(57)【要約】本発明は、ＧＣＲ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）に関する。本発明は、また、ｄｓＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子もしくはベクターを医薬的に許容可能な担体と一緒に含む医薬組成物；ＧＣＲ遺伝子の発現により起こされる疾患を、前記医薬組成物を使用して処置するための方法；及び細胞中でのＧＣＲの発現を阻害するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＣＲ遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％阻害することが可能である二本鎖リボ核酸分子。
【請求項２】
前記二本鎖リボ核酸分子がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が少なくとも部分的にセンス鎖と相補的であり、それにより、センス鎖が、ＧＣＲをコードするｍＲＮＡの少なくとも部分と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、それにおいて、前記配列が（ｉ）前記センス鎖の前記アンチセンス鎖に対する相補性の領域中に位置し、そして（ｉｉ）それにおいて前記配列が３０未満のヌクレオチド長である、請求項１記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項３】
前記センス鎖が、配列番号：８７３、９２９、１０２１、１０２３、９６７、及び９０５に描写されるヌクレオチド核酸配列を含み、そして前記アンチセンス鎖が、配列番号：８７４、９３０、１０２２、１０２４、９６８、及び９０６に描写される核酸配列を含み、それにおいて、前記二本鎖リボ核酸分子が、配列番号：８７３／８７４、９２９／９３０、１０２１／１０２２、１０２３／１０２４、９６７／９６８、及び９０５／９０６からなる群より選択される配列対を含む、請求項１〜２記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項４】
アンチセンス鎖が、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングをさらに含む、請求項３記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項５】
アンチセンス鎖のオーバーハングが、ウラシル又はＧＣＲをコードするｍＲＮＡに相補的であるヌクレオチドを含む、請求項４記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項６】
センス鎖が、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングをさらに含む、請求項３〜５のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項７】
センス鎖のオーバーハングが、ウラシル又はＧＣＲをコードするｍＲＮＡと同一であるヌクレオチドを含む、請求項６記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項８】
前記二本鎖リボ核酸分子が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項９】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、逆位デオキシチミジン、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸、及びヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群より選択される、請求項８記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１０】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、逆位デオキシチミジン、及びデオキシチミジンである、請求項８及び９のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１１】
前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖が、１〜２のデオキシチミジンのオーバーハング及び／又は逆位デオキシチミジンを含む、請求項３〜１０記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１２】
前記センス鎖が、配列番号：３、７、５５、２５、８３、３１、３３、７４７、及び７６４に描写される核酸配列からなる群より選択され、そして前記アンチセンス鎖が、配列番号：４、８、５６、２６、８４、３２、３４、７５３、及び７７２に描写される核酸配列からなる群より選択され、それにおいて、前記二本鎖リボ核酸分子が、配列番号：３／４、７／８、５５／５６、２５／２６、８３／８４、３１／３２、３３／３４、７４７／７５３、及び７６４／７７２からなる群より選択される配列対を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に定義される二本鎖リボ核酸分子に含まれるセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に定義される二本鎖リボ核酸分子に含まれるセンス鎖又はアンチセンス鎖の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む又は請求項１３記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に定義される二本鎖リボ核酸分子、請求項１３記載の核酸分子、又は請求項１４記載のベクターを含む細胞、組織、又は非ヒト生物。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に定義される二本鎖リボ核酸分子、請求項１３記載の核酸分子、請求項１４記載のベクター、又は請求項１５記載の細胞もしくは組織を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
医薬的に許容可能な担体、安定剤、及び／又は希釈剤をさらに含む、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
以下の工程：
（ａ）細胞、組織、又は生物中に、請求項１〜１２のいずれか一項に定義される二本鎖リボ核酸分子、請求項１３記載の核酸分子、又は請求項１４記載のベクターを導入すること；及び
（ｂ）工程（ａ）において産生された細胞、組織、又は生物を、ＧＣＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間にわたり維持し、それにより細胞中でのＧＣＲ遺伝子の発現を阻害すること
を含む細胞、組織、又は生物においてＧＣＲ遺伝子の発現を阻害するための方法。
【請求項１９】
ＧＣＲ遺伝子の発現により起こされる病理学的状態及び疾患を処置、予防、又は管理する方法であって、そのような処置、予防、又は管理を必要とする被験体に、治療的又は予防的に効果的な量の請求項１〜１２のいずれか一項に定義される二本鎖リボ核酸分子、請求項１３記載の核酸分子、請求項１４記載のベクター、及び／又は請求項１６もしくは１７に定義される医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記の被験体がヒトである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
２型糖尿病、肥満、脂質異常症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、高血圧、又はうつ病を処置する際での使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に定義される二本鎖リボ核酸分子、請求項１３記載の核酸分子、請求項１４記載のベクター、及び／又は請求項１６もしくは１７に定義される医薬組成物。
【請求項２２】
２型糖尿病、肥満、脂質異常症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、高血圧、又はうつ病の処置のための医薬組成物の調製のための、請求項１〜１２のいずれか一項に定義される二本鎖リボ核酸分子、請求項１３記載の核酸分子、請求項１４記載のベクター、及び／又は請求項１５記載の細胞もしくは組織の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、及びＧＣＲ遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡ干渉を媒介する際でのそれらの使用に関する。さらに、ＧＣＲ遺伝子の発現に関連する広範囲の疾患／障害（糖尿病、脂質異常症、肥満、高血圧、心臓血管疾患、又はうつ病など）を処置／防止するための前記ｄｓＲＮＡの使用が、本発明の一部である。
【０００２】
グルココルチコイドは、いくつかの生理学的機能（ストレス、免疫、及び炎症反応に対する応答を含む）ならびに肝臓糖新生の刺激及び末梢でのグルコース利用に関与する。グルココルチコイドは、核ステロイドレセプターのファミリーに属する細胞内グルココルチコイドレセプター（ＧＣＲ）を介して作用する。非活性化ＧＣＲは、細胞の細胞質中に位置し、いくつかのシャペロンタンパク質に会合する。リガンドがレセプターを活性化する場合、複合体は細胞核において転位置され、いくつかの遺伝子プロモーター中に位置するグルココルチコイド応答エレメントと相互作用する。レセプターは、ホモ二量体又はヘテロ二量体として細胞核において作用しうる。さらに、いくつかの関連するコアクチベーター又はコレプレッサーも複合体と相互作用しうる。可能な組み合わせのこの大きな範囲は、いくつかのＧＣＲ立体構造及びいくつかの可能な生理学的応答に導き、完全な特異的ＧＣＲ阻害剤として作用することができる小さな化学成分を同定することを困難にする。
【０００３】
病態（糖尿病、クッシング症候群、又はうつ病など）は、中程度から重度のコルチゾン過剰症と関連づけられてきた（Chiodini et al, Eur. J. Endocrinol. 2005, Vol. 153, pp 837-844; Young, Stress 2004, Vol. 7 (4), pp 205-208）。ＧＣＲアンタゴニスト投与は、うつ病（Flores et al, Neuropsychopharmacology 2006, Vol. 31, pp 628-636）において又はクッシング症候群（Chu et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001, Vol. 86, pp 3568-3573）において臨床的に活性であることが証明されている。これらの臨床上の証拠は、多くの適応症（糖尿病、脂質異常症、肥満、高血圧、心臓血管疾患、又はうつ病など）における強力で選択的なＧＣＲアンタゴニストの潜在的な臨床的価値を例証する（Von Geldern et al, J. Med. Chem. 2004, Vol 47 (17), pp 4213-4230; Hu et al, Drug Develop. Res. 2006, Vol. 67, pp 871-883; Andrews, Handbook of the stress and the brain 2005, Vol. 15, pp 437-450）。このアプローチは、また、末梢のインスリン感受性（Zinker et al, Meta. Clin. Exp. 2007, Vol. 57, pp 380-387）を改善し、膵臓ベータ細胞を保護しうる（Delauney et al, J. Clin. Invest. 1997, Vol. (100, pp 2094-2098）。
【０００４】
糖尿病患者は、空腹時血中グルコースの増加レベルを有し、それは臨床において糖新生制御障害と相互に関連づけられてきた（DeFronzo, Med. Clin. N. Am. 2004, Vol. 88 pp 787-835）。肝臓糖新生プロセスは、グルココルチコイドの制御下にある。非特異的ＧＣＲアンタゴニスト（ＲＵ４８６／ミフェプリストン）の臨床投与は、健常ボランティアにおいて急性的に空腹時血漿グルコースの減少（Garrel et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 1995, Vol. 80 (2), pp 379-385）及びクッシング患者において慢性的に血漿ＨｂＡ１ｃの減少（Nieman et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 1985, Vol. 61 (3), pp 536-540）に導く。さらに、レプチン欠損動物に与えられたこの薬物は、空腹時血漿グルコース（ｏｂ／ｏｂマウス、Gettys et al, Int. J. Obes. 1997, Vol. 21, pp 865-873）ならびに糖新生酵素の活性（ｄｂ／ｄｂマウス、Friedman et al, J. Biol. Chem. 1997, Vol. 272 (50) pp 31475-31481）を正常化する。肝臓特異的ノックアウトマウスが、産生されており、これらの動物は、それらを４８時間にわたり絶食させた場合に中程度の低血糖を呈し、重度の低血糖のリスクを最小限にする（Opherk et al, Mol. Endocrinol. 2004, Vol. 18 (6), pp 1346-1353）。さらに、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）におけるアンチセンスアプローチを用いた肝臓及び脂肪組織ＧＣＲ発現抑制は、血中グルコースの有意な低下に導く（Watts et al, Diabetes, 2005, Vol 54, pp 1846-1853）。
【０００５】
副腎のレベルでの内因性コルチコステロイド分泌を、視床下部−下垂体−副腎軸（ＨＰＡ）により調節することができる。内因性コルチコステロイドの低い血漿レベルによって、この軸を、フィードバック機構を介して活性化することができ、血液中に循環する内因性コルチコステロイドの増加に導く。ミフェプリストンは、血液脳関門を通過し、ＨＰＡ軸を刺激することが公知であり、究極的には血液中に循環する内因性コルチコステロイドの増加に導く（Gaillard et al, Pro. Natl. Acad. Sci. 1984, Vol. 81, pp 3879-3882）。ミフェプリストンは、また、長期処置（１年まで、概説については以下を参照のこと：Sitruk-Ware et al, 2003, Contraception, Vol. 68, pp 409-420）後に一部の副腎不全症状を誘導する。さらに、組織選択性のその欠如のため、ミフェプリストンは、前臨床モデルにおいてならびにヒトにおいて末梢でグルココルチコイドの効果を阻害する（Jacobson et al, 2005 J. Pharm. Exp.Ther. Vol 314 (1) pp 191-200; Gaillard et al, 1985 J. Clin. Endo. Met., Vol. 61 (6), pp 1009-1011）。
【０００６】
ＧＣＲ調節因子を適応症（例えば糖尿病、脂質異常症、肥満、高血圧、及び心臓血管疾患など）において使用するために、リスクを限定し、ＨＰＡ軸を活性化又は阻害し、肝臓より他の臓器において末梢でＧＣＲを阻害することが必要である。肝細胞において直接的にＧＣＲを発現抑制することが、肝臓糖新生を調節／正常化するためのアプローチでありうる（最近実証された通り）。しかし、この効果は、かなり高濃度でだけ見られてきた（２５nMの範囲におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＣ５０／Watts et al, Diabetes, 2005, Vol 54, pp 1846-1853）。オフターゲットの効果のリスクを最小限にし、ならびに肝臓より他の臓器における末梢での薬理学的活性を限定するために、より強力なＧＣＲ発現抑制薬剤を得ることが必要であろう。
【０００７】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知である高度に保存された調節機構において遺伝子発現を遮断することが示されている。本発明は、ＧＣＲの発現を選択的及び効率的に減少させることができる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ＧＣＲ  ＲＮＡｉの使用は、グルココルチコイド経路の任意の調節不全に関連する疾患／障害の治療的及び／又は予防的処置のための方法を提供する。これらの疾患／障害は、内因性グルココルチコイドの全身的又は局所的な過剰産生のため又は合成グルココルチコイドを用いた処置のために生じうる（例えば、高用量のグルココルチコイドを用いて処置された患者における糖尿病様症候群）。特定の疾患／障害状態は、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、高血圧、及びうつ病の治療的及び／又は予防的処置を含み、その方法は、人間又は動物へのＧＣＲ標的化ｄｓＲＮＡの投与を含む。さらに、本発明は、メタボリックシンドロームＸ、クッシング症候群、アディソン病、炎症疾患（例えば喘息、鼻炎、及び関節炎など）、アレルギー、自己免疫疾患、免疫不全、食欲不振、悪液質、骨喪失又は骨脆弱性、及び創傷治癒の治療的及び／又は予防的処置のための方法を提供する。メタボリックシンドロームＸは、肥満、脂質異常症、特に高トリグリセリド、グルコース不耐性、高血糖、及び高血圧を含むリスク因子のクラスターを指す。
【０００８】
１つの好ましい実施態様において、記載したｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％ＧＣＲ遺伝子の発現を阻害することが可能である。本発明は、また、ＧＣＲ  ｄｓＲＮＡを用いて肝臓を特異的に標的化するための、上に記載したものを含むＧＣＲ遺伝子の発現により起こされる病理学的状態及び疾患を処置するための組成物及び方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、罹患した他の組織又は臓器（限定はされないが、脂肪組織、視床下部、腎臓、又は膵臓を含む）を特異的に標的化するための組成物及び方法を提供する。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、ＧＣＲ遺伝子の発現、特に哺乳動物又はヒトＧＣＲ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１配列を含むセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、第２配列を含みうる。配列リストに提供する配列及び、また、添付の表１及び４における特定のｄｓＲＮＡ対の提供を参照のこと。一実施態様において、センス鎖は、ＧＣＲをコードするｍＲＮＡの少なくとも部分と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。前記配列が、アンチセンス鎖に対するセンス鎖の相補性の領域中に、好ましくはアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド２〜７内に位置する。１つの好ましい実施態様において、ｄｓＲＮＡは、特に、ヒトＧＣＲ遺伝子を標的化する。さらに別の好ましい実施態様において、ｄｓＲＮＡは、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）及びラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＧＣＲ遺伝子を標的化する。
【００１０】
一実施態様において、アンチセンス鎖は、前記ＧＣＲ遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、相補性の領域は、最も好ましくは、３０未満のヌクレオチド長である。さらに、本明細書に記載する発明のｄｓＲＮＡ分子（二本鎖長）の長さは、約１６〜３０ヌクレオチドの範囲中、特に約１８〜２８ヌクレオチドの範囲中であることが好ましい。本発明に関連して特に有用であるのは、約１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチドの二本鎖長である。最も好ましいのは、１９、２１、又は２３ヌクレオチドの二本鎖ストレッチである。ｄｓＲＮＡは、ＧＣＲ遺伝子を発現する細胞との接触時に、ＧＣＲ遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは９０％阻害する。
【００１１】
添付の表１３は、本発明に従ってｄｓＲＮＡとして使用される好ましい分子に関する。また、修飾ｄｓＲＮＡ分子を、本明細書において提供し、特に添付の表１及び４において開示し、本発明の修飾ｄｓＲＮＡ分子の例証的な例を提供する。本明細書において上で指摘する通り、表１は、本発明の修飾ｄｓＲＮＡの例証的な例を提供する（それにより、対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖をこの表中に提供する）。表１３に示す未修飾の好ましい分子と表１の修飾ｄｓＲＮＡとの関係を、表１４に例証する。さらに、発明のｄｓＲＮＡのこれらの構成物の例証的な修飾を、修飾の例として本明細書に提供する。
【００１２】
表２及び３は、本発明の特定のｄｓＲＮＡ分子の選択的な、生物学的、臨床的、及び医薬的に関連するパラメーターを提供する。
【００１３】
最も好ましいｄｓＲＮＡ分子を、添付の表１３に提供し、とりわけ及び好ましくは、それにおいて、センス鎖が、配列番号８７３、９２９、１０２１、１０２３、９６７、及び９０５に描写される核酸配列からなる群より選択され、アンチセンス鎖が、配列番号８７４、９３０、１０２２、１０２４、９６８、及び９０６に描写される核酸配列からなる群より選択される。したがって、発明のｄｓＲＮＡ分子は、とりわけ、配列番号８７３／８７４、９２９／９３０、１０２１／１０２２、１０２３／１０２４、９６７／９６８、及び９０５／９０６からなる群より選択される配列対を含みうる。本明細書において提供する特定のｄｓＲＮＡ分子に関連して、配列番号の対は、対応するセンス及びアンチセンス鎖配列（５’から３’）（また、添付の含まれる表に示す通り）に関連する。
【００１４】
一実施態様において、前記ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長の、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを伴うアンチセンス鎖を含む。好ましくは、アンチセンス鎖の前記オーバーハングが、ウラシル又は、ＧＣＲをコードするｍＲＮＡと相補的であるヌクレオチドを含む。
【００１５】
別の好ましい実施態様において、前記ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長の、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを伴うセンス鎖を含む。好ましくは、センス鎖の前記オーバーハングが、ウラシル又は、ＧＣＲをコードするｍＲＮＡと同一であるヌクレオチドを含む。
【００１６】
別の好ましい実施態様において、前記ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長の、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを伴うセンス鎖、及び１〜５ヌクレオチド長の、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを伴うアンチセンス鎖を含む。好ましくは、センス鎖の前記オーバーハングが、ウラシル又は、ＧＣＲをコードするｍＲＮＡと少なくとも９０％同一であるヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の前記オーバーハングが、ウラシル又は、ＧＣＲをコードするｍＲＮＡと少なくとも９０％相補的であるヌクレオチドを含む。
【００１７】
最も好ましいｄｓＲＮＡ分子を、以下の表１及び４に提供し、とりわけ及び好ましくは、それにおいて、センス鎖が、配列番号７、３１、３、２５、３３、５５、８３、７４７、及び７６４に描写される核酸配列からなる群より選択され、アンチセンス鎖が、配列番号８、３２、４、２６、３４、５６、８４、７５３、及び７７２に描写される核酸配列からなる群より選択される。したがって、発明のｄｓＲＮＡ分子は、とりわけ、配列番号７／８、３１／３２、３／４、２５／２６、３３／３４、５５／５６、８３／８４、７４７／７５３、及び７６４／７７２からなる群より選択される配列対を含みうる。本明細書に提供する特定のｄｓＲＮＡ分子に関連して、配列番号の対は、対応するセンス及びアンチセンス鎖配列（５’から３’）（また、添付の含まれる表に示す）に関連する。
【００１８】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、天然ヌクレオチドからなりうる、又は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドなど）、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、逆位デオキシチミジン、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基（ｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｓｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）に連結された末端ヌクレオチドからなりうる。２’修飾ヌクレオチドは、特定の免疫刺激因子又はサイトカインが、発明のｄｓＲＮＡ分子をｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば医療の場で用いた場合に抑制されるという追加の利点を有しうる。あるいは及び非限定的に、修飾ヌクレオチドを、以下の群より選んでもよい：２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸、及びヌクレオチドを含む非天然塩基。１つの好ましい実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、以下の修飾ヌクレオチドの少なくとも１つを含む：２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びデオキシチミジン。別の好ましい実施態様において、センス鎖の全てのピリミジンが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の全てのピリミジンが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである。１つの好ましい実施態様において、２つのデオキシチミジンヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡ分子の両鎖の３’に見出される。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡ分子の両鎖の３’のこれらのデオキシチミジンヌクレオチドの少なくとも１つが、５’−ホスホロチオエート基を含む。別の実施態様において、センス鎖中のアデニンが続く全てのシトシン、及びアデニン、グアニン、又はウラシルのいずれかが続く全てのウラシルが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖のアデニンが続く全てのシトシン及びウラシルが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチドを含む好ましいｄｓＲＮＡ分子を、表１及び４に与える。
【００１９】
好ましい実施態様において、発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１及び４に与えられる配列において詳述される修飾ヌクレオチドを含む。１つの好ましい実施態様において、発明のｄｓＲＮＡ分子は、配列番号７／８、３１／３２、３／４、２５／２６、３３／３４、５５／５６、及び８３／８４からなる群より選択される配列対を含み、表１に詳述される修飾を含む。
【００２０】
別の実施態様において、発明のｄｓＲＮＡは、表１及び４に開示されるものとは異なる位置に修飾ヌクレオチドを含む。１つの好ましい実施態様において、２つのデオキシチミジンヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡ分子の両鎖の３’に見出される。別の好ましい実施態様において、両鎖の３’のデオキシチミジンヌクレオチドの１つが、逆位デオキシチミジンである。
【００２１】
一実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンス鎖からなり、それにおいて、両鎖が少なくとも９時間の半減期を有する。１つの好ましい実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンス鎖からなり、それにおいて、両鎖がヒト血清中で少なくとも９時間の半減期を有する。別の実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンス鎖からなり、それにおいて、両鎖がヒト血清中で少なくとも２４時間の半減期を有する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、非免疫刺激性であって、例えば、ＩＮＦ−アルファ及びＴＮＦ−アルファをｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激しない。
【００２３】
本発明は、また、本発明のｄｓＲＮＡの少なくとも１つを含む細胞を提供する。細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞など）である。さらに、また、本明細書で定義するｄｓＲＮＡ分子を含む組織及び／又は非ヒト生物が本発明に含まれ、それにより、前記の非ヒト生物が、研究目的のため又は研究ツールとして、例えば、また、薬物テストにおいて特に有用である。
【００２４】
さらに、本発明は、ＧＣＲ遺伝子、特に哺乳動物又はヒトのＧＣＲ遺伝子の発現を、細胞、組織、又は生物において阻害するための方法に関し、以下の工程：
（ａ）細胞、組織、又は生物中に、本明細書で定義する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入すること；
（ｂ）工程（ａ）において産生された前記の細胞、組織、又は生物を、ＧＣＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるために十分な時間にわたり維持し、それにより、ＧＣＲ遺伝子の発現を所与の細胞において阻害すること
を含む。
【００２５】
本発明は、また、本発明の発明のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物に関する。これらの医薬的組成物は、細胞、組織、又は生物におけるＧＣＲ遺伝子の発現の阻害において特に有用である。本発明のｄｓＲＮＡの１つ又は複数を含む医薬的組成物は、また、（ａ）医薬的に許容可能な担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含んでもよい。
【００２６】
別の実施態様において、本発明は、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、高血圧、及びうつ病に関連する障害を処置、予防、又は管理するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置、予防、又は管理を必要とする被験体に、治療的又は予防的に効果的な量の本発明のｄｓＲＮＡの１つ又は複数を投与することを含む。好ましくは、前記の被験体は、哺乳動物、最も好ましくはヒトの患者である。
【００２７】
一実施態様において、本発明は、ＧＣＲ遺伝子の発現により媒介される病理学的状態を有する被験体を処置するための方法を提供する。そのような状態は、上に記載する糖尿病及び肥満に関連する障害を含む。この実施態様において、ｄｓＲＮＡは、ＧＣＲ遺伝子の発現を制御するための治療用薬剤として作用する。方法は、本発明の医薬的組成物を患者（例えば、ヒト）に投与し、ＧＣＲ遺伝子の発現を発現抑制することを含む。その高い特異性のため、本発明のｄｓＲＮＡは、ＧＣＲ遺伝子のｍＲＮＡを特異的に標的化する。１つの好ましい実施態様において、記載するｄｓＲＮＡは、ＧＣＲ  ｍＲＮＡレベルを特異的に減少させ、細胞中でのオフターゲット遺伝子の発現及び／又はｍＲＮＡレベルに直接的に影響を与えない。別の好ましい実施態様において、記載するｄｓＲＮＡは、ＧＣＲ  ｍＲＮＡレベル、ならびに、ＧＣＲにより通常活性化される遺伝子のｍＲＮＡレベルを特異的に減少させる。別の実施態様において、発明のｄｓＲＮＡはグルコースレベルをｉｎ  ｖｉｖｏで減少させる。
【００２８】
１つの好ましい実施態様において、記載するｄｓＲＮＡは、肝臓中のＧＣＲ  ｍＲＮＡレベルを、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％ｉｎ  ｖｉｖｏで減少させる。好ましくは、本発明のｄｓＲＮＡは、肝臓トランスアミナーゼにおける変化を伴わずに糖血症を減少させる。別の実施態様において、記載するｄｓＲＮＡは、ＧＣＲ  ｍＲＮＡレベルを、ｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも４日間にわたり減少させる。別の実施態様において、記載するｄｓＲＮＡは、ＧＣＲ  ｍＲＮＡレベルをｉｎ  ｖｉｖｏで、少なくとも６０％、少なくとも４日間にわたり減少させる。
【００２９】
治療用ｄｓＲＮＡに関して特に有用なのは、マウス及びラットＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの組であって、それらを使用し、動物又は細胞培養モデルにおいて個々のｄｓＲＮＡについての毒性、治療効力及び効果的な投与量、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を推定することができる。
【００３０】
別の実施態様において、本発明は、細胞中のＧＣＲ遺伝子、特に、本発明のｄｓＲＮＡの１つの少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含むＧＣＲ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供する。
【００３１】
別の実施態様において、本発明は、細胞中のＧＣＲ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む細胞を提供する。前記ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡの１つの少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む。さらに、前記ベクターは、前記調節配列の他に、発明のｄｓＲＮＡの少なくとも１つの「センス鎖」及び前記ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの「アンチセンス鎖」をコードする配列を含むことが好ましい。また、主張する細胞が、前記調節配列の他に、本発明のｄｓＲＮＡの１つの少なくとも１つの鎖をコードする、本明細書において定義する配列を含む２つ又は複数のベクターを含むことが想定される。
【００３２】
一実施態様において、方法は、ｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、それにおいて、ｄｓＲＮＡは、処置される哺乳動物のＧＣＲ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。上で指摘した通り、本明細書で定義するｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖をコードする核酸分子を含むベクター及び細胞も、医薬的組成物として使用することができ、従って、医学的介入の必要がある被験体を処置する、本明細書に開示する方法において用いることもできる。また、医薬的組成物及び（ヒト）被験体を処置する対応する方法に関連するこれらの実施態様も、アプローチ（遺伝子治療アプローチなど）に関連することに注目すべきである。本明細書に提供するＧＣＲ特異的ｄｓＲＮＡ分子又はこれらの発明のｄｓＲＮＡ分子の個々の鎖をコードする核酸分子を、また、ベクター中に挿入してもよく、ヒト患者のための遺伝子治療ベクターとして使用してもよい。遺伝子治療ベクターを、被験体に、例えば、静脈内注射、局所投与により（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）又は定位注射により（例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照のこと）送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬的調製物は、遺伝子治療ベクターを許容可能な希釈剤中に含むことができる、又は、遺伝子送達媒体が包埋される徐放マトリクスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え細胞からインタクトで産生することができる場合（例えば、レトロウイルスベクター）、医薬的調製物は、遺伝子送達システムを産生する１つ又は複数の細胞を含むことができる。
【００３３】
本発明の別の局面において、ＧＣＲ遺伝子発現活性を調節するＧＣＲ特異的ｄｓＲＮＡ分子が、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現される（例えば、Skillern, A., et al.，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／２２１１３を参照のこと）。これらのトランスジーンを、線形コンストラクト、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、それを、宿主ゲノム中に組み込まれたトランスジーンとして取り込ませ、遺伝させることができる。トランスジーンを構築し、それを染色体外プラスミドとして遺伝させることを許容することもできる（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292）。
【００３４】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖を、プロモーターにより、２つの別々の発現ベクター上で転写させ、標的細胞中にコトランスフェクトすることができる。あるいは、ｄｓＲＮＡの各々の個々の鎖を、プロモーターにより転写させることができ、その両方が同じ発現プラスミド上に位置する。好ましい実施態様において、ｄｓＲＮＡを、リンカーポリヌクレオチド配列により連結された逆位反復として発現させ、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するようにする。
【００３５】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、好ましくは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウイルスベクターを、限定はされないが、アデノ関連ウイルス（概説については、Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158: 97-129を参照のこと）；アデノウイルス（例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6: 616、Rosenfeld et al. (1991, Science 252: 431-434）、及びRosenfeld et al.(1992), Cell 68:143-155を参照のこと）；又はアルファウイルスならびに当技術分野において公知の他のものに基づき構築することができる。レトロウイルスを使用し、種々の遺伝子が多くの異なる細胞型（上皮細胞を含む）中にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで導入されてきた（例えば、Danos and Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85: 6460-6464を参照のこと）。細胞のゲノム中に挿入された遺伝子を伝達及び発現することが可能である組換えレトロウイルスベクターを、組換えレトロウイルスゲノムを適したパッケージング細胞株（例えばＰＡ３１７及びＰｓｉ−ＣＲＩＰなど）中にトランスフェクトすることにより産生することができる（Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2: 5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6349）。組換えアデノウイルスベクターを使用し、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー）において多種多様な細胞及び組織に感染させることができ（Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769）、また、感染のために有糸分裂的に活性な細胞を要求しないという利点を有する。
【００３６】
本発明のＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターのいずれかにおいてｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーター又はアクチンプロモーター又はＵ１  ｓｎＲＮＡプロモーター）、又は、好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ又は７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター）あるいは原核生物プロモーター、例えば、Ｔ７プロモーター（発現プラスミドが、Ｔ７プロモーターからの転写のために要求されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼもコードするという条件で）でありうる。プロモーターは、また、トランスジーン発現を膵臓に向けることができる（例えば、膵臓についてのインシュリン調節配列を参照のこと（Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2511-2515）。
【００３７】
また、トランスジーンの発現は、例えば、誘導性の調節配列及び発現システム、例えば、特定の生理学的レギュレーター（例えば、循環グルコースレベル、又はホルモン）に感受性である調節配列などを使用することにより正確に調節することができる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8: 20-24）。そのような誘導性発現システムは、細胞における又は哺乳動物におけるトランスジーン発現の制御のために適しており、エクジソンにより、エストロジェン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的インデューサー、及びイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節を含む。当業者は、ｄｓＲＮＡトランスジーンの意図される使用に基づき、適切な調節／プロモーター配列を選ぶことができうる。
【００３８】
好ましくは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能である組換えベクターを、以下に記載する通りに送達し、標的細胞において持続させる。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを、使用することができる。そのようなベクターを、必要な場合、反復して投与することができる。一旦、発現されると、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合し、その機能又は発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、全身的に、例えば、静脈内又は筋肉内投与により、患者から外植された標的細胞への投与、それに続く患者中への再導入により、又は所望の標的細胞中への導入を可能にする任意の他の手段によりことができる。
【００３９】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には、標的細胞中に、陽イオン性の脂質担体（例えば、Oligofectamine）又は非陽イオン性の脂質ベース担体（例えば、Transit-TKO（商標））との複合体としてトランスフェクションされる。単一のＧＣＲ遺伝子又は複数のＧＣＲ遺伝子の異なる領域を１週間又はそれ以上の期間にわたり標的化するｄｓＲＮＡ媒介性ノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも、本発明により熟慮される。宿主細胞中への本発明のベクターの成功裏の導入を、種々の公知の方法を使用してモニターすることができる。例えば、一過性トランスフェクションを、レポーター、例えば蛍光マーカーなど、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などを用いてシグナル化することができる。エクスビボ細胞の安定トランスフェクションは、特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬物）に対する耐性、例えばハイグロマイシンＢ耐性などを伴うトランスフェクション細胞を提供するマーカーを使用して確実にすることができる。
【００４０】
以下の詳細な記載は、ｄｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡを含む組成物をどのように作製及び使用し、標的ＧＣＲ遺伝子の発現を阻害するか、ならびに前記ＧＣＲ遺伝子の発現により起こされる疾患及び障害を処置するための組成物及び方法を開示する。
【００４１】
定義
利便性のために、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において使用する特定の用語及び語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の使用法とこのセクションに提供するその定義の間に明白な矛盾がある場合、このセクションの定義を優先すべきである。
【００４２】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｕ」、及び「Ｔ」又は「ｄＴ」は、それぞれ、各々が、一般的に、グアニン、シトシン、アデニン、ウラシル、及びデオキシチミジンを塩基としてそれぞれ含むヌクレオチドを表す。しかし、用語「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」は、また、修飾ヌクレオチド（以下でさらに詳述する）、又は代替置換成分を指しうる。そのような置換成分を含む配列は、本発明の実施態様である。以下に詳述する通り、本明細書に記載するｄｓＲＮＡ分子は、また、「オーバーハング」、即ち、「センス鎖」及び「アンチセンス鎖」の本明細書で定義する対により通常形成されるＲＮＡ二重らせん構造に直接的に関与しない不対オーバーハングヌクレオチドを含みうる。しばしば、そのようなオーバーハングストレッチは、デオキシチミジンヌクレオチド、大半の実施態様において、２デオキシチミジンを３’末端中に含む。そのようなオーバーハングを以下に記載及び例証する。
【００４３】
用語「ＧＣＲ」は、本明細書で使用する通り、特に、細胞内グルココルチコイドレセプター（ＧＣＲ）に関連し、前記用語は、対応する遺伝子（ＮＲ３Ｃ１遺伝子としても公知である）、コードされるｍＲＮＡ、コードされるタンパク質／ポリペプチドならびに同の機能的フラグメントに関連する。好ましいのは、ヒトＧＣＲ遺伝子である。その好ましい実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）及びマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＧＣＲ遺伝子を標的化し、さらに別の好ましい実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、ヒト（Ｈ．  ｓａｐｉｅｎｓ）及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＧＣＲ遺伝子を標的化する。用語「ＧＣＲ遺伝子／配列」は、野生型配列だけでなく、また、前記遺伝子／配列に含まれうる突然変異及び変化に関する。したがって、本発明は、本明細書に提供する特定のｄｓＲＮＡ分子に限定されない。本発明は、また、そのような突然変異／変化を含むＧＣＲ遺伝子のＲＮＡ転写物の対応するヌクレオチドストレッチと少なくとも８５％相補的であるアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡ分子に関する。
【００４４】
本明細書で使用する「標的配列」は、ＧＣＲ遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の隣接部分を指し、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む。
【００４５】
本明細書で使用する用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して指す配列により記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。しかし、本明細書で詳述する通り、そのような「配列を含む鎖」は、また、修飾（修飾ヌクレオチドなど）を含みうる。
【００４６】
本明細書に記載する通り、及び、別に示さない場合、用語「相補的」は、第２のヌクレオチド配列に関連して第１のヌクレオチド配列を記載するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションし、二本鎖構造を形成する能力を指す。「相補的」配列は、本明細書で使用する通り、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対及び／又は非天然の修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含みうるか、あるいはそれらから完全に形成されうる（ハイブリダイゼーションするそれらの能力に関する上の要求が満たされる限り）。
【００４７】
「完全に相補的」と言及される配列は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの、第１及び第２のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。
【００４８】
しかし、第１の配列が、本明細書における第２の配列に関して「実質的に相補的」として言及される場合、２つの配列は完全に相補的でありうるか、又はそれらは、１つ又は複数の、しかし、好ましくは、多くて１３のミスマッチ塩基対をハイブリダイゼーション時に形成しうる。
【００４９】
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」、及び「実質的に相補的」は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間での、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間での塩基マッチングに関して使用してもよい（それらの使用の関連から理解されうる通り）。
【００５０】
用語「二本鎖ＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡ分子」、又は「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書で使用する通り、リボ核酸分子、又はリボ核酸分子の複合体（２つの逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有する）を指す。二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分でありうる。又は、それらは、別々のＲＮＡ分子でありうる。２つの鎖が、１つのより大きな分子の一部であり、従って、二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端とそれぞれの他の鎖の５’末端との間が、中断のないヌクレオチド鎖により連結される場合、連結ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と言及される。２つの鎖が、二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端とそれぞれの他の鎖の５’末端との間が中断のないヌクレオチド鎖以外の手段により共有結合的に連結される場合、連結構造は「リンカー」と言及される。ＲＮＡ鎖は、同じ又は異なる数のヌクレオチドを有しうる。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含みうる。前記「オーバーハング」中のヌクレオチドは、０〜５の間のヌクレオチドを含みうるが、それにより、「０」は、「オーバーハング」を形成する追加のヌクレオチドがないことを意味するのに対し、「５」は、ｄｓＲＮＡ二本鎖の個々の鎖上の５つの追加のヌクレオチドを意味する。これらの任意の「オーバーハング」は、個々の鎖の３’末端中に位置する。以下で詳述される通り、２つの鎖の１つにおいてだけ「オーバーハング」を含むｄｓＲＮＡ分子も、本発明に関連して有用であり、さらには有利でありうる。「オーバーハング」は、好ましくは０〜２の間のヌクレオチドを含む。最も好ましくは、２つの「ｄＴ」（デオキシチミジン）ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの両鎖の３’末端で見出される。また、２つの「Ｕ」（ウラシル）ヌクレオチドを、オーバーハングとして、ｄｓＲＮＡの両鎖の３’末端で使用することができる。したがって、「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの１つの鎖の３’末端が他の鎖の５’末端を越えて伸長する（又はその逆の）場合、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する不対ヌクレオチド又はヌクレオチド群を指す。例えば、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチドを含み、センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、２つのヌクレオチドのオーバーハングをアンチセンス鎖の３’末端に形成する。好ましくは、２つのヌクレオチドのオーバーハングは、標的遺伝子のｍＲＮＡと完全に相補的である。「平滑」又は「平滑末端」は、不対ヌクレオチドがｄｓＲＮＡのその末端にない、即ち、ヌクレオチドのオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、その全長にわたり二本鎖である、即ち、分子のいずれかの末端にヌクレオチドのオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。
【００５１】
用語「アンチセンス鎖」は、標的配列と実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用する用語「相補性の領域」は、配列、例えば、標的配列と実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が標的配列と完全に相補的ではない場合、ミスマッチは、アンチセンス鎖の５’末端の外側のヌクレオチド２〜７で最も耐容性がある。
【００５２】
用語「センス鎖」は、本明細書で使用する通り、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。「実質的に相補的」は、センス及びアンチセンス鎖中のオーバーラップするヌクレオチドの好ましくは少なくとも８５％が相補的であることを意味する。
【００５３】
「細胞中に導入する」は、ｄｓＲＮＡを指す場合、細胞中への取り込み又は吸収を促進することを意味し、当業者により理解される通りである。ｄｓＲＮＡの吸収又は取り込みは、自発的な拡散又は能動的な細胞プロセスを通じて、又は補助薬剤又はデバイスにより生じうる。この用語の意味は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞に限定されない；ｄｓＲＮＡは、また、「細胞中に導入」してもよいが、それにおいて細胞は生きた生物の一部である。そのような例において、細胞中への導入は、生物への送達を含む。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために、ｄｓＲＮＡを組織部位中に注射することができるか、又は、全身的に投与することができる。例えば、本発明のｄｓＲＮＡ分子が、医学的介入を必要とする被験体に投与されることが想定される。そのような投与は、前記の被験体における罹患側中への、例えば、肝臓組織／細胞中への、又は癌性組織／細胞（肝臓癌組織など）中への本発明のｄｓＲＮＡ、ベクター、又は細胞の注射を含みうる。しかし、また、罹患組織の近傍における注射が想定される。細胞中へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入は、当技術分野において公知の方法（例えばエレクトロポレーション及びリポフェクションなど）を含む。
【００５４】
用語「発現抑制する」、「の発現を阻害する」、及び「ノックダウンする」は、それらがＧＣＲ遺伝子に言及する限り、本明細書において、ＧＣＲ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指し、第１の細胞又は細胞の群（それにおいてＧＣＲ遺伝子が転写され、ＧＣＲ遺伝子の発現が阻害されるように処置されている）より単離されうるＧＣＲ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量の低下により明らかにされる（第１の細胞又は細胞の群と実質的に同一であり、そのように処置されていない第２の細胞又は細胞の群（コントロール細胞）と比較して）。阻害の程度は、通常、
【数１】
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の観点から表される。
【００５５】
あるいは、阻害の程度は、ＧＣＲ遺伝子転写に機能的に関連するパラメーター（例えば、細胞により分泌されるＧＣＲ遺伝子によりコードされるタンパク質の量、又は特定の表現型を呈する細胞の数）の低下の観点から与えてもよい。
【００５６】
本明細書において提供される添付の実施例において及び添付の表において例証する通り、発明のｄｓＲＮＡ分子は、ヒトＧＣＲの発現を、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することが可能である。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、本明細書で使用する通り、しかし、限定はされないが、細胞培養アッセイを含む。別の実施態様において、発明のｄｓＲＮＡ分子は、マウス又はラットＧＣＲの発現を、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％阻害することが可能である。当業者は、そのような阻害率及び関連する効果を、特に、本明細書に提供するアッセイに照らして容易に決定することができる。
【００５７】
用語「オフターゲット」は、本明細書で使用する通り、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの方法により、配列相補性に基づき、記載するｄｓＲＮＡにハイブリダイゼーションすることが予測されるトランスクリプトームの全ての非標的ｍＲＮＡを指す。本発明のｄｓＲＮＡは、好ましくは、ＧＣＲの発現を特異的に阻害する、即ち、任意のオフターゲットの発現を阻害しない。
【００５８】
特に好ましいｄｓＲＮＡを、例えば、添付の表１及び２に提供する（センス鎖及びアンチセンス鎖配列がそれにおいて５’から３’方向で提供される）。最も好ましいｄｓＲＮＡは表２中にある。
【００５９】
用語「半減期」は、本明細書で使用する通り、化合物又は分子の安定性の測定値であり、当業者に公知の方法により、特に、本明細書に提供するアッセイに照らして評価することができる。
【００６０】
用語「非免疫刺激性」は、本明細書で使用する通り、発明されたｄｓＲＮＡ分子による免疫応答の任意の誘導の非存在を指す。免疫応答を決定するための方法は、当業者に周知であり、例えば、実施例のセクションにおいて記載される通りにサイトカインの放出を評価することによる。
【００６１】
用語「処置する」、「処置」などは、本発明に関連して、ＧＣＲ発現に関連する障害（糖尿病、脂質異常症、肥満、高血圧、心臓血管疾患、又はうつ病など）からの解放又はその軽減を意味する。
【００６２】
本明細書で使用する「医薬的組成物」は、薬理学的に効果的な量のｄｓＲＮＡ及び医薬的に許容可能な担体を含む。しかし、そのような「医薬的組成物」は、また、そのようなｄｓＲＮＡ分子の個々の鎖、又は、本発明のｄｓＲＮＡ中に含まれるセンス又はアンチセンス鎖の少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む本明細書に記載するベクターを含みうる。また、本明細書で定義するｄｓＲＮＡを発現する又は含む細胞、組織、又は単離臓器を「医薬的組成物」として使用してもよいことが想定される。本明細書で使用する「薬理学的に効果的な量」、「治療的に効果的な量」、又は単に「効果的な量」は、意図される薬理学的、治療的、又は予防的な結果を産生するために効果的なＲＮＡの量を指す。
【００６３】
用語「医薬的に許容可能な担体」は、治療用薬剤の投与のための担体を指す。そのような担体は、しかし、限定はされないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びその組み合わせを含む。この用語は、具体的には、細胞培養液を除外する。経口投与される薬物について、医薬的に許容可能な担体は、しかし、限定はされないが、医薬的に許容可能な賦形剤、例えば、当業者に公知の不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、及び保存剤などを含む。
【００６４】
医薬的に許容可能な担体は、本発明のｄｓＲＮＡ、ベクター、又は細胞の全身投与を可能にすることが特に想定される。腸内投与も想定されるのに対し、非経口投与及び、また、経皮又は経粘膜（例えば、吹送、バッカル、腟内、肛門）投与ならびに薬物の吸入が、医学的介入を必要とする患者に、本発明の化合物を投与する実行可能な方法である。非経口投与を用いる場合、これは、罹患組織中又は少なくとも近傍における本発明の化合物の直接注射を含みうる。しかし、また、本発明の化合物の静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、皮内、くも膜下腔内、及び他の投与が、当業者、例えば担当医師の技術の範囲内にある。
【００６５】
筋肉内、皮下、及び静脈内使用のために、本発明の医薬的組成物は、一般的に、適切なｐＨ及び等張性に緩衝化された無菌水溶液又は懸濁液中で提供される。好ましい実施態様において、担体は、排他的に、水性緩衝液からなる。これに関連して、「排他的に」は、補助薬剤又はカプセル化物質（ＧＣＲ遺伝子を発現する細胞中でｄｓＲＮＡの取り込みに影響を与える又はそれを媒介しうる）が存在しないことを意味する。本発明の水性懸濁剤は、懸濁剤（例えばセルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及びゴムトラガカントなど）及び湿潤剤（例えばレシチンなど）を含みうる。水性懸濁剤のための適した保存剤は、エチル及びｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸を含む。本発明の有用な医薬的組成物は、また、身体からの迅速な除去に対してｄｓＲＮＡを保護するためのカプセル化製剤、例えば制御放出製剤（インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む）などを含む。生物分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる（例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など）。そのような製剤の調製のための方法は、当業者には明かであろう。リポソーム懸濁剤も医薬的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法に従って、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９（参照により本明細書に組み入れられる）に記載される通りに調製することができる。
【００６６】
本明細書で使用する「形質転換細胞」は、少なくとも１つのベクターが導入されている細胞であって、そこからｄｓＲＮＡ分子又はそのようなｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖が発現されうる。そのようなベクターは、好ましくは、本発明のｄｓＲＮＡ中に含まれるセンス鎖又はアンチセンス鎖の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含むベクターである。
【００６７】
表１及び４の配列の１つから、一方又は両方の末端上においてわずか数個のヌクレオチドを差し引いたものを含む、より短いｄｓＲＮＡが、上に記載するｄｓＲＮＡと比較して、同様に効果的でありうることを合理的に予測することができる。上で指摘する通り、本発明の大半の実施態様において、本明細書で提供するｄｓＲＮＡ分子は、約１６〜約３０ヌクレオチドの二本鎖長（即ち、「オーバーハング」を伴わない）を含む。特定の有用なｄｓＲＮＡ二本鎖長は、約１９〜約２５ヌクレオチドである。最も好ましいのは、１９ヌクレオチドの長さを伴う二本鎖構造である。発明のｄｓＲＮＡ分子において、アンチセンス鎖は、少なくとも部分的に、センス鎖と相補的である。
【００６８】
１つの好ましい実施態様において、発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１３に与える配列のヌクレオチド１〜１９を含む。
【００６９】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対する１つ又は複数のミスマッチを含むことができる。好ましい実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、わずか１３のミスマッチを含む。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド２〜７内に位置しないことが好ましい。別の実施態様において、ミスマッチの領域が、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド２〜９内に位置しないことが好ましい。
【００７０】
上で言及する通り、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端／鎖が、１〜５、好ましくは１又は２のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有しうる。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、予想外に、それらの平滑末端の対応物よりも優れた阻害特性を有する。さらに、本発明者らは、わずか１つのヌクレオチドオーバーハングの存在によって、ｄｓＲＮＡの干渉活性が、その全体的な安定性に影響を与えることなく強化されることを発見している。わずか１つのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ならびに種々の細胞、細胞培養液、血液、及び血清中で特に安定で効果的であることが証明されている。好ましくは、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端側末端に又は、あるいは、センス鎖の３’末端側末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、また、平滑末端（好ましくはアンチセンス鎖の５’末端に位置する）を有しうる。好ましくは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖はヌクレオチドオーバーハングを３’末端に有し、５’末端は平滑である。別の実施態様において、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ又は複数は、ヌクレオシドチオリン酸を用いて置換される。
【００７１】
本発明のｄｓＲＮＡを、また、化学的に修飾し、安定性を増強してもよい。本発明の核酸は、当技術分野において十分に確立された方法、例えば“Current protocols in nucleic acid chemistry”, Beaucage, S. L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA（本明細書により、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるものなどにより合成及び／又は修飾してもよい。化学的修飾は、しかし、限定はされないが、２’修飾、非天然塩基の導入、リガンドへの共有結合性の付着、及びチオリン酸結合を用いたリン酸結合の置換を含みうる。この実施態様において、二本鎖構造の完全性は、少なくとも１つ、好ましくは２つの化学結合により強化される。化学結合は、種々の周知の技術のいずれか、例えば、共有結合、イオン結合、又は水素結合の導入により；疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、又はスタッキング相互作用；金属イオン配位を用いて、又はプリン類似体の使用を通じて達成されうる。好ましくは、ｄｓＲＮＡを修飾するために使用することができる化学基は、限定なしに、メチレンブルー；二官能基、好ましくは、ビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；及びソラレンを含む。１つの好ましい実施態様において、リンカーは、ヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合において、ｄｓＲＮＡは、固相合成により産生され、ヘキサ−エチレングリコールリンカーが標準的な方法に従って取り込まれる（例えば、Williams, D. J., and K. B. Hall, Biochem. (1996) 35: 14665-14670）。特定の実施態様において、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学的に連結される。別の実施態様において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドは、ホスホロチオエート基又はホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端での化学結合は、好ましくは、三重らせん結合により形成される。
【００７２】
特定の実施態様において、化学結合は１つ又はいくつかの結合基を用いて形成されうる。それにおいて、そのような結合基は、好ましくは、ポリ−（オキシホスフィニコオキシ−１，３−プロパンジオール）鎖及び／又はポリエチレングリコール鎖である。他の実施態様において、化学結合は、また、プリンの代わりに二本鎖構造中に導入されたプリン類似体を用いて形成されうる。さらなる実施態様において、化学結合は、二本鎖構造中に導入されたアザベンゼン単位により形成されうる。さらなる実施態様において、化学結合は、二本鎖構造中に導入されたヌクレオチドの代わりに、分岐ヌクレオチド類似体により形成されうる。特定の実施態様において、化学結合は、紫外線光により誘導されうる。
【００７３】
さらに別の実施態様において、２つの単鎖の１つ又は両方のヌクレオチドを修飾し、細胞酵素、例えば、特定のヌクレアーゼの活性化を予防又は阻害してもよい。細胞酵素の活性化を阻害するための技術が、当技術分野において公知であり、しかし、限定はされないが、２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、非荷電骨格修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、逆位チミジン、及びホスホロアミド酸を含む（例えば、Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8を参照のこと）。このように、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１つの２’ヒドロキシル基を、化学基により、好ましくは２’アミノ基又は２’メチル基により置換する。また、少なくとも１つのヌクレオチドを修飾し、ロックドヌクレオチドを形成してもよい。そのようなロックドヌクレオチドは、リボースの２’酸素をリボースの４’炭素と結合させるメチレン架橋を含む。オリゴヌクレオチド中へのロックドヌクレオチドの導入によって、相補配列についての親和性が改善され、融解温度が数度だけ増加する。
【００７４】
本発明の化合物を、１つ又は複数の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジン又は逆位アデニンを使用して合成することができる（例えば、Takei, et al., 2002, JBC 277(26): 23800-06を参照のこと）。
【００７５】
本明細書に提供するｄｓＲＮＡ分子の修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらの安定性にポジティブに影響し、また、（罹患）標的側へのそれらの送達を改善する。さらに、そのような構造的及び化学的修飾は、投与時でのｄｓＲＮＡ分子に対する生理学的反応にポジティブに影響しうる（例えば、サイトカイン放出が、好ましくは、抑制される）。そのような化学的及び構造的修飾は、当技術分野において公知であり、とりわけ、Nawrot (2006) Current Topics in Med Chem, 6, 913-925に例証される。
【００７６】
リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲーションすることによって、その細胞吸収ならびに特定組織への標的化を増強することができる。特定の例において、疎水性リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲーションさせ、細胞膜の直接的な浸透を促進する。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲーションされたリガンドは、レセプター媒介性エンドサイトーシスのための基質である。これらのアプローチを使用し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞浸透が促進されてきた。例えば、コレステロールを種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションし、その非コンジュゲーション類似体と比較して実質的により活性である化合物がもたらされてきた。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103を参照のこと。オリゴヌクレオチドにコンジュゲーションされている他の親油性化合物は、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロール、及びメントールを含む。レセプター媒介性エンドサイトーシスのためのリガンドの１つの例は、葉酸である。葉酸は、葉酸レセプター媒介性エンドサイトーシスにより細胞に入る。葉酸を持つｄｓＲＮＡ化合物は、細胞中に、葉酸レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して効率的に輸送されうる。オリゴヌクレオチドの３’末端への葉酸の付着は、オリゴヌクレオチドの増加した細胞取り込みをもたらす（Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540）。オリゴヌクレオチドにコンジュゲーションされている他のリガンドは、ポリエチレングリコール、炭水化物クラスター、架橋薬剤、ポルフィリンコンジュゲーション、及び送達ペプチドを含む。
【００７７】
特定の例において、オリゴヌクレオチドへの陽イオンリガンドのコンジュゲーションは、しばしば、ヌクレアーゼに対する改善された耐性をもたらす。陽イオンリガンドの代表的な例は、プロピルアンモニウム及びジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、陽イオンリガンドがオリゴヌクレオチド全体に分散した場合、ｍＲＮＡに対するそれらの高い結合親和性を保持することが報告された。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103及び本明細書中の参考文献を参照のこと。
【００７８】
本発明のリガンドにコンジュゲーションされているｄｓＲＮＡは、ペンダント反応性の官能性を持つｄｓＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ上への連結分子の付着に由来するものなど）の使用により合成されうる。この反応性オリゴヌクレオチドは、商業的に利用可能なリガンド、種々の保護基のいずれかを持つ合成されたリガンド、又はそれに付着した連結成分を有するリガンドと直接的に反応しうる。本発明の方法は、リガンドにコンジュゲーションされているｄｓＲＮＡの合成を、一部の実施態様において、リガンドに適切にコンジュゲーションされている、及び、固体支持体材料にさらに付着させてもよいヌクレオシド単量体の使用により促進する。そのようなリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートは、場合により固体支持体材料に付着させ、本発明の方法の一部の好ましい実施態様に従って、選択された血清結合リガンドとヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの５’末端上に位置する連結成分との反応を介して調製される。特定の例において、ｄｓＲＮＡの３’末端に付着されたアルキルリガンドを持つｄｓＲＮＡが、最初に、モノマービルディングブロックを、制御されたポアガラス支持体に、長鎖アミノアルキル基を介して共有結合的に付着させることにより調製する。次に、ヌクレオチドを、標準的な固相合成技術を介して、固体支持体に結合されたモノマービルディングブロックに結合させる。モノマービルディングブロックは、ヌクレオシド、又は固相合成と適合する他の有機化合物でありうる。
【００７９】
本発明のコンジュゲートにおいて使用されるｄｓＲＮＡは、便利に及びルーチン的には、固相合成の周知の技術を通じて作製されうる。また、他のオリゴヌクレオチド（例えばホスホロチオエート及びアルキル化誘導体など）を調製するための同様の方法を使用することが公知である。
【００８０】
特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示が、以下の米国特許において見出されうる：米国特許第５，２１８，１０５号（ポリアミンにコンジュゲーションされているオリゴヌクレオチドを引用する）；米国特許第５，５４１，３０７号（修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドを引用する）；米国特許第５，５２１，３０２号（キラルリン連結を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスを引用する）；米国特許第５，５３９，０８２号（ペプチド核酸を引用する）；米国特許第５，５５４，７４６号（βラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドを引用する）；米国特許第５，５７１，９０２号（オリゴヌクレオチドの合成のための方法及び材料を引用する）；米国特許第５，５７８，７１８号（アルキルチオ基を有するヌクレオシドを引用し、それにおいて、そのような基を、ヌクレオシドの種々の位置のいずれかに付着された他の成分に対するリンカーとして使用してもよい）；米国特許第５，５８７，３６１号（高いキラル純度のホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドを引用する）；米国特許第５，５０６，３５１号（２’−Ｏ−アルキルグアノシン及び関連化合物（２，６−ジアミノプリン化合物を含む）の調製のためのプロセスを引用する）；米国特許第５，５８７，４６９号（Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドを引用する）；米国特許第５，５８７，４７０号（３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドを引用する）；米国特許第５，６０８，０４６号（両方とも、コンジュゲーションされている４’−デスメチルヌクレオシド類似体を引用する）；米国特許第．５，６１０，２８９号（骨格修飾オリゴヌクレオチド類似体を引用する）；米国特許第６，２６２，２４１号（とりわけ、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドを合成する方法を引用する）。
【００８１】
本発明の配列特異的な連結ヌクレオシドを持つリガンドにコンジュゲーションされているｄｓＲＮＡ及びリガンド分子において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドを、適したＤＮＡシンセサイザーで、標準的ヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体、あるいはヌクレオチド又はヌクレオシドにコンジュゲーションされている体の前駆体（連結成分を既に持つ）、リガンドヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲートの前駆体（リガンド分子を既に持つ）、又は非ヌクレオシドリガンドを持つ構築ブロックを利用して組み立ててもよい。
【００８２】
ヌクレオチドコンジュゲートの前駆体（連結成分を既に持つ）を使用する場合、配列特異的な連結ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、リガンド分子を、次に、連結成分と反応させ、リガンドにコンジュゲーションされているオリゴヌクレオチドを形成する。種々の分子（例えばステロイド、ビタミン、脂質、及びレポーター分子など）を持つオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、以前に記載されている（Manoharan et al.，ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３を参照のこと）。好ましい実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド又は連結ヌクレオシドを、自動シンセサイザーにより、商業的に利用可能なホスホラミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホラミダイトを使用して合成する。
【００８３】
オリゴヌクレオチドのヌクレオシドにおける２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アリル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基、又は２’−デオキシ−２’−フルオロ基の取り込みは、増強されたハイブリダイゼーション特性をオリゴヌクレオチドに与える。さらに、ホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチドは、増強したヌクレアーゼ安定性を有する。このように、本発明の官能性を持たせた連結ヌクレオシドを強化し、ホスホロチオエート骨格又は２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基、２’−Ｏ−アリル基、もしくは２’−デオキシ−２’−フルオロ基のいずれか又は両方を含むことができる。
【００８４】
一部の好ましい実施態様において、５’末端にアミノ基を持つ本発明の官能性を持たせたヌクレオシド配列を、ＤＮＡシンセサイザーを使用して調製し、次に、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は、当業者に周知である。代表的な活性エステルは、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステル、及びペンタクロロフェノールエステルを含む。アミノ基及び活性エステルの反応は、オリゴヌクレオチドを産生し、それにおいて、選択されたリガンドを、５’位置に、連結基を通じて付着させる。５’末端のアミノ基を、5'-Amino-Modifier C6試薬を利用して調製することができる。好ましい実施態様において、リガンド分子を、オリゴヌクレオチドに、５’位置に、リガンド−ヌクレオシドホスホラミダイトの使用によりコンジュゲーションさせてもよく、それにおいて、リガンドを、５’−ヒドロキシ基に、直接的に又はリンカーを介して間接的に連結する。そのようなリガンド−ヌクレオシドホスホラミダイトは、典型的には、自動合成手順の終わりに使用し、リガンドを５’末端に持つリガンドコンジュゲーションオリゴヌクレオチドを提供する。
【００８５】
本発明の方法の１つの好ましい実施態様において、リガンドにコンジュゲーションされているオリゴヌクレオチドの調製は、適切な前駆体分子の選択で始め、この上でリガンド分子を構築する。典型的には、前駆体は、一般的に使用されるヌクレオシドの適切に保護された誘導体である。例えば、本発明のリガンドにコンジュゲーションされているオリゴヌクレオチドの合成のための合成前駆体は、しかし、限定はされないが、２’−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、２’−６−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２’−デオキシ−ヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２−保護−ヌクレオシド、３’−６−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、及び３’−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド（分子の核酸塩基部分において保護されうる）を含む。そのようなアミノ連結保護ヌクレオシド前駆体の合成のための方法が、当業者に公知である。
【００８６】
多くの場合において、保護基が、本発明の化合物の調製の間に使用される。本明細書で使用する用語「保護」は、示した成分が、それに付加される保護基を有することを意味する。本発明の一部の好ましい実施態様において、化合物は、１つ又は複数の保護基を含む。多種多様な保護基を、本発明の方法において用いることができる。一般的に、保護基は、化学的官能性を特定の反応条件に対して不活性にし、分子の残りに実質的に損傷を与えることなく分子中のそのような官能性に付加する又はそれから除去することができる。
【００８７】
代表的なヒドロキシル保護基、ならびに他の代表的な保護基が、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed., John Wiley & Sons, New York, 1991及びOligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y, 1991に開示される。
【００８８】
酸処理に対して安定であるアミノ保護基を、塩基処理を用いて選択的に除去し、置換のために選択的に利用可能な反応性アミノ基を作製するために使用する。そのような基の例は、Ｆｍｏｃ（E. Atherton and R. C. Sheppard in The Peptides, S. Udenfriend, J. Meienhofer, Eds., Academic Press, Orlando, 1987, volume 9, p.1）及び種々の置換スルホニルエチルカルバメートＮｓｃ基により例示される（Samukov et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35: 7821)）である。
【００８９】
追加のアミノ保護基は、しかし、限定はされないが、カルバメート保護基、例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニルイル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、及びベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）など；アミド保護基、例えばホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、及びニトロフェニルアセチルなど；スルホンアミド保護基、例えば２−ニトロベンゼンスルホニルなど；ならびにイミン及び環状イミド保護基、例えばフタルイミド及びジチアスクシノイルなどを含む。これらのアミノ保護基の等価物は、また、本発明の化合物及び方法により包含される。
【００９０】
多くの固形支持体が、商業的に利用可能であり、当業者は、固相合成工程において使用するための固形支持体を容易に選択することができる。特定の実施態様において、ユニバーサル支持体を使用する。ユニバーサル支持体によって、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する異常な又は修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの調製が可能になる。ユニバーサル支持体についてのさらなる詳細については、Scott et al., Innovations and Perspectives in solid-phase Synthesis, 3rd International Symposium, 1994, Ed. Roger Epton, Mayflower Worldwide, 115-124を参照のこと。また、オリゴヌクレオチドを、固体支持体に、Ｓｙｎ−１，２−アセトキシリン酸基（より容易に塩基性加水分解を受ける）を介して結合させると、オリゴヌクレオチドを、ユニバーサル支持体から、より穏やかな反応条件下で切断することができることが報告されている。Guzaev, A. I.; Manoharan, M. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2380を参照のこと。
【００９１】
ヌクレオシドが、リン含有又は非リン含有の共有結合的なヌクレオシド間連結により連結される。同定の目的のために、そのようなコンジュゲーションされたヌクレオシドを、リガンドを持つヌクレオシド又はリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートとして特徴付けることができる。その配列内にヌクレオシドにコンジュゲーションされたアラルキルリガンドを有する連結ヌクレオシドによって、コンジュゲーションされていない類似のｄｓＲＮＡ化合物と比較した場合、増強されたｄｓＲＮＡ活性が実証される。
【００９２】
本発明のアラルキルリガンドにコンジュゲーションされたオリゴヌクレオチドは、また、オリゴヌクレオチド及び連結ヌクレオシドのコンジュゲートを含み、それにおいて、リガンドは、リンカー基の仲介を伴わず、ヌクレオシド又はヌクレオチドに直接的に付着される。リガンドは、好ましくは、連結基を介して、リガンドのカルボキシル基、アミノ基、又はオキソ基に付着させてもよい。典型的な連結基は、エステル基、アミド基、又はカルバメート基でありうる。
【００９３】
本発明のリガンドにコンジュゲーションされたオリゴヌクレオチドにおける使用のために想定される好ましい修飾オリゴヌクレオチドの特定の例は、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義する通り、修飾骨格又はヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を骨格中に保持するもの及びリン原子を骨格中に有さないものを含む。本発明の目的のために、リン原子をその糖間骨格中に有さない修飾オリゴヌクレオチドは、また、オリゴヌクレオシドと考えることができる。
【００９４】
特定のオリゴヌクレオチド化学修飾が、以下に記載される。所与の化合物中の全ての位置について均一に修飾されることは必要ではない。逆に、１を上回る修飾を、単一のｄｓＲＮＡ化合物中に又はさらにはその単一ヌクレオチド中に取り込んでもよい。
【００９５】
好ましい修飾ヌクレオシド間連結又は骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミド酸（３’−アミノホスホロアミド酸及びアミノアルキルホスホロアミド酸を含む）、チオノホスホロアミド酸、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’連結を有するボラノリン酸、これらの２’−５’連結類似体、ならびに逆極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’又は２’−５’から５’−２’で連結されている）を含む。種々の塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。
【００９６】
上のリン原子含有連結の調製に関連する代表的な米国特許は、しかし、限定はされないが、米国特許第４，４６９，８６３号；第５，０２３，２４３号；第５，２６４，４２３号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号及び第５，４６６，６７７号を含み、その各々が本明細書において参照により組み入れられる。
【００９７】
それにおいてリン原子を含まない好ましい修飾ヌクレオシド間連結又は骨格（即ち、オリゴヌクレオシド）は、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキル糖間連結、あるいは１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環状糖間連結により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２成分部分を有する他を含む。
【００９８】
上のオリゴヌクレオシドの調製に関連する代表的な米国特許は、しかし、限定はされないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２６４，５６２号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，６０２，２４０号及び第５，６６３，３１２号を含み、その各々が本明細書において参照により組み入れられる。
【００９９】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、糖及びヌクレオシド単位のヌクレオシド間連結（即ち、骨格）の両方を新たな基を用いて置換する。核酸塩基単位が、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド模倣体は、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されており、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として言及される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格を、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を用いて置換する。核酸塩基が保持され、直接的に又は間接的に、骨格のアミド部分の原子に結合される。ＰＮＡ化合物の教示は、例えば、米国特許第５，５３９，０８２号に見出すことができる。
【０１００】
本発明の一部の好ましい実施態様では、ホスホロチオエート連結を伴うオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を伴うオリゴヌクレオシド、特に、上で参照する米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、及び−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［それにおいて、ネイティブなホスホジエステル骨格は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、及び上で参照する米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を用いる。また、好ましいのは、上で参照する米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１０１】
本発明のリガンドにコンジュゲーションされたオリゴヌクレオチドにおいて用いられるオリゴヌクレオチドは、追加で又は代わりに、核酸塩基（しばしば、当技術分野において「塩基」と言及される）修飾又は置換を含みうる。本明細書で使用する「未修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシならびに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含む。
【０１０２】
さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されるもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されるもの、及びSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されるものを含む。これらの核酸塩基のいくつかが、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるために特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含む）を含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（同上、ページ２７６−２７８）、本発明では好ましい塩基置換である（さらに特に２’−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合）。
【０１０３】
上記の修飾された核酸塩基ならびに他の修飾された核酸塩基の特定のものの調製に関する代表的な米国特許は、しかし、限定はされないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第５，１３４，０６６号；第５，４５９，２５５号；第５，５５２，５４０号；第５，５９４，１２１号、及び第５，５９６，０９１号を含み、その全てが本明細書により参照により組み入れられる。
【０１０４】
特定の実施態様において、本発明のリガンドにコンジュゲーションされたオリゴヌクレオチドにおいて用いられるオリゴヌクレオチドは、追加で又は代わりに、１つ又は複数の置換糖成分を含みうる。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の１つを２’位置に含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル、又はＯ、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル。それにおいて、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルでありうる。特に好ましいのはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、そこでｎ及びｍは１から約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の１つを２’位置に含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、及び類似の特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても公知である］、即ち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても公知である）を含み、米国特許第６，１２７，５３３号（１９９８年１月３０日出願）に記載される通りであり、その内容は参照により組み入れられる。
【０１０５】
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。類似の修飾を、また、オリゴヌクレオチド上の他の位置に、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置に、又は、２’−５’連結オリゴヌクレオチド中に作製してもよい。
【０１０６】
本明細書で使用する用語「糖置換基」又は「２’−置換基」は、リボフラノシル成分の２’位置に付着した基（酸素原子を伴う又は伴わない）を含む。糖置換基は、しかし、限定はされないが、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール、及び化学式（Ｏ−アルキル）ｍのポリエーテル（式中、ｍは１から約１０である）を含む。これらのポリエーテルの内で好ましいのは、線状及び環状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び（ＰＥＧ）含有基（例えばクラウンエーテルなど）、及びとりわけ、Delgardo et. al.（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9:249）（本明細書により、参照によりその全体が組み入れられる）により開示されるものである。さらなる糖修飾が、Cook（Anti-fibrosis Drug Design, 1991, 6: 585-607）により開示される。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル、及びアルキルアミノ置換が、米国特許第６，１６６，１９７号（表題「Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions」）（本明細書により、参照によりその全体が組み入れられる）に記載される）に記載される。
【０１０７】
本発明に受け入れることができる追加の糖置換基は、２’−ＳＲ基及び２’−ＮＲ２基を含み、それにおいて各々のＲは、非依存的に、水素、保護基、又は置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、もしくはアルキニルを含む。２’−ＳＲヌクレオシドが米国特許第５，６７０，６３３号に開示され、本明細書により、参照によりその全体が組み入れられる。２’−ＳＲ単量体シントンの組み入れは、Hamm et al.（J. Org. Chem., 1997, 62: 3415-3420）により開示される。２’−ＮＲヌクレオシドが、Goettingen, M., J. Org. Chem., 1996, 61, 6273-6281;及びPolushin et al., Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3227-3230に開示される。本発明に受け入れることができる代表的な２’−置換基は、化学式Ｉ又はＩＩ：
【化１】
2012526533.tif 000003
（式中、ＥはＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｑ３）（Ｑ４）、又はＮ＝Ｃ（Ｑ３）（Ｑ４）であり；各々のＱ３及びＱ４は、非依存的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ジアルキルアミノアルキル、窒素保護基、テザー又は非テザーコンジュゲート基、固体支持体へのリンカーであり；又はＱ３及びＱ４は、一緒に、窒素保護基又は環構造（場合により、Ｎ及びＯより選択される少なくとも１つの追加のヘテロ原子を含む）を形成し；
ｑ１は１から１０の整数であり；
ｑ２は１から１０の整数であり；
ｑ３は０又は１であり；
ｑ４は０、１、又は２であり；
各々のＺ１、Ｚ２、及びＺ３は、非依存的に、Ｃ４−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１４アリール、又はＣ３−Ｃ１５ヘテロシクリルであり、それにおいて、前記ヘテロシクリル基中のヘテロ原子は、酸素、窒素、及び硫黄より選択され；
Ｚ４は、ＯＭ１、ＳＭ１、又はＮ（Ｍ１）２であり；各々のＭ１は、非依存的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２、又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２である；Ｍ２は、Ｈ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり；及び
Ｚ５は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、Ｎ（Ｑ３）（Ｑ４）、ＯＱ３、ハロ、ＳＱ３、又はＣＮである）
の１つを有するものを含む。
【０１０８】
化学式Ｉの代表的な２’−Ｏ−糖置換基が、米国特許第６，１７２，２０９号（表題「Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides」）（本明細書により、参照によりその全体が組み入れられる）に開示される。化学式ＩＩの代表的な環状２’−Ｏ−糖置換基が、米国特許第６，２７１，３５８号（表題「RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized」）（本明細書により、参照によりその全体が組み入れられる）に開示される。
【０１０９】
リボシル環上にＯ−置換を有する糖も、本発明に受け入れることができる。環Ｏについての代表的な置換は、しかし、限定はされないが、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦ、及びＣＦ２を含む。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドは、また、糖模倣体（例えばシクロブチル成分など）を、ペントフラノシル糖の代わりに有しうる。そのような修飾された糖の調製に関する代表的な米国特許は、しかし、限定はされないが、米国特許第５，３５９，０４４号；第５，４６６，７８６号；第５，５１９，１３４号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６４６，２６５号、及び第５，７００，９２０号を含み、その全てが、本明細書により、参照により組み入れられる。
【０１１１】
追加の修飾を、また、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置に作製してもよい。例えば、本発明のリガンドにコンジュゲーションされたオリゴヌクレオチドの１つの追加の修飾は、オリゴヌクレオチドに、１つ又は複数の追加の非リガンド成分又はコンジュゲートを化学的に連結することを含み、それによって、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みが増強される。そのような成分は、しかし、限定はされないが、脂質成分、例えばコレステロール成分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991,10,111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl.Acids Res., 1990, 18, 3777）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651）、パルミチル成分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、又はオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）を含む。
【０１１２】
本発明は、また、オリゴヌクレオチド内の特定の位置に関して実質的にキラルに純粋であるオリゴヌクレオチドを用いた組成物を含む。実質的にキラルに純粋であるオリゴヌクレオチドの例は、しかし、限定はされないが、少なくとも７５％Ｓｐ又はＲｐであるホスホロチオエート連結を有するもの（Cook et al.、米国特許第５，５８７，３６１号）及び実質的にキラルに純粋（Ｓｐ又はＲｐ）であるアルキルホスホネート、ホスホロアミド酸、又はホスホトリエステル連結（Cook、米国特許第５，２１２，２９５号及び第５，５２１，３０２号）を有するものを含む。
【０１１３】
特定の例において、オリゴヌクレオチドを、非リガンド基により修飾してもよい。多くの非リガンド分子が、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを増強するために、オリゴヌクレオチドにコンジュゲーションされてきた。そのようなコンジュゲーションを実施するための手順が、科学文献において利用可能である。そのような非リガンド成分は、脂質成分、例えばコレステロール（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991,10,111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327;Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl.Acids Res., 1990, 18, 3777）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651）、パルミチル成分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、又はオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）を含む。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つ又は複数の位置にアミノリンカーを持つオリゴヌクレオチドの合成を含む。アミノ基を次に反応させ、分子を適切な共役試薬又は活性化試薬を使用してコンジュゲーションする。コンジュゲーション反応を、依然として固体支持体に結合されているオリゴヌクレオチドを用いて、又は、溶液相中でのオリゴヌクレオチドの切断の後にのいずれかで実施してよい。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製は、典型的に、純粋なコンジュゲートを与える。コレステロールコンジュゲートの使用が、特に好ましい。なぜなら、そのような成分によって、肝臓（ＧＣＲタンパク質産生の部位）中の組織への標的化を増加することができるからである。
【０１１４】
あるいは、コンジュゲーションされる分子を、ビルディングブロック（例えばホスホラミダイトなど）に、分子中に存在するアルコール基を介して又はリン酸化されうるアルコール基を持つリンカーの付着により変換してもよい。
【０１１５】
重要なことに、これらのアプローチの各々を、リガンドにコンジュゲーションされたオリゴヌクレオチドの合成のために使用してもよい。アミノ連結オリゴヌクレオチドを、リガンドと、共役試薬の使用を介して又はＮＨＳもしくはペントフルオロフェノレート（ｐｅｎｔｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）エステルとしてのリガンドの活性化に続いて直接的に共役してもよい。リガンドホスホラミダイトを、カルボキシル基の１つへのアミノヘキサノールリンカーの付着、それに続く末端アルコール官能性のホスフィチル化を介して合成してもよい。他のリンカー（例えばシステアミンなど）も、合成されたオリゴヌクレオチド上に存在するクロロアセチルリンカーへのコンジュゲーションのために利用してもよい。
【０１１６】
別に定義しない場合、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似の又は等価の方法及び材料を、本発明の実行又はテストにおいて使用することができるが、適した方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献が、参照により、その全体が組み入れられる。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）により制御されうる。また、材料、方法、及び実施例は、例証的だけであり、限定する意図はない。
【０１１７】
上に提供する本発明の実施態様及び項目を、本明細書では、以下の非限定的な実施例を用いて例証する。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
図の説明及び添付の表：
【図１】オフターゲット配列の発現抑制に対する配列番号対５５／５６を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡの効果。ＧＣＲ  ｍＲＮＡの１９ｍｅｒ標的部位（「ｏｎ」）又はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ  １」から「ｏｆｆ  １５」；「ｏｆｆ  １」−  「ｏｆｆ  １２」がアンチセンス鎖オフターゲットであり、及び「ｏｆｆ  １３」から「ｏｆｆ  １５」がセンス鎖オフターゲットである）のいずれかについて示す、二重ルシフェラーゼコンストラクトを発現するＣＯＳ７細胞の、５０nMのＧＣＲ  ｄｓＲＮＡを用いたトランスフェクション後でのウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡがコントロールである。
【図２】オフターゲット配列の発現抑制に対する配列番号対８３／８４を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡの効果。ＧＣＲ  ｍＲＮＡの１９ｍｅｒ標的部位（「ｏｎ」）又はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ  １」から「ｏｆｆ  １４」；「ｏｆｆ  １」−  「ｏｆｆ  １１」がアンチセンス鎖オフターゲットであり、及び「ｏｆｆ  １２」及び「ｏｆｆ  １４」がセンス鎖オフターゲットである）のいずれかについて示す、二重ルシフェラーゼコンストラクトを発現するＣＯＳ７細胞の、５０nMのＧＣＲ  ｄｓＲＮＡを用いたトランスフェクション後でのウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡがコントロールである。
【図３】オフターゲット配列の発現抑制に対する配列番号対７／８を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡの効果。ＧＣＲ  ｍＲＮＡの１９ｍｅｒ標的部位（「ｏｎ」）又はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ  １」から「ｏｆｆ  １４」；「ｏｆｆ  １」−  「ｏｆｆ  １１」がアンチセンス鎖オフターゲットであり、及び「ｏｆｆ  １２」から「ｏｆｆ  １４」がセンス鎖オフターゲットである）のいずれかについて示す、二重ルシフェラーゼコンストラクトを発現するＣＯＳ７細胞の、５０nMのＧＣＲ  ｄｓＲＮＡを用いたトランスフェクション後でのウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡがコントロールである。
【図４】ヒト初代肝細胞において、ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子について、又はハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢについて、ＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ又はルシフェラーゼｄｓＲＮＡコントロールを用いたトランスフェクション後９６時間に、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ−１トランスフェクション試薬単独に曝露されたコントロール細胞と比較した、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０単位／細胞で表すｍＲＮＡレベル。
【図５ａ】ＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡに４８時間曝露されたヒト初代肝細胞における、ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子（ａ）、ＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子（ｂ）ならびにＧＣＲ標的遺伝子ＰＣＫ１（ｃ）、Ｇ６Ｐｃ（ｄ）及びＴＡＴ（ｅ）について、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０単位／細胞で表すｍＲＮＡレベル。
【図５ｂ】ＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡに４８時間曝露されたヒト初代肝細胞における、ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子（ａ）、ＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子（ｂ）ならびにＧＣＲ標的遺伝子ＰＣＫ１（ｃ）、Ｇ６Ｐｃ（ｄ）及びＴＡＴ（ｅ）について、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０単位／細胞で表すｍＲＮＡレベル。
【図５ｃ】ＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡに４８時間曝露されたヒト初代肝細胞における、ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子（ａ）、ＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子（ｂ）ならびにＧＣＲ標的遺伝子ＰＣＫ１（ｃ）、Ｇ６Ｐｃ（ｄ）及びＴＡＴ（ｅ）について、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０単位／細胞で表すｍＲＮＡレベル。
【図５ｄ】ＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡに４８時間曝露されたヒト初代肝細胞における、ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子（ａ）、ＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子（ｂ）ならびにＧＣＲ標的遺伝子ＰＣＫ１（ｃ）、Ｇ６Ｐｃ（ｄ）及びＴＡＴ（ｅ）について、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０単位／細胞で表すｍＲＮＡレベル。
【図５ｅ】ＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡに４８時間曝露されたヒト初代肝細胞における、ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子（ａ）、ＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子（ｂ）ならびにＧＣＲ標的遺伝子ＰＣＫ１（ｃ）、Ｇ６Ｐｃ（ｄ）及びＴＡＴ（ｅ）について、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０単位／細胞で表すｍＲＮＡレベル。
【図６ａ】ＬＮＰ０１−ｄｓＲＮＡ（ａ）ルシフェラーゼｄｓＲＮＡコントロール、ｂ）配列番号対５５／５６を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ、ｃ）配列番号対８３／８４を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡに４８時間にわたり曝露され、糖新生前駆体（乳酸及びピルビン酸）の存在における５時間にわたるインキュベーション前に９６時間にわたり飢餓させた初代ヒト肝細胞において測定されたグルコースアウトプット。
【図６ｂ】ＬＮＰ０１−ｄｓＲＮＡ（ａ）ルシフェラーゼｄｓＲＮＡコントロール、ｂ）配列番号対５５／５６を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ、ｃ）配列番号対８３／８４を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡに４８時間にわたり曝露され、糖新生前駆体（乳酸及びピルビン酸）の存在における５時間にわたるインキュベーション前に９６時間にわたり飢餓させた初代ヒト肝細胞において測定されたグルコースアウトプット。
【図６ｃ】ＬＮＰ０１−ｄｓＲＮＡ（ａ）ルシフェラーゼｄｓＲＮＡコントロール、ｂ）配列番号対５５／５６を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ、ｃ）配列番号対８３／８４を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡに４８時間にわたり曝露され、糖新生前駆体（乳酸及びピルビン酸）の存在における５時間にわたるインキュベーション前に９６時間にわたり飢餓させた初代ヒト肝細胞において測定されたグルコースアウトプット。
【図７ａ】ＬＮＰ０１−ｄｓＲＮＡ（ａ）ルシフェラーゼｄｓＲＮＡコントロール、ｂ）配列番号対５５／５６を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ、ｃ）配列番号対８３／８４を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡに４８時間にわたり曝露され、糖新生前駆体（乳酸及びピルビン酸）の存在における５時間にわたるインキュベーション前に９６時間にわたり飢餓させた初代ヒト肝細胞において測定された細胞ＡＴＰ含量。
【図７ｂ】ＬＮＰ０１−ｄｓＲＮＡ（ａ）ルシフェラーゼｄｓＲＮＡコントロール、ｂ）配列番号対５５／５６を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ、ｃ）配列番号対８３／８４を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡに４８時間にわたり曝露され、糖新生前駆体（乳酸及びピルビン酸）の存在における５時間にわたるインキュベーション前に９６時間にわたり飢餓させた初代ヒト肝細胞において測定された細胞ＡＴＰ含量。
【図７ｃ】ＬＮＰ０１−ｄｓＲＮＡ（ａ）ルシフェラーゼｄｓＲＮＡコントロール、ｂ）配列番号対５５／５６を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ、ｃ）配列番号対８３／８４を含むＧＣＲ  ｄｓＲＮＡに４８時間にわたり曝露され、糖新生前駆体（乳酸及びピルビン酸）の存在における５時間にわたるインキュベーション前に９６時間にわたり飢餓させた初代ヒト肝細胞において測定された細胞ＡＴＰ含量。
【図８ａ】ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１遺伝子、図８ａ）ならびにＧＣＲによりアップレギュレーションされる遺伝子ＴＡＴ（図８ａ）、ＰＣＫ１（図８ｂ）、Ｇ６Ｐｃ（図８ｂ）、及びＨＥＳ１（ＧＣＲによりダウンレギュレーションされる、図８ｃ）について得られた、高血糖及び糖尿病の１４週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスにおける配列番号対５１７／５１８又はルシフェラーゼコントロール配列番号対６８１／６８２を含むＧＣＲについての、ＬＰＮＯ１製剤化ｄｓＲＮＡの単回静脈内投与後１０３時間での、ＧＵＳＢハウスキーピングｍＲＮＡレベルと比べた肝臓ｍＲＮＡレベル。
【図８ｂ】ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１遺伝子、図８ａ）ならびにＧＣＲによりアップレギュレーションされる遺伝子ＴＡＴ（図８ａ）、ＰＣＫ１（図８ｂ）、Ｇ６Ｐｃ（図８ｂ）、及びＨＥＳ１（ＧＣＲによりダウンレギュレーションされる、図８ｃ）について得られた、高血糖及び糖尿病の１４週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスにおける配列番号対５１７／５１８又はルシフェラーゼコントロール配列番号対６８１／６８２を含むＧＣＲについての、ＬＰＮＯ１製剤化ｄｓＲＮＡの単回静脈内投与後１０３時間での、ＧＵＳＢハウスキーピングｍＲＮＡレベルと比べた肝臓ｍＲＮＡレベル。
【図８ｃ】ＧＣＲ（ＮＲ３Ｃ１遺伝子、図８ａ）ならびにＧＣＲによりアップレギュレーションされる遺伝子ＴＡＴ（図８ａ）、ＰＣＫ１（図８ｂ）、Ｇ６Ｐｃ（図８ｂ）、及びＨＥＳ１（ＧＣＲによりダウンレギュレーションされる、図８ｃ）について得られた、高血糖及び糖尿病の１４週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスにおける配列番号対５１７／５１８又はルシフェラーゼコントロール配列番号対６８１／６８２を含むＧＣＲについての、ＬＰＮＯ１製剤化ｄｓＲＮＡの単回静脈内投与後１０３時間での、ＧＵＳＢハウスキーピングｍＲＮＡレベルと比べた肝臓ｍＲＮＡレベル。
【図９】高血糖及び糖尿病の１４週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＬＰＮＯ１−ｄｓＲＮＡの単回静脈内投与後での血中グルコースレベルに対する経時的効力（＊：ｐ＜０．０５対ビヒクル）。＋５５、＋７９、＋１０３時間に観察された減少するグルコースレベルにおける配列番号対５１７／５１８を含むＧＣＲについてのＬＰＮＯ１−ｄｓＲＮＡの効力は、プラセボ（ＬＮＰ０１ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ配列番号対６８１／６８２）と比較して、それぞれ−１３％、−３１％、及び−２９％であった（ｎ＝４、平均値＋／−ＳＥＭ、各日についての等分散を仮定したｔ検定）。
【図１０】配列番号対５１７／５１８を含むＧＣＲについてのＬＰＮＯ１−ｄｓＲＮＡ又はルシフェラーゼコントロールｄｓＲＮＡ（配列番号対６８１／６８２）の単回静脈内投与後５５、７９、及び１０３時間での、高血糖及び糖尿病の１４週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＡＬＴ及びＡＳＴにおける経時的血漿レベル。
【図１１ａ】ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対６８１／６８２）又はＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ（配列番号対７４７／７５３又は配列番号対７６４／７７２）の単回静脈内ボーラス注射後３日での、ｂＤＮＡアッセイにより測定された、カニクイザルの肝臓生検におけるＧＣＲ  ｍＲＮＡレベル。各群について与えられたｄｓＲＮＡに関する用量（ｍｇ／ｋｇ）。Ｎ＝２雌及び雄のカニクイザル。値を、個々のサル毎でのＧＡＰＤＨ値の平均値に対して（ａ）、又はルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対６８１／６８２）と比べて（エラーバーはサル間での変動を示す）（ｂ）標準化する。
【図１１ｂ】ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対６８１／６８２）又はＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ（配列番号対７４７／７５３又は配列番号対７６４／７７２）の単回静脈内ボーラス注射後３日での、ｂＤＮＡアッセイにより測定された、カニクイザルの肝臓生検におけるＧＣＲ  ｍＲＮＡレベル。各群について与えられたｄｓＲＮＡに関する用量（ｍｇ／ｋｇ）。Ｎ＝２雌及び雄のカニクイザル。値を、個々のサル毎でのＧＡＰＤＨ値の平均値に対して（ａ）、又はルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対６８１／６８２）と比べて（エラーバーはサル間での変動を示す）（ｂ）標準化する。
【０１１９】
表１−ヒトＧＣＲ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡ。大文字の文字は、ＲＮＡヌクレオチドを示し、小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」、及び「ｕ」は、２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートを、「ｄＴ」は、デオキシチミジンを、「ｉｎｖｄＴ」は、逆位デオキシチミジンを、「ｆ」は、先行するヌクレオチドの２’フルオロ修飾を示す。
【０１２０】
表２−ヒトＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの特徴付け：ＨｅｐＧ２及びＨｅＬａＳ３細胞における用量反応についての活性テスト。ＩＣ５０：５０％阻害濃度。
【０１２１】
表３−ヒトＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの特徴付け：安定性及びサイトカイン誘導。ｔ1/2：実施例において定義される鎖の半減期。ＰＢＭＣ：ヒト末梢血単核細胞。
【０１２２】
表４−マウス及びラットＧＣＲ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡ。大文字の文字は、ＲＮＡヌクレオチドを示し、小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」、及び「ｕ」は、２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートを、「ｄＴ」は、デオキシチミジンを示す。「ｆ」は、先行するヌクレオチドの２’フルオロ修飾を示す。
【０１２３】
表５−マウス及びラットＧＣＲ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡの特徴付け：安定性及びサイトカイン誘導。ｔ1/2：実施例において定義される鎖の半減期。ＰＢＭＣ：ヒト末梢血単核細胞。
【０１２４】
表６−配列番号対５５／５６を含むヒトＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
【０１２５】
表７−配列番号対８３／８４を含むヒトＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
【０１２６】
表８−配列番号対７／８を含むヒトＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
【０１２７】
表９−ヒトＧＡＰＤＨの決定のためのｂＤＮＡプローブの配列；ＬＥ＝標識エクステンダー、ＣＥ＝捕捉エクステンダー、ＢＬ＝遮断プローブ。
【０１２８】
表１０−ヒトＧＣＲの決定のためのｂＤＮＡプローブの配列；ＬＥ＝標識エクステンダー、ＣＥ＝捕捉エクステンダー、ＢＬ＝遮断プローブ。
【０１２９】
表１１−マウスＧＣＲの決定のためのｂＤＮＡプローブの配列；ＬＥ＝標識エクステンダー、ＣＥ＝捕捉エクステンダー、ＢＬ＝遮断プローブ。
【０１３０】
表１２−マウスＧＡＰＤＨの決定のためのｂＤＮＡプローブの配列；ＬＥ＝標識エクステンダー、ＣＥ＝捕捉エクステンダー、ＢＬ＝遮断プローブ。
【０１３１】
表１３−ヒトＧＣＲ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡ。大文字の文字は、ＲＮＡヌクレオチドを示す。
【０１３２】
表１４−修飾を伴わないヒトＧＣＲ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡ及びそれらの修飾された対応物。大文字の文字は、ＲＮＡヌクレオチドを示し、小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」、及び「ｕ」は、２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートを、「ｄＴ」は、デオキシチミジンを、「ｉｎｖｄＴ」は、逆位デオキシチミジンを示す。
【０１３３】
実施例
治療的使用のためのｄｓＲＮＡの同定
ｄｓＲＮＡ設計を行い、治療的使用のためにヒトＧＣＲを特異的に標的化するｄｓＲＮＡを同定した。最初に、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＧＣＲの公知のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０００１７６．２、ＮＭ＿００１０１８０７４．１、ＮＭ＿００１０１８０７５．１、ＮＭ＿００１０１８０７６．１、ＮＭ＿００１０１８０７７．１、  ＮＭ＿００１０２０８２５．１、ＮＭ＿００１０２４０９４．１、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、配列番号６６４、及び配列番号６６５として列挙する）が、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋからダウンロードされた。
【０１３４】
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）ＧＣＲのｍＲＮＡ（ＸＭ＿００１０９７０１５．１、ＸＭ＿００１０９７１２６．１、ＸＭ＿００１０９７２３８．１、ＸＭ＿００１０９７３４１．１、ＸＭ＿００１０９７４４４．１、ＸＭ＿００１０９７５４２．１、ＸＭ＿００１０９７６４０．１、ＸＭ＿００１０９７７４９．１、ＸＭ＿００１０９７８４６．１  ａｎｄ  ＸＭ＿００１０９７９４２．１）が、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋからダウンロードされた（配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、及び配列番号６７５）。
【０１３５】
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＧＣＲ（ＢＢ８７８８４３．１）のＥＳＴが、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋからダウンロードされた（配列番号６７６）。
【０１３６】
サル配列を、ヒトＧＣＲ  ｍＲＮＡ配列（配列番号６７７）と一緒に、コンピュータ解析により検証し、ヒト及びアカゲザル又はヒト及びカニクイザル配列と交差反応性のあるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）薬剤をもたらす１９ヌクレオチドの相同配列を同定した。
【０１３７】
ＲＮＡｉ薬剤を同定する際、選択は、独自アルゴリズムを使用することにより、ヒトＲｅｆＳｅｑデータベース（リリース２７）（それを、本発明者らは、包括的ヒトトランスクリプトームを示すと仮定した）中の任意の他の配列に対するアンチセンス鎖において少なくとも２つのミスマッチを有する１９ｍｅｒ配列に限定された。
【０１３８】
カニクイザルＧＣＲ遺伝子を、配列決定し（配列番号６７８を参照のこと）、ＲＮＡｉ薬剤の標的領域について検証した。
【０１３９】
ヒトならびにカニクイザルＧＣＲに交差反応性のあるｄｓＲＮＡは、治療的使用のために最も好ましいとして定義された。４つ又はそれ以上の連続Ｇ（ポリＧ配列）を含む全ての配列が、合成から除外された。
【０１４０】
このようにして同定された配列は、添付の表１及び１４中のＲＮＡｉ薬剤の合成のための基礎を形成した。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの概念実証試験のためのｄｓＲＮＡの同定
ｄｓＲＮＡ設計を行い、ｉｎ  ｖｉｖｏでの概念実証実験のためにマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）及びラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）を標的化するｄｓＲＮＡを同定した。最初に、マウスＧＣＲ（ＮＭ＿００８１７３．３、配列番号６７９）及びラットＧＣＲ（ＮＭ＿０１２５７６．２、配列番号６８０）についての転写物を、コンピュータ解析により検証し、これらの配列の間で交差反応性のあるＲＮＡｉ薬剤をもたらす１９ヌクレオチドの相同配列を同定した。
【０１４２】
ＲＮＡｉ薬剤を同定する際、選択は、独自アルゴリズムを使用することにより、マウス及びラットＲｅｆＳｅｑデータベース（リリース２７）（それを、包括的マウス及びラットトランスクリプトームを示すと仮定した）中の任意の他の配列に対するアンチセンス鎖において少なくとも２つのミスマッチを有する１９ｍｅｒ配列に限定された。
【０１４３】
４つ又はそれ以上の連続Ｇ（ポリＧ配列）を含む全ての配列が、合成から除外された。このようにして同定された配列は、添付の表４中のＲＮＡｉ薬剤の合成のための基礎を形成した。
【０１４４】
ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給源が、本明細書に具体的に与えられない場合、そのような試薬は、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から、分子生物学における適用のための品質及び／純度基準で得てもよい。
【０１４５】
一本鎖ＲＮＡを、１μモルのスケールでの固相合成により、Expedite 8909シンセサイザー（Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany）及び固体支持体としての制御されたポアガラス（CPG, 500A, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany）を使用して産生した。ＲＮＡ及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡを、固相合成により、対応するホスホラミダイト及び２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト（Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany）をそれぞれ用いて生成した。これらのビルディングブロックを、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に、標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学、例えばCurrent protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載するものなどを使用して取り込ませた。ホスホロチオエート連結を、ヨード酸化剤溶液とアセトニトリル中のBeaucage試薬（Chruachem Ltd, Glasgow, UK）の溶液（１％）との置換により導入した。さらなる補助試薬をMallinckrodt Baker（Griesheim, Germany）から得た。
【０１４６】
陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護及び精製を、確立された手順に従って行った。産出量及び濃度を、分光光度計
【化２】
2012526533.tif 000004
を使用した波長２６０nmでのそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸光度により決定した。二本鎖ＲＮＡを、アニーリング緩衝液（２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．８；１００mM塩化ナトリウム）中の相補鎖の等モル溶液を混合することにより生成し、８５〜９０℃の水浴中で３分間にわたり加熱し、室温まで３〜４時間の期間にわたり冷却した。アニーリングしたＲＮＡ溶液を、−２０℃で使用まで保存した。
【０１４７】
活性テスト
ヒトＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの活性
上に記載する治療的使用のためのＧＣＲ−ｄｓＲＮＡの活性を、ＨｅＬａＳ３細胞でテストした。培養中の細胞を、ＧＣＲ特異的ｄｓＲＮＡを用いてインキュベーションした細胞に由来する全ｍＲＮＡ中の分岐ＤＮＡによるＧＣＲ  ｍＲＮＡの定量化のために使用した。
【０１４８】
ＨｅＬａＳ３細胞を、American Type Culture Collection（Rockville, Md., cat. No.CCL-2.2）から得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.S0115）、ペニシリン１００U/ml、ストレプトマイシン１００mg/ml（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.A2213）を含むように添加されたＨａｍ’ｓ  Ｆ１２（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.FG 0815）中で、３７℃で、５％ＣＯ２を伴う大気中で加湿インキュベータ（Heraeus HERAAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany）において培養した。
【０１４９】
細胞播種及びｄｓＲＮＡのトランスフェクションを、同時に実施した。ｄｓＲＮＡを用いたトランスフェクションのために、ＨｅＬａＳ３細胞を、密度２．０．ｔｉｍｅｓ．１０．ｓｕｐ．４細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。ｄｓＲＮＡのトランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat.No.11668-019）を用いて製造業者により記載される通りに行った。最初の単回投与実験において、ｄｓＲＮＡを、濃度３０nMでトランスフェクションした。２つの独立した実験を、実施した。３０nMでの最初の単回投与スクリーンから８０％超のｍＲＮＡノックダウンを示す最も効果的なｄｓＲＮＡを、用量反応曲線によりさらに特徴付けた。用量反応曲線のために、トランスフェクションを、上の単回投与スクリーンについて記載される通りに、ＨｅＬａＳ３細胞において実施したが、しかし、以下のｄｓＲＮＡの濃度を用いた（nM）：２４、６、１．５、０．３７５、０．０９３８、０．０２３４、０．００５９、０．００１５、０．０００４、及び０．０００１nM。トランスフェクション後、細胞を、２４時間にわたり３７℃及び５％ＣＯ２で加湿インキュベータ（Heraeus GmbH, Hanau, Germany）においてインキュベーションした。ＧＣＲ  ｍＲＮＡの測定のために、細胞を収集し、ｍＲＮＡのｂＤＮＡ定量化のためのQuantigene 1.0 Assay Kit（Panomics, Fremont, Calif., USA, cat. No.QG-0004）の製造業者により推奨される手順に従って５３℃で溶解した。その後、５０μlのライセートを、ヒトＧＣＲ及びヒトＧＡＰＤＨに特異的なプローブセット（プローブセットの配列、表９及び１０を参照のこと）を用いてインキュベーションし、QuantiGeneのための製造業者のプロトコールに従って加工した。化学発光を、Victor2-Light（Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany）においてＲＬＵ（相対光単位）として測定し、ヒトＧＣＲプローブセットを用いて得られた値を、それぞれのヒトＧＡＰＤＨ値に対して、各ウェルついて標準化した。無関係のコントロールｄｓＲＮＡを、ネガティブコントロールとして使用した。
【０１５０】
阻害データを、添付の表１及び２に与える。
【０１５１】
齧歯類ＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの活性
齧歯類モデルにおける使用のためのＧＣＲ−ｓｉＲＮＡの活性を、Ｈｅｐａ１−６細胞においてテストした。培養中のＨｅｐａ１−６細胞は、ＧＣＲ特異的ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞に由来する全細胞ライセートからの分岐ＤＮＡアッセイによるＧＣＲ  ｍＲＮＡの定量化のために使用した。
【０１５２】
Ｈｅｐａ１−６細胞を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Braunschweig Germany, cat. No.ACC 175）から得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.S0115）、ペニシリン１００U/ml、ストレプトマイシン１００mg/ml（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.A2213）、Ｌグルタミン４mM（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.K0283）を含むように添加されたＤＭＥＭ（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.FG 0815）中で、３７℃で、５％ＣＯ２を伴う大気中で加湿インキュベータ（Heraeus HERAAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany）において培養した。
【０１５３】
細胞播種及びｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、同時に実施した。ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションのために、Ｈｅｐａ１−６細胞を密度１５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat.No.11668-019）を用いて製造業者により記載される通りに行った。ｓｉＲＮＡの２つの化学的に異なるスクリーニングセットを、濃度５０nMでトランスフェクションした。ＧＣＲ  ｍＲＮＡの測定のために、細胞をトランスフェクション後２４時間で収集し、ｍＲＮＡのｂＤＮＡ定量化のためのQuantigene 1.0 Assay Kit（Panomics, Fremont, Calif., USA, cat. No.QG-0004）の製造業者により推奨される手順に従って５３℃で溶解した。その後、５０μlのライセートを、マウスＧＣＲ及びマウスＧＡＰＤＨに特異的なプローブセット（プローブセットの配列、以下を参照のこと）を用いてインキュベーションし、QuantiGeneのための製造業者のプロトコールに従って加工した。化学発光を、Victor2-Light（Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany）においてＲＬＵ（相対光単位）として測定し、マウスＧＣＲプローブセットを用いて得られた値を、それぞれのマウスＧＡＰＤＨ値に対して、各ウェルついて標準化した。無関係のコントロールｓｉＲＮＡを、ネガティブコントロールとして使用した。最も有効な３つのｓｉＲＮＡを、齧歯類ｉｎ  ｖｉｖｏ実験における薬理学的な概念実証試験のために使用した。
【０１５４】
阻害データを、添付の表４に与える。
【０１５５】
ｄｓＲＮＡの安定性
ｄｓＲＮＡの安定性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ヒトＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡについてのヒト血清又はカニクイザルからの血漿のいずれかを用いて、及び、マウス／ラットＰＴＢ１Ｂを標的化するｄｓＲＮＡについてのマウス血清を用いて、各々の一本鎖の半減期を測定することにより決定した。
【０１５６】
測定を、３通りに、各時間点について、３０μlのヒト血清又はカニクイザル血漿（Sigma Aldrich）と混合した３μlの５０μM  ｄｓＲＮＡサンプルを使用して行った。混合物を、０分、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、又は４８時間のいずれかにわたり３７℃でインキュベーションした。非特異的分解についてのコントロールとして、ｄｓＲＮＡを３０μlの１ｘ  ＰＢＳ  ｐＨ  ６．８と４８時間にわたりインキュベーションした。反応を、４μlのプロテイナーゼＫ（２０mg/ml）、２５μlの「Tissue and Cell Lysis Solution」（Epicentre）、及び３８μlのMillipore水の添加により３０分間にわたり６５℃で停止した。サンプルを、その後、０．２μmの９６ウェルフィルタープレートを通じて、１４００rpmで８分間にわたりスピンろ過し、５５μlのMillipore水を用いて２回洗浄し、再びスピンろ過した。
【０１５７】
一本鎖の分離及び残りの完全長産物（ＦＬＰ）の分析のために、サンプルを、イオン交換Dionex Summit HPLCを通じて、変性条件下で、溶出液Ａとして２０mM  Ｎａ３ＰＯ４（１０％  ＡＣＮ  ｐＨ＝１１中）及び溶出液Ｂとして１Ｍ  ＮａＢｒ（溶出液Ａ中）を使用して流した。
【０１５８】
以下の勾配を、適用した：
【０１５９】
【表１】
2012526533.tif 000005
【０１６０】
すべての注射について、クロマトグラムを、Dionex Chromeleon 6.60 HPLCソフトウェアにより自動的に統合し、必要な場合、手動で調整した。全てのピーク面積を、内部標準（ＩＳ）ピークに対して補正し、ｔ＝０分でのインキュベーションに対して標準化した。ピーク下面積及び結果として得られる残りのＦＬＰを、各々の一本鎖について、３通りに別々に算出した。鎖の半減期（ｔ１／２）を、ＦＬＰの半分が分解した時間点の３通りについての平均時間点［時間］により定義した。
【０１６１】
結果を、添付の表３及び５に与える。
【０１６２】
サイトカイン誘導
ｄｓＲＮＡの潜在的なサイトカイン誘導を、ＩＮＦ−ａ及びＴＮＦ−ａの放出を測定することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＢＭＣアッセイにおいて決定した。
【０１６３】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２つのドナーの軟膜血液から、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により、トランスフェクションの日に単離した。細胞を、４通りに、ｄｓＲＮＡを用いてトランスフェクションし、２４時間にわたり３７℃で、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中の最終濃度１３０nMで、Gene Porter 2（ＧＰ２）又はＤＯＴＡＰのいずれかを使用して培養した。ＩＮＦ−ａ及びＴＮＦ−ａをこのアッセイにおいて誘導することが公知であるｄｓＲＮＡ配列、ならびにＣｐＧオリゴを、ポジティブコントロールとして使用した。トランスフェクション試薬をサイトカイン誘導のために必要としない化学的なコンジュゲーションされたｄｓＲＮＡ又はＣｐＧオリゴヌクレオチドを、濃度５００nMで、培養液中でインキュベーションした。インキュベーションの終了時、４通りの培養上清を、プールした。
【０１６４】
ＩＮＦ−ａ及びＴＮＦ−ａを、次に、これらのプールした上清中で、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡにより、１プール当たり２つのデータポイントを用いて測定した。サイトカイン誘導の程度を、ポジティブコントロールと比べて、スコア０〜５（５が最高誘導を示す）を使用して表した。
【０１６５】
結果を、添付の表３及び５に与える。
【０１６６】
ヒトＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのオフターゲット分析
psiCHECK（商標）ベクター（Promega）は、ＲＮＡｉ活性をモニターするための２つのレポーター遺伝子を含む：合成バージョンのウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲｌｕｃ）遺伝子及び合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｈｌｕｃ＋）。ホタルルシフェラーゼ遺伝子によって、ホタルルシフェラーゼ発現に対するウミシイタケルシフェラーゼ発現における変化の標準化が可能になる。ウミシイタケ及びホタルルシフェラーゼ活性を、Dual-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）を使用して測定した。発明のｄｓＲＮＡのオフターゲットの効果を分析するためのpsiCHECK（商標）を使用するために、予測されたオフターゲット配列を、合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子及びその翻訳停止コドンの３’に位置するマルチプルクローニング領域中にクローニングした。クローニング後、ベクターを哺乳動物細胞株中にトランスフェクションし、続いて、ＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡを用いてコトランスフェクションする。ｄｓＲＮＡが、予測されたオフターゲットの標的ＲＮＡ上でＲＮＡｉプロセスを効果的に開始する場合、融合されたウミシイタケ標的遺伝子ｍＲＮＡ配列が分解され、低下したウミシイタケルシフェラーゼ活性をもたらす。
【０１６７】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのオフターゲット予測
ヒトゲノムを、コンピュータ解析により、発明のｄｓＲＮＡと相同な配列について探索した。発明のｄｓＲＮＡと６未満のミスマッチを呈する相同配列を、可能なオフターゲットとして定義した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのオフターゲット解析のために選択されたオフターゲットを、添付の表６、７、及び８に与える。
【０１６８】
予測されたオフターゲット配列を含むpsiCHECKベクターの生成
ｄｓＲＮＡリード候補についてのオフターゲットの効果を分析するための戦略は、予測されたオフターゲット部位の、psiCHECK2ベクターシステム（Dual Glo（登録商標）system, Promega, Braunschweig, Germany cat.No C8021）中への、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位を介したクローニングを含む。従って、オフターゲット部位を、１０ヌクレオチドを用いて、ｄｓＲＮＡ標的部位の上流及び下流で伸長する。加えて、ＮｈｅＩ制限部位を組み込み、制限分析によりフラグメントの挿入を証明する。一本鎖オリゴヌクレオチドを、標準的プロトコール（例えば、Metabionによるプロトコール）に従ってMastercycler（Eppendorf）中でアニーリングし、次に、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩを用いて先に消化したpsiCHECK（Promega）中にクローニングした。成功裏の挿入を、ＮｈｅＩを用いた制限分析及び続く陽性クローンの配列決定により立証した。配列決定のための選択されたプライマー（配列番号６７７）は、ベクターpsiCHECKの位置１４０１に結合する。クローン産生後、プラスミドを配列決定により分析し、次に、細胞培養実験において使用した。
【０１６９】
ｄｓＲＮＡオフターゲット効果の分析
細胞培養：
Ｃｏｓ７細胞をDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen（DSMZ, Braunschweig, Germany, cat. No.ACC-60）から得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.S0115）、ペニシリン１００U/ml、及びストレプトマイシン１００μg/ml（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.A2213）及び２mM  Ｌグルタミン（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.K0283）ならびに１２μg/ml重炭酸ナトリウムを含むように添加されたＤＭＥＭ（Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No.F0435）中で、３７℃で、５％ＣＯ２を伴う大気中で加湿インキュベータ（Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany）において培養した。
【０１７０】
トランスフェクション及びルシフェラーゼ定量化：
プラスミドを用いたトランスフェクションのために、Ｃｏｓ−７細胞を密度２．２５ｘ１０４個細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種し、直接的にトランスフェクションした。プラスミドのトランスフェクションは、リポフェクタミン２０００（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat. No.11668-019）を用いて、製造業者により記載される通りに、濃度５０ng/ウェルで行った。トランスフェクション後４時間で、培地を捨てて、新鮮培地を加えた。ここで、ｄｓＲＮＡを、濃度５０nMで、リポフェクタミン２０００を使用し、上に記載する通りにトランスフェクションした。ｄｓＲＮＡトランスフェクション後２４時間に、細胞を、製造業者により記載されるルシフェラーゼ試薬（Dual-GloTM Luciferase Assay system, Promega, Mannheim, Germany, cat. No.E2980）を使用して溶解し、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼを製造業者のプロトコールに従って定量化した。ウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベルを、ホタルルシフェラーゼレベルに対して標準化した。各々のｄｓＲＮＡについて、８つの個々のデータポイントを、２つの独立した実験において回収した。全ての標的部位と無関係のｄｓＲＮＡを、コントロールとして使用し、ｄｓＲＮＡ処理細胞中の相対的なウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベルを決定した。
【０１７１】
結果を、図１、２、及び３に示す。
【０１７２】
ヒト初代肝細胞におけるＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡの効力
ｄｓＲＮＡのトランスフェクション後でのＧＣＲ標的遺伝子ノックダウン
外科手術切除物から単離されたヒト初代肝細胞の新鮮な懸濁液を、HepaCult GmbHから購入し、１２ウェルコラーゲンコートプレート中に、密度３２５  ０００個細胞／ウェルで、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％  GlutaMAX  ２００mM（Invitrogen GmbH, cat. No 35050-038）、及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、及びゲンタマイシン）を添加したWilliam's E培地（Sigma-Aldrich Inc, cat. No W1878）中に蒔いた。一晩培養後（３７℃で、５％  ＣＯ２を伴う大気中で加湿インキュベータにおいて）、培地を、同様に添加したＤＭＥＭ培地（Invitrogen GmbH, cat. No 21885）を用いて交換し、ｄｓＲＮＡトランスフェクションを、最終濃度１５nMで、DharmaFECT-1トランスフェクション試薬（ThermoFisher Scientific Inc, cat. No T2001）を使用して実施した。７２時間後、培地を、２uM  ｃＡＭＰ（Sigma-Aldrich Inc, cat. No S3912）を添加した新鮮培地を用いて交換し、細胞をさらに一晩培養し、遺伝子発現の誘導を可能にした。細胞を、次に、デキサメタゾン５００nM（Sigma-Aldrich Inc, cat. No D4902）に６時間にわたり曝露させ、ＧＣＲの活性化及び核への転位置を誘発し、Quantigene 2.0技術のためのPanomics/Affymetrix Incプロトコール（http://www.panomics.com/index.php?id=product_1）に従った分岐ＤＮＡ技術による遺伝子発現解析のために回収した。これらの条件において、ＧＣＲについてのｄｓＲＮＡへのヒト初代肝細胞の曝露は、ＧＣＲ遺伝子発現の最高９０％ＫＤに導いた。
【０１７３】
結果を、図４に示す。
【０１７４】
ＧＣＲ及びＧＣＲ制御遺伝子発現に対するＧＣＲについてのＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡの効果
ヒト初代肝細胞を蒔き、上に記載する通り（４５０  ０００個の細胞を１ウェル当たりに播種したことを除き）に培養した。一晩培養後、細胞を、４８時間にわたり、陽イオンリポソーム製剤ＬＮＰ０１中に１〜１００nMの範囲の用量でパッケージされたｄｓＲＮＡに曝露させた。ｄｓＲＮＡへの３２時間の暴露後、ｃＡＭＰを、２uMの最終濃度で加えた。培地に、さらに、デキサメサゾンを５００nMの最終濃度で、遺伝子発現解析のための細胞回収前６時間に添加した。これらの条件において、ＧＣＲについてのＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡへの細胞曝露は、ＧＣＲ遺伝子発現の用量反応阻害に導き、ＧＣＲ遺伝子発現の８０％  ＫＤに、ＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子の発現における変化を伴わず、１００nM曝露で達した。ＧＣＲ  ＫＤは、ＴＡＴ及びＰＣＫ１遺伝子の発現の強い阻害に、及び、より少ない範囲で、Ｇ６Ｐｃ遺伝子阻害に変換した（それらの発現は、活性化時のＧＣＲレセプターにより、誘導される）。
【０１７５】
結果を、図５に示す。
【０１７６】
グルコースアウトプットに対するＧＣＲについてのＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡの効果
グルコースアウトプットアッセイを、播種し、ＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡに曝露された初代ヒト肝細胞で実施し、以下を除いて上に記載する通りである：９６ウェルプレートフォーマットを３５  ０００個播種／ウェルと使用したこと、及び、ＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡへの４８時間の暴露後、細胞を、飢餓条件において、１％  ＦＣＳ及び抗生物質を添加したグルコース不含ＲＰＭＩ  １６４０培地（Invitrogen GmbH, cat. No 11879）中で７２時間にわたり培養し、その後培地を新しくし、２uM  ｃＡＭＰ及び３０nMデキサメタゾンを添加して一晩培養したこと。コントロール細胞をｃＡＭＰ単独を用いて、又はｃＡＭＰ、デキサメタゾン、及びミフェプリストン１uM（ＧＣＲアンタゴニスト）を用いて処理することも実施した。細胞を、次に、糖新生前駆体（乳酸及びピルビン酸）の存在においてさらにインキュベーションし、グルコース産生を、５時間にわたり、０．１％脂肪酸フリー（free-fatty acid）ＢＳＡ、２０mMピルビン酸ナトリウム、及び２mM乳酸を含むＤＰＢＳ（Invitrogen GmbH, cat. No 1404）中で誘導した。産生されたグルコースを、Amplex-Red Glucose/Glucoseオキシダーゼアッセイキット（Invitrogen GmbH, cat. No A22189）を用いて、培養上清中で評価した。細胞生存の指標として、細胞ＡＴＰ含量も、Cell-titer Glo発光細胞生存アッセイ（Promega Corporation, cat. No G7571）を使用して測定した。ＧＣＲについてのＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡへの細胞曝露は、ミフェプリストンにより達成されるＧＣＲ活性の完全アンタゴニズムから予測される最高レベルまでのグルコース産生の用量反応阻害に導いた。
【０１７７】
結果を、図６及び７に示す。
【０１７８】
マウス及びラットＧＣＲを標的化するｄｓＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果
肝臓におけるＲＮＡｉ媒介性ＧＣＲ  ＫＤ、及び単回静脈内注射後でのｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースに対する効力
３０匹の雄ｄｂ／ｄｂマウス（Jackson laboratories）の群に、通常の固形飼料食（Kliba 3436）を与えた。各々４匹のマウスの均質群を、摂食条件下で実験の日に測定されたそれらのＢＷ及び血中グルコースに従って組織化し、２時間後に食物を除去した。
【０１７９】
マウスを、ルシフェラーゼコントロールについてのＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡ（配列番号対６８１／６８２）又はＧＣＲについてのＬＮＰ０１製剤化ｄｓＲＮＡ（配列番号対５１７／５１８）のいずれかの単回静脈内注射（５．７６mg/kgで、最大１０３時間にわたり）を用いて処置した。
【０１８０】
血中グルコースレベルを、Accu-Chek（Aviva）を用いて、午後（食物を除去した後１０時間に相当する）の静脈内注射後２日目、３日目、及び４日目（処置後＋５５時間、＋７９時間、及び＋１０３時間）に測定した。マウスを次に屠殺した。血漿中ＡＬＴ及びＡＳＴをHitachiにより分析した。肝臓を、分岐ＤＮＡによるＧＣＲ及びＧＣＲ調節遺伝子（ＴＡＴ、ＰＣＫ１、Ｇ６Ｐｃ、及びＨＥＳ１遺伝子）のｍＲＮＡ発現解析のために収集し、液体窒素中に瞬間凍結し、動物組織用のPanomics/Quantigene 2.0サンプルプロセシングプロトコール（Panomics-Affymetrix Inc, cat. No QS0106）に従い最大葉（左側葉）を加工した。ＧＣＲ  ｄｓＲＮＡを用いたｄｂ／ｄｂマウス処置は、マウス肝臓におけるＧＣＲ遺伝子発現の有意なＫＤ及び肝臓トランスアミナーゼにおける変化を伴わない減少した糖血症を招いた。
【０１８１】
結果を、図８、９、及び１０に示す。
【０１８２】
ＧＣＲ（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を標的化するｄｓＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果
以下の試験のために、等張緩衝液中のｄｓＲＮＡ脂質粒子の滅菌製剤（例えば、Semple SC et al., Nat Biotechnol. 2010 Feb; 28(2): 172-6. Epub 2010 Jan 17. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery）を使用した。
【０１８３】
サル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における単回用量滴定試験
サルは、０．５、１．５、又は３mg/kgのいずれかのＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ（配列番号対７４７／７５３）、又は用量１．５mg/kgのｄｓＲＮＡ（配列番号対７６４／７７２）の単回静脈内ボーラス注射を受けた。コントロール群は、脂質粒子により起こされる効果とＲＮＡｉ媒介性の効果との間で区別するために、１．５mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対６８１／６８２）を受けた。全ての処理群を、１匹の雄サル及び１匹の雌サルを用いて実行した。肝臓生検サンプルを、注射後３日目に採取した。
【０１８４】
ＧＣＲ  ｍＲＮＡレベルを、肝臓生検サンプルから、ｂＤＮＡアッセイにより、上に記載する通りに測定した。
【０１８５】
ＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ処置群は、ＧＣＲ  ｍＲＮＡレベルにおける用量依存的な減少を示し、１．５mg/kgのＧＣＲ  ｄｓＲＮＡを用いて開始して、ＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ（配列番号対７４７／７５３）による約２４％の減少及びＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ（配列番号対７６４／７７２）による２９％減少をもたらし、３mg/kgのＧＣＲ  ｄｓＲＮＡ（配列番号対７４７／７５３）を用いてＧＣＲ  ｍＲＮＡにおける４５％減少に達した（図１１）。
【０１８６】
【表２】
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【０１８７】
【表３】
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【０１８８】
【表４】
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【０１８９】
【表５】
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【０１９０】
【表６】
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【０１９１】
【表７】
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【０１９２】
【表８】
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【０１９３】
【表９】
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【０１９４】
【表１０】
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【０１９５】
【表１１】
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【０１９６】
【表１２】
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【０１９７】
【表１３】
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【０１９８】
【表１４】
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【０１９９】
【表１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
2012526533.tif 000073
【図５ｅ】
2012526533.tif 000074
【図６ａ】
2012526533.tif 000075
【図６ｂ】
2012526533.tif 000076
【図６ｃ】
2012526533.tif 000077
【図７ａ】
2012526533.tif 000078
【図７ｂ】
2012526533.tif 000079
【図７ｃ】
2012526533.tif 000080
【図８ａ】
2012526533.tif 000081
【図８ｂ】
2012526533.tif 000082
【図８ｃ】
2012526533.tif 000083
【図９】
2012526533.tif 000084
【図１０】
2012526533.tif 000085
【図１１ａ】
2012526533.tif 000086
【図１１ｂ】
2012526533.tif 000087
【配列表】
2012526533000001.app
【国際調査報告】
2012526533.tif 000088
2012526533.tif 000089
2012526533.tif 000090
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