(57)【要約】本発明は、例えば、ＬＴブロック能の改善に至る抗体の新規クラスの特定に少なくとも部分的に基づく。また、前記対象の結合分子の作製方法および本発明の結合分子をＬＴβＲシグナル伝達に拮抗するために使用する方法も提供する。一局面において、本発明は、リンホトキシン（ＬＴ）に結合し、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託）が細胞中ＬＴ誘発性生体活性を約５０％ブロックする条件下において、細胞中ＬＴ誘発性生体活性を少なくとも約７０％ブロックする単離抗体、またはその抗原結合領域を成す分子を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンホトキシン（ＬＴ）に結合し、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託）が細胞中ＬＴ誘発性生体活性を約５０％ブロックする条件下において、細胞中ＬＴ誘発性生体活性を少なくとも約７０％ブロックする単離抗体、またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項２】
リンホトキシン（ＬＴ）に結合し、細胞中ＬＴ誘発性生体活性を１００ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする単離抗体、またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項３】
リンホトキシン（ＬＴ）に結合し、ＬＴβＲ−Ｉｇの細胞への結合を少なくとも８５％ブロックする単離抗体、またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項４】
前記ＬＴ誘発性生体活性がＩＬ−８放出である、請求項１または２の単離抗体またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項５】
ヒトアミノ酸配列を含む、請求項１、２、または３の単離抗体またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項６】
前記ヒトアミノ酸配列が抗体定常領域配列またはその断片を含む、請求項１または２の単離抗体またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項７】
前記ヒト定常領域が、少なくとも１つのＦｃ受容体への結合を低下させるために改変されているＩｇＧｌ定常領域である、請求項６に記載の単離抗体またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項８】
前記ヒト定常領域が、少なくとも１つのＦｃ受容体への結合を高めるために改変されているＩｇＧｌ定常領域である、請求項６に記載の単離抗体またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項９】
ヒト化である、請求項１、２、または３の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項１０】
前記ＬＴ誘発性生体活性が少なくとも約８０％ブロックされる、請求項１または２の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項１１】
前記ＬＴ誘発性生体活性が少なくとも約９０％ブロックされる、請求項１、または２の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項１２】
ＬＴΒＲ−Ｉｇ結合が少なくとも約９０％ブロックされる、請求項３に記載の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項１３】
細胞中のＬＴ誘発性生体活性を３０ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項１４】
細胞中のＬＴ誘発性生体活性を１０ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項１５】
細胞中ＬＴ誘発性生体活性を３ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合領域を成す分子。
【請求項１６】
ＬＴ上でＬＴβＲ結合部位を残さないように２つの部位に結合する、請求項３に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
完全長抗体である、請求項１、２または３の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項１８】
ｓｃＦｖ分子である、請求項１、２、または３の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項１９】
ＬＴのエピトープに特異的に結合する単離抗体であり、前記抗体による前記ＬＴエピトープへの結合が１０２抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、単離抗体。
【請求項２０】
ＬＴβのアミノ酸１９３位および１９４位が前記抗体の結合にとって重要である、請求項１９に記載の単離抗体。
【請求項２１】
ＬＴのエピトープに特異的に結合する単離抗体であり、前記抗体による前記ＬＴエピトープへの結合が、Ａ０Ｄ９抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、単離抗体。
【請求項２２】
ＬＴのエピトープに特異的に結合する単離抗体であり、前記抗体による前記ＬＴエピトープへの結合が、１０１／１０３抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、単離抗体。
【請求項２３】
ＬＴのエピトープに特異的に結合する単離抗体であり、前記抗体による前記ＬＴエピトープへの結合が、１０５抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、単離抗体。
【請求項２４】
ＬＴβのアミノ酸９６位、９７位、９８位、１０６位、１０７位、および１０８位が前記抗体の結合にとって重要である、請求項２３に記載の単離抗体。
【請求項２５】
ＬＴのエピトープに特異的に結合する単離抗体であり、前記抗体による前記ＬＴエピトープへの結合が、９Ｂ４抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、単離抗体。
【請求項２６】
ＬＴβのアミノ酸９６位、９７位、および９８位が前記抗体の結合にとって重要である、請求項２５に記載の単離抗体。
【請求項２７】
ＬＴのエピトープに特異的に結合する単離抗体であり、前記抗体による前記ＬＴエピトープへの結合が、Ａ１Ｄ５抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、単離抗体。
【請求項２８】
ＬＴβのアミノ酸１７２位が前記抗体の結合にとって重要である、請求項２７に記載の単離抗体。
【請求項２９】
ＬＴのエピトープに特異的に結合する単離抗体であり、前記抗体による前記ＬＴエピトープへの結合が、１０７抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、単離抗体。
【請求項３０】
ＬＴβのアミノ酸１５１位および１５３位が前記抗体の結合にとって重要である、請求項２９に記載の単離抗体。
【請求項３１】
ＬＴのエピトープに特異的に結合する単離抗体であり、前記抗体による前記ＬＴエピトープへの結合が、１０８抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、単離抗体。
【請求項３２】
ヒトアミノ酸配列を含む、請求項１９乃至請求項３１のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項３３】
前記ヒトアミノ酸配列が抗体定常領域配列である、請求項３２に記載の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項３４】
前記抗体がヒト化である、請求項１９乃至請求項３１のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合領域。
【請求項３５】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記軽鎖および重鎖ＣＤＲが、Ａ０Ｄ９、１０８、１０７、Ａ１Ｄ５、１０２、１０１／１０３、９Ｂ４および１０５からなる群から選択される抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項３６】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記ＣＤＲがＡ０Ｄ９抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項３７】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記ＣＤＲが１０８抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項３８】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記ＣＤＲが１０７抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項３９】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記ＣＤＲがＡ１Ｄ５抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４０】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記ＣＤＲが１０２抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４１】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記ＣＤＲが１０１／１０３抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４２】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記ＣＤＲが１０５抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４３】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、前記ＣＤＲが９Ｂ４抗体由来である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４４】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、ここでＣＤＲＨ１は前記配列ＧＦＳＬＸ１Ｘ２Ｙ／ＳＧＸ３Ｈを含み、Ｘは任意のアミノ酸である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４５】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、ここでＣＤＲＨ２は前記配列ＶＩＷＸ１ＧＧＸ２ＴＸ３Ｘ４ＮＡＸ５ＦＸ６Ｓを含み、Ｘは任意のアミノ酸である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４６】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、ここでＣＤＲＬ１は前記配列ＲＡＳＸ１ＳＶＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５またはＸ１ＡＳＱＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６を含み、Ｘは任意のアミノ酸である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４７】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、ＣＤＲＬ２は配列ＲＡＸ１ＲＬＸ２Ｄを含み、Ｘは任意のアミノ酸である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４８】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、ＣＤＲＬ２は配列Ｘ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｓを含み、Ｘは任意のアミノ酸である、リンホトキシン結合分子。
【請求項４９】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、ＣＤＲＬ３は配列Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＰＸ６Ｔを含み、Ｘは任意のアミノ酸である、リンホトキシン結合分子。
【請求項５０】
重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子であり、ＣＤＲＬ３は配列ＬＸ１Ｘ２ＤＸ４ＦＰＸ６Ｔを含み、Ｘは任意のアミノ酸である、リンホトキシン結合分子。
【請求項５１】
１０５抗体変異体の重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域および１０５変異体の軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子。
【請求項５２】
１２０ｍｇ／ｍｌを超える溶解度を有する、請求項５１に記載の結合分子。
【請求項５３】
前記結合分子が前記１０５変異体のＬ１０型の軽鎖可変領域を含む、請求項５１に記載のリンホトキシン結合分子。
【請求項５４】
前記結合分子が前記１０５変異体のＨ１型の重鎖可変領域を含む、請求項５１に記載のリンホトキシン結合分子。
【請求項５５】
前記結合分子が前記１０５変異体のＬ１０型の軽鎖可変領域および前記１０５変異体型であるＨ１の重鎖可変領域を含む、請求項５１に記載のリンホトキシン結合分子。
【請求項５６】
請求項１乃至請求項３４のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合領域、および担体を含む組成物。
【請求項５７】
請求項３５乃至請求項５５のいずれか一項に記載の結合分子および担体を含む組成物。
【請求項５８】
請求項５６または５７のいずれか一項の組成物を、治療が起こるように前記対象に投与することを含む、抗ＬＴ結合分子による治療から恩恵を受けるであろう対象の治療方法。
【請求項５９】
前記対象が炎症を特徴とする障害を呈する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記炎症障害が、関節リウマチ、多発性硬化症、クーロン病、潰瘍性大腸炎、移植、ループス、炎症肝疾患、乾癬、シェーグレン症候群、多発性硬化症（例えば、ＳＰＭＳ）、ウイルス誘発性肝炎、自己免疫性肝炎、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、およびウイルス性ショック症候群からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記炎症障害が関節リウマチである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象が癌を呈する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記癌が、多発性骨髄腫および無痛性濾胞性リンパ腫からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項１乃至請求項３５のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子。
【請求項６５】
請求項３６乃至請求項５５のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
【請求項６６】
ベクター中にある請求項６４または６５の核酸分子。
【請求項６７】
請求項６６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６８】
抗体または結合分子の産生方法であって、（ｉ）前記抗体または結合分子が宿主細胞培養培地中で分泌されるように請求項６７に記載の宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）前記培地から前記抗体または結合分子を単離すること、を含む、方法。
【請求項６９】
薬品の製造における、請求項５６または５７の組成物の使用。
【請求項７０】
前記薬品が炎症を伴う障害の治療用である、請求項６９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年１２月３１日に出願された「抗リンホトキシン抗体（Ａｎｔｉ−Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という題名の米国仮出願第６１／１４２，１８２号の利益を主張する。先の仮出願の内容はすべて、参照することにより本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
リンホトキシン（ＬＴ）は、ＴＮＦに関連するサイトカインであり、ヒト系において分泌形態と膜結合形態の両方で見られる。ＬＴの分泌形態は単一タンパク質の三量体ＬＴαであり、表面形態は２つの関連分子であるＬＴαとＬＴβの結合体である。優勢形態はα１β２という組成物を有するヘテロ三量体であるが、α２βｌヘテロ三量体も存在する。ＬＴαホモ三量体の唯一知られている細胞表面受容体は、２つのＴＮＦ受容体であるｐ５５、ｐ７５と、ＨＶＥＭである。一方、ＬＴα１β２ヘテロ三量体はこれらのＴＮＦ受容体には結合せず、ＬＴβ受容体（ＬＴβＲ）に結合する。ＬＴのＬＴβＲへの結合はリンパ脈管新生および炎症において重要な役割を担う。ＬＴのＬＴβＲへの結合を強力かつ特異的にブロックする抗体の出現は、患者におけるＬＴβＲ介入反応の調節において甚大な利益をもたらすであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ＬＴα１β２は、他のＬＴファミリーメンバーに見られるような単鎖のホモ三量体ではなく２本の異なる鎖であるＬＴαとＬＴβのヘテロ三量体であるため、ＴＮＦリガンドファミリーの独特な成員である。このファミリーの分子の受容体は、三量体鎖間の裂け目で結合することが見出されており、リガンドがホモ三量体である場合、３つの裂け目はすべて同一であり、裂け目中で結合する単一の抗体が３つの結合部位をすべて同時にブロックすることが予期される。一方、ＬＴα１β２ヘテロ三量体は、（β−β、β−α、およびα−βと示すことができる）３つの異なる裂け目を提示し、本発明の以前は、単一の抗体がヘテロ三量体に結合して受容体結合部位をすべて効果的にブロックし、それによって生体活性を完全にブロックできることは明らかではなかった。本抗体が、ＬＴα３に結合しないこと（またはＬＴα３に結合するが、ＴＮＦα受容体結合をブロックしないこと）、および先行技術の抗ＬＴα１β２抗体と比較して改善された機能を有することは注目に値する。
【０００４】
例えば、１つの実施形態では、本抗体は、先行技術の抗体よりもＬＴのＬＴβＲへの結合をより強力にブロックするおよび／またはＬＴβＲを介するＬＴシグナル伝達の１つ以上の生物学的効果をより強力にブロックする（本明細書で使用する、ＬＴという用語は、別段の指定のない限り、ＬＴα１β２を指す）。例えば、１つの実施形態では、これらの抗体は、ＬＴ誘発性サイトカイン産生を７０％超ブロックする。別の実施形態では、これらの抗体は、ＬＴ誘発性サイトカイン産生を８０％超ブロックする。１つの実施形態では、これらの抗体は、ＬＴ誘発性サイトカイン産生を９０％超ブロックする。１つの実施形態では、これらの抗体は、ＬＴ誘発性サイトカイン産生を９５％超ブロックする。別の実施形態では、かかる抗体のＬＴ結合および／またはＬＴ誘発性サイトカイン産生の阻害ＩＣ５０は約０．０５μｇ／ｍｌ未満である。１つの実施形態では、かかる抗体のＬＴ結合および／またはＬＴ誘発性サイトカイン産生の阻害ＩＣ５０は約１００ｎＭ未満である。１つの実施形態では、かかる抗体のＬＴ結合および／またはＬＴ誘発性サイトカイン産生の阻害ＩＣ５０は約３０ｎＭ未満である。１つの実施形態では、かかる抗体のＬＴ結合および／またはＬＴ誘発性サイトカイン産生の阻害ＩＣ５０は約１０ｎＭ未満である。１つの実施形態では、かかる抗体のＬＴ結合および／またはＬＴ誘発性サイトカイン産生の阻害ＩＣ５０は約３ｎＭ未満である。かかる抗体のパネルが開発されており、これらの抗体のいくつかが結合するエピトープがマッピングされている。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、非ヒト霊長類、例えば、カニクイザルのＬＴエピトープにも結合する。これらの抗体の可変領域構造も解明されている。抗体のこのパネル由来のＣＤＲ（例えば、コチアまたはカバットＣＤＲ）を用いて、ＬＴに結合し、ＬＴ誘発性シグナル伝達をブロックする結合分子（例えば、ヒト化抗体、修飾抗体、単鎖結合分子）を生成することができる。したがって、本発明は、ＬＴに特異的な１つ以上の結合部位（例えば、可変重および可変軽領域）を含み、ＬＴのＬＴβＲへの結合をブロックし、先行技術の抗体と比較して改善され機能的特性を有する結合分子を対象とする。
【０００５】
１つの態様では、本発明は、リンホトキシン（ＬＴ）に結合し、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託）が細胞中ＬＴ誘発性生体活性を約５０％ブロックする条件下において、細胞中ＬＴ誘発性生体活性を少なくとも約７０％ブロックする単離結合分子、またはその抗原結合領域を成す分子に関する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、リンホトキシン（ＬＴ）に結合し、細胞中ＬＴ誘発性生体活性を１００ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする単離結合分子、またはその抗原結合領域を成す分子に関する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、リンホトキシン（ＬＴ）に結合し、ＬＴβＲ−Ｉｇの細胞への結合を少なくとも８５％ブロックする単離結合分子、またはその抗原結合領域を成す分子に関する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、単離結合分子またはその抗原結合領域を成す分子に関し、ここでＬＴ誘発性生体活性はＩＬ−８放出である。
【０００９】
１つの実施形態では、結合分子は、ヒトアミノ酸配列を含む。
【００１０】
１つの実施形態では、結合分子（その抗原結合領域を含む）は、抗体定常領域配列またはその断片を含むヒトアミノ酸配列を含む。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明は、ヒト定常領域が少なくとも１つのＦｃ受容体への結合を低下させるように改変されているＩｇＧ１定常領域である結合分子に関する。
【００１２】
１つの実施形態では、本発明は、ヒト定常領域が少なくとも１つのＦｃ受容体への結合を高めるように改変されているＩｇＧ１定常領域である結合分子に関する。
【００１３】
１つの実施形態では、本発明は、ヒト化である結合分子に関する。
【００１４】
１つの実施形態では、ＬＴ誘発性生体活性は、少なくとも約８０％ブロックされる。１つの実施形態では、ＬＴ誘発性生体活性は、少なくとも約９０％ブロックされる。１つの実施形態では、ＬＴΒＲ−Ｉｇ結合は、少なくとも約９０％ブロックされる。
【００１５】
１つの実施形態では、結合分子は、細胞中のＬＴ誘発性生体活性を３０ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする、またはその抗原結合領域を成す分子である。
【００１６】
１つの実施形態では、結合分子は、細胞中のＬＴ誘発性生体活性を１０ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする、またはその抗原結合領域を成す分子である。
【００１７】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、細胞中のＬＴ誘発性生体活性を３ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする、またはその抗原結合領域を成す分子である。
【００１８】
１つの実施形態では、結合分子は、ＬＴβＲ結合部位を残さないようにＬＴ上の２つの部位に結合する。
【００１９】
１つの実施形態では、結合分子は、完全長抗体である。１つの実施形態では、結合分子は、ｓｃＦｖ分子である。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、その抗体によるＬＴエピトープへの結合は１０２抗体により用量依存的、競合的にブロックされる。
【００２１】
１つの実施形態では、ＬＴβのアミノ酸１９３位および１９４位が抗体の結合にとって重要である。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、その抗体によるＬＴエピトープへの結合がＡ０Ｄ９抗体により用量依存的、競合的にブロックされる。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、その抗体によるＬＴエピトープへの結合が１０１／１０３抗体により用量依存的、競合的にブロックされる。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、その抗体によるＬＴエピトープへの結合が１０５抗体により用量依存的、競合的にブロックされる。
【００２５】
１つの実施形態では、ＬＴβのアミノ酸９６位、９７位、９８位、１０６位、１０７位、および１０８位が抗体の結合にとって重要である。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、その抗体によるＬＴエピトープへの結合が９Ｂ４抗体により用量依存的、競合的にブロックされる。
【００２７】
１つの実施形態では、ＬＴβのアミノ酸９６位、９７位、および９８位が抗体の結合にとって重要である。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、その抗体によるＬＴエピトープへの結合がＡ１Ｄ５抗体により用量依存的、競合的にブロックされる。
【００２９】
１つの実施形態では、ＬＴβのアミノ酸１７２位が抗体の結合にとって重要である。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、抗体によるＬＴエピトープへの結合が１０７抗体により用量依存的、競合的にブロックされる、。
【００３１】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴβのアミノ酸１５１位および１５３位が抗体の結合にとって重要である。
【００３２】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離抗体に関し、その抗体によるＬＴエピトープへの結合が１０８抗体により用量依存的、競合的にブロックされる。
【００３３】
１つの実施形態では、結合分子はヒトアミノ酸配列を含む。
【００３４】
１つの実施形態では、ヒトアミノ酸配列は抗体定常領域配列である。
【００３５】
１つの実施形態では、抗体はヒト化である。
【００３６】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、軽鎖および重鎖ＣＤＲがＡ０Ｄ９、１０８、１０７、Ａ１Ｄ５、１０２、１０１／１０３、９Ｂ４および１０５からなる群から選択される抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲがＡ０Ｄ９抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲが１０８抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲが１０７抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲがＡ１Ｄ５抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲが１０２抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲが１０１／１０３抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲが１０５抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲが９Ｂ４抗体由来であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲＨ１が配列ＧＦＳＬＸ１Ｘ２Ｙ／ＳＧＸ３Ｈを含み、Ｘは任意のアミノ酸であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲＨ２が配列ＶＩＷＸ１ＧＧＸ２ＴＸ３Ｘ４ＮＡＸ５ＦＸ６Ｓを含み、Ｘは任意のアミノ酸であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１が配列ＲＡＳＸ１ＳＶＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５またはＸ１ＡＳＱＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６を含み、Ｘは任意のアミノ酸であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ２は配列ＲＡＸ１ＲＬＸ２Ｄを含み、Ｘは任意のアミノ酸であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ２は配列Ｘ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｓを含み、Ｘは任意のアミノ酸であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ３は配列Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＰＸ６Ｔを含み、Ｘは任意のアミノ酸であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ３は配列ＬＸ１Ｘ２ＤＸ４ＦＰＸ６Ｔを含み、Ｘは任意のアミノ酸であるリンホトキシン結合分子に関する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、１０５抗体変異体の重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに１０５変異体の軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン結合分子に関する。
【００５３】
１つの実施形態では、本発明は、溶解度が１００または１２０ｍｇ／ｍｌ超である結合分子に関する。
【００５４】
１つの実施形態では、結合分子は、１０５変異体のＬ１０型の軽鎖可変領域を含む。
【００５５】
１つの実施形態では、結合分子は、１０５変異体のＨ１型の重鎖可変領域を含む。
【００５６】
１つの実施形態では、結合分子は、１０５変異体のＨ１型の重鎖可変領域もしくはそのＣＤＲならびに１０５変異体のＬ１０型の軽鎖可変領域もしくはそのＣＤＲを含む。
【００５７】
１つの実施形態では、本発明は、本発明の結合分子および担体を含む組成物に関する。
【００５８】
１つの実施形態では、本発明は、抗ＬＴ結合分子による治療から恩恵を受けるであろう対象の治療方法に関し、本方法は、対象が治療されるように対象に分子を投与することを含む。
【００５９】
１つの実施形態では、対象は炎症を特徴とする障害を呈する。
【００６０】
１つの実施形態では、炎症障害は、関節リウマチ、多発性硬化症、クーロン病、潰瘍性大腸炎、移植、ループス、炎症肝疾患、乾癬、シェーグレン症候群、多発性硬化症（例えば、ＳＰＭＳ）、ウイルス誘発性肝炎、自己免疫性肝炎、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、およびウイルス性ショック症候群からなる群から選択される。
【００６１】
１つの実施形態では、炎症障害は関節リウマチである。
【００６２】
１つの実施形態では、対象は癌を呈する。１つの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫および無痛性濾胞性リンパ腫からなる群から選択される。
【００６３】
本発明の１つの態様では、本発明の結合分子をコードする核酸分子に関する。１つの実施形態では、核酸分子はベクター中にある。
【００６４】
１つの実施形態では、本発明は、ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００６５】
１つの実施形態では、本発明は、（ｉ）請求項６６の宿主細胞を培養して、宿主細胞培養培地中に抗体または結合分子が分泌されるようにすること、（ｉｉ）抗体または結合分子を培地から単離すること、を含む抗体または結合分子の産生方法に関する。
【００６６】
別の態様では、本発明は、薬品の製造における本発明の結合分子を含む組成物の使用に関する。
【００６７】
別の実施形態では、薬品は、炎症を伴う障害の治療用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】図１Ａは、ＩＬ−８放出アッセイを用いた抗ＬＴ抗体の阻害曲線を示す。パネルＡにおいて、白菱形は１０２抗体を表し、白四角は１０５抗体を表し、黒三角はＡ０Ｄ９抗体を表し、白三角はＢ９抗体を表し、黒丸はＣ３７抗体を表し、および白丸はＢ２７抗体を表す。パネルＢにおいて、黒丸は１０５抗体を表し、白三角は１０７抗体を表す。パネルＣは、９Ｂ４抗体の阻害曲線を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＩＬ−８放出アッセイを用いた抗ＬＴ抗体の阻害曲線を示す。パネルＡにおいて、白菱形は１０２抗体を表し、白四角は１０５抗体を表し、黒三角はＡ０Ｄ９抗体を表し、白三角はＢ９抗体を表し、黒丸はＣ３７抗体を表し、および白丸はＢ２７抗体を表す。パネルＢにおいて、黒丸は１０５抗体を表し、白三角は１０７抗体を表す。パネルＣは、９Ｂ４抗体の阻害曲線を表す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＩＬ−８放出アッセイを用いた抗ＬＴ抗体の阻害曲線を示す。パネルＡにおいて、白菱形は１０２抗体を表し、白四角は１０５抗体を表し、黒三角はＡ０Ｄ９抗体を表し、白三角はＢ９抗体を表し、黒丸はＣ３７抗体を表し、および白丸はＢ２７抗体を表す。パネルＢにおいて、黒丸は１０５抗体を表し、白三角は１０７抗体を表す。パネルＣは、９Ｂ４抗体の阻害曲線を表す。
【図２】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＯＰＣ−２１（アイソタイプ対照として用いたマウスＩｇＧ１抗体）：図２Ｂ）、ｍＬＴΒＲ−ｍＩｇＧｌ（図２Ｃ）、抗体ＢＢＦ６（ｍＩｇＧｌ）（図２Ｄ）；抗体Ｂ９（ｍＩｇＧｌ）（図２Ｅ）；抗体ＬＴ１０２（図２Ｆ）、抗体ＬＴ１０５（図２Ｇ）を注射したキメラ化（ｈｕＳＣＩＤ）マウス由来のＭＯＭＡ−１＋マクロファージの状態を示す組織学的結果を提示する。野生型Ｃ５７ＢＬ／６切片も図２Ａに示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｇは、ヒトＬＴα１β２のブロックによるＨＥＶの低減を示す組織学的結果を提示する。ＭＯＰＣ−２１（アイソタイプ対照として用いたマウスＩｇＧ１抗体）：図３Ｂ）、ｍＬＴΒＲ−ｍＩｇＧｌ（図３Ｃ）、抗体ＢＢＦ６（ｍＩｇＧｌ）（図３Ｄ）；抗体Ｂ９（ｍＩｇＧｌ）（図３Ｅ）；抗体ＬＴ１０２（図３Ｆ）、抗体ＬＴ１０５（図３Ｇ）。野生型Ｃ５７ＢＬ／６切片も図３Ａに示す。
【図４Ａ】図４、パネルＡは、ＬＴ発現細胞へのＬＴβＲＩｇ（またはＦｃ）のブロックを測定するブロックアッセイにおいて抗体ＬＴ１０２およびＬＴ１０５が優れた効能を示すことを示すグラフを提示する。パネルＡにおいて、黒四角はＬＴβＲ−Ｉｇを表し、白丸は１０２抗体を表し、白四角は１０５抗体を表し、白三角はＢ９抗体を表し、白菱形はＣ３７抗体を表し、黒丸はＢ２７抗体を表す。パネルＢは、抗体９Ｂ４によるＬＴβＲＩｇ（またはＦｃ）をブロックすることにおいて類似の優れた効能を示す。
【図４Ｂ】図４、パネルＡは、ＬＴ発現細胞へのＬＴβＲＩｇ（またはＦｃ）のブロックを測定するブロックアッセイにおいて抗体ＬＴ１０２およびＬＴ１０５が優れた効能を示すことを示すグラフを提示する。パネルＡにおいて、黒四角はＬＴβＲ−Ｉｇを表し、白丸は１０２抗体を表し、白四角は１０５抗体を表し、白三角はＢ９抗体を表し、白菱形はＣ３７抗体を表し、黒丸はＢ２７抗体を表す。パネルＢは、抗体９Ｂ４によるＬＴβＲＩｇ（またはＦｃ）をブロックすることにおいて類似の優れた効能を示す。
【図５】図５は、抗体１０２（白三角）、１０５（黒丸）、Ａ１Ｄ５（白菱形）、１０７（黒三角）、Ａ０Ｄ９ｂ（白丸）、および１０３（黒ダイヤ）がすべてＢ９（白多角形）、Ｂ２７（白逆三角）、およびＣ３７（白四角）よりも効果的にブロックすることを示すＬＴβＲＩｇブロックアッセイ（図４）のデータを提示する。ＬＴβＲは黒四角で示す。
【図６】図６は、３つの異なる裂け目（αβ、βα、およびββ）を含む、２つのＢサブユニットおよび単一のＡサブユニットを含むＬＴα１β２ヘテロ三量体の図式を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
Ｉ．定義
「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、１つ以上の実体を指すことに留意されたい；例えば、「ＬＴ結合分子（ａｎ  ＬＴ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、１つ以上のＬＴ結合分子を表すことが理解される。（本明細書で使用する、ＬＴという用語は、別段の指定のない限り、ＬＴα１β２を指す）。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において同義的に使用できる。
【００７０】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）により線形的に結合した単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（１つまたは複数）を指し、特定の長さの生産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（１つまたは複数）を指すために使用する他の用語はいずれも「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれの代わりにもまたはこれらの用語のいずれとも同義的に用いてよい。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後修飾の生産物（グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾が挙げられるが、これらに限定されない）を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物源から単離または精製してもよいし、組換え技術により産生してもよいが、指定の核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは、当技術分野で知られている方法（化学合成を含む）を用いて生成することができる。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、本明細書に詳述のとおりＬＴに特異的な結合部位を少なくとも１つ含む。したがって、主題のポリペプチドは、本明細書において「結合分子」とも呼ばれる。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、抗ＬＴ抗体または修飾抗体である。
【００７２】
１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、単離されている。「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを指す。１つの実施形態では、特定レベルの精製を要さない。例えば、単離ポリペプチドはその天然または自然環境から除くことができる。宿主細胞中で発現する組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術により分離、分画、または部分的にもしくは実質的に精製されている天然もしくは組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されているとみなされる。
【００７３】
本明細書で使用する、指定のタンパク質「由来の」という用語は、ポリペプチドの起源を指す。１つの実施形態では、特定の開始ポリペプチド由来のポリペプチドまたはアミノ酸配列は、可変領域配列（例えばＶＨおよび／またはＶＬ）またはそれに関連する配列（例えばＣＤＲまたはそこに由来するフレームワーク領域）である。１つの実施形態では、特定の開始ポリペプチド由来のアミノ酸配列は、連続的ではない。例えば、１つの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（例えば、コチアまたはカバットＣＤＲ）が本発明の結合分子の使用のための開始抗ＬＴ抗体に由来する。１つの実施形態では、特定の開始ポリペプチドまたはアミノ酸配列由来のポリペプチドまたはアミノ酸配列は、開始配列またはその一部と本質的に同一であり、部分が少なくとも３〜５個のアミノ酸、５〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、または少なくとも３０〜５０個のアミノ酸、あるいはその開始配列にその起点を有すると、当業者が識別可能なものからなるアミノ酸配列を有する。
【００７４】
また、本発明のポリペプチドは、上述のポリペプチドの断片、誘導体、アナログ、もしくは変異体、ならびにそれらの組み合わせも含む。「断片」、「変異体」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、本発明の結合分子を指す場合、対応する分子の結合特性の少なくとも一部を保持するポリペプチドを含む。本発明のポリペプチド断片としては、本明細書の他の個所で論じた特異的な抗体断片に加えてタンパク質分解断片、ならびに欠失断片が挙げられる。本発明の結合分子の変異体は、上記のような断片を含み、アミノ酸置換、欠失、または挿入により改変されたアミノ酸配列のポリペプチドも含む。変異体は天然でもよいし、非天然でもよい。非天然変異体は当技術分野で知られている変異誘発技術を用いて産生してよい。変異体ポリペプチドは、保守的もしくは非保守的アミノ酸置換、欠失または添加を含んでよい。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換してよい。別の実施形態では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成物が異なる構造的に類似したストリングで置換することができる。あるいは、別の実施形態では、すべてまたは一部のポリペプチドに沿って無作為に変異を誘発してよい。
【００７５】
１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、６つのＣＤＲ（すなわち、ＬＴに結合する抗体由来である３つの軽鎖ＣＤＲおよびＬＴに結合する同じまたは異なる抗体由来である３つの重鎖ＣＤＲ）を含む抗ＬＴ抗体結合部位を少なくとも１つ含む抗体分子または修飾抗体分子である。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ＬＴに結合する抗体由来である軽鎖可変領域およびＬＴに結合する抗体由来である重鎖可変領域を含む１つの結合部位を含む。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも２つの結合部位を含む。１つの実施形態では、結合分子は、２つの結合部位を含む。１つの実施形態では、結合分子は、２つより多い結合部位を含む。１つの実施形態では、本発明は、これらの単離ＬＴ結合分子またはこれらをコードする核酸分子に関する。
【００７６】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は単量体である。別の実施形態では、本発明の結合分子は多量体である。例えば、１つの実施形態では、本発明の結合分子は二量体である。１つの実施形態では、本発明の二量体はホモ二量体であり、２つの同一の単量体サブユニットを含む。別の実施形態では、本発明の二量体はヘテロ二量体であり、２つの同一ではない単量体サブユニットを含む。二量体サブユニットは、１本以上のポリペプチド鎖を含んでよい。例えば、１つの実施形態では、二量体は、少なくとも２本のポリペプチド鎖を含む。１つの実施形態では、二量体は２本のポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、二量体は４本のポリペプチド鎖を含む（例えば、抗体分子の場合）。
【００７７】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は一価である、すなわち、１つのＬＴ標的結合部位を含む（例えば、ｓｃＦｖ分子の場合）。１つの実施形態では、本発明の結合分子は多価である、すなわち、標的結合部位を１つより多く含む。別の実施形態では、結合分子は少なくとも２つの結合部位を含む。１つの実施形態では、結合分子は２つの結合部位を含む（例えば、抗体の場合）。１つの実施形態では、結合分子は３つの結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は４つの結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は結合部位を４つより多く含む。
【００７８】
本明細書で使用する「結合価」という用語は、結合分子における潜在的な結合部位数を指す。結合分子は、「一価」で単一の結合部位を有してもよいし、「多価」（例えば、二価、三価、四価、または五価以上）であり得る。各結合部位は、１つの標的分子または標的分子上の特定部位（例えば、エピトープ）に特異的に結合する。結合分子が標的結合部位を１つより多く含む場合（例えば多価結合分子）、各標的結合部位は同じ分子に特異的に結合してもよいし、異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるＬＴ分子に結合してもよいし、同一分子上の異なるエピトープに結合してもよい）。
【００７９】
本明細書で使用する「結合部分」、「結合部位」、または「結合ドメイン」という用語は、ＬＴに特異的に結合する抗体の可変領域部分を指す。１つの実施形態では、結合部位は、ＬＴに結合する抗体由来である３つの軽鎖ＣＤＲおよびＬＴに結合する抗体由来である３つの重鎖ＣＤＲを含む。
【００８０】
「結合特異性」または「特異性」という用語は、所与の標的分子またはエピトープと特異的に結合する（例えば、免疫反応する）結合分子の能力を指す。ある実施形態では、本発明の結合分子は、２つ以上の結合特異性を含む（すなわち、それらは１つ以上の異なる抗原上に存在する２つ以上の異なるエピトープと同時に結合する）。結合分子は「単一特異的」で単一の結合特異性を有してもよいし、「多特異的」（例えば、二重特異性または三重特異性または四重以上の多特異性）で２つ以上の結合特異性を有してもよい。例示的な実施形態では、本発明の結合分子は、「二重特異性」であり、２つの結合特異性を含む。したがって、ＬＴ結合分子が「単一特異的」であるか「多特異的」、例えば、「二重特異性」であるかということは、結合分子が反応する異なるエピトープ数を指す。例示的な実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、１つ以上のＬＴ分子上の異なるエピトープに特異的であり得る。所与の本発明の結合分子は、特定の結合特異性に対して一価であってもよいし、多価であってもよい。
【００８１】
本明細書に開示される結合分子は、それらが認識するかまたはそれらが特異的に結合する抗原（例えば、ＬＴ標的ポリペプチド）のエピトープ（１つまたは複数）またはその部分（１つまたは複数）に関して記載し得るかまたは指定し得る。結合部位と特異的に相互作用する標的ポリペプチド部分または結合分子部分が、「エピトープ」、または「抗原決定因子」である。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含んでよいが、典型的には、少なくとも２個のエピトープを含み、サイズ、立体構造、および抗原種類に応じていくつかのエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、非ポリペプチド因子であってもよいしそれを含んでもよい、例えば、「エピトープ」は炭水化物側鎖を含んでよいことに留意されたい。抗体のためのペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５個のアミノ酸と考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。ＣＤＲは３級の形態での抗原ペプチドまたはポリペプチドを認識できるため、エピトープを含むアミノ酸は連続的である必要がなく、場合によっては、同一ペプチド鎖上になくてもよい。本発明では、本発明の抗ＬＴ抗体により認識されるプチドまたはポリペプチドエピトープは、ＬＴの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または約１５〜約３０個の連続的または非連続的アミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、二価的にＬＴヘテロ三量体に結合する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ヘテロ三量体によるＬＴβＲリガンドの結合がブロックされるように、例えば、ＬＴβＲリガンドの結合部位が残らないようにＬＴヘテロ三量体に結合する。
【００８２】
「特異的に結合する」とは、結合分子が、その結合部位（例えば、抗原結合ドメイン）を介してエピトープに結合し、結合が結合部位とエピトープ間でいくらかの相補性を要することを一般に意味する。この定義によると、結合分子は、エピトープに結合時、関連しないエピトープに結合するよりも容易に、結合部位を介してエピトープに結合する時、「特異的に結合する」と呼ぶ。結合分子が多特異的である場合、結合分子は、結合分子の別の結合部位（例えば、抗原結合ドメイン）を介して第二（すなわち、第一エピトープと関連しない）エピトープに特異的に結合し得る。
【００８３】
「選択的に結合する」とは、結合分子が、関連する、類似の、相同の、または相似のエピトープに結合するより容易に結合部位を介してエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「選択的に結合する」抗体は、かかる結合分子は関連エピトープと交差反応し得るが、関連エピトープに結合するよりもエピトープに結合する可能性が高い。
【００８４】
本明細書で使用する「交差反応」という用語は、１つの抗原または抗体に特異的である結合分子が第二抗原と反応する能力を指し、２つの異なる抗原物質間の関連性の測定値である。したがって、抗体は、その形態を誘発したもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応する。交差反応エピトープは一般には、誘発するエピトープと同じ相補的構造的特性の多くを含む。
【００８５】
例えば、ある結合分子は、関連するが同一ではないエピトープ、例えば、（当技術分野で知られている方法および本明細書に記載の方法を用いて計算して）参照エピトープと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％同一性のエピトープと結合する点で、ある程度の交差反応を有する。抗体は、（当技術分野で知られている方法および本明細書に記載の方法を用いて計算して）参照エピトープと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性のエピトープに結合しない場合、交差反応がないかほとんどないと呼び得る。抗体が、ある抗原またはエピトープの他のいかなるアナログ、オルソログ、もしくはホモログにも結合しない場合、その抗原またはエピトープに対して「高度に特異的」であるとみなしてよい。
【００８６】
本明細書で使用する「親和性」という用語は、結合分子の結合部位と個々のエピトープとの結合の強さの測定を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８８）  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２７−２８を参照されたい。好ましい結合親和性は、解離定数またはＫｄが５×１０−２Ｍ未満のものを含む。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の親和性でＬＴに特異的に結合する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ＬＴヘテロ三量体上の高親和性部位に１００×１０−９未満の親和性で結合する。
【００８７】
本明細書で使用する「結合活性」という用語は、結合分子（例えば抗体）集団と抗原間の結合体の全体的な安定性、すなわち、抗原と混合した結合分子の機能的結合の強さを指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２９−３４を参照されたい。結合活性は、集団における個々の結合分子の特異的なエピトープとの親和性、および結合分子と抗原の結合価の両方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体と高度に反復するエピトープ構造の抗原（ポリマーなど）間の相互作用は１つの高い結合活性である。
【００８８】
本明細書で使用する「効能」という用語は、特定のアッセイにおいて、あるレベルの有効性を与えることが見出される結合分子濃度を指す。例えば、１つの実施形態では、主題の結合分子はＬＴβＲの生体活性を少なくとも約７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％ブロックする；ＬＴβＲ結合を少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％ブロックする、ならびに／または細胞中ＬＴ誘発性生体活性を５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、３ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックする。
【００８９】
本発明の結合分子の結合部位は、抗体分子の抗原結合部位を含む。抗原結合部位は、ポリペプチドごとに異なる可変領域により形成される。１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも２つの抗原結合部位を含む。本明細書で使用する「抗原結合部位」という用語は、抗原（例えば、抗原の細胞表面または可溶型）と特異的に結合する（免疫反応する）部位を含む。抗原結合部位は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域を含み、これらの可変領域により形成される結合部位が抗体の特異性を決定する。１つの実施形態では、本発明の抗原結合部位は、抗ＬＴ抗体分子の重鎖または軽鎖ＣＤＲを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１つ以上の抗ＬＴ抗体分子由来のＣＤＲを少なくとも２つ含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１つ以上の抗ＬＴ抗体分子由来のＣＤＲを少なくとも３つ含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１つ以上の抗ＬＴ抗体分子由来のＣＤＲを少なくとも４つ含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１つ以上の抗ＬＴ抗体分子由来のＣＤＲを少なくとも５つ含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、ＬＴに結合する１つ以上の抗体分子由来の少なくとも６つのＣＤＲ（３つの重および３つの軽）を含む。
【００９０】
本発明の好ましい結合分子は、ヒトアミノ酸配列由来のフレームワークおよび／または定常領域アミノ酸配列を含む。しかしながら、結合ポリペプチドは、別の哺乳類種由来のフレームワークおよび／または定常領域配列を含んでよい。例えば、マウス配列を含む結合分子が、ある用途のために適している場合がある。１つの実施形態では、霊長類フレームワーク領域（例えば、非ヒト霊長類）、重鎖部分、および／またはヒンジ部分を主題の結合分子に含んでよい。１つの実施形態では、１つ以上の非ヒト（例えば、マウス）アミノ酸が結合ポリペプチドのフレームワーク領域に存在し得る、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類フレームワークアミノ酸配列は、対応するマウスアミノ酸残基が存在するおよび／または開始マウス抗体に見られない異なるアミノ酸残基の１つ以上の変異（例えば、結合または生物物理学的特性を至適化する他の変異）を含み得る１つ以上のアミノ酸復帰変異を含んでよい。本発明の好ましい結合分子は、同じＣＤＲを含むマウス抗体よりヒトにおける免疫原性が小さい。
【００９１】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において同義的に使用される。抗体または免疫グロブリンは少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常は、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基礎的免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８８）を参照されたい。
【００９２】
以下に詳細に論じるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に識別できる様々な広いクラスのポリペプチドを含む。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に、それらの間の一部のサブクラス（例えば、γ１〜γ４）に分類されることを、当業者は理解するであろう。この鎖の性質により、抗体「クラス」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定される。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）の特性は十分に決定されており、機能的分化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾型は、当業者にとって本開示を考慮して容易に識別可能であり、したがって、本発明の範囲内である。
【００９３】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合し得る。
【００９４】
軽鎖と重鎖は両方とも、構造的および機能的相同領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は機能的に使用する。この観点から、軽（ＶＬ）鎖部分と重（ＶＨ）鎖部分の両可変ドメインにより抗原認識および特異性が決定されることが理解されるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、重要な生物学的特性（分泌、経胎盤性、Ｆｃ受容体結合、補体結合など）を付与する。慣例的に、定常領域ドメイン番号は、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより離れると増大する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である。ＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインは実際、それぞれ重鎖のカルボキシル末端および軽鎖のカルボキシル末端を含む。
【００９５】
上に示すように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能とする。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）の部分集合（例えば、ある場合には、ＣＨ３ドメイン）は、合わさって、３次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四価抗体構造は、Ｙ字型の各腕の末端に存在する抗原結合部位を形成する。１つの実施形態では、抗原結合部位は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖それぞれの３つのＣＤＲにより定義される。ある場合には、例えば、ラクダ科種由来であるかまたはラクダ科免疫グロブリンに基づき遺伝子操作されたある免疫グロブリン分子、完全な免疫グロブリン分子は、軽鎖を欠いた重鎖のみからなり得る。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８  （１９９３）を参照されたい。
【００９６】
本明細書で使用する「可変領域ＣＤＲアミノ酸残基」という用語は、配列または構造に基づいた方法を用いて特定したＣＤＲすなわち相補性決定領域におけるアミノ酸を含む。本明細書で使用する「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両可変領域内に見られる非連続的抗原結合部位を指す。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２，  ６６０９−６６１６  （１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  （１９９１）により、ならびにＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）により、ならびにＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２：７３２−７４５  （１９９６）によって記載されており、これらの定義は互いに比較時にアミノ酸残基の重複もしくは部分集合を含み、当業者はこれらの任意の定義を用いて本明細書に記載の抗ＬＴ抗体のＣＤＲを容易に同定できる。上に引用したそれぞれの参考文献により定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基を比較のために以下に説明する。好ましくは、「ＣＤＲ」という用語は、配列比較に基づくカバットにより定義されるＣＤＲである。
【表１】
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【００９７】
本明細書で使用する「可変領域フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」という用語は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域内のアミノ酸またはその一部を指す。本明細書で使用する「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」という用語は、可変領域の一部であるが、（例えば、ＣＤＲのカバット定義を用いて）ＣＤＲの一部ではないアミノ酸残基を含む。したがって、可変領域フレームワークは、約１００〜１２０個のアミノ酸の長さであるが、ＣＤＲの外のアミノ酸のみを含む。重鎖可変領域の具体例において、およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．により定義されるＣＤＲにおいて、フレームワーク領域１はアミノ酸１〜３０位を含む可変領域ドメインに対応し；フレームワーク領域２はアミノ酸３６〜４９位を含む可変領域ドメインに対応し；フレームワーク領域３はアミノ酸６６〜９４位を含む可変領域ドメインに対応し、およびフレームワーク領域４は可変領域のアミノ酸１０３位から末端までの可変領域ドメインに対応する。同様に軽鎖のフレームワーク領域は各軽鎖可変領域ＣＤＲにより分離される。同様に、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．またはＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．によるＣＤＲの定義を用いて、フレームワーク領域の境界は、上記のようにそれぞれのＣＤＲ末端により分離される。好ましい実施形態では、ＣＤＲは、カバットにより定義される。別の実施形態では、ＣＤＲは、コチアにより定義される。
【００９８】
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．はまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付け体系も定義した。当業者は、この「カバット番号付け」体系を、配列自体以外のいかなる実験データにもよらずに任意の可変ドメイン配列に明白に適用できる。本明細書で使用する「カバット番号付け」とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”  （１９８３）により説明されている番号付け体系を指す。他に指定のない限り、本発明のＬＴβＲ抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の可変領域の番号付けへの言及は、カバット番号付け体系に従う。
【００９９】
本明細書で使用する「Ｆｃ領域」という用語は、パパイン切断部位の直上のヒンジ領域（すなわち、重鎖定常領域の第一残基を１１４位と考慮した場合のＩｇＧ中の残基２１６位）に開始し、抗体のＣ末端で終わる免疫グロブリン重鎖部分を指す。したがって、完全なＦｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。抗体分子のＦｃ領域は、二量体である。本発明の結合分子は、完全なＦｃ領域または１つ以上のＦｃ部分を含んでよい。１つの実施形態では、結合分子のＦｃ領域はキメラでよい。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含んでよい。別の例では、Ｆｃ領域は、部分的にＩｇＧ１分子由来および部分的にＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Ｆｃ領域は、部分的にＩｇＧ１分子由来、部分的にＩｇＧ４分子由来のキメラヒンジを含むことができる。１つの実施形態では、本発明の二量体Ｆｃ領域は、１本のポリペプチド鎖を含んでよい。別の実施形態では、本発明の二量体Ｆｃ領域は、例えば、抗体分子の場合、２本のポリペプチド鎖を含んでよい。
【０１００】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、定常領域、例えば、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を少なくとも１つ含む。１つの実施形態では、かかる定常領域は、野生型定常領域と比較して修飾されている。すなわち、本明細書に開示された本発明のポリペプチドは、１つ以上の３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）および／または軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）に改変または修飾を含んでよい。例示的な修飾は、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。かかる変化はエフェクター機能、半減期などを至適化するために含んでよい。
【０１０１】
重鎖定常領域におけるアミノ酸位置（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン中のアミノ酸位置を含む）は、本明細書においてＥＵインデックス番号付け体系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１を参照されたい）に従い番号付けされる。一方、軽鎖定常領域におけるアミノ酸位置（例えばＣＬドメイン）は、本明細書においてカバットインデックス番号付け体系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、同書を参照されたい）に従い番号付けされる。
【０１０２】
例示的な結合分子は、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインかＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生した断片を含むかまたは含んでよい。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。Ｉｇ重鎖を含む本発明の結合分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラスであり得る。
【０１０３】
結合分子は、単独または、完全もしくは部分的なヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインと組み合わせた可変領域（１つまたは複数）を含んでよい。また、本発明は、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを有する可変領域（１つまたは複数）の組み合わせを含む抗原結合断片も含む。
【０１０４】
「断片」という用語は、無傷または完全なポリペプチドより少ないアミノ酸残基を含むポリペプチドの一部またはポリペプチド部分（例えば、抗体または抗体鎖）を指す。「抗原結合断片」という用語は、抗原と結合するかまたは無傷の抗体と（すなわち、それらが由来する無傷の抗体と）抗原結合（すなわち、特異的な結合）について競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。本明細書で使用する、抗体分子の「抗原結合断片」という用語は、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、および単一ドメイン抗体断片（ＤＡｂ）を含む。断片は、例えば、無傷の抗体もしくは完全抗体または抗体鎖の化学的もしくは酵素的処置を介して、または組換え手段により得ることができる。
【０１０５】
先に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および３次元立体配置が周知である。本明細書で使用する「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第一（最もアミノ末端側）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、アミノ末端は免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に隣接している。
【０１０６】
本明細書で使用する「ＣＨ１ドメイン」という用語は、例えば、約ＥＵ１１８〜２１５位に伸びる免疫グロブリン重鎖の第一（最もアミノ末端側）定常領域ドメインを含む。免疫グロブリン重鎖分子のＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、アミノ末端はヒンジ領域に隣接しており、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域部分は形成していない。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、免疫グロブリン重鎖分子（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４分子）由来のＣＨ１ドメインを含む。
【０１０７】
本明細書で使用する「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、約ＥＵ２３１〜３４０位に伸びる重鎖免疫グロブリン分子部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合していない点で独特である。代わりに、２つのＮ結合型分岐炭水化物鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に割り込んでいる。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ＩｇＧ１分子（例えばヒトＩｇＧ１分子）由来のＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態では、改変された本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）由来のＣＨ２ドメインを含む。例示的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ２ドメイン（ＥＵ２３１〜３４０位）、またはその一部を含む。
【０１０８】
本明細書で使用する「ＣＨ３ドメイン」という用語は、ＣＨ２ドメインのＮ末端から、から残基約１１０個分、例えば、約３４１〜４４６ｂ位（ＥＵ番号付け体系）に伸びる重鎖免疫グロブリン分子部分を含む。ＣＨ３ドメインは、典型的には、抗体のＣ末端部分を形成する。しかしながら、一部の免疫グロブリンでは、ＣＨ３ドメインからさらなるドメインが伸びて分子のＣ末端部分（例えばＩｇＭのμ鎖およびＩｇＥのε鎖におけるＣＨ４ドメイン）を形成し得る。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）由来のＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）由来のＣＨ３ドメインを含む。
【０１０９】
本明細書で使用する「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子部分を含む。このヒンジ領域は約２５個の残基を含み可動性であるため、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することを可能にする。ヒンジ領域は、３つの異なるドメイン、すなわち上部、中央部、および下部のヒンジドメインに細分化できる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１：４０８３  （１９９８））。
【０１１０】
本明細書で使用する「キメラ抗体」という用語は、結合部位または部分（例えば、可変領域）が第一の種から得られるか第一の種に由来し、定常領域（無傷でも、一部分でも、または本発明により修飾されていてもよい）が第二の種から得られる抗体を指す。好ましい実施形態では、標的結合領域または部位が非ヒト（例えばマウスまたは霊長類）由来であり、定常領域はヒトである。
【０１１１】
本明細書で使用する「ｓｃＦｖ分子」という用語は、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）もしくはその一部、ならびに１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）もしくはその一部から本質的になり、各可変ドメイン（またはその一部）は同じまたは異なる抗体由来である結合分子を含む。ｓｃＦｖ分子は、好ましくは、ＶＨドメインとＶＬドメイン間に割り込んだｓｃＦｖリンカーを含む。ｓｃＦｖ分子は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９．  Ｇｅｎｅ  ７７：５１；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；  Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７；  Ｍｉｌｅｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３；  Ｔａｋｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７に記載されている。ｓｃＦｖ分子のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、１つ以上の抗体分子由来である。本発明のｓｃＦｖ分子の可変領域は、アミノ酸配列が、それらが由来する抗体分子から変わるように修飾してよいことも当業者に理解されるであろう。例えば、１つの実施形態では、アミノ酸残基（例えば、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基）に保守的置換または変化を起こすヌクレオチドまたはアミノ酸置換を行ってよい。あるいは、または加えて、当技術分野で認識されている技術を用いて抗原結合を至適化するためにＣＤＲアミノ酸残基を変異させてよい。本発明の結合分子は、ＬＴ抗原に結合する能力を維持している。
【０１１２】
本明細書で使用する「ｓｃＦｖリンカー」とは、ｓｃＦｖのＶＬドメインとＶＨドメイン間に割り込んだ部分を指す。ｓｃＦｖリンカーは好ましくは抗原結合立体構造のｓｃＦｖ分子を維持している。１つの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖリンカーペプチドを含むか、またはそれからなる。ある実施形態では、ｓｃＦｖリンカーペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒＣペプチドを含むか、またはそれからなる。他の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、ジスルフィド結合を含む。
【０１１３】
本明細書で使用する「ｇｌｙ−ｓｅｒＣペプチド」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ−ｓｅｒＣペプチドは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。１つの実施形態では、ｎはｌである。１つの実施形態では、ｎは２である。別の実施形態では、ｎは３である。１つの好ましい実施形態では、ｎは４、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。別の実施形態では、ｎは５である。さらに別の実施形態では、ｎは６である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒＣペプチドは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。１つの実施形態では、ｎはｌである。１つの実施形態では、ｎは２である。１つの好ましい実施形態では、ｎは３である。別の実施形態では、ｎは４である。別の実施形態では、ｎは５である。さらに別の実施形態では、ｎは６である。
【０１１４】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、遺伝子操作された抗体分子である。本明細書で使用する「遺伝子操作された抗体」または「修飾抗体」という用語は、抗ＬＴ抗体の結合部位を含むが、従来の二価４本鎖抗体分子ではない結合分子を指す。
【０１１５】
１つの実施形態では、かかる分子は、重鎖と軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインが、特異性が知られている抗体の１つ以上のＣＤＲ（例えば、カバットまたはコチアＣＤＲ）の少なくとも部分的な置換により、必要な場合、部分的なフレームワーク領域置換および配列変化により改変されている可変領域を含む。１つの実施形態では、ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスの抗体、または同じサブクラスの抗体にさえも由来し得る。１つの実施形態では、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体から、好ましくは異なる種の抗体由来である。特異性が知られている非ヒト抗体由来の１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域にグラフト化されている遺伝子操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と呼ばれる。ある可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移すためには、すべてのＣＤＲをドナー可変領域由来の完全なＣＤＲと置換する必要はない場合がある。そうではなく、標的結合部位の活性を維持する必要がある残基を移すことのみが必要であり得る。１つの実施形態では、かかる「ヒト化」抗体は、さらなる変化、例えば、フレームワーク領域アミノ酸配列の変異（ドナーアミノ酸の復帰変異、生殖系列アミノ酸の変異、または他の置換など）を含んでよい。本明細書に記載した説明および当技術分野で知られている説明（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号）を考慮すると、通例の実験を実施するか試行錯誤試験するかのいずれかにより機能的に遺伝子操作された抗体かまたはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の力量内であろう。
【０１１６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離核酸分子または構築物、例えば、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合または従来にない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるアミド結合など）を含んでよい。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その自然環境から除かれている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含まれるＬＴ結合分子をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されるとみなされる。さらに単離ポリヌクレオチドの例としては、異種の宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチドや、溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離ＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生したかかる分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写終結部位などの制御要素であってもよいし、それらを含んでもよい。
【０１１７】
本明細書で使用する「コーディング領域」とは、アミノ酸中に翻訳されたコドンからなる核酸分子部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸中に翻訳されないが、コーディング領域の一部であるとみなしてよい。ただし、隣接配列（例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写終結部位、イントロンなど）はいずれもコーディング領域部分ではない。２つ以上の本発明のコーディング領域が単一のポリヌクレオチド構築物、例えば、単一ベクター上、または別々のポリヌクレオチド構築物、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在できる。さらに、ベクターはいずれも単一のコーディング領域を含んでもよいし、２つ以上のコーディング領域を含んでもよく、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードし得る。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、ＬＴ結合分子またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸と融合しているかまたは融合していない異種のコーディング領域をコードし得る。異種のコーディング領域としては、特殊因子またはモチーフ（分泌シグナルペプチドまたは異種の機能的ドメインなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書で使用する「遺伝子操作された」という用語は、核酸またはポリペプチド分子に関して、合成手段により（例えば組換え技術、インビトロペプチド合成により、ペプチドの酵素もしくは化学カップリング、またはこれらの技術の一部の組み合わせにより）操作されたかかる分子を指す。
【０１１９】
本明細書で使用する「結合した」、「融合した」または「融合」という用語は同義的に使用される。これらの用語は、化学接合や組換え手段などの任意の手段による２つ以上の因子または成分の結合を指す。「インフレーム融合」とは、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の結合して、元のＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームを維持する形で連続したより長いＯＲＦを形成するためことを指す。したがって、組換え融合タンパク質とは、（セグメントが天然で通常はそのように結合していない）オリジナルＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含む単一タンパク質である。したがって、リーディングフレームは融合セグメント全体で連続しているが、セグメントは（例えば、インフレームリンカー配列により）物理的または空間的に分離されている場合がある。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドはインフレーム融合し得るが、「融合した」ＣＤＲが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドにより分離される。
【０１２０】
ポリペプチドの文脈において、「線形配列」または「配列」とは、配列中の互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続しているポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端への方向のアミノ酸順である。
【０１２１】
本明細書で使用する「治療する」または「治療」という用語は、治療処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）もしくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）測定の両方を指し、その目的は、望ましくない生理的変化または障害（炎症の発現または拡散など）を予防するかまたは緩慢化する（軽減する）ことである。利益または所望の臨床結果としては、検出可能か検出不能かを問わず、症状の軽減、疾患範囲の縮小、病態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患進行の遅延化または緩慢化、病態の改良もしくは緩和、および寛解（部分寛解か完全寛解かを問わず）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」は、未治療の場合の予想生存と比較した延命も意味し得る。治療を必要としているものとしては、状態もしくは障害を既に呈しているもの、ならびに状態もしくは障害を呈する傾向があるもの、または状態もしくは障害を予防すべきものが挙げられる。
【０１２２】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」とは、診断、予後判断、または療法が望ましい任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象としては、ヒト、家畜、農場動物、および動物園の動物、スポーツ動物、または飼育動物（イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、雌牛など）が挙げられる。
【０１２３】
本明細書で使用する「結合分子の投与から恩恵を受けるであろう対象」および「治療を必要とする動物」などの語句は、例えば、結合分子により認識された抗原の検出のために（例えば、診断手段のために）使用した結合分子の投与および／またはＬＴに特異的に結合する結合分子による治療、すなわち、疾患（炎症疾患または癌など）の一時的緩和または予防から恩恵を受けるであろう対象（哺乳類対象など）を含む。本明細書に詳述のとおり、結合分子は非複合形態で使用することもでき、（例えば、薬剤、プロドラッグ、または同位体との）結合体であることもできる。
【０１２４】
本明細書で使用する「炎症を特徴とする障害」という用語は、対象において炎症反応を引き起こすまたは炎症反応を特徴とする障害を指す。炎症障害は急性であることも慢性であることもできる。例示的な炎症障害としては、関節リウマチ、多発性硬化症、クーロン病、潰瘍性大腸炎、移植、ループス、炎症肝疾患、乾癬、シェーグレン症候群、多発性硬化症（例えば、ＳＰＭＳ）、ウイルス誘発性肝炎、自己免疫性肝炎、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、およびウイルス性ショック症候群、ならびに移植を施行予定もしくは移植を施行済みの個体が挙げられる。
【０１２５】
ＩＩ．抗ＬＴ結合分子
新規の抗ＬＴ結合分子のパネルが開発された。本発明の抗ＬＴ結合分子は、先行技術の抗体と比較して改善された機能的特性を示す。別の実施形態では、本発明の抗ＬＴ結合分子は、先行技術の抗ＬＴ抗体と比較して独特な構造的特性を有する。
【０１２６】
１つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗体Ａ０Ｄ９、１０８、１０７、１０５、９Ｂ４、Ａ１Ｄ５、１０２、もしくは１０１／１０３抗体（本明細書において、ＬＴ抗体（例えば、ＬＴ１０５）とも呼ばれる）；これらの抗体のＣＤＲ；これらの抗体の可変領域配列；これらの抗体の変異体型のＣＤＲ配列；これらの抗体の変異体型の可変領域配列；ならびにこれらのＣＤＲおよび／もしくは可変領域を含む結合分子に関する。これらの結合分子をコードする核酸分子も提供する。ある実施形態では、本発明は、シグナル配列を欠く成熟形態の分子に関する。本発明の機能的および構造的特徴または主題の抗体および他の態様を以下に詳細に説明する。
【０１２７】
Ａ．ＬＴ誘発性シグナル伝達の増大した阻害
ＬＴ誘発性シグナル伝達（ＬＴβＲへの結合時）は炎症反応を誘発し、正常なリンパ系組織の発現にも関与する。本発明の結合分子は、ＬＴβＲのリンホトキシンへの結合と競合し、それによってＬＴ介入シグナル伝達を阻害し、細胞中のＬＴ介入生体反応を低下させる。本発明の結合分子のブロック効果を示すために様々なアッセイを用いてよい。
【０１２８】
例えば、１つの実施形態では、本発明の結合分子の、ＬＴ（例えば、ＬＴヘテロ三量体）のＬＴβＲへの結合阻害能を測定できる。１つの実施形態では、生理的、単量体ＬＴβ受容体（ＬＴβＲ）を使用できる。１つの好ましい実施形態では、二量体形態のＬＴβ受容体、例えば、ＬＴΒＲ−Ｉｇ融合タンパク質（当技術分野に記載されているようなＦｃ融合タンパク質）を、当技術分野で知られているかまたは本明細書に記載されている方法を用いて、ブロック試験に使用できる。例えば、ビオチン標識したＬＴβＲは、表面上でＬＴα１β２を発現するホルボールエステル（ＰＭＡ）で処理したＩＩ−２３細胞上でリンホトキシンに結合する。ホルボールエステルで処理した細胞を、ビオチン標識したＬＴβＲ−Ｉｇと競合する結合分子とインキュベーションし、細胞を洗浄して結合していないＬＴβＲ−Ｉｇを除き、結合したＬＴβＲ−Ｉｇをストレプトアビジン−ＰＥで検出する。したがって、ビオチンタグ化ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の表面ＬＴへの結合をブロックする結合分子の能力（適切な対照、例えば、結合分子の欠損と比較して）を、例えば、ＦＡＣＳ分析を用いて測定できる。
【０１２９】
別の実施形態では、ＬＴβＲ発現細胞（例えば、Ａ３７５細胞）によるサイトカイン（例えば、ＩＬ−８）産生を阻害する結合分子の能力を測定する。このアッセイでは、ＬＴβＲ発現細胞をＬＴα１β２と接触させ、結合分子および結合分子のＩＬ−８放出を細胞により阻害する能力（適切な対照、例えば、結合分子の欠損と比較して）を、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定する。
【０１３０】
１つの実施形態では、本発明の結合分子によるＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害および／または１つ以上のＬＴ生体活性、例えば、サイトカイン（ＩＬ−８など）産生の７０％超の阻害を達成する。１つの実施形態では、本発明の結合分子によるＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害および／または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害は８０％超に達する。１つの実施形態では、本発明の結合分子によるＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害および／または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害は９０％超に達する。１つの実施形態では、本発明の結合分子によるＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害および／または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害は９５％超に達する。１つの実施形態では、本発明の結合分子によるＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害および／または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害は完全（すなわち、１００％）である。
【０１３１】
１つの実施形態では、本発明は、リンホトキシンα１β２に結合し、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を少なくとも約７０％阻害する単離結合分子に関する。別の実施形態では、本発明の単離結合分子は、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を少なくとも約８０％ブロックする。別の実施形態では、本発明の単離結合分子は、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を少なくとも約８５％ブロックする。別の実施形態では、本発明の単離結合分子は、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を少なくとも約９０％ブロックする。別の実施形態では、本発明の単離結合分子は、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を少なくとも約９５％ブロックする。別の実施形態では、本発明の単離結合分子は、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を少なくとも約９８％ブロックする。別の実施形態では、本発明の単離結合分子は、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を少なくとも約１００％ブロックする。１つの実施形態では、生体活性はＩＬ−８放出である。
【０１３２】
１つの実施形態では、本発明は、リンホトキシンβに結合して細胞へのＬＴβＲ結合（または、上に説明するように、二量体ＬＴΒＲ−Ｉｇ結合）を少なくとも約７０％阻害する単離結合分子に関する。別の実施形態では、本発明は、リンホトキシンβに結合して細胞へのＬＴβＲ（またはＬＴΒＲ−Ｉｇ）結合を少なくとも約８０％阻害する単離結合分子に関する。別の実施形態では、本発明は、リンホトキシンβに結合して細胞へのＬＴβＲ（またはＬＴΒＲ−Ｉｇ）結合を少なくとも約９０％阻害する単離結合分子に関する。別の実施形態では、本発明は、リンホトキシンβに結合して細胞へのＬＴβＲ（またはＬＴΒＲ−Ｉｇ）結合を少なくとも約９５％阻害する単離結合分子に関する。別の実施形態では、本発明は、リンホトキシンβに結合して細胞へのＬＴβＲ（またはＬＴΒＲ−Ｉｇ）結合を少なくとも約９８％阻害する単離結合分子に関する。別の実施形態では、本発明の単離結合分子は、リンホトキシンβに結合して細胞へのＬＴβＲ（またはＬＴΒＲ−Ｉｇ）結合を少なくとも約１００％阻害する単離結合分子に関する。
【０１３３】
Ｂ．増大した効能および／または親和性
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、先行技術の抗体より低い濃度でＬＴのＬＴβＲへの結合および／またはＬＴ誘発性生体活性を阻害する。これは、本発明のＬＴ結合部位を含む抗体のＬＴ誘発性生体活性（例えば、ＩＬ−８放出）を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を先行技術のＬＴ結合部位を含む抗体と比較時に容易に確かめることができる。先行技術の抗体がＬＴのＬＴβＲへの結合の５０％阻害に達するには３桁多い量の抗体が必要であり（図１、４および５参照）、一部は５０％阻害に全く達しない。これらの抗体の「理論上のＩＣ５０」を比較のために用いてよい。ＩＣ５０値の計算では、（細胞と緩衝液の添加後の最終抗体濃度ではなく）抗原（ＬＴ）との前インキュベーション工程中に存在する抗体濃度を使用した。
【０１３４】
１つの実施形態では、本発明の結合分子のＬＴβＲもしくはＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害ＩＣ５０または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害ＩＣ５０は約５００ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明の結合分子のＬＴβＲもしくはＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害ＩＣ５０または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害ＩＣ５０は約１００ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明の結合分子のＬＴβＲもしくはＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害ＩＣ５０または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害ＩＣ５０は約３０ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明の結合分子のＬＴβＲもしくはＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害ＩＣ５０または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害ＩＣ５０は約１０ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明の結合分子のＬＴβＲもしくはＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害ＩＣ５０または１つ以上のＬＴ生体活性の阻害ＩＣ５０は約３ｎＭ未満である
【０１３５】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、これらの改善された特性を１つより多く有する、すなわち、ＬＴβＲもしくはＬＴβＲ−Ｉｇ結合の阻害または１つ以上のＬＴ生体活性の７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％超の阻害を達成し、阻害ＩＣ５０は約５００ｎＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、もしくは３ｎＭ未満である。
【０１３６】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ＬＴα１β２に約０．３ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＬＴα１β２に約０．１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＬＴα１β２に約０．０３ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する。
【０１３７】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上のＬＴ生体活性（例えば、ＩＬ−８放出）を少なくとも９０％、１００ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上のＬＴ生体活性（例えば、ＩＬ−８放出）を少なくとも９０％、３０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上のＬＴ生体活性（例えば、ＩＬ−８放出）を少なくとも９０％、１０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上のＬＴ生体活性（例えば、ＩＬ−８放出）を少なくとも９０％、３ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。１つの実施形態では、主題の本発明の結合分子はまた、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）ＬＴβＲまたはＬＴβＲ−Ｉｇ結合を少なくとも７０％阻害する。１つの実施形態では、主題の本発明の結合分子はまた、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）ＬＴβＲまたはＬＴβＲ−Ｉｇ結合を少なくとも８０％阻害する。１つの実施形態では、主題の本発明の結合分子はまた、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）ＬＴβＲまたはＬＴβＲ−Ｉｇ結合を少なくとも９０％阻害する。１つの実施形態では、主題の本発明の結合分子はまた、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）ＬＴβＲまたはＬＴβＲ−Ｉｇ結合を少なくとも９５％阻害する。１つの実施形態では、主題の本発明の結合分子はまた、（例えば、参照抗体Ｂ９（細胞系Ｂ９．Ｃ９．１により産生、寄託番号ＨＢ１１９６２のもとＡＴＣＣに寄託またはその抗原結合領域を含む分子）が細胞中ＬＴα１β２誘発性生体活性を約５０％阻害する条件において）ＬＴβＲまたはＬＴβＲ−Ｉｇ結合を少なくとも１００％阻害する。
【０１３８】
Ｃ．ＬＴの新規領域への結合
本発明の結合分子はＬＴα３に結合せず（または、１０３の場合）、ＬＴα３に結合する場合はＬＴα３のＴＮＦＲへの結合をブロックするようには結合しない。加えて、本発明の結合分子はすべてＬＴのＬＴβＲまたはＬＴβＲ−Ｉｇへの結合をブロックする。１つの実施形態では、本発明の抗ＬＴ結合分子は、ＬＴの本発明の抗ＬＴ抗体への結合について競合する。したがって、ある実施形態では、本発明の組成物に使用される結合部分は、競合アッセイにおける参照抗体（例えば、本明細書に記載のＡ０Ｄ９、１０８、１０７、１０５、９Ｂ４、Ａ１Ｄ５、１０２、または１０１／１０３抗体）と同じエピトープに結合し得る。例えば、結合部分は、本発明の抗ＬＴ抗体と交差ブロックする（すなわち、結合について競合する）あるいは抗体結合に干渉する抗体に由来し得る。
【０１３９】
結合分子が、リガンド（例えばＬＴ）のＬＴβＲまたはＬＴβＲ−Ｉｇへの結合をリガンド濃度に依存する形で阻害するかまたはブロックする（例えば立体的にブロックする）程度、エピトープに特異的または選択的に結合する場合、リガンドの結合を「競合的に阻害する」または「競合的にブロックする」と呼ぶ。例えば、生化学的に測定時、リガンドの結合が結合分子の標的分子（例えば、ＬＴβＲ）への結合に勝る場合、リガンド濃度を増大することにより所与の結合分子濃度における競合的阻害を克服できる。いずれの特定の理論にも縛られず、結合分子が結合するエピトープがリガンドの結合部位またはその近くに位置して、リガンドの結合を防止する場合、競合が生じると考えられる。競合的阻害は、当技術分野において周知の方法および／または実施例に記載の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイなどにより決定し得る。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、Ａ０Ｄ９、１０８、１０７、１０５、９Ｂ４、Ａ１Ｄ５、１０２、または１０１／１０３からなる群から選択される抗ＬＴ抗体のＬＴへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％競合的に阻害する（またはＬＴのＬＴβＲへの結合を低下させるかもしくはＬＴ介入シグナル伝達を下方制御する抗体の能力の１つと競合する）。
【０１４０】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、Ａ０Ｄ９抗体のＬＴへの結合を競合的に阻害する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１０８抗体のＬＴへの結合を競合的に阻害する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１０７抗体のＬＴへの結合を競合的に阻害する。
【０１４１】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１０５または９Ｂ４抗体のＬＴへの結合を競合的に阻害する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、Ａ１Ｄ５抗体のＬＴへの結合を競合的に阻害する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１０２抗体のＬＴへの結合を競合的に阻害する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１０１／１０３抗体のＬＴへの結合を競合的に阻害する。
【０１４２】
競合的ＬＴエピトープに結合する他の抗体は、当技術分野で認識されている方法および特性を決定したそれらの可変領域を用いて特定し得る。かかる抗体を結合分子として用いてもよいし、それらの可変領域を結合部位として用いて本発明の結合分子に組み込んでもよい。例えば、かかる抗体のＣＤＲを本発明の結合分子に組み込んでよい。例えば、シグナル配列のない完全長ＬＴに対する抗体またはシグナル配列のない完全長ＬＴの様々な断片に対する抗体がいったん産生されたら、ＬＴのどのアミノ酸もしくはエピトープがどの抗体もしくは抗原結合断片に結合するかについては、当技術分野で知られているエピトープマッピングプロトコール（例えば”Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  −  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，”  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｄ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｖ．２，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （１９９６）に記載の二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）により決定できる。さらなるエピトープマッピングプロトコールについては、Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｇ．  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）（両方ともそれらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）に見出し得る。エピトープマッピングは市販の手段（すなわちＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，  Ｉｎｃ．  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））によっても実施できる。
【０１４３】
さらに別の実施形態では、本発明の結合分子は、その結合にとって重要であり得るＬＴのあるアミノ酸残基またはＬＴのあるアミノ酸に結合する結合部位を含んでよい。以下に開示するＬＴ中のアミノ酸位置は、成熟形態のタンパク質中のアミノ酸位置を指す。成熟ＬＴβタンパク質の配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ  ｅｎｔｒｉｅｓ  ＧＩ：２９２２７７  ａｎｄ  ４５０５０３５  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７２：８４７−８５６  （１９９３）（これらのすべてがそれらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１４４】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離結合分子であり、結合分子によるＬＴエピトープへの結合が１０２抗体により用量依存的、競合的にブロックされる単離結合分子に関する。別の実施形態では、ＬＴβのアミノ酸１９３位（Ｒ）および１９４位（Ｒ）（以下の配列番号：に説明される）が結合分子の結合にとって重要である。ＬＴβの配列を以下に示す。
１  ＭＧＡＬＧＬＥＧＲＧ  ＧＲＬＱＧＲＧＳＬＬ  ＬＡＶＡＧＡＴＳＬＶ  ＴＬＬＬＡＶＰＩＴＶ  ＬＡＶＬＡＬＶＰＱＤ
５１  ＱＧＧＬＶＴＥＴＡＤ  ＰＧＡＱＡＱＱＧＬＧ  ＦＱＫＬＰＥＥＥＰＥ  ＴＤＬＳＰＧＬＰＡＡ  ＨＬＩＧＡＰＬＫＧＱ
１０１  ＧＬＧＷＥＴＴＫＥＱ  ＡＦＬＴＳＧＴＱＦＳ  ＤＡＥＧＬＡＬＰＱＤ  ＧＬＹＹＬＹＣＬＶＧ  ＹＲＧＲＡＰＰＧＧＧ
１５１  ＤＰＱＧＲＳＶＴＬＲ  ＳＳＬＹＲＡＧＧＡＹ  ＧＰＧＴＰＥＬＬＬＥ  ＧＡＥＴＶＴＰＶＬＤ  ＰＡＲＲＱＧＹＧＰＬ
２０１  ＷＹＴＳＶＧＦＧＧＬ  ＶＱＬＲＲＧＥＲＶＹ  ＶＮＩＳＨＰＤＭＶＤ  ＦＡＲＧＫＴＦＦＧＡ  ＶＭＶＧ
【０１４５】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離結合分子でありかつ結合分子によるＬＴエピトープへの結合がＡ０Ｄ９抗体により用量依存的、競合的にブロックされる単離結合分子に関する。別の実施形態では、ＬＴβのアミノ酸１５１位（Ｄ）および１５３位（Ｑ）（配列番号：に説明される）が結合分子の結合にとって重要である。
【０１４６】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離結合分子でありかつ結合分子によるＬＴエピトープへの結合が１０１／１０３抗体により用量依存的、競合的にブロックされる単離結合分子に関する。
【０１４７】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離結合分子でありかつ結合分子によるＬＴエピトープへの結合が１０５または９Ｂ４抗体により用量依存的、競合的にブロックされる単離結合分子に関する。１つの実施形態では、ＬＴβのアミノ酸９６位（Ｐ）、９７位（Ｌ）、９８位（Ｋ）が結合分子の結合にとって重要である。
【０１４８】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離結合分子でありかつ結合分子によるＬＴエピトープへの結合が１０５抗体により用量依存的、競合的にブロックされる単離結合分子に関する。１つの実施形態では、ＬＴβのアミノ酸９６位（Ｐ）、９７位（Ｌ）、９８位（Ｋ）、１０６位（Ｔ）、１０７位（Ｔ）、および１０８位（Ｋ）（配列番号：に説明される）が結合分子の結合にとって重要である。
【０１４９】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離結合分子でありかつ結合分子によるＬＴエピトープへの結合がＡ１Ｄ５抗体により用量依存的、競合的にブロックされる単離結合分子に関する。１つの実施形態では、ＬＴβのアミノ酸１７２位（Ｐ）（配列番号：に示される）が結合分子の結合にとって重要である。
【０１５０】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離結合分子でありかつ結合分子によるＬＴエピトープへの結合が１０７抗体により用量依存的、競合的にブロックされる単離結合分子に関する。１つの実施形態では、ＬＴβのアミノ酸１５１位（Ｄ）および１５３位（Ｑ）（配列番号：に示される）が結合分子の結合にとって重要である。
【０１５１】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＴエピトープに特異的に結合する単離結合分子でありかつ結合分子によるＬＴエピトープへの結合が１０８抗体により用量依存的、競合的にブロックされる単離結合分子に関する。
【０１５２】
Ｄ．新規構造
さらに別の実施形態では、本発明の抗ＬＴ結合分子は、ある構造的特徴を共有する抗ＬＴ結合部位、例えば、本明細書に記載の抗ＬＴ結合部位と同じアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
特許請求の範囲の機能的活性を有する抗体パネルのＣＤＲ配列を下表１および２に示す。
【０１５４】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むリンホトキシン（ＬＴ）結合分子に関し、ここで軽鎖および重鎖ＣＤＲは、Ａ０Ｄ９、１０８、１０７、Ａ１Ｄ５、１０２、１０１／１０３、９Ｂ４、および１０５からなる群から選択される抗体由来である。
【０１５５】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲはＡ０Ｄ９抗体由来である。
【０１５６】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲは１０８抗体由来である。
【０１５７】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲは１０７抗体由来である。
【０１５８】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲはＡ１Ｄ５抗体由来である。
【０１５９】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲは１０２抗体由来である。
【０１６０】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲは１０１／１０３抗体由来である。
【０１６１】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲは１０５抗体由来である。
【０１６２】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲは９Ｂ４抗体由来である。
【０１６３】
本実施例によって単離した抗体のＣＤＲクラスの分析により、コンセンサスＣＤＲアミノ酸配列の発現が促進された。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、本明細書に記載の１つ以上のコンセンサスＣＤＲ配列を含む（例えば、表１および２を参照されたい）。例えば、実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲＨ１は配列ＧＦＳＬＸ１Ｘ２Ｙ／ＳＧＸ３Ｈ／ＧＸ４Ｘ５を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｘ１はＳもしくはＴからなる群から選択され；Ｘ２はＴ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｘ３はＶ、ＭもしくはＩからなる群から選択され、Ｘ４は欠損しているかもしくはＶであり、ならびにＸ５は欠損しているかもしくはＳである。１つの実施形態では、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列の７／１０または７／１２はコンセンサス配列におけるものと同一である。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、Ａ０Ｄ９抗体、１０８抗体、９Ｂ４抗体、もしくは１０７抗体、またはそれらの組み合わせ由来である。
【０１６４】
別の実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲＨ１は配列ＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０を含み、ここでＸ１はＹもしくはＦからなる群から選択され；Ｘ２はＳ、Ｔ、もしくはＶからなる群から選択され；Ｘ３はＦもしくはＩからなる群から選択され；Ｘ４はＴもしくはＳからなる群から選択され；Ｘ５はＧ、Ｄ、もしくはＳからなる群から選択され；Ｘ６はＹ、Ｓ、もしくはＧからなる群から選択され；Ｘ７はＦ、Ｙ、もしくはＷからなる群から選択され；Ｘ８はＭもしくはＹからなる群から選択され；Ｘ９はＮ、ＹもしくはＷからなる群から選択され；ならびにＸ１０は欠損もしくはＮからなる群から選択される。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、ＡｌＤ５、Ａ１０５、１０２または１０１／１０３抗体由来である。
【０１６５】
別の実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲＨ２は配列ＶＩＷＸ１ＧＧＸ２ＴＸ３Ｘ４ＮＡＸ５ＦＸ６Ｓを含む。１つの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｘ１はＲもしくはＳからなる群から選択され；Ｘ２はＮもしくはＳからなる群から選択され；Ｘ３はＮもしくはＤからなる群から選択され；Ｘ４はＹもしくはＨからなる群から選択され；Ｘ５はＡもしくはＶからなる群から選択され；ならびにＸ６はＭ、Ｔ、もしくはＩからなる群から選択される。１つの実施形態では、結合分子の残りの５つのＣＤＲは、Ａ０Ｄ９抗体、１０８抗体、もしくは１０７抗体由来である。
【０１６６】
別の実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲＨ２は配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＹＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６を含み、ここでＸ１はＲ、Ｔ、Ｇ、もしくは欠損からなる群から選択され；Ｘ２はＩ、Ｈ、もしくはＹからなる群から選択され；Ｘ３はＮ、Ｇ、Ｙ、もしくはＩからなる群から選択され；Ｘ４は、Ｐ、Ｄ、Ｙ、もしくはＳからなる群から選択され；Ｘ５はＹ、Ｗ、もしくはＧからなる群から選択され；Ｘ６はＮ、Ｔ、もしくはＤからなる群から選択され；Ｘ７はＧ、ＤもしくはＳからなる群から選択され；Ｘ８はＤ、Ｙ、もしくはＳからなる群から選択され；Ｘ９はＳ、Ｔ、Ｋ、もしくはＮからなる群から選択され；Ｘ１０はＦ、Ｈ、Ｄ、Ｒ、もしくはＮからなる群から選択され；Ｘ１１はＮ、Ｐ、もしくはＴからなる群から選択され；Ｘ１２はＱ、Ｄ、Ｇ、もしくはＰからなる群から選択され；Ｘ１３はＫもしくはＳからなる群から選択され；Ｘ１４はＦ、Ｖ、もしくはＬからなる群から選択され；Ｘ１５はＫもしくはＱからなる群から選択され；ならびにＸ１６はＤ、Ｇ、もしくはＮからなる群から選択される。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、Ａ１Ｄ５、１０２、９Ｂ４、１０５もしくは１０１／１０３抗体またはそれらの組み合わせ由来である。
【０１６７】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲＨ３は配列Ｇ／ＡＹＹＧ／Ａを含む。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、Ａ０Ｄ９、１０７、１０８、９Ｂ４抗体またはそれらの組み合わせ由来である。
【０１６８】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲＬ１は、Ｘ１ＡＳＱＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６配列を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。１つの実施形態では、Ｘ１はＫもしくはＲからなる群から選択され；Ｘ２はＩもしくはＭからなる群から選択され；Ｘ３はＮもしくはＳからなる群から選択され；Ｘ４はＴもしくはＮからなる群から選択され；Ｘ５はＹもしくはＦからなる群から選択され；Ｘ６はＮ、Ｔ、もしくはＲからなる群から選択される。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、Ａ０Ｄ９抗体、１０８抗体、１０７抗体、Ａ１Ｄ５抗体、または１０１／１０３抗体由来である。
【０１６９】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲＬ１は、ＲＡＳＸ１ＳＶＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５配列を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。１つの実施形態では、Ｘ１はＥまたはＳからなる群から選択され；Ｘ２はＤまたはＳからなる群から選択され；Ｘ３はＮまたはＹからなる群から選択され；Ｘ４はＹまたはＭからなる群から選択され；Ｘ５はＧまたはＩからなる群から選択される。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、１０５抗体もしくは９Ｂ４抗体またはそれらの組み合わせ由来である。
【０１７０】
１つの実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子に関し、ここでＣＤＲＬ２は配列ＲＡＸ１ＲＬＸ２Ｄを含み、Ｘは任意のアミノ酸である。１つの実施形態では、Ｘ１はＮまたはＤからなる群から選択され；Ｘ２はＶまたはＬからなる群から選択される。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、Ａ０Ｄ９抗体、１０８抗体、１０７抗体、もしくは１０１／１０３抗体、またはそれらの組み合わせ由来である。
【０１７１】
別の実施形態では、ＣＤＲＬ２は配列Ｘ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｓを含み、ここでＸ１はＹ、Ｒ、Ａ、またはＫからなる群から選択され；Ｘ２はＴ、Ａ、またはＶからなる群から選択され；Ｘ３はＫ、Ｓ、またはＮからなる群から選択され；Ｘ４はＬまたはＲからなる群から選択され；Ｘ５はＨ、Ｅ、Ａ、またはＦからなる群から選択される。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、Ａ１Ｄ５抗体、１０２抗体、１０５抗体、１０５Ａ抗体、１０５Ｂ抗体、１０５Ｃ抗体、または９Ｂ４抗体由来である。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明は重鎖ＣＤＲのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む軽鎖可変領域ならびに軽鎖ＣＤＲのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むＬＴ結合分子を対象とし、ここでＣＤＲＬ３は配列Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＰＸ６Ｔを含み、ここでＸ１はＱもしくはＦからなる群から選択され；Ｘ２はＹ、Ｖ、Ｇ、Ｗ、もしくはＳからなる群から選択され；Ｘ３はＤ、Ｓ、もしくはＮからなる群から選択され；Ｘ４はＤ、Ｈ、Ｙ、もしくはＫであり；Ｘ５はＦ、Ｎ、もしくはＤからなる群から選択され；ならびにＸ６はＷ、Ｌ、もしくはＹである。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、１０８、１０７、Ａ１Ｄ５、１０２、９Ｂ４、もしくは１０５抗体またはそれらの組み合わせ由来である。
【０１７３】
別の実施形態では、ＣＤＲＬ３は配列ＬＸ１Ｘ２ＤＸ３ＦＰＸ４Ｔを含み、ここでＸ１はＨまたはＱからなる群から選択され；Ｘ２はＨまたはＹからなる群から選択され；Ｘ３はＡまたはＫからなる群から選択され；Ｘ４はＷまたはＰからなる群から選択される。１つの実施形態では、残りの５つのＣＤＲは、Ａ０Ｄ９もしくは１０１／１０３抗体またはそれらの組み合わせ由来である。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明は、任意の１つのＶＨ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換を除き、ＶＨ−ＣＤＲｌ、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に記載の抗体のＶＨ−ＣＤＲｌ、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３配列と同じポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離ポリペプチドを提供する（例えば、カバットＣＤＲまたはコチアＣＤＲ（例示的な置換部位を表１に示す））。より大きなＣＤＲ（例えば、ＶＨ−ＣＤＲ−３）では、ＶＨ−ＣＤＲを含むＶＨがＬＴに特異的にまたは選択的に結合する限り、ＣＤＲをさらに置換してよい。ある実施形態では、アミノ酸置換は保守的である。
【０１７５】
別の実施形態では、本発明は、任意の１つのＶＬ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換を除き、ＶＬ−ＣＤＲｌ、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が本明細書に記載の抗体のＶＬ−ＣＤＲｌ、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３配列と同じポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる単離ポリペプチドを提供する（例えば、カバットＣＤＲまたはコチアＣＤＲ（例示的な置換部位を表２に示す））。ある実施形態では、アミノ酸置換は保守的である。
【０１７６】
１つの実施形態では、特性（例えば結合特性または物理化学特性、例えば、可溶性）が改善された結合分子を得るように結合分子のＣＤＲを変化させることができる。例えば、１つの実施形態では、自己結合に影響を与えて分子の溶解度を改善するように重鎖または軽鎖の１つ以上のＣＤＲを変化させてよい。１つの実施形態では、かかる変化は表１および２に説明するモチーフにより提供された置換アミノ酸とアミノ酸の置換に至る。１つの実施形態では、少なくとも１つの変異を、（例えば、１０５抗体中）ＣＤＲＬ２に対して行う。別の実施形態では、２つの変異を、（例えば、１０５抗体中）ＣＤＲＬ２に対して行う。
【０１７７】
例えば、１つの実施形態では、ＣＤＲＬ２のカバット５４位のＲがＫに変異した１０５抗体の軽鎖の１つの型（Ａ型）、ＣＤＲＬ２のカバット５７位のＮがＳに変異した第２の型（Ｂ型）、ならびにＣＤＲＬ２に両変異を有する第３の型（カバット５４位のＫおよびカバット５７位のＳを含む；Ｃ型）を作製し得る。本実施例に示すように、ＣＤＲＬ２のこれらの修飾型を含む抗体は、改善された溶解度を示した。
【０１７８】
本発明の結合分子のＬＴ結合分子は、抗原認識部位、完全可変領域、または本発明の１つ以上の開始もしくは親抗ＬＴ抗体由来である１つ以上のＣＤＲを含んでよい。
【０１７９】
１つの実施形態では、Ａ０Ｄ９、１０８、９Ｂ４、および１０７重鎖ＣＤＲ間の相同性を考慮すると、様々な組み合わせを行うことができる。例えば、１つの実施形態では、Ａ０Ｄ９重鎖ＣＤＲＨ１は、１０８、９Ｂ４、または１０７のＣＤＲＨ１と置換して、これらの任意の抗体可変領域由来のＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と組み合わせてよい。
【０１８０】
別の実施形態では、Ａ０Ｄ９、１０８、９Ｂ４、１０１／１０３、および１０７軽鎖ＣＤＲ間の相同性を考慮すると、様々な組み合わせを行うことができる。例えば、１つの実施形態では、Ａ０Ｄ９軽鎖ＣＤＲＬ１１は、１０８、９Ｂ４、１０１／１０３、または１０７のＣＤＲＬ１と置換して、これらの任意の抗体可変領域由来のＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と組み合わせてよい。
【０１８１】
別の実施形態では、本発明の第一抗ＬＴ抗体の重鎖は本発明の第二抗ＬＴ抗体の軽鎖と組み合わせることができる。例えば、Ａ０Ｄ９、１０８、および１０７重鎖ＣＤＲ間の相同性を考慮すると、Ａ０Ｄ９重鎖を１０８または１０７軽鎖と組み合わせて抗ＬＴ結合部位を生成してよい。別の実施形態では、１０８重鎖は、Ａ０Ｄ９または１０７軽鎖と組み合わせて抗ＬＴ結合部位を生成してよい。さらに別の実施形態では、１０８重鎖は、Ａ０Ｄ９または１０７軽鎖と組み合わせて抗ＬＴ結合部位を生成してよい。
【０１８２】
さらに別の実施形態では、様々型の抗ＬＴ抗体軽鎖と重鎖を組み合わせることができる。例えば、１つの実施形態では、本明細書に記載の様々な型の１０５抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせることができる。本明細書において示すように、これらの型の多くが開始１０５抗体と比較して改善された溶解度を示す。１０５軽鎖と重鎖の例示的な組み合わせとしては、Ｈ１／Ｌ０（重鎖第１型および軽鎖第０型）；Ｈ１／Ｌ  Ａ型；Ｈ１／Ｌ  Ｂ型；Ｈ１／Ｌ１０；Ｈ１／Ｌ１２；Ｈ１／Ｌ１３；Ｈ１１／Ｌ１０；Ｈ１１／Ｌ１２；Ｈ１１／Ｌ１３；Ｈ１４／Ｌ１０；およびＨ１４／Ｌ１２が挙げられる。
【０１８３】
本発明は、主題の結合分子をコードするポリヌクレオチド配列にも関する。
【０１８４】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコーディング領域に作動可能に連結しているプロモーターならびに／または他の転写もしくは翻訳制御要素を含み得る。作動可能な連結において、遺伝子生産物（例えば、ポリペプチド）のコーディング領域は、調節配列（１つまたは複数）の影響または制御下にて遺伝子生産物の発現を置くような方法で１つ以上の調節配列と結合している。
【０１８５】
抗ＬＴ結合部位をコードする核酸分子は、１つ以上の定常領域部分をコードするヌクレオチド配列、または抗体由来の場合もあり抗体由来ではない場合もある他の所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る。ＤＮＡ断片（ポリペプチドコーディング領域およびそこに結合したプロモーターなど）は、プロモーター機能の導入が所望の遺伝子生産物をコードするｍＲＮＡの転写に至る場合、ならびに２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が発現調節配列の遺伝子生産物発現に対する能力に干渉しないかもしくはＤＮＡ鋳型を転写する能力と干渉しない場合、「作動可能に連結」している。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結していることとなる。プロモーターは、事前に決定した細胞内のみＤＮＡの実質的な転写に対する細胞特異的なプロモーターであり得る。プロモーターを除く他の転写制御要素（例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終止シグナル）はポリヌクレオチドに作動可能に連結でき、細胞特異的な転写を指示する。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域を本明細書に開示する。
【０１８６】
様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、サイトメガロウイルス（イントロンＡとあわせた最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどが挙げられるが、これらに限定されない脊椎動物細胞中で機能する転写制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子由来のもの（アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ増殖ホルモンおよびウサギβグロビンなど）、ならびに真核細胞中の遺伝子発現を制御できる他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサーならびにリンフォカイン誘発性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘発可能なプロモーター）が挙げられる。
【０１８７】
同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにピコルナウイルス由来の因子（特に配列内リボソーム進入部位、つまりＩＲＥＳ。ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子、例えば、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）形態である。
【０１８９】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コーディング領域は、分泌、またはシグナルペプチドをコードするさらなるコーディング領域を伴い得、これは本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指示する。シグナル仮説によると、哺乳類細胞により分泌されたタンパク質は、粗面小胞体にわたる増殖タンパク鎖の輸送がいったん開始後、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。脊椎動物細胞により分泌されたポリペプチドは、一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有すること、完全または「完全長」ポリペプチドから切断されて分泌または「成熟」形態のポリペプチドを産生することを、当業者は認識している。ある実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、またはそこに作動可能に連結しているポリペプチドの分泌に対する能力を保持するその配列の機能的誘導体を用いる。あるいは、異種の哺乳類シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を用いてよい。例えば、野生型リーダー配列はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβグルクロニダーゼのリーダー配列で置換し得る。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、シグナルペプチドを欠く成熟形態の分子である。
【０１９０】
また、本明細書の他の個所に詳述のとおり、本発明は、上記ポリヌクレオチドを１つ以上含む組成物も含む。
【０１９１】
ＩＩＩ．結合分子の例示的な形態
Ａ．抗ＬＴ抗体
ある実施形態では、本発明のＬＴ結合分子は抗体である。本出願に開示のデータを考慮すると、既に生成されている抗体に勝るＬＴ結合抗体を作製できることが明らかである。１つの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されたものに機能的に関連する抗体に関する。１つの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されたものに構造的に関連する抗体に関する。別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されたものに構造的かつ機能的に関連する抗体に関する。本発明の抗体は、当技術分野で知られている抗体の合成方法により、特に、化学合成により、または好ましくは、本明細書に記載の組換え発現技術により産生できる。例えば、抗体産生細胞系は、当業者に周知の技術を用いて選択および培養してよい。かかる技術は、様々な実験室マニュアルおよび主要刊行物に記載されている。この点に関して、下記の本発明における使用に適した技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１）（補足を含み、これらは、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１９２】
本発明のさらに他の実施形態では、例えば、内因性免疫グロブリン産生ができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）におけるヒトまたは実質的にヒト抗体の生成を含む（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号および同第５，５８９，３６９号（それぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域の同種接合体欠失により、内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。かかる生殖系列変異マウスにヒト免疫グロブリン遺伝子配置を移すことにより、抗原投与時にヒト抗体が産生される。ＳＣＩＤマウスを用いた別の好ましいヒト抗体生成手段については、米国特許第５，８１１，５２４号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。これらのヒト抗体と結合した遺伝子物質も本明細書に記載のように単離かつ操作し得ることが理解されるであろう。
【０１９３】
別の実施形態では、顕微操作および単離した可変遺伝子によりリンパ球を選択できる。例えば、末梢血液単核細胞を、免疫化哺乳類から単離して約７日間インビトロ培養することができる。培養物は、スクリーニング基準を満たす特異的なＩｇＧについてスクリーニングできる。陽性ウェルの細胞を単離できる。個々のＩｇ産生Β細胞をＦＡＣＳにより、または補体媒介性溶血プラークアッセイにおいてそれらを特定することにより単離できる。Ｉｇ産生Β細胞は、管中に顕微操作でき、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅できる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は抗体発現ベクターにクローン化して、発現のため細胞（例えば、真核生物または原核生物細胞）中にトランスフェクトすることができる。
【０１９４】
ある実施形態では、ＬＴ抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の可変領域と定常領域は両方とも完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当技術分野で知られており本明細書に記載している技術を用いて作製できる。例えば、特異的な抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原投与への反応においてかかる抗体を産生するように修飾されているが、内因性遺伝子座は無効化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製できる。かかる抗体を作製するために使用できる例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技術は、当技術分野で知られている。完全ヒト抗体は、様々なディスプレイ技術、例えば、本明細書の他の個所に詳述のとおり、ファージディスプレイ系または他のウイルスディスプレイ系により同様に産生できる。
【０１９５】
目的のエピトープに対するポリクローナル抗体は、当技術分野において周知の様々な手段を用いて産生できる。例えば、目的のエピトープを含む抗原を様々な宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、鶏、ハムスター、ヤギ、ロバなどが挙げられるが、これらに限定されない）に投与して抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清産生を誘発することができる。免疫反応を増大するために、宿主種に応じて、様々なアジュバント（フロイント（完全フロイントおよび不完全フロイント）、鉱物ゲル（水酸化アルミニウムなど）、表面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノールなど）、および潜在的に有用なヒトアジュバント（ＢＣＧ（ウシ型弱毒結核菌ワクチン）など）およびコリネバクテリウムパルヴムが挙げられるが、これらに限定されない）を用いてよい。かかるアジュバントはまた、当技術分野において周知でもある。
【０１９６】
モノクローナルＬＴ抗体は、当技術分野で知られている多種多様の技術を用いて（ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む）調製できる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られているもので、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８８）；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  ５６３−６８１  （１９８１）（前記参考文献は、それらの全体を参照することにより組み込まれる）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて産生できる。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を介して産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、単一クローン由来の抗体（任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む）を指し、産生されたものによる方法ではない。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を介して産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体はＬＴノックアウトマウスを用いて、エピトープ認識領域を拡大するために調製できる。モノクローナル抗体は当技術分野で知られている多種多様の技術を用いて（本明細書の他の個所に記載のハイブリドーマおよび組換えおよびファージディスプレイ技術の使用を含む）調製できる。
【０１９７】
当技術分野で認識されているプロトコールを使用した１例では、抗体は哺乳類において、関連抗原（例えば、精製されたＬＴα１β２またはＬＴα１β２発現細胞またはＬＴα１β２を含む細胞抽出物）およびアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注射により産生される。この免疫化により、典型的には、活性化脾細胞またはリンパ球からの抗原反応抗体の産生を含む免疫反応が誘発される。生成抗体を動物の血清から回収してポリクローナル調製物を得ることができるが、脾臓由来の個々のリンパ球、リンパ節または末梢血液を単離してモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の同種調製物を得ることが望まれることが多い。好ましくは、リンパ球は脾臓由来である。この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５  （１９７５））では、抗原と注射されている、哺乳類由来の比較的短命または致死のリンパ球を不死の腫瘍細胞系（例えば骨髄腫細胞系）と融合し、それによって、不死でΒ細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生できるハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」を産生する。生成ハイブリッドは、単一抗体形成のための特異的な遺伝子を含むそれぞれの個々の菌株の選択、希釈、および再増殖により単一の遺伝性質に分離する。それらは所望の抗原に対して同種の抗体を産生し、それらの純粋な遺伝子的家系に関して「モノクローナル」と呼ぶ。
【０１９８】
そのように調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合、親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中で播種し増殖する。ハイブリドーマの形成、選択および増殖用の試薬、細胞系および培地は、いくつかの供給源から市販されており、標準プロトコールが十分に確立されていることを、当業者は理解するであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生のためにアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生したモノクローナル抗体の結合特異性を、インビトロアッセイ（免疫沈殿、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など）により決定する。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定後、クローンを限界希釈手段によりサブクローン化し標準的な方法により増殖し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ  ５９−１０３  （１９８６））。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の精製手段（例えば、タンパク質Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーなど）により、培養培地、腹水または血清から分離し得ることがさらに理解されるであろう。
【０１９９】
抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡは抗体ライブラリー（ファージディスプレイライブラリーなど）由来であってもよいことを当業者は理解するであろう。特に、かかるファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現する抗原結合ドメインをディスプレイするために使用できる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により（例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲させた抗原を用いて）選択することもすることもできる。これらの方法に用いるファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ  ＯＥ  ＤＡＢ（軽鎖または重鎖由来の個々のＦｖ領域）、つまりファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質か遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え融合させたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを持つファージから発現させたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む、線維状ファージである。例示的な方法については、例えば、欧州特許第３６８  ６８４  Ｂｌ号；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｈ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１  （２０００）；  Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：８０１  （２００２）；  Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：２６８２  （２００１）；  Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１５：１０６３  （２００２）（それぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に説明されている。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３  （１９９２））に、鎖混合による高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大量ファージライブラリーを構築するための戦略としてコンビナトリアル感染およびインビボ組換えについて記載されている。別の実施形態では、リボソームディスプレイを用いて、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージを置換できる（例えば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：１２８７  （２０００）；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：３７５０  （２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１  （２００１）を参照されたい）。さらに別の実施形態では、細胞表面ライブラリーにおいて抗体をスクリーニングできる（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：１０７０１  （２０００）；  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１  （２０００））。さらに別の例示的な実施形態では、高親和性ヒトＦａｂライブラリーを、選択された相補性決定領域（ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２など）に合成多様性を有するヒトドナー由来の免疫グロブリン配列を結合させることにより設計する（例えば、Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２３：３４４−３４８  （２００５）（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。かかる手段は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための従来のハイブリドーマ技術の代替物を提供する。
【０２００】
ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子表面上に機能的抗体ドメインをディスプレイする。例えば、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列を増幅するか、あるいは動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから単離する。ある実施形態では、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーで互いに結合させ、ファージミドベクターにクローン化する（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ６またはｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）。ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に電気穿孔し、この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をヘルパーファージに感染させる。これらの方法に使用されるファージは、典型的には、線維状ファージ（ｆｄおよびＭ１３を含む）であり、ＶＨ領域またはＶＬ領域は、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩか遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え融合している。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージ（すなわち、ＬＴポリペプチドまたはその断片）を、抗原で（例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕獲された抗原を用いて）選択することも特定することもできる。
【０２０１】
抗体作製に使用できるファージディスプレイ方法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０  （１９９５）；  Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６  （１９９５）；  Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：９５２−９５８  （１９９４）；  Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８  （１９９７）；  Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０  （１９９４）；ＰＣＴ特許／英国特許第９１／０１１３４号；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９号；ＷＯ９１／１０７３７号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９３／１１２３６号；ＷＯ９５／１５９８２号；ＷＯ９５／２０４０１号；および米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（それぞれ、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示のものが挙げられる。
【０２０２】
上記参考文献に記載のとおり、ファージの選択後、ファージ由来の抗体コーディング領域を単離して、完全抗体（ヒト抗体を含む）または任意の他の所望の抗原結合断片を生成するために使用し、任意の所望の宿主（哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、および細菌を含む）内で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片の組換え産生技術は、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９  （１９９２）；およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４  （１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３  （１９８８）（前記参考文献は、それらの全体を参照することにより組み込まれる）に開示のものなどの当技術分野で知られている方法を用いて使用することもできる。
【０２０３】
単鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用できる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８  （１９９１）；  Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９  （１９９３）；およびＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０  （１９８８）に記載のものが挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含む一部の使用において、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。
【０２０４】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望まれる。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な方法（ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いた上記ファージディスプレイ方法を含む）により作製できる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５号、同ＷＯ９８／５０４３３号、同ＷＯ９８／２４８９３号、同ＷＯ９８／１６６５４号、同ＷＯ９６／３４０９６号、同ＷＯ９６／３３７３５号、および同ＷＯ９１／１０７４１号（それぞれ、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０２０５】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて産生することもできる。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子と軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体を、無作為にまたは相同的組換えにより、マウス胚幹細胞に導入してよい。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚幹細胞に導入してよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別にまたは同時に非機能性を付与され得る。特に、ＪＨ領域の同種接合体欠失は、内因性抗体産生を防止する。修飾胚幹細胞を拡大し、胚盤胞中に微量注入してキメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスを交配させてヒト抗体を発現する同種接合体の産仔を産生する。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドのすべてまたは一部を用いて通常の方法で免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスに宿ったヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Β細胞の分化中に再配列してから、クラススイッチおよび体細胞変異を遂げる。このように、かかる技術を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するための当該技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：６５−９３  （１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するための当該技術およびかかる抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号（これらは、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．  （Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，  Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ  （Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  Ｃａｌｉｆ．）などの企業が、上記のものと類似した技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに取り組み得る。
【０２０６】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択」と呼ばれる技術を用いて生成できる。この方法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を用いて、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする。（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３  （１９８８）。米国特許第５，５６５，３３２号も参照されたい）。
【０２０７】
「親和性成熟」抗体とは、そのＣＤＲの１つ以上に改変を１つ以上有し、その結果、それらの改変（１つまたは複数）を有さない親抗体と比較して抗体の抗原親和性が改善された抗体である。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル親和性、またはピコモル親和性さえも有するであろう。親和性成熟抗体は、当技術分野で知られている手段により産生される。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３  （１９９２）には、ＶＨドメインとＶＬドメインの混合による親和性成熟について記載されている。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基の無作為変異誘発については、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，  ＰｒｏｃＮａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３  （１９９４）；  Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５  （１９９５）；  Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：１９９４−２００４  （１９９５）；  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４．７）：３３１０−９  （１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６  （１９９２）によって記載されている。
【０２０８】
Ｂ．単鎖結合分子
他の実施形態では、本発明の結合分子は、単鎖結合分子であってよい（例えば、単鎖可変領域またはｓｃＦｖ）。単鎖抗体産生のために記載された技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２  （１９８８）；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３  （１９８８）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４  （１９８９））を改変して単鎖結合分子を産生することができる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖と軽鎖断片とをアミノ酸結合を介して結合することにより形成され、単鎖抗体を生成する。Ｅ  ｃｏｌｉ中の機能的Ｆｖ断片の組立技術も用いてよい（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１  （１９８８））。
【０２０９】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、ｓｃＦｖ分子（例えば、ｓｃＦｖリンカーにより結合した本発明の抗ＬＴ抗体由来のＶＨドメインおよびＶＬドメイン）であるか、またはかかる分子を含む。ｓｃＦｖ分子は従来のｓｃＦｖ分子または安定化ｓｃＦｖ分子であってよい。改善された安定性（例えば、改善された熱安定性）をｓｃＦｖまたはｓｃＦｖを含む結合分子に付与する安定した変異、ジスルフィド結合、または至適化されたリンカーを含む安定化ｓｃＦｖについては、米国特許第１１／７２５，９７０号（その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）に詳述されている。
【０２１０】
他の実施形態では、本発明の結合分子は、ｓｃＦｖ分子を含むポリペプチドである。ある実施形態では、多特異的な結合分子は、ｓｃＦｖ分子（例えば、安定化ｓｃＦｖ分子）を上記抗ＬＴ抗体、または１つの抗ＬＴ抗体の結合部位を含む単一特異的な結合分子と結合させることにより作製してよく、ここでｓｃＦｖ分子および親結合分子は同じ結合特異性を有する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ｓｃＦｖ分子が融合されている天然抗ＬＴ抗体である。
【０２１１】
安定化ｓｃＦｖ分子の熱安定性は改善されている（例えば、融解温度（Ｔｍ）値が５４℃超（例えば５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃またはそれ以上）またはＴ５０値が３９℃超（例えば４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、または５９℃）である。本発明のｓｃＦｖ分子またはそれらを含む融合タンパク質の安定性は、従来の（安定していない）ｓｃＦｖ分子または従来のｓｃＦｖ分子を含む結合分子の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）を参照して評価できる。１つの実施形態では、本発明の結合分子の熱安定性は対照の結合分子（例えば、従来のｓｃＦｖ分子）より約０．１℃、約０．２５℃、約０．５℃、約０．７５℃、約１℃、約１．２５℃、約１．５℃、約１．７５℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、または約１０℃高い。
【０２１２】
１つの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４からなるかまたは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４配列を含む。他の例示的なリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５配列を含むか、またはそれからなる。本発明のｓｃＦｖリンカーの長さは様々であることができる。１つの実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約５〜約５０個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約１０〜約４０個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約１５〜約３０個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約１７〜約２８個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約１９〜約２６個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約２１〜約２４個のアミノ酸の長さである。
【０２１３】
ある実施形態では、本発明の安定化ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメイン中のアミノ酸とＶＨドメイン中のアミノ酸を結合するジスルフィド結合を少なくとも１つ含む。システイン残基が、ジスルフィド結合を提供するために必要である。本発明のｓｃＦｖ分子には、例えば、ＶＬのＦＲ４とＶＨのＦＲ２を連結するか、またはＶＬのＦＲ２とＶＨのＦＲ４を連結するためにジスルフィド結合を含むことができる。ジスルフィド結合の例示的な位置としては、ＶＨの４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、１０３位、１０４位、１０５位、および１０６位ならびにＶＬの４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、９８位、９９位、１００位、および１０１位（カバット番号付け）が挙げられる。システイン残基に変異しているアミノ酸位置の例示的な組み合わせとしては、ＶＨ４４−ＶＬ１００、ＶＨ１０５−ＶＬ４３、ＶＨ１０５−ＶＬ４２、ＶＨ４４−ＶＬ１０１、ＶＨ１０６−ＶＬ４３、ＶＨ１０４−ＶＬ４３、ＶＨ４４−ＶＬ９９、ＶＨ４５−ＶＬ９８、ＶＨ４６−ＶＬ９８、ＶＨ１０３−ＶＬ４３、ＶＨ１０３−ＶＬ４４、およびＶＨ１０３−ＶＬ４５が挙げられる。１つの実施形態では、ジスルフィド結合はＶＨアミノ酸４４位とＶＬアミノ酸１００位を結合する。
【０２１４】
１つの実施形態では、本発明の安定化ｓｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメイン間に割り込んだアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４を有するｓｃＦｖリンカーを含み、ここでＶＨドメインとＶＬドメインは、ＶＨ中のアミノ酸４４位とＶＬ中のアミノ酸１００位間のジスルフィド結合により結合されている。
【０２１５】
他の実施形態では、本発明の安定化ｓｃＦｖ分子は、１つ以上（例えば２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の安定した変異をｓｃＦｖの可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）内に含む。１つの実施形態では、安定した変異は、以下からなる群から選択される：ａ）ＶＬのカバット３位のアミノ酸（例えば、グルタミン）の、例えば、アラニン、セリン、バリン、アスパラギン酸、もしくはグリシンとの置換；（ｂ）ＶＬのカバット４６位のアミノ酸（例えば、セリン）の、例えば、ロイシンとの置換；（ｃ）ＶＬのカバット４９位のアミノ酸（例えば、セリン）の、例えば、チロシンもしくはセリンとの置換；（ｄ）ＶＬのカバット５０位のアミノ酸（例えば、セリンもしくはバリン）の、例えば、セリン、トレオニン、およびアルギニン、アスパラギン酸、グリシン、もしくはリシンとの置換；（ｅ）ＶＬのカバット４９位のアミノ酸（例えば、セリン）およびカバット５０位のアミノ酸（例えば、セリン）の、それぞれ、チロシンおよびセリンとの置換；チロシンおよびトレオニンとの置換；チロシンおよびアルギニンとの置換；チロシンおよびグリシンとの置換；セリンおよびアルギニンとの置換；またはセリンおよびリシンとの置換；（ｆ）ＶＬのカバット７５位のアミノ酸（例えば、バリン）の、例えば、イソロイシンとの置換；（ｇ）ＶＬのカバット８０位のアミノ酸（例えば、プロリン）の、例えば、セリンもしくはグリシンとの置換；（ｈ）ＶＬのカバット８３位のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の、例えば、セリン、アラニン、グリシン、もしくはトレオニンとの置換；（ｉ）ＶＨのカバット６位のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）の、例えば、グルタミンとの置換；（ｊ）ＶＨのカバット１３位のアミノ酸（例えば、リシン）の、例えば、グルタメートとの置換；（ｋ）ＶＨのカバット１６位のアミノ酸（例えば、セリン）の、例えば、グルタメートもしくはグルタミンとの置換；（ｌ）ＶＨのカバット２０位のアミノ酸（例えば、バリン）の、例えば、イソロイシンとの置換；（ｍ）ＶＨのカバット３２位のアミノ酸（例えば、アスパラギン）の、例えば、セリンとの置換；（ｎ）ＶＨのカバット４３位のアミノ酸（例えば、グルタミン）の、例えば、リシンもしくはアルギニンとの置換；（ｏ）ＶＨのカバット４８位のアミノ酸（例えば、メチオニン）の、例えば、イソロイシンもしくはグリシンとの置換；（ｐ）ＶＨのカバット４９位のアミノ酸（例えば、セリン）の、例えば、グリシンもしくはアラニンとの置換；（ｑ）ＶＨのカバット５５位のアミノ酸（例えば、バリン）の、例えば、グリシンとの置換；（ｒ）ＶＨのカバット６７位のアミノ酸（例えば、バリン）の、例えば、イソロイシンもしくはロイシンとの置換；（ｓ）ＶＨのカバット７２位のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）の、例えば、アスパルテートもしくはアスパラギンとの置換；（ｔ）ＶＨのカバット７９位のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の、例えば、セリン、バリン、もしくはチロシンとの置換；ならびに（ｕ）ＶＨのカバット１０１位のアミノ酸（例えば、プロリン）の、例えば、アスパラギン酸との置換。
【０２１６】
Ｃ．単一ドメイン結合分子
ある実施形態では、結合分子は、ナノボディとしても知られている単一ドメイン結合分子（例えば単一ドメイン抗体）であるか、それを含む。例示的な単一ドメイン分子としては、抗体の単離した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、すなわち、軽鎖可変ドメインのない重鎖可変ドメイン、および抗体の単離した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、すなわち、重鎖可変ドメインのない軽鎖可変ドメインが挙げられる。本発明の結合分子に使用される例示的な単一ドメイン抗体としては、例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８  （１９９３）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：５００−５１５  （２００２）に記載のラクダ科重鎖可変ドメイン（約１１８〜１３６個のアミノ酸残基）が挙げられる。単一ドメイン抗体の多量体も本発明の範囲内である。他の単一ドメイン抗体としては、サメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ）が挙げられる。サメＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲ）のホモ二量体および５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲ）を含み、残基５〜２３個の長さで変化する伸長したＣＤＲ３領域に多様性が集中している。ラクダ科種（例えば、ラマ）において、重鎖可変領域（ＶＨＨと呼ばれる）は完全抗原結合ドメインを形成する。ラクダ科ＶＨＨ可変領域と従来の抗体（ＶＨ）由来のものとの主な相違点としては、（ａ）ＶＨの軽鎖接触表面中における、ＶＨＨの対応領域と比較してより疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨにおけるより長いＣＤＲ３、および（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲｌとＣＤＲ３間のジスルフィド結合の生じる頻度、が挙げられる。単一ドメイン結合分子の作製方法については、米国特許第６，００５，０７９号および同第６，７６５，０８７号（両方とも、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２１７】
Ｄ．小体
ある実施形態では、本発明の結合分子は小体であるか、または小体を含む。小体は当技術分野に記載の方法を用いて作製できる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１号を参照されたい）。ある実施形態では、小体は、天然もしくは非天然（例えば、変異した）重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメイン、またはそれらの組み合わせの相補性決定領域（ＣＤＲ）を２つのみ含む結合分子である。かかる小体の例は、Ｐｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３６７−３６９  （１９９３）によって記載されている。別の例示的な小体は、ＣＨ３ドメインまたは完全なＦｃ領域に結合または融合しているｓｃＦｖ分子を含む。小体の多量体も、本発明の範囲内である。
【０２１８】
Ｅ．結合分子断片
特に記載のない限り、本明細書で使用する、結合分子に関する「断片」とは、抗原結合断片、すなわち、抗原に特異的に結合する結合部分を指す。１つの実施形態では、本発明の結合分子は抗体断片であるか、またはかかる断片を含む。特異的なエピトープを認識する抗体断片は既知の技術により生成してよい。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は組換え産生してもよいし、免疫グロブリン分子のタンパク質切断により（Ｆａｂ断片を産生するための）パパインや（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するための）ペプシンなどの酵素を用いて産生してもよい。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０２１９】
Ｆ．多価小体
１つの実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、第一結合部位のある少なくとも１つのｓｃＦｖ断片および第二結合部位のある少なくとも１つのｓｃＦｖを有する多価小体である。２つのｓｃＦｖ分子の結合部位は同じでも異なってもよい。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｃＦｖ分子は安定している。例示的な二重特異性の二価小体構築物は、Ｎ末端でＣペプチドに融合しているＣＨ３ドメインを含み、ＣペプチドはＮ末端でＶＨドメインに融合し、ＶＨドメインはＮ末端で（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ可動性リンカーに融合し、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ可動性リンカーはＮ末端でＶＬドメインに融合している。ある実施形態では、多価小体は二価であっても、三価（例えば、三量体）であっても、二重特異性（例えば、二重特異性抗体）であっても、または四価（例えば、四量体）であってもよい。
【０２２０】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、異なる結合特異性を有する第一および第二ｓｃＦｖ断片を含むｓｃＦｖ四価小体の各重鎖部分を有するｓｃＦｖ四価小体である。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｃＦｖ分子は安定している。前記第二ｓｃＦｖ断片は、第一ｓｃＦｖ断片のＮ末端に結合してよい（例えば二重特異性のＮＨｓｃＦｖ四価小体または二重特異性のＮＬｓｃＦｖ四価小体）。あるいは、第二ｓｃＦｖ断片は、前記第一ｓｃＦｖ断片を含む前記重鎖部分のＣ末端に結合してもよい（例えば二重特異性のＣ−ｓｃＦｖ四価小体）。二重特異性の四価小体の第一重鎖部分の第一ｓｃＦｖ断片と第二ｓｃＦｖ断片が同じ標的ＬＴ分子に結合する場合、二重特異性の四価小体の第二重鎖部分の第一ｓｃＦｖ断片と第二ｓｃＦｖ断片の少なくとも１つは同じＬＴ標的分子に結合してもよいし、異なるＬＴ標的分子に結合してもよい。
【０２２１】
Ｇ．多特異的な抗体
本発明の多特異的な結合分子は、少なくとも２つの結合部位を含んでよく、このうち少なくとも１つの結合部位は、上記１つの単一特異的な結合分子由来の結合部位に由来するかまたはそれを含む。ある実施形態では、本発明の多特異的な結合分子の少なくとも１つの結合部位は、抗体の抗原結合領域またはその抗原結合断片（例えば上記の抗体または抗原結合断片）である。
【０２２２】
ある実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、二重特異性である。二重特異性の結合分子は二価であり得、より高い結合価（例えば、三価、四価、五価など）でもあり得る。二重特異性の二価抗体、およびそれらの作製方法については、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；同第５，８０７，７０６号；同第５，８２１，３３３号；ならびに米国特許公開第２００３／０２０７３４号および第２００２／０１５５５３７号（これらの開示はすべて、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。二重特異性の四価抗体およびそれらの作製方法については、例えば、ＷＯ０２／０９６９４８号およびＷＯ００／４４７８８号（両開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。概して、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５号；ＷＯ９２／０８８０２号；ＷＯ９１／００３６０号；ＷＯ９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：６０−６９  （１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−１５５３  （１９９２）を参照されたい。
【０２２３】
Ｈ．ｓｃＦｖ含有の多特異的な結合分子
１つの実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、ｓｃＦｖ分子（例えば上記のｓｃＦｖ分子）を少なくとも１つ含む多特異的な結合分子である。他の実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、２つのｓｃＦｖ分子（例えば二重特異性のｓｃＦｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ））を含む。ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子は従来のｓｃＦｖ分子である。他の実施形態では、ｓｃＦｖ分子は上記の安定化ｓｃＦｖ分子である。ある実施形態では、多特異的な結合分子は、上記の抗ＬＴ抗体または１つの抗ＬＴ抗体の結合部位を含む単一特異的な結合分子にｓｃＦｖ分子（例えば、安定化ｓｃＦｖ分子）を結合させることにより作製することができ、ここでｓｃＦｖ分子とＬＴの異なる領域に結合する親結合分子は異なる重要なＬＴ接触残基を有する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ｓｃＦｖ分子が融合している天然抗ＬＴ抗体である。１つの実施形態では、かかるｓｃＦｖ分子は安定している。
【０２２４】
安定化ｓｃＦｖが親結合分子に結合している場合、安定化ｓｃＦｖ分子の結合は好ましくは結合分子の熱安定性を少なくとも約２℃または３℃改善する。１つの実施形態では、本発明のｓｃＦｖ含有の結合分子の熱安定性は、従来の結合分子と比較して１℃改善されている。別の実施形態では、本発明の結合分子の熱安定性は、従来の結合分子と比較して２℃改善されている。別の実施形態では、本発明の結合分子の熱安定性は、従来の結合分子と比較して４、５、６℃改善されている。
【０２２５】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は安定化「抗体」または「免疫グロブリン」分子、例えば、天然抗体または免疫グロブリン分子（またはその抗原結合断片）または抗体分子に類似した形で抗原に結合し本発明のｓｃＦｖ分子を含む遺伝子組換え抗体分子である。本明細書で使用する「免疫グロブリン」という用語は、任意の関連する特異的な免疫再活性を所有するかどうかを問わず、２本の重鎖と２本の軽鎖の組み合わせを有するポリペプチドを含む。
【０２２６】
１つの実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、抗体重鎖のＣ末端に結合した少なくとも１つのｓｃＦｖ（例えば２つ、３つ、または４つのｓｃＦｖ、例えば、安定化ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖと抗体は異なる結合特異性を有する。別の実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、抗体重鎖のＮ末端に結合した少なくとも１つのｓｃＦｖ（例えば２つ、３つ、または４つのｓｃＦｖ、例えば、安定化ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖと抗体は異なる結合特異性を有する。別の実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、抗体軽鎖のＮ末端に結合した少なくとも１つのｓｃＦｖ（例えば、２つ、３つ、もしくは４つのｓｃＦｖまたは安定化ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖと抗体は異なる結合特異性を有する。別の実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、抗体重鎖もしくは軽鎖のＮ末端に結合した少なくとも１つのｓｃＦｖ（例えば、２つ、３つ、または４つのｓｃＦｖまたは安定化ｓｃＦｖ）、重鎖のＣ末端に結合した少なくとも１つのｓｃＦｖ（例えば、２つ、３つ、もしくは４つのｓｃＦｖまたは安定化ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖは異なる結合特異性を有する。
【０２２７】
Ｉ．多特異的な二重特異性抗体
他の実施形態では、本発明の結合分子は、多特異的な二重特異性抗体である。１つの実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、二重特異性の二重特異性抗体であり、二重特異性抗体の各腕は直列ｓｃＦｖ断片を含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｃＦｖ断片は安定している。１つの実施形態では、二重特異性の二重特異性抗体は、第一結合特異性を有する第一の腕および第二結合特異性を有する第二の腕を含んでよい。別の実施形態では、二重特異性抗体の各腕は、第一結合特異性を有する第一ｓｃＦｖ断片および第二結合特異性を有する第二ｓｃＦｖ断片を含んでよい。ある実施形態では、多特異的な二重特異性抗体は完全なＦｃ領域またはＦｃ部分（例えばＣＨ３ドメイン）に直接融合できる。
【０２２８】
Ｊ．多特異的な結合分子断片
ある実施形態では、本発明の結合分子断片を多特異的に作製し得る。本発明の多特異的な結合分子は、二重特異性のＦａｂ２または多特異的な（例えば三重特異的な）Ｆａｂ３分子を含む。例えば、多特異的な結合分子断片は、異なる特異性を有するＦａｂまたはｓｃＦｖ分子の化学的に複合した多量体（例えば二量体、三量体、または四量体）を含んでよい。
【０２２９】
Ｋ．ｓｃＦｖ２四価抗体
他の実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、各重鎖部分がｓｃＦｖ分子を含むｓｃＦｖ２四価抗体である。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｃＦｖ分子は安定している。ｓｃＦｖ断片は、重鎖部分の可変領域のＮ末端（例えばＮＨｓｃＦｖ２四価抗体またはＮＬｓｃＦｖ２四価抗体）に結合し得る。あるいは、ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖ２四価抗体の重鎖部分のＣ末端に結合し得る。ｓｃＦｖ２四価抗体の各重鎖部分は可変領域、ならびに同じもしくは異なる標的ＬＴ分子もしくはエピトープに結合するｓｃＦｖ断片を有し得る。多特異的な分子の場合、ｓｃＦｖ断片およびｓｃＦｃ２四価抗体の第一重鎖部分の可変領域は同じ標的分子またはエピトープと結合し、二重特異性の四価小体の第二重鎖部分の第一および第二ｓｃＦｖ断片の少なくとも１つは異なる標的分子またはエピトープと結合する。
【０２３０】
Ｌ．直列可変ドメイン結合分子
他の実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、直列抗原結合部位を含む結合分子を含んでよい。例えば、可変ドメインは、直接融合しているかまたは連続して結合している可変重ドメイン（ＶＨドメイン）を少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）含むように遺伝子操作された抗体重鎖、ならびに直接融合しているかまたは連続して結合している可変軽ドメイン（ＶＬドメイン）を少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）含むように遺伝子操作された抗体軽鎖を含んでよい。ＶＨドメインは対応するＶＬドメインと相互作用して一連の抗原結合部位を形成し、ここで少なくとも２つの結合部位はＬＴの同じ、または異なるエピトープに結合する。直列可変ドメイン結合分子は、２つ以上の重鎖または軽鎖を含んでよく、結合価がより高い（例えば、二価または四価）。直列可変ドメイン結合分子の作製方法は、当技術分野で知られており、例えばＷＯ２００７／０２４７１５号を参照されたい。
【０２３１】
Ｍ．多特異的な融合タンパク質
別の実施形態では、本発明の多特異的な結合分子は、多特異的な融合タンパク質である。本明細書で使用する「多特異的な融合タンパク質」という語句は、上記の結合特異性を少なくとも２つ有する（本明細書の上記に定義した）融合タンパク質を示す。多特異的な融合タンパク質は集合でき、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体、本質的にＷＯ８９／０２９２２号（１９８９年４月６日公開）、欧州特許第３１４，３１７号（１９８９年５月３日公開）、および米国特許第５，１１６，９６４号（１９９２年５月２日発行）に開示されている。好ましい多特異的な融合タンパク質は、二重特異性である。ある実施形態では、多特異的な融合タンパク質の結合特異性の少なくとも１つがｓｃＦｖ、例えば、安定化ｓｃＦｖを含む。
【０２３２】
他の様々な多価抗体構築物が、例えばＰＣＴ国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；欧州特許第１８４，１８７号；欧州特許第１７１，４９６号；欧州特許第１７３，４９４号；ＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９：３５２１−３５２６；  Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７：９９９−１００５；  Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；  Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０：１５５３−１５５９）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；  Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；  Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４１：４０５３−４０６０；およびＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４９，  ｐｐ．  ２９３−９９  （１９９１））に記載の通例の組換えＤＮＡ技術を用いて当業者により開発され得る。好ましくは、非ヒト抗体は、非ヒト抗原結合ドメインをヒト定常ドメインと結合させることにより「ヒト化」されている（例えばＣａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８１，  ｐｐ．  ６８５１−５５  （１９８４））。
【０２３３】
多価抗体構築物を調製するために用いてよい他の方法については、以下の刊行物に記載されている：Ｇｈｅｔｉｅ，  Ｍａｒｉａ−Ａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｂｌｏｏｄ  ９７：１３９２−１３９８；  Ｗｏｌｆｆ，  Ｅｄｉｔｈ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５；  Ｇｈｅｔｉｅ，  Ｍａｒｉａ−Ａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９４：７５０９−７５１４；  Ｋｉｍ，  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９７（４）：５４２−５４７；  Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ，  Ａｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６；  Ｃｏｌｏｍａ  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１５９−１６３；  Ｚｕｏ，  Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （Ｓｕｐｐｌ．）  １３（５）：３６１−３６７；  Ｓａｎｔｏｓ  Ａ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：３１１８ｓ−３１２３ｓ；  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｇ．  （２００２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２３７−２５６；  ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ，  Ａｎｎｅｍｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（８）  ３９１−３９７
【０２３４】
ＩＶ．修飾結合分子
ある実施形態では、本発明の結合分子の少なくとも１つは、修飾を１つ以上含んでよい。修飾形態の本発明のＬＴ結合分子は、当技術分野で知られている技術を用いて完全な前駆体または親抗体から作製できる。
【０２３５】
ある実施形態では、本発明の修飾ＬＴ結合分子は、天然ポリペプチド上に見られない特徴を示すように改変（例えば、機能（例えば、エフェクター機能）を低下または向上させるように修飾）されているポリペプチドである。１つの実施形態では、結合分子の１つ以上の残基は官能性側鎖の反応により化学的に誘導体化し得る。１つの実施形態では、結合分子は、２０種類の標準的なアミノ酸の１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含むように修飾してよい。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換してよい；５−ヒドロキシリシンはリシンと置換してよい；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換してよい；ホモセリンはセリンと置換してよい；およびオルニチンはリシンと置換してよい。
【０２３６】
１つの実施形態では、本発明のＬＴ結合分子は、１つ以上のドメインが部分的にまたは完全に欠失している（「ドメイン欠失結合分子」）合成定常領域を含む。ある実施形態では、適合する修飾結合分子は、完全ＣＨ２ドメインが除かれているドメイン欠失構築物または変異体（ΔＣＨ２構築物）を含む。他の実施形態では、可変領域に柔軟性および移動の自由を付与するために短いＣペプチドを欠失ドメインと置換してよい。かかる構築物は異化率の抗体上のＣＨ２ドメインの調節特性のために特に好ましいことを、当業者は理解するであろう。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを用いて得ることができる（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照されたい）。このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失して、ＩｇＧ１定常領域を欠くドメインを発現する合成ベクターを提供するために遺伝子操作される。
【０２３７】
１つの実施形態では、本発明のＬＴ結合分子は、単量体サブユニット間の結合が可能な限り数個またはわずか１個のアミノ酸の欠失または置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ある状況では、Ｆｃ結合を実質的に低下させるためには、ＣＨ２ドメインの選択された領域における１個のアミノ酸変異で十分である場合がある。同様に、調整すべきエフェクター機能（例えば補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を単に欠失させることが望まれる場合がある。定常領域のかかる部分的な欠失により、対象の定常領域ドメインインタクトと関連する他の望まれる機能を残しつつ、抗体の選択された特徴（血清半減期）が改善される場合がある。さらに、上記に暗示されるように、結合分子の定常領域は、生成構築物のプロファイルを高める１つ以上のアミノ酸の変異または置換を介して改変される場合がある。この点において、修飾結合分子の立体配置および免疫原性プロファイルを実質的に維持しつつ、保守的結合部位により提供される活性（例えばＦｃ結合）を中断することが可能である場合がある。さらに他の実施形態では、定常領域にアミノ酸を１つ以上付加して、望まれる特性（エフェクター機能など）を高めるか、または細胞毒もしくは炭水化物結合をより多く提供することを含む。かかる実施形態では、選択された定常領域ドメイン由来の特異的な配列を挿入または複製することが所望され得る。
【０２３８】
本発明は、本明細書に記載の結合部分（例えば、抗体分子のＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる結合分子も提供し、この結合部分はＬＴポリペプチドに免疫特異的に結合する。ＬＴ結合分子をコードするヌクレオチド配列中に変異を誘発するために使用できる、当業者に知られている標準的な技術としては、部位指向変異誘発およびアミノ酸置換に至るＰＣＲ介入変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域のＶＨ−ＣＤＲｌ、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域のＶＬ−ＣＤＲｌ、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３と比較して５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を類似した電荷の側鎖を有するアミノ酸残基で置換したものである。類似の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいは、（飽和変異誘発などにより）すべてまたは一部のコード配列に沿って変異を無作為に誘発することができ、誘発した変異の生体活性をスクリーニングして、活性（例えば、ＬＴポリペプチドと結合する能力）を保持する変異を特定することができる。
【０２３９】
例えば、本発明の結合分子（例えば、抗体分子）のフレームワーク領域のみまたはＣＤＲ領域のみに変異を誘発することが可能である。誘発された変異はサイレントであってもよいし、中和ミスセンス変異であってもよい。すなわち、抗原に結合する能力に対する効果がないかほとんどなくてもよく、実際かかる変異の一部はいかなるアミノ酸配列も変化させない。これらの種類の変異は、コドン使用を至適化するために、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいは、非中和ミスセンス変異は抗原に結合する結合分子の能力を変化させ得る。例えば、最も多くのサイレントおよび中和ミスセンス変異の抗体位置は、フレームワーク領域にある可能性が高く、最も多くの非中和ミスセンス変異の位置は、ＣＤＲにある可能性が高い（ただし、これは絶対的な必要条件ではない）。当業者は、抗原結合活性の改変または結合活性の改変を起こさないように所望の特性を有する被験変異分子（例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変化）を設計することが可能であろう。変異誘発後、コードタンパク質は定期的に発現し得、コードタンパク質の機能的および／もしくは生体活性（例えば、少なくとも１つのＬＴポリペプチドのエピトープに免疫特異的に結合する能力）は、本明細書に記載の技術を用いて、または当技術分野で知られている技術を定期的に修正することにより決定できる。
【０２４０】
Ａ．共有結合
本発明のＬＴ結合分子は、例えば、分子の結合分子への共有結合（結合分子が同族エピトープへ特異的に結合することを妨げない形の共有結合）により修飾してよい。例えば、これらに限定されないが、本発明の結合分子は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合など（含むか除くかのいずれか）により修飾してよい。多数の化学的修飾のいずれも既知の技術（特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない）により実施してよい。さらに、誘導体は、従来と異なるアミノ酸を１つ以上含んでよい。
【０２４１】
本明細書の他の個所において詳細に論じているように、本発明の結合分子は、Ｎ末端またはＣ末端で異種のポリペプチドにさらに組換え融合してもよいし、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に複合してもよい（共有結合および非共有結合接合を含む）。例えば、ＬＴ特異的な結合分子は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（異種のポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素など）に組換え融合してもよいし、複合してもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５号；ＷＯ９１／１４４３８号；ＷＯ８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照されたい。
【０２４２】
本発明のＬＴ結合分子は、ペプチド結合または修飾ペプチド、すなわち、ペプチドイソスター結合によって互いに結合しているアミノ酸から構成されることができ、２０種類の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでよい。ＬＴ特異的結合分子は、翻訳後プロセシングなどの自然なプロセスにより修飾してもよいし、当技術分野において周知である化学的修飾技術により修飾してもよい。かかる修飾は基本的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に詳述されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端または部分（炭水化物など）を含むＬＴ特異的な結合分子内のどこでも起こることができる。同一種類の修飾は、所与のＬＴ特異的な結合分子内のいくつもの部位において同程度存在してもよいし、異なる程度存在してもよいことが理解されるであろう。また、所与のＬＴ特異的な結合分子は、多種類の修飾を含んでよい。ＬＴ特異的な結合分子は例えば、ユビキチン化の結果として分枝していてもよいし、分岐を伴うまたは伴わない環状でもよい。環状、分枝、および分枝環状ＬＴ特異的な結合分子は、翻訳後の自然なプロセスによるものでもよいし、合成方法によって作製してもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋形成、システイン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡ介入のアミノ酸のタンパク質への付加（アルギニン化、およびユビキチン化など）が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  （１９９３）；  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｇｓ．  １−１２  （１９８３）；  Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６  （１９９０）；  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２  （１９９２）を参照されたい）。
【０２４３】
本発明は、ＬＴ結合分子、および異種のポリペプチドを含む融合タンパク質も提供する。抗体が融合した異種のポリペプチドは、標的のＬＴポリペプチド発現細胞に所望の機能性も提供し得、有用でもあり得る。１つの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本発明の結合分子の任意の１つ以上の結合部位のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび異種のポリペプチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。別の実施形態では、本明細書に開示された診断および治療方法における使用のための融合タンパク質は、ＬＴ特異的な結合分子の任意の１つ、２つ、もしくは３つのＶＨ−ＣＤＲのアミノ酸配列またはＬＴ特異的な結合分子の任意の１つ、２つ、もしくは３つのＶＬ−ＣＤＲのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに異種のポリペプチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。１つの実施形態では、融合タンパク質は、本発明のＬＴ特異的な結合分子のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに異種のポリペプチド配列を含み、この融合タンパク質は少なくとも１つのＬＴエピトープと特異的に結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、本発明のＬＴ特異的な結合分子の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列および本発明のＬＴ特異的な結合分子の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに異種のポリペプチド配列を含む。１つの実施形態では、融合タンパク質のＶＨ領域およびＶＬ領域は、少なくとも１つのＬＴエピトープに特異的に結合する単一の結合分子源に相当する。さらに別の実施形態では、本明細書に開示された診断および治療方法における使用のための融合タンパク質はＬＴ特異的な結合分子の任意の１つ、２つ、もしくは３つまたはそれ以上のＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列とＬＴ特異的な結合分子の任意の１つ、２つ、もしくは３つまたはそれ以上のＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに異種のポリペプチド配列を含む。１つの実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＶＨ−ＣＤＲ（１つまたは複数）またはＶＬ−ＣＤＲ（１つまたは複数）は本発明の単一の結合分子源に相当する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に包含する。
【０２４４】
文献中で報告された例示的な融合タンパク質は、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：２９３６−２９４０  （１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１  （１９８９）；  Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８−７０  （１９８９）；  Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ＵＳＡ  ９：３４７−３５３  （１９９０）；およびＢｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７−６７０  （１９９０）；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１０：２２２１−２２２９  （１９９０）；およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４−１６７  （１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３  （１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：７２１−７３０  （１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４：５６１−５６９  （１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４  （１９９１））；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９  （１９９１）；  Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：２８８３−２８８６  （１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４：１４８３−１４８９  （１９９１））；およびＩｇＥ受容体（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  １１５，  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  １４４８  （１９９１））の融合を含む。
【０２４５】
本明細書の他の個所において論じているように、本発明のＬＴ抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ポリペプチドのインビボ半減期を延ばすためまたは当技術分野で知られている方法を用いた免疫アッセイにおける使用のために異種のポリペプチドに融合してよい。例えば、１つの実施形態では、本発明のＬＴ結合分子に複合できるＰＥＧは、それらのインビボ半減期を延ばす。Ｌｅｏｎｇ，  Ｓ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６  （２００１）；  Ａｄｖ．  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５４：５３１  （２００２）；またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２  （２００２）。
【０２４６】
さらに、本発明のＬＴ結合分子は、それらの精製または検出を促進できるマーカー配列（ペプチドなど）に融合することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド（ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．，  ９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  Ｃａｌｉｆ．，  ９１３１１）に提供されるタグなど）であり、とりわけ、これらの多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４  （１９８９）に記載のとおり、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープと相関する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ３７：７６７  （１９８４））および「フラグ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４７】
融合タンパク質は、当技術分野において周知である方法（例えば米国特許第５，１１６，９６４号および同第５，２２５，５３８号を参照されたい）を用いて調製できる。融合を行う正確な部位は、融合タンパク質の分泌または結合特性を至適化するように経験的に選択してよい。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現のための宿主細胞中にトランスフェクトする。
【０２４８】
本発明のＬＴ結合分子は、非複合形態で使用してもよいし、例えば、分子の治療特性を改善するため、標的検出を促進するため、または患者の画像化もしくは療法のために様々な分子のうち少なくとも１つに複合してもよい。本発明のＬＴ結合分子は、精製を実施時、精製前か精製後のいずれかに標識または複合できる。
【０２４９】
特に、本発明のＬＴ結合分子は、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体反応修飾因子、医薬品、またはＰＥＧに複合してよい。
【０２５０】
結合体は複合のために選択された薬剤に応じて様々な技術を用いて組み立て得ることも、当業者は理解するであろう。例えば、ビオチンとの結合体は、例えば結合ポリペプチドをビオチンの活性化エステル（ビオチンＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルなど）と反応させることにより調製する。同様に、蛍光マーカーとの結合体はカップリング薬剤の存在下、例えば本明細書に列挙したものにおいて、またはイソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応により調製してよい。本発明のＬＴ結合分子の結合体は類似した形で調製する。
【０２５１】
本発明は、診断または治療薬に複合した本発明のＬＴ結合分子をさらに包含する。ＬＴ結合分子は、例えば、疾患の発現または進行をモニタリングするために、例えば、所与の治療および／または予防計画の有効性を決定するための部分的な臨床試験手段として診断的に使用できる。検出は、ＬＴ結合分子を検出可能な物質にカップリングすることにより促進できる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、配合団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性物質、様々な陽電子放出断層撮影を用いた陽電子放出金属、および非放射活性常磁性金属イオンが挙げられる。本発明による診断としての使用のため抗体に複合できる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な配合団結合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；ならびに適切な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０２５２】
ＬＴ結合分子は、化学ルミネセンス化合物へカップリングすることにより検出可能に標識もできる。次いで、化学反応経過中に生じる発光の存在を検出することにより、化学ルミネセンスタグ化ＬＴ結合分子の存在を決定する。特に有用な化学ルミネセンス標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０２５３】
ＬＴ結合分子が検出可能に標識できる１つの方法は、ＬＴ結合分子を酵素に結合して酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において結合した生産物を用いることである（Ｖｏｌｌｅｒ，  Ａ．，  ”Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  （ＥＬＩＳＡ）”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．，  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７  （１９７８））；  Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３１：５０７−５２０  （１９７８）；  Ｂｕｔｌｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ７３：４８２−５２３  （１９８１）；  Ｍａｇｇｉｏ，  Ｅ．  （ｅｄ．），  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．，  （１９８０）；  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，  Ｔｏｋｙｏ  （１９８１）。ＬＴ結合分子に結合している酵素は、検出できる化学部分を産生する形で、例えば、分光光度法、蛍光測定により、または視覚的手段により適切な基質（好ましくは発色基質）と反応する。検出可能に標識した抗体のために使用できる酵素としては、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、検出は、酵素の発色基質を用いる比色分析方法によって成し遂げることができる。検出は、同様に調製した標準と比較した基質の酵素反応範囲の視覚的比較によって成し遂げてもよい。
【０２５４】
検出は、他の任意の様々な免疫アッセイを用いて達成することができる。例えば、放射活性的に標識したＬＴ結合分子により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を介して結合分子を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｂ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  （Ｍａｒｃｈ，  １９８６）（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。放射活性同位体は、γ計数器、シンチレーション計数器、またはオートラジオグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない手段により検出できる。
【０２５５】
ＬＴ結合分子は、蛍光放出金属（１５２Ｅｕなど）、または他のランタニド系列を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）としてのかかる金属キレート化群を用いて結合分子に結合できる。
【０２５６】
様々な部分を結合分子に接合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ２４３−５６  （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  （１９８５）；  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ６２３−５３  （１９８７）；  Ｔｈｏｒｐｅ，  ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ４７５−５０６  （１９８５）；  ”Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．  ３０３−１６  （１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６２：１１９−５８  （１９８２）を参照されたい。
【０２５７】
特に、本明細書に開示された診断および治療方法における使用のための結合分子は、細胞毒（放射同位体、細胞毒性薬、または毒素など）治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体反応修飾因子、医薬品、免疫学的活性リガンド（例えば、リンフォカインまたは他の抗体であり、生成分子は腫瘍細胞とＴ細胞などのエフェクター細胞との両方に結合する）、またはＰＥＧに複合し得る。別の実施形態では、本明細書に開示された診断および治療方法における使用のための結合分子は、腫瘍の血管新生を低減する分子に複合できる。他の実施形態では、開示された組成物は、薬剤またはプロドラッグにカップリングした結合分子を含んでよい。本発明のさらに他の実施形態では、特異的な生体毒素またはそれらの細胞毒性断片（リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素またはジフテリア毒素など）に複合される結合分子の使用を含む。どの複合結合分子または非複合結合分子を使用するかの選択は、癌の種類および病期、補助治療（例えば、化学療法または外部放射線）の使用ならびに患者の状態に応じる。当業者は、かかる選択を本明細書における教示に照らして容易に行うことができることが理解されるであろう。
【０２５８】
先行試験において、同位体で標識した抗腫瘍抗体が、固形腫瘍細胞ならびに動物モデルにおける（および一部の場合ではヒトにおける）リンパ腫／白血病を破壊するために成功裏に使用されていることが理解されるであろう。例示的な放射同位体としては、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅが挙げられる。放射性核種は作用して核ＤＮＡ中の複数の鎖切断を引き起こす電離放射線を産生し、細胞死をもたらす。治療結合体を産生するために使用される同位体は、典型的には、短経路長の高エネルギーα粒子またはβ粒子を産生する。かかる放射性核種は近接する細胞、例えば結合体が結合しているかまたは進入している腫瘍性細胞を殺傷する。それらは非局所化細胞に対して効果がほとんどないか無効である。放射性核種は、本質的に非免疫原性である。
【０２５９】
本発明と共に放射標識された結合体の使用に関して、結合分子は（例えばヨウ素化を介して）直接標識してもよいし、キレート剤の使用を介して間接的に標識してもよい。本明細書で使用する「間接標識」および「間接標識法」という語句は両方とも、キレート剤が結合分子に共有結合し、少なくとも１種の放射性核種がキレート剤と結合することを意味する。かかるキレート剤は、ポリペプチドと放射同位体の両方に結合するため、二官能性キレート剤と典型的に呼ばれる。特に好ましいキレート剤は、ｌ−イソチオサイクマトベンジル−３−メチルジオセレントリアミン五酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）およびシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート剤は、Ｐ−ＤＯＴＡおよびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接標識のために特に好ましい放射性核種としては、１１１Ｉｎおよび９０Ｙが挙げられる。
【０２６０】
本明細書で使用する「直接標識」および「直接標識法」という語句は両方とも、放射性核種が（典型的には、アミノ酸残基を介して）直接ポリペプチドに共有結合していることを意味する。より具体的に述べると、これらの結合技術には、無作為標識および部位特異的標識が含まれる。後者の場合、標識は、ポリペプチド上の特定部位（結合体のＦｃ部分のみに存在するＮ結合型糖類残基など）が対象とされる。さらに、様々な直接標識技術およびプロトコールが本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９標識ポリペプチドは、リガンド交換プロセスにより、スズイオン溶液を用いて過テクネチウム酸（ＴｃＯ４−」）を還元し、セファデックスカラム上へ還元されたテクネチウムをキレート化し、このカラムに結合ポリペプチドを適用することにより、またはバッチ標識技術により、例えば過テクネチウム酸、還元剤（ＳｎＣｌ２など）、緩衝液（フタル酸ナトリウム−カリウム溶液など）、および結合分子をインキュベーションすることによって調製してよい。いずれの場合でも、ポリペプチドを直接標識するために好ましい放射性核種は当技術分野において周知であり、直接標識のために特に好ましい放射性核種はチロシン残基を介して共有結合する１３１Ｉである。本明細書に開示された方法における使用のための結合分子は、例えば、放射性ナトリウムまたはヨウ化カリウムおよび化学的酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなど）、または酵素的酸化剤（ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコースなど）を用いて誘導し得る。
【０２６１】
キレート剤およびキレート剤結合体に関する特許は、当技術分野で知られている。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、ポリ置換されたジエチレントリアミン五酢酸キレートおよびこれを含むタンパク質結合体、ならびにそれらの調製方法を対象としている。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、同第５，２４６，６９２号、同第５，２８６，８５０号、同第５，４３４，２８７号および同第５，１２４，４７１号もポリ置換されたＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許は、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。適合する金属キレートの他の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、ｌ−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡが特に好ましく、以下で何度も例示する。さらに他の適合するキレート剤（未発見のものを含む）が当業者により容易に識別され得、明らかに本発明の範囲内である。
【０２６２】
結合分子（例えば、結合ポリペプチド）に接合するためのさらなる好ましい薬剤は、細胞毒性薬であり、特に癌療法に使用される薬剤である。本明細書で使用する「細胞毒または細胞毒性薬」とは、細胞の成長および増殖弊害をもたらし、細胞または悪性腫瘍を低下させる、阻害するかまたは破壊するように作用し得る任意の薬剤を意味する。例示的な細胞毒としては、放射性核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制剤もしくは細胞毒性治療薬、プロドラッグ、免疫学的活性リガンドおよび生体反応修飾因子（サイトカインなど）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫反応細胞または悪性腫瘍細胞の増殖を遅延化または緩慢化するように作用する細胞毒はいずれも本発明の範囲内である。
【０２６３】
様々な部分を結合分子に接合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ２４３−５６  （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  （１９８５）；  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ６２３−５３  （１９８７）；  Ｔｈｏｒｐｅ，  ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ４７５−５０６  （１９８５）；  ”Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．  ３０３−１６  （１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６２：１１９−５８  （１９８２）を参照されたい。
【０２６４】
Ｂ．免疫原性の低下
ある実施形態では、本発明のＬＴ結合分子またはその一部を、当技術分野で認識されている技術を用いてそれらの免疫原性を低下させるように修飾する。例えば、結合分子またはその一部はヒト化、霊長類化、または脱免疫化であることができる。１つの実施形態では、キメラ結合分子を作製することもでき、または結合分子がキメラ抗体分子の少なくとも一部を含んでもよい。かかる場合、非ヒトＬＴ結合分子、典型的には、親結合分子の抗原結合特性を保持するかまたは実質的に保持するがヒトにおける免疫原性は低いマウスまたは霊長類結合分子を構築する。これは、（ａ）ヒト定常領域上へ完全非ヒト可変ドメインをグラフトしてキメラ結合分子を生成すること；（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持しつつまたは保持せずヒトフレームワークおよび定常領域中に１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも一部グラフトすること；または（ｃ）完全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基を置換することによりそれらをヒト様部分で「覆い隠す」こと、を含む様々な方法により成し遂げ得る。かかる方法については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４：６５−９２  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２８：４８９−４９８  （１９９１）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ３１：１６９−２１７  （１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１９０，３７０号（これらのすべてがそれらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０２６５】
１つの実施形態では、本発明の結合分子（例えば、抗体）またはその一部はキメラであってよい。キメラ結合分子は、結合分子の異なる部分が異なる動物種に由来している結合分子（マウスモノクローナル抗体由来である可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など）である。キメラ結合分子の産生方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２  （１９８５）；  Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４  （１９８６）；  Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２  （１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号（これらは、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。「キメラ抗体」産生のために開発した技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：８５１−８５５（１９８４）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８  （１９８４）；  Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４  （１９８５））を用いて、前記分子を合成してよい。例えば、マウスＬＴ抗体分子の結合特異性をコードする遺伝子配列を適切な生体活性のヒト抗体分子の配列と融合してよい。本明細書で使用する、キメラ結合分子とは、異なる部分が異なる動物種由来の分子（マウスモノクローナル抗体由来である可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど）、例えば、ヒト化抗体である。
【０２６６】
別の実施形態では、本発明の結合分子またはその一部は霊長類化されている。抗体の霊長類化方法は、Ｎｅｗｍａｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  １４５５−１４６０  （１９９２）により開示されている。具体的には、この技術により、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含む抗体が生成される。この参考文献は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、この技術は、一般に指定された米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号および同第５，７５６，０９６号（それぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）にも記載されている。
【０２６７】
別の実施形態では、本発明の結合分子（例えば、抗体）またはその一部はヒト化されている。ヒト化結合分子は、非ヒト種由来の結合特異性を有する、すなわち、非ヒト種抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を１つ以上、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する結合分子である。ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変異することが多く、好ましくは改善するために変異させる、例えば、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法により特定される（例えば、抗原結合にとって重要であるフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置の通常ではないフレームワーク残基を同定するための配列比較により）。（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  （１９８８）（これらは、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又は表面再処理（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８  （１９９１）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４  （１９９４）；  Ｒｏｇｕｓｋａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３  （１９９４））、および鎖混合（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む当技術分野で知られている様々な技術を用いてヒト化できる。抗体のヒト化に関する他の参考文献としては、以下が挙げられる：Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  Ｗｕ，  Ｔ．Ｔ．，  Ｐｅｒｒｙ，  Ｈ．Ｍ．，  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｋ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｆｏｅｌｌｅｒ，  Ｃ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．  Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖｔ．  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ．  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．，  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，  Ａ．，  Ｌｅｖｉｔｔ，  Ｍ．，  Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，  Ｓ．Ｊ．，  Ａｉｒ，  Ｇ．，  Ｓｈｅｒｉｆｆ，  Ｓ．，  Ｐａｄｌａｎ，  Ｅ．Ａ．，  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｄ．，  Ｔｕｌｉｐ，  Ｗ．Ｒ．，  Ｃｏｌｍａｎ，  Ｐ．Ｍ．，  Ｓｐｉｎｅｌｌｉ，  Ｓ．，  Ａｌｚａｒｉ，  Ｐ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｐｏｌｊａｋ，  Ｒ．Ｊ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３．  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．，  Ｎｏｖｏｔｎｙ，  Ｊ．，  Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｋａｒｐｌｕｓ，  Ｍ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８６：６５１Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓ  Ｊ，  Ｚｏｃｈｅｒ  Ｉ，  Ｔｈｉｅｂｅ  Ｒ，  Ｚａｃｈａｕ  ＨＧ．  （１９９７）．  Ｇｅｎｅ．  １９１（２）：１７３−８１．Ｍａｔｓｕｄａ  Ｆ，  Ｉｓｈｉｉ  Ｋ，  Ｂｏｕｒｖａｇｎｅｔ  Ｐ，  Ｋｕｍａ  Ｋ，  Ｈａｙａｓｈｉｄａ  Ｈ，  Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，  Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．（１９９８）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １８８（１１）：２１５１−６２．  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ．Ｊ．  （２０００）  ”Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｔｈｅｍ”米国特許第６，４０７，２１３号  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｔ．Ａ．，  Ｒａｓｓｅｎｔｉ，  Ｌ．Ｚ．，  ａｎｄ  Ｋｉｐｐｓ，  Ｔ．Ｊ．  （１９９７）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：２３５−２４６、それぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。本出願に包含される例示的なヒト化可変領域を、実施例に説明する。
【０２６８】
脱免疫化も、結合分子の免疫原性を低減するために使用することができる。本明細書で使用する「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための結合分子の改変を含む（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、ＷＯ００３４３１７Ａ２号を参照されたい）。例えば、開始抗体からのＶＨおよびＶＬ配列を分析することができ、各Ｖ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の主要残基に関してエピトープ位置を示す。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終抗体の活性を変えるリスクが低い代替アミノ酸置換を特定するために分析される。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の代替ＶＨおよびＶＬ配列を設計し、続いてこれらの配列を一連の結合ポリペプチド（例えば、本明細書に開示された診断および治療方法における使用のためのＬＴ特異的抗体またはその免疫特異的な断片）に組み込んでから機能について試験する。典型的には、１２〜２４の変異体抗体を生成して試験する。次いで、完全抗体の産生のため、修飾ＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を発現ベクターにクローン化し、その結果生じるプラスミドを細胞系中に導入する。次いで、抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイにおいて比較し、至適変異体を特定する。
【０２６９】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ヒト化抗体であるかまたはアクセプターヒトフレームワークまたは実質的にヒトアクセプターフレームワークを有するヒト化抗体可変領域を含む。本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンフレームワーク由来、またはヒトコンセンサスフレームワーク由来のＶＬまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークとは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいし、変化したあるアミノ酸配列を含んでもよい。１つの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、配列中でＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
【０２７０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も多く生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。ヒト生殖系列配列または一部のコンセンサス配列（例えば、ＦＲ４）の生殖系列配列も考慮し得る。
【０２７１】
１つの実施形態では、軽鎖および重鎖のアクセプターフレームワーク配列は、正準、接触面およびベニヤゾーン残基におけるマウス開始抗体配列と高い類似性を有するものを特定する。生殖系列配列との類似性を決定時にＣＤＲ配列は除外する。１つの実施形態では、アクセプター配列は同じ長さの（ＣＤＲ−Ｈ３を除く）ＣＤＲを有する；および最少数の復帰変異を必要とする。
【０２７２】
１つの実施形態では、ヒト化設計の物理化学特性を改善するために、安定したコンセンサスクラスからより離れているアクセプターフレームワークを選別する。
【０２７３】
１０５抗体の１つの実施形態では、（コンセンサスヒトＫＶ３  ＦＲ４を有する）ヒト生殖系列配列ｈｕＬ６およびヒトｇｉ｜３００４６８８をそれぞれ軽鎖および重鎖のアクセプターフレームワークとして用いてよい。
【０２７４】
１つの実施形態では、アミノ酸１位に復帰変異（Ｅ→Ｄ；すなわち、ＥからＤへ）を含むヒト化１０５軽鎖を作製する。１つの実施形態では、アミノ酸２１位に復帰変異（Ｌ→Ｉ）を作製する。別の実施形態では、アミノ酸６８位に復帰変異（Ｇ→Ｒ）を作製する。さらに別の実施形態では、アミノ酸８６位に復帰変異（Ｙ→Ｆ）を作製する。
【０２７５】
１つの実施形態では、１位に復帰変異を含むヒト化軽鎖の第１の型を作製する。別の実施形態では、１位、２１位、および８６位に復帰変異を含む１０５軽鎖の第２の型を作製する。別の実施形態では、１位、２１位、６８位、および８６位に復帰変異を含む１０５軽鎖の第３の型を作製する。
【０２７６】
３つの異なる型のヒト化ＬＴ１０５軽鎖を以下に記載する。ヒト化ＬＴ１０５軽鎖は生殖系列ｈｕＬ６フレームワーク／／コンセンサスヒトＫＶ４  ＦＲ４／／ＬＴ１０５  Ｌ  ＣＤＲを含む。下記Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の復帰変異を小文字の太字フォントで示す。ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【化１】
2012514458.tif 000003
【０２７７】
１つの実施形態では、アミノ酸１位に復帰変異（Ｅ→Ｄ）を含むヒト化１０５重鎖を作製する。１つの実施形態では、アミノ酸２ｒ位に復帰変異（Ａ→Ｖ）を作製する。別の実施形態では、アミノ酸２５位に復帰変異（Ｓ→Ｔ）を作製する。さらに別の実施形態では、アミノ酸３７位に復帰変異（Ｖ→Ｉ）を作製する。さらに別の実施形態では、アミノ酸４７位に復帰変異（Ｗ→Ｇ）を作製する。さらに別の実施形態では、アミノ酸４８位に復帰変異（Ｉ→Ｍ）を作製する。さらに別の実施形態では、アミノ酸４９位に復帰変異（Ｓ→Ｇ）を作製する。さらに別の実施形態では、アミノ酸６７位に復帰変異（Ｆ→Ｉ）を作製する。さらに別の実施形態では、アミノ酸７８位に復帰変異（Ｌ→Ｆ）を作製する。さらに別の実施形態では、アミノ酸８２位に復帰変異（Ｍ→Ｌ）を作製する。
【０２７８】
１つの実施形態では、２４位および４７位に復帰変異を含むヒト化１０５重鎖の第１の型を作製する。別の実施形態では、２４位、３７位、４９位、６７位、および７８位に復帰変異を含む１０５重鎖の第２の型を作製する。別の実施形態では、１位、２４位、２５位、３７位、４７位、４９位、６７位、および７８位に復帰変異を含む１０５重鎖の第３の型を作製する。別の実施形態では、１位、２４位、２５位、３７位、４７位、４８位、４９位、６７位、７８位、および８２位に復帰変異を含む１０５重鎖の第４の型を作製する。
【０２７９】
４つの異なる型のヒト化ＬＴ１０５重鎖を以下に記載する。ヒト化ＬＴ１０５重鎖はｇｉ｜３００４６８８フレームワーク／／ＬＴ１０５  Ｈ  ＣＤＲを含む。下記Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４の復帰変異を小文字の太字フォントで示す。ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【化２】
2012514458.tif 000004
【０２８０】
上に説明するように、１０５抗体の代替の型を生成するためにさらに改変してよく、様々な軽鎖と重鎖の組み合わせを行うことができる。例えば、１つの実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第０の型の軽鎖またはそのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第１の型の重鎖またはそのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第０の型の軽鎖またはそのＣＤＲと、１０５抗体の第１の型の重鎖またはそのＣＤＲとの組み合わせを含む。
Ｌ０
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬ
５１  ＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号：）
Ｈ１
１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＶＳＧＹＳＩＴ  ＳＧＹＹＷＮＷＶＲＱ  ＡＰＧＫＧＬＥＧＩＳ
５１  ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹ  ＮＰＳＬＫＮＲＦＴＩ  ＳＲＤＳＡＫＮＳＦＹ  ＬＨＭＨＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＡ
１０１  ＹＳＹＧＭＤＹＷＧＱ  ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳ  ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ  ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ  ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ  ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ  ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ  ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ  ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１  ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ  ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳ  ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧ
（配列番号：）
別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体のＡ型の軽鎖またはそのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体のＢ型の軽鎖またはそのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体のＣ型の軽鎖またはそのＣＤＲを含む。例えば、１つの実施形態では、かかる軽鎖は１０５抗体の重鎖の型と対合できる。
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＮＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｂ型
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬ
５１  ＬＩＹＲＡＳＳＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｃ型
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２８１】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第１０の型の軽鎖またはそのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第１の型の重鎖またはそのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第１０の型の軽鎖またはそのＣＤＲと１０５抗体の第１の型の重鎖またはそのＣＤＲとの組み合わせを含む。
Ｌ１０
１  ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳ  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２８２】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第１２の型もしくは１３の型の軽鎖またはそのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第１の型の重鎖またはそのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第１２の型もしくは１３の型の軽鎖またはそのＣＤＲと１０５抗体の第１の型の重鎖またはそのＣＤＲとの組み合わせを含む。
Ｌ１２
１  ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＲＱＫＰＧＫＡＰＫＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳ  ＧＶＰＳＲＦＳＧＲＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｌ１３
１  ＤＩＲＬＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＱＲＶＴ  ＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＲＱＫＰＧＫＡＰＫＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳ  ＧＶＰＳＲＦＳＧＲＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
別の実施形態では、本発明の結合分子は、１０５抗体の第１１の型または第１４の型の重鎖またはそのＣＤＲ、例えば、１０５抗体の軽鎖の型との組み合わせを含む。
Ｈ１１
１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＲＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＶＳＧＹＳＩＴ  ＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱ  ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ
５１  ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹ  ＮＰＳＬＫＮＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＦＹ  ＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤ  ＴＡＡＹＹＣＡＲＤＡ
１０１  ＹＳＹＧＭＤＹＷＧＱ  ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳ  ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ  ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ  ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ  ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ  ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ  ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ  ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１  ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ  ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳ  ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧ
Ｈ１４
１  ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＬＶＫＰＲＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＶＳＧＹＳＩＴ  ＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱ  ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ
５１  ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹ  ＮＰＳＬＫＮＲＦＳＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＦＹ  ＬＫＭＮＲＬＲＡＥＤ  ＳＡＡＹＹＣＡＲＤＡ
１０１  ＹＳＹＧＭＤＹＷＧＱ  ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳ  ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ  ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ  ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ  ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ  ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ  ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ  ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１  ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ  ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳ  ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧ
【０２８３】
１０２抗体の１つの実施形態では、（コンセンサスＨＵＭＫＶ２  ＦＲ４を有する）ヒト生殖系列配列ｈｕＡ３および（コンセンサスＨＵＭＨＶ３  ＦＲ４を有する）ヒト生殖系列配列ｈｕＶＨ３−１１を使用する。
【０２８４】
再加工した可変軽鎖の１つの型を設計し、軽および重ＣＤＲグラフト配列に加えて、４つの型の再加工した可変重鎖を設計した。重鎖において、第１の型は、最少数の復帰変異を含み、次の型は、より多くの復帰変異を含む（すなわちそれらは最小の「ヒト化」である）。すべての型の重鎖においてマウスＡ１１３を（ヒトＨＶ  ＦＲ４に存在する）Ｓ１１３に置換し、これは復帰変異として分析しなかった。番号付けはカバット体系に従う。
【０２８５】
１つの実施形態では、ヒト化ＬＴ１０２（ｈｕＬＴ１０２）の再加工した軽鎖は生殖系列ｈｕＡ３フレームワーク、コンセンサスヒトＫＶ２  ＦＲ４、およびＬＴ１０２  Ｌ  ＣＤＲを含む。ｈｕ１０２の軽鎖における復帰変異は、Ｉ２Ｖを含む。Ｖ２は、ＣＤＲ−Ｌ１を支持する正準残基である。
【０２８６】
例示的なヒト化ＬＴ１０２軽鎖配列は、下記である（復帰変異に関する詳細については、上記を参照されたい）。ヒト化ＬＴ１０２軽鎖は、生殖系列ｈｕＡ３フレームワーク／／コンセンサスヒトＫＶ２  ＦＲ４／／ＬＴ１０２  Ｌ  ＣＤＲを含む。復帰変異を小文字の太字フォントで示す。ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【化３】
2012514458.tif 000005
【０２８７】
４つの異なる型のヒト化ＬＴ１０２重鎖を以下に記載する。ヒト化ＬＴ１０２重鎖は生殖系列ｈｕＶＨ３−ｌ１フレームワーク／／コンセンサスヒトＨＶ３  ＦＲ４／／ＬＴ１０２  Ｈ  ＣＤＲを含む。下記Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４の復帰変異を小文字の太字フォントで示す。ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【化４】
2012514458.tif 000006
１つの実施形態では、アミノ酸２位に復帰変異（Ｉ→Ｖ）を含むヒト化１０２軽鎖を作製する。
【０２８８】
１つの実施形態では、アミノ酸２４位に復帰変異（Ａ→Ｖ）を含むヒト化１０２重鎖を作製する。１つの実施形態では、アミノ酸７３位に復帰変異（Ｎ→Ｙ）を含むヒト化１０２重鎖を作製する。１つの実施形態では、アミノ酸３位に復帰変異（Ｑ→Ｋ）を含むヒト化１０２重鎖を作製する。１つの実施形態では、アミノ酸位置に復帰変異（Ｋ→Ｔ）を含むヒト化１０２重鎖を作製する。１つの実施形態では、アミノ酸７７位に復帰変異（Ｓ→Ｎ）を含むヒト化１０２重鎖を作製する。
【０２８９】
１つの実施形態では、２４位に復帰変異を含むヒト化１０２重鎖の第１の型を作製する。別の実施形態では、２４位、１位、および７３位に復帰変異を含む１０２重鎖の第２の型を作製する。別の実施形態では、２４位、１位、７３位、および３位に復帰変異を含む１０２重鎖の第３の型を作製する。別の実施形態では、２４位、１位、７３位、３位、７５位、および７７位に復帰変異を含む１０２重鎖の第４の型を作製する。
【０２９０】
Ｃ．エフェクター機能およびＦｃ修飾
本発明のＬＴ結合分子は、エフェクター機能を１つ以上媒介する定常領域を含んでよい。例えば、抗体定常領域への補体Ｃｌ成分の結合は補体系を活性化し得、したがって、標的細胞の補体依存性細胞毒を引き起こす。補体の活性化は、細胞病原のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は炎症反応も刺激し、自己免疫性過敏症にも関与し得る。さらに、抗体は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）へ結合する抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位で、Ｆｃ領域を介して、様々な細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、異なるクラスの抗体に特異的なＦｃ受容体がいくつかある。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体コーティングした粒子の貪食および破壊、免疫結合体のクリアランス、（抗体依存性細胞傷害、またはＡＤＣＣと呼ばれる）キラー細胞による抗体コーティングした標的細胞の溶解、炎症メディエイターの放出、胎盤通過および免疫グロブリン産生の制御を含む多くの重要かつ多様な生体反応を引き起こす。
【０２９１】
本発明のある実施形態は、ほぼ同じ免疫原性の完全な、改変されていない抗体と比較して、エフェクター機能（１つまたは複数）の低下、エフェクター機能（１つまたは複数）の上昇、非共有二量体化の能力の改善、腫瘍部位に局所化する能力の増大、低下した血清半減期、または増大した血清半減期などの所望の生化学特性を提供するように、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも１個のアミノ酸が欠失しているかあるいは改変されているＬＴ結合分子を含む。例えば、本明細書に記載の診断および治療方法における使用のためのある結合分子は、免疫グロブリン重鎖に類似するポリペプチド鎖を含むが１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠くドメインを欠失した抗体である。例えば、ある抗体、修飾抗体の定常領域の１つの完全ドメインは欠失される、例えば、すべてのまたは部分的なＣＨ２ドメインが欠失される。
【０２９２】
あるＬＴ結合分子では、抗ＬＴ結合部位はＦｃ部分に融合してよい。１つの実施形態では、Ｆｃ部分は抗体分子由来の野生型Ｆｃ部分であってよい。別の実施形態では、当技術分野で知られている技術を用いて、エフェクター機能を変化（例えば、上昇または低下）させるためにＦｃ部分を変異させてよい。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異または他の手段を介して）は、Ｆｃ受容体の循環中修飾結合分子への結合を低下し得、したがって腫瘍の局所化を増大し得る。他の場合、本発明と一致する定常領域修飾は補体結合を緩和し得、したがって血清半減期および複合細胞毒の非特異的な結合を低下させ得る。さらに定常領域の他の修飾を用いて、増大した抗原特異性または柔軟性により高まった局所化を可能とするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾し得る。結果として生じる生理的プロファイル、生物学的利用能および修飾の他の生化学的効果（腫瘍局所化、体内分布および血清半減期など）を過度の実験なしに周知の免疫技術を用いて容易に測定かつ定量化し得る。
【０２９３】
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドに使用されるＦｃドメインは、Ｆｃ変異体である。本明細書で使用する「Ｆｃ変異体」という用語は、Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃドメインと比較して、アミノ酸置換を少なくとも１つ有する前記Ｆｃドメインを指す。例えば、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１抗体に由来し、前記ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃ変異体は、野生型Ｆｃドメインと比較して（例えば、結合分子のエフェクター機能または半減期を改変するように設計されている）アミノ酸置換を少なくとも１つ含む。
【０２９４】
Ｆｃ変異体のアミノ酸置換（１つまたは複数）はＦｃドメイン内の任意の位置（すなわち、任意のＥＵ規定アミノ酸位置）に位置してよい。１つの実施形態では、Ｆｃ変異体は、ヒンジドメインまたはその一部に位置するアミノ酸に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ変異体は、ＣＨ２ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ変異体は、ＣＨ３ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ変異体は、ＣＨ４ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸に置換を含む。
【０２９５】
本発明の結合ポリペプチドは、エフェクター機能および／またはＦｃＲ結合の改善（例えば、低下または上昇）を付与することが知られている当技術分野で認識されているＦｃ変異体を用いてよい。前記Ｆｃ変異体は、例えば、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１号、同ＷＯ９６／１４３３９Ａ１号、同ＷＯ９８／０５７８７Ａ１号、同ＷＯ９８／２３２８９Ａ１号、同ＷＯ９９／５１６４２Ａ１号、同ＷＯ９９／５８５７２Ａ１号、同ＷＯ００／０９５６０Ａ２号、同ＷＯ００／３２７６７Ａ１号、同ＷＯ００／４２０７２Ａ２号、同ＷＯ０２／４４２１５Ａ２号、同ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２号、同ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２号、同ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２号、同ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２号、同ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２号、同ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２号、同ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２号、同ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２号、同ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２号、同ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１号、同ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２号、同ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２号、同ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２号、同ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１号、同ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２号、および同ＷＯ０６／０８５９６７Ａ２号または米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，７３９，２７７号；同第５，８３４，２５０号；同第５，８６９，０４６号；同第６，０９６，８７１号；同第６，１２１，０２２号；同第６，１９４，５５１号；同第６，２４２，１９５号；同第６，２７７，３７５号；同第６，５２８，６２４号；同第６，５３８，１２４号；同第６，７３７，０５６号；同第６，８２１，５０５号；同第６，９９８，２５３号；および同第７，０８３，７８４号（それぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示の任意の１つのアミノ酸置換を含んでよい。
【０２９６】
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、抗原に依存しない抗体のエフェクター機能、特に抗体の循環中半減期を改変するアミノ酸置換を含むＦｃ変異体ポリペプチドを含む。かかる結合ポリペプチドは、これらの置換がない結合ポリペプチドと比較時、ＦｃＲｎへの結合が増大または低減しており、したがって、それぞれ、血清中半減期が増大しているかまたは低減している。ＦｃＲｎに対する親和性の改善されたＦｃ変異体の血清半減期はより長いことが予想され、かかる分子は、（例えば、慢性疾患または障害を治療するために）投与したポリペプチドの半減期が長いことが望まれる場合に、哺乳類の治療方法における用途に有用である。一方、ＦｃＲｎ結合親和性が低減したＦｃ変異体の半減期はより短いことが予期され、かかる分子は、短縮された循環時間が有利であり得る場合（例えばインビボ診断画像化用）、または開始ポリペプチドが循環中に長時間存在時に毒性副作用を有する状況下で、例えば、哺乳類への投与にも有用である。ＦｃＲｎ結合親和性が低減したＦｃ変異体は胎盤と交差する可能性も低いため、妊娠女性が呈する疾患または障害の治療にも有用である。加えて、低減したＦｃＲｎ結合親和性が望まれ得る他の用途としては、脳、腎臓、および／または肝臓に局所化した用途が挙げられる。１つの例示的な実施形態では、改変された本発明のポリペプチドは、血管系から腎臓糸球体上皮を通過する輸送の低減を示す。別の実施形態では、改変された本発明のポリペプチドは、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する脈管性間隙への輸送の低減を示す。１つの実施形態では、ＦｃＲｎ結合の改変された結合ポリペプチドは、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合ループは、アミノ酸残基２８０〜２９９位（ＥＵ番号付けに従う）を含む。他の実施形態では、ＦｃＲｎ結合親和性が改変された本発明の結合ポリペプチドは、１５ÅＦｃＲｎ「接触ゾーン」内に１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。本明細書で使用する、１５ÅＦｃＲｎ「接触ゾーン」という用語は、２４３〜２６１位、２７５〜２８０位、２８２〜２９３位、３０２〜３１９位、３３６〜３４８位、３６７位、３６９位、３７２〜３８９位、３９１位、３９３位、４０８位、４２４位、４２５〜４４０位（ＥＵ番号付け）の残基を含む。好ましい実施形態では、ＦｃＲｎ結合親和性が改変された本発明の結合ポリペプチドは、２５６位、２７７〜２８１位、２８３〜２８８位、３０３〜３０９位、３１３位、３３８位、３４２位、３７６位、３８１位、３８４位、３８５位、３８７位、４３４位、および４３８位の任意の１つにアミノ酸置換を１つ以上有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合活性が改変された例示的なアミノ酸置換については、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ０５／０４７３２７号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０２９７】
他の実施形態では、本明細書に記載の診断および治療方法における使用のためのある結合分子の定常領域（例えば、ＩｇＧ４重鎖定常領域）は、グリコシル化を低減または除去するために改変されている。例えば、本発明の結合ポリペプチドは、結合ポリペプチドのグリコシル化を改変するアミノ酸置換を含むＦｃ変異体も含んでよい。例えば、前記Ｆｃ変異体は、低減したグリコシル化（例えば、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化）を有してもよいし、改変された野生型Ｆｃドメインのグリコフォーム（例えば、フコースが少ないかフコースを含まないグリカン）を含んでもよい。かかる改変された形態を産生するために、かかるフコースが少ないかフコシル化形態の分子を、当技術分野で知られている代替細胞系を用いて作製することができる。１つの実施形態では、Ｆｃ変異体はフコシル化である。
【０２９８】
例示的な実施形態では、Ｆｃ変異体は、アミノ酸２９７位（ＥＵ番号付け）に通常見られるＮ結合型グリカンの低減したグリコシル化を含む。別の実施形態では、結合ポリペプチドは、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含むＮ結合グリコシル化モチーフの近辺または中にアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、結合ポリペプチドは、アミノ酸２２８位または２９９位（ＥＵ番号付け）でアミノ酸置換したＦｃ変異体を含む。さらにより特定の実施形態では、結合分子は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ変異（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４定常領域を含む。
【０２９９】
グリコシル化を低下させるか改変する例示的なアミノ酸置換については、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ０５／０１８５７２号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、グリコシル化を除去するように修飾される。かかる結合分子は、「ａｇｌｙ」結合分子（例えば「ａｇｌｙ」抗体）と呼び得る。理論に縛られないが、「ａｇｌｙ」結合分子は改善されたインビボ安全性および安定性プロファイルを有し得ると考えられる。例示的なａｇｌｙ結合分子は、ＩｇＧ４抗体のグリコシル化Ｆｃ領域（「ＩｇＧ４．Ｐ」）を含み、これはＦｃエフェクター機能を欠き、したがってＬＴを発現する正常な重要臓器に対するＦｃ介入毒性の可能性が除かれる。特定の実施形態では、本発明のａｇｌｙ結合分子は、当技術分野で知られているようにＩｇＧ４．ＰまたはＩｇＧ４ＰＥ定常領域を含んでよい。
【０３００】
Ｖ．結合分子の作製方法
周知のように、ＲＮＡは、標準的な技術（グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿、その後の遠心分離またはクロマトグラフィーなど）によりオリジナルのハイブリドーマ細胞からまたは他の形質転換細胞から単離することができる。所望の場合、ｍＲＮＡは、標準的な技術（オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィーなど）により総ＲＮＡから単離してよい。適切な技術は当技術分野において精通している。
【０３０１】
１つの実施形態では、本発明の結合分子の別々の鎖（例えば、抗体の軽鎖および重鎖）をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従い逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて同時に作製しても別々に作製してもよい。例えば、コンセンサス定常領域プライマーによって、またはより特異的なプライマーによって、公開ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づきＰＣＲを開始してよい。上に論じたように、別々の結合分子鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するためにもＰＣＲを用いてよい。この場合、ライブラリーをコンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（マウス定常領域プローブなど）によりスクリーニングしてよい。ＤＮＡ（典型的には、プラスミドＤＮＡ）は、当技術分野で知られている技術を用いて、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に詳細に説明されている標準的な、周知の技術に従い制限酵素マッピングおよび配列した細胞から単離してよい。勿論、ＤＮＡは、単離プロセスまたは続く分析中の任意の時点で本発明に従って合成してよい。本発明の結合分子を提供する単離された遺伝子物質の操作後、ＬＴ結合分子をコードするポリヌクレオチドを、典型的には、所望の量のＬＴ結合分子を産生するために用い得る宿主細胞への導入用の発現ベクターに挿入する。
【０３０２】
結合分子、例えば、本明細書に記載の標的分子に結合する抗体（例えば、ＬＴ）の重鎖または軽鎖の組換え発現には、結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。本発明の結合分子（または鎖もしくはその一部）をコードするポリヌクレオチドがいったん得られたら、当技術分野において周知の技術を用いた組換えＤＮＡ技術により結合分子産生用ベクターを産生してよい。したがって、ヌクレオチド配列をコードする結合分子を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法は、本明細書に記載している。当業者に周知である方法を用いて、結合分子コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、本発明の結合分子をコードするヌクレオチド配列、またはその鎖もしくはドメインを含み、プロモーターに作動可能に連結した複製できるベクターを提供する。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでよく（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７号；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６号；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、結合分子（またはその鎖もしくはドメイン）をコードするヌクレオチドは、完全結合分子の発現のためかかるベクターにクローン化してよい。
【０３０３】
本発明の結合分子が二量体である場合、宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクターである、第一ポリペプチド単量体をコードする第一ベクターと第二ポリペプチド単量体をコードする第二ベクターとをコトランスフェクトしてよい。２つのベクターは、単量体の同等の発現を可能とする同一選択可能マーカーを含んでよい。あるいは、単量体の両方をコードする単一ベクターを用いてよい。実施形態では、単量体は抗体軽鎖および重鎖であり、軽鎖は、重鎖の前に有利に置かれて過剰な毒性遊離重鎖を避ける（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２  （１９８６）；  Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：２１９７  （１９８０））。結合分子の単量体のためのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでよい。本明細書で使用する「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、宿主細胞内に導入し、そこで所望の遺伝子を発現させるためのビヒクルとして本発明により使用されるベクターを意味する。当業者に知られているように、かかるベクターはプラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択し得る。通常、本発明と適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングおよび真核生物もしくは原核生物細胞への進入および／もしくは複製能を促進する適切な制限部位を含む。
【０３０４】
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を用いてよい。例えば、ベクターのあるクラスは、動物ウイルス（ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスなど）由来のＤＮＡ因子を用いる。他は、配列内リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用に関与する。さらに、トランスフェクトした宿主細胞の選択を可能とする１つ以上のマーカーを導入することにより、ＤＮＡを染色体中に統合した細胞を選択してよい。このマーカーにより、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生剤）または重金属（銅など）耐性が得られる場合がある。選択可能なマーカー遺伝子は、ＤＮＡ配列に直接結合して発現させることもでき、同時形質転換により同じ細胞に導入することもできる。追加要素もｍＲＮＡの至適合成のために必要な場合がある。これらの要素としては、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを挙げ得る。特に好ましい実施形態では、上に論じたように、重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）合成とあわせて、クローン化可変領域遺伝子を発現ベクターに挿入する。１つの実施形態では、これは、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，  Ｉｎｃ．専売の発現ベクターを用いて成し遂げる（米国特許第６，１５９，７３０号に開示されている）。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、複製のＳＶ４０起点、ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含む。このベクターは、可変および定常領域遺伝子の取込時、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション時、その後のＧ４１８含有培地およびメトトレキサート増幅の選択時に抗体を非常に高レベル発現することが見出されている。勿論、本発明には、真核細胞中で発現させることができるいかなる発現ベクターを使用してもよい。適切なベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。通常、多数の形質転換細胞に対する免疫グロブリン重鎖および軽鎖にて適切に高レベル発現するもののスクリーニングは、（例えば、ロボット系により）実施できる通例の実験である。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および同第５，６５８，５７０号（それぞれ、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）にも教示されている。この系により、高い発現レベル、例えば、３０ｐｇ／細胞／日超が得られる。他の例示的なベクター系については、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号���開示されている。
【０３０５】
他の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、米国特許公開第２００３−０１５７６４１  Ａｌ号（２００２年１１月１８日出願）（その全体は本明細書に組み込まれる）に開示されたものなど、多シストロン性構築物を用いて発現し得る。これらの新規発現系において、目的の複数の遺伝子生産物（抗体の重鎖および軽鎖など）を単一の多シストロン性構築物から産生し得る。これらの系は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有利に用いて、真核宿主細胞内のそのＬＴ結合分子を比較的高レベルで得る。適合するＩＲＥＳ配列については、米国特許第６，１９３，９８０号（これも本明細書に組み込まれる）に開示されている。かかる発現系を用いて本出願に開示の全範囲のＬＴ結合分子を効果的に産生し得ることを、当業者は理解するであろう。
【０３０６】
より一般的に、ＬＴ結合分子の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列をいったん調製したら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入してよい。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に周知の様々な技術により成し遂げることができる。これらの技術としては、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、封入ＤＮＡとの細胞融合、微量注入、およびインタクトウイルス感染が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，  Ａ．  Ａ．  Ｇ．  ”Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，  Ｅｄｓ．，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｍａｓｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，  ｐｐ．  ４７０−４７２  （１９８８）を参照されたい。典型的には、宿主へのプラスミド導入は、電気穿孔を介す。発現構築物を持つ宿主細胞は、結合分子の産生に適した状態下で増殖し、結合分子の合成についてアッセイした。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別器分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
【０３０７】
従来の技術により発現ベクターを宿主細胞に移し、次いでトランスフェクトした細胞を従来の技術により培養して、本明細書に記載の方法に使用する結合分子を産生する。したがって、本発明は、本発明の結合分子、またはその単量体もしくは鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、異種のプロモーターに作動可能に連結した宿主細胞を含む。二重鎖または二量体結合分子の発現のために好ましい実施形態では、結合分子鎖を別々にコードするベクターは、以下に詳述するように、完全結合分子の発現のため宿主細胞中で共発現し得る。
【０３０８】
本明細書で使用する「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築したベクターを持ち、異種の遺伝子を少なくとも１つコードする細胞を指す。組換え宿主から結合分子を単離するプロセスの説明において、「細胞」および「細胞培養」という用語は、他に明確に指示されない限り、結合分子源と同義的に使用される。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回復とは、遠沈した完全細胞から、または培地と細胞浮遊液の両方を含む細胞培養からのいずれかを意味し得る。
【０３０９】
本明細書に記載の方法における使用用に結合分子を発現するために、様々な宿主発現ベクター系を用いてよい。かかる宿主発現系は、目的のコード配列を産生し、続いて精製し得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列と形質転換時またはトランスフェクト時に本発明の抗体分子をｉｎ  ｓｉｔｕ発現し得る細胞も表す。これらとしては、結合分子コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターと形質転換した細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；結合分子コード配列を含む組換え酵母発現ベクターと形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；結合分子コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；結合分子コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイク病ウイルス、ＴＭＶ）と感染させたか、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）と形質転換した植物細胞系；または哺乳類細胞ゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含む組換え発現構築物を持つ哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。組換え結合分子の発現のために、好ましくは、細菌細胞（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）など）、より好ましくは、真核細胞が、特に完全な組換え結合分子の発現のために使用される。例えば、ベクター（ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な最初期遺伝子プロモーター要素など）と連結した哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）など）は、抗体および他の結合分子の効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ４５：１０１  （１９８６）；  Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２  （１９９０））。
【０３１０】
タンパク質発現のために使用する宿主細胞系は、哺乳類由来であることが多い；そこで発現する、所望の遺伝子生産物に最も適した特定の宿主細胞系を選択的に決定する能力が当業者にはあると考えられる。例示的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲ（−））、ＨＥＬＡ（ヒト頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原とのＣＶＩ誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞系は、典型的には、市販のサービスであるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは公開文献から入手可能である。加えて、挿入した配列の発現を調整するか、または遺伝子生産物を所望の特異方法で修飾およびプロセスする宿主細胞株を選択し得る。タンパク質生産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞がタンパク質および遺伝子生産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機序を有する。正しい修飾および発現した外来タンパク質のプロセシングを確実にするために適切な細胞系または宿主系を選別できる。この目的のため、主要転写物の適切なプロセシング、遺伝子生産物のグリコシル化、およびリン酸化の細胞機構を所有する真核宿主細胞を用いてよい。
【０３１１】
組換えタンパク質の長期、大量産生のために、安定した発現が好ましい。例えば、結合分子を安定的に発現する細胞系を遺伝子操作してよい。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いてではなく、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結部位、ポリアデニル化部位など）により制御されたＤＮＡ、および選択マーカーにより形質転換できる。外来ＤＮＡ導入後、遺伝子操作された細胞は１〜２日間栄養強化培地において増殖が可能であり得、次いで選択培地に変更される。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択物に耐性を付与し、細胞がそれらの染色体中にプラスミドを安定的に統合することを可能とし、増殖して次にクローン化できる病巣を形成して、細胞系内に拡大する。この方法を有利に用いて、結合分子を安定的に発現する細胞系を遺伝子操作してよい。
【０３１２】
単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３  （１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２  （１９９２））が挙げられるが、これらに限定されないいくつかの選択系を用いてよく、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）遺伝子をそれぞれｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞に使用できる。また、抗代謝物質耐性を以下の遺伝子選択の基礎として使用できる。メトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３５７  （１９８０）；  Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１５２７  （１９８１））；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２  （１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５  （１９９１）；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：５１３−５９６  （１９９３）；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２  （１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２：１９１−２１７  （１９９３）；  ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：  １５５−２１５  （Ｍａｙ，  １９９３）；およびハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ３０：１４７  （１９８４））。当技術分野において一般に知られている使用できる組換えＤＮＡ技術方法については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９３）；  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９９０）；およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，  Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９４）；  Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０：１  （１９８１）（これらは、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３１３】
結合分子の発現レベルは、ベクター増幅により高められ得る（総論については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｖｏｌ．  ３．  （１９８７）を参照されたい）。結合分子を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞培養物中に存在する阻害剤レベルの上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅された領域は結合分子と関連するため、結合分子の産生もまた増大する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２５７  （１９８３））。
【０３１４】
インビトロ産生は拡大して大量の所望のポリペプチドを得ることが可能である。組織培養条件下の哺乳類細胞培養技術は、当技術分野で知られており、同種懸濁培養（例えばエアリフト型リアクタ中または連続撹拌リアクタ中）、または固定化もしくは封入細胞培養（例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上またはセラミック薬包上）が挙げられる。必要な場合および／または所望の場合、ポリペプチド溶液が慣例のクロマトグラフィー方法（例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース上のクロマトグラフィーまたは（免疫）親和性クロマトグラフィー）により、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成後または本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィー工程の前もしくは後に精製できる。
【０３１５】
本発明のＬＴ結合分子をコードする遺伝子は、非哺乳類細胞（細菌または昆虫または酵母菌または植物細胞など）にも発現できる。核酸を容易に取り込む細菌としては、腸内細菌科メンバー（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株など）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）など）が挙げられる。異種のポリペプチドは、細菌中に発現時、典型的には、封入体の一部となることがさらに理解されるであろう。異種のポリペプチドは、単離、精製してから、機能的分子中に集合させなければならない。四価形態の結合分子を所望の場合、サブユニットを四価結合分子（例えば四価抗体（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号））中に自己集合する。
【０３１６】
細菌系において、いくつかの発現ベクターは、発現している結合分子のために意図された使用に応じて有利に選択し得る。例えば、結合分子の医薬組成物生成のためにかかるタンパク質が大量に産生される場合、高い発現レベルの融合タンパク質生産物を対象とし容易に精製されるベクターが所望され得る。かかるベクターとしては、融合タンパク質が産生されるように、結合分子コード配列が個々にｌａｃＺコーディング領域を有するフレーム中でベクターにライゲーションされ得る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：１７９１  （１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：３１０１−３１０９  （１９８５）；  Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４：５５０３−５５０９  （１９８９））；などが挙げられるが、これらに限定されない。外来ポリペプチドを発現するために、ｐＧＥＸベクターをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として使用し得る。通常、かかる融合タンパク質は可溶性であり、遊離グルタチオンの存在下で、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、その後の溶離により溶解細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子生産物がＧＳＴ部分から放出できるように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０３１７】
原核生物に加えて、真核微生物も使用してよい。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）つまり一般的パン酵母は、真核微生物の間で最も一般的に使用されているが、他のいくつかの菌株、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）も一般に利用可能である。
【０３１８】
サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）内での発現のためには、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９  （１９７９）；  Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ７：１４１  （１９７９）；  Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １０：１５７  （１９８０））が一般的に使用されている。このプラスミドは既に、例えばＡＴＣＣ寄託番号４４０７６またはＰＥＰ４−１といったようなトリプトファン内で増殖する能力を欠く酵母の変異菌株のための選択マーカーを提供するＴＲＰｌ遺伝子を含む（Ｊｏｎｅｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２  （１９７７））。このとき、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ病変の存在は、トリプトファンの不在下での増殖による形質転換を検出するために効果的な環境を提供する。
【０３１９】
昆虫系において、キンウワバ科（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、典型的には、ベクターとして外来遺伝子を発現させるために使用される。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。抗体コード配列はウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローン化し得、およびＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。
【０３２０】
本発明の結合分子は、いったん組換えで発現したら、結合分子の精製のため当技術分野で知られている任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にタンパク質Ａの後に特異的な抗原に対する親和性により、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、吸収率較差溶解度、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技術により精製し得る。あるいは、本発明の結合分子（例えば抗体）の親和性を増大する好ましい方法は、米国特許公開第２００２  ０１２３０５７  Ａｌ号に開示されている。
【０３２１】
ＶＩ．ＬＴに結合する結合分子を含む組成物を用いた治療方法
本発明の１つの実施形態では、抗ＬＴ結合分子の投与から恩恵を受けるであろう対象の治療方法を提供し、この方法は本明細書に記載の有効量の本発明の結合分子または組成物を動物に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【０３２２】
１つの実施形態では、本発明の結合分子を、炎症を伴う障害または自己免疫性反応を呈する対象に投与する。１つの実施形態では、本発明の結合分子を、癌を呈する対象に投与する。
【０３２３】
例示的な炎症または自己免疫性障害としては、臓器特異的な疾患（すなわち、免疫反応が１つの臓器系（内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸および肝系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系など）を特異的に指向する）または複数の臓器系に影響を与え得る全身疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、多発性筋炎など）が挙げられる。１つの実施形態では、本発明の結合分子による治療のための自己免疫性または炎症障害は、異所性リンパ系徴候を有するものである。
【０３２４】
例示的な自己免疫性または炎症疾患としては、例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、ループス（ＳＬＥおよびループス腎炎など）、多発性筋炎／皮膚筋炎、低温型グロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、および乾癬性関節炎）、自己免疫性胃腸および肝障害（例えば、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫性胃炎および悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、およびセリアック病など）、血管炎（例えば、ＡＮＣＡ陰性血管炎およびＡＮＣＡ関連血管炎、チャーグストラウス血管炎、ヴェグナー肉芽腫症、および顕微鏡的多発性血管炎などを含む）、自己免疫性神経障害（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、ＲＲＭＳ、ＳＰＭＳ、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、および自己免疫性多発神経障害など）、腎障害（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、およびベルガー病など）、自己免疫性皮膚障害（例えば、乾癬、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、蕁麻疹（ｈｉｖｅｓ）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および皮膚エリテマトーデスなど）、血液障害（例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、および自己免疫性溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば、内耳疾患および聴力低下など）、ベーチェット病、レイノー症候群、皮膚筋炎、臓器移植、および自己免疫性内分泌障害（例えば、糖尿病関連自己免疫性疾患（インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）など）、アジソン病、および自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス病および甲状腺炎）など）が挙げられる。より好ましいかかる疾患としては、例えば、ＲＡ、ＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、ＡＮＣＡ関連血管炎、ループス、ＭＳ、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎、および糸球体腎炎が挙げられる。さらにより好ましいものは、ＲＡ、ＩＢＤ、ループス、およびＭＳであり、より好ましいものはＲＡおよびＩＢＤであり、最も好ましいものはＲＡである。
【０３２５】
例示的な非自己免疫性適応としては、濾胞性リンパ腫、アテローム性動脈硬化症、ウイルス誘発性肝炎、気管支喘息、およびウイルス性ショック症候群が挙げられる。
【０３２６】
１つの実施形態では、主題の結合分子は、関節リウマチ治療に使用される。本明細書で使用する「関節リウマチ」または「ＲＡ」とは、ＲＡ分類のためのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ基準２０００年改訂版、または任意の類似の基準に従い診断し得る、認識されている疾患状態を指し、以下に定義する活動性、初期、および初発性ＲＡを含む。ＲＡの生理的指標としては、対称性の関節腫脹が挙げられるが、それは関節リウマチにおいて特徴的であるが不変ではない。手の近位指節間（ＰＩＰ）関節、ならびに中手指節関節（ＭＣＰ）、手首、肘、膝、足首および中足指節（ＭＴＰ）関節の紡錘状腫脹を通常発症しており、腫脹は容易に検出される。受動運動時の疼痛は、関節炎症に対して最も感度の高い試験であり、炎症および構造的な変形は、罹患している関節の可動域を制限することが多い。典型的な目に見える変化としては、ＭＣＰ関節における指の尺側偏位、ＭＣＰおよびＰＩＰ関節の過伸展または過屈曲、肘の屈曲拘縮、ならびに手根骨および足指の亜脱臼が挙げられる。ＲＡを呈する対象は、症状を治療する際にＤＭＡＲＤが有効ではないか、または完全に有効ではないという点においてＤＭＡＲＤに対して抵抗性であり得る。
【０３２７】
１つの実施形態では、本発明による療法の候補者として、ＴＮＦ阻害剤による過去または現在の治療が十分に奏効していない者が挙げられる。
【０３２８】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、活動性関節リウマチの治療に使用される。「活動性関節リウマチ」患者とは、活動性であって潜伏性ではないＲＡ症状を呈する患者を意味する。「初期活動性関節リウマチ」を呈する対象は、ＲＡ分類のためのＡＣＲ基準１９８７年改訂版に従い少なくとも８週間かつ４年以下、活動性ＲＡと診断されている対象である。「初期関節リウマチ」を呈する対象は、ＲＡ分類のためのＡＣＲ基準１９８７年改訂版に従い少なくとも８週間かつ４年以下、ＲＡと診断されている対象である。初期ＲＡとしては、例えば、若年発症ＲＡ、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、または若年性ＲＡ（ＪＲＡ）が挙げられる。
【０３２９】
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、初発性関節リウマチの治療に使用される。「初発性ＲＡ」患者は、ＲＡ診断のためのＡＣＲ基準を完全に満たしてはいないが、ＲＡ特異的な予後生物マーカー（抗ＣＣＰおよび共有エピトープなど）の存在と関連している初期多発性関節炎を呈する。それらの患者としては、多発性関節炎を呈するが、まだＲＡと診断されておらず、公式ＡＣＲ基準ＲＡを発現するリスクが高い（９５％の可能性）抗ＣＣＰ抗体陽性患者が挙げられる。
【０３３０】
「関節損傷」とは、最も広義に使用され、１つ以上の関節（結合組織および軟骨を含む）の任意の部分に対する損傷または部分的もしくは完全な破壊を指し、ここで損傷は任意の原因による構造的および／または機能的損傷を含み、関節の疼痛／関節痛を引き起こしていてもいなくてもよい。関節損傷としては、炎症性関節疾患に関連するか炎症性関節疾患に続発する関節損傷、ならびに非炎症性関節疾患に関連するか非炎症性関節疾患に続発する関節損傷が挙げられるが、これらに限定されない。この損傷は、任意の状態（自己免疫性疾患など、特に関節炎、最も特にＲＡ）により惹起され得る。例示的なかかる状態（急性および慢性関節炎を含む）としては、ＲＡ（若年発症ＲＡを含む）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、または若年性ＲＡ（ＪＲＡ）、および病期（リウマチ滑膜炎など）、痛風もしくは痛風関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性関節症、ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎、感染性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スチル病、脊椎関節炎、骨関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎、原発性慢性多発性関節炎、反応性関節炎、更年期関節炎、エストロゲン欠乏性関節炎、および強直性脊椎炎／リウマチ性脊椎炎）、ＲＡ以外のリウマチ性自己免疫性疾患、ならびにＲＡに続発する著しい全身性関連（血管炎、肺線維症またはフェルティ症候群）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の目的において、関節とは（動物などの脊椎動物の）骨格因子間で骨格因子を取り囲んで支える部分の接触点であり、例えば、腰、脊椎間の関節、背骨と骨盤間の関節（仙腸関節）、腱と靱帯が骨に結合する関節、肋骨と背骨間の関節、肩、膝、足、肘、手、指、足首、および足指、特に両手両足の関節が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３１】
１つの実施形態では、対象は、障害を治療するための免疫抑制剤（１種または複数）などの薬剤（１種または複数）治療歴が一度もなく、特定の実施形態では、ＴＮＦアンタゴニスト治療歴が一度もない。代替的な実施形態では、対象は、障害を治療するための、（ＴＮＦアンタゴニストを含む）薬剤（１種または複数）治療歴がある。
【０３３２】
なおさらなる態様では、患者は障害を再発している。代替的な実施形態では、患者は障害を再発していない。
【０３３３】
別の態様では、本明細書の抗体は、障害を治療するために対象に投与する唯一の薬剤である。代替的な態様では、本明細書の結合分子は、障害を治療するために使用する薬剤の１つである。
【０３３４】
さらなる態様では、対象は自己免疫性障害としてＲＡのみ呈する。
【０３３５】
あるいは、対象は自己免疫性障害としてＭＳのみ呈する。さらに代替的に、対象は自己免疫性障害としてループス、またはＡＮＣＡ関連血管炎、またはシェーグレン症候群のみ呈する。
【０３３６】
ＶＩＩＩ．医薬組成物および投与方法
ＬＴ特異的な結合分子の調製およびそれを必要としている対象への投与方法は、当業者に周知であるかまたは当業者により容易に決定される。結合分子の投与経路は、例えば、経口、非経口（吸入または局所による）であってよい。本明細書で使用する、非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与を含む。これらの投与形態はすべて、本発明の範囲内であることを明確に意図し、投与形態は注射液、特に静脈内または動脈内の注射または点滴用である。通常、注射用に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）を含んでよく、任意に安定剤（例えばヒトアルブミン）などを含んでよい。しかしながら、本明細書における教示と適合する他の方法によっても結合分子を有害な細胞集団部位に直接送達すること、それによって治療薬に対する疾患組織の曝露を増大することができる。
【０３３７】
非経口投与のための調製物としては、滅菌水溶液もしくは滅菌非水溶液、懸濁液、および乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注入可能有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、乳剤または懸濁液が挙げられ、それらには生理食塩水および緩衝液が含まれる。主題の本発明において、医薬上許容可能な担体としては、０．０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養物補充液及び電解質補充液（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。保存剤および他の添加剤（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなど）も存在してよい。
【０３３８】
さらに特に、注入のための使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性）、または滅菌注射液もしくは分散液の即時調製用の分散液および滅菌粉末を含む。かかる場合において、組成物は滅菌でなければならず、容易に注射器に入る程度に流体であるべきである。製造および保存状況下において安定し、好ましくは微生物（細菌および真菌など）の汚染活動から保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散培地であることができる。適切な流動性は、例えば、コーティング（レシチンなど）の使用により、分散の場合、必要な粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤の使用により維持できる。本明細書で開示する治療方法における使用に適した製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  １６ｔｈ  ｅｄ．  （１９８０）に記載されている。
【０３３９】
微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより成し遂げることができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、多価アルコール（マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなど）を含めることが好ましい。注入可能な組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることにより引き起こすことができる。
【０３４０】
いずれの場合も、滅菌注射液は、本明細書に列挙した成分の１つまたは組み合わせと適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、本発明の結合分子）を組み込み、必要に応じて、その後に滅菌濾過することにより調製できる。一般に、分散液は、塩基性分散培地および上に列挙した他の必要成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことにより調製する。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分と、先に滅菌濾過したその溶液由来の任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる。注射用調製物は、当技術分野で知られている方法に従い、プロセス化し、容器（アンプル、袋、瓶、シリンジまたはバイアルなど）中に充填し、無菌状態で密封する。さらに、調製物はパッケージ化してキット形態で販売し得る（同時係属出願ＵＳＳＮ０９／２５９，３３７号（米国特許第２００２−０１０２２０８  Ａｌ号）（その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されているものなど）。かかる製品には好ましくは関連する組成物が自己免疫性または腫瘍性障害を呈するかまたは呈しやすい対象を治療するために有用であることを示すラベルが貼られるか、または添付文書が付随する。
【０３４１】
本明細書に記載の過剰増殖障害治療のための本発明の組成物の有効量は、多くの異なる要因（投与方法、対象部位、患者の生理状態、患者がヒトであるか動物であるか、他剤を投与されているかどうか、および処置が予防的であるか治療的であるかなど）によって異なる。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳類（トランスジェニック哺乳類を含む）も治療できる。治療投与量は、安全性および有効性を至適化するために、当業者に知られている通例の方法を用いて滴定してよい。
【０３４２】
抗体またはその断片による過剰増殖障害の治療において、投与量は、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の宿主体重の範囲であることができる。例えば投与量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であることができ、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。上記範囲の中間用量も本発明の範囲内であることを意図する。対象はかかる用量を連日、隔日、週１回または経験的分析により決定された他の任意のスケジュールに従い投与できる。例示的な治療は、複数回、長期間（例えば、少なくとも６ヶ月間）にわたる投与を伴う。さらなる例示的な治療計画は、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月ごとに１回の投与を伴う。例示的な投与量スケジュールとしては、１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ連日、３０ｍｇ／ｋｇ隔日または６０ｍｇ／ｋｇ週１回が挙げられる。いくつかの方法では、異なる結合特異性の２つ以上のモノクローナル抗体を、投与した各抗体の用量が指定範囲内に収まる場合、同時に投与する。
【０３４３】
本明細書に開示されたＬＴ特異的な結合分子は、複数の場合において投与できる。各投与の間隔は週１回、月１回または年１回にできる。間隔は、適応があれば、患者における標的ポリペプチドまたは標的分子の血中レベルの測定により不規則にすることもできる。いくつかの方法では、投与量は、血漿ポリペプチド濃度を１〜１０００μｇ／ｍｌに達するように、いくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌに達するように調整する。あるいは、結合分子は、低頻度の投与が要される場合、徐放性製剤として投与できる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により異なる。結合分子の半減期は、安定したポリペプチドまたは部分、例えば、アルブミンまたはＰＥＧとの融合を介して延長することもできる。通常、ヒト化抗体は最長の半減期を示し、その後にキメラ抗体および非ヒト抗体と続く。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、非複合形態で投与できる。別の実施形態では、結合分子は、本明細書に開示された方法における使用のために複合形態で複数回投与できる。さらに別の実施形態では、本発明の結合分子は、非複合形態で投与してから複合形態で投与することもでき、逆順で投与することもできる。
【０３４４】
投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかによっても変わり得る。予防用途の場合、抗体またはその混合物を含む組成物を、まだその疾患の症状を呈していない患者か、または前症状患者に投与し、患者の抵抗力を高める。かかる量を「予防的有効量」と定義する。本用途でも、正確な量は、患者の健康状態および全身の免疫状態によってやはり変わるが、一般に１回の投与あたり０．１〜２５ｍｇの範囲であり、特に、１回の投与あたり０．５〜２．５ｍｇの範囲である。長期間にわたって、比較的低用量を比較的低頻度の間隔で投与する。一部の患者は、残りの生涯ずっと治療を受け続ける。
【０３４５】
治療用途の場合、比較的高用量（例えば、結合分子（例えば、抗体）を１回の投与あたり約１〜４００ｍｇ／ｋｇ、放射性免疫結合体の場合、５〜２５ｍｇ、細胞毒と薬物の複合分子の場合には、これより多い量が一般に使用される）を比較的短い間隔で、疾患進行が遅くなるか、または抑えられるまで、好ましくは、患者が疾患症状の部分的または完全な改良を示すまで必要とされる場合がある。その後、予防計画に沿って患者に投与できる。
【０３４６】
１つの実施形態では、対象を、ＬＴ特異的抗体またはその免疫特異的な断片をコードする核酸分子（例えば、ベクター中にある）で治療できる。ポリペプチドをコードする核酸の用量範囲は、患者あたり、約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡである。感染ウイルスベクターの用量範囲は、１回の投与あたり、１０〜１００ビリオンまたは１００ビリオン超である。
【０３４７】
治療薬を、予防的および／または治療的処置のため、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内に投与できる。いくつかの方法では、ＬＴβＲを発現する細胞が集まっている特定の組織に薬剤を直接、例えば、頭蓋内注射により注射する。抗体を投与する場合、筋肉内注射または静脈内注射が好ましい。いくつかの方法では、特定の治療用抗体を、頭蓋に直接注射する。いくつかの方法では、抗体を徐放性組成物または徐放性機器（Ｍｅｄｉｐａｄ（商標登録）機器など）として投与する。
【０３４８】
ＬＴ結合分子は、任意に、（例えば、予防的または治療的）処置を必要としている障害または状態を治療する上で有効な他の薬剤と併用して投与できる。
【０３４９】
本開示の範囲内を維持しつつ、本発明のＬＴ特異的結合分子を上記の処置方法に従い、治療的または予防的効果を得るために十分な量でヒトまたは他の動物に投与してよい。本発明のＬＴ特異的抗体結合分子は、本発明の抗体を既知の技術に従い従来の医薬上許容可能な担体または希釈液と混合して調製した従来の投与形態でかかるヒトまたは他の動物に投与できる。医薬上許容可能な担体または希釈液の形態および特性は、混合する活性成分量、投与経路および他の周知の変数により決定されることを、当業者は認識するであろう。さらに、本発明による結合分子の１つ以上の種を含む混合物が特に効果的であることが証明され得ることを、当業者は理解するであろう。
【０３５０】
本発明の実践には、別段の指定のない限り、当技術分野の技能内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  （１９８９）；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９２），  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  （１９８５）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ  ｅｄ．，  （１９８４）；  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  米国特許第４，６８３，１９５号；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８４）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８４）；  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  （１９８７）；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８７）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  １５４  ａｎｄ  １５５  （Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．）；  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ  （１９８７）；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  （１９８６）；  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９８６）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）を参照されたい。
【０３５１】
抗体工学の一般的原理については、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃ．Ａ．Ｋ．  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，  Ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）に説明されている。タンパク質工学の一般的原理については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇ．  （１９９５）に説明されている。抗体および抗体ハプテン結合の一般的原理については、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，  Ａ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ  （１９８４）；およびＳｔｅｗａｒｄ，  Ｍ．Ｗ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  （１９８４）に説明されている。さらに、当技術分野で知られており具体的な記載のない免疫学における標準的な方法は、一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  ，  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  −  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （８ｔｈ  ｅｄ．），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）に従う。
【０３５２】
免疫学の一般的原理を説明する標準的な参考資料としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｋｌｅｉｎ，  Ｊ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８２）；  Ｋｅｎｎｅｔｔ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）；  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ａ．，  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”  ｉｎ  Ｂｕｒｄｅｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ，  Ｖｏｌ．  １３，  Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９８４），  Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．  Ｅｄ．  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．  Ｇｏｌｄｓｂｙ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．  Ｋｉｎｄｔ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｒａ  Ａ．  Ｏｓｂｏｒｎｅ，  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．  （２０００）；  Ｒｏｉｔｔ，  Ｉ．，  Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｄ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｍｏｓｂｙ  （２００１）；  Ａｂｂａｓ  Ａ．，  Ａｂｕｌ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，  Ａ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．  ５，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  （２００５）；  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ  （２００１）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）；  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  （２００３）；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）；  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （２００３）が挙げられる。
【０３５３】
上に引用した参考文献のすべて、ならびに本明細書に引用した参考文献のすべてが、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３５４】
（実施例１）
抗リンホトキシン抗体のクローニング
ヒトリンホトキシン（ＬＴ）に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、ビーズ上に存在するＬＴα１β２をマウスに注射することにより調製した。当技術分野で認識されている技術を用いて（抗ｍｙｃ抗体を用いてまたはビーズ表面に対するＣｎＢｒ固定を介して）、ＬＴα１β２をビーズに結合した。
【０３５５】
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを製造業者の推奨プロトコールに従って用いて、マウスハイブリドーマ細胞から総細胞ＲＮＡを調製した。第一鎖ｃＤＮＡのプライミングのため無作為六量体を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを総細胞ＲＮＡからクローン化した。インタクトシグナル配列によるマウス免疫グロブリン可変ドメインのＰＣＲ増幅のため、退化順行プライマーの混合物を、複数のマウス免疫グロブリン遺伝子ファミリーシグナル配列およびマウス定常ドメインの５末端に特異的な単一の逆行プライマーにハイブリッドする。ＰＣＲには、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ混合物を製造業者の推奨プロトコールに従って用いた。ＰＣＲ生産物をゲル精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター中に、製造業者の推奨プロトコールに従って、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯクローニングキットを用いてサブクローン化した。複数の独立したサブクローン由来の挿入物を配列してコンセンサス配列を確立した。推定成熟免疫グロブリンＮ末端はハイブリドーマからエドマン分解により決定したものと一致した。
【０３５６】
特異的なサブグループへの割り当ては、カバットデータベース（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．  Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖｔ．  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ．）由来のコンセンサス免疫グロブリン可変ドメイン配列を用いたＢＬＡＳＴ分析に基づいた。以下のＣＤＲはカバット定義を用いて示している。
【０３５７】
ｍＡｂ  Ａ０Ｄ９
以下に、Ａ０Ｄ９成熟重鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧ  ＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩ  ＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳ ＴＹＧＶＨＷＶＲＱＦ  ＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶ
５１  ＩＷＲＧＧＮＴＮＹＮ ＡＡＦＭＳＲＬＴＩＳ  ＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦ  ＫＭＮＳＬＱＡＫＤＴ  ＡＩＹＹＣＶＲＮＱＩ
１０１  ＹＤＧＹＹＤＹＡＭＤ ＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶ  ＳＳ（配列番号：）
Ａ０Ｄ９重鎖はマウスサブグループＩ（Ｂ）重鎖である。
【０３５８】
以下に、Ａ０Ｄ９重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４６０由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード重鎖は、ＭＡＶＬＧＬＬＦＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣ ＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴ ＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧ ＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣ ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴ
５１  ＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧ  ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡ  ＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧ  ＡＣＣＴＧＧＣＣＴＡ  ＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴ
１０１  ＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴ  ＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣ  ＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴ  ＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣ  ＡＴＴＡＴＣＴＡＣＣ
１５１  ＴＡＴＧＧＴＧＴＣＣ  ＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧ  ＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡ  ＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣ  ＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴ
２０１  ＧＧＧＡＧＴＧＡＴＡ  ＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧ  ＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡ  ＣＴＡＴＡＡＴＧＣＡ  ＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴ
２５１  ＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣ  ＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧ  ＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡ  ＡＧＡＧＴＣＡＡＧＴ  ＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡ
３０１  ＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣ  ＴＧＣＡＡＧＣＴＡＡ  ＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣ  ＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴ  ＧＴＧＴＣＡＧＡＡＡ
３５１  ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴ  ＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴ  ＡＣＧＡＣＴＡＴＧＣ  ＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣ  ＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧ
４０１  ＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴ  ＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ  ＴＣＡ（配列番号：）
【０３５９】
以下に、Ａ０Ｄ９成熟軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳ  ＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴ  ＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮ ＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰ  ＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲ
５１  ＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＲＧＳＧＱＤ  ＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹ  ＥＤＶＧＩＹＹＣＬＨ ＹＤＡＦＰＷＴＦＧＧ
１０１  ＧＴＫＬＥＩＫ
Ａ０Ｄ９軽鎖は、マウスサブグループＶκ軽鎖である。
【０３６０】
以下に、成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４６３由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード軽鎖は、ＭＲＡＰＡＱＦＦＧＦＬＬＬＷＦＰＧＩＫＣ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣ ＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴ ＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣ ＴＴＧＴＴＧＣＴＣＴ ＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧ
５１  ＴＡＴＣＡＡＡＴＧＴ  ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡ  ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ  ＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣ  ＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴ
１０１  ＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡ  ＧＡＧＡＧＴＣＡＣＴ  ＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡ  ＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴ
１５１  ＡＣＣＴＡＴＴＴＡＡ  ＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡ  ＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡ  ＧＧＧＡＡＡＴＣＴＣ  ＣＴＡＡＧＡＣＣＣＴ
２０１  ＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴ  ＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴ  ＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧ  ＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡ  ＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧ
２５１  ＧＣＣＧＴＧＧＡＴＣ  ＴＧＧＧＣＡＡＧＡＴ  ＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡ  ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧ  ＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴ
３０１  ＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧ  ＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡ  ＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣ  ＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴ  ＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣ
３５１  ＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡ  ＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣ  ＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡ  Ａ（配列番号：）
【０３６１】
ｍＡｂ  ＡｌＤ５
以下に、Ａ１Ｄ５成熟重鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥ  ＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩ  ＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴ ＧＹＦＭＮＷＭＲＱＳ  ＨＧＫＳＬＥＷＩＧＲ
５１  ＩＮＰＹＮＧＤＳＦＹ ＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬ  ＴＶＤＫＳＳＴＴＡＨ  ＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤ  ＳＡＶＹＹＣＧＲＧＹ
１０１  ＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴ  ＳＶＴＶＳＳ（配列番号：）
Ａ１Ｄ５重鎖は、マウスサブグループＩ（Ｂ）重鎖である。
【０３６２】
以下に、Ａ１Ｄ５重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３３８由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード重鎖は、ＭＧＷＳＣＶＭＬＦＬＬ  ＳＶＴＶＧＶＦＳ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡ ＧＣＴＧＴＧＴＡＡＴ ＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣ ＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡ ＣＴＧＴＡＧＧＴＧＴ
５１  ＧＴＴＴＴＣＴＧＡＧ  ＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣ  ＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧ  ＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧ  ＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧ
１０１  ＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴ  ＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣ  ＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴ  ＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣ  ＡＴＴＴＡＣＴＧＧＣ
１５１  ＴＡＣＴＴＴＡＴＧＡ  ＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧ  ＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴ  ＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣ  ＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴ
２０１  ＴＧＧＡＣＧＴＡＴＴ  ＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡ  ＡＴＧＧＴＧＡＴＴＣ  ＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣ  ＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡ
２５１  ＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣ  ＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴ  ＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴ  ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＣ  ＡＧＣＣＣＡＣＡＴＧ
３０１  ＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡ  ＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣ  ＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴ  ＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴ  ＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧ
３５１  ＡＧＧＡＴＡＣＧＡＣ  ＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴ  ＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡ  ＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡ  ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴ
４０１  ＣＣＴＣＡ（配列番号：）
【０３６３】
以下に、Ａ１Ｄ５成熟軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳ  ＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴ  ＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳ ＮＦＬＴＷＹＱＱＫＰ  ＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹ
５１  ＴＳＫＬＨＳＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＹＳＬＴＩＳＮＬＥＰ  ＧＤＩＡＴＹＹＣＱＱ ＶＳＫＦＰＷＴＦＧＧ
１０１  ＧＡＫＬＥＩＫ（配列番号）
Ａ１Ｄ５軽鎖は、マウスサブグループＶκ軽鎖である。
【０３６４】
以下に、成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３５２由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード軽鎖は、ＭＶＳＴＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣ（配列番号）である）。
１  ＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡ ＣＡＧＣＴＣＡＧＴＴ ＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣ ＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴ ＧＴＴＴＴＣＡＡＧＧ
５１  ＴＡＣＣＡＧＡＴＧＴ  ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡ  ＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ  ＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣ  ＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴ
１０１  ＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡ  ＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣ  ＡＴＴＡＧＴＴＧＣＡ  ＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡ  ＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣ
１５１  ＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡ  ＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡ  ＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡ  ＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧ  ＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴ
２０１  ＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣ  ＡＣＡＴＣＡＡＡＡＴ  ＴＡＣＡＣＴＣＡＧＧ  ＡＧＴＣＣＣＡＴＣＡ  ＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧ
２５１  ＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣ  ＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴ  ＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡ  ＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡ  ＣＣＴＧＧＡＡＣＣＧ
３０１  ＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧ  ＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡ  ＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧ  ＧＴＴＡＧＴＡＡＧＴ  ＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣ
３５１  ＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡ  ＧＧＣＧＣＣＡＡＧＣ  ＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡ  Ａ（配列番号：）
【０３６５】
ｍＡｂ  ＬＴｌ０１およびＬＴｌ０３
抗体ＬＴ１０１（Ｐ１Ｇ４．４）とＬＴ１０３（Ｐ１Ｇ９．１）は同一であることが見出された。以下に、ＬＴ１０１とＬＴ１０３の成熟重鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥ  ＬＶＫＰＧＡＳＶＱＩ  ＳＣＫＡＳＧＹＶＦＳ ＳＳＷＭＮＷＶＫＱＲ  ＰＧＲＧＬＥＷＩＧＲ
５１  ＩＹＰＧＤＧＤＴＤＹ ＴＧＫＦＫＧＫＡＴＬ  ＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹ  ＭＱＬＳＳＬＴＳＶＤ  ＳＡＶＹＦＣＡＳＧＹ
１０１  ＦＤＦＷＧＱＧＴＰＬ  ＴＶＳＳ（配列番号）
抗体ＬＴ１０１とＬＴ１０３の重鎖は、マウスサブグループＩＩ（Ｂ）重鎖である。
【０３６６】
以下に、ＬＴ１０１重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４５８またはｐＹＬ４５９由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード重鎖は、ＭＧＷＳＣＩＭＦＦＬＬＳＩＴＡＧＶＨＣ（配列番号）である）。
１  ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡ ＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴ ＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣ ＣＴＧＴＣＡＡＴＡＡ ＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴ
５１  ＣＣＡＴＴＧＣＣＡＧ  ＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣ  ＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧ  ＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧ  ＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧ
１０１  ＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴ  ＧＣＡＧＡＴＴＴＣＣ  ＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴ  ＣＴＧＧＣＴＡＣＧＴ  ＴＴＴＣＡＧＴＡＧＴ
１５１  ＴＣＴＴＧＧＡＴＧＡ  ＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡ  ＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴ  ＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣ  ＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴ
２０１  ＴＧＧＧＣＧＧＡＴＴ  ＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧ  ＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣ  ＴＧＡＣＴＡＣＡＣＴ  ＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡ
２５１  ＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣ  ＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴ  ＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴ  ＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣ  ＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧ
３０１  ＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡ  ＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣ  ＴＧＴＧＧＡＣＴＣＴ  ＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴ  ＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧ
３５１  ＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴ  ＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧ  ＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣ  ＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣ  ＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号）
【０３６７】
以下に、ＬＴ１０１およびＬＴ１０３成熟軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＤＩＴＭＴＱＳＰＳＳ  ＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴ  ＩＴＣＫＡＳＱＤＭＮ ＮＹＬＲＷＦＱＱＫＰ  ＧＫＳＰＱＴＬＩＦＲ
５１  ＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤ  ＹＳＬＴＩＳＳＬＥＦ  ＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱ ＨＤＫＦＰＰＴＦＧＧ
１０１  ＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：）
ＬＴ１０１およびＬＴ１０３の軽鎖は、マウスサブグループＶκ軽鎖である。
【０３６８】
以下に、成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４６１またはｐＹＬ４６２由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード軽鎖は、ＭＲＡＰＡＱＦＬＧＩＬＬＬＷＦＰＧＩＫＣ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣ ＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴ ＴＣＴＴＧＧＣＡＴＣ ＴＴＧＴＴＧＣＴＣＴ ＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧ
５１  ＴＡＴＣＡＡＡＴＧＴ  ＧＡＣＡＴＣＡＣＧＡ  ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ  ＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣ  ＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴ
１０１  ＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡ  ＧＡＧＡＧＴＣＡＣＴ  ＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡ  ＧＧＡＣＡＴＧＡＡＴ
１５１  ＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡ  ＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡ  ＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡ  ＧＧＧＡＡＧＴＣＴＣ  ＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴ
２０１  ＧＡＴＣＴＴＴＣＧＴ  ＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴ  ＴＧＧＴＣＧＡＴＧＧ  ＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡ  ＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧ
２５１  ＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣ  ＴＧＧＧＣＡＡＧＡＴ  ＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡ  ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧ  ＣＣＴＧＧＡＡＴＴＴ
３０１  ＧＡＡＧＡＴＡＴＧＧ  ＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡ  ＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧ  ＣＡＴＧＡＴＡＡＡＴ  ＴＴＣＣＴＣＣＧＡＣ
３５１  ＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡ  ＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣ  ＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡ  Ａ（配列番号：）
【０３６９】
ｍＡｂ  ＬＴ１０２
以下に、ＬＴ１０２（Ｐ１Ｇ８．２）成熟重鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬ  ＳＣＡＶＳＧＦＴＦＳ ＤＹＹＭＹＷＩＲＱＴ  ＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴ
５１  ＩＧＤＧＴＳＹＴＨＹ ＰＤＳＶＱＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＹＡＴＮＮＬＹ  ＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤ  ＴＡＬＹＹＣＡＲＤＬ
１０１  ＧＴＧＰＦＡＹＷＧＱ  ＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号）
ＬＴ１０２重鎖は、マウスサブグループＩＩＩ（Ｄ）重鎖である。
【０３７０】
以下に、ＬＴ１０２重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３７５由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード重鎖は、ＭＤＦＧＬＳＷＶＦＬＶＬＶＬＫＧＶＱＣ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧ ＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧ ＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴ ＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴ ＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴ
５１  ＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡ  ＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧ  ＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ  ＡＧＧＡＧＧＣＴＴＡ  ＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧ
１０１  ＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴ  ＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣ  ＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴ  ＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣ  ＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣ
１５１  ＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴ  ＡＴＴＧＧＡＴＴＣＧ  ＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧ  ＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣ  ＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴ
２０１  ＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴ  ＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡ  ＣＴＡＧＴＴＡＣＡＣ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡ  ＧＡＣＡＧＴＧＴＧＣ
２５１  ＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴ  ＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣ  ＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧ  ＣＣＡＣＧＡＡＣＡＡ  ＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧ
３０１  ＣＡＡＡＴＧＡＣＴＡ  ＧＴＣＴＧＡＧＧＴＣ  ＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡ  ＧＣＣＴＴＡＴＡＴＴ  ＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧ
３５１  ＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡ  ＡＣＣＧＧＧＣＣＴＴ  ＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧ  ＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧ  ＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡ
４０１  ＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣ  Ａ（配列番号：）
【０３７１】
以下に、ＬＴ１０２成熟軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＤＶＬＭＴＱＴＰＲＳ  ＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳ  ＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶ ＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷ  ＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫ
５１  ＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦ ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳ  ＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩ  ＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶ  ＹＹＣＦＱＧＳＨＦＰ
１０１  ＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥ  ＩＫ（配列番号：）
ＬＴ１０２軽鎖は、マウスサブグループＩＩκ軽鎖である。
【０３７２】
以下に、成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３７８由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード軽鎖は、ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＳＳ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣ ＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴ ＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧ ＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡ ＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣ
５１  ＣＡＧＣＡＧＴＧＡＣ  ＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡ  ＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣ  ＡＣＧＣＴＣＣＣＴＧ  ＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣ
１０１  ＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡ  ＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣ  ＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴ  ＣＴＡＧＴＣＡＧＡＡ  ＣＡＴＴＧＴＴＣＡＴ
１５１  ＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡ  ＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴ  ＡＧＡＡＴＧＧＴＡＣ  ＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣ  ＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣ
２０１  ＴＣＣＡＡＡＧＣＴＣ  ＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡ  ＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡ  ＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴ  ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧ
２５１  ＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧ  ＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡ  ＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧ  ＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴ  ＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣ
３０１  ＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧ  ＣＴＧＡＧＧＡＴＣＴ  ＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴ  ＴＡＣＴＧＣＴＴＴＣ  ＡＡＧＧＴＴＣＡＣＡ
３５１  ＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧ  ＡＣＡＴＴＣＧＧＴＧ  ＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡ  ＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣ  ＡＡＡ（配列番号：）
【０３７３】
ｍＡｂ  ＬＴ１０５
以下に、ＬＴ１０５（Ｐ２Ｅ９．７）成熟重鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧ  ＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬ  ＴＣＳＶＴＧＹＳＩＴ ＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱ  ＦＰＧＮＫＬＥＧＭＧ
５１  ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹ ＮＰＳＬＫＮＲＩＳＩ  ＴＲＤＳＳＫＮＱＦＦ  ＬＫＬＮＳＶＴＡＥＤ  ＳＧＴＹＹＣＡＲＤＡ
１０１  ＹＳＹＧＭＤＹＷＧＱ  ＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号：）
ＬＴ１０５重鎖は、マウスサブグループＩ（Ａ）重鎖である。
【０３７４】
以下に、ＬＴ１０５重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３８２由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード重鎖は、ＭＭＶＬＳＬＬＹＬＬＴＡＩＰＧＩＬＳ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧ ＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧ ＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴ ＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴ ＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴ
５１  ＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡ  ＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧ  ＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ  ＡＧＧＡＧＧＣＴＴＡ  ＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧ
１０１  ＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴ  ＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣ  ＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴ  ＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣ  ＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣ
１５１  ＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴ  ＡＴＴＧＧＡＴＴＣＧ  ＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧ  ＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣ  ＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴ
２０１  ＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴ  ＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡ  ＣＴＡＧＴＴＡＣＡＣ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡ  ＧＡＣＡＧＴＧＴＧＣ
２５１  ＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴ  ＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣ  ＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧ  ＣＣＡＣＧＡＡＣＡＡ  ＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧ
３０１  ＣＡＡＡＴＧＡＣＴＡ  ＧＴＣＴＧＡＧＧＴＣ  ＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡ  ＧＣＣＴＴＡＴＡＴＴ  ＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧ
３５１  ＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡ  ＡＣＣＧＧＧＣＣＴＴ  ＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧ  ＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧ  ＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡ
４０１  ＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣ  Ａ（配列番号：）
【０３７５】
以下に、ＬＴ１０５成熟軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳ  ＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴ  ＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤ ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬ
５１  ＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮ  ＰＶＥＴＤＤＶＡＴＦ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ  Ｋ（配列番号：）
ＬＴ１０５軽鎖は、マウスサブグループＩＩＩκ軽鎖である。
【０３７６】
以下に、成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３８３由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード軽鎖は、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧ ＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴ ＧＣＴＡＴＧＧＧＴＧ ＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴ ＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧ
５１  ＴＴＣＣＡＣＡＧＧＴ  ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣ  ＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣ  ＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴ  ＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴ
１０１  ＣＴＣＴＡＧＧＧＣＡ  ＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣ  ＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡ  ＧＡＧＣＣＡＧＣＧＡ  ＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴ
１５１  ＡＡＴＴＡＴＧＧＣＡ  ＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴ  ＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣ  ＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣ  ＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣ
２０１  ＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣ  ＣＴＣＡＴＣＴＡＴＣ  ＧＴＧＣＡＴＣＣＡＡ  ＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴ  ＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧ
２５１  ＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧ  ＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧ  ＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧ  ＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴ  ＣＡＣＣＡＴＴＡＡＴ
３０１  ＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡ  ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴ  ＴＧＣＡＡＣＣＴＴＴ  ＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣ  ＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡ
３５１  ＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣ  ＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧ  ＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡ  ＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡ  ＡＡＡ（配列番号：）
【０３７７】
ｍＡｂ  ＬＴ１０７
以下に、ＬＴ１０７（Ｐ５Ｃ４．１）成熟重鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
【化５】
2012514458.tif 000007
ＬＴ１０７はマウスサブグループＩ（Ｂ）重鎖である。ＦＲｌ中の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位は上記の太字で示されていることに留意されたい。
【０３７８】
以下に、ＬＴ１０７重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４４７由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード重鎖は、ＭＡＶＬＧＬＬＦＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣ ＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴ ＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧ ＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣ ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴ
５１  ＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧ  ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡ  ＡＡＣＡＧＴＣＡＧＧ  ＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣ  ＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴ
１０１  ＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴ  ＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣ  ＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴ  ＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣ  ＡＴＴＡＡＣＴＡＡＣ
１５１  ＴＡＴＧＧＴＡＴＡＣ  ＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧ  ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡ  ＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣ  ＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴ
２０１  ＧＧＧＡＧＴＧＡＴＡ  ＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧ  ＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡ  ＣＣＡＴＡＡＴＧＣＴ  ＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴ
２５１  ＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧ  ＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧ  ＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡ  ＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴ  ＴＴＴＣＴＴＴＡＣＡ
３０１  ＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣ  ＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡ  ＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣ  ＡＴＡＴＡＣＴＡＣＴ  ＧＴＧＣＣＡＧＡＡＡ
３５１  ＴＡＧＡＧＣＣＴＡＣ  ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＧ  ＡＧＧＧＧＧＧＴＡＴ  ＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧ  ＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡ
４０１  ＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣ  ＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：）
【０３７９】
以下に、ＬＴ１０７成熟軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳ  ＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴ  ＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮ ＴＹＬＮＷＦＱＱＫＰ  ＧＫＳＰＭＴＬＩＹＲ
５１  ＡＤＲＬＬＤＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤ  ＹＳＬＴＩＳＳＬＥＤ  ＥＤＭＧＩＹＹＣＱＱ ＹＤＤＦＰＬＴＦＧＡ
１０１  ＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：）
【０３８０】
これはマウスサブグループＶκ軽鎖である。以下に、成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４４８由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード軽鎖は、ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＩＬＬＬＷＦＰＧＩＫＣ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＴＡＴＣＣＴ ＣＡＧＣＴＣＡＧＴＴ ＣＣＴＴＧＧＡＡＴＣ ＴＴＧＴＴＧＣＴＣＴ ＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧ
５１  ＴＡＴＣＡＡＡＴＧＴ  ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡ  ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ  ＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣ  ＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴ
１０１  ＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡ  ＧＡＧＡＧＴＣＡＣＴ  ＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡ  ＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴ
１５１  ＡＣＣＴＡＴＴＴＡＡ  ＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡ  ＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡ  ＧＧＧＡＡＡＴＣＴＣ  ＣＴＡＴＧＡＣＣＣＴ
２０１  ＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴ  ＧＣＡＧＡＣＡＧＡＴ  ＴＧＴＴＡＧＡＴＧＧ  ＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡ  ＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧ
２５１  ＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣ  ＴＧＧＧＣＡＡＧＡＴ  ＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡ  ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧ  ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴ
３０１  ＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧ  ＧＡＡＴＴＴＡＣＴＡ  ＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧ  ＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴ  ＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣ
３５１  ＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴ  ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣ  ＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡ  Ａ（配列番号：）
【０３８１】
ｍＡｂ  ＬＴ１０８
以下に、ＬＴ１０８（Ｐ４Ｆ２．２）成熟重鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
【化６】
2012514458.tif 000008
【０３８２】
これはマウスサブグループＩ（Ｂ）重鎖である。ＦＲ３中の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位は上記の太字で示されていることに留意されたい。以下に、ＬＴ１０７重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４４９由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード重鎖は、ＭＡＶＬＡＬＬＦＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴ ＴＡＧＣＧＣＴＧＣＴ ＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧ ＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣ ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴ
５１  ＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧ  ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡ  ＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧ  ＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣ  ＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴ
１０１  ＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴ  ＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣ  ＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴ  ＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣ  ＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣ
１５１  ＴＡＴＧＧＴＡＴＡＣ  ＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧ  ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡ  ＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣ  ＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴ
２０１  ＧＧＧＡＧＴＧＡＴＡ  ＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧ  ＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡ  ＣＣＡＴＡＡＴＧＣＴ  ＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴ
２５１  ＣＣＡＧＡＣＴＧＡＡ  ＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧ  ＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡ  ＡＧＡＧＴＣＡＡＧＴ  ＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡ
３０１  ＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣ  ＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡ  ＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣ  ＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴ  ＧＴＧＣＣＡＧＡＡＡ
３５１  ＴＡＧＡＧＣＣＴＡＣ  ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＧ  ＡＧＧＧＧＧＧＴＡＴ  ＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧ  ＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡ
４０１  ＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣ  ＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：）
ＬＴ１０７およびＬＴ１０８の重鎖は、タンパク質レベルにて９３．４％同一であり、ＩｇＢＬＡＳＴ分析により、それらは類似のＶ−Ｄ−Ｊ組換え事象から派生したことが示唆される。以下に、ＬＴ１０７（上）とＬＴ１０８（下）重鎖可変ドメイン間の整列を示す。
【化７】
2012514458.tif 000009
【０３８３】
以下に、ＬＴ１０８成熟軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳ  ＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴ  ＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮ ＴＹＬＮＷＦＱＱＫＰ  ＧＫＳＰＭＴＬＩＹＲ
５１  ＡＤＲＬＬＤＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤ  ＹＳＬＴＩＳＳＬＥＤ  ＥＤＭＧＩＹＹＣＱＱ ＹＤＤＦＰＬＴＦＧＡ
１０１  ＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：）
【０３８４】
これはマウスサブグループＶκ軽鎖である。これは、タンパク質レベルにて、ＬＴ１０７軽鎖と１００％同一である。以下に、成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４５０由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード軽鎖は、ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＩＬＬＬＷＦＰＧＩＫＣ（配列番号）である）。
１  ＡＴＧＧＴＡＴＣＣＴ ＣＡＧＣＴＣＡＧＴＴ ＣＣＴＴＧＧＡＡＴＣ ＴＴＧＴＴＧＣＴＣＴ ＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧ
５１  ＴＡＴＣＡＡＡＴＧＴ  ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡ  ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ  ＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣ  ＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴ
１０１  ＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡ  ＧＡＧＡＧＴＣＡＣＴ  ＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡ  ＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴ
１５１  ＡＣＣＴＡＴＴＴＡＡ  ＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡ  ＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡ  ＧＧＧＡＡＡＴＣＴＣ  ＣＴＡＴＧＡＣＣＣＴ
２０１  ＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴ  ＧＣＡＧＡＣＡＧＡＴ  ＴＧＴＴＡＧＡＴＧＧ  ＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡ  ＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧ
２５１  ＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣ  ＴＧＧＧＣＡＡＧＡＴ  ＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡ  ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧ  ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴ
３０１  ＧＡＡＧＡＴＡＴＧＧ  ＧＡＡＴＴＴＡＣＴＡ  ＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧ  ＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴ  ＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣ
３５１  ＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴ  ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣ  ＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡ  Ａ（配列番号：）
これは、ＬＴ１０７の軽鎖と単一のヌクレオチドが異なる、すなわち残基Ｅ８１のコドンにおいてサイレント不安定位置が変化している。
【０３８５】
以下は、９Ｂ４成熟重鎖可変ドメインタンパク質配列であり、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧ  ＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬ  ＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳ ＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲ  ＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬ
５１  ＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲ ＹＮＰＳＬＲＳＲＬＴ  ＩＳＫＤＴＳＲＮＱＶ  ＦＬＫＩＴＳＶＤＴＡ  ＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲ
１０１  ＥＧＹＹＧＳＳＦＤＦ ＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴ  ＶＳＳ
抗体９Ｂ４の重鎖は、マウスサブグループＩ（Ｂ）重鎖である。
【０３８６】
以下に、９Ｂ４重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ５７３由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード重鎖はＭＧＲＬＴＦＳＦＬＬ  ＬＩＶＰＡＹＶＬＳ（配列番号）である）。
１  ＡＴＧＧＧＣＡＧＡＣ ＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣ ＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧ ＣＴＧＡＴＴＧＴＣＣ ＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴ
５１  ＣＣＴＴＴＣＣＣＡＧ  ＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡ  ＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧ  ＣＣＣＴＧＧＧＡＴＡ  ＴＴＧＣＡＧＣＣＣＴ
１０１  ＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴ  ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴ  ＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴ  ＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣ  ＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴ
１５１  ＴＣＴＧＧＧＡＴＧＧ  ＧＴＧＴＧＡＧＣＴＧ  ＧＡＴＴＣＧＴＣＡＧ  ＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡ  ＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡ
２０１  ＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡ  ＣＡＣＡＴＴＴＡＣＴ  ＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡ  ＣＡＡＧＣＧＣＴＡＴ  ＡＡＣＣＣＡＴＣＣＣ
２５１  ＴＧＡＧＧＡＧＣＣＧ  ＧＣＴＣＡＣＡＡＴＣ  ＴＣＣＡＡＧＧＡＴＡ  ＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡ  ＣＣＡＧＧＴＡＴＴＣ
３０１  ＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡ  ＣＣＡＧＴＧＴＧＧＡ  ＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴ  ＡＣＴＧＣＣＡＣＡＴ  ＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣ
３５１  ＴＣＧＡＡＧＡＧＡＧ  ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧ  ＧＴＡＧＴＡＧＣＴＴ  ＣＧＡＣＴＴＣＧＡＴ  ＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ
４０１  ＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣ  ＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣ  ＴＣＣＴＣＴ
【０３８７】
以下に、ＬＴ９Ｂ４成熟軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示し、ＣＤＲを下線で示す。
１  ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩ  ＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴ  ＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳ ＹＭＩＷＹＱＱＫＰＧ  ＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴ
５１  ＳＳＬＡＳＧＶＰＴＲ  ＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹ  ＳＬＴＩＳＲＶＥＡＡ  ＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷ ＳＹＮＰＬＴＦＧＡＧ
１０１  ＴＫＬＥＬＫ
【０３８８】
これはマウスサブグループＶＩκ軽鎖である。以下に、成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ９Ｂ４由来）のＤＮＡ配列を示し、そのシグナル配列を下線で示す（シグナルコード軽鎖は、ＭＤＬＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＫＭＳＲＧ（配列番号：）である）。
１  ＡＴＧＧＡＴＴＴＡＣ ＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴ ＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣ ＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡ ＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴ
５１  ＣＡＡＡＡＴＧＴＣＣ ＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡ  ＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣ  ＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ  ＧＣＡＡＴＣＣＴＧＴ
１０１  ＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣ  ＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧ  ＧＴＣＡＣＡＡＴＧＡ  ＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣ  ＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴ
１５１  ＧＴＧＡＧＴＴＡＣＡ  ＴＧＡＴＣＴＧＧＴＡ  ＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧ  ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴ  ＣＣＣＣＣＡＡＡＣＣ
２０１  ＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴ  ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡ  ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＣ  ＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴ  ＡＣＴＣＧＣＴＴＣＡ
２５１  ＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧ  ＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣ  ＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣ  ＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧ  ＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧ
３０１  ＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧ  ＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡ  ＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧ  ＣＡＧＴＧＧＡＧＴＴ  ＡＴＡＡＣＣＣＧＣＴ
３５１  ＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴ  ＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡ  ＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴ  ＧＡＡＡ
【０３８９】
ＣＤＲコンセンサス配列
様々な抗ＬＴα１β２抗体の配列分析により、ＣＤＲ内のコンセンサス配列をいくつか特定した。表１に重鎖配列のために特定したコンセンサス配列を記載し、表２に軽鎖配列のために特定したコンセンサス配列を記載する。
【表２−１】
2012514458.tif 000010
【表２−２】
2012514458.tif 000011
【表３−１】
2012514458.tif 000012
【表３−２】
2012514458.tif 000013
【表３−３】
2012514458.tif 000014
（実施例２）
【０３９０】
抗リンホトキシン（ＬＴ）抗体のインビトロ活性
ＩＬ−８放出アッセイ
ＩＬ−８放出アッセイを用いて、実施例１に記載の抗ＬＴ抗体の機能的活性を決定した。ＩＬ−８放出アッセイは、Ａ３７５細胞（ヒト黒色腫細胞系）上の細胞表面リンホトキシンベータ受容体に可溶性組換えヒトリンホトキシンα１β２が結合後に観察されるＩＬ−８分泌に基づく。ＩＬ−８放出アッセイにより、可溶性リンホトキシンα１β２へ結合し、リンホトキシンベータ受容体への結合を防止することによりこのＩＬ−８分泌をブロックする抗体能を測定する。次いで、培地上清中に分泌されるＩＬ−８をＥＬＩＳＡアッセイにより測定する。
【０３９１】
抗体を適切な濃度に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート中、可溶性組換えヒトリンホトキシンα１β２（１７０ｎｇ／ｍｌ）で室温で１時間インキュベーションした。リンホトキシンα１β２濃度をＩＬ−８放出の最大量を決定する滴定実験により至適化した。
【０３９２】
次いで、１５０００〜２００００個のＡ３７５細胞を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で５％ＣＯ２で１７時間インキュベーションした。インキュベーション期間の終了時、プレートを遠心分離し、上清を回収した。上清のＩＬ−８濃度を標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにて試験した。ＩＬ−８濃度を抗体濃度に対してプロットし、データの４変数曲線適合からＩＣ５０を決定した（阻害曲線については、図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。表３に各抗体のＩＣ５０計算値を記載する。ＩＣ５０値の計算において、抗体濃度は、前インキュベーション工程中にＬＴα１β２で示す（細胞および４倍低い緩衝液添加後の抗体濃度ではない）。
【表４】
2012514458.tif 000015
【０３９３】
ＬＴα３  ＥＬＩＳＡ
加えて、結合実験により、実施例１に記載の抗ＬＴ抗体にて、ｍＡｂ  ＬＴ１０１／ＬＴ１０３のみＬＴα３（可溶性ホモ三量体）と結合し、他は結合しなかったことが明らかになった。ＭＡｂ  ＬＴ１０１／ＬＴ１０３は、以下のアッセイを用いて測定したところ、ＬＴα１β２−ＬＴΒＲ相互作用をブロックできた（最大約７０％ブロック）。しかしながら、ＬＴ１０１／１０３は、（ＥＬＩＳＡ形式のブロックにおいて評価した）ＬＴα３とＴＮＦＲ−Ｉｇ（ｐ５５）間の相互作用はブロックできなかった。
【０３９４】
ＬＴα３  ＥＬＩＳＡにおいて、マイクロタイタープレートをＬＴα３（１または５μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液）でコーティングし、次いで非特異的な結合部位を１％カゼイン緩衝液でブロックした。試料（抗体、受容体−Ｉｇ）を添加して、結合をＨＲＰ−複合抗マウスＩｇ抗体で検出した。ＬＴα３とＴＮＦＲ−ｈＩｇ（ｐ５５）間の相互作用をブロックするｍＡｂ能を評価するため、プレートをＬＴα３でコーティングし、上記のようにブロックした。ＴＮＦＲ−Ｉｇ添加の３０分前に、プレートに連続希釈抗体を添加した。ＴＮＦＲ−ｈＩｇのプレート結合ＬＴα３への結合をＨＰＲ複合抗ヒトＩｇ抗体にて検出した。
【０３９５】
ＬＴΒＲ−Ｉｇブロックアッセイ（ＩＩ−２３アッセイ）
ＩＩ−２３細胞を５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ、５％ＣＯ２で３７℃で４時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、５００，０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。抗体を適切な濃度に希釈し、ＩＩ−２３細胞に添加した。４℃で３０分間インキュベーション後、ビオチン標識したＬＴβＲ−Ｉｇを各ウェルに添加して最終濃度をｌμｇ／ｍｌとした。細胞を４℃でさらに３０分間インキュベーションしてから、３回洗浄する。ストレプトアビジン−ＰＥを１／５００に希釈し、各ウェルに添加して４℃で１時間インキュベーションした。細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳ分析により読み込んだ。平均蛍光度を抗体濃度に対してプロットし、データの４変数曲線適合からＩＣ５０を決定する。
【０３９６】
ＩＩ−２３アッセイにおいて、９０％超の効能を有するｍＡｂ（ＬＴ１０５、９Ｂ４  ＬＴ１０２、Ａｌ．Ｄ５、およびＡ０Ｄ９を含む）をいくつか特定した。ＩＩ−２３アッセイにおいて、ｍＡｂ  ＬＴ１０２およびＬＴ１０５のブロックは９８％超であった。図４に示すように、ＩＩ−２３ブロックアッセイにおいて、ＬＴ１０２およびＬＴ１０５は、抗ＬＴ抗体Ｂ９（米国特許第５，９２５，３５１号を参照されたい）、Ｃ３７、およびＢ２７（Ｃ３７とＢ２７は両方ともＢｒｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４：３３に記載されている）と比較して優れた効能を示した。データの概要を表４に示す。
【表５】
2012514458.tif 000016
【０３９７】
交差反応
ＬＴ１０５、９Ｂ４およびＡ１Ｄ５は、ＬＴ１０２が低い安定期で結合したように、カニクイザル（オナガザル科）由来のＬＴへも結合した。一部の抗ＬＴｍＡｂの交差反応評価の概要を下表５に記載する。先行技術のある抗体はカニクイザルＬＴ（例えば、Ｂ９）に結合しなかったことは注目に値する。
【表６】
2012514458.tif 000017
【０３９８】
エピトープ分析
交差ブロック実験を実施して、実施例１に記載の新規抗ＬＴ抗体の結合したエピトープを決定した。当技術分野で知られている抗ＬＴ抗体の交差反応も決定した。表６に交差ブロック試験の概要を提示する。
【表７】
2012514458.tif 000018
【０３９９】
表６に記載のとおり、新規抗ＬＴ抗体間の交差反応は限られていた。さらに、ＬＴ１０２、ＬＴ１０５、９Ｂ４、ＬＴ９Ｂ４、ＬＴ１０７、Ａ１Ｄ５、Ａ０Ｄ９はすべて抗ＬＴ抗体Ｂ９、Ｃ３７、およびＢ２７と異なってエピトープと結合した。
【０４００】
ＬＴ１０２は、ヒトＬＴと比較して、カニクイザルＬＴとより低い安定期で結合した。この結果により、ＬＴ１０２の臨界接触点（１つまたは複数）はカニクイザルＬＴとヒトＬＴ間の非相同領域にある可能性が高いことが示唆された。したがって、Ｄ１５１Ｒ／Ｑ１５３Ｒ；Ｒ１９３Ａ／Ｒ１９４Ａ；Ｄ１５１Ｒ／Ｑ１５３Ｒ／Ｒ１９３Ａ／Ｒ１９４Ａ；ＰＬＫ（９６、９７、９８）ＷＭＳ；ＴＴＫ（１０６、１０７、１０８）ＡＳＱ；ＴＴＫ（１０６、１０７、１０８）ＡＷＱ；ＦＡ（２３１、２３２）ＹＲ；Ｔ１１４Ｒ；ＤＡＥ（１２１、１２２、１２３）ＰＴＨ；およびＰ１７２Ｒのアミノ酸置換を含むヒトＬＴβの変異体型は、分子モデリングに基づき、この領域に設計した。
【０４０１】
この結果により、ＬＴΒＲ−Ｆｃ（陽性対照）は１００ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌの両濃度にて変異ＬＴパネルのすべてのメンバーへ結合したことが示された。しかしながら、抗体ＬＴ１０２は（ＬＴΒＲ−Ｆｃ陽性対照と同一濃度にて）、変異ＬＴパネルのすべてのメンバーのうち変異Ｒ１９３Ａ／Ｒ１９４ＡおよびＤ１５１Ｒ／Ｑ１５３Ｒ／Ｒ１９３Ａ／Ｒ１９４Ａは除いて結合した。したがって、残基Ｒ１９３およびＲ１９４はヒトＬＴへのＬＴ１０２結合にとって重要である。
【０４０２】
抗体ＬＴ１０５は、カニクイザルＬＴには結合するがマウスＬＴには結合しないことが見出された。この結果により、ＬＴ１０５の臨界接触点（１つまたは複数）はカニクイザルＬＴとマウスＬＴ間の非相同領域内にある可能性が高いことが示唆された。ヒトＬＴの変異形態は、（ＬＴΒＲとの相互作用の可能性に基づき）この領域内に設計した。Ｄ１５１Ｒ／Ｑ１５３Ｒ；Ｒ１９３Ａ／Ｒ１９４Ａ；Ｄ１５１Ｒ／Ｑ１５３Ｒ／Ｒ１９３Ａ／Ｒ１９４Ａ；ＰＬＫ（９６、９７、９８）ＷＭＳ；ＴＴＫ（１０６、１０７、１０８）ＡＳＱ；ＴＴＫ（１０６、１０７、１０８）ＡＷＱ；ＦＡ（２３１、２３２）ＹＲ；Ｔ１１４Ｒ；ＤＡＥ（１２１、１２２、１２３）ＰＴＨ；およびＰ１７２Ｒのアミノ酸置換を含むヒトＬＴの変異体型は、分子モデリングに基づき設計した。
【０４０３】
この結果により、ＬＴΒＲ−Ｆｃ（陽性対照）は１００ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌの両濃度にて変異ＬＴパネルのすべてのメンバーへ結合したことが示された。しかしながら、抗体ＬＴ１０５は、変異ＰＬＫ（９６、９７、９８）ＷＭＳ；ＴＴＫ（１０６、１０７、１０８）ＡＳＱ；およびＴＴＫ（１０６、１０７、１０８）ＡＷＱとは結合しなかった。したがって、Ｐ９６／Ｌ９７／Ｋ９８およびＴ１０６／Ｔ１０７／Ｋ１０８はＬＴのＬＴ１０５への結合にとって重要であることが見出された。９Ｂ４はＬＴ１０５と交差競合し、この結合は、ＬＴβに対するＰ９６／Ｌ９７／Ｋ９８変異により影響を受けるが、１０６位、１０７位、または１０８位の変異による影響は受けないことが見出された。
【０４０４】
結論として、ヒトＬＴβの変異形態を用いたＬＴ１０２、ＬＴ１０５、９Ｂ４およびＡ１Ｄ５のエピトープマッピングにより、Ｒ１９３／Ｒ１９４はＬＴ１０２結合にとって重要であり、Ｐ９６／Ｌ９７／Ｋ９８およびＴ１０６／Ｔ１０７／Ｋ１０８はＬＴ１０５および９Ｂ４結合にとって重要な残基であることが示された。類似の変異試験により、残基Ｐ１７２はＡ１Ｄ５のヒトＬＴへの結合にとって重要であり、残基Ｄ１５１／Ｑ１５３はＬＴ１０７およびＡ０Ｄ９結合にとって重要であることが明らかになった。
【０４０５】
ＬＴヘテロ三量体の図解を図６に記載する。サブユニットＬＴα上、Ｄ５０ＮおよびＹ１０８Ｆ変異は、αβ／βα裂け目側を定義する。加えて、ＬＴ１０５結合をブロックするＬＴＢ変異は、Ｙ１０８Ｆ部位に密接して整列する。
（実施例３）
【０４０６】
抗リンホトキシン（ＬＴ）抗体のインビボ活性
以下の物質および方法を本実施例に使用した。
マウス：ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ仔（生後７２時間未満）に照射（１００ラド）して、直後に３×１０４ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞をＲＯ洞注射した。詳細については、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２４：２５を参照されたい。
試薬：ＬＴ１０２、ＬＴ１０５、およびＢ９は、マウス抗ヒトＬＴα１β２（ｍＩｇＧｌ）抗体（ＢＩＩＢ、マウスＬＴと交差なし）である。ＢＢＦ６は、ハムスター抗マウスＬＴα１β２抗体（ＢＩＩＢ、ヒトＬＴと交差なし）である。ＬＴ−ＬＴΒＲ相互作用ブロックのために陽性対照としてマウスＬＴΒＲ−ｍＩｇＧｌを用いた（マウスＬＴの約２倍低い親和性でヒトＬＴと結合することが示された）。ＭＯＰＣ−２１は、アイソタイプ対照抗体として用いたマウスＩｇＧ１抗体である。
投薬：約４ヶ月齢時、再生マウスを群に無作為化した（マウス５匹／群）。マウスにアイソタイプ対照（ＭＯＰＣ−２１）、陽性対照（ｍＬＴΒＲ−ｍＩｇＧｌ）、ＢＢＦ６、Ｂ９、ＬＴ１０２かＬＴ１０５のいずれかを５０μｇ／マウス／週（図２）または２００μｇ／マウス／週（図３）注射した（腹腔内投与、計５回注射、マウス５匹／群）。最終注射から７日後、分析用に組織を回収した。
組織学的分析：ＰＮＡｄ／ＭＥＣＡ７９（ＨＥＶ）：リンパ節組織を１０％中性緩衝液ホルマリンで２４時間固定し、パラフィンブロックで保存した。３μｍ切片を切断し、脱パラフィン化および抗原の回復（Ｄａｋｏ）を実施した。
内因性ペルオキシダーゼブロック（Ｄａｋｏ）およびＦｃブロック（ウサギ血清）後にラット抗マウスＰＮＡｄ一次抗体（１：３００）（ＢＤ）を適用した。ビオチン化ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）およびＡＢＣ標準キット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）を用いた後、ＤＡＢ基質（Ｖｅｃｔｏｒ）で発現させた。マイヤーヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）対比染色を最終工程として行った後、スライドを９５％および１００％アルコールで連続脱水し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔカバースリップで保存した。
シアロアドヘシン／ＭＯＭＡ−１：１０μｍ切片をメチルブタンでＯＣＴ中で凍結した脾臓組織から切断し、−８０℃で保存した。スライドをアセトンで固定し、１×ＴＢＳ中で再水和し、内因性ペルオキシダーゼブロックおよびＦｃブロック（ＢＳＡ）を実施した。切片をラット抗マウスＭＯＭＡ−１  ＦＩＴＣ一次抗体（ｌ：１００）（Ｓｅｒｏｔｅｃ）で染色した。抗ＦＩＴＣ−ＡＰ二次抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いた後、ＡＰ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ）で発現させた。クリスタルマウント（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｏｕｎｔ）を用いて切片をカバーし、室温で一晩空気乾燥させた。
【０４０７】
抗ヒトＬＴα１β２  ｍＡｂの機能的活性を調査するため、歴史的ｍＡｂであるＢ９を参照したＬＴ１０２およびＬＴ１０５、ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞をグラフトしたＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｙｎｕｌｌマウスを使用した。これらのマウスは機能的ヒト免疫系の多くの成分の発現を支持する。特に、キメラマウスは成功裏に再生されており、末梢リンパ節中のＭＥＣＡ−７９＋ＨＥＶおよび脾臓中シアロアドヘシン／ＭＯＭＡ−ｌ＋マクロファージ環を示す。かかる構造は、ＬＴ−ＬＴβＲ依存性であり、したがって、投与した抗ＬＴ抗体活性の読み出し情報として使用できる。
【０４０８】
ＭＯＰＣ−２１を注射したキメラ化（ｈｕＳＣＩＤ）マウスは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに観察されたものに類似の脾臓中シアロアドヘシン／ＭＯＭＡ−ｌ＋好金属マクロファージ環を有することが、ＭＯＭＡ−１染色陽性により証明された（図２Ａおよび２Ｂ参照）。組織学的分析により、ヒトＬＴα１β２ブロックにより脾臓中Ｍ０ＭＡ−１＋好金属マクロファージが損失することが示された。ｈｕＳＣＩＤマウスにｍＬＴβＲ−ｍＩｇを注射したＬＴβＲ阻害により、ＭＯＭＡ−１＋好金属マクロファージの消失に至った（図２Ｃ参照）。これは、抗体ＢＢＦ６を注射したｈｕＳＣＩＤマウスでは反復せず、マウスＬＴα１β２へのｍＡｂをブロックし（図２Ｄ参照）、ＬＴα１β２源がヒトであることが確認された。ヒトＬＴα１β２に対する新規抗体（ＬＴ１０２およびＬＴ１０５）を注射したＨｕＳＣＩＤマウスにおいても、ＭＯＭＡ−１染色の類似の損失が示された（図２Ｆおよび２Ｇ参照）。先行技術の抗ヒトＬＴ抗体であるＢ９による処置では、ＭＯＭＡ−１＋マクロファージ構造は損失しなかったことに留意されたい（図２Ｅ）。
【０４０９】
高内皮細静脈（ＨＥＶ）は、リンパ節への細胞進入を補助する特殊構造である。これらの構造の発現および維持はＬＴβＲ発現に依存することが示されている。組織学的分析により、ＨＥＶはヒトＬＴα１β２のブロックにて低下できたことが示された。キメラモデルにおいて、ＨＥＶは同様に野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）およびＭＯＰＣ−２１を注射したｈｕＳＣＩＤマウスに存在することが示され（図３Ａ、Ｂ）、それらはＬＴβＲ−Ｉｇ処置（ｍＬＴΒＲ−ｍＩｇＧｌを注射したｈｕＳＣＩＤマウス）で損失したため、低頻度ではあるが同様にＬＴΒＲシグナル伝達に依存することが示された（図３Ｃ）。予想どおり、ｈｕＳＣＩＤマウスへの抗マウスＬＴα１β２  ｍＡｂ（ＢＢＦ６）投与は効果がなかった（図３Ｄ）。ＬＴ１０２かＬＴ１０５のいずれかを注射したｈｕＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＬＴα１β２のブロックによりＨＥＶは有意に低下し（図３Ｆおよび３Ｇ）、一方、先行技術の抗体Ｂ９による処置では、ＨＥＶ構造に対して最小限の効果しか得られなかった（図３Ｅ）。
【０４１０】
結論として、新規抗ヒトＬＴ抗体であるＬＴ１０２およびＬＴ１０５は、ヒト疾患の治療にとって重要である可能性が高い対象などに対し、先行技術のｍＡｂであるＢ９に勝るインビボ機能的活性を有することが示された。これにより、低減した密度のＣＤ１６９＋（シアロアドヘシン／ＭＯＭＡ−ｌ／Ｓｉｇｌｅｃ−１）マクロファージにより証明された。この結論は、低減したＨＥＶ密度および機能的ＰＮＡｄ／ＭＡｄＣＡＭ（リンパ節への輸送を中断した）によっても支持される。
（実施例４）
【０４１１】
抗リンホトキシン（ＬＴ）抗体ＬＴ１０５のヒト化
マウスＬＴ１０５軽鎖および重鎖の配列を、以下に説明する。
【化８】
2012514458.tif 000019
【０４１２】
マウス可変領域の分析
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原に結合する可能性が最も高くかつ再加工した抗体に保持されているはずである残基を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１）に応じる配列に定義される。ＣＤＲは主要残基がＣＤＲループの広範囲の立体構造を決定する正準クラス（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に該当する。これらの残基は、再加工した抗体中にほぼ常に保持される。重鎖および軽鎖のＣＤＲを以下のとおり正準クラスに分類した。
【化９】
2012514458.tif 000020
これらのＣＤＲクラスにとって重要である正準残基を表４に示す。
【表８】
2012514458.tif 000021
【０４１３】
ＢＬＡＳＴプログラムならびにコンパイルされたコンセンサスおよび生殖系列ブラストタンパク質配列データベースを用いて、マウスとヒトサブグループの可変軽鎖および重鎖をコンセンサス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９１）および生殖系列配列（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）を比較した。
【０４１４】
可変軽鎖は、マウスサブグループΚ３のメンバーであり（１１１個のアミノ酸重複にて８９％同一である；ＣＤＲ−Ｌ３は通常より残基１個分短い）、以下に示すとおり、マウスｍｕ２１−５生殖系列に由来する可能性が高い（９９個のアミノ酸重複にて９４％同一）。
ｍｕ２１−５
ＬＴ１０５：１    ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳ  ６０
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤ＋ＹＧ  ＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳ
Ｍｕ２１−５：１  ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳ  ６０
ＬＴ０１５：６１    ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＤＤＶＡＴＦＹＣＱＱＳＮＫＤＰ  ９９
ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥ  ＤＤＶＡＴ＋ＹＣＱＱＳＮ＋ＤＰ
Ｍｕ２１−５：６１  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＤＤＶＡＴＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰ  ９９
【０４１５】
可変重鎖は、マウスサブグループ重１Ａのメンバーであり（１１７個のアミノ酸重複にて８１％同一である；ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ２は通常よりそれぞれ残基１個分短い）、以下に示すとおり、マウスＶＨ３６−６０生殖系列に由来する可能性が高い（９７個のアミノ酸重複にて８１％同一）。
ｍｕＶＨ３６−６０
ＬＴ１０５：１
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＳＶＴＧＹＳＩＴＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＧＭＧＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹ  ６０
＋ＶＱＬＱＥＳＧＰ  ＬＶＫＰＳＱ＋ＬＳＬＴＣＳＶＴＧ  ＳＩＴＳ  Ｙ  ＷＮＷＩＲ＋ＦＰＧＮＫＬＥ  ＭＧＹＩＳＹ  ＧＳＹ
ｍｕＶＨ３−６０：１  ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＳＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＴＳＤＹ−ＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＫＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹ  ５９
ＬＴ１０５：６１        ＮＰＳＬＫＮＲＩＳＩＴＲＤＳＳＫＮＱＦＦＬＫＬＮＳＶＴＡＥＤＳＧＴＹＹＣＡＲ  ９８
ＮＰＳＬＫ＋ＲＩＳＩＴＲＤ＋ＳＫＮＱ＋＋Ｌ＋ＬＮＳＶＴ＋ＥＤ＋  ＴＹＹＣＡＲ
ｍｕＶＨ３−６０：６０  ＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲ  ９７
【０４１６】
可変軽鎖は、ヒトサブグループΚ４と相関し（１１１個のアミノ酸重複にて６７％同一である；ＣＤＲ−Ｌ１は通常より残基２個分短い）、以下に示すとおり、ヒトＢ３生殖系列に最も近い（９９個のアミノ酸重複にて６６％同一）。
ｈｕＢ３
ＬＴ１０５：１  ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶ−−ＤＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬ  ５８
ＤＩＶ＋ＴＱＳＰ  ＳＬＡＶＳＬＧ＋ＲＡＴＩ＋Ｃ＋＋Ｓ＋ＳＶ      ＋      ＋＋＋    ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ  ＡＳ
ｈｕＢ３：１    ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲ  ６０
ＬＴ１０５：５９  ＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＤＤＶＡＴＦＹＣＱＱＳＮＫＤＰ  ９９
ＥＳＧ＋Ｐ  ＲＦＳＧＳＧＳ  ＴＤＦＴＬＴＩ＋  ＋＋  ＋ＤＶＡ  ＋ＹＣＱＱ          Ｐ
ｈｕＢ３：６１    ＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰ  １０１
【０４１７】
可変重鎖は、ヒトサブグループ重２と相関し（１１４個のアミノ酸重複にて６９％同一である；ＣＤＲ−Ｈ１は通常より残基１個分短い；ＣＤＲ−Ｈ２は通常より残基３個分短い）、以下に示すとおり、ヒトＶＨ４−２８生殖系列に最も近い（９８個のアミノ酸重複にて６８％同一）。
ｈｕＶＨ４−２８
ＬＴ１０５：２
ＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＳＶＴＧＹＳＩＴＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＧＭＧＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹＮ  ６１
ＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳ  ＋ＬＳＬＴＣ＋Ｖ＋ＧＹＳＩ＋Ｓ      ＋Ｗ  ＷＩＲＱ  ＰＧ    ＬＥ  ＋ＧＹＩ    Ｙ  ＧＳＹＮ
ｈｕＶＨ４−２８：２
ＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＩＳＳＳＮＷＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮ  ６１
ＬＴ１０５：６２        ＰＳＬＫＮＲＩＳＩＴＲＤＳＳＫＮＱＦＦＬＫＬＮＳＶＴＡＥＤＳＧＴＹＹＣＡＲ  ９８
ＰＳＬＫ＋Ｒ＋＋＋＋  Ｄ＋ＳＫＮＱＦ  ＬＫＬ＋ＳＶＴＡ
Ｄ＋    ＹＹＣＡＲ
ｈｕＶＨ４−２８：６２  ＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＶＤＴＡＶＹＹＣＡＲ  ９８
【０４１８】
可変領域構造のモデリング
このＬＴ１０５可変領域モデルのヒト化を、モデラー、ＳＣＷＲＬ側鎖配置、ならびにＧｒｏｍｏｓ９６  ４３ｂ１パラメータ集合との真空における簡単な最小化を用いて、軽鎖および重鎖の結晶構造ＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｆ５８に基づき構築した。２Ｆ５８とＬＴ１０５のＣＤＲおよびフレームワーク領域の長さは同じである。
【０４１９】
再加工した可変領域の分析
軽鎖および重鎖の抗体アクセプターフレームワーク配列を選別するため、正準、接触面およびベニヤゾーン残基におけるマウスＬＴ１０５配列との類似性が高い；可能な場合、同じ長さのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ３を除く）；最少数の復帰変異（すなわち、ヒトアクセプターのフレームワーク残基種類からＬＴ１０５成熟マウス抗体のフレームワーク残基種類への変化）候補を特定した。ＦＲ４フレームワーク領域においてヒトコンセンサス残基で埋めたヒト生殖系列配列を同様に考慮した。
選別したフレームワーク：（コンセンサスヒトＫＶ３  ＦＲ４を有する）ヒト生殖系列配列ｈｕＬ６およびヒトｇｉ｜３００４６８８をそれぞれ軽鎖および重鎖のアクセプターフレームワークとして複数の候補から選択した（下記配列を参照されたい）。アクセプターフレームワークは安定したＫＶ３からより離れており、ＨＶ３コンセンサスクラスをヒト化設計の物理化学特性を改善するために選別した。
＞ＬＴ１０５Ｌ
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＤＤＶＡＴＦＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
＞ｈｕＬ６
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ
＞コンセンサスヒトＫＶ３  ＦＲ４領域
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
＞ＬＴ１０５Ｈ
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＳＶＴＧＹＳＩＴＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＧＭＧＹＩＳ ＹＤＧＳＮＮＹＮＰＳＬＫＮＲＩＳＩＴＲＤＳＳＫＮＱＦＦＬＫＬＮＳＶＴＡＥＤＳＧＴＹＹＣＡＲＤＡＹＳＹＧＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞ｇｉ｜３００４６８８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＥＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＹＩＳＮＧＤＮＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＡＫＮＳＬＹＬＨＭＨＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＧＧＮＧＹＦＹＹＹＡＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【０４２０】
ＬＴｌ０５のヒト化設計
３つの異なる型のヒト化ＬＴ１０５軽鎖を以下に記載する。ヒト化ＬＴ１０５軽鎖は、生殖系列ｈｕＬ６フレームワーク／／コンセンサスヒトＫＶ４ＦＲ４／／ＬＴ１０５  Ｌ  ＣＤＲを含む。下記Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の復帰変異を小文字の太字フォントで示す。ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【化１０】
2012514458.tif 000022
【０４２１】
４つの異なる型のヒト化ＬＴ１０５重鎖を以下に記載する。ヒト化ＬＴ１０５重鎖はｇｉ｜３００４６８８フレームワーク／／ＬＴ１０５  Ｈ  ＣＤＲを含む。下記Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４の復帰変異を小文字の太字フォントで示す。ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【化１１】
2012514458.tif 000023
（実施例５）
【０４２２】
抗リンホトキシン（ＬＴ）抗体ＬＴ１０２のヒト化
マウスＬＴ１０２軽鎖および重鎖の配列を、以下に説明する。
【化１２】
2012514458.tif 000024
【０４２３】
マウス可変領域の分析
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原に結合する可能性が最も高くかつ再加工した抗体に保持されているはずである残基を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１）に応じた配列により定義する。ＣＤＲは主要残基がＣＤＲループの広範囲の立体構造を決定する正準クラス（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９）に該当する。これらの残基は、再加工した抗体中にほぼ常に保持される。重鎖および軽鎖のＣＤＲを以下のとおり正準クラスに分類した。
【化１３】
2012514458.tif 000025
これらのＣＤＲクラスにとって重要である正準残基を表１に示す。
【表９】
2012514458.tif 000026
【０４２４】
マウスおよびヒトサブグループのための可変軽鎖および重鎖をＢＬＡＳＴプログラムを用いて、コンセンサス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９１）および生殖系列配列（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）を含むデータベースを検索して、コンセンサスおよび生殖系列配列と比較した。生殖系列との比較のためＣＤＲは配列から除外した。
【０４２５】
ＬＴ１０２の可変軽鎖は、マウスサブグループΚ２のメンバーであり（１１２個のアミノ酸重複にて９４％同一）、マウスｍｕｃｒｌ生殖系列に由来する可能性が高い（１００個のアミノ酸重複にて９７％同一）。ＬＴ１０２のＶＬとｍｕｃｒｌのＶＬ間の比較を以下に示す。
ｍｕｃｒｌ
クエリー：１                      ＤＶＬＭＴＱＴＰＲＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦ  ６０
ＤＶＬＭＴＱＴＰ  ＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱ＋ＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦ
Ｓｂｊｃｔ（データベース配列）：１  ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦ  ６０
クエリー：６１          ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＦＰ  １００
ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨ  Ｐ
データベース配列：６１  ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰ  １００
【０４２６】
可変重鎖は、マウスサブグループ重３Ｄのメンバーである（１１８個のアミノ酸重複にて８０％同一）、マウスＶＨ３７．１生殖系列に由来する可能性が高い（９８個のアミノ酸重複にて８６％同一）。ＬＴ１０２のＶＨとＶＨ３７．１のＶＨ間の比較を以下に示す。
ｍｕＶＨ３７．１
クエリー：１          ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＩＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＧＤＧＴＳＹＴＨＹ  ６０
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡ  ＳＧＦＴＦＳ  Ｙ  Ｍ  Ｗ＋ＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩ  Ｇ  ＳＹＴ＋Ｙ
データベース配列：１  ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＳＹＴＹＹ  ６０
クエリー：６１          ＰＤＳＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＹＡＴＮＮＬＹＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲ  ９８
ＰＤＳＶ＋ＧＲＦＴＩＳＲＤ  Ａ  ＮＮＬＹＬＱＭ＋ＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲ
データベース配列：６１  ＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲ  ９８
【０４２７】
可変軽鎖は、ヒトサブグループΚ２と相関し（１１２個のアミノ酸重複にて７７％同一）、ヒトＡ３生殖系列に最も近い（１００個のアミノ酸重複にて７６％同一）。ＬＴ１０２のＶＬとｈｕＡ３のＶＬの比較を以下に示す。
＞ｈｕＡ３
クエリー：１          ＤＶＬＭＴＱＴＰＲＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦ  ６０
Ｄ＋＋ＭＴＱ＋Ｐ  ＳＬＰＶ＋  Ｇ＋  ＡＳＩＳＣＲＳＳＱ＋＋＋ＨＳＮＧ      ＹＬ＋ＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰ＋ＬＬＩＹ    ＳＮＲ
データベース配列：１  ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡ  ６０
クエリー：        ６１  ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＦＰ  １００
ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤ＋ＧＶＹＹＣ  Ｑ        Ｐ
データベース配列：６１  ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰ  １００
【０４２８】
可変重鎖は、ヒトサブグループ重３と相関し（１１７個のアミノ酸重複にて７２％同一）、ヒトＶＨ３−２１生殖系列に最も近い（９８個のアミノ酸重複にて７３％同一）。ＬＴ１０２のＶＨとｈｕＶＨ３−２１のＶＨの比較を以下に示す。
＞ｈｕＶＨ３−２１
クエリー：１          ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＩＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＧＤＧＴＳＹＴＨＹ  ６０
ＥＶ＋ＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬ＋ＬＳＣＡ  ＳＧＦＴＦＳ  Ｙ  Ｍ  Ｗ＋ＲＱ  Ｐ  Ｋ  ＬＥＷＶ＋＋Ｉ      ＋ＳＹ  ＋Ｙ
データベース配列：１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹ  ６０
クエリー：        ６１  ＰＤＳＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＹＡＴＮＮＬＹＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲ  ９８
ＤＳＶ＋ＧＲＦＴＩＳＲＤ  Ａ  Ｎ＋ＬＹＬＱＭ  ＳＬＲ＋ＥＤＴＡ＋ＹＹＣＡＲ
データベース配列：６１  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ  ９８
【０４２９】
可変領域構造のモデリング
ＬＴ１０２のヒト化においてＬＴ１０２可変領域モデルを、モデラー、ＳＣＷＲＬ側鎖配置、ならびにＧｒｏｍｏｓ９６  ４３ｂ１パラメータ集合との真空における簡単な最小化を用いて、軽鎖および重鎖の結晶構造ＰＤＢ  ＩＤ  １ＣＬＺに基づき構築した。１ＣＬＺはＣＤＲ−Ｈ３に残基を１個余分に有する。
【０４３０】
再加工した可変領域の分析
方法：軽鎖および重鎖のための抗体アクセプターフレームワーク配列を選別するため、我々は抗体配列データベースおよびクエリーツールを用いて、正準、接触面およびベニヤゾーン残基におけるマウスＬＴ１０２配列との類似性が最も高い適切な鋳型；同じ長さのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ３を除く）；最少数の復帰変異（すなわち、ヒトアクセプターのフレームワーク残基種類からＬＴ１０２成熟マウス抗体のフレームワーク残基種類への変化）、およびいずれの位置（Ｌ４、３８、４３、４４、５８、６２、６５〜６９、７３、８５、９８およびＨ２、４、３６、３９、４３、４５、６９、７０、７４、９２）にも復帰変異がない鋳型を特定した（Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ，  ２０００を参照されたい）。ＦＲ４領域におけるヒトコンセンサス残基で埋めたヒト生殖系列配列も同様に考慮した。
選別したフレームワーク：（コンセンサスＨＵＭＫＶ２  ＦＲ４を有する）ヒト生殖系列配列ｈｕＡ３および（コンセンサスＨＵＭＨＶ３  ＦＲ４を有する）ヒト生殖系列配列ｈｕＶＨ３−１１をそれぞれ軽鎖および重鎖のアクセプターフレームワークとして複数の候補から選択した。配列を以下に記載する。
＞ＬＴ１０２Ｌ
ＤＶＬＭＴＱＴＰＲＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
＞ｈｕＡ３
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ
＞コンセンサスヒトＫＶ２  ＦＲ４領域
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
＞ＬＴ１０２Ｈ
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＩＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＧＤＧＴＳＹＴＨＹＰＤＳＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＹＡＴＮＮＬＹＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＤＬＧＴＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞ｈｕＶＨ３−１１
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
＞コンセンサスヒトＨＶ３  ＦＲ４領域
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
この抗体において、すべての正準残基の復帰変異を回避できたわけではなかった：生殖系列ｈｕＡ３はＬＴ１０２  Ｌと３個の正準残基（Ｌ２、２７ｂ、５１）が異なり、生殖系列ｈｕＶＨ３−１１はＬＴ１０２  Ｈと１個の正準残基（Ｈ２４）が異なる。
【０４３１】
再加工した可変軽鎖の１つの型を設計し、軽および重ＣＤＲグラフト配列に加えて、４つの型の再加工した可変重鎖を示した。重鎖において、第１の型は、最少数の復帰変異を含み、次の型は、より多くの復帰変異を含む（すなわちそれらは最小の「ヒト化」である）。すべての型の重鎖においてマウスＡ１１３を（ヒトＨＶ  ＦＲ４に存在する）Ｓ１１３に置換し、これは復帰変異として分析しなかった。番号付けはカバット体系に従う。
【０４３２】
再加工したＶＬにおける復帰変異
ヒト化ＬＴ１０２（ｈｕＬＴ１０２）の再加工した軽鎖は、生殖系列ｈｕＡ３フレームワーク、コンセンサスヒトＫＶ２  ＦＲ４、ＬＴ１０２  Ｌ  ＣＤＲを含む。ｈｕ１０２の軽鎖の復帰変異は、Ｉ２Ｖを含む。Ｖ２は、ＣＤＲ−Ｌ１を支持する正準残基である。
【０４３３】
再加工したＶＨにおける復帰変異
ヒト化ＬＴ１０２（ｈｕＬＴ０１２）の４つの型の再加工した重鎖は、それぞれ生殖系列ｈｕＶＨ３−１１フレームワーク、コンセンサスヒトＨＶ３  ＦＲ４、およびＬＴ１０２  Ｈ  ＣＤＲを含む。
【０４３４】
ＬＴｌ０２のヒト化設計
ヒト化ＬＴ１０２軽鎖配列は、下記である（復帰変異に関する詳細については、上記を参照されたい）。ＬＴ１０２のヒト化軽鎖は、生殖系列ｈｕＡ３フレームワーク／／コンセンサスヒトＫＶ２  ＦＲ４／／ＬＴ１０２  Ｌ  ＣＤＲを含む。復帰変異を小文字の太字フォントで示す。ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【化１４】
2012514458.tif 000027
【０４３５】
４つの異なる型のヒト化ＬＴ１０２重鎖を以下に記載する。ヒト化ＬＴ１０２重鎖は生殖系列ｈｕＶＨ３−１１フレームワーク／／コンセンサスヒトＨＶ３  ＦＲ４／／ＬＴ１０２  Ｈ  ＣＤＲを含む。下記Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４の復帰変異を小文字の太字フォントで示す。ＣＤＲ（コチア定義を含む）を下線で示す。
【化１５】
2012514458.tif 000028
（実施例６）
【０４３６】
可溶性改善のための改変
ヒト化１０５軽鎖と重鎖の組み合わせであるＬ０  Ｈ１（１０５抗体の第０型の軽鎖／１０５抗体の第１型の重鎖）を発現および安定性試験のために選別した。
Ｌ０
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬ
５１  ＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号：）
Ｈ１
１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＶＳＧＹＳＩＴ  ＳＧＹＹＷＮＷＶＲＱ  ＡＰＧＫＧＬＥＧＩＳ
５１  ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹ  ＮＰＳＬＫＮＲＦＴＩ  ＳＲＤＳＡＫＮＳＦＹ  ＬＨＭＨＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＡ
１０１  ＹＳＹＧＭＤＹＷＧＱ  ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳ  ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ  ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ  ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ  ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ  ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ  ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ  ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１  ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ  ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳ  ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０２  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧ
（配列番号：）
ヒト化１０５のＨ１／Ｌ０型の可溶性は９．９ｍｇ／ｍｌであることが見出された。分子の自己結合（およびしたがって不溶性）に携わると考えられるいくつかの軽鎖ＣＤＲ残基を変異させた。軽鎖のＣＤＲＬ２のカバット５４位のＲがＫに変異した１つの型（Ａ型）、ＣＤＲＬ２のカバット５７位のＮがＳに変異した第の２型（Ｂ型）、ならびにＣＤＲＬ２に両変異を有する第３の型（カバット５４位のＫおよびカバット５７位のＳを含む；Ｃ型）を作製した。Ａ型は２８．６ｍｇ／ｍｌで沈殿物を示さず、Ｂ型は３４．９ｍｇ／ｍｌで沈殿物を示さなかった。
Ａ型
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＮＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｂ型
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬ
５１  ＬＩＹＲＡＳＳＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｃ型
１  ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳ  ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０４３７】
可溶性をさらに改善する試みにおいて、軽鎖のＣ型に見られるＲ５４ＫとＮ５７Ｓ  ＣＤＲＬ２変異の両方を含み、総電荷を増大するために選択される新規フレームワークも含む軽鎖の新規型を作製し、生成配列Ｌ１０を得た。
Ｌ１０
１  ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳ  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
軽鎖のＬ１０型をＨ１と組み合わせた場合に、１００ｍｇ／ｍｌ超の可溶性を示した。
Ｌ１２およびＬ１３を含む追加型の軽鎖も作製した。
Ｌ１２
１  ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＲＱＫＰＧＫＡＰＫＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳ  ＧＶＰＳＲＦＳＧＲＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｌ１３
１  ＤＩＲＬＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＱＲＶＴ  ＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤ  ＮＹＧＩＳＦＭＨＷＹ  ＲＱＫＰＧＫＡＰＫＬ
５１  ＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳ  ＧＶＰＳＲＦＳＧＲＧ  ＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ  ＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ  ＹＣＱＱＳＮＫＤＰＹ
１０１  ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩ  ＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦ  ＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ  ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬ  ＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶ
１５１  ＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ  ＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱ  ＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳ  ＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹ  ＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶ
２０１  ＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｈ１と組み合わせたＬ１２も１００ｍｇ／ｍｌで沈殿物を示さず、Ｈ１と組み合わせたＬ１３は４８ｍｇ／ｍｌで沈殿物を示さなかった。Ｈ１１およびＨ１４を含むさらなる重鎖型も作製した。
Ｈ１１
１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＲＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＶＳＧＹＳＩＴ  ＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱ  ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ
５１  ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹ  ＮＰＳＬＫＮＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＦＹ  ＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤ  ＴＡＡＹＹＣＡＲＤＡ
１０１  ＹＳＹＧＭＤＹＷＧＱ  ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳ  ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ  ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ  ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ  ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ  ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ  ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ  ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１  ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ  ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳ  ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧ
Ｈ１４
１  ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＬＶＫＰＲＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＶＳＧＹＳＩＴ  ＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱ  ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ
５１  ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹ  ＮＰＳＬＫＮＲＦＳＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＦＹ  ＬＫＭＮＲＬＲＡＥＤ  ＳＡＡＹＹＣＡＲＤＡ
１０１  ＹＳＹＧＭＤＹＷＧＱ  ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳ  ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ  ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ  ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ  ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ  ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ  ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ  ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１  ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ  ＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳ  ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ  ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ  ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ  ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ  ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧ
Ｌ１０と、Ｈ１１またはＨ１４との組み合わせは、Ｈ１との組み合わせで観察されたより低い可溶性（それぞれ３．７および２８ｍｇ／ｍｌ超）を示した。さらなる組み合わせも試験した。データを下表に提示する。
【表１０】
2012514458.tif 000029
（実施例７）
【０４３８】
ＬＴへの抗体結合
以下の方法を用いて競合物の存在下におけるＬＴβＲ結合部位の利用可能性を決定した。
【０４３９】
Ｂｉａｃｏｒｅチップ調製。すべての実験をＢｉａｃｏｒｅ３０００機器を用いて実施した。Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキットを製造業者の説明書に従って用いて、抗フラグ抗体Ｍ２をＣＭ５センサーチップ上に固定化した。簡単に述べると、抗体を１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．０）で５０μｇ／ｍｌに希釈し、３０μｌを１：１  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイミド（ＮＨＳ）：１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ）の３０μｌ注射で活性化されているチップ表面上に注射した。次いで、過剰な遊離アミン基を１Ｍエタノールアミンの５０μｌ注射でキャッピングした。典型的な固定化レベルは４０００〜６０００ＲＵであった。すべての試料をアッセイ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％洗剤ｐ−２０＋０．０５％ＢＳＡ）中で調製した。これと同じ緩衝液を、試料分析中に流れる緩衝液として使用した。固定化のため、これと同じ緩衝液からＢＳＡを除いたものを使用した。
Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ。可溶性フラグタグ化ＬＴα１β２をアッセイ緩衝液で２００ｎＭに希釈し、Ｍ２被覆表面上、または背景対照として非被覆表面上に流速２５μｌ／分で注入した。緩衝液が表面上に２５μｌ／分で流しつつ、表面を２分間安定させた。飽和濃度の競合物（すなわち８μＭ  ＬＴβＲ−Ｉｇ、２μＭ抗体ＬＴ１０５、４μＭ抗体Ｂ９、４μＭ抗体ＬＴ１０２または２μＭ抗体９Ｂ４；別々の実験において決定）を２５μｌ／分で３分間注射した。やはりこの表面を流れる緩衝液下で３分間安定させた。安定化後、アッセイ緩衝液中２０μＭ単量体ＬＴβＲを表面上に２５μｌ／分で４分間注入した。次いで、３Ｍ塩酸グアニジンの０．５Ｍ  ＫＣｌ溶液を２回注入して表面を再生成した。
各成分の結合の親和性捕獲したＬＴα１β２に対する化学量論を以下のとおり決定した。
（１）利用可能な競合部位＝［（競合物分子量）／（リガンド分子量）］×（リガンド反応）
（２）競合物結合＝（正味の競合物反応）／（利用可能な競合物部位）
（３）利用可能なＬＴβＲ部位＝［（ＬＴβＲ分子量）／（リガンド分子量）］×（正味のリガンド反応）
（４）ＬＴβＲ結合＝（正味のＬＴβＲ反応）／（利用可能なＬＴβＲ部位）
【０４４０】
これらの方法を用いて、ＬＴα１β２上の２つのＬＴβＲ結合部位を特定し、ＬＴβＲに対する親和性により識別した（部位１は約５０ｎＭの親和性を示し、部位２は約１５００ｎＭの親和性を示した）。
【０４４１】
被験抗体は高い顕性親和性（０．３ｎＭ以上）で結合する一方、被験Ｆａｂ断片（ＬＴ１０５およびＢ９）はインタクト抗体と比較して低い親和性（２ｎＭ以下）で結合する。したがって、各被験抗体は単一のＬＴα１β２三量体に二価的に高い親和性で結合する。
【０４４２】
下表に例証するように、結合したＬＴβＲ−Ｉｇ、ＬＴ１０５、ＬＴ１０２、または９Ｂ４の存在下では利用可能なＬＴβＲ結合部位はなく、Ｂ９の存在下では１つのＬＴβＲ結合部位が利用可能のまま残る。したがって、先行技術のＢ９抗体は二価の高い親和性でＬＴα１β２と相互作用できる一方、１つの受容体結合部位しかブロックできない。一方、（本明細書において、ＬＴのＬＴβＲへの結合をより完全にブロックすることが示されている）結合したＬＴ１０５、ＬＴ１０２、および９Ｂ４抗体の存在下では、利用可能なＬＴβＲ結合部位はない。
【表１１】
2012514458.tif 000030
【０４４３】
均等物
本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等物を当業者は通例の実験のみ用いて認識するか、または確定できるであろう。かかる均等物が以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【図２】
2012514458.tif 000031
【図３】
2012514458.tif 000032
【図１Ａ】
2012514458.tif 000033
【図１Ｂ】
2012514458.tif 000034
【図１Ｃ】
2012514458.tif 000035
【図４Ａ】
2012514458.tif 000036
【図４Ｂ】
2012514458.tif 000037
【図５】
2012514458.tif 000038
【図６】
2012514458.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】平成23年8月30日(2011.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012514458000001.app
【国際調査報告】
2012514458.tif 000040
2012514458.tif 000041
2012514458.tif 000042
2012514458.tif 000043
2012514458.tif 000044
2012514458.tif 000045