(57)【要約】  レーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）を用いる質量分析のための系および方法を本明細書中に開示する。ＬＳＩは、分析のために大気圧で多荷電イオン（多価イオン）を生成することが可能であり、４０００ダルトンを超える分子を含む高分子量分子の分析を可能にする。該分析は、溶媒に基づく分析、または無溶媒分析でありうる。ＬＳＩによる無溶媒分析は、表面および／または組織イメージングにおいて有益な改善された空間分解能を可能にする。
2012529058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質の分析のために多荷電イオンを製造する方法であって、
ａ．物質およびマトリックスを物質／マトリックスアナライトとして表面に適用し、
ｂ．該物質／マトリックスアナライトを大気圧またはその圧力付近でレーザーでアブレーションし、
ｃ．該レーザーアブレート化物質／マトリックスアナライトを加熱領域に通過させた後、該物質／マトリックスアナライトを質量分析計の高真空領域に進入させることを含む、方法。
【請求項２】
マトリックスが、レーザーの波長におけるエネルギーを吸収する小分子から構成される、請求項１の方法。
【請求項３】
小分子が、ジヒドロキシ安息香酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）；ジヒドロキシアセトフェノン、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（２，５−ＤＨＡＰ）、２，６−ジヒドロキシアセトフェノン（２，６−ＤＨＡＰ）、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（２，４，６−ＴＨＡＰ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、２−アミノベンジルアルコール（２−ＡＢＡ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
レーザーが紫外領域の出力を有する、請求項１の方法。
【請求項５】
レーザーが窒素レーザー（３３７ｎｍ）または周波数３倍化Ｎｄ／ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）である、請求項１の方法。
【請求項６】
加熱領域が加熱チューブである、請求項１の方法。
【請求項７】
チューブが、質量分析計真空系に有害な蒸気を放出しない耐熱性物質から構成される、請求項６の方法。
【請求項８】
チューブが金属または石英から構成される、請求項７の方法。
【請求項９】
チューブが５０から６００℃の温度に加熱される、請求項６の方法。
【請求項１０】
チューブが１５０から４５０℃の温度に加熱される、請求項６の方法。
【請求項１１】
質量分析計の真空へのイオン進入および物質／マトリックスアナライトのレーザーアブレーションの点により定められるイオン源領域内の電場が８００Ｖ未満である、請求項１の方法。
【請求項１２】
イオン源領域内の電場が１００Ｖ未満である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
イオン源領域内の電場が０Ｖまたは０Ｖ未満である、請求項１１の方法。
【請求項１４】
物質が生物学的物質または非生物学的物質である、請求項１の方法。
【請求項１５】
物質が、タンパク質、ペプチド、炭水化物および脂質からなる群から選択される生物学的物質である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
物質が、重合体および油からなる群から選択される非生物学的物質である、請求項１４の方法。
【請求項１７】
無溶媒物質／マトリックスアナライト調製方法を用いて、該物質／マトリックスアナライトを分析することを更に含む、請求項１の方法。
【請求項１８】
分析することが、構造の特徴づけのための表面イメージングおよび／または電荷遠隔フラグメンテーションを含む、請求項１８の方法。
【請求項１９】
物質／マトリックスアナライトを分析するために質量分析計を使用する、請求項１の方法。
【請求項２０】
請求項１の方法を実施するための系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の分野
レーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）を用いる質量分析のための系および方法を本明細書中に開示する。ＬＳＩは、分析のために大気圧で多荷電イオン（多価イオン）を生成することが可能であり、４０００ダルトンを超える分子を含む高分子量分子の分析を可能にする。該分析は、溶媒に基づく分析、または無溶媒分析でありうる。ＬＳＩによる無溶媒分析は、組織イメージングおよび限られた溶解度の化合物の分析において有益な改善された空間分解能を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、多数の（生物）分子の分析を可能にする、質量分析（ＭＳ）において用いられるイオン化技術である。（生物）分子のイオン化はレーザーにより誘発され、一方、マトリックスは、（生物）分子をレーザーから保護するために使用される。適当なマトリックス物質は、一般に、低い分子量を有し、優先的に正に荷電した（生物）分子を得るためのプロトン源となるよう、しばしば酸性である。優先的に負に荷電した（生物）分子イオンを得るために、塩基性マトリックス物質も使用されうる。また、マトリックス物質は、使用されるレーザー波長において、良好な光吸収を示し、それはレーザー照射を迅速に吸収する。この方法においては溶媒も頻繁に使用される。
【０００３】
表面イメージングは、癌境界の検出、薬物取り込み位置の決定のような多様な分野において並びに脳組織内のシグナリング分子のマッピングおよび合成分子の分析（重合体組成物における亀裂）において非常に有用となる可能性を有する。ＭＳによるイメージングは、特に二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）を用いて、十分に確立されているが、ＳＩＭＳは、無傷生物組織では限られた有用性を有するに過ぎない。一方、ＭＡＬＤＩ  ＭＳは、特に膜脂質、薬物代謝産物およびタンパク質のような高含量成分に関する組織イメージングに用いられており、ある程度の成功を収めている。しかし、特に純粋な組織に関する組織イメージングのための、そのような真空に基づくＭＡＬＤＩ  ＭＳの使用には、多数の欠点が存在する。常圧（ＡＰ）−ＭＡＬＤＩ組織イメージングは真空ＭＡＬＤＩの欠点の多くを回避するが、高い空間分解能におけるその感度の問題のため、限られたものであるにすぎない。重要なことに、ＭＡＬＤＩは、ＭＳによる分析のために主として１価イオンを生成させるためのイオン化法として注目されている。しかし、強力なＭＳ装置は、しばしば、１価イオンを検出せず、その結果、ＡＰ−ＭＡＬＤＩは、高分解能質量分析に適さない可能性がある。
【０００４】
溶媒を使用する伝統的な分析方法も多数の欠点を有する。例えば、現在使用されているＭＡＬＤＩ技術は幾つかの（生物）分子を分析するために用いられうるが、一般的な溶媒にしばしば不溶性であるタンパク質を含む多数の（生物）分子に関して重大な技術的問題が尚も存在する。例えば、膜タンパク質のような幾つかのタンパク質は、疎水性であるため、不溶性である。さらに、ミスフォールドしたタンパク質は疎水性領域を露出しており、不溶性凝集物を形成しうる。多数の組換えタンパク質は、異種宿主内で過剰発現されると、ミスフォールディングのため、またはアルツハイマー病のような病態の進行において、不溶性となる。
【０００５】
さらに、溶媒に基づくＭＳサンプル調製においては、トリプトファンおよびメチオニン残基の酸化のようなアーチファクトが生じうる（Ｃｏｈｅｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６；７８：４３５２−４３６２；Ｆｒｏｅｌｉｃｈら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００８；８：１３３４−１３４５）。これらのアーチファクトは、サンプルの溶液とマトリックスの溶液とが一緒にされたのと同時に生じうる。したがって、溶媒に基づくＭＳは、酸化ストレスを受けることに関連した用途には最適でないかもしれない。
【０００６】
ＭＳは、物質の特徴づけにおけるその使用において、これら及び他の欠点を有する。なぜなら、それは、純粋で複合的なイオン化または溶解遅延性の物質を分析できないからである。生物学的物質はそのような複合的物質の１つのタイプである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｏｈｅｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６；７８：４３５２−４３６２
【非特許文献２】Ｆｒｏｅｌｉｃｈら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００８；８：１３３４−１３４５
【発明の概要】
【０００８】
開示の概要
本開示は、質量分析（ＭＳ）による物質の分析および表面イメージング（組織イメージングを含む）を改良する系および方法を提供する。該系および方法は、通常のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）により生成される主として単一に荷電したイオンよりもＭＳ法により検出されやすい多数の多荷電イオン（多価イオン）を生成するレーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）法を用いる。透過配置で整列されたレーザーは、表面イメージング分析に特に重要な空間分解能を改善する。ＬＳＩ後のＭＳは、溶媒に基づくもの、または溶媒を含まないもの（無溶媒分析）でありうる。ＬＳＩ後の無溶媒分析は、溶媒に基づく分析に伴う前記欠点の多くを回避する。無溶媒分析は、ＭＳ表面イメージングにおいて有益な改善された空間分解能をも可能にする。
【０００９】
特に、本明細書に開示されている１つの実施形態は、物質およびマトリックスを物質／マトリックスアナライトとして表面に適用し、該物質／マトリックスアナライトを大気圧（常圧）またはその圧力付近でレーザーでアブレーションし、該レーザーアブレート化物質／マトリックスアナライトを加熱領域に通過させた後、該物質／マトリックスアナライトを質量分析計の高真空領域に進入させることを含む、物質の分析のための多荷電イオン（多価イオン）の製造方法（生成方法）を提供する。生成した多荷電イオンは正または負でありうる。
【００１０】
もう１つの実施形態においては、該マトリックスは、レーザーの波長におけるエネルギーを吸収する小分子から構成される。もう１つの実施形態においては、該小分子は、ジヒドロキシ安息香酸およびジヒドロキシアセトフェノンからなる群から選択される。もう１つの実施形態においては、該小分子は、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ；酸性マトリックス物質）、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（２，５−ＤＨＡＰ）、２，６−ジヒドロキシアセトフェノン（２，６−ＤＨＡＰ）、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（２，４，６−ＴＨＡＰ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、２−アミノベンジルアルコール（２−ＡＢＡ；塩基性マトリックス物質）および／または類似した位置的官能性を有する他の小さな芳香族分子からなる群から選択される。
【００１１】
もう１つの実施形態においては、該レーザーは紫外領域の出力を有する。もう１つの実施形態においては、該レーザーは窒素レーザー（３３７ｎｍ）または周波数３倍化Ｎｄ／ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）である。
【００１２】
もう１つの実施形態においては、該加熱領域は加熱チューブである。特定の実施形態においては、該加熱チューブは、質量分析計真空系に有害な蒸気を放出しない耐熱性物質から構成される。もう１つの実施形態においては、該チューブは金属または石英から構成される。該チューブは直接的または間接的に加熱されうる。幾つかの実施形態においては、それは５０〜６００℃の温度に直接的または間接的に加熱されうる。もう１つの実施形態においては、該チューブは１５０〜４５０℃の温度に直接的または間接的に加熱されうる。
【００１３】
もう１つの実施形態においては、質量分析計の真空へのイオン進入および物質／マトリックスアナライトのレーザーアブレーションの点により定められるイオン源領域内の電場は８００Ｖ未満である。もう１つの実施形態においては、該イオン源領域内の電場は１００Ｖ未満である。もう１つの実施形態においては、該イオン源領域内の電場は０Ｖである。もう１つの実施形態においては、該イオン源領域内の電場は０Ｖ未満である。
【００１４】
該物質は生物学的物質または非生物学的物質でありうる。ある実施形態においては、該物質は生物学的物質であり、限定的なものではないが、タンパク質、ペプチド、炭水化物または脂質でありうる。他の実施形態においては、該物質は非生物学的物質であり、限定的なものではないが、重合体または油でありうる。
【００１５】
本明細書に開示されている実施形態は、溶媒を含まない（無溶媒）または溶媒に基づく物質／マトリックスアナライト調製方法を用いて、該物質／マトリックスアナライトを分析することを含みうる。１つの実施形態においては、該分析は構造の特徴づけのための表面イメージングおよび／または電荷遠隔（ｃｈａｒｇｅ  ｒｅｍｏｔｅ）フラグメンテーションを含む。もう１つの実施形態においては、該物質／マトリックス内のアナライトを分析するために質量分析計を使用する。該分析は正または負イオン形態で行われうる。
【００１６】
レ−ザーアブレーションは透過または反射配置で達成されうる。透過配置はアブレーション面積（例えば、組織における細胞下の場合）を最小にする。
【００１７】
該表面は、限定的なものではないが、反射形態におけるガラス、石英、セラミック、金属、重合体、または透過形態におけるガラス、石英および／または重合体でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、図２〜１４（７種のペプチド、２種の小タンパク質および４種の脂質）に示されているイメージを得るために使用したマトリックス（２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）／アナライト）の写真を示す。
【図２】図２は、β−アミロイド（３３−４２）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図３】図３は、リポトロピンの、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図４】図４は、バソプレッシンの、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図５】図５は、ダイノルフィンの、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図６】図６は、β−アミロイド（１−１１）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図７】図７は、サブスタンスＰの、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図８】図８は、メリチンの、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図９】図９は、β−アミロイド（１−４２）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図１０】図１０は、ウシインスリンの、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図１１】図１１は、２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図１２】図１２は、Ｎ−アラキドノイルガンマアミノ酪酸（ＮＡＧＡＢＡ）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図１３】図１３は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図１４】図１４は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【図１５】図１５は形状による等圧分子（同じ名目質量を有する化合物）の無溶媒分離を示す。
【図１６】図１６は、異性体分子（同じ元素組成を有するが異なる構造を有する化合物）に関して示された、形状による無溶媒分離を示す。
【図１７】図１７は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）を用いるイメージング質量分析方法の概要図を示す。真空または常圧（ＡＰ）法（ＡＰ−ＭＡＬＤＩおよびレーザースプレーイオン化（ＬＳＩ））のための、より均一な無溶媒マトリックス／アナライト調製の利点が示されている。
【図１８】図１８は、組織切片上のマトリックスの調製を示すＴｉｓｓｕｅＢｏｘの概要図を示す。
【図１９】図１９はＴｉｓｓｕｅＢｏｘの写真を示す。
【図２０】図２０は、内側に示されているＴｉｓｓｕｅＢｏｘのためのアダプターセットを示す。
【図２１】図２１は、ボールミル法によりボールがマトリックスを粉砕するよう所望の時間および周波数で２つのアダプターセットを同時に振とうするボールミル装置（ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜Ｂは、４４ミクロンのメッシュを使用してボールミル（ＤＨＢマトリックス、２５Ｈｚで３０秒間）に付した後のマトリックス結晶サイズを示す。図２２Ａは１００倍拡大図（倍尺線は５００μｍ）および１００倍拡大図（倍尺線は５０μｍ）のインセットを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜Ｂは、４４ミクロンのメッシュを使用してボールミル（ＤＨＢマトリックス、２５Ｈｚで３０秒間）に付した後のマトリックス結晶サイズを示す。図２２Ｂは３０００倍の走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）での１０μｍの倍尺線を示す。
【図２３】図２３は、４４ミクロンのメッシュを使用してボールミル（ＤＨＢマトリックス、２５Ｈｚで３０秒間）に付した後のマトリックス結晶サイズを示す。
【図２４】図２４は約１０μｍのサイズの図２５のマトリックス結晶の拡大図を示す。
【図２５】図２５は、マトリックスを移すために２０μｍメッシュを使用して２５Ｈｚの周波数および６０秒間の持続時間のＴｉｓｓｕＬｙｚｅｒ設定を用いる異なるステンレス鋼ビーズ（１．２および４ｍｍ）の及び種々のメッシュサイズでマウントされたＳｕｒｆａｃｅＢｏｘを使用した場合の裸顕微鏡スライド上に蒸着されたマトリックスの光学顕微鏡観察イメージを示す。ＤＨＢマトリックスを使用した。
【図２６】図２６は、α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックスを使用すること以外は図２５の場合と同様にして得られたマトリックスの光学顕微鏡観察イメージを示す。
【図２７】図２７は、マトリックスを移すために３μｍメッシュを使用して２５Ｈｚの周波数および５分間の持続時間のＴｉｓｓｕＬｙｚｅｒ設定を用いる異なるステンレス鋼ビーズ（１．２および４ｍｍ）の及び種々のメッシュサイズでマウントされたＳｕｒｆａｃｅＢｏｘを使用した場合の裸顕微鏡スライド上に蒸着されたマトリックスの光学顕微鏡観察イメージを示す。ＣＨＣＡマトリックスを使用した。
【図２８】図２８は、（１）急速無溶媒ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘマトリックス蒸着（左）および（２）スプレーコーティング（右）ならびにＣＨＣＡマトリックスを用いた場合のマウス脳組織の組織イメージングを示す：（Ａ）ＣＨＣＡマトリックスで被覆された組織の写真、（Ｂ）質量スペクトル、（Ｃ）以下のそれぞれのｍ／ｚ値のＭＳイメージ：（Ｉ）無溶媒の場合は７７９．６および（ＩＩ）８４３．３、ならびに溶媒に基づく場合は（Ｉ）７２６．３および（ＩＩ）８０４．３。
【図２９】図２９はマウス脳の無溶媒ＤＨＢ調製を示す。
【図３０】図３０は、Ｂｒｕｋｅｒ装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上での２，５−ＤＨＢをマトリックスとして使用するマウス脳の無溶媒ＴｉｓｓｕＢｏｘ調製を示す。
【図３１】図３１は、エタノールで洗浄され５０：５０：０．２  アセトニトリル（ＡＣＮ）／水／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のシナピン酸マトリックスでスポットされたマウス脳のＭＡＬＤＩ−飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳ質量スペクトルを示す。
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、エタノールで洗浄され５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックスでスポットされたマウス脳からのＬＳＩ−ＭＳ質量スペクトルを示す。
【図３３】図３３は、エタノールで洗浄され５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックスでスポットされたマウス脳からのＬＳＩ−ＭＳ質量スペクトルを示す。
【図３４】図３４は、より細かい粒径を得るための二重メッシュアプローチを用いる代表例を示す。
【図３５】図３５は二重メッシュＴｉｓｓｕｅＢｏｘアプローチの代表例を示す。
【図３６】図３６は、（Ａ）１５Ｈｚの周波数で３０分間および（Ｂ）２５Ｈｚの周波数で５分間のＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ条件で（１）クロムビーズおよび（２）ステンレスビーズを使用する、予め破砕されたマトリックスのＳＥＭイメージを示す。
【図３７】図３７は、２５Ｈｚの周波数および５分間の持続時間のＴｉｓｓｕＬｙｚｅｒ設定を用いる異なるステンレス鋼ビーズ（１．２および４ｍｍ）の及び３μｍのメッシュサイズでマウントされたＳｕｒｆａｃｅＢｏｘを使用した場合のマウス脳組織切片上に蒸着されたＤＨＢマトリックスの光学顕微鏡観察イメージを示す。透過光が示されている。
【図３８】図３８は、ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘを使用した場合のマウス脳組織切片上に蒸着されたＤＨＢマトリックスの光学顕微鏡観察イメージを示し、２５Ｈｚ／３００秒間の４４×３μｍのメッシュの後のＤＨＢの光学顕微鏡観察イメージを示す。
【図３９】図３９は、２５Ｈｚの周波数および５分間の持続時間のＴｉｓｓｕＬｙｚｅｒ設定を用いる異なるステンレス鋼ビーズ（１．２および４ｍｍ）の及び３μｍのメッシュサイズでマウントされたＳｕｒｆａｃｅＢｏｘを使用した場合のマウス脳組織切片上に蒸着されたＤＨＢマトリックスの光学顕微鏡観察イメージを示す。反射光が示されている。
【図４０】図４０は、二重メッシュＴｉｓｓｕＢｏｘが、単一メッシュＴｉｓｓｕＢｏｘ（図２３）と比較して、＜５μｍ（右下の倍尺線）より小さい粒子の顕著な増加をもたらすことを示している。
【図４１】図４１は、通常のＲＧ（上）をＴＧ（下）と比較するスキームを示す。
【図４２】図４２は、ＡＰにおけるイオンの生成のためのレーザーに基づく源の設計およびマトリックス適用の概要図を示す。図４２（Ａ）はＲＧを示し、図４２（Ｂ）はＴＧを示す。
【図４３】図４３は、無電場透過配置常圧（ＬＳＩ）を用いたマウス脳組織の分析からの結果を示す。
【図４４】図４４はマウス脳切片の分析を示す。
【図４５】図４５はレーザーアブレーション後の図４４（１）の無溶媒マトリックス処理組織切片を示す。
【図４６】図４６はレーザーアブレーション後の図４４（１）の無溶媒マトリックス処理組織切片を示し、クレーター周囲の残存マトリックスは該組織のアブレーション過程におけるマトリックス支援を示す。
【図４７】図４７はレーザーアブレーション後の図４４（２）の無溶媒マトリックス処理組織切片を示す。
【図４８】図４８は２つの異なる無溶媒サンプル調製法を示す。
【図４９】図４９は、多荷電イオンを生成させるためのＬＳＩでの実験の結果を示す。
【図５０】図５０は前面からのイオンマックス（Ｉｏｎ  Ｍａｘ）源の拡大図を示し、ｘ，ｙ，ｚステージ上に保持された集束レンズが最前面に示されている。
【図５１】図５１はイオン進入口（アパーチャー）の近傍の石英プレートの拡大図を示す。
【図５２】図５２は、前方および後方のみの移動方向でのレーザービームによる石英プレートの複数回の通過により生じている、マトリックス（ハート形）を貫く線を示す。
【図５３】図５３は２，５−ＤＨＢマトリックスにおけるスフィンゴミエリンを示す。
【図５４】図５４は、全て１価（単一荷電）であるスフィンゴミエリンからのイオンを示す。
【図５５】図５５は、１価イオンを示す２，５−ＤＨＢにおけるホスファチジルグリセロールを示す。
【図５６】図５６は、１価イオンを示す２，５−ＤＨＢにおけるホスファチジルイノシトールのスペクトルを示す。
【図５７】図５７は、１価イオンを示す２，５−ＤＨＢにおけるアナンダミドのスペクトルを示す。
【図５８】図５８は、１価イオンを示す２，５−ＤＨＢにおけるＮＡＧｌｙのスペクトルを示す。
【図５９】図５９は、１価イオンを示すＬｅｕ−エンケファリンのスペクトルを示す。
【図６０】図６０は、ＬＳＩにより２価イオンを示し１価イオンを示さないブラジキニンのスペクトルを示す。
【図６１】図６１はサブスタンスＰの２価イオンのスペクトルを示す。
【図６２】図６２はアンジオテンシン１のＬＳＩスペクトルを示す。
【図６３】図６３はアンジオテンシン１のＥＳＩスペクトルを示す。
【図６４】図６４は、分子量の増加と共にＬＳＩがより高い電荷状態を生成させることを示す、ＡＣＴＨのスペクトルを示す。
【図６５】図６５は、電荷状態＋４を有するアミロイド１−４２に関するスペクトルを示す。
【図６６】図６６は、電荷状態＋５を有するアミロイド１−４２に関するスペクトルを示す。
【図６７】図６７は、電荷状態＋６を有するアミロイド１−４２に関するスペクトルを示す。
【図６８】図６７は、電荷状態＋４および＋５を示すウシインスリンに関するスペクトルを示す。
【図６９】図６９は、ガラススライド上のマトリックス／アナライトサンプル調製物上に配置された針金（ワイヤ）メッシュを示す。
【図７０】図７０は、図６９の針金メッシュを使用した結果を示す。
【図７１Ａ】図７１Ａ〜Ｃは、溶媒に基づくサンプル調製条件および２，５−ＤＨＡＰマトリックス、１５０℃のコーン温度ならびにマウント化脱溶媒和装置（非加熱）を用いる、トリプシンによるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質消化物のＬＳＩ−イオン移動度スペクトロメトリー−質量分析（ＩＭＳ）−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを示す：Ｉ）ＩＭＳ−ＭＳ（図７１Ａ）、ＩＩ）図７１（Ｂ）トラップおよび図７１（Ｃ）ＴｒｉＷａｖｅ部の移動領域におけるＣＩＤフラグメンテーション。左側に質量スペクトルが示されており、右側にドリフト時間分離対質量／電荷比（ｍ／ｚ）の２Ｄプロットが示されている。
【図７１Ｂ】図７１Ａ〜Ｃは、溶媒に基づくサンプル調製条件および２，５−ＤＨＡＰマトリックス、１５０℃のコーン温度ならびにマウント化脱溶媒和装置（非加熱）を用いる、トリプシンによるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質消化物のＬＳＩ−イオン移動度スペクトロメトリー−質量分析（ＩＭＳ）−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを示す：Ｉ）ＩＭＳ−ＭＳ（図７１Ａ）、ＩＩ）図７１（Ｂ）トラップおよび図７１（Ｃ）ＴｒｉＷａｖｅ部の移動領域におけるＣＩＤフラグメンテーション。左側に質量スペクトルが示されており、右側にドリフト時間分離対質量／電荷比（ｍ／ｚ）の２Ｄプロットが示されている。
【図７１Ｃ】図７１Ａ〜Ｃは、溶媒に基づくサンプル調製条件および２，５−ＤＨＡＰマトリックス、１５０℃のコーン温度ならびにマウント化脱溶媒和装置（非加熱）を用いる、トリプシンによるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質消化物のＬＳＩ−イオン移動度スペクトロメトリー−質量分析（ＩＭＳ）−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを示す：Ｉ）ＩＭＳ−ＭＳ（図７１Ａ）、ＩＩ）図７１（Ｂ）トラップおよび図７１（Ｃ）ＴｒｉＷａｖｅ部の移動領域におけるＣＩＤフラグメンテーション。左側に質量スペクトルが示されており、右側にドリフト時間分離対質量／電荷比（ｍ／ｚ）の２Ｄプロットが示されている。
【図７２】図７２は完全無溶媒分析の利点の一例を示す。
【図７３】図７３Ａ〜Ｂは、無溶媒サンプル調製およびそれに続く粗油サンプルのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ取得によるＴＳＡを示す。
【図７４Ａ】図７４Ａ〜ＣはＴＳＡ質量スペクトルを示す。
【図７４Ｂ】図７４Ａ〜ＣはＴＳＡ質量スペクトルを示す。
【図７４Ｃ】図７４Ａ〜ＣはＴＳＡ質量スペクトルを示す。
【図７５】図７５は、４００℃の加熱移動毛管を使用し２，５−ＤＨＢを使用する炭酸脱水酵素（平均分子量２９０２９）タンパク質のＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ装置上のＬＳＩを示す。
【図７６】図７６はＬＴＱ−ＥＴＤ  Ｖｅｌｏｓ装置上のＬＳＩを示す。
【図７７】図７７はＯＶＡペプチド３２３−３３９の種々の電荷状態のＬＳＩ−ＣＩＤ質量スペクトルを示す。
【図７８Ａ】図７８Ａ〜Ｆは図７８（Ａ、Ｄ）混合物ＩのＬＳＩ−ＬＴＱ−ＭＳ分析と図７８（Ｂ、Ｅ）ＧＦ（ｍ／ｚ＝６１２．４）のＣＩＤスペクトルとの比較を示す。図７８（Ｃ、Ｆ）は、ＤＨＡＰおよびＤＨＢマトリックスを使用した場合のＡｎｇＩ（ｍ／ｚ＝６４８．９）を示す。
【図７８Ｂ】図７８Ａ〜Ｆは図７８（Ａ、Ｄ）混合物ＩのＬＳＩ−ＬＴＱ−ＭＳ分析と図７８（Ｂ、Ｅ）ＧＦ（ｍ／ｚ＝６１２．４）のＣＩＤスペクトルとの比較を示す。図７８（Ｃ、Ｆ）は、ＤＨＡＰおよびＤＨＢマトリックスを使用した場合のＡｎｇＩ（ｍ／ｚ＝６４８．９）を示す。
【図７８Ｃ】図７８Ａ〜Ｆは図７８（Ａ、Ｄ）混合物ＩのＬＳＩ−ＬＴＱ−ＭＳ分析と図７８（Ｂ、Ｅ）ＧＦ（ｍ／ｚ＝６１２．４）のＣＩＤスペクトルとの比較を示す。図７８（Ｃ、Ｆ）は、ＤＨＡＰおよびＤＨＢマトリックスを使用した場合のＡｎｇＩ（ｍ／ｚ＝６４８．９）を示す。
【図７８Ｄ】図７８Ａ〜Ｆは図７８（Ａ、Ｄ）混合物ＩのＬＳＩ−ＬＴＱ−ＭＳ分析と図７８（Ｂ、Ｅ）ＧＦ（ｍ／ｚ＝６１２．４）のＣＩＤスペクトルとの比較を示す。図７８（Ｃ、Ｆ）は、ＤＨＡＰおよびＤＨＢマトリックスを使用した場合のＡｎｇＩ（ｍ／ｚ＝６４８．９）を示す。
【図７８Ｅ】図７８Ａ〜Ｆは図７８（Ａ、Ｄ）混合物ＩのＬＳＩ−ＬＴＱ−ＭＳ分析と図７８（Ｂ、Ｅ）ＧＦ（ｍ／ｚ＝６１２．４）のＣＩＤスペクトルとの比較を示す。図７８（Ｃ、Ｆ）は、ＤＨＡＰおよびＤＨＢマトリックスを使用した場合のＡｎｇＩ（ｍ／ｚ＝６４８．９）を示す。
【図７８Ｆ】図７８Ａ〜Ｆは図７８（Ａ、Ｄ）混合物ＩのＬＳＩ−ＬＴＱ−ＭＳ分析と図７８（Ｂ、Ｅ）ＧＦ（ｍ／ｚ＝６１２．４）のＣＩＤスペクトルとの比較を示す。図７８（Ｃ、Ｆ）は、ＤＨＡＰおよびＤＨＢマトリックスを使用した場合のＡｎｇＩ（ｍ／ｚ＝６４８．９）を示す。
【図７９】図７９Ａ〜Ｂは、ＯＶＡペプチド３２３−３３９（ｍ／ｚ  ４４４．５５４）のＣＩＤを用いた場合のＬＳＩ−ＭＳｎスペクトルを示す。
【図８０】図８０Ａ〜Ｂはアンジオテンシン−ＩのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図８１】図８１Ａ〜Ｂは酸化型β−アミロイド１０−２０（ｍ／ｚ  ４８８）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す：（Ａ）ＬＳＩ−ＣＩＤ、（Ｂ）ＬＳＩ−ＥＴＤ（ＤＨＢを使用）。
【図８２】図８２Ａ〜Ｅは、ＬＳＩ−ＭＳ分析の最適化および利点を例示する写真を示す：（Ｉ）ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２（左側の列）のＸＹＺ−ステージを用いる正確かつ連続的なアブレーションを利用する取得、手動イメージング実験設定、（Ａ）〜Ｃ；マトリックス／アナライトがマウントされたガラススライド：２，５−ＤＨＡＰおよびアンジオテンシン１を使用する（Ｄ）溶媒に基づく、（Ｅ）無溶媒サンプル調製。
【図８３】図８３Ａ〜Ｂは、溶媒に基づく蒸着された２，５−ＤＨＢの、および透過配置ＬＳＩ設定においてＮ２レーサーによりアブレーションされた顕微鏡観察を示す。
【図８４】図８４は、ＥＳＩ様多荷電イオンが得られるようにレーザーアブレーション中に形成されたマトリックス／アナライト塊の脱溶媒和を可能にするためのＩＭＳ−ＭＳ  ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２上の源修飾を示す。
【図８５】図８５は、５０：５０  ＡＣＮ／水において２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用して調製された、ＬＳＩ−ＭＳ質量スペクトルを得るために使用されるサンプルとしての１）アンジオテンシン１、２）ウシ由来インスリンおよび３）ユビキチンを使用する、脱溶媒和装置金属材料Ａ）銅およびＢ）ステンレス鋼の比較研究を示す。
【図８６】図８６は、Ａ）加熱を伴わない、およびＢ）熱（５Ｖ）が加えられた銅脱溶媒和装置を使用した場合の、１）アンジオテンシン１、２）インスリン、３）ユビキチン、および４）リゾチームのマトリックスとして２，５−ＤＨＡＰを使用したＬＳＩ−ＭＳ質量スペクトルを示す。
【図８７】図８７はユビキチンの多荷電構造のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図８８Ａ】図８８はＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。区分（１）は質量スペクトルを示し、区分（２）は、５０：１０  ＡＣＮ／水において２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用して調製され加熱を伴わないで銅脱溶媒和装置を使用して得られたＡ）シトクロムＣ、（Ｂ）リゾチームおよびＣ）ミオグロビンのｔｄ対ｍ／ｚの２Ｄプロットを示す。
【図８８Ｂ】図８８はＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。区分（１）は質量スペクトルを示し、区分（２）は、５０：１０  ＡＣＮ／水において２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用して調製され加熱を伴わないで銅脱溶媒和装置を使用して得られたＡ）シトクロムＣ、（Ｂ）リゾチームおよびＣ）ミオグロビンのｔｄ対ｍ／ｚの２Ｄプロットを示す。
【図８８Ｃ】図８８はＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。区分（１）は質量スペクトルを示し、区分（２）は、５０：１０  ＡＣＮ／水において２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用して調製され加熱を伴わないで銅脱溶媒和装置を使用して得られたＡ）シトクロムＣ、（Ｂ）リゾチームおよびＣ）ミオグロビンのｔｄ対ｍ／ｚの２Ｄプロットを示す。
【図８９】図８９は、加熱を伴わないで銅脱溶媒和装置を使用して得られた、５０：５０  ＡＣＮ／水において２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用した場合のβ−アミロイド（１−４２）および（４２−１）の異性体タンパク質のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図９０】図９０は、熱を加えないで銅脱溶媒和装置を使用して得られた、２，５  ＤＨＡＰマトリックスを使用した場合のアルツハイマー病の非アミロイド成分（ＮＡＣ）のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ  ＴＳＡを示す。
【図９１】図９１Ａ〜ＢはＬＴＱ−Ｖｅｌｏｓからのアンジオテンシン１のＬＳＩ質量スペクトルを示す。（Ａ）飽和ＤＨＡＰ溶液（５０：５０  ＡＣＮ／水）におけるもの、および（Ｂ）それぞれの２μＬスポットにおいて、より多数のマトリックスが可能となるように、該溶液が加温され過飽和になった場合。
【図９２】図９２はＡＢＡ溶液（５０：５０  ＡＣＮ／水）からの単一および二重荷電アンジオテンシン１負イオンのＬＳＩ  ＬＴＱ質量スペクトルを示す。
【図９３】図９３は負および正の二重荷電アンジオテンシン１イオンのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳドリフト時間分布を示す。
【図９４】図９４Ａ〜ＣはＤＨＡＰによる複数の電荷のＴＳＡ生成を示す。
【図９５】図９５は、無溶媒で調製された各マトリックスにより生成された最高アンジオテンシン１電荷状態（＋２〜＋３）が５分以降には粉砕時間に反比例することを示すグラフを示す。
【図９６】図９６は、ＤＨＡＰマトリックスでアブレーションされたアンジオテンシン１のＬＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図９７】図９７は、３３７ｎｍのレーザーによりアブレーションされたＤＨＢを示す。
【図９８】図９８は高流束で３５５ｎｍのレーザーによりアブレーションされたＤＨＢを示す。
【図９９】図９９は、３３７ｎｍのレーザーによりアブレーションされたＡＢＡを示す。
【図１００】図１００は、３５５ｎｍのレーザーによりアブレーションされたＡＢＡを示す。
【図１０１】図１０１Ａ〜Ｃは電荷遠隔（ｃｈａｒｇｅ  ｒｅｍｏｔｅ）フラグメンテーションによる脂肪酸分析を示す。
【図１０２】図１０２は電荷遠隔フラグメンテーションによる脂肪酸分析を示す。
【図１０３】図１０３はアンジオテンシン１の伝統的なイオン化法の要約を示す。
【図１０４】図１０４は、ＬＳＩを加えた場合の、図１０３に示されているアンジオテンシン１に関する伝統的なイオン化法の要約を示す。
【図１０５】図１０５はＬＳＩ−ＭＳの概要および結果を示す。
【図１０６】図１０６はＬＳＩ装置の写真を示す。
【図１０７】図１０７Ａ〜Ｂは、マトリックスとして２，５−ＤＨＢを使用した場合のウシインスリンのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図１０８】図１０８は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢおよび加熱装置（この場合は約５ボルトをヒータ線に加えた）を使用した場合のリゾチームおよびユビキチンの低存在量タンパク質のＬＤＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図１０９】図１０９は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢおよび加熱装置（この場合は約５ボルトをニクロムヒータ線に加えた）を使用した場合の、図１０８に類似した濃度におけるユビキチンの二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。
【図１１０】図１１０は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢおよび加熱装置（この場合は約５Ｖ）を使用した場合の、図１０８に類似した濃度におけるリゾチームの二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。
【図１１１】図１１１は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢおよび加熱装置（この場合は約５Ｖ）を使用した場合の、図１０８と同じ濃度におけるユビキチンおよびリゾチームの二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。
【図１１２】図１１２Ａ〜ＢはユビキチンおよびリゾチームのＭＳを示す。
【図１１３】図１１３は、加熱することなく２，５−ＤＨＢを使用した場合の、粗製油のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ分析を示す。
【図１１４】図１１４は、加熱を伴って２，５−ＤＨＢを使用した場合の、粗製油のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ分析を示す。
【図１１５Ａ】図１１５Ａ〜Ｄは、加熱することなく２，５−ＤＨＡＰおよび脱溶媒和装置を使用した場合の、漸増分子量を有するタンパク質に関するＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図１１５Ｂ】図１１５Ａ〜Ｄは、加熱することなく２，５−ＤＨＡＰおよび脱溶媒和装置を使用した場合の、漸増分子量を有するタンパク質に関するＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図１１５Ｃ】図１１５Ａ〜Ｄは、加熱することなく２，５−ＤＨＡＰおよび脱溶媒和装置を使用した場合の、漸増分子量を有するタンパク質に関するＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図１１５Ｄ】図１１５Ａ〜Ｄは、加熱することなく２，５−ＤＨＡＰおよび脱溶媒和装置を使用した場合の、漸増分子量を有するタンパク質に関するＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図１１６】図１１６は、同じｍ／ｚおよびここに示されているとおり非常に類似した電荷状態分布を有するために質量分析のみでは識別されていない異性体タンパク質の分析のためのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。
【図１１７】図１１７はβ−アミロイド（１−４２）の二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。
【図１１８】図１１８はβ−アミロイド（４２−１）の二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。
【図１１９】図１１９は、ユビキチンを使用するＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳとのＥＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ比較に用いた条件を示す。
【図１２０】図１２０は、二次元ドリフト時間対ｍ／ｚプロットにおいて示されたユビキチンのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳに関する結果を示す。
【図１２１】図１２１は、二次元ドリフト時間対ｍ／ｚプロットにおいて示されたユビキチンのＥＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳに関する結果を示す。
【図１２２】図１２２は、図１２０および１２１の全電荷状態に関する抽出ドリフト時間分布を示す。
【図１２３】図１２３は、図１２４〜１２７に示されている結果で用いた条件を示す。
【図１２４】図１２４は、イオン存在量の増加およびより低い電荷状態（電荷ストリッピング）を示す漸増コーン電圧で得られたＭＳを示す。ドリフト時間分布は電荷状態＋９、＋７、＋５に関して抽出された。
【図１２５】図１２５は、図１２４から抽出された電荷状態＋９のドリフト時間を示す。
【図１２６】図１２６は、図１２４から抽出された電荷状態＋７のドリフト時間を示す。
【図１２７】図１２７は、図１２４から抽出された電荷状態＋５のドリフト時間を示す。
【図１２８】図１２８は、タンパク質（左パネル）と比較した場合のタンパク質複合体（右パネル）のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳドリフト時間分布を示す。
【図１２９】図１２９はウシインスリンのＴＳＡを示す。
【図１３０】図１３０はアンジオテンシン１のＴＳＡを示す。
【図１３１】図１３１は、１：１のモル比における一定の脂質（スフィンゴミエリン、ＳＭ）およびペプチド（アンジオテンシン１、Ａｎｇ．Ｉ）の、溶媒に基づく分析を示す。
【図１３２】図１３２は、１：１のモル比における一定の脂質（スフィンゴミエリン、ＳＭ）およびペプチド（アンジオテンシン１、Ａｎｇ．Ｉ）の、ＴＳＡ分析を示す。
【図１３３】図１３３は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用して多荷電タンパク質イオンを示している、５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックスでスポットされた無蒸着（ｐｌａｉｎ）ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＬＳＩ−ＭＳ総計完全質量スペクトルおよびインセット（差込）質量スペクトルを示す。
【図１３４】図１３４Ａ〜Ｂ２は、ＬＴＱ−Ｖｅｌｏｓを使用した場合の、５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックスでスポットされた無蒸着ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＬＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図１３５】図１３５は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用した場合の、無蒸着ガラススライド上の５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰでスポットされた脱脂熟成組織から検出された最高質量イオンの同位体分布を示すＬＳＩ  ＭＳを示す。
【図１３６Ａ】図１３６Ａ〜Ｂ３は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用した場合の、無蒸着ガラススライド上で５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰでスポットされた金被覆ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＬＳＩ  ＭＳを示す。
【図１３６Ｂ１】図１３６Ａ〜Ｂ３は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用した場合の、無蒸着ガラススライド上で５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰでスポットされた金被覆ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＬＳＩ  ＭＳを示す。
【図１３６Ｂ２】図１３６Ａ〜Ｂ３は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用した場合の、無蒸着ガラススライド上で５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰでスポットされた金被覆ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＬＳＩ  ＭＳを示す。
【図１３６Ｂ３】図１３６Ａ〜Ｂ３は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用した場合の、無蒸着ガラススライド上で５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰでスポットされた金被覆ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＬＳＩ  ＭＳを示す。
【図１３７】図１３７はＬＳＩ  ＭＳのインセットを示す。
【図１３８】図１３８Ａ〜Ｂは、５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックス（倍率１００倍）（図１３８Ａ）および２，５−ＤＨＢ（倍率５倍）（図１３８Ｂ）でスポットされた無蒸着ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＬＳＩ−ＩＭＳを用いるレーザーアブレーション後の顕微鏡観察を示す。
【図１３９】図１３９Ａ〜Ｂは、５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックス（倍率１００倍）（図１３９Ａ）および２，５−ＤＨＢ（倍率１０倍）（図１３９Ｂ）でスポットされた金被覆ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＬＳＩ−ＩＭＳを用いるレーザーアブレーション後の顕微鏡観察を示す。
【図１４０】図１４０Ａ〜Ｂは、０．１％  ＴＦＡ中の５０：５０  ＡＣＮ：水中のシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（図１４０Ａ）および５０：５０  ＡＣＮ：水中の２，５−ＤＨＡＰ（図１４０Ｂ）でスポットされた金被覆ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＭＡＬＤＩ  ＭＳを示す。
【図１４１】図１４１Ａ〜Ｂは、０．１％  ＴＦＡ中の５０：５０  ＡＣＮ：水中のシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（図１４１Ａ）および５０：５０  ＡＣＮ：水中の２，５−ＤＨＡＰ（図１４１Ｂ）でスポットされた無蒸着ガラススライド上の脱脂新鮮組織のＭＡＬＤＩ  ＭＳを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、多数の（生物）分子の分析を可能にする、質量分析（ＭＳ）において用いられるイオン化技術である。ＭＳによるイメージングも、特に二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）を用いて、十分に確立されている。しかし、ＳＩＭＳは、無傷生物組織または他の表面では限られた有用性を有するに過ぎない。（ＡＰ）−ＭＡＬＤＩイメージングは、高い空間分解能におけるその感度の問題のため、同様に限られたものであるに過ぎない。
【００２０】
通常のＡＰ−ＭＡＬＤＩは、マトリックス／アナライトのレーザーアブレーションにより、主として、単一の又は低い電荷状態のイオンを生成する。ＡＰ−ＭＡＬＤＩにおいては、低い電荷状態のイオンを上昇させて質量分析計のイオン進入口に集中させるのを助けるためにサンプル保持プレートに電圧が加えられる。市販のＡＰ−ＭＡＬＤＩ源は、サンプルプレートに〜２０００Ｖが加えられた場合に最高イオン存在量に達し、〜５００Ｖではイオンをほとんど生成しない。通常、蒸着サンプルがイオン化チャンバーと分光計との間のインターフェースの入口に接近するように、そしてサンプルが反射配置でレーザービームにより照射されうるように、サンプル支持体はイオン化チャンバーの内部に配置される。このサンプル支持体は、通常、伝導性物質を含む群から選択される。サンプル支持体が伝導性である場合、それは、通常、イオン化アナライトを標的表面からインターフェイス（それを通ってイオン化アナライトは分光計に進入する）の入口へ移動させる電場を与えるための電極として使用される。
【００２１】
ＭＳ中に溶媒を使用する伝統的な分析方法も多数の欠点を有する。例えば、タンパク質を含む多数の（生物）分子は、しばしば、一般的な溶媒に不溶性である。さらに、ミスフォールドしたタンパク質は疎水性領域を露出しており、不溶性凝集物を形成しうる。多数の組換えタンパク質は、異種宿主内で過剰発現されると、ミスフォールディングのため、またはアルツハイマー病のような病態の進行において、不溶性となる。
【００２２】
さらに、溶媒に基づくＭＳサンプル調製においては、トリプトファンおよびメチオニン残基の酸化のようなアーチファクトが生じうる（Ｃｏｈｅｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６；７８：４３５２−４３６２；Ｆｒｏｅｌｉｃｈら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００８；８：１３３４−１３４５）。これらのアーチファクトは、サンプルの溶液とマトリックスの溶液とが一緒にされたのと同時に生じうる。したがって、溶媒に基づくＭＳは、酸化ストレスを受けることに関連した用途には最適でないかもしれない。
【００２３】
本開示は、質量分析（ＭＳ）による物質の分析および表面イメージング（組織イメージングを含む）を改良する系および方法を提供する。該系および方法は、通常のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）により生成される主として単一に荷電したイオンよりもＭＳ法により検出されやすい多数の多荷電イオンを生成するレーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）法を用いる。レーザーはサンプルホルダー（サンプル保持体）に対して反射または透過配置で整列されうるが、透過配置で整列された場合、表面イメージング分析に特に重要な空間分解能を改善する。ＬＳＩ後のＭＳは、溶媒に基づくもの、または溶媒を含まないもの（無溶媒分析）でありうる。ＬＳＩ後の無溶媒分析は、溶媒に基づく分析に伴う前記欠点の多くを回避する。無溶媒分析は、ＭＳ表面イメージングにおいて有益な改善された空間分解能をも可能にする。
【００２４】
本開示の多荷電イオンは、４０００の質量対電荷（ｍ／ｚ）比にしばしば制限される高性能質量分析計の質量範囲の拡張を可能にする。単一荷電イオンの場合、これは分子量を４０００ダルトンに制限する。多荷電は、電子移動解離（ＥＴＤ）を用いて実証されたとおり、フラグメンテーションの改善をももたらしうる。
【００２５】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）に類似しているが、ＥＳＩにおけるような印加電圧および液体溶液ではなくマトリックス／アナライトのレーザーアブレーションを用いる、大気圧またはその付近における多荷電イオンの製造方法（生成方法）を本発明において提供する。いくつかのＥＳＩ様法、例えばＥＳＩ（ＤＥＳＩ）およびＡＰ−ＭＡＬＤＩ法は多荷電イオンを生成するが、それは常に電場（通常はキロボルト）および溶媒の存在下である。本明細書に開示されている方法は、ＬＳＩにより、迅速な分析（サンプル当たり約１秒）および正確な質量測定（＜５ｐｐｍ）を可能にする。該方法は更に、ＬＳＩおよび場合によっては無溶媒分析による、質量特異的表面イメージング（組織イメージングを含む）を可能にする。該方法はまた、液体分離とのＬＳＩの結合、およびＴＳＡによる相対的定量を可能にする。オリゴヌクレオチド、グリカンおよび糖タンパク質（これらに限定されるものではない）のような他の化合物のクラスもＬＳＩにより分析されうる。
【００２６】
ＬＳＩにより多荷電イオンを生成させるためには電場は不要であり、ＡＰ−ＭＡＬＤＩで用いられる高電場は多荷電イオンの生成に有害となりうる。いくつかの実施形態においては、レーザーによりアブレーションされた物質は、質量分析に使用される質量分析計の高真空に進入する前に加熱領域を通過しうる。ＬＳＩの利点はレーザーの使用、ひいては高い空間分解能、溶媒に基づく又は無溶媒サンプル調製（溶解度が限られた化合物の場合および組織イメージングでの空間分解能の改善のためには無溶媒）、多荷電イオンが高性能質量分析計の質量範囲を拡張させ、構造分析のためのフラグメンテーションを改善することである。ＬＳＩはまた、多荷電イオンと単一荷電イオンとの間の迅速な変換を可能にする。無溶媒条件の変換も、随意的に、単一または多荷電イオンを生成する。大気圧および真空中で作動させ、レーザーを透過形態で背部から一直線に向けた場合に、空間分解能は増強されうると予想される。
【００２７】
該マトリックスは、レーザー波長で吸収する多数の小分子のいずれか、例えば、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（２，５−ＤＨＡＰ）および２−アミノベンジルアルコール（２−ＡＢＡ）（３３７ｎｍにおけるもの）および２，５−ＤＨＡＰ（３５５ｎｍにおけるもの）；ならびに／または類似した位置的官能性を有する他の小さな芳香族分子でありうる。低い蒸気圧を有する又は室温で液体である、多荷電イオンを生成する物質／マトリックス、例えばエチル  ２−アミノベンゾアート（Ｎ２レーザー、３３７ｎｍ）または２−ヒドロキシアセトフェノン（Ｎｄ／ＹＡＧレーザー、３５５ｎｍ）が使用されうる。溶媒で濡れた又は更には溶媒中で蒸発したマトリックス物質は、しばしば、ＬＳＩの条件下で多荷電イオンを生成する。
【００２８】
これらの実験に使用されるレーザーは、紫外領域の出力を有する任意のレーザーでありうるが、最も典型的には、窒素レーザー（３３７ｎｍ）または周波数３倍化Ｎｄ／ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）である。
【００２９】
いくつかの実施形態においては、該加熱領域は加熱チューブであり、それを通って、レーザーによりアブレーションされた物質が過渡的に真空へと通過しなければならない。該チューブは、金属、石英、または質量分析計真空系に有害な蒸気を放出しない任意の耐熱性物質のものでありうる。いくつかの実施形態においては、該チューブは、５０〜６００℃の温度、あるいはもう１つの実施形態においては１２５〜４５０℃に直接的または間接的に加熱されうる。
【００３０】
質量分析計の真空へのイオン進入および物質／マトリックスアナライトのレーザーアブレーションの点により定められるイオン源領域内の電場は５００Ｖ未満でありうる。いくつかの実施形態においては、該電場は１００Ｖ未満、または０Ｖ未満、または更には−１００Ｖ未満でありうる。
【００３１】
該レーザービームは反射配置でマトリックスアナライト表面に衝突し、この場合、該レーザーは、アブレーション（ＭＳイオン進入口に向かうアブレーション）と同じ側から該サンプルに衝突し、あるいは、透過配置形態でレーザービームをレーザー波長透過サンプルホルダーに通過させて、イオン進入口へ向かう次第に増大するマトリックスアナライトプルーム（ｐｌｕｍｅ）を伴って該サンプルをレーザーアブレーションに対してマトリックス／アナライトの反対側から衝突させることによりそれが生じる。
【００３２】
反射形態においては、金属または非伝導性表面、例えば金属、ガラスまたはプラスチック（これらに限定されるものではない）がサンプルホルダーとして使用可能であり、透過配置においては、レーザービーム伝導性物質、例えばガラス、石英およびプラスチック（これらに限定されるものではない）がサンプルホルダーとして使用可能である。
【００３３】
添加マトリックスの存在下の組織のレーザーアブレーションは、イオン源電圧が低く加熱移動領域が適用された場合には、例えばタンパク質の多荷電イオンを生成しうる。これは特に重要でありうる。なぜなら、それは、高性能質量分析計が組織イメージングのために及びＡＰ状態で使用されることを可能にするからである。
【００３４】
この方法を用いて、１００，０００の質量分解能（１０００〜２０００の従来の分解能と比べて大きな増加）および５ｐｐｍの質量精度（２５〜１００ｐｐｍの従来の質量精度との比較）で、組織からのタンパク質のスペクトルが得られ、遥かに改善されたタンパク質特定が可能となった。
【００３５】
本明細書に記載されているとおりに行った無溶媒マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析は、均一な適用範囲が得られうることを示している。したがって、得られた均一サンプルは、より低いレーザー出力を用いて、厳密な意味でそれぞれのレーザースポットからイオンを生成しうる。なぜなら、結晶サイズのばらつきが存在せず、したがって、化学的不均一性（質量測定の定性的および定量的態様を改善する、「スエットスポット」または「ホットスポット」）望ましくないアナライトフラグメンテーションおよび化学的バックグラウンド（マトリックスシグナル）を有効に減少させるからである。
【００３６】
また、下流でのタンパク質の取扱い中のサンプルの喪失は、溶媒に基づくアプローチにおいては５０％にも達しうる。この問題は、無溶媒ＭＡＬＤＩ法においては、いくつかの場合には有意に軽減されうる。なぜなら、ビーズを機械的に使用してアナライトと物質／マトリックスとを混合する工程中に該サンプルがバイアルの壁から有効に回収されうるからである。図５６および５７は、伝統的ＭＡＬＤＩと無溶媒ＭＡＬＤＩとの一般的相違を示す概要図を示す。
【００３７】
本明細書に開示されている方法は自動化無溶媒マトリックス蒸着法でも使用可能であり、２０μｍメッシュを使用して＜１〜１２μｍの範囲の結晶サイズの均一マトリックス保証範囲で約１分間で純粋組織サンプルの調製を可能にする。それぞれのマトリックスを３μｍのメッシュで約５分以内のボールミルに付すことにより、該サイズは＜１〜５μｍのサイズの結晶へと更に減少されうる。この迅速表面適用方法をマウス脳組織に適用し、結果を、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計を使用して、溶媒に基づくスプレーコーティング法と比較した（実施例４）。ＭＡＬＤＩ−イオン移動度分光法−質量分析（ＩＭＳ）−ＴＯＦ質量分析計上で行った全無溶媒分析（ＴＳＡ）は、無溶媒気相分離を用いて等圧組成物を分離することが示されうる。
【００３８】
本開示による無溶媒ＭＡＬＤＩ法の一例はアミロイドペプチドの分析である（実施例８）。アミロイドペプチド（１−４２）はアルツハイマー病の発病に極めて重要であり、酸化ストレスを促進し、不溶性神経毒性β−アミロイド原線維形態に変化する。アルツハイマー病に関連したアセチル化およびリン酸化に関連したタンパク質修飾における変化のほかに、Ｈｉｓ−６、Ｈｉｓ−１３、Ｈｉｓ−１４およびＭｅｔ−３５の重要な関与を証拠は示唆している。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のミスフォールディングおよびアルツハイマー病の開始の原因としてＭｅｔ−３５の酸化も議論されている。
【００３９】
しかし、本開示によれば、アミロイドペプチドの疎水性成分は、無溶媒ＭＡＬＤＩ分析が、ＭＳに適さない界面活性剤の使用を伴うことなく、これらの酸化アーチファクトおよび溶解度の問題を克服しうることを示した。疎水性ペプチドのイオン化抑制および発射ごとの再現不可能性も著しく軽減されて、分析の定量的態様が改善されうる。トリプシンで消化されたアミロイドペプチド（１−４２）は無溶媒アプローチでは１００％の配列カバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ；適用範囲）を示しうるが、溶媒に基づくＭＡＬＤＩは、溶解度およびイオン化の問題のため、疎水性ペプチドを検出し得ない。膜タンパク質であるバクテリオロドプシンの分析でも同様の改善が見出されうる。
【００４０】
本開示によれば、同時調製、均質化およびＭＡＬＤＩプレート上への蒸着による、それぞれのサンプルホルダー（例えば、マイクロタイタープレート）を使用する無溶媒ＭＡＬＤＩ法は、ハイスループット分析の可能性を増大させうる。
【００４１】
タンパク質／ペプチド分析に関する無溶媒ＭＡＬＤＩ法の現在の問題点には、溶媒に基づく方法と比べて物質に対する必要性が高いこと、および金属付加の傾向がより高く、このため分析時間が長くなりうることが含まれる。これは、無溶媒ＭＡＬＤＩ分析を用いた場合に疎水性ペプチドの分析を信頼しうるものとする少なくとも１つの金属カチオン（Ｎａ＋）を結合させることにより克服されうる。
【００４２】
マトリックス／アナライトの無溶媒調製または溶媒に基づく調製はいずれも、多荷電イオンを生成しうる。無溶媒サンプル調製は組織サンプルに関する利点を有しうる。なぜなら、それは、溶媒による化合物の拡散を回避しうるからである。また、それは、溶媒溶解度の要件を伴うことなく適用可能でありうる。
【００４３】
本開示のもう１つの実施形態は、ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘ／ＴｉｓｓｕｅＢｏｘであり、これらは、高分解能イメージングをもたらすようマトリックスを組織に適用するための無溶媒法をもたらしうる。また、それは、複数のサンプル無溶媒サンプルを同時に調製しＭＡＬＤＩ標的プレート（これは、限定的なものではないがガラス顕微鏡スライドでありうる）に直接移するために、マイクロタイタープレートと共に使用されうる。ガラススライドは、高価な金属サンプルプレートに伴うキャリオーバーおよびクリーニングの問題を排除する。
【００４４】
透過配置はより高い空間分解能の表面イメージングを可能にしうる。ティッシュ・ボックス、透過配置およびレーザースプレー多荷電イオンの組合せは、より大きな分子のイメージングにおいて有用でありうる。
【００４５】
大気圧（常圧）は、該方法を、真空イオン化より迅速かつより生理的に適切なものにしうる。本明細書に記載されているとおり、これらの方法では空間分解能および質量分解能の両方が高くなりうる。
【００４６】
したがって、本明細書に記載されている系および方法は、場合によっては無溶媒マトリックス蒸着および／または分離を伴う、ＬＳＩの迅速かつ簡便な手段を提供する。該系および方法は、ＭＡＬＤＩにおける複数の電荷が、より効率的なフラグメンテーションをもたらし、適用可能な質量範囲を拡張しうることを示している。開示されている方法の利点は、例えば図６５に示されているベータアミロイド（１−４２）のような４，０００Ｄａを超える分子量のタンパク質をイメージングしうることを含む。該開示はまた、図７０に示されているとおり、該分子をイメージングする能力に対する高電圧の効果を示している。
【００４７】
本明細書に記載されている系および方法は、ＥＳＩに類似した多荷電イオンの生成を可能にする。ＬＳＩは、伝統的には真空またはＡＰ−ＭＡＬＤＩにおいて使用される、溶媒に基づくサンプル調製法により、または無溶媒サンプル調製により得られうる。該マトリックス／アナライトＬＳＩサンプルは透過配置または反射配置においてレーザー（Ｎ２レーザー３３７ｎｍ；Ｎｄ／ＹＡＧレーザー３５５ｎｍ）でアブレーションされて、ＬＳＩイオンを生成しうる。
【００４８】
該イオンはサンプルプレートとイオン入口との間の低または無電圧で得られる。これは、限定的なものではないがガラス、プラスチックまたは金属サンプルホルダーの使用を可能にする。透明なガラスおよびプラスチック（金属コーティングを伴う又は伴わないもの）は透過配置を可能にする。低電圧は５００〜１００ボルトのレベルを含みうる。
【００４９】
本明細書に開示されている方法の多荷電イオンは、マトリックスによるレーザーエネルギーの吸収により生成された多荷電マトリックス滴内にアナライトが捕捉されるメカニズムにより生じる。ガス噴射が生じて、該多荷電滴をイオン入口へと噴射する。この過程の運動量は、電場の非存在下で該荷電滴がイオン入口に達するのを可能にする。
【００５０】
これらの多荷電滴は脱溶媒和されて、多荷電イオンを与える。したがって該多荷電イオンは、ミクロン単位ではなくミリメートル単位で測定される、表面からの距離において生成される。あるマトリックスでは、他のマトリックスの場合より該脱溶媒和エネルギーが小さい可能性があるが、すべては、好ましくは、熱を利用して、多荷電アナライトイオンを生成するマトリックス蒸発（脱溶媒和）を引き起こすであろう。
【００５１】
したがって、脱溶媒和領域は、レーザースプレーイオンを生成させるためには使用されるが、ＭＡＬＤＩイオンの生成においては一般に有用でない。加熱チューブ（限定的なものではないが例えば銅またはステンレス鋼のような種々の金属から構成されるもの；種々の直径および長さ；ならびにコーン熱以外の熱の適用の存在下および非存在下）が使用され、それにおいて、該イオンは、大気圧から、脱溶媒和のための領域としての真空へと移される。これが有する利点としては、壁への損失を減少させ、より低い圧力領域において機能するイオン漏斗（ｉｏｎ  ｆｕｎｎｅｌ）のような手段を用いて、より低い圧力の毛管口における該イオンの集中を可能にする層流において、該イオンが生成されることが挙げられる。
【００５２】
電場の非存在下の多荷電滴（またはクラスター）の生成のもう１つの利点は、ＡＰから真空領域へのイオン進入口における喪失（「リム損失（ｒｉｍ  ｌｏｓｓ）」）が最小になることである。
【００５３】
本明細書に開示されている系および方法の例は、タンパク質、脂質、表面および組織（これらに限定されるものではない）を分析および／またはイメージングするために使用されうる。しかし、該系および方法は、タンパク質、ペプチドおよび脂質での使用には限定されず、組織のような複雑な表面からも直接的に使用される。とりわけ、重合体およびプラスチックは、本明細書に開示されている分析に適した非限定的な典型的な物質である。オリゴヌクレオチドも分析されうる。本明細書に開示されている系および方法は、プロテオミクスおよびメタボロミクスの分野における分析にも適している。
【００５４】
レーザーは赤外線（ＩＲ）または紫外線（ＵＶ）でありうる。レーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）は無電場透過配置ＡＰ−ＭＡＬＤＩと互換的に用いられうる。方法の説明における参考文献の引用を、参照されている方法に関するそれらの教示について、参照により本明細書に組み入れることとする。
【実施例】
【００５５】
Ｉ．実施例１
本実施例は、高い空間分解能および超高質量分解能でのＡＰにおける組織から直接的なタンパク質分析のためのレーザースプレーイオン化の使用を記載する。本実施例に記載されている実験からの結果は、ＬＳＩ−ＭＳがＭＡＬＤＩの分析速度、高い空間分解能およびイメージング能とＥＳＩのソフトイオン化、多荷電、フラグメンテーションおよび横断面分析とを兼ね備えたものでありうることを示唆している。
【００５６】
Ａ．序論
ＭＳによる組織イメージングは、腫瘍境界の検出、高い薬物取り込みの部位の決定のような分野、および脳組織におけるシグナリング分子のマッピングにおいて有用であることが判明している。二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）を用いるイメージングは十分に確立されているが、生物学的組織および他の表面からの無傷分子質量測定では限られた有用性を有するに過ぎない。真空条件下で作動するＭＡＬＤＩ  ＭＳは、特に膜脂質、薬物代謝産物およびタンパク質のような高含量成分に関する組織イメージングに用いられており、ある程度の成功を収めている。２０μｍまでの空間分解能が得られており、パーキンソン病、筋ジストロフィー、肥満および癌疾患を解明するためにＭＡＬＤＩ−ＭＳ法が適用されている。
【００５７】
純粋な又は溶媒で希釈された又は有機溶媒と混合された溶媒での組織の洗浄または固定はペプチドおよびタンパク質のシグナルの質を向上させ、マトリックス適用前の組織の寿命を延長させうる。Ｓｃｈｗａｒｔｚらは、ペプチドおよびタンパク質分析のための組織切片の適切な取り扱い（組織の貯蔵、切片化およびマウント）に関する、ならびにＭＡＬＤＩを用いる最適な質量分析データの取得のためのマトリックス、溶媒組成物、マトリックス蒸着法および装置パラメーターの選択および濃度に関する一連の実施指針を作成した（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２００３；３８：６９９−７０８）。組織の厚さも全体的なピーク強度ならびにペプチドおよびタンパク質の観測ピーク数の総数に影響を及ぼす。また、マトリックスおよび組織上へのその蒸着の選択は、該組織から抽出され検出されるタンパク質の亜集団の決定において重要である。
【００５８】
残念ながら、純粋組織の分析に関する組織イメージングのための、真空に基づくＭＳには、欠点が存在する。また、これらの研究において使用される質量分析計は、しばしば、不十分な質量分解能および質量精度を有する。真空イオン化法は単一荷電イオン（１価イオン）を生成するため、質量により選択されるフラグメンテーション法は、特にペプチドおよびタンパク質に関しては、限られた情報しかもたらさない。また、電子移動解離（ＥＴＤ）のような進化したフラグメンテーションは、信頼しうるタンパク質特定に利用可能ではない。
【００５９】
ＡＰ−ＭＡＬＤＩ組織イメージングは高分解能質量分析計に接続されうるが、高空間分解能における感度の問題を受ける。また、ＡＰ−ＭＡＬＤＩは主として単一荷電イオンを生成する。したがって、これらの質量分析計でＡＰ−ＭＡＬＤＩを用いた場合、４０００未満の質量対電荷比（ｍ／ｚ）をしばしば有するそれらの固有の質量範囲の限界のため、無傷タンパク質の質量および横断面分析は不可能である。
【００６０】
ＡＰにおいて作動する新規ＭＡＬＤＩ様方法であるＬＳＩは、タンパク質の組織イメージングのためのＭＳに基づく他の方法と比べて、分析の速度、空間分解能の改善、より適切なＡＰ条件、多荷電による質量範囲の拡張およびフラグメンテーションの改善、ならびに適当な装置で横断面データを入手しうることを含む利点を有する。高性能ＡＰイオン化質量分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ，ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２）での高質量化合物へのＬＳＩの適用可能性は、ＥＳＩ様多プロトン化イオンを生成させることにより実証されている。ＬＳＩ法を用いるＥＴＤによる配列分析を示している第１の実験はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計で成功裏に行われた。重要な調節タンパク質であるユビキチンに関してほぼ完全な配列カバレッジが得られた。ＬＳＩ−ＭＳ分析へのＥＴＤフラグメンテーションの適用は、無傷タンパク質からの及び直接的に組織からのリン酸化、グリコシル化およびユビキチン化部位のマッピングを含む生物学的過程を研究するための新規方法をもたらす可能性がある。
【００６１】
さらに、ＥＳＩおよびＥＳＩに基づく関連方法（例えば、脱離−ＥＳＩ）とは異なり、ＬＳＩ法は、脂質に関して示されたとおりの高空間分解能イメージング（〜１０から〜８０μｍまで）を可能にする。同じ開発段階におけるＡＰ−ＭＡＬＤＩに関する報告と比較して、ＬＳＩは１桁以上高感度であり、高分解能質量分析計でタンパク質を分析しうる。これは、顕微鏡ガラススライドへの僅か１７フェトモルのウシ膵インスリンの適用の後で完全取得質量スペクトルを得ることにより実証されたとおりである。ＬＳＩ法の速度は、５つのサンプルの質量スペクトルを８秒で得ることにより示されており、これは、該方法が、機械的運動を用いれば１サンプルを１秒以内で分析する可能性を有することを予測させるものである。ＭＳにおいては例示されていないが、無傷タンパク質分析の有用性は、１００，０００質量分解能に設定されたＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計、および〜３００μｍ３空間体積をアブレーションするように集中する窒素レーザーを使用して、マウス脳組織から直接的に示された。
【００６２】
Ｂ．実験方法
１．材料
マトリックスである２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）９８％、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（２，５−ＤＨＡＰ）９９．５％およびシナピン酸（ＳＡ）９９％をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。溶媒であるＡＣＮ、トリフルオロ酢酸ＴＦＡおよびＥｔＯＨをＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡから購入した。精製水を使用した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ’ｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。無蒸着顕微鏡ガラススライド（寸法７６．２×２５．４×１ｍｍ）をＧｏｌｄ  Ｓｅａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨから入手した。イメージング実験のためのＩＴＯ被覆伝導性ガラススライドはＢｒｕｋｅｒ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）からの贈呈品であった。
【００６３】
２．マウス脳組織
２０週齢のＣ５７  Ｂｌ／６マウスをＣＯ２ガスで安楽死させ、氷冷１×リン酸緩衝食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）で経心的（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）に５分間潅流して、赤血球を除去した。Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１８５０クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，  ＩＬ）を使用して、脳を−２２℃で冷凍し、連続的に１０μｍ切片に薄片化した。該組織切片を、予め冷却された顕微鏡ガラススライド（無蒸着または金被覆）上に配置し、裏側から指で手短に加温して切片を緩和させ付着させた。組織がマウントされたガラススライドを乾燥剤含有気密箱内で使用まで貯蔵（−２０℃）し輸送（ドライアイス下）することにより、水分凝結を防ぐように注意した。
【００６４】
３．熟成（ａｇｅｄ）および新鮮組織サンプルの分析
本研究において使用するマウス脳組織切片をドライアイス中で輸送した後で脱脂（ｄｅｌｉｐｉｆｙ）し、ついでドライアイス中で一晩輸送した。該熟成脱脂組織サンプルを−５℃で約２ヶ月間貯蔵した。該脱脂は、まず、該熟成組織サンプル上で行われ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認された。最適化された脱脂条件を、ＭＡＬＤＩおよびＬＳＩ−ＭＳ分析から得られた結果を比較する更なる研究に用いた。
【００６５】
第２組のマウス脳組織サンプルを切断し、冷凍し、直ちに一晩にわたって輸送した。各顕微鏡ガラススライド（無蒸着および金被覆）に４〜５個の組織切片をマウントした。該凍結サンプルを受領したら、ガラススライド上の該組織の脱脂を後記のとおりに行い、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計上での即時分析のために、再び直ちに冷凍し、一晩にわたって輸送した。顕微鏡観察ならびにそれに続くＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＬＳＩ−ＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ分析のために、これらのサンプルを再び冷凍し、一晩にわたって輸送した。
【００６６】
４．組織の脱脂
組織切片中の脂質を、公開されている方法に従い除去した。簡潔に説明すると、組織がマウントされたガラススライドをデシケータ内で乾燥させた後、エタノールで２回洗浄した。第１洗浄においては、マウントされた組織を伴うガラススライドを、７０％  ＥｔＯＨで満たされたガラスペトリ皿に浸漬させ、３０秒間回転させ、注意深く取り出した。ついで、溶媒を除去するために該ガラススライドを約１０秒間傾け、直ちに別のペトリ皿中の９５％  ＥｔＯＨで更に３０秒間洗浄した。２回目の洗浄の後、該ガラススライドを分析前にデシケータ内で２０分間乾燥させ、あるいは使用または輸送までドライアイス下で−２０℃で貯蔵した。
【００６７】
５．マウス脳組織のレーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）質量分析（ＭＳ）
Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＥｘａｃｔｉｖｅまたはＬＴＱ−Ｖｅｌｏｓ質量分析計でのＬＳＩは、Ｉｏｎ  Ｍａｘ源の除去、ならびにインターロックを解除し、または前窓および横窓を取り外してイオン進入口へのレーザーおよびサンプルの接近を可能にすることを含む。簡潔に説明すると、レーザービーム（３３７ｎｍ，Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＶＳＬ−３３７ＮＤ−Ｓ）を質量分析計のイオン進入口と整列させた。マウス脳組織がマウントされた顕微鏡ガラススライドを、該組織材料上に幾つかの０．２μＬの液滴を載せることにより、５０：５０  ＡＣＮ：水中に溶解されたＬＳＩマトリックス（２，５−ＤＨＢまたは２，５−ＤＨＡＰ）を使用して調製した。溶媒蒸発後、マウス脳組織に適用されたＬＳＩマトリックスを含有するガラススライドを質量分析計イオン移動チューブ進入口（孔）の前方に接近（１〜３ｍｍ）させて配置し、イオン進入口に対して１８０度に調節して配置されたレーザービームが通るように（透過配置）、手動で移動させた。該ＡＰないし真空イオン移動毛管を２，５−ＤＨＢの場合には３７５℃に、２，５−ＤＨＡＰの場合には３００℃に加熱し、パルス当たりのレーザー・フルエンス（ｆｌｕｅｎｃｅ）は約０．５〜１Ｊｃｍ−２であった。該イオン源領域において電場の非存在下で多荷電イオンが観察された。そのような配置は、多荷電イオンを観察するための手動粗組織研究を可能にする。無蒸着ガラススライドおよび金被覆ガラススライドの両方を使用した。
【００６８】
６．マウス脳組織のＭＡＬＤＩ  ＭＳ
組織脱脂の成否をモニターするために、およびＬＳＩ結果との比較のために、窒素レーザー（３３７ｎｍ）を備えたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。公開されている研究に従ってＭＡＬＤＩサンプル調製を行った。該組織を洗浄し、デシケーター内で乾燥させた後、該組織を、０．１％  ＴＦＡ中の５０：５０  ＡＣＮ：水に溶解された０．２μＬのＳＡマトリックス、または５０：５０  ＡＣＮ：水中の２，５−ＤＨＡＰでスポットした。２０．１６ｋＶの加速電圧、１８．４８ｋＶの抽出電圧、７．０６ｋＶのレンズ電圧および３６０ｎｓのパルス化イオン抽出で直線正イオンモードを用いて質量スペクトルを得た。１２ｋＤａの質量範囲に最適な分解能および感度を示すように遅延抽出パラメーターを最適化した。３０レーザーショットの増量を用い、単一マトリックススポット内にショットを配置し、移動させて、合計１２０レーザーショットを有する質量スペクトルを得た。Ｆｌｅｘ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、該質量スペクトルを処理し、ベースラインを補正した。無蒸着および金被覆の両方の顕微鏡スライドを使用した。金被覆顕微鏡スライドのみが、正確な質量校正をもたらすと予想される。
【００６９】
７．顕微鏡観察および空間体積測定
ＬＳＩ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ分析（およびＷＳＵへの輸送）後の組織上のアブレーション面積を測定することにより、光学顕微鏡観察（Ｎｉｋｏｎ，ＥＣＬＩＰＳＥ，ＬＶ  １００）を行って、空間分解能に関する定性的情報を得た。５倍〜１００倍の種々の倍率条件を用いて、分解能１μｍ未満までの詳細な像を得た。熟成組織サンプルおよび新鮮組織サンプルの両方に関して顕微鏡観察データを得た。該熟成組織切片に関して観察されたとおり、厚さ１０μｍの組織切片上で幅３μｍ未満で長さ１０μｍ未満の空間分解能で、３００μｍ３未満の十分に定められた高空間体積決定に関する典型例が得られる。該新鮮組織切片は、それより若干良好な分解能を示した。
【００７０】
Ｃ．結果
１．熟成組織サンプルに関する実験条件の評価
質量スペクトル組織分析前に脂質を抽出するために本研究において使用した溶媒は、これまでに報告されている研究に基づいて、および本発明者らがＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析から得た結果から選択された。該熟成組織切片を脱脂するために２つの溶媒を使用したが、マトリックスとしてＳＡをした場合、エタノール洗浄はイソプロパノール洗浄より高い強度のタンパク質ＭＡＬＤＩ−ＭＳシグナルを与えた。質量スペクトルの取得は、どちらの脱脂法に関しても、無蒸着顕微鏡ガラススライド上にマウントされた同じマウス脳からの異なる組織切片上のほぼ同じ位置であった。図３１は、エタノールで洗浄され５０：５０：０．２  ＡＣＮ／水／ＴＦＡ中のシナピン酸マトリックスでスポットされたマウス脳のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量スペクトルを示す。図３１に示されているとおり、検出されたペプチドおよびタンパク質シグナルは約５，０００から１９，０００までのｍ／ｚの範囲にわたり（図３１）、これは、Ｓｅｅｌｅｙら（Ｓｅｅｌｅｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２００８；１９：１０６９−１０７７）が提示しているｍ／ｚ範囲内である。伝導性コーティングを伴わない無蒸着顕微鏡ガラススライドを使用したため、質量校正は若干ずれていると予想される。検出されたタンパク質の少数のみが有意なシグナル強度を示しており、該組織における最も豊富なタンパク質種からのものだと推定される。
【００７１】
質量範囲ｍ／ｚが２２００未満に設定されたＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ装置上でのＬＳＩ法の使用は、主にタンパク質をイオン化する２，５−ＤＨＡＰと比較して、脂質のイオン化に関しては２，５−ＤＨＢのほうが遥かに好ましいことを示している。マトリックスとして２，５−ＤＨＢを使用した場合、脱脂組織においてさえも、従前の報告と同様に、脂質シグナルのみがＬＳＩにより観察されたが、十分に洗浄された組織においては、より低い存在量で存在した。一方、図３２Ａに示されているとおり、エタノールで洗浄され５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックスでスポットされたマウス脳の完全な質量スペクトルは、大部分は、多荷電イオンを示している。該質量スペクトル分解能は１３Ｃ同位体の分離をもたらすものであるため、単一荷電状態の分布が、タンパク質分子量を高い精度で決定するのに必要な全てである。したがって、対応する単同位体ピークが、信頼可能な様態では特定され得ない、ノイズの直ぐ上で観察されたイオンでさえも、直線的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ値に比肩する平均的な質量データを与える。図３２Ｂは、６５０〜１０００のｍ／ｚに設定された質量範囲を有する、図３２Ａからのインセット領域を示す。該多荷電イオンは＋３〜＋８であり、約６５０〜５０００Ｄａの分子量を有するイオンに相当する。このデータセットに関しては、ほとんどのイオンは１０ｋＤａ未満の化合物からのものであり、小さなタンパク質だと考えられる。図１３５は、無蒸着ガラススライド上で５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰでスポットされた脱脂熟成組織から検出された最高質量イオンの同位体分布が１３ｋＤａ未満の化合物のものであることを示している（図１３５）。該熟成サンプルの長い貯蔵期間のため、観察されたタンパク質の幾つかは死後酵素消化に由来するものである可能性がある。
【００７２】
レーザーアブレーション後、ＬＳＩによりアブレーションされた組織領域の空間分解能を調べるために顕微鏡観察データを得た。同様の源配置を用いたこれまでの組織分析研究は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢの無溶媒適用により、平均して約８０μｍの空間分解能を示し、未洗浄組織切片上への無溶媒マトリックス蒸着を用いて、有意に、より大きなアブレーション面積を示した。図３３の光学顕微鏡イメージに示されているとおり、改善されたレーザー集束により、およびマトリックスとして２，５−ＤＨＡＰを使用した場合、アブレーション領域は幅＜３〜１０μｍであった。拡張されたアブレーション領域特性（長さ〜８〜１５μｍ）は、おそらく、集束レーザービームが通るマウント化組織の連続的移動により説明されうる。アブレーション領域付近に蒸着物として見出されるマトリックスは該組織材料の脱離／イオン化におけるＬＳＩマトリックスの効用を示している。
【００７３】
２．新鮮組織サンプル上でのＬＳＩ−ＭＳ、顕微鏡観察およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の比較
熟成組織サンプルでの成功した結果は、ガラススライドへの組織のマウント化、脱脂、質量分析および顕微鏡観察に必要な短時間を除き−２０℃以下で維持された新鮮組織切片の検査を促す契機となった。図１３３は、無蒸着ガラススライド上で５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用した場合の、新鮮脱脂サンプルの総計完全質量スペクトルおよびインセット（差込）ＭＳを示しており、ｍ／ｚ  ９１７．５０（ＭＷ  １８３３．０）における豊富な二重荷電ＬＳＩイオン、およびより高いｍ／ｚ値における、大部分は多価である荷電イオンを示している。約１９，６６５Ｄａの分子量を有するイオンに関して、単一の低存在量同位体分布が観察されたものの、少なくとも２つの観察電荷状態分布を有する最高質量タンパク質は１７，８８２Ｄａの分子量を有していた。熟成組織において観察された、より低い分子量のタンパク質の幾つかは（図３２Ｂ）、該新鮮サンプルにおいても観察されたが、それはより低い存在量で観察され、一方、より高い質量のタンパク質は、有意に、より高い存在量を示した。図１３６Ａ〜Ｂ３は、単一のレーザーショット（レーザー射出）において、最も高い存在量のタンパク質が観察されることを示している。図１３６Ａは、該レーザービームが通るように、そしてイオン進入口から３ｍｍ以内で該組織を移動させることにより得られた全イオン電流を示している。該レーザーは１Ｈｚで作動され、１秒ごとに１つの質量スペクトルが得られた。図１３６Ｂ１は完全取得からの総和を示し、図１３６Ｂ２は、単一ショット取得を示し、図１３６Ｂ３は、約７レーザーショットに相当する７つの連続的質量スペクトル取得の総和を示す。金被覆ガラススライド（図１３６）と無蒸着ガラススライド（図１３３）との間で顕著な相違は観察されなかった。図１３７は３つの同位体分布を示し、それぞれは、９９０８、１１７８８および１２３６９Ｄａ（単一同位体質量）の分子量を有するタンパク質に関するものである。図１３７に示されているタンパク質の同位体分布は、１００，０００質量分解能に設定されたＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用した場合の、５０：５０  ＡＣＮ：水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックスでスポットされた金被覆ガラススライド上の脱脂新鮮組織からのものである。
【００７４】
同一マウスからの新鮮組織切片を脱脂し、直ちにＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ装置で質量を測定した。前記の多荷電イオンのほとんどが観察された。しかし、分子量１８３０を有するペプチドは観察されず、脱脂中に除去された可能性がある。図１３４Ｂ１は、ＭＷ  １１，７８８を有するタンパク質の多荷電状態分布を示す単一の０．１秒取得を示す。図１３４Ｂ２はマウス脳組織の別の領域に関する単一取得を示し、ＭＷ  １７８８２の第２のタンパク質より低い存在量のＭＷ  １１，７８８のタンパク質を示す。多走査の総和質量スペクトルを図１３４Ａに示す。図１３４Ａ〜Ｂ２においてｍ／ｚ  約７６０で観察されるイオンは脂質由来である。これらの結果は高空間分解能組織イメージングに対するこの方法の可能性を示している。
【００７５】
さらに、ＬＳＩマトリックスの添加を伴わないＬＳＩ−ＭＳ分析は有用な分析結果を何ら示していない。ＬＳＩマトリックスの蒸着の後の金被覆顕および無蒸着顕微鏡スライドの使用は該脱脂組織の比較されうる存在量の質量スペクトルを与えた。予想どおり、伝導性または非伝導性ガラススライドを使用した場合のＡＰ  ＬＳＩ結果において、質量シフトは観察されない。熟成組織の場合とちょうど同じように、２，５−ＤＨＢは脂質成分および２，５−ＤＨＡＰタンパク質成分を優先的に検出する。
【００７６】
図１３８Ａは、無蒸着顕微鏡ガラススライド上にマウントされ２，５−ＤＨＡＰで処理された新鮮脱脂組織のＬＳＩ−ＩＭＳを用いた場合のレーザーアブレーションの後の倍率１００倍での顕微鏡観察が幅＜３〜８μｍおよび長さ＜５〜２５μｍの空間分解能を示すことを示している。金被覆ガラススライドを使用する新鮮脱脂組織のＬＳＩ−ＩＭＳを用いるレーザーアブレーションの後の倍率１００倍での図１３９Ａの顕微鏡観察は、図１３８Ａに見られるものより若干良好な空間アブレーションを示している。図１３８Ｂは、図１３８Ａの同一ガラススライド上およびほぼ同じレーザー集束での、２，５−ＤＨＢマトリックスを使用した場合および倍率１０倍での別の脱脂切片を示す。図１３８Ｂの顕微鏡観察は〜２００μｍの空間分解能を示している。同様に、図１３９Ｂは、図１３９Ａの同一金被覆ガラススライド上およびほぼ同じレーザー集束での、２，５−ＤＨＢマトリックスを使用した場合および倍率１０倍での別の脱脂切片を示す。図１３８Ｂの顕微鏡観察は〜１００μｍの空間分解能を示している。明らかに、２，５−ＤＨＢを使用した場合には、より高い空間分解能および体積分析を得ることが、有意に、より困難である。種々の実験条件の空間分解能は以下の一般的傾向を示している：２，５−ＤＨＢ（金被覆および無蒸着ガラススライド）＞＞２，５−ＤＨＡＰ（金被覆および無蒸着ガラススライド）＞マトリックス無し（金被覆および無蒸着ガラススライド）。
【００７７】
比較目的で、金被覆および無蒸着ガラススライド上でマウントされたマウス脳からの連続的組織切片を真空ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に使用した。各脱脂組織切片の半分を２，５−ＤＨＡＰでコーティング（被覆）し、残り半分を、数個の０．２μｌマトリックス溶液を使用するＳＡでコーティングした。興味深いことに、多荷電イオンの同一分子量はいずれも、２，５−ＤＨＡＰを使用するＬＳＩと、２，５−ＤＨＡＰまたはＳＡのいずれかを使用するＭＡＬＤＩとで共通ではない。２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用するＭＡＬＤＩは不良な結果を示し、これは真空ＭＡＬＤＩとＬＳＩとの間の矛盾を説明する手助けとなるかもしれない。図１４０Ａおよび１４１Ａは、それぞれ金被覆ガラススライドおよび無蒸着ガラススライド上の、０．１％  ＴＦＡ中の５０：５０  ＡＣＮ：水中のシナピン酸でスポットされた脱脂新鮮組織のＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。図１４０Ｂおよび１４１Ｂは、それぞれ金被覆ガラススライドおよび無蒸着ガラススライド上の、５０：５０  ＡＣＮ：水中の２，５−ＤＨＡＰでコーティングされた脱脂新鮮組織のＭＡＬＤＩ  ＭＳを示す。
【００７８】
Ｄ．考察
１００，０００質量分解能および＜５ｐｐｍの外部質量精度（単一レーザーショットに相当する単一の１秒取得から）に設定されたＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を使用して、マウス脳組織から質量スペクトルが観察される。図１３３に示す質量スペクトルは、０．２μＬ  マトリックススポットのほとんどのアブレーションに相当する約１５秒のデータの平均化を要した。前記の図１３４Ａ〜Ｂ２に示すとおり、ＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計を使用して、質量分離を伴わないが同様の結果が得られた。
【００７９】
アブレーション領域の深さは、反射配置のＭＡＬＤＩ測定においては得ることが困難な値であるが、組織再構築のためには必要な情報である。反射配置ＭＡＬＤＩの適用によるイメージングは、深さおよび形状の大きなばらつきを伴う深さ約５０μｍのアブレーションを示しており、標準的な側方アブレーションは約１００μｍである。該ばらつきはレーザー衝突角およびレーザービームの集束不良の結果でありうるが、特に、サンプル調製条件、各分析の空間分解能の決定における不確実さの導入によるものでありうる。一方、ＳＩＭＳは最上層のみをアブレーションし（正確な深さは尚も議論されているところである）、５０μｍの側方分解能が商業的に入手可能である。しかし、ＳＩＭＳは、多数の生物学的分子で、有意なフラグメンテーションを引き起こし、イオン収率はｍ／ｚの増加と共に急速に減少し、これは組織切片の分析を極めて困難にする。最近の研究は、レーザーに基づく新しいイメージング技術であるレーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化ＭＳを導入した。これは、生きた組織の、横３５０μｍおよび深さ５０μｍの分解能を有する深さプロファイリングもたらす。これらの研究は、反射配置のレーザー衝突によりどのくらいの量の物質がアブレーションされるかの何らかの指標をもたらす。大きなアブレーション面積（体積）は不良な空間分解能を与える。アブレーション面積のばらつきも、ＭＡＬＤＩの、不良な定量的性能の原因となりうる。真空ＭＡＬＤＩを用いた場合、購入したペプチドおよびタンパク質標準物のアブレーション領域から〜１２ｍｍ離れた集束レンズで５μｍ側方分解能が達成されると報告された。ＭＡＬＤＩサンプルへのそのような短い距離は、レーザービームを透過配置で使用することによってのみ達成されうる。本発明者らの測定アブレーション値および既知の１０μｍの組織切片の厚さは、＜３００μｍ３の十分に定められた空間体積が得られうることを示している。
【００８０】
本研究で用いられた、マトリックスをスポットする乾燥滴（ｄｒｉｅｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）法は、組織イメージングには不適当である。なぜなら、ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ溶媒中に抽出される可溶性タンパク質は、溶媒に基づく適用マトリックスにさらされる領域の大部分に広がると予想されるからである。この問題を緩和するために、本発明者らは無溶媒マトリックス調製方法を用いている。透過配置のＬＳＩでは組織の厚さ全体がアブレーションされるという事実は、ＬＳＩおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（後者は該組織切片の表面領域のみをアブレーションする）に関して得られた異なる質量スペクトル結果を説明しうる。さらに、ＬＳＩ−ＭＳから得られたアブレーション面積に基づけば、レーザーによるアブレーションおよび溶媒／マトリックスによる組織傷害の度合は、２，５−ＤＨＡＰを使用した場合には２，５−ＤＨＢを使用した場合と比較して、また、脱脂組織を使用した場合には未洗浄組織を使用した場合と比較して、有意に低いようである。
【００８１】
検討を要するもう１つの難点は、レーザービームが組織を透過しないレーザーアブレーション領域である。これは不均一な組織の厚さおよびマトリックス適用に関連しているようである。将来の進展は、改善された感度、各レーザーショットが組織を透過することを可能にする条件、および生成される気相イオンの複雑性の効率的な単純化のための無溶媒気相分離を要するであろう。
【００８２】
ＴＯＦ分析装置を使用する現在のイメージング質量分析計が、１０，０００を超える質量分解能、および２０ｐｐｍより良好な質量精度をもたらしうるとしても、これは、タンパク質構造を特定し又は更には証明するためには不適当である。さらに、ＥＴＤのような進歩した技術によるフラグメンテーションは、タンパク質イオンの低荷電状態のため、適用不可能である。ＬＳＩアプローチでは、多荷電ＥＳＩ様イオンが生成されうるため、ＡＰＩ質量分析計の質量分解能および精度ならびにＥＴＤおよび横断面分析を適用する潜在的可能性と共に、ＭＡＬＤＩの空間的利点が達成される。
【００８３】
Ｅ．結論
同時的な高い空間分解能および質量分解能により、多荷電イオンを生成する組織から直接的に観察されるペプチドおよびタンパク質の最初の具体例を報告する。単一レーザーショット取得および＜３００μｍ３のアブレーション空間体積が達成される。多荷電イオンの生成は、高性能ＡＰＩ質量分析計が高質量分析に使用されることを可能にして、同位体分離および正確な質量測定をもたらしうる。多荷電イオンは、改善されたタンパク質特定のための電子移動解離（ＥＴＤ）フラグメンテーションを潜在的に可能にする。組織からの直接イオン化のためのレーザーの使用は質量特異的組織イメージングのための高い空間分解能を可能にする。組織イメージングにおけるタンパク質のマッピングに関連した多数の潜在的用途がこの新規アプローチには存在する。この技術を単一細胞分析へと進展させるためには、改善された感度、サンプル調製およびレーザー集束が必要である。
【００８４】
ＩＩ．実施例２
本実施例は、２つの脱溶媒和装置を用いて行った研究、およびそれらが２，５−ＤＨＡＰマトリックスを脱溶媒和しうることを記載する。銅およびステンレス鋼から構成される脱溶媒和装置を使用して、比較研究を行った。本実施例に含まれる追加的研究は、該脱溶媒和装置の適用により得られた結果を記載する。
【００８５】
Ａ．概観
レーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）は、マトリックス／アナライト混合物のレーザーアブレーションにより多荷電イオン（多価イオン）を生成させるための方法である。ＬＳＩは、効率的な脱溶媒和条件を導入することにより、市販のイオン移動度スペクトロメトリー質量分析ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２装置上で達成される。
【００８６】
Ｂ．序論
レーザースプレーイオン化（ＬＳＩ）−質量分析（ＭＳ）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により最近導入された。このイオン化法の原理は、大気圧（ＡＰ）で作動するレーザーの使用によりアナライト／マトリックスサンプルがアブレーションされ、ついで脱溶媒和過程中に多荷電マトリックス／アナライトクラスターからイオンが生成されるというものである。電荷状態の選択が自由に選べることは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）で得られるものに類似した単一荷電イオンおよびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により生成されるものに類似した多荷電イオンを用いる複雑な混合物の分析のためのＬＳＩの有用性を示している。後者は、タンパク質および合成重合体のようなより大きな分子をレーザーアブレーションによりイオン化し次いでＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｘａｃｔｉｖｅのような高性能であるが質量範囲が限られた装置で該多荷電イオンを分析することを可能にするのに特に有益である。本研究においては、図８４に示されているとおり、自作の脱溶媒和装置を使用してタンパク質を分析するために、市販のイオン移動度スペクトロメトリー（ＩＭＳ）ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２装置でＬＳＩを例示する。ＩＭＳ−ＭＳは、高分解能質量分析計と比較した場合にも多数の利点を有する。なぜなら、それはダイナミックレンジを拡張し、異性体組成物を分離しうるからである。ＩＭＳの次元（ディメンション）は、電荷および横断面（サイズおよび形状）に従いイオンを分離する。ＩＭＳは、無溶媒気相分離の利点を有し、無溶媒サンプル調製により、イオン化、分離および質量分析を、いずれの溶媒の使用からも完全に切り離して、ＭＳによる完全な無溶媒分析を達成する。
【００８７】
Ｃ．方法
１．脱溶媒和装置の製造
外径１／８インチ、内径１／１６インチ、長さ３／４インチの銅およびステンレス鋼チューブを脱溶媒和チャンバーとして使用した。該チューブに２４ゲージのニクロム線（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ  ａｎｄ  Ｂｏｒｅａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｎａｗａｎｄａ，ＮＹ，ＵＳＡ）を巻きつけた。該線の上および下には絶縁および安定性のためにＳａｕｒｅｉｓｅｎ  Ｐ１セメント（Ｉｎｓｏ−ｌｕｔｅ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｃｅｍｅｎｔ  Ｐｏｗｄｅｒ  ｎｏ．Ｐ１）が塗られていた。該チューブの出口末端はＷａｔｅｒｓ  Ｚ−スプレー源のイオン入口スキマーの向かいに配置された。「乾燥滴（ｄｒｉｅｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）」法を用いて顕微鏡ガラススライド上に蒸着されたマトリックス／アナライトサンプルを、透過配置を用いて、窒素レーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ＶＳＬ  ３３７  ＮＤ  Ｓ）がアブレーションした。
【００８８】
２．材料
２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）マトリックス（純度９８％）、インスリン（ウシ膵臓）、ユビキチン（ウシ赤血球）、リゾチーム（ニワトリ卵白）、シトクロムＣ（ウマ心臓）およびミオグロビン（ウマ心臓）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから入手し、アンジオテンシン１（ヒト）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅから入手した。アセトニトリル（ＡＣＮ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および酢酸溶媒をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡから入手した。精製水を使用した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）。顕微鏡スライド（寸法１×３インチ）をＧｏｌｄ  Ｓｅａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ，ＵＳＡから入手した。
【００８９】
３．サンプル調製
アンジオテンシン、ユビキチン、リゾチーム、シトクロムＣおよびミオグロビンのストック溶液を個別に純粋水で調製し、インスリンのストック溶液を５０：５０  ＭｅＯＨ：水中で調製した。１μＬを使用して、５０：５０  ＡＣＮ：水中で調製され２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用する無溶媒サンプル調製法を用いてガラススライド上でＬＳＩサンプルを調製し、ついで完全に送風乾燥した。該乾燥ＬＳＩを該脱溶媒和装置の前に約１から３ｍｍの距離で配置した。ＥＳＩとＬＳＩとの比較のために、ユビキチンを４９：４９：２  ＡＣＮ／水／酢酸中で調製した。
【００９０】
Ｅ．結果
自作脱溶媒和装置を使用する、レーザーに基づく新規イオン化法を例示した。該脱溶媒和装置の概要は図８４に見られうる。図８４は、ＥＳＩ様多荷電イオンが得られるようにレーザーアブレーション中に生じるマトリックス／アナライトクラスターの脱溶媒和を可能にするための、ＩＭＳ−ＭＳ  ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２上の源修飾を示す。該脱溶媒和装置は、例えばＶａｒｉａｃを使用して加熱されうる。該脱溶媒和装置への熱の適用は必ずしも必要ではない。また、該マトリックスの熱要件を低下させることにより、該脱溶媒和はより効率的にされて、イオン化効率が向上しうる。これは２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（２，５−ＤＨＡＰ）に関して示されうる。多荷電イオンの生成を示しうるマトリックスの他の具体例としては、２−アミノベンゾイルアルコール（ＡＢＡ）、およびＤＨＢ異性体の幾つかが挙げられる。揮発性および液体マトリックスも使用されうる。
【００９１】
２つの脱溶媒和装置を、２，５−ＤＨＡＰマトリックスを脱溶媒和するそれらの能力に関して調べた。図８５Ａ〜Ｂは、銅およびステンレス鋼脱溶媒和装置から得られたＭＳを示し、低質量タンパク質に関しては、シグナル強度における差は存在しない。図８５（Ａ）は銅脱溶媒和装置からのＭＳを示し、図８５（Ｂ）はステンレス鋼脱溶媒和装置からのＭＳを示し、これらにおいては、サンプル（１）アンジオテンシン（ＭＷ  １２９５）、（２）ウシ由来インスリン（ＭＷ  ５７３１）、および（３）ユビキチン（ＭＷ  ８５６１）を使用した。５０：５０  ＡＣＮ／水中で２，５−ＤＨＡＰを使用して該サンプルを調製した。図８５Ａ３は、銅が、タンパク質の質量が大きくなるほど高いシグナル強度をもたらすことを示している。
【００９２】
図８６は、マトリックスとして２，５−ＤＨＡＰを使用した場合の、１）アンジオテンシン（ＭＷ  １２９５）、２）インスリン（ＭＷ  ５７３１）、３）ユビキチン（ＭＷ  ８５６１）、および４）リゾチーム（ＭＷ  １４３００）のＬＳＩ−ＭＳ質量スペクトルを示し、この場合、区分（Ａ）に示されているとおりに非加熱で、および区分（Ｂ）に示されているとおりに加熱（５Ｖ）して、該銅脱溶媒和装置を使用した。源温度は１５０℃である。図８６（Ａ）（２）の質量スペクトルは、該タンパク質が、図８６（Ｂ）（２）において見られるとおり、該脱溶媒和装置上で加熱を伴わない場合に、より高いＳＮ比（シグナル対ノイズ比）、およびより良好な質量スペクトルを有することを示している。
【００９３】
図８７は、Ａ）ＬＳＩによる、およびＢ）ＥＳＩによる、ユビキチンのＩＭＳ−ＭＳデータを示す。区分（１）は質量スペクトルを示し、区分（２）はドリフト時間対ｍ／ｚの２Ｄプロットを示し、区分（３）は、Ａ）５０：５０  ＡＣＮ／水中の２，５−ＤＨＡＰマトリックスを含むＬＳＩ、およびＢ）４９：４９：２  ＡＣＮ／水／酢酸中のＥＳＩを用いて得られた種々の電荷状態のドリフト時間分布を示す。ＬＳＩの場合、２，５−ＤＨＡＰをマトリックスとして使用し、加熱を伴わないがイオン源温度が１５０℃に設定された銅脱溶媒和装置を使用してデータを得た。ＥＳＩは５μＬ／分の流量および１５０℃の源で得た。図８７（Ａ）（１）および８７（Ｂ）（１）における質量スペクトル電荷状態は類似しており、図８７（Ａ）（３）および８７（Ｂ）（３）におけるドリフト時間はほぼ同一であり、このことは、それらの２つのイオン化法による、類似した気相イオン構造を示している。
【００９４】
図８８の区分（１）は質量スペクトルを示し、区分（２）は、５０：１０  ＡＣＮ／水において２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用して調製され加熱を伴わないで銅脱溶媒和装置を使用して得られた高質量タンパク質：Ａ）シトクロムＣ（ＭＷ  １２３１０）、（Ｂ）リゾチーム（ＭＷ  １４３００）および（Ｃ）ミオグロビン（ＭＷ  １６９５２）のｔｄ対ｍ／ｚの２Ｄプロットを示す。該源温度は１５０℃である。これらの、より高い質量のタンパク質は、加熱を伴わないが１５０℃の源温度を有する銅脱溶媒和装置を使用してＩＭＳ−ＭＳデータ（図８８（２））を得るための、該ＬＳＩの適用可能性を示している。
【００９５】
また、該方法を用いて、β（１−４２）および（４２−１）の同位体タンパク質混合物を分析した。図８９は、加熱を伴わないで銅脱溶媒和装置を使用して得られた、５０：５０  ＡＣＮ／水において２，５−ＤＨＡＰマトリックスを使用した場合のβ−アミロイド（１−４２）および（４２−１）の異性体タンパク質のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。区分（Ａ）の質量スペクトルは２つの化合物の存在を識別しないが、ｔｄ対ｍ／ｚドリフトスコープ・スナップショット（ｄｒｉｆｔｓｃｏｐｅ  ｓｎａｐｓｈｏｔ）の二次元プロット（区分（Ｂ））は、それらの２つの成分を明らかに示している。区分（Ｂ）におけるインセットは、＋４電荷状態の、ベースラインに近い分離を示している。該二次元ドリフト時間対ｍ／ｚは、両方のタンパク質に関する、ならびにそれぞれ図１１７および１１８において分析された純粋なサンプルと比較して重ね合わされた位置における、電荷の数および横断面による分離を示している。電荷状態＋４の抽出（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）ドリフト時間分布（右下の隅）により示されているとおり、該タンパク質の電荷状態はベースライン分離される。ベータ−アミロイド（１−４２）は、その低い溶解度および高い凝集傾向に関して知られており、アルツハイマー病における神経毒性プラーク形成において中心的な役割を果たしている。これは、ＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを用いて該同位体ペプチドがイオン化され分離されうることを示しており、より速いドリフト時間から認められるとおり、該（１−４２）はより小さな構造を有する。該分析は、マトリックスとして２，５−ＤＨＡＰを使用して行われ、イオン源の１５０℃以外の追加的な熱は該熱装置に適用されなかった。
【００９６】
また、該方法を用いて、アルツハイマー病の非アミロイド成分（ＮＡＣ）に関する完全無溶媒分析を分析した。図９０は、熱を加えないで銅脱溶媒和装置を使用して得られた、２，５  ＤＨＡＰマトリックスを使用した場合のアルツハイマー病の非アミロイド成分（ＮＡＣ）のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ完全無溶媒分析を示す。区分（Ａ）は質量スペクトルを示し、区分（Ｂ）は、２Ｄ時間ドリフト対ｍ／ｚを示す。該ドリフトスコープ表示は、大気圧における表面からの直接的な、大きな多荷電ペプチドイオンの効率的生成を示している。より高い電荷状態は、真空ＭＡＬＤＩにおける観察に類似したカチオン付加およびプロトン付加を示している。より低い電荷状態は２つの異なる形状を示している。
【００９７】
Ｆ．結論
マトリックス／タンパク質混合物のレーザーアブレーションにより生成された多荷電マトリックス／アナライトクラスターを、低い加熱および／または熱容量を有する装置（例えば、Ｗａｔｅｒｓ  ＩＭＳ−ＭＳ装置）のための多荷電イオンに変換するために、単純な脱溶媒和装置を製造した。多荷電ＬＳＩイオンを生成させるための、この製造された脱溶媒和装置のＡＰ条件下での使用の成功は、ＬＳＩがＥＳＩに類似しているという、提示されているイオン化メカニズムを支持するものである。ＩＭＳ−ＭＳ技術を用いるタンパク質混合物の無溶媒混雑除去（分離）および完全無溶媒分析に該方法が適用可能であることは組織イメージング用途にとって非常に有望である。
【００９８】
ＩＩＩ．実施例３
本実施例は、レーザースプレーイオン化により完全無溶媒分析のための多荷電正および負イオンを生成するマトリックスおよびマトリックス調製方法を研究する。
【００９９】
Ａ．序論
これまでの研究は、溶媒に基づく乾燥滴サンプル調製物からの多荷電ＬＳＩイオンの生成を示しているに過ぎない。ＭＡＬＤＩ  ＭＳにおいて一般に使用されるマトリックスのレーザーアブレーションによりＬＳＩにおいて生成されるＥＳＩ様多荷電イオンの生成および電荷減少に関与する過程を理解するための努力がなされている。マトリックスにおけるアナライトの含有が主として多荷電のイオンをどのように生成するのか、および非含有が、全て単一に荷電したイオンを、どのように生成するのか、およびこれが２，５−ジヒドロキシ安息香酸以外のマトリックスに当てはまるか否かを理解することは、ＭＡＬＤＩのメカニズムを理解し新規な且つ改良されたＭＳ用途を開発するうえで根本的に重要である。いくつかの共通のマトリックス材料が関わるこれらの研究において得られた洞察、ならびにＴＳＡのための多荷電正および負イオンの生成の知見は、レーザーに基づくＡＰイオン化法を用いる多荷電イオンの生成における改善をもたらすと予想される。無溶媒調製を、ＬＳＩを用いて研究した。
【０１００】
Ｂ．方法
一般的なＭＡＬＤＩマトリックスである２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）ならびにこれまでにＬＳＩ法で試験されていないマトリックスである２−アミノベンジルアルコール（ＡＢＡ）、アントラニル酸（ＡＡ）および２−ヒドロキシアセトフェノン（ＨＡＰ）について研究した。溶媒に基づく用途においては、粉末化アナライト（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．から購入）を７．７ｎｍｏｌ  μＬ−１の濃度で５０：５０  ＡＣＮ：水に溶解することにより、アンジオテンシン１アナライトを調製した。粉末化ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入）を９０ｐｍｏｌ  μＬ−１の濃度で５０：５０  水：ＭｅＯＨに溶解することにより、タンパク質アナライトを調製した。２μＬのアナライト溶液をガラススライド（Ｇｏｌｄ  Ｓｅａｌから購入）上にスポットし、ついで２μＬの飽和マトリックス溶液を最上部にスポットし、混合し、乾燥させた。無溶媒調製の場合には、１０μＬのアナライト（５０：５０  水：ＭｅＯＨ溶液中で調製されたもの）をステンレス鋼ビーズ上に注ぎ、３５℃で３時間蒸発させて、溶媒を蒸発させた。ついでＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒアプローチを用いて、該固体アナライト／マトリックス混合物をガラススライド上に配置した。粉末化アンジオテンシン１およびマトリックスをＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒで直接的に混合することにより、ＡＢＡを含むサンプルを調製した。２μＬのアナライト溶液および２μＬのマトリックスをガラススライド上で混合することにより、ＨＡＰ（２５℃で液体）を含むサンプルを調製した。イオン移動度スペクトロメトリー（ＩＭＳ）−ＭＳ分析のための改造されたＷａｔｅｒｓ  ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２質量分析計またはＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ−Ｖｅｌｏｓ質量分析計内に、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ＶＳＬ  ３３７  ＮＤ−Ｓ窒素レーザーを用いて、透過配置で、全てのサンプルをアブレーションした。また、顕微鏡観察研究およびＨＡＰサンプルのために３５５ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザーを用いた。全てのマトリックスはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１０１】
Ｃ．結果
ＬＳＩにおける多荷電イオン生成の改善ための条件を例示する。図９１Ａ〜ＢはＬＴＱ−Ｖｅｌｏｓからのアンジオテンシン１のＬＳＩ質量スペクトルを示す。図９１（Ａ）においては、飽和ＤＨＡＰ溶液（５０：５０  水：ＡＣＮ）は、＋３イオンより多くの＋１イオンを生成している。図９１（Ｂ）においては、該溶液は加温され、過飽和になって、各２μＬスポット中に、より多くのマトリックスが存在することが可能となった。この方法は、該飽和溶液より高い＋３イオン比およびより高い全体的イオン強度を有するスペクトルを与えた。図９２は、ＡＢＡ溶液（５０：５０  水：ＡＣＮ）からの単一および二重荷電アンジオテンシン１負イオンのＬＳＩ  ＬＴＱ質量スペクトルを示す。スペクトルの拡大図は、該電荷に対応する同位体分布を示している。塩基性アミノ酸置換基により、ＬＳＩは多荷電負イオンを生成しうることが示されている。アミノ基を含有しないマトリックスは単一荷電負イオンを生成したに過ぎなかった。正および負二重荷電アンジオテンシン１イオンに関するドリフト時間分布の観察は、どのマトリックスがそれらを生成するのかに無関係に、該負イオンが、より遅いドリフト時間を有し、該正イオンが、同じドリフト時間を有することを示している。図９３は、どのマトリックスが使用されたかには無関係に、該−２イオンが、該＋２イオンより若干遅く移動すること、および該＋２が、同じドリフト時間を示すことを示している。
【０１０２】
多荷電イオンの豊富な生成が示されており、３０Ｈｚの粉砕周波数（ｇｒｉｎｄｉｎｇ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）がマトリックス内へのアナライトの含有に最適である。図９４Ａ〜ＣはＤＨＡＰによる複数の電荷のＴＳＡ生成を示す。図９４（Ａ）は、２５Ｈｚにおける１０分間の粉砕が＋２の電荷のみを与えることを示している。図９４（Ｂ）は、３０Ｈｚにおける１０分間の粉砕が＋２および＋３の両方の電荷を与え、＋３が最高相対存在量を示すことを示している。図９４（Ｃ）は、強力二次元ドリフト時間プロットにおいて＋７もの電荷状態が得られるように、３０Ｈｚの粉砕がウシインスリンをＤＨＡＰの結晶内に含有させることを示している。
【０１０３】
また、有機液体マトリックスを使用することによりアナライトをマトリックス自体に溶解させることにより、複数の電荷が生成された。尤も、図９６に示すとおり、ＨＡＰマトリックス（２５℃で液体）を使用してアブレーションされたアンジオテンシン１のスペクトルは、３５５ｎｍの波長を有するＮｄ／ＹＡＧレーザーを使用した場合にのみ結果が達成されたことを示している。図９５は、無溶媒で調製された各マトリックスにより生成された最高アンジオテンシン１電荷状態（＋２〜＋３）が５分以降には粉砕時間に反比例することを示すグラフを示す。無溶媒サンプルを調製した場合、各マトリックス混合物は、５分間ではなく１０分間粉砕された場合に、より小さな高電荷比を与えることが示された。最後に、定性的顕微鏡研究は、図９８に示されているとおり、より高い流速で３５５ｎｍ  Ｎｄ：ＹＡＧレーザーが使用された場合には溶融ＤＨＢ／アナライト滴の生成を示しており、一方、図９７に示されているとおり、３３７ｎｍの窒素レーザーからは非常に少量の溶融物質を示している。３３７ｎｍのレーザーによりアブレーションされたＤＨＢの無溶媒ＬＳＩ実験は単一の電荷のみを生成した。３５５ｎｍのレーザーによりアブレーションされたＤＨＢの無溶媒ＬＳＩ実験は多荷電イオンを生成した。また、該窒素レーザーを使用する溶媒に基づくＡＢＡ実験における溶融アブレーションを行わなかった場合も示されており、３５５ｎｍ  Ｎｄ／ＹＡＧレーザーで生成された多量の溶融物質とは対照的であった。図９９は、３３７ｎｍのレーザーによりアブレーションされたＡＢＡを示す。このレーザーは、ＡＢＡの結晶構造を破壊するという問題を有し、したがって、溶媒に基づくＬＳＩ実験では遥かに低いシグナルを生成する。図１００は、３５５ｎｍのレーザーによりアブレーションされたＡＢＡを示す。このレーザーは、溶媒に基づくＬＳＩ実験における３３７ｎｍより遥かに良好な多荷電シグナルを与える。なぜなら、より高いレーザー流速は溶融マトリックス／アナライト滴の生成を可能にするからである。
【０１０４】
Ｄ．結論
どのようなＬＳＩ条件が多荷電イオンの豊富な生成をもたらすかの理解はＭＳ用途の改良に非常に重要である。無溶媒多荷電生成は、おそらく、ＬＳＩフラグメンテーション技術を、溶解度が限られたアナライトに拡張させることが可能であり、負イオンの生成は、プロトン化より脱プロトン化する傾向が遥かに高い分子の分析を改善するであろう。
【０１０５】
ＩＶ．実施例４
本実施例は、表面への無溶媒ＭＡＬＤＩマトリックス蒸着のためにＴｉｓｓｕｅＢｏｘ／ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘ装置を使用して得られたサンプルの無溶媒ＭＡＬＤＩ研究および結果を記載する。
【０１０６】
Ａ．一般的方法
ボールミル法のために、ステンレス鋼ビーズ（１．２ｍｍ）およびクロムビーズ（１．３ｍｍ）をＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫから購入した。物質Ａの３および２０μｍメッシュをＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｎｅｔｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから購入し、物質Ｂの２０μｍのものをＨｏｇｅｎｔｏｇｌｅｒ  ＆  Ｃｏ，Ｉｎｃ．Ｃｏｌｏｍｂｉａ，ＭＤから購入した。マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）および２，５−ジヒドロキシ安息香酸９８％（ＤＨＢ）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。溶媒であるアセトニトリル（ＡＣＮ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡから購入した。精製水を使用した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ’ｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。無蒸着顕微鏡スライド（寸法１インチ×３インチ）をＧｏｌｄ  Ｓｅａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨから購入した。イメージングのためのＩＴＯ被覆伝導性スライドを使用した（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。エアブラシ（１／５馬力、１００ＰＳＩコンプレッサおよびエアブラシキット）をＣｅｎｔｒａｌ  Ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｈｌｌｏ，ＣＡから得た。組織／マトリックス組成物を損なうことなくサンプルを輸送し除霜するためにプラスチック真空密閉食品容器を使用し、それをＺｅＶＲＯ，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬから購入した。
【０１０７】
１．マウス脳組織
１８週齢のＣ５７  Ｂｌ／６マウスを麻酔し、氷冷１×リン酸緩衝食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）で経心的（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）に５分間潅流して、赤血球を除去した。Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１８５０クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，  ＩＬ）を使用して、脳を−２０℃で冷凍し、連続的に１０μｍ切片に薄片化した。それぞれのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＩＭＳ−ＭＳ研究においては、切片は同一マウスからのものを使用したが、動物は、該分析に使用した２つの異なるタイプの質量分析計によって異なるものであった。予め冷却されたスライド上に切片を配置した。該ガラススライドを裏側から指で手短に加温して、切片を緩和させ付着させた。水分凝結を防ぐように注意した。スライドを、使用まで、乾燥剤含有気密箱内で−２０℃で貯蔵した。
【０１０８】
２．急速無溶媒マトリックス蒸着適用のためのＳｕｒｆａｃｅＢｏｘ：設計および製造
表面への無溶媒ＭＡＬＤＩマトリックス蒸着のための装置を設計し製造した。図１８は、ボールミル装置（ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ）により可能となるビーズの激しい運動およびメッシュの生じうる曲がりが組織切片を損なわないように、堅く固定されているが十分な距離（約１ｃｍ）が隔てられている２つの区画からなる、この装置の原理的設計を示す。上部区画には、下部区画に面するメッシュ（２０または３μｍ）が取り付けられている。それぞれのマトリックス物質およびビーズはＳｕｒｆａｃｅＢｏｘの上部区画に加えられる。該ビーズは、所望のマトリックス物質と共に、ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘの上部区画に留まる。上部区画に面する組織切片を保持する顕微鏡スライドは下部区画内に十分な距離を隔てて配置され、ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘの側壁内のスリットにより又は単に顕微鏡スライドの裏側に両面粘着テープを使用することにより、下部区画に固定される。ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘは、顕微鏡スライドを越えてマトリックスを汚染することがないように設計される。それぞれのマトリックス物質の適用は、労力を要さない柔軟なＴｉｓｓｕＬｙｚｅｒ装置を使用して、ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘの激しい運動により行われる。
【０１０９】
Ｂ．マウス脳組織のＭＳ分析
１．無溶媒ＭＡＬＤＩ分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置
ＩＴＯガラススライド（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に付着された凍結マウス脳組織切片を、組織解凍中、乾燥窒素チャンバー内に２０分間配置した。該組織のデジタルイメージをＥｐｓｏｎスキャナー（Ｅｐｓｏｎ  Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  ４４９０  Ｐｈｏｔｏ）で２４００ｄｐｉの解像度で得た。該組織をＡｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）内に配置し、サンプルステージのｘｙ配置を、Ｆｌｅｘｌｍａｇｉｎｇ  ２．１ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）内の３つのティーチポイント（ｔｅａｃｈ  ｐｏｉｎｔ）を用いて整合させた。該装置は、５００〜２０００Ｄａの質量範囲を測定する正イオン  レフレクトロン（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）モードで作動させた。全ての固体スマートビームレーザーは、２００Ｈｚの繰返し率で作動させ、レーザービーム径は、５０μｍに調節した。高い空間分解能の分子イメージを得るために、イメージングラスタ分解能も５０μｍに設定した。マウス脳（２ｍｍ×５ｍｍ）の部分を、３６００スペクトルを超える取得をもたらすイメージング実験のために手動で定めた。合計２００レーザーショットを各画素から合計した。該分析の完了後、ＦｌｅｘＩｍａｇｉｎｇを使用して、問合せたシグナルの検出および強度の両方に基づいてカラーグラジエントとして各ボクセル（ｖｏｘｅｌ）の分子詳細を表示させることにより、結果を処理した。
【０１１０】
２．ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒを使用する急速無溶媒マトリックス蒸着のためのＳｕｒｆａｃｅＢｏｘの適用
大量のストックマトリックス物質（約１ｇ）を、ビーズ剤を含有する５ｍＬガラスバイアル内で、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で一定時間（この場合は５および３０分間）にわたり、所定の周波数（この場合は１５および２５Ｈｚ）で前粉砕する。１つの実験においては、３０〜５０個のクロムビーズ（１．３ｍｍ）を使用した。もう１つの実験においては、３個の４ｍｍビーズと共に２０〜３０個のステンレス鋼ビーズ（１．２ｍｍ）を使用した。
【０１１１】
３．マトリックス移動条件の評価
前粉砕マトリックス（ＣＨＣＡ、ＤＨＢ）を３個の大きな（４ｍｍ）ステンレス鋼ビーズおよび１０〜２０個の小さな（１．２ｍｍ）ステンレス鋼ビーズと共にＳｕｒｆａｃｅＢｏｘの上部区画内に配置する。マウントされたマウス脳切片を含有する顕微鏡スライドを下部区画内に配置する。ついで、組み立てられたＳｕｒｆａｃｅＢｏｘ装置をＴｉｓｓｕＬｙｚｅｒサンプルホルダー内に配置し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒアームに固定する。該組織切片のマトリックスの厚さは２５Ｈｚの所定周波数で時間（３０秒〜５分）により制御される。２０μｍの開口部を有するメッシュ材の場合、ＤＨＢおよびＣＨＣＡマトリックス物質に関して、６０秒で均一なカバレッジ（被覆）が得られた。３μｍの開口部を有するメッシュ材の場合、ボールミル時間を５分に増加させた（ＤＨＢ、ＣＨＣＡマトリックス）。また、１つの顕微鏡スライド上に位置する２つの異なる組織切片上に２つの異なるマトリックス物質（ＤＨＢ、ＣＨＣＡ）を適用した。それぞれの切片をマトリックス適用範囲内で単に移動させることのみにより、後続の２つのマトリックス適用サイクルを行った。２つのＳｕｒｆａｃｅＢｏｘをＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒホルダー内に配置することにより、多重化が達成されうる（補足情報において写真が入手可能である）。
【０１１２】
４．溶媒に基づくマトリックス蒸着のためのスプレーコーティング
既に報告されている方法（Ｇａｒｒｅｔｔら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２００７，２６０，１６６−１７６）に従いエアブラシを使用して、溶媒に基づくマトリックスを組織切片に適用した（それに関する該文献の教示を参照により本明細書に組み入れることとする）。
【０１１３】
簡潔に説明すると、マトリックス（ＣＨＣＡ）を、０．１％  ＴＦＡを含有する５０：５０  ＡＣＮ／水の溶液に溶解させ、それを、エアブラシを使用して１２〜１５ｃｍの距離から、ガラススライド上にマウントされた組織切片上に噴霧（スプレー）した。合計２０のマトリックス溶液のコーティングを各組織切片に適用した。溶媒に基づくこのマトリックス適用法は全てのサンプルに関して一定に保たれ、したがって全てのサンプルに関して最適ではなかった。
【０１１４】
５．顕微鏡観察
ガラススライド上の蒸着マトリックスおよびマトリックス被覆組織ならびに純粋な組織および種々のメッシュの定性的理解を得るために、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，ＥＣＬＩＰＳＥ，ＬＶ  １００）を使用した。種々の拡大条件（５倍〜１００倍）を用いて、約１〜１０μｍまでの詳細な像を得た。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−２４００走査電子顕微鏡により走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析を行った。該ＳＥＭ研究のために、マトリックスで覆われた組織の上にカーボンテープを配置してＳＥＭサンプルを得た。該ＳＥＭサンプルをＳＥＭサンプルホルダーに配置し、種々の倍率で分析した。
【０１１５】
６．サンプルの調製および貯蔵
ＭＡＬＤＩマトリックスで調製された組織サンプルを、プラスチック真空密閉食品容器内に確実に配置し、少し排気して、空気中に含まれる水分を除去した。サンプル容器を−８０℃で一晩維持し、ドライアイス上に配置した。使用前に、容器をドライアイスから取り出し、該容器を室温に加温した後、弱真空密閉を解いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ上で１日間およびＭＡＬＤＩ−ＩＭＳ−ＴＯＦのための６日間の後、質量測定値を得た。
【０１１６】
Ｃ．マウス脳組織のＭＳ分析
１．無溶媒ＭＡＬＤＩ分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置
ＩＴＯガラススライド（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に付着された凍結マウス脳組織切片を、組織解凍中、乾燥窒素チャンバー内に２０分間配置した。該組織のデジタルイメージをＥｐｓｏｎスキャナー（Ｅｐｓｏｎ  Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  ４４９０  Ｐｈｏｔｏ）で２４００ｄｐｉの解像度で得た。該組織をＡｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）内に配置し、サンプルステージのｘｙ配置を、Ｆｌｅｘｌｍａｇｉｎｇ  ２．１ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）内の３つのティーチポイント（ｔｅａｃｈ  ｐｏｉｎｔ）を用いて整合させた。該装置は、５００〜２０００Ｄａの質量範囲を測定する正イオン  レフレクトロン（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）モードで作動させた。全ての固体スマートビームレーザーは、２００Ｈｚの繰返し率で作動させ、レーザービーム径は、５０μｍに調節した。高い空間分解能の分子イメージを得るために、イメージングラスタ分解能も５０μｍに設定した。マウス脳（２ｍｍ×５ｍｍ）の部分を、３６００スペクトルを超える取得をもたらすイメージング実験のために手動で定めた。合計２００レーザーショットを各画素から合計した。該分析の完了後、ＦｌｅｘＩｍａｇｉｎｇを使用して、問合せたシグナルの検出および強度の両方に基づいてカラーグラジエントとして各ボクセル（ｖｏｘｅｌ）の分子詳細を表示させることにより、結果を処理した。
【０１１７】
２．完全無溶媒分析（ＴＳＡ）：ＭＡＬＤＩ−ＩＭＳ−ＭＳ装置
イメージング実験の前に、ＣａｎｏＳｃａｎ  ４４００Ｆスキャナー（Ｃａｎｏｎ，Ｒｅｉｇａｔｅ，Ｕ．Ｋ．）を使用して該組織切片のデジタルスキャンを得、ＭＡＬＤＩイメージング・パターン・クリエータ（ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｒｅａｔｏｒ）ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）内に移し、それにおいて、イメージングされるべき領域を選択した。ＩＭＳモードで作動するＭＡＬＤＩ  ＳＹＮＡＰＴ  ＨＤＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＩＭＳ−ＭＳ分析を行った。該装置の校正は、ｍ／ｚ  １００〜１０００の範囲のポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）の標準混合物を使用して行った。２００Ｈｚ  Ｎｄ／ＹＡＧレーザーを使用して、１００〜１０００のｍ／ｚ範囲にわたってＨＤＭＳモードで作動するＭＡＬＤＩ  ＳＹＮＡＰＴ  ＨＤＭＳ上で該組織イメージングデータを得た。１５０μｍの空間分解能を選択し、画素当たり４００レーザーショットを得た。イオン移動度分離に用いた気体は、２２ｍＬ  分−１に設定された流量の窒素であった。ＩＭＳ装置内の圧力は５．０７×１０−１  ｍＢａｒであった。ＩＭＳ波速度は３００ｍ  秒−１に設定され、この場合、種々の波高が可能であった。該波高は６〜１４Ｖに設定された。取得後、該データを、ＢｉｏＭａｐ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，ＣＨ）を用いるイメージ分析のために、ＭＡＬＤＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）を使用してアナライズ（Ａｎａｌｙｚｅ）ファイルフォーマットに変換した。また、ＤｒｉｆｔＳｃｏｐｅ  ２．１（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）を使用して、該データを評価した。この場合、ｍ／ｚ対ドリフト時間二次元プロットが可視化されうる。ここでは、「ピーク検出」アルゴリズムを適用して、ｍ／ｚ、強度およびドリフト時間が表示されるＥｘｃｅｌ内にローディングされうるピーク一覧を作成した。したがって、ｍ／ｚ  ８６３．５における低存在量の等圧（ｉｓｏｂａｒｉｃ）種に関して示されるとおり、類似したｍ／ｚ（等圧）および異なるドリフト時間（移動度）を有する種を特定することが可能であった。ＤｒｉｆｔＳｃｏｐｅ  ２．１から、特定のｍ／ｚおよびドリフト時間をそれらのＸおよびＹ座標と共に保有する個々のイオン種が選択され抽出されうる。ついで、抽出された生データはＢｉｏＭａｐのために変換されうる。該出力は、関心のあるイオンのみが表示されるイオンイメージである。
【０１１８】
ＴｉｓｓｕＬｙｚｅｒを使用して、幾つかの無溶媒サンプルを調製した。それらのサンプルを分析し、結果を図１〜１４に示す。図１は、図２〜１４（７種のペプチド、２種の小タンパク質および４種の脂質）に示されているイメージを得るために使用したマトリックス（２，５−ＤＨＢ／アナライト混合物）の写真を示す。均質化およびＭＡＬＤＩプレートへの粉末の直接的な移動のためにＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（２０Ｈｚの周波数で１０分間）を使用して、サンプルを無溶媒条件で調製した（左側）。それらの２つの異なるイオン化アプローチにおいて同じマトリックス／アナライト条件が満たされることが保証されるよう、該容器内に残った該無溶媒調製マトリックス／アナライトサンプルの一部を５０／５０  アセトニトリル／水に溶解させ、ＭＡＬＤＩ標的プレート上にスポットし、その後、該溶媒を蒸発させて、溶媒に基づく調製サンプルを得た（右側）。この定められたモデル混合物は多種多様な化合物クラス（ペプチド、小さなタンパク質および脂質）、分子量（３７８．６〜５７３３．５Ｄａ）、溶解度／疎水性［例えば、ウシインスリン（可溶性）対β−アミロイド（１−４２）（不溶性）；β−アミロイド（１−１１）（親水性）対β−アミロイド（３３−４２）（疎水性）］；およびイオン化［例えば、２−ＡＧ対ＮＡＧＡＢＡ；ＰＩ対ＰＣ］にわたっていて、生きた組織内に存在する単純な難題を例示する。他のマトリックス（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ））も使用した。
【０１１９】
それらの２つの異なる調製されたサンプル（溶媒の使用を伴うもの及び伴わないもの）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用してイメージングした。得られたイメージングは、無溶媒調製に関して、溶媒に基づく調製と比較して、イオン存在量の測定による該マトリックスにおける均一なサンプル分布を示している。左側のイメージは無溶媒のものであり、右側のイメージは溶媒に基づくものであり、これらは、多種多様な化合物クラス（ペプチド、小さなタンパク質および脂質）、分子量（３７８．６〜５７３３．５Ｄａ）、溶解度／疎水性［例えば、ウシインスリン対β−アミロイド（１−４２）；β−アミロイド（１−１１）対β−アミロイド（３３−４２）］；およびイオン化［例えば、２−ＡＧ対ＮＡＧＡＢＡ；ＰＩ対ＰＣ］に関する一定のモデル混合物におけるペプチド、小さなタンパク質および脂質に関して例示されている。溶媒に基づくイオン化法を用いた場合には、類似した化合物および分子量［例えば、図２（ｍ／ｚ  ９１５．２）〜１１（ｍ／ｚ  ２８４６．５）における次第に増加する分子量により定められるペプチド］でさえも低い再現性の結果を示しているが（右）、無溶媒の場合は、全体のサンプルにわたって類似したイオン存在量を示している（左）。種々の特性を有する多種多様な化合物を使用する無溶媒サンプル調製を用いた場合には（左イメージ）、該分析に関するイオンシグナルは全体のサンプルにわたって相当に一定であるが、溶媒に基づく方法の場合には（右イメージ）、該イオンシグナルは非常に不均一である。
【０１２０】
図２〜１４は、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を用いた場合の幾つかのタンパク質、ペプチドおよび脂質の分析を示す。図２は、β−アミロイド（３３−４２；  ＭＷ  ９１５．２）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図３は、リポトロピン（ＭＷ  ９５１．１）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図４は、バソプレッシン（ＭＷ  １０８４．３）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図５は、ダイノルフィン（ＭＷ  １１３７．４）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図６は、β−アミロイド（１−１１；ＭＷ  １３２５．３）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図７は、サブスタンスＰ（ＭＷ  １３４７．８）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図８は、メリチン（ＭＷ  ２８４６．５）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図９は、β−アミロイド（１−４２；ＭＷ  ４５１１）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図１０は、ウシインスリン（ＭＷ  ５７３３．５）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図１１は、２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）（ＭＷ  ３７８．６）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図１２は、Ｎ−アラキドノイルガンマアミノ酪酸（ＮＡＧＡＢＡ）（ＭＷ  ３８９．６）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図１３は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）（ＭＷ  ９０９．１）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。図１４は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（ＭＷ  ７６０．１）の、溶媒を含まない（無溶媒）および溶媒に基づく分析を示す。
【０１２１】
Ｖ．実施例５
本実施例は、組織切片の被覆の改善のための、ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘにおいて使用されるマトリックス結晶のサイズの均一な減少を達成するために行った研究を記載する。
【０１２２】
Ａ．マトリックス適用
図１８は、ＭＡＬＤＩを用いるイメージング質量分析での使用に適したＴｉｓｓｕｅＢｏｘの概要図を示す。より多数の組織切片またはより多数の箱を同じホルダー内に加えて、後にそれが種々のマトリックスを使用することが可能となるようにすることにより、ＴｉｓｓｕｅＢｏｘを多重化することが可能である。示されている部分は、マトリックス物質、メッシュおよび金属ビーズを収容するＳｕｒｆａｃｅＢｏｘ上部区画、ならびに組織薄片およびガラススライドを含む下部区画を含む。ＴｉｓｓｕｅＢｏｘは、マトリックスとビーズとを含有する重ね合わせ可能な箱、ならびに約４４μｍの開口を有するメッシュ底を含む。収容箱はガラススライド上に組織サンプルを含みうる。それらの成分はぴったりと密着して嵌るように重ね合されて、該メッシュの分離を維持するのに十分な空間の確保を可能にする。
【０１２３】
製造されたＳｕｒｆａｃｅＢｏｘの場合のように、ボールミルは内容物の激しい運動のための周波数および時間の長さの選択を可能にする。そしてこれは、メッシュ開口を通って押出される（したがって組織切片表面上のマトリックスの厚さに対応した）物質の量を変化させるための非常に容易かつ簡便な手段をもたらす。該アプローチは迅速であり、実施者の介入および経験をほとんど要さす、使用されるメッシュに応じて＜１〜３０μｍの結晶サイズ（４４μｍメッシュ開口を使用した場合の組織からのＳＥＭデータ）を有する均一な被覆（カバレッジ）をもたらす。図２２Ａ〜Ｂは、４４ミクロンのメッシュを使用してボールミル（ＤＨＢマトリックス、２５Ｈｚで３０秒間）に付した後のマトリックス結晶サイズを示す。図２２Ａは１００倍拡大図（倍尺線は５００μｍ）および１００倍拡大図（倍尺線は５０μｍ）のインセットを示す。図２２Ｂは３０００倍の走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）での１０μｍの倍尺線を示す。
【０１２４】
ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘにおいて使用されるマトリックス結晶の均一な減少を達成するための条件を調べた。図３６は適切な粒径の重要性に関するものである。図３６は、（Ａ）１５Ｈｚの周波数で３０分間および（Ｂ）２５Ｈｚの周波数で５分間のＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ条件で（１）クロムビーズおよび（２）ステンレスビーズを使用した場合の、５μｍの倍尺線を有する６０００倍における顕微鏡走査を示す。１．３ｍｍのクロムビーズを含有するバイアルにおける予め粉砕されたマトリックスからの最適な顕微鏡観察の結果は、ステンレス鋼ビーズの場合と比較して、結晶サイズの効率的かつ均一な減少が達成されることを示している。より重いクロム金属ビーズを使用する、より長い粉砕時間は、得られた最小かつ均一な結晶サイズ（＜１〜５μｍの寸法を有する綿毛状非結晶性物質）に基づけば、図３６（１）（Ａ）に示されているとおり、最良の結果をもたらす。
【０１２５】
均一な結晶カバレッジを達成するために、ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘ装置において使用されるメッシュ開口（２０および３μｍ）を減少させるための条件を評価した。マトリックス層の個々の結晶サイズをより明らかにするために、裸の顕微鏡ガラススライド上での比較、および評価を妨げる、より厚いマトリックス層を避けるための短い粉砕時間との比較が得られる。図２４〜２７はＤＨＢまたはＣＨＣＡの光学顕微鏡観察イメージを示す。図２４および２５は、２５Ｈｚ／６０Ｈｚ秒における２０μｍメッシュの後のＤＨＢの光学顕微鏡観察イメージを示し、１０μｍの倍尺線を示している。図２６は、２５Ｈｚ／６０Ｈｚ秒における２０μｍメッシュの後のＣＨＣＡの光学顕微鏡観察イメージを示し、１０μｍの倍尺線を示している。図２７は、マトリックスを移すために３μｍメッシュを使用して２５Ｈｚの周波数および５分間の持続時間のＴｉｓｓｕＬｙｚｅｒ設定を用いる異なるステンレス鋼ビーズ（１．２および４ｍｍ）の混合物および種々のメッシュサイズでマウントされたＳｕｒｆａｃｅＢｏｘを使用した場合の裸顕微鏡スライド上に蒸着されたＣＨＣＡマトリックスの光学顕微鏡観察イメージを示す。２０μｍメッシュの物質（物質Ａ）がマウントされたＳｕｒｆａｃｅＢｏｘとの図３６（１）（Ａ）において決定された減少した及びより均一な結晶サイズの使用は＜１〜１２μｍのＤＨＢ結晶サイズおよび約１〜１２μｍのＣＨＣＡを与えた。該相違は、ＤＨＢが、約１μｍ以下の有意な数の結晶を、それより相当に大きな（３〜１２μｍ）第２のサイズの結晶と共に有することによるものであるらしい。ＣＨＣＡの場合、小さな及び大きな結晶のばらつきはそれほど顕著ではなく、結晶は主に１〜３μｍの範囲であり、少数のみが１２μｍもの大きさである。
【０１２６】
該マトリックス適用アプローチの単純性は、より一層小さな開口を有するメッシュを使用してサンプルを調製することを保証する。最終実験において、３μｍのメッシュ開口の適用可能性を調べた。３μｍの物質の構造は２０μｍの物質Ａに類似している。組織切片のカバレッジの改善のために、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒでのＳｕｒｆａｃｅＢｏｘの激しい振動の持続時間を２５Ｈｚの周波数で５分にまで増加させた。図２７に例示されているとおり、これらの条件は均一サイズ結晶の非常に均一なカバレッジをもたらす。＜１〜５μｍのＣＨＣＡ結晶が観察される。
【０１２７】
図３７〜３９は、ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘを使用した場合のマウス脳組織切片上に蒸着されたＤＨＢマトリックスの光学顕微鏡観察イメージを示し、２５Ｈｚ／３００秒で４４×３μｍのメッシュに付された後のＤＨＢの光学顕微鏡観察イメージを示す。異なるステンレス鋼ビーズ（１．２および４ｍｍ）の混合物が使用された。図３７は、透過光および２００μｍの倍尺線を用いた場合の光学顕微鏡観察のイメージを示す。図３８は、反射光および１００μμの倍尺線を用いた場合の光学顕微鏡観察のイメージを示す。図３９は、反射光および１０μμの倍尺線を用いた場合の光学顕微鏡観察のイメージを示す。図４０は、２５Ｈｚ／３００秒で４４×３μｍのメッシュに付された後のＤＨＢのＳＥＭイメージを示し、５μｍの倍尺線を示す。二重メッシュＴｉｓｓｕｅＢｏｘは、単一メッシュＴｉｓｓｕｅＢｏｘ（図２３）と比較して、＜５μｍ（右下の倍尺線）より小さな粒子における顕著な増加をもたらす。該組織上に蒸着されたマトリックス（この場合はＤＨＢ）に関して得られた結果は図３７および４０に示されている。透過光顕微鏡観察（２００μｍの倍尺線）を用いた場合に図３７において見られうるとおり、３μｍメッシュを使用した場合の該組織のカバレッジは全体的に均一であり、反射光においては、該マトリックスは暗い斑点として現われる。拡大視野（図４０、５μｍの倍尺線）を用いた場合の反射光は、裸ガラススライドに関してこれまでに観察されていたもの（図２７、ＣＨＣＡ）に類似した均一性を示している。該データは、該マトリックスが該組織表面上に含まれることを示唆しており、これは、おそらくはＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒアームの激しい運動により生じた速度の結果であろう。ここで用いた条件下、該均一性は、溶媒に基づくマトリックス適用と比較して改善される。したがって、マウス脳組織切片の均一なマトリックスのカバレッジ（ＤＨＢ）が達成される。
【０１２８】
図２８Ａ〜Ｃに示されている組織ＭＳイメージング研究のために、２０μｍの物質Ａを使用した。図２８Ａ〜Ｃは、（１）急速無溶媒ＳｕｒｆａｃｅＢｏｘマトリックス蒸着（左イメージ）および（２）スプレーコーティング（右イメージ）ならびにＣＨＣＡマトリックスを使用した場合のマウス脳組織の組織イメージングを比較している。図２８Ａは、ＣＨＣＡマトリックスで被覆された組織を示し、図２８Ｂは質量スペクトルを示し、図２８Ｃは、以下のそれぞれのｍ／ｚ値を示す：（Ｉ）無溶媒の場合は７７９．６および（ＩＩ）８４３．３、ならびに溶媒に基づく場合は（Ｉ）７２６．３および（ＩＩ）８０４．３。マウス脳切片への急速無溶媒マトリックス（この場合はＣＨＣＡ）適用を用いて得られたＭＳ組織イメージングの結果がスプレーコーティング法（Ｇａｒｒｅｔｔら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２００７，２６０，１６６−１７６）と比較されている。この方法を用いた場合、溶媒に基づく適用は、ＣＨＣＡの飽和溶液が噴霧として適用された場合に約５〜５０μｍの結晶サイズを与える。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置を使用するデータ取得は、５０μｍの側方分解能およびマトリックス閾値をちょうど超えるレーザー力を用いて両方の組織切片に関して同一に維持された。図２８には、それぞれ各方法で得られた典型的な質量スペクトル（Ｂ）および重ね合されたイオンイメージ（Ｃ）と共に、各マウス脳切片のイメージング領域が（Ａ）に示されている。より豊富なイオンのｍ／ｚ（図２８Ｂ）はカリウム化ホスファプチジルコリンに対応する（例えば、ｍ／ｚ  ７７２（３２：０）およびｍ／ｚ  ７９８（３４：１））。
【０１２９】
ｍ／ｚ  ７７９．６および７２６．３ならびにｍ／ｚ  ８４３．３および８０４．３のような、相補的イメージを示す、ｍ／ｚ値の重ね合わされたイオンイメージが、ヒットの数と共に示されている。溶媒に基づくサンプル調製を用いた場合および無溶媒サンプル調製を用いた場合で異なるイオンが検出されることは意外ではない。それらの方法は相補的であり、該無溶媒サンプル調製は、疎水性の及び溶解度が限られた化合物をより良好にイオン化する。組織変化から脂質シグナルを得ることはマトリックスの選択、溶媒系および極性に左右される（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２００３，３８，６９９−７０８）。
【０１３０】
脂質プロファイルおよびシグナル強度はそれらの２つのサンプル調製の間で異なる。個々のイオンは、十分なイオン強度を有するように、および視認可能な分子イメージが得られるように、および同一サンプル調製において相補的ペアとなるように選択された。本実施例および図２８Ａ〜Ｃにおいて重要なのは、イオンシグナルの強度やｍ／ｚ値ではなく、均一な応答である。
【０１３１】
イオンイメージは、イメージ全体を構成する各質量スペクトルにおけるイオン強度を示すように色分けされる。イオンイメージにおける同一ｍ／ｚ値に関する同一色の均一分布は、ほぼ同一のイオン強度を有する質量シグナルを示す。例えば、同一色を有する領域の大きな斑点により示されているとおり（図２８、１、Ｃ）、無溶媒ＭＡＬＤＩ分析を用いて均一なイオンシグナル応答が得られる。溶媒に基づくＭＡＬＤＩ分析（図２８、２Ｃ）は、例えば主に緑（中等度の存在量）の斑点における赤（高存在量）および青（低存在量）ピクセルとしての、シグナル強度変化のランダムな変動を示している。イオンシグナル強度変化は、ＭＡＬＤＩ分析においてしばしば生じるスイートスポット（ｓｗｅｅｔ  ｓｐｏｔ）、およびＭＡＬＤＩ組織イメージング適用の制限によるものだと考えられうる。この比較は、迅速なマトリックス適用および高分解能イメージ分析のためにＳｕｒｆａｃｅＢｏｘを使用して高分解能イメージが得られうることを示している。組織イメージングのためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置を使用する従来の無溶媒適用は１００μｍの側方分解能を用いていた（Ｐｕｏｌｉｔａｉｖａｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２００８，１９，８８２−８８６）。
【０１３２】
ＶＩ．実施例６
本実施例は、ＦＦ−ＴＧ−ＡＰ  ＭＡＬＤＩを用いるマウス脳組織の分析を記載する。無溶媒および溶媒に基づくマトリックス適用の比較も記載する。
【０１３３】
Ａ．マウス脳の組織質量分析
図４３Ａ〜Ｂは、組織とガラススライドとの間にマトリックスを配置することにより調製されたマウス脳の、無電場透過配置常圧（ｆｉｅｌｄ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（ＦＦ−ＴＧ−ＡＰ）ＭＡＬＤＩ源を使用する組織質量分析を示す。図４３（Ａ）は、新しい（ｖｉｒｇｉｎ）組織スポットをサンプリングすることにより得られた全イオン電流を示し、図４３（Ｂ）は質量スペクトルを示す。該インセットは、高質量分解能装置（５００００質量分解能、＜５ｐｐｍ質量精度）を使用して表された等圧（ｉｓｏｂａｒｉｃ）組成を示す。このＦＦ設計はＴＧ−ＡＰ源での組織およびマトリックス層の両方のアブレーションを可能にする。組織およびマトリックスの両方の厚さは厳密に決定され最適化されうる。
【０１３４】
後記に詳細に説明するとおり、図４４は、レーザーアブレーションを行う前の、乾燥物質に噴霧することによりＤＨＢで被覆された脳切片の顕微鏡スライドの写真を示す。図４４は、（１）レーザーアブレーション前に容器から直接的に乾燥物質に噴霧することによりＤＨＢで被覆された、および（２）４滴を用いて、溶媒に基づくＤＨＢマトリックスが添加された、脳切片の顕微鏡スライドを示す。図４５および４６は、レーザーアブレーション後の図４４の無溶媒マトリックス処理組織切片の光学顕微鏡イメージを示す。図４５（５０μｍの倍尺線）においては、クレーターの形状は、該組織を通ったレーザーアブレーションの成功を示しており、図４６（１０μｍの倍尺線）においては、クレーターを囲む残留マトリックスは該組織のアブレーションにおけるマトリックス支援を示している。図４７はレーザーアブレーション後の図４４（２）の無溶媒マトリックス処理組織切片を示し、０．２μＬのマトリックスにさらされた領域は黒色として現われている。
【０１３５】
組織切片上の、溶媒に基づくおよび無溶媒マトリックス適用を、イオンを生成させるためのレーザー照射の後、イオン光学顕微鏡観察により調べた。レーザービームがマトリックスへの到達の前に該組織を横断するように、該組織切片をＤＨＢマトリックスで被覆した。該マトリックスはこの配置で組織物質のイオン化を支持したが、それは、組織と顕微鏡スライドとの間にマトリックスが存在する場合より低い度合であった。組織に対するレーザーの影響（衝撃）は裸眼では視認できなかった。
【０１３６】
光学顕微鏡検査は組織全体にわたる衝撃事象を示した。図４５および４６には２つの領域が示されている。図４５は図４４の無溶媒マトリックス処理組織切片を示し、これらは、図４７に示されている溶媒に基づく適用からの結果と比較されうる。図４５における、より大きな衝撃領域は、アブレーションされた組織領域（〜８０μｍ）の形状を示している。アブレーションされた組織の隆起周囲により示されるとおり、組織損傷が観察される。図４６に示されている２つのアブレーション領域の小さいほうは該マトリックスの考えられうる役割を示している。マトリックスが組織に十分に接近している場合にのみ、組織分子の脱離／イオン化におけるマトリックス支援が生じうる。考えられうるメカニズムは、最初のショットの後、熱がマトリックスを組織へ溶融させる、というものである。これは、クレーターの両側に尚も存在するマトリックス結晶の部分を伴うアブレーション組織領域を説明するであろう。
【０１３７】
マトリックスを組織の下に配置した場合に、有意に、より良好なイオン電流が得られたが、レーザーでアブレーションされた組織領域は顕著に、より大きかった。ＦＦ−ＴＧ−ＡＰアプローチで生成したイオンの存在量は、改善されたレーザービーム集束で十分なシグナルが観察されることを示唆している。
【０１３８】
ＶＩＩ．実施例７
本実施例はアンジオテンシン１の無溶媒ＭＳ分析を示す。
【０１３９】
ＭＡＬＤＩサンプルの調製には、乾燥滴法に従った（Ｋａｒａｓら，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８；６０：２２９９）。ガラススライドへのサンプルの直接蒸着に関する無溶媒サンプル調製物は、Ｔｒｉｍｐｉｎら，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ  ２００１；１５：１３６４に記載されているプロトコールを用いて調製した。ペプチド、タンパク質、ＤＨＢ異性体および溶媒をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１４０】
図６２は、２，５−ＤＨＢを使用するＬＳＩにより得られたアンジオテンシン１の質量スペクトルを示す。インセットは、示されている拡大領域を示す。図６３は、５０／５０  ＣＡＮ／水を使用するエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により得られたアンジオテンシン１の質量スペクトルを示す。
【０１４１】
結果は、アンジオテンシン１のような小さな系に関しては、２，５−ＤＨＢおよび溶媒に基づくサンプル調製条件を用いた場合、ＥＳＩとＦＦ−ＴＧ  ＡＰ−ＭＡＬＤＩとで同じ電荷状態分布および存在量が観察されることを示している。
【０１４２】
ＶＩＩＩ．実施例８
本実施例はイオン化アミロイドペプチド（１−４２）のＡＰ−ＭＡＬＤＩを示す。
【０１４３】
アミロイドペプチド（１−４２）はアルツハイマー病の発生病理において主要な役割を果たしている。疾患過程の一部として、それは不溶性神経毒性β−アミロイド原線維形態に変換される（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｎら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  １９９９；２５；３３０−３３１）。本実施例では、アミロイド（１−４２）に対してＡＰスルーステージ（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｓｔａｇｅ）ＭＡＬＤＩを行った。該タンパク質分子量は標準的なＭＳ範囲を上回るため、該タンパク質はイオン化された。図６５〜６７は、＋４、＋５および＋６の電荷を有する質量スペクトルを示す。本実施例は、より大きな分子量のタンパク質（約４，０００ｍｗを超える）のイオン化が、ＡＰスルーステージＭＡＬＤＩを用いるそれらの分析を可能にしうることを示している。
【０１４４】
ＩＸ．実施例９
本実施例はウシインスリンの調製およびＭＳ分析を示す。
【０１４５】
２，５−ＤＨＢおよび溶媒に基づくＭＡＬＤＩマトリックス／アナライト調製法を用いて、ウシインスリンに関する質量スペクトルを得た（Ｋａｒａｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８；６０：２２９９）。該ＭＡＬＤＩ質量スペクトル（図６８）はインスリンに関するＥＳＩスペクトルに類似していた。図１０はウシインスリンの無溶媒および溶媒に基づく調製を示す。
【０１４６】
Ｘ．実施例１０．追加的なデータおよび開示
以下の図は、質量分析（ＭＳ）による物質の分析および組織イメージングを改善するために行った研究および実験に関する追加的なデータおよび開示を表す。
【０１４７】
図１５は形状による同圧（ｉｓｏｂａｒｉｃ）分子の無溶媒分離を示す。ＩＭＳ−ＭＳは電荷の数および横断面（サイズおよび形状）により分子を分離し、ガラクトースおよびアスピリンは実質的に同じ分子量（実質的に同じサイズ）を有し、１個のカチオンを加えることによりイオン化される（同じ数の電荷）。図１５は、アスピリン（Ｃ９Ｈ８Ｏ４；正確な分子量１８０．０４２Ｄａ）と対比されたガラクトース（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６；正確な分子量１８０．０６３Ｄａ）のＥＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ（ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いた場合のドリフト時間スペクトル（無溶媒分離、イオン移動度出力）を示す。
【０１４８】
図１６は形状による異性体分子の無溶媒分離を示す。ＩＭＳ−ＭＳは電荷の数および横断面（サイズおよび形状）により分子を分離する。Ｎ−ＡＥＡ（アナンダミド；医薬関連化合物エンドカンナビノイド；脳機能および健康（幸福）に関連；アミド結合を生成するようにアミン官能性により互いに連結されたアラキドン酸およびエタノールアミン）およびＯ−ＡＥＡ（アナンダミド；薬理学的には重要でないと考えられる化合物；エステル結合を生成するようにアルコール官能性により互いに連結されたアラキドン酸およびエタノールアミン）は同一分子量（同一サイズ）を有し、１個のカチオンを加えることによりイオン化される（同じ数の電荷）。図１６は、Ｎ−ＡＥＡと対比されたＯ−ＡＥＡのＥＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ（ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いた場合のドリフト時間スペクトル（無溶媒分離、イオン移動度出力）を示す。インセットのスペクトルは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）３４８．２８における［Ｍ＋Ｈ］＋に関して豊富なイオンを示すＮ−ＡＥＡおよびＯ−ＡＥＡの質量スペクトル（ＭＳ出力）である。これらのイオンは、同一の分子量および電荷を有するため、ＭＳ次元（ｍ／ｚのみにより分離される）においては区別できない。
【０１４９】
図１７はサンプル調製および反射配置（ＲＧ）ＭＡＬＤＩのスキームを示し、組織物質の分析に特に関連した問題を示している。組織はサンプルホルダー上に配置され、マトリックスが適用される。レーザーは該マトリックスおよびサンプルに向けられて、組織分子の脱離およびイオン化を引き起こす。
【０１５０】
図１７は特に、マトリックス物質が組織サンプルを完全には被覆しないことが望ましくないことを示している。ＲＧ  ＭＡＬＤＩは、現在市販されている真空および常圧（大気圧）ＭＡＬＤＩ質量分析計において専ら用いられている源配置である。一番左のイメージは表面（しばしば、金被覆ガラススライド、金属板、またはガラススライドを保持しうる金属板）上の組織物質を示す。
【０１５１】
該分子を気相内に元のまま（無傷）で移し、電荷を付けるためには、より大きな分子に特に重要なことであるが、該アナライトの脱離およびイオン化を支援するマトリックスを使用しなければならない。真ん中の上のイメージは理想的な場合を示し、真ん中の下のイメージは、溶媒に基づく適用アプローチを用いてマトリックスを適用した場合の実験的な実際の状況を示しており、組織切片における種々の化合物のイオン化が乱れ混乱していて、それらはそれらの元の及び天然の環境および位置を喪失している。
【０１５２】
右上のイメージは、気相内で無傷分子イオンを生成するＲＧ  ＭＡＬＤＩを示す。ＵＶレーザー（しばしば３５５ｎｍ［Ｎ２レーザー］；３５５ｎｍ［Ｎｄ：ＹＡＧレーザー］）は該マトリックスを「前」から或る角度で励起する（これは側方および深さの次元でのアブレーション領域の制御を制限する）。生成されるイオンは、電圧の適用により該表面から上昇し、加速して分析計へと送られ、該分析計において、該分子は、多くの場合にはｍ／ｚにより、分離される。
【０１５３】
図１９は、ＴｉｓｓｕｅＢｏｘの、１つの代表例の写真を示す。図１８に概要が示されているＴｉｓｓｕｅＢｏｘを組み立てるために使用される組み立て部分が示されている。左イメージは、メッシュ（典型的には金属またはプラスチックであり、＞４４〜１μｍの種々の「細孔」径を有する）を保持する上部区画を示す。この上部区画は、組み立てられると、マトリックスおよびビーズ（しばしば、ステンレス鋼、ガラス、クロムであり、典型的なサイズは０．５ｍｍ〜５ｍｍの範囲である）で満たされる。右イメージは、底部においてガラススライド（２つの組織切片がマウントされる）を保持する下部区画を示しており、これが上部区画と合体した場合、組織とメッシュとの間に十分な空間が存在し、後続のＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒの適用（時間および周波数は、所望のマトリックス、例えば２，５−ＤＨＢおよびＣＨＣＡの最適な均一な被覆が得られるように調節されうる）中にビーズの激しい運動が生じてもそれらが接触しないように、それらの区画は設計され製造されている。
【０１５４】
図２０は、内側に示されているＴｉｓｓｕｅＢｏｘのためのアダプターセットホルダーを示す。
【０１５５】
図２１は、ボールミル法によりボールがマトリックスを粉砕するように所望の時間および周波数で２つのアダプターセットを同時に振とうするＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ装置を示す。図１８に示されているとおりに該スクリーンが配置された場合、該マトリックスは組織薄片上に蒸着される。該スクリーンが存在しない場合、図１〜１４に示されているとおりにマトリックス／アナライト無溶媒調製が行われうる。
【０１５６】
図２９は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＴＯＦ／ＴＯＦ装置上で２，５−ＤＨＢをマトリックスとして使用するマウス脳の無溶媒ＴｉｓｓｕｅＢｏｘ調製を示す。上側のイメージは、組織イメージを示し、そのスポットは質量により選択されたものであり、下側のイメージにおいては、質量スペクトルが示されており、その質量は、ｍ／ｚ  ７７２．５におけるシグナルのＭＳ／ＭＳフラグメンテーションをもたらすように選択されている。結果を図３０に示す。これは、ＴｉｓｓｕｅＢｏｘ調製方法を用いた場合の組織イメージングの一例である。
【０１５７】
図３０はマウス脳組織からのｍ／ｚ  ７７２．５Ｄａの無溶媒ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦを示す。ピークは８６，０５８  ｍ／ｚ、１８３，９９１  ｍ／ｚ、５５１，２８８  ｍ／ｚ、７１３，３７１  ｍ／ｚおよび７７２，５０１  ｍ／ｚで見られる。組織物質からの組織スポット選択および質量選択イオンｍ／ｚ  ７７２．５（図２９を参照されたい）のフラグメンテーションの質量スペクトル。
【０１５８】
図３４は、より一層細かい粒径のために二重メッシュアプローチを用いるためのティッシュ・ボックス（ｔｉｓｓｕｅ  ｂｏｘ）の代表例を示す。その設計は、２つのメッシュが使用されていることを除き、単一メッシュＴｉｓｓｕｅＢｏｘである図１８に類似している。該二重メッシュアプローチは、しばしば、２つの異なるサイズのメッシュを使用し、ビーズを保持しうる大きいほうの開口を有するメッシュの下に、小さいほうの「細孔」開口を有するメッシュが位置する。この中央区画は、下方の表面（ここに例示されているのは、組織切片がマウントされたガラススライドである）を覆う、より一層小さな粒子へと、粒径を精密化する。
【０１５９】
図３５は、組織を含有するガラススライド、および二重メッシュＴｉｓｓｕｅＢｏｘアプローチの代表例を示す。図３５は、図３４に概要が示されている二重メッシュＴｉｓｓｕｅＢｏｘを組み立てるために使用される製造部分を示す。２つの異なるを有するマウントされたメッシュ「細孔」径（ここでは、上部に合体される２０μｍのもの、および中央部に合体される３μｍのもの）が左側に示されている。右から２番目には下部区画が示されている。一番右側には、下部区画の下に合体されるガラススライド（２つの組織切片がマウントされている）が示されている。該二重メッシュアプローチでは前粉砕が省略されうる。
【０１６０】
図４１は、通常のＲＧ（上）をＴＧ（下）と比較するスキームを示す。ＴＧにおける前方の運動量は、より高い運動量の粒子を得るために質量分析計へのイオン進入口とサンプルプレートとの間に加えられる電圧の必要性を排除する。
【０１６１】
図４２は、ＡＰにおけるイオンの生成のためのレーザーに基づく源の設計およびマトリックス適用の概要図を示す。図４２（Ａ）はＲＧを示し、図４２（Ｂ）はＴＧを示す。
【０１６２】
図４８は２つの異なる無溶媒サンプル調製法を示す。該スキームの上部は、組織の上に、ＴｉｓｓｕｅＢｏｘアプローチを用いてマトリックスを無溶媒で適用することを示し、これは、典型的には、ＲＧ  ＭＡＬＤＩと共に用いられる。下半分は、まず、ＴｉｓｓｕｅＢｏｘ無溶媒アプローチを用いて顕微鏡ガラススライドをマトリックスで被覆（コーティング）し、ついで、該組織を上に適用することを示す。このアプローチは透過配置に関する利点を有する。どちらの場合も、レーザーエネルギーは、組織ではなくマトリックスにより吸収される。
【０１６３】
図４９〜５２は、無溶媒ＭＡＬＤＩを行うために用いられる装置の写真を示す。図４９は、多荷電イオンを生成させるためのＬＳＩでの実験の結果を示す。乾燥滴（ｄｒｉｅｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）アプローチを用いてマトリックス／アナライトが適用された石英プレートのホルダーが示されている。窒素レーザーは黒色の箱であり、その真正面には熱Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｏｎ  Ｍａｘ源がある。図５０は前面からのイオンマックス（Ｉｏｎ  Ｍａｘ）源の拡大図を示し、ｘ，ｙ，ｚステージ上に保持された集束レンズが最前面に示されている。レーザービームは、質量分析計イオン進入口の近くの石英プレート上に保持されているマトリックス／アナライトサンプルに達するように該レンズにより集束される。該レーザービームはイオン進入毛管と一列（１８０度）に並んでおり、該ＭＳの０．２ｍｍのイオン進入口と２０ｍｍのイオン進入口との間に保持されたサンプルに達する。図５１も、孔、および石英ガラス上のサンプルを示す。図５２は、前方および後方のみの移動方向でのレーザービームによる石英プレートの複数回の通過により生じている、マトリックス（ハート形）を貫く線を示す。
【０１６４】
図５３〜６１は、ＬＳＩを用いて得られた結果を示す。図５３および５４は、ＬＳＩ用いて得られたスフィンゴミエリンに関する結果を示す。図５５は、２，５−ＤＨＢにおける、脂質であるホスファチジルグリセロールに関する結果を示し、この場合も、ＥＳＩの場合とちょうど同じのように、ＬＳＩにおける単一荷電（１価）イオンを示している。図５６は、ＬＳＩを用いて得られたホスファチジルイノシトールに関する結果を示す。図５７は、ＬＳＩを用いて得られたアナダミドに関する結果を示す。図５８は、ＬＳＩを用いて得られたＮＡＧｌｙに関する結果を示す。図５９は、ＬＳＩを用いて得られたｌｅｕ−エンカファリンに関する結果を示す。図６０は、ＬＳＩを用いて得られたブラジキニンに関する結果を示す。図６１は、ＬＳＩを用いて得られたサブスタンスＰに関する結果を示す。
【０１６５】
図６４〜６７は、ＬＳＩを用いて得られた追加的な結果を示す。図６４は、＋２および＋３の電荷状態を有するＡＣＴＨに関する結果を示す。図６５〜６７は、それぞれ＋４、＋５および＋６の電荷状態を有するアミロイド（１−４２）に関する結果を示す。
【０１６６】
図６９は、電圧の存在下で無溶媒ＭＡＬＤＩを行うために使用した装置の写真を示す。図７０は、電圧の存在下でＡＰスルー・ステージ（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｓｔａｇｅ）ＭＡＬＤＩを用いて得られた、アンジオテンシン１に関する結果を示す。電荷状態は＋１および＋２であり、図６２（この場合、電圧の非存在下で＋２および＋３の電荷状態が見られた）と比較される。
【０１６７】
図７１〜８０は、本明細書に開示されている方法の利点の更なる証拠を示す。図７１Ｂ〜Ｃに示されているとおり、フラグメントイオンはＢＳＡのトリプシン消化性ペプチドの必要な配列情報を与える。特に、図７１Ａ〜Ｃは、溶媒に基づくサンプル調製条件および２，５−ＤＨＡＰマトリックス、１５０℃のコーン温度ならびにマウント化脱溶媒和装置（非加熱）を用いる、トリプシンによるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質消化物のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを示す：Ｉ）ＩＭＳ−ＭＳ（図７１Ａ）、ＩＩ）図７１（Ｂ）トラップおよび図７１（Ｃ）ＴｒｉＷａｖｅ部の移動領域におけるＣＩＤフラグメンテーション。左側に質量スペクトルが示されており、右側にドリフト時間分離対質量／電荷比（ｍ／ｚ）の２Ｄプロットが示されている。
【０１６８】
図７２Ａ〜Ｂは完全無溶媒分析の利点の一例を示す。ペプチドおよび脂質（５０／５０のモル比）のモデル混合物を調製し、Ｉ）ＬＳＩを用いる完全無溶媒分析、ＩＩ）無溶媒サンプル調製を用いるＩＭＳ−ＭＳにより分析した。ＩＩのみが両方の成分を検出する。区分（Ａ）は２Ｄ  ＩＭＳ−ＭＳプロットを示し、区分（Ｂ）は質量スペクトルを示す。図７３Ａ〜Ｂは、無溶媒サンプル調製およびそれに続く粗油サンプルのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ取得によるＴＳＡを示す。図７３（Ａ）は質量スペクトルを示し、図７３（Ｂ）は、加熱（２００℃以上）を伴う無溶媒条件下の２，５−ＤＨＢにおける原液粗油のドリフト時間（ｔｄ）対ｍ／ｚの二次元プロットを示す。
【０１６９】
図７４Ａ〜ＣはＴＳＡ質量スペクトル、およびドリフト時間（ｔｄ）対ｍ／ｚの二次元プロットを示す。図７４Ａは、３０Ｈｚで５分間、追加的マトリックスの添加および３０Ｈｚで５分間の粉砕の反復の粉砕パターンで無溶媒条件下で調製された２，５−ＤＨＡＰ中の粗油を示す。図７４Ｂは、図７４Ａと同じ純粋な植物油を示す。図７４Ｃは、３０Ｈｚで５分間の粉砕パターンにおける２，５−ＤＨＡＰ中のモーター油を示す。図７４Ａ〜Ｃに関しては、２μＬのアナライトを使用し、無溶媒条件下で調製した。全３個のサンプルに熱を加えた。生成したイオンはイオン移動度次元における形状により分離される。この情報は、伝統的なＭＡＬＤＩ分析で一般的に存在するレーザー誘発性凝集物が存在しないことを示している。これらのＬＳＩの結果はまた、該マトリックスに関連した化学的バックグラウンドが重要ではないことを示している。該純粋植物油およびモーター油はより低い質量種の存在を有さないが、該粗油サンプルに関連した複雑性が該２Ｄプロットにおいて見られうる。さらに、該２Ｄプロットは、ドリフト時間対ｍ／ｚの画像２Ｄ表示のスナップショットアプローチを用いる比較分析に有用であることを示している。
【０１７０】
図７５は、４００℃の加熱移動毛管を使用し２，５−ＤＨＢを使用する炭酸脱水酵素（平均分子量２９０２９）タンパク質のＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ装置上のＬＳＩを示す。図７６はＬＴＱ−ＥＴＤ  Ｖｅｌｏｓ装置上のＬＳＩを示す。ダウンタイム（真空インターロック）も交差汚染も伴うことなく、複数のサンプルに関する迅速な取得が行われる。
【０１７１】
図７７Ａ〜Ｂは、ＯＶＡペプチド３２３−３３９の種々の電荷状態のＬＳＩ−ＣＩＤ質量スペクトルを示す。図７７（Ａ）ｍ／ｚ＝８８７；図７７（Ｂ）ｍ／ｚ＝４４４（ＤＨＢマトリックスを使用）。
【０１７２】
図７８Ａ〜Ｆは図７８（Ａ、Ｄ）混合物ＩのＬＳＩ−ＬＴＱ−ＭＳ分析と図７８（Ｂ、Ｅ）ＧＦ（ｍ／ｚ＝６１２．４）のＣＩＤスペクトルとの比較を示す。図７８（Ｃ、Ｆ）は、ＤＨＡＰおよびＤＨＢマトリックスを使用した場合のＡｎｇＩ（ｍ／ｚ＝６４８．９）を示す。図７８（Ｄ）  ＤＨＢは、ＤＨＡＰ（図７８Ａ）より高い電荷状態を生成する。図７８（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）は、ＣＩＤフラグメンテーションにより得られた類似した配列情報が両方のマトリックスに関して観察されることを示している。
【０１７３】
図７９Ａ〜Ｂは、ＯＶＡペプチド３２３−３３９（ｍ／ｚ  ４４４．５５４）のＣＩＤを用いた場合のＬＳＩ−ＭＳｎ（ｎ＝２および３）スペクトルを示す。図７９（Ａ）はＬＳＩ−ＭＳ２を示し、図７９（Ｂ）は、ＤＨＢを使用した場合のＬＳＩ−ＭＳ３を示す。図８０Ａ〜Ｂは、アンジオテンシン１（Ａｎｇ．１）、ＯＶＡペプチド３２３−３３９（ＯＶＡ）、β−アミロイド１０−２０（ＢＡ（１０−２０））、、ミエリンプロテオリピドタンパク質１３９−１５１（ＭＰＰ）および増殖因子１０２−１１１（ＧＦ）を含有する混合物中のＡｎｇ．１（ｍ／ｚ  ４３３）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図８０（Ａ）はＬＳＩ−ＣＩＤを示し、図８０（Ｂ）は、ＤＨＢマトリックスを使用した場合のＬＳＩ−ＥＴＤを示す。
【０１７４】
図８１Ａ〜Ｂは、酸化型β−アミロイド１０−２０（ＢＡ），ｍ／ｚ  ４８８のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す：（Ａ）ＬＳＩ−ＣＩＤ、（Ｂ）ＬＳＩ−ＥＴＤ（ＤＨＢを使用）。ＬＳＩ−ＥＴＤを用いた場合には、ＬＳＩ−ＣＩＤと比較して改善された配列カバレッジが認められる。
【０１７５】
図８２Ａ〜ＥはＬＳＩ−ＭＳ分析の最適化および利点を例示する：（Ｉ）ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２（左側の列）のＸＹＺ−ステージを用いる正確かつ連続的なアブレーションを利用する取得、手動イメージング実験設定（Ａ）〜Ｃ；マトリックス／アナライトがマウントされたガラススライド：２，５−ＤＨＡＰおよびアンジオテンシン１を使用する（Ｄ）溶媒に基づく、（Ｅ）無溶媒サンプル調製。
【０１７６】
図８３Ａ〜Ｂは、溶媒に基づく蒸着された２，５−ＤＨＢの、および透過配置ＬＳＩ設定においてＮ２レーサーによりアブレーションされた顕微鏡観察を示す。質量分析計進入口ではなく、約２ｍｍの距離の位置に第２の顕微鏡ガラススライドを配置して、アブレーションプルームを集めた。左側（ａ）には親スライド上のアブレーション領域が示されており、右側（ｂ）には、集められた該プルームが示されている。実験観察は該レーザーアブレーション過程における「クラスター」または「滴」の生成を示している。
【０１７７】
図１０１Ａ〜Ｃは、電荷遠隔（ｃｈａｒｇｅ  ｒｅｍｏｔｅ）フラグメンテーションによる脂肪酸分析を示す。該図は、真空ＭＡＬＤＩを用いてＳＹＮＡＰＴ  ＨＤ質量分析計上で取得されたオレイン酸のＴＳＡを示す。図１０１Ａは質量スペクトルを示し、図１０１Ｂは二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示し、図１０１Ｃは、２つの等圧体（ｉｓｏｂａｒ）ｍ／ｚ  ２９５．１２３〜２９５．１７９およびｍ／ｚ  ２９５．２６０〜２９５．３２２に関する抽出ドリフト時間を示す。
【０１７８】
図１０２は電荷遠隔（ｃｈａｒｇｅ  ｒｅｍｏｔｅ）フラグメンテーションによる脂肪酸分析を示す。オレイン酸の図１０１Ａ〜ＣからのＭＳ／ＭＳ：区分（Ａ）は全ＭＳを示し、区分（Ｂ）は、３つの移動度が観察されることを示している。最低移動度は電荷遠隔フラグメンテーションを示し、したがって、区分（Ｃ．３）に示されているとおり構造情報（Ｃ−９二重結合位置）を与える。
【０１７９】
図１０３はアンジオテンシン１（ペプチド）の伝統的なイオン化法の要約を示す。左パネルは真空ＭＡＬＤＩからの結果を示し、右パネルはＡＰ  ＥＳＩを示す。
【０１８０】
図１０４は、ＬＳＩ（下）を加えた場合の、図１０３に示されているアンジオテンシン１（ペプチド）に関する伝統的なイオン化法の要約を示す。該ＬＳＩは、微量の該ペプチドを含有する固体マトリックス（２，５−ジヒドロキシ安息香酸［２，５−ＤＨＢ］）のレーザーアブレーションを用いた場合にＥＳＩ様多荷電イオン質量スペクトルを示す。
【０１８１】
図１０５はＬＳＩ−ＭＳの概要および結果を示す。上区分は、多荷電イオンを遊離するための該マトリックスの蒸発のために脱溶媒和領域に進入する多荷電クラスターまたは液滴を生成するレーザーアブレーションを示すＬＳＩ法の概要を示す。左下区分は、通常のＭＡＬＤＩメカニズム（ＡＰＣＩ過程）により見掛け上生成されている若干荷電したイオンと比較した場合の、脱溶媒和領域（上右に示されている）の温度の上昇に対する多荷電イオンの応答を示す。右下区分は、マトリックス２，５−ＤＨＢを含有する親ガラス顕微鏡スライドから３ｍｍの距離を隔てて保持された顕微鏡スライド上に集められたレーザーアブレーションされた液滴を示す。該条件はＬＳＩレーザーアブレーション条件に類似しており、ＡＰにおけるレーザーアブレーションにより該固体マトリックスから液滴が生成されることを示している。
【０１８２】
図１０６はＬＳＩ装置の写真を示す。上区分はＩＭＳ−ＭＳ  ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２を示す。レーザー（右上）が質量分析計の孔と一直線に並ぶことが可能となるように、ロッススプレーのモーターは取り外されている。レーザーと孔との間の集束レンズは、ガラススライド上に配置され該孔から１〜３ｍｍ前にマウントされたマトリックス／アナライトサンプル上にレーザービームが直接的に集束することを可能にする。右下区分は源改造の内部図を示す。該サンプルは熱装置（白）に面しており、レーザーは後方（この場合は右側）から当たり、集束レーザービームが通るようにマトリックス／アナライトサンプルを移動（ラスタ）させるためにナノエレクトロスプレー源のｘｙｚステージが用いられる。前部の針金は例えばＶａｒｉａｃ装置につなぎとめられて、使用マトリックスに応じて熱も加えられる。左下区分は、約３ダースのＬＳＩサンプルがローディングされた顕微鏡ガラススライドを示す。
【０１８３】
図１０７Ａ〜Ｂは、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢを使用した場合のウシインスリンのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。図１０７Ａは、熱が加えられ、集束レーザービームを通るようにサンプルが移動された場合、全イオン電流が効率的なイオン生成の指標となることを示す。約８０秒間の取得の後に加温をやめた後、イオン電流の有意な低下が観察される。図１０７Ｂは全イオン電流からの複数の取得の質量スペクトルを示す。ＥＳＩで典型的に観察される豊富なシグナルおよび電荷状態が、電荷状態＋４に関するインセットスペクトルで示されているとおり高い分解能で示されている。
【０１８４】
図１０８は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢおよび加熱装置（この場合は約５ボルト）を使用した場合のリゾチームおよびユビキチンの低存在量タンパク質混合物のＬＤＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。それらの２つのタンパク質の電荷状態の複雑さのため、混雑した全質量スペクトルが認められる。
【０１８５】
図１０９は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢおよび加熱装置（この場合は約５ボルト）を使用した場合の、図１０８に類似した濃度におけるユビキチンの二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。ＬＳＩイオンは、ＥＳＩイオンの場合と同様に電荷の数および横断面（サイズおよび形状）により分離される。
【０１８６】
図１１０は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢおよび加熱装置（この場合は約５Ｖ）を使用した場合の、図１０８に類似した濃度におけるリゾチームの二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。ＬＳＩイオンは、ＥＳＩイオンの場合と同様に電荷の数および横断面（サイズおよび形状）により分離される。
【０１８７】
図１１１は、マトリックスとしての２，５−ＤＨＢおよび加熱装置（この場合は約５Ｖ）を使用した場合の、図１０８と同じ濃度におけるユビキチンおよびリゾチームの二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。両方のタンパク質のＬＳＩイオンは、ＥＳＩイオンの場合と同様に電荷の数および横断面（サイズおよび形状）により分離される。該データの二次元性および該表示の画像は、電荷状態および両方のタンパク質に対するそれぞれの特徴の特定を可能にする。各タンパク質の質量スペクトルは、図１１２においてリゾチームに関して示されているとおり、正確に抽出されうる。
【０１８８】
図１１２Ａ〜ＢはユビキチンおよびリゾチームのＭＳを示す。図１１２Ａは、図１０８に示されているとおりのユビキチンおよびリゾチームの全ＭＳを示す。図１１２Ｂは、図１１１に示されている二次元ドリフト時間対ｍ／ｚプロットからの、リゾチームの抽出質量スペクトルを示す。
【０１８９】
図１１３は、加熱することなく２，５−ＤＨＢを使用した場合の、粗製油のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ分析を示す。
【０１９０】
図１１４は、加熱を伴って２，５−ＤＨＢを使用した場合の、粗製油のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ分析を示す。脱溶媒和装置に「加熱が適用されない」（「加熱することなく」、「非加熱」）と記載されている場合、それは、１５０℃であるイオン源スキマーに尚も接続されている。したがって、金属脱溶媒和装置は１５０℃に近い。脱溶媒和装置に熱が加えられると、それは１５０℃を超える温度に加熱される。熱が加えられた場合、より豊富かつより高い分子量のイオンが観察される。該イオンは気相中で分離される。レーザー脱離／イオン化でしばしば観察される高いレーザー力またはＥＳＩでのより高い濃度による凝集は観察されない。同一サンプルおよび取得プロトコールが用いられる限り、これらの複雑な系の画像スナップショットは、迅速に識別されるのに十分な程度に区別されうる。
【０１９１】
図１１５Ａ〜Ｄは、加熱することなく２，５−ＤＨＡＰおよび脱溶媒和装置を使用した場合の、漸増分子量を有するタンパク質に関するＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。図１１５Ａはブタインスリンに関する結果を示し、図１１５Ｂはユビキチンに関する結果を示し、図１１５ＣはシトクロムＣに関する結果を示し、図１１５Ｄはリゾチームに関する結果を示す。
【０１９２】
図１１６は、同じｍ／ｚおよびここに示されているとおり非常に類似した電荷状態分布を有するために質量分析のみでは識別不可能な異性体タンパク質混合物の分析のためのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳを示す。ベータアミロイド（１−４２）の全質量スペクトルが区分（Ａ）に示されており、アミロイド（４２−１）のものが区分（Ｂ）に示されている。該分析は、マトリックスとして２，５−ＤＨＡＰを使用し脱溶媒和装置に熱を加えないで行った。
【０１９３】
図１１７はベータアミロイド（１−４２）の二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。該二次元ドリフト時間対ｍ／ｚは電荷の数および横断面による分離を示す。該分析は、マトリックスとして２，５−ＤＨＡＰを使用し加熱装置に熱を加えないで行った。
【０１９４】
図１１８はアミロイド（４２−１）の二次元ドリフト時間対ｍ／ｚを示す。該二次元ドリフト時間対ｍ／ｚは電荷の数および横断面による分離を示す。該分析は、マトリックスとして２，５−ＤＨＡＰを使用し加熱装置に熱を加えないで行った。
【０１９５】
ここに開示されている方法は、温度を増加させること（２，５−ＤＢＨでは〜４００℃）およびマトリックスの熱要件を低下させること（２，５−ＤＨＢでは〜３００℃）により、アナライト／マトリックスクラスターの脱溶媒和が達成されうることを示している。ここに開示されている方法はまた、異性体タンパク質混合物の電荷状態同族体（ファミリー）がＩＭＳ次元においてベースライン分離されることを示している。
【０１９６】
図１１９〜１２２は、ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２上で同じナノエレクトロスプレーイオン化源を使用するＥＳＩにより得られた結果と比較した場合の、ＬＳＩにより得られたドリフト時間の結果に基づくユビキチンの構造を示す。図１１９は、ユビキチンを使用するＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳとのＥＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ比較に用いた条件を示す。図１２０は、二次元ドリフト時間対ｍ／ｚプロットにおいて示されたユビキチンのＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳに関する結果を示す。図１２１は、二次元ドリフト時間対ｍ／ｚプロットにおいて示されたユビキチンのＥＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳに関する結果を示す。電荷状態はＬＳＩとＥＳＩとで非常に類似しており、イオン存在量は、ＥＳＩイオンで、より高い。図１２２は、図１２０および１２１の全電荷状態に関する抽出ドリフト時間分布を示す。左側にはＬＳＩイオンが示されており、右側にはＥＳＩイオンが示されている。ＬＳＩおよびＥＳＩイオンは実質的に同一のドリフト時間を示している。電荷状態には無関係に、ＬＳＩイオンは、それぞれのＥＳＩイオンより狭いドリフト時間を有する。さらに、電荷状態＋１２を有するＬＳＩイオンは、ＥＳＩイオン＋１２より分離されたドリフト時間分布を示している。したがって、ＬＳＩは大きな分子の軟（ソフト）イオン化をもたらし、構造情報を保有する。
【０１９７】
図１２３〜１２７は、ＬＳＩにより得られたドリフト時間の結果に基づくユビキチンの構造を示す。図１２３は、図１２４〜１２７に示されている結果で用いた条件を示す。該ＬＳＩ条件は図１９９におけるものと同一であるが、コーン電圧は０Ｖ（伝統的なＬＳＩ条件）から１００Ｖ（典型的なＥＳＩ値）へと系統的に変化された。図１２４は、イオン存在量の増加およびより低い電荷状態（電荷ストリッピング）を示す漸増コーン電圧で得られたＭＳを示す。ドリフト時間分布は電荷状態＋９、＋７、＋５に関して抽出された。図１２５は、図１２４から抽出された電荷状態＋９のドリフト時間を示す。電荷状態＋９は狭いドリフト時間分布を示す。１００Ｖのコーン電圧においては、より長いドリフト時間（約８０ドリフト時間ビン）も観察され、このことは、幾つかのタンパク質イオンが、より伸張した構造へと開くことによりそれらの構造を喪失したことを示している。図１２６は、図１２４から抽出された電荷状態＋７のドリフト時間を示す。電荷状態＋７は、コーンにおける０Ｖにおける幾つかの小型構造を示す幾つかのドリフト時間（＜約９５ビン）を示している。電圧の増加と共に、これらのドリフト時間は消失し、１つの豊富なドリフト時間のみが観察される。図１２７は、図１２４から抽出された電荷状態＋５のドリフト時間を示す。電荷状態＋５は広いドリフト時間分布を示す。電圧の増加と共に、該分布の存在量はより強力になる。これらの結果は、コーンにおいて０Ｖにおいて、電圧の増加と共に喪失した幾つかの構造が適用されることを示している。したがって、ＬＳＩは、ユビキチンの構造の完全性を維持する軟イオン化法である。
【０１９８】
図１２８は、タンパク質（左パネル）と比較した場合のタンパク質複合体（右パネル）のＬＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳドリフト時間分布を示す。全ての電荷状態に関して、より長いドリフト時間が観察され、最も顕著なのは電荷状態＋７である。この観察は、該タンパク質−リガンド複合体の、より大きな横断面と合致している。
【０１９９】
ここに開示されている方法は、同じナノＥＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ装置を使用して、ＬＳＩおよびＥＳＩの両方が、より少数のコンホーメーションを示す該ＬＳＩにおける全ての電荷状態に関して類似したドリフト時間を示すことを示している。ここに開示されている方法はまた、ＬＳＩおよびコーン電圧に関して、該電圧が、より低い電荷状態（電荷ストリッピング）のイオンの存在量を増加させること、電圧がバックグラウンドを導入すること、およびより少数のコンホメーションが電圧の増加と共に観察されることを示している。
【０２００】
図１２９はウシインスリンのＴＳＡを示す。該分析は、２，５−ＤＨＡＰマトリックス／ウシインスリンのＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ均一化／移動、および熱の適用を伴わない脱溶媒和装置を用いて行った。二次元ドリフト時間対ｍ／ｚプロットにおいて観察されるとおり、気相中で多荷電イオンが生成され分離される。
【０２０１】
図１３０はアンジオテンシン１のＴＳＡを示す。該分析は、種々のマトリックス／アンジオテンシン１脱溶媒和、および熱の適用を伴わない脱溶媒和装置を用いて行った。該抽出ドリフト時間分布において示されるとおり、気相中で多荷電イオンが生成され分離される。上に示されているドリフト時間は、負イオンモードで測定された２−アミノベンジルアルコールを示し、中央に示されているドリフト時間は、正イオンモードで測定された２−アミノベンジルアルコールを示し、下に示されているドリフト時間は、正イオンモードで測定された２，５−ＤＨＡＰを示す。結果は、負および正イオンモードの両方のＴＳＡに多種多様なマトリックスが使用されうることを示している。同じ電荷状態（２価）の負イオンは、プロトン化されているイオンより速いドリフト時間を有する。２つの異なるマトリックスにより生成された正の２価イオンは実質的に同一のドリフト時間を有し、このことは、該マトリックスが該イオンのドリフト時間（ひいては構造）にほとんど影響を及ぼさないことを示している。注目すべきこととして、ＡＢＡの溶媒に基づくサンプル調製は負の２価イオンの生成をもたらさず、Ｎｄ／ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）を使用した場合に負の２価イオンが観察された。
【０２０２】
図１３１〜１３２は、１：１のモル比の脂質（スフィンゴミエリン、ＳＭ）およびペプチド（アンジオテンシン１、Ａｎｇ．１）の一定の混合物の分析を示す。図１３１は、１：１のモル比における脂質（スフィンゴミエリン、ＳＭ）およびペプチド（アンジオテンシン１、Ａｎｇ．１）の一定の混合物の、溶媒に基づく分析を示す。
【０２０３】
図１３２は、１：１のモル比における脂質（スフィンゴミエリン、ＳＭ）およびペプチド（アンジオテンシン１、Ａｎｇ．１）の一定の混合物の、ＴＳＡ分析を示す。図１３１はペプチドのみを観察しているが、図１３２は、ＳＭとＡｎｇ．１との混合物の両方の成分を観察している。これらの結果は分析における定性的および相対定量的改善を示している。該分析は、２，５−ＤＨＡＰマトリックス／アナライト混合物のＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ均一化／移動、および熱の適用を伴わない脱溶媒和装置を用いて行った。二次元ドリフト時間対ｍ／ｚプロットにおいて観察されるとおり、気相中で多荷電イオンが生成され分離される。
【０２０４】
特に示さない限り、本明細書および特許請求の範囲において用いられる、成分の量、特性、例えば分子量、反応条件などを表す全ての数字は、全ての場合において、「約」なる語により修飾されていると理解されるべきである。したがって、特に示さない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数的パラメーターは、本発明が得ることを望む所望の特性に応じて変動しうる近似値である。少なくとも、そして特許請求の範囲の範囲への均等論の適用を制限するものではないが、各数的パラメーターは、少なくとも、示されている有効数字を考慮して、および通常の丸め技術を適用することにより解釈されるべきである。
【０２０５】
本発明の広い範囲を記載している数的範囲およびパラメーターは近似値であるが、具体例において記載されている数値は、可能な限り厳密に示されている。しかし、いずれの数値も、そのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる或る誤差を本質的に含有する。
【０２０６】
本発明を記載する文脈で用いられている単数形は、本明細書中で特に示されていない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、該範囲内に含まれるそれぞれの別個の値に個々に言及する省略法として用いられているに過ぎないと意図される。本明細書中に特に示されていない限り、それぞれの個々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているのと同様に、本明細書に含まれる。本明細書中で特に示されていない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、本明細書に記載されている全ての方法は任意の適当な順序で行われうる。本明細書に記載されている全ての例または例示的用語（例えば、「のような」）は単に、本発明をより明らかにすることを意図したものであり、別に特許請求されている本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるどのような表現も、本発明の実施に必須である特許請求されていないいずれかの要素を示していると解釈されるべきではない。
【０２０７】
本発明の代替的要素または実施形態の群分けは限定的なものと解釈されるべきではない。それぞれの群構成要素は、個別に、または該群の他の構成要素もしくは本明細書中で見出される他の要素とのいずれかの組合せとして言及され特許請求されうる。群の構成要素の１以上は、便宜上および／または特許性の理由により、群に含められ又は群から除外されうると予想される。いずれかのそのような包含または除外が生じる場合、本明細書は、該群を、修飾されたものとして、したがって添付の特許請求の範囲において用いられている全てのマーカッシュ群の記載説明を満たすものとして含有するとみなされる。
【０２０８】
本発明の或る実施形態は、本発明を実施するための、本発明者らに知られている最良の形態を含むものとして、本明細書に記載されている。もちろん、これらの記載実施形態に対する変更は、前記説明を読めば当業者に明らかとなるであろう。本発明者は、当業者がそのような変更を適宜用いると予想しており、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されている以外の様態で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律により認められているとおり、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載されている内容の全ての修飾および均等物を含む。さらに、本明細書に特に示されていない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、前記要素の、その全ての可能な変更を伴うあらゆる組合せが本発明に含まれる。
【０２０９】
本明細書に開示されている特定の実施形態は、からなる、および／または、から実質的になる、の表現を用いて、特許請求の範囲において更に限定されうる。「からなる」なる移行句は、特許請求の範囲において用いられる場合、それが出願時に用いられているか補正により加えられるかには無関係に、特許請求の範囲において特定されていないいずれの要素、工程または成分をも除外する。「から実質的になる」なる移行句は、特許請求の範囲の範囲を、特定されている物質または工程、および基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。そのように特許請求されている本発明の実施形態は本明細書において本質的または明示的に記載されており実施可能にされている。
【０２１０】
最後に、本明細書に開示されている本発明の実施形態は本発明の原理を例示するものであると理解されるべきである。用いられうる他の修飾も本発明の範囲内である。したがって、限定的なものではなく例示としてであるが、本発明の代替的態様も本明細書における教示に従い用いられうる。したがって、本発明は、示されており記載されているとおりのものには限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７１Ｃ】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７４Ｃ】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
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【図７８Ｃ】
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【図７８Ｄ】
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【図７８Ｅ】
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【図７８Ｆ】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８Ａ】
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【図８８Ｂ】
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【図８８Ｃ】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５Ａ】
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【図１１５Ｂ】
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【図１１５Ｃ】
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【図１１５Ｄ】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６Ａ】
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【図１３６Ｂ１】
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【図１３６Ｂ２】
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【図１３６Ｂ３】
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【図１３７】
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【図１３８】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【国際調査報告】
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