(57)【要約】 【課題】現在利用可能な技術を用いて解析することができる生物学的粒子のサイズには限界がある。【解決手段】  流体媒体中に懸濁された生物学的粒子の光学検知に集束光散乱技術を使用するための方法を開示する。光学検知により、所与試料中の粒子のサイズおよび／または分布を特徴付けることが可能となる。そしてこれにより、生物学的粒子の同定、それらの相対粒子密度の測定、粒子排出の検出および粒子凝集の確認を行うことができる。この方法はまた、薬剤候補のスクリーニングおよび最適化、このような薬剤の効力および投与量レベルの評価において、ならびに個別化医療応用においても有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料媒体中の目的の生物学的粒子を同定する方法であって、
ａ）目的の生物学的粒子を含み得るまたは含み得ない試料媒体を、集束光ビームを通過させることと、
ｂ）集束光散乱技術を用いて、試料媒体内から粒子サイズ分布を示すスペクトルを作成することと、
ｃ）試料媒体中の粒子のサイズを、目的粒子の既知のサイズと比較することにより、目的の生物学的粒子存在の有無を確認することと
を含む方法。
【請求項２】
前記試料媒体中の粒子のサイズを、集束光散乱技術を用いて得られた粒子サイズのライブラリーを含む参照用データベースと比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ライブラリーが、１０個以上のスペクトルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料媒体中に目的粒子が存在することを最初に判定した後に確認アッセイを行う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記確認アッセイが、前記試料媒体のＥＱＥＬＳスペクトルの取得と、生物学的粒子に固有の特徴を特定することによる生物学的粒子存在の確認とを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記確認アッセイが、前記試料媒体を、前記目的の生物学的粒子と結合することが既知である化合物とインキュベートすることを含み、前記化合物が、微粒子またはナノ粒子と共有結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記確認アッセイが、前記目的の生物学的粒子の、前記微粒子またはナノ粒子と結合している前記化合物とのコンジュゲートを検出することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記確認アッセイが、
ａ）前記試料媒体を特定の種類の細胞を殺すことが知られている化合物で処理し、前記目的の生物学的粒子が、前記化合物により殺される特定の種類の細胞であることと、
ｂ）前記処理された試料媒体に集束光散乱解析を行って、目的粒子の濃度が低下したか否かを判定することと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記目的の生物学的粒子が、リンパ球、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、単球、細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的微粒子が、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、癌細胞、幹細胞、細菌、ウイルスおよび真菌から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的微粒子が、約０．１μｍ〜約２０μｍの範囲のサイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料媒体が、血液、血液製剤、水、脳脊髄液、腹水、胸水および滑液からなる群由来の１つまたは複数の流体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
推定治療薬剤の効力を測定する方法であって、
ａ）推定治療薬剤が結合するであろう受容体を有する生物学的粒子を含む試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示すスペクトルを得ることと、
ｂ）試料媒体を推定治療薬剤とインキュベートすることと、
ｂ）前記インキュベートした試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを得ることと、
ｃ）前記粒子のサイズおよび分布が、前記推定治療薬剤のインキュベーションにより変化したか否かを測定し、前記粒子のサイズおよび／または分布における変化が、前記推定治療薬剤と前記生物学的粒子との複合体形成を示すことと
を含む方法。
【請求項１４】
前記生物学的微粒子が、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、癌細胞、細菌、ウイルスおよび真菌から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的微粒子が０．１μｍ〜２０μｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料媒体が、血液、血液製剤、水、脳脊髄液、腹水、胸水または滑液からなる群より選択される流体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記推定治療薬剤が微粒子とコンジュゲートし、これにより、複合体を形成していない生物学的粒子と、前記微粒子／治療薬剤コンジュゲートと複合体を形成している粒子との間に測定可能なサイズの差異が存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
生物学的粒子が、既知の治療薬剤と複合体を形成するか否かを判定するための方法であって、
ａ）既知の治療薬剤が結合し得るまたは結合し得ない受容体を有する生物学的粒子を含む試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示すスペクトルを得ることと、
ｂ）前記試料媒体を既知の治療薬剤とインキュベートすることと、
ｂ）前記インキュベートした試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを得ることと、
ｃ）前記粒子のサイズおよび分布が、前記既知の治療薬剤のインキュベーションにより変化したか否かを判定し、前記粒子のサイズおよび／または分布における変化が、前記既知の治療薬剤と前記生物学的粒子との複合体形成を示すことと
を含む方法。
【請求項１９】
前記生物学的微粒子が、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、癌細胞、細菌、ウイルスおよび真菌から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的微粒子が、約０．１μｍ〜約２０μｍの範囲のサイズを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料媒体が、血液、血液製剤、水、脳脊髄液、腹水、胸水および滑液からなる群由来の生物学的流体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
既知の細胞、微生物またはウイルスに対する治療薬剤の有効量を決定するための方法であって、
ａ）既知の細胞、微生物またはウイルスに関して、集束光散乱法を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第一のスペクトルを作成することと、
ｂ）第一の濃度の治療薬剤を前記既知の細胞、微生物またはウイルスとインキュベートすることと、
ｃ）前記治療薬剤と前記既知の細胞、微生物またはウイルスとの組合せに関する集束光散乱法を用いて、粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを作成することと、
ｄ）前記第一と第二のスペクトルを比較し、前記粒子のサイズおよび／または分布における変化が、前記治療薬剤と前記細胞、微生物またはウイルスとの結合を示し、結合が、前記既知の細胞、微生物またはウイルスの阻害を示すことと、
ｅ）段階ａ〜ｅを様々な量の前記治療薬剤で繰り返すことと、
ｆ）前記スペクトルを比較して、前記既知の細胞、微生物またはウイルスと有効に結合するために必要とされる治療薬剤の最小量を決定することと
を含む方法。
【請求項２３】
前記治療薬剤が抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記既知の細胞、微生物またはウイルスが、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球および癌細胞からなる群より選択される細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記既知の細胞が癌細胞であり、かつ前記治療薬剤が癌の治療において有効である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記既知の細胞、微生物またはウイルスが、細菌および真菌から選択される微生物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記既知の微生物が細菌であり、かつ前記治療薬剤が細菌感染症の治療において有効である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記既知の細胞、微生物またはウイルスがウイルスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
細胞相互作用により生じる粒子排出を検出する方法であって、
ａ）試料媒体中の既知の細胞に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第一のスペクトルを作成することと、
ｂ）潜在的治療薬剤を前記試料媒体中の前記既知の細胞とインキュベートし、前記潜在的治療薬剤が微粒子であることと、
ｃ）前記インキュベートした試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを作成することと、
ｄ）前記第一と第二のスペクトルを比較し、前記最初の既知の細胞のサイズよりも小さいサイズの粒子の存在または粒子密度の増加が、粒子排出を示すことと
を含む方法。
【請求項３０】
試料媒体中における粒子凝集を確認する方法であって、
ａ）生物学的粒子を含む試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第一のスペクトルを作成し、凝集した粒子の粒子サイズに対応するピークの存在が、凝集の存在を示すことを含む方法。
【請求項３１】
前記試料媒体を、前記生物学的粒子における特定の突然変異の非存在下で粒子凝集を促進または阻害する活性薬剤とインキュベートし、粒子凝集の進行または進行の欠如が、この特定の生物学的粒子に対する前記活性薬剤の活性または活性の欠如に関する情報を提供することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的微粒子が血小板を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記活性薬剤が硫酸クロピドグレルである、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略的には、流体媒体中に懸濁させた生物学的粒子の光学検知の使用法に、およびより具体的には、粒子のサイズおよび／または数を測定するための光学検知に関する。この方法は、薬剤候補のスクリーニングおよび最適化、このような薬剤の有効性および投与量レベルの評価において、並びに個別化医療のアプローチ開発において有用である。
【背景技術】
【０００２】
生物学的粒子をそのサイズ、表面状態、任意の表面受容体の活性化の状態、分布などにより特徴付けることが不可欠な場合が多い。こうした情報は、そのような特徴に依存する細胞ベースのアッセイおよびその他のプロセスにおいて有用である。さらに、生物学的粒子表面の既知の変化を検出することが特定の診断的応用において有用である。したがって、表面の検出および表面の変化の監視を効率的かつ正確な方法で行うことが望ましい場合がある。
【０００３】
「電気泳動準弾性光散乱法」（ＥＱＥＬＳ）は、生物学的粒子を特徴付けるための１つの方法である。この方法では、粒子の表面電荷密度に依存する電気泳動を用いて、懸濁させた生物学的粒子の同定および特徴付けを行う。ＥＱＥＬＳでは、電場に置かれた細胞を使用し、そこで、粒子の表面電荷が、電場において粒子がどれだけ移動するかを決定する。細胞の電気泳動移動度を監視することにより、場における異なった粒子間の区別に有用な情報が得られる。単独のまたは薬剤候補と結合した粒子のスペクトルを比較することにより、生物学的粒子と相互作用する薬剤候補をスクリーニングおよび最適化することができる。
【０００４】
また、コールターカウンターを用いて生物学的粒子を特徴付けることもできる。これらの装置は、主として細胞およびその他の生物学的粒子の数およびサイズを測定するために使用される。コールターカウンターは、生物学的粒子を含む流体を２電極間の流れの中にある細孔に引き込むことにより機能する。流体が孔に引き込まれると、生物学的粒子が流れの中を通過し、流れの一部を測定可能な程度に変位させる。この測定可能な変位がパルスに翻訳され、これがコールターカウンターによりデジタル処理され、流体中の生物学的粒子のサイズおよび数を特徴付けることができるように翻訳される。
【０００５】
また、フローサイトメトリーを用いて生物学的粒子を特徴付けることもできる。フローサイトメトリーは、流体に照準を合わせたレーザーなどのビームを用いて、流体中の粒子を特徴付け、計数し、および任意で選別する。流体を１つの流れに集め、光と流体の流れの交差部分にある検出器により、前方および側方の両方の散乱が測定される。さらに、蛍光性のまたは蛍光標識した粒子を検出するために、蛍光検出器が備えられている場合もある。検出されたパターンを解析することにより、個々の各粒子の様々な物理的および化学的特徴を測定することができる。
【０００６】
これらの方法は、粒子数、粒子の流体媒体内での密度、サイズおよび表面の特徴の測定、結合の有無の確認などを含めた、微粒子の検出および特徴付けにおいて有用である。微粒子は一般的に０．１μｍ〜１００μｍの間のサイズである。しかし、技術の発達により、ナノ粒子を非限定的に含めたより小さな生物学的粒子の特徴付けが必要とされる。
【０００７】
現在利用可能な技術を用いて解析することができる生物学的粒子のサイズには限界がある。したがって、微粒子よりも小さな粒子を含めた様々なサイズの生物学的粒子を検出することが可能であり、かつ検出された粒子を正確に特徴付けし、粒子を定量化し、および／または粒子を監視することが可能な、生物学的粒子の特徴付けのためのプロセスが必要とされている。本発明はこのようなプロセスを提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、集束光散乱法を用いて生物学的粒子のサイズおよび分布を検出し、この情報を用いて、疾患を診断し、治療薬剤を同定し、ならびに試料媒体中の生物学的粒子および／または治療薬剤についてのその他の有用な情報を得る方法に関する。測定可能な代表的な粒子サイズは、約０．１μｍ〜約１００μｍの間の範囲にあり、より一般的には、約０．１〜約２０μｍの範囲にある。
【０００９】
集束光散乱法を用いることにより、ＥＱＥＬＳ、フローサイトメトリーのような技術および生物学的粒子測定の他の従来の方法を用いる場合よりも著しく小さい粒子を検出することができる。本明細書に記載の数学的アルゴリズムにより、小さな粒子を検出するだけでなく、粒子サイズの範囲、このような粒子の相対量および粒子の形状を決定することも可能となる。
【００１０】
簡潔に述べれば、集束光散乱法では、特定の経路に試料媒体を通過させることを含み、集束されたビームが試料媒体を通過する。集束されたビームは、０．１〜１０μｍのサイズ範囲の粒子が、すべてのビーム、または大部分のビームを十分遮蔽する大きさであるので、粒子のサイズを測定することができる。
【００１１】
ビームの経路を通過する粒子がない場合、ビームは媒体を通過してセンサに到達する。粒子または粒子の一部がビームを通過した場合、ビームが屈折する。そして、量の減少した光がセンサに到達するか、または光が全く到達しないことにより、粒子（または粒子の一部）がビームと相互作用したことを示す。センサに到達する減少した光の量は、粒子のサイズに関する情報を提供する。試料媒体中の粒子がビームを通過するたびに、例えば試料媒体がすべてビームを通過するまで、これが繰り返される。次いで、適当なアルゴリズムがその情報を受け取り、粒子サイズおよび粒子分布を示すスペクトルが出力される。
【００１２】
細胞は、検出可能な生物学的粒子の一種である。この方法を用いて、所与の溶液中に特定の種類の細胞が存在するか否かを判定することができる。例えば、血液、尿、髄液などの試料を、細菌、真菌、ウイルスなど存在の有無に関して評価することができる。粒子サイズおよび任意には粒子の形状は、特定の種類の細菌、真菌またはウイルスに関する情報をも提供し得る。
【００１３】
一実施形態において、粒子に関する適切な情報は、試料媒体の集束光散乱を用いてスペクトルを得るだけで得ることが可能であり、ここでは、粒子のサイズおよび分布により、試料媒体中に存在する特定の生物学的粒子の存在の有無に関する十分な情報が提供される。例えば、特定の細菌、真菌またはウイルスをそのサイズに基づくだけで同定することができ、またリポソーム流体懸濁液を、凝集粒子のサイズに基づくだけで凝集に関して評価することが可能である。
【００１４】
他の実施形態において、特定の薬剤が特定の種類の生物学的粒子と複合体を形成するか否かを判定する目的がある場合、さらなる情報が必要とされ得る。つまり、特定の種類の細胞またはある種類の細胞から放出された粒子の存在の有無を、ａ）細胞または放出される粒子と、ｂ）微粒子またはナノ粒子とコンジュゲートされた活性薬剤（「コンジュゲート」）との間で複合体を形成することにより、判定することができる。複合体は、細胞、放出される粒子またはコンジュゲートよりも粒子サイズが大きいため、複合体が形成されたか否かを集束光散乱法により判定することができる。
【００１５】
この実施形態のある態様では、生物学的粒子は特定の受容体を発現する細胞であり、この技術により、受容体と結合する推定治療薬剤のハイスループットスクリーニングを行うことができる。
【００１６】
この実施形態の他の態様では、生物学的粒子は患者由来の細胞、例えば、血液細胞または癌細胞を含み、これらの細胞を推定治療薬剤とインキュベートする。細胞と結合する薬剤は患者の治療薬剤として潜在的に有用であり得る。したがって、この実施形態は、個別化医療のアプローチを提供する。
【００１７】
これらの実施形態のいくつかでは、２つのスペクトルを取得する。第一のスペクトルを複合体形成前の試料媒体に関して取得し、第二のスペクトルを複合体形成後に取得し、粒子のサイズおよび分布の差異を調べることができる。しかし、他の実施形態において、複合体が既知粒子サイズを有し、かつ複合体の形成を示すことのみが必要とされる場合は、生物学的粒子と、その生物学的粒子と複合体を形成し得るか、または形成し得ないであろう物質とのインキュベーションのみを行い、集束光散乱法を用いて複合体形成の有無を判定することができる。
【００１８】
試料媒体を、生物学的粒子とコンジュゲートがともに存在する状態で一定時間にわたり、繰り返し集束光散乱検出器を通過させると、複合体形成の動態を観察することができる。
【００１９】
生物学的粒子とコンジュゲートがともに存在する状態で試料媒体をスキャンするが、異なる濃度の生物学的粒子および／またはコンジュゲートで別々にスキャンを行う場合、結合親和性、最小阻止濃度などに関連したさらなる情報を決定することができる。
【００２０】
試料媒体が、異なる受容体を発現する異なるサイズの細胞を含む場合、推定治療薬剤の、１つの受容体の他の受容体に対する選択性に関する情報を得ることができる。
【００２１】
細胞と結合する薬剤が細胞破壊を生じさせる場合、試料媒体中の粒子（細胞）密度の経時的な減少によりその活性薬剤の効力を表すことができる。
【００２２】
このように、複合体形成は生物学的粒子あるいは微粒子またはナノ粒子と結合した薬剤に関する有用な情報を提供する。例えば、細胞が既知の細胞である場合、その細胞と結合する能力に関して推定治療薬剤をスクリーニングすることができる。治療薬剤が既知の治療薬剤である場合、特定の細胞がその治療薬剤と結合するか否かを判定することができる。こうした情報は患者に対する個別化医療のアプローチの特定に有用である。
【００２３】
例えば、癌患者が特定の治療法に応答するか否かを時機を逸せず判定することが重要である。つまり、患者が治療法に応答しないと医師が判断する前に腫瘍が増殖および転移することがある。
【００２４】
別の例では、硫酸クロピドグレルのような薬剤を必要とする患者のうち、少数の者は、血液細胞が硫酸クロピドグレルと結合しないためにそれを使用することができない。特定の遺伝的変異に関して血液細胞をスクリーニングすることは可能ではあるが、遺伝子検査は費用と時間がかかる。この場合、血液細胞を硫酸クロピドグレルとインキュベートすることができ、患者がこの種の治療法に応答するか否かを迅速に判定することができる。血小板は、硫酸クロピドグレルと結合して相互作用しなければ凝集するため、硫酸クロピドグレルを微粒子とコンジュゲートする必要はない。つまり、血小板凝集を検査することにより、患者が治療に応答するか否かを判定することができる。しかし、目的の生物学的粒子のサイズがスクリーニングアッセイの間にあまり変化（すなわち、サイズが増加または減少する）しない場合は、推定治療薬剤を微粒子とコンジュゲートさせることが必要であり得る。
【００２５】
一実施形態において、微粒子は、粒子サイズが約０．１〜１０μｍの間の範囲にあり、理想的には、それと結合した比較的一貫した量の活性薬剤を有する。比較的一貫した量の活性薬剤が結合した粒子を製造するための１つの方法は、デンドリマーを使用することであり、この場合、デンドリマーは既知量の活性薬剤を含む。別の方法は、ａ）比較的狭いサイズ分布およびｂ）比較的一貫した量の保護された官能基を有するポリマー粒子を製造することであり、その結果、ポリマー製造後に、保護基およびポリマー粒子と活性薬剤をコンジュゲートさせるために用いた官能基を除去することができる。
【００２６】
活性薬剤を、活性である（すなわち、受容体と結合する）ことが既知である活性薬剤の部分が、それと粒子とのコンジュゲーションにより立体的に著しく妨害されないように、粒子とコンジュゲートさせることができる。いくつかの実施形態において、このことは、粒子と結合させ得るさらなる官能基を含む活性薬剤の類似体の調製を含む。
【００２７】
一実施形態において、金粒子のような金属粒子を使用する。このような粒子は多量の光を散乱させるため、特定の活性薬剤とコンジュゲートさせ、それを用いて薬剤と結合する小分子さえも同定することができる。つまり、粒子が散乱させる光の量が十分多いため、目的の分子が、測定可能な生物学的粒子のサイズ範囲内になくても、薬剤とその分子との結合を測定することができる。活性薬剤と金属粒子をコンジュゲートさせる方法は、当業者に知られている。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】比較的薄いフローチャネルを流れる粒子を照射する比較的狭い集束光ビームを用る、本発明のＬＥ型センサ（以降「新規ＬＥ型センサ」と称する）の簡略化したブロック図である。
【図２】比較的薄いフローチャネルを流れる粒子を照射する比較的狭い集束光ビームを用いた、本明細書に記載のＬＥ型センサの簡略化したブロック図である。
【図３】本発明に記載の解析法で使用される光散乱装置のさらなる実施形態を示すブロック図である。
【図４】一群の生物学的粒子、および微粒子と結合した抗体を示す実例のグラフであり、ここでは、抗体／微粒子コンジュゲートが生物学的粒子と結合する。ゼロ時間を図３に示し、また、コンジュゲートと生物学的粒子との結合に伴う、生物学的粒子および抗体／微粒子コンジュゲートの濃度の低下ならびにコンジュゲートと結合した生物学的粒子を示すピークの増加を含めた事象の進行を図４〜７に示す。
【図５】一群の生物学的粒子、および微粒子と結合した抗体を示す実例のグラフであり、ここでは、抗体／微粒子コンジュゲートが生物学的粒子と結合する。ゼロ時間を図３に示し、また、コンジュゲートと生物学的粒子との結合に伴う、生物学的粒子および抗体／微粒子コンジュゲートの濃度の低下ならびにコンジュゲートと結合した生物学的粒子を示すピークの増加を含めた事象の進行を図４〜７に示す。
【図６】一群の生物学的粒子、および微粒子と結合した抗体を示す実例のグラフであり、ここでは、抗体／微粒子コンジュゲートが生物学的粒子と結合する。ゼロ時間を図３に示し、また、コンジュゲートと生物学的粒子との結合に伴う、生物学的粒子および抗体／微粒子コンジュゲートの濃度の低下ならびにコンジュゲートと結合した生物学的粒子を示すピークの増加を含めた事象の進行を図４〜７に示す。
【図７】一群の生物学的粒子、および微粒子と結合した抗体を示す実例のグラフであり、ここでは、抗体／微粒子コンジュゲートが生物学的粒子と結合する。ゼロ時間を図３に示し、また、コンジュゲートと生物学的粒子との結合に伴う、生物学的粒子および抗体／微粒子コンジュゲートの濃度の低下ならびにコンジュゲートと結合した生物学的粒子を示すピークの増加を含めた事象の進行を図４〜７に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、集束光散乱法を生物学的応用において用いるための方法に関する。集束光散乱法により、流体を解析して所与の試料中の粒子のサイズおよび数を測定することができ、かつ任意で、試料中の粒子をさらに特徴付けることができる。粒子が生物学的粒子である場合、この情報を用いて、疾患を診断すること、ハイスループットバイオアッセイを実施することおよび個別化医療のための情報を取得することが可能である。
【００３０】
本明細書に記載の方法は、当該技術分野における従来の方法よりも数多くの利点を提供し、このような利点には、より小さな粒子の同定および特徴付ける能力、蛍光抗体または高価なフローサイトメトリーを使用せずに粒子を同定し、粒子のサイズ、数またはその他の特徴を測定する能力、生じるスペクトルの分解能を向上させる電圧変化の開始識別の向上、粒子ずり（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｈｅａｒｉｎｇ）の制御および粒子の形状に関する情報の改善が含まれる。
【００３１】
この方法はまた、評価される粒子の、以下のものを非限定的に含めた数多くの特徴を提供する：生物学的粒子の同定および種々の細胞からの区別、粒子の定量化、表面エピトープの同定、粒子の形状の同定およびこの情報と血小板活性化、トロンビン産生、疾患状態および推定治療薬剤の効力との関連付け。
【００３２】
定義
本明細書で使用される「細胞」という用語は、ヒト細胞、動物細胞（ブタ細胞、げっ歯類細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヒツジ細胞および／またはウマ細胞）、クローン細胞、植物細胞などを含めた任意の種類の細胞を指す。細胞は、血液細胞、培養細胞、生検細胞または保存剤で固定した細胞であり得る。細胞は、白血球または浮遊内皮細胞のような有核であっても、あるいは血小板または赤血球のような無核であってもよい。
【００３３】
「集束光散乱」という用語は、集束したビームを溶液が通過する際に、その溶液中に懸濁された単一粒子を検知する方法を指す。ビームが粒子により散乱することなく溶液を通過した場合、そのビームが光検出器まで伝わり、強度が測定される。ビームが粒子により全部または部分的に散乱した場合、光検出器に衝突する衝突するビームの強度が変化する。粒子のサイズおよび濃度は、例えば、減光、光散乱の検出またはその両方を用いて計算することができる。
【００３４】
「集束光散乱装置」とは多粒子光学センサのことであり、高い感度を有し、比較的高濃度の流体懸濁液に応答し、比較的狭いビームを用いて光学検知ゾーンを不均一に照射する。
【００３５】
本明細書で使用される「粒子」とは、小断片または完全無傷な生体細胞のことであり、「生物学的粒子」という場合は生体と関連する。無傷細胞は、約１ミクロン〜２０ミクロンの範囲のサイズであり得る。無傷細胞または細胞断片の凝集体は、２ミクロン〜１００ミクロンの範囲のサイズであり得る。「微粒子」とは、一般に約０．１μｍ〜約０．８μｍ、一般的には０．１〜２０μｍの範囲のサイズである生体細胞断片または粒子のことである。血液細胞、血小板（１〜３ミクロン）、癌細胞（５〜１５ミクロン）、赤血球（約７μｍ）、白血球（約５〜１０μｍ）、細菌（約０．５〜１μｍ）、腫瘍、顆粒球、単球、好中球、リンパ球、内皮細胞、幹細胞、ウイルスおよび真菌が例として挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用される「減光」とは、粒子が電磁場を通過するときの、場における粒子による光の吸収および／または散乱の尺度のことである。粒子が場を通過する際、光の屈折、吸収および／または散乱により透過光強度が一時的に低下する。粒子による減光の測定により、粒子の特徴に関するさらなる情報が得られる。各粒子について減光スペクトルを作成し得る。減光システムの例を図１〜３に示す。
【００３７】
「光散乱」は、入射光子と粒子との相互作用により引き起こされる入射光強度の一時的な変化が生じた場合に起こる。集束散乱装置の場合、検出器に到達する散乱光の強度は粒子のサイズに比例する。したがって、特徴付けされる粒子が生物学的粒子である場合、光散乱法は検出器での電圧の測定を含み、これは粒子サイズに比例する。生物学的粒子検出のための集束光散乱システムの例を図１〜３に示す。
【００３８】
本明細書で使用される「ナノ粒子」とは、一般的にサイズが０．１μｍよりも小さい粒子または生物学的粒子のことである。ナノ粒子はサイズが小さいため、体積に対する表面積の比が非常に大きい。したがって、ナノ粒子は特有の物理学的特徴を有する場合が多い。本発明は、ナノ粒子、特に、生体中におけるさらなる生化学的プロセス開始に関与するとしばしば考えられている細胞ナノ粒子の定量および監視をともに行うための方法を提供する。
【００３９】
Ｉ．粒子のサイズおよび形状測定のための集束光散乱装置およびアルゴリズム
米国特許公開第２００７００１０９７４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の集束光散乱法の主な決定的特徴は、照射エリアＡ０の大きさが著しく減少し、その結果、ＶＯＳＺが著しく減少し感度が向上するというだけではない。むしろ、照射ビームの性質およびそれにより規定される得られたＯＳＺに関係する。
【００４０】
本明細書に記載の方法の実施に有用な装置の例は、米国特許出願公開第２００４００１１９７５号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。そこに記載の装置は、集束光散乱法を用いた粒子解析の実施に有用である。しかし、本明細書に記載のように、集束光散乱および／または減光用の検出器を含むその他の同様な装置を使用し得る。
【００４１】
「集束光散乱」という用語は、集束したビームを溶液が通過する際に、その溶液中に懸濁された単一粒子を検知する方法を指す。ビームが粒子により散乱することなく溶液を通過した場合、そのビームは光検まで伝わり、強度が測定される。ビームが粒子により全部または部分的に散乱した場合、光検出器に衝突するビームの強度が変化する。粒子のサイズおよび濃度は、例えば、減光、光散乱の検出またはその両方を用いて計算することができる。
【００４２】
「集束光散乱装置」とは、単一粒子光学センサのことであり、高い感度を有し、比較的高濃度の流体懸濁液に応答し、比較的狭いビームを用いて光学検知ゾーンを不均一に照射する。これは、より高濃度の溶液およびより小さな粒子サイズを取り扱うことができるという点で、従来のＳＰＯＳ装置とは異なる。
【００４３】
使用の際には、懸濁粒子を含む溶液がゾーンを通過する。このゾーンはフローチャネルよりも狭いため、センサはフローチャネルを流れる総粒子数のごく一部のみに応答し、統計的に有意な数の、任意の関連する直径の粒子を検出する。
【００４４】
異なる粒子軌跡は、異なる強度で照射されるゾーンの異なる部分を流れるため、結果をデコンボリューションする必要がある。２つのデコンボリューション法、すなわち、修正行列反転または逐次減算を用いることができる。両方法では、実験により測定されるかまたは理論モデルから計算される少数の基底ベクトルを使用し、残りの基底ベクトルはこれらの少数の基底ベクトルから導き出される。センサは濁度に関して補正される。
【００４５】
流体懸濁液中の粒子の単一粒子光学サイズ決定のためのセンサ装置は通常、物理的に明確に定められた測定フローチャネルを通る懸濁液の流れを確立するための手段を含む。測定フローチャネル内に光学検知ゾーンを形成するために、軸を有する比較的狭いビームを有効に測定フローチャネルの中を向かわせる照射手段も存在する。光ビームおよび光学検知ゾーンは、測定フローチャネルのサイズに対して、センサ装置がフローチャネルを流れる総粒子数のごく一部のみに応答するような大きさである。このようにして、センサ装置は比較的高濃度の流体懸濁液に有効に応答する。
【００４６】
ビームには最大強度部分と、最大強度部分から、軸から垂直に離れた位置に対して連続的に弱くなる強度がある。このようにして、ある粒子は最大強度部分を通る軌跡を有し、別の粒子はより弱い強度の位置を通る軌跡を有し、さらに別の粒子はゾーンの外側に軌跡を有する場合もある。通常は、ビームの最大強度部分はビームの中心の位置にある。
【００４７】
装置はまた、ゾーンからの光を光検出してパルス波高信号を提供するための検出器手段を含む。これらの信号はそれぞれゾーンを流れる粒子に応答する。パルス波高信号は、検出された粒子のサイズと軌跡の関数である。所与のサイズの粒子は、最大強度部分を流れたときには最大のパルス波高信号を、またゾーンのより弱い強度の部分を流れたときには弱いパルス波高信号を生じる。パルス波高信号は総体としてパルス波高分布ＰＨＤを形成する。
【００４８】
装置は、パルス波高分布を数学的にデコンボリューションして流体懸濁液中のＰＳＤ粒子の粒子サイズ分布を抽出するための手段をさらに含む。センサ装置は、任意の所与の直径または流体懸濁液に関連する直径の範囲の粒子を統計的に有意な数だけ検出することができる。
【００４９】
一実施形態において、測定フローチャネルは、光ビームの軸方向の厚さ寸法、ビームと垂直な幅寸法ならびに厚さ寸法および幅寸法と実質的に垂直な流れ方向を有する。ビームは幅方向に測定フローチャネルよりも狭い。ビームは、実質的に厚さ寸法よりも大きい被写界深度をもつように集束することができ、ビームは、実質的に厚さ寸法にわたって変化しない有効幅を実質的に有する。
【００５０】
別の実施形態において、ビームは、ビームの軸に関して互いに対向する位置間で、有効幅を有し、そこでは、弱い強度は最大強度の所与の割合に低下する。有効幅は、目的の最大の粒子が有効にサイズ決定され得るように選択する。所与の割合は、例えば、ｅを自然対数の底として、最大強度の１／ｅ２とすることができ、有効幅は、実質的にはサイズ決定される最大粒子のサイズの半分である。
【００５１】
光ビームは、例えば、粒子流と垂直な方向により広い円形断面または楕円形断面のガウス強度分布を有し得る。
【００５２】
検出器手段は、減光型の検出器を含み得、また検出器の組み合わせ、例えば減光型検出器と光散乱型の組合せであり得る。光散乱型の検出器手段は、マスクにゾーンからの散乱光の一部を通過させてビームに対する第一および第二の角度の間で散乱する光を選択するための手段およびゾーンの中を伝わる光の一部を減光型の検出器に向かわせるための手段を含み得る。
【００５３】
検出器手段は、光学検知ゾーンからの光の一部を減光検出器へ偏向させるための反射鏡を含み得る。照射手段は、光源と、光源から光学検知ゾーンへ光を伝達し、光をゾーン中に投射するための光ファイバ手段とを含み得る。
【００５４】
検出器手段はまた、光学検知ゾーンの中を通過する光を減光型の検出器へ伝達するための光ファイバ手段を含み得る。検出器手段はまた、ゾーンから散乱された光の一部をマスクに通過させて、ビームに対して第一および第二の角度の間で散乱される光を選択するための手段ならびに光の一部を光散乱型の検出器に伝達する光ファイバ手段を含み得る。検出器手段はまた、光散乱検出器を含み得る。
【００５５】
一実施形態において、照射手段は、測定フローチャネル内に位置する一対の光学検知ゾーンを通過する２つの光ビームを提供し、各ビームは所望の最大粒子サイズにより決定される有効幅を有する。
【００５６】
検出器手段は、光散乱検出器と、ゾーンから散乱された光をマスク手段に通過させるための手段とを含み得る。マスク手段は、複数のマスクと、ゾーンから散乱された光を通過させるためのマスクを１つ選択するための手段とを含み得、各マスクは、その間で光が散乱される異なった角度を定める。マスクは、回転可能なホイール上に位置し得、かつホイールを所望の位置に回転させることによりマスクを選択し得る。
【００５７】
照射手段は、光学検知ゾーン内に比較的幅の広い平行ビームを投射することができ、かつビームの軸近くを取り囲む光線のみを捕捉するための受容開口部を含み得る。これにより、有効なビーム幅は、サイズ決定される最大粒子の実質的に２分の１のサイズの、光ビーム軸に垂直方向の幅にまで減少する。照射手段はまた、光線と検出器手段とを連結させるための手段を含み得る。これは、例えば光ファイバ手段であり得る。
【００５８】
本発明の一態様では、各適切なサイズの統計的に有意な数の粒子がゾーンのすべての部分および位置を通って流れる。
【００５９】
本発明の別の態様では、流体懸濁液は比較的高濃度であり、装置は懸濁液の濁度を補正するための手段をさらに含む。この態様では、検出器手段が減光方式で動作し、基準電圧レベルを有する信号をもたらすことができる。パルス波高信号は基準電圧レベルから下方に伸長するパルスとして現れ、懸濁液の濁度に対する補正のための手段は、基準電圧レベルを検知し、そのレベルを懸濁液中の濁度の非存在下でのほぼ基準電圧レベルにまで自動的に増加させるための手段を含み得る。検出器手段は減光方式で動作し、基準電圧レベルを有する信号をもたらすことができ、ここで、濁度を補正するための手段は、流体懸濁液が混濁していない場合の基準電圧レベルの割合に応答して、パルス波高信号を混濁した流体懸濁液の基準電圧レベルに修正するためのコンピュータ手段を含み得る。
【００６０】
検出器手段はまた、減光方式で動作し、かつ基準電圧レベルを有する信号をもたらすことができ、ここで、濁度を補正するための手段は、流体懸濁液が混濁していない場合の基準電圧レベルの割合に応答して、照射手段により生じる光の量を混濁した流体懸濁液の基準電圧レベルまで増加させることにより、ビームの強度を調節するための手段を含む。
【００６１】
粒子軌跡は、測定フローチャネルの幅全体にわたり実質的に均一に分布し得る。
【００６２】
パルス波高分布をデコンボリューションするための手段は基底ベクトルを含み得、各基底ベクトルは特定の粒子サイズに対応し、入力ベクトルは、検出器手段により検出される、流体懸濁液の測定パルス波高分布を表す。また、パルス波高分布から粒子サイズ分布を導き出すためのデコンボリューションアルゴリズムを用いた手段も存在し得る。基底ベクトルの少なくとも一部は、既知のサイズの粒子の測定結果に基づく値を有し得る。また、基底ベクトルには、既知のサイズの粒子の測定結果に基づく値を有し得るものもあれば、内挿および／または外挿により基底ベクトルの和から計算され得るものもある。
【００６３】
基底ベクトルは計算され得、また基底ベクトルは行列の列基底ベクトルであり得、この場合、デコンボリューションアルゴリズムを用いた手段が行列反転およびベクトル乗算を行うか、またはデコンボリューションアルゴリズムを用いた手段が逐次減算を行い得る。
【００６４】
デコンボリューションアルゴリズムを用いた手段は、デコンボリューションされたパルス波高分布ｄＰＨＤを提供し得、装置は、パルス波高と直径との関係の較正曲線を提供する手段と、ｄＰＨＤ中の各デコンボリューションされたパルス波高値を、較正曲線を用いて、このパルス波高値と関連する固有の粒子径に変換する手段とをさらに含む。これにより、「生の」粒子サイズ分布（ＰＳＤ）を得ることができる。また、生のＰＳＤに１／ＰＨＩｄ値を乗じて再正規化することにより、生のＰＳＤを最終ＰＳＤに変換するための手段も存在し得、ここでＰＨＩｄは、各サイズの粒子に関して装置により実際に検出された粒子の割合である。
【００６５】
粒子軌跡は、測定フローチャネルの幅全体にわたり不均一に分布し得、基底ベクトルは、流体懸濁液と同じ不均一な粒子軌跡分布を有する、測定フローチャネルを流れる既知のサイズの粒子の応答に基づき得る。
【００６６】
センサ装置は、測定フローチャネルを流れる総粒子数の一部のみに応答し得る。
【００６７】
単一粒子光学サイズ決定装置の不均一な光照射野を異なる軌跡に沿って流れる未知のサイズの粒子に由来するパルス波高分布をデコンボリューションするための行列を作成し得る。これにより流体懸濁液中の粒子のサイズ決定を行い得る。これを行うために、単一粒子光学サイズ決定装置を流れる既知のサイズの粒子の応答を測定することにより、実験に基づく少なくとも１つの基底ベクトルの値を行列用に決定し得る。次いで、実験に基づく基底ベクトルから他の基底ベクトルを内挿および／または外挿することにより、他のサイズの粒子に対応する行列用に他の基底ベクトルを計算し得る。
【００６８】
また、単一粒子光学サイズ決定装置を流れる既知のサイズの粒子の応答を測定し、実験に基づく少なくとも１つの基底ベクトルおよび実験に基づく追加の基底ベクトルから、他のサイズの粒子に対応する行列用に他の基底ベクトルを計算することにより、実験に基づく追加の基底ベクトルの値を行列用に決定することもできる。
【００６９】
流体懸濁液中の粒子をサイズ決定するための単一粒子光学サイズ決定装置の不均一な光照射野を異なる軌跡に沿って流れる未知のサイズの粒子から導き出されるパルス波高分布をデコンボリューションするための行列を作成する別の方法は、少なくとも１つのサイズの粒子に対応する少なくとも１つの計算された基底ベクトルの値を行列用に決定することを含む。計算された基底ベクトルから、他のサイズの粒子に対応する行列用に他の基底ベクトルを計算し得る。
【００７０】
流体懸濁液中の粒子をサイズ決定するための単一粒子光学サイズ決定装置の不均一な光照射野を異なる軌跡に沿って流れる未知のサイズの粒子から導き出されるパルス波高分布をデコンボリューションする方法も開示される。この方法は、複数の列を有する行列の設定を含み、各列には、既知のサイズの粒子に対する装置の光検出器の応答に対応する既知のサイズの粒子のパルス波高分布を含む基底ベクトルが含まれる。連続する各列は、逐次的に大きくなるサイズの粒子に対する基底ベクトルを含む。行列はまた、同様な複数の行を有し、各行は連続するパルス波高チャンネルに対応し、各チャンネルは様々なパルス波高を含み、連続する行は逐次的に大きくなるパルス波高に対応し、各列は、列と関連する既知のサイズの粒子に対応するパルス波高と関係する行の位置に最大計数値のパルス波高値を有する。連続する列の最大計数値のパルス波高値が行列の対角線上に配置される。列中の最大計数値のパルス波高値よりも大きなパルス波高値に対応する全項をゼロに設定することにより行列が修正される。デコンボリューションアルゴリズムを用いて、パルス波高分布および修正された行列の行列反転およびベクトル乗算が行われる。
【００７１】
修正段階の前に、最大値計数値のパルス波高値を１．０とし、列中の他のすべてのパルス波高値をそのパルス波高値が列の最大計数値のパルス波高値に対して有していたものと同じ比例値を１．０に対して保持する値に設定することにより、列中の基底ベクトルの値を再正規化し得る。
【００７２】
実質的に既知のサイズである粒子を装置に通過させて既知のサイズの粒子に対する装置の応答を生じさせることにより、いくつかの基底ベクトルに対して、既知のサイズの粒子に対する光検出の応答を実験的に開発する。そのいくつかの基底ベクトルから残りの基底ベクトルに対する応答を内挿および／または外挿することにより、残りの基底ベクトルに対する光検出器の応答を計算し得る。
【００７３】
既知のサイズの粒子に対する光検出器の応答をいくつかの基底ベクトルに対して計算し、そのいくつかの基底ベクトルから応答を内挿および／または外挿することにより、光検出器に対する応答を残りの基底ベクトルに対して計算し得る。
【００７４】
流体懸濁液中の粒子をサイズ決定するための単一粒子光学サイズ決定装置の不均一な光照射野を異なる軌跡に沿って流れる未知のサイズの粒子から導き出し得るパルス波高分布（「ＰＨＤ」）を、複数の列を有する行列を設定することによりデコンボリューションし得る。各列には、既知のサイズの粒子に対する装置の光検出器の応答に対応する、実質的に既知のサイズの粒子のパルス波高分布を含む基底ベクトルが含まれ、かつ連続する各列は、逐次的に大きくなるサイズの粒子に対する基底ベクトルを含む。行列はまた、同様な複数の行を含み得、各行は連続するパルス波高チャンネルに対応し、各チャンネルは様々なパルス波高を含み、連続する行は逐次的に大きくなるパルス波高に対応し、各列は、列と関連する既知のサイズの粒子に対応するパルス波高と関係する行の位置に最大計数値のパルス波高値を有する。連続する列の最大計数値のパルス波高値は行列の対角線上に配置することができる。逐次減算アルゴリズムを最大行数に最大計数値を有する基底ベクトルから始めて以下のように実行し得る；列番号と一致するＰＤＨ中の行の値に対応する係数で列基底ベクトルをスケーリングする；ＰＨＤからスケーリングした基底ベクトルを減産して、デコンボリューションされたＰＨＤ（ｄＰＨＤ）の要素を形成し、総粒子数の小さい中間ＰＨＤベクトルを残す；このプロセスを、ＰＨＤのすべてが使用され、デコンボリューションされたｄＰＨＤの要素がすべて形成されるまで、残りの基底ベクトルを用いて繰り返す。
【００７５】
比較的高濃度の流体懸濁液試料における粒子サイズ決定のための単一粒子光学サイズ決定センサを、流体懸濁液試料の濁度に関して、減光方式で動作するセンサを用いて補正し得、これにより、光検出器は、基準電圧レベルおよび粒子による光の遮断に対する応答を基準電圧レベルから下方に伸長するパルスとして有する信号ＶＬＥ（ｔ）を生じる。補正方法は、非混濁懸濁液をセンサに通過させること；非混濁懸濁液に応答して生じる基準電圧レベルＶ０を測定すること；比較的高濃度の懸濁液試料をセンサに通過させること；比較的高濃度の懸濁液試料に応答して生じる基準電圧Ｖ０Ｔを測定して、比１Ｇ＝Ｖ０Ｖ０Ｔを計算すること；およびＧに応じてセンサを調節して、比較的高濃度の懸濁液試料がセンサを通過するときの濁度に関して補正することを含む。
【００７６】
基準電圧Ｖ０Ｔは信号ＶＬＥ（ｔ）から有効に減算され得、残りの信号は反転されてパルス波高信号２Ｖ  ＬＥ  Ｔ（ｔ）を生じ得、増幅率調節可能な増幅手段を用いてパルス波高信号３Ｖ  ＬＥ  Ｔ（ｔ）を増幅し得る。増幅率調節可能な増幅手段を比Ｇにより制御して補正パルス波高信号ΔＶＬＥ（ｔ）を生じ得る。
【００７７】
比較的高濃度の懸濁液試料に応答したセンサにより生じた信号ＶＬＥ（ｔ）を、増幅率調節可能な増幅手段で増幅し、その増幅率は、比Ｇにより制御され、補正基準電圧Ｖ０を有する補正信号ＶＬＥ（ｔ）を生じ、補正信号ＶＬＥ（ｔ）から基準電圧Ｖ０を減算し、残りの信号を反転させて補正パルス波高信号ΔＶＬＥ（ｔ）を生じ得る。
【００７８】
一実施形態において、単一粒子光学サイズ決定センサは強度調節可能な光ビームを生じる光源を含み、ここでは、その強度を比Ｇに応じて増加させて濁度に関して補正する。
【００７９】
流体懸濁液中の粒子はまた、単一粒子光学サイズ決定センサ装置の物理的に明確に定められた測定フローチャネルでの懸濁液の流れを確立することにより、光学的にサイズ決定され得、ここで、軸を有するビームが測定フローチャネル内に照射されて、測定フローチャネル内に光学検知ゾーンを形成する。光ビームおよび光学検知ゾーンは、理想的には、測定フローチャネルの大きさに対して、センサ装置が測定フローチャネルを流れる総粒子数のごく一部のみに応答するような大きさである。センサ装置は比較的高濃度の流体懸濁液に有効に応答する。ビームはビーム内の最大強度部分と、軸から垂直に離れたビーム内の位置に対して連続的に弱くなる強度があり、これにより、ある粒子は最大強度部分を通る軌跡を有し、別の粒子はより弱い強度の位置を通る軌跡を有し、さらに別の粒子はゾーンの外側に軌跡を有する場合もある。ゾーンからの光が検出されて、それぞれがゾーンを流れる粒子に対応したパルス波高信号を生じ得る。パルス波高信号は、検出された粒子のサイズおよび軌跡の関数であり、かつパルス波高信号は総体としてパルス波高分布ＰＨＤを形成する。ＰＤＨは数学的にデコンボリューションされ、流体懸濁液中の粒子の粒子サイズ分布ＰＳＤをＰＨＤから抽出するために処理され得る。
【００８０】
ＰＨＤを数学的にデコンボリューションする段階は、単一粒子光学サイズ決定装置を流れる既知のサイズの粒子に対する応答を測定することにより、実験に基づく少なくとも１つの基底ベクトルの値を決定することを含み得る。他のサイズの粒子に対応する他の基底ベクトルを、実験に基づく基底ベクトルから他の基底ベクトルを内挿および／または外挿することにより計算し得る。
【００８１】
単一粒子光学サイズ決定装置を流れる既知のサイズの粒子に対する、実験に基づくさらなる基底ベクトルの値を決定し得る；そして他のサイズの粒子に対応する行列用に他の基底ベクトルを、実験に基づく少なくとも１つの基底ベクトルおよび実験に基づくさらなる基底ベクトルから他の基底ベクトルを内挿および／または外挿することにより計算し得る。この方法は、少なくとも１つのサイズの粒子に対応する少なくとも１つの計算された基底ベクトルの値の決定をさらに含み得る。他のサイズの粒子に対応する他の基底ベクトルも、計算された基底ベクトルから他の基底ベクトルを内挿および／または外挿することにより計算し得る。
【００８２】
ＰＨＤをデコンボリューションおよび処理する段階は、複数の列を有する行列を設定することを含み得、各列には既知のサイズの粒子に対する装置の光検出器の応答に対応する既知のサイズの粒子のパルス波高分布を含む基底ベクトルが含まれ、連続する各列は逐次的に大きくなるサイズの粒子に対する基底ベクトルを含む。行列はまた、同様な複数の行を有し得、各行は連続するパルス波高チャンネルに対応し、各チャンネルは様々なパルス波高を含み、連続する行は逐次的に大きくなるパルス波高に対応し、各列は、列と関連する既知のサイズの粒子に対応するパルス波高と関係する行の位置に最大計数値のパルス波高値を有する。連続する列の最大計数値のパルス波高値は行列の対角線上に配置される。行列は、列中の最大計数値のパルス波高値よりも大きなパルス波高値に対応する全項をゼロに設定することにより修正され得る。デコンボリューションアルゴリズムを用いて、パルス波高分布および修正された行列の行列反転およびベクトル乗算を行い得る。既知のサイズの粒子を装置に通過させて既知のサイズの粒子に対する装置の応答を生じさせることにより、いくつかの基底ベクトルに対して既知のサイズの粒子に対する光検出の応答を実験的に出力し得る。そのいくつかの基底ベクトルから残りの基底ベクトルに対する応答を内挿および／または外挿することにより、残りの基底ベクトルに対する光検出器の応答を計算し得る。
【００８３】
ＰＨＤを数学的にデコンボリューションする段階はまた、デコンボリューションアルゴリズムを用いて、デコンボリューションされたパルス波高分布ｄＰＨＤを得る段階を含む。この方法は、パルス波高と直径との関係の較正曲線を得て、ｄＰＨＤ中の各デコンボリューションされたパルス波高値を、較正曲線を用いて、このパルス波高値と関連する固有の粒子径に変換し、これにより、ＰＳＤの状態で「生の」粒子サイズ分布を得ることができる。生のＰＳＤは、生のＰＳＤに１／ＰＨＩｄ値を乗じて再正規化することにより、最終ＰＳＤに変換し得、ここでＰＨＩｄは、各サイズの粒子に関して装置により実際に検出された粒子の割合である。
【００８４】
代表的な集束光散乱装置を図１〜３に示す。
【００８５】
図１に示される通り、この光学設計には重要な固有の特徴が２つある。第一に、入射ビームのみ（測定フローチャネル３５の前面および背面の窓である３５および３７とともに）がＯＳＺを規定する。ｘ軸に沿って流体−粒子懸濁液を閉じ込める側壁３８および３９は、ＯＳＺの規定に関してもはや重要ではない。第二に、ＯＳＺと関連する物理的体積は、もはや単一値で表されることはなく、むしろ測定される粒子のサイズに依存する。
【００８６】
図１で模式的に示されるアプローチは、測定フローチャネル３５をレーザー光源４０からの光ビーム４１で照射し、これがレンズ４２により集束されて、比較的狭い断面、すなわち、従来のＬＥ型センサにおけるフローセルの通常の照射幅ａよりも細いビーム４４を形成するというものである。したがって、得られるＯＳＺは、フローセルの前面および背面の窓とともに「ビーム束」の光ビーム４６によりほぼ規定され、寸法「ｂ」により区切られる。図１の模式図は、集束された光ビーム４６により規定されるＯＳＺの略図を示したものである。第一に、ＯＳＺを含む照射領域は、図１に示されるほぼ円筒形のゾーンで表されるほど明確には規定されない。むしろ、ＯＳＺの外側境界は「曖昧」であり、以下で述べるように、表されているゾーンをはるかに超えて広がる。第二に、フローチャネル１０を通過するビームは、集束されたと仮定して、通常、均一な幅ではない。むしろ、集束ビームの場合、その幅は測定フローセル３５の奥行きにわたって変化する。チャネルの奥行きにわたるビームウエストの変化の度合は、ビームウエストがその最小値の２倍に増加する地点間の距離（ｙ軸）により規定される、集束ビームの被写界深度に依存する。理想的には、被写界深度はチャネル厚ｂよりもかなり大きく、その結果フローチャネル全体を通して比較的均一なビーム幅を生じる。
【００８７】
その結果、集束光散乱装置は根本的に異なるセンサを含み得る。従来の設計では、フローチャネル１０の物理的幅およびＯＳＺの有効幅（ｘ軸）は1つで、同じであり、寸法「ａ」と等しい。これに対して、集束光散乱装置に使用されるセンサのフローチャネルの物理的幅（これも「ａ」として定義される）は、通常、入射光ビームの表示幅２ｗよりもかなり大きく、ゆえにＯＳＺに大きな影響を与えない。したがって、フローセル（およびＯＳＺ）の奥行きｂを決定する前面および背面の窓である３６および３７を隔てるスペーサ（またはシム）３８および３９は、これまでのように境界による散乱を避けるために光学スケールで不透明または平滑である必要はない。このことは著しい利点であり、フローセルの製造をより容易かつ安価にする。
【００８８】
「円形の」光ビームを使用することは通常、好都合かつ効率的であり、この場合、入射強度は、理想的にはビーム軸（図１に示すように、ｘ＝ｚ＝０でｙ軸と一致する）からの半径方向距離ｒのみに依存する。通常、「ガウス」光ビーム、すなわち、ｙ＝ｂ／２での焦点面（最小ビームウエスト）においてＩ（ｒ）＝Ｉ０ｅｘｐ（−２ｒ２／ｗ２）（７）で表されるガウス強度分布を有する光ビームを使用し、ここで、仮定される円形ビームに関して、ｒ２＝ｘ２＋ｚ２である。
【００８９】
２ｗ数は、入射光束の大部分を含む仮想円筒の直径である。その表面の強度は、ｅを自然対数の底としたときの１／ｅ２またはビームの中心（ｒ＝０）におけるその値Ｉ０の０．１３５倍に等しい。入射ビームに含まれる光束の実質１００％（光インターフェースでの反射およびビーム中の粒子による減光による減少は除く）が、フローチャネル内の流体−粒子混合物を横断し、離れた位置にある検出器ＤＬＥに衝突する。これにより検出器ＤＬＥが、Ｉ／Ｖ変換増幅器３４の出力において、図２のパルス３０に似た、下方に伸長するパルスの形で減光信号ＶＬＥを生じる。
【００９０】
この動作は従来のＬＥ型センサで使用される照射スキームとは非常に対照的である。そこでは、開始光ビームが、その幅（１／ｅ２強度）が前面窓（およびＯＳＺ）の幅ａよりもかなり大きくなるように、フローセルの横（ｘ）軸に沿って非常に拡張される。その結果、ｘ軸方向に拡張されたガウスビームの先端で光が補足されるため、ビームがフローセルに入るｘ軸（すなわち、ｙ＝ｚ＝０に対する）に沿った入射強度の変化が比較的少なくなる。したがって、ＯＳＺを通過する粒子は、その軌跡に関係なく実質的に同じ最大ビーム強度（すなわち、ｚ＝０における）を受けることになる。軌跡を規定する特定のｘおよびｙの値は、理想的には、得られるセンサの応答、すなわちパルス波高に全く影響しない。
【００９１】
従来の光学設計と集束光散乱装置に用いられるセンサで使用されるスキームとの間にははっきりした差異がある。フローチャネルの幅に沿った位置（ｘ軸）の関数としての入射強度は大きく変化する。入射光ビームが対称性の（円形の）ガウスプロファイルを有する場合、強度の変化は、ｒ＝ｘとして方程式７により得られる。最大強度Ｉ０は、簡単にするためにｘ＝０がチャネルの中心点を表す（側壁はｘ＝±ａ／２）とすれば、ビームの中心（ｘ＝０）で得られる。上述のように、ｘ＝±ｗ、ｚ＝０で生じる強度は、大幅に、０．１３５Ｉ０にまで減少する。強度はビームからの距離の増加とともに急激に低下し、例えば、ｘ＝±２ｗ、ｚ＝０で０．０１８Ｉ０、およびｘ＝±４ｗ、ｚ＝０で０．０００３３Ｉ０にまで低下する。
【００９２】
このようにして粒子の新規ＯＳＺの通過により生じる減光信号に関する結果は、広範囲に及ぶ。第一に、従来のＬＥ型センサに関しては、粒子のＯＳＺ通過により生じるパルス波高、ΔＶＬＥは一般に、他のすべての因子が等しい場合、粒子サイズの増加とともに増加する。一般に、粒子が大きいほど入射ビームから「外れる」ために検出器ＤＬＥに到達できない光の割合は大きい。しかし、新規センサでは、ビームから外れる光の割合は粒子の正確な軌跡、具体的には、ビームの中心ｘ＝０までの粒子の最小距離｜ｘ｜に依存する（第一近似として、フローチャネルの奥行きにわたってビーム幅がほぼ一定であると仮定すれば、上述のように、適度な大きさの被写界深度であればセンサの応答は軌跡のｙ軸における変化によってはあまり変化しない）。
【００９３】
所与のサイズおよび組成の粒子（以下、簡単にするために球状かつ均質であると仮定する）に関しては、最大の「信号」またはパルス波高は、粒子がビームの中心ｘ＝０を通過する場合に達成される。所与の有効断面積ΔＡの粒子は、強度が最大であるビームの中心で入射光の最大量を遮蔽する。ビーム軸からの異なる最小距離｜ｘ｜で異なる軌跡に沿ってフローチャネルを通過する同一サイズの粒子は、様々であるがより小さい最大レベルの照射に曝される。ビーム軸からの距離が大きいほど、粒子に入射する総強度は低く、したがって、ビームを外れる光束が少なく、得られるパルス波高が小さい。したがって、応答はパルス波高の連続する「スペクトル」からなり、ビームの中心を通過する軌跡に対する最大値から、入射ビームから非常に離れた位置にある軌跡（｜ｘ｜＞＞ｗ）に対する実質ゼロ（すなわち、ノイズ変動と区別できない）までの範囲にある。最大パルス波高は、ビームウエスト２ｗおよび粒子のサイズのみならず、場合によっては粒子および周囲の流体の屈折率にも依存する。（これは、光散乱が、全体の減光信号に対して屈折および反射と比べてどの程度大きく寄与するかによる。）粒子軌跡がフローチャネル内にランダムに分布している（すなわち、同頻度で生じる）ことが重要な前提である。この前提は通常、一般的な寸法のフローチャネルおよび比較的低い流速が用いられるのであれば有効である。また、センサを通過する粒子の数が十分大きく、任意の所与のｘ軸値の（すなわち、任意の（狭い）範囲のｘ値にわたる）軌跡を有する粒子数の統計変動が無視できることも前提となる。
【００９４】
したがって、集束光散乱装置内のセンサに対する粒子サイズとパルス波高の間の関係は、従来の設計のセンサに対して得られるものとは根本的に異なる。後者の場合、所与のサイズ（および組成）の粒子は、その軌跡に関係なくほぼ均一な高さのパルスを生じる。この動作は従来のＳＰＯＳ法のセンサ設計にとって重要である。例えば、実質的に均一なサイズのポリスチレンラテックスの「標準」粒子を測定する際に生じるパルス波高の典型的な小さな変化は、所与のｚ軸値に対するｘおよびｙ軸に沿ったＯＳＺ内の入射ビーム強度の変化により引き起こされる。このような変化が最終的にセンサの分解能を決定する。したがって、得られるＰＳＤの幅は主として、実際の粒子径の範囲ではなく、ＯＳＺ全体にわたる照射の未処理の不均一性による結果である。
【００９５】
一方、集束光散乱装置用のセンサ設計では粒子サイズ分解能の明らかな低下が見られる。単一の粒子がセンサを通過する際、所与の最大値と実質ゼロの間で変化し得る波高ΔＶＬＥを有する減光パルスを生じる。逆に、単一の検出パルスを与えられて、パルス波高を知るだけではそれを生じた粒子のサイズを判定することは不可能である。例えば、比較的小さいがビーム軸を直接通過する粒子は、そのサイズ（および組成）の粒子に可能な最大パルス波高を生じる。あるいは、それよりはるかに大きいがビーム軸から比較的離れて通過する粒子は、そのサイズおよび軌跡によっては実際にも同じであり得るパルス波高を生じる。大きな粒子は、小さな粒子よりもはるかに大きな領域の入射光を遮蔽することができるが、それに入射する平均強度は小さな粒子に入射する強度よりも小さい。したがって、得られるパルス波高は小さな粒子により生じたものと同じになり得る。同じパルス波高を生じ得る粒子径と最小のビーム軌跡距離の組合せ｛ｄ，｜ｘ｜｝の数は無限に存在することは明らかである。粒子径ｄと得られるパルス波高ΔＶＬＥとは事実上、互いに「切り離される」。これは「軌跡の曖昧さ」の問題であり、２０年以上の間、ガウスビームを用いた粒子サイズ測定のための新規な光散乱に基づくスキームの探究を促してきた。
【００９６】
上述軌跡の曖昧さの影響は、単一粒子または比較的少数の粒子のサイズ測定の困難さを表していると考えられる。しかし、集束光散乱装置に使用されるセンサに関連した一見不十分なサイズ分解能は、パルス波高データの適切な数学的デコンボリューションにより非常に好ましいレベルにまで引き戻し得る。有効なセンサ分解能において得られる劇的な改善は、目的の試料中に含まれる、あらゆる適する直径または直径の範囲の統計的に有意な数の粒子に集束光散乱装置内のセンサが曝されるようになっているという事実により可能である。このことは、新規な検知法を粒子サイズ解析に非常に有用なものとし、「夾雑物」適用に当てはまる状況とは著しく対照的である。そこでは、センサを任意の所与のサイズの比較的少数の粒子に曝すため、統計的有意性が達成されないことが多い。
【００９７】
集束ビーム装置で使用されるセンサの「生の」応答は、その従来のＳＰＯＳ先行物と同様に、パルス波高分布（ＰＨＤ）、すなわち粒子「計数値」対パルス波高ΔＶＬＥのヒストグラムからなる。パルス波高目盛を比較的多数（例えば、３２、６４または１２８）の「チャンネル」または「ビン」に分割し、それぞれ適切な狭い範囲のパルス波高電圧を包含することにより、ＰＨの電圧分解能を規定する）。一般に、対数電圧目盛上に均等に割り振られたチャンネルを定めることが好都合である。新たにパルスを測定することにより、ヒストグラム中の適切なパルス波高チャンネルに記憶されている粒子計数値が１だけ増加する。データは理想的には、得られるＰＨＤが統計的に信頼でき、したがって平滑でありかつ再現性があるように、十分に長い時間、目的粒子懸濁液から収集する。このことは、Ｉ番目のパルス波高チャンネルで収集された粒子計数値ＮＩが統計的に有意であり、すべてのＩに対して、例えば、１２８チャンネルの場合、１≦Ｉ≦１２８に対して、統計的「ノイズ」による変動を支配していることを意味する。ポアソン統計であれば、これはすべてのＩに対してＮＩ＞＞ＮＩを意味する。
【００９８】
センサは、それを通過する総粒子数のごく一部のみに応答するため、比較的高いレベルの粒子濃度が可能である。例えば、何十ｍｌもの試料サイズで何十万個粒子／ｍｌもの範囲の濃度を測定することができる。つまり、何百万個もの粒子が存在していてもよく、その一部がビームを通過して計数される。試料中に存在する粒子数（Ｎｐ）に対する、実際に計数される粒子の一部は、ｐｈｉｄまたは「検知率」として知られ、試料中の粒子数に対して実際に検出された粒子の割合を得ることにより計算される。試料中の粒子数に対して検出される粒子数は通常、約０．５〜約５％の範囲にある。
【００９９】
検知率が相対的に非常に小さいという事実は驚くべきことではない。密に集束されたビームの場合、フローチャネルの幅ａは、常に集束ビームの表示幅２ｗよりも著しく大きい。したがって、センサを通過する粒子のほとんどは、その軌跡がビーム軸から非常に比較的離れて位置している、すなわち、｜ｘ｜＞＞ｗであるため、無視できるレベルの光強度に曝される。その結果、総粒子数のごく一部のみが、背景にあるノイズレベルと比べて検出可能なパルスを生じるだけの十分な光を「遮蔽する」。大部分の粒子がセンサに検出されずに通過する。
【０１００】
このような制限は深刻に思えるかもしれないが、実際のところ、２つの理由によりほとんど問題はない。第一に、検出可能で測定可能なパルスを生じる粒子の割合ｐｈｉｄは、その値が粒子径ｄとともに変化しても、所与のセンサ幅ａに対して固定される。第二に、そもそも新規な検知法は、当然ながら非常に高濃度の試料の粒子サイズ分布（ＰＳＤ）測定での使用が意図されている。必要に応じて希釈した後でも、任意の所与のサイズ（すなわち、任意の（狭い）サイズの範囲内）の粒子の濃度は当然、比較的高い。適切な流速およびデータ収集時間であれば、得られるＰＨＤは、統計変動レベルの低い許容できる信号／ノイズ比を有する。したがって、利用可能な粒子のごく一部のみが生のデータに寄与するが、得られるＰＨＤは、無視されたはるかに多数の試料中の粒子を代表するものとなる。したがって、試料全体の代表である、信頼できる正確なＰＳＤが本明細書に記載の集束光散乱装置で使用される「効率の悪い」センサから得ることができる。
【０１０１】
得られるＰＨＤのさらなるいくつかの特徴が注目すべきことである。第一に、粒子軌跡が広範囲の｜ｘ｜値に及ぶという事実の結果として、均一の粒子がセンサを通過することにより、広範なパルス波高を含むＰＨＤが実際に生じる。この場合、これらは、個別のパルス検出の閾値（支配的なｒ．ｍ．ｓ．ノイズレベルにより定まる）である約５ミリボルト（ｍＶ）から、分布の公称「限界」の最大約３２６ｍＶの範囲に及ぶ。（ここでは、５００ｍＶまで及ぶ凝集体および特大粒子の一次粒子による少数の「外れ値」パルスは除外される）。粒子が均一であれば、この６５倍の範囲のパルス波高は粒子軌跡の違いのみが原因であり得る。（第一近似として、上述のように、フローチャネルの奥行きにわたるビーム幅の変化は無視し得る。）
【０１０２】
第二に、予想されるように、ＰＨＤは非常に非対称であり、小さいパルス波高に向かって大きく傾いている。広範囲の｜ｘ｜値（したがって、ビーム強度も）をサンプリングする粒子軌跡が多く存在するが、強度が実質的に均一であるガウスプロファイルの中心部分をプローブするものは比較的少ないことは明らかである。ＰＨＤは、パルス波高の増加とともに広く滑らかな粒子数の上昇を示し、比較的鋭いピークまで急上昇した後、ゼロパルス事象を表す基準まで劇的に低下する。分布上端におけるこの鋭い「カットオフ」により、以下ＭΔＶＬＥと呼ぶ最大パルス波高が定まる。この最大値で収集された計数値は、ビームの中心、すなわちｘがほぼ０に等しい軌跡の中または非常に近くを通過する粒子を表し、この場合、総入射光束のうち粒子により「遮られる」割合は、とり得る最大の値である。より小さなパルス波高チャンネルで収集される計数値は、ビーム軸からより離れて通過した粒子を表し；パラメータ｜ｘ｜が大きいほど、得られるパルス波高は小さい。
【０１０３】
粒子軌跡と得られるパルス波高との間には関連性がある。ＰＨＤの上方カットオフ直前で、軌跡「Ａ」が、最大パルス波高ＭΔＶＬＥを有する減光パルスを生じる。ビーム軸から次第に離れて位置する軌跡「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」および「Ｅ」は、それに応じた低いパルス波高および次第に少なくなる粒子計数値を生じる。最終的には、パルス波高が検出限界（約５ｍＶに等しい）に達するとともに、チャンネル当たりの粒子計数値がゼロに近づく。
【０１０４】
ＰＨＤの再現性は、様々なチャンネルに含まれる計数値が統計変動に比べてどの程度大きいかに依存する。したがって、ＰＨＤの「信頼性」（すなわち、平滑性および再現性）は、測定中に計数される総粒子数に依存するはずである。所与の粒子サイズに対して、計数され解析されるべき最低限のパルス数が存在することは明らかであり、それを下回る場合のＰＨＤは、統計ノイズにより、測定ごとに有意で再現性のない「構造」を示すと予想されるはずである。この場合もやはり、新規なセンサにより生じるＰＨＤは、比較的大きな統計的に意味のある数の同じサイズの粒子をデータ収集時間中に検出するという限りにおいてのみ意義がある。これに当てはまる場合のみ、最適な再現性のあるＰＨＤの結果、そしてそれに応じて、以下に述べる方法を用いた後者から得られる正確で代表的な粒子サイズ分布（ＰＳＤ）の結果を得ることが期待できる。
【０１０５】
得られたデータが有意であることを確認するために、同じ試料を複数回流して測定して得られた２つ以上のＰＨＤを重ね合わせ得る。
【０１０６】
センサをより大きな粒子に曝すことで、より大きなパルス波高にシフトしたＰＨＤが得られる。具体的には、ビーム軸の中または非常に近くを通過した粒子軌跡に対応する最大パルス波高ＭΔＶＬＥが増加する。
【０１０７】
図２に示されるように、新規ＬＳ型センサとそのＬＥ同等物とを区別する主な設計上の違いは、入射光ビームにより作り出されたＯＳＺを通過する各粒子から生じる散乱光線を集めるために、集光手段（通常、１つまたは複数のレンズ）を追加する点である。
【０１０８】
レンズ系は、通常は比較的小さい散乱角を包含する、特定の最適な角度の範囲にわたる散乱光を収集するように設計される。図２に示されるスキームでは、マスク５０が第一集束レンズの正面に設置されている。マスク５０は外側の不透明リング５２および内側の不透明領域５４を含み、この２つが透明リング５６を形成する。マスク５０は、角θ１およびθ２（すなわち、θ１≦θ２）により規定される仮想円錐内にある散乱角θの光線のみを第一集束レンズ６２に衝突させる。通常、このレンズの中心は入射ビームの軸上でフローチャネルの中心から適当な距離（すなわち、その焦点距離）にあり、ＯＳＺから発散する散乱光線の一部がレンズに捕捉されてほぼ平行になる。次いで、得られた平行な散乱光線を、第二レンズ６４を用いて適切な（小面積の）検出器ＤＬＳ上に集束させる。得られた信号は通常、電流電圧変換および増幅機能を含む１つまたは複数の電子回路により「調整」する。
【０１０９】
この光学スキームにより作り出される信号ＶＬＳとＬＥ型センサにより生じる信号ＶＬＥとの間には重要な違いがある。後者とは異なり、ＬＳ型センサはフローセルの背面窓から出てくる入射光ビームが検出器ＤＬＳに到達するのを意図的に防ぐ。代わりに入射ビームは適切な小型の不透明なビーム「ストップ」（例えば、内側の不透明領域５４）により「トラップされ」るか、またはレンズから離れたところにあり、ＯＳＺから生じる散乱光線を集めるために使用される小型の反射鏡により偏向される。その結果、ＬＥ型センサにより生じる信号ＶＬＥすべてに必ず存在する比較的大きな「基準」レベルＶ．ｓｕｂ．０が、ＬＳ信号ＶＬＳにはもう存在しない。理想的には、新規「基準」信号レベルはゼロである、すなわち、粒子の非存在下でＯＳＺ内の源から生じる散乱光はもう存在しないはずである。もちろん実際には、フローセル表面の欠陥またはそれに付着した混入物により、フローチャネルの前面および／または背面窓の表面から散乱された光により引き起こされるバックグラウンド光がいくらか存在するであろう。さらに、希釈液中に懸濁する小さな混入粒からの散乱によるバックグラウンド光の変動があり得る。また、一部の試料に関しては、全粒子集団の主な割合を占めるが、小さすぎて個別に検出されない「多数」の超微粒子により生じるバックグラウンド光の変動もあり得る。
【０１１０】
十分なサイズの粒子が、入射ガウス光ビームおよびフローチャネル３５の前面および背面の窓により規定されるＯＳＺを通過する場合、検出器ＤＬＳおよび関連する信号調整回路が作り出す出力信号中に瞬間パルスが発生する。一般に、軌跡が同じであれば、粒子が大きいほどそれにより散乱する光の量も多く、したがって、信号パルスの波高も大きいと単純に予測されるかもしれない。
【０１１１】
実際のところ、実際のパルス波高は粒子のサイズのみならず、その組成、具体的には、入射波長におけるその屈折率（および周囲の流体の屈折率）と、もしあれば、吸光度にも依存する。パルス波高はまた、粒子が球形かつ均質でない場合、ビームの波長およびＯＳＺを通過するときの粒子の方向にも依存する。最終的には、サイズが波長に匹敵するまたはそれより大きい粒子に関しては、散乱強度は散乱角によって著しく変化する。結果として、この場合、パルス波高は散乱光が収集および測定される角度の範囲に依存する。
【０１１２】
散乱光の「放射パターン」（すなわち、強度対角度）とこれらすべての変数の間との関係は、粒子内での散乱光波の相互干渉を考慮する古典的なＭｉｅ散乱理論により説明される。一般に、粒子が大きいほど、粒子間干渉により生じる散乱強度の角度依存はより複雑（すなわち非等方的）である。ＬＳ型センサの応答および動作を最適化するためには、可能なまたは予測される最大のサイズ範囲にわたり、所与の組成（すなわち屈折率）の粒子の直径ｄとともに正味の総応答ΔＶＬＥが単調に増加する角度θの範囲に散乱光の収集を制限しなければならない。この必要性は通常、進行方向に近い比較的小角度の範囲、θ１＜θ＜θ２を選択することにより満たすことができる。このようにして、Ｍｉｅ粒子間干渉の結果として大角度において特に顕著な、角度の変化に伴った強度変動による粒子サイズの増加に伴う総散乱強度の「逆転」が避けられる。
【０１１３】
新規ＬＳ型センサにより作り出される信号ＶＬＳには、対応するＬＥ型センサにより作り出される信号ＶＬＥの特性とは質的に異なる２つの特性がある。第一に、粒子のＯＳＺ通過により生じる信号パルスおよび「全体の」信号ＶＬＳは、ＬＳ型センサの場合には基本的には同じである。ＬＥ型センサにおける目的のパルスに伴う比較的高いバックグラウンド信号レベルが存在しない：（同じ状況が従来のＬＳ型センサにも明らかに当てはまる）。
【０１１４】
したがって、低振幅のパルスを生じる比較的小さい粒子の場合、ＬＳ法を用いて実際に達成される信号／ノイズ比は、ＬＥ法を用いて得られるものよりも有意に優れているはずである。この利点は、粒子が小さいほどおよび得られるパルスが弱いほど、後者では支配的なノイズ変動に近づくほど、重要となる。ＬＳ法がそのＬＥ対応物を上回る固有の利点を評価する別の方法は、前者が「ヌル検出」に基づくということを理解することである。つまり、パルスの量的検出は理想的には、ゼロバックグラウンド信号の存在下で行われる。信号／ノイズの観点から、これは、高い「コモンモード拒絶」を必要とするという、ＬＥ法に見られる状況とは非常に対照的である。生の信号ＶＬＥの中には「コモンモード」信号Ｖ０が常に存在し、目的の信号パルス（小さい場合が多い）を抽出するためにはこれを減算するか、または削除しなければならない。
【０１１５】
ＬＳ信号ＶＬＳには第二の重要かつ際立った特性がある。入射光ビームの出力を増加させて、ＯＳＺ内の全地点で粒子に入射する光強度を増加させることにより、ΔＶＬＳ測定に関連する信号／ノイズ比を向上させることが原理的に可能である。したがって、従来のＬＳセンサに対するのと同様に、光源の出力を増加させることにより、新規ＬＳセンサの低いサイズ検出限界を低下させることが原理的に可能である。最終的には、懸濁液流体ならびに／または光源および検出系に関連したノイズ変動に基づいて、最小のサイズ限界に達する。もちろん上述のように、後者の出力を変化させないのであれば、入射ビーム幅２ｗを減らすことにより新規ＬＳ型センサの低い粒子サイズ限界を向上させることも可能である。これを行うことにより、ビーム軸（ｘ＝０）を通過する粒子に照射される最大強度、ひいては所与のサイズの粒子に対して得られる最大パルスの波高も明らかに増加する。しかし、感度を向上させるこの方法は、回折理論により受ける制限（最小ビーム幅を定める）および過剰に長い被写界深度によるフローセルの奥行きｂに対する集束ビーム幅の過剰な変動により、最終的には収穫逓減の点に達する。
【０１１６】
一方、光源の出力増加は、ＬＥ法を用いて測定し得る最小粒子サイズに対する効果は比較的少ない。例えば、光源出力を２倍にすれば、基準信号レベル（図２）は２倍の２Ｖ０になる。ビーム幅を変化させなければ、同じサイズおよび軌跡の粒子により生じるパルス波高ΔＶＬＥも２倍になる。しかし、比較的高い基準信号レベルに関連したノイズ変動の二乗平均平方根の大きさは、こうした変動が光源と関連し、ひいては出力パワーに対応するため、通常は２倍となる。したがって、ＬＥ型センサの信号／ノイズレベルの向上はほとんどまたは全く期待されない。その結果、光源のパワー増加の結果としてＬＥ法により達成される最小のサイズ検出限界の減少は、ほとんどまたは全くないはずである。光源に関連した信号／ノイズ比が出力増加とともに向上する場合にのみ向上が実現される。
【０１１７】
均一サイズの粒子が新規ＬＳ型センサを通過する際、粒子はその軌跡によりそれぞれが異なった最大入射強度値（ｒ＝ｘ、ｚ＝０とする方程式７により得られる）に曝される。（簡単にするため、所与の粒子のあらゆる地点が任意の所与の時間において同じ強度に曝されるように、粒子はビーム幅よりもかなり小さいものと仮定し得る。）したがって、新規ＬＥ型センサと同様に、所与のサイズの粒子により生じて得られるパルス波高ΔＶＬＳは、入射ビーム軸に最接近した（ｚ＝０）距離｜ｘ｜に依存する。距離｜ｘ｜が小さくなるほどΔＶＬＳの値は大きくなる。したがって、ＬＳ型センサはそのＬＥ対応物と同様に、均一な粒子の懸濁液が適切な流速でそれを通過する場合、様々なパルス波高ΔＶＬＳの分布を生じる。得られるＰＨＤの形状は、ＬＥ法を用いて得られる非常に対称的なＰＨＤの形状と質的に極めて類似しており、その例を図４、６および７に示す。つまり、パルス計数値（ｙ軸）はノイズ変動のすぐ上方の測定可能な最小パルス波高において比較的小さく）、パルス波高ΔＶＬＳの増加に伴い上昇する。パルス計数値は、｜ｘ｜．ａｐｐｒｘｅｑ．０である粒子軌跡に対応する、ＭΔＶＬＳで表される最大パルス波高でピーク値の最高となる。粒子濃度がそのサイズの粒子に対する一致濃度（上述）よりも低く、任意の所定の時間において高々１つ粒子がＯＳＺを有効に占めるならば、ΔＡＶＬＳより上では、パルス計数値は理想的にはゼロまで下がる。もちろん、新規ＬＳ法を用いて得られるＰＨＤは通常、新規ＬＥ法を用いて典型的なＰＨＤを生じさせる粒子よりも小さい（有意に小さい場合が多い）粒子に適している。
【０１１８】
上述のように、均一な粒子に関して新規ＬＳ法を用いて生じるＰＨＤ（パルス計数値対ΔＶＬＳ）の形状は、均一な（通常は大型の）粒子に関して新規ＬＥ法を用いて得られるＰＨＤの形状と質的に類似している。両種のＰＨＤには、その最大パルス波高値ＭΔＶＬＳおよびＭΔＶＬＥと一致する、それぞれのピークパルス計数値後の鋭い「カットオフ」という共通する際立った特徴がある。しかし、同じ粒子サイズ、例えばｄ＝１μｍに対しても、その量的な類似性にもかかわらず、ｄ＝１の２種類の形状に量的な違いがあることを理解するべきである。新規ＬＳ型センサの「フロントエンド」の設計、すなわち、集束された光ビームおよび比較的薄いフローセルは、基本的に新規ＬＥ型センサで用いられるものと同じである。したがって、同じサイズの粒子の場合でも、一方の種類のセンサともう一方とを区別するのは、光検出の手段および方式ならびに各方法により生じる応答パルスの種類および大きさに関係することである。新規ＬＳ法に関しては、応答は光散乱のみによるものであり、その大きさΔＶＬＳは、他の関連する変数がすべて同じであるとして、粒子に照射される光の強度に比例する。
【０１１９】
一方、新規ＬＥ法に関しては、応答の大きさΔＶＬＥは粒子に照射される強度のより複雑な関数である。第一に、応答は物理的効果、すなわち屈折（および反射）と光散乱の組合せによる。しかし、散乱現象は「逆の」意味でその存在を明らかにする。つまり、ビームが検出器に到達する前に入射光束のごく一部がビームから除去される。第二に、新規ＬＥ法が適用可能な典型的なサイズ範囲にわたり、粒子を横切る入射強度の実質的な変動がある。したがって、粒子サイズおよび軌跡の両方に依存する｜ｘ｜の所与の変化によるパルス波高の変化率が２つの方法では全般的に異なるということは驚くべきことではない。同様に、粒子サイズおよび軌跡の両方に依存する粒子径に関するパルス波高の変化率も２つの方法では全般的に異なる。
【０１２０】
懸濁粒子の試料から得られた「生の」データをＰＨＤを最終目的である粒子サイズ分布つまりＰＳＤに変換するタスクを以下に詳細に説明する。
【０１２１】
このタスクを従来のＬＥまたはＬＳ型センサの場合に必要とされる動作と概念的に比較することが有用である。そこでは、入射ビームの強度は、フローチャネル全体にわたり（すなわち、ｘ軸に沿って）所与のｚ軸値（例えばｚ＝０）に対してほぼ一定になるように設計されているため、粒子のＯＳＺ通過によるパルス波高は粒子の軌跡とはほぼ無関係である。その結果、所与のサイズの粒子は理想的には実質的に同じ波高のパルスを生じ、したがって、得られるＰＨＤは最終目的のＰＳＤと実質的に等しくなる。所与の測定パルス波高ΔＶＬＥ（またはΔＶＬＳ）と粒子径ｄの間には１対１の対応がある。より大きなまたはより小さなサイズの粒子がセンサを通過する場合、得られるパルス波高はそれぞれより大きくまたはより小さくなる。単純な内挿によりＰＨＤからＰＳＤを得るために必要とされるのは、パルス波高対粒子径からなる「較正曲線」のみである。従来のＳＰＯＳ法を用いて生のＰＨＤデータを得ることは、最終目的のＰＳＤを測定することに相当する。
【０１２２】
一方、上述のように、ＬＥ（またはＬＳ）型センサの応答は、さらにより「コンボリューションされて」いる。最も単純な単一サイズ粒子の場合でも、得られるＰＨＤは、そのサイズに関連した、支配的なノイズ変動よりすぐ上方の最小値から最大値ＭΔＶＬＥ（またはＭΔＶＬＳ）までの広範なパルス波高のスペクトルからなる。したがって、一般的な様々なサイズの粒子の場合には、得られるＰＨＤはさらに広範なパルス波高を集めたものからなる。パルス波高と粒子サイズの間の単純な対応はもはや存在しない。したがって、ＰＨＤに含まれる粒子計数値対パルス波高値のセットを所望のサイズ分布、すなわち粒子計数値対粒子径に変換するための単純で直接的な方法はもはや存在しない。
【０１２３】
ＰＨＤの所望のＰＳＤへの変換には通常、３つの手順が含まれる。第一に、生のＰＨＤを特化した数学的アルゴリズムを用いて反転またはデコンボリューションしなければならない。その目的は、新規ＬＥ（またはＬＳ）型センサにより作り出された「広スペクトル」のＰＨＤを、実質的に従来のＬＥ（またはＬＳ）型センサを用いて得られたであろうものと実質的に等しい、「鮮明な」理想化されたＰＨＤに変換することである。このような理想化されデコンボリューションされたＰＨＤ（以下、ｄＰＨＤと呼ぶ）には、所与の波高ΔＶＬＥ（またはΔＶＬＳ）のすべてのパルスが所与のサイズの粒子（常に所与の組成の粒子であると仮定する）にのみ属するという特性を有する。ｄＰＨＤは、仮に元のＰＨＤに寄与するすべての粒子が入射ビームの中心（軸）を通過した場合に得られたであろうものと等しい。
【０１２４】
次いで、第二の単純な手順を行う。新規ＬＥ（またはＬＳ）型センサに適用される較正曲線、例えば、図８Ａに示される曲線の単純な内挿により、ｄＰＨＤから予備段階のすなわち「生の」ＰＳＤを得る。この手順により、ｄＰＨＤ中の各デコンボリューションされたパルス波高値をこの値と関連する固有の粒子径へ１対１で翻訳することで、生のＰＳＤを得ることができる。次いで、このようにして得た生のＰＳＤを量的に正確な最終ＰＳＤへ変換するために、第三の手順が必要である。生のＰＳＤの各直径チャンネルの粒子計数値は、測定ＰＨＤに実際に寄与したこのサイズの数である。上述のように、これは通常、データ収集の間にセンサを通過した試料懸濁液量に存在する同じサイズ（すなわち、直径チャンネルにより規定されるサイズ範囲内）の総粒子数のわずか一部である。新規ＬＥ（またはＬＳ）型センサにより実際に検出される粒子の割合ｐｈｉｄは、粒子径ｄによって著しく異なる。
【０１２５】
第三の手順は、生のＰＳＤの直径チャンネル中に含まれる粒子数に、そのチャンネルに適応される１／ｐｈｉ１の値を乗じることを含む。この操作により、データ収集中にセンサを通過した試料懸濁液量中に存在すると推定される各サイズの粒子の数を表す最終目的のＰＳＤが得られる。各直径値ｄに対する１／ｐｈｉｄの値は、検知率曲線ｐｈｉｄ対ｄから内挿により得ることができる。
【０１２６】
測定ＰＨＤをデコンボリューションしてｄＰＨＤを得るための２つの独立したアルゴリズムが本明細書に示され、以下、「行列反転」および「逐次減算」と呼ぶ。いずれの方法の実施も、新規ＬＥ（またはＬＳ）型センサの応答がその従来のＳＰＯＳ対応物と同じく加法的であるという特性に基づく。センサを通過する粒子は信号パルスを１つずつ生じるため、得られるＰＨＤは、様々なサイズの均一粒子に対応する各ＰＨＤの線形結合または加重和からなると考えることができ、「基底ベクトル」と呼ばれる。（この用語は線形代数においてよく知られている。）これらの基底ベクトルはそれぞれ単一の所与のサイズの統計的に有意な数の粒子に対する系の応答を表す。
【０１２７】
本明細書に記載の集束光散乱装置の好適な実施形態を図３に示す。この装置には、単一のセンサに本発明の新規ＬＥおよびＬＳ型のＳＰＯＳセンサが組み込まれ、２つの独立した出力信号ＶＬＥおよびＶＬＳを有する。得られる二元「ＬＥ＋ＬＳ」設計により、性能および柔軟性の向上がもたらされ、比較的広い粒子サイズの範囲にわたる単一粒子の計数およびサイズ決定が提供される。ＬＳ型センサのサブシステムを用いて、新規ＬＥ型センサのサブシステムにより提供される低い検出限界を下回るまでサイズ範囲を拡張することができる。低い粒子サイズ限界が拡張され得る程度は様々なパラメータに依存する。これには以下のものが含まれる：測定フローセル内の狭い（通常、集束された）ビームの幅２ｗ；光源の出力；新規ＬＳ型検知機能実行のため散乱光が収集される角度の範囲；ならびに粒子および流体懸濁液両方の屈折率を含めた物理的特性。
【０１２８】
二元ＬＥ＋ＬＳセンサは、光源１６０を含み、この光源は、好ましくはレーザーダイオードモジュールからなり、通常は６００〜１１００ナノメートル（ｎｍ）の範囲の出力波長を有する。光源手段により作り出されるビーム１６２は、好ましくは一直線（平行）であり、かつ「円形」である、すなわち、強度が中心軸からの距離ｒのみの関数である。さらに、ビームは、好ましくはビームの伝播軸に垂直な任意の軸に沿って方程式７で表されるガウス強度分布を有する。新規ＬＥ＋ＬＳセンサはまた、通常は単一または複数エレメントのレンズである集束手段１６４を含み、この手段は、始めの一直線の光ビーム１６２を、ＯＳＺ１６８内の測定フローチャネル１６６の中心で所望の粒子サイズ範囲に合わせて所望のビーム幅２ｗに集束することができる。集束手段は、適切な焦点距離を有するため、集束ビームの幅および被写界深度の両方に望ましい値を生じると考えられる。後者は、好ましくは得られるＰＳＤの分解能を最適化するためにフローチャネルの幅ｂよりもかなり長い。
【０１２９】
測定フローセル１６６は、ガラス、石英もしくはサファイアのような適切な透明材料または動作波長において十分透過性がありかつ流体−粒子混合物と適合性のあるＰＴＦＥ（例えば、ＤｕＰｏｎｔ社製のＴＥＦＬＯＮ（商標））もしくは他の適切なプラスチックのような別の半透明材料で作られている。粒子−流体懸濁液のフローセル１６６内での安定した流れを促進するために、出発試料懸濁液の自動希釈のための流動ポンプ手段および任意の手段（必要な場合）を含めた適切な流体工学系が通常必要とされる。流速Ｆは通常、ＬＥまたはＬＳ型センサ用の較正曲線を作成するために使用された値と同じかまたはそれに近くなるよう選択する。
【０１３０】
フローチャネルの厚さｂは、高い一致濃度限界および可能な限り均一なビーム幅を達成できるほど小さくなければならず（理想的には、ｂ＜＜被写界深度）、その結果、最終ＰＳＤの分解能が向上する。しかし、それは特大粒子（例えば、一次凝集物および流体／希釈剤中の混入物）による頻繁な目詰まりを防ぐほどの大きさでなければならない。フローチャネルの幅ａも、２つの競合する効果の間で妥協点を得るように選択する。比較的大きい値では、流れる流体−粒子混合物のインピーダンスが減少するとともに、所与の流速Ｆの速度が低下する（およびパルス幅が増加する）。しかし、パラメーターａが大きいほど、任意の所与の粒子径ｄに対する検知率ｐｈｉｄは小さくなる。これにより、測定ＰＨＤおよび最終ＰＳＤに実際に寄与する試料中の粒子の割合が小さくなり、小さすぎれば好ましくないかもしれない。
【０１３１】
新規ＬＥ＋ＬＳセンサは、２つの独立した光収集および検出サブシステムを含み、所望のＬＥおよびＬＳ型の信号を抽出するために独立して使用される。ＬＥ型の信号は、入射光の狭いビーム１６７がフローセルおよび流体−粒子混合物を通過した後にそれを遮断するように置かれた、小型の光反射手段Ｍ（例えば反射鏡）を用いて捕捉することができる。得られた透過ビーム１６９は、このようにして複合センサの光軸から偏向し、近くの光検出手段ＤＬＥ上に衝突させられる。後者は通常、小面積の固体状態（ケイ素）の検出器からなり、線形領域で動作し、光源１６０の波長に整合するスペクトル応答を有するため、許容できる信号／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比の出力信号を提供する。検出器手段の出力は通常、電流（「光電流」）であり、電流電圧変換器（「トランスインピーダンス」増幅器）１７０による調整が可能であり、出力信号が一般的に望ましい時変電圧ＶＬＥ（ｔ）の形で得られる。
【０１３２】
あるいは、光ビーム１６７がフローセルから出てくる後ろに、小型の検出器素子をその経路に直接置くことができ、このようにすれば、上で述べた中間の光反射手段の必要がなくなる。透過光ビームを「捕捉する」ために反射鏡または検出器素子のいずれを使用するかに関係なく、２つの要件がある。第一に、使用する手段は有効なビーム「ストップ」として機能しなければならない。つまり、それは到達する光束の任意の多くの割合がフローセルに向かって後方に反射されて、「迷」光の源となることを防がなければならない。様々な光学表面からの意図されない内部反射を経て、一部の迷光が散乱検出手段ＤＬＳに到達し、入射強度の一部を後者に提供することにより、得られるＬＳ信号に悪影響を与える場合がある。第二に、ＬＥ信号を捕捉するために使用される手段は、以下に述べるように、捕捉して光検出手段ＤＬＳへ向け直そうとする任意の角度の散乱光線を途中で妨害、ひいては遮蔽しないほど小さくなければならない。
【０１３３】
ＯＳＺ１６８を通過する粒子から生じる散乱光は、θ１＜θ＜θ２の様々な散乱角θにわたって別個に収集され、その際、角θ１およびθ２は、外側の不透明部分１７４、中間の透明部分１７６および内側の不透明部分１７８を有する、写真ネガフィルムから作られたマスク１７２のような適切な絞り手段により規定される。マスク１７２により選択された散乱光線は適当な焦点距離および位置にある集束レンズ１８０上に衝突させられ、これにより、発散した散乱光線がほぼ平行なビーム１８２に変換される。次いで、通常は、第二のレンズ１８４を用いて比較的小さい光検出手段ＤＬＳ上にビームを再集束させる。ＬＥサブシステムの場合と同様に、通常はＤＬＳの出力信号は電流であり、任意で、最終出力が時変電圧ＶＬＳ（ｔ）の形になるように、通常はトランスインピーダンス増幅器１８６により調整することができる。
【０１３４】
信号ＶＬＥ（ｔ）およびＶＬＳ（ｔ）は、パルス波高分析器１８８および１８９によりそれぞれのパルス波高分布ＰＨＤに編成される。次いで、ＰＨＤはそれぞれコンピュータデコンボリューション手段１９０および１９１でデコンボリューションされ、最終的には１対の個別の粒子サイズ分布ＰＳＤ１９２および１９３が算出される。
【０１３５】
この実施形態は、単に不要なサブシステムと関連した光学素子、検出手段および信号調整回路を取り外す（または最初から組み込まない）ことにより、ＬＥ型またはＬＳ型センサのみとして実行することができる。この場合、得られるＬＥまたはＬＳ型センサの動作を最適化するために、測定フローチャネル内の集束ビーム幅２ｗを調節することが有用であり得る。このパラメータは、上述のように、２つの検知様式に対して、使用可能な粒子サイズ範囲、一致濃度限界および最小検出可能粒子サイズに異なった影響を与える。
【０１３６】
ＩＩ．検出可能な粒子
本明細書に記載の技術を用いて、様々な生物学的粒子を検出することができる。
細胞は、検出可能な生物学的粒子の一種である。この方法を用いて、所与の溶液中に特定の種類の細胞が存在するか否かを判定することができる。例えば、血液、尿、髄液などの試料を、細菌、真菌、ウイルスなど存在の有無に関して評価することができる。粒子サイズおよび任意には粒子の形状は、特定の種類の細菌、真菌またはウイルスに関する情報をも提供し得る。
【０１３７】
ＩＩＩ．集束光散乱法での使用に適した微粒子およびナノ粒子
いくつかの実施形態において、活性薬剤と生物学的粒子との間の複合体が粒子サイズの変化を生じない（すなわち、粒子凝集または細胞破壊が無い）場合、活性薬剤を微粒子（例えば、ナノ粒子、ポリスチレンビーズ、金粒子など）とコンジュゲートさせる必要があり得る。したがって、薬剤が生物学的粒子と複合体を形成すると、複合体が微粒子のサイズ分だけ生物学的粒子のサイズを増加させ、この増加した粒子サイズは、本明細書に記載の技術を用いて測定可能である。
【０１３８】
一実施形態において、粒子は、粒子サイズが約０．１〜１０μｍの間の範囲にあり、理想的には、それと結合した比較的一貫した量の活性薬剤を有する。つまり、生物学的粒子が目的の活性薬剤と結合したことを判定することのみが重要な場合、単に、生物学的粒子とコンジュゲートとのインキュベーションを行い、生物学的粒子に対応するピークの減少を調べることができる。これにより、生物学的粒子と活性薬剤の複合体の形成が確認される。
【０１３９】
生物学的粒子の存在量を定量化することが目的である場合、平均粒子サイズの５％以内の粒子を９０％以上有する、より好ましくは、約９９％またはそれ以上の均一性を有すると定義されるような、ほぼ均一な粒子サイズを有する粒子を使用することが重要であり得る。均一な粒子サイズに加え、いくつかの実施形態では、粒子に関して均一な置き換えを有することが望ましい場合がある。つまり、定量化を容易にするためには、比較的均一な粒子サイズの粒子と目的の生物学的粒子とで、異なる粒子サイズを有する複合体を形成させるよりも、比較的均一な粒子サイズを有する複合体を形成するほうが望ましい場合がある。
【０１４０】
比較的一貫した粒子サイズを有し、かつ粒子とコンジュゲートした比較的一貫した量の活性薬剤を有する粒子を製造する１つの方法は、デンドリマーを使用することである。デンドリマーは、デンドリマー末端上の活性官能基により既知量の活性薬剤を含むことができる。
【０１４１】
別の方法は、ａ）比較的狭いサイズ分布およびｂ）比較的一貫した量の保護された官能基を有するポリマー粒子を製造することであり、その結果、ポリマー製造後に、保護基およびポリマー粒子と活性薬剤をコンジュゲートさせるために用いた官能基を除去することができる。
【０１４２】
活性薬剤を、活性である（すなわち、受容体と結合する）ことが既知である活性薬剤の部分が、それと粒子とのコンジュゲーションにより立体的に著しく妨害されないように、粒子とコンジュゲートさせることができる。いくつかの実施形態において、このことは、粒子と結合させ得るさらなる官能基を含む活性薬剤の類似体の調製を含む。
【０１４３】
一実施形態において、金粒子のような金属粒子を使用する。このような粒子は、多量の光を散乱させるため、特定の活性薬剤とコンジュゲートさせて、薬剤と結合する小分子の同定にも使用することができる。つまり、粒子が散乱させる光の量が十分多いため、目的分子が、測定可能な生物学的粒子のサイズ範囲内になくても、薬剤とその分子との結合を測定することができる。活性薬剤と金属粒子をコンジュゲートさせる方法は、当業者に既知である。
【０１４４】
金粒子のような金属粒子も使用することができる。これらを既知の方法を用いて活性薬剤とコンジュゲートさせ、集束光散乱技術を用いて検出するには小さすぎる粒子を含めた生物学的粒子と複合体形成が可能な粒子を形成することができる。こうした粒子は非常に高密度であるため、その小さなサイズにもかかわらず、検出するのに十分な光散乱を生じる。金属ビーズからの強い散乱により、複合体形成を測定するのに十分な光が散乱するため、小分子と粒子の結合でさえも検出することができる。
【０１４５】
ＩＶ．溶液中における特定粒子の存在有無の検出方法
試料媒体を特定粒子の存在の有無に関して評価することができる。例えば、血液、尿、髄液、羊水、胸水、腹水などを、特定の微生物（細胞（リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、単球など）、細菌、真菌、ウイルスなど）の存在の有無に関して、および／または病的状態を示す比較的高濃度の白血球もしくはその他の生物学的粒子の存在に関して評価することができる。この方法により、排出された粒子の存在の有無も判定することができる。
【０１４６】
未知粒子表面上の特定の表面エピトープを認識して結合する、特定の薬剤でコーティングしたプローブ粒子を加えることにより、粒子（無傷細胞、微粒子、細菌、ウイルス、真菌、など）をさらに同定し特徴付けることができる。プローブ粒子による認識および結合が起こった場合、新たな粒子サイズが生じて現れることで、未知粒子を同定する。例えば、未知粒子が幹細胞であり、プローブ粒子が抗ＣＤ３４抗体で標識された場合、プローブ粒子と幹細胞と結合が起こり、新たなサイズの粒子が現れ、ＣＤ３４陽性幹細胞の存在が同定される。
【０１４７】
粒子のサイズが同定されると、例えば、参照用ライブラリーを用いて、粒子サイズと所与の生物種を関連付けることにより、その粒子の素性を確認することができる。したがって、一実施形態において、この方法は、生物学的粒子に関して集束光散乱技術を用いて得られた情報を、同様の集束光散乱技術を用いて得られた生物学的粒子に関するデータのライブラリーと比較することを含む。ライブラリーは、２種以上の生物学的粒子、好ましくは１０種以上の粒子、より好ましくは１００種以上の粒子、そして最も好ましくは１，０００種以上の粒子に関する情報を含む。
【０１４８】
生物学的粒子の種類に関して予備的な同定を行った後、任意で他の生物学的手法を用いて粒子の素性を確認することができる。例えば、粒子のＥＱＥＬＳスペクトルを取得し、既知粒子のＥＱＥＬＳスペクトルライブラリーと比較して、粒子の素性を確認することができる。
【０１４９】
特定の生物学的粒子に対して特異的な抗体またはその他の分子を溶液に加えてもよく、粒子が抗体と結合する場合、この方法により粒子の非存在が検出される。理想的には、分子をラテックス粒子のような微粒子またはナノ粒子とコンジュゲートさせる。コンジュゲートが生物学的粒子と相互作用すると、粒子およびコンジュゲートを表すピークが減少し、粒子／コンジュゲート複合体に対応するピークが増加する。
【０１５０】
一実施形態において、生物学的粒子は微生物である。この技術を用いて、微生物（すなわち、細菌、真菌またはウイルス）の種類、そして理想的には、微生物の特定の種類（すなわち、Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａなど）を同定することができる。この実施形態では、微生物の予備的な同定を一度行えば、最初に溶液中の微生物のＥＱＥＬＳスペクトルを取得し、微生物をその微生物に特異的な抗体に曝し、第二のＥＱＥＬＳスペクトルを取得することにより、確認アッセイを行うことができる。ＥＱＥＬＳスペクトルが異なる場合、抗体がその微生物を適切に識別し結合したことが確認される。さらに、微生物が同定されると、推定抗菌性化合物を微生物とともに溶液／懸濁液中に入れて、その化合物が微生物を死滅させることができるか否かを判定することができる。
【０１５１】
一実施形態において、この方法を用いて、癌細胞、細菌、真菌またはウイルスのような既知の細胞と相互作用することができる潜在的治療薬剤を同定することができる。この実施形態では、最初に集束光散乱技術を用いて、試料媒体中の既知の癌細胞、細菌、真菌またはウイルスに関して粒子のサイズおよび分布を示すスペクトルを作成する。次いで、微粒子またはナノ粒子とコンジュゲートされた推定治療薬剤を試料媒体に加え、既知の細胞、微生物またはウイルスとインキュベートする。集束光散乱技術を用いて第二のスペクトルを作成する。微粒子コンジュゲート治療薬剤と既知の細胞または微生物との複合体に対応するピークが観測されれば、治療薬剤が細胞と結合したことになる。このことは、既知の細胞、微生物またはウイルスに対する推定治療薬剤の潜在的有用性を示す。
【０１５２】
この実施形態の一態様では、試料媒体中の微生物のスペクトルを既知微生物のスペクトルの参照用データベースと比較することにより、特定微生物の同定のための迅速な手段が提供される。またスペクトルにより媒体における粒子サイズおよび／または粒子密度の初期測定が提供される。
【０１５３】
細菌検出
微生物同定の一例において、微生物が単分散または多分散のいずれであるかを、その数およびサイズにより判定することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は単分散の傾向にあり、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）は多分散の傾向があるため、この実施形態を用いて試料中の粒子サイズを観測することができ、この場合、凝集の観測により、凝集することが既知である細菌（すなわち、連鎖球菌）の存在が確認される。
【０１５４】
粒子排出の検出
別の実施形態において、この方法を用いて粒子排出を検出する。小型の粒子を排出する代表的な生物学的粒子として、腫瘍、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、内皮細胞、癌細胞、幹細胞、細菌、ウイルスおよび真菌が挙げられる。粒子排出は、細胞相互作用、発現の結果としての活性化または不活性化のような細胞状態の変化、細胞死などにより生じ得る。本明細書に記載の方法を用いて、このような粒子排出を確認することができる。
【０１５５】
一実施形態において、薬剤またはリガンドを細胞とともに容器に加える。薬剤またはリガンドが細胞と反応する場合、細胞は膜粒子またはその他の粒子を排出し得る。本明細書に詳述されるように、この方法を用いて、反応により排出された粒子のサイズ、数および／または種類を検出することができる。したがって、細胞が既知の場合、この技術を用いて未知の薬剤を検出し得；また薬剤が既知である場合、この技術を用いて特定の細胞類の存在を確認し得る。
【０１５６】
本明細書に記載の方法を用いて、放出される粒子を観測することができる。サイズおよび／または形状を、既知の放出粒子に集束光散乱技術を用いて収集したデータのライブラリーと比較することにより、ならびに／あるいは一部またはすべての放出粒子を抗体または他のそのような分子と結合させることにより、放出粒子を同様に特徴付けることができる。
【０１５７】
抗体／微粒子コンジュゲートと結合している排出粒子の概略図を図４〜７に示す。図４は、複合体形成前のゼロ時間における状態を示し、図５〜７は、複合体の漸次形成ならびに排出粒子および微粒子／抗体コンジュゲートと関連したピークにおける対応する減少を示す。
【０１５８】
単一分子の検出
一実施形態において、この方法により、特定の分子の存在を検出することができ、この場合、分子は集束光散乱技術の検出限界値を下回るサイズである。この実施形態では、金粒子のような高反射性の金属粒子を、目的分子と結合するリガンドと共有結合させる。金属粒子は高密度で、かつ光を非常に効果的に散乱させる粒子であるため、リガンドが目的分子と結合したときの光散乱の量を集束光散乱技術を用いて測定することにより、溶液中の目的分子の存在の有無を確認することが可能である。別の実施形態において、金属粒子ではなく、特定の排出粒子種と特定の方法で結合することが既知である活性薬剤とコンジュゲートされた微粒子を使用する。次いで、排出粒子と微粒子の複合体を測定する。代表的な薬剤として、特定の排出粒子と結合することが知られている抗体および小分子が挙げられる。
【０１５９】
粒子凝集の検出
別の実施形態において、この方法を用いて粒子凝集および凝集のタイプを判定する。このような凝集として、粒子と他の粒子との凝集または粒子と薬剤との凝集が挙げ得るが、これらに限定されない。
【０１６０】
具体的にはリポソーム治療に関して、粒子（リポソームなど）の凝集は、凝集粒子が投与された場合の高い死亡率または罹患率をもたらし得る。したがって、この方法を用いてリポソーム試料を投与前に評価し、患者を治療する前に粒子が凝集していないことを確実にすることができる。
【０１６１】
ＩＶ．粒子と既知分子との結合の検出方法
いくつかの実施形態において、試料媒体中に存在し得るか、または存在し得ない既知の分子、例えば、生物学的粒子上の受容体と相互作用することが既知である薬剤分子の素性がわかる。試料媒体を薬剤分子／微粒子コンジュゲートとともにインキュベートすることにより、薬剤分子と試料媒体中の生物学的粒子との結合を示す複合体形成を調べることができる。複合体形成を経時的にまたは単に適切なインキュベーション期間後に観測することができる。
【０１６２】
この方法は、容器中の薬剤または生物学的微粒子を出発物質として用い、次いで、薬剤との相互作用を試験するために既知の物質（例えば、既知の細胞または微生物）を；または微粒子との相互作用を試験するために既知薬剤を加えることにより行うことができる）。次いで、集束光散乱技術を行って出発物質のサイズからの粒子サイズの変化を調べることができ、ここで、粒子サイズの増加または減少が相互作用および結合を示す。
【０１６３】
既知分子の目的粒子との結合能を保つために、分子を微粒子とコンジュゲートする実施形態においては、既知分子を、その目的粒子との結合能に悪影響を及ぼさないようにコンジュゲートする。これには修飾分子の開発が含まれ得、ここでは、微粒子とコンジュゲート可能な官能基を含むように分子を修飾し、その分子は依然として目的粒子との複合体形成能を維持する。このような修飾は当該技術分野において日常的に行われる。
【０１６４】
活性薬剤と複合体を形成することが既知である生物学的粒子を用いて、このような修飾化合物またはその化合物と微粒子とのコンジュゲートを、粒子とインキュベートすることにより、目的粒子に対するその結合親和性を維持する能力に関してその修飾化合物を評価することができる。複合体の粒子サイズは非複合体化粒子および非複合体化コンジュゲートの粒子サイズよりも大きいため、目的粒子との結合能を維持する化合物を集束光散乱技術を用いて同定することができる。
【０１６５】
生物学的粒子除去のカラムベースアプローチ
生物学的粒子と活性薬剤／微粒子コンジュゲートとの複合体を形成せずに、任意で、目的の生物学的粒子と結合する薬剤とコンジュゲートされた微粒子を含むカラムを調製し、試料媒体を、微粒子を含むカラムに通過させてもよい。任意の複合体化された生物学的粒子を除いた試料がカラムから溶出される。溶出された物質に対して集束光散乱法を行うことにより、出発物質と比較した粒子の数／集団密度の変化を確認することができる。粒子の数／集団密度の減少は、カラム中での相互作用および結合を示し、したがって、目的の生物学的粒子が試料中に存在したことを示す。
【０１６６】
生物学的粒子除去の磁気ビーズベースアプローチ
生物学的粒子と活性薬剤／微粒子コンジュゲートとの複合体の形成および集束光散乱法を用いた生物学的粒子／コンジュゲート複合体の存在の確認を行うのではなく、任意で、活性薬剤とコンジュゲートされた磁性微粒子を使用してもよい。したがって、最初に本明細書に記載の方法を用いて集束光散乱スペクトルを得、次いで、磁性粒子を用いて目的の生物学的粒子との複合体を形成することができる。磁石を用いてこの複合体を試料媒体から除去し得る。次いで、第二の集束光散乱スペクトルを得、目的の生物学的粒子の数が減少したか否かを確認し得る。
【０１６７】
Ｖ．既知粒子の未知化合物への結合の判定法
他の実施形態において、推定治療薬剤が既知の生物学的粒子と結合し得るか否かを知ることを目的とする。このような実施形態では、推定治療薬剤を微粒子または金粒子のような金属ナノ粒子とコンジュゲートして、既知の生物学的粒子とインキュベートする。このようにして、化合物が生物学的粒子と複合体を形成するか否かを判定することができる。
【０１６８】
この実施形態のある態様では、活性薬剤の最小阻止濃度または結合親和性を知ることを目的とする。薬剤を異なる濃度で生物学的粒子と複合体形成させることができ、この情報を得ることができる。微粒子とコンジュゲートされるため、薬剤が元の薬剤と異なる挙動を示し得ることから、ある程度の外挿が必要な場合がある。
【０１６９】
この実施形態の他の態様では、活性薬剤の１つの受容体に対する別の受容体よりも高い選択性を知ることを目的とする。この態様では、薬剤を異なる受容体を発現する複数の生物学的粒子と複合体形成させることができ、各受容体に関して結合情報を得ることができる。このようにして、選択性を判定することができる。
【０１７０】
治療活性／効力／選択性の判定
別の実施形態において、この方法を用いて治療薬剤を同定する。小分子、タンパク質およびペプチドは、この技術を用いても調べることができる可能性がないほどの大きさであるが、ラテックス粒子または磁気ビーズのような微粒子と結合させることができ、分子とインキュベートするか、またはカラムにかけることができる。
【０１７１】
この実施形態の一態様では、治療薬剤の標的（すなわち、受容体）を有する生物学的粒子を懸濁液にして、１つまたは複数の推定治療薬剤とコンジュゲートされた微粒子をこの懸濁液に加える。
【０１７２】
治療薬剤が生物学的粒子と結合した場合、生物学的粒子／コンジュゲート複合体のサイズは、コンジュゲートまたは生物学的粒子のサイズよりも大きいため、その結合を観察することができる。
【０１７３】
この技術を用いて、例えば、特定の感染症に対する特定の抗菌性またはその他の薬剤候補の効力を判定する、あるいは特定種の癌の治療に有用な薬剤を同定することができる。この実施形態の一態様では、この技術は個別化医療に有用であり、この場合、特定患者の細菌感染、血小板または癌細胞または赤血球を、特定の治療薬剤と結合および相互作用する能力に関して解析する。この実施形態の別の態様では、複数のスペクトルを作成してその結果を比較し、所与の薬剤（この場合、薬剤は阻害剤である）に関して、最小阻止濃度ひいては有効な投与量範囲を決定することができる。
【０１７４】
ＶＩ．治療が有効である可能性が高い患者の特定法
特定の患者は細胞受容体と薬剤分子との相互作用による治療に応答する。しかし、他の特定の患者は、その患者の細胞が薬剤分子と結合することができないような遺伝子突然変異により薬剤が無効である。患者が所与の治療に応答するか否かを判定するために、患者の細胞の溶液を、プローブ粒子、微粒子またはナノ粒子と結合した目的の薬剤分子と混合し得る。目的の薬物分子が患者の細胞と結合した場合、コンジュゲートおよび／または患者の細胞の濃度が低下し、細胞／コンジュゲート複合体に対応する新たなピークが観察される。細胞／コンジュゲート複合体に対応する新たなピークが存在しないことは、その患者がその特定の薬物治療に応答しないことを示す。したがって、この方法により、患者が特定の薬物治療を用いて効果を得るか否かを確認することができる。これにより、迅速かつ安価な方法を用いた個別化医療のアプローチが可能となる。
【０１７５】
この実施形態の一態様では、細胞は個々の患者由来の癌細胞であり、癌細胞を含む試料媒体を、微粒子またはナノ粒子と結合した一連の治療薬剤とインキュベートする。癌細胞と複合体を形成する治療薬剤は、癌細胞と結合し相互作用するため、患者の個別化治療のための潜在的候補である。この技術は、ＨＥＲ２陽性患者、癌細胞がビタミンＤ受容体を有する患者、エストロゲン応答性癌細胞を有する患者など、特定の突然変異を有する患者を特定するための比較的迅速かつ安価な方法を提供し得る。
【０１７６】
この実施形態の別の態様では、細胞は、アテローム性動脈硬化症に罹患しその血液細胞が硫酸クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ（登録商標））による治療に応答するか否かを調べるために評価されている患者に由来する、血液細胞である。血液細胞と硫酸クロピドグレルと相互作用は表面相互作用であるが、少数の割合の患者は、この化合物との表面相互作用を阻害する突然変異を血液細胞中に有する。このような患者の大半に対しては別の治療薬剤が存在するが、症状が悪化し、おそらくは心臓発作を引き起こす前に、こうした患者を特定することが重要である。この態様では、患者の血液細胞を硫酸クロピドグレルとコンジュゲートされた微粒子とともにインキュベートし、集束光散乱技術を用いてスペクトルを得る。例えば、プローブ粒子の相互作用は、ＡＤＰ受容体とＰｌａｖｉｘの標的Ｐ２Ｙ１２との間にある、またはＶＡＳＰ経路の活性化に対するものであり得る。硫酸クロピドグレルと血液細胞との間の複合体の存在が観察され得る。さらに、患者がＰｌａｖｉｘに対して応答性である場合、ＡＤＰまたは他の特異的アゴニストが患者の血小板に添加されたときに活性化が起こらない。したがって、活性化が起こらず、ＣＤ６２、糖タンパク質α１、β３などのような特異的活性化エピトープが特異的プローブ粒子により検出されない。血液細胞と微粒子／硫酸クロピドグレルコンジュゲートのサイズが既知であるため、１つのスペクトルしか得る必要がなく、目的のピークのみがコンジュゲート／血液細胞複合体のピークに対応する。
【０１７７】
ＶＩＩ．ハイスループットバイオアッセイの実施方法
任意のまたはすべてのこれらのアッセイは、適切なロボット工学を用いてハイスループットスクリーニング用に最適化することができる。流体ハンドラは試料をマルチチューブまたはマルチウェルプレートに移すことができ、「メモリマップ」を用いて試料をプレート上のそれらの位置と関連付けることができる。次いで、各試料に関する情報を保存し、薬剤候補、患者診断および提案される患者の治療選択に関する情報を提供するために使用することができる。
【０１７８】
ロボット工学系は当該分野で公知であり、個々の患者から得られた試料をマルチチューブまたはマルチウェルプレートの既知の場所に移動させることができる。試料に関する情報が本明細書に記載の集束光散乱法技術用いて得られれば、チューブの位置と患者の身元とを関連付ける保存された情報を介して、その情報を個々の患者と関連付けることができる。流体ハンドラは、試料の一部を採取して、例えば、試料の一部を異なる活性薬剤と結合した異なる微粒子とインキュベートすることにより、複数の（すなわち、少なくとも２つの）異なるスクリーニングアッセイを評価することができる。
【０１７９】
「メモリマップ」の使用により（ハイスループットスクリーニングと同様に）試料を取って、置くための既知のロボット工学を用いた自動化プロセス。次いで、使用者は、行うべき所望のスクリーニングを選択することができ、ロボット工学装置が所望のプロセスを実行する。
【０１８０】
本明細書に記載の実施形態の別の態様では、（従来のハイスループットスクリーニング法と同様に）試料を取って、置くためのロボット工学を用い、任意で「メモリマップ」と連結させて、この方法を自動化することができる。次いで、使用者は、行うべき所望のスクリーニングを選択することができ、ロボット工学装置が所望のプロセスを実行することができる。この実施形態では、多数の試料を自動的にスクリーニングするための実験室を設置することができる。
【０１８１】
好適な一実施形態において、本明細書に記載の個別化医療プロセスを自動化し、疾患に罹患した患者のために好適な治療を特定するための比較的安価で比較的迅速なハイスループットスクリーニング法を提供する。
【０１８２】
ＶＩＩＩ．参照用ライブラリー
既知の化合物に関して集束光散乱法を行うことにより得られた情報の参照用データベースを使用することができる。試験試料中の粒子を同定するまたは特徴付けるために、試料を参照用データベースと比較することができる。参照用データベースは、粒子サイズに関する少なくとも２つ、好ましくは１０を超える、より好ましくは１００を超える、そして最も好ましくは１，０００を超える情報を含み、これらの情報を用いて、本明細書に記載の技術を用いて測定された粒子サイズを、参照用データベースに保存された既知の生物学的粒子の粒子サイズと関連付けることができる。
【０１８３】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することで、より良く説明されるであろう。
【実施例】
【０１８４】
一般実施例
プロセス段階：１）細菌存在が疑われる胸水の試料を得る；２）集束光散乱法を用いてその粒子のサイズおよび／または形状により細菌の存在を確認し、細菌のスペクトルを既知の細菌のスペクトルと比較し、これにより液中に存在する細菌を同定することができる；３）ここで識別された細菌上の固有のマーカーに特異的な抗体薬剤を加えて細菌の素性を確認する；４）特定の細菌に関して（例えば、ＥＱＥＬＳを用いて）特有な鞭毛の遊泳速度を観測して細菌の素性を確認する。潜在的薬剤候補の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するのに役立ち得る、推定抗菌薬剤の結合定数を測定することができる。上記段階のすべてを毎回一緒に用いる必要はない。上記プロセスは、生物学的試料中のウイルスまたは真菌の同定にも同様に適用可能である。
【０１８５】
以下の実施例は、本発明を限定するのではなく、説明することを意図するものである。実施例１：生物学的試料中の微粒子（ＭＰ）存在の検出
【０１８６】
この実施例では、試料に対して粒子のサイズ決定および計数を行う。試料を適当に希釈した後、希釈試料を解析装置に導入する。計数の進行に伴い、１ミクロン未満のサイズ領域において計数値が累算される。このサイズ領域のおけるＭＰの出現はＭＰの存在を示す。
【０１８７】
実施例２：微粒子の特徴付け
実施例１に記載のようにＭＰが検出されると、ＭＰの源（血小板、好中球、腫瘍由来など）を決定することが重要となり得る。この実施例では、ＭＰの特徴付けための２つの異なる選択肢が提供される。
【０１８８】
第一の選択肢はＭＰのサイズ決定および計数の使用である。この場合、試料を、表面に特定のリガンドがコンジュゲートされた第二の粒子とインキュベートする。リガンドの選択は特徴付けされる特定のＭＰによる。例えば、目的のＭＰがその表面に凝固組織因子（ＴＦ）を有する場合、コンジュゲート粒子が、ＴＦ粒子に対する抗体または凝固因子ＦＶＩＩとコンジュゲートすることができる。いずれのリガンドも表面上にＴＦを有するＭＰと特異的に結合する。
【０１８９】
コンジュゲート粒子を抗ＴＦコンジュゲート粒子とインキュベートした場合、ＭＰとプローブ粒子を計数したときに、ＴＦ−ＭＰ＋抗ＴＦコンジュゲート粒子に対応する新たなサイズが出現する。同様にして、目的のＭＰに特異的なコンジュゲートリガンドを有するプローブ粒子を開発することにより、他のＭＰを特徴付けることができる。
【０１９０】
第二の選択肢は、ＥＱＥＬＳ装置を用いたＭＰの解析である。粒子の電気泳動移動度の違いを解析することができることを除けば、基本的な手順は同じである。
【０１９１】
具体的には、基準となるＭＰの電気泳動移動度を得ることができる。次いで、目的のＭＰに対する特異的リガンドとコンジュゲートされたプローブ粒子と、またはプローブ粒子とコンジュゲートせずにリガンドのみと、ＭＰを混合する。プローブ粒子が目的のＭＰと結合すれば、電気泳動移動度における違いが観察される。このデータによりＭＰの特異的同定が提供される。リガンドのみを用いてＭＰと結合させた場合、ＥＱＥＬＳデータにより、粒子のＩＰに加えて、ＭＰに対するリガンドの結合定数も提供される。
【０１９２】
実施例３：細胞活性化の測定
この実施例では、血小板活性化のような細胞活性化を測定する。サイズ決定−計数装置で行った基準となる休止血小板を測定する。次いで、血小板または細胞を適当なアゴニストを用いて活性化する。活性化が起こると、新たな表面エピトープが表面上に出現する。血小板の場合、ＤＣ６２、ＣＤ４１、種々のインテグリンなどが出現し始める。
【０１９３】
次いで、目的の特定エピトープに対するリガンドを有するプローブ粒子を活性化血小板（またはその他の細胞）に加える。リガンドは、活性化されたエピトープと特異的に結合する抗体または小分子であり得る。結合が起こった場合、活性化細胞またはプローブ粒子よりも大きいサイズの粒子（活性化細胞＋プローブ粒子）が生じる。こうした新たな粒子の出現は、活性化血小板＋結合プローブ粒子の出現を表す。
【０１９４】
実施例４：微生物の同定
この実施例では、本明細書に記載の技術を用いて微生物を同定する。微生物は、細菌、ウイルス、真菌または原生動物であり得る。微生物を含む試料を、本明細書に記載の計数／サイズ決定装置を用いて解析する。試料は、供給水由来、患者（ヒトまたは動物）またはその他の源由来であり得る。サイズ分布を決定し、データベースと比較して、試料中の１つまたは複数の粒子が既知の微生物に典型的なサイズのいずれかに該当するか否かを判定する。もし該当する場合、その微生物と特異的に結合するリガンドとコンジュゲートされたプローブ粒子を加えることができる。試料をプローブ粒子とインキュベートして新たなサイズ分布が得られれば、微生物の素性を確認することができる。
【０１９５】
試料をＥＱＥＬＳで分析すればさらなる検証を得ること可能であり、この場合、ＥＱＥＬＳ装置の速度測定モードを用いて鞭毛生物の遊泳速度を測定する。ＥＱＥＬＳ装置はまた、微生物の電気泳動移動度を測定することができる。粒子の素性のさらなる確認のために、この情報をＥＱＥＬＳデータベースのデータと比較することができる。
【０１９６】
必要であれば、次いで、ＥＱＥＬＳを用いて適当な抗菌性（抗生、抗ウイルス性など）薬剤の決定に役立てる。既知の濃度の抗菌性薬剤を試料に加える。微生物の電気泳動移動度の変化により、薬剤と微生物の結合が判定される。さらに、薬剤により微生物が死滅すれば、その表面電荷密度が変化し、死滅した微生物の電気泳動移動度にかなり大きな変化が生じる。
【０１９７】
実施例５：薬剤効力：細胞阻害効果
アスピリンまたは／およびＰ２Ｙ１２による血小板活性化阻害の具体例
動脈血栓形成性疾患における血小板阻害は、標準治療であると考えられている。残念なことに、一部の患者において従来の薬剤では患者の血小板が阻害されない。ＡＳＡ治療患者の約２５％およびＰｌａｖｉｘ治療患者の約２９％が治療に応答しない。現在、耐性／難治性患者を特定するための一般に認められたアッセイはない。
【０１９８】
本明細書に記載のアッセイは、以下の概念に基づいた粒子サイズ決定を用いて耐性／難治性患者を特定することができる。抗血小板薬剤による治療の目的は活性化を阻害することである。血小板が活性化されると新たな表面エピトープが出現する。したがって、この実施形態では、最初に患者の血小板を多血小板血漿（ＰＲＰ）として得る。次いで、粒子のサイズおよび／または分布の基準測定を行う。次に、一定分量の患者ＰＲＰを血小板活性化因子（アゴニスト）と混合することができる。薬剤が作用すれば、活性化は起こらない。薬剤が作用しなければ、血小板が活性化する。次いで、このアッセイにより、ＣＤ６２、ＣＤ４１などのような新たなエピトープ出現に関して血小板表面をプローブすることができる。粒子とコンジュゲートされたリガンド（抗体またはその他）で表面をプローブすることができる。結合が起これば、プローブ粒子が活性化血小板と結合し、異なる（より大きな）粒子サイズの粒子（すなわち、活性化血小板＋コンジュゲートプローブ粒子）が出現する。薬剤が作用すれば、粒子サイズ分布の変化は起こらない。
【０１９９】
実施例６：薬剤送達ビヒクルとしての脂肪滴
特定のサイズの粒子は毛細血管を十分灌流しない。一般的な毛細血管は直径が約２〜３ミクロンであるため、そのサイズよりも大きい粒子は、赤血球と同様に、それが毛細血管系に入ることができるように粒子の変形が可能な表面積対体積率を有していなければならない。この実施例では、灌流されない範囲に該当し、患者の不調または死をもたらす可能性のある粒子を、粒子サイズ決定を用いて同定する。さらに、一部の粒子の表面特性が、粒子の凝集または分解を引き起こし得る不安定性をもたらす。同様の問題はコロイド化学においてもよく認められている。
【０２００】
この実施形態では、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（商標）、Ｄａｕｎｏｓｏｍｅ（商標）、Ｄｏｘｉｌ（商標）またはその他のリポソーム薬剤送達ビヒクルのような薬剤を、注入前に安全な粒子サイズ分布に関してスクリーニングすることができる。スクリーニングでは粒子のサイズおよび分布により粒子が同定できるため、凝集したリポソーム粒子またはその他の粒子に相当する比較的大きな粒子が観測された場合、注入される前に試料を排斥することができる。あるいは、粒子を脱凝集させる条件下（例えば、超音波など）におき、試料を再試験することができる。これらのアッセイはまた、溶液の最適化および１つまたは複数の最も優秀な化合物の同定のための粒子表面最適化に使用することができる。
【０２０１】
実施例７：小分子分布アッセイ。ｖＷＦまたは血清／血漿の具体例
ｖＷＦは５００，０００〜２億またはさらに大きい範囲の分子量分布である多分散分子である。したがって、分子サイズ分布に大きな違いがある。現在の技術では、解析するのに最低でも数日を要する。
【０２０２】
この実施形態では、金ビーズを、１つのビーズが１つのｖＷＦ多量体と結合するように抗ｖＷＦ抗体とコンジュゲートする。金ビーズの質量密度がより効果的な光散乱を生じるため、金ビーズと結合したｖＷＦ分子が集束散乱サイズ決定／計数装置で確認できる。したがって、ｖＷＦの存在を、またいくつかの実施形態ではその量を測定することができる。
【０２０３】
本発明は上記実施例に関連して説明されているが、修正および変更が本発明の精神および範囲内にあることが理解されるべきである。したがって、本発明は以下の請求項によってのみ限定される。
【図１】
2012500385.tif 000003
【図２】
2012500385.tif 000004
【図３】
2012500385.tif 000005
【図４】
2012500385.tif 000006
【図５】
2012500385.tif 000007
【図６】
2012500385.tif 000008
【図７】
2012500385.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月3日(2010.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料媒体中の目的の生物学的粒子を同定する方法であって、
ａ）目的の生物学的粒子を含み得るまたは含み得ない試料媒体を、集束光ビームに通過させることと、
ｂ）集束光散乱技術を用いて、前記試料媒体内から粒子サイズ分布を示すスペクトルを作成することと、
ｃ）試料媒体中の粒子のサイズを、目的粒子の既知のサイズと比較することにより、目的の生物学的粒子存在の有無を確認することと
を含み、前記集束ビームが、０．１〜１０μｍのサイズ範囲の粒子がすべての前記ビームまたは大部分の前記ビームを十分遮蔽するような大きさであるため、粒子サイズを測定することができる方法。
【請求項２】
前記試料媒体中の粒子のサイズを、集束光散乱技術を用いて得られた粒子サイズのライブラリーを含む参照用データベースと比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ライブラリーが１０個以上のスペクトルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料媒体中に目的粒子が存在することが最初に判定された後に確認アッセイを行う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記確認アッセイが、前記試料媒体のＥＱＥＬＳスペクトルの取得と、生物学的粒子に固有の特徴を特定することによる生物学的粒子存在の確認とを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試料媒体中の目的の生物学的粒子を同定する方法であって、
ａ）目的の生物学的粒子を含み得るまたは含み得ない試料媒体を、集束光ビームに通過させることと、
ｂ）集束光散乱技術を用いて、前記試料媒体内から粒子サイズ分布を示すスペクトルを作成することと、
ｃ）前記試料媒体中の粒子サイズを前記目的粒子の既知のサイズと比較することにより、前記目的の生物学的粒子の存在の有無を確認し、前記媒体中に目的粒子が存在することが最初に判定された後、確認アッセイを行い、前記確認アッセイが、前記試料媒体を前記目的の生物学的粒子と結合することが既知である化合物とインキュベートすることを含み、前記化合物が、微粒子またはナノ粒子と共有結合していることと
を含む方法。
【請求項７】
前記確認アッセイが、前記目的の生物学的粒子の、前記微粒子またはナノ粒子と結合している前記化合物とのコンジュゲートを検出することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記確認アッセイが、
ａ）前記試料媒体を特定の種類の細胞を殺すことが知られている化合物で処理し、前記目的の生物学的粒子が、前記化合物により殺される特定の種類の細胞であることと、
ｂ）前記処理された試料媒体に集束光散乱解析を行って、前記目的粒子の濃度が低下したか否かを判定することと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記目的の生物学的粒子が、リンパ球、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、単球、細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的微粒子が、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、癌細胞、幹細胞、細菌、ウイルスおよび真菌から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的微粒子が、約０．１μｍ〜約２０μｍの範囲のサイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料媒体が、血液、血液製剤、水、脳脊髄液、腹水、胸水および滑液からなる群由来の１つまたは複数の流体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
推定治療薬剤の効力を測定する方法であって、
ａ）推定治療薬剤が結合するであろう受容体を有する生物学的粒子を含む試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示すスペクトルを得ることと、
ｂ）前記試料媒体を推定治療薬剤とインキュベートすることと、
ｃ）前記インキュベートした試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを得ることと、
ｄ）前記粒子のサイズおよび分布が、前記推定治療薬剤のインキュベーションにより変化したか否かを測定し、前記粒子のサイズおよび／または分布における変化が、前記推定治療薬剤と前記生物学的粒子との複合体形成を示すことと
を含み、前記集束ビームが、０．１〜１０μｍのサイズ範囲の粒子がすべての前記ビームまたは大部分の前記ビームを十分遮蔽するような大きさであるため、粒子サイズを測定することができる方法。
【請求項１４】
前記生物学的微粒子が、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、癌細胞、細菌、ウイルスおよび真菌から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的微粒子が０．１μｍ〜２０μｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料媒体が、血液、血液製剤、水、脳脊髄液、腹水、胸水または滑液からなる群より選択される流体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
推定治療薬剤の効力を測定する方法であって、
ａ）推定治療薬剤が結合するであろう受容体を有する生物学的粒子を含む試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示すスペクトルを得ることと、
ｂ）前記試料媒体を推定治療薬剤とインキュベートすることと、
ｃ）前記インキュベートした試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを得ることと、
ｄ）前記粒子のサイズおよび分布が、前記推定治療薬剤のインキュベーションにより変化したか否かを測定し、前記粒子のサイズおよび／または分布における変化が、前記推定治療薬剤と前記生物学的粒子との複合体形成を示し、前記推定治療薬剤が微粒子とコンジュゲートされているため、複合体を形成していない生物学的粒子と、前記微粒子／治療薬剤コンジュゲートと複合体を形成している粒子との間に測定可能なサイズの差異が存在することと
を含む方法。
【請求項１８】
生物学的粒子が、既知の治療薬剤と複合体を形成するか否かを判定するための方法であって、
ａ）既知の治療薬剤が結合し得るまたは結合し得ない受容体を有する生物学的粒子を含む試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて、前記試料媒体を集束光ビームに通過させることにより、粒子のサイズおよび分布を示すスペクトルを得、前記集束ビームが、０．１〜１０μｍのサイズ範囲の粒子がすべての前記ビームまたは大部分の前記ビームを十分遮蔽するような大きさであるため、粒子サイズを測定することができることと、
ｂ）前記試料媒体を既知の治療薬剤とインキュベートすることと、
ｂ）前記インキュベートした試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを得ることと、
ｃ）前記粒子のサイズおよび分布が、前記既知の治療薬剤のインキュベーションにより変化したか否かを判定し、前記粒子のサイズおよび／または分布における変化が、前記既知の治療薬剤と前記生物学的粒子との複合体形成を示すことと
を含む方法。
【請求項１９】
前記生物学的微粒子が、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、癌細胞、細菌、ウイルスおよび真菌から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的微粒子が、約０．１μｍ〜約２０μｍの範囲のサイズを有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料媒体が、血液、血液製剤、水、脳脊髄液、腹水、胸水および滑液からなる群由来の生物学的流体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
既知の細胞、微生物またはウイルスに対する治療薬剤の有効量を決定するための方法であって、
ａ）試料媒体中の既知の細胞、微生物またはウイルスに関して、集束光散乱法を用いて、前記試料媒体を集束光ビームに通過させることにより、粒子のサイズおよび分布を示す第一のスペクトルを作成し、前記集束ビームが、０．１〜１０μｍのサイズ範囲の粒子がすべての前記ビームまたは大部分の前記ビームを十分遮蔽するような大きさであるため、粒子サイズを測定することができることと、
ｂ）第一の濃度の治療薬剤を前記既知の細胞、微生物またはウイルスとインキュベートすることと、
ｃ）前記試料媒体中における前記治療薬剤と前記既知の細胞、微生物またはウイルスとの組合せに関する集束光散乱法を用いて、粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを作成することと、
ｄ）前記第一と第二のスペクトルを比較し、前記粒子のサイズおよび／または分布における変化が、前記治療薬剤と前記細胞、微生物またはウイルスとの結合を示し、結合が、前記既知の細胞、微生物またはウイルスの阻害を示すことと、
ｅ）段階ａ〜ｅを様々な量の前記治療薬剤で繰り返すことと、
ｆ）前記スペクトルを比較して、前記既知の細胞、微生物またはウイルスと有効に結合するために必要とされる治療薬剤の最小量を決定することと
を含む方法。
【請求項２３】
前記治療薬剤が抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記既知の細胞、微生物またはウイルスが、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球および癌細胞からなる群より選択される細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記既知の細胞が癌細胞であり、かつ前記治療薬剤が癌の治療において有効である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記既知の細胞、微生物またはウイルスが、細菌および真菌から選択される微生物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記既知の微生物が細菌であり、かつ前記治療薬剤が細菌感染症の治療において有効である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記既知の細胞、微生物またはウイルスがウイルスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
細胞相互作用により生じる粒子排出を検出する方法であって、
ａ）試料媒体中の既知の細胞に関して、集束光散乱技術を用いて、前記試料媒体を集束光ビームに通過させることにより、粒子のサイズおよび分布を示す第一のスペクトルを作成し、前記集束ビームが、０．１〜１０μｍのサイズ範囲の粒子がすべての前記ビームまたは大部分の前記ビームを十分遮蔽するような大きさであるため、粒子サイズを測定することができることと、
ｂ）潜在的治療薬剤を前記試料媒体中の前記既知の細胞とインキュベートし、前記潜在的治療薬剤が微粒子であることと、
ｃ）前記インキュベートした試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第二のスペクトルを作成することと、
ｄ）前記第一と第二のスペクトルを比較し、前記最初の既知の細胞のサイズよりも小さいサイズの粒子の存在または粒子密度の増加が、粒子排出を示すことと
を含む方法。
【請求項３０】
試料媒体中における粒子凝集を確認する方法であって、
ａ）生物学的粒子を含む試料媒体に関して、集束光散乱技術を用いて粒子のサイズおよび分布を示す第一のスペクトルを作成し、凝集した粒子の粒子サイズに対応するピークの存在が、凝集の存在を示すことを含む方法。
【請求項３１】
前記試料媒体を、前記生物学的粒子における特定の突然変異の非存在下で粒子凝集を促進または阻害する活性薬剤とインキュベートし、粒子凝集の進行または進行の欠如が、この特定の生物学的粒子に対する前記活性薬剤の活性または活性の欠如に関する情報を提供することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的微粒子が血小板を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記活性薬剤が硫酸クロピドグレルである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料媒体中の粒子サイズを、集束光散乱技術を用いて得られた粒子サイズのライブラリーを含む参照データベースと比較する、請求項６に記載の方法。
【請求項３５】
前記ライブラリーが１０個以上のスペクトルを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料媒体中に目的粒子が存在することが最初に判定された後に確認アッセイを行う、請求項６に記載の方法。
【請求項３７】
前記目的の生物学的粒子が、リンパ球、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、単球、細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物である、請求項６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物学的微粒子が、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、癌細胞、幹細胞、細菌、ウイルスおよび真菌から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物学的微粒子が、約０．１μｍ〜約２０μｍの範囲のサイズを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料媒体が、血液、血液製剤、水、脳脊髄液、腹水、胸水および滑液からなる群由来の１つまたは複数の流体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的微粒子が、腫瘍細胞、赤血球、白血球、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、癌細胞、細菌、ウイルスおよび真菌から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物学的微粒子が０．１μｍ〜２０μｍである、請求項１７に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料媒体が、血液、血液製剤、水、脳脊髄液、腹水、胸水および滑液からなる群より選択される流体を含む、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
2012500385.tif 000010
2012500385.tif 000011