(57)【要約】本発明は、肺癌の発癌においてＳＹＮＧＲ４遺伝子が果たす役割に関し、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の１つまたは複数に対する二本鎖分子、またはそのような二本鎖分子および抗体を含む組成物、ベクター、もしくは細胞を投与することによって肺癌を治療または予防するための方法を特徴とする。本発明はまた、ＳＹＮＧＲ４の中より選択される１つまたは複数の過剰発現遺伝子を用いて、肺癌を診断するため、または肺癌、特にＮＳＣＬＣもしくはＳＣＬＣを有する患者の予後を評価／判定するための方法を特徴とする。その目的のために、ＳＹＮＧＲ４は肺癌に対する新規の血清学的バイオマーカーとして役立ち得る。また、肺癌における１つまたは複数のＳＹＮＧＲ４の過剰発現に対する化合物の効果を指標として用いる、肺癌を治療および予防するための化合物を同定する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌を診断するための方法であって、
（ａ）（ｉ）ＳＹＮＧＲ４のｍＲＮＡの検出、
（ｉｉ）ＳＹＮＧＲ４タンパク質の検出、
（ｉｉｉ）ＳＹＮＧＲ４タンパク質の生物活性の検出
からなる群より選択される方法のいずれか１つにより、対象由来の生物試料中の該遺伝子の発現レベルを測定する段階；および
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階（ａ）で測定した発現レベルの上昇を、肺癌の存在と関連付ける段階
を含む、方法。
【請求項２】
段階（ａ）で測定した発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％高い、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）で測定した発現レベルが、ＳＹＮＧＲ４タンパク質に対する抗体の結合を検出することによって測定される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記対象由来の生物試料が生検材料、痰、血液、胸水、または尿を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
肺癌を有する患者の予後を評価または判定する方法であって、
（ａ）患者由来の生物試料中の遺伝子の発現レベルを検出する段階；
（ｂ）検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｃ）（ｂ）の比較に基づいて該患者の予後を判定する段階
を含み、該遺伝子がＳＹＮＧＲ４である、方法。
【請求項６】
前記対照レベルが予後良好な対照レベルであり、該対照レベルと比較した発現レベルの上昇が予後不良と判定される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記上昇が前記対照レベルよりも少なくとも１０％高い、請求項５記載の方法。
【請求項８】
（ａ）ＳＹＮＧＲ４のｍＲＮＡの検出；
（ｂ）ＳＹＮＧＲ４タンパク質の検出；および
（ｃ）ＳＹＮＧＲ４タンパク質の生物活性の検出
からなる群より選択されるいずれか１つの方法によって前記発現レベルを測定する、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記患者由来の生物試料が生検材料、痰もしくは血液、胸水、または尿を含む、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
肺癌を診断するため、または肺癌患者の予後を評価もしくは判定するためのキットであって、
（ａ）遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）該遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）該タンパク質の生物活性を検出するための試薬
からなる群より選択される試薬を含み、該遺伝子がＳＹＮＧＲ４である、キット。
【請求項１１】
前記試薬が前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブである、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
前記試薬が前記遺伝子によってコードされる前記タンパク質に対する抗体である、請求項１０記載のキット。
【請求項１３】
細胞に導入されるとＳＹＮＧＲ４のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、二本鎖分子。
【請求項１４】
前記センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０からなる群より選択される標的配列に相当する配列を含む、請求項１３記載の二本鎖分子。
【請求項１５】
前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する前記二本鎖分子を形成する、請求項１４記載の二本鎖分子
【請求項１６】
介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、請求項１３記載の二本鎖分子。
【請求項１７】
一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０からなる群より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、請求項１６記載の二本鎖分子。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項１９】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、または２０のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターが、ＳＹＮＧＲ４遺伝子を発現している細胞に導入されると、該遺伝子の発現を阻害する、ベクター。
【請求項２０】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する癌を治療する方法であって、少なくとも１つの請求項１３記載の単離された二本鎖分子、または請求項１８もしくは１９記載のベクターを投与する段階を含む、方法。
【請求項２１】
治療される癌が肺癌である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子を発現する癌を治療するための組成物であって、少なくとも１つの請求項１３記載の単離された二本鎖分子、または請求項１８もしくは１９記載のベクターを含む、組成物。
【請求項２３】
治療される癌が肺癌である、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
肺癌を治療もしくは予防するため、または肺癌細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項２５】
肺癌を治療もしくは予防するため、または肺癌細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出された、ＳＹＮＧＲ４の該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドの生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項２６】
前記生物活性が、細胞増殖および細胞浸潤の促進からなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
肺癌を治療もしくは予防するため、または肺癌細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物を、ＳＹＮＧＲ４を発現している細胞と接触させる段階；および
（ｂ）試験化合物の非存在下で検出された発現レベルと比較して、ＳＹＮＧＲ４の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項２８】
肺癌を治療もしくは予防するため、または肺癌細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物を、ＳＹＮＧＲ４の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる候補化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項２９】
薬学的有効量の抗ＳＹＮＧＲ４抗体またはその断片を含む、肺癌を治療または予防するための組成物。
【請求項３０】
対象において肺癌を治療または予防するための方法であって、抗ＳＹＮＧＲ４抗体またはその断片を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３１】
ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドとＧＲＢ２ポリペプチドとの間の結合を阻害するため、または癌を治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的同等物をＧＲＢ２ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）段階（ｃ）で、試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較して、結合レベルを低下させるまたは阻害する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項３２】
ＳＹＮＧＲ４の機能的同等物がチロシン−４６を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＳＹＮＧＲ４のリン酸化を阻害するため、または癌を治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的同等物を、該ポリペプチドのリン酸化を可能にする条件下で試験化合物と接触させる段階；
（ｂ）（ａ）に記載のポリペプチドのチロシン−４６残基におけるリン酸化レベルを検出する段階；
（ｃ）該ポリペプチド中のチロシン−４６残基のリン酸化レベルを、該化合物の非存在下で検出されたタンパク質中のチロシン−４６残基のリン酸化レベルと比較する段階；および
（ｄ）該ポリペプチドのチロシン−４６残基のリン酸化レベルを低下させた化合物を候補化合物として選択する段階
を含む、方法。
【請求項３４】
下流エフェクターのリン酸化に関するＳＹＮＧＲ４の活性を阻害するため、または癌を治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ポリヌクレオチドＧＲＢ２およびＰＡＫ１によってコードされるポリヌクレオチドの存在下において、試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ１／２、およびＥＲＫ１／２からなる群より選択されるＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターのうち少なくとも１つのリン酸化のための条件下で接触させる段階；
（ｂ）ＳＹＮＧＲ４の該下流エフェクターのリン酸化レベルを検出する段階；ならびに
（ｃ）該試験化合物の非存在下で検出されたＳＹＮＧＲ４の該下流エフェクターのリン酸化レベルと比較して、ＳＹＮＧＲ４の該下流エフェクターのリン酸化レベルを抑制する試験化合物を選択する段階
を含む、方法。
【請求項３５】
検出されるＳＹＮＧＲ４の該下流エフェクターのリン酸化レベルが、それぞれＰＡＫ１のＴｈｒ４２３、ｃ−ＲａｆのＳｅｒ３３８、ＭＥＫ１のＳｅｒ  ２９８、ＭＥＫ１／２のＳｅｒ２１７／２２１、およびＥＲＫ１／２のＴｈｒ２０２／２０４のリン酸化レベルである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
癌が肺癌である、請求項３１〜３５のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２００８年８月２７日に出願した米国仮特許出願第６１／１９０，３５８号の恩典を主張し、その全開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌研究、癌診断、および癌治療の分野に関する。特に本発明は、肺癌を検出および診断する方法、ならびに肺癌を治療および予防する方法に関する。さらに本発明は、肺癌を治療および／または予防するための薬剤をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肺癌は最もよく見られる癌の１つであり、世界中の癌による死因の第１位である（非特許文献１：Shibuya K et al., BMC Cancer 2002, 2:37）。放射線療法および化学療法などの様々な補助治療様式と組み合わせて最新の手術技法を用いているにもかかわらず、肺癌患者の全５年生存率はいまだ約２０％に留まっている（非特許文献２：Naruke T, et al., Ann Thorac Surg 2001, 71(6): 1759-64）。ゲフィチニブおよびベバシズマブなどの分子標的薬が最近開発されたことは希望をもたらすが、ゲフィチニブによる間質性肺炎またはベバシズマブによる重篤な出血などの致死的有害事象が報告されている。したがって、有害な副作用を伴わずに癌特異的分子を標的とする新しい薬剤の開発が緊急に必要である（非特許文献３：Ranson M, et al., J Clin Oncol 2002, 20: 2240-50；非特許文献４：Inoue A, et al., Lancet 2003, 361: 137-9；非特許文献５：Johnson DH, et al., J Clin Oncol 2004, 22: 2184-91）。発癌機能を有する癌精巣抗原のいくつかを含む癌抗原は、理想的な治療標的である。癌精巣抗原とは、癌細胞においては高発現するが、精巣、卵巣、および胎盤などの生殖組織の細胞を除く正常細胞では高発現しないタンパク質と定義される。これらの組織に由来する細胞はＭＨＣクラスＩ分子を発現しないため、癌精巣抗原は、癌ワクチンなどの免疫療法の有望な標的であるとも考えられている（非特許文献６：Daigo Y, et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53）。
【０００４】
ｃＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた数千個の遺伝子の発現レベルの体系的な解析は、発癌の経路に関与する分子、または抗癌療法に対する有効性を有する分子を同定するための有効なアプローチであり；そのような遺伝子の一部またはそれらの遺伝子産物は、新規療法を開発するための優れた標的分子および／または癌バイオマーカーとなり得る。以前、レーザーマイクロダイセクションによる腫瘍細胞の濃縮と共に、１０１例の臨床肺癌試料のゲノム全域にわたる発現プロファイル解析が行われ、次いで３１例の正常ヒト組織（成人器官２７例および胎児器官４例）の発現プロファイルデータとの比較がなされた（非特許文献６：Daigo Y, et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53; 非特許文献７：Kikuchi T, et al., Oncogene 2003, 22: 2192-205; 非特許文献８：Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003, 1: 485-99; 非特許文献９：Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004, 13: 3029-43; 非特許文献１０：Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006, 28: 799-805; 非特許文献１１：Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006, 29: 567-75）。
【０００５】
本発明では、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析とＲＮＡ干渉技術の組み合わせによって、スクリーニング系を確立した（非特許文献１２：Suzuki C, et al., Cancer Res 2003, 63: 7038-41; 非特許文献１３：Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 8363-70; 非特許文献１４：Kato T, et al., Cancer Res 2005, 65: 5638-46; 非特許文献１５：Furukawa C, et al., Cancer Res 2005, 65: 7102-10; 非特許文献１６：Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005, 65: 9176-84; 非特許文献１７：Suzuki C, et al., Cancer Res 2005, 65: 11314-25; 非特許文献１８：Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006, 97: 737-45; 非特許文献１９：Takahashi K, et al., Cancer Res 2006, 66: 9408-19; 非特許文献２０：Hayama S, et al., Cancer Res 2006, 66: 10339-48; 非特許文献２１：Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 434-42; 非特許文献２２：Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007, 6: 542-51; 非特許文献２３：Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25; 非特許文献２４：Hayama S, et al., Cancer Res 2007, 67: 4113-22 ; 非特許文献２５：Kato T, et al., Cancer Res 2007, 67: 8544-53; 非特許文献２６：Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 6624-31; 非特許文献２７：Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007, 67: 11601-11; 非特許文献２８：Mano Y, et al., Cancer Sci 2007, 98: 1902-13; 非特許文献２９：Suda T, et al., Cancer Sci 2007, 98: 1803-8; 非特許文献３０：Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008, 14: 2363-70; 非特許文献３１：Mizukami Y, et al., Cancer Sci 2008, 99: 1448-54）。シナプトギリン４（「ＳＹＮＧＲ４」）が、原発性肺癌で一般的に過剰発現しかつ細胞浸潤および癌細胞の増殖／生存に関与する新規な癌精巣抗原であることが、この体系的なアプローチによって明らかになった。
【０００６】
ＳＹＮＧＲ４は、１９番染色体長腕（１９ｑ−ａｒｍ）神経膠腫腫瘍抑制領域におけるその染色体局在性が初めて記載された２５  ｋＤタンパク質である（非特許文献３２：Smith JS, et al., Genomics 2000, 64: 44-50）。ＳＹＮＧＲ４は、シナプトギリンファミリーの新規メンバーであると考えられている。ＳＹＮＧＲ１〜３は、神経細胞または非神経細胞内の微小胞において豊富に発現する（非特許文献３３：Kedra D, et al., Hum Genet 1998, 273: 2851-7；非特許文献３４：Janz R, et al., Neuron 1999, 24: 687-700；非特許文献３５：Zhao H, et al., Mol Biol Cell 2001, 12: 2275-89）。ＳＹＮＧＲ１およびＳＹＮＧＲ２（セルギリン）の機能は十分に特徴付けられている。ＳＹＮＧＲ１とＳＹＮＧＲ２は異なる発現プロファイルを有し、ＳＹＮＧＲ１は主に中枢神経系で発現し、ＳＹＮＧＲ２は脳を除く様々な器官で偏在的に発現する（非特許文献３３：Kedra D, et al., Hum Genet 1998, 273: 2851-7）。ＳＹＮＧＲ１タンパク質はニューロンのシナプス小胞に局在し、ニューロンの可塑性および細胞膜からのエンドサイトーシスに機能的に影響を与える（非特許文献３４：Janz R, et al., Neuron 1999, 24: 687-700；非特許文献３５：Zhao H, et al., Mol Biol Cell 2001, 12: 2275-89）。ＳＹＮＧＲ２タンパク質は、大部分の細胞型で偏在的に認められるシナプス様微小胞（ＳＬＭＶ）の成分である（非特許文献３６：Belfort GM, et al., J Biol Chem 2003, 278: 47971-8；非特許文献３７：Belfort GM, et al., J Biol Chem 2005, 280: 7262-72）。ＳＹＮＧＲ２は、ＳＬＭＶ内の主要な成分タンパク質であるシナプトフィジンをＳＬＭＶ表面に動員することにより、ＳＬＭＶの生合成に重要である（非特許文献３６：Belfort GM, et al., J Biol Chem 2003, 278: 47971-8；非特許文献３７：Belfort GM, et al., J Biol Chem 2005, 280: 7262-72）。ＳＹＮＧＲ３タンパク質はＳＹＮＧＲ１と同じ発現プロファイルを示すが、ＳＹＮＧＲ３の正確な機能は不明である（非特許文献３８：Belizaire R, et al., J Comp Neurol 2004, 470: 266-81）。ＳＹＮＧＲ４の生理学的機能および発癌機能は十分に記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Shibuya K et al., BMC Cancer 2002, 2:37
【非特許文献２】Naruke T, et al., Ann Thorac Surg 2001, 71(6): 1759-64
【非特許文献３】Ranson M, et al., J Clin Oncol 2002, 20: 2240-50
【非特許文献４】Inoue A, et al., Lancet 2003, 361: 137-9
【非特許文献５】Jphnson DH, et al., J Clin Oncol 2004, 22: 2184-91
【非特許文献６】Daigo Y, et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53
【非特許文献７】Kikuchi T, et al., Oncogene 2003, 22: 2192-205
【非特許文献８】Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003, 1: 485-99
【非特許文献９】Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004, 13: 3029-43
【非特許文献１０】Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006, 28: 799-805
【非特許文献１１】Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006, 29: 567-75
【非特許文献１２】Suzuki C, et al., Cancer Res 2003, 63: 7038-41
【非特許文献１３】Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 8363-70
【非特許文献１４】Kato T, et al., Cancer Res 2005, 65: 5638-46
【非特許文献１５】Furukawa C, et al., Cancer Res 2005, 65: 7102-10
【非特許文献１６】Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005, 65: 9176-84
【非特許文献１７】Suzuki C, et al., Cancer Res 2005, 65: 11314-25
【非特許文献１８】Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006, 97: 737-45
【非特許文献１９】Takahashi K, et al., Cancer Res 2006, 66: 9408-19
【非特許文献２０】Hayama S, et al., Cancer Res 2006, 66: 10339-48
【非特許文献２１】Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 434-42
【非特許文献２２】Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007, 6: 542-51
【非特許文献２３】Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25
【非特許文献２４】Hayama S, et al., Cancer Res 2007, 67: 4113-22
【非特許文献２５】Kato T, et al., Cancer Res 2007, 67: 8544-53
【非特許文献２６】Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 6624-31
【非特許文献２７】Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007, 67: 11601-11
【非特許文献２８】Mano Y, et al., Cancer Sci 2007, 98: 1902-13
【非特許文献２９】Suda T, et al., Cancer Sci 2007, 98: 1803-8
【非特許文献３０】Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008, 14: 2363-70
【非特許文献３１】Mizukami Y, et al., Cancer Sci 2008, 99: 1448-54
【非特許文献３２】Smith JS, et al., Genomics 2000, 64: 44-50
【非特許文献３３】Kedra D, et al., Hum Genet 1998, 273: 2851-7
【非特許文献３４】Janz R, et al., Neuron 1999, 24: 687-700
【非特許文献３５】Zhao H, et al., Mol Biol Cell 2001, 12: 2275-89
【非特許文献３６】Belfort GM, et al., J Biol Chem 2003, 278: 47971-8
【非特許文献３７】Belfort GM, et al., J Biol Chem 2005, 280: 7262-72
【非特許文献３８】Belizaire R, et al., J Comp Neurol 2004, 470: 266-81
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、癌ワクチン療法の理想的な標的である癌精巣抗原のメンバーとしてのＳＹＮＧＲ４の発見、ならびに肺での発癌および腫瘍進行におけるＳＹＮＧＲ４の役割に一部基づいている。ＳＹＮＧＲ４は、肺癌に対する有用な予後バイオマーカーおよび治療標的である。
【０００９】
したがって本発明は、ＳＹＮＧＲ４に関し、かつ肺癌の発癌およびＳＹＮＧＲ４を過剰発現するその他の癌における、その役割に関する。よって本発明は、ＳＹＮＧＲ４を過剰発現する癌、例えば肺癌、特にＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣを検出、診断、治療、および／または予防するための組成物および方法、ならびにＳＹＮＧＲ４と結合するおよび／またはＳＹＮＧＲ４を阻害する有用な薬剤をスクリーニングする方法に関する。
【００１０】
特に本発明は、ＳＹＮＧＲ４の発現を阻害する特異的配列（詳細には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０）からなる二本鎖分子が、ＳＹＮＧＲ４を過剰発現している癌細胞、例えば肺癌細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという発見に一部起因する。具体的には、本発明により、ＳＹＮＧＲ４遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が提供される。これらの二本鎖分子は単離状態で用いることができ、またはベクターにコードさせて、該ベクターから発現させることもできる。したがって、そのような二本鎖分子を、ならびに、ＳＹＮＧＲ４の発現を阻害するそれらを発現するベクターおよび宿主細胞を提供することは、本発明の目的である。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターをそれを必要とする対象に投与することにより、細胞増殖を阻害するためおよび肺癌を治療するための方法を提供する。そのような方法は、１つまたは複数の該二本鎖分子またはベクターからなる組成物を対象に投与する段階を包含する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、ＳＹＮＧＲ４の発現を阻害するのに有効である本発明の二本鎖分子またはベクターの少なくとも１つを含む、肺癌を治療するための組成物を提供する。
【００１３】
さらに別の局面において、本発明は、患者由来の生物試料中のＳＹＮＧＲ４の発現レベルを測定することにより、対象における肺癌に対する素因を診断または決定する方法を提供する。ＳＹＮＧＲ４の正常対照レベルと比較してＳＹＮＧＲ４の発現レベルが上昇していることにより、対象が肺癌に罹患しているか、または肺癌の発症リスクを有することが示される。
【００１４】
さらに本発明は、ＳＹＮＧＲ４の高発現レベルが、癌患者、特に肺癌患者における生存率不良と相関するという発見に関する。したがって本発明は、癌、例えば肺癌を有する患者の予後を評価または判定するための方法を提供し、該方法は、ＳＹＮＧＲ４の発現レベルを検出する段階、それを所定の参照発現レベルと比較する段階、およびそれらの違いから患者の予後を判定する段階を含む。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、ＳＹＮＧＲ４の過剰発現によって促進される、または引き起こされる、または一部促進される癌、例えば肺癌を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような化合物は、ＳＹＮＧＲ４遺伝子と結合するか、ＳＹＮＧＲ４の生物活性を低下させるか、ＳＹＮＧＲ４と他のタンパク質との間の相互作用を阻害するか、または、ＳＹＮＧＲ４遺伝子もしくはＳＹＮＧＲ４遺伝子の転写開始領域によって制御されたレポーター遺伝子の発現を低下させると考えられている。
【００１６】
１つの局面において、本発明は、ＳＹＮＧＲ４タンパク質に結合するおよび／またはＳＹＮＧＲ４タンパク質の活性を阻害する抗体を投与することによって、ＳＹＮＧＲ４の過剰発現によって促進される、または引き起こされる、または一部促進される癌、例えば肺癌を治療または予防する方法を提供する。
【００１７】
本発明の１つまたは複数の局面が特定の目的を満たし得る一方、１つまたは複数の他の局面が特定の他の目的を満たし得ることが、当業者によって理解されよう。各目的は、すべての点において本発明のすべての局面に等しく当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的は、本発明の任意の１つの局面に関して択一的に考慮され得る。本発明のこれらおよびその他の目的物および特徴は、実施例および添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読んだ場合に、より完全に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ−Ｃ】腫瘍組織、細胞株、および正常組織におけるＳＹＮＧＲ４発現の解析。Ａ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出した、臨床肺癌試料１５例および正常肺組織試料（上パネル）［肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；上部］、ならびに肺癌細胞株２２例（下パネル）におけるＳＹＮＧＲ４の発現。Ｂ、ＳＹＮＧＲ４陽性およびＳＹＮＧＲ４陰性の肺癌細胞株、ならびに気管支上皮細胞における内因性ＳＹＮＧＲ４タンパク質の発現および細胞内局在性。ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＬＣ３１９、Ａ５４９、およびＳＢＣ３細胞では、ＳＹＮＧＲ４は粒状の外観を呈して主に細胞質において染色されかつ細胞表面上で弱く染色されたのに対し、ＮＣＩ−Ｈ１７８１ならびに気管支上皮由来のＢＥＡＳ−２Ｂ細胞株およびＳＡＥＣ細胞株では、染色は認められなかった。Ｃ、Ｃ末端ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ＳＹＮＧＲ４をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞において抗ｍｙｃ抗体を用いた、および、Ｎ末端３×Ｆｌａｇタグ付ＳＹＮＧＲ４をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞において抗Ｆｌａｇ抗体を用いた、免疫細胞化学による細胞表面ＳＹＮＧＲ４の検出。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを行っても行わなくても細胞表面上のＳＹＮＧＲ４の染色が認められたが、酸性グリシンにより細胞表面抗体を除去することによりＳＹＮＧＲ４染色は消失し、このことからＳＹＮＧＲ４のＣ末端およびＮ末端が細胞膜の外側にあることが示される。
【図１Ｄ】Ｄ、フローサイトメトリーによる、肺癌細胞株における細胞表面ＳＹＮＧＲ４の検出。ＳＹＮＧＲ４は、ＳＹＮＧＲ４発現細胞株の細胞表面上で検出された。
【図２】正常組織および肺癌におけるＳＹＮＧＲ４の発現、ならびにＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連性。Ａ、正常ヒト成人組織１６例におけるＳＹＮＧＲ４転写産物のノーザンブロット解析。精巣において強力なシグナルが観察された。Ｂ、免疫組織化学による、正常組織と肺癌との間のＳＹＮＧＲ４タンパク質発現の比較。Ｃ、肺癌組織および正常組織におけるＳＹＮＧＲ４の強発現、弱発現、および発現なしの例（左写真）。元の拡大率、×１００。ＳＹＮＧＲ４の発現レベルによる、ＮＳＣＬＣ患者の生存のカプラン・マイヤー解析を示す（ログランク検定によりＰ＝０．０００２）（右パネル）。
【図３Ａ】ＳＹＮＧＲ４の増殖促進効果。Ａ、ＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の増殖の阻害。上方パネル、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した、ｓｉ−ＳＹＮＧＲ４（＃１および＃２）および対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＰ／高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子、ｓｉ−ＬＵＣ／ルシフェラーゼ）による、Ａ５４９細胞（左）およびＳＢＣ−５細胞（右）におけるＳＹＮＧＲ４発現に対する遺伝子ノックダウン効果。下方パネル、ｓｉ−ＳＹＮＧＲ４または対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞およびＳＢＣ−５細胞のコロニー形成アッセイおよびＭＴＴアッセイ。カラム、３つ組アッセイの相対吸光度；バー、ＳＤ。
【図３Ｂ】Ｂ、ＳＹＮＧＲ４を外因的に過剰発現するＣＯＳ−７細胞またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細胞増殖の促進。上方パネル、ウエスタンブロッティングによる一過性ＳＹＮＧＲ４発現の検出。下方パネル、ＳＹＮＧＲ４発現ベクターのトランスフェクションから９６時間後のＣＯＳ−７細胞のＭＴＴアッセイ。カラム、３つ組アッセイの相対吸光度；バー、ＳＤ。
【図４Ａ】ＳＹＮＧＲ４の細胞浸潤効果。Ａ、ＳＹＮＧＲ４を外因的に過剰発現する哺乳動物細胞における細胞浸潤の促進。上パネル、ウエスタンブロッティングにより検出した、ＣＯＳ−７細胞（左）およびＮＩＨ３Ｔ３細胞（右）におけるＳＹＮＧＲ４タンパク質の一過性発現。下パネル、ヒトＳＹＮＧＲ４の発現プラスミドをトランスフェクトした後の、マトリゲル基質におけるＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の浸潤性を実証するアッセイ。ギムザ染色（×２００；左下）、およびマトリゲル被覆フィルターを通して遊走する細胞の数を示すグラフパネル（右下）。バー、ＳＤ。アッセイは３つ組ウェルで３回行った。
【図４Ｂ】Ｂ、外因的にＳＹＮＧＲ４を発現するＣＯＳ−７細胞における細胞浸潤活性に対する抗ＳＹＮＧＲ４抗体の阻害効果。左パネル、抗ＳＹＮＧＲ４抗体もしくはアイソタイプＩｇＧ、またはＰＢＳで処理した浸潤ＣＯＳ−７細胞の顕微鏡下での評価。右パネル、マトリゲル被覆フィルターを通して遊走するＣＯＳ−７細胞の数；バー、ＳＤ。アッセイは３つ組ウェルで３回行った。
【図４Ｃ】Ｃ、肺癌細胞における細胞浸潤活性に対する抗ＳＹＮＧＲ４抗体の阻害効果。上パネル、抗ＳＹＮＧＲ４抗体、アイソタイプＩｇＧ、またはＰＢＳで処理した浸潤Ａ５４９細胞（左）および浸潤ＮＣＩ−Ｈ１７８１細胞（右）の顕微鏡下での評価。下パネル、マトリゲル被覆フィルターを通して浸潤する癌細胞の数；バー、ＳＤ。アッセイは３つ組ウェルで３回行った。
【図５Ａ−Ｂ】ＳＹＮＧＲ４とＧＲＢ２との相互作用。Ａ、ＳＹＮＧＲ４のリン酸化の同定。左上パネル、ＣＯＳ−７細胞における外因性ＳＹＮＧＲ４タンパク質のホスファターゼ処理。ホスファターゼ処理した試料におけるバンドの移動は、ＳＹＮＧＲ４がリン酸化されたことを示す。左下パネル、外因的にＳＹＮＧＲ４を発現するＣＯＳ−７細胞またはモックベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に由来する溶解物の免疫沈降物の、抗リン酸化チロシン抗体による免疫ブロット。右パネル、ＳＹＮＧＲ４タンパク質のタンパク質配列。数字はＮ末端からのアミノ酸を示す。Ｂ、哺乳動物細胞における、免疫沈降（ＩＰ）による外因性ＳＹＮＧＲ４とＧＲＢ２との結合の確認。左パネル、ＣＯＳ−７細胞にモックまたはＳＹＮＧＲ４をトランスフェクトし、これを抗ｍｙｃ抗体によるＩＰ−ｍｙｃに供し、続いて抗ＧＲＢ２抗体を用いて免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った。同時に、沈降させていない細胞溶解物（インプット）を用いた免疫ブロッティングを行った。ＳＹＮＧＲ４の免疫沈降を確認するため、抗ｍｙｃ抗体を用いて再免疫ブロッティングを行った。右パネル、ＣＯＳ−７細胞にモックまたはＳＹＮＧＲ４をトランスフェクトし、抗ＧＲＢ２抗体によるＩＰ−ＧＲＢ２を行い、続いて抗ｍｙｃ抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。ＧＲＢ２の免疫沈降を確認するため、抗ＧＲＢ２抗体を用いて再免疫ブロッティングを行った。
【図５Ｃ】Ｃ、ＳＹＮＧＲ４におけるチロシン−４６のフェニルアラニンとの置換（ＳＹＮＧＲ４−Ｙ４６Ｆ）により、ＳＹＮＧＲ４中のチロシン−４６はリン酸化され、ＧＲＢ２との相互作用に重要であった。左パネル、ＣＯＳ−７細胞にモックまたは野生型（ＷＴ）ＳＹＮＧＲ４またはＳＹＮＧＲ４−Ｙ４６Ｆをトランスフェクトし、抗Ｆｌａｇ抗体によるＩＰ−Ｆｌａｇを行い、続いて抗リン酸化チロシン抗体による免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った。右パネル、ＣＯＳ−７細胞にモックまたはＳＹＮＧＲ４−ＷＴまたはＳＹＮＧＲ４−Ｙ４６Ｆをトランスフェクトし、これを抗ｍｙｃ抗体を用いたＩＰ−ｍｙｄに供し、続いて抗ＧＲＢ２抗体を用いる免疫ブロッティングを行った。ＳＹＮＧＲ４の免疫沈降を確認するため、抗ｍｙｃ抗体を用いる再免疫ブロッティングを行った。
【図６Ａ】上流であるＳＹＮＧＲ４依存的ＧＲＢ２−ＰＡＫ１経路を介したＭＡＰＫシグナル伝達の活性化。Ａ、哺乳動物細胞におけるＳＹＮＧＲ４またはＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションによる、ＭＡＰＫシグナル伝達分子のリン酸化の状態。左パネル、ＣＯＳ−７細胞にモックまたはＳＹＮＧＲ４をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に、細胞溶解物を抗リン酸化ｃ−ＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）抗体、抗ｃ−ＲＡＦ抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）抗体、抗リン酸化ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗ｍｙｃ抗体、および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。右パネル、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ−３細胞にＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に、細胞溶解物を抗リン酸化ｃ−ＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）抗体、抗ｃ−ＲＡＦ抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）抗体、抗リン酸化ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、抗ＥＲＫ抗体、および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いる免疫ブロッティングに供した。細胞全ＲＮＡも取得し、逆転写反応を行い、続いてＰＣＲ反応を行って、ＳＹＮＧＲ４転写産物のノックダウンを評価した。ＧＡＰＤＨ転写産物を内部対照として使用した。
【図６Ｂ−Ｄ】Ｂ、ＳＹＮＧＲ４によるＭＡＰＫシグナル伝達を増強する効果は、ＧＲＢ２に仲介される。ＧＲＢ２に対するｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）をＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４時間後に、細胞にモックまたはＳＹＮＧＲ４をトランスフェクトした。２回目のトランスフェクションの２４時間後に、細胞溶解物を続いて抗リン酸化ｃ−ＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）抗体、抗ｃ−ＲＡＦ抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）抗体、抗リン酸化ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗ＧＲＢ２抗体、抗ｍｙｃ抗体、および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いる免疫ブロッティングに供した。Ｃ、変異ＳＹＮＧＲ４を発現するＣＯＳ−７細胞における、ＭＡＰＫシグナル伝達を増強する機能の低下。ＣＯＳ−７細胞にモック、野生型ＳＹＮＧＲ４（ＷＴ）、または変異ＳＹＮＧＲ４（Ｙ４６Ｆ）をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に、細胞溶解物を抗リン酸化ｃ−ＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）抗体、抗ｃ−ＲＡＦ抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）抗体、抗リン酸化ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗ｍｙｃ抗体、および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いる免疫ブロッティングに供した。Ｄ、肺癌細胞における、ＳＹＮＧＲ４トランスフェクションによるＰＡＫ１リン酸化の影響。Ａ５４９細胞およびＳＢＣ−３細胞に、ＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に、細胞溶解物を抗リン酸化ＰＡＫ１（Ｔｈｒ４２３）抗体、抗ＰＡＫ１抗体、および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いる免疫ブロッティングに供した。細胞全ＲＮＡも取得し、逆転写反応を行い、続いてＰＣＲ反応を行って、ＳＹＮＧＲ４転写産物のノックダウンを評価した。ＧＡＰＤＨ転写産物を内部対照として使用した。
【図６Ｅ】Ｅ、ＳＹＮＧＲ４によるＭＡＰＫシグナル伝達を増強する効果は、ＰＡＫ１に仲介される。ＰＡＫ１に対するｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）をＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４時間後に、細胞にモックまたはＳＹＮＧＲ４をトランスフェクトした。２回目のトランスフェクションの２４時間後に、細胞溶解物を続いて抗リン酸化ｃ−ＲＡＦ（Ｓｅｒ３３８）抗体、抗ｃ−ＲＡＦ抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）抗体、抗リン酸化ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗ＰＡＫ１抗体、抗ｍｙｃ抗体、および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いる免疫ブロッティングに供した。
【図６Ｆ−Ｇ】Ｆ、変異ＳＹＮＧＲ４を発現するＣＯＳ−７細胞における、細胞の増殖および浸潤を促進する機能低下。左パネル、ＣＯＳ−７細胞にモック、野生型ＳＹＮＧＲ４（ＷＴ）、または変異ＳＹＮＧＲ４（Ｙ４６Ｆ）をトランスフェクトし、１２０時間後にコロニー形成アッセイ（上）およびＭＴＴアッセイ（下）を行った。カラム、３つ組アッセイの相対吸光度；バー、ＳＤ。右パネル、ＣＯＳ−７細胞にモック、ＳＹＮＧＲ４−ＷＴ、またはＳＹＮＧＲ４−Ｙ４６Ｆをトランスフェクトし、マトリゲル浸潤チャンバーにアプライして２２時間インキュベーションし、続いてマトリゲル被覆フィルターを通して遊走する細胞を計数した。ギムザ染色（×２００；右上）、および遊走細胞の数を示すグラフパネル（右下）。バー、ＳＤ。アッセイは３つ組ウェルで３回行った。Ｇ、ＳＹＮＧＲ４に関する推定の相互作用カスケード。
【図７】補足図。Ａ、ＳＹＮＧＲ４抗体に対する抗原ペプチドのプレインキュべーションを伴うまたは伴わない肺癌細胞の免疫組織化学。Ｂ、ＧＴＰ結合ＲＡＳを検出するためのＲＡＦ１プルダウンアッセイ。ＣＯＳ−７細胞にモックプラスミドまたはＳＹＮＧＲ４発現プラスミドをトランスフェクトし、２４時間後に、細胞溶解物を組換え活性ＲＡＦ１結合ビーズとのインキュベーションに供し、続いて抗ＲＡＳ抗体を用いる免疫ブロッティングを行った。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という語は、特記しない限り「少なくとも１つの」を意味する。
【００２０】
本明細書で用いる「生物試料」という用語は、生物全体、またはその組織（例えば、肺組織）、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、血清、血漿、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、痰、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。「生物試料」はさらに、生物全体またはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製されたホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、またはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生物試料」は、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含む、その中で生物が増殖したニュートリエントブロスまたはゲルなどの培地を指す。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーを指すよう本明細書において互換的に用いられ、かつ特記しない限り、その一般に認められている１文字コードで呼ばれる。本用語は、１つまたは複数の核酸がエステル結合によって結合している核酸（ヌクレオチド）ポリマーに適用される。核酸ポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせからなってよく、天然および非天然の核酸ポリマーの両方を包含する。
【００２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう本明細書において互換的に用いられる。本用語は、天然アミノ酸ポリマーのみならず、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００２３】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子またはＳＹＮＧＲ４タンパク質
本発明における遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は以下の番号で示されるが、これらに限定されるわけではない；
ＳＹＮＧＲ４：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４。
【００２４】
さらに、配列データは以下のアクセッション番号によっても入手可能である：
ＳＹＮＧＲ４：ＮＭ＿０１２４５１。
【００２５】
本発明は、ＳＹＮＧＲ４発現が新規ＧＲＢ２／ＰＡＫ１／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化を通して細胞の増殖／生存および転移を促すことにより肺腫瘍の進行を促進し得ることを、初めて開示するものである。
【００２６】
ＧＲＢ２遺伝子またはＧＲＢ２タンパク質
本発明における遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は以下の番号で示されるが、これらに限定されるわけではない；
ＧＲＢ２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２〜２５。
【００２７】
さらに、配列データは以下のアクセッション番号によっても入手可能である：
ＧＲＢ２：ＮＭ＿００２０８６およびＮＭ＿２０３５０６。
【００２８】
この遺伝子によってコードされるタンパク質は上皮増殖因子受容体と結合し、１つのＳＨ２ドメインおよび２つのＳＨ３ドメインを含む。その２つのＳＨ３ドメインは、他のタンパク質のプロリンリッチ領域との複合体形成を指示し、そのＳＨ２ドメインはチロシンリン酸化配列と結合する。この遺伝子は、シグナル伝達経路に関与する線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）のＳｅｍ５遺伝子と類似している。この遺伝子に関して、異なるアイソフォームをコードする２つの選択的スプライシング転写産物変異体が見出されている。変異体（１）（ＮＭ＿００２０８６）はより長い転写産物であり、より長いアイソフォームをコードする。
【００２９】
ＰＡＫ１遺伝子またはＰＡＫ１タンパク質
本発明における遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は以下の番号で示されるが、これらに限定されるわけではない；
ＰＡＫ１：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６〜２９。
【００３０】
さらに、配列データは以下のアクセッション番号によっても入手可能である：
ＰＡＫ１：ＮＭ＿００１１２８６２０およびＮＭ＿００２５７６。
【００３１】
ＰＡＫタンパク質は、ＲｈｏＧＴＰアーゼを細胞骨格再構成および核シグナル伝達に結びつける重要なエフェクターである。セリン／スレオニンｐ２１活性化キナーゼのファミリーであるＰＡＫタンパク質には、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、およびＰＡＫ４が含まれる。これらのタンパク質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｃｄｃ４２およびＲａｃの標的として働き、広範な生物活性に関与している。ＰＡＫ１は、細胞の運動性および形態を調節する。この遺伝子に関して、異なるアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写産物変異体が見出されている。変異体（１）（ＮＭ＿００１１２８６２０）は、より長いアイソフォームをコードする。
【００３２】
ｃ−Ｒａｆ遺伝子またはｃ−Ｒａｆタンパク質
本発明における遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は以下の番号で示されるが、これらに限定されるわけではない；
ｃ−Ｒａｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０〜３１。
【００３３】
さらに、配列データは以下のアクセッション番号によっても入手可能である。
ｃ−Ｒａｆ：ＮＭ＿００２８８０。
【００３４】
この遺伝子は、ウイルスｒａｆ遺伝子（ｖ−ｒａｆ）の細胞ホモログである。コードされるタンパク質はＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）であり、これは膜結合型ＧＴＰアーゼのＲａｓファミリーに直接結合し、その下流で機能する。ひとたび活性化されると、細胞ＲＡＦ１タンパク質は、二重特異性プロテインキナーゼＭＥＫ１およびＭＥＫ２をリン酸化して活性化することができ、これらが次にセリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼであるＥＲＫ１およびＥＲＫ２をリン酸化して活性化する。活性化されたＥＲＫは細胞生理の多面的なエフェクターであり、細胞分裂周期、アポトーシス、細胞分化、および細胞遊走に関与する遺伝子発現の制御において重要な役割を果たす。この遺伝子の変異は、ヌーナン症候群５およびレオパード症候群２と関連している。
【００３５】
ＭＥＫ１／２の遺伝子またはタンパク質
本発明における遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は以下の番号で示されるが、これらに限定されるわけではない；
ＭＥＫ１：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２および３３、ＭＥＫ２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４および３５。
【００３６】
さらに、配列データは以下のアクセッション番号によっても入手可能である：
ＭＥＫ１：ＮＭ＿００２７５５、ＭＥＫ２：ＮＭ＿０３０６６２。
【００３７】
ＭＥＫ１は、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼキナーゼとして作用する二重特異性プロテインキナーゼファミリーのメンバーである。細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）としても知られるＭＡＰキナーゼは、多数の生化学的シグナルの統合点として作用する。このプロテインキナーゼはＭＡＰキナーゼの上流に位置し、多種多様な細胞外シグナルおよび細胞内シグナルを受けてＭＡＰキナーゼの酵素活性を刺激する。このキナーゼはＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の必須成分として、増殖、分化、転写調節、および発生などの多くの細胞過程に関与する。ＭＥＫ２は、ＭＡＰキナーゼキナーゼファミリーに属する二重特異性プロテインキナーゼである。このキナーゼは、マイトジェン増殖因子シグナル伝達において重要な役割を果たすことが知られている。これは、ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ２およびＭＡＰＫ２／ＥＲＫ３をリン酸化し、したがってそれらを活性化する。このキナーゼ自体の活性化は、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼによるＳｅｒ／Ｔｈｒリン酸化に左右される。この遺伝子の変異は、心臓顔面皮膚（ｃａｒｄｉｏｆａｃｉｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ）症候群遅滞、およびヌーナン症候群において認められるものと類似した特有の顔貌を引き起こす。このキナーゼの阻害または分解が、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）および炭疽菌の病原性に関与することも判明している。この遺伝子に関して、第７染色体に位置するモック遺伝子が同定されている。
【００３８】
ＥＲＫ１／２の遺伝子またはタンパク質
本発明における遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は以下の番号で示されるが、これらに限定されるわけではない；
ＥＲＫ１：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６〜４１、ＥＲＫ２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜４５。
【００３９】
さらに、配列データは以下のアクセッション番号によっても入手可能である：
ＥＲＫ１：ＮＭ＿００２７４６、ＮＭ＿００１０４００５６、ＮＭ＿００１１０９８９１、ＥＲＫ２：ＮＭ＿００２７４５、ＮＭ＿１３８９５７。
【００４０】
ＥＲＫ１はＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）としても知られるＭＡＰキナーゼは、様々な細胞外シグナルに応答して増殖、分化、および細胞周期進行などの様々な細胞過程を調節する、シグナル伝達カスケードにおいて働く。このキナーゼは上流キナーゼによって活性化され、結果として核に移行し、そこで核内標的をリン酸化する。異なるタンパク質アイソフォームをコードする選択的スプライシング転写産物変異体が記載されている（ＮＭ＿００２７４６、ＮＭ＿００１０４００５６、ＮＭ＿００１１０９８９１）。変異体（１）（ＮＭ＿００２７４６）は最も一般的な転写産物に相当し、アイソフォーム１をコードする。ＥＲＫ２はＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）としても知られるＭＡＰキナーゼは、多数の生化学的シグナルの統合点として作用し、増殖、分化、転写調節、および発生などの多種多様な細胞過程に関与する。このキナーゼの活性化には、上流キナーゼによる自身のリン酸化が必要である。活性化されると、このキナーゼは刺激された細胞の核に移行し、そこで核内標的をリン酸化する。この遺伝子に関して、同一タンパク質をコードするがＵＴＲが異なる２つの選択的スプライシング転写産物変異体が報告されている。この変異体（１）（ＮＭ＿００２７４５）は、より長い転写産物である。変種１（ＮＭ＿００２７４５）および変異体２（ＮＭ＿１３８９５７）はいずれも同一のタンパク質をコードする。
【００４１】
本発明の一局面によれば、機能的同等物もまた上記の「ポリペプチド」であるとみなされる。本明細書において、タンパク質の「機能的同等物」とは、該タンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。すなわち、その生物活性を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的同等物として用いることができる。そのような機能的同等物には、タンパク質の天然アミノ酸配列に対して１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。あるいは、該ポリペプチドは、デフォルト設定に設定された公知の配列比較アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴまたはＡＬＩＧＮを用いて測定すると各タンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも称する）を有する、より好ましくは、参照配列、例えばＳＹＮＧＲ４ポリペプチド、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に対して少なくとも約９０％、９３％、９５％、９７％、９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列から構成されてもよい。他の態様において、該ポリペプチドは、遺伝子の天然ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの態様において、該ポリペプチドは、公知の配列比較アルゴリズムを用いて測定すると参照配列、例えばＳＹＮＧＲ４ポリヌクレオチド、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に対して少なくとも約９０％、９３％、９５％、９７％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、これを産生させるために用いた細胞もしくは宿主または使用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異を有しうる。しかしながらこれは、本発明のヒトタンパク質の機能と同等の機能を有する限り、本発明の範囲内に含まれる。
【００４３】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度  ｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である（Ｔｍにおいて標的配列が過剰に存在する場合、プローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、５０℃での洗浄。
【００４４】
本発明の文脈において、上記のヒトタンパク質と機能的に同等のポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって規定通り選択され得る。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて６８℃で３０分間またはそれ以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、６８℃で１時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。それに続く洗浄工程は、例えば低ストリンジェント条件下で行い得る。例示的な低ストリンジェント条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。高ストリンジェント条件の使用が好ましいことが多い。例示的な高ストリンジェント条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおける室温で２０分間の洗浄を３回行った後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける３７℃で２０分間の洗浄を３回行い、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける５０℃で２０分間の洗浄を２回行うことが含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
【００４５】
一般的に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている。実際、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の１つもしくは複数の置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。
【００４６】
タンパク質の活性が維持されている限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。本発明において、本発明者らは、強力なＳＹＮＧＲ４発現がＮＳＣＬＣ患者の臨床転帰不良と関連していること、ｓｉＲＮＡによるＳＹＮＧＲ４の内因的発現の阻害により肺癌細胞の生存率が顕著に低下すること、ならびに、哺乳動物細胞においてＳＹＮＧＲ４の外因的発現により細胞増殖および細胞の遊走／浸潤活性が増大することを実証した。さらに、ＳＹＮＧＲ４中のＴｙｒ４６がリン酸化され、これがＧＲＢ２との結合にとって、および同じくＧＲＢ２／ＰＡＫ１／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化にとっても重要であることが明らかになった。しかしながら、アミノ酸配列の５％またはそれ未満を変更することが一般的に好ましい。したがって、好ましい態様において、このような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般的に、３０アミノ酸またはそれ未満、好ましくは２０アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは１０アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは６アミノ酸またはそれ未満、およびさらにより好ましくは３アミノ酸またはそれ未満である。
【００４７】
突然変異されるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存された別のアミノ酸に突然変異されることが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および共通して以下の官能基または特徴を有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有する側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有する側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有する側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有する側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；および芳香族を含有する側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を規定する保存的置換表は当技術分野で周知である。例えば、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００４８】
このように保存的に修飾されたポリペプチドが本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、タンパク質は、該タンパク質の少なくとも１種類の生物活性が保持されている限り、非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質は、多型変異体、種間ホモログ、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によりコードされるものも含む。
【００４９】
さらに、本発明の遺伝子は、タンパク質のそのような機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。上記の配列情報に基づき合成されたプライマーを用いて、タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加え、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。ヒトの遺伝子およびタンパク質とそれぞれ機能的に同等なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは典型的に、４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％から９５％またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。
【００５０】
抗体
本明細書中で使用される「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を含むことが意図される。抗体は、ヒト抗体、霊長類化（primatized）抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射性標識と融合させた抗体、および抗体断片を含み得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）を包含し、かつ、所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」とは全てのクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
【００５１】
ＳＹＮＧＲ４に特異的に結合する抗体は、肺癌細胞の増殖および浸潤活性を阻害するのに有用である（図４Ａ〜Ｃおよび図６Ｆ）。
【００５２】
したがって本発明の抗体は、肺癌を治療するために有用である。これらの抗体は、公知の方法によって産生することができる。本発明に従って用いられる抗体を産生するための例示的な技法は当技術分野で公知であり、本明細書に記載される。
【００５３】
本発明は、肺癌を治療および予防するためにＳＹＮＧＲ４に対する抗体を用いる。これらの抗体は公知の方法によって提供される。本発明によって用いられる例示的な抗体産生技術について記載する。
【００５４】
（ｉ）ポリクローナル抗体：
ポリクローナル抗体は、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射により動物中で産生されることが好ましい。二官能性物質または誘導体化物質、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、またはＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲおよびＲは異なるアルキル基である）を用いて、免疫されるべき種における免疫原性を有するタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害因子に関連抗原を結合させることが有用でありうる。
【００５５】
例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を３倍容量のフロイント完全アジュバントと混合し、複数の部位に溶液を皮内注射することによって、抗原、例えばＳＹＮＧＲ４、免疫原性結合体、または誘導体に対して動物を免疫する。１ヶ月後、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたは結合体を当初量の１／５〜１／１０用いて、複数部位での皮下注射により、動物を追加免疫する。７〜１４日後、動物の採血を行い、抗体力価について血清を分析する。力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。好ましくは、同一抗原の結合体であるが別のタンパク質におよび／または別の架橋試薬を介して結合されている結合体を用いて、動物を追加免疫する。
【００５６】
結合体を、タンパク質融合体として組換え細胞培養物中で作成してもよい。同様に、免疫反応を増強するためにミョウバンなどの凝集剤が適切に用いられる。
【００５７】
（ｉｉ）モノクローナル抗体：
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる可能性のある天然の変異体を除き同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体との混合物ではないという抗体の特徴を示す。
【００５８】
例えばモノクローナル抗体は、Kohler G & Milstein C. Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて産生することができ、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によっても産生されうる。
【００５９】
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターなどを上記のように免疫して、免疫に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロにおいて免疫してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
【００６０】
このように調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一つまたは複数の物質を含有することが好ましい適切な培養培地中に播種し、その培地中で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンリン酸化リボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損しているならば、ハイブリドーマ用の培養培地には典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質によってＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
【００６１】
好ましい骨髄腫細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を補助し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性を有するものである。中でも好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびに、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒトモノクローナル抗体の産生に関して、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Kozbor D, et al., J Immunol. 1984 Dec;133(6):3001-5；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【００６２】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、または、放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）などの、インビトロ結合測定によって決定される。
【００６３】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson PJ & Rodbard D. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39の３０スキャッチャード分析によって決定することができる。
【００６４】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、このクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適した培養培地の例として、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＬ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍のようなインビボで増殖させることもできる。
【００６５】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【００６６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ＤＮＡを単離すると、発現ベクターの中に配し、これを次に、免疫グロブリンタンパク質を他の方法では産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクションして、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する総説には、Skerra A. Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):256-62 and Pluckthun A. Immunol Rev. 1992 Dec;130:151-88が含まれる。
【００６７】
ＳＹＮＧＲ４に対して反応性を示す特異的抗体または抗体断片を産生するための別の方法とは、細菌中で発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部分をコードする発現ライブラリーを、ＳＹＮＧＲ４を用いてスクリーニングすることである。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域、およびＦｖ領域をファージ発現ライブラリーを用いて細菌中で発現させることができる。例えば、Ward ES, et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6; Huse WD, et al., Science. 1989 Dec 8;246(4935):1275-81; and McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4を参照されたい。ＳＹＮＧＲ４ペプチドを用いてそのようなライブラリーをスクリーニングすることによって、ＳＹＮＧＲ４に対して反応性を有する免疫グロブリン断片を同定することができる。あるいは、抗体またはその断片を産生するためにＳＣＩＤ−ｈｕ−マウス（Ｇｅｎｐｈａｒｍから入手できる）を用いてもよい。
【００６８】
さらなる態様において、抗体または抗体断片は、McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4に記載されている技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離することができ；Clarkson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8; and Marks JD, et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991) J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97では、ファージライブラリーを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離についてそれぞれ記載している。その後の刊行物では、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Marks JD, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Jul;10(7):779-83）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としての組み合わせ感染およびインビボ組換え（Waterhouse P, et al., Nucleic Acids Res. 1993 May 11;21(9):2265-6）について記載されている。このようにこれらの技術は、モノクローナル抗体単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わる実行可能な手段である。
【００６９】
例えば、ヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列を相同的なマウス配列と置き換えることにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison SL, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Nov;81(21):6851-5）、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部もしくは一部を共有結合的に連結することにより、ＤＮＡを改変することもできる。
【００７０】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを抗体の定常ドメインの代わりに用いるか、またはそれらを抗体の一方の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いて、ある抗原に対して特異性を有する一つの抗原結合部位および別の抗原に対して特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作成する。
【００７１】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体：
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、非ヒト供給源由来の一つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と呼ばれることが多く、これらは典型的に「移入」可変ドメインから取り出されている。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5; Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7; Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6）にしたがい、超可変領域配列をヒト抗体の相当する配列の代わりに用いることによって実施可能である。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、ここで、無傷のヒト可変ドメインには実質的に満たないものが相当する非ヒト種由来の配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は通常、一部の超可変領域残基および場合により一部のＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似部位に由来する残基で置換されている、ヒト抗体である。
【００７２】
ヒト化抗体を作成する際に用いる、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「最良適合（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）とする（Sims MJ, et al., J Immunol. 1993 Aug 15;151(4):2296-308; Chothia C & Lesk AM. J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループにおける全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を用いる。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体に用いることができる（Carter P, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9; Presta LG, et al., J Immunol. 1993 Sep 1;151(5):2623-32）。
【００７３】
抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の過程によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元高次構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検討によって、候補免疫グロブリン配列の機能において残基が果たす可能性の高い役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性増大などの所望の抗体の特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列および移入配列から選択して組み合わせることができる。一般に、超可変領域の残基は、抗原結合に直接的かつ最も実質的に影響を及ぼす。
【００７４】
（ｉｖ）ヒト抗体：
ヒト化の代わりに、ヒト抗体を作成することができる。例えば現在、免疫の際に、内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失によって内因性抗体の産生が完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖系列変異体マウスの中にヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することで、抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。例えば、Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5; Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8; Bruggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、および同第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【００７５】
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4）を用いて、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロにおいてヒト抗体および抗体断片を産生することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要なまたは主要ではない外被タンパク質遺伝子の中にインフレームでクローニングされ、機能的抗体断片としてファージ粒子の表面上に提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づく選択によって、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択も行われる。すなわち、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは種々の形式で行うことができる；その総説については、例えば、Johnson KS & Chiswell DJ. Curr Opin Struct Biol. 1993 ;3:564-71を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。
【００７６】
Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8では、免疫マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模な無作為コンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原の多様なアレイ（自己抗原を含む）に対する抗体をMarks JD, et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97、またはGriffiths AD, et al., EMBO J. 1993 Feb;12(2):725-34により記載されている技術に本質的にしたがって単離することができる。同様に、米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号を参照されたい。
【００７７】
インビトロ活性化Ｂ細胞によってヒト抗体を作成することもできる（米国特許２０  ５，５６７，６１０および５，２２９，２７５参照）。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作成する好ましい手段は、共同所有される同時係属中の出願に開示されている。
【００７８】
（ｖ）抗体断片：
さまざまな技術が抗体断片の産生のために開発されている。従来は、無傷の抗体のタンパク質分解消化を介してこれらの断片が得られていた（例えば、Morimoto K & Inouye K. J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar;24(1-2):107-17; Brennan M, et al., Science. 1985 Jul 5;229(4708):81-3を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片を上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成させてもよい（Carter P, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):163-7）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の態様において、最適な抗体とは一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開公報第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。また抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性または二重特異性を有しうる。
【００７９】
（ｖｉ）非抗体結合タンパク質：
「非抗体結合タンパク質」または「非抗体リガンド」または「抗原結合タンパク質」という用語は、下記でより詳細に論じられる、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子、および抗体様結合ペプチド模倣体を含む、非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する抗体模倣体を互換可能に指す。
【００８０】
抗体と同じ様式で標的化および標的への結合を行う他の化合物も、開発されている。これらの「抗体模倣体」の一部は、非免疫グロブリンタンパク質骨格を抗体の可変領域に対するタンパク質フレームワークの代替として使用する。
【００８１】
例えば、Ladner et al.（米国特許第５，２６０，２０３号）には、凝集しているが分子的には分離している、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と同様の結合特異性を有する一本鎖ポリペプチド結合分子が記載されている。該一本鎖結合分子は、ペプチドリンカーにより連結した抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方の抗原結合部位を含有し、２つのペプチド抗体と同様の構造に折り畳まれる。一本鎖結合分子は、サイズがより小さいこと、安定性がより大きいこと、およびより容易に修飾されること等の、従来の抗体に優るいくつかの利点を示す。
【００８２】
Ku et al. (Proc Natl Acad Sci USA 92(14):6552-6556 (1995))は、シトクロムｂ５６２に基づく抗体の代替物を記載している。Ku et al. (1995)は、シトクロムｂ５６２のループのうち２つを無作為化しかつウシ血清アルブミンに対する結合に関して選択したライブラリを作り出した。個々の突然変異体は、抗ＢＳＡ抗体と同様に選択的にＢＳＡに結合することが見出された。
【００８３】
Lipovsek et al.（米国特許第６，８１８，４１８号および同第７，１１５，３９６号）は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様タンパク質骨格、および少なくとも１つの可変ループを特徴とする抗体模倣体を記載している。アドネクチンとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的リガンドに関する高い親和性および特異性を含む、天然抗体または改変抗体と同じ特徴の多くを示す。新たなまたは改善された結合タンパク質を発展させる任意の技術を、これらの抗体模倣体と共に使用することができる。
【００８４】
これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の構造と類似している。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と本質的に類似した抗原結合特性および親和性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体および抗体断片に優る或る特定の利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は固有の折り畳み安定性に関してジスルフィド結合に依存せず、したがって、通常は抗体が分解され得る条件下で安定である。また、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の構造と類似しているため、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスと類似したループの無作為化およびシャフリングのプロセスを、インビトロで用いることができる。
【００８５】
Beste et al.（Proc Natl Acad Sci USA 96(5): 1898-1903 (1999)）は、リポカリン骨格（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））に基づく抗体模倣体を記載している。リポカリンは、タンパク質末端に４つの超可変ループを有するβバレルからなる。Beste（1999）は、該ループをランダム突然変異誘発に供し、例えばフルオレセインとの結合に関して選択した。３つの変異体がフルオレセインとの特異的な結合を示し、１つの変異体が抗フルオレセイン抗体と類似する結合を示した。さらなる分析によって、無作為化位置が全て可変であることが明らかとなったが、これはＡｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）が抗体の代替物としての使用に適切であり得ることを意味する。
【００８６】
Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）は、典型的には１６０残基〜１８０残基の小さな一本鎖ペプチドであり、生産コストの減少、貯蔵安定性の増大、および免疫反応の減少を含む、抗体に優るいくつかの利点を提供する。
【００８７】
Hamilton et al.（米国特許第５，７７０，３８０号）は、結合部位として使用される複数の可変ペプチドループが付着した、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を使用した合成抗体模倣体を記載している。ペプチドループは全て、互いに対してカリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出している。この幾何学的構造のために、全てのループが結合に利用可能であり、これによって、リガンドに対する結合親和性が増加する。しかしながら、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体はペプチドのみからなるものではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。上記骨格も純粋にペプチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡからなるものではなく、これは、この抗体模倣体が厳しい環境条件において比較的安定であり、寿命が長いことを意味する。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応をもたらす可能性は低い。
【００８８】
Murali et al.（Cell Mol Biol. 49(2): 209-216 (2003)）は、抗体をより小さいペプチド模倣体にする方法論を記載している。該ペプチド模倣体は「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）と称され、これもまた抗体に対する代替物として有用であり得る。
【００８９】
Silverman et al.（Nat Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561）は、「アビマー」と称される複数のドメインを含む一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質を記載している。アビマーは、ヒト細胞外受容体ドメインからインビトロエキソンシャフリングおよびファージディスプレイにより開発され、様々な標的分子に対する親和性および特異性に関して抗体と幾らか類似するクラスの結合タンパク質である。得られるマルチドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して改善された親和性（場合によってはｎＭ以下の）および特異性を示し得る、複数の独立した結合ドメインを含むことができる。アビマーの構築法および使用法に関するさらなる詳細は、例えば米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、同第２００５００４８５１２号、同第２００５００５３９７３号、同第２００５００８９９３２号、および同第２００５０２２１３８４号に開示されている。  
【００９０】
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、その全てが本発明による使用に適している、ＲＮＡ分子および非天然オリゴマー（例えばプロテアーゼインヒビター、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、およびβターン模倣体）を非限定的に含む化合物においても、抗体特性は模倣されている。  
【００９１】
（ｖｉｉ）医薬製剤：
本発明に従って使用される本発明の抗体の治療用製剤は、貯蔵のために、所望の純度を有する抗ＳＹＮＧＲ４抗体を任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams and Wilkins, 2005）と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製され得る。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、採用する用量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００９２】
皮下投与に適合させた凍結乾燥製剤は、国際公開公報第９７／０４８０１号に記載される。そのような凍結乾燥製剤を適切な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成し、この再構成した製剤を本明細書において治療される哺乳類に皮下投与してもよい。
【００９３】
本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に対する必要に応じて２種類以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない補完的な活性を有する活性化合物も含有し得る。例えば、化学療法剤、サイトカイン、または免疫抑制剤をさらに提供するのが望ましいこともある。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患または障害または治療のタイプ、および上述の他の要素に左右される。これらは一般に、本明細書の上記で使用したのと同じ用量および投与経路で使用され、または従来採用されてきた用量の約１％〜９９％で使用される。
【００９４】
有効成分はまた、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおける、例えばコアセルベーション技術によりまたは界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入してもよい。そのような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams and Wilkins, 2005に開示されている。
【００９５】
持続放出調製品を調製してもよい。適切な持続放出調製品の例としては、薬剤を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリクス（マトリクスは成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である）が挙げられる。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルとの共重合体、非（noir）分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから成る注射可能なミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。インビボ投与に使用する製剤は滅菌されてなくてはならない。これは滅菌ろ過膜を介したろ過により容易に達成される。
【００９６】
（ｘ）抗体を用いた治療：
抗ＳＹＮＧＲ４抗体を含む組成物は、適正な医療行為と整合する様式で処方、投薬、および投与され得る。好ましくは、本発明の抗体はヒト抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体のｓｃＦｖ、または抗体断片である。この文脈において考慮される要素としては、治療される特定の肺癌、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾患または障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者に既知の他の要素が挙げられる。投与される抗体の治療的有効量は、このような考慮により調整される。
【００９７】
一般的な提案として、１回の投与あたりの、非経口的に投与される抗体の治療的有効量は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重／日の範囲であり、使用される抗体の典型的な初期範囲は約２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００９８】
しかしながら、上述したように、これらの提唱される抗体量は治療における裁量に大いに委ねられる。適当な投与量およびスケジューリングの選択における重要な要素とは、前述のように、得られる結果である。
【００９９】
例えば、進行中および急性の疾患の治療に関しては、初期に比較的大きな投与量が必要とされ得る。疾患または障害に応じた最も効果的な結果を得るために、抗体は、疾患または障害の最初の兆候、診断、出現、または発生に可能な限り近く、または疾患または障害の寛解の間に投与され得る。
【０１００】
抗体は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、吸入投与、および鼻腔内投与、ならびに、局所免疫抑制治療が所望される場合には病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与され得る。非経口注入には筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。
【０１０１】
また、例えば抗体の投与量を減少させたパルス注入により、抗体を適切に投与してもよい。好ましくは、投薬は、投与が短期であるか長期であるかに一部依存するが、注射により、最も好ましくは静脈内または皮下注射により行なわれる。
【０１０２】
さらに、細胞毒性剤、化学療法剤、免疫抑制剤、および／またはサイトカイン等の他の化合物を、本明細書における抗体とともに投与してもよい。併用投与には、別個の製剤または単一の医薬製剤を用いた同時投与、およびいずれかの順序での連続投与が含まれるが、この場合、両方の（または全ての）活性剤が同時にその生物活性を発揮する期間があるのが好ましい。
【０１０３】
患者への抗体の投与に加え、本発明は、遺伝子治療による抗体の投与を意図する。抗体をコードする核酸のそのような投与は、「治療的有効量の抗体を投与する」という表現に包含される。例えば、細胞内抗体を産生するための遺伝子治療の使用に関する、１９９６年３月１４日付で公開された国際公開公報第９６／０７３２１号を参照されたい。
【０１０４】
インビボおよびエクスビボにおける、核酸（任意でベクター中に含有される）を患者の細胞に入れるための２つの主要なアプローチが存在する。インビボ送達については、通常は抗体が必要である部位において、核酸を患者に直接注射する。エクスビボ治療については、患者の細胞を取り出し、これらの単離された細胞に核酸を導入し、改変細胞を患者に直接投与するか、または例えば多孔質膜に封入してこれを患者に移植する（例えば米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号を参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な多様な技術が存在する。核酸をインビトロで意図される宿主の培養細胞中に移入させるのかまたはインビボで細胞に移入させるのかに応じて、技術は異なる。インビトロでの哺乳類細胞への核酸の移入に適した技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法等が含まれる。遺伝子のエクスビボ送達に関して一般に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
【０１０５】
現在好ましいインビボ核酸移入技術としては、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、またはアデノ随伴ウイルス等）を用いたトランスフェクション、および脂質ベースのシステム（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである）が挙げられる。場合によっては、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド等の標的細胞を標的とする薬剤と共に、核酸供給源を供給するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスと関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、例えば特定の細胞型に指向性のあるカプシドタンパク質またはその断片、循環中にインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を標的としかつ細胞内半減期を増大させるタンパク質を標的化するためおよび／またはその取り込みを容易にするために使用してもよい。受容体媒介エンドサイトーシス技術は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)およびWagner et al, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)により記載されている。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子治療のプロトコルの概説に関しては、Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992)を参照されたい。また、国際公開公報第９３／２５６７３号、およびその中に引用される参考文献も参照されたい。
【０１０６】
二本鎖分子
本明細書で使用される「二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。いくつかの態様において、二本鎖分子は単離されているか組換え型である。
【０１０７】
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡが転写される鋳型をＤＮＡとした技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術を用いる。ｓｉＲＮＡとしては、ＳＹＮＧＲ４センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＳＹＮＧＲ４アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
【０１０８】
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
【０１０９】
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１１０】
本明細書で使用される「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなる二本鎖ポリヌクレオチド分子を指し、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドとＲＮＡからなるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有し得るものを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡとしては、ＳＹＮＧＲ４センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＳＹＮＧＲ４アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）またはその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
【０１１１】
本明細書で使用される「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つの分子の構築物を指す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」のポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される（キメラ分子）か、あるいは代替的に、一方の分子がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【０１１２】
本明細書で使用される「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１１３】
本明細書で用いられる「単離された核酸」とは、その元の環境（例えば、天然由来である場合には天然の環境）から取り出され、かつしたがってその天然状態から合成によって改変された、核酸である。本発明において、単離された核酸の例には、ＤＮＡ、RＮＡ、およびこれらの誘導体が含まれる。
【０１１４】
標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ＳＹＮＧＲ４に対する二本鎖分子は、該遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写産物に結合し、それにより翻訳に干渉し、かつしたがってタンパク質の発現を阻害することによって、ＳＹＮＧＲ４遺伝子でコードされるＳＹＮＧＲ４タンパク質の産生を低減または阻害する。本明細書において実証されるように、肺癌細胞株におけるＳＹＮＧＲ４の発現は、ＳＹＮＧＲ４コード遺伝子に特異的にアニーリングするｄｓＲＮＡによって阻害された（図３Ａ）。
【０１１５】
したがって本発明は、ＳＹＮＧＲ４を発現している細胞に導入されるとＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現を阻害する、単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、後述のものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計され得る。
【０１１６】
ＳＹＮＧＲ４標的配列は、例えば以下のヌクレオチドを含む。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の３８９〜４０７ｎｔの位置）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の７５４〜７７２ｎｔの位置）
【０１１７】
具体的には、本発明は、以下の二本鎖分子［１］〜［１８］を提供する：
［１］  細胞に導入されるとＳＹＮＧＲ４の発現を特異的に阻害する、単離された二本鎖分子であって、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、二本鎖分子；
［２］  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の３８９〜４０７ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の７５４〜７７２ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡに作用する、［１］記載の二本鎖分子；
［３］  前記センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２］記載の二本鎖分子；
［４］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［３］に記載の二本鎖分子；
［５］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［４］に記載の二本鎖分子；
［６］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［５］に記載の二本鎖分子；
［７］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の二本鎖分子；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［７］に記載の二本鎖分子；
［９］介在一本鎖によって連結されたセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を有する単一ポリヌクレオチドからなる、［１］に記載の二本鎖分子；
［１０］一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、センス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、［Ａ’］は、［Ａ］と相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［９］に記載の二本鎖分子；
［１１］ＲＮＡからなる、［１］に記載の二本鎖分子；
［１２］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなる、［１］に記載の二本鎖分子；
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１４］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１３］に記載の二本鎖分子；
［１５］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１６］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、または、センス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡである、［１５］に記載の二本鎖分子；
［１７］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドからなる、［１６］に記載の二本鎖分子；ならびに
［１８］３’オーバーハングを含有する、［２］に記載の二本鎖分子。
【０１１８】
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
【０１１９】
細胞内の標的遺伝子発現を阻害する能力をもつ二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば、その全体が本明細書中で参照により組み入れられる米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ambionのウェブサイトから入手可能である（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）。
【０１２０】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
【０１２１】
標的部位の選択：
１．  転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のアミノ酸とその３’側に隣接する１９ヌクレオチドとの出現を記録する。Tuschl et al.は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’非翻訳領域および開始コドン近傍（７５塩基以内）の領域に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２．  潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるＮＣＢＩサーバー上のＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17): 3389-402）。
３．  合成用の的確な標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って標的配列をいくつか選択して評価するのが一般的である。
【０１２２】
上記プロトコルを用い、本発明の単離された二本鎖分子の標的配列を、ＳＹＮＧＲ４遺伝子についてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０として設計した。
【０１２３】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、該標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力に関して調べた。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する：
ＳＹＮＧＲ４遺伝子についてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の３８９〜４０７ｎｔの位置）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の７５４〜７７２ｎｔの位置）、１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５１９〜５３７ｎｔの位置）、および２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５２０〜５３８ｎｔの位置）。
【０１２４】
本発明の二本鎖分子は単一の標的ＳＹＮＧＲ４遺伝子配列を対象としてもよく、または複数の標的ＳＹＮＧＲ４遺伝子配列を対象としてもよい。
【０１２５】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子の上述の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子としては、標的配列の核酸配列および／または標的配列に相補的な配列のいずれかを含む単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。ＳＹＮＧＲ４遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、もしくは２０の配列を含むものおよび／またはこれらのヌクレオチドに相補的な配列が挙げられる。しかしながら本発明はこれらの例に限定されず、修飾分子がＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上述の核酸配列における軽微な修飾が許容可能である。本明細書において核酸配列に関連して用いられる「軽微な修飾」という語句は、該配列に対する１つ、２つまたはいくつかの核酸の置換、欠失、付加または挿入を示す。本発明の文脈において、核酸の置換、欠失、付加および／または挿入に適用される「いくつかの」という用語は、３〜７個の、好ましくは３〜５個の、より好ましくは３〜４個の、さらにより好ましくは３個の核酸残基を意味しうる。
【０１２６】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。本明細書で後述する実施例では、ＳＹＮＧＲ４遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖またはそれに相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖分子を、標準的な方法に従い、（例えば、Ａ５４９およびＳＢＣ−５を用いて）肺癌細胞株におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子産物の産出を低減させる能力に関してインビトロで試験した。さらに例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べて、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子産物の低減は、例えば、実施例１「半定量的ＲＴ−ＰＣＲ」の項で言及されたＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡに対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてＳＹＮＧＲ４遺伝子産物の産生を低減する配列を、次に、肺癌細胞増殖に対するこれらの阻害効果に関して試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて肺癌細胞増殖を阻害する配列を、肺癌を有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いてこれらのインビボでの能力に関して試験し、ＳＹＮＧＲ４産物の産生の低減および肺癌細胞増殖の低減を確認することができる。
【０１２７】
単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合し得る。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。１つの好ましい態様において、このような二重鎖は１０個のマッチあたりわずか１個のミスマッチしか含有しない。特に好ましい態様では、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。
【０１２８】
ＳＹＮＧＲ４については、ポリヌクレオチドが１０００ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子については５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＳＹＮＧＲ４遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、または二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子を形成するのに使用される場合、ポリヌクレオチドのセンス鎖は１９ヌクレオチドより長くてよく、好ましくは２１ヌクレオチドより長く、より好ましくは約１９〜２５ヌクレオチド長である。したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
【０１２９】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含有し得る。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう（国際公開公報第０３／０７０７４４号、国際公開公報第２００５／０４５０３７号）。一態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込み（ＵＳ２００６０１２２１３７）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３０】
別の態様では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的化効率を増大させるために修飾を用いることができる。そのような修飾の例としては、二本鎖分子の相補鎖２つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３’末端または５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（国際公開公報第２００４／０２９２１２号）が、これらに限定されるわけではない。
【０１３１】
別の態様において、標的ｍＲＮＡにおけるおよび／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる（国際公開公報第２００５／０４４９７６号）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドが突出したヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換してもよい（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、ＵＳ２００６０２３４９７０などの公開文献が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
【０１３２】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とからなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方にＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成してもよい。
【０１３３】
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡからなってもよく、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなってもよい。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がＲＮＡであることが必要である。
【０１３４】
キメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）がＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。あるいは、センス鎖の５’末端に隣接する領域および／またはアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域を、上流部分領域と称する。即ち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、または、センス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域との両方がＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：
５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、および
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’
：アンチセンス鎖。
【０１３５】
好ましくは上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５’側領域およびアンチセンス鎖では３’側領域）がＲＮＡでありかつもう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる（ＵＳ２００５０００４０６４）。
【０１３６】
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および、ＤＮＡとＲＮＡからなるショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、続いてＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合し、これを切断する。
【０１３７】
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、ＳＹＮＧＲ４についてのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０のヌクレオチドの中から選択され得る。
【０１３８】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、標的となるＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現を抑制する能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する修飾配列であってもよい。領域［Ａ］は領域［Ａ’］とハイブリダイズし、領域［Ｂ］からなるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中から選択することができる（ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【０１３９】
ヘアピンループ構造を有する本発明の二本鎖分子の好ましい例を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＣＡＡＧＡＵＧＧＡＧＵＣＵＣＣＧＣＡＧ−［Ｂ］−ＣＵＧＣＧＧＡＧＡＣＵＣＣＡＵＣＵＵＧ
（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
ＡＵＧＡＵＧＣＵＣＣＡＧＵＣＣＣＵＵＡ−［Ｂ］−ＵＡＡＧＧＧＡＣＵＧＧＡＧＣＡＵＣＡＵ
（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；
ＣＧＣＡＵＵＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＧＣＵ−［Ｂ］−ＡＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＣＧ
（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；
ＧＣＡＵＵＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＧＣＵＵ−［Ｂ］−ＡＡＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＣ
（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）。
【０１４０】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「ｕ」を３’オーバーハングとして標的配列のアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加される「ｕ」の数は少なくとも２個、一般に２〜１０個、好ましくは２〜５個である。付加される「ｕ」は二本鎖分子のアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。
【０１４１】
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することが好ましい。化学合成法に従って、一本鎖のセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する特定の例には、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約３：７のモル比で、より好ましくは約４：６のモル比で、最も好ましくは実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が挙げられる。
【０１４２】
その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、ＳＹＮＧＲ４配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。ＳＹＮＧＲ４遺伝子鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。
【０１４３】
本発明の二本鎖分子を含有するベクター：
本明細書に記載の二本鎖分子を１つまたは複数含有するベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
【０１４４】
具体的には、本発明は以下のベクター［１］〜［１０］を提供する。
［１］  細胞に導入されるとＳＹＮＧＲ４の発現を特異的に阻害する二本鎖分子をコードするベクターであって、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、ベクター。
［２］  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の３８９〜４０７ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の７５４〜７７２ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５１９〜５３７ｎｔの位置）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５２０〜５３８ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡに作用する前記二本鎖分子をコードする、［１］記載のベクター；
［３］  前記センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［１］記載のベクター；
［４］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１００ヌクレオチド長未満の該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［３］記載のベクター；
［５］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約７５ヌクレオチド長未満の該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［４］記載のベクター；
［６］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約５０ヌクレオチド長未満の該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［５］記載のベクター；
［７］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約２５ヌクレオチド長未満の該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［６］記載のベクター；
［８］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１９〜約２５ヌクレオチド長の該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［７］記載のベクター；
［９］  前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載のベクター；
［１０］  一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する二本鎖分子をコードし、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［９］記載のベクター。
【０１４５】
本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードすることが好ましい。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、または癌を治療するための有効成分として直接用いることができる。
【０１４６】
あるいは本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターを提供し、ここで該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターは、ＳＹＮＧＲ４遺伝子を発現している細胞に導入されると、該遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、本ポリヌクレオチドは、約１９〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド配列に由来する連続したヌクレオチド）である。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写産物を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０を含むヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【０１４７】
本発明のベクターは、例えば、調節配列が（ＤＮＡ分子の転写によって）両方の鎖の発現を可能にする様式で機能的にＳＹＮＧＲ４配列に連結されるように、ＳＹＮＧＲ４配列を発現ベクターにクローニングすることによって作製することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされるＤＮＡの３’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、該ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば該クローニングされるＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
【０１４８】
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためのものを包含してもよい（例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、および国際公開公報第９８／０４７２０号を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに媒介される）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１４９】
本発明のベクターは、例えばウイルス性または細菌性のベクターを含む。発現ベクターの例としては、牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin；ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１５０】
本発明の二本鎖分子を用いて癌細胞の増殖を阻害または低減する方法および癌を治療する方法：
特定のｓｉＲＮＡがＮＳＣＬＣを阻害する能力は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２００５／８９７３５号で既に記載されている。本発明においては、ＳＹＮＧＲ４に対する２種類の異なるｄｓＲＮＡを、肺癌細胞増殖を阻害する能力に関して試験した。ＳＹＮＧＲ４に対する２種類のｄｓＲＮＡ（図３Ａ、３Ｂ）は肺癌細胞株における該遺伝子の発現を効果的にノックダウンし、これは細胞増殖の抑制と一致した。
【０１５１】
したがって本発明は、ＳＹＮＧＲ４の発現を阻害することによって肺癌細胞増殖を阻害するための方法を提供する。ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現は、ＳＹＮＧＲ４遺伝子を特異的に標的とする上述の二本鎖分子、またはＳＹＮＧＲ４遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子を発現する上述のベクターの使用を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって阻害することができる。
【０１５２】
本発明の二本鎖分子およびベクターが肺癌細胞の細胞増殖をそのように阻害できることは、これらが、肺癌を治療および/または予防するための方法に使用可能であることを示す。ＳＹＮＧＲ４遺伝子は正常組織において過剰発現していないので（図１Ａ、２ＡおよびＢ）、したがって本発明は、有害副作用を伴わずに、ＳＹＮＧＲ４遺伝子に対する二本鎖分子または該分子を発現するベクターを投与することによって肺癌を有する患者を治療するための方法を提供する。
【０１５３】
特に本発明は、以下の方法［１］〜［３６］を提供する：
［１］  癌細胞の増殖を阻害するためおよび／または癌を治療するための方法であって、該癌細胞または該癌がＳＹＮＧＲ４遺伝子を過剰発現し、該方法が、該遺伝子を過剰発現している癌細胞においてＳＹＮＧＲ４の発現を特異的に阻害する少なくとも１つの単離された二本鎖分子と該細胞を接触させる段階を含み、それによって肺癌細胞の増殖を阻害する、および／または肺癌を治療する、方法。
［２］  前記二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の３８９〜４０７ｎｔの位置）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の７５４〜７７２ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５１９〜５３７ｎｔの位置）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５２０〜５３８ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡにおいて作用する、［１］記載の方法。
［３］  前記センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２］記載の方法。
［４］  治療される前記癌が肺癌である、［１］記載の方法；
［５］  前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣである、［４］記載の方法；
［６］  ＳＹＮＧＲ４の発現を特異的に阻害する複数の二本鎖分子を投与する、［１］記載の方法；
［７］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］記載の方法；
［８］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約７５ヌクレオチド長未満である、［７］記載の方法；
［９］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約５０ヌクレオチド長未満である、［８］記載の方法；
［１０］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約２５ヌクレオチド長未満である、［９］記載の方法；
［１１］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［１０］記載の方法；
［１２］  前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載の方法；
［１３］  前記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１２］記載の方法；
［１４］  前記二本鎖分子がＲＮＡである、［１］記載の方法；
［１５］  前記二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］記載の方法；
［１６］  前記二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１５］記載の方法；
［１７］  前記センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１６］記載の方法；
［１８］  前記二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１５］記載の方法；
［１９］  前記アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡからなる、［１８］記載の方法；
［２０］  前記隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドからなる、［１９］記載の方法；
［２１］  前記二本鎖分子が３’オーバーハングを含む、［１］記載の方法；
［２２］  前記二本鎖分子が、該分子に加えてトランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、［１］記載の方法。
［２３］  前記二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］記載の方法；
［２４］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の３８９〜４０７ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の７５４〜７７２ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５１９〜５３７ｎｔの位置）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５２０〜５３８ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２３］記載の方法。
［２５］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２４］記載の方法。
［２６］  治療される前記癌が肺癌である、［２３］記載の方法；
［２７］  前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣである、［２６］記載の方法；
［２８］  複数種類の前記二本鎖分子を投与する、［２３］記載の方法；
［２９］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約１００ヌクレオチド長未満である、［２５］記載の方法；
［３０］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約７５ヌクレオチド長未満である、［２９］記載の方法；
［３１］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約５０ヌクレオチド長未満である、［３０］記載の方法；
［３２］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約２５ヌクレオチド長未満である、［３１］記載の方法；
［３３］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［３２］記載の方法；
［３４］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［２３］記載の方法；
［３５］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［３４］記載の方法；ならびに
［３６］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、該分子に加えてトランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、［２３］記載の方法。
【０１５４】
本発明の方法を、以下でより詳細に説明する。
【０１５５】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子を発現している細胞の増殖は、ＳＹＮＧＲ４遺伝子に特異的にアニーリングする二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはこれを含む組成物に該細胞を接触させることによって阻害され得る。さらに該細胞を、トランスフェクション剤に接触させてもよい。好適なトランスフェクション剤は当技術分野で既知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、分子に曝露されていない細胞に比べて、細胞の増殖速度がより遅くなるか、または生存率が低減することを示す。細胞増殖は、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイの使用を含む、当技術分野で既知の方法によって、測定されうる。
【０１５６】
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子であるＳＹＮＧＲ４を発現または過剰発現している限り、いずれの種類の細胞の増殖も本発明に従って抑制され得る。例示的な細胞としては、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの両方を含む肺癌細胞が挙げられる。
【０１５７】
したがって、ＳＹＮＧＲ４の過剰発現に一部起因して引き起こされるか促進される疾患を患うまたはその発症リスクを有する患者は、少なくとも１つの本発明の二本鎖分子、少なくとも１つの該分子を発現する少なくとも１つのベクター、または少なくとも１つの該分子を含む少なくとも１つの組成物を投与することによって、治療され得る。例えば、肺癌患者は本方法に従って治療され得る。癌の種類は、診断されるべき特定の種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定され得る。肺癌は、例えば肺癌マーカーとして癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＹＦＲＡ、ｐｒｏ−ＧＲＰなどを用いて、あるいは胸部Ｘ腺撮影および／または喀痰細胞診を用いて診断され得る。より好ましくは、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノアッセイによって該患者由来の生検材料におけるＳＹＮＧＲ４の発現を検出することによって、選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、当技術分野で既知の方法、例えば免疫組織化学解析またはＲＴ−ＰＣＲによって、対象由来の生検標本をＳＹＮＧＲ４遺伝子過剰発現に関して確認する。
【０１５８】
肺癌細胞増殖を阻害してそれにより肺癌を治療するための本方法によれば、複数の二本鎖分子（またはこれを発現するベクターまたはこれを含有する組成物）を投与する場合、それぞれの分子は異なる構造を有しうるが、ＳＹＮＧＲ４の同一の標的配列に一致するｍＲＮＡで作用する。代替的に、複数の二本鎖分子がＳＹＮＧＲ４遺伝子内の異なる標的配列に一致するｍＲＮＡで作用してもよく、あるいは、異なる遺伝子の異なる標的配列に一致するｍＲＮＡで作用してもよい。例えば本方法は、ＳＹＮＧＲ４に指向性を有する二本鎖分子を利用してもよい。代替的に例えば本方法は、ＳＹＮＧＲ４コード配列内の１つ、２つまたはそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を利用してもよい。
【０１５９】
肺癌細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子に対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成するための形態で細胞内に直接導入してもよい。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡを、ベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞内に導入するために、ＦｕＧＥＮＥ（Roche diagnostics）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Invitrogen）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬工業株式会社）などのトランスフェクション増強剤を利用してもよい。
【０１６０】
阻害性ポリヌクレオチドおよび阻害性ポリペプチドの文脈における「特異的に阻害する」という用語は、ＳＹＮＧＲ４以外のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現または生物学的機能と比較して、ＳＹＮＧＲ４の発現または生物学的機能を優先的に阻害する薬剤またはリガンドの能力を指す。特異的阻害は典型的に、バックグラウンドに対する少なくとも約２倍の阻害をもたらし、好ましくは、１０倍の発現（例えば、転写または翻訳）または測定される生物学的機能（例えば、細胞の成長または増殖、アポトーシスの阻害、ＳＹＮＧＲ４からの細胞内シグナル伝達）の約１０倍超および最も好ましくは１００倍超の阻害をもたらす。処理細胞と未処理細胞との比較、または処理前後の細胞集団の比較の文脈において、発現レベルおよび／または生物学的機能を測定することができる。いくつかの態様において、ＳＹＮＧＲ４の発現または生物学的機能は完全に阻害される。典型的には、特異的阻害とは、適切な統計検定を用いる、ＳＹＮＧＲ４の発現または生物学的機能の統計的に有意な低下（例えば、ｐ＜＝０．０５）である。
【０１６１】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子発現の低減または対象における癌のサイズ、有病率もしくは転移能の低下などの臨床的利点がもたらされる場合、治療は「有効」であると見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、癌の形成を遅らせる若しく妨害すること、または癌の臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性（Efficaciousness）は、特定の腫瘍型を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。
【０１６２】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡを分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。したがって、標準的な癌治療に比べて、治療効果を発揮するために癌部位またはその近くに送達されねばならない二本鎖分子は、有意に少ない。
【０１６３】
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかなどの要素を考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、癌部位またはその近傍での細胞内濃度約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要とされる正確な投与量は、当業者によって容易かつ規定通りに決定され得る。
【０１６４】
本発明の方法を用いて、ＳＹＮＧＲ４を発現している癌；例えば肺癌、特にＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣの増殖または転移を阻害することができる。具体的には、ＳＹＮＧＲ４の標的配列（すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、または２０）を含む二本鎖分子が、肺癌の治療のために特に好ましい。
【０１６５】
癌を治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、癌を治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、癌の治療または癌転移の予防に現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンまたはタモキシフェンなどの化学療法剤を用いた治療）と組み合わせて投与することができる。
【０１６６】
本方法において、二本鎖分子を、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
【０１６７】
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０１６８】
リポソームは、肺腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子の送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明における使用に好適なリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質および、コレステロールなどのステロールを含む。一般に脂質の選択は、所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要素を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）に記載されたような様々な方法が知られている。
【０１６９】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームを癌部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が、好ましい。
【０１７０】
特に、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾される。一態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１７１】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０１７２】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【０１７３】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは分子量が約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、より好ましくは約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの、合成ポリマー；直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分岐鎖）；あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
【０１７４】
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０１７５】
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば比率３０：１２のテトラヒドロフランと水を用いる６０℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１７６】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも１つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者の癌領域に送達する方法は当技術分野内である。
【０１７７】
本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子を癌部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０１７８】
好適な腸内投与経路としては、経口送達、直腸送達、吸入送達、または鼻腔内送達が挙げられる。
【０１７９】
好適な非経口投与経路としては、静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（placement device）（例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）による癌部位の領域またはその近傍への直接適用；ならびに吸入が挙げられる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、癌部位またはその近傍で行われることが好ましい。
【０１８０】
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。組織内への薬剤の直接注射とは、好ましい癌部位またはその近傍である。癌部位またはその近傍の組織への薬剤の複数回注射が特に好ましい。
【０１８１】
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えば癌部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の期間にわたり、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与レジメンでは、二本鎖分子を７日間、１日１回、癌部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
【０１８２】
本発明の二本鎖分子を含む組成物：
上記に加えて、本発明は、本発明の二本鎖分子または該分子をコードするベクターの少なくとも１つを含む医薬組成物も提供する。具体的には、本発明は以下の組成物［１］〜［３６］を提供する：
［１］  ＳＹＮＧＲ４の発現および癌細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離された二本鎖分子を含む、癌細胞の増殖を阻害するためおよび癌を治療するための組成物であって、該癌細胞および該癌がＳＹＮＧＲ４遺伝子を過剰発現し、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなる、組成物。
［２］  前記二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の３８９〜４０７ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の７５４〜７７２ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５１９〜５３７ｎｔの位置）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５２０〜５３８ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］記載の組成物。
［３］  前記二本鎖分子、前記センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２］記載の組成物。
［４］  治療される前記癌が肺癌である、［１］記載の組成物；
［５］  前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣである、［４］記載の組成物；
［６］  複数種類の二本鎖分子を含む、［１］記載の組成物；
［７］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］記載の組成物；
［８］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約７５ヌクレオチド長未満である、［７］記載の組成物；
［９］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約５０ヌクレオチド長未満である、［８］記載の組成物；
［１０］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約２５ヌクレオチド長未満である、［９］記載の組成物；
［１１］  前記二本鎖分子の前記センス鎖が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［１０］記載の組成物；
［１２］  前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載の組成物；
［１３］  前記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１２］記載の組成物；
［１４］  前記二本鎖分子がＲＮＡである、［１］記載の組成物；
［１５］  前記二本鎖分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、［１］記載の組成物；
［１６］  前記二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１５］記載の組成物；
［１７］  前記センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１６］記載の組成物；
［１８］  前記二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１５］記載の組成物；
［１９］  前記アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡからなる、［１８］記載の組成物；
［２０］  前記隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドからなる、［１９］記載の組成物；
［２１］  前記二本鎖分子が３’オーバーハングを含む、［１］記載の組成物；
［２２］  トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む、［１］記載の組成物。
［２３］  前記二本鎖分子がベクターによってコードされ、かつ前記組成物中に含まれる、［１］記載の組成物；
［２４］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の３８９〜４０７ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の７５４〜７７２ｎｔの位置）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５１９〜５３７ｎｔの位置）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の５２０〜５３８ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２３］記載の組成物。
［２５］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２４］記載の組成物。
［２６］  治療される前記癌が肺癌である、［２３］記載の組成物；
［２７］  前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣである、［２６］記載の組成物；
［２８］  複数種類の前記二本鎖分子を投与する、［２３］記載の組成物；
［２９］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約１００ヌクレオチド長未満である、［２５］記載の組成物；
［３０］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約７５ヌクレオチド長未満である、［２９］記載の組成物；
［３１］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約５０ヌクレオチド長未満である、［３０］記載の組成物；
［３２］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約２５ヌクレオチド長未満である、［３１］記載の組成物；
［３３］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［３２］記載の組成物；
［３４］  前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［２３］記載の組成物；
［３５］  前記二本鎖分子が、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［２３］記載の組成物；ならびに
［３６］  トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む、［２３］記載の組成物。
【０１８３】
本発明の適切な組成物を、以下でさらに詳細に説明する。
【０１８４】
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で既知の技術に従って、対象に投与する前に医薬組成物として製剤化することが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用される「医薬製剤」とは、ヒトおよび獣医学的用途のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられるRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., Lippincott, Williams and Wilkins. (2005)に記載のように、当技術分野の技術の範囲内である。
【０１８５】
本発明の医薬製剤は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合した、本発明の二本鎖分子またはこれをコードするベクターの少なくとも１つ（例えば０．１重量％〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は例えば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０１８６】
本発明によれば、本組成物は複数の二本鎖分子を含有してもよく、該分子のそれぞれが、ＳＹＮＧＲ４の同一標的配列または異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば本組成物は、ＳＹＮＧＲ４に指向性を有する二本鎖分子を含有してもよい。代替的に、例えば本組成物は、１つ、２つまたはそれ以上の標的配列ＳＹＮＧＲ４に指向性を有する、二本鎖分子を含有してもよい。
【０１８７】
さらに本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有してもよい。例えば該ベクターは、１種類、２種類または複数種類の二本鎖分子をコードしてもよい。代替的に本発明の組成物は、複数のベクターを含有してもよく、該ベクターのそれぞれが別々の二本鎖分子をコードする。
【０１８８】
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「二本鎖分子を用いて癌を治療する方法」の項を参照されたい。
【０１８９】
本発明の医薬組成物はまた、従来の医薬賦形剤および／または添加剤も含み得る。好適な医薬賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性がある緩衝液（例えば塩酸トロメタミン）、（例えばＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなどの）キレート剤（chelant）の添加またはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、あるいは任意でカルシウム塩またはナトリウム塩の添加（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
【０１９０】
固体組成物については、従来の非毒性固体担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
【０１９１】
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記で列挙された任意の担体および賦形剤と、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含むことができる。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソーム内に封入された、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含むことができる。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達用のレシチンを含むことができる。
【０１９２】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性な成分を含有してもよい。例えば本組成物は、癌を治療するのに従来使用される化学療法剤を含有してもよい。
【０１９３】
別の態様において、本発明は、ＳＹＮＧＲ４の過剰発現に特徴づけられる肺癌を治療するための医薬組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、ＳＹＮＧＲ４を過剰発現する肺癌の治療用の医薬組成物を製造するための、細胞内のＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、ここで該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中から選択される配列を標的とする。
【０１９４】
代替的に本発明は、ＳＹＮＧＲ４の過剰発現に一部起因して引き起こされるか促進される癌、例えばＳＹＮＧＲ４の過剰発現に特徴づけられる肺癌の治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、ここで該方法またはプロセスは、有効成分としての、ＳＹＮＧＲ４を過剰発現する細胞内で該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に薬学的または生理学的に許容可能な担体を製剤化する段階を含み、該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中から選択される配列を標的とする。
【０１９５】
別の態様において、本発明はまた、ＳＹＮＧＲ４の過剰発現に一部起因して引き起こされるか促進される癌、例えばＳＹＮＧＲ４の発現に特徴づけられる肺癌の治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、ここで該方法またはプロセスは、有効成分と薬学的または生理学的に許容可能な担体とを混和させる段階を含み、該有効成分は、ＳＹＮＧＲ４を過剰発現する細胞内で該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１９、および２０の中から選択される配列を標的とする。
【０１９６】
肺癌を検出または診断する方法
ＳＹＮＧＲ４の発現は、肺癌細胞内で特異的に上昇することが見出された（図１）。したがって、本明細書で同定された遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物は肺癌に対するマーカーとして診断上の有用性を有し、肺組織試料におけるＳＹＮＧＲ４の発現を測定することによって、肺癌を診断することができる。特に本発明は、対象におけるＳＹＮＧＲ４の発現レベルを測定することによって、肺癌を診断するための方法を提供する。本発明の方法によって診断することができる肺癌にはＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣが含まれる。さらに、肺腺癌および肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含むＮＳＣＬＣも、本発明によって診断または検出可能である。
【０１９７】
本発明に従って、対象の状態を試験するための中間的な結果が与えられ得る。そのような中間的な結果をさらなる情報と組み合わせて、対象が疾患を患っていると、医師、看護師、または他の実施者が診断するのを補助してもよい。代替的に本発明は、対象由来の組織において癌性細胞を検出するため、および対象が疾患を患っていると診断するのに有用な情報を医師に与えるために、使用され得る。
【０１９８】
あるいは本発明は、対象由来の肺組織試料中の癌細胞を検出または同定するための方法を提供し、該方法は、対象由来の生物試料中のＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを測定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることにより、該肺組織中に癌細胞が存在することまたはその疑いがあることが示される。
【０１９９】
このような結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患していると診断する際の医師、看護師、または他の医療従事者を支援することができる。換言すれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば本発明によると、対象から得られた組織中に癌細胞の存在が疑われる場合には、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、公知の血中腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む疾患の様々な局面を考慮することによって、医療従事者は臨床判断を下すことができる。例えば、ＩＡＰ、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＫＭＯ−１、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＴＰＡ、ＣＳＬＥＸ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、およびＣＹＦＲＡは、血中の周知の肺腫瘍診断マーカーである。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間的な結果として役立つ。
【０２００】
別の態様において、本発明は、癌の診断マーカーを検出するための方法を提供し、該方法は、肺癌の診断マーカーとして、対象由来の生物試料中のＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現を検出する段階を含む。特に本発明は、以下の方法［１］〜［１０］を提供する：
［１］肺癌を診断する方法であって、
（ａ）生物試料において、ＳＹＮＧＲ４のアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する段階と、
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比べて、検出された発現レベルが増大したことを、疾患の存在と関連付ける段階と
を含む、方法。
［２］前記発現レベルが前記正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、［１］に記載の方法。
［３］前記発現レベルが、
（ａ）ＳＹＮＧＲ４の配列を含むｍＲＮＡの検出、
（ｂ）ＳＹＮＧＲ４のアミノ酸配列を含むタンパク質の検出、および
（ｃ）ＳＹＮＧＲ４のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性の検出
の中から選択される方法によって検出される、［１］に記載の方法。
［４］前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣである、［１］に記載の方法。
［５］前記発現レベルが、前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって決定される、［３］に記載の方法。
［６］前記発現レベルが、遺伝子にコードされる前記タンパク質に対する抗体の結合を検出することによって、該遺伝子の該発現レベルとして決定される、［３］に記載の方法。
［７］前記生物試料が生検材料、痰または血液を含む、［１］に記載の方法。
［８］対象由来の生物試料が上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
［９］対象由来の生物試料が癌細胞を含む、［１］に記載の方法。
［１０］対象由来の生物試料が癌性上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
【０２０１】
肺癌を診断する方法が以下でより詳細に説明される。
【０２０２】
本方法によって診断される対象は好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物としては例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
生物試料を診断するべき対象から採取して、診断を実施することが好ましい。目的となるＳＹＮＧＲ４転写産物またはＳＹＮＧＲ４翻訳産物を含んでいる限り、任意の生物材料を、判定のための生物試料として使用することができる。生物試料としては、これらに限定されるわけではないが、診断が望まれるかまたは癌への罹患が疑われる身体組織、ならびに体液、例えば生検材料、血液、血清、血漿、唾液、痰、胸水、および尿が挙げられる。好ましくは、生物試料は、上皮細胞、より好ましくは癌性上皮細胞、または、癌性であると疑われる組織、例えば肺組織に由来する上皮細胞を含む、細胞群を含有する。さらに、必要に応じて、入手した身体組織および体液から細胞を精製し、生物試料として使用してもよい。
【０２０４】
本発明に従って、対象由来の生物試料におけるＳＹＮＧＲ４の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルとして測定することができる。例えば、ＳＹＮＧＲ４のｍＲＮＡを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。ＳＹＮＧＲ４を含む複数の遺伝子（例えば様々な癌特異的遺伝子）の発現レベルを検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、ＳＹＮＧＲ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１２４５１）の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＳＹＮＧＲ４のｃＤＮＡをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【０２０５】
さらに、ＳＹＮＧＲ４の転写産物を、プライマーを用いて増幅ベースの検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって定量してもよい。そのようなプライマーは、入手可能な該遺伝子の配列情報に基づいて調製することもできる。例えば、実施例で使用されるプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８）は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析による検出に用いられ得るが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
【０２０６】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＳＹＮＧＲ４のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Ｔｍにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ  ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０  Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０  Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【０２０７】
代替的に、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法としては、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、断片がＳＹＮＧＲ４タンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
【０２０８】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＳＹＮＧＲ４タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を観察してもよい。即ち、強い染色が観察されることは、タンパク質の存在量が多いことを示すと同時に、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルが高いことを示す。
【０２０９】
さらに、診断の正確性を向上させるために、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルに加えて他の癌関連遺伝子、例えば肺癌において差次的に発現することが公知である遺伝子の発現レベルを測定してもよい。ＳＹＮＧＲ４の発現レベルは、癌性状態または前癌性状態に関する細胞および／または組織の病理学的測定値とも相関しうる。
【０２１０】
生物試料におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルよりも、例えば１０％、２５％、もしくは５０％増大していれば、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上増大していれば、増大したとみなすことができる。
【０２１１】
疾患状態（癌性または非癌性）が既知である対象（複数可）から以前に採取して保存していた試料（複数可）を使用することによって、試験される生物試料と同時に対照レベルを決定してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであることもできる。さらに、本発明の一局面によれば、生物試料におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。患者由来の生物試料、例えば肺組織の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
【０２１２】
本発明の文脈において、癌性でないことが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、癌性生物試料から決定した場合、対照レベルは「癌性対照レベル」と称する。
【０２１３】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、または癌性対照レベルと同程度である場合、対象は、癌を患っているかまたはその発症リスクを有すると診断され得る。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることは、対象が、癌を患っているかまたはその発症リスクを有することを示す。
【０２１４】
試験される生物試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違を、細胞の癌性状態または非癌性状態に応じて発現レベルが変わらない対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して、正規化することができる。例示的な対照遺伝子としては、βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質Ｐ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
癌の予後を評価するための方法
本発明は、ＳＹＮＧＲ４発現が、肺癌を有する患者の予後不良（ｐｏｏｒｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）に有意に関連しているという発見に一部関連する。したがって本発明は、患者の生物試料におけるＳＹＮＧＲ４の発現レベルを検出し；検出した発現レベルを対照レベルと比較し；かつ正常対照レベルと比較して増大したＳＹＮＧＲ４の発現レベルを予後不良（低い生存率）を示すと判定することによって、ＳＹＮＧＲ４の過剰発現に一部起因して引き起こされるか促進される癌、特に肺癌を有する患者の予後を判定するまたは評価するための方法を提供する。別の態様においては、癌性対照レベルと比較したＳＹＮＧＲ４の発現レベルを類似または増大と判定することが、予後不良を示す。
【０２１６】
本明細書中で、「予後」という用語は、疾患の推定転帰、ならびに症例の性質および症状によって示されるような疾患からの回復の予想に関する予測を指す。したがって、好ましくない、陰性の、または不良である予後は、治療後生存期間または生存率が低いことによって定義される。反対に、陽性、良好な、または好ましい予後は、治療後生存期間または生存率が高いことによって定義される。
【０２１７】
「予後を評価する」という用語は、患者の癌の今後の転帰（例えば悪性度、癌の治癒見込み、生存見込み等）を予測するまたは、所定の検出または測定と関連付ける能力を指す。例えば、ＳＹＮＧＲ４の発現レベルの経時的な測定により、患者に対する転帰（例えば悪性度の増減、癌の進行度（grade）の増減、癌の治癒見込み、生存率等）の予測が可能となる。
【０２１８】
本発明の文脈において、「予後を評価する（または判定する）」という語句は、癌の進行、特に癌の再発、転移拡散、および疾患再発の予測および見込み解析を包含することが意図される。本発明の予後評価法は、治療的介入、病期分類などの診断基準、ならびに腫瘍性疾患の転移または再発に関する疾患モニタリングおよび監視を含む治療様式について結論を出す際に、臨床的に使用されることが意図される。
【０２１９】
本方法に使用する、患者由来の生物試料は、試料中でＳＹＮＧＲ４遺伝子を検出することができる限り、評価するべき対象由来の任意の試料でありうる。対象由来の生物試料は、対象、例えば肺癌を有することが既知であるかまたは肺癌を有すると疑われる患者に由来する、任意の試料でありうる。好ましくは、生物試料は、肺細胞（肺から得られる細胞）である。さらに、生物試料には、痰、血液、血清、または血漿などの体液が含まれ得る。さらに、試料は組織から精製された細胞であってもよい。生物試料は、治療前、治療中および／または治療後を含む様々な時点で、患者から得ることができる。
【０２２０】
本発明に従って、患者由来の生物試料において測定されるＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルが高ければ高いほど、治療後の寛解、回復および／または生存に関する予後が不良になり且つ不良な臨床転帰の見込みが高くなることが示された。したがって、本方法によれば、比較に使用される「対照レベル」とは例えば、治療後に癌の良好なまたは陽性の予後を示した個体または個体群において何らかの種類の治療の前に検出されたＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルであり得、これは本明細書で「予後良好対照レベル」とも称される。代替的に、「対照レベル」とは、治療後に癌の不良なまたは陰性の予後を示した個体または個体群において何らかの種類の治療の前に検出されたＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルであり得、これは本明細書で「予後不良対照レベル」と称する。「対照レベル」とは、単一の参照群に由来するまたは複数の発現パターンに由来する、単一の発現パターンである。したがって対照レベルは、癌患者において、または疾患状態（予後良好または予後不良）が既知である患者群において何らかの種類の治療の前に検出されたＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。好ましくは、癌は肺癌である。疾患状態が既知である患者群におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
【０２２１】
何らかの種類の治療を行う前の、疾患状態（良好な予後または不良な予後）が既知である癌患者（複数可）（対照または対照群）から以前に採取および保存されていた試料（複数可）を使用することによって、試験される生物試料と同時に対照レベルを決定することができる。
【０２２２】
代替的に、対照レベルは、対照群から以前に採取および保存された試料におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法によって決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に検証された細胞由来の発現パターンのデータベースであり得る。
【０２２３】
さらに、本発明の一局面によれば、生物試料におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較してもよい。患者由来の生物試料と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。
【０２２４】
本発明によれば、予後良好対照レベルに対してＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルが類似していることは患者のより良好な予後を示し、予後良好対照レベルに対して発現レベルが増大していることは、治療後の寛解、回復、生存および／または臨床転帰に関するあまり好ましくない不良な予後を示す。他方で、予後不良対照レベルに対してＳＹＮＧＲ４の発現レベルが低減していることは、患者のより好ましい予後を示し、予後不良対照レベルに対して発現レベルが類似していることは治療後の寛解、回復、生存および／または臨床転帰に関するあまり好ましくない予後不良を示す。
【０２２５】
生物試料におけるＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルは、対照レベルと比べて１．０倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、またはそれ以上異なる場合に、変化したとみなされ得る。
【０２２６】
試験される生物試料と対照レベルとの間の発現レベルの相違は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。例えば、癌性細胞と非癌性細胞との間で発現レベルが異ならないことが知られるポリヌクレオチド、例えばβアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを正規化してもよい。
【０２２７】
発現レベルは、当技術分野で周知の技術を用いて患者由来の生物試料における遺伝子転写産物を検出することによって、決定してもよい。本発明の方法によって検出される遺伝子転写産物には、転写産物および翻訳産物の両方、例えばｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。
【０２２８】
例えば、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の転写産物は、遺伝子転写産物に対するＳＹＮＧＲ４遺伝子プローブを使用するハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析によって検出することができる。検出はチップまたはアレイ上で行ってもよい。ＳＹＮＧＲ４遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。別の例として、検出のために、増幅ベースの検出法、例えばＳＹＮＧＲ４遺伝子特異的なプライマーを使用する逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用してもよい（実施例を参照されたい）。ＳＹＮＧＲ４遺伝子特異的なプローブまたはプライマーは、ＳＹＮＧＲ４遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の配列全体を参照することにより、従来の技術を用いて設計および調製されうる。例えば、実施例で使用するプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２）は、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に利用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０２２９】
詳細には、本発明の方法で使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下でＳＹＮＧＲ４遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用される「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列に関する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。一般的にＴｍでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）である条件であり、該温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーについては少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても達成され得る。
【０２３０】
代替的に、本発明の評価のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の量を測定することができる。翻訳産物としての該タンパク質の量を測定する方法としては、ＳＹＮＧＲ４タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、該断片がＳＹＮＧＲ４タンパク質との結合能を保持している限り、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製するための方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を本発明で利用することができる。
【０２３１】
その翻訳産物に基づきＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを検出するための別の方法として、ＳＹＮＧＲ４タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色の強度を観察することができる。即ち、強い染色が確認されることは、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の存在量が多いことおよび同時に、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルが高いことを示す。
【０２３２】
さらに、ＳＹＮＧＲ４タンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを、指標としてそのような細胞増殖活性を用いて測定することができる。例えば、ＳＹＮＧＲ４を発現する細胞を、生物試料の存在下で調製および培養し、次に所定の期間内の増殖の程度を検出することまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、該生物試料の細胞増殖活性を決定することができる。
【０２３３】
さらに、評価の正確性を向上させるために、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルに加えて、他の肺癌関連遺伝子、例えば肺癌において差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルも測定してもよい。そのような他の肺細胞関連遺伝子の例としては、本明細書ならびに国際公開公報第２００４／０３１４１３号および国際公開公報第２００５／０９０６０３号に記載されるものが挙げられ、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３４】
代替的に、本発明に従って、対象の予後を評価するための他の試験結果に加えて、中間的な結果も与えられ得る。そのような中間的な結果は、医師、看護師、または他の実施者が対象の予後を評価、判断または推測する助けとなりうる。予後を評価するために本発明によって得られる中間的な結果と組み合わせて考慮することができる付加的情報としては、対象の臨床症状および身体状態が挙げられる。
【０２３５】
本方法に従って癌の予後を評価される患者は哺乳動物であることが好ましく、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。
【０２３６】
癌を診断するためまたは癌の予後を評価するためのキット：
本発明は、癌を診断するためまたは癌の予後を評価するためのキットを提供する。好ましくは、癌は肺癌である。詳細には、本キットは、患者由来の生物試料においてＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現を検出するための試薬を少なくとも１種類含み、該試薬は、
（ａ）ＳＹＮＧＲ４遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）ＳＹＮＧＲ４タンパク質を検出するための試薬、および
（ｃ）ＳＹＮＧＲ４タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。
【０２３７】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬としては、ＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡの一部に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡと特異的に結合するまたはこれを同定する核酸が挙げられる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の方法に基づき調製することができる。必要に応じて、ＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡを検出するための試薬を、固体支持体、例えばビーズ、アレイチップ、多孔性ストリップ等の表面に固定化させてもよい。さらに、ＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡを検出するための試薬を２種類以上、本キットに包含させることができる。
【０２３８】
ＳＹＮＧＲ４タンパク質を検出するのに適した試薬として、ＳＹＮＧＲ４タンパク質に対する抗体が挙げられる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、該断片がＳＹＮＧＲ４タンパク質に対する結合能を保持している限り、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を本発明において利用することができる。さらに抗体を、直接連結または間接的な標識法によってシグナル生成分子で標識してもよい。抗体を標識するためおよびその標的に対する抗体の結合を検出するための標識および方法が当技術分野で周知であり、任意の標識および方法を本発明に利用することができる。さらに、ＳＹＮＧＲ４タンパク質を検出するための試薬を２種類以上、本キットに包含させることができる。
【０２３９】
さらに生物活性は、例えば生物試料内で発現したＳＹＮＧＲ４タンパク質によって細胞増殖活性を測定することによって決定することができる。例えば、細胞を患者由来の生物試料の存在下で培養し、次に、増殖速度を検出することによってまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、ＳＹＮＧＲ４タンパク質発現の存在下または非存在下での該生物試料の細胞増殖活性を決定することができる。必要に応じて、ＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体支持体上に固定化することができる。さらに、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の生物活性を検出するための試薬を２種類以上、本キットに包含させることができる。
【０２４０】
本キットは、上述の試薬を２種類以上含み得る。さらに本キットは、固体支持体と、ＳＹＮＧＲ４遺伝子に対するプローブを結合させるための試薬またはＳＹＮＧＲ４タンパク質に対する抗体と、細胞を培養するための培地および容器と、陽性および陰性の対照試薬と、ＳＹＮＧＲ４タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体とを含み得る。例えば、予後良好または予後不良の患者から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットはさらに、（緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、および取扱説明書を含む添付文書（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上のエンドユーザーの観点から望ましい他の材料を含み得る。これらの試薬等は、ラベルを付けた容器内に含まれ得る。好適な容器としては、ボトル、バイアルおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で形成され得る。
【０２４１】
本発明の一態様として、試薬がＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡに対するプローブである場合、該試薬を、多孔性ストリップなどの固体支持体上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成してもよい。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含有する複数の部位を含み得る。試験ストリップはまた、陰性対照および／または陽性対照用の部位も含有し得る。代替的に、対照部位を、試験ストリップと分離したストリップ上に位置させてもよい。任意で、異なる検出部位は、異なる量の、即ち第１の検出部位ではより多い量の、および後続の部位ではより少ない量の、固定化核酸を含有することができる。試験試料の添加の際、検出可能なシグナルを提示する部位の数が、該試料中に存在するＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡの量の定量的指標を与える。検出部位は、任意の好適に検出可能な形状で構成されていてもよく、かつこれは典型的に試験ストリップ幅に広がったバーまたはドットの形状である。
【０２４２】
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはＳＹＮＧＲ４標準試料を含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＳＹＮＧＲ４陽性の血液試料を採取することによって調製することができ、次にそのＳＹＮＧＲ４レベルを分析する。代替的に、精製されたＳＹＮＧＲ４タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＳＹＮＧＲ４を含まない血清に添加して、陽性試料またはＳＹＮＧＲ４標準を形成することができる。
【０２４３】
抗肺癌化合物のスクリーニング
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される薬剤は任意の化合物であってもよく、複数の化合物を含む組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験薬剤は、単一の化合物であってもよく、化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合、該化合物を連続的にまたは同時に接触させることができる。
【０２４４】
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験薬剤、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（核酸構築物、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等を含む）、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験薬剤はまた、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、（３）逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。
【０２４５】
アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２１０３３６０号）の表面に提供され得る。
【０２４６】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされ、構造の一部が付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる薬剤に含まれる。
【０２４７】
さらに、スクリーニングした試験薬剤がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡは、癌を治療または予防するための候補である試験薬剤の調製における有用性を確認される。
【０２４８】
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験薬剤とは、ＳＹＮＧＲ４タンパク質または元のタンパク質の生物活性が欠如したその部分ペプチドにインビボで特異的に結合する、抗体でもあり得る。
【０２４９】
試験薬剤ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験薬剤の同定およびそのような薬剤のライブラリの構築についてのさらなる案内を提供する。
【０２５０】
（ｉ）分子モデリング：
試験薬剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である化合物の分子構造、および／または、ＳＹＮＧＲ４の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験薬剤を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験薬剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
【０２５１】
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該化合物および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−化合物間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型（computationally intensive）コンピュータが必要である。
【０２５２】
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation，Waltham，Mass）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。
【０２５３】
多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。
【０２５４】
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc（Mississauga，Ontario，Canada）、およびHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
【０２５５】
後述のように、推定インヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターまたは「試験薬剤」のライブラリを、本方法を用いてスクリーニングし、肺癌を治療または予防する試験薬剤を同定してもよい。
【０２５６】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成：
試験薬剤のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を必要とする合理的薬物設計プログラムの一部として作製してもよい。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが６アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは６アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
【０２５７】
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成してもよい。コンビナトリアル化学ライブラリとしては、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド（例えば国際公開公報第９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（random bio-oligomer）（例えば国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド等のダイバーソマー（diversomer）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（peptidylphosphonate）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995-2009 Wiley Interscience: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdEd, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、糖質ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン（metathiazanone）（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）等を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Advanced Chem Tech，Louisville KY）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Rainin，Woburn，MA）、４３３Ａ（Applied Biosystems，Foster City，CA）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Millipore，Bedford，MA）を参照されたい）。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている（例えば、ComGenex（Princeton，N.J.）、Tripos, Inc.（St. Louis，MO）、3D Pharmaceuticals（Exton，PA）、Martek Biosciences（Columbia，MD）等を参照されたい）。
【０２５９】
（ｉｉｉ）その他の候補物質：
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、およびFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
【０２６０】
アプタマーとは、特定の分子標的に対して緊密に結合する核酸からなる巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249:505-510 (1990)）は、アプタマーの選択に関するＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大きなライブラリ（例えば１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【０２６１】
ＳＹＮＧＲ４結合化合物のスクリーニング
本発明において、正常器官ではＳＹＮＧＲ４の発現は認められなかったのに対し、肺癌ではＳＹＮＧＲ４の過剰発現が検出された（図１および２）。したがって本発明は、ＳＹＮＧＲ４遺伝子、該遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて、ＳＹＮＧＲ４に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。肺癌におけるＳＹＮＧＲ４の発現により、ＳＹＮＧＲ４に結合する化合物は肺癌細胞の増殖を抑制し、かつしたがって肺癌を治療または予防するために有用であると予測される。したがって本発明はまた、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを用いて、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、および肺癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供する。具体的には、このスクリーニング法の１つの態様は以下の段階を含む：
（ａ）試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する試験化合物を選択する段階。
【０２６２】
本発明において、ＳＹＮＧＲ４の発現を抑制することにより肺癌細胞増殖が低下することが明らかとなる。したがって、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドに結合する候補化合物をスクリーニングすることによって、肺癌を治療または予防するために有用な候補化合物を同定することができる。肺癌を治療または予防するための候補化合物の有用性は、肺癌の治療薬剤を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０２６３】
本発明に従って、肺癌細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは化合物の治療効果、または一部ＳＹＮＧＲ４発現によって引き起こされるか促進される疾患（「ＳＹＮＧＲ４関連疾患」）を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を、評価することができる。したがって本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補薬剤もしくは化合物、またはＳＹＮＧＲ４関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）試験薬剤または化合物を、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；
ｂ）該ポリペプチドまたはその機能的断片と該試験化合物との間の結合活性を検出する段階、および
ｃ）ｂ）の結合活性を試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０２６４】
本発明において、治療効果は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片に対する結合活性と相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物がＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片に結合する場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する薬剤または化合物の候補として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物がＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片に結合しない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０２６５】
本発明のスクリーニング法を以下でより詳細に説明する。
【０２６６】
スクリーニングに使用されるＳＹＮＧＲ４ポリペプチドは、天然ポリペプチドまたはその部分ペプチドに由来する組換えポリペプチドまたはタンパク質であり得る。試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【０２６７】
例えば、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを用いてＳＹＮＧＲ４ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当技術分野で既知の任意の方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは例えば、特に以下の様式の、免疫沈降法によって実施することができる。ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＤ８に挿入することによって、該遺伝子を宿主（例えば、動物）細胞等において発現させる。
【０２６８】
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141（1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23（1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193(1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等が挙げられる。
【０２６９】
外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993)）等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。
【０２７０】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子によってコードされるポリペプチドを、特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってＳＹＮＧＲ４ポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜１２アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のエピトープ、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。
【０２７１】
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する、上記のように調製可能な抗体の使用に加えて、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもできる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。ＳＹＮＧＲ４遺伝子によってコードされるポリペプチドを、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて形成することができる。
【０２７２】
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
【０２７３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、放射性同位体、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
【０２７４】
ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを用いて該ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウェスト−ウェスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。具体的には、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞（例えばＬＣ１７６、ＬＣ３１９、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＰＣ３、ＰＣ９、ＰＣ１４、ＳＫ−ＬＵ−１、ＥＢＣ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＷ９００、およびＳＷ１５７３）からｃＤＮＡライブラリを調製する段階、ＬＢ−アガロース上で該タンパク質を発現させる段階、発現した該タンパク質をフィルター上に固定する段階、精製および標識したＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを上記のフィルターと反応させる段階、ならびに、標識に従って、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを検出することによって、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、またはＳＹＮＧＲ４と特異的に結合する抗体、またはＳＹＮＧＲ４ポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって、標識してもよい。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用してもよい。
【０２７５】
代替的に、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。
【０２７６】
ツーハイブリッドシステムにおいて、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリを調製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる）から、該ライブラリに由来するｃＤＮＡを単離する。上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入する段階および該タンパク質を発現させる段階によって、該ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質を調製することができる。ＨＩＳ３遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
【０２７７】
ＳＹＮＧＲ４遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する化合物を、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化してもよく、本発明のポリペプチドと結合可能なタンパク質を含有する試験化合物を該カラムに適用する。本明細書における試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物をロードした後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、プローブとして該オリゴＤＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
【０２７８】
表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサが、本発明における結合化合物を検出または定量するための手段として使用され得る。そのようなバイオセンサを使用する場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
【０２７９】
ＳＹＮＧＲ４タンパク質と結合するタンパク質だけでなく化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンクまたはランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64（1996）、Verdine, Nature 384: 11-13（1996）、Hogan, Nature 384: 17-9(1996)）は、当業者に既知である。
【０２８０】
ＳＹＮＧＲ４の生物活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明において、ＳＹＮＧＲ４タンパク質は肺癌細胞の細胞増殖（図３Ｂ）および細胞浸潤活性（図４Ａ）を促進する活性を有する。本発明は、これらの生物活性を用いて、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、および肺癌を治療または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供する。したがって、本発明は、以下の段階を含む、ＳＹＮＧＲ４遺伝子によりコードされるポリペプチドを用いて肺癌を治療または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出されるＳＹＮＧＲ４のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制している試験化合物を選択する段階。
【０２８１】
本発明において、ＳＹＮＧＲ４の発現を抑制することにより、肺癌細胞増殖が低下することが明らかとなる。したがって、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドの生物活性を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、肺癌の治療または予防に有用な候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が癌を治療または予防する可能性は、肺癌の治療または予防に有用な治療剤を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ＳＹＮＧＲ４タンパク質に結合する化合物が、例えば肺癌細胞の増殖活性または浸潤活性を阻害する場合には、そのような化合物がＳＹＮＧＲ４特異的治療効果を有すると結論づけることができる。
【０２８２】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは化合物の治療効果、またはＳＹＮＧＲ４関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補薬剤もしくは化合物、またはＳＹＮＧＲ４関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）試験薬剤または化合物を、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；および
ｂ）段階（ａ）の該ポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階；および
ｃ）ｂ）の生物活性を試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０２８３】
本発明において、治療効果はＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性と相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制または阻害する場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０２８４】
本発明の方法を以下でより詳細に記載する。
【０２８５】
ＳＹＮＧＲ４タンパク質の生物活性を含む限り、任意のＳＹＮＧＲ４ポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。このような生物活性には、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の細胞増殖活性または浸潤活性が含まれる。例えば、ＳＹＮＧＲ４タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等のポリペプチドもまた用いることができる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現され得る。さらに、ＳＹＮＧＲ４タンパク質はＧＲＢ２との相互作用活性を有し、ＳＹＮＧＲ４のチロシン−４６残基はその活性に不可欠である。ＳＹＮＧＲ４は、おそらくはＧＲＢ２−ＰＡＫ１およびそれに続くＭＡＰＫシグナル活性化により、発癌機能を発揮し得る。
【０２８６】
このスクリーニングにより単離された化合物は、ＳＹＮＧＲ４遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、ＳＹＮＧＲ４をコードする遺伝子の発現を低下させるまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された化合物は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０２８７】
本発明の方法において検出されるべき生物活性が細胞増殖である場合には、例えば、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養し、かつ、細胞増殖速度を決定すること、細胞周期等を測定することによって、および例えば図３に示す生存細胞またはコロニー形成活性を測定することによって、それを検出することができる。ＳＹＮＧＲ４を発現した細胞の増殖速度を低下させる化合物を、肺癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０２８８】
より具体的には、本方法は以下の段階を含む：
（ａ）試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４を過剰発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）細胞増殖活性を測定する段階；および
（ｃ）試験化合物の非存在下における細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を低下させる試験化合物を選択する段階。
【０２８９】
好ましい態様において、本発明の方法は以下の段階をさらに含み得る：
（ｄ）ＳＹＮＧＲ４をほとんどまたは全く発現しない細胞に対して全く影響を与えない試験化合物を選択する段階。
【０２９０】
本発明の方法において検出されるべき生物活性が浸潤活性である場合には、例えば、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを発現する細胞を調製し、かつ、例えば図４Ａに示すようなマトリゲル浸潤アッセイを用いるなどの当技術分野で公知の任意の方法を用いて、浸潤細胞数を計数することによって、それを検出することができる。浸潤細胞数を減少させる化合物を、肺癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０２９１】
より具体的には、本方法は以下の段階を含む：
（ａ）試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４を過剰発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞の浸潤活性を測定する段階；および
（ｃ）試験化合物の非存在下における該細胞の浸潤活性と比較して、該細胞の浸潤活性を低下させる試験化合物を選択する段階。
【０２９２】
好ましい態様において、本発明の方法は以下の段階をさらに含み得る：
（ｄ）ＳＹＮＧＲ４をほとんどまたは全く発現しない細胞に対して全く影響を与えない試験化合物を選択する段階。
【０２９３】
本発明において、ＳＹＮＧＲ４の発現を抑制することにより、肺癌細胞浸潤が低下することが明らかとなる。したがって、浸潤活性を低下させる候補化合物をスクリーニングすることにより、肺癌細胞浸潤を治療または予防するのに有用な候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が肺癌細胞浸潤を治療または予防する可能性は、癌浸潤の治療剤を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０２９４】
本発明に従って、癌細胞浸潤の阻害に対する試験薬剤もしくは化合物の治療効果、または肺癌細胞浸潤を治療もしくは予防するための候補剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその断片を用いて、肺癌細胞浸潤を阻害するための候補薬剤もしくは化合物、または肺癌細胞浸潤を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）試験薬剤または化合物を、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片を発現している細胞と接触させる段階；
ｂ）該細胞の浸潤活性を測定する段階、および
ｃ）ｂ）の細胞の該浸潤活性を該試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０２９５】
本発明において、治療効果は浸潤活性と相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、浸潤活性を抑制または阻害する場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、浸潤活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０２９６】
本明細書において定義される「生物活性を抑制する」とは、化合物の非存在下と比較した、ＳＹＮＧＲ４の生物活性の好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制を指す。
【０２９７】
ＳＹＮＧＲ４の発現を改変する化合物のスクリーニング
本発明において、ｓｉＲＮＡによるＳＹＮＧＲ４の発現の低下は肺癌細胞増殖を阻害する（図３Ａ）。したがって本発明は、ＳＹＮＧＲ４の発現を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＳＹＮＧＲ４の発現を阻害する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制すると予測され、よって肺癌の治療または予防に有用である。したがって本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングするための方法、および肺癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供する。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
（ａ）ＳＹＮＧＲ４を発現している細胞と候補化合物を接触させる段階；および
（ｂ）対照と比較して、ＳＹＮＧＲ４の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する段階。
【０２９８】
本発明において、ＳＹＮＧＲ４の発現を抑制することにより、肺癌細胞増殖が低下することが明らかとなる。したがって、ＳＹＮＧＲ４の発現レベルを阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、ＳＹＮＧＲ４の過剰発現によって一部引き起こされるまたは促進される癌の治療または予防に有用な候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が癌を治療または予防する可能性は、ＳＹＮＧＲ４関連癌の治療薬を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０２９９】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは化合物の治療効果、またはＳＹＮＧＲ４関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、およびＳＹＮＧＲ４関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【０３００】
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
ａ）試験薬剤または化合物を、ＳＹＮＧＲ４遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
ｂ）ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
ｃ）ｂ）の発現レベルを試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０３０１】
本発明において、治療効果はＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルと相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを低下させる場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルを低下させない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０３０２】
本発明の方法を以下でより詳細に記載する。
【０３０３】
ＳＹＮＧＲ４を発現する細胞には、例えば肺癌から樹立された細胞株が含まれる；そのような細胞株を、本発明の上記スクリーニングに用いることができる（例えば、Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ１４、ＰＣ３、ＰＣ９、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＥＢＣ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＬＸ１、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＮＣＩ−Ｈ１９６、ＮＣＩ−Ｈ４４６）。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー解析によって推定することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」とは、化合物の非存在下における発現レベルと比較した、ＳＹＮＧＲ４の発現レベルの好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、および最も好ましくは少なくとも９５％のレベル低下である。有用な化合物を本明細書において記載するが、これには化学物質、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は、上記で記載されている。スクリーニング法においては、ＳＹＮＧＲ４の発現レベルを低下させる化合物を、肺癌の治療または予防に用いられる候補化合物として選択する。
【０３０４】
あるいは、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含み得る：
（ａ）候補化合物を、ＳＹＮＧＲ４の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；および
（ｃ）該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる候補化合物を選択する段階。
【０３０５】
本発明において、ＳＹＮＧＲ４の発現を抑制することにより、肺癌細胞増殖が低下することが明らかとなる。したがって、レポーター遺伝子の発現または活性を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、肺癌の治療または予防に有用な候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が癌を治療または予防する可能性は、肺癌の治療薬剤を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０３０６】
本発明に従って、肺癌細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは化合物の治療効果、またはＳＹＮＧＲ４関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、およびＳＹＮＧＲ４関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【０３０７】
別の局面に従って、本発明は以下の段階を含む方法を提供する：
ａ）試験薬剤または化合物を、ＳＹＮＧＲ４遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階；ならびに
ｃ）ｂ）の発現レベルを該試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０３０８】
本発明において、治療効果はレポーター遺伝子の発現または活性と相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０３０９】
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＳＹＮＧＲ４の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるＳＹＮＧＲ４の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも５００  ｂｐ上流まで、好ましくは１０００  ｂｐまで、より好ましくは５０００または１００００  ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはＰＣＲによって増幅することができる。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０３１０】
前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に感染させ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書において定義される「発現または活性を低下させる」とは、化合物非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは少なくとも９５％の低下を指す。
【０３１１】
ＳＹＮＧＲ４のリン酸化レベルを指標として用いるスクリーニング
さらに、本発明において、ＳＹＮＧＲ４タンパク質がリン酸化されることが確認された。したがって、ＳＹＮＧＲ４タンパク質のリン酸化を阻害する化合物を、そのような修飾を指標として用いてスクリーニングすることができる。したがって本発明はまた、ＳＹＮＧＲ４タンパク質のリン酸化を阻害する化合物をスクリーニングする方法も提供する。さらに、本発明はまた、癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供する。本方法は、癌の治療または予防に用いられ得る薬剤をスクリーニングするのに特に適している。より具体的には、本方法は以下の段階を含む：
（ａ）（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物活性を有する、ポリペプチド
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有する、ポリペプチド；ならびに
（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを発現している細胞を、試験化合物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドのリン酸化レベルを検出する段階；
（ｃ）該ポリペプチドのリン酸化レベルを、該化合物の非存在下で検出された該ポリペプチドのリン酸化レベルと比較する段階；ならびに
（ｄ）該ポリペプチドのリン酸化レベルを低下させた化合物を、該ポリペプチドのリン酸化のインヒビター、または癌を治療もしくは予防するための化合物として選択する段階。
【０３１２】
本明細書では、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的同等物を発現する限り、任意の細胞を用いることができる。本発明のスクリーニングに用いられる細胞は、例えば、肺癌および精巣に由来する細胞ならびにそれらから樹立された細胞株を含む、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを天然に発現する細胞であってよい。Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＮＣＩ−Ｈ１９６、およびＮＣＩ−Ｈ４４６などの、肺癌の細胞株を使用することができる。
【０３１３】
あるいは、スクリーニングに用いられる細胞は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを天然には発現せず、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはＳＹＮＧＲ４の機能的同等物を発現するベクターをトランスフェクトした細胞であってもよい。そのような組換え細胞は、上記のように公知の遺伝子工学法（例えば、Morrison DA., J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）によって得ることができる。
【０３１４】
前述した試験化合物の任意のものを、本発明のスクリーニングに用いることができる。しかしながら、細胞内に浸透し得る化合物を選択することが好ましい。あるいは、試験化合物がポリペプチドである場合には、試験薬剤をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで細胞を形質転換し、該試験薬剤を該細胞内で発現させることにより、本発明のスクリーニングにおける細胞と試験薬剤との接触を行うこともできる。
【０３１５】
別の態様においては、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的同等物のリン酸化に適した条件を、インビトロで提供することができる。このスクリーニング法は以下の段階を含む：
（ａ）試験化合物を、本発明のポリペプチドまたはその断片（例えば、チロシン−４６を含む）と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の該ポリペプチドのリン酸化を検出する段階；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出された生物活性と比較して、該ポリペプチドのリン酸化を抑制する化合物を選択する段階。
【０３１６】
本発明においては、上記の通り、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の生物活性は好ましくはリン酸化活性である。当業者はリン酸化レベルを評価することができる。
【０３１７】
したがってこれらの態様において、本発明は、以下の段階を含む、ＳＹＮＧＲ４のリン酸化を阻害する、または癌を予防もしくは治療するための剤をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物活性を有する、ポリペプチド
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列のポリペプチドと同等の生物活性を有する、ポリペプチド；ならびに
（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物活性を有する、ポリペプチド；またはリン酸化部位を含むその断片
からなる群より選択されるポリペプチドを、該ポリペプチドのリン酸化を可能にする条件下で試験化合物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたはその断片のリン酸化レベルを検出する段階；
（ｃ）基質のリン酸化レベルを、該試験化合物の非存在下で検出された該ポリペプチドのリン酸化レベルと比較する段階；ならびに
（ｄ）該ポリペプチドのリン酸化レベルを低下させた化合物を、該ポリペプチドのリン酸化を阻害するためまたは癌を治療もしくは予防するための化合物として選択する段階。
【０３１８】
これらの態様において、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドのリン酸化を可能にする条件は、該ポリペプチドを、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドのリン酸化に適したキナーゼおよびＡＴＰと共にインキュベーションすることによって提供され得る。いくつかの態様においては、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドをＡＵＲＫＢポリペプチドとさらに接触させる。さらに、好ましい態様においては、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドのリン酸化を増強する物質をスクリーニングの反応混合物に添加することもできる。物質の添加によってポリペプチドのリン酸化が増強されると、リン酸化レベルをより高感度で測定することができる。
【０３１９】
ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的同等物のリン酸化レベルは、当技術分野で公知の任意の方法に従って検出することができる（例えば、実施例を参照されたい）。
【０３２０】
ＳＹＮＧＲ４の相互作用を指標として用いるスクリーニング
さらに本発明者らは、ＳＹＮＧＲ４がＧＲＢ２と相互作用することを明らかにした（図５）。したがって、両ポリペプチドの相互作用は、発癌または細胞増殖、特に癌の細胞増殖において極めて重要な役割を果たすと考えられる。それ故、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドとＧＲＢ２ポリペプチドとの間の相互作用を阻害するかまたはその逆である、癌の治療または予防に有用な化合物をスクリーニングすることが意図される。したがって本発明は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドとＧＲＢ２ポリペプチドとの間の相互作用を阻害するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。さらに本発明は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドとＧＲＢ２ポリペプチドとの間の結合を阻害するためまたは癌を治療もしくは予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。本方法は以下の段階を含む：
（ａ）試験化合物の存在下で、ＧＲＢ２ポリペプチドまたはその機能的同等物をＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチド間の結合を検出する段階；および
（ｃ）ＧＲＢ２ポリペプチドとＳＹＮＧＲ４ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
【０３２１】
本発明の文脈において、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはＧＲＢ２ポリペプチドの機能的同等物とは、それぞれＳＹＮＧＲ４ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）またはＧＲＢ２ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３または２５）と同等の生物活性を有するポリペプチドである（定義の項を参照されたい）。
【０３２２】
ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、およびＥＲＫ１／２のリン酸化活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明の文脈において、ＳＹＮＧＲ４ノックダウンにおいてＰＡＫ１（Ｔｈｒ４２３）、ｃ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）、ＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）、ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）、およびＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／２０４）のリン酸化が低下することが確認された。一方、ＳＹＮＧＲ４発現の後には、リン酸化されたＰＡＫ１（Ｔｈｒ４２３）、ｃ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）、ＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）、ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）、およびＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／２０４）が増加した（図６）。これらの知見から、ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ１／２、およびＥＲＫ１／２は、細胞増殖をもたらすＳＹＮＧＲ４ポリペプチドのリン酸化シグナル伝達の下流エフェクター分子であることが示される。本発明において、ＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターとは、直接的または間接的な様式でＳＹＮＧＲ４によってリン酸化される分子を指す。したがって、ＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターには、ＳＹＮＧＲ４からのシグナル伝達経路の間にリン酸化される分子が含まれる。例えば、本発明によれば、ＳＹＮＧＲ４は、ＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターの１つであるＰＡＫ１のリン酸化レベルを増強する。加えて、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ１／２、およびＥＲＫのリン酸化レベルは、ＳＹＮＧＲ４のリン酸化の後に増大する。したがって、これらの分子もまた、ＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターである。よって、この活性を指標として用いることにより、本発明は、ＳＹＮＧＲ４、ＧＲＢ２およびＰＡＫ１、ならびにｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、またはＥＲＫ１／２を発現する癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法と、癌、特に肺癌を含む癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法とを提供する。したがって本発明は、以下の段階を含む、ＳＹＮＧＲ４遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、下流エフェクターをリン酸化するＳＹＮＧＲ４の活性を阻害するためまたは癌を治療もしくは予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ１／２、およびＥＲＫ１／２からなる群より選択される少なくとも１つの下流エフェクターのリン酸化のための条件下で、ポリヌクレオチドＧＲＢ２およびＰＡＫ１によってコードされるポリペプチドの存在下において、ＳＹＮＧＲ４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと試験化合物とを接触させる段階；
（ｂ）ＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターのリン酸化レベルを検出する段階；ならびに
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出されたＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターのリン酸化レベルと比較して、ＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターのリン酸化レベルを抑制する試験化合物を選択する段階。
【０３２３】
好ましい態様において、検出されるべきＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターのリン酸化レベルは、それぞれＰＡＫ１のＴｈｒ４２３、ｃ−ＲａｆのＳｅｒ３３８、ＭＥＫ１のＳｅｒ  ２９８、ＭＥＫ１／２のＳｅｒ２１７／２２１、およびＥＲＫ１／２のＴｈｒ２０２／２０４のリン酸化レベルである。本発明において、ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ１／２、およびＥＲＫ１／２からなる群より選択される少なくとも１つの下流エフェクターのリン酸化のための条件は、ＳＹＮＧＲ４とその下流エフェクターの少なくとも１つとを発現する細胞の培養により提供され得る。例えば、ＳＹＮＧＲ４と、ＧＲＢ２を含むこれら下流エフェクターすべてとを発現する細胞は、これらの下流エフェクターのリン酸化にとって好ましい条件である。詳細には、これらの分子を発現する肺癌細胞株を本発明に用いることができる。あるいは、ＳＹＮＧＲ４を発現させるためのベクターをトランスフェクトされた、該下流エフェクターを内因的に発現する任意の細胞もまた、本発明に有用である。
【０３２４】
本発明に従って、ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、もしくはＥＲＫ１／２のリン酸化活性の抑制に対する試験化合物の治療効果、またはＳＹＮＧＲ４に関連する癌（例えば、肺癌）を治療もしくは予防するための候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその断片、およびＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、もしくはＥＲＫ１／２ポリペプチドまたはそれらの断片を用いて、リン酸化活性を抑制するための候補化合物、またはＳＹＮＧＲ４に関連する癌を治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ１／２、およびＥＲＫ１／２からなる群より選択されるＳＹＮＧＲ４の少なくとも１つの下流エフェクターのリン酸化のための条件下で、ＧＲＢ２およびＰＡＫ１、ならびにｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、またはＥＲＫ１／２ポリペプチドまたはそれらの機能的断片の存在下において、試験化合物をＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；
ｂ）ＳＹＮＧＲ４の下流エフェクターのリン酸化レベルを検出する段階；ならびに
ｃ）ｂ）のリン酸化レベルを試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０３２５】
本発明の文脈において、治療効果は、ＳＹＮＧＲ４によって増強されるＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、もしくはＥＲＫ１／２ポリペプチドまたはそれらの機能的断片のリン酸化活性と相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、もしくはＥＲＫ１／２ポリペプチドまたはそれらの機能的断片のリン酸化活性を抑制または阻害する場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する候補剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、もしくはＥＲＫ１／２ポリペプチドまたはそれらの機能的断片のリン酸化活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定または選択することができる。
【０３２６】
本発明の方法を以下でより詳細に記載する。
【０３２７】
ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、またはＥＲＫ１／２のリン酸化活性を抑制する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。例えば、ＳＹＮＧＲ４タンパク質、およびＧＲＢ２、ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、またはＥＲＫ１／２タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等であるポリペプチドもまた用いることができる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現され得る。
【０３２８】
このスクリーニングにより単離された化合物は、ＳＹＮＧＲ４遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、ＳＹＮＧＲ４をコードする遺伝子の発現を低下させるまたは阻害する分子も指す。さらに、このスクリーニングによって単離された化合物は、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドとＧＲＢ２のインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０３２９】
本発明の方法において検出されるべき生物活性がリン酸化である場合には、例えば、ＳＹＮＧＲ４、ＧＲＢ２およびＰＡＫ１、ならびにｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、またはＥＲＫ１／２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養し、ＰＡＫ１、ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、またはＥＲＫ１／２のリン酸化を判定し、細胞周期等を測定することによって、および生存細胞またはコロニー形成活性を測定することによって、検出することができる。ＳＹＮＧＲ４を発現した細胞のＰＡＫ１、およびｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、またはＥＲＫ１／２のリン酸化を低下させる化合物を、肺癌を含む癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０３３０】
好ましい態様では、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドを発現しない対照細胞を用いる。したがって本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質、またはＳＹＮＧＲ４関連疾患を治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４、ＧＲＢ２およびＰＡＫ１、ならびにｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、またはＥＲＫ１／２を過剰発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）ＰＡＫ１（Ｔｈｒ４２３）、ｃ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）、ＭＥＫ１（Ｓｅｒ  ２９８）、ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）、およびＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／２０４）のリン酸化活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）試験化合物の非存在下における細胞増殖活性と比較して、リン酸化活性を低下させる試験化合物を選択する段階。
【０３３１】
好ましい態様において、本発明の方法は以下の段階をさらに含み得る：
（ｄ）ＳＹＮＧＲ４をほとんど又は全く発現しない細胞に対する効果を有さない試験化合物を選択する段階。
【０３３２】
あるいは、本発明に従って、ＳＹＮＧＲ４の下流エフェクター分子のＳＹＮＧＲ４仲介性のリン酸化を阻害する能力について、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドの潜在的アンタゴニストを評価することができる。例えば、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドに結合する任意の化合物が、該ポリペプチドの潜在的アンタゴニストであり得る。そのような化合物は、以下の段階を含む方法に従うことによって単離することができる：
ｉ）試験化合物をＳＹＮＧＲ４ポリペプチドと接触させる段階、
ｉｉ）該試験化合物とＳＹＮＧＲ４ポリペプチドとの間の結合を検出する段階、および
ｉｉｉ）ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドに結合する試験化合物を、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドの潜在的アンタゴニストとして選択する段階。
【０３３３】
本明細書において定義される「リン酸化を抑制するまたは低下させる」という語句は、化合物非存在下の場合と比較した、ＳＹＮＧＲ４の生物活性の好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制である。本発明の局面を以下の実施例に記載するが、これらは、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３３４】
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似のまたは同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。
【０３３５】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０３３６】
実施例１：一般的方法
１．細胞株および組織試料
本実施例で用いた２２例のヒト肺癌細胞株は、９例の腺癌（ＡＤＣ；Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、およびＮＣＩ−Ｈ３５８）、１例の腺扁平上皮癌（ＡＳＣ；ＮＣＩ−Ｈ２２６）、５例の扁平上皮癌（ＳＣＣ；ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ）、１例の大細胞癌（ＬＸ１）、および６例の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ；ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＮＣＩ−Ｈ１９６、およびＮＣＩ−Ｈ４４６）を含んだ。ヒト気管支上皮細胞（ＢＥＡＳ−２Ｂ）およびヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）を対照として使用した。細胞はすべて、１０％ＦＣＳを補充した適切な培地中で単層で増殖させ、５％ＣＯ２を含む加湿大気中で３７℃で維持した。原発性肺癌試料は以前に入手していた。臨床病期は、国際対癌連合のＴＮＭ分類（Sobin L et al., 6th ed. New York 2002）に従って判断した。ＡＤＣ  ２０３例、ＳＣＣ  １００例、ＬＣＣ  ２５  例、ＡＳＣ  １１例を含む原発性ＮＳＣＬＣ（病期Ｉ〜ＩＩＩＡ）および隣接する正常肺組織のホルマリン固定試料計３３９例を、埼玉県立がんセンター（埼玉、日本）において外科手術を受けた患者から、臨床病理データと共に以前に入手した。言及したすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。
【０３３７】
２．半定量的逆転写−ＰＣＲ
各試料由来のｍＲＮＡの計３μｇアリコートを、ランダムプライマー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ＳＹＮＧＲ４特異的合成プライマーまたは内部対照としてのβ−アクチン（ＡＣＴＢ）特異的プライマーの以下のセットを用いて、半定量的逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）実験を行った：ＳＹＮＧＲ４、５’−ＣＡＡＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡＣＡＴＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および５’−ＡＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；ＡＣＴＢ、５’−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５’−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）。産物強度が直線増幅期の範囲内に確実に入るように、サイクル数に関してＰＣＲを最適化した。
【０３３８】
３．ノーザンブロット解析
プライマー５’−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および５’−ＧＡＡＧＣＧＣＴＴＧＴＡＡＧＧＧＡＣＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）をプローブとして用いて調製した、［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識したＳＹＮＧＲ４の４０６−ｂｐ  ＰＣＲ産物と、１６の組織にわたるヒト多組織ブロット（ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｔ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）とをハイブリダイズさせた。製造業者の仕様書に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。−８０℃で７日間、増感スクリーンを用いて、ブロットのオートラジオグラフィーを行った。
【０３３９】
４．ＳＹＮＧＲ４発現ベクターの構築
ＳＹＮＧＲ４の全コード領域を、プライマーセット（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）および５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＡＧＣＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ  Ａ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の適切な部位にクローニングし、ＳＹＮＧＲ４タンパク質のＣＯＯＨ末端にｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓエピトープ配列（ＬＤＥＥＳＩＬＫＱＥＨＨＨＨＨＨ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を含めた。本発明者らはまた、ｐＣＡＧＧＳｎ−３ＦｃベクターおよびｐＣＡＧＧＳｎ−３ＦＨベクターを用いて、ＳＹＮＧＲ４タンパク質のＮＨ２末端に３×Ｆｌａｇエピトープ配列（ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を含む発現ベクターも構築した。Ｔｙｒ４６をフェニルアラニンで置換した変異ＳＹＮＧＲ４（Ｙ４６Ｆ）の作製は、標準的な変異誘発ＰＣＲにより行った（Suzuki C, et al. Cancer Res 2005; 65:11314-25.）。ＳＹＮＧＲ４−Ｙ４６Ｆに使用したプライマーセットは、以下の通りであった；フォワード、５’−ＣＧＡＣＧＧＣＴｔＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、およびリバース、５’−ＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧａＡＧＣＣＧＴＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）（小文字は変異させたヌクレオチドを示す）。簡潔に説明すると、フォワードクローニングプライマーとリバースＹ４６Ｆプライマー、またはフォワードＹ４６Ｆプライマーとリバースクローニングプライマーのプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ＳＹＮＧＲ４配列を増幅した。２つの増幅ＰＣＲ産物を精製し、変異誘発ＰＣＲを行うことにより融合した。
【０３４０】
５．免疫細胞化学的解析
透過化条件下での解析のために、細胞をカバーガラス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）上にプレーティングし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で５分間の透過処理を行った。非特異的な結合を、Ｃａｓｂｌｏｃｋ（ＺＹＭＥＤ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）により室温で１０分間ブロッキングした。次いで、細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した１．３μｇ／ｍｌのヤギポリクローナル抗ヒトＳＹＮＧＲ４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）と共に室温で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により室温で６０分間染色した。ＰＢＳでさらに洗浄した後、各標本を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）でマウントし、スペクトル共焦点スキャンシステム（ＴＳＣ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で可視化した。ＳＹＮＧＲ４の細胞内局在を判定するために、固定した細胞を、透過処理ありまたはなしの条件に分けた。ブロッキングおよび一次抗体とのインキュベーション後、細胞表面に結合した抗体を除去するために、細胞を酸性グリシンで５分間処理した。酸性グリシン処理の後、二次抗体および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを通常の手順により処理した。
【０３４１】
６．フローサイトメトリー解析
肺癌細胞（細胞２×１０６個）を、細胞表面ＳＹＮＧＲ４を検出するためのヤギ抗ＳＹＮＧＲ４抗体（５μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）または対照ヤギＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８結合抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）で解析し、ＭｏｄＦｉｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ，  Ｉｎｃ．、Ｔｏｐｓｈａｍ，  ＭＥ）により解析した。平均蛍光強度を、相対シグナル強度値、すなわち、抗ＳＹＮＧＲ４抗体で処理した細胞／対照ヤギＩｇＧで処理した細胞として算出した。
【０３４２】
７．免疫組織化学および組織マイクロアレイ
本発明では、以下の様式で、パラフィンブロック内に包埋した臨床試料中のＳＹＮＧＲ４タンパク質を染色した。簡潔に説明すると、内在性ペルオキシダーゼおよびタンパク質のブロッキング後、ＳＹＮＧＲ４に対する２０μｇ／ｍＬの一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を各スライドに添加し、二次抗体としてのＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ［Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｉｎ  ＭＡＸ  ＰＯ  （Ｇ）、Ｎｉｃｈｉｒｅｉ、Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ］と共に切片をインキュベーションした。基質−色原体を添加し、標本をヘマトキシリンで対比染色した。ＳＹＮＧＲ４に対する抗体特異性を調べるための抗原ブロッキングアッセイを、以下の通りに行った。免疫組織化学染色の前に、２０μｇ／ｍＬの抗ＳＹＮＧＲ４抗体（カタログ番号ｓｃ−３４９６８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＳＹＮＧＲ４抗原ペプチド（カタログ番号ｓｃ−３４９６８Ｐ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に３７℃で６０分間インキュベーションし、反応産物を１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離して、免疫複合体を除去した。上清を、さらなる解析のための中和化抗体として使用した。抗ＳＹＮＧＲ４抗体とその抗原ペプチドの反応モル比は１：８であった。
【０３４３】
他所に記載した通りに、ホルマリン固定した３３９例の原発性肺癌を用いて腫瘍組織マイクロアレイを構築した（Chin SF et al., Mol Pathol 2003, 56: 275-9；Callagy G et al., Diagn Mol Pathol 2003, 12: 27-34；Callagy G et al., J Pathol 2005, 205: 388-96）。スライド上の対応するＨ＆Ｅ染色切片を用いた視覚的位置合わせに基づいて、試料採取用の組織領域を選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ、または５つの組織コア（直径０．６  ｍｍ；深さ３〜４  ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｕｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，  ＷＩ）を用いて、レシピエントのパラフィンブロック中に配置した。各症例から正常組織のコアを打ち抜き、得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学的解析に使用した。３名の独立した研究者が、臨床病理学的データの事前知識を持たずに、ＳＹＮＧＲ４陽性度を半定量的に評価した。以下の基準を用いて、ＳＹＮＧＲ４染色の強度を評価した：強陽性（スコア２＋）、細胞質を完全に不明瞭化する＞５０％の腫瘍細胞における褐色染色；弱陽性（１＋）、腫瘍細胞細胞質中で認識可能である任意のより低度の褐色染色；および、なし（スコア０）、腫瘍細胞中の染色は認識不可能。評価者らが独立して症例を強陽性と規定した場合にのみ、症例を強陽性と認めた。
【０３４４】
８．統計学的解析
ＳｔａｔＶｉｅｗ統計プログラム（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を用いて、統計学的解析を行った。手術日からＮＳＣＬＣ関連の死亡時点までの、または最後の経過観察時点までの、腫瘍特異的生存曲線を算出した。各関連変数に関して、およびＳＹＮＲＧ４発現に関して、カプラン・マイヤー曲線を算出し；ログランク検定を用いて、患者サブグループ間の生存期間の差を解析した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を行い、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との関連性を判定した。最初に、死亡と、年齢、性別、病理学的腫瘍分類、および病理学的結節分類を含む他の予後因子との関連性を、一度に１因子を考慮して解析した。次に、多変量Ｃｏｘ解析を、Ｐ値＜０．０５の開始レベルを満たした任意の全ての変数と共に、常にＳＹＮＧＲ４強発現を強制的にモデルに当てはめる逆方向の（段階的な）手法に適用した。モデルが因子を付加し続ける限り、独立因子はＰ＜０．０５の終了レベルを超えなかった。
【０３４５】
９．ＲＮＡ干渉アッセイ
本発明は以前、哺乳動物細胞中で低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を合成するように設計された、ベクターに基づくＲＮＡ干渉系であるｐｓｉＨ１ＢＸ３．０を確立した（Suzuki C et al., Cancer Res 2003, 63: 7038-41）。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３０μＬを用いて、ｓｉＲＮＡ発現ベクター１０μｇを肺癌細胞株ＳＢＣ−５およびＡ５４９にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で７日間培養し；コロニー数をギムザ染色によって計数し；処理の７日後に、細胞の生存率を臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムアッセイによって評価した。簡潔に説明すると、細胞計数キット−８溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１／１０容積の濃度で各ディッシュに添加し、プレートを３７℃でさらに１時間インキュベーションした。次いで、４９０  ｎｍおよび参照として６３０  ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。ＳＹＮＧＲ４  ｍＲＮＡ発現の抑制を確認するために、標準的プロトコールに従って、以下のＳＹＮＧＲ４特異的合成プライマーを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。ＲＮＡ干渉のための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：対照１（ＥＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）緑色蛍光タンパク質の変異体）、５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；対照２（ルシフェラーゼ／ＬＵＣ：フォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子）、５’−ＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；ｓｉＲＮＡ−ＳＹＮＧＲ４−＃１、５’−ＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；ｓｉＲＮＡ−ＳＹＮＧＲ４−＃２、５’−ＡＴＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ｓｉＲＮＡ−ＳＹＮＧＲ４−＃３、５’−ＣＧＣＡＵＵＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＧＣＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ｓｉＲＮＡ−ＳＹＮＧＲ４−＃４、５’−ＧＣＡＵＵＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＧＣＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ｓｉＲＮＡ−ＰＡＫ１、５’−ＣＡＡＡＣＡＵＵＧＵＧＡＡＵＵＡＣＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）。ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖の３’にＴＴを付加した。
【０３４６】
１０．細胞増殖アッセイ
ＳＹＮＧＲ４を発現するプラスミドまたはモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、６ウェルプレートに播種し（細胞５×１０４個／ウェル）、１０％ＦＢＳおよび０．４  ｍｇ／ｍｌジェネテシンを含む培地中で維持した。７２時間後に、細胞計数キット（Ｗａｋｏ、Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を用いてＭＴＴアッセイにより、細胞増殖を評価した。
【０３４７】
１１．マトリゲル浸潤アッセイ
ＳＹＮＧＲ４を発現するプラスミドまたはモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でコンフルエント近くまで増殖させた。細胞をトリプシン処理によって回収し、血清もプロテイナーゼインヒビターも添加していないＤＭＥＭで洗浄し、２×１０５個／ｍＬでＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲル基質（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）の乾燥層をＤＭＥＭを用いて室温で２時間再水和した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（０．７５  ｍＬ）を２４ウェルマトリゲル浸潤チャンバーの各下部チャンバーに添加し、細胞懸濁液０．５  ｍＬ（１×１０５個／細胞）を上部チャンバーの各インサートに添加した。インサートのプレートを３７℃で２２時間インキュベーションした。インキュベーション後、チャンバーを処理し；供給業者（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）の指示通りに、マトリゲルを通して浸潤する細胞を固定し、ギムザで染色した。
【０３４８】
１２．ＳＹＮＧＲ４の細胞浸潤活性を抑制する抗体処理アッセイ
外因性または内因性のＳＹＮＧＲ４を過剰発現した哺乳動物細胞の浸潤能に対する抗ＳＹＮＧＲ４抗体の阻害効果を評価するために、抗ＳＹＮＧＲ４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）による処理下で、マトリゲル浸潤アッセイを行った。ＳＹＮＧＲ４を発現するプラスミドもしくはモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、または内因性ＳＹＮＧＲ４を発現している肺癌細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でコンフルエント近くまで増殖させた。細胞をトリプシン処理によって回収し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭで洗浄し、回収して、ＳＹＮＧＲ４を発現しているＣＯＳ−７細胞、モックをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、またはＳＹＮＧＲ４を内因的に発現している肺癌細胞に関して、１００  ｎＭまたは２００  ｎＭの抗ＳＹＮＧＲ４抗体と共に細胞１×１０５個／チャンバーの数でマトリゲルチャンバー中に入れた。対照アッセイとして、これらの細胞を２００  ｎＭアイソタイプヤギＩｇＧまたはＰＢＳでも処理した。下部チャンバーにおいて、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（０．７５  ｍＬ）を２４ウェルマトリゲル浸潤チャンバーの各下部チャンバーに添加し、上部チャンバーと同濃度の抗ＳＹＮＧＲ４抗体、アイソタイプＩｇＧ、またはＰＢＳを下部チャンバーに添加した。インサートのプレートを３７℃で２２時間インキュベーションし、インキュベーション後、チャンバーを処理した；マトリゲルを通して浸潤する細胞を固定し、ギムザで染色し、浸潤細胞の数を計数した。
【０３４９】
１３．抗体および試薬
抗ＳＹＮＧＲ４抗体（カタログ番号ｓｃ−３４９６８）、抗ｍｙｃ抗体、および抗ＧＡＰＤＨ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１（Ｓｅｒ２９８）抗体、抗ＭＥＫ１／２抗体、抗リン酸化ｃ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ３３８）抗体、抗ｃ−Ｒａｆ抗体、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）抗体、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）抗体、抗ＡＫＴ抗体、抗ＧＲＢ２抗体、抗ＰＡＫ１抗体、および抗リン酸化ＰＡＫ１／２（Ｔｈｒ４２３）抗体は、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。抗リン酸化トリプシン抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製である。フローサイトメトリーに用いたアイソタイプヤギＩｇＧは、Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．製である。ＲａｃおよびＲａｓ活性化アッセイキットはＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃから購入し、アッセイは製造業者のプロトコールに従って行った。
【０３５０】
１４．ウエスタンブロット解析
ｓｉ−ＳＹＮＧＲ４−＃１またはｓｉ−ＥＧＦＰをトランスフェクトしたＡ５４９細胞およびＳＢＣ−３細胞の溶解物、ならびに、野生型ＳＹＮＧＲ４もしくは変異ＳＹＮＧＲ４−Ｙ４６Ｆを発現するプラスミドまたはモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の溶解物を、ウエスタンブロッティングに供した。簡潔に説明すると、プロテアーゼインヒビター（プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で、細胞を１  ｍＬの溶解緩衝液（０．５％ＮＰ−４０、５０  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０  ｍｍｏｌ  ＮａＣｌ）中でインキュベーションした。以前に記載された通りに（Suzuki C, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25.）、ＥＣＬウエスタンブロッティング解析システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてウエスタンブロッティングを行った。ＳＹＮＧＲ４によるＭＡＰＫシグナル伝達活性化の解析には、各ＭＡＰＫシグナル伝達タンパク質に対する特異的抗体（上記を参照されたい）を使用し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体および抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が、これらの実験用の二次抗体として役立った。
【０３５１】
１５．ホスファターゼアッセイ
ＳＹＮＧＲ４プラスミドを発現するプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を溶解緩衝液によって溶解し、５０  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ７．５）、０．１  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２−ＥＤＴＡ、５  ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール、２  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、および０．０１％Ｂｒｉｊ−３５を含むホスファターゼ緩衝液中で４００単位のλホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で３０℃にて１時間処理し、その後上記の通りウエスタンブロッティングを行った。
【０３５２】
１６．免疫沈降
ＳＹＮＧＲ４を発現するプラスミドまたはモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞溶解物を、免疫沈降およびウエスタンブロッティングに供した。簡潔に説明すると、プロテアーゼインヒビター（プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）の存在下、１  ｍＬの溶解緩衝液（０．５％ＮＰ−４０、５０  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０  ｍｍｏｌ  ＮａＣｌ）中で、細胞をインキュベーションした。プロテアーゼインヒビターの存在下、最終容量１  ｍｌの溶解緩衝液中で、３０  ｍＬプロテインＧ−アガロースビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で１時間インキュベーションすることにより、細胞抽出物をあらかじめ清澄化（ｐｒｅｃｌｅａｒ）した。外因性ＳＹＮＧＲ４に特異的な抗体（抗ｍｙｃ抗体または抗Ｆｌａｇ抗体）および内因性ＧＲＢ２またはリン酸化チロシンに特異的な抗体を用いて、免疫沈降およびそれに続くウエスタンブロッティングを行った。
【０３５３】
実施例２：肺癌および正常組織におけるＳＹＮＧＲ４発現
癌細胞の生物学的特徴に基づいた新規のバイオマーカーおよび治療の開発に適用可能となり得る新規分子を同定するため、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、肺癌１０１例のゲノム全域にわたる発現プロファイル解析を行った（Kikuchi T et al., Oncogene 2003, 22: 2192-205；Kakiuchi S et al., Mol cancer Res 2003, 1: 485-99；Kakiuchi S et al., Hum Mol Genet 2004, 13: 3029-43；Kikuchi T et al., Int J Oncol 2006, 28: 799-805；Taniwaki M et al., Int J Oncol 2006, 29: 567- 75）。スクリーニングした３２，２５６遺伝子のうち、調べた肺癌試料の大多数で、癌細胞におけるＥＢＩ３転写産物の発現上昇（５倍またはそれ以上）が同定された。肺癌組織１５例のうち１０例において、肺癌細胞株２２例のうち１７例において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によりその過剰発現が確認された（図１Ａ）。本発明者らは、免疫蛍光解析を行って、肺癌細胞における内因性ＳＹＮＧＲ４の細胞内局在を調べた。ＳＹＮＧＲ４は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によりＳＹＮＧＲ４転写産物が検出されたＬＣ３１９細胞、ＮＣＩ−Ｈ１３７３細胞、およびＡ５４９細胞において、主に腫瘍細胞の細胞質および表面上で高レベルで検出されたが、ＮＣＩ−Ｈ１７８１細胞ならびに気管支上皮由来のＢＥＡＳ−２Ｂ細胞およびＳＡＥＣ細胞では検出されず、これらはＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現を示さなかった（図１Ｂ）。この結果から、ＳＹＮＧＲ４抗体の特異性もまた示された。ＳＹＮＧＲ４は、４つの膜貫通ドメインを有する細胞表面タンパク質をコードすると予測されたが、ＳＹＮＧＲ４のＮ末端およびＣ末端の両方が細胞内部分に相当し得るのかまたは細胞外部分に相当し得るのかを示す報告はなかった。そのため、本発明者らはまず、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘのような細胞透過処理剤を用いてまたは用いずに免疫細胞化学的解析を行った。Ｃ末端にｍｙｃ／Ｈｉｓタグを有するＳＹＮＧＲ４を発現するように設計したプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＳＹＮＧＲ４−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）、およびＮ末端に３×Ｆｌａｇタグを有するＳＹＮＧＲ４を発現するように設計したプラスミド（ｐＣＡＧＧＳｎ３Ｆ−ＳＹＮＧＲ４）を構築した。次いで、該プラスミドまたはモックプラスミドをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、ｍｙｃタグ付ＳＹＮＧＲ４を検出するために抗ｍｙｃ抗体、およびＦｌａｇタグ付ＳＹＮＧＲ４を検出するために抗Ｆｌａｇ抗体を用いて、該細胞を染色した。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで前処理した細胞の免疫細胞化学染色により、細胞表面上および細胞質中のＳＹＮＧＲ４タンパク質の発現が確認された。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ処理を行わない場合には、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の細胞表面染色のみが観察され（図１Ｃ、左上パネル）、これによりＳＹＮＧＲ４タンパク質のＣ末端が細胞外部分であり得ることが示された。また、Ｎ末端タグ付ＳＹＮＧＲ４発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞表面上でＳＹＮＧＲ４が染色されることも確認された（データは示さず）。抗ＳＹＮＧＲ４抗体はＳＹＮＧＲ４のＣ末端を認識するため、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ処理無しで肺癌ＬＣ３１９細胞の免疫蛍光解析を行い、内因性ＳＹＮＧＲ４タンパク質のＣ末端が細胞外に位置することを確認した（図１Ｃ、左下パネル）。ＳＹＮＧＲ４のＣ末端およびＮ末端がいずれも細胞外部分であることを��らに確認するため、一次抗体反応後に酸性グリシンで細胞を処理することにより、免疫蛍光解析を行った。予測通り、ＳＹＮＧＲ４陽性のＣＯＳ−７細胞  ＬＣ３１９細胞の細胞表面上のＳＹＮＧＲ４染色は、酸性グリシン処理により抗体を剥ぎ取ることによって消失した（図１Ｃ、右パネル）。また、ＳＹＮＧＲ４のＣ末端を認識する同じ抗ＳＹＮＧＲ４抗体を用いたフローサイトメトリーにより、ＳＹＮＧＲ４陽性およびＳＹＮＧＲ４陰性の肺癌細胞の表面上のＳＹＮＧＲ４タンパク質のレベルも測定し、ＳＹＮＧＲ４のＣ末端およびＮ末端の両方が細胞表面上で検出されること、ならびに膜ＳＹＮＧＲ４タンパク質のレベルが、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現レベルと相関することを確認した（図１Ｄ）。
【０３５４】
プローブとしてＳＹＮＧＲ４  ｃＤＮＡ断片を用いるノーザンブロット解析により、精巣においてのみ１．２  ｋｂの転写産物が同定され、任意の他の正常組織では同定されなかった（図２Ａ）。本発明はまた、５例の正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺、および精巣）および肺癌組織（ＡＤＣ、ＳＣＣ、およびＳＣＬＣ）において、ＳＹＮＧＲ４特異的なポリクローナル抗体を用いてＳＹＮＧＲ４タンパク質の発現も調べた。ＳＹＮＧＲ４染色は、主に肺腫瘍細胞および精巣の細胞質において観察されたが、他の４例の正常組織では検出されなかった（図２Ｂ）。
【０３５５】
実施例３：ＳＹＮＧＲ４発現とＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連性
肺発癌におけるＳＹＮＧＲ４の生物学的および臨床病理学的な重要性を検証するため、根治的外科切除を受けたＮＳＣＬＣ３３９例からの組織切片を含む組織マイクロアレイにおいて免疫組織化学染色を行った。ＳＹＮＧＲ４に特異的なポリクローナル抗体で検出されたＳＹＮＧＲ４染色は、主に腫瘍細胞の膜および細胞質で観察されたが、正常肺細胞では観察されなかった（図２Ｃ、左パネル）。本発明では、組織アレイでのＳＹＮＧＲ４発現のパターンを、なし（スコア０）〜弱／強陽性（スコア１＋〜２＋）の範囲に分類した。３３９例のＮＳＣＬＣ中、ＳＹＮＧＲ４は１２７例（３７．５％）で強く染色され（スコア２＋）、１５７例（４６．３％）で弱く染色され（スコア１＋）、および５５例（１６．２％）で染色されなかった（スコア０）（表１Ａ）。次いで、ＳＹＮＧＲ４発現（強陽性  対  弱陽性／なし）と様々な臨床病理学的パラメータとの相関関係を調べ、性別（男性で高い；フィッシャーの正確確率検定によりＰ＝０．０４８７）、組織型（非ＡＤＣで高い；フィッシャーの正確確率検定によりＰ＝０．０１１６）、およびリンパ節転移（ｐＮ１〜２で高い；フィッシャーの正確確率検定によりＰ＝０．０１７５）とのその有意な相関関係を認めた（表１Ａ）。ＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値は、ＳＹＮＧＲ４のより高い発現レベルと一致して、有意により短かった（Ｐ＝０．０００２、ログランク検定；図２Ｃ、右パネル）。また本発明は単変量解析を適用して、患者の予後と、年齢、性別、病理学的腫瘍病期（腫瘍サイズ；Ｔ１  対  Ｔ２〜３）、病理学的結節病期（結節状態；Ｎ０  対  Ｎ１〜２）、組織像（ＡＤＣ  対  他の組織型）、およびＳＹＮＧＲ４状態（スコア０、１＋  対  ２＋）を含む複数の因子との間の関連性も評価した。それらの変数はすべて、予後不良と有意に関連していた。Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた多変量解析により、ＳＹＮＧＲ４（Ｐ＝０．００７８）および他の３つの因子（年齢、腫瘍サイズ、およびリンパ節転移）は、外科的治療を受けたＮＳＣＬＣ患者の独立予後因子であると判断された（表１Ｂ）。
【０３５６】
（表１Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＳＹＮＧＲ４陽性度と患者の特徴との関連（ｎ＝３３９）
2012501161.tif 000002
＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの正確確率検定）
ＮＳ：有意性なし
ＡＤＣ：腺癌
非ＡＤＣ：扁平上皮癌＋大細胞癌および腺扁平上皮癌
【０３５７】
（表１Ｂ）ＮＳＣＬＣ患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
2012501161.tif 000003
ＡＤＣ：腺癌
非ＡＤＣ：扁平上皮癌＋大細胞癌および腺扁平上皮癌
ＮＳ：有意性なし
＊Ｐ＜０．０５
【０３５８】
実施例４：ＳＹＮＧＲ４の細胞増殖効果
ＳＹＮＧＲ４の上方制御が肺癌細胞の増殖および／または生存に役立つかどうかを評価するため、２つの異なる対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰおよびＬＵＣに対するｓｉＲＮＡ）と共に、ＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡによる内因性ＳＹＮＧＲ４発現の阻害を評価した。有効なｓｉＲＮＡでＮＳＣＬＣ細胞（Ａ５４９）（左パネル）およびＳＣＬＣ細胞（ＳＢＣ−５）（右パネル）を処理することによりＳＹＮＧＲ４の発現を低下させることができ（図３Ａ）、結果として、ＭＴＴアッセイおよびコロニー形成アッセイにより測定した細胞生存度およびコロニー数の有意な阻害がもたらされた（図３Ａ）。腫瘍形成におけるＳＹＮＧＲ４の役割を明らかにするため、ＳＹＮＧＲ４を発現するプラスミドまたはモックプラスミドをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、細胞増殖に対するＳＹＮＧＲ４の効果を評価し、ＳＹＮＧＲ４を外因的に過剰発現するＣＯＳ−７細胞における有意な細胞増殖を認めた（図３Ｂ）。ｓｉＲＮＡアッセイの結果と一致して、このデータは、ＳＹＮＧＲ４が腫瘍の増殖および／または生存に必要であるという結論と合致する。
【０３５９】
実施例５：ＳＹＮＧＲ４による哺乳動物細胞浸潤の促進
強力なＳＹＮＧＲ４発現は肺癌患者のリンパ節転移および予後不良と関連していたため、哺乳動物細胞の細胞浸潤におけるＳＹＮＧＲ４の役割を、マトリゲルアッセイによって調べた。ＳＹＮＧＲ４発現ベクターをＣＯＳ−７細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトしたところ、マトリゲルを通したその浸潤は、モックベクターをトランスフェクトした細胞と比較して有意に増大した（図４Ａ）。
【０３６０】
実施例６：細胞浸潤活性に対する抗ＳＹＮＧＲ４抗体の阻害効果
ＳＹＮＧＲ４が細胞表面上に発現することが判明したため、ＳＹＮＧＲ４に対する抗体を用いることによりＳＹＮＧＲ４の機能を阻止した。ＳＹＮＧＲ４のＣ末端は細胞膜の外側にあると考えられたため、この領域（ｌｅｓｉｏｎ）を抗体処理により標的化した。本発明者らは、ＳＹＮＧＲ４抗体によるＳＹＮＧＲ４依存的細胞浸潤の阻害を評価するため、ＳＹＮＧＲ４発現ベクターまたはモックベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞をマトリゲルアッセイに適用した。ＳＹＮＧＲ４により誘導される浸潤活性は、抗ＳＹＮＧＲ４抗体により用量依存的様式で有意に阻止された（図４Ｂ）。次いで、肺癌細胞浸潤に対する抗ＳＹＮＧＲ４抗体の機能阻止効果を評価した。ＣＯＳ−７細胞の結果と一致して、内因性ＳＹＮＧＲ４を高度に発現するＡ５４９細胞の細胞浸潤性は、抗ＳＹＮＧＲ４抗体により用量依存的様式で効果的に阻止されたが、該抗体はＳＹＮＧＲ４陰性ＮＣＩ−Ｈ１７８１細胞の細胞浸潤性は阻止しなかった（図４Ｃ）。これらの結果は、ＳＹＮＧＲ４が細胞浸潤に必要であり、抗体に基づく免疫療法の理想的な標的であるという結論と合致する。
【０３６１】
ＳＹＮＧＲ４におけるＧＲＢ２  ＳＨ２ドメイン結合モチーフを介したＳＹＮＧＲ４とＧＲＢ２との相互作用
実証した通り、ＳＹＮＧＲ４は膜タンパク質であり、Ｎ末端およびＣ末端はいずれも細胞表面の外側にある。本発明者らは次に、ＳＹＮＧＲ４の細胞内領域における転写後修飾を評価した。ＳＹＮＧＲ４ファミリータンパク質は重度にリン酸化されるため（Janz R et al. Neuron 1999;24:687-700.、Janz R, J Biol Chem. 1998; 273: 2851-7.）、本発明者らはまず、ＳＹＮＧＲ４を外因的に発現するＣＯＳ−７細胞をホスファターゼ処理し、処理後にバンドが下方へ移動したことから、ＳＹＮＧＲ４がリン酸化されている可能性が高いことを見出した（図５Ａ、左上パネル）。本発明者らは次に、免疫沈降させた、外因的にＳＹＮＧＲ４を発現するＣＯＳ−７細胞の溶解物を、抗リン酸化チロシンを用いて免疫ブロットすることにより、ＳＹＮＧＲ４タンパク質のリン酸化残基を同定することを試み（図５Ａ、右パネル）、ＳＹＮＧＲ４中のチロシン残基がリン酸化され得ることを確認した。本発明者らは次に、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の細胞内配列におけるチロシン残基に注目し、チロシン−４６が細胞内に位置することを見出した（図５Ａ、下パネル）。ＳＹＮＧＲ４チロシン−４６は、予測されるコンセンサスＧＲＢ２  ＳＨ２ドメイン結合モチーフ（ｐＹ−Ｘ−Ｎ）内に含まれたため、本発明者らは次に、様々なタンパク質と相互作用する多機能性アダプタータンパク質であるＧＲＢ２とＳＹＮＧＲ４が相互作用する可能性を評価した。免疫沈降実験によりこれらの相互作用が確認され（図５Ｂ）、これにより、ＳＹＮＧＲ４がＧＲＢ２を用いる機能的シグナル伝達経路に関与し得ることが示される。ＳＹＮＧＲ４中のチロシン−４６がリン酸化され、ＧＲＢ２相互作用残基として機能し得るかどうかを調べるため、本発明者らは次に、フェニルアラニン置換変異ＳＹＮＧＲ４を作製し、抗Ｆｌａｇ抗体によって得られた野生型ＳＹＮＧＲ４または変異ＳＹＮＧＲ４の免疫沈降物を用いて、抗リン酸化チロシンを用いる免疫ブロッティングを行った。予測通り、ブロットされたリン酸化チロシンは著しく減少し（図５Ｃ、左パネル）、チロシン−４６がリン酸化され得ることが示された。次に、同じ免疫沈降物を用いてＧＲＢ２の免疫ブロッティングを行い、野生型ＳＹＮＧＲ４と比較して、変異ＳＹＮＧＲ４−Ｙ４６ＦにおいてはＧＲＢ２結合ＳＹＮＧＲ４の量が減少することを見出した（図５Ｃ、左パネル）。これらのデータから、ＳＹＮＧＲ４中のチロシン−４６が、ＳＹＮＧＲ４とＧＲＢ２との相互作用にとって重要な残基であることが示される。
【０３６２】
ＰＡＫ１を介するＭＡＰＫシグナル伝達経路の新規調節因子としてのＳＹＮＧＲ４
ＳＹＮＧＲ４を哺乳動物細胞に導入すると細胞増殖および浸潤の促進が示されるため、本発明者らは、細胞の増殖および浸潤に関連するＳＹＮＧＲ４依存的シグナル伝達分子を見つけることを試みた。ＧＲＢ２は、ＳＯＳと協働して細胞表面のシグナルをＲａｓ−ＭＡＰＫ経路へと仲介する重要な分子であることが知られている（Downward J. FEBS Lett. 1994; 338: 113-7）。Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル伝達は肺癌進行の最も原因となるシグナルの１つと考えられているため（Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ  ＪＳ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００４；４；９３７−４７）、本発明者らはまず、ＣＯＳ−７細胞におけるＲＡＳ−ＭＡＰＫシグナル伝達分子の活性化に対する、外因性ＳＹＮＧＲ４発現の効果を評価した。ＲＡＦ１組換えタンパク質を用いたプルダウンアッセイにより、活性化ＲＡＳのレベルは上昇しないが（図７Ｂ）、興味深いことに、外因的に発現させたＳＹＮＧＲ４によってｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ、およびＥＲＫタンパク質のリン酸化が有意に増大することを、本発明者らは見出した（図６Ａ、左パネル）。さらに、肺癌細胞株であるＡ５４９細胞およびＳＢＣ−３細胞において、ＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡにより内因性ＳＹＮＧＲ４発現をノックダウンすることによって、本発明者らは、各ＭＡＰＫシグナル伝達タンパク質のリン酸化が顕著に低下することを見出した（図６Ａ、右パネル）。これらのデータから、ＭＡＰＫシグナル伝達はＳＹＮＧＲ４の標的であるが、ＲＡＳ活性化を介さないことが示唆された。本発明者らは次に、ＧＲＢ２に対するｓｉＲＮＡによりＣＯＳ−７細胞において内因性ＧＲＢ２タンパク質をノックダウンし、その後ＳＹＮＧＲ４を導入するアッセイを行った（図６Ｂ）。おそらくはＧＲＢ２−ＳＯＳ−ＲＡＳシグナル伝達経路の終結のために、ｓｉ−ＧＲＢ２によりベースラインリン酸化状態の有意な減少が認められたが、ｓｉＧＲＢ２で処理した細胞にＳＹＮＧＲ４を導入してもＭＡＰＫシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態は変化しないことが判明した。本発明者らはさらに、ＧＲＢ２に対する結合親和性が有意に低下した変異ＳＹＮＧＲ−Ｙ４６ＦをＣＯＳ−７細胞に導入することにより、ＳＹＮＧＲ４とＧＲＢ２との関連性を解析した。予測通り、野生型ＳＹＮＧＲ４を発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞と比較して、変異ＳＹＮＧＲ−Ｙ４６Ｆ発現ベクターをトランスフェクトした細胞では、リン酸化状態のＭＡＰＫシグナル伝達分子が有意に減少した（図６Ｃ）。これらのデータから、ＧＲＢ２は、ＳＹＮＧＲ４がその下流シグナル伝達分子として機能するために不可欠な相互作用タンパク質であることが示される。次に本発明者らは、ＭＡＰＫシグナル伝達に影響を与える、ＲＡＳ以外の他の分子を探索した。ＭＡＰＫシグナル伝達分子内のリン酸化部位の中で、ＭＥＫ１のセリン−２９８は、ｐ２１タンパク質活性化キナーゼ（ＰＡＫ）によって特異的にリン酸化される部位として知られており（Slack-Davis JK, et al. J Cell Biol. 2003; 162: 281-91.、Park ER et al. Cell Signal. 2007; 19: 1488-96.）、本発明者らは、ＭＥＫ１のセリン−２９８リン酸化のレベルが、ＳＹＮＧＲ４の発現と一致して増強されることを見出した（図６Ａおよび６Ｃ）。そのため、肺癌細胞���おいて、そのキナーゼ活性にとって不可欠なリン酸化部位として知られるＰＡＫ１−Ｔｈｒ４２３のリン酸化状態を、ＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡによって評価し、ＰＡＫ１活性が低下することを見出した（図６Ｄ）。次に、ＰＡＫ１に対するｓｉＲＮＡにより内因性ＰＡＫ１をノックダウンすることにより、ＣＯＳ−７細胞において外因性ＳＹＮＧＲ４によって誘導されるリン酸化の増強が低下することを見出した（図６Ｅ）。この結果から、ＳＹＮＧＲ４は、おそらくはＧＲＢ２−ＰＡＫ１およびそれに続くＭＡＰＫシグナルの活性化により、発癌機能を発揮し得ることが示唆された。最後に本発明者らは、ＳＹＮＧＲ４によって誘導される増殖および浸潤活性の増強が、ＳＹＮＧＲ４におけるチロシン−４６をフェニルアラニンへ置換することによって阻害されるかどうかを評価した。外因的に変異ＳＹＮＧＲ−Ｓ４６Ｆを発現するＣＯＳ−７細胞は、野生型ＳＹＮＧＲ４を導入した細胞と比較して、増殖活性および浸潤活性を増強する能力の喪失を示した（図６Ｆ）。これらの知見に従って、ＳＹＮＧＲ４、ＧＲＢ２、ＰＡＫ１が関与する代替的な増殖促進および浸潤促進の経路が示唆され得た（図６Ｇ）。
【０３６３】
考察
癌ゲノミクスおよび分子生物化学における知識の近年の蓄積により、分子標的薬のような癌の治療に関する新たな戦略が導入された（Daigo Y et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53）。分子標的薬は、悪性細胞に対して特異性が高いこと、および、十分に規定されたその作用機序のために副作用が最小限であることが期待されている。そのような分子を見出すため、肺癌細胞において特異的に活性化されるタンパク質を同定するための強力なスクリーニング系を確立した。この戦略は以下の通りであった：（ａ）レーザーマイクロダイセクションと組み合わせた、３２，２５６超の遺伝子を含むゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイシステムを通した、１０１例の肺癌試料中の上方制御された遺伝子の同定（Daigo Y et al., Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008, 56: 43-53; Kikuchi T et al., Oncogene 2003, 22: 2192-205; Kakiuchi S et al., Mol Cancer Res 2003, 1: 485-99; Kakiuchi S et al., Hum Mol Genet 2004, 13: 3029-43; Kikuchi T et al., Int J Oncol 2006, 28: 799-805; Taniwaki M et al., Int J Oncol 2006, 29: 567-75）；（ｂ）ｃＤＮＡマイクロアレイ解析および多組織ノーザンブロット解析による、正常器官においてそのような遺伝子の発現が非常に低いかまたはないことの検証；（ｃ）数百のＮＳＣＬＣ組織試料からなる組織マイクロアレイを用いた、それらの過剰発現の臨床病理学的意義の確認（Suzuki C et al., Cancer Res 2003, 63: 7038-41; Ishikawa N et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 8363-70; Kato T et al., Cancer Res 2005, 65: 5638-46; Furukawa C et al., Cancer Res 2005, 65: 7102-10; Ishikawa N et al., Cancer Res 2005, 65: 9176-84; Suzuki C et al., Cancer Res 2005, 65: 11314-25; Ishikawa N et al., Cancer Sci 2006, 97: 737-45; Takahashi K et al., Cancer Res 2006, 66: 9 408-19; Hayama S et al., Cancer res 2006, 66: 10339-48; Kato T et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 434-42; Suzuki C et al., Mol Cancer Ther 2007, 6: 542-51; Yamabuki T et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25; Hayama S et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25; Kato T et al., Cancer Res 2007, 67: 8544-53; Taniwaki M et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 6624-31; Ishikawa N et al., 2007, 67: 11601-11; Mano T et al., Cancer Sci 2007, 98: 1902-13）；ならびに、（ｄ）ｓｉＲＮＡによる、標的遺伝子が肺癌細胞の生存または増殖に必須であるかどうかの検証（Suzuki C et al., 2003, 63: 7038-41; Ishikawa N et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 8363-70; Kato T et al., Cancer Res 2005, 65: 5638-46; Furukawa C et al., Cancer Res 2005, 65: 7102-10; Suzuki C et al., Cancer Res 2005, 65: 11314-25; Ishikawa N et al., Cancer Sci 2006, 97: 737-45; Takahashi K et al., Cancer Res 2006, 66: 9408-19; Hayama S et al., Cancer Res 2006, 66: 10339-48; Kato T et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 434-42; Suzuki C et al., Mol Cancer Ther 2007, 6: 542-51; Yamabuki T et al., Cancer Res 2007, 67: 2517-25; Hayama S et al., Cancer Res 2007, 67: 4113-22; Kato T et al., Cancer Res 2007, 67: 8544-53; Taniwaki M et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 6624-31; Ishikawa N et al., Cancer Res 2007, 67: 11601-11; Mano Y et al., Cancer Sci 2007, 98: 1902-13; kato T et a;., Clin Cancer Res 2008, 14:2263-70）。解析を通して、診断マーカー、治療薬、および／または免疫療法を開発するための候補となる癌抗原をコードするいくつかの遺伝子が同定された。それらの中で、腫瘍特異的な膜貫通タンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子は、これらが細胞表面上または細胞外空間に存在するという理由のため重大な利点を有すると考えられる。本発明は、上記遺伝子の１つである、複数回膜貫通タンパク質をコードするＳＹＮＧＲ４の発見に一部基づき、ＳＹＮＧＲ４が臨床肺癌試料お��び細胞株において頻繁に過剰発現していること、ならびにその遺伝子産物が肺癌細胞の増殖および浸潤において重要な役割を果たしていることを示した。ＳＹＮＧＲ４は、１９番染色体長腕神経膠腫腫瘍抑制領域の転写産物マッピングによってその染色体局在が最初に記載された２５  ｋＤタンパク質であるが（Smith JS et al., Genomics 2000, 64: 44-50；Kedra D et al., Hum Genet 1998, 273: 2851-7）、その生物学的機能および発癌におけるその関与に言及する報告は存在しない。
【０３６４】
本実施例において、強力なＳＹＮＧＲ４発現がＮＳＣＬＣ患者の臨床転帰不良と関連していることがわかった。ｓｉＲＮＡによりＳＹＮＧＲ４の内因的発現を阻害すると、肺癌細胞の生存率が顕著に低下することもまた実証された。哺乳動物細胞において、ＳＹＮＧＲ４の外因的発現により、細胞増殖および細胞の遊走／浸潤活性が増大した。さらに、ＳＹＮＧＲ４中のＴｙｒ４６がリン酸化され、これがＧＲＢ２との結合に重要であることが明らかになった。ＧＲＢ２は、細胞表面の刺激を細胞質シグナル伝達経路に伝達するのに重要な分子であり（Downward J. FEBS Lett. 1994; 338: 113-7.）、細胞の増殖および浸潤を引き起こす下流シグナル伝達経路に関連したＧＲＢ２の複数の相互作用タンパク質が存在する。ＭＡＰＫシグナル伝達は癌細胞増殖に関して重要な役割を有すると考えられているため（Sebolt-Leopold JS and Herrera R. Nat Rev Cancer. 2004; 4; 937-47.）、本発明者らはＳＹＮＧＲ４の機能を解明するために、このシグナル伝達経路に注目した。予測通り、ＭＡＰＫシグナル伝達分子の活性はＳＹＮＧＲ４の発現によって増強され、ＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡによって抑制された。
【０３６５】
ＰＡＫ１キナーゼによる特異的リン酸化部位として知られているＭＥＫ１中のセリン−２９８（Slack-Davis JK, et al. J Cell Biol. 2003; 162: 281-91., 53）のリン酸化レベルは、ＳＹＮＧＲ４発現と一致して上昇または低下した。さらに、ＰＡＫ１によってリン酸化されかつＲＡＳと協働してｃ−ＲＡＦ活性を増強することが知られているｃ−ＲＡＦ中のセリン３３８（Chaudhary A, et al. Curr Biol 2000; 10: 551-4.）もまた、ＳＹＮＧＲ４発現と一致してそのリン酸化状態が変化した。別の証拠から、ＧＲＢ２はＰＡＫ１と直接相互作用してＰＡＫ１を活性化し得ることが示されている（Puto LA, et al. J Biol Chem. 2003; 278: 9388-93.）。したがって本発明者らは、ＳＹＮＧＲ４がＰＡＫ１を介してＭＡＰＫシグナル伝達経路を正に調節し得ると仮定した。一貫して、ＰＡＫ１に対するｓｉＲＮＡによるＰＡＫ１のノックダウンにより、各タンパク質におけるリン酸化全体の消失を伴うことなく、ＭＡＰＫシグナルタンパク質のリン酸化の増大に対するＳＹＮＧＲ４の効果が減少することが明らかになり、このことは、ｃ−ＲＡＦおよびＭＥＫ１のＰＡＫ１仲介性調節が、標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）増殖因子の最大化およびＭＡＰＫシグナル伝達経路のＲＡＳ仲介性調節にとって重要である可能性が高いという事実と合致する（Beeser A, et al. J Biol Chem. 2005; 280: 36609-15.）。さらに、ＰＡＫ１はＲａｃ／Ｃｄｃ４２  ＧＴＰアーゼのエフェクターの１つであり、その活性は細胞浸潤、細胞骨格動態、および細胞運動性と密接に関連している（Kumar R, et al. Nat Rev Cancer. 2006; 6: 459-71.）。
【０３６６】
ｄ型およびＹ４６Ｆ  ＳＹＮＧＲ４を導入したＣＯＳ−７細胞、ならびに能力の低下が、ＳＹＮＧＲ４に対するｓｉＲＮＡで処理した肺癌細胞において見出された。これらのデータは、ＳＹＮＧＲ４が、ＧＲＢ２−ＰＡＫ１経路を介して細胞浸潤を促進するという本発明者らの仮説を支持するものである。
【０３６７】
肺発癌におけるＳＹＮＧＲ４の詳細な機能はいまだ解析中であるが、本発明者らの結果は、ＳＹＮＧＲ４発現が、細胞の増殖／生存および転移を促すことにより、肺腫瘍の進行を促進するという結論と合致する。
【０３６８】
ＳＹＮＧＲ４は正常組織の中では精巣のみで発現し、かつ膜タンパク質は抗体に基づく療法の理想的な標的であると考えられているため、ＳＹＮＧＲ４陽性細胞でのＳＹＮＧＲ４依存的浸潤活性の阻止における抗ＳＹＮＧＲ４抗体の有効性を調べ、抗ＳＹＮＧＲ４抗体によって細胞浸潤が有意に抑制されることを認めた。この知見は、肺癌治療のための抗ＳＹＮＧＲ４抗体の使用を支持するものである。
【０３６９】
本発明は、ＳＹＮＧＲ４癌精巣抗原が肺癌において頻繁に発現すること、およびこの疾患の予後バイオマーカーであることを実証する。切除標本におけるＳＹＮＧＲ４過剰発現は、予後不良を示す可能性の高い肺癌患者に補助療法を適用するための有用な指標となり得る。さらに、ＳＹＮＧＲ４はＮＳＣＬＣの侵襲性の特性に対する必須の寄与因子である可能性が高く、肺癌に対する分子標的薬および抗体に基づく免疫療法などの新規治療アプローチを開発するための有望な標的である。
【０３７０】
［産業上の利用可能性］
本明細書において実証する通り、細胞増殖は、ＳＹＮＧＲ４遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって抑制される。したがって、該新規二本鎖分子は抗癌剤の開発に有用な候補である。例えば、ＳＹＮＧＲ４タンパク質の発現を阻止しかつ／またはその活性を妨害する剤は、抗癌剤、具体的には肺癌の治療用の抗癌剤として、より具体的にはＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの治療用の抗癌剤として、治療的に有用であり得る。
【０３７１】
ヒトＳＹＮＧＲ４遺伝子の発現は、正常器官と比較して肺癌で顕著に増大する。したがって該遺伝子は、肺癌の診断マーカーとして便利に使用することができ、これによってコードされるタンパク質は、肺癌の診断アッセイにおいて有用である。
【０３７２】
さらに、本明細書に記載した方法は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌の診断、ならびにこれらの疾患を有する患者の予後不良の予測にも有用である。さらに本発明は、肺癌を含む癌の治療アプローチを開発するための有望な候補を提供する。
【０３７３】
さらに、ＳＹＮＧＲ４ポリペプチドは抗癌剤を開発するための有用な標的である。例えば、ＳＹＮＧＲ４と結合するかまたはＳＹＮＧＲ４の発現を阻止するかまたはその活性を妨害する剤は、抗癌剤、特に肺癌治療用の抗癌剤として、治療的有用性を見出し得る。
【０３７４】
本明細書で引用した出版物、データベース、配列、特許、および特許出願はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３７５】
本発明をその特定の態様に関して詳細に説明してきたが、その境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、その範囲内で様々な変更および改変がなされ得ることは、当業者にとって明白であろう。
【図１Ａ】
2012501161.tif 000004
【図１Ｂ】
2012501161.tif 000005
【図１Ｃ】
2012501161.tif 000006
【図１Ｄ】
2012501161.tif 000007
【図２】
2012501161.tif 000008
【図３Ａ】
2012501161.tif 000009
【図３Ｂ】
2012501161.tif 000010
【図４Ａ】
2012501161.tif 000011
【図４Ｂ】
2012501161.tif 000012
【図４Ｃ】
2012501161.tif 000013
【図５Ａ】
2012501161.tif 000014
【図５Ｂ】
2012501161.tif 000015
【図５Ｃ】
2012501161.tif 000016
【図６Ａ】
2012501161.tif 000017
【図６Ｂ】
2012501161.tif 000018
【図６Ｃ】
2012501161.tif 000019
【図６Ｄ】
2012501161.tif 000020
【図６Ｅ】
2012501161.tif 000021
【図６Ｆ】
2012501161.tif 000022
【図６Ｇ】
2012501161.tif 000023
【図７】
2012501161.tif 000024
【国際調査報告】
2012501161.tif 000025
2012501161.tif 000026
2012501161.tif 000027