(57)【要約】  本発明は、哺乳類細胞によって発現される繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合し癌細胞浸潤を抑制する単離された抗体またはその抗体フラグメントを提供する。所望により、その抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５により結合されるＦＧＦＲ４のエピトープと結合するか、またはモノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５の相補性決定領域と同一の相補性決定領域を含んでなる。被験体において癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートし癌を処置するために抗体またはそのフラグメントを使用する方法も提供される。本発明は、加えて、浸潤性を抑制する抗体または抗体フラグメントを同定する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞によって発現される繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する単離された抗体またはその抗体フラグメントであって、癌細胞浸潤を抑制する、抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項２】
哺乳類細胞によって発現される繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記抗体および前記ポリペプチドが癌細胞浸潤を抑制する、ポリペプチド。
【請求項３】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８を発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する単離された抗体またはその抗体フラグメントであって、前記細胞におけるＦＧＦＲ４の繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性リン酸化を阻害する、抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項４】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８を発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記抗体および前記ポリペプチドが前記細胞におけるＦＧＦＲ４の繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性リン酸化を阻害する、ポリペプチド。
【請求項５】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８および繊維芽細胞増殖因子受容体−１（ＦＧＦＲ１）を共発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する単離された抗体またはその抗体フラグメントであって、前記細胞における繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性ＦＧＦＲ１分解を増大させる、抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項６】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８および繊維芽細胞増殖因子受容体−１（ＦＧＦＲ１）を共発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記抗体および前記ポリペプチドが前記細胞における繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性ＦＧＦＲ１分解を増大させる、ポリペプチド。
【請求項７】
前記細胞におけるＦＧＦＲ４のＦＧＦ２誘導性リン酸化も阻害する、請求項１、２、５および６のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項８】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８および膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）を共発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する単離された抗体またはその抗体フラグメントであって、前記細胞におけるＦＧＦＲ４とＭＴ１−ＭＭＰの間での複合体形成を阻害する、抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項９】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８および膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）を共発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記抗体および前記ポリペプチドが前記細胞におけるＦＧＦＲ４とＭＴ１−ＭＭＰの間での複合体形成を阻害する、ポリペプチド。
【請求項１０】
癌細胞浸潤を抑制する、請求項３〜９のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＦＧＦＲ４と結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項１２】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＦＧＦＲ４と結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも一つのＦＧＦＲ４ペプチドと結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号７からなるＦＧＦＲ４ペプチドと結合する、請求項１３に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項１５】
前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号１または２のアミノ酸残基７９〜８１を含んでなる配列番号１または２のエピトープと結合する、請求項１３に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項１６】
モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）により結合されるＦＧＦＲ４のエピトープと結合する、単離された抗体またはそのフラグメント。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）である、請求項２、４、６および９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記抗体フラグメントが、抗体のＳｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ダイアボディー、またはＦ（ａｂ’）２抗原結合フラグメントである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体フラグメントまたはポリペプチド。
【請求項１９】
モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）の総ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる単離された抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドであって、哺乳類細胞によって発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２０】
モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）の可変領域を含んでなる、請求項１９に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２１】
前記抗体または抗体フラグメントが、腫瘍細胞浸潤性アッセイにおいて、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８タンパク質を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤を抑制する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２２】
前記抗体または抗体フラグメントが前記細胞浸潤を少なくとも２５％減少させる、請求項２１に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２３】
前記抗体または抗体フラグメントが前記細胞浸潤を少なくとも５０％減少させる、請求項２１に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２４】
モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６）の総ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる単離された抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドであって、哺乳類細胞によって発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２６】
モノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６）の可変領域を含んでなる、請求項２５に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２７】
モノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６）である、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
モノクローナル抗体Ｆ９０−３Ｂ６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５）の総ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる単離された抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドであって、哺乳類細胞によって発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２９】
モノクローナル抗体Ｆ９０−３Ｂ６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５）の可変領域を含んでなる、請求項２８に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項３０】
モノクローナル抗体Ｆ９０−３Ｂ６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５）である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１、３、５、７、８、１０〜１５および２１〜２３のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項３２】
前記抗体がヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である、請求項１、３、５、７、８、１０〜１５、２０〜２３、２５、２６、２８、２９および３１のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項３３】
ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５、Ｆ８５−６Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６）、またはＦ９０−３Ｂ６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５）の可変領域またはＦＧＦＲ４と結合するこれらのいずれかのフラグメントを含んでなる、ヒト化抗体。
【請求項３４】
コンジュゲートまたは結合させた抗新生物薬または細胞傷害薬をさらに含んでなる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項３５】
前記抗新生物薬が放射性ヌクレオチドを含んでなる、請求項３４に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド、および生理学上許容される担体を含んでなる、組成物。
【請求項３７】
標準的治療の抗癌治療化合物をさらに含んでなる、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｃ刺激を抑制する薬剤をさらに含んでなる、請求項３６または３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記薬剤が、
ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦＲ−３もしくはＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインと結合する抗体または抗体フラグメント；
ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと結合するのに有効な、ＶＥＧＦＲ−３細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含んでなる可溶性タンパク質；および
ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと結合するのに有効な、ＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含んでなる可溶性タンパク質
からなる群から選択されるメンバーを含んでなる、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドが、モノクローナル抗体またはそのフラグメント（「第一のモノクローナル抗体またはそのフラグメント」）である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第一のモノクローナル抗体またはそのフラグメントによって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４の第二のエピトープと結合する第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメントをさらに含んでなる、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメントがヒトまたはヒト化抗体である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）阻害薬をさらに含んでなる、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬が、ＭＴ１−ＭＭＰと結合する抗体もしくはそのフラグメント、またはＭＴ１−ＭＭＰの小分子阻害薬である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬が、ＭＴ１−ＭＭＰゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズして、ＭＴ１−ＭＭＰ転写または翻訳を阻害する阻害薬核酸である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４６に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【請求項４８】
発現ベクターである、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
複製欠損性ウイルスベクターである、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
請求項４９に記載のベクターおよび生理学上許容される担体を含んでなる、組成物。
【請求項５１】
請求項４６〜４９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、単離された細胞。
【請求項５２】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを産生する、単離された細胞。
【請求項５３】
請求項２４、２７および３０〜３２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを産生する、ハイブリドーマ。
【請求項５４】
癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートする方法であって、癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または組成物と、癌細胞集団を接触させることを含んでなる、方法。
【請求項５５】
前記癌細胞が哺乳類被験体におけるものであり、前記接触が前記組成物を前記哺乳類被験体に投与することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
哺乳類被験体を処置する方法であって、
癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること；および
癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の、請求項３６〜４５および５０のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項５７】
（ｉ）前記組成物が請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを含んでなるものであ、かつ、
前記組成物の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドによって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４の第二のエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントを前記哺乳類被験体に投与することをさらに含んでなる、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
第二のエピトープと結合する前記抗体またはそのフラグメントが、ｍＡｂ  Ｆ９０−３Ｂ６またはそのフラグメントである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の組成物であり、かつ、膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）阻害薬を含んでなる組成物を前記哺乳類被験体に投与することをさらに含んでなる、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬が、ＭＴ１−ＭＭＰと結合する抗体もしくはそのフラグメント、またはＭＴ１−ＭＭＰの小分子阻害薬である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物が請求項３６、３７および４０〜４２のいずれか一項に記載の組成物であり、かつ、ＶＥＧＲ−３またはＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｃ刺激を抑制する薬剤を含んでなる組成物を前記哺乳類被験体に投与することをさらに含んでなる、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項６２】
標準的治療の抗癌療法を前記哺乳類被験体に投与することをさらに含んでなる、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
被験体において癌を処置する方法であって、癌を処置するのに有効な量の、請求項３６〜４５および５０のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与することを含んでなる、方法。
【請求項６４】
哺乳類被験体における癌細胞の浸潤、内方成長、または転移を抑制するための、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または組成物の使用。
【請求項６５】
哺乳類被験体における癌細胞の浸潤、内方成長、または転移を抑制するための、ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬、またはＶＥＧＦＲ−３もしくはＶＥＧＦＲ−２へのＶＥＧＦ−ＣもしくはＶＥＧＦ−Ｄの結合の阻害薬と組み合わせての、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
（ｉ）前記組成物が請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを含んでなるものであり、前記組成物の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドによって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４の第二のエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントと併用される、請求項６４または６５に記載の使用。
【請求項６７】
前記被験体がヒトである、請求項５４〜６６のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項６８】
前記癌が、乳癌、膀胱癌、黒色腫、前立腺癌、中皮腫、肺癌、精巣癌、甲状腺癌、扁平上皮癌、膠芽腫、神経芽腫、子宮癌、結腸直腸癌、および膵臓癌からなる群から選択される、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項６９】
抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨおよび前記ＶＬが、モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と同一のＣＤＲを含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項７０】
請求項６９に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【請求項７１】
請求項６９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項７０に記載のベクターを含んでなる細胞であって、（ａ）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含有する抗体または抗体フラグメントを発現し、かつ（ｂ）該抗体または抗体フラグメントがＦＧＦＲ４と結合する、細胞。
【請求項７２】
抗体または抗体フラグメントを選択する方法であって、
（ａ）ＦＧＦＲ４と結合する１以上の抗体または抗体フラグメントを得ること；
（ｂ）腫瘍細胞浸潤性アッセイにおいて前記抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること；および
（ｃ）前記アッセイにおいて浸潤性を少なくとも５０％抑制する抗体を選択すること
を含んでなる、方法。
【請求項７３】
前記（ｂ）が、繊維芽細胞増殖因子−２を化学誘引物質として使用する三次元コラーゲン浸潤アッセイにおいてＦＧＦＲ４を発現する腫瘍細胞の浸潤を検出することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
請求項７２または７３に記載の方法により選択された、単離された抗体または抗体フラグメント。
【請求項７５】
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７で寄託された、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項７６】
ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６で寄託された、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項７７】
ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５で寄託された、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項７８】
抗体ｍＡｂ  Ｆ９０−３Ｂ６を産生することができる、単離された細胞。
【請求項７９】
ハイブリドーマＦ９０−３Ｂ６（ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５）である、請求項７８に記載の単離された細胞。
【請求項８０】
抗体ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５を産生することができる、単離された細胞。
【請求項８１】
ハイブリドーマＦ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）である、請求項８０に記載の単離された細胞。
【請求項８２】
抗体ｍＡｂ  Ｆ８５−６Ｃ５を産生することができる、単離された細胞。
【請求項８３】
ハイブリドーマＦ８５−６Ｃ５（ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６）である、請求項８２に記載の単離された細胞。
【請求項８４】
ＦＧＦＲ４をコードするアミノ酸配列の５〜２５個のアミノ酸からなる単離された抗原ペプチドであって、配列番号５〜９のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列またはそのフラグメントを含んでなる、単離された抗原ペプチド。
【請求項８５】
請求項８４に記載の抗原ペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８６】
請求項８５に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【請求項８７】
請求項８６に記載のベクターを含んでなる、単離された細胞。
【請求項８８】
請求項８４に記載のペプチドおよびアジュバントを含んでなる、組成物。
【請求項８９】
前記癌においてＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードするＦＧＦＲ４対立遺伝子の有無を決定する工程を含み、前記癌がＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードする少なくとも１つのＦＧＦＲ４対立遺伝子を有する場合に前記処置が投与される、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
哺乳類被験体を処置する方法であって、
癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること（ここで、前記癌は、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードする少なくとも１つのＦＧＦＲ４対立遺伝子を含む細胞を含む）；および
癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の、請求項３６〜４５および５０のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項９１】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子の有無が、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８およびＧ３８８対立遺伝子と別個に結合する抗体または抗体フラグメントを用いてＦＧＦＲ４タンパク質をアッセイすることにより判定される、請求項８９または９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子の有無が、前記被験体由来または前記癌由来の核酸をアッセイすることにより判定される、請求項８９または９０に記載の方法。
【請求項９３】
哺乳類被験体を処置する方法であって、
癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること；ならびに
第一の抗ＦＧＦＲ４抗体またはそのＦＧＦＲ４結合フラグメントおよび第二の抗ＦＧＦＲ４抗体またはそのＦＧＦＲ４結合フラグメントを前記被験体に投与すること（ここで、前記第一の抗ＦＧＦＲ４抗体またはフラグメントはＦＧＦＲ４  Ｒ３８８のＦＧＦ２誘導性リン酸化を阻害し、前記第二の抗ＦＧＦＲ４抗体またはフラグメントはリガンド非依存性ＦＧＦＲ４リン酸化を阻害する）
を含んでなる、方法。
【請求項９４】
前記第一および第二の抗体またはそのフラグメントが、前記第一の抗体またはフラグメントを含む第一の組成物および前記第二の抗体またはフラグメントを含む第二の組成物として、同時にまたは逐次的に、別々に投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記癌の標準的治療の化学療法を前記被験体に投与することをさらに含んでなる、請求項９０〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００８年９月３日出願の米国仮特許出願第６１／０９３，９２５号、および２００９年３月２日出願の米国仮特許出願第６１／１５６，６３４号の優先権を主張するものである。
【発明の背景】
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、一般的には、癌療法、さらに繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）と結合する抗体および抗体フラグメントならびにその使用ならびにそれらを含有する併用療法に関する。
【０００３】
発明の背景
腫瘍細胞浸潤は、癌の病因において重要な役割を果たす。下にある基底膜への癌細胞の浸潤および遠隔臓器への転移は発癌現象および癌拡散における律速段階と考えられている。これらのプロセス中に、腫瘍細胞はその細胞表面を目標とするタンパク質分解活性により基底膜を通り抜け、コラーゲンまたはフィブリン豊富な間質の一時的基質に浸潤しそこで成長する。体の遠位領域における二次性腫瘍の形成は、治療上の選択肢を複雑にし、多くの場合、癌患者において不良な臨床転帰をもたらす。
【０００４】
現在の癌処置戦略は、アポトーシス促進療法、増殖抑制療法、および抗脈管形成療法を通じて腫瘍成長を阻害することに主眼を置いている。例えば、増殖因子受容体、例えば、繊維芽細胞増殖因子受容体は、増殖を抑制するための考えられる標的として示唆されている。例えば、St. Bernard et al., Endocrinology, 146(3): 1145-1153 (2005)参照。増殖因子受容体シグナル伝達の考えられるレギュレーターとしては、例えば、小分子、不活性化リガンド、および抗体が挙げられる。Kwabi-Addo et al., Endocrine-Related Cancer, 11: 709-724 (2004). Chen et al., Hybridoma, 24(3): 152-159 (2005)では、例えば、ヒト乳癌腫瘍細胞株におけるＦＧＦＲ４と結合する抗体が意図的に同定された。しかしながら、腫瘍浸潤を抑制しようとする試みはそれほど成功していない。よって、細胞浸潤へ向ける新たな介入の開発は、より効率的な癌処置のために決定的に重要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一般的には、癌などの新生物性障害の処置において有用な材料に関し、それらには抗体物質、核酸、ポリペプチド、および組成物が含まれる。本発明はさらに、かかる材料を使用する方法にも関し、それらには処置、医学的使用、および医薬組成物作製のための使用の方法が含まれる。本発明はまた、新規治療用物質についてスクリーニングするための手段および新規併用療法にも関する。
【０００６】
本発明は、（ｉ）哺乳類細胞によって発現される繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合し、かつ（ｉｉ）癌細胞浸潤を抑制する単離された抗体または抗体フラグメントを提供する。加えて、本発明は、モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５、ならびにモノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５の１以上の、好ましくは総ての相補性決定領域(all complementarity determine regions)（ＣＤＲ）を含んでなり、かつ哺乳類細胞において発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する単離された抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを提供する。もう１つの態様において、本発明は、単離された抗体、例えば、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５により結合されるＦＧＦＲ４のエピトープと結合するそのフラグメントなどを提供する。前記抗体によって認識されるＦＧＦＲ４は、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８タンパク質またはＦＧＦＲ４  Ｒ３８８変異体のアミノ酸配列を含んでなり得る。前記抗体、そのフラグメント、またはポリペプチドを、所望により他の治療用物質とおよび／または薬学上許容される担体（群）、賦形剤（群）、アジュバントなどと組み合わせて、含んでなる組成物も本発明に含まれる。
【０００７】
本発明はまた、特許請求する抗体またはそのフラグメントを作製するための材料および方法も提供する。例えば、本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含んでなる単離された宿主細胞、およびハイブリドーマを提供する。抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドもまた本発明により提供される。前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５  ＣＤＲと同一の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる。本発明はまた、抗体または抗体フラグメントを同定する方法も提供する。その方法は、ＦＧＦＲ４と結合する１以上の抗体または抗体フラグメントを得ること；腫瘍細胞浸潤性アッセイにおいて前記抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること；および前記アッセイにおいて浸潤性を少なくとも５０％抑制する抗体を同定することを含む。
【０００８】
本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントを使用する方法をさらに含む。例えば、癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートする方法を提供する。その方法は、癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の本発明の抗体またはそのフラグメントを含んでなる組成物と癌細胞集団を接触させることを含む。その方法はin vivoで行うことができるため、前記癌細胞は哺乳類被験体におけるものであり、前記接触工程は前記組成物を前記哺乳類被験体に投与することを含む。
【０００９】
もう１つの態様において、本発明は、本発明の抗体、そのフラグメント、またはポリペプチドを含んでなる組成物を投与することにより被験体を処置する方法を含む。例えば、一つの実施態様において、その方法は、癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること；および癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の本発明の組成物を前記被験体に投与することを含む。癌を処置する方法も提供される。その方法は、癌を処置するのに有効な量の本発明の抗体またはそのフラグメントを含んでなる組成物を前記被験体に投与することを含む。所望により、（ｉ）前記抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５により結合されるＦＧＦＲ４のエピトープと結合しかつ（ｉｉ）前記方法は、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５によって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４のエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントと癌細胞集団を接触させること（または前記被験体に投与すること）をさらに含む。あるいはまたは加えて、前記方法は、ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬と癌細胞集団を接触させること（または前記被験体に投与すること）を含み得る。
【００１０】
本発明のいくつかの変形において、前記被験体は、アミノ酸位置３８８のアルギニン（ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８）を特徴とする少なくとも１つのＦＧＦＲ４対立遺伝子を含む細胞を含む癌を有する。この特定の対立遺伝子は癌細胞浸潤亢進および不良な患者予後と関係しており、本発明の方法から思いもよらない利益を得る可能性がある。前記癌細胞は、ＦＧＦＲ４  Ｒ２８８対立遺伝子を、前記癌に局在する突然変異により有し得るかまたはその対立遺伝子の継承により有し得る。前記癌に１以上のＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子を有する癌患者を処置のために選択することは、本発明の態様として具体的に企図される。
【００１１】
以下の番号付けしたパラグラフ各々により、本発明の１以上の例示的な変形を簡潔に定義する：
１．哺乳類細胞によって発現される繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合し癌細胞浸潤を抑制する、単離された抗体またはその抗体フラグメント。
２．哺乳類細胞によって発現される繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記抗体および前記ポリペプチドが癌細胞浸潤を抑制する、ポリペプチド。
３．ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８（配列番号２）を発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合し前記細胞におけるＦＧＦＲ４の繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性リン酸化を阻害する、単離された抗体またはその抗体フラグメント。
４．ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８（配列番号２）を発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記抗体および前記ポリペプチドが前記細胞におけるＦＧＦＲ４の繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性リン酸化を阻害する、ポリペプチド。
５．ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８（配列番号２）および繊維芽細胞増殖因子受容体−１（ＦＧＦＲ１）を共発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する単離された抗体またはその抗体フラグメントであって、前記細胞における繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性ＦＧＦＲ１分解を増大させる、抗体またはその抗体フラグメント。
６．ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８（配列番号２）および繊維芽細胞増殖因子受容体−１（ＦＧＦＲ１）を共発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記抗体および前記ポリペプチドが前記細胞における繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性ＦＧＦＲ１分解を増大させる、ポリペプチド。
７．前記細胞におけるＦＧＦＲ４のＦＧＦ２誘導性リン酸化も阻害する、パラグラフ５または６の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
８．ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８（配列番号２）および膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）を共発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する単離された抗体またはその抗体フラグメントであって、前記細胞におけるＦＧＦＲ４とＭＴ１−ＭＭＰの間での複合体形成を阻害する、抗体またはその抗体フラグメント。
９．ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８（配列番号２）および膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）を共発現する哺乳類細胞上の繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記抗体および前記ポリペプチドが前記細胞におけるＦＧＦＲ４とＭＴ１−ＭＭＰの間での複合体形成を阻害する、ポリペプチド。
１０．癌細胞浸潤を抑制する、パラグラフ３〜９のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
１１．前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＦＧＦＲ４と結合する、パラグラフ１〜１０のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
１２．前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＦＧＦＲ４と結合する、パラグラフ１〜１０のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
１３．前記抗体が、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも一つのＦＧＦＲ４ペプチドと結合する、パラグラフ１〜１２のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
１４．配列番号７からなるＦＧＦＲ４ペプチドと結合する、パラグラフ１３の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
１５．前記抗体または抗体フラグメントが、アミノ酸残基７９〜８１を含んでなる配列番号１または２のエピトープと結合する、パラグラフ１３の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
１６．モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５により結合されるＦＧＦＲ４のエピトープと結合する、単離された抗体またはそのフラグメント。
１７．前記抗体がモノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５である、パラグラフ２、４、６および９のいずれか１つのポリペプチド。
１８．前記抗体フラグメントが、抗体のＳｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ダイアボディー、またはＦ（ａｂ’）２抗原結合フラグメントである、パラグラフ１〜１７のいずれか１つの抗体フラグメントまたはポリペプチド。
１９．モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５の総ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる単離された抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドであって、哺乳類細胞によって発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
２０．モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５の可変領域を含んでなる、パラグラフ１９の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
２１．前記抗体または抗体フラグメントが、腫瘍細胞浸潤性アッセイにおいて、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８タンパク質を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤を抑制する、パラグラフ１〜２０のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
２２．前記抗体または抗体フラグメントが腫瘍細胞浸潤性アッセイにおいて細胞浸潤を少なくとも２５％減少させる、パラグラフ２１の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
２３．前記抗体または抗体フラグメントが腫瘍細胞浸潤性アッセイにおいて細胞浸潤を少なくとも５０％減少させる、パラグラフ２１の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
２４．モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５である、パラグラフ２０の抗体。
２５．モノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５の総ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる単離された抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドであって、哺乳類細胞によって発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
２６．モノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５の可変領域を含んでなる、パラグラフ２５の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
２７．モノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５である、パラグラフ２６の抗体。
２８．モノクローナル抗体Ｆ９０−３Ｂ６の総ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる単離された抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドであって、哺乳類細胞によって発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
２９．モノクローナル抗体Ｆ９０−３Ｂ６の可変領域を含んでなる、パラグラフ２８の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
３０．モノクローナル抗体Ｆ９０−３Ｂ６である、パラグラフ２９の抗体。
３１．前記抗体がモノクローナル抗体である、パラグラフ１、３、５、７、８、１０〜１５および２１〜２３のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
３２．前記抗体がヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である、パラグラフ１、３、５、７、８、１０〜１５および２０〜３１のいずれか１つの抗体または抗体フラグメント。
３３．ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５、Ｆ８５−６Ｃ５、またはＦ９０−３Ｂ６の可変領域またはＦＧＦＲ４と結合するこれらのいずれかのフラグメントを含んでなる、ヒト化抗体。
３４．コンジュゲートまたは結合させた抗新生物薬または細胞傷害薬をさらに含んでなる、パラグラフ１〜３３のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
３５．前記抗新生物薬が放射性ヌクレオチドを含んでなる、パラグラフ３４の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
３６．パラグラフ１〜３５のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド、および生理学上許容される担体を含んでなる、組成物。
３７．標準的治療の抗癌治療化合物をさらに含んでなる、パラグラフ３６の組成物。
３８．ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｃ刺激を抑制する薬剤をさらに含んでなる、パラグラフ３６または３７の組成物。
３９．前記薬剤が、
ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦＲ−３もしくはＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインと結合する抗体または抗体フラグメント；
ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと結合するのに有効な、ＶＥＧＦＲ−３細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含んでなる可溶性タンパク質；および
ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと結合するのに有効な、ＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含んでなる可溶性タンパク質
からなる群から選択されるメンバーを含んでなる、パラグラフ３８の組成物。
４０．前記抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドが、モノクローナル抗体またはそのフラグメント（「第一のモノクローナル抗体またはそのフラグメント」）である、パラグラフ３６〜３８のいずれか１つの組成物。
４１．前記第一のモノクローナル抗体またはそのフラグメントによって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４の第二のエピトープと結合する第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメントをさらに含んでなる、パラグラフ４０の組成物。
４２．前記第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメントがヒトまたはヒト化抗体である、パラグラフ４１の組成物。
４３．膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）阻害薬をさらに含んでなる、パラグラフ３６〜４２のいずれか１つの組成物。
４４．前記ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬が、ＭＴ１−ＭＭＰと結合する抗体もしくはそのフラグメント、またはＭＴ１−ＭＭＰの小分子阻害薬である、パラグラフ４３の組成物。
４５．前記ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬が、ＭＴ１−ＭＭＰゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズして、ＭＴ１−ＭＭＰ転写または翻訳を阻害する阻害薬核酸である、パラグラフ４３の組成物。
４６．パラグラフ１〜３３のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
４７．パラグラフ４６のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
４８．発現ベクターである、パラグラフ４７のベクター。
４９．複製欠損性ウイルスベクターである、パラグラフ４８のベクター。
５０．パラグラフ４９のベクターおよび生理学上許容される担体を含んでなる、組成物。
５１．パラグラフ４６〜４９のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、単離された細胞。
５２．パラグラフ１〜３３のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを産生する、単離された細胞。
５３．パラグラフ２４、２７および３０〜３２のいずれか１つのモノクローナル抗体または抗体フラグメントを産生する、ハイブリドーマ。
５４．癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートする方法であって、癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の、パラグラフ１〜５０のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または組成物と、癌細胞集団を接触させることを含んでなる、方法。
５５．前記癌細胞が哺乳類被験体におけるものであり、前記接触が前記組成物を前記哺乳類被験体に投与することを含む、パラグラフ５４の方法。
５６．哺乳類被験体を処置する方法であって、
癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること；および
癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の、パラグラフ３６〜４５および５０のいずれか１つの組成物を前記被験体に投与すること
を含んでなる、方法。
５７．（ｉ）前記組成物がパラグラフ１３〜１７のいずれか１つによる抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを含んでなるものであり、かつ、
前記組成物の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドによって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４の第二のエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントを前記哺乳類被験体に投与することをさらに含んでなる、パラグラフ５５または５６の方法。
５８．第二のエピトープと結合する前記抗体またはそのフラグメントが、ｍＡｂ  Ｆ９０−３Ｂ６またはそのフラグメントである、パラグラフ５７の方法。
５９．前記組成物がパラグラフ３６〜４２のいずれか１つによる組成物であり、かつ、膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）阻害薬を含んでなる組成物を前記哺乳類被験体に投与することをさらに含んでなる、パラグラフ５５または５６の方法。
６０．前記ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬が、ＭＴ１−ＭＭＰと結合する抗体もしくはそのフラグメント、またはＭＴ１−ＭＭＰの小分子阻害薬である、パラグラフ５９の方法。
６１．前記組成物がパラグラフ３６、３７および４０〜４２のいずれか１つによる組成物であり、かつ、ＶＥＧＲ−３またはＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｃ刺激を抑制する薬剤を含んでなる組成物を前記哺乳類被験体に投与することをさらに含んでなる、パラグラフ５５または５６の方法。
６２．標準的治療の抗癌療法を前記哺乳類被験体に投与することをさらに含んでなる、パラグラフ５５〜６１のいずれか１つの方法。
６３．被験体において癌を処置する方法であって、癌を処置するのに有効な量の、パラグラフ３６〜４５および５０のいずれか１つの組成物を前記被験体に投与することを含んでなる、方法。
６４．哺乳類被験体における癌細胞の浸潤、内方成長、または転移を抑制するための、パラグラフ１〜５０のいずれか１つの抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または組成物の使用。
６５．哺乳類被験体における癌細胞の浸潤、内方成長、または転移を抑制するための、ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬、またはＶＥＧＦＲ−３もしくはＶＥＧＦＲ−２へのＶＥＧＦ−ＣもしくはＶＥＧＦ−Ｄの結合の阻害薬と組み合わせての、パラグラフ６４による使用。
６６．（ｉ）前記組成物がパラグラフ１３〜１７のいずれか１つによる抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを含んでなるものであり、前記組成物の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドによって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４の第二のエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントと併用される、パラグラフ６４または６５による使用。
６７．前記被験体がヒトである、パラグラフ５４〜６６のいずれか１つの方法または使用。
６８．前記癌が、乳癌、膀胱癌、黒色腫、前立腺癌、中皮腫、肺癌、精巣癌、甲状腺癌、扁平上皮癌、膠芽腫、神経芽腫、子宮癌、結腸直腸癌、および膵臓癌からなる群から選択される、パラグラフ５４〜６７のいずれか１つの方法または使用。
６９．抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨおよび前記ＶＬが、モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５の相補性決定領域（ＣＤＲ）と同一のＣＤＲを含んでなる、ポリヌクレオチド。
７０．パラグラフ６９によるポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
７１．パラグラフ６９によるポリヌクレオチドまたはパラグラフ７０によるベクターを含んでなる細胞であって、（ａ）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含有する抗体または抗体フラグメントを発現し、かつ（ｂ）該抗体または抗体フラグメントがＦＧＦＲ４と結合する、細胞。
７２．抗体または抗体フラグメントを選択する方法であって、
（ａ）ＦＧＦＲ４と結合する１以上の抗体または抗体フラグメントを得ること；
（ｂ）腫瘍細胞浸潤性アッセイにおいて前記抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること；および
（ｃ）前記アッセイにおいて浸潤性を少なくとも５０％抑制する抗体を選択すること
を含んでなる、方法。
７３．前記（ｂ）が、繊維芽細胞増殖因子−２を化学誘引物質として使用する三次元コラーゲン浸潤アッセイにおいてＦＧＦＲ４を発現する腫瘍細胞の浸潤を検出することを含む、パラグラフ７２の方法。
７４．パラグラフ７２またはパラグラフ７３の方法により選択された、単離された抗体または抗体フラグメント。
７５．Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７で寄託された、ハイブリドーマ細胞株。
７６．ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６で寄託された、ハイブリドーマ細胞株。
７７．ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５で寄託された、ハイブリドーマ細胞株。
７８．抗体ｍＡｂ  Ｆ９０−３Ｂ６を産生することができる、単離された細胞。
７９．ハイブリドーマＦ９０−３Ｂ６（ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５）である、パラグラフ７８の単離された細胞。
８０．抗体ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５を産生することができる、単離された細胞。
８１．ハイブリドーマＦ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）である、パラグラフ８０の単離された細胞。
８２．抗体ｍＡｂ  Ｆ８５−６Ｃ５を産生することができる、単離された細胞。
８３．ハイブリドーマＦ８５−６Ｃ５（ＤＳＭＺ寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６）である、パラグラフ８２の単離された細胞。
８４．ＦＧＦＲ４をコードするアミノ酸配列の５〜２５個のアミノ酸からなる単離された抗原ペプチドであって、配列番号５〜９のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列またはそのフラグメントを含んでなる、単離された抗原ペプチド。
８５．パラグラフ８４の抗原ペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
８６．パラグラフ８５のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
８７．パラグラフ８６のベクターを含んでなる、単離された細胞。
８８．パラグラフ８４のペプチドおよびアジュバントを含んでなる、組成物。
８９．前記癌においてＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードするＦＧＦＲ４対立遺伝子の有無を決定する工程を含み、前記癌がＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードする少なくとも１つのＦＧＦＲ４対立遺伝子を有する場合に前記処置が投与される、パラグラフ５６〜６３のいずれか１つの方法。
９０．哺乳類被験体を処置する方法であって、
癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること（ここで、前記癌は、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードする少なくとも１つのＦＧＦＲ４対立遺伝子を含む細胞を含む）；および
癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の、請求項３６〜４５および５０のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与すること
を含んでなる、方法。
９１．ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子の有無が、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８およびＧ３８８対立遺伝子と別個に結合する抗体または抗体フラグメントを用いてＦＧＦＲ４タンパク質をアッセイすることにより判定される、パラグラフ８９または９０の方法。
９２．ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子の有無が、前記被験体由来または前記癌由来の核酸をアッセイすることにより判定される、パラグラフ８９または９０の方法。
９３．哺乳類被験体を処置する方法であって、
癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること；ならびに
第一の抗ＦＧＦＲ４抗体またはそのＦＧＦＲ４結合フラグメントおよび第二の抗ＦＧＦＲ４抗体またはそのＦＧＦＲ４結合フラグメントを前記被験体に投与すること（ここで、前記第一の抗ＦＧＦＲ４抗体またはフラグメントはＦＧＦＲ４  Ｒ３８８のＦＧＦ２誘導性リン酸化を阻害し、前記第二の抗ＦＧＦＲ４抗体またはフラグメントはリガンド非依存性ＦＧＦＲ４リン酸化を阻害する）
を含んでなる、方法。
９４．前記第一および第二の抗体またはそのフラグメントが、前記第一の抗体またはフラグメントを含む第一の組成物および前記第二の抗体またはフラグメントを含む第二の組成物として、同時にまたは逐次的に、別々に投与される、パラグラフ９３の方法。
９５．前記癌の標準的治療の化学療法を前記被験体に投与することをさらに含んでなる、パラグラフ９０〜９４のいずれか１つによる方法。
【００１２】
上述の概要は、本発明の総ての態様を定義するものではなく、他の節、例えば、詳細な説明などにおいてさらなる態様が記載される。本文書全体は統合的開示として関係づけられるものであり、特徴の組合せが本文書と同じ文、またはパラグラフ、または節において一緒に記載されていなくても、本明細書において記載される特徴の総ての組合せが企図されることは理解されるべきである。タンパク質（例えば、抗体）療法が記載されている場合には、ポリヌクレオチド療法（前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド／ベクターを使用）を含む実施態様が具体的に企図され、その逆もまた当てはまる。本発明の実施態様が特定の抗体、例えば、ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体などに関して記載されている場合には、抗体フラグメント、変異体などを含む類似実施態様が具体的に企図されることは理解されるべきである。
【００１３】
上述のものに加えて、本発明は、さらなる態様として、上に具体的に記述された変形より多少なりとも範囲が狭い本発明の総ての実施態様を含む。属として記載された本発明の態様に関して、総ての個別の種は個別に本発明の独立した態様とみなされる。「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」を用いて記載されたまたは特許請求された本発明の態様に関して、これらの用語は、文脈上より限定された意味に解すべき場合を除き「１以上の」を意味することは理解されるべきである。１セット内での１以上と記載された要素に関して、そのセット内での総ての組合せが企図されることは理解されるべきである。
【００１４】
本出願人（ら）は添付の特許請求の範囲の全範囲を発明したが、添付の特許請求の範囲はそれらの範囲に他者の先行技術を包含するものではない。従って、特許庁あるいは他の団体または個人により、本出願人らに対して請求項の範囲内にある法定先行技術が指摘された場合には、本出願人（ら）は適用される特許法の下に補正の権利を行使する権利を留保し、かかる法定先行技術または法定先行技術の明らかな変形をかかる請求項の範囲から具体的に排除するようにかかる請求項の対象を再定義する。かかる特許請求の範囲の補正によって定義された本発明の変形もまた、本発明の態様として意図される。本発明のさらなる特徴および変形は本願全体から当業者には明らかであり、かかる総ての特徴は本発明の態様として意図される。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本発明は、少なくとも一部は、周囲組織への癌細胞の浸潤を抑制するある特定の抗繊維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）抗体の予期せぬ同定に関する。特定の作用機序に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、驚くべきことに、ＦＧＦＲ４はヒト膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）と機能的に関係しており、そしてそれは癌および反応性細胞において発現されることを見つけ出した。ＭＴ１−ＭＭＰは、主として、組織微小環境に隔離され、数多くの公知のＭＭＰ阻害薬による不活性化を逃れることができる。ＦＧＦＲ４は、ＭＴ１−ＭＭＰにより媒介される転移事象の新規標的となる。本発明は、ＦＧＦＲ４と結合し癌細胞浸潤を抑制またはダウンレギュレートする単離された抗体またはそのフラグメント、ならびに癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするために前記抗体またはそのフラグメントを使用する方法を提供する。このように、本発明の抗体は、癌の進行を遅らせる治療的有用性を有する。
【００１６】
ＦＧＦＲ４
ＦＧＦＲ４は、ＦＧＦにより活性化される４回膜貫通型受容体チロシンキナーゼの１つである(Givol et al., FASEB J., 6: 3362-3369, 1992)。その受容体は、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、チロシンキナーゼ、およびＣＯＯＨ末端尾部からなる(Givol et al., 前掲)。少なくとも２つの既知ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列が報告されており、コドン３８８に作用する突然変異の結果として異なり、この位置においてグリシン（ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８、配列番号１）またはアルギニン（ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８、配列番号２）のいずれかとなる。Ｒ３８８突然変異を有する対立遺伝子は、浸潤性腫瘍進行と相関し、不良な臨床転帰の指標と考えられる（例えば、Bange et al., Cancer Res., 62(3): 840-7, 2002参照）。その突然変異は、タンパク質の膜貫通ドメインにおいて疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸との置換をもたらす。この関連で、野生型ＦＧＦＲ４膜貫通ドメインはおおよそアミノ酸配列ＲＹＴＤＩＩＬＹＡＳＧＳＬＡＬＡＶＬＬＬＬＡＧＬＹ（配列番号３）を含んでなり、一方、Ｒ３８８変異体はおおよそアミノ酸配列ＲＹＴＤＩＩＬＹＡＳＧＳＬＡＬＡＶＬＬＬＬＡＲＬＹ（配列番号４）を含んでなる膜貫通ドメインを含んでなる。Ｒ３８８  ＦＧＦＲ４変異体は、例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Bange et al., 前掲；および米国特許第６，７７０，７４２号にさらに記載されている。
【００１７】
抗体およびそのフラグメント
本発明のいくつかの実施態様または態様は、ＦＧＦＲ４（任意のＦＧＦＲ４ポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなり、ＦＧＦＲ４のあらゆる天然に存在するアイソフォームまたは対立遺伝子変異体が含まれる）の細胞外エピトープと結合し癌細胞浸潤を抑制する抗体またはそのフラグメントに関する。例えば、前記抗体またはそのフラグメントは、哺乳類（例えば、ヒト）細胞の表面で発現されるＦＧＦＲ４と結合する。前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を含んでなるＦＧＦＲ４（一般にＦＧＦＲ４  Ｇ３８８対立遺伝子と呼ばれる）と結合することができる。あるいはまたは加えて、前記抗体またはそのフラグメントは、野生型ＦＧＦＲ４の３８８位のグリシンがアルギニンと置換されているＦＧＦＲ４（ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子）（配列番号２）と結合することができる。
【００１８】
好ましくは、前記抗体またはそのフラグメントはＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する。ＦＧＦＲ４の細胞外領域の３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインは、膜貫通ドメインを超えて細胞外間隙に広がり、配列番号１および２に関しては、ＦＧＦＲ４アミノ酸配列のおおよそアミノ酸残基２５〜３６９を含んでなる。本発明のある特定の態様において、前記抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸残基２５〜３６６にわたる細胞外ドメインの領域に位置する細胞外エピトープ、例えば、ＦＧＦＲ４の細胞外領域の最初の免疫グロブリン様ドメイン（ＦＧＦＲ４アミノ酸配列のおおよそアミノ酸残基５０〜１０７にわたる）などと結合する。ＦＧＦＲ４の細胞外ドメインは、Loo et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 32: 489-97, 2000;およびSorenson et al., J. Cell. Sci., 117: 1807-1819, 2004にさらに記載されており、ＦＧＦＲ４に関するそれらの開示は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１９】
いかなるタイプの抗体も本発明において好適であり、それらには全長重鎖および／または軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、またはヒト型が含まれる。本発明はまた、本発明のＦＧＦＲ４抗体のＦＧＦＲ４結合特性を保持する抗体フラグメント（および／または抗体フラグメントを含んでなるポリペプチド）も含む。抗体フラグメントには、抗体の抗原結合領域および／またはエフェクター領域、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｃ、およびＦｖフラグメント（非共有結合された重鎖可変領域と軽鎖可変領域からなるフラグメント）、または単一ドメイン抗体（ナノボディー）が含まれる。一般用語において、可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重（ＶＨ）鎖可変ドメインおよび／または軽（ＶＬ）鎖可変ドメインの任意の好適な配列であってよい。よって、例えば、Ｖ領域ドメインは二量体で、ＦＧＦＲ４と結合するＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含んでよい。必要に応じて、そのＶＨ鎖およびＶＬ鎖は直接またはリンカーを通じて共有結合し、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成してよい。参照しやすいように、ｓｃＦｖタンパク質は本明細書においてカテゴリー「抗体フラグメント」に含まれるとみなされる。同様に、抗体フラグメントは、癌細胞浸潤を抑制するために、単一ドメイン抗体、マキシボディー（maxibodies）、ミニボディー(minibodies)、イントラボディー(intrabodies)、ダイアボディー、トリアボディー(triabodies)、テトラボディー(tetrabodies)、新抗原受容体(new antigen receptors)（ｖ−ＮＡＲ）の可変ドメイン、およびビス−単鎖Ｆｖ領域(bis-single chain Fv regions)に組み込んでよい（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology, 23(9): 1126-1136, 2005参照）。加えて、本発明は、哺乳類細胞によって発現される繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）の細胞外エピトープと結合する抗体のフラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドを提供する。必要に応じて、抗体フラグメントは、エフェクター機能（例えば、細胞傷害性、免疫補充活性など）を有する部分、混合物からの単離を容易にする部分（例えば、タグ）、検出標識などと融合される。本明細書において記載される本発明の抗体またはそのフラグメントの特徴は、抗体フラグメントを含んでなるポリペプチドにも及ぶことは理解されるべきである。
【００２０】
前記抗体または抗体フラグメントは、合成または遺伝子操作の免疫動物から単離することができる。抗体由来の抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質分解による加水分解により、得ることができる。例えば、全抗体のパパインまたはペプシン消化により、それぞれ、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメント（すなわち、２つの一価Ｆａｂフラグメント）およびＦｃフラグメントが生ずる。Ｆ（ａｂ）２は、チオール還元剤を用いてさらに開裂することができ、３．５Ｓ  Ｆａｂ一価フラグメントが得られる。抗体フラグメントを作出する方法は、例えば、Edelman et al., Methods in Enzymology, 1: 422 Academic Press (1967); Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244, 1960; Porter, Biochem. J., 73: 119-127, 1959;米国特許第４，３３１，６４７号;およびAndrews, S.M. and Titus, J. A.によるCurrent Protocols in Immunology (Coligan et al., eds), John Wiley & Sons, New York (2003), ２．８．１−２．８．１０頁および２．１０Ａ．１−２．１０Ａ．５頁にさらに記載されている。
【００２１】
抗体またはそのフラグメントも、例えば、組換えＤＮＡ工学技術により作出された可変領域ドメインを含んでなるように遺伝子操作することができる。例えば、特異的抗体可変領域を、抗体のアミノ酸配列中またはその配列への挿入、欠失、または変更によって修飾し、対象となる抗体を作製することができる。この関連で、対象となる相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用い抗体産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として用いて可変領域を合成することにより調製される（例えば、Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), １６６頁(Cambridge University Press 1995); Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), １３７頁(Wiley-Liss, Inc. 1995);およびLarrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2: 106-110, 1991参照）。現在の抗体操作技術は、第一の抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲおよび所望により１以上のフレームワークアミノ酸、ならびに第二の抗体由来の可変領域ドメイン残部を含有する操作された可変領域ドメインの構築を可能にする。かかる技術は、例えば、抗体をヒト化するためまたは結合標的に対する抗体の親和性を向上させるために用いられる。
【００２２】
「ヒト化抗体」は、モノクローナル抗体の相補性決定領域が非ヒト免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖からヒト可変ドメインへと移入された組換えタンパク質である。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合には、定常領域は、所望によりヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％同一、ある特定の実施態様においては約９５％以上同一である。よって、ある場合には、ヒト化免疫グロブリンの総ての部分（場合によってはＣＤＲの部分を除く）は、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、一態様において、ヒト化抗体は、宿主抗体の超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（宿主抗体）である。本明細書において記載されるもののようなヒト化抗体は、当業者には公知の技術を用いて作製することができる（Zhang et al., Molecular Immunology, 42(12): 1445-1451, 2005; Hwang et al., Methods, 36(1): 35-42, 2005; Dall'Acqua et al., Methods, 36(1): 43-60, 2005; Clark, Immunology Today, 21(8): 397-402, 2000、ならびに米国特許第６，１８０，３７０号；同第６，０５４，９２７号；同第５，８６９，６１９号；同第５，８６１，１５５号；同第５，７１２，１２０号；および同第４，８１６，５６７号、それらの総ては、これによって総て明示的に引用することにより本明細書の一部とされる）。
【００２３】
一つの実施態様において、前記抗体は、ヒト抗体、例えば、限定されるものではないが、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方が、例えば、Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242に記載されているヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体などである。抗体が定常領域を含む場合には、定常領域も、好ましくはヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来のものである。ヒト抗体は、例えば、抗体の活性を増大させるために、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含んでなってよいが、他の種由来のＣＤＲ（すなわち、ヒト可変フレームワーク領域内に置かれるマウスＣＤＲ）を含まない。
【００２４】
前記抗体またはそのフラグメントは、癌細胞浸潤を抑制し（または減少させ）かつ／または他の望ましい活性パラメーターの１以上が保持される限り、ＦＧＦＲ４のいずれの領域と結合してもよい。一つの実施態様において、本発明はさらに、下の実施例においてさらに記載される、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ９０−１０Ｃ５（本明細書では「１０Ｃ５」とも呼ぶ）により結合されるＦＧＦＲ４のエピトープと結合する単離された抗体または抗体フラグメントを提供する。ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５の結合活性は、ＦＧＦＲ４の細胞外領域の最初の免疫グロブリン様ドメインに局在する（図３Ａ〜３Ｃ参照）。驚くべきことに、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５は、ＦＧＦＲ４の細胞外ドメイン（シグナル配列を除く）のアミノ酸６７〜９３にわたる一連の１５のアミノ酸フラグメント（それらの配列は３つのアミノ酸で重複）で構成された免疫ブロッティングアレイによって判定されたように、ＦＧＦＲ４アミノ酸配列のおおよそアミノ酸６７〜９３内の線状エピトープを認識する。ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５は、以下のＦＧＦＲ４フラグメント：ＹＫＥＧＳＲＬＡＰＡＧＲＶＲＧ（配列番号５）；ＧＳＲＬＡＰＡＧＲＶＲＧＷＲＧ（配列番号６）；ＬＡＰＡＧＲＶＲＧＷＲＧＲＬＥ（配列番号７）；ＡＧＲＶＲＧＷＲＧＲＬＥＩＡＳ（配列番号８）；およびＶＲＧＷＲＧＲＬＥＩＡＳＦＬＰ（配列番号９）と結合する。前記単離抗体またはそのフラグメントは、好ましくは、配列番号５〜９に記載されたアミノ酸配列の任意の１以上を含んでなるペプチドと結合する。より好ましくは、前記単離抗体またはそのフラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる（またはからなる）ペプチドと結合する。
【００２５】
ＦＧＦＲ４と結合し癌細胞浸潤を抑制する他の抗体も、本発明において好適である。例えば、様々な実施態様において、本発明は、（ｉ）ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５との結合について競合するか、（ｉｉ）ＦＧＦＲ４  ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５によって認識される領域と結合するか、または（ｉｉｉ）ＦＧＦＲ４細胞外領域のアミノ酸残基６７〜９３（例えば、アミノ酸残基７３〜８７またはアミノ酸残基７９〜８１）においてまたはその近くで結合すると同時に、癌細胞浸潤を抑制する、抗体またはそのフラグメントを投与することを含む。必要に応じて、前記抗体フラグメントは、抗体、例えば、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５などの抗原結合エレメントの総てまたは一部（ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５（または本発明の任意の他の抗体）の可変領域を含む）を含んでなる。前記抗体フラグメントは、抗体の抗原結合エレメントの総てまたは一部を含んでなり得るが抗体のフレームワーク領域の総てまたは一部を含まない。この関連で、前記単離抗体またはそのフラグメントは、癌細胞浸潤を抑制するＦＧＦＲ４結合抗体、例えば、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ（すなわち、総て）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる。相補性決定領域および特異性決定領域を同定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Tamura et al., J. Immunol, 164: 1432-1441, 2000にさらに記載されている。一つの実施態様において、前記抗体またはそのフラグメントはｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５またはそのＦＧＦＲ４結合フラグメントである。
【００２６】
本発明において、抗体結合とは、抗体の可変領域と抗原との免疫反応を指し、他のタンパク質−タンパク質相互作用（例えば、免疫グロブリンとの黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)プロテインＡ相互作用など）とは異なる。前記抗体またはそのフラグメントは、好ましくは、ＦＧＦＲ４と選好的に結合し、前記抗体またはそのフラグメントが、関連のない対照タンパク質と結合するよりも高い親和性でＦＧＦＲ４と結合することを意味する。より好ましくは、前記抗体またはそのフラグメントは、ＦＧＦＲ４（またはその部分）を特異的に認識し結合する。「特異的結合」とは、関連のない対照タンパク質との交差反応性が本質的にないことを意味する。本発明のいくつかの変形において、前記抗体はＦＧＦＲ４と実質的に排他的に結合する（すなわち、結合親和性の測定可能な差異によってＦＧＦＲ４と他の公知のポリペプチド（例えば、他のＦＧＦＲ）とを区別することができる）。実施態様に応じて、前記抗体またはそのフラグメントは、関連のない対照タンパク質に対する親和性より少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍高い親和性でＦＧＦＲ４と結合する。他の変形において、前記抗体は、他のＦＧＦＲ配列と交差反応する。抗体の結合特異性／親和性を決定し、さらに結合部位について競合する（すなわち、例えば、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５の、ＦＧＦＲ４との交差阻害結合）抗体を同定するためのスクリーニングアッセイは周知で、当技術分野では日常的に実施されている。例えば、結合親和性または交差阻害は、実施例に記載される方法を用いて決定することができる。表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定する、Biacore社装置使用の競合結合アッセイも適している。もう１つの好適なアッセイは、ＦＧＦＲ４との結合に関しての抗体間の競合を測定するＥＬＩＳＡに基づくアプローチを用いる。結合アッセイの網羅的な議論については、Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), 第６章を参照のこと。一般的に、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５と「競合する」かまたは「交差阻害する」抗体は、ＦＧＦＲ４とのｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５の結合を５０％〜１００％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）妨げる。
【００２７】
抗体およびそのフラグメントを作製するための材料および方法
本発明による抗体は、任意の好適な方法により、例えば、本明細書において記載され当技術分野で公知の免疫化および細胞融合手法および／または本明細書において記載されるＦＧＦＲ４細胞外ドメインエピトープを用いた抗体または抗体フラグメントライブラリーのスクリーニングなどにより得ることができる。本発明のモノクローナル抗体は、種々の公知の技術を用いて作出される（例えば、Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1: 2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.) (1980); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); およびPicksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 第２版, Glover et al. (eds.), ９３頁 (Oxford University Press 1995)参照）。一つの実施態様において、本発明は、抗体ｍＡｂ  Ｆ９０−３Ｂ６、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５、またはｍＡｂ  Ｆ８５−６Ｃ５を産生することができる単離された細胞を提供する。一般に、モノクローナル抗体はハイブリドーマによって産生され、本発明は、本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを産生するハイブリドーマを提供する。抗体Ｆ９０−１０Ｃ５、Ｆ８５−６Ｃ５、およびＦ９０−３Ｂ６を産生するハイブリドーマ細胞株は、本発明によって提供され、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（the Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure）(「ブダペスト条約」)の規定に基づいてthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Wep 1b. D-38124, Germanyに寄託され、それぞれ、寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６、およびＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５が割り当てられた。
【００２８】
同様に、ヒト抗体は、限定されるものではないが、ヒト末梢血液細胞（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のin vitro免疫化、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する免疫トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、または当技術分野で公知であり本明細書における開示に基づく他の手法を含む複数の技術のいずれかによって作出される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法は、例えば、Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8: 455-58, 1997; Jakobovits et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 764: 525-35, 1995; Green et al., Nature Genet., 7: 13-21, 1994; Lonberg et al., Nature, 368: 856-859, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6: 579-591, 1994; および米国特許第５，８７７，３９７号にさらに記載されている。
【００２９】
例えば、ヒト抗体は、抗原投与に応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物から得られる。例えば、国際特許公報第ＷＯ  ９８／２４８９３号には、内因性重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の不活性化により機能的内因性免疫グロブリンを産生しない、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物が開示されている。また、抗体が霊長類定常領域および／または可変領域を有し、遺伝子座をコードする内因性免疫グロブリンが置換または不活性化されている、免疫原に対する免疫応答を開始することができるトランスジェニック非霊長類哺乳類宿主も記載されている。国際特許公報第ＷＯ  ９６／３０４９８号には、哺乳類における免疫グロブリン遺伝子座を修飾するため、例えば、定常領域または可変領域の総てまたは一部を置き換え修飾抗体分子を形成するなどのためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用が開示されている。国際特許公報第ＷＯ  ９４／０２６０２号には、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座と機能的ヒトＩｇ遺伝子座とを有する非ヒト哺乳類宿主が開示されている。米国特許第５，９３９，５９８号には、内因性重鎖を欠き１以上の異種定常領域を含んでなる外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法が開示されている。トランスジェニック動物、例えば、本明細書において記載されるトランスジェニック動物などを用いて、選択された抗原分子に対して免疫応答を引き起こすことができ、抗体産生細胞を動物から取り出し、ヒト由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために用いることができる。免疫化プロトコール、アジュバントなどは、当技術分野で公知であり、国際特許公報第ＷＯ  ９６／３３７３５号に記載されているように、例えば、トランスジェニックマウスの、免疫化に用いられる。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物活性または生理学的効果を阻害または中和する能力について試験することができる。
【００３０】
本発明は、本発明の抗ＦＧＦＲ４抗体およびそのフラグメントを作出するための材料を提供する。例えば、本発明は、本発明の抗体または抗体フラグメントを産生する単離された細胞（例えば、ハイブリドーマ）、例えば、本明細書においてさらに記載されるハイブリドーマ細胞株Ｆ９０−１０Ｃ５、Ｆ８５−６Ｃ５、およびＦ９０−３Ｂ６などを提供する。本発明はさらに、本発明の抗体または抗体フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。本発明の一態様において、前記単離ポリヌクレオチドは、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および／または抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、ここで、前記ＶＨおよび前記ＶＬは、モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５の相補性決定領域（ＣＤＲ）と同一のＣＤＲを含んでなる。
【００３１】
関連実施態様において、本発明は、好適な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を命令するために本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。かかるベクターは、例えば、有用な量を与えるために宿主細胞においてポリヌクレオチドを増幅するため、および組換え技術を用いて、ペプチド、例えば、抗体または抗体フラグメントなどを発現するために、有用である。好ましい実施態様において、前記ベクターは、本発明のポリヌクレオチドが、発現制御配列を含んでなるポリヌクレオチドと機能しうる形で連結された発現ベクターである。本発明のポリヌクレオチドを組み込んでいるプラスミドおよびウイルスＤＮＡベクターなどの自己複製する組換え発現構築物が具体的に企図される。発現制御ＤＮＡ配列としては、プロモーター、エンハンサー、およびオペレーターが挙げられ、一般的には、発現構築物が利用される発現系に基づいて選択される。好ましいプロモーター配列およびエンハンサー配列は、一般的に、遺伝子発現を増加させる能力のために選択され、一方、オペレーター配列は、一般的に、遺伝子発現を調節する能力のために選択される。本発明の発現構築物はまた、発現構築物を有する宿主細胞の同定を可能にする１以上の選択マーカーをコードする配列も含んでよい。発現構築物はまた、宿主細胞における相同組換えを容易にし、好ましくは促進する配列も含んでよい。本発明の好ましい発現構築物はまた、宿主細胞における複製に必要な配列も含んでよい。
【００３２】
例示的な発現制御配列としては、標的哺乳類細胞における発現のための、プロモーター／エンハンサー配列、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー(Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29: 2494-2502, 1991; Boshart et al., Cell, 41: 521-530, 1985)；ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Davis et al., Hum. Gene Ther., 4: 151, 1993)；Ｔｉｅプロモーター(Korhonen et al., Blood, 86(5): 1828-1835, 1995)；シミアンウイルス４０プロモーター；ＤＲＡ（ダウンレギュレーティド・イン・アデノーマ(downregulated in adenoma)；Alrefai et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol, 293: G923-G934, 2007）；ＭＣＴ１（モノカルボン酸輸送体１；Cuff et al., Am. J. Physiol. Gastrointet. Liver Physiol, G977-G979. 2005）；およびＭａｔｈ１（マウスアトナルホモログ１(mouse atonal homolog 1)；Shroyer et al., Gastroenterology, 132: 2477-2478, 2007）が挙げられ、プロモーターはポリペプチドコード配列の上流（すなわち、５’）に機能しうる形で連結される（引用した参考文献の開示は全体として特に発現制御配列の考察に関して引用することにより本明細書の一部とされる）。もう１つの変形において、前記プロモーターは、上皮特異的プロモーターまたは内皮特異的プロモーターである。本発明のポリヌクレオチドはまた、所望により、ポリペプチドコード配列の下流（すなわち、３’）に機能しうる形で連結された好適なポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０またはヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化配列）も含んでよい。
【００３３】
必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドはまた、所望により、ポリペプチド配列とインフレームで融合された分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列も含んでなる。分泌シグナルペプチドは、前記ポリヌクレオチドを発現する細胞による本発明のポリペプチドの分泌を命令し、分泌されたポリペプチドから細胞により切断される。前記ポリヌクレオチドはさらに、所望により、例えば、細菌における、ベクターの大量生産を促すことだけが目的の機能である配列、例えば、細菌複製起点および選択マーカーをコードする配列なども含んでなってよい。しかしながら、ベクターが動物に投与される場合には、かかる無関係の配列は好ましくは少なくとも部分的に切断される。他の導入遺伝子について文献に記載されている手法を用いて遺伝子療法のためのポリヌクレオチドを製造し投与することができる。例えば、Isner et al., Circulation, 91: 2687-2692, 1995;およびIsner et al., Human Gene Therapy, 7: 989-1011, 1996参照；引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３４】
いくつかの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞による取り込みおよび前記抗体またはそのフラグメント（および／または任意の他のペプチド）の発現を促すためのさらなる配列をさらに含んでなる。一つの実施態様において、本明細書において記載される抗体またはそのフラグメントをコードする「裸の」導入遺伝子（すなわち、トランスフェクションを促すウイルスベクター、リポソームベクター、または他のベクターを含まない導入遺伝子）が使用される。
【００３５】
ベクターはまた、「遺伝子療法」処置計画にも有用であり、その場合、例えば、抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、浸潤癌に罹患しているまたは罹患する危険性がある被験体に、前記被験体の細胞にin vivoで前記抗体またはそのフラグメントを発現させる形で導入される。任意の好適なベクターを用い抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを前記宿主に導入し得る。文献において記載されている例示的なベクターとしては、複製欠損性レトロウイルスベクター、限定されるものではないが、レンチウイルスベクターを含む(Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816, 1998; Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, October, 1998, ４３〜４６頁)；パルボウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなど（米国特許第５，４７４，９３５１号；同第５，１３９，９４１号；同第５，６２２，８５６号；同第５，６５８，７７６号；同第５，７７３，２８９号；同第５，７８９，３９０号；同第５，８３４，４４１号；同第５，８６３，５４１号；同第５，８５１，５２１号；同第５，２５２，４７９号；Gnatenko et al., J. Invest. Med., 45: 87-98, 1997）；アデノウイルス（ＡＶ）ベクター（米国特許第５，７９２，４５３号；同第５，８２４，５４４号；同第５，７０７，６１８号；同第５，６９３，５０９号；同第５，６７０，４８８号；同第５，５８５，３６２号；Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584, 1992; Stratford Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630, 1992;およびRosenfeld et al., Cell, 68: 143-155, 1992）；アデノウイルス・アデノ随伴ウイルスキメラベクター（米国特許第５，８５６，１５２号）またはワクシニアウイルスもしくはヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，８７９，９３４号；同第５，８４９，５７１号；同第５，８３０，７２７号；同第５，６６１，０３３号；同第５，３２８，６８８号
）；リポフェクチンにより媒介される遺伝子移入（ＢＲＬ）；リポソームベクター（米国特許第５，６３１，２３７号）；およびそれらの組合せが挙げられる。上述の文書の総ては全体として特に発現ベクターの考察に関して引用することにより本明細書の一部とされる。これらの発現ベクターのいずれも、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。所望により、前記ウイルスベクターは、例えば、ウイルス複製に必要な選択遺伝子を欠失または破壊することにより、複製欠損性にされる。
【００３６】
企図される他の非ウイルス送達機構としては、リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, Virology, 52: 456-467 ', 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7: 2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10: 689-695, 1990)ＤＥＡＥ−デキストラン(Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190, 1985)、エレクトロポレーション(Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7161-7165, 1984)、直接マイクロインジェクション(Harland and Weintraub, J. Cell Biol, 101: 1094-1099, 1985、ＤＮＡ添加リポソーム(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348-3352, 1979; Feigner, Sci Am., 276(6): 102-6, 1997; Feigner, Hum Gene Ther., 7(15): 1791-3, 1996)、細胞音波処理(Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8463-8467, 1987)、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568-9572, 1990)、および受容体媒介トランスフェクション(Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432, 1987; Wu and Wu, Biochemistry, 27: 887-892, 1988; Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12: 159-167, 1993)が挙げら
れる。
【００３７】
前記発現ベクター（または本明細書において論じられる抗体またはそのフラグメント）は、リポソーム中に取り込ませてもよい。リポソームは、リン脂質二重層および内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁すると自然に形成される。閉鎖構造の形成前に脂質成分は自己再構成を受け、脂質二重層の間に水および溶解溶質を取り込む(Ghosh and Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C ed., New York: Marcel Dekker, ８７〜１０４頁 (1991))。ＤＮＡのカチオン性リポソームへの添加は、リポソームから光学的複屈折液晶性凝縮球へのトポロジー転移を引き起こす(Radler et al., Science, 275(5301): 810-814, 1997)。これらのＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子療法および送達における使用のための潜在的な非ウイルスベクターである。
【００３８】
in vitroでの外来ＤＮＡのリポソーム媒介核酸送達および発現には成功している。また、本発明では、「リポフェクション」技術を含めた様々な商業的アプローチも企図される。本発明のある特定の実施態様において、リポソームは、血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化し得る。これは、細胞膜との融合を促進し、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞浸入を促すことが分かっている(Kaneda et al., Science, 243: 375-378, 1989)。他の実施態様において、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とともに複合体化するかまたは併用する(Kato et al., J. Biol. Chem., 266: 3361-3364, 1991)。いっそうさらなる実施態様において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方とともに複合体化するかまたは併用する。かかる発現構築物は、in vitroおよびin vivoでの核酸の移入および発現に使用することに成功している。本発明のいくつかの変形において、リポソームが表面にＦＧＦＲ４を発現する細胞（癌細胞など）を標的とするように、リポソームにＦＧＦＲ４標的化部分、例えば、ＦＧＦＲ４抗体またはフラグメントなどが含められる。
【００３９】
裸のＤＮＡ発現構築物の細胞への移入は、粒子衝撃を用いることにより行うことができる。この方法は、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルを高速まで加速し、それらが細胞膜を貫通し細胞を死滅することなく細胞に浸入することができる能力に依存する(Klein et al., Nature, 327: 70-73, 1987)。小粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。かかる１つの装置は、電流を発生させるための高圧放電に依存し、そしてそれが次に原動力を提供する(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568-9572, 1990)。使用されたマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズなどの生物学的に不活性な物質で構成されていた。
【００４０】
ウイルスベクターを使用する実施態様において、好ましいポリヌクレオチドはさらに、上記のような好適なプロモーターおよびポリアデニル化配列も含む。さらに、これらの実施態様において、前記ポリヌクレオチドはさらに、本発明のポリペプチドをコードする配列に機能しうる形で連結されたベクターポリヌクレオチド配列（例えば、アデノウイルスポリヌクレオチド配列）も含むことは容易に分かるであろう。
【００４１】
本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含んでなる細胞を提供し、例えば、その細胞は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターで形質転換またはトランスフェクトされる。本発明のある特定の態様において、前記細胞は、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５のＣＤＲと同一のＣＤＲを含んでなるＶＨおよびＶＬを含有する抗ＦＧＦＲ４抗体または抗体フラグメントを発現する。前記細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌(Escherichia coli)など（例えば、Pluckthun et al., Methods Enzymol., 178: 497-515, 1989参照）、または真核宿主細胞、例えば、動物細胞（例えば、骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、またはハイブリドーマ細胞）、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）、または植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、またはイネの細胞）などであってよい。哺乳類宿主細胞の使用は、組換え発現産物に最適な生物活性を与えるために望ましい可能性があるような翻訳修飾（例えば、グリコシル化、末端切断、脂質化、およびリン酸化）を提供すると予想される。同様に、本発明は、グリコシル化されたまたはグリコシル化されていないかつ／あるいはポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールなどの１以上の水溶性ポリマー結合を含むように共有結合により修飾されたポリペプチドを包含する。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、環状プラスミドの一部として、または単離されたタンパク質コード領域もしくはウイルスベクターを含んでなる線状ＤＮＡとして宿主細胞に導入し得る。宿主細胞にＤＮＡを導入するための方法は、周知で、当技術分野では日常的に実施されており、それらの方法としては、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核注入、またはリポソーム、ミセル、ゴースト細胞、およびプロトプラストなどの担体との融合が挙げられる。上述のように、かかる宿主細胞は、前記ポリヌクレオチドの増幅に、さらに前記ポリヌクレオチドによりコードされる本発明のポリペプチドの発現にも有用である。前記宿主細胞は単離されかつ／または精製されていてよい。前記宿主細胞はまた、in vivoで前記ポリペプチドの一過的発現または永久発現を引き起こすようにin vivo形質転換した細胞であってもよい。前記宿主細胞はまた、例えば、治療目的でin vivoで前記ポリペプチドを産生するように、ex vivo形質転換し、形質転換後に導入される単離された細胞であってもよい。宿主細胞の定義は、トランスジェニックヒトを明確に排除する。
【００４３】
ポリヌクレオチドから抗体を作製するための特定の方法は、一般的に周知で、日常的に用いられている。例えば、基礎分子生物学手法は、Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989によって記載されている(Maniatis et al., 第３版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001も参照)。加えて、多数の刊行物には、ＤＮＡ操作による抗体調製、発現ベクターの創出、および適当な細胞の形質転換および培養に好適な技術が記載されている（例えば、Mountain and Adair, Biotechnology and Genetic Engineering Reviewsの第１章, Tombs ed., Intercept, Andover, UK, 1992）;およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel ed., Wiley Interscience, New York, 1999参照）。
【００４４】
本発明はさらに、ＦＧＦＲ４のアミノ酸６７〜９３またはＦＧＦＲ４のアミノ酸６７〜９３の亜領域を含んでなる（またはからなる）ペプチドを提供する。この関連で、本発明は、アミノ酸配列ＹＫＥＧＳＲＬＡＰＡＧＲＶＲＧ（配列番号５）；ＧＳＲＬＡＰＡＧＲＶＲＧＷＲＧ（配列番号６）；ＬＡＰＡＧＲＶＲＧＷＲＧＲＬＥ（配列番号７）；ＡＧＲＶＲＧＷＲＧＲＬＥＩＡＳ（配列番号８）；またはＶＲＧＷＲＧＲＬＥＩＡＳＦＬＰ（配列番号９）を含んでなる（またはからなる）ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、、例えば、ＦＧＦＲ４に対する抗体を作出しおよび／または抗ＦＧＦＲ４活性について抗体を同定するために使用し得る。加えて、本発明は、例えば、ＦＧＦＲ４を提示する腫瘍細胞に対する免疫系を刺激するための、免疫原としてのペプチドの使用を企図する。一態様において、本発明は、ＦＧＦＲ４をコードするアミノ酸配列の５〜２５個のアミノ酸からなる単離された抗原ペプチドを提供し、そのペプチドは、配列番号５〜９のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列またはそのフラグメントを含んでなる。本発明はまた、上述のペプチドのいずれかと１以上の賦形剤（群）、アジュバント（群）、化学療法薬（群）などを含んでなる組成物も提供する。抗体またはそのフラグメントを作出するための材料および方法は、本明細書において記載されるペプチドにも適用されることは理解されよう。例えば、本発明は、上述のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および前記ポリヌクレオチド（所望によりベクターに組み込まれたもの）を含んでなる単離された細胞を提供する。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチド、ベクター、および細胞は、in vitroおよびin vivoで癌細胞浸潤を抑制する方法において（例えば、被験体において癌を処置する方法において）用いることができることは理解されよう。
【００４６】
癌細胞浸潤の抑制／処置方法
前記抗体または抗体フラグメントはＦＧＦＲ４と結合し癌細胞浸潤を抑制する。本明細書において、「癌細胞浸潤」とは、癌細胞の周囲組織またはコラーゲンもしくはフィブリン豊富な間質の一時的基質への内方成長を指す。この関連で、本発明はまた、癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートする方法も提供し、その方法は、癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の本発明の抗体またはそのフラグメント（例えば、前記抗体またはそのフラグメントを含んでなる組成物）と癌細胞集団を接触させることを含む。哺乳類被験体において癌細胞が存在する場合に、本発明の抗体またはそのフラグメントを含んでなる組成物を前記哺乳類被験体に投与することにより癌細胞集団に接触させる。in vivoにおいて、癌細胞浸潤および転移は、基底膜およびコラーゲン豊富な間質性基質を含む細胞外基質の分解と、原発腫瘍からの活性細胞移動とを必要とする多面的なプロセスである。前記抗体またはそのフラグメントは、in vivoでの癌細胞浸潤、例えば、細胞外基質の分解などに関連した１以上のプロセスを妨げる。好ましくは、前記抗体またはそのフラグメントは、細胞外基質（コラーゲンおよび基底膜）の分解および三次元組織環境での細胞移動の両方を阻害する（すなわち、ダウンレギュレートするまたは遅らせる）。
【００４７】
癌細胞浸潤を抑制する抗体の効力は、in vitro浸潤性アッセイを用いて立証され、好ましくは、癌についての動物モデルにおいて確認される。この関連で、本発明は、抗体または抗体フラグメントを同定する方法を提供し、その方法は、（ａ）ＦＧＦＲ４と結合する１以上の抗体または抗体フラグメントを得ること；（ｂ）腫瘍細胞浸潤性アッセイにおいて前記抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること；および（ｃ）前記アッセイにおいて浸潤性を、例えば、少なくとも５０％抑制する抗体を同定すること、を含む。例示的なin vitroデュアルチャンバー腫瘍細胞浸潤性アッセイを実施例に記載している。いくつかの変形において、前記浸潤性アッセイに用いられる細胞は、ＦＧＦＲ４を他の受容体、例えば、ＦＧＦＲ１などと共発現する。いくつかの変形において、対象となる受容体（群）は組換え発現される。他の変形において、前記細胞は腫瘍（初代分離株）から単離されるかまたは対象となる受容体（群）を発現する腫瘍細胞株由来のものである。
【００４８】
例示的なアッセイにおいて、ＦＧＦＲ４（例えば、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８タンパク質）を発現する癌細胞（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）は、三次元培養（例えば、コラーゲン）ゲルに加えられる。所望により、細胞移動を活性化するために、化学誘引物質、例えば、ＦＧＦ２などは、（デュアルチャンバー形式を使用する場合には下部チャンバーに）加えられる。浸潤は、培養ゲルへ移動した細胞の数を測定することにより、または培養ゲルに達している細胞アームの長さを測定することにより判定することができる。抗体の不在下での浸潤と比べての、候補抗体によってもたらされる培養ゲルへの細胞浸潤の減少は、癌細胞浸潤を抑制する抗体またはそのフラグメントを示している。腫瘍細胞浸潤アッセイは、例えば、Puiffe et al., Neoplasia, P(10): 820-829, 2007; Alonso-Escolano et al., J. Pharm. Exper. Ther., 318: 373-380, 2006;およびKeese et al., BioTechniques, 33: 842-850, 2002にさらに記載されている。前記方法により同定された抗体またはそのフラグメントが提供される。
【００４９】
抗体またはそのフラグメントは、当技術分野で公知の他のアッセイ、例えば、実施例に記載されるものなどを用いて特徴付けることができることは理解されよう。例えば、ＦＧＦＲ４活性化は、例えば、免疫沈降技術および免疫ブロット技術を用いて受容体リン酸化を検出することにより調べることができる。ある特定の態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＦＧＦＲ４のリガンド非依存性またはリガンド依存性（例えば、繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性）リン酸化を阻害するまたは減少させる。同様の技術を使用して、細胞におけるＦＧＦＲ４およびＭＴ１−ＭＭＰの共局在に対する抗体またはそのフラグメントの影響を調べることができる。
【００５０】
加えて、in vivoでの癌細胞浸潤を抑制する抗体またはそのフラグメントの能力は、任意の好適な動物モデル、例えば、骨浸潤モデル（例えば、Kang, Cancer Cell, 3: 537-549, 2003;およびPauli et al., Cancer Research, 40: 4571-4580, 1980参照）、膀胱癌浸潤の動物モデル(Mohammed et al., Mol. Cancer Ther., 2(2): 183-188, 2003;およびKameyama et al., Carcinogenesis., 14(8): 1531-1535, 1993)、マウス黒色腫転移モデル(Lee et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 57(6): 761-71, 2006)など、または修飾漿尿膜を使用するスクリーニングアッセイ（例えば、Ossowski, J. Cell Biol., 107(6): 2437-2445, 1988参照）を用いて判定することができる。ヒト患者における転移をモニタリングする方法は周知であり、それらの方法としては、例えば、転移細胞を検出するための組織生検材料の検査が挙げられる。
【００５１】
癌細胞浸潤を「抑制すること」、「阻害すること」、または「妨害すること」には、浸潤または転移の１００％廃絶は必要でない。癌細胞浸潤のいかなる減少も被験体において有益な生物学的効果となる。この関連で、前記抗体またはそのフラグメントは、細胞浸潤（例えば、３−Ｄコラーゲン腫瘍細胞浸潤性アッセイのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞浸潤）を、前記抗体またはそのフラグメントの不在下で（例えば、前記抗体またはそのフラグメントに曝されない、生物学的に適合した対照の被験体、検体、または細胞培養物において）観察された癌細胞浸潤レベルと比べて、例えば、少なくとも約５％（少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％）抑制することができる。いくつかの実施態様において、細胞浸潤は、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少する。in vitroモデルもしくは動物モデルではまたは繰り返しを必要とする臨床試験では、浸潤性の抑制は、結果が（例えば、有意水準ｐ＜０．０５に対して）統計的に有意であることを確認する標準的な統計分析を用いて確認することができる。
【００５２】
加えて、本発明は、被験体（例えば、哺乳類、例えば、ヒトなど）において癌を処置する方法を提供する。その方法は、癌を処置するのに有効な量の本発明の抗体またはそのフラグメントを前記被験体に投与することを含む。「癌を処置すること」は、異常な細胞または組織の成長または増殖を特徴とする障害、特に、転移能を有するものの発生または進行を抑制することまたは阻止することを包含する。「癌を処置すること」はまた、周囲組織における浸潤性成長の進展を妨害すること、それにより遠隔臓器への癌細胞拡散および二次性腫瘍の成長（転移）を遅らせることも包含する。「癌を処置すること」はまた、過剰増殖を特徴とする障害を、総てまたは部分的に、軽減することも包含する。本発明において、転移能または浸潤態様を有しかつＦＧＦＲ４を発現するあらゆる癌が治療処置に好適である。実際には、ある特定の実施態様において、前記方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントを、転移癌と診断された患者(a patent)に投与することを含む。例示的な癌としては、口腔および咽頭、消化器系、呼吸器系、骨および関節（例えば、骨転移）、軟部組織、皮膚（例えば、黒色腫）、乳房、生殖器系、泌尿器系、眼および眼窩、脳および神経系（例えば、神経膠腫）、または内分泌系（例えば、甲状腺）の癌が挙げられる。いくつかの実施態様において、本発明の方法の癌は乳癌、膀胱癌、黒色腫、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、神経膠腫、中皮腫、肺癌、精巣癌、または膵臓癌である。Ｒ３８８  ＦＧＦＲ４変異体は、乳房腫瘍、扁平上皮癌、膠芽腫、神経芽腫および子宮癌由来の細胞株において検出されている（米国特許第６，７７０，７４２号参照）；よって、本発明の材料および方法は、前記障害の処置に特に好適である。
【００５３】
癌の処置（例えば、周囲組織への癌細胞浸潤の妨害）における本発明の方法の進行は、任意の好適な方法、例えば、本明細書において記載される、癌進展を追跡するために診療所で現在用いられている方法などを用いて確かめることができる。必要に応じて、本発明の方法の効力を、新たな腫瘍の検出、腫瘍抗原またはマーカーの検出、生検、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）スキャン、生存、無増悪生存、無増悪期間、症状緩和効果(Clinical Benefit Response)の評価などの生活の質に関する評価など（それらは総てヒトにおける癌の全体的な進行（または退縮）を示すことができる）により判定する。
【００５４】
本発明のいくつかの実施態様において、本発明の方法は、前記癌においてＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードするＦＧＦＲ４対立遺伝子の有無を決定することを含む。特定の実施態様に応じて、前記癌がＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードする少なくとも１つのＦＧＦＲ４対立遺伝子を有する場合に前記処置が投与される。よって、一態様において、本発明は、哺乳類被験体を処置する方法を提供し、その方法は、癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること（ここで、前記癌は、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードする少なくとも１つのＦＧＦＲ４対立遺伝子を含む細胞を含む）；および癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の前記抗体またはそのフラグメント（または前記抗体またはそのフラグメントをコードする核酸）を含んでなる組成物を前記被験体に投与することを含む。
【００５５】
生体サンプルにおけるＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子の有無は、種々の技術を用いて判定することができる。サンプルは、一般に、血液、血清、尿、または例えば、筋肉、結合組織、神経組織などからの組織生検材料から単離される。一度得たら、サンプルの細胞を検査し、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８の有無を検出する。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８を同定するための１つの方法は、被験体（例えば、癌検体または組織生検材料）から採取した生体サンプルの核酸をアッセイすること（例えば、核酸配列データを得ること）を含む。生体サンプルからゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡを得、所望により、ＦＧＦＲ４をコードする核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。次いで、そのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡサンプルを検査する。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８の存在は、Ｒ３８８対立遺伝子に特異的な核酸プローブの配列特異的ハイブリダイゼーションにより判定することができる。当業者は、生体サンプルがＦＧＦＲ４  Ｒ３８８コード配列を含む場合にのみ配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるようにプローブを設計するのに必要な知識と技能を有している。あるいはまたは加えて、被験体から得たＤＮＡまたはＲＮＡを直接配列決定することによりＦＧＦＲ４  Ｒ３８８の有無を判定する。
【００５６】
一つの態様において、生体サンプル（例えば、細胞）におけるＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子の有無は、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８およびＧ３８８対立遺伝子と別個に結合する抗体または抗体フラグメントを用いてＦＧＦＲ４タンパク質をアッセイすることにより判定される。用語「別個に結合する」とは、Ｒ３８８  ＦＧＦＲ４タンパク質とＧ３８８  ＦＧＦＲ４タンパク質とを区別する抗体の能力を指す。例えば、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８と別個に結合する抗体またはそのフラグメントは、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８と結合するより高い親和性（例えば、少なくとも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍高い親和性）で前記タンパク質と結合する。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８タンパク質を検出するための例示的な方法としては、限定されるものではないが、イムノアッセイ、例えば、蛍光免疫イムノアッセイ、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(radioimmunoasays)、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらの方法は、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８と別個に結合する抗体またはそのフラグメントと生体サンプルを接触させること、およびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８と結合する抗体を検出することを含む。
【００５７】
非抗体系阻害薬
本発明のいくつかの変形は、ＦＧＦＲ４および、所望により、ＭＴ１−ＭＭＰに対する非抗体系阻害薬の使用を含む。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、癌組織における細胞外基質の分解に関与する酵素のファミリーを構成する(Nagase et al., J. Biol. Chem., 274: 21491-21494, 1999; Nelson et al., J. Clin. Oncol., 18: 1135-1149, 2000)。ＭＭＰは、ほとんど例外なく、プロペプチドドメイン、触媒ドメイン、ヒンジドメイン、およびＣ末端（ヘモペキシン様）ドメインを含んでなる基本構造的構成を共有する亜鉛依存性マルチドメインエンドペプチダーゼである(Nagase et al., 前掲; Massova et al., FASEB J., 12: 1075-1095, 1998)。総てのＭＭＰは、触媒活性の活性化（プロペプチドドメインのタンパク質分解による除去により通常行われるプロセス）を必要とする潜在型（プロＭＭＰ）で産生される。
【００５８】
ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）は、繊維状コラーゲンおよびフィブリンを含む種々の細胞外基質成分を分解する多機能酵素である(Pei et al., J. Biol. Chem., 271: 9135-9140, 1996; d'Ortho et al., FEBS Lett., 421: 159-164, 1998; Ohuchi et al., J. Biol. Chem., 272: 2446-2451, 1997)。加えて、ＭＭＰ−２およびＭＴ１−ＭＭＰは両方、多くのヒト癌の転移能と関係しており、実験系において腫瘍細胞浸潤を増大させる。ＭＴ−ＭＭＰ１は、癌細胞および様々な形態の癌の反応性間質細胞の両方においてアップレギュレートされることが多く、ＭＴ１−ＭＭＰを過剰発現する癌細胞は、対照細胞より著しく速い速度でヌードマウスにおいて浸潤し増殖し転移する。ＭＴ１−ＭＭＰのアミノ酸配列は配列番号１０に記載される。
【００５９】
ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬は、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰを直接標的とすること、すなわち、タンパク質レベルでは、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰの転写または翻訳を標的とすること、あるいはＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰ機能実現に必要な下流分子を標的とすることにより活性をモジュレートする。核酸レベルでは、阻害薬は、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰコード配列を不活性化するかまたは破壊する。阻害はまた、ゲノムＤＮＡまたはＦＧＦＲ４  ｍＲＮＡ、ＦＧＦＲ４リガンド  ｍＲＮＡ、ＭＴ１−ＭＭＰ  ｍＲＮＡおよび／または下流標的のｍＲＮＡを標的とすることによっても転写または翻訳を遮断し得る。この関連で、アンチセンス療法は、特にＦＧＦＲ４およびＭＴ１−ＭＭＰに関して（その説明は他の遺伝子標的にも等しく好適であるという理解の下で）下に記載される、発現を阻害するための１つの方法である。
【００６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ４（またはＭＴ１−ＭＭＰ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションを介してＦＧＦＲ４（またはＭＴ１−ＭＭＰ）発現を負に調節する。ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８タンパク質およびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８タンパク質をコードする核酸配列は、例えば、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８（配列番号１１）の核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５７２０５で記載されるように公知である。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８の核酸配列は配列番号１２に記載される。同様に、ＭＴ１−ＭＭＰをコードする核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９０９２５（配列番号１３）で記載されるように当技術分野で公知である。これらの配列は、当技術分野で公知の任意の方法を用いてアンチセンス分子を調製し最適化するために使用し得る。この関連で、本発明は、ＭＴ１−ＭＭＰ（またはＦＧＦＲ４）ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズして、ＭＴ１−ＭＭＰ（またはＦＧＦＲ４）転写または翻訳を阻害する阻害薬核酸の使用を含む。本明細書において記載されるあらゆる種類の核酸阻害薬は、単独でも、本明細書において記載される他の阻害薬物質と組み合わせても使用することができる（併用療法に関する下の節を参照のこと）。
【００６１】
一つの態様において、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰをコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしｍＲＮＡ発現を阻害し、結果としてＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰタンパク質発現を阻害する、少なくとも５〜約５０ヌクレオチド長（間の（整数のヌクレオチドで測定される）総ての長さを含む）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、本発明の方法における使用のために企図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの安定性を向上させること、すなわち、前記オリゴヌクレオチドの、特にin vivoでのヌクレアーゼ分解に対する耐性を高めることが当技術分野で知られている、修飾ヌクレオチド間結合を含んでなるものおよび／または修飾ヌクレオチドを含んでなるもを含む。標的ポリヌクレオチド中の領域と完全相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは最高度の特異的阻害を与える一方、完全には相補的でないアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、標的ポリヌクレオチド中の領域に関して限られた数のミスマッチを含むものも高度のハイブリダイゼーション特異性を保持するため、標的ｍＲＮＡの発現を阻害することは当技術分野では理解される。従って、本発明は、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰをコードするポリヌクレオチド中の標的領域と完全相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる方法、ならびに完全には相補的でない、すなわち、標的ポリヌクレオチド中の標的領域に対して、ミスマッチを、そのミスマッチが標的ポリヌクレオチド中の標的領域との特異的ハイブリダイゼーションを妨げない程度に含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する方法を含む。アンチセンス化合物の調製および使用は、米国特許第６，２７７，９８１号に記載されており、その開示は全体として引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６２】
本明細書において記載される標的遺伝子の発現を阻害するためのもう１つの種類の治療用物質は、リボザイムである。リボザイム阻害薬は、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするヌクレオチド領域および標的ポリヌクレオチドを消化する酵素部分を含む。リボザイム阻害の特異性は、アンチセンス領域の長さおよび標的ポリヌクレオチド中の標的領域とのアンチセンス領域の相補性の程度と関係している。よって、本発明は、完全相補的である、５〜約５０ヌクレオチド長（間の総てのヌクレオチド長を含む）のアンチセンス領域、ならびにミスマッチを、そのミスマッチが標的ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰをコードするポリヌクレオチド中の標的領域との特異的ハイブリダイゼーションを妨げない程度に含むアンチセンス領域を含んでなるＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰのリボザイム阻害薬の使用を含む。本発明の方法に有用なリボザイムは、前記オリゴヌクレオチドの安定性を向上させること、すなわち、前記オリゴヌクレオチドの、特にin vivoでのヌクレアーゼ分解に対する耐性を高めることが当技術分野で知られている、修飾ヌクレオチド間結合を含んでなるものおよび／または修飾ヌクレオチドを含んでなるものを、その修飾が、標的領域と特異的にハイブリダイズするまたは前記分子の酵素活性を低下させるリボザイムの能力を変えない程度に含む。リボザイムは酵素であるため、単一分子により複数の標的分子の消化を命令することができ、それによって非酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドより低い濃度で効果があるという利点を提供する。リボザイム技術の調製および使用は、米国特許第６，６９６，２５０号；同第６，４１０，２２４号；および同第５，２２５，３４７号に記載されており、それらの開示は全体として引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６３】
本明細書において記載される標的遺伝子／経路の発現（それゆえ、活性）を阻害するためのもう１つの種類の治療用物質は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としても知られるＲＮＡ干渉技術である。ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰなどの標的遺伝子の配列の知識を用いて、前記遺伝子の発現に干渉するｓｉＲＮＡ分子を形成する。ＳｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の混合物）の直接導入により転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を誘導する技術を表す(Fire et al., Nature, 391: 806-811, 1998)。現在のＰＴＧＳモデルにより、干渉ｄｓＲＮＡの短いストレッチ（２１〜２３ヌクレオチド；「ガイドＲＮＡ」としても知られるｓｉＲＮＡ）がＰＴＧＳを媒介することが示されている。ｓｉＲＮＡは、直接または導入遺伝子またはウイルスを介して導入されたｄｓＲＮＡの切断によって生じることは明らかである。これらのｓｉＲＮＡはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により増幅することができ、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、その複合体を相同内因性ｍＲＮＡへ導き、そこで複合体は転写物を切断する。組織特異的に遺伝子の発現を破壊するためにＲＮＡｉを使用し得ることが企図される。所望のｄｓＲＮＡをコードする遺伝子フラグメントを誘導プロモーターまたは組織特異的プロモーターの後に置くことにより、生物内の特定位置でまたは特定の発達段階に遺伝子を不活性化することができるはずである。
【００６４】
また、一方の鎖が標的ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰをコードするポリヌクレオチド中の標的領域と相補的である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）も企図される。一般的に、３０ヌクレオチド長より短いこの種のｄｓＲＮＡ分子は、当技術分野では低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれている。しかしながら、本発明はまた、３０ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡ分子の使用も含み、本発明のある特定の態様においては、これらのより長いｄｓＲＮＡ分子は、約３０ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長までおよびそれ以上であってよく、間の総ての長さのｄｓＲＮＡ分子を含む。他のＲＮＡ阻害薬と同様に、ｄｓＲＮＡ分子の一方の鎖の相補性は、標的ポリヌクレオチド中の標的領域と完全マッチであり得るか、またはミスマッチを、そのミスマッチが標的ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰをコードするポリヌクレオチド中の標的領域との特異的ハイブリダイゼーションを妨げない程度に含んでよい。他のＲＮＡ阻害技術と同様に、ｄｓＲＮＡ分子は、前記オリゴヌクレオチドの安定性を向上させること、すなわち、前記オリゴヌクレオチドの、特にin vivoでのヌクレアーゼ分解に対する耐性を高めることが当技術分野で知られている、修飾ヌクレオチド間結合を含んでなるものおよび／または修飾ヌクレオチドを含んでなるものを含む。ＭＴ１−ＭＭＰを標的とする例示的なレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物としては、Open Biosystems (Huntsville, Alabama)のＴＲＣＮ０００００５０８５４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９９５）およびＴＲＣＮ０００００５０５８５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６７０３）（カタログ番号  ｃａｔａｌｏｇ  ＲＨＳ３９７９−９６１８０５３およびＲＨＳ３９７９−９６１７７８４；Tatti et al., Exp. Cell. Res., 314(13): 2501-14, 2008にさらに記載されている）が挙げられる。Qiagen (Hilden, Germany)のＨＰ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ＳＩ０３６４８８４１（配列番号１４）もＭＴ１−ＭＭＰを効果的にダウンレギュレートする。例示的な、ＦＧＦＲ４を標的とするｓｉＲＮＡとしては、Qiagen (Hilden, Germany)のＨＰ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ＳＩ０２６５９９７９（配列番号１５）、ＨＰ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ＳＩ０２６６５３０６、およびＨＰ  ＧｅｎｏｍｅＷｉｄｅ  ｓｉＲＮＡ  ＳＩ０００３１３６０（配列番号１６）が挙げられる。ＲＮＡｉ化合物の調製および使用は、米国特許出願第２００４００２３３９０号に記載されており、その開示は全体として引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６５】
本発明はさらに、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰの阻害がＲＮＡ  ｌａｓｓｏ技術を用いて行われる方法も企図する。環状ＲＮＡ  ｌａｓｓｏ阻害薬は、本質的に分解に対してより耐性があり、それゆえ、一般的に修飾ヌクレオチド間結合または修飾ヌクレオチドを含まないまたは必要としない高度に構造化された分子である。環状ｌａｓｓｏ構造は、標的ポリヌクレオチド中の標的領域とハイブリダイズすることができる領域を含み、このｌａｓｓｏ中のハイブリダイズする領域は他のＲＮＡ阻害技術について典型的な長さである。他のＲＮＡ阻害技術と同様に、ｌａｓｓｏ中のハイブリダイズする領域は、標的ポリヌクレオチド中の標的領域と完全マッチであってよく、またはミスマッチを、そのミスマッチが標的ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰをコードするポリヌクレオチド中の標的領域との特異的ハイブリダイゼーションを妨げない程度に含んでよい。ＲＮＡ  ｌａｓｓｏは環状であり標的領域と強固なトポロジー結合を形成するため、この種の阻害薬は、典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドと異なり、一般的にヘリカーゼ作用により置き換えられず、それゆえ典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドより低い用量で利用することができる。ＲＮＡ  ｌａｓｓｏの調製および使用は、米国特許第６，３６９，０３８号に記載されており、その開示は全体として引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６６】
ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰに対するアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉならびに三重らせん分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成について当技術分野で公知の任意方法によって調製することができる。これらには、当技術分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学合成するための技術が含まれ、限定されるものではないが、固相ホスホルアミダイト化学合成などである。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroおよびin vivo転写により作出してよい。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた様々なベクターに組み込み得る。あるいは、用いるプロモーターに応じて構成的にまたは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、安定にまたは一過的に細胞に導入することができる。
【００６７】
（アプタマーは）ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰの相互作用に干渉するためのもう１つの核酸に基づく方法は、アプタマーの使用である。アプタマーは、他の分子と結合する能力に基づきランダムなプールから選択されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。核酸、タンパク質、低分子有機化合物、さらには完全生物と結合するアプタマーが選択されている。アプタマーを同定し作製するための方法および組成物は当業者に公知であり、例えば、各々引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，８４０，８６７号および米国特許第５，５８２，９８１号に記載されている。ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰと結合するアプタマーは、本治療実施態様において有用であるように具体的に企図される。
【００６８】
コンビナトリアルサイエンスの分野における最近の進歩により、所定の標的に対して高い親和性と特異性を有する短いポリマー配列が同定された。例えば、ＳＥＬＥＸ技術は哺乳類抗体に匹敵する結合特性を有するＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーを同定するために使用されており、免疫学分野では無数の化合物と結合する抗体または抗体フラグメントが作出、単離されており、ファージディスプレイは非常に有利な結合特性を有する新規ペプチド配列を発見するために利用されている。これらの分子進化技術の成功に基づき、いずれの標的分子と結合する分子も創出することができることは確かである。ループ構造は、以下の場合のように、所望の結合特性の提供に関与することが多い：相補的塩基対形成をしない短い領域から創出されるヘアピンループを利用することが多いアプタマー、ループ超可変領域のコンビナトリアル配列を利用する天然由来抗体、および直鎖ペプチドのファージディスプレイの結果と比較したときに結果の改善を示した環状ペプチドを利用する新規なファージディスプレイライブラリー。このように、コンビナトリアル分子進化技術によって高親和性リガンドを創出および同定することができることを示唆する十分な証拠が得られている。本発明では、分子進化技術は、本明細書において記載されるリガンドに特異的な結合構築物を単離するために使用することができる。アプタマーについての詳細は、一般的には、Gold et al., J. Biotechnol., 74: 5-13, 2000を参照のこと。アプタマーを作出するための関連技術は、米国特許第６，６９９，８４３号に見ることができ、それは全体として引用することにより一部とされる。
【００６９】
いくつかの実施態様において、アプタマーは、核酸ライブラリーを作成し；その核酸ライブラリーを標的、例えば、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰと接触させることにより作出し得、ここで、（ライブラリーの他の核酸と比べて）その標的に対してより高い結合親和性を有する核酸が選択され増幅され、その標的との結合に対して比較的高い親和性および特異性を有する核酸を多く含む核酸混合物が生じる。このプロセスを繰り返してよく、選択された核酸を突然変異させ再びスクリーニングし、それによって標的アプタマーを同定する。
【００７０】
他の阻害薬は、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰを直接、すなわち、タンパク質レベルを標的とする。この関連で、ＦＧＦＲ４またはＭＴ１−ＭＭＰの化学化合物阻害薬が企図される。小型化により分子が標的細胞により取り込こまれ易くなるため、小分子化合物（すなわち、分子量が１０００ダルトン未満、一般に３００〜７００ダルトンの間である化合物）が一般的に好ましい。ＦＧＦＲ４の合成阻害薬としては、ＰＤ１７３０７４(Pfizer; Ezzat et al., Clinical Cancer Res., 11: 1336-1341, 2005、およびKwabi-Addo et al., Endocrine-Related Cancer, 11; 709-724, 2004)が挙げられる。ＭＴ１−ＭＭＰ活性を遮断することができる合成阻害薬としては、Maquoi et al., Clin. Cancer Res., 15: 4038-47 (2004)に記載されている、Ｒｏ−２８−２６５３が挙げられる。合成阻害薬は、Nisato et al., Cancer Res., 65(20): 9377-9387, 2005;およびGalvez et al., J. Biol. Chem., 276: 37491-500, 2001にさらに記載されている。
【００７１】
他の阻害薬としては、ＦＧＦＲ４と特異的に結合し１以上のリガンド、例えば、ＦＧＦ２などとのヒトＦＧＦＲ４の結合を遮断するかまたは減じるＦＧＦＲ４結合剤が挙げられる。かかる薬剤は前記受容体と結合するが、それらの薬剤はＦＧＦＲ４活性に関与するシグナル伝達カスケードを引き起こさない。あるいは、可溶性ＦＧＦＲ４受容体はＦＧＦＲ４からリガンドを隔離するために使用し得る。この関連で、ＦＧＦＲ４の細胞外領域を、血清半減期を延長する別の部分、例えば、Ｆｃ抗体ドメインと融合して融合タンパク質を作製することができるし、またはＰＥＧ部分と融合して可溶性ＦＧＦＲ４受容体を作出することができる。
【００７２】
投与に関する考察
癌を処置するまたはin vivoでの癌細胞浸潤をモジュレートする場合、前記方法は、好ましくは、被験体は癌の危険性があると判定された（例えば、癌マーカーが検出された）後できる限り早期にあるいは癌および／または周囲組織浸潤が検出された後（例えば、腫瘍切除後）できる限り早期に行われる。この目的のために、前記抗体またはそのフラグメントは、癌細胞の浸潤、内方成長、または転移を総てまたは部分的に保護するために、腫瘍浸潤が検出される前に投与される。前記抗体またはそのフラグメントは、さらなる浸潤または二次性腫瘍の形成を総てまたは部分的に予防するために、腫瘍浸潤が始まった後にも投与することができる。この関連で、本発明は、哺乳類被験体を処置する方法を提供し、その方法は、（ｉ）癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体を処置のために選択すること；および（ｉｉ）癌細胞の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートするのに有効な量の本発明の抗体またはそのフラグメント（例えば、組成物に処方された本発明の抗体またはそのフラグメント）を前記被験体に投与することを含む。
【００７３】
好ましい実施態様において、前記抗体または抗体フラグメント（および／または本明細書において記載される任意の他の治療薬）は、組成物、例えば、担体（すなわち、ビヒクル、アジュバント、または希釈剤）を含んでなる生理学上許容される組成物などに処方される。使用される特定の担体は、物理化学的要件、例えば、溶解度および反応性の欠如などによってのみ限定され、投与経路によって限定される。生理学上許容される担体は当技術分野で周知である。注射用途に好適な例示的剤形には、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末が含まれる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号参照）。注射用処方物は、例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia. Pa., Banker and Chalmers, eds. (1982)、およびASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 第４版 (1986))にさらに記載されている。本明細書において記載される材料のいずれかを含んでなる医薬組成物は、容器内に、かかる医薬組成物の使用に関する説明を提供するパッケージング材料とともに入れてよい。一般的に、かかる使用説明書には、試薬濃度と、ある特定の実施態様においては、賦形剤成分または医薬組成物を再構成するのに必要な希釈剤（例えば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）の相対量も記載している具体的な表現が含まれる。
【００７４】
特定の被験体についての特定の投与計画は、用いる特定の抗体、他の治療用物質の存在、投与される量、投与経路、ならびに副作用の原因および程度によってある程度決まるであろう。本発明により被験体（例えば、哺乳類、例えば、ヒトなど）に投与される量は、妥当な期間にわたって所望の応答に影響を及ぼすのに十分であるべきである。用量の大きさも投与の経路、時期、および回数によって決まるであろう。従って、医師ならば、最適な治療効果を得るために、用量を滴定し投与経路を変更し得、従来の用量反応域検出技術は、当業者には公知である。単に例として、本発明の方法は、上述の因子に応じて、例えば、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでまたはそれ以上を投与することを含み得る。他の実施態様において、前記用量は、１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでに及んでよい。癌の過剰増殖性から、抗体またはそのフラグメントの１回用量は、完全な抗癌（抗浸潤）効果に達するものでなくてよい。実際には、大部分の慢性疾患と同様に、治療薬の複数回投与を必要とする長期処置が必要な場合がある。従って、一つの実施態様において、本発明の方法は、ある期間にわたって医薬組成物の複数回用量を送達することを含む。
【００７５】
生理学上許容される組成物、例えば、抗ＦＧＦＲ４抗体またはそのフラグメントを含んでなる医薬組成物などを投与する好適な方法は、当技術分野で周知である。薬剤の投与には２以上の経路を用いることができるが、他の経路より即時で効果的な反応を提供することができる特定の経路がある。状況に応じて、前記薬剤を含んでなる医薬組成物は体腔内に適用または注入され、皮膚または粘膜を通じて吸収され、消化され、吸入され、および／または循環に入る。例えば、ある特定の状況においては、生理学上許容される（例えば、医薬）組成物を静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、尿道、膣、または直腸手段による注射により、持続放出システムにより、あるいは埋込み装置により送達することも望ましいであろう。必要に応じて、前記抗体またはそのフラグメントは、対象となる領域に供給する動脈内または静脈内投与を介して、例えば、肝臓への送達の場合には肝動脈を介して局部的に投与される。あるいは、前記組成物は、前記抗体を吸収させたまたは封入したメンブレン、スポンジ、または別の適当な材料の埋込みを介して局所的に投与される。埋込み装置を使用する場合には、その装置を任意の好適な組織または器官に埋め込んでよく、前記抗体の送達は、拡散、時限放出型ボーラス、または連続投与を介したものであってよい。他の態様において、前記薬剤は、腫瘍切除または他の外科的処置中に露出した組織に直接または標的化注射（例えば、腫瘍内注射）により投与される。治療的送達アプローチは当業者には周知であり、それらのいくつかは、例えば、米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載されている。
【００７６】
併用療法
適当な場合には、前記薬剤は、さらなる（または増大された）生物学的効果を得るために、他の物質（例えば、治療用物質）および／または他の治療モダリティーと組み合わせて投与される。例えば、一つの実施態様において、本発明の方法は、２種以上の異なる抗ＦＧＦＲ４抗体（またはそのフラグメント）を被験体に投与することを含む。この関連で、本発明の方法が、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５によって認識されるＦＧＦＲ４エピトープと結合する抗体を使用することを必要とする場合、その方法は、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５によって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４のエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントを被験体に投与すること（または前記抗体またはそのフラグメントと癌細胞集団を接触させること）をさらに含んでよい。例示的な第二の抗体およびそのフラグメントとしては、（ｉ）実施例において記載されるＦ８５−６Ｃ５およびＦ９０−３Ｂ６（本明細書ではそれぞれ「６Ｃ５」および「３Ｂ６」とも呼ぶ）、（ｉｉ）Ｆ８５−６Ｃ５および／またはＦ９０−３Ｂ６とのＦＧＦＲ４の結合について競合する抗体またはそのフラグメント、ならびに（ｉｉｉ）Ｆ８５−６Ｃ５および／またはＦ９０−３Ｂ６によって認識されるＦＧＦＲ４の領域と結合する抗体またはそのフラグメントが挙げられる。驚くべきことに、癌細胞を、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５に、Ｆ８５−６Ｃ５もしくはＦ９０−３Ｂ６とを組み合わせて曝露すると、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５単独での処置と比べて、前記細胞中の総ＭＴ１−ＭＭＰタンパク質量および活性化ＭＴ１−ＭＭＰタンパク質量の減少が大きい結果となる。異なるＦＧＦＲ４エピトープ（とりわけ、異なる細胞外エピトープ）を認識する２種以上の抗ＦＧＦＲ４抗体による併用療法は、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５の阻害効果を増大させることができる。
【００７７】
あるいは（またはこれに加えて）、複数の生物学的効果を得るために、複数の抗体が被験体に送達される。一態様において、本発明は、哺乳類被験体を処置する方法を提供し、その方法は、第一および第二の抗ＦＧＦＲ４抗体またはそのＦＧＦＲ４結合フラグメントを、癌と診断された、または癌の処置を受ける被験体に投与することを含み、ここで、前記第一の抗ＦＧＦＲ４抗体またはフラグメントは、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８のＦＧＦ２誘導性リン酸化を阻害し、前記第二の抗ＦＧＦＲ４抗体またはフラグメントは、リガンド非依存性ＦＧＦＲ４リン酸化を阻害する。前記抗体またはそのフラグメントは単一組成物に処方してよく、あるいは同時にまたは逐次的に投与される別個の組成物（すなわち、前記第一の抗体またはフラグメントを含有する第一の組成物および前記第二の抗体またはフラグメントを含有する第二の組成物）で投与してよい。本発明の方法はまた、前記抗ＦＧＦＲ４抗体を非抗体系ＦＧＦＲ４阻害薬、例えば、本明細書においてさらに記載されるものなどと組み合わせて投与することを必要とすることもある。例えば、前記方法は、癌の標準的治療の化学療法を前記被験体に投与することを含み得る。
【００７８】
あるいは、またはこれに加えて、本発明の方法は、ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬を被験体に投与すること（または前記阻害薬と癌細胞集団を接触させること）をさらに含む。ＭＴ１−ＭＭＰのいずれの阻害薬も、本発明において使用に好適であり、非抗体系（例えば、小分子）ＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬は上に記載されている。一態様において、前記阻害薬は、ＭＴ１−ＭＭＰと結合してその酵素の活性を阻害する（例えば、細胞外基質の分解を阻害する）抗体またはそのフラグメントである。いくつかの抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体は当技術分野で公知である。例えば、Nisato et al., Cancer Res., 65(20): 9377-9387, 2005にさらに記載されている、抗体ＬＥＭ−１およびＬＥＭ−２は、用量依存的に、三次元コラーゲンゲルのサイトカイン誘導性ウシ微小血管内皮（ＢＭＥ）細胞浸潤を抑制する。抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体は、Galvez et al., J. Biol. Chem., 276: 37491-500, 2001にも記載されている。ＦＧＦＲ４抗体に関して上に記載した抗体およびそのフラグメントの考察は、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体にも関連している。
【００７９】
ＭＴ１−ＭＭＰの内因性阻害薬は同定されており、本発明の方法における使用のために企図される。例えば、一度活性化したら、ＭＭＰは、その活性部位と結合し触媒作用を阻害する、メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の内因性組織阻害薬群により特異的に阻害される（Nagase et al., 前掲）。ＭＴ１−ＭＭＰは、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４により阻害されるが、ＴＩＭＰ−１によっては阻害されない(Will et al., J. Biol. Chem., 271: 17119-17123, 1996; Bigg et al., Cancer Res., 61: 3610-3618, 2001)。ＧＰＩ結合糖タンパク質であるＲＥＣＫ（Ｋａｚａｌモチーフを含む復帰突然変異誘発システインリッチタンパク質(reversion inducing-cysteine rich protein with Kazal motifs)）は、ＭＴ１−ＭＭＰのもう１つの阻害薬である(Oh et al., Cell, 107: 789-800, 2001)。突然変異ＲＥＣＫを有するマウスは、Ｅ１０．５において胚致死となり、コラーゲン原繊維、基底板、および血管発生の異常−過剰なＭＭＰ活性と相関している可能性がある表現型を示す。コンドロイチン／ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ｔｅｓｔｉｃａｎ  １、ｔｅｓｔｉｃａｎ  ３、およびｔｅｓｔｉｃａｎ  ３のスプライス変異体であるＮ−ＴｅｓもＭＴ１−ＭＭＰを阻害することが分かっている(Nakada et al., Cancer Res., 67: 8896-8902, 2001)。
【００８０】
血管内皮細胞増殖因子受容体−３（ＶＥＧＦＲ−３）または血管内皮細胞増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）の阻害薬もまた、本発明の抗体、そのフラグメント、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドとともに使用するために企図される。本発明の方法は、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｃ刺激を抑制する薬剤、例えば、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦＲ−３もしくはＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインと結合する抗体または抗体フラグメント；ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと結合するのに有効な、ＶＥＧＦＲ−３細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含んでなる可溶性タンパク質；あるいはＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと結合するのに有効な、ＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含んでなる可溶性タンパク質などを投与することを含み得る。ＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２活性をモジュレートするための例示的な薬剤および方法は、例えば、米国特許第７，０３４，１０５号および同第６，８２４，７７７号、米国特許公報第２００５／０２８２２３３号および同第２００６／００３００００号；ならびに国際特許公報第ＷＯ  ２００５／０８７８１２号（出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００７７４２号）、同第ＷＯ  ２００５／０８７８０８号（出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００７７４１号）、同第ＷＯ  ２００２／０６０９５０号（出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００１７８４号）、および同第ＷＯ  ２０００／０２１５６０号（出願第ＰＣＴ／ＵＳ  １９９９／０２３５２５号）に記載されている。
【００８１】
いかなる場合でも、医師は、例えば、特定の癌、進行度、および患者のタイプに適当である、または好ましいと考えられる１以上の「標準的治療の」療法を有する。本発明は、さらなる変形として、本明細書において記載される療法と組み合わせての、標準的治療の療法(standard or care therapies)の投与／使用を含む。
【００８２】
本発明の方法との併用に好適な他の治療用物質／同時療法としては、例えば、放射線療法、温熱療法、外科的切除、化学療法、抗脈管形成因子（例えば、可溶性増殖因子受容体（例えば、ｓｆｌｔ）、増殖因子アンタゴニスト（例えば、アンジオテンシン）など）、鎮静薬などが挙げられる。各治療因子は、前記薬剤に好適な計画に従って投与される。これには、本発明の抗体またはそのフラグメントおよび１種以上のさらに好適な薬剤（群）の同時発生投与（すなわち、実質的に同時投与）および非同時発生投与（すなわち、重なっているかどうかにはかかわらず任意の順序での異なる時間での投与）が含まれる。異なる成分は、同じ組成物でまたは別個の組成物で、同じまたは異なる投与経路により投与してよいことは分かるであろう。この関連で、本発明の組成物は、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５によって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４のエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントおよび／またはＭＴ１−ＭＭＰ阻害薬を含んでなり得る。あるいはまたは加えて、本発明の抗体またはそのフラグメントは、コンジュゲートまたは結合させた抗新生物薬（例えば、放射性ヌクレオチド）または細胞傷害薬を含んでなり得る。放射性ヌクレオチド−抗体コンジュゲートのさらなる考察については、例えば、Appelbaum et al., Blood, 75(8): 2202, 1989；および米国特許第６，７４３，４１１号を参照のこと。
【００８３】
本発明と併用するための化学療法処置は抗悪性腫瘍薬を使用し、抗悪性腫瘍薬としては、限定されるものではないが、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファランおよびクロラムブシルなど；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）など；トリエチレンメラミン(thriethylenemelamine)（ＴＥＭ）、トリメチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、およびヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）などのエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン；メトトレキサートおよびトリメトレキサートなどの葉酸類似体、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジンなどのピリミジン類似体、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）などのプリン類似体を含む代謝拮抗物質；パクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、およびリン酸エストラムスチンなどの細胞分裂抑制薬を含む天然物；エトポシドおよびテニポシドなどのピポドフィロトキシン(pipodophylotoxins)；アクチモマイシンＤ(actimomycin D)、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、およびアクチノマイシンなどの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどの生物応答修飾物質；シスプラチンおよびカルボプラチンなどのプラチニウム配位錯体(platinium coordination complexes)、ミトキサントロンなどのアントラセンジオン、ヒドロキシウレアなどの置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトーテン（ｏ，ｐ’?ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤を含む様々な薬剤；プレドニゾンおよび等価物、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミドなどの副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含むホルモンおよびアンタゴニスト；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン薬；プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリドなどの抗アンドロゲン薬；ならびにフルタミドなどの非ステロイド系抗アンドロゲン薬：を含むアルキル化剤が挙げられる。
【００８４】
腫瘍転移の抑制に効果的なサイトカインも併用療法における使用のために企図される。かかるサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子としては、限定されるものではないが、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンが挙げられる。
【実施例】
【００８５】
このように一般的に記載した本発明は、以下の実施例を参照することによりより理解されるであろう。それらの実施例は例示として記載し、本発明を限定するものではない。
【００８６】
実施例１
この実施例では、ＭＴ１−ＭＭＰ活性についてのバイアスのかからない機能獲得型ｋｉｎｏｍｅスクリーニングを用いてＦＧＦＲ４および他のキナーゼ分子を腫瘍細胞浸潤のレギュレーターとして同定する。
【００８７】
腫瘍細胞浸潤を調節するキナーゼ分子を同定するために、ゼラチンザイモ電気泳動を用いるＭＴ１−ＭＭＰ活性についてのバイアスのかからない機能獲得型ｋｉｎｏｍｅスクリーニングを開発した。ＭＴ１−ＭＭＰは、ＨＴ−１０８０細胞において最も顕著に発現されるＭＴ−ＭＭＰで、主要なＭＭＰ−２アクチベーターである(Lehti et al., J. Biol. Chem., 27(10): 8440-48, 2002)ため、ＭＭＰ−２活性化はＭＴ１−ＭＭＰ活性の間接的な指標となった。ヒトプロテインキナーゼ全体の約９３％をコードするｃＤＮＡライブラリー（４８０種の異なるキナーゼをコードする５６４種のｃＤＮＡ）(Varjosalo et al., Cell, 133(3): 537-48, 2008)をＦｕＧＥＮＥ６(Roche)で、９６ウェルプレートに密度１×１０４細胞／ウェルでプレーティングしたヒトＨＴ−１０８０繊維肉腫細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション後、その細胞を完全培地中で２４時間、無血清培地中でさらに２０時間インキュベートした。馴化培地のアリコートを非還元Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーに溶解させ、不連続３．５：１０％ポリアクリルアミドゲル（１ｍｇ／ｍｌゼラチン含有）を用いて電気泳動により分離した。Lohi et al., Eur. J. Biochem., 239(2): 239-47, 1996に記載されているように、ＳＤＳを除去し、ＭＭＰ再折りたたみおよび自己活性化をさせた。その後、それらのゲルを３７℃で１６時間インキュベートし、１０％酢酸、５％メタノール中クーマシーブルーで染色した。
【００８８】
それらのゲルをゼラチンザイモ電気泳動により展開し、プロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−９の相対的タンパク質レベルおよび活性化レベルをザイモ電気泳動画像から定量した。最大の相対的レベルのプロＭＭＰ−２をもたらしたキナーゼのサブセットを次のスクリーニングのために選択した。ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＭＰ−９はどちらも再構成プロセス（浸潤を含む）に一般に関与する生物学的に重要なＭＭＰであるため、これらのＭＭＰは共通の調節経路を共有する可能性が考えられる。しかしながら、プロ酵素としてのみ検出可能なＭＭＰ−９の相対的レベルを増大させたキナーゼは、ＭＴ１−ＭＭＰ活性およびＭＭＰ−２活性化を増大させるキナーゼと大部分は異なっていた。
【００８９】
次のＭＴ１−ＭＭＰ／ＭＭＰ−２カスケードスクリーニングでは、２２種のキナーゼの発現は、対照と比べてプロＭＭＰ−２活性化の２倍を超える増大を生じた（図１）。これらのキナーゼは、公知のＭＴ１−ＭＭＰ誘導性刺激の下流に新規ＭＴ１−ＭＭＰ／ＭＭＰ−２カスケードレギュレーターおよび経路成分の両方を含んだ。この後者の群には、ＩＬ−ＩまたはＴＮＦ−αにより活性化される炎症シグナル伝達経路に関連するＴＧＦ−βファミリーメンバーおよびキナーゼの受容体がある。ＭＭＰ−２活性化を有意に増大させた予期せぬヒットには、受容体チロシンキナーゼＦＧＦＲ４およびＥｐｈＡ２などがあった。
【００９０】
ＦＧＦＲ４は、ＭＴ１−ＭＭＰ活性の間接的な指標であるＭＭＰ−２活性化を有意に増大させた。これらの結果は、腫瘍細胞浸潤のレギュレーターとしてのＦＧＦＲ４の役割を示した。
【００９１】
実施例２
この実施例では、ＭＴ１−ＭＭＰ活性についてＦＧＦＲ４のモジュレーションが転写後に起こることを立証する。
【００９２】
ＭＴ１−ＭＭＰ遺伝子発現は悪性組織では、正常組織に対してアップレギュレートされていることが多いため、選択キナーゼのＭＴ１−ＭＭＰ発現への潜在的寄与を検討した。ＨＴ−１０８０細胞を、ＦＧＦＲ４、ＥｐｈＡ２、またはＴＧＦβ、ＩＬ−Ｉ、およびＴＮＦα経路において最も有力なキナーゼをコードする発現ベクターでトランスフェクトした。ＭＴ１−ＭＭＰ  ｍＲＮＡのレベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより決定した。ＩＲＡＫ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＡＣＶＲＩＣ、およびＥｐｂＡ２は、緩やかではあるが有意にＭＴ１−ＭＭＰ  ｍＲＮＡのレベルを増大させた（１．５〜２．５倍、ｎ＝３、ｐ＜０．００５）。in vitroデータと一致して、８４７８個の悪性サンプルの正規化された発現データを含むＩｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ（ＩＳＴ）データベースの相関ブロットでは、いくつかのタイプの癌の組織サンプルにおいてＭＴ１−ＭＭＰの発現とＩＲＡＫ１、ＥｐｈＡ２、またはＡＣＶＲｌＬとの間に有意な正の相関が明らかになった。興味深いことに、ＭＴ１−ＭＭＰ／ＭＭＰ−２スクリーニングにおいて最大のヒットに入ったＦＧＦＲ４は、ＨＴ−１０８０細胞においてＭＴ１−ＭＭＰ  ｍＲＮＡレベルにほとんど影響を及ぼさなかった。同様に、種々のタイプの腫瘍の組織サンプルにおいてＦＧＦＲ４発現レベルとＭＴ１−ＭＭＰ発現レベルとの間には弱い相関しか認められなかった。これは、これらの２つの遺伝子の非依存性転写調節と一致し、ＦＧＦＲ４によるＭＴ１−ＭＭＰ調節のより直接的な機構の可能性を提起する。
【００９３】
ＭＴ１−ＭＭＰレベルおよび細胞内分布に対するキナーゼの転写後の影響を評価するために、検出可能な内因性ＭＴ１−ＭＭＰを発現しないＣＯＳ−１細胞においてＭＴ１−ＭＭＰをＦＧＦＲ４、ＥｐｈＡ２、またはＩＲＡＫ１と共発現させた。細胞を抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体での免疫蛍光染色に付した。観察により、ＭＴ１−ＭＭＰは、ＭＴ１−ＭＭＰ単独でトランスフェクトした細胞の細胞内核周囲コンパートメントに主に局在するように見えた。興味深いことに、生じたＦＧＦＲ４の共発現は、細胞質構造および細胞表面膜構造の両方におけるＭＴ１−ＭＭＰの局在を強調する。これらの変化は、ＦＧＦＲ４発現細胞における細胞拡散の増大と一致し、それはＥｐｈＡ２トランスフェクト細胞でも見られた。ＩＲＡＫは、細胞表面におけるＭＴ１−ＭＭＰ染色の強度を高めた。ＭＴ１−ＭＭＰは、変異体キナーゼを発現する細胞では主に核周囲に留まり活性部位モチーフにおける点突然変異を不活性化したことから、触媒キナーゼ活性は、ＭＴ１−ＭＭＰ調節に必須であった(Varjosalo et al., 前掲)。
【００９４】
トランスフェクト細胞におけるＭＴ１−ＭＭＰタンパク質の量も調査した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、様々なキナーゼをコードする発現ベクターで一過的にトランスフェクトし、ＭＴ１−ＭＭＰタンパク質発現を免疫ブロッティングにより評価した。ＭＴ１−ＭＭＰタンパク質の細胞表面レベルを、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン標識およびＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体を用いた免疫沈降により評価した。ＦＧＦＲ４、ＩＲＡＫ１、およびＥｐｈＡ２は総て、ＭＴ１−ＭＭＰの総レベルと細胞表面レベルを著しく高めたが、ＩＲＡＫ１は、リアルタイムＰＣＲによって評価されるようにＭＴ１−ＭＭＰ  ｍＲＮＡ発現をわずかに高めただけであった。活性化ＭＴ１−ＭＭＰと、高い細胞表面ＭＴ１−ＭＭＰ活性と相関することが多い(Lehti et al., Biochem. J., 334: 345-53, 1998; Lehti et al., J. Biol. Chem., 275: 15006-13, 2000)自己触媒的にプロセシングを受けた４３ｋＤａ型の両方がＩＲＡＫ１およびＦＧＦＲ４発現細胞において検出された。対照的に、ＭＴ１−ＭＭＰレベルは大部分の非機能性キナーゼによってあまり影響を受けなかった。
【００９５】
これらの結果は、活性ＦＧＦＲ４がＭＴ１−ＭＭＰタンパク質レベルを転写後に高めその分布を変更することを示唆している。
【００９６】
実施例３
この実施例では、ＦＧＦＲ４およびＭＴ１−ＭＭＰが物理的に相互作用しＦＧＦＲ４によるＭＴ１−ＭＭＰ調節の潜在的な機構を強調することを立証する。
【００９７】
ＦＧＦＲ４によるＭＴ１−ＭＭＰ調節の考えられる機構を検討するために、ＦＧＦＲ４またはＩＲＡＫ１およびＭＴ１−ＭＭＰについて、それぞれのキナーゼをコードする発現ベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において二重免疫蛍光染色を行った。ＦＧＦＲ４トランスフェクト細胞をＦＧＦ２（２５ｎｇ／ｍｌ）とともにまたはＦＧＦ２なしで３０分間インキュベートし、その後ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４に対する抗体で免疫蛍光染色した、ＩＲＡＫ１トランスフェクト細胞をＩＬ−１β（５ｎｇ／ｍｌ）とともにまたはＩＬ−１βなしで３０分間インキュベートし、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＩＲＡＫ１について免疫蛍光染色を行った。興味深いことに、ＦＧＦＲ４は、主として、未処置細胞の小胞膜構造にＭＴ１−ＭＭＰとともに共局在し、ＦＧＦ２刺激はこの共局在をさらに増大させた。ＩＲＡＫ１発現細胞では、ＭＴ１−ＭＭＰは、ＩＬ−１β刺激を受けてもＩＬ−１β刺激なしでもその細胞表面上に顕著に局在した。どちらのタンパク質も細胞の同じ領域に蓄積する傾向があったが、ＦＧＦＲ４とは異なり、細胞質ＩＲＡＫ染色はＭＴ１−ＭＭＰとともに特異的に共局在しなかった。
【００９８】
同じ膜小胞に局在するＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４が、同じ膜受容体複合体で物理的に相互作用するかどうかを定義するために、細胞を共トランスフェクトしＨＡタグ付きＭＴ１−ＭＭＰおよびＶ５タグ付きＦＧＦＲ４を作製した。この後、免疫沈降および免疫ブロッティング解析を行った。免疫ブロッティング実験では、コンフルエントな細胞培養物を洗浄し、無血清ＤＭＥＭ中で２４時間インキュベートした。一過的にトランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後、無血清培地へ入れる前に１６時間インキュベートした。次いで、馴化培地を回収し、記載されているとおりに細胞溶解物を調製した（Lehti et al. 1998、前掲）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４〜２０％勾配Ｌａｅｍｍｌｉポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて行った。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、記載されているとおりにそれらの免疫検出を行った(Lohi et al., Eur. J. Biochem., 239: 239-47, 1996)。免疫ブロッティング解析は、タンパク質タグ、ＨＡおよびＶ５に対する抗体を用いて行った。
【００９９】
ＦＧＦＲ４は、抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降したＭＴ１−ＭＭＰ複合体における抗Ｖ５抗体を用いた免疫ブロッティングによりはっきりと検出できた。同様に、抗Ｖ５抗体を用いて免疫沈降したＦＧＦＲ４複合体でもＨＡタグ付きＭＴ１−ＭＭＰが検出された。同じ実験条件下ではＶ５タグ付きＩＲＡＫ１とＨＡタグ付きＭＴ１−ＭＭＰとの間の相互作用は検出されなかったため、ＦＧＦＲ４とＭＴ１−ＭＭＰとの間の相互作用は特異的であった。
【０１００】
ＦＧＦＲ４はエンドサイトーシス後にほとんど再循環されることが報告されているため、ＭＴ１−ＭＭＰのエンドソーム局在に対するＦＧＦＲ４の影響を評価した。エンドソームマーカータンパク質（クラスリンおよびＥＥＡ１）に対する抗体を用いた免疫蛍光解析により、ＦＧＦＲ４とのＭＴ１−ＭＭＰ相互作用が細胞内クラスリンおよびＥＥＡ１陽性エンドソーム小胞におけるＭＴ１−ＭＭＰのレベルの増大と一致することが明らかになった。一方、ＩＲＡＫ１発現細胞の表面において顕著なＭＴ１−ＭＭＰ染色が検出された。これらの結果は、ＦＧＦＲ４との相互作用によりエンドサイトーシスされたＭＴ１−ＭＭＰの潜在的に増大した安定性と一致する。
【０１０１】
ＩＲＡＫ１およびＦＧＦＲ４によるＭＴ１−ＭＭＰ活性およびタンパク質発現の調節に対するリソソーム分解の寄与を定義するために、これらのキナーゼを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、リソソーム阻害薬、バフィロマイシンＡ(Calbiochem)、およびプロテオソーム阻害薬、ＭＧ１３２(MG-132, Z-Leu-Leu-CHO; Peptide Institute Inc., Osaka, Japan)とともにインキュベートした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、エンプティーｐＣＲ３．１発現ベクター（模擬）およびＩＲＡＫ１またはＦＧＦＲ４についてコードする対応するベクターでトランスフェクトした。細胞を抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体および抗クラスリン抗体で免疫染色し、共焦点像により評価した。ＦＧＦＲ４トランスフェクト細胞を抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体および抗ＬＡＭＰ１抗体で免疫染色した。ＭＴ１−ＭＭＰのレベルに対するＭＧ１３２の影響はごくわずかであった。対照的に、バフィロマイシンＡによるリソソーム分解の阻害は対照細胞におけるＭＴ１−ＭＭＰタンパク質レベルを増大させ、これは、ＭＴ１−ＭＭＰの報告されている急速で構成的なリソソーム分解と一致する。重要なことに、ＦＧＦＲ４は、未処置細胞におけるＭＴ１−ＭＭＰのレベルを特異的に増大させ、その結果、処置していない細胞とバフィロマイシンＡで処置した細胞との間でのＭＴ１−ＭＭＰタンパク質レベルの差は減少した。従って、ＦＧＦＲ４発現細胞ではＬＡＭＰ−１陽性リソソーム構造におけるＭＴ１−ＭＭＰ局在は、対照細胞と比べて著しく減少した。
【０１０２】
この実施例の結果は、ＦＧＦＲ４がＭＴ１−ＭＭＰのリソソーム選別および分解を阻害し、その結果、細胞の活性ＭＴ１−ＭＭＰレベルが増大することを示している。ＦＧＦＲ４により媒介されるＭＴ１−ＭＭＰの増大は、ひいては、腫瘍細胞浸潤性をモジュレートする。
【０１０３】
実施例４
この実施例では、三次元コラーゲン浸潤アッセイを用いて、すなわち、腫瘍細胞浸潤アッセイを用いて、キナーゼにより媒介されるＭＴ１−ＭＭＰ調節の機能的意義を例示する。
【０１０４】
細胞周囲のコラーゲン分解は、ＭＴ１−ＭＭＰの主要な確立された生物学的機能である。ＭＴ１−ＭＭＰ活性のキナーゼ媒介モジュレーションは、三次元コラーゲン浸潤アッセイにより判定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、ＦＧＦＲ４、ＥＰＨＡ２、およびＩＲＡＫ１をコードする発現ベクターで、またはそれぞれの不活性化したキナーゼでトランスフェクトした。それらの細胞をI型コラーゲンゲルの上部に播種し、５日間浸潤させた。それらのゲルを固定し、パラフィン包埋した。コラーゲン基質に浸潤した細胞を視覚化し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片から計数した。
【０１０５】
活性キナーゼのそれぞれの過剰発現は、他の場合では相対的に遅い、未刺激ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤を有意に増大させた。ＩＲＡＫ１、ＦＧＦＲ４、またはＥｐｈＡ２の発現はそれぞれ、模擬トランスフェクト細胞と比べて４倍を超える浸潤速度の増大をもたらした。予想通り、不活性化したキナーゼは細胞浸潤にほとんど影響を及ぼさなかった。注目すべきは、ＦＧＦＲ４およびＥｐｈＡ２のみ、２０μｍを超えて浸潤した細胞の数を有意に増大させた（それぞれ１２．１倍および９．８倍）ことである。ＦＧＦＲ４は、１００μｍを超えて浸潤したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の数を２０倍増大させた。ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４は、急速に浸潤する細胞の先導端にも細胞内小胞内にも共局在した。
【０１０６】
細胞浸潤研究に加えて、基質分解を検討した。トランスフェクト細胞を、Ａｌｅｘａ  ４８８ゼラチンコートしたカバースリップ上に播種し、ＧＭ６００１（１０μＭ）の存在下で３時間付着および拡散させた。ＭＭＰ阻害薬を洗い流した後、細胞媒介ゼラチン分解を完全培地中で２０分間行った。固定し透過処理した細胞を抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体で免疫染色した。分解を共焦点顕微鏡により視覚化し、低倍率図から分解面積と細胞数との比率として定量した（平均±１ＳＤ、ｎ＝３）。加えて、トランスフェクト細胞を架橋コラーゲン基質上で３時間インキュベートし、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４について免疫染色した。
【０１０７】
コラーゲン浸潤速度が増大したことと一致して、ＩＲＡＫ１、ＦＧＦＲ４およびＥｐｈＡ２を発現する細胞は、対照細胞またはＫＤキナーゼでトランスフェクトした細胞より効率的に蛍光ゼラチン基質を分解することができた。興味深いことに、前記細胞におけるＦＧＦＲ４発現により、細胞の一端にＭＴ１−ＭＭＰクラスターとともに共局在する、細胞周囲基質タンパク質分解による著しく分極した病巣が誘導された。ＦＧＦＲ４発現細胞はまた、３時間内に架橋コラーゲン基質を分解し通り抜けることもできた。対照的に、細胞−基質接着においてゼラチン分解およびＭＴ１−ＭＭＰレベルを効率的に増大させたＩＲＡＫ１は、同じ期間内に架橋３−Ｄコラーゲン層において分解ホールの大きさを増大することはできなかった。
【０１０８】
これらの結果は、ＭＴ１−ＭＭＰが細胞運動性機構と協調的に機能し架橋３−Ｄコラーゲンにおける浸潤を駆動するという、高浸潤性癌細胞表現型の誘導におけるＦＧＦＲ４の特異的な役割を示唆している。
【０１０９】
実施例５
この実施例では、ＭＴ１−ＭＭＰ機能および細胞浸潤に対する２つのＦＧＦＲ４対立遺伝子の影響を比較し、ＦＧＦＲ４を癌細胞浸潤抑制のための新規標的として確立する。
【０１１０】
ＦＧＦＲ４遺伝子における一塩基多型は、乳腺癌、前立腺癌、および結腸腺癌、ならびに頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、および軟部組織肉腫などのいくつかのタイプの腫瘍を有する患者の不良な予後と関係していた。該当するＦＧＦＲ４変異体では、膜貫通ドメインのグリシン３８８がアルギニンに変更されている（Ｒ３８８）。興味深いことに、配列解析により、実施例１に記載したｋｉｎｏｍｅライブラリーに含まれるＦＧＦＲ４  ｃＤＮＡはＡｒｇ３８８変異体をコードすることが明らかになった。ＭＴ１−ＭＭＰ機能および細胞浸潤に対するＧ３８８  ＦＧＦＲ４対立遺伝子およびＲ３８８  ＦＧＦＲ４対立遺伝子の影響を比較するために、ｋｉｎｏｍｅライブラリーのＲ３８８  ＦＧＦＲをコードするｃＤＮＡを、野生型Ｇ３８８  ＦＧＦＲ４をコードするように修飾した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＦＧＦＲ４対立遺伝子（ＦＧＦＲ４Ｇ３８８−Ｖ５−ＨｉｓおよびＦＧＦＲ４Ｒ３８８−Ｖ５−Ｈｉｓ）をコードする発現ベクターおよび対応する非機能性キナーゼ、ならびにＨＡタグ付きＭＴ１−ＭＭＰをコードする発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。細胞をバフィロマイシンＡまたはＧＭ６００１とともに１６時間インキュベートし、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４のレベルを免疫ブロッティングにより評価した。細胞培地を回収し、記載されているとおりに細胞溶解物を調製した(Lehti et al. 1998、前掲)。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４〜２０％勾配Ｌａｅｍｍｌｉポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて行った。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、記載されているとおりにそれらの免疫検出を行った(Lohi et al., 前掲)。
【０１１１】
対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるバフィロマイシンＡによるリソソーム分解阻害によりＭＴ１−ＭＭＰタンパク質レベルが増大した。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８変異体の発現により、処置していない細胞においてＭＴ１−ＭＭＰレベルが増大したことで、この効果が相対的に低下した。対照的に、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８の発現では、ＭＴ１−ＭＭＰレベルはあまり増大しなかった。ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８発現細胞では、バフィロマイシン処置後のＭＴ１−ＭＭＰレベルの増大は、大きなＦＧＦＲ４ダウンレギュレーションにつながった。Ｒ３８８または不活性化したキナーゼのいずれか１つを発現する細胞ではその効果ははっきりしなかった。合成ＭＭＰ阻害薬であるＧＭ６００１によるＭＴ１−ＭＭＰ活性の阻害は、免疫ブロッティングにより検出されないレベルでＦＧＦＲ４  Ｇ３８８を正常に発現する対照細胞における内因性ＦＧＦＲ４の検出と関係していた。
【０１１２】
ＭＴ１−ＭＭＰタンパク質発現に対する、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８およびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８により媒介される逆の影響も共トランスフェクション実験により明らかになった。ＦＧＦＲ４  Ｇｌｙ３８８発現は、ＭＴ１−ＭＭＰタンパク質レベルの減少につながったが、一方、ＦＧＦＲ４  Ａｒｇ３８８変異体はＭＴ１−ＭＭＰの相対的レベルを増大させた。ＦＧＦＲ４  Ａｒｇ３８８はＭＴ１−ＭＭＰにより顕著に共沈降した。しかしながら、ＭＴ１−ＭＭＰ免疫沈降物中には対立遺伝子および不活性キナーゼ変異体の両方が検出された。
【０１１３】
細胞浸潤に対する２つのＦＧＦＲ４対立遺伝子の影響も、実施例４に記載した方法と同様の方法を用いて検討した。Ｇ３８８対立遺伝子についてコードするｃＤＮＡをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において安定発現させ、それらの細胞を1型コラーゲンゲルの上にプレーティングした。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８発現細胞は、模擬トランスフェクト細胞と比べて増大した速度でコラーゲンに浸潤したが、一方、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８発現細胞は、模擬トランスフェクト細胞、と同じ速度であるいはよりゆっくりと、浸潤した。コラーゲン浸潤は、レンチウイルスＭＴ１−ＭＭＰサイレンシングＲＮＡにより廃絶され、浸潤の駆動におけるＭＴ１−ＭＭＰとＦＧＦＲ４  Ｒ３８８との間の機能的関係が確認された。
【０１１４】
この実施例では、ＦＧＦＲ４  Ｇｌｙ３８８およびＭＴ１−ＭＭＰが、キナーゼ活性およびメタロプロテイナーゼ活性それぞれに依存する機構を通じて相互にダウンレギュレートされることを立証する。よって、Ｇｌｙ３８８および／またはＡｒｇ３８８  ＦＧＦＲ４変異体は腫瘍細胞浸潤抑制のための標的である。
【０１１５】
実施例６
この実施例の結果により、ＦＧＦＲ４およびＭＴ１−ＭＭＰがin vivoで浸潤癌細胞において共発現されることを確立し、前記分子間の機能的関係をさらに裏付ける。
【０１１６】
ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡは、種々のタイプのヒト癌由来のサンプルにおいて共発現されることが多い。個々の組織サンプルにおける発現に十分な相関がない場合でも、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４両方の平均発現レベルは、結腸癌、精巣癌、子宮癌および乳癌を含む種々の腫瘍タイプにおいてアップレギュレートされることが多い。これらの結果は、両方のタンパク質がin vivoで同じ細胞において発現される場合には、それらの相互作用がヒト腫瘍の浸潤性に機能的に寄与することを示唆する。種々の腫瘍および間質細胞集団におけるＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４の共局在をさらに検討するために、４０の悪性組織サンプルおよび正常乳房組織サンプルを含む凍結組織アレイを得、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体および抗ＦＧＦＲ４抗体で免疫染色した。抗ＦＧＦＲ４抗体は、培養細胞の他のＦＧＦＲと交差反応しない十分に確立されたポリクローナル抗体であった。ＭＴ１−ＭＭＰ−／−マウスの免疫化によって作製されたモノクローナル抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体(Ingvarsen et al., Biol. Chem., 389: 943-53, 2008)を用いた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の免疫蛍光染色により試験した場合、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体により内因性ＭＴ１−ＭＭＰが容易に検出され、その染色はｓｉＲＮＡ媒介ＭＴ１−ＭＭＰノックダウン後に完全に阻害した。検体はＬｅｉｃａ顕微鏡により分析した。
【０１１７】
ＦＧＦＲ４が主として乳房上皮細胞および乳癌細胞に局在することを観察した。ＦＧＦＲ４は、分析した正常乳房４ケース総ての乳管上皮細胞で検出され、乳管癌細胞においては相対的レベルが増大した場合が多かった（２０／３６ケースで強い染色）。ＭＴ１−ＭＭＰは、乳癌の反応性間質において（２８／３６ケース）、とりわけ、癌細胞に隣接する筋上皮において有意にアップレギュレートされた。これは、癌の浸潤領域および非浸潤領域の両方において観察された。重要なことに、ＭＴ１−ＭＭＰは、腫瘍の浸潤先進部に局在する癌細胞と、低分化型乳癌の細胞で特異的に検出され（１０／３６ケース）、そこでＭＴ１−ＭＭＰは、ＦＧＦＲ４とともに顕著に共局在した。１４の異なる腫瘍タイプおよび対応する正常組織由来のサンプルを含む複数の凍結組織アレイの免疫組織化学により、ＭＴ１−ＭＭＰ染色の相対的レベルがほとんどの他の悪性組織においても増大した（１０／１４ケース）ことが明らかになった。ＭＴ１−ＭＭＰは、反応性間質においてアップレギュレートされた場合が多く（６／１４ケース）、腫瘍細胞ではＦＧＦＲ４とともに共発現された（８／１４ケース）。乳癌と同様に、他のタイプの癌、例えば、結腸腺癌などにおけるＭＴ１−ＭＭＰは、浸潤先進部の腫瘍細胞において顕著に発現された。
【０１１８】
in vivoでのＦＧＦＲ４対立遺伝子（ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８およびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８）およびＭＴ１−ＭＭＰの発現を、ｑＰＣＲアレイを用いて検討し、そのアレイは、４８のヒト乳癌ｃＤＮＡサンプルからのＦＧＦＲ４配列決定につながった。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(Qiagen)で抽出し、続いて、ランダムヘキサマープライマー(Invitrogen)およびスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素(Life Technologies)による逆転写を行った。ｍＲＮＡ発現は、記載されているとおりに(Tatti et al., Exp. Cell Res., 314: 2501-2514, 2008)、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび有効なプライマー（ＭＴ１−ＭＭＰ；Ｈｓ  ０１０３７００６＿ｇＨ、ＭＴ２−ＭＭＰ；Ｈｓ  ００２３３９９７＿ｍｌ、ＭＴ３−ＭＭＰ；Ｈｓ  ００２３４６７６＿ｍｌ、ＭＴ４−ＭＭＰ；Ｈｓ  ００２１１７５４ｍｌ、ＭＴ５−ＭＭＰ；Ｈｓ  ００１９８５８０ｍｌ、ＭＴ６−ＭＭＰ；Ｈｓ  ００３６０８６１＿ｍｌ；ＭＭＰ−９；Ｈｓ００９５７５５５＿ｍｌ；ＦＧＦＲ１；Ｈｓ００９１５１４０＿ｍｌ、ＦＧＦＲ４；Ｈｓ００２４２５５８＿ｍｌ(Applied Biosystems)）を用いて定量した。発現は、ＴＡＴＡ−結合タンパク質（ＴＢＰ）およびグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ発現を用いて正規化した。Ｇｌｙ３８８〜Ａｒｇ３８８部位（塩基対１３２９〜１３３１）を含有するＦＧＦＲ４  ｃＤＮＡのフラグメントをＰＣＲ（プライマー：ＴＡＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣ（配列番号１７）およびＡＧＴＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＴ（配列番号１８））により増幅し、ＢｓｔＮｌ(New England BioLabs)により消化した。Ｒ３８８対立遺伝子は、特異的な１２６塩基対フラグメントにより同定した。Ｇ３８８対立遺伝子は、２つのフラグメント（９７塩基対および２９塩基対）により同定した。
【０１１９】
４８のヒト乳癌ｃＤＮＡサンプルのうち、２２サンプルはＦＧＦＲ４の同型接合のＧ／Ｇ対立遺伝子を有し（４６％）；２２サンプルは異型接合のＧ／Ｒ対立遺伝子を有し（４６％）；４サンプルは同型接合のＲ／Ｒ対立遺伝子を有した（８％）。癌患者において報告された不良な予後と一致して、同型接合のＲ３８８対立遺伝子を有する４つのｃＤＮＡサンプルは総て悪性度が最も高い（３）乳癌由来のものであった。ＭＴ１−ＭＭＰ  ｍＲＮＡはこれらの腫瘍の総てにおいて顕著に発現され、それは低いＦＧＦＲ４  Ｒ３８８発現と一致した。
【０１２０】
この実施例において記載した観察結果により、ＦＧＦＲ４およびＭＴ１−ＭＭＰには腫瘍浸潤性に対して相乗作用があることが強く示唆され、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子が高浸潤性癌と強く相関することが確認される。
【０１２１】
実施例７
この実施例では、コラーゲンの前立腺癌細胞浸潤におけるＦＧＦＲ４  Ｒ３８８活性化およびＦＧＦＲ４  Ｇ３８８抑制の機能的意義を例示する。
【０１２２】
ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４はヒト前立腺癌において共発現されることが最も多かったため、対応する細胞株を内因性ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４発現について評価した。ＰＣ３およびＤＵ１４５前立腺腺癌細胞は、著しいレベルのＦＧＦＲ１、ＭＴ１−ＭＭＰ、およびＦＧＦＲ４のＲ３８８（ＰＣ３細胞）またはＧ３８８（ＤＵ１４５細胞）変異体のいずれかを発現した。特に、同型接合のＦＧＦＲ４  Ｒ３８８対立遺伝子を発現するＰＣ３細胞だけがコラーゲンゲルに効率的に浸潤したが、一方、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８対立遺伝子について同型接合の対応するＤＵ１４５細胞は浸潤しなかった。ＦＧＦＲ４  ｓｉＲＮＡは、ＰＣ３細胞浸潤の８７％を抑制し、それはＴＩＭＰ−２により媒介されるＭＴ１−ＭＭＰ阻害によっても本質的に阻止された。報告されているＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４の両方による増殖および運動性誘導(Sahadevan et al., J. Pathol, 213: 82-90, 2007)と一致して、これらのＦＧＦＲのいずれか１つを一過的に標的とするｓｉＲＮＡは、ＦＧＦ２誘導性ＥＲＫリン酸化を減少させた。しかしながら、ＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡ発現をサイレンシングした場合にはコラーゲン浸潤が増大し、ＦＧＦＲ１が異なる機能を有することが示唆された。特に、ＤＵ  １４５細胞のＭＴ１−ＭＭＰ  ｍＲＮＡ発現は低かったが、これらの細胞もＦＧＦＲ４  Ｒ３８８でのトランスフェクション後にコラーゲンに浸潤した。
【０１２３】
細胞成長も検討した。レンチウイルスｓｈＲＮＡによる安定なＭＴ１−ＭＭＰまたはＦＧＦＲ４ノックダウンは、ＰＣ３細胞またはＤＵ１４５細胞いずれの正常な単層成長にも大きな変化をもたらさなかった。しかしながら、前記細胞を架橋コラーゲンＩで構成される成長制限３−Ｄ基質内にプレーティングした場合には、ＭＴ１−ＭＭＰサイレンシングによりＰＣ３細胞およびＤＵ１４５細胞成長および浸潤が有意に減少した。同様に、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８ノックダウンによりＰＣ３細胞の成長および浸潤が抑制され、同時にＭＴ１−ＭＭＰ含量および繊維芽細胞受容体基質−２（ＦＲＳ２）リン酸化が減少した。対照的に、ＤＵ１４５細胞におけるＦＧＦＲ４  Ｇ３８８のノックダウンによりそれらの細胞のコラーゲンへの浸潤性が増大し、それは内因性ＭＴ１−ＭＭＰのレベル増大と一致した。安定なＦＧＦＲ４  Ｇ３８８およびＭＴ１−ＭＭＰノックダウン細胞ではＦＲＳ２およびＥＲＫリン酸化も増大した。ＰＣ３細胞におけるＦＲＳ２リン酸化の強い阻害ですらＥＲＫ活性化と関係しておらず、ＦＧＦＲ４活性化以外の経路が細胞分裂ＦＧＦシグナル伝達に関与していることが示唆された。
【０１２４】
要するに、上記の結果により、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８が３−ＤコラーゲンにおけるＭＴ１−ＭＭＰ駆動のＰＣ３腫瘍細胞浸潤および成長の新規補助因子として同定され、Ｇ３８８およびＲ３８８対立遺伝子がＭＴ１−ＭＭＰ依存性浸潤に対して逆の影響を及ぼすことが示唆される。
【０１２５】
実施例８
この実施例では、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８がＭＴ１−ＭＭＰリン酸化およびエンドソーム安定化を誘導することを立証し、ＦＧＦＲ４によるＭＴ１−ＭＭＰ調節のさらなる潜在的な機構を強調する。
【０１２６】
ＭＴ１−ＭＭＰ細胞質尾部は、Ｓｒｃによりリン酸化され得る１個のチロシン残基を含む(Nyalendo et al., J. Biol. Chem., 282: 15690-15699, 2007)。ＦＧＦＲ４がＭＴ１−ＭＭＰリン酸化を誘導することができるかどうかを判定するために、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８および  ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をＨＡタグ付きＭＴ１−ＭＭＰとともに共発現させ、続いて、ＭＴ１−ＭＭＰ免疫沈降を行った。ＭＴ１−ＭＭＰチロシンリン酸化は、ＭＴ１−ＭＭＰをＦＧＦＲ４のいずれかの対立遺伝子とともに共発現するＣＯＳ１細胞では繰り返し検出されたが、非機能性キナーゼドメインを有するＦＧＦＲ４タンパク質またはＭＴ１−ＭＭＰ単独を発現する細胞では検出されなかった。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８およびＭＴ１−ＭＭＰは主として細胞内小胞において共局在した。ＦＧＦ２処置は、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８自己リン酸化だけでなく、ＭＴ１−ＭＭＰリン酸化およびエンドソーム蓄積も増大させ、複合体において活性化されたＦＧＦＲ４  Ｒ３８８がＭＴ１−ＭＭＰリン酸化を誘導することを示唆した。初期エンドソーム抗原−１（ＥＥＡ１）およびクラスリンによる共局在の増大、およびリソソーム結合膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ１）による共局在の減少により示されるように、この相互作用はエンドサイトーシスされたＭＴ１−ＭＭＰの安定性を増大させた。対照的に、細胞内小胞における弱く／一過的に活性化されたＦＧＦＲ４  Ｇ３８８またはキナーゼ欠損ＫＤタンパク質とのＭＴ１−ＭＭＰの共局在の程度は、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８で観察されたものよりも有意に低かった。
【０１２７】
ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内チロシン残基だけをフェニルアラニンに突然変異させ（ＭＴ１−Ｙ／Ｆ）、ＭＴ１−ＭＭＰリン酸化の重要性を評価した。Ｙ５７３Ｆ突然変異により、内因性ＦＧＦＲ４をほとんど発現しないＨＴ−１０８０細胞では、ＭＴ１−ＭＭＰ活性が変わらないように思われた。しかしながら、その突然変異は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞間接触および細胞内小胞における野生型ＭＴ１−ＭＭＰおよび内因性ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８の共局在を廃絶した。ＭＴ１−Ｙ／Ｆは主として細胞表面に局在したが、一方、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８は細胞内小胞内に移行した。細胞表面ＭＴ１−ＭＭＰの増強と一致して、突然変異は３−Ｄコラーゲンにおける細胞成長および浸潤を増大させた。よって、トランスフェクトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ではＦＧＦＲ４  Ｒ３８８／ＭＴ１−ＭＭＰ複合体と比べて、観察されたＦＧＦＲ４  Ｒ３８８／ＭＴ１−Ｙ／Ｆ複合体は少なかった。ＭＴ１−Ｙ／Ｆ含量が高い細胞ではＦＧＦＲ４  Ｒ３８８レベルは少し減少したが、一方、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８タンパク質およびＦＧＦＲ４  Ｇ３８８／ＭＴ１−Ｙ／Ｆ複合体は十分に抑制されて検出されなかった。ＭＴ１−ＭＭＰ阻害後の内因性ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８の検出増加と一致して、過剰発現したＦＧＦＲ４  Ｇ３８８は野生型ＭＴ１−ＭＭＰによっても抑制され、プロテイナーゼ活性が廃絶された変異体ＭＴ１−Ｅ／Ａでは抑制されなかった。
【０１２８】
上記の観察結果により、非リン酸化ＭＴ１−ＭＭＰによるＦＧＦＲ４抑制によってＦＧＦＲ４  Ｇ３８８含有細胞に、浸潤促進(proinvasive)ＭＴ１−ＭＭＰ活性を保持するフィードバック機構が提供されることが示唆される。ＭＴ１−ＭＭＰによりＦＧＦＲ４  Ｇ３８８のリン酸化は変わらなかったが、一方、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８リン酸化は、ＭＴ１−ＭＭＰにより著しく増大し、不活性ＭＴ１−ＭＭＰ変異体では増大しなかった。よって、ＭＴ１−ＭＭＰ／ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８複合体の相互作用、リン酸化、および輸送が細胞浸潤におけるそれらの相乗的機能を支えているように思われる。
【０１２９】
実施例９
この実施例では、内因性ＦＧＦＲ４／ＭＴ１−ＭＭＰ活性がin vivoでの腫瘍成長および浸潤を制御することを立証する。
【０１３０】
ＦＧＦＲ４／ＭＴ１−ＭＭＰ軸を標的とすることによりin vivoでの腫瘍細胞挙動が調節されるかどうかを判定するために、ＰＣ３細胞およびＤＵ１４５細胞のＳＣＩＤマウスへの皮下注射後に腫瘍成長、形態学、および細胞外基質（ＥＣＭ）組成を分析した。ＰＣ３細胞およびＤＵ  １４５細胞に、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−融合レポータータンパク質をレンチウイルス形質導入した。ＭＴ１−ＭＭＰ、およびＦＧＦＲ４−を標的とする小ヘアピンＲＮＡを発現する安定細胞スクランブルプールをレンチウイルス形質導入により作製し、続いてピューロマイシン(Sigma)選抜を行った。ｑＰＣＲによりノックダウン効率が９０％を超えていることが確認された。それらの細胞（２×１０６）をＩＣＲ−ＳＣＩＤ雄マウス（５〜７週齢；Taconic）の腹部皮下組織に埋め込み、６〜８週間成長させた。腫瘍サイズはカリパスおよび非侵襲的生物発光により測定し、３５μｇ／１００μｌコエレンテラジンの腹膜内注射後にＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｙｓｔｅｍ(Xenogen)を使用して視覚化した。
【０１３１】
ＭＴ１−ＭＭＰまたはＦＧＦＲ４  Ｒ３８８のいずれかの安定なサイレンシングにより、ＰＣ３腫瘍の成長速度および血管内に侵入した(intravasated)腫瘍細胞を含む間質血管の数が劇的に減少した。腫瘍、および腫瘍内細胞外基質（ＥＣＭ）周囲に蓄積した繊維性被膜によりＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８ノックダウン腫瘍細胞が小コンパートメントに分散され、増殖速度の減少を示した。腫瘍の細胞分裂指数、成長、浸潤、および転移は、コラーゲンおよび他のＥＣＭタンパク質含量と逆相関した。同時に、細胞はコラーゲンＩＶ、フィブロネクチンおよびラミニンへの極性の増大を示し、腺房形成の増加が検出された。
【０１３２】
in vitroアッセイの観察結果と一致して、ＭＴ１−ＭＭＰサイレンシングはＤＵ１４５腫瘍の成長も減少させ、同時にコラーゲン含量が増加した。ＭＴ１−ＭＭＰノックダウンＤＵ１４５腫瘍では、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８ｍＲＮＡ発現は２倍〜４倍の間に増大し、転写フィードバック機構がＭＴ１−ＭＭＰによるＦＧＦＲ４  Ｇ３８８抑制に関与することが示唆された。対照的に、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８サイレンシングはＤＵ１４５腫瘍細胞のより顕著な浸潤および血管外遊出をもたらし、同時に腫瘍内および腫瘍端においてコラーゲン蓄積が減少した。ｑＰＣＲによるコラーゲン  ｍＲＮＡ発現では有意な変化は検出されなかった。
【０１３３】
上記の結果は、ＭＴ１−ＭＭＰ／ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８複合体のいずれかの成分のサイレンシングが、腫瘍成長、浸潤および転移を抑制したことを示している。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、その抑制は、腫瘍拡散を物理的に制限し上皮分化を促すＥＣＭのタンパク質分解の阻害によって起こるように思われた。ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８のサイレンシングでは逆の効果が得られた。
【０１３４】
実施例１０
この実施例では、抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体、例えば、本発明の抗体などを作出する例示的な方法を提供する。この実施例はまた、抗ＦＧＦＲ４抗体またはそのフラグメントの結合親和性を特徴付ける方法も提供する。
【０１３５】
Ｈｉｓ−タグと連結されたＦＧＦＲ４の細胞外領域をコードするバキュロウイルス発現ベクターを、当技術分野で標準的な方法に従って構築した。組換えＦＧＦＲ４エクトドメインコードベクターおよび線状化したＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（商標）ＤＮＡ(Pharmingen)でのＳｆ９細胞の共トランスフェクションにより組換えバキュロウイルスを作出した。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を、Ｓｆ９細胞から得たウイルスストックに感染させ、免疫化のために組換えＨｉｓタグ付きＦＧＦＲ４タンパク質を、ニッケルカラムを用いて精製した。ハイブリドーマクローンを、標準的な方法を用いて作出し、必要に応じてサブクローニングした。腹水または培養したハイブリドーマ細胞クローンの培養培地を、組換えＦＧＦＲ４エクトドメイン／Ｆｃ−融合タンパク質(R&D systems)を用いた免疫ブロッティングによりスクリーニングした。陽性クローンを、対照およびＦＧＦＲ４トランスフェクトＣＯＳ−７細胞の溶解物を用いた免疫ブロッティングにより、さらに、対応する細胞の免疫蛍光によりさらに評価した。モノクローナル抗体を、使用説明書(GE Life Sciences)に従ってＨｉＴｒａｐプロテインＧカラムを使用して精製した。３つのモノクローナル抗体、Ｆ８５−６Ｃ５、Ｆ９０−３Ｂ６およびＦ９０−１０Ｃ５を、機能阻害分析に付した。
【０１３６】
ＦＧＦＲ４−Ｆｃに対するｍＡｂ  ３Ｂ６、６Ｃ５および１０Ｃ５の親和性を、酵素結合免疫測定法形式での受容体結合アッセイを用いて比較した（図２）。ヒトＩｇＧのカルボキシ末端領域（アミノ酸残基１００〜３３０）とポリペプチドリンカーを介して融合されたＦＧＦＲ４細胞外ドメイン（アミノ酸残基１〜３６９、Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8913-8917, 1990）を含んでなる組換えヒトＦＧＦＲ４−Ｆｃは、R&D Systemsから入手した（カタログ番号６８５−ＦＲ）。マイクロタイタープレートウェル（ThermoElectron、カタログ番号９５０２９１００）を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５中の組換えヒトＦＧＦ２（R&D Systems、カタログ番号２３３−ＦＢ）およびヘパリン（Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｈ−３１４９）でコートした。それらのウェルを洗浄し（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）、利用可能な非特異的タンパク質結合部位をＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５％ＢＳＡで遮断した。それらのウェルを２回洗浄した。ＦＧＦ２−ヘパリンコートしたウェルとの競合結合の前に、ＦＧＦＲ４−Ｆｃを、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１％ＢＳＡ、０．１μｇ／ｍｌヘパリン、ｐＨ７．５中、一連の希釈の各ｍＡｂ（３Ｂ６、６Ｃ５または１０Ｃ５）とともにプレインキュベートした。プレインキュベートしたＦＧＦＲ４−Ｆｃを添加しさらにインキュベーションを行った後、ＦＧＦ２コートウェルを洗浄した。結合したＦＧＦＲ４−Ｆｃを、ヤギ抗ヒトアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート（Sigma-Aldrich、カタログ番号Ａ９５４４）を用いて検出した。
【０１３７】
図２で示されるように、固定化されたＦＧＦ２とＦＧＦＲ４−Ｆｃとの結合の阻害に対するｍＡｂ  ３Ｂ６、６Ｃ５および１０Ｃ５の効力は異なっていた。最大のＦＧＦＲ４−ＦＧＦ２相互作用は低濃度の阻害薬で見られ、一方、より高い濃度ではその相互作用（吸光度単位により測定）はバックグラウンド吸光度のレベルまで阻害される。ｍＡｂ  ３Ｂ６および６Ｃ５は、可溶性ＦＧＦ２またはＦＧＦ１と同様の効力で固定化されたＦＧＦ２とＦＧＦＲ４との結合を阻害した。また、ｍＡｂ  ３Ｂ６および６Ｃ５の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）はＦＧＦ２およびＦＧＦ１のＩＣ５０と近かった（それぞれ、１．０７７ｎＭ、０．３０１９ｎＭ、０．６９１４ｎＭ、および０．７３３４ｎＭ）。ｍＡｂ  １０Ｃ５によるＦＧＦＲ４−ＦＧＦ２相互作用の阻害は、高濃度阻害薬への高５０％阻害濃度（６．２１７ｎＭ）からの阻害曲線のシフトにより示されるように他の２つのｍＡｂよりも弱かった。固定化されたＦＧＦ２とＦＧＦＲ４との結合は特異的であり、これは（可溶性ＦＧＦ２とともにまたは可溶性リガンドなしでプレインキュベーションした後に）ヘパリンコートしたウェルから得られた吸光度レベルが非常に低いことから示された。ＦＧＦＲ４を事前添加せずにｍＡｂを使用したときには、バックグラウンドレベルの吸光度値が得られた。よって、このアッセイでは、特異的に結合するＦＧＦＲ４−ＦＧＦ２の阻害が測定される。
【０１３８】
バイオセンサーチップ上に固定化されたＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質と、ｍＡｂ  ３Ｂ６、６Ｂ５、および１０Ｃ５との異なる結合をＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、すなわち、バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（登録商標）、BIAcore AB）を使用した表面プラズモン共鳴により測定した。ＦＧＦＲ４−Ｆｃを、１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．７により希釈し、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップとアミンカップリングした。抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体で飽和している場合には、固定化ＦＧＦＲ４−Ｆｃの使用量で１０００応答単位のシグナルが発生した。カップリングしていないバイオセンサーチップチャネルを用いて非特異的バックグラウンドシグナルを測定し、その値をＦＧＦＲ４−Ｆｃカップリングチャネルから得られたシグナルから差し引いた。一連の希釈の各ｍＡｂを、バイオセンサーチップ上のＦＧＦＲ４−Ｆｃに注入し、結合を相対応答単位で測定した。各ｍＡｂ（３Ｂ６、６Ｃ５または１０Ｃ５）は、ＰＢＳバッファー中１０ｎＭ〜２４０ｎＭで注入した。流速は２０μｌ／分に維持し、５分の結合段階を用いた。ｍＡｂ注入後、解離速度を決定するために流れをＰＢＳバッファーと交換した。サイクル間に１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２を３０秒流し、センサーチップを再生した。速度論は、ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア３．１を使用した１：１ラングミュアフィッティング(1:1 Langmuir fitting)により解析した。比較のため、一連の希釈の各ｍＡｂを用いて得られた最大相対応答単位をプロットすることによりＫｄ値も評価した。図４Ａ〜Ｃでは、Ｘ軸にｍＡｂの濃度を示し、Ｙ軸に得られた応答単位を示している。各ｍＡｂの解離平衡定数（Ｋｄ）は、曲線適合後、得られた最大応答単位と最小応答単位の中間の濃度により評価した。これらのＫｄ値に基づき、固定化されたＦＧＦＲ４−Ｆｃに対するｍＡｂ  ６Ｃ５の親和性（Ｋｄ  １．８×１０−８Ｍ）は、同様の親和性を有するｍＡｂ  ３Ｂ６またはｍＡｂ  １０Ｃ５の親和性（それぞれ、Ｋｄ  ２．１７×１０−７および１．３３×１０−７Ｍ）より有意に高い。
【０１３９】
加えて、Ｆ９０−１０Ｃ５によって認識されるＦＧＦＲ４エピトープを同定した。ＦＧＦＲ４の細胞外ドメイン（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列を含む一連のペプチドで構成されたＰｅｐＳｐｏｔアレイを得た。ペプチドは１５アミノ酸長であり、３つのアミノ酸で重複した配列を含んだ。免疫ブロッティングアッセイは、上記のモノクローナル抗ＦＧＦＲ４抗体を用いて行った。ｍＡｂ  ６Ｃ５および３Ｂ６が線状エピトープを認識しなかったが、１０Ｃ５は以下のペプチドを検出した：ＹＫＥＧＳＲＬＡＰＡＧＲＶＲＧ（配列番号５）；ＧＳＲＬＡＰＡＧＲＶＲＧＷＲＧ（配列番号６）；ＬＡＰＡＧＲＶＲＧＷＲＧＲＬＥ（配列番号７）；ＡＧＲＶＲＧＷＲＧＲＬＥＩＡＳ（配列番号８）；およびＶＲＧＷＲＧＲＬＥＩＡＳＦＬＰ（配列番号９）。配列番号７を含んでなるペプチドは最強のシグナルを引き起こした。ＦＧＦＲ４の細胞外領域における配列番号５〜９の位置を図３Ａ〜３Ｃに例示する。
【０１４０】
抗体Ｆ９０−１０Ｃ５を産生するハイブリドーマ１０Ｃ５は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約(「ブダペスト条約」)の規定に基づいて、２００８年９月２日に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Wep 1b. D-38124, Germanyに譲渡され、２００８年９月４日に寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７が割り当てられた。ｍＡｂ  Ｆ８５−６Ｃ５およびＦ９０−３Ｂ６それぞれを産生するハイブリドーマＦ８５−６Ｃ５およびＦ９０−３Ｂ６も、ブダペスト条約の規定に基づいてＤＳＭＺに寄託され、２００８年９月４日に寄託受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６（Ｆ８５−６Ｃ５）およびＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５（Ｆ９０−３Ｂ６）が割り当てられた。
【０１４１】
実施例１１
この実施例では、コラーゲン浸潤へのＦＧＦＲ４  Ｇ３８８およびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８の寄与を検討し、モノクローナル抗ＦＧＦＲ４抗体を用いたＭＴ１−ＭＭＰ媒介癌細胞浸潤の抑制を記載する。
【０１４２】
ＭＴ１−ＭＭＰのレベルに対する２つのＦＧＦＲ４変異体の効果が異なると仮定し、コラーゲン浸潤へのそれらの寄与を判定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８またはＦＧＦＲ４  Ｒ３８８変異体のいずれかをコードする発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞の一部を、１０μｇ／ｍｌ対照ＩｇＧまたはモノクローナル抗ＦＧＦＲ４抗体３Ｂ６、６Ｃ５および１０Ｃ５で処置した。それらのトランスフェクト細胞を、デュアルチャンバー装置内の３−Ｄコラーゲン上にプレーティングした。ＦＧＦ２（２５ｎｇ／ｍｌ）を化学誘引物質として用いて浸潤を刺激した。それらの細胞を５日間浸潤させた後、浸潤病巣を定量した。
【０１４３】
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、模擬トランスフェクト細胞またはＦＧＦＲ４  Ｇ３８８発現細胞のいずれよりも速い速度で浸潤した。対照細胞、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８発現細胞、およびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８発現細胞の浸潤は、ＭＴ１−ＭＭＰに対するレンチウイルスｓｈＲＮＡ(Open Biosystems, Huntsville, AL)を用いてＭＴ１−ＭＭＰ  ｍＲＮＡを減少させること（８５％減少）によって完全に抑制された。これらの結果は、確認された癌細胞浸潤におけるＦＧＦＲ４とＭＴ１−ＭＭＰとの間の機能的関係をさらに裏付けている。
【０１４４】
ＦＧＦＲ４とのリガンド結合について競合するモノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５、Ｆ９０−３Ｂ６、およびＦ９０−１０Ｃ５を、デュアルチャンバーコラーゲンアッセイの上部チャンバーと下部チャンバーの両方に添加した。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８誘導性浸潤は、１０Ｃ５モノクローナル抗ＦＧＦＲ４抗体により効率的に抑制された（図５）。対照的に、３Ｂ６抗体および６Ｃ５抗体は、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８およびＲ３８８発現細胞のどちらの浸潤も増大させる傾向があった（図５）。
【０１４５】
細胞浸潤の抑制の裏側にある考えられる機構を解明するために、抗ＦＧＦＲ４抗体の存在下でのＦＧＦＲ４活性化を検討した。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８またはＦＧＦＲ４  Ｇ３８８（どちらもＶ５のタグが付けられている）を発現する血清飢餓ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ｆ８５−６Ｃ５抗体、Ｆ９０−３Ｂ６抗体、およびＦ９０−１０Ｃ５抗体（１０μｇ／ｍｌ）で一晩事前処置し未刺激の状態のままにしたかまたはＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間インキュベートした。それらの細胞抽出物をＦＧＦＲ４に対する抗体での免疫沈降に付し、続いてＶ５、ホスホチロシン残基、ＦＧＦＲ１、またはＥＲＫ１／２のリン酸化型に対する抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。その免疫ブロットを図６に示している。別に、Ｖ５タグ付きＦＧＦＲ４  Ｇ３８８、Ｖ５タグ付きＦＧＦＲ４  Ｒ３８８、およびＦＧＦＲ１を単独でまたは組み合わせて発現するようにＣＯＳ−１細胞をトランスフェクトした。血清飢餓にした後、それらの細胞を抗ＦＧＦＲ４抗体（１０μｇ／ｍｌ）で３０分間事前処置した。トランスフェクト細胞の一部を未刺激の状態のままにし、他のものをＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間インキュベートした。ＦＧＦＲ４タンパク質を免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体および抗Ｖ５抗体を用いて免疫ブロットした。その免疫ブロットを図７に示している。
【０１４６】
興味深いことに、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８は、リガンド刺激を受けたときも受けないときも顕著に自己リン酸化されたが、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８変異体のリン酸化は、ＦＧＦ２とのインキュベーション後に非常に増加した。ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８発現細胞を、浸潤を促進するＦ８５−６Ｃ５抗体により処置することで、（ｉ）リガンド非依存性ＦＧＦＲ４自己リン酸化は抑制されたが、（ｉｉ）ＦＧＦ２誘導性リン酸化は増大した。Ｆ８５−６Ｃ５抗体は、ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８のリガンド非依存性自己リン酸化をやや抑制したが、リガンド刺激によるリン酸化にはあまり影響を及ぼさなかった。注目すべきは、ｍＡｂ  ６Ｃ５で処置した、ＦＧＦＲ４変異体のいずれかを発現する細胞のリン酸化パターンが類似していたことである。ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８発現細胞をｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５により処置することで、タンパク質のリガンド非依存性リン酸化およびリガンド誘導性リン酸化は減少した。ｍＡｂ  １０Ｃ５と、ｍＡｂ  １０Ｃ５とは異なるＦＧＦＲ４エピトープと結合するｍＡｂ  ３Ｂ６との両方に細胞を曝露するとリン酸化はさらに減少した（図６）。
【０１４７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は高レベルの内因性ＦＧＦＲ１を発現するため、総ＦＧＦＲ１レベルおよび下流ＥＲＫ経路の活性化に対するＦＧＦＲ４発現の潜在的な効果を分析した。対照細胞およびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８発現細胞の両方において、ＦＧＦ２はＥＲＫ１／２リン酸化をわずかに増加させたがＦＧＦＲ１レベルにはあまり影響を及ぼさなかった。対照的に、ＦＧＦＲ１レベルはＦＧＦＲ４  Ｇ３８８発現細胞において著しく低下し、同時にＦＧＦ２誘導性ＥＲＫ１／２リン酸化の抑制が起こった。興味深いことに、浸潤を抑制する１０Ｃ５抗体ではなくｍＡｂ  ６Ｃ５によりＦＧＦＲ４  Ｇ３８８発現細胞を処置することで、ＦＧＦ２刺激後にＦＧＦＲ１レベルとＥＲＫ活性化の両方が救済された。これは、ＦＧＦＲ１とＦＧＦＲ４（腫瘍細胞浸潤に寄与し、浸潤をモジュレートする抗ＦＧＦＲ４抗体による影響を受け得る）との機能的協調と一致している。
【０１４８】
これらの結果は、本来ＦＧＦＲを発現しないトランスフェクトＣＯＳ−１細胞を用いて確認された。ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８は、リガンド刺激を受けずに顕著に自己リン酸化されたが、Ｒ３８８変異体のリン酸化は、ＦＧＦ２との１５分のインキュベーション後に非常に増加した。ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８発現細胞を、浸潤を促進するｍＡｂ  ６Ｃ５により処置することで、リガンド非依存性ＦＧＦＲ４自己リン酸化の抑制が起こり、ＦＧＦ２誘導性リン酸化が増大した。ｍＡｂ  ６Ｃ５によりＦＧＦＲ４  Ｒ３８８のリガンド非依存性自己リン酸化もやや抑制されたが、リガンド刺激によるリン酸化はあまり影響を受けなかった。抗体６Ｃ５はまた、ＦＧＦ２刺激後にＦＧＦＲ４／ＦＧＦＲ１ヘテロ二量化も減少させる。注目すべきは、ｍＡｂ  ６Ｃ５で処置した、ＦＧＦＲ４変異体のいずれかを発現する細胞のリン酸化パターンが類似していたことである。予測される機能的ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ４相互作用と一致して、これらの受容体の共発現により、ＦＧＦＲ４  Ｇ３８８およびＲ３８８のリガンド非依存性リン酸化の著しい増加が起こった。これはｍＡｂ  ６Ｃ５の影響をあまり受けなかった。ｍＡｂ  ６Ｃ５は、構成的ＦＧＦＲ４自己リン酸化を阻害し、ＦＧＦＲ１との異型相互作用またはリガンド誘導性同型ＦＧＦＲ４シグナル伝達に利用可能なＦＧＦＲ４を多く残すことによって、細胞浸潤に対してその効果を及ぼし得る。ｍＡｂ  １０Ｃ５により処置することで、ＦＧＦ２誘導性ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８リン酸化とＦＧＦＲ１ダウンレギュレーションの阻害が起こった（図７）。
【０１４９】
この実施例では、ある特定の抗ＦＧＦＲ４抗体が、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＦＧＦＲ４  Ｒ３８８の両方を発現する癌細胞の浸潤を抑制することが確認される。
【０１５０】
本明細書に引用された総ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が引用することにより一部とされることが具体的にかつ個別に示されたように引用することにより本明細書の一部とされる。上述の発明は、明確に理解することを目的として例示および例として幾分詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、本発明に特定の変更および修飾を加え得ることは、本発明の教示に照らして当業者ならば容易に分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１は、様々なキナーゼ（Ｘ軸に記載）についてのＭＭＰ２活性化の相対的レベル（活性型／潜在型）（Ｙ軸）を例示するグラフであり、誘導されたＭＭＰ２活性化が模擬トランスフェクト対照細胞と比べて２倍を超えていることを示している。
【図２】図２は、リガンド−受容体結合によってもたらされた吸光度（Ｙ軸）と潜在的結合阻害薬の濃度（ｎＭ）（Ｘ軸）を比較するグラフである。
【図３】図３Ａ−Ｃは、二量体化ＦＧＦＲ４の三次元構造についての代替図の例示であり、抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（配列番号５〜９）により結合されるエピトープ領域の位置をビーズ付き領域として示している。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、応答単位（Ｙ軸）とｍＡｂ  １０Ｃ５（本明細書ではＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５とも呼ぶ）（図４Ａ）、ｍＡｂ  ６Ｃ５（本明細書ではＡｂ  Ｆ８５−６Ｃ５とも呼ぶ）（図４Ｂ）、およびｍＡｂ  ３Ｂ６（本明細書ではＡｂ  Ｆ９０−３Ｂ６とも呼ぶ）（図４Ｃ）の濃度（ｎＭ）（Ｘ軸）を比較するグラフである。
【図５】図５は、対照抗体、ｍＡｂ  １０Ｃ５、ｍＡｂ  ６Ｃ５、およびｍＡｂ  ３Ｂ６（Ｘ軸）を用いた処置によるコラーゲン浸潤病巣の数（Ｙ軸）をまとめたグラフである。
【図６】図６は、Ｖ５タグ付きＦＧＦＲ４  Ｒ３８８（ＦＧＦＲ４  Ｒ）をコードする発現ベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から作成された免疫ブロットを示す。それらの細胞は、ｍＡｂ  Ｆ９０−３Ｂ６、ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５、またはｍＡｂ  Ｆ９０−３Ｂ６およびｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５の組合せを用いて一晩前処理し、未刺激の状態のままにした（−）かまたはＦＧＦ２とともにインキュベートした（＋）。細胞抽出物をＦＧＦＲ４に対する抗体（ＩＰ：ＦＧＦＲ４）で免疫沈降させ、Ｖ５タグに対する抗体（ＩＢ：Ｖ５）またはホスホチロシン残基に対する抗体（ＩＢ：ｐＹ）を用いて免疫ブロットした。
【図７】図７は、Ｖ５タグ付きＦＧＦＲ４  Ｇ３８８（「ＦＧＦＲ４  Ｇ」または「ＦＲ４  Ｇ」）、Ｖ５タグ付きＦＧＦＲ４  Ｒ３８８（「ＦＧＦＲ４  Ｒ」または「ＦＲ４  Ｒ」）、ＦＧＦＲ１を単独でまたは組み合わせてコードする発現ベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞から作成された免疫ブロットを示す。それらの細胞は、ｍＡｂ  Ｆ８５−６Ｃ５またはｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５を用いて前処理し、ＦＧＦ２とともにインキュベートした（＋）かまたは未刺激の状態のままにした（−）。細胞抽出物を、抗ＦＧＦＲ４抗体（ＩＰ：ＦＧＦＲ４）を用いて免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体（ＩＢ：ｐＹ）、ＦＧＦＲ１に対する抗体（ＩＢ：ＦＧＦＲ１）、またはＶ５タグに対する抗体（ＩＢ：Ｖ５）を用いて免疫ブロットした。ｍＡｂ  Ｆ９０−１０Ｃ５処理は、ＦＧＦ２誘導性ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８リン酸化およびＦＧＦＲ１ダウンレギュレーションを阻害したのに対し、ｍＡｂ  Ｆ８５−６Ｃ５は、ＦＧＦ２刺激後にリガンド非依存性ＦＧＦＲ４リン酸化およびＦＧＦＲ４／ＦＧＦＲ１ヘテロ二量化を減少させた。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年5月6日(2011.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、または該抗体のフラグメントを含んでなるポリペプチドであって、
哺乳類細胞によって発現される繊維芽細胞増殖因子受容体−４（ＦＧＦＲ４）、好ましくは配列番号１または２のアミノ酸配列を含んでなるＦＧＦＲ４、の細胞外エピトープと結合し；かつ
哺乳類における癌細胞浸潤を抑制すること；
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８を発現する哺乳類細胞におけるＦＧＦＲ４  Ｒ３８８の繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）誘導性リン酸化を阻害すること；
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８および繊維芽細胞増殖因子受容体−１（ＦＧＦＲ１）を共発現する哺乳類細胞におけるＦＧＦＲ１のＦＧＦ２誘導性分解を増大させること；および
ＦＧＦＲ４  Ｒ３８８および膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）を共発現する哺乳類細胞におけるＦＧＦＲ４とＭＴ１−ＭＭＰの間での複合体形成を阻害すること
からなる群から選択される少なくとも１つの活性を示す、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項２】
配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＦＧＦＲ４ペプチドと結合し、好ましくは配列番号７からなるＦＧＦＲ４ペプチドと結合し、より好ましくは配列番号１または２のアミノ酸残基７９〜８１を含んでなるＦＧＦＲ４細胞外エピトープとさらに結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）である、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項４】
抗体のＳｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ダイアボディー、およびＦ（ａｂ’）２抗原結合フラグメントからなる群から選択されるメンバーを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体フラグメントまたはポリペプチド。
【請求項５】
モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）の総ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるか、またはモノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）の可変領域を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項６】
単離されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント、または該抗体のフラグメントを含んでなるポリペプチドであって、
モノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６６）もしくはモノクローナル抗体Ｆ９０−３Ｂ６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６５）の総ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるか、またはモノクローナル抗体Ｆ８５−６Ｃ５もしくはＦ９０−３Ｂ６の可変領域を含んでなり、かつ
哺乳類細胞によって発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合する、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項７】
ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体であるか、または哺乳類細胞によって発現されるＦＧＦＲ４の細胞外エピトープと結合するヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体のフラグメントを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項８】
コンジュゲートまたは結合させた抗新生物薬または細胞傷害薬、例えば放射性ヌクレオチド、をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド（「第一のモノクローナル抗体またはそのフラグメント」）および生理学上許容される担体を含んでなる、組成物。
【請求項１０】
好ましくはヒトまたはヒト化の、第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメント、またはそのフラグメントを含んでなるポリペプチド（「第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメント」）をさらに含んでなり、該第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメントが、前記第一のモノクローナル抗体またはそのフラグメントによって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４の第二のエピトープと結合する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）阻害薬をさらに含んでなる、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを産生する単離された細胞、例えば、ハイブリドーマ細胞、または前記抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
【請求項１３】
癌と診断された、または癌の処置を受ける哺乳類被験体の処置における使用のための、または哺乳類被験体、好ましくはヒト被験体における癌細胞（例えば、乳癌、膀胱癌、黒色腫、前立腺癌、中皮腫、肺癌、精巣癌、甲状腺癌、扁平上皮癌、膠芽腫、神経芽腫、子宮癌、結腸直腸癌、および膵臓癌の細胞など）の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートすること、抑制することにおける使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物であって、前記癌が、好ましくはＦＧＦＲ４  Ｒ３８８をコードする少なくとも１つのＦＧＦＲ４対立遺伝子を有すると判定された癌である、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、または組成物。
【請求項１４】
癌の処置における、前記癌の浸潤、内方成長、または転移をモジュレートすることまたは抑制することにおける、以下：
好ましくはヒトまたはヒト化の、第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメント（ここで、該第二のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、前記第一のモノクローナル抗体またはそのフラグメントによって認識されるエピトープとは異なるＦＧＦＲ４の第二のエピトープと結合し、該第二の抗ＦＧＦＲ４抗体またはフラグメントは、好ましくはリガンド非依存性ＦＧＦＲ４リン酸化を阻害する）；
膜型−１メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）阻害薬を含んでなる組成物；および
標準的治療の抗癌療法
の１以上と組み合わせての、請求項１３に記載の使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチド、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨおよび前記ＶＬが、モノクローナル抗体Ｆ９０−１０Ｃ５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９６７）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と同一のＣＤＲを含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
アジュバントおよびＦＧＦＲ４をコードするアミノ酸配列の５〜２５個のアミノ酸からなる単離された抗原ペプチドを含んでなる組成物であって、前記ペプチドが、配列番号５〜９のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列またはそのフラグメントを含んでなる、組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物の抗原ペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【国際調査報告】
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