(57)【要約】本発明は、感染細胞において、呼吸器系ウイルスを検出するために、迅速かつ精度が高い液体直接蛍光抗体試験に関する。アッセイは、標本を遠心分離し、液体中でサンプルと試薬をインキュベートし、呼吸器系ウイルス存在又は非存在の検出を含む。モノクローナル抗体を入れるために、細胞の透過性を上げる界面活性剤としてサポゲニンを用い、細胞内抗原と反応させる。細胞をバックグラウンド染色及び蛍光核染色と伴ってウイルス抗原に対する蛍光標識モノクローナル抗体で染色する。この反対の染色は、バックグラウンドを減少し、検出を増強するための抗原及び核構造の共局在を与える。【選択図】図１
2012529009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）少なくとも一つのウイルス抗原を含む生体サンプル、及び
ｉｉ）第一抗体が第一ウイルス抗原と反応し、第二ウイルス抗原と反応せず、第一蛍光標識で標識化され、第二抗体が前記第二ウイルス抗原と反応し、前記第一ウイルス抗原と反応せず、第二蛍光標識で標識化される第一及び第二抗体
を提供する工程、
ｂ）抗体が抗原と結合するような条件下にて、懸濁液中で前記サンプルの少なくとも一部を前記第一及び第二抗体とインキュベートする工程、
ｃ）前記第一蛍光標識を検出することに基づいて第一ウイルスを同定する工程、及び
ｄ）前記第二蛍光標識を検出することに基づいて第二ウイルスを同定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記第一標識が、Ｒ‐フィコエリトリンを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二標識が、フルオレセインイソチオシアネートを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一及び第二抗体がモノクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一及び第二抗体を前記懸濁液と前記インキュベートする工程が同時であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第一及び第二抗体を前記懸濁液と前記インキュベートする工程が連続であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ）ｉ）少なくとも一つのウイルス抗原を含む疑いのある生体サンプルを含む懸濁液と、
ｉｉ）前記少なくとも一つのウイルス抗原が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に結合することができ、抗体が異なって標識化されることを特徴とする少なくとも二つの蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｂ）少なくとも一つの前記蛍光標識された抗体が前記ウイルス抗原に結合するような条件下にて、前記蛍光標識された抗体と前記懸濁液をインキュベートし、それにより標識化抗原‐抗体複合体を形成する工程、
ｃ）一つの蛍光標識された抗体を同定することにより前記懸濁液内で前記標識化抗原‐抗体複合体を検出し、それにより前記ウイルス抗原を同定する工程
を含む方法。
【請求項８】
前記蛍光標識された抗体がモノクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス抗原が、呼吸器合胞体ウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つの前記蛍光標識されたモノクローナル抗体が呼吸器合胞体ウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光標識されたモノクローナル呼吸器合胞体ウイルス抗体がＲ‐フィコエリトリン蛍光標識を有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルス抗原がインフルエンザウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記インフルエンザウイルス抗原がインフルエンザＡウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インフルエンザウイルス抗原がインフルエンザＢウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一つの前記蛍光標識されたモノクローナル抗体がインフルエンザＡウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光標識されたインフルエンザＡモノクローナル抗体がＲ‐フィコエリトリン蛍光標識を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも一つの前記蛍光標識されたモノクローナル抗体がインフルエンザＢウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光標識されたインフルエンザＢモノクローナル抗体がフルオレセインイソチオシアネート蛍光標識を有することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルス抗原がアデノウイルスのウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも一つの前記蛍光標識されたモノクローナル抗体がアデノウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光標識されたアデノウイルスモノクローナル抗体がフルオレセインイソチオシアネート蛍光標識を有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルス抗原がパラインフルエンザウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項２３】
前記パラインフルエンザウイルス抗原がパラインフルエンザ１ウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記パラインフルエンザウイルス抗原がパラインフルエンザ２ウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記パラインフルエンザウイルス抗原がパラインフルエンザ３ウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一つの前記蛍光標識されたモノクローナル抗体がパラインフルエンザウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項２７】
前記蛍光標識されたパラインフルエンザモノクローナル抗体がＲ‐フィコエリトリン蛍光標識を有することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記蛍光標識されたパラインフルエンザモノクローナル抗体がパラインフルエンザ１ウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記蛍光標識されたパラインフルエンザモノクローナル抗体がパラインフルエンザ２ウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記蛍光標識されたパラインフルエンザモノクローナル抗体がパラインフルエンザ３ウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルス抗原がメタニューモウイルスのウイルス抗原を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項３２】
前記蛍光標識されたモノクローナル抗体がメタニューモウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項３３】
前記蛍光標識されたメタニューモウイルスモノクローナル抗体がフルオレセインイソチオシアネート蛍光標識を有することを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、前記懸濁液がエバンスブルー、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される染色試薬を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項３５】
さらに、前記懸濁液が界面活性剤を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項３６】
前記界面活性剤がサポゲニンであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、液体形式で直接的にウイルスを検出するための生体サンプルを処理すること関する。例えば、サンプルは呼吸器系に由来してもよい。検出方法は、ウイルス抗原に直接に結合する抗体を使用してよく、それにより検出も同定もできてよい。いくつかの態様では、抗体は標識モノクローナル抗体である。方法は、複数の蛍光信号を区別することができるアルゴリズムを含む装置に統合されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
背景
ウイルス感染(言い換えると、例えば、インフルエンザＡ及びＢウイルス)は、子どもと成人の両者において毎年の流行病の原因である。インフルエンザＡ及びＢウイルスによって引き起こされた疾病は臨床的に判別不能で、共に循環しうる。Ｖａｎ  Ｖｏｒｉｓら、“Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ”  ｐ．  ２６７−２９７．  Ｉｎ：  Ｒ．  Ｂ．  Ｂｅｌｓｈｅ  （ｅｄ．），  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ＰＳＧ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，  Ｍａｓｓ．  （１９８４）。抗ウイルス化学予防及び治療は現在非常に限られている（つまり、例えば、インフルエンザＡウイルス特異的な薬剤アマンタジン及びリマンタジン等に限られる）。したがって、インフルエンザウイルスの迅速な検出は、患者治療を促進し、かつ効果的な抑制対策を始めるのに不可欠である。
【０００３】
直接的蛍光抗体（ＤＦＡ）染色のために標本を調製するための現在知られている方法は、高価で、多くの時間と労力を有する。通常、標本からの細胞懸濁液の１滴をスライドガラス上で乾かし、アセトン、メタノール及びエタノール等、沈殿する又は変性する固定液で固定する。これらの化合物は、タンパク質の第三の疎水的相互作用を崩壊させ、タンパク質分子の可溶性を低減するために働く。固定後、サンプルを
ｉ）標識をつける工程、
ｉｉ）洗浄する工程、及び
ｉｉｉ）カバーガラスに付着させる工程、
などいくつかの工程を含む蛍光抗体で染色する。最後に、サンプルを蛍光顕微鏡の下で検査する。
【０００４】
抗体調製物が、細胞を同定する際に手助けするエバンスブルーのような一般的なタンパク質対比染色を通常含んでいるので、顕微鏡検査中にＤＦＡ技術のさらなる問題に遭遇する。この対比染色は、さらに細胞を同定することを困難にさせ得る細胞構造がない物質を染色する。さらに、細胞が完全には乾燥していない場合、処理工程中に細胞は失われる場合があり、ウイルスの存在に関して判断を下すために細胞の不適当な数をもたらし得る。また、現在のＤＦＡ方法は、標本中非特異性の染色性粘液又は残屑が存在し得るので、結果を調製し、読み、かつ判断するために非常に熟練した専門家を必要とする。細胞をガラス上で乾燥する場合、細胞形態や染色パターンも損なわれる。
【０００５】
当分野に必要なものは、現在利用可能なものよりよい精度及びより速い処理時間を備えた改善されたＤＦＡアッセイである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、液体形式で直接的にウイルスを検出するための生体サンプルを処理することに関する。例えば、サンプルは、呼吸器系（例えば肺吸引物サンプル又は鼻咽頭の綿棒のサンプル）に由来してもよい。検出方法は、細胞上の、又は細胞中のウイルス抗原に直接に結合する抗体を使用してよく、それによって、検出も同定も可能となる。いくつかの実例では、抗体は、標識モノクローナル抗体である。方法は、複数の蛍光信号を区別することができるアルゴリズムを含む装置に統合されてよい。
【０００７】
ある実施態様においては、本発明は、少なくとも１つの蛍光標識を含む液体直接蛍光アッセイ（ＬＤＦＡ）を実施する方法を意図する。ある実施態様においては、蛍光標識はＲ‐フィコエリトリン（ＰＥ）を含む。ある実施態様においては、蛍光標識はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含む。ある実施態様においては、蛍光標識は抗体に付着される。
【０００８】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）少なくとも一つのウイルス抗原を含む生体サンプル、及び
ｉｉ）第一抗体が第一ウイルス抗原と反応し、第二ウイルス抗原と反応せず、第一蛍光標識で標識化され、第二抗体が前記第二ウイルス抗原と反応し、前記第一ウイルス抗原と反応せず、第二蛍光標識で標識化されることを特徴とする第一及び第二抗体を提供する工程、
ｂ）前記第一及び第二抗体の一つだけが抗原と結合するような条件下にて、懸濁液中で前記サンプルの少なくとも一部を前記第一及び第二抗体とインキュベートする工程、
ｃ）前記第一蛍光標識を検出することに基づいて第一ウイルスを同定する工程、
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、さらに方法は、ｄ）前記第二蛍光標識を検出することに基づいて第二ウイルスを同定する工程を含む。ある実施態様においては、さらに方法は、前記第一蛍光標識及び前記第二蛍光標識を検出することに基づいて前記第一ウイルス及び第二ウイルスを同定することを含む。ある実施態様においては、第一標識が、Ｒ‐フィコエリトリンを含む。ある実施態様においては、第二標識が、フルオレセインイソチオシアネートを含む。ある実施態様においては、抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、第一及び第二抗体を懸濁液とインキュベートすることが同時である。ある実施態様においては、第一及び第二抗体を懸濁液でインキュベートすることが連続である。ある実施態様においては、ウイルスは、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス（ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ）、コルチコ・ウイルス科（ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ‐ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（ｈｅｐａｄｎｖｉｒｉｄａｅ）、肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、イノウイルス科（ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、オルソミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）、パラミキソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポキシスウイルス科（ｐｏｘｙｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、セムリキ森林ウイルス（ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、テトラウイルス科（ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、ベルンウイルス（ｔｏｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、水痘帯状ヘルペスウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、牛痘ウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）及び水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）を含む群から選択されてよいが、これらに限定されない。
【０００９】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）少なくとも一つのウイルス抗原で感染した細胞を含む生体サンプル、及び
ｉｉ）第一抗体が呼吸器合胞体ウイルス抗原と反応し、メタニューモウイルス抗原と反応せず、第一蛍光標識で標識化され、第二抗体が前記メタニューモウイルス抗原と反応し、前記呼吸器合胞体ウイルス抗原と反応せず、第二蛍光標識で標識化されることを特徴とする第一及び第二抗体を提供する工程、
ｂ）前記第一及び第二抗体の一つだけが抗原と結合するような条件下にて、懸濁液中前記サンプルの少なくとも一部を前記第一及び第二抗体とインキュベートする工程、及び
ｃ）前記第一又は第二蛍光標識を検出することに基づいて前記ウイルス抗原を同定する工程、
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、方法は、第一蛍光標識を検出することに基づいて呼吸器合胞体ウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、方法は、第二蛍光標識を検出することに基づいてメタニューモウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、第一及び第二蛍光標識を検出することに基づいて呼吸器合胞体ウイルス抗原及びメタニューモウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、第一標識が、Ｒ‐フィコエリトリンを含む。ある実施態様においては、第二標識が、フルオレセインイソチオシアネートを含む。ある実施態様においては、抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、第一及び第二抗体を懸濁液とインキュベートすることが同時である。ある実施態様においては、第一及び第二抗体を懸濁液でインキュベートすることが連続である。
【００１０】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）少なくとも一つのウイルス抗原を含む生体サンプル、及び
ｉｉ）第一抗体がインフルエンザウイルスＡ抗原と反応し、インフルエンザＢウイルス抗原と反応せず、第一蛍光標識で標識化され、第二抗体が前記インフルエンザＢウイルス抗原と反応し、前記インフルエンザＡウイルス抗原と反応せず、第二蛍光標識で標識化されることを特徴とする第一及び第二抗体を提供する工程、
ｂ）前記第一及び第二抗体の一つだけがウイルスと結合するような条件下にて、懸濁液中で前記サンプルの少なくとも一部を前記第一及び第二抗体とインキュベートする工程、及び
ｃ）前記第一又は第二蛍光標識を検出することに基づいてウイルス抗原の少なくとも一つを同定する工程、
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、方法は、第一蛍光標識を検出することに基づいてインフルエンザＡウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、方法は、第二蛍光標識を検出することに基づいてインフルエンザＢウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、第一及び第二蛍光標識を検出することに基づいてインフルエンザＡウイルス抗原及びインフルエンザＢウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、第一標識が、Ｒ‐フィコエリトリンを含む。ある実施態様においては、第二標識が、フルオレセインイソチオシアネートを含む。ある実施態様においては、抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、第一及び第二抗体を懸濁液とインキュベートすることが同時である。ある実施態様においては、第一及び第二抗体を懸濁液でインキュベートすることが連続である。
【００１１】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）少なくとも一つのウイルス抗原を含む生体サンプル、及び
ｉｉ）第一抗体がパラインフルエンザウイルス抗原と反応し、アデノウイルスのウイルス抗原と反応せず、第一蛍光標識で標識化され、第二抗体が前記アデノウイルスのウイルス抗原と反応し、前記パラインフルエンザウイルス抗原と反応せず、第二蛍光標識で標識化されることを特徴とする第一及び第二抗体を提供する工程、
ｂ）前記第一及び第二抗体の一つだけがウイルスと結合するような条件下にて、懸濁液中で前記サンプルの少なくとも一部を前記第一及び第二抗体とインキュベートする工程、及び
ｃ）前記第一又は第二蛍光標識を検出することに基づいて少なくとも一つのウイルス抗原を同定する工程、
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、方法は、第一蛍光標識を検出することに基づいてパラインフルエンザウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、方法は、第二蛍光標識を検出することに基づいてアデノウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、第一及び第二蛍光標識を検出することに基づいてパラインフルウイルス抗原及びアデノウイルスのウイルス抗原を同定する。ある実施態様においては、第一標識が、Ｒ‐フィコエリトリンを含む。ある実施態様においては、第二標識が、フルオレセインイソチオシアネートを含む。ある実施態様においては、抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、第一及び第二抗体を懸濁液とインキュベートすることが同時である。ある実施態様においては、第一及び第二抗体を懸濁液でインキュベートすることが連続である。
【００１２】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）少なくとも一つのウイルス抗原を含む疑いのある生体サンプルを含む懸濁液と、
ｉｉ）前記少なくとも一つの抗原が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に相互作用することができ、前記抗体が異なって標識化されることを特徴とする少なくとも二つの蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｂ）少なくとも一つの前記蛍光標識された抗体が前記少なくとも一つのウイルス抗原に結合するような条件下にて、前記蛍光標識された抗体と前記懸濁液をインキュベートし、それにより標識化抗原‐抗体複合体を形成する工程、及び
ｃ）一つの蛍光標識された抗体を同定することにより前記標識化抗原‐抗体複合体を前記懸濁液内で検出し、それにより少なくとも一つのウイルス抗原を同定する工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、生体サンプルは、患者由来であり、それによりウイルス感染を診断する。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、ウイルス抗原が、呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体が呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル呼吸器合胞体ウイルス抗体がＰＥ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、ウイルス抗原がインフルエンザウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、インフルエンザウイルスのウイルス抗原がインフルエンザＡウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、インフルエンザウイルスのウイルス抗原がインフルエンザＢウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がインフルエンザＡウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたインフルエンザＡモノクローナル抗体がＰＥ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がインフルエンザＢウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたインフルエンザＢモノクローナル抗体がＦＩＴＣ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、ウイルス抗原がアデノウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がアデノウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたアデノウイルスモノクローナル抗体がＦＩＴＣ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、ウイルス抗原がパラインフルエンザウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、パラインフルエンザウイルスのウイルス抗原がパラインフルエンザ１ウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、パラインフルエンザウイルスのウイルス抗原がパラインフルエンザ２ウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、パラインフルエンザウイルスのウイルス抗原がパラインフルエンザ３ウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がパラインフルエンザウイルスに特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたパラインフルエンザモノクローナル抗体がＰＥ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたパラインフルエンザモノクローナル抗体がパラインフルエンザ１ウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたパラインフルエンザモノクローナル抗体がパラインフルエンザ２ウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたパラインフルエンザモノクローナル抗体がパラインフルエンザ３ウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、ウイルス抗原がメタニューモウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がメタニューモウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたメタニューモウイルスモノクローナル抗体がＦＩＴＣ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、ウイルス抗原が水痘帯状ヘルペスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体が水痘帯状ヘルペスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識された水痘帯状ヘルペスモノクローナル抗体がＰＥ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、ウイルス抗原が単純ヘルペスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体が単純ヘルペス‐１のウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体が単純ヘルペス‐２のウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識された単純ヘルペスモノクローナル抗体がＦＩＴＣ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、懸濁液がエバンスブルー、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、及びこれらの組み合わせの群から選択される染色試薬を含む。ある実施態様においては、懸濁液が界面活性剤を含む。ある実施態様においては、界面活性剤がサポゲニンである。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが同時である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが連続である。
【００１３】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原を含む疑いのある生体サンプルを含む懸濁液と、
ｉｉ）前記ウイルス抗原が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に相互作用することができ、抗体が異なって標識化されることを特徴とする少なくとも二つの蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｂ）前記呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に結合するような条件下にて、前記蛍光標識された抗体と前記懸濁液をインキュベートし、それにより標識化抗原‐抗体複合体を形成する工程、及び
ｃ）一つの蛍光標識された抗体を同定することにより前記標識化抗原‐抗体複合体を懸濁液内で検出し、それにより前記呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原を同定する工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、生体サンプルは、患者由来であり、それにより呼吸器合胞体ウイルス感染を診断する。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体が呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル呼吸器合胞体ウイルス抗体がＰＥ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、懸濁液がエバンスブルー、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、及びこれらの組み合わせの群から選択される染色試薬を含む。ある実施態様においては、懸濁液が界面活性剤を含む。ある実施態様においては、界面活性剤がサポゲニンである。ある実施態様においては、モノクローナル呼吸器合胞体ウイルス抗体が３Ａ４Ｄ９クローン又は４Ｆ９Ｇ３クローンを含む群から選択されるクローン由来である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが同時である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが連続である。
【００１４】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）インフルエンザウイルスのウイルス抗原を含む疑いのある生体サンプルを含む懸濁液と、
ｉｉ）前記ウイルス抗原が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に相互作用することができ、抗体が異なって標識化されることを特徴とする少なくとも二つの蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｂ）少なくとも一つの前記蛍光標識された抗体が前記インフルエンザウイルスのウイルス抗原に結合するような条件下にて、前記蛍光標識された抗体と前記懸濁液をインキュベートし、それにより標識化抗原‐抗体複合体を形成する工程、及び
ｃ）一つの蛍光標識された抗体を同定することにより前記標識化抗原‐抗体複合体を前記懸濁液内で検出し、それにより前記インフルエンザウイルスのウイルス抗原を同定する工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、生体サンプルは、患者に由来するものであり、それによりインフルエンザウイルス感染を診断する。ある実施態様においては、インフルエンザウイルスのウイルス抗原は、インフルエンザウイルスＡのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、インフルエンザウイルスのウイルス抗原は、インフルエンザウイルスＢのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がインフルエンザウイルスＡのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたインフルエンザウイルスＡモノクローナル抗体がＰＥ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がインフルエンザウイルスＢのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、インフルエンザＢモノクローナル抗体は８Ｃ７Ｅ１１クローン又は９Ｂ４Ｄ９クローンを含む群から選択されるクローンに由来する。ある実施態様においては、蛍光標識されたインフルエンザウイルスＢモノクローナル抗体がＦＩＴＣ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、懸濁液がエバンスブルー、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、及びこれらの組み合わせの群から選択される染色試薬を含む。ある実施態様においては、懸濁液が界面活性剤を含む。ある実施態様においては、界面活性剤がサポゲニンである。ある実施態様においては、インフルエンザウイルスＡモノクローナル抗体が２Ｈ３Ｃ５クローン又はＡ（６）Ｂ１１クローンを含む群から選択されるクローン由来である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが同時である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが連続である。
【００１５】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）アデノウイルスのウイルス抗原を含む疑いのある生体サンプルを含む懸濁液と、
ｉｉ）前記ウイルス抗原が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に相互作用することができ、抗体が異なって標識化されることを特徴とする少なくとも二つの蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｂ）前記少なくとも一つの前記蛍光標識された抗体が前記アデノウイルスのウイルス抗原に結合するような条件下にて、前記蛍光標識された抗体と前記懸濁液をインキュベートし、それにより標識化抗原‐抗体複合体を形成する工程、及び
ｃ）一つの蛍光標識された抗体を同定することにより前記標識化抗原‐抗体複合体を前記懸濁液内で検出し、それによりアデノウイルスのウイルス抗原を同定する工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、生体サンプルは、患者由来であり、それによりアデノウイルス感染を診断する。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がアデノウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたアデノウイルスモノクローナル抗体がＦＩＴＣ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、懸濁液がエバンスブルー、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、及びこれらの組み合わせの群から選択される染色試薬を含む。ある実施態様においては、懸濁液が界面活性剤を含む。ある実施態様においては、界面活性剤がサポゲニンである。ある実施態様においては、アデノウイルスモノクローナル抗体が８Ｈ２Ｃ９クローン、２Ｈ１０Ｅ２クローン、又は４Ｈ６Ｃ９クローンを含む群から選択されるクローン由来である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが同時である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが連続である。
【００１６】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）パラインフルエンザのウイルス抗原を含む疑いのある生体サンプルを含む懸濁液と、
ｉｉ）前記ウイルス抗原が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に相互作用することができ、前記抗体が異なって標識化されることを特徴とする少なくとも二つの蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｂ）前記少なくとも一つの前記蛍光標識された抗体が前記パラインフルエンザのウイルス抗原に結合するような条件下にて、前記蛍光標識された抗体と前記懸濁液をインキュベートし、それにより標識化抗原‐抗体複合体を形成する工程、及び
ｃ）一つの蛍光標識された抗体を同定することにより前記標識化抗原‐抗体複合体を検出し、それにより前記パラインフルエンザのウイルス抗原を同定する工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、生体サンプルは、患者由来であり、それによりパラインフルエンザ感染を診断する。ある実施態様においては、インフルエンザウイルスのウイルス抗原はパラインフルエンザ１ウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、インフルエンザウイルスのウイルス抗原はパラインフルエンザ２ウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、インフルエンザウイルスのウイルス抗原はパラインフルエンザ３ウイルスのウイルス抗原を含む。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がＰＥ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体は、パラインフルエンザ１ウイルスのウイルス抗原の特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体は、パラインフルエンザ２ウイルスのウイルス抗原の特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体は、パラインフルエンザ３ウイルスのウイルス抗原の特異的親和性を含む。ある実施態様においては、懸濁液がエバンスブルー、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、及びこれらの組み合わせの群から選択される染色試薬を含む。ある実施態様においては、懸濁液が界面活性剤を含む。ある実施態様においては、界面活性剤がサポゲニンである。ある実施態様においては、パラインフルエンザウイルス１モノクローナル抗体が１Ｄ８Ｅ１０クローン又は９Ｆ６１Ｃ９クローンを含む群から選択されるクローン由来である。パラインフルエンザウイルス２モノクローナル抗体が２Ｅ４Ｄ７クローン又は５Ｅ４Ｅ１１クローンを含む群から選択されるクローン由来である。パラインフルエンザウイルス３モノクローナル抗体が４Ｇ５（１）Ｅ２Ｈ９クローン又は１Ｆ６Ｃ８クローンを含む群から選択されるクローン由来である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが同時である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが連続である。
【００１７】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）メタニューモウイルスのウイルス抗原を含む疑いのある生体サンプルを含む懸濁液と、
ｉｉ）前記ウイルス抗原が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に相互作用することができ、抗体が異なって標識化されることを特徴とする少なくとも二つの蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｂ）少なくとも一つの前記蛍光標識された抗体が前記メタニューモウイルスのウイルス抗原に結合するような条件下にて、請求項蛍光標識された抗体と前記懸濁液をインキュベートし、それにより標識化抗原‐抗体複合体を形成する工程、及び
ｃ）一つの蛍光標識された抗体を同定することにより前記標識化抗原‐抗体複合体を検出し、それにより前記メタニューモウイルスのウイルス抗原を同定する工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、生体サンプルは、患者由来であり、それによりメタニューモウイルス感染を診断する。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体がメタニューモウイルスのウイルス抗原に特異的親和性を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたメタニューモウイルスモノクローナル抗体がＦＩＴＣ蛍光標識を含む。ある実施態様においては、懸濁液がエバンスブルー、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、及びこれらの組み合わせの群から選択される染色試薬を含む。ある実施態様においては、懸濁液が界面活性剤を含む。ある実施態様においては、界面活性剤がサポゲニンである。ある実施態様においては、メタニューモウイルスモノクローナル抗体が＃４クローン、＃２３クローン、又は＃２８クローンを含む群から選択されるクローン由来である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが同時である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが連続である。
【００１８】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）患者由来の非固定細胞を含む生体サンプルを含む懸濁液であり、前記濁液がさらにサポニゲンを含み、固定剤及び非水溶性溶剤を含まないことを特徴とする前記懸濁液、及び
ｉｉ）ウイルス抗原と反応する蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｂ）抗体の少なくとも一部が前記ウイルス抗原と反応するような条件下にて、前記細胞懸濁液中に前記蛍光標識された抗体を導入し、それにより前記細胞に結合した前記ウイルス抗原を暴露する工程、
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、サンプルは、ウイルス感染を有する疑いのある患者由来である。ある実施態様においては、ウイルス抗原は、細胞内である。ある実施態様においては、ウイルス抗原は、細胞外である。ある実施態様においては、ウイルス抗原は、ウイルスに付着している。ある実施態様においては、ウイルス抗原は細胞表面上に表示されている。
【００１９】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）サイトメーターと滑動自在に接合するサンプルトレイ内に存在するように備わるサンプル容器、
ｂ）前記容器の少なくとも一部を照らすために位置した励起照明光源、及び
ｃ）前記容器の前記少なくとも一部からの発光照明を集めるように配置される検出器を含むサイトメーターを意図する。ある実施態様においては、サンプル容器は、複数のウェルを有するスライドグラスを含む。ある実施態様においては、サンプルトレイは、照明を受けた部分に複数のコンテナーを連続的に露出するようにスライドする。ある実施態様においては、励起照明光源は発光ダイオードを含む。ある実施態様においては、発光照明は蛍光標識されたモノクローン抗体に由来する。
【００２０】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）蛍光標識された生体細胞を含む生体サンプルを含む懸濁液、
ｉｉ）サンプルトレイを含むサイトメーターであって、前記トレイが装置内にサンプル容器を読み取るために構成され、前記容器が複数のサンプルを含むことを特徴とするサイトメーター、及び
ｉｉｉ）少なくとも一つのサンプルに目標を設定した励起照明光源
を提供する工程、及び
ｂ）第一サンプルが前記励起照明光源により照らされるような条件下にて前記サンプル容器を前記サンプルトレイに挿入する工程、及び
ｃ）第二サンプルが前記励起照明光源により照らされるような条件下にて前記サンプル容器を読み取る工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、蛍光標識された細胞が蛍光染料を含む。ある実施態様においては、蛍光染料がヨウ化プロピジウム、臭化エチジウム、及びアクリジンオレンジからなる群から選択される。ある実施態様においては、蛍光標識された細胞は蛍光標識されたモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がＲ‐フィコエリトリンを含む。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体が蛍光フルオレセインイソチオシアネートを含む。
【００２１】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）少なくとも二つの蛍光標識されたウイルス抗原を含む生体サンプルを含む懸濁液、及び
ｉｉ）前記少なくとも二つの蛍光標識されたウイルス抗原を特異的に検出できるサイトメーター
を提供する工程、
ｂ）前記懸濁液を前記サイトメーターへ置く工程、及び
ｃ）少なくとも一つの前記蛍光標識されたウイルス抗原を検出する工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、第一ウイルス抗原の検出が第一ウイルスを同定する。ある実施態様においては、第二ウイルス抗原の検出が第二ウイルスを同定する。
【００２２】
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）異常細胞を含む疑いのある生体サンプルを含む懸濁液と、
ｉｉ）前記細胞が少なくとも一つの蛍光標識された抗体に相互作用することができ、前記抗体が異なって標識化されることを特徴とする少なくとも二つの蛍光標識された抗体
を提供する工程、
ｃ）少なくとも一つの前記蛍光標識された抗体が前記細胞に結合するような条件下にて、前記蛍光標識された抗体と前記懸濁液をインキュベートし、それにより標識化細胞‐抗体複合体を形成する工程、及び
ｄ）一つの蛍光標識された抗体を同定することにより前記標識化細胞‐抗体複合体を前記懸濁液内で検出し、それにより前記異常細胞を診断する工程
を含む方法を意図する。ある実施態様においては、生体サンプルは、患者由来である。ある実施態様においては、懸濁液がエバンスブルー、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、及びこれらの組み合わせの群から選択される染色試薬を含む。ある実施態様においては、懸濁液が界面活性剤を含む。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体がＲ‐フィコエリトリン（ＰＥ）を含む。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体が蛍光フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含む。ある実施態様においては、界面活性剤がサポゲニンである。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが同時である。ある実施態様においては、蛍光標識された抗体と懸濁液のインキュベートが連続である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
図の簡単な説明
この特許のファイルは、カラーで行なわれた少なくとも１つの図面を含んでいる。色図面を有するこの特許のコピーは、必要な料金の請求及び支払いに応じて特許商標庁によって提供されるだろう。
【００２４】
図１は、非インフルエンザＡ型ウイルス感染細胞（言い換えると、ネガティブコントロール）の中で蛍光標識されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）インキュベーションの典型的なデータを示す。黄色染色：バックグラウンド信号。
【００２５】
図２は、インフルエンザＡ型ウイルス感染細胞の１＋稀釈アリコート（低い力価）中で蛍光標識されたＭＡｂインキュベーションの典型的なデータを示す。アップルグリーン染色：ＭＡｂ‐標識化細胞。黄色染色：バックグラウンド信号。
【００２６】
図３は、インフルエンザＡ型ウイルス感染細胞の４＋稀釈アリコート（高い力価）の中で蛍光標識されたＭＡｂインキュベーションの典型的なデータを示す。アップルグリーン染色：ＦＩＴＣ  ＭＡｂ‐標識化ウイルス感染細胞。黄色染色：バックグラウンド信号。
【００２７】
図４は、アデノウイルス感染細胞の中蛍光標識されたＦＩＴＣ  ＭＡｂインキュベーションの典型的なデータを示す。上図：ヨウ化プロピジウム及びエバンスブルーで染色されたネガティブコントロール標本。下図：アップルグリーン染色：ＦＩＴＣ  ＭＡｂ‐標識化アデノウイルス感染細胞。
【００２８】
図５は、呼吸系ウイルス感染細胞の中で蛍光標識されたＰＥ  ＭＡｂインキュベーションの典型的なデータを示す。上図：ヨウ化プロピジウム及びエバンスブルーで染色されたネガティブコントロール標本。下図：金染色：ＰＥ  ＭＡｂ‐標識化アデノウイルス感染細胞。
【００２９】
図６は、インフルエンザＡ型ウイルスＭＡｂｓのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動単離の典型的なデータを示す。
ｉ）  ＭＡｂ  Ａ（６）Ｂ１１：レーンＡ２、Ｃ５及びＣ６；
ｉｉ）  ＭＡｂ  １０Ｂ１２Ｃ１１：レーンＢｌ；及び
ｉｉｉ）ＭＡｂ  ２Ｈ３Ｃ５：レーンＣｌ、Ｃ２及びＣ３。
分子量マーカーはレーンＡ６、Ｂ４及びＣ４である；２本のより重いマーカー・バンドは、それぞれ５０及び２０ｋＤａを表わす。他のレーンは他のウイルスＭＡｂｓの代表である。およそ５μｇのタンパク質を各ウェルに充填した。
【００３０】
図７は、インフルエンザＡ型（テキサス）ウイルスへのインフルエンザＡ型ウイルスＭＡｂｓに関する様々な態様の結合能の典型的なデータを提示する。正方形：ＭＡｂ  １０Ｂ１２Ｃ１１。円：ＭＡｂ  ２Ｈ３Ｃ５。三角形：ＭＡｂ  ＺｙｍｅＴｘ  Ａ（６）Ｂ１１
【００３１】
図８は、イエロー‐ゴールドの蛍光性のモノクローナル抗体（図８Ａ）又はアップルグリーンの蛍光性のモノクローナル抗体（図８Ｂ）を用いてインフルエンザＡ型ウイルス感染細胞の検出を示す典型的なデータを示す。
【００３２】
図９は、インフルエンザＡ型（図９Ａ）及びインフルエンザＢ型（図９Ｂ）に関してＤＦＡ対ＬＤＦＡ（ＭＡｂｓ：  １０Ｂ１２Ｃｌ１＋Ａ（６）Ｂ１１）のウイルス検出の比較を示す典型的なデータを示す。
【００３３】
図１０は、呼吸系ウイルス（図１０Ａ）及びメタニューモウイルス（図１０Ｂ）に関するＤＦＡ対ＬＤＦＡ（ＭＡｂｓ：  １０Ｂ１２Ｃｌ１＋Ａ（６）Ｂ１１）のウイルス検出の比較を示す典型的なデータを示す。
【００３４】
図１１は、アデノウイルス（図１１Ａ）及びパラインフルエンザウイルス１（図１１Ｂ）に関するＤＦＡ対ＬＤＦＡ（ＭＡｂｓ：  １ＯＢ  １２Ｃｌ  １＋Ａ（６）Ｂ１１）のウイルス検出の比較を示す典型的なデータを示す。
【００３５】
図１２は、パラインフルエンザウイルス２（図１２Ａ）及びパラインフルエンザウイルス３（図１２Ｂ）に関するＤＦＡ対ＬＤＦＡ（ＭＡｂｓ：  １ＯＢ  １２Ｃｌ  １＋Ａ（６）Ｂ１１）のウイルス検出の比較を示す典型的なデータを示す。
【００３６】
図１３は、パラインフルエンザ（１−３）（図１３Ａ）及び図９から１３Ａの中のウイルスの組み合わせ混合物（図１３Ｂ）に関するＤＦＡ対ＬＤＦＡ（ＭＡｂｓ：  １０Ｂ１２Ｃ１１＋Ａ（６）Ｂ１１）のウイルス検出の比較を示す典型的なデータを示す。
【００３７】
図１４は、少なくとも２つの異なるように標識化されたＭＡｂｓからの発光イルミネーションを検出及び測定することができポータブルの蛍光性の読取り機の１つの実施態様を示す。さらに、サンプル用の引き出しに挿入される（１ユニットとして）スライドトレイ上に装置へのエントリーのために置かれたマルチ‐ウェルサンプルスライドを示す。
【００３８】
図１５は、図１４の装置で示されるようなマルチ‐ウェルサンプルスライドの１つの実施態様を示す。ピペットは、液体試料の挿入及び／又は排出のための入口及び出口ポートの位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本明細書に使用される用語「の疑いのある」は、患者が特別の疾病又は疾患にかかりうることを示唆する、患者によって示された病状又は病状のセットをいう。例えば、これらの条件は、異常な身体症状、異常な情動性症状又は異常な生化学のテスト結果を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書に使用される用語「液体細胞懸濁液」又は「懸濁液」は、生体サンプルを含む任意の流体組成物いい、ここでサンプルの成分は任意の天然又は人工表面及び／又は物質に比べて流動的なままである。液体組成物は有機成分及び水性成分も含んでもよい。例えば、液体細胞懸濁液はリン酸緩衝生理食塩水を含んでもよい。
【００４１】
本明細書に使用される用語「付着される（ａｔｔａｃｈｅｄ）」は、媒介物（又はキャリアー）と薬の間の任意の相互作用をいう。付着は可逆的又は不可逆でよい。そのような付着は共有結合、イオンの結合、ファンデルワールス力又は、摩擦などを含むがこれらに限定されない。薬が媒介物（あるいはキャリアー）に浸透し、取り込まれ、覆われ、懸濁し、溶け込み、混合する場合等には、薬は媒介物に付着されている。
【００４２】
本明細書に使用される用語「に由来する」は、目的のアイテム（つまり、例えばモノクローナル抗体又はエネルギー・シグネチャー）の源をいう。
ある点では、ウイルス感染細胞は、生物学的な生物体（言い換えると、例えば人間、動物、植物又は患者）に由来してもよい。ある点では、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ・クローン細胞系（言い換えると、例えばクローン）に由来してもよい。ある点では、発光イルミネーションは蛍光化合物に由来してもよい。ある点では、励起イルミネーションは発光源に由来してもよい。
【００４３】
本明細書に使用される用語「に基づいて」は、特定の励起源の強度の量を計る能力に帰着する数学アルゴリズムを含む任意の処理又は方法を指す。さらに、処理、方法又は数学アルゴリズムは、個々にそれらの量を計り比較することができるように複数の励起源を区別することができる。
【００４４】
本明細書に使用される用語「検出すること」又は「検出する」又は「検出された」は、イルミネーション源又は励起源を同定することができる任意の方法及び／又は装置をいう。
【００４５】
本明細書にて用いる用語「患者」は、人間又は動物で入院する必要はない。例えば、外来患者、老人ホームの人は「患者」である。患者は、人間又は人間以外の動物のどんな年齢も含み、従って、成人及び年少者（つまり子ども）両方を含める。用語「患者」は、治療の必要とする人を意味することは意図されず、従って、患者は、自発的であるか否かを問わず、臨床研究であろうと、基礎科学研究のサポートであろうと実験作業の一環に組み込まれる者をいう。
【００４６】
本明細書に用いる用語「親和性」は、物質又は粒子状物質を化合結合へ入らせ、とどまらせる、物質又は粒子状物質の間のあらゆる引力をいう。例えば、受容体に高親和性がある阻害剤化合物は、受容体がその天然リガンドと相互に作用するのを防ぐ際に、低親和性を有する阻害剤より大きな効能を提供するだろう。
【００４７】
本明細書にて用いる用語「タンパク質」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基から成る、多数の自然発生の非常に複雑な物質（酵素又は抗体として）のうちのいずれかをいい、炭素、水素、窒素、酸素、通常、硫黄の元素を含む。一般的に、タンパク質は、何百にも達し得る数を有するアミノ酸を含む。
【００４８】
本明細書に用いる用語「ペプチド」は、１つのアミノ酸のアミノ基と別のアミノ酸のカルボキシル基の結合による２つ以上のアミノ酸に由来し、通常タンパク質の部分加水分解によって得られる様々なアミドのうちのいずれかをいう。一般的に、ペプチドは、何十の数のアミノ酸を有するものを含む。
【００４９】
本明細書にて用いる「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及びそれのフラグメント又は、それらの部分をいい、一本鎖又は二本鎖でよく、センス鎖又はアンチセンス鎖と表現してよい、ゲノム又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡをいう。
【００５０】
本明細書にて用いる用語「単離された核酸」は、その自然状態（例えば、好ましい実施態様においては、細胞から除かれ、他のゲノムの核酸がない）から取り除かれたあらゆる核酸分子をいう。
【００５１】
本明細書にて用いる用語「アミノ酸配列」及び「ポリペプチド配列」は相互に交換可能であり、アミノ酸の順序をいう。
【００５２】
本明細書において「所定のタンパク質の一部」などという場合のタンパク質について用いる用語「一部」は、そのタンパク質のフラグメントをいう。フラグメントのサイズは、４アミノ酸残基以上で全アミノ酸配列から１アミノ酸を引いたアミノ酸配列までの範囲でよい。
【００５３】
ヌクレオチド配列に関して使用される時、用語「部分」は、そのヌクレオチド配列のフラグメントいう。フラグメントのサイズは、５ヌクレオチド残基からなるフラグメント以上で、全ヌクレオチド配列から１核酸残基を引いたフラグメントまでの範囲でよい。
【００５４】
用語「抗体」は、免疫原（抗原）によって動物に引き起こされた免疫グロブリンをいう。抗体は、免疫原に含まれるエピトープへの特異性を実証することが望ましい。用語「ポリクローナル抗体」は、形質細胞の２以上のクローンから生産された免疫グロブリンをいい、対照的に、「モノクローナル抗体」は、形質細胞の単一のクローンから生産された免疫グロブリンをいう。ウイルス抗原の特異親和性を有する、本明細書にて意図するモノクローナル抗体は、すべて市販で入手可能である。（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，  Ｉｎｃ．，  Ａｔｈｅｎｓ，  ＯＨ）。
【００５５】
抗体及びタンパク質又はペプチドの相互作用に関して使用する場合、用語「特異親和性」、「特異的結合」又は「特異的に結合すること」は、相互作用がタンパク質上の特定構造（言い換えると、例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。言いかえれば、抗体は一般的なタンパク質ではなくむしろ特異タンパク質構造を認識して結合している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識化「Ａ」及び抗体を含む反応物中、エピトープＡ（又は遊離した、非標識化Ａ）を含むタンパク質の存在は、抗体に結合する標識化Ａの量を減らすだろう。
【００５６】
本明細書に手用いる用語「サンプル」は、その最も広い意味の中で使用され、環境サンプル及び生体サンプルを含む。環境サンプルは、土と水のような環境からの物質を含む。生体サンプルは、人間を含む動物、液体（例えば、鼻咽頭分泌物、血液、血漿及び血清）、固形物（例えば、排便）、組織、液状食品（例えば、ミルク）、また固形食（例えば、野菜）でよい。例えば、肺のサンプルは、肺組織に由来した液体及び細胞を含む気管支肺胞洗浄（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ）（ＢＡＬ）によって集められてもよい。ウイルス感染細胞、組織抽出液又は体液を含む疑いのある生体サンプルを集めてよい。
【００５７】
用語「免疫学的に活性のある」は、適切な動物又は細胞中の特異的免疫反応を引き起こすために及び／又は特異抗体と結合するために、自然の、組み換えの、又は、合成のペプチド（言い換えると、例えば、コラーゲン様ファミリータンパク質）又はそれらの任意のオリゴペプチドの能力をいう。
【００５８】
本明細書に用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体（つまりエピトープ）によって認識される分子のその部分をいう。タンパク質又はタンパク質のフラグメントが宿主動物を免疫にするために使用される場合、タンパク質の多数の領域は、タンパク質上の一定の領域又は三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を引き起こしてもよい。これらの領域又は構造は、抗原決定基という。抗原決定基は、無傷の抗原（つまり、免疫反応を誘発するために使用される免疫原）が抗体に結合することを競合してよい。そのような１つの抗原決定基は、「ウイルス抗原」でよく、その抗原が、ウイルスに感染した宿主細胞表面上に又はその中に表示されてもよく、又はウイルス・コート表面上に表示されてもよい。
【００５９】
用語「免疫原」、「抗原」、「免疫原の」、及び「抗原の」は、動物へ導入された時、抗体を作りだすことができる任意の物質をいう。定義によって、免疫原は少なくとも１つのエピトープ（免疫反応を引き起こすことができる特異的な生化学ユニット）を含んでいるに違いないし、一般的にさらに多く含んでいる。タンパク質は、免疫原として最も頻繁に使用される。しかし、タンパク質と複合体を作る脂質及び核酸の部分は、さらに免疫原として働いてもよい。わずかのエピトープを有するより小さな分子が満足な免疫反応を単独で刺激しない場合、後者の複合体は、しばしば有用である。
【００６０】
用語「抗体」は、免疫原（抗原）によって動物に引き起こされた免疫グロブリンをいう。抗体は、免疫原に含まれるエピトープへの特異性を実証することが望ましい。用語「ポリクローナル抗体」は、形質細胞の２以上のクローンから生産された免疫グロブリンをいい、対照的に、「モノクローナル抗体」は、形質細胞の単一のクローンから生産された免疫グロブリンをいう。
【００６１】
用語「標識」又は「検出できる標識」は、蛍光、分光器、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的手段によって検出できる任意の組成物をいうために本明細書に使用される。例えば、そのような標識、テトラメチルローダミンイソチアシヤネート（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、量子ドット、ＣＹ３及びＣＹ５を含んでもよいが、これらに限定されない。他のそのような標識は、標識化ストレプトアビジン結合体で染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド（ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、及び一般にＥＬＩＳＡの中で使用される他のもの）、及びコロイド金又は色ガラスのような熱量測定の標識又はプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズを含むがこれらに限定されない。そのような標識の使用を開示する特許は、米国特許番号３，８１７，８３７、３，８５０，７５２、３，９３９，３５０、３，９９６，３４５、４，２７７，４３７、４，２７５，１４９、及び４，３６６，２４１（本明細書に参照によりすべて組込まれる）を含むがこれらに限定されない。本発明の中で意図する標識は、多くの方法によって検出されてもよい。例えば、放射性同位体は、写真フィルム又はシンチレーション計数器を使用して検出されてもよく、蛍光マーカーは放射光を検出するために光検出器を使用して検出されてもよい。酵素の標識は、酵素に基質を提供し、基質上の酵素の作用によって生産された反応生成物を検出することにより典型的に検出され、及び熱量測定の標識は、単に有色の標識を視覚化することにより検出される。
【００６２】
本明細書にて用いる用語「結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、感染抑制組成物と表面の間の任意の相互作用をいう。表面等は「結合表面」として規定される。結合は可逆的又は不可逆的でよい。そのような結合は非共有結合、共有結合、イオン結合、ファン・デル・ワールス力又は、摩擦等でよいがこれらに限定されない。感染抑制組成物が表面から浸透し、取り込まれ、表面により覆われ、内側で懸濁し、溶け込み、混合する等の場合、感染抑制組成物はその表面に結合している。
【００６３】
用語「蛍光を発する中心」は、蛍光的に抗体を標識化した時、蛍光を発する１個の細胞又は密着して隣接する細胞の一群のいずれかをいう。いくつかの単独ウイルス感染は、マルチ細胞プラークを生産し、他のものは、生存可能なウイルス当たり１個又は２個の細胞の感染でのみ生じる。多くの蛍光染色細胞から成るウイルスのプラークは、ＨＳＶ、ＶＺＶ、及びＲＳＶなどウイルスについて「１」として数えられる。インフルエンザＡ型、Ｂ型、及びアデノウイルスのようなウイルスは、生存可能な感染性ウイルス当たりわずか１つ又は少数の蛍光染色細胞しかつくらない。
【００６４】
用語「ウイルス」は、自律複製（つまり、複製は、宿主細胞の機構の使用を必要とする）のできない、偏性で、超顕微鏡的な細胞内寄生体をいう。ウイルスは、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ヒト乳頭腫ウイルス(ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ)、ヒト免疫不全ウイルス(ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ)、肝炎ウイルス(ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ)、ニューカッスル病ウイルス(Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ)、カルジオウイルス（ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ）、コルチコ・ウイルス科（ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ‐ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（ｈｅｐａｄｎｖｉｒｉｄａｅ）、肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、イノウイルス科（ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、オルソミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、パラミキソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポキシスウイルス科（ｐｏｘｙｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、セムリキ森林ウイルス（ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、テトラウイルス科（ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、ベルンウイルス（ｔｏｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、牛痘ウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）及び水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）を例示されるが、これらに限定されない。「ウイルス」はプラス鎖ＲＮＡウイルスでない動物ウイルスを含み、例えば、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ブンヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、カルジオウイルス（Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ）、コルチコウイルス（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ‐Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎｖｉｒｉｄａｅ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、メタニュ��モウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポーバウイルス（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）、パラミキソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポキシスウイルス科（Ｐｏｘｙｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、テトラウイルス科（Ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、ベルンウイルス（Ｔｏｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、牛痘ウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）を例示するが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書にて用いる用語「病原体」は、少なくとも１つの抗原を含む任意の超顕微鏡的生物又は微生物をいう。例えば、抗原を含む病原体は、病原体抗原に対して特異親和性を有する、蛍光標識されたモノクローナル抗体によって検知し同定することができる。病原体の代表的な例は、バクテリア、菌類、酵母、ウイルス又は任意の微生物を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書にて用いる用語「呼吸系ウイルス」は、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）組織（つまり例えば肺（ｌｕｎｇ）組織）を感染させることができる任意のウイルスをいう。例えば、レスピレーターウイルスは、インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、パラインフルエンザ（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ハンタウイルス（ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）、又はサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
発明の詳細な説明
本発明は、液体形式で直接的にウイルスを検出するための生体サンプルを処理すること関する。例えば、サンプルは呼吸器系に由来してもよい。検出方法は、ウイルス抗原に直接に結合する抗体を使用してよく、それにより検出も同定もできてよい。いくつかの態様では、抗体は標識モノクローナル抗体である。方法は、複数の蛍光信号を区別することができるアルゴリズムを含む装置に統合されてもよい。
【００６８】
ある実施態様においては、本発明は、細胞がウイルス感染について陽性又は陰性かどうか判断するために処理された生体細胞標本の画像及びアルゴリズムを使用して、ウイルス抗原を検出し同定する方法を意図する。ある実施態様においては、方法は、調製、処理、及び検査の間、液体試料を含む。
【００６９】
Ｉ．ウイルス感染
流行の間に、ウイルスは、特に老年者、及び慢性肺疾患及び／又心血管障害を有する患者にとって、罹患率と死の重要な原因となりうる。Ｓｗｅｎｓｏｎ  ら、  ”Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｙ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”  Ｄｉａｇｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ７：２６５−２６８  （１９８７）．適切な感染抑制措置及び適切な患者治療は臨床検査材料中のウイルスの迅速な検出及び同定によって最適化されてよい。
【００７０】
ウイルスは、繁殖（例えば、複製）するために生細胞に侵入しなければならない小さな感染性の生物体（菌類又はバクテリアよりはるかに小さい）である。ウイルスは細胞（宿主細胞という）に付着し、それに侵入し、細胞の内部へそのＤＮＡ又はＲＮＡを放出する。ウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡはウイルスを複製するために必要とされる情報を含んでいる遺伝物質である。ウイルスの遺伝物質は細胞を支配し、ウイルスを複製することをそれに強いる。ウイルスが、それがその正常機能を行なわないようにするので、感染細胞は通常死ぬ。死ぬ場合、細胞は新しいウイルスを放出する。それは次に他の細胞を感染させる。
【００７１】
いくつかのウイルスは、それらが感染させる細胞を殺さないが、代わりに、細胞の機能を変更する。時々、感染細胞は、正常細胞分裂に対するコントロールを失い、癌になる。いくつかのウイルスは宿主細胞の中に遺伝物質を残し、ここで遺伝物質は長時間（例えば、潜伏感染）で休止しているままである。細胞が妨害される場合、ウイルスは再び複製し始め、疾病を引き起こしうる。
【００７２】
通常、ウイルスは細胞の１つの特別の型を感染させる。例えば、かぜウイルスは、上気道の細胞だけを感染させる。さらに、ほとんどのウイルスは、植物又は動物のほんの少数の種を感染させる。いくつかは人々だけを感染させる。多くのウイルスが一般に幼児と子どもに感染する。
【００７３】
ウイルスは、様々な方法で蔓延する（例えば、感染する）。一部のウイルスは呑み込まれ、一部は吸入され、及び一部は、昆虫及び他の寄生生物（つまり、例えば、蚊及びダニ）にさされることによって流布する。一部のウイルスは性的に流布される。
【００７４】
１．防御物
ほとんどの生物学的な生物体は、ウイルスに対する多くの防衛をしている。例えば、皮膚のような身体的なバリアは容易な侵入を妨げる。感染細胞はさらにインターフェロン（非感染細胞を多くのウイルスによる感染に対してもっと耐性にすることができる物質）を作る。
【００７５】
ウイルスが身体を入る場合、ウイルスは身体の免疫防御を引き起こしうる。これらの防御は、リンパ球と単球のような白血球から始まり、ウイルス又は感染細胞を攻撃し破壊する抗体を産生する。抗ウイルス抗体の産生は、続いて起こる免疫の状態をつくり、その状態においては白血球は、再感染に直ちに応答するようにプログラムされる。免疫のこれらの状態は、無感染のウイルス粒子を有する予防接種によって人為的に引き起こされる場合がある。予防接種は、様々な白血球からの抗体の産生を始めて、それによって、性質上ポリクローナルな抗体を生産する。
【００７６】
２．ウイルス感染の型
恐らく、最も一般的なウイルス感染は、上部呼吸器気道（つまり、例えば、鼻、喉、等）のものである。これらの感染は咽頭炎、副鼻腔炎及び風邪を含む。インフルエンザは、ウイルス呼吸器感染症である。小さな子どもにおいて、ウイルスは、一般にクループ及び気管の炎症（言い換えると、例えば、喉頭気管気管支炎）又は肺の内部でより深い他の気道の炎症を引き起こす。呼吸器感染症は、幼児、年配の人々及び肺又は心疾患を持った人々において、重い症状を引き起こす可能性が大きい。
【００７７】
いくつかのウイルス（言い換えると、例えば、狂犬病ウイルス(ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ)、西ナイルウイルス(Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ)及びいくつかの異なる脳炎ウイルス(ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）は、神経系に感染する。ウイルス感染は、皮膚の中で成長し、ときどき、疣贅又は他の斑点に至る。
【００７８】
他の一般的なウイルス感染はヘルペスウイルスによって引き起こされる。異なる８つのヘルペスウイルスが人々に感染し、単純ヘルペスウイルス１型（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １）、単純ヘルペスウイルス２型（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２）、及び水痘帯状ヘルペスウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ‐ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）を含むが、これらに限定されない。これらのウイルスは、皮膚又は粘液の膜の上の水疱を生産する感染を引き起こす。別のヘルペスウイルス（エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ‐Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）は伝染性単核症を引き起こす。サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）は、新生児、及び弱体化された免疫系を有する人々において重篤感染症の原因である。サイトメガロウイルスはさらに健康な免疫系を有する人々において伝染性単核症に似ている症状を出すことができる。ヒトヘルペスウイルス６及び７は、小児バラ疹（ｒｏｓｅｏｌａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ）と呼ばれる小児期感染症を引き起こす。ヒトヘルペスウイルス８は癌（カポジ肉腫（Kaposi's  sarcoma））の原因としてＡＩＤＳの人々に密接に結び付けられた。
【００７９】
ウイルスが休止している（潜在している）状態でその宿主細胞内にとどまるので、すべてのヘルペスウイルスは、生涯にわたる感染を引き起こす。時々、ウイルスは再活性化し、疾病のさらなる症状を発現する。再活性化が急速にあるいは初感染後の長年たって生じ得る。
【００８０】
３．診断
通常のウイルス感染は症状に基づいて、通常分析される。流行（言い換えると、例えば、インフルエンザ）で生じる感染については、他の同様なケースの存在により、医者が特定の感染を同定するのを助けうる。他の感染については、血液検査、及び培養（血液、体液又は感染地域から取られた他の物質のサンプルからの研究所にて微生物を培養する）を行ってよい。血液は、ウイルスの抗体又は抗原（身体の防御物を引き起こすウイルス上の、又はそのウイルス中のタンパク質）に関して試験してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）テクニックは、医者が速やかにかつ正確にウイルスを同定することを可能にして、ウイルスの遺伝物質の多くのコピーを作るために使用してもよい。例えば、感染は公衆衛生に対する深刻な脅威である場合、又は症状が重い場合に、テストは時々速く行われる。血液又は他の組織のサンプルは、電子顕微鏡で時々検査され、それは高倍率に明瞭な解像力を提供する。
【００８１】
４．処置
ウイルス感染と戦う医薬品は抗ウイルス薬と呼ばれる。ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）感染を治療するために使用される医薬品など、多くの抗ウイルス薬が、ウイルスの複製を妨害することにより作用する。ウイルスは、細胞自身の代謝機能を使用する細胞の内部で複製するので、抗ウイルス薬がターゲットとすることができる代謝機能の数は限られている。したがって、抗ウイルス薬は開発するのが難しい。さらに、効果的な抗ウイルス薬はヒト細胞へ有毒でありうる。ウイルスは、抗ウイルス薬に対する抵抗性を発現させることもできる。
【００８２】
他の抗ウイルス薬は、ウイルス感染への生物学的な免疫反応を強くする。これらの医薬品はいくつかの型のインターフェロン、免疫グロブリン及びワクチン剤を含む。インターフェロン医薬品はウイルス複製を遅くする又は止める自然におこる物質のレプリカである。免疫グロブリンは、一群の人々から集められた抗体（免疫グロブリンともいう）の滅菌溶液である。ワクチン剤は、身体の自然な防衛機構を刺激することにより感染を防ぐのを助ける物質である。多くの免疫グロブリン及びワクチン剤が感染を防ぐためにウイルスに暴露する前に与えられる。感染が進行するのを防ぐか又は感染の発病度を低下させるのを助けるために、狂犬病とＢ型肝炎用のものなど、いくつかの免疫グロブリン及びいくつかのワクチン剤は、ウイルスへの暴露の後にも使用される。免疫グロブリンは、さらにいくつかの確立した感染を治療し、かつウイルスへの将来の暴露の後に感染を防ぐのを助けてもよい。
【００８３】
ほとんどの抗ウイルス薬は経口投与することができる。いくつかは、静脈（静脈内で）又は筋肉（筋肉内に）への注射から投与することができる。いくつかは、軟膏剤、クリーム剤又は目薬として適用されるか、又はパウダーとして吸入される。
【００８４】
抗生物質はウイルス感染に対して効果的ではない。しかし、人がウイルス感染に加えて細菌感染をしていれば、抗生物質は多くの場合必要である。
【００８５】
ＩＩ．ウイルス検出アッセイ
感染症割合及び免疫戦略は、社会のニーズ、国防、及び疾病を生む生物体中の進化の変更に応じて、米国及び世界的に発展し続ける。予防接種は多くの感染を防ぐために行なわれる一方、集団検診は、効果的なワクチン剤がない感染のため、及び一般的予防注射が十分な効果が無いと考える低い発生率を有する疾病のために用いられている。
【００８６】
病気の診断、病原体など生体試料への暴露の有無を決定し、又は免疫状態をモニタリングするための現行手法は、特異的アッセイに依存して変わる。いくつかの方法はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイを使用する。他のものは、取得され、試験されるべき、血液又は血清など、生体サンプルを必要とする。通常行なわれるテストは、酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  ａｓｓａｙ）（以下、「ＥＬＩＳＡ」）、ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（以下に「ＲＩＡ」）又は凝集など非均一型診断法のうちの一つである。すべては、表面結合、異種混合アッセイであり、成功するために、目的の抗原が表面と相互に作用することが必要であり、しばしば、かなりの非特異的結合及び特異性の損失という犠牲を払う。
【００８７】
本明細書に記載の実施態様は、方法のすべての工程を包含する、全体として液体環境を提供することにより、従来報告された免疫測定を改良する。
【００８８】
Ａ．非蛍光抗体アッセイ
溶液中のウイルスを発見することができると考えられた一般的方法については、蛍光標識された感染細胞を捕らえる抗体を表示する複合有機無機のナノクラスタを使用することが報告された。Ｓｕｎら、”Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｉｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，”  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ２００７／０２７９６２６。その後、捕らえられた感染細胞の数を決定するために、ナノクラスタ‐抗体‐細胞複合体はラマン分析法ともにＦＡＣＳにて処理される。液相の免疫診断アッセイは、抗原／抗体複合体が第一及び第二酵素によって作用する場合、生化学的なリポーターを作りだすことが報告された。Ｃｌｅｍｍｏｎｓら、  ”Ｌｉｑｕｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｓｓａｙ，”  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，６３７，４７３。示唆された抗原／抗体複合体が様々なウイルス関連のエピトープを含む。病気を持っている疑いのある患者の臨床のサンプルからの検体検出は、核酸‐標識結合構築物でサンプルを反応させることにより報告された。結合する構築物は検体への親和性がある抗体でよい。一度結合したら、抗体／検体複合体は単離され、核酸標識は、捕らえられた検体の定量するために、増幅され、同定される。Ｌａｗｔｏｎ，  ”Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ７，  ３４１，  ８３７、及び米国特許番号２００５／００４８５００。
【００８９】
Ｂ．間接免疫蛍光法
間接免疫蛍光法は、特異性抗原対して向けた、第一の標識化されていないＩｇＧ抗体が第一抗体と同じ種の標識化された（つまり、例えば、蛍光標識された）抗‐ＩｇＧの使用によって検出される方法を表わす。例えば、標識化されたヤギ抗‐ウサギＩｇＧ抗体は、ウサギの中で惹起された特異的第一抗体に対して使用することができる。
【００９０】
ＦＡＣＳ方法論を用いることによるフローサイトメトリーは、マトリックス  タンパク質Ｉ及び核タンパク質に向けられた蛍光標識されたモノクローナル抗体の使用により、細胞内のインフルエンザＡ型の複製をモニタリングにすることに使用された。このシステムでは、着生ＭＤＣＫ細胞は、最初にウイルスを含んでいるサンプルで接種を受けて、次に、エタノール及びパラホルムアルデヒド／エタノールで固定し、脱水した。Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｈｏｒｓｅｌ  ら、  ”Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＭＤＣＫ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８：４５  （２００８）、及びＬｏｎｓｄａｌｅら、  ”Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １１０（ｌ）：６７−７１，  （２００３））。
【００９１】
インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗体産生は、ＦＡＣＳ免疫蛍光検査法を使用して、インフルエンザウイルスに感染したネズミで研究された。データは、感染した脾臓細胞から分離されたＢ細胞が、感染の間に、自然なＩｇＭアイソタイプからインフルエンザ‐特異的アイソタイプまでアイソタイプ・スイッチングを経験しないことを実証した。Ｂａｕｍｇａｒｔｈ  ら、  ”Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  ｔｏ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  ａｒｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ａｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，”  ＰＮＡＳ  ９６：２２５０−２２５５  （１９９９）。
【００９２】
インフルエンザウイルスの検出は、細胞培養に基づいた間接免疫蛍光染色を使用して、様々な処理方法間で比較された。チャンバースライド（Ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ）、シェル・バイアル（ｓｈｅｌｌ  ｖｉａｌ）、標準ウイルス単離及び鼻洗浄標本はすべて、インフルエンザＡ型ウイルス（つまり、マトリックスタンパク質又は核タンパク質）又はインフルエンザＢ型ウイルス（つまり、核タンパク質又は赤血球凝集素）のいずれかの抗原に特異的なモノクローナル抗体を使用して試験された。Ｗａｌｌｓ他  ”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｆｏｒ  ｔｙｐｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２３：２４０−２４５  （１９８６）。これらの比較は、間接免疫蛍光法試験が激しい洗浄にかかわらず豊富な粘液デブリにより、及び時々生菌の不適当な数により判断するのが難しいことを示した。Ｓｔｏｋｅｓら、”Ｒａｐｉｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｂｙ  ２４−ｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｆｏｃｕｓ  Ａｓｓａｙｓ，”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２６（７）：１２６３−１２６６  （１９８８）。また、インフルエンザ感染は、組み換え的につくられたインフルエンザＡ型Ｍ２タンパク質で覆われた表面上に臨床のサンプル内の自然に産生された抗体を捕らえることにより検知されてもよい。
Ｋｅｎｄａｌら、”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｍ２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｍ２  Ｐｒｏｔｅｉｎ，”  ＷＯ／１９９３／００３１７３．インフルエンザウイルス感染も、サンドイッチ免疫蛍光測定法を使用して検知されてもよく、この方法は、ＮＰ、Ｍｌ、ＨＡ及びＮＡタンパク質を認識する抗‐インフルエンザ抗血清が、固定され透過性になったＨｅＬａ細胞と反応する。得られたタンパク質‐抗体複合体はＦＩＴＣ‐標識化抗ウサギＩｇＧ抗体で視覚化された。Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉら、  ”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４（１９）：  ９２４０−９２４４  （２０００）。
【００９３】
インフルエンザウイルスは、抗マウスＦＩＴＣ二次抗体によって検出される非標識化インフルエンザＡ型‐特異的モノクローナル抗体を用いて組織塗布標本上で検知された。方法は、サポゲニンの使用、又はヨウ化プロピジウムを開示していない。Ｓｅｌｌｅｃｋら、  ”Ｒａｐｉｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｍｅａｒｓ，”  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ４７（ｓ３）：ｌ  １９０−１１９５  （２００２）。
【００９４】
Ｃ．直接的な蛍光性アッセイ（ＤＦＡ）
直接免疫蛍光法は、標識化されていない反応物（つまり、例えば、抗原、ウイルスのエピトープ又は細胞エピトープ）の存在を検出するとともに示す標識化された反応物（つまり、例えば、抗体）の使用を含む。ある場合には、標識は、蛍光分子を含む。ある場合には、蛍光分子で直接に標識化された一次抗体を使用することが有利である。この直接標識は、染色手順での工程を減少させ、そして、さらに重要なことには、しばしば交差反応性及び高いバックグラウンド問題を回避する。
【００９５】
１．非液体をベースとしたＤＦＡ
ウイルスの直接検出は、免疫蛍光法又は酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）の使用により実施されてきた。免疫蛍光法による直接塗抹検査は低感度及び非特異性のバックグラウンド染色により問題である。代替的に、シェル・バイアル遠心分離アッセイが、インフルエンザウイルスの検出のために適応させてきた。Ｅｓｐｙら、  ”Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｓｈｅｌｌ  ｖｉａｌ  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２４：６７７−６７９  （１９８６）、及びＳｔｏｋｅｓら、”Ｒａｐｉｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｂｙ  ２４−ｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｃｕｓ  ａｓｓａｙ”  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２６：１２６３−１２６６  （１９８８）。
【００９６】
臨床の呼吸器検体でインフルエンザＡ型及びインフルエンザＢ型ウイルスを検出するいくつかの細胞培養に基づいた方法は、メイディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ‐Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓細胞を使用し、それは、インフルエンザウイルスによる感染に非常に敏感である。そのような方法は、サンプルによる細胞培養のウイルス感染から得られる細胞変性効果の発現を観察するために、インキュベーションが少なくとも１週かかる。Ｆｒａｎｋ  ら、  ”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １０：３２−３６  （１９７９）、及びＭｅｇｕｒｏら、”Ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９：１７５−１７９  （１９７９）。臨床検体塗布標本も直接免疫蛍光法アッセイの使用により試験された。これらの塗抹標本は、顕微鏡上で見る前に、スライドグラス上のサンプルを調製し乾かすために、いくつかの工程で処理された。インフルエンザは、エバンスブルーを有する対比染色法と共にＦＴＩＣ標識抗体を使用して検出された。この方法は、検出できる信号を改善するためにサポゲニンを使用することによって、又はヨウ化プロピジウムと対比染色組み合わせを使用することによって増強されない。Ｍｉｌｌｓら、”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＤＣＫ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２７（１１）：２５０５−２５０８  （１９８９）。
【００９７】
現在、インフルエンザＡとＢ型、呼吸器合胞体ウイルスなどの呼吸器系ウイルスの存在を検知するために蛍光性の標識抗体を使用して、直接に呼吸器検体を色付けするために使用された２つの（２）一般的方法（つまり、標準のＤＦＡ及びサイトスピンＤＦＡ）がある。これらのアッセイ手順は、はるかに速い、本明細書に記載の１つの実施態様（つまり、例えば、液体ＤＦＡ；ＬＤＦＡ）と比較される。表１を見てください。
【００９８】
【表１】
2012529009.tif 000003
【００９９】
現在の標準及びサイトスピンＤＦＡは、
ｉ）標本から細胞を集めて濃縮するために遠心分離する工程（この工程は実験に依存して、変わる。多数のすすぎが行なわれる場合に、それは１０分から３０分以内までに及びうる。）、
ｉｉ）スライド上の置かれた細胞を乾燥させる工程、
ｉｉｉ）脱水剤（つまり、例えば、アセトン）を使用して、細胞を固定する工程、
ｉｖ）付着し、固定した細胞をそれぞれのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化Ａｂと３７℃でインキュベートする工程、及び
ｖ）標識化／固定細胞を顕微鏡で見るため操作し、蛍光性の細胞の存在について検査する工程
を含む多数でかつ長い実験工程を含むことを必要とする。現在のＤＦＡの重要な１つの欠点は、顕微鏡を見ること及び蛍光性に標識化された細胞のための検査が手動で（つまり、目視検査によって）行われるということである。さらに、通常、単一の蛍光標識が各抗体に使用されるので、個別のサンプルは、各疑わしいウイルスの存在を検出するために逐次連続的に処理されなければならない。
【０１００】
ＤＦＡの中の固定液は、通常脱水剤（つまり、例えば、アセトン）であり、それは、タンパク質を固定し、細胞をスライドガラスへ付着させ、細胞を、細胞内抗原と反応するＭＡｂの侵入のために透過性にする。ＤＦＡの中の染色剤は、細胞対比染色法用のタンパク染料（つまり、例えば、エバンスブルー）と組み合わせたウイルス抗原用、通常直接に標識化されたＦＩＴＣ  ＭＡｂである。
【０１０１】
２．液体ＤＦＡ（ＬＤＦＡ）
現在利用可能なＤＦＡは、上記に記述するように、長くかつ困難な技術を使用して、ウイルス（つまり、８つのアリコート合計）それぞれを検出し、同定するために異なるアリコートを必要とするだろう。例えば、８つの（８）ウイルスの非液体ＤＦＡ検出は、３７の（３７）実験操作を必要とする。対照的に、本発明によって考えられたＬＤＦＡ実施態様は、液体試料の３つのアリコートの連続分析を使用して、わずか１４の（１４）実験操作しか含まない。ある実施態様においては、方法は、さらにコントロールとして標識化されたモノクローナル抗体のない液体試料の第４のアリコートを含む。
【０１０２】
蛍光標識されたリガンド（つまり、例えば、小分子、ペプチド）は、蛍光偏光法の変化の測定により抗体を検出することにより溶液ベース診断アッセイの中で使用した。蛍光に標識化されたリガンドは、分子の回転速度の変化をうけ、それによって、リガンドが結合するパートナー（つまり例えば、抗体で結合する標識抗原）と結合する場合、その発光パターンを変更する。例えば、方法は、微生物（つまり、例えば、バクテリア又はウイルス）に感染する、患者からの生体サンプル中の自然に生成された抗体を検出してもよい。Ｃｕｌｌｕｍら、”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｓａｌｉｖａ，  Ｏｒａｌ  ｏｒ  Ｂｏｄｉｌｙ  Ｆｌｕｉｄｓ，”  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ７，４０８，６４０  （２００８）、及び米国特許公報番号２００５／００９５６０１（本明細書に比較によって組込まれる）。
【０１０３】
蛍光標識されたモノクローナル抗体の溶液は、ＥＬＩＳＡ型でのマイコプラズマ肺炎(Mycoplasma  pneumonia)を同定するために用いるアゾ化合物で安定した。感染細胞は、抗体を用いたインキュベーションの前にマイクロウェル・プレートに固定した。これらの方法は、改善された細胞透過性（つまり、例えば、サポゲニンの追加による）又はヨウ化プロピジウムで逆染色することに依存せず、ウイルス（つまり、例えば、インフルエンザ）の検出を意図しない。Ｓａｗａｙａｎａｇｉら、”Ｓｔａｂｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ，”  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，６０２，２３４  （１９９７）（本明細書に参照により組込まれる）。
【０１０４】
ある実施態様においては、本発明は、透過性を上昇させる薬剤及び少なくとも１つの細胞染色と液体試料をインキュベートすることを含むＬＤＦＡを実施する方法に関する。発明の機構を理解することは必要ではないが、これは現在利用可能な、２つの個別の工程で固定及び染色のアナログ工程を実施する非液体ＤＦＡに対する顕著な利点であると考えられる。ある実施態様においては、透過性を上昇させる薬剤はアセトンを含む。ある実施態様においては、細胞染色は、現在利用可能なＤＦＡ中の約１／８量で特異タンパク質染色（つまり、例えば、エバンスブルー）及び非特異性の細胞核染色（つまり、例えば、ヨウ化プロピジウム）を含む。
【０１０５】
ある実施態様においては、本発明は、１０（１０）分未満で検査のために液体試料を調製することを含むＬＤＦＡを実施する方法を意図する。ある実施態様においては、方法は約５（５）分の間透過性を上昇する薬剤（つまり、例えば、アセトン）と少なくとも１つの細胞染色で室温にて液体試料をインキュベートすることを含む。ある実施態様においては、方法は約２（２）分の間室温で透過性になり、染色された液体試料をすすぎ遠心分離機にかけることを含む。ＬＤＦＡは、検査技師が液体の標本で速くウイルス感染細胞を同定し数を数える能力を著しく改善することにより、現在知られているＤＦＡアッセイに対して著しい有益性を持つ。表２を見てください。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
スライドガラスへ細胞を付着させる固定液は、ＬＤＦＡにおいて必要とされないが、脱水剤は細胞透過性を上昇させる薬剤として恐らく有用であろう。さらに、界面活性剤（つまり、例えば、サポゲニン）は、細胞内抗原と反応するＭＡｂの侵入用の細胞を透過性にするために使用してもよい。通常、ＬＤＦＡ中の染色剤は、エバンスブルー（つまり、例えば、蛍光性のバックグラウンド染色を消すこと）及び細胞の核染色法を用いてＦＩＴＣ及び／又はＰＥからの蛍光関して何の細胞であるか同定するのを助けるために使用されるヨウ化プロピジウム（蛍光性の核染色法）の低濃度と組み合わせて、ウイルス抗原用の直接に標識化された蛍光性のＭＡｂのである。
【０１０８】
そのような標識化は、試験液の中に存在する感染細胞（つまり、例えばインフルエンザＡ型に感染した）の数に比例することが観察された。実施例Ｉに従って行なった図１、２及び３を見てください。同様のデータはＨＳＶ−Ｉ感染細胞（データ示さず）で得られた。本明細書にて開示されたＬＤＦＡの１つの利点は、細胞懸濁液が乾燥すること又は封入液体でカバーすることを必要とせず、顕微鏡検査を容易にすることである。洗浄ステップも必要ではないが、洗浄ステップを含む本発明の実施態様はより低いバックグラウンド信号を持つだろうと考えられる。これらの予備的研究は、染色した単層に対する掻き集められた懸濁液でのＭＡｂ陽性細胞の数の比較に基づいて非常によい感度を実証した。
【０１０９】
本発明のＬＤＦＡ方法は、ＬＤＦＡ対従来のＤＦＡの特異性及び選択性を実証することにより、従来のＤＦＡ方法と比較された：
ｉ）クローン２Ｈ３Ｃ５及びクローンＡ（６）Ｂ１１のインフルエンザＡ型（ＦｌｕＡ）ＭＡｂ組み合わせ；
ｉｉ）クローン８Ｃ７Ｅ１１及びクローン９Ｂ４Ｄ９のインフルエンザＢ型（ＦｌｕＢ）ＭＡｂ組み合わせ；
ｉｉｉ）クローン３Ａ４Ｄ９及びクローン４Ｆ９Ｇの呼吸系ウイルス（ＲＳＶ）ＭＡｂ組み合わせ；
ｉｖ）クローン＃４、クローン＃２３及びクローン＃２８のメタニューモウイルス（ＭＰＶ）ＭＡｂ組み合わせ；
ｖ）クローン８Ｈ２Ｃ９、クローン２Ｈｌ０Ｅ２及びクローン４Ｈ６Ｃ９のアデノウイルス（ＡＤＶ）ＭＡｂ組み合わせ；
ｖｉ）クローン１Ｄ８Ｅ１０及びクローン９Ｆ６１Ｃ９のパラインフルエンザ（ＰＩＶ）ウイルス１  ＭＡｂ組み合わせ；
ｖｉｉ）クローン２Ｅ４Ｄ７及びクローン５Ｅ４Ｅ１１のパラインフルエンザウイルス２  ＭＡｂ組み合わせ；
ｖｉｉｉ）クローン４Ｇ５（１）Ｅ２Ｈ９及びクローン１Ｆ６Ｃ８のパラインフルエンザウイルス３  ＭＡｂ組み合わせ；
ｉｘ）上述のようにプールしたパラインフルエンザ１−３  ＭＡｂｓ及び
ｘ）ｉ）−ｉｘ）の組み合わせた混合物。
代表的な顕微鏡写真は、ＬＤＦＡ対ＤＦＡ結果についてＭＡｂ陽性信号を示す。それぞれ図４及び図５見てください。さらに、単一のＭＡｂアッセイ系では、ウイルスの陽性細胞対ウイルス陰性の細胞のＬＤＦＡ及びＤＦＡ同定を比較する。表３〜８をそれぞれ見てください。
【０１１０】
表３：個々のインフルエンザＡ型試薬と比較した、ＬＤＦＡインフルエンザＡ＆Ｂ試薬を使用する、インフルエンザＡ型ウイルス検出及び同定に関するＬＤＦＡ及びＤＦＡ間の相互相関
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
表４：個々のインフルエンザＢ型試薬と比較した、ＬＤＦＡインフルエンザＡ＆Ｂ試薬を使用する、インフルエンザＢ型ウイルス検出及び同定に関するＬＤＦＡ及びＤＦＡ間の相互相関
【０１１３】
【表４】
2012529009.tif 000006
【０１１４】
表５：個々のＲＳＶ試薬と比較した、ＬＤＦＡインフルエンザＲＳＶ＆ＭＶＢ試薬を使用する、ＲＳＶ検出及び同定に関するＬＤＦＡ及びＤＦＡ間の相互相関
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
表６：個々のＭＶＰ試薬と比較した、ＬＤＦＡインフルエンザＲＳＶ＆ＭＶＢ試薬を使用する、ＭＶＰ検出及び同定に関するＬＤＦＡ及びＤＦＡ間の相互相関
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
表７：個々のパラインフルエンザ試薬と比較した、ＬＤＦＡパラインフルエンザプール及びアデノウイルス試薬を使用する、パラインフルエンザ検出及び同定に関するＬＤＦＡ及びＤＦＡ間の相互相関
【０１１９】
【表７】
2012529009.tif 000009
【０１２０】
表８：個々のアデノウイルス試薬と比較した、ＬＤＦＡインフルエンザパラインフルエンザプール及びアデノウイルス試薬を使用する、アデノウイルス検出及び同定に関するＬＤＦＡ及びＤＦＡ間の相互相関
【０１２１】
【表８】
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【０１２２】
研究は、次のものについて、ＬＤＦＡ対従来のＤＦＡの特異性及び選択性をさらに実証した：
ｉ）クローン１０Ｂ  １２Ｃｌ１及びクローンＡ（６）Ｂ１１（図９Ａ）のインフルエンザＡ型（ＦｌｕＡ）ＭＡｂ組み合わせ、
ｉｉ）クローン８Ｃ７Ｅ１１及びクローン９Ｂ４Ｄ９（図９Ｂ）のインフルエンザＢ型（ＦｌｕＢ）ＭＡｂ組み合わせ、
ｉｉｉ）クローン３Ａ４Ｄ９及びクローン４Ｆ９Ｇ３（図１０Ａ）の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ＭＡｂ組み合わせ、
ｉｖ）クローン＃４、クローン＃２３及びクローン＃２８（図１０Ｂ）のメタニューモウイルス（ＭＰＶ）ＭＡｂ組み合わせ、
ｖ）クローン８Ｈ２Ｃ９、クローン２Ｈ１０Ｅ２及びクローン４Ｈ６Ｃ９（図１１Ａ）のアデノウイルス（ＡＤＶ）ＭＡｂ組み合わせ、
ｖｉ）クローン１Ｄ８Ｅ１０及びクローン９Ｆ６１Ｃ９（図１１Ｂ）のパラインフルエンザ（ＰＩＶ）ウイルス１  ＭＡｂ組み合わせ、
ｖｉｉ）クローン２Ｅ４Ｄ７及びクローン５Ｅ４Ｅ１１（図１２Ａ）のパラインフルエンザウイルス２  ＭＡｂ組み合わせ、
ｖｉｉｉ）クローン４Ｇ５（１）Ｅ２Ｈ９及びクローン１Ｆ６Ｃ８（図１２Ｂ）のパラインフルエンザウイルス３  ＭＡｂ組み合わせ、
ｉｘ）上記に記載のようにプールしたパラインフルエンザ１−３  ＭＡｂｓ（図１３Ａ）及び
ｘ）ｉ）−ｉｘ）の組み合わせ混合物（図１３Ｂ）。
【０１２３】
ある実施態様においては、本発明は、ウイルス特異の抗体を含むＬＤＦＡを行なう方法を意図する。ある実施態様においては、抗体はモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、ウイルス特異的モノクローナル抗体は蛍光標識を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体はＦｌｕＡモノクローナル抗体（つまり、例えば、ＰＥ標識を有する）を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体はＦｌｕＢモノクローナル抗体（つまり例えばＦＩＴＣ標識を有する、）を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体はＲＳＶモノクローナル抗体（つまり、例えば、ＰＥ標識を有する）を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体はＭＰＶモノクローナル抗体（つまり、例えば、ＦＩＴＣ標識を有する）を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体はパラインフルエンザ（つまり、例えば、ＰＩＶ−１、−２及び−３）モノクローナル抗体（つまり、例えば、ＰＥ標識を有する）を含む。ある実施態様においては、蛍光標識されたモノクローナル抗体はアデノウイルスモノクローナル抗体（つまり、例えば、ＦＩＴＣ標識を有する）を含む。
【０１２４】
ある実施態様においては、本発明は、第一ウイルスに向けられた少なくとも１つのＰＥ標識されたモノクローナル抗体及び第二のウイルスに向けられた少なくとも１つのＦＩＴＣ標識されたモノクローナル抗体と単一液体サンプルをインキュベートすることを含むウイルスの少なくとも８（８）を検知し、少なくとも５つの（５）ウイルスを同定する方法に関する。ある実施態様においては、液体試料の第１のアリコートはＰＥ標識インフルエンザＡモノクローナル抗体及びＦＩＴＣ標識インフルエンザＢモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、液体試料の二次のアリコートはＰＥ標識ＲＳＶモノクローナル抗体及びＦＩＴＣ標識ＭＰＶモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、液体試料の第３のアリコートはＰＥ標識ＰＩＶモノクローナル抗体及びＦＩＴＣ標識アデノウイルス・モノクローナル抗体を含む。本発明は、現在利用可能なＤＦＡのものに対して、顕著な有益性がある。なぜなら、本発明は単一の生体サンプルからの３つの（３）アリコートを使用して、少なくとも８つの（８）呼吸系ウイルスを検出し同定することができるからだ。
【０１２５】
ａ．サポゲニン増強方法
ある実施態様においては、本発明は、ウイルスを検出するための液体直接的蛍光測定を意図し、それは固定液又は脱水剤のいずれのインキュベーションを必要としない。これらの固定液及び／又は脱水剤は、ＤＦＡにおいて必要である。なぜなら、顕微鏡で観察し、検査することを容易にするために、ウイルス感染細胞をガラス物質に付着させるからである。ある実施態様においては、本発明の方法は、非固定細胞を含み、液体は、固定液又は非水溶媒（言い換えると、例えば、アルコール、アセトン、アルデヒド、トルエン、等）を含まない。ある実施態様においては、発明は、細胞が界面活性剤を用いて透過性になることを特徴とするＬＤＦＡを意図する。ある実施態様においては、界面活性剤はサポゲニンを含む。発明の機構を理解することは必要ではないが、界面活性剤は、従来の固定液及び脱水剤に比較して、蛍光標識された抗体の改善された細胞透過性を供給すると考えられる。さらにこの改善された蛍光標識された抗体透過性は、ウイルス抗原とかなり高い結合性をもたらすと考えらえれ、それによって、改善された信号強度をもたらす。さらに改善された信号強度はウイルス検出と同定に関して本発明のＬＤＦＡ対現在利用可能なＤＦＡについて等価な感度及び改善された精度を提供すると考えられる。
【０１２６】
サポゲニンを含むサポニンは、脂質ベースの界面活性剤として報告された。サポゲニンは、組織学のスライド調製物での細胞及びサブ細胞形態学の差異を増強することができることとして示唆された。典型的に、そのような組織学調製物は、脱水溶媒（つまり、例えば、トルエン）を使用するが、蛍光標識を使用してもよい。サポゲニンは、ウイルス（つまり、例えば、インフルエンザ）の検出を容易にするためには使用されなかった。Ｆａｒｒｅｌｌら、”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ，”米国特許公報番号２００７／０１７２９１１（本明細書に参照によって組込まれる）。サポニンは、細胞膜を透過性にするためにさらに報告された。インフルエンザウイルスを染色するエバンスブルー及びヨウ化プロピジウムと共に使用されるサポニンは、溶液ベースアッセイにおけるウイルスを検出するのには気づかれなかった。Ｊｏｈａｎｓｅｎら、”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”米国特許公報番号２００８／０１６１３２４（本明細書に参照によって組込まれる）。
【０１２７】
サポニンは界面活性剤様の特性を持ち、泡立て剤のように有用であることが報告された。さらに、サポニンは免疫アジュバントとしてインフルエンザを含むウイルス性ワクチンに使用されてもよく、蛍光標識された場合、細胞表面マーカーを検知することができる。Ｍａｒｃｉａｎｉら、”Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  Ｓａｐｏｎｉｎ  Ａｎａｌｏｇｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，”  米国特許番号５，９７７，０８１（１９９９）、米国特許番号６，２６２，０２９、及び米国特許番号６，０８０，７２５（両者は、本明細書に参照によって組込まれる）。サポニンは、栄養補助食品及び／又は薬剤とくみわせてよい。例えば、サポニンはＨＩＶ複製を抑えてもよい。Ｄｏｂｂｉｎｓら、”Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  Ｓａｐｏｎｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，”米国特許番号６，３５５，８１６（２００２）（本明細書に参照によって組込まれる）。
【０１２８】
ある実施態様においては、本発明は、サポゲニンを含む液体の直接蛍光アッセイ（（ｌｉｑｕｉｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  ａｓｓａｙ）ＬＤＦＡ）を実施する方法を意図する。発明の機構を理解することは必要ではないが、化合物が細胞を固定する代わりに細胞を透過性にするので、サポゲニンには現在知られるＤＦＡ方法に対して著しい長所があると考えられる。さらに透過性上昇は次の有益性を有すると考えられる。それは、
ｉ）穏やかな界面活性剤で感染細胞の処理し、それにより、細胞がタンパク質対比染色及び標識抗体で染色されながら、細胞の３次元構造を維持することを可能にすること、
ｉｉ）細胞膜の脂質部分を可溶性にすること、及び
ｉｉｉ）より大きな色素分子及び抗体が細胞の内部にアクセス可能となること
である。ある実施態様においては、本発明は、ＬＤＦＡを含む方法であって、サポゲニン処理がバックグラウンドノイズを減少し、抗体信号強度を改善することによりウイルス検出と同定を改善することを特徴とする該方法を意図する。
【０１２９】
ＩＩＩ．ポータブル蛍光読取り装置
蛍光顕微鏡法は、目視検査による蛍光に染色された標本の検査を可能とした。しかしながら、全細胞数について蛍光標識された細胞計数の自動化は、速く信頼できる診断情報（つまり、例えば、内部アルゴリズムを有するサイトメーター）のための機会を提供する。ある実施態様においては、本発明は、従来のヘマサイトメーターからのものに比較して優れているデータを作りだす装置を意図する。しかし、それは、主観的な解釈に関連した不安定性を除去する。ある実施態様においては、装置は１つのサンプル当たり１分未満でテスト結果を表示することができる。ある実施態様においては、装置はさらに自動的に細胞の生存率を計算する。
【０１３０】
ある実施態様においては、装置は複数の染色剤と一緒に使用してもよい。ある実施態様においては、汚染剤は、哺乳動物細胞、ハイブリドーマ及びフィコール調製物を含むが、これらに限定されない、多様な有核細胞系を試験することを提供する。ある実施態様においては、染色剤は、細胞計数手順を効率化する蛍光顕微鏡に基づいた画像システムによって検出される。例えば、染色剤は、複数の蛍光標識されたモノクローナル抗体及び核酸染料を含んでもよいが、これらに制限されない。ある実施態様においては、核酸染料は、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ又は臭化エチジウム含むが、これらに制限されない。
【０１３１】
ある実施態様においては、装置は、電荷結合素子が、発光ダイオードによる照明の結果である発光された蛍光を集めることを特徴とする落射照明顕微鏡を含む。ある実施態様においては、装置は、複数のサンプル（つまり、例えば、マルチウェルサンプルスライド）を含む試料トレイを受納するように構成されたサンプル・引き出しを含む。ある実施態様においては、照明は、高強度水銀アーク又は石英ハロゲン電球発光ダイオードによって実施される。蛍光の照明及び収集に続いて、細胞計数は内部アルゴリズムを使用して、画像分析によって作りだされる。ある実施態様においては、装置は、タッチ・スクリーン上に視覚的にテスト結果を表示する。ある実施態様においては、装置が独立貯蔵装置（つまり、例えば、コンピューター）にテスト結果をエクスポートすることができる。
【０１３２】
ある実施態様においては、装置は、
ａ）マルチウェル・スライドグラスの少なくとも１つのマイクロウェルへサンプルをピペッティングする工程、
ｂ）スライド・トレイ上にスライドを載せる工程、及び
ｃ）装置のサンプル・引き出しにスライド・トレイを挿入する工程
を含む方法と互換性をもつ。ある実施態様においては、サンプルは細胞懸濁液及び複数の染色試薬を含む。細胞（生細胞及び死細胞）の合計は染色することで数えられてもよく、例えばチオフラビンＴ、アクリジンオレンジ、非特異性の蛍光染料、又は顕微鏡によって検出できる抗体に付けられた任意の粒子によってである。臭化エチジウムは、死細胞を同定するためにさらに追加され、生細胞の数は減算によって決定する。
【０１３３】
本発明はこの明細書で述べる方法発明の方法に用いることのできる様々な仕組みの使用を意図する。好ましい使用は次のものを含むが、これらに限定されない。
ｉ）約８μｌサンプルのサンプルボリューム、
ｉｉ）ダイナミックレンジ：５×１０４から１×１０７細胞／ｍＬ、
ｉｉｉ）約８−４０ミクロン間の検出できるセル径、
ｉｖ）画面サイズの指定されたボリューム中の標識細胞及び細胞の合計を数えることにより、標識された細胞計数及び％生存度を決定する計算ソフトウェア、
ｖ）例えば、電荷結合素子カメラを有する蛍光顕微鏡、
ｉｖ）２発光ダイオード（ＬＥＤ）＠それぞれ４７０と５３０ｎｍ；
ｖ）１つのテスト当たり約１分の全分析時間、
ｖｉ）６つの（６）イメージ／テストの処理、
ｖｉ）およその寸法：３７．５Ｈｘ２５Ｄｘ３０Ｗｃｍ、
ｖｉｉ）およその重量：９ｋｇ（２０  ｌｂｓ）、
ｖｉｉ）およそ１０−３５℃間の最適な動作温度、
ｖｉｉｉ）およそ２０−８０％の相対湿度間の最適な動作湿度、
ｉｘ）およそ２，０００メーター以内の最適な操作の高度、
またｘ）所要動力：１００−２４０のＶＡＣ、５０−６０Ｈｚ。
図１４を見てください。
【０１３４】
ある実施態様においては、本発明は、複数のサンプルウェル（〜２００μｌ）を含むスライドグラスを意図する。ある実施態様においては、マイクロウェルは入口ポートを含む。ある実施態様においては、マイクロウェルは出口ポートを含む。ある実施態様においては、マイクロウェルは入口ポートと出口ポートを含み、ある実施態様においては、マイクロウェルはカバーガラスによってカバーされる。ある実施態様においては、ポートは１０μｌのピペットチップと互換性をもつ。図１５を見てください。
【０１３５】
ある実施態様においては、第一、第二、第三、及び第四アリコートは、ガラス支持体に独立的に置く。ある実施態様においては、ガラス支持体は少なくとも４つの（４）サンプルウェルを含み、それは独立したサンプルがそれぞれ個別のマイクロウェル内に置かれる。ある実施態様においては、マイクロウェルはそれぞれ側面の入口ポート及び側面の出口ポートを含む。ある実施態様においては、マイクロウェルは常設蓋を含む。
【０１３６】
ＩＶ．装置と方法の統合
ある実施態様においては、本発明は、
ａ）ｉ）複数のサンプルを含むサンプル容器に適合した蛍光性のサイトメトリー、及び
ｉｉ）複数の細胞を含む生物標本
を提供する工程、
ｂ）複数の蛍光染料で細胞を標識する工程、
ｃ）サンプル容器内に標識された細胞を置く工程、及び
ｄ）サイトメトリーを使用して、蛍光用のサンプル容器を検査する工程
を含む方法を意図する。
【０１３７】
ある実施態様においては、本発明は、複数の蛍光信号を区別することができるアルゴリズムを含むマイクロプロセッサーを含む装置を意図する。ある実施態様においては、第一の蛍光信号はＰＥ信号を含み、ある実施態様においては、ＰＥ信号がゴールデンイエロー蛍光染色液として現われる。ある実施態様においては、第二の蛍光信号はＦＩＴＣ信号を含む。ある実施態様においては、ＦＩＴＣ信号がアップルグリーンの蛍光染色液として現われる。ある実施態様においては、第３の蛍光信号はヨウ化プロピジウム信号を含む。ある実施態様においては、ヨウ化プロピジウム信号が赤い蛍光染色として現われる。
【０１３８】
ある実施態様においては、すすがれ、遠心分離機にかけられた液体サンプルは、ガラス支持体を含むサンプル容器に載せられる。ある実施態様においては、ガラス支持体は複数の独立したサンプルを含む。ある実施態様においては、ガラス支持体は、複数の蛍光信号を検出し、評価できるアルゴリズムを含む装置と互換性をもつ。ある実施態様においては、装置は、個々の独立したサンプルからの信号を検出する。
【０１３９】
細胞を調製し、検査する多くの異なる方法があるが、次のプロトコルは、本明細書に示された発明に適した１つの実施例として、詳細に記載される。手短に言えば、器械で読むための標本の処理は次の通りである。鼻咽頭（ＮＰ）綿棒又は吸引されたＮＰ標本は、輸送培地（つまり、例えば、リン酸緩衝生理食塩水；  ＰＢＳ）に置かれる。アリコート（〜１ｍｌ）はペレット成形用の遠心分離管に移される。細胞ペレットは、約０．１ｍｌのＰＢＳの中で再懸濁し、攪拌し、細胞を分散させ、そして次に２５ｕＬのけん濁液を４本の別個のチューブに移し、１滴の蛍光標識された、非免疫マウスＡｂ、ＦｌｕＡ  ＭＡｂ、ＦｌｕＢ  ＭＡｂ及びＲＳＶ  ＭＡｂをそれぞれ加え、１０分間室温で放置した。任意に、これらのＭＡｂ溶液の各々は、細胞浸透性試薬としてサポゲニン、感染したすべてのウイルスの核を対比染色するヨウ化プロピジウム及び感染していないＮＰ細胞も含んでいる。その後、１．５ｍｌのＰＢＳを遠心分離機にかけた各チューブに加え、各上澄みを（それは過剰のＭＡｂ、対比染色及び透過性上昇試薬を含む）デカントする。各細胞ペレットは、ＰＢＳの最小のボリューム中で再懸濁する。マウス抗体のＦｃ部分を結合する細胞を含むいくつかの標本があるので、免疫性がないマウスＡｂはコントロールとして含まる。そのような場合、蛍光標識ＭＡｂを含むすべてのウェルが蛍光性を示し、標本の感染の状態はこの方法によって決定することができない。約ｌ０ｕＬの各４つの懸濁液は、上記に記載されたオーダーで特別のスライドの４つのウェルのへピペットで移される。４つの別個のウェルはカバーガラスによってカバーされ、各々ウェルは各側面で入口ポートを有する。各々ウェルは、約７ｕＬの容量がある。細胞懸濁液を含むスライドは、サイトメーター装置のスライド・トレイに挿入され、その装置では、スライドの整列が最初にチェックされ、次に連続的に５Ｘ対物レンズの下に各ウェルを配置させるように装置内部でスライドを移動させる。例えば、その整列は約９５秒かかってもよく、マイクロウェルはそれぞれ約２分（つまり４つの連続のマイクロウェル読み取りのための合計８分）かかってもよい。器械は少なくとも２つのＬＥＤを含んでよい。第１のＬＥＤは、フルオレセインを励起するために一定波長で光を放射する。第２のＬＥＤは、ヨウ化プロピジウム対比染色を励起する光を放射する。放射光線とＣＣＤの間に置かれた狭い帯域波長フィルターがある。各ウェルにて、フィールドの予定数（例えば、２７のうち、９又は１６）は、ＣＣＤによって捕らえられる両方のＬＥＤ波長で別々に（最初にフルオレセイン、直後にヨウ化プロピジウムが続く）励起され、画像化される。その後、アルゴリズムを用いて、画像を分析し、サイズ及び蛍光標識ＭＡｂとヨウ化プロピジウムの共局在に基づいて、特異的なウイルス感染細胞を同定し、及びサイズとヨウ化プロピジウム染色に基づいて、非感染の細胞を同定する。アルゴリズムは、検査したウェルとフィールドでの感染細胞の数、及び細胞の総数を提供する。４つのウェルの読みとり完了後、スライドは器械から放出される。器械は次の標本含むスライドを操作する準備ができている。
【０１４０】
ある実施態様においては、本発明は公に利用可能なＭＡｂｓの混合物を使用して、ウイルスを検出し同定することを意図する。ある実施態様においては、ウイルスはそれぞれ少なくとも１つの標識されたＭＡｂを使用して検出されてもよい。表９を参照してください。
【０１４１】
【表９】
2012529009.tif 000011
【０１４２】
ある実施態様においては、インフルエンザＡ(ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ)型試薬は、クローン２Ｈ３Ｃ５又はクローンＡ（６）Ｂ１１含む群から選択されるＰＥ標識ＭＡｂの少なくとも１つを含む。ある実施態様においては、インフルエンザＢ(ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ)型試薬は、クローン８Ｃ７Ｅ１１又はクローン９Ｂ４Ｄ９を含む群から選択されるＦＩＴＣ標識ＭＡｂの少なくとも１つを含む。ある実施態様においては、呼吸器合胞体ウイルス(ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ)試薬は、クローン３Ａ４Ｄ９又はクローン４Ｆ９Ｇ３を含む群から選択されるＰＥ標識ＭＡｂの少なくとも１つを含む。ある実施態様においては、メタニューモウイルス試薬は、クローン(ｃｌｏｎｅ)＃４、クローン＃２３又はクローン＃２８を含む群から選択されるＦＩＴＣ標識ＭＡｂの少なくとも１つを含む。ある実施態様においては、パラインフルエンザウイルス１(ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  １)型試薬は、クローン１Ｄ８Ｅ１０又はクローン９Ｆ６１Ｃ９を含む群から選択されるＰＥ標識ＭＡｂの少なくとも１つを含む。ある実施態様においては、パラインフルエンザウイルス２型試薬(ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ２)は、クローン４Ｇ５（１）Ｅ２Ｈ９又はクローン１Ｆ６Ｃ８を含む群から選択されるＰＥ標識ＭＡｂの少なくとも１つを含む。ある実施態様においては、パラインフルエンザウイルス３(ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ３)型試薬は、クローン４Ｇ５（１）Ｅ２Ｈ９又はクローン１Ｆ６Ｃ８を含む群から選択されるＰＥ標識ＭＡｂの少なくとも１つを含む。ある実施態様においては、アデノウイルス(ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ)試薬は、クローン８Ｈ２Ｃ９、クローン２Ｈ１０Ｅ２又はクローン４Ｈ６Ｃ９を含む群から選択されるＦＩＴＣ標識ＭＡｂの少なくとも１つを含む。
【０１４３】
ウイルスの感染細胞を検出する及び同定する多くの異なる方法があるが、次のプロトコルは、本明細書に記載の発明と互換性をもつ１つの実施例として詳細に記載されている。ある実施態様においては、上記に記載されたように調製した標本は、ガラス支持体（つまり、例えば、顕微鏡スライス）上の３つの（３）独立したウェルへ小分けされる。ある実施態様においては、方法は、第１のウェル中のサンプルとインフルエンザＡ型試薬及びインフルエンザＢ型試薬を接触する工程をさらに含む。１つの実施態様では、方法は第二のウェル中のサンプルと呼吸器合胞体ウイルス試薬及びメタニューモウイルス試薬を接触する工程をさらに含む。ある実施態様においては、第３のウェルはパラインフルエンザウイルス１型試薬、パラインフルエンザウイルス２型試薬、パラインフルエンザウイルス３型試薬及びアデノウイルス試薬を含む。ある実施態様においては、方法は第１のウェルにゴールデンイエロー蛍光染色が出現したときにインフルエンザＡ型を検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第１のウェルに赤色染色だけが出現したときにインフルエンザＡ型の非存在を検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第１のウェルにアップルグリーンの蛍光染色が出現したときにインフルエンザＢ型を検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第１のウェルに赤色染色だけが出現したときにインフルエンザＢ型の非存在を検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第２のウェルにゴールデンイエロー蛍光染色が出現したときに呼吸器合胞体ウイルスを検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第２のウェルに赤色染色だけが出現したときに呼吸器合胞体ウイルスの非存在を検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第２のウェルにアップルグリーンの蛍光染色が出現したときにメタニューモウイルスを検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第２のウェルに赤色染色だけが出現したときにメタニューモウイルスの非存在を検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第３のウェルにゴールデンイエロー蛍光染色が出現したときに少なくとも１つのパラインフルエンザウイルスを検出することをさらに含む。ある実施態様においては、少なくとも１つのパラインフルエンザウイルスは、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型又はパラインフルエンザウイルス３型を含む群から選択される。ある実施態様においては、方法は第３のウェルに赤色染色だけが出現したときにいずれのパラインフルエンザウイルスもの非存在を検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第３のウェルにアップルグリーンの蛍光染色が出現したときにアデノウイルスを検出することをさらに含む。ある実施態様においては、方法は第３のウェルに赤色染色だけが出現したときにアデノウイルスの非存在を検出することをさらに含む。
【０１４４】
Ｖ．  抗体
本発明は単離した抗体（つまり、例えば、ポリクローンの又はモノクローンの）を提供する。ある実施態様においては、本発明は、少なくとも５つのアミノ酸残基又は脂質残基で構成されたウイルスのエピトープに特に結合するモノクローナル抗体を提供する。これらの抗体は上記に記述された検出方法に用いる。
【０１４５】
抗体がエピトープを認識することができる限り、本発明のウイルスのエピトープに対する抗体は任意のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体かもしれない。抗体は普通抗体又は抗血清の調製方法による抗原として本発明のタンパク質を使用することにより生産することができる。
【０１４６】
本発明は、モノクローナル及びポリクローナル抗体の両方の使用を意図する。任意の適切な方法は、本明細書に示されたものを含むが、これらに限定されずに、本発明の方法及び組成物の中で使用される抗体を作りだすために使用されてもよい。モノクローナル抗体の調製のために、例えば、タンパク質等、又は適切なキャリアーと一緒のタンパク質又は希釈剤は、抗体の産生を許す条件の下で動物（例えば哺乳動物）に投与される。抗体産生能力の増強のために、完全又は不完全フロイントアジュバントが投与されてもよい。通常は、タンパク質は、２週から６週の間に一度、合計、約２回から約１０回投与される。そのような方法で使用するに適している動物は霊長動物、ウサギ、犬、モルモット、ハツカネズミ、ネズミ、羊、ヤギなどを含むがこれらに限定されない。
【０１４７】
モノクローナル抗体生産細胞の調製のために、最終免疫後２日から５日に、その抗体価が確認された個々の動物（例えばマウス）を選択し、その脾臓又はリンパ節を回収し、そこに含まれる抗体産生細胞は、ミエローマ細胞で融合され、所望のモノクローナル抗体生産ハイブリドーマを調製する。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、以下に記載するように、標識タンパク質と抗血清を反応させることにより、次に、抗体に結合標識薬剤の活性を測定するにより実施する。細胞融合は既知の方法（例えばＫｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  （Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５  ［１９７５］によって記述された方法）によって実行することができる。融合プロモーターとして、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）であり、好ましくは、ＰＥＧを用いる。
【０１４８】
様々な方法は、抗体（例えば本発明のウイルスのエピトープに対する）を生産するハイブリドーマのためのスクリーニングに使用されてもよい。例えば、抗体が直接に又はキャリアーと一緒に吸着される固相（例えばマイクロプレート）にハイブリドーマの上澄みを加え、抗免疫グロブリン抗体（マウス細胞が細胞融合の中で使用される場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が使用される）又は、放射性物質又は酵素で標識されたプロテインＡを固相に結合するタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出するために加える。あるいは、ハイブリドーマの上澄みは、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡが吸着される固相に加えられ、次に、放射性物質又は酵素で標識されたタンパク質を固相に結び付けられたタンパク質に対するモノクローナル抗体を検知するために加える。
【０１４９】
モノクローナル抗体の選択は任意の既知の方法又はその変形によって行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）が加えられる動物細胞用の培地を使用する。ハイブリドーマが培養できる限り、どんな選択及び増殖培地も使用することができる。例えば、１％から２０％、好ましくは１０％から２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１％から１０％のウシ胎児血清を含むＧＩＴ培地、ハイブリドーマの培養用の血清のない培地（ＳＦＭ−１０１（ニッスイ  製薬））などを使用することができる。通常は、培養を２０℃から４０℃まで、好ましくは３７°Ｃにて、約５日から３週間の、好ましく１週から２週間、約５％のＣＯ２ガスの下で実行される。ハイブリドーマ培養の上澄みの抗体価は、抗血清中の抗タンパク質の抗体価に関して上記に記載のような同じ方法によって測定することができる。
【０１５０】
モノクローナル抗体（例えば本発明のウイルスのエピトープに対する）の分離及び精製は、免疫グロブリンの分離及び精製など、従来のポリクローナル抗体のものと同じ方法によって行なうことができ、例えば、塩析、アルコール沈殿、等電点析出法、電気泳動、イオン交換体（例えばＤＥＡＥ）を有する吸脱着、超遠心分離、ゲル濾過、又は抗体だけが、抗原結合固相、プロテインＡ又はプロテインＧなど、活性のある吸着剤で集められ、結合を解離し、抗体を得ることを特徴とする特異的な精製方法である。
【０１５１】
ポリクローナル抗体は、任意の既知の方法又は患者から抗体を得ることを含むこれらの方法の変形によって調製されてよい。例えば、免疫原（タンパク質に対する抗原）及びキャリヤータンパク質の複合体は調製され、上記のモノクローナル抗体調製に関して記載された同じ方法で、動物を複合体で免疫する。抗体を含んでいる物質は、免疫した動物から回復され、抗体を分離し精製する。
【０１５２】
動物の免疫化に使用する免疫原及びキャリヤータンパク質の複合体に関して、ハプテンに対する抗体（それはキャリアー上で架橋され、免疫化に使用される）が、効率的に生産される限り、任意のキャリヤータンパク質、及びキャリアーとハプテンの任意混合割合も使用することができる。例えば、ウシ血清アルブミン、牛のシクログロブリン（ｃｙｃｌｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、キーホールリンペットヘモシニアン(ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ)等は、１部のハプテン当たり約０．１部から約２０部まで、好ましくは約１部から約５部までの重量比のハプテンに結合されてよい。
【０１５３】
さらに、様々な縮合剤は、ハプテンとキャリアーの結合に使用することができる。例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性化エステル、チオール基又はジチオピリジル（ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｙｌ）基を含む、活性化されたエステル試薬などを本発明に用いる。縮合物それ自体又は適切なキャリアー又は希釈剤と一緒に抗体産生をさせる動物の部位へ投与する。抗体産生能力の増強のために、完全又は不完全フロイントアジュバントを投与してよい。通常は、タンパク質は、２週から６週の間に一度、合計、約３回から約１０回、投与される。
【０１５４】
ポリクローナル抗体は、上記の方法によって免疫化した動物の血液、腹水などから回収する。抗血清中の抗体価はハイブリドーマ培養の上澄みに関して上記に記述されたそれと同じ方法によって測定することができる。抗体の分離及び精製は、上記のモノクローナル抗体に関して記載のように免疫グロブリンの同じ分離及び精製方法によって行なうことができる。
【０１５５】
免疫原として本明細書に使用されるタンパク質は、免疫原の任意の特別の型に制限されない。例えば、ウイルス感染（ヌクレオチド配列を部分的に変更する遺伝子をさらに含んで）に起因して表現されたタンパク質は、免疫原として使用することができる。さらに、タンパク質のフラグメントを使用してもよい。フラグメントは、遺伝子のフラグメント、タンパク質の酵素のプロセッシング、化学合成などの表現を含むが、これらに限定されないどんな方法によって得てもよい。
【０１５６】
本発明は任意の抗体を用いて実施してよい。上記に記載のように、好ましい抗体は、ハイブリドーマ細胞培養から生産するモノクローナル抗体を含む。ある実施態様においては、本発明は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞培養を意図し、ここで前記モノクローナル抗体は、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、サイトメガロウイルスＩＥ、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３、重症急性呼吸器症候群ウイルス、コクサッキーウイルスＢ３  ＶＰｌＰａｎ−ＥＶ、ポリオウイルス１  ＶＰｌ  Ｐａｎ−ＥＶ、腸内ウイルス７０特異性、腸内ウイルス７１特異性、腸内ウイルス７１／コクサッキー  Ａｌ６  二重特異性、ボカウイルス及びヒト乳頭腫ウイルスを含む群から選択されるウイルス由来のウイルス抗原に特異親和性があるがこれらに限定されない。ある実施態様においては、本発明は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞培養を意図し、ここで、モノクローナル抗体は、クラミジア、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、グループＡ連鎖球菌、及びグループＢ連鎖球菌を含む群から選択されるバクテリア由来の細菌抗原に特異親和性を有するがこれらに限定されない。ある実施態様においては、本発明は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞培養を意図し、ここで、モノクローナル抗体にはニコチン又はコチニンを含む群から選択される小さな有機分子に特異親和性があるがこれらに限定されない。
【０１５７】
Ａ．インフルエンザＡ型／呼吸器系ウイルス・モノクローナル抗体
ある実施態様においては、本発明は、質的にインフルエンザＡ型ウイルス抗原を検出でき同定できる特異的なモノクローナル抗体を意図する。ある実施態様においては、本発明は、インフルエンザＢ型ウイルス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、アデノウイルス抗原及びパラインフルエンザウイルス型１、２及び３の抗原を含む群から選択されるウイルス抗原のスクリーニングができる特異的なモノクローナル抗体を意図する。ある実施態様においては、検出及び／又はスクリーニングは、呼吸器系の生物標本に由来の細胞を直接に試験することを含む。ある実施態様においては、検出及び／又はスクリーニングは、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）を使用して用いる免疫蛍光法によって細胞培養物の中で行う方法を含む。
【０１５８】
ある実施態様においては、ＭＡｂｓは、複数のウイルス抗原に特異的なマウスＭＡｂｓを含むキットの中で提供される。ある実施態様においては、インフルエンザＡ型ウイルスのＭＡｂｓは、Ｒフィコエリトリン（つまり、例えば、ゴールデンイエロー蛍光を発光する）で直接に標識付される。ある実施態様においては、インフルエンザＢ型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス型１、２及び３のＭＡｂｓは、フルオレセインイソチオシアネート（つまり、例えば、アップルグリーンの蛍光を発光する）で直接に標識付けされる。発明の機構を理解することは必要ではないが、これらのＭＡｂｓはこれらのウイルスの質的及び定量的検出をもたらすと考えられる。
【０１５９】
ある実施態様においては、本発明は、臨床の及び／又は生物の標本、又は細胞培養由来の細胞を単離することを含む方法を意図する。ある実施態様においては、細胞を処理し、染色し、標識化する。ある実施態様においては、標識化により、インフルエンザＡ型ウイルス感染細胞がゴールデンイエロー蛍光となる。ある実施態様においては、標識化により、インフルエンザＢ型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス又はパラインフルエンザウイルス型（１−３）感染細胞がアップルグリーンの蛍光となる。
【０１６０】
１．ハイブリドーマ開発
ある実施態様においては、本発明は、ＭＡｂ  ２Ｈ３Ｃ５を含む組成物を意図する。ある実施態様においては、組成物はさらにＭＡｂ  １０Ｂ１２Ｃｌ１を含んでよい。ある実施態様においては、組成物は、Ａ（６）Ｂ１１  ＭＡｂを含んでもよい。ある実施態様においては、ＭＡｂｓはマウス・ハイブリドーマを含む哺乳類ハイブリドーマの中で生産されてもよいが、これらに限定されない。表１０を見てください。
【０１６１】
【表１０】
2012529009.tif 000012
【０１６２】
発明のメカニズムを理解することは必要ではないが、最も高い抗原親和性があるＭＡｂｓは最も明るい蛍光染色を与えるだろうと考えられる。ある実施態様においては、本発明は、感染細胞培養上で間接の蛍光性のアッセイ（ＩＦＡ）を使用して、高親和性ＭＡｂｓでハイブリドーマを生産するＭＡｂをスクリーニングすることを含む方法を意図する。例えば、インフルエンザＡ型ウイルスは、Ｒ−Ｍｉｘ（商標）（ダイアグノスティック  ハイブリット社、Ａｔｈｅｎｓ、ＯＨ）９６のウェル・プレートの細胞単層上に接種をし、３５°から３７℃にて２４時間培養した。その後、細胞は、アセトンで固定し、洗浄し、加湿インキュベーターの中で３０分間ハイブリドーマ細胞上清と３５°から３７℃でインキュベートした。細胞は、再度洗浄し、次に、３０分間ＦＩＴＣ標識ヤギ抗‐マウス抗体と加湿インキュベーターの中で３５°から３７℃でインキュベートした。得られた染色は開発工程（つまり、例えば、小スケールの精製及び直接標識）の次のステップへ進むために最良のクローンを選ぶために使用された。
【０１６３】
このようにスクリーニングされ選別されたハイブリドーマにより、特異的なアイソタイプの同定をもたらした。例えば、マウス免疫化に使用された１つの免疫原は市販の羊水（Ｒ０２３０２；  バイオデザイン（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ））から精製した、インフルエンザＡ型抗原（テキサス（Ｔｅｘａｓ）  １／７７、Ｈ３Ｎ２）だった。表１１を見てください。
【０１６４】
【表１１】
2012529009.tif 000013
【０１６５】
２．モノクローナル抗体精製
次に、上記に生産されるようなハイブリドーマ・モノクローナル抗体を高速蛋白質液体クロマトグラフィー（Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＰＬＣ））を使用して、プロテインＧ親和性によって細胞培養上清から精製した。ＭＡｂ純度を、内部品質管理基準が、少なくとも９０％の最小純度を保証するＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。
【０１６６】
さらに、得られた精製ＭＡｂｓを変性条件の下にて４％から２０％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動・ゲル上で分離した（図６）。ＭＡｂｓの各々の純度はデンシトメトリーの走査により決定された。表１２を見てください。
【０１６７】
【表１２】
2012529009.tif 000014
【０１６８】
データは、個々の代表的なＭＡｂの純度が最低の品質管理９０％の純度条件を上回ったことを示し、すべてのＭＡｂｓの純度は約９９．７〜１００％の間の範囲であった。
【０１６９】
３．モノクローナル抗体結合親和性
様々なウイルス抗原のＭＡｂｓの相対親和性をＥＬＩＳＡアッセイによって以下のように決定した。
ｉ）Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得られたウイルス感染細胞（つまり、例えば、インフルエンザＡ型（テキサス／１／７７  Ｈ３Ｎ２））の溶解物は、９６のウェル・マイクロタイタープレートにコーティングするために使用した。
ｉｉ）二倍階段希釈法で希釈したＭＡｂｓを各プレート上でインキュベートした。
ｉｉｉ）固定されたウイルス抗原への各ＭＡｂの結合性は、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用することにより検出した。
アッセイの結果を次に示す。
インフルエンザＡ型への
ｉ）  ＭＡｂ（１０Ｂ１２Ｃ１１）；
ｉｉ）ＭＡｂｓ  ２Ｈ３Ｃ５；及び
ｉｉｉ）  ＭＡｂ  Ａ（６）Ｂ１１
の結合親和性は、２Ｈ３Ｃ５が、〜０．０１３  ｎＭの、１０Ｂ１２Ｃ１１が、〜０．３６  ｎＭの、及びＡ（６）Ｂ１１が〜０．９６  ｎＭのｋＤａ値に対応する結合親和性を示した。インフルエンザＡ型ウイルスＭＡｂ  ２Ｈ３Ｃ５の結合親和性は、１０Ｂ１２Ｃｌ１  ＭＡｂ及び／又はＡ（６）Ｂ１１  ＭＡｂｓより２−１０倍高いオーダーだった。ある実施態様においては、２Ｈ３Ｃ５  ＭＡｂは、インフルエンザＡ型抗原への特異親和性を含む。
【０１７０】
４．モノクローナル抗体特徴付け
様々な方法を本発明のインフルエンザＡ型ウイルスＭＡｂｓを特徴づけるために使用した。表１３を見てください。
【０１７１】
【表１３】
2012529009.tif 000015
【０１７２】
データは２Ｈ３Ｃ５及びＡ（６）Ｂ１１が両方ともインフルエンザＡ型を検出することができたことを示す。
【０１７３】
ａ．分析感度
代表的なＭＡｂｓの分析感度をインフルエンザＡ型ウイルスを使用して評価した。例えば、菌株ビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（Ｈ３Ｎ２；  ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２２）を使用した。この測定では、２枚の９６‐ウェル細胞培養プレートに０．２ｍL接種物あたり１．０の５０％組織培養感染量（１．０ＴＣＩＤ５０）レベルに希釈したインフルエンザＡ型ウイルスを接種した。プレートを２４時間３５℃から３７℃にてインキュベートし、次に、染色した。アッセイを４回行った。（９６からの）平均３５の陽性のウェルが、ＭＡｂ  ２Ｈ３Ｃ５及びＭＡｂ  Ａ（６）Ｂ１１の組み合わせで検出された。同様に、（９６からの）平均３５の陽性のウェルが、ＭＡｂ  １０Ｂ１２Ｃｌ１及びＭＡｂ  Ａ（６）Ｂ１１の組み合わせで検出された。表１４を見てください。
【表１４】
2012529009.tif 000016
【０１７４】
データは、１．０ＴＣＩＤ５０では、両方のＭＡｂ組み合わせが明確にインフルエンザＡ型ウイルス感染細胞を同定したことを示す。
【０１７５】
ｂ．検出限界
分析検出範囲は、各ＭＡｂの組み合わせごとに決定した。例として２Ｈ３Ｃ５／Ａ（６）Ｂ１１  ＭＡｂの組み合わせを使用した。アッセイ条件は、上記に記載されたものと似ていた。結果は、異なるやり方（細胞単層当たりの蛍光細胞の数）で報告された。例えば、インフルエンザＡ型ウイルス（ビクトリア）ストック・ウイルス調製物を接種物当たり３５９ＴＣＩＤ５０の値に希釈し、それから、２倍階段稀釈を、最終計算値が０．７ＴＣＩＤ５０になるまで行った。それぞれウイルスの稀釈液を、シェル・バイアル中のＲ−Ｍｉｘ（商標）細胞の６つの融合性単層に接種し、６０分間７００ｘｇで遠心分離機にかけ、４８時間３５°から３７°Ｃにてインキュベートした。
【０１７６】
２Ｈ３Ｃ５／Ａ（６）Ｂ１１  ＭＡｂの組み合わせ又は１０Ｂ１２Ｃ１１／Ａ（６）Ｂ１１  ＭＡｂの組み合わせは、９６‐ウェル・プレートの個々のウイルスの稀釈の３つのシェル・バイアルを染色するために用いた。測定を３回繰り返して行ない、ウェル当たりの陽性細胞の数を数えた。蛍光細胞を示されたウイルス稀釈液にて各カバーガラス上で数えた。
【０１７７】
【表１５】
2012529009.tif 000017
【０１７８】
データは、１．４と０．７ＴＣＩＤ５０の間で検出された最小のウイルスの稀釈液を用いて、両方の蛍光抗体染色の組み合わせが比較可能な限界まで実施できたことを示す。
【０１７９】
５．ウイルス・モノクローナル抗体の性能
ある実施態様においては、本発明はＦＩＴＣ又はＲ−ＰＥを含むが、これらに限定されない蛍光性の部分で標識されたウイルスのモノクローナル抗体を意図する。ある実施態様においては、蛍光標識ＭＡｂは蛍光性のアップルグリーンの色を示す。ある実施態様においては、フィコエリトリン標識ＭＡｂは蛍光性のゴールデンイエローを示す。発明のメカニズムを理解することは必要ではないが、標準ＦＩＴＣフィルターが取り付けられた顕微鏡を通して観察する時、両方の蛍光色は蛍光顕微鏡上でセットされた同じＦＩＴＣフィルターを使用して視覚化されうると考えられる。
【０１８０】
ある実施態様においては、インフルエンザＡ型ウイルスに特異性を有する第一ＭＡｂは、Ｒ−ＰＥ（ゴールデンイエロー）で標識化され、及びインフルエンザＢ型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス１、２及び３型に特異性を有する第二ＭＡｂは、ＦＩＴＣ（アップルグリーン）で標識される。ある実施態様においては、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスと呼吸系ウイルスを区別することができる第１のＤＦＡキットを意図し、ここで、インフルエンザＡ型ウイルスによって感染した細胞はゴールデンイエローに染色される（図８Ａ）。ある実施態様においては、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルス病巣及び呼吸系ウイルス病巣を区別することができる第二のＤＦＡキットを意図し、ここで、インフルエンザウイルスよって感染した細胞はアップルグリーンに染色される（図８Ｂ）。また、第１又は第２のいずれかのＤＦＡキットにおいては、インフルエンザＢ型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス及びパラインフルエンザウイルス１、２及び３型で感染させた細胞は、アップルグリーンに染色される。ある実施態様においては、インフルエンザＡ型ウイルスＭＡｂは複数のインフルエンザＡ型株に対して特異性を持っている。発明のメカニズムを理解することは必要ではないが、蛍光染色ウイルス病巣は、蛍光標識された特異抗体を使用して染色された時蛍光を発する、１個の細胞又は一群の隣接細胞のいずれかであると考えられる。さらにインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型及びアデノウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスは、生存可能な感染性ウイルス当たりわずか１つ又は少数の蛍光染色細胞しかもたらさないと考えられる。
【０１８１】
６．交差反応性テスト
２Ｈ３Ｃ５／Ａ（６）Ｂ１  ＩＭＡｂの組み合わせは、呼吸系ウイルスのためにテストする間に、感染性の生物体又は汚染物質のいずれかとして出会うかもしれない多くの微生物（つまり、例えば、ウイルス及び／又はバクテリア）に対する交差反応性のために評価された。
【０１８２】
交差反応性試験のためのストリンジェントな条件を微生物の高力価及びＭＡｂｓの高濃度の使用により達成した。特定のウイルスに依存して、接種物当たり７１―１，４００ＴＣＩＤ５０を試験に用いた。６．４ｘｌ０４から２．９３ｘｌ０７／１０μＬの範囲のコロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ）（ＣＦＵ）のバクテリアを試験した。
【０１８３】
結合したＭＡｂｓは、臨床実験レジメン中の使用より高い濃度（つまり、例えば１．５Ｘ）で使用されたが、「信号」と一般的なバックグラウンドを区別することができる限度で十分に低くした。ある非特異性のバックグラウンド「グロー」はあったが、１．５Ｘ濃度で、特異的に感染した標的は１Ｘ濃度と等しい「明るい」標的を示した（つまり、例えば、消光はより高い濃度で観察されなかった）。
【０１８４】
いくつかの微生物を例えば米国培養菌保存施設（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から商業的に購入した。６６の（６６）ウイルス株、１７の宿主細胞培養型、２５のバクテリア(ｂａｃｔｅｒｉａ)、３のバクテリアのクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ）、１つの酵母(ｙｅａｓｔ)及び１つの原虫類(ｐｒｏｔｏｚｏａ)培養物は、既知のプロテインＡ生産バクテリアである黄色ブドウ球菌（Ｃｏｗａｎ菌株）含み、特異性と交差反応性とが検査された。これらの微生物を推奨プロトコルに従って培養し、凍結保存物を調製した。
【０１８５】
微生物の量は、蛍光信号が蛍光顕微鏡を使用して、検査によって容易に検出されるだろうということを保証するために選択された。特定のウイルスによって、７１‐１，４００ＴＣＩＤ５０のウイルスの接種物をシェル・バイアル又はマルチウェルプレート細胞培養に接種し、２４〜４８時間インキュベートし、１＋から３＋の細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）（ＣＰＥ）をつくり、処理し、１．５Ｘ試薬で染色した。染色された細胞を２００Ｘ拡大で検査した。バクテリアを培養し、懸濁液として処理し、次に１０μＬドット中６．４ｘ１０４から２．９３ｘ１０７／ウェルの範囲のＣＦＵでスライドグラス上にスポットし、次に、１．５Ｘ  ＭＡｂｓ調製物で染色した。染色スライドを４００Ｘ拡大で試験した。いくつかの微生物をポジティブコントロールとしてアッセイに使用する目的で、スライドグラスを調製するような外部ソースから調達した。細胞培養を無傷の単層又はアセトン−固定細胞・スポットとして試験した。試験されたセルラインは呼吸系ウイルスを検出するために通常使用されるものだった。
【０１８６】
個々の試験されたウイルス株について、対象試薬で観察された交差反応性はなかった。ＤＦＡ試薬ポジティブコントロールの各々は、陽性の結果を示す明るい蛍光を示す一方、その試薬は視覚的に蛍光性のない赤いエバンスブルー対比染色だけを示した。非感染細胞培養系統はいずれも蛍光も重要なバックグラウンド染色も示さない。ウイルスの交差反応性試験の２Ｈ３Ｃ５／Ａ（６）Ｂ１１  ＭＡｂの組み合わせの結果をまとめる（表１６）。
【０１８７】
【表１６】
2012529009.tif 000018
2012529009.tif 000019
2012529009.tif 000020
【０１８８】
２Ｈ３Ｃ５／Ａ（６）Ｂ１１  ＭＡｂの組み合わせはウイルスの標的−特異的感染細胞と反応的であると明らかとなった。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）での反応性は、ほぼ確実に、黄色ブドウ球菌によって生産されたプロテインＡによるＭＡｂｓの特異的結合による。試験された他のすべての微生物、又は非感染細胞では、陽性の蛍光性の細胞がないこと又は高いバックグラウンド蛍光がないことによって示されるように、反応性は示されなかった。
【０１８９】
他のすべての培養が陰性だったけれども、黄色ブドウ球菌の染色は蛍光の小さな点として現われる。発明のメカニズムを理解することは必要ではないが、黄色ブドウ球菌によって生産されたプロテインＡはいくつかの蛍光標識モノクローナル抗体のＦｃ部分を結合しうると考えられている。さらに、そのような結合は、形態学（つまり、例えば、黄色ブドウ球菌‐結合蛍光が、小さく（〜１ミクロン直径）明るいドットとして現われる）に基づいて、ウイルス抗原結合と識別することができると考えられる。従って、偽陽性は細菌汚染を有する細胞培養の中に存在し得る。
【０１９０】
バクテリアのＣＦＵ確認のために接種を受けたプレートは次の結果を得た。情報は、ｍＬ当たりのＣＦＵとして表され、０．０１ｍLを試薬が試験される各スライドウェルにドットするために使用した。マイコプラズマ試験及び商業的に試験されたスライドの結果をリストし要約する（表１７）。
【０１９１】
【表１７】
2012529009.tif 000021
【０１９２】
それぞれの試験されたバクテリアは、対象試薬を有する２００又は４００Ｘ拡大で観察された蛍光はなかった。黄色ブドウ球菌はある少しの蛍光を示す。しかし、それはＭＡｂを結合するプロテインＡによると推測される。
【０１９３】
７．安定性試験
２Ｈ３Ｃ５／Ａ（６）Ｂ１１  ＭＡｂの組み合わせの保存可能期間は、少なくとも１２か月として確立されていた。安定性試験は、約２°から８°Ｃの間の範囲の温度でＭＡｂの組み合わせを保存することにより行なわれる。様々なウイルスに感染したＲ−Ｍｉｘ（商標）細胞はヒト呼吸器系ウイルスで培養された（表１８）。
【０１９４】
【表１８】
2012529009.tif 000022
【０１９５】
性能試験が、保管中に様々な時間間隔で行い、ｐＨ、色及び清澄性を含むが、これらに限定されずに特性をモニターされた。それぞれアッセイは、「原液」そして１／１６稀釈液、それから１／２稀釈液、１／２５６希釈液までＭＡｂ結合体のそれぞれの希釈系列で実行した。判定基準は、少なくとも１／１６稀釈液を使用して、固定した、染色した、感染細胞において観察される「明るい蛍光」である。表１９を見てください。
【０１９６】
【表１９】
2012529009.tif 000023
【実施例】
【０１９７】
実施例Ｉ
インフルエンザＡ型ウイルスのＬＤＦＡ検出
二重のＲ−Ｍｉｘ（商標）ｓｖ／ｃｓ細胞培養単層は、インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／Ｈ３Ｎ２）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ）のいずれかの一連の４つの（４）１０倍の階段希釈（つまり、サンプルとして指定された：４＋、３＋、２＋及び１＋）と接種してネガティブコントロール（ＮＣ）と比較した。約２２（２２）時間ウイルス複製を可能とするために、感染した培養物は、シェル・バイアル内のカバーガラス上で培養された。
【０１９８】
培地を各ウイルス・セットの４＋、１＋及びＮＣシェル・バイアルから吸引した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；  ２００μｌ）を各シェル・バイアルに加えた；及び、単層はカバーガラスからこすり取られ、標識された１．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離管に移された。アセトン（１００％；  ８００μｌ）を、最終ボリュームが１ｍｌまでになるように各遠心分離管に加え、８０％のアセトン／細胞懸濁液溶液を作成した。この溶液を約１０分間室温にてインキュベートし、細胞を透過性にした。
【０１９９】
その後、透過性になった細胞をＣａｒｌのマイクロチューブ遠心分離機の中で６分間４０００ｒｐｍにて遠心分離機にかけ、採取した。その後、チューブをそれぞれ吸引し、液体をすべて除去した。蛍光標識インフルエンザＡ  ＭＡｂ又は蛍光標識ＨＳＶ−Ｉ  ＭＡｂ（２００μｌ）を適切なチューブに加えた。その後、各細胞ペレットをＭＡｂ溶液で再懸濁し、１時間３５から３７℃でインキュベートした。
【０２００】
ＭＡｂインキュベーションの後に続き、チューブを、マイクロチューブ遠心分離機の中で６分間４０００ｒｐｍにて遠心分離機にかけた。その後、各チューブを吸引し、ＭＡｂ溶液を除去し、細胞をＰＢＳ（２０μｌ）中で再懸濁した。各細胞懸濁液のアリコート（１０μｌ）をそれぞれのスライド上に置き、次に、ワイドパス（ｗｉｄｅｐａｓｓ）バンドＦＩＴＣフィルター（１００Ｘ拡大）上で見た。
【０２０１】
実施例ＩＩ
臨床吸引液中のデュエット（Ｄｕｅｔ）ＭＡｂウイルス・スクリーニング
鼻汁標本を患者から集めた。各標本のアリコートはＡ／Ｂチューブ；Ｒ／Ｍチューブ；あるいはＰ／Ａｄチューブに入れた（Ａ−インフルエンザＡ型；Ｂ−インフルエンザＢ型；Ｒ―呼吸系ウイルス；Ｍ−メタニューモウイルス；Ｐ−パラインフルエンザウイルス；Ａｄ−アデノウイルス）。
１．各チューブに細胞懸濁液の７０μｌを加える。
２．対応するＭＡｂの２滴を加える。
３．５分間３５°Ｃから３７°Ｃでインキュベートする。
４．１．５ｍｌのＰＢＳで洗う。
５．２０００ｘｇにて２分間遠心分離する
６．ホールピペットで上清を吸引する
７．各チューブに２０μｌの再懸濁緩衝液を加える。
８．スライドに充填する。
【０２０２】
実施例ＩＩＩ
ＭＡｂ交差反応性：材料のリスト
下記は、実施例ＩＶ及びＶに従って、本明細書に記載された交差反応性試験に用いる材料とロット番号のリストである。
【０２０３】
材料    ロット番号
R-Mix  培養物（Cultures）(A549及びMv1  Lu細胞)    960309
MRC-5  シェル・バイアル（Shell  Vials）    C510328A
H&V  混合培養物（Mix  Cultures）  (MRC-5  及び  CV-1  細胞)    980309
RM-03T  リフィード培地（Refeed  Medium）    011206A
RM02  リフィード培地（Refeed  Medium）    110905A
010306A
HSV-1  DFA  コントロール株    013105
HSV-2  DFA  コントロール株    013105A
インフルエンザＡ（Influenza  A）  DFA  コントロール株    061505A
インフルエンザＢ（Influenza  B）  DFA  コントロール株    060205B
アデノウイルス（Adenovirus）  DFA  コントロール株    041205D
パラインフルエンザ１（Parainfluenza  1）  DFA  コントロール株  081205Pl
パラインフルエンザ２（Parainfluenza  2）  DFA  コントロール株  040505P2
パラインフルエンザ３（Parainfluenza  3）  DFA  コントロール株  052705P3
RSV  DFA  コントロール株    052505R
CMV  IFA  コントロール株    031804
ケミコン（Chemicon）  VZV  DFA  コントロール株  24100183CE  
アデノウイルス（Adenovirus）
ATCC  VR-1  タイプ1    061704J
ATCC  VR-3  タイプ3    112701A
ATCC  VR-5  タイプ5    070505
ATCC  VR-1083  タイプ6    111201A
ATCC  VR-7  タイプ7    112701C
ATCC  VR-1087  タイプ10    111201B
ATCC  VR-14  タイプ13    112701E  
ATCC  VR-15  タイプ14    033104
ATCC  VR-19  タイプ18    011702A
ATCC  VR-1109  タイプ31    011702B
ATCC  VR-931  タイプ40    012802
ATCC  VR-930  タイプ41    012802A
インフルエンザＡウイルス（Influenza  A  Virus）
ATCC  VR-547  A2/Aichi/2/68  株    061704O
ATCC  VR-98  A/MaI/302/54  株    061704D
ATCC  VR-544  A/Hong  Kong/8/68  株    040104
ATCC  VR-546  Al/Denver/1/57  株    061704P
ATCC  VR-810  A/Port  Chalmers/1/73  株    061704C
ATCC  VR-822  A/Victoria/3/75  株    080204
ATCC  VR-897  A/New  Jersey/8/76  株  110404  
ATCC  VR-  1520  A/WS/33  株    061704B
ATCC  VR-  1469  A/PR/8/34  株    061704Q
インフルエンザBウイルス（Influenza  B  Virus）
ATCC  VR-790  B/Russia/69  株    041105  
ATCC  VR-295  B/Taiwan/2/62  株    061704E  
ATCC  VR-103  B/GL/1739/54  株    061704F  
ATCC  VR-523  B/Mass/3/66  株    093004A  
ATCC  VR-296  B/Maryland/1/59  株    041105  
ATCC  VR-823  B/Hong  Kong/5/72  株    093004B  
JH-OOl  Isolate,  Cell  Culture  Adapted    061704R
RSV
ATCC  VR-1401  RSV  B  Wash/18537/'62  株    042204W
ATCC  VR-26  Long  株    042204L
ATCC  VR-955  9320  株    0617041
パラインフルエンザ１型ウイルス（Parainfluenza  1  Virus）
ATCC  VR-94  C-35  株    061704L
パラインフルエンザ２型ウイルス（Parainfluenza  2  Virus）
ATCC  VR-92  Greer  株    061704M
パラインフルエンザ３型ウイルス（Parainfluenza  3  Virus）  
ATCC  VR-243  C  243  株    061704N
パラインフルエンザ４型ウイルス（Parainfluenza  4  Virus）
ATCC  VR-  1378  M-25  株    112701U  
ATCC  VR-1377  CH  19503  株    112701V  
メタニューモウイルス（Metapneumovirus）  
サブグループ（Subgroup）A1    110905  
サブグループ（Subgroup）A2    110805  
サブグループ（Subgroup）B1    111105  
サブグループ（Subgroup）B2    110405
コロナウイルス（Coronavirus）
ATCC  VR-740  229E  株    121903
ATCC  VR-1558  OC43  株    041204B
ライノウイルス（Rhinovirus）39
ATCC  VR-340  209  ピコルナウイルス（Picornavirus）株    112701EE
HSV-I
ATCC  VR-733  F  (1)  株    052405
ATCC  VR-539  Maclntyre  株    071005
HSV-2
ATCC  VR-540  MS  株    112701Y
ATCC  VR-734  G  株    052605
CMV
ATCC  VR-977  Towne  株    011503  
ATCC  VR-807  Davis  株    062005  
ATCC  VR-538  Ad-169  株    052705
VZV
ATCC  VR-916  Webster  株    040504
ATCC  VR-1367  Ellen  株    050903
エコーウイルス（Echovirus）
エコー（Echo）4、6、9、11、30、及び34を有するビオンエンタープライジス（Bion  Enterprises）エコーウイルス（Echovirus）パネル抗原（Panel  Antigen）コントロール・スライド（Control  Slide）    QEC-0008
コクサッキーウイルス（Coxsackie  virus）
コクサッキー（Coxsackie）B１、B2、B3、B4、B5及びB6を有するビオンエンタープライジス（Bion  Enterprises）  コクサッキー（Coxsackie）  グループ  B  抗原コントロールスライド    QCB-0011
ムンプスウイルス（Mumps  Virus）  
ビオンエンタープライジス（Bion  Enterprises）  ムンプス（Mumps）抗原コントロールスライド    QMU-0308
麻疹ウイルス（Rubeola  (Measles)  Virus）  
ビオンエンタープライジス（Bion  Enterprises）  麻疹（Rubeola）  抗原コントロールスライド    QME-0424  
交差反応性のために試験した細胞セルライン（Cell  Lines）
RD  (ヒト横紋筋肉腫（Human  Rhabdomyosarcoma）)    C760908
MvI  Lu  (ミンク肺（Mink  Lung）)    C580915
LLC-MK2  (アカゲザル腎臓（Rhesus  Monkey  Kidney）)    C860928S
MRHF  (ヒト包皮線維芽細胞（Human  Foreskin  Fibroblast）)    C440912  
NCI-H292  (ヒト肺粘表皮癌（Human  Pulmonary  Muco-Epidermoid  Carcinoma))    C590929  
BGMK  (バッファローミドリザル腎臓（Buffalo  Green  Monkey  Kidney）)  C530914  
MDCK  (メイディン・ダービー・イヌ腎臓（Madin-Darby  Canine  Kidney）)  C830921S  
pRHMK  (初代アカゲザル腎臓（Primary  Rhesus  Monkey  Kidney）)  CA490922
pRHMK  II  (3歳未満のpRHMK)    A490909YS  
MRC-5  (ヒト杯肺線維芽細胞（Human  Embryonic  Lung  Fibroblast）)  C510920  
HEp-2  (ヒト表皮癌（Human  Epidermoid  Carcinoma）)  C570914  
pRK  (初代ウサギ腎臓（Primary  Rabbit  Kidney）)  480909  
pCMK  (初代マカクザル腎臓（Primary  Cynomolgus  Monkey  Kidney）)  A470907  
A549  (ヒト肺癌（Human  Lung  Carcinoma）)  C560921  
R-Mix  (MvILu及びA549混合細胞)  C960922  
WI-38  (Human  Embryonic  Lung  Fibroblasts)  850913  
Vero  (アフリカミドリザル腎臓（African  Green  Monkey  Kidney）)  C840914S
他の微生物/培養培地
ATCC  15531  マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma  pneumoniae）  031404  
ATCC  23114  マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma  hominis）  031404  
ATCC  23714  マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma  orale）  031404  
ATCC  23064  マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma  salivarium）  031404  
ATCC  27618  ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma  urealyticum）  031404  
ATCC  23206  アコレプラズマ‐ライドラウィー（Acholeplasma  laidlawii）  031404  
ATCC  10580  ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Bordetella  bronchiseptica）  031404  
ATCC  10380  百日咳菌（Bordetella  pertussis）  031404  
ATCC  33152  レジロネラ・ニューモフィラ（Legionella  pneumophila）  031404  
ATCC  8176  モラクセラ・カタラーリス（Moraxella  cartarrhalis）  031404  
ATCC  19409  コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium  diphtheriae）  031404  
ATCC  9006  ヘモフィリス・インフルエンザエ・タイプA（Haemophilis  influenzae  Type  A）  031404  
ATCC  33495  クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella  pneumoniae）  031404  
ATCC  9027  緑膿菌（Pseudomonas  aeruginosa）  031404  
ATCC  10813  ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus  pneumoniae）  031404  
ATCC  9898  化膿連鎖球菌（Streptococcus  pyogenes）  031404  
膣トリコモナス（Trichomonas  vaginalis）スライド  25030319CE  
クラミジア・シッタシ（Chlamydia  psittaci）  スライド  FP-I2-050218  
クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia  pneumoniae）  スライド  CP-0176  
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia  trachomatis）  スライド  052705  
ガードネレラ・バジナリス（Gardnerella  vaginalis）  410721  
サルモネラ・ミネソタ（Salmonella  minnesota）(エンテリティデス（enteriditi）)  3457511  
淋菌（Neisseria  gonorrhoeae）        060805  
ネズミチフス菌（Salmonella  typhimurium）  363162  
アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter  calcoaceticus）  934332  
カンジダ・グラブラタ（Candida  glabrata）  992206  
大腸菌（Escherichia  coli）  335472  
プロテウス・ミラビリス（Proteus  mirabilis）  440498  
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus  agalactiae）  370784  
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）  081100
ＢＧサルファイト寒天培地（BG  Sulfa  agar）ハーディー  ダイアグノスティックス  （Hardy  Diagnostics）  G87  
血液寒天培地（Blood  agar）  ハーディー  ダイアグノスティックス  （Hardy  Diagnostics）  5257771  
ＲＴＦキャスマン寒天培地（RTF  Casman  Agar）  ハーディー  ダイアグノスティックス  （Hardy  Diagnostics）  A68  
マッコンキー寒天培地（MacConkey  agar）  ハーディー  ダイアグノスティックス  （Hardy  Diagnostics）  G35  
ニッケルソン寒天培地（Nickerson's  Agar）  ハーディー  ダイアグノスティックス  （Hardy  Diagnostics）  G17  
トリプチケースソイ寒天培地（Trypticase  Soy  Agar）  BD  BBL  292396
【０２０４】
実施例ＩＶ
ウイルスの交差反応性プロトコル
Ａ．呼吸系ウイルス
１．凍結ストックの調製：
ａ．インフルエンザＡ及びＢ型
オリジナルのＡＴＣＣ培養物からのＭＤＣＫ  Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中インフルエンザを以下のように増幅する：
・溶解し、必要ならば、各凍結乾燥されたインフルエンザのバイアルに滅菌水を加え、５〜１０秒間ボルテックスにかける。
・０．２５０ｍLを除き、ＲＭ０３Ｔ  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＨＩカタログ番号１０−３３０５００）の１０ｍLを加える。５〜１０秒ボルテックスにかける。
・フラスコからの培地を吸引する。１０ｍＬのＲＭ０３Ｔを用いてフラスコをすすぎ、ステップ２からの希釈されたウイルスの１０ｍＬを加える。
・２時間５％ＣＯ２を有する加湿した３５°から３７°Ｃインキュベーターに放置する。１０〜１５分ごとにフラスコを揺り動かす。
・フラスコにＲＭ０３Ｔの２０ｍＬを加えて、インキュベーターにそれを戻す。
・細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日モニターする。単層が〜８０％から１００％のＣＰＥへ達する場合、少なくとも２４時間−８０℃の冷凍庫にフラスコを放置する。
・速やかに３５°から３７°Ｃの水浴中でフラスコを溶解する。
・フラスコからウイルスに感染した培地を５０ｍＬポリプロピレン製円錐遠心分離管に移しボルテックスにかける。
・１０分間３００ｘｇにて遠心分離機にかけ、細胞残屑をペレットにする。
・ペレットを乱さないように注意して、上澄みを除去し、別の遠心分離管に移し及びボルテックスにかける。
・ラベルされた１ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏ‐ｖｉａｌ）中へのウイルス懸濁液の１ｍＬを分注し、−８０℃以下で凍結する。
【０２０５】
ｂ．呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、及びパラインフルエンザウイルス１、２及び４型
オリジナルのＡＴＣＣ培養物からのＨＥｐ−２  Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中ＲＳＶを以下のように増幅する：
・溶解し、必要ならば、各凍結乾燥されたＲＳＶのバイアルに滅菌水を加え、５〜１０秒間ボルテックスにかける。
・０．２５０ｍＬを除き、ＲＭ０３Ｔ  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＨＩカタログ番号１０−３３０５００）の１０ｍＬを加える。５〜１０秒ボルテックスにかける。
・フラスコからの培地を吸引する。１０ｍＬのＲＭ０３Ｔを用いてフラスコをすすぎ、ステップ２からの希釈されたウイルスの１０ｍＬを加える。
・２時間５％ＣＯ２で加湿した３５°から３７°Ｃインキュベーターに放置する。１０〜１５分ごとにフラスコを揺り動かす。
・フラスコにＲＭ０３Ｔの２０ｍＬを加えて、インキュベーターにそれを戻す。
・細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日モニターする。単層が〜８０％から１００％のＣＰＥへ達する場合、少なくとも２４時間−８０℃の冷凍庫にフラスコを放置する。
・速やかに３５°から３７°Ｃの水浴中でフラスコを溶解する。
・フラスコからウイルスに感染した培地を５０ｍＬポリプロピレン製円錐遠心分離管に移しボルテックスにかける。
・１０分間３００ｘｇにて遠心分離機にかけ、細胞残屑をペレットにする。
・ペレットを乱さないように注意して、上澄みを除去し、別の遠心分離管に移し及びボルテックスにかける。
・ラベルされた１ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏ‐ｖｉａｌｓ）中へのウイルス懸濁液の１ｍＬを分注し、−８０℃以下で凍結する。
【０２０６】
ｃ．アデノウイルス
オリジナルのＡＴＣＣ培養物からのＡ５４９  Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中アデノウイルスを以下のように増幅する：
・溶解し、必要ならば、各凍結乾燥されたアデノウイルスのバイアルに滅菌水を加え、５〜１０秒間ボルテックスにかける。
・０．２５０ｍＬを除き、ＲＭ０３Ｔ  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）の１０ｍＬを加える。５〜１０秒ボルテックスにかける。
・フラスコからの培地を吸引する。ステップ２からの希釈されたウイルスの１０ｍＬを加える。
・２時間５％ＣＯ２で加湿した３５°から３７°Ｃインキュベーターに放置する。１０〜１５分ごとにフラスコを揺り動かす。
・フラスコにＲＭ０３Ｔの２０ｍＬを加えて、インキュベーターにそれを戻す。
・細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日モニターする。単層が８０％から１００％のＣＰＥへ達する場合、少なくとも２４時間、−８０℃の冷凍庫にフラスコを放置する。
・速やかに３５°から３７°Ｃの水浴中でフラスコを溶解する。
・フラスコからウイルスに感染した培地を５０ｍＬポリプロピレン製円錐遠心分離管に移しボルテックスにかける。
・１０分間３００ｘｇにて遠心分離機にかけ、細胞残屑をペレットにする。
・ペレットを乱さないように注意して、上澄みを除去し、別の遠心分離管に移し及びボルテックスにかける。
・ラベルされた１ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏ‐ｖｉａｌｓ）中へのウイルス懸濁液の１ｍＬを分注し、−８０℃以下で凍結する。
【０２０７】
２．呼吸系ウイルス濃度の測定
呼吸系ウイルス・ストックを冷凍後、それらをＲ−Ｍｉｘ細胞培養上で定量する（力価）。各ウイルスは、下記方法を使用して力価を測定する。
・速やかに適切なウイルスの１バイアルを３５°から３７°Ｃの水浴中又は加熱ブロック中で溶かす。
・バイアルをボルテックスにかけ、０．５ｍＬを除去して、ＲＭ０３Ｔ  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）の４．５ｍＬに移し、１：１０に稀釈する。
・１：１００、１：１、０００、１：１０，０００、１：１００，０００、及び１：１，０００，０００の稀釈液を作成するために１：１０の階段希釈を行う。
・Ｒ−Ｍｉｘ培養物からの培地を吸引し、各稀釈の１ｍＬを２つの単層に加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・２４時間３５°から３７°Ｃにてインキュベーターに単層を放置する。
・培地を吸引して、５−１０分間８０％アセトンで細胞を固定する。アセトンを除き、単層が乾燥するのを防ぐためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）洗浄溶液（ＤＨＩカタログ番号０１−００１０２５）を加える。
・特異的なＭＡｂ試薬で染色し、蛍光性を検査する。
・蛍光を発する中心を数え、希釈数を計算して記録する。次のように力価を計算する。平均数Ｘ希釈係数の逆数＝ウイルス／ｍＬ。
【０２０８】
これらのストックを培養してもよく、通常の方式でサブ培養してもよい。
【０２０９】
例：１ｍＬ接種物中１：１０，０００希釈にて数えられた２５０の蛍光を発する中心は（１ｍＬ接種物を用いて２５０の中心Ｘ１０，０００＝２．５ｅ６ウイルス／ｍＬ）を算出する。これは、ＡＴＣＣによって述べられるように、０．７で１ｍＬあたりのその中心を割ることによりＴＣＩＤ５０に変換される。
ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｏｎ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌｌｎｆｏ／ｆａｑＡｎｉｍａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ
【０２１０】
３．交差反応性テスト
Ｍｖ１Ｌｕ及びＡ５４９細胞の両方を含んでいるＲ−ＭｉｘセルラインをインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、ＲＳＶ、パラインフルエンザウイルス型１、２及び３、４ａ、４ｂ及びアデノウイルスのウイルス単離染色に使用する。９６ウェルマイクロタイタープレート中の単層を下記手順によって使用し、処理する。
・速やかに３５°から３７°Ｃの水浴で又は加熱ブロックで適切なウイルスの１つのバイアルを溶解する。
・凍結バイアルをボルテックスし、その後、０．５ｍＬ接種物当たり１，４００のＴＣＩＤ５０にて、ＲＭ０３Ｔリフィード培地中各呼吸系ウイルス株を希釈する。
・各４８のウェル・プレートから培地を吸引し、接種物の０．５ｍＬを加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・プレートを２４時間３５°から３７°Ｃのインキュベーターに放置する。
・インキュベーターから取り出し、培地を吸引し、１ｍＬのＰＢＳですすぐ。
・ＰＢＳを吸引し、その後、５分間８０％アセトンの１ｍＬで単層を固定する。吸引し、その後、ＰＢＳの０．５ｍＬを加える。
・ＰＢＳを除き、０．１５ｍＬのＣＭＶ試薬を二つの単層に加える。さらに二つの単層にインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ、ＲＳＶ及びアデノウイルス・ポジティブコントロール試薬（ＤＨＩカタログ番号０１−０１３１０２、０１−０１３２０２、０１−０１３３０２、０１−０１３４０２、０１−０１３５０２、０１−０１３６０２及び０１−０１３７０２、ならびにライト・ダイアゴノスティックス（Ｌｉｇｈｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）パラインフルエンザウイルス４型試薬  カタログ番号５０３４）の０．１５ｍＬを加える。
・３０分間３５°から３７°Ｃインキュベーターに培養物を放置する。
・ＩＸＰＢＳ溶液で２〜３回すすぐ。曲がっている先端針を用いて、各カバーガラスを除き、一滴の封入液（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ）に細胞側を下にして置く。
・１００‐２００Ｘ全体倍率で蛍光について検査して、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。特異的なポジティブコントロール試薬だけが蛍光を示すに違いない。テストＭＡｂ試薬からの蛍光はないはずである。
【０２１１】
Ｂ．単純ヘルペスウイルス（Herpes  Simplex  Virus）（ＨＳＶ）１及び２ならびにサイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）（ＣＭＶ）
１．  凍結ストックの調製：
オリジナルのＡＴＣＣ培養物からのＭＲＣ−５  Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中ＨＳＶ及びＣＭＶを以下のように増幅する。
・溶解し、必要ならば、各凍結乾燥されたＨＳＶ又はＣＭＶのバイアルに滅菌水を加え、５〜１０秒間ボルテックスにかける。
・０．２５０ｍＬを除き、ＳＲ１２０  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＨＩカタログ番号１０−２００１００）の１０ｍＬに加える。５〜１０秒間ボルテックスする。
・フラスコから培地を吸引する。１０ｍＬのＲＭ０２リフィード培地を用いてフラスコをすすぎ、ステップ２からの希釈されたウイルスの１０ｍＬを加える。
・２時間５％ＣＯ２で加湿された３５°から３７°Ｃインキュベーターに放置する。１０〜１５分ごとにフラスコを揺り動かす。
・フラスコにＳＲ１２０の２０ｍＬを加えて、インキュベーターにそれを戻す。
・細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日モニターする。単層が〜８０％から１００％のＣＰＥへ達する場合、下記のようにＨＳＶ及びＣＭＶを処理する。
【０２１２】
ＨＳＶのみについて：
ＨＳＶ−感染フラスコを少なくとも２４時間−８０℃の冷凍庫へ放置する。
速やかに３５°から３７°Ｃの水浴中でフラスコを溶解する。
【０２１３】
ＣＭＶのみについて：
細胞をフラスコの培地中へはぎ取る。
注射器に移し、２６ゲージ注射針を通して５０ｍＬ遠心分離管へ溶解物を圧をかけて押し出す。
【０２１４】
・１０分間３００ｘｇにて遠心分離機にかけ、細胞残屑をペレットにする。
・ペレットを乱さないように注意して、上澄みを除去し、別の遠心分離管に移し及びボルテックスする。
・ラベルされた１ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏ‐ｖｉａｌｓ）中へのウイルス懸濁液の１ｍＬを分注し、−８０℃以下で凍結する。
【０２１５】
２．ＨＳＶ／ＣＭＶ濃度の測定
ストックは、下記方法により力価を測定する。
・ＨＳＶ／ＣＭＶの各菌の１つのバイアルを３５°から３７°Ｃのウォーターブロック中で溶かす。
・各バイアルをボルテックスし、０．５ｍＬを除去して、ＨＳＶに関してＥＬＶＩＳ（商標）交換培地（ＤＨＩカタログ番号１０−２２０１００）の４．５ｍＬに移し及びＣＭＶに関してＲＭ−０２リフィード培地（ＤＨＩカタログ番号１０−３２０１００）４．５ｍＬに移し１：１０に稀釈する。
・１：１００、１：１、０００、１：１０，０００、１：１００，０００、及び１：１、０００，０００の稀釈液を作成するために１：１０の階段希釈を行う。
・ＥＬＶＩＳ（商標）／ＭＲＣ−５培養物からの培地を吸引し、各稀釈の１ｍＬを２つの単層に加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・２４時間３５°から３７°Ｃにてインキュベーターに培養物を放置する。
・培地を吸引して、５−１０分間８０％のアセトンで細胞を固定する。アセトンを除き、単層が乾燥するのを防ぐためにＰＢＳを加える。
・ＥＬＶＩＳタイピングシステム（Ｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）でＨＳＶを染色し及び最初期（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ）ＣＭＶ抗原に特異的な抗体で染色し、蛍光性を検査する。
・ＣＭＶ及びＨＳＶ両方の蛍光を発する中心を数え、希釈数を計算し記録する。次のように力価を計算する。平均数Ｘ希釈係数の逆数＝ウイルス／ｍＬ。
【０２１６】
これらのストックを培養してもよく、通常の方式でサブ培養してもよい。
【０２１７】
例：１ｍＬ接種物中１：１０，０００希釈にて数えられた２５０の蛍光を発する中心は（１ｍＬ接種物を用いて２５０の中心Ｘ１０，０００＝２．５ｅ６ウイルス／ｍＬ）を算出する。これは、ＡＴＣＣによって述べられるように、０．７で１ｍＬあたりのその中心を割ることによりＴＣＩＤ５０に変換される。
ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｏｎ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌｌｎｆｏ／ｆａｑＡｎｉｍａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ
【０２１８】
３．交差反応性テスト
交差反応性研究については、ＨＳＶ及びＣＭＶ株はＨ＆Ｖ  ＭＩＸ（ＭＲＣ‐５＋ＣＶ１混合）シェル・バイアル培養物に接種される：
・各ウイルス・ストックを３５°から３７℃のウォーターブロックで速やかに溶解する。
・各ＨＳＶ及びＣＭＶ、ウイルス・ストックをＲＭ０２リフィード培地中１ｍＬ接種物当たり１４０ＴＣＩＤ５０で試験されるように希釈する。
・各Ｈ＆Ｖ  ＭＩＸシェル・バイアルから培地を吸引し、接種物の１ｍＬを加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・単層を２４時間３５°から３７°Ｃのインキュベーターに放置する。
・インキュベーターから取り出し、接種物を吸引し、１ｍＬのＰＢＳですすぐ。
・ＰＢＳを吸引し、その後、５分間アセトンの１ｍＬで単層を固定する。吸引し、その後、ＰＢＳの１ｍＬを加える。
・ＰＢＳを除き、０．２ｍＬのＣＭＶ  ＭＡｂ試薬をＨＳＶ及びＣＭＶ両者感染単層の二つのシェル・バイアルに加える。ＨＳＶ感染単層について、それぞれ二つに、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ポジティブコントロール試薬（ＤＨＩカタログ番号０３−０９５１０及び０３−０９５２０）の０．２  ｍＬを加える。ＣＭＶ感染シェル・バイアルについて、ＣＭＶ  ＩＥ  Ａｇポジティブコントロール試薬（ＤＨＩカタログ番号０３−０７３００）を二つのシェル・バイアルに０．２  ｍＬを加える。
・３０分間３５°から３７°Ｃインキュベーターに培養物を放置する。
・ＣＭＶ  ＩＥ  Ａｇポジティブコントロール試薬で染色するシェル・バイアルについて、２〜３回各バイアルをすすぎ、ＣＭＶ  ＩＥ  Ａｇヤギ抗マウス試薬（ＤＨＩカタログ番号０３−０７４００）の０．２ｍＬを加え、３０分間再びインキュベートする。
・ＰＢＳで２から３回すすぐ。曲がっている先端針を用いて、各カバーガラスを除き、一滴の封入液（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ）に細胞側を下にして置く。
・１００‐２００Ｘ全体倍率で蛍光について検査して、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。特異的なポジティブコントロール試薬だけが蛍光を示すに違いない。ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に感染した単層上のＣＭＶ  ＭＡｂテスト試薬由来の蛍光はないはずである。ＣＭＶ感染単層では、ＣＭＶ  ＭＡｂテスト試薬及びポジティブコントロールの両方が蛍光を示すはずである。
【０２１９】
Ｃ．水痘帯状ヘルペスウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ）（ＶＺＶ）
１．凍結ストックの調製
オリジナルのＡＴＣＣ培養物からのＣＶ−１  Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中ＶＺＶを以下のように増幅する。
・ＶＺＶを溶解し、５〜１０秒間ボルテックスする。
・０．２５０ｍＬを除き、ＳＲ１２０  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＨＩカタログ番号１０−２００１００）の１０ｍＬに加える。５〜１０秒間ボルテックスする。
・フラスコから培地を吸引する。１０ｍＬＲＭ０２  リフィード培地を用いてフラスコをすすぎ、ステップ２からの希釈されたウイルスの１０ｍＬを加える。
・２時間５％ＣＯ２を有する加湿された３５°から３７°Ｃインキュベーターに放置する。１０〜１５分ごとにフラスコを揺り動かす。
・フラスコにＳＲ１２０の２０ｍＬを加えて、インキュベーターにそれを戻す。
・細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日モニターする。単層が〜５０％のＣＰＥへ達する場合、細胞をトリプシン処理して、ＣＶ−１  Ｔ−２２５ｃｍ２フラスコに移し、ＣＰＥについて毎日モニターする。単層が８０％から１００％ＣＰＥへ達する場合、細胞をはぎ取り、２６ゲージ注射針を通して５０ｍＬ遠心分離管へ溶解物を圧をかけて押し出す。
・１０分間３００ｘｇにて遠心分離機にかけ、細胞残屑をペレットにする。
・ペレットを乱さないように注意して、上澄みを除去し、別の遠心分離管に移し及びボルテックスする。
・ラベルされた１ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏ‐ｖｉａｌｓ）中へウイルス懸濁液の１ｍＬを分注し、−８０℃以下で凍結する。
【０２２０】
２．ＶＺＶ濃度の測定
ストックは、ＭＲＣ−５単層上、下記方法により力価を測定する。
・各ＶＺＶ菌の１つのバイアルを３５°から３７°Ｃのウォーターブロック中で溶かす。
・各バイアルをボルテックスし、０．５ｍＬをＲＭ−０２の４．５ｍＬに移し１：１０に稀釈する。
・１：１００、１：１、０００、１：１０，０００、１：１００，０００、及び１：１，０００，０００の稀釈液を作成するために１：１０の階段希釈を行う。
・ＭＲＣ−５単層から培養培地を吸引し、各稀釈の１ｍＬを２つの単層に加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・７２時間３５°から３７°Ｃにてインキュベーターに単層を放置する。
・培地を吸引して、５−１０分間８０％アセトンで細胞を固定する。アセトンを除き、単層が乾燥するのを防ぐためにＰＢＳを加える。
・ＶＺＶに特異的なＭＡｂを用いて染色し蛍光性を検査する。
・蛍光を発する中心を数え、希釈数を計算して記録する。次のように力価を計算する。平均数Ｘ希釈係数の逆数＝ウイルス／ｍＬ。
【０２２１】
これらのストックを培養してもよく、通常の方式でサブ培養してもよい。
【０２２２】
例：１ｍＬ接種物中１：１０，０００希釈にて数えられた２５０の蛍光を発する中心は（１ｍＬ接種物を用いて２５０の中心Ｘ１０，０００＝２．５ｅ６ウイルス／ｍＬ）を算出する。これは、ＡＴＣＣによって述べられるように、０．７で１ｍＬあたりのその中心を割ることによりＴＣＩＤ５０に変換される。
ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｏｎ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌｌｎｆｏ／ｆａｑＡｎｉｍａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ
【０２２３】
３．交差反応性テスト
交差反応性試験については、ＶＺＶ株はＨ＆Ｖ  Ｍｉｘ（ＭＲＣ‐５＋ＣＶ‐１混合）シェル・バイアル培養物に接種される：
・各ウイルス・ストックを３５°から３７℃のウォーターブロックで速やかに溶解する。
・各ＶＺＶ株をＲＭ０２リフィード培地中１ｍＬ接種物当たり１４０ＴＣＩＤ５０を得るように希釈する。
・各Ｈ＆Ｖ  Ｍｉｘマルチウェルプレートから培地を吸引し、接種物の０．２ｍＬを加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・プレートを７２時間３５°から３７°Ｃのインキュベーターに放置する。
・インキュベーターから取り出し、接種物を吸引し、０．２ｍＬのＰＢＳですすぐ。
・ＰＢＳを吸引し、その後、５分間８０％アセトンの０．２ｍＬで単層を固定する。吸引し、その後、ＰＢＳの０．２ｍＬを加える。
・ＰＢＳを吸引し、０．０５ｍＬの対象試薬を二つのウェルに加える。二つのウェルにＶＺＶポジティブコントロール試薬（ＤＨＩカタログ番号０１−０２５００５）の０．２  ｍＬを加える。
・３０分間３５°から３７°Ｃインキュベーターに培養物を放置する。
・ＰＢＳで２から３回すすぐ。一滴の封入液（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ）を各ウェルに加える。
・１００‐２００Ｘ全体倍率で蛍光について検査して、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。特異的なポジティブコントロール試薬だけが蛍光を示すに違いない。ＭＡｂテスト試薬由来の蛍光はないはずである。
【０２２４】
Ｄ．ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）３９
１．凍結ストックの調製
オリジナルのＡＴＣＣ培養物からのＭＲＣ−５  Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中ライノウイルスを以下のように増幅する。
・ライノウイルスを溶解し、５〜１０秒間ボルテックスする。
・０．２５０ｍＬを除き、ＳＲ１２０  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＨＩカタログ番号１０−２００１００）の１０ｍＬに加える。５〜１０秒間ボルテックスする。
・フラスコから培地を吸引する。１０ｍＬＲＭ０２  リフィード培地を用いてフラスコをすすぎ、ステップｂからの希釈されたウイルスの１０ｍＬを加える。
・２時間５％ＣＯ２を有する加湿された３３°から３５°Ｃインキュベーターに放置する。１０〜１５分ごとにフラスコを揺り動かす。
・フラスコにＳＲ１２０の２０ｍＬを加えて、インキュベーターにそれを戻す。
・ＣＰＥ（細胞変性効果）を毎日モニターする。単層が〜８０％から１００％ＣＰＥへ達する場合、フラスコを少なくとも２４時間、−８０℃の冷凍庫で凍結する。
・ちょうど溶解するまで３５°から３７℃の水浴中でフラスコを溶解する。
・フラスコからウイルス感染培地を５０ｍＬポリプロピレン円錐型遠心分離官に移し、ボルテックスする。
・１０分間３００ｘｇにて遠心分離機にかけ、細胞残屑をペレットにする。
・ペレットを乱さないように注意して、上澄みを除去し、別の遠心分離管に移し及びボルテックスする。
・ラベルされた１ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏ‐ｖｉａｌｓ）中へウイルス懸濁液の１ｍＬを分注し、−８０℃以下で凍結する。
【０２２５】
２．ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）濃度の測定
ストックは、ＭＲＣ−５単層上、下記方法により力価を測定する。
・迅速に、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）３９の１つのバイアルを３５°から３７°Ｃのウォーターブロック中で溶かす。
・各バイアルをボルテックスし、０．５ｍＬをＲＭ−０２の４．５ｍＬに移し１：１０に稀釈する。
・１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００、及び１：１，０００，０００の稀釈液を作成するために１：１０の階段希釈を続ける。
・ＭＲＣ−５単層から培養培地を吸引し、各稀釈の１ｍＬを２つの単層に加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・ＣＰＥが観察されるまで、３３°から３５°Ｃにてインキュベーターに単層を放置する。日数と希釈数を記録する。
【０２２６】
これらのストックを培養してもよく、通常の方式でサブ培養してもよい。
【０２２７】
３．交差反応性テスト
交差反応性試験については、ライノウイルスはＭＲＣ−５細胞培養物に接種される：
・ウイルス・ストックを３５°から３７℃のウォーターブロック中速やかに溶解する。
・ライノウイルスをＲＭ０２リフィード培地中１ｍＬ接種物当たり１，４００ＴＣＩＤ５０を得るように希釈する。
・各ＭＲＣ−５シェル・バイアルから培地を吸引し、接種物の１ｍＬを加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・プレートを２４時間３３°から３５°Ｃのインキュベーターに放置する。
・インキュベーターから取り出し、接種物を吸引し、１ｍＬのＰＢＳですすぐ。
・ＰＢＳを吸引し、その後、５分間８０％アセトンの１ｍＬで単層を固定する。吸引し、その後、ＰＢＳの１ｍＬを加える。
・ＰＢＳを除き、０．２ｍＬの対象試薬を二つのウェルに加える。
・３０分間３５°から３７°Ｃインキュベーターに培養物を放置する。
・ＰＢＳで２から３回すすぐ。曲がっている先端針を用いて、カバーガラスを除き、細胞側を下にして、一滴の封入液（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ）に置く。
・１００Ｘ全体倍率で蛍光について検査する。ウイルスのプラークは、蛍光染色もないし、過剰なバックグラウンド染色もないはずである。
【０２２８】
Ｅ．コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）
１．凍結ストックの調製
オリジナルのＡＴＣＣ培養物からのＭＲＣ−５  Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中ライノウイルスを以下のように増幅する。
・コロナウイルスを溶解し、５から１０秒間ボルテックスする。
・０．２５０ｍＬを除き、１０ｍＬのＳＲ１２０  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＨＩカタログ番号１０−２００１００）に加える。５から１０秒間ボルテックスする。
・フラスコから培地を吸引する。１０ｍＬＲＭ０２  リフィード培地を用いてフラスコをすすぎ、ステップｂからの希釈されたウイルスの１０ｍＬを加える。
・２時間５％ＣＯ２を有する加湿された３３°から３５°Ｃインキュベーターに放置する。１０〜１５分ごとにフラスコを揺り動かす。
・フラスコにＳＲ１２０リフィード培地の２０ｍＬを加えて、インキュベーターにそれを戻す。
・ＣＰＥ（細胞変性効果）を毎日モニターする。単層が〜８０％から１００％ＣＰＥへ達する場合、フラスコを少なくとも２４時間、−８０℃の冷凍庫で凍結する。
・ちょうど溶解するまで３５°から３７℃の水浴中でフラスコを溶解する。
・フラスコからウイルス感染培地を５０ｍＬポリプロピレン円錐型遠心分離官に移し、ボルテックスする。
・１０分間３００ｘｇにて遠心分離機にかけ、細胞残屑をペレットにする。
・ペレットを乱さないように注意して、上澄みを除去し、別の遠心分離管に移し及びボルテックスする。
・ラベルされた１ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏ‐ｖｉａｌｓ）中へウイルス懸濁液の１ｍＬを分注し、−８０℃以下で凍結する。
【０２２９】
２．コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）濃度の測定
コロナウイルスストックは、ＭＲＣ−５単層上、下記方法により力価を測定する。
・迅速に、各コロナウイルスの１つのバイアルを３５°から３７°Ｃのウォーターブロック中で溶かす。
・各バイアルをボルテックスし、０．５ｍＬをＲＭ−０２の４．５ｍＬに移し１：１０に稀釈する。
・１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００の稀釈液を作成するために１：１０の階段希釈を続ける。
・ＭＲＣ−５単層から培養培地を吸引し、各稀釈の１ｍＬを２つの単層に加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・１６‐２４時間３３°から３５°Ｃのインキュベーターに単層を放置する。
・培地を吸引して、５−１０分間８０％アセトンで細胞を固定する。アセトンを除き、単層が乾燥するのを防ぐためにＰＢＳを加える。
・試験使用のみのコロナウイルスモノクローナル抗体を用いて染色し蛍光性を検査する。
・蛍光を発する中心を数え、希釈数を計算して記録する。次のように力価を計算する。平均数Ｘ希釈係数の逆数＝ウイルス／ｍＬ。
【０２３０】
これらのストックを培養してもよく、通常の方式でサブ培養してもよい。
【０２３１】
例：１ｍＬ接種物中１：１０，０００希釈にて数えられた２５０の蛍光を発する中心は（１ｍＬ接種物を用いて２５０の中心Ｘ１０，０００＝２．５ｅ６ウイルス／ｍＬ）を算出する。これは、ＡＴＣＣによって述べられるように、０．７で１ｍＬあたりのその中心を割ることによりＴＣＩＤ５０に変換される。
ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｏｎ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌｌｎｆｏ／ｆａｑＡｎｉｍａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ
【０２３２】
３．交差反応性テスト
交差反応性試験については、コロナウイルスはＭＲＣ−５細胞培養物に接種される：
・ウイルス・ストックを３５°から３７℃のウォーターブロックで速やかに溶解する。
・コロナウイルスをＲＭ０２リフィード培地中１ｍＬ接種物当たり１，４００ＴＣＩＤ５０を得るように希釈する。
・各ＭＲＣ−５シェル・バイアルから培地を吸引し、接種物の１ｍＬを加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・プレートを２４時間３３°から３５°Ｃのインキュベーターに放置する。
・インキュベーターから取り出し、接種物を吸引し、１ｍＬのＰＢＳですすぐ。
・ＰＢＳを吸引し、その後、５分間８０％アセトンの１ｍＬで単層を固定する。吸引し、その後、ＰＢＳの１ｍＬを加える。
・ＰＢＳを除き、０．２ｍＬの対象試薬を二つのウェルに加える。研究使用のみのモノクローナル抗体試薬を二つのウェルに加える。
・３０分間３５°から３７°Ｃインキュベーターに培養物を放置する。
・ＰＢＳで２から３回すすぐ。曲がっている先端針を用いて、各カバーガラスを除き、細胞側を下にして、一滴の封入液（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ）に置く。
・１００Ｘ全体倍率で蛍光について検査する。対象試薬は、蛍光染色するはずがなく、過剰なバックグラウンド染色もないはずである。ポジティブコントロールは明るいアップルグリーンの蛍光を有するはずだ。
【０２３３】
Ｆ．メタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）
１．凍結ストックの調製
Ｐａｖｉａ大学  （イタリア）から得られたＬＬＣ−ＭＫ２  Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中メタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）サブグループを以下のように増幅する。
・すべてのサブグループを溶解し、５から１０秒間ボルテックスする。
・０．２５０ｍＬを除き、１０ｍＬのＳＲ１２０  リフィード培地（Ｒｅｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＨＩカタログ番号１０−２００１００）に加える。５から１０秒間ボルテックスする。
・フラスコから培地を吸引する。１０ｍＬのＲＭ０２  リフィード培地を用いてフラスコをすすぎ、ステップ２からの希釈されたウイルスの１０ｍＬを加える。
・２時間５％ＣＯ２を有する加湿された３５°から３７°Ｃのインキュベーターに放置する。１０から１５分ごとにフラスコを揺り動かす。
・フラスコにＳＲ１２０リフィード培地の２０ｍＬを加えて、インキュベーターにそれを戻す。
・ＣＰＥ（細胞変性効果）を毎日モニターする。単層が〜８０％から１００％ＣＰＥへ達する場合、フラスコから細胞をこすり落とし懸濁液にする。
・２６ゲージ針を通して、各ウイルス懸濁液を別々に圧をかけて溶解する。
・溶解したウイルス／細胞懸濁液を５０ｍＬポリプロピレン円錐型遠心分離官に移し、ボルテックスする。
・１０分間３００ｘｇにて遠心分離機にかけ、細胞残屑をペレットにする。
・ペレットを乱さないように注意して、上澄みを除去し、別の遠心分離管に移し及びボルテックスする。
・ラベルされた１ｍＬのクライオバイアル（ｃｒｙｏ‐ｖｉａｌｓ）中へウイルス懸濁液の１ｍＬを分注し、−８０℃以下で凍結する。
【０２３４】
２．メタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）濃度の測定
ストックは、Ｒ−Ｍｉｘ単層上、下記方法で力価を測定する。
・迅速に、各ＭＶＰサブグループの１つのバイアルを３５°から３７°Ｃのウォーターブロック中で溶かす。
・各バイアルをボルテックスし、０．５ｍＬをＲＭ−０３Ｔの４．５ｍＬに移し１：１０に稀釈する。
・１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００、及び１：１，０００，０００の稀釈液を作成するために１：１０の階段希釈を続ける。
・Ｒ−Ｍｉｘ単層から培養培地を吸引し、各稀釈の１ｍＬを２つの単層に加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・２４時間３５°から３７°Ｃのインキュベーターに単層を放置する。
・培地を吸引して、５−１０分間８０％のアセトンで細胞を固定する。アセトンを除き、単層が乾燥するのを防ぐためにＰＢＳ洗浄液（ＤＨＩカタログ番号０１−００１０２５）を加える。
・ＭＶＰモノクローナル抗体試薬を用いて染色し蛍光性を検査する。
・蛍光を発する中心を数え、希釈数を計算し記録する。次のように力価を計算する。平均数Ｘ希釈係数の逆数＝ウイルス／ｍＬ。
【０２３５】
これらのストックを培養してもよく、通常の方式でサブ培養してもよい。
【０２３６】
例：１ｍＬ接種物中１：１０，０００希釈にて数えられた２５０の蛍光を発する中心は（１ｍＬ接種物を用いて２５０の中心Ｘ１０，０００＝２．５ｅ６ウイルス／ｍＬ）を算出する。これは、ＡＴＣＣによって述べられるように、０．７で１ｍＬあたりのその中心を割ることによりＴＣＩＤ５０に変換される。
ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｏｎ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌｌｎｆｏ／ｆａｑＡｎｉｍａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ
【０２３７】
３．交差反応性テスト
交差反応性試験については、ＭＶＰサブグループはＲ−Ｍｉｘ５細胞培養物に接種される：
・適切なウイルスの１バイアルを３５°から３７℃の水浴又はヒートブロックで速やかに溶解する。
・凍結バイアルをボルッテックスし、それから各ＭＶＰサブグループをＲＭ０３リフィード培地中０．２ｍＬ接種物当たり１，４００ＴＣＩＤ５０にて希釈する。
・各９６ウェルプレートから培養培地を吸引し、接種物の０．２ｍＬを加える。
・６０分間７００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・プレートを２４時間３５°から３７°Ｃのインキュベーターに放置する。
・インキュベーターから取り出し、培地を吸引し、０．２ｍＬのＰＢＳですすぐ。
・ＰＢＳを吸引し、その後、５分間８０％アセトンの０．２ｍＬで単層を固定する。吸引し、その後、ＰＢＳの０．２ｍＬを加える。
・ＰＢＳを除き、０．０５ｍＬの対象試薬を二つの単層に加える。また、ポジティブコントロールとしてＤＨＩ  ＭＰＶ  ＡＳＲの０．０５ｍＬを加える。
・３０分間３５°から３７°Ｃインキュベーターに培養物を放置する。
・ＰＢＳ洗浄溶液で２から３回すすぐ。１滴の封入液（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ）を各染色されるウェルに添加する。
・１００Ｘ全体倍率で蛍光について検査する。蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。蛍光は、対象試薬で染色された単層で観察されるはずはない。すべての４ＭＰＶサブグループは、ＭＶＰポジティブコントロールを用いると蛍光染色細胞が示されるはずだ。
【０２３８】
Ｇ．エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹（Ｍｅａｓｌｅｓ）及びムンプス（Ｍｕｍｐｓ）
次のコントロールスライドをＭＡｂスクリーニング及び交差反応性試験の目的でビオン  エンタープライズ（Ｂｉｏｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ）から購入した。各スライドは、感染していない培養細胞だけを含むウェルに加えて特異的なウイルス薬で感染した培養細胞の微生物を含むウェルで個々にホイルに包まれる。感染培養細胞はポジティブコントロールとして役立ち、感染していない培養細胞はネガティブコントロールとして役立つ。特異的な微生物抗原を製品ラベル上で同定する。
【０２３９】
エコーウイルス・パネル（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｎｅｌ）（カタログ番号ＱＥＣ−６５０６）は、感染細胞及び非感染細胞のミックスを含む６つのウェルを各々含む。各スライドは、エコーウイルス型４、６、９、１１、３０及び３４で別々に構成される。
【０２４０】
コクサッキーウイルス・パネル（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐａｎｅｌ）（カタログ番号ＱＣＢ−２５０６）は、感染細胞及び非感染細胞のミックスをそれぞれ含む６つのウェルを含む。スライドはそれぞれ、コクサッキーウイルス型Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６で別々に構成される。
【０２４１】
ムンプス抗原コントロール・スライド（Ｍｕｍｐｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｌｉｄｅｓ）（カタログ番号ＱＭＵ−８００２）は、ムンプス感染細胞の一つのウェル及びにムンプス非感染細胞の一つのウェルを含む。
【０２４２】
麻疹抗原コントロール・スライド（Measles  Antigen  Control  Slides）（カタログ番号ＱＭＥ−０４２４）は、麻疹感染細胞の一つのウェル及び麻疹非感染細胞の一つのウェルを含む。
【０２４３】
抗原コントロール・スライドのテスト及び染色の手順は次の通りである：
・対象試薬のウェルあたり０．０３ｍＬで二つの各スライドに染色する。
・３０分間３５°−３７℃のインキュベーターにスライドを入れる。
・インキュベーターから取り出し、ＰＢＳで優しくスライドをすすぐ。細胞スポットに触れない又は乱さないようにしながら、個々のスライドを拭き取り、乾燥する。
・各ウェルに一滴の封入液を加えて、各スライドにカバーグラスを置く。
・１００Ｘ全体倍率で蛍光性を試験して、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。
【０２４４】
Ｈ．非感染細胞培養
シェル・バイアル型及びガラス丸底チューブでの非感染細胞培養を次の手順により、交差反応性について試験した（表２０）。
【０２４５】
【表２０】
2012529009.tif 000024
【０２４６】
１．シェル・バイアル手順
・培養培地を吸引し、一回ＰＢＳを用いてすすぐ。
・ＰＢＳを吸引し、１０分間１００％アセトン固定液の１ｍＬを加える。
・固定液を吸引し、ＰＢＳの１ｍＬを加える。
・そのＰＢＳを吸引し、その後、重複して、対象試薬の０．２ｍＬを加え、その後、３０分の３５°‐３７°Ｃのインキュベーターの中へ放置する。
・インキュベーターから取り出し、ＰＢＳで２−３回すすぐ。
・鉗子及び曲がっている先端針を使用して、各カバーガラスを除き、ガラス標本スライド上の一滴の封入液上へ置く。
・１００Ｘ全体倍率で蛍光性を試験し、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が目に見えるかどうか注意する。
【０２４７】
２．ガラス丸底チューブ手順：
・２ｍＬ血清用ピペットを使用して、培養培地に細胞単層を剥がして集める。
・１．５ｍＬ  エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移し、１０分間３００ｘｇで遠心分離する。
・上澄みを吸引し、ＰＢＳの１ｍＬ中にペレットを懸濁させる。
・０．０１ｍＬで８つのウェル標本をスポットする。２０分間風乾させる。
・１００％アセトンの中で１０分間標本スライドを定着させる。
・各セルラインの二つのウェル中に対象試薬の０．０３ｍＬを加える。
・３０分間３５°‐３７°Ｃのインキュベーターの中へ放置する。
・インキュベーターから取り出し、ＰＢＳで２−３回すすぐ。
・各ウェルに封入剤の１滴加え、１００Ｘ全体倍率で蛍光性を試験する。蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が目に見えるかどうか注意する。
【０２４８】
実施例Ｖ
バクテリア交差反応性試験
Ａ．  マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、ウレアプラスマ種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、またアコレプラズマ‐レイドロウイィ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）
１．凍結ストックの調製：
・ＡＴＣＣからの培養物を溶解し、再構成する。
・培養可能なマイコプラズマ検出用ＭＹＣＯＴＲＩＭ（商標）ＴＣ  Ｔｒｉｐｈａｓｉｃ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号Ｔ５００−０００）の中で供給された培養液で培養物を１：１０及び１：１００に希釈する。
・フラスコの上部の寒天に刻み目をいれて、希釈されたバクテリアの１ｍＬを接種し、次に、フラスコの底の培養液に残りの接種物を放出する。注：希釈していないサンプルを接種しない。なぜならそれがバクテリアの増殖を防止する防腐剤を含んでいるかもしれないので。
・３５°から３７°Ｃにてフラスコを放置する。寒天中「目玉焼き」状のコロニーの外観及び培地中の濁度について、毎日フラスコを検査する。
・コロニーが観察される場合（約６〜７日接種後）、フラスコの底のものを培養液に掻き集めて、１．５ｍＬエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離機バイアルに移す。また、ディーンズ染色（Ｄｉｅｎｅｓ  Ｓｔａｉｎ）の０．２ｍＬをフラスコの寒天培地側へ加え、３５℃から３７℃にて３０分間染色する。この染色は、コロニーを観察するのを助けるだろう。
・３０分間微小遠心管で９，０００ｘｇに遠心分離機にかける。上清を吸引して除き、５０％グリセロール中にペレットを懸濁し、−８０℃にて凍結する。
【０２４９】
２.  交差反応性試験:
各バクテリアを交差反応性試験用に培養し、スライド上で調製し、及び下記手順を用いて、濃度を同時に確認する:
・各バクテリア・ストック・バイアルを３５℃及び３７℃ウォーター・ブロックの中ですみやかに溶解する。
・各バイアルをボルテックスにかけ、１．５ｍＬエッペンドルフチューブへ移す。
・３０分管９，０００ｘｇにて遠心分離機にかける。
・上澄みを吸引して、ＰＢＳの１ｍＬにペレットを再懸濁する。
・培養をＭＹＣＯＴＲＩＭ（商標）ＴＣ  Ｔｒｉｐｈａｓｉｃ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍの中で供給された培養液で１：１００及び１：１０００に希釈する
・フラスコの上部の寒天に刻み目をいれて、希釈されたバクテリアの１ｍＬで接種し、次に、フラスコの底の培養液に残りの接種物を放出する。
・３５°から３７°Ｃにてフラスコを放置する。寒天中「目玉焼き」状のコロニーの外観及び培地中の濁度について、毎日フラスコを検査する。
・コロニーが観察される場合（約６〜７日接種後）、フラスコの底のものを培養液に掻き集めて、１．５ｍＬエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離バイアルに移す。また、ディーンズ染色（Ｄｉｅｎｅｓ  Ｓｔａｉｎ）の０．２ｍＬをフラスコの寒天培地側へ加え、３５℃から３７℃にて３０分間染色する。この染色は、コロニーを観察するのを助けるだろう。
・３０分間微小遠心管で９，０００ｘｇに遠心分離機にかける。
・上清を吸引して除き、ＰＢＳの１ｍＬ中にペレットを懸濁する。
・スペクトロフォトメーターを用いて、６００ｎｍにて９６−ウェル・マイクロタイタープレート中の各懸濁液の０．１ｍＬを読み取りする。同じプレート上に０．５から４．０にわたるマクファーランド濁度標準（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  カタログ番号２３５０）を含む。
・Ｏ．Ｄ．値に基づいて、ＰＢＳに各バクテリア懸濁液を希釈し、ｍＬあたり約６．０ｅ６  ＣＦＵと等しい２．０のマクファーランドの標準とぴったり一致させる。
・その後、懸濁液をボルテックスし、両方のマクファーランドの調整濃度にて８‐ウェル・スライドガラスへ１つのウェル当たり０．０１ｍＬ加える。
・各スライドを空気乾燥し、それから１０分間アセトンで固定する。
・乾燥剤小袋を有する気密性の小袋に未使用のスライドを保管する。
・スライドを作るために使用される２．０のマクファーランド標準（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）に調整された各懸濁液をＭＹＣＯＴＲＩＭ（商標）ＴＣ  Ｔｒｉｐｈａｓｉｃ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍで供給された培養液で１：１０００、１：１，０００，０００、及び１００，０００，０００に希釈する。
・フラスコの上部の寒天に刻み目をいれて、バクテリアの希釈系列の１ｍＬのそれぞれを接種し、次に、フラスコの底の培養液に残りの接種物を放出する。
・３５°から３７°Ｃにてフラスコを放置する。寒天中「目玉焼き」状のコロニーの外観及び培地中の濁度について、毎日フラスコを検査する。
・どの希釈系列にてコロニーがまだフラスコ中にみえるか注意する。
【０２５０】
各８ウェル・スライドを下記手順によって対象試薬で染色する：
・ＣＭＶ  ＭＡｂテスト試薬の１ウェル当たり３０μＬを有する各バクテリア・スライドの２つのウェルを染色する。
・６０分間３５℃から３７°Ｃのインキュベーターにスライドを放置する。
・インキュベーターから取り出し、それからＰＢＳでスライドを優しくすすぐ。
細胞スポットに触れないよう、又は妨害しないようにして拭き取って乾燥する。
・各ウェルに一滴の封入液体を加え、各スライド上にカバーグラスを置く。
・２００及び４００Ｘの全体の倍率で蛍光性を検査し、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。
【０２５１】
Ｂ．ボルデテラ種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐ．）、モラクセラ種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐ．）、コリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ヘモフィリス種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｓｐ．），クレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．），シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）
１．凍結ストックの調製：
各々のストックはＡＴＣＣから得られ、下のようにリストされた適切な寒天上で成長した：
・緩衝‐活性炭酵母エキス（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｃｈａｒｃｏａｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）：ボルデテラ種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．）及びレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）
・血液寒天培地：モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｒｔａｒｒｈａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、及びストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。
・トリプチケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ）：
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）
・チョコレート寒天培地：ヘモフィリス・インフルエンザエ・タイプA（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  Ａ）
【０２５２】
これらの微生物を下記手順を使用して培養する：
・トリプチケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ）中のバクテリアを１：１０と１：１００で希釈し、適切な寒天上に懸濁液の１ｍＬを吸収する。
・寒天プレートを３５°から３７°Ｃにて加湿したインキュベータへの中で表を下にして放置する。コロニーを毎日チェックする。
・コロニーが観察される場合、無菌の０．０１ｍＬループを使用し、ＰＢＳの１ｍＬを含む１．５ｍＬエッペンドルフ微小遠心管にコロニーを移す。ＰＢＳを濁っているようにするために十分なコロニーを取る。３０分間９，０００ｘｇにて遠心分離機にかける。上清を吸引して除き、５０％グリセロール中にペレットを再懸濁し、−８０℃にて凍結する。
【０２５３】
２.  交差反応性試験:
各バクテリアを交差反応性試験用に培養し、スライド上で調製し、及び下記手順を用いて、濃度を同時に確認する:
・各バクテリア・ストック・ガラスを３５℃から３７℃のウォーター・ブロック中ですみやかに溶解する。
・トリプチケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ）中のバクテリアを１：１０と１：１００で希釈し、適切な寒天上に懸濁液の１ｍＬを吸収する。
・寒天プレートを３５°から３７°Ｃにて加湿したインキュベーターへの中で表を下にして放置する。コロニーを毎日チェックする。
・コロニーが観察される場合、滅菌の０．０１ｍＬループを使用し、ＰＢＳの１ｍＬを含む１．５ｍＬ  エッペンドルフ微小遠心管にコロニーを移す。ＰＢＳを濁っているようにするために十分なコロニーを取る。
・滅菌の０．０１ｍＬループを使用し、各標本を適切な寒天培地上にストリークする。
・寒天プレートを３５°から３７°Ｃにて加湿したインキュベーターへの中で表を下にして放置する。コロニーを毎日チェックする。
・コロニーが観察される場合、滅菌の０．０１ｍＬループを使用し、ＰＢＳの１ｍＬを含む１．５ｍＬ  エッペンドルフ微小遠心管にコロニーを移す。ＰＢＳを濁っているようにするために十分なコロニーを取る。
・スペクトロフォトメーターを用いて、６００ｎｍにて９６−ウェル・マイクロタイタープレート中の各懸濁液の０．１ｍＬを読み取りする。同じプレート上に０．５から４．０にわたるマクファーランド濁度標準（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  カタログ番号２３５０）を含む。
・Ｏ．Ｄ．値に基づいて、ＰＢＳに各バクテリア懸濁液を希釈し、ｍＬあたり約３．０ｅ６及び６．０ｅ６  ＣＦＵと等しい１．０及び２．０のマクファーランドの標準とぴったり一致させる。
・懸濁液をボルテックスし、両方のマクファーランドの調整濃度にて８‐ウェル・スライドガラスへ１つのウェル当たり０．０１ｍＬ加える。
・各スライドを空気乾燥し、それから１０分間アセトンで固定する。
・乾燥剤小袋を有する気密性の小袋に未使用のスライドを保管する。
・スライドを作るために使用される１．０のマクファーランド標準（ＭｃＦｒｌａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）にて各懸濁液を１：１００、１：１０,０００、１：１，０００，０００、１：１０，０００，０００及び１００，０００，０００に希釈する。コロニー確認のために、各バクテリアからの各希釈液の１ｍＬを適切な寒天培地に吸収する。
・寒天プレートを３５°から３７°Ｃにて加湿したインキュベーターへの中で表を下にして放置する。コロニーを毎日チェックする。
・約３０−３００を有する希釈プレートのコロニーを数える。１ｍＬ当たりのＣＦＵを計算するためにカウント数に希釈係数の逆数を掛ける。
【０２５４】
各８ウェル・スライドを下記手順によってＣＭＶ  ＭＡｂ試薬で染色する：
・１ウェル当たり３０μＬのＣＭＶ  ＭＡｂテスト試薬で各バクテリア・スライドの２つのウェルを染色する。
・６０分間３５℃から３７°Ｃのインキュベーターにスライドを放置する。
・インキュベーターから取り出し、それからＰＢＳでスライドをやさしくすすぐ。細胞スポットに触れないよう、又は妨害しないようにして拭き取って乾燥する。
・各ウェルに一滴の封入液体を加え、各スライド上にカバーグラスを置く。
・２００及び４００Ｘの全体の倍率で蛍光性を検査し、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。
【０２５５】
Ｃ．ガードネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ  １（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  １）
１．凍結ストックの調製：
ハーディー  ダイアグノスティックス（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から得られた各凍結乾燥ディスクを適切な寒天上で培養した：
・ＢＧサルファイト寒天培地（BG  Sulfa  agar）：サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）
・血液寒天培地：ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）
・ＲＴＦキャスマン寒天培地（RTF  Casman  Agar）：ガードネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）
・マッコンキー寒天培地（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ  ａｇａｒ）：
プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）
・ニッケルソン寒天培地（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ’ｓ  ａｇａｒ）：カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）
【０２５６】
これらの微生物は次の方法で再構成され培養した：
・４−８°Ｃの貯蔵庫からＬＹＦＯ  ＤＩＳＫ（商標）バイアルを取りだし、未開封バイアルを室温に平衡になるようにする。
・無菌的にバイアルから１つのゼラチン・ペレットを取り除く。無菌のブレインハートインフィージョン培地（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ）  （Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号Ｒｌ0）の０．５ｍＬにペレットを置く。
・ペレット粒子が、サイズが同じで、懸濁液が外観的に均質になるまで、無菌の綿球又はピペットでペレットを乳化し及び砕く。
・含水材料で綿球を直ちに染み込ませて、適切な、非選択的な、栄養的、又は富栄養な寒天培地に材料を移す。圧力で、綿球を回転させて、寒天培地の円形のエリア（つまり直径１インチ又は２５ｍｍ）に接種する。同じ綿球又は無菌のループを用いて、接種を受けたエリアにそって繰り返し（約１０〜２０回）ストリークし、そして次に、寒天表面の残りにストリークを続ける。
・コロニーが観察される場合、無菌の０．０１ｍＬループを使用し、ＰＢＳの１ｍＬを含む１．５ｍＬ  エッペンドルフ微小遠心管にコロニーを移す。ＰＢＳを濁っているようにするために十分なコロニーを取る。
３０分間９，０００ｘｇにて遠心分離機にかける。上清を吸引して除き、５０％グリセロール中にペレットを再懸濁し、−８０℃にて凍結する。
【０２５７】
２.  交差反応性試験:
各バクテリアを交差反応性試験用に培養し、スライド上で調製し、及び下記手順を用いて、濃度を同時に確認する:
・各バクテリア・ストック・ガラスを３５℃から３７℃のウォーター・ブロック中ですみやかに溶解する。
・トリプチケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ）中のバクテリアを１：１０と１：１００で希釈し、適切な寒天上に懸濁液の１ｍＬを吸収する。
・寒天プレートを３５°から３７°Ｃにて加湿したインキュベーターへの中で表を下にして放置する。コロニーを毎日チェックする。
・コロニーが観察される場合、滅菌の０．０１ｍＬループを使用し、ＰＢＳの１ｍＬを含む１．５ｍＬ  エッペンドルフ微小遠心管に別々のコロニーを移す。ＰＢＳを濁っているようにするために十分なコロニーを取る。
・滅菌の０．０１ｍＬループを使用し、各標本を適切な寒天培地上にストリークする。
・寒天プレートを３５°から３７°Ｃにて加湿したインキュベーターへの中で表を下にして放置する。コロニーを毎日チェックする。
・コロニーが観察される場合、滅菌の０．０１ｍＬループを使用し、ＰＢＳの１ｍＬを含む１．５ｍＬ  エッペンドルフ遠心管にコロニーを移す。ＰＢＳを濁っているようにするために十分なコロニーを取る。
・スペクトロフォトメーターを用いて、６００ｎｍにて９６−ウェル・マイクロタイタープレート中の各懸濁液の０．１ｍＬを読み取りする。同じプレート上に０．５から４．０にわたるマクファーランド濁度標準（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  カタログ番号２３５０）を含む。
・Ｏ．Ｄ．値に基づいて、ＰＢＳに各バクテリア懸濁液を希釈し、１ｍＬあたり約３．０ｅ６及び６．０ｅ６  ＣＦＵと等しい１．０及び２．０のマクファーランド標準とぴったり一致させる。
・懸濁液をボルテックスし、両方のマクファーランドの調整濃度にて８‐ウェル・スライドガラスへ１ウェル当たり０．０１ｍＬ加える。
・各スライドを空気乾燥し、それから１０分間アセトンで固定する。
・乾燥剤小袋を有する気密性の小袋に未使用のスライドを保管する。
・スライドを作るために使用される１．０のマクファーランド標準（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）にて各懸濁液を１：１００、１：１０,０００、１：１，００，０００、１：１，０００，０００、１：１０，０００，０００及び１００，０００，０００に希釈する。コロニー確認のために、各バクテリアからの各希釈液の１ｍＬを適切な寒天培地に吸収する。
・寒天プレートを３５°から３７°Ｃにて加湿したインキュベーターへの中で表を下にして放置する。コロニーを毎日チェックする。
・約３０−３００を有する希釈プレートのコロニーを数える。１ｍＬ当たりのＣＦＵを計算するためにカウント数に希釈係数の逆数を掛ける。
【０２５８】
各８ウェル・スライドを下記のようにＣＭＶ  ＭＡｂ試薬で染色する：
・１ウェル当たり３０μＬのＣＭＶ  ＭＡｂテスト試薬で各バクテリア・スライドの２つのウェルを染色する。
・６０分間３５℃から３７°Ｃのインキュベーターにスライドを放置する。
・インキュベーターから取り出し、それからＰＢＳでスライドを優しくすすぐ。細胞スポットに触れないように、又は妨害しないようにして拭き取って乾燥する。
・各ウェルに一滴の封入液体を加え、各スライド上にカバーグラスを置く。
・２００及び４００Ｘの全体の倍率で蛍光性を検査し、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。
【０２５９】
Ｄ．膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）
これらの微生物は、定着された抗原コントロール・スライドである。膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（カタログ番号５０７３−５）及びクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）コントロール・スライド（カタログ番号ＣＰ−４２１２）をＣｈｅｍｉｃｏｎ／Ｌｉｇｈｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから得た。クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（カタログ番号２１０−８８−１２−ＦＣ）をＶＭＲＤ，  Ｉｎｃ．から購入した。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（カタログ番号０１−０００１１）スライドは商品としてＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｓによって製造される。
【０２６０】
各スライドを下記の手順でＣＭＶ  ＭＡｂ試薬で染色する：
・１ウェル当たり３０μＬのＣＭＶ  ＭＡｂテスト試薬で各バクテリアの２つスライドを染色する。
・６０分間３５℃から３７°Ｃのインキュベーターにスライドを放置する。
・インキュベーターから取り出し、それからＰＢＳでスライドを優しくすすぐ。細胞スポットに触れないように、又は妨害しないようにして拭き取って乾燥する。
・各ウェルに一滴の封入液体を加え、各スライド上にカバーグラスを置く。
・２００及び４００Ｘの全体の倍率で蛍光性を検査し、蛍光染色細胞又はバックグラウンド染色が見えるウェルを記録する。
【図１】
2012529009.tif 000025
【図２】
2012529009.tif 000026
【図３】
2012529009.tif 000027
【図４】
2012529009.tif 000028
【図５】
2012529009.tif 000029
【図６】
2012529009.tif 000030
【図７】
2012529009.tif 000031
【図８Ａ】
2012529009.tif 000032
【図８Ｂ】
2012529009.tif 000033
【図９】
2012529009.tif 000034
【図１０】
2012529009.tif 000035
【図１１】
2012529009.tif 000036
【図１２】
2012529009.tif 000037
【図１３】
2012529009.tif 000038
【図１４】
2012529009.tif 000039
【図１５】
2012529009.tif 000040
【国際調査報告】
2012529009.tif 000041