(57)【要約】【課題】本発明は、イガイ接着蛋白質および陰イオン性高分子を含むコアセルベートに関し、具体的にイガイ接着蛋白質および陰イオン性高分子を混合して製造されたコアセルベートおよびその新規な用途に関する。【解決手段】本発明におけるイガイ接着蛋白質および陰イオン性高分子を混合して製造されたコアセルベートは、細胞や金属など多様な基質に対して接着力が非常に優れており、特に水分が存在する場合または水中でも接着力が維持され、接着剤として効果的に使用され得、ひいては、生体活性物質を封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）することができる活性があるため、生体活性物質伝達用組成物の有効性分として効果的に使用され得る。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子が含まれたコアセルベート。
【請求項２】
前記イガイ接着蛋白質は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列が１〜１０回連続して連結されたポリペプチド、および
（ｄ）前記（ａ）のポリペプチド、（ｂ）のポリペプチドおよび前記（ｃ）のポリペプチドからなる群より選択された二種以上が融合されたポリペプチド
からなる群より選択された一種以上である、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項３】
前記（ｃ）のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列からなるものである、請求項２に記載のコアセルベート。
【請求項４】
前記（ｄ）の融合されたポリペプチドは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列からなるものである、請求項２に記載のコアセルベート。
【請求項５】
前記イガイ接着蛋白質の変異体は、前記イガイ接着蛋白質のカルボキシル末端またはアミノ末端にＲＧＤを含む３〜２５個のアミノ酸からなるポリペプチドが連結されたものである、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項６】
ＲＧＤを含むポリペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されたアミノ酸配列で表されるものである、請求項５に記載のコアセルベート。
【請求項７】
前記イガイ接着蛋白質の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項５に記載のコアセルベート。
【請求項８】
前記イガイ接着蛋白質の変異体は、イガイ接着蛋白質をなすチロシン残基総数の１〜１００％が３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ＤＯＰＡ）で置換されたものである、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項９】
前記陰イオン性高分子は、ヒアルロン酸、フェレドキシン、ポリスチレンスルホン酸、アラビアガム、ゼラチン、アルブミン、カルボポル、高または低メトキシルペクチン、カルボキシメチルグアーガムナトリウム、キサンタンガム、乳清蛋白質、レグミン、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヘキサメタリン酸ナトリウム、カゼインナトリウム、ヘモグロビン、ヘパリンおよび細胞外多糖体Ｂ４０からなる群より選択された一つ以上である、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１０】
前記陰イオン性高分子の平均分子量は、１ｋＤａ〜３００ｋＤａである、請求項９に記載のコアセルベート。
【請求項１１】
前記コアセルベートは、前記イガイ接着蛋白質と陰イオン性高分子が１：０．０１〜１：１０の重量比で混合して形成されたものである、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１２】
前記コアセルベートは、前記イガイ接着蛋白質と陰イオン性高分子をｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０で混合して形成されたものである、請求項１に記載のコアセルベート。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを含む、接着剤。
【請求項１４】
前記接着剤は、プラスチック、ガラス、金属、および高分子合成樹脂からなる群より選択された基質に接着されるものである、請求項１３に記載の接着剤。
【請求項１５】
前記接着剤は、生体物質に適用されるものである、請求項１３に記載の接着剤。
【請求項１６】
前記接着剤は、水中接着用である、請求項１３に記載の接着剤。
【請求項１７】
前記接着剤は、界面活性剤、酸化剤、架橋剤、および充填剤からなる群より選択された一種以上の物質をさらに含むものである、請求項１３に記載の接着剤。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを含む、生体活性物質伝達用組成物。
【請求項１９】
前記コアセルベートは、前記イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子をｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０で１：０．０１〜１：１０の重量比で混合して形成されたものである、請求項１８に記載の生体活性物質伝達用組成物。
【請求項２０】
前記生体活性物質は、抗ガン剤、抗生剤、抗炎症剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インタロイキン、インターフェロン、ヘパリン、酵素、成長因子、腫よう怪死因子、エンドトキシン、リンホトキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性剤、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、放射線同位元素標識物質、界面活性剤、心血管系薬品、胃腸管系薬品および神経系薬品からなる群より選択された一つ以上である、請求項１８に記載の生体活性物質伝達用組成物。
【請求項２１】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートおよび生体活性物質を含み、
（ｂ）前記コアセルベートの内部に前記生体活性物質が封入されたことを特徴とする、生体活性物質伝達体。
【請求項２２】
前記生体活性物質伝達体は、マイクロカプセルである、請求項２１に記載の生体活性物質伝達体。
【請求項２３】
（ａ）イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子および生体活性物質を混合する段階、および
（ｂ）前記イガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子により形成されたコアセルベートが生体活性物質の周囲に被膜を形成する段階を含む、生体活性物質伝達体の製造方法。
【請求項２４】
前記（ａ）段階において、前記イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子をｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０で１：０．０１〜１：１０の重量比で混合するものである、請求項２３に記載の生体活性物質伝達体の製造方法。
【請求項２５】
前記生体活性物質伝達体は、マイクロカプセルである、請求項２３に記載の生体活性物質伝達体の製造方法。
【請求項２６】
イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子をｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０で１：０．０１〜１：１０の重量比で混合する段階を含む、コアセルベートの製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを接着に使用するための用途。
【請求項２８】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを準備する段階、および
（ｂ）前記コアセルベートを基質に接着させる段階を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを接着に使用する方法。
【請求項２９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを生体活性物質伝達に使用するための用途。
【請求項３０】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを準備する段階、および
（ｂ）前記コアセルベートの内部に生体活性物質を封入する段階を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを生体活性物質伝達に使用する方法。
【請求項３１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを生体活性物質伝達体の製造に使用するための用途。
【請求項３２】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを準備する段階、および
（ｂ）前記コアセルベートの内部に前記生体活性物質を封入する段階を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコアセルベートを生体活性物質伝達体の製造に使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イガイ接着蛋白質および陰イオン性高分子を含むコアセルベートに関し、具体的には、イガイ接着蛋白質および陰イオン性高分子を混合して製造されたコアセルベートおよびその新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
海洋生命体であるイガイ（ｍｕｓｓｅｌ）は、接着蛋白質（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を生産、分泌することによってイガイ自分を海の中の岩のような濡れた固体表面に固く付着することができ、波の衝撃や海水の浮力効果に影響を受けない（Ｊ．Ｈ．Ｗａｉｔｅなど、１９８３、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ５８、２０９〜２３１；Ｈ．Ｊ．Ｃｈａなど、２００８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３、６３１〜６３８）。
【０００３】
イガイ接着蛋白質は、現在知られた化学合成接着剤と比較した時、強力な自然接着剤として知られており、大部分エポキシ樹脂よりも約二倍程度の高い引張強度を現わしながらも曲がり得る柔軟性を有している。また、イガイ接着蛋白質は、プラスチック、ガラス、金属、テフロン（登録商標）および生体物質などの多様な表面に接着することができる能力を有しており、濡れた表面に数分内に付着することができる。このような特性はまだ化学接着剤の分野では未完の課題として残っている。また、接着蛋白質は人間細胞を攻撃したり免疫反応を起こさないと知られ、手術時に生体組織の接着や折れた歯の接着などの医療分野に応用の可能性が大きい（Ｊ．Ｄｏｖｅなど、１９８６、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｅｎｔａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １１２、８７９）。
特に前記イガイ接着蛋白質は、細胞の表面接着技術分野にも利用され得るが、細胞の表面接着技術は、細胞培養および組織工学分野に必要な非常に重要な技術の一つであり、つまり、細胞および組織培養のために細胞を細胞培養表面に効率的に接着させる技術であるため、細胞の増殖および分化を促進させるのに非常に重要である（Ｍ．Ｔｉｒｒｅｌｌなど、２００２、Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．，５００、６１〜８３）。
【０００４】
しかし、イガイから自然抽出した接着物質が、既存の他のコーティング方法と比較して高い細胞接着能力と細胞の増殖および分化をさらに促進させる結果を基に商業的に使用されているが、自然抽出物１グラムを得るために一万個のイガイを必要とする問題がある（Ｃ．Ｖ．Ｂｅｎｅｄｉｃｔなど、１９８９、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎｏ．３８５、４５２〜４８３）。
したがって、イガイ接着蛋白質を既存の方法よりも効果的に利用することができる方法、特に細胞接着活性がより優れて細胞の表面接着技術に効果的に適用することができる方法が必要な実情である。
【０００５】
一方、コアセルベートは、陰イオン性高分子電解質と陽イオン性高分子電解質が特定の条件で混合された時に形成されるコロイド物質の一種であって、コアセルベートが形成された時、溶液の吸光度は増加するようになり、溶液上で丸い球形態で外部溶液と分離して存在する。コアセルベートの形成時、参加電解質は溶液で分離されて凝縮し、依然として液状を示すようになり、この時、表面張力が減少し粘性が増加するなど、物性も変化する。コアセルベートは、蛋白質とその反対性質を有する高分子電解質との混合を通じても形成され得る（Ｃ．Ｇ．ｄｅＫｒｕｉｆなど、２００４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９、３４０〜３４９）。コアセルベートの低い表面張力に起因して薬品、酵素、細胞、食品添加物などの機能性物質を微細カプセル内に固定化するのに利用される技術も報告されている（Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｃ．など、１９９８、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ８、６８９〜７５３）。
【０００６】
しかし、イガイ接着蛋白質からコアセルベートを形成した研究は全くなく、またイガイ接着蛋白質を生体活性物質伝達用として使用するための研究も全くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０７１８３号
【特許文献２】国際公開第２００５／０９２９２０号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／６５０６０号明細書
【特許文献４】米国特許第５０１５６７７号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｈ．Ｗａｉｔｅなど、１９８３、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ５８、２０９〜２３１；
【非特許文献２】Ｊ．Ｄｏｖｅなど、１９８６、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｅｎｔａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １１２、８７９
【非特許文献３】Ｃ．Ｖ．Ｂｅｎｅｄｉｃｔなど、１９８９、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎｏ．３８５、４５２〜４８３
【非特許文献４】Ｃ．Ｇ．ｄｅＫｒｕｉｆなど、２００４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９、３４０〜３４９
【非特許文献５】Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｃ．など、１９９８、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ８、６８９〜７５３
【非特許文献６】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ
【非特許文献７】Ｄ．Ｓ．Ｈｗａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８、３５６０〜３５６８、２００７
【非特許文献８】Ｄ．Ｓ．Ｈｗａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３３５２〜３３５９、２００４
【非特許文献９】Ｖ．Ｄｕｃｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ａ−Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ、２３２、２３９〜２４７、２００４
【非特許文献１０】Ｆｕｌｋｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｐ．など（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８（６）、ｐｐ．７９３〜７９８
【非特許文献１１】Ｈ．Ｊ．Ｃｈａなど、２００８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３、６３１〜６３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者らは陽イオン性であるイガイ接着蛋白質と陰イオン性高分子を混合して形成されたコアセルベートがイガイ接着蛋白質よりも優れた接着活性があり、生体活性物質を伝達するのに有用に使用され得ることを確認することによって本発明を完成した。
したがって、本発明は、イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子が含まれたコアセルベートを提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、前記コアセルベートを含む接着剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記コアセルベートを含む生体活性物質伝達用組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、（ａ）前記コアセルベートおよび生体活性物質を含み、（ｂ）前記コアセルベートの内部に前記生体活性物質が封入されたことを特徴とする生体活性物質伝達体を提供することを目的とする。
また、本発明は、（ａ）イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子および生体活性物質を混合する段階、および（ｂ）前記イガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子により形成されたコアセルベートが生体活性物質の周囲に被膜を形成する段階を含む生体活性物質伝達体の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子をｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０で１：０．０１〜１：１０の重量比で混合する段階を含むコアセルベートの製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、本発明のコアセルベートを接着に使用するための用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートを基質に接着させる段階を含む、本発明のコアセルベートを接着に使用する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達に使用するための用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートの内部に生体活性物質を封入する段階を含む、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達に使用する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達体の製造に使用するための用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートの内部に前記生体活性物質を封入する段階を含む、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達体の製造に使用する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような課題を解決するために、本発明は、イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子が含まれたコアセルベートを提供する。
また、本発明は、前記コアセルベートを含む接着剤を提供する。
また、本発明は、前記コアセルベートを含む生体活性物質伝達用組成物を提供する。
また、本発明は、（ａ）前記コアセルベートおよび生体活性物質を含み、（ｂ）前記コアセルベートの内部に前記生体活性物質が封入されたことを特徴とする生体活性物質伝達体を提供する。
また、本発明は、（ａ）イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子および生体活性物質を混合する段階、および（ｂ）前記イガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子により形成されたコアセルベートが生体活性物質の周囲に被膜を形成する段階を含む生体活性物質伝達体の製造方法を提供する。
また、本発明は、イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子をｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０で１：０．０１〜１：１０の重量比で混合する段階を含むコアセルベートの製造方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、本発明のコアセルベートを接着に使用するための用途を提供する。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートを基質に接着させる段階を含む、本発明のコアセルベートを接着に使用する方法を提供する。
また、本発明は、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達に使用するための用途を提供する。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートの内部に生体活性物質を封入する段階を含む、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達に使用する方法を提供する。
また、本発明は、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達体の製造に使用するための用途を提供する。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートの内部に前記生体活性物質を封入する段階を含む、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達体の製造に使用する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明におけるイガイ接着蛋白質および陰イオン性高分子を混合して製造されたコアセルベートは、細胞や金属など多様な基質に対して接着力が非常に優れており、特に水分が存在する場合または水中でも接着力が維持され、接着剤として効果的に使用され得、ひいては、生体活性物質を封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）することができる活性があるため、生体活性物質伝達用組成物の有効性分として効果的に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】イガイ接着蛋白質であるｆｐ−１５１と陰イオン性高分子であるヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を多様なｐＨと比率で混合した時、吸光度の変化を測定した結果である。
【図２】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）をｐＨ２．５の酢酸溶液で６０：４０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図３】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を多様なｐＨと比率で混合した時、吸光度の変化を測定した結果である。
【図４】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）をｐＨ２．５の酢酸溶液で６０：４０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図５】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１−ＲＧＤとヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を多様なｐＨと比率で混合した時、吸光度の変化を測定した結果である。
【図６】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１−ＲＧＤとヒアルロン酸（１７ｋＤａ）をｐＨ２．５の酢酸溶液で６０：４０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図７】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を多様なｐＨと比率で混合した時、吸光度の変化を測定した結果である。
【図８】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）をｐＨ２．５の酢酸溶液で６０：４０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図９】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）を多様なｐＨと比率で混合した時、吸光度の変化を測定した結果である。
【図１０】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）をｐＨ２．５の酢酸溶液で６０：４０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図１１】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）をｐＨ３．８の酢酸溶液で８０：２０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図１２】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）をｐＨ３．８の酢酸溶液で８０：２０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図１３】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヘパリンを多様なｐＨと比率で混合した時、吸光度の変化を測定した結果である。
【図１４】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヘパリンを多様なｐＨの酢酸溶液で８０：２０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図１５】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とフェレドキシンをｐＨ４．５の酢酸溶液で７０：３０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図１６】イガイ接着蛋白質ｆｐ−５とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）をｐＨ４．６の酢酸溶液で８０：２０で混合した時、コアセルベート形成を確認した結果である。
【図１７】イガイ接着蛋白質ｆｐ−５とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）をｐＨ４．６で混合した時、吸光度の変化を測定した結果である。
【図１８】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を利用したコアセルベートとイガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を利用したコアセルベートを利用して唐辛子種油を微細カプセル内に固定させた結果である。
【図１９】図１８で形成された微細カプセルが８日間維持されるか否かを確認した結果である。
【図２０】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヘパリンを利用したコアセルベートを利用して唐辛子種油を微細カプセル内に固定させた結果である。
【図２１】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を利用してコアセルベートを形成し、これを利用して表面をコーティングした後、細胞接着を行った結果である。
【図２２】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１−ＲＧＤとヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を利用してコアセルベートを形成し、これを利用して表面をコーティングした後、細胞接着を行った結果である。
【図２３】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を利用してコアセルベートを形成し、これを利用して表面をコーティングした後、細胞接着を行った結果である。
【図２４】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を利用してコアセルベートを形成し、これを利用して表面をコーティングした後、細胞接着を行った結果である。
【図２５】イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）を利用してコアセルベートを形成し、これを利用して表面をコーティングした後、細胞接着を行った結果である。
【図２６】イガイ接着蛋白質ｍｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）、イガイ接着蛋白質ｍｆｐ−１３１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を利用したコアセルベートの乾燥状態での接着力を単一のイガイ接着蛋白質の接着力と比較実験した結果である。
【図２７】チロシナーゼとグルタルアルデヒドを添加した時、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ  ｏｒ  ５９ｋＤａ）で形成されたコアセルベートの湿潤状態での接着力を単一のイガイ接着蛋白質の接着力と比較実験した結果である。
【図２８】チロシナーゼとグルタルアルデヒドを添加した時、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）を利用したコアセルベートの湿潤状態での接着力を単一のイガイ接着蛋白質の接着力と比較実験した結果である。
【図２９】チロシナーゼとグルタルアルデヒドを添加した時、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）を利用したコアセルベートの水中状態での接着力を牛血清アルブミンの接着力と比較実験した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１７】
本発明におけるイガイ接着蛋白質は、イガイで由来した接着蛋白質であり、これに限定されないが、好ましくは、国際公開第２００６／１０７１８３号または国際公開第２００５／０９２９２０号に記載された全てのイガイ接着蛋白質を含む。
【００１８】
好ましくは、前記イガイ接着蛋白質は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列が１〜１０回連続して連結されたポリペプチド、および（ｄ）前記（ａ）のポリペプチド、（ｂ）のポリペプチドおよび前記（ｃ）のポリペプチドからなる群より選択された二種以上が融合されたポリペプチドであってもよい。前記（ｃ）でポリペプチドは、これに限定されないが、好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。また、前記（ｄ）で融合されたポリペプチドは、これに限定されないが、好ましくは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００１９】
本発明におけるイガイ接着蛋白質の変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）は、好ましくは、イガイ接着蛋白質の接着力を維持する前題下に前記イガイ接着蛋白質のカルボキシル末端やアミノ末端に追加的な配列を含んだり、一部のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよい。より好ましくは、前記イガイ接着蛋白質のカルボキシル末端またはアミノ末端にＲＧＤを含む３〜２５個のアミノ酸からなるポリペプチドが連結されたものであったり、イガイ接着蛋白質をなすチロシン残基総数の１〜１００％、好ましくは５〜１００％が３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ＤＯＰＡ）で置換されたものであってもよい。
【００２０】
前記ＲＧＤを含む３〜２５個のアミノ酸は、これに限定されないが、好ましくは、ＲＧＤ（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ、配列番号８）、ＲＧＤＳ（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ、配列番号９）、ＲＧＤＣ（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ、配列番号１０）、ＲＧＤＶ（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｖａｌ、配列番号１１）、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ、配列番号１２）、ＧＲＧＤＳ（Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ、配列番号１３）、ＧＲＧＤＴＰ（Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ、配列番号１４）、ＧＲＧＤＳＰ（Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ、配列番号１５）、ＧＲＧＤＳＰＣ（Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ、配列番号１６）およびＹＲＧＤＳ（Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ、配列番号１７）からなる群より選択された一種以上であってもよい。
【００２１】
前記イガイ接着蛋白質のカルボキシル末端またはアミノ末端にＲＧＤを含む３〜２５個のアミノ酸からなるポリペプチドが連結されたイガイ接着蛋白質の変異体は、これに限定されないが、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００２２】
本発明における前記イガイ接着蛋白質は、これに限定されないが、好ましくは、外部遺伝子を発現できる用途で製作された通常のベクターに発現可能なように挿入し、遺伝工学的な方法で大量生産することができる。前記ベクターは蛋白質を生産するための宿主細胞の種類および特性に応じて適切に選択したり、新規に製作することができる。前記ベクターを宿主細胞に形質転換する方法および形質転換体から再組み合わせ蛋白質を生産する方法は、通常の方法で容易に実施することができる。前述したベクターの選択、製作、形質転換および再組み合わせ蛋白質の発現などの方法は、本願発明が属する技術分野の当業者であれば容易に実施することができ、通常の方法で一部の変形も本願発明に含まれる。
【００２３】
本発明における陰イオン性高分子は、前記陽イオン性であるイガイ接着蛋白質と結合してコアセルベートを形成することができる高分子物質であれば制限なく使用され得るが、好ましくは、前記陽イオン性であるイガイ接着蛋白質のｐＩ（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ）よりも低い高分子、より好ましくは、ｐＩ数値が２〜６である高分子、さらに好ましくは、ｐＩ数値が２〜４である高分子であってもよい。
【００２４】
本発明における陰イオン性高分子は、例えば、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、フェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）、ポリスチレンスルホン酸（ｐｏｌｙ  ｓｔｙｒｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アラビアガム（ｇｕｍ  ａｒａｂｉｃ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）、高または低メトキシルペクチン（ｈｉｇｈ  ｏｒ  ｌｏｗ  ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ｐｅｃｔｉｎ）、カルボキシメチルグアーガムナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｇｕａｒ  ｇｕｍ）、キサンタンガム（ｘａｎｔｈａｎ  ｇｕｍ）、乳清蛋白質（ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、レグミン（ｆａｂａ  ｂｅａｎ  ｌｅｇｕｍｉｎ）、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、ヘキサメタリン酸ナトリウム （ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｘａｍｅｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、カゼインナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｓｉｎａｔｅ）、ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）および細胞外多糖体Ｂ４０（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｂ４０）からなる群より選択された一つ以上であってもよく、前記陰イオン性高分子の平均分子量は、これに限定されないが、好ましくは、１ｋＤａ〜３００ｋＤａからなる群より選択された分子量を有してもよく、より好ましくは、１０ｋＤａ〜１００ｋＤ、さらに好ましくは、１７ｋＤａ〜５９ｋＤａ、最も好ましくは、１７ｋＤａ、３５ｋＤａまたは５９ｋＤの分子量を有してもよい。前記分子量を超えたり未満である場合、コアセルベートが形成されないことがあるためである。
【００２５】
本発明における生体活性物質は、生体に投与されたり皮膚表面に塗布する場合、一定の薬理活性を示す物質であって、これに限定されないが、好ましくは、薬品、酵素、細胞および食品添加物からなる群より選択された一種以上であってもよく、より好ましくは、抗ガン剤、抗生剤、抗炎症剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インタロイキン、インターフェロン、成長因子、腫よう怪死因子、エンドトキシン、リンホトキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性剤、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、放射線同位元素標識物質、界面活性剤、心血管系薬品、胃腸管系薬品および神経系薬品からなる群より選択された一つ以上であってもよい。前記抗炎症剤としては、これに限定されないが、好ましくは、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）であってもよい。
【００２６】
本発明におけるコアセルベートは、前記イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子を混合することによって生成されたコロイドの一種をいう。
本発明のコアセルベートは、前記イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子が含まれたことを特徴とする。前記コアセルベートは、陽イオン性であるイガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子が混合して形成されてもよい。
本発明のコアセルベートは、これに限定されないが、好ましくは、水溶性溶媒、より好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、酢酸水溶液で製造されてもよく、さらに好ましくは、酢酸水溶液、より一層好ましくは、０．１％〜１０％の酢酸水溶液、さらにより一層好ましくは、０．５〜８％の酢酸水溶液で製造されてもよい。
【００２７】
前記溶媒で本発明のコアセルベートを製造する場合、適正ｐＨはこれに限定されるが、好ましくは、ｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０であってもよく、より好ましくは、ｐＨ２．０〜ｐＨ６．０であってもよく、さらに好ましくは、ｐＨ２．５〜ｐＨ５．５であってもよい。前記ｐＨを超えたり未満である場合、コアセルベートが形成されなかったり高分子の変形が発生することがあるためである。
【００２８】
前記溶媒にイガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子の添加量は、これに限定されないが、好ましくは、それぞれ溶媒全体体積対比０．００１〜１００％（ｗ／ｖ）であってもよく、より好ましくは、０．０１〜３０％（ｗ／ｖ）であってもよい。
本発明のコアセルベートは、これに限定されるが、好ましくは、前記イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子を１：０．０１〜１：１０の重量比で混合して製造されてもよく、より好ましくは、１：０．２５〜１：２．５の重量比で、さらに好ましくは、１：０．２５〜１：２．３３の重量比で混合して製造されてもよい。前記混合比を超えたり未満である場合、コアセルベートが効果的に形成されないことがあるためである。
【００２９】
前記のようにイガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子を混合して製造されたコアセルベートは、従来イガイ接着蛋白質や細胞接着活性があると知られたポリ−エル−ライシン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）よりも細胞接着活性が非常に優れている。
本発明の一実施例では、前記コアセルベートで細胞培養プレートにコーティングし、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞を前記コーティングされた細胞培養プレートに培養した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗い落とし、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）分析を実施してプレートに接着された細胞数を測定することによって細胞接着活性を測定した。その結果、イガイ接着蛋白質および陰イオン性高分子を混合して製造されたコアセルベートは、従来イガイ接着蛋白質や細胞接着活性があると知られたポリ−エル−ライシン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）よりも細胞接着活性が非常に優れていることを確認した（《実施例３》参照）。
【００３０】
また、本発明のコアセルベートは、前記細胞接着活性などの微細接着システムのみならず、大容量の接着システム、例えば、アルミニウムなどの金属物質の接着にも効果的な接着力を維持する。
本発明の一実施例では、本発明のコアセルベートを利用した時、単一のイガイ接着蛋白質よりも２倍程度大きい接着力を維持し、特に架橋剤であるチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）またはグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を添加した場合、水分が存在する場合または水中でも優れた接着力を維持することができる（《実施例４》参照）。
したがって、前記イガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子を混合して製造されたコアセルベートは接着用として有用に使用され得る。
【００３１】
本発明の接着剤は、前記コアセルベートを含有することを特徴とする。
【００３２】
前記接着剤は、通常のバイオ接着剤に含有されたりまたは薬理学的に許容可能な賦形剤を０．０００１〜９９重量％でさらに含んでもよい。賦形剤の例としては、界面活性剤、酸化剤、架橋剤および充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）があるが、これに限定されない（参照：米国特許出願公開第２００３／６５０６０号明細書および米国特許第５０１５６７７号明細書）。
【００３３】
前記界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、非イオン性、両性界面活性剤であってもよく、その例としては、ソジウムドデシルスルフェート（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）およびソジウムドデシルベンゼンスルホネート（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｂｅｎｚｅｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）がある。前記酸化剤は、カテコールオキシダーゼ（ｃａｔｅｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ホルムアルデヒド、ビス（スルホスクシニミジル）スベリン酸塩（ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ）、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）（３，３’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、Ｏ２、Ｆｅ３＋、Ｈ２Ｏ２およびＩＯ４−からなる群より選択されてもよく（参照：Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１９９８、３１、４７３９〜４７４５）、前記充填剤は、コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイタンスルフェート（ｃｏｎｄｒｏｉｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、エラスチン、ラミニン、カセイン、ヒドロキシアパタイト、アルブミン、フィブロネクチンおよびヒブリンからなる群より選択されてもよい。
【００３４】
特に前記架橋剤は、チロシナーゼまたはグルタルアルデヒドであってもよく、前記架橋剤の添加量は、イガイ接着蛋白質またはその変異体の質量対比チロシナーゼの場合、０．０００１〜１重量％、より好ましくは、０．００１〜１重量％、さらに好ましくは、０．０１〜１重量％であってもよく、グルタルアルデヒドの場合、全体接着溶液体積対比０．００１〜５体積％、より好ましくは、０．０１〜５体積％、さらに好ましくは、０．１〜５体積％であってもよい。
本発明の接着剤を水分が存在する場合や水中で適用する場合、前記架橋剤は、これに限定されないが、グルタルアルデヒドを使用することがより好ましい。
【００３５】
本発明の接着剤は、細胞接着活性などの微細接着システムのみならず、大容量の接着システム、例えば、アルミニウムなどの金属物質の接着にも効果的な接着力を維持する（《実施例３》および《実施例４》参照）。
また、本発明の接着剤は、水分が存在する場合にも接着力を維持することができ、これに限定されないが、好ましくは、水中接着用として使用され得る。前記のように接着剤を水中接着用として使用する場合、これに限定されないが、好ましくは、前記接着剤の有効成分であるコアセルベートはコアセルベートであってもよい。例えば、本発明の接着剤は、水中構造物の維持補修のための親環境接着剤、より好ましくは、プール、浴槽、船などの亀裂の縫合に使用され得、医療用接着剤、より好ましくは、軟質（連結）組織接着剤（例えば、裂傷および／または切開部を閉じる時に縫合術およびステープルを代替する皮膚接着剤）および硬質（硬化された）組織接着剤（例えば、脳または歯科用接着剤）として容易に使用され得る（《実施例４》参照）。
【００３６】
本発明の接着剤は、プラスチック、ガラス、金属、および高分子合成樹脂からなる群より選択された基質に適用するために使用されてもよく、つまり、前記基質を接着させたり固定するための用途で使用されてもよい。使用方法は通常の接着剤使用方法に準じ、代表的な方法は塗布法である。
【００３７】
特に本発明の接着剤は、生体物質に適用されてもよいが、前記生体物質は生物に分類される全ての動植物および前記動植物から由来した一部を意味し、一例としては、細胞、組織、器官、ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、ポリヌクレオチド、ホルモン、脂質および化合物があるが、これに限定されるのではない。生体物質に使用される場合、本発明の接着剤は、具体的な使用法、使用量および剤型などは、現在市販されるＣｅｌｌ−Ｔａｋ製品（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｗｏ  ｏａｋ  Ｐａｒｋ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）に準じて使用され得る。一例として、本発明の接着剤は、溶剤型、水溶性、無溶剤型であってもよく、基質に対して０．０１〜１００ｕｇ／ｃｍ２で使用することができるが、これに限定されるのではない。
【００３８】
本発明の接着剤の適用例は、これに限定されないが、（１）水（水または塩分がある水）中にある基質間の接着；（２）骨、靭帯、筋、半月（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）および筋肉治療および人工材料移植のような整形外科的治療；（３）穿孔、裂創、切開などの治療、角膜移植、人工角膜挿入のような眼科的接合；（４）補正装置、架工義歯、歯冠装着、揺れる歯の固定、折れた歯の治療および充填剤の固定のような歯科的接合；（５）血管接合、細胞組織接合、人工材料移植、傷の縫合のような外科的治療；（６）植物の移植片接合、傷の治癒のような植物での接合；および（７）薬品、ホルモン、生物学的因子、医薬品、生理的または代謝的観察装置、抗生剤および細胞の移植のような用途がある（参照：米国特許第５０１５６７７号明細書）。
【００３９】
また、本発明は、接着剤に界面活性剤、酸化剤、架橋剤、および充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）からなる群より選択された物質を処理したり、または前記接着剤の有効成分であるコアセルベートの濃度を調節することによって前記接着剤の接着力を調節することができる（参照：米国特許第５０１５６７７号明細書）。前記酸化剤、界面活性剤、架橋剤および充填剤は前記と同意義である。
【００４０】
前記のようにイガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子を混合して形成されたコアセルベートは、生体活性物質を効果的に伝達することができる。
本発明の一実施例でイガイ接着蛋白質または彼の変異体とヒアルロン酸、またはヘパリンを混合して形成されたコアセルベート、より好ましくは、配列番号１または３のポリペプチドからなるイガイ接着蛋白質または配列番号２の変異体にヒアルロン酸やヘパリンを混合してコアセルベートを形成し、これを生体活性物質の例として唐辛子種油を追加混合した結果、前記コアセルベートが唐辛子種油の周囲に被膜を形成することが分かる（《実施例２》参照）。
【００４１】
したがって、本発明の生体活性物質伝達用組成物は、イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子が混合されて形成されたコアセルベートを含むことを特徴とする。
【００４２】
前記本発明の生体活性物質伝達用組成物は、これに限定されないが、好ましくは、薬学的組成物の形態であってもよい。
本発明の生体活性物質伝達用組成物は、組成物総重量に対してコアセルベート、これに限定されないが、好ましくは、コアセルベートを０．０００１〜５０重量％含む。本発明の組成物は、前記有効成分に追加で同一または類似する機能を示す有効成分を一種以上含有してもよい。
【００４３】
本発明の生体活性物質伝達用組成物は、投与のために前記のコアセルベート以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を一種以上含んで製造してもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストローズ溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポゾームおよびこれら成分の中の１成分以上を混合して使用してもよく、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化してもよく、標的器官に特異的に作用することができるように標的器官特異的抗体またはその他リガンドを前記担体と結合させて使用してもよい。ひいては、当該技術分野の適正な方法でまたはレミングトンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を利用して各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００４４】
前記コアセルベートを含む生体活性物質伝達用組成物は、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｉｎ）、腹膜内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、皮下内（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、鼻内（ｎａｓａｌ）、粘膜内（ｍｕｃｏｓａｌ）、吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）および経口（ｏｒａｌ）などの経路で注入することによって生体内に伝達され得る。投与量は対象の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などに応じてその範囲が多様である。一日投与量は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回〜数回に分けて投与することがより好ましい。
【００４５】
一方、本発明の生体活性物質伝達体は、（ａ）前記コアセルベートおよび生体活性物質を含み、（ｂ）前記コアセルベートの内部に前記生体活性物質が封入なされたことを特徴とする。
【００４６】
前記コアセルベートは、これに限定されないが、好ましくは、コアセルベートであってもよい。
【００４７】
前記生体活性物質伝達体は、これに限定されないが、好ましくは、マイクロカプセルであってもよい。
【００４８】
前記コアセルベートは、前述した通り、前記イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子をｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０で１：０．０１〜１：１０の重量比で混合して形成されてもよい。
【００４９】
前記コアセルベートは、生体活性物質、例えば唐辛子種油の周囲に被膜を形成し、コアセルベート内部に前記生体活性物質を効果的に封入することができ、生体活性物質伝達体であるマイクロカプセルを形成することができる。ひいては、前記のように形成されたマイクロカプセルが長時間が経過してもその形態を維持する特性がある（《実施例２》参照）。
前記のように形成された生体活性物質伝達体の大きさは、これに限定されないが、好ましくは、直径基準に１〜５０ｕｍであってもよい。
本発明の生体活性物質伝達体は、前記コアセルベートの内部に生体活性物質が疎水性であるか親水性であるかに関係なく封入が可能であるため、疎水性または親水性の生体活性物質を効果的に封入することによって生体活性物質を効果的に伝達することができる。前記生体活性物質は、これに限定されないが、好ましくは、前記コアセルベートの内部に分散形態やコア形態で封入されてもよい。前記封入は、生体活性物質の周辺に被膜を形成することによって生体活性物質を封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）することをいう。
本発明の生体活性物質伝達体は、薬学的組成物の有効性分として利用されてもよく、これについては前記と同意義である。
【００５０】
一方、本発明の生体活性物質伝達体の製造方法は、（ａ）イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子および生体活性物質を混合する段階、および（ｂ）前記イガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子により形成されたコアセルベートが生体活性物質の周囲に被膜を形成する段階を含むことを特徴とする。
【００５１】
前記（ａ）段階で混合は、イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子および生体活性物質を同時に混合する場合を意味したり、より好ましくは、イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子のうちのいずれか一つが溶けている溶液に生体活性物質を混合し、その後、前記コアセルベート形成を誘導するためにイガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子のうちの残りの一つを追加混合する場合を意味する。
具体的に前記イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子の混合比は、前記と同意義である。また、イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子は、これに限定されないが、好ましくは、前述した適正ｐＨに設定された溶媒に０．０００１〜５０重量％で混合することができる。また、前記（ａ）段階で混合時、生体活性物質は、これに限定されないが、好ましくは、前述した適正ｐＨに設定された溶媒に体積対比０．０１〜２０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは、０．１〜２％（ｖ／ｖ）で混合することが好ましい。
【００５２】
前記生体活性物質伝達体を製造するための溶媒の種類、適正ｐＨ、適正温度は前述したコアセルベートが効果的に形成され得る条件と同一である。
具体的に適正溶媒は、これに限定されないが、好ましくは、水溶性溶媒、より好ましくは、リン酸塩水溶液または酢酸水溶液で製造されてもよく、さらに好ましくは、酢酸水溶液、より一層好ましくは、０．１％〜１０％の酢酸水溶液、さらにより一層好ましくは、０．５〜８％の酢酸であってもよい。
適正ｐＨは、これに限定されるが、好ましくは、ｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０であってもよく、より好ましくは、ｐＨ２．０〜ｐＨ６．０であってもよく、さらに好ましくはｐＨ２．５〜ｐＨ５．５であってもよい。前記ｐＨを超えたり未満である場合、前記コアセルベートが形成されなかったり高分子の変形が発生するため、生体活性物質伝達体が効果的に形成されないことがあるためである。
また、適正温度は、４〜１００℃であってもよく、好ましくは、１０〜６０℃であってもよく、前記温度を超えたり未満である場合、前記コアセルベートが形成されなかったり高分子の変形が発生することがあるためである。
【００５３】
一方、本発明のコアセルベートの製造方法は、イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子をｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０で１：０．０１〜１：１０の重量比で混合する段階を含むことを特徴とする。
【００５４】
本発明のコアセルベートは、これに限定されないが、好ましくは、水溶性溶媒、より好ましくは、リン酸塩水溶液または酢酸水溶液で製造されてもよく、さらに好ましくは、酢酸水溶液、より一層好ましくは、０．１％〜１０％の酢酸水溶液、さらにより一層好ましくは、０．５〜８％の酢酸水溶液で製造されてもよい。
前記溶媒で本発明のコアセルベートを製造する場合、適正ｐＨは、ｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０であってもよく、より好ましくは、ｐＨ２．０〜ｐＨ６．０であってもよく、さらに好ましくは、ｐＨ２．５〜ｐＨ５．５であってもよい。前記ｐＨを超えたり未満である場合、コアセルベートが形成されなかったり高分子の変形が発生することがあるためである。また、適正温度は、４〜１００℃であってもよく、好ましくは、１０〜６０℃であってもよく、前記温度を超えたり未満である場合、コアセルベートが形成されなかったり高分子の変形が発生することがあるためである。
前記溶媒にイガイ接着蛋白質またはその変異体および陰イオン性高分子の添加量は、これに限定されないが、好ましくは、溶媒全体体積対比０．００１〜１００％（ｗ／ｖ）であってもよく、より好ましくは、０．０１〜３０％（ｗ／ｖ）であってもよい。
本発明のコアセルベートは、これに限定されるが、好ましくは、前記イガイ接着蛋白質またはその変異体と陰イオン性高分子を１：０．０１〜１：１０の重量比で混合して製造されてもよく、より好ましくは、１：０．２５〜１：２．５の重量比で、さらに好ましくは、１：０．２５〜１：２．３３の重量比で混合して製造されてもよい。前記混合比を超えたり未満である場合、コアセルベートが効果的に形成されないことがあるためである。
【００５５】
一方、本発明は、本発明のコアセルベートを接着に使用するための用途を提供し、これについては前記と同意義である。特に本発明のコアセルベートは、接着剤の製造に使用するための用途でも使用されてもよい。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートを基質に接着させる段階を含む、本発明のコアセルベートを接着に使用する方法を提供し、これについては前記と同意義である。
また、本発明は、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達に使用するための用途を提供し、これについては前記と同意義である。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートの内部に生体活性物質を封入する段階を含む、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達に使用する方法を提供し、これについては前記と同意義である。
また、本発明は、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達体の製造に使用するための用途を提供し、これについては前記と同意義である。
また、本発明は、（ａ）本発明のコアセルベートを準備する段階、および（ｂ）前記コアセルベートの内部に前記生体活性物質を封入する段階を含む、本発明のコアセルベートを生体活性物質伝達体の製造に使用する方法を提供し、これについては前記と同意義である。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳しく説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるのではない。
【００５７】
《参照例１》
［イガイ接着蛋白質の製造］
＜１−１＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１の製造
前記イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１は、自然に存在するイガイ接着蛋白質ｆｐ−１の中で８０回程度反復される１０個のアミノ酸から構成されたデカペプチド（ｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）が大腸菌で発現され得るように６個のデカペプチドからなるｆｐ−１変異体を合成し、２個のｆｐ−１変異体間にＭｇｆｐ−５の遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＳ００４６３またはＡＹ５２１２２０）を入れた後、大腸菌で生産したものである（Ｄ．Ｓ．Ｈｗａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８、３５６０〜３５６８、２００７）。
具体的にｆｐ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．Ｑ２７４０９またはＳ２３７６０）のアミノ酸配列において、配列番号４で表されるＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫからなるペプチドが６回反復連結されたｆｐ−１変異体（以下、６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫという）を製造し、Ｍｇｆｐ−５のＮ−末端に前記６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫを組み合わせ、また、Ｍｇｆｐ−５のＣ−末端に６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫを組み合わせて配列番号１のｆｐ−１５１を製造した。
【００５８】
＜１−２＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１−ＲＧＤの製造
前記＜実施例１−１＞のｆｐ−１５１のＣ−末端にフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）ＲＧＤグループで選択されたＧＲＧＤＳＰ配列を追加して配列番号２のｆｐ−１５１−ＲＧＤを製造した。
【００５９】
＜１−３＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１の製造
イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１は、前記＜実施例１−１＞のｆｐ−１５１と同一の方式で２個のｆｐ−１変異体間に自然に存在するイガイ接着蛋白質Ｍｇｆｐ−３Ａの遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＢＡＢ１６３１４またはＡＢ０４９５７９）を入れた後、大腸菌で生産したものである。
具体的にｆｐ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．Ｑ２７４０９またはＳ２３７６０）のアミノ酸配列において、配列番号６で記載されるＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫからなるペプチドが６回反復連結された配列番号７で表されるｆｐ−１変異体（以下、６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫという）を製造し、Ｍｇｆｐ−３のＮ−末端に前記６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫを組み合わせ、また、Ｍｇｆｐ−３のＣ−末端に６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫを組み合わせて配列番号３のｆｐ−１３１を製造した。
【００６０】
＜１−４＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−５の製造
イガイ接着蛋白質ｆｐ−５は、自然に存在するイガイ接着蛋白質Ｍｇｆｐ−５の遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＳ００４６３またはＡＹ５２１２２０）を大腸菌で生産したものである（Ｄ．Ｓ．Ｈｗａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３３５２〜３３５９、２００４）。
【００６１】
《実施例１》
〔イガイ接着蛋白質を利用したコアセルベート（ｃｏａｃｅｒｖａｔｅ）の形成〕
コアセルベート（ｃｏａｃｅｒｖａｔｅ）は、特定のｐＨ条件で特定の比率で陰イオン性電解質高分子と陽イオン性電解質高分子を混合することによって生成されたコロイドの一種である。前記コアセルベートが形成されると溶液の吸光度が増加するため、コアセルベートの形成有無を確認するために主に吸光度を測定するようになる（Ｖ．Ｄｕｃｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ａ−Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ、２３２、２３９〜２４７、２００４）。下記の実施例は前記参照例で製造されたイガイ接着蛋白質と陰電荷電解質高分子を混合した場合、コアセルベートが形成されるか否かを確認したものである。
【００６２】
＜１−１＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を利用したコアセルベートの形成
前記＜参照例１−１＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１と陰電荷電解質高分子であるヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を混合した場合、コアセルベートが形成されるかを確認した。
具体的に１７ｋＤａの分子量を有するヒアルロン酸（Ｌｉｆｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｍｉｎｅｓｏｔａ、米国）を０．０５％（ｗ／ｖ）濃度に５％酢酸（水酸化ナトリウムでｐＨ調節）に溶かし、前記と同一の溶液に溶かしたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１を溶質（イガイ接着蛋白質およびヒアルロン酸）部分で占める比率を１０％（ｗ／ｗ）ずつ上昇させながら混合した。前記混合後、ＵＶ−ｓｐｅｃｔｒｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｏｐｔｉｚｅｎ  ３２２０ＵＶｂｉｏ、Ｍｅｃａｓｙｓ、大田、韓国）を利用して６００ｎｍ波長で吸光度を測定し、その結果を図１に記載した。
前記図１に記載された通り、ｐＨ２．５でｆｐ−１５１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）の重量比が５８：４２、ｐＨ３．０で６３：３７、ｐＨ３．５で６８：３２である時、コアセルベートが最もよく形成されることが分かった。
また、前記吸光度の増加がコアセルベートの形成によるものかを顕微鏡写真を通じて確認し、その結果を図２に記載した。
前記図２に記載された通り、１０μｍ程度の大きさの円形体が形成されたことを確認することができ、これはイガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）により形成されたコアセルベートであることを分かった。
【００６３】
＜１−２＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を利用したコアセルベートの形成
前記＜参照例１−３＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１を使用したことを除いては前記＜実施例１−１＞と同様な方法によりコアセルベートが形成されるか否かを確認し、その結果を図３および図４に記載した。
前記図３および図４に記載された通り、ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）の重量比がｐＨ２．５で４１：５９、ｐＨ３．０で５６：４４、ｐＨ３．５で５９：４１でコアセルベートが最もよく形成されることを確認することができた。
【００６４】
＜１−３＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１−ＲＧＤとヒアルロン酸（１７ｋＤａ）を利用したコアセルベートの形成
前記＜参照例１−２＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１−ＲＧＤを使用したことを除いては前記＜実施例１−１＞と同様な方法によりコアセルベートが形成されるか否かを確認し、その結果を図５および図６に記載した。
前記図５および図６に記載された通り、ｆｐ−１５１−ＲＧＤとヒアルロン酸の（１７ｋＤａ）重量比がｐＨ２．５で６０：４０、ｐＨ３．０で７０：３０、ｐＨ３．５で７３：２７でコアセルベートが最もよく形成されることを確認することができた。特にｆｐ−１５１よりもｆｐ−１５１−ＲＧＤを利用した場合、吸光度がより多く増加するため、コアセルベートがより一層よく形成されることが分かった。
【００６５】
＜１−４＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を利用したコアセルベートの形成
ヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を使用したことを除いては前記＜実施例１−１＞と同様な方法によりコアセルベートが形成されるか否かを確認し、その結果を図７および図８に記載した。
前記図７および図８に記載された通り、ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）の重量比がｐＨ２．５で５９：４１、ｐＨ３．０で７０：３０、ｐＨ３．５で７７：２７でコアセルベートが最もよく形成されることを確認することができた。特に１７ｋＤａヒアルロン酸よりも３５ｋＤａヒアルロン酸を利用した場合、吸光度がより多く増加するため、コアセルベートがより一層よく形成されることが分かった。
【００６６】
＜１−５＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）を利用したコアセルベートの形成
ヒアルロン酸（５９ｋＤａ）を使用したことを除いては前記＜実施例１−１＞と同様な方法によりコアセルベートが形成されるか否かを確認し、その結果を図９および図１０に記載した。
前記図９および図１０に記載された通り、ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）の重量比がｐＨ２．５で６２：３８、ｐＨ３．０で７１：２９、ｐＨ３．５で７５：２５でコアセルベートが最もよく形成されることを確認することができた。特に１７ｋＤａヒアルロン酸よりも５９ｋＤａヒアルロン酸を利用した場合、吸光度がより多く増加するため、コアセルベートがより一層よく形成されることが分かった。
【００６７】
＜１−６＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とフェレドキシンを利用したコアセルベートの形成
イガイ接着蛋白質として前記＜参照例１−３＞で製造されたｆｐ−１３１を使用したことを除いては前記ｆｐ−１３１とフェレドキシンの重量比がｐＨ４．５で７０：３０である時、＜実施例１−１＞と同様な方法によりコアセルベートが形成されるか否かを確認し、その結果を図１７に記載した。
前記図１５に記載された通り、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とフェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）を利用した場合、コアセルベートが形成されることが分かった。
【００６８】
＜１−７＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を利用したコアセルベートの形成
前記＜参照例１−３＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１を使用したことを除いては前記ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）の重量比がｐＨ３．８で８０：２０である時、＜実施例１−５＞と同様な方法によりコアセルベートが形成されるか否かを確認し、その結果を図１１に記載した。
【００６９】
＜１−８＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）を利用したコアセルベートの形成
前記＜参照例１−３＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１を使用したことを除いては前記ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）の重量比がｐＨ３．８で８０：２０である時、＜実施例１−６＞と同様な方法によりコアセルベートが形成されるか否かを確認し、その結果を図１２に記載した。
【００７０】
＜１−９＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）を利用したコアセルベートの形成
ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ、ｓｉｇｍａ）とｆｐ−１５１の吸光度測定実験がｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５でそれぞれ行われた。ヘパリンを０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度に前記ｐＨを有する１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶かし、同一の溶液に溶かしたｆｐ−１５１を１０％ずつ比率変化で１０〜９０％まで混合して吸光度を特定し、その結果を図１３および図１４に記載した。
前記図１３および図１４に記載された通り、ｆｐ−１５１とヘパリンの重量比がｐＨ５．０で９０：１０である場合、吸光度が最も高く、図１４でコアセルベートが形成されることを確認した。
【００７１】
＜１−１０＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−５とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を利用したコアセルベートの形成
前記＜参照例１−４＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−５を使用したことを除いては前記＜実施例１−４＞と同様な方法によりコアセルベートが形成されるか否かを確認し、その結果を図１６および図１７に記載した。
前記図１６および図１７に記載された通り、ｆｐ−５とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）の重量比がｐＨ４．６で８０：２０で混合した時、吸光度が最も多く増加することが分かった。
【００７２】
《実施例２》
〔コアセルベートの微細カプセル形成活性〕
＜２−１＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの微細カプセル形成活性
水酸化ナトリウムでｐＨ３．８に合わせた１００ｍＭのアセテートバッファーにｆｐ−１５１を１０ｇ／Ｌで溶かした後、最終体積の１％量の唐辛子種油を加えてこれを乳化するために１０分間撹拌した。前記撹拌後、ヒアルロン酸をｆｐ−１５１と質量比が８：２（ｆｐ−１５１：ヒアルロン酸）になるように唐辛子種油の乳化液にヒアルロン酸（３５ｋＤａ）を追加的に添加した。
前記添加後、微細カプセルが形成されるか否かを唐辛子種油が浮かぶ蛍光を利用して蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を通じて確認し、その結果を図１８に記載した。また、８日が経過するまで微細カプセルが維持されるか否かを確認し、その結果を図１９に記載した。
前記図１８および図１９に記載された通り、イガイ接着蛋白質とヒアルロン酸により形成されたコアセルベートは微細カプセルを形成することができる活性があり、特に前記のように形成された微細カプセルが８日が経過してもそのまま維持されることが分かる。
【００７３】
＜２−２＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの微細カプセル形成活性
イガイ接着蛋白質としてｆｐ−１３１を利用したことを除いて前記＜実施例２−１＞と同様な方法によりイガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの微細カプセル形成活性があるか否かを確認し、その結果を図１８および図１９に記載した。
前記図１８および図１９に記載された通り、イガイ接着蛋白質とヒアルロン酸により形成されたコアセルベートは微細カプセルを形成することができる活性があり、特に前記のように形成された微細カプセルが８日が経過してもそのまま維持されることが分かる。
【００７４】
＜２−３＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヘパリンにより形成されたコアセルベートの微細カプセル形成活性
ヒアルロン酸の代わりにヘパリンを利用したことと、ｆｐ−１５１とヘパリンの質量比が９：１になるようにしたことを除いて前記＜実施例２−１＞と同様な方法によりイガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヘパリンにより形成されたコアセルベートの微細カプセル形成活性があるか否かを確認し、その結果を図２０に記載した。
【００７５】
《実施例３》
〔コアセルベートの細胞接着活性〕
＜３−１＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性
前記＜実施例１−１＞で形成されたコアセルベートを利用して、表面が処理されていない２４ウェル培養プレートをコーティングし、これを通じて細胞接着活性を確認した。この時、陽性対照群として細胞接着活性があると知られたｆｐ−１５１およびｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを使用した。前記陽性対照群に対しては従来公知となった重炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）による沈澱法を利用した（Ｆｕｌｋｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｐ．など（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８（６）、ｐｐ．７９３〜７９８、（１９９０））
具体的に本実験で使用されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０％ＩＭＳ（ｉｎｓｅｃｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｓｉｇｍａ）、１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および３μｌ／ｍｌのｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（ｈｙｃｌｏｎｅ）が含まれた昆虫細胞培養液（Ｍ３  ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ）を使用して２７℃インキュベータで培養した。前記細胞を前記培養液に１×１０５個／ｍｌ濃度に希釈し、前記コアセルベートでコーティングされた細胞培養皿にウェル当り５×１０４個で前記細胞を入れ、１時間インキュベータで培養した。前記培養後、生きている細胞を定量化するために３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）分析を実施した。まず、前記培養後に付いていない細胞を除去するためにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、３００μｌのＭＴＴ溶液をウェルに注入した。生きている細胞は、ミトコンドリアでＭＴＴをＭＴＴホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に還元させるため、ＭＴＴ試薬を入れて２時間追加培養した後、ＭＴＴホルマザンに還元されたものをｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）で溶出した後、分光器（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を通じて５７０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図２１に記載した。
前記図２１に記載された通り、ｆｐ−１５１およびｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅなどの陽性対照群に比べて、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性がより優れていることが分かった。
【００７６】
＜３−２＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１−ＲＧＤとヒアルロン酸（１７ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性
前記＜実施例１−３＞で形成されたコアセルベートを利用したことを除いては前記＜実施例３−１＞と同様な方法により細胞接着活性を測定し、その結果を図２２に記載した。
前記図２２に記載された通り、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１−ＲＧＤとヒアルロン酸（１７ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性がより優れていることが分かった。
【００７７】
＜３−３＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性
前記＜実施例１−２＞で形成されたコアセルベートを利用したことを除いては前記＜実施例３−１＞と同様な方法により細胞接着活性を測定し、その結果を図２３に記載した。
前記図２３に記載された通り、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（１７ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性が非常に優れていることが分かった。
【００７８】
＜３−４＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性
前記＜実施例１−４＞で形成されたコアセルベートを利用したことを除いては前記＜実施例３−１＞と同様な方法により細胞接着活性を測定し、その結果を図２４に記載した。
前記図２４に記載された通り、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性が非常に優れていることが分かった。
【００７９】
＜３−５＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性
前記＜実施例１−５＞で形成されたコアセルベートを利用したことを除いては前記＜実施例３−１＞と同様な方法により細胞接着活性を測定し、その結果を図２５に記載した。
前記図２５に記載された通り、イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの細胞接着活性がより優れていることが分かった。
【００８０】
《実施例４》
〔コアセルベートの接着力測定〕
＜４−１＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１またはｆｐ−１３１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの接着力測定（乾燥条件）
イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とｆｐ−１３１のチロシン残基をドーパに変えるためにチロシナーゼ酵素反応を行った。具体的に５μｇ／ｍｌのきのこ由来チロシナーゼ酵素と２ｇ／Ｌの蛋白質を２５ｍＭのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）を含むＰＢＳに溶かし、３７℃で半日反応させて蒸溜水に二回透析し凍結乾燥することによって修正されたイガイ接着蛋白質ｍｆｐ−１５１とｍｆｐ−１３１を得た。
水酸化ナトリウムでｐＨ３．８に合わせた１００ｍＭアセテートバッファーにｍｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）をそれぞれ１０ｇ／Ｌで溶かした溶液を質量比８：２で混合してコアセルベートを製造した。そして、これを遠心分離して凝縮された液状コロイド状態のコアセルベートをアルミニウム試片に１２ｍｍ×１０ｍｍの広さに塗抹して接着させた。比較実験のために同一の濃度のＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）と凍結乾燥状態の単一のイガイ接着蛋白質ｍｆｐ−１５１またはｍｆｐ−１３１を同一のバッファーに溶かして同様な方法により付け、これを２４時間常温で乾燥して接着されたアルミニウム試片の両側に力を加えて脱着時にに加えられる力を引張強度測定機器（Ｉｎｓｔｒｏｎ）で定量して接着剤の引張強度を測定し、その結果を図２６に記載した。
前記図２６に記載された通り、イガイ接着蛋白質とヒアルロン酸を利用したコアセルベートの接着力が単一のイガイ接着蛋白質に比べてより優れていることが分かる。
【００８１】
＜４−２＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａまたは５９ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの接着力測定（水分条件）
前記＜実施例４−１＞でイガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（３５ｋＤａ）により形成されたコアセルベートに架橋剤であるチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）をｆｐ−１５１と質量対比１：２００で混合したり、あるいは前記＜実施例１−５＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）により形成されたコアセルベートにグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を全体体積対比０．５％で混合してアルミニウム試片に１０ｍｍ×１０ｍｍの広さに塗抹し、これを接着させた。比較実験のためにｆｐ−１５１を同一のバッファーに溶かし、同一量のチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）やグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を入れて同様な方法により付けた。
前記サンプル上に蒸溜水に浸漬したガーゼを巻き、乾燥されないようにラップで巻いた。これを３時間３７℃で置いた後、接着剤の引張強度を測定し、その結果を図２７に記載した。
前記図２７に記載された通り、２種類の架橋剤（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を添加したイガイ接着蛋白質とヒアルロン酸により形成されたコアセルベートの接着力が単一のイガイ接着蛋白質に比べてより優れていることが分かる。
【００８２】
＜４−３＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの接着力測定（水分条件）
前記＜実施例４−２＞と同様な方法により、前記＜実施例１−１１＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１３１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）により形成されたコアセルベートにチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）をｆｐ−１３１と質量対比１：１０００で混合したりグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を全体体積対比０．５％で混合してアルミニウム試片に１０ｍｍ×１０ｍｍの広さに塗抹し、これを接着させた。
比較実験のためにｆｐ−１３１を同一のバッファーに溶かして同一量のチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）とグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を入れて同様な方法により付け、これを温度３０℃、湿度９０％で３時間置いた後、接着剤の引張強度を測定し、その結果を図２８に記載した。
前記図２８に記載された通り、２種類の架橋剤（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を添加したイガイ接着蛋白質とヒアルロン酸により形成されたコアセルベートの接着力が単一のイガイ接着蛋白質に比べてより優れていることが分かる。
【００８３】
＜４−４＞イガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）により形成されたコアセルベートの接着力測定（水中条件）
前記＜実施例４−２＞と同様な方法により、前記＜実施例１−１１＞で製造されたイガイ接着蛋白質ｆｐ−１５１とヒアルロン酸（５９ｋＤａ）により形成されたコアセルベートにチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）をｆｐ−１５１と質量対比１：１０００で混合し、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を全体体積対比０．５％で混合してアルミニウム試片に１０ｍｍ×１０ｍｍの広さに塗抹し、これを接着させた。
比較実験のために牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）を同一のバッファーに溶かして同一量のチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）とグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を入れて同様な方法により付け、これを２４時間ＰＢＳに浸漬した後、接着剤の引張強度を測定し、その結果を図２９に記載した。
前記図２９に記載された通り、２種類の架橋剤（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を添加したイガイ接着蛋白質とヒアルロン酸により形成されたコアセルベートの接着力がＢＳＡに比べてより優れていることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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