(57)【要約】  本発明は凝集核が結合された高分子支持体に関する。より詳しくは、本発明は生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体及びその製造方法並びにこれを用いたβ−２−マイクログロブリン除去方法に関するものである。
2012505204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体。
【請求項２】
前記凝集核がアミロイド凝集核であることを特徴とする、請求項１に記載の高分子支持体。
【請求項３】
前記アミロイド凝集核がβ−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核であることを特徴とする、請求項２に記載の高分子支持体。
【請求項４】
前記凝集核の大きさが１ｎｍ〜１０μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の高分子支持体。
【請求項５】
前記高分子がポリスチレンレジン、ＰＥＧ−ｇ−ＰＳレジン、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭレジン、ＰＥＧＡＴＭレジン、ＣＬＥＡＲＴＭレジン、エポキシレジン、フェノールレジン、フェノキシレジン、メラミンレジン、ポリエステルレジン、セルロースレジン、アガロースレジン、キトサンレジン及びＰＭＭＡレジンよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の高分子支持体。
【請求項６】
i）カルボキシル基が導入された高分子樹脂をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、グルタルアルデヒド及びエポキシよりなる群から選ばれるいずれか一つと反応させて活性化した高分子支持体樹脂を製造する段階；及び
ii）前記活性化した高分子支持体樹脂と生体物質凝集用凝集核を反応させて前記高分子樹脂の表面に前記アミロイド凝集核を導入する段階；を含む、生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項７】
前記高分子樹脂がポリスチレンレジン、ＰＥＧ−ｇ−ＰＳレジン、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭレジン、ＰＥＧＡＴＭレジン、ＣＬＥＡＲＴＭレジン、エポキシレジン、フェノールレジン、フェノキシレジン、メラミンレジン、ポリエステルレジン、セルロースレジン、アガロースレジン、キトサンレジン及びＰＭＭＡレジンよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項８】
前記i）段階の溶媒がジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）またはジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）であることを特徴とする、請求項６に記載の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項９】
前記i）段階の触媒が４−ジメチル−アミノピリジン（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）であることを特徴とする、請求項６に記載の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項１０】
前記i）段階の反応温度が０℃〜５０℃であることを特徴とする、請求項６に記載の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項１１】
前記i）段階の反応時間が２時間〜４８時間であることを特徴とする、請求項６に記載の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項１２】
前記ii）段階の生体物質凝集用凝集核がアミロイド凝集核であることを特徴とする、請求項６に記載の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項１３】
前記ii）段階のアミロイド凝集核がβ−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核であることを特徴とする、請求項１２に記載の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項１４】
前記ii）段階のアミロイド凝集核の大きさが１ｎｍ〜１０μｍであることを特徴とする、請求項６に記載の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法。
【請求項１５】
β−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核が結合された高分子支持体をβ−２−マイクログロブリンが含有された流体と接触させる段階を含む、β−２−マイクログロブリン除去方法。
【請求項１６】
前記β−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核の大きさが１ｎｍ〜１０μｍであることを特徴とする、請求項１５に記載のβ−２−マイクログロブリン除去方法。
【請求項１７】
前記β−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核が結合された高分子支持体がウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、ウマ血清、人血清、及び脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）よりなる群から選ばれるもので処理されたことを特徴とする、請求項１５に記載のβ−２−マイクログロブリン除去方法。
【請求項１８】
前記高分子がポリスチレンレジン、ＰＥＧ−ｇ−ＰＳレジン、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭレジン、ＰＥＧＡＴＭレジン、ＣＬＥＡＲＴＭレジン、エポキシレジン、フェノールレジン、フェノキシレジン、メラミンレジン、ポリエステルレジン、セルロースレジン、アガロースレジン、キトサンレジン及びＰＭＭＡレジンよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１５に記載のβ−２−マイクログロブリン除去方法。
【請求項１９】
前記β−２−マイクログロブリンが含有された流体が燐酸塩緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載のβ−２−マイクログロブリン除去方法。
【請求項２０】
ｐＨが６．０〜８．０に維持されることを特徴とする、請求項１５に記載のβ−２−マイクログロブリン除去方法。
【請求項２１】
前記流体が哺乳類の血液であることを特徴とする、請求項１５に記載のβ−２−マイクログロブリン除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は凝集核が結合された高分子支持体に関する。より詳しくは、本発明は生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体及びその製造方法、並びに、これを用いたβ−２−マイクログロブリン除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アミロイド（ａｍｙｌｏｉｄ）とは水溶性タンパク質が相互に交差したベータ構造（ｃｒｏｓｓ β−ｓｈｅｅｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を形成することで非水溶性の超分子タンパク質構造物を誘導して形成した繊維状タンパク質凝集体を言う。アミロイドタンパク質はパーキンソン病、痴ほう、狂牛病などの退行性疾患の患者で共通して見つかる。
【０００３】
腎臓に異常がある患者の場合、体内の老廃物を除去する機能が円滑でないため血液透析によってこれを除去することになる。しかし、腎臓に比べ、血液透析器は各種老廃物の除去効率が落ち、特にＩ型主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃａｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ｃｌａｓｓ Ｉ）の一部であるβ−２−マイクログロブリン（β−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）タンパク質の場合、血液透析器によって完全に除去されずに体内に蓄積して結局アミロイドを形成して関節組職などに沈着する。この症状を透析関連類殿粉症（ｄｉａｌｙｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）という。透析関連類殿粉症による疾患では手首トンネル症侯群、関節炎、頚椎関節炎、骨折を誘発する骨嚢胞などがある。
【０００４】
長期的に血液透析を受ける患者の場合、血清中のβ−２−マイクログロブリンの濃度が一般人に比べて６０倍以上高くなることが知られており、患者の体内に高濃度で存在しているβ−２−マイクログロブリンの濃度を正常近くに下げると、透析関連類殿粉症による疾患の程度が緩やかになることが報告されている。よって、血液透析器を改良してβ−２−マイクログロブリン除去効率を高める方法または血液透析器にβ−２−マイクログロブリン除去専用の吸着能を示す補助クロマトグラフィー（カラム）を設置する方法などによって血清中のβ−２−マイクログロブリンの濃度を正常に近く下げる努力が活発になされて来た（非特許文献１〜３）。
【０００５】
ＬｕｘｅｌｌＴＭのような従来の商用化したカラムはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）またはセルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）高分子由来のビードを充填した管で、β−２−マイクログロブリンを除去する方式で大きさの差によるタンパク質分離及び疎水性を用いるタンパク質吸着を用いるものである。これは結合親和力が低下して除去されるβ−２−マイクログロブリンの量が十分ではなく、非特異的に類似の大きさの他のタンパク質も一緒に除去される欠点がある。
【０００６】
β−２−マイクログロブリンを選択的に除去するために高分子支持体に抗体を導入した場合、β−２−マイクログロブリンに対する高い親和力と特異性を持つ。しかし、抗体は生産費用が高くて安全性が落ちるため、長期間常温で保管すると損傷し易いという問題点がある（非特許文献４）。
【０００７】
ＬｕｘｅｌｌＴＭとの商標として市販されるβ−２−マイクログロブリン除去カラムの場合、疎水性を導入して親和力を増進させるためにセルロースビードに炭素鎖を導入した高分子支持体を使っているが、β−２−マイクログロブリンの外に他の有用なタンパク質も一緒に除去されるという欠点がある。
【０００８】
したがって、当業界ではβ−２−マイクログロブリンにだけ選択的に結合して除去することで、他の有用なタンパク質は除去しながらも血液からβ−２−マイクログロブリンのみを除去することができる高分子支持体が要求されている。
【０００９】
本発明の発明者らはアミロイド性タンパク質単量体がすでに同種のタンパク質で作られた繊維状構造と共存するとき、アミロイドの形成が一層促進されるという点に着眼し；除去しようとするタンパク質でアミロイドを製造し、前記アミロイドから製造された凝集核を高分子支持体に結合して除去しようとするタンパク質を選択的に除去することができるアミロイド凝集核が結合された高分子支持体を発明することにより本発明を完成することになった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｕｍｅｓ ＨＤ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２００６，６９，１１１５−１１１９
【非特許文献２】Ｆｕｒｕｙｏｓｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ ａｄｓｏｒｂｅｎｔ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ． Ｉｎ：Ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８８，６２９−６３４
【非特許文献３】Ａｍｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｏｆ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００１，５９，１５４４−５５０
【非特許文献４】Ｓｈａｂｕｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｆｏｒ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ． Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１，１３２，９８４−９８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の基本的な目的は、生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、i）カルボキシル基が導入された高分子樹脂をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、グルタルアルデヒド及びエポキシよりなる群から選ばれるいずれか一つと反応させて活性化した高分子支持体樹脂を製造する段階；及びii）前記活性化した高分子支持体樹脂とアミロイド凝集核を反応させて前記高分子樹脂の表面に前記アミロイド凝集核を導入する段階を含む、生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、β−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核が結合された高分子支持体をβ−２−マイクログロブリンが含有された流体と接触させる段階を含む、β−２−マイクログロブリン除去方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前述した本発明の基本的な目的は、生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体を提供することにより達成できる。
【００１５】
本発明によれば、生体物質を凝集させることができる凝集核（ｓｅｅｄ）を高分子支持体に結合させることで前記生体物質を分離または除去することができる。前記凝集核の大きさは１ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。
【００１６】
特に、前記生体物質凝集用凝集核はアミロイド凝集核であることができる。本発明の明細書において、アミロイド凝集核（ａｍｙｌｏｉｄ ｓｅｅｄ）とはアミロイド形成に適した骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を提供することにより早く伸張してより大きいアミロイドを形成するようにする臨界大きさまたは構造を持つアミロイド断片を指称する。
【００１７】
特に、アミロイド凝集核が結合された高分子支持体はタンパク質凝集効果によって除去しようとするタンパク質のみを選択的に除去することができるようにする。タンパク質凝集効果とは、アミロイド性タンパク質単量体がすでに同種のタンパク質で作られた繊維状構造と共存するとき、アミロイドの形成が一層促進される現象を意味する。凝集核が存在するときのアミロイド形成程度は凝集核が存在しないときと比較すると、アミロイドの形成速度がずっと速く、作られる最終産物であるアミロイドの量においても大きな差を示す。前記アミロイド凝集核はβ−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核であることができるが、アミロイドを形成することができるタンパク質であれば制限なしに使うことができる。
【００１８】
本発明の高分子支持体として、ポリスチレンレジン、ＰＥＧ−ｇ−ＰＳ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｇ−ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）レジン、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭレジン、ＰＥＧＡＴＭレジン、ＣＬＥＡＲＴＭレジンなどのＰＥＧ鎖を持つレジン、エポキシレジン、フェノールレジン、フェノキシレジン、メラミンレジン、ポリエステルレジン、セルロースレジン、アガロースレジン、キトサンレジン、ＰＭＭＡレジン及びシリカビードなどの固体状支持体を使うことができ、好ましくはポリスチレン樹脂を使うことができる。
【００１９】
前述した本発明の他の目的は、i）カルボキシル基が導入された高分子樹脂をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、グルタルアルデヒド及びエポキシよりなる群から選ばれるいずれか一つと反応させて活性化した高分子支持体樹脂を製造する段階；及びii）前記活性化した高分子支持体樹脂とアミロイド凝集核を反応させて前記高分子樹脂の表面に前記アミロイド凝集核を導入する段階；を含む、生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法を提供することにより達成できる。
【００２０】
本発明の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体製造方法に使われる高分子樹脂は、ポリスチレンレジン、ＰＥＧ−ｇ−ＰＳレジン、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭレジン、ＰＥＧＡＴＭレジン、ＣＬＥＡＲＴＭレジンなどのＰＥＧ鎖を持つレジン、エポキシレジン、フェノールレジン、フェノキシレジン、メラミンレジン、ポリエステルレジン、セルロースレジン、アガロースレジン、キトサンレジン、ＰＭＭＡレジン及びシリカビードなどの固体状支持体を使うことができ、好ましくはポリスチレン樹脂を使うことができる。
【００２１】
前記カルボキシル基が導入された高分子樹脂は本明細書の実施例２に記載したように従来の方法で製造することができる。
【００２２】
本発明の生体物質凝集用凝集核が結合された高分子支持体の製造方法のi）段階の溶媒はジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）またはジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）であることが好ましい。また、前記i）段階の触媒として４−ジメチル−アミノピリジン（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）を使うことができる。
【００２３】
また、前記i）段階の反応温度は０℃〜５０℃であり、反応時間は２時間〜４８時間であることが好ましい。
【００２４】
前記ii）段階の生体物質凝集用凝集核はアミロイド凝集核であることができ、前記アミロイド凝集核はβ−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核であることができる。また、前記アミロイド凝集核の大きさは１ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。
【００２５】
前述した本発明のさらに他の目的は、β−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核が結合された高分子支持体をβ−２−マイクログロブリンが含有された流体と接触させる段階を含む、β−２−マイクログロブリン除去方法を提供することにより達成できる。
【００２６】
β−２−マイクログロブリンが生体内でアミロイドを形成し易いこととは異なり、試験管内では酸性の条件でばかりアミロイドが作られ、中性の条件でアミロイドが作られるためには繊維化を促進させる多様な要素を添加することにより可能であると知られている。その一つとして、アミロイドの形成を促進させる効果としてタンパク質凝集核の効果がある。前記β−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核が固定されたポリスチレン支持体をカラム形式で活用することにより流体の流れによるβ−２−マイクログロブリンのアミロイド形成加速化現象を用いてβ−２−マイクログロブリン除去の効率性を増進させることができる。
【００２７】
すなわち、β−２−マイクログロブリンをβ−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核に結合させて安定的なアミロイド形成を誘導することにより、体内のβ−２−マイクログロブリンを除去することができ、前記支持体を用いて血液透析過程で血液透析器とともに補助カラムとして使用してβ−２−マイクログロブリンを効果的に除去することができる。また、前記β−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核の大きさは１ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。
【００２８】
本発明のβ−２−マイクログロブリン除去方法に使われる高分子支持体としては、ポリスチレンレジン、ＰＥＧ−ｇ−ＰＳレジン、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭレジン、ＰＥＧＡＴＭレジン、ＣＬＥＡＲＴＭレジンなどのＰＥＧ鎖を持つレジン、エポキシレジン、フェノールレジン、フェノキシレジン、メラミンレジン、ポリエステルレジン、セルロースレジン、アガロースレジン、キトサンレジン、ＰＭＭＡレジン及びシリカビードなどの固体状支持体を使うことができ、好ましくはポリスチレン樹脂を使うことができる。
【００２９】
固定化した抗体にタンパク質を反応させる前に他のタンパク質が吸着されることを防止するためにウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ、ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍなどを含むｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、ウマ血清、人血清、脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）などの遮断溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で処理をする。また、ＰＥＧ、キトサンなどの物質がグラフティングされた表面を使うことにより、他のタンパク質が吸着されることを防止する効果をもたらすことができる。
【００３０】
前記β−２−マイクログロブリンが含有された流体と本発明の高分子支持体を接触させるとき、ｐＨの急激な変化を防止するために燐酸塩緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をさらに添加することが好ましい。この際、ｐＨは６．０〜８．０に維持することが好ましい。これにより、人体内の条件と類似の環境を維持することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のアミロイド凝集核が結合された高分子支持体を用いて除去しようとするタンパク質のみを選択的に除去することができるようにする。
【００３２】
特に、β−２−マイクログロブリンを血液から選択的に除去して腎不全症患者の血液透析過程でβ−２−マイクログロブリンが非正常的に体内に蓄積することを防止することができる。よって、透析関連類殿粉症を予防及び治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】チオフラビン−Ｔを用いたβ−２−マイクログロブリンアミロイド形成を示すグラフである。
【図２】超音波処理方法で製造された本発明のアミロイド凝集核の電子燎微鏡写真である。
【図３】本発明によってＨｉｃｏｒｅビードにβ−２−マイクログロブリン凝集核を接合させる方法の一実施例である。
【図４】本発明のタンパク質凝集核が固定されたビードとβ−２−マイクログロブリン結合を電子燎微鏡で確認した写真である。
【図５】本発明のタンパク質凝集核が固定されたビードのβ−２−マイクログロブリン結合を蛍光で確認した写真である（Ａ：Ｈｉｃｏｒｅビード、Ｂ：凝集核がないＨｉｃｏｒｅビードをβ−２−マイクログロブリンと反応させた写真、Ｃ：凝集核があるＨｉｃｏｒｅビードをβ−２−マイクログロブリンと１日間反応させた写真、Ｄ：凝集核があるＨｉｃｏｒｅビードをβ−２−マイクログロブリンと３日間反応させた写真、Ｅ：凝集核があるＨｉｃｏｒｅビードをα−シヌクレイン（他のタンパク質）と３日間反応させた写真）。
【図６】タンパク質凝集核ビードの時間によるβ−２−マイクログロブリン除去効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、次の実施例または図面に基づいて本発明をより具体的に説明する。しかし、次の実施例または図面についての説明は本発明の具体的な実施態様を特定して説明しようとするものであり、本発明の権利範囲をこれに記載した内容に限定するか制限して解釈しようとするものではない。
【００３５】
実施例１．凝集核として使われるβ−２−マイクログロブリンのアミロイド凝集核の製造
精製されたβ−２−マイクログロブリン単量体を１ｍｇ／ｍｌの濃度でｐＨ２．５の０．１５Ｍの塩化ナトリウムが含まれている２０ｍＭ塩化燐酸塩緩衝溶液に入れ、３７℃で２週間以上維持してアミロイド生成反応を進めた。アミロイド原線維（ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌ）の形成有無はタンパク質のアミロイド形成程度を測定するのに広く使われる蛍光色素であるチオフラビン−Ｔ（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｔ）を用いて確認した（図１）。充分に成熟したアミロイドが作られたことを確認した後、これを超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）法で小切れに破砕した後、濾過処理して長さ１０ｎｍ程度のアミロイド凝集核（ａｍｙｌｏｉｄ ｓｅｅｄ）を製作した（図２）。
【００３６】
実施例２．高分子支持体の製造
高分子支持体として固体状合成及び支持体物質として多く使われているポリスチレン樹脂を改質したＨｉＣｏｒｅレジン（（株）ビードテック）を使った。まず、ＨｉＣｏｒｅビードのアミン官能基に無水コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）をＮ−メチル−２−ピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）溶媒の下で常温で２４時間反応させてカルボキシル基を導入した。そのうえ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−カルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を用いて４−ジメチル−アミノピリジン（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）触媒の下でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を導入させた。溶媒としてはジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）とジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を使用し、温度は反応初期には氷浴（ｉｃｅ ｂａｔｈ）を用いて０℃を維持し、１時間後に常温に取り出して１８時間反応させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）の形態に活性化させた後、超音波処理によって得られたβ−２−マイクログロブリンの凝集核に存在するアミンとの縮合反応によって化学的に結合されたリガンド含有高分子支持体を製造した（図３参照）。
【００３７】
実施例３．凝集核と結合した高分子支持体を使っての溶液内のβ−２−マイクログロブリン除去
実施例２の凝集核が固定化した高分子ビード（０．４ｍｍｏｌ ＮＨ２／ｇ ｂｅａｄ）を１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）溶液に１時間のうち室内温度で反応させることで、高分子支持体表面の非特異的タンパク質吸着を最小化するように前処理した。このようにＢＳＡ処理されたビードを１ｍｇ／ｍｌのβ−２−マイクログロブリンが入っている２０ｍＭ塩化燐酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．５）２００ｍｌに加えた。この状態で３７℃撹拌培養器で反応させながら時間によって凝集核と結合されるβ−２−マイクログロブリンの量を測定した。その結果、時間によって凝集核が固定化した高分子ビードにβ−２−マイクログロブリンが選択的に結合する様相を定性及び定量分析によって確認した。ｐＨ６．５とｐＨ７．０の環境でも高分子支持体にβ−２−マイクログロブリンがよく結合することを確認した。
【００３８】
１）蛍光を用いた定性分析
ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で蛍光標識したβ−２−マイクログロブリン単量体とタンパク質凝集核が固定化したビードを２０ｍＭ燐酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）内で３７℃で３日間反応させた後、ビードに付いたβ−２−マイクログロブリンを共焦点燎微鏡を用いて確認した（図４）。
【００３９】
図４の左側写真は凝集核が導入されなかったビードを７２時間のうち蛍光が導入されたβ−２−マイクログロブリン単量体と反応させた後の共焦点燎微鏡写真；図４の中央写真は凝集核が導入されたビードを２４時間のうち蛍光が導入されたβ−２−マイクログロブリン単量体と反応させた後の共焦点燎微鏡写真；図４の右側写真は凝集核が導入されたビードを７２時間のうち蛍光が導入されたβ−２−マイクログロブリン単量体と反応させた後の共焦点燎微鏡写真である。
【００４０】
凝集核が導入されなかった対照群は３日間の反応にもかかわらず、高分子支持体が放出する弱い自己蛍光と少しの吸着によって微細な蛍光を帯びる反面、凝集核が導入されたビードの場合は２４時間のうち反応させた後にも非常に鮮やかな蛍光を示すことからβ−２−マイクログロブリンが選択的に結合することを確認した。
【００４１】
２）定量分析結果
定量分析のためにタンパク質凝集核が付いているビードをβ−２−マイクログロブリンを含むｐＨ７．４条件の２０ｍＭ燐酸塩緩衝溶液に入れ、３７℃で撹拌器で反応させた後、時間によって溶液に残っているβ−２−マイクログロブリン単量体の濃度をブラッドフォード分析法で分析した。その結果、図５に示すように、時間によって溶液中に残ったβ−２−マイクログロブリンが徐々に減少することから、凝集核固定化ビードがβ−２−マイクログロブリンを除去することができる能力を有することを確認した。また、これに基づいて各区間別に除去速度を計算して棒グラフで示した。その結果、時間が経つにつれて徐々に除去速度が増加することを観察した。これはアミロイド形成の凝集核効果が固定化支持体状態でもそのまま現れていることを意味する。
【図１】
2012505204.tif 000003
【図２】
2012505204.tif 000004
【図３】
2012505204.tif 000005
【図４】
2012505204.tif 000006
【図５】
2012505204.tif 000007
【図６】
2012505204.tif 000008
【国際調査報告】
2012505204.tif 000009
2012505204.tif 000010
2012505204.tif 000011
2012505204.tif 000012