(57)【要約】  ケラチノサイトの増殖および分化を調節する方法であって、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現を調整することができる薬剤にケラチノサイトを供し、それにより、ケラチノサイトの増殖および分化を調節する方法が提供される。また、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードする核酸配列を対象に投与することによる、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置する方法であって、その必要性のある対象にインスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）ポリペプチドまたは前記ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードする核酸配列の治療効果的な量を投与し、それにより、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置することを含む方法。
【請求項２】
インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）ポリペプチドまたは前記ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードする核酸配列と、医薬的に許容されるキャリアとを、局所的投与のために配合されて含む医薬組成物。
【請求項３】
インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）ポリペプチドまたは前記ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードする核酸配列の使用であって、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置するための医薬品を製造するための使用。
【請求項４】
過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状の処置のために特定される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドはＩＧＦＢＰ７の機能的部分を少なくとも含む、請求項１に記載の方法、請求項２または４に記載の医薬組成物、または請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる前記病状は乾癬である、請求項１に記載の方法、請求項４に記載の医薬組成物、または請求項３に記載の使用。
【請求項７】
前記過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる前記病状は、乾癬、扁平苔癬、毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）、丘疹鱗屑性疾患、皮膚炎および慢性単純性苔癬からなる群から選択される、請求項１に記載の方法、請求項４に記載の医薬組成物、または請求項３に記載の使用。
【請求項８】
前記皮膚炎は、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎からなる群から選択される、請求項７に記載の方法、医薬組成物、または使用。
【請求項９】
前記病状の症状を少なくとも部分的に軽減することができる薬剤を対象に投与することをさらに含み、ただし、この場合、前記薬剤は、局所的投与または全身的投与のために、および／あるいは、対象を光線療法により処置するために好適である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記局所的投与のために好適な前記薬剤は、コルチコステロイド、ビタミンＤのアナログまたは誘導体、アントラリン、局所用レチノイド、カルシニューリン阻害剤、サリチル酸、コールタールおよび保湿剤からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記光線療法は、日光光線療法、ＵＶＢ光線療法、狭帯域ＵＶＢ光線療法、光化学療法、ＰＵＶＡおよびエキシマレーザーからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記全身的投与のために好適な前記薬剤は、レチノイド、免疫抑制薬物、免疫標的化生物学的薬剤、イムノトキシンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻止剤からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
コルチコステロイド、ビタミンＤアナログ、アントラリン、局所用レチノイド、カルシニューリン阻害剤、サリチル酸、コールタール、レチノイド、免疫抑制薬物、免疫標的化生物学的薬剤、イムノトキシンおよびＴＮＦ阻止剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項２または４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置する方法および医薬組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、世界中で総人口のおよそ２％〜５％が冒される慢性的炎症性皮膚疾患である。乾癬の病因は多因子性であり、乾癬は、環境的要因と、遺伝的要因との相互作用から生じると考えられている。乾癬における典型的な組織病理学的特徴には、表皮異常（過錯角化）および免疫学的異常（好中球微小膿瘍ならびに皮膚の単球浸潤および血管増殖）の両方が含まれる。乾癬は、ケラチノサイトの増大した増殖、低下したアポトーシスおよび異常な分化によって特徴づけられ、多くの場合、他の疾患または状態（例えば、関節炎、心臓血管疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および糖尿病など）に付随し得る。
【０００３】
乾癬の現在の処置には、コールタール、ビタミンＤ誘導体、レチノイドおよびカルシニューリン阻害剤の局所的投与；ＵＶＢ、ＮＢ−ＵＶＢおよび／またはレーザーを使用する光線療法；組み合わされた全身的療法および光線療法（例えば、プソラレンの経口投与、それに続く、ＵＶＡへの暴露）；シクロスポリン、メトトレキサートおよびレチノイドなどの全身的投与；ならびに、生物学的薬剤（例えば、Ａｌｅｆａｃｅｐｔ、インフリキシマブ、エタネルセプトおよびウステキヌマブなど）の投与が含まれる。
【０００４】
乾癬の病因は明らかではない。様々な候補遺伝子が、この疾患を発症させる遺伝的素因に関連することが見出された（ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＢａｒｋｅｒ、２００７；Ｌｏｗｅｓ他、２００７；Ｎａｉｒ他、２００９；Ｎａｉｒ他、２００６；Ｙａｎｇ他、２００８；Ｚｅｎｚ他、２００８；ＺｅｎｚおよびＷａｇｎｅｒ、２００６；Ｚｈａｎｇ他、２００９）。このことは、免疫学的機能不全および表皮欠陥の両方がこの疾患の病理発生に関与することを明らかにする。
【０００５】
様々な動物モデルが、乾癬の表現型を模倣するために使用されている。例えば、Ｊｕｎタンパク質の誘導可能な表皮欠失が、乾癬様皮膚疾患および関節炎を引き起こすことが見出された（Ｚｅｎｚ他、２００５）。加えて、ケラチノサイトにおける血清応答因子（ＳＲＦ）の喪失が過増殖性皮膚疾患をマウスにおいて生じさせることが見出された（Ｋｏｅｇｅｌ他、２００９）。さらに、Ｓｈｏｎ他［Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００８（Ａｕｇ）、１７（８）：７０３〜１２］はこの疾患の様々な動物モデルを検討し、これらのモデルが乾癬の二元的病因を反映することを見出した。
【０００６】
光線療法の前後での患者における乾癬皮膚のゲノム規模の分析では、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）をコードするＩＧＦＢＰ７の際立ったアップレギュレーションが明らかにされた（Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  Ｍ．、Ｚｅｌｉｇｓｏｎ  Ｓ．他、２００７）。
【０００７】
ＩＧＦＢＰ７は、ＩＧＦＢＰスーパーファミリー、すなわち、共通するＮ末端のシステインリッチドメインを互いに有する分泌型タンパク質の大きな一群に属する。合計で１６個のファミリーメンバーがこれまでに特定されており、そのうちの６つがＩＧＦと大きい親和性で結合し（ＩＧＦＢＰ１〜６）、他の１０個のメンバーがインスリン増殖因子（ＩＧＦ）と低い親和性で結合する。ＩＧＦＢＰ７（これはＩＧＦＢＰ−ｒＰ１またはＭＡＣ２５とも呼ばれる）はＩＧＦと低い親和性で結合するが、インスリンを大きい親和性で認識し、それにより、その代謝、分布、および、インスリン受容体に結合する能力を調整する。ＩＧＦＢＰ７は、ＩＧＦ／インスリンに依存しない作用を有する。例えば、ＩＧＦＢＰ７は、正常な乳房細胞機能、性腺機能および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出を調節するアクチビン（増殖因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）へのその結合を可能にする「フォリスタチンモジュール」を含有する。ＩＧＦＢＰ７は、細胞増殖、細胞接着、細胞老化および血管形成を種々のガン細胞株において調節することが示されている（Ａｋａｏｇｉ他、１９９６；Ｂｕｒｇｅｒ他、２００５；Ｒｕａｎ他、２００７；Ｓａｔｏ他、２００７；Ｗｉｌｓｏｎ他、２００２）。より近年には、ＩＧＦＢＰ７は、老化およびアポトーシスをメラノサイトにおいて媒介すること、また、メラノーマの成長をインビボで抑制することが示されている（Ｗａｊａｐｅｙｅｅ他、２００８）。
【０００８】
ＩＧＦＢＰ７は遍在的様式で発現し、その分泌型形態がすべてのヒト体液（例えば、精液、尿および羊水など）において見出され得る（Ｄｅｇｅｏｒｇｅｓ他、２０００；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｍｅｊｏ他、２００３）。ＩＧＦＢＰ７はタンパク質分解プロセシングによって不活性化される；加えて、過剰メチル化が新生物組織におけるその発現にもまた影響することが報告されている。ＩＧＦＢＰ７は、ＴＧＦ−β、グルココルチコイドおよびレチノイン酸によって誘導される。ＩＧＦＢＰ７は、ケラチノサイト以外の細胞タイプと比較して、ケラチノサイトにおいて示差的に発現されるいくつかのケラチノサイト特異的遺伝子の１つであることが見出されている（Ｇａｚｅｌ他、２００３）。
【０００９】
米国特許出願公開第２００９００３５３１２号は、ビメンチン、ＣＤ５９、ＨＭＧＢ１およびＩＧＦＢＰ７の抗体標的化を使用するインビトロおよびインビボでの血管形成の抗血管形成的血管標的化アプローチおよび阻害を設計するための特異的標的分子を特定する方法を教示する。
【００１０】
さらなる背景技術には、Ｃａｎｄｉｌｌｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７；Ｌａｎｄｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、２００８；Ｃｈａｍｏｒｒｏ他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏ．、２００９；Ｄｕｎｃａｎ他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１９９４；Ｋｒｕｇｅｒ−Ｋｒａｓａｇａｋｉｓ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２００６；Ｗｒｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９７；Ｋｏｍｉｎｅ他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２００７；Ｒａｈｍｏｕｎ他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２００９；ＫｒｕｅｇｅｒおよびＢｏｗｃｏｃｋ、２００５；ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ、１９９５；Ｂｅｒｎｅｒｄ他、１９９２；Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ他、２００５；Ｖｉｓｓｅｒｓ他、２００８；Ｈａｉｄｅｒ他、２００６；Ｂｏｗｅｎ他、２００４；Ｇｕｎｄｕｚ他、２００６；Ｙａｎｇ他、２００９；Ｌａｐｏｒｔｅ他、２０００；Ｒａｊ他、２００６；Ｙａｍａｎａｋａ他、１９９７；Ｇｅｎｕａ他、２００９；Ｎｅｅｌｙ他、１９９１；Ｓａｄａｇｕｒｓｋｉ他、２００７；Ｗｅｒｔｈｅｉｍｅｒ他、２００１；Ｗｅｒｔｈｅｉｍｅｒ他、２０００；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ他、２００６が含まれる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置する方法であって、その必要性のある対象にインスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）ポリペプチドまたはこのＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードする核酸配列の治療効果的な量を投与し、それにより、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置することを含む方法が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）ポリペプチドまたはこのＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードする核酸配列と、医薬的に許容されるキャリアとを、局所的投与のために配合されて含む医薬組成物が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）ポリペプチドまたはこのＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードする核酸配列の使用であって、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置するための医薬品を製造するための使用が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ケラチノサイトの増殖および分化を調節する方法であって、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現を調整することができる薬剤にケラチノサイトを供し、それにより、ケラチノサイトの増殖および分化を調節することを含む方法が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医薬組成物は、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状の処置のために特定される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドはＩＧＦＢＰ７の機能的部分を少なくとも含む。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状は乾癬である。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状は、乾癬、扁平苔癬、毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）、丘疹鱗屑性疾患、皮膚炎および慢性単純性苔癬からなる群から選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、皮膚炎は、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎からなる群から選択される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記病状の症状を少なくとも部分的に軽減することができる薬剤を上記対象に投与することを含み、ただし、この場合、前記薬剤は、局所的投与または全身的投与のために、および／あるいは、上記対象を光線療法により処置するために好適である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、局所的投与のために好適な薬剤は、コルチコステロイド、ビタミンＤのアナログまたは誘導体、アントラリン、局所用レチノイド、カルシニューリン阻害剤、サリチル酸、コールタールおよび保湿剤からなる群から選択される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記光線療法は、日光光線療法、ＵＶＢ光線療法、狭帯域ＵＶＢ光線療法、光化学療法、ＰＵＶＡおよびエキシマレーザーからなる群から選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、全身的投与のために好適な薬剤は、レチノイド、免疫抑制薬物、免疫標的化生物学的薬剤、イムノトキシンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻止剤からなる群から選択される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医薬組成物はさらに、コルチコステロイド、ビタミンＤアナログ、アントラリン、局所用レチノイド、カルシニューリン阻害剤、サリチル酸、コールタール、レチノイド、免疫抑制薬物、免疫標的化生物学的薬剤、イムノトキシンおよびＴＮＦ阻止剤からなる群から選択される薬剤を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケラチノサイトの増殖および分化を調節することは、ケラチノサイトの増殖をダウンレギュレーションし、ケラチノサイトの分化を促進させることを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現を調整することができる薬剤は、ＩＧＦＢＰ７の所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現を調整することができる薬剤は、ＩＧＦＢＰ７の所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記増殖をダウンレギュレーションし、上記分化を促進させることは、乾癬を処置するためである。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケラチノサイトの増殖および分化を調節することは、その増殖をアップレギュレーションすることを含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現を調整することができる薬剤は、ＩＧＦＢＰ７発現をサイレンシングすることができるオリゴヌクレオチド、中和抗体、優性ネガティブなＩＧＦまたはインスリンからなる群から選択される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、乾癬をその必要性のある対象において処置する方法であって、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現をアップレギュレーションすることができる薬剤の治療効果的な量を前記対象に投与し、それにより、乾癬を処置することを含む方法が提供される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、局所的治療（コルチコステロイド、ビタミンＤアナログ、アントラリン、局所用レチノイド、カルシニューリン阻害剤、サリチル酸、コールタールおよび保湿剤）、光治療（日光、ＵＶＢ光線療法、狭帯域ＵＶＢ光線療法、光化学療法、エキシマレーザー）、および、注射治療または経口治療（レチノイド）、免疫抑制薬物（メトトレキサート、シクロスポリン）、免疫標的化生物学的薬剤、イムノトキシン（デニロイキン）、ならびに、ＴＮＦ阻止生物学的薬剤からなる群から選択される医薬品を上記対象に投与することを含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、皮膚再生を促進させる方法であって、前記皮膚を、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現をダウンレギュレーションすることができる薬剤と接触させ、それにより、皮膚再生を促進させることを含む方法が提供される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記薬剤は局所的投与のために配合される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＩＧＦＢＰ７と、医薬的に許容されるキャリアとを、局所的投与のために配合されて含む医薬組成物が提供される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現をダウンレギュレーションすることができる薬剤と、医薬的に許容されるキャリアとを、局所的投与のために配合されて含む医薬組成物が提供される。
【００３７】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００３９】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、乾癬におけるＩＧＦＢＰ７タンパク質の発現を示す免疫染色分析の代表的画像である。扁平苔癬に冒される患者（ｎ＝１３）または健康なコントロール（ｎ＝１３）から得られる組織切片を、マウス抗ＩＧＦＢＰ７抗体またはマウス抗ＫＲＴ１４抗体（示されず）を使用する免疫染色分析に供し、ヘマトキシリンにより対比染色した。図１Ａ−健康なコントロールから得られ、マウス抗ＩＧＦＢＰ７抗体により染色された代表的な組織切片；図１Ｂ−健康なコントロールから得られ、非免疫血清により染色された組織切片（陰性コントロールのスライド）；図１Ｃ−扁平苔癬に冒される患者から得られ、マウス抗ＩＧＦＢＰ７抗体により染色された代表的な組織切片。図１Ｄ−乾癬患者およびコントロールにおける染色強度を示すヒストグラム。染色強度は、１〜４の評点が２名の独立した観察者によってつけられた。データが平均染色強度評点として示される。棒は群平均を示す（星印、ｐ＜０．０１、平均±ＳＤ）。
【００４０】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、ＨａＣａｔ細胞および初代ヒトケラチノサイトにおけるＩＧＦＢＰ７発現のダウンレギュレーションを示す。図２Ａ−ＨａＣａｔ細胞株および初代ヒトケラチノサイトを、ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション、または、ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターによる感染のどちらかに供した。非特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコントロールとして役立った。ＲＮＡを４８時間の培養の後で抽出した。ｍＲＮＡ発現をβ−アクチン（ＡＣＴＢ）またはグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（示されず）に対して正規化した。結果がコントロールのパーセントとして表される。示されるデータは、二連で行われた３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表す。図２Ｂ−ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈＩＧＦＢＰ７）または非特異的ｓｈＲＮＡ（Ｃｏ）を安定的に発現するＨａＣａｔ細胞から得られる馴化培地からのタンパク質抽出物を免疫ブロッティングによって分析し、抗ＩＧＦＢＰ７によりプローブ探査した。ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡを感染させた細胞でのＩＧＦＢＰ７発現における著しい低下に留意すること。
【００４１】
【図３Ａ−３Ｆ】図３Ａ−３Ｆは、ケラチノサイトの生存性アッセイおよび増殖アッセイを示す。図３Ａ−細胞生存性を、ｓｉＲＮＡを使用してＩＧＦＢＰ７についてダウンレギュレーションされ、２４時間（ｈ）および７２時間（ｈ）培養されたＨａＣａｔ細胞において、同様にまた、ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡまたはコントロールｓｈＲＮＡを安定的に発現するＨａＣａｔ細胞においてＭＴＴアッセイを使用して評価した。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表す。星印、ｐ＜０．０１（コントロール細胞と比較した場合）。図３Ｂ−ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡまたはコントロールｓｈＲＮＡを安定的に発現するＨａＣａｔ細胞を、ＢｒＤｕアッセイを使用して評価した（安定的トランスフェクション）。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表す。星印、ｐ＜０．０１（コントロール細胞と比較した場合）。図３Ｃおよび図３Ｄ−ＫＲＴ６ａのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを、ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡまたはコントロールｓｈＲＮＡを安定的に発現するＨａＣａｔ細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲ（図３Ｃ）および免疫ブロッティング（図３Ｄ）によって評価した。図３Ｅおよび図３Ｆ−初代ケラチノサイトをＩＧＦＢＰ７特異的ｓｉＲＮＡ（ＩＧＦＢＰ７）またはコントロールｓｉＲＮＡ（コントロール）により一過性にトランスフェクションし、ＭＴＴアッセイ（図３Ｅ；トランスフェクション後２４時間および４８時間）およびＢｒＤｕアッセイ（図３Ｆ；トランスフェクション後２４時間）を使用して評価した。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表す（星印、ｐ＜０．０１、コントロール細胞と比較した場合）。ＩＧＦＢＰ７がダウンレギュレーションされるとき、ケラチノサイトは、コントロール細胞と比較して、より生存性かつ増殖性であり、また、より大きいレベルのＫｒｔ６（表皮増殖のマーカー）を発現することに留意すること。これらの結果は、ケラチノサイトに対するＩＧＦＢＰ７の抗増殖効果を明らかにする。
【００４２】
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ−４Ｃは、ＨａＣａｔ細胞または初代ケラチノサイト細胞におけるアポトーシスアッセイを示す。図４Ａ〜図４Ｂ−ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡ（ＩＧＦＢＰ７）またはコントロールｓｈＲＮＡ（Ｃｏ）（スクランブル化コントロール）を安定的に発現するＨａＣａｔ細胞を、トランスフェクション後２４時間で、１０ｎｇ／μｌの組換え腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）（＋）またはビヒクル（−）にさらした。アポトーシスを、ＴＵＮＥＬアッセイ（図４Ａ）またはアネキシンＶアッセイ（図４Ｂ）を使用して測定した。図４Ｃ−初代ケラチノサイトをＩＧＦＢＰ７特異的ｓｉＲＮＡ（ＩＧＦＢＰ７）またはスクランブル化コントロールｓｉＲＮＡ（Ｃｏ）により一過性にトランスフェクションし、１０ｎｇ／μｌのＴＮＦ−α（＋）またはビヒクル（−）にさらした。アポトーシス活性を、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して評価した。すべての実験を３回繰り返した。結果が、平均値±ＳＤとして提供される。結果は、＊ｐ＜０．０１については有意であると見なした。アポトーシスレベルが、ＩＧＦＢＰ７がダウンレギュレーションされるケラチノサイト細胞において有意に低いこと、および、アポトーシスが、ＩＧＦＢＰ７がダウンレギュレーションされる細胞においてＴＮＦ−αによって誘導されないことに留意すること。これらの結果は、ＩＧＦＢＰ７がＴＮＦ−α媒介によるアポトーシスのために要求されること、および、ＩＧＦＢＰ７の低下した発現がヒトケラチノサイトにおける低下したアポトーシスを伴うことを明らかにする。
【００４３】
【図５Ａ−５Ｃ】図５Ａ−５Ｃは、ＨａＣａｔ細胞または初代ケラチノサイト細胞における分化関連事象を示す。図５Ａおよび図５Ｂ−ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡまたはコントロールｓｈＲＮＡを安定的に発現するＨａＣａｔ細胞（図５Ａ）または初代ヒトケラチノサイト（図５Ｂ）を、細胞外カルシウム濃度を上げることによって分化するように誘導した。ＫＲＴ１０およびインボルクリン（ＩＮＶ）の遺伝子発現を初期および後期の分化関連事象の尺度としてそれぞれ評価した。データは、二連で行われた３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表す。これらの結果は、ＩＧＦＢＰ７がカルシウム誘導のケラチノサイトの分化のために要求されることを明らかにする。図５Ｃ−大域的プロセスＧＯ用語分析を、カルシウム誘導後のＩＧＦＢＰ７サイレンシングに対する最大の応答を初代ケラチノサイトおよびＨａＣａｔ細胞で得られたデータセットにおいて示した上位１００個の遺伝子を使用して行った。有意な用語（０．０１未満のｐ値）は、細胞増殖および細胞分化と直接の関連性を有するプロセス、すなわち、酸素ラジカルに対する応答；ＡＴＰの加水分解と共役したプロトン輸送；精子運動能；水素イオン恒常性；解けたタンパク質に対する応答；ｍＲＮＡプロセシング；ＲＮＡスプラシング；タンパク質修飾；アポトーシスの調節；ナトリウムイオン輸送；視知覚；細胞増殖の負の調節；カリウムイオン輸送を包含する。緑色棒は、それらの予想頻度（茶色棒）と比較して、特定されたＧＯ用語の観測頻度に対応する。
【００４４】
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ−６Ｃは、ＩＧＦＢＰ７を外因的に発現する初代ケラチノサイトの細胞生存性アッセイおよび細胞増殖アッセイを示す。初代ケラチノサイトを１．８μｇ／μｌのヒト組換えＩＧＦＢＰ７ポリペプチド（ｒＩＧＦＢＰ７；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号１３３４−Ｂ７−０２５）により７２時間処理し、その後、ｒＩＧＦＢＰ７を含まない培地で１２時間培養した。図６Ａ〜図６Ｂ−細胞生存性および細胞増殖を、ＭＴＴアッセイ（図６Ａ）およびＢｒＤＵアッセイ（図６Ｂ）を使用して評価した。図６Ｃ−アポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイによって定量化した。すべての実験を３回繰り返した。結果が、平均値±ＳＤとして提供される。結果は、＊ｐ＜０．０１については有意であると見なした。ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドがケラチノサイト細胞におけるＴＮＦ−α媒介のアポトーシスを誘導し（図６Ｃ）、ケラチノサイト細胞の生存性の低下（図６Ａ）および増殖の低下（図６Ｂ）をもたらすことに留意すること。
【００４５】
【図７Ａ−７Ｄ】図７Ａ−７Ｄは、ＩＧＦＢＰ７がダウンレギュレーションされるＨａＣａｔ細胞の免疫アッセイを示す。インスリン受容体を介するシグナル伝達に対するＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションの影響を評価するために、タンパク質を、ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡまたはコントロールｓｈＲＮＡを安定的に発現するＨａＣａｔ細胞から抽出した。タンパク質抽出物を、リン酸化ＩＲＳ−１（ｐＩＲＳ、図７Ａ、上段パネル）およびＩＲＳ−１（図７Ａ、中断パネル）またはリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ、図７Ｂ、上段パネル）およびＥＲＫ２（図７Ｂ、中央パネル）に対する抗体による免疫ブロッティングを使用して分析した。β−アクチンに対する抗体による免疫染色がコントロールとして役立った（図７Ａ、下段パネル、および、図７Ｂ、下段パネル）。図７Ｃ〜図７Ｄ−バンド強度をデンシトメトリーによって評価した。実験を３回繰り返した。結果が、平均＋ＳＤを示すグラフで示される。図７Ｃ−リン酸化ＩＲＳ−１（ｐＩＲＳ）およびＩＲＳ−１の発現レベルの比率。図７Ｄ−リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）およびＥＲＫ２の発現レベルの比率。結果は、ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションが、ＩＲＳ−１およびチロシンキナーゼＥＲＫ１／２の増大したリン酸化によって明らかにされるように、インスリン受容体を介するシグナル伝達を増大させることを示す。対照的に、ＩＧＦＢＰ７はＳＭＡＤ２／３のリン酸化状態には影響を与えなかった（データは示されず）。このことは、ＩＧＦＢＰ７がＩＧＦ／インスリンのシグナル伝達の調整を介してＫＣ（ケラチノサイト細胞）に影響を及ぼすことを示唆する。
【００４６】
【図８】図８は、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６およびＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡ発現レベルを、ＩＧＦＢＰ７がｓｉＲＮＡによってダウンレギュレーションされるＨａＣａｔ細胞において示すヒストグラムである。ＲＮＡを、ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡ（ＩＧＦＢＰ７  ｓｈＲＮＡ）または非特異的ｓｈＲＮＡ（Ｃｏ）を安定的に発現するＨａＣａｔ細胞から抽出した。ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６およびＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して評価し、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨに対して正規化した。結果がコントロールのパーセントとして表される。示されるデータは平均値±ＳＤを表す。ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションが、ＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ６のｍＲＮＡレベルではなく、ＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡレベルを著しく低下させたことに留意すること。
【００４７】
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ−９Ｄは、ＩＧＦＢＰ７がカルシウム誘導分化の後でｓｉＲＮＡによってダウンレギュレーションされるＨａＣａｔ細胞における形態学的変化を示す位相差顕微鏡法画像である。ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡ（図９Ａおよび図９Ｂ）またはコントロールｓｈＲＮＡ（図９Ｃおよび図９Ｄ）により安定的にトランスフェクションされたＨａＣａｔ細胞を高密度（８０％）で置床し、細胞外カルシウムの低濃度（図９Ａおよび図９Ｃ）または高濃度（図９Ｂおよび図９Ｄ）の存在下で４日間培養し、位相差顕微鏡法によって調べた。コントロール細胞は典型的な丸いくり石様の外観を取った一方で、著しい変化が、ＩＧＦＢＰ７についてダウンレギュレーションされた細胞では何ら見られなかった。
【００４８】
【図１０】図１０は、ＩＧＦＢＰ７がｓｈＲＮＡによってダウンレギュレーションされる初代ケラチノサイトにおけるＫＲＴ６ａの遺伝子発現を示すヒストグラムである。ＫＲＴ６ａのｍＲＮＡレベルを、一般的材料および実験方法において記載されるように、特異的ｓｈＲＮＡを使用してＩＧＦＢＰ７について一過性にダウンレギュレーションされる初代ケラチノサイトにおいてｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＫＲＴ６ａのｍＲＮＡレベルが、ＩＧＦＢＰ７がダウンレギュレーションされるケラチノサイトにおいてアップレギュレーションされることに留意すること。
【００４９】
【図１１】図１１は、ＨａＣａｔ細胞におけるロリクリンのカルシウム誘導発現を示すヒストグラムである。ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡまたはコントロールｓｈＲＮＡを安定的に発現するＨａＣａｔ細胞を、細胞外カルシウム濃度を上げることによって分化するように誘導した。ロリクリン（ＬＯＲ）の遺伝子発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して４日後に評価した。データは、二連で行われた３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表す。カルシウムが、コントロールｓｈＲＮＡを発現する細胞においてロリクリンのアップレギュレーションを誘導した一方で、ロリクリン発現のレベルが、ＩＧＦＢＰ７−ｓｈＲＮＡを発現する細胞において著しくより低かったことに留意すること。
【００５０】
【図１２】図１２は、ＩＧＦＢＰ７発現に対する血清の影響を示すグラフである。ＨａＣａｔ細胞をウシ胎児血清の増大する濃度の存在下で培養した。ＲＮＡを４８時間後に抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用してＩＧＦＢＰ７発現について評価し、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨに対して正規化した。示されるデータは平均値±ＳＤを表す。血清はＩＧＦＢＰ７発現レベルを低下させることに留意すること。
【００５１】
【図１３】図１３は、本発明のいくつかの実施形態によるモデルを示す：細胞増殖を誘導することが知られている増殖因子の増大する濃度が、低下したＩＧＦＢＰ７発現に関連したので、また、低下したＩＧＦＢＰ７発現が、増大した増殖活性に関連するので、乾癬は、ＩＧＦＢＰ７の役割を考慮する限りは、２つの要素（ＩＧＦＢＰ７およびケラチノサイト増殖）のそれぞれが他方の影響を強化する悪循環から生じていると考えることができる。
【００５２】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ−１４Ｂは、ケラチノサイトにおけるＴＵＮＥＬアッセイを示す蛍光顕微鏡法画像である。特異的ｓｈＲＮＡ（図１４Ｂ）またはコントロールｓｈＲＮＡ（図１４Ａ）を使用してＩＧＦＢＰ７について一過性にダウンレギュレーションされた初代ケラチノサイトをＴＵＮＥＬアッセイに供した。ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡによるのではなく、コントロールｓｈＲＮＡにより処理されたケラチノサイト細胞が赤く染色されること（これはアポトーシス細胞に対応する）に留意すること。このことは、アポトーシスが、ＩＧＦＢＰ７のｓｈＲＮＡにより処理される細胞において阻害されることを示している。
【００５３】
【図１５Ａ−１５Ｄ】図１５Ａ−１５Ｄは、野生型細胞およびＩＧＦＢＰ７サイレンシング細胞における高カルシウムに対する応答での遺伝子発現における変化を示す散布図分析である。図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＩＧＦＢＰ７サイレンシング細胞（赤色ドット）に対して野生型細胞（青色ドット）において高カルシウム暴露後の発現における２倍を超える増大（図１５Ａ）または低下（図１５Ｂ）を示すすべての遺伝子の発現レベルにおける変化を比較する散布図である。特定の遺伝子が、野生型細胞では、高カルシウムに対する応答における著しいアップレギュレーション（図１５Ａ）またはダウンレギュレーション（図１５Ｂ）を受けた一方で、ＩＧＦＢＰ７サイレンシング細胞では、これらの遺伝子は高カルシウムに対する応答において著しく変化しなかったことに留意すること。発現における変化の著しい減弱を、高カルシウム濃度にさらした後での示差的発現を野生型細胞において示した遺伝子の９５％超でＩＧＦＢＰ７サイレンシング後に認めることができる（図１５Ａ〜図１５Ｂ）。図１５Ｃ〜図１５Ｄは、ＩＧＦＢＰ７サイレンシング細胞（赤色ドット）における同数のランダム選択された遺伝子に対する野生型細胞（青色ドット）での高カルシウム暴露後の発現における２倍を超える増大（図１５Ｃ）または低下（図１５Ｄ）を示す遺伝子の発現レベルにおける変化を比較する散布図である。図１５Ａ〜図１５Ｂに見られる影響は、同じ比較が１組のランダム選択された遺伝子に対して行われるときには見られないので（図１５Ｃ〜図１５Ｄ）、カルシウムによって誘導または抑制される遺伝子に対して特異的である。
【００５４】
【図１６】図１６は、β−ガラクトシダーゼ（細胞老化についてのマーカー）の発現を示すヒストグラムである。ＩＧＦＢＰ７はケラチノサイトの細胞老化に影響しないことに留意すること。
【００５５】
【図１７】図１７は、ＩＧＦＢＰ７サイレンシング細胞およびコントロール細胞における初代ケラチノサイト増殖に対するＥＲＫ阻害の影響を示すヒストグラムである。ＩＧＦＢＰ７のｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされた初代ケラチノサイトを１２０μＭのＰＤ９８０５９（ＥＲＫ阻害剤）により７２時間処理し、その間、培地を２４時間毎に新しくした。ＥＲＫの阻害は、ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションによって誘導される細胞増殖を弱めることに留意すること（ｐ＜０．０１）。
【００５６】
【図１８】図１８は、三次元皮膚モデルの確立を記載する概略図である。簡単に記載すると、初代ケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞を皮膚生検物から採取し、真皮線維芽細胞をＩ型コラーゲン含有マトリックスに埋め込み、ケラチノサイトを空気表面で成長させた。層化が２週間〜３週間の期間にわたって生じた。
【００５７】
【図１９】図１９は、細胞を図１８に記載される三次元モデルの空気表面で成長させるために使用される特別な６ウエルプレートの写真である。
【００５８】
【図２０Ａ−２０Ｃ】図２０Ａ−２０Ｃは、７日間（図２０Ａ）、１０日間（図２０Ｂ）および１２日間（図２０Ｃ）成長させた（図１８に記載されるように確立された）器官型皮膚同等物のＨ＆Ｅ染色を示す顕微鏡法画像である。すべての表皮層の形成、正常な角化が１０日目に生じること、および、落屑が１２日目に始まることに留意すること。
【００５９】
【図２１】図２１は、インビトロでの３次元表皮の形成の期間中におけるＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡ発現を示すヒストグラムである。「ｄ」＝日；皮膚形成期間中のＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡ発現における増大に留意すること。
【００６０】
【図２２Ａ−２２Ｂ】図２２Ａ−２２Ｂは、コントロールｓｉＲＮＡ（図２２Ａ）またはＩＧＦＢＰ７特異的ｓｉＲＮＡ（図２２Ｂ）によりトランスフェクションされた三次元モデルのＨ＆Ｅ染色を示す顕微鏡法画像である。これは、乾癬表現型がｓｉＲＮＡ媒介のＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションを使用して再現されることを明らかにする。
【００６１】
【図２３】図２３は、乾癬についてのインビボモデルを構築する概略的例示である。簡単に記載すると、乾癬が、乾癬患者から得られるＮＫ／Ｔ細胞を、Ｂｇマウスに移植された正常なヒト皮膚に注入することによって誘導される。
【００６２】
【図２４】図２４は、ＰＢＳが注入されたマウスに由来する組織切片のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の顕微鏡法画像である。甚だしい皮膚浸潤、乳頭間隆起の伸張および典型的な好中球性膿瘍が表皮に存在することに留意すること（４０倍の倍率）。
【００６３】
【図２５】図２５は、デキサメタゾンが注入されたマウスに由来する組織切片のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の顕微鏡法画像である。図２４と比較して、表現型の正常化に留意すること（４０倍の倍率）。
【００６４】
【図２６】図２６は、ＩＧＦＢＰ７が注入されたマウスに由来する組織切片のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の顕微鏡画像である。図２４と比較して、表現型の正常化に留意すること（４０倍の倍率）。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ケラチノサイトの増殖および／または分化を調節する方法、ならびに、限定的ではないが、より具体的には、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置する方法に関連する。
【００６６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００６７】
本発明者らは、ＩＧＦＢＰ７がケラチノサイトの増殖および分化を調節することを発見している。
【００６８】
下記の実施例の節において示されるように、ＩＧＦＢＰ７の発現レベルが、正常な非患部組織と比較して乾癬の組織サンプルでは低下する（図１Ａ〜Ｄ；実施例１）。本発明者らは、血清がＩＧＦＢＰ７発現レベルのダウンレギュレーションを刺激すること（図１２；実施例１）、そして、ＩＧＦＢＰ７特異的な遺伝子サイレンシング（ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用した遺伝子サイレンシング；図２Ａ〜Ｂ、図８；実施例２）がケラチノサイトの増殖および生存性を誘導し（図３Ａ〜Ｆ；実施例２）、ケラチノサイトのアポトーシスを低下させ（図４Ａ〜Ｃ、図１４Ａ〜Ｂ；実施例２）、しかし、ケラチノサイトの老化には影響を与えないこと（図１６；実施例２）を発見している。そのうえ、本発明者らは、ＩＧＦＢＰ７がカルシウム誘導によるケラチノサイトの分化のために要求されること（図５Ａ〜Ｃ、図９Ａ〜Ｄ、図１１、表３および表４；実施例３）、ＩＧＦＢＰ７サイレンシングがケラチノサイトにおいてＩＲＳ１およびＥＲＫのリン酸化を誘導すること（図７Ａ〜Ｄ、実施例５）、そして、ＥＲＫの阻害が、ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションによって誘導される細胞増殖を弱めること（図１７；実施例５）を見出した。加えて、下記の実施例の節の実施例４において示されるように、本発明者らは、組換えＩＧＦＢＰ７がヒトケラチノサイトにおいて増殖を阻害し、アポトーシスを誘導すること（図６）を発見している。そのうえ、エクスビボモデルを使用して、本発明者らは、ＩＧＦＢＰ７の低下が乾癬の表現型を生じさせること（実施例６；図２２Ａ〜Ｂ）、そして、組換えＩＧＦＢＰ７がヒト−マウスのキメラモデルにおいて乾癬を治癒させること（図２３〜図２６；実施例７）を示した。これらの結果は、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドの投与、または、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与がケラチノサイト細胞のアポトーシスを誘導し得ること、したがって、ケラチノサイトの過増殖を伴う病状を処置するために使用され得ることを明らかにする。
【００６９】
本発明の１つの局面によれば、ケラチノサイトの増殖および分化を調節する方法であって、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現を調整することができる薬剤にケラチノサイトを供し、それにより、ケラチノサイトの増殖および分化を調節することを含む方法が提供される。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケラチノサイトの増殖および分化を調節することは、ケラチノサイトの増殖をダウンレギュレーションし、ケラチノサイトの分化を促進させることを含む。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケラチノサイトの増殖をダウンレギュレーションし、ケラチノサイトの分化を促進させることが、ＩＧＦＢＰ７の活性または発現をアップレギュレーションすることによって達成される。
【００７２】
本明細書中で使用される用語「ＩＧＦＢＰ７」は、遺伝子記号ＩＧＦＢＰ７（インスリン様増殖因子結合タンパク質７）に指定される合成された、組換えられた、および／または、天然に存在するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＧＦＢＰ７の発現をアップレギュレーションすることができる薬剤は、ＩＧＦＢＰ７の機能的部分を少なくとも発現するために設計および構築される外因性ポリヌクレオチド配列である。それによれば、そのような外因性ポリヌクレオチド配列は、ケラチノサイトのアポトーシスを誘導することができる、ＩＧＦＢＰ７分子をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。
【００７４】
ＩＧＦＢＰ７ポリヌクレオチド配列の限定されない例には、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１５５３．１（配列番号１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿０００００４．１１のヌクレオチド５７８９７２４４〜５７９７６５３９（相補体）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＴ＿０２２８５３．１５のヌクレオチド５２３７１２６〜５３１６４２１（相補体）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＣ＿００００４７．１（Ｃｅｌｅｒａ）のヌクレオチド５５４０２２６７〜５５４８１２８６（相補体）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＷ＿９２２１６２．１（Ｃｅｌｅｒａ）のヌクレオチド５２２７２４１〜５３０６２６０（相補体）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＣ＿０００１３６．１（ＨｕＲｅｆ）のヌクレオチド５３８５０８１７〜５３９３００７８（相補体）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＷ＿００１８３８９１３．１（ＨｕＲｅｆ）のヌクレオチド５２４８３３５〜５３２７５９６（相補体）が含まれる。
【００７５】
ＩＧＦＢＰ７が、ヒト、ラットおよびマウスの供給源からクローン化されている。表１は、本発明のいくつかの実施形態に従って使用することができるＩＧＦＢＰ７の核酸配列およびポリペプチド配列を提供する。
【表１】
2012522762.tif 000002
【００７６】
したがって、ＩＧＦＢＰ７についてのコード配列情報が、ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ（ドット）ｎｃｂｉ（ドット）ｎｌｍ（ドット）ｎｉｈ（ドット）ｇｏｖ／から入手可能なＧｅｎＢａｎｋデータベースを含めて、いくつかのデータベースから入手可能である。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＧＦＢＰ７の発現をアップレギュレーションすることができる薬剤は、ＩＧＦＢＰ７の機能的部分を少なくとも含むポリペプチドである。
【００７８】
天然に存在するＩＧＦＢＰ７ポリペプチド配列の限定されない例には、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１５４４．１（配列番号１２）、同ＣＣＤＳ３５１２．１（配列番号１３）、同Ｑ１６２７０（配列番号１４）、同ＥＡＸ０５５２１．１（配列番号１５）、同ＥＡＸ０５５２０．１（配列番号１６）、同ＡＡＸ２９７２３．１（配列番号１７）、同ＡＡＸ４２９６２．１（配列番号１８）、同ＡＡＸ３６９２７．１（配列番号１９）および同ＡＡＸ３６５２８．１（配列番号２０）が含まれる。
【００７９】
表現「機能的部分」は、本明細書中で使用される場合、分泌型ポリペプチドの機能的性質（例えば、ケラチノサイトにおけるアポトーシスの誘導および／またはケラチノサイト増殖の阻害など）を示すＩＧＦＢＰ７タンパク質（すなわち、ポリペプチド）の一部を示す。様々なアッセイ、例えば、本明細書中下記の実施例２〜７において記載されるようなアッセイを、ＩＧＦＢＰ７タンパク質の所与部分が、本明細書中に記載されるような機能的部分であるかどうかを明らかにするために用いることができる。
【００８０】
ＩＧＦＢＰ７の機能的部分を含むポリペプチドの適格性を求める方法には、インビトロアッセイ（例えば、初代ケラチノサイトまたはケラチノサイト細胞株を使用して行われるアポトーシスアッセイ、細胞生存性アッセイ、増殖アッセイ）、エクスビボアッセイ（例えば、実施例の節において記載されるように、過増殖性ケラチノサイトの生検物から得られる初代ケラチノサイト培養物で行われるか、または、三次元皮膚モデルで行われるアポトーシスアッセイ、細胞生存性アッセイ、増殖アッセイ）、および、インビボアッセイ（例えば、実施例の節において記載されるように、組織学的検出方法および免疫学的検出方法を使用する組織形態学に対するＩＧＦＢＰ７の影響をモニターすることによって、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状についての動物モデルを使用するもの）が含まれる。
【００８１】
述べられたように、ＩＧＦＢＰ７は合成ポリペプチドであることが可能である。
【００８２】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、およびペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）、ならびにペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドを包含し、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有しうる。そのような修飾には、限定されないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれる。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書の下記に示される。
【００８３】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００８４】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在することができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在することができる。
【００８５】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換されることができる。
【００８６】
上述のことに加えて、本発明のペプチドはまた、１個以上の修飾されたアミノ酸または１個以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００８７】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；生体内で多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００８８】
本発明のペプチドは、線状形態で利用されることが好ましい。しかし、環化がペプチドの特性をひどく妨害しない場合、ペプチドの環状形態もまた利用できることが理解される。
【００８９】
本発明のペプチドは好ましくは、ペプチドが可溶性形態であることを要求する治療剤または診断剤において利用されるので、本発明のペプチドは好ましくは、ペプチドの溶解性をそれらのヒドロキシル含有側鎖のために増大させことができるセリンおよびトレオニン（これらに限定されない）を含めて、１つまたは複数の非天然型または天然型の極性アミノ酸を含む。
【００９０】
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者に既知の任意の技術によって合成されることができる。固相ペプチド合成については、多くの技術の要約が、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），１９６３に、また、Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９７３に見出されうる。古典的な溶液合成については、Ｇ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｐｋｅ「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９６５を参照のこと。
【００９１】
一般に、これらの方法は、１つ以上のアミノ酸または好適に保護されたアミノ酸を成長中のペプチド鎖に逐次付加することを含む。通常、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、好適な保護基によって保護される。保護または誘導体化されたアミノ酸は、その後、好適に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列内の次のアミノ酸を、アミド連結を形成するために好適な条件のもとで加えることによって、不活性な固体担体に結合されることできるか、または、溶液中で利用されることができる。その後、保護基が、この新しく付加されたアミノ酸残基から除かれ、その後、次のアミノ酸（好適に保護されたアミノ酸）が加えられ、以降、同様に繰り返される。所望されるアミノ酸のすべてが適切な配列で連結された後、いずれかの残留する保護基（および何らかの固体担体）が、最終的なペプチド化合物を得るために、逐次的または同時に除かれる。この一般的な手順の簡便な変性によって、２つ以上のアミノ酸を一度に、例えば、保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドに（キラル中心をラセミ化させない条件のもとで）カップリングして、脱保護後にペンタペプチドを形成することなどによって、成長中の鎖に付加することが可能である。ペプチド合成のさらなる記載が米国特許第６４７２５０５号に開示される。
【００９２】
本発明のペプチド化合物を調製する好ましい方法は、固相ペプチド合成を含む。
【００９３】
大規模なペプチド合成がＡｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０００；５５（３）：２２７〜５０によって記載される。
【００９４】
ＩＧＦＢＰ７はまた、組換え技術を使用して調製することができる。
【００９５】
例えば、組換えヒトＩＧＦＢＰ７が様々な商業的供給源から入手可能であり、例えば、ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ（Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＸＯＮ、英国）、カタログ番号ＰＨＰ１７８；Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）（Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ、米国）、カタログ番号ＣＲ１５１１Ｂ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）；Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、米国）、カタログ番号ａｂ５０１９５などから入手可能である。
【００９６】
外因性ＩＧＦＢＰ７を哺乳動物細胞において発現させるために、ＩＧＦＢＰ７をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、上記で提供されるようなポリヌクレオチド配列）が好ましくは、哺乳動物細胞における発現のために好適な核酸構築物に連結される。そのような核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を、構成的様式、組織特異的様式または誘導的様式で導くためのプロモーター配列を含む。
【００９７】
本発明の核酸構築物ではまた、所望される活性（すなわち、ケラチノサイトアポトーシス活性の誘導）を示すＩＧＦＢＰ７ホモログをコードするポリヌクレオチドが利用され得ることが理解される。そのようなホモログは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して求められるとき、ただし、ギャップ加重が５０に等しく、長さ加重が３に等しく、平均マッチが１０に等しく、平均ミスマッチが−９に等しい場合、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドに対する同一性が、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％であり得る。
【００９８】
本発明と共に使用するのに好適な構成的プロモーターが、細胞のほとんどの環境条件およびほとんどのタイプのもとで活性であるプロモーター配列であり、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などである。本発明と共に使用するのに好適な誘導可能プロモーターには、例えば、テトラサイクリン誘導可能プロモーター（Ｚａｂａｌａ  Ｍ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００４、６４（８）：２７９９〜８０４）が含まれる。
【００９９】
ケラチノサイト細胞内への本発明のポリヌクレオチドの発現を導くために使用することができる組織特異的プロモーターの限定されない例には、ケラチノサイト特異的プロモーター、例えば、Ｋ１４プロモーター［例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ１１０７６（配列番号２１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＤＱ３４３２８２（配列番号２２）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ０９１３８０（配列番号２３）のヌクレオチド１〜２３３４、あるいは、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ１１０７６（配列番号２１）のヌクレオチド１〜２２５８またはヌクレオチド１〜２２８１］、ＩＩ型毛髪特異的ケラチンプロモーター［例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＹ０３７５５２（配列番号２４）］、ケラチン４（ＫＲＴ４）プロモーター［例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０６６０５１（配列番号２５）のヌクレオチド１〜１０４０またはヌクレオチド１〜１１０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ９７５６６（配列番号２６）のヌクレオチド１〜９２５、ヌクレオチド１〜９４８、ヌクレオチド１〜１０１０］、ケラチンＫ１７プロモーター［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｓ８１０２６（配列番号２７）］、ケラチンＫ５プロモーター［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｓ５６２０３（配列番号２８）］、ＩＩ型毛髪ケラチン６プロモーター［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｙ１９２１１（配列番号２９）のヌクレオチド１〜６４２、ヌクレオチド１〜６４７またはヌクレオチド１〜７００］、ＩＩ型毛髪ケラチン１プロモーター［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｙ１９２０６（配列番号３０）のヌクレオチド１〜５００、ヌクレオチド１〜５０５またはヌクレオチド１〜５５０］、６５ｋＤのＩＩ型ケラチンのプロモーター［ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ０５４１８（配列番号３１）のヌクレオチド１〜４３７またはヌクレオチド１〜５４０］が含まれる。
【０１００】
本発明の核酸構築物（これはまた、本明細書中では「発現ベクター」として示される）は、このベクターを、原核生物、真核生物、または、好ましくは両者における複製および組込みのために好適にするさらなる配列を含む（例えば、シャトルベクター）。加えて、典型的なクローニング用ベクターはまた、転写開始配列および翻訳開始配列、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、ならびに、ポリアデニル化シグナルを含有することができる。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部分を含む。
【０１０１】
本発明の核酸構築物は典型的には、核酸構築物が置かれる宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列、または、本発明のポリペプチド変化体のシグナル配列である。
【０１０２】
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列、すなわち、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。ＴＡＴＡボックスは転写開始部位の上流側２５塩基対〜３０塩基対に位置しており、ＲＮＡポリメラーゼに、ＲＮＡ合成を開始させることに関与すると考えられる。もう一方の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
【０１０３】
エンハンサーエレメントは、連結されている同種プロモーターまたは異種プロモーターからの、１０００倍に至るまでの転写を刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれるとき、活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは幅広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子プロモーターは多くの細胞タイプについて好適である。本発明のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルスに由来する組合せ、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する組合せ、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはＲｏｕｓ肉腫ウイルス、および、ＨＩＶなど）から得られる長末端反復に由来する組合せが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３を参照のこと（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１０４】
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、異種の転写開始部位からの距離が、そのプロモーターがその天然の環境において転写開始部位から置かれるのとほぼ同じである。しかしながら、この技術分野では知られているように、この距離におけるいくらかの変動が、プロモーター機能を失うことなく受け入れられ得る。
【０１０５】
ポリアデニル化配列もまた、ＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡ翻訳の効率を増大させるために発現ベクターに加えることができる。２つの明確な配列エレメントが、正確かつ効率的なポリアデニル化のために要求される。すなわち、ポリアデニル化部位の下流側に位置するＧＵリッチ配列またはＵリッチ配列と、１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド上流側に位置する６ヌクレオチド（ＡＡＵＡＡＡ）の高度に保存された配列とが要求される。本発明のために好適である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するシグナルが含まれる。
【０１０６】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または、組換えＤＮＡを保有する細胞の特定を容易にするために意図される他の特殊化されたエレメントを含有することができる。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドにおいて運ばれる遺伝子によって、または、宿主細胞のゲノムにより提供される限り、エピソームとして複製する。
【０１０７】
ベクターは真核生物レプリコンを含んでもよく、または、含まなくてもよい。真核生物レプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム増幅を行うことができない。代わりに、組換えＤＮＡが、操作された細胞のゲノムに一体化し、その細胞において、プロモーターが、所望される核酸の発現を行わせる。
【０１０８】
本発明の発現ベクターはさらに、例えば、ただ１つのｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）など、および、プロモーター−キメラポリペプチドのゲノム組込みのための配列を含むことができる。
【０１０９】
哺乳動物発現ベクターについての例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ならびに、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、そして、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節エレメントを含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタインバールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的ベクターには、真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されるＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にするｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＮｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよび任意の他のベクターが含まれる。
【０１１１】
上記で記載されたように、ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を回避するために進化してきた非常に特殊化された感染性媒介因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的とし、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。したがって、本発明によって使用されるベクターのタイプは、形質転換される細胞タイプに依存する。好適なベクターを形質転換される細胞タイプに従って選択することができることは、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのようなものとして、選択を検討する一般的記載は本明細書中では提供されない。例えば、ケラチノサイト細胞を、Ｆｒｉｅｎｄ由来レトロウイルスベクター（ＦＯＣＨ２９−ＮｅｏＲ）を使用して標的化することができる［Ａｒａｎｇｏ  Ｍ．他、２００５、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１１（２）：２；これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる］。
【０１１２】
組換えウイルスベクターは、様々な利点、例えば、横方向の感染および標的化特異性などを提供するので、ＩＧＦＢＰ７のインビボ発現のために有用である。横方向の感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有的であり、１個の感染細胞が、出芽して回りの細胞に感染する多くの子孫ビリオンを産生するプロセスである。その結果は、広い面積が、そのほとんどは最初のウイルス粒子によって最初に感染しなかったが、急速に感染することである。これは、感染性媒介因子が娘子孫を介してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。横方向に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。所望される目的が、指定の遺伝子を局在化された数の標的化された細胞だけに導入することであるならば、この特徴は有用であり得る。
【０１１３】
様々な方法を、本発明の発現ベクターを幹細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９８８）；およびＧｉｌｂｏａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４（６）：５０４〜５１２（１９８６）に大まかに記載され、これらには、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、正負選択法については、米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１１４】
ウイルス感染による核酸の導入は、より大きいトランスフェクション効率をウイルスの感染性のために得ることができるので、他の方法（例えば、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなど）を上回るいくつかの利点を提供する。
【０１１５】
現在好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物によるトランスフェクション、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）および脂質に基づくシステムなどによるトランスフェクションが含まれる。遺伝子の脂質媒介移入のための有用な脂質が、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子治療において使用される最も好まれる構築物がウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物など）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント、あるいは、遺伝子発現を他の手段（例えば、メッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾など）によって制御する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在する場合を除いて、使用されるウイルスに適切であるパッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部分、ならびに、プラス鎖およびマイナス鎖のプライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は典型的には、構築物が置かれる宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列、または、本発明のポリペプチド変化体のシグナル配列である。必要な場合には、構築物はまた、ポリアデニル化を導くシグナルを、１つまたは複数の制限部位、および、翻訳終結配列と同様に含むことができる。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部分を含む。非ウイルス性である他のベクターを使用することができ、例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなどを使用することができる。
【０１１６】
挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現ペプチドの安定性、産生、精製または収量を高めるために操作される配列を含むことができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態のＩＧＦＢＰ７タンパク質と、異種タンパク質とを含む融合タンパク質または切断可能な融合タンパク質の発現を操作することができる。そのような融合タンパク質は、融合タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、異種タンパク質について特異的なカラムでの固定化によって容易に単離できるように設計することができる。切断部位が、ＩＧＦＢＰ７タンパク質と、異種タンパク質との間で操作される場合、ＩＧＦＢＰ７タンパク質を、切断部位を分断する適切な酵素または薬剤による処理によってクロマトグラフィーカラムから遊離させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ他（１９８８）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９：６５〜７０；およびＧａｒｄｅｌｌａ他（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５８５４〜１５８５９を参照のこと］。
【０１１７】
本明細書中上記で述べられるように、様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、本発明のＩＧＦＢＰ７ポリペプチドを発現させるための宿主−発現システムとして使用することができる。これらには、微生物、例えば、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌；コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））が感染させられるか、または、コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換される植物細胞システムが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現システムもまた、本発明のポリペプチドを発現させるために使用することができる。
【０１１８】
細菌用構築物の例には、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターのｐＥＴシリーズが含まれる［Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９］。
【０１１９】
酵母では、米国特許第５９３２４４７号に開示されるように、構成的または誘導可能なプロモーターを含有する数多くのベクターを使用することができる。代替において、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組込みを促進するベクターを使用することができる。
【０１２０】
植物発現ベクターが使用される場合、コード配列の発現を数多くのプロモーターによって行わせることができる。例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４］、あるいは、ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３０７〜３１１］などを使用することができる。代替において、植物プロモーター、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：１６７１〜１６８０、および、Ｂｒｏｇｌｉ他（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３］、または、熱ショックプロモーター（例えば、ダイズのｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５］）などを使用することができる。これらの構築物は、当業者には広く知られているＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的なＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび他の技術を使用して植物細胞に導入することができる。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁を参照のこと。
【０１２１】
他の発現システム、例えば、この技術分野では広く知られており、また、本明細書中下記においてさらに記載される昆虫および哺乳動物宿主細胞システムもまた、本発明によって使用することができる。
【０１２２】
組換えポリペプチドの回収が培養での適切な時間の後で達成される。表現「組換えポリペプチドを回収する」は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を伴う必要はない。上記にもかかわらず、本発明のポリペプチドは、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して、例えば、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化などを使用して精製することができる。
【０１２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖をダウンレギュレーションし、分化を促進させることは、ケラチノサイトの過増殖（過増殖性ケラチノサイト）によって特徴づけられる病状（例えば、乾癬などにおいて生じる表皮の過形成）を処置するためである。
【０１２４】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置する方法であって、その必要性のある対象にＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはこのＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードする核酸の治療効果的な量を投与し、それにより、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状を処置することを含む方法が提供される。
【０１２５】
用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、病状（疾患、障害、または状態）の進行を阻害すること、防止すること、または抑えること、および／または、病状を低減、軽減、または退縮させることを示す。当業者は、病状の進行を評価するために使用されることができる種々の方法論およびアッセイを理解し、同様に、病状の低減、軽減、または退縮を評価するために使用されることができる種々の方法論およびアッセイを理解するだろう。
【０１２６】
本明細書中で使用される用語「対象」は哺乳動物を包含し、好ましくは、上記病状に罹患する任意の年齢のヒトを包含する。
【０１２７】
本明細書中で使用される表現「過増殖性ケラチノサイト」は、組織（例えば、皮膚）におけるケラチノサイトの密度を増大させる程度に増殖し、および／または、冒されていない（例えば、健康な）組織（例えば、健康な対象の組織）のケラチノサイトと比較して、組織におけるより大きい増殖速度を有するケラチノサイトを示す。
【０１２８】
本明細書中で使用される用語「ケラチノサイト」は、ケラチンを産生し、かつ、表皮の主要構成成分を形成する細胞（表皮細胞集団の約９５％を構成する）を示す。
【０１２９】
ケラチノサイト含有組織の限定されない例には、皮膚、頭皮、上部消化管および気道の粘膜内張り、ならびに、下部尿生殖路および胃腸管の粘膜内張りが含まれる。
【０１３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、表現「過増殖性ケラチノサイト」は、腫瘍形成を除く「表皮の過形成」、すなわち、表皮細胞における異常な増大（過度なケラチノサイト増殖）を示す。
【０１３１】
表皮の過形成は、表皮の伸張をもたらす一方で、表皮の落屑を伴って、乾癬の主要な症状発現である。表皮の過形成は生理学的条件下（例えば、創傷治癒の期間中）でもまた生じ、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＲＡ）またはその前駆体（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノール）による局所的処置の、多くの個体における結果である。
【０１３２】
本明細書中で使用される表現「過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状」は、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられるか、または、過増殖性ケラチノサイトから生じる何らかの疾患、障害または状態を示す。
【０１３３】
過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状の限定されない例には、乾癬、扁平苔癬、毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）、丘疹鱗屑性疾患、皮膚炎および慢性単純性苔癬が含まれる。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状は乾癬である。
【０１３５】
本明細書中で使用される用語「乾癬」は、成人および小児の乾癬を示す。
【０１３６】
本明細書中で使用される用語「扁平苔癬」は、皮膚および口腔粘膜を冒し、丘疹、病巣および発疹の形で現れる慢性的皮膚粘膜疾患を示す。本発明のいくつかの実施形態によれば、用語「扁平苔癬」は、環状扁平苔癬、線状扁平苔癬、肥厚性扁平苔癬、萎縮性扁平苔癬、小胞水疱性扁平苔癬、潰瘍性扁平苔癬、毛孔性扁平苔癬、光線性扁平苔癬、色素性扁平苔癬、併発部位、手掌および足裏の扁平苔癬（手掌足底扁平苔癬）、粘膜扁平苔癬、爪の扁平苔癬、頭皮の扁平苔癬、インバース扁平苔癬、薬物誘発扁平苔癬、紅斑性狼瘡・扁平苔癬重複症候群、類天疱瘡性扁平苔癬、慢性苔癬様角化症、移植片対宿主病の苔癬様反応、苔癬様角化症ならびに／または苔癬様皮膚炎を包含する。
【０１３７】
本明細書中で使用される用語「毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）」は、赤みを帯びたオレンジ色の鱗屑性プラークおよび角化性毛包性丘疹によって特徴づけられる一群の慢性的障害を示す。
【０１３８】
本明細書中で使用される用語「丘疹鱗屑性の」疾患または障害は、丘疹および鱗屑の両方、または、鱗状丘疹およびプラークの両方を呈する状態を示す。
【０１３９】
本明細書中で使用される用語「皮膚炎」は、特定の作用因またはアレルゲンに対するアレルギー性反応または刺激性反応を共通して通常的には有する種々のタイプの皮膚の炎症（例えば、発疹）を包含する。この用語は、湿疹性皮膚炎としてもまた知られている湿疹を示すために使用されることがある。本発明のいくつかの実施形態によれば、皮膚炎の用語はアトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎を示す。
【０１４０】
本明細書中で使用される用語「慢性単純性苔癬」は、厚い皮革様の褐色皮膚を通常の場合には引き起こす慢性的な痒みおよび引掻きによって特徴づけられる皮膚障害を示す。
【０１４１】
本明細書中で使用される用語「投与する」は、活性な薬剤を対象に投与する任意の手段を示し、全身的投与（例えば、静脈内、経口）および／または局部的投与（例えば、皮膚への局部的投与、例えば、局所的投与）を包含する。
【０１４２】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果（例えば、ケラチノサイトのアポトーシスを誘導すること、および／または、ケラチノサイトの増殖を阻害すること）を引き起こし得るＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはその機能的部分、および／あるいは、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードするか、または、その機能的部分をコードするポリヌクレオチドを示す。
【０１４３】
活性な薬剤は、それ自体で、または、生理学的に許容され得るキャリアもまた含む医薬組成物の一部として個体に投与することができる。医薬組成物の目的は、生物への有効成分の投与を容易にすることである。
【０１４４】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。
【０１４５】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容されるキャリア」および表現「医薬的に許容されるキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０１４６】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１４７】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１４８】
好適な投与経路には、例えば、局所的投与［例えば、（活性な薬剤を含み、かつ、皮膚の外側表面に適用される）ゲル、液体スプレーおよびパッチを使用する局所的投与］、皮下投与、皮内投与（例えば、皮内注射による皮内投与）、病巣内投与（例えば、パッチ、ゲル、ニードルを使用する病巣内投与）、全身的投与（例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達（とりわけ、経鼻送達）、腸管送達または腸管外送達（筋肉内注射および髄内注射、同様にまた、クモ膜下注射、直接の脳室内注射、心臓内注射（例えば、右心室腔内もしくは左心室腔内、総冠状動脈内）、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）などによる投与）が含まれ得る。
【０１４９】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０１５０】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容されるキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１５１】
特定の実施形態によれば、投与は局所的に達成される。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、活性な薬剤を対象の皮膚内に投与することが、非浸襲的に、例えば、対象の皮膚に塗布される、活性な薬剤を含むローション、軟膏、クリーム、ゲル、液体スプレーまたはパッチを使用して行われる。
【０１５３】
本発明の組成物において利用されるキャリアは多種多様な形態であり得る。これらには、エマルションキャリア（水中油型、油中水型、水中油中水型およびシリコーン中水中油型エマルションが含まれるが、これらに限定されない）、クリーム、軟膏、水溶液、ローションまたはエアロゾルが含まれるが、これらに限定されない。当業者によって理解されるように、所与の成分は、組成物における成分の水溶性／分散性に依存して、水相または油／シリコーン相のどちらかに主として分布する。
【０１５４】
本発明によるエマルションは一般に、医薬的に有効な量の本明細書に開示される薬剤と、脂質または油とを含有する。脂質および油は、動物、植物または石油に由来することができ、天然または合成（すなわち、人工）であり得る。好ましいエマルションは、グリセリンのような湿潤剤も含む。エマルションは、好ましくは、キャリアの重量に基づいて約１％〜約１０％、より好ましくは約２％〜約５％の乳化剤をさらに含む。乳化剤は、非イオン性、アニオン性またはカチオン性のものであることができる。好適な乳化剤の例が、例えば、米国特許第３７５５５６０号（Ｄｉｃｋｅｒｔ他に対して発行、１９７３年８月２８日）、米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎ他に対して発行、１９８３年１２月２０日）、および、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、３１７頁〜３２４頁（１９８６年））に記載される。
【０１５５】
エマルションはまた、角質性組織に適用したとき、泡立ちを最小限に抑えるための消泡剤を含有することができる。消泡剤には、そのような使用について当該技術分野で知られている高分子量シリコーンおよび他の物質が含まれる。
【０１５６】
好適なエマルションは、所望される生成物形態に依存して、多種多様な粘度を有することができる。好ましい例示的な低粘度エマルションは、約５０センチストークス以下の粘度、より好ましくは約１０センチストークス以下の粘度、最も好ましくは約５センチストークス以下の粘度を有する。エマルションはまた、ケラチン性組織に適用したときの泡立ちを最小限に抑えるための消泡剤を含有することができる。消泡剤には、そのような使用についてこの技術分野において広く知られている高分子量シリコーンおよび他の物質が含まれる。
【０１５７】
１つのタイプのエマルションがシリコーン中水型エマルションである。シリコーン中水型エマルションは、連続するシリコーン相と、分散された水性相とを含有する。本発明の好ましいシリコーン中水型エマルションは重量比で約１％〜約６０％（好ましくは約５％〜約４０％、より好ましくは約１０％〜約２０％）の連続するシリコーン相を含む。連続するシリコーン相は、本明細書中下記で記載される不連続な水性相を含有する、すなわち、取り囲む外側相として存在する。
【０１５８】
連続するシリコーン相はポリ有機シロキサンオイルを含有することができる。好ましいシリコーン中水型エマルションシステムが、医薬効果的な量の本明細書中に開示される薬剤を送達するための酸化安定性ビヒクルを提供するために配合される。これらの好ましいエマルションの連続するシリコーン相は、約５０重量％〜約９９．９重量％の間の有機ポリシロキサンオイルと、約５０重量％未満の非シリコーン系オイルとを含む。特に好ましい実施形態において、連続するシリコーン相は、連続するシリコーン相の重量比で少なくとも約５０％（好ましくは約６０％〜約９９．９％、より好ましくは約７０％〜約９９．９％、一層より好ましくは約８０％〜約９９．９％）のポリ有機シロキサンオイルと、連続するシリコーン相の重量比で約５０％までの非シリコーン系オイル（好ましくは約４０％未満、より好ましくは約３０％未満、一層より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約２％未満）とを含む。これらの有用なエマルションシステムは、より低い濃度の当該ポリ有機シロキサンオイルを含有する比較可能な油中水型エマルションよりも大きい酸化安定性を長期間にわたって提供することができる。連続するシリコーン相における非シリコーン系オイルの濃度は、組成物における本発明の活性な化合物の酸化安定性をもしかするとさらに高めるように最小限に抑えられるか、または、完全に避けられる。このタイプのシリコーン中水型エマルションが米国特許第５６９１３８０号（Ｍａｓｏｎ他、１９９７年１１月２５日発行）に記載される。
【０１５９】
組成物において使用される有機ポリシロキサンオイルは、揮発性シリコーン、不揮発性シリコーン、または、揮発性シリコーンおよび不揮発性シリコーンの混合物であり得る。用語「不揮発性」は、これに関連して使用される場合、周囲条件のもとで液体であり、かつ、約１００℃以上の（１気圧下での）引火点を有するそのようなシリコーンを示す。用語「揮発性」は、これに関連して使用される場合、すべての他のシリコーンオイルを示す。好適な有機ポリシロキサンを、広い範囲の揮発性および粘度に及ぶ広範囲の様々なシリコーンから選択することができる。好適な有機ポリシロキサンオイルの例には、ポリアルキルシロキサン、環状ポリアルキルシロキサンおよびポリアルキルアリールシロキサンが含まれ、これらは当業者には知られており、また、市販されている。
【０１６０】
連続するシリコーン相は１つまたは複数の非シリコーン系オイルを含有することができる。連続するシリコーン相における非シリコーン系オイルの濃度は好ましくは、組成物における医薬効果的薬剤の酸化安定性をさらに高めるように最小限に抑えられるか、または、完全に避けられる。好適な非シリコーン系オイルは約１気圧の圧力のもとで約２５℃以下の融点を有する。連続するシリコーン相における使用のために好適な非シリコーン系オイルの例が、油中水型エマルションの形態での局所用パーソナルケア製品で化学技術分野において広く知られているものであり、例えば、鉱油、植物油、合成油、半合成油などである。
【０１６１】
本発明の有用な局所用組成物は約３０％〜約９０％（より好ましくは約５０％〜約８５％、最も好ましくは約７０％〜約８０％）の分散された水性相を含む。用語「分散された水性相」は当業者には広く知られており、この相が、連続相に懸濁される、すなわち、連続相によって取り囲まれる小さい粒子または液滴として存在することを暗示する。分散相はまた、内部相または不連続相として知られている。分散された水性相は、本明細書中前記で記載される連続するシリコーン相に懸濁される、すなわち、連続するシリコーン相によって取り囲まれる小さい水性の粒子または液滴の分散物である。水性相は、水、あるいは、水と、１つまたは複数の水溶性成分または水分散性成分との組合せが可能である。そのような随意的成分の限定されない例には、増粘剤、酸、塩基、塩、キレート剤、ゴム、水溶性または水分散性のアルコールおよびポリオール、緩衝剤、保存剤、日焼け止め剤、ならびに、着色剤などが含まれる。
【０１６２】
本発明の局所用組成物は典型的には、組成物の重量比で約２５％〜約９０％（好ましくは約４０％〜約８０％、より好ましくは約６０％〜約８０％）の水を分散された水性相に含む。
【０１６３】
本発明のシリコーン中水型エマルションは好ましくは乳化剤を含む。好ましい実施形態において、組成物は、組成物の重量比で約０．１％〜約１０％の乳化剤、より好ましくは約０．５％〜約７．５％の乳化剤、最も好ましくは約１％〜約５％の乳化剤を含有する。乳化剤は、連続するシリコーン相の内部に水性相を分散および懸濁することを助ける。
【０１６４】
広範囲の様々な乳化用薬剤を、好ましいシリコーン中水型エマルションを形成するためにこの場合には用いることができる。知られているか、または、従来からの乳化用薬剤を、選択された乳化用薬剤が組成物の必須成分と化学的および物理的に適合可能であり、かつ、所望される分散特性を提供するならば、組成物において使用することができる。好適な乳化剤には、シリコーン系乳化剤、例えば、局所用パーソナルケア製品における使用について当業者によって知られている有機修飾された有機ポリシロキサン（これはまた、シリコーン系界面活性剤として当業者には知られている）、ケイ素非含有乳化剤、および、それらの混合物が含まれる。
【０１６５】
有用な乳化剤には、広範囲の様々なシリコーン系乳化剤が含まれる。これらのシリコーン系乳化剤は典型的には、有機修飾された有機ポリシロキサンである（これはまた、シリコーン系界面活性剤として当業者には知られている）。好適な乳化剤が、例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北米版（１９８６）、Ａｌｌｕｒｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって発行）、米国特許第５０１１６８１号（Ｃｉｏｔｔｉ他、１９９１年４月３０日発行）、米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎ他、１９８３年１２月２０日発行）および米国特許第３７５５５６０号（Ｄｉｃｋｅｒｔ他、１９７３年８月２８日発行）に記載される。
【０１６６】
他の好ましい局所用キャリアには、連続する水性相と、それに分散される疎水性の水不溶性相（「油相」）とを有する水中油型エマルションが含まれる。水中油型エマルションを構成する好適なキャリアの例が、米国特許第５０７３３７１号（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．他、１９９１年１２月１７日発行）および米国特許第５０７３３７２号（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．他、１９９１年１２月１７日発行）に記載される。構造化剤、親水性界面活性剤および水を含有する特に好ましい水中油型エマルションが本明細書中下記で詳しく記載される。
【０１６７】
好ましい水中油型エマルションは、液晶性のゲルネットワーク構造の形成を助けるための構造化剤を含む。理論によって限定されることはないが、構造化剤は、組成物の安定性に寄与するレオロジー特性を組成物に与えることを助けると考えられる。構造化剤はまた、乳化剤または界面活性剤として機能することができる。本発明の好ましい組成物は組成物の重量比で約０．５％〜約２０％（より好ましくは約１％〜約１０％、最も好ましくは約１％〜約５％）の構造化剤を含む。本発明の好ましい構造化剤が、ステアリン酸、パルミチン酸、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ベヘニルアルコール、ステアリン酸、パルミチン酸、平均して約１個〜約２１個のエチレンオキシドユニットを有するステアリルアルコールのポリエチレングリコールエーテル、平均して約１個〜約５個のエチレンオキシドユニットを有するセチルアルコールのポリエチレングリコールエーテル、および、それらの混合物からなる群から選択される。
【０１６８】
多種多様なアニオン性界面活性剤もまた本明細書において有用である。例えば、米国特許第３９２９６７８号（Ｌａｕｇｈｌｉｎ他、１９７５年１２月３０日発行）を参照のこと。加えて、両性界面活性剤および双性イオン性界面活性剤もまた本明細書において有用である。
【０１６９】
好ましい水中油型エマルションは、疎水性物を水相に分散させることができる約０．０５％〜約１０％（好ましくは約１％〜約６％、より好ましくは約１％〜約３％）の少なくとも１つの親水性界面活性剤を含む（局所用キャリアの重量比での百分率）。界面活性剤は、最低でも、水に分散するために十分に親水性でなければならない。好適な界面活性剤には、多種多様の知られているカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤および両性界面活性剤のどれもが含まれる。ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北米版（１９８６）、Ａｌｌｕｒｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって発行）、米国特許第５０１１６８１号（Ｃｉｏｔｔｉ他、１９９１年４月３０日発行）；米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎ他、１９８３年１２月２０日発行）および米国特許第３７５５５６０号を参照のこと。選ばれる的確な界面活性剤は、組成物のｐＨ、および、存在する他の成分に依存する。好ましいものがカチオン性界面活性剤であり、とりわけ、ジアルキル第四級アンモニウム化合物であり、その例が、米国特許第５１５１２０９号（ＭｃＣａｌｌ他、１９９２年９月２９日発行）、米国特許第５１５１２１０号（Ｓｔｅｕｒｉ他、１９９２年９月２９日発行）、米国特許第５１２０５３２号、米国特許第４３８７０９０号、米国特許第３１５５５９１号、米国特許第３９２９６７８号、米国特許第３９５９４６１号、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ＆Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北米版、１９７９）（Ｍ．Ｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、および、Ｓｃｈｗａｒｔｚ他、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ，Ｔｈｅｉｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９４９）に開示される。
【０１７０】
代替では、他の有用なカチオン性乳化剤には、アミノ−アミドが含まれる。これらのカチオン性乳化剤の限定されない例には、ステアルアミドプロピルＰＧジモニウムクロリドホスファート、ベヘンアミドプロピルＰＧジモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルエチルジモニウムエトスルファート、ステアルアミドプロピルジメチル（ミリスチルアセタート）アンモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルジメチルセテアリルアンモニウムトシラート、ステアルアミドプロピルジメチルアンモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルジメチルアンモニウムラクタートおよびそれらの混合物が含まれる。
【０１７１】
好ましい水中油型エマルションは局所用キャリアの重量比で約２５％〜約９８％（好ましくは約６５％〜約９５％、より好ましくは約７０％〜約９０％）の水を含む。
【０１７２】
本発明の医薬組成物または化粧用組成物は、下記で記載されるように、溶液、ローション、スプレー、クリーム、軟膏、膏薬、ゲルなどを含めて、皮膚適用のために製薬業界または化粧品業界によって利用される様々な形態のいずれかで配合することができる。
【０１７３】
好ましくは、本発明の医薬組成物または化粧用組成物は、処置された皮膚区域に留まるために十分に粘性に配合され、かつ、容易に蒸発せず、および／または、水ですすぐことによって容易に除去されず、むしろ、石けん、清浄剤および／またはシャンプーの助けをかりて除去可能である。
【０１７４】
そのような性質を有する組成物を調製するための方法が当業者には広く知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０、上掲）、および、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（第６版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５）に詳しく記載される。
【０１７５】
本発明の局所用組成物（ローションおよびクリームが含まれるが、これらに限定されない）は、皮膚科学的に許容される皮膚軟化剤を含むことができる。かかる組成物は、約２％〜約５０％の皮膚軟化剤を含むことが好ましい。本明細書で使用される「皮膚軟化剤」は、皮膚の保護のためだけではなく、乾燥状態の防止または軽減のために有用な物質を示す。多種多様な好適な皮膚軟化剤が知られており、本明細書において使用することができる。例えば、Ｓａｇａｒｉｎ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（第２版、第１巻、３２４３頁（１９７２））を参照のこと。これは、皮膚軟化剤として好適な物質の数多くの例を含有する。好ましい皮膚軟化剤はグリセリンである。グリセリンは好ましくは、０．００１％または約０．００１％〜２０％または約２０％（より好ましくは０．０１％または約０．０１％〜１０％または約１０％、最も好ましくは０．１％または約０．１％〜５％または約５％、例えば、３％）の量で使用される。
【０１７６】
本発明によるローションおよびクリームは一般に、溶液キャリアシステムと、１つまたは複数の皮膚軟化剤とを含む。ローションは典型的には、約１％〜約２０％（好ましくは約５％〜約１０％）の皮膚軟化剤、約５０％〜約９０％（好ましくは約６０％〜約８０％）の水、および、医薬効果的な量の本明細書中に記載される薬剤を含む。クリームは典型的には、約５％〜約５０％（好ましくは約１０％〜約２０％）の皮膚軟化剤、約４５％〜約８５％（好ましくは約５０％〜約７５％）の水、および、医薬効果的な量の本明細書中に記載される薬剤を含む。
【０１７７】
本発明の局所適用される医薬または化粧組成物はまた、例えば、化粧組成物の価値を芳香および皮膚栄養因子により高めるために添加されるさらなる成分を含むことができる。
【０１７８】
そのような成分は、妥当な医学的判断の範囲内で、毒性、不適合性、不安定性およびアレルギー性応答などの誘導を伴わないヒトの角質性組織での使用のために好適に選択される。加えて、必要に応じて使用されるそのような成分は、本発明の活性な化合物の利益を許容できないほどに変化させないならば、有用である。
【０１７９】
ＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）（１９９２）は、本発明の組成物における使用のために好適である、スキンケア産業で一般に使用される多種多様な限定されない化粧品成分を記載する。これらの成分クラスの例には、研磨剤、吸収剤、審美的成分（例えば、香料、顔料、着色剤／染料、精油、皮膚感覚剤、収斂剤、その他（例えば、チョウジ油、メントール、ショウノウ、ユーカリ油、オイゲノール、乳酸メンチル、ウイッチヘーゼル油））、抗ざ瘡剤、凝固防止剤、消泡剤、抗菌剤（例えば、ヨードプロピルブチルカルバメート）、抗酸化剤、結合剤、生物学的添加物、緩衝化剤、増量剤、キレート化剤、化学的添加物、染料、化粧品用収斂剤、化粧品用殺生物剤、変性剤、薬物収斂剤、外用鎮痛剤、組成物の薄膜形成特性および持続性を助けるための薄膜形成剤または材料（例えば、ポリマー）（例えば、エイコセンおよびビニルピロリドンのコポリマー）、不透明化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、還元剤、金属イオン封鎖剤、スキンコンディショニング剤（例えば、湿潤剤、これには、種々のものおよび閉塞性が含まれる）、皮膚緩和剤および／または皮膚治癒剤（例えば、パンテノールおよび誘導体（例えば、エチルパンテノール）、アロエベラ、パントテン酸およびその誘導体、アラントイン、ビサボロール、ならびに、グリチルリチン酸二カリウム）、皮膚処置剤、増粘剤、ならびに、ビタミンおよびその誘導体が含まれる。
【０１８０】
本発明の医薬または化粧組成物は皮膚に対して直接に適用することができる。代替では、本発明の組成物は、この技術分野で知られている様々な経皮薬物送達システムによって、例えば、組成物を徐放性様式で皮膚内に放出する経皮パッチなどによって通常の皮膚適用により送達することができる。この技術分野で知られている他の薬物送達システムには、加圧エアロゾルボトル、イオントフォレーシスまたはソノフォレーシスが含まれる。イオントフォレーシスが、皮膚透過性を増大させ、かつ、経皮送達を容易にするために用いられる。米国特許第５６６７４８７号および同第５６５８２４７号が、皮膚を横断する治療剤の超音波−イオントフォレーシス媒介輸送に好適なイオンソニック装置を開示する。代替として、または、加えて、リポソームまたはミセルもまた、送達ビヒクルとして用いることができる。
【０１８１】
活性な薬剤を対象の皮膚内に投与するために使用することができる２つの主要なタイプの皮膚パッチが存在する。これらはリザーバー型パッチおよびマトリックス型パッチである。リザーバーパッチは通常、固体薬物（活性な薬剤）および希釈剤溶液、または、非常に高濃度の薬物溶液がポリマーマトリックスの内部に満たされる構造を含有し、速度制御物質のフィルムまたはメンブランによって取り囲まれる。マトリックスパッチは、薬物が拡散によって外部環境に放出される均一なシステムを形成する薬物およびポリマーを含有する。放出が続くにつれて、マトリックス型パッチにおけるその速度は通常、低下することに留意しなければならない。これは、活性な薬剤は放出までの次第により長くなる距離を有し、したがって、放出までのより長い拡散時間を必要とするからである。経皮薬物送達のさらなる詳細および例については、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ  ＭＲ．他、２００４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、３：１１５〜１２４；Ｓｃｈｅｉｎｄｌｉｎ  Ｓ．、２００４、経皮薬物送達：過去、現在、未来、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ、第４巻：３０８〜３１２；Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ  ＭＲおよびＬａｎｇｅｒ  Ｒ．、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６：１２６１〜１２６８；Ｔａｎｎｅｒ  ＴおよびＭａｒｋｓ  Ｒ、２００８、経皮経路による薬物送達：総説およびコメント、Ｓｋｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：２４９〜２６０を参照のこと（これらのそれぞれが本明細書によりその全体において参照によって組み込まれる）。
【０１８２】
活性な薬剤を本発明の教示に従って皮膚内に投与するために使用することができる皮膚薬物送達パッチの限定されない一例が、Ｓｅｎｔｉ  Ｇ．他、２００９、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、９月４日［印刷に先立つＥｐｕｂ］に記載される（これは本明細書によりその全体において参照によって組み込まれる）。
【０１８３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、活性な薬剤を皮膚に投与することが、リザーバー型パッチを使用して行われる。
【０１８４】
無傷の皮膚の中に投与することを、半固体リザーバーと、可塑性の裏打ちする接着性輪郭物と、保護用の取り除き可能なカバーとを有する閉鎖性パッチを使用して行うことができる。
【０１８５】
半固体リザーバーは、様々な賦形剤、例えば、脂肪、オイル（例えば、鉱油、ワセリン、植物油またはシリコン油）、ポリマー、ゲル化剤、懸濁化剤、安定剤、親水性溶媒、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、安定化用界面活性剤、コロイドなどおよびそれらの組合せなどを使用する任意のゲル、クリーム、軟膏、エマルション、懸濁物、マイクロ粒子が可能である。
【０１８６】
活性な薬剤の皮膚内への送達を大きくするために、活性な薬剤は、表皮層または真皮層への送達を大きくするために意図される様々なビヒクルとともに配合され得ることに留意しなければならない。そのようなビヒクルには、リポソーム、デンドリマー、ニオソーム、トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）、マイクロエマルションおよび固体脂質ナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない（さらなる詳細については、Ｃｅｖｃ，Ｇ．、皮膚におけるトランスファーソーム、リポソームおよび他の脂質懸濁物：透過強化、小胞浸透および経皮薬物送達、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１３、２５７〜３８８（１９９６）（これは本明細書によりその全体が参照によって組み込まれる）；Ｋｏｇａｎ  Ａ、Ｇａｒｔｉ  Ｎ、経皮薬物送達ビヒクルとしてのマイクロエマルション、Ａｄｖ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ、２００６、１２３−１２６：３６９〜３８５（これは本明細書によりその全体が参照によって組み込まれる）を参照のこと。加えて、活性な薬剤は、活性な薬剤の皮膚内への送達を高める化学的強化剤（例えば、スルホキシド、アゾン、グリコール、アルカノールおよびテルペンなど）と混合することができる（さらなる詳細については、Ｋａｒａｎｄｅ  Ｐ、Ｊａｉｎ  Ａ、Ｅｒｇｕｎ  Ｋ、Ｋｉｓｐｅｒｓｋｙ  Ｖ、Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ、経皮薬物送達のための化学的浸透強化剤の設計原理、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００５、１０２：４６８８〜４６９３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＣ、Ｂａｒｒｙ  ＢＷ、浸透強化剤、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００４、５６：６０３〜６１８；およびＳｍｉｔｈ，ＥＷ、Ｍａｉｂａｃｈ，ＨＩ．（編者）、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ：Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ、２００６、Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓを参照のこと。これらのそれぞれが本明細書によりその全体において参照によって組み込まれる）。
【０１８７】
パッチは、表皮または真皮に対する薬物の透過性化を容易にするために設計されるエマルションに配合される活性な薬剤を含むことができる。例えば、パッチは、活性な薬剤を、活性な薬剤が角質層を通って真皮内に透過性化することを容易にするために設計されるグリセリン中オイル型エマルションの内部に含むことができる。真皮内への角質層を介した送達のために好適なグリセリン中オイル型エマルションの限定されない一例が米国特許出願公開第２００４００６７２４４号に記載される（これは本明細書によりその全体が参照によって組み込まれる）。そのようなグリセリン中オイル型エマルションは１ミクロン未満の平均液滴サイズを示し、連続するグリセリン相と、内部相を構成する少なくとも１つの植物油と、少なくとも１つの乳化用安定剤と、少なくとも１つの疎水性成分をその構造内に含む少なくとも１つの生物活性化合物とを含み、この場合、組成物は、生物活性化合物が角質層を通って真皮内に透過性化することを容易にする。
【０１８８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、活性な薬剤を皮膚に投与することが、ブリーチ（ｂｒｅａｃｈ）された皮膚［例えば、外部の物体などにより透過性化されている（例えば、裂けている）皮膚、または、損傷性皮膚（損傷部を含む皮膚）］に対して達成される。
【０１８９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、皮膚のブリーチングが一時的に達成され（例えば、所定の短期間にわたって行われ）、皮膚内への有効成分のより良好な透過性化を可能にするために設計される。
【０１９０】
皮膚のブリーチングを、例えば、微小孔（例えば、微小経路）を皮膚の外側層に導入することによって行うことができる。そのような微小経路を、例えば、Ｒａｄｉｏ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＲＦ）−Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ（商標）（ＴｒａｎｓＰｈａｒｍａ  Ｍｅｄｉｃａｌ（商標）Ｌｔｄ．）技術を使用して形成することができる［ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ（ドット）ｔｒａｎｓｐｈａｒｍａ−ｍｅｄｉｃａｌ（ドット）ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＿ｒｆ（ドット）ｈｔｍｌ］。
【０１９１】
加えて、または、代替において、パッチから皮膚の表皮層への活性な薬剤（例えば、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の送達を、この技術分野において知られている物理的強化剤を使用して、例えば、超音波、イオン泳動、エレクトロポレーション、マグネトフォレシス、マイクロニードルおよび連続混合などを使用して高めることができる［例えば、Ｒｉｚｗａｎ  Ｍ、Ａｑｉｌ  Ｍ、Ｔａｌｅｇａｏｎｋａｒ  Ｓ、Ａｚｅｅｍ  Ａ、Ｓｕｌｔａｎａ  Ｙ、Ａｌｉ  Ａ、強化された経皮薬物送達技術：特許の幅広い検討、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｆｏｒｍｕｌ、２００９、３（２）：１０５〜２４を参照のこと。これは本明細書によりその全体が参照によって組み込まれる）］。
【０１９２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物が皮内注射のために配合される。
【０１９３】
活性な薬剤を、Ｍａｎｔｏｕｘ  Ｃ（１９０８）試験について記載されるような皮内注射によって対象の皮膚の真皮内に投与することができる。簡単に記載すると、活性な薬剤を（例えば、２６ゲージまたは２７ゲージのニードルを介して０．５ｍｌまたは１．０ｍｌのツベルクリンシリンジを使用して）皮内注射することができる。シリンジを皮膚に対して４５度の角度で置くことができ、ニードルの斜端が下向きに動かされ、これにより、皮膚に向い、そして、皮膚の表在層よりも深くないが、皮膚を完全に突き抜ける。およそ０．０１ｍｌ〜０．０５ｍｌ（例えば、約０．０２ｍｌ）の体積が、小さい表在性ブレベを生じさせるために静かに注入される（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ’ｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆ｐｒａｃｔｉｃｅ、第６版、２００３）。
【０１９４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物は液体スプレー（例えば、活性な薬剤を所定の濃度および投薬量で含むスプレー）のために配合される。
【０１９５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物はゲル（例えば、活性な薬剤を所定の濃度および投薬量で含むゲル）のために配合される。
【０１９６】
例えば、ゲルまたはスプレーを使用する投与については、活性な薬剤を投与するための事前に定められた区域が選択され、必要な場合には、補助機器を使用して固定される（例えば、ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ（ドット）ｔｒｕｅｔｅｓｔ（ドット）ｃｏｍを参照のこと］。
【０１９７】
過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状（例えば、乾癬病変部など）は頭皮の皮膚を冒すことが多いので、本発明の医薬組成物または化粧用組成物はさらに、頭皮皮膚および頭髪における使用のために好適である皮膚軟化剤、界面活性剤および／またはコンディショナーを含む。
【０１９８】
そのような皮膚軟化剤には、炭化水素系の油およびワックス（例えば、鉱油およびワセリン）、植物系および動物系の油脂（例えば、オリーブ油、パーム油、ひまし油、トウモロコシ油およびダイズ油など）、ならびに、ラノリンおよびその誘導体（例えば、ラノリン、ラノリン油、ラノリンワックスおよびラノリンアルコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。他の皮膚軟化剤には、１０〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸（これには、例えば、ミリスチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸およびパルミチン酸などが含まれる）のエステルが含まれ、例えば、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸プロピル、ミリスチン酸ブチル、ステアリン酸プロピル、イソステアリン酸プロピルおよびパルミチン酸プロピルなどが含まれる。他の皮膚軟化剤には、１０〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸が含まれ、そのような脂肪酸には、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、イソステアリン酸およびパルミチン酸などが含まれる。皮膚軟化剤にはまた、セチルアルコール、ミリスチルアルコール、ラウリルアルコール、イソステアリルアルコールおよびステアリルアルコールなどの１０〜２０個の炭素原子を有する脂肪アルコールが含まれる。
【０１９９】
いくつかは水溶性であるが、多価アルコールおよびポリエーテル誘導体が皮膚軟化剤として含まれ、これらには、グリコール、グリセロール、ソルビトールおよびポリアルキレングリコールなど、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール２００〜５００などが含まれる。水溶性の例が好ましい。
【０２００】
本発明の医薬または化粧組成物を毛髪での使用のために配合するとき、乳化剤／界面活性剤が好ましくは利用される。
【０２０１】
界面活性剤の例には、親水性のアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド、ポリエチレンオキシドまたはポリエチレングリコールとの縮合に利用可能なフリーの反応性水素を有する疎水性のアルキル官能基、アルケン官能基またはアルキル芳香族官能基のポリオキシアルキレンオキシド縮合生成物が含まれるが、これらに限定されない。特に効果的なものが、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙによって商品名ＴＲＩＴＯＮ１００（登録商標）シリーズの製品で販売される、約７〜約１３モルのエチレンオキシドとのオクチルフェノールの縮合生成物である。
【０２０２】
他の成分、例えば、香料、安定化剤、色素、抗微生物剤、抗細菌剤、抗凝集剤および紫外線吸収剤などもまた、毛髪での使用のために配合される本発明の組成物に含められる。
【０２０３】
酸加水分解に対して安定なコンディショナー剤、例えば、少なくとも１つの第四級アンモニウム成分をエトキシ化モノコートと一緒に有するシリコーン化合物などもまた好ましくは、毛髪での使用のために配合される本発明の組成物を安定化し、かつ、場合によりその粘性を高めるために利用される。
【０２０４】
必要に応じて使用される増粘剤もまた、組成物の審美学を改善するために、また、毛髪への組成物の適用を容易にするために含めることができる。０％〜約３重量％の量の非イオン性増粘剤が好ましい。例示的な増粘剤が、メチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース、ジ（水素化タロー）フタル酸アミド、架橋された無水マレイン酸−メチルビニルエーテルコポリマー、グアーガム、キサンタンガムおよびアラビアゴムである。
【０２０５】
コンディショニング組成物のキャリアは主に水であるが、有機溶媒もまた、組成物の製造を容易にするために、または、審美的性質（例えば、粘度制御）を提供するために含めることができる。好適な溶媒には、低級アルコール、例えば、エチルアルコールおよびイソプロピルアルコール；グリコールエーテル、例えば、２−ブトキシエタノール、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールおよびジエチレングリコールのモノエチルエーテルまたはモノメチルエーテル；ならびにそれらの混合物が含まれる。非水性溶媒を、組成物におけるキャリアの総重量の重量比で約１％〜約５０％の量で、特に約５％〜約２５％の量で本発明のコンディショング組成物に存在させることができる。
【０２０６】
不透明なコンディショナーにおいて使用することができる限定されないコンディショニング剤には、ステアリルトリメチルアンモニウム塩化物；ベヘントリメチルアンモニウム塩化物；セトリモニウム臭化物；ソイトリモニウム塩化物；タロートリモニウム塩化物；ジ水素化タロージメチルアンモニウム塩化物；ベヘントリメチルアンモニウムメトサルフェート；Ｐｅｇ−２オレアンモニウム塩化物；ジ水素化タロージメチルアンモニウム臭化物；ジ水素化タロージメチルアンモニウムメトサルフェート；パルミチルトリメチルアンモニウム塩化物；水素化タロートリメチルアンモニウム塩化物；水素化タロートリメチルアンモニウム臭化物；ジセチルジメチルアンモニウム塩化物；ジステアリルジメチルアンモニウム塩化物；ジパルミチルジメチルアンモニウム塩化物；水素化タロートリメチルアンモニウムメトサルフェート；セトリモニウムトシラート；エイコシルトリメチルアンモニウム塩化物およびジタロージメチルアンモニウム塩化物が含まれる。
【０２０７】
本発明の組成物を不透明にするために使用することができる物質には、脂肪エステル、不透明化ポリマー（例えば、スチレンポリマー、例えば、Ｍｏｒｔｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から得られるＯＰＡＣＩＦＩＥＲ６５３（商標））、および、脂肪アルコールが含まれる。下記は脂肪アルコールの限定されない列挙である：セチルアルコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ベヘニルアルコールおよびアラキジルアルコール。透明でない本発明のコンディショニング組成物はまた、Ｌｅｘａｍｉｎｅ  Ｓ−１３、ジセチルアンモニウム塩化物およびｃｅｔｅａｒｅｔｈ−２０を含むことができる。
【０２０８】
シャンプー配合物は時には、頭皮の病変部（例えば、頭皮の乾癬）を処置するために好都合である。
【０２０９】
本発明のヘアシャンプー組成物は、その清浄化成績を改善するために非イオン性界面活性剤または両性界面活性剤を含有することができる。
【０２１０】
非イオン性界面活性剤の例には、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレン（水素化）ひまし油、スクロース脂肪酸エステル、ポリグリセリンアルキルエーテル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミドおよびアルキルグリコシドが含まれるが、これらに限定されない。これらのうち、アルキルグリコシド、ポリオキシアルキレン（Ｃ８〜Ｃ２２）脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン水素化ひまし油および脂肪酸アルカノールアミドが好ましい。脂肪酸アルカノールアミドとしては、アシル基が８個〜１８個の炭素原子（より好ましくは１０個〜１６個の炭素原子）を有するものが好ましい。脂肪酸アルカノールアミドとして、モノアルカノールアミドまたはジアルカノールアミドのどちらも使用することができ、ヒドロキシアルキル基が２個〜３個の炭素原子を有するものが好ましい。例には、オレイン酸ジエタノールアミド、パーム核脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ラウリン酸イソプロパノールアミドおよびラウリン酸モノエタノールアミドが含まれる。
【０２１１】
本発明のシャンプー組成物において使用することができる両性界面活性剤には、ベタイン系界面活性剤、例えば、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタインおよび脂肪酸アミドプロピルベタインなどが含まれる。脂肪酸アミドプロピルベタインとしては、アシル基が８個〜１８個の炭素原子（より好ましくは１０個〜１６個の炭素原子）を有するものが好ましく、ラウリルアミドプロピルベタイン、パーム核アミドプロピルベタインおよびココアミドプロピルベタインがとりわけ好ましい。
【０２１２】
非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤を、必要とされるように本発明のヘアシャンプー組成物において配合することができる。それらのうちの２つ以上を組合せで使用することができる。本発明のヘアシャンプー組成物が水性液体シャンプーの形態で提供されるとき、脂肪酸アミドプロピルベタインまたは脂肪酸アルカノールアミドの使用が、泡立ち力を改善するだけでなく、十分な流動性もまたシャンプーに提供するので好ましい。
【０２１３】
ヘアシャンプー組成物における非イオン性界面活性剤の含有量はヘアシャンプー組成物において０ｗｔ．％〜１５ｗｔ．％（より好ましくは０．５ｗｔ．％〜１０ｗｔ．％、さらにより好ましくは１ｗｔ．％〜５ｗｔ．％）の範囲内に含まれ得る。一方、ヘアシャンプー組成物における両性界面活性剤の含有量は０ｗｔ．％〜１０ｗｔ．％（より好ましくは０．５ｗｔ．％〜８ｗｔ．％、さらにより好ましくは１ｗｔ．％〜５ｗｔ．％）の範囲内に含まれ得る。
【０２１４】
本発明のヘアシャンプー組成物はさらに、泡の肌理、泡の滑る感触、シャンプー時の毛髪間の摩擦における低下、および、乾燥後の滑らかさを考慮して、カチオン性ポリマーを含有することができる。カチオン性ポリマーの例には、カチオン性セルロース誘導体、カチオン性デンプン、カチオン性グアーガム誘導体、ジアリル第四級アンモニウム塩のホモポリマー、ジアリル第四級アンモニウム塩／アクリルアミドコポリマー、四級化ポリビニルピロリドン誘導体、ポリグリコール−ポリアミン縮合生成物、ビニルイミダゾリウムトリクロリド／ビニルピロリドンコポリマー、ヒドロキシエチルセルロース／ジメチルジアリルアンモニウムクロリドコポリマー、ビニルピロリドン／四級化ジメチルアミノエチルメタクリラートコポリマー、ポリビニルピロリドン／アルキルアミノアクリラートコポリマー、ポリビニルピロリドン／アルキルアミノアクリラート／ビニルカプロラクタムコポリマー、ビニルピロリドン／メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリドコポリマー、アルキルアクリルアミド／アクリラート／アルキルアミノアルキルアクリルアミド／ポリエチレングリコールメタクリラートコポリマー、アジピン酸／ジメチルアミノヒドロキシプロピルエチレントリアミンコポリマー（ＵＳ  Ｓａｎｄｏｓ  Ｃｏｒｐ．によって製造されるＣＡＬＴＡＬＥＴＩＮＥ）、ならびに、特開昭５３−１３９７３４および特開昭６０−３６４０７に記載されるカチオン性ポリマーが含まれる。これらのうち、カチオン性セルロース誘導体およびカチオン性グアーガム誘導体が好ましい。
【０２１５】
これらのカチオン性ポリマーの２つ以上を組合せで使用することができる。本発明のヘアシャンプー組成物におけるその含有量は、シャンプー時の泡の性状、乾燥後における頭髪の扱いやすさ、および、感触における改善の観点から、好ましくは０．０２ｗｔ．％〜５ｗｔ．％であり、より好ましくは０．０５ｗｔ．％〜１ｗｔ．％であり、一層より好ましくは０．１ｗｔ．％〜０．３ｗｔ．％である。
【０２１６】
本発明のヘアシャンプー組成物はさらに、乾燥後の仕上がりを改善するためにコンディショング成分（例えば、シリコーンなど）を含有することができる。シリコーンの例には、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、アミノ修飾シリコーン、ポリエーテル修飾シリコーン、エポキシ修飾シリコーン、フッ素修飾シリコーン、環状シリコーン、アルキル修飾シリコーンおよびオキサゾリン修飾シリコーンが含まれる。これらのうち、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、アミノ修飾シリコーン、ポリエーテル修飾シリコーン、オキサゾリン修飾シリコーンおよび環状シリコーンが好ましい。これらのシリコーンの２つ以上を組合せで使用することができる。その（それらの）含有量は好ましくは、本発明のヘアシャンプー組成物において０．０１ｗｔ．％〜２０ｗｔ．％（より好ましくは０．０５ｗｔ．％〜１０ｗｔ．％、さらにより好ましくは０．１ｗｔ．％〜５ｗｔ．％）の範囲である。
【０２１７】
本発明のヘアシャンプー組成物は、上記成分に加えて、水溶性ポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシセルロース、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールなど）、多価アルコール（例えば、ソルビトールなど）、湿潤剤、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、薬物（例えば、ビタミン調製物など）、アミノ酸およびその誘導体、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリラート）、ナイロンまたはシリコーンおよびそれらの疎水性製造物など）の微細粒子、動物または植物に由来する抽出物、紫外線吸収剤、真珠箔、防腐剤、殺菌剤、ｐＨ調節剤、着色剤ならびに芳香剤を使用目的に従って含有することができる。
【０２１８】
本発明のヘアシャンプー組成物は、必要に応じて、液体、粉末、ゲルおよび顆粒から選択される形態で提供することができる。水または低級アルコールを溶媒として使用する液体組成物が好ましく、水を使用する液体組成物がとりわけ好ましい。
【０２１９】
上記で述べられたように、医薬組成物は例えば、注射によって、全身的または局部的に投与することができる。
【０２２０】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０２２１】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容されるキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０２２２】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０２２３】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０２２４】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０２２５】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０２２６】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０２２７】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０２２８】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０２２９】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０２３０】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、過増殖性ケラチノサイトによって特徴づけられる病状（例えば乾癬）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（上述の薬剤）の量を意味する。
【０２３１】
治療有効量の決定は、特に、本明細書中に与えられる詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２３２】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、動物モデルにおいて決定されることができ、所望の濃度または力価を達成することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０２３３】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０２３４】
投薬量および投薬間隔を、生物学的効果を誘導または抑制するために十分である活性な成分の組織（皮膚組織）レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿中濃度を求めることができる。
【０２３５】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０２３６】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０２３７】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、指示された症状を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０２３８】
本明細書中に記載される処置療法様式が、抗乾癬性の従来薬を使用して増強され得ることが理解される。
【０２３９】
したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法さらに、病状の症状を少なくとも部分的に軽減することができる薬剤を対象に投与することを含み、ただし、この場合、そのような薬剤は、局所的投与または全身的投与（例えば、経口投与または注射投与）のために、および／あるいは、対象を光線療法により処置するために好適である。
【０２４０】
病状の症状を少なくとも部分的に軽減することができる薬剤を投与することが、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはＩＧＦＢＰ７ポリヌクレオチドによる処置に先立って、あるいは、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはＩＧＦＢＰ７ポリヌクレオチドにより処置することと同時に、あるいは、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはＩＧＦＢＰ７ポリヌクレオチドによる処置の後で行われ得ることに留意しなければならない。
【０２４１】
病状の症状を少なくとも部分的に軽減することができる薬剤は、上記で記載されるように、ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの組合せで医薬組成物の一部（例えば、有効成分の一部）を形成することができる。
【０２４２】
局所的治療（医薬品の局所的投与）のために好適な薬剤は、クリーム、軟膏、ゲルまたはエマルションの形態でのいずれであれ、コルチコステロイド、ビタミンＤのアナログまたは誘導体、アントラリン、局所用レチノイド、カルシニューリン阻害剤、サリチル酸、コールタールおよび保湿剤が可能である。
【０２４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、光線療法は、日光光線療法、Ｂ型紫外線（ＵＶＢ）光線療法、狭帯域ＵＶＢ光線療法、光化学療法（例えば、ＰＵＶＡ［プソラレン類（Ｐ）、その後、皮膚をＵＶＡ（長波長紫外線）にさらすことからなる混合処置］およびエキシマレーザーが可能である。
【０２４４】
全身的治療（医薬品の全身的投与）のために好適な薬剤は、レチノイド、免疫抑制薬物（例えば、メトトレキサート、シクロスポリン）、免疫標的化生物学的薬剤（例えば、Ａｌｅｆａｃｅｐｔ、インフリキシマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ウステキヌマブ）、イムノトキシン（例えば、デニロイキン）およびＴＮＦ−α阻止生物学的薬剤（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプトおよびゴリムマブなど）が可能である。
【０２４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケラチノサイトの増殖および分化を調節することは、増殖を、ＩＧＦＢＰ７の発現レベルおよび／または活性をダウンレギュレーションすることによってアップレギュレーションすることを含む。
【０２４６】
本発明の実施形態によれば、増殖をアップレギュレーションすることは、一般には創傷、火傷、潰瘍および皮膚再生の処置のためである。
【０２４７】
ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションを、転写および／または翻訳を妨げる様々な分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング剤、リボザイム、ＤＮＡザイムおよびアンチセンス）を使用してゲノムレベルおよび／または転写レベルで達成することができ、あるいは、例えば、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素、ＩＧＦＢＰ７活性を中和する抗体（ａｂ５１３９２  Ａｂｃａｍ）などを使用してタンパク質レベルで達成することができる。
【０２４８】
下記は、ＩＧＦＢＰ７の発現レベルおよび／または活性をダウンレギュレーションすることができる薬剤の列挙である。
【０２４９】
ＩＧＦＢＰ７をダウンレギュレーションすることができる薬剤の一例が、ＩＧＦＢＰ７と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントである。好ましくは、抗体はＩＧＦＢＰ７の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原表面におけるいずれかの抗原決定基を示す。
【０２５０】
エピトープ決定基は通常、分子（例えば、アミノ酸または炭水化物側鎖など）の化学的活性な表面群からなり、通常、特定の三次元構造特徴、同様にまた、特定の電荷特徴を有する。
【０２５１】
本発明で使用される用語「抗体」は、完全な分子並びにその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを含む。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である。
【０２５２】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体並びにそのフラグメントを作製する方法が当技術分野では周知である（例えば、本明細書中に参考として組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと）。
【０２５３】
例えば、本発明による抗体フラグメントを抗体のタンパク質分解的加水分解によって調製することができ、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現システム）における発現によって調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得ることによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、および場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接的に得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびにそれらに含まれる参考文献に記載されている（それらの特許は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、１９５６も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
【０２５４】
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されているように非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、グルタルアルデヒドなどの化学剤によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによりつながれたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに導入され、続いて、発現ベクターは大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。
【０２５５】
抗体フラグメントの他の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
【０２５６】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、または抗体の他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは取り込まれたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメインまたは１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
【０２５７】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。
【０２５８】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
【０２５９】
ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションはまた、ＲＮＡサイレンシングによって達成することができる。本明細書中で使用される表現「ＲＮＡサイレンシング」は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される一群の調節機構［例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）、共抑制および翻訳抑制］を示す。ＲＮＡサイレンシングが、植物、動物および菌類を含めて、多くのタイプの生物において認められている。
【０２６０】
本明細書中で使用される用語「ＲＮＡサイレンシング剤」は、標的遺伝子の発現を阻害または「サイレンシング」することができるＲＮＡを示す。特定の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は転写後サイレンシング機構を介してｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を妨げることができる。ＲＮＡサイレンシング剤には、非コードＲＮＡ分子（例えば、対形成した鎖を含むＲＮＡ二重鎖）、同様にまた、そのような小さい非コードＲＮＡが生じ得る前駆体ＲＮＡが含まれる。例示的なＲＮＡサイレンシング剤には、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどが含まれる。１つの実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤はＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は翻訳抑制を媒介することができる。
【０２６１】
ＲＮＡ干渉は、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを示す。植物における対応プロセスが転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと一般に呼ばれ、これはまた、菌類ではクエリングと呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ、多様なフローラおよび門によって一般に共有される。外来遺伝子の発現からのそのような防御は、相同的な一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介した、ウイルス感染に由来するか、または、トランスポゾンエレメントの宿主ゲノム内へのランダムな組み込みに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に対する応答において進化してきたかもしれない。
【０２６２】
細胞における長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサー活性に由来する短い干渉性ＲＮＡは、長さが典型的には約２１ヌクレオチド〜約２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するエンドヌクレアーゼ複合体（これは一般にはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる）を特徴とする。標的ＲＮＡの切断が、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な領域の中央で生じる。
【０２６３】
したがって、本発明では、ｍＲＮＡからのタンパク質発現をダウンレギュレーションするためのｄｓＲＮＡの使用が意図される。
【０２６４】
１つの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは３０ｂｐを超える。長いｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡ）の使用は、二本鎖ＲＮＡのこれらのより長い領域がインターフェロンおよびＰＫＲ応答の誘導をもたらすと考えられるために非常に限定されている。しかしながら、長いｄｓＲＮＡの使用は、細胞が最適なサイレンシング配列を選択でき、これにより、数多くのｓｉＲＮＡを試験する必要性を緩和するという点で、また、長いｄｓＲＮＡは、サイレンシングライブラリーが、ｓｉＲＮＡのために必要であると思われるよりも少ない複雑性を有することを可能にするという点で、そして、おそらく最も重要であるかもしれないが、長いｄｓＲＮＡは、これが治療剤として使用されるときにはウイルスの逃避変異を妨げ得るという点で、数多くの利点を提供することができる。
【０２６５】
様々な研究により、長いｄｓＲＮＡが、ストレス応答を誘導することなく、また、著しい標的外の影響を引き起こすことなく、遺伝子発現のサイレンシングを行うために使用され得ることが明らかにされる。例えば、Ｓｔｒａｔ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、第３４巻、第１３号、３８０３〜３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ  Ａ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２００４、１３：１１５〜１２５；Ｄｉａｌｌｏ  Ｍ．他、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３、１３：３８１〜３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００２、９９：１４４３〜１４４８；Ｔｒａｎ  Ｎ．他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２００４、５７３：１２７〜１３４を参照のこと。
【０２６６】
特に、本発明ではまた、インターフェロン経路が活性化されない細胞（例えば、胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングのために、長いｄｓＲＮＡ（３０塩基を超える転写物）の導入が意図される。例えば、Ｂｉｌｌｙ他、ＰＮＡＳ、２００１、第９８巻、１４４２８頁〜１４４３３頁、および、Ｄｉａｌｌｏ他、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３年１０月１日、１３（５）：３８１〜３９２を参照のこと。ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９。
【０２６７】
本発明ではまた、遺伝子発現をダウンレギュレーションするために、インターフェロン経路およびＰＫＲ経路を誘導しないように特別に設計される長いｄｓＲＮＡの導入が意図される。例えば、ＳｈｉｎａｇｗａおよびＩｓｈｉｉ［Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．、１７（１１）：１３４０〜１３４５、２００３］は、長い二本鎖ＲＮＡをＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターから発現するための、ｐＤＥＣＡＰと名づけられたベクターを開発している。ｐＤＥＣＡＰからの転写物は、細胞質へのｄｓＲＮＡ輸出を容易にする５’−キャップ構造および３’−ポリ（Ａ）テールの両方を欠いているので、ｐＤＥＣＡＰからの長いｄｓＲＮＡはインターフェロン応答を誘導しない。
【０２６８】
哺乳動物システムにおけるインターフェロン経路およびＰＫＲ経路を回避する別の方法が、トランスフェクションまたは内因性発現のどちらかを介する小さい阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入による方法である。
【０２６９】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する小さい阻害ＲＮＡ二重鎖（一般には１８塩基対〜３０塩基対の間）を示す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１９ｂｐの二重鎖領域と、末端における対称的な２塩基の３’−突出とを有する２１ｍｅｒ体として化学合成される。だが、近年には、２５塩基〜３０塩基の長さの化学合成されたＲＮＡ二重鎖が、同じ場所において２１ｍｅｒ体と比較して、効力において１００倍もの大きい増大を有し得ることが明らかにされている。ＲＮＡｉを誘発することにおいて、より長いＲＮＡを使用して得られた観測されている増大した効力は理論によれば、生成物（２１ｍｅｒ）の代わりに基質（２７ｍｅｒ）をダイサーに与えることから生じると考えられ、このことにより、ｓｉＲＮＡ二重鎖がＲＩＳＣに進入する速度または効率が改善される。
【０２７０】
３’−突出の位置はｓｉＲＮＡの効力に影響を与え、３’−突出をアンチセンス鎖に有する非対称な二重鎖は、３’−突出をセンス鎖に有するものよりも一般に強力であることが見出されている（Ｒｏｓｅ他、２００５）。これは、非対称な鎖がＲＩＳＣに入ってくることに起因すると考えられ得る。逆の効力パターンが、アンチセンス転写物を標的とするときに認められるからである。
【０２７１】
二本鎖の干渉性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、ヘアピン構造またはステム−ループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成するためにつなぐことができる。したがって、述べられたように、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はまた、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。
【０２７２】
用語「ｓｈＲＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、相補的配列の第１の領域および第２の領域を含み、これらの領域の相補性の程度および向きが、塩基対形成がこれらの領域の間で生じように十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、ループがループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の間における塩基対形成の欠落から生じるステム−ループ構造を有するＲＮＡ剤を示す。ループにおけるヌクレオチドの数は、３〜２３の数（３および２３を含む）、または、５〜１５の数（５および１５を含む）、または、７〜１３の数（７および１３を含む）、または、４〜９の数（４および９を含む）、または、９〜１１の数（９および１１を含む）である。ループにおけるヌクレオチドのいくつかは、ループにおける他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与することができる。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．他（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．他（２００２）、ＲＮＡ、８：１４５４）が含まれる。得られる単鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ装置と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループ構造またはヘアピン構造を形成することが当業者によって認識される。
【０２７３】
別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤はｍｉＲＮＡであり得る。ｍｉＲＮＡは、様々なサイズの一次転写物をコードする遺伝子から作製される小さいＲＮＡである。ｍｉＲＮＡが動物および植物の両方で特定されている。一次転写物（これは「プリｍｉＲＮＡ」と称される）が、様々な核酸分解工程を介して、より短い前駆体ｍｉＲＮＡ、すなわち、「プレｍｉＲＮＡ」にプロセシングされる。プレｍｉＲＮＡは、折り畳まれた形態で存在し、その結果、最終的な（成熟）ｍｉＲＮＡが二重鎖で存在する（これら２つの鎖がｍｉＲＮＡ（最終的には標的と塩基対形成する鎖）と呼ばれる）。プレｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ二重鎖を前駆体から除くダイサーの一形態に対する基質であり、その後、ｓｉＲＮＡと同様に、二重鎖はＲＩＳＣ複合体に取り込まれ得る。ｍｉＲＮＡを遺伝子導入により発現させることができ、また、ｍｉＲＮＡは、完全な一次形態ではなく、むしろ、前駆体形態の発現により効果的であり得ることが明らかにされている（Ｐａｒｉｚｏｔｔｏ他（２００４）、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１８：２２３７〜２２４２、および、Ｇｕｏ他（２００５）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１７：１３７６〜１３８６）。
【０２７４】
ｓｉＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡは、ほんの部分的にすぎない相補性を有する転写物配列に結合し（Ｚｅｎｇ他、２００２、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、９：１３２７〜１３３３）、定常状態のＲＮＡレベルに影響を及ぼすことなく、翻訳を抑制する（Ｌｅｅ他、１９９３、Ｃｅｌｌ、７５：８４３〜８５４；Ｗｉｇｈｔｍａｎ他、１９９３、Ｃｅｌｌ、７５：８５５〜８６２）。ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡはともにダイサーによってプロセシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の成分と会合する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ他、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：８３４〜８３８；Ｇｒｉｓｈｏｋ他、２００１、Ｃｅｌｌ、１０６：２３〜３４；Ｋｅｔｔｉｎｇ他、２００１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５：２６５４〜２６５９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：６８８９〜６８９４；Ｈａｍｍｏｎｄ他、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：１１４６〜１１５０；Ｍｏｕｒｌａｔｏｓ他、２００２、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１６：７２０〜７２８）。近年の報告（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ他、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ、２９７：２０５６〜２０６０）は、ｓｉＲＮＡ経路に対してｍｉＲＮＡ経路を介する遺伝子調節が、単に標的転写物に対する相補性の程度によって決定されると仮定する。ｍＲＮＡ標的に対するほんの部分的にすぎない同一性を有するｓｉＲＮＡが、ＲＮＡの分解を誘発するのではなく、ｍｉＲＮＡと同様な翻訳抑制において機能することが推測される。
【０２７５】
本発明とともに使用するために好適なＲＮＡサイレンシング剤の合成を下記のように達成することができる。最初に、ＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡ配列がＡＡジヌクレオチド配列についてＡＵＧ開始コドンから下流側に走査される。それぞれのＡＡおよび３’側の隣接１９ヌクレオチドの存在が、可能性のあるｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択される。これは、非翻訳領域（ＵＴＲ）には、調節タンパク質結合部位がより多く存在するからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害するかもしれない［Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ、２：２３９〜２４５］。だが、ＧＡＰＤＨについて明らかにされるように（この場合、５’ＵＴＲに向けられたｓｉＲＮＡが細胞のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡにおける約９０％の低下を媒介し、タンパク質レベルを完全に消滅させた［ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ（ドット）ａｍｂｉｏｎ（ドット）ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２（ドット）ｈｔｍｌ］）、非翻訳領域に向けられるｓｉＲＮＡもまた効果的であり得ることが理解される。
【０２７６】
次に、可能性のある標的部位が、何らかの配列アラインメントソフトウエア（例えば、ＮＣＢＩサーバー［ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ（ドット）ｎｃｂｉ（ドット）ｎｌｍ（ドット）ｎｉｈ（ドット）ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／］から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウエアなど）を使用して、適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）に対して比較される。他のコード配列に対する有意な相同性を示す推定される標的部位が取り出される。
【０２７７】
適格な標的配列が、ｓｉＲＮＡ合成のためのテンプレートとして選択される。好ましい配列が、低いＧ／Ｃ含有量を含むものである。これらは、Ｇ／Ｃ含有量が５５％を超えるものと比較して、遺伝子サイレンシングを媒介することにおいてより効果的であることが判明しているからである。いくつかの標的部位が好ましくは、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択される。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のために、陰性コントロールが好ましくは、併せて使用される。陰性コントロールｓｉＲＮＡは好ましくは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する有意な相同性を有しない。したがって、ｓｉＲＮＡのスクランブル化ヌクレオチド配列が、どのような他の遺伝子に対しても何らかの有意な相同性を示さないならば、好ましく使用される。
【０２７８】
例えば、ＩＧＦＢＰ７の好適なｓｉＲＮＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【０２７９】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含有するそのような分子に限定される必要はなく、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが理解される。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるＲＮＡサイレンシング剤は細胞浸透ペプチドと機能的に関連し得る。本明細書中で使用される「細胞浸透ペプチド」は、細胞の形質膜および／または核膜を横切る膜透過性複合体の輸送に関連するエネルギー非依存的（すなわち、非エンドサイトーシス的）転位置特性を与える短い（約１２残基〜３０残基の）アミノ酸配列または機能的モチーフを含むペプチドである。本発明の膜透過性複合体において使用される細胞浸透ペプチドは好ましくは、少なくとも１つの非機能的システイン残基を含んでおり、この場合、この非機能的システイン残基はフリーであるか、または、そのような連結のために修飾されている二本鎖リボ核酸とのジスルフィド連結を形成するために誘導体化される。そのような特性を与える代表的なアミノ酸モチーフが米国特許第６３４８１８５号に列挙される（その内容が特に、参照によって本明細書中に組み込まれる）。本発明の細胞浸透ペプチドには好ましくは、ペネトラチン、トランスポルタン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳおよびＭＡＰが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８１】
ＲＮＡサイレンシング剤を使用して標的化されるためのｍＲＮＡには、その発現が、望まれない表現型形質と相関するｍＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。標的化され得る例示的なｍＲＮＡが、短縮型タンパク質をコードするｍＲＮＡ、すなわち、欠失を含むｍＲＮＡである。したがって、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、欠失のどちらの側でも橋渡し領域に対して標的化することができる。そのようなＲＮＡサイレンシング剤の細胞への導入は、成熟型タンパク質のダウンレギュレーションを引き起こし、一方で、非成熟型タンパク質には影響を与えないままにすると思われる。
【０２８２】
ＩＧＦＢＰ７をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤が、ＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖および二本鎖の両方の標的配列を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．およびＪｏｙｃｅ，Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムについての一般的モデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡザイムは、それぞれが７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインが両側に位置する１５デオキシリボヌクレオチドの触媒作用ドメインを有する。このタイプのＤＮＡザイムはその基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン接合部において効果的に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ［Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、４：１１９〜２１（２００２）］を参照のこと）。
【０２８３】
一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する合成された改変ＤＮＡザイムの構築および増幅の様々な例が、米国特許第６３２６１７４号（Ｊｏｙｃｅ他）に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に向けられた類似する設計のＤＮＡザイムが最近、ウロキナーゼ受容体の発現を阻害すること、また、結腸ガン細胞の転移をインビボで首尾よく阻害することが認められた（Ｉｔｏｈ他、２００２、アブストラク４０９、Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ、ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ（ドット）ａｓｇｔ（ドット）ｏｒｇ）。別の適用において、ｂｃｒ−ａｂ１ガン遺伝子に対して相補的なＤＮＡザイムが白血病細胞におけるガン遺伝子発現を阻害することに成功し、また、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合には自家骨髄移植における再発率を小さくすることに成功した。
【０２８４】
ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションはまた、ＩＧＦＢＰ７をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを使用して達成することができる。
【０２８５】
ＩＧＦＢＰ７を効率的にダウンレギュレーションするために使用することができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンス法にとって重要である２つの側面を考慮しながら行われなければならない。第１の側面が、適切な細胞の細胞質内へのオリゴヌクレオチドの送達であり、一方、第２の側面が、その翻訳を阻害する様式で細胞内において指定のｍＲＮＡと特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【０２８６】
先行技術は、様々なオリゴヌクレオチドを幅広い様々な細胞タイプに効率的に送達するために使用することができるいくつかの送達方策を教示する［例えば、Ｌｕｆｔ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、７６：７５〜６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ他、Ｂｌｏｏｄ、９１：８５２〜６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ、８：９３５〜４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２３７：５６６〜７１（１９９７）；およびＡｏｋｉ他（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２３１：５４０〜５（１９９７）を参照のこと］。
【０２８７】
加えて、その標的ｍＲＮＡに対する最も大きい予測された結合親和性を有するそれらの配列を、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造的変化のエネルギー論を説明する熱力学的サイクルに基づいて特定するためのアルゴリズムもまた入手可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、６５：１〜９（１９９９）を参照のこと］。
【０２８８】
そのようなアルゴリズムが、アンチセンス法を細胞において実行するために首尾よく使用されている。例えば、Ｗａｌｔｏｎ他によって開発されたアルゴリズムは、科学者がウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の転写物のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを首尾よく設計することを可能にした。同じ研究グループがより近年には、３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよび同Ｂならびにラットｇｐ１３０）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドの細胞培養におけるアンチセンス活性が、速度論的ＰＣＲ技術によって評価される場合、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド化学およびホスホロチオアートオリゴヌクレオチド化学による２つの細胞タイプにおける３つの異なる標的に対する試験を含めて、ほとんどすべての場合において効果的であることが判明したことを報告している。
【０２８９】
加えて、特異的オリゴヌクレオチドを設計し、それらの効率を、インビトロシステムを使用して予測するためのいくつかの取り組みもまた発表された［Ｍａｔｖｅｅｖａ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：１３７４〜１３７５（１９９８）］。
【０２９０】
いくつかの臨床試験により、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性および活性が明らかにされている。例えば、ガンの処置のために好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドが首尾よく使用されており［Ｈｏｌｍｕｎｄ他、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１：３７２〜８５（１９９９）］、一方で、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３およびＢｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血液学的悪性腫瘍の処置が臨床試験に入っており、患者によって許容されることが示されていた［Ｇｅｒｗｉｔｚ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１：２９７〜３０６（１９９９）］。
【０２９１】
より近年には、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介抑制は、ヒトガン細胞の胸膜播種をマウスモデルにおいて阻害することが示されている［Ｕｎｏ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１：７８５５〜６０（２００１）］。
【０２９２】
したがって、現在の一致した意見は、上記で記載されるように、非常に正確なアンチセンス設計アルゴリズムおよび広範囲の様々なオリゴヌクレオチド送達システムをもたらしているアンチセンス技術分野における近年の発達は、当業者が、過度な試行錯誤実験に頼ることを必要とすることなく、既知配列の発現をダウンレギュレーションするために好適なアンチセンス法を設計し、実行することを可能にするということである。
【０２９３】
ＩＧＦＢＰ７をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤が、ＩＧＦＢＰ７をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。様々なリボザイムが、目的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されつつある［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９：４８６〜９６（１９９８）］。リボザイムを、どのような特定の標的ＲＮＡでも切断するために設計することができることにより、リボザイムは基礎研究および治療適用の両方において貴重なツールになっている。治療領域では、リボザイムが、感染性疾患におけるウイルスＲＮＡ、ガンにおける支配的なガン遺伝子、および、遺伝的障害における特定の体細胞変異を標的とするために開発されている［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｖｉｒｏｌ、１０：１６３〜７１（１９９８）］。中でも特筆すべきことは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコルが既に第Ｉ相試験中である。より近年には、リボザイムが、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的検証および経路解明のために使用されている。いくつかのリボザイムが臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥが、ヒト臨床研究で研究されることになった最初の化学合成リボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管形成経路における重要な成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、同様にまた、他の企業が、抗血管形成治療剤の重要性を動物モデルにおいて明らかにしている。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ、すなわち、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡを選択的に破壊するために設計されたリボザイムは、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡを細胞培養アッセイで低下させることにおいて効果的であることが見出された（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。
【０２９４】
ＩＧＦＢＰ７活性をダウンレギュレーションすることができるさらに別の薬剤が、ＩＧＦＢＰ７エフェクタータンパク質の非機能的変化体である（これはまた、優性ネガティブとも呼ばれる）。そのような優性ネガティブ変化体は、ＩＧＦＢＰ７と結合するが、その下流側のシグナル伝達を発揮することができないエフェクタータンパク質である。そのようなものの例には、優性ネガティブＩＧＦおよび優性ネガティブインスリンが含まれる。そのような薬剤はインスリンと結合することができるが、例えば、ＩＲＳ１／２とは結合することができない。
【０２９５】
本明細書中に記載されるダウンレギュレーション薬剤のどれもが、上記で記載されるような医薬的に許容されるキャリアと一緒に医薬組成物において含まれ得る。
【０２９６】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２９７】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【０２９８】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０２９９】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０３００】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０３０１】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０３０２】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０３０３】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０３０４】
用語「任意選択的」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０３０５】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０３０６】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０３０７】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０３０８】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａ��ｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０３０９】
一般的材料および実験方法
細胞培養−ＨａＣａｔ細胞（自発的不死化ヒトケラチノサイト株）が、Ｄｉｎａ  Ｒｏｎ博士（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）によって譲渡された。細胞を、１０％のウシ胎児血清、１％のＬ−グルタミンおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンが補充される、０．０７５ｍＭまたは１．４ｍＭのＣａＣｌ２を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ−Ｈａ−Ｅｍｅｋ、イスラエル）において維持した。
【０３１０】
初代ヒトケラチノサイトを、ＣＥＬＬｎＴＥＣ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｅｒｎ、スイス）から購入した。細胞を、増殖因子の弾丸状キット（Ｌｏｎｚａ、ＭＤ、米国）が補充される、０．１５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＫＣ成長培地（ＫＧＭ）において成長させた。培地を２日毎〜３日毎に交換した。細胞を３回の継代で使用した。分化のために、細胞をＫＧＭ培地および１．４ｍＭのＣａＣｌ２において培養した。
【０３１１】
免疫組織化学−ホルムアルデヒド固定された５μｍのパラフィン包埋切片を、室温で５分間、メタノールにおける３％Ｈ２Ｏ２により処理し、クエン酸塩緩衝液において９０℃で１５分間、電子レンジで暖め、マウスモノクローナル抗ＩＧＦＢＰ７抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）、抗ケラチン１４抗体（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）または免疫前ウサギ抗血清により室温で１時間染色した。リン酸塩緩衝化生理的食塩水における徹底的な洗浄の後、抗体を、ＡＢＣ技術（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）を使用して明らかにし、スライドをヘマトキシリンにより対比染色した。
【０３１２】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション−初代ＫＣ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を使用する６６ｎｍｏｌｌ−１の、ＩＧＦＢＰ７に対するｓｉＲＮＡ二重鎖、または、陰性コントロールｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）によるトランスフェクションの前に８×１０４細胞／ウエルの密度で６ウエルプレートにおいて培養した。５つの異なるｓｉＲＮＡ種をＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションについて試験した。本研究におけるさらなる使用のために選択されたｓｉＲＮＡ  ＩＧＦＢＰ７二重鎖は、５’−ｒＧｒＣＵｒＧｒＧＵｒＡＵｒＣＵｒＣｒＣＵｒＣＵｒＡｒＡｒＧＵＴＴ−３’（配列番号３２）および５’−ｒＡｒＣＵＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＧｒＡｒＧｒＡＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＧｒＣＴＴ−３’（配列番号３３）（Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ、ＴＸ、米国）からなった。陰性コントロールとして、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから購入した標準的なスクランブル化ｓｉＲＮＡを使用した（カタログ番号１２９３５２００）。
【０３１３】
ｓｈＲＮＡのレンチウイルス形質導入−安定した遺伝子ダウンレギュレーションを達成するために、ＤＮＡのｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを使用した（５’−ＣＣＧＧＣＡＡＴＣＣＡＣＴＡＡＣＡＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＡＡＡＧＴＧＴＴＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＴＴＴＴＧ−３’；配列番号３４；ｈＩＧＦＢＰ７  ＮＭ＿００１５５３レンチウイルス粒子、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＴＲＣＮ０００００７７９４３）。非標的のｓｈ−コントロールレンチウイルス粒子をＳｉｇｍａから購入した（カタログ番号ＳＨＣ００２Ｖ）。ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターは、ｓｈＲＮＡ配列を感染性ビリオンにパッケージングするために、ウイルスのパッケージングシグナル、調節エレメントおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含有する（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）。ＨａＣａｔ細胞を製造者の勧めに従ってｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子により形質導入した。簡単に記載すると、形質導入の２４時間前に、細胞を１．６×１０４細胞／ウエルに６ウエルプレートにおいて成長させた。１μｌ〜５μｌのウイルスストックおよび２μｌの４ｍｇ／ｍｌ  Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを細胞に加え、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて３７℃で１８時間〜２０時間インキュベーションした。ウイルスストックの量を、所望のＭＯＩ（ＭＯＩ＝５）、および、Ｓｉｇｍａによって供給される総形質導入ユニット／ｍｌに従って決定した。計算式は下記の通りである：（ウエルあたりの細胞総数）＊（所望のＭＯＩ）＝必要総形質導入ユニット（ＴＵ）；必要ＴＵ／（供給ＴＵ／ｍｌ）＝各ウエルについてのレンチウイルス粒子の総ｍｌ。形質導入後２４時間で、細胞をＰＢＳ（×１）で２回洗浄し、完全成長培地において維持した。培養での拡大を４８時間行った後、細胞を、ピューロマイシンが４μｇ／ｍｌの最終濃度で補充される成長培地において維持した。選抜を、ピューロマイシンの存在下、１週間行った。選抜されたクローンをさらなる使用の前に液体窒素で凍結した。
【０３１４】
初代ケラチノサイトを、わずかな改変を伴う、ＨａＣａｔ細胞について記載されるのと同じプロトコルに従って形質導入した。形質導入後２４時間で、細胞をＰＢＳ（×１）で２回洗浄し、０．１５ｍＭまたは１．４ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＫＧＭ培地において維持した。培養での拡大を７２時間行った後、細胞をインビトロアッセイのために使用した。
【０３１５】
定量的逆転写ＰＣＲ−ＲＮＡを、ＲＮＡ抽出キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して培養細胞から抽出した。ｃＤＮＡを、Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｉＴ第１鎖合成キット（ＡＢｇｅｎｅ、Ｅｐｓｏｎ、英国）およびランダムヘキサマーを使用して５００ｎｇの総ＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を、Ｍｘ３０００ｐ／５ｐマルチフィルターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ、ＴＸ、米国）において、下記の表２に列記される遺伝子特異的な、イントロンをまたぐオリゴヌクレオチド対とともに使用して行った。反応条件の特異性を保証するために、個々の操作が終わったとき、増幅生成物の融解温度（Ｔｍ）を測定して、その均質性を確認した。サイクル処理条件は下記の通りであった：合計で４０サイクルについては９５℃で１０分間、９５℃で１０秒間、６２℃で１５秒間および７２℃で２５秒間。それぞれのサンプルを三連で分析した。定量化のために、標準曲線を、同じリアルタイムＰＣＲ操作で増幅される連続希釈ｃＤＮＡを使用して得た。結果をＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対して正規化した。定量化手順の後、生成物を、反応により、予想サイズのＤＮＡフラグメントが増幅されていたことを確認するために２．５％アガロースゲル電気泳動によって分離した。
【表２】
2012522762.tif 000003
【０３１６】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ分析−総ＲＮＡ（２００ｎｇ）を逆転写し、ｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を、ＴｏｔａｌＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、米国）を製造者のプロトコルに従って使用して調製した。１．５μｇのビオチン化ｃＲＮＡを、Ｓｅｎｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  ＷＧ−６  ｖ２アレイ（４８７０１個の転写物標的を包含する）に対してハイブリダイゼーションし、洗浄し、ＢｅａｄＡｒｒａｙ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で走査した。走査データをＭａｔＬａｂソフトウエアにエクスポートし、四分位正規化し、検出ｐ値が０．０１を超える転写物を分析から除いた（１３０００個を超える転写物が０．０１未満のｐ値を有した）。大域的ＧＯ用語分析において、遺伝子セットにおいて２回以上存在したすべてのＧＯ用語を調べた。遺伝子セットは、そのカルシウム誘導のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションがＩＧＦＢＰ７サイレンシングによって最も著しく影響された上位１００個の遺伝子から構成された。それぞれの用語について、遺伝子セットにおけるのと同じ数の遺伝子を無作為に選択し、その用語がこのセットにおいて現れた回数を計算した。このプロセスを１００回繰り返し、このＧＯ用語頻度のヒストグラムを組み立てた。結果を、本発明者らの実験遺伝子セットにおける相対的集積を評価するために、一サンプル・ウィルコクスン符号付順位検定を使用して分析した。
【０３１７】
ウエスタンブロッティング−細胞を、Ｃｅｌｌｙｔｉｃ  ＭＴ溶解／抽出試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）およびプロテアーゼ阻害剤ミックス（１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍｇ  ｍｌ−１のアプロチニンおよびロイペプチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を含む）においてホモジネートした。遠心分離を４℃において１００００×ｇで１０分間行った後、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、ニトロセルロースメンブラン（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）に転写した。３％のＢＳＡおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含む１×Ｔｒｉｓ緩衝化生理的食塩水（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）による１時間のブロッキング処理の後、ブロットを一次抗体とインキュベーションした。一次抗体には、ｐ−ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−１、ｐ−ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ２、ＳＭＡＤ２／３、ｐ−ＳＭＡＤ２／３に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、米国）、ＩＧＦＢＰ７に対する抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）、サイトケラチン６に対する抗体（ＡＢＣＡＭ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、米国）が含まれた。ブロットをＴｒｉｓ緩衝化生理的食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、４ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）により３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化された二次の抗マウス抗体または抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）とのインキュベーション、および、続く洗浄の後、タンパク質を、ＥＺ−ＥＣＬケミルミネセンス検出キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を使用して検出した。異なるサンプルにおけるタンパク質の量を比較するために、ブロットを、β−アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）および二次の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）により再プローブした。
【０３１８】
ＭＴＴアッセイ−ＭＴＴ試験は、黄色塩のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を青紫色の不溶性ホルマザン沈殿物に還元する生細胞の選択能力に基づく。ＭＴＴをリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に５ｍｇ／ｍｌで溶解し、それぞれのウエルに加え（総体積の１０％）、３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、培地を除き、紫色のホルマザン生成物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。上清を集め、その後、ＥＬＩＳＡリーダーＺｅｎｙｔｈ２００（Ａｎｔｈｏｓ  Ｌａｂｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）により５６０ｎｍにおいて走査した。
【０３１９】
ＢｒＤｕアッセイ−ＢｒｄＵの取り込み速度を、製造者のプロトコルに従って、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ＢｒｄＵ比色キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）によって求めた。４５０ｎｍにおける吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定した。簡単に記載すると、細胞を６ウエルプレートにおいて培養し、ＢｒｄＵと３７℃で６時間インキュベーションした。その後、細胞を固定処理し、ＤＮＡを、ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加えることによって変性した。抗ＢｒｄＵ  ＰＯＤ抗体をＲＴで９０分間加え、細胞をすすいだ。免疫複合体を、基質溶液を加えることによって、ＥＬＩＳＡリーダーＺｅｎｙｔｈ２００（Ａｎｔｈｏｓ  Ｌａｂｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）を使用して４５０ｎｍにおいて検出した。
【０３２０】
ＴＵＮＥＬアッセイ−アポトーシスを、ＴＵＮＥＬキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を製造者のプロトコルに従って使用して評価した。簡単に記載すると、細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、米国）の添加の有無とともにカバースリップに１２時間置き、風乾し、新しく調製された固定処理溶液（リン酸塩緩衝化生理的食塩水における４％パラホルムアルデヒド）により固定処理し、その後、リン酸塩緩衝化生理的食塩水により２回すすいだ。細胞を０．１％のクエン酸ナトリウムにおける０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過性処理した。細胞サンプルを、暗所において３７℃で１時間、ＴＵＮＥＬ反応混合物の存在下、加湿雰囲気でインキュベーションし、ＤＡＰＩにより対比染色した。１０００個を超える細胞をそれぞれのスライドについて計数し、蛍光顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ  ２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）で調べた。画像分析を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ５ソフトウエアを用いて行った。アポトーシス活性における差は、標準的なスチューデントｔ検定を使用して計算される０．０１未満のｐ値で有意であると見なした。
【０３２１】
アネキシンＶアッセイ−アネキシンＶアッセイを、ＡｐｏＡｌｅｒｔ（登録商標）Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）を製造者のプロトコルに従って使用して行った。簡単に記載すると、細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、米国）の添加の有無とともにカバースリップに１２時間置き、供給された結合緩衝液によりすすぎ、室温で１５分間、暗所においてアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムとインキュベーションした。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を使用して、細胞を対比染色した。１０００個を超える細胞をそれぞれのスライドについて計数し、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）で調べた。画像分析を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ５ソフトウエアを用いて行った。アポトーシス活性における差は、標準的なスチューデントｔ検定を使用して計算される０．０１未満のｐ値で有意であると見なした。
【０３２２】
老化関連β−ガラクトシダーゼアッセイ−細胞を、染色の４８時間前に、６ウエルプレートにおいて２〜４×１０４細胞／ウエルで接種した。この細胞密度は、培養物がコンフルエンシーに達する前に、染色が行われることを保証する。ＳＡ−β−Ｇａｌ染色を、わずかな改変とともに記載の通りに行った（Ｄｉｍｒｉ  ＧＰ、Ｌｅｅ  Ｘ他、１９９５、老化ヒト細胞を培養およびインビボでの加齢皮膚において特定するバイオマーカー、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２：９３６３〜９３６７）。簡単に記載すると、細胞を冷ＰＢＳにより洗浄し、冷ＰＢＳにより希釈された０．５％グルタルアルデヒドにより５分間固定処理した。固定処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）と、以前に記載されるような成分の残り（Ｄｉｍｒｉ他、１９９５、上掲）とを含有する染色溶液において３７℃で８時間インキュベーションした。異なるｐＨ値での染色のために、０．１Ｍのクエン酸溶液および０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液を適切な割合で混合した。３７℃でのインキュベーション期間の後、細胞を冷ＰＢＳにより３回洗浄し、画像を集めるまでＰＢＳ中で４℃で保存した。
【０３２３】
画像の定量的分析を、Ｍａｔｌａｂアプリケーションを細胞マーキング（ＳｅｇｍｅｎｔＧｕｉ）および色分析のために使用して行った［ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ｍｄ（ドット）ｔｅｃｈｎｉｏｎ（ドット）ａｃ（ドット）ｉｌ／ｐｉｃｔｕｒｅｓ／ｓｔｏｒａｇｅ／４５／４７（ドット）ｚｉｐ］。それぞれの測定のために、少なくとも２５０個の無作為に選ばれた細胞を手でマーキングした。コルモゴロフ−スミルノフ検定を統計学的分析のために使用した。ｐ値が０．０５未満である差を有意であると見なした。
【０３２４】
実施例１
ＩＧＦＢＰ７の発現が、正常な皮膚と比較して、乾癬皮膚では低下する
実験結果
ＩＧＦＢＰ７の発現が、正常な皮膚と比較して、乾癬皮膚では低下する−以前のデータは、乾癬がＩＧＦＢＰ７の低下した発現を伴うことを示した（Ｈｏｃｈｂｅｒｇ他、２００７）。これらのデータを患者の独立した集団において確認するために、本発明者らは、一連の乾癬生検物（ｎ＝１３）およびコントロール生検物（ｎ＝１３）におけるＩＧＦＢＰ７タンパク質の発現を免疫組織化学によって調べている（図１Ｄ）。ＩＧＦＢＰ７が、正常な表皮の全体に強く発現することが見出され（図１Ａ）、これに対して、その発現が乾癬の表皮では存在しないか、または、非常に弱いかのどちらかであった（図１Ｃ）。これらの結果は、乾癬患者の皮膚では、ＩＧＦＢＰ７の低下した発現が認められることを明らかにする。
【０３２５】
血清刺激はＩＧＦＢＰ７発現をダウンレギュレーションする−ＩＧＦＢＰ７発現レベルに対する血清の影響を調べるために、ＨａＣａｔ細胞をウシ胎児血清の増大する濃度の存在下で培養し、ＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡのレベルを４８時間後に求めた。図１２に示されるように、血清刺激はＩＧＦＢＰ７発現をダウンレギュレーションすることが見出された。このことは、ＩＧＦＢＰ７発現の調節におけるＥＧＦＲシグナル伝達についての起こり得る役割を示唆する。対照的に、ＩＧＦＢＰ７に対するカルシウムの影響は何ら認められなかった（データは示されず）。
【０３２６】
実施例２
ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションは、ケラチノサイトの増殖、生存性およびアポトーシスを増大させる
ＩＧＦＢＰ７が乾癬（表皮ケラチノサイトの異常な増殖および分化によって特徴づけられる障害）の病理発生に関与するかどうかを調べるために、本発明者らは、下記のようにケラチノサイトにおけるＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションを誘導した。
【０３２７】
実験結果
ＩＧＦＢＰ７のｓｉＲＮＡは、ＩＧＦＢＰファミリーにおける他の遺伝子ではなく、ＩＧＦＢＰ７の特異的なダウンレギュレーションをもたらす−本発明者らは、表皮ケラチノサイト増殖の調節におけるＩＧＦＢＰ７発現についての役割を評価した。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを、ＩＧＦＢＰ７発現をＨａＣａｔ細胞において一過性および安定的にそれぞれ低下させるために使用し、ｓｈＲＮＡを、ＩＧＦＢＰ７発現をヒト初代ケラチノサイトにおいて一過性に低下させるために使用した。ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションがｑＲＴ−ＰＣＲ（図２Ａ）および馴化培地の免疫ブロッティング（図２Ｂ）によって確認された。使用されたｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの標的外影響を除外するために、本発明者らは、ＩＧＦＢＰファミリーの他のメンバーの発現レベルに対するＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションの影響を調べたが、それらのｍＲＮＡレベルにおける著しい変化は何ら見出されなかった（図８）。このことは、使用されたｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡがＩＧＦＢＰ７を特異的に標的としたことを示唆する。
【０３２８】
ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションはケラチノサイトの細胞生存性および細胞増殖を増大させる−ＨａＣａｔ細胞におけるＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションは、ＭＴＴアッセイによって評価されるように細胞生存性を増大させ（図３Ａ）、また、ＢｒＤＵ取り込みによって求められるように細胞増殖速度を増大させた（図３Ｂ）。細胞増殖における増大に随伴して、ＫＲＴ６（表皮増殖のマーカー）の発現が、ＩＧＦＢＰ７についてダウンレギュレーションされたＨａＣａｔ細胞（図３Ｃおよび図３Ｄ）および初代ケラチノサイト（図１０）においてアップレギュレーションされた。これらのデータが、ＭＴＴアッセイ（図３Ｅ）およびＢｒＤＵ取り込みアッセイ（図３Ｆ）の両方を使用して初代ケラチノサイトにおいて確認された。
【０３２９】
低下したＩＧＦＢＰ７発現はケラチノサイトにおける低下したアポトーシスを伴う−ＩＧＦＢＰ７は、いくつかのガン細胞株において細胞のアポトーシスおよび老化を誘導することが示されている（Ａｋａｏｇｉ他、１９９６；Ｂｕｒｇｅｒ他、２００５；Ｒｕａｎ他、２００７；Ｓａｔｏ他、２００７；Ｗａｊａｐｅｙｅｅ他、２００８；Ｗｉｌｓｏｎ他、２００２）。本発明者らは、ケラチノサイトにおけるアポトーシス活性に対するＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションの影響を評価した。ＨａＣａｔ細胞をＩＧＦＢＰ７特異的またはコントロールのｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのどちらかにより安定的または一過性にトランスフェクションし、アポトーシスを、ＴＵＮＥＬアッセイおよびアネキシンＶアッセイを使用して推定した。本発明者らは、ＨａＣａｔ細胞における低下したＩＧＦＢＰ７発現が、１０μｇ／μｌの組換えＴＮＦ−αの存在下でさえ、アポトーシス活性における随伴した低下を引き起こしたことを発見した（図４Ａ〜Ｂ）。同様に、初代ケラチノサイトにおけるＩＧＦＢＰ７特異的ｓｉＲＮＡによるＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションは、ＴＮＦ−α誘導の細胞アポトーシスを妨げた（図４Ｃ）。同様に、アポトーシスが、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して示されるように、ＩＧＦＢＰ７−ｓｈＲＮＡにより一過性にダウンレギュレーションされる初代ケラチノサイトにおいて著しく阻害された（図１４Ａ〜Ｂ）。
【０３３０】
低下したＩＧＦＢＰ７はケラチノサイトの老化には影響しない−ヒトケラチノサイトにおける老化速度に対するＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションの影響は、β−ガラクトシダーゼ（細胞老化についてのマーカー）の発現によって明らかにされるように何ら認められなかった（図１６）。
【０３３１】
実施例３
ＩＧＦＢＰ７はケラチノサイトのカルシウム誘導による分化に関与する
実験結果
ＩＧＦＢＰ７はケラチノサイトの分化に関連する遺伝子のカルシウム誘導発現のために要求される−表皮の恒常性におけるＩＧＦＢＰ７の役割を調べるために、本発明者らは、以前の記載（Ｂｏｕｋａｍｐ  Ｐ、Ｐｅｔｒｕｓｓｅｖｓｋａ  ＲＴ他、１９８８、自発的不死化した異数性ヒトケラチノサイト細胞株における正常な角質化、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１０６：７６１〜７７１）のように、１．４ｍＭのＣａ２＋の培地の存在下でＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡまたはコントロールｓｈＲＮＡのどちらかを発現するＨａＣａｔ細胞の分化を誘導した。ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションは、ケラチノサイト分化の３つのマーカー、すなわち、ＫＲＴ１０、インボルクリン（図５Ａ）およびロリクリン（図１１）の誘導を阻止することが見出された。加えて、ＩＧＦＢＰ７についてダウンレギュレーションされる細胞は、カルシウム誘導の分化に特徴的な形態学的変化を明らかにすることができなかった（図９Ａ〜Ｄ）。同様な結果が初代ケラチノサイトに関して得られた（図５Ｂ）。このことは、ＩＧＦＢＰ７がケラチノサイトの分化の調節にもまた関与しているかもしれないことを示唆する。
【０３３２】
ＩＧＦＢＰ７はカルシウム誘導のケラチノサイトの分化に関連する遺伝子の発現を調節する−この可能性をより広いレベルでさらに調べるために、本発明者らは、低い細胞外カルシウム濃度および高い細胞外カルシウム濃度のもとで培養されるＨａＣａｔ細胞において示差的に発現される遺伝子の発現に対するＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションの影響を評価するために大域的遺伝子発現分析を行った。ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションは、細胞外カルシウム濃度における増大に対する応答での発現における２．５倍を超える変化を示す遺伝子の９９．６％および７６．２％の発現をＨａＣａｔ細胞および初代ケラチノサイトにおいてそれぞれ著しく減弱したことが本発明者らによって見出された。２つのデータセットの大域的経路ＧＯ（遺伝子オントロジー）分析（０．０１未満のｐ値）により、分析において有意に集積することが見出されたプロセス用語のいくつかは、増殖および分化の調節との関連性があることが示された（図５Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＩＧＦＢＰ７が、カルシウム誘導のケラチノサイトの分化に関連する遺伝子の発現を調節することを示唆する。
【０３３３】
低い細胞外カルシウム濃度および高い細胞外カルシウム濃度のもとで培養されるＨａＣａｔ細胞において示差的に発現される遺伝子の発現に対するＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションの影響を評価するために、本発明者らは、細胞外カルシウムの増大した濃度に対する応答でのアレイ上に表されるすべての遺伝子（約４８０００個の転写物）の倍数変化をＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーション細胞およびコントロール細胞において計算した（下記の表３および表４、ならびに、図１５Ａ〜Ｄ）。その後、遺伝子を２つのデータセットの倍数変化の間における差（倍数変化の倍数変化）に従って分類した。上位１００個の遺伝子（増大した１００個、低下した１００個）が下記の表３および表４に示される。
【表３】
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【表４】
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【０３３４】
実施例４
ＩＧＦＢＰ７はケラチノサイトの増殖を阻害し、ケラチノサイトのアポトーシスを誘導する
実験結果
組換えＩＧＦＢＰ７はヒトケラチノサイトの増殖を阻害し、ヒトケラチノサイトのアポトーシスを誘導する−ケラチノサイトの増殖および分化の調節におけるＩＧＦＢＰ７の関与を確認するために、本発明者らは、初代ケラチノサイト細胞に対する組換えヒトＩＧＦＢＰ７ポリペプチド（ｒＩＧＦＢＰ７）の影響を調べた。ｒＩＧＦＢＰ７の添加は、ＭＴＴアッセイ（図６Ａ）によって明らかにされるように、生細胞数における低下を初代ヒトケラチノサイト培養物においてもたらした。この観察結果は、最も可能性が高いこととして、ＢｒＤＵアッセイ（図６Ｂ）によって明らかにされるように細胞増殖における低下によって、同様にまた、図６Ｃに示されるようにケラチノサイトのアポトーシスにおける増大によって引き起こされた。ｒＩＧＦＢＰ７は、細胞分化に対する著しい影響を有していなかった（データは示されず）。
【０３３５】
実施例５
ＩＧＦＢＰ７サイレンシングはケラチノサイトにおけるＩＲＳ１およびＥＲＫのリン酸化を誘導する
実験結果
ＴＧＦ−βおよびインスリンのシグナル伝達に対するＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションの影響−ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションによって影響されるシグナル伝達経路を調べるために、本発明者らは、ＩＧＦＢＰ７について安定的にダウンレギュレーションされるＨａＣａｔ細胞を使用した。ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションは、インスリン受容体会合インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）およびチロシンキナーゼＥＲＫ１／２のリン酸化を誘導することが見出された。このことは、インスリン受容体を介するシグナル伝達の妨害を示唆する（図７Ａ〜Ｄ）。対照的に、ＩＧＦＢＰ７はＳＭＡＤ２／３のリン酸化状態には影響を与えなかった（データは示されず）。
【０３３６】
ＥＲＫの阻害はＩＧＦＢＰ７ダウンレギュレーションによって誘導される細胞増殖を弱める−ＩＧＦＢＰ７媒介の細胞増殖におけるＥＲＫの関与をさらに調べるために、ＩＧＦＢＰ７のｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされた初代ケラチノサイトをＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９により処理した（１２０μＭで７２時間、その間、培地を２４時間毎に新しくした）。図１７に示されるように、ＥＲＫの阻害は、ＩＧＦＢＰサイレンシングを受けた細胞において観測されるケラチノサイト増殖の誘導を妨げた。
【０３３７】
実施例６
生理学的に関連したモデルにおけるＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションは免疫学的要素の非存在下で乾癬様表現型を誘導する
本発明者らは、乾癬の病理発生における低下したＩＧＦＢＰ７発現の役割をモデル化するために三次元器官型細胞培養システムを使用した（図１８および図１９）。このモデルシステムでは、ケラチノサイトが、２週間までの間、コラーゲンおよび線維芽細胞からなる担体における気液界面で成長させられる。この期間中に、ケラチノサイトは完全に分化し、これにより、正常な表皮の生物学のほとんどの生理学的側面を忠実に再現する多層の角化した表皮を形成する。本発明者らは、そのような三次元皮膚同等物を成長させるために必要な条件を確立した。組織学的分析および免疫組織化学的分析により、正規の分化プログラムがこれらの培養物には存在することが確認された。７日目および１０日目に、皮膚同等物は、損なわれていない表皮分化の特徴、ならびに、表皮の主要層（基層、有棘層、顆粒層および角化層）および真皮の存在を示した。１２日目に、角質層が厚くなり、落屑、すなわち、角化したケラチノサイトの剥離が生じた（図２０）。ＩＧＦＢＰ７の発現がこの人工的表皮の層化の進行とともに増大することが見出された（図２１）。
【０３３８】
ケラチノサイト単層におけるこれらの発見の生理学的関連性を確認するために、本発明者らはＩＧＦＢＰ７の発現を皮膚器官型培養物におけるＲＮＡ干渉によって抑制した。増殖中のケラチノサイトをエレクトロポレーションによってＩＧＦＢＰ７特異的な小さい干渉性ＲＮＡまたはコントロールの小さい干渉性ＲＮＡによりトランスフェクションした。続いて、トランスフェクション細胞を、コラーゲンおよび線維芽細胞の担体において、気液境界で、インビトロ皮膚同等モデルの表皮成分として培養した。パンチ生検物を培養１４日目に採取し、ホルマリン固定し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理した。パンチ生検物をまた、ＲＮＡ抽出のために７日目に採取し、ｃＤＮＡに転写し、ＩＧＦＢＰ７のｍＲＮＡ発現についてｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｉＲＮＡは、ＩＧＦＢＰ７の発現を、７日目に測定されるとき、皮膚同等物において、正常なレベルの６０％未満に抑制した（データは示されず）。ｓｉＲＮＡの影響が器官型皮膚モデルにおいて少なくとも７日間持続した（データは示されず）。ＩＧＦＢＰ７についてダウンレギュレーションされる皮膚同等物のＨ＆Ｅ染色は、異常な層化、顆粒層の非存在、錯角化および著しい過角化を含めて、驚くべき変化を１４日目に明らかにした（図２２ＡおよびＢ）。
【０３３９】
実施例７
組換えＩＧＦＢＰ７は乾癬をヒト化マウスモデルにおいて治癒させる
乾癬に対するＩＧＦＢＰ７の影響を評価するために、本発明者らは、キメラなマウスモデル（図２３）を使用した。このモデルは、ｂｅｉｇｅ−ＳＣＩＤマウスに移植される、健康なコントロールに由来する正常な皮膚の使用に基づく。その後、移植片には、乾癬患者から単離されるＮＫ／Ｔ細胞が注入される（Ｇｉｌｈａｒ他、２００２）。乾癬患者から単離される末梢血単核細胞は、ＮＫ完全培地［ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、１％グルタミンおよび１％抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、ならびに、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、米国）］において３週間培養される。そのような細胞株は異種ＮＫ細胞マーカーを発現し、ＮＫ細胞毒性を示す。皮膚生着後４週間で、ＮＫ細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を欠くｂｅｉｇｅ−ＳＣＩＤマウスにおけるヒト皮膚外植片に注入され、次の４週間以内に、真のヒト乾癬と区別できない皮膚表現型が現れる（Ｇｉｌｈａｒ他、２００２）。
【０３４０】
本実施例で使用される実験系では、ＮＫ注入後２週間（生着後６週間）において、３つのマウス群が、病巣内ＰＢＳ、局所用デキサメタゾンおよび病巣内ＩＧＦＢＰ７により処置された。処置の影響を処置後２週間（生着後８週間）で組織学分析によってモニターした。
【０３４１】
予想されるように、ＰＢＳにより処置された５匹すべてのマウスが、表皮肥厚（表皮有棘層の肥厚）、乳頭間隆起の伸長、錯角化（角質層の細胞における核の保持）および過角化（角質層の肥厚）、ならびに、真皮における密集した単核浸潤を始めとする組織学での典型的な乾癬の特徴を示した（図２４）。すべてのこれらの特徴が、デキサメタゾンにより処置された５匹すべてのマウスには存在しなかった（図２５）。デキサメタゾン（合成ステロイド）が抗炎症性免疫抑制剤として作用する。ｒＩＧＦＢＰ７により処置されたマウス群では、３匹のマウスが完全な回復を示し（図２６）、１匹のマウスが部分的に回復し（５０％）、１匹の動物が組織学での乾癬の特徴を示しただけであった。興味深いことに、ｒＩＧＦＢＰ７による処置は表皮における乾癬表現型を逆戻りさせた一方で、単核の浸潤する細胞が、より少ない数であるにもかかわらず、真皮において依然として認められ得る。このことは、ＩＧＦＢＰ７は主として、疾患の病理発生の表皮成分を標的とすることを示唆する。
【０３４２】
結果の分析
ＩＧＦＢＰ７はケラチノサイトの増殖、分化およびアポトーシスを調節する−インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）７は、ＩＧＦシグナル伝達の調節に関与するＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する。ＩＧＦＢＰ７はいくつかのプロセス（例えば、性ホルモン放出の調整、細胞分裂促進シグナルの中和、老化の誘導、ガン細胞における接着および血管形成の調節など）に関わっている。加えて、ＩＧＦＢＰ７は乾癬表皮においてダウンレギュレーションされ、ＵＶＢ光線療法はその発現を正常に戻すことが見出された（Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  Ｍ．他、２００７）。
【０３４３】
本発明者らは、乾癬の主要な特徴との潜在的関連性がある４つのパラメーター、すなわち、細胞の増殖、分化、アポトーシスおよび老化に対するＩＧＦＢＰ７の影響を調べた。本発明者らは、低いＩＧＦＢＰ７発現がＨａＣａｔ細胞および初代ヒトケラチノサイトの両方において細胞増殖を誘発し、分化を阻止し、アポトーシスを低下させ、老化速度に対しては何ら影響を有しないことを見出した。逆に、ｒＩＧＦＢＰ７は、細胞のアポトーシスを誘導し、細胞増殖を低下させることが見出された。
【０３４４】
乾癬においては異常であるが、ケラチノサイトの増殖および分化の調節におけるＩＧＦＢＰ７の役割を、ＩＧＦＢＰ７がダウンレギュレーションされるインビトロシステムで調べた。ＨａＣａｔ細胞および初代ヒトケラチノサイトを、ＩＧＦＢＰ７特異的ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターによりトランスフェクションした。ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションはケラチノサイトの増殖を両方のシステムにおいて高めることが見出された。加えて、ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションは、ＴＮＦ−α誘導のアポトーシスに対するケラチノサイトの感受性における著しい低下を伴ったが、老化に対する影響は何ら有していなかった。ＩＧＦＢＰ７のダウンレギュレーションはまた、ヒトケラチノサイトのカルシウム誘導による分化に関連する遺伝子の発現を阻止することが見出された。
【０３４５】
加えて、組換えＩＧＦＢＰ７はケラチノサイトの増殖を著しく阻害し、ケラチノサイトのアポトーシスを高めることが見出された。これらのデータはＩＧＦＢＰ７をケラチノサイトの増殖および分化の主要な調節因子として位置づける。このことは、過増殖性障害（例えば、乾癬など）の病態生理学および処置におけるこのタンパク質についての潜在的役割を示唆する。
【０３４６】
エクスビボモデルを使用して、本発明者らは、ＩＧＦＢＰ７における低下が乾癬の表現型をもたらすことを示した（実施例６；図２２Ａ〜Ｂ）。加えて、インビボモデルを使用して、本発明者らは、組換えＩＧＦＢＰ７が乾癬をヒト−マウスのキメラモデルにおいて治癒させることを明らかにした（図２３〜図２６；実施例７）。
【０３４７】
結論として、これらのデータはＩＧＦＢＰ７をケラチノサイトの分化および増殖の重要な調節因子として位置づけ、したがって、このタンパク質を、ケラチノサイトの異常な増殖および分化を伴う様々な病状を処置するための魅力のある標的として示唆する。
【０３４８】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３４９】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０３５０】
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【配列表フリーテキスト】
【０３５１】
配列番号１７〜２０は、合成構築物の配列である。
配列番号３２および３３は、ＳｉＲＮＡ標的化ＩＧＦＢＰ７の配列である。
配列番号３４は、ＳｈＲＮＡ標的化ＩＧＦＢＰ７の配列である。
配列番号３５〜４６は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２１】
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【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ−７Ｄ】
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【図９Ａ−９Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５Ａ−１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ−２０Ｃ】
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【図２２Ａ−２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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