(57)【要約】  本発明はＮａＣｌを含有せず、２０ｍｇを上回るポリオールと、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤を提供する。本発明は長期安定性と皮下投与に有利な特徴をもつ高濃度抗体製剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２０ｍｇを上回るポリオールと、配列番号３に記載のアミノ酸配列あるいは１、４、５、７もしくは８位の１カ所のアラニン置換又は１、３、４、６、７、８及び／もしくは９位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号３から変異したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖と、配列番号４に記載のアミノ酸配列あるいは２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位の１カ所のアラニン置換又は２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／もしくは１２位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号４から変異したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含む少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤であって、前記製剤が添加剤ＮａＣｌを含有しない前記製剤。
【請求項２】
製剤が約３０ｍｇを上回るポリオールを含有する請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
製剤が約４０ｍｇを上回るポリオールを含有する請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
約４０〜４５ｍｇのポリオールを含有する請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
ポリオールが糖アルコールである請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
ヒト抗体がヒトＩｇＧ１κ抗体である請求項１から６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
ヒト抗体の軽鎖が更に配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、及び／又はヒト抗体の重鎖が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む請求項１から６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
ヒト抗体の軽鎖が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ヒト抗体の重鎖が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む請求項１から６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
抗体がアダリムマブである請求項１から６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
ｐＨが約５．０〜６．４であり、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖と、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含む少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤であって、前記製剤がＮａＣｌを含有せず、標準２４時間撹拌ストレスアッセイ後の濁度が約６０ＮＴＵ未満である前記製剤。
【請求項１２】
ｐＨが約５．０〜６．４であり、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖と、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含む少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤であって、前記製剤がＮａＣｌを含有せず、標準４８時間撹拌ストレスアッセイ後の濁度が約１００ＮＴＵ未満である前記製剤。
【請求項１３】
ｐＨが約５．０〜６．４であり、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖と、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含む少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤であって、前記製剤がＮａＣｌを含有せず、５℃、２５℃又は４０℃で３カ月間保存後の濁度が約４０ＮＴＵ未満である前記製剤。
【請求項１４】
更に約２０ｍｇを上回るポリオールを含有する請求項１１から１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
更に約３０ｍｇを上回るポリオールを含有する請求項１１から１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
更に約４０ｍｇを上回るポリオールを含有する請求項１１から１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１７】
更に約４０〜４５ｍｇのポリオールを含有する請求項１１から１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１８】
ポリオールが糖アルコールである請求項１３から１７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
ｐＨが約５．０〜５．４又は約５．８〜６．４である請求項１１から１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
凝集蛋白質が約１％未満である請求項１１から２０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２２】
ヒト抗体がヒトＩｇＧ１κ抗体である請求項１１から２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
ヒト抗体の軽鎖が更に配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、及び／又はヒト抗体の重鎖が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む請求項１１から２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２４】
ヒト抗体の軽鎖が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ヒト抗体の重鎖が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む請求項１１から２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２５】
抗体がアダリムマブである請求項１１から２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２６】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖と、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含む少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分と；
約２０ｍｇ／ｍＬを上回る糖アルコールと；
約０．１〜２．０ｍｇ／ｍＬの界面活性剤と；
約１．１５〜１．４５ｍｇ／ｍＬのクエン酸・Ｈ２Ｏと；
約０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム脱水和物と；
約１．３５〜１．７５ｍｇ／ｍＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏと；
約０．７５〜０．９５ｍｇ／ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ
を含有する液体医薬製剤であって、
前記製剤がｐＨ約４．７〜６．５であり、ＮａＣｌを含有しない前記製剤。
【請求項２７】
糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである請求項２６に記載の製剤。
【請求項２８】
約４０〜４５ｍｇ／ｍＬのマンニトール又はソルビトールを含有する請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
界面活性剤がポリソルベート８０である請求項２６に記載の製剤。
【請求項３０】
約１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含有する請求項２９に記載の製剤。
【請求項３１】
約１．３０〜１．３１ｍｇ／ｍＬのクエン酸・Ｈ２Ｏを含有する請求項２６に記載の製剤。
【請求項３２】
約０．３０〜０．３１ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム脱水和物を含有する請求項２６に記載の製剤。
【請求項３３】
約１．５０〜１．５６ｍｇ／ｍＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含有する請求項２６に記載の製剤。
【請求項３４】
約０．８３〜０．８９ｍｇ／ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含有する請求項２６に記載の製剤。
【請求項３５】
ｐＨが約５．２である請求項２６に記載の製剤。
【請求項３６】
ｐＨが約６．０である請求項２６に記載の製剤。
【請求項３７】
ヒト抗体がヒトＩｇＧｌκ抗体である請求項２６から３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
ヒト抗体の軽鎖が更に配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、及び／又はヒト抗体の重鎖が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む請求項２６から３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３９】
ヒト抗体の軽鎖が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ヒト抗体の重鎖が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む請求項２６から３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４０】
抗体がアダリムマブである請求項２６から３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４１】
皮下投与に適している請求項１から４０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４２】
対象における有害なＴＮＦα活性に関連する疾患の治療方法であって、請求項１から４１のいずれか一項に記載の製剤を前記対象に投与する段階を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗体等の治療用蛋白質の製剤化は経済的及び治療薬として成功するために多数の望ましい特性（例えば安定性、投与適性、濃度）を満たす必要があるため、困難であることが多い。製造、保存及び配送中に、治療用蛋白質は物理的及び化学的劣化を受けることが知られている。これらの不安定性は蛋白質の力価を下げ、患者に有害なイベントが発生する危険を増し、従って、当局の許可に著しく影響する可能性がある（例えばＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９６：１参照）。従って、治療用蛋白質の成功には安定した蛋白質製剤が不可欠である。
【０００２】
有効にするために、多くの治療用蛋白質は高用量を投与する必要があり、高濃度製剤に製剤化することが好ましい。高濃度蛋白質製剤は薬剤を対象に投与する方法（例えば静脈内と皮下のどちらにするか）と頻度に影響を与えることができるので望ましい。
【０００３】
高濃度蛋白質製剤は有益であるが、高濃度治療用蛋白質を製剤化するには多くの問題がある。例えば、蛋白質濃度を上げると、蛋白質凝集、溶解度、安定性及び粘度にマイナスの影響を与えることが多い（例えばＳｈｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：１３９０参照）。高蛋白質溶液に非常に一般的な問題である粘度増加は製剤の投与にマイナスの影響（例えば疼痛感及び灼熱痛症候群や、製造、加工、充填−仕上げ及び薬剤送達装置選択の制限）を与える恐れがある（例えばＳｈｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：１３９０参照）。一般的な構造特徴をもつ治療用蛋白質（例えば抗体）でも、今日までに認可されている製剤は成分と濃度範囲が多様であった。例えば、抗ＣＤ２０抗体であるリツキサンは１０ｍｇ／ｍＬの濃度で静脈内投与用に製剤化されているが、抗ＲＳＶ抗体であるシナジスは１００ｍｇ／ｍＬの濃度で筋肉内投与用に製剤化されている。このように、治療目的に使用することができる高蛋白質製剤、特に抗体製剤には課題が残っている。従って、投薬及び投与上の利点を提供する安定した高濃度蛋白質製剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９６：１
【非特許文献２】Ｓｈｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：１３９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は少なくとも部分的にヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメント（例えばアダリムマブ）の新規高濃度製剤の発見に基づく。本発明の製剤は抗体濃度が高いため、多数の驚くべき特徴を提供する。例えば、本発明の製剤は蛋白質濃度が高いにも拘わらず、物理的及び化学的安定性を長期間維持し、皮下投与に適した粘度をもつ。本発明の製剤は少なくとも部分的にヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分が高濃度（例えば１００ｍｇ／ｍＬ）で可溶性に維持できると共に、注射（例えば皮下投与）に適した粘度を維持しながら非凝集状態に維持できるという驚くべき知見に基づく。本発明の製剤は、高濃度（例えば１００ｍｇ／ｍＬ）のヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分が可溶性に維持できると共に、広いｐＨ範囲（例えば約ｐＨ５．２〜約ｐＨ６．０）にわたって非凝集状態で且つ化学的に安定に維持できる（例えば酸化や脱アミド化を生じない）という点も意外である。これらの有益な特徴は安定剤としてＮａＣｌを必要とせずに、糖アルコール添加剤を増加することにより達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の１側面は、４０ｍｇを上回るポリオールと、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤を提供する。
【０００７】
本発明の別の側面は、２０ｍｇを上回るポリオールと、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤を提供する。１態様において、本発明の製剤はＮａＣｌを含有しない。
【０００８】
本発明は更に、ｐＨが約５．０〜６．４であり、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤であって、ＮａＣｌを含有せず、標準２４時間撹拌ストレスアッセイ後又は液体として２４カ月間の長期保存後の濁度が６０ＮＴＵ未満である前記製剤に関する。
【０００９】
本発明は更に、ｐＨが約５．０〜６．４であり、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤であって、ＮａＣｌを含有せず、標準４８時間撹拌ストレスアッセイ後の濁度が１００ＮＴＵ未満である前記製剤を提供する。
【００１０】
本発明の別の側面は、ｐＨが約５．０〜６．４であり、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する液体医薬製剤であって、ＮａＣｌを含有せず、５℃、２５℃又は４０℃で３カ月間保存の濁度が４０ＮＴＵ未満である前記製剤を包含する。
【００１１】
本発明は更に、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分と、約２０ｍｇ／ｍＬを上回るポリオールと、０．１〜２．０ｍｇ／ｍＬの界面活性剤と、約１．１５〜１．４５ｍｇ／ｍＬのクエン酸・Ｈ２Ｏと、約０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム脱水和物と、約１．３５〜１．７５ｍｇ／ｍＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏと、約０．７５〜０．９５ｍｇ／ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含有する液体医薬製剤であって、ｐＨが約４．７〜６．５であり、ＮａＣｌを含有しない前記製剤を提供する。
【００１２】
本発明の製剤は皮下投与に適している。従って、本発明は更に、対象における有害なＴＮＦα活性に関連する疾患の治療における、ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する本発明の製剤の使用を包含する。
【００１３】
１態様において、本発明の製剤は一定濃度のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分と、約３．１〜３．３ｍＰａ・ｓの粘度を有する。
【００１４】
１態様において、本発明の製剤は２０ｍｇを上回るポリオールを含有する。本発明の製剤に添加することができるポリオールのその他の量は３０ｍｇを上回るポリオールである。あるいは、本発明の製剤では４０ｍｇを上回るポリオールを使用することもでき、限定されないが、４０〜４５ｍｇ又は約４２ｍｇが挙げられる。
【００１５】
１態様において、本発明の製剤で使用されるポリオールは糖アルコールであり、限定されないが、マンニトール又はソルビトールが挙げられる。１態様において、製剤は約４０〜４５ｍｇ／ｍＬのマンニトール又はソルビトールを含有する。
【００１６】
本発明の製剤では当分野で公知の各種界面活性剤を使用することができる。１態様において、界面活性剤はポリソルベート８０である。別の態様において、本発明の製剤では約０．１〜２．０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を使用する。
【００１７】
本発明の１態様において、製剤は約１．３０〜１．３１ｍｇ／ｍＬのクエン酸・Ｈ２Ｏを含有する。
【００１８】
本発明の別の態様において、製剤は約０．３０〜０．３１ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム脱水和物を含有する。
【００１９】
本発明の更に別の態様において、製剤は約１．５０〜１．５６ｍｇ／ｍＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含有する。
【００２０】
本発明の別の態様において、製剤は約０．８３〜０．８９ｍｇ／ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含有する。
【００２１】
別の態様において、本発明の製剤のｐＨは約４．８〜約６．４である。例えば、本発明の製剤のｐＨは約５．０〜約５．４（例えば約５．２）でもよいし、約５．８〜約６．４（例えば約６．０）でもよい。
【００２２】
本発明の製剤の１つの利点は、一般に蛋白質濃度の上昇と共に生じる蛋白質凝集の増加を伴わずに高濃度の抗体を提供する点である。１態様において、本発明の製剤は凝集蛋白質含有量が約１％未満である。
【００２３】
本願に記載する製剤として、ヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分の濃度が少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬである製剤も本発明に含むものとする。
【００２４】
１態様において、ヒト抗体又はその抗原結合部分は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖と、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含む。
【００２５】
本発明の１態様において、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列あるいは１、４、５、７もしくは８位の１カ所のアラニン置換又は１、３、４、６、７、８及び／もしくは９位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号３から変異したアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインと、配列番号４のアミノ酸配列あるいは２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位の１カ所のアラニン置換又は２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／もしくは１２位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号４から変異したアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインをもつ。
【００２６】
本発明の抗体は所定の機能的特徴をもつことができる。例えば、ヒト抗体又はその抗原結合部分は、いずれも表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、１×１０−８Ｍ以下のＫｄでヒトＴＮＦαから解離することができ、１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離することができ、及び／又は標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０でヒトＴＮＦα細胞傷害作用を中和することができる。
【００２７】
１態様において、ヒト抗体又はその抗原結合部分はヒトＩｇＧ１κ抗体である。
【００２８】
本発明の１態様において、ヒト抗体又はその抗原結合部分の軽鎖は更に配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含み、及び／又はヒト抗体の重鎖は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む。別の態様において、ヒト抗体又はその抗原結合部分の軽鎖は配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ヒト抗体の重鎖は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。本願に記載する各種配列番号と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％一致するアミノ酸配列をもつヒト抗体又はその抗原結合部分も本発明に包含する。
【００２９】
本発明の更に別の態様において、ヒト抗体又はその抗原結合部分はアダリムマブである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】０．１％  Ｓｏｌｕｔｏｌを含有する溶液中の高分子量（ｈｍｗ）蛋白質試料の存在を示すグラフである。ＭＡＬＳ（灰色の線）によると、凝集物モル質量はほぼ１０９ｇ／ｍｏｌまでに等しく、総蛋白質の２．６％に相当する（ＵＶ２８０，黒線）。４０℃で１２週間保存。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは４０℃で保存中に出現する高分子量（ｈｍｗ）凝集物の初期段階検出を示すグラフである。ＵＶ２８０（黒曲線）では凝集物を検出できなかったが、ＭＡＬＳ（灰色曲線）は明白にｈｍｗ試料の存在を立証した。１週間保存後（Ａ）と元のサンプル（Ｂ）を比較。
【図３】製剤Ｆ１〜Ｆ６の凍結／解凍サイクルに対する濁度を示すグラフである。
【図４】製剤Ｆ１〜Ｆ６の凍結／解凍サイクルに対する多分散指数を示すグラフである。
【図５】製剤Ｆ１〜Ｆ６の凍結／解凍サイクルに対するＳＥＣによる凝集物濃度を示すグラフである。
【図６】Ｔ０における製剤Ｆ１〜Ｆ６のＤＳＣによるＴｍ（℃）を示すグラフである。
【図７】製剤Ｆ１〜Ｆ６の撹拌時間に対するＳＥＣによる凝集物濃度を示すグラフである。
【図８】Ｆ２、Ｆ６及びＦ７（３種類の代表的なバッチ０１０３２〜０１３４）の３カ月間保存後の安定性試験で得られた濁度値の比較を示すグラフである。
【図９】Ｆ２、Ｆ６及びＦ７（３種類の代表的なバッチ０１０３２〜０１３４）の３カ月間保存後の安定性試験で得られたＤＡＣスコアによる可視粒子値の比較を示すグラフである。
【図１０】Ｆ２、Ｆ６及びＦ７（３種類の代表的なバッチ０１０３２〜０１３４）の３カ月間保存後の安定性試験で得られた不可視粒子値（≧１０μｍ）の比較を示すグラフである。
【図１１】Ｆ２、Ｆ６及びＦ７（３種類の代表的なバッチ０１０３２〜０１３４）の３カ月間保存後の安定性試験で得られた不可視粒子値（≧２５μｍ）の比較を示すグラフである。
【図１２】Ｆ２、Ｆ６及びＦ７（３種類の代表的なバッチ０１０３２〜０１３４）の３カ月間保存後の安定性試験で得られた残留モノマー含有量の比較を示すグラフである。
【図１３】Ｆ２、Ｆ６及びＦ７（３種類の代表的なバッチ０１０３２〜０１３４）の３カ月間保存後の安定性試験で得られたリジン変異体合計の比較を示すグラフである。
【図１４】２４時間後の各種撹拌速度の撹拌ストレスに対する安定性についてＦ２、Ｆ６及びＦ７を比較した濁度データを示すグラフである。
【図１５】２４時間後の各種撹拌速度の撹拌ストレスに対する安定性についてＦ２、Ｆ６及びＦ７を比較したＤＬＳデータ（Ｚ平均値）を示すグラフである。
【図１６】数種のポンプサイクル前後のストレスに対する安定性についてＦ２、Ｆ６及びＦ７を比較した濁度データを示すグラフである。
【図１７】数種のポンプサイクル前後の安定性についてＦ２、Ｆ６及びＦ７を比較したＤＬＳデータ（Ｚ平均）を示すグラフである。
【図１８】数種のポンプサイクル前後の安定性についてＦ２、Ｆ６及びＦ７を比較したＳＥＣデータ（凝集物濃度）を示すグラフである。
【図１９】蠕動ポンプを使用して充填した１００ｍｇ／ｍＬ製剤の目視スコアを示すグラフである。
【図２０】ピストンポンプを使用して充填した１００ｍｇ／ｍＬ製剤の目視スコアを示すグラフである。
【図２１】蠕動ポンプを使用して充填した１００ｍｇ／ｍＬ製剤の濁度を示すグラフである。
【図２２】ピストンポンプを使用して充填した１００ｍｇ／ｍＬ製剤の濁度を示すグラフである。
【図２３】Ｔ０及び５℃で４週間保存後における製剤Ｆ８〜Ｆ１１の濁度を示すグラフである。
【図２４】Ｔ０及び５℃で４週間保存後における製剤Ｆ８〜Ｆ１１のモノマー含有量を示すグラフである。
【図２５】Ｔ０及び５℃で４週間保存後における製剤Ｆ８〜Ｆ１１の凝集物濃度を示すグラフである。
【図２６】Ｔ０及び５℃で４週間保存後における製剤Ｆ８〜Ｆ１１の不可視粒子数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．定義
本発明を理解し易くするために、先ず所定の用語を定義する。更に、当然のことながら、パラメーターの数値又は数値範囲を記載する場合には、記載する数値の中間の数値及び範囲も常に本発明に含むものとする。
【００３２】
「医薬製剤」なる用語は活性成分の生物活性を明白に有効にすることが可能な形態であり、製剤を投与する対象に有意に毒性となるような付加成分を含有しない製剤を意味する。
【００３３】
「医薬的に許容可能な担体」なる用語は当業者に公知であり、哺乳動物に投与するのに適した医薬的に許容可能な材料、組成物又はビヒクルを包含する。担体としては、ある臓器又は生体の一部から別の臓器又は生体の一部への主剤の輸送又は移送に関与する液体又は固体増量剤、希釈剤、添加剤、溶媒又は封入材料が挙げられる。各担体は製剤の他の成分と適合可能であり、患者の安全性に有害な作用や影響を与えないという意味で「許容可能」でなければならない。
【００３４】
「医薬的に許容可能な添加剤」（ビヒクル、助剤）とは、使用する活性成分の有効用量を提供するために対象哺乳動物に妥当に投与することができる添加剤である。
【００３５】
「添加剤」なる用語は例えばバルク特性を改変する所望コンシステンシーを提供するため、安定性を改善するため、及び／又は浸透圧を調節するために製剤に添加することができる物質を意味する。一般に使用される添加剤の例としては、限定されないが、糖質、ポリオール、アミノ酸、界面活性剤及びポリマーが挙げられる。
【００３６】
一般に使用される添加剤はポリオールである。本願で使用する「ポリオール」とは複数のヒドロキシル基をもつ物質を意味し、糖質（還元糖及び非還元糖）、糖アルコール及び糖酸を包含する。本願で好ましいポリオールは約６００ｋＤ未満（例えば約１２０〜約４００ｋＤ）の分子量を有する。ポリオールの非限定的な例はフルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、Ｌ−グルコン酸及びその金属塩である。
【００３７】
本願で使用する「緩衝液」とは、その酸−塩基共役成分の作用によりｐＨの変化を阻止する緩衝溶液を意味する。本発明の緩衝液はｐＨが約４〜約８、好ましくは約４．５〜約７の範囲であり、最も好ましくはｐＨが約５．０〜約６．５の範囲である。ｐＨをこの範囲に制御する緩衝液の例としては、リン酸塩、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えばコハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。１態様において、本発明の製剤で使用するのに適した緩衝液はクエン酸リン酸緩衝液である。
【００３８】
「界面活性剤」なる用語は一般に空気／溶液界面に誘導されるストレスと溶液／表面に誘導されるストレスから製剤中の蛋白質を保護する物質を包含する。例えば、界面活性剤は蛋白質を凝集から保護することができる。適切な界面活性剤としては、例えばポリソルベート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えばＢｒｉｊ  ３５（登録商標））、又はポロキサマー（例えばＴｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０又はポロキサマー１８８）が挙げられる。好ましい界面活性剤はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えばＢｒｉｊ  ３５（登録商標）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ａ２５、Ｓｙｍｐａｔｅｎｓ  ＡＬＭ／２３０）、及びポリソルベート／Ｔｗｅｅｎ類（例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｍｉｒｊとポロキサマー類（例えばポロキサマー１８８）及びＴｗｅｅｎ類（例えばＴｗｅｅｎ  ２０及びＴｗｅｅｎ  ８０））である。
【００３９】
「安定」した製剤とは製剤中の抗体が製造工程中及び／又は保存後にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物活性を本質的に維持する製剤である。蛋白質安定性を測定するための各種分析技術が当分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０に記載されている。例えば、１態様において、蛋白質の安定性は溶液中のモノマー蛋白質の百分率に従って測定され、分解（例えば断片化）及び／又は凝集蛋白質の百分率が低いほうが安定である。製剤は室温（約３０℃）もしくは４０℃で少なくとも約１カ月間安定であり、及び／又は約２〜８℃で少なくとも約１年間もしくは少なくとも２年間安定であることが好ましい。更に、製剤は製剤の（例えば−７０℃まで）凍結及び解凍（以下、「凍結／解凍サイクル」と言う）後に安定であることが好ましい。
【００４０】
抗体は色及び／もしくは透明度の目視試験後、又はＵＶ光散乱法もしくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したときに例えば凝集、沈殿及び／又は変性の徴候を実質的に示さない場合に、製剤中で「その物理的安定性を維持する」。凝集とは、個々の分子又は複合体が共有的又は非共有的に会合して凝集物を形成するプロセスである。凝集は可視沈殿が形成される程度まで進行することができる。
【００４１】
製剤の物理的安定性等の安定性はサンプルの見かけの光減衰（吸光度ないし光学密度）の測定を含む当分野で周知の方法により評価することができる。このような光減衰の測定は製剤の濁度に相関する。製剤の濁度は溶液に溶解した蛋白質の固有特性でもあり、一般にネフェロメトリー法により測定され、ネフェロメトリー濁度単位（ＮＴＵ）で表される。
【００４２】
例えば溶液中の成分の１種以上の濃度（例えば蛋白質及び／又は塩濃度）の関数としての濁度を製剤の「乳白」又は「乳白外観」とも言う。濁度は既知濁度の懸濁液を使用して作成した標準曲線を参照することにより計算することができる。医薬組成物の濁度を測定するための参照標準は欧州薬局方基準（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．，Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅ（ＥＤＱＭ），Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）に準じることができる。欧州薬局方基準によると、透明溶液は欧州薬局方標準に基づいて濁度約３を有する参照懸濁液と同等以下の濁度を有する溶液として定義される。ネフェロメトリー濁度測定は会合又は非理想効果の不在下で一般に濃度と共に線形変化するレイリー散乱を検出することができる。物理的安定性を評価するための他の方法も当分野で周知である。
【００４３】
所定時点の化学的安定性に関して、抗体が以下に定義するようにその生物活性を維持するとみなされるような状況である場合に、抗体は医薬製剤中で「その化学的安定性を維持する」。化学的安定性は例えば抗体の化学的改変形を検出及び定量することにより評価することができる。化学的改変としては、サイズ改変（例えば切り取り）が挙げられ、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）により測定することができる。他の型の化学的改変としては、（例えば脱アミド化又は酸化の結果として生じる）電荷改変が挙げられ、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより評価することができる。
【００４４】
医薬製剤中の抗体がその所期目的のために生物学的に活性である場合に、抗体は医薬製剤中で「その生物活性を維持する」。例えば、医薬製剤中の抗体の生物活性が（例えば抗原結合アッセイで測定したときに）医薬製剤の製造時に示される生物活性の（アッセイの誤差内で）約３０％、約２０％又は約１０％以内にある場合に、生物活性は維持される。
【００４５】
薬理学的な意味で、本発明に関して抗体の「治療有効量」又は「有効量」とは、抗体が治療に有効である疾患の症状の予防又は治療又は緩和に有効な量を意味する。「疾患」とは抗体投与が有効となる任意病態である。これは慢性及び急性疾患ないし疾病を含み、該当疾患の素因を対象に与える病態を含む。
【００４６】
「治療」とは治療処置と予防ないし防止措置の両方を意味する。治療を必要とする対象としては、既に疾患に罹患している対象と、疾患を予防すべき対象が挙げられる。
【００４７】
本願で使用する「非経口投与」及び「非経口投与する」なる用語は経腸管及び局所投与以外の投与方法を意味し、通常は注射による投与方法であり、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、関節包下、クモ膜下、頭蓋内、関節内、脊髄内及び胸骨内注射及び輸液が挙げられる。
【００４８】
本願で使用する「全身投与」、「全身投与する」、「末梢投与」及び「末梢投与する」なる用語は、化合物、薬剤及び他の材料が患者の生体系に入り、従って、代謝等のプロセスを受けるように、中枢神経系への直接投与以外の方法で投与することを意味する（例えば皮下投与）。
【００４９】
本願で使用する「ヒトＴＮＦα」（本願ではｈＴＮＦα、ＴＮＦα、又は単にｈＴＮＦと略称する）なる用語は１７ｋＤ分泌型及びその生物活性型が非共有的に結合した１７ｋＤ分子の三量体から構成される２６ｋＤ膜結合型として存在するヒトサイトカインを意味する。ｈＴＮＦαの構造は例えばＰｅｎｎｉｃａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４−７２９；Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６：１３２２−１３２６；及びＪｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２２５−２２８に詳細に記載されている。ヒトＴＮＦαなる用語は標準組換え発現法により作製することもできるし、市販品（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２１０−ＴＡ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）として購入することもできる組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）を包含するものとする。
【００５０】
本願で使用する「抗体」なる用語はジスルフィド結合により相互に結合した２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖からなる４本のポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子を意味する。構造の異なる他の天然抗体（例えばラクダ抗体）もこの定義に含まれる。各重鎖は重鎖可変領域（本願ではＨＣＶＲ又はＶＨと略称する）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３個のドメインから構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本願ではＬＣＶＲ又はＶＬと略称する）と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１個のドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域とＶＬ領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存度の高い領域を挟んで相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に分割することができる。各ＶＨ及びＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される。本発明の１態様において、製剤は各々本願に援用する米国特許第６，０９０，３８２号及び６，２５８，５６２号に記載されている配列等のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列をもつ抗体を含む。
【００５１】
本願で使用する「ＣＤＲ」なる用語は抗体可変配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖と軽鎖の可変領域の各々に３個のＣＤＲが存在し、可変領域の各々についてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ぶ。これらのＣＤＲの厳密な境界は種々のシステムに従って種々に定義されている。Ｋａｂａｔ（同書）により記載されているシステムは抗体の任意可変領域に適用可能な明白な残基ナンバリングシステムを提供するのみならず、３個のＣＤＲを規定する厳密な残基境界も提供する。これらのＣＤＲをＫａｂａｔ  ＣＤＲと言う場合もある。ＣｈｏｔｈｉａらはＫａｂａｔ  ＣＤＲ内の所定のサブ部分がアミノ酸配列レベルでは多様性が高いにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造をとることを見出した（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）。これらのサブ部分はＬ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と呼ばれ、ここで「Ｌ」及び「Ｈ」は夫々軽鎖領域と重鎖領域を意味する。これらの領域をＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと言う場合もあり、その境界はＫａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップする。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを規定する他の境界もＰａｄｌａｎ（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５に記載されている。本願に記載するシステムと厳密に一致しない場合もあるが、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップする更に他のＣＤＲ境界定義もあり、特定残基もしくは残基群又はＣＤＲ全体が抗原結合にさほど影響しないという予想又は実験結果を踏まえると、ＣＤＲを短縮又は延長してもよい。本願で使用する方法はこれらのシステムのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができるが、所定の態様はＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａにより定義されるＣＤＲを使用する。
【００５２】
本願で使用する抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）なる用語は抗原（例えばｈＴＮＦα）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１個以上のフラグメントを意味する。全長抗体のフラグメントにより抗体の抗原結合機能を実施できることが分かっている。抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される１価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋により結合した２個のＦａｂフラグメントから構成される２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬドメインとＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖフラグメントの２領域であるＶＬとＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用し、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して１価分子（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）を形成する１本の蛋白質鎖とすることが可能な合成リンカーにより結合することができる。このような１本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」なる用語に含むものとする。ダイアボディ等の他の型の１本鎖抗体も包含する。ダイアボディはＶＨドメインとＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上で発現される２価の二重特異性抗体であるが、同一鎖上の２領域間を対合させるには短いリンカーを使用することにより、これらの領域を別の鎖の相補領域と対合させ、２個の抗原結合部位を形成する（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。本発明の１態様において、製剤は各々本願に援用する米国特許第６，０９０，３８２号及び６，２５８，５６２号に記載されている抗原結合部分を含有する。
【００５３】
更に、抗体又はその抗原結合部分は抗体又は抗体部分と１個以上の他の蛋白質又はペプチドの共有的又は非共有的会合により形成される大きな免疫接着分子の一部でもよい。このような免疫接着分子の例としては、ストレプトアビジンコア領域を使用して四量体ｓｃＦｖ分子を作製する場合（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）や、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグを使用して２価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製する場合（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体部分は全長抗体の夫々パパイン又はペプシン消化等の従来技術を使用して全長抗体から作製することができる。更に、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は本願に記載するような標準組換えＤＮＡを使用して得ることができる。
【００５４】
本願で使用する「ヒト抗体」なる用語はヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ抗体を包含する。本発明で使用されるヒト抗体はヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えばランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によりインビトロ又は体細胞突然変異によりインビボ導入される突然変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含むことができる。他方、本願で使用する「ヒト抗体」なる用語はマウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体を包含しない。
【００５５】
本願で使用する「組換えヒト抗体」なる用語は組換え手段により作製、発現、創製又は単離される全ヒト抗体を包含し、例えば宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現される抗体（下記セクションＩＩに詳述）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体（下記セクションＩＩＩに詳述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離される抗体（例えばＴａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列と他のＤＮＡ配列のスプライシングを含む他の任意手段により作製、発現、創製もしくは単離される抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体はヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ。他方、所定態様では、このような組換えヒト抗体をインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用する場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）するため、組換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列はヒト生殖系列ＶＨ配列及びＶＬ配列に由来及び関連するが、ヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然にインビボ存在し得ない配列となる。
【００５６】
本願で使用する「単離抗体」とは、異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えば、ｈＴＮＦαと特異的に結合する単離抗体はｈＴＮＦα以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。他方、ｈＴＮＦαと特異的に結合する単離抗体は他の種に由来するＴＮＦα分子等の他の抗原に対して交差反応性をもつ場合がある。更に、単離抗体は他の細胞材料及び／又は薬品を実質的に排除することができる。
【００５７】
本願で使用する「中和抗体」（又は「ｈＴＮＦα活性を中和した抗体」）とはｈＴＮＦαと結合する結果、ｈＴＮＦαの生物活性を阻害する抗体を意味する。ｈＴＮＦαの生物活性のこの阻害はｈＴＮＦαにより（インビトロ又はインビボで）誘導される細胞傷害作用、ｈＴＮＦαにより誘導される細胞活性化及びｈＴＮＦαとｈＴＮＦα受容体の結合等のｈＴＮＦα生物活性の１種以上の指標を測定することにより評価することができる。ｈＴＮＦα生物活性のこれらの指標は各々本願に援用する米国特許第６，０９０，３８２号及び６，２５８，５６２号に記載されている当分野で公知の数種類の標準インビトロ又はインビボアッセイの１種以上により評価することができる。抗体がｈＴＮＦα活性を中和する能力は、ｈＴＮＦαにより誘導されるＬ９２９細胞の細胞傷害作用の阻害により評価することが好ましい。ｈＴＮＦα活性の付加又は代替パラメーターとして、抗体がＨＵＶＥＣ上でｈＴＮＦαにより誘導されるＥＬＡＭ−１の発現を阻害する能力は、ｈＴＮＦαにより誘導される細胞活性化の指標として評価することができる。
【００５８】
本願で使用する「表面プラズモン共鳴法」なる用語は例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用してバイオセンサーマトリックス内の蛋白質濃度の変化の検出によりリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を意味する。詳細については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７参照。
【００５９】
本願で使用する「Ｋｏｎ」なる用語は当分野で公知のように結合性蛋白質（例えば抗体）が抗原と会合して例えば抗体／抗原複合体を形成する会合速度定数を意味する。
【００６０】
本願で使用する「Ｋｏｆｆ」なる用語は抗体が抗体／抗原複合体から解離する解離速度定数を意味する。
【００６１】
本願で使用する「Ｋｄ」なる用語は特定抗体−抗原相互作用の解離定数を意味し、平衡状態の滴定測定又は解離速度定数（ｋｏｆｆ）を会合速度定数（ｋｏｎ）で割ることにより得られる値を意味する。
【００６２】
以下のサブセクションでは本発明の各種側面について更に詳細に記載する。
【００６３】
ＩＩ．本発明の製剤
本発明は当業者に公知の製剤に比較して特性を改善した液体医薬製剤（例えば抗体製剤）に関する。本発明はＮａＣｌを除去し、２０ｍｇ／ｍＬを上回るポリオール（例えば糖アルコール）を加えることにより、製剤中のヒトＴＮＦα抗体の濃度を約１００ｍｇ／ｍＬまで上げることができるという驚くべき知見に基づく。抗体濃度が高いにも拘わらず、本発明の製剤は例えば製造、保存及び／もしくは反復凍結／解凍処理工程中又は拡大した気液界面への長期暴露中に溶解度と安定性を維持することが可能である。更に、本発明の製剤は約１００ｍｇ／ｍＬの抗体濃度でありながら、低レベル蛋白質凝集（即ち１％未満）を維持する。本発明の製剤は更に、驚くべきことに、約１００ｍｇ／ｍＬの抗体濃度でありながら、皮下注射に適した範囲内の低粘度を維持する。更に、本発明の製剤（例えば高濃度ＴＮＦα抗体）は皮下注射に適した低粘度を維持すると共に、ほぼ１のｐＨ範囲（例えばｐＨ５．２〜ｐＨ６．０）にわたって安定性を維持する。１態様において、製剤の濁度は標準４８時間撹拌ストレスアッセイ後に１００ＮＴＵ未満である。従って、本発明の高濃度抗体製剤は安定性、粘度、濁度及び物理的劣化の問題を含む製剤の多数の公知課題を解決する。
【００６４】
本発明の製剤の驚くべき特徴の１つは、高い抗体濃度（例えば１００ｍｇ／ｍＬ以上）でありながらＮａＣｌの不在下で製剤の総粘度が低く維持される点である（例えば約３．１〜３．３ｍＰａ・ｓ、例えば約３．００、３．０５、３．１０、３．１５、３．２０、３．２５、３．３０、３．３５又は約３．４０ｍＰａ・ｓ）。一般に、粘度は蛋白質濃度の増加と共に増加する（詳細については、Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：１３９０参照）。このような増加は殆どの場合、イオン性添加剤（例えばＮａＣｌやＭｇＣｌ２）を添加することにより抑制されるが、このような添加剤を添加すると、溶液の濁度も上昇する可能性がある。濁度上昇は不溶性蛋白質凝集物、沈殿又は蛋白質粒子の形成（例えば凝集）と関係していることが多い。従って、本発明の液体医薬製剤はＮａＣｌを添加する必要なしに、皮下投与に適した粘度で高い抗体濃度（例えば少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ）を実現する。
【００６５】
１態様において、本発明の製剤は液体製剤が有意乳白、凝集又は沈殿を示さないような高濃度の蛋白質を含有する。
【００６６】
別の態様において、本発明の製剤は（例えば目視アナログスケール（ＶＡＳ）スコアにより判定した場合に）有意疼痛感覚なしに例えば皮下投与に適するような高濃度の蛋白質を含有する。
【００６７】
本発明の製剤は例えば約５０ｍｇ／ｍＬ又は約１００ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度のヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントを含む高濃度蛋白質を含有する。従って、下記実施例１に記載するように、本発明の１側面において、液体医薬製剤は約５０ｍｇ／ｍＬの濃度のヒト抗ＴＮＦα抗体を含有する。下記実施例２〜６に記載するように、本発明の別の側面において、液体医薬製剤は約１００ｍｇ／ｍＬの濃度のヒト抗ＴＮＦα抗体を含有する。本発明の更に別の側面において、液体医薬製剤は約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のヒト抗ＴＮＦα抗体を含有する。本発明の好ましい態様は高濃度蛋白質を含有する製剤であるが、本発明の製剤が約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ又は約４０ｍｇ／ｍＬ〜１２５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度となり得ることも考えられる。上記濃度の中間の濃度及び範囲（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９又は２００ｍｇ／ｍＬ）も本発明に含むものとする。
【００６８】
別の側面において、本発明は例えば約１００ｍｇ／ｍＬを上回る濃度の治療用抗体（例えばアダリムマブ）を製剤化するために十分な量のポリオール、界面活性剤及び緩衝液系を含有する液体医薬組成物を提供する。１態様において、液体医薬組成物はＮａＣｌを含有しない。
【００６９】
但し、当然のことながら、本発明の好ましい製剤はＮａＣｌを含有しないが、少量（例えば約０．０１ｍＭ〜約３００ｍＭ）のＮａＣｌが製剤中に存在していてもよい。更に、上記数値の中間の任意量のＮａＣｌも含むものとする。
【００７０】
１側面において、本発明はヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメント（例えばアダリムマブ）と、ＮａＣｌの不在下で治療用抗体を製剤化するために十分な量のポリオールを含有する液体医薬組成物を提供する。
【００７１】
本発明は更に、ヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する液体製剤であって、ｐＨが約５．０〜６．４であり、ＮａＣｌを添加せずに標準２４時間撹拌ストレスアッセイ後の濁度が約６０ＮＴＵ未満（例えば約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７．３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２又は６３ＮＴＵ）である製剤を提供する。別の側面において、本発明はヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する液体製剤であって、ｐＨが約５．０〜６．４であり、ＮａＣｌを添加せずに標準４８時間撹拌ストレスアッセイ後の濁度が約１００ＮＴＵ未満（例えば約３５、３６、３７．３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ＮＴＵ）である製剤を提供する。更に別の側面において、本発明はヒト抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する液体製剤であって、ｐＨが約５．０〜６．４であり、ＮａＣｌを添加せずに５℃、２５℃又は４０℃で３カ月間保存の濁度が約４０ＮＴＵ未満（例えば約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７．３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０ＮＴＵ）である製剤を提供する。
【００７２】
本発明の製剤の１つの特徴は２０ｍｇ／ｍＬを上回る濃度のポリオール（例えば糖アルコール）を含有する点にある。１態様において、ポリオールはソルビトール又はマンニトールである。なお、蛋白質溶液にソルビトール又はマンニトールを添加しても必ずしも蛋白質安定性が増すわけではない。例えば、熱又は界面ストレス条件下で評価した場合にソルビトールは夫々Ｔｗｅｅｎ  ２０とヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに比較してブタ成長ホルモンの沈殿に対する効果がなかった（Ｃｈａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１０（７）：９５４−６２）。
【００７３】
１態様において、本発明の製剤で使用するのに適切なポリオールは糖アルコール（例えばマンニトール又はソルビトール）である。ポリオールを含有する本発明の液体製剤は一般に約２０ｍｇを上回るポリオールを含有する。１態様において、製剤は約３０ｍｇ／ｍＬを上回るポリオールを含有する。別の態様において、製剤は約４０ｍｇ／ｍＬを上回るポリオールを含有する。別の態様において、製剤は約４０〜４５ｍｇ／ｍＬ、例えば約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５ｍｇ／ｍＬのポリオールを含有する。更に、上記数値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として使用する数値範囲も含むものとする。
【００７４】
本発明の所定態様では、ｐＨ緩衝溶液中に抗体を含有する液体製剤を製造する。本発明の緩衝液はｐＨ約４〜約８、好ましくは約４．５〜約７．０、より好ましくは約４．５〜約６．０、更に好ましくは約４．８〜約５．５であり、最も好ましくはｐＨ約５．０〜約６．４である。１態様において、本発明の製剤のｐＨは約５．２である。別の態様において、本発明の製剤のｐＨは約６．０である。上記ｐＨ値の中間の範囲（例えば４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４）も本発明に含むものとする。上記数値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として使用する数値範囲（例えば５．２〜５．８）も含むものとする。ｐＨをこの範囲内に制御する緩衝液の例としては、リン酸塩、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えばコハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。
【００７５】
本発明の特定態様において、製剤はｐＨを約５．０〜約６．４の範囲に維持するためにクエン酸塩及び／又はリン酸塩を含む緩衝液系を含有する。１態様において、製剤のｐＨは約５．２である。別の態様において、製剤のｐＨは約６．０である。
【００７６】
別の好ましい態様において、緩衝液系はクエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／又はリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。別の好ましい態様において、緩衝液系は約１．１５〜１．４５（例えば約１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０又は１．４５）ｍｇ／ｍｌのクエン酸と、約０．２〜０．４（例えば約０．２、０．２５、０．３、０．３５又は０．４）ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム脱水和物と、約１．３５〜１．７５（例えば１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０又は１．７５）ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム脱水和物と、約０．７５〜０．９５（例えば約０．７５、０．８０、０．８５、０．９又は０．９５）ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム脱水和物を含む。
【００７７】
上記濃度の中間の数値及び範囲も本発明に含むものとする。更に、上記数値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として使用する数値範囲（例えば１．２０〜１．４０ｍｇ／ｍＬ）も含むものとする。
【００７８】
他の態様において、緩衝液系は１．３〜１．３１ｍｇ／ｍＬ（例えば約１．３０５ｍｇ／ｍＬ）のクエン酸を含む。別の態様において、緩衝液系は約０．２７〜０．３３ｍｇ／ｍＬ（例えば約０．３０５ｍｇ／ｍＬ）のクエン酸ナトリウム脱水和物を含む。１態様において、緩衝液系は約１．５〜１．５６ｍｇ／ｍＬ（例えば約１．５３ｍｇ／ｍＬ）のリン酸二ナトリウム脱水和物を含む。別の態様において、緩衝液系は約０．８３〜０．８９ｍｇ／ｍＬ（例えば約０．８６ｍｇ／ｍＬ）のリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。
【００７９】
デタージェントないし界面活性剤も本発明の抗体製剤に添加することができる。典型的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０、８０等）やポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の添加量は製剤化抗体の凝集を抑え、及び／又は製剤中の粒状物の形成を最小限にし、及び／又は吸着を減らすように選択する。本発明の好ましい１態様において、製剤はポリソルベートである界面活性剤を含有する。本発明の別の好ましい態様において、製剤は界面活性剤としてポリソルベート８０を含有する。好ましい１態様において、製剤は約０．１〜約２．０ｍｇ／ｍＬ（例えば約１ｍｇ／ｍＬ）のポリソルベート８０を含有する。
【００８０】
上記濃度の中間の数値及び範囲（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９）も本発明に含むものとする。更に、上記数値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として使用する数値範囲（例えば０．３〜１．１ｍｇ／ｍＬ）も含むものとする。
【００８１】
１態様において、本発明の製剤は少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬの濃度のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分と、界面活性剤（例えばポリソルベート８０）と、ポリオール（例えば２０ｍｇ／ｍＬを上回るソルビトール又はマンニトール）と、緩衝液系（例えばクエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物及び／又はリン酸二水素ナトリウム二水和物）から本質的に構成され、ＮａＣｌを含有しない。
【００８２】
１態様において、製剤は上記成分を含有し（即ち少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体と、緩衝液系と、ポリオールと、界面活性剤を含有し、ＮａＣｌを含有しない）、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及びベンゼトニウムＣｌ等の防腐剤を実質的に含有しない。別の態様では、防腐剤を製剤に加えることができる。製剤の望ましい特性を著しく悪化させない限り、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されているもの等の１種以上の他の医薬的に許容可能な担体、添加剤又は安定剤も製剤に加えることができる。許容可能な担体、添加剤又は安定剤は使用する用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、他の緩衝剤；補助溶媒；アスコルビン酸やメチオニン等の酸化防止剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；金属錯体（例えばＺｎ−蛋白質錯体）；ポリエステル等の生体適合性ポリマー；及び／又はナトリウム等の塩形成対イオンを含む。
【００８３】
本願の製剤は治療する特定適応症の必要に応じて１種以上の他の治療剤、好ましくは製剤の抗体に悪影響を与えない相補活性をもつ治療剤と併用してもよい。このような治療剤は所期目的に有効な量で併存すると適切である。本発明の製剤と併用することができる他の治療剤は各々本願に援用する米国特許第６，０９０，３８２号及び６，２５８，５６２号に詳細に記載されている。
【００８４】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。これは製剤の製造前又は製造後に滅菌濾過膜で濾過することにより容易に実施される。
【００８５】
上記のように、本発明の液体製剤は有利な安定性と保存性をもつ。液体製剤の安定性は保存形態に依存せず、限定されないが、凍結製剤、凍結乾燥製剤、噴霧乾燥製剤、又は活性成分を懸濁した製剤が挙げられる。安定性は選択された温度で選択された期間にわたって測定することができる。本発明の１側面において、液体製剤中の蛋白質は液体形態で少なくとも約３カ月間、少なくとも約４カ月間、少なくとも約５カ月間、少なくとも約６カ月間、少なくとも約１２カ月間、少なくとも約１８カ月間安定である。上記期間の中間の数値及び範囲（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は約２４カ月間）も本発明に含むものとする。更に、上記数値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として使用する数値範囲も含むものとする。好ましくは、製剤は室温（約３０℃）もしくは４０℃で少なくとも約１カ月間安定であり、及び／又は約２〜８℃で少なくとも約１年間安定であり、又はより好ましくは約２〜８℃で少なくとも約２年間安定である。更に、製剤は製剤の（例えば−８０℃まで）凍結及び解凍（以下、「凍結／解凍サイクル」と言う）後に安定であることが好ましい。
【００８６】
液体製剤中の蛋白質の安定性は製剤中の蛋白質のモノマー、凝集物もしくはフラグメント又はその組合せの百分率として表すこともできる。蛋白質は色及び／もしくは透明度の目視試験後、又はＵＶ光散乱法もしくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したときに凝集、沈殿及び／又は変性の徴候を実質的に示さない場合に、製剤中で「その物理的安定性を維持する」。本発明の１側面において、安定した液体製剤とは製剤中に凝集物として存在する蛋白質が約１０％未満、好ましくは約５％未満の製剤である。
【００８７】
１態様において、液体製剤の物理的安定性は撹拌ストレスアッセイ（例えば２４時間又は４８時間撹拌ストレスアッセイ）後に製剤の濁度を測定することにより測定される。例えば、磁気スターラー（例えばマルチポイントＨＰ，５５０ｒｐｍ）を取り付けたビーカーに適切な容量の液体製剤を入れ、適切な任意時点（例えばＴ０〜Ｔ４８（時間））でアリコートを分取し、アリコートに応じて適切なアッセイを実施することにより、撹拌ストレスアッセイを実施することができる。同一条件下で非撹拌下の製剤のサンプルを対照とする。
【００８８】
Ｈａｃｈ（ドイツ）製実験室濁度測定システムを使用して濁度測定を実施することができ、ネフェロメトリー単位（ＮＴＵ）として報告する。
【００８９】
本発明の液体製剤は有利な耐容性も有する。耐容性は疼痛視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を使用して注射部位疼痛を知覚した対象の評価に基づいて評価される。
【００９０】
（ＶＡＳ）は例えば無痛から極限量の疼痛までの一連の値にわたって疼痛を測定する計器である。操作上、ＶＡＳは長さ約１００ｍｍの水平線であり、数値及び／又は語句表記（例えば０もしくは１０、又は「無痛」もしくは「耐え難い痛み」）を表示され、場合により極限間の他の語句又は数値表記（例えば、軽度、中度及び重度；又は１〜９）を加えてもよい（例えばＬｅｅ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｃａｄ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ  ７：５５０参照）。
【００９１】
測定することができる耐容性の他の指標としては、例えばドレイズスケール（出血、点状出血、紅斑、浮腫、痒み）と皮下出血が挙げられる。
【００９２】
ＩＩＩ．本発明の製剤で使用される抗体
本発明の製剤で使用することができる抗体はヒトＴＮＦα（ないしｈＴＮＦα）を含む抗原ＴＮＦαに対する抗体である。
【００９３】
１態様において、本発明は高い親和性と低い解離速度でヒトＴＮＦαと結合すると共に、高い中和能をもつ単離ヒト抗体又はその抗原結合部分に関する。好ましくは、本発明で使用されるヒト抗体は組換え中和ヒト抗ｈＴＮＦα抗体である。本発明の最も好ましい組換え中和抗体を本願ではＤ２Ｅ７と言い、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）ないしアダリムマブとも言う（Ｄ２Ｅ７  ＶＬ領域のアミノ酸配列を配列番号１に示し、Ｄ２Ｅ７  ＶＨ領域のアミノ酸配列を配列番号２に示す）。Ｄ２Ｅ７（アダリムマブ／ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））の特性は各々本願に援用するＳａｌｆｅｌｄらの米国特許第６，０９０，３８２号、６，２５８，５６２号及び６，５０９，０１５号に記載されている。
【００９４】
１態様において、ヒトＴＮＦα又はその抗原結合部分は、いずれも表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、１×１０−８Ｍ以下のＫｄと１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離し、標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０でヒトＴＮＦα細胞傷害作用を中和する。より好ましくは、単離ヒト抗体又はその抗原結合部分は５×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆ、更に好ましくは１×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆでヒトＴＮＦαから解離する。より好ましくは、単離ヒト抗体又はその抗原結合部分は標準インビトロＬ９２９アッセイにおいて１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０、更に好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０、更に好ましくは１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０でヒトＴＮＦα細胞傷害作用を中和する。好ましい１態様において、抗体は単離ヒト組換え抗体又はその抗原結合部分である。
【００９５】
抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３ドメインが抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において重要な役割を果たすことは周知である。従って、別の側面において、本発明はｈＴＮＦαとの会合の解離速度が遅く、Ｄ２Ｅ７と構造的に一致又は関連する軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３ドメインをもつヒト抗体を投与することによるクローン病の治療に関する。Ｋｏｆｆを実質的に変化させずにＤ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ３の９位をＡｌａ又はＴｈｒで占めることができる。従って、Ｄ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ３のコンセンサスモチーフはアミノ酸配列Ｑ−Ｒ−Ｙ−Ｎ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｙ−（Ｔ／Ａ）（配列番号３）を含む。更に、Ｋｏｆｆを実質的に変化させずにＤ２Ｅ７  ＶＨ  ＣＤＲ３の１２位をＴｙｒ又はＡｓｎで占めることができる。従って、Ｄ２Ｅ７  ＶＨ  ＣＤＲ３のコンセンサスモチーフはアミノ酸配列Ｖ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−（Ｙ／Ｎ）（配列番号４）を含む。更に、米国特許第６，０９０，３８２号の実施例２に実証されているように、Ｋｏｆｆを実質的に変化させずにＤ２Ｅ７重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３ドメイン（ＶＬ  ＣＤＲ３内の１、４、５、７もしくは８位又はＶＨ  ＣＤＲ３内の２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位）を１個のアラニン残基で置換することができる。更に、当業者に自明の通り、Ｄ２Ｅ７  ＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲ３ドメインをアラニンで置換できるならば、抗体の低い解離速度定数を維持しながらＣＤＲ３ドメイン内の他のアミノ酸の置換、特に保存アミノ酸による置換も可能であると思われる。Ｄ２Ｅ７  ＶＬ及び／又はＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン内に１〜５カ所以下の保存アミノ酸置換を導入することが好ましい。Ｄ２Ｅ７  ＶＬ及び／又はＶＨ  ＣＤＲ３ドメイン内に１〜３カ所以下の保存アミノ酸置換を導入することがより好ましい。更に、ｈＴＮＦαとの結合に必須のアミノ酸位置には保存アミノ酸置換を導入すべきでない。Ｄ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ３の２位及び５位と、Ｄ２Ｅ７  ＶＨ  ＣＤＲ３の１位及び７位はｈＴＮＦαとの相互作用に必須であると思われるため、これらの位置には保存アミノ酸置換を導入しない（但し、上記のように、Ｄ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ３の５位のアラニン置換は許容可能である）（米国特許第６，０９０，３８２号参照）。
【００９６】
従って、別の態様において、抗体又はその抗原結合部分は以下の特徴を含むことが好ましい：
ａ）表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離する；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列あるいは１、４、５、７もしくは８位の１カ所のアラニン置換又は１、３、４、６、７、８及び／もしくは９位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号３から変異したアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをもつ；
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列あるいは２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位の１カ所のアラニン置換又は２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／もしくは１２位の１〜５カ所の保存アミノ酸置換により配列番号４から変異したアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインをもつ。
【００９７】
より好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は５×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆでヒトＴＮＦαから解離する。更により好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は１×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆでヒトＴＮＦαから解離する。
【００９８】
更に別の態様において、抗体又はその抗原結合部分は好ましくは配列番号３のアミノ酸配列又は１、４、５、７もしくは８位の１カ所のアラニン置換により配列番号３から変異したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインをもつ軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、配列番号４のアミノ酸配列又は２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位の１カ所のアラニン置換により配列番号４から変異したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインをもつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。好ましくは、ＬＣＶＲは更に配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（即ちＤ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ２）をもち、ＨＣＶＲは更に配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（即ちＤ２Ｅ７  ＶＨ  ＣＤＲ２）をもつ。更により好ましくは、ＬＣＶＲは更に配列番号７のアミノ酸を含むＣＤＲ１ドメイン（即ちＤ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ１）をもち、ＨＣＶＲは配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（即ちＤ２Ｅ７  ＶＨ  ＣＤＲ１）をもつ。ＶＬのフレームワーク領域は好ましくはＶκＩヒト生殖系列ファミリーに由来し、より好ましくはＡ２０ヒト生殖系列Ｖｋ遺伝子に由来し、最も好ましくは米国特許第６，０９０，３８２号の図１Ａ及び１Ｂに示されるＤ２Ｅ７  ＶＬフレームワーク配列に由来する。ＶＨのフレームワーク領域は好ましくはＶＨ３ヒト生殖系列ファミリーに由来し、より好ましくはＤＰ−３１ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子に由来し、最も好ましくは米国特許第６，０９０，３８２号の図２Ａ及び２Ｂに示されるＤ２Ｅ７  ＶＨフレームワーク配列に由来する。
【００９９】
従って、別の態様において、抗体又はその抗原結合部分は好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）（即ちＤ２Ｅ７  ＶＬ）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）（即ちＤ２Ｅ７  ＶＨ）を含む。所定態様において、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域等の重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。更に、抗体はκ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域である軽鎖定常領域を含むことができる。好ましくは、抗体はκ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分は例えばＦａｂフラグメント又は１本鎖Ｆｖフラグメントとすることができる。
【０１００】
更に他の態様において、本発明はＤ２Ｅ７関連ＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを含む単離ヒト抗体又はその抗原結合部分の使用を包含する。例えば、配列番号３、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインをもつ軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、配列番号４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインをもつ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体又はその抗原結合部分が挙げられる。
【０１０１】
本発明の方法及び組成物で使用される抗体又は抗体部分は宿主細胞で免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子を組換え発現させることにより作製することができる。抗体を組換え発現させるためには、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを組込んだ１個以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、軽鎖及び重鎖を宿主細胞で発現させ、好ましくは宿主細胞を培養する培地に分泌させ、培地から抗体を回収することができる。抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を獲得し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組込み、ベクターを宿主細胞に導入するためには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及びＢｏｓｓらの米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法等の標準組換えＤＮＡ法を使用する。
【０１０２】
アダリムマブ（Ｄ２Ｅ７）又はアダリムマブ（Ｄ２Ｅ７）関連抗体を発現させるためには、先ず軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得る。これらのＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して生殖系列軽鎖及び重鎖可変配列の増幅と修飾により得ることができる。ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は当分野で公知である（例えば「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース参照；更に各々その開示内容を特に本願に援用するＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＭ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；及びＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）“Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  Ｖ７８  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６も参照）。Ｄ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得るためには、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子のＶＨ３ファミリーのメンバーを標準ＰＣＲにより増幅する。ＤＰ−３１  ＶＨ生殖系列配列を増幅するのが最も好ましい。Ｄ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得るためには、ヒト生殖系列ＶＬ遺伝子のＶκＩファミリーのメンバーを標準ＰＣＲにより増幅する。Ａ２０  ＶＬ生殖系列配列を増幅するのが最も好ましい。ＤＰ−３１生殖系列ＶＨ及びＡ２０生殖系列ＶＬ配列の増幅用に適切なＰＣＲプライマーは標準方法を使用して上記引用文献に開示されているヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。
【０１０３】
生殖系列ＶＨ及びＶＬフラグメントが得られたら、本願に開示するＤ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連アミノ酸配列をコードするように、これらの配列を突然変異させることができる。生殖系列ＶＨ及びＶＬ  ＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を先ずＤ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と比較し、Ｄ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連配列のうちで生殖系列と異なるアミノ酸残基を同定する。次に、どのヌクレオチド変異を導入すべきかを決定するために遺伝コードを使用し、突然変異後の生殖系列配列がＤ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連アミノ酸配列をコードするように、生殖系列ＤＮＡ配列の適切なヌクレオチドを突然変異させる。（ＰＣＲ産物が突然変異を含むように、突然変異させたヌクレオチドをＰＣＲプライマーに導入する）ＰＣＲ突然変異誘発法や部位特異的突然変異誘発法等の標準方法により生殖系列配列の突然変異誘発を実施する。
【０１０４】
更に、当然のことながら、ＰＣＲ増幅により得られた「生殖系列」配列が真の生殖系列構成に由来するフレームワーク領域でアミノ酸変異（即ち、例えば体細胞突然変異の結果として、真の生殖系列配列に対する増幅配列の変異）をコードする場合には、これらのアミノ酸変異を真の生殖系列配列に復帰変異（即ちフレームワーク残基を生殖系列構成に「復帰突然変異」）させることが望ましいと思われる。
【０１０５】
（例えば上記のように生殖系列ＶＨ及びＶＬ遺伝子の増幅と突然変異誘発により）Ｄ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、これらのＤＮＡフラグメントを標準組換えＤＮＡ技術により更に操作することができる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントを、抗体定常領域又はフレキシブルリンカー等の別の蛋白質をコードする別のＤＮＡフラグメントと機能的に連結する。この文脈で使用する「機能的に連結」なる用語は、２つのＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームに維持されるように２つのＤＮＡフラグメントを結合することを意味する。
【０１０６】
ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅法により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域とすることができるが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域が最も好ましい。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することができる。
【０１０７】
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することにより、ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅法により得ることができる。軽鎖定常領域はκ又はλ定常領域とすることができるが、κ定常領域が最も好ましい。
【０１０８】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するためには、ＶＬ領域とＶＨ領域をフレキシブルリンカーでつないでＶＨ配列とＶＬ配列を連続する１本鎖蛋白質として発現させることができるように、ＶＨとＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、フレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントと機能的に連結する（例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４参照）。
【０１０９】
本発明で使用される抗体又は抗体部分を発現させるためには、遺伝子を転写及び翻訳制御配列と機能的に連結するように、上記のように得られた部分的又は全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入する。この文脈で「機能的に連結」なる用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するというその所期機能を発揮するように、抗体遺伝子をベクターにライゲーションすることを意味する。発現ベクターと発現制御配列は使用する発現宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することもできるが、より一般には、両方の遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。標準方法（例えば抗体遺伝子フラグメントとベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）により抗体遺伝子を発現ベクターに挿入する。Ｄ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連軽鎖又は重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターに予め定常領域配列を組込んでもよい。例えば、Ｄ２Ｅ７又はＤ２Ｅ７関連ＶＨ及びＶＬ配列を全長抗体遺伝子に変換する１つのアプローチは、ＶＨセグメントをベクター内のＣＨセグメントと機能的に連結し、ＶＬセグメントをベクター内のＣＬセグメントと機能的に連結するように、夫々重鎖定常領域と軽鎖定常領域を予めコードする発現ベクターに挿入する方法である。上記の追加又は代替として、組換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を助長するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドを抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結するように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち非免疫グロブリン蛋白質に由来するシグナルペプチド）とすることができる。
【０１１０】
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列をもつ。「調節配列」なる用語はプロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。このような調節配列は例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。当業者に自明の通り、調節配列の選択を含めて発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の選択、所望される蛋白質発現レベル等の因子に依存し得る。哺乳動物宿主細胞発現に好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルの蛋白質発現を誘導するウイルスエレメントが挙げられ、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。ウイルス調節エレメントとその配列の詳細な説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらの米国特許第４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらの米国特許第４，９６８，６１５号参照。
【０１１１】
抗体鎖遺伝子と調節配列に加え、本発明で使用される組換え発現ベクターには、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子等の他の配列を組込むことができる。選択マーカー遺伝子はベクターを導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えばいずれもＡｘｅｌらの米国特許第４，３９９，２１６号、４，６３４，６６５号及び５，１７９，０１７号参照）。例えば、一般に選択マーカー遺伝子はベクターを導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサート等の薬剤に対耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ欠損宿主細胞におけるメトトレキサート選択／増幅用）とｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０１１２】
軽鎖と重鎖を発現させるために、重鎖と軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」なる用語の各種語形は外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために一般に使用されている多様な技術（例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等）を包含するものとする。理論的には本発明の抗体を原核又は真核宿主細胞のどちらでも発現させることが可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞は原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫的に活性な抗体を会合・分泌させるので、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞で抗体を発現させるのが最も好ましい。抗体遺伝子の原核細胞発現は活性抗体の高収率生産には無効であることが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【０１１３】
本発明の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されているｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞と、例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ  （１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーの併用を含む）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞における抗体の発現、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間にわたって宿主細胞を培養することにより抗体を産生させる。標準蛋白質精製法を使用して培地から抗体を回収することができる。
【０１１４】
ＦａｂフラグメントやｓｃＦｖ分子等の無傷の抗体の部分を作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形も本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（両方ではない）をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。ｈＴＮＦαとの結合に不要な軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような低分子ＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の抗体に含まれる。更に、標準化学架橋法により本発明の抗体を第２の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と一方の軽鎖が本発明の抗体であり、他方の重鎖と軽鎖がｈＴＮＦα以外の抗原に特異的である２価抗体を作製することもできる。
【０１１５】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現に好ましいシステムでは、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをリン酸カルシウムトランスフェクション法によりｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、遺伝子の高レベル転写を誘導するように抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を各々ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと機能的に連結する。メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子も組換え発現ベクターに組込む。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、無傷の抗体を培地から回収する。標準分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。
【０１１６】
上記に鑑み、本発明で使用される抗体及び抗体部分の組換え発現に使用することができる核酸、ベクター及び宿主細胞としては、ヒトＴＮＦα抗体アダリムマブ（Ｄ２Ｅ７）を含む核酸と、前記核酸を組込んだベクターが挙げられる。Ｄ２Ｅ７軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を配列番号３６に示す。ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインはヌクレオチド７０〜１０２を含み、ＣＤＲ２ドメインはヌクレオチド１４８〜１６８を含み、ＣＤＲ３ドメインはヌクレオチド２６５〜２９１を含む。Ｄ２Ｅ７重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を配列番号３７に示す。ＨＣＶＲのＣＤＲ１ドメインはヌクレオチド９１〜１０５を含み、ＣＤＲ２ドメインはヌクレオチド１４８〜１９８を含み、ＣＤＲ３ドメインはヌクレオチド２９５〜３３０を含む。当業者に自明の通り、Ｄ２Ｅ７関連抗体又はその部分（例えばＣＤＲ３ドメイン等のＣＤＲドメイン）をコードするヌクレオチド配列は、遺伝コード及び標準分子生物学技術を使用してＤ２Ｅ７  ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲをコードするヌクレオチド配列から誘導することができる。
【０１１７】
１態様において、液体医薬製剤は抗体アダリムマブに対して生物学的に等価又は生物学的に同等のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する。１態様において、生物学的に同等の抗体とは参照抗体（例えばアダリムマブ）と比較した場合に臨床的に有意な差を示さない抗体である。生物学的に同等の抗体は参照抗体（例えばアダリムマブ）と等価の安全性、純度及び力価をもつ。
【０１１８】
ＩＶ．本発明の製剤の投与
本発明の製剤の１つの利点は高濃度のヒト抗ＴＮＦα抗体又は抗原結合部分（例えばアダリムマブ）を対象に皮下送達するために使用できるという点である。従って、１態様では、本発明の製剤を対象に皮下送達する。１態様において、対象は製剤を自己投与する。
【０１１９】
１態様では、有効量の製剤を投与する。製剤の「有効量」なる用語はＴＮＦα活性を阻害するため、例えば有害なＴＮＦα活性に関連する状態の各種形態的及び身体的症状を予防するために必要又は十分な量である。別の態様において、製剤の有効量は所望結果を達成するために必要な量である。
【０１２０】
製剤の有効量の１例は有害なＴＮＦα活性を阻害するため、又はＴＮＦα活性が有害である疾患を治療するために十分な量である。本願で使用する「ＴＮＦα活性が有害である疾患」なる用語は疾患に罹患している対象におけるＴＮＦαの存在が前記疾患の病態生理に関与しているか又は前記疾患の増悪に寄与する因子であることが分かっているか又はその疑いのある疾病及び他の疾患を包含するものとする。従って、ＴＮＦα活性が有害である疾患とは、ＴＮＦα活性の阻害が疾患の症状及び／又は進行を緩和すると予想される疾患である。このような疾患は例えば、疾患に罹患している対象の体液中のＴＮＦα濃度の上昇（例えば対象の血清、血漿、滑液等におけるＴＮＦα濃度上昇）により確認することができ、このような上昇は例えば抗ＴＮＦα抗体を使用して検出することができる。
【０１２１】
下記実施例に記載するように、本発明の製剤の１つの利点は製剤の粘度を増加せずに高濃度の抗体を含有する製剤を製造できる点である。従って、同じく以下に記載するように、新規製剤は従来の市販製剤に比較して少ない容量で多量（例えば有効量）の抗体の投与を可能にすることにより、疼痛を緩和する。
【０１２２】
１態様において、抗体の有効量は厳密に体重に基づく投与スキーム（例えばｍｇ／ｋｇ）に従って決定することもできるし、体重から独立した総用量（固定用量とも言う）でもよい。１例において、製剤の有効量は総用量約８０ｍｇの抗体を含有する製剤０．８ｍＬ（即ち本発明の１００ｍｇ／ｍＬ抗体製剤０．８ｍＬ）である。別の例において、製剤の有効量は総用量約４０ｍｇの抗体を含有する本発明の製剤０．４ｍＬ（即ち本発明の１００ｍｇ／ｍＬ抗体製剤０．４ｍＬ）である。更に別の例において、製剤の有効量は総用量約１６０ｍｇの抗体を含有する製剤０．８ｍＬ×２（即ち本発明の１００ｍｇ／ｍＬ抗体製剤０．８ｍＬずつを含む２単位）である。別の例において、製剤の有効量は総用量約２０ｍｇの抗体を含有する本発明の製剤０．２ｍＬ（即ち本発明の１００ｍｇ／ｍＬ抗体製剤０．２ｍＬ）である。あるいは、体重に基づく固定用量レジメンに従って有効量を決定してもよい（例えば本願に援用するＷＯ２００８／１５４５４３参照）。
【０１２３】
本発明は、１態様ではＴＮＦα活性が有害である疾患に罹患している対象におけるＴＮＦα活性を阻害するために使用される貯蔵寿命の長い安定した高濃度製剤を提供し、対象におけるＴＮＦα活性を阻害するように本発明の製剤を対象に投与する。好ましくは、ＴＮＦαはヒトＴＮＦαであり、対象はヒト対象である。あるいは、対象は本発明の抗体と交差反応するＴＮＦαを発現する哺乳動物でもよい。更に、対象は（例えばｈＴＮＦαの投与又はｈＴＮＦαトランスジーンの発現により）ｈＴＮＦαを導入された哺乳動物でもよい。
【０１２４】
本発明の製剤は（以下に詳述する）治療目的でヒト対象に投与することができる。本発明の１態様において、液体医薬製剤は容易に投与可能であり、例えば患者により自己投与される製剤が挙げられる。好ましい１態様において、本発明の製剤は皮下注射により好ましくは単回投与される。更に、本発明の製剤は獣医学的目的のため又はヒト疾患の動物モデルとして抗体と交差反応するＴＮＦαを発現する非ヒト哺乳動物（例えば霊長類、ブタ又はマウス）に投与することもできる。後者に関して、このような動物モデルは本発明の抗体の治療効力の評価（例えば投与用量及び時間コースの試験）に有用であると思われる。
【０１２５】
１態様では、プレフィルドシリンジ、自己注射ペン又は無針投与装置により本発明の液体医薬製剤を対象に投与することができる。従って、本発明は本発明の液体医薬製剤を収容する自己注射ペン、プレフィルドシリンジ又は無針投与装置にも関する。１態様において、本発明は１００ｍｇ／ｍＬのヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する製剤の１用量を収容する送達装置に関し、例えば自己注射ペン又はプレフィルドシリンジは約１９ｍｇ、２０、ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ、５０ｍｇ、５１ｍｇ、５２ｍｇ、５３ｍｇ、５４ｍｇ、５５ｍｇ、５６ｍｇ、５７ｍｇ、５８ｍｇ、５９ｍｇ、６０ｍｇ、６１ｍｇ、６２ｍｇ、６３ｍｇ、６４ｍｇ、６５ｍｇ、６６ｍｇ、６７ｍｇ、６８ｍｇ、６９ｍｇ、７０ｍｇ、７１ｍｇ、７２ｍｇ、７３ｍｇ、７４ｍｇ、７５ｍｇ、７６ｍｇ、７７ｍｇ、７８ｍｇ、７９ｍｇ、８０ｍｇ、８１ｍｇ、８２ｍｇ、８３ｍｇ、８４ｍｇ、８５ｍｇ、８６ｍｇ、８７ｍｇ、８８ｍｇ、８９ｍｇ、９０ｍｇ、９１ｍｇ、９２ｍｇ、９３ｍｇ、９４ｍｇ、９５ｍｇ、９６ｍｇ、９７ｍｇ、９８ｍｇ、９９ｍｇ、１００ｍｇ、１０１ｍｇ、１０２ｍｇ、１０３ｍｇ、１０４ｍｇ、１０５ｍｇ等の製剤の１用量を収容する。
【０１２６】
好ましくは、本発明の製剤はＴＮＦα活性が有害である疾患を治療するために使用される。本願で使用する「ＴＮＦα活性が有害である疾患」なる用語は疾患に罹患している対象におけるＴＮＦαの存在が前記疾患の病態生理に関与しているか又は前記疾患の増悪に寄与する因子であることが分かっているか又はその疑いのある疾病及び他の疾患を包含するものとする。従って、ＴＮＦα活性が有害である疾患とは、ＴＮＦα活性の阻害が疾患の症状及び／又は進行を緩和すると予想される疾患である。このような疾患は例えば、疾患に罹患している対象の体液中のＴＮＦα濃度の上昇（例えば対象の血清、血漿、滑液等におけるＴＮＦα濃度上昇）により確認することができ、このような上昇は例えば上記のように抗ＴＮＦα抗体を使用して検出することができる。
【０１２７】
ＴＮＦα活性が有害である疾患には多数の例が存在する。ＴＮＦα活性が有害である疾患の例はいずれもその開示内容全体を本願に援用する米国特許第６，０１５，５５７号、６，１７７，０７７号、６，３７９，６６６号、６，４１９，９３４号、６，４１９，９４４号、６，４２３，３２１号、６，４２８，７８７号、及び６，５３７，５４９号、並びにＰＣＴ公開第ＷＯ００／５００７９号及びＷＯ０１／４９３２１号にも記載されている。本発明の製剤はいずれもその開示内容全体を本願に援用する米国特許第６，０９０，３８２号、６，２５８，５６２号及び米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１２６３７２号に記載されているようなＴＮＦα活性が有害である疾患を治療するために使用することもできる。
【０１２８】
以下、特定の代表的疾患の治療における本発明の製剤の使用について詳述する。
【０１２９】
Ａ．敗血症
腫瘍壊死因子は血圧低下、心筋抑制、血管漏出症候群、臓器壊死、毒性二次メディエーターの放出の刺激及び血液凝固カスケードの活性化を含む生物学的効果により、敗血症の病態生理に関与することが知られている（例えばＴｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４５：４９１−５０３；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：７１４−７２１参照）。従って、本発明の製剤は敗血症性ショック、内毒素ショック、グラム陰性菌敗血症及び毒素性ショック症候群を含むその臨床背景のいずれかにおいて敗血症を治療するために使用することができる。
【０１３０】
更に、敗血症を治療するために、インターロイキン１阻害剤（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１６２２１号及びＷＯ９２／１７５８３に記載されているもの）、サイトカインであるインターロイキン６（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１１７９３号参照）又は血小板活性化因子のアンタゴニスト（例えば欧州特許出願公開第ＥＰ３７４５１０号参照）等の敗血症を更に緩和することができる１種以上の他の治療剤と本発明の製剤を併用投与することができる。
【０１３１】
更に、好ましい１態様では、治療時のＩＬ−６の血清又は血漿濃度が５００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは１０００ｐｇ／ｍｌを上回る敗血症患者のサブグループ内のヒト対象に本発明の製剤を投与する（ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／２０９７８号参照）。
【０１３２】
Ｂ．自己免疫疾患
腫瘍壊死因子は各種自己免疫疾患の病態生理に関与すると考えられている。例えば、ＴＮＦαは組織炎症を活発にし、関節リウマチにおける関節破壊をもたらすと考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出；Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．ａｎｄ  Ｄａｙｅｒ，Ｊ−Ｍ．（１９９５）Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．３８：１５１−１６０；Ｆａｖａ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４：２６１−２６６参照）。ＴＮＦαは膵島細胞の死滅を促進し、糖尿病におけるインスリン抵抗性に関与するとも考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８６０９号参照）。ＴＮＦαは多発性硬化症において希突起膠細胞に対する細胞傷害作用と炎症性プラークの誘導に関与するとも考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出参照）。本発明の製剤を使用して治療することができる自己免疫疾患には、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）（若年性関節リウマチとも言う）も含まれる（Ｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３９：１７０３；Ｍａｎｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．８：２１１参照）。
【０１３３】
本発明の製剤は自己免疫疾患、特に炎症を伴うものを治療するために使用することができ、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎（強直性脊椎炎とも言う）、変形性関節症及び通風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、若年性特発性関節炎（若年性関節リウマチとも言う）、並びにネフローゼ症候群が挙げられる。
【０１３４】
Ｃ．感染症
腫瘍壊死因子は各種感染症に認められる生物学的作用に関与すると考えられている。例えば、ＴＮＦαはマラリアにおいて脳炎症と毛細血管血栓及び梗塞に関与すると考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出参照）。ＴＮＦαは髄膜炎において脳炎症に関与し、血液脳関門の破壊を誘導し、敗血症性ショック症候群を誘発し、静脈梗塞を活性化するとも考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出参照）。ＴＮＦαは後天性免疫不全症候群（エイズ）において悪液質を誘導し、ウイルス増殖を刺激し、中枢神経系損傷に関与するとも考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出参照）。従って、本発明の抗体及び抗体部分は細菌性髄膜炎（例えば欧州特許出願公開第ＥＰ５８５７０５号参照）、脳マラリア、エイズ及びエイズ関連症候群（ＡＲＣ）（例えば欧州特許出願公開第ＥＰ２３０５７４号参照）、並びに移植に伴うサイトメガロウイルス感染（例えばＦｉｅｔｚｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：６７５−６８０参照）を含む感染症の治療に使用することができる。本発明の製剤は感染による発熱及び筋肉痛（例えばインフルエンザ）や、感染に伴う（例えばエイズ又はＡＲＣに伴う）悪液質を含めて感染症に伴う症状を緩和するために使用することもできる。
【０１３５】
Ｄ．移植
腫瘍壊死因子は同種移植片拒絶反応及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の主要なメディエータであり、腎移植の拒絶反応を抑制するためにＴ細胞受容体ＣＤ３複合体に対するラット抗体ＯＫＴ３を使用する場合に認められている有害反応に関与すると考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出；Ｅａｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５９：３００−３０５；Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｂ．（１９９４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：３６５−３７５参照）。従って、本発明の製剤は同種移植片及び異種移植片の拒絶反応を含む移植拒絶反応を抑制し、ＧＶＨＤを抑制するために使用することができる。抗体又は抗体部分は単独で使用してもよいが、同種移植片に対する免疫応答を抑制又はＧＶＨＤを抑制する１種以上の他の物質と併用することができる。例えば、１態様では、ＯＫＴ３により誘導される反応を抑制するために本発明の製剤をＯＫＴ３と併用する。別の態様では、細胞表面分子ＣＤ２５（インターロイキン２受容体α）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）及び／又はＣＤ８６（Ｂ７−２）等の免疫応答の調節に関与する他の標的に対する１種以上の抗体と本発明の製剤を併用する。更に別の態様では、シクロスポリンＡやＦＫ５０６等の１種以上の一般的な免疫抑制剤と本発明の製剤を併用する。
【０１３６】
Ｅ．悪性腫瘍
腫瘍壊死因子は悪性腫瘍において悪液質を誘導し、腫瘍増殖を刺激し、転移の可能性を増し、細胞傷害作用に関与すると考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出参照）。従って、本発明の製剤は腫瘍増殖もしくは転移を抑制し、及び／又は悪性腫瘍に伴う悪液質を緩和するために、悪性腫瘍の治療で使用することができる。
【０１３７】
Ｆ．肺疾患
腫瘍壊死因子は白血球−内皮細胞活性化の刺激、肺細胞に対する細胞傷害作用の誘発及び血管漏出症候群の誘導を含む成人呼吸窮迫症候群の病態生理に関係があると考えられている（例えばＴｒａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，前出参照）。従って、本発明の製剤は成人呼吸窮迫症候群（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０４０５４号参照）、ショック肺、慢性肺炎症疾患、肺サルコイドーシス、肺線維症及び珪肺症を含む各種肺疾患を治療するために使用することができる。
【０１３８】
Ｇ．腸疾患
腫瘍壊死因子は炎症性腸疾患の病態生理に関係があると考えられている（例えばＴｒａｃｙ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：４７０−４７４；Ｓｕｎ，Ｘ−Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１３２８−１３３１；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：３０１−３０５参照）。キメラマウス抗ｈＴＮＦα抗体がクローン病の治療用に臨床試験されている（ｖａｎ  Ｄｕｌｌｅｍｅｎ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０９：１２９−１３５）。本発明の製剤はクローン病と潰瘍性大腸炎の２種類の症候群を含む特発性炎症性腸疾患等の腸疾患を治療するために使用することもできる。
【０１３９】
Ｈ．心疾患
本発明の製剤は心筋虚血（例えば欧州特許出願公開第ＥＰ４５３８９８号参照）と心不全（心筋の弱化）（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２０１３９号参照）を含む各種心疾患を治療するために使用することもできる。
【０１４０】
Ｉ．脊椎関節症
ＴＮＦαは脊椎関節症等の炎症性疾患を含む多様な疾患の病態生理に関係があると考えられている（例えばＭｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２：１６２−１６９；Ｍｏｅｌｌｅｒらの米国特許第５，２３１，０２４号；Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａの欧州特許公開第２６０６１０Ｂ１号参照）。本発明の製剤により治療することができる脊椎関節症の１例としては乾癬性関節炎が挙げられる。腫瘍壊死因子は乾癬性関節炎の病態生理に関係があると考えられている（Ｐａｒｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．５７：６９１；Ｒｉｔｃｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５：１５４４）。
【０１４１】
Ｊ．皮膚及び爪疾患
１態様において、本発明の製剤は皮膚及び爪疾患を治療するために使用される。本願で使用する「ＴＮＦα活性が有害である皮膚及び爪疾患」なる用語は疾患に罹患している対象におけるＴＮＦαの存在が前記疾患の病態生理に関与しているか又は前記疾患の増悪に寄与する因子であることが分かっているか又はその疑いのある皮膚及び／又は爪疾患と他の疾患（例えば乾癬）を包含するものとする。本発明の製剤を使用して治療することができる皮膚疾患の１例は乾癬である。１態様において、本発明の製剤はプラーク乾癬を治療するために使用される。腫瘍壊死因子は乾癬の病態生理に関係があると考えられている（Ｔａｋｅｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ．２８１：３９８；Ｖｉｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（２００２）Ｊ  Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１（３）：２６４）。
【０１４２】
１態様において、本発明の製剤は関節リウマチ、乾癬性関節炎又は強直性脊椎炎を治療するために使用される。単離ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）を含有する本発明の製剤は関節リウマチ、乾癬性関節炎又は強直性脊椎炎を治療するために有効な投与スキーム及び用量に従ってヒト対象に投与することができる。１態様では、関節リウマチ、乾癬性関節炎又は強直性脊椎炎を治療するために、本発明の製剤中のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）約４０ｍｇの１用量（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤０．４ｍＬ）を１週間置きにヒト対象に投与する。１態様では、関節リウマチ、強直性脊椎炎又は乾癬性関節炎を治療するために製剤を１週間置き（隔週とも言う、本願に援用するＵＳ２００３０２３５５８５に記載されている投与方法参照）に皮下投与する。
【０１４３】
１態様において、本発明の製剤はクローン病を治療するために使用される。単離ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）を含有する本発明の製剤はクローン病を治療するために有効な投与スキーム及び用量に従ってヒト対象に投与することができる。１態様では、クローン病を治療するために、本発明の製剤中のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）約１６０ｍｇの１用量（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤１．６ｍＬ）をヒト対象に約１日目に初期投与した後、２週間後に抗体８０ｍｇの後続用量（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤０．８ｍＬ）を投与し、更にその後、１週間置きに約４０ｍｇ（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤０．４ｍＬ）を投与する。１態様では、クローン病を治療するために誘導用量と維持用量を含む多回可変用量レジメン（例えば、各々本願に援用する米国特許公開第ＵＳ２００６０００９３８５号及びＵＳ２００９０３１７３９９号参照）に従って製剤を皮下投与する。
【０１４４】
１態様において、本発明の製剤は乾癬を治療するために使用される。単離ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）を含有する本発明の製剤は乾癬を治療するために有効な投与スキーム及び用量に従ってヒト対象に投与することができる。１態様では、本発明の製剤中のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）約８０ｍｇの初期用量（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤０．８ｍＬ）をヒト対象に投与した後、初期投与の１週間後から開始して１週間置きに抗体４０ｍｇの後続用量（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤０．４ｍＬ）を投与する。１態様では、乾癬を治療するために誘導用量と維持用量を含む多回可変用量レジメン（例えば、各々本願に援用するＵＳ２００６０００９３８５及びＷＯ２００７／１２０８２３参照）に従って製剤を皮下投与する。
【０１４５】
１態様において、本発明の製剤は若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）を治療するために使用される。単離ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）を含有する本発明の製剤はＪＩＡを治療するために有効な投与スキーム及び用量に従ってヒト対象に投与することができる。１態様では、ＪＩＡを治療するために、本発明の製剤中のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分２０ｍｇ（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤０．２ｍＬ）を体重１５ｋｇ（約３３ｌｂ）〜３０ｋｇ（６６ｌｂ）未満の対象に１週間置きに投与する。別の態様では、ＪＩＡを治療するために、本発明の製剤中のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分４０ｍｇ（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤０．４ｍＬ）を体重３０ｋｇ（６６ｌｂ）以上の対象に１週間置きに投与する。１態様では、ＪＩＡを治療するために、体重に基づく固定用量（例えば、本願に援用する米国特許公開第２００９０２７１１６４号参照）に従って製剤を皮下投与する。
【０１４６】
１態様では、有害なＴＮＦα活性に関連する疾患を治療するために、抗体を１カ月に一度又は４週間に一度投与するような毎月投与スケジュールに従って単離ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）をヒト対象に投与することができる。上記のように、毎月投与スケジュールに従って治療することができる疾患の例としては、限定されないが、関節リウマチ、強直性脊椎炎、ＪＩＡ、乾癬、クローン病又は乾癬性関節炎が挙げられる。従って、単離ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）を含有する本発明の製剤は有害なＴＮＦα活性に関連する疾患を治療するために毎月投与スケジュールに従ってヒト対象に投与することができる。１態様では、有害なＴＮＦα活性に関連する疾患をもつ対象に本発明の製剤中のヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分８０ｍｇ（例えば本発明の１００ｍｇ／ｍＬ製剤０．８ｍＬ）を投与する。
【０１４７】
本願に記載する投与量は単回用量（例えば０．４ｍＬ中に４０ｍｇ又は０．８ｍＬ中に８０ｍｇの単回用量）として送達してもよいし、あるいは多回用量（例えば１６０ｍｇ用量を送達するために４０ｍｇずつ４回又は８０ｍｇずつ２回）として送達してもよい。
【０１４８】
単離ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分（例えばアダリムマブ）を含有する本発明の製剤を対象に別の治療剤と併用投与することもできる。１態様では、関節リウマチを治療するために製剤をヒト対象にメトトレキサート又は他の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と併用投与する。別の態様では、ＪＩＡを治療するために製剤をヒト対象にメトトレキサート又は他の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と併用投与する。その他の併用療法も米国特許第６，２５８，５６２号及び７，５４１，０３１号と、米国特許公開第ＵＳ２００４０１２６３７２号に記載されており、いずれもその開示内容全体を本願に援用する。
【０１４９】
ヒトＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分を含有する本発明の製剤は過去にＴＮＦ阻害剤療法の効果がなかった対象、例えばインフリキシマブに応答しなかった対象又は不寛容な対象を治療するために使用することもできる。
【０１５０】
以下、実施例により本発明を更に例証するが、これらの実施例は限定的であるとみなすべきではない。
【実施例１】
【０１５１】
ヒト抗ＴＮＦα抗体液体医薬製剤の安定性の改善
本実施例は抗体アダリムマブの医薬製剤の安定性の改善を目的とする実験の結果について記載する。
【０１５２】
材料及び方法
最終薬剤濃度５０ｍｇ／ｍＬの液体非経口剤形を作製するために、アダリムマブ（サブクラスＧ１，約４７ｋＤａ）を修飾医薬製剤に製剤化した。過去の製剤実験によると、リン酸／クエン酸緩衝液系はアダリムマブの蛋白質安定化に関して他の緩衝液系よりも優れていることが分かっている。従って、液体５０ｍｇ／ｍＬ製剤に添加剤を添加することにより安定性の改善を試みた。使用した全添加剤は最高純度（「プロアナリシス」グレード）のものをＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。マンニトールはＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ  Ｂ．Ｖ．，Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｈｏｌｌａｎｄから入手した。
【０１５３】
可視粒状物の分析はＰｈ．Ｅｕｒ．２００２の規定に従って実施した（§２．９．２０  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｍａｔｔｅｒ−ｖｉｓｉｂｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。不可視粒状物分析は光遮蔽により判定した（ＳＶＳＳ−Ｃ４０，ＰＡＭＡＳ  ＧｍｂＨ，Ｒｕｔｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＴＭ６  １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＳＥ−ＨＰＬＣ分析（蛋白質モノマー含有量の評価）に使用し、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで流し、オンライン検出のためにＵＶ２８０分光分析、屈折率検出及びＭＡＬＳと連動させた。各サンプルの分析を少なくとも３回ずつ実施した。特に指定しない限り、全ＳＥ−ＨＰＬＣデータでＳｒｅｌは０．１３未満であり、全光遮蔽データで２．３未満であった。
【０１５４】
アダリムマブ濃厚液（〜７０ｍｇ／ｍＬ）を添加剤ストック溶液で希釈することにより個々の蛋白質製剤を調製した。７０ｍｇ／ｍＬアダリムマブストック溶液は表１６に示すようなクエン酸リン酸緩衝液成分の組成（即ちクエン酸・Ｈ２Ｏ、クエン酸ナトリウム脱水和物、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）を使用して調製した。
【０１５５】
表１６に示すようなクエン酸リン酸緩衝液成分の組成（即ちクエン酸・Ｈ２Ｏ，クエン酸ナトリウム脱水和物、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）を使用して添加剤をリン酸／クエン酸緩衝液溶媒に溶解することにより添加剤ストック溶液を作製した。滅菌濾過（０．２μｍ，Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標），Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）前に、緩衝液成分の酸／塩基試料を添加することによりｐＨ調節を実施した。全製剤を少なくとも２本ずつ調製し、無菌空気層流条件下で熱滅菌（１８０℃，２５分）２Ｒガラスバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ  Ｇｌａｓ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶液バッチを最終滅菌濾過することにより作製した。使用前にＰｈ．Ｅｕｒ．に従ってテフロン（登録商標）被覆ブチルラバーストッパーを湿熱（１２１℃）滅菌した。
【０１５６】
各種製剤を３種類の異なる温度（５℃、２５℃、４０℃）で３カ月短期保存した。
【０１５７】
リン酸／クエン酸緩衝液溶媒を緩衝液交換に使用し、アダリムマブバルク溶液をＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０  ｕｎｉｔｓ（カットオフ５０ｋＤａ，Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で透析濾過することによりアダリムマブ濃厚液を準備した。バイオ医薬品溶液の現行の濃縮法と緩衝液交換法はＩＥＸ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、限外／透析濾過及び接線流濾過に基づく（Ｃｈｒｉｓｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ，１４４：１３３−１３６）。透析濾過は可変流速で１回の操作で精製、濃縮及び緩衝液交換が可能であるため、蛋白質ストレスが最小限になることから、透析濾過を適用した（表１）。
【０１５８】
【表１】
2012526121.tif 000002
実施した各サイクルは総蛋白質の〜０．２５％の蛋白質損失をもたらした。一般に、蛋白質損失は濃厚液生成中に７％を超えなかった。
【０１５９】
１回の透析濾過サイクル以内で、蛋白質濃度は倍増したので、最終濃縮段階以外は元の濃度まで希釈した。従って、存在すべきでない望ましくない溶解物質を有効に除去することができる（例えば透析濾過サイクル１０回以内で１．００％濃度を０．０００９８％まで低下させることができる）。精製及び濃縮後、アダリムマブ濃厚液を遠心した（５℃，３０００ｇ，２０分間）。
【０１６０】
ｐＨ最適値の評価
最適溶液ｐＨ（即ちｐＨ５．２又はｐＨ６．０）を評価するために、ｐＨのみを変化させた２種類の異なるアダリムマブ製剤を分析した。１ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ８０を含有する製剤の安定性データを表２Ａ及び２Ｂに示す。
【０１６１】
【表２】
2012526121.tif 000003
【０１６２】
【表３】
2012526121.tif 000004
モノマー含有量については、両製剤とも４０℃保存時に同等のモノマー損失を示したため、ｐＨによる優劣はないことが分かった。２５℃保存条件のデータは４０℃データと同様であったが、５℃では、この試験中に分析した全蛋白質溶液はモノマー含有量の有意変化を生じなかった。
【０１６３】
他方、濁度には差が認められた。保存温度に関係なく、溶液ｐＨ６．０では、１２週間保存中に不可視粒状物の形成を生じた。粒状物形成の強度は低温に結び付けられるので、粒子の起源は蛋白性ではないと予想される。この点で、深刻な粒状物形成が蛋白質不安定のみに起因したのであるならば、これは保存試験中の高温暴露に関係があると考えられる（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８３：１６６２−１６６９）。
【０１６４】
Ｔｗｅｅｎ  ８０の代わりに６．１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌを含有する５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤については、塩添加の結果、１μｍよりも大きい粒子の数が両溶液で同程度増加したので、不可視粒子が形成された（表３Ａ及び３Ｂ参照）。更に、１２週間後に、ＳＥ−ＨＰＬＣデータによると、差は最小限（〜０．３％）であり、２５℃結果により確証されなかったが、ｐＨ６．０溶液はｐＨ５．２溶液よりもモノマー含有量が多かった。
【０１６５】
【表４】
2012526121.tif 000005
【０１６６】
【表５】
2012526121.tif 000006
粒子形成はＮａＣｌ添加とｐＨ６．０保存により助長され、Ｔｗｅｅｎ  ８０添加と溶液ｐＨ５．２により改善されると思われた。従って、ＮａＣｌ等の塩を含有する溶液中の粒子汚染を軽減することができる成分としてＴｗｅｅｎ  ８０を提案した（表４Ａ及び４Ｂ）。次に６．１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌと１ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ８０の両方を含有する溶液を試験した。
【０１６７】
【表６】
2012526121.tif 000007
【０１６８】
【表７】
2012526121.tif 000008
表４Ｂに示すように、塩と界面活性剤を含有する製剤では、Ｔｗｅｅｎ  ８０の添加にも拘わらず不可視粒子が明白であったことから、界面活性剤を添加しても不可視粒子形成については影響がなかった。興味深いことに、全サンプルで粒子数は最低保存温度（５℃）で最大であり、粒子起源が潜在的に無機材料によることが示唆された。更に、塩を含有する溶液の目視検査によると、保存温度に関係なく、４週間保存後に若干の濁りが判明した。保存が一時的であっても、低温保存の結果として可視無機成分が沈殿する場合があり、例えばリン酸ナトリウム緩衝液は４℃で比較的不溶性のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを生じる場合がある（Ｂｏｒｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，４０：２１２−２４１）。他方、粒状物を評価基準とすると、溶液ｐＨ５．２は試験した溶液ではｐＨ６．０よりも有利であった。
【０１６９】
他方、モノマー含有量については、どちらの溶液ｐＨ値も保存中に同一のモノマー含有量となり、ＮａＣｌ含有製剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０不含）の場合、ｐＨ６．０では安定性が若干高くなるとさえ思われた。この同様のモノマープロファイルにも拘わらず、中性又は塩基性条件よりのｐＨ値で蛋白質はより多様な潜在的分解メカニズムを受け易いと一般に認められており（Ｗａｎｇ（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１８５：１２９−１８８）、例えば非イオン化蛋白質アミドのカルボニル−アミン反応、（塩基触媒）β脱離及び脱アミド化は各種酸化反応と同様に高ｐＨ値により助長される（Ａｋｅｒｓ  ａｎｄ  ＤｅＦｅｌｉｐｐｉｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｆｒｏｋｊａｅｒ，Ｓ；Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｌ．（２０００）１４５−１７７）。従って、要約すると、溶液ｐＨ５．２はアダリムマブ５０ｍｇ／ｍＬ長期安定性の点で６．０値よりも優れていると判断された。
【０１７０】
添加剤による安定化：界面活性剤
５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤に及ぼす界面活性剤の安定化能を調べるために、６．１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌを含有する蛋白質溶液に種々の量のＴｗｅｅｎ  ８０（０．％、０．０３％、０．１％）を加えた。一般に、Ｔｗｅｅｎ  ８０は例えば疎水性表面相互作用により結合することにより蛋白質を安定化させると予想される。蛋白質の表面特性は塩の存在に影響されるので、ＮａＣｌ不在の影響も調べた（ＮａＣｌ不含０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０溶液として表５に示す）（Ｋｈｅｉｒｏｌｏｍｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．，２：８１−８８も参照5.53een）。
【０１７１】
【表８】
2012526121.tif 000009
ＮａＣｌの存在下と不在下でＴｗｅｅｎ  ８０の量を変化させた結果を表５に示す。この結果から明らかなように、Ｔｗｅｅｎ  ８０はＮａＣｌの存在下又は不在下で製剤に安定性を提供することができなかった。０．０３％  Ｔｗｅｅｎ  ８０／ＮａＣｌについては、併用の結果、４０℃で１２週間保存後にモノマー含有量が低下した。一般にＴｗｅｅｎ  ８０の安定化効果は界面活性剤濃度の増加に相関する（０．００１〜１％の範囲で有効）ので、この結果はこの主題に関する大半の論文と相反するものであった（Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，４６：３０７−３２６参照）。
【０１７２】
ＮａＣｌの存在下及び不在下で種々のＴｗｅｅｎ  ８０百分率におけるモノマー濃度に加え、種々の温度で不可視粒子形成も試験した（表６参照）。全保存温度で、Ｔｗｅｅｎ  ８０を加えると、特に０．０３％の濃度で不可視粒子数は実質的に増加し、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析の結果が確証された。興味深いことに、保存温度に関係なく、ＮａＣｌの不在下では不可視粒子形成は著しく減ることが判明した。
【０１７３】
【表９】
2012526121.tif 000010
【０１７４】
更に凍結／解凍サイクル後の粒状物形成について各種濃度のＴｗｅｅｎ  ８０を試験した。保存中の溶液に及ぼす僅かな安定化効果とは対照的に、Ｔｗｅｅｎ  ８０は凍結・解凍サイクル中にアダリムマブに対する顕著な安定性を付与することが判明した（表７）。
【０１７５】
【表１０】
2012526121.tif 000011
【０１７６】
凍結（−８０℃，１２時間）と解凍（５℃，１２時間）によるストレスを溶液に繰返し付与することにより更にＴｗｅｅｎ  ８０の影響を検討した。適用した凍結・解凍（凍結／解凍）サイクル数は不可視粒状物の増加に密接に相関した。他方、Ｔｗｅｅｎ  ８０濃度０又は０．０３％の溶液に及ぼす５回の凍結／解凍サイクルの影響の結果、粒子汚染（粒子≧１μｍ）は〜１０倍に増加したが、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０溶液では状況は殆ど変わらなかった。これらの結果はＳＥ−ＨＰＬＣ分析により確証された（表８）。
【０１７７】
【表１１】
2012526121.tif 000012
他の蛋白質に及ぼす凍結／解凍サイクルの影響について発表されている多数の試験の結果と厳密に一致し、界面活性剤の非添加時に反復凍結／解凍ストレスに暴露すると、５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブの安定性は低下した。逆に、界面活性剤を添加すると、（多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）を使用して検証した）天然モノマー含有量は変わらなかったため、凍結／解凍に関連する有害なパラメーターに対して蛋白質は保護された。
【０１７８】
要約すると、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０をアダリムマブ５０ｍｇ／ｍＬ溶液に添加することが好ましかった。０．１％  Ｔｗｅｅｎは保存液中の蛋白質安定性を僅かに改善したが、凍結・解凍等のプロセス中に安定化効果は十分であった。他方、凍結は蛋白質製剤の製造、保存及び輸送における一般的な単位操作であるため、Ｔｗｅｅｎ  ８０の添加は大きな効果として現れる（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８２：６８４−６９０）。更に、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（登録商標）（マウスＩｇＧ２ａ）が１９８６年という初期にＦＤＡに認可されていることから明らかなように、薬剤中で０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を使用することは定着している。
【０１７９】
Ｔｗｅｅｎ  ８０以外に、非イオン性界面活性剤Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５についてもそのアダリムマブ安定化能を試験した。濃度０．０３及び０．１％のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）の保護特徴はアビスクミン非経口薬について最近報告されている（Ｓｔｅｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２５７：１８１−１９４）。従って、粒状物形成汚染の形成についてアダリムマブ溶液に及ぼすＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）の影響を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を含有する蛋白質溶液と比較した（表９）。
【０１８０】
【表１２】
2012526121.tif 000013
０．０３％及び０．１％  Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）を含有する溶液とは対照的に、夫々１％  Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を含有するアダリムマブ溶液は保存中に粒状物の顕著な増加を示した。低濃度Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）のこのプラスの効果はＳＥ−ＨＰＬＣ分析データには反映されなかった。１２週間保存（４０℃）後に、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）を含有する全溶液は参照（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０）に比較して〜０．５％のモノマー含有量の低下を示した（図１）。
【０１８１】
この実験では、高分子量（ｈｍｗ）蛋白質凝集物の初期段階検出で大きな効果が得られることもＭＡＬＳにより判明した（図２Ａ及び２Ｂ）。大量の分析物で高感度であることから、ＭＡＬＳにより凝集物を検出するには最低濃度で十分であり、例えば１週間保存（４０℃）後のｈｍｗ凝集物の形成はＭＡＬＳにより確認することができたが、ＵＶ２８０検出では殆ど検出不能であった。
【０１８２】
従って、加速貯蔵寿命試験の初期段階で既にｈｍｗ凝集物が形成されていることは一般に許容できないため、潜在的安定剤のリストからＳｏｌｕｔｏｌを除外した。最少量（＜０．１％）の蛋白質でも沈殿に原因となることが知られている（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｅｄ．ｂｙ  ＭｃＮａＩＩｙ，Ｅ．Ｊ．，３（２０００）７１−１１０）。上記結果はより高濃度（＞１％）のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５がセルピン関連プロテアーゼ阻害剤の溶液を脱安定化し、可視粒状物現象に有効であったという従来の報告を裏付けるものである（例えばＷＯ２００６０３７６０６参照）。
【０１８３】
添加剤による安定化：ポリオール
多くの糖質（例えばスクロース、グルコース、ラフィノース、トレハロース）とポリオール（例えばグリセロール、ソルビトール、マンニトール）は蛋白質を安定化する補助溶媒に分類される。これらの物質は主に立体排除メカニズムにより作用すると広く考えられている。例えば、ソルビトール等のポリオールは、例えばＭｕｍｐｓｖａｘ（登録商標）、Ｍｅｒｕｖａｘ（登録商標）ＩＩ及びＡｔｔｅｎｕｖａｘ（登録商標）等の多数の凍結乾燥ワクチン製剤又はＣａｒｄｅｎｅ（登録商標）等の静脈内投与可能な溶液で非経口薬を安定化させるために使用されることが多い。
【０１８４】
界面活性剤等の他の添加剤とは対照的に、糖質とポリオールはその完全な安定化能を発揮するためにはより高濃度（＞０．５Ｍ）で添加する必要がある。従って、５０及び１００ｍｇ／ｍＬの濃度のソルビトールをアダリムマブ溶液に加え、１２週間保存した（表１０）。
【０１８５】
【表１３】
2012526121.tif 000014
【０１８６】
ソルビトールはソルビトールを添加しない溶液に比較して保存中の粒子形成傾向を低下させた。ソルビトールの添加量は殆ど差を生じなかった。モノマー含有量については、ソルビトールの安定化効果は厳密に濃度依存性であることが判明した。ＮａＣｌの存在は蛋白質安定性を低下させる（表１１）。
【０１８７】
【表１４】
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表１１によると、１００ｍｇ／ｍＬソルビトールを添加すると、４０℃で１２週間保存中にモノマー含有量は〜１．５％増加した。添加剤の量を減らすと、アダリムマブ安定性は低下する。ウマ免疫グロブリンの安定性に関する最近の報告によると、１８０ｍｇ／ｍＬソルビトールは熱ストレスに対する蛋白質安定化に関して９０ｍｇ／ｍＬの添加よりも優れていることが判明したが、これらの結果はこの報告を裏付けるものである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３７（１），３３−４５）。糖質及び糖質由来ポリオールの安定化の濃度依存性は報告されている（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１３：７５６−７６１；Ｆａｔｏｕｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７ｂ）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：１６７９−１６８４）。興味深いことに、表１１に示すように、４ｍｇ／ｍＬ塩を添加すると、ソルビトールの安定化能は著しく低下した（〜０．２５％モノマー）。他方、（表１１に示すように）０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を含有するアダリムマブ溶液にＮａＣｌを添加しないと、貯蔵寿命実験中にモノマー含有量はごく少量であるが増加した。
【０１８８】
表１２に示すように、ソルビトールの代わりにマンニトールを使用して実験を繰返した。ソルビトールで得られた結果はマンニトールをアダリムマブ溶液に添加することにより確証され、（１）８０ｍｇ／ｍＬマンニトールを添加した溶液は１２週間保存（４０℃）後にマンニトール不含溶液よりも蛋白質モノマー含有量が〜１．５％上回り、（２）マンニトールの安定化添加量は濃度依存プロフィルの傾向があり、（３）ＮａＣｌはマンニトール単独の漸減するモノマー含有量を低下させた。興味深いことに、これらのデータは２５℃で実施した同一実験により確証された。
【０１８９】
【表１５】
2012526121.tif 000016
要約すると、濃度５０ｍｇ／ｍＬのアダリムマブはソルビトールとマンニトールのどちらでも安定化された。この安定化はＮａＣｌにより妨害された。０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を含有する蛋白質溶液に添加した場合にＮａＣｌがアダリムマブ安定性を妨害しないという結果は上記結論と一致した。
【０１９０】
表１３に示すように、各アダリムマブ製剤中の天然モノマーの量はポリオールの添加と添加剤混合物に依存した。これに対応して、凝集物とフラグメントの量も変化した。モノマー損失量における凝集物の割合は添加剤を添加しても添加に関係なく一定であった。換言するならば、アダリムマブ凝集物とフラグメントの比は平衡しており（即ち〜３８％凝集物と〜７２％フラグメント）、この平衡はポリオールと塩の添加により影響されなかった。ソルビトールとマンニトールが天然状態安定化のみによりアダリムマブ安定性に寄与していたならば、これは凝集物割合の変化に反映されるはずである。そうでなかったことから、ソルビトール／マンニトールによるアダリムマブ安定化には別のメカニズムがあり、その結果、断片化プロセスが妨害されたと考えられる。
【０１９１】
【表１６】
2012526121.tif 000017
結論として、濃度５０ｍｇ／ｍＬのアダリムマブはマンニトール又はソルビトールを製剤に加えることにより有効に安定化された。天然状態保護による蛋白質安定性への寄与以外に、マンニトールとソルビトールは別のメカニズムにより蛋白質を安定化し、長期保存中に断片化を抑制した。
【０１９２】
添加剤による安定化：塩
ＮａＣｌは蛋白質非経口薬の製剤化で最もよく使用されている塩である。しかし、上記結果によると、５０ｍｇ／ｍＬのアダリムマブ濃度でＮａＣｌはポリオールの存在下でアダリムマブ安定性を妨害し、単独添加剤として蛋白質安定性を増加しなかった。塩の潜在的安定化効果を考慮した場合、ホフマイスター離液順列に従ってその挙動を考察すると、大まかな原則が得られた。従って、ナトリウム塩における対イオンとして塩化物の代わりにアニオン性酢酸塩の使用について検討した。
【０１９３】
表１４に示すように、各溶液（即ち５０ｍｇ／ｍＬソルビトール／４ｍｇ／ｍＬ酢酸Ｎａ、５０ｍｇ／ｍＬソルビトール／４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、及び５０ｍｇ／ｍＬソルビトール、塩不含）は異なる蛋白質安定性を示した。ＮａＣｌ又は酢酸ナトリウムを含有する製剤を比較すると、僅か４週間保存（４０℃）後に酢酸ナトリウムを添加したバッチにおけるモノマー含有量はＮａＣｌを含有する製剤よりも〜０．２５％高くなり、１２週間後に差は＞０．４％まで拡大したことから、ＮａＣｌを含有するアダリムマブ溶液は蛋白質安定性に対して不利であった。従って、酢酸ナトリウムは塩化ナトリウムよりもアダリムマブ安定性に大きく寄与した。他方、塩不含製剤はモノマー含有量が同一であったことから、酢酸ナトリウムを添加しても蛋白質安定化は増加しなかった。
【０１９４】
【表１７】
2012526121.tif 000018
他の２種類の製剤（５０ｍｇ／ｍＬソルビトールと４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌを含有する製剤と、塩を含有しない製剤）と比較すると、酢酸塩を含有する製剤は１μｍ超の粒子数が多かった（＜６，０００個／ｍＬに対して〜１８０，０００個／ｍＬ）。
【０１９５】
緩衝液系も試験し、ソルビトール濃度を変化させてナトリウム緩衝液系とカリウム緩衝液系を比較した。表１５に示すように、リン酸カリウム緩衝液に溶解したアダリムマブの安定性はリン酸ナトリウム緩衝液中で測定された安定性と同等であった。これらの結果は２５℃で実施した保存試験のデータにより裏付けられた。更に、両者緩衝液系は粒状物汚染も同等であった。従って、液体蛋白質製剤ではリン酸カリウムのほうが好ましいと判断された。
【０１９６】
【表１８】
2012526121.tif 000019
要約すると、５０ｍｇ／ｍＬのアダリムマブ溶液を製剤化する際にはＮａＣｌの添加を避けるべきである。例えば浸透圧の理由により塩を添加することが好ましい場合には、酢酸ナトリウムのほうが塩化ナトリウムよりも有利である。同様に、カリウム系リン酸緩衝液系はアダリムマブ安定性に関してリン酸ナトリウム緩衝液系と同等であった。
【０１９７】
要約すると、約５０ｍｇ／ｍＬのアダリムマブ溶液には溶液ｐＨ５．２と０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０の添加が他の方法よりも有利であった。凍結／解凍試験及び（加速）保存試験後の蛋白質安定性及び粒状物汚染を評価基準として使用した。更に、マンニトールやソルビトール等のポリオールはほぼ同一の効力で蛋白質安定性に実質的に寄与した。蛋白質凝集と断片化のどちらも妨げられたので、天然状態蛋白質における優先的蓄積が唯一の安定化経路ではなかった。ＮａＣｌはポリオールの存在下で蛋白質安定性を妨害した。酢酸ナトリウムの添加は蛋白質安定性に有害な影響を生じなかった。
【０１９８】
これらのデータから、ｐＨ５．２のリン酸カリウム緩衝液と、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０と、〜５０ｍｇ／ｍＬマンニトール又はソルビトールを含有しており、アダリムマブ濃度５０ｍｇ／ｍＬで最終浸透圧値〜３００ｍｏｓＭ／ｋｇを目標とする製剤が提案された。
【実施例２】
【０１９９】
高濃度アダリムマブ製剤
本実施例は抗ＴＮＦα抗体アダリムマブを含有する多数の高濃度蛋白質製剤の成分について記載する。驚くべきことに、下記製剤は抗体濃度が高い（即ち約１００ｍｇ／ｍＬ）にも拘わらず、多数の有利な特性があった。
【０２００】
濁度を含む製剤（Ｆ１〜Ｆ６と言う）の多数の特徴を市販５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤（Ｆ７）と比較検討した。溶液の濁度は未希釈溶液の分析により測定した。濁度をＮＴＵ値（ネフェロメトリー濁度単位）として報告する。
【０２０１】
ドイツ医薬品規格（Ｇｅｒｍａｎ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｄｅｘ）に記載されているような目視検査により可視粒子汚染を測定した。ＵＳＰに準拠する光遮蔽法により不可視粒子をモニターした。希釈溶液の動的光散乱分析を使用し、流体力学的直径を求めた（粒子の粒度分布のＤＬＳ測定強度自己相関関数と多分散指数ＰＤＩのキュムラント分析により計算した平均又はＺ平均寸法として報告する）。
【０２０２】
フラグメントと凝集物の検出を可能にするＳＥＣにより製剤の物理化学的安定性を評価した。化学的安定性をモニターするために、ＳＥ−ＨＰＬＣ（フラグメント及び加水分解試料の検出）とＣＥＸ−ＨＰＬＣ（カチオン交換ＨＰＬＣ）を使用した。ＣＥＸ−ＨＰＬＣは保存中に形成され得る各種リジンアイソフォーム及び分解生成物（例えば脱アミド化及び酸化種）を分離する。
【０２０３】
試験した製剤はＦ１〜Ｆ６（表１６）とし、ｐＨ５．２〜ｐＨ６．０の各種基剤中に１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブを含有しており、各種ポリオールを添加し、塩化ナトリウムの存在下又は不在下で製剤化した。
【０２０４】
【表１９】
2012526121.tif 000020
【０２０５】
下記実施例３〜６に記載するように、総合的な安定性と粘度を決定するために、上記１００ｍｇ／ｍＬ製剤（Ｆ１〜Ｆ７）を更に試験した。
【０２０６】
以下、特に代表的溶液Ｆ２及びＦ６に関して、高濃度アダリムマブ製剤の製造方法について説明する。出発溶液は精製抗体を液体緩衝剤（例えば前段階の製造工程段階からの緩衝液）に低濃度（本発明の高濃度よりも低濃度）で溶解した溶液とする。この場合には、ｐＨ５．２で界面活性剤を添加しないＦ７と同一の緩衝液系に約７０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したアダリムマブ溶液を準備した。次に、出発溶液を濃縮し、例えば１０ｋＤのカットオフで抗体を定量的に保持することが可能な膜を使用して、好ましくは接線流濾過システムで限外濾過により透析濾過する。
【０２０７】
１例として、透析濾過緩衝液として界面活性剤を添加しない対応する基剤を使用して濃厚液を約５０ｍｇ／Ｌまで希釈することにより代表的製剤Ｆ２及びＦ６を製造した。接線流濾過システムを使用して連続緩衝液交換を実施した。一般に少なくとも５容量、又は好ましくは８容量の透析濾過緩衝液を使用して一定の保持液量で透析濾過を実施した。最終段階で、透析濾過溶液を高濃度（例えば１５０ｍｇ／ｍＬ以上）まで更に濃縮した。次に管を透析濾過緩衝液でフラッシュすることにより濁った最終保持液を限外濾過システムから回収した。各量のポリソルベート８０を添加し、透析濾過緩衝液を使用して目標蛋白質濃度に調整後、透明〜やや乳白色の高濃度液体製剤を得た。０．２２μｍフィルターで濾過後、溶液は約２〜８℃で保存した場合に少なくとも約１２カ月間安定であった。
【実施例３】
【０２０８】
凍結／解凍ストレスに対する高濃度アダリムマブ製剤の安定性
アダリムマブ製剤が１００ｍｇ／ｍＬ蛋白質濃度で安定であることを実証するために、凍結／解凍ストレス（−８０℃で凍結を実施し、２５℃で解凍を実施）実験を実施した。
【０２０９】
粒子形成に対して感受性の一連の分析方法を使用して潜在的な物理的不安定を検出した。コロイドないし可視範囲の粒状凝集物の生成の指標として濁度を測定した。濁度（ＮＴＵ値として報告する）は４回目の凍結／解凍サイクル後もさほど変化しなかった（図３）。高ｐＨ溶液の濁度上昇は蛋白質のｐＩ（アダリムマブ８．５）に近いｐＨにおける電荷反発の低下による蛋白質−蛋白質相互作用の増大に起因すると考えられる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９６（１）２４５７−２４６８）。
【０２１０】
サブミクロン範囲の粒度を測定するための方法として動的光散乱法を使用した。粒度分布測定中に得られた多分散指数値をコロイドないしマイクロメーター寸法範囲の凝集の別の感受性指標として使用した。濁度データと同様に、試験した製剤のうちで物理的不安定の徴候を示すものは皆無であった（図４）。
【０２１１】
更に、サイズ排除データを評価した。図５は凝集物濃度を示す。反復凍結／解凍ストレスに対して物理化学的不安定の徴候は全く検出されなかった。
【０２１２】
凍結／解凍処理により実質的な蛋白質変性と凝集が生じ、その結果、可溶性及び不溶性凝集物形成を生じる場合があることは周知である（Ｐａｒｂｏｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １１（５）７６４−７７１）。本願に記載する全製剤を反復凍結・解凍処理した結果、反復凍結／解凍サイクル（−８０℃／２５℃）に感受性の製剤は皆無であることが判明した。製剤のｐＨがアダリムマブのｐＩ（即ち８．５）に近い高値であるにも拘わらず、全製剤はそのｐＨから独立して同様に安定であった（いずれの場合も初期値に比較して優位変化は認められなかった）。
【０２１３】
これらの結果は各種緩衝液を比較した別の試験からのデータにより裏付けられた。凍結・解凍後に均質溶液（即ちｐＨ、浸透圧、密度の勾配が最少の溶液）が得られるという点と凍結・解凍中のｐＨ変化が最少であるという点で最も有益な緩衝液系はＮａＣｌを添加しない緩衝液組成であることが判明した（実施例１参照）。ｐＨ６で製剤化したＮａＣｌ不含緩衝液系は評価した全ｐＨレベルのｐＨ変化が最少であることが判明した。
【実施例４】
【０２１４】
等張化剤として各種ポリオールを含有する１００ｍｇ／ｍＬ製剤の安定性
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を利用し、全１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤を安定性全般について試験した。Ｍｉｃｒｏｃａｌ製ＶＰ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣを使用してＤＳＣデータを得た。全実験は以下の標準化手順：温度範囲：２０℃〜９０℃、加熱速度：１Ｋ／ｍｉｎ、蛋白質濃度１ｍｇ／ｍＬを使用する１回の加熱試験で実施した。
【０２１５】
Ｔｍ値が高いほど一般に構造安定性は高い（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ  ４（３）ａｒｔｉｃｌｅ  ４２）。図６は１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤のＴｍ値を示す。これらのデータから明らかなように、全製剤は高いＴｍ値に達する。他方、塩化ナトリウム不含製剤（Ｆ２，Ｆ３，Ｆ５，Ｆ６）は有意に高いＴｍ値を示し、これらの製剤の堅牢性を示した。１ｍｇ／ｍＬで製剤を試験するので、Ｆ１のＴｍデータはＦ７のＴｍと同一であり、塩化ナトリウムの不在下又はｐＨ６．０の１００ｍｇ／ｍＬ製剤の安定性はＦ７製剤よりも改善されることが確認された。
【０２１６】
磁気撹拌棒を使用する撹拌ストレスモデルを使用し、新規アダリムマブ製剤の物理化学的不安定を検出した。この周知モデルはアダリムマブを長期気液界面暴露と撹拌関連キャビテーションに供することによりストレスを誘導し、予測可能な方法で可溶性及び不溶性蛋白質凝集物の形成をもたらす。
【０２１７】
一般に、夫々のｐＩ（アダリムマブｐＩ８．５，低純電荷，最小化静電反発力）の範囲のｐＨ値で製剤化した蛋白質は反発力が弱いため、気液界面に関連する凝集に対する感受性が高い。更に、塩化ナトリウム等のイオン性添加剤はそれらのイオン遮断性により蛋白質凝集に関与する。塩化ナトリウムの存在により疎水性吸引力を低下させ、蛋白質−蛋白質相互作用を抑制し、コロイド安定性を増すことができる（Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９３（６）１３９０−１４０２）。
【０２１８】
撹拌ストレスにより誘導される凝集物形成を検出するために濁度データを評価した。表１７は製剤組成と撹拌時間に対するネフェロメトリー値を示す。（５．２の低ｐＨで製剤化した）Ｆ１〜Ｆ３の初期濁度値は塩化ナトリウム含有溶液（Ｆ１）とＮａＣｌ不含溶液（Ｆ２，Ｆ３）で差を示した。他方、６．０の高ｐＨに調整した溶液（Ｆ４〜Ｆ６）は濁度が高かった。ＮａＣｌが撹拌等の機械的ストレス後にｍＡｂ溶液の透明度を低下させ得ることは当分野で知られている（例えばＦｅｓｉｎｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２６（４）９０３−９１３）。
【０２１９】
【表２０】
2012526121.tif 000021
【０２２０】
４８時間まで撹拌すると、試験した全製剤で濁度値が上昇した。低ｐＨのＮａＣｌ不含製剤は撹拌による濁度上昇を最も生じにくかった。驚くべきことに、試験した全１００ｍｇ／ｍＬ製剤は低濃度（５０ｍｇ／ｍＬ）アダリムマブ製剤に比較して撹拌後の濁度が有意に低かった（表１８）。
【０２２１】
一般に、乳白外観は単なるレイリー散乱の結果であり、蛋白質濃度と線形相関する。他方、乳白外観は物理的不安定を生じない（Ｓｕｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２１（７）１０８７−１０９３）。５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤は２４時間撹拌後に６３〜１３０ＮＴＵ、４８時間後に１０９〜２４３ＮＴＵの濁度を示したが、１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤は２７〜６３（２４時間）から４０〜８７（４８時間）の数値であった。Ｔｒｅｕｈｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（（２００２）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １９（４）５１１−５１６）によると、蛋白質濃度が高いと、１０ｍｇ／ｍＬ未満の範囲のＯＰＣ−Ｆｃ溶液中で気液界面に誘導される凝集は減少する。同様の結果がＫｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（（２００８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９７（１０）４３４７−４３６６）からも報告されている。意外にも、新規アダリムマブ製剤は１００ｍｇ／ｍＬという著しく高い蛋白質濃度で撹拌ストレス安定性の増加の特徴を示した。
【０２２２】
従って、新規製剤は５０ｍｇ／ｍＬ製剤に比較して安定性が増加した。
【０２２３】
【表２１】
2012526121.tif 000022
【０２２４】
更に、サイズ排除クロマトグラフィーデータによると、全１００ｍｇ／ｍＬ製剤は４８時間撹拌後の凝集物濃度が＜１％であり、新規製剤の安定性が裏付けられた（図７）。やはり、低ｐＨと塩化ナトリウムの不在が有益であった。一般には高ｐＨで純電荷が低いと不安定が増すと考えられているが、このデータは新規製剤がアダリムマブのｐＩに近いｐＨ値であるにも拘わらず安定であり、ＮａＣｌの不在が有益であるという驚くべき知見を裏付けるものである。
【実施例５】
【０２２５】
塩化ナトリウムの存在下及び不在下で２種類の異なるポリオールを添加したｐＨ５．２及び６．０の１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤の長期安定性
新規１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤を長期保存し、５０ｍｇ／ｍＬ標準製剤と比較して安定性が優れていることを確認した。５℃（市販品の推奨保存温度）で１２カ月間の安定性データを評価した。データは実際に、新規製剤が安定性の低下を示さなかったことを示唆している（表１９）。
【０２２６】
ＳＥＣ及びＩＥＸに関して、モノマー含有量の有意低下又は測定可能な分解は生じなかった。
【０２２７】
更に、新規アダリムマブ製剤は蛋白質濃度が高いにも拘わらず、５０ｍｇ／ｍＬ市販アダリムマブ製剤の１２Ｍデータに比較して不可視範囲の粒子汚染に関する有意強化が得られた。（凝集、沈殿及び一般物理的不安定現象を示す）不可視粒状物汚染を試験した処、新規アダリムマブ製剤は実際に不可視粒子を含まずに維持されることが判明した。最大値２８（≧１０）及び最大値３（≧２５）の初期粒子数は５０ｍｇ／ｍＬ製剤Ｆ７（夫々７０３と３８）よりも有意に少なかった。
【０２２８】
更に、粒子レベルは１２カ月間安定性試験を通して有意に変化せず、Ｆ７よりも有意に低レベルに維持された。
【０２２９】
薬剤製品バッチは試験した全保存条件下でその物理化学的安定性に関してほぼ等価であった。例えば蛋白質濃度が高いほど物理的安定性は低下する傾向があることは広く認められているため、これは意外である（Ｗａｎｇ  Ｗ．（１９９９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  １８５：１２９−１８８）。
【０２３０】
【表２２】
2012526121.tif 000023
【０２３１】
新規１００ｍｇ／ｍＬ製剤の保存安定性増加の結果を検証するために、２種類の代表的な製剤であるＦ２及びＦ６を加速安定性試験（５℃、２５℃、４０℃で３カ月）に供し、市販５０ｍｇ／ｍＬ製剤（対照試験からの代表的バッチ）と比較した。これらの実験の結果を図８〜１３にまとめる。
【０２３２】
これらのバッチからの濁度データは特に５．２の低ｐＨで１００ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ不含製剤の優れた挙動を実証する。溶液中の蛋白質の濃度が増加すると、乳白が増し、レイリー散乱により濁度読取り値が増すことは一般に知られている（Ｓｕｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２１（７）１０８７−１０９３）。驚くべきことに、塩化ナトリウムを添加しない新規製剤は５０ｍｇ／ｍＬ製剤と同一ｐＨで同等の濁度レベルであることが判明した（図８）。
【０２３３】
図９〜１１は新規製剤の粒状物形成（可視粒子と不可視粒子）の詳細なデータを示す。安定性の増加という驚くべき知見が確証された。実際に、高温で３カ月間保存後も不可視粒子及び可視粒子両方のスコアを下げることが可能であった。
【０２３４】
図１２〜１３に示すデータはＳＥＣ分析とＩＥＸを使用して試験した化学的安定性の両方で安定性の問題を示さないため、１００ｍｇ／ｍＬ製剤の安定性を更に裏付けた。
【実施例６】
【０２３５】
５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤と比較した１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤の製造適性の強化
本実施例は現在市販されている５０ｍｇ／ｍＬ製剤に比較して新規１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤（代表的製剤Ｆ２及びＦ６）のプロセス安定性の改善に関するデータをまとめる。
【０２３６】
ポンピング、濾過、混合、充填−仕上げ工程、輸送又は振盪により生じる機械的ストレスは空気−水界面、材料表面及び剪断力への蛋白質の暴露により、変性とそれに続いて凝集を生じる恐れがある（Ｍａｈｌｅｒ  ａｔ  ａｌ．（２００５）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ５９：４０７−４１７；Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９３（６）１３９０−１４０２）。
【０２３７】
先ず蛋白質溶液の処理適性の特徴を表す基本パラメーターとして粘度値を測定した。表２０はＦ１〜Ｆ７製剤で得られた粘度データを示す。蛋白質濃度が増加すると、５０ｍｇ／ｍＬ製剤（Ｆ７）に比較して粘度が増加した。
【０２３８】
静電遮断剤であるＮａＣｌを除去すると、特にアダリムマブのｐＩに近いｐＨ値で疎水性蛋白質相互作用が増加し、従って粘度が増加すると予想される。この作用はＮａＣｌ濃度＜２００ｍＭで最も顕著であると報告されている（Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９３（６）１３９０−１４０２）。
【０２３９】
しかし、意外にも、製剤からＮａＣｌを除去しても（Ｆ１は〜１０５ｍＭ  ＮａＣｌを含有する）依然として約３．１〜３．３ｍＰａ・ｓという比較的低い粘度値であった（Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５及びＦ６）。これは６．０という高ｐＨ値の溶液（Ｆ５及びＦ６）で特に意外であった。
【０２４０】
要約すると、全製剤は液体充填−仕上げ製造操作に最適な範囲の粘度をもつことを特徴とする。
【０２４１】
【表２３】
2012526121.tif 000024
無菌製造工程中の滅菌濾過により誘導されるストレスを模倣した実験室モデルで、１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブを含有する２種類の代表的な新規製剤から分析データを得た処、全製剤は濾過に関連する剪断ストレスに対して安定であることが分かった。低レベルの高分子量サブ集団の感受性指標である多分散指数は有意に増加しなかったため、ＤＬＳデータは高分子量凝集物の形成の徴候を示さなかった。高分子量種は散乱強度が高い（ｄ６に比例する）ため、ＺＡｖｅ及びＺＡｖｅ粒度分布の指標としての多分散指数に有意に影響しないので、特にＤＬＳ測定を使用して粒度分布における少量の高分子量種、例えば凝集物を検出する。更に、濾過により凝集が誘導されないことがＳＥＣデータにより確認された。
【０２４２】
驚くべきことに、１００ｍｇ／ｍＬ製剤でも不安定を示さなかった。最悪の場合のシナリオとして複数回滅菌濾過後でも、蛋白質含有量が高いにも拘わらず、処理適性は高レベルに維持された。
【０２４３】
【表２４】
2012526121.tif 000025
プロセス関連ストレスに対する新規アダリムマブ製剤の高い安定性を更に実証するために、磁気撹拌棒の撹拌速度を変えてその挙動を比較する撹拌ストレスモデルで製剤を試験した（撹拌ストレスは配合プロセス段階で製造条件下に生じる）。
【０２４４】
撹拌ストレス耐性を比較した処、１００ｍｇ／ｍＬ蛋白質濃度で濁度の上昇は認められなかった（図１４）。塩化ナトリウムを添加せずにポリオール含有量を高くした代表的な１００ｍｇ／ｍＬ製剤はいずれも試験した全撹拌速度でｐＨ５．２の市販製剤と同様に挙動した。撹拌速度を上げると、全製剤は２４時間撹拌後に濁度値の僅かな上昇を示したが、１００ｍｇ／ｍＬで剪断ストレスによる不安定に対する感受性の顕著な増加は検出されなかった。
【０２４５】
ＤＬＳ測定により得られる流体力学的直径の変化を比較した処、同様のデータが得られた。蛋白質濃度の高い製剤のほうが撹拌ストレスに対する感受性が強いと考えられるが、どちらの１００ｍｇ／ｍＬ製剤も５０ｍｇ／ｍＬ製剤と同様に挙動した。驚くべきことに、ｐＨが最高の製剤Ｆ２は濁度及び流体力学的直径のどちらの分析でも相対増加が最低であることが判明した（図１５）。
【０２４６】
蛋白質濃度が高くてもプロセス安定性は同様であるというこの驚くべき結果はポンピングプロセスにより誘導されるストレスを模倣した機械的ストレスモデルにより更に確証された。製造工程のこの最終段階は蠕動ポンピングによる剪断ストレスを伴い、溶液不安定の危険を増す。この場合も、濁度（図１６）とＤＬＳ（図１７，表２２）を使用して得られたデータは、新規１００ｍｇ／ｍＬ製剤が粒子成長反応を生じず、５０ｍｇ／ｍＬ製剤と同様に安定に維持されることを裏付けた。ポンプストレスにより誘導した凝集物形成に対する感受性は検出できなかった。この結果は更にＳＥＣデータにより裏付けられ、試験した製剤はポンプサイクルに関して差がないことが分かった（図１８）。
【０２４７】
【表２５】
2012526121.tif 000026
各種充填装置（回転ピストンと蠕動ポンプ）を使用し、１００ｍｇ／ｍＬ製剤の安定性の差を評価した。
【０２４８】
これらの試験の結果、特にｐＨの高い塩化ナトリウム含有製剤（Ｆ１及びＦ４）では、ピストンポンプで発生する剪断ストレスが高いほど、可視粒子数が増加した。同様の結果がＢａｕｓｃｈ，Ｕｒｓｕｌａ  Ｊ．から最近報告されている（Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．２００８，ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｓｅｌ，Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；ｈｔｔｐ：／／ｅｄｏｃ．ｕｎｉｂａｓ．ｃｈ／８４５／１／ＤｉｓｓＢ＿８４２７．ｐｄｆ）が、これはリツキシマブ溶液の１０ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度に過ぎない。驚くべきことに、１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブを含有する塩化ナトリウム製剤はピストンポンプを使用する高剪断条件下で処理適性の改善を示した。
【０２４９】
図１９〜２２はプロセスストレス増加条件に対するＮａＣｌ含有アダリムマブ溶液の感受性の増加を裏付ける粒子数と濁度データを示し、ＤＡＣ目視スコア法による≧１０μｍ及び≧２５μｍの粒度範囲の測定は非経口薬に不可欠の品質属性である。従って、ＮａＣｌ不含製剤における不可視粒子の減少により有意な製剤改善が得られる。
【０２５０】
図１９に示すように、蠕動充填の結果、充填直後（Ｔ０）及び保存後に可視粒子形成は生じなかった。他方、ピストン充填の結果、ｐＨ６．０で製剤化した溶液ではＴ０でも有意粒子数が認められた（図２０）。塩化ナトリウムを含有するＦ４で最高値が測定されたが、Ｆ５〜Ｆ６はスコアが有意に低く、プロセスストレスに対する塩化ナトリウム不含製剤の安定性の改善が確証された。
【０２５１】
濁度測定により裏付けとなる結果が得られた（図２１〜２２）。ピストンポンプを使用して充填した溶液の初期値は蠕動充填法を使用して充填した溶液よりも高かった。塩化ナトリウム不含製剤は塩化ナトリウムを含有する製剤よりも濁度が低かった。更に、ピストン充填による剪断ストレスの結果、濁度に関してＦ４（塩化ナトリウム添加）をＦ５及びＦ６（塩化ナトリウム非添加）から識別することができた。
【実施例７】
【０２５２】
塩化ナトリウム不含製剤中の各種ポリオール濃度の比較
１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブを含有する以下の塩化ナトリウム不含製剤を５℃における短期安定性に及ぼすポリオール濃度の影響について試験した。
【０２５３】
凝集及び粒子形成傾向に関して不良な条件となるように、製剤をｐＨ６．０に調整した。
【０２５４】
【表２６】
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塩化ナトリウム不含溶液の張度要件に見合うように、マンニトール又はソルビトールを４２ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。データによると、先に使用した１２ｍｇ／ｍＬの濃度に比較して、どちらのポリオールも溶液の浸透圧に寄与するのみならず、更に蛋白質安定性にも有意影響を与えることが判明した。
【０２５５】
安定性データによると、ポリオールの種類に関係なく、ポリオール濃度が高いほうが透明度は改善されると思われた。一般に最適とはみなされない条件下（例えばアダリムマブのｐＩに近いｐＨ６．０）で、ポリオール濃度の高い製剤は５℃で４週間の短期保存後でも透明度の改善を示した。これは数種類の分析法で確認された。
【０２５６】
図２３から明らかなように、試験した製剤の透明度はポリオール濃度を増加することにより有意に低下し、試験期間にわたって低レベルに保つことができた。更に、５℃で４週間後に凝集がやや低下した結果、高いポリオール濃度で高いモノマー含有量が認められた（図２４及び２５）。ポリオール濃度が高いと、≧１０μｍの範囲の不可視粒子は（例えばＴ０で）減少した。
【実施例８】
【０２５７】
ヒト抗ＴＮＦα抗体の安定した高蛋白質濃度製剤
加速安定性試験条件下と推奨保存温度条件における長期保存下の両方でアダリムマブの物理的及び化学的安定性を維持する適性について各種アダリムマブ製剤を試験した（下表１参照）。製剤のｐＨ（ｐＨ５．２とｐＨ６）、添加剤条件（例えばマンニトール又はソルビトールの濃度）、塩／イオン強度条件（例えばＮａＣｌの濃度）、及び蛋白質濃度（５０ｍｇ／ｍＬと１００ｍｇ／ｍＬ）を変化させた。
【０２５８】
【表２７】
2012526121.tif 000028
【０２５９】
表２はストレス温度とサンプル抽出点の総覧である。製剤Ｆ２及びＦ６はアダリムマブの物理的及び化学的安定性の両方を夫々少なくとも１８カ月間及び１２カ月間維持する製剤であると認められた。製剤添加剤ＮａＣｌをマンニトール（製剤Ｆ２）とソルビトール（製剤Ｆ６）に交換すると、蛋白質濃度の１００％増加（製剤Ｆ７の５０ｍｇ／ｍＬから製剤Ｆ２及びＦ６の１００ｍｇ／ｍＬまで）にも拘わらず、高い安定化能が得られる。驚くべきことに、両製剤の物理的安定性は夫々少なくとも１２カ月間及び１８カ月維持された。１２カ月間保存後も、両製剤のモノマー含有量は９９％を上回り（ＳＥＣデータ）、凝集物濃度は１％未満であった。
【０２６０】
同様に、リジン変異体合計（Ｌ０＋Ｌ１＋Ｌ２）を表す安定性は８０％を上回ったため、非常に多くの場合に蛋白質薬剤における貯蔵寿命制限因子である化学的安定性も安定性モニター期間にわたって維持された。
【０２６１】
蛋白質製剤の物理的及び／又は化学的安定性をモニターするのに適切であるとして当分野で認められている他の試験（例えば不可視粒子試験、濁度測定、目視検査、透明度又は色モニター）でも製剤Ｆ２及びＦ６の安定化能が確認された。
【０２６２】
重要な点として、抗ＴＮＦ中和試験を示す効力によると、どちらの製剤も完全なサンプル抽出スケジュールにわたってアダリムマブの効力を維持し、データは７５〜１２５％の高品質レベル範囲内にあることが判明した。
【０２６３】
【表２８】
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【０２６４】
【表２９】
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【０２６５】
【表３０】
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【実施例９】
【０２６６】
高濃度アダリムマブの疼痛試験
皮下注射によりモノクローナル抗体を投与された患者は注射部位に疼痛又は不快感を感じる場合がある（例えばＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．；Ｅｓｐａｎｄｅｒ−Ｊａｎｓｓｏｎ，Ａ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４８（１０），１０１２−１０１５；Ｐａｒｈａｍ，Ｓ．Ｍ．；Ｐａｓｉｅｋａ，Ｊ．Ｌ．（１９９６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．３９，３１−３５；Ｍｏｒｉｅｌ  Ｅ  Ｚ；Ｒａｊｆｅｒ  Ｊ（１９９３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｕｒｏｌｏｇｙ  １４９（５  Ｐｔ  ２），１２９９−３００参照）。患者の体験を模倣した動物モデルを使用し、疼痛及び耐容性効果を評価すると共に、人体使用前の可能な製剤修飾を評価した。蛋白質製剤の特性を識別する適性について利用可能な動物モデルを評価した。注射時の発声、足フリンチ（注射後０〜１０分）、機械的アロディニアの試験、及び熱痛覚過敏（注射後３０分）について測定した。患部足をなめたり、振ったりする侵害受容挙動や、注射部位の発赤又は腫脹についても動物を観察した。
【０２６７】
注射部位疼痛を評価するためにフリンチモデルを選択し、耐容性及び疼痛感覚に及ぼす製剤組成の影響を評価するために使用した。
【０２６８】
各種アダリムマブ１００ｍｇ／ｍＬ製剤の耐容性を製剤Ｆ７（５０ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤）と比較した。得られたデータは、５０ｍｇ／ｍＬ製剤（Ｆ７）に比較して皮下注射後の注射部位で１００ｍｇ／ｍＬ製剤の耐容性が改善されるという驚くべき結果を裏付けた。
【０２６９】
注射部位の疼痛等の皮下注射に伴う副作用を抑えるように新規１００ｍｇ／ｍＬ製剤を最適化した。注射部位の疼痛は注射針穿刺に関連する疼痛と、皮下デポーへの溶液注入に関連する感覚の両者を含む。文献から入手可能なデータによると、所定の注射針設計が注射部位の不快感を軽減するために有利であると思われたが、製剤寄与に関する明白なデータは入手できなかった（例えばＣｈａｎ，Ｇ．Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ７６（４）：３９８−４０４参照）。
【０２７０】
ラット疼痛モデルを使用した本発明者らのデータによると、新規１００ｍｇ／ｍＬ製剤は現在市販されているＨｕｍｉｒａ（登録商標）製剤に比較して同等の治療用量の皮下注射後の注射部位疼痛を軽減するのに有効であると思われた。これは新規１００ｍｇ／ｍＬ製剤の容量注射低下により達成され、患者治療の最適化と患者コンプライアンスの向上という非常に有益な効果を示した。
【０２７１】
同時に、本発明者らは１００ｍｇ／ｍＬ製剤を製剤化するために許容可能な範囲内の製剤ｐＨが注射部位疼痛に影響を与えないことも確認した。興味深いことに、生理的ｐＨ範囲からかけ離れた低いｐＨ値も同様の耐容性で投与可能であった。
【０２７２】
耐容性試験に適用した方法：
足フリンチ及び侵害防御挙動アッセイ
成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを右後足への試験溶液の足裏（ｓ．ｃ．）注射前２０〜３０分間試験条件に馴化させた。足フリンチ数を記録し、注射後、最初の１０分間、侵害防御挙動（足をかばう又はなめる動作）に費やした時間を測定した。特に指定しない限り、全試験溶液は総容量１５０μＬを注射した。実験はコード化し、盲検・無作為法で行った。食塩水とカプサイシン（２．５μｇ）を夫々陰性及び陽性対照として使用した。
【０２７３】
容量効果
足フリンチ応答に及ぼす注射容量の影響をプラセボ及び試験製剤Ｆ７の両者で試験した。物理的容量を減らすことにより応答を改善できるか否かを調べるために、注射容量の変動（１０μｌ、５０μｌ及び１５０μｌを足裏注射）がフリンチ結果に及ぼす影響を試験した。
【０２７４】
試験データから容量効果を以下のようにまとめることができる：１５０μｌではプラセボ（３２±１２）とＦ７の両者で食塩水（４±２）に比較してフリンチが有意に増加したが、容量を減らすと、食塩水と区別がつかなかった。１５０μＬという高い注射容量では高いフリンチ応答が常に生じたが、低容量（１０μＬ及び５０μＬ）では有意に低い応答となった。
【０２７５】
この結果から、注射容量を減らすと刺激が低下すると思われ、Ｆ２及びＦ６等の高濃度製剤はＦ７等の低濃度製剤に比較して耐容性及び疼痛感覚に関して有利であると考えられる。
【０２７６】
【表３１】
2012526121.tif 000036
【実施例１０】
【０２７７】
耐容性／疼痛に及ぼすアダリムマブ含有溶液のｐＨ効果
アダリムマブを含有する活性溶液で別の実験を実施した。試験した製剤はＦ２（ｐＨ５．２）、生理的条件により近いｐＨ値の対応する製剤であるＦ５及びＦ７とした。
【０２７８】
データによると、ｐＨは足フリンチ応答と侵害防御挙動に費やされた時間を使用して測定した動物応答に影響を与えないと思われた。陽性及び陰性対照データは予想範囲内であった。製剤ｐＨが低い（即ち酸性）ほど、特に皮下注射による非経口投与後に不耐容及び疼痛感覚の危険が増すことは文献から周知である。従って、Ｆ２及びＦ５アダリムマブ製剤では、製剤ｐＨが耐容性及び／又は疼痛感覚に影響を与えないことは意外であった。これは製剤ｐＨ、物理的安定性及び凝集物濃度（潜在的に免疫原性の危険に相関する）等の他のパラメーターに製剤化意志決定に関する高い優先性を与えることができるので、非常に有益である。
【０２７９】
【表３２】
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【実施例１１】
【０２８０】
アダリムマブ不含溶液の製剤ｐＨ効果の影響
製剤組成の影響（例えばリン酸塩等の緩衝液、マンニトール等の添加剤、又はポリソルベート８０等の界面活性剤の影響）を試験するために、別の実験を実施し、蛋白質不含製剤で同様のデータを得た。プラセボ溶液のｐＨを約５〜７の範囲で変動させた処、驚くべきことに、ｐＨの異なる製剤で認められたフリンチ応答は同様であったため、疼痛改善効果はないとも思われた。上記に説明したように、これにより製剤処方者は製剤ｐＨ、物理的安定性及び凝集物濃度（潜在的に免疫原性の危険に相関する）等の他のパラメーターに製剤化意志決定に関する高い優先性を与えることができるので、バイオ医薬品製剤開発において非常に有益である。
【０２８１】
【表３３】
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要約すると、上記データは耐容性を低下0---)--------------)---------+--及び／又は疼痛感覚を増加せずに一定範囲のｐＨでこれらの高蛋白質濃度の粘性溶液を低容量で投与できるという１００ｍｇ／ｍＬアダリムマブ製剤の利点を明白に立証するものである。
【０２８２】
文献援用
本願の随所に引用する全引用文献（例えば、文献資料、特許、特許出願及びウェブサイトを含む）の内容は任意目的でその全文を特に本願に援用する。本発明の実施は、特に指定しない限り、当分野で周知の蛋白質製剤の従来技術を利用する。
【０２８３】
等価物
その趣旨又は本質的特徴から離れずに本発明を他の特定形態で具体化することもできる。従って、上記態様は本願に記載する発明を制限するものではなく、あらゆる点で例示とみなすべきである。従って、本発明の範囲は上記記載ではなく、以下の特許請求の範囲により指定され、特許請求の範囲の等価物の意味及び範囲に該当する全変更も本願に含むものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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