(57)【要約】  本発明は、ウイルスをハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン、臭化物イオン及びアンモニウムイオンと接触させることによりウイルスを不活性化するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを不活性化するための酵素的方法であって、該ウイルスをハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン及び／又は臭化物イオンならびにアンモニウムイオンと接触させることを含んで成る、方法。
【請求項２】
前記ハロペルオキシダーゼが酵素クラスＥＣ１．１１．１．１０由来のクロロペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハロペルオキシダーゼがバナジウム含有ハロペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列が、クルブラリア・ベルクロサ（Curvularia verruculosa）又はクルブラリア・イネクアリス（Curvularia inequalis）から得られるハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記塩化物イオン及び／又は臭化物イオンが、塩化物及び／又は臭化物の塩に由来し、好ましくは該塩化物及び／又は臭化物の塩が、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、塩化アンモニウム又は臭化アンモニウムを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アンモニウムイオンが、アンモニウム塩に由来し、好ましくは該アンモニウム塩が、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム又はヨウ化アンモニウム、あるいはこれらの混合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記塩化物イオンの濃度がアンモニウムイオンの濃度の少なくとも２倍高く、好ましくはアンモニウムイオンの濃度の少なくとも４倍、さらに好ましくは少なくとも６倍、最も好ましくは少なくとも８倍、そして特には少なくとも１０倍高い、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスを界面活性剤と接触させることをさらに含んで成る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスが非エンベロープウイルス、例えば小型非エンベロープウイルスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが腸内ウイルスである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスがポリオウイルスである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが表面、例えば医療用の装置又は機器の表面に存在する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
高レベル消毒方法である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスを不活性化するための、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物塩及び／又は臭化物塩ならびにアンモニウム塩の使用。
【請求項１５】
医療用装置又は機器の高レベル消毒のための請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを不活性化するための方法、ならびに医療用装置及び機器を消毒又は滅菌するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大半の真菌、ウイルス、及び病原性細菌の栄養細胞は、７０℃で数分以内に死滅又は不活性化される。しかしながら、いくつかの病原性ウイルス、例えばポリオウイルスは、不活性化することが非常に難しい。さらに、高精度の医療用機器は、このような高温に曝露された場合には、しばしば低減した耐用年数を有するため、ウイルス不活性化能を保持しながら、低温且つ温和な条件を利用した医療用機器の消毒方法を使用することが望ましい。
【０００３】
特に、小型非エンベロープウイルス（small non-enveloped virus)、例えばポリオウイルス、パルボウイルス及びＡ型肝炎ウイルスが懸念される。これらは、小型（直径２３〜２７ナノメートル）でエンベロープを有さないヒト病原体であり、脂質エンベロープウイルス、例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスに有効性を示す除去及び不活性化の手段に対して耐性であることが実証されている。
【０００４】
非常に安定なサブクラスの小型非エンベロープウイルスは、腸内ウイルス（例えば、ポリオウイルス及びＡ型肝炎ウイルス）であり、これらは、３未満のｐＨ、洗剤、７０％アルコール及びその他の脂質溶媒、例えばクロロホルムやエーテルに対して耐性である。これらは、５％リゾールや１％第四級アンモニウム化合物のような消毒薬にも耐えるため、腸内ウイルスは不活性化するのが特に難しい。
【０００５】
本発明は、高精度器具、例えば医療用機器において従来法よりも穏やかなウイルスを不活性化するための改善された酵素的方法を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ウイルスを不活性化するための方法であって、ウイルスを、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素の供給源、塩化物イオン及び／又は臭化物イオン、ならびにアンモニウムイオンと接触させることを含んで成る方法を提供する。
【０００７】
一実施形態において、ハロペルオキシダーゼはクロロペルオキシダーゼ又はブロモペルオキシダーゼである。別の実施形態では、ハロペルオキシダーゼはバナジウム含有ハロペルオキシダーゼである。
【０００８】
詳細な説明
ハロペルオキシダーゼ及びハロペルオキシダーゼ活性を示す化合物
本発明の方法に組み入れられるのに適しているハロペルオキシダーゼとしては、クロロペルオキシダーゼ、ブロモペルオキシダーゼ、ならびにクロロペルオキシダーゼ又はブロモペルオキシダーゼ活性を示す化合物が挙げられる。ハロペルオキシダーゼは、過酸化水素又は過酸化水素生成系の存在下において、ハロゲン化物（Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−）を対応する次亜ハロゲン酸に酸化し得る酵素の一クラスを構成する。
【０００９】
ハロペルオキシダーゼは、ハロゲン化物イオンに対するそれらの特異性に従って分類される。クロロペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.10）は、塩化物イオンから次亜塩素酸塩の形成、臭化物イオンから次亜臭素酸塩の形成、及びヨウ化物イオンから次亜ヨウ素酸塩の形成を触媒し、そしてブロモペルオキシダーゼは、臭化物イオンから次亜臭素酸塩の形成、ヨウ化物イオンから次亜ヨウ素酸塩の形成を触媒する。しかしながら、次亜ヨウ素酸塩は、ヨウ素への自発的不均化を受けるため、ヨウ素は観察される生成物である。これらの次亜ハロゲン酸化合物は、その後、他の化合物と反応してハロゲン化化合物を生成する。
【００１０】
好ましい一実施形態において、本発明のハロペルオキシダーゼはクロロペルオキシダーゼである。
【００１１】
ハロペルオキシダーゼは、種々の生物：哺乳類、海洋動物、植物、藻類、地衣類、真菌及び細菌から単離されている。ハロペルオキシダーゼは、本来、ハロゲン化化合物の形成に関与する酵素であるが、他の酵素も関しうることが一般的に許容される。
【００１２】
ハロペルオキシダーゼは、多数の異なる真菌から、特に真菌群の糸状不完全菌類暗色線菌科（dematiaceous hyphomycetes）、例えば海洋性糸状菌（Caldariomyces）、例えばカルダリオミセス・フマゴ（C. fumago）、アテルナリア（Alternaria）、クルブラリア（Curvularia）、例えばクルブラリア・ベルクロサ（C. verruculosa）及びクルブラリア・イネクアリス（C. inaequalis）、ドレクスレラ（Drechslera）、ウロクラジウム（Ulocladium）及びボツリティス（Botrytis）から単離されている。
【００１３】
ハロペルオキシダーゼは、細菌、例えばシュードモナス、例えばシュードモナス・ピロシニア（P. pyrrocinia）及びストレプトミセス、例えばストレプトミセス・アウレオファシエンス（S. aureofaciens）からも単離されている。
【００１４】
好ましい一実施形態において、ハロペルオキシダーゼは、クルブラリア、特にクルブラリア・ベルクロサ又はクルブラリア・イネクアリス、例えばＣ．イネクアリスＣＢＳ  １０２．４２（ＷＯ９５／２７０４６に記載）から得られるバナジウムハロペルオキシダーゼ（すなわち、バナジウム又はバナデート含有ハロペルオキシダーゼ）、例えばＷＯ９５／２７０４６、図２のＤＮＡ配列によりコードされるバナジウムハロペルオキシダーゼ（参照により全て組み入れられる）；あるいはＣ．ベルクロサＣＢＳ１４７．６３又はＣ．ベルクロサＣＢＳ４４４．７０（ＷＯ９７／０４１０２に記載）から得られるバナジウムハロペルオキシダーゼである。好ましくはハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列は、クルブラリア・ベルクロサ（例えばＷＯ９７／０４１０２の配列番号２参照）又はクルブラリア・イネクアリス（例えば、ＷＯ９５／２７０４６の図２のＤＮＡ配列によりコードされる成熟アミノ酸配列）から得られるハロペルオキシダーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性を有する。
【００１５】
別の好ましい実施形態では、ハロペルオキシダーゼは、バナジウム含有ハロペルオキシダーゼ、特にバナジウムクロロペルオキシダーゼである。バナジウムクロロペルオキシダーゼは、ドレクスレラ・ハルトレビ（Drechslera hartlebii）（ＷＯ０１／７９４５９に記載）、デンドリフィエラ・サリナ（Dendryphiella salina）（ＷＯ０１／７９４５８に記載）、フェオトリココニス・クロタラリエ（Phaeotrichoconis crotalarie）（ＷＯ０１／７９４６１に記載）又はゲニクロスポリウム種（Geniculosporium sp.）（ＷＯ０１／７９４６０）から得られる。バナジウムハロペルオキシダーゼは、さらに好ましくは、ドレクスレラ・ハルトレビ（ＤＳＭ１３４４４）、デンドリフィエラ・サリナ（ＤＳＭ１３４４３）、フェオトリココニス・クロタラリエ（ＤＳＭ１３４４１）又はゲニクロスポリウム種（ＤＳＭ１３４４２）から得られる。
【００１６】
ハロペルオキシダーゼの濃度は、典型的には、０．０１〜１００ｐｐｍ酵素タンパク質、好ましくは０．０５〜５０ｐｐｍ酵素タンパク質、さらに好ましくは１〜４０ｐｐｍ酵素タンパク質、さらに好ましくは０．１〜２０ｐｐｍ酵素タンパク質、最も好ましくは０．５〜１０ｐｐｍ酵素タンパク質の範囲である。
【００１７】
一実施形態において、ハロペルオキシダーゼの濃度は、典型的には５〜５０ｐｐｍ酵素タンパク質、好ましくは５〜４０ｐｐｍ酵素タンパク質、さらに好ましくは８〜３２ｐｐｍ酵素タンパク質の範囲である。
【００１８】
ハロペルオキシダーゼ活性の決定
ハロペルオキシダーゼ活性を決定するための検定は、１００μＬのハロペルオキシダーゼ試料（約０．２μｇ／ｍＬ）及び１００μＬの０．３Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７緩衝液−０．５Ｍ臭化カリウム−０．００８％フェノールレッドを混合し、その溶液を１０μＬの０．３％Ｈ2Ｏ2に添加し、そして時間の一関数として５９５ｎｍで吸光度を測定することにより行うことができる。
【００１９】
基質としてモノクロロジメドン（Sigma M4632、290 nmにおいてε＝20000 M-1cm-1）を用いる別の検定は、時間の一関数として２９０ｎｍでの吸光度の低減を測定することにより行うことができる。検定は、０．１Ｍリン酸ナトリウム又は０．１Ｍ酢酸ナトリウム、５０μＭモノクロロジメドン、１０ｍＭＫＢｒ／ＫＣｌ、１ｍＭＨ2Ｏ2及び約１μｇ／ｍＬハロペルオキシダーゼの水溶液中で行われる。１ハロペルオキシダーゼ単位（ＨＵ）は、ｐＨ５及び３０℃で、塩化又は臭化される１マイクロモルのモノクロロジメドン／分と定義される。
【００２０】
過酸化水素
ハロペルオキシダーゼにより必要とされる過酸化水素は、過酸化水素又は過酸化水素のin situ製造のための過酸化水素前駆体の水溶液として提供される。ハロペルオキシダーゼにより使用可能な過酸化物を溶解時に遊離する任意の固体存在物は、過酸化水素の供給源として役立ち得る。水又は適切な水性ベースの媒質中で溶解時に過酸化水素を生じる化合物としては、金属過酸化物、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過オキシ酸、アルキルペルオキシド、アシルペルオキシド、ペルオキシエステル、過酸化尿素、過ホウ酸塩及びペルオキシカルボン酸又はその塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
過酸化水素の別の供給源は、過酸化水素発生酵素系、例えばオキシダーゼのための基質を伴うオキシダーゼである。オキシダーゼと基質の組合せの例としては、アミノ酸オキシダーゼ（例えば米国特許第６，２４８，５７５号参照）と適切なアミノ酸、グルコースオキシダーゼ（例えばＷＯ９５／２９９９６参照）とグルコース、ラクテートオキシダーゼとラクテート、ガラクトースオキシダーゼ（例えばＷＯ００／５０６０６参照）とガラクトース、ならびにアルドースオキシダーゼ（例えばＷＯ９９／３１９９０参照）と適切なアルドースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
（国際生化学連合下で）ＥＣ１．１．３．＿、ＥＣ１．２．３．＿、ＥＣ１．４．３．＿及びＥＣ１．５．３．＿又は類似のクラスを試験することにより、オキシダーゼと基質のこのような組合せの他の例は、当業者に容易に認識される。
【００２３】
過酸化水素又は過酸化水素の供給源は、当該工程の開始時又は工程中に、例えば、典型的には０．００１ｍＭ〜２５ｍＭのレベル、好ましくは０．００５ｍＭ〜５ｍＭのレベル、特に０．０１〜１ｍＭ過酸化水素のレベルに対応する量において添加できる。過酸化水素は、０．１ｍＭ〜２５ｍＭのレベル、好ましくは０．５ｍＭ〜１５ｍＭのレベル、さらに好ましくは１〜１０ｍＭのレベル、最も好ましくは２ｍＭ〜８ｍＭ過酸化水素のレベルに対応する量で用いてもよい。
【００２４】
塩化物及び臭化物イオン
本発明によれば、ハロペルオキシダーゼとの反応に必要とされる塩化物及び／又は臭化物イオン（Ｃｌ-及び／又はＢｒ-）は、多数の異なる方法で、例えば塩化物及び／又は臭化物の塩を添加することにより提供され得る。好ましい一実施形態において、塩化物及び臭化物の塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）又は臭化アンモニウム（ＮＨ4Ｂｒ）；あるいはこれらの混合物である。
【００２５】
一実施形態において、塩化物及び／又は臭化物イオンは、塩化物イオン（Ｃｌ-）又は臭化物イオン（Ｂｒ-）のみに限定される。別の実施形態では、塩化物及び／又は臭化物イオンは、塩化物イオン（Ｃｌ-）及び臭化物イオン（Ｂｒ-）のみに限定される。塩化物イオンは、水溶液に塩化物の塩を添加することにより提供され得る。塩化物の塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化アンモニウムあるいはこれらの混合物であり得る。臭化物イオンは、水溶液に臭化物の塩を添加することにより提供され得る。臭化物の塩は、臭化ナトリウム、臭化カリウム又は臭化アンモニウム、あるいはこれらの混合物であり得る。
【００２６】
塩化物及び臭化物イオンの各々の濃度は、典型的には０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲、好ましくは０．０５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲、さらに好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、最も好ましくは０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲、特に１ｍＭ〜２５ｍＭの範囲である。塩化物イオンの濃度は臭化物イオンの濃度とは無関係であり、そして逆も言える。
【００２７】
一実施形態において、塩化物及び臭化物イオンの各々のモル濃度は、アンモニウムイオンの濃度より、少なくとも２倍高く、好ましくは少なくとも４倍高く、さらに好ましくは少なくとも６倍高く、最も好ましくは少なくとも８倍高く、特には少なくとも１０倍高い。
【００２８】
アンモニウムイオン
本発明の方法によりウイルスを不活性化するために必要とされるアンモニウムイオン（ＮＨ4+）は、多数の異なる方法で、例えばアンモニウムの塩を添加することにより提供され得る。好ましい一実施形態において、アンモニウム塩は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）、炭酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＣＯ3）、塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）、臭化アンモニウム（ＮＨ4Ｂｒ）又はヨウ化アンモニウム（ＮＨ4Ｉ）、あるいはこれらの混合物である。
【００２９】
アンモニウムイオンの濃度は、典型的には０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲、好ましくは０．０５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲、さらに好ましくは０．１〜１００ｍＭの範囲、最も好ましくは０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲、特に１ｍＭ〜２５ｍＭの範囲である。
【００３０】
ウイルス
本発明によるハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン及び／又は臭化物イオン、ならびにアンモニウムイオンで不活性化されるウイルスは、全ての種類のウイルスを含む。
【００３１】
一実施形態において、ウイルスは、以下からなる群：アデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、カリシウイルス、コロナウイルス、デルタウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、ラブドウイルス、レオウイルス、レトロウイルス及びトガウイルス。
【００３２】
別の実施形態では、ウイルスは、以下のものからなる群から選択される：ノロウイルス（ノーウォークウイルス）、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、Ａ及びＢ型インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、１型単純ヘルペスウイルス及び２型単純ヘルペスウイルス、から選択される。
【００３３】
別の実施形態では、ウイルスは小型非エンベロープウイルスである。小型非エンベロープウイルスの例としては、ピコルナウイルス、例えばヒトライノウイルスＡ型、ヒトライノウイルスＢ型、手足口病ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス及び腸内ウイルス（例えばポリオウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい一実施形態において、ウイルスは腸内ウイルスである。
【００３４】
界面活性剤
本発明の方法は、界面活性剤（例えば、洗剤製剤の一部又は湿潤剤として）の適用を包含し得る。適用されるのに適している界面活性剤は、非イオン性（例えば、半極性）、陰イオン性、陽イオン性及び／又は両イオン性であってよい。好ましくは界面活性剤は、陰イオン性（例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、アルファ−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸又は石鹸）、あるいは非イオン性（例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミド」））、あるいはこれらの混合物である。
【００３５】
本発明の方法に包含される場合、界面活性剤の濃度は、通常は約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．０５重量％〜約５重量％、さらに好ましくは約０．１重量％〜約１重量％である。
【００３６】
方法及び使用
第一の態様において、本発明は、ウイルスを不活性化するための酵素的方法であって、ウイルスをハロペルオキシダーゼ、過酸化水素の供給源、塩化物及び／又は臭化物イオンならびにアンモニウムイオンと接触させることを含んで成る方法を提供する。好ましい一実施形態において、本発明は、医療用の装置又は機器を消毒するか又は滅菌するための方法であって、医療用装置又は機器を組成物と接触させることを含んで成る方法を提供する。
【００３７】
組成物は、液体（例えば水性）又は乾燥製剤として処方され得る。乾燥製剤は、その後、再水和されて、本発明の方法に使用可能な活性液体又は半液体製剤を形成し得る。
【００３８】
組成物が乾燥製剤として処方される場合、構成成分は混合され、異なる層に配置されるか、又は別々に包装され得る。
【００３９】
第二の態様では、本発明は、本発明の方法を適用することによってもたらされる組成物も網羅する。この場合、組成物は、ハロペルオキシダーゼ、過酸化水素、塩化物イオン及び／又は臭化物イオン、アンモニウムイオン、活性又は不活性ウイルス、ならびに医療用装置又は機器を含む。
【００４０】
本発明の方法は、ウイルス、例えば生物兵器剤に曝露された場所の除染のために有用である。
【００４１】
本発明の状況において、「ウイルスを不活性化する」という用語は、ウイルスの少なくとも９９％が適切な細胞に感染し得ないことを意味するよう意図される。ウイルスの、好ましくは９９．９％、さらに好ましくは９９．９９％、最も好ましくは９９．９９９％、特には９９．９９９９％が、適切な細胞に感染し得ない。
【００４２】
一実施形態において、「消毒する」又は「消毒」という用語は、米国食品医薬品局の”Content and Format of Premarket Notification [510(k)] Submissions for Liquid Chemical Sterilants/High Level Disinfectants”, U.S. Food and Drug Administration, Jan. 2000による高レベルの消毒を指す。
【００４３】
本発明による方法は、０〜７０℃、好ましくは５〜６０℃、さらに好ましくは１０〜６０℃、さらに好ましくは１５〜６０℃、さらに好ましくは２０〜６０℃、最も好ましくは２０〜５０℃、特には２０〜４０℃の温度で行うことができる。
【００４４】
本発明の方法は、１０分〜（少なくとも）４時間、好ましくは１５分〜（少なくとも）３時間、さらに好ましくは２０分〜（少なくとも）２時間、最も好ましくは２０分〜（少なくとも）１時間、特に３０分〜（少なくとも）１時間の治療時間を用いることができる。
【００４５】
本発明は、種々の環境においてウイルスを不活性化するのに適している。本発明の方法は、望ましくは、ヘルスケア産業（例えば、動物病院、ヒトの病院、動物クリニック、ヒトのクリニック、養護施設、小児又は高齢者のためのデイケア施設等）、食品産業（例えば、レストラン、食品加工工場、食品貯蔵工場、食料品店等）、ホスピタリティ産業（例えば、ホテル、モーテル、リゾート、クルーズ船等）、教育産業（例えば、学校及び大学）等のような任意の環境で用いられて、ウイルス感染を低減することができる。
【００４６】
本発明の方法により利用されているかなり低い温度のために、それらは、ヘルスケア産業に用いられる機器、例えば医療用の装置（例えば、乾式外科用器械、麻酔機器、中空容器等）を消毒するか又は滅菌するために非常に有用である。消毒済み又は滅菌済み機器は、変形及び摩滅の低減を示し、機器は、実質的に消毒又は滅菌直後に使用する準備が出来ている。これは、異なる材料からなる複雑な又は感熱性の医療用装置、例えば超音波変換器及び内視鏡を消毒又は滅菌する場合に特に有益であるが、その理由は、これらの装置の摩滅が有意に低減され、それによりこれらしばしば非常に高価な装置の耐用年数がより長くなり、それらの運転経費が有効に低減されるからである。実際、再使用可能な衛生製品のようなその他の非医療用の機器でさえ、本発明の使用により有効に消毒され、滅菌することができる。
【００４７】
好ましい一実施形態において、医療用装置及び／又は非医療用の機器の消毒又は滅菌は、本発明の方法を用いて、ＥＮ  ＩＳＯ  １５８８３−１に従って（又は”Class II Special Controls Guidance Document: Medical Washers and Medical Washer-Disinfectors; Guidance for the Medical Device Industry and FDA Review Staff”, U.S. Food and Drug Administration, Feb. 2002に記載されているように）、（医療用）洗浄器−消毒器で行われる。
【００４８】
本発明の方法は、望ましくは、ウイルス感染を低減するための任意の環境中で、例えば、一般的な建物表面（例えば、床、壁、天井、家具外面等）、特定機器表面（例えば、硬質表面、製造機器、加工機器等）、布地（例えば、綿、羊毛、絹、合成繊維、例えばポリエステル、ポリオレフィン及びアクリル、混合繊維、例えば綿ポリエステル等）、羊毛及びセルロースベースの系（例えば、紙）、土壌、動物の屠殺体（例えば、皮革、食肉、毛、羽毛等）、食料（例えば、果実、野菜、木の実、食肉等）で、ならびに水中で用いることができる。
【００４９】
一実施形態において、本発明の方法は、布地の殺ウイルス処理に関する。本発明の組成物で処理され得る布地の例としては、個人用物品（例えば、シャツ、ズボン、ストッキング、下着等）、施設用物品（例えば、タオル、実験着、ガウン、エプロン等）、ホスピタリティ用物品（例えば、タオル、ナプキン、テーブルクロス等）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の組成物による布地の殺ウイルス処理は、布地を本発明の組成物と接触させることを包含し得る。この接触は、布地を洗濯する前に生じ得る。代替的には、この接触は布地の洗濯前に行い、殺ウイルス活性を提供し、任意に浄化活性を提供して、汚れ、染み等を布地から除去するか又は低減することができる。
【００５１】
本発明の組成物により接触されるウイルスは、任意の表面、例えば、例えば乳製品、化学品又は医薬品の加工処理工場で用いられる加工処理機器の表面、医療用装置、例えば内視鏡、又はその他の医療用具、実験室機器片、洗浄機、又は水処理システムの表面（これらに限定されない）に局在しうる。本発明の組成物は、当該表面のウイルスを不活性化するために有効な量で用いられるべきである。
【００５２】
ウイルスは、組成物の水性製剤中にウイルスを沈めること（例えば、洗濯工程）により、組成物をウイルスに噴霧することにより、布で組成物をウイルスに塗布することにより、又は当業者により認められた任意の他の方法により、本発明の方法で用いられる組成物と接触させることができる。本発明の組成物をウイルスに適用する任意の方法（これによりウイルスは不活性化される）は、許容可能な適用方法である。
【００５３】
本発明の方法は、生物兵器剤のようなウイルス（例えば、病原性ウイルス）に曝露された場所の除染にも有用である。このような場所としては、衣服（例えば軍服）、車の内側及び外側部分、建物の内側及び外側部分、任意の種類の軍隊施設、ならびに任意の種類の上記の環境が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。
【実施例】
【００５５】
緩衝剤及び基質として用いられる化学物質は、少なくとも試薬等級の市販製品とした。
【００５６】
実施例１
ポリオウイルスの不活性化
ウイルス及び細胞
ＷＨＯから入手したポリオウイルスＳａｂｉｎ株（２Ｈ．０１０７０４型）を、イーグルＭＥＭ２％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを用いて、３４．５℃、５％ＣＯ2で、ＶＥＲＯ細胞中で増殖させた。培養上清を濾過（０．４５ｎｍ）し、等分して、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５７】
ストック溶液
以下のストック溶液を調製した。
溶液１：２０  ｍＭ  ＤＭＧ（Sigma  D4379）緩衝液、ｐＨ７．０中２２．８ｍＭ  ＮａＣｌ及び７．２ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ；
溶液２：ＭｉｌｌｉＱ水中１０％Ｈ2Ｏ2；
溶液３：２０ｍＭ  ＤＭＧ緩衝液、ｐＨ７．０中クルブラリア・ベルクロサ（ＷＯ９７／０４１０２における配列番号２参照）からの８０００ｐｐｍハロペルオキシダーゼ；
リン酸塩緩衝生理食塩水。
【００５８】
消毒溶液
約５０ｍＬの活性消毒溶液を作るために、以下のものを混合した：５０ｍＬの溶液１；６２μＬの溶液２；及び１００μＬの溶液３。
非希釈消毒溶液を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でさらに希釈して、１：１０及び１：１００溶液を得た。
【００５９】
細胞培地
４％ウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補足したイーグルＭＥＭ培地。
【００６０】
ウイルスの処理
微量滴定プレート中で、試験溶液５０μＬを、ＰＢＳ中の希釈ポリオウイルスストック５０  μＬと混合して、３４．５℃で１時間インキュベートした。
酵素消毒溶液を既知の消毒剤と比較するために、次亜塩素酸ナトリウムを、0.5％、0.05％及び0.005％の濃度で、対照として用いた。
全ての処理に関して、細胞株に及ぼす試験溶液の任意の細胞傷害性作用を確認するために、ウイルス添加なしの対照を作った。さらに、消毒溶液を添加しないウイルス感染性の陽性対照を包含した。
処理後の残留感染性ウイルスに関して検定するために、ＲＤ細胞株（ヒト横紋筋肉腫）の集密的増殖が確立された新鮮な微量滴定プレートに、100 μLの試験溶液及び4％ＦＣＳを含有する100 μLのイーグル最小培地を添加した。このプレートを、34.5℃及び5％ＣＯ2で5日間、インキュベートした後、顕微鏡を用いて専門的評価により、感染性及び細胞傷害性を採点した。
【００６１】
表１．  ポリオウイルスSabin株（2H.010704型）の抗ウイルス試験からの結果
【表１】
2012522743.tif 000002
酵素：        ハロペルオキシダーゼ
次亜塩素酸塩：次亜塩素酸ナトリウム
Ｉ：          感染
Ｎ：          感染なし
Ｎ*：        わずかな毒性作用を伴う感染なし
Ｔ：          毒性
【００６２】
結果は、本発明の方法（レーン２〜４）が、次亜塩素酸ナトリウム（レーン５〜７）と同程度にポリオウイルスを抑制するということを示した。検定は、二重反復実験で実施した。酵素系は、１：１００希釈に薄めても、強い殺ウイルス活性を示した。
【００６３】
実施例２
ＨＩＶ−１ウイルスの不活性化
ウイルス及び細胞
ＨＩＶ−１  ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株（NIH AIDS Research and Reference Program）を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０μｇ／ｍＬゲンタマイシン及び１０ＩＵ／ｍＬニスタチンを含有するＲＰＭＩ１６４０を用いて、３７℃、５％ＣＯ2で、Ｈ９細胞（NIH AIDS Research and Reference Program）中で増殖させた。培養上清を濾過（０．４５ｎｍ）し、等分して、使用するまで−８０℃で保存した。
【００６４】
ストック溶液
以下のストック溶液を調製した。
溶液１：２０ｍＭ  ＤＭＧ（Sigma D4379）緩衝液、ｐＨ７．０中２２．８ｍＭ  ＮａＣｌ及び７．２ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ；
溶液２：ＭｉｌｌｉＱ水中１０％Ｈ2Ｏ2；
溶液３：２０ｍＭ  ＤＭＧ緩衝液、ｐＨ７．０中クルブラリア・ベルクロサ（ＷＯ９７／０４１０２における配列番号２参照）からの８０００ｐｐｍハロペルオキシダーゼ；
リン酸塩緩衝生理食塩水。
【００６５】
消毒溶液
約５０ｍＬの活性消毒溶液を作るために、以下のものを混合した：５０ｍＬの溶液１；６２μＬの溶液２；及び１００μＬの溶液３。
非希釈消毒溶液を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でさらに希釈して、１：１０及び１：１００溶液を得た。
【００６６】
細胞培地
１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０ＩＵ／ｍＬニスタチン及び５％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ１６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Sigma R8758）。
【００６７】
ＭＴＴ試薬
５０ｍｇのＭＴＴ（Sigma M5655）
１０ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４
【００６８】
ＭＴＴ停止試薬
１０ｍＬのトリトンＸ−１００（Sigma T8787）
４ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌ
イソプロパノールで全量を１００ｍＬにする。
【００６９】
ウイルスの処理
微量滴定プレート中で、試験溶液５０μＬを、ＰＢＳ中の希釈ＨＩＶウイルスストック５０μＬと混合して、３７℃で５分間インキュベートした。
酵素消毒溶液を既知の消毒剤と比較するために、次亜塩素酸ナトリウムを、０．５％、０．０５％及び０．００５％の濃度で、対照として用いた。
全ての処理に関して、細胞株に及ぼす試験溶液の任意の細胞傷害性作用を確認するために、ウイルス添加なしの対照を作った。さらに、消毒溶液を添加しないウイルス感染性の陽性対照を包含した。
処理後の残留感染性ウイルスに関して検定するために、１００μＬの試験溶液、及び０．３×１０3ＭＴ４細胞／ｍＬを含有する５％ＦＣＳを有する１００μＬのＲＰＭＩ  １６４０細胞培地を、新鮮な微量滴定プレートに添加した。このプレートを、３７℃及び５％ＣＯ2で６日間、インキュベートした後、生存度を、ＭＴＴ検定で測定した。３０μＬのＭＴＴ試薬を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１５０μＬの溶液を取り出して、１３０μＬのＭＴＴ停止溶液と入れ替えて、内容物を混合した。
５４０ｎｍでプレート読取器で吸光度を測定し、参照として６９０ｎｍでの吸光度を用いた。吸光度に基づいて、各ウェルは、ウイルス含有ウェル中で感染している、又は感染していないと採点された；細胞傷害性に関して、対照ウェルでは毒性又は非感染であった。
【００７０】
表２．  ＨＩＶ−１ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株）の抗ウイルス試験からの結果
【表２】
2012522743.tif 000003
酵素：        ハロペルオキシダーゼ
次亜塩素酸塩：次亜塩素酸ナトリウム
Ｉ：          感染
Ｎ：          感染なし
Ｎ*：        わずかな毒性作用を伴う感染なし
Ｔ：          毒性。
【００７１】
結果は、本発明の方法が、５分のインキュベーション期間中、１：１００希釈液（レーン４）中のＨＩＶウイルスに及ぼす抗ウイルス作用を有した、ということを示す。
【００７２】
参考文献：(1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to profileration and cytotoxity assays. J. Imm. Meth, 65, 55-63.
【国際調査報告】
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