明しており、ヘマグルチニン阻害の防御力価を得るには複数回の投与が必要とされている。
【００１９】
過去の研究によると、抗原特異的ペプチドを用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の予備刺激により、ウイルス中和抗体の産生が増強され、かつ、ウイルス排除が促進されることが立証されている（Zhong, W., et al., 2000, J Immunol 164:3274；Crowe, S. R., et al., 2006. Vaccine 24:457；およびZhao, et al., 2007, Methods of Mol Biol, 409:217-225）。保存されたクラスＩＩエピトープをインバリアント鎖の断片を含有するように改変した改変エピトープを用いる独特なアプローチで、Ｈ５Ｎ１ワクチンの免疫原性や、他種のインフルエンザ株用の認可済みのワクチンまたは開発中のワクチンの免疫原性を増強したり、異種亜型に対する免疫をもたらしたりするか否かについては予測できていない。出願人の理解するところでは、本願が、ワクチン設計目的のクラスＩＩＨ５Ｎ１型ＨＡ（ヘマグルチニン）エピトープを特定することに成功した初の文献である。他の研究者の研究は、季節性インフルエンザ感染後（Gelder, C, M., et a!., 1995. J Virol. 69:7497；およびRichards, K, A., et al., 2007; J Virol 81:7608）またはワクチン接種後（Gelder, C, M,, et a!., 1996. J Virol 70:4787；Danke, N, A., and W. W. Kwok. 2003, J Immunol 171 3163；およびNovak, E. Jet al., 1999. J Clin Invest 104:R63）の、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞の対ＨＡレパトアに関するものであったが、本願出願人は、不活性化されたＨ５Ｎ１サブビリオンワクチンによるワクチン接種後に最も高確率で認識されるエピトープが何であるかについて分析を行った。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アルゴリズムで予測されたクラスＩＩＨＬＡＨ５Ｎ１型のＨＡペプチドをＩｉ−Ｋｅｙ部位を含有するように改変した改変ペプチドによる、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での刺激時の、ＣＤ４陽性ＩＦＮ−γＴ細胞の頻度および大きさを示すグラフである。３５名のドナーからＰＢＭＣサンプルを取り出し、このサンプルをＣＤ８陽性Ｔ細胞欠損に調製し、２４種類の各ＨＡ・Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドと共にインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＰＯＴ分析法を実施して、各ペプチドに対する応答率および応答の大きさを測定した。ワクチン接種者間の、各ペプチドに対する応答率を示す。応答の大きさの総計を、バックグウンドの３〜５倍超、５〜８倍超、８〜１０倍超、および１０倍超の各区分に適宜分けた（最低でもバックグランドの３倍超、すなわち、３０ＳＦＣ以上とした）。
【図２】Ｈ５Ｎ１型のＨＡのペプチドアレイのマトリックス(H5N1 HA peptide array matrix)を示す図である。第１ラウンドのＴ細胞刺激として、A/Thailand/4(SP-528)/2004由来の９４種類の重複ＨＡペプチドからなる２０種類のペプチドプールを利用した。マトリックス内において、２種類の正のスコア（最低でもバックグランドの３倍超、すなわち、３０ＳＦＣ以上とした）が両方出た場合に、当該マトリックスから、第２ラウンドのＴ細胞スクリーニングの試験対象とするための個々のペプチドを導き出した。
【図３】A/Thailand/4(SP-528)/2004由来の９４種類の重複ＨＡペプチドプールによる、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）刺激時の、ＣＤ４陽性ＩＦＮ−γに基づく当該ペプチドプールの認識応答および認識率を示したグラフである。３５名のドナーからＰＢＭＣサンプルを取り出し、このサンプルをＣＤ８陽性Ｔ細胞欠損に調製し、Ｈ５Ｎ１型のＨＡ配列全体をカバーした２０種類の各ペプチドプールと共にインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＰＯＴ分析法を実施して、各ペプチドプールに対する応答率および応答の大きさを測定した。各ペプチドプール、サブビリオンワクチン（ウイルス）、およびＨ５Ｎ１型の組換えＨＡに対するワクチン接種者の応答率を示す。応答の大きさの総計を、バックグウンドの３〜５倍超、５〜８倍超、８〜１０倍超、および１０倍超の各区分に適宜分けた（最低でもバックグランドの３倍超、すなわち、３０ＳＦＣ以上とした）。
【図４Ａ】組換えＨＡに対して応答を示したドナーのＰＢＭＣの、各種ペプチドプールに対するＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ応答率を示したグラフである。各種ペプチドに対する応答（グラフ中の円印）からバックグランド応答（非刺激ＰＢＭＣ）を減算し、各ドナーの正味のＳＦＣをプロットした。グラフ中の各々の丸印は、３列式のアッセイ分析によって算出した、各種ペプチドプールに対する平均ＳＦＣ応答を示すものであり、グラフ中の「Ｘ」は組換えＨＡに対する応答を表す。ナイーブなドナーには、Ｎ１〜Ｎ８という番号を付した。
【図４Ｂ】組換えＨＡに非応答的なドナーのＰＢＭＣの、各種ペプチドプールに対するＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ応答率を示したグラフである。各種ペプチドに対する応答（グラフ中の円印）からバックグランド応答（非刺激ＰＢＭＣ）を減算し、各ドナーの正味のＳＦＣをプロットした。グラフ中の各々の丸印は、３列式のアッセイ分析によって算出した、各種ペプチドプールに対する平均ＳＦＣ応答を示すものであり、グラフ中の「Ｘ」は組換えＨＡに対する応答を表す。
【図４Ｃ】ナイーブなドナーのＰＢＭＣの、各種ペプチドプールに対するＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ応答率を示したグラフである。各種ペプチドに対する応答（グラフ中の円印）からバックグランド応答（非刺激ＰＢＭＣ）を減算し、各ドナーの正味のＳＦＣをプロットした。グラフ中の各々の丸印は、３列式のアッセイ分析によって算出した、各種ペプチドプールに対する平均ＳＦＣ応答を示すものであり、グラフ中の「Ｘ」は組換えＨＡに対する応答を表す。これらナイーブなドナーには、Ｎ１〜Ｎ８という番号を付した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の種々の構成は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原性エピトープを適切な介在的化学構造を介して哺乳類Ｉｉ−ｋｅｙのペプチドに共有結合させてハイブリッドポリペプチドとしたものが、その前駆体である抗原性エピトープ単独よりも大幅に高い効率で抗原提示細胞によってＴリンパ球に提示されるという研究結果に基づくものである。このようにして形成されるハイブリッドポリペプチドを、本明細書では「ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示増強能を有するハイブリッドポリペプチド」、あるいはよりシンプルに「増強ハイブリッド」と称する。本発明の増強ハイブリッドは、抗原提示増強能（後で詳述する）を保持する、哺乳類Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチドまたはその改変物を含むＮ末端を有する。当該Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチドには、提示される特異的抗原性エピトープが共有結合している。本発明において、当該特異的抗原性エピトープは、ウイルスエピトープ、インフルエンザエピトープ、またはインフルエンザ株Ｈ５Ｎ１および／またはインフルエンザ株Ｈ１Ｎ１に由来するエピトープである。前記Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチドと前記抗原性エピトープとの間には、これら２つの構成要素間を共有結合する介在的化学構造が設けられる。この介在的化学構造を、「スペーサー」と称する。そのようなスペーサーに必要なパラメータについては、後で詳述する。
【００２２】
（インフルエンザエピトープ）
本発明の種々の構成は、特に、本発明のハイブリッドペプチドに使用され、所定のＴリンパ球または所定のＴリンパ球由来のクローン細胞を刺激したり、対象または個体を免疫化したりするのに効果的なウイルスエピトープの認識に関する。本発明の一実施形態において、前記ウイルスエピトープはインフルエンザ由来のものである。
【００２３】
インフルエンザＨ５Ｎ１に対するワクチンこそが、世界的な流行が発生した際の罹患率および死亡率を抑えるのに効果的な唯一の手段であると考えられる。昨今の数年間で、トリからヒトへの直接感染の事例は、主に中国南部および東南アジアで報告されている（Fauci, A. S. 2006. Cell 124:665；およびMonto. A. S., and R. J. Whitley. 2008. Clin Infect Ds 46:1024）。さらに、これよりも恐ろしいヒトからヒトへのウイルス伝染があった可能性について、幾つかの事例が特定されている（Taubenberger, J. K., et al., 2007. Jama 297:2025）。ウイルスが遺伝物質を混合（reassort）し、ヒトからヒトへの直接感染が可能となれば、世界的流行の危険が存在する。従来の卵由来のワクチン、例えば、季節性インフルエンザの３価ワクチンなどは、季節性インフルエンザの亜型には極めて効果的であるものの、Ｈ５Ｎ１インフルエンザに対する十分な交差防御をもたらすことができるかについては疑問視されている。孵化鶏卵を用いてＨ５Ｎ１ウイルスを増殖させてワクチンを生産する初期の試みは、ウイルスの病原性によって高濃度増殖が妨げられたため、比較的少ないワクチン量しか得られず、残念な結果となった。この欠点は、株特異的なＨ５Ｎ１型ＨＡタンパク質およびノイラミニダーゼタンパク質と、病原性のないA/PR/8/1934（Ｈ１Ｎ１）株由来のウイルス内タンパク質とを組み合わせたサブビリオンワクチン（subvirion vaccine）を生産することによって対処することができた。この手法に加え、ＨＡ１とＨＡ２との間の多塩基性切断部位を移動させることにより、鶏卵への最小限の毒性を有するウイルスが高濃度で得られた（ワクチン供給量の増加につながった）。このワクチンは、製造能力の上昇をもたらすものの、臨床試験では弱い程度ないし緩やかな程度の免疫原性しか見受けられなかった（Treanor, J. J., et al., 2006. N Engl J Med 354:1343；Zangwill, K. M., et al., 2008. J Infect Dis 197:580；およびBresson. J. Let al., 2006. Lancet 367:1657）。その一方で、最新の臨床試験では、アジュバントを添加したスプリットワクチン3.8μgを２回にわたり投与することにより、７７％の抗体陽転が得られたという結果もある（Leroux-Roels, l., et al., 2007. Lancet 370:580）。しかしながら、これらのワクチンは、力価の経時的な損失や、抗原ドリフトによる変異株の発生などによって効果が低下する可能性があるので、そのようなワクチンを備蓄する意義には疑問の余地がある。
【００２４】
インフルエンザ感染の研究は、マウスモデル系で最も徹底的に行われている。そのような研究によると、マウスにおけるＢ細胞の欠如は、ウイルス曝露後の死亡率を上昇させ得ると示されており（Mozdzanowska, K., et al., 1997. Virology 239:217；およびMozdzanowska. K., et al., 2005. J Virol 79:5943）、これは、強力な抗ウイルス液性免疫が重要であることを示唆している。ただし、ＣＤ８陽性エフェクター応答の誘導も、ウイルス排除および回復に貢献しているとされている（Topham, D. J., et al., J Immunol 159:5197）。免疫応答の両部門（液性応答および細胞性応答）の活性化が最も効果的な抗ウイルス応答をもたらすことが分かっているものの、その大半は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の支援に大きく依存していることが立証されている。活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、メモリーＢ細胞およびメモリーＴ細胞を誘導するのに必要不可欠なサポートを提供すると共に、Ｂ細胞およびＣＤ８陽性細胞に対する間接的な「ヘルプ」も提供する（Brown, D. M., et al., 2004. Semin Immunol 16:171；およびSwain, S, L., et al., 2006, Immunol Rev 211:8）。ＣＤ４陽性Ｔ細胞のさらなるエフェクター機能として、ウイルス感染に対する直接的な制御が挙げられ（Hogan, R, J., et al., 2001. J Exp Med 193:981；およびPaludan, C., et al., 2002. J Immunol 169:1593）、それには、インフルエンザに対する特異的な細胞殺傷活動も含まれる（Graham. M. B., et al., 1994. J Exp Med 180:1273；およびGraham, M, B., and T. J. Braciale, 1997. J Exp Med 186:2063。いずれもSwain, S. L., et al., 2006. Immunol Rev 211:8のなかで述べられている）。別の研究によると、ＣＤ４を欠損したマウスでも、極めて高い致死率のＰＲ８マウスインフルエンザウイルスを排除できる可能性があることが示されている（Mozdzanowska, K., et al., 2000. J Immunol 164:2635）一方、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、およびＢ細胞の組合せがマウスのウイルス排除能および生存率を大幅に上昇させることが立証されており（Gerhard, W, 2001. Curr Top Microbiol Immunol 260:171；および Levi, R., and R. Arnon 1996, Vaccine 14:85）、すなわち、防御には、多面的な応答が最も効果的であることを示唆している。ヒトのＨ５Ｎ１感染の防御に対する各種細胞の貢献の程度は現在分かっておらず、それは流行株の病原性および総合的な毒性に大きく依存するものと思われる。以上をまとめると、免疫応答の複数の部門を誘導し且つ広範囲の免疫を引き起こすように設計されたＨ５Ｎ１ワクチンが、Ｈ５Ｎ１の集団発生に対する最も有効な対策であると考えられる。
【００２５】
予備的研究では、アルゴリズムで予測したＨ５Ｎ１型ＨＡのＭＨＣクラスＩＩエピトープをＩｉ−Ｋｅｙに結合させたものでマウスを予備刺激することにより、臨床試験済みの組換えＨＡＨ５Ｎ１サブユニットワクチンに対する免疫応答を増強できることが立証された（未発表の研究）。具体的には、Ｈ５Ｎ１型ＨＡの高度に保存された領域に由来するクラスＩＩＨ５Ｎ１型ＨＡ／Ｉｉ−Ｋｅｙ予測エピトープを用いた予備刺激により、組換えＨＡを用いた追加免疫に対するＴヘルパー細胞および抗体の応答が増強された。他種の抗原を用いた過去の研究でも、ＣＤ４陽性に対し、抗原特異的な予備刺激を行ってから組換えワクチンで追加免疫することの有用性が立証されており、詳細には、このような構成により、より強力な免疫学的応答が得られる（Hosmalin, A., et al., 1991. J Immunol 146:1667）。したがって、従来のＨ５Ｎ１ワクチンの限られた供給量を拡大するためには、Ｈ５Ｎ１ワクチンの総合的戦略の一部として、Ｉｉ−Ｋｅｙを用いて改変したワクチンペプチドを予防ワクチンとして使用することを推進するのが合理的なように考えられる。また、Ｈ５Ｎ１型ＨＡの保存された領域に由来する少なくとも１つのＩｉ−Ｋｅｙ改変Ｈ５Ｎ１型ＨＡエピトープは、「単独」のワクチンとしても、世界的流行時に発生しかねない複数のＨ５Ｎ１型に対してある程度の防御を提供し得る可能性がある。
【００２６】
出願人は、後述の実施例３で説明するように、このようなワクチンを開発するために、Ｈ５Ｎ１サブビリオンワクチン臨床試験の被験者からＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）を入手し、具体的なＣＤ４陽性エピトープ応答を評価・特定した。アルゴリズムで予測されたクラスＩＩＨＡペプチド（合理的な設計およびコンビナトリアルケミストリーで得られるエピトープも本発明の用途に適している）をＩｉ−Ｋｅｙで改変したもの、およびＨ５Ｎ１型ＨＡ配列の全体をカバーした重複ペプチドのライブラリ（ペプチドプールのアレイ）を、有望なＭＨＣクラスＩＩエピトープの特定源として使用した。この研究は、Ｈ５Ｎ１サブビリオンワクチンに対するＣＤ４陽性応答の特性を把握し、Ｈ５Ｎ１ワクチン開発に適した有望なＭＨＣクラスＩＩエピトープを特定する初の研究である。
【００２７】
Ｈ５Ｎ１不活性サブビリオンワクチン接種後のＣＤ４陽性免疫優性エピトープを特定するために、ＣＤ８陽性が除去されたＰＢＭＣのサンプルを利用し、アルゴリズムで予測された２４種類のペプチドをＩｉ−Ｋｅｙ部位を含有するように改変した改変ペプチドのセットを用いて、まず、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で直接刺激した。これらのペプチドをスクリーニングすることにより、ドナーＰＢＭＣのあいだで高確率で応答を誘導し且つ強力なＩＦＮ−γ応答を誘発した数種類のペプチドを見出した。これらのペプチドは他のＨ５Ｎ１株の間で高度に保存されており、複数のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子と結合すると予測され、そのためＨ５Ｎ１ペプチドワクチンを得るために２つの望ましい面を有する。この研究結果をさらに拡張するために、エピトープを特定するためのより大胆なアプローチとして、複数の重複ＨＡペプチドからなるペプチドアレイのセットを用意した。マトリックス的アプローチにより、これらの重複ペプチドプールを、３５人のワクチン接種者に対して予備試験・分析した後、さらに、個々のペプチドを再び試験した。これにより、一度でたくさんの数のペプチドを実用的にスクリーニングすることができた。このようなアプローチで第１ラウンドのＴ細胞分析を実行したところ、サブビリオンワクチンに対する応答およびＨ５Ｎ１組換えＨＡに対する応答をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で迅速に評価することができ、かつ、クラスＩＩエピトープの候補を特定することができた。興味深いことに、ワクチンを接種したドナーの約半数は、組換えＨＡに対して反応を示さなかった。この理由の一部として、当該研究のために得られたサンプルがワクチン接種から約二年後のものであったこと、すなわち、メモリーＴ細胞が検出不能な範囲であったかもしれないことが考えられ、あるいは、そもそもワクチン自体が新規の免疫応答を誘発するのに有効でなかった可能性も考えられる。後者の説明は、サブビリオンワクチン接種後の初代長期臨床試験の被験者のうちの数名にＨＡ特異的抗体応答が見られなかったことによって部分的に裏付けられる（Treanor, J. J., et al., 2006. N Engl J Med 354:1343；およびZangwill, K. M, et al., 2008 J Infect Dis 197:580）。組換えＨＡに対するＴ細胞の応答が、最大のワクチン投与量（90μg×３回）を受けた一部のドナーでは検出不能であった一方、それよりもワクチン投与量の低いドナーでは、応答を示したということ（データは表示せず）は、当該技術分野の予測不可能な側面を表している。また、組換えＨＡに対して応答を示したドナーのサンプルの圧倒的多数が、ペプチドプールとＩｉ−Ｋｅｙによって改変された予測エピトープとの両方に応答した一方、組換えＨＡに非応答的なドナーおよびナイーブ（ｎａｉｖｅ）なドナーがペプチドプールに対して僅かな応答または全く応答を示さなかったという結果は、驚くようなものではない（図４Ａ〜４Ｃ）。
【００２８】
当該研究の懸念材料としては、季節性インフルエンザウイルスの感染および／または免疫を有する人口の頻度が高いことであり、そのため、ワクチンによって誘発された新規のＣＤ４陽性Ｔ細胞応答と、過去の季節性ウイルスの感染または免疫に起因する交差応答とを区別する必要がある。ナイーブなドナーまたは組換えＨＡに非応答的なドナーのなかには、アルゴリズムで予測されたペプチドおよびＨ５Ｎ１型ＨＡ重複ペプチドに対して微かな応答しか示さないものがあったが、Ｈ５Ｎ１ワクチン接種者のうちＨ５Ｎ１組換えＨＡに対して応答を示したドナーのＰＢＭＣのほうが、遥かに高確率かつ強力な応答をはっきりと示していた。ナイーブな個人にＨ５Ｎ１特異的なＴ細胞応答が検出されたことは、Roti達の研究結果、具体的には、過去にＨ５Ｎ１に曝されたことのない健康成人がＨ５Ｎ１のＨＡ、ＮＡ、マトリックスタンパク質、および核タンパク質のエピトープに対し、検出可能なＣＤ４陽性Ｔ細胞応答を示すという研究結果に沿ったものである。出願人の研究のデータ解析は、「予防接種前」の対照ＰＢＭＣを入手できなかったことから複雑化した。もし、そのような対照ＰＢＭＣがあれば、試験対象の抗原に対するＴ細胞応答のバックグランドレベルを確立することができたであろう。しかしながら、この点は、Ｈ５Ｎ１にナイーブな数名のドナーのＰＢＭＣをスクリーニングすることによって部分的に修正することができた。なお、ペプチドプールは、総じて、ワクチン接種者に全体的に弱いＩＦＮ−γ活性ないし緩やかなＩＦＮ−γ活性（バックグランドの３〜５倍超）を誘発した。ただし、幾つかのプールは、ドナーによっては、それよりも高い活性を誘発した。ドナー達の最新の追加免疫ワクチン投与時とＰＢＭＣの収集時との間の時間（約２４ヶ月）を考慮すると、ペプチドプールの応答の多くが弱かったのも驚くべきことではない。
【００２９】
Ｈ５Ｎ１の前記ペプチドのライブラリからＨ５Ｎ１型ＨＡに特異的なエピトープを特定する可能性を高めるために、第１ラウンドの試験において組換えＨＡに応答を示したドナーだけを、特定のペプチドのスクリーニングを行う第２ラウンドに使用した。このグループから活性ペプチドを特定することができたが、一部のドナーは、Ｈ１Ｎ１組換えＨＡについても陽性反応を示した。よって、第２ラウンドのスクリーニングにおける活性ペプチドが、交差反応の結果であったという可能性を完全に排除することはできない。１６種類の個々のペプチドが、第２ラウンドのＴ細胞刺激において活性であると認められた。これらのうち８種類は、一般的な季節性インフルエンザＨ１Ｎ１株に対して部分的ないし実質的に完全な配列相同性を有することが判明し、残りの８種類は、ニューカレドニアＨＡに対して相同性が全くないことから、Ｈ５Ｎ１型ＨＡに固有である。また、これらの特定された１６種類のペプチドは、ＢＥＩ７（aa 36-52）（ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ寄託機関（本明細書では「ＢＥＩ」と称することにする）；米国バージニア州マナッサス市）からＢＥＩ７８（aa 459-475）までのＨＡ配列全体に分散しており、それらのうちの７５％がＨＡ１に位置している。４種類の重複ペプチドクラスター（ＢＥＩ７−８、ＢＥＩ２７−２９、ＢＥＩ３８−３９、ＢＥＩ７３−７４）が９種類の有望なエピトープを形成しているが、これらの重複ペプチドは、２種類（以上）の互いに異なるクラスＩＩ結合溝挿入部（registry）を有している可能性があり、そのような場合には、未特定のさらなるエピトープが存在していることになる。第２ラウンドのＴ細胞刺激では、ＢＥＩ５９、ＢＥＩ７３、およびＢＥＩ７４が、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でドナーＮｏ．１０４４、Ｎｏ．３４、およびＮｏ．２１において強力な記憶応答（recall response）（バックグランドの２０〜５７倍超）を引き起こした。A/Vietnam/1203/04のＨＡ配列とA/New Caledonia/20/99のＨＡ配列との照らし合わせたところ、これらのインフルエンザ株は、それらの領域において顕著な相同性を有していた。したがって、上述のような強力な応答は、ニューカレドニアインフルエンザ株、別の季節性インフルエンザ株、または同様の相同性を有する亜型に対する既存のＴ細胞応答のブーストであると考えられる。
【００３０】
インフルエンザウイルス感染に対して、防御免疫を発生したり、当該防御免疫に何らかの貢献をしたりする抗原特異的ＣＤ４陽性細胞の重要性は、様々な研究によってはっきりと立証されている（MozdKanowska, K., et al., 2005. J Virol 79:5943；Brown, D. M., et al., 2006. J Immunol 177:2888；およびHogan. R. J., et al., 2001. J Exp Med 193:981）。残念なことに、季節性インフルエンザに対するヒトのＣＤ４陽性Ｔ細胞のレパトアを調査した研究の数は少なく、出願人の知るところによれば、Ｈ５Ｎ１型ＨＡに対するこのような応答を調査した研究はひとつもない。ワクチン設計、特に、ペプチドベースのアプローチでワクチン設計を行う場合には、まず、免疫優性なウイルスエピトープを特定することが重要である。本明細書では、Ｈ５Ｎ１型ＨＡに対して特異的である可能性が高いと思われるＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド、およびＨ５Ｎ１型ＨＡと季節性インフルエンザウイルスＨＡとの間に交差反応性を有する可能性が高いと思われるエピトープの両方が特定されている。いずれのエピトープの場合も、有用なワクチンペプチドとなり得る。高度に保存されたＭＨＣクラスＩＩエピトープを用いた、Ｈ５Ｎ１型ＨＡに対して応答を示すＣＤ４陽性Ｔ細胞を生産するための免疫化は、ある程度の部分免疫をもたらし、Ｈ５Ｎ１の世界的流行時の致死率を単独で軽減できると十分に考えられ、さらには、異種亜型に対する免疫を増強させる可能性も高いと十分に予測される。また、ＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチドは、予防的な免疫戦略に利用できる可能性があるので、これにより、従来の限られた供給量のワクチンの抗原投与量を減らし、より多くの人口をカバーすることができる。
【００３１】
（Ｉｉ−Ｋｅｙ）
過去の研究では、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の幾つかの抗原性ペプチドを、当該抗原性ペプチドを認識するＴリンパ球−ハイブリドーマに提示する提示能について、哺乳類のＩｉ−ｋｅｙにおけるペプチド：ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１）およびその改変物：ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：２）を用いることにより、その抗原性ペプチドの提示能を変化できることが立証された（特許文献１；特許文献２；および米国特許第６４３２４０９号明細書（R. Humphreys, et al.）を参照。これら米国特許の開示内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする）。Ｉｉ−ｋｅｙのペプチドの改変バージョンを用いた過去の実験によると、このようなポリペプチドに対し、その活性に悪影響を及ぼすことなく様々な変更または改変が可能であることが分かっている。事実、そのような変更または改変により、当該ポリペプチドの抗原提示能が増強した事例が多く存在する。後述の実施例の結果から、抗原提示増強能を保持するあらゆるＩｉ−ｋｅｙ改変ペプチドは、適切に組み込まれることにより、本発明の増強ハイブリッドとして良好に機能することが分かる。Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチドの改変には、Ｎ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失、Ｃ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失、Ｎ末端の保護、アミノ酸の置換や、環状ペプチドの挿入などが含まれる。Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチドの欠失物であっても、少なくとも元来の配列からの４つの連続するアミノ酸またはその置換バージョンが残っていれば、機能活性（functional activity）を示す。また、各残基部は、様々な天然由来または非天然由来のアミノ酸で置換されていてもよい。置換に使用可能な分子の例として、ペプチド模倣構造体、Ｄ−異性体アミノ酸、Ｎ−メチル化アミノ酸、Ｌ−異性体アミノ酸、修飾Ｌ−異性体アミノ酸、環誘導体などが含まれる。また、創薬化学の当業者であれば、当該技術分野の技法を通常の実験法で適用することにより、ハイブリッドのＮ末端領域の他の改変物を得ることができる。このような技法の例として、合理的ドラッグデザイン、Ｘ線回折データや核磁気共鳴データおよびその他の算出法（computational methods）からの構造的情報に基づく分子モデリング、コンビナトリアル化学合成生成物のスクリーニング、天然物の単離などが挙げられる。Ｉｉ−ｋｅｙペプチドにおいて、高い抗原提示促進活性を有することが知られている改変バージョンの例として、ＬＲＭＫ（配列番号：３）、ＬＲＭＫＬＰＫ（配列番号：４）、ＬＲＭＫＬＰＫＳ（配列番号：５）、ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰ（配列番号：６）、ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫ（配列番号：７）などが挙げられる。Ｉｉ−ｋｅｙペプチドの他の改変物および改変バージョンは、特許文献２および特許文献１に記載されている。Ｉｉ−ｋｅｙにおけるペプチドの、活性を保持することが知られている改変バージョン（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：２）は、以降、「Ｉｉ−ｋｅｙのホモログ」と称する。本明細書において、「Ｉｉ−ｋｅｙのホモログ」という用語には、Ｉｉ−ｋｅｙペプチド自体という意味も包まれる。
【００３２】
（エピトープ）
増強ハイブリッドの「抗原性エピトープ」とは、所与のＴ細胞に対して、所与の対立遺伝子の所与のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープのことを指す。すなわち、抗原性エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性エピトープ結合部位に結合する。本発明の増強ハイブリッドの生産用途のために選択される「抗原性エピトープ」は、その用途に合わせて変更または改変を施されていてもよい。すなわち、抗原性エピトープは、天然ポリペプチド、その配列の改変物、ペプチド模倣構造体、および非天然由来のアミノ酸またはアミノ酸の改変物である化学構造を含んでもよい。また、抗原性エピトープに対し、様々な化学的な改変または変更を施してもよい。例えば、そのような改変または変更として、哺乳類のＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に対する抗原性ペプチドの結合が、Ｔ細胞を刺激するのに好適なものに維持される範囲内で、非天然由来のアミノ酸の全体もしくは一部を組み込んでもよいし、または他の主鎖部位もしくは側鎖部位を組み込んでもよい。このような化学構造は、天然由来のタンパク質配列から導き出された抗原性ペプチドに比べて構造的類似性を少ししか持たないか、ほぼ持たないか、または全く持たない。また、このような改変または変更は、Ｔ細胞受容体による認識に影響を及ぼすかもしれないし、または及ぼさないかもしれない。改変または変更によっては、抗原性エピトープの認識を増強させる場合もある（例えば、改変または変更前は認識を行わなかったＴ細胞受容体のサブセットが、認識を行うようになる可能性がある）。
【００３３】
（スペーサー）
ハイブリッドにおける上述のような介在的化学部位、すなわち、「スペーサー」は、Ｉｉ−Ｋｅｙのホモログと抗原性エピトープとを結合するものを指す。このようなスペーサーが複数ある場合には、「複数のスペーサー」と称する。スペーサーは、直線状に並べられると最大２０個のアミノ酸長にまで伸張し得るペプチド主鎖原子を有する、原子数ゼロ以上の共有結合原子群である。好ましくは、スペーサーは、直線で９個未満のアミノ酸長のペプチド主鎖である。最も好適なのは、スペーサーが、直線で４〜６個のアミノ酸長の主鎖ペプチドである場合である。好ましくは、スペーサーは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して空間的（立体的）に顕著な変化を伴う水素結合を形成しないものである。
【００３４】
スペーサー部位には、アミノ酸の代わりに、様々な種類の化学基が組み込まれてもよい。米国特許第５９１０３００号明細書（Tournier, et. al., (1999)）には、そのような化学基の例が記載されており、その内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。好ましい一実施形態において、スペーサーは、ヘテロ原子が適度に介在した脂肪族鎖で構成されており、例えば、Ｃ２〜Ｃ６アルキレン、すなわち、＝Ｎ−（ＣＨ２）２〜６−Ｎ＝などが挙げられる。あるいは、スペーサーは、疎水性配列、親油性配列、脂肪族配列、芳香族−脂肪族配列などの単位が交互に並び、Ｏ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子が適度に介在したものである。このようなスペーサーの好ましい構成成分は、以下の種類の化合物から選択される：ステロール類、アルキルアルコール類、様々なアルキル基を有するポリグリセリド、アルキル−フェノール類、アルキル−アミン類、アミド類、疎水性ポリオキシアルキレンなど。他の例として、疎水性ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ酪酸などが挙げられる。スペーサーは、酸素原子によって互いに隔てられた、短い脂肪族鎖の繰り返し単位、例えば、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレンなどを含むものであってもよい。
【００３５】
また、スペーサー中に使用可能なペプチド配列は、米国特許第５８５６４５６号（Whitlow, et. al., (1999)）に記載されており、この米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。一実施形態において、スペーサーは、内部で切断され得る化学基を含む。このような化学基は、プロテアーゼ、所定の化学基、または触媒活性を有するモノクローナル抗体によって、切断が触媒されるものであってもよいが、必ずしもこれらに限定されない。プロテアーゼ感受性の化学基の場合、トリプシンターゲット（カチオン性の側鎖を有する２種類のアミノ酸）、キモトリプシンターゲット（疎水性の側鎖を有するアミノ酸）、およびカテプシン（Ｂ、ＤまたはＳ）に感受性を示すものが好適である。本明細書において「トリプシンターゲット」とは、トリプシンやトリプシン様酵素によって認識されるアミノ酸配列を指す。本明細書において「キモトリプシンターゲット」とは、キモトリプシンやキモトリプシン様酵素によって認識されるアミノ酸配列を指す。また、触媒活性を有するモノクローナル抗体の化学的ターゲットや化学的に切断可能なその他の化学基は、ペプチド合成、酵素触媒、および有機化学一般の分野における当業者にとって周知であり、通常の実験的方法を用いて合成したり、ハイブリッド構造体に組み込んだりすることができる。
【００３６】
（Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッド）
本発明のハイブリッドは、全体的にペプチド様の性質を有するものから、実質的に非ペプチドの性質の性質を有するものまで多岐にわたる。ホモログの中には、ペプチド様の性質を著しく低下させたものまたは実質的に非ペプチド性のものがあることを考えると、このようなホモログは、好適な特性、例えば、細胞膜内への侵入、可溶性、耐タンパク質分解性、抱合による不活性化に対する耐性、経口バイオアベイラビリティ、長いインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での半減期などを有する可能性が高いと考えられる。
【００３７】
本発明の範囲には、構造内に酸性基または塩基性基を有する、ハイブリッド分子の薬学的に許容可能な塩も含まれる。「薬学的に許容可能な塩」とは、アセテート（酢酸塩）、アンモニウム塩、ベンゼンスルホネート（ベンゼンスルホン酸塩）、ベンゾエート、ボレート、ブロミド、エデト酸カルシウム、カンシレート（カンシル酸塩）、カルボネート（炭酸塩）、クロリド（塩化物塩）／ジヒドロクロリド、シトレート（クエン酸塩）、クラブラネート（クラブラン酸塩）、エデテート（エデト酸塩）、エディシレート、エストレート、エシレート、フマレート、ヘキシルレゾルシネート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン、ヒドロキシナフトエート、イオダイド（ヨウ化物塩）、イソチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、メシレート、メチルブロミド、メチルニトレート、メチルサルフェート、ムケート、ナプシレート、ニトレート、Ｎ−メチルグルカミド、オレート（oleaste）、オキサレート、パモエート、パルミテート、パノエート、パントテネート（パントテン酸塩）、フォスフェート／ジフォスフェート、ポリガラクツロネート（polygalacturonate）、サブアセテート（subacetate）、スルフェート、タートレート、トシレート、トリエチオダイド、バレレートなどといった、あらゆる種類の薬学的に許容可能な塩を包含する。薬学的に許容可能な塩は、可溶性特性もしくは加水分解特性を改変する剤形、持続放出性の剤形、またはプロドラッグの剤形の形態で使用されてもよい。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は、その化合物の機能性（functionality）に応じて、例えば、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マンガン、亜鉛などのカチオン、アンモニア、アルギニン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、リシン、Ｎ−メチル−グルタミン、オルニチン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ピペラジン、プロカイン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、テトラメチレンジアミンヒドロキシド（tetramethylenejiamine hydroxide）などの塩基から構成してもよい。これらの種類の塩は、一般的な手法、例えば、遊離の酸を適切な有機塩基または無機塩基と反応させる手法によって調製してもよい。また、アミノ基などの塩基性基が存在するとき、アセテート、ヒドロブロミド、ヒドロクロリド、パモエートなどの酸性塩を剤形として利用してもよい。
【００３８】
また、酸（−ＣＯＯＨ）またはアルコール基に対し、薬学的に許容可能なエステル、例えば、アセテート、マレエート、ピバロイルオキシメチルなど、および可溶性特性または加水分解特性を改変する当該技術分野で公知のエステルを、持続放出性の剤形またはプロドラッグの剤形の形態で使用してもよい。
【００３９】
本発明のハイブリッド分子またはハイブリッド分子の成分は、キラル中心を有するものであってもよく、すなわち、ラセミ体、ラセミ混合物、個々のエナンチオマー、ジアステレオマーとして存在し得る。本発明には、それらのあらゆる異性体および異性体の混合物が包含される。さらに、本発明のハイブリッド化合物は、結晶形態の一部が結晶多形として存在していてもよく、そのような結晶多形も、本発明に包含される。さらに、本発明の化合物には、水や一般的な有機溶媒によって溶媒和物を形成するものも含まれる。そのような溶媒和物も、本発明の範囲に包含される。
【００４０】
本発明の増強ハイブリッドは、抗原性ペプチドの合成・選択のために開発された方法で合成・選択することのできる、ペプチド単位、ペプチド模倣体単位、またはその他の種類の化学基によって構成されたものであってもよい。これらの方法および化合物は、以下の米国特許明細書に記載されている：米国特許第４７０８８７１号（Geysen, et. al., (1987)）；米国特許第５１９４３９２号（Geysen, et. al., (1993)）； 米国特許第５２７０１７０号（Schatz, et al., (1993)）；米国特許第５３８２５１３号（Lam, et al., (1995)）； 米国特許第５５３９０８４号（Geysen, et al., (1996)）；米国特許第５５５６７６２号（Pinilla, et al.,  (1996)）；米国特許第５５９５９１５号（Geysen, et al., (1997)）；米国特許第５７４７３３４号（Kay, et al., (1998)）；および米国特許第５８７４２１４号 （Nova, et al., (1999)）。これら米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。
【００４１】
（ハイブリッドの活性）
ハイブリッドの活性は、Ｔ細胞による抗原性ペプチド配列認識への影響を検出するタイプの一種以上の免疫学的アッセイによって判定することができる。後の実施例で詳述する実験では、種々の抗原性エピトープをハイブリッドに組み込むことの有用性が立証されている。これら各ハイブリッドは、抗原性エピトープ単独の場合よりも、応答性Ｔ細胞ハイブリドーマを高効率に刺激することが立証された。このような立証は、抗原提示細胞に対するハイブリッドおよび抗原性エピトープの結合能、およびその後の、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合したエピトープを認識するためのＴ細胞受容体を有するＴ細胞ハイブリドーマによる認識能を濃度の関数として測定することにより行った。使用した抗原提示細胞はＣＨ２７細胞株であり、使用したＴ細胞ハイブリドーマはＴｐｃ９  １  Ｔ細胞株であった。実験方法のさらなる詳細は、実施例の欄で後述するとおりである。
【００４２】
上記の実験の結果は、試験した各ハイブリッドの活性が、対照の抗原性ペプチドの活性よりも大幅に高いことが立証している。具体的に述べると、抗原性ペプチドの場合、半最大刺激の終点は約２０ｎＭである。ハイブリッドの場合、エピトープによって変動はあるものの、半最大刺激の終点は約５０ｐＭである。メチレン系スペーサーを用いたハイブリッドの活性は、Ｉｉタンパク質の天然由来のスペーサーを用いたハイブリッドの活性と実質的に同じである。上記の実験は、Ｉｉ−Ｋｅｙのコア配列と抗原性エピトープとのハイブリッドの、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効率を立証するものであり、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合する抗原性エピトープを本発明の増強ハイブリッドに組み込むことにより、その提示効率を増強できることを示している。上記の実験は、さらに、Ｉｉ−Ｋｅｙ配列について登録されたＩｉタンパク質の一次配列に由来するペプチド配列は必ずしも必要ではなく、さらには、そのような構成は必ずしも最適な構成ではないことを立証している。
【００４３】
他の種類のアッセイ系を用いて、本発明の増強ハイブリッドに抗原性エピトープを組み込むことの効果を測定してもよい。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原性エピトープの認識能を定量化するための別のアッセイには、Ｂ細胞の免疫グロブリンの産生効率を測定する手法、傷害性Ｔ細胞の生成効率を測定する手法、および非近交系、近交系、コンジェニック、トランスジェニックなどの動物のナイーブなＴ細胞を使用し、そのＴ細胞受容体またはその他の生物学的に関連する分子を利用する手法などが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００４４】
（阻害ハイブリッド）
本発明の増強ハイブリッドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しているエピトープを立ち退かせることにより、当該増強ハイブリッドに組み込まれたエピトープとは別のエピトープに対するＴ細胞の応答を阻害または調節する能力を有する。すなわち、この場合のハイブリッドは、他のあらゆる種類のエピトープに対するＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原提示の実質的な阻害因子（阻害物質、阻害薬）として機能する。この場合のハイブリッドを、「ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示阻害能を有するハイブリッドポリペプチド」、あるいは、単純に「阻害ハイブリッド」と称す。
【００４５】
ＭＨＣクラスＩＩ分子抗原結合部位に結合可能であるけれどＴ細胞刺激能を有さない分子は、そのようなＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位のブロッカーであると見なせる。このようなブロッカーが結合することにより、存在する抗原性エピトープの結合が阻害されたり、既に結合している抗原性エピトープの結合が解除されたりする。そのような分子は、免疫抑制剤としての価値がある。本発明の阻害ハイブリッドは、通常は抗原性エピトープが占める場所にブロッカーを組み込むことによって調製してもよい。阻害ハイブリッドにブロッカーを組み込むことにより、ブロッカーの阻害活性を増強することができる。本明細書において「抗原結合部位リガンド」とは、ＭＨＣクラスＩＩ分子抗原結合部位に結合する分子のことを指す。なお、この用語は、抗原性エピトープおよび非抗原性分子の両方の意味を包含する。
【００４６】
抗原性エピトープについて既述したパラメータと同様のパラメータが、阻害ハイブリッドを構成するにあたっての抗原結合部位リガンドの物理的要件にも当てはまる。本明細書において、阻害ハイブリッドを構成するために使用される抗原結合部位リガンドとは、天然由来のあらゆるペプチド配列またはその改変配列、ペプチド模倣配列またはその改変配列、天然由来のアミノ酸または改変アミノ酸を含まない化学構造体を含むものと定義される。抗原結合部位リガンドは、哺乳類のＭＨＣクラスＩＩ分子における、一部のＴ細胞によって認識される公知の抗原性ペプチドが占有する空間の全体または一部に結合することが立証されている、あるいは、そうであると考えられている。抗原結合部位リガンドは、必ずしも天然由来のアミノ酸で構成されたものである必要はなく、天然由来のアミノ酸の種々の改変物で構成されたものであってもよく、改変物を含む抗原結合部位リガンドとして、例えば、その全体または一部が天然由来でないアミノ酸で構成されたものや、アミノ酸の全体または一部が他種の主鎖または側鎖で改変されたものが挙げられ、このような改変により、哺乳類のＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に対する結合が、所望の結果を生じるように適宜になされる場合がある。そのような化学的構造体は、天然のタンパク質配列に由来する抗原性ペプチドの構造と少ししか類似性がなかったり、少しも類似性がなかったり、あるいは、全く類似性がなかったりし得る。
【００４７】
本発明のハイブリッドに組み込まれることによって阻害活性を生じる抗原結合部位リガンドは、以下の１つ以上の米国特許明細書に記載されているか、それらの米国特許明細書に記載された方法によって見出すことができる：米国特許第５７３６１４２号（Sette, et al., (1998)）；米国特許第５８１７７５７号（Adams, et al., (1998)）；米国特許第５６７９６４０号（Gaeta, et al., (1997)）；米国特許第５６６２９０７号（Kubo, et al., (1997)）；米国特許第５８４３６４８号（Robbins, et al., (1998)）；および米国特許第５８４４０７５号（Kawakami, et al., (1998)）。これらの米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。
【００４８】
本発明の阻害ハイブリッドによる、当該阻害ハイブリッドに組み込まれたエピトープとは異なる抗原性エピトープ（基準抗原性エピトープまたは対照抗原性エピトープ）に対するＴ細胞の応答を阻害または調節する効果を測定するためのアッセイは、当業者の日常的な実験手法を用いて構築されてもよい。このようなアッセイにおいて、阻害ハイブリッドは、当該阻害ハイブリッドに組み込まれたエピトープとは異なる抗原性エピトープを投入する前、その投入と同時に、またはその投入後に、基準アッセイ混合物（standard assay mixture）に投入される。ハイブリッドに組み込まれたエピトープとは異なる抗原性エピトープを投入する前、またはその投入後に上記ハイブリッドを投入する場合、当該ハイブリッドの投入は複数回行われてもよい。これらのアッセイは、様々な条件下の有用性を有し得る。例えば、免疫応答の阻害をもたらす最適なハイブリッド構造の検出や、体内でプロセシングされてチャージされた抗原性エピトープを生理学的条件下で排除して合成ペプチドに置き換える最適なハイブリッド構造体の検出などにおける有用性が見込まれる。
【００４９】
（エピトープ提示の増強）
本発明の他の構成は、Ｔリンパ球に対するＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原性エピトープの提示能を増強する方法に関する。この方法では、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性エピトープを、既述したとおり、本発明の増強ハイブリッドのＣ末端に適切に組み込む。その後、生理学的条件下で、上記のように調製された増強ハイブリッドを、ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞と接触させる。このＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞は、Ｔ細胞と接触しているか、または後にＴ細胞と接触する。前記Ｔ細胞は、当該抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による前記抗原性エピトープの提示に応答する。この方法は、抗原性エピトープに関する前述の説明に当てはまる、あらゆる抗原性エピトープに対して好適である。このようなインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での増強をアッセイ分析する方法の例は、後の実施例、および本願に記載した米国特許明細書に詳述されている。
【００５０】
このようなＴリンパ球に対するＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原性エピトープの提示能を増強する方法は、疾患の診断および治療において幅広く適用することができる。診断目的の抗原性エピトープに対するＴ細胞応答は、しばしば、疾患を診断するにあたって測定され、特に、病原性感染因子を診断するにあたって測定される。このようなインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での診断アッセイにおいて、本発明の増強ハイブリッドにそのような診断目的の抗原性エピトープを組み込んだものを使用することにより、当該診断アッセイの感受性を著しく向上させることができる。感染性疾患およびがんの場合、病原体として特定される抗原性エピトープまたはがん特異的な抗原性エピトープを本発明の増強ハイブリッドに組み込んだ後、この増強ハイブリッドを用いて病原体特異的またはがん特異的なＭＨＣクラスＩＩ提示抗原性エピトープに対するＴｈ応答を引き起こすようにしてもよい。この応答は、Ｔヘルパー細胞の活性化および拡大をもたらし、このような活性化および拡大により、樹状細胞が活性化、すなわち、樹状細胞が「許可」されるので、外部から侵入した生物に対する効果的なＭＨＣクラスＩ拘束性傷害性Ｔリンパ球応答が活性化する。自己免疫疾患、アレルギー、および移植片拒絶の場合、病原性免疫応答を引き起こす特異的抗原性エピトープを特定した後、これを本発明の増強ハイブリッドに組み込む。このハイブリッドを用いることにより、Ｔｈ２応答を引き起こしてＴ細胞応答のダウンレギュレーションをもたらすようにＴ細胞を刺激することができる。この場合、サプレッサー細胞応答が刺激されることにより、病原性免疫応答のダウンレギュレーションがもたらされる。所定のサブセットのＴリンパ球を特異的に刺激する増強ハイブリッドを特定する方法については、既述したとおりである。このようなハイブリッドの、疾患を治療するにあたっての有用性および方法については、後述するとおりである。
【００５１】
（コンビナトリアルケミストリーによって特定される抗原性エピトープ）
本発明のさらなる他の構成は、ペプチド合成のためのコンビナトリアルケミストリー、合理的な設計、またはアルゴリズムベースの予測手法を用いることにより、（所定の）Ｔリンパ球またはＴリンパ球由来のクローン細胞を刺激する特異的な抗原性エピトープを特定する方法に関する。本発明の増強ハイブリッドを用いた、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞刺激の感受性の増強を利用することにより、多数の異なる分子の中から、Ｔリンパ球内のＴ細胞刺激活性に好適な分子をスクリーニングすることが容易となる。この方法では、候補となるペプチド（候補ペプチド）または化合物（候補化合物）のライブラリが用意または合成される。ライブラリ内の各候補化合物は、既述したように、前述のスペーサーを介して、Ｎ末端が哺乳類のＩｉ−ｋｅｙのホモログに独立して共有結合しており、本発明の増強ハイブリッドに類似したハイブリッドを形成する。これら各ハイブリッドについて、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した状態で提示された際の、所定のＴリンパ球を刺激する能力を試験する。このような試験は、各ハイブリッド生成物を、抗原提示細胞と、当該抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した状態で提示される適切な抗原性エピトープに応答するＴリンパ球とに接触させることによって実施することができる。好ましい一実施形態において、このようなアッセイは、多数の候補をスクリーニングするように大規模に実施される。抗原提示細胞によって提示された際にＴリンパ球を刺激することが判明したハイブリッドは、Ｔリンパ球を刺激する抗原性エピトープを含有するハイブリッドであると定義される。
【００５２】
候補化合物は、様々な入手源から得ることができ、例えば、自然界に存在する分子のライブラリ、コンビナトリアルケミストリーのライブラリ、合理的な設計、およびアルゴリズムベースの予測から得ることができる。一実施形態において、候補化合物を合成するための方法は、必要なハイブリッドを生成する方法として拡張されてもよい。多くの場合、それらのライブラリは、候補となる（ｐｏｓｓｉｂｌｅ）配列のセットを用いて設計される。当該候補となる各配列は、それぞれ、所定の位置において１つないし幾つかのアミノ酸を含んでいる。これらのペプチドの合成過程は、Ｃ方向またはＮ方向で進められ、スペーサー配列の１つ以上の残基が追加された後、Ｎ末端部のＩｉ−ｋｅｙの所望の残基が追加される。候補化合物を構成する材料または成分は、本明細書で定義される抗原性エピトープの有望な材料または成分として既述のとおり特定したものであれば何でもよい。最も好適なのは、候補化合物が、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合すると予測されるポリペプチドまたはペプチド模倣構造体の場合である。
【００５３】
本発明は、さらに、上記の方法によって特定される特異的な抗原性エピトープを包含する。また、この特異的な抗原性エピトープが組み込まれた増強ハイブリッドも、本発明に包含される。
【００５４】
候補化合物は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の方法によって遺伝子学的レベルでの多様性を確保してから、ポリペプチド配列の発現（例えば、定方向分子進化など）によって入手してもよい。このようなスクリーニングによって特定された化合物は、さらに、そのスクリーニングと同一のアッセイまたは他の種類のアッセイでのスクリーニングにかけることにより、さらなるサブライブラリのベースとしてもよい。抗原性エピトープの配列の多様性を発生させる方法には、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ＲＮＡ−タンパク質混合技術などの様々な方法がある。これらの方法の一部は、以下の米国特許明細書に記載されている：米国特許第５５１６６３７号（Huang, et al., (1996)）；米国特許第５８２１０４７号（Garrard, et al., (1998)）；米国特許第５８５２１６７号（Kay, et al., (1998)）；および米国特許第５９２５５５９号（Collines, et al., (1998)）。これらの米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。上記の方法の一部は、他にも、以下の文献にも紹介されている：Roberts, et al., ( 1997) Proc Natl, Acad. Sci, U.S.A. 94: 12297；Hanes, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 95: 14130；および Jermutus, et al., (1998) Curr. Opin. Biotechnol, 9: 534。これらの方法に基づいた方法により、遺伝子学的手法を用いて配列ＬＲＭＫ（配列番号：３）およびその改変物をポリペプチド生成物に導入するようにしてもよい。この生成物の直線状配列に配されたＬＲＭＫ（配列番号：３）モチーフは、前述したようなスペーサーにより、抗原性エピトープから適切に隔離される。このようなポリペプチド生成物の生成、発現、および解析、ならびに好適な特性を有する１つ以上のポリペプチド生成物の選択を行うための実験方法は、当業者にとって周知な常套方法である。
【００５５】
すなわち、本発明は、さらに、免疫応答の刺激に効果的なウイルスエピトープ、特に、所定のＴリンパ球または所定のＴリンパ球に由来するクローン細胞を刺激するのに効果的なウイルスエピトープを構築および／または特定する方法に関する。具体的に述べると、本発明は、さらに、免疫応答の刺激に効果的なインフルエンザウイルスエピトープ、特に、所定のＴリンパ球または所定のＴリンパ球に由来するクローン細胞を刺激するのに効果的なインフルエンザエピトープを構築および／または特定する方法に関する。このような構築物の例は、実施例３に記載されている。
【００５６】
（治療用途）
個体の免疫応答を調節する前述の方法の用途として、個体の疾患または状態の治療処置が挙げられる。まず、抗原性エピトープとして、そのエピトープに対する免疫応答の増強が患者の治療に有益な結果をもたらすと考えられるものが選択される。一実施形態において、前記抗原性エピトープの由来となる分子は、発病に寄与する分子である。あるいは、前記抗原性エピトープは、病原体などの有害因子または病原体の感染した細胞に見受けられるエピトープである。本明細書における「治療処置」という用語は、疾患の兆候または症状を改善すること、および疾患に罹っていると特定されたかまたはそうであると考えられる個体における当該疾患の進行を阻止することの両方の意味を含む。本明細書において「予防」という用語は、疾患の認識可能な兆候または症状を未だ示していない個体について、当該疾患の根本的な原因または関連する素因を改善するという意味を含む。
【００５７】
前記疾患は、細菌、ウイルス、寄生体、真菌、リケッチア、その他の感染因子、またはこれらの因子の組合せの感染によって引き起こされた感染性疾患またはそのような感染に関係する感染性疾患であり得る。前記治療は、疾患の毒素に対するものであってもよい。エピトープを導き出すのに好適な毒素には、ブドウ球菌腸毒素、トキシックショック症候群毒素、レトロウイルス抗原（例えば、ヒト免疫不全ウイルスなど）、連鎖球菌抗原、マイコプラズマ、ミコバクテリウム、ヘルペスウイルスなどが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。極めて好適な毒素は、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥ１〜３、ＳＥＤ、およびＳＥＥである。
【００５８】
前記疾患または状態として、自己免疫プロセス、例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、深在性エリテマトーデス、真性糖尿病、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、皮膚筋炎、天疱瘡、その他の同様のプロセスなどが考えられ得る。本発明の化合物および方法の効果を評価するために利用可能な、これらのような自己免疫疾患のモデル系として、例えば、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、実験的アレルギー脳脊髄炎などが挙げられる。これらの実験を実施するための手順は、米国特許第５２８４９３５号明細書（Clark, et al., (1994)）に紹介されている。当該米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。
【００５９】
前記疾患または状態として、アレルギープロセス、例えば、喘息、枯草熱、アレルギー性鼻炎、局所性皮膚炎、大腸炎、特定のアレルゲンまたは不特定のアレルゲンによって引き起こされるかまたはそれに関連するその他のアレルギープロセスなどが考えられ得る。このようなアレルゲンとして、例えば、植物、動物、バクテリア、寄生体性アレルゲン（parasitic allergen）、接触過敏性を引き起こす金属系アレルゲンなどが挙げられる。本発明の用途に適したアレルゲンとして、雑草、芝生、ピーナッツ、ダニ、ノミ、ネコ抗原などが挙げられる。
【００６０】
あるいは、前記疾患または状態として、増殖性プロセスまたは悪性プロセス、例えば、がん、良性前立腺肥大、乾癬、腺腫やその他の内因性の細胞増殖、ウイルスプロセスやその他の感染プロセス、刺激性プロセス、環境プロセスなどが挙げられる。
【００６１】
本明細書において「哺乳類」という用語は、ヒト種およびその他のあらゆる哺乳類種を包含する。本発明の化合物および方法は、どの哺乳類腫の個体に生じる疾患および状態の治療に適用されてもよい。「個体」または「対象」という用語は、ヒト種を含む全ての哺乳類種のうちの一種のことを指す。本明細書においてヒト種を例に挙げて述べた、個体に生じ得る前記疾患および状態は、それが同一の生体または発病プロセスによって引き起こされたものであるか否かに関係なく、かつ、それが関連する生体または発病プロセスによって引き起こされたものであるか否かに関係なく、また、それがその他の生体および／または発病プロセス、または未知の生体および／または発病プロセスによって引き起こされたものであるか否かに関係なく、他の種において生じ得る同等の疾患または状態を包含するものとする。本明細書において「医師」という用語は、獣医師、哺乳類種の個体の診断および／または治療に参加するあらゆる個人、例えば、看護師、医師助手、医療補助員（パラメディック）などを包含する。
【００６２】
本発明は、さらに、化合物を、適切な医薬処方物の形態に調製した、薬剤、当該化合物のプロドラッグ、または当該化合物の薬物代謝物として投与することを含む。「投与」または化合物と「投与する」という用語は、本発明の化合物を、薬剤、当該化合物のプロドラッグ、または当該化合物の薬物代謝物として、疾患の治療または予防を必要とする個体に供給することを意味する。本発明の１種以上のハイブリッドポリペプチドを、前述の１つ以上の疾患および状態の治療または予防のための活性主成分として含有するこのような薬剤は、一般的な添加剤によって調製された、局所投与、経口投与、経腸投与、および非経口投与に用いられる様々な治療剤形で投与されてもよい。投与経路および投与計画は、治療対象の疾患または状態に応じて変更され、熟練者によって決定される。例えば、前記化合物は、錠剤もしくはカプセル剤（それぞれ、徐放性処方物または持続放出性処方物を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの経口投与剤形の形態、または注射剤によって投与されてもよい。同様に、前記化合物は、静脈（ボーラス法もしくは注入法）、腹腔内、皮下、密封（occlusion）または非密封の外用剤、筋肉内に投与されてもよい。医薬分野の当業者であれば、これらの全ての形態は周知である。
【００６３】
当該製品の１日用量は、大人で０．００１ｍｇから１，０００ｍｇである。経口投与の場合、好ましくは、当該組成物は、治療過程で患者の兆候および症状に合わせて用量を対症調節できるように、活性成分０．００１〜１，０００ｍｇの錠剤の形態で供給され、より好ましくは活性成分０．００１ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、１０．０ｍｇ、２０．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、または１００．０ｍｇの錠剤の形態で供給される。通常、薬剤の有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与レベルで供給される。特には、薬剤の有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約７ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与レベルで供給される。
【００６４】
有利なことに、本発明の適切な処方物（剤形）は、１日用量で投与されてもよいし、１日総量を、例えば１日あたり２回、３回、または４回に分けて投与してもよい。本発明の増強ハイブリッドポリペプチドは、前述した疾患または状態の治療に有用な薬剤または薬を調製するのに使用されてもよい。また、本発明の化合物は、適切な鼻腔内用の添加剤を用いて鼻腔内に局所投与されてもよいし、当業者にとって周知の経皮吸収パッチ（transdermal skin patch）の形態で経皮経由で投与されてもよい。用量投与を経皮送達系の形態で行うのであれば、当該投与は、断続的ではなく投与計画をとおして継続的に行われる。
【００６５】
本発明のハイブリッドポリペプチドは、局所投与用に適合された薬学的に許容可能な担体と組み合わせられた活性化合物を含む、疾患の治療用および予防用の医薬組成物の形態で投与されてもよい。局所投与用の医薬組成物は、例えば、皮膚への適用に適合された、液剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、シャンプー剤、またはエアロゾル剤（aerosol formulation）の形態であってもよい。本発明の化合物を含有するこれらの局所用医薬組成物は、通常、活性化合物約０．００５％から約５％を、薬学的に許容可能な添加剤との混合物として含有している。
【００６６】
本発明のハイブリッドポリペプチドは、疾患および状態、例えば、前述した疾患および状態の治療および予防のために、それらのような疾患および状態を治療するのに有用であることが知られている他種の薬剤（agent）と共に使用されてよい。２種類以上の活性成分による組合せ治療、すなわち、それらの活性成分が併用的に投与され得る治療では、それらの活性成分は、同時投与されてもよいし、あるいは、時間をずらして別々に投与されてもよい。
【００６７】
本発明の組成物を利用した投与計画は、様々なファクタ（因子）、例えば、患者の型、種、年齢、体重、性別、医学的状態（medical condition）、治療対象の状態の重症度、使用される特定の化合物などに応じて選択される。当該技術分野の医師であれば、前記疾患または状態の進行を予防、対抗、または阻止するのに必要な薬剤の有効量を容易に決定・処方できるであろう。薬剤の濃度を、毒性を全く生じないかまたは毒性を許容可能な程度に抑えて効能が発揮される範囲に高精度に調節するには、ターゲット部位への薬剤の到達動態に基づいた投与計画が必要となる。これには、薬剤の分散、平衡、および消失を考慮することが必要となるが、それらは当該技術分野の熟練者の能力範囲内である。
【００６８】
本明細書で詳述する化合物は、本発明の方法での活性成分を構成することができ、かつ、典型的には、従来の薬務に沿って、経口の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などの目的の投与形態に応じて適宜選択された適切な薬学的な希釈剤、賦形剤、担体（cardar）（本明細書ではこれらをまとめて「担体物質（cardar material）」と称する）との混合物として投与される。例えば、錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与の場合、薬剤の活性成分は、エタノール、グリセロール、水などの経口用の非毒性の薬学的に許容可能な不活性の担体と組み合わされてもよい。この混合物には、さらに、必要に応じて、または所望どおりに、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤が組み込まれてもよい。適切な結合剤には、スターチ、ゼラチン、グルコースやβ−ラクトースなどの天然糖、デンプン糖、アラビアガム、トラガカント、アルギン酸ナトリウムなどの天然または人工ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。この剤形（dosage）に使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マンガン、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。崩壊剤には、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００６９】
液状の剤形である場合、当該剤形は、合成ガムおよび天然ガム、例えば、トラガカント、アラビアガム、メチルセルロースなどによって適宜風味付けされた懸濁剤または分散剤であってもよい。使用可能な分散剤として、他にもグリセリンなどが挙げられる。経口投与には、無菌懸濁剤および無菌液剤が望ましい。静脈への投与が望ましい場合、適切な防腐剤を一般的に含有した等張調製物が使用される。
【００７０】
薬剤の活性成分を含有した局所投与用の調製物は、当該技術分野において周知の様々なキャリア材料、例えば、アルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡオイル、ビタミンＥオイル、鉱物油、プロピオン酸ＰＰＧ−２ミリスチルなどと混合されて、例えば、クリーム剤形またはゲル剤形の、アルコール性液剤、局所用洗浄剤、クレンジング用クリーム、スキンジェル、スキンローション、シャンプーなどを形成するものであってもよい。
【００７１】
本発明のハイブリッドポリペプチドは、スモールユニラメラベシクル、ラージユニラメラベシクル、マルチラメラベシクルなどのリポソーム送達系の形態で投与されてもよい。リポソームは、例えば、コレステロール、ステアリルアミン、種々のフォスファチジルコリンなどの様々な化合物から形成され得る。
【００７２】
本発明のハイブリッドポリペプチドまたはその処方物は、薬剤の放出制御を達成するのに有用な生分解性ポリマー類、例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、ヒドロゲルの架橋ブロックコポリマーまたは両親媒性ブロックコポリマーなどに結合されてもよい。
【００７３】
本発明のハイブリッドポリペプチドおよびその処方物は、容易に入手可能な開始材料、試薬、および従来の合成手法を用いて調製されてもよい。この場合の反応について、当業者に知られているが本明細書には詳述しないような変更または変形を施してもよい。
【００７４】
（本発明のエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での使用）
本発明の増強ハイブリッドを個体に直接投与することにより、当該個体のＴリンパ球に対する抗原性エピトープのＭＨＣクラスＩＩ提示能を増強する構成の変形例として、当該個体から抗原提示細胞の集団を得て、これらを本発明の増強ハイブリッドによってエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で処理するようにしてもよい。これらの細胞を、前記増強ハイブリッドにより、当該ハイブリッドが抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのに適切な条件下で処理する。処理後の抗原提示細胞は、当該処理後の細胞と前記個体のＴリンパ球との物理的接触を促進する条件下で、当該個体に投与される。既述のとおり、免疫応答に対する効果（増強または抑制）は、どのＴ細胞のサブセットが当該増強ハイブリッドによって好適に刺激されるかに依存する。免疫応答の増強は、傷害性応答、例えば、がん細胞や感染性生物などに対する傷害性応答に好ましい効果をもたらし得る。一方、Ｔサブレッサー細胞応答の増強は、特定の分子に対する免疫応答を抑制する効果をもたらし得る。このような抑制は、自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、深在性エリテマトーデスなどの病因性抗原由来の抗原性エピトープを利用した際に、治療効果をもたらし得る。本発明の化合物および方法を用いて、患者の細胞をエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で処理する方法および手順については、以下の米国特許明細書に記載されたものを採用・適合してもよい：米国特許第５１２６１３２号（Rosenberg (1998) ）；米国特許第５６９３５２２号（Chada, et al., (1997)）；米国特許第５８４９５８６号（Kriegler, et al., (1998)）；米国特許第５８５６１８５号（Gruber, et al., (1999)）；および 米国特許第５８７４０７７号（Kriegler, et al., (1999)）。これらの米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。
【００７５】
さらなる他の構成において、本発明の化合物および方法は、米国特許第５８４６８２７号（Celis, et al., (1998)）に記載された化合物および方法にしたがい、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）の条件下で傷害性Ｔリンパ球の生成を促進するのに使用されてもよい。上記米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。
【００７６】
（本発明の他の用途）
本発明の増強ハイブリッドに抗原性エピトープを組み込むことは、抗原提示細胞による抗原性エピトープの総合的な提示効率を増強することのほかにも、ある対立遺伝子拘束性の抗原性エピトープについて、そのエピトープを提示可能なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子型の範囲を拡大することができる。増強ハイブリッドによって所与の抗原性エピトープに対する対立遺伝子型の範囲が拡大したか否かは、前述のアッセイ手法において、抗原提示細胞から広範囲の型のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を発現させることによって検出することができる。そのようなＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の型の広範囲は、所望の範囲を反映するものであるのが望ましい。このようにＭＨＣクラスＩＩ分子の多種類の対立遺伝子を提示するアッセイ系の例は、特許文献１、特許文献２などに紹介されている。これらの米国特許の内容については、既述のとおりである。ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の型の所望の範囲内で最大の活性を示すハイブリッドを、使用のために選択する。対立遺伝子の前記所望の範囲での活性は、公知の疾患またはその他の医学的状態に関係するものであってもよい。好ましい一実施形態において、前記ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の型の範囲は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病などに関係するＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子から選択される。このようなＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の選択、ならびにそのような対立遺伝子に対する反応性についてアッセイ分析される抗原提示細胞、Ｔ細胞株、およびハイブリドーマの選択は、当業者であれば、簡単に入手可能な材料および日常的な実験条件を用いて容易に行うことができる。
【００７７】
本発明のさらなる他の構成は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の所定のパターンのＴｈ１刺激およびＴｈ２刺激を示す抗原性エピトープを特定する方法または選択する方法に関する。所望の前記所定のパターンの刺激は、Ｔ細胞に対してＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原性エピトープが提示された際の応答の、Ｔｈ１刺激のみ、Ｔｈ２刺激のみ、あるいは、Ｔｈ１刺激およびＴｈ２刺激の両方であってもよい。本発明の抗原提示増強能を有するハイブリッドポリペプチドには、候補となる抗原性エピトープが適切に組み込まれる。その後、所望のパターンのＭＨＣクラスＩＩ拘束性のＴｈ１刺激およびＴｈ２刺激を伴う提示活性を示す増強ハイブリッドが、調製された複数の増強ハイブリッドの中から特定される。所望の活性を示すハイブリッド分子のスクリーニングは、ハイブリッドポリペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩに係る抗原提示細胞と、当該抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原性エピトープの提示に応答するＴ細胞とに接触させることによって実行される。前記ハイブリッドと前記細胞との接触は、生理学的条件下で行われるのが望ましい。Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答のアッセイ方法は、以下の米国特許明細書に記載されている：米国特許第５５４０９１９号（Daynes, et al., (1996)）；米国特許第５６０１８１５号（Powrie, et al., (1997)）；米国特許第５６６５３４７号（Metzger, et al., (1997)）；米国特許第５７７６４５１号（Hsu, et al., (1998)）；米国特許第５８３０８８０号（Sedlacek, et al., (199S)）；米国特許第５８３７２６９号（Daynes, et al., (1998)）；米国特許第５８７９６８７号（Reed (1399)）；米国特許第５８９５６４６号（Wang (1999)）；米国特許第５８９７９９０号（Baumann, et al., (1999)）；および米国特許第５９０８８３９号（Levitt, et al., (1999)）。これらの米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。
【００７８】
一般的に、Ｔｈ１刺激およびＴｈ２刺激は、サイトカイン放出についてのアッセイによって決定することができる。所望のＴｈ１刺激および／またはＴｈ２刺激に相関するサイトカイン放出について最大の活性を示す増強ハイブリッドが特定され、選択して使用される。好ましい一実施形態において、前記所定のパターンのサイトカイン放出は、疾患またはその他の生理学的状態の増強または抑制に関連したパターンを反映したものである。例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病などの自己免疫疾患に関連したパターンのサイトカイン放出を引き起こすハイブリッドが好ましいとされる。また、感染性疾患およびアレルギーに関連するパターンのサイトカイン放出に対して好適な影響をもたらすハイブリッドが選択されてもよい。Ｔｈ１刺激およびＴｈ２刺激を決定する適切なアッセイの選択および実行は、動物実験およびこれに付随する当該動物の応答についてのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアッセイ、およびその他のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアッセイを含め、当業者であれば、簡単に入手可能な材料および日常的な実験条件を用いて容易に行うことができる。
【００７９】
本発明の増強ハイブリッドポリペプチドは、個体のＴリンパ球に対する特定の分子の抗原性エピトープのＭＨＣクラスＩＩ提示能を増強し、その特定の分子に対する当該個体の免疫応答を調節するのに使用されてもよい。免疫応答の調節とは、増強または抑制であり、増強は、ＴヘルパーのＴリンパ球サブセットに対応し、抑制は、ＴサプレッサーのＴリンパ球サブセットに対応し、いずれも刺激を受ける。どちらのＴリンパ球が刺激されるかは、投与される特定の増強ハイブリッドによって決まり、そのような特定のハイブリッドは、上述のように所望のＴリンパ球刺激のパターンに応じて選択される。適切な増強ハイブリッドが調製・選択されると、当該増強ハイブリッドは、個体に対し、当該個体の抗原提示細胞に対するハイブリッドの送達が適切に行われる条件下で投与される。増強ハイブリッドの適切な送達を行うために、薬学的に許容可能な担体が使用されてもよい。本発明の増強ハイブリッドの適切な処方物（製剤）には、局所投与用、経口投与用、経腸投与用、および非経口投与用の処方物が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。処方物（製剤）、投与方法、および投与量については、後で詳述する。
【００８０】
本発明のさらなる他の構成は、Ｔリンパ球に対するＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原性エピトープの提示または提示能を阻害する方法である。既述のとおり、抗原結合部位リガンドは、主要組織適合性クラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するあらゆるペプチドまたは分子で構成される。当該結合する分子は、Ｔリンパ球刺激活性を有するものであっても、有さないものであってもよい。Ｉｉ−ｋｅｙのホモログをスペーサーを介して抗原結合部位リガンドに結合することにより、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原提示を実質的に阻害する能力が増強されたハイブリッドを調製することができる。Ｔリンパ球に対するＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原性エピトープの提示または提示能を実質的に阻害するために、抗原提示能を阻害する阻害ハイブリッドペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞に接触させられる。当該抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球提示抗原性エピトープをその表面上に出現させている。このような操作により、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原性エピトープの提示に応答するＴリンパ球の機能が調節される。
【００８１】
Ｔ細胞に対する抗原性エピトープの提示または提示能が阻害されたことを証明するためのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアッセイは、特許文献１および特許文献２に記載されており、これら特許文献の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。ハイブリッドの生物学的活性のアッセイ分析、例えば、抗原特異的なＴリンパ球活性化を阻害する能力などのアッセイ分析は、多種多様なアッセイ系で行ってもよい。プロトコルの一例として、過剰な量のハイブリッドを、公知のＭＨＣ発現（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１など）の抗原提示細胞と、公知の抗原特異性（例えば、破傷風毒素（830-843））およびＭＨＣ拘束性（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１など）のクローンＴ細胞と、抗原性ペプチド（破傷風毒素（830-843））と共にインキュベートすることが挙げられる。このアッセイ培地は、Ｔ細胞の増殖に十分な時間（例えば、１〜４日間）インキュベートした後、増殖を定量化する。この定量化は、インキュベーションの最後の１８時間をトリチウム標識チミジンでパルスすることで実施してもよいし、あるいは、その上澄み液を、応答性Ｔ細胞が放出するインターロイキン次第で増殖の是非が決まるＨＴ−２細胞の二次培養培地（second culture）に移した後、インキュベーションの最後の１８時間をトリチウム標識チミジンでパルスすることで実施してもよい。そして、阻害因子を受けなかった対照と比較し、その対照に対する阻害率を算出する。インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアッセイで分析される、ハイブリッドおよびその他の阻害要因の抗原提示または抗原提示能の容量は、そのような化合物の、免疫応答に対するインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での阻害能力と相関し得る。動物モデルにおけるインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）活性は、例えば、前記ペプチドを介して認識され、特定のＭＨＣ分子に拘束されることが判明している抗原と、免疫調節ハイブリッドとを投与することによって決定してもよい。そのような投与後、当該動物からＴリンパ球を取り出し、ある用量域の抗原で培養する。そして、刺激の阻害または阻害能を、一般的な手段、例えば、トリチウム標識チミジンをパルスした後に適切な対照と比較するという手段などによって測定する。当業者であれば、実験の詳細は明白であろう。
【００８２】
本発明の阻害性増強ハイブリッドに抗原性ペプチド結合部位リガンドを組み込むことによってもたらされる活性増強は、阻害活性のより迅速かつ高精度な検出を可能にする。このように向上した検出により、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示または提示能を阻害する新規の化合物の特定が可能になる。この点を踏まえると、本発明は、さらに、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示または提示能を阻害する化合物を特定する方法に関する。この方法は、抗原結合部位リガンドであると予測される候補化合物のライブラリを用意し、候補化合物の各々を、哺乳類のＩｉ−ｋｅｙのホモログに対し、前記Ｉｉ−ｋｅｙのホモログがＮ末端に位置して当該候補化合物Ｃ末端に位置するようにスペーサーを解して共有結合させることを含む。このようにして得られた生成物は、「抗原提示阻害能を有するハイブリッドポリペプチド候補」、あるいは、「阻害ハイブリッド候補」と称することにする。上記のようにして得られた阻害ハイブリッド候補のスクリーニングは、これらの各候補を、ＭＨＣクラスＩＩ分子の一部に天然由来の配列の抗原性ペプチドを発現している抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した状態で提示される前記抗原性エピトープに応答するＴリンパ球とに接触させることによって行われる（Ｔリンパ球活性化アッセイとして知られている）。そして、阻害ハイブリッドの候補が、対照の反応と比べてＴリンパ球の活性化を低減させているか否かを判断する。このアッセイでＴリンパ球の活性が低下していると、それは、ハイブリッドに組み込まれた候補化合物、および阻害ハイブリッドの候補それ自体が、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示または提示能の阻害因子であるということを示唆している。
【００８３】
阻害ハイブリッドの候補を調製するために使用される候補化合物は、自然界で生じる生成物であってもよいし、コンビナトリアルによって調製されたペプチドもしくはペプチド模倣体であってもよいし、またはその他の有機化合物であってもよい。
【００８４】
本発明は、さらに、上述した方法によって特定される阻害分子および阻害ハイブリッドを包含する。このような抗原提示または提示能の阻害因子の主な用途は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ではなくインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）であり、詳細には、ＭＨＣクラスＩＩ抗原性ペプチド結合部位の連続的なブロックを介して、またはそのようなブロックを介さずに、体内で結合した抗原性ペプチドを放出させることで有益な効果をもたらす臨床用途である。このようなハイブリッドの他の用途として、既述のとおり、自己免疫疾患の治療が挙げられる。
【００８５】
本発明のさらなる他の構成は、個体のＴリンパ球に対する応答を実質的に阻害する本発明の阻害ハイブリッドを当該個体に投与することにより、抗原性エピトープに特異的なＴリンパ球の応答を阻害して、当該個体の疾患を治療する治療方法に関する。阻害ハイブリッド化合物の許容可能な処方物（製剤）、投与方法、および投与計画は、本発明の増強ハイブリッドの既述の許容可能な処方物（製剤）、投与方法、および投与計画とそれぞれ一致する。
【００８６】
本発明の化合物および方法は、米国特許第５８２０８６６号明細書（Kappier, et al., (1998)）（本米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。）に開示された化合物および方法とは異なる。なぜなら、本発明の抗原性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各受容体部位に非共有結合的に結合するＩｉタンパク質断片に結合しているのであり、ＭＨＣクラスＩＩ分子の２本の鎖のうちの一方のＮ末端に共有結合する構成ではない点で異なっているためである。また、本発明の範囲には、以下のような構築物も包含される。すなわち、前記構築物では、抗原性ペプチドが、他種の化合物に対し結合しており、この他種の化合物は、適切な親和性をもって、ＭＨＣクラスＩＩ分子（必ずしもＩｉ−ｋｅｙのホモログが結合する部位ではない）、または他の細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ４など）に対して結合する。なお、前記他の細胞表面タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子とＴ細胞受容体との結合（例えば、抗原提示細胞とＴリンパ球との結合など）によって形成される複合体と相互作用する。このようなハイブリッドは、本明細書の別の箇所で述べたように、ＭＨＣクラスＩＩ分子の構造モデルに基づいて設計してもよく、また、古典的な薬剤設計方法、またはコンビナトリアル合成によるスクリーニング生成物によって設計してもよく、あるいは、そのようなハイブリッドは、天然の生成物の単離によって得られてもよい。
【００８７】
本発明の化合物および方法は、米国特許第５２８４９３５号明細書（Clark, et al., (1934)）（本米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。）に開示された化合物および方法とは異なる。なぜなら、当該米国特許の発明の化合物では、抗原性ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子とが共有結合した複合体を用いているが、その複合体の抗原性ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子の一方の鎖のＭ末端）のいずれかに、毒素が結合されている。
【００８８】
本発明の化合物および方法は、米国特許第５８０７５５２号明細書（Stanton, et al., (1998)）（本米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。）に開示された化合物および方法とは異なる。なぜなら、当該米国特許の発明の化合物では、両親媒性のヘリックスペプチドの複数のペプチド断片によって抗原性エピトープが囲まれており、このペプチド断片の相互作用により、周期的に離間した抗原性エピトープが非共有結合的に集合した多量体が形成される。
【００８９】
本発明の化合物および方法は、改変遺伝子を抗原提示細胞に導入させることにより改変したＩｉを発現しているＩｉタンパク質配列中において、置換・改変された抗原性エピトープを含有する化合物およびその方法とは異なる（Barton, et al., Internat, Immunol, 10:1159 (1998)）；Fujii, et a!., Human Immunology 59; 607 (1998)；Malcherek, et al., Eur. J. Immunol. 28: 1524 (1998)；Stumptner, et al., The EMBO Journal 16: 5807 (1997)）；およびVan Bergen, el al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 94: 7499 (1997)）。少なくとも、このような構築物は、Ｉｉタンパク質とＭＨＣクラスＩＩ分子との間で形成された複合体の細胞内送達が、ポストゴルジ区画方向に優勢になるようにすることで、抗原／Ｉｉタンパク質のプロセシングおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドに対するチャージング（charging）を促進させるものとして記載されている（Bakke, et al., Cell 16: 707 (1990)；およびLamb, et al., J. Immunol. 148: 3478 (1992)）。すなわち、これらの構成では、本発明の特徴的な分子メカニズムおよび細胞生物学的メカニズムが好適に利用されていない。
【００９０】
後述の実施例の欄で紹介するデータは、マウスの生物学的活性を分析するアッセイを用いて実験的に得られるものであるが、同様の結果は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）条件下のヒト細胞からでも、生理学的条件下のヒト細胞からでも得られる。Ｉｉ−ｋｅｙ配列およびスペーサーから導き出されるハイブリッド構築物の断片の最適化は、日常的な実験で達成することができる。
【実施例】
【００９１】
（実施例１）
［Ｉｉ−Ｋｅｙコアモチーフと抗原性エピトープとを結び付けるスペーサーの構成が多様に変更されたハイブリッドペプチドの設計および合成］
【００９２】
Ｉｉ−Ｋｅｙにおけるペプチドの活性コアと抗原性エピトープとを共有結合させて、「ハイブリッド」ペプチドを調製した。このような構築物は、そのＩｉ−Ｋｅｙの作用で、当該ハイブリッドに組み込まれた抗原性ペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子の提示能が変化することにより、力価およびその他の機能的な利点が増強されている。これら２種類の生物学的に活性な単位同士を結び付けるスペーサーの構成を多様（様々な長さおよび組成）に変化させた数種類のハイブリッドを、それらの生物学的活性を判定する目的で調製した。
【００９３】
上記ハイブリッドを設計するにあたっての最初の構造的課題は、Ｉｉ−Ｋｅｙにおけるコアペプチドの、活性に必要な長さの決定であった。Ｉｉ−Ｋｅｙにおける活性配列の最小単位であるペプチドＬＲＭＫ（配列番号：３）を、本研究の試験対象となるハイブリッドの調製に使用した。過去の研究において、このテトラペプチドの、ＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原性ペプチドの提示能に対する効果をアッセイで調べた結果、当該テトラペプチドは、Ｉｉ−ｋｅｙペプチド群の任意のペプチドが持つ最大活性の少なくとも５０％を保持することが判明していた（Adams, et al., Eur. J. Immunol. 25: 1693 (1995)）；およびAdams, et al., Arzneim. Forsch./Drug Research 47: 1069 (1997)）。ＬＲＭＫ（配列番号：３）のＣ末端からＩｉタンパク質の配列由来のさらなる残基が続いたペプチドも、過去の研究によると、ＭＨＣクラスＩＩ分子にペプチドをチャージする能力の増強を調べる基礎的アッセイ（basic assay）において、より強力な活性を示すことが判明している。しかしながら、上記のホモログ群におけるＩｉ−ｋｅｙペプチド部位については、ＬＲＭＫ（配列番号：３）を用いて一定とした。
【００９４】
上記のホモログ群における抗原性ペプチドについても、同様に一定とした。その抗原性ペプチドには、ハトチトクロームＣ（ＰＧＣＣ）抗原性ペプチドであるＰＧＣＣ95-104；ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号：８）を用いた。
【００９５】
後述の表１に挙げたハイブリッド群は、その活性に対するスペーサーの長さおよび組成の影響を調べるために設計されたものである。この化合物群を設計するにあたっては、Ｉｉタンパク質由来ペプチドおよび抗原性ペプチドの、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合溝への結合についての知見を一部利用した。インフルエンザヘマグルチニンＨＡ（307-319）（Stern, et al., Nature 378: 215-221 (1994)）由来の抗原性ペプチド、およびロイペプチン誘導切断ペプチド（ＣＬＩＰ）として知られるＩｉタンパク質由来のペプチド(Ｉｉ(86-102)）（Ghosh, et al., Nature 378: 457-462 (1995)）を用いた過去のＸ線結晶構造解析により、これらのペプチドの、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ１の抗原性ペプチド結合部位内での分子配向が判明した。抗原性ペプチド結合部位内でＣＬＩＰが占める位置は、ＣＬＩＰを含む弱結合性ペプチドを取り除いて強結合性の抗原性ペプチドと交換する機能を持つＨＬＡ−ＤＭ分子を欠如した細胞株において特定された（Setts, et al., Science 258: 1801 (1992)；Avva, et al., Immunity 1: 763-772 (1994)；Sloan, et al., Nature 375: 802-805 (1995)；およびDenzin, et al., Cell 82: 155-163 (1995)）。Ｉｉ−Ｋｅｙにおけるコア：ＬＲＭＫ（配列番号：３）は、特定されたＣＬＩＰペプチド群のなかの最長のペプチドにおいて、Ｎ末端から離れた場所に位置する（Chicz, et al., Nature 358: 764 (1992)）。しかしながら、Ｉｉ−Ｋｅｙペプチド群のうちの長いホモログ（ＬＲＭＫ（配列番号：３）のＣ末端からさらに続いたもの）は、ＣＬＩＰペプチド群のうちの長いペプチドのＮ末端の一次アミノ酸配列との間で重複する部分を有する。
【００９６】
【表１】
2012516350.tif 000003
【００９７】
表１のハイブリッド６は、Ｃ末端に向かってＩｉ−Ｋｅｙにおけるコア配列：ＬＲＭＫ（配列番号：３）と、そこから延びるＩｉタンパク質残基のスペーサー：ＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫ（配列番号：１２）と、それに続く抗原性エピトープ：ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号：８）とを含むハイブリッドである。この「参照ハイブリッド」のスペーサー部位にＩｉタンパク質の一配列を配するという構成は、ハイブリッド６のＸ線結晶構造解析画像に、前述した過去の２種類のＸ線結晶構造解析画像を重ね合わせることによって想到した。これらの画像は、ＨＡ（307-319）（Stern, et al., Nature 378: 215-221 (1994)）がＨＬＡ−ＤＲ１のＭＨＣクラスＩＩ分子結合ポケットに結合した画像と、ＣＬＩＰがＨＬＡ−ＤＲ１のＭＨＣクラスＩＩ分子結合ポケットに結合した画像（Ghosh, et al., Nature 378: 457-462 (1995)）であった。これら２種類の結晶構造解析画像において、ＨＬＡ−ＤＲ１のＭＨＣクラスＩＩ分子のＰ１疎水性ポケットには、ＣＬＩＰのＩｉ配列のメチオニン９９またはＨＡ（307-319）ペプチドのロイシン８７が充填されている。よって、当業者であれば、この疎水性Ｐ１ポケットには、ＰＧＣＣ（95-104）のイソロイシン９５も適合できると十分に予測できる。そのため、ハイブリッド６は、Ｉｉタンパク質のリシン９０を中心とした配列を含み、かつ、Ｃ末端にはＰＧＣＣ（95-104）配列を含む。このハイブリッドにおけるＩｉタンパク質の配列と抗原性ペプチドとの配列「重複」は、ＨＬＡ−ＤＲ１のＰ１疎水性ポケットに結合すると予測される残基の位置の直前に生じている。
【００９８】
その他のハイブリッドペプチドは、ポリプロリル型ＩＩ（ＰＰＩＩ）へリックスとしての、Ｉｉ部位および抗原性ペプチド部位の二次構造と配置、特に抗原性ペプチド結合溝に対する適合性とを入念に考慮したうえで設計した。Ｘ線結晶構造解析画像によると、ＣＬＩＰと抗原性ペプチドは、それぞれ、二次構造においてポリプロリル型ＩＩへリックスの螺旋を形成することが示されている。この型のヘリックスは、一巻きごとのアミノ酸繰り返し頻度が３．０アミノ酸であり、これは、周知のαヘリックスで見受けられる、一巻きごとのアミノ酸繰り返し頻度３．２アミノ酸とは対照的である。これら二種類のヘリックスを長手軸心に沿って観察すると、ＰＰＩＩヘリックスは、αヘリックスよりも、一巻きごとに「伸張する」距離が約２倍である。また、ＰＰＩＩヘリックスは、αヘリックスとは異なり、ヘリックスを安定化させる巻き内部の水素結合を有していない。つまり、α−ヘリックスでは、ｉ番目の残基のペプチド主鎖のイミド部のプロトンが、ｉ＋３番目の残基のペプチド主鎖のカルボニル基に水素結合している。このようなペプチド主鎖の巻きに沿って生じる内部安定化が、α−ヘリックスの、比較的強力なエネルギーを有する局所的二次構造を形成している。αヘリックスは、タンパク質内で、互いに折り重なりあったり、他種の局所的な二次構造に折り重なったりすることができる。これとは対照的に、ＰＰＩＩ構造は、タンパク質内で、タンパク質−タンパク質の相互作用を認識する単位として用いられる。このようなＰＰＩＩヘリックスは、例えば、ＳＲ−１ドメインに見受けられ、当該ＳＲ−１ドメインは、細胞間タンパク質によって膜貫通型受容体の細胞内領域が認識される過程を仲介する。なお、当該細胞内領域の構造または間隔は、細胞表面事象によって変化する。Ｔ細胞によって認識される抗原性エピトープも、ＰＰＩＩ構造として螺旋を形成している。このようなＰＰＩＩ構造は、α−ヘリックスに比べて、幅広い領域において、抗原性配列に含まれる多数の側鎖の提示が可能になると考えられている。これにより等辺ピラミッド構造が生じ、この構造では、抗原性ペプチドのヘリックスの稜線に沿った複数の残基が、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合割れ目（cleft）の基部に位置した疎水性ポケットに結合する。抗原性ペプチドのＰＰＩＩヘリックスのその他の２本の稜線に沿った複数の側鎖は、ＭＨＣ分子の表面に沿った浅いポケットに曝されてＴ細胞受容体と相互作用する。抗原性配列が、α−ヘリックスではなくＰＰＩＩヘリックスであることにより、当該抗原性配列の各側鎖に接触し得るＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴＣＲ分子の側鎖の原子の数は、約２倍になる。２つの非平行なヘリックスの間の抗原性ペプチド結合内では、結合した抗原性ペプチドのＰＰＩＩヘリックス構造のＮ末端が、一般的に抗原性エピトープであると特定される第１の残基から少なくとも５個の残基分延びている。Ｘ線結晶構造解析によると、２つの非平行α−ヘリックス（これらの間には、ＣＬＩＰまたは抗原性ペプチドが配される）によって形成される溝の端部には、Ｉｉ配列のＰ８７の存在が確認される。
【００９９】
本発明は特定の理論に限定されるものではないが、Ｉｉ−Ｋｅｙコア構造：ＬＲＭＫ（配列番号：３）と抗原性エピトープ：ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号：８）とが結び付いたハイブリッドペプチドに生じ得る相互作用をモデル化したものから、ＬＲＭＫ（配列番号：３）の機能性基（functional group）および抗原性エピトープを結合するスペーサーに含まれる原子（表１）とＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用の構造的要件についての幾つかの仮説を導き出すことができる。第一の仮説として、スペーサーのアミノ酸側鎖の原子は、当該スペーサーがＰＰＩＩヘリックスである場合にのみ、ＭＨＣクラスＩＩ分子の特定の残基と最適に相互作用するというものが挙げられる。この仮説については、ハイブリッド６（表１を参照）によって試験した。このハイブリッドでは、Ｉｉタンパク質の配列においてＬＲＭＫ９１（配列番号：３）のＣ末端から直接続く完全な１０個のアミノ酸残基によってスペーサーが構成されており、ＣＬＩＰのＩｉタンパク質配列のＸ線結晶構造解析モデルとＨＡの抗原性ペプチドのＸ線結晶構造解析モデルとを重ね合わせた際に見られた、これらの合致部（registry）が維持されている。もし、試験でハイブリッド６だけが生物学的に活性であると判明したならば、当業者であれば、抗原性配列の第１の残基から離れた場所に位置する、ＭＨＣクラスの溝における残基に対する接触が必要条件であると結論付けることができるであろう。
【０１００】
他の仮説は、前記スペーサーにおける一部の残基のみが、ハイブリッドペプチドの機能的観点からみて必要であるというものである。ハイブリッド５（表１を参照）は、Ｉｉタンパク質の配列においてＬＲＭＫ９１（配列番号：３）のＣ末端から直接続く最初の７個の残基のみが、前記スペーサーにおいて残るように設計されている。ハイブリッド４（表１を参照）では、Ｉｉタンパク質の配列においてＬＲＭＫ９１（配列番号：３）のＣ末端から直接続く最初の４個の残基のみがスペーサーを構成している。もし、ハイブリッド５（表１を参照）とハイブリッド４（表１を参照）がハイブリッド６と同等の活性を示した場合、この結果は、介在的部位がポリプロリル型ＩＩ（ＰＰＩＩ）ヘリックスの二次構造であることは重要でないことを示唆している。さらに、この結果は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に含まれる残基のなかの重要な接触対象残基と、そのような相互作用に重要な（恐らく）主鎖の位置（例えば、ペプチドのカルボニル残基またはイミノ残基）とを探し出す動機となる。
【０１０１】
その他のハイブリッドは、スペーサーにＩｉタンパク質の配列の明確な残基が必要であるか否かを調べるものである。スペーサー配列中にＩｉタンパク質の特定の残基が必要であることが分かると、当該スペーサーが活性部位においてＰＰＩＩヘリックスとして螺旋を形成している必要があるという見解が支持されることとなる。これらのハイブリッドでは、前記スペーサーのアミノ酸残基が、Ｅ−アミノ−吉草酸（ａｖａ）残基に置き換えられている。ハイブリッド３（表１を参照）には２個のａｖａ残基が含まれており、ハイブリッド２（表１を参照）には１個のａｖａ残基が含まれている。これらのハイブリッドペプチドは、それぞれ、ハイブリッド５のホモログ、ハイブリッド４のホモログである。アミノ基−メチレン−カルボキシ基を含むａｖａ残基が直線状に延在している構造は、トリペプチド単位の主鎖長さに実質的に相当する。これらの「欠失ホモログ」ならびにハイブリッド５およびハイブリッド４のいずれもが生物的活性を有していた場合、スペーサーの側鎖原子とＭＨＣクラスＩＩペプチド結合溝との相互作用について、特定の機能的な条件は存在しないと結論付けることができる。
【０１０２】
本研究で使用した全種類のハイブリッドペプチドについて、エキソペプチダーゼの活性を阻害するために、Ｎ末端をアセチル化し、かつ、Ｃ末端をアミド化した。
【０１０３】
表１のペプチドは、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，社（米国２３２２５バージニア州リッチモンド市Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｄｒｉｖｅ  ６０１）によって合成されたものであった。各種類のペプチドの純度および組成は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分離および質量分析によって確認した。
【０１０４】
（実施例２）
［ハイブリッドペプチドの生物学的活性］
表１に挙げたペプチド群の生物学的活性を、Ｔハイブリドーマ応答アッセイによって判定した。蛾・チトクロームＣエピトープ：ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号：８）に特異的なＴ細胞ハイブリドーマを、その抗原性ペプチド、または、表１に挙げたような、その抗原性ペプチドとＩｉ−Ｋｅｙにおけるコア配列とのハイブリッド群の各ハイブリッドによって刺激した。これら各ハイブリッドは、それぞれ互いに異なる長さの結合スペーサーを含んでいた。これらのスペーサーは、Ｉｉタンパク質の天然由来の配列のアミノ酸、または５−アミノ−ｎ−吉草酸（ａｖａ：５−アミノペンタン酸）のメチレン基を含んでいた。抗原提示細胞とＴ細胞ハイブリドーマとの培地に対し、抗原性ペプチドにより、これを３μＭからの段階的な希釈系列（１：４）でインキュベートした。この抗原性刺激培地（２４時間刺激）の上澄みをＨＴ−２培地に移し、当該ＨＴ−２培地によるトリチウム標識チミジンの取込量を測定することにより、応答を判定した（以下の表２を参照）。ハイブリッド１（抗原性ペプチド単独）における半最大応答の終点は、約２０ｎＭであった。ハイブリッド５およびハイブリッド２における半最大刺激の終点は、約５０ｐＭであった。メチレン系スペーサーを含んだハイブリッドであるハイブリッド２およびハイブリッド３の活性は、Ｉｉタンパク質の天然由来の配列を含んだスペーサーを有するハイブリッドの活性と同等であった。この実験から、Ｉｉ−Ｋｅｙにおけるコア配列と抗原性ペプチドとのハイブリッドのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果が立証された。
【０１０５】
【表２】
2012516350.tif 000004
【０１０６】
上記の実験の結果は、Ｉｉ−Ｋｅｙにおけるコア配列、例えば、ＬＲＭＫ（配列番号：３）を、可撓性の鎖を介して、選択された抗原性エピトープに共有結合的にハイブリッド化することにより、効果的な治療薬を調製できることを示唆している。この可撓性の鎖は、その長さが３〜６個のペプチド単位に伸張可能なものであってもよいし、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して空間的（立体的）に顕著な変化を伴う水素結合を形成しない単純な繰り返し単位で構成されたものであってもよい。このように短くて単純な可撓性のスペーサーは、最善の水準に次ぐ(sub-optimal)活性を有するハイブリッド６によって示されたように、特定のアミノ酸残基で構成された長いスペーサーに比べて、より大きな活性増強をもたらすことができる。当該ハイブリッド６は、詳細には、Ｉｉタンパク質の天然由来の１０個のアミノ酸からなるスペーサーと、結晶構造解析データから示唆されるように、ＬＲＭＫ（配列番号：３）と、ＣＬＩＰと抗原性ペプチドとの推定重複部位とで構成されているものである。
【０１０７】
（方法）
本研究のアッセイでは、一次培養培地（primary culture）に対し、以下の成分を同時に投入した：（ａ）抗原性エピトープを含むハイブリッドペプチド（表１）；（ｂ）特異的な抗原性ペプチドの結合およびその抗原性ペプチドに特異的なＴ細胞ハイブリドーマに対する当該抗原性ペプチドの提示に必要なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を有する、マイトマイシンＣで処理したＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞（ＡＰＣ）；ならびに（ｃ）前記抗原性ペプチドおよびその提示の拘束性を有するＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に特異的な、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子拘束性Ｔ細胞ハイブリドーマ。この一次培養培地のインキュベーションの終了時に、その上澄みの一定分量を二次培養培地に移し、インターロイキン依存性リンパ芽球様細胞株と共にインキュベートした。一次培養培地の活性化Ｔ細胞ハイブリドーマから放出されたインターロイキンによる、当該二次培養培地の指標細胞の刺激の程度を、当該二次培養培地のＨＴ−２指標細胞のＤＮＡへのトリチウム標識チミジンデオキシリボース｛［３Ｈ］ＴｄＲ｝の取込量を定量化することによって測定した。
【０１０８】
Ｉｉ−Ｋｅｙにおけるコア配列：ＬＲＭＫ（配列番号：３）とＰＧＣＣ９５〜１０４：ハトチトクロームＣ（95-104）：ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号：８）とのハイブリッドは、Ｅｋによって提示される。これらのペプチドを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝成分；ｐＨ７．２で０．１ＭのＮａＣｌ）に溶解した。これらの溶液を、滅菌ろ過した。ＴＰｃ９．１Ｔハイブリドーマは、マウスのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子Ｅｋ上に提示されるハトチトクロームＣ８１〜１０４ペプチドに特異的である。Ｈ−２Ｋ対立遺伝子を発現するＣＨ２７Ｂ細胞リンパ腫株を、抗原提示細胞として使用した。
【０１０９】
抗原性ペプチド特異的なＴ細胞の活性化を、以下の手順で測定した。すなわち、５×１０６細胞数／ｍＬを、マイトマイシンＣ（シグマ社）０．０２５ｍｇ／ｍＬと共に、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｎ−２（ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’［２−エタンスルホン酸］）（ＨＥＰＥＳ）１０ｍＭにおいて、３７℃で２０分間インキュベートした後、４ｖｏｌ倍のＤＭＥＭ−５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭで２回洗浄することにより、マイトマイシンＣで処理したＣＨ２７細胞群（ＡｋＥｋ）ＡＰＣ（抗原提示細胞）を調製した。また、各アッセイ分析前には、Ｔ細胞ハイブリドーマに対し、２２００ｒａｄの照射を行った。
【０１１０】
一次培養培地のアッセイでは、５×１０４個のマイトマイシンＣで処理されたＡＰＣ、５×１０４個のＴハイブリドーマ細胞、および抗原性エピトープを含むペプチド（３μＭからの段階希釈（１：４））を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）５％、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、１×非必須アミノ酸（シグマ社）、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリンＧ１００Ｕ／ｍＬ、硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、および２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）５×１０−５を含む完全ＤＭＥＭ培地において培養した。Ｔハイブリドーマ（Ｔ）およびＡＰＣのみを含有するウェルを、Ｔ細胞活性化のバックグランドをモニタリングするために含め、Ｔ、ＡＰＣおよび抗原性ペプチドを含有するウェルを、ＡＥ１０１シリーズの各ペプチドによる非特異的なＴハイブリドーマ活性化をモニタリングするために含めた。２４時間後に各種培地から上澄み（分量：２０μｌ、４０μｌ、７５μｌ）を取り出して、１×１０４個のインターロイキン依存性ＨＴ−２リンパ芽球様細胞株（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｃｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝完全培地−５％ＦＣＳ：それぞれ、１４０μｌ、１２０μｌ、７５μｌ）の生育に対する影響をアッセイし、［３Ｈ］ＴｄＲをＨＴ−２アッセイの２４時間中、最後の５時間に１μＣｉ／ウェルで組み込むことによって測定し、分析した。全てのアッセイ分析において、報告値は、３列ウェル（triplicate well）の平均値であり、平均標準誤差は±１０％未満であった。一次培養培地においても、二次培養ＨＴ−２指標培地においても、アッセイ間で刺激の程度は変動するので、様々な時間でアッセイ間を比較するために、標準となるペプチド、すなわち、参照ペプチドを常に含めておいた。
【０１１１】
（実施例３）
［インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）のサブビリオンワクチン接種後の、ＨＬＡクラスＩＩＨ５Ｎ１型ヘマグルチニンエピトープの特定］
【０１１２】
（第１ラウンドのＰＢＭＣ分析：アルゴリズムで予測されたＩｉ−Ｋｅｙにおけるペプチド、およびＨ５Ｎ１型ＨＡにおける重複ペプチドによる刺激後のエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でのＣＤ４陽性Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答）
【０１１３】
Ｈ５Ｎ１不活性化サブビリオンワクチン接種後のＣＤ４陽性免疫優性エピトープを特定するために、免疫化された対象からボランディアを募り、これらのボランティアからＰＢＭＣを取り出し、ＣＤ８陽性欠損ＰＢＭＣサンプルを調製して、これを、アルゴリズムで予測されたＨＡのクラスＩＩエピトープをＩｉ−Ｋｅｙに結合したもの、またはＨＡの重複ペプチドのライブラリに対して、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で刺激した。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズムを、各種ＨＡに対して無差別かつ各種ＨＡ間で保存されたエピトープが特定される可能性を最大限に高めるようにして使用した。これにより、少数のクラスＩＩエピトープで、幅広い人口をカバーでき、かつ、株間の交差防御を誘発することのできる有望なワクチンを調製することができる。このようにして得られた試験対象の２４個のペプチドは、ＨＡ１領域およびＨＡ２領域の両方に分布している。これらのアルゴリズムで予測された２４個のエピトープの配列を、以下の表３に示す。アルゴリズムで予測されたペプチドは、試験対象の３５人のワクチン接種者の最大２９％に対してＩＦＮ−γ陽性応答を誘発することができた（図１）。これらの応答の特徴を示すために、当該応答を、さらに、４段階の力価：バックグランドの３〜５倍超、５〜８倍超、８〜１０倍超、および１０倍超に適宜振り分けた。Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドによって誘導された応答は主にバックグランドの３〜１０倍超であった一方、２４個のペプチドのうちの７個はバックグラウンドの１０倍超の応答を誘導した。試験した２４個のペプチドのうち、Ｉｉ−ＫｅｙペプチドのＮｏ．１７７、Ｎｏ．１７０、およびＮｏ．１２１は、最も高頻度に認識され（それぞれ、ワクチン接種者３５人のうちの１０人、９人、９人）、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で強力なＩＦＮ−γ応答を誘発した。なおかつ、これらのペプチドは、ドナーのＨＬＡタイピング結果（データは示さず）に基づいてＨＬＡ拘束性でないことが判明し、これは、少なくともある程度のエピトープ無差別性（epitope promiscuity）を有することを示唆している
【０１１４】
【表３】
2012516350.tif 000005
【０１１５】
ワクチン開発用のクラスＩＩのさらなるＨ５Ｎ１型ＨＡエピトープを特定するために、ワクチン接種者のＰＢＭＣを、ＨＡ配列全体をカバーしたクラスＩＩ重複ペプチドのライブラリに対してスクリーニングするという古典的かつ大胆なアプローチを取った。これは、２０種類の個別のペプチドプールを利用したマトリックス的アプローチ（図２）を用いることにより実施した。各ペプチドプールは、A/Thailand/4(SP-528)/2004のＨＡタンパク質配列全体にわたって分布する最大１０個の重複１６〜１７ｍｅｒ（マー；アミノ酸残基数の単位）を含み、かつ、そのワクチン株と９９％の相同性を有するものとした。このような各ペプチドプールを用いて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激した。このようなアプローチは、一度でたくさんの数のペプチドを実用的にスクリーニングし、後の再試験対象となる個別のペプチドを特定することを可能にする。各ペプチドプールでドナーのＰＢＭＣを２４時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＰＯＴ法を用いてＩＦＮ−γの誘導の程度についてアッセイ分析した。試験対象の各ドナーのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を正規化した後、ペプチドプールの応答率を決定した。ワクチン接種者の応答率は、特定のペプチドプールにもよるが、６〜２６％であった（図３）。全般的に、Ｔ細胞応答の大きさは、バックグランドの３〜５倍超であった。その一方、数種類のプールではバックグランドの５〜８倍超の応答が得られ、さらには、数種類のプールでは、バックグランドの８〜１０倍超および１０倍超の応答が誘導された。また、ＣＤ８陽性欠陥サンプルを、ペプチドに対する高確率かつ強力な応答を誘導すると予測される臨床試験サブビリオンワクチンを用いて試験した。事実、試験対象者の８０％が、このインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で試験したサブビリオンワクチンに対してバックグランドの３．２〜４９４倍超の測定可能なＴ細胞応答を示した。このサブビリオンワクチンは他種のウイルスタンパク質：（ＮＡ、ＮＰ、Ｍ２）を含んだ全ウイルス不活性化Ｈ５Ｎ１ウイルス調製物であり、これら他種のウイルスタンパク質一部は季節性インフルエンザ株と高い相同性を有するので、上述のようなＨ５Ｎ１に対する応答の一部は、Ｔ細胞の交差応答に起因すると考えられる。この点を部分的に考慮に入れるために、ＰＢＭＣを、さらに、「ＨＡ単独」での応答を評価するための手段として、高純度のＨ５Ｎ１型の組換えＨＡで再刺激した。Ｈ５１Ｎ株間では高いＨＡ相同率（９５％超）があるにもかかわらず、A/Vietnam/1203/2004と最近の流行株である季節性インフルエンザ株A/New Caledonia/20/99との間には約６３％程度の相同性しかない。よって、このＨ５Ｎ１型の組換えＨＡに対する応答はワクチンによって誘導された可能性が高い。５５％のボランティアが組換えＨＡに対して検出可能な応答を示し、２９％のドナーは１０倍超の応答を示した（図３）。前述のペプチドプール内に存在する、Ｔ細胞の刺激に活性な特定のペプチドを特定するための第２ラウンドのＴ細胞スクリーニングでは、組換えＨＡに対して応答を示したドナーからのＰＢＭＣのみを使用した。このような組換えＨＡに関する条件を入れたこと、および限られた数のドナーＰＢＭＣ試料の制限により、第２ラウンドの試験では、最初の３５人のドナーのうちの１４人のＰＢＭＣを使用することとなった（下記の説明を参照）。
【０１１６】
（アルゴリズムで予測されたペプチドとＩｉ−Ｋｅｙとのハイブリッドおよび重複ペプチドに対するＩＦＮ−γ測定応答は、主にワクチンによって誘導されたものである。）
【０１１７】
第１ラウンドにおいて組換えＨＡに対して応答を示したドナーＰＢＭＣサンプルは、ＨＡのペプチドプールおよびアルゴリズムで予測されたペプチドに対し、より高確率で応答を示すと予測された。これは、観察される応答は、ワクチンによって誘導されたものであり、交差反応性によるものではないことが示唆される。これを試験するために、組換えＨＡに応答を示したワクチン接種ドナーと、組換えＨＡに対して非応答的であったワクチン接種ドナーと、８人のナイーブな個人（非ワクチン接種者）との間で、ペプチドプールに対する応答率を比較した。ワクチン接種ボランティアの「ワクチン接種前」のＰＢＭＣサンプルが入手できず、各ドナーのベースラインＴ細胞活性を決定できなかったので、本研究で特定されたクラスＩＩエピトープに対するＰＢＭＣ応答がワクチンによって誘導されたものなのか、それとも交差反応性による既存の免疫によってもたらされたものであるのかを確定するのに困難が生じた。組換えＨＡに対して応答を示したワクチン接種者は、ペプチドプールに対して高確率の応答を示すと予測される。第１ラウンドのスクリーニングで試験した組換えＨＡ陽性ワクチン接種者１９人のうちの１４人は、組換えＨＡに対する応答（図４Ａ中の「Ｘ」）と、２０種類のうちの１８種類のペプチドプールに対する応答（図４Ａ中の閉じた円）との両方を示した。興味深いことに、このグループ中の５人のドナーは、組換えＨＡには応答を示した一方で、ペプチドプールについてはどのプールにも応答を示さなかった。この理由としては、アッセイ分析のばらつきや、これらの個人にとっては各ペプチドプールが最適以下であった可能性が考えられる。組換えＨＡに非応答的なワクチン接種ドナーのＰＢＭＣサンプルを調べた結果、１６人のうちの３人（ドナーＮｏ．１００４、Ｎｏ．０２５、Ｎｏ．０３３）だけが、数種類のペプチドプールに測定可能な応答を示した（図４Ｂ）。また、組換えＨＡに対する応答性は、予測されたペプチドをＩｉ−Ｋｅｙで改変した改変ペプチドに対する応答率と相関した（データは示さず）。最後に、上記と同一の解析を、ナイーブなドナーのＰＢＭＣに対しても実施した。応答率は低かったものの、８人のうちの３人のドナーのサンプルにおいて、数種類のペプチドプールおよび組換えＨＡに対するＴ細胞応答が観察された（図４Ｃ）。これは、健康な被験者がＨ５Ｎ１型ＨＡクラスＩＩエピトープに対して検出可能なＣＤ４陽性Ｔ細胞応答を示し、かつ、それは、季節性インフルエンザウイルスに対する交差応答の結果である可能性が高いということを立証した近年の研究結果（Roti, 2008）と一致するものである。まとめると、以上のデータは、組換えＨＡに対して応答を示す個人の応答率と、ペプチドプールおよびＩｉ−Ｋｅｙ改変ペプチドの両方に対して応答を示す個人の応答率との間には正の相関性があることを明確に示しており、さらに、これらの応答が主にワクチンによって誘導されたものであるという我々の予測を裏付けるものである。
【０１１８】
（第２ラウンドのＰＢＭＣ分析：マトリックスから導き出したＨＡペプチドの特定およびその活性の確認）
【０１１９】
重複ペプチドのライブラリから特定のＨ５Ｎ１型ＨＡクラスＩＩペプチドを決定するために、第１ラウンドのＴ細胞スクリーニングで用いたマトリックスから導きだされた各ペプチドを、第２ラウンドのアッセイ分析で再試験することにより、活性を確認した。第１ラウンドでＨ５Ｎ１の組換えＨＡに対する陽性応答が証明されたドナーのＰＢＭＣのみを、第２ラウンドのスクリーニングに使用した。この選択基準条件により、サブビリオンワクチンのＨＡに対してワクチン誘導による特異的なＴ細胞応答を示さなかったと考えられるドナーのサンプルを取り除いた。Ｈ５Ｎ１型ＨＡの９４個の重複ペプチドのうち、１４名の各ドナーに対して、ＨＡ配列全体にわたって広範囲に分布する種々のペプチドが「ヒット」した。第１ラウンドを経たこの方法は、偽陽性（後検出）を特定することができるので、マトリックスによって導き出されて「ヒット」した全種類のペプチドを、各ドナーに対して個別的に試験した。その結果、各ドナーに対する試験対象となる２８種類のペプチドが得られた。このようにマトリックスで導き出されたペプチドを試験することにより、純粋に活性なペプチドを少数に絞ることができた。一部のドナーは、マトリックスで導き出されたペプチドのうちの１種類のみに応答し、その一方で、他のドナー（例えば、ドナーＮｏ．１００８など）は、最大７種類のペプチドに対して応答を示した（表４）。総合的には、９４種類のアレイペプチドのうち、１６種類が検出され、そのうちの８種類（ＢＥＩ  １２、３９、５４、５７、５９、７３、７４、７８）はNew Caledonia型の組換えＨＡ配列に対して半分ないし実質上同一の相同性を有し、残りの８種類（ＢＥＩ  ７、８、２２、２７、２８、２９、３６、３８）は、Ｈ５Ｎ１の組換えＨＡに固有のものであった。つまり、後者のペプチドが、ワクチン特異的であるように思われる。マトリックスで導き出されたペプチドのうちの数種類、例えば、ＢＥＩ  ３６、５９などは、他種類のペプチドよりも高確率（２１％）で認識された；他方、観測された応答の大きさは、広範囲にばらついていた（バックグランドの３．３〜５７倍超）。表４の結果は、第２ラウンドの試験で陽性を示したペプチドのみを示していることに注意されたい。例えば、ドナーＮｏ．２７は、マトリックス導き出されたペプチドのうち２０種類のペプチドがヒットしたが、その後これらのペプチドを個別的に試験した結果、実際には２種類のみ（ＢＥＩ  ３６、７８）が活性であることが確認された。同様に、ドナーＮｏ．３２は、第１ラウンドの分析のマトリックスで導き出されたペプチドのうち６種類がヒットしたが、それらのペプチドを個別に試験してみると、バックグランドを超える応答を示すペプチドは一つもなかった。このことは、ペプチドのライブラリをスクリーニングする際のマトリックス戦略の制限を示している可能性がある。すなわち、１０種類のペプチドで構成される一つのプールに対するＰＢＭＣのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の応答（第１ラウンド）は、（例えば、ペプチド間の競合などの原因により、）それと同じペプチドを個別的に試験した際の応答と異なる可能性があるということである。とはいえ、ライブラリ内の全種類のペプチド（９４種類の���５Ｎ１型ＨＡペプチド）を、１４人の全ドナーに対して個々にスクリーニングするというのは、存在する細胞数を考慮すると、実用的ではなかったであろう。マトリックスで導き出されたペプチド配列のうち、ドナーのＰＢＭＣにおいて免疫応答を引き起こすものを、以下の表５に示した。
【０１２０】
【表４】
2012516350.tif 000006
【０１２１】
【表５】
2012516350.tif 000007
【０１２２】
第２ラウンドのスクリーニングでのＨ５Ｎ１型ＨＡに対するＴ細胞応答は、全体的に第１ラウンドの分析と同等であったが、１４人のドナーのうちの６人のサンプルに関しては、第１ラウンドで陽性応答を示したにもかかわらず、組換えＨＡに対する応答が陽性閾レベルよりも下回った。これら６人のうち、ドナーＮｏ．１００８、Ｎｏ．１００７、Ｎｏ．２７は、第１ラウンドでの組換えＨＡに対する応答が弱かった。第２ラウンドの刺激で検出が認められなかった原因は、最大１１％にまで変動すると報告（Lindemann, M., et al., 2006. Clin Immunol 120:342；およびMwau, M., et al., 2002. AIDS Res Hum Retroviruses 18:611.）されているＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法のアッセイ間ばらつきか、あるいは、Ｔ細胞活性化の最適下限であると思われる。
Ｈ５Ｎ１型のＨＡ由来のＭＨＣクラスＩＩエピトープに対する応答が、Ｈ５Ｎ１に曝されていない個人にも観察されている（Roti, M., et al., 2008. J Immunol 180:1758）ので、本研究の応答の一部も、季節性インフルエンザに対する交差応答Ｔ細胞によるものである可能性がある。この可能性に対処するため、ドナーのＰＢＭＣを、New Caledonia（Ｈ１Ｎ１）型の組換えＨＡに対して試験した。事実、第２ラウンドの刺激時に試験した１４人のドナーのうちの８人に、この抗原に対するＩＦＮ−γの検出可能なレベルとして、バックグランドの３．１〜２４０倍超の応答大きさが見受けられた（表４）。例えば、ドナーＮｏ．２３、Ｎｏ．２０、Ｎｏ．１０４４、Ｎｏ．３４、Ｎｏ．２１、Ｎｏ．３２は、いずれも、Ｈ５Ｎ１型の組換えＨＡおよびＨ１Ｎ１型の組換えＨＡの両方に対して測定可能な応答を示した。そのため、Ｈ５Ｎ１型の組換えＨＡに対する抗原特異的応答の誘導の全体が、サブビリオンワクチンによって誘導されたものであるの否かを結論付けることが難しくなった。これら２種類の株の間の配列相同性が約６３％のみであるといえども、自然感染またはワクチン接種による比較的最近のNew Caledonia（またはその他の季節性亜型）に対する既存の免疫により、Ｈ５Ｎ１型のＨＡに対する交差応答性のＴ細胞免疫が誘発された可能性が存在する。なお、この証拠は、ドナーＮｏ．１０４４、Ｎｏ．３４、Ｎｏ．２１が、A/Thailand/4(SP-528)/2004株のaa 345-361に相当するＢＥＩ  ５９に対して（それぞれ、２８倍、３９倍、５７倍の）強力な応答を示したという事実に見受けられる。当該A/Thailand/4(SP-528)/2004株は、その１７ｍｅｒの最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を除けば、A/New Caledonia/20/99と配列が完全に相同している。同様に、ドナーＮｏ．１０４４、Ｎｏ．２１は、New Caledonia株のＨＡの同一の領域内との間で８８％の配列相同性を有するaa 435-451に相当するＢＥＩ  ７４に対して（それぞれ、２０倍、４９倍の）強力な応答を示した。この領域に対する交差反応性は、インフルエンザＨＡに対するヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞レパトアを調査した過去の研究において立証されており（Roti, M., et al., 2008. J Immunol 180:1758；およびGelder, C. M. et al., 1995 J Virol 69:7497）、さらに、A/New Caledonia/20/99に感染したＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスからも立証されている（Richards, K. A,, et al., 2007. J Virol 81:7608）。最後に、aa 429-445に相当するＢＥＩ  ７３（１５倍）に対して緩やかなＴ細胞応答を示したドナーＮｏ．３０は、Ｈ５Ｎ１型の組換えＨＡに対して検出可能な応答を示さなかった。このことは、当該ドナーの対ペプチド応答が、季節性インフルエンザに対する既存のメモリーＴ細胞応答によるものであったことを示唆している。同様に、アルゴリズムで予測されたエピトープをＩｉ−Ｋｅｙで改変した改変ペプチドの一部も、Ｈ５Ｎ１型のＨＡに非応答的であったドナーのサンプルにおいて活性を示した。Ｈ５Ｎ１に曝されたことのない個人の、Ｈ５Ｎ１型のＨＡ由来のペプチドに対するＴ細胞応答には交差応答が含まれていることを立証した点では他者の研究と合致したが、この第２ラウンドの分析で特定されたペプチドの少なくとも半分が、過去のＨ５Ｎ１サブビリオンによる免疫化の結果であることは明白である。
【０１２３】
［材料および方法］
（ＰＢＭＣサンプル）
【０１２４】
最初の二重盲検試験は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡサブビリオンワクチン（rgA/Vietnam/1203/2004）の２回の筋肉内投与（投与量：９０、４５、１５、または７．５μｇ）を受けた後に安全性試験、忍容性試験、および赤血球凝集抑制試験を受けた４５１人の健康成人に対して実施された（Treanor, J. J., et al., 2006. N Engl J Med 354:1343）。２回目の免疫化から６ヵ月後、３３７人の研究参加者に対し、前述の最初の研究に対する追跡研究として３回目の免疫化処置を行った（Zangwill, K. M., et al., 2008. J Infect Dis 197:580）。その研究完了の２０〜２９ヶ月後に、これらの参加者から３５名の被験者（年齢：２３〜７８歳）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒに呼び戻し、血液を採取して、ＰＢＭＣの単離を行った。その後、これらのＰＢＭＣは、液体窒素ドライシッパー（dry shipper）を用いてＡｎｔｉｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ社に輸送し、分析を行うまで液体窒素内に保管した状態を保った。
【０１２５】
（合成ペプチド、組換えＨＡタンパク質、およびＨ５Ｎ１サブビリオンワクチン）
【０１２６】
免疫優性クラスＩＩＨＡエピトープの特定のために、インフルエンザのペプチドのアレイを利用した。ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ機関（本明細書では「ＢＥＩ」と称する）（米国バージニア州マナッサス市）によって提供されたこのアレイは、A/Thailand/4(SP-528)/2004のＨＡタンパク質全体をカバーした、９４種類の重複ペプチド（１１〜１２個のアミノ酸で互いに重複した、１６〜１７ｍｅｒの重複ペプチドからなる）を含んでいた。当該９４種類の重複ペプチドは、さらに、試験で使用されたVietnam/1203/2004株のＨＡと約９９％の相同率を有するものであった。クラスＩＩエピトープを特定するために、ＰＢＭＣに対する最初のスクリーニング（第１ラウンド）を、マトリックス的アプローチに基づいて、ＩＦＮ−γを調べるＥＬＩＳＰＯＴ法を使用して実行した。簡単に説明すると、９４種類のＨ５Ｎ１型のＨＡペプチドからなるアレイを、各プール（２ｍｇ／ｍｌ）に１０個のペプチドが配されるように、２０種類の互いに異なるペプチドプールに分けた。例外として、プール５〜１０には、それぞれ９個のペプチドが配され、プール２０には、４個のペプチドのみを含ませた。新規の有望なクラスＩＩエピトープを迅速かつ効率よく特定するために、Kaufmann et al.（Kaufmann, D. E., et al., 2004. J Virol 78:4463）に記載されたものと同様のマトリックス的戦略を用いた。詳細には、１つのペプチドが２種類の異なるプールの両方に含まれるように構成することにより、これら２種類の異なるプールの両方で正の応答が生じた場合に、目的とするペプチドを個別的に特定することが可能となる。その後、このようにして特定された各ペプチドを、第２ラウンドのＥＬＩＳＰＯＴ解析で再試験することにより、その反応性を確認した。
【０１２７】
上述のように重複ペプチドのライブラリをスクリーニングするのに加えて、予測されたＨ５Ｎ１型のＨＡクラスＩＩエピトープに対するＴ細胞応答も分析した。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズム（www.syfpeithi.de）を、Ｈ５Ｎ１型A/Duck/Anyang/AVL-1/2001のＨＡアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ、寄託番号：＃ＡＦ４６８８３７）から各種ＨＡに対して無差別なエピトープが特定される可能性を最大限に高めるようにして使用した。エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲβ１対立遺伝子（ＤＲβ１＊０１０１、ＤＲβ１＊０３０１、ＤＲβ１＊０４０１、ＤＲβ１＊０７０１、ＤＲβ１＊１１０１、およびＤＲβ１＊１５０１）に対して予測されたものであり、予測されたエピトープを、前述の対立遺伝子に対してＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムが挙げたスコアの累積をもとにしたランキングで、トップスコアの４０種類のエピトープを格付けした。トップスコアの４０種類のペプチドに対してさらなる基準条件および制限条件（例えば、他のＨ５Ｎ１株に対する相同性、無差別性（promiscuity）、ペプチド合成の容易性など）を適用することにより、試験対象となる２４種類のクラスＩＩ予測エピトープからなる、より小規模なグループを得ることができた。ペプチドは、クラスＩＩ分子との相互作用が増強されるように、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフ（ＬＲＭＫ）を含有する改変ペプチドとして合成されたもの（ＮｅｏＭＰＳ社；米国カリフォルニア州サンディエゴ市）を使用した。当該改変ペプチドは、各種ペプチドのＮ末端に対し、リンカー配列（５−アミノペンタン酸、ａｖａ）を介して共有結合されたものであった。当該ペプチドは、使用するまで、２０％ＤＭＳＯに溶解して−８０℃で凍結させておいた。
【０１２８】
Ｔ細胞応答を、さらに、Ｈ５Ｎ１型の組換えＨＡ（ｒＨＡ）（A/Vietnam/1203/2004）５μｇ／ｍｌ、Ｈ１Ｎ１型の組換えＨＡ（A/New Caledonia/20/99）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社；米国コネチカット州メリデン市））５μｇ／ｍｌ、およびＨ５Ｎ１サブビリオンワクチン（rgA/Vietnam/1203/2004）（ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ機関）２．５μｇ／ｍｌに対して試験・測定した。
【０１２９】
（ＰＢＭＣ調製およびＣＤ８陽性欠損）
【０１３０】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析の準備のために、ドナーのＰＢＭＣサンプルを、３７℃のぬるま湯で急速解凍し、これを、予備加熱した完全培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ、Ｃａｍｂｒｅｘ社製；米国メリーランド州ウォーカーズビル市：および１０％ヒトＡＢ、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社；米国カリフォルニア州サクラメント市）に対してゆっくりと滴下投入した。ワクチン接種前のサンプルが入手できなかったので、無作為選出の８人のナイーブなドナーのＰＢＭＣサンプル（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社；米国カリフォルニア州エメリービル市）を用いて、交差応答性のＴ細胞応答の有無を調べた。細胞（ＰＢＭＣ）は、遠心分離し、デカンテーション法で取り出した後、当該ＰＢＭＣを完全培地に再懸濁させた。細胞数および細胞生存率の測定を、トリパンブルー色素排除試験法によって実行した結果、実質的に９０％超の生存率が得られた。さらに、ＰＢＭＣは、抗体ベースの磁気分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社；米国カリフォルニア州オーバーン市）を用いてＣＤ８陽性Ｔ細胞を欠損させた後、フローサイトメトリー解析によって細胞集団の純度を測定した。除去されずに残っていたＣＤ８陽性細胞は、いずれのサンプルでも１％未満であった。
【０１３１】
（ＥＬＩＳＰＯＴ分析）
【０１３２】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析を、ヒト抗ＩＦＮ−γキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製；米国カリフォルニア州サンノゼ市）を用いて実施した。簡単に説明すると、ＰＶＤＦプレートを、滅菌ＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）に希釈した抗ＩＦＮ−γ抗体５μｇ／ｍｌによってコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートのブロッキングは、完全培地２００μｌ／ウェルによって１回洗浄した後、完全培地（２００μｌ／ウェル）を添加してから室温で２時間インキュベートすることによって実行した。完全培地は、デカンテーション法で取り出した後、ＣＤ８陽性欠損ＰＢＭＣを、試験対象のドナーのサンプルに応じて（１〜４）×１０５／ウェル添加した。第１ラウンドのＴ細胞刺激では、ペプチドプール、およびＩｉ−Ｋｅｙを含有するように改変されたＨ５Ｎ１型のアルゴリズム予測ＨＡペプチドを試験した（最終濃度：２０μｇ／ｍｌ）。さらに、Ｈ５Ｎ１型の組換えＨＡ（５μｇ／ｍｌ）に対する応答、および不活性化Ｈ５Ｎ１サブビリオンウイルス（２．５μｇ／ｍｌ）に対する応答も試験した。陽性対照ウェルには、ＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍｌ：Ｓｉｇｍａ社製；米国ミズーリ州セントルイス市）および破傷風トキソイド（１μｇ／ｍｌ：Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製；米国ワシントン州レドモンド市）が含まれ、陰性対照は、抗原性刺激の不在下で試験される各ドナーのＰＢＭＣからなるものとした。ＥＬＩＳＰＯＴプレートは、その後、３７℃で２４時間インキュベートした。プレートは、プレートウォッシャー（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製；米国バーモント州ウィノースキー市）を用いてＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳに希釈されたビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ（２μｇ／ｍｌ）を添加した。２時間のインキュベーションを行った後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳに（１：１００）希釈したストレプトアビジン／ＨＲＰを添加した。室温で１時間のインキュベーションを行った後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、さらに、ＰＢＳで２回洗浄した。そして、十分なスポット形成が生じるまで（典型的には１〜２分間）ＡＥＣ基質（ＢＤ  Ｂｉｏｔｓｃｉｅｎｃｅｓ社製；米国カリフォルニア州サンディエゴ市）を添加することにより、アッセイ最適化（assay development）を実行した。その後、脱イオン蒸留水でリンスしてから乾燥させた。このようにして得られたイムノスポットを、ＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｋａ社製；独国ストラスバーグ市）を用いてカウントした。データは、３列で試験した各抗原の平均スポット数を用いて算出した。この数値が、３０ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣを上回っており且つ非刺激の対象ウェルの少なくとも３倍超である場合を、陽性の応答とした。実験によっては、ＥＬＩＳＰＯＴデータは、抗原刺激済みサンプルが、非刺激の対照のバックグランド（ベースラインは３．０と考えられる）に対して何倍増（fold increase）であるかによって表され、他の実験では、非刺激のバックグランドＳＦＣから抗原刺激済みのサンプルを減算した正味のＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣが、報告値とされる。
【０１３３】
第２ラウンドのＴ細胞刺激およびＥＬＩＳＰＯＴ分析を、第１ラウンドの刺激においてＨ５Ｎ１型の組換えＨＡに対して応答を示したドナーを用いて実施した。詳細には、１４人のドナーを、第１ラウンドのスクリーニング時のマトリックスでの位置をもとに活性であると予測された、ライブラリ由来の各ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）に対して試験した。季節性インフルエンザのＨＡとＨ５Ｎ１型のＨＡとの交差応答の可能性を調べるために、ＰＢＭＣサンプルを、A/New Caledonia/20/99の組換えＨＡ（２．５μｇ／ｍｌ）に対して試験した。
【図１】
2012516350.tif 000008
【図２】
2012516350.tif 000009
【図３】
2012516350.tif 000010
【図４Ａ】
2012516350.tif 000011
【図４Ｂ】
2012516350.tif 000012
【図４Ｃ】
2012516350.tif 000013
【配列表】
2012516350000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月28日(2011.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
2012516350.tif 000014
【国際調査報告】
2012516350.tif 000015