(57)【要約】  本発明は、複数のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体を含むバイオポリマー合成用器具であって、前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含む、バイオポリマー合成用器具に関する。
2012507513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体
を含むバイオポリマー合成用器具であって、
前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含む、バイオポリマー合成用器具。
【請求項２】
複数のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体
を含むバイオポリマー合成用器具であって、
前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含有し、
さらに前記マイクロウェルが、前記多孔質基材を保持するためのふるい部材を包含する、バイオポリマー合成用器具。
【請求項３】
複数のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体
を含むバイオポリマー合成用器具であって、
前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含有し、
さらに前記マイクロウェルが、前記多孔質基材を保持するように適合された少なくとも1つの部位を包含する、バイオポリマー合成用器具。
【請求項４】
前記支持体がガラスまたはシリコンのチップである、請求項1から3のいずれか一項に記載の器具。
【請求項５】
前記支持体がマイクロウェルプレートである、請求項1から3のいずれか一項に記載の器具。
【請求項６】
前記多孔質基材がバイオポリマー合成のための高表面積を提供する、請求項1から5のいずれか一項に記載の器具。
【請求項７】
前記高表面積が、約10m2/gから約200m2/g、または20m2/gから約180m2/g、または30m2/gから約160m2/g、または30m2/gから約140m2/g、または40m2/gから約120m2/g、または50m2/gから約110m2/g、または60m2/gから約100m2/gである、請求項6に記載の器具。
【請求項８】
前記バイオポリマーが、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、多糖、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリフェノール、ポリサルフェートまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項6に記載の器具。
【請求項９】
前記バイオポリマーがオリゴヌクレオチドである、請求項8に記載の器具。
【請求項１０】
前記多孔質基材が、多孔質ガラスビーズ、シリカ粒子、モノリス型シリカまたはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の器具。
【請求項１１】
前記モノリス型シリカおよび/またはシリカ粒子が前記マイクロウェル内に形成される、請求項10に記載の器具。
【請求項１２】
前記モノリス型シリカまたはシリカ粒子がゾルゲル法によるものである、請求項11に記載の器具。
【請求項１３】
前記多孔質基材が、N-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)、ビス(ヒドロキシエチル)アミノ-プロピルトリエトキシシラン、ヒドロキシブチルアミドプロピルトリエトキシシランまたはそれらの組合せのうちの少なくとも1つにより官能基修飾される、請求項1から12のいずれか一項に記載の器具。
【請求項１４】
前記多孔質基材が、9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトにより処理される、請求項13に記載の器具。
【請求項１５】
前記多孔質基材が、切断可能なリンカーにより官能基修飾されて、合成されたバイオポリマーを選択的に溶出させることができる、請求項14に記載の器具。
【請求項１６】
前記切断可能なリンカーが、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシメチルアミド]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイトまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項15に記載の器具。
【請求項１７】
複数のマイクロチャネルを有する少なくとも1つの支持体
を含むバイオポリマー合成用器具であって、
前記マイクロチャネルが、バイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含む、バイオポリマー合成用器具。
【請求項１８】
前記支持体がガラスまたはシリコンのチップである、請求項17に記載の器具。
【請求項１９】
前記支持体がマイクロチャネルプレートである、請求項17または請求項18に記載の器具。
【請求項２０】
前記多孔質基材がバイオポリマー合成のための高表面積を提供する、請求項17から19のいずれか一項に記載の器具。
【請求項２１】
前記高表面積が、約10m2/gから約200m2/g、または20m2/gから約180m2/g、または30m2/gから約160m2/g、または30m2/gから約140m2/g、または40m2/gから約120m2/g、または50m2/gから約110m2/g、または60m2/gから約100m2/gである、請求項20に記載の器具。
【請求項２２】
前記多孔質基材が、多孔質ガラスビーズ、シリカ粒子、モノリス型シリカまたはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項17から21のいずれか一項に記載の器具。
【請求項２３】
前記モノリス型シリカまたはシリカ粒子が前記マイクロチャネル内に形成される、請求項22に記載の器具。
【請求項２４】
前記モノリス型シリカまたはシリカ粒子がゾルゲル法によるものである、請求項22または請求項23に記載の器具。
【請求項２５】
前記多孔質基材が、N-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)、ビス(ヒドロキシエチル)アミノ-プロピルトリエトキシシラン、ヒドロキシブチルアミドプロピルトリエトキシシランまたはそれらの任意の組合せにより官能基修飾される、請求項17から24のいずれか一項に記載の器具。
【請求項２６】
前記多孔質基材が、9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトにより処理される、請求項25に記載の器具。
【請求項２７】
前記多孔質基材が、切断可能なリンカーにより官能基修飾されて、合成されたバイオポリマーを選択的に溶出させることができる、請求項25に記載の器具。
【請求項２８】
前記切断可能なリンカーが、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシメチルアミド]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイトまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項27に記載の器具。
【請求項２９】
バイオポリマーを合成するための、請求項1から28のいずれか一項に記載の器具の使用。
【請求項３０】
前記バイオポリマーが、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、多糖、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリフェノール、ポリサルフェートまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項29に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオポリマー合成用器具およびその使用に関する。詳細には、本発明は、バイオポリマー合成用のフロースルー型多孔質基材を有する器具およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイ分析や合成において基材を用いることが知られている。例えば、二次元DNAマイクロアレイ合成のために平面ガラス支持体表面上にシリカ粒子の薄層を作製する方法がある。シリカ粒子の多孔質層は、多孔質部位の操作を容易にするための機械的な支持体として機能する支持構造体、典型的にはガラスの上に重ねられる。当該設計や類似の設計に関連した1つの問題は、平坦な多孔質表面であるためにバイオポリマーユニットが層上で合成中のバイオポリマーの一部を形成する前に粒子を通り抜けて拡散することである。この影響でバイオポリマーの拡散領域が生成され、バイオポリマー合成に利用可能な分離スポットまたは領域の数を限定する。同様に、このような設計をDNAマイクロアレイに適用する場合、粒子を通り抜けた分子の拡散はハイブリダイゼーション反応中に律速段階を導入し、バイオポリマーの拡散領域は生成されるシグナルを、ひいてはアレイの感度を限定する。
【０００３】
ガラス支持体内に形成された試料ウェルを有するフロースルー型器具もまた知られている。いくつかの器具において、各々の試料底部は、バイオポリマー接着のための基材として働く多孔質シリコンウェハを含有する。このような素子は、バイオポリマーでの官能基修飾が可能な表面積が狭く、それ故に単位面積あたりのバイオポリマー密度が限定される。DNAマイクロアレイなどの用途において、これは検出感度を限定する。
【０００４】
既存のバイオポリマー合成用器具に伴うさらなる問題は、合成反応終了前の試薬の蒸発である。これは特にナノリットル量の試薬が合成反応終了前に蒸発し得るマイクロスケールのバイオポリマー合成においてよく見られ、その結果、不十分なバイオポリマー合成につながって合成されるバイオポリマーの純度が低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、バイオポリマー合成のための高表面積を有する分離領域を提供するバイオポリマー合成用のフロースルー型多孔質基材を有する器具に対する需要は依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の態様によると、
複数のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体
を含むバイオポリマー合成用器具であって、
前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含む、バイオポリマー合成用器具が提供される。
【０００７】
本発明の第二の態様によると、
複数のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体
を含むバイオポリマー合成用器具であって、
前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含み、
さらに前記マイクロウェルが、前記多孔質基材を保持するためのふるい部材を包含する、バイオポリマー合成用器具が提供される。
【０００８】
本発明の第三の態様によると、
複数のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体
を含むバイオポリマー合成用器具であって、
前記マイクロウェルがバイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含み、
さらに前記マイクロウェルが前記多孔質基材を保持するように適合された少なくとも1つの部位を包含する、バイオポリマー合成用器具が提供され得る。
【０００９】
一実施形態において、支持体はガラスまたはシリコンのチップであってもよい。あるいは支持体はマイクロウェルプレートであってもよい。
【００１０】
代替の実施形態において、多孔質基材はバイオポリマー合成のための高表面積を提供する。多孔質基材の表面積は、約10m2/gから約200m2/g、または20m2/gから約180m2/g、または30m2/gから約160m2/g、または30m2/gから約140m2/g、または40m2/gから約120m2/g、または50m2/gから約110m2/g、または60m2/gから約100m2/gであってもよい。
【００１１】
一実施形態において、バイオポリマーは、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、多糖、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリフェノール、ポリサルフェートまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。
【００１２】
一実施形態において、バイオポリマーはオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００１３】
代替の実施形態において、多孔質基材は、多孔質ガラスビーズ、シリカ粒子、モノリス型シリカまたはそれらの組合せからなる群から選択され得る。モノリス型シリカまたはシリカ粒子はマイクロウェル内に形成され得る。
【００１４】
一実施形態において、モノリス型シリカまたはシリカ粒子はゾルゲル法によるものであってもよい。
【００１５】
さらなる実施形態において、多孔質基材は、N-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)により官能基修飾された後、オリゴヌクレオチド合成のために9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトにより処理され得る。
【００１６】
さらに別の実施形態において、多孔質基材は、切断可能なリンカーにより官能基修飾されて、例えばオリゴヌクレオチドなどの合成されたバイオポリマーを選択的に溶出させることができる。
【００１７】
切断可能なリンカーは、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシメチルアミド]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト(Solid CRP II、Glen Research)またはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。
【００１８】
本発明の第四の態様によると、
複数のマイクロチャネルを有する少なくとも1つの支持体
を含むバイオポリマー合成用器具であって、
前記マイクロチャネルが、バイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材を含む、バイオポリマー合成用器具が提供される。
【００１９】
代替の実施形態において、多孔質基材は、バイオポリマー合成のための高表面積を提供する。多孔質基材の表面積は、約10m2/gから約200m2/g、または20m2/gから約180m2/g、または30m2/gから約160m2/g、または30m2/gから約140m2/g、または40m2/gから約120m2/g、または50m2/gから約110m2/g、または60m2/gから約100m2/gであってもよい。
【００２０】
一実施形態において、支持体はガラスまたはシリコンのチップであってもよい。あるいは、支持体はマイクロチャネルプレートであってもよい。
【００２１】
代替の実施形態において、多孔質基材は、多孔質ガラスビーズ、シリカ粒子、モノリス型シリカまたはそれらの組合せからなる群から選択され得る。例えばモノリス型シリカまたはシリカ粒子はマイクロチャネル内に形成され得る。
【００２２】
一実施形態において、モノリス型シリカまたはシリカ粒子はゾルゲル法によるものであってもよい。
【００２３】
さらなる実施形態において、多孔質基材は、N-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)により官能基修飾された後、オリゴヌクレオチド合成のために9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトにより処理され得る。
【００２４】
一実施形態において、多孔質基材は、切断可能なリンカーにより官能基修飾されて、例えばオリゴヌクレオチドなどの合成されたバイオポリマーを選択的に溶出させることができる。
【００２５】
切断可能なリンカーは、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシメチルアミド]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト(Solid CRP II、Glen Research)またはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。
【００２６】
本発明の第五の態様によると、バイオポリマーを合成するための、本発明の器具の使用が提供される。
【００２７】
一実施形態において、バイオポリマーは、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、多糖、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリフェノール、ポリサルフェートまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】フロースルー型多孔質チップの一連の模式図である。(A)多孔質ガラスビーズが詰められたシリコンマイクロウェル、(B)ゾルゲル法によるシリカ粒子が詰められたシリコンマイクロウェル、(C)モノリス型のゾルゲル法によるシリカが詰められたシリコンマイクロウェル、(D)モノリス型のゾルゲル法によるシリカが詰められたマイクロチャネルプレート、(E)モノリス型のゾルゲル法によるシリカが詰められた多孔質シリコンチャネルのそれぞれの側面図(左)および上面図(右)である。
【図２】(A)垂直側壁、(B)カラムふるいおよび(C)逆ボトル形状を有するマイクロウェルの模式図である。
【図３】加工された本発明の多孔質基材の一連の顕微鏡写真である。(A)貫通ウェルを有するシリコンチップ。正方形のウェルは幅250μm、ピッチ400μmである。(B)多孔質ガラスビーズが詰められたマイクロウェルを有するシリコンチップ。(C、D)ゾルゲル法による直径15μmのシリカ粒子が詰められたマイクロウェルを有するシリコンチップ。(E)モノリス型のゾルゲル法によるシリカが詰められたマイクロウェルを有するシリコンチップ。(F)直径5μm、ピッチ6μmのチャネルを有するマイクロチャネルプレート。(G)モノリス型のゾルゲル法によるシリカが詰められたマイクロチャネルプレート。(H)多孔質シリコンチャネル。
【図４】チップのシリル化および合成されたオリゴヌクレオチドの選択的溶出の図である。オリゴヌクレオチド溶出段階で化学的リン酸化リンカーは選択的に切断される。
【図５】大規模並列オリゴヌクレオチド合成機の図である。
【図６】ゾルゲル法による直径15μmのシリカ粒子が詰められたウェルを有するDNAマイクロアレイのイメージである。(A)チップ全体が20塩基長のATCGにより合成された。(B)Cy3蛍光タグにより末端標識された20塩基長の相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後のチップの蛍光イメージ。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
本明細書の内容において、用語「含む(comprising)」は、「主であるが、唯一である必要はなく包含する」を意味する。さらに「含む(comprise)」、「含む(comprises)」などの「含む(comprising)」という語の変形は、対応した変形の意味を持つ。
【００３０】
用語「ウェル」および「マイクロウェル」は、本明細書で交換可能に用いられ、モノリスまたは複数の粒子を収容可能なマイクロスケールのチャンバーをいう。マイクロウェルは任意の形状または深さであってよく、いくつかの実施形態において、不規則なまたは傾斜した側面を持つことができる。好ましい実施形態において、マイクロウェルの深さはそれぞれ、約100μmから約1500μmの間または約10μmから約500μmの間である。
【００３１】
用語「マイクロチャネル」および「チャネル」は本明細書で交換可能に用いられ、バイオポリマー合成用多孔質基材のモノリスおよび/または粒子を収容可能なμmスケール径のチャネルをいう。マイクロチャネルは任意の横断的な形状であってよい。マイクロチャネル内の流体はマイクロ流体の挙動を呈すことができる。
【００３２】
詳細な説明
本発明によると、支持構造体内に形成されたマイクロウェルおよび/またはマイクロチャネル内に存在するバイオポリマー合成用の多孔質基材が提供される。多孔質基材は一般に、多孔質ガラスビーズ、ゾルゲル法によるシリカ粒子またはモノリスを含む。支持構造体は一般に、シリコンまたはガラスである。
【００３３】
図を参照すると、本発明は、複数のマイクロウェル102を有する少なくとも1つの支持体110を含むバイオポリマー合成用器具50を提供し、前記マイクロウェルは、多孔質ガラスビーズ(図1(A))、ゾルゲル法によるシリカ粒子(図1(B)および図2(A-C))またはモノリス型のゾルゲル法によるシリカ(図1(C-E))などのバイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材100を含む。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、複数のマイクロウェル102を有する少なくとも1つの支持体110を含むバイオポリマー合成用器具50を提供し、前記マイクロウェルは、ゾルゲル法によるシリカ粒子(図1(B)および図2(A-C))などのバイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材100を含有し、さらに前記マイクロウェル102は、前記多孔質基材100を保持するためのふるい部材160を含有する。
【００３５】
代替の実施形態において、本発明は、複数のマイクロウェル102を有する少なくとも1つの支持体110を含むバイオポリマー合成用器具50を提供し、前記マイクロウェルは、ゾルゲル法によるシリカ粒子(図1(B)および図2(A-C))などのバイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材100を含有し、さらに前記マイクロウェルは、例えば逆ボトル形状170(図1(A)および図2(C))などの前記多孔質基材を保持するように適合された少なくとも1つの部位を包含する。
【００３６】
別の代替の実施形態において、本発明は、マイクロチャネルプレートまたは多孔質シリコンチップなどの少なくとも1つの支持体110を含むバイオポリマー合成用器具50を提供し、前記支持体は複数のマイクロチャネル104を有し、前記マイクロチャネルは、モノリス型のゾルゲル法によるシリカなどのバイオポリマー合成のための表面積を提供する多孔質基材100を含む。
【００３７】
図1は、フロースルー型多孔質チップの一連の模式図である。側面図(左)および上面図(右)が示される。図1(A)において、多孔質基材100が、この場合は複数の多孔質ガラスビーズが支持体110内のシリコンマイクロウェル102に配置される。別の実施形態(図1(B))において、基材100は、複数のゾルゲル法によるシリカ粒子であり、シリコンマイクロウェル102内に含有される。これらの図において(基材が多孔質ガラスビーズまたはゾルゲル法によるシリカ粒子である実施形態における)基材100のサイズは変動するが、これは粒子サイズにはいくつかの分布があるためである。
【００３８】
代替の実施形態(図1(C))において、基材100は、シリコンマイクロウェル102内に含有されるモノリス型のゾルゲル法によるシリカである。他の実施形態(図1(D)および(E))において、支持体110は、マイクロチャネルプレートまたは多孔質シリコンチップである。支持体110は各々マイクロチャネル104を含み、マイクロチャネル104は、バイオポリマー合成のためのモノリス型のゾルゲル法によるシリカの基材100を含有する。
【００３９】
図2は、垂直側壁を有するマイクロウェル102を含む支持体110の模式図であり、マイクロウェル102はゾルゲル法によるシリカ粒子の基材100を含有する(図2(A))。一実施形態(図2(B))において、マイクロウェル102は垂直側壁を持ち、ゾルゲル法によるシリカ粒子の基材100を含有する。粒子はふるい部材160により保持され、図にはカラムふるいが示されている。代替の実施形態において、マイクロウェルは逆ボトル形状170である(図2(C))。
【００４０】
基材用のマイクロウェルおよびマイクロチャネル支持体
一実施形態において、本発明は、バイオポリマー合成用多孔質基材を受け入れるためのマイクロウェルおよび/または複数のマイクロチャネルを包含する固形支持体を提供する。
【００４１】
典型的には、支持体は、マイクロウェル、マイクロチャネルもしくはそれらの組合せに加工可能なシリコン、ガラスまたは任意の他の材料である。
【００４２】
支持体は、例えば、半導体ウェハ、シリコンウェハ、ガラスまたは石英の顕微鏡スライド、金属表面、ポリマー表面や、マイクロウェル、マイクロチャネルまたはそれらの組合せが内部に形成される表面上の単層コーティングであってもよい。好ましくは、固形支持体は、シリコンウェハまたはガラススライドなどの平坦で薄く、硬いものである。
【００４３】
マイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルは、支持体上で離れて置かれる。好ましくは、マイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルは、支持体上の規則的な間隔を持つ二次元アレイに設置され、例えば支持体表面上の仮想正方形グリッドの頂点に配置される。しかしながら、本発明は、固形支持体におけるマイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルのいかなる配置をも提供する。本発明はまた、固形支持体はバイオポリマー合成用基材としても機能可能であることを提供する。
【００４４】
支持体内のマイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルは、少なくとも1つの基材を少なくとも1つの他の基材から分離する物理的バリアとなる。物理的バリアは、バイオポリマー合成用試薬がウェル内の基材から離れて拡散することができないという既存技術の問題に対して、利点がある。この物理的バリアはまた、異なるウェル内で異なるポリマーを合成する可能性および/または異なるウェル内で異なる基材を使用する可能性を提供する。
【００４５】
マイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルは任意の形状であってよいが、好ましくは横断面が正方形、長方形または円形である。ウェル側面は、実質的に支持体平面に対して垂直であることができ、または一方の末端が他方の末端よりも広く設定され得る。
【００４６】
マイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルの密度は、少なくとも約500/cm2、少なくとも約1000/cm2、少なくとも約5000/cm2、少なくとも約10,000/cm2、少なくとも約5×104/cm2、少なくとも約1×105/cm2、少なくとも約1×106/cm2または少なくとも約5×106/cm2であってもよい。
【００４７】
それぞれのウェルで異なるバイオポリマーを合成することができると考えられる。例えば一実施形態において、本発明の器具の設計は固有のバイオポリマーを基材あたり103から104提供することができる。加えて、本発明の器具において用いられる多孔質基材の高表面積は、少なくともマイクロウェルまたはマイクロチャネルあたり20ピコモルであってもよい。
【００４８】
マイクロウェルは、任意の方法により支持体内に形成され得る。特に、深堀り反応性イオンエッチング(DRIE)がマイクロウェルおよびマイクロチャネルの形成に用いられ得る。
【００４９】
深堀り反応性イオンエッチング(DRIE)
DRIEは、高度に異方性、すなわち方向性のあるエッチングプロセスで、深く急勾配のウェルやチャネルをシリコンウェハなどの支持体内に作製するのに有用である。DRIEプロセスにおいて、例えばシリコンウェハなどの、内部にマイクロウェルおよびマイクロチャネルがエッチングされる予定の支持体が提供される。当該技術分野で公知のフォトレジストは支持体上面の上に被着する。ネガ型またはポジ型のフォトレジストが用いられ得る。いくつかの実施形態において、均一な厚さを確保するようにフォトレジストは支持体上に回転塗布され得る。一実施形態において、12μm厚のAZ4620フォトレジスト(Clariant Corp.)がシリコンウェハ(500μm厚、10cm径)上に回転塗布される。支持体は続いて、例えば熱板の上でフォトレジスト中の溶媒を蒸発させるようにベークされ得る。ベーク温度は約85℃から約200℃の間である。好ましい実施形態において、ベーク温度は約110℃である。
【００５０】
フォトレジストマスクは、所望のマイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルのパターンおよび断面形状に対応するようにパターン形成される。フォトレジストマスクは、当該技術分野で公知の任意の方法によりパターン形成され得る。典型的には、所望のパターンがマスクアライナー(例えばEVG620マスクアライナー)を用いて支持体上に露光される。露光された支持体上のフォトレジストは、その後当該技術分野で公知の方法により現像され、ポストベークされる。好ましい実施形態において、ポストベークは120℃で5分間である。
【００５１】
DRIEプロセスは好ましくは高異方性プロセスである。好ましい実施形態において、高異方性DRIEプロセスは、例えばAlcatel AMS 100SE装置等による機械制御で行われる。高異方性DRIEプロセスは典型的には、SF6およびO2によるエッチングサイクルとC4F8を用いる不動態化サイクルとを用いる。一実施形態において、SF6、O2およびC4F8の流量はそれぞれ130sccm/s、13sccm/sおよび100sccm/sに維持される。エッチングおよび不動態化の時間はそれぞれ8秒間および5秒間、RFプラズマのコイル電力は800Wであった。DRIEプロセスは当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されたプロセスの変形は当業者が通常行うものであることが理解されるであろう。
【００５２】
本発明によるマイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルを支持体内に製造するため、当業者は通常、エッチングおよび不動態化の薬剤、時間、流量およびコイル電力のうちの任意の1つまたは任意の組合せを変更することが理解されるであろう。
【００５３】
マイクロウェルは、エッチングされる領域を定めるのに用いられるフォトレジストにおけるパターンの最大径または寸法を選択することで支持体内に作り出され得る。エッチングされる支持体の厚さに依存して、エッチングプロセスを支持体底部より上の一定のポイントで終了させることができる。このようにプロセスパラメータの通常の選択により、マイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルを一方の末端が他方よりも間隔幅が広いように作り出すことができる。
【００５４】
バイオポリマー合成用基材
本発明において用いられるバイオポリマー合成用基材は、多孔質ガラスビーズ、シリカ粒子、モノリス型シリカまたはそれらの任意の組合せであってよい。
【００５５】
本発明の器具において用いられる多孔質基材は流体量の削減をもたらす。これには、バイオポリマー合成において用いられる試薬の量を削減する利点がある。
【００５６】
多孔質ガラスビーズ
本発明において用いられる多孔質ガラスビーズは市販されている。例えば多孔質ガラスビーズはGlen ResearchによりUniversal Support IIという商標名のもとで供給されるものであってよい。これらのビーズは、平均孔径500Åまたは1000Åの多孔質シリコン酸化物(ガラス)粒子である。好ましくは多孔質ガラスビーズの直径は、約25μmから約750μm、または約50μmから約500μm、または約75μmから約425μm、または約100μmから約250μm、または約125μmから約175μmであろう。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明で用いられる多孔質ガラスビーズは、バイオポリマー合成用に調製済の官能基修飾ビーズとして市販されているものであってよい。例えばGlen Research Universal Support IIビーズは、1-ジメトキシトリチルオキシ-2-O-ジクロロアセチル-プロピル-3-N-ウレアイル-ポリスチレンで誘導体化されて提供される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明の多孔質ガラスビーズは、シリル化などの標準的な方法論を用いて官能基修飾されたものであってよい。一実施形態において、多孔質ガラスビーズは、2%のN-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)のエタノール溶液とともに4時間室温でインキュベートされることにより官能基修飾され、95%エタノール中で10分間すすがれ、そして真空乾燥器内で120℃で12時間硬化され得る。多孔質ガラスビーズは、ビス(ヒドロキシエチル)アミノ-プロピルトリエトキシシランまたはヒドロキシブチルアミドプロピルトリエトキシシランで官能基修飾されてもよい。
【００５９】
ビーズはその後、バイオポリマー(特に核酸)合成用ビーズを調製するようにスペーサーを用いて処理され得る。スペーサーは9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト、18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト、3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト、12-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ドデシル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。
【００６０】
次いで、官能基修飾ビーズは、支持体のマイクロウェルおよび/またはマイクロチャネル内に充填され得る。代替の実施形態において、ビーズは、マイクロウェルおよび/またはマイクロチャネル内でその場で官能基修飾され得る。
【００６１】
ゾルゲル法
本発明の一実施形態において、多孔質基材は、ゾルゲル法で得られるモノリス型シリカまたはシリカ粒子であってよい。
【００６２】
用語「ゾルゲル法」は、乾燥されてガラス状の粒子またはモノリスになることができるゲルを製造するための幅広い手法をいう。ゾルゲル法のプロセスは、意図した材料(例えばシリカ)の前駆体溶液を使用し、例えば以下の段階を包含することができる。
(i) Siの溶液または懸濁液の調製
(ii) Si調製物の酸または塩基で触媒された加水分解。次の反応によりSi-OH基を形成する。
SiXn + nH2O  →  Si(OH)n + nHX
この方法で得られる混合物は、「ゾル」として知られる溶液またはコロイド懸濁液である。
(iii)次の反応によるSi-OH基の重縮合。
Si-OH + Si-OH  →  Si-O-Si + H2O
この段階は、粘度の増加および同時に起こる「ゲル」として知られるマトリックスの形成により特徴づけられる。
【００６３】
ゲルを乾燥させると、特にゲルがマイクロチャネルまたはマイクロウェル内で形成されて乾燥された場合に、多孔質モノリス型の物体が形成される。乾燥はキセロゲルを生成する制御された溶媒蒸発またはエアロゲルを生成する溶媒の超臨界抽出により行うことができる。乾燥されたゲルは、本発明のマイクロウェルおよび/またはマイクロチャネル支持体においてこの形状で用いることができ、または熱処理により濃縮させてガラス状のモノリスまたは粒子を調製してもよい。
【００６４】
上の段階ii)におけるコロイド(ゾル)溶液は、1つまたは複数の(上でSiに代表される)金属または半金属酸化物の前駆体を水または水/アルコールとともに酸や塩基などの触媒の存在下で混合して調製することができる。金属または半金属酸化物は、周期表の3、4または5族に属する元素のn価のカチオンであってもよいが、特にSi、Ge、Ti、Alまたはそれらの任意の組合せであってもよい。上で用いられるXは酸化物、アルコキシド、メトキシ、テトラメトキシ、エトキシ、プロポキシもしくはブトキシまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。
【００６５】
加水分解段階(上の段階(iii))は室温で約5分間から4時間以上または水和したカチオン酸化物がゾルを形成するまで行うことができる。ゲル化前にゾルに少なくとも1つの既存カチオン酸化物のコロイド懸濁液を添加してもよい。例えば、シリコン酸化物を含む前駆体が利用される場合、水、任意選択でさらに溶媒、ヒュームドシリカ、酸または塩基を混合して調製された溶液/懸濁液をゾルに加えてもよい。
【００６６】
ゾルのゲル化は、ゾルを典型的には約90℃より低い温度で、少なくとも数分間にわたってインキュベートすることで行うことができる。
【００６７】
ゲル化後、ゲルは例えば水およびメタノールまたは別の有機溶媒により、ゲル中の溶媒が非プロトン性溶媒または水およびメタノールにより置換されるように洗浄される。非プロトン性溶媒は、アセトン、ジオキサン、ハイドロフランを含む群から選択され得る。
【００６８】
このようにして得られるゲルはその後、不活性ガスを用いてパージした加圧チャンバー内で、ゲル溶媒の臨界温度より低い温度のときに溶媒臨界圧より低い全圧力を達成するのに適切な圧力で乾燥され得る。このような条件の下、ゲル溶媒が蒸発して乾燥ゾルゲルを生成するよう予め決められたプログラムに従って加圧チャンバーの温度が上げられる。
【００６９】
乾燥ゾルゲルはガラス化を受け、通常の大気圧または不活性ガス気圧下で約100℃から約1650℃より高い温度に加熱され得る。ガスは窒素、アルゴン、ヘリウム、酸素、塩素等からなる群から選択され得る。乾燥ゾルゲルは約10分間から長時間にわたって加熱され得る。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態において、ゾルゲルは支持体のマイクロチャネル内に形成され、モノリス型ゾルゲルシリカチップを形成することができる。マイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルを有する支持体は最初に清浄化され、例えば支持体を1Mの水酸化ナトリウム水溶液により40℃で3時間処理することでゾルゲル法プロセスの準備がされ、水およびアセトンで洗浄された後、乾燥される。
【００７１】
シリカ粒子およびモノリス
一実施形態において、モノリス型シリカチップは例えばテトラメトキシシラン(TMOS、40〜70ml)をポリ(エチレングリコール)(PEG、8〜13g)および尿素(9.0g)の0.01M酢酸溶液(100ml)に添加して、約4℃から約40℃で、約30分間撹拌することで形成される。代替の実施形態において、モノリス型シリカチップは例えばPEG(0.9〜1.1g)、TMOS+MTMS(テトラメトキシシラン+メチルトリメトキシシラン)(体積比で1:1のものを9ml)および尿素2.0gを0.01M酢酸(20ml)に添加して、約4℃から約40℃で、約30分間撹拌することで形成される。溶液はその後チップ内に詰められて25℃で一晩(ゲル)反応される。モノリス型シリカチップはその後120℃で3時間乾燥され、水およびメタノールで洗浄される。乾燥後、シリカチップは10℃/minの速度で加熱することでガラス化され、350℃で12時間維持される。本発明において用いられるゾルゲルシリカ粒子はTMOS前駆体にシリカ粒子を添加する追加の段階を有する以外、モノリス型シリカチップと同様に調製され得る。好ましくはシリカ粒子の直径は約5から約35μm、または好ましくは約15μmである。
【００７２】
バイオポリマー合成用基材の表面積
一実施形態において、基材の表面積は、約10m2/gから約200m2/g、または20m2/gから約180m2/g、または30m2/gから約160m2/g、または30m2/gから約140m2/g、または40m2/gから約120m2/g、または50m2/gから約110m2/g、または60m2/gから約100m2/gである。
【００７３】
バイオポリマーの生産
本発明の器具に用いられる多孔質基材の高表面積は、少なくとも約1アトモル、または少なくとも約1ピコモル、または少なくとも約5ピコモル、または少なくとも約10ピコモル、または少なくとも約20ピコモル、または少なくとも約50ピコモル、または少なくとも約100ピコモル、または少なくとも約500ピコモル、または少なくとも約1ナノモル、または少なくとも約5ナノモルのバイオポリマーを各マイクロウェルまたはマイクロチャネル内で生産するのに十分なものであってもよい。
【００７４】
バイオポリマー合成
本発明の基材はDNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、多糖、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリフェノール、ポリサルフェートを含む群から選択されるバイオポリマーの合成に用いられ得る。
【００７５】
オリゴヌクレオチド合成
本発明の一実施形態において、合成されるバイオポリマーは核酸、特にDNAおよび/またはRNAのオリゴヌクレオチドである。
【００７６】
オリゴヌクレオチドはホスホロアミダイト合成を用いて典型的に合成される。ホスホロアミダイト合成化学は4つのステージ、すなわち脱トリチル化、カップリング、キャッピングおよび酸化からなる。DNAやRNAは、周知の商業的に利用可能な「ホスホロアミダイト方法論」として知られる化学的手法により典型的に化学合成され得る。核酸合成に重要なのは、離れたヌクレオチドの5'-OH基と3'-P基の間に特異的で連続的なリン酸結合を形成することである。5'-OH基と3'-P基はオリゴヌクレオチド合成において適切に反応するように修飾される必要がある。典型的には5'-OH基は別の部分と早期に結合することを防ぐために(典型的にはジメトキシトリチル(「DMT」)基により)修飾される。したがって核酸合成における第一段階は、供給される別のヌクレオチドの3'-Pと結合できるようにヌクレオチドを脱トリチル化することで、これにより2つのヌクレオチドは正しく組み合わされる。脱トリチル化は通常、約2〜5%のトリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いて約20秒間から約90秒間行われる。
【００７７】
オリゴヌクレオチド合成の第二段階は、あるヌクレオチドと別のヌクレオチドとのカップリングである。典型的にカップリング反応において、活性化された中間体はホスホロアミダイトヌクレオチドモノマーとテトラゾールとを反応に同時に添加することにより作られる。テトラゾールはホスホロアミダイトの窒素をプロトン化し、これにより求核攻撃に対して感受性にさせ、ホスホロアミダイトモノマーの3'-Pと脱トリチル化ヌクレオチドの5'-OHの間に亜リン酸トリエステル結合を形成させることができる。伸長されたホスホロアミダイトヌクレオチドの5'-OHはDMT基によりブロックされる。カップリング反応は典型的には約10秒間から約90秒間にわたって行われる。
【００７８】
オリゴヌクレオチド合成の次の段階は、追加塩基がなかったオリゴヌクレオチドを終了させるための未反応5'-OH基のキャッピングである。キャッピングは典型的に無水酢酸および1-メチルイミダゾールを用いるアセチル化により、約5秒間から約90秒間にわたって行われる。前段階において伸長されたホスホロアミダイトヌクレオチドは未だDMT基により保護されているため影響されない。キャッピングは混入する(すなわち間違って形成される)オリゴヌクレオチドの長さを最小化し、これにより所望のオリゴヌクレオチドの識別と精製を促進する。
【００７９】
オリゴヌクレオチド合成の最終段階は5'-OH基と3'-P基の間の不安定な亜リン酸トリエステル結合をより安定なリン酸トリエステル結合へと酸化することである。典型的にこれはヨウ素と水をテトラハイドロフラン中で用いることで達成され、ここでヨウ素は酸化剤として用いられ、水は酸素供与体として用いられる。
【００８０】
これら4つの段階を繰り返すことで規定の配列を持つオリゴヌクレオチドを正確に作り出すことができる。
【００８１】
合成中、ヌクレオチドは「一時的に」保護される必要がある、すなわちヌクレオチド上の反応部位がオリゴヌクレオチド合成が終了するまで不適切に反応することを阻止する必要がある。保護基はまたオリゴヌクレオチドの生物学的活性が影響されないように除去可能である必要がある。塩基を保護することにより合成中に環外のアミノ基が5'-OH基への結合で競合するのを防ぐ。オリゴヌクレオチド合成のためのホスホロアミダイト方法論とともに用いられる最も汎用されている保護基はベンゾイルおよびイソブチリルである。
【００８２】
オリゴヌクレオチド合成が完了したら、これら保護基はアンモニア化合物により除去され得る(オリゴヌクレオチドは脱保護される)。典型的にこれは、オリゴヌクレオチドを25%〜35%の水酸化アンモニウム溶液または体積比で1:1の30%水酸化アンモニウム/40%メチルアミンの混合物などのアンモニア化合物とともに約3時間から約24時間にわたって、約50℃から約80℃の温度でインキュベートすることを伴う。典型的な脱保護化プロトコールは、オリゴヌクレオチドを30%の水酸化アンモニウム溶液中、55℃で16時間インキュベートすることを伴う。他の実施形態において、脱保護はオリゴヌクレオチドを1:1(体積比)のエチレンジアミン/エタノール溶液中で約6時間インキュベートすることで行われ得る。
【００８３】
選択的溶出
本発明の器具の多孔質基材上で合成されたオリゴヌクレオチドは、基材とオリゴヌクレオチドの間に切断可能なリンカーを組み込むことにより、基材から選択的に溶出され得る。切断可能なリンカーは化学的または酵素的な切断に感受性であってもよい。好ましい実施形態において、切断可能なリンカーは水酸化アンモニウムによる切断に感受性であることができ、例えば[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト(Chemical Phosphorylation Reagent II、Glen Research)である。
【００８４】
基材から選択的に溶出するオリゴヌクレオチドを合成するため、典型的には多孔質ガラス基材は官能基修飾される。官能基修飾剤はN-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)であってよく、これはエタノール中の2%の濃度で室温で4時間用いられ得る。本発明において用いられる他の官能基修飾剤としては、ビス(ヒドロキシエチル)アミノ-プロピルトリエトキシシランやヒドロキシブチルアミドプロピルトリエトキシシランが挙げられる。官能基修飾剤の組合せもまた考えられる。官能基修飾剤により処理した後、基材は余剰な官能基修飾剤を除去するため、典型的には95%エタノールで約10分間洗浄される。この洗浄段階に続いて、官能基修飾された基材は真空乾燥器内で硬化される。これは例えば約105℃から約150℃で、約4時間から約24時間である。
【００８５】
官能基修飾された基材はその後スペーサーで処理される。スペーサーは9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト(Spacer Phosphoramidite 9、Glen Research)、18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト、3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト、12-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ドデシル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。
【００８６】
[3-(4,4'-ジメトキシトリチロキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト(Chemical Phosphorylation Reagent II、Glen Research)などの切断可能なリンカーがその後製造業者のプロトコールに従って添加されてオリゴヌクレオチド合成用基材が調製される。切断可能なリンカーは[3-(4,4-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシメチルアミド]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト(例えばSolid CRP II、Glen Research)またはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。
【００８７】
オリゴヌクレオチド合成に続いて、オリゴヌクレオチドは基材の少なくとも一部に水酸化アンモニウム溶液を働かせることにより、水酸化アンモニウムを用いた基材からの選択的切断がなされ、5分間インキュベートされ得る。その後、切断されたオリゴヌクレオチドは30%水酸化アンモニウムで洗い流されて回収される。切断され洗い流された後、オリゴヌクレオチドはさらに水酸化アンモニウム中で脱保護され得る。これは例えば30%水酸化アンモニウム中で16時間、55℃である。他の実施形態において、脱保護はオリゴヌクレオチドを1:1(体積比)のエチレンジアミン/エタノール溶液中で約6時間インキュベートすることにより行われ得る。
【００８８】
本発明はここで以下の特定の実施例の参照によりさらに綿密に記載されるものであるが、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００８９】
(実施例)
(実施例1)
シリコンウェハにおけるマイクロウェルおよび/またはマイクロチャネルの調製
シリコンウェハ(500μm厚、10cm径)が支持体として用いられた。12μm厚のAZ4620フォトレジスト(Clariant Corp.)がウェハ上に回転塗布された。ウェハは熱板上、110℃でベークされた。所望のパターンがその後マスクアライナー(EVG620)を用いてウェハ上で露光され、現像されて120℃で5分間ポストベークされた。Alcatel AMS 100SE装置が高異方性DRIEプロセスにおいて用いられた。このAMS 100SEシステムはSF6およびO2によるエッチングサイクルを使用し、その後C4F8を用いる不動態化サイクルに切り替える。SF6、O2およびC4F8の流量はそれぞれ130sccm/s、13sccm/sおよび100sccm/sに維持され、エッチングおよび不動態化の時間はそれそれ8秒間および5秒間であり、RFプラズマのコイル電力は800Wであった。
【００９０】
(実施例2)
モノリス型ゾルゲルシリカチップの調製
モノリス型ゾルゲルシリカチップは次のように調製される。マイクロセルおよび/またはマイクロチャネルを含有するように予めエッチングされたチップは1Mの水酸化ナトリウム水溶液により40℃で3時間処理され、水およびアセトンで洗浄された後、乾燥された。テトラメトキシシラン(TMOS、40ml)がポリ(エチレングリコール)(PEG、12.4g)および尿素(9.0g)の0.01M酢酸溶液(100ml)に添加され、4℃で30分間撹拌された。溶液はチップ内に詰められて25℃で一晩反応された。その後、モノリス型シリカチップは120℃で3時間処理され、水およびメタノールで洗浄された。乾燥後、シリカチップは10℃/minの速度で加熱され、350℃で12時間維持された。
【００９１】
ゾルゲルシリカ粒子はTMOS前駆体に直径15μmのシリカ粒子を添加する以外、上と同じ方法でチップ内に形成される。
【００９２】
(実施例3)
微細加工されたシリコンマイクロウェル
図1Aに図示された第一の設計は、微細加工されたシリコンマイクロウェルと、次いで物理的に捕捉された多孔質ガラスビーズ(Universal Support II、Glen Research)を使用する。多孔質ガラスビーズの直径は125μmから175μmの範囲であった。逆ボトル形状のマイクロウェルは100μmのボトルネック幅を有するように設計され、これは多孔質ガラスビーズを効率的に捕捉するようにビーズのサイズより小さいものであった。ウェルのピッチを200μmと400μmの間に調整することで、マイクロウェルの密度は2500スポット/cm2と625スポット/cm2の間に制御可能であった。
【００９３】
第二および第三の設計(図1Bおよび1C)は、それぞれゾルゲル法によるシリカ粒子とモノリス型のゾルゲル法によるシリカで満たされたシリコンウェルを持つ。ゾルゲル前駆体はマイクロウェル内に充填され、シリカゲルを形成するよう硬化された。マイクロウェル密度は微細加工プロセスにより限定された。幅30μm、ピッチ60μmのマイクロウェルは、反応性イオンエッチングを用いて350μm厚のシリコン基材上に2.7×104スポット/cm2のマイクロウェル密度を与えるように作製され得た。3つの異なるマイクロウェル設計は、加工された多孔質カラムをオリゴヌクレオチド合成の間マイクロウェル内に効果的に固定するように採用されたもので、それによって流体の圧力が多孔質カラムに加えられた。幅<100μmのマイクロウェルのため、垂直側壁設計が採用された(図2A)。幅広いウェルのため、カラムふるい(図2B)または逆ボトル形状(図2C)の設計が使用されたが、これはたとえ側壁から剥離されたとしても多孔質カラムを引っ張った。
【００９４】
第四の設計は、シリコンマイクロウェルに換えてマイクロチャネルプレートを用いる。市販のマイクロチャネルプレートは様々なチャネル径およびピッチ寸法を有するシリカ製のものであった。それはシリコンマイクロウェルよりはるかに高いアレイ密度を提供することができる。本実験で採用されたマイクロチャネルプレートはチャネル直径5μm、ピッチ6μmであり、これは2.7×106スポット/cm2のアレイ密度に対応する。表面積はモノリス型のゾルゲル法によるシリカをマイクロチャネルに詰めることでさらに増加した(図1D)。別のアプローチは、マイクロチャネルをシリコン上にマクロ多孔質シリコンエッチング法を用いて作製した後、モノリス型のゾルゲル法によるシリカをマイクロチャネルに詰めることである(図1E)。本法によりマイクロチャネルプレートと同程度のアレイ密度を提供することができた。
【００９５】
(実施例4)
フロースルー型多孔質基材
図3は加工されたフロースルー型多孔質基材を示す。マイクロウェルを含有するシリコンチップは深堀り反応性イオンエッチング(DRIE)を用いて500μm厚のシリコン基材上に作製された(図3A)。多孔質ガラスビーズ(Universal Support II、Glen Research)が詰められたチップは図3Bに示されるが、これは幅250μm、ピッチ400μmの正方形ウェルで、625スポット/cm2のアレイ密度をもたらす。普遍的なリンカーを有する多孔質ガラスビーズはオリゴヌクレオチド合成用の標準的な基材であった。それらは不規則な形状を持ち、ウェルの表面積を変化させた。表面積の均一性は、ゾルゲル法によるシリカ粒子(15μm径、Chemikalie Pte Ltd、Singapore)(図3Cおよび3D)またはテトラエトキシシラン(TEOS)もしくはテトラメトキシシラン(TMOS)ゾルゲル前駆体を用いたモノリス型のゾルゲル法によるシリカ(図3E)をウェルに詰めることにより劇的に改善された。表面積、骨格サイズおよび孔サイズはゾルゲル前駆体および処理条件を調整することで制御され得た。
【００９６】
図3Fはチャネル径5μm、ピッチ6μmの300μm厚マイクロチャネルプレート(GCA 25/6/5/0/03、Photonis, Inc.)である。チャネルはモノリス型ゾルゲルTMOSによるシリカ(図3G)で満たされた。高密度に詰められたマイクロチャネルは、シリコンマイクロウェルチップよりさらに高いアレイ密度をもたらした。またオリゴヌクレオチド合成用のモノマーの分注がさらに容易になったが、それはナノリットルディスペンサーが各々の多孔質構造内に4つのホスホロアミダイトモノマーを分注するために用いられたことによる。ナノリットルディスペンサーからの液滴の直径(50〜100μm)はおおよそマイクロウェルの寸法であった。それ故、各マイクロウェルへの正確な試薬供給を達成するため、ディスペンサーをマイクロウェルと合わせる必要がある。対照的に、100μm径の液滴は200個より多くのピッチ6μmのマイクロチャネルを覆うであろうから、基材の位置合わせの必要性やマイクロチャネルにおける不均一性によるあらゆる影響を排除する。また高価な市販のマイクロチャネルプレートの代わりに、マクロ多孔質シリコンチャネル(図3H)をマクロ多孔質シリコンエッチング法で加工することができ、マイクロチャネルプレートと同様のチャネル寸法を提供することが可能であった。
【００９７】
(実施例4)
多孔質チップの官能基修飾
フロースルー型多孔質チップをオリゴヌクレオチド、ペプチドおよび低分子の合成のための支持基材として用いることができた。我々はこれら多孔質基材上でのオリゴヌクレオチド合成を成功裏に実証した。オリゴヌクレオチド合成用多孔質基材の上に官能基を付与するため(図4)、加工された基材は2%のN-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)(Gelest)のエタノール溶液中、室温で4時間穏やかに振盪され、95%エタノール中で10分間すすがれ、真空乾燥器において120℃で12時間硬化された。チップはその後、製造業者のプロトコールに従って、9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト(Spacer Phosphoramidite 9、Glen Research)および3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]-プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト(Chemical Phosphorylation Reagent、Glen Research)で処理された。Chemical Phosphorylation Reagentは合成されたオリゴヌクレオチドの選択的切断に使用された。官能基修飾され、活性化された多孔質基材はその後、大規模並列オリゴヌクレオチド合成機(図5に模式図を示す)内に充填された。
【００９８】
(実施例5)
多孔質ガラス基材の官能基修飾
多孔質ガラス基材は2%のN-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)のエタノール溶液とともに4時間室温でインキュベートされることにより官能基修飾され、95%エタノール中で10分間すすがれ、そして真空乾燥器内で120℃で12時間硬化された。シリル化基材は製造業者のプロトコールに従って9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト(Spacer Phosphoramidite 9、Glen Research)などのスペーサー化学物質で、次いで[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト(CRP II、Glen Research)などの切断可能なリンカーで処理され、オリゴヌクレオチド合成用基材が調製された。
【００９９】
(実施例6)
オリゴヌクレオチドの選択的溶出
オリゴヌクレオチドは当該技術分野で公知のホスホロアミダイト合成を用いて合成された。脱トリチル化は、3%のトリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液75μlをチップ全体に広がるように注入して行われた。脱トリチル化反応は50秒間実施された。カップリングのため、チップ全体が最初に50μlのテトラゾールで洗い流された後、各ウェルにホスホロアミダイト一滴が分注された。反応は試薬排液前に45秒間進められた。キャッピング試薬(45μl)がその後チップ全体に広がるように注入され、10秒間そのまま置かれて排液された。その後50μlの酸化試薬がチップに供給され、25秒間そのまま置かれて排液された。60μlのアセトニトリルでの洗浄段階が各プロセスステージ間に加えられた。プロセスは所望のオリゴヌクレオチド長のために繰り返された。
【０１００】
オリゴヌクレオチドは大規模並列オリゴヌクレオチド合成機(図5)を用いて合成された後、任意選択で、多孔質基材から水酸化アンモニウムを用いて選択的に切断された。数滴の水酸化アンモニウムが多孔質ウェル内にナノリットルディスペンサー(大規模並列オリゴヌクレオチド合成機の一部)を用いて選択的に分注され、5分間インキュベートされた。その後、切断されたオリゴヌクレオチドは50μlの30%水酸化アンモニウムで洗い流されて回収プレートに移され、さらに55℃で16時間脱保護された。
【０１０１】
(実施例7)
マイクロアレイ分析
オリゴヌクレオチド合成は多孔質チップを有する大規模並列オリゴヌクレオチド合成機上で成功裏に実証された。図6はゾルゲル法によるシリカ粒子が詰められたマイクロウェルを有するチップを用いたDNAマイクロアレイ合成を示す。チップ全体が20塩基長のATCGATCGATCGATCGATCGにより合成された(図6A)。その後、保護基が1:1(体積比)のエチレンジアミン/エタノール溶液中で6時間かけて除去された。得られたチップはその後、Cy3蛍光タグにより末端標識された20塩基長の相補オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされた。加工されたチップは100nMの3'-Cy3標識された相補オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションバッファー(50mM MES(2-[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸)、0.5M NaCl、10mM EDTA、0.005%(v/v)Tween-20)溶液と40℃で4時間ハイブリダイズされた後、6×SSPEバッファー(0.9M塩化ナトリウム、60mMリン酸水素ナトリウム、6mM EDTA、pH7.4)で十分に洗浄された。ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーでの洗浄の後、ハイブリダイゼーションの蛍光イメージが蛍光撮像装置(Typhoon 9400、GE Healthcare)により測定された。DNAハイブリダイゼーションの蛍光イメージ(図6B)は多孔質チップでの標的オリゴヌクレオチド合成が成功したことを示す。
【符号の説明】
【０１０２】
50  バイオポリマー合成用器具
100  多孔質基材
102  マイクロウェル
104  マイクロチャネル
110  支持体
160  ふるい部材
170  逆ボトル形状
【図１（Ａ）】
2012507513.tif 000003
【図１（Ｂ）】
2012507513.tif 000004
【図１（Ｃ）】
2012507513.tif 000005
【図１（Ｄ）】
2012507513.tif 000006
【図１（Ｅ）】
2012507513.tif 000007
【図２（Ａ）】
2012507513.tif 000008
【図２（Ｂ）】
2012507513.tif 000009
【図２（Ｃ）】
2012507513.tif 000010
【図３（Ａ）】
2012507513.tif 000011
【図３（Ｂ）】
2012507513.tif 000012
【図３（Ｃ）】
2012507513.tif 000013
【図３（Ｄ）】
2012507513.tif 000014
【図３（Ｅ）】
2012507513.tif 000015
【図３（Ｆ）】
2012507513.tif 000016
【図３（Ｇ）】
2012507513.tif 000017
【図３（Ｈ）】
2012507513.tif 000018
【図４】
2012507513.tif 000019
【図５】
2012507513.tif 000020
【図６（Ａ）】
2012507513.tif 000021
【図６（Ｂ）】
2012507513.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月18日(2010.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1cm2あたり少なくとも約500個のマイクロウェルを有する少なくとも1つのフロースルー型支持体を含むバイオポリマー合成用器具であって、前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための約10m2/gより大きい表面積を提供する、マイクロウェル内に形成された多孔質基材を含む、バイオポリマー合成用器具。
【請求項２】
1cm2あたり少なくとも約500個のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体を含むバイオポリマー合成用器具であって、前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための約10m2/gより大きい表面積を提供する、マイクロウェル内に形成された多孔質基材を含有し、さらに前記マイクロウェルが、前記多孔質基材を保持するためのふるい部材を包含する、バイオポリマー合成用器具。
【請求項３】
1cm2あたり少なくとも約500個のマイクロウェルを有する少なくとも1つのフロースルー型支持体を含むバイオポリマー合成用器具であって、前記マイクロウェルが、バイオポリマー合成のための約10m2/gより大きい表面積を提供するマイクロウェル内に形成された多孔質基材を含有し、さらに前記マイクロウェルが、前記多孔質基材を保持するように適合された少なくとも1つの部位を包含する、バイオポリマー合成用器具。
【請求項４】
前記支持体がガラスまたはシリコンのチップである、請求項1から3のいずれか一項に記載の器具。
【請求項５】
前記支持体がマイクロウェルプレートである、請求項1から3のいずれか一項に記載の器具。
【請求項６】
前記バイオポリマーが、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、多糖、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリフェノール、ポリサルフェートまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の器具。
【請求項７】
前記バイオポリマーがオリゴヌクレオチドである、請求項6に記載の器具。
【請求項８】
前記多孔質基材が、多孔質ガラスビーズ、シリカ粒子、モノリス型シリカまたはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の器具。
【請求項９】
前記モノリス型シリカまたはシリカ粒子がゾルゲル法によるものである、請求項8に記載の器具。
【請求項１０】
前記多孔質基材が、N-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)、ビス(ヒドロキシエチル)アミノ-プロピルトリエトキシシラン、ヒドロキシブチルアミドプロピルトリエトキシシランまたはそれらの組合せのうちの少なくとも1つにより官能基修飾される、請求項1から9のいずれか一項に記載の器具。
【請求項１１】
前記多孔質基材が、9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトにより処理される、請求項10に記載の器具。
【請求項１２】
前記多孔質基材が、切断可能なリンカーにより官能基修飾されて、合成されたバイオポリマーを選択的に溶出させることができる、請求項11に記載の器具。
【請求項１３】
前記切断可能なリンカーが、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシメチルアミド]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイトまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項12に記載の器具。
【請求項１４】
複数のマイクロチャネル1cm2あたり少なくとも約500個のマイクロウェルを有する少なくとも1つの支持体を含むバイオポリマー合成用器具であって、前記マイクロチャネルが、バイオポリマー合成のための約10m2/gより大きい表面積を提供するマイクロウェル内に形成された多孔質基材を含む、バイオポリマー合成用器具。
【請求項１５】
前記支持体がガラスまたはシリコンのチップである、請求項14に記載の器具。
【請求項１６】
前記支持体がマイクロチャネルプレートである、請求項14または請求項15に記載の器具。
【請求項１７】
前記多孔質基材が、多孔質ガラスビーズ、シリカ粒子、モノリス型シリカまたはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項14から16のいずれか一項に記載の器具。
【請求項１８】
前記モノリス型シリカまたはシリカ粒子が前記マイクロチャネル内に形成される、請求項17に記載の器具。
【請求項１９】
前記モノリス型シリカまたはシリカ粒子がゾルゲル法によるものである、請求項17または請求項18に記載の器具。
【請求項２０】
前記多孔質基材が、N-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-(ヒドロキシブチルアミド)、ビス(ヒドロキシエチル)アミノ-プロピルトリエトキシシラン、ヒドロキシブチルアミドプロピルトリエトキシシランまたはそれらの任意の組合せにより官能基修飾される、請求項14から19のいずれか一項に記載の器具。
【請求項２１】
前記多孔質基材が、9-o-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイトにより処理される、請求項20に記載の器具。
【請求項２２】
前記多孔質基材が、切断可能なリンカーにより官能基修飾されて、合成されたバイオポリマーを選択的に溶出させることができる、請求項20に記載の器具。
【請求項２３】
前記切断可能なリンカーが、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト、[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシメチルアミド]プロピル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイトまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項22に記載の器具。
【請求項２４】
バイオポリマーを合成するための、請求項1から23のいずれか一項に記載の器具の使用。
【請求項２５】
前記バイオポリマーが、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、多糖、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリフェノール、ポリサルフェートまたはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項24に記載の使用。
【国際調査報告】
2012507513.tif 000023
2012507513.tif 000024
2012507513.tif 000025