(57)【要約】  本発明は、ヒトもしくは動物中に注射することができる生成物中において、またはこの生成物の画分中において、イノシトール六リン酸（IHP）をアッセイするための方法であって、金属化合物が、試料またはこの生成物の画分に添加され、かつ、続いて、前記金属化合物の存在するIHPとの錯体形成が検出され、その錯体形成によって、生成物中のまたはその画分中に存在するIHPがアッセイされる方法に関する。本発明は、懸濁液中または溶液中の、特に赤血球細胞の懸濁液の様々な部分中の、IHPをアッセイすることを可能にする。
2012522978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトもしくは動物中に注射することができる生成物中において、またはこの生成物の画分中において、イノシトール六リン酸（IHP）をアッセイするための方法であって、金属化合物が、試料またはこの生成物の画分に添加され、かつ、続いて、前記金属化合物の存在するIHPとの錯体形成が検出され、その錯体形成によって、生成物中のまたはその画分中に存在するIHPがアッセイされる方法。
【請求項２】
錯体形成により錯体が生成し、その錯体の着色が、金属化合物の着色と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
出発金属化合物と比較して、錯体の吸光度の変化が測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記吸光度の変化が吸光光度分析法によって検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試薬が、Fe(III)化合物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Fe(III)化合物がFe(III)-チオシアネートである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Fe(III)化合物がFe(III)-スルホサリチレートである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
試料が赤血球細胞の懸濁液である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
合計IHPに対して適用され、
―赤血球細胞を溶解する工程、
―ヘモグロビンおよび細胞の破片を欠き、IHPを含む画分を得る工程、
―この画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―合計IHP含有量を決定する工程、
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
赤血球内IHPに適用され、
―細胞外媒体を除去し、赤血球細胞画分を回収する工程、
―赤血球細胞を溶解する工程、
―ヘモグロビンおよび細胞の破片を欠き、IHPを含む画分を得る工程、
―この画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―赤血球内IHP含有量を決定する工程、
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ヘモグロビンを、酸の存在下でタンパク質を沈殿する工程を用いて除去する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞外IHPに適用され、
―細胞外画分を回収する工程、
―この細胞外画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―細胞外IHP含有量を決定する工程、
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１２に規定される細胞外IHPの測定と請求項８に規定される合計IHPの測定とを組み合わせる請求項８に記載の方法であって、前記赤血球内IHP含有量が以下の等式を用いて得られる：
[細胞内IHP]＝{[合計IHP]×100-[細胞外IHP]×(100-ヘマトクリット値)}/ヘマトクリット値
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトもしくは動物中に注射することができる生成物中の、または、この生成物の画分中の、特に、赤血球細胞の懸濁液中の、イノシトール六リン酸またはIHPをアッセイするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
IHPは、ヘモグロビンの強力なアロステリックエフェクターである。この点において、IHPを、ヘモグロビンの酸素に対する親和性を減少させるために、および、組織中における酸素の放出を増加させるために、使用することができる。IHPを、腫瘍学における放射線療法のアジュバンドとして、特に、低酸素腫瘍（hypoxic tumor）に対して、使用することができる。WO-A-2006/016247は、バイオベクターとして役立つ、赤血球細胞内のIHPの封入を記載する。
【０００３】
IHPを封入する赤血球細胞の臨床的使用は、規定の用量に従い輸血する懸濁液の量を決定することができるようにするために、既知のIHP存在量を必要とする。加えて、IHPは金属キレート剤、例えば、カルシウムキレート剤であるために、遊離形態で投与された場合に、有害な効果を持つ可能性があり、また、最終医薬生成物中に存在する細胞外のIHPをアッセイすることが必須である。
【０００４】
IHPをアッセイするための様々な方法が文献に記載されてきた。これらの方法の大部分は、食物抽出物に存在するIHPのアッセイに関して発展してきた。これらの方法を、直接的であるか、間接的であるか、酵素的であるかによって、3つの群に分類することができる。
【０００５】
直接的な方法の中で、特に、質量分析法、核磁気共鳴法、伝導度測定法、および、屈折率測定法を挙げることができ、それらは共通して、測定される試料が高い純度である必要性があり、その結果として、それらは長い実行時間を有する。
【０００６】
間接的方法は、金属イオンを錯体化するIHPの能力に基づき、比色分析法、または蛍光定量法によって[金属イオン-IHP]錯体の形成を測定することができる。Kenan Dost, Ozge Tokul（Analytica Chimica Acta 558（2006）:22-27）は、小麦中および小麦ベース生成物中におけるIHPの間接的なアッセイのための方法を記載する。この方法は、IHPの存在下で有色の錯体[Fe(III)-チオシアネート]が無色の錯体[Fe(III)-フィチン酸]に置換される反応に基づく。読み取りを、UV可視光光度検出器(UV-visible spectrophotometric detector)と共役した高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて実行する。
【０００７】
Plaamiら（Journal of the association of official analytical chemists, the association, Arlington, VA, US, 1991, 74, 32-36）からも、穀物中のフィチン酸の存在をアッセイするための方法が既知である。前記方法は、フィチン酸に含まれるリンを検出するための、誘導結合高周波プラズマ発光分光分析法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry）（ICP-AES）に基づいて、開示する。
【０００８】
Parkら（Butterworth, London, 2006, 17(9), 727-732）からも、子供のための食物中におけるフィチン酸の量を決定するための、様々な方法が既知である。記載された方法の一つは、LattaおよびEskin（J. Agric. Food. Chem., 1980, 28, 1315-1317）による分光光度法であり、イオン交換樹脂上のクロマトグラフィーによる分析の一工程を必要とする。Parkらによるフィチン酸のアッセイのための最も良い方法は、AOAC法である。
【０００９】
酵素的方法は、フィターゼ（phytases）と称される酵素によるIHPの加水分解に基づく。これらの方法は、赤血球内のIHP測定に対して応用できない。
【００１０】
農産物中のアッセイに関する文献中に記載された方法は、特に著しい組成中の相違のために、IHPを含む医薬生成物の場合へ、直接的に置き換え可能ではない。これらの研究の本願明細書における提示を、本発明の特許性の評価において、それらを重要視するとしてみなすことはできない。
【００１１】
また、医薬生成物の製造との関連で、所定のアッセイのためにそれら研究を不適当にする、一定数の欠点を有する直接的方法を用いた赤血球内のIHPのアッセイに関係する文献中に、実験群を見つけることができる。
【００１２】
S. Villaら（Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 41-49）は、HLPCによる、赤血球中のIHPを測定するための、単純で信頼性のある手段を記載する。提案された分析の方法は以下の工程を含む：
・  IHPを取り込んだ赤血球の溶解および過塩素酸を用いた抽出により、試料を調製する工程、
・  移動相を調製し、HLPCカラムを平衡化する工程、
・  試料を通過させる工程、
・  屈折率測定法によりIHP濃度を測定する工程。
【００１３】
しかし、この方法は、HLPCによる試料の分離を必要とし、従って、その実行時間は非常に長い。例えば、較正範囲の調整は、10種の異なるIHP濃度の測定（それぞれ何回か測定する）を必要とし、その持続時間は６時間と見積もることができる。さらに、この方法の検出限界（0.5mM）は、最終生成物に存在する細胞外IHPを定量するのに全く不十分である。この方法は、工業スケールの製造によって課される、アッセイの速度および感度の課題を満足していない。
【００１４】
B.Teisseireら（J. Appl.Physiol. 1985 Jun; 58(6): 1810-7）は、子豚中におけるIHPを取り込んだ赤血球の輸血の生理学的効果を評価する。この文献は、IHP取り込みの前と後の細胞内のリン酸濃度の決定に基づいた赤血球内のIHPを測定するための方法を記載する。これら二つの濃度の違いはIHPに起因する。この非常に概算的な方法は、治療的用途のための生成物の、赤血球内IHPを測定するのに適していない。
【００１５】
Moscaら（Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 19-26）およびR. Nanoら（Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 35-39）は、リン酸濃度がこの場合NMRによって測定されていることを除けば、B.Teisseireらに記載されたような、赤血球内IHPのアッセイの同様の方法を記載する。従って、B.Teisseireらの方法に既に記載された正確性の欠如に加えて、また、NMR装置に関連した実施および高額なコストにおいて、困難性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】WO-A-2006/016247
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Kenan Dost, Ozge Tokul、Analytica Chimica Acta 558（2006）:22-27
【非特許文献２】Plaamiら、Journal of the association of official analytical chemists, the association, Arlington, VA, US, 1991, 74, 32-36
【非特許文献３】Parkら、Butterworth, London, 2006, 17(9), 727-732
【非特許文献４】LattaおよびEskin、J. Agric. Food. Chem., 1980, 28, 1315-1317
【非特許文献５】S. Villaら、Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 41-49
【非特許文献６】B.Teisseireら、J. Appl.Physiol. 1985 Jun; 58(6): 1810-7
【非特許文献７】Moscaら、Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 19-26
【非特許文献８】R. Nanoら、Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 35-39
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の第一の目的は、速く、かつ信頼性のあるアッセイ方法を提案することである。
【００１９】
本発明の第二の目的は、容易に自動化することができるこのような方法を提案することである。
【００２０】
本発明の第三の目的は、ICH（医薬品規制調和国際会議（International Conference on Harmonization））によって設定された指示を満たすことができる、このような手動の、または自動化方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
従って、本発明の対象は、ヒトもしくは動物中に注射することができる生成物中において、またはこの生成物の画分中において、イノシトール六リン酸（IHP）をアッセイするための方法であって、金属化合物が、試料またはこの生成物の画分に添加され、かつ、続いて、前記金属化合物の存在するIHPとの錯体形成が検出され、その錯体形成によって、生成物中のまたはその画分中に存在するIHPがアッセイされる方法である。
【００２２】
表現「ヒトまたは動物に注射することができる生成物」は、活性成分または混入物質としてIHPを含むことができる医薬生成物を意味することが意図される。本発明は第一に、かつ、最も、生成物またはその画分中の、活性成分として存在するIHPをアッセイすることを対象とする。用語「画分（fraction）」は、IHPを含むことができる、生成物の一部を意味することが意図され、かつ、そのIHP含有量が知られるべきである。本発明は、特に、IHP送達に関与するベクターの懸濁液から、または溶液から形成される生成物中のIHPをアッセイすることを対象とする。それらは、IHPを含むもしくは封入するベクター、またはIHPへ、対イオンを含む任意の結合によって結合するベクターであってよい。一つの重要な様式において、本発明によるIHPのアッセイ方法を、ベクターの懸濁液中の合計IHPのアッセイに、または、ベクター外媒体、特に上清もしくは懸濁液、および、ベクターによって代表される、一方またはもう一方または両方の画分中の、IHPのアッセイに、適用する。好ましくは、それはベクターの懸濁液、例えば、リポソーム、ミクロスフェアまたはナノスフェア、マイクロカプセルまたはナノカプセル、赤血球細胞などを含む。また、本発明は、IHPベクターを含む生成物の上清中の遊離IHPのアッセイを対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Fe(III)-チオシアネート試薬を用いて得られた、IHP濃度の関数として検定線ΔODを表すグラフである。
【図２】Fe(III)-チオシアネート試薬を用いて得られた、計量添加法により得られた、添加したIHPの濃度の関数として線ΔODを表すグラフである。
【図３】Fe(III)-スルホサリチレートを用いて得られた、IHP濃度の関数として検定線ΔODを表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によれば、錯体形成により錯体が生成し、その錯体の着色は、出発金属化合物の色と異なる。出発金属化合物と比較して、錯体の吸光度の変化を測定することができる。一つの有利な特性により、吸光度の変化は吸光光度分析法によって検出される。
【００２５】
一つの実施態様によれば、試薬は有色のFe(III)化合物である。前記試薬は、特に、フィチン酸塩錯体を生成することができるようにする金属化合物であり、特に、参照として、F Creaら, 2008, Coordination Chemistry Reviews 252, 1108-1120が挙げられる。試薬として、例えば、Fe(III)-チオシアネート、および、溶液中でFe(III)-スルホサリチレート（sulfosalicylate）の形態であることができるFe(III)-5-スルホサリチル酸が挙げられる。一つの実施態様において、試薬は、Fe(III)-チオシアネートである。
【００２６】
一つの実施態様において、試薬はFe(III)-スルホサリチレートである。
【００２７】
一つの実施態様において、アッセイ方法を、赤血球細胞の懸濁液中のIHPのアッセイに適用する。本発明を、特に、IHPでロードした赤血球細胞の懸濁液中に存在するIHPのアッセイに適用し、患者の治療を意図する。前記方法を、細胞内IHPおよび／または細胞外IHPの、合計IHPのアッセイに適用する。ひとつの実施態様によれば、前記方法をある容積の懸濁液中に存在するIHPのアッセイに適用する。このアッセイを、患者のために処方されたIHPの用量により、一方では同時に細胞外のIHP含有量を考慮にいれて、投与されるべき懸濁液の量を決定するために使用することができる。もう一つの実施態様において、前記方法を、上清中に存在するIHPのアッセイに適用する。
【００２８】
合計IHPのアッセイに適用される前記方法は、特に：
―細胞外媒体の存在下で赤血球細胞を溶解する工程、
―ヘモグロビンおよび細胞の破片を欠き、IHPを含む画分を得る工程、
―この画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―合計IHP含有量を決定する工程、
を含むことができる。
【００２９】
赤血球内IHPに適用される前記方法は、特に：
―細胞外媒体を除去し、赤血球細胞画分を回収する工程、
―赤血球細胞を溶解する工程、
―ヘモグロビンおよび細胞の破片を欠き、IHPを含む画分を得る工程、
―この画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―赤血球内IHP含有量を決定する工程、
を含むことができる。
【００３０】
細胞外IHPに適用される前記方法は：
―細胞外画分を回収する工程、
―この細胞外画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―細胞外IHP含有量を決定する工程、
を含むことができる。
【００３１】
同様の手順を、IHPを含む任意の他のタイプのベクターに、例えば、リポソームまたはミクロスフェアに適用することができ、また、IHPに結合するベクターを含む生成物の上清中の遊離IHPのアッセイにも適用することができる。
【００３２】
細胞外IHP測定を同じ赤血球細胞懸濁液の合計IHP測定と組み合わせる場合、赤血球内IHP含有量はそれから推定されうる。以下の等式を特に適応することができる：
[細胞内IHP]＝{[合計IHP]×100-[細胞外IHP]×(100-ヘマトクリット値)}/ヘマトクリット値
【００３３】
一つの特性によれば、ヘモグロビンは、酸の存在下におけるタンパク質の沈殿の工程を用いて取り除かれる。ヘモグロビンを含むタンパク質を沈殿することを可能とする任意の酸は、この抽出工程を実行することが予測されうる。前記工程は、これらのタンパク質および膜の破片を取り除くことができ、かつ、IHPのような小分子を回収することを可能とする。非限定的例示を目的として、過塩素酸、トリクロロ酢酸、シュウ酸、クエン酸、硝酸、塩酸、硫酸、および乳酸を挙げることができる。塩酸は完全に適切である。IHPを含む画分を遠心分離により回収することができる。
【００３４】
本発明の一つの特性によれば、Fe(III)有色試薬(Fe(III)-トリシアネートまたはFe(III)-スルホサリチレート)が添加された後、アッセイされる試料を、形成したFe(III)-フィテート（phytate）錯体が安定化するのに十分な時間、インキュベートする。この時間は短く、例えば、約5分から約30分の間の時間が十分である。前記時間は特に、約10分から約20分の間であることができ、これは典型的には15分のオーダーである。このインキュベーションは、好ましくは暗所で行われる。
【００３５】
好ましい実施態様によれば、Fe(III)トリシアネート着色試薬は以下の特性を有する：
―0.1〜1μmol/mlのFe(III)の試薬、特に、0.25〜0.6μmol/mlの試薬、好ましくは、0.3〜0.4μmol/mlの試薬、
―過剰のトリシアネート、特に、10〜50μmol/mlのトリシアネート、好ましくは20〜40μmol/ml、より好ましくは、30〜40μmol/mlのトリシアネート。
【００３６】
本発明の一つの特性によれば、Fe(III)チオシアネート試薬は0.25〜0.6μmol/mlのFe(III)、20〜40μmol/mlのチオシアネートを含む。好ましくは、前記試薬は、0.3〜0.4μmol/mlのFe(III)、および30〜40μmol/mlのチオシアネートを含む。
【００３７】
一つの好ましい実施態様により、Fe(III)-スルホサリチレート着色試薬は、0.5〜2μmol/mlのFe(III)、および、5〜15μmol/mlのスルホサリチレートを含む。
【００３８】
前記試薬はさらに、水を含み、かつ、特に酸溶液、特に沈殿化中に使用されたものと同一の酸で構成されている。
【００３９】
一つの特性によれば、前記試薬は、Fe(III)の、かつ、チオシアネートの塩酸溶液である。
【００４０】
一つの特性によれば、前記試薬は、Fe(III)の、かつ、サリチレートの、塩酸溶液である。
【００４１】
一つの特性によれば、前記試薬中の酸の濃度は、0.01〜0.2 mol/L、好ましくは、0.05〜0.15mol/Lである。
【００４２】
一つの実施態様によれば、本発明は、IHPのFe(III)イオンを錯体化をする能力に基づいてIHPをアッセイするための分光光度法からなる。前記方法は、有色の錯体[Fe(III)-チオシアネート]または[Fe(III)-スルホサリチレート]の形態で、アッセイする試薬中に存在するFe(III)イオンが、アッセイされる試料中に存在するIHPとの、新しい無色の錯体[Fe(III)-フィテート]を形成する間の置換反応に基づく。[Fe(III)-チオシアネート]錯体の吸光度のピークは460nmであるため、OD460を測定することで、[Fe(III)-チオシアネート]の濃度を決定することができ、アッセイ反応をまとめた等式を介して、IHPの濃度を、[Fe(III)-チオシアネート]の濃度から推定することができる。[Fe(III)-スルホサリチレート]錯体の吸光度のピークは506nmであるため、OD506を測定することで、[Fe(III)-スルホサリチレート]の濃度を決定することができ、アッセイ反応をまとめた等式を介して、IHPの濃度を、[Fe(III)-スルホサリチレート]の濃度から推定することができる。
【００４３】
本発明の特性によれば、[Fe(III)-チオシアネート]または[Fe(III)-スルホサリチレート]着色試薬を即席で調製する。したがって、アッセイ方法は、アッセイされる試料または試料画分へ、着色試薬を添加する工程の前に、着色試薬を調製する工程を組みこむことができる。
【００４４】
Fe(III)-チオシアネートまたはFe(III)-スルホサリチレート試薬は、有利には、それが使用されるすぐ前（典型的には30分から1時間前）、調製され、かつ使用されるまで暗所に貯蔵される。
【００４５】
この方法は、患者に投与される前に、IHPを封入した赤血球細胞のバッチを示す試料、または製造コントロールとしての試料に適用されうる。
【００４６】
ブランクを、赤血球細胞マトリクスに関連したバックグラウンドノイズを差し引くことができる方法で、溶解−再シール形成した（lysed-resealed）（RBC-LR）赤血球細胞を用いて準備することができる。
【００４７】
一つの実施態様によれば、前記方法は、IHP較正範囲の調整を含み、好ましくは、この範囲はアッセイの1日前に調整される。もう一つの実施態様によれば、較正範囲の代わりに、既知の量のIHPが試料のアリコートに加えられる方法が用いられる。
【００４８】
本発明によるアッセイは、赤血球細胞マトリクスに完全に適している。IHP抽出工程は、特に、その着色が吸光度測定に影響しうる、ヘモグロビンを除去することを可能にする。溶解―再シール形成し、次いで、IHPでロードした試料と同様に処理された赤血球細胞を用いたブランクの添加は、赤血球細胞の影響を決定し、差し引くことを可能にする。アッセイ試薬の選択、および、簡単な分光光度計の使用は、自動化された、速い、かつ、実行を容易にしたアッセイを可能にする。従って、前記アッセイを、自動化生化学的機器上で実行することができる。本発明による方法は、クロマトグラフィー（HPLC、イオン交換クロマトグラフィー）または、NMR分光法の含有を必要としない。従来技術と比較して、アッセイの、劇的なコストおよび実行時間の削減が得られる。HPLCを試料が通過するのに約15分かかる一方で、分光光度計上でODを取得するためには、数秒で十分である。かかる時間のこの減少は、試験される各試料、また、アッセイの前に実行されなければならない各較正範囲のポイントに適用する。また、試料の調製は長いインキュベーション工程を必要としない。従って、アッセイの合計持続時間は、大幅に減少され、このことは、工業的スケール上での使用に適合する。
【００４９】
最後に、前記方法を、例えば、タンパク質沈殿のための酸の選択を介する、任意の危険な生成物なしに、実行することができる。
【００５０】
また、本発明の対象は、このような治療から利益を得ることができる病的状態の治療のための、IHPを含むベクター（特に、リポソーム、マイクロカプセル、ミクロスフェア、赤血球細胞、など）の懸濁液から、特に、IHPを封入した赤血球細胞の懸濁液から、またはIHPへ結合したベクターの溶液から形成した医薬生成物を用いた患者の治療のための方法であり、以下の工程を含む：
―このような懸濁液または溶液、特にIHPを封入した赤血球細胞の懸濁液を得る、または調製する工程、
―この懸濁液またはこの溶液を示す試料を除去する工程、
―本発明のアッセイ方法を用いて試料中のIHPをアッセイする工程、
―患者のために処方した用量を遵守する方法で投与するために、濃度データに基づいて、懸濁液または溶液の、特に赤血球細胞の懸濁液の量を計算する工程、
―前記患者へこの量を投与する工程。
【００５１】
この度、本発明は、非限定的実施例を用い、かつ図を参照した実施態様を用いて、さらなる詳細を記載する。
【実施例】
【００５２】
（実施例１：試薬および化学溶液）
塩化鉄(III)溶液の調製：20mgの塩化鉄（III）を40mlの蒸留水に溶解した（0.5mg/ml）。
【００５３】
チオシアン酸アンモニウム溶液の調製：200mgのチオシアン酸アンモニウムを40mlの蒸留水に溶解した（5mg/ml）。
【００５４】
着色試薬を使用の少なくとも40分前に調製し、かつ、着色試薬は、1mlの0.5mg/ml塩化鉄（III）、5mlの5mg/mlチオシアン酸アンモニウム、0.9mlの1N塩酸、および、2mlの蒸留水から成る。
【００５５】
トリクロロ酢酸TCA溶液（重量／容積）の調製
18.75%溶液：3mlの6.1N TCA(100%)＋13mlの蒸留水
9.375％溶液：10mlの18.75％TCA溶液＋10mlの蒸留水
7.5％溶液：15mlの6.1N TCA溶液(100%)＋185mlの蒸留水
24％溶液：6mlの6.1N TCA溶液(100%)＋19mlの蒸留水
12%溶液：10mlの24％TCA溶液＋10mlの蒸留水
6%溶液：15mlの6.1N TCA溶液(100%)＋235mlの蒸留水
【００５６】
IHPの保存溶液の調整：1mlの45mM溶液について、量Xの、検量されるIHPのドデカナトリウム塩を、以下の方法で計算した：X(g)＝415.719/(p)×(100-H)、（式中、pは、塩の純度（%）であり、Hは、水の含有量（%）である）。最終容積を蒸留水で1mlに調整した。
【００５７】
ヒト赤血球細胞におけるIHPの封入方法：低張カラム透析法（hypotonic column dialysis）によって、IHP(660g/mol)をヒト赤血球細胞（RBC）に封入した。バッグ（bag）からRBCを3回0.9％NaClで洗浄した。ヘマトクリット値は、透析の開始前に17または20mMの終濃度で添加されたIHPの存在下で60％に提供される。RBCを、低浸透性溶解バッファー（15ml/分の逆流）に対して、1.5ml/分の流速で透析した。カラムを出て溶解したRBCを高浸透圧溶液の添加、および、30分間37℃のインキュベーションにより、再シールした。何回か0.9％NaCl、0.2％グルコース中で洗浄した後、RBCは、保存溶液（AS-3バッファー）を用いて50％のヘマトクリット値に提供される。
【００５８】
（実施例２：合計RBC-IHP試料中および細胞外媒体中における、IHPのアッセイ）
１）アッセイされる試料の性質
細胞内IHPを決定するために、試料中の合計IHP（RBC-IHP）および上清（細胞外媒体）中のIHP含有量がアッセイされる。上清は、1000g、4℃、10分間の、RBC-IHPの遠心分離により得られる。また、アッセイされる試料はIHPの水性溶液であることができ、それはその後、いかなる抽出も経るべきではない。
【００５９】
較正範囲でのアッセイ方法（外部較正）
＜試料調製＞
RBC-IHP（50μl）および上清（50μl）を、-20℃で30分間凍結する。周辺温度へ再加熱した後、試料を細胞を溶解するために蒸留水で希釈し、IHPをトリクロロ酢酸を用いた酸性条件下で抽出する。試料の性質により適用される希釈は異なる。様々な濃度のトリクロロ酢酸（TCA）溶液を試料の調製に使用することができる。
【００６０】
各試薬を以下の表に示されたように加える：
【００６１】
【表１】
2012522978.tif 000003
【００６２】
その後、試料を、15000g、4℃、10分間、遠心分離し、着色試薬に接触させるために、抽出上清を収集する。RBC‐IHP（75μlの7.5%トリクロロ酢酸を75μlの抽出上清と混合する）のためにさらに希釈を行い、その後、着色試薬と混合する。
【００６３】
＜IHP較正範囲の調整＞
1mM溶液の調製
20μlの45mM IHP溶液（実施例１を参照のこと）を880μlの7.5％トリクロロ酢酸と混合する。
【００６４】
標準溶液の調製：
【００６５】
【表２】
2012522978.tif 000004
【００６６】
ブランクは7.5％トリクロロ酢酸で作製される。
【００６７】
＜光度検出＞
光度検出のために、300μlの（例えば実施例１において調製された）着色試薬を150μlの各抽出上清および標準溶液へ、ならびにブランクへ添加する。暗所における15分間の撹拌およびインキュベーションの後に、溶液を10mmキュベットに入れ、吸光度を460nmにおいて測定する。各濃度（20-120μM）について、デルタ吸光度ΔOD＝ODblank-ODstandardを決定する。ΔOD/[IHP]較正曲線をプロットし、直線回帰パラメーターを計算し、ΔOD=ODblank-ODsample測定に基づいて抽出上清中に存在するIHP量を決定するために使用する。RBC-IHPについて、赤血球細胞マトリクス由来の干渉に起因するノイズを、同様の透析工程を受け、かつ同様の条件下（RBC-LR）で50%ヘマトクリット値へ調整されている、赤血球細胞のアッセイを介して評価する。RBC-IHP上清について、アッセイで干渉は観察されなかった。
【００６８】
２）計量添加によるアッセイ方法
この方法により赤血球細胞マトリクス効果を取り除くことができ、従って、RBC-IHPに含まれるIHPのアッセイについてRBC-LRの生成を避けることができる。X mMのIHPを含むアッセイされる試料は50μl容積でアリコートされ、既知の濃度（C1、C2、C3、C4、C5など）のIHP(950μl)の様々な添加を、赤血球溶解工程中に行う。各チューブへの18.75％TCA（333μl）の添加、それに続く15000ｇ、10分間の遠心分離により上清中のIHPを回収することができる。光度定量のために、（例えば実施例１で調製された）300μlの着色試薬を150μlの各抽出上清に添加する。参考チューブを300μlの着色試薬を150μlの6％TCAに添加することによって調製する。暗所における15分間の撹拌およびインキュベーションの後に、溶液を10mmキュベットに入れ、吸光度を460nmにおいて測定する。各点に関して、デルタ吸光度ΔOD＝ODreference-ODsampleを決定する。ΔOD/添加した[IHP]の較正曲線をプロットする。曲線が線型のの直線ではない場合、最も高い濃度の点を7.5％トリクロロ酢酸中で希釈し、再度アッセイする。直線と（絶対値における）x-軸との間の交差点は、直接的に初期試料に含まれたIHPの値Xを与える。
【００６９】
（実施例３：赤血球細胞に封入したIHPの量の計算）
RBC-IHP中の、および細胞外媒体におけるIHP濃度を、例えば実施例２で記載されたように決定する。細胞内IHPを計算するために、以下の等式を適用する：
[細胞内IHP]={[IHP]total×100-[IHP]extracellular)×(100-ヘマトクリット値)}/ヘマトクリット値
【００７０】
（実施例４：方法の効率の最適化および特性評価）
１）着色試薬の安定性
着色試薬を実施例1で示したように調製した。その安定性を460nmで300分間、光度計により研究した。結果は、使用の少なくとも40分前に調製するのが好ましく、それから着色試薬は少なくとも4時間安定であり、4時間ですべての分析を行うことが可能であることを示した。
【００７１】
２）範囲の直線性
IHP範囲の直線性を20〜120μM IHP（着色試薬に接触させる前の濃度）の範囲にわたって研究した。例えば実施例2のように調製した、各範囲点について150μlを、300μlの着色試薬と混合し、範囲を実施例2に示したようにプロットした。フィッシャー検定（Fisher test）は較正範囲が有効であることを示した。
【００７２】
【表３】
2012522978.tif 000005
【００７３】
３）試料抽出条件の最適化
2.5倍容積の蒸留水および3.5倍容積の9.375％TCAを用いた従来の抽出を、最適化された重複パーセンテージを得るために最適化した。様々なIHP含有量を含む、より大きな容積（19倍容積）の、浸透圧の無い（non-osmolar）水性溶液を、RCB＋様々なIHP濃度のIHPの懸濁液の抽出をモデル化するために用いた。終濃度7.5%で使用した濃縮された18.5％TCAの使用により、あまり試料を希釈せず、アッセイ感度の喪失を避けることができる。実施例2に記載されたプロトコルに従い、試料をアッセイした。二つの抽出法を比較した結果を以下に示す。
【００７４】
【表４】
2012522978.tif 000006
【００７５】
４）方法のロバスト性
試料を様々な温度（6℃、22℃、および35℃）でアッセイした。方法が温度の変化に対してロバストであることが判明した。
【００７６】
５）定量化および検出限界
定量化および検出限界をICHの推奨に従って決定した。これについて、8つのブランク（7.5%TCA）を調製し、範囲を、その直線範囲（20〜120μM）中で研究した。着色試薬との混合の後、ブランクおよび範囲の点を、実施例2で記載したように分光光度計上で分析した。以下のICH式：
【００７７】
【数１】
2012522978.tif 000007
【００７８】
（式中：σ＝ブランクに基づいた標準偏差、P＝検定線の傾き）
に従ってLDおよびLQを決定できるように、得られたODの標準偏差を計算した。
【００７９】
得られた範囲は、0.0045uOD/μM（uOD＝ODのユニット）の傾きを有する。この方法により得られた結果の標準偏差は、0.00477uODであり、計算の後に、範囲上のLDおよびLQ値はそれぞれ、3.5μMおよび10.6μMである。
【００８０】
前記方法の希釈効果を考慮に入れて、補正の後に以下の値を得る：
―上清LD＝25μM；LQ＝74μM
―合計LD＝94μM；LQ＝283μM。
【００８１】
（実施例５）
１）RBC-LRマトリクスのアッセイによる赤血球細胞マトリクスに関連した較正範囲およびノイズの除去を伴う方法を用いた結果の実施例
以下の表中の値を用いたIHP較正直線のプロット（図１）：
【００８２】
【表５】
2012522978.tif 000008
【００８３】
試料中のIHPの計算：
【００８４】
【表６】
2012522978.tif 000009
【００８５】
２）計量添加法を用いた結果の実施例
アッセイする試料を50μl容積にアリコートし、実施例2に詳細に記載したように処理する（計量添加法）。添加の表を以下に示す：
【００８６】
【表７】
2012522978.tif 000010
【００８７】
得られた点（以下の表）により図２の直線をプロットすることができる。
【００８８】
【表８】
2012522978.tif 000011
【００８９】
濃度をy＝0の点において決定し、前記濃度より、初期試料＝1.72mMの絶対値[IHP]を、得る。前記濃度は等式：y=1.599x＋0.2756を用いて計算する。
【００９０】
３）計量添加および較正範囲法の比較
【００９１】
【表９】
2012522978.tif 000012
【００９２】
（実施例６：アッセイの自動化）
較正範囲によるアッセイを用いた実施例
IHPを封入したRBCのアッセイを部分的に、生化学機器（MaxMat）上で自動化した。着色試薬（試薬）、7.5％TCA（希釈剤）および1mＭ IHP貯蔵溶液（標準）を実施例１のように調製し、その後、自動化デバイスのプラットホーム上に設置した。アッセイする試料を実施例2に記載した工程により手動で調製した。アッセイする試料の抽出物由来の各上清を1.5mlチューブに移し、プラットホーム上に設置した。
【００９３】
アッセイ法を正確にパラメーター化した：
―ポジティブモード
―ネガティブ直線回帰モード
―30サイクル
・サイクル１：調製した試料をサンプリングする工程：75μlおよび460nmのOD読み取り、
・サイクル２：着色試薬を添加する工程：150μl
・サイクル３０：460nmでのOD読み取り。
【００９４】
アッセイを開始する時、自動化デバイスは、7.5%TCA中の、較正範囲（1/8.3、1/10、1/12、１/15、1/25、1/50）の希釈物を調製し、その後、着色試薬との様々な混合物を調製する。30サイクルが完了する時、自動化デバイスは前記範囲の点および様々な試料に対する460nmにおけるOD値を示す。その後結果は、実施例３のものと同一のエクセル計算シートに移動する。一つまたは複数の試料のアッセイを60分未満で実行する。
【００９５】
いくつかの試料に関する手動および自動化アッセイで得られた結果は、50%ヘマトクリット値におけるRBC-IHPおよび上清に関して同程度である（%CV<10%）（以下の表を参照のこと）。
【００９６】
【表１０】
2012522978.tif 000013
【００９７】
（実施例７：リガンドとしてFe(III)-スルホサリチレートを用いたアッセイおよびFe(III)-チオシアネートとの比較）
a）方法の説明
塩化鉄(III)溶液の調製：49mgの塩化鉄(III)を、21.2mlの蒸留水に溶解した（2.31mg/ml）。
【００９８】
5-スルホサリチル酸溶液の調製：98.6mgのスルホサリチレートを19.7mlの蒸留水に溶解した（5mg/ml）。
【００９９】
塩酸溶液の調製：500μlの１N塩酸を9.5mlの蒸留水に溶解した（0.05N）。
【０１００】
着色試薬は、1mlの2.31mg/ml塩化鉄(III)溶液、5mlの5mg/mlスルホサリチル酸溶液、0.9mlの0.05N塩酸溶液、および、2mlの蒸留水から構成された。
【０１０１】
Fe(III)-チオシアネートを上記の方法によって調製した。
【０１０２】
＜試料の調製＞：
RBS-IHP(50μl)および上清(50μl)を-20℃で30分間凍結した。周辺温度まで再加熱した後、細胞を溶解するために試料を蒸留水に希釈し、トリクロロ酢酸を用いた酸性条件下でIHPを抽出した。適用された希釈は、試料によって様々であった。各試薬を以下の表に示されたように添加した：
【０１０３】
【表１１】
2012522978.tif 000014
【０１０４】
その後、試料を15000ｇ、4℃、10分間遠心分離し、抽出上清を着色試薬に接触させるために回収した。
【０１０５】
＜光度検出＞
光度検出のために、300μlの着色試薬を150μlの各抽出上清および標準溶液へ、ならびにブランクへ添加した。暗所における15分間の撹拌とインキュベーションの後に、溶液を10mmキュベットに入れ、吸光度を506nmで測定した。各濃度（100-500μl）に関して、デルタ吸光度ΔOD=ODblank-ODstandardを決定した。OD/[IHP]較正曲線をプロットし、直線回帰パラメーターを計算し、ΔOD=ODblank-ODsampleに基づいて抽出上清中に存在するIHPの量を決定するために使用した。RBC-IHPのために赤血球細胞マトリクス由来の干渉に起因するノイズを、着色試薬なしで同様の透析工程を経た、同様の条件（RBC-LR）下の50％ヘマトクリット値に調節されている、赤血球細胞のアッセイを介して評価した。
【０１０６】
ｂ）IHP較正範囲の調整
1mM溶液の調製
20μlの45mM IHP溶液（実施例１を参照のこと）を880μlの6％トリクロロ酢酸と混合した。
【０１０７】
標準溶液の調製：
【０１０８】
【表１２】
2012522978.tif 000015
【０１０９】
ブランクを6％トリクロロ酢酸で作製した。
【０１１０】
図３は、Fe(III)-スルホサリチレートで得られたIHP濃度の関数として検定線ΔODを表す。
【０１１１】
前記方法はR2値が0.99075に等しいため、直線的である。
【０１１２】
ｃ）較正範囲を用いたアッセイの実施例
―合計試料をアッセイする工程
合計試料は、最終生成物（ヘマトクリット値50％におけるRBC）に含まれる合計IHPのアッセイに関する。
【０１１３】
使用された方法を、以下に説明した。
【０１１４】
【表１３】
2012522978.tif 000016
【０１１５】
二つの方法は同様の結果を示した。
【０１１６】
―多量かつ既知の量のIHPを含む試料をアッセイする工程、
【０１１７】
【表１４】
2012522978.tif 000017
【０１１８】
―上清中のIHPをアッセイする工程、
【０１１９】
【表１５】
2012522978.tif 000018
【０１２０】
Fe(III)-スルホサリチレートを用いた方法は、上清をアッセイするために評価されたバックグラウンドノイズを示した（比色法によって評価された値の50％まで）。
―RBC中に含まれたIHP量を評価する工程、
【０１２１】
【表１６】
2012522978.tif 000019
【０１２２】
二種の錯体を用いることによって得られた値は同様である。
【０１２３】
―Fe(III)-スルホサリチレート法のための定量化および検出限界
【０１２４】
得られた範囲は、0.001158 uOD/μM（uOD＝ODのユニット）の傾きを有する。この方法によって得られた結果の標準偏差は、0.0001737uODであった；計算の後、範囲上のLDおよびLQ値はそれぞれ22μMおよび67μMであった。
【０１２５】
前記方法の希釈効果を考慮し、補正の後に、以下の値を得た：
―上清LD＝154μM、LQ＝469μM
―合計LD＝220μM、LQ＝670μM
【図１】
2012522978.tif 000020
【図２】
2012522978.tif 000021
【図３】
2012522978.tif 000022
【国際調査報告】
2012522978.tif 000023
2012522978.tif 000024
2012522978.tif 000025
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