(57)【要約】本開示は、結晶性インスリン複合体を提供する。また、本開示は、これらの結晶性インスリン複合体を含むものの製剤、治療法、投与法および製造法を開示する。
2012516342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2012516342.tif 000061
の結晶性インスリン複合体。
（式中、
［（Ａ−Ｔ）］は、それぞれ、複合体内のポテンシャル分岐部を示し；
（Ａ−Ｔ）は、それぞれ、複合体の分岐部内のポテンシャル繰返しを示し；
−Ａ−は、それぞれ独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、または場合によっては置換された基であって、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される基であり；
Ｔは、それぞれ独立して、共有結合、または２価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられ；
Ｒは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分、またはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
Ｘは、それぞれ独立して、糖を含むリガンドであり；
ＬＢは、それぞれ独立して、共有結合、またはＴとＸとの共有結合型複合に由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−ＷＩであり；
ＷＩは、インスリン分子であり；
ＬＤは、それぞれ独立して、共有結合、またはＴとＷＩとの共有結合型複合に由来する基であり；
ｋは、１〜１２の整数であり、
ｐは、それぞれ独立して、１〜５の整数であり；
ｎは、それぞれ独立して、０〜５の整数であり；
ｍは、それぞれ独立して、１〜５の整数であり；および
ｖは、それぞれ独立して、０〜５の整数であり、ただし、ｋ−分岐部内で、ｎの少なくとも１つが≧１であり、およびｖの少なくとも１つが≧１である。）
【請求項２】
複合体が、式（ＩＩＩａ）：
【化２】
2012516342.tif 000062
の複合体である、請求項１に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３】
複合体が、式（ＩＩＩａ−１）：
【化３】
2012516342.tif 000063
の複合体である、請求項２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４】
複合体が、式（ＩＩＩａ−２）：
【化４】
2012516342.tif 000064
の複合体である、請求項２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５】
複合体が、式（ＩＩＩａ−３）：
【化５】
2012516342.tif 000065
の複合体である、請求項２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６】
複合体が、式（ＩＩＩｂ）：
【化６】
2012516342.tif 000066
の複合体である、請求項１に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項７】
複合体が、式（ＩＩＩｂ−１）：
【化７】
2012516342.tif 000067
の複合体である、請求項６に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項８】
複合体が、式（ＩＩＩｂ−２）：
【化８】
2012516342.tif 000068
の複合体である、請求項６に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項９】
複合体が、式（ＩＩＩｂ−３）：
【化９】
2012516342.tif 000069
の複合体である、請求項６に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１０】
複合体が、式（ＩＩＩｂ−４）：
【化１０】
2012516342.tif 000070
の複合体である、請求項６に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１１】
複合体が、式（ＩＩＩｂ−５）：
【化１１】
2012516342.tif 000071
の複合体である、請求項６に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１２】
複合体が、式（ＩＩＩｂ−６）：
【化１２】
2012516342.tif 000072
の複合体である、請求項６に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１３】
複合体が、式（ＩＩＩｂ−７）：
【化１３】
2012516342.tif 000073
の複合体である、請求項６に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１４】
複合体が、式（ＩＩＩｃ）：
【化１４】
2012516342.tif 000074
の複合体である、請求項１に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１５】
複合体が、式（ＩＩＩｃ−１）：
【化１５】
2012516342.tif 000075
の複合体である、請求項１４に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１６】
複合体が、式（ＩＩＩｃ−２）：
【化１６】
2012516342.tif 000076
の複合体である、請求項１４に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１７】
Ｔは、それぞれ独立して、２価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたＣ１−２０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている、請求項２、６または１４に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１８】
Ｔの１、２、３、４、または５個のメチレン単位が、場合によってはおよび独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている、請求項１７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１９】
Ｔは、Ｃ１−１０炭化水素鎖から構築され、ここで、Ｔの１個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている、請求項１７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２０】
Ｔの１個以上のメチレン単位が、−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられている、請求項１７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２１】
Ｔの１個以上のメチレン単位が、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−で置き換えられている、請求項１７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２２】
Ｔの１個以上のメチレン単位が、−Ｏ−で置き換えられている、請求項１７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２３】
それぞれのＴが同じである、請求項１７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２４】
ＬＢおよび／またはＬＤが共有結合である、請求項２、６または１４に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２５】
ＬＢおよび／またはＬＤが、Ｔの場合によっては置換されたカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性部分と、ＸまたはＷＩのカルボキシル、チオール、アミン、またはヒドロキシル基との複合に由来する、場合によっては置換された部分である、請求項２、６または１４に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２６】
ＬＢおよび／またはＬＤが、ＸまたはＷＩの場合によっては置換されたカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性部分と、Ｔのカルボキシル、チオール、アミン、またはヒドロキシル基との複合に由来する、場合によっては置換された部分である、請求項２、６または１４に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２７】
インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリン、およびウシインスリンからなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２８】
インスリン分子が、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリシンからなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項２９】
インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３０】
インスリン分子が、３個のジスルフィド架橋を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３１】
インスリン分子が、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３２】
インスリン分子が、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して複合体化したヒトインスリンである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３３】
Ｘは、それぞれ、ビマンノースを含むリガンドである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３４】
Ｘは、それぞれ、トリマンノースを含むリガンドである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３５】
Ｘは、それぞれ、直鎖トリマンノースを含むリガンドである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３６】
Ｘは、それぞれ、分岐状トリマンノースを含むリガンドである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３７】
Ｘは、それぞれ、糖およびアミン基を含むリガンドである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３８】
糖およびアミン基が、Ｃ１−Ｃ６アルキル基で分離されている、請求項３７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３９】
Ｘが、それぞれ独立して、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含むリガンドである、請求項３８に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４０】
Ｘは、それぞれ、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含むリガンドである、請求項３９に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４１】
複合体が、Ｘがアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含むリガンドである箇所を２個または３個含む、請求項４０に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４２】
Ｘが、それぞれ、アノマー炭素を介して複合体化された糖を含むリガンドである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４３】
アノマー炭素が、αアノマーである、請求項４２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４４】
Ｘが、それぞれ、αアノマー炭素を介して、複合体骨格に複合体化したアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）であり；およびＷＩが、ＬｙｓＢ２９のεアミノ基を介して、複合体骨格に複合体化したインスリン分子である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４５】
式（ＩＩＩｂ−３）：
【化１７】
2012516342.tif 000077
の結晶性インスリン複合体。
（式中、
ＷＩは、インスリン分子であり；および
−Ｘは、それぞれ、
【化１８】
2012516342.tif 000078
である。）
【請求項４６】
式（ＩＩＩｃ−２）：
【化１９】
2012516342.tif 000079
の結晶性インスリン複合体。
（式中、ＷＩは、インスリン分子であり；および
−Ｘは、それぞれ、
【化２０】
2012516342.tif 000080
である。）
【請求項４７】
式（ＩＩＩｄ−１）：
【化２１】
2012516342.tif 000081
の結晶性インスリン複合体。
（式中、
ＷＩは、インスリン分子であり；および
−Ｘは、それぞれ、
【化２２】
2012516342.tif 000082
である。）
【請求項４８】
インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリン、およびウシインスリンからなる群から選択される、請求項４５、４６または４７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４９】
インスリン分子が、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリシンからなる群から選択される、請求項４５、４６または４７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５０】
インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項４５、４６または４７に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５１】
アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）、およびアミノエチルフコース（ＡＥＦ）からなる群から独立して選択される１個以上のリガンドに複合体化したインスリン分子を含む結晶性インスリン複合体。
【請求項５２】
インスリン分子が、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項５１に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５３】
１個以上のリガンドが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である、請求項５２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５４】
１個以上のリガンドが、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である、請求項５２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５５】
１個以上のリガンドが、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である、請求項５２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５６】
１個以上のリガンドが、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である、請求項５２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５７】
１個以上のリガンドが、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である、請求項５２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５８】
１個以上のリガンドが、アミノエチルフコース（ＡＥＦ）である、請求項５２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５９】
インスリン分子が、２個以上の異なるリガンドに複合体化している、請求項５１に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６０】
インスリン分子が、２個の異なるリガンドに複合体化している、請求項５９に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６１】
インスリン分子が、３個の別のリガンドに複合体化している、請求項５９に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６２】
２個以上の別のリガンドが、インスリン分子に複合体化している単一複合体骨格に複合体化している、請求項５９に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６３】
２個以上の別のリガンドおよびインスリン分子が、それぞれ、単一分岐複合体骨格の異なる分岐部に位置する、請求項５９に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６４】
２個以上の別のリガンドおよびインスリン分子が、それぞれ、単一分岐複合体骨格の別の分岐部の末端に位置する、請求項５９に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６５】
２個以上の別のリガンドが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６６】
２個以上の別のリガンドが、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６７】
２個以上の別のリガンドが、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６８】
２個以上の別のリガンドが、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６９】
２個以上の別のリガンドが、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項７０】
２個以上の別のリガンドが、アミノエチルフコース（ＡＥＦ）である、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項７１】
アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）に複合体化したインスリン分子を含む結晶性インスリン複合体。
【請求項７２】
アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）に複合体化したインスリン分子を含む結晶性インスリン複合体。
【請求項７３】
アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）に複合体化したインスリン分子を含む結晶性インスリン複合体。
【請求項７４】
アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）に複合体化したインスリン分子を含む結晶性インスリン複合体。
【請求項７５】
β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）に複合体化したインスリン分子を含む結晶性インスリン複合体。
【請求項７６】
アミノエチルフコース（ＡＥＦ）に複合体化したインスリン分子を含む結晶性インスリン複合体。
【請求項７７】
インスリン分子が、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項７８】
式：
【化２３】
2012516342.tif 000083
の結晶性インスリン複合体。
【請求項７９】
式：
【化２４】
2012516342.tif 000084
の結晶性インスリン複合体。
【請求項８０】
式：
【化２５】
2012516342.tif 000085
の結晶性インスリン複合体。
【請求項８１】
式：
【化２６】
2012516342.tif 000086
の結晶性インスリン複合体。
【請求項８２】
式：
【化２７】
2012516342.tif 000087
の結晶性インスリン複合体。
【請求項８３】
式：
【化２８】
2012516342.tif 000088
の結晶性インスリン複合体。
【請求項８４】
式：
【化２９】
2012516342.tif 000089
の結晶性インスリン複合体。
【請求項８５】
式：
【化３０】
2012516342.tif 000090
の結晶性インスリン複合体。
【請求項８６】
請求項１〜８５のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体を含む徐放性製剤。
【請求項８７】
絶食状態で哺乳類に投与した場合、製剤は、複合体のゼロ次放出を示す、請求項８６に記載の製剤。
【請求項８８】
絶食状態で哺乳類に皮下投与した場合、製剤は、複合体のゼロ次放出を示す、請求項８６に記載の製剤。
【請求項８９】
製剤が、プロタミンを含む、請求項８６に記載の製剤。
【請求項９０】
製剤が、プロタミンおよび亜鉛を含む、請求項８６に記載の製剤。
【請求項９１】
製剤が、約０．０５〜約１０ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体を含む、請求項９０に記載の製剤。
【請求項９２】
製剤が、複合体１ｍｇ当たり約１〜約５ｍｇのプロタミンを含む、請求項９０に記載の製剤。
【請求項９３】
製剤が、約０．００６〜約０．５ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体を含む、請求項９０に記載の製剤。
【請求項９４】
製剤が、約０．１〜約０．２５ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体を含む、請求項９０に記載の製剤。
【請求項９５】
製剤が、プロタミンおよび亜鉛を、約１００：１〜約５：１の範囲の比（ｗ／ｗ）で含む、請求項９０に記載の製剤。
【請求項９６】
製剤が、プロタミンおよび亜鉛を、約４０：１〜約１０：１の範囲の比（ｗ／ｗ）で含む、請求項９０に記載の製剤。
【請求項９７】
製剤が、さらに、抗菌性防腐剤を含む、請求項８６〜９６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９８】
抗菌性防腐剤が、ｍ−クレゾール、フェノール、メチルパラベン、およびプロピルパラベンからなる群から選択される、請求項９７に記載の製剤。
【請求項９９】
抗菌性防腐剤が、ｍ−クレゾールである、請求項９７に記載の製剤。
【請求項１００】
製剤が、約０．１〜約１．０％ｖ／ｖのｍ−クレゾールを含む、請求項９９に記載の製剤。
【請求項１０１】
製剤が、約０．１５〜約０．３５％ｖ／ｖのｍ−クレゾールを含む、請求項９９に記載の製剤。
【請求項１０２】
製剤が、さらに、等張剤を含む、請求項８６〜９６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０３】
等張剤が、ポリオールである、請求項１０２に記載の製剤。
【請求項１０４】
等張剤が、マンニトール、プロピレングリコールおよびグリセロールからなる群から選択される、請求項１０３に記載の製剤。
【請求項１０５】
等張剤がグリセロールである、請求項１０４に記載の製剤。
【請求項１０６】
等張剤が塩である、請求項１０２に記載の製剤。
【請求項１０７】
塩がＮａＣｌである、請求項１０６に記載の製剤。
【請求項１０８】
製剤が、約０．０５〜約０．５ＭのＮａＣｌを含む、請求項１０７に記載の製剤。
【請求項１０９】
製剤が、約０．１〜約０．２ＭのＮａＣｌを含む、請求項１０８に記載の製剤。
【請求項１１０】
製剤が、さらに、ある量の複合体化されていないインスリン分子を含む、請求項８６〜９６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１１】
製剤が、結晶性インスリン複合体の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約１００：１〜約１：１の範囲で含む、請求項１１０に記載の製剤。
【請求項１１２】
製剤が、結晶性インスリン複合体の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約２５：１〜約２：１の範囲で含む、請求項１１０に記載の製剤。
【請求項１１３】
結晶性インスリン複合体が、請求項７８〜８５の結晶性インスリン複合体のいずれか１つである、請求項８６〜１１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１４】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９、８０、または８２の結晶性インスリン複合体である、請求項１１３に記載の製剤。
【請求項１１５】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９の結晶性インスリン複合体である、請求項１１４に記載の製剤。
【請求項１１６】
請求項１〜８５のいずれか一項の結晶性インスリン複合体の懸濁液を含むポンプデリバリーシステムであって、該ポンプデリバリーシステムは、結晶性インスリン複合体懸濁液を哺乳類に注入することにより動く、ポンプデリバリーシステム。
【請求項１１７】
ポンプが、結晶性インスリン複合体懸濁液を、皮下にまたは腹腔内に注入することにより動く、請求項１１６に記載のポンプ。
【請求項１１８】
結晶性インスリン複合体が、請求項７８〜８５の結晶性インスリン複合体のいずれか１つである、請求項１１６または１１７に記載のポンプ。
【請求項１１９】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９、８０または８２の結晶性インスリン複合体である、請求項１１８に記載のポンプ。
【請求項１２０】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９の結晶性インスリン複合体である、請求項１１９に記載のポンプ。
【請求項１２１】
高血糖症を治療する方法であって、請求項１〜１１５のいずれか一項の結晶性インスリン複合体またはその製剤を、それを必要とする哺乳類患者に投与することを含む方法。
【請求項１２２】
患者が糖尿病である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
患者が、血糖管理不良に関連する感染症を患う、請求項１２１の方法。
【請求項１２４】
製剤が、レクチンを含まない、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
製剤が、皮下注射によって投与される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２６】
患者がヒトである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２７】
結晶性インスリン複合体が、請求項７８〜８５の結晶性インスリン複合体のいずれか１つである、請求項１２１〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９、８０または８２の結晶性インスリン複合体である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９の結晶性インスリン複合体である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
結晶性インスリン複合体またはその製剤を、インスリン分子の平均一日量が、１０〜２００Ｕの範囲になるように投与する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１３１】
結晶性インスリン複合体またはその製剤を毎日投与する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
結晶性インスリン複合体またはその製剤を毎週投与する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
結晶性インスリン複合体またはその製剤を毎月投与する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３４】
患者が、インスリン感受性改善薬も投与されている、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３５】
患者が、インスリン分泌促進薬も投与されている、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３６】
請求項１〜１１５のいずれか一項の結晶性インスリン複合体またはその製剤を、その投与を必要とする哺乳類患者に投与することを含む方法。
【請求項１３７】
結晶性インスリン複合体が、インスリン分子の複合体化されていないものより、血糖降下の誘発が少ない、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
結晶性インスリン複合体が、請求項７８〜８５の結晶性インスリン複合体のいずれか１つである、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９、８０または８２の結晶性インスリン複合体である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９の結晶性インスリン複合体である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
請求項８６〜９６のいずれか一項の製剤を、その投与を必要とする哺乳類患者に投与することを含む方法。
【請求項１４２】
製剤が、インスリン分子の複合体化されていないものを含む製剤より、血糖降下の誘発が少ない、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
製剤が、インスリン分子の複合体化されていないものを含む製剤より低いＨｂＡ１ｃを含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
製剤が、請求項７８〜８５のいずれか一項の結晶性インスリン複合体を含む、請求項１４１〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
製剤が、請求項７９、８０または８２の結晶性インスリン複合体を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
製剤が、請求項７９の結晶性インスリン複合体を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
さらに、トリガー量の外因性糖を、患者に投与することを含む、請求項１３６〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
外因性糖が、マンノースである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
外因性糖が、Ｌ−フコースである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
外因性糖がＮ−アセチルグルコサミンである、請求項１４７の方法。
【請求項１５１】
外因性糖が、α−メチルマンノースである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５２】
複合体または製剤と、外因性糖とを、異なる経路で哺乳類に投与する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５３】
複合体または製剤を皮下投与し、および外因性糖を経口投与する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５４】
複合体または製剤を皮下投与し、およびに外因性糖を静脈内投与する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５５】
請求項１〜８５のいずれか一項の結晶性インスリン複合体を製造する方法であって、リン酸塩緩衝液からインスリン複合体を結晶化することを含む方法。
【請求項１５６】
緩衝液のカリウム濃度がナトリウム濃度より高い、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
緩衝液の一塩基性リン酸カリウムの濃度が、二塩基性リン酸ナトリウムの濃度より高い、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５８】
緩衝液のｐＨが、約６〜９の範囲である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５９】
緩衝液のｐＨが約８である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６０】
緩衝液のｐＨが８．２である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６１】
結晶性インスリン複合体が、ＬｙｓＢ２９で複合体化されている、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６２】
結晶性インスリン複合体が、請求項７９、８０または８２の結晶性インスリン複合体である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６３】
１種以上の添加剤が加えられ、該添加剤が、クレゾール、フェノール、プロタミン、ポリ（アルギニン）、グリセロール、塩化亜鉛または酢酸亜鉛からなる群から選択される、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６４】
ポリエチレングリコールが加えられる、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６５】
有機溶剤を加え、結晶化を促進する、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６６】
有機溶剤が、メタノール、エタノール、またはイソプロパノールである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６７】
請求項１〜８５のいずれか一項の結晶性インスリン複合体を製造する方法であって、ＨＥＰＥＳ緩衝液からインスリン複合体を結晶化することを含む方法。
【請求項１６８】
請求項１〜８５のいずれか一項の結晶性インスリン複合体を製造する方法であって、トリス緩衝液からインスリン複合体を結晶化することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年１月２８日出願の米国仮特許出願第６１／１４７，８７８号、２００９年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／１５９，６４３号、２００９年３月２０日出願の米国仮特許出願第６１／１６２，１０７号、２００９年３月２５日出願の米国仮特許出願第６１／１６３，０８４号、２００９年６月２４日出願の米国仮特許出願第６１／２１９，８９６号、２００９年６月２４日出願の米国仮特許出願第６１／２１９，８９７号、２００９年７月７日出願の米国仮特許出願第６１／２２３，５７２号および２００９年１０月１９日出願の米国仮特許出願第６１／２５２，８５７号の優先権を主張し、これらそれぞれの内容全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
従来技術で公知の大半の「制御放出」薬物送達システム（たとえば、米国特許第４，１４５，４１０号、Ｓｅａｒｓ、これは酵素的に不安定なカプセルからの薬物放出を記載する）では、ヒトの体内に存在する分子指標物質（たとえば、代謝産物）の量に直接比例した間隔および濃度で、薬物を患者に与えるのは不可能である。従って、これらの従来技術のシステムにおける薬物は、厳密な意味では「制御され」ているのではなく、単に外部または内部要因とは独立した、低速度放出フォーマットにより提供されるだけである。
【０００３】
インスリン注射剤による真性糖尿病の治療は、インスリンの制御されていない低速度放出は望ましくないという周知の研究された例である。事実、ホルモンの単純な置き換えは、この疾患に関連する病理学的後遺症を予防するのには不十分であることは明らかである。これらの後遺症の進展は、患者が経験する血糖濃度の変化に比例した外因性インスリンの投与ができないことを反映していると考えられる。この問題を解決するため、より生理的なインスリン送達システムを開発する、いくつかの生物学的および生物工学的アプローチが示唆されている（たとえば、米国特許第４，３４８，３８７号、Ｂｒｏｗｎｌｅｅら；米国特許第５，８３０，５０６号、第５，９０２，６０３号および第６，４１０，０５３号、Ｔａｙｌｏｒら、および米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９号、Ｚｉｏｎら参照）。
【０００４】
これらのシステムはそれぞれ、多価グルコース結合分子（たとえば、レクチンＣｏｎＡ）と多価グルコース結合分子によって可逆的に結合された糖ベース成分との組合わせに依存する。残念ながら、ＣｏｎＡおよび他の多くの入手容易なレクチンは、リンパ球増殖を刺激する可能性がある。ある種のリンパ球の表面上の炭水化物受容体に結合することにより、これらのいわゆる「分裂促進的な」レクチンは、リンパ球の有糸分裂を誘発する可能性があり、これによりリンパ球を増殖させる。ＣｏｎＡを含む最も分裂促進的なレクチンは、選択的Ｔ細胞マイトジェンである。２、３のレクチンは、選択性が殆どなく、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方を刺激する。分裂促進的なレクチンへの局所または全身インビボ曝露は、炎症、細胞毒性、マクロファージ消化およびアナフィラキシーを始めとするアレルギー反応を起こす結果となり得る。さらに、植物レクチンは、特に、高い力価の抗レクチン特異抗体の産生をもたらす、免疫原生であることが知られている。従って、分裂促進的なレクチンは、これらの放出を防ぐために十分な注意を払わない限り、インビボ方法および装置用に、原型で使用できないことは理解されることである。たとえば、米国特許第５，８３０，５０６号、Ｔａｙｌｏｒは、ＣｏｎＡを使用することに関連する毒性のリスクを際立たせ、薬物送達装置の内外で自由に拡散するために、これもグルコースおよびインスリン分子を必要とする薬物送達装置内でＣｏｎＡを含有することの重要性および困難性を強調する。
【０００５】
レクチンを必要としない代替制御薬物送達システムを提供することができれば、レクチンのこれらおよび他のインビボ用途に関連するリスクおよび困難性を、大きく軽減させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，１４５，４１０号
【特許文献２】米国特許第４，３４８，３８７号
【特許文献３】米国特許第５，８３０，５０６号
【特許文献４】米国特許第５，９０２，６０３号
【特許文献５】米国特許第６，４１０，０５３号
【特許文献６】米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、、本開示は、インスリンの薬物動態学的（ＰＫ）および／または薬力学的（ＰＤ）プロファイルを、グルコースのような糖の全身濃度に応答する様式で、制御する方法を提供する。実施例で検討するように、本発明者らは、インスリンを高親和性糖リガンドに複合体化した場合、ＣｏｎＡのような外因性多価糖結合分子が存在しなくても、糖濃度変化に応答するＰＫ／ＰＤプロファイルを示せるようにすることができることを発見した。この発見は、予期し得ぬものであり、単純な、レクチンのない糖に応答性のインスリン系を形成する前例のない機会を提供する。
【０００８】
従来のインスリンの徐放性製剤は、通常、体循環にゆっくりとインスリンを放出するために使用される。たとえば、ＰＺＩ（プロタミン亜鉛インスリン）製剤は、この目的のために使用され得る。従来のインスリンをプロタミンおよび亜鉛とともに製剤化した場合、結晶性徐放性製剤が一般的に製造される。対照的に、本明細書で記載されるインスリン複合体を、類似の方法を使用して、プロタミンおよび亜鉛で製剤化した場合、無定形製剤が製造され、徐放性を得るためには、従来のインスリン、たとえば、ＲＨＩが必要とされる量より、非常に多くのプロタミンおよび亜鉛が必要とされる。驚くべきことに、本発明者らは、本明細書に記載の特定のインスリン複合体は、結晶化し得ることを発見した。インスリン複合体は、おそらく、それらの糖を含有する立体的に嵩高い構造のため、標準的なインスリン結晶化条件を使用して、結晶化することが難しい。本明細書で記載するように、次いで、本開示の結晶性インスリン複合体を製剤化して、結晶性徐放性製剤を提供することができる。本開示は、結晶性インスリン複合体およびその製剤を提供する。また、結晶性インスリン複合体の製造法および使用法も提供する。インスリン複合体の結晶性製剤は、バッチからバッチへの再生産性を改善し、製剤安定性を増し、長期保存での粒子凝集を減らすという利点があり得る。
【０００９】
定義
以下、本明細書全体で使用される特定の官能基、化学用語および一般用語との定義を、さらに詳細に記載する。本発明の目的のため、化学元素は、元素の周期表、ＣＡＳバージョン、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，第７５編、表紙裏に従って表し、特定の官能基は、一般的に、本明細書に記載するように定義する。さらに、有機化学の一般原則および特定の官能部分および反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９；ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３編，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されている。
【００１０】
アシル−  本明細書で使用される用語「アシル」は、一般式：−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＸ１）２、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＸ１）２および−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ（ＲＸ１）、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＳＲＸ１および−Ｃ（＝ＮＲＸ１）Ｎ（ＲＸ１）２（式中、ＲＸ１は、水素；ハロゲン；置換または非置換ヒドロキシル；置換または非置換チオール；置換または非置換アミノ；置換または非置換アシル；環状または非環状、置換または非置換、分岐状または非分岐状脂肪族；環状または非環状、置換または非置換、分岐状または非分岐状ヘテロ脂肪族；環状または非環状、置換または非置換、分岐状または非分岐状アルキル；環状または非環状、置換または非置換、分岐状または非分岐状アルケニル；置換または非置換アルキニル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノまたはジ脂肪族アミノ、モノまたはジヘテロ脂肪族アミノ、モノまたはジアルキルアミノ、モノまたはジヘテロアルキルアミノ、モノまたはジアリールアミノ、またはモノまたはジヘテロアリールアミノ；または２個のＲＸ１基は一緒になって、５〜６員複素環を形成する）を有する基をさす。アシル基の例として、アルデヒド（−ＣＨＯ）、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、ケトン、アシルハライド、エステル、アミド、イミン、カーボネート、カルバメート、および尿素が挙げられる。アシル置換基として、本明細書に記載する任意の置換であって、適切な部分を形成する置換基（たとえば、脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど、これらはそれぞれ、さらに置換されてもされなくてもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
脂肪族−  本明細書で使用される用語「脂肪族」または「脂肪族基」は、場合によっては置換された炭化水素部分であって、直鎖（すなわち、非分岐）、分岐状、または環状（「炭素環状」）であってもよく、完全に飽和されまたは不飽和部分を１個以上含有してもよく、しかし芳香族ではない炭化水素部分を示す。特に明記しない限り、脂肪族基は１〜１２個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含有し、さらに他の実施形態では、脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含有する。適切な脂肪族基として、直鎖または分岐状アルキル、アルケニルおよびアルキニル基、およびこれらの混成体、たとえば、（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
アルケニル−  本明細書で使用される用語「アルケニル」は、炭素−炭素二重結合を少なくとも１個有する直鎖または分岐鎖状脂肪族部分から１個の水素原子の脱離により誘導された、場合によっては置換された１価の基を示す。ある実施形態では、本発明で使用されるアルケニル基は、２〜６個の炭素原子を含有する。ある実施形態では、本発明で使用されるアルケニル基は、２〜５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるアルケニル基は、２〜４個の炭素原子を含有する。別の実施形態では、使用されるアルケニル基は、２〜３個の炭素原子を含有する。アルケニル基として、たとえば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられる。
【００１３】
アルキル−  本明細書で使用される用語「アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含有する脂肪族部分から１個の水素原子の脱離により誘導された、場合によっては置換された、飽和の直鎖または分岐鎖状炭化水素ラジカルをさす。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるアルキル基は、１〜５個の炭素原子を含有する。別の実施形態では、使用されるアルキル基は、１〜４個の炭素原子を含有する。さらに他の態様では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を含有する。さらに別の態様では、アルキル基は１〜２個の炭素を含有する。アルキルラジカルの例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ドデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
アルキニル−  本明細書で使用される用語「アルキニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖状脂肪族部分から１個の水素原子の脱離により誘導された、場合によっては置換された１価の基をさす。ある実施形態では、本発明で使用されるアルキニル基は、２〜６個の炭素原子を含有する。ある実施形態では、本発明で使用されるアルキニル基は、２〜５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるアルキニル基は、２〜４個の炭素原子を含有する。別の実施形態では、使用されるアルキニル基は、２〜３個の炭素原子を含有する。代表的なアルキニル基として、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
アリール−  本明細書で使用される用語「アリール」であって、単独でまたは「アラルキル」、「アラルコキシ」または「アリールオキシアルキル」におけるような、より大きな部分の一部として使用される「アリール」は、合計５〜１０環員を有する、場合によっては置換された単環式および二環式環構造であって、該構造中の少なくとも１個の環が芳香族であり、該構造中のそれぞれの環は、３〜７環員を含有する環構造である。用語「アリール」は、用語「アリール環」と互換的に使用されてもよい。本発明のある実施形態では、「アリール」は、芳香族環構造をさし、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどが挙げられるが、これらに限定されず、１個以上の置換基を有してもよい。
【００１６】
アリールアルキル−  本明細書で使用される用語「アリールアルキル」は、アリール基（たとえば、芳香族またはヘテロ芳香族基）で置換されたアルキル基をさす。
【００１７】
２価の炭化水素鎖−  本明細書で使用される用語「２価の炭化水素鎖」（「２価のアルキレン基」ともいう）は、ポリメチレン基、すなわち、−（ＣＨ２）Ｚ−（式中、ｚは、１〜３０、１〜２０、１〜１２、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、または２〜３の自然数である）である。置換された２価の炭化水素鎖は、１個以上のメチレン水素原子が置換基で置き換えられているポリメチレン基である。適切な置換基として、以下の置換された脂肪族基に関して記載されるものが挙げられる。
【００１８】
カルボニル−  本明細書で使用される用語「カルボニル」は、炭素−酸素二重結合を含有する１価または２価の部分をさす。カルボニル基の非限定的な例として、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、アシルハライド、無水物、尿素、カルバメート、カーボネート、チオエステル、ラクトン、ラクタム、ヒドロキサメート、イソシアネートおよびクロロホルメートが挙げられる。
【００１９】
シクロ脂肪族−  本明細書で使用される用語「シクロ脂肪族」、「炭素環」または「炭素環状」であって、単独でまたはより大きな部分の一部として使用される「シクロ脂肪族」、「炭素環」または「炭素環状」は、本明細書で記載するような、３〜１０員を有する、場合によっては置換された飽和または部分的に不飽和の環状脂肪族単環式または二環式環構造をさす。シクロ脂肪族基として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニルおよびシクロオクタジエニルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、３〜６個の炭素を有する。
【００２０】
ハロゲン−  本明細書で使用される用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−Ｃｌ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）およびヨウ素（ヨード、−Ｉ）から選択される原子をさす。
【００２１】
ヘテロ脂肪族−  本明細書で使用される用語「ヘテロ脂肪族」または「ヘテロ脂肪族基」は、炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する、場合によっては置換された炭化水素部分であって、直鎖（すなわち、非分岐）、分岐状、または環状（「複素環」）であってもよく、および完全に飽和されていてもよく、または１個以上の不飽和単位を含有してもよい、しかし、芳香族ではない炭化水素部分を示す。特に明記しない限り、ヘテロ脂肪族基は、１〜６個の炭素原子を含有し、ここで１〜３個の炭素原子は、場合によってはおよび独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。いくつかの実施形態では、ヘテロ脂肪族基は、１〜４個の炭素原子を含有し、ここで、１〜２個の炭素原子は、場合によってはおよび独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。さらに他の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は、１〜３個の炭素原子を含有し、ここで、１個の炭素原子は、場合によってはおよび独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。適切なヘテロ脂肪族基として、直鎖または分岐状ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニル基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
ヘテロアラルキル−  本明細書で使用される用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されたアルキル基であって、該基中のアルキルおよびヘテロアリール部分は、独立して、場合によっては置換されている基をさす。
【００２３】
ヘテロアリール−  本明細書で使用される用語「ヘテロアリール」であって、単独またはより大きな部分、たとえば「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアラルコキシ」の一部として使用される「ヘテロアリール」は、５〜１０個の環原子、好ましくは５、６または９個の環原子を有し、サイクリック配列で共有された６、１０または１４π電子を有し、炭素原子に加えて、１〜５個のヘテロ原子を有する場合によっては置換された基をさす。ヘテロアリール基として、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される用語「ヘテロアリール」および「ヘテロアル−」は、ヘテロ芳香族環が１個以上のアリール環、炭素環または複素環と縮合し、ここで、ラジカルまたは結合点が、ヘテロ芳香族環上にある基も含む。非限定的な例として、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニルおよびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。ヘテロアリール基は、単環でも二環でもよい。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」または「ヘテロ芳香族」と互換的に使用してもよく、これらの用語はどれも、場合によっては置換された環を含む。
【００２４】
ヘテロ原子−  本明細書で使用される用語「ヘテロ原子」は、窒素、酸素またはイオウをさし、窒素またはイオウの任意の酸化形態を含み、および塩基性窒素の任意の四級化形態を含む。用語「窒素」は、置換された窒素も含む。
【００２５】
複素環−  本明細書で使用される用語「ヘテロ環」、「ヘテロサイクリル」、「複素環ラジカル」および「複素環リング」は、互換的に使用され、安定な、飽和または部分的に不飽和の、場合によっては置換された５〜７員単環式または７〜１０員二環式複素環部分であって、炭素原子に加えて、１個以上の先に定義したヘテロ原子を有する部分である。複素環リングは、安定な構造になる、任意のヘテロ原子または炭素原子で側鎖基と結合することができ、および環原子のいずれも、場合によっては置換され得る。そのような飽和または部分的に不飽和の複素環ラジカルの例として、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニルおよびキヌクリジニルが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ヘテロ環」、「ヘテロサイクリル」、「複素環リング」、「複素環基」、「複素環部分」および「複素環ラジカル」は、本明細書では互換的に使用され、複素環リングが１個以上のアリール、ヘテロアリールまたは炭素環状リングに縮合する基、たとえば、インドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロキノリニルであって、結合するラジカルまたは結合点は、ヘテロサイクリル環上である基も含む。ヘテロサイクリル基は、単環式でも二環式でもよい。用語「ヘテロサイクリルアルキル」は、ヘテロサイクリルで置換されたアルキル基であって、アルキルおよびヘテロサイクリル部は、独立して、場合によっては置換されているアルキル基をさす。
【００２６】
不飽和−  本明細書で使用される用語「不飽和」は、ある部分が１個以上の二重結合または三重結合を有することを意味する。
【００２７】
部分的に不飽和−  本明細書で使用される用語「部分的に不飽和」は、少なくとも１個の二重結合または三重結合を含む環部分をさす。用語「部分的に不飽和」は、複数の不飽和部分を有する環を包含するものと意図されるが、本明細書で定義した、アリールまたはヘテロアリール部分は包含しないと意図される。
【００２８】
場合によっては置換−  本明細書で記載するように、本発明の化合物は、「場合によっては置換」された部分を含有してもよい。一般的に用語「置換」は、用語「場合によっては」が先についていてもついていなくても、指定された部分の１個以上の水素が、適切な置換基で置き換えられていることを意味する。他に示されていなければ、「場合によっては置換された」基は、該基の置換可能なそれぞれの位置に、適切な置換基を有してよく、任意の所与の構造体の複数の位置が特定の群から選択される複数の置換基で置換され得る場合は、該置換基は、各位置で、同じまたは異なってもよい。本発明で考える置換基の組合わせは、安定なまたは化学的に実施可能な化合物となるものが好ましい。本明細書で使用される用語「安定な」は、これらの製造、検出、および、ある実施形態では、回収、精製、および本明細書で開示する１つ以上の目的を可能にする条件に供された場合、実質的に変化しない化合物をさす。
【００２９】
「場合によっては置換されている」基の置換可能な炭素原子上の適切な１価の置換基は、独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０−４Ｒｏ；−（ＣＨ２）０−４ＯＲｏ；−Ｏ−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；−（ＣＨ２）０−４ＣＨ（ＯＲｏ）２；−（ＣＨ２）０−４ＳＲｏ；−（ＣＨ２）０−４Ｐｈ、これはＲｏで置換されてもよい；−（ＣＨ２）０−４Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、これはＲｏで置換されてもよい；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ、これはＲｏで置換されてもよい；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒｏ）２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；−Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｓ）Ｒｏ；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ２；−Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｓ）ＮＲｏ２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；−Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；−Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ２；−Ｎ（Ｒｏ）Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；−Ｃ（Ｓ）Ｒｏ；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＳＲｏ；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲｏ３；−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）ＲＯ；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０−４ＳＲ−；ＳＣ（Ｓ）ＳＲＯ；−（ＣＨ２）０−４ＳＣ（Ｏ）ＲＯ；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＮＲｏ２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲｏ２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲｏ；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲｏ，−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）ＮＲｏ２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲｏ）Ｒｏ；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；−Ｃ（ＮＯＲｏ）Ｒｏ；−（ＣＨ２）０−４ＳＳＲｏ；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２Ｒｏ；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２ＯＲｏ；−（ＣＨ２）０−４ＯＳ（Ｏ）２Ｒｏ；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｏ２；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）Ｒｏ；−Ｎ（Ｒｏ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲｏ２；−Ｎ（Ｒｏ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｏ；−Ｎ（ＯＲｏ）Ｒｏ；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｏ２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒｏ；−Ｐ（Ｏ）Ｒｏ２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒｏ２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｏ）２；ＳｉＲｏ３；−（Ｃ１−４直鎖または分岐状アルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒｏ）２；または−（Ｃ１−４直鎖または分岐状アルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒｏ）２であり、ここで各Ｒｏは、以下に定義するように置換されてもよく、独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、５〜６員飽和、部分的に不飽和、またはアリール環、または、先の定義にもかかわらず、２個の独立したＲｏは、中間に位置する原子と一緒になって、窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する３〜１２員飽和、部分的に不飽和、またはアリール単環式または二環式リングであって、以下に定義するように置換されていてもよい環を形成する。
【００３０】
Ｒｏ（または２個の独立したＲｏがそれらの中間にある原子と一緒になって形成される環）上の適切な１価の置換基は、独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０−２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０−２ＯＨ、−（ＣＨ）０−２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＣＨ（ＯＲ●）２；−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＨ、−（ＣＨ２）０−２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０−２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＮＲ●２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１−４直鎖または分岐状アルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または−ＳＳＲ●であり、ここで、各Ｒ●は、非置換、または「ハロ」が先に記載されている場合、１個以上のハロゲンのみで置換され、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、５〜６員飽和、部分的に不飽和、またはアリール環である。Ｒｏの飽和炭素原子上の適切な二価の置換基として、＝Ｏおよび＝Ｓが挙げられる。
【００３１】
「場合によっては置換されている」基の飽和炭素原子上の適切な二価の置換基として、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｏ−、または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｓ−が挙げられ、ここで、Ｒ＊は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族（これは、以下に定義するように置換されてもよい）、または窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、非置換５〜６員飽和、部分的に不飽和またはアリール環から選択される。「場合によっては置換されている」基の隣接する置換可能な炭素に結合する適切な二価の置換基として、−Ｏ（ＣＲ＊２）２−３Ｏ−が挙げられ、ここで、Ｒ＊は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族（これは、以下に定義するように置換されてもよい）、または窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、非置換５〜６員飽和、部分的に不飽和またはアリール環から選択される。
【００３２】
Ｒ＊の脂肪族基上の適切な置換基として、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２または−ＮＯ２が挙げられ、ここで、各Ｒ●は、非置換、または「ハロ」が先に記載されている場合、１個以上のハロゲンのみで置換され、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、５〜６員飽和、部分的に不飽和、またはアリール環である。
【００３３】
「場合によっては置換されている」基の置換可能な窒素上の適切な置換基として、−Ｒｔ、−ＮＲｔ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒｔ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｔ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒｔ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｔ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｔ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲｔ２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｔ２または−Ｎ（Ｒｔ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｔが挙げられ、ここで、各Ｒｔは、独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族（これは以下に定義するように置換されてもよい）、非置換−ＯＰｈ、または窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、非置換５〜６員飽和、部分的に不飽和、またはアリール環、または、先の定義にもかかわらず、２個の独立したＲｔは、中間に位置する原子と一緒になって、窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する３〜１２員飽和、部分的に不飽和、またはアリール単環式または二環式リングであって、以下に定義するように置換されていてもよい環を形成する。
【００３４】
Ｒｔの脂肪族基上の適切な置換基は、独立して、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２または−ＮＯ２であり、ここで各Ｒ●は、非置換、または「ハロ」が先に記載されている場合、１個以上のハロゲンのみで置換され、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素またはイオウから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、５〜６員飽和、部分的に不飽和、またはアリール環である。
【００３５】
適切な保護基−  本明細書で使用される用語「適切な保護基」は、化合物内のその位置によって決まる、アミノ保護基またはヒドロキシル保護基をさし、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ中のＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，第３編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に記載されているものが挙げられる。
【００３６】
適切なアミノ保護基として、メチルカルバメート、エチルカルバメート、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Νｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトベンジルカルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンズイソオキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、フェノチアジニル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ���−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、ｔ−アミルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニルカルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリメチルベンジルカルバメート、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトフェニルアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンアミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１���イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン−３−イル）アミン、四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド，Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−フェニル（ペンタカルボニルクロミウム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミデート、ジベンジルホスホルアミデート、ジフェニルホスホルアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Νｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Νｐｙｓ）、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミドおよびフェナシルスルホンアミドが挙げられる。
【００３７】
適切な水酸基保護基として、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、グアイアコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４’’−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）ビス（４’，４’’−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルｔヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチ���シリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（メシトエート）、アルキルメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカーボネート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカーボネート、アルキルビニルカーボネートアルキルアリルカーボネート、アルキルｐ−ニトロフェニルカーボネート、アルキルベンジルカーボネート、アルキルｐ−メトキシベンジルカーボネート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルｐ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルＳ−ベンジルチオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチルカーボネート、メチルジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシノエート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ニトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、サルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート、およびトシレート（Ｔｓ）が挙げられる。１，２−または１，３−ジオールを保護するための保護基として、メチレンアセタール、エチリデンアセタール、１−ｔ−ブチルエチリデンケタール、１−フェニルエチリデンケタール、（４−メトキシフェニル）エチリデンアセタール、２，２，２−トリクロロエチリデンアセタール、アセトニド��シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、２，４−ジメトキシベンジリデンケタール、３，４−ジメトキシベンジリデンアセタール、２−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルソエステル、１−メトキシエチリデンオルソエステル、１−エトキシエチリジンオルソエステル、１，２−ジメトキシエチリデンオルソエステル、α−メトキシベンジリデンオルソエステル、１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチリデン誘導体、α−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体、２−オキサシクロペンチリデンオルソエステル、ジ−ｔ−ブチルシリレン基（ＤＴＢＳ）、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体（ＴＩＰＤＳ）、テトラ−ｔ−ブトキシジシロキサン−１，３−ジイリデン誘導体（ＴＢＤＳ）、環状カーボネート、環状ボロネート、エチルボロネートおよびフェニルボロネートが挙げられる。
【００３８】
化学的な可変要素（たとえば、Ｒ基）が、環の結合を横切った結合に付いているように示されている場合は、いかなるときも、１個以上のそのような変化し得る部分が、場合によっては、その横切った結合を有する環に結合していることを意味する。そのような環上の各Ｒ基は、任意の適切な位置に結合することができ、これは、一般的に、該基は、親環上の水素原子の代わりに結合していることを意味すると理解される。これは、２個のＲ基が、同じ環原子に結合し得る可能性を含む。さらに、複数のＲ基が環に存在する場合、それぞれのＲ基は、それに結合する他のＲ基と同じ、または異なってもよく、各基は、たとえ、同じ識別記号で表されていても、同じ分子上の他で結合してもよい他の基から、独立して定義される。
【００３９】
生体分子−  本明細書で使用される用語「生体分子」は、一般的に細胞および組織で見出される、天然のまたは人工的に作り出される（たとえば、合成法または組換え法）の分子（たとえば、ポリペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、多糖類、糖質、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド、代謝産物など）をさす。生体分子の特定のクラスとして、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、成長因子および走化因子のような細胞応答調節剤、抗体、ワクチン、ハプテン、毒物、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
薬物−  本明細書で使用される用語「薬物」は、生物学的現象を変化させる、抑制する、活性化する、または他に影響する小分子または生体分子をさす。たとえば、該薬物として、抗ＡＩＤＳ物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿病性物質、免疫抑制剤、抗ウィルス物質、酵素抑制剤、神経毒、オピオイド、睡眠薬、抗ヒスタミン、潤滑剤、トランキライザー、抗痙攣薬、筋弛緩剤および抗パーキンソン物質、チャネルブロッカー、縮瞳薬およびコリン作用抑制剤を始めとする鎮痙薬および筋肉収縮剤、抗緑内障化合物、抗寄生虫化合物および／または抗原虫化合物、細胞成長抑制剤および抗接着分子を始めとする細胞外基質相互作用の調節剤、血管拡張剤、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成の抑制剤、降圧剤、鎮痛剤、解熱剤、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管新生因子、抗分泌因子、抗凝固剤および／または抗血栓剤、局所麻酔薬、点眼剤、プロスタグランジン、抗うつ剤、抗神経病物質、制吐剤、およびイメージング剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の使用に適した、例示的な薬物のさらに完成したリストは、Ａｘｅｌ  ＫｌｅｅｍａｎｎおよびＪｕｒｇｅｎ  Ｅｎｇｅｌによる「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９９；Ｓｕｓａｎ  Ｂｕｄａｖａｒｉらにより編集された「Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６，およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ社により刊行されたｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ−２０，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ，２００１にある。
【００４１】
外因性−  本明細書で使用される「外因性」分子は、患者に投与されない限り、患者の体内には有意濃度で存在しない分子である。ある実施形態では、患者は、哺乳類、たとえば、ヒト、イヌ、ネコ、ラットなどである。その種の患者の正常血清が０．１ｍＭ未満の分子しか含まない場合、本明細書で使用される分子は、患者の体内に有意濃度で存在しない。ある実施形態では、患者の正常血清に、０．０８ｍＭ未満、０．０６ｍＭ未満、または０．０４ｍＭ未満の分子を含んでもよい。
【００４２】
多分岐−  本明細書で使用される「多分岐」構造は、少なくとも１つの分岐された分岐部（たとえば、デンドリマー構造）を含む共有結合構造である。多分岐構造は、ポリマーおよび／または非ポリマー下部構造を含んでもよい。
【００４３】
正常血清−  本明細書で使用される「正常血清」は、５人以上の非糖尿病患者からのほぼ等しい量の凝固全血の液状部をプールすることにより得られる血清である。非糖尿病のヒト患者は、採血のとき、糖尿病の症状のない１８〜３０歳の患者を無作為に選択する。
【００４４】
ポリマー−  本明細書で使用される「ポリマー」または「ポリマー構造」は、一連の共有結合されたモノマーを含む構造である。ポリマーは、１種類のモノマー、または複数の種類のモノマーから作り出すこともできる。従って、用語「ポリマー」は、異なる種類のモノマーがポリマー全体内に分離してグループ化しているブロック共重合体を始めとする共重合体を包含する。ポリマーは、直鎖でも分岐状でも可能である。
【００４５】
多糖類−  本明細書で使用される「多糖類」は、糖のポリマーである。用語「多糖類」、「炭水化物」および「オリゴ糖」は、互換的に使用してもよい。ポリマーとして、天然の糖類（たとえば、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクトロースおよびシアロース）および／または修飾糖類（たとえば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、およびヘキソース）が挙げられる。例示的な二糖類として、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コジビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノースおよびキシロビオースが挙げられる。
【００４６】
小分子−  本明細書で使用される用語「小分子」は、天然のものまたは人工的に作られた（たとえば、化学合成により）に関わらず、比較的低い分子量を有する分子をさす。通常、小分子は、単量体であり、約１５００Ｄａ未満の分子量を有する。好ましい小分子は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトにおいて、局所または全身的な効果を作り出す点で、生物学的に活性である。ある好ましい実施形態では、小分子は薬物である。薬物は、適切な政府機関や団体によって、使用に際し安全で効果的であることがすでに示されているものが好ましいが、必ずしもこれに限らない。たとえば、ＦＤＡ、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§３３０．５、３３１〜３６１および４４０〜４６０に挙げられているヒトに使用される薬物、およびＦＤＡ、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§５００〜５８９に挙げられている獣医学で使用される薬物は、全て、本発明による使用にふさわしいと考えられる。
【００４７】
治療−本明細書で使用される用語「治療」（または「治療している」、「治療された」、「治療」など）は、状態（たとえば、糖尿病）、症状または状態の症状（たとえば、高血糖症）、またはある状態に対する素因を、緩和、軽減、変更、寛解、改善または影響する目的で、本開示のインスリン複合体を、それを必要とする対象へ投与することをさす。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】例示的なインスリン複合体骨格およびリガンドの化学構造。
【図２−１】例示的なＢ２９インスリン複合体の構造。実施例で記載するように、これらの複合体は、それぞれ、組換え野生型ヒトインスリンで調製した（図３３の野生型ヒトインスリンの構造を参照）。従って、図２で示される楕円の中の記号「インスリン」は、本来、野生型ヒトインスリンを表すものである。本明細書で検討するように、本開示が特に、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を含む、これらおよび他の複合体の変種も包含することは理解される。
【図２−２】例示的なＢ２９インスリン複合体の構造。実施例で記載するように、これらの複合体は、それぞれ、組換え野生型ヒトインスリンで調製した（図３３の野生型ヒトインスリンの構造を参照）。従って、図２で示される楕円の中の記号「インスリン」は、本来、野生型ヒトインスリンを表すものである。本明細書で検討するように、本開示が特に、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を含む、これらおよび他の複合体の変種も包含することは理解される。
【図２−３】例示的なＢ２９インスリン複合体の構造。実施例で記載するように、これらの複合体は、それぞれ、組換え野生型ヒトインスリンで調製した（図３３の野生型ヒトインスリンの構造を参照）。従って、図２で示される楕円の中の記号「インスリン」は、本来、野生型ヒトインスリンを表すものである。本明細書で検討するように、本開示が特に、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を含む、これらおよび他の複合体の変種も包含することは理解される。
【図２−４】例示的なＢ２９インスリン複合体の構造。実施例で記載するように、これらの複合体は、それぞれ、組換え野生型ヒトインスリンで調製した（図３３の野生型ヒトインスリンの構造を参照）。従って、図２で示される楕円の中の記号「インスリン」は、本来、野生型ヒトインスリンを表すものである。本明細書で検討するように、本開示が特に、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を含む、これらおよび他の複合体の変種も包含することは理解される。
【図２−５】例示的なＢ２９インスリン複合体の構造。実施例で記載するように、これらの複合体は、それぞれ、組換え野生型ヒトインスリンで調製した（図３３の野生型ヒトインスリンの構造を参照）。従って、図２で示される楕円の中の記号「インスリン」は、本来、野生型ヒトインスリンを表すものである。本明細書で検討するように、本開示が特に、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を含む、これらおよび他の複合体の変種も包含することは理解される。
【図２−６】例示的なＢ２９インスリン複合体の構造。実施例で記載するように、これらの複合体は、それぞれ、組換え野生型ヒトインスリンで調製した（図３３の野生型ヒトインスリンの構造を参照）。従って、図２で示される楕円の中の記号「インスリン」は、本来、野生型ヒトインスリンを表すものである。本明細書で検討するように、本開示が特に、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を含む、これらおよび他の複合体の変種も包含することは理解される。
【図３】非糖尿病雄ＳＤラットへ、０時で複合体Ｉ−７（５Ｕ／ｋｇ）の皮下注射後の（◆）血清インスリン濃度および（○）血糖値のグラフ。データは、ｎ＝３匹のラットの平均および標準偏差を示す。
【図４】非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）へ、０時で複合体Ｉ−７の皮下注射、次いで１５分後、α−メチルマンノース（左）または生理食塩水（右）の腹腔内注射後の血清インスリン濃度および血糖値のグラフ。
【図５】非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）へ、０時で複合体Ｉ−５の皮下注射、次いで１５分後、α−メチルマンノース（左）または生理食塩水（右）の腹腔内注射後の血清インスリン濃度および血糖値のグラフ。
【図６】非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）へ、０時で複合体Ｉ−８の皮下注射、次いで１５分後、α−メチルマンノース（左）または生理食塩水（右）の腹腔内注射後の血清インスリン濃度および血糖値のグラフ。
【図７】非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）へ、０時で複合体Ｉ−９の皮下注射、次いで１５分後、α−メチルマンノース（左）または生理食塩水（右）の腹腔内注射後の血清インスリン濃度および血糖値のグラフ。
【図８】非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）へ、０時で複合体Ｉ−１０の皮下注射、次いで１５分後、α−メチルマンノース（左）または生理食塩水（右）の腹腔内注射後の血清インスリン濃度および血糖値のグラフ。
【図９】非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）へ、０時で複合体Ｉ−１１の皮下注射、次いで１５分後、α−メチルマンノース（左）または生理食塩水（右）の腹腔内注射後の血清インスリン濃度および血糖値のグラフ。
【図１０】非糖尿病雄ＳＤラット（１グループ当たりｎ＝３）への、（◆）ＲＨＩおよび（▲）複合体Ｉ−６、０．４ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に関する、時間の関数とした、血清インスリン濃度のグラフ。データ（ｎ＝３の平均）は、２分画２項分布モデルを使用して適合させる。
【図１１−１】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２０：（ａ）１×Ｐ−１×Ｚ、（ｂ）４×Ｐ−４×Ｚおよび（ｃ）１０×Ｐ−４×Ｚに記載のように調製した。
【図１１−２】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２０：（ａ）１×Ｐ−１×Ｚ、（ｂ）４×Ｐ−４×Ｚおよび（ｃ）１０×Ｐ−４×Ｚに記載のように調製した。
【図１２】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２１：（ａ）４×Ｐ−１×Ｚおよび（ｂ）４×Ｐ−２×Ｚに記載のように調製した。
【図１３】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２１：（ａ）１０×Ｐ−１×Ｚおよび（ｂ）１０×Ｐ−２×Ｚに記載のように調製した。
【図１４】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２２：（ａ）クレゾールなしおよび（ｂ）４×クレゾールに記載のように調製した。
【図１５−１】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２３：（ａ）塩なし、（ｂ）３．３×塩および（ｃ）グリセロールに記載のように調製した。
【図１５−２】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２３：（ａ）塩なし、（ｂ）３．３×塩および（ｃ）グリセロールに記載のように調製した。
【図１６−１】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２４：（ａ）１／２４、（ｂ）１／１２および（ｃ）１／６に記載のように、修飾されていないインスリンの増加量を含有して調製した。
【図１６−２】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。製剤は、実施例２４：（ａ）１／２４、（ｂ）１／１２および（ｃ）１／６に記載のように、修飾されていないインスリンの増加量を含有して調製した。
【図１７】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、実施例２５に従って調製した持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。
【図１８】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、実施例２６に従って調製した持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。物質は、２−８℃で、（ａ）１週間または（ｂ）２週間保存した後注射した。
【図１９】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、実施例２６に従って調製した持続型複合体Ｉ−６の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。物質は、室温で、（ａ）１週間または（ｂ）２週間保存した後注射した。
【図２０−１】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、実施例２７に従って調製した持続型複合体（Ｉ−８、Ｉ−１０、Ｉ−７、Ｉ−１７、Ｉ−９、Ｉ−１１）の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。
【図２０−２】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、実施例２７に従って調製した持続型複合体（Ｉ−８、Ｉ−１０、Ｉ−７、Ｉ−１７、Ｉ−９、Ｉ−１１）の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。
【図２０−３】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、実施例２７に従って調製した持続型複合体（Ｉ−８、Ｉ−１０、Ｉ−７、Ｉ−１７、Ｉ−９、Ｉ−１１）の皮下注射、次いで２４０分でグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。
【図２１】非糖尿病雄ＳＤラット（投与量当たりｎ＝３）へ、０時で、実施例２８に従って調製した複合体Ｉ−６（ａ）およびＩ−５（ｂ）の持続型製剤の皮下注射、次いで２４０分でα−メチルマンノース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血清インスリン（◆）濃度および血糖値（○）のグラフ。
【図２２−１】非糖尿（正常）および糖尿（ＤＭ）雄ＳＤラットへ、０時で、ＰＺＩ複合体Ｉ−６を皮下注射した後の血糖値のグラフ。複合体は、５、１０および２０Ｕ／ｋｇで投与した。図示するように、非糖尿病雄ＳＤラットは、いかなる低血糖症状も示さなかったが、糖尿病雄ＳＤラットにおけるグルコース濃度は、最高用量で８時間持続する、明らかな用量比例応答を示した。
【図２２−２】非糖尿（正常）および糖尿（ＤＭ）雄ＳＤラットへ、０時で、ＰＺＩ複合体Ｉ−６を皮下注射した後の血糖値のグラフ。複合体は、５、１０および２０Ｕ／ｋｇで投与した。図示するように、非糖尿病雄ＳＤラットは、いかなる低血糖症状も示さなかったが、糖尿病雄ＳＤラットにおけるグルコース濃度は、最高用量で８時間持続する、明らかな用量比例応答を示した。
【図２３】非糖尿病（正常）および糖尿病（ＤＭ）雄ＳＤラットへ、０時で、ＰＺＩ複合体Ｉ−６を皮下注射した後の２４時間にわたる血糖値のグラフ。複合体は、７、１４および２８Ｕ／ｋｇで投与した。
【図２４】グルコースまたはα−メチルマンノースとともに、あるいはなしで、複合体Ｉ−６またはＲＨＩを注射した後の時間の関数としての血清インスリン濃度のグラフ。
【図２５−１】最初の２つのパネルは、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）への、ＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）またはＩ−６（１５ｍＵ／分）の定速静脈内（ｉ．ｖ．）注入後の血清インスリン濃度（◆）および血糖値（○）のグラフを示す。グルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射は、２４０分に行った。次の３つのパネルでは、グルコース（４、２または１ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を２４０分に行った場合の、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）への、ＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）またはＩ−６（１５ｍＵ／分）の定速静脈内（ｉ．ｖ．）注入後の血清インスリン濃度（◆）およびグルコース濃度（○）を比較する。
【図２５−２】最初の２つのパネルは、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）への、ＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）またはＩ−６（１５ｍＵ／分）の定速静脈内（ｉ．ｖ．）注入後の血清インスリン濃度（◆）および血糖値（○）のグラフを示す。グルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射は、２４０分に行った。次の３つのパネルでは、グルコース（４、２または１ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を２４０分に行った場合の、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）への、ＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）またはＩ−６（１５ｍＵ／分）の定速静脈内（ｉ．ｖ．）注入後の血清インスリン濃度（◆）およびグルコース濃度（○）を比較する。
【図２５−３】最初の２つのパネルは、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）への、ＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）またはＩ−６（１５ｍＵ／分）の定速静脈内（ｉ．ｖ．）注入後の血清インスリン濃度（◆）および血糖値（○）のグラフを示す。グルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射は、２４０分に行った。次の３つのパネルでは、グルコース（４、２または１ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を２４０分に行った場合の、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）への、ＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）またはＩ−６（１５ｍＵ／分）の定速静脈内（ｉ．ｖ．）注入後の血清インスリン濃度（◆）およびグルコース濃度（○）を比較する。
【図２６】グルコースまたはα−メチルマンノースとともに、あるいはなしで、複合体の注射の後の時間の関数としての血清インスリン濃度のグラフ。ラットに、糖質溶液を、ｔ＝−６０分で静脈内注入し、試験中ずっと続けた。各複合体は、０時で１０Ｕ／ｋｇ静脈内注射し、血清複合体濃度を測定した。
【図２７−１】結晶化および顕微鏡を使用する目視観察結果のための指標緩衝溶液。
【図２７−２】結晶化および顕微鏡を使用する目視観察結果のための指標緩衝溶液。
【図２８】指標緩衝液１９を等容積の２．５ｍｇ／ｍｌの複合体の脱イオン水（左：Ｉ−６、右：Ｉ−７）溶液と混合して形成した、代表的な結晶のＳＥＭ顕微鏡写真。
【図２９】０時で、１５Ｕ／ｋｇの複合体Ｉ−６結晶分散液をｓｕｂ−Ｑ注射し（プロタミンもｍ−クレゾールもなし）、次いで、２４０分で４ｇ／ｋｇ腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）で得た、絶食させた非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝２）における、（◆）血清インスリン複合体濃度と（○）血糖値のグラフ。血清インスリン濃度は、イソインスリンＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは、平均値±１標準偏差としてプロットする。
【図３０】０時で、プロタミンおよびｍ−クレゾールを含有する１５Ｕ／ｋｇの複合体Ｉ−６結晶分散液をｓｕｂ−Ｑ注射し、次いで、２４０分で４ｇ／ｋｇ腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）で得た、絶食させた、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝２）における（◆）血清インスリン複合体濃度と（○）血糖値のグラフ。血清インスリン濃度は、イソインスリンＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは、平均値±１標準偏差としてプロットする。
【図３１】０時で、プロタミンおよびｍ−クレゾールを含有する１５Ｕ／ｋｇの複合体Ｉ−７結晶分散液をｓｕｂ−Ｑ注射し、次いで、２４０分で４ｇ／ｋｇ腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）で得た、絶食させた、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における（◆）血清インスリン複合体濃度と（○）血糖値のグラフ。血清インスリン濃度は、イソインスリンＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは、平均値±１標準偏差としてプロットする。
【図３２】０時で、１５Ｕ／ｋｇの複合体Ｉ−９結晶分散液（プロタミンおよびｍ−クレゾールを含有する１×ＰＢＳ中で熟成）をｓｕｂ−Ｑ注射し、次いで、２４０分で４ｇ／ｋｇ腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）で得た、絶食させた、非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における（◆）血清インスリン複合体濃度と（○）血糖値のグラフ。血清インスリン濃度は、イソインスリンＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは、平均値±１標準偏差としてプロットする。
【図３３】野生型ヒトインスリンの構造。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本出願は、特許および非特許文献を含む数多くの文献を引用する。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
一態様において、、該開示は、グルコースのような糖の全身濃度に応答する様式で、インスリンの薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学的（ＰＤ）プロフィールを制御する方法を提供する。本明細書で検討するように、これらの方法は、部分的に、高親和性糖リガンド（たとえば、図１内のリガンド参照）を含むある合成インスリン複合体は、ＣｏｎＡのような外因性多価糖結合分子が不在であっても、糖濃度変化に応答するＰＫ／ＰＤプロフィールを発揮するという発見に基づいている。この発見は、予期し得ぬものであり、簡便なレクチンのない、糖応答性インスリン系を生み出す、前例のない機会を提供した。
【００５１】
そのようなインスリン複合体であって、Ｉ−６として知られているものの一例を、図２に示す。複合体Ｉ−６は、２個のアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）糖部分を有する、分離した低分子量合成骨格（トリス−スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセテート、またはＴＳＡＴ−Ｃ６）を含む。骨格は、Ｂ２９ε−アミノ基（野生型ヒトインスリンは、Ｂ２９位に、リジン残基を有する）を介して、インスリンに、共有結合で複合体化している。実施例で検討するように、Ｉ−６のようなインスリン複合体は、グルコース応答性薬物動態を発揮する。その結果、Ｉ−６のようなインスリン複合体の利用能、従って、生物活性は、内在性グルコース濃度に応答して変化する。本発明者らは、プロタミンおよび亜鉛（ＰＺＩ製剤）を使用して、複合体Ｉ−６の徐放性製剤を調製し、これは、低血糖症状を誘発することなく、要求に応じて、基本的および大量瞬時のインスリン「送達」の両方を提供する。対照的に、従来のインスリンは、速効性（たとえば、ＲＨＩ）または遅効性（たとえば、ランタス）のいずれかであり、グルコース濃度の変化に応答してプロフィールを変化させることができなかった。糖尿病ラットおよび正常ラットにおいて、従来のインスリンと比べた場合、複合体Ｉ−６は、４回の治療投与量で、低血糖症状の最小リスクを伴う、実質的に改善された治療域を示す。
【００５２】
本発明者らの研究が、複合体Ｉ−６を使用したＴＳＡＴ−Ｃ６骨格は、グルコース応答性活性を必要としないことを示したことは有意なことである。実際、実施例で示すように、本発明者らは、図１および２で示されたもののような他のインスリン複合体化骨格も、同じような結果を提供できることを発見した。また、本発明者らの研究は、複合体化糖質の種類および数および、ある状況では、インスリン分子上の複合点が、インビボグルコース応答の調整においてより重要な役割を果たすことも示唆している。
【００５３】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、Ｉ−６のような複合体によって発揮されるグルコース応答性は、内在性レクチンに結合を介して行われると考えられる。従って、本発明者らは、体内のグルコース濃度が低い場合、内在性レクチンは、合成インスリン複合体による結合に応じることができる、とりわけ複合体のインスリン様活性を不活性化することができるグルコース結合部位を有すると理論付ける。逆に、体内のグルコース濃度が高い場合、レクチン上の結合部位は、内在性グルコースにより満たされ、従って、合成インスリン複合体が、その効果を循環し発揮することを可能にする。図１は、４種の糖質の相対的なレクチン結合親和力を示し、ＡＥＴＭは、示した４種の糖質の中で、最も高い親和力でレクチンに結合する。本発明者らは、特定の糖質のレクチン結合親和力は、少なくとも部分的に、本発明者らの合成インスリン複合体のインビボグルコース応答性の調整に関与していると理論付ける。
【００５４】
従来のインスリンの徐放性製剤は、通常、体循環へのインスリン放出を遅らせるために、使用されている。たとえば、ＰＺＩ（プロタミン亜鉛インスリン）製剤は、この目的のために使用され得る。従来のインスリンを、プロタミンおよび亜鉛で製剤化した場合、一般的に、結晶性徐放性製剤が製造される。対照的に、Ｉ−６のようなインスリン複合体を、類似の方法を使用して、プロタミンおよび亜鉛で製剤化した場合、無定形製剤が製造され、徐放性を得るためには、従来のインスリン、たとえば、ＲＨＩが必要とされる量より、非常に多くのプロタミンおよび亜鉛が必要とされる。驚くべきことに、本発明者らは、Ｉ−６のようなインスリン複合体は、従来のインスリンとは異なり、プロタミンまたは亜鉛のような添加剤が存在しなくても結晶化し得ることを発見した。本明細書で記載するように、次いで、これらの結晶性インスリン複合体は、製剤化され、結晶性徐放性製剤を提供することができる。インスリン複合体の結晶性製剤は、バッチからバッチへの再生産性を改善し、製剤安定性を増し、長期保存での粒子凝集を減らすという利点があり得る。
【００５５】
複合体：
一態様において、、本開示は、インスリン分子と第一糖を含むリガンドとを含む結晶性複合体を提供する。リガンドは、結晶性インスリン複合体を哺乳類に投与したとき、少なくとも１つの複合体の薬物動態または薬力学的特性が、第二糖の血清濃度に対し感受性を示すようなものである。ある実施形態では、複合体のＰＫおよび／またはＰＤ特性は、グルコースのような内在性糖の血清濃度に対して感受性を示す。ある実施形態では、複合体のＰＫおよび／またはＰＤ特性は、外因性糖、たとえば、マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはα−メチルマンノース（これらに限定されない）の血清濃度に対して感受性を示す。
【００５６】
ある実施形態では、インスリンのない複合体の分子量は、約１０，０００Ｄａ未満である。たとえば、インスリンのない複合体の分子量は、約２５０〜約５，０００Ｄａ、約４５０〜約３，５００Ｄａ、約７５０〜約２，５００Ｄａ、または約９００〜約２，０００Ｄａの範囲であってもよい。
【００５７】
ある実施形態では、インスリンを含む複合体の分子量は、約２０，０００Ｄａ未満である。たとえば、インスリンを含む複合体の分子量は、約２，０００〜約１８，０００Ｄａ、約４，０００〜約１５，０００Ｄａ、約５，０００〜約１００００Ｄａ、または約６，５００〜約８，０００Ｄａの範囲であってもよい。
【００５８】
ある実施形態では、複合体は、独特の分子量を有する（すなわち、分子量の多分散指数を有する）。
【００５９】
ＰＫおよびＰＤ特性
種々の実施形態において、結晶性インスリン複合体の薬物動態および／または薬力学的挙動は、糖の血清濃度の変動によって変更され得る。
【００６０】
たとえば、薬物動態（ＰＫ）的な見方から、糖（たとえば、グルコース）の血清濃度が増えた場合、または糖の血清濃度が閾値を横切った場合（たとえば、正常グルコース濃度を超えた場合）、血清濃度曲線は上方にシフトする。
【００６１】
ある実施形態では、絶食させかつ高血糖状態の哺乳類に投与した場合、結晶性インスリン複合体の血清濃度曲線は、実質的に異なる。本明細書で使用される用語「実質的に異なる」は、２つの曲線がスチューデントｔ検定で測定して統計的に異なる（ｐ＜０．０５）ことを意味する。本明細書で使用される用語「絶食させた状態」は、血清濃度曲線が、５個以上の絶食させた非糖尿病個体からのデータを組合わせて得られたことを意味する。ある実施形態では、絶食させた、非糖尿病個体は、採血時に糖尿病の症状がなく、採血時前１２時間は食事をしていない無作為に選択された１８〜３０歳のヒトである。本明細書で使用される用語「高血糖状態」は、血清濃度曲線が、高血糖状態（グルコースＣｍａｘが、絶食状態下で観察された平均グルコース濃度を少なくとも１００ｍｇ／ｄＬ上回る）が、複合体およびグルコースの並行投与によって誘発された、５個以上の絶食させた非糖尿病個体からのデータを組合わせることによって得られたことを意味する。複合体およびグルコースの並行投与は、グルコースＣｍａｘが、複合体が血清中に測定可能な濃度で存在する時間中に起こることを必要とするだけである。たとえば、グルコース注射（または摂取）は、複合体を投与する直前、同時または直後に行うことができる。ある実施形態では、複合体およびグルコースが、異なる経路によってまたは異なる部位に投与される。たとえば、ある実施形態では、複合体を皮下投与し、グルコースを経口または静脈内に投与する。
【００６２】
ある実施形態では、複合体の血清Ｃｍａｘは、絶食させた状態に比べて高血糖状態下のほうが高い。これに加え、または代わりに、ある実施形態では、複合体の曲線下の血清面積（ＡＵＣ）は、絶食させた状態に比べて高血糖状態下のほうが高い。種々の実施形態で、複合体の血清排出速度は、絶食させた状態に比べて高血糖状態下のほうが遅い。実施例で検討するように、本発明者らは、ある実施形態で、複合体の血清濃度曲線を、１つは短半減期および１つは長半減期の２分画２項分布モデルを使用して、適合させることができることを発見した。長半減期は、特に、グルコース濃度に対して感受性を示すようである。従って、ある実施形態では、長半減期は、絶食させた状態と比べて高血糖状態下がより長い。ある実施形態では、絶食させた状態として、１００ｍｇ／ｄＬ未満（たとえば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。ある実施形態では、高血糖状態として、２００ｍｇ／ｄＬを超える（たとえば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。平均血清残存時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）などのような他のＰＫパラメータも先に記載したパラメータの代わりに、あるいはそれと組合わせて使用できることは理解されることである。
【００６３】
ヒト、イヌ、ネコおよびラットにおけるグルコース濃度の正常範囲は、６０〜２００ｍｇ／ｄＬである。当業者であれば、異なる正常範囲を有する種に関する以下の値を推定することができる（たとえば、小型ブタのグルコース濃度の正常範囲は、４０〜１５０ｍｇ／ｄｌである）。６０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース濃度は、低血糖と考えられる。２００ｍｇ／ｄＬを超えるグルコース濃度は、高血糖と考えられる。ある実施形態では、複合体のＰＫ特性を、グルコースクランプ法を使用して試験してもよく、５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および３００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬなどのグルコース濃度で投与した場合、複合体の血清濃度曲線は、実質的に異なり得る。これに加えてまたは代わりに、血清Ｔｍａｘ、血清Ｃｍａｘ、平均血清残存時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期は、２種類のグルコース濃度で、実質的に異なり得る。以下で検討するように、ある実施形態では、１００ｍｇ／ｄＬおよび３００ｍｇ／ｄＬを、グルコース濃度の比較に使用してもよい。しかし、本開示が以下の組：５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬなど（これらに限定されない）の任意の１つを含む、比較用グルコース濃度の代替の組に関するこれらの実施形態のそれぞれを包含することは理解される。
【００６４】
従って、ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、複合体のＣｍａｘはより高い。ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、複合体のＣｍａｘは、少なくとも５０％（たとえば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）高い。
【００６５】
ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、複合体のＡＵＣはより高い。ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、複合体のＡＵＣは、少なくとも５０％（たとえば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）高い。
【００６６】
ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、複合体の血清排出速度はより遅い。ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、１００対３００ｍｇ／ｄＬグルコース）の低い濃度で哺乳類に投与した場合、複合体の血清排出速度は、少なくとも２５％（たとえば、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも４００％）速い。
【００６７】
実施例で検討するように、本発明者らは、ある実施形態で、複合体の血清濃度曲線を、１つは短半減期および１つは長半減期の２分画２項分布モデルを使用して、適合させることができることを発見した。長半減期は、特に、グルコース濃度に対して感受性を示すようである。従って、ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、長半減期はより長くなる。ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、長半減期は、少なくとも５０％（たとえば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）長い。
【００６８】
ある実施形態では、高血糖状態下の哺乳類に投与した場合、複合体の血清濃度曲線は、インスリンを複合体化されていない変種の血清濃度曲線と実質的に同じである。本明細書で使用される用語「実質的に同じ」は、スチューデントｔ検定によって測定して、２つの曲線の間に統計的差異がない（ｐ＞０．０５）ことを意味する。ある実施形態では、絶食させた状態下で投与した場合、複合体の血清濃度曲線は、インスリンの複合体化されていない変種の血清濃度曲線と実質的に異なる。ある実施形態では、高血糖状態下で投与した場合、複合体の血清濃度曲線は、インスリンの複合体化されていない変種の血清濃度曲線と実質的に同じであり、絶食させた状態下で投与した場合、実質的に異なる。ある実施形態では、高血糖状態として、２００ｍｇ／ｄＬを超える（たとえば３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬなど）グルコースＣｍａｘを含む。ある実施形態では、絶食させた状態として、１００ｍｇ／ｄＬ未満（たとえば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。血清Ｔｍａｘ、血清Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、平均血清残存時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期のような先に記載したＰＫパラメータの任意のものを比較することもできることは理解されることである。
【００６９】
薬力学的（ＰＤ）的な見方から、グルコース濃度が増加する、またはグルコース濃度が閾値を横切る、すなわち正常グルコース濃度より高い場合、複合体の生物活性は増加し得る。ある実施形態では、複合体の生物活性は、高血糖状態と比べた場合、絶食させた状態下で投与した場合がより低い。ある実施形態では、絶食させた状態として、１００ｍｇ／ｄＬ未満（たとえば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。ある実施形態では、高血糖状態は、２００ｍｇ／ｄＬを超える（たとえば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。
【００７０】
ある実施形態では、複合体のＰＤ特性は、定常グルコース濃度を維持するのに必要なグルコース注入速度（ＧＩＲ）を測定することにより、試験してもよい。そのような実施形態によれば、５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および３００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬなどのグルコース濃度で投与した場合、複合体の生物活性は実質的に異なり得る。従って、ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、複合体の生物活性はより高い。ある実施形態では、２種類のグルコース濃度（たとえば、３００対１００ｍｇ／ｄＬグルコース）の高い濃度で哺乳類に投与した場合、複合体の生物活性は、少なくとも２５％（たとえば、少なくとも５０％または少なくとも１００％）高い。
【００７１】
ある実施形態では、最小血糖濃度に到達する時間（Ｔｎａｄｉｒ）、血糖値が初期値のある割合未満を保つ持続時間（たとえば、初期値の７０％、Ｔ７０％ＢＧＬ）などを比べることによってインスリンのＰＤ挙動を観察することができる。
【００７２】
一般的に、この項で検討されている任意のＰＫおよびＰＤ特徴は、種々の公開されている薬物動態および薬力学的方法（たとえば、皮下送達の適切な方法に関して、Ｂａｕｄｙｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３，１９９８参照）の任意の方法に従って測定できることは理解されることである。また、ＰＫおよび／またはＰＤ特性は、任意の哺乳類（たとえば、ヒト、ラット、ネコ、小型ブタ、イヌなど）において測定してもよいことも理解される。ある実施形態では、ＰＫおよび／またはＰＤ特性は、ヒトで測定される。ある実施形態では、ＰＫおよび／またはＰＤ特性は、ラットで測定される。ある実施形態では、ＰＫおよび／またはＰＤ特性は、小型ブタで測定される。ある実施形態では、ＰＫおよび／またはＰＤ特性は、イヌで測定される。
【００７３】
以上は、グルコース−応答性複合体との関連で記載したが、同じ特性およびアッセイが、外因性糖、たとえば、マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、α−メチルマンノースなどを始めとする他の糖に対して応答性のある複合体にも適用されることも理解されることである。以下の実施例でより詳しく検討するように、絶食させ、高血糖条件下でＰＫおよび／またはＰＤ特性を比較する代わりに、ＰＫおよび／またはＰＤ特性を、外因性糖を投与した、または投与しない絶食させた条件下で比較してもよい。複合体は、投与された外因性糖の異なるＣｍａｘ値に応答するよう設計することができることは理解される。
【００７４】
リガンド
一般的に、提供される結晶性インスリン複合体は、少なくとも１個のリガンドを含む。ある実施形態では、複合体は、単一のリガンドを含む。ある実施形態では、複合体は、少なくとも２個の分離リガンド、たとえば、２、３、４、５個またはそれ以上のリガンドを含む。複数のリガンドが存在する場合、該リガンドは、同じまたは異なる化学構造を有してもよい。
【００７５】
ある実施形態では、リガンドは、内在性糖結合分子（たとえば、界面活性タンパク質ＡおよびＤ、またはセレクチンファミリーのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない）に結合する糖（たとえば、グルコースまたはマンノース）と競合することができる。ある実施形態では、リガンドは、細胞表面糖質受容体（たとえば、マクロファージマンノース受容体、グルコーストランスポータリガンド、内皮細胞糖質受容体、または肝細胞糖質受容体が挙げられるが、これらに限定されない）に結合する糖（たとえば、グルコースまたはマンノース）と競合することができる。ある実施形態では、リガンドは、内在性グルコース−結合分子（たとえば、界面活性タンパク質ＡおよびＤ、またはセレクチンファミリーのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない）に結合するグルコースと競合することができる。ある実施形態では、リガンドは、非ヒトレクチン（たとえば、ＣｏｎＡ）に結合する糖と競合することができる。ある実施形態では、リガンドは、非ヒトレクチン（たとえば、ＣｏｎＡ）に結合するグルコースまたはマンノースと競合することができる。例示的なグルコース結合レクチンとして、カルネキシン、カルレティキュリン、Ｎ−アセチルグルコサミン受容体、セレクチン、アシアロ糖タンパク質受容体、コレクチン（マンノース結合レクチン）、マンノース受容体、アグリカン、バーシカン、ピスム・サティブム凝集素（ＰＳＡ）、ソラマメ・レクチン、レンズマメ・レクチン、ダイズ・レクチン、ピーナツ・レクチン、レンリソウ・レクチン、イガマメ・レクチン、ソフォラ・ジャポニカ・レクチン、ボーリンギア・ミルブラエディ（ｂｏｗｒｉｎｇｉａ  ｍｉｌｂｒａｅｄｉｉ）レクチン、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）およびポークウィード・マイトジェンが挙げられる。
【００７６】
ある実施形態では、リガンドは、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）のリガンドである。
【化１】
2012516342.tif 000003
【００７７】
（式中、
各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚまたは−ＣＨ２Ｒｘであり、
各Ｒｘは、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙまたは−Ｏ−Ｙであり、
各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２であり、
各Ｙは、独立して、単糖、二糖または三糖であり、
各Ｇは、独立して、共有結合、または場合によっては置換されたＣ１−９アルキレンであって、ここで、Ｇの１個以上のメチレン単位は、場合によっては、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−で置き換えられ、
各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２または−ＯＳＯ２Ｒ２であり、
各Ｒ２は、独立して、水素、またはＣ１−６脂肪族、フェニル、窒素、酸素またはイオウから選択された１〜２個のヘテロ原子を有する４〜７員複素環リング、または窒素、酸素またはイオウから選択された１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロアリール環から選択される、場合によっては置換された基である。）
ある実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）のリガンドは、単糖である。ある実施形態では、該リガンドは二糖である。ある実施形態では、該リガンドは三糖である。ある実施形態では、該リガンドは四糖である。ある実施形態では、該リガンドは、合計４個以下の単糖部分を含む。
【００７８】
先に一般的に定義したように、各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚまたは−ＣＨ２ＲＸである。ある実施形態では、Ｒ１は水素である。ある実施形態では、Ｒ１は−ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある実施形態では、Ｒ１は−Ｏ−Ｙである。ある他の実施形態では、Ｒ１は−Ｇ−Ｚである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２−Ｏ−Ｙである。さらに他の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨ２である。当業者であれば、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）における各Ｒ１置換基は、（Ｒ）または（Ｓ）立体化学であり得ることは理解する。
【００７９】
先に一般的に定義したように、各Ｒｘは、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙまたは−Ｏ−Ｙである。いくつかの実施形態では、Ｒｘは水素である。ある実施形態では、Ｒｘは−ＯＨである。他の実施形態では、Ｒｘは−Ｏ−Ｙである。
【００８０】
先に一般的に定義したように、各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。いくつかの実施形態では、Ｒｙは、水素である。他の実施形態では、Ｒｙは−Ｒ２である。いくつかの実施形態では、Ｒｙは−Ｃ（Ｏ）Ｒ２である。ある実施形態では、Ｒｙはアセチルである。他の実施形態では、Ｒｙは−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−ＣＯ２Ｒ２または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。
【００８１】
先に一般的に定義したように、Ｙは、単糖、二糖または三糖である。ある実施形態では、Ｙは単糖である。いくつかの実施形態では、Ｙは二糖である。他の実施形態では、Ｙは三糖である。いくつかの実施形態では、Ｙは、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノースまたはキシロピラノースである。いくつかの実施形態では、Ｙは、スクロース、マルトース、ツラノース、トレハロース、セロビオースまたはラクトースである。ある実施形態では、Ｙはマンノースである。ある実施形態では、ＹはＤ−マンノースである。当業者は、糖Ｙは、アノマー炭素を介して−Ｏ−Ｙ酸素基に結合し、グルコシド結合を形成することを理解する。グルコシド結合は、α配置でもβ配置でもよい。
【００８２】
先に一般的に定義したように、各Ｇは、独立して、共有結合、または場合によっては置換されているＣ１−９アルキレンであり、ここで、Ｇの１個以上のメチレン単位は、場合によっては、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−で置き換える。いくつかの実施形態では、Ｇは、共有結合である。ある実施形態では、Ｇは−Ｏ−Ｃ１−８アルキレンである。ある実施形態では、Ｇは−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
【００８３】
先に一般的に定義したように、各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２または−ＯＳＯ２Ｒ２である。いくつかの実施形態では、Ｚは、ハロゲンまたは−ＯＳＯ２Ｒ２である。他の実施形態では、Ｚは−Ｎ３または−Ｃ≡ＣＲ２である。ある実施形態では、Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２または−ＳＲ２である。ある実施形態では、Ｚは−ＳＨである。ある実施形態では、Ｚは−ＮＨ２である。ある実施形態では、−Ｇ−Ｚは−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、式（ＩＶａ）のＣ１炭素上のＲ１置換基は、−Ｇ−Ｚであり、式（ＩＶａ−ｉ）：
【化２】
2012516342.tif 000004
【００８５】
（式中、Ｒ１、ＧおよびＺは、本明細書で定義し、記載した通りである）の化合物を与える。
【００８６】
いくつかの実施形態では、リガンドは、式（ＩＶａ−ｉｉ）：
【化３】
2012516342.tif 000005
【００８７】
（式中、Ｒ１、Ｒｘ、ＧおよびＺは、本明細書で定義し、記載した通りである）のリガンドである。
【００８８】
ある実施形態では、リガンドは、グルコースと同じ化学構造を有してもよいし、またはグルコースの化学的近縁種であってもよい。種々の実施形態では、リガンドは、たとえば、複合体のグルコース応答を微調整するために、グルコースとは異なる化学構造を有するのが有利な場合もある。たとえば、ある実施形態では、グルコース、マンノース、Ｌ−フコースまたはこれらの誘導体（たとえば、α−Ｌ−フコピラノシド、マンノサミン、β架橋Ｎ−アセチルマンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノース、プロピルグルコース、プロピルマンノースなど）および／またはこれら高次組合せ（たとえば、ビマンノース、直鎖および／または分岐状トリマンノースなど）を含有するリガンドを使用してもよい。
【００８９】
ある実施形態では、リガンドは、単糖を含む。ある実施形態では、リガンドは二糖を含む。ある実施形態では、リガンドは、三糖を含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、糖と、１個以上のアミン基とを含む。ある実施形態では、糖およびアミン基は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、たとえば、Ｃ１−Ｃ３アルキル基で分離されている。いくつかの実施形態では、リガンドは、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。いくつかの実施形態では、リガンドは、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。いくつかの実施形態では、リガンドは、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。いくつかの実施形態では、リガンドは、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。いくつかの実施形態では、リガンドは、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。いくつかの実施形態では、リガンドは、アミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。ある実施形態では、糖リガンドは、「Ｄ」配置のものである。他の実施形態では、糖リガンドは、「Ｌ」配置のものである。以下に、本発明者らはこれらの例示的なリガンドの構造を示す。当業者は、他の例示的なリガンドも、認識する。
【化４】
2012516342.tif 000006
【００９０】
一般的に、リガンドは、インスリン分子に直接または間接的に（すなわち、リンカーまたは骨格を介して）複合体化してもよい。以下により詳しく検討するように、リガンドは、複合体骨格内に自然に（たとえば、ポリマー骨格の一部として、またはモノマーの側鎖として）存在してもよい。あるいは（またはこれに加えて）、リガンドは、複合体骨格に人工的に導入（たとえば、複合体骨格に合成的に付加された化学基の形態で）されてもよい。ある実施形態では、複合体は、５個以上、１０個以上、または２０個以上のリガンドを含む骨格を含んでもよい。ある実施形態では、複合体は、１、２、３、４または５個のような少ない数の分離リガンドを含んでもよい。
【００９１】
ある実施形態では、少なくとも２個の分離リガンドが、異なる複合点を介して、インスリン分子に複合体化している。ある実施形態では、少なくとも２個の分離リガンドが、これもインスリン分子に複合体化している単一の複合体骨格に複合体化している。いくつかの実施形態では、ＡＥＴＭ、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＧＡまたはＡＥＦのようなリガンドの少なくとも１個が、１個のインスリン分子に複合体化している。ある実施形態では、少なくとも１個のＡＥＴＭリガンドが、１個のインスリン分子に複合体化している。いくつかの実施形態では、ＡＥＴＭ、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＧＡまたはＡＥＦのようなリガンドの少なくとも２個が、１個の複合点または複数の複合点のいずれかを介して、１個のインスリン分子に複合体化している。ある実施形態では、少なくとも２個のリガンドは、同じリガンドではない。ある実施形態では、少なくとも２個のリガンドは、同じリガンドである。ある実施形態では、少なくとも２個のＡＥＴＭリガンドが、１個の複合点または複数の複合点のいずれかを介して、１個のインスリン分子に複合体化している。
【００９２】
ある実施形態では、１個以上のリガンド内の糖が、Ｃ１、Ｃ２またはＣ６位を介して、（直接またはリンカーによって間接的に）複合体化している。ある実施形態では、複合体化は、Ｃ１位が関与する。糖のＣ１位は、アノマー炭素とも称され、αまたはβ配置で、インスリン分子または複合体骨格に結合することがある。ある実施形態では、Ｃ１位は、αアノマーとして構成される。他の実施形態では、Ｃ１位は、βアノマーとして構成される。
【００９３】
インスリン
本明細書で使用される用語「インスリン」または「インスリン分子」は、インスリン分子の全ての塩の形態および非塩の形態を包含する。塩形態は、インスリン分子により、アニオン性でもカチオン性でもよいことは理解される。「インスリン」または「インスリン分子」は、生物活性（すなわち、インビボで投与された場合、グルコースの検出可能な還元を起こすことができる）である限り、インスリンの野生型も修飾型も両方包含すると本発明者らは意図する。野生型インスリンとして、精製、合成または組換えの形態を問わず、いかなる種からのインスリン（たとえば、ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）が挙げられる。これらの数多くが、たとえば、シグマ・アルドリッチ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、市販されている。インスリンの種々の修飾型が当分野で公知である（たとえば、ＣｒｏｔｔｙおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｍｅｒｇ．Ｃａｒｅ．２３：９０３−９０５，２００７およびＧｅｒｉｃｈ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１１３：３０８−１６，２００２およびそこに列挙されている参考文献参照）。インスリンの修飾型は、化学的に修飾（たとえば、以下に記載するように、ＰＥＧ基または脂肪族アシル鎖のような化学的部分の付加によって）してもよく、および／または突然変異を（すなわち、１個以上のアミノ酸の添加、欠失または置換によって）起こさせてもよい。
【００９４】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、１−１０個の（たとえば、１−９、１−８、１−７、１−６、１−５、１−４、１−３、１−２、２−９、２−８、２−７、２−６、２−５、２−４、２−３、３−９、３−８、３−７、３−６、３−５、３−４、４−９、４−８、４−７、４−６、４−５、５−９、５−８、５−７、５−６、６−９、６−８、６−７、７−９、７−８、８−９、９、８、７、６、５、４、３、２または１）アミノ酸置換、添加および／または欠失の点で、野生型インスリンと異なる。ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、アミノ酸置換のみの点で、野生型インスリンと異なる。ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、アミノ酸添加のみの点で、野生型インスリンと異なる。ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、アミノ酸置換および添加の点で、野生型インスリンと異なる。ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、アミノ酸置換と欠失との点で、野生型インスリンと異なる。
【００９５】
ある実施形態では、アミノ酸置換を、関与する残基の極性、荷電性、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性特性における類似性に基づいて行ってもよい。ある実施形態では、置換は保存的であってもよく、すなわち、１つのアミノ酸が、それと類似した形および電荷を持つものと置き換えられてもよい。保存的置換は、当分野で周知であり、通常、以下の群、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびチロシン、フェニルアラニン内での置換が挙げられる。ある実施形態では、適切な置換変異の選択において、アミノ酸の疎水性指数を考慮してもよい。ポリペプチドにおける相互作用的生物学的機能の付与における疎水性アミノ酸指数の重要性は、当分野で一般的に理解されている。あるいは、アミノ酸と同じ置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができる。ポリペプチドにおける相互作用的生物学的機能の付与における親水性の重要性は、当分野で一般的に理解されている。ポリペプチドの設計における疎水性指数または親水性の使用については、米国特許第５，６９１，１９８号で、さらに検討されている。
【００９６】
ヒトインスリンの野生型配列（Ａ鎖およびＢ鎖）を、以下および図３３に示す。
【００９７】
Ａ鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
Ｂ鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
ヒトインスリンは、ウサギ、ブタ、ウシおよびヒツジのインスリンと、アミノ酸Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＢ３０においてのみ異なる（以下の表を参照）。
【表１】
2012516342.tif 000007
【００９８】
種々の実施形態で、本開示のインスリン分子は、Ｂ−ペプチド配列のＢ２８および／またはＢ２９位で変異を起こす。たとえば、インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は、Ｂ−ペプチドのＣ末端上の最後から２番目のリシンと、プロリン残基とが逆転した速効性インスリン変異体（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン）である。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。インスリンアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））は、Ｂ２８位のプロリンがアスパラギン酸で置換された他の速効性インスリン変異体（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン）である。この変異体も、多量体の形成を阻止する。いくつかの実施形態では、Ｂ２８および／またはＢ２９位での変異は、インスリンポリペプチドの別の部分での１個以上の変異によって達成される。たとえば、インスリングルリシン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））は、Ｂ３位のアスパラギン酸がリシン残基で置き換えられ、Ｂ２９位のリシンがグルタミン酸残基で置き換えられた別の速効性インスリン変異体（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン）でもある。
【００９９】
種々の実施形態で、本開示のインスリン分子は、ヒトインスリンに対してシフトする等電点を有する。いくつかの実施形態では、等電点のシフトは、１個以上のアルギニン残基を、インスリンＡ−ペプチドのＮ末端および／またはインスリンＢ−ペプチドのＣ末端に付加することによって達成される。そのようなインスリンポリペプチドの例として、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンおよびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンが挙げられる。さらなる例として、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、ＡｓｐＡ２１がグリシンで置き換えられ、２個のアルギニン残基がＢ−ペプチドのＣ末端に付加された例示的な持続型インスリン変異体である。これらの変化の効果は、等電点をシフトさせることであり、ｐＨ４で完全に溶解する溶液を作り出す。従って、いくつかの実施形態では、本開示のインスリン分子は、Ａ２１がＧｌｙであるＡ−ペプチド配列と、Ｂ３１がＡｒｇ−ＡｒｇであるＢ−ペプチド配列とを含む。本開示は、これらの変異および本明細書で記載される他のいかなる変異（たとえば、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）の単独および複数の組合せ全てを包含することは理解されるべきである。
【０１００】
種々の実施形態で、本開示のインスリン分子は、トランケートされる。たとえば、ある実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのＢ−ペプチド配列は、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９および／またはＢ３０が欠けている。ある実施形態では、残基の組合せが、本開示のインスリンポリペプチドのＢ−ペプチド配列から欠けている。たとえば、Ｂ−ペプチド配列は、残基Ｂ（１−２）、Ｂ（１−３）、Ｂ（２９−３０）、Ｂ（２８−３０）、Ｂ（２７−３０）および／またはＢ（２６−３０）を欠いてもよい。いくつかの実施形態では、これらの欠失および／またはトランケーションは、先に記載したいずれのインスリン分子（たとえば、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンリスプロ、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンアスパルト、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングルリシン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングラルギンなど（これらに限定されない）を製造するために）にも適用される。
【０１０１】
いくつかの実施形態で、インスリン分子は、ＡまたはＢ−ペプチド配列のＮまたはＣ末端に追加のアミノ酸残基を含有する。いくつかの実施形態では、１個以上のアミノ酸残基が、Ａ０、Ａ２１、Ｂ０および／またはＢ３１位に位置する。いくつかの実施形態では、１個以上のアミノ酸残基がＡ０位に位置する。いくつかの実施形態では、１個以上のアミノ酸残基がＡ２１位に位置する。いくつかの実施形態では、１個以上のアミノ酸残基がＢ０位に位置する。いくつかの実施形態では、１個以上のアミノ酸残基がＢ３１位に位置する。ある実施形態では、インスリン分子は、Ａ０、Ａ２１、Ｂ０またはＢ３１位にはいかなる追加のアミノ酸残基も含まない。
【０１０２】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子を、１個以上のアミド化アミノ酸を酸性型で置き換えるように変異させる。たとえば、アスパラギンを、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えてもよい。同様に、グルタミンをアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えてもよい。特に、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１またはＡｓｎＢ３、またはこれらの残基の任意の組合せを、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えてもよい。ＧｌｎＡ１５またはＧｌｎＢ４、または両方を、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えてもよい。ある実施形態では、インスリン分子は、Ａ２１位でアスパラギン酸を、またはＢ３位でアスパラギン酸を有し、またはその両方でアスパラギン酸を有する。
【０１０３】
当業者であれば、生物学的活性を保ちつつ、インスリン分子内の他のアミノ酸も変異することが可能であることを認識する。たとえば、以下の修飾も、限定されることなく当分野で広く認められている。Ｂ１０位のヒスチジン残基のアスパラギン酸による置換え（ＨｉｓＢ１０→ＡｓｐＢ１０）、Ｂ１位のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸による置換え（ＰｈｅＢ１→ＡｓｐＢ１）、Ｂ３０位のスレオニン残基のアラニンによるによる置換え（ＴｈｒＢ３０→ＡｌａＢ３０）、Ｂ２６位のチロシン残基のアラニンによる置換え（ＴｙｒＢ２６→ＡｌａＢ２６）、およびＢ９位のセリン残基のアスパラギン酸による置換え（ＳｅｒＢ９→ＡｓｐＢ９）。
【０１０４】
種々の実施形態で、本開示のインスリン分子は、作用の遅延性プロフィールを有する。従って、ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、脂肪酸でアシル化されてもよい。すなわち、インスリン分子上のアミノ基と脂肪酸のカルボン酸基との間にアミド結合が形成されている。アミノ基は、インスリン分子のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基でもよいし、またはインスリン分子のリシン残基のε−アミノ基でもよい。本開示のインスリン分子は、野生型インスリンに存在する３個のアミノ基の１個以上のアミノ基で、アシル化されてもよいし、または野生型配列に導入されているリシン残基でアシル化されてもよい。ある実施形態では、インスリン分子は、Ｂ１位でアシル化されてもよい。ある実施形態では、インスリン分子は、Ｂ２９位でアシル化されてもよい。ある実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。たとえば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失され、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合されている持続型インスリン変異体である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、Ａ−ペプチドのＮ末端、Ｂ−ペプチドのＮ末端、Ｂ２９位のＬｙｓのε−アミノ基、または本開示のインスリン分子中の任意の他の可能なアミノ基は、一般式：
【化５】
2012516342.tif 000008
【０１０６】
（式中、ＲＦは、水素またはＣ１−３０アルキル基である）の脂肪酸部分に共有結合で結合している。いくつかの実施形態では、ＲＦは、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−１９アルキル基、Ｃ５−１８アルキル基、Ｃ６−１７アルキル基、Ｃ８−１６アルキル基、Ｃ１０−１５アルキル基またはＣ１２−１４アルキル基である。ある実施形態では、インスリンポリペプチドは、Ａ１位で前記部分に複合体化する。ある実施形態では、インスリンポリペプチドは、Ｂ１位で前記部分に複合体化する。ある実施形態では、インスリンポリペプチドは、Ｂ２９位のＬｙｓのε−アミノ基で前記部分に複合体化する。ある実施形態では、インスリン分子のＢ２８位はＬｙｓであり、ＬｙｓＢ２８のε−アミノ基が脂肪酸部分に複合体化する。ある実施形態では、インスリン分子のＢ３位はＬｙｓであり、ＬｙｓＢ３のε−アミノ基が脂肪酸部分に複合体化する。いくつかの実施形態では、脂肪酸鎖は、炭素数８〜２０の長さである。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、オクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）、またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。ある実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）またはアラキドン酸（Ｃ２０）である。たとえば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失し、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合する持続型インスリン変異体である。
【０１０７】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリンアスパルト）、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリングルリシン）、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリングラルギン）、ＮεＢ２９−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリンデテミル）、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２７）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１−Ｂ３）−ヒトインスリン。
【０１０８】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１０９】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ヒトインスリン。
【０１１０】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１１１】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリンポリペプチドの１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ａｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１１２】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１１３】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−トリデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン。
【０１１４】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン。
【０１１５】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。
【０１１６】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３●−ヒトインスリン。
【０１１７】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１１８】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１１９】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１２０】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１２１】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン。
【０１２２】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン。
【０１２３】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン。
【０１２４】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン。
【０１２５】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン。
【０１２６】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン。
【０１２７】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン。
【０１２８】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン。
【０１２９】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン。
【０１３０】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡｌ−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン。
【０１３１】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１３２】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１３３】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１３４】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１３５】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１３６】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡｌ−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１３７】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１３８】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１３９】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４０】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４１】
ある実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む。ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ｄｅｓ（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン。
【０１４２】
また、本開示は、先に記載した変異および／または化学修飾のいずれか１つを含む、非ヒトインスリン（たとえば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）の修飾型も包含する。
【０１４３】
これらおよび他の修飾インスリン分子については、米国特許第６，９０６，０２８号、第６，５５１，９９２号、第６，４６５，４２６号、第６，４４４，６４１号、第６，３３５，３１６号、第６，２６８，３３５号、第６，０５１，５５１号、第６，０３４，０５４号、第５，９５２，２９７号、第５，９２２，６７５号、第５，７４７，６４２号、第５，６９３，６０９号、第５，６５０，４８６号、第５，５４７，９２９号、第５，５０４，１８８号、第５，４７４，９７８号、第５，４６１，０３１号、および第４，４２１，６８５号、ならびに米国特許第７，３８７，９９６号、第６，８６９，９３０号、第６，１７４，８５６号、第６，０１１，００７号、第５，８６６，５３８および第５，７５０，４９７号に詳細に記載されている。これらの開示の全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
種々の実施形態で、本開示のインスリン分子は、３つの野生型ジスルフィド架橋（すなわち、１つはＡ鎖の７位とＢ鎖の７位との間にあり、２番目はＡ鎖の２０位とＢ鎖の１９位との間にあり、３番目はＡ鎖の６位と１１位との間にある）を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、インスリン分子は、インスリン受容体に対する親和力を減らすように、修飾および／または変異される。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、修飾（たとえば、アシル化）または変異によるインスリン分子の受容体親和力の減衰は、インスリン分子が血清から排除される速度を落とし得ると考えられる。いくつかの実施形態では、インビトロでのインスリン受容体親和力減少により、インスリン複合体のインビボ活性が優れた結果となる。ある実施形態では、インスリン分子を変異部位を複合点として使用し、変異部位での複合が、インスリン受容体（たとえば、ＬｙｓＡ３）への結合を減らすように変異させる。ある他の実施形態では、野生型アミノ酸が存在するところまたは末端での複合により、インスリン受容体（たとえば、ＧｌｙＡ１）への結合が減る。いくつかの実施形態では、インスリン分子は、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９またはＢ３０位で複合体化する。ある実施形態では、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９またはＢ３０位での複合は、野生型アミノ酸側鎖（たとえば、ＧｌｕＡ４）により行われる。ある他の実施形態では、インスリン分子は、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９またはＢ３０位で変異を起こし、複合のための部位（たとえば、ＬｙｓＡ４、ＬｙｓＡ５、ＬｙｓＡ８、ＬｙｓＡ９またはＬｙｓＢ３０）を提供する。
【０１４６】
インスリン分子を複合体化する方法を、以下に記載する。ある実施形態では、インスリン分子は、Ａ１アミノ酸残基を介して、リガンドまたは複合体骨格に複合体化される。ある実施形態では、Ａ１アミノ酸残基はグリシンである。しかし、本開示は、Ｎ末端複合に限定されず、ある実施形態では、インスリン分子は、末端ではないＡ鎖アミノ酸残基を介して複合体化されてもよいことは理解される。特に、本開示は、Ａ鎖（野生型または部位特異的変異によって導入された）の任意の位置に存在するリシン残基のε−アミン基を介する複合を包含する。Ａ鎖上の異なる複合位置は、インスリン活性の異なる減少を起こし得る。特に、本開示は、Ｂ鎖（野生型または部位特異的変異により導入された）の任意の位置に存在するリシン残基のε−アミン基を介する複合を包含する。たとえば、ある実施形態では、インスリン分子はＢ２９リシン残基を介して複合体化されてもよい。
【０１４７】
例示的なインスリン複合体
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）およびアミノエチルフコース（ＡＥＦ）からなる群から独立して選択される１種以上のリガンドに複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、インスリン分子は、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して複合体化する。
【０１４８】
ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、１個以上のアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）リガンドに複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、１個以上のアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）リガンドに複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、１個以上のアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）リガンドに複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、１個以上のアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）リガンドに複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、１個以上のβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）リガンドに複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、１個以上のアミノエチルフコース（ＡＥＦ）リガンドに複合体化するインスリン分子を含む。
【０１４９】
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、２個以上の異なるリガンドに複合体化するインスリン分子を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、２個の異なるリガンドに複合体化するインスリン分子を含む。他の実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、３個の異なるリガンドに複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、そのような結晶性インスリン複合体の２個以上の異なるリガンドは、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。ある実施形態では、そのような結晶性インスリン複合体の２個以上の異なるリガンドは、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。ある実施形態では、そのような結晶性インスリン複合体の２個以上の異なるリガンドは、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。ある実施形態では、そのような結晶性インスリン複合体の２個以上の異なるリガンドは、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。ある実施形態では、そのような結晶性インスリン複合体の２個以上の異なるリガンドは、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。ある実施形態では、そのような結晶性インスリン複合体の２個以上の異なるリガンドは、アミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。
【０１５０】
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、これもインスリン分子に複合体化する単一複合体骨格に複合体化する２個以上の異なるリガンドを含む。いくつかの実施形態では、そのような結晶性インスリン複合体の２個以上の異なるリガンドおよびインスリン分子は、それぞれ、単一分岐複合体骨格の異なる分岐部上に位置する。いくつかの実施形態では、そのような結晶性インスリン複合体の２個以上の異なるリガンドおよびインスリン分子は、それぞれ、単一分岐複合体骨格の異なる分岐部の末端に位置する。
【０１５１】
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）に複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）に複合体化するインスリン分子を含む。
【０１５２】
種々の実施形態で，本開示の結晶性インスリン複合体は、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）に複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）に複合体化するインスリン分子を含む。
【０１５３】
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）に複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）に複合体化するインスリン分子を含む。
【０１５４】
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）に複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）に複合体化するインスリン分子を含む。
【０１５５】
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）に複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）に複合体化するインスリン分子を含む。
【０１５６】
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、アミノエチルフコース（ＡＥＦ）に複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して、アミノエチルフコース（ＡＥＦ）に複合体化するインスリン分子を含む。
【０１５７】
複合体骨格
この項では、いくつかの例示的な複合体骨格を記載する。種々の実施形態で、本開示の複合体は、一般式（Ｉ）：
【化６】
2012516342.tif 000009
【０１５８】
を有し得る。
【０１５９】
（式中、
［（Ａ−Ｔ）］は、それぞれ、複合体内のポテンシャル分岐部を示し；
（Ａ−Ｔ）は、それぞれ、複合体の分岐部内のポテンシャル繰返を示し；
−Ａ−は、それぞれ独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、または場合によっては置換された基であって、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される基であり；
Ｔは、それぞれ独立して、共有結合、または２価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられ；
Ｒは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分、またはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
Ｘは、それぞれ独立して、糖を含むリガンドであり；
ＬＢは、それぞれ独立して、共有結合、またはＴとＸとの共有結合型複合に由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−ＷＩであり；
ＷＩは、インスリン分子であり；
ＬＤは、それぞれ独立して、共有結合、またはＴとＷＩとの共有結合型複合に由来する基であり；
ｋは、１〜１２の整数であり、
ｐは、それぞれ独立して、１〜５の整数であり；
ｎは、それぞれ独立して、０〜５の整数であり；
ｍは、それぞれ独立して、１〜５の整数であり；および
ｖは、それぞれ独立して、０〜５の整数であり、
ただし、各ｋ−分岐部内で、ｎの少なくとも１つは≧１であり、およびｖの少なくとも１つは≧１である。）
一般式（Ｉ）（および本明細書中の他の式）は、全ての水素を明記していないことは理解すべきである。たとえば、中央の−Ａ−がＣ６アリール基であり、ｋ＜５の場合、Ｃ６アリール環上のオープンポジションには水素が含まれていることは理解されることである。
【０１６０】
一般的に、各−Ａ−は、ポテンシャル分岐ノードを示し、各ノードでの分岐の数は、中央の−Ａ−のｋおよび中央にない−Ａ−のｎの値で決まることは理解されることである。ｎは０〜５の整数であり得るから、本開示は、これらの複合体の直鎖、分岐状、および多分岐状（たとえば、デンドリマー様）実施形態も考慮していることを当業者であれば理解する。各ｋ−分岐部内で、ｎの少なくとも１つは≧１であり、およびｖの少なくとも１つは≧１であるという但し書きは、全ての複合体は、少なくとも１つのＢ（すなわち、リガンド）を含むことを明確にしている。
【０１６１】
ある実施形態では、ｐの括弧でくくられた部分における−Ａ−は、それぞれ、≧１の数に対応する数のｎの括弧でくくられた部分によって置換されてもよい。たとえば、ｋ＝２および該２つのｋの分岐部分でｐ＝２の場合、複合体は、式（Ｉａ）：
【化７】
2012516342.tif 000010
【０１６２】
の複合体である場合がある。
【０１６３】
他の実施形態では、ｐの括弧でくくられた部分における−Ａ−の末端部のみが、≧１の数に対応する数のｎの括弧でくくられた部分によって置換されている。たとえば、ｋ＝２および該２つのｋの分岐部分でｐ＝２（および、両ｋ−分岐部における最初のｐの括弧でくくられた部分に関しｎ＝０）の場合、複合体は、式（Ｉｂ）：
【化８】
2012516342.tif 000011
【０１６４】
の複合体である場合がある。
【０１６５】
ある実施形態では、ｍの括弧でくくられた部分における−Ａ−は、それぞれ、≧１の数に対応する数のＢ部分によって置換されている。たとえば、ｋ＝２、各場合のｐ＝１、および各場合のｍ＝２の場合、複合体は、式（Ｉｃ）：
【化９】
2012516342.tif 000012
【０１６６】
の複合体である場合がある。
【０１６７】
他の実施形態では、ｍの括弧でくくられた部分における−Ａ−の末端部のみが、≧１の数に対応する数のＢ部分によって置換されている。たとえば、ｋ＝２、各場合のｐ＝１、および各場合のｍ＝２（および各ｎ−分岐部における最初のｍの括弧でくくられた部分に関しｖ＝０）である場合、複合体は、式（Ｉｄ）：
【化１０】
2012516342.tif 000013
【０１６８】
の複合体である場合がある。
【０１６９】
さらなる例示として、先の式の両ｋ−分岐部において、ｎ＝１の場合、複合体は、式（Ｉｅ）：
【化１１】
2012516342.tif 000014
【０１７０】
の複合体である場合がある。
【０１７１】
あるいは、先の式の両ｋ−分岐部において、ｎ＝２の場合、複合体は式（Ｉｆ）：
【化１２】
2012516342.tif 000015
【０１７２】
の複合体である場合がある。
【０１７３】
例示的な基の説明
−Ａ−（ノード）：
ある実施形態では、−Ａ−は、それぞれ、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される、場合によっては置換された基である。いくつかの実施形態では、それぞれの−Ａ−
は、同じである。いくつかの実施形態では、中央の−Ａ−
は、他の全ての−Ａ−と異なる。ある実施形態では、全ての−Ａ−が、中央の−Ａ−以外、同じである。
【０１７４】
いくつかの実施形態では−Ａ−は、場合によっては置換された、アリールまたはヘテロアリール基である。いくつかの実施形態では、−Ａ−は、６−員環アリールである。ある実施形態では、−Ａ−はフェニルである。
【０１７５】
ある実施形態では、−Ａ−は、Ｎ、ＯまたはＳから選択されるヘテロ原子である。いくつかの実施形態では、−Ａ−は、窒素原子である。いくつかの実施形態では、−Ａ−は酸素原子である。いくつかの実施形態では、−Ａ−はイオウ原子である。いくつかの実施形態では、−Ａ−は炭素原子である。
【０１７６】
Ｔ（スペーサー）：
ある実施形態では、Ｔは、それぞれ独立して、２価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和、場合によっては置換された、Ｃ１−２０炭化水素鎖であって、Ｔの１個以上のメチレン単位は、場合によっておよび独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられた炭化水素鎖である。ある実施形態では、Ｔの１、２、３、４または５個のメチレン単位が、場合によっておよび独立して、置き換えられる。ある実施形態では、Ｔは、Ｃ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４、Ｃ２−１２、Ｃ４−１２、Ｃ６−１２、Ｃ８−１２またはＣ１０−１２炭化水素鎖であって、Ｔの１個以上のメチレン単位は、場合によっておよび独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられた炭化水素鎖で構成される。いくつかの実施形態では、Ｔの１個以上のメチレン単位は、複素環基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、Ｔの１個以上のメチレン単位は、トリアゾール部分によって置き換えられる。ある実施形態では、Ｔの１個以上のメチレン単位は、−Ｃ（Ｏ）−によって置き換えられる。ある実施形態では、Ｔの１個以上のメチレン単位は、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−によって置き換えられる。ある実施形態では、Ｔの１個以上のメチレン単位は、−Ｏ−によって置き換えられる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化１３】
2012516342.tif 000016
【０１７８】
である。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化１４】
2012516342.tif 000017
【０１８０】
である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化１５】
2012516342.tif 000018
【０１８２】
である。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化１６】
2012516342.tif 000019
【０１８４】
である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化１７】
2012516342.tif 000020
【０１８６】
である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化１８】
2012516342.tif 000021
【０１８８】
である。
【０１８９】
ある実施形態では、各Ｔは同じである。
【０１９０】
ある実施形態では、各Ｔ（外側の基ＢおよびＤ）は、共有結合であり、複合体は、一般式（ＩＩ）：
【化１９】
2012516342.tif 000022
【０１９１】
（式中、−Ａ−、Ｂ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎ、ｐ、ｋおよびｊは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体である。
【０１９２】
一般式（ＩＩ）のある実施形態では、中央の−Ａ−を除いた−Ａ−は、それぞれ、共有結合であり、それぞれの場合でｖ＝１であり、複合体は、式（ＩＩＩ）：
【化２０】
2012516342.tif 000023
【０１９３】
（式中、−Ａ−、Ｂ、Ｄ、ｑ、ｋおよびｊは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体である。
【０１９４】
式（ＩＩＩ）に関して、あるそのような実施形態では、ｋ＝１である。
【０１９５】
他の実施形態では、ｋ＝２である。
【０１９６】
他の実施形態では、ｋ＝３である。
【０１９７】
いくつかの実施形態で、本開示は、一般式（ＩＩＩａ）：
【化２１】
2012516342.tif 000024
【０１９８】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０１９９】
たとえば、いくつかの実施形態で、本開示は、式：
【化２２】
2012516342.tif 000025
2012516342.tif 000026
【０２００】
（式中、ＷＩおよびＸは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０２０１】
いくつかの実施形態で、本開示は、一般式（ＩＩＩｂ）：
【化２３】
2012516342.tif 000027
【０２０２】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０２０３】
たとえば、いくつかの実施形態で、本開示は、式：
【化２４】
2012516342.tif 000028
2012516342.tif 000029
【０２０４】
（式中、ＷＩおよびＸは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０２０５】
たとえば、いくつかの実施形態で、本開示は、式：
【化２５】
2012516342.tif 000030
2012516342.tif 000031
【０２０６】
（式中、ＷＩおよびＸは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０２０７】
いくつかの実施形態で、本開示は、一般式（ＩＩＩｃ）：
【化２６】
2012516342.tif 000032
【０２０８】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０２０９】
たとえば、いくつかの実施形態で、本開示は、式：
【化２７】
2012516342.tif 000033
【０２１０】
（式中、ＷＩおよびＸは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０２１１】
いくつかの実施形態で、本開示は、一般式（ＩＩＩｄ）および（ＩＩＩｅ）：
【化２８】
2012516342.tif 000034
【０２１２】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０２１３】
たとえば、いくつかの実施形態で、本開示は、式：
【化２９】
2012516342.tif 000035
【０２１４】
（式中、ＷＩおよびＸは、本明細書で定義し、記載した通りである）の複合体を提供する。
【０２１５】
Ｂ（リガンド）：
−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘ（式中、Ｘは、糖を含むリガンドであり、およびＬＢは、共有結合またはＸとＴとの共有結合型複合体から誘導される基である）である。例示的なリガンドおよびそれらの糖成分は、本明細書に記載されている。
【０２１６】
Ｄ（インスリン）：
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−ＷＩ（式中、ＷＩはインスリン分子であり、ＬＤは、共有結合、またはＷＩとＴとの共有結合型複合体から誘導される基である）である。例示的なインスリン分子は、本明細書に記載されている。
【０２１７】
ＬＢおよびＬＤ（共有結合型複合体）：
当業者であれば、種々の複合化学が、ＸとＴと、および／またはＷＩとＴと（一般的に「成分」）を共有結合で複合体化するために使用されることを理解する。そのような技術は、当分野で広く知られており、例示的な技術を以下に検討する。成分は、直接的に結合（すなわち、介在する化学基なしで）またはスペーサー（たとえば、複合体化された構成成分と複合体骨格の残部との間にある物理的な分離を提供する架橋剤または共役鎖）を介して間接的に結合し得る。該成分は、アミド結合、アミン結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、イソ尿素結合、イミン結合など（これらに限定されない）を始めとする、任意の数の化学結合を介して、共有結合で、複合体骨格に結合することができることは理解される。ある実施形態では、ＬＢおよび／またはＬＤ（この項の目的では、一般的に、「Ｌ」）は、共有結合である。いくつかの実施形態では、Ｌは、Ｔの場合によっては置換されたカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性またはヒドロキシル反応性部分と、ＸまたはＷＩのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基との複合に由来する、場合によっては置換された部分である。いくつかの実施形態では、Ｌは、ＸまたはＷＩの場合によっては置換されたカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性またはヒドロキシル反応性部分と、Ｔのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基の複合に由来する、場合によっては置換された部分である。いくつかの実施形態では、Ｌは、
【化３０】
2012516342.tif 000036
【０２１８】
である。いくつかの実施形態では、Ｌは、スクシンイミド部分である。
【０２１９】
種々の実施形態で、当分野で公知の「クリックケミストリー」反応を使用して、成分を共有結合で複合体骨格に結合してもよい。これらの方法として、たとえば、シクロ付加反応、求核開環反応、および炭素・炭素多重結合に対する付加（たとえば、ＫｏｌｂおよびＳｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ８：１１２８−１１３７，２００３およびこれに列挙されている参考文献、およびＤｏｎｄｏｎｉ，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２：７００−７０８，２００７およびこれに列挙されている参考文献参照）が挙げられる。先に検討したように、種々の実施形態で、自然のまたは化学的に付加された側鎖基を介して、複合体骨格に結合してもよい。一般的に、一組の反応性基（たとえば、反応してアミド結合を生成するカルボキシル基とアミン基）の第一と第二メンバーは、成分および骨格のいずれか１つに存在し得る（すなわち、２つのメンバーの相対的な位置は、それらが反応して複合体を生成する限り、あまり重要な意味を持たない）ことが理解される。例示的な架橋を、以下にさらに詳しく検討する。
【０２２０】
種々の実施形態で、成分を有するカルボキシル（または反応性エステル）を、Ｋｉｍら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４：４８４３−４８５１（２００３）により略述された手順を使用して、−ＯＨ含有骨格（ＯＢＦ）に複合体化することができる。手短に言えば、ＯＢＦをカルボキシル含有成分とともにＤＭＳＯに溶解し、Ｎ’，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として使用して、乾燥雰囲気下で反応させる。カルボキシル含有成分は、カルボジイミド（ＥＤＡＣ）架橋法を使用して、−ＮＨ２含有骨格（ＮＢＦ）に複合体化することができる。この方法を使用して、ｐＨ５の緩衝液中でＥＤＡＣと反応させ、次いでＮＢＦを付加することによって、カルボキシル含有成分に官能性を持たせる。これらのどちらの場合も（および以下のいかなる場合も）、得られた生成物は、サイズ排除クロマトフグフィー、逆相クロマトフグフィー、シリカゲルクロマトフグフィー、イオン交換クロマトフグフィー、限外ろ過、および選択的沈殿（これらに限定されない）を始めとする、当業者に公知の方法の様々な方法によって精製してもよい。
【０２２１】
種々の実施形態で、アミン含有成分は、−ＣＯＯＨ含有骨格（ＣＢＦ）にカップリングすることができる。活性化エステル部分を使用するＣＢＦ（たとえば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８およびこれに挙げられた参考文献参照）。簡単に言えば、−ＮＨＳ、−ＳＳＣ、−ＮＰＣなどのような末端活性化カルボン酸エステルを有するＣＢＦを、ＤＭＳＯまたはＤＭＦのような無水有機溶剤に溶解する。次いで、所望の当量数のアミン含有成分を加え、室温で数時間混合する。アミン含有成分を、Ｂａｕｄｙｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３，１９９８に記載されるように、ＣＢＦに複合体化し、安定なアミド結合を生成することもできる。この反応は、トリブチルアミン（ＴＢＡ）およびイソブチルクロロホルメートを、ＣＢＦおよびアミン含有成分のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に、無水条件下で加えることによって達成することができる。あるいは、アミン含有成分を、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）、およびｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）（これらに限定されない）を始めとする試薬を使用するシアン化により、ＯＢＦにカップリングすることもできる。ＣＮＢｒ反応は、水溶液中、弱塩基性ｐＨで行うことができる。ＣＤＡＰ反応は、ＤＭＳＯおよび水の混合物中、弱塩基性ｐＨで、触媒としてトリエチルアミン（ＴＥＡ）を使用して行うことができる。ある実施形態では、たとえば、ピリジンを含有する水性緩衝溶液中でグルタルアルデヒドカップリングを行い、次いでグリシンでクエンチすることによって、アミン含有成分をＮＢＦに複合体化するすることができる。ある実施形態では、シッフ塩基架橋法、次いで還元することによって、アミン含有成分を、アルデヒドを有する骨格に複合体化することができる（たとえば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８およびこれに挙げられた参考文献、ならびにＭｅｉら．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６，１９９９およびこれに挙げられた参考文献参照）。簡単に言えば、末端活性化アルデヒド（たとえば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドなど）を有する骨格を、中性またはそれ以下のｐＨの水性緩衝液に溶解し、望ましくないアルデヒド加水分解を防止する。次いで、所望の当量数のアミン含有成分を加え、室温で混合し、次いで過剰の適切な還元剤（たとえば、ナトリウムボロハイドライド、ナトリウムシアノボロハイドライド、ナトリウムトリアセトキシボロハイドライドピリジンボラン、トリエチルアミンボランなど）を添加する。
【０２２２】
種々の実施形態で、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）手法に従って、ヒドロキシル含有成分をＯＢＦに複合体化することができる。この手法を使用して、ＯＢＦをｐＨ１１．４の重炭酸塩緩衝液に加え、ＤＶＳで活性化し、次いでヒドロキシル含有成分を添加し、その後グリシンを加え中性とし、反応をクエンチする。先に記載したように、活性化エステル部分を使用して、ヒドロキシル含有成分をＯＢＦに複合体化して、エステル結合を生成してもよい。
【０２２３】
種々の実施形態で、比較的温和な手法を使用して、スルフヒドリル含有成分をマレイミド含有骨格（ＭＢＦ）に架橋し、チオエーテル結合を生成することができる（たとえば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８およびこれに挙げられた参考文献参照）。マレイミド基は、活性化エステルより加水分解に対して殆ど影響を受けにくいので、反応は、水性条件下で行うことができる。簡単に言えば、ＭＢＦをｐＨ６．５〜７．５で緩衝水溶液に溶解し、次いで所望の当量数のスルフヒドリル含有成分に溶解する。室温で数時間混合した後、チオエーテルが架橋した複合体を精製してもよい。スルフヒドリル含有成分は、Ｔｈｏｍａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５９１９−５９２９，１９９９によって記載された方法に従って、ＮＢＦに複合体化することもできる。この反応は、ＮＢＦを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁し、次いで２，６−ルチジンおよび酸無水物を添加し、引き続き反応性中間体を精製することを含む。次いで、スルフヒドリル含有成分を、該中間体のトリエチルアミンを含むＤＭＦ溶液に加える。
【０２２４】
種々の実施形態で、ヒュスゲン型アジド−アルキンシクロ添加の銅（Ｉ）−触媒現代版を使用して、アジド含有成分をアルキン含有骨格（ＡＢＦ）にカップリングし、１，４−ジ−置換１，２，３−トリアゾールを得ることができる（たとえば、Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２：７００−７０８，２００７およびこれに挙げられた参考文献、ならびにＤｅｄｏｌａら，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．５：１００６−１０１７，２００７参照）。通常「クリック」反応と称される、この反応は、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを触媒系として使用して、純粋なＴＨＦ中で行ってもよい（たとえば、Ｗｕら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５７７５−５７７７，２００５参照）。反応は、アスコルビン酸ナトリウムおよびＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを触媒系として使用し、３：１（ＴＨＦ：水）の混合物中で行ってもよい（たとえば、前出、Ｗｕら参照）。どちらの場合も、アジド含有成分を所望の当量数でＡＢＦに加え、次いで室温で１２〜４８時間混合する。あるいは、アルキン含有成分を、先に記載した条件と正確に同じ条件を使用して、アジド含有骨格に複合体化してもよい。
【０２２５】
ある成分は、複数の同じ化学反応性部分を自然に有し得る。いくつかの例では、該成分をこれらの部位の１つだけに選択的に反応させるため、化学的反応タイプおよび条件を選択することが可能である。たとえば、インスリンを、反応性アミンを介して複合体化する場合、ある実施形態では、インスリン生物活性を保存するためには、Ｎ末端α−Ｐｈｅ−Ｂ１が、Ｎ末端α−Ｇｌｙ−Ａ１およびε−Ｌｙｓ−Ｂ２９より結合の好ましい部位である（たとえば、Ｍｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６，１９９９およびこれに挙げられた参考文献、ならびにＴｓａｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７参照）。インスリンとヘキサデセナール（アルデヒド末端分子）との間の例示的な反応において、研究者らは、ナトリウムシアノボロハイドライドの存在下、２つの成分を、５４％イソプロパノールを含有する、１．５ＭのｐＨ６．８のサリチル酸ナトリウム水溶液中で、１：６の比（インスリン：アルデヒド、モル／モル）で、一晩混合することによって、単一置換Ｐｈｅ−Ｂ１第二アミン複合体化生成物に対し、８０％を超える変化率となることを発見した（Ｍｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６，１９９９）。彼らの研究は、溶剤、ｐＨおよびインスリン：アルデヒドの比の選択は、全て、反応の選択性および収率に影響を及ぼすことを示した。しかし、殆どの場合、化学反応条件の選択により選択率を達成することは困難である。従って、ある実施形態では、反応のための１つの所望の成分以外の全ての部位での成分（たとえば、インスリン）を選択的に保護し、その後、物質を反応させ、精製した後、脱保護ステップを行うのが有利であり得る。たとえば、酸性（ＢＯＣ）、弱酸性（シトラコン酸無水物）および塩基性（ＭＳＣ）条件下で脱保護され得るものを始めとする、文献で知られているインスリンアミン基の選択的保護の数多くの例がある（たとえば、Ｔｓａｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７；Ｄｉｘｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０９：３１２−３１４，１９６８；およびＳｃｈｕｅｔｔｌｅｒら，Ｄ．Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６０：１７２１，１９７９参照）。一例では、Ｇｌｙ−ＡｌおよびＬｙｓ−Ｂ２９アミンは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基で選択的に保護され、これは次いで、９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／１０％アニソール溶液中１時間４℃のインキュベーションによる複合の後、除去される。一実施形態では、インスリンの乾燥粉末を、無水ＤＭＳＯに溶解し、次いで過剰のトリエチルアミンを溶解する。この溶液に、約２当量のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートのＴＨＦ溶液をゆっくり加え、該溶液を３０〜６０分混合する。反応後、粗溶液を過剰量のアセトンに注ぎ込み、次いで希ＨＣｌを滴下し、反応インスリンを析出させる。析出した物質を遠心分離し、アセトンで洗浄し、完全に真空乾燥する。目的の保護されたジ−ＢＯＣ生成物を、分取逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用して、未反応のインスリン、望ましくないジ−ＢＯＣ異性体およびモノ−ＢＯＣおよびトリ−ＢＯＣ副生物から分離する（たとえば、Ｔｓａｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７参照）。逆相ＨＰＬＣの場合、租生成物の０．１％ＴＦＡを含有する７０％水／３０％アセトニトリル溶液を、Ｃ８カラムに負荷し、アセトニトリル勾配の増加によって溶出する。目的とするジ−ＢＯＣピークを収集し、ロートバップし、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋な生成物を得る。
【０２２６】
ｋ：
ｋは、１〜１２の整数である。ある実施形態では、ｋ＝１〜６、たとえば、１、２または３である。
【０２２７】
ｐおよびｍ：
ｐは、それぞれ独立して、１〜５の整数である。ある実施形態では、各ｐは同じである。ある実施形態では、ｐ＝１、２または３である。ある実施形態では、ｐ＝１である。
【０２２８】
ｍは、それぞれ独立して、１〜５の整数である。ある実施形態では、各ｍは同じである。ある実施形態では、ｍ＝１、２または３である。ある実施形態では、ｍ＝１である。
【０２２９】
ｎおよびｖ：
ｎは、それぞれ独立して、０〜５の整数であり、ただし、各ｋ−分岐部内で、少なくとも１つのｎは、≧１である。あるｋ−分岐部内の分岐部を、本明細書では、ｎ−分岐部と称する。
【０２３０】
ある実施形態では、ｐの括弧でくくられた部分における各−Ａ−は、≧１の値に対応する数のｎの括弧でくくられた部分によって置換される。たとえば、前記式（Ｉａ）参照。そのような実施形態のいくつかでは、複合体中の各ｎは、同じである。これらの実施形態のいくつかでは、ｎ＝１または２である。
【０２３１】
他の実施形態では、ｐの括弧でくくられた部分における−Ａ−の末端のみが、ｎ≧１の値に対応する数のｎの括弧でくくられた部分によって置換されている。たとえば、上記式（Ｉｂ）参照。ある実施形態では、各ｋ−分岐部は、ｎ≧１の場合を１つしか含まない（すなわち、他の全ては、ｎ＝０である）。そのような実施形態のいくつかでは、複合体中の各ｎは同じである。これらの実施形態のいくつかでは、ｎ＝１または２である。
【０２３２】
ｖは、それぞれ独立して、０〜５の整数であり、ただし、各ｋ−分岐部内で、少なくとも１つのｖは、≧１である。
【０２３３】
ある実施形態では、ｍの括弧でくくられた部分における各−Ａ−は、ｖ≧１の値に対応する数のＢ部分によって置換されている。たとえば、前記式（Ｉｃ）参照。そのような実施形態のいくつかでは、複合体中の各ｖは同じである。これらの実施形態のいくつかでは、ｖ＝１または２である。
【０２３４】
他の実施形態では、ｍの括弧でくくられた部分における−Ａ−の末端のみが、ｖ≧１の値に対応する数のＢ部分によって置換されている。たとえば、前記式（Ｉｄ）参照。ある実施形態では、各ｋ−分岐部は、ｖ≧１の場合を１つしか含まない（すなわち、他の全ては、ｖ＝０である）。そのような実施形態のいくつかでは、複合体内の各ｖは同じである。これらの実施形態のいくつかでは、ｖ＝１または２である。ある実施形態では、各ｎ−分岐部は、ｖ≧１の場合を少なくとも１つ含む。ある実施形態では、各ｎ−分岐部は、ｖ≧１の場合を１つしか含まない（すなわち、他の全ては、ｖ＝０である）。そのような実施形態のいくつかでは、複合体中の各ｖは同じである。これらの実施形態のいくつかでは、ｖ＝１または２である。
【０２３５】
薬物負荷：  
一般的に、複合体に負荷される薬物の量は、複合体骨格の分子量および／または化学的活性化のレベル（すなわち、側鎖基が骨格に付加される場合）を調整することによって、コントロールすることができる。種々の実施形態で、薬物負荷濃度は、複合体に対し５〜９９％ｗ／ｗの薬物の範囲であり得る。種々の実施形態で、５０〜９９％の狭い範囲内の負荷濃度が使用され得、たとえば、８０〜９９％の範囲で使用され得る。
【０２３６】
その他：
先の項目では、異なる見出しで複合体の成分（たとえば、リガンド、薬物、骨格）を記載したが、本開示は、開示したリガンド、薬物および骨格のいずれかおよび全てを含む複合体を包含するものであることは理解されるべきである。
【０２３７】
インスリン複合体を調製する方法：
実施例で記載するように、本発明者らは、例示的なインスリン分子として、ヒト組換えインスリンを、および例示的なリガンドとして、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）、アミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）、アミノエチルフコース（ＡＥＦ）、β−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）および／またはグルコサミン（ＧＡ）を使用して、先に記載した複合体を調製する方法を例示する。限定ではないが、複合体骨格として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、トリス−スクシンイミジル−ｌ，３，５−ベンゼントリカルボキシレート（ＴＳＢ）およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−４−酪酸−ＮＨＳ−エステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ４）を使用して、複合部位１つ当たり２個のリガンドを有し、全骨格成分の間が短い複合体を調製してもよい。より広い骨格成分間空間が望ましい場合は、スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−Ｃ６）、スクシンイミジル（６−アミノ（ＰＥＯ−６））アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６）、ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−６−アミノカプロン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ６）、およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−１０−アミノデカン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ１０）を使用してもよい。ＴＳＡＴ−Ｃ６スペーサー・アーム化学は、ＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６と比較して、複合体により疎水性特性を付与する。
【０２３８】
たとえば、説明の目的のため、一実施形態では、リガンド（たとえば、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＭＢおよびＡＥＴＭ）およびインスリンの両方を、末端活性化エステルを介して、ＴＳＡＴ−Ｃ６骨格に反応させ、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＧ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭＢ−２およびインスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２複合体を生成してもよい。実施例で検討するように、種々のリガンドを前もって合成する。いくつかの実施形態では、実施例で記載するように、各インスリンがＰｈｅ−Ｂ１α−アミノ基でのみ反応できるように、インスリンのＡ１およびＢ２９アミノ基をＢＯＣで保護する。いくつかの実施形態では、実施例で記載するように、各インスリンがＧｌｙ−Ａ１α−アミノ基でのみ反応できるように、インスリンのＢ１およびＢ２９アミノ基をＢＯＣで保護する。約１当量のＢＯＣ−インスリンを４０〜５０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液として、過剰のトリエチルアミンを含有する５０ｍｇ／ｍｌのＴＳＡＴ−Ｃ６のＤＭＳＯ溶液に室温で加え、約１時間反応させる。次に、過剰のＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよび／またはＡＥＴＭ（２〜１０当量）を、１００ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液として加え、さらに２時間反応させる。反応後、ＤＭＳＯ溶液をｐＨ５の生理食塩水緩衝液へ入れ、１０倍希釈を行い、そのｐＨを８．０に調整し、溶液をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、低分子量反応物および塩を除去する。ボイド率で溶出された物質を、３Ｋ限外ろ過装置を使用して濃縮し、その後、分取スケール逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ８、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水移動相）に注入し、目的生成物を未反応ＢＯＣ２−インスリンから精製する。目的の溶出ピークを収集し、プールし、ロートバップし、アセトニトリルを除去し、次いで凍結乾燥し、乾燥粉末を得る。最後に、凍結乾燥した粉末を、９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４℃で１時間で溶解し、次いで、０．１５０ＭのＮａＣｌを含有するＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２の緩衝液で１０倍希釈して、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを７．０および８．０の間に調整し、その後、物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび任意の他の混入塩類を除去する。次いで、脱保護され、精製された複合体の水溶液を所望の濃度に濃縮し、必要になるまで、４℃で保存する。
【０２３９】
別の態様では、これらの条件下では、Ｂ２９アミノ基は、野生型インスリンに存在する３つのアミノ基の中で最も反応性が高いので、炭酸塩緩衝液中の保護されていないインスリンを使用して、Ｂ２９ε−アミノ基で反応を行ってもよい。例示的な合成では、Ｎ末端活性化エステルを含有する骨格を、６０ｍＭで無水ＤＭＳＯに溶解し、次いでトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。該溶液を室温で１０分間素早く攪拌する。平行して、適切な量の無水ＤＭＳＯ中でリガンドの４４８ｍＭ溶液を調製する。溶解した時点で、十分な量のリガンド溶液を１０分にわたって滴下し、骨格上の活性化エステル基の数Ｎの１．５倍−１に等しい数の反応性等価物を提供する。たとえば、１つの骨格当たりＮ＝３の初期活性化エステル基があれば、（３×（３−ｌ）×６０ｍＭ／３７０ｍＭ）＝０．９７３ｍｌのリガンド溶液を加える。１つの骨格当たりＮ＝４の初期活性化エステル基があれば、（３×（４−ｌ）×６０ｍＭ／３７０ｍＭ）＝１．４６ｍｌのリガンド溶液を加える、など。リガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で１時間攪拌する。
【０２４０】
次いで、インスリン分子を、別々に、１７．２ｍＭで、炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ１１）に別々に溶解し、続けて、ｐＨを１．０Ｎの水酸化ナトリウムで１０．８に調整する。一度溶解すれば、全骨格／ＤＭＳＯ／リガンド／ＴＥＡ溶液を、７５分にわたってインスリン／炭酸塩緩衝液溶液に滴下する。添加の間、得られた混合物のｐＨを、必要であれば、希ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用して、５分毎に１０．８に調整する。滴下添加終了後、該溶液をさらに１５分攪拌し、反応の完了を確実にする。
【０２４１】
次いで、得られた溶液を０．１５０ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのｐＨ５．０ＨＥＰＥＳ  緩衝生理食塩水で１０倍希釈し、次いでｐＨを希ＨＣｌで最終ｐＨに８．０調整する。該水溶液を、先ず、複合体化物質と複合体化されていない物質の目的の分離に適切な固相を使用する、サイズ排除によって精製する。次いでカラムボイド体積を通過した溶液を、適切なサイズの限外ろ過膜を使用して、約４０ｍｌに濃縮する。この溶液を、分取逆相ＨＰＬＣを使用してさらに精製し、所望の生成物を得る。収集した時点で、該溶液をロートバップしアセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋な複合体を得る。
【０２４２】
別の態様では、米国特許第７，４０２，５６５号で報告されている方法に類似する方法を使用して、Ｂ２９−モノ置換インスリン複合体を、Ｎ末端保護アミノ酸配列を使用して合成する。具体的には、保護アミノ酸配列がＡｒｇＡ０およびＡｒｇＢ０を含有するように、Ｎ末端ペプチド配列をインスリンＡ鎖およびＢ鎖上に操作し、インスリン中間体を得る。複合は、インスリン中間体のＬｙｓＢ２９で起こり、一方Ｎ末端は、複合副生物から保護されている。複合体化されたインスリン中間体を、トリプシンで処理してＮ末端保護アミノ酸配列を切断し、ＬｙｓＢ２９だけが複合体化されているインスリン複合体を得る。いくつかの実施形態では、米国特許第７，４０２，５６５号に記載されているように、インスリン中間体は、単鎖インスリン前駆体から誘導される。いくつかの実施形態では、インスリン中間体は、ＬｙｓＢ２９以外の複合部位を含有する変異体であり、ＬｙｓＢ２９に関して記載した合成法と類似の合成法が行われる。
【０２４３】
これらの例示的な手法を使用して、異なるリガンドおよびインスリン分子、異なる複合化学、骨格成分間の異なる分離および／またはＴＳＡＴ−Ｃ６骨格を以下に記載する異なる骨格で置換することにより得られる異なる原子価を有する他の複合体を生成するために使用してもよいことは理解されることである。
【０２４４】
たとえば、骨格成分の間がさらにあいたものおよび／または複合の部位で保存電荷が必要な場合、適切なサイズのアミンを有するジエチルアセタール（たとえば、アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（ＡＰＤＡ）またはアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ））を、本明細書で挙げた骨格上の反応性基の１つに複合化させ、次いで、対象のリガンド（たとえば、ＡＥＭ、ＡＥＢＭまたはＡＥＴＭ）を有する残存する反応性基と完全に反応させてもよい。次いで、反応性アルデヒド基を、酸性条件下でジエチルアセタールから現すことができ、次いで、インスリンとの還元性アミノ化を行い、インスリン複合化ステップを完了し、次いで、ＡＢＤＡ−ＴＳＡＴ、ＡＢＤＡ−ＬＣＴＳＡＴなどを使用してもよい。
【０２４５】
さらに別の例では、多原子価を増やすために、テトラキス−（Ｎ−スクシンイミジルカルボキシプロピル）ペンタエリスリトール（ＴＳＰＥ）を使用して、１つの複合部位当たり３個のリガンドを結合してもよい。幾分より高いオーダーの原子価を持つ多分岐（たとえば、デンドリマー様）複合体を生成するために、上記技術のどれを使用してもよいことも、当業者には理解されることである。たとえば、ＲｏｃｋｅｎｄｏｒｆおよびＬｉｎｄｈｏｒｓｔは、Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２１７：２０２−２３８，２００１で、多分岐構造を作るための現在のアプローチの包括的な見解を提供している。
【０２４６】
さらに、所定の多原子価度をすでに含有するリガンドを、先に記載された手法に従って、再び反応させ、幾分高いオーダーのリガンド多様性を作り出してもよい。たとえば、各リガンドの２つを反応性アミンも複合体化している適切な骨格に複合体化することによって、末端反応性アミンを含有する２価のＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２またはＡＥＴＭ−２分子を調製してもよい。各リガンドの３つを反応性アミンも複合体化している適切な骨格に複合体化することによって、末端反応性アミンを含有する３価のＡＥＭ−３、ＡＥＢＭ−３またはＡＥＴＭ−３分子を調製してもよい。ＮＨ２−２価の糖を先に記載した骨格と同じ骨格と反応させ、インスリン分子１個当たり４個および６個のリガンドを有するインスリン複合体を生成してもよい。ＮＨ２−３価の糖を先に記載した骨格と同じ骨格と反応させ、インスリン分子１個当たり６個および９個のリガンドを有する薬物複合体を生成してもよい。
【０２４７】
いかなる場合でも、異なるリガンドの混合物を、骨格化学、原子価、およびリガンド：骨格化学量論を調整することによって、多価骨格を介して同じインスリン分子に複合体化してもよいことは理解すべきである。たとえば、インスリン−ＡＥＭ−１−ＡＥＢＭ−１、インスリン−ＡＥＢＭ−１−ＡＥＴＭ−１、インスリン−ＡＥＭ−２−ＡＥＴＭ−２およびインスリン−ＡＥＭ−１−ＡＥＴＭ−２は、全て、この混合リガンド方法に従って合成してもよい。
【０２４８】
場合によっては、インスリン分子とは異なる方法によってリガンドを骨格に複合体化するのが望ましいこともある。たとえば、２価のマレイミド／１価の活性化エステル官能化骨格（たとえば、スクシンイミジル−３，５−ジマレイミドフェニルベンゾエート（ＳＤＭＢ））を使用して、分離ステップで、２個のスルフヒドリル官能化リガンドおよび１個のインスリン分子を複合体化してもよい。たとえば、本明細書に記載された方法を使用して、インスリン分子を骨格の活性化エステル部分に複合体化してもよい。分離ステップでは、アミノエチル糖（ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）を、４−イミノチオランとの反応により、末端スルフヒドリル含有リガンドに変換してもよい。最後に、骨格−ジ−マレイミド−インスリン複合体を、過剰のスルフヒドリル多官能化糖と混合して、２価のリガンド−インスリン複合体を生成してもよい。
【０２４９】
インスリン複合体の結晶化：
驚くべきことに、本明細書で記載するあるインスリン複合体は、プロタミンまたは亜鉛のような添加剤を使用することなく結晶化することができることが発見された。インスリン複合体の結晶性製剤は、バッチ毎の再生産性を改善し、製剤安定性を増し、長期保存で粒子の凝集を減らすことができる点で有利であり得る。
【０２５０】
実施例で記載するように、適切な結晶化条件を決めるために、スクリーニング実験を行うことができる。一般的に、結晶化すべきインスリン複合体の溶液を水に溶解し、および緩衝液で懸濁し、結晶化の証拠のために溶液を観察する。次いで、スクリーニング実験において確認された適切な緩衝液を使用して、結晶性インスリン複合体を、規模を拡大して調製することができる。
【０２５１】
ある実施形態では、結晶性インスリン複合体の骨格は、ＬｙｓＢ２９位で複合体化する。ある実施形態では、結晶性インスリン複合体は、図２に示す複合体の１つである。ある実施形態では、結晶性インスリン複合体は、Ｉ−６、Ｉ−７またはＩ−９である。
【０２５２】
ある実施形態では、結晶化のために使用される緩衝液は、ｐＨが７を超える。ある実施形態では、緩衝液のｐＨは、約７．５と約８．５との間である。ある実施形態では、緩衝液はリン酸塩、トリスまたはＨＥＰＥＳ緩衝液である。
【０２５３】
ある実施形態では、結晶化のために使用される緩衝液は、リン酸塩緩衝液である。ある実施形態では、緩衝液は、カリウムの濃度がナトリウムの濃度より高い。ある実施形態では、緩衝液は、第二リン酸カリウムの濃度が第一リン酸ナトリウムの濃度より高い。ある実施形態では、緩衝液のｐＨは、約６〜９の範囲内である。ある実施形態では、緩衝液のｐＨは約８である。ある実施形態では、緩衝液のｐＨは約８．２である。ある実施形態では、緩衝液は、ｐＨが約８．２の第一リン酸ナトリウム、第二リン酸カリウムである。
【０２５４】
ある実施形態では、結晶化は、１種以上の添加剤の存在下で起こる。ある実施形態では、添加剤は、ｍ−クレゾール、フェノール、プロタミン、ポリ（アルギニン）、グリセロール、塩化亜鉛または酢酸亜鉛である。ある実施形態では、添加剤は、ポリエチレングリコールである。
【０２５５】
ある実施形態では、有機溶剤を加えて、結晶化を促進する。ある実施形態では、有機溶剤は、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールである。ある実施形態では、有機溶剤は、医薬組成物の最終調製の前に除去される。
【０２５６】
結晶性インスリン複合体の製剤：
実施例で検討するように、ある実施形態では、持続した形式（すなわち、溶解性組換えヒトインスリンより持続する吸収プロフィールを示す形態）で結晶性インスリン複合体を投与し、従って、典型的なグルコース変動タイムスケール（すなわち分というより時間）により近い関係のタイムスケールでのグルコースにおける変動に応答することができる複合体の持続性レベルを提供するのが有利であり得る。ある実施形態では、非高血糖条件（すなわち、絶食させた状態）で哺乳類に投与した場合、徐放性製剤は、複合体のゼロ次放出を示し得る。
【０２５７】
持続した吸収プロフィールを提供する任意の製剤を使用してもよいことは理解されることである。ある実施形態では、持続した吸収は、結晶性インスリン複合体と、その全身循環への放出特性の速度を落とす他の成分とを組合わせることによって達成され得る。たとえば、ＰＺＩ（プロタミン亜鉛インスリン）製剤は、この目的のために使用され得る。実施例で記載するように、発明者らは、ある実施形態で、無定形インスリン複合体で調製したＰＺＩ製剤の吸収プロフィールおよび安定性は、製剤に含まれるプロタミンおよび亜鉛の絶対および相対量に対して感受性を示すことを発見した。たとえば、効果的な持続性吸収プロフィールを得るために、市販のＰＺＩおよびＮＰＨ（中性プロタミン・ハーゲドルン）インスリン製剤は、約０．０５〜約０．２ｍｇのプロタミン／ｍｇインスリンしか必要でないのに対し、ＰＺＩ−複合体製剤の中には、約１〜約５ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体を必要とするものもある。さらに、市販のプロタミンインスリン製剤は、約０．００６ｍｇの亜鉛／ｍｇインスリンを含有するものの、発明者らは、プロタミン濃度とともに亜鉛濃度が増加すると、ある実施形態では、より安定で、容易に分散し得る製剤を得ることができることを発見した。場合によっては、亜鉛含量は、約０．０５〜約０．５ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体の範囲である。さらに、予期し得ぬことに、発明者らは、ある実施形態では、Ｂ１−アミン基で置換されたインスリン複合体は、Ｂ２９−アミン基で置換されたインスリン複合体に対して効果的に放出プロフィールを持続するためには、より多くのプロタミンおよび亜鉛が必要であることを発見した。
【０２５８】
ある実施形態では、前結晶化インスリン複合体懸濁液を、プロタミンと混合し、結晶性インスリン複合体プロタミン製剤を形成する。いくつかの実施形態では、製剤化の間、生理的緩衝液強さに該懸濁液を中和する。
【０２５９】
ある実施形態では、本開示の製剤は、約０．０５〜約１０ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体を含む。たとえば、約０．２〜約１０ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体、たとえば、約１〜約５ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体。
【０２６０】
ある実施形態では、本開示の製剤は、約０．００６〜約０．５ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体を含む。たとえば、約０．０５〜約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇ複合体、たとえば、約０．１〜約０．２５ｍｇ亜鉛／ｍｇ複合体。
【０２６１】
ある実施形態では、本開示の製剤は、プロタミンと亜鉛とを、約１００：１〜約５：１の範囲の比（ｗ／ｗ）、たとえば、約５０：１〜約５：１、たとえば、約４０：１〜約１０：１で含む。ある実施形態では、本開示のＰＺＩ製剤は、プロタミンと亜鉛とを、約２０：１〜約５：１の範囲の比（ｗ／ｗ）、たとえば、約２０：１〜約１０：１、約２０：１〜約１５：１、約１５：１〜約５：１、約１０：１〜約５：１、約１０：１〜約１５：１で含む。
【０２６２】
ある実施形態では、１種以上の以下の成分が製剤に加えられる。抗菌性防腐剤、等張剤および／または複合体化されていないインスリン分子。
【０２６３】
ある実施形態では、本開示の製剤は、抗菌性防腐剤（たとえば、ｍ−クレゾール、フェノール、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）を含む。ある実施形態では、抗菌性防腐剤は、ｍ−クレゾールである。たとえば、ある実施形態では、製剤は、約０．１〜約１．０％ｖ／ｖのｍ−クレゾールを含んでもよい。たとえば、約０．１〜約０．５％のｖ／ｖｍ−クレゾール、たとえば、約０．１５〜約０．３５％ｖ／ｖのｍ−クレゾール。
【０２６４】
ある実施形態では、本開示の製剤は、ポリオールを等張剤（たとえば、マンニトール、プロピレングリコールまたはグリセロール）として含む。ある実施形態では、等張剤はグリセロールである。ある実施形態では、等張剤は塩、たとえば、ＮａＣｌである。たとえば、製剤は、約０．０５〜約０．５ＭのＮａＣｌ、たとえば、約０．０５〜約０．２５ＭのＮａＣｌまたは約０．１〜約０．２ＭのＮａＣｌを含んでもよい。
【０２６５】
ある実施形態では、本開示の製剤は、ある量の複合体化されていないインスリン分子を含む。ある実施形態では、製剤は、複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比が、約１００：１〜１：１、たとえば、約５０：１〜２：１または約２５：１〜２：１で含む。
【０２６６】
ある実施形態では、本開示は、本開示の結晶性複合体を含む徐放性製剤であって、プロタミンおよび亜鉛を含む製剤を提供する。ある実施形態では、結晶性インスリン複合体の骨格が、ＬｙｓＢ２９位で複合体化する。ある実施形態では、結晶性インスリン複合体は、図２に示す複合体の１つである。ある実施形態では、結晶性インスリン複合体は、Ｉ−６、Ｉ−７またはＩ−９である。
【０２６７】
ある実施形態では、製剤は、約１〜約５ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体と、約０．１〜約０．２５ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体とを含む。
【０２６８】
ある実施形態では、製剤は、プロタミンと亜鉛とを、約４０：１〜約１０：１の範囲の比（ｗ／ｗ）で含む。
【０２６９】
ある実施形態では、製剤は、さらに、ある量の複合体化されていないインスリン分子を含む。ある実施形態では、製剤は、複合体化するインスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比が約２５：１〜約２：１の範囲で含む。
【０２７０】
ある実施形態では、製剤は、さらに、抗菌性防腐剤を含む。ある実施形態では、抗菌性防腐剤は、ｍ−クレゾールである。ある実施形態では、製剤は、約０．１５〜約０．３５％ｖ／ｖのｍ−クレゾールを含む。
【０２７１】
ある実施形態では、製剤は、さらに、等張剤を含む。ある実施形態では、等張剤はグリセロールである。ある実施形態では、等張剤はＮａＣｌである。ある実施形態では、製剤は、約０．１〜約０．２ＭのＮａＣｌを含む。
【０２７２】
ある実施形態では、製剤は、
プロタミンおよび亜鉛を約４０：１〜約１０：１の範囲の比（ｗ／ｗ）で、
複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比が約２５：１〜約２：１で、
約０．１５〜約０．３５％ｖ／ｖのｍ−クレゾール、および
グリセロールまたは約０．１〜約０．２ＭのＮａＣｌを含む。
【０２７３】
ある実施形態では、製剤は、
約３．６ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体と、
約０．２ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体とを含む。
【０２７４】
ある実施形態では、製剤は、
約３．６ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体と、
約０．２ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体と、
複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比が約５：１とを含む。
【０２７５】
ある実施形態では、製剤は、
約３．６ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体と、
約０．２ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体と、
複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比が約５：１と、
約０．２％ｖ／ｖのｍ−クレゾールとを含む。
【０２７６】
ある実施形態では、製剤は、
約３．６ｍｇのプロタミン／ｍｇ複合体と、
約０．２ｍｇの亜鉛／ｍｇ複合体と、
複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子のモル比が約５：１と、
約０．２％ｖ／ｖのｍ−クレゾールと、
グリセロールまたは約０．１５ＭのＮａＣｌとを含む。
【０２７７】
結晶性インスリン複合体の用途：
別の態様では、本開示は、結晶性インスリン複合体を使用する方法を提供する。一般的に、結晶性複合体は、糖（たとえば、グルコース、または本明細書で記載した、マンノース、α−メチルマンノース、Ｌ−フコースなどのような外因性糖）に応答する生理活性インスリンをコントロール可能に提供するために使用することができる。本開示は、本開示の結晶性インスリン複合体の投与による、疾患または状態を治療することを包含する。複合体は、いかなる患者（たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、マウスなど）を治療するために使用することができるが、最も好ましくは、ヒトの治療に使用される。結晶性インスリン複合体は、種々の経路によって患者に投与することができる。一般的に、投与の最も適切な経路は、治療される疾患または状態の性質、患者の状態などを始めとする様々な要因に依存する。一般的に、本開示は、経口、筋肉内、皮下、経皮、直腸、経膣、腹腔内、局所（粉末、軟膏剤または滴剤のように）、バッカル、または経口または経鼻スプレーまたは噴霧剤として投与を包含する。これらの異なる経路に関する医薬組成物の製剤および製造における概論は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１９編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出され得る。種々の実施形態で、結晶性インスリン複合体懸濁液は、皮下、たとえば注射により投与してもよい。懸濁液の担体として、無菌水、生理食塩水または緩衝生理食塩水（これらに限定されない）を始めとする水溶液があり得る。
【０２７８】
一般的に、治療に効果的な量の結晶性インスリン複合体が投与される。「治療に効果的な量」は、複合体の効力と毒性のバランスを含む、合理的な利益／リスク比で疾患または状態を治療するために十分な、結晶性インスリン複合体の量を意味する。一般的に、治療効力および毒性は、細胞培養においてまたは実験動物を使用して、標準的な薬理学的手法、たとえば、ＥＤ５０（５０％の治療対象に対し治療的に効果のある用量）およびＬＤ５０（５０％の治療対象が致死する用量）を計算することによって、測定され得る。ＥＤ５０／ＬＤ５０は、インスリンの治療指数を表す。一般的に、当分野で周知のように、大きな治療指数が好ましいが、重篤な疾患または状態、特に代替の治療選択がない場合は、より小さな治療指数も許容され得る。ヒトへの投与のための適切な用量範囲の最終的な選択は、臨床試験の過程で決定される。
【０２７９】
種々の実施形態で、インスリンの平均一日量は、１０〜２００Ｕ、たとえば、２５〜１００Ｕ（１単位のインスリンは、約０．０４ｍｇの場合）の範囲である。ある実施形態では、これらのインスリン用量を含むある量の複合体を、日単位で投与する。ある実施形態では、これらのインスリン用量の５〜１０倍を含むある量の複合体を週単位で投与する。ある実施形態では、これらのインスリン用量の１０〜２０倍を含むある量の複合体を２週単位で投与する。ある実施形態では、これらのインスリン用量の２０〜４０倍を含むある量の複合体を月単位で投与する。
【０２８０】
ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体は、患者（たとえば、哺乳類患者）における高血糖症の治療に使用され得る。ある実施形態では、患者は、糖尿病である。しかし、本方法は、糖尿病患者の治療に限定されない。たとえば、ある実施形態では、複合体を、血糖管理不良を伴う感染症を患う患者の高血糖症を治療するのに使用してもよい。ある実施形態では、結晶性インスリン複合体を、糖尿病の治療に使用してもよい。
【０２８１】
ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体またはその製剤を、患者（たとえば、哺乳類患者）に投与した場合、インスリン分子が複合体化されていないものより低い低血糖症状を誘発する。ある実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体製剤は、インスリン分子が複合体化されていないものを含む製剤より低いＨｂＡ１ｃ価を、患者（たとえば、哺乳類患者）に誘発する。ある実施形態では、該製剤は、インスリン分子が複合体化されていないものを含む製剤より少なくとも１０％低い（たとえば、少なくとも２０％低い、少なくとも３０％低い、少なくとも４０％低い、少なくとも５０％低い）ＨｂＡ１ｃ値をもたらす。ある実施形態で、該製剤は、７％未満、たとえば約４〜約６％の範囲のＨｂＡ１ｃ値をもたらす。ある実施形態では、インスリン分子が複合体化されていないものを含む製剤は、７％を超える、たとえば、約８〜約１２％のＨｂＡ１ｃ値をもたらす。
【０２８２】
任意のある患者に与えられる複合体の合計日使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されることが理解される。任意の特定の患者のための具体的な治療に効果的な量は、治療されている疾患または状態、使用される特定のインスリン分子の活性、使用される特定の組成、患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事状態、投与時間、使用した特定のインスリン分子の投与経路および排泄速度、治療の期間、使用される特定のインスリン分子と組合わせてまたは同時に使用される薬物、およびこのような医術の分野で周知の要因を始めとする種々の要因による。種々の実施形態で、本開示の複合体は、１回以上で投与してもよい。たとえば、本開示は、具体的に、結晶性インスリン複合体懸濁液を、連続したスケジュール（たとえば、１日１回、２日毎に１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回など）で皮下注射により患者に投与する方法を包含する。
【０２８３】
種々の実施形態で、本開示の結晶性インスリン複合体は、少なくとも１種の追加の治療を受けている患者に投与してもよい。種々の実施形態で、該少なくとも１種の追加の治療は、投与された複合体と同じ疾患または障害を治療することを意図している。
【０２８４】
インスリン感受性改善薬（たとえば、メトホルミン、グリタゾンのようなビグアナイド類）は、与えられた量のインスリンに対する患者の応答を増すことによって作用する。従って、インスリン感受性改善薬を受けた患者は、本開示の結晶性インスリン複合体を、他の方法で同じ患者が必要とする用量より低い用量しか必要としない。従って、ある実施形態では、結晶性インスリン複合体を、インスリン感受性改善薬の治療も受けている患者に投与してもよい。種々の実施形態では、本開示の結晶性インスリン複合体を、７５％までのインスリン感受性改善薬の不存在下で必要とされる通常用量で投与してもよい。種々の実施形態では、５０、４０、３０または２０％までの通常用量で投与してもよい。
【０２８５】
インスリン抵抗性は、通常量のインスリンでは、正常なインスリン応答を作り出すには不十分である障害である。たとえば、インスリン抵抗性患者は、抵抗性を克服し、十分なグルコース降下作用を得るために、高い用量のインスリンを必要とし得る。この場合、抵抗性の少ない患者で低血糖症状を正常に誘発するインスリン用量では、高い抵抗性の患者には、グルコース降下作用が発揮されない。同様に、本開示の結晶性インスリン複合体が、適切な時間枠で高いレベルの生理活性インスリンを提供した場合にのみ、これらはこのサブクラスの患者に効果的である。ある実施形態では、このサブクラスの患者の治療は、２つの取組みを組合わせることによって容易になり得る。従って、ある実施形態では、従来型のインスリンを基本とする治療を使用してベースラインレベルのインスリンを提供し、本発明の結晶性インスリン複合体を投与して、患者に必要とされる場合、生理活性インスリンのコントロールされた補充を提供する。従って、ある実施形態では、結晶性インスリン複合体を、インスリンによる治療も受けている患者に投与してもよい。種々の実施形態で、インスリンを、７５％までの本開示の複合体の不存在下で必要とされる通常用量で投与してもよい。種々の実施形態では、５０、４０、３０または２０％までの通常用量で投与してもよい。この組合せの取組みは、インスリン分泌促進薬（たとえば、スルホニル尿素、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４など）および／またはインスリン感受性改善薬（たとえば、メトホルミン、グリタゾンのようなビグアナイド類）を受けているインスリン抵抗性患者にも使用してもよいことは理解されることである。
【０２８６】
外因性誘因：
先に記載したように、本明細書で記載される方法、複合体および組成物は、グルコース応答性複合体に限定されない。実施例で示すように、数種の例示的なグルコース−応答性複合体は、α−メチルマンノースおよびＬ−フコースのような外因性糖に対しても応答性があった。従って、ある実施形態では、複合体は、α−メチルマンノースおよびＬ−フコースのようなグルコース以外の糖、または複合体のＰＫまたはＰＤ特性を変更し得る任意の他の糖の外因性投与により、誘引され得ることは理解されることである。
【０２８７】
先に記載したように複合体を投与したとき（たとえば、徐放性製剤として）、該複合体は、適切な外因性糖の投与によって、誘引され得る。ある実施形態では、トリガー量の外因性糖を投与する。本明細書で使用される、外因性糖の「トリガー量」は、複合体のＰＫおよび／またはＰＤ特性（たとえば、先に記載したように、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、半減期など）の少なくとも１つの変化を起こすのに十分な量である。複合体に関し先に記載した任意の投与方法が、外因性糖に同じように適用されることは理解される。複合体および外因性糖の投与方法は、同じでも異なってもよいことも理解される。種々の実施形態で、投与方法は異なる（たとえば、説明の目的で、結晶性インスリン複合体は週単位で皮下注射により投与し、一方外因性糖は、日々経口投与してもよい）。患者のコンプライアンスを促進するので、外因性糖の経口投与は、特に価値がある。一般的に、結晶性インスリン複合体のＰＫおよびＰＤ特性は、外因性糖のＰＫプロフィールに関連することは理解されることである。従って、複合体ＰＫおよびＰＤ特性は、外因性糖のＰＫプロフィールをコントロールすることにより調節することができる。当分野で周知のように、外因性糖のＰＫプロフィールは、用量、経路、頻度および使用される製剤に基づいて調節することができる。たとえば、複合体の短く、著しい活性化を望む場合は、即放性経口製剤が使用され得る。対照的に、複合体のより長く、それほど激しくない活性化を望む場合は、代わりに、徐放性経口製剤が使用される。即放性および徐放性製剤の製剤および製造における概論は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１９編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出され得る。
【０２８８】
本開示の結晶性インスリン複合体および外因性糖の投与の相対頻度は、同じまたは異なってもよいことも理解されることである。ある実施形態では、外因性糖を複合体より頻繁に投与する。たとえば、ある実施形態では、複合体を毎日投与し、一方外因性糖を１日に複数回投与する。ある実施形態では、複合体を、１週間に２回、１週間毎、２週間毎または１ヶ月毎に投与してもよく、外因性糖は毎日投与する。ある実施形態では、複合体を１ヶ月毎に投与し、外因性糖を、１週間に２回、１週間毎、または２週間毎に投与する。これらのスキームにおける他の変法も当業者には認識され、複合体の性質および使用される製剤によって、変更する。
【実施例】
【０２８９】
実施例で記載され使用される例示的な複合体Ｉ−５〜Ｉ−１１およびＩ−１７の構造を、図２に示す。
【０２９０】
これらの方法は、本発明の範囲内に入る他の複合体を生成するために、修正することができることは、理解すべきである。
【０２９１】
実施例１−アジドエチルグルコース（ＡｚＥＧ）の合成
ａ．ブロモエチルグルコースの合成
ＤＯＷＥＸ５０Ｗ×４樹脂（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（アルファー・エイサー社）、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を脱イオン水で洗浄し、色を落とした。２２５ｇのＤ−グルコース（１．２５ｍｏｌ；１当量、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）と１４０ｇのＤＯＷＥＸ５０Ｗ×４との混合物を、２．２Ｌの２−ブロモエタノール（３０．５ｍｏｌ、２５当量；１２４．９７ｇ／ｍｏｌ；１．７６２ｇ／ｍＬ；ＢＰ＝１５０℃；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）で処理し、該混合物を攪拌しながら、８０℃で４時間加熱した。反応を、ＴＬＣ（２０％メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によりモニターした。約４時間後反応が終了し、室温まで放冷した。溶液をろ過して樹脂を取出し、該樹脂を酢酸エチルおよびＤＣＭで洗浄した。得られたろ液を回転蒸発器で琥珀色の油状物とした。油状物とした後の総量は、４００ｇであった。
【０２９２】
琥珀色の油状物を、シリカゲル（ＤＣＭに充填された４ｋｇのシリカ）を使用し、以下の方法で精製した。粗生成物を、ＤＣＭに溶解し、カラムに負荷し、次いで２×４Ｌの１０％メタノール／ＤＣＭ；２×４Ｌの１５％メタノール／ＤＣＭ；および３×４Ｌの２０％メタノール／ＤＣＭで溶出した。画分（ＴＬＣに基づく）を含有する生成物をプールし、乾燥し、１５２ｇの１−α−ブロモエチル−グルコース（４２％）を得た。
【０２９３】
ｂ．ブロモエチルグルコースのアジドエチルグルコース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱用マントル、オーバーヘッド攪拌器および温度計を備える、５Ｌの丸底三ツ口フラスコに、１５０ｇのブロモエチルグルコース（５２５ｍｍｏｌ）を充填した。前記油状物を、２Ｌの水に溶解し、６８．３ｇのアジ化ナトリウム（１．０５ｍｏｌ、２当量；６５ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）、次いで７．９ｇのヨウ化ナトリウム（５２．５ｍｍｏｌ、０．０８当量；１４９．８９ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理し、溶液を５０℃に温め、一晩攪拌した。溶液を室温まで冷却し、ロートバップで濃縮乾燥した。固体残渣を、４０℃で、３×５００ｍＬの５：１体積のＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨを用い分解した。合わせた有機部分をろ過し、蒸発乾固し、アジドエチルグルコース（８６ｇ）をオフホワイトの固体として得た。ＴＬＣ（２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；Ｈ２ＳＯ４を含む木炭）：単一スポット、出発物質から区別できない。
【０２９４】
ｃ．アジドエチルグルコースの再精製
３２ｇのアジドエチルグルコースを１００ｍＬの水に取った。混濁した溶液を、ガラス・マイクロファイバー・フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂ）によってろ過した。黄金色のろ液をロトベーパーで蒸発させ、固体とした。該固体をメタノール（１００ｍＬ）に採り、混濁した溶液を再び、ガラス・マイクロファイバー・フィルターでろ過した。得られた淡黄色ろ液を真空下、固体とした。
【０２９５】
該固体を最小量のメタノール（５０ｍＬ）に取り、攪拌しながら、酢酸エチル（１５０ｍＬ）をゆっくり加えた。重質のスラリーを冷却し、ろ過した。固体を空気乾燥（吸湿性）し、６０℃のオーブンに一晩置いた。ＴＬＣは、ほんの少ししか元の物質を有しない。収量：１５．４ｇ。母液を真空蒸発させ、黄色のガム状物質を得た。この時点で、さらにこの物質を精製しなかった。
【０２９６】
実施例２−アジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）の合成
ａ．ブロモエチルマンノースの合成
ＤＯＷＥＸ５０Ｗ×４樹脂（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を脱イオン水で洗浄し、色を落とす。２２５ｇのＤ−マンノース（１．２５ｍｏｌ；１当量、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）と、１４０ｇのＤＯＷＥＸ５０Ｗ×４の混合物を、２．２Ｌの２−ブロモエタノール（３０．５ｍｏｌ、２５当量；１２４．９７ｇ／ｍｏｌ；１．７６２ｇ／ｍＬ；ＢＰ＝１５０℃；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）で処理し、該混合物を攪拌しながら、８０℃で４時間加熱する。反応を、ＴＬＣ（２０％メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によりモニターする。約４時間後反応が終了し、次いで室温まで放冷する。溶液をろ過して樹脂を取出し、該樹脂を酢酸エチルおよびＤＣＭで洗浄する。得られたろ液を回転蒸発器で琥珀色の油状物とする。
【０２９７】
琥珀色の油状物を、シリカゲル（ＤＣＭに充填された４ｋｇのシリカ）を使用し、以下の様式で精製する。粗生成物を、ＤＣＭに溶解し、カラムに負荷し、次いで２×４Ｌの１０％メタノール／ＤＣＭ；２×４Ｌの１５％メタノール／ＤＣＭ；および３×４Ｌの２０％メタノール／ＤＣＭで溶出する。画分（ＴＬＣに基づく）を含有する生成物をプールし、乾燥し、１５２ｇの１−α−ブロモエチルマンノース（４２％）を得る。
【０２９８】
ｂ．ブロモエチルマンノースのアジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱用マントル、オーバーヘッド攪拌器および温度計を備える、５Ｌの丸底三ツ口フラスコに、１５０ｇのブロモエチルマンノース（５２５ｍｍｏｌ）を充填する。油状物を、２Ｌの水に溶解し、６８．３ｇのアジ化ナトリウム（１．０５ｍｏｌ、２当量；６５ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）、次いで７．９ｇのヨウ化ナトリウム（５２．５ｍｍｏｌ、０．０８当量；１４９．８９ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理し、溶液を５０℃に温め、一晩攪拌する。溶液を室温まで冷却し、ロートバップで濃縮乾燥する。固体残渣を、４０℃で、３×５００ｍＬの５：１体積のＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨを用い分解する。合わせた有機部分をろ過し、蒸発乾固し、アジドエチルマンノースをオフホワイトの固体として得る。
【０２９９】
ｃ．アジドエチルマンノースの再精製
３２ｇのアジドエチルマンノースを１００ｍＬの水に取る。混濁した溶液を、ガラス・マイクロファイバー・フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂ）によってろ過する。ろ液をロトベーパーで蒸発させ、固体とする。該固体をメタノール（１００ｍＬ）に取り、混濁した溶液を再び、ガラス・マイクロファイバー・フィルターでろ過する。得られた淡黄色ろ液を真空下、固体とする。
【０３００】
該固体を最小量のメタノール（５０ｍＬ）に取り、攪拌しながら、酢酸エチル（１５０ｍＬ）をゆっくり加える。重質のスラリーを冷却し、ろ過する。固体を空気乾燥（吸湿性）し、６０℃のオーブンに一晩置く。母液を真空蒸発させ、黄色のガム状物質を得る。
【０３０１】
実施例３−アジドエチルマンノビオース（ＡｚＥＢＭ）の合成
実施例２のＡｚＥＭ化合物を、ベンゼンジメチルエーテルを使用して選択的に保護し、カラムクロマトグラフィーで精製し、続いて臭化ベンジルと反応させ、１−α−（２−アジドエチル）−４，６−ベンズアルデヒドジアセタール−３−ベンジル−マンノピラノシドを得る。続いて、生成物を、厳密に無水条件下で、銀トリフレート化学を使用して、１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイルマンノピラノシドでグリコシル化し、保護されたアジドエチルマンノビオース生成物を得る。中間体生成物を脱保護し、ベンゾイル基を除去し、ＡｚＥＢＭを得る。
【０３０２】
実施例４−アジドエチルマンノトリオース（ＡｚＥＴＭ）の合成
ａ．１−ａ−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイル−マンノース
攪拌棒および窒素流入口を含む５００ｍＬの三口フラスコに、４０ｇ（６０．９ｍｍｏｌｅ）のペンタベンゾイルマンノースおよび８０ｍＬの塩化メチレンを加えた。得られた溶液を、氷浴で＜５℃に冷却し、８０ｍＬの３３％ＨＢｒ−酢酸溶液を、添加ロートによって、反応温度を＜１０℃に保つ速度で加えた。添加終了時（約３０分）、氷浴を取り外し、攪拌を３時間続けた。
【０３０３】
反応溶液を同体積（１６０ｍＬ）のＤＣＭで希釈し、水（２×５００ｍＬ）、飽和重炭酸塩（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で続けて抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶剤を蒸発させ、４１ｇの固体泡状物を得（理論収量：４０．１ｇ）、Ｎ２下冷凍庫で保存した。この物質は、さらに精製することなく使用した。反応は、ＴＬＣ：シリカゲル（ヘキサン／酢酸エチル、７／３）出発物質Ｒｆ０．６５、生成物Ｒｆ０．８ＵＶ視覚化によりモニターした。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．１１（ｄ，２Ｈ）、８．０１（ｍ，４Ｈ）、７．８４（ｄ，２Ｈ）、７．５８（ｍ，４Ｈ）、７．４１（ｍ，６Ｈ）、７．２８（ｔ，２Ｈ）、６．５８（ｓ，１Ｈ）、６．２８（ｍ，２Ｈ）、５．８（ｍ，１Ｈ）、４．７５（ｄｄ，１Ｈ）４．６８（ｄｄ，１Ｈ）４．５（ｄｄ，１Ｈ）。
【０３０４】
ｂ．１−アジドエチル−２，４−ジベンゾイルマンノース
攪拌棒、窒素流入口および３００ｍＬの無水アセトニトリルを含む１．０Ｌの三口フラスコに、２５ｇの１−アジドエチルマンノース（１００．４ｍｍｏｌｅ）および５０ｍＬのトリエチルオルソベンゾエート（２２０ｍｍｏｌｅ、２．２当量）を加えた。得られたスラリーを室温で攪拌し、０．８ｍＬ（１０ｍｍｏｌｅ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をそのまま加えた。溶液は、１０分以内に透明になり、攪拌をさらに２時間続け、次いで２５ｍＬの１０％ＴＦＡ水溶液を加え、攪拌をさらに２時間続け、中間体をエステル異性体に加水分解した。溶剤を真空蒸発させ、粘稠な油状物とし、これを５０ｍＬのＤＣＭで完全に粉砕し、再び蒸発させ、粘稠な油状物を得た。トルエン（７０ｍＬ）を該残基に加え、粘稠な溶液に２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースで種添加を行った。微細析出物が１５分以内に形成し、攪拌を室温で一晩続けた。得られた重質の懸濁液を、冷凍庫に２〜４時間置き、次いでろ過し、固体を氷冷したトルエン（２×１０ｍＬ）で洗浄した。固体を重さが一定になるまで風乾し、２１ｇ（ＴＹ：５０％異性体純度で２２．８５ｇ）の約９５％異性体純度を得た。生成物を４０ｍＬのトルエンに取り、１時間攪拌し、次いで冷凍庫にさらに２時間置いた。固体をろ過し、氷冷トルエンで洗浄（２×１０ｍＬ）し、重さが一定になるまで風乾し、１８．５ｇの単一異性体生成物、２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースを８３％の収率で得た。母液には、望ましくない異性体および少量の目的異性体が含有されていた。反応を、ＴＬＣ：ＳＧ（ヘキサン／酢酸エチル：７／３）出発物質Ｒｆ０．０、オルソエステル中間体Ｒｆ０．９（ヘキサン／酢酸エチル：８／２）ＳＭ  Ｒｆ０．８、目的異性体Ｒｆ０．４、望ましくない異性体Ｒｆ０．２で、モニターした。
【０３０５】
１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ８．１２（ｔ，４Ｈ）、７．６６（ｔ，２Ｈ）、７．５（ｍ，４Ｈ）、５．５６（ｔ，１Ｈ）、５．４８（ｍ，１Ｈ）、５．１４（ｍ，１Ｈ）、４．５（ｄｄ，１Ｈ）、４．０（ｍ，２Ｈ）、３．８（ｍ，３Ｈ）、３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）。
【０３０６】
ｃ．過ベンゾイル化−マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
攪拌棒、窒素流入口を供える１．０Ｌの三口フラスコに、１８５ｍＬのＤＣＭ中の４１ｇの粗１−ブロモ−テトラベンゾイルマンノース（６０．９ｍｍｏｌｅ、約２．５当量）を加えた。これに、１１．２ｇの２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノース（２４．５ｍｍｏｌｅ）、次いで１１．２ｇの４Ａシーブを加えた。スラリーを室温で１０分間攪拌し、メタノール／氷浴で−１５℃に冷却した。
【０３０７】
別の暗い容器に、１９０ｍＬのトルエン、続いて１５．１ｇの銀−トリフルオロメタンスルホネート（ＡｇＯＴｆ）（５８．８ｍｍｏｌｅ、２．４当量）を加え、暗所で溶液になるまで攪拌した。この溶液を大きな添加ロートに移し、反応物を光から保護しながら、攪拌している懸濁液に滴下した。ＡｇＯＴｆ添加速度を調整することにより、反応温度を＜−１０℃に維持した。添加が終了したとき（約３０分）、冷浴を取り外し、ＴＬＣ（ＳＧ、ヘキサン／酢酸エチル：７／３、ブロモＲｆ０．９、アジドＲｆ０．４、ｔｒｉｏｓ生成物Ｒｆ０．５、ｕｖ視覚化）によって測定し、単一生成物が残るまで反応物をさらに２時間攪拌した。
【０３０８】
トリエチルアミン（７ｍＬ、５．０当量）、次いで２００ｍＬのＤＣＭを加えた。得られたスラリーを、シリカゲルおよびセライトのパッドによりろ過し、２×７５ｍＬのＤＣＭで洗浄した。溶剤を真空蒸発させ、残渣を酢酸エチルに取り、水（２×１００ｍＬ）、重炭酸塩（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×７５ｍＬ）で順番に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶剤を真空蒸発させ、３９ｇの固体泡状物（ＴＹ３９．５ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ８．３（ｄ，２Ｈ）、８．２（ｍ，８Ｈ）、７．８５（ｄ，４Ｈ）、７．７５（ｄｄ，４Ｈ）、７．３−７．６５（ｍ，３０Ｈ）、７．２（ｔ，２Ｈ）、６．０５（ｍ，４Ｈ）、５．９（ｔ，２Ｈ）、５．６３（ｍ，２Ｈ）、５．３８（ｓ，２Ｈ）、５．１８（ｄ，１Ｈ）、４．６５（ｍ，４Ｈ）、４．５（ｍ，２Ｈ）、４．３５（ｍ，４Ｈ）、３，８（ｍ，２Ｈ）、３．５４（ｍ，２Ｈ）。
【０３０９】
ｄ．マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
３．０ｇの過ベンゾイル化−マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド（１．８６ｍｍｏｌｅ）の４０ｍＬのメタノール懸濁液に、攪拌しながら、０．２ｍＬの４．２８Ｍナトリウムメトキシドをメタノール中で加えた。得られた懸濁液を室温で２０時間攪拌し、透明溶液を得た。反応の終了を、ＴＬＣ（ＳＧ、ヘキサン／酢酸エチル：８／２  ＳＭ  Ｒｆ０．４、生成物Ｒｆ０．０）でモニターした。
【０３１０】
メタノールを真空蒸発させ、油状半固体を得た。残基を酢酸エチル（５０ｍＬ）に取り、３時間攪拌した。固体をろ過し、新しい酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、重さが一定になるまで風乾し、１．０９ｇ（ＴＹ１．０７ｇ）の生成物を得た。母液には、残余の安息香酸メチル、脱保護副生物が含有されていた。
【０３１１】
実施例５−アジドエチル−糖（ＡｚＥＧ、ＡｚＥＭ、ＡｚＥＢＭ、ＡｚＥＴＭ）からアミノエチル−糖（ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）を合成
パラジウム／炭素触媒、少量の酢酸、および溶剤としてエタノールを使用することによって、実施例１〜４の末端アジド化合物を、室温で直ちに水素化し、対応する末端アミン化合物を得る。図１に、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭの化学構造式を示す。試薬、溶剤などの量を水素化すべき糖−リガンドのモル数にあわせるべきであると当業者が理解すること以外は、プロセスは、ＡＥＴＭに関して以下に記載するものと同じである。
【０３１２】
ａ．マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アミノエチルマンノピラノシド（「アミノエチルトリマンノース」、ＡＥＴＭ）
５．３ｇ（９．２５ｍｍｏｌｅ）のマン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシドの１００ｍＬの水および５０ｍＬのエタノール溶液に、０．８ｇの５％Ｐｄ／Ｃを加えた。懸濁液を激しく攪拌しながら、３０〜４０ｐｓｉで４８時間、または出発物質がＴＬＣ（ＳＧ、メタノール、ＳＭ  Ｒｆ０．７５、Ｐｄｔ  Ｒｆ０．０，ＰＭＡ  ｖｉｓ．）で測定して現れなくなるまで水素化した。懸濁液をセライトでろ過し、これをエタノール（２×５０ｍＬ）で濯ぎ、ろ液を真空で濃縮した。
【０３１３】
この物質のＨＰＬＣ（Ｃ１８、３％アセトニトリル／９７％の０．１％Ｈ３ＰＯ４、２２０ｎｍ、２ｍｌ／分）により、Ｒｔ２．５分でインジェクション・カラム・ボイド物質のＵＶ吸着を得、ベンゾエートエステルを示していた。
【０３１４】
ろ液を、７０ｍＬの水および１２ｍＬの１ＮのＮａＯＨで希釈し、該溶液を室温で一晩攪拌した（ＨＰＬＣ：カラムボイドＲｔ２．５分でＵＶ物質なし、Ｒｔ１０．５分、安息香酸と共溶出でＵＶ物質）。２ｇの脱色木炭を加え、懸濁液を攪拌しながら８０℃に加熱し、室温に冷却し、セライトでろ過した。ろ液のｐＨを２ＮのＨＣｌで８．０に調整し、無色の溶液を真空下濃縮し、約５０％の体積とした。
【０３１５】
該溶液を樹脂カラム（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ、５０ｇ）に負荷し、残っているいかなる酸副生物も除去され、溶出画分のｐＨが中性になるまで（６×７５ｍＬ）水洗した。アミン生成物を、０．２５Ｎの水酸化アンモニウム（６×７５ｍＬ）でカラムから洗い落とし、アミン生成物−ニンヒドリン検出を含有する画分を合わせ、真空下濃縮し、２５〜３０ｍＬとした。この濃縮溶液を、攪拌されている３００ｍＬのエタノールに滴下し、さらに２時間攪拌を続けた。生成物をろ過し、新しいエタノール（２×５０ｍＬ）で洗浄し、重さが一定になるまで風乾した。得られた白色無定形固体を、さらに、真空オーブン中、８０℃で５時間乾燥し、４．１ｇの白色顆粒固体（ＴＹ５．１ｇ）を得た。ＮＭＲには、いかなる芳香族プロトンもなかった。１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（Ｄ２Ｏ）δ５．０８（ｓ，１Ｈ）、４．８７（ｓ，１Ｈ）、４．８１（ｓ，１Ｈ）、４．８−３．６（ｍ，１８Ｈ）、２．９（ｍ，２Ｈ）。
【０３１６】
実施例６−ＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンの合成
ａ．Ｆｍｏｃ−１−（Ｂ２９）−インスリン
典型的な合成では、４ｇの粉末インスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、室温で、１００ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、次いで４ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。該溶液を室温で３０分攪拌する。次に、１．２当量の９−フルオレニルメチルＮ−スクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ΝＨＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１．０ＭのＦｍｏｃ−ΝＨＳのＴＨＦ溶液としてインスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり加える。反応物を約１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０ｕｌのエタノールアミンを含有する原液４ｍｌを加えることにより、反応をクエンチし、次いで５分間混合する。クエンチ後、全溶液を１６００ｍｌのアセトンに注ぎ入れ、スパチュラで簡単に混合する。次に、１８．９％のＨＣｌ：水溶液のアリコートを８×４００μｌで混合物の表面に滴下し、反応インスリンを析出させる。次いで、析出した物質を遠心分離し、析出したケーキは取っておき、上澄みを第２ビーカーにデカントする。上澄み溶液に対し、別の１８．９％のＨＣｌ：水溶液のアリコートを８×４００μｌで混合物の表面に滴下し、反応インスリンの第２の析出物を得る。この第２の析出物を遠心分離し、上澄みは廃棄する。２つの析出ステップの遠心分離し、合わせたケーキを、アセトンで１回洗浄し、室温で真空乾燥し、粗粉末を得る。該粉末は、通常、２０％のＦｍｏｃ１生成物、６５％のＦｍｏｃ２生成物、および１５％の未反応インスリンを含有する。
【０３１７】
分取逆相ＨＰＬＣ方法を使用して、純粋な所望のＦｍｏｃ１−インスリンを粗粉末から単離する。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。粗粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂ混合物に溶解し、カラムに注入する前にシリンジろ過する。精製前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍ，１９×１５０ｍｍ）を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔｒａ  Ｐｒｅｐ  ６００システムで、７０％Ａ／３０％Ｂ移動相を用い１５ｍｌ／分で平衡化する。約５ｍｌの粗粉末の溶液を、５分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入し、その後、７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの線形勾配を３．５分間にわたって使用し、さらに２．５分間そこで維持する。この方法を使用して、未反応ＲＨ１ピーク、その後すぐのＦｍｏｃ２−インスリンピークの後、所望のＦｍｏｃ１ピークを約３分で溶出する。収集した時点で、溶液を、ロートバップし、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋なＦｍｏｃ１−インスリン粉末を得る。識別を、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で確認し、および複合部位を、Ｎ末端シークエンス解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により測定する。
【０３１８】
ｂ．ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ−（Ｂ２９）−インスリン
典型的な合成では、１ｇのＦｍｏｃ１−（Ｂ２９）−インスリンを室温で２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、次いで１ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。溶液を室温で３０分攪拌する。次に、０．３７９ｍｌ（２．２当量）のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート／ＴＨＦ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をインスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり加え、約１時間混合する。反応を５ｍｌのＤＭＳＯ中で、２５０ｕｌのエタノールアミンを含有する原液１ｍｌを添加してクエンチし、５分間混合する。クエンチ後、全溶液を４００ｍｌのアセトンに注ぎ入れ、スパチュラで簡単に混合する。次に、１８．９％のＨＣｌ：水溶液のアリコートを８×１００μｌで混合物の表面に滴下し、反応インスリンを析出させる。次いで、析出した物質を遠心分離し、析出したケーキは取っておき、上澄みを第２ビーカーにデカントする。上澄み溶液に対し、別の１８．９％のＨＣｌ：水溶液のアリコートを８×１００μｌで混合物の表面に滴下し、反応インスリンの第２の析出物を得る。この第２の析出物を遠心分離し、上澄みは廃棄する。２つの析出ステップの遠心分離した合わせたケーキを、アセトンで１回洗浄し、室温で真空乾燥し、粗粉末を得る。該粉末は、９０％を超える所望のＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１生成物を含有する。
【０３１９】
分取逆相ＨＰＬＣ方法を使用して、純粋なＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１−インスリンを粗粉末から単離する。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。粗粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂ混合物に溶解し、カラムに注入する前にシリンジろ過する。精製前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍ）を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔｒａ  Ｐｒｅｐ  ６００システムで、７０％Ａ／３０％Ｂ移動相を用い１５ｍｌ／分で平衡化する。約５ｍｌの粗粉末の溶液を、５分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入し、その後、７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの線形勾配を次の３．５分間にわたって使用し、さらに２．５分間そこで維持する。この方法を使用して、Ｆｍｏｃ１−インスリン出発物質の後、所望のＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１ピークを約５分で溶出する。収集した時点で、溶液を、ロートバップし、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋なＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ（Ｂ２９）−インスリン粉末を得る。識別を、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で確認し、および複合部位を、Ｎ末端シークエンス解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により測定する。
【０３２０】
ｃ．ＮＨ２−（Ｂ２９）−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリン
先のステップによって得られた凍結乾燥した粉末を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンに、４℃で３０分で溶解し、次いで、０．１５０ＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２緩衝液で１０倍希釈することによって、ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ（Ｂ２９）のＦｍｏｃ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを７．０と８．０との間に調整し、その後、物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、Ｆｍｏｃ、ＤＭＦおよび他の任意の混入塩を除去する。ＮＨ２−（Ｂ２９）−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンを、必要であれば、凍結乾燥して粉末とし、または望ましい場合は、水溶液で直接使用する。
【０３２１】
実施例７−有機溶剤での多価活性化エステルとのインスリン複合
Ｎ末端活性化エステルを含有する骨格を、６０ｍＭで、１ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、４００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。溶液を室温で１０分素早く攪拌する。平行して、１２２ｍＭのリガンド溶液を、適切な容量の無水ＤＭＳＯで調製する。溶解した時点で、十分な量のリガンド溶液を１０分にわたって滴下し、骨格上の活性化エステル基の数Ｎ−１に正確に等しい数の反応性等価物を得る。たとえば、骨格上にＮ＝３の活性化エステル基があれば、（１×（３−１）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝０．９８ｍｌのリガンド溶液を加える。骨格上にＮ＝４の活性化エステル基があれば、（ｌ×（４−ｌ）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝１．５ｍｌのリガンドを加える、など。リガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で２時間攪拌する。
【０３２２】
次いで、別に、インスリンを７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに８．１ｍＭの濃度で溶解する。溶解した時点で、全インスリン溶液を、１０分かけて骨格／ＤＭＳＯ／リガンド／ＴＥＡ溶液に加え、次いで室温でさらに２時間混合し、反応の完了を確実にする。
【０３２３】
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのｐＨ５．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液で１０倍希釈し、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０に調整する。該水溶液を、先ず、複合体化物質と複合体化されていない物質の所望の分離に適切な固相を使用する、サイズ排除によって精製する。次いでカラムボイド体積を通過した溶液を、適切なサイズの限外ろ過膜を使用して、約１０ｍｌに濃縮する。この溶液を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍカラム、１９×１５０ｍｍの分取逆相ＨＰＬＣを使用して、さらに精製し、目的生成物を得る。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製前に、カラムを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔｒａ  Ｐｒｅｐ  ６００システムで、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相を用い１５ｍｌ／分で平衡化する。約５ｍｌの粗溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入し、その後、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂまでの線形勾配を次の５分間にわたって、次いで７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのよりゆるやかな線形勾配を次の２２分間にわたって使用する。目的ピークの保持時間は、使用されるインスリン分子、骨格およびリガンドによって変化する。収集した時点で、溶液を、ロートバップし、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋な複合体を得る。その識別は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認してもよい。
【０３２４】
実施例８−保護されていないインスリンから有機溶剤で生成された多価糖を有するＢ２９−インスリン複合体
この実施例では、保護されていないインスリンにおいて、Ｌｙｓ−Ｂ２９ε−アミノ部分が最も反応性のあるアミンであり、次いでＡ１、次いでＢ１であるという事実を利用する。従って、保護されていないインスリンを使用する場合、得られた複合体は、Ｌｙｓ−Ｂ２９位が主に置換されているはずである。実施例７で記載した方法および組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８Ｄａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入したＴＳＡＴ−Ｃ６活性化エステル骨格から、以下のインスリン複合体を調製した。ＡＥＭおよびＡＥＴＭは、先に記載したように合成した。適切なサイズのサイズ排除溶媒は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外ろ過膜の分子量カットオフは、３ｋＤａであった。
【表２】
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【０３２５】
Ｎ末端シークエンス解析に従って、約８５％のＡＥＭ含有骨格を、Ｌｙｓ−Ｂ２９を介してインスリンに複合体化し、約８７％のＡＥＴＭ含有骨格を、Ｌｙｓ−Ｂ２９を介してインスリンに複合体化した。
【０３２６】
実施例９−水性溶剤中での多価活性化エステルとのインスリン複合
この実施例では、実施例７で記載した方法の変法であって、反応を有機溶剤の代わりに水性溶剤中で行う方法を記載する。
【０３２７】
Ｎ末端活性化エステルを含有する骨格を、６０ｍＭで６．２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、次いで２ｍｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。溶液を室温で１０分間素早く攪拌する。平行して、４４８ｍＭのリガンド溶液を、適切な容積の無水ＤＭＳＯで調製する。溶解した時点で、十分な量のリガンド溶液を１０分にわたって滴下し、骨格上の活性化エステル基の数Ｎの１．５倍−１に等しい数の反応性等価物を得る。たとえば、１つの骨格上にＮ＝３の活性化エステル基があれば、（１．５×（３−１）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝２．５ｍｌのリガンド溶液を加える。１つの骨格上にＮ＝４の活性化エステル基があれば、（１．５×（４−ｌ）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝３．８ｍｌのリガンド溶液を加える、など。リガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で１時間攪拌する。
【０３２８】
次いで、インスリン分子を別に１７．２ｍＭで、２．６７ｍｌの０．１ＭのｐＨ１１の炭酸ナトリウム緩衝液に溶解し、続いて１．０Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを１０．８に調整する。溶解した時点で、全骨格／ＤＭＳＯ／リガンド／ＴＥＡ溶液を、インスリン／炭酸塩緩衝溶液に、７５分で滴下する。添加の間、必要であれば、希ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用して、得られる混合物のｐＨを５分毎に１０．８に調整する。滴下添加の後、溶液をさらに１５分攪拌し、反応の完了を確実にする。
【０３２９】
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのｐＨ５．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液に１０倍希釈し、次いで希ＨＣｌでｐＨを最終ｐＨ８．０に調整する。該水溶液を、先ず、複合体化物質と複合体化されていない物質の所望の分離に適切な固相を使用する、サイズ排除によって精製する。次いでカラムボイド体積を通過した溶液を、適切なサイズの限外ろ過膜を使用して、約４０ｍｌに濃縮する。この溶液を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍカラム、１９×１５０ｍｍの分取逆相ＨＰＬＣを使用して、さらに精製し、目的生成物を得る。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製前に、カラムを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔｒａ  Ｐｒｅｐ  ６００システムで、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相を用い１５ｍｌ／分で平衡化する。約５ｍｌの粗溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入し、その後、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂまでの線形勾配を次の５分間にわたって、次いで７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのよりゆるやかな線形勾配を次の２２分間にわたって使用する。目的ピークの保持時間は、使用されるインスリン分子、骨格およびリガンドによって変化する。収集した時点で、溶液を、ロートバップし、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋な複合体を得る。その識別は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認する。
【０３３０】
実施例１０−保護されていないインスリンから水性溶剤中で合成されたＢ２９−ＡＥＭ−２−インスリン複合体Ｉ−７
この実施例は、保護されていないインスリンにおいて、Ｌｙｓ−Ｂ２９ε−アミノ部分が最も活性のあるアミンであり、次いでＡ１、次いでＢ１であるという事実を利用する。従って、保護されていないインスリンを使用する場合、得られた複合体は、Ｌｙｓ−Ｂ２９位が主に置換されているはずである。実施例９で記載した方法および組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、ＡＥＭ−２インスリン複合体を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入した、ＴＳＡＴ−Ｃ６活性化エステル骨格を使用して調製した。インスリン類縁体として使用されるＡＥＭは、先に記載したように合成した。適切なサイズのサイズ排除溶媒は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外ろ過膜の分子量カットオフは、３ｋＤであった。最終生成物（ＨＰＬＣによる純度９５％）は、６７２９ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）の所望のＭＷを有し、１インスリン当たり計２．０個のＡＥＭ分子の複合体化が示され、Ｌｙｓ−Ｂ２９部位で複合体化する複合体分子が８５％を超える（Ｎ末端シークエンス解析）ことがわかった。
【０３３１】
実施例１１−ウシおよびブタのような他の種からの天然のインスリンを使用して調製された複合体
他の種のインスリンであって、少なくとも１つの反応性アミン官能基を含有するインスリン（たとえば、ウシおよびブタインスリン）を、組換えヒトインスリンを複合体化するために使用される任意の方法を使用して結合してもよい。当業者は、ウシまたはブタインスリンから生成された複合体の分子量は、以下の表に挙げる量だけ、組換えヒトインスリンから生成したものとは異なることを理解する。
【表３】
2012516342.tif 000038
【０３３２】
また当業者は、ウシまたはブタインスリンから生成された複合体は、インスリン間の構造における小さな相違により、ヒトインスリンから生成された複合体と僅かに異なるクロマトグラフピークの保持時間を有し得ることを理解する。
【０３３３】
実施例１２−リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギンおよびデテミールのようなインスリン類縁体で調製した複合体
少なくとも１個の反応性アミン官能基を含有する公知の全てのインスリン類縁体（たとえば、リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギンおよびデテミール）は、組換えヒトインスリンを複合体化するために使用される任意の方法を使用して結合してもよい。当業者は、インスリン類縁体から生成された複合体の分子量は、以下の表に挙げる量だけ、組換えヒトインスリンから生成したものとは異なることを理解する。
【表４】
2012516342.tif 000039
【０３３４】
また当業者は、インスリン類縁体から生成された複合体は、インスリン間の構造における小さな相違により、ヒトインスリンから生成された複合体と僅かに異なるクロマトグラフピークの保持時間を有し得ることを理解する。
【０３３５】
実施例１３−ＡＥＭ−２−ＴＳＡＴ−Ｃ６−インスリン複合体のＢ２９−置換変種のＰＫおよび生物活性
この実施例では、例示的な複合体を皮下投与して得た、血清インスリンおよび血中グルコースの低下プロフィールを記載する。図２の例示的な複合体Ｉ−７は、骨格としてＴＳＡＴ−Ｃ６、リガンドとしてＡＥＭ、および組換えヒトインスリンを使用して合成し、Ｂ２９−置換複合体を生成した。この場合、５Ｕ／ｋｇの複合体を、絶食させた、正常な非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝３）の首の後ろに注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、０分、および注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後に集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（ヒトインスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。図３でわかるように、皮下注射の後、Ｂ２９−置換複合体は、血清から素早く吸収され、排出される。
【０３３６】
実施例１４−リガンド親和力を関数とする、ＰＫおよび生物活性におけるａ−ＭＭの効果
この実施例では、ＴＳＡＴ−Ｃ６骨格を使用し、実施例９に記載した方法に従って、以下の複合体を合成した（注：グルコサミンＨＣｌまたはＧＡ−ＨＣｌは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、さらに精製を行わずに使用した）：
【表５】
2012516342.tif 000040
【０３３７】
Ｎ末端シークエンス解析によれば、糖含有骨格のそれぞれ約９０％が、Ｌｙｓ−Ｂ２９を介してインスリンに複合体化された。ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２（Ｂ２９）およびＴＳＡＴ−Ｃ６−ＧＡ−２（Ｂ２９）を、それぞれ、複合体Ｉ−７およびＩ−５として図２に示す。
【０３３８】
複合体（５Ｕ／ｋｇ）を、絶食させた、正常な非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝３）の首の後ろに注射した。１５分遅れて、４ｇ／ｋｇ用量のａ−ＭＭを腹腔内注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、０分、および最初の複合体注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後に集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＳＯインスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。コントロールは、１５分後に、ａ−ＭＭの代わりに生理食塩水を注射することによって行った。
【０３３９】
図４および図５は、それぞれＩ−７およびＩ−５のｓｕｂ−Ｑ注射の１５分後にａ−ＭＭを腹腔内注射して得られた結果を示す。示されているように、ａ−ＭＭの注射により得られるＰＫ／ＰＤプロフィールの増加は、生理食塩水を注射されたコントロール群と比較して、複合体Ｉ−７は、非常に有意（ｐ＜０．０５）であった。Ｉ−５複合体のプロフィールは、ａ−ＭＭ注射によって影響されなかった。
【０３４０】
実施例１５−リガンドの原子価を関数とする、ＰＫおよび生物活性におけるａ−ＭＭの効果
この実施例では、数が増えている例示的な糖リガンドが、共有結合で結合している複合体の薬物動態および薬力学的挙動の測定を試みた。全ての複合体は、実施例９に記載された方法に従って、以下に特定する骨格および糖リガンドを使用して合成した。
【表６】
2012516342.tif 000041
【０３４１】
Ｎ末端シークエンス解析によれば、糖含有骨格のそれぞれ約９０％が、Ｌｙｓ−Ｂ２９を介してインスリンに複合体化された。複合体を、Ｉ−８、Ｉ−９、Ｉ−１０およびＩ−１１として図２に示す。
【０３４２】
前記表に記載された複合体に関して、実施例１４で記載したものと同じ種類の実験を繰返した。各実験で、同じ用量の複合体（５Ｕ／ｋｇ）を、絶食させた、正常な非糖尿病のラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００−５００ｇ、ｎ＝３）の首の後ろに注射した。
【０３４３】
１５分遅れて、４ｇ／ｋｇ用量のａ−ＭＭを腹腔内注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、０分、および最初の複合体注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後に集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＳＯインスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。コントロールは、１５分後に、ａ−ＭＭの代わりに生理食塩水を注射することによって行った。
【０３４４】
図６および図７は、それぞれ、Ｉ−８およびＩ−９のｓｕｂ−Ｑ注射の１５分後にａ−ＭＭを腹腔内注射して得られた結果を示す。示されているように、ａ−ＭＭの注射により得られるＰＫ／ＰＤプロフィールの増加は、生理食塩水を注射されたコントロール群と比較してＩ−９は非常に有意（ｐ＜０．０５）で、Ｉ−８はこれより劣った。
【０３４５】
図８および図９は、それぞれ、Ｉ−１０およびＩ−１１のｓｕｂ−Ｑ注射の１５分後にａ−ＭＭを腹腔内注射して得られた結果を示す。示されているように、ａ−ＭＭの注射により得られるＰＫ／ＰＤプロフィールの増加は、生理食塩水を注射されたコントロール群と比較して、Ｉ−１１は非常に有意（ｐ＜０．０５）で、Ｉ−１０はこれより僅かに劣った。
【０３４６】
実施例１６−インビボ半減期／排出速度の比較
例示的な複合体を使用して、複合体化されていないインスリンと対比して、これらが血清からのインビボで除去される速度を測定するために、以下の実験を行った。この実験で使用した複合体は、全て、実施例９で記載した一般的方法に従って合成した。
【０３４７】
各実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０〜４００ｇ、ｎ＝３）に、溶解性複合体を、０．４ｍｇの複合体／ｋｇ体重で投薬した。無菌複合体溶液またはコントロールインスリンを、１つのＪＶカニューレを介して静脈に注射し、直後にヘパリン−生理食塩水のチェイス溶液を注射し、服用させた全ての複合体が動物に投与されることを確実にした。第二のカニューレは、ｔ＝０（投与前）、および投与後、１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分で血液サンプルを集めるために使用した。
【０３４８】
市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。
【０３４９】
図１０は、ＲＨＩまたは図２にＩ−６として示すＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２複合体の血清濃度を、静脈注射後の時間の関数として示す。明らかに、Ｉ−６は、ＲＨＩより非常に素早く血清から排出されている。データは、以下の一般式：Ｃ（ｔ）＝ＡｏＥＸＰ（−ａｔ）＋ＢｏＥＸＰ（−ｂｔ）（式中、ｔは時間であり、Ｃ（ｔ）は、時間を関数とする血清中の濃度であり、Ａｏは、第一分画濃度定数であり、ａは、第一分画指数時間定数であり、Ｂｏは、第二分画濃度定数であり、およびｂは、第二分画指数時間定数である）を持つ２分画２項分布モデルを使用した場合、最良適合を示す。各分画と関連する排出半減期（単位：分）は、ｔ１／２（ａ）＝０．６９３／ａおよびｔ１／２（ｂ）＝０．６９３／ｂである。図１０において、ＲＨＩに関して、ｔ１／２（ａ）＝０．７６およびｔ１／２（ｂ）＝１１．４６、およびＩ−６に関して、ｔ１／２（ａ）＝０．４７およびｔ１／２（ｂ）＝２．８７である。換言すれば、Ｉ−６のｔ１／２（ｂ）は、ＲＨＩのｔ１／２（ｂ）より約４倍短い。
【０３５０】
以下の表に、先に記載した手法と正確に同一の手法を使用して試験した数多くの複合体のｔｌ／２パラメータをまとめる。（構造は図２に示されている）
【表７】
2012516342.tif 000042
【０３５１】
このデータは、例示的な複合体は、複合体化されていないインスリンより素早く血清から排出され、その程度は、内在性レクチンの特定の複合体の親和力と複合体当たりの置換されたリガンドの数とによって左右されるという仮説と一致する。
【０３５２】
実施例１７−グルコース注入下のインビボ半減期／排出速度
この実施例では、例示的な複合体の排出速度は、生理的濃度のグルコースの存在下で抑制され得るとさらに仮定した。高血糖状態下で、複合体がインビボで血清から排出される速度を測定するために、以下の実験を行った。各実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０〜４００ｇ、ｎ＝３）に、Ｉ−７を、０．４ｍｇの複合体／ｋｇ体重で投薬した。
【０３５３】
実験開始の１時間前に、１匹のラットのカニューレを、無菌５０％ｗ／ｖグルコース溶液を含有するシリンジ注入ポンプに接続した。ポンプ注入速度は、実験者によって調整され、実験中の全ての時間で、動物が、３００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値を維持することを確実にした。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。典型的な実験では、動物が３００ｍｇ／ｄＬを上回る濃度を保持するために必要な注入ポンプ速度は、通常、８５ｕＬ／分を超えることがわかった。血液サンプルを、ｔ＝０分に取り、その後、無菌複合体溶液またはコントロールインスリンを、第二ラットカニューレを介し、静脈内に注射し、その直後にヘパリン−生理食塩水のチェイス溶液を注射し、服用させた全ての複合体が動物に投与されることを確実にした。ヘパリン−生理食塩水のカニューレラインによる追加の流し込みの後、第二カニューレを使用して、血液サンプルを、投与からｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分後に集めた。
【０３５４】
各時点の血液を４℃で遠心分離し血清を集め、続いて、血清インスリンまたは血清複合体濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。インスリンまたは複合体血清濃度対時間データは、２分画モデルに従う２つの独立した減衰指数の合計（Ｃ（ｔ）＝ａ  ｅｘｐ（−ｋａｔ）＋ｂ  ｅｘｐ（−ｋｂｔ））（式中、ｔ１／２（ａ）＝（Ｉｎ２）／ｋａおよびｔ１／２（ｂ）＝（Ｉｎ２）／ｋｂに最良適合を示した。以下の表に、グルコース注入を伴うまたは伴わないＩ−７のｔ１／２パラメータを、実施例１６のＲＨＩで得られたものとともにまとめる。
【表８】
2012516342.tif 000043
【０３５５】
これらのデータから、グルコースは、この複合体の血清からの排出の加速を阻害し、それによりフェーズｂの排出半減期を２．７７分から５．１１分と２倍にできると結論付けることができる。
【０３５６】
実施例１８−ａ−ＭＭ注入下のインビボ半減期／排出速度
この実施例では、任意の高濃度のグルコース以外の抑制作用のある糖、たとえば、α−メチル−マンノース（ａ−ＭＭ）の存在により、インスリン複合体の排出速度が抑制され得るとさらに仮定した。ａ−ＭＭの存在下、例示的な複合体がインビボで血清から排出する速度を測定するために、以下の実験を行った。それぞれの実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０〜４００ｇ、ｎ＝３）に、可溶性複合体を、０．４ｍｇの複合体／ｋｇ体重で投薬した。
【０３５７】
実験開始の１時間前に、１匹のラットのカニューレを、無菌２５％ｗ／ｖ  ａ−ＭＭ溶液を含有するシリンジ注入ポンプに接続した。ポンプ注入速度は、実験者によって調整されたが、通常、８５ｕＬ／分に設定した。血液サンプルを、ｔ＝０分に取り、その後、無菌複合体溶液またはコントロールインスリンを、第二ラットカニューレを介し、静脈内に注射し、その直後にヘパリン−生理食塩水のチェイス溶液を注射し、服用させた全ての複合体が動物に投与されることを確実にした。ヘパリン−生理食塩水のカニューレラインによる追加の流し込みの後、第二カニューレを使用して、血液サンプルを、投与から、ｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分後に集めた。
【０３５８】
さらに、市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。各時点の血液を４℃で遠心分離し血清を集め、続いて、血清インスリンおよび血清複合体濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。インスリンまたは複合体血清濃度対時間データは、２分画モデルに従う２つの独立した減衰指数の合計（Ｃ（ｔ）＝ａ  ｅｘｐ（−ｋａｔ）＋ｂ  ｅｘｐ（−ｋｂｔ））（式中、ｔ１／２（ａ）＝（Ｉｎ２）／ｋａおよびｔ１／２（ｂ）＝（Ｉｎ２）／ｋｂ）に、最良適合を示した。以下の表に、ａ−ＭＭ注入を伴うまたは伴わないＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２複合体のｔ１／２パラメータを、実施例１７のグルコースを注入したものおよび実施例１６の糖注入のないＲＨＩのものとともにまとめる。
【表９】
2012516342.tif 000044
【０３５９】
本発明者らはこれらのデータから、ａ−ＭＭの投与により、この複合体の血清排出の加速が阻害されるばかりではなく、グルコースの投与より幾分その度合いが広がると結論付けることができる。この場合、フェーズｂ排出半減期は、２．７７分から１０．０９分と、４倍近くなる。
【０３６０】
実施例１９−プロタミン、亜鉛および他の賦形剤を使用する持続型インスリン複合体
持続型複合体を生成するために、本発明者らは、実施例９の方法に基づいて調製したＢ２９−置換複合体からＰＺＩ（プロタミン亜鉛インスリン）製剤を調製した。これらの製剤で使用された賦形剤は、プロタミン、亜鉛、ｍ−クレゾールおよび塩を含み、これらは全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販品を購入する。これらの成分の濃度は、最適な平坦な持続した吸収速度を得るために、変更してもよい。さらに、場合によっては、少量の無修飾インスリンの添加は、製剤の安定化の助けになることがわかった。これらの場合、サンプルにおいて含有される無修飾インスリンの濃度は、最適な平坦な持続した吸収速度を得るために、変更される。試験した全ての製剤において、以下の処方レシピを使用した。
【表１０】
2012516342.tif 000045
【０３６１】
特に明記しない限り、先の表に記載した順番で成分を添加した後、製剤を調製すると、インビボ試験の前に、それらを、３０分十分混合した。
【０３６２】
特定の製剤の徐放性プロフィールおよびグルコース−応答性ＰＫプロフィールを試験するため、以下の実験を行った。製剤を、所定の用量で（特に明記しない限り、殆どの実験で、約１５Ｕ／ｋｇ）で、絶食させた、正常な非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝３）の首の後ろに注射した。２４０分遅れて、グルコース用量（４ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。血液サンプルを、尾血管出血で、０分および最初の複合体注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後に集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。製造業者のアッセイ明細書によれば、Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡは、ラットインスリンに７１％の交差反応性を示す。各サンプルで検出される内在性ラットインスリンの量を最小限にするため、血清サンプルを１０倍希釈したが、ラットインスリン検出の可能性は、完全に除外することができなかった。従って、結果を、一般的に、「測定インスリン」として報告するが、これは、実験によっては、複合体またはＲＨＩの他に、ある量の内在性ラットインスリンを含む可能性がある。しかし、以下の各実施例で収集された全てのサンプルは、同じように処置され、特性の相違に関し、直接比較することができる。
【０３６３】
実施例２０−持続型インスリン複合体特性におけるプロタミン濃度の効果
この実施例の目的は、例示的な複合体の時間動作におけるプロタミン濃度の効果およびグルコース−応答性ＰＫプロフィールを示すことであった。この実施例では、実施例９に記載の方法に従って合成したＩ−６を全身性製剤および実施例１９で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
【表１１】
2012516342.tif 000046
【表１２】
2012516342.tif 000047
【０３６４】
４時間グルコース腹腔内注射（４ｇ／ｋｇ）実験を、１５Ｕ／ｋｇ（体重（単位：ｇ）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）の先に記載した３種の製剤のそれぞれを投与することにより行った。図１１ａ〜ｃに示した結果は、製剤中のプロタミン濃度の増加に伴って、得られる製剤の遅延性は増加し、４時間後のグルコース注射での血清インスリンプロフィールにおける測定増加が顕著になることを示している。１×Ｐ−１×Ｚ製剤は、注射直後の短時間に、グルコース腹腔内注射後に微小シグナルしか検出しないように、大部分のインスリン複合体負荷量を放出する。一方、１０×Ｐ−４×Ｚ製剤は、低い基本量のインスリンを、低血糖症状を伴わずに、最初の４時間にわたって放出し、続いて、グルコース腹腔内注射の直後、測定インスリン濃度は、＞４倍の増加に達する。
【０３６５】
実施例２１−持続型インスリン複合体特性における亜鉛濃度の影響
この実施例の目的は、例示的な複合体の製剤安定性、時間動作およびグルコース−応答性ＰＫプロフィールにおける亜鉛濃度の効果を示すことであった。この実施例では、実施例９に記載の方法に従って合成したＩ−６を全身性製剤および実施例１９で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
【表１３】
2012516342.tif 000048
【表１４】
2012516342.tif 000049
【０３６６】
４時間グルコース腹腔内注射（４ｇ／ｋｇ）実験を、１５Ｕ／ｋｇ（体重（単位：ｇ）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）の先に記載した４種の製剤のそれぞれを、投与することにより行った。図１２ａ〜ｂおよび１３ａ〜ｂの結果は、実験誤差内で、亜鉛濃度は、製剤の全体徐放性またはグルコース−応答性プロフィールに関して有意な効果はないことを示す。全ての実験で、グルコースの腹腔内注射の後、測定インスリン濃度において統計学的に有意な増加が観察された。実施例２０で示したように、亜鉛濃度に関係なく、より高いプロタミン（１０×Ｐ）製剤はより低いプロタミン（４×Ｐ）製剤より少ない複合体を時間をかけて放出する。しかし、製剤を室温で２４時間を超える時間放置した場合、両１０×Ｐ製剤は、易分散性粒子溶液から粘着性のある、凝集した、２相溶液に変換された。これは、対応する１０×Ｐ−４×Ｚ製剤には起こらなかった。同様に、４×Ｐ−１×Ｚ製剤は、１０×Ｐ−１×Ｚ製剤と同じように変換され、一方４×Ｐ−２×Ｚは、数週間も室温で確実に安定であることがわかった。従って、あるプロタミン濃度に関する亜鉛濃度は、長時間安定な、易分散性製剤を調製するように、調整することができる。
【０３６７】
実施例２２−持続型インスリン複合体特性におけるｍ−クレゾール濃度の効果
この実施例の目的は、例示的な複合体の時間動作およびグルコース−応答性ＰＫプロフィールにおけるｍ−クレゾール濃度の効果を示すことであった。この実施例では、実施例９に記載の方法に従って合成したＩ−６を全身性製剤および実施例１９で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
【表１５】
2012516342.tif 000050
【表１６】
2012516342.tif 000051
【０３６８】
４時間グルコース腹腔内注射（４ｇ／ｋｇ）実験を、１５Ｕ／ｋｇ（体重（単位：ｇ）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）の先に記載した２種の製剤のそれぞれを投与することにより行った。図１４ａ〜ｂの結果は、ｍ−クレゾールの存在により、より遅延性のある製剤を維持することを示す。クレゾールを含まない製剤は、注射直後の短時間に、グルコース腹腔内注射を行った場合測定インスリン濃度の非常に少ない増加が観察されるように、大部分のインスリン複合体負荷量を放出する。一方、４×クレゾール製剤は、低い基本量のインスリンを、低血糖症状を伴わずに、最初の４時間にわたって放出し、続いて、グルコース腹腔内注射の直後、測定インスリン濃度は、３〜４倍の増加に達する。
【０３６９】
実施例２３−持続型インスリン複合体特性における塩／等張剤濃度の効果
この実施例の目的は、例示的な複合体の時間動作およびグルコース−応答性ＰＫプロフィールにおける塩濃度および等張剤の選択を示すことであった。この実施例では、実施例９に記載の方法に従って合成したＩ−６を全身性製剤および実施例１９で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
【表１７】
2012516342.tif 000052
【表１８】
2012516342.tif 000053
【０３７０】
４時間グルコース腹腔内注射（４ｇ／ｋｇ）実験を、１５Ｕ／ｋｇ（体重（単位：ｇ）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）の先に記載した３種の製剤のそれぞれを投与することにより行った。図１５ａ〜ｃの結果は、製剤中に塩が存在することにより、より遅延性のある製剤を維持することを示す。塩を含まない製剤は、実験の最初の４時間で、グルコース腹腔内注射を行った場合測定インスリン濃度の非常に少ない増加が観察されるように、大部分のインスリン複合体負荷量を放出する。一方、３．３×塩製剤は、低い基本量の複合体を、低血糖症状を伴わずに、最初の４時間にわたって放出し、続いて、グルコース腹腔内注射の直後、測定インスリン濃度は、約４倍の増加に達する。この特性は、実施例２０の１０×Ｐ−４×Ｚ製剤で得られたものと類似し、これは、３．３×塩製剤と全く同じであるが、約１／３の塩濃度（５．０Ｍに対して１．５Ｍ）しか含有していなかった。最後に、等張剤としてグリセロールをＮａＣｌの代わりとしても、製剤の遅延性に対して悪い影響は与えないようである。
【０３７１】
実施例２４−持続型インスリン複合体特性における無修飾インスリン濃度の効果
この実施例の目的は、例示的な複合体の時間動作およびグルコース−応答性ＰＫプロフィールにおける異なる濃度を含む無修飾インスリンの効果を示すことであった。この実施例では、実施例９に記載の方法に従って合成したＩ−６を全身性製剤および実施例１９で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
【表１９】
2012516342.tif 000054
【表２０】
2012516342.tif 000055
【０３７２】
４時間グルコース腹腔内注射（４ｇ／ｋｇ）実験を、１５Ｕ／ｋｇ（体重（単位：ｇ）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）の先に記載した３種の製剤のそれぞれを投与することにより行った。図１６ａ〜ｃの結果は、製剤中に無修飾インスリンが存在することにより、グルコース腹腔内注射後に測定インスリン濃度が実質的に増加する、より遅延性のある製剤が、有利に生成することを示す。さらに、無修飾インスリンの存在は、数週間室温での温置後でも製剤の特性を維持する助けにもなる（以下の実施例２６参照）。
【０３７３】
実施例２５−持続型インスリン複合体−用量応答効果
この実施例では、本発明者らは、例示的な持続型複合体の特定の製剤の用量応答効果を評価した。実施例９に記載の方法に従って合成した複合体Ｉ−６を全身性製剤および実施例１９で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
【表２１】
2012516342.tif 000056
【０３７４】
４時間グルコース腹腔内注射（４ｇ／ｋｇ）実験を、１５Ｕ／ｋｇ（体重（単位：ｇ）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）の先に記載した製剤を、投与することにより行った。
【０３７５】
複合体は、図１７に示すように、グルコースが注射されるまで平坦なＰＫプロフィールを示した。グルコース腹腔内注射後の測定インスリン濃度の増加は劇的で、用量依存性であった（複合体用量５Ｕ／ｋｇ（左）および１５Ｕ／ｋｇ（右）で得たデータを比較）。
【０３７６】
実施例２６−例示的な持続型グルコース応答性複合体の安定性
この実施例では、本発明者らは、実施例２５の持続型製剤と正確に同じ製剤を２倍スケールで合成した。物質の半分を２〜８℃で、残りの半分を室温で１週間または２週間保存した。特定した保存時間後、物質を再分散し、実施例２５で記載したものと同じ４時間グルコース腹腔内注射プロトコルを使用して、１５Ｕ／ｋｇの用量で（体重（単位：ｇ）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）試験した。図１８〜１９に示すように、この製剤は、少なくとも２週間、冷凍保存後（図１８）または室温保存後（図１９）であっても、類似した性能を示した。
【０３７７】
実施例２７−様々なリガンド親和力および多原子価を持つ複合体から調製された持続型複合体の性能
この実施例では、本発明者らは、異なる種類および数のリガンドから作られた複合体の持続型製剤の時間動作およびグルコース−応答性ＰＫプロフィールの測定を試みた。この実施例の全ての複合体は、以下に明記する骨格および糖リガンドを使用して実施例９に記載する方法に従って合成した。
【表２２】
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【０３７８】
以下の持続型製剤を各複合体として使用した。
【表２３】
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【０３７９】
４時間グルコース腹腔内注射（４ｇ／ｋｇ）実験を、１５Ｕ／ｋｇ（体重（単位：ｇ）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）の先に記載した複合体それぞれを投与することにより行った。図２０で示すように、全ての複合体が、４時間グルコース注射後、測定血清インスリン濃度の何らかの増加を伴った、遅延性の吸収プロフィールを示した。持続型ＴＳＰＥ−ＡＥＴＭ−３複合体Ｉ−１１の注射後、最初の４時間内に、何らかの有意な複合体吸収があったようである。しかし、他の複合体は全て、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２複合体で観察されたような、平坦な吸収プロフィールを示した。これらの結果は、これらの複合体の半減期は、全て、実施例１６〜１７で記載したような無修飾インスリンより短く、それらはそれぞれ、実施例１４、１５で記載したような、ａ−ＭＭで誘発されたＰＫ／ＰＤプロフィールの増加を示すという事実とよく相関している。
【０３８０】
実施例２８−ＩＰ  ａ−ＭＭ試験条件下での持続型複合体の性能
この実施例では、本発明者らは、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２（Ｉ−６）およびＴＳＡＴ−Ｃ６−ＧＡ−２（Ｉ−５）複合体から造った複合体の持続型製剤のａ−ＭＭ−応答性プロフィールを試験した。両複合体とも、実施例９に記載された一般的方法に従って調製した。さらに、各複合体について、以下の持続型製剤を使用した。
【表２４】
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【０３８１】
製剤の徐放性およびａ−ＭＭ−応答性ＰＫプロフィールを試験するため、以下の実験を行った。製剤を１５Ｕ／ｋｇ（体重（単位：グラム）／１．８７＝マイクロリットル、注入量）で、絶食させた、正常な非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝３）の首の後ろに注射した。２４０分遅れてａ−ＭＭ容量（４ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、０分、および最初の複合体注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後に集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。
【０３８２】
図２１ａに示されるように、持続型ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２（Ｉ−６）製剤のａ−ＭＭ腹腔内注射後のピーク：ベースライン血清濃度比は、ａ−ＭＭの代わりにグルコースを用いた同じ製剤で観察される比より幾分高い。さらに、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＧＡ−２（Ｉ−５）製剤（図２１ｂ）は、ａ−ＭＭ注射後、血清複合体濃度の増加を示していない。これらの結果は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＧＡ−２（Ｉ−５）複合体の排出半減期は無修飾インスリン（実施例１６）と殆ど同じであり、該複合体は、ＰＫにおけるａ−ＭＭ−誘発変化（実施例１４）を示さないという事実とよく相関している。
【０３８３】
実施例２９−糖尿病および非糖尿病における持続型複合体
持続型ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２（Ｉ−６）製剤のインビボでの有用性を確認するために、本発明者らは、これを（５、１０および２０Ｕ／ｋｇ）、正常およびＳＴＺ−誘発糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）に投与した。製剤は、以下の手法を使用して調製した。
【表２５】
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【０３８４】
複合体の生物活性を誘引するために、グルコースの外部腹腔内注射は使用しなかった。代わりに、本発明者らは、複合体製剤のＰＫおよびＰＤプロフィールをコントロールするために、ラットの体内のグルコースの内在性レベルを当てにした。血液サンプルを、尾血管出血によって、最初の複合体注射後、種々の時点で集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。図２２に示すように、正常または糖尿病ラットに、早いまたは遅い時点で、低血糖症状は観察されなかった。糖尿病ラットで観察されたグルコースプロフィールは劇的であり、複合体は、より高いグルコース濃度によって活性化され、長い時間にわたり（最高用量で８時間にわたる）用量比例的にグルコース降下作用を発揮したことを示す。
【０３８５】
実験を、異なる用量（７、１４および２８Ｕ／ｋｇ）を用い、より長い時間（２４時間）で繰返した。該実験で得られた結果を図２３に示す。
【０３８６】
実施例３０−インビボ半減期／排出速度比較
Ｉ−６複合体がグルコースまたはａ−ＭＭのような抑制糖質の存在化または不存在下で、血清からインビボで排出される速度を測定するために、以下の実験を行った。各実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０〜４００ｇ、ｎ＝３）に、溶解性複合体（またはコントロールとしてＲＨＩ）を、０．４ｍｇ複合体／ｋｇ体重で投薬した。
【０３８７】
上昇するグルコース濃度の存在下での排出速度を測定するため、実験開始の１時間前に、１匹のラットのカニューレを、無菌５０％ｗ／ｖグルコース溶液を含有するシリンジ注入ポンプに接続した。ポンプ注入速度は、実験者によって調整され、実験中の全ての時間で、動物が、３００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値を維持することを確実にした。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。典型的な実験では、動物が３００ｍｇ／ｄＬを上回る濃度を保持するために必要な注入ポンプ速度は、通常、８５ｕＬ／分を超えることがわかった。血液サンプルを、ｔ＝０分に取り、その後、無菌複合体溶液またはコントロールインスリンを、第二ラットカニューレを介し、静脈内に注射し、その直後にヘパリン−生理食塩水のチェイス溶液を注射し、複合体用量の全てが動物に投与されることを確実にした。ヘパリン−生理食塩水のカニューレラインによる追加の流し込みの後、第二カニューレを使用して、血液サンプルを、投与からｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分後に集めた。
【０３８８】
ａ−ＭＭ存在下での排出速度を測定するため、実験開始の１時間前に、１匹のラットのカニューレを、無菌２５％ｗ／ｖ  ａ−ＭＭ溶液を含有するシリンジ注入ポンプに接続した。ポンプ注入速度は実験者によって調整されたが、通常、８５ｕＬ／分に設定された。血液サンプルを、ｔ＝０分に取り、その後、無菌複合体溶液またはコントロールインスリンを、第二ラットカニューレを介し、静脈内に注射し、その直後にヘパリン−生理食塩水のチェイス溶液を注射し、複合体用量全てが動物に投与されることを確実にした。ヘパリン−生理食塩水のカニューレラインによる追加の流し込みの後、第二カニューレを使用して、血液サンプルを、投与からｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分後に集めた。
【０３８９】
実験全体を通して、血糖値は、市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して測定した。各時点の血液を４℃で遠心分離し血清を集め、続いて、血清インスリンまたは血清複合体濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。インスリンまたは複合体血清濃度対時間データは、２分画モデルに従う２つの独立した減衰指数の合計（Ｃ（ｔ）＝ａ  ｅｘｐ（−ｋａｔ）＋ｂ  ｅｘｐ（−ｋｂｔ））（式中、ｔ１／２（ａ）＝（Ｉｎ２）／ｋａおよびｔ１／２（ｂ）＝（Ｉｎ２）／ｋｂに、最良適合を示した。結果を図２４に示す。左の図は、ａ−ＭＭまたはグルコース不存在下でのＩ−６複合体対ＲＨＩに関する有意に高い（＞５×）排出速度を示す。右の図は、グルコースの存在下（Ｇ４００注入）で、排出速度がいくらか（約５０％）減少し、ａ−ＭＭ存在下（ａ−ＭＭ注入）でかなり実質的に（約４００％）減少することを示す。
【０３９０】
実施例３１−Ｉ−６の静脈内注入でのグルコース応答性ＰＫ
この実施例では、実施例３０に記載した静注排出速度実験を、０．４ｍｇ複合体／ｋｇ体重の単一静注ボーラスから連続静脈内注入に変えた。該実験の目的は、４時間目にグルコース腹腔内注射を投与し、複合体（またはコントロールとしてＲＨＩ）の投与量速度を６時間一定に保ち、血清複合体（またはＲＨＩ）濃度において得られた効果を測定することであった。各実験で、１つの頸動脈ラインを複合体またはＲＨＩの注入のために、もう１つは血液収集のために用いるように、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０〜４００ｇ、ｎ＝３）を使用した。
【０３９１】
ＲＨＩに関して、５０ｍＵ／ｍｌ溶液を、０．２ｕｍろ過膜を通して無菌ろ過し、０．０７ｍｌ／分で注入し、６時間試験全体について、３．５ｍＵ／分の一定投与量速度で投与を行った。血液サンプルをｔ＝０分で取り、その後、一定量静脈内注入を始めた。第二カニューレを使用して、ｔ＝３０、６０、１２０、１８０および２４０分で血液サンプルを集めた。ｔ＝２４０分で、４ｇ／ｋｇ用量のグルコースを、腹腔内注射によって投与し、次いでｔ＝２５５、２７０、３００、３３０および３６０分で血液を集めた。
【０３９２】
Ｉ−６複合体に関し、１５０ｍＵ／ｍｌ溶液を、０．２μｍろ過膜を通して無菌ろ過し、０．１０ｍｌ／分で注入し、６時間試験全体について、１５ｍＵ／分の投与量速度で投与を行った。血液サンプルをｔ＝０分で取り、その後、一定量静脈内注入を始めた。第二カニューレを使用して、ｔ＝３０、６０、１２０、１８０および２４０分で血液サンプルを集めた。ｔ＝２４０分で、１、２または４ｇ／ｋｇ用量のグルコースを、腹腔内注射によって投与し、次いでｔ＝２５５、２７０、３００、３３０および３６０分で血液を集めた。
【０３９３】
実験全体を通して、血糖値は、市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して測定した。各時点の血液を４℃で遠心分離し血清を集め、続いて、血清インスリンまたは血清複合体濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。
【０３９４】
図２５の最初の２つの図は、４ｇ／ｋｇのグルコース腹腔内注射前後の血糖値および血清インスリン複合体濃度プロフィールを、３．５ｍＵ／分注入のＲＨＩと１５ｍＵ／分注入のＩ−６とで比較している。ＲＨＩ注入は、Ｉ−６注入と比べ、グルコース注射前に有意な低血糖症状を起こす。グルコース腹腔内注射の直後に、Ｉ−６の測定血清インスリン濃度は、血糖濃度増加として、３００％を超える増加を示し、次いでグルコース濃度が減少するにつれ、素早くベースライン濃度に戻る。一方、同じ実験条件下でも、グルコース腹腔内注射後、ＲＨＩは、測定血清インスリン濃度において有意な変化はない。図２５の次の３つの図は、測定インスリン濃度がグルコース腹腔内注射中に増える度合いは、投与されたグルコース用量および結果として得られる血糖値に直接関連することを示す。たとえば、血清インスリン濃度において、１ｇ／ｋｇグルコース注射については、ベースラインに対して５０％ピークの変化しか観察されないのに対し、４ｇ／ｋｇ用量では、ベースラインに対して３００％ピークの変化が観察される。
【０３９５】
実施例３２−糖質を含むまたは含まないインスリン複合体のインビボ排出速度
Ｉ−９複合体がグルコースまたはａ−ＭＭのような抑制糖質の存在下または不存在下で、血清からインビボで排出する速度を測定するため、以下の実験を行った。各実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０〜４００ｇ、ｎ＝３）に、溶解性複合体（またはコントロールとしてＲＨＩ）を、０．４ｍｇ複合体／ｋｇ体重で投薬した。
【０３９６】
上昇するグルコース濃度の存在下での排出速度を測定するため、実験開始の１時間前に、１匹のラットのカニューレを、無菌５０％ｗ／ｖグルコース溶液を含有するシリンジ注入ポンプに接続した。ポンプ注入速度は、実験者によって調整され、実験中の全ての時間で、動物が、３００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値を維持することを確実にした。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。典型的な実験では、動物が３００ｍｇ／ｄＬを上回る濃度を保持するために必要な注入ポンプ速度は、通常、８５μＬ／分を超えることがわかった。血液サンプルを、ｔ＝０分に取り、その後、無菌複合体溶液またはコントロールインスリンを、第二ラットカニューレを介し、静脈内に注射し、その直後にヘパリン−生理食塩水のチェイス溶液を注射し、複合体用量の全てが動物に投与されることを確実にした。ヘパリン−生理食塩水のカニューレラインによる追加の流し込みの後、第二カニューレを使用して、血液サンプルを、投与からｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分後に集めた。
【０３９７】
ａ−ＭＭ存在下での排出速度を測定するため、実験開始の１時間前に、１匹のラットのカニューレを、無菌２５％ｗ／ｖ  ａ−ＭＭ溶液を含有するシリンジ注入ポンプに接続した。ポンプ注入速度は実験者によって調整されたが、通常、８５ｕＬ／分に設定された。血液サンプルを、ｔ＝０分に取り、その後、無菌複合体溶液またはコントロールインスリンを、第二ラットカニューレを介し、静脈内に注射し、その直後にヘパリン−生理食塩水のチェイス溶液を注射し、複合体用量全てが動物に投与されることを確実にした。ヘパリン−生理食塩水のカニューレラインによる追加の流し込みの後、第二カニューレを使用して、血液サンプルを、投与からｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分後に集めた。
【０３９８】
実験全体を通して、血糖値は、市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して測定した。各時点の血液を４℃で遠心分離し血清を集め、続いて、血清インスリンまたは血清複合体濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。インスリンまたは複合体血清濃度対時間データは、２分画モデルに従う２つの独立した減衰指数の合計（Ｃ（ｔ）＝ａ  ｅｘｐ（−ｋａｔ）＋ｂ  ｅｘｐ（−ｋｂｔ））（式中、ｔ１／２（ａ）＝（Ｉｎ２）／ｋａおよびｔ１／２（ｂ）＝（Ｉｎ２）／ｋｂ）に、最良適合を示した。図２６の最初の図は、無修飾インスリンの排出速度は、糖質の存在下（グルコースＧ４００またはａ−ＭＭ）影響されないことを示す。糖質注入を伴う複合体Ｉ−６を示す図２６の最後の図は、比較のために、実施例３１の結果を再プロットしたものである。糖質注入を伴う複合体Ｉ−９を示す図２６の真ん中の図は、グルコース（Ｇ４００の注入）対Ｉ−６複合体との存在で、排出速度がさらにいっそうはっきりと減少（約３５０％対約５０％）することを示す。また、複合体Ｉ−９は、ａ−ＭＭ（ａ−ＭＭ注入）対Ｉ−６複合体の存在で、排出速度がより大きく減少（約７００％対約４００％）することも示す。
【０３９９】
実施例３３−水性緩衝液中での複合体溶液の結晶化
実施例２５〜２７により合成された持続型複合体の懸濁液は、光走査型顕微鏡によって無定形（非結晶性）であることが確認された。一方、類似の条件下で処方された従来の複合体化されていないインスリン懸濁液は、通常、結晶性である。インスリン複合体の結晶性製剤は、バッチ毎の再生産性が改良され、製剤安定性が増し、長期間の保存でも粒子の凝集が減少する点で有利であり得る。従って、本発明者らは本発明の複合体の結晶化することができる適切な一組の水性条件が存在するか否かを判断することにする。
【０４００】
特別に設計されたハンギング・ドロップ・ベーパー・ディフュージョン（Ｈａｎｇｉｎｇ  Ｄｒｏｐ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）プレートとともに、一組の４８種の結晶化スクリーニング溶液（ＨＲ２−１４４）をＨａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ａｌｔａ  Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）から購入した。簡単に言うと、カバー・スライド・シーラントの細いビーズを、２枚のプレートのそれぞれの上の２４個の貯蔵部のそれぞれの上縁に適用し、１ｍｌの指標試薬１を貯蔵部Ａ１にピペットで入れ、１ｍｌの指標試薬２を貯蔵部Ａ２にピペットで入れる、など。２マイクロリットルの２．５ｍｇ／ｍｌ複合の脱イオン水溶液を、清潔な、シリコン処理した２２ｍｍの直径の円形カバースライドの中心に加え、貯蔵部１の指標試薬１、２マイクロリットルと混合した。カバースライドをひっくり返し、液滴が貯蔵部の溶液上で垂れ下がるように、Ａ１貯蔵部を塞いだ。この手順全体を、試験される４８種の指標溶液全てについて繰返し、プレートを、光学顕微鏡による観察の前に、室温で一晩放置した。
【０４０１】
スクリーニング実験の結果を、図２７にまとめる。４８種の指標溶液の殆どが、結晶性粒子を形成せず、さらに言えば、析出も全くなかった。指標緩衝液１９（ｐＨ８．２、０．０５６Ｍの第一リン酸ナトリウム・１水和物および１．３４４Ｍの第二リン酸カリウム）は、はっきりと、大量の明確な結晶を形成した。指標緩衝液１９を使用したさらなる試験で、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２（Ｂ２９）およびＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３（Ｂ２９）複合体Ｉ−６およびＩ−９について、実質的な結晶形成が明らかになった。これらの化合物の構造式を図２に示す。図２８に、緩衝液１９と、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２（Ｂ２９）およびＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２（Ｂ２９）複合体、Ｉ−６および１−７とを使用して形成した代表的な結晶の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像を示す。
【０４０２】
実施例３４−前結晶化複合体からの持続型中性プロタミン製剤
スケールアップしたバッチで、５０／５０ｖ／ｖ混合物（０．５ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌのＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２（Ｂ２９）複合体Ｉ−６および０．５ｍｌの指標緩衝液１９）を使用して合成した結晶を調製し、室温で２４時間放置し、完全に結晶化させた。得られた懸濁液０．５ｍｌに、０．０７９５ｍｌの３％ｍ−クレゾール溶液を加え、次いで０．０９７ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌプロタミン溶液（ｐＨを７．０に調整）を加えた。得られた懸濁液を、ラットに投薬する前に、約２時間ゆっくり混合した。
【０４０３】
結晶性懸濁液（プロタミンもｍ−クレゾールも添加せず）および先に記載したプロタミン／クレゾール含有懸濁液の徐放性およびグルコース応答性ＰＫプロフィールを試験するために、以下の実験を行った。絶食させた、非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、それぞれｎ＝２）の首の後ろに、非プロタミン結晶懸濁液を、動物の体重を（単位：グラム）２．１９で割った容量（単位：マイクロリットル）で注射し、プロタミン／クレゾール含有結晶懸濁液を、動物の体重（単位：グラム）を１．６２で割った用量（単位：マイクロリットル）で注射した。２４０分遅れて、グルコース用量（４ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、０分、および最初の複合体注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後に集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。
【０４０４】
図３０に示すように、プロタミン／ｍ−クレゾール含有結晶は、４時間グルコース注射の後、血清濃度において有意なグルコース−応答性増加を伴う、非常に平坦な、遅延性の吸収プロフィールを示した。しかし、プロタミンもｍ−クレゾールも含まない結晶性懸濁液は、注射直後の複合体の大量の放出、次いで４時間グルコース注射後の血清濃度におけるグルコース応答性のいくらかの増加を示した（図２９）。これらの結果は、目的の持続型薬物動態プロフィールを維持するために、結晶に関し、プロタミンおよびｍ−クレゾールの組合せに価値があることを示している。
【０４０５】
これと同じ実験をＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２（Ｂ２９）複合体Ｉ−７で繰返した。スケールアップしたバッチで、５０／５０ｖ／ｖ混合物（１．０ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌ複合体＋１．０ｍｌの指標緩衝液１９）を使用して合成した結晶を調製し、室温で２４時間放置し、完全に結晶化させた。得られた各複合体の懸濁液１．０ｍｌに、０．１５９ｍｌの３％ｍ−クレゾール溶液を加え、次いで０．１９４ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌプロタミン溶液（ｐＨを７．０に調整）を加えた。得られた懸濁液を、ラットに投薬する前に、約２時間ゆっくり混合した。
【０４０６】
絶食させた、非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ，それぞれｎ＝２）の首の後ろに、プロタミン／クレゾール含有結晶懸濁液を、動物の体重（単位：グラム）を１．６２で割った用量（単位：マイクロリットル）で注射した。２４０分遅れて、グルコース用量（４ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、０分、および最初の複合体注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後に集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。製造業者のアッセイ明細書によれば、Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡは、ラットインスリンに７１％の交差反応性を示す。各サンプルで検出される内在性ラットインスリンの量を最小限にするため、血清サンプルを１０倍希釈したが、ラットインスリン検出の可能性は、完全に除外することができなかった。従って、結果を、一般的に、「測定インスリン」として報告するが、これは、複合体の他に、ある量の内在性ラットインスリンを含む可能性がある。
【０４０７】
図３１に示すように、プロタミン／クレゾール含有結晶は、４時間グルコース注射の後、測定血清インスリン濃度において有意な増加を伴う、非常に平坦な、遅延性の吸収プロフィールを示した。
【０４０８】
先に記載したプロタミン／クレゾール結晶懸濁液は、安定性を保ち経時的性能を改善するために、複合体化されていない遊離インスリンの添加を必要としない。本発明者らは、冷凍庫で数週間保存した後でさえ、各結晶性懸濁液は、新しく調製した物質と同じように機能することを発見した。
【０４０９】
実施例３５−生理的緩衝液強度での前結晶化複合体からの持続型中性プロタミン製剤
先に記載したプロタミン／クレゾール含有結晶性懸濁液は、繰返投薬の後、望ましくない注射部位での炎症を起こす可能性のあるカリウムおよびリン酸塩を、生理的濃度を大きく超える濃度でまだ含有している。一度形成した結晶は、プロタミンおよびクレゾールを含有する生理食塩水中で安定であるかを判断するために、以下の実験を行った。３．０ｍｌのＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３（Ｂ２９）複合体Ｉ−９（２．５ｍｇ／ｍｌ）を３．０ｍｌの緩衝液１９と混合し、室温で一晩放置し、完全に結晶化させた。次の日、０．９５６ｍｌの３％ｍ−クレゾール溶液および１．１６４ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌプロタミン溶液（ｐＨ７．０）を、前記懸濁液に加え、４℃で一晩放置した。次の日、懸濁液をｌ，０００ｇで３分間遠心分離し、その後、７．５ｍｌの上澄みを取除き、５．６ｍｌの１×リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。得られた２．８ｍｌの懸濁液に、０．４４７ｍｌの３％ｍ−クレゾール溶液、０．２０４ｍｌの１×ＰＢＳおよび０．３３８ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌプロタミン溶液（ｐＨ７．０）を加えた。得られた懸濁液を４℃で１週間保存し、その後ラットで試験した。
【０４１０】
時間が経った結晶性懸濁液を、動物の体重（単位：グラム）を１．６２で割った用量（単位：マイクロリットル）で、絶食させた、非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝３）の首の後ろに注射した。２４０分遅れて、グルコース用量（４ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、０分、および最初の複合体注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後に集めた。市販の検査片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を４℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。図３２に示すように、クレゾールおよびプロタミン中に懸濁し、時間を置いた結晶は、４時間グルコース注射の後、血清濃度において有意なグルコース−応答性の増加を伴う、非常に平坦な、遅延性の吸収プロフィールを示した。
【０４１１】
他の実施形態
本発明の他の実施形態も、本発明の考察および本明細書に記載された本発明の実施から、当業者には明らかになる。本明細書および実施例は例示としてのみ考えられるもので、本発明の真の範囲および精神は、以下に続く特許請求の範囲によって示されているものである。
【図１】
2012516342.tif 000091
【図２−１】
2012516342.tif 000092
【図２−２】
2012516342.tif 000093
【図２−３】
2012516342.tif 000094
【図２−４】
2012516342.tif 000095
【図２−５】
2012516342.tif 000096
【図２−６】
2012516342.tif 000097
【図３】
2012516342.tif 000098
【図４】
2012516342.tif 000099
【図５】
2012516342.tif 000100
【図６】
2012516342.tif 000101
【図７】
2012516342.tif 000102
【図８】
2012516342.tif 000103
【図９】
2012516342.tif 000104
【図１０】
2012516342.tif 000105
【図１１−１】
2012516342.tif 000106
【図１１−２】
2012516342.tif 000107
【図１２】
2012516342.tif 000108
【図１３】
2012516342.tif 000109
【図１４】
2012516342.tif 000110
【図１５−１】
2012516342.tif 000111
【図１５−２】
2012516342.tif 000112
【図１６−１】
2012516342.tif 000113
【図１６−２】
2012516342.tif 000114
【図１７】
2012516342.tif 000115
【図１８】
2012516342.tif 000116
【図１９】
2012516342.tif 000117
【図２０−１】
2012516342.tif 000118
【図２０−２】
2012516342.tif 000119
【図２０−３】
2012516342.tif 000120
【図２１】
2012516342.tif 000121
【図２２−１】
2012516342.tif 000122
【図２２−２】
2012516342.tif 000123
【図２３】
2012516342.tif 000124
【図２４】
2012516342.tif 000125
【図２５−１】
2012516342.tif 000126
【図２５−２】
2012516342.tif 000127
【図２５−３】
2012516342.tif 000128
【図２６】
2012516342.tif 000129
【図２７−１】
2012516342.tif 000130
【図２７−２】
2012516342.tif 000131
【図２８】
2012516342.tif 000132
【図２９】
2012516342.tif 000133
【図３０】
2012516342.tif 000134
【図３１】
2012516342.tif 000135
【図３２】
2012516342.tif 000136
【図３３】
2012516342.tif 000137
【配列表】
2012516342000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月27日(2011.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2012516342.tif 000138
の結晶性インスリン複合体。
（式中、
［（Ａ−Ｔ）］は、それぞれ、複合体内のポテンシャル分岐部を示し；
（Ａ−Ｔ）は、それぞれ、複合体の分岐部内のポテンシャル繰返しを示し；
−Ａ−は、それぞれ独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、または場合によっては置換された基であって、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される基であり；
Ｔは、それぞれ独立して、共有結合、または２価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられ；
Ｒは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分、またはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
Ｘは、それぞれ独立して、糖を含むリガンドであり；
ＬＢは、それぞれ独立して、共有結合、またはＴとＸとの共有結合型複合に由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−ＷＩであり；
ＷＩは、インスリン分子であり；
ＬＤは、それぞれ独立して、共有結合、またはＴとＷＩとの共有結合型複合に由来する基であり；
ｋは、１〜１２の整数であり、
ｐは、それぞれ独立して、１〜５の整数であり；
ｎは、それぞれ独立して、０〜５の整数であり；
ｍは、それぞれ独立して、１〜５の整数であり；および
ｖは、それぞれ独立して、０〜５の整数であり、ただし、ｋ−分岐部内で、ｎの少なくとも１つが≧１であり、およびｖの少なくとも１つが≧１である。）
【請求項２】
複合体が、式（ＩＩＩａ）：
【化２】
2012516342.tif 000139
の複合体である、請求項１に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項３】
複合体が、以下の式：
【化３】
2012516342.tif 000140
【化４】
2012516342.tif 000141
または、
【化５】
2012516342.tif 000142
の複合体である、請求項２に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項４】
複合体が、式（ＩＩＩｂ）：
【化６】
2012516342.tif 000143
の複合体である、請求項１に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項５】
複合体が、以下の式：
【化７】
2012516342.tif 000144
【化８】
2012516342.tif 000145
【化９】
2012516342.tif 000146
または
【化１０】
2012516342.tif 000147
または
【化１１】
2012516342.tif 000148
または
【化１２】
2012516342.tif 000149
または、
【化１３】
2012516342.tif 000150
の複合体である、請求項４に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項６】
複合体が、式（ＩＩＩｃ）：
【化１４】
2012516342.tif 000151
の複合体である、請求項１に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項７】
複合体が、以下の式：
【化１５】
2012516342.tif 000152
または、
【化１６】
2012516342.tif 000153
の複合体である、請求項６に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項８】
インスリン分子が、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリシンからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項９】
インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１０】
インスリン分子が、ＬｙｓＢ２９のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１１】
Ｘは、それぞれ、ビマンノース、トリマンノース、分岐状トリマンノース、または直鎖マンノースを含むリガンドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１２】
Ｘが、それぞれ独立して、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含むリガンドである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１３】
Ｘが、それぞれ、アノマー炭素を介して複合体化された糖を含むリガンドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１４】
アノマー炭素が、αアノマーである、請求項１３に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１５】
Ｘが、それぞれ、αアノマー炭素を介して、複合体骨格に複合体化したアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）であり；およびＷＩが、ＬｙｓＢ２９のεアミノ基を介して、複合体骨格に複合体化したインスリン分子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体。
【請求項１６】
以下の式：
【化１７】
2012516342.tif 000154
または
【化１８】
2012516342.tif 000155
または、
【化１９】
2012516342.tif 000156
の結晶性インスリン複合体。
（式中、
ＷＩは、インスリン分子であり；および
−Ｘは、それぞれ、
【化２０】
2012516342.tif 000157
である。）
【請求項１７】
以下の群よりなる式を含む結晶性インスリン複合体。
【化２１】
2012516342.tif 000158
【化２２】
2012516342.tif 000159
【化２３】
2012516342.tif 000160
【化２４】
2012516342.tif 000161
【化２５】
2012516342.tif 000162
【化２６】
2012516342.tif 000163
【化２７】
2012516342.tif 000164
【化２８】
2012516342.tif 000165
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体を含む徐放性製剤。
【請求項１９】
製剤が、プロタミンを含む、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体の懸濁液を含むポンプデリバリーシステムであって、該ポンプデリバリーシステムは、結晶性インスリン複合体懸濁液を哺乳類に注入することにより動く、ポンプデリバリーシステム。
【請求項２１】
高血糖症を治療するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結晶性インスリン複合体またはその製剤。
【国際調査報告】
2012516342.tif 000166
2012516342.tif 000167