(57)【要約】本発明は、一般式（Ａ）または（Ｂ）を有する多量体分子、ならびに腫瘍の診断および／または療法におけるその使用に関する。
2012507573.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式ＡまたはＢを有し、
【化１】
2012507573.tif 000010
式中、
ｎ＝１〜５であり、
【化２】
2012507573.tif 000011
（式中、ｍ＝９〜１２であり、ｐ＝１〜５である）
【化３】
2012507573.tif 000012
（式中、ｑ＝１〜５であり、ｍ＝９〜１２である）
【化４】
2012507573.tif 000013
であり、Ｚ＝ＮＨ２またはＯＨである多量体分子。
【請求項２】
ペプチドが、以下のアミノ酸配列：ＱＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ（配列番号１）、ｐｙｒｏＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ（配列番号２）、またはＲＲＰＹＩＬ（配列番号１のアミノ酸８からアミノ酸１３）を含む、請求項１に記載の多量体分子。
【請求項３】
医療に使用するための、請求項１または２に記載の多量体分子。
【請求項４】
抗腫瘍剤としての、請求項１または２に記載の多量体分子。
【請求項５】
前記腫瘍が、結腸、膵臓または前立腺癌腫である、請求項５に記載の多量体分子。
【請求項６】
薬剤を調製するための、請求項１に記載の多量体分子の使用。
【請求項７】
前記薬剤が抗腫瘍活性を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記腫瘍を診断するための、請求項１に記載の多量体分子の使用。
【請求項９】
前記腫瘍が、結腸、膵臓または前立腺癌腫である、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項に記載の多量体分子、または医薬的に許容され有効なその塩、ならびに希釈剤、および／または溶媒、および／または担体、および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の多量体分子を投与または曝露することを含む、治療方法。
【請求項１２】
前記治療が抗腫瘍治療である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の多量体分子を投与または曝露することを含む、診断方法。
【請求項１４】
前記診断が腫瘍診断である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が、結腸、膵臓または前立腺癌腫である、請求項１２または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ニューロテンシン（ＮＴ）の配列から誘導されたインビボで安定な分岐ペプチドに関する。これらのペプチドは、癌細胞を特異的に標的化する機能単位（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｔ）に結合することができる。したがって、これらのペプチドは、腫瘍の診断および／または療法に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
古典的な化学療法の主要な問題の１つは、ほとんどの抗癌剤の、正常細胞にも非特異的な毒性である。そのため、腫瘍の特異的標的化は、癌の療法および診断の研究における主要な課題である。
【０００３】
現在、革新的な腫瘍特異的療法は、特に腫瘍細胞に発現または過剰発現する、腫瘍関連タンパク質を標的化するストラテジーに従う。
【０００４】
様々な内因性調節ペプチドの受容体がいくつかのヒト原発性癌に発現するという観察は、腫瘍選択的標的化のための合成ペプチドの使用に新しい展望を切り開いた１〜３。
【０００５】
ニューロテンシン（ＮＴ）は、中枢神経系における神経伝達物質または神経修飾物質および末梢における局所ホルモンの二元機能を有する、アミノ酸１３個のペプチドである。ＮＴ受容体は、小細胞肺癌、結腸、膵臓、および前立腺癌腫などの重度の悪性腫瘍に過剰発現する。ＮＴ安定化類似体は、数年前に腫瘍療法のために提示されており４〜１０、ＮＴは依然として、これらの腫瘍においてＮＴ受容体の発生率および密度が高いことから、膵臓外分泌癌腫(exocrine pancreatic carcinoma)のペプチドベースの療法の可能な最良の候補であるとみなされている１１。すべての膵臓腺管癌腫の７５％超がＮＴ受容体を過剰発現するのに対して、正常な膵臓組織、膵炎、および膵臓内分泌部(endocrine pancreas)は過剰発現しない１２。
【０００６】
腫瘍受容体標的化は、癌化学療法の非特異的毒性の問題へのアプローチにおいて基本となるものであり、放射性同位体による腫瘍局在の貴重なツールである。それにもかかわらず、ペプチドのインビボでの使用は、それらの短い半減期によって大きく制限されている。
【０００７】
本発明の発明者らは以前に、分岐デンドリマー形態のペプチドの合成によって、ペプチド生物活性を保持することができ、生物流体のタンパク分解活性に非常に耐性であり、したがって単量体ペプチドに対して著しく高い半減期を有する分子が得られることを実証した１３〜１４。
【０００８】
本発明は、ＮＴから誘導されたインビボで安定なデンドリマーペプチドに関する。そのようなペプチドはまた、癌細胞を標的化するために用いられる機能単位に結合している。具体的には、ＮＴ４（８−１３）と光感受性物質(Photosensitizer)Ｃｈｅ６または化学療法分子ＭＴＸとの結合は、腫瘍細胞に特異的であり、健康な細胞に非毒性であり、そのためマウスに全身投与されたとき、古典的な化学療法剤の二次作用を克服することが示されている１５。
【０００９】
本発明では、分子の特異性に加えて、遊離非カップリング薬物と比較して増大した結合分子の活性が観察された。本発明の分子は、本発明者らが合成した多数の類似体のプールから選択された。「担体」ペプチド（ニューロテンシン）は、他のいくつかの担体のなかで最良の担体である。たとえば、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）（ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ、配列番号３）としても知られる黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）は、ＮＴより低いインビトロでの結合プロファイルを示した。さらに、本発明で用いられるリンカーは、分子の活性に大きく影響するため、それぞれ新しい分子のために選択された。たとえば、ＮＴ（８−１３）４−β−Ａｌａ−ビオチンは、ＮＴ（８−１３）４と比較してＮＴ受容体に対する結合活性が緩やかであることが示されたが、ＮＴ４−ｐｅｇ−ビオチンは、ＮＴ４のＩＣ５０値に匹敵するＩＣ５０値を維持した。ＮＴ（１−１３）４−フルオレセインおよびＮＴ（８−１３）４−フルオレセインは、ＮＴ（８−１３）４−β−Ａｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−フルオレセイン）より有効に癌細胞および組織を染色することができ、フルオロフォアもより安定である。最後に、化学療法剤部分は選択的であり、カップリングに一義的(univocally)に用いられるように、その官能基に基づいて選択された。結合の強さは、薬物自体の作用部位および様式に応じて調節され、最良の結合が選択された。例として、「切断不能な」リンカーを介してニューロテンシンに結合した６−メルカプトプリンは完全に非細胞毒性であり、「切断可能な」リンカーを介して結合した同薬物は活性であったが、その活性はさらなる開発を考慮するには不十分であった。同様に、モナストロール誘導体は、本発明における化合物の第１の選択肢ではない。総合すると、これらの特定の特徴のために本発明の目的は可能な任意の類似体より独自性があり好ましいものになる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Reubi JC. J NuclMed. 1995; 36(10) 1825-35
【非特許文献２】Reubi JC. EndocrRev. 2003; 24(4): 389-427
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、一般式ＡまたはＢを有し、
【００１２】
【化１】
2012507573.tif 000003
【００１３】
式中、
ｎ＝１〜５であり、
【００１４】
【化２】
2012507573.tif 000004
【００１５】
（式中、ｍ＝９〜１２であり、ｐ＝１〜５である）
【００１６】
【化３】
2012507573.tif 000005
【００１７】
（式中、ｑ＝１〜５であり、ｍ＝９〜１２である）
【００１８】
【化４】
2012507573.tif 000006
【００１９】
であり、Ｚ＝ＮＨ２またはＯＨである多量体分子である。
【００２０】
好ましくは、ペプチドは、以下のアミノ酸配列：ＱＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ（ニューロテンシン、配列番号１）、ｐｙｒｏＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ（配列番号２）、またはＲＲＰＹＩＬ（ニューロテンシン８−１３、すなわち配列番号１のアミノ酸８からアミノ酸１３）を含む。
【００２１】
好ましくは、本発明の多量体分子は医療に使用するためのものである。さらに好ましくは抗腫瘍剤としてである。さらに好ましくは、腫瘍は、結腸または膵臓または前立腺癌腫である。本発明のさらなる目的は、薬剤を調製するための本発明の多量体分子の使用である。好ましくは前記薬剤は抗腫瘍活性を有する。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、腫瘍を診断するための本発明の多量体分子の使用である。好ましくは、腫瘍は結腸または膵臓または前立腺癌腫である。本発明のさらなる目的は、本発明の多量体分子、または医薬的に許容され有効なその塩、ならびに希釈剤、および／または溶媒、および／または担体、および／または賦形剤、および／またはビヒクルを含む医薬組成物である。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、本発明の多量体分子を投与または曝露することを含む治療方法である。好ましくは前記治療は抗腫瘍治療である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、本発明の多量体分子を投与または曝露することを含む診断方法である。好ましくは前記診断は腫瘍診断である。さらに好ましくは、腫瘍は結腸または膵臓または前立腺癌腫である。
【００２５】
本発明を、以下の図面を参照しながら非限定的な例によって説明する。
【００２６】
図１は、四分岐ＮＴ（８−１３）４−ＰＥＧ−Ｋ（ＰＥＧ−フルオレセイン）［ＮＴ４（８−１３）−ＦＬＵＯ］１、ＮＴ（８−１３）４−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−クロラムブシル）［ＮＴ４（８−１３）−ＣＬＢ］２、四分岐ＮＴ（８−１３）−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−５−フルオロデオキシウリジン）［ＮＴ４（８−１３）−５−ＦｄＵ］３、四分岐ＮＴ（８−１３）−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−６−メルカプトプリン）［ＮＴ４（８−１３）−６−ＭＰ］４、四分岐ＮＴ（８−１３）−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−コンブレタスタチン）［ＮＴ４（８−１３）−ＣＢＴＳＴ］５、四分岐ＮＴ（８−１３）−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−モナストロール）［ＮＴ４（８−１３）−Ｍｏｎ］６、四分岐ＮＴ（８−１３）−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−チラパザミン）［ＮＴ４（８−１３）−ＴＰＺ］７、四分岐ＮＴ（８−１３）−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−Ａｓｐ−ＤＯＴＡ）［ＮＴ４（８−１３）−ＤＯＴＡ］８、ならびに四分岐ＮＴ（８−１３）−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−コンブレタスタチンエーテル）［ＮＴ４（８−１３）−Ｏ−ＣＢＴＳＴ］９、および四分岐ＮＴ（８−１３）−βＡｌａ−Ｋ（ＰＥＧ−モナストロールエーテル）［ＮＴ４（８−１３）−Ｏ−Ｍｏｎ］１０の合成を示す図である。ＮＴ（１−１３）４類似体は、アミノ酸配列ｐｙｒｏＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ（配列番号２）を有する。
【００２７】
図２は、腫瘍細胞系における結合および内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す図である。ＨＴ−２９、ＰＣ−３、およびＰＡＮＣ−１を３０分間（０時点）、ＮＴ（１−１３）４−フルオレセインに曝露した。０時点、ならびに３７℃で培地中１時間および２時間インキュベートした後に画像を撮影した。細胞膜はレクチン−Ｃｙ３（赤色）で染色し、核はＤＡＰＩ（青色）で染色した。
【００２８】
図３は、ＨＴ−２９、ＰＣ−３、およびＰＡＮＣ−１細胞に対する薬物結合徐放性分岐ＮＴの細胞毒性を示す図である。パネルＡ）左から：メトトレキサート（ＭＴＸ）に結合したＮＴ（８−１３）、遊離ＭＴＸ；ＭＴＸに結合した非関連ペプチド（Ｕ４）、Ａ１：ＭＴＸに結合したＮＴ（１−１３）。パネルＢ）左から：クロラムブシル−化合物２−（ＣＬＢ）に結合したＮＴ（８−１３）、遊離ＣＬＢ；ＣＬＢに結合した非関連ペプチド（Ｕ４）。パネルＣ）左から：コンブレタスタチンエーテル−化合物９−（Ｏ−ＣＢＴＳＴ）に結合したＮＴ（８−１３）、遊離ＣＢＴＳＴ；ＣＢＴＳＴに結合した非関連ペプチド（Ｕ４）。パネルＤ）左から：モナストロールエーテル−化合物１０−（ＭＯＮ）に結合したＮＴ（８−１３）、遊離ＭＯＮ；ＭＯＮに結合した非関連ペプチド（Ｕ４）。パネルＥ）左から：チラパザミン−化合物７−（ＴＰＺ）に結合したＮＴ（８−１３）、遊離ＴＰＺ；ＴＰＺに結合した非関連ペプチド（Ｕ４）。
【００２９】
図４は、ＨＴ−２９、ＰＣ−３、およびＰＡＮＣ−１細胞に対する薬物結合速放性分岐ＮＴの細胞毒性を示す図である。パネルＦ）左から：５−フルオロデオキシウリジン−化合物３−（５ＦｄＵ）に結合したＮＴ（８−１３）、遊離５ＦｄＵ、５ＦｄＵに結合した非関連ペプチド（Ｕ４）、Ｆ１：５ＦｄＵに結合したＮＴ（１−１３）。パネルＧ）左から：コンブレタスタチンエステル−化合物５−（ＣＢＴＳＴ）に結合したＮＴ（８−１３）、遊離ＣＢＴＳＴ、ＣＢＴＳＴに結合した非関連ペプチド（Ｕ４）。
【００３０】
図５は、ＮＴ（１−１３）４−フルオレセイン）で染色した結腸および膵臓腺癌（Ｋ）ならびに対応する健康な組織（Ｈ）を示す図である。共焦点顕微鏡画像（Ａ）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによってピクセル分布に関して分析し、ＲＧＢシステムの緑色スケールのピクセル数として報告した。（Ｂ）結腸（ｎ＝１７）および膵臓（ｎ＝１２）ヒト検体に関して、正常（薄い灰色）および癌（灰色）サンプルの平均蛍光値の比較。
【００３１】
図６は、箱ひげ図（ボックスプロット、boxplot）である。各カテゴリーの箱は四分位範囲（２５〜７５％）を表し、箱内部の黒い線は中央値である。ひげの下部および上部の細い線は、それぞれ１０％および９０％を示す。外れ値は白丸で示し、２群間のｐ値が示される。
【００３２】
図７は、マウスでの腫瘍増殖低下を示す図である。Ａ、ＮＴ（１−１３）−５ＦｄＵ（１群）、遊離５ＦｄＵ（２群）、および食塩水（３群）を注射したマウスの腫瘍体積；Ｂ、未処置マウスの腫瘍体積（３群、１００％とする）とＮＴ（１−１３）−５ＦｄＵおよび遊離５ＦｄＵで処置したマウスの腫瘍体積（１群および２群）との間の差異として算出した腫瘍増殖の阻害、Ｃ、腫瘍重量。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】四分岐ＮＴの合成を示す図である。
【図２】腫瘍細胞系における結合および内在化を示す図である。
【図３−１】ＨＴ−２９、ＰＣ−３、およびＰＡＮＣ−１細胞に対する薬物結合徐放性分岐ＮＴの細胞毒性を示す図である。
【図３−２】ＨＴ−２９、ＰＣ−３、およびＰＡＮＣ−１細胞に対する薬物結合徐放性分岐ＮＴの細胞毒性を示す図である。
【図３−３】ＨＴ−２９、ＰＣ−３、およびＰＡＮＣ−１細胞に対する薬物結合徐放性分岐ＮＴの細胞毒性を示す図である。
【図４】ＨＴ−２９、ＰＣ−３、およびＰＡＮＣ−１細胞に対する薬物結合速放性分岐ＮＴの細胞毒性を示す図である。
【図５】ＮＴ（１−１３）４−フルオレセイン）で染色した結腸および膵臓腺癌（Ｋ）ならびに対応する健康な組織（Ｈ）を示す図である。
【図６】箱ひげ図（ボックスプロット、boxplot）である。
【図７】マウスでの腫瘍増殖低下を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
ペプチド合成
第２アミノ酸がβ−ＡｌａではなくＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨである［ＮＴ４（８−１３）−Ｆｌｕｏ］１を除いて、Ｎｏｖａｓｙｎ  ＴＧＲ樹脂で第１アミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨおよび第２アミノ酸としてβ−Ａｌａを用いて、四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−Ｋ（ＰＥＧ＿フルオレセイン）［ＮＴ４（８−１３）−Ｆｌｕｏ］１、ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−クロラムブシル［ＮＴ４（８−１３）−ＣＬＢ］２、四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−５−フルオロデオキシウリジン［ＮＴ４（８−１３）−５−ＦｄＵ］３、四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−６−メルカプトプリン［ＮＴ４（８−１３）−６−ＭＰ］４、四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−コンブレタスタチン［ＮＴ４（８−１３）−ＣＢＴＳＴ］５、四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−モナストロール［ＮＴ４（８−１３）−Ｍｏｎ］６、四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−チラパザミン［ＮＴ４（８−１３）−ＴＰＺ］７、四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−ＤＯＴＡ）［ＮＴ４（８−１３）−ＤＯＴＡ］８、ならびに四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−コンブレタスタチンエーテル［ＮＴ４（８−１３）−Ｏ−ＣＢＴＳＴ］９、および四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−モナストロールエーテル［ＮＴ４（８−１３）−Ｏ−Ｍｏｎ］１０を合成した（図１）。その後、上記のとおりであるが、最終２つのカップリングステップが側鎖アームで選択的に起こるように、ニューロテンシン配列の最後のアミノ酸としてＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを用いて、四量体を構築した。アミノ酸配列が完了したら、Ｄｄｅ保護基をヒドラジンで除去し、中間体をＰＥＧとカップリングする。ＰＥＧからＦｍｏｃを除去した後、リンカーに遊離カルボキシル基を有する機能単位（Ｗ）に化合物をカップリングする。
【００３５】
ＮＴ４（８−１３）−ＦＬＵＯ１、ＮＴ４（８−１３）−ＣＬＢ２、ＮＴ４（８−１３）−ＴＰＺ７、ＮＴ４（８−１３）−ＤＯＴＡ８、ならびにＮＴ４（８−１３）−Ｏ−ＣＢＴＳＴ９、およびＮＴ４（８−１３）−Ｏ−Ｍｏｎ１０は、フルオロフォアまたは薬物に存在する遊離カルボキシル基およびペプチドのアミン基に由来するアミド結合を介して分岐担体に結合した（図１）。一方、ＮＴ４（８−１３）−５−ＦｄＵ３、ＮＴ４（８−１３）−ＣＢＴＳＴ５、およびＮＴ４（８−１３）−Ｍｏｎ６は、ペプチド側にアミド結合を提供し、薬物側にエステル結合を提供する二官能リンカーを介して、担体ペプチドに結合した。ＮＴ（８−１３）４−６−ＭＰは、ペプチド側にアミド結合を提供し、６−ＭＰ側にチオ−エン(thio-enoic)結合を提供する二官能リンカーを介して、担体ペプチドに結合した。これら３種の結合配置は、異なる薬物放出パターンを生じさせた、すなわち、ＮＴ４（８−１３）−ＦＬＵＯ１、ＮＴ４（８−１３）−ＣＬＢ２、ＮＴ４（８−１３）−ＴＰＺ７、ＮＴ４（８−１３）−ＤＯＴＡ８、ＮＴ４（８−１３）−Ｏ−ＣＢＴＳＴ９、およびＮＴ４（８−１３）−Ｏ−Ｍｏｎ１０は、ＦＬＵＯ、ＣＬＢ、ＴＰＺ、ＤＯＴＡ、ＣＢＴＳＴ、およびＭｏｎをほとんど放出しない。それに対して、ＮＴ４（８−１３）−５−ＦｄＵ３、ＮＴ４（８−１３）−ＣＢＴＳＴ５、ＮＴ４（８−１３）−Ｍｏｎ６、およびＮＴ（８−１３）４−６−ＭＰ４は、ＦｄＵ、ＣＢＴＳＴ、Ｍｏｎ、および６−ＭＰを付加物から容易に放出する。
【００３６】
配列ｐｙｒｏＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ（配列番号２）を有する四分岐ペプチドを上記のとおり合成した。
【００３７】
配列ＡｃＤＤＨＳＶＡ（配列番号４）を有する非関連分岐ペプチドを上記のとおり合成し、コントロールとして用いた。
【００３８】
ペプチド内在化および薬物放出
分岐結合ペプチド１〜１０は、分岐ペプチドと機能単位とのカップリングに用いるリンカーによって異なる。リンカーは、本明細書では担体ペプチドから機能単位を放出する能力によって、速放性または徐放性とみなされる。
【００３９】
５ＦｄＵ、モナストロール、およびコンブレタスタチンの放出
１０６ＰＡＮＣ−１細胞を、３７℃において様々な時間間隔で、ＮＴ結合分岐ペプチドＮＴ（８−１３）４−５−ＦｄＵ３、ＮＴ４（８−１３）−ＣＢＴＳＴ５、ＮＴ４（８−１３）−Ｏ−ＣＢＴＳＴ９、ＮＴ４（８−１３）−Ｍｏｎ６、およびＮＴ４（８−１３）−Ｏ−Ｍｏｎ１０（１００μＭ）、ならびに非関連分岐ペプチド（１００μＭ）と共にインキュベートした。細胞を遠心分離し、洗浄し、次いで、凍結融解した後、水中で溶解した。加速電圧２０ｋＶ、リフレクトロンモードでＥｔｔａｎ  ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析計を用い、内部標準としてＮＴ（８−１３）４を添加した後、上清および溶解細胞を質量分析法によって分析した。
【００４０】
ＮＴ４（８−１３）−Ｏ−ＣＢＴＳＴ９およびＮＴ４（８−１３）−Ｏ−Ｍｏｎ１０は、細胞培地中で徐々に減少したが、細胞溶解物では増加し、これは１時間後に出現し、インキュベーションから４８時間後に最大濃度に達した。非関連四分岐ペプチドは、細胞培地中、４８時間後に完全体で見出され、溶解細胞中では検出されなかった。
【００４１】
ＮＴ（８−１３）４−５−ＦｄＵは、細胞溶解物および細胞培地中で徐々に減少した。５ＦｄＵに結合した非関連四分岐ペプチド［（ＡｃＤＤＨＳＶＡ）４−５ＦｄＵ］は、４時間、細胞溶解物では見出されず、培地中で完全体のままであった。実際、ＮＴ（８−１３）４−５−ＦｄＵおよび（ＡｃＤＤＨＳＶＡ）４−５ＦｄＵは、５−ＦｄＵの加水分解によって攻撃され、５−ＦｄＵがエステルリンカーから放出され、したがってより短い半減期を示す。
【００４２】
ＮＴ４（８−１３）−ＣＢＴＳＴ５、ＮＴ４（８−１３）−Ｍｏｎ６は、エステル結合の加水分解によって、２時間後にＣＢＳＴＳおよびＭＯＮを放出したが、エーテル結合薬物９および１０は、上清または溶解物において完全体で見出された。
【００４３】
ＮＴ（８−１３）４−６−ＭＰからの６−ＭＰの放出
ＮＴ（８−１３）４−６−ＭＰを、１、５、および１５当量のＧＳＨの存在下、リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）中、３７℃でインキュベートした。次いで、粗混合物を様々な時間間隔でＨＰＬＣに注入し、６−ＭＰの放出を測定した。ＮＴ（８−１３）４−６−ＭＰは、１当量のＧＳＨの存在下、１３５分後に８６％の６−ＭＰを放出し、５当量のＧＳＨでは３０分後に１００％放出した。
【００４４】
その後、官能化分岐ペプチドを速放性または徐放性／非放出性に分類した。ＮＴ４（８−１３）−Ｆｌｕｏ１、ＮＴ４（８−１３）−ＣＬＢ２、ＮＴ４（８−１３）−ＴＰＺ７、ＮＴ４（８−１３）−ＤＯＴＡ８、ＮＴ４（８−１３）−Ｏ−ＣＢＴＳＴ９、およびＮＴ４（８−１３）−Ｏ−Ｍｏｎ１０は徐放性付加物であり、ＮＴ４（８−１３）−５−ＦｄＵ３、ＮＴ４（８−１３）−ＣＢＴＳＴ５、ＮＴ４（８−１３）−Ｍｏｎ６、およびＮＴ４（８−１３）−６−ＭＰ４は速放性である。
【００４５】
機能単位に結合した分岐ＮＴペプチドのインビトロ活性
ヒト癌細胞系におけるペプチド結合および内在化
ビオチンに結合した四分岐ＮＴ（８−１３）（ＮＴ（８−１３）４−ＰＥＧ−ビオチン）のペプチド結合および内在化を、ヒト結腸腺癌（ＨＴ２９）、ヒト膵臓癌腫（Ｐａｎｃ−１）、およびヒト前立腺癌腫（ＰＣ３）細胞系において、共焦点顕微鏡法によって分析した１５。
【００４６】
本発明において、ＮＴ（１−１３）４−フルオレセインおよびＮＴ（８−１３）４−フルオレセインは、ＮＴ受容体を発現する３種の細胞系に特異的に結合することが見出された（図２）。細胞を播種し、２４時間増殖させ、ＴＢＳ中３％ＢＳＡを用いて３７℃で３０分間ブロックし、その後、４倍モル過剰の単量体類似体と比較して、ペプチド（ＴＢＳ−０．３％ＢＳＡ中２μＭ）と共にインキュベートした。プロテアーゼ阻害剤カクテルを、単量体ペプチドによる実験の緩衝液に添加した。細胞を３７℃で１、２または４時間、培地で増殖させ、その後、４％ホルマリンで固定し、原形質膜をレクチン−Ｃｙ３（ＴＢＳ−０．３％ＢＳＡ中０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、核を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＴＢＳ−１％ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌ）で染色した。共焦点レーザー顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５）で画像を撮影した。
【００４７】
結合ペプチドの内在化は１時間で完了した。ペプチドは、１８時間以内に細胞内で分解した１５。細胞結合または内在化速度の差異は、ＮＴ（１−１３）とＮＴ（８−１３）四分岐ペプチドとの間に検出されなかった。単量体ＮＴ（１−１３）−フルオレセイン（Ｍ）は、シグナルを示さなかった。
【００４８】
ＮＴ受容体を介して癌細胞系に結合し、細胞内で迅速に内在化され、４時間後に依然として検出可能である、機能単位に結合した四分岐ペプチドの能力は、そのようなペプチドの治療適用例における重要性を示している。
【００４９】
種々の腫瘍細胞系における薬物結合ＮＴ４の細胞毒性
臨床の実践に用いられる古典的な化学療法剤は、異なる腫瘍に対して異なる活性を有することがよく知られている。これは、細胞による薬物の取り込みの低下もしくは送出の増大、細胞内部での薬物不活化の増大、またはＤＮＡアルキル化剤によって生成されたＤＮＡ損傷の修復の増強を含む様々な機序に起因する、薬物に対する癌細胞の自然の耐性によるものである。
【００５０】
本発明の筆者らによってＨＴ−２９で行われた、以前に報告された細胞毒性実験は１５、メトトレキサート（ＭＴＸ）または光感受性物質、塩素ｅ６の四分岐ＮＴ（８−１３）との結合は、プロドラッグ様分子を生じさせることを実証した。そのような分子は、対応する遊離薬物の機序によって、もはや原形質膜を通って輸送されることはできず、ペプチド−受容体結合によってのみ「活性化」され得、したがって非特異的薬物毒性が大いに低減される。
【００５１】
ペプチド受容体によって仲介される、薬物の細胞内在化の新規な機序の導入により、自然な細胞耐性の機序を回避できる可能性がある。そのため、筆者らは、古典的な腫瘍化学療法に通常用いられるいくつかの異なる分子、メトトレキサート（ＭＴＸ、クロラムブシル（ＣＬＢ）、６−メルカプトプリン、および５−フルオロ−２'−デオキシウリジン（５−ＦｄＵ）、または新興の薬物、コンブレタスタチン（ＣＢＴＳＴ）１６、モナストロール（ＭＯＮ）１７、チラパザミン（ＴＰＺ）１８を選択した。ＨＴ−２９、ＰＡＮＣ−１、およびＰＣ−３腫瘍細胞系において、遊離薬物または四分岐結合として、これらの分子を試験した（図３および４）。詳細には、ＨＴ−２９、ＰＡＮＣ−１、およびＰＣ−３細胞を、９６ウェルマイクロプレートにおいて、１ウェル当たり２．５×１０４の密度で播種した。０．１５から３０μｍｏｌ／Ｌの様々な濃度の遊離またはＮＴ結合薬物を、播種の２４時間後に添加した。６日間、培地を交換せずに、細胞を増殖させた。３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドによって、増殖阻害を評価した。ＧｒａｐｈＰａＤ  ｐｒｉｓｍ３．０２ソフトウェアを用い、非線形回帰分析によってＥＣ５０値を算出した。得られた最良のＥＣ５０値（モル濃度で表す）は以下のとおりであった：ＨＴ２９においてＮＴ（８−１３）４−ＣＬＢでは１．９ｅ−００６、ＨＴ２９においてＮＴ（８−１３）４−５ＦｄＵでは３．３ｅ−００７、ＰＣ３においてＮＴ（８−１３）−ＴＰＺでは１．４ｅ−７、ＰＡＮＣ−１においてＮＴ（８−１３）４−ＣＢＴＳＴでは４．７ｅ−００７、およびＨＴ２９においてＮＴ（１−１３）４−５ＦｄＵでは１．１ｅ−００７。
【００５２】
すべての薬物結合ＮＴ４の細胞毒性を３種の細胞系で試験し、対応する遊離薬物の細胞毒性、および同じ薬物に同様に結合した非関連四分岐ペプチド（Ｕ４）の細胞毒性と比較した。
【００５３】
５−ＦｄＵ、モナストロール、およびＣＢＴＳＴは、付加物から速く放出された。そこで、細胞を遊離またはＮＴ結合薬物の１時間パルス(pulse)に曝露し、洗浄し、６日間インキュベートするか、または別法としてさらに洗浄することなく、ペプチドと共に６日間インキュベートする実験で、ＨＴ−２９、ＰＡＮＣ−１、およびＰＣ−３において速放性薬物結合四分岐ペプチドの細胞毒性を試験した。さらなる洗浄は、その後の６日間で細胞内に遊離薬物が拡散するのを回避するために行った。
【００５４】
四分岐ＮＴ（８−１３）との結合は薬物活性を大いに改変し、これはｉ）薬物の細胞感受性、ｉｉ）薬物の作用機序、ｉｉｉ）薬物に対する細胞耐性の機序、ｉｖ）結合薬物の膜輸送の効率を含む、細胞および薬物両方の特徴の組合せに起因する可能性がある。
【００５５】
予期されるとおり、遊離薬物の活性は互いに非常に異なり、また細胞系によって非常に異なる（図３および４、左から２番目のパネル）。原理上、四分岐ＮＴとの結合は、結果として以下を生じさせる可能性がある。
・薬物特異性の増大、
・薬物活性の増大、
・特異性および活性両方の増大、または遊離薬物の改善なし。
【００５６】
ＰＣ−３におけるＭＴＸおよびＣＬＢのように、一部の例では、分岐ＮＴに結合することによって、薬物に対する自然の細胞耐性を回避し（図３）、細胞を完全に非感受性から十分な応答性に転換することができる。分岐ペプチド担体の確実な利点は、その標的特異性であり、これは非関連分岐ペプチドにカップリングしたとき、３種の細胞系でいずれの薬物も活性が欠如していることで実証される。（図３および４のすべて左から３番目のパネルを参照）。四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−６−メルカプトプリン［ＮＴ４（８−１３）−６−ＭＰ］４および四分岐ＮＴ（８−１３）−ＰＥＧ−モナストロール［ＮＴ４（８−１３）−Ｍｏｎ］６は、親遊離薬物と比較して、改善が得られなかった。速放性四分岐ＮＴによる結果は、５−ＦｄＵおよびＣＢＴＳＴいずれの場合においても、分岐ＮＴ４との結合によって薬物の活性が明らかに増大するため、非常に興味深い（図４パネルＦおよびＧ）。徐放性分子および速放性分子でＣＢＴＳＴによって得られた結果の比較は、速放性分子が徐放性化合物よりさらに活性であり得ることを示している。
【００５７】
興味深いことに、ＭＴＸ、ＣＬＢ、および５−ＦｄＵによるＰＣ−３など、ある薬物に影響を受けない細胞は、分岐ＮＴと結合したとき、その薬物に感受性となり得る（図４パネルＡ、ＢおよびＦ）。ペプチド受容体に仲介される機序に転換することによって、膜輸送の機序が変化することで、細胞の外部から内部への薬物輸送が大きく改変され得る。さらに、分岐ペプチドとの結合は、細胞内部から外部への薬物送出の機序も損ない、結合薬物を標的細胞に封入する可能性がある。これは、ＮＴ受容体を過剰発現し、古典的な化学療法に応答しない腫瘍の療法に極めて重要である。
【００５８】
フルオロフォア結合ＮＴ４を用いる、外科的切除片からのヒト腫瘍サンプルの分析
結腸または膵臓腺癌の療法の可能な標的化剤として、本発明のＮＴ分岐ペプチドを確認するために、健康な組織と比較して、ヒト腫瘍外科的サンプルに対する四分岐ＮＴペプチドの結合を分析し、定量化した。１６件の結腸腫瘍および１２件の膵臓腫瘍の外科的切除片を採集した。腫瘍サンプルを、腫瘍端から５ｃｍ離れたところで得た同じ患者の健康な組織と比較した。同じ生検の一連の切片を、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）光学顕微鏡および蛍光共焦点顕微鏡によって分析した。詳細には、サンプルをｔｉｓｓｕｅ  ｔｅｋに包埋し、液体窒素中に保管した。２８００  Ｆｒｉｇｏｃｕｔ  Ｎ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ、Ｄｅｐｅｗ、ＮＹ）を用いて得た厚さ１０μｍの切片を、３７℃で３０分間乾燥し、室温で１５分間、４％ホルマリンで固定し、４℃で１２時間、グリシン０．１Ｍ中でインキュベートした。ＦＢＳを用いて３７℃で３０分間ブロックし、その後、ＮＴ（１−１３）４−フルオレセイン（ＴＢＳ−０．３％ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌ）と共に室温で３０分間インキュベートした。各ステップ後、ＴＢＳで洗浄した。最後に、切片を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＴＢＳ−１％ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌ）と共に５分間インキュベートした。各ステップ後、ＴＢＳで洗浄した。非関連フルオレセイン結合四分岐ペプチドを用いて、コントロールを行った。類似体単量体ペプチドを比較のためにアッセイした。ペプチド結合は、フルオレセインでは４８８ｎｍ吸収波長および５００〜５４０発光波長、ＤＡＰＩでは４０５吸収波長および４２０〜４６０発光波長を用い、共焦点レーザー顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５）によって分析した。すべての画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて処理した。得られた電子データをＲＧＢシステムの緑色範囲のピクセル分布として報告した。
【００５９】
これにより各サンプルに関して、腫瘍組織および健康な組織の免疫蛍光シグナルを、ＲＧＢシステムの範囲の平均緑色染色を表す数に翻訳することができた（図５パネルＢ）。
【００６０】
ＮＴ（１−１３）４−フルオレセインで処理したとき、結腸および膵臓腺癌両方の腫瘍組織はいずれも、同じ患者の正常組織と比較して、著しく高い蛍光発光を示した（図５パネルＡ）。ＮＴ（１−１３）４のいずれの組織サンプルとの結合も、ＮＴ（８−１３）４の同一サンプルとの結合と同じであった。
【００６１】
１６件の結腸癌のうち１４件は組織学的に腺癌、２件は腺腫と特徴づけられた。後者は、Ｋ／Ｈランクの最低範囲に相当するＫ／Ｈ値を有した。膵臓のサンプルでは、１２件のサンプルのうち１１件は腺癌、１件はリンパ腫であり、すなわち、１件は非常に異なる細胞起源を有した。このサンプルは、試験を行ったすべての外科的サンプルのなかで最低のＫ／Ｈを有した。結腸または膵臓の腫瘍の病期分類と受容体発現（Ｋ／Ｈ値）との間に相関は見出されなかった。これは、疾患の初期段階であっても、Ｋ組織とＨ組織との間の差異が統計的に有意(relevant)であることを意味している。これは、腫瘍細胞に独自には発現されず、むしろ腫瘍細胞によって過剰発現される腫瘍マーカーにとって非常に重要なポイントである。そのため、ＮＴ受容体は分岐ペプチドによる初期治療の標的として用いられる可能性がある（表１、図６）。
【００６２】
【表１】
2012507573.tif 000007
【００６３】
細胞起源が完全に異なるためリンパ腫を除いて、結腸および膵臓癌腫に関して、採集したすべての外科的サンプルの健康組織と腫瘍組織とのペプチド結合における差異の有意性を評価するために、統計的分析を行った。箱ひげ図に示したとおり（図６）、健康な対照物に対して、膵臓および結腸癌ではいずれも著しいシグナルの差異が観察された。健康サンプルと腫瘍サンプルとの比較では、両側検定の有意性水準は膵臓でｐ＜０．０１および結腸でｐ＜０．０２であった。この結果は、これらのペプチドが健康サンプルと癌サンプルを識別することができ、したがって腫瘍マーカーとして使用できることを意味している。
【００６４】
この結果は、ＮＴ分岐ペプチドによる結腸癌腫および膵臓外分泌癌腫の可能な療法にとって非常に有望である。腫瘍生検の画像化は、ＮＴをベースとする標的療法の有効性を治療前に推定することを可能にし得、これは各患者において、腫瘍組織と健康組織で測定された分岐ペプチド結合の差異に基づいて評価することができる。さらに、健康組織と腫瘍組織との間でそのように明確に識別されるシグナルは、分岐ＮＴが結腸および膵臓癌腫の特異的診断において顕著な役割を果たす可能性のあることを示している。
【００６５】
機能単位に結合した分岐ＮＴペプチドのインビボ活性
マウスにおける腫瘍増殖低下
右側腹部にＨＴ２９腫瘍を有するヌードマウスに、６回用量のＮＴ（１−１３）−５ＦｄＵを注射した。化合物ＮＴ（１−１３）−５ＦｄＵは、ＭＴＸにカップリングした類似体ペプチドと比較したときのＨＴ２９に対するインビトロでの細胞毒性を考慮して、すべてのなかからインビボ実験に選択した。
【００６６】
詳細には、５から６週齢（平均体重２０ｇ）のＣＤ−１雌ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の右側腹部に、１×１０６ＨＴ２９細胞を皮下注射した。腫瘍が直径３から４ｍｍに達したとき（腫瘍接種から５日後）、マウスを無作為に群に分け（１群当たりマウス４匹）、０．９％ＮａＣｌ中の以下の溶液５００μｌ：（ａ）１ｍｇ／ｍＬ  ＮＴ（１−１３）４−５ＦｄＵ（３．０５μｍｏｌ／ｋｇ）；（ｂ）３０μｇ／ｍＬ  ５ＦｄＵ（３．０５μｍｏｌ／ｋｇ）；および（ｃ）０．９％ＮａＣｌを尾静脈に繰り返し注射した（初回注射後０、３０、７０、１４０、１９０、２４０時間）。
【００６７】
次式を用い、腫瘍体積をカリパスで毎日測定した：体積＝長さ×幅２×π／６。腫瘍接種から２１日後、すなわち、最終処置の６日後、マウスを屠殺し、腫瘍を切除し、秤量した。実験は、癌研究で動物を使用するための地方倫理委員会の承認に従って行った。動物の使用に関連する手順は、ＵＫＣＣＣＲ（１９９８）Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｗｅｌｆａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．２ｎｄ  ｅｄ  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ７７：１〜１０を含む、研究目的で用いられる動物を保護するすべての規則に従う。統計的分析は、スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）を用いて行った。最終処置後（２４０時間）、ＮＴ（１−１３）−５ＦｄＵで処置したマウスの平均腫瘍体積は、遊離５ＦｄＵまたは食塩水で処置した動物の平均腫瘍体積の約５０％であった（図７Ａ）。最終処置から５日後（３６０時間）に測定した腫瘍重量は、薬物結合ペプチドで処置したマウスでは、コントロール群より４０％少なかった（図７Ｃ）。１０日の期間に用量３μ／ｋｇで６回投与した遊離５−ＦｄＵは、腫瘍増殖を１０％だけ阻害した。
【００６８】
参考文献
【００６９】
【表２−１】
2012507573.tif 000008
【００７０】
【表２−２】
2012507573.tif 000009
【図１】
2012507573.tif 000014
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
2012507573.tif 000020
【図６】
2012507573.tif 000021
【図７】
2012507573.tif 000022
【配列表】
2012507573000001.app
【国際調査報告】
2012507573.tif 000023
2012507573.tif 000024
2012507573.tif 000025
2012507573.tif 000026
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