(57)【要約】本明細書は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼを含む組成物及び方法を開示する。組成物及び方法は、特に冷水洗浄に用いると効果的である。【選択図】図２
2012522875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
洗浄組成物であって、
（ａ）配列番号２で示すアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアルファ‐アミラーゼ、及び
（ｂ）プロテアーゼ
を含み、
ここで、前記組成物が、アルファ‐アミラーゼが無い又はプロテアーゼが無い対応する組成物にみられるものより高い洗浄レベルを提供する洗浄組成物。
【請求項２】
少なくとも一つの追加酵素がサブチリシンであることを特徴する請求項１に記載の洗浄組成物。
【請求項３】
少なくとも一つの追加酵素がサブチリシンＢＰＮ′又はその変異体であることを特徴する請求項２に記載の洗浄組成物。
【請求項４】
少なくとも一つの追加酵素がサブチリシンＢＰＮ′のＹ２１７Ｌ変異体であることを特徴する請求項３に記載の洗浄組成物。
【請求項５】
さらに、少なくとも一つの界面活性剤を含むことを特徴する請求項１から４のいずれか１つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項６】
さらに、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ及びペルオキシダーゼからなる群から選択される追加酵素の少なくとも一つを含むことを特徴する請求項１から５のいずれか１つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項７】
前記アルファ‐アミラーゼが、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来するものであることを特徴する請求項１から６のいずれか１つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項８】
前記アルファ‐アミラーゼが、アミラーゼ活性を有する変異体アルファ‐アミラーゼの成熟形態、及び１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１６、１１８、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３８、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７２、１７４、１７７、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、１９２、１９５、１９７、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３６、２３７、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６７、２６９、２７０、２７２、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７０、４７５、４７６、４８３、及び４８４からなる群から選択される一以上の位置での置換を含む変異体アルファ‐アミラーゼの成熟形態であり、
ここで、前記位置が、配列番号２で示すアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応し、及び
前記一以上の位置での自然に発生するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換が、安定性の測定で性能指標＞１．０、及び活性の測定で性能指標＞１．０を有するアルファ‐アミラーゼ変異体を生成することを特徴する請求項１から７のいずれか１つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項９】
前記変異体アルファ‐アミラーゼが、７、２９、３５、５３、６０、７２、８７、１０８、１１６、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３８、１４２、１５６、１６１、１６５、１７８、１８２、１８５、１８９、１９２、１９５、１９７、２０２、２１０、２１４、２１７、２２１、２３４、２４６、２６９、３０３、３１０、３３７、３４０、３７４、４０１、及び４３８からなる群から選択される一以上の位置での置換を含み、
ここで、自然に発生するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換が、活性の測定で性能指標＞１．５及び安定性の測定で性能指標＞１．０を有するアルファ‐アミラーゼ変異体を生成することを特徴する請求項８に記載の洗浄組成物。
【請求項１０】
前記変異体アルファ‐アミラーゼが、２、７、２２、２５、２８、３０、３７、７０、７５、８３、８７、９１、９３、１０８、１２８、１６０、１６５、１７８、１８２、１８３、２１７、２６９、２７０、２７９、２８３、２９８、３０５、３０６、３１０、３２０、３７４、３７５、３７６、４０７、４１９、４７５、及び４７６からなる群から選択される一以上の位置での置換を含み、
ここで、自然に発生するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換が、安定性の測定で性能指標＞１．５及び活性の測定で性能指標＞１．０を有するアルファ‐アミラーゼ変異体を生成することを特徴する請求項８に記載の洗浄組成物。
【請求項１１】
前記変異体アルファ‐アミラーゼが、８３、１２５、１２８、１３１、１６０、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、２７９、３０５、３１９、３２０、３７９、４０７、４３３、４５３、４７５、４７６、及び４８３からなる群から選択される一以上の位置での置換を含むことを特徴する請求項８に記載の洗浄組成物。
【請求項１２】
前記アルファ‐アミラーゼが、８３、１２５、１２８、１３１、１６０、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、２７９、３０５、３１９、３２０、３７９、４０７、４３３、４５３、４７５、４７６、及び４８３からなる群から選択される一以上の位置での置換を含む変異体アルファ‐アミラーゼの成熟形態であり、
ここで、前記位置が、配列番号２で示すアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応し、及び
前記置換が、改善された洗浄性能、改善された洗剤安定性、改善された熱安定性、及び改善されたタンパク質発現からなる群から選択される少なくとも一つの有益な効果を提供することを特徴とする請求項１から７のいずれか１つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項１３】
前記アルファ‐アミラーゼが、５、３２、８３、９５、１５４、２１４、２２１、２２８、３２２、４０１、４０７、４１９、４４４、４４７、４５９、４７０、４８３、及び４８４からなる群から選択される一以上の位置での置換を含む変異体アルファ‐アミラーゼの成熟形態であり、
ここで、前記位置が、配列番号２で示すアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応し、及び
自然に発生するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換が、ｐＨ８．０での活性、ｐＨ１０での活性、１６℃での活性、及び３２℃での活性に関して、０．５以上の性能指標値、及び洗剤中の安定性及び熱安定性に関して０．５以上の性能指標値を有することを特徴とする請求項１から７のいずれか１つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項１４】
さらに、前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、配列番号２で示すアミノ酸配列に対応する２４３位にて置換を含むことを特徴とする請求項８から１３のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項１５】
さらに、前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、配列番号２で示すアミノ酸配列に対応する１８０位及び／又は１８１位にて欠失を含むことを特徴とする請求項８から１３のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項１６】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する親アルファ‐アミラーゼに由来するものであることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項１７】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、配列番号２で示すアミノ酸配列と少なくとも７５％配列同一性を有することを特徴とする請求項１から１６のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項１８】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、配列番号２で示すアミノ酸配列と少なくとも８０％配列同一性を有することを特徴とする請求項１から１７のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項１９】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、配列番号２で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一性を有することを特徴とする請求項１から１８のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２０】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、配列番号２で示すアミノ酸配列に対応する１２８、１７８、１８２、１８５、及び１８９からなる群から選択される一以上の位置での置換を含み、ここで、前記置換が改善された洗浄性能又は改善された洗剤安定性を提供することを特徴とする請求項１から１９のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２１】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、
（ａ）１２５位の位置でのアラニン、
１２８位の位置でのシステイン、
１３１位の位置でのイソロイシン、
１６５位の位置でのイソロイシン、
１７８位の位置でのロイシン、
１８２位の位置でのグリシン、
２０２位の位置でのチロシン、
３０５位の位置でのアルギニン、
３１９位の位置でのトレオニン、又は
４７５位の位置でのアルギニン、
（ｂ）置換Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、及び
Ｓ１２５Ａ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｆ２０２Ｙ、及びＤ３１９Ｔからなる群から選択される少なくとも一つの追加置換、又は
（ｃ）置換
Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ、
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、又は
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ
を含み、
ここで、任意に、前記変異体が２４３位の位置での置換及び／又は１８０位及び／又は１８１位の位置での欠失をさらに含み、
前記位置が配列番号２で示すアミノ酸配列に対応することを特徴とする請求項１から２０のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２２】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、４７５位の位置での置換を含むことを特徴とする請求項１から２１のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２３】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、２４３位の位置での置換及び／又は１８０位及び／又は１８１位の位置での欠失を含むことを特徴とする請求項１から２２のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２４】
前記アルファ‐アミラーゼ変異体が、２４３位の位置での置換及び／又は１８０位及び／又は１８１位の位置での欠失を含むことを特徴とする請求項１から２３のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２５】
洗浄組成物が、約２５℃未満の温度にて測定して、前記アルファ‐アミラーゼが無い又は前記プロテアーゼが無い対応する組成物について観察されるものより高い洗浄レベルを提供することを特徴とする請求項１から２４のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２６】
洗浄組成物が、約２０℃未満の温度にて測定して、前記アルファ‐アミラーゼが無い又は前記プロテアーゼが無い対応する組成物について観察されるものより高い洗浄レベルを提供することを特徴とする請求項１から２５のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２７】
前記アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼが共に調合されることを特徴とする請求項１から２６のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物。
【請求項２８】
布地又は硬い表面を請求項１から２７のいずれか一つの請求項に記載の洗浄組成物と接触させることを特徴とする布地又は硬い表面を洗浄する方法。
【請求項２９】
方法が約２５℃未満の温度にて実施されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
方法が約２０℃未満の温度にて実施されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は２００９年４月１日に出願した米国仮特許出願第６１／１６５，８１３に対して優先権を主張する。それにより、それら全体が参照により取り込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼを含む組成物及び方法に関する。特に、組成物及び方法は、冷水洗浄適用に効果がある。
【背景技術】
【０００３】
デンプンはアミロース（１５から３０％ｗ／ｗ）とアミロペクチン（７０から８５％ｗ／ｗ）の混合物である。アミロースは約６０、０００から約８００、０００の分子量（ＭＷ）を有する直鎖アルファ‐１，４‐結合グルコースユニットからなる。アミロペクチンは２４から３０のグルコースのユニットごとにアルファ‐１、６分岐点を含む枝分かれポリマーである。そのＭＷは一億に達し得る。
【０００４】
濃縮デキストロースシロップの形態のデンプン由来の糖は、現在、
（１）アルファ‐アミラーゼでの固体デンプンの液状化（又は粘度低下）による約７から１０の平均重合度を有するデキストリンの生成、及び
（２）アミログルコシダーゼ（またグルコアミラーゼ又はＧＡと呼ばれる）で得られた液化デンプン（即ち、デンプン加水分解物）の糖化
を含む酵素の触媒による方法で生産される。得られたシロップは高いグルコース含有量を有する。商業的に生産されるグルコースシロップの多くは、後に、イソシロップで知られるデキストロース／フルクトース混合物へ酵素的に異性化される。
【０００５】
アルファ（α）‐アミラーゼ類（アルファ‐１，４‐グルカン‐４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は不規則（無作為的）に内部のアルファ‐１，４‐グルコシド結合を切断することによりデンプン、グリコーゲン、関連する多糖を加水分解する酵素群を構成する。この酵素のクラスは、例えばデンプン処理の最初の段階（液状化）にて、織物の湯通しにて、再利用紙の脱インク処理にて、製紙及びパルプ産業におけるデンプンの改変にて、浸漬穀物の粉砕にて、アルコール生産にて、甘味料（例えば、糖）の製造にて、飲料産業にて、醸造にて、油田にて、動物飼料にて、及び洗剤マトリクス中の洗浄剤として、数多くの重要な産業上の利用を有する。例えば、このような酵素は食器洗浄及び洗濯においてデンプン汚れを除くため用いることができる。
【０００６】
アルファ‐アミラーゼは、広範囲の細菌類、菌類、植物、及び動物の供給源から単離される。産業的に、多くの重要なアルファ‐アミラーゼは、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）から単離されたものである。ある特徴的なアルファ‐アミラーゼは好アルカリ性バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼであって、デンプン加水分解活性を有する少なくとも５種類の酵素を生産する（Lin他、Biotechnol.  Appl.  Biochem.  28:  61-68  1998）。広いｐＨ範囲（即ち、ｐＨ４．７からｐＨ１０．８）に渡って安定であるけれども、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）番号ＴＳ‐２３のアルファ‐アミラーゼは、最適ｐＨ９を有する。酵素は低い温度、例えば１５℃から２０℃で活性を有するけれども、その最適温度は、４５℃である。
【０００７】
改変される生化学的特性を有し、産業上利用において改善される性能を提供する変異体アミラーゼ（例えば、アルファ‐アミラーゼ）の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼを含む洗浄組成物、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼから成る洗浄組成物、又は実質的にバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼから成る洗浄組成物に関する組成物、システム、及び方法を開示する。
【０００９】
ある態様においては、洗浄組成物であって
（ａ）配列番号２で示すアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアルファ‐アミラーゼ、及び
（ｂ）プロテアーゼ
を含み、
該組成物が、アルファ‐アミラーゼが無い又はプロテアーゼが無い対応する組成物にみられるものより高い洗浄レベルを提供することを特徴とする洗浄組成物を提供する。いくつかの実施態様においては、システムは、冷水洗浄システムである。
【００１０】
いくつかの実施態様においては、少なくとも一つの追加酵素がサブチリシンである。いくつかの実施態様においては、少なくとも一つの追加酵素がサブチリシンＢＰＮ′又はその変異体である。いくつかの実施態様においては、少なくとも一つの追加酵素がサブチリシンＢＰＮ′のＹ２１７Ｌ変異体である。
【００１１】
いくつかの実施態様においては、さらに、洗浄組成物は、少なくとも一つの界面活性剤を含む。いくつかの実施態様においては、洗浄組成物は、さらに、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ及びペルオキシダーゼからなる群から選択される追加酵素の少なくとも一つを含む。
【００１２】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼが、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。
【００１３】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼが、アミラーゼ活性を有する変異体アルファ‐アミラーゼの成熟形態、及び１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１６、１１８、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３８、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７２、１７４、１７７、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、１９２、１９５、１９７、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３６、２３７、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６７、２６９、２７０、２７２、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７０、４７５、４７６、４８３、及び４８４からなる群から選択される一以上の位置での置換を含む変異体アルファ‐アミラーゼの成熟形態であり、
ここで、前記位置が、配列番号２で示すアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応し、及び
一以上の位置での自然に発生するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換が、安定性の測定で性能指標＞１．０、及び活性の測定で性能指標＞１．０を有するアルファ‐アミラーゼ変異体を生成することを特徴とする。
【００１４】
いくつかの実施態様においては、変異体アルファ‐アミラーゼが、７、２９、３５、５３、６０、７２、８７、１０８、１１６、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３８、１４２、１５６、１６１、１６５、１７８、１８２、１８５、１８９、１９２、１９５、１９７、２０２、２１０、２１４、２１７、２２１、２３４、２４６、２６９、３０３、３１０、３３７、３４０、３７４、４０１、及び４３８からなる群から選択される一以上の位置での置換を含み、
ここで、自然に発生するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換が、活性の測定で性能指標＞１．５及び安定性の測定で性能指標＞１．０を有するアルファ‐アミラーゼ変異体を生成することを特徴する。
【００１５】
いくつかの実施態様においては、変異体アルファ‐アミラーゼが、２、７、２２、２５、２８、３０、３７、７０、７５、８３、８７、９１、９３、１０８、１２８、１６０、１６５、１７８、１８２、１８３、２１７、２６９、２７０、２７９、２８３、２９８、３０５、３０６、３１０、３２０、３７４、３７５、３７６、４０７、４１９、４７５、及び４７６からなる群から選択される一以上の位置での置換を含み、
ここで、自然に発生するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換が、安定性の測定で性能指標＞１．５及び活性の測定で性能指標＞１．０を有することを特徴とする。
【００１６】
いくつかの実施態様においては、変異体アルファ‐アミラーゼが、８３、１２５、１２８、１３１、１６０、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、２７９、３０５、３１９、３２０、３７９、４０７、４３３、４５３、４７５、４７６、及び４８３からなる群から選択される一以上の位置での置換を含む。
【００１７】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼが、８３、１２５、１２８、１３１、１６０、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、２７９、３０５、３１９、３２０、３７９、４０７、４３３、４５３、４７５、４７６、及び４８３からなる群から選択される一以上の位置での置換を含む変異体アルファ‐アミラーゼの成熟形態であり、
ここで、前記位置が、配列番号２で示すアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応し、及び
前記置換が、改善された洗浄性能、改善された洗剤安定性、改善された熱安定性、及び改善されたタンパク質発現からなる群から選択される少なくとも一つの有益な効果を提供することを特徴とする。
【００１８】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼが、５、３２、８３、９５、１５４、２１４、２２１、２２８、３２２、４０１、４０７、４１９、４４４、４４７、４５９、４７０、４８３、及び４８４からなる群から選択される一以上の位置での置換を含む変異体アルファ‐アミラーゼの成熟形態であり、
ここで、前記位置が、配列番号２で示すアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応し、及び
自然に発生するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換が、ｐＨ８．０での活性、ｐＨ１０での活性、１６℃での活性、及び３２℃での活性に関して、０．５以上の性能指標値及び洗剤中の安定性及び熱安定性に関して０．５以上の性能指標値を有することを特徴とする。
【００１９】
いくつかの実施態様においては、さらに、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２で示すアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列の２４３位にて置換を含む。いくつかの実施態様においては、さらに、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２で示すアミノ酸配列に対応する配列の１８０位及び／又は１８１位にて欠失を含む。
【００２０】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２で示すアミノ酸配列と少なくと７５％配列同一性を有する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２で示すアミノ酸配列と少なくとも８０％配列同一性を有する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一性を有する
【００２１】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体が、配列番号２で示すアミノ酸配列に対応する配列の１２８、１７８、１８２、１８５、及び１８９からなる群から選択される一以上の位置での置換を含み、ここで、置換が、改善された洗浄性能又は改善された洗剤安定性を提供する
【００２２】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、
（ａ）１２５位の位置でのアラニン、
１２８位の位置でのシステイン、
１３１位の位置でのイソロイシン、
１６５位の位置でのイソロイシン、
１７８位の位置でのロイシン、
１８２位の位置でのグリシン、
２０２位の位置でのチロシン、
３０５位の位置でのアルギニン、
３１９位の位置でのトレオニン、又は
４７５位の位置でのアルギニン、
（ｂ）置換Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、及び
Ｓ１２５Ａ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｆ２０２Ｙ、及びＤ３１９Ｔからなる群から選択される少なくとも一つの追加置換、又は
（ｃ）置換
Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ、
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、又は
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ
を含み、
ここで、任意に、変異体が２４３位での置換及び／又は１８０位及び／又は１８１位での欠失をさらに含み、
前記位置が配列番号２で示すアミノ酸配列に対応する。
【００２３】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体が、４７５位での置換を含む。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体が、２４３位での置換及び／又は１８０位及び／又は１８１位での欠失を含む。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体が、２４３位での置換及び／又は１８０位及び／又は１８１位での欠失を含む。
【００２４】
いくつかの実施態様においては、洗浄組成物が、約２５℃未満の温度にて測定して、アルファ‐アミラーゼが無い又はプロテアーゼが無い対応する組成物について観察されるものより高い洗浄レベルを提供する。いくつかの実施態様においては、洗浄組成物が、約２０℃未満の温度にて測定して、アルファ‐アミラーゼが無い又はプロテアーゼが無い対応する組成物について観察されるものより高い洗浄レベルを提供する。
【００２５】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼが共に調合される。
【００２６】
別の態様においては、布地又は硬い表面を洗浄する方法を提供し、布地及び硬い表面を任意の明細書に記載の洗浄組成物と接触させることを特徴とする。いくつかの実施態様においては、方法が、約２５℃未満の温度にて実施される。いくつかの実施態様においては、方法が約２０℃未満の温度にて実施される。
【００２７】
関連する実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、アミラーゼ活性を有し、１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２３９、２４０、２４３、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４７５、４８３、及び４８４からなる群から選択される一以上（好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上）の位置で置換を含む成熟形態であり、ここで、前記位置は、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致することにより番号をつけられる。ある実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。別の実施態様においては、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。好ましい実施態様においては、前記位置は、１、２、３、４、５、７、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５７、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０８、１１２、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８２、１８３、１８５、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０２、２０７、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２４３、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５，２７９、２８３、２８４，２９８、３０１，３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４７、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４７５及び４８３からなる群から選択され、ここで、前記位置は、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致することにより番号を付される。さらに別の実施態様においては、前記位置は、１、２、３、４、５、７、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５７、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、９０、９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０８、１１２、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８５、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０２、２０７、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７３、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１８、３１９、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４７、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４７５、及び４８３からなる群から選択され、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、５８位の位置のチロシン及び２３６位の位置のアラニンを含み、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、２４３位のグルタミン及び４７５位のリジンを含み、ここで、位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。
【００２８】
いくつかの実施態様においては、変異体は、アミラーゼ活性を有し、１８２、１８３、３０５、３２０、３７９、４０７、４１９及び４７５からなる群から選択される１から８つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ）の位置での置換を含む成熟形態であり、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群の任意のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。好ましい実施態様においては、置換は、Ｘ１８２Ｎ、Ｘ１８３Ｎ、Ｘ３０５Ｑ、Ｘ３２０Ｆ、Ｘ３７９Ａ、Ｘ４０７Ｄ、Ｘ４１９Ｓ及びＸ４７５Ｔからなる群の１から８つを含む。これらの実施態様のサブセットにおいては、置換は、Ｔ１８２Ｎ、Ｇ１８３Ｎ、Ｙ３０５Ｑ、Ｑ３２０Ｆ、Ｐ３７９Ａ、Ｑ４０７Ｄ、Ｔ４１９Ｓ及びＧ４７５Ｔからなる群の１から８つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８つ）を含む。
【００２９】
いくつかの実施態様においては、変異体は、アミラーゼ活性を有し、１６０、１８２、１８３、１８９、３０５、３７９、及び４７５から成る群から選択される１から７（例えば１、２、３、４、５、６、又は７）の位置での置換を含む成熟形態であり、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群の任意のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。別の好ましい実施態様においては、置換は、Ｘ１６０Ｅ、Ｘ１８２Ｇ、Ｘ１８３Ｎ、Ｘ１８９Ｐ、Ｘ３０５Ｇ、Ｘ３７９Ｅ、及びＸ４７５Ｔからなる群から選択される１から７つを含む。これらの実施態様のサブセットにおいては、置換は、Ｙ１６０Ｅ、Ｔ１８２Ｇ、Ｇ１８３Ｎ、Ｅ１８９Ｐ、Ｙ３０５Ｇ、Ｐ３７９Ｅ、及びＧ４７５Ｔから成る群の１から７（例えば１、２、３、４、５、６、又は７）を含む。
【００３０】
いくつかの実施態様においては、変異体は、アミラーゼ活性を有し、１２５、１８２、２１４、２７９、３０５、３１９、３２０、及び４７５から成る群から選択される１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）の位置での置換を含む成熟形態であり、ここで、位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群の任意のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。別の実施態様においては、置換は、Ｘ１２５Ａ、Ｘ１８２Ａ、Ｘ２１４Ｑ、Ｘ２７９Ｎ、Ｘ３０５Ｒ、Ｘ３１９Ｔ、Ｘ３２０Ｎ、及びＸ４７５Ｒからなる群の１から８つを含む。これらの実施態様のサブセットにおいては、置換は、Ｓ１２５Ａ、Ｔ１８２Ａ、Ｔ２１４Ｑ、Ｔ２７９Ｎ、Ｙ３０５Ｒ、Ｄ３１９Ｔ、Ｑ３２０Ｎ及びＧ４７５Ｒから成る群の１から８つ（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８つ）を含む。
【００３１】
いくつかの実施態様においては、変異体は、アミラーゼ活性を有し、７、１８２、２９８、３７６、３７９、４０７、４１９、及び４５３から成る群から選択される１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）の位置での置換を含む成熟形態であり、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群の任意のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。別の実施態様においては、置換は、Ｘ７Ｈ、Ｘ１８２Ｗ、Ｘ２９８Ｑ、Ｘ３７６Ｒ、Ｘ３７９Ｋ、Ｘ４０７Ｗ、Ｘ４１９Ｓ、及びＸ４５３Ｗからなる群の１から８つを含む。これらの実施態様のサブセットにおいては、置換は、Ｅ７Ｈ、Ｔ１８２Ｗ、Ｔ２９８Ｑ、Ｙ３７６Ｒ、Ｐ３７９Ｋ、Ｑ４０７Ｗ、Ｔ４１９Ｓ、及びＬ４５３Ｗ（から成る群の１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）を含む。
【００３２】
いくつかの実施態様においては、変異体は、アミラーゼ活性を有し、１２８、１７８、１８２及び１８５から成る群から選択される１から４（例えば１、２、３、又は４）の位置での置換を含む成熟形態であり、アルファ‐アミラーゼ変異体は、２４３位のセリン又はグルタミンを含み、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。ある実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群の任意のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。さらに、別の実施態様においては、置換は、Ｎ１２８Ｃ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ、及びＡ１８５Ｄから成る群の１から４（例えば１、２、３、又は４）を含む。
【００３３】
いくつかの実施態様においては、変異体は、アミラーゼ活性を有し、１２５、１８２、１８３、１８９、２７９、３０５、３１９、３７９及び４７５から成る群から選択される１から９（例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９）の位置での置換を含む成熟形態であり、アルファ‐アミラーゼ変異体は、３２０位のグルタミン、フェニルアラニン又はアスパラギンを含み、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。ある実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群の任意のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、
１２５位の位置のセリン又はアラニン、
１８２位の位置のトレオニン、アスパラギン、グリシン又はアラニン、
１８３位の位置のグリシン又はアスパラギン、
１８９位の位置のグルタミン酸又はプロリン、
２７９位の位置のトレオニン又はアスパラギン、
３０５位の位置のチロシン、グルタミン、グリシン又はアルギニン、
３１９位の位置のアスパラギン酸又はトレオニン、
３７９位の位置のプロリン又はアラニン、及び
４７５位の位置のグリシン、トレオニン又はアルギニン
を含み、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。
【００３４】
いくつかの実施態様においては、変異体は、アミラーゼ活性を有し、１２５、１２８、１７８、１８２、１８３、１８９、２７９、３０５、３１９、３７９及び４７５から成る群から選択される１から１１（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１）の位置での置換を含む成熟形態であり、アルファ‐アミラーゼ変異体は、２４３位の位置のセリン又はグルタミン、及び３２０位の位置のグルタミン、フェニルアラニン又はアスパラギンを含み、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。ある実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼに由来する。好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群の任意のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼに由来する。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、
１２５位の位置のセリン又はアラニン、
１２８位の位置のアスパラギン又はシステイン、
１７８位の位置のリジン又はロイシン、
１８２位の位置のトレオニン、アスパラギン、グリシン又はアラニン、
１８３位の位置のグリシン又はアスパラギン、
１８９位の位置のグルタミン酸又はプロリン、
２７９位の位置のトレオニン又はアスパラギン、
３０５位の位置のチロシン、グルタミン、グリシン又はアルギニン、
３１９位の位置のアスパラギン酸又はトレオニン、
３７９位の位置のプロリン又はアラニン、及び
４７５位の位置のグリシン、トレオニン又はアルギニンを含み、ここで、前記位置が、配列番号２で示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列と一致するように番号を付される。別の好ましい実施態様においては、置換は、Ｎ１２８Ｃ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１３４Ｐ、Ｑ１３８Ｅ、Ｙ１６０Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｔ１６５Ｖ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ａ、Ｔ１８２Ｃ、Ｔ１８２Ｄ、Ｔ１８２Ｍ、Ｔ１８２Ｆ、 Ｔ１８２Ｎ、Ｔ１８２Ｇ、Ｔ１８２Ｐ、Ｔ１８２Ｑ、Ａ１８５Ｄ、Ａ１８５Ｅ、Ｅ１８９Ｐ、Ｓ２４３Ｄ、Ｓ２４３Ｅ及びＳ２４３Ｑからなる群から選択される。
【００３５】
本明細書に記載のアミノ酸変異は、開始点、言い換えると「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」として、典型的なアルファ‐アミラーゼを用いて、作られ、試験がされた。しかしながら、同様の効果を作りかつ同様の有益性を得ると予測できる同等のアミノ酸変異が関連アルファ‐アミラーゼ内で作ることができることは理解できる。骨格として用いる他の典型的なアルファ‐アミラーゼは、本明細書に記載の同一のものを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
さらに、本明細書に記載の発明は、任意の前述の段落に記載のアルファ‐アミラーゼ変異体をコードする単離核酸を提供する。ある実施態様においては、プロモーターと作動可能に結合する単離核酸を含む発現ベクターを含む。別の実施態様においては、その発現ベクターを含む宿主細胞を含む。別の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体を生成する方法であって、
宿主細胞をアルファ‐アミラーゼ変異体をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換する工程、
形質転換宿主細胞をアルファ‐アミラーゼ変異体の生成に適した条件下にて培養する工程を含む方法を提供する。別の実施態様においては、さらに、生成されたアルファ‐アミラーゼ変異体を採取する工程を含む。さらに別の実施態様においては、宿主細胞としてバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含み、さらに別の実施態様においては、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００３７】
いくつかの実施態様においては、洗浄組成物は、アルファ‐アミラーゼ、プロテアーゼ、少なくとも一つの追加的酵素を含み、その追加酵素は、追加的アミラーゼ又は追加的プロテアーゼでよい。ある実施態様においては、追加的酵素は、中性メタロプロテアーゼ、アスパラチルプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ及び／又はペルオキシダーゼである。別の実施態様においては、洗浄組成物は、洗濯洗剤であり、さらに別の実施態様においては、洗浄組成物は、食器洗剤である。別の実施態様においては、洗浄組成物は、漂白剤を含む洗濯洗剤及び／又は食器洗剤である。別の実施態様においては、洗浄組成物は、布地の前処理剤であり、例えば、洗浄前に適用する。別の実施態様においては、洗浄組成物は、洗濯洗剤添加剤又は食器洗浄洗剤添加剤である。さらに、本明細書に記載の発明は、洗浄方法を提供し、表面及び／又は布地を含む製品をアルファ‐アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物と接触する工程を含む。ある実施態様においては、方法は、食器洗浄方法であり、
ｉ）食器洗浄組成物、及び
ｉｉ）洗浄を必要とする食器類
を提供する工程、及び
食器類を効果的な条件下にて食器洗浄組成物と接触させ、食器類の洗浄を提供する工程を含む方法である。別の実施態様においては、方法は、布地洗浄方法であり、
ｉ）布地洗浄組成物、及び
ｉｉ）洗浄を必要とする洗濯物
を提供する工程、及び
洗濯物を効果的な条件下にて布地洗浄組成物と接触させ、洗濯物の洗浄を提供する工程を含む方法である。別の実施態様においては、方法は、湯通しの場合に、織物生地の糸から物質を除去することを含む。
【００３８】
組成物及び方法のこれらの及び他の態様及び実施態様は、本明細書の記載から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】それぞれ配列番号２及び５−１４に示す様々な比較アミラーゼの成熟形態のアラインメントを提供する。配列は、ＭＵＳＣＬＥ  ３．７マルチプルシークエンスアラインメントアルゴリズム（Ｅｄｇａｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２：１７９２−１７９７、２００４）を使用して整列した。
【図２】バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＡＴプロモーター（Ｐｌａｔ）及びレプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びブレオマイシン耐性マーカー（ｂｌｅｏ）を含むｐＵＢ１１０（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｓｍｉｄ、１５：  ９３−１０３、１９８６）由来の追加要素を含むｐＨＰＬＴベクターの地図を提供する。
【図３】ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥプラスミドの地図を提供する。
【図４】ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑプラスミドの地図を提供する。
【図５】洗濯洗剤適用におけるマルチプルアルファ‐アミラーゼの洗浄性能を示すグラフを提供する。試験した酵素を次に示す。Ｗ９（ＢＡＳＥ−Ｓ１２５Ａ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｑ−Ｔ２７９Ｎ−Ｄ３１９Ｔ−Ｑ３２０Ｎ−Ｇ４７５Ｒ）、Ｗ１０（ＢＡＳＥ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｑ−Ｙ３０５Ｒ−Ｄ３１９Ｔ−Ｇ４７５Ｒ、Ｗ１１（ＢＡＳＥ−Ｓ１２５Ａ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｑ−Ｙ３０５Ｒ−Ｇ４７５Ｒ、及びＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ。
【図６】洗濯洗剤適用におけるマルチプルアルファ‐アミラーゼの洗浄性能を示すグラフを提供する。試験した酵素を次に示す。ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ、ＢＡＳＥ−Ｗ１０ＥＫ、ＡＣＥ−ＱＫ、及びコントロール（ベンチマーク商用酵素）
【図７Ａ】洗濯適用でのＡＣＥアルファ‐アミラーゼ及びＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼ間の相乗作用を示すグラフを提供する。
【図７Ｂ】洗濯適用でのＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（ＡＣＥ−ＱＫ）アルファ‐アミラーゼ及びＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼ間の相乗作用を示すグラフを提供する。
【図８】洗濯適用でのＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ（Ｗ１１−Ｔ１３１Ｉ−Ｔ１６５Ｉ）アルファ−アミラーゼ及びＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼ間の相乗作用を示すグラフを提供する。
【図９】洗濯適用でのＢＡＳＥ  Ｗ１０ＥＫ（ＢＡＳＥ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｅ−Ｙ３０５Ｒ−Ｄ３１９Ｔ−Ｇ４７５Ｋ）アルファ−アミラーゼとＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼ間の相乗作用を示すグラフを提供する。
【図１０】洗濯適用でＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（ＡＣＥ−ＱＫ）アルファ−アミラーゼ及びＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼの間の相乗作用を示すグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
１．  アルファ‐アミラーゼ変異体の定義及び命名法
本発明は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼを含む組成物及び方法に関する。とくに、組成物及び方法は、食器洗浄（自動食器洗浄を含む）及び洗濯など冷水洗浄適用に効果的である。ある場合、組成物及び方法は、変異体アルファ‐アミラーゼを含む。洗浄組成物及び方法、並びに変異体のこれらの及び他の特徴を詳細に記載する。
【００４１】
本明細書にて他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び科学用語は当業者によって普通に理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  (１９９４)及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｋｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ  (１９９１)が、当業者には本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書となる。
【００４２】
組成物及び方法のいくつかの態様は、遺伝子工学及び分子生物学の分野にて用いる規定の技術及び方法に依存する。次の資料は、本組成物及び本発明に従って有用な遺伝子工学の記載を含む。それはＳａｍｂｒｏｏｋ他ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ:  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  (２ｎｄ  Ｅｄ.、１９８９);  Ｋｒｅｉｇｌｅｒ、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ；  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  （１９９０）及び  Ausubel他、Eds.  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （１９９４）である。これらの一般的参考書は、当業者に周知の定義及び方法を記載する。しかしながら、本明細書に記載の組成物及び方法は任意の特定の方法、プロトコール、及び記載される試薬に限定すべきではない。なぜならこれらは変化するからである。本明細書に記載のものと類似及び同等の任意の方法及び材料が、本明細書に開示される化合物、組成物及び使用方法の実施又は試験に用いてよいけれども、ここには好ましい方法及び材料を開示する。
【００４３】
タンパク質及びそれらをコードする遺伝子を記載する場合、遺伝子の名前は一般的に、イタリック体であり、大文字ではないが、一方、タンパク質の名前はイタリック体ではなく、一般的に最初の文字が大文字である。
【００４４】
単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。すなわち、例えば、「酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」はそんな酵素の複数を含み、「調合物（ｔｈｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」の意味は調合物及び当業者等が知っているそれらと同等なものの一以上を含む。
【００４５】
特許及び刊行物内に記載されるすべての配列を含む本明細書に言及されるすべての特許及び刊行物は、参照により明確に取り込まれる。
【００４６】
１．１定義
次の用語を明確にするために定義する。
【００４７】
本明細書にて用いる用語「デンプン（ｓｔａｒｃｈ）」は、植物性ポリサッカライドの炭水化物の複合体を含み、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘで表すアミロース及びアミロペクチンを含む任意の原料をいい、ここで「ｘ」は任意の数字である。特に、その用語は任意の植物ベースの原料であって、穀物、草、塊茎、及び根を含むが、これらに限定されず、さらに具体的には、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、コメ、ソルガム、ふすま、キャッサバ、アワ（ｍｉｌｌｅｔ）、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカを含むがこれらに限定されない。
【００４８】
本明細書にて用いる用語「アミラーゼ」は、デンプンの分解を触媒できる酵素を意味する。一般的に、アルファ‐アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１；  α‐Ｄ‐（ｌ→４）‐グルカン  グルカノヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））は不規則的にデンプン分子内のアルファ‐Ｄ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断するエンド作用酵素として定義される。それに対して、エキソ作用デンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を切断し、例えば、ベータ‐アミラーゼ（ＥＣ  ３．２.１．２．α‐Ｄ‐（ｌ→４）−グルカン  マルトヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｍａｌｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））及びマルトジェニックアルファ‐アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  α‐ａｍｙｌａｓｅ）（ＥＣ  ３．２．１．１３３）のようなある産物特異的アミラーゼ類である。ベータ‐アミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ  (ＥＣ  ３．２．１．２０;  α‐Ｄ‐グルコシド  グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、グルコアミラーゼ  (ＥＣ  ３．２．１．３;  α‐Ｄ‐（ｌ→４）-グルカン  グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、及び産物特異的アミラーゼ類はデンプンから特徴的な長さの麦芽オリゴ糖を生産する。本明細書にて用いるアミラーゼは、任意／すべてアミラーゼを含み、グルコアミラーゼ、アルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、及び例えばバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）のような野生型アルファ‐アミラーゼを含むが、一方アルファ‐アミラーゼはこれらの酵素の前述のサブセットを含む。
【００４９】
本明細書にて用いる、「バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ」及び同様なフレーズは、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３由来のアルファ‐アミラーゼをいう。アルファ‐アミラーゼをコードする遺伝子は、野生型遺伝子又はアルファ‐アミラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドである。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３の成熟アルファ‐アミラーゼ（アミノからカルボキシの方向）（配列番号１）を示す。
【００５０】
2012522875.tif 000003
【００５１】
本明細書にて用いる「アルファ‐アミラーゼ変異体」及び同様なフレーズは、比較アルファ‐アミラーゼの変異体／ミュータントをいい、それは比較アルファ‐アミラーゼの親（野生型、比較）アミノ酸配列についてアミノ酸置換、追加、及び／又は欠失を含む。「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、「ミュータント（ｍｕｔａｎｔ）」という用語と互換可能に用いてよい。変異体アルファ‐アミラーゼは親シグナル配列に関してシグナル配列中に変異を含んでよい。さらに、変異体アルファ‐アミラーゼは、例えば、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＬＡＴ）由来の異種のアルファ‐アミラーゼシグナル配列を含む融合タンパク質の形態でもよい。
【００５２】
本明細書にて用いる語句「親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ」、「野生型バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ」、「比較バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ」、及び同様な語句は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３のポリペプチドをいう。その用語は、「親酵素（ｐａｒｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ）」、「野生型酵素（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｅｎｚｙｍｅ）」、「親ポリペプチド（ｐａｒｅｎｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「比較ポリペプチド（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」等に便宜的に略されてよい。親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼは親ポリペプチドのシグナル配列における変異を含んでよい。さらに、親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼは、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＬＡＴ）のような異種のアルファ‐アミラーゼシグナルペプチドを含む融合タンパク質の形態でもよい。
【００５３】
本明細書にて用いる「親核酸／ポリヌクレオチド」、「野生型核酸／ポリヌクレオチド」又は「比較核酸／ポリヌクレオチド」は、親ポリペプチドをコードする核酸配列及びそれらに相補的な核酸をいう。
【００５４】
本明細書にて用いる「変異体核酸／ポリヌクレオチド」は、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列又はそれらに相補的な核酸、又は親ポリヌクレオチド配列又はそれらに相補的な核酸に対して少なくとも一つの塩基置換、挿入、欠失を有するポリヌクレオチド配列をいう。具体的には、そのような特定の核酸は、比較配列に特定の割合で相同性を有するもの又は比較配列にハイブリダイズできるものを含んでよい。例えば、ストリンジェント条件下[例えば、５０℃及び０．２ＸＳＳＣ(１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  Ｎａ３ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ７．０])、又は高いストリンジェント条件下[例えば、６５℃及び０．１ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  Ｎａ３ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ７．０）]である。変異体核酸は、例えば、メチロトローフ酵母（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）等）又は糸状菌（例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等（例、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ））又は、他の発現宿主（例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等）のような特定の宿主生物にとって有用な所望のコドンを反映して最適化してよい。
【００５５】
本明細書にて用いる用語「組み換え」は、対象の細胞、核酸、タンパク質又はベクターに言及して用いる場合、対象が、異種核酸又はタンパク質の導入又は天然の核酸又はタンパク質の改変により修飾されていること、又は細胞が、そのように修飾された細胞由来であることを示す。即ち、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態の中に見られない遺伝子を発現し、これを用いなければ異常に発現したり、発現が不充分であったり、まったく発現しなかったりする。
【００５６】
本明細書にて用いる用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、自然に結合し及び自然に存在する少なくとも一つの他の成分から分離される化合物、タンパク質、細胞、核酸、又はアミノ酸をいう。
【００５７】
本明細書にて用いる用語「精製される」は、相対的に純粋状態、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋又は少なくとも約９９％純粋である材料（例えば、単離されるポリペプチド又はポリヌクレオチド）をいう。
【００５８】
本明細書にて用いる用語「熱安定性の」及び「熱安定性」は、高い温度にさらされた後、活性を維持するような酵素能力を意味する。例えば、アルファ‐アミラーゼ酵素のような酵素の熱安定性は、その半減期（ｔ１／２）によって測定される。半減期（ｔ１／２）は、所定の条件下、半分の酵素活性が消失する間の分、時間、日の単位で表す時間である。半減期は、高い温度にさらされた（即ち、高温に影響された）後残りのアルファ‐アミラーゼ活性を測定することにより計算される。
【００５９】
本明細書にて用いる「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を有するもとでのｐＨの範囲をいう。
【００６０】
本明細書にて用いる用語「ｐＨ安定の」及び「ｐＨ安定性」は、所定の時間（例えば、１５分、３０分、１時間等）にｐＨの広い範囲に渡って活性を維持する酵素能力に関する。
【００６１】
本明細書にて用いる「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」と同義語であり、互換可能に用いる。そのようなアミノ酸配列が活性を有する場合、それらの用語は「酵素」をいう。従来の１文字又は３文字アミノ酸残基コードを本明細書にて用いる。
【００６２】
本明細書にて用いる用語「核酸」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二重鎖、及びポリペプチドをコードできる合成分子を含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖でよく及び化学的修飾でよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は互換可能に用いてよい。遺伝子コードは縮退するので、二以上のコドンを特定のアミノ酸をコードするために用いてよく、明細書に記載の組成物及び方法は特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。他に指示しない限り、それぞれ核酸は５’から３’の方向を左から右へ記載し、アミノ酸はアミノからカルボキシルの方向を左から右へそれぞれ記載する。
【００６３】
本明細書にて用いる「相同体」は、比較アミノ酸配列又はヌクレオチド配列、あるいは別の具体的な共通構造又は機能特徴とある度合いの同一性を有するアミノ酸又は核酸配列をいう。周知の配列アライメントツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴ等）を用いて、相同配列は対象配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％でさえも同一なアミノ酸配列を含むと考えられる。一般的に、特に断りがない限り、相同体は対象アミノ酸配列の同様の活性部位残基を含む。
【００６４】
本明細書にて用いる「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション法及びＰＣＲ法の間で生じる相補鎖と対をなす核酸塩基の一本鎖をつくるプロセスをいう。
【００６５】
本明細書にて用いる「合成の」分子は、生物によって生産されるよりむしろインビトロで化学的又は酵素的合成によって生産される。
【００６６】
本明細書にて用いる、細胞に関して用いる場合の用語「形質転換される」「安定に形質転換される」及び「トランスジェニックの」は、細胞がその遺伝子に組み込まれ又は複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして保持される外来種（例えば、異種の）の核酸配列を有することを意味する。
【００６７】
細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される」という用語は、周知技術の「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」を意味する。
【００６８】
本明細書にて用いる「宿主菌株」又は「宿主細胞」は、所望のポリペプチド（例えば、変異体アルファ‐アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ファージ、ウイルス又はＤＮＡ構築体が導入された微生物を意味する。例えば、宿主菌株は細菌細胞である。その用語「宿主細胞」は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の細胞のような細胞から創製されるプロトプラストを含む。
【００６９】
本明細書にて用いる、ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「異種の」は宿主細胞に自然的に発生しないポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。
【００７０】
本明細書にて用いる、ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」は宿主細胞中に自然的に発生するポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。
【００７１】
本明細書にて用いる用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスをいう。プロセスは転写及び翻訳両方を含む。
【００７２】
本明細書にて用いる「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」は、遺伝子を保持する宿主細胞の選別に役立つように宿主中に発現可能な遺伝子をいう。選択可能なマーカーの例は抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はネオマイシン）及び／又は宿主細胞の栄養的利益のような代謝利益を与える遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書にて用いる「培養する」は、液体又は固体培地において適切な条件下に微生物細胞の集団を増殖することをいう。「培養する」は、最終産物への粒状デンプンを含むデンプン基質の発酵性バイオコンバージョン（一般的に容器又は反応器中での）をいう。
【００７４】
「発酵」は、単純な有機化合物を生産するために行われる微生物による有機基質の酵素的分解である。発酵は嫌気的条件下に行われるけれども、酸素存在下でも発酵が行われるので、その用語は厳格な嫌気的条件に限定されることを意図していない。
【００７５】
本明細書にて用いる「遺伝子」は、ポリペプチドを生産するのに関係するＤＮＡセグメントをいい、コード領域、コード領域の前後の領域、及び個々のコードセグメント（エクソン）間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００７６】
本明細書にて用いる「ベクター」は、一以上の細胞のタイプへ核酸を導入するために設計されるポリヌクレオチド配列をいう。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。
【００７７】
本明細書にて用いる「発現ベクター」は、適切な宿主においてＤＮＡの発現を与える適切な制御配列に作動可能に結合された所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体をいう。そのような制御配列は転写を行うプロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボゾーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでもよい。
【００７８】
本明細書にて用いる「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを結合することに関係する調節配列である。プロモーターは、誘導プロモーター又は構成的プロモーターでよい。プロモーターの例は、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＬ）プロモーターである。
【００７９】
本明細書にて用いる用語「作動可能に結合する」は、特定の成分を意図する態様で機能するようにさせる関係（並列を含むがこれに限定されない）であることを意味する。例えば、調節配列は、コード配列に作動可能に結合し、コード配列の発現が調節配列の制御下にある。
【００８０】
本明細書にて用いる用語「転写コントロール下に」は、ポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写開始又は転写の促進に貢献する要素に作動可能に結合することに依存することを意味する。
【００８１】
本明細書にて用いる用語「翻訳コントロール下に」は、ポリヌクレオチド配列、通常ＲＮＡ配列のポリペプチドへの翻訳が翻訳の開始又は翻訳の促進に貢献する要素に作動可能に結合することに依存することを意味する。
【００８２】
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ末端の一部に結合するアミノ酸配列を意味し、細胞外へのタンパク質の分泌を手助けする。細胞外タンパク質の成熟形態は、分泌過程で切断されるシグナル配列を欠損している。
【００８３】
本明細書にて用いる「生物学的活性な」は、酵素活性のような特定の生物学的活性を有する配列をいう。本発明のアミラーゼの場合、活性はアルファ‐アミラーゼ活性である。
【００８４】
本明細書にて用いる「水の硬度」とは、水中に存在する鉱物（例えば、カルシウム及びマグネシウム）の尺度である。
【００８５】
本明細書にて用いる用語「冷水」は、約２５℃未満の温度の水をいう。特に述べられる場合には、冷水は、約２０℃未満の温度をいう。冷水の範囲の例は、約１５℃から約２５℃及び約１５℃から２０℃である。
【００８６】
本明細書にて用いる用語「性能指標（ＰＩ）」は、親アミラーゼ又は比較アミラーゼに対して変異体性能の比率をいう。性能（言い換えると、特性）の測定は、熱安定性、洗浄能力、発現レベル等を含み、文脈から明らかになるだろう。
【００８７】
本明細書にて用いる、性能を改善する変異は「上昇変異（Ｕｐ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」として知られ、特定の特性に関してＰＩ＞１を有する。「中性変異（Ｎｅｕｔｒａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」は、特定の特性に関して、ＰＩ＞０．５を有する。「有害でない変異（Ｎｏｎ−ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」は、ＰＩ＞０．０５を有する。「有害な変異（Ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」は、特定の特性に関してＰＩ≦０．０５を有する。「組み合わせできる変異（Ｃｏｍｂｉｎａｂｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」は、少なくとも一つの特性に関してＰＩ≧０．５を有し、すべての特性に関して＞０．０５を有する。組み合わせできる変異は、同じ変異体中に存在でき、少なくとも一つの有益的な特性を有する酵素を生産する。
【００８８】
本明細書にて用いる用語「活性の測定」は、本明細書に記載のような酵素活性の測定をいう。そのような活性の測定は、ｐＨ８．０での洗浄性能、ｐＨ１０での洗浄性能、１６℃での洗浄性能、３２℃での洗浄性能、及び合成基質を用いる活性を含む。
【００８９】
本明細書にて用いる用語「安定性の測定」は、本明細書に記載のような酵素安定性の測定をいう。そのような安定性の測定は洗剤での安定性及び熱安定性を含む。
【００９０】
本明細書にて用いる用語「共調合物（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」は、酵素など対象成分が同じ液体、半固体、又は乾燥組成物中に共に存在することを意味する。
【００９１】
本明細書にて用いる「糖化」は、グルコースへのデンプンの酵素的転換をいう。
【００９２】
本明細書にて用いる「ゼラチン化」は、クッキングによりデンプン分子の可溶化を意味し、粘性懸濁液となる。
【００９３】
本明細書にて用いる「液化」は、ゼラチン化デンプンが加水分解され低い分子量の可溶化デキストリンとなる時のデンプン転換段階をいう。
【００９４】
本明細書にて用いる用語「第一液化（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は、スラリーの温度がそのゼラチン化温度又はそれに近い温度に上昇した場合に生ずる液化の段階をいう。温度上昇に引き続き、スラリーは熱交換器又はジェットを通して送られ、２００−３００°Ｆ、例えば２２０−２３５°Ｆの温度となる。熱交換器又はジェットの温度にさらされた後、スラリーを３‐１０分間その温度で維持する。スラリーを２００−３００°Ｆに維持するこの段階を第一液化という。
【００９５】
本明細書にて用いる用語「第二液化（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は第一液化（２００−３００°Ｆに加熱）に引き続く液化段階をいい、このときスラリーは室温に冷やされる。この冷却段階は、３０分から１８０分（３時間）であってよく、例えば９０分から１２０分（２時間）である。
【００９６】
本明細書にて用いる用語「第二液化の時間（ｍｉｎｕｔｅｓ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は第二液化の開始からＤＥが測定される時間までの経過時間をいう。
【００９７】
本明細書にて用いる用語「重合度（ＤＰ）」は、所定のサッカライドにおけるアンヒドログルコピラノース単位の数（ｎ）をいう。ＤＰ１の例は、グルコース及びフルクトースのようなモノサッカライドである。ＤＰ２の例は、マルトース及びスクロースのようなジサッカライドである、ＤＰ＞３は、３より大きい重合度を有するポリマーを示す。
【００９８】
デンプン転換に関して、本明細書にて用いる用語「最終産物」又は「所望の最終産物」は、デンプン基質から酵素的に転換される特定の炭素供給源由来分子いう。
【００９９】
本明細書にて用いる用語「乾燥固体容量（ｄｓ）」は、乾燥重量％で表すスラリー中の固体全体をいう。
【０１００】
本明細書にて用いる用語「スラリー」は、不溶性固体を含む水溶性混合物をいう。
【０１０１】
本明細書にて用いる用語「残留デンプン」は、デンプンを含む基質の発酵又は酵素的加水分解後組成物に残されたデンプン（可溶又は不溶）をいう。
【０１０２】
本明細書にて用いる「再循環段階」は、マッシュ成分の再循環をいい、残留デンプン、酵素及び／又はデンプンを含む基質を発酵する微生物を含む。
【０１０３】
本明細書にて用いる用語「マッシュ」は、アルコールのような発酵産物を生産するために用いる発酵炭素源（炭水化物）を含む水溶性の混合物をいう。用語「ビ−ル（ｂｅｅｒ）」及び「マッシュ（ｍａｓｈ）」は互換可能に用いる。
【０１０４】
本明細書にて用いる用語「蒸留残液（ｓｔｉｌｌａｇｅ）」は非発酵性固体及び水の混合物を意味し、発酵マッシュからアルコールを除去した後の残渣である。
【０１０５】
本明細書にて用いる用語「乾燥した蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎｓ）（ＤＤＧ）」及び可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎ  ｐｌｕｓ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）(ＤＤＧＳ)は、穀物発酵の有用な副産物をいう。
【０１０６】
本明細書にて用いる「エタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」は、糖又はオリゴサッカライドをエタノールへ転換する能力を有する微生物をいう。エタノール生産微生物は別個に又は共同して糖をエタノールへ転換する一以上の酵素を発現する能力によりエタノール生産性を有する。
【０１０７】
本明細書にて用いる用語「エタノール生産するもの」又は「エタノール生産微生物」は、ヘキソース又はペントースからエタノールを生産することができる任意の微生物又は細胞をいう。一般的にエタノール生産細胞は、アルコール脱水酵素及びピルビン酸デカルボキシラーゼを含む。エタノール生産微生物の例は、酵母のような真菌微生物を含む。好ましい酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌株を含み、特にサッカロミセス  セレビジアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む。
【０１０８】
アミラーゼ酵素及びその基質に関して、本明細書にて用いる用語「接触する」は、酵素が基質を最終産物に転換できるように基質に十分に接近する状態に酵素を配置することをいう。接触は、混合を含んでよい。
【０１０９】
本明細書にて用いる用語「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」は文脈次第で「から得られる（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」、「に基づく（ｂａｓｅｄ  ｏｎ）」、「から得られる（ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ）」、又は「から得られる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｒｏｍ）」及び「から単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」を意味する。
【０１１０】
本明細書にて用いる用語「酵素転換」は、一般的に酵素作用（例えば、アミラーゼ）による基質（例えば、デンプン）の修飾をいう。
【０１１１】
本明細書にて用いる用語「分解」は、バイオフィルム中個々の微生物細胞と一緒に連結及び結合するバイオフィルムマトリックスにおいて多糖類の加水分解をいい、それによりバイオフィルムから微生物細胞を放出及び除去することができる。
【０１１２】
本明細書にて用いる「布見本（ｓｗａｔｃｈ）」は、織物のような１片の物質であり、組成物の洗浄効率の評価のために、汚れを塗布してよい。
【０１１３】
本明細書にて用いる用語「特異的活性」は、特定の条件下に単位時間当たり酵素調製物によって産物に転換される基質のモル数をいう。特異的活性は単位（Ｕ）／ｍｇタンパク質として表わされる。
【０１１４】
本明細書にて用いる用語「収率」は、方法により生産される最終産物の量をいい、例えば濃度、体積、量、又は出発原料の割合で表される。
【０１１５】
本明細書にて用いる「ＡＴＣＣ」はマナッサス、Ｖａ、２０１０８に位置するアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ）をいう。
【０１１６】
本明細書にて用いる「ＮＲＲＬ」はアグリカルチャー  リサーチ  サービス  カルチャー  コレクション  ナショナル  センター  フォー  アグリカルチャー  ユーティリゼーション  リサーチ（以前はＵＳＤＡ  ノーザン  リージョナル  リサーチ  ラボラトリーとして知られる）ピオリア、ＩＬをいう。
【０１１７】
数字範囲は、範囲を規定する数字すべてを含む。
【０１１８】
一般的に、見出しは、説明であり、限定するものとして意味しない。
【０１１９】
１．２  命名法
本明細書及び特許請求の範囲において、従来のアミノ酸残基用の１文字及び３文字コードを用いる。見やすいように、本発明の組成物及び方法のアルファ‐アミラーゼ変異体は次の命名法を用いて記載する。
原型のアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸
【０１２０】
この命名法に従って、例えば２４２位のアラニンによるセリンの置換を次のように示す。
Ｓｅｒ２４２Ａｌａ又はＳ２４２Ａ
３０位でのアラニンの欠失を次のように示す。
Ａｌａ３０＊又はＡ３０＊又はΔＡ３０
リジンのような追加するアミノ酸残基の挿入を次のように示す
Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓ又はＡ３０ＡＫ。
【０１２１】
アミノ酸残基３０−３３のようなアミノ酸残基の連続欠失を（３０−３３）＊又はΔ(Ａ３０−Ｎ３３)又はΔ３０−３３のように示す。アミノ酸残基Ｒ１８０−Ｓ１８１のような二つの連続するアミノ酸の欠失をΔＲＳ又はΔ１８Ｏ−１８１のように示す。
【０１２２】
特定のアルファ‐アミラーゼが他のアルファ‐アミラーゼと比較して「欠失」を含み、そのような位置に挿入される場合次のように示す。
例えば３６位にアスパラギン酸を挿入する場合
＊３６Ａｓｐ又は＊３６Ｄ。
【０１２３】
複数の変異はプラス又はマイナスの記号によって分離される。
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ、Ａｌａ３０Ａｓｐ−Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ−Ｅ３４Ｓ
これは、３０及び３４位にてそれぞれアラニン及びグルタミン酸をアスパラギン及びセリンへ置換する変異を表す。
【０１２４】
一以上の別のアミノ酸残基が与えられる位置に挿入される場合それは次のように示す。
Ａ３０Ｎ，Ｅ又は
Ａ３０Ｎ又はＡ３０Ｅ。
【０１２５】
さらに、修飾に有用な位置が任意の具体的修飾が示唆されずに本明細書にて同定される場合、任意のアミノ酸残基がその位置に存在するそのアミノ酸残基のかわりに置換されてよいことが理解される。すなわち、例えば、これに特定されないが、３０位でアラニンの修飾が意図される場合、アラニンが欠失又は他のアミノ酸、即ち、
Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれかひとつに置換されてよいことが理解される。
【０１２６】
さらに、「Ａ３０Ｘ」は次の置換のいずれか一つを意味する。
Ａ３０Ｒ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｃ、Ａ３０Ｑ、Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｇ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｔ、Ａ３０Ｗ、Ａ３０Ｙ又はＡ３０Ｖ、又は
略した場合、Ａ３０Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖとなる。
【０１２７】
次の名称は、非特定の親アミラーゼの位置でアミノ酸残基を示すために用いる。その位置は、配列番号２として示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列に一致するようにナンバリングされる。
「Ｘ３０Ｎ」又は「Ｘ３０Ｎ、Ｖ」。
例えば、Ｎ又はＶの一つが変異体アミラーゼの３０位に存在する場合は、Ｘ３０Ｎ又はＸ３０Ｎ、Ｖとなる。ここで、２０の標準アミノ酸のうち一つが親アミラーゼ（例えば野生型又は変異体酵素）中に存在する。
【０１２８】
１．３  アミノ酸残基の特徴
荷電アミノ酸は、
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓを含む。負の電荷を持つアミノ酸（最も負に帯電している残基が最初に来る）は、Ａｓｐ及びＧｌｕを含む。正の電荷を持つアミノ酸（最も正に帯電している残基が最初に来る）は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＨｉｓを含む。
【０１２９】
中性アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＰｒｏを含む。
【０１３０】
疎水性アミノ酸残基（最も疎水性が高い残基を最後に記載する）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐを含む。
【０１３１】
親水性アミノ酸残基（最も親水性が高い残基を最後に記載する）は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、及びＡｓｎを含む。
【０１３２】
１．４  相同性（同一性）
別の配列に特定のパーセント（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％さえ）の配列同一性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、アラインされる時、塩基又はアミノ酸残基のその割合が二つの配列を比較して同じであることを意味する。このアライメント及びパーセント相同性又は同一性は、周知の任意の適切なソフトウエアプログラムを用いて決定できる。例えばＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  １９８７、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０、ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８）に記載されるプログラム。好ましいプログラムはｔｈｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ（商標）９．０  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕｐ  ｐｒｏｇｒａｍ、ＦＡＳＴＡ  （Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４‐２４４８）、及びＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｌ  Ｃｅｎｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｉｎｆ．、Ｎａｔｌ  Ｌｉｂ．  Ｍｅｄ．  （ＮＣＩＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９７）  ＮＡＲ  ２５：３３８９‐３４０２）を含む。他の好ましいアライメントプログラムはＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ  （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＰＡ）であり、好ましくはデフォルトパラメータを用いる。使用に適した別の配列ソフトウエアプログラムはｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で入手できるＴＦＡＳＴＡ  Ｄａｔａ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍである。
【０１３３】
相同性は第二から第一配列の導出を示す二つの配列間の相同性割合として決定されてよい。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージ（上述）が提供するＧＡＰのような周知のコンピュータープログラムにより適切に決定されてよい。従って、ＧＡＰ  ＧＣＧ  ｖ８は、相同性用デフォルトスコアリングマトリックス及び次のデフォルトパラメータを用いてよい。それは、核酸配列比較のためにそれぞれ５．０のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．３のエクステンションペナルティー及びタンパク質配列比較のためにそれぞれ３．０のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．１のエクステンションペナルティーである。アライメントを作り、相同性を計算するためにＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３  （１９７０）の方法を用いる。
【０１３４】
ＢＡＳＥ（配列番号２）又はＢＡＳＥ変異体、及び例えば、別のアルファ‐アミラーゼの間の構造アライメントは、ＡｍｙＴＳ２３と高い相同性、例えば、約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９６％、９７％、９８％、又は９９％さえも有する他のアルファ‐アミラーゼにおける同等／対応の位置を同定するために用いてよい。前記構造アライメントを得る一つの方法はギャップペナルティーのデフォルト値、即ち、３．０のギャップクリエーションペナルティー及び０．１のギャップエクステンションペナルティーを用いてＧＣＧパッケージからのＰｉｌｅ  Ｕｐプログラムを用いることである。他の構造アライメント方法は疎水性クラスター分析(Ｇａｂｏｒｉａｕｄ他、  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２２４、ｐｐ．１４９−１５５  （１９８７）)及びリバーススリーディング（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）(Ｈｕｂｅｒ、Ｔ；  Ｔｏｒｄａ、ＡＥ、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ  Ｖｏｌ．  ７、Ｎｏ．１  ｐｐ．  １４２−１４９  （１９９８）)を含む。
【０１３５】
様々な比較アミラーゼの成熟形態の典型的なアラインメントを図１に提供する。比較アミラーゼは次のものを含む。
本明細書にてＡｍｙＴＳ２３ｔ又はＢＡＳＥ、配列番号２（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＡＡ６３９００）と呼ばれる欠失のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）ＴＳ−２３アルファ−アミラーゼ、
本明細書にてＡｍｙＬ又はＬＡＴ、配列番号５（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＡＡ２２２４０）と呼ばれるバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼ、
ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（以前はバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））アルファ−アミラーゼＡｍｙＳ、配列番号６（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＡＡ２２２４１）、
バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ−アミラーゼＢＡＣＡＭ、配列番号７（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＡＡ２２１９１）、
本明細書にてＡｍｙＧ６又はＡｍｙ＃７０７、配列番号８（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＡＡ２２２３１）と呼ばれるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）＃７０７アルファ−アミラーゼ、
バシルス  メガテリウム（Ｂ．  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）アルファ−アミラーゼＡｍｙＧ５又はＡｍｙＢｍ、配列番号：９（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＡＫ００５９８）、
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）アルファ−アミラーゼＡＬＢＡ、配列番号１０（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＣＡＬ４８１５５及びＷＯ  ２００６／０３７４８４）、
バシルス  ハルマパルス（Ｂ．  ｈａｌｍａｐａｌｕｓ）アミラーゼＡｍｙＢｈ、配列番号１１（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＡＥ００４３２及び米国特許第５，８５６，１６４）、
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）アミラーゼＡＡ５６０、配列番号１２（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＣＡＣ１６４８６及びＷＯ  ２０００／０６００６０）、
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−ＡＰ１３７８アルファ−アミラーゼＡｍｙＫＳＭ１３７８、配列番号１３（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＣＡＤ３５９８５及びＥＰ番号１１９９３５６）、及び
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ｐＨＳＰ−Ｋ３８アミラーゼＡｍｙＫ３８、配列番号１４（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＣＡＪ０００４０及びＷＯ  ２００５／０４５０４５）。
配列は、ＭＵＳＣＬＥ  ３．７マルチプルシークエンスアラインメントアルゴリズム（Ｅｄｇａｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２：１７９２−１７９７、２００４）を使用して整列した。図１の配列アラインメントのアルファ−アミラーゼのパーセント同一性を示すマトリックスを表１に提供する。
【０１３６】
【表１】
2012522875.tif 000004
【０１３７】
１．５  ハイブリダイゼーション
上記ＡｍｙＴＳ２３の特徴付けに用いたオリゴヌクレオチドプローブは、問題とするアルファ‐アミラーゼの完全又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて適切に調製されてよい。
【０１３８】
ハイブリダイゼーションを試験するために適した条件は５ＸＳＳＣに予浸及び２０％ホルムアミド、５Ｘデンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ`ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、及び５０ｍｇの変性超音波処理仔牛胸腺ＤＮＡ溶液に４０℃にて１時間予ハイブリダイゼーションを行い、引き続き、１００ｍＭ  ＡＴＰを補給した同様の溶液に４０℃にて１８時間ハイブリダイゼーションをし、それから２ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中４０℃で３０分間（低いストリンジェンシー）好ましくは５０℃（中程度のストリンジェンシー）で、より好ましくは６５℃（高いストリンジェンシー）でさらに好ましくは７５℃（非常に高いストリンジェンシー）で三回のフィルター洗浄を行う。より詳しいハイブリダイゼーション方法についてはＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９に記載される。
【０１３９】
本明細書において、「から由来する」は該当生物の菌株により生産された、もしくは生産され得るアルファ‐アミラーゼを示すだけでなく、そのような菌株から単離されるＤＮＡ配列によってコードされるアルファ‐アミラーゼ及びそのようなＤＮＡ配列で形質転換される宿主生物中に生産されるアルファ‐アミラーゼも示すように用いられる。最後に、その用語は合成の及び／又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によりコードされ、該当アルファ‐アミラーゼとして同定される特徴を有しているアルファ‐アミラーゼ示すように用いられる。また、その用語は親アルファ‐アミラーゼが自然に発生するアルファ‐アミラーゼの変異体、即ち、自然に発生するアルファ‐アミラーゼのアミノ酸残基の一以上の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体を示すこともある。
【０１４０】
また、本発明の組成物及び方法により含まれる配列が、例示する基礎配列（例えば、配列番号４）を伴うストリンジェントハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイゼーションする能力によって明らかとなることを当業者は理解できる。核酸の一本鎖の形態が、温度及び溶液のイオン強度の適切な条件下に他の核酸にアニールできる場合、核酸は、別の核酸配列とハイブリダイゼーションできる。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）上述、特に９章及び１１章を参照願いたい）。いくつかの実施態様においては、ストリンジェントな条件は６５℃のＴｍ及び０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する。
【０１４１】
１．６  親アルファ‐アミラーゼ
本明細書によれば、任意のアルファ‐アミラーゼは、親（即ち、骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ））アルファ‐アミラーゼとして用いてよい。好ましい実施態様においては、親アルファ‐アミラーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）である。
【０１４２】
１．７  改変される特性
次のセクションは本明細書にて記載する変異体アミラーゼ中に存在する変異及びそれらから得られうる特徴（親アルファ‐アミラーゼの特徴と相対的に）についての所望の改変との関係を記載する。本発明の組成物及び方法により含まれる変異体を本明細書を通して詳しく記載し、次のパラグラフにて単にまとめるにすぎない。
【０１４３】
上述のように、本発明の組成物及び方法の態様は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）菌株アルファ‐アミラーゼ由来又は由来できるアルファ‐アミラーゼに関連し、親アミラーゼに比較して改変される特性を有する変異体／ミュータントを含む。親アミラーゼは、上述の親アルファ‐アミラーゼ及び成熟ポリペプチドのアミノ酸配列のような、アルファ‐アミラーゼの少なくとも一部を含むハイブリッド又はキメラアミラーゼである。
【０１４４】
ＢＡＳＥアルファ‐アミラーゼ（配列番号２）を変異体アミラーゼを検討するための開始点として用いる一方、ＢＡＳＥアルファ‐アミラーゼに高い度合いで相同性を有する他のバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼが本発明の組成物及び方法の範囲を逸脱せずに親アミラーゼとして役立つと理解できる。これは本明細書に記載の対象であって、置換、欠失、又は挿入を含まないＢＡＳＥアルファ‐アミラーゼに比較して非常にわずかな配列の違いを含む他の自然的に発生するバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼに特にあてはまる。
【０１４５】
本発明の組成物及び方法の第一の態様においては、親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）アルファ‐アミラーゼの変異体を提供する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、アミラーゼ活性を有し及び１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２３９、２４０、２４３、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４７５、４８３、及び４８４からなる群から選択される一以上（好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上）の位置での置換を含む成熟形態である。他に示さない限り、位置は、配列番号２（ＢＡＳＥ）に示す比較アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列に対応（例えば、図１に提供するようなアルファ‐アミラーゼ配列のアライメントにおいて同じ位置）により番号付けされる。いくつかの好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫから成る群から選択される親アルファ‐アミラーゼ由来である。他の好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群の任意のメンバーと少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有する親アルファ‐アミラーゼ由来である。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、５８位のチロシン及び２３６位のアラニンを含む。いくつかの実施態様においては、アルフ���‐アミラーゼ変異体は、２４３位のグルタミン及び４７５位のリジンを含む。
【０１４６】
また、本発明は、アミラーゼ活性を有し、１８２、１８３、３０５、３２０、３７９、４０７、４１９及び４７５から成る群から選択される１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）つの位置での置換を含む成熟形態であることを特徴とする単離アルファ‐アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼ由来であり、及び／又は置換が、Ｔ１８２Ｎ、Ｇ１８３Ｎ、Ｙ３０５Ｑ、Ｑ３２０Ｆ、Ｐ３７９Ａ、Ｑ４０７Ｄ、Ｔ４１９Ｓ及びＧ４７５Ｔ（例えば、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー１の変異体）から成る群の１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）つを含む。
【０１４７】
さらに、本発明は、アミラーゼ活性を有し、１６０、１８２、１８３、１８９、３０５、３７９、及び４７５から成る群から選択される１から７（例えば１、２、３、４、５、６、又は７）の位置での置換を含む成熟形態であることを特徴とする単離アルファ‐アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼ由来であり、及び／又は置換が、Ｙ１６０Ｅ、Ｔ１８２Ｇ、Ｇ１８３Ｎ、Ｅ１８９Ｐ、Ｙ３０５Ｇ、Ｐ３７９Ｅ、及びＧ４７５Ｔ（例えば、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー２の変異体）から成る群の１から７（例えば１、２、３、４、５、６、又は７）を含む。
【０１４８】
本発明は、アミラーゼ活性を有し、１２５、１８２、２１４、２７９、３０５、３１９、３２０、及び４７５から成る群から選択される１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）の位置での置換を含む成熟形態であることを特徴とする単離アルファ‐アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼ由来であり、及び／又は置換が、Ｓ１２５Ａ、Ｔ１８２Ａ、Ｔ２１４Ｑ、Ｔ２７９Ｎ、Ｙ３０５Ｒ、Ｄ３１９Ｔ、Ｑ３２０Ｎ及びＧ４７５Ｒ（例えば、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー３の変異体）から成る群の１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）を含む。
【０１４９】
さらに、本発明は、アミラーゼ活性を有し、７、１８２、２９８、３７６、３７９、４０７、４１９、及び４５３から成る群から選択される１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）の位置での置換を含む成熟形態であることを特徴とする単離アルファ‐アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼ由来であり、及び／又は置換が、Ｅ７Ｈ、Ｔ１８２Ｗ、Ｔ２９８Ｑ、Ｙ３７６Ｒ、Ｐ３７９Ｋ、Ｑ４０７Ｗ、Ｔ４１９Ｓ、及びＬ４５３Ｗ（例えば、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー４の変異体）から成る群の１から８（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８）を含む。
【０１５０】
本発明は、アミラーゼ活性を有し、１２８、１７８、１８２及び１８５から成る群から選択される１から４（例えば１、２、３、又は４）つの位置での置換を含む成熟形態であり、２４３位のセリン又はグルタミンを含むことを特徴とする単離アルファ‐アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼ由来であり、及び／又は置換が、Ｎ１２８Ｃ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ、及びＡ１８５Ｄ（例えば、ＢＡＳＥ‐Ｓ１からＳ３２変異体）から成る群の１から４（例えば１、２、３、又は４）を含む。
【０１５１】
またさらなる実施態様においては、本発明は、アミラーゼ活性を有し、１２５、１８２、１８３、１８９、２７９、３０５、３１９、３７９及び４７５から成る群から選択される１から９（例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９）の位置での置換を含む成熟形態であり、３２０位のグルタミン、フェニルアラニン又はアスパラギンを含むことを特徴とする単離アルファ‐アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼ由来である。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、
１２５位のセリン又はアラニン、
１８２位のトレオニン、アスパラギン、グリシン又はアラニン、
１８３位のグリシン又はアスパラギン、
１８９位のグルタミン酸又はプロリン、
２７９位のトレオニン又はアスパラギン、
３０５位のチロシン、グルタミン、グリシン又はアルギニン、
３１９位のアスパラギン酸又はトレオニン、
３７９位のプロリン又はアラニン、及び
４７５位のグリシン、トレオニン又はアルギニン
を含む（例えば、ＢＡＳＥ−Ｐ１からＰ１２変異体）。
【０１５２】
また、本発明は、アミラーゼ活性を有し、１２５、１２８、１７８、１８２、１８３、１８９、２７９、３０５、３１９、３７９及び４７５から成る群から選択される１から１１（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１）の位置での置換を含む成熟形態であり、２４３位のセリン又はグルタミン、及び３２０位のグルタミン、フェニルアラニン又はアスパラギンを含むことを特徴とする単離アルファ‐アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群から選択される親アルファ‐アミラーゼ由来である。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体は、
１２５位のセリン又はアラニン、
１２８位のアスパラギン又はシステイン、
１７８位のリジン又はロイシン、
１８２位のトレオニン、アスパラギン、グリシン又はアラニン、
１８３位のグリシン又はアスパラギン、
１８９位のグルタミン酸又はプロリン、
２７９位のトレオニン又はアスパラギン、
３０５位のチロシン、グルタミン、グリシン又はアルギニン、
３１９位のアスパラギン酸又はトレオニン、
３７９位のプロリン又はアラニン、及び
４７５位のグリシン、トレオニン又はアルギニンを含む（例えば、ＢＡＳＥ−Ｗ１からＷ１３変異体）。
アルファ‐アミラーゼ変異体の多数の例を特許請求の範囲に記載の組成物及び方法に用いるために開示する。次のアルファ‐アミラーゼ変異体は、典型的なアルファ‐アミラーゼ変異体の例である。それは、
ＢＡＳＥ  ＳＥＬ変異体、ＡＣＥ−Ｑ  ＳＥＬ変異体、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー１変異体、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー２変異体、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー３変異体、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー４変異体、ＢＡＳＥ−Ｓ１からＳ３２の組み合わせ変異体、ＢＡＳＥ−Ｐ１からＰ１２の組み合わせ変異体、ＢＡＳＥ−Ｗ１からＷ１３の組み合わせ変異体、及びＡＣＥ−ＱＫ変異体である。しかしながら、本明細書に記載のアルファ‐アミラーゼ変異体は、それらの例の変異体に限定されなく、対応する位置での置換を有するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）親アルファ‐アミラーゼの変異体を含む。本明細書にて提供したアライメント及び他のデータに基づいて、対応する置換が他のアルファ‐アミラーゼポリペプチド、言い換えると他の「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）」中になされてよく、得られるアミラーゼ変異体が、例示したものと同様の特性を有することが予想されることも理解できる。
【０１５３】
１．７．１  安定性
本明細書にて記載する変異体の文脈において、改変される安定性（即ち、より高い又はより低い安定性）、特に、改善された安定性、特に高い温度（即ち、７０−１２０℃）及び／又は極端なｐＨ（即ち、低い又は高いｐＨ、即ち、それぞれｐＨ４−６又はｐＨ８−１１）、特に、６０ｐｐｍ未満の遊離（即ち、溶液中非結合）カルシウム濃度での安定性を達成することについて重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は、本明細書に記載される変異のいずれかを含む。安定性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。
【０１５４】
１．７．２  Ｃａ２＋安定性
改変されるＣａ２＋安定性は、Ｃａ２＋減少下に酵素の安定性が改善される、即ち、高い又はより低い安定性を意味する。本明細書に記載する変異体の文脈において、改変されるＣａ２＋安定性、特に、Ｃａ２＋安定性の改善、即ちより高い又はより低い安定性、特に、高いｐＨ（即ち、ｐＨ８−１０．５）の安定性を達成することについて重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は、本明細書に記載される変異のいずれかを含む。
【０１５５】
１．７．３  特異的活性
さらなる態様においては、改変される特異的活性、特に特異的活性の増減、特に、１０から６０℃までの温度、好ましくは２０から５０℃、特に３０から４０℃の温度で特異的活性を有する変異体を得ることに関して重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は、本明細書に記載される変異のいずれかを含む。特異的活性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。
【０１５６】
１．７．４  酸化安定性
本明細書にて記載される変異体は、親アルファ‐アミラーゼと比較して、改変される酸化安定性、特に高い酸化安定性を有してよい。増加される酸化安定性は例えば、洗剤組成物において有利であり、減少される酸化安定性はデンプン液化用組成物において有利である。酸化安定性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。
【０１５７】
１．７．５  改変されたｐＨプロファイル
改変されたｐＨプロファイル、特に高いｐＨ（即ち、ｐＨ８−１０．５）又は低いｐＨ（即ち、ｐＨ４−６）で改善された活性を有する変異体を得ることについて、重要な位置及び変異は、活性部位残基のそばに位置するアミノ酸残基の変異を含む。好ましい変異は、本明細書に記載のものである。適切なアッセイを下記「方法」のセクションに記載する。
【０１５８】
１．７．６  洗浄性能
改善された洗浄性能、特に高いｐＨ（即ち、ｐＨ８．５−１１）での洗浄性能を有する変異体を得ることに関して重要な位置及び変異は、本明細書に記載の具体的な変異を含む。洗浄性能は下記の「方法」のセクションにて記載されるように試験されてよい。
【０１５９】
２．アルファ‐アミラーゼ変異体の調製方法
本発明の組成物及び方法のある態様は、特定されたアミノ酸の置換、欠失、トランスバージョン、挿入、及びそれらの組み合わせを有する、本発明のアルファ‐アミラーゼの変異体を調製する方法である。これらの変異体は、増加されたｐＨ安定性、増加された温度安定性、低減されたＣａ２＋の要求性、増加された特異的活性、増加された食器洗浄又は洗浄性能、増加された可溶性、増加された保存安定性、又はこれらの組み合わせなど、有益な特性を有してよい。
【０１６０】
遺伝子に変異を導入するための及びこれらの遺伝子によりコードされる変異されたポリペプチドを発現する幾つかの方法は周知である。アルファ‐アミラーゼコードＤＮＡ配列のクローニングの手短な説明の後、アルファ‐アミラーゼコード配列内の具体的な位置にて変異を作成する方法を説明する。
【０１６１】
２．１  アルファ‐アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親アルファ‐アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、周知の多様な方法を用いて、問題のアルファ‐アミラーゼを生産する任意の細胞又は微生物から単離されてよい。まず、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、試験されるアルファ‐アミラーゼを生産する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築される。それから、アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、問題の生物から調製する遺伝子ライブラリーからのアルファ‐アミラーゼコーディングクローンを同定するために相同体、ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを合成して用いてよい。あるいは、知られているアルファ‐アミラーゼ遺伝子に相同性のある配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブを低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、アルファ‐アミラーゼコーディングクローンを同定するためのプローブとして用いることができる。
【０１６２】
アルファ‐アミラーゼコーディングクローンを同定するためのさらに別の方法は、プラスミドのような発現ベクターに遺伝子ＤＮＡのフラグメントを挿入し、アルファ‐アミラーゼ陰性細菌を得られる遺伝子ＤＮＡライブラリーを用いて形質転換し、及びそれからアルファ‐アミラーゼに対する基質を含む寒天培地の上に形質転換細菌を平板培養し、それによってアルファ‐アミラーゼを発現するクローンを同定できる。
【０１６３】
あるいは、酵素をコードするＤＮＡ配列を例えば、Ｓ.  Ｌ.  Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＭ.  Ｈ.  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  （１９８１）により記載されるフォスフォアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）法又はＭａｔｔｈｅｓ他  （１９８４）により記載される方法のような確立した標準方法により合成的に調製してもよい。フォスフォアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）法において、オリゴヌクレオチドを例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、及び適切なベクターへクローニングする。
【０１６４】
最後にＤＮＡ配列は、標準的な方法に従って、合成、遺伝子、又はｃＤＮＡ原型フラグメント（必要に応じて、完全なＤＮＡ配列の多様な部分に相当するフラグメント）をライゲーションにより調製される遺伝子及び合成の原型の混合、合成の及びｃＤＮＡの原型の混合又は遺伝子及びｃＤＮＡ原型の混合でよい。また、ＤＮＡ配列を例えば、米国特許第４，６８３，２０２又はＲ.  Ｋ.  Ｓａｉｋｉ他  （１９８８）に記載されるように、特異的なプライマーを用いるポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）により調製してよい。
【０１６５】
２．２  部位特異的突然変異誘発法
アルファ‐アミラーゼコードＤＮＡ配列を単離し、変異のための所望の部位を同定すると、変異を合成オリゴヌクレオチドを用いて導入してよい。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位を挟むヌクレオチド配列を含む。オリゴヌクレオチドを合成する間に変異ヌクレオチドを挿入する。具体的方法において、アルファ‐アミラーゼコード配列をブリッジングするＤＮＡの一本鎖ギャップをアルファ‐アミラーゼ遺伝子を保持するベクター中に作成する。それから、所望の変異を有する合成ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの相同性のある部分にアニーリングする。それから、残されるギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ））で満たし、構築体をＴ４リガーゼを用いて結合する。Ｍｏｒｉｎａｇａ他  （１９８４）米国特許第４，７６０，０２５に記載のこの方法の具体例は、カセットのマイナー改変を実施することにより多数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、多数の、種々の長さのオリゴヌクレオチドが導入できるので、より多くの変異をＭｏｒｉｎａｇａの方法によって一度で導入できる。
【０１６６】
アルファ‐アミラーゼコーディングＤＮＡ配列に変異を導入する別の方法が、Ｎｅｌｓｏｎ及びＬｏｎｇ（１９８９）に記載される。それはＰＣＲ反応におけるプライマーの一つとして化学的に合成されるＤＮＡ鎖を用いることによって導入される所望の変異を含むＰＣＲフラグメントの３段階の生成を含む。ＰＣＲ生成フラグメントから変異を有するＤＮＡフラグメントを制限エンドヌクレアーゼの切断により単離し、発現プラスミドへ再挿入してよい。
【０１６７】
変異体を提供する別の方法は、例えばＷＯ  ９５／２２６２５(Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎ.  Ｖ.から)又はＷＯ  ９６／００３４３(Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓから)に記載のように、遺伝子シャッフリング、又は問題の変異例えば、置換及び／又は欠失を含むハイブリッド酵素を得る他の相当する方法を含む。
【０１６８】
２．３  アルファ‐アミラーゼ変異体の発現
上述する方法により又は任意の別の周知の方法により生産するアルファ‐アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列をプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意の抑制遺伝子又は種々の活性遺伝子など、特に例えば、制御配列を含む発現ベクターを用いて、変異体アミラーゼ（即ち酵素）を発現するために用いてよい。
【０１６９】
アルファ‐アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を保持する組み換え発現ベクターは、便宜的に組み換えＤＮＡ手法の施される任意のベクターでよく、ベクターの選択は、しばしば、それが導入される宿主細胞で決まる。従って、ベクターは自律的に複製するベクターでもよく、即ち、染色体外に存在するベクターでもよく、その複製はプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外因子、小染色体、又は人工染色体のような染色体複製から独立した複製であるものでもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞染色体に組み込まれ、及び組み込まれてしまった染色体とともに複製されるベクターでもよい。
【０１７０】
ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は、適切なプロモーター配列に作動可能に結合すべきである。プロモーターは選択された宿主細胞での転写活性を示す任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に相同の又は異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子由来でもよい。本発明の組成物及び方法のアルファ‐アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を方向付ける適切なプロモーターの例は、特に細菌の宿主において、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトミセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）麦芽アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ）遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ‐アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。菌類の宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール  ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ)、アスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）中性アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）酸安定アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール  ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ)リパーゼ、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギルス  ニドゥラン（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセタミダーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターである。
【０１７１】
発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター及び、真核生物において、本発明の組成物及び方法のアルファ‐アミラーゼの変異体をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合するポリアデニル化配列を含んでもよい。ターミネーション及びポリアデニル化配列はプロモーターとして同じ供給源から適切に由来してもよい。
【０１７２】
さらに、ベクターは問題とする宿主細胞でベクターが複製可能なＤＮＡ配列を含んでもよい。そのような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、及びｐＩＪ７０２の複製の原型である。
【０１７３】
また、ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。例えば、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来ｄａｌ遺伝子のような、宿主細胞中の欠点を補完する遺伝子産物、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン又はテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を有する遺伝子である。さらに、ベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、及びｓＣのようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカー、ハイグロマイシン耐性を生ぜしめるマーカー、又は例えば、ＷＯ  ９１／１７２４３に記載のような同時形質転換によって行われる選択マーカーを含んでよい。
【０１７４】
例えば、ある細菌を宿主細胞として用いる場合、細胞内発現が幾つかの点で有利であるが、一般的に発現は細胞外であることが好ましい。一般的に本明細書にて記載するバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼは、培地への発現プロテアーゼの分泌を可能とするプレ領域又はシグナル配列を含む。所望に応じて、このプレ領域を、個別のプレ領域をコードするＤＮＡ配列の置換によって容易に行われる異なるプレ領域又はシグナル配列により置換してもよい。
【０１７５】
アルファ‐アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター、及び他の要素をそれぞれコードするＤＮＡ構築体を結合し、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、  ２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９を参照）。
【０１７６】
ＤＮＡ構築体又は発現ベクターのいずれかを含む細胞は、アルファ‐アミラーゼ変異体の組み換えの生産での宿主細胞として有効に用いられる。宿主染色体にＤＮＡ構築体（一以上のコピー）を都合よく組み込むことにより、細胞は、変異体をコードする本発明の組成物及び方法のＤＮＡ構築体で容易に形質転換される。ＤＮＡ配列が細胞で安定的に維持される可能性が高いので、この組み込みは有利であると一般的に考えられる。宿主染色体へのＤＮＡ構築体の組み込みは、例えば、相同の又は異種の組み換えによる、従来の方法により行われる。あるいは、細胞は、宿主細胞の異なる型では上述のように発現ベクターで形質転換されてもよい。細胞は、哺乳動物又は昆虫のような高等生物の細胞でもよく、しかし、好ましくは微生物細胞、例えば細菌又は真菌類（酵母を含む）細胞である。
【０１７７】
適切な細菌微生物の例は、グラム陽性菌であって、例えば、バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス  ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アルカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス  ランツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バシルス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、及び  バシルス  ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）又はストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス  ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）あるいは、グラム陰性菌であって、例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）である。細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換により、又はそれ自体周知の方法であるコンピテント細胞を用いることにより達成される。
【０１７８】
好ましい酵母生物を例えばサッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種から選択してよい。糸状菌は、例えば、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種に有利に属してよい。菌細胞をプロトプラスト形成及びそれ自体知られている方法の細胞壁の再生を伴うプロトプラストの形質転換を含むプロセスにより形質転換してよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換にかかる適切な方法は、例えば、ＥＰ２３８０２３の記載を含む。
【０１７９】
細胞を培養のために用いる培地は、アルファ‐アミラーゼ変異体の発現が得られ、問題となる宿主細胞の成長に適した任意の従来の培地でよい。適切な培地は業者から入手可能であり、又は出版された手順（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログに記載のように）に従って調製してもよい。
【０１８０】
宿主細胞から分泌されるアルファ‐アミラーゼ変異体は、周知の方法により、培養培地から便利に回収されてよく、遠心分離又はろ過によって培地から細胞を分離すること、及び硫酸アンモニウムのような塩を用いて培地のタンパク質成分を沈殿させ、引き続き、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィーの方法を用いて分離することを含む。
【０１８１】
３．  洗剤組成物
本発明の組成物及び方法のある態様は、アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼを含む、洗剤組成物、又は洗剤添加物に関連する。洗剤組成物は、手作業、又は機械用の洗濯洗剤組成物、染みが付いた布地の前処理に適した洗濯用添加組成物、すすぎに添加される布地用柔軟組成物、一般的な家庭用の固い表面洗浄処理に用いるための洗剤組成物、又は、手作業又は機械食器洗浄組成物として調合されてよい。
【０１８２】
適切なプロテアーゼは、動物、野菜、又は微生物のものを含む。微生物が好ましい。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理される変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼでもよく、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼ又はキモトリプシン様プロテアーゼでよい。アルカリプロテアーゼの例はサブチリシン類であり、特に、例えば、サブチリシンレンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、サブチリシンアミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、サブチリシンノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｎｏｖｏ）、サブチリシンカールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８(ＷＯ  ８９／０６２７９に記載)のようなバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のものである。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例、豚又は牛由来の）、及びＷＯ  ８９／０６２７０及びＷＯ  ９４／２５５８３に記載のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。
【０１８３】
また、有用なプロテアーゼの例は、米国特許第ＲＥ３４，６０６、５，８０１，０３９、５，３４０，７３５、５，５００，３６４、５，８５５，６２５、５，９５５，３４０、５，７００，６７６、６，３１２，９３６及び６，４８２，６２８、米国特許公報番号２００８／００９０７４７、並びに国際特許公報ＷＯ９８／２３７３２、ＷＯ９９／２０７７０、ＷＯ  ９２／１９７２９、ＷＯ  ９８／２０１１５、ＷＯ  ９８／２０１１６、ＷＯ  ９８／３４９４６、ＷＯ９５／２３２２１、ＷＯ  ９２／２１７６０及びＷＯ  ８９／０６２７０に記載の変異体、特に、次の位置、２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５及び２７４、の一以上で置換を有する変異体を含むがこれらに限定されない。
【０１８４】
商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素は、アルカラーゼ（商標）（ＡＬＣＡＬＡＳＥ）、サビナーゼ（商標）（ＳＡＶＩＮＡＳＥ）、プリマーゼ（商標）（ＰＲＩＭＡＳＥ）、ドゥララーゼ（商標）（ＤＵＲＡＬＡＳＥ）、エスペラーゼ（商標）（ＥＳＰＥＲＡＳＥ）、ドゥラザイム（商標）（ＤＵＲＡＺＹＭ）、ポーラーザイム（商標）（ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ）、オボザイム（商標）（ＯＶＯＺＹＭＥ）、リカナーゼ（商標）（ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ）、ニュートラーゼ（商標）（ＮＥＵＴＲＡＳＥ）、リラーゼ（商標）（ＲＥＬＡＳＥ）及びカンナーゼ（商標）（ＫＡＮＮＡＳＥ）(ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ)製）、マキサターゼ（商標）（ＭＡＸＡＴＡＳＥ）、マキサカール（商標）（ＭＡＸＡＣＡＬ）、マキサペム（商標）（ＭＡＸＡＰＥＭ）、プロペラーゼ（商標）（ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ）、プラフェクト（商標）（ＰＵＲＡＦＥＣＴ）、プラフェクトＯＸＰ（商標）（ＰＵＲＡＦＥＣＴ  ＯＸＰ）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）、及びＦＮ４（商標）オプチクリーン（商標）（ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ）、オプチマーゼ（商標）（ＯＰＴＩＭＡＳＥ）、プラマックス（商標）（ＰＵＲＡＭＡＸ）、エクセラーゼ（商標）（ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ）及びプラファスト（商標）（ＰＵＲＡＦＡＳＴ）（ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）製）、及びＢＬＡＰ（商標）（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ａｕｆ  Ａｋｔｉｅｎ製、  デュッセルドルフ、ドイツ）を含む。
【０１８５】
更なるいくつかの実施態様においては、本発明に使用できるメタロプロテアーゼは、ＷＯ  ０７／０４４９９３に記載の中性メタロプロテアーゼを含むが、これに限定されない。
【０１８６】
アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼに加えて、洗剤組成物又は添加剤は、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のタンパク質分解酵素、例えば、別のアルファ‐アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトジェニックアルファ‐アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ及び／又はセルロース、マンナナーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製マンナスター（ＭＡＮＮＡＳＴＡＲ）（商標）のような）ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クチナーゼ、及び／又はラッカーゼのような一以上の他の酵素を含んでよい。一般的に選択される酵素の特性は、選択される洗剤（例えば、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分等との適合性）と適合すべきであり、酵素は、効果的な量で存在すべきである。
【０１８７】
リパーゼ：適切なリパーゼは細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語  サーモミセス(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ)）由来のリパーゼであって、例えば、ＥＰ  ２５８０６８及びＥＰ  ３０５２１６記載のフミコーラ  ラヌギノサ（Ｈ．  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ  (Ｔ．  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ)）由来、又は例えばＷＯ  ９６／１３５８０記載のフミコーラ  インソレンス（Ｈ．  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来であり又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ由来であり、例えば、シュードモナス  アルカリゲネス（Ｐ．  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）又はシュードモナス  シュードアルカリゲネス（Ｐ．  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＥＰ  ２１８  ２７２)、シュードモナス  セパシア（Ｐ．  ｃｅｐａｃｉａ）(ＥＰ  ３３１  ３７６)、シュードモナス  スタッチェリ（Ｐ．  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＧＢ  １，３７２，０３４)、シュードモナス  フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）の菌株ＳＤ  ７０５（ＷＯ  ９５／０６７２０及びＷＯ  ９６／２７００２)、シュードモナス  ウィスコンシネンシス（Ｐ．  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（ＷＯ  ９６／１２０１２）由来であり、又は  バシルス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼであって、例えば、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ他、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１１３１  ：  ２５３−３６０)、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＪＰ  ６４／７４４９９２)、又はバシルス  プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ（ＷＯ  ９１／１６４２２)由来を含むが、これらに限定されない。調合物の使用が考えられる更なるリパーゼ変異体例は、例えば  ＷＯ  ９２／０５２４９、ＷＯ  ９４／０１５４１、ＥＰ  ４０７２２５、ＥＰ  ２６０１０５  ＷＯ  ９５／３５３８１、ＷＯ  ９６／００２９２、ＷＯ  ９５／３０７４４、ＷＯ  ９４／２５５７８、ＷＯ  ９５／１４７８３、ＷＯ  ９５／２２６１５、ＷＯ  ９７／０４０７９、及びＷＯ  ９７／０７２０２に記載のものも含む。商業的に入手可能なリパーゼ酵素は、リポラーゼ（商標）（ＬＩＰＯＬＡＳＥ）及びリポラーゼウルトラ（商標）（ＬＩＰＯＬＡＳＥ  ＵＬＴＲＡ（商標））(Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａ／Ｓ製）である。
【０１８８】
ポリエステラーゼ：適切なポリエステラーゼを組成物に含むことができる。適切なポリエステラーゼは、例えば、ＷＯ  ０１／３４８９９及びＷＯ  ０１／１４６２９に記載のものを含む。
【０１８９】
アミラーゼ：一以上の追加的アミラーゼ（本明細書に記載の変異体アミラーゼに加えて）も含んでよい。適切なアミラーゼは（アルファ及び／又はベータ）は、細菌類又は菌類由来のものを含む。化学修飾又はタンパク質工学的に処理される変異体を含む。アミラーゼは例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られるアルファ‐アミラーゼを含み、例えばＧＢ  １，２９６，８３９に詳しく記載のバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特別な菌株である。有用なアミラーゼの例は、ＷＯ  ９４/１８３１４、ＷＯ  ９６/３９５２８、ＷＯ  ９４/０２５９７、ＷＯ  ９４/１８３１４、ＷＯ  ９６/２３８７３、及びＷＯ  ９７/４３４２４記載の変異体であり、特に、次の一以上の位置に置換を有する変異体である。その位置は、１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４である。商業的に入手可能なアルファ‐アミラーゼは、デュラミル（商標）（ＤＵＲＡＭＹＬ）、リクエザイム（商標）（ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ）、ターマミル（商標）（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）、ナタラーぜ（商標）（ＮＡＴＡＬＡＳＥ）、ステインザイム（商標）プラス（ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ）、ステインザイム（商標）ウルトラ（ＳＴＡＩＮＺＹＭ    ＵＬＴＲＡ）ファンガミル（商標）（ＦＵＮＧＡＭＹＬ）、及びバン（商標）（ＢＡＮ）(Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ａ／Ｓ製）又はラピダーゼ（商標）（ＲＡＰＩＤＡＳＥ）、及びプラスター（商標）（ＰＵＲＡＳＴＡＲ）（ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）製）である。
【０１９０】
セルラーゼ：セルラーゼを組成物に添加してよい。適切なセルラーゼは、細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理される変異体が含まれる。適切なセルラーゼは、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼを含むがこれらに限定されない。例えば、米国特許第４，４３５，３０７、米国特許第５，６４８，２６３、米国特許第５，６９１，１７８、米国特許第５，７７６，７５７、及び国際ＰＣＴ出願  ＷＯ  ８９／０９２５９に開示されるフミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ  サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、フザリウム  オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生産される菌類のセルラーゼである。一般的なトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼは、米国特許第４，６８９，２９７、米国特許第５，８１４，５０１、米国特許第５，３２４，６４９、ＷＯ  ９２／０６２２１及びＷＯ  ９２/０６１６５に記載される。一般的なバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）セルラーゼは米国特許第６，５６２，６１２に記載される。商業的に入手可能なセルラーゼは、セルザイム（商標）（ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ）及びケアザイム（商標）（ＣＡＲＥＺＹＭＥ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ製）又はクラジネース（商標）（ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ）及びプラダックス  ＨＡ（商標）（ＰＵＲＡＤＡＸ  ＨＡ）（ジェネンコア  インターナショナル  インク（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．））及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王社）を含む。
【０１９１】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼ例は、コプリナス  シネレウス（Ｃ．  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のようなコプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ及びＷＯ  ９３／２４６１８、ＷＯ  ９５／１０６０２、及びＷＯ  ９８／１５２５７に記載のようなそれらの変異体由来のペルオキシダーゼを含む。商業的に入手可能なペルオキシダーゼは、例えば、ガードザイム（商標）（ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ製）を含む。
【０１９２】
洗剤酵素は、一以上の酵素を含む個別の添加物を加えることによって、又はこれらの酵素すべてを含む組合せ添加物を加えることによって洗剤組成物中に含有してもよい。本発明の組成物及び方法の洗剤添加物、すなわち、個別の添加物又は組合せ添加物は、例えば粒子、液体、スラリー等として調合される。好ましい洗剤添加物調合物は、粒子、特に非粉塵化（ｎｏｎ−ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子、液体、特に安定化液体又はスラリーを含む。
【０１９３】
非粉塵化粒子を、米国特許第４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に記載のように調製してよく、任意に周知の方法でコーティングしてよい。ワックスコーティング材の例は、平均分子量１０００から２００００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子を含むアルコール及び１５から８０のエチレンオキシド単位であるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ‐、ジ‐、トリグリセロールである。流動層技術による適用に有用なフィルム形状コーティング材の例は、ＧＢ  １４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製物は、プロピレングリコール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸のようなポリオールを確立した方法に従って加えることにより、安定化されてよい。被保護酵素はＥＰ２３８，２１６に記載の方法に従って調製されてよい。
【０１９４】
一般的に、洗剤組成物は、例えば棒状、錠剤、粉、粒子、ペースト、又は液体のような任意の便利な形態でよい。液体洗剤は水性、典型的には、約７０％水分まで、及び０％から約３０％の有機溶剤まで含んでよい。例えば、約３０％以下の水分を含むコンパクト洗剤ゲルである。
【０１９５】
パーシルパーシル（Ｐｅｒｓｉｌ）、タイド（商標）（ＴＩＤＥ）２Ｘ冷水、及びアリエール（Ａｒｉｅｌ）の洗剤は、典型的なアルファ−アミラーゼ変異体をテストするために本明細書に使用される典型的な洗剤である。本発明のアルファ−アミラーゼ変異体は、典型的な組成物に制限されない。なぜなら、それらが、広範囲の一般に用いられている洗浄組成物存在下で機能されると考えられるからである。
【０１９６】
洗剤組成物は、一以上の界面活性剤を含み、それは、半極性及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／又は両性イオン性を含む非イオン性でもよい。界面活性剤は一般的に、０．１％から６０ｗｔ．％の範囲に存在する。典型的なアルファ‐アミラーゼ変異体を陰イオン性及び非イオン性界面活性剤を含む洗剤組成物で試験した。本明細書に記載のアルファ‐アミラーゼ変異体は、洗剤中に通常用いる他の界面活性剤を含む組成物で活性があると考えられる。
【０１９７】
界面活性剤が含まれる場合、洗剤は、通常約１％から約４０％の陰イオン性界面活性剤を含み、例えば、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコール  エトキシ硫酸塩、第二級アルカンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル‐又はアルケニルコハク酸又は石鹸である。
【０１９８】
界面活性剤を含む場合、通常、洗剤は約０．２％から約４０％の非イオン性界面活性剤を含み、例えば、アルコールエトキレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ‐アシル‐Ｎ‐アルキル誘導体（「グルカミド」）である。
【０１９９】
洗剤は、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例、ヘキスト社製ＳＫＳ−６）のような０％から６５％の洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよい。
【０２００】
洗剤は、一以上のポリマーを含んでよい。ポリマーの例は、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニル‐ピロリドン）、ポリ（エチレン  グリコール）、ポリ（ビニル  アルコール）、ポリ（ビニルピリジン‐Ｎ‐オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリル  メタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。
【０２０１】
洗剤は、過酸形成漂白活性化剤（例えば、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート）と結合する過ホウ酸塩又は過炭酸塩のようなＨ２Ｏ２供給源を含みうる漂白システムを含んでよい。あるいは、漂白システムは、ペルオキシ酸（例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸）を含んでよい。また、漂白システムは、酵素的漂白システムでもよい。例えば、ＷＯ  ０５/０５６７８２を参照願いたい。
【０２０２】
本発明の組成物及び方法の洗剤組成物の酵素を、従来の安定化剤を用いて安定化してよい。例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば、芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体、又は例えば４−フォルミルフェニルホウ酸のようなフェニルホウ酸誘導体であり、組成物はＷＯ  ９２／１９７０９及びＷＯ  ９２／１９７０８に記載のように調合されてよい。
【０２０３】
また、洗剤組成物は他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば、クレー、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトープ、曇り防止剤、及び／又は香料を含む布地コンディショナーである。
【０２０４】
本発明のアルファ‐アミラーゼを洗浄液１リットル当たり０．０１から１００ｍｇの酵素タンパク質、例えば、洗浄液１リットル当たり約０．０５から約５．０ｍｇの酵素タンパク質、又は洗浄液１リットル当たり約０．１から約１．０ｍｇの酵素タンパク質に相当する量を添加してよい。
【０２０５】
本発明のアルファ‐アミラーゼをＷＯ  ９７/０７２０２に記載の洗剤調合物に追加的に取り込んでよく、参照によりここに組み込まれる。
【０２０６】
４．  組成物及び使用
本発明のアルファ‐アミラーゼ洗浄組成物を洗剤組成物及び洗浄に関連する方法に用いてよく、特に洗濯用洗剤組成物、食器洗浄洗剤組成物、硬い表面の洗浄組成物などである。
【０２０７】
４．１  洗濯洗剤組成物及び使用
ある実施態様によれば、組成物及び方法は洗濯洗剤組成物及びその使用方法である。洗剤組成物は、非粉塵化粒子、安定化した液体、又は保護された酵素の形態でよい。ドライ調合物は粒子又は微粒子の形態でもよい。非粉塵化粒子は例えば米国特許第４，１０６，９９１、及び４，６６１，４５２に記載されるように生産されてよく、任意的に周知の方法で表面を覆ってもよい。ワックスのコーティング原料の例は、平均分子量１、０００から２０、０００であるポリ（エチレンオキシド）産物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシドの単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子を含むアルコール及び１５から８０のエチレンオキシド単位が存在するエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪酸のモノ、ジ、トリグリセリドである。流動層技術による適用に有用なフィルムコーティング材料の例は、例えばＧＢ  １４８３５９１に記載される。液体酵素の調製物は、例えば、確立した方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化される。他の酵素の安定化剤は周知の技術である。被保護酵素を例えばＥＰ  Ａｐｐｌｎ．２３８、２１６に記載される方法に従って調製してよい。ポリオールはタンパク質の安定化剤としても、タンパク質溶解性の改善としても長い間認められている。例えば、Ｊ．  Ｋ．  Ｋａｕｓｈｉｋ他、「Ｗｈｙ  ｉｓ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ａｎ  ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ?  Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｏｓｍｏｌｙｔｅ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：  ２６４５８−６５  （２００３）及び  そこに引用されている文献、及びＭｏｎｉｃａ  Ｃｏｎｔｉ他、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ：  ｔｈｅ  ｐｒｏｂｌｅｍ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ」、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ７５７：  ２３７−２４５  （１９９７）を参照願いたい。
【０２０８】
組成物は、主要な酵素成分として、本発明のアルファ‐アミラーゼ又はプロテアーゼの一以上を含んでよい。あるいは、組成物はアミノペプチダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン  グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼのような多数の他の酵素活性も以下に記載の他の酵素のような多数の酵素活性も含んでもよい。添加酵素はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（例、フミコーラ  インソレンス（Ｈ．  ｉｎｓｏｌｅｎｓ））及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物の手段により生産されてよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の典型的な仲間はセルロース高分解糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス  アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を含む。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の典型的な仲間はフザリウム  バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅ）、フザリウム  セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム  クロオクウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム  クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）,フザリウム  グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム  ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム  ネガンディニス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉｎｉｓ）、フザリウム  オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム  レティクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム  サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム  サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム  スルフリューム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム  トルローサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム  トリコテキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）及び、フザリウム  ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）を含む。
【０２０９】
洗剤組成物は、例えば、粉体、粒体、ペースト、又は液体として、いずれかの有用な形態でよい。一般的に、液体洗剤は、約７０％までの水及び０％から約３０％の有機溶剤を含有する液体でよい。また、約３０％の水のみを含むコンパクトゲルタイプの形態における洗剤組成物でもよい。酵素は、酵素の安定性に適合する任意の洗剤組成物を用いてよい。一般的に、酵素は、カプセル化という周知の形態によって有害な成分から保護され、例えば、ハイドロゲルでの粒状化及び封入である。酵素及び特定のアルファ‐アミラーゼは、洗濯及び食器洗浄に適用に限定されず、また、表面洗浄剤、デンプン又はバイオマスからのエタノール産物でも用いられる。
【０２１０】
洗剤組成物はそれぞれ陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオンである界面活性剤の一以上を含む。洗剤は、通常、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＬＡＳ）、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＡＯＳ）、アルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）(脂肪アルコール硫酸塩（ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）)（ＡＳ）、アルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）第二級アルカンスルホネート（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｌｋａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）（ＳＡＳ）、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル（α‐ｓｕｌｆｏ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ）、アルキル‐又はアルケニルコハク酸（ａｌｋｙｌ‐  ｏｒ  ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）又は石鹸のような０％から約５０％の陰イオン界面活性剤を含む。また、組成物は、アルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコール  エトキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）、ノニルフェノールエトキシレート（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、アルキルポリグリコシド（ａｌｋｙｌｐｏｌｙｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、アルキルジメチルアミンオキシド（ａｌｋｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｏｘｉｄｅ）、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、脂肪酸モノエタノールアミド（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ  ａｌｋｙｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｍｉｄｅ）  (例えばＷＯ  ９２／０６１５４に記載されるように)のような０％から約４０％の非イオン界面活性剤を含んでもよい。
【０２１１】
さらに、洗剤組成物は、任意の組み合わせで、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又はラッカーゼのような一以上の酵素を含んでもよい。上記を参照願いたい。
【０２１２】
洗剤は、任意に、約１％から約６５％の洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよく、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ  ｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（例えば、ヘキスト製ＳＫＳ−６）である。また、洗剤は、アンビルト（ｕｎｂｕｉｌｔ）でもよい。即ち、本質的に洗剤ビルダーがなくてもよい。
【０２１３】
洗剤は、任意に、一以上のポリマーを含んでよい。例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニル  アルコール）（ＰＶＡ）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。
【０２１４】
洗剤は、任意に、漂白システムを含んでよく、それは、過ホウ酸塩、過炭酸塩のようなＨ２Ｏ２供給源を含んでよく、ここで、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）のような過酸形成漂白活性化剤と組み合わせてもよい。あるいは、漂白システムは、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含んでよい。また、漂白システムは、例えば、ＷＯ  ２００５／０５６７８３に記載される、ペルヒドロラーゼが過酸を活性化する酵素的漂白システムでもよい。
【０２１５】
洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又は例えば、芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体のような従来の安定化剤を用いて安定化されてよく、組成物が、例えばＷＯ  ９２／１９７０９及びＷＯ  ９２／１９７０８に記載のように調合されてもよい。
【０２１６】
また、洗剤は、クレイ、発泡剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、蛍光増白剤、又は香料を含む例えば繊維コンディショナーのような他の従来の洗剤成分を含んでもよい。
【０２１７】
ｐＨ（用いる濃度での水溶液で測定）は通常中性又はアルカリ、例えば、ｐＨ約７．０から約１１．０である。
【０２１８】
アルファ‐アミラーゼ変異体を含む洗剤組成物の特定の形態は、下記を含むように調合される。
【０２１９】
１）約７％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１８アルコール、１−２エチレンオキシド（ＥＯ））、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１６−１８）、約５％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１４−１５アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約２から約６％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、約１５％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約６％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、約１１％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約２％から約６％のＴＡＥＤ、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％のタンパク質の酵素（純粋酵素として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として調合される洗剤組成物。
【０２２０】
２）約６％から約１１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約３％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１８アルコール、１−２ＥＯ）、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１６−１８）、約５％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１４−１５アルコール、７ＥＯ）、約１５％から約２１％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、約２４％から約３４％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約４％から約１０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−６％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％のタンパク質の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として調合される洗剤組成物。
【０２２１】
３）約５％から約９％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約７％から約１４％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ）、約１から約３％脂肪酸（例、Ｃ１６−２２脂肪酸）としての石鹸、約１０％から約１７％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約３％から約９％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、約２３％から約３３％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約４％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約８％から約１６％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約２％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約１％のホスホン酸塩（例、ＥＤＴＭＰＡ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％のタンパク質の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として調合される洗剤組成物。
【０２２２】
４）約８％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１０％から約２５％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）、約１％から約５％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、約２５％から約３５％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約１０％の硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として調合される洗剤組成物。
【０２２３】
５）約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１２％から約１８％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１３％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、０％から約１３％のアルケニルコハク酸（ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｃ１２−１４）、約８％から約１８％のアミノエタノール、約２％から約８％のクエン酸、０％から約３％のホスホン酸塩、０％から約３％のポリマー（例、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０％から約２％のホウ酸塩（Ｂ４Ｏ７）、０％から約３％のエタノール、約８％から約１４％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０２２４】
６）約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、３−９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１０％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、約１４％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約９％から約１８％のクエン酸カリウム、０％から約２％のホウ酸塩（Ｂ４Ｏ７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０から約３％のポリマー（例、ＰＥＧ、ＰＶＰ）、０から約３％の例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、分子量３８００のような固着用ポリマー、０％から約５％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性構造化液体洗剤組成物。
【０２２５】
７）約５％から約１０％の脂肪アルコール硫酸塩、約３％から約９％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０−３％脂肪酸としての石鹸、約５％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、約２０％から約４０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約２％から約８％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約１２％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約２％から約７％のＴＡＥＤ、約１％から約５％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、石鹸泡抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として調合される洗剤組成物。
【０２２６】
８）約８％から約１４％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約５％から約１１％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０％から約３％脂肪酸としての石鹸、約４％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、約３０％から約５０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約３％から約１１％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約５％から約１２％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）、約１％から約５％のポリマー（例、ＰＶＰ、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料）を含む粒子として調合される洗剤組成物。
【０２２７】
９）約６％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％の非イオン界面活性剤、約２％から約６％脂肪酸としての石鹸、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１８％から約３２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約５％から約２０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約３％から約８％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）、約４％から約９％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約１％から約５％の漂白活性剤（例、ＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、約１％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、香料）を含む粒子として調合される洗剤組成物。
【０２２８】
１０）約１５％から約２３％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約８％から約１５％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、２−３ＥＯ）、約３％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、０％から約３％脂肪酸（例、ラウリン酸）としての石鹸、約１％から約５％のアミノエタノール、約５％から約１０％のクエン酸ナトリウム、約２％から約６％のハイドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）（例トルエンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｏｌｕｅｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ））、０％から約２％のホウ酸塩（例、Ｂ４Ｏ７）、０％から約１％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、約１％から約３％のエタノール、約２％から約５％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０２２９】
１１）約２０％から約３２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、６−１２％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約２％から約６％のアミノエタノール、約８％から約１４％のクエン酸、約１％から約３％のホウ酸塩（例、Ｂ４Ｏ７）、０％から約３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーのような固着用ポリマー）、約３％から約８％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、ヒドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０２３０】
１２）約２５％から約４０％の陰イオン界面活性剤（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、アルキル硫酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸、石鹸）、約１％から約１０％の非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート）、約８％から約２５％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約５％から約１５％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、０％から約５％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約１５％から約２８％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約２０％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３４Ｈ２Ｏ）、約０％から約５％の漂白活性剤（例、ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約３％の少量の成分（例、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として調合される洗剤組成物。
【０２３１】
１３）上記組成物１）−１２）に記載の洗剤組成物であって、すべて又は一部のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩が（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩により置換される洗剤組成物。
【０２３２】
１４）約９％から約１５％の（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩、約３％から約６％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約５％のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ  ａｌｋｙｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｍｉｄｅ）、約１０％から約２０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約１０％から約２０％層状２ケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（例、ヘキストからＳＫ５６）、約３％から約１２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、０％から約６％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、約４％から約８％のクエン酸ナトリウム、約１３％から約２２％の過ホウ酸ナトリウム、約３％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、光退色、香料、石鹸泡抑制剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として調合される洗剤組成物。
【０２３３】
１５）約４％から約８％の（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩、約１１％から約１５％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約４％の石鹸、約３５％から約４５％のゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ、約２％から約８％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、０％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）、約１３％から約２２％の過炭酸ナトリウム、１―８％のＴＡＥＤ、０％から約３％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０％から約３％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、及びＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素タンパク質として計算）、及び０から約３％の少量の成分（例、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として調合される洗剤組成物。
【０２３４】
１６）追加的成分か又はすでに特定された漂白システムに置換するかどちらか一方として、安定化又は封入された過酸を含むことを特徴とする、上述１）から１５）に記載の洗剤調合物。
【０２３５】
１７）過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられることを特徴とする、１）、３）、７）、９）、及び１２）に上述するような洗剤組成物。
【０２３６】
１８）マンガン触媒を追加的に含有することを特徴とする、１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）に上述するような洗剤組成物。例えば、該マンガン触媒は、Ｈａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６３７‐６３９  （１９９４）に記載の化合物の一つである。
【０２３７】
１９）例えば、直鎖アルコキシル化第一級アルコール、ビルダーシステム（例、リン酸塩）、酵素、及びアルカリのような液体非イオン性界面活性剤を含む非水性洗剤液として調合される洗剤組成物。洗剤は陰イオン界面活性剤及び／又は漂白システムを含んでもよい。
【０２３８】
一以上の本発明のアルファ‐アミラーゼは、洗剤中に従来使用される濃度で含まれてよい。本発明において、洗剤組成物中アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は、洗浄液のリットル当たり０．００００１‐１．０ｍｇ（純粋酵素タンパク質として計算）の酵素に相当する量を加えることを意図する。
【０２３９】
別の実施態様おいては、２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は洗剤組成物に含まれてよく、家庭用及び／又は産業用の織物／洗濯に存在するバイオフィルムの除去／洗浄に用いてよい。
【０２４０】
例えば、洗剤組成物は、染みが付いた布地の前処理に適した洗濯用添加組成物及びすすぎに添加される布地用柔軟組成物を含む手作業又は機械用の洗濯洗剤組成物として調合されてよく、又は、一般的な家庭用の固い表面洗浄処理に用いるための洗剤組成物として調合されてよく、又は手作業又は機械食器洗浄処理のために調合されてよい。
【０２４１】
特定の実施態様においては、洗剤組成物は、一以上の本発明のアルファ‐アミラーゼ変異体及びプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼ、及び／又はこれ等の組み合わせのような一以上の他の洗浄酵素に加えて２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、一以上のアルファ‐アミラーゼをさらに含んでもよい。
【０２４２】
一般的に選択される酵素の特性は、選択される洗剤（例えば、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分等との適合性）と適合すべきであり、酵素は、効果的な量で存在すべきである。幾つかの実施態様においては、アミラーゼ及びプロテアーゼは共に調合される（言い換えると、同じ液体、顆粒等でともに調合される）。或いは、アミラーゼ及びプロテアーゼは、別個の液体又は顆粒として調合され、後で洗浄組成物へ結合される。
【０２４３】
４．２  食器洗浄洗剤組成物
別の実施態様においては、本発明は、食器洗浄洗剤組成物を提供し、下記を含む。
【０２４４】
１）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤  ０．４‐２．５％
メタケイ酸ナトリウム  ０‐２０％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）  ３‐２０％
３リン酸ナトリウム  ２０‐４０％
炭酸ナトリウム  ０‐２０％
過ホウ酸ナトリウム  ２‐９％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）  １‐４％
硫酸ナトリウム  ５‐３３％
酵素  ０．０００１‐０．１％
【０２４５】
２）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤  １‐２％
(例、アルコールエトキシレート)
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）  ２‐３０％
炭酸ナトリウム  １０‐５０％
ホスホン酸ナトリウム  ０‐５％
クエン酸３ナトリウム２水和物  ９‐３０％
ニトリロトリソジウム酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）（ＮＴＡ）０‐２０％
過ホウ酸ナトリウム１水和物  ５‐１０％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）  １‐２％
ポリアクリル酸ポリマー  ６‐２５％
(例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー)
酵素  ０．０００１‐０．１％
香料  ０．１‐０．５％
水  ５‐１０％
【０２４６】
３）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤  ０．５‐２．０％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）  ２５‐４０％
クエン酸ナトリウム  ３０‐５５％
炭酸ナトリウム  ０‐２９％
重炭酸ナトリウム  ０−２０％
過ホウ酸ナトリウム１水和物  ０‐１５％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）  ０‐６％
マレイン酸／アクリル酸性コポリマー  ０‐５％
クレイ  １−３％
ポリアミノ酸  ０−２０％
ポリアクリルナトリウム  ０−８％
酵素  ０．０００１‐０．１％
【０２４７】
４）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤  １‐２％
ゼオライト  ＭＡＰ  １５‐４２％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）  ３０‐３４％
クエン酸ナトリウム  ０‐１２％
炭酸ナトリウム  ０‐２０％
過ホウ酸ナトリウム１水和物  ７‐１５％
テトラアセチルエチレン  ０−３％
ジアミン（ＴＡＥＤ）ポリマー  ０‐４％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ０‐５％
有機ホスホン酸塩（ｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）  ０‐４％
クレイ  １‐２％
酵素  ０．０００１‐０．１％
硫酸ナトリウム  適量
【０２４８】
５）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤  １‐７％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）１８‐３０％
クエン酸３ナトリウム  １０‐２４％
炭酸ナトリウム  １２‐２０％
１過硫酸  １５−２１％
（２ＫＨＳＯ５．ＫＨＳＯ４．Ｋ２ＳＯ４）
漂白安定剤  ０．１−２％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ０‐６％
ジエチレントリアミン５酢酸、５ナトリウム塩  ０−２．５％
酵素  ０．０００１‐０．１％
硫酸ナトリウム、水  適量
【０２４９】
６）洗浄界面活性剤システムを有する粉状及び液状食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤  ０‐１．５％
オクタデシルジメチルアミンＮ‐オキシド２水和物  ０−５％
オクタデシルジメチルアミンＮ‐オキシド２水和物及びヘキサデシルジメチルアミンＮ‐オキシド２水和物の８０：２０ｗｔ．  Ｃ１８／Ｃ１６ブレンド  ０−４％
オクタデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ‐オキシド無水和物及びヘキサデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ‐オキシド無水和物の７０：３０ｗｔ．  Ｃ１８／Ｃｌ６のブレンド  ０−５％、
平均エトキシ化度が３であるＣ１３−Ｃ１５アルキルエトキシ硫酸塩  ０−１０％
平均エトキシ化度が３であるＣ１２−Ｃ１５アルキルエトキシ硫酸塩  ０−５％
平均エトキシ化度が１２であるＣ１３−Ｃ１５エトキシ化アルコール  ０−５％
平均エトキシ化度が９であるＣ１２−Ｃ１５エトキシ化アルコールのブレンド  ０−６．５％
平均エトキシ化度が３０であるＣ１３−Ｃ１５エトキシ化アルコールのブレンド  ０−４％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）  ０‐３３％、
トリポリリン酸ナトリウム  ０‐４６％
クエン酸ナトリウム  ０−２８％
クエン酸  ０−２９％
炭酸ナトリウム  ０‐２０％
過ホウ酸ナトリウム１水和物  ０‐１１．５％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）０‐４％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ０‐７．５％
硫酸ナトリウム  ０−１２．５％
酵素  ０．０００１‐０．１％
【０２５０】
７）非水溶性液状自動食器洗浄組成物
液状非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート）  ２．０‐１０．０％
アルカリ金属ケイ酸塩  ３．０‐１５．０％
アルカリ金属リン酸塩  ２０．０‐４０．０％
高グリコール（ｈｉｇｈｅｒ  ｇｌｙｃｏｌｓ）、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから選択される液状担体  ２５．０‐４５．０％
安定剤  (例、リン酸エステルの一部及びＣ１６−Ｃ１８アルカノール)    ０．５‐７．０％
泡抑制剤(例、シリコーン)  ０‐１．５％
酵素０．０００１‐０．１％
【０２５１】
８）非水溶性液状食器洗浄組成物
液状非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート）  ２．０‐１０．０％
ケイ酸ナトリウム  ３．０‐１５．０％
アルカリ金属炭酸塩  ７．０‐２０．０％
クエン酸ナトリウム０．０‐１．５％
安定化システム(例、微粉化シリコーン及び低分子量ジアルキルポリグリコールエーテルの混合)  ０．５‐７．０％
低分子量ポリアクリレートポリマー  ５．０‐１５．０％
クレイゲル増粘剤（ｃｌａｙ  ｇｅｌ  ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）(例、ベントナイト)  ０．０‐１０．０％
ヒドロキシプロピルセルロースポリマー（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ）  ０．０‐０．６％
酵素  ０．０００１‐０．１％
高グリコール（ｈｉｇｈｅｒ  ｇｌｙｃｏｌｓ）、ポリグリコール、ポリオキシド、及びグリコールエーテルから選択される液状担体  適量
【０２５２】
９）チキソトロピック液状自動食器洗浄組成物
Ｃ１２−Ｃ１４脂肪酸  ０−０．５％
ブロックコポリマー界面活性剤  １．５−１５．０％
クエン酸ナトリウム  ０‐１２％
トリポリリン酸ナトリウム  ０−１５％
炭酸ナトリウム  ０−８％
トリステアレートアルミニウム  ０−０．１％
クメンスルホン酸ナトリウム  ０−１．７％
ポリアクリレート増粘剤  １．３２−２．５％
ポリアクリル酸ナトリウム  ２．４−６．０％
ホウ酸  ０−４．０％
蟻酸ナトリウム  ０−０．４５％
蟻酸カルシウム  ０−０．２％
ｎ−デシルジフェニルオキシドジスルホン酸ナトリウム  ０−４．０％
モノエタノールアミン（ＭＥＡ）  ０−１．８６％
水酸化ナトリウム（５０％）  １．９−９．３％
１，２−プロパンジオール  ０−９．４％
酵素  ０．０００１‐０．１％
泥抑制剤、染料、香料、水  適量
【０２５３】
１０）液状自動食器洗浄組成物
アルコールエトキシレート  ０‐２０％
脂肪酸エステルスルホン酸塩  ０‐３０％
ドデシル硫酸ナトリウム  ０‐２０％
アルキル  ポリグリコシド  ０‐２１％
オレイン酸  ０‐１０％
２ケイ酸ナトリウム１水和物  １８‐３３％
クエン酸ナトリウム２水和物  １８‐３３％
ステアリン酸ナトリウム  ０‐２．５％
過ホウ酸ナトリウム１水和物  ０‐１３％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）  ０‐８％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ４‐８％
酵素  ０．０００１‐０．１％
水  適量
【０２５４】
１１）被保護漂白粒子を含む液状自動食器洗浄組成物
ケイ酸ナトリウム  ５‐１０％
ピロリン酸４カリウム  １５‐２５％
３リン酸ナトリウム  ０‐２％
炭酸カリウム  ４‐８％
被保護漂白粒子、例、塩素  ５‐１０％
重合増粘剤  ０．７‐１．５％
水酸化カリウム  ０‐２％
酵素  ０．０００１‐０．１％
水  適量
【０２５５】
１２）過ホウ酸が過炭酸塩によって置き換えられる１）、２）、３）、４）、６）及び１０）に記載の自動食器洗浄組成物。
【０２５６】
１３）さらにマンガン触媒を含む１）‐６）に記載の自動食器洗浄組成物。例えば、該マンガン触媒は、Ｈａｇｅ ｅｔ ａｌ.、Ｎａｔｕｒｅ ３６９: ６３７−６３９ （１９９４）に記載の化合物の一つである。
【０２５７】
５．方法
５．１  フィルタースクリーニング試験
下記に説明する試験を親アルファ‐アミラーゼ酵素に比してＣａ２＋減少条件下及び／又は高い又は低いｐＨにて改変される安定性を有する本発明のアルファ‐アミラーゼのスクリーニング中に用いてよい。
【０２５８】
５．２  高いｐＨフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃にて１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＴＹ寒天プレート上にセルロースアセテート(ＯＥ  ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ)とニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ  ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロースアセテート膜はＴＹ寒天プレートに置かれる。
【０２５９】
フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように各フィルターサンドイッチは、インキュベーション前であって、固定後、具体的に針で印を入れ、変異体を結合しているニトロセルロースフィルターをｐＨ８．６−１０．６のグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液を有する容器へ移し、１５分間室温（１０‐６０℃変化できる）でインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性をｐＨ８．６−１０．６のグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液中１％寒天、０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、室温にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレート上で同定する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。
【０２６０】
５．３  低いカルシウムフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃で例えば、カナマイシン又はネオマイシンのような関連抗生物質含有ＴＹ寒天プレート上のセルロースアセテート(ＯＥ  ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ)及びニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ  ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロース‐アセテート膜をＴＹ寒天プレートに置く。
【０２６１】
フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように各フィルターサンドイッチは、インキュベーション前であって、固定後、具体的に針で印を入れ、及び変異体を結合しているニトロセルロースフィルターをｐＨ８．５−１０の炭酸／重炭酸緩衝液及び異なるＥＤＴＡ濃度（０．００１ｍＭ‐１００ｍＭ）を有する容器へ移す。フィルターを１時間室温にてインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性をｐＨ８．５−１０の炭酸／重炭酸緩衝液中１％寒天、０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、室温にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレート上で同定する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。
【０２６２】
５．４  低いｐＨフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃で、１０μｇ／ｍｌネオマイシン含有ＴＹ寒天プレート上のセルロースアセテート  (ＯＥ  ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ)及びニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ  ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロースアセテート膜をＴＹ寒天プレートに置く。
【０２６３】
フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように固定後しかしインキュベーション前に各フィルターサンドイッチは具体的に針で印を入れ、変異体を結合しているニトロセルロースフィルターをｐＨ４．５のクエン酸を有する容器へ移し、フィルターを２０分間８０℃（野生型骨格中変異体をスクリーニングする場合）又は、６０分間８５℃（親型アルファ‐アミラーゼ変異体をスクリーニングする場合）でインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性をｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中１％寒天、０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、５０℃にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレートで同定する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。
【０２６４】
５．５  第二次スクリーニング
再スクリーニング後、陽性形質転換体を保管プレートから拾い、第二次プレート試験を実施する。陽性形質転換体を５ｍｌのＬＢ＋ネオマイシン中３７℃にて２２時間培養する。各陽性形質転換体のバシルス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物及びコントロールとして対応する骨格を発現するクローンを９０℃にてクエン酸緩衝液ｐＨ４．５中インキュベーションし、サンプルを０、１０、２０、３０、４０、６０、及び８０分にて採取する。３μＬのサンプルを試験用プレートに付ける。試験用プレートを１０％ルゴール液で染色する。改善変異体がバックボーンより高い残留活性（試験用プレート上ハローとして検出される）を有する変異体として得らる。改善変異体はヌクレオチドスシーケンスによって決定される。
【０２６５】
５．６  未精製変異体の安定性試験
変異体の安定性を次のように試験できる。それは、分析すべき変異体を発現するバシルス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物を１０ｍｌのＬＢ＋ネオマイシン中３７℃にて２１時間で培養する。８００μＬ培養物を２００μＬのクエン酸緩衝液ｐＨ４．５で混合する。サンプリング時点の数に相当する７０μＬのアリコートをＰＣＲ試験管に入れ、種々の時間（一般的に５、１０、１５、２０、２５、及び３０分）７０℃又は９０℃にてインキュベーションする。０分サンプルは高い温度でインキュベーションしていない。サンプル中の活性を「アルファ‐アミラーゼ活性用試験」の下、下記に記載のように２０μＬを２００μＬのアルファ‐アミラーゼＰＮＰ−Ｇ７基質ＭＰＲ３  ((Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ番号１６６０７３０)に移すことにより測定する。結果を時間に対して活性率（０時点と比較して）としてグラフに表す、又は特定の時間のインキュベーション後の残留活性率として表す。
【０２６６】
５．７  アルファ‐アミラーゼ変異体の発酵及び精製
関連する発現プラスミドを保持しているバシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を次のように発酵及び精製してよい。菌株を−８０℃にて保管される１０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ寒天プレート上にストリークし、３７℃で一晩培養する。コロニーを５００ｍｌ振盪フラスコ中１０μｇ／ｍｌのネオマイシン含有１００ｍｌのＰＳ−１培地に移す。
ＰＳ−１培地の組成
パールシュガー（Ｐｅａｒｌ  ｓｕｇａｒ）  １００ｇ／ｌ
大豆ミール（Ｓｏｙ  Ｂｅａｎ  Ｍｅａｌ）  ４０ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４，１２Ｈ２Ｏ                  １０ｇ／ｌ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ６１００      ０．１ｇ／ｌ
ＣａＣＯ３                                  ５ｇ／ｌ。
【０２６７】
培養物を５日間２７０ｒｐｍで３７℃にて振盪培養する。細胞及び細胞かすを２０から２５分間４５００ｒｐｍで遠心分離することにより培養培地から除く。後で、完全に透明な溶液を得るために上清をろ過する。ろ過物を濃縮しＵＦ−フィルター（１０，０００ＭＷカットオフ膜）上で洗浄し、緩衝液を２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．５に変える。ＵＦ−ろ過物をＳ−セファロースＦ．Ｆ．に注入し同じ緩衝液で０．２ＭＮａＣｌを用いる溶出ステップにて溶出を行う。溶出物を１０ｍＭトリスｐＨ９．０にて透析し、Ｑ−セファロースＦ．Ｆ．に注入し６カラム体積以上、０から０．３ＭＮａＣｌの直線勾配で溶出する。活性（ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）試験により測定）を含む分画を集め、ｐＨをｐＨ７．５に調整し、着色を５分間、０．５％Ｗ／ｖｏｌの活性炭素で処理することにより除く。
【０２６８】
５．８  特異的活性の検出
特異的活性を活性／ｍｇ酵素（ａｃｔｉｖｉｔｙ／ｍｇ  ｅｎｚｙｍｅ）としてファデバス（商標）（ＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標））試験(ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ)）を用いて検出する。取扱説明書は次に示す（また下記「アルファ‐アミラーゼ活性試験」を参照願いたい）。
【０２６９】
５．９  等電点の検出
ｐＩを等電点電気泳動法  (例：Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ，ｐＨ  ３．５−９．３)にて検出する。
【０２７０】
５．１０  促進される安定性試験
５０ｍｌのプロピレン試験管に、１０ｍｌの対象となる洗剤を加えた。適切な希釈を行い、各１８０ｐｐｍのアルファ‐アミラーゼをピペットで洗剤を含む別々の試験管に移し測定した。各アルファ‐アミラーゼを含む洗剤を３０秒間ボルテックスし、それから１０分間ＲｏｔａＭｉｘ（ＡＴＲ  ＲＫＶＳ  Ｍｏｄｅｌ）に固定した。変異体酵素を有する１００マイクロリットルの洗剤をピペットで測定し、１：６５１に希釈した。変異体の初期の活性をブロック化Ｐ‐ニトロ‐フェニル‐マルトヘプタオース（Ｂｌｏｃｋｅｄ  Ｐ−Ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅｎｙｌ−Ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）(Ｂｌｏｃｋｅｄ  ＰＢＮＰＧ７)基質を用いてＫｏｎｅｌａｂ，Ｍｏｄｅｌ  ２０ＸＴにて試験をした。洗剤サンプルをそれから３７℃にセットした一定温度のインキュベーターでインキュベーションした。サンプルを１、２、４、７、及び１７日で採取し、酵素活性を測定した。
【０２７１】
５．１１  アルファ‐アミラーゼ活性試験
５．１１．１  ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）試験
アルファ‐アミラーゼ活性をファデバス（商標）（ＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標））錠剤を基質として用いる方法によって検出する。ファデバス錠剤（ファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））アミラーゼ試験、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃより供給）は、架橋された不溶性青色デンプンポリマーを含み、このポリマーは、ウシ血清アルブミン及び緩衝基質と混合され、錠剤化される。
【０２７２】
一つの測定ごとに、ひとつの錠剤を５ｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液（５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭリン酸、５０ｍＭホウ酸、０．１ｍＭＣａＣl２，ｐＨをＮａＯＨを用いて対象となる値に調整）を含む試験管に懸濁する。試験を対象となる温度にて水浴中で行う。試験すべきアルファ‐アミラーゼをｘｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液で希釈する。１ｍｌのこのアルファ‐アミラーゼ溶液を５ｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液に加える。デンプンは可溶性青色フラグメントを与えるアルファ‐アミラーゼによって加水分解される。得られる青色溶液の吸光度を６２０ｎｍで分光光度的に測定し、アルファ‐アミラーゼ活性の関数である。
【０２７３】
１０分又は１５分（試験時間）のインキュベーション後、測定された６２０ｎｍ吸光度は６２０ｎｍで０．２から２．０単位の範囲であることが重要である。この吸収範囲において活性と吸光度（ランベルトベールの法則）の間に直線性がある。それゆえ、酵素の希釈はこの基準に適合するように調整すべきである。具体的な設定条件（温度、ｐＨ、反応時間、緩衝液の条件）下では、１ｍｇの所与のアルファ‐アミラーゼは特定量の基質を加水分解し、青色を生じる。色の強さを６２０ｎｍで測定する。測定吸光度は、与えられる設定条件下、該当アルファ‐アミラーゼの特異的活性（純粋アルファ‐アミラーゼタンパク質のａｃｔｉｖｉｔｙ／ｍｇ）に正比例する。
【０２７４】
５．１１．２  代替方法
アルファ‐アミラーゼ活性をｐ−ニトロフェニル‐アルファ‐Ｄ‐マルトヘプタオシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ‐ａｌｐｈａ‐Ｄ‐ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ）（ＰＮＰ‐Ｇ７）基質を用いる方法で検出する。ＰＮＰ‐Ｇ７は、エンドアミラーゼにより切断できるブロック化オリゴサッカライドである。切断に続き、黄色を有する遊離ＰＮＰ分子を放出するためにキット中のアルファグルコシダーゼが基質を消化し、即ち、λ＝４０５ｎｍ（４００‐４２０ｎｍ）での可視分光光度法により測定する。ＰＮＰ‐Ｇ７基質及びアルファ‐グルコシダーゼを含むキットはベーリンガー‐マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）(カタログ番号１０５４６３５)にて作られる。
【０２７５】
試薬液を調整するために１０ｍｌの基質／緩衝液を製造業者によって推奨される５０ｍｌの酵素／緩衝液に追加する。２０μＬのサンプルを９６穴マイクロプレートに移し、２５℃でインキュベーションすることにより試験を実施する。２５℃に前もって平衡化した２００μＬの試薬液を加える。溶液を混合し、一分間プレインキュベーションし、吸収をＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ４０５ｎｍにて４分以上３０秒ごとに測定する。
【０２７６】
吸収曲線に依存する時間の勾配は与えられる設定条件下問題とするアルファ‐アミラーゼの活性に正比例する。
【０２７７】
５．１２  洗剤組成物中の酵素性能の検出
５．１２．１  ＵＳ洗濯条件
Ｔｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒ（ユーナイテッド・ステーツ・テスティング（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ.Ｊ.）をＵＳ洗浄条件下洗浄試験をシミュレートするために用いた。検量効率曲線（ｄｏｓｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃｕｒｖｅ）（ＤＥＣ）を蛍光増白剤を含まないＬｉｑｕｉｄ  ＡＡＴＣＣ  ２００３及び／又は粉ＡＡＴＣＣ  １９９３  (Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｓｔｓ)のような標準的な洗剤を用いて２０℃で実施した。比較アルファ‐アミラーゼの相当するＤＥＣを本発明の変異体酵素の汚れ除去性能を比較するために実施した。このプロセスを４０℃で繰り返した。一般的に、ＣＳ‐２８コメデンプン汚れ(オランダのＣＦＴ)の４つの布見本を１リットルのＤＩ水及び１．５ｇの液体ＡＡＴＣＣで満たしたＴｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒのスチール製容器へ移した。粉体ＡＡＴＣＣを用いる場合、１．５ｇの洗剤粉を化学天秤（Ｍｏｄｅｌ  ＰＭ４８００、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｉｇｈｓｔｏｗｎ、ＮＪ．  ０８５２０）で重量測定後、Ｔｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒへ加えた。二回の再現テストを同時に行った。他に述べていない限り、試験を１２分間で行い、３分間すすいだ。洗浄後、布見本を空気乾燥し試験布見本の反射率をコニカミノルタ製Ｃｈｒｏｍａ  Ｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＣＲ‐４１０で測定した。集めたデータを適切な統計分析で処理した。
【０２７８】
５．１２．２  欧州洗濯条件
（Ａｔｌａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇｅｏｒｇｉａ）Ｌａｕｎｄｅｒ‐Ｏ‐ｍｅｔｅｒの使用を欧州洗浄条件下洗浄をシミュレートするために用いた。対象となる変異体酵素の検量効率曲線（ｄｏｓｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃｕｒｖｅ）（ＤＥＣ）を標準欧州試験洗剤、ＩＥＣ  Ａ及び漂白（ＴＡＥＤ‐テトラ‐アセチル‐エチレン‐ヂアミンアセテート）及び過ホウ酸ナトリウムを有するＩＥＣ  Ａ洗剤を用いて４０℃で実施した。比較変異体酵素の対応するＤＥＣ曲線を本発明の変異体酵素汚れ除去性能と比較するために実施した。必要に応じて、このプロセスをより高い洗浄温度で繰り返した。一般的に、ＥＭＰＡ  １６１の４つの布見本であるトウモロコシデンプン（ＥＭＰＡ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を６．８ｇ／ＬのＩＥＣ  Ａ洗剤又は８．０ｇ／Ｌの漂白洗剤を有するＩＥＣ  Ａを有する２５０ｍｌのＤＩ水をスチール製容器へ移した。二回の再現テストを同時に実施した。他に述べていない限り、試験を４５分間で行い、５分間すすいだ。洗浄後、布見本を空気乾燥し試験布見本の反射率をＣｈｒｏｍａ  Ｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＣＲ‐４１０で測定した。集めたデータを適切な統計分析で処理した。
【０２７９】
５．１２．３  洗剤組成物を評価する微小布見本方法
多くのアルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼ洗浄試験が当分野において知られている。典型的な洗浄試験は「布見本（ｓｗａｔｃｈ）」を含み、それは、布地に塗布し得る汚れを有する布地のような材料の一片をいう。例えば、材料を綿、ポリエステル又は天然と合成繊維の混合から作製してよい。さらに、該見本は、フィルター紙又はニトロセルロースのような紙、又はセラミック、金属、又はグラスのような固い材料でもよい。アミラーゼにとって、汚れはデンプンベースであり、血液、牛乳、インク、草、紅茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、泥、染料、油又はこれらの化合物の混合物を含むが、これらに限定されない。
【０２８０】
いくつかの試験は、大きな布見本の小さな部分を使用してよく、それは、一穴式の穴開け器でカットされた見本片であり、又はカスタムメードの９６穴用穴開け器であって、多数の穴の穴開け器のパターンが標準９６穴マイクロタイタープレートに対応するようになっている穴開け器でカットされた見本片、又は別な方法で布見本から切り出された部分である。見本は繊維、紙、金属、又は他の適切な材料である。小さな布見本は、その見本が、２４‐、４８‐、又は９６‐穴マイクロタイタープレートに置かれる前又は後のいずれか一方にて染みが付着される。小さな布見本は、また少量の材料に染みをとふして作成してもよい。例えば、小さな布見本は、汚れが付いた直径５／８″又は０．２５″の布地のものでよい。カスタムメードの穴開け器は９６穴プレートのすべての穴に同時に９６個の布見本が挿入されるように設計されている。装置は、単に同じ９６穴プレートに複数回挿入することにより、穴ごとに二以上の布見本が搬送されるように設けられる。複数穴用穴開け器は、任意の設定プレートに布見本の同時挿入をすることができるものであり、２４‐、４８‐、又は９６‐穴プレートを含むがこれらに限定されない。他の考えられる方法は、汚れ試験プラットフォームが金属、プラスティック、グラス、セラミック又は汚れ物質でコートされる他の適切な材料から作られるビーズであり、繊維以外材料での洗浄組成物試験に用いるために汚れ物質でコーティングされる。一以上のコートされるビーズは適切な緩衝液と酵素を含んだ９６‐、４８‐、又は２４‐穴プレート又はより大きい穴に挿入される。この場合、上清は直接吸光度の測定をすることにより、又は二次的な色の発色反応後のどちらかの方法で分離する汚れを測定する。また、分離する汚れの分析を質量スペクトル解析によって処理する。さらにマイクロスクリーニング試験は、例えばインディゴ染色デニムの布見本をマルチウェルプレートの穴に供給し、固定し、砂のような粒子又は例えば６から８、又は９ゲージの粒子を含むふるいで得たガーネットのようなより大きな粒子を加え、添加粒子によって布見本を摩耗させるようにプレートを攪拌する。この試験はストーンウォッシング適用におけるセルラーゼの評価に有用である。酵素の有効性を、反応液への色の放出（例えば、放出インディゴをジメチルスルホキシドに溶解し、Ａ６００ｎｍの吸収で測定する。）によって又は摩耗する布見本の反射率の測定により判断する。
【０２８１】
例えば、未処理のＢＭＩ（血液（ｂｌｏｏｄ）／牛乳（ｍｉｌｋ）／インク（ｉｎｋ））布見本を漂白剤のない洗剤で洗浄する場合、インクの大部分はプロテアーゼの助けなしでも除去される。プロテアーゼの添加によりインクの除去が少し増大する。これは大きなバックグラウンドにおいては定量化が困難である。本発明は、染みの固定度合いを制御する処理手順を提供する。結果として、例えば、試験されるべき酵素の不存在下で洗浄するとき、汚れの量を変えて放出することのできる布見本の作製が可能となる。固定化布見本の使用によって、洗浄試験における信号対雑音の比に劇的な改善が得られる。さらに、固定度合いの変化によって、種々の洗浄条件下、最適な結果が得られる染みの付着を与えることができる。
【０２８２】
種々のタイプの材料の周知の「強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」の汚れを有する布見本は商業的に入手可能であり（ＥＭＰＡ、Ｓｔ．  Ｇａｌｌｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；  ｗｆｋ−Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ、Ｋｒｅｆｅｌｄ  Ｇｅｒｍａｎｙ;又はＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び／又は、専門家（Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｔｏ、Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５２（４）：  ２８０  ２８６  （１９８２））によっても作成される。他の試験用布見本は、綿を含む繊維上の血液／牛乳／インク（ＢＭI）染み、綿を含む繊維上のホウレンソウの染み、綿を含む繊維上の草の染み、及び、綿を含む繊維上のチョコレート／牛乳／すすを含むがこれらに限定されない。
【０２８３】
ＢＭＩ染みは０．０００３％から０．３％の過酸化水素で綿に固定される。他の組み合わせは０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定される草又はホウレンソウ、ゼラチン及び０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるクーマシィーブリリアントブルー染色又は０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるチョコレート、牛乳やすすを含む。
【０２８４】
また、布見本を酵素及び／又は洗剤調合物でインキュベーションする間、攪拌する。洗浄性能データはウェル、特に９６穴プレートにおける布見本の方向（水平対垂直）に依存する。これは、インキュベーション期間に混合が不十分であったことを示すであろう。インキュベーション期間の十分な攪拌を確認する多くの方法があるけれども、アルミニウムの二つのプレートの間でマイクロタイタープレートを挟むプレートホルダーが設計された。これの設置の仕方は単純で、例えば、接着プレート用シールでウェルを覆い、二つのアルミニウムプレートを適切なタイプの商業的に入手可能なクランプで９６穴プレートに固定すれば足りる。それは商業的なインキュベーター振盪機に設置可能である。振盪機を約４００ｒｐｍで設定することによって非常に効率のよい攪拌が得られ、一方、漏れ又は交互の汚染がホルダーによって効果的に防止される。
【０２８５】
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）は洗浄液体中アミノ基の濃度を定量するために用いる。これは、布見本から除去されたタンパク質の量の測定に役立つ（例えば、Ｃａｙｏｔ  ａｎｄ  Ｔａｉｎｔｕｒｉｅｒ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４９：  １８４−２００  （１９９７）を参照願いたい）。しかしながら、洗剤又は酵素のサンプルが非常に小さいペプチド断片（例えば、サンプル中のペプチダーゼの存在から）を生じる場合、より大きなＴＮＢＳシグナル、即ち「ノイズ」が生じる。
【０２８６】
血液／牛乳／インク又は他の染みの洗浄性能を測定する他の手段は、インク放出に基づく。布見本上のタンパク質のタンパク質分解によって、洗浄液の吸光度を測定することにより定量されるインク粒子の放出が得られる。吸光度を３５０ｎｍと８００ｎｍの間の任意の波長で測定する。波長を４１０ｎｍ又は６２０ｎｍで測定する。また洗浄液体を用いて、草、ホウレンソウ、ゼラチン、又はクーマシィーブリリアントブルー染色を含む汚れにおける洗浄性能を決定するために試験を行う。これらの染みに対する典型的な波長は、ホウレンソウ又は草について６７０ｎｍ及びゼラチン又はクーマシィーについては６２０ｎｍを含む。例えば、洗浄液のアリコート（例えば、一般的に９６穴プレートから１００‐１５０μＬ）を除き、キュベット又はマルチウェルマイクロプレートに移す。その時これを分光光度計にセットし、吸光度を適切な波長にて測定する。
【０２８７】
また本発明のシステムを例えば衣服、プラスティック、又はセラミックのような適当な物質上に付着した血液／牛乳／インク染みに適用して食器洗浄用の強化酵素及び／又は洗剤組成物を判定するために用いることができる。
【０２８８】
ある実施態様においては、０．３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間２５℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定し、又は０．０３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間６０℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定する。約０．２５″の小さな布見本をＢＭＩ／綿見本から切り離し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移す。各ウェルに洗剤組成物及び変異タンパク質のような酵素の周知の混合を添加する。マイクロタイタープレートの上に粘着プレート用シールを固定した後、マイクロタイタープレートをアルミニウムプレートに挟み、約１０から６０分間、約２５０ｒｐｍでオービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）で攪拌する。この時間の最終時点で、上清は新しいマイクロタイタープレートのウェルに移され、６２０ｎｍでインクの吸光度を測定する。これは０．０１％グルタルアルデヒドをホウレンソウ／綿見本又は草／綿見本に３０分間２５℃で処理によるホウレンソウ又は草染み固定綿で同様に試験される。同様にチョコレート、牛乳、及び／又はすすの染みで行われる。さらに血液／牛乳／インク試験及び条件を米国特許第７，１２２，３３４  (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．)に記載する。
【０２８９】
５．１３  ＬＡＳ感受性の検出
変異体を４０℃にて１０分間、異なる濃度のＬＡＳ（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌ  ｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、Ｎａｎｓａ  １１６９/Ｐ）とインキュベーションする。残留活性をファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））試験方法又はＰＮＰ−Ｇ７基質を用いる代替方法を用いて測定する。ＬＡＳを０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５で希釈する。次の濃度を用いる。それは５００ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍを含むか、又はＬＡＳを含まない。
【０２９０】
変異体を全体積１０ｍｌ中０．０１‐５ｍｇ／ｌの濃度になるように異なるＬＡＳ緩衝液で希釈し、温度を制御する水浴にて１０分間インキュベーションする。インキュベーションを少量のアリコートを低温の試験緩衝液に移すことにより停止する。活性測定に影響しないために、活性測定の間ＬＡＳ濃度を１ｐｐｍ未満にすることは重要である。
【０２９１】
それから残留活性を上記ファデバス（商標）（ＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標））試験又は代替方法を用いて２回再現する。活性はブランクを除いた後測定する。ＬＡＳを含まない活性を１００％とする。
【０２９２】
本出願は読みやすいように多くのセクションで編成されている。しかしながら、読む者はあるセクションの記載が他のセクションへ適用してよいと理解できる。同様に、本発明を開示する各セクションに用いる見出しはその開示範囲を限定するものではない。
【０２９３】
さらに本発明の組成物及び方法及びその効果を説明するために、次に具体的な実施例を示す。これらの実施例は本発明の組成物及び方法を説明するために提供されるという理解をもって記載され、特許請求の範囲を限定するとして決して理解すべきでない。
【実施例】
【０２９４】
実験
本発明は、次の実施例に一層に詳細に記載され、実施例は、特許請求の範囲の記載の範囲を制限すると決して意図しない。
【０２９５】
次の略語が、開示の全体にわたって適用する：
ＡＥ（アルコールエトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ））；
ＡＥＯ（アルコールエトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ））；
ＡＥＯＳ（アルコールエトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ））；
ＡＥＳ（アルコールエトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ））；
ＡＦＡＵ（酸性菌類アルファ‐アミラーゼユニット（ａｃｉｄ  ｆｕｎｇａｌ  α−ａｍｙｌａｓｅ  ｕｎｉｔｓ））；
ＡＧＵ（グルコアミラーゼ活性ユニット（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｎｉｔ））；
ＡＯＳ（アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ））；
ＡＳ（アルコール硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｕｌｆａｔｅ））；
ＢＡＡ（バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ‐アミラーゼ）；
ＢＬＡ（バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はＬＡＴ）；
ＢＰＮＰＧ７（ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ)）；
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ））；
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ））；
ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ））：
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））；
ＤＰ３（３つのサブユニットを有する重合度（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｅｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ））；
ＤＰｎ（ｎサブユニットを有する重合度（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ））；
ＤＴＭＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ））
ＥＣ（酵素の分類のための酵素委員会(ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ)）；
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ））
ＥＯ（エチレンオキシド（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ））；
Ｆ＆ＨＣ（織物及び家庭用ケア（ｆａｂｒｉｃ  ＆  ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ  ｃａｒｅ））；
ＦＡＵ（菌アミラーゼユニット（ｆｕｎｇａｌ  ａｍｙｌａｓｅ  ｕｎｉｔ））；
ＧＡ（グルコアミラーゼ）；
ｇｐｇ（１ガロン当たりのグレイン（ｇｒａｉｎｓ  ｐｅｒ  ｇａｌｌｏｎ））；
ＨＦＣＳ（高フルクトーストウモロコシシロップ（ｈｉｇｈ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｃｏｒｎ  ｓｙｒｕｐ））；
ＨＦＳＳ（高フルクトースデンプンベースシロップ（ｈｉｇｈ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｓｔａｒｃｈ  ｂａｓｅｄ  ｓｙｒｕｐ））；
ＩＰＴＧ（イソプロピル  ベータ‐Ｄ‐１‐チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β‐Ｄ‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ））
ＬＡＳ（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ））；
ＬＯＭ（ラウンダー‐Ｏ‐メーター（Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒ））；
ＬＵ（リクイフオン単位（Ｌｉｑｕｉｐｈｏｎ  Ｕｎｉｔｓ））；
ＭＴＰ（マイクロタイタープレート(ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ)）；
ＭＷ（分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ））；
ＭＷＵ（修飾ウォールゲムート（Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ）単位）；
ＮＯＢＳ（ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩  （ｎｏｎａｎｏｙｌｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ））
ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ））；
ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ））；
ＰＥＧ  （ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ））
ＰＩ（性能指数）；
ＰＶＡ（ポリ（ビニル  アルコール）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）））
ＰＶＰ（ポリ（ビニルピロリドン）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ））
ＲＮＡ（リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））；
ＳＡＳ（第二級アルカンスルホン酸塩（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｌｋａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ））；
ＳＥＬ（サイト評価ライブラリー（ｓｉｔｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ））；
ＴＡＥＤ（テトラアセチルエチレンジアミン（ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ））
ＴＣＡ（トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ））；
ＴＳＢ（トリプティックソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ））；
ＵＦＣ（限外濾過濃縮物（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ））；
℃（摂氏(ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ)、；
Ｈ２Ｏ（水（ｗａｔｅｒ））；
ｄＨ２Ｏ又はＤＩ（脱イオン水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ））；
ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ,Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ)；
ＥＴＯＨ（エタノール(ｅｔｈａｎｏｌ)）
ｅｑ（当量(ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ)、
Ｎ（規定(Ｎｏｒｍａｌ)）
ＤＳ（（乾燥固体(ｄｒｙ  ｓｏｌｉｄｓ)））；
ｇ又はｇｍ（グラム（ｇｒａｍｓ））、
μg（マイクログラム(ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ)）、
ｍｇ（ミリグラム（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ））、
ｋｇ（キログラム（ｋｉｌｏｇｒａｍｓ））、
μＬ及びμｌ（マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ））、
ｍＬ及びｍｌ（ミリリットル(ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ)、
ｍｍ（ミリメートル（ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ））、
μｍ（マイクロメートル(ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ)）、
Ｍ（モル（ｍｏｌａｒ））、
ｍＭ（ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ））、
μＭ（マイクロモル(ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ)）、
Ｕ（単位(ｕｎｉｔｓ)）、
ｓｅｃ（秒(ｓｅｃｏｎｄｓ)）、
ｍｉｎ（ｓ）（分(ｍｉｎｕｔｅ／ｍｉｎｕｔｅｓ)）、
ｈｒ（ｓ）（時間(ｈｏｕｒ／ｈｏｕｒｓ)）、
ＤＯ（溶解酸素(ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ)）、
ＷＴ％（重量パーセント(ｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒｃｅｎｔ)）
W／V（重量／体積(ｗｅｉｇｈｔ  ｔｏ  ｖｏｌｕｍｅ)）、
Ｗ／Ｗ（重量／重量(ｗｅｉｇｈｔ  ｔｏ  ｗｅｉｇｈｔ)）、
Ｖ／Ｖ（体積／体積(ｖｏｌｕｍｅ  ｔｏ  ｖｏｌｕｍｅ)）、
ＧＥＮＥＡＲＴ（ＧＥＮＥＡＲＴ  有限会社、レーゲンスブルク、ドイツ（ＧＥＮＥＡＲＴ  ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ））；
Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ダニスコ  ユーエス社、ジェネンコディビジョン、パロアルト、カリフォルニア（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ））。
【０２９６】
実施例１
アッセイ
次の実施例においては、読みやすくするために、下記に述べられるような、様々なアッセイを用いた。下記に示されるプロトコールと異なる事項はその都度それを示す。これらの実験では、反応の完成の後に形成された生成物の吸収度を測定するために分光光度計を用いた。
【０２９７】
Ａ．タンパク質含有量アッセイ
このアッセイは、３００ｒｐｍ及び８０％の湿度で振盪しながら３７℃にて３日間培養したマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）からのろ過された培養液上清を用いて行った。ウェルごとに５０μｌの上清を含む新しい９６−穴平底ＭＴＰを高速液体クロマトグラフィー方法によってタンパク質アッセイに使用した。上澄みを５％のアセトニトリル及び１０％の塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２５へ３倍希釈し、各希釈サンプルの１０μｌを分析した。Ｓｗｉｆｔ（商標）ＲＰ−ａｌｌ  ＰＮ  ６８−１０３０−０４１（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ、Ｉｎｃ．）カラムを装備したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰＬＣを使用した。溶剤系は、水相中の０．１％トリフルオロ酢酸及びアセトニトリル中の０．０７％のトリフルオロ酢酸から成った。吸収度を２２２ｎｍで読み、サンプルのタンパク質濃度を精製されたＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）タンパク質の標準曲線に基づいて決定した。
【０２９８】
Ｂ．セラルファ（Ｃｅｒａｌｐｈａ）アミラーゼアッセイ
このアルファ‐アミラーゼアッセイの原理は、熱安定性アルファ‐グルコシダーゼの過剰レベル存在下で規定のオリゴサッカロイド（ＢＰＮＰＧ７）のグルコース及び遊離したｐ−ニトロフェノールの加水分解に基づく。４００ｎｍにて吸収度を測定し、これは、分析されたサンプル中の活性のあるアミラーゼのレベルに直接関係する。
【０２９９】
使用される装置は、バイオメックＦＸロボット（Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｒｏｂｏｔ）（ベックマンクルター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））、スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）ＭＴＰリーダー（タイプ３４０−モレキュラー  デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））及びｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（サーモ／ラボシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ））であった。このアッセイ系では、使用される試薬と溶液は次の通りだった。
１）ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ）（ＢＰＮＰＧ７）基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  ＨＲキット）；
２）５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ（商標）８０緩衝液、ｐＨ７．１５；及び
３）２００ｍＭホウ酸／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．２（ストップ緩衝液）。
【０３００】
５４．５ｍｇのＢＰＮＰＧ７基質を含むバイアルを１０ｍｌのミリＱ水に溶解した。アミラーゼサンプル（発酵上澄み）をＭＯＰＳ緩衝液の中で希釈した。アッセイをＭＴＰのウェルの中への希釈したアミラーゼ溶液の２５μｌを加え、引き続き２５μｌの５．４５ｍｇ／ｍｌのＢＰＮＰＧ７基質溶液の添加により行った。溶液を混合し、マイクロタイタープレートをプレートシールで密閉し、２５℃及び９００ｒｐｍで、３０分間インキュベーター／シェーカー（ｉＥＭＳ−Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）に置いた。反応を５０μｌのストップ緩衝液を添加することにより終了し、吸収度を波長４００ｎｍにてＭＴＰリーダーで測定した。酵素を含有しないコントロールをバックグラウンド吸光度値について修正するために使用した。
【０３０１】
Ｃ．ＣＳ−２８  コメデンプン微小布見本（Ｍｉｃｒｏｓｗａｔｃｈ）アッセイ
このアルファ‐アミラーゼアッセイの原理は、微小布見本に組み入れられたコメデンプンの加水分解によりオレンジ‐染料の遊離に基づく。４８８ｎｍにて吸収度を測定し、これは所望の条件（ｐＨ、温度及び緩衝液）で分析されたサンプル中のアミラーゼ活性のレベルに関係する。
【０３０２】
使用される装置は、バイオメックＦＸロボット（Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｒｏｂｏｔ）（ベックマンクルター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））、スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）ＭＴＰリーダー（タイプ３４０−モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））及びｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（サーモ／ラボシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ））だった。このアッセイ系では、使用される試薬と溶液は次のとおりだった：
１）ＣＳ−２８微小布見本；（コメデンプン、有色）
２）２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ８０緩衝液、ｐＨ８．０；
３）２５ｍＭ  ＣＡＰＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ８０緩衝液、ｐＨ１０．０；及び
４）１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ８０（希釈緩衝液）。
【０３０３】
１／４″の円形の直径のＣＳ−２８微小布見本を試験材料用のセンターから（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ）（ＣＦＴ、ヴラールディンゲン、オランダ）得た。総表面エリアを露出するために、二つの微小布見本を９６−穴マイクロタイタープレートの各々ウェルに垂直に置いた（例えば、ウェルの底が平底ではない）。アミラーゼサンプル（発酵上澄み）をあらかじめ１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０溶液の中で希釈した、いくつかの条件の適正濃度でテストした。：
１）ｐＨ８（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液）及び１６℃；アッセイでの最終アミラーゼ濃度＜０．０２５μｇ／ｍｌ；
２）ｐＨ８（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液）及び３２℃；アッセイでの最終アミラーゼ濃度＜０．０１２μｇ／ｍｌ；
３）ｐＨ１０（２５ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液）及び３２℃；アッセイでの最終アミラーゼ濃度＜０．０２５μｇ／ｍｌ；及び
４）ｐＨ１０（２５ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液）及び５０℃；アッセイでの最終アミラーゼ濃度＜０．０１２μｇ／ｍｌ。
【０３０４】
インキュベーター／シェーカーを所望の温度、１６℃（冷蔵貯蔵室又は冷凍庫）、３２℃又は５０℃でセットした。微小布見本を９６−穴ＭＴＰのウェルに入れた。培養液上清サンプルを１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０中、所望の最終濃度２０Ｘに希釈した。ＨＥＰＥＳ又はＣＡＰＳ緩衝液いずれかの１９０μｌを微小布見本‐ＭＴＰの各ウェルに加え、続いて、酵素溶液の１０μｌを各ウェルに加え、全体積を２００μｌ／ウェルとした。ＭＴＰをプレートシールで密閉し、インキュベーター／シェーカーに置き、所望の温度（１６°、３２°又は５０℃）にて１１５０ｒｐｍで６０分間インキュベーションした。適切な条件の下でのインキュベーションに続いて、各ウェルから１００μｌ溶液を新しいＭＴＰに移し、４８８ｎｍの吸収度にてＭＴＰ分光光度計を使用して測定した。２つの微小布見本及び緩衝液を含み、しかし酵素を含まないコントロールをバックグラウンド除去法のために含んだ。
【０３０５】
得られた吸光度は、ブランク値（酵素がない状態での微小布見本のインキュベーションの後に得られた）で修正し、その結果得られた吸光度は加水分解の活性の尺度である。各サンプル（変異体）については、性能指数（ＰＩ）を計算した。性能指数は、同じタンパク濃度で変異体（実際の値）及び比較酵素（理論値）の性能を比較する。理論値は、比較酵素のラングミュア式のパラメーターを使用して計算することができる。１より大きい（ＰＩ＞１）であるＰＩはよりよい変異体（比較又は標準酵素［例えば、野生型］に比較して）を同定する一方、１（ＰＩ＝１）のＰＩは、標準と同じ性能を有する変異体を同定し、１未満（ＰＩ＜１）であるＰＩは、標準より悪い性能を有する変異体を同定する。したがって、ＰＩは、ある状況の下の使用においてはそれほど望ましくない変異体も望ましい変異体も同定する。
【０３０６】
Ｄ．熱安定性アッセイ‐初期及び残存活性の決定
比較アミラーゼに比べてアミラーゼ変異体の耐熱性をＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．１５中で規定された条件下でアミラーゼサンプルをインキュベートすることにより検出した。初期の比較アミラーゼ活性のおよそ７０％が失われるように、インキュベーションの温度を選択した。初期かつ残存のアミラーゼ活性をセラルファ（Ｃｅｒａｌｐｈａ）方法を使用して決定した。
【０３０７】
使用される装置は、バイオメックＦＸロボット（Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｒｏｂｏｔ）（ベックマンクルター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））、スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）ＭＴＰリーダー（タイプ３４０−モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））及びｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（サーモ／ラボシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ））であった。このアッセイ系では、使用される試薬溶液は次の通りだった：
１）ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ）（ＢＰＮＰＧ７）基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  ＨＲキット）；
２）１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０緩衝液（希釈緩衝液）；
３）５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０緩衝液、ｐＨ７．１５；
４）２００ｍＭホウ酸／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．２（ストップ緩衝液）；及び
５）５０−１５０μｇ／ｍｌタンパク質を含むアミラーゼ培養液上清。
【０３０８】
「マスター希釈」プレートを１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０緩衝液中、培養液上清を希釈し（２０Ｘ）、続けてＭＯＰＳ緩衝液中４２Ｘ希釈ステップを行うことにより調製した。マスター希釈から２５μｌを初期アミラーゼ活性を決定するために使用し、１００μｌを加熱インキュベーションに使用した。１００μｌサンプルをアルミテープで密閉したＭＴＰ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５．１０１）に入れ、ｉＥＭＳインキュベーターの中で９００ｒｐｍにて撹拌しながら６０分間６５．５℃でインキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＰを氷水上で冷却し、残存アミラーゼ活性を決定した。初期（ｔ００）及び残存（ｔ６０）活性を決定するために、２５μｌサンプルを１ウェルに２５μｌのＢＰＮＰＧ７溶液を含む新しいＭＴＰへ移し、３０分間２５℃でインキュベートした。セクションＢにおいて上記に記載したように、セラルファアミラーゼアッセイを行った。
【０３０９】
残存及び初期のアミラーゼ活性の比を次のように熱安定性を計算するために使用した：熱安定性＝［ｔ−６０値］／［ｔ−００値］。各変異体については、変異体の熱安定性を比較（標準）酵素と比較する性能指数も計算した。１より大きい（ＰＩ＞１）である性能指数（ＰＩ）はよい変異体（比較又は標準に対する［例えば、野生型、又は骨格］）を同定する。その一方で１（ＰＩ＝１）のＰＩは、標準と同じ安定性を有する変異体を同定し、１未満（ＰＩ＜１）であるＰＩが、標準より安定していない変異体を同定する。したがって、ＰＩは、ある状況の下の使用においてはそれほど安定していない変異体も安定した変異体も同定する。
【０３１０】
Ｅ．熱安定性アッセイ‐Ｔ５０値の決定
上記セクションＤに述べられる熱安定性アッセイは、所定の条件下で活性を失う変異体をランクづけのみできる。所定の条件で１００％安定している変異体を互いに識別することができない。したがって、Ｔ５０値（初期活性の５０％が失われるインキュベーション温度）の決定は、著しく増加した熱安定性を有する変異体をランク付けするのに適切なアッセイである。
【０３１１】
使用される装置は、バイオメックＦＸロボット（ベックマン  クルター）、スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）ＭＴＰリーダー（タイプ３４０−モレキュラー・デバイス）及びエッペンドルフ  マスターサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）であった。アミラーゼ変異体を含む培養液上清はＭＯＰＳ緩衝液中に１０００Ｘ希釈し、初期のアミラーゼ活性を上記セクションＢに記載のセラルファアミラーゼアッセイを使用して決定した。希釈したアミラーゼサンプルを使用して、ＰＣＲプレートは１００μｌ／ウェルを含むように調製した。プレートを６０℃‐８０℃（シングルサイト変異体）又は６０℃‐１００℃（組み合わせの変異体）にわたる温度勾配でエッペンドルフ  マスターサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）の上で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、ＭＴＰを４℃へ冷却した後、残存アミラーゼ活性を測定した。
【０３１２】
残存及び初期のアミラーゼ活性の比率をインキュベーション温度に対して表示し、データを次の方程式を使用して適応した：
ｙ＝ａ０＋ａ１／（１＋（ｘ／ａ２）ａ３）
続いて、各アミラーゼ変異体についてＴ５０値を計算した（例えば、残存活性が５０％である温度）。したがって、Ｔ５０値は変異体の熱安定性に関する尺度であり、比較アミラーゼ及び互いに関して変異体を評価することができる。
【０３１３】
Ｆ．１０％洗剤安定性アッセイ
比較アミラーゼ及びその変異体の安定性は、規定条件下で１０％洗剤（業務用洗剤；熱不活性化）存在下インキュベーション後に測定し、初期の及び残余のアミラーゼ活性は、セラルファアミラーゼアッセイを使用して決定した。
【０３１４】
使用される装置は、バイオメックＦＸロボット（ベックマン  クルター）、スペクトロマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）ＭＴＰリーダー（タイプ３４０−モレキュラー  デバイス）及びｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（サーモ／ラボシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ））であった。
このアッセイ系では、使用される試薬溶液は次の通りだった：
１）ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ）（ＢＰＮＰＧ７）基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  ＨＲキット）：
２）液体洗剤（ＨＤＬ商品、酵素−不活性化、９５℃にて２時間）；
３）１０．５％の洗剤を含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０
４）５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ（商標）８０緩衝液、ｐＨ７．１５；
５）２００ｍＭホウ酸／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．２（ストップ緩衝液）；及び
６）５０−１５０μｇ／ｍｌタンパク質を含むアミラーゼ培養液上清。
【０３１５】
手短かに言えば、１０．５％洗剤溶液の９５μｌをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移し、培養液上清の５μｌと混合した。３μｌアリコートを初期アミラーゼ活性の測定のために除いた。ＭＴＰは、９００ｒｐｍの攪拌で３０分間４０°（又はより高い安定性を有するＢＡＳＥの組み合わせの変異体の場合の５０℃）にてｉＥＭＳインキュベーターの中でインキュベートした。インキュベーション後、残存アミラーゼ活性を洗剤‐酵素混合物の３μｌを使用して測定した。初期（ｔ０）及び残存（ｔ３０）アミラーゼ活性：３μｌ「洗剤‐酵素」混合物を１２２μｌのＭＯＰＳ緩衝液に希釈し、続いて２５μｌを上記に記載されたセラルファアミラーゼアッセイを使用して、アミラーゼ活性を決定するために使用した。
【０３１６】
残存及び初期のアミラーゼ活性の比率を次のように「１０％洗剤」安定性を計算するために使用した：
安定性＝［ｔ３０値］／［ｔ０値］。
各変異体については、性能指数も計算した。性能指数は、アミラーゼ変異体の１０％洗剤安定性を比較アミラーゼに対して比較する。１より大きい（ＰＩ＞１）である性能指数（ＰＩ）はより安定した変異体（比較又は標準［例えば、野生型］に対する）を同定する。その一方で１（ＰＩ＝１）のＰＩは、標準と同じ程度安定している変異体を同定し、１未満（ＰＩ＜１）であるＰＩは、標準ほど安定していない変異体を同定する。したがって、ＰＩは、ある状況の下での使用にはそれほど安定していない変異体も勝利者も同定する。
【０３１７】
Ｇ．１００％洗剤安定性アッセイ‐温度勾配カーブ
ＢＡＳＥ‐骨格及びＢＡＳＥ‐変異体のＨＤＬ洗剤安定性は、１００％洗剤（業務用洗剤、酵素不活性化された）存在下で、規定条件下にてインキュベーション後に、測定し、初期及び残存アミラーゼ活性は、セラルファアミラーゼアッセイを使用して決定した。
【０３１８】
使用される装置は、バイオメックＦＸロボット（ベックマン  クルター）、スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）ＭＴＰリーダー（タイプ３４０−モレキュラー・デバイス）、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）ＰＣＲマスターサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）及びｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（サーモ／ラボシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ））であった。このアッセイ系では、使用される試薬溶液は次の通りだった：
１）ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ）（ＢＰＮＰＧ７）基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  ＨＲキット）：
２）液体洗剤（ＨＤＬ商品−２時間９５℃で加熱より不活性化された）；
３）５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０緩衝液、ｐＨ７．１５；
４）２００ｍＭホウ酸／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．２（ストップ緩衝液）；及び
５）５０−１５０μｇ／ｍｌタンパク質を含むアミラーゼ培養液上清。
【０３１９】
アミラーゼ培養液上清をＨＤＬ洗剤に２０Ｘで希釈し、完全に混合した。初期のアミラーゼ活性をセクションＢにおいて上記に記載されたセラルファアミラーゼアッセイを使用して決定した。希釈したアミラーゼ‐ＨＤＬサンプルを使用して、ＰＣＲプレートを１００μｌ／ウェルを含んで調製した。プレートを３０℃‐７０℃にわたる温度勾配でエッペンドルフ  マスターサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＰを４℃へ冷却した後、上記に記載されるように残存アミラーゼ活性を測定した。
【０３２０】
ＨＤＬ  Ｔ５０値を計算するために、残存及び初期のアミラーゼ活性の比率をインキュベーション温度に対して表示し、データを次の方程式を使用して適応した：
ｙ＝ａ０＋ａ１／（１＋（ｘ／ａ２）ａ３）
続いて、各ＢＡＳＥ‐変異体についてＴ５０値を計算した（例えば、残存活性が５０％である温度）。したがって、Ｔ５０値は変異体の熱安定性に関する尺度であり、比較アミラーゼ及び互いに対して変異体を評価することができる。
【０３２１】
Ｈ．ＡＡＰＦプロテアーゼ
本明細書に記載のサブチリシンプロテアーゼのプロテアーゼ活性を決定するために、Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−ｐ−ニトロアニリド（ＡＡＰＦ）の加水分解を測定した。使用される試薬溶液は次の通りだった：
１）０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０含有１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．６、（トリス希釈緩衝液）；
２）１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）‐８０含有１００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．６（トリス／Ｃａ緩衝液）；及び
３）ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ保存溶液）（シグマ：Ｓ−７３８８）中の１６０ｍＭ  ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ。
【０３２２】
ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ作業溶液を調製するために、１ｍｌのＡＡＰＦストックを１００ｍｌのトリス／Ｃａ緩衝液に加え、ウェルを少なくとも１０秒混合した。アッセイは、各ウェルに希釈プロテアーゼ溶液の１０μｌを添加し、直ちに続けて、１９０μｌの１ｍｇ／ｍｌＡＡＰＦ作業溶液を添加することにより行なった。溶液を５秒間混合し、キネティックモード（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅ）（５分で２０の読みとり）での吸収度変化は、２５℃で４１０ｎｍにてＭＴＰリーダーで測定した。プロテアーゼ活性をＡＵ（活性＝ＯＤ・ｍｉｎ−１ｍｌ−１）として表現した。
【０３２３】
実施例２
ＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）及びその変異体を発現するバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の作成
この実施例において、ＢＡＳＥ（バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＴＳ−２３アルファ−アミラーゼ又はＡｍｙＴＳ２３ｔの欠失形態）を発現するバシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株及びその変異体の構築を記載する。ＢＡＳＥ、欠失アミラーゼの成熟形態は、好アルカリ性（ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｉ）及び好熱性のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＴＳ−２３（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８２：３２５−３３４、１９９７）のＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＴＳ２３）に由来する。
【０３２４】
ＡｍｙＴＳ２３の成熟形態のアミノ酸配列を配列番号１として示す。
【０３２５】
2012522875.tif 000005
【０３２６】
ＡｍｙＴＳ２３の成熟形態をコードする、コドン‐修飾核酸配列を配列番号３として示す。
【０３２７】
2012522875.tif 000006
【０３２８】
ＢＡＳＥは、シグナルペプチドをコードする５’−配列領域の最初の９０ｂｐ及び酵素のカルボキシル末端をコードする３’−配列の２９７ｂｐの両方を欠失することにより作成され、欠失アルファ‐アミラーゼを得た。ＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）の成熟形態のアミノ酸配列を配列番号２として示す。
2012522875.tif 000007
【０３２９】
ＧＥＮＥＡＲＴによって生産され、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現用コドン‐修飾ＢＡＳＥ遺伝子を含む合成ＤＮＡフラグメント（０７２３０１３）は、ＢＡＳＥ及びその変異体を発現するバシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の構築用の鋳型ＤＮＡ（配列番号：４）として役立った。ＢＡＳＥを発現するために、ＢＡＳＥ  ＤＮＡフラグメントは、特異的なＰｓｔＩ及びＨｐａＩ制限部位を使用して、ＧＥＮＥＡＲＴによってｐＨＰＬＴベクター（Ｓｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ５：３３３−３４１、２００１）へクローン化した。ｐＨＰＬＴ発現ベクターは、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＡＴプロモーター（Ｐｌａｔ）及びレプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びブレオマイシン抵抗性マーカー（ｂｌｅｏ）を含むｐＵＢ１１０（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｓｍｉｄ、１５：  ９３−１０３、１９８６）由来の追加要素を含む。
【０３３０】
ＬＡＴシグナルペプチド用のコード領域を配列番号１５として示す。
atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagca.
【０３３１】
ＬＡＴシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６として示す。
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA.
【０３３２】
ｐＨＰＬＴ発現ベクターの地図を図２示し、一方、ＢＡＳＥ遺伝子を含むｐＨＰＬＴベクターの地図を図３に示す。ＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）の成熟形態をコードする、ＧＥＮＥＡＲＴによって生産された、コドン‐修飾核酸配列を配列番号４として示す。Ｎ００１  Ｎ末端コドン及びＫ４８４  Ｃ末端コドンを太字で示す。
【０３３３】
2012522875.tif 000008
2012522875.tif 000009
【０３３４】
ＧＥＮＥＡＲＴは、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥベクターＤＮＡを使用して、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株（遺伝子型：  ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、Δｅｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）及び（ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ３５０１、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ）を形質転換した。当分野（ＷＯ  ０２／１４４９０）中で知られているように、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換を行なった。バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体をハートインフュージョン寒天培地（Ｄｉｆｃｏ（カタログ２４４４００番））及び１０ｍｇ／Ｌの硫酸ネオマイシン（シグマ、カタログ番号Ｎ−１８７６；１ｍｇ当たり７３２μｇネオマイシンを含む）を含む寒天平板上で選別した。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ  ＧＥＮＥＡＲＴベクターを含むバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体の選択的増殖をＭＢＤ培養液（ＭＯＰＳに基づいた規定培地）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含む振盪フラスコの中で行った。当分野（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１９：  ７３６−７４７、１９７４）で知られているように、ＭＢＤ培養液をＮＨ４Ｃｌ２、ＦｅＳＯ４及びＣａＣｌ２が基本培養液から除かれた以外は、原則的に作り、３ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４を使用し、基本培養液は、６０ｍＭ尿素、７５ｇ／Ｌグルコース及び１％ソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）で補われた。微量養素は、１リットルに、４００ｍｇＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、１００ｍｇＺｎＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇＣｕＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇＮａＭｏＯ４  ２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇＮａ２Ｂ４Ｏ７  １０Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２及び１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウムに含む１００Ｘ保存溶液として作成された。増殖は、デンプン加水分解活性を有する分泌されたＢＡＳＥアミラーゼの生産をもたらした。
【０３３５】
実施例３
ＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）サイト評価ライブラリーの作成
サイト評価ライブラリー（ＳＥＬ）作成を独自の発明にかかる方法（ＷＯ  ２００４／０５９５５６Ａ３）を使用して、ＧＥＮＥＡＲＴによって行なわれた。ＰＣＲによるタンパク質の発現の目的でヌクレオチド配列を最適化する装置及び方法、及びＤＮＡ分子の製造は、ＧＥＮＥＡＲＴ（ヨーロッパ特許番号０  ２００  ３６２及び０  ２０１（１８４）；及び米国特許第４，６８３，１９５、４，６８３，２０２及び６，４７２，１８４）によって所有される又はＧＥＮＥＡＲＴへライセンスした技術を利用した。この実施例に記載のＢＡＳＥ  ＳＥＬの構築は、ＧＥＮＥＡＲＴが有するノウハウ及び／又は知的財産を用いて遺伝子最適化、遺伝子合成及びライブラリー作成用のそれらのテクノロジープラットフォームを使用して、ＧＥＮＥＡＲＴによって行なわれた。ＳＥＬを作成するためのＧＥＮＥＡＲＴのシーケンシャル  パーミューテーション  アプローチ（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ）は、会社のウェブサイトにおいて一般的に開示される。
【０３３６】
ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥプラスミドＤＮＡが、ＳＥＬを生産する鋳型として用いられた。ＢＡＳＥ  ＳＥＬは、発明者によってあらかじめ選択された位置（表３−１）にてＧＥＮＥＡＲＴによって生産された。対応するＤＮＡコドンは、（可能な１９から選ばれる）少なくとも１６の異なるアミノ酸のコドンでそれぞれ置換された。コドン突然変異ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ混合物は、当分野（ＷＯ  ２００２／０１４４９０）で知られているようなコンピテント  バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ]）を形質転換するために使用し、ＢＡＳＥ  ＳＥＬを作成した。形質転換混合物を１０ｍｇ／Ｌの硫酸ネオマイシンを含むＨＩ寒天平板（ハートインフュージョン寒天培地）上に塗布した。各ライブラリーについては、後のＤＮＡ抽出法及び遺伝子配列分析のために、単一なコロニーを採取し、１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン選択を有するＴＳＢ（トリプトン及び大豆に基づいた培養液）液体培地において増殖した。配列分析データにより１つのライブラリー当たり最高１９ＢＡＳＥ成熟変異体が明らかになった。ＢＡＳＥ  ＳＥＬ中で同定したＢＡＳＥ変異体を表３−２にリストする。生化学特性評価のためのＢＡＳＥ及びＢＡＳＥの変異体酵素サンプルを作成するために、ＢＡＳＥ  ＳＥＬ変異体の選別成長をＭＢＤ培養液の中で６８時間３７℃にて９６のウェルＭＴＰで行った。
【０３３７】
【表２】
2012522875.tif 000010
【０３３８】
【表３】
2012522875.tif 000011
2012522875.tif 000012
2012522875.tif 000013
2012522875.tif 000014
2012522875.tif 000015
2012522875.tif 000016
2012522875.tif 000017
【０３３９】
実施例４
ＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）の組み合わせライブラリーの作成
合成ＢＡＳＥ組み合わせライブラリーは、成熟配列の２つ以上の選択されたコドンが特定のＤＮＡ配列により置換される合成ＢＡＳＥ遺伝子の混合物を含む。４つの合成ＢＡＳＥ組み合わせライブラリーがＧＥＮＥＡＲＴのノウハウ及び／又は知的財産に属する遺伝子最適化、遺伝子合成及びライブラリー作成用のＧＥＮＥＡＲＴのテクノロジープラットフォームを使用して、Ｇｅｎｅｎｃｏｒとの契約に基づいてＧＥＮＥＡＲＴによって作成された。組み合わせライブラリーを作成するためにＧＥＮＥＡＲＴのアドバンスト  ミュータジェネシス  アプローチ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ）は、会社のウェブサイト上の一般的に開示される。
【０３４０】
表４−１〜４−４は、合成ＢＡＳＥ組み合わせライブラリー（番号は、配列番号２のＢＡＳＥ成熟アミノ酸配列に従って付けられた）のメンバーの中に存在し得る置換をリストする。各ライブラリーでは、ターゲットとされたＢＡＳＥ位置は、野生型（ｗｔ）として残るか又は表４−１〜４−４にリストされた具体的なアミノ酸と置換されるかについて等しい可能性を有する。ＢＡＳＥ組み合わせのライブラリーは、ｐＨＰＬＴベクターに突然変異ＢＡＳＥ遺伝子をクローン化することにより作成され、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥプラスミドＤＮＡの変異体を作成し、続いてバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を形質転換する。形質転換混合物を１０ｍｇ／Ｌの硫酸ネオマイシン、及び０．５％のＲＢＢ‐デンプン（シグマ‐アルドリッチ製品、番号Ｓ７６２９、Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒと共有結合でリンクされたジャガイモデンプン）を含むＨＩ‐寒天平板（ハート・インフュージョン寒天培地）上に塗布した。各ライブラリーについては、透明帯を生産する単一コロニーを採取し、１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシンを含むＴＳＢ（トリプトン及び大豆に基づいた培養液）液体培地の中で増殖させた。生化学特性評価のためのＢＡＳＥ組み合わせの変異体酵素サンプルを生成するために、ＢＡＳＥ組み合わせライブラリーメンバーの選別培養をＭＢＤ培養液の中で６８時間３７℃にて９６ウェルＭＴＰで行なった。
【０３４１】
【表４】
2012522875.tif 000018
【０３４２】
【表５】
2012522875.tif 000019
【０３４３】
【表６】
2012522875.tif 000020
【０３４４】
【表７】
2012522875.tif 000021
【０３４５】
実施例５
ＢＡＳＥ組み合わせ変異体の作成
この実施例において、ＢＡＳＥ組み合わせ変異体を発現するバシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の構築を記載する。ＢＡＳＥ組み合わせ変異体を発現するために、ＢＡＳＥ変異体ＤＮＡフラグメントを特異的なＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の使用により、ｐＨＰＬＴベクターの中でクローン化し、続いて、バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株へ導入した。下記に記載されるように、ＢＡＳＥ  ＤＮＡ変異体フラグメントを構築した。表５−１（Ｓ１からＳ３２）にリストした個々のＢＡＳＥ組み合わせ変異体については、ＰＣＲ反応を表５−２及び表５−３にリストしたプライマーを使用して行った。
【０３４６】
下記に記載のＰＣＲ反応については、最終濃度０．２μＭ  ＤＮＡプライマー及び０．１‐１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ鋳型を使用した。表５−２は特定のｐＤＮＡ鋳型及び変異体の各々を構築するために用いたプライマーペアをリストした。さらに、ＰＣＲ反応はすべて、フィンザイムズ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）（フィンザイムズ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）ＯＹ、エスポー、フィンランド）のヒュージョンハイ‐フィデリティ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｆ−５３０Ｌ）を使用して、５０μＬの体積で完了した。すべてのＰＣＲ反応混合物は、５０μＬの全体積について、１０μＬの５Ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、１μＬの１０ｍＭデオキシリボヌクレオチド３リン酸混合物、０．７５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（２  ｕｎｉｔｓ／μＬ）、１μＬの１００％ＤＭＳＯ及びオートクレーブ滅菌された脱イオン化水を含んだ。ＰＣＲプログラムは、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウォルサム（ＭＡ））を次のように使用して実行された。
９８℃にて３０秒、２５Ｘ（９８℃にて１０秒、５５℃にて２０秒、７２℃にて２５秒）及び最後に７２℃にて５分。
【０３４７】
ＢＡＳＥ組み合わせ変異体Ｓ１からＳ１６については、ＰＣＲ１及び２により作成された増幅ＤＮＡ断片を第３のＰＣＲにより融合した。ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の両方の増幅ＤＮＡ断片の０．５μＬアリコートをプライマーＰｓｔＩ−ＦＷ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＲＶを含む第３の反応液に加えた。増幅された線形の１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを（Ｑｉａｇｅｎ（商標）Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、カタログ２８１０６番）で精製し、ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で消化した。続いて、ＢＡＳＥ組み合わせ変異体ＤＮＡフラグメントＳ１からＳ１６及びｐＨＰＬＴ  ｐＤＮＡ（ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で消化された５０ｎｇ／μＬ）を精製（Ｑｉａｇｅｎ（商標）Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、カタログ２８１０６番）し、結合した。反応条件は次の通りだった：
４μＬの精製ＰｓｔＩ及びＨｐａＩ消化ＢＡＳＥ変異体フラグメント、２μＬの精製ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＨＰＬＴ  ＤＮＡフラグメント、８μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ４６３００−０１８番）、２５μＬのオートクレーブ滅菌された脱イオン化水及び１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ、１  ｕｎｉｔ／μＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ１５２２４−０１７番）。連結反応を２０℃にて１６−２０時間行なった。
【０３４８】
結合反応混合物を直接バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に形質転換するために、結合されたｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ変異体ＤＮＡは、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキット（アマシャム  カタログ２５−６４００番）を使用して増幅した。この目的のために、１μＬの結合反応混合物をＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットからのサンプル緩衝液の５μＬと混合し、９５℃で３分間加熱し、ＤＮＡを変性した。反応液を２分間冷却のため氷上に放置し、それからすぐにスピンダウンした。次に、反応緩衝液の５μＬ、及びＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットからのｐｈｉ２９ポリメラーゼの０．２μＬを加え、反応物を４時間ＭＪリサーチＰＣＲ機械中で３０℃にてインキュベートした。ｐｈｉ２９酵素を１０分間６５℃のインキュベーションにより加熱不活性化した。
【０３４９】
バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）へＢＡＳＥ変異体を導入することについては、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ増幅反応生成物の０．１μＬをコンピテント・バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞［（遺伝子型  ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：（ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ）]の５００μＬと混合し、続いて、１時間３７℃にて激しく振盪し、１００μＬ及び５００μＬを１０ｍｇ／Ｌの硫酸ネオマイシン及び０．５％ＲＢＢ‐デンプンを含むハートインフュージョン寒天培地（Ｄｉｆｃｏ（Ｃａｔ．ｎｏ  ２４４４００））上に塗布した。各変異体について、透明ゾーンを生産する単一コロニーを採取し、後のプラスミドＤＮＡ単離及び遺伝子配列分析のために、１０ｍｇ／Ｌのネオマイシン選別を有するＴＳＢ（トリプトン及び大豆に基づいた培養液）液体培地の中で培養した。ＢＡＳＥ組み合わせ変異体の同一性を配列分析によって決定した。本明細書に記載されるように、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ  Ｓ１からＳ１６プラスミドＤＮＡは、鋳型ＤＮＡとして役立ち、ＢＡＳＥ組み合わせ変異体Ｓ１７からＳ３２を構築した。生化学特性評価のためのＢＡＳＥ組み合わせ変異体の酵素サンプルを生成するために、ＢＡＳＥ組み合わせ変異体をＭＢＤ培養液の中で６８時間３７℃にて９６のウェルＭＴＰの中で培養した。
【０３５０】
【表８】
2012522875.tif 000022
【０３５１】
【表９】
2012522875.tif 000023
【０３５２】
【表１０】
2012522875.tif 000024
【０３５３】
ＢＡＳＥ組み合わせ変異体Ｗ１からＷ１３をＢＡＳＥ組み合わせ変異体Ｐ１からＰ１２の使用により構築した。表５−４のＰ１−Ｐ１２変異体は、実施例４に記載のＢＡＳＥ組み合わせライブラリー１−４から選ばれた。表５−５（Ｗ１からＷ３２）にリストされた個々のＢＡＳＥ組み合わせ変異体については、ＰＣＲ反応を表５−６にリストされたプライマーを使用して行なった。ＰＣＲ反応条件はすべて、上記に示す、ＢＡＳＥ組み合わせ変異体Ｓ１からＳ３２の作成のために使用されたプロトコールに類似する。
【０３５４】
【表１１】
2012522875.tif 000025
【０３５５】
【表１２】
2012522875.tif 000026
【０３５６】
【表１３】
2012522875.tif 000027
2012522875.tif 000028
【０３５７】
ＢＡＳＥ組み合わせ変異体Ｗ１からＷ１３を構築するためのＰＣＲ一覧表を表５−７及び５−８に示す。変異体生産は５つのＰＣＲ反応（シリーズＡからＥ）から始まり、２つの融合ＰＣＲ反応（シリーズＦ及びＧ）を継続する。すべてのＰＣＲフラグメントをＱｉａｇｅｎ（商標）Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（カタログ２８１０６番）を使用して精製した。変異体Ｓ１からＳ３２の構築に関して記載するように、ＰＣＲ  Ｇ１からＧ１３の融合ＤＮＡフラグメントをＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ‐消化ｐＨＰＬＴベクターＤＮＡに結合した。続いて、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ増幅連結反応混合物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓへ導入した。各変異体については、透明ゾーンを生産する単一コロニーを採取し、後のプラスミドＤＮＡ単離及び遺伝子配列分析のために１０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含むＴＳＢ（トリプトン及び大豆に基づいたブイヨン）液体培地の中で培養した。ＢＡＳＥ組み合わせ変異体の同一性を配列分析によって確認した。生化学特性評価用組み合わせの変異体Ｗ１からＷ１３の酵素サンプルを生成するために、ＢＡＳＥ組み合わせ変異体の選択培養をＭＢＤ培地の中で６８時間３７℃にて９６ウェルＭＴＰの中で行なった。
【０３５８】
【表１４】
2012522875.tif 000029
【０３５９】
【表１５】
2012522875.tif 000030
【０３６０】
実施例６
ＡＣＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ）サイト評価ライブラリーの作成
この実施例において、ＢＡＳＥ変異体を発現するバシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株であるＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１（またＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ又はＡＣＥとしても知られる）及びＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１−Ｓ２４３Ｑ（またＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ又はＡＣＥ−Ｑという名のＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ−Ｓ２４３Ｑとして知られる）の構築を記載する。さらに、ＡＣＥ−Ｑサイト評価ライブラリー（ＳＥＬ）の作成を記載する。
【０３６１】
ＤＮＡコドン‐修飾ＢＡＳＥ遺伝子を含む合成ＤＮＡフラグメント０５６４２６（Ｇｅｎｅａｒｔ製、レーゲンスブルク、ドイツ）は、鋳型ＤＮＡとして役立った。このＢＡＳＥ  ＤＮＡフラグメントを特異的なＰｓｔＩ及びＨｐａＩ制限部位を使用して、ｐＨＰＬＴベクター（Ｓｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ、５：３３３−３４１、２００１）へクローン化した。ｐＨＰＬＴ発現ベクターは、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＡＴプロモーター（Ｐｌａｔ）、続いてＢＡＳＥのクローン用ＰｓｔＩとＨｐａＩの制限部位があり、及びレプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びブレオマイシン耐性マーカー（ｂｌｅｏ）を含むｐＵＢ１１０（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｓｍｉｄ、１５：  ９３−１０３、１９８６）由来追加要素を含む。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥプラスミドの地図を図３に示す。コドン１８０（ＣＧＧ）及び１８１（ＡＧＣ）欠失（ＢＡＳＥ−ＡＣＥという名のΔＲ１８０―ΔＳ１８１）を有するＢＡＳＥ  ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ及び表６−１にリストされたＤＮＡプライマーを使用して作成した。ＤＮＡプライマーを合成し、シグマ（シグマ・オールドリッチＣｈｅｍｉｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、オランダ）によって脱塩した。
【０３６２】
２つのＰＣＲ反応をプライマーペアＴＳ−ｄｅｌＲＳ−ＦＷ／ｐＨＰＬＴ−ＨｐａＩ−ＲＶ及びＴＳ−ｄｅｌＲＳ−ＲＶ／ｐＨＰＬＴ−ＰｓｔＩ−ＦＷを使用して、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ鋳型ＤＮＡを使用して行なった。２つのＰＣＲ生成フラグメントを融合させるために、両方の反応からの未精製ＰＣＲ混合物１μｌをプライマーｐＨＰＬＴ−ＰｓｔＩ−ＦＷ及びｐＨＰＬＴ−ＨｐａＩ−ＲＶが加えられた第３のＰＣＲ反応物に添加した。増幅された線形の１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを精製し（Ｑｉａｇｅｎ（商標）Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットカタログ  ２８１０６番を使用）、ＰｓｔＩとＨｐａＩの制限酵素で消化した。
【０３６３】
記載のすべてのＰＣＲ反応については、最終濃度０．２μＭ  ＤＮＡプライマーを使用し、０．１―１０ｎｇのＤＮＡ鋳型を使用した。さらに、ＰＣＲ反応はすべて、フィンザイムズ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）（フィンザイムズ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）ＯＹ、エスポー、フィンランド）のヒュージョンハイ‐フィデリティ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｆ−５３０Ｌ）を使用して、５０μＬの体積で完了した。すべてのＰＣＲ反応混合物は、１０μＬの５Ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、１μＬの１０ｍＭデオキシリボヌクレオチド３リン酸混合物、０．７５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（２  ｕｎｉｔｓ／μＬ）、１μＬの１００％ＤＭＳＯ及びオートクレーブ滅菌された脱イオン化水を含み、５０μＬの最終体積とした。ＰＣＲプログラムは、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウォルサム（ＭＡ））をフィンザイムズ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）（９８℃にて３０秒、３０Ｘ[９８℃にて１０秒、５５℃にて２０秒、７２℃にて２２秒／ｋｂ]及び７２℃にて５分の最終ステップ）により記載のように実行された。
【０３６４】
続いてＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１  ＤＮＡフラグメント、及びｐＨＰＬＴプラスミドＤＮＡ（ＰｓｔＩ及びＨｐａＩの制限酵素で消化された５０ｎｇ／μＬ）を精製し（Ｑｉａｇｅｎ（商標）Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットカタログ番号２８１０６番を使用）、次に、次の反応条件を使用して、ＰｓｔＩ及びＨｐａＩ末端で結合した：
４μＬの精製ＰｓｔＩ及びＨｐａＩ消化ＢＡＳＥ‐ΔＲ１８０‐ΔＳ１８１  ＤＮＡフラグメント、２μＬの精製ＰｓｔＩ及びＨｐａＩ消化ｐＨＰＬＴ  ＤＮＡフラグメント、８μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ４６３００−０１８番）、２５μｌのオートクレーブ滅菌された脱イオン化水及び１μＬ  Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１  ｕｎｉｔ／μＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ１５２２４−０１７番））。結合反応を２０℃で１６−２０時間行った。
【０３６５】
細菌形質転換の開示について参照により本明細書に組込まれるＷＯ  ０２／１４４９０に記載されるように、連結反応混合物をバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、Δｅｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）及び（ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ３５０１、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ、（Δｖｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ‐ｙｂｆＪ、ΔｎｐｒＢ））に形質転換した。バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体をハートインフュージョン寒天培地（Ｄｉｆｃｏ、カタログ番号２４４４００）及び１０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含む寒天平板上で選別した。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１プラスミドを保持するバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体の選別培養を２５ｍｌのＭＢＤ培養液（ＭＯＰＳに基づいた規定培地）及び１０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含む振盪フラスコの中で行なった。これは、デンプン加水分解活性を持つ分泌されたＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１アミラーゼの生成をもたらした。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１プラスミドは、本明細書においてｐＨＰＬＴ−ＡＣＥとも呼ばれる。
【０３６６】
ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０−ΔＳ１８１−Ｓ２４３Ｑアミラーゼを発現するバシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の作成のために、同様のプロトコールを使用した。最初の２つのＰＣＲ反応をプライマーＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−ＦＷ及びｐＨＰＬＴ−ＨｐａＩ−ＲＶ、及びプライマーＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ―ＲＶ及びｐＨＰＬＴ−ＰｓｔＩ−ＦＷ及びｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ鋳型ＤＮＡを使用して行なった。プライマー配列を表６−１にリストする。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１−Ｓ２４３Ｑを保持するバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体を作成し、デンプン加水分解活性を有するＢＡＳＥ−ΔＲ１８０−ΔＳ１８１−Ｓ２３４Ｑアミラーゼを分泌した。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１−Ｓ２４３Ｑプラスミド（ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑとも名付けられる）の地図を図４に示す。
【０３６７】
【表１６】
2012522875.tif 000031
【０３６８】
ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３ＱプラスミドＤＮＡは、サイト評価ライブラリー（ＳＥＬ）の作成用の鋳型として役立った。ＡＣＥ−Ｑ  ＳＥＬに選択されるアミノ酸位置を成熟ＢＡＳＥアミノ酸配列（配列番号：２）に従って番号を付け、その位置は次の、Ｒ１２７、Ｙ３０５、Ｑ３２０、Ｐ３７９、Ｔ４１９、Ｌ４５３及びＧ４７５を含む。対応するＤＮＡコドンを各々、最高２０の異なるアミノ酸をコードする変異コドンで置換した。このｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑプラスミドは特異的なＢｇｌＩＩ制限部位を含み、それはＳＥＬ構築の間に利用された。ライブラリーを作成するために使用されるプライマー（商業的に合成され脱塩された）の配列を表６−２にリストする。
【０３６９】
ＡＣＥ−Ｑ  ＳＥＬを構築するために、次の３つの反応を行なった。それは、ＡＣＥ−Ｑ  ＤＮＡ配列に目的の変異コドンを導入する２つの変異誘発反応及び２つのＰＣＲフラグメントを融合させる第３の反応である。変異誘発方法はコドン‐特異的変異アプローチに基づいた。この方法では、特定のＤＮＡトリプレット中のあらゆる変異の作成が、変異されるコドンの配列に一致し、目的のコドンにてヌクレオチドのランダムな取り込みを保証する特定の設計されたトリプレットＤＮＡ塩基配列ＮＮＳ（（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）、（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）、（Ｃ又はＧ））をコードするフォワード及びリバースのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。表６−２のプライマー名に記載の数は、特定のＡＣＥ−Ｑコドン位置（成熟ＢＡＳＥアミノ酸配列の番号付けのものに基づいた）に一致する。ＳＥＬを構築するために使用される２つの追加的オリゴヌクレオチドプライマーは、特異的なＢｇｌＩＩ制限部位及びＢｇｌＩＩ制限部位側に隣接するｐＨＰＬＴ  ＤＮＡ配列をコードする。
【０３７０】
【表１７】
2012522875.tif 000032
【０３７１】
各ＳＥＬの構築は２つのプライマリー増幅反応から始まった。それは、ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷプライマー及び特定のＡＣＥ−Ｑリバース変異誘発プライマーを使用する第１のＰＣＲ、及びｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶプライマー及び特定のＡＣＥ−Ｑフォワード変異誘発プライマーを使用する第２のＰＣＲである。成熟ＡＣＥ−Ｑ配列の変異の導入をＦｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ、エスポー、フィンランド）（カタログ番号Ｆ−５３０Ｌ）を使用して行なった。すべての反応をメーカーによって供給されたプロトコールによって行なった。プライマリー反応のためのＰＣＲ条件は次に示すものであった。
プリマリーＰＣＲ１のために：
ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷプライマー及び特定のＡＣＥ−Ｑリバース変異誘発プライマー‐両方１μＬ（１０μＭ）、及び０．１―１０ｎｇのＤＮＡ鋳型（ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ）、１０μＬの５Ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦバッファー、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．７５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（２ユニット／μＬ）、１μＬの１００％のＤＭＳＯ及びオートクレーブ滅菌された脱イオン化水で最終総体積５０μＬとする。
プライマリーＰＣＲ２のために：
ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶプライマー及び特定のＡＣＥ−Ｑフォワード変異誘発プライマー‐両方１μＬ（１０μＭ）、及び０．１―１０ｎｇのＤＮＡ鋳型（ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ）、１０μＬの５Ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦバッファー、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．７５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（２ユニット／μＬ）、１μＬの１００％のＤＭＳＯ及びオートクレーブ滅菌された脱イオン化水で最終総体積５０μＬとする。
【０３７２】
次のプログラムを用いてＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラー（ＭＪリサーチ社、ウォルサム（ＭＡ））を使用した。
３０秒９８℃、３０Ｘサイクル（１０秒９８℃、２０秒５５℃、１分７２℃）及び５分７２℃。
各ＳＥＬのプライマリー増幅反応のために、目的のＡＣＥ−Ｑコドン周辺とオーバーラップする約３０ヌクレオチドを有する約２−３ｋｂの２つのＤＮＡフラグメントを精製した。２つのＤＮＡフラグメントを融合させるために、両方の反応物から１μＬ未精製ＰＣＲ混合物をプライマーｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷ及びｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶが加えられた第３の増幅反応に加えた。増幅された線形の５．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを精製（Ｑｉａｇｅｎ(商標)Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、カタログ番号２８１０６使用）し、ＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、融合フラグメントの両側に粘着末端を作成した。３５μＬの精製線状ＤＮＡフラグメント、４μＬ  Ｒｅａｃｔ(商標)３緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリーＰＡ４  ９ＲＦ、英国）及び１μＬ  ＢｇｌＩＩ、１０ユニット／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリーＰＡ４  ９ＲＦ、英国）を含む制限消化物を１時間３０℃にてインキュベートした。
【０３７３】
ＡＣＥ−Ｑ  ＳＥＬを作成するためにＷＯ  ２００２／０１４４９０に記載のように、コドン変異ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ連結反応混合物は、コンピテントバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ，ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ]）を形質転換するために使用した。形質転換混合物を１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ネオマイシン（シグマ、カタログ番号Ｎ−１８７６；１ｍｇ当たり７３２μｇネオマイシンを含む。）を含むＨＩ寒天平板（ハート・インフュージョン寒天培地）上に塗布した。各ライブラリーについては、単一のコロニーを採取し、後のＡＣＥ−Ｑ遺伝子変異体のプラスミドＤＮＡ単離及びＤＮＡ塩基配列分析用に、１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン選別下のトリプトン及び大豆に基づいた液体培地の中で培養した。ＤＮＡ塩基配列分析をＢａｓｅＣｌｅａｒ  Ｂ．Ｖ．（ライデン、オランダ）により行った。配列分析データにより、１つのライブラリー当たり最高１８のＡＣＥ−Ｑ変異体が明らかとなった。７つのＡＣＥ−Ｑ  ＳＥＬの中で同定された、すべてのＡＣＥ−Ｑ変異体を表６−３にリストする。生化学特性評価のためのＡＣＥ−Ｑ変異体酵素サンプルを生成するために、ＡＣＥ−Ｑ  ＳＥＬメンバーの選別培養を９６ウェルＭＴＰでＭＢＤミディアム（ＭＯＰＳに基づいた特定培地）中６８時間３７℃にて行った。
【０３７４】
【表１８】
2012522875.tif 000033
【０３７５】
実施例７
ＢＡＳＥ変異体に対する性能指数値
この実施例において、ＢＡＳＥ及びその変異体の洗浄性能（ｐＨ１０／３２℃、ｐＨ１０／５０℃、ｐＨ８／１６℃及びｐＨ８／３２℃でのＣＳ−２８  微小布見本（ｍｉｃｒｏｓｗａｔｃｈ）アッセイ）、洗剤安定性、熱安定性、ＢＰＮＰＧ７アミラーゼ活性及びＨＰＬＣタンパク質濃度（目的の特性のテスト）を決定するために行なわれた実験の結果を記載する。結果は、実施例１の方法を使用して得た。本明細書中を通して記載するように、ＢＡＳＥ変異体を性能指数（ＰＩ）として定量した。それは、親タンパク質に対する変異体の性能の比率である。表１０−１は、特性試験に関する多数のＢＡＳＥ変異体に対するＰＩ値を示す。様々なアミノ酸の位置で導入された変異を示す。０．０５以下の性能指数は０．０５までに固定した。０．０５以下のＨＰＬＣタンパク質ＰＩを持ったすべての変異体については、値はすべて０．０５で固定した。また、２つの安定性測定において、安定性アッセイ中の初期活性のＰＩが０．０５以下だった場合、関連する安定性ＰＩは０．０５とした。表７−１は、組み合わせできる変異（それらの変異は本明細書では、少なくとも１つの特性についてＰＩ値≧０．５を有し、及びすべての特性についてＰＩ値＞０．０５を有する変異体中の変異として定義される）を有するＢＡＳＥ変異体のＰＩを提供する。
【０３７６】
【表１９】
2012522875.tif 000034
2012522875.tif 000035
2012522875.tif 000036
2012522875.tif 000037
2012522875.tif 000038
2012522875.tif 000039
2012522875.tif 000040
2012522875.tif 000041
2012522875.tif 000042
2012522875.tif 000043
2012522875.tif 000044
2012522875.tif 000045
2012522875.tif 000046
2012522875.tif 000047
2012522875.tif 000048
2012522875.tif 000049
2012522875.tif 000050
2012522875.tif 000051
2012522875.tif 000052
2012522875.tif 000053
2012522875.tif 000054
2012522875.tif 000055
2012522875.tif 000056
2012522875.tif 000057
2012522875.tif 000058
2012522875.tif 000059
2012522875.tif 000060
2012522875.tif 000061
2012522875.tif 000062
2012522875.tif 000063
2012522875.tif 000064
2012522875.tif 000065
2012522875.tif 000066
2012522875.tif 000067
2012522875.tif 000068
2012522875.tif 000069
2012522875.tif 000070
2012522875.tif 000071
2012522875.tif 000072
2012522875.tif 000073
2012522875.tif 000074
2012522875.tif 000075
2012522875.tif 000076
2012522875.tif 000077
2012522875.tif 000078
2012522875.tif 000079
2012522875.tif 000080
2012522875.tif 000081
2012522875.tif 000082
2012522875.tif 000083
2012522875.tif 000084
2012522875.tif 000085
2012522875.tif 000086
2012522875.tif 000087
2012522875.tif 000088
2012522875.tif 000089
2012522875.tif 000090
2012522875.tif 000091
2012522875.tif 000092
2012522875.tif 000093
2012522875.tif 000094
2012522875.tif 000095
2012522875.tif 000096
2012522875.tif 000097
2012522875.tif 000098
2012522875.tif 000099
2012522875.tif 000100
2012522875.tif 000101
2012522875.tif 000102
2012522875.tif 000103
2012522875.tif 000104
2012522875.tif 000105
2012522875.tif 000106
2012522875.tif 000107
2012522875.tif 000108
2012522875.tif 000109
2012522875.tif 000110
2012522875.tif 000111
2012522875.tif 000112
【０３７７】
表３−２の中にあるが、表７−１に無いＢＡＳＥ  ＳＥＬメンバーの他の８２１の変異は、親α−アミラーゼの組み合わせ変異体に含ませるほど適していない。同様に、前記８２１の組み合わせできない変異に一致する、配列番号２に対応する、位置での自然発生的アルファ‐アミラーゼの残基は、標準以下の自然発生のアルファ‐アミラーゼ中に存在すると考えられ、したがって変異誘発に対する候補である。そのため、本明細書は、特性の所望のセットを有する変異体アルファ‐アミラーゼを生成するための詳細レシピを提供する。
【０３７８】
実施例８
アルファ‐アミラーゼ中の制限的及び非制限的な位置
ＢＡＳＥ及びその変異体の洗浄性能（ｐＨ１０／３２℃、ｐＨ１０／５０℃、ｐＨ８／１６℃及びｐＨ８／３２℃でのＣＳ−２８  微小布見本（ｍｉｃｒｏｓｗａｔｃｈ）アッセイ）、洗剤安定性、熱安定性、ＢＰＮＰＧ７アミラーゼ活性及びＨＰＬＣタンパク質濃度（目的の特性のテスト）を決定するために行なわれた実験の結果を記載する。結果は、実施例１の方法を使用して得た。本明細書中を通して記載するように、ＢＡＳＥ変異体を性能指数（ＰＩ）として定量した。それは、親タンパク質又は比較アミラーゼに対する変異体の性能の比率である。次に述べられた様々な用語は、変異を記載するために使用する：
上昇変異（ｕｐ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）はＰＩ＞１を有する、中性変異（ｎｅｕｔｒａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）はＰＩ＞０．５を有する、有害でない変異（ｎｏｎ‐ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）はＰＩ＞０．０５を有する、有害な変異（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）はＰＩ≦０．０５を有する、組み合わせできる変異は、変異体が少なくとも一つの特性についてＰＩ≧０．５、及びすべての特性についてＰＩ＞０．０５を有する変異のものである。組み合わせできる変異は、１つ以上の所望な特性について適切なＰＩを有するタンパク質を導き出すために組み合わせることができる変異である。
【０３７９】
変異が生じる位置を次のように分類する。
非制限的な位置は、少なくとも１つの特性について≧２０％中性変異を有する、及び
制限的な位置は、活性と安定性について、＜２０％中性変異を有する。
表８−１は、活性と安定性について２０％未満の中性変異（ＰＩ＞０．５）が検出された制限的な位置を示す。表８−２は、少なくとも１つの試験された特性について≧２０％中性変異（ＰＩ＞０．５）が検出された非制限的な位置を示す。％＝中性変異の規定を満たす、評価された変異体のパーセント。
【０３８０】
【表２０】
2012522875.tif 000113
【０３８１】
【表２１】
2012522875.tif 000114
2012522875.tif 000115
2012522875.tif 000116
2012522875.tif 000117
2012522875.tif 000118
2012522875.tif 000119
2012522875.tif 000120
【０３８２】
一般に、制限的な位置は変異させられるべきでない。なぜなら、どのような特性についても中性的であるこれらの位置では置換があまり生じない。これらの位置を変更しなければならない場合、それらの位置はアミノ酸置換が保存的な置換であることを必要とする。例えば、位置５８の２つの変異、つまりＡ５８Ｇ及びＡ５８Ｔ及び、位置２３６の２つの変異、つまりＹ２３６Ｆ及びＹ２３６Ｗは組み合わせ可能である。非制限的な位置は、組み合わせライブラリーを構築する際に使用するのに好適な位置である。なぜなら、それらが組み合わせ可能な変異の多くを有するからである。相同タンパク質は同じ構造を共有するので、制限的な位置はすべての相同のアミラーゼにおいて制限的である。なぜなら、それらがタンパク質の構造及び／又は機能にとって重要であるからである。本明細書で実証されるように、制限的な位置は、可能なアミノ酸変異を試験し及びタンパク質のうちの１つ（例えば、アルファ‐アミラーゼ）の特性を測定することにより同定できるだけである。２つの制限的な部位が図１中の配列アラインメントに保存されるが、保存されていることそれ自身が、位置が制限的であるということにはならないことに注目されたい。例えば、Ｑ７１、Ｋ７２及びＧ７３はすべて配列アラインメントに保存される。しかし、３つの位置はすべて、活性、安定性又はその両方に関して親よりよいいくつかの変異を有する。各特性について２０％を超える中性変異を持つ非制限的な位置は、組み合わせ変異に対する一般的に非常によい選択肢である。アルファ‐アミラーゼの中で試験された１９８の位置のうち、この条件を満たす１１５の位置が存在する。
【０３８３】
実施例９
ＡＣＥ−Ｑアミラーゼ変異体の洗剤安定性
ＡＣＥ−Ｑ（ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ）アミラーゼ変異体の洗剤安定性を７０℃にて１０％洗剤（業務用洗剤；不活性化された）存在下、規定の条件の下でインキュベーション後に測定し、初期及び残存アミラーゼ活性を実施例１において記載されるようなセラルファ方法（ＢＰＮＰＧ７）を使用して決定した。アミノ酸残基の番号付けは、ＢＡＳＥアルファ‐アミラーゼのものに相当する。下記の表９−１の中の結果は、ＡＣＥアルファ‐アミラーゼに関しての各変異体の性能指数（ＰＩ）として示される。
【０３８４】
【表２２】
2012522875.tif 000121
2012522875.tif 000122
2012522875.tif 000123
【０３８５】
示された変異体は、ＳＥＬデータで同定される組み合わせ可能な変異である。ＰＩ≧０．５を有する変異体だけを示す。これらの変異は、安定性と活性の所望の組合せを与えるために組み合わせることができる。
【０３８６】
実施例１０
ＡＣＥ−Ｑ変異体の洗浄性能
ＡＣＥ−Ｑ（ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ）アミラーゼ変異体の洗浄性能は、実施例１において記載されたように４つの異なる条件、ｐＨ８／１６℃、ｐＨ８／３２℃、ｐＨ１０／３２℃及びｐＨ１０／５０℃、下にてＣＳ２８微小布見本を使用して測定された。アミノ酸残基の番号付けはＢＡＳＥアルファ‐アミラーゼの番号付けに相当する。下記表１０−１〜１０−４の中の結果は、ＡＣＥアルファ‐アミラーゼに関しての各変異体の性能指数（ＰＩ）として示す。
【０３８７】
【表２３】
2012522875.tif 000124
2012522875.tif 000125
2012522875.tif 000126
【０３８８】
【表２４】
2012522875.tif 000127
2012522875.tif 000128
2012522875.tif 000129
【０３８９】
【表２５】
2012522875.tif 000130
2012522875.tif 000131
2012522875.tif 000132
【０３９０】
【表２６】
2012522875.tif 000133
2012522875.tif 000134
【０３９１】
実施例１１
ＢＡＳＥ単一変異変異体の熱安定性
ＢＡＳＥの２３の単一変異を有する変異体が、加熱不活性化した１００％パーシル（Ｐｅｒｓｉｌ）（ヘンケル（Ｈｅｎｋｅｌ））ＨＤＬ中の正確なＴ５０％測定用にＳＥＬスクリーニングから選択された。業務用洗剤の熱不活性化は、非酵素の成分の特性を保持する一方、任意の酵素成分の活性を破壊する役目をする。ＳＥＬスクリーニングの中で行なわれるように、選別は、熱安定性及び１０％パーシルＨＤＬ安定性アッセイ中の改善された性能指数に基づいた。１００％パーシルＨＤＬ中のそれぞれのＴ５０％値を有する選別された変異体を表１１−１にリストする。
【０３９２】
【表２７】
2012522875.tif 000135
【０３９３】
実施例１２
ＢＡＳＥ組み合わせ変異体の熱安定性
実施例５において記載されたように、ＢＡＳＥ比較アミラーゼの５つの位置（Ｎ１２８Ｃ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ、Ａ１８５Ｄ及びＳ２４３Ｑ）が、組み合わせライブラリーの構築のために選ばれた。この組み合わせライブラリーの可能な３２の変異体（設計されたＢＡＳＥ−Ｓ１からＢＡＳＥ−Ｓ３２）のうち、３０の変異体を加熱不活性化したパーシルＨＤＬ中の安定性について分析した。変異体、それぞれの変異及びパーシルＨＤＬ中で測定されたＴ５０％を野生型ＢＡＳＥ（比較アミラーゼ）、ＡＣＥ及びＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑアミラーゼ変異体との比較で表１２−１にリストする。
【０３９４】
【表２８】
2012522875.tif 000136
【０３９５】
結果は、ＡＣＥ及びＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑが、ＷＴ  ＢＡＳＥと比較して、著しく熱安定性を増加することを示す。さらに、いくつかの組み合わせ変異体も著しく増加した熱安定性を実証し、安定性の５０％越える増加を示す６つの変異体（ＢＡＳＥ−Ｓ２６、ＢＡＳＥ−Ｓ２０、ＢＡＳＥ−Ｓ３１、ＢＡＳＥ−Ｓ１２、ＢＡＳＥ−Ｓ２７、ＢＡＳＥ−Ｓ２８）であった。
【０３９６】
実施例１３
ＢＡＳＥ組み合わせ変異体の洗浄性能及び熱安定性
実施例５において記載されるように、１３の組み合わせＢＡＳＥ変異体は、性能を向上させる変異及び安定性を向上させる性能を組込んで構築した。ＢＡＳＥ−Ｗ１からＢＡＳＥ−Ｗ１３のアルファ−アミラーゼ変異体を表１３−１に示すように、ＭＯＰＳバッファー及び１００％のパーシル（Ｐｅｒｓｉｌ）ＨＤＬ中で熱安定性（Ｔ５０％）について及び２つの異なる条件（ｐＨ８、１６℃及びｐＨ８、３２℃）下にて、ＣＳ２８微小布見本で洗浄性能（ＰＩ又は性能指数）について分析した。
【０３９７】
【表２９】
2012522875.tif 000137
【０３９８】
結果は、いくつかの組み合わせの変異体が、ＷＴ  ＢＡＳＥと比較して著しく増加した洗浄性能及び洗剤安定性を実証することを示す。３つの変異体、ＢＡＳＥ−Ｗ９、ＢＡＳＥ−Ｗ１０及びＢＡＳＥ−Ｗ１１が、低温洗浄において３倍を超える改善を示しながら、同時に１．７５倍を超える改善された洗剤安定性を示す。
【０３９９】
実施例１４
ＢＡＳＥ変異体Ｗ９、Ｗ１０、Ｗ１１及びＡＣＥ−ＱＫの洗浄性能
ＢＡＳＥ変異体Ｗ９、Ｗ１０及びＷ１１及びＡＣＥ−ＱＫの洗浄性能を洗濯用洗剤適用でテストした。汚れ除去は、綿上のＣＦＴ  ＣＳ−２８米澱粉（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ、ヴラールディンゲン、オランダ）及び綿上のＥＭＰＡ１６１デンプン（Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ、Ｓｔ．  Ｇａｌｌｅｎ、スイス）上で、地元のスーパーマーケットから購入し、加熱不活性化したアリエール（Ａｒｉｅｌ）の洗剤（Ｐｒｏｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｌｅ）を用いてラウンダー‐Ｏ‐メーター（ｌａｕｎｄｅｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ）実験において測定した。アリエールの洗剤を８分間ブラザーハイスピード（Ｂｒｏｔｈｅｒ  Ｈｉ−Ｓｐｅｅｄ）電子レンジ中９０℃から１００℃にて不活性化した。洗剤を５０℃未満に冷却し、次に、７分間電子レンジの中で再び加熱した。このステップを一回繰り返した。
【０４００】
ＥＭＰＡ布見本を三刺激ミノルタメーター（Ｔｒｉｓｔｉｍｕｌｕｓ  Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｍｅｔｅｒ）ＣＲ−４００を使用して、光学的反射率により処理前後に測定した。ＣＩＥ−ＬＡＢ色空間によって規定されるように、Ｌ，ａ，ｂ値の差を色差（ｄＥ）の合計に変換した。汚れの洗浄を洗浄前後の色差間の比を取り、汚れていない織物に対する未洗浄の汚れ（洗浄前の）の差とそれを比較することにより、パーセント汚れ除去指標（％ＳＲＩ）として表現する。
【０４０１】
洗浄処理を３０°Ｃでラウンダー‐Ｏ‐メーター（ｌａｕｎｄｅｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ）の中で実施した。洗浄時間は、冷たい水で軽くたたく５分のすすぎ時間を有する４５分間（１５分で３０℃に達し、その後、３０分間３０℃）だった。水硬度を８．５°ＧＨに調節した。また、加熱不活性化したアリエールを４．５ｍｌ／Ｌで使用した。汚れ投入物は、１個のビーカー当たりのＥＭＰＡ  １６１及びＣＦＴ  ＣＳ−２８布見本を各二つプラス６つのスチールボールから成った。洗浄処理の後に、すべての布見本を脱水機にかけ、その後、空気乾燥し、上記に記載されるように、光学的反射率を測定した。そのコントロールは、ベンチマーク商用酵素から成った。結果を図５に示す。
【０４０２】
一般的に、約０．０５から約０．５ｐｐｍ量のＢＡＳＥ変異体の存在は、コントロールと比較して、  Ｗ１０＞Ｗ１１＞Ｗ９＞ＡＣＥ−Ｑのパターンに従ったＢＡＳＥ変異体の相対的な性能で性能を改善した。
【０４０３】
実施例１５
ＢＡＳＥ変異体ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ、Ｗ１０ＥＫ、及びＡＣＥ−ＱＫの洗浄性能
追加のＢＡＳＥ変異体ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ（つまりＷ１１−Ｔ１３１Ｉ−Ｔ１６５Ｉ）、ＢＡＳＥ−Ｗ１０ＥＫ（つまりＢＡＳＥ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｅ−Ｙ３０５Ｒ−Ｄ３１９Ｔ−Ｇ４７５Ｋ）及びＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（つまりＡＣＥ−ＱＫ）の洗浄性能をＴｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒを使用して、洗濯用洗剤適用でテストした。性能評価を１６°Ｃで実施した。汚れ投入物は、１ＬのＤＩ水で満たしたＴｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒの１個のビーカー当たり二つのＣＳ−２８コメデンプン（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ、ヴラールディンゲン、オランダ）、二つのＡＳ−１０色素油ミルク（オランダのＣＦＴ）、二つのＥＭＰＡ  １６１トウモロコシデンプン、二つのＥＭＰＡ  １６０チョコレートクリーム、及びＥＭＰＡ  １６３粥（ＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ、Ｓｔ．  Ｇａｌｌｅｎ（スイス））の布見本から成った。水硬度を１ガロン当たり６グレインに調節し、加熱不活性化したＧｒｅａｔ  Ｖａｌｕｅ（ウォルマート）洗剤を１．０ｍｌ／Ｌで使用した。洗浄時間は１５分だった。洗浄処理の後、すべて布見本を脱水機にかけ、後で空気乾燥した。
【０４０４】
それぞれ汚れをＤ６５（６５００°Ｋ）標準光源へのミノルタ反射計色度メーター  モデルＣＲ−４１０（コニカ  ミノルタ）セットを使用して、光学的反射率によって処理前後に測定した。ＣＩＥ−ＬＡＢ色空間によって規定するように、Ｌ，ａ，ｂ値の差を色差（ｄＥ）の合計に変換した。汚れの洗浄を洗浄前後に色差間の比をとることにより、汚れ除去指標（ＳＲＩ）として表現した。ＥＭＰＡ  １６０布見本の洗浄についての結果を図６に示す。すべて試験したＢＡＳＥ変異体は、コントロールと比較して、効果的な洗浄を示した。
【０４０５】
実施例１６
ＢＡＳＥ変異体及びサブチリシンプロテアーゼ間の洗濯適用相乗作用
汚れ除去のためのＢＡＳＥ及びサブチリシンプロテアーゼ（バシルス  アミロリケファシエンス(Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)サブチリシンＢＰＮ′−Ｙ２１７Ｌ；ＢＰＮ′Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受入番号Ｐ００７８２）の間の相乗作用は、フルスケール洗濯適用でチョコレートクリーム‐汚れＥＭＰＡ  １６０及び粥‐汚れＥＭＰＡ  １６３布見本の上で測定した。ＥＭＰＡ  １６０及びＥＭＰＡ  １６３布見本からの汚れ除去を緩衝液５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（シグマ、Ｈ４０３４）ｐＨ８．０及び加熱不活性化したＴＩＤＥ(商標)２Ｘ冷水洗剤（Ｐｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅ、シンシナティ（オハイオ））中で試験した。業務用洗剤の熱不活性化は、非酵素の成分の特性を保持しながら酵素成分の活性を破壊する役目をする。熱不活性化を２時間９５°Ｃの水浴にあらかじめ量られた液体洗剤（ガラスびんの中）を置くことにより実施した。洗剤を地元のスーパーマーケットから購入した。非加熱及び加熱洗剤は、非活性化パーセンテージを正確に断定するために、洗剤を溶して５分以内に分析した。酵素活性をＡＡＰＦ及びセラルファアッセイによって試験した。
【０４０６】
ＥＭＰＡ布見本をＤ６５（６５００°Ｋ）標準光源へのミノルタ反射計ＣＲ−４１０セットを使用して、光学的反射率によって処理前後に測定した。ＣＩＥ−ＬＡＢ色空間によって規定するように、Ｌ、ａ、ｂ値の差は色差（ｄＥ）の合計に変換した。汚れの洗浄は、洗浄前後の色差間の比をとり、これを汚れていない織物と未洗浄（洗浄の前の）の差と比較することにより、パーセント汚れ除去指標（％ＳＲＩ）として表現した。洗浄処理をケンモア（Ｋｅｎｍｏｒｅ）洗濯機中４４Ｌで実施した。洗濯機を「低温自動温度」セッティングを使用して満たし、水硬度を１５，０００ｇｐｇ  ３：１  Ｃａ：Ｍｇ水硬度原液を用いて６ｇｐｇに調節した。ＴＩＤＥ(商標)冷水不活性化洗剤（４３．１２ｇ）を添加し、温度を３２℃に調節した。サブチリシンプロテアーゼを加え、最終濃度を０．６ｐｐｍにし、ＡＣＥアミラーゼを添加し、最終濃度０．１ｐｐｍとした。洗浄条件につき４つの布見本を使用し、漂白されたコットンインターロックニットをバラストとして添加し、全体の布地投入量を４０ｇ／Ｌとした。洗浄条件は次の通りだった。
第２のすすぎ（３分）を有する通常サイクル（１５．５分）、８９．６ｏＦ／３２℃の洗浄／すすぎ温度、速い撹拌及び速い回転。
洗浄の後に、布見本を低温加熱で機械乾燥し、上記に記載のように光学的反射率によって測定した。
【０４０７】
図７Ａで示すように、ＡＣＥアルファ‐アミラーゼ及びＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼは洗濯適用で相乗作用的な洗浄効果をもたらした。同様の洗濯適用相乗作用試験をＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（ＡＣＥ−ＱＫ）アルファ‐アミラーゼ及びサブチリシンプロテアーゼ（バシルス  アミロリケファシエンス(Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)サブチリシンＢＰＮ′−Ｙ２１７Ｌ変異体）で実施した。図７Ｂで示すように、ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（ＡＣＥ−ＱＫ）アルファ‐アミラーゼ及びＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼは、洗濯適用での相乗効果の洗浄効果をもたらし、ＢＡＳＥ変異体及びプロテアーゼを洗濯適用において優れた洗浄のために併用して使用することができることを示唆する。
【０４０８】
実施例１７
ＢＡＳＥ変異体及びサブチリシンプロテアーゼの用量効果
ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ及びサブチリシンプロテアーゼ（バシルス  アミロリケファシエンス(Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)サブチリシンＢＰＮ′−Ｙ２１７Ｌ；ＢＰＮ′Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受入番号Ｐ００７８２）の選択された濃度の用量効果曲線をＴｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒを使用して作成した。性能評価を２０℃及び４０℃の両方で行った。典型的に、各２つのＣＳ−２８コメデンプン（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ、ヴラールディンゲン、オランダ）、ＡＳ−１０色素油ミルク（オランダのＣＦＴ）、ＥＭＰＡ  １６１トウモロコシデンプン、ＥＭＰＡ  １６０チョコレートクリーム及びＥＭＰＡ  １６３粥（ＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ、Ｓｔ．  Ｇａｌｌｅｎ、スイス）の布見本をＴｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒのスチール製容器に置いた。それは、１ＬのＤＩ水及び１．０ｇの商品のＷＩＳＫ(商標)（Ｓｕｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、アメリカで購入）洗濯用洗剤又は４．５ｇのＯＭＯ(商標)（ユニリーバ、デンマークで購入）洗濯用洗剤で充填された。２つの再現試験を同時に実施した。特段の定めが無い限り、試験を１２分間行い、布見本を３分間すすいだ。洗浄の後、布見本を空気乾燥した。
【０４０９】
汚れはそれぞれ、Ｄ６５（６５００°Ｋ）標準光源へのミノルタ反射計色度メーター  モデルＣＲ−４１０（コニカ  ミノルタ）セットを使用して、光学的反射率によって処理前後に測定した。ＣＩＥ−ＬＡＢ色空間によって規定するように、Ｌ、ａ、ｂ値の差を色差（ｄＥ）の合計に変換した。汚れの洗浄を洗浄前後に色差間の比をとることにより、汚れ除去指標（ＳＲＩ）として表現した。
【０４１０】
表１７−１に示す結果は、ＢＡＳＥ変異体及びプロテアーゼの組合せがいくつかの技術的な洗浄汚れに対して顕著な洗浄有益性をもたらすことを実証する。
これらのデータは、プロテアーゼと組み合わせてＢＡＳＥ変異体を使用すると独特の洗浄有益性が得られることを実証する。
【０４１１】
【表３０】
2012522875.tif 000138
2012522875.tif 000139
2012522875.tif 000140
2012522875.tif 000141
【０４１２】
ＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼと組み合わせる追加的なＢＡＳＥ変異体［つまりＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ（つまりＷ１１−Ｔ１３１Ｉ−Ｔ１６５Ｉ），ＢＡＳＥ  Ｗ１０ＥＫ（つまりＢＡＳＥ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｅ−Ｙ３０５Ｒ−Ｄ３１９Ｔ−Ｇ４７５Ｋ）、及びＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（つまりＡＣＥ−ＱＫ）」間の洗濯適用相乗作用を上記に記載のように、ＥＭＰＡ  １６０及びＥＭＰＡ  １６３布見本の上でさらに試験した。結果を図８（ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ）、図９（ＢＡＳＥ  Ｗ１０ＥＫ）及び図１０（ＡＣＥ−ＱＫ）に示す。これらのデータは、プロテアーゼと組み合わせてＢＡＳＥ変異体を使用すると独特の洗浄有益性が得られることを実証する。
【０４１３】
明細書に言及するすべての文献及び特許は、本明細書開示の技術に関係する当業者の技術水準を示す。本明細書の開示は本発明の目的を実施し、本明細書に述べられた最終製品及び有利な効果、並びに本明細書の記述に内在するものを得るために十分適用できることを当業者は容易に認識できる。本明細書に記載の組成物及び方法は、好ましい実施態様の代表例であり、典型例であり、本明細書の開示する範囲に限定されるものとして意図していない。本明細書には多様な変化及び修飾が本明細書の範囲及び精神を逸脱せずに記載されていることを当業者は容易に理解できる。
【０４１４】
本明細書に説明的に記載される開示は、本明細書にて具体的に開示されていない任意の要素又は要素（複数）、制限又は制限（複数）が存在しないときにも、適切に実施されてよい。本明細書中に使用された用語及び表現は、説明のための用語として使用されるものであり、本発明を限定するものではなく、そのような用語及び表現は、本明細書中に示され、開示された特徴又はそれらの一部の任意の等価物を排除するものとして用いることを意図していない。しかし、多様な修飾が特許請求項の範囲内でありうることは認識される。つまり、本明細書は、好ましい実施態様及び任意の特徴により具体的に記述されたが、当業者は本明細書に記載の概念の修飾及び変化を用いてよく、そのような修飾及び変化は本明細書により記載のように、本明細書の範囲内であると考えられる。
【０４１５】
本発明の開示は、本明細書にて広くかつ総括的に記載されているが、総括的記載に含まれる狭い属及び亜属のグループも本開示の一部を形成する。これは、切除された物質が具体的に本明細書に述べられるかどうかにかかわらず、任意の対象物を上位概念の類から除外するような、条件付の開示又は否定的な限定の記載を伴う上位概念の記載を含む。
【図１−１】
2012522875.tif 000142
【図１−２】
2012522875.tif 000143
【図１−３】
2012522875.tif 000144
【図２】
2012522875.tif 000145
【図３】
2012522875.tif 000146
【図４】
2012522875.tif 000147
【図５】
2012522875.tif 000148
【図６】
2012522875.tif 000149
【図７Ａ】
2012522875.tif 000150
【図７Ｂ】
2012522875.tif 000151
【図８】
2012522875.tif 000152
【図９】
2012522875.tif 000153
【図１０】
2012522875.tif 000154
【配列表】
2012522875000001.app
【国際調査報告】
2012522875.tif 000155
2012522875.tif 000156
2012522875.tif 000157
2012522875.tif 000158
2012522875.tif 000159
2012522875.tif 000160
2012522875.tif 000161
2012522875.tif 000162
2012522875.tif 000163