(57)【要約】  本発明は、蛍光標識された抗ＣＤ３１抗体を検出することを含んでなる、被験体における腫瘍脈管構造をインビボ画像処理するための非観血法及び用途に関する。更なる態様では、本発明は、蛍光標識された抗ＣＤ３１抗体を検出することを含んでなる、被験体における抗血管新生剤の治療効果をインビボでモニタするための非観血法及び用途に関する。更には、蛍光標識された抗ＣＤ３１抗体及び被験体において抗体を検出するための近赤外画像処理のための手段を具備する、本発明の方法に用いられるキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における腫瘍脈管構造をインビボ画像処理する非観血法であって、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することを含んでなる方法。
【請求項２】
被験体における抗血管新生剤の治療効果をインビボでモニタする非観血法であって、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することを含んでなる方法。
【請求項３】
前記抗体を検出する前に、被験体に蛍光標識抗ＣＤ３１抗体が投与される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被験体が癌を患っている請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
被験体が固形腫瘍を有している請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
被験体の固形腫瘍が異種移植片、好ましくはヒト異種移植片である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験体が抗血管新生剤で処置される請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
検出が、近赤外線蛍光画像処理（ＮＩＲＦ）によって達成される請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
近赤外線蛍光画像処理が、蛍光反射率画像処理（ＦＲＩ）又は蛍光媒介断層撮影（ＦＭＴ）を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗血管新生剤が、ＶＥＧＦ-Ａ、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２又はアンジオポエチンの阻害剤である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
阻害剤が抗体、ｓｉＲＮＡ又は小分子である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１０に記載された方法の何れかにおいて使用するための蛍光標識抗ＣＤ３１抗体。
【請求項１３】
請求項１から１０に記載の方法の何れかにおいて使用するためのキットであって、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体及び被験体において前記抗体を検出するための近赤外線蛍光画像処理の手段を具備してなるキット。
【請求項１４】
被験体における腫瘍脈管構造のインビボ画像処理のための診断用組成物の調製のための、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体の使用。
【請求項１５】
被験体における抗血管新生剤の治療効果をインビボでモニタするための診断用組成物の調製のための、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（インビボ腫瘍脈管構造画像処理）
本発明は、被験体における腫瘍脈管構造のインビボ画像処理ための、非観血法（非侵襲的方法）及び用途に関し、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することを含んでなる。更なる態様では、被験体における抗血管新生剤の治療効果をモニタするための非観血法及び用途に関し、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することを含んでなる。更に、本発明の方法に用いられるキットが提供され、それは、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体、及び被験体における抗体を検出するための近赤外線蛍光画像処理のための手段を含む。
【０００２】
血管新生は、脈管形成（vasculogenesis）及び血管新生（angiogenesis）を通じて起こる。脈管形成は、胚発生の間、血管芽細胞として知られる前駆細胞からの、血管内皮細胞のデノボ分化である。
【０００３】
この過程は、既存のものからの新しい血管の出芽によって特徴付けられる再構成プロセスである血管新生の過程と異なる（Folkman and D'Amore, Cell 1996; Vol. 87: 1153-1155; Risau, Nature 1997; Vol. 386: 671-674）。脈管形成が初期の胚発生の間のみで起こると、常に広く信じられてきた。最近の研究は血管内皮前駆幹細胞の存在を明らかにし、またこれらの骨髄由来細胞が、創傷した角膜、虚血性下肢及び腫瘍の脈管構造を含む、成人の新生血管（neovascular foci）に組み込まれることが明らかとなり、これは脈管形成が成人に起こることが出来ることを示唆する（Asahara等, Science 1997; Vol. 275: 964-967; Shi等, Blood 1998; Vol. 92: 362-367）。
【０００４】
血管新生は、しかしながら、胚発生の間に起こり、成人では限られた範囲内であり、例えば女性生殖系において、生理学的創傷治癒において、及び癌等の病理学的疾病プロセスにおいて等である。（Klagsbrun and Moses, Chemistry & Biology 1999; Vol. 6:217-224）。
【０００５】
血管新生は、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）等の様々な成長因子によって刺激される。血管新生刺激因子への初期反応は、例えばマトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのメンバ等のプロテアーゼによる、内皮細胞基底膜の劣化である。ＭＭＰｓは、コラーゲン及び他の細胞外マトリックス構成要素を劣化させる（図１を参照）。基底膜バリアを破壊することは、内皮細胞が、既存の血管から血管新生刺激の方へ遊走し、増殖することを可能にする（Marsh, Stem Cells 1997; Vol. 15: 180-189）。脈管細胞接着分子は、細胞-細胞外マトリックス相互作用を仲介することにより内皮細胞遊走に貢献する。主要メディエータの内の一つは、インテグリンαｖβ３であり、フィブロネクチン等のタンパク質の受容体である。インテグリンαｖβ３のアンタゴニストは、新しい血管の成長を阻害し、細胞接着が血管新生における重要なステップであることを示唆する（Brooks等, Cell 1994; Vol. 79: 1157-1164）。遊走及び増殖の後、内皮細胞は、明瞭なルーメンを有する管を組み立てる。成熟した血管を造ることにおける重要な工程は、間葉細胞の動員と、新しく形成する脈管構造を安定させると考えられる平滑筋細胞様周皮細胞への、それらのその後の分化である。これらの周皮細胞は、内皮叢によって段階的に引き寄せられ、血管樹の漸進的な被覆へと導く（Benjamin等, Development 1998; Vol. 125:1591-1598）。この期間の間、非被覆の毛細管の後退が生じ、周皮細胞被覆の取得の後停止する。血管新生の後期は、従って、非保護血管が取り除かれ、周皮細胞に覆われた血管が安定化し、不安定化及び後退しにくくなる、再構成ステップによって特徴づけられる。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、おそらく内皮細胞源に由来し、内皮細胞と結合する周皮細胞を動員し血管安定性を増加する（Lindahl等, Science 1997; Vol. 277: 242-245）。血管新生における上記の工程は、また、図１にて例示される。
【０００６】
脈管形成及び血管新生、特に新血管新生（neo-angiogenesis）は、正常発生においてだけでなく、例えば腫瘍形成等における異常発生においても生じるプロセスである。すなわち、腫瘍細胞の増殖及び生存は、増殖因子の十分な供給及び毒素分子の除去に依存する。固形組織において、酸素は、例えば１５０〜２００μｍだけ毛細管から放射状に拡散することが出来る。
【０００７】
距離がこれを上回る場合、細胞死が後に続く（Vincent等, CANCER-Principles & Practice of Oncology, 5th Edition; Lippincott-Raven）。このように、直径２ｍｍを越えた腫瘍塊の拡張は、十分な血液供給の展開に依存する。多くの刊行物が、腫瘍血管新生の現象を記載する。腫瘍が、例えば角膜等の無血管領域内に、又はニワトリ絨毛尿膜等の特徴的に血管に富んだ表面上に移植されることが出来、何れの場合においても新しい毛細管の内方成長を形成するという観察は、腫瘍は、休止脈管構造に毛細管発芽を開始する信号を送ることが出来る、拡散性の血管新生活性化因子を放出することを示唆する（Hanahan and Folkman, Cell 1996; Vol. 86: 353-364）。
【０００８】
この数年で、血管新生の多くの誘導因子及び阻害因子が、例えば増殖分析及び走化性分析等の多くのインビトロ及びインビボ生物検定を用いて識別されて来た。増殖分析は、培養された毛細管内皮細胞を使用し、増加した細胞数又は放射標識された又は修飾されたヌクレオシドの組込みを測定し、Ｓ期の細胞を検出する。一方、走化性分析は、多孔質膜円板によって内皮細胞と試験溶液を分離し、バリアを超えた内皮細胞の遊走は、試験溶液に存在する化学遊走物質を示す（Hanahan and Folkman, Cell 1996; Vol. 86: 353-364）。
【０００９】
例えば角膜の移植等のインビボ分析を使用することによって、インビトロ分析は、補足されることができる。血管新生の幾つかの誘導因子及び阻害因子が、これらの分析を用いて識別された。検出された一つ目は、線維芽細胞成長因子であり、またほぼ同じ頃に分泌タンパク質が、その血管透過性を引き出す能力によって識別され、血管内皮成長因子又は脈管透過性因子（ＶＥＧＦ）と呼ばれるた（Simpson-Haidaris and Rybarczyk, Annals of the New York Academy of Sciences 2001; Vol. 936: 406-425）。両方のタンパク質（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ）が、毛細管の成長を強化することが出来、従って血管新生の有力な誘導因子となることが示された。
【００１０】
近年では、２つの関連成長因子ＶＥＧＦ-Ｂ及びＶＥＧＦ-Ｃが同定されており、また全３つのＶＥＧＦ遺伝子並びにＦＧＦが、マウス及びヒトの正常の成体臓器において広く発現され、組織ホメオスタシス並びに血管新生における役割を示唆する。ＦＧＦ及びＶＥＧＦは、膜貫通チロシン・キナーゼである内皮細胞上の受容体と結合し、従って、シグナル伝達カスケードを通して細胞調整ネットワークに連結される（Brown等, EXS 1997; Vol. 79: 233-269）。
【００１１】
ＦＧＦ及びＶＥＧＦは、多種多様なヒトで動物の癌において、一般に発現され、また、それらは、かなりの割合の腫瘍保有患者の尿及び血清において高いレベルで検出された（Simpson-Haidaris and Rybarczyk, Annals of the New York Academy of Sciences 2001; Vol. 936: 406-425）。過去数十年の間に、数多くの血管新生誘導因子が同定されたが、また、内因性血管新生阻害因子の最初の証拠も提示された。例えば、研究者は、αインターフェロン及び血小板第４因子が、内皮細胞走化性及び増殖を阻害することができることを観察し、それぞれ、走化性インビトロベースアッセイ及び角膜ポケットインビボアッセイが用いられた（Brouty-Boye and Zetter, Science 1980; Vol. 208: 516-518）。
【００１２】
上記段落は、血管新生が、内皮細胞増殖及び遊走の誘導因子及び阻害因子によって調整されることが出来るという証拠を要約する。
【００１３】
今日、阻害因子及び誘導因子のバランスが、血管新生スイッチを決定することを示唆している手掛かりがある。幾つかの手掛かりは、この仮説の基礎を提供する。第一の手掛かりは、インビトロ生物検定から得られる。上述のように、ＦＧＦ及びＶＥＧＦは、増殖及び走化性分析を用いた、毛細管内皮細胞から陽性反応を引き出す。実験は、トロンボスポンジン-１（ＴＳＰ-１）のような阻害因子の量の増加が、血管新生を妨げることを示し、十分な量の阻害因子は、正の活性因子の信号を覆し、血管新生スイッチをオフにすることを示唆する（Dameron等, Science 1994; Vol. 265: 1582-1584）。第２の手掛かりは、ヒトの癌細胞の研究から得られ、ｐ５３腫瘍抑制機能の復元が、結果とＴＳＰ-１の上方調節となり、細胞が自身で合成する血管新生誘導因子並びに加えられたＦＧＦを覆す（Dameron等, Science 1994; Vol. 265: 1582-1584）。これらの及び他の手掛かりは、正及び負の信号のバランスの変化が「血管新生スイッチ」を調停することを示唆する。
【００１４】
脈管形成及び血管新生、特に新血管新生が、腫瘍形成において鍵となる要因であることを知ることで、研究者は、最終的に腫瘍を殺す目的で、これらのプロセスを妨害することに興味を持った。従って、３０年以上前、研究者は、生存し増殖するために、腫瘍は血管を必要とし、そして、血液供給を止めることによって、癌が飢えて寛解をすることが出来ることを仮定した。
【００１５】
癌へのこの革命的なアプローチは、今日、科学研究の最も刺激的な分野の内の一つに発展した。過去数十年において研究者は、タンパク質を単離し、血管新生を調整するプロセスを解明した（Ribatti, Angiogenesis 2008; Vol. 11: 3-10）。理論的には、血管新生カスケードの各ステップは、癌治療の潜在的標的である。内皮増殖及び血管新生の、多数の特異的及び非特異的阻害因子が、単離され特徴づけられた。アメリカ合衆国にあるアメリカ国立癌研究所（ＮＣＩ）は、臨床試験において、１９の潜在的血管新生阻害剤を扱い、それらのうちの５つが、現在、第３相臨床試験にある（ＮＣＩ、アメリカ国立癌研究所の公式のウェブサイト）。非常に有望である２つの阻害剤、アンジオスタチン及びエンドスタチンは、内皮細胞の増殖を阻害する。周皮細胞線維芽細胞及び腫瘍細胞自体の増殖は、遂行されない。アンジオスタチンは、前立腺癌異種移植における９９％の腫瘍抑制を示し、エンドスタチンは、例えばルイス肺癌及びＢ１６Ｆ１０黒色腫等の幾つかのネズミ腫瘍モデルで、腫瘍退縮を示した（O'Reilly等, Cell 1994; Vol. 79: 315-328; O'Reilly等, Cell 1997; Vol. 88: 277-285）。今日では、主要な製薬会社は、有望なトピックを認識し、例えばＶＥＧＦ、ＦＧＦ又はアンジオポエチン等の血管新生活性因子を阻害する、新規な抗体を開発することに取り組んでいる。
【００１６】
幾つかの抗体が開発され、おおよそ大きな成功を伴って試験された。アバスチンは、例えば、血管内細胞増殖長因子を阻害するための抗体であり、乳癌及び大腸癌患者における阻害効果で大きな成功をした。最初の研究が公開され、ここでは、血管新生阻害剤が、悪性腫瘍の遺伝子療法で用いられた。これに加え、特定の血管新生阻害剤を用いた動物実験では、副作用はこれまでに報告されていない（ＮＣＩ、アメリカ国立癌研究所の公式のウェブサイト）。血管新生阻害剤がまた、重要な生理的機能、例えば創傷治癒等を阻害することが出来るという批判が、ＴＮＰ-４７０に対して部分的にだけ報告された。創傷治癒がマウスにおいて遅れることが示された（O'Reilly等, Science 1999; Vol. 285: 1926-1928）。エンドスタチン又はアンジオスタチンのような他の阻害剤は、マウスにおける創傷治癒又は他の生理的機能へ負の影響を示さなかった。
【００１７】
つまり、血管新生を研究するために多くの努力が成されてきた。研究者は、血管新生を調節するタンパク質を単離した。幾つかのインビトロ研究が、内皮血管の形成を調査するために実施された。過去数十年において、研究者は、血管新生がまた、腫瘍成長において主要な役割を果たすことに気付いた。動物での移植を使用した早期の研究は、腫瘍組織によって誘導された血管新生反応、血管の形成は、正常組織に誘導される形成又は創傷後の形成より大きくまた早いことを報告した。腫瘍増殖が血管新生に依存することが示されたため、会社は、腫瘍を飢えさせ寛解にする、血管新生成長因子に対する新薬を開発することに集中した。特に抗血管新生剤を用いた治療の間、腫瘍血管新生を監視するために、研究者は、異なる画像処理技術、異なる血管標的及び染料を試用した。
【００１８】
しかしながら、これまでに適用された画像処理技術は、リアルタイム状況下でのインビボ画像処理を可能にしない。例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ポジトロンＣＴ（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が、幾つかの古典的非侵襲性の画像処理技術（表１を参照）である。これらの技術は、解剖学的、形態学的、及び生理学的変化に基づいた、例えば癌等の疾病の診断を可能にする。しかしながら、これらの築き上げられた技術の内の多くは、感度を欠き、特異的ターゲティングを低減し、また分子ベースでの機能変化を示すことができず、従って、基礎研究、前臨床及びトランスレーショナル応用において、適切なツールでない。従って、疾病は、時間において遅い、形態学的に可視な時点でのみ診断されることが出来る。
【００１９】
他の画像処理技術は、脈管構造を含む腫瘍材料が被験体から得られなければならないという欠陥を有する。
【００２０】
腫瘍内の脈管系は、一般に活発な血管新生を経ており、結果として増殖する腫瘍を支えるための新しい血管の継続的な形成となる。このような血管新生血管は、血管新生脈管系は、αｖβ３インテグリン（Brooks等, Cell 1994, Vol. 79:1157-1164; 国際公開第９５／１４７１４号）及び血管新生成長因子に対する受容体（Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 1995, Vol. 129: 895-898; Lappi, Semin. Cancer Biol. 1995, Vol. 6: 279-288）を含む固有の内皮細胞表面マーカーを発現する点で、成熟脈管系と識別される。更には、腫瘍脈管構造は、腫瘍脈管構造が有窓である点で、一般的に血管と組織学的に識別される（Folkman, Nature Med. 1995, Vol. 1: 27-31; Rak等, Anticancer Drugs 1995, Vol. 6: 3-18）。このように、血管新生脈管構造は、腫瘍ホーミング分子を標的にするのに特に魅力的な標的である。
【００２１】
従って、αｖβ３インテグリン、ＶＥＧＦｓ等の血管新生成長因子及びそれらの受容体は、腫瘍脈管構造の画像処理に魅力的な標的である。米国特許第６９５８１４０号は、特に腫瘍脈管構造の画像処理の血管標的として、エフリン-Ｂ２を提案する。米国特許第６０５１２３０号は、画像処理の標的として、ＦＧＦを提案する。欧州出願公開６２７９４０号は、ＥＬＡＭ-１-１、ＶＣＡＭ-１、ＩＣＡＭ-１、ＬＡＭ-１又はＭＨＣクラスＩＩ抗原を提案する。Citrin等, Mol Cancer Ther. 2004, Vol. 4: 481-8は、エンドスタチンを提案する。Bix等, J Natl Cancer Inst. 2006, Vol. 98: 1634-1646は、エンドレペリン（endorepellin）を提案する。他の著者は、ＭＰＩのための造影剤、すなわちガドリニウムを使用することを提案する（Saban等, BMC Cancer 2007, Vol. 7:219-238）。
【００２２】
更に、被験体においてリアルタイム条件下で、腫瘍脈管構造の非侵襲性のインビボ画像処理、又は抗血管新生剤の治療効果のモニタリングを可能にする、画像処理技術、血管マーカー及び染料間の適切な関係はこれまで見つかっていない。従って、研究者は、腫瘍脈管構造画像処理について周知の技術にとどまり、腫瘍の凍結切片に免疫化学的な技術を適用する（Ninomiya等, J. Surg. Res. 2009, Vol. 154: 196-262を参照）。一部の研究者は、ＣＤ３１抗体を用いることによって、マトリゲルに補充されマウスに移植されたＨＵＶＥＣｓの運命のインビボ画像処理を適用した（Bogdanov等, Pharm. Res. 2007, Vol. 24: 1186-1192）。これらの著者は、生物工学目的のため及び薬剤開発において、マウスにおけるヒト内皮細胞の養子移植のインビボ画像処理にＣＤ３１抗体を使用することを、また、マウスモデルにおけるヒト細胞の運命の決定にＣＤ３１抗体を使用することを提案する。具体的には、これらの著者は、マウスにおいてヒト細胞の運命を追跡することを求め、マウスにおけるヒト内皮細胞に対する抗ＣＤ３１抗体の特異性を決定した。しかしながら、これらの著者は、標識ＣＤ３１抗体を用いた腫瘍脈管構造の可視化に、マウス腫瘍モデルを使用しなかった。加えて、これらの著者は、インビボでの細胞養子の運命及びインビボでの最終的な受入をモニタするために、非侵襲性の画像処理が、重要な補佐となることを提案する。従って、彼らは、更に、生物工学目的のため及び薬剤開発において、抗ＣＤ３１抗体が、マウスにおけるヒト内皮細胞の養子移植の画像処理の潜在的な造影剤となることを、またこれらの抗体が、ヒト細胞の運命の決定補助をすることが出来ることを提案する。しかしながら、これらの著者は、被験体における抗血管新生剤の治療効果を、インビボでモニタするための抗ＣＤ３１抗体の使用を提案しない。
【００２３】
ミトラ（Mitra）及びフォスター（Foster）, Neoplasia 2008, Vol. 10: 429-438は、光増感剤mono-L-aspartylchlorin-e6（ＮＰｅ６）の取込み及び腫瘍内分布を可視化するために、インビボ共焦蛍光画像処理を適用した。光増感剤は、光線力学療法において使用される。光線力学療法は、癌に対する第３レベル治療であって、３つのキー構成要素を含んでなる：光増感剤、光、及び組織酸素。このように、ミトラ及びフォスターはＮＰｅ６光増感剤の分布及びその動力学を調査した。この目的のため、彼らは、ＮＰｅ６を尾静脈によって、マウスＥＭＴ６腫瘍モデルに全身投与し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗マウスＣＤ３１抗体を用いて、脈管構造に関してＮＰｅ６を可視化した。しかしながら、ミトラ及びフォスターは、腫瘍脈管構造を可視化するために、標識抗ＣＤ３１抗体を使用しなかった。彼らは、ＮＰｅ６光増感剤の分布を可視化するために、そのような抗体を適用した。
【００２４】
ランネルス（Runnels）等, Mol. Imaging 2006, Vol.5: 31-40は、血管内皮細胞の典型的な接着分子の分子発現を可視化するために、マウスにおけるインビボ画像処理を適用した。このように、ランネルス等は、例えば、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ-１）、Ｅ-セレクチン、Ｐ-セレクチン及びＶＣＡＭ-１等に対してモノクローナル抗体を投与して、これらのタンパク質の時間的及び空間的発現を調査した。しかしながら、ランネルス等は、腫瘍脈管構造を可視化しなかった。これは、彼らは腫瘍モデルを使用せず、また脈管構造を可視化することに全く興味がなく、例えばＣＤ３１等の発現を可視化することに興味をもったからである。
【００２５】
日本特許出願公開第２００９１２６８６４号は、膜において血管を可視化することが出来る血管造影剤であって、標的指向基及び検出基と結合したポリマーである造影剤を開示する。
【００２６】
要するに、血管新生、特に腫瘍血管新生をモニタすることに利用可能な様々な画像処理技術、様々な血管標的及び多くの染料についての知識にもかかわらず、我々の知識の及ぶ限りでは、特に治療的な抗血管新生剤を用いた治療の間及び／又は後に、腫瘍血管新生の可視化及び／又は腫瘍脈管構造のインビボ画像処理のための、適切な手段及び方法を見つける必要性がまだある。より詳しくは、被験体における腫瘍腫瘍脈管構造のインビボ画像処理のため、並びに被験体における抗血管新生剤の治療効果を画像処理するために、これらの手段を適用する非侵襲性の手段及び方法を提供する必要性がまだある。それ故、本発明の技術的問題は、上記必要性に応ずることである。
【００２７】
本発明は、この必要性に取り組み、そして、該技術的問題に対する答えとして、例えばツール及びキット等の手段、並びに、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することによる、被験体における、腫瘍脈管構造のインビボ画像処理に対して及び抗血管新生剤の治療効果のインビボモニタすることに対して、これらの手段を適用する方法及び使用に関する実施態様を提供する。これらの実施態様は、ここに特徴付け及び記載が成され、実施例に例示され、また請求項に反映されている。
【００２８】
本出願の発明者は、非侵襲的に腫瘍血管新生を好ましくはリアルタイム状況下で研究すること、特に、治療的な抗血管新生剤を用いた治療の間及び／又は後に非侵襲的に腫瘍血管新生を研究することを目的とし、異なる画像処理技術、血管マーカー、これらの血管マーカーを結合するための手段、及び血管マーカーに対する結合手段の可視化を容易にする染料を適用した。彼らは、最も適切な造影剤、染料、及び腫瘍血管を可視化する画像処理技術を見つける目的で、様々な画像処理パラメータを検査し、腫瘍脈管構造をイメージングした。
【００２９】
彼らは目的を達成し、非侵襲的な腫瘍血管新生の可視化及び定量化のための手段及び方法を確立し評価した。具体的には、彼らは、異なる画像処理技術、血管マーカー、これらの血管マーカーを結合するための手段、及び試験されたこれらの血管マーカーに対する手段の結合の可視化を容易にする染料の中で、抗ＣＤ３１抗体を適用する蛍光ベースモニタリング手法が、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することによる、被験体における、腫瘍脈管構造の非侵襲的イメージング及び／又は抗血管新生剤の治療効果のモニタリングに最も適切であることを発見した。腫瘍特異性血管新生マーカーが、より適していると予想されることができたため、ＣＤ３１が、腫瘍形成の間、血管新生に対する特に適したマーカーであることは、発明者にとって驚くべきであった。
【００３０】
更には、ＣＤ３１は、内皮細胞、血小板、マクロファージ及びクッパー細胞、顆粒白血球、Ｔ／ＮＫ細胞、リンパ球、巨核球、破骨細胞、好中球で通常見つかる。ＣＤ３１はまた、上皮様血管内皮腫、上皮様肉腫様血管内皮腫、他の血管腫瘍、組織球性悪性腫瘍及び形質細胞腫を含む、特定の腫瘍において発現される。
【００３１】
ＣＤ３１は、また、好中球、単球、骨髄細胞、未熟リンパ球様細胞、骨髄系造血細胞、及び白血病及びリンパ腫患者からの細胞の膜、並びに血小板及び内皮細胞膜において見つかることが出来る。
【００３２】
このように、抗ＣＤ３１抗体が、多くの細胞／組織に非特異的に結合し、これによって多すぎるバックグラウンド信号を生成することが予想されることが出来た。しかしながら、発明者は、驚くべきことに逆のものを観察した。
【００３３】
要するに、開発された方法は、特に高い信号対バックグラウンド比で、腫瘍血管新生をモニタすることが可能である。それは、腫瘍脈管構造の比較を可能にし、また、腫瘍血管の発達を阻害する及び／又は腫瘍血管に異化効果を及ぼす、抗血管新生剤の能力及び／又は有効性をモニタすることが出来る。
【００３４】
従って、第一の態様では、本発明は、被験体における腫瘍脈管構造のインビボ画像処理の非観血法に関し、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することを含んでなる。本願明細書において記載されている方法及び用途は、リアルタイム画像処理を可能にし、つまり、脈管構造、特に腫瘍脈管構造が直接可視化され、画像の形成における遅延等が必要でない。従って、脈管構造、特に腫瘍脈管構造のいかなる変化も、直接（オンライン）可視化されることが出来る。リアルタイム画像処理の利点は、例えば抗血管新生剤の効果が、この種の薬物の投与の直後にモニタされることが出来るということである。
【００３５】
用語「腫瘍脈管構造のインビボ画像処理」は、また、腫瘍形成の間に生じる血管新生のインビボ画像処理又はインビボモニタリングを含む。それはまた、血管、特に腫瘍血管のインビボ画像処理又はインビボモニタリングを含む。
【００３６】
具体的には、適用される方法は、標的特異性であり、適切に血管を可視化すると判明した蛍光標識抗ＣＤ３１抗体に基づく。発明者によって示されたように、ＣＤ３１は、腫瘍脈管構造を可視化するために特に有用なマーカーであり、それは、ＣＤ３１が血管新生の間、特に腫瘍形成における血管新生の間、発現されるマーカーだからである。
【００３７】
より具体的には、異なる標的薬剤、抗体ベースの又は非ペプチドの分子が、血管成長及び分布の画像処理のために検査された。全ての薬剤が、血管新生において重要な役割を有し、また薬剤開発の重要な標的である。それらは、インビトロ試薬より厳しい設計基準に向かう。基本的な潜在的な難しさは、高い標的体バックグラウンド比でそれらを設計することである。例えば、非特異性の組織管外溢出、マクロファージによる内部移行、又は腎臓又は肝臓排出は最小限であるべきであり、興味の領域で、高い局所濃度が得られなければならない。これらの理由から、ａｌｅｘａ標識の複数コピーではあるが、特定の標識化デザインの基礎をなすｍａｂ３-ａｌｅｘａ６４７、抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０及びｍａｂ７-ａｌｅｘａ７００が単一の抗体（約１／３の比率で）に対して使われた。第四の造影剤、ＩｎｔｅｇｒｉＳｅｎｓｅ６８０は、標的化された蛍光造影剤であり、強力な選択的非ペプチド小分子インテグリンαＶβ３アンタゴニスト及びＮＩＲ蛍光色素を含んで成る。これは、新脈管構造（neovasculature）並びに腫瘍細胞における、細胞-細胞外マトリックス相互作用を仲介することにより内皮細胞遊走に寄与する、細胞接着分子であるインテグリンαＶβ３発現の可視化のために開発された。Ｍａｂ３-ａｌｅｘａ６４７を用いた画像処理結果は、強く且つ腫瘍に集中した信号を示したが、Ｎｕａｎｃｅ画像処理研究は、抗体が腫瘍細胞と関係していることを示したが血管は検出されることが出来なかった（図１６Ａを参照）。Ｍａｂ３-成長因子複合体が、サル網膜セクションの腫瘍に組み込まれることが示された。一方、抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０画像処理は、全マウス体における、抗体の規則的な分布を呈した。これは、使用されたモノクローナル抗体（抗マウスＣＤ３１）及びマウスＣＤ３１の最小限の発現により説明され得る。組織学的検査は、血管毛細管の明確な輪郭を示した（図１６Ｂを参照）。第三の造影剤ｍａｂ７-ａｌｅｘａ７００及びその血管新生成長因子標的は、肺及び肝臓において終わる全血液システムを循環すると考えられる。Ｎｕａｎｃｅ画像処理は、ネズミ・ストロマでの弱い信号強度及び少量の抗体のみを検出できた。血管は見られなかった（図１６Ｃを参照）。新脈管構造を可視化できると考えられた非ペプチド小分子であるＩｎｔｅｇｒｉＳｅｎｓｅ６８０は、使用された異種移植片において、血管新生をモニタするために適切な造影剤ではない。インビボで、それは、低標的対バックグラウンド比を有する強い信号を与える。しかしながら、この信号は、所望の血管の代わりに腫瘍細胞を標的とすることによって発生された（図１６Ｄを参照）。
【００３８】
この目的で、発明者は、抗ＣＤ３１抗体だけが、特に高いシグナル体バックグラウンド比で、血管内皮細胞に標識をつけることを観察した。
【００３９】
蛍光又は近赤外線蛍光標識構造、例えば器官又は腫瘍、の検出が可能ないかなる適切な画像処理システムが、本発明のキット、方法及び用途に用いられることが出来る。
【００４０】
好ましい画像処理システムは、本願明細書（図５を参照）において記載されているＭＡＥＳＴＲＯシステムであり、腫瘍での血管新生を含む腫瘍脈管構造を調べるための、標的特異的なインビボライブ画像処理を可能にする。これに加え、１匹のマウスで同時に、標的特異的な信号（signals）を決定することが可能である。プログラムは、２つの発光スペクトルを分け、異なる色で両試薬を可視化することが可能である。更にまた、信号強度が、比較されることが出来、標的濃度及び分布について結果を出すことが出来る。ＨＥＲ２受容体に結合する、ヒト化モノクローナル抗体であるハーセプチンは、ａｌｅｘａ７００で標識され、等濃度で抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０と共に注入され、異なる発現パターン及び画像処理システムの感度が検査された（図１７を参照）。蛍光信号は分離されそして、信号強度の比較は、ＣＤ-３１信号がハーセプチン-ａｌｅｘａ７００のものより１００倍に弱いことを示した（図１７Ｅ-Ｆを参照）。これらの結果は、本願明細書において記載される、エクスビボＮｕａｎｃｅ画像によって確認された。ハーセプチンは、腫瘍細胞表面に集中し、血管毛細管を表すマウスＣＤ３１＋内皮細胞より、非常に多く存在した。
【００４１】
理想的な画像処理条件のために、高い標的対バックグラウンド比が所望される。低減された循環造影試薬の投与、及び最低限の非特異的結合が、最高の画像処理結果のために必要である。逆に、腫瘍内での標的特異的濃度は、最大であるべきである。IntegriSense680の画像処理結果は、経時の、バックグラウンド信号の減少を示した。試薬注入２時間及び５時間後の画像図は、循環蛍光剤又は非特異的結合により生じる高いバックグラウンド信号を示した（図１８を参照）。後に、これらのプローブは、代謝され、その後除去されることが出来る。
【００４２】
ＭＡＥＳＴＲＯ画像処理システムは、平面蛍光反射画像処理システムであって、従って、近赤外線の組織透過は制限される。蛍光信号の強度は、マウス組織におけるそれらの位置（深さ）に依存する。皮下腫瘍のような上方組織部の信号と比較した、肝臓、脾臓、腎臓及び肺のような器官の造影剤の信号は、正確に定量化されることが出来ない。腫瘍及び排泄器官において、インビボライブ画像処理から得られたＭａｂ３-ａｌｅｘａ６４７信号の強度は、Ｎｕａｎｃｅシステムを用いたエクスビボ研究における信号分布と相関しなかった。インビボ研究が、腫瘍において最も高い薬剤濃度を呈した一方、外植臓器の蛍光検査は、肝臓、腎臓及び脾臓において、より高い又は少なくとも類似の濃度を見せた（図１９を参照）。これらの結果は、信号強度が造影剤の組織深度に非常に依存しているという理論に一致する。
【００４３】
要するに、血管新生標的に特異的な幾つかの造影剤が、インビボ蛍光画像処理、好ましくは近赤外線画像処理を使用して、インビボ且つ非侵襲的に、腫瘍血管新生をモニタするために評価された。画像処理プローブは、それらのマーカーの感度及び特異性を試験するために、ＭＡＥＳＴＲＯシステムを用いてインビボで、また、場合によっては、ホルマリン固定されたパラフィン包埋腫瘍切片においてエクスビボに評価されることが出来る。内皮細胞及び腫瘍の血管性（vascularity）の同定は、次の研究の必要条件である。抗ＣＤ３１マーカーだけが、血管内皮細胞に、特に高い信号対バックグラウンド比で標識する（図２８を参照）。それは、また、一つの血管のエクスビボでの可視化を、定量化プロセスの出発点として可能にする。
【００４４】
本発明は、また、本願明細書において記載するように、被験体における、腫瘍脈管構造のインビボ画像処理、又は抗血管新生剤の治療効果をインビボでモニタすることに加えて、標識抗体を、ここに記載される何れかの画像処理技術を用いて検出することにより、被験体において、標識された抗ＣＤ３１抗体の位置が、モニタ／画像処理されることが出来ることを検討する。
【００４５】
この更なる態様は、抗体の位置に関する全体像を提供する。例えば、抗体がまた、血中、特に血清中、腎臓、膀胱中等にあるかどうかに関してモニタされることが出来る。従って、抗体の、特異性、半減期、分布、その他についても評価することが出来る。
【００４６】
請求された方法及び用途において、抗体は、非経口に、好ましくは静注で被験体に、好ましくは、治療の間異なる時点にて投与され、また、蛍光画像処理システムによって、好ましくは近赤外線蛍光画像処理システムによって、例えば蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）システム、又は蛍光媒介トモグラフィー（ＦＭＴ）システムによってインビボで画像処理される。
【００４７】
本発明の実施に際して有用であるＮＩＲ蛍光測定のための画像処理システムは、概して３つの基本要因：（１）近赤外線光源、（２）蛍光色素励起のために使用される光からの蛍光放出を分ける又は識別するための手段、及び（３）検出システムを一般的に含む。
【００４８】
光源は、単色（又は実質的に単色）の近赤外線を提供する。光源は、適切にフィルタされた白色光、すなわち広帯域光源からの帯域通過光でありえる。例えば、１５０ワットのハロゲン灯からの光は、Omega Optical（Brattleboro, VT）から市販されている、適切なバンドパスフィルタに通されることが出来る。幾つかの実施形態では、光源はレーザーである。例えば、Boas, D.A.,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, Vol. 91: 4887-4891; Ntziachristos, V.,等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, Vol. 97: 2767-2772; Alexander, W., J. Clin. Laser Med. Surg. 1991, Vol. 9: 416-418を参照。
【００４９】
高域フィルタ（７００ｎｍ）が、励起光からの蛍光放出を分けるために用いられることが出来る。適切な高域フィルタが、Omega Opticalから市販されている。
【００５０】
一般に、光検出システムは、集光／画像形成要素及び光検出／画像記録要素を含むとして考えられることが出来る。光検出システムは、両要素を合体した一つの統合装置であってもよいが、集光／画像形成要素及び光検出／画像記録要素は、別々でありえる。
【００５１】
いかなる適切な光検出／画像記録要素、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）システム又は写真フィルムが、本発明で用いられることが出来る。光検出／画像記録の選択は、使用されている集光／画像形成要素のタイプを含む要因に依存するだろう。適切な要素を選び、近赤外線画像処理システムにそれらを組み立て、またシステムを操作することは、当分野において通常の技術の範囲内である。
【００５２】
本発明にもおいて適用されるインビボ画像処理技術は、小動物において、非侵襲性の、全体の、深部組織画像処理を提供し、蛍光光源の３Ｄ再構成を生成し、及び／又は本発明において適用される標識抗ＣＤ３１抗体の結合による、蛍光標識構造の蛍光濃度の測定を可能にする、レーザーベース３次元画像処理システムである、ＦＭＴ技術（蛍光分子トモグラフィー）を含む。該システムは、画像処理プローブのリアル分布を決定することを可能にする。平面の、二次元画像処理（図２９Ａを参照）は、腫瘍領域内で最高の抗体濃度を表すが、ＦＭＴシステムを用いた３Ｄ画像処理研究は、マウス体内における抗体分布の改良された評価を可能にする（図２９Ｂ-Ｄ及び図３１を参照）。従って、蛍光信号強度の定量化は、より実際的なアプローチで分析されることが出来る。
【００５３】
本発明の方法及び使用法を実行する時に、抗体、すなわち蛍光標識抗ＣＤ３１抗体からの信号を検出する前に、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体が、被験体に投与されることが好ましい。上記したように、治療の間の異なる時点、また、場合によっては、最初の位置と同じ位置及び／又は異なる位置での別の腫瘍の再発を排除する、コントロールの目的のため治療の後に、抗体が投与されることが予測される。また、抗体は、治療の前に腫瘍脈管構造を可視化する目的のために治療の前に、及び／又は抗血管新生剤が治療的に効果的かどうか評価するために、抗血管新生剤の治療効果をモニタする前に腫瘍を可視化するために、投与されることが出来る。
【００５４】
近赤外線蛍光画像処理システムの実施例は、添付の実施例に記載されているＭＡＥＳＴＲＯシステムである。従って、ＭＡＥＳＴＲＯシステムは、本発明のキット、方法及び用途において適用されることが出来る好ましいシステムである。
【００５５】
ＭＡＥＳＴＲＯシステムは、非侵襲性のインビボ蛍光測定を可能にする、平面蛍光反射画像処理システムである。このマルチスペクトル分析では、一連の画像が、特定の波長で捕えられる。捕えられる波長の範囲は、標本に存在する標識の、予想されるスペクトル放出範囲を包含しなければならない。結果は、「イメージキューブ（image cube）」と呼ばれる一連の画像であり、自己蛍光及び特定標識双方の個々のスペクトルを決定するために用いられるのが、この一連の画像内のデータである。生物学的興味の多くの標識は、非常に類似した発光スペクトルを有し、高価な狭帯域フィルタを使用した分離が難しい又は不可能である。一つのロングパス放出フィルタ（emission filter）は、放出フィルタの大きなコレクションを交換する。皮膚、毛皮、皮脂腺の天然の自己蛍光に加えて、共生生物（菌類、ダニ、その他）及び摂取食物（葉緑素）からの異なった自己蛍光がある。マルチスペクトル分析は、所望の信号及び自己蛍光の信号の発光スペクトルが分かっている限りは、放出された蛍光光の線形信号混成の数学的な解きほぐし（非混合）によって、サンプルに適用された特定のラベルから、これらの信号全てを分けることが出来る。
【００５６】
ＭＡＥＳＴＲＯシステムを用いた測定は、以下の通りに動作する：照明モジュールは白色光を励起するキセノン灯（Cermax）を備えている。下流に連結された励起フィルタ（実験者によって選ばれる）を通して、光は実験のために所望の波長範囲に区切られ、そして、画像処理モジュールに光ファイバを経て伝導される。ここでは、制限された光は、麻酔された試験動物を照らす、４つの光ファイバに分配される。ＭＡＥＳＴＲＯシステムは、自動的に最適露光時間を選択するので、露光過度の危険がない。活性化された蛍光プローブの放出された蛍光光は、放出フィルタ（表１を参照）によって選択され、液晶（ＬＣ）を通って高感度冷却ＣＣＤカメラに伝導される。液晶は、カメラを、特定波長の選択的な画像の記録を可能にする。波長測定範囲は、選択されたフィルタセット（青、緑、黄色、赤、深い赤、ＮＩＲ）に依存し、画像は１０ｎｍごとに記録される。各一つの画像のスペクトル情報は、「イメージキューブ」と呼ばれる一つの「画像パッケージ」に組み込まれる。
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【００５７】
ＭＡＥＳＴＲＯシステムを用いる分析は、以下の通りに機能する：
各記録は、４０９６の異なるグレイスケール（grey scales）において図示されることが出来る、１２ビットの白黒の画像から成り、従って、放出強度における最小差間を区別することが出来る。対照的に、ヒトの目は、３０-３５の間グレイスケールを区別することが可能である。放出強度に対するこれらの値（グレイスケール）が、波長範囲に対して示され、そして、その結果、各プローブ及び組織自己蛍光の発光スペクトルを得る。ソフトウェアは、３つの基本的な色（赤い、緑の、青い）をイメージキューブのために使用される波長範囲に再分割し、それによって、白黒画像がカラー画像（ＲＧＢ画像、図６Ｂを参照）に変わる。これらの得られたマルチスペクトル情報から、システムは、注入されたプローブ及び何れの由来からの自己蛍光を区別することが可能である。プログラムはスペクトルライブラリを使用し、ここでは各純プローブからの単スペクトル及び何れの注入無しの実験動物（Ｂａｌｂｃ／ヌード又はＳｃｉｄ Ｂｅｉｇｅマウス）を画像処理することにより得られるスペクトル（マウス自己蛍光）である。純画像及び自己蛍光の正確なスペクトルを知ることによって、システムは、全画像を所望のスペクトルに対してフィルタし、色をそれらの各々に割り当てることが可能である。生成された画像（分離合成画像（unmixed composite image））は、存在スペクトルを異なる色で示す。プローブ信号の強度分布を可視化するために、信号を疑似色で図示することが可能であるが、低強度は青、そして、高強度の領域は赤である。それの他に、プローブの信号強度の検出限度を決めることが出来て、巡回プローブの信号及び非特異的な結合を低減することを可能にする。
【００５８】
ＭＡＥＳＴＲＯシステムを用いた比較及び定量化は、以下の通りに機能する：
画像の蛍光色素分子領域を比較するＭＡＥＳＴＲＯの能力は、治療の間、腫瘍蛍光信号強度を比較することを容易にする。プログラムは、腫瘍領域における異なる信号強度の比較（比較画像）のためのツールを提供する。全ての画像は最適露光時間で撮られるので、それらは信号の強度に依存して異なる。信頼性が高い比較のためには、画像は１つの露光時間に標準化され、信号強度における差異を示すこととなる。測定領域を手動で描き変更することにより、信号強度は強度値において定量化されることが出来る。一旦測定領域が腫瘍周辺で選ばれると、複製され、比較される次の画像へ移されることが出来る。各領域は、現在の設定（ステージ高さ（stage height）及びビニング）に基づいて、ピクセル及びｍｍ２において算出される。結果として、それは、作られた測定領域内で、平均信号、トータル信号、最大信号、及び平均信号／露光時間（１／ｍｓ）に関する情報を伝える（図７を参照）。
【００５９】
本発明の方法、用途及びキットにおいて好ましくは適用される、インビボ蛍光画像処理システム、特に、近赤外線蛍光画像処理システムは、インビボ信号の比較及び定量化を可能にし、例えば、脈管構造、特に腫瘍脈管構造のインビボ画像処理を可能にするだけでなく、経時における、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体信号の増加又は減少によって、示され比較されることが出来る抗血管新生剤の効果のインビボ画像処理を可能にする。すなわち、血管の増加又は減少が、ＣＤ３１への、標識された抗ＣＤ３１抗体の結合によって可視化され、すなわち、血管新生／血管が少ないと、抗体によって提供される信号も少なく、同様に、血管が多いと、抗体によって提供される信号も多い。
【００６０】
エクスビボでの実験が、インビボデータを確認するために適用された。特に、腫瘍は、腫瘍部を蛍光顕微鏡で検査するために、外植されて、パラフィンに固定され封埋された。
【００６１】
従って、本発明の好ましい態様において、本願明細書において記載されているキット、方法及び用途は、目的のために適した何れかの技術、例えば、免疫化学、免疫組織化学、組織学的技術、例えば組織染色、又はｍＲＮＡ発現プロファイリングによって、インビボデータの確認を含むステップを含むことが可能である。
【００６２】
具体的には、組織染色のために、腫瘍は外植され、断片がパラフィンに準備、固定、封埋され、そして、例えば、添付の実施例により詳細に記載される、ヘマトキシリン・エオシンで染色される。このように染色された腫瘍切片は、例えばＮｕａｎｃｅ（登録商標）システムによって、エクスビボに画像処理される。
【００６３】
Ｎｕａｎｃｅカメラを用いたマルチスペクトル画像処理技術は、パラフィン又は凍結切片において高感度画像を得て、スペクトル放出の微妙な差の定量的及び高感度の測定を可能にする。Ｎｕａｎｃｅは、２つの利点がある。第一に、明視野画像処理が可能であり、また優れたカラーカメラとして作用することが出来る。第２に、蛍光顕微鏡検査において、多くの組織切片でそうである、自己蛍光であるサンプルにおいて、Ｎｕａｎｃｅは、フィルタ・セット及びマルチスペクトル分析を用いて、組織の自己蛍光を興味がある信号から分離する。Ｎｕａｎｃｅシステムは、また、添付の実施例に記載されており、また本発明のキット、方法及び使用法に適用される好ましい実施態様である。
【００６４】
腫瘍説明のための実施例では、動物が犠牲にされ、そして腫瘍が、専門のガイドライン（ＧＶＳｏｌａｓ、Ｆｅｌａｓａ、ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って外植される。動物を殺した後、腫瘍は、例えばメスを使用して外植されて、包埋カセットに移されるか、又は免疫組織化学応用にはイソペンタンを用いて、ｍＲＮＡ／ＰＣＲ応用にはイソペンタン無しで液体窒素において瞬間冷凍される。
【００６５】
固定のための実施例では、外植された腫瘍は包埋カセットに入れられ、そして、好ましくはおよそ２４時間、ホルマリンにおける連続的な撹拌の下、インキュベートされる。その後、ホルマリンは廃棄され、腫瘍は蒸留水で洗われ、続いて腫瘍の脱水及びパラフィンの浸透となる。全てのインキュベーション・ステップは、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（登録商標）VIP Vacuum Infiltration Processorを使用して実行される。
【００６６】
パラフィン浸透の後、腫瘍は、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（登録商標）パラフィン包埋ステーションを用いて、流動パラフィンに包埋され、最終的な組織学的ブロックとなる。厚さ２-８μｍの範囲のパラフィン切片が、ミクロトームを使用してこれらのブロックから得られる。それらは、切断され、ガラススライド上に取り込まれ、３７の°Ｃで一晩空気乾燥され、続いて、脱パラフィン及びＨＥ染色される（実施例４．１０及び表６及び７を参照）。スライドは、Ｎｕａｎｃｅシステムで検査される。
【００６７】
更に、本発明は、また、好ましい態様で、腫瘍切片における蛍光標識血管を定量化する方法を提供する。この定量化は、本発明の方法及び用途において、更なるステップとして適用されることが出来る。
【００６８】
具体的には、腫瘍セクションは、腫瘍の組織染色の関連で、本願明細書、上記されたように準備される。それにより、パラフィン切片における血管密度の定量化は、Ｋ-平均-クラスタリングを用いて抗ＣＤ３１信号を分離する、カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを用いて実行される（図１０Ｂを参照）。フィルタ処理された特定の信号は、二値画像に変換され、それから妨害信号を取り除くために「浸食」される（浸食関数（erosion function））。画像を反転させた後（図１０Ｃを参照）、手動で血管外観の領域を定めることが可能である。プログラムは、関心の領域を赤に示し（図１０Ｄを参照）、そして、記録された画像内で血管領域のパーセンテージを算出する。
【００６９】
この血管定量化ツールは、スライド当たりの血管域のパーセンテージを可能にする。このツールは、システムが人工知能によって自動的に血管域を識別しまた算出するように、適用されることが出来ると想定される。システムは、血管域と非特異的信号を区別し、包埋された血管域を算出することが可能である。
【００７０】
免疫組織化学に関しては、非標識抗ＣＤ３１抗体が、非経口に注入、好ましくは静注され、好ましくは抗体の注入後２４時間頃に、腫瘍は外植され、例えば液体窒素及びイソペンタン内で、瞬間冷凍され、そして薄片にされる。非標識抗ＣＤ３１抗体は、非標識抗ＣＤ３１抗体のＩｇサブタイプに対する二次抗体、例えばヤギ抗マウスＩｇＧ、を用いて識別される。この技術は、添付の実施例において更に詳細に記載され、本発明のキット、方法及び用途の好ましい実施態様である。
【００７１】
免疫組織化学のための実施例として、腫瘍血管は、全体腫瘍切片を通して可視化され、非標識内皮抗体（マウス、ハムスター、ネズミ、その他からの抗マウス-ＣＤ３１）は、被験体に注入される。例えば、マウスでは、ハムスターからの非標識抗マウスＣＤ３１は、５０μｇ／マウスの濃度において注入される。腫瘍は、注射後２４時間で外植されて、液体窒素及びイソペンタンで瞬間凍結された後、薄片にされる。非標識血管マーカーは、二次抗体（ヤギ抗ハムスターＩｇＧ）アルカリホスファターゼ・システムを使用して識別される（図９を参照）。スライド走査は、全体腫瘍切片の可視化を可能にする。
【００７２】
免疫組織化学応用のために、腫瘍は、切除の直後に、イソペンタン及び液体窒素において瞬間冷凍され、切片化まで−２０°Ｃで保持される。例えば、１０のμｍの腫瘍凍結切片は、Ｃｒｙｏｓｔａｔ（２８００Ｆｒｉｇｏｃｕｔ）を用いて、最適の切断温度−１８°Ｃで切断され、１分間アセトンによって固定され、空気乾燥され、そして免疫組織化学応用のために使われる。
【００７３】
免疫染色手順及びスライトスキャン（slight scan）は、係属中の実施例において詳述される。
【００７４】
ｍＲＮＡ発現プロファイリングに関して、腫瘍は、外植されて、例えば液体窒素（イソペンタン無し）で瞬間冷凍される。腫瘍は、当分野において一般的に公知であり更に添付の実施例に示される方法に従って、溶解され、ホモジナイズされＲＮＡが調製された。その後、ｃＤＮＡが準備され、血管新生成長因子、例えばＦＧＦ、ＶＥＧＦ-Ａ、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ等、それらの受容体、例えばＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２等、及び／又はアンジオポエチンの発現が、定性的及び／又は定量的に分析される。定量的発現分析のローディング・コントロールとして、β-アクチン又はＧＡＰＤＨのような典型的なハウスキーピング遺伝子が、用いられることが出来る。
【００７５】
ｍＲＮＡ発現プロファイリングの好ましい実施態様は、添付の実施例により詳細に記載される。それは、例えば、腫瘍サンプルにおいて、ＶＥＧＦ-Ａ、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ１及び／又はＡｎｇ２等の、血管新生に関与する遺伝子の存在及び／又は発現レベルを決定することによって、本願明細書に記載されているもののような治療的抗血管新生剤の効果をモニタするために用いることが出来る。従って、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、本発明のキット、方法及び用途の好ましい実施例であり、例えば更なる、つまり付加的なステップに適用されることが出来る。
【００７６】
本発明の方法及び用途に適用される抗体は、近赤外線蛍光標識を含む蛍光標識を用いて標識される。従って、本発明のキット、方法及び用途に関して使用される場合、用語「蛍光」は、当分野で公知である又は本明細書に記載されるような蛍光標識を含み、また、近赤外線蛍光標識も含み、後者が、本発明の関連において好ましい。蛍光標識化は、蛍光色素分子の化学的に反応性な誘導体を使用して達成される。一般的な反応基は、アミン反応性イソチオシアン酸塩誘導体、例えばＦＩＴＣ及びＴＲＩＴＣ（フルオレセイン及びローダミンの誘導体）、アミン反応性サクシニミジルエステル、例えばＮＨＳ-フルオレセイン、スルフヒドリル反応性マレイミド活性化フルオル（fluors）、例えばフルオレセイン-５-マレイミを含む。これらの反応性染料の何れかと、別の分子との反応は、蛍光色素分子及び標識分子間に形成される安定化した共有結合となる。このように、本発明の抗体は、上述した蛍光標識によって標識されることが出来る。本発明によって想定される他の適切な蛍光標識は、アレクサフルオル（Alexa Fluors）、ダイライトフルオル（Dylight fluors）、ＡＴＴＯ色素（ATTO Dyes）である。同様に、ＧＦＰ、ＹＦＰ又はＣＦＰのような蛍光タンパク質が、用いられ得る。また、ｐＨ変化又は電圧、温度によって活性化される、活性化可能な蛍光染料が使用されると想定される。標識抗ＣＤ３１抗体が、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の、複数の蛍光又は近赤外線蛍光標識を含むことが想定される。同様に、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の異なる蛍光又は近赤外線蛍光標識抗ＣＤ３１抗体が、本発明のキット、方法及び用途に適用されることが想定される。ＣＤ３１に結合するこれらの異った抗体は、しかしながら、異なるエピトープと結合し得る。
【００７７】
別法では、本発明の抗ＣＤ３１抗体は、間接的に標識されることが出来る。例えば、非標識抗ＣＤ３１抗体は、非標識抗体に指向される二次抗体によって標識され（非標識抗体の定常領域への結合による）、二次抗体は、蛍光信号を与える。
【００７８】
上述したように、本発明のキット、用途及び方法に適用される抗体は、また、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光標識を用いて標識されることが出来る。近赤外線スペクトルの励起及び放出波長を有するＮＩＲ蛍光標識が使用され、つまり６４０−１３００ｎｍ、好ましくは６４０−１２００ｎｍ、より好ましくは６４０−９００ｎｍである。電磁スペクトルのこの部分の使用は、組織透過を最大にし、また、例えばヘモグロビン（＜６５０ｎｍ）及び水（＞１２００ｎｍ）等の生理学的に豊富な吸収物による吸収を最小化する。インビボ用途のための理想的な近赤外線の蛍光色素は：
（１）狭いスペクトル特徴、
（２）高感度（量子収量）、
（３）生体適合性、及び、
（４）切り離された吸収及び励起スペクトル
を呈する。
【００７９】
様々な近赤外線（ＮＩＲ）蛍光標識は、市販され、また本発明によるプローブを調製するために使用することが出来る。例示的な典型的なＮＩＲＦ標識には、以下が含まれる：Ｃｙ５．５、Ｃｙ５及びＣｙ７（Amersham, Arlington Hts., IL）；ＩＲＤ４１及びＩＲＤ７００(LI-COR, Lincoln, NE)；ＮＩＲ-Ｉ(Dejindo, Kumamoto, Japan)；ＬａＪｏＩＩａ Ｂｌｕｅ (Diatron, Miami, FL)；インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）及びその類似体(Licha, K.,等, SPIE-The International Society for Optical Engineering 1996; Vol. 2927: 192-198;米国特許第５９６８４７９号）；インドトリカルボシアニン（ＩＴＣ；国際公開第９８／４７５３８号)；及びキレートランタニド化合物及びＳＦ６４、５−２９、５−３６及び５−４１ (国際公開第２００６／０７２５８０号から)。蛍光ランタニド金属は、ユウロピウムと、テルビウムとを含む。ランタニドの蛍光特性は、Lackowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Kluwer Academic, New York, (1999)に記載されている。
【００８０】
本発明の抗体は、好ましくは、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＩＲＤ４１、ＩＲＤ７００、ＮＩＲ-Ｉ、ＬａＪｏＩＩａ Ｂｌｕｅ、インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ），インドトリカルボシアニン（ＩＴＣ）及びＳＦ６４、５−２９、５−３６及び５−４１（国際公開第２００６／０７２５８０号から）の群から選択されるＮＩＲ蛍光標識によって、標識され、より好ましくは、前記抗体は、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５及びＣｙ７の群から選択されるＮＩＲＦ標識を用いて標識される。
【００８１】
ＮＩＲ蛍光標識の結合のために使用する方法は、公知技術である。抗体へのＮＩＲ蛍光標識のコンジュゲーション技術は、これまでの間著しく成熟し、またすばらしい概要が、Aslam, M., and Dent, A., Bioconjugation (1998) 216-363, London, and in the chapter "Macromolecule conjugation" in Tijssen, P., "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), Elsevier, Amsterdamに与えられる。
【００８２】
適切な結合化学が、上記の引用文献（Aslam、上記）から知られる。ＮＩＲ蛍光標識は、どの結合部分が存在するかに依存し、水性又は有機媒体のどちらかで、抗体と直接反応されることが出来る。結合部分は、抗体への蛍光色素標識の化学的な結合のために使用される反応基又は活性化基である。蛍光色素標識は、抗体に直接接着されるか、又はスペーサーを介して抗体に連結され、抗体及びＮＩＲ蛍光標識を含んで成るＮＩＲ蛍光標識コンジュゲートを形成する。使用されるスペーサは、本質的に、適切に長いインビボ持続性（半減期）を有するように選択、又は設計されることが出来る。
【００８３】
本願明細書において用いられる被験体は、哺乳類及び非哺乳類の被験体を含む。治療のための「哺乳類」は、哺乳類として分類されるいかなる動物を意味し、ヒト、家畜（domestic animals）及び家畜（farm animals）、非ヒト霊長類、及び乳房組織がある他のいかなる動物も含む。哺乳類は、ヒト、齧歯動物、例えばマウス、ネズミ又はウサギ、イヌ、ネコ、チンパンジーその他を含み、ヒトが好ましい。被験体も、ヒト及び獣医の患者を含む。非哺乳類被験体は、例えば、鶏、カモ又はゼブラフィッシュである。本発明の方法及び用途のの好ましい態様では、被験体は、抗血管新生剤を用いて扱われる。
【００８４】
更に、本発明の発明者は、被験体における血管新生を含む腫瘍脈管構造へ向かう、抗血管新生剤の治療効果をモニタするために、本願明細書において記載されている方法及び用途を適用し、それがまた、この目的ために適当であることを発見した。
【００８５】
特に、本発明の方法及び用途は、インビボ信号の比較及び定量化を可能にし、そして、従って、抗血管新生剤の効果は、時間にわたる、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体信号の増加又は減少によって、示されまた比較されることが出来る。
【００８６】
より詳しくは、抗血管新生剤を用いた治療の間及び／又は後の、被験体における、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体信号の増加又は減少は、決定され、また、抗血管新生剤を用いた治療前の、抗ＣＤ３１抗体蛍光信号に対して比較される。
【００８７】
このように、本発明の方法及び用途は、腫瘍体積の変化及び腫瘍脈管構造の変化の間の相関に関して、データ及び／又は情報を提供し、それによって、被験体における抗血管新生剤の治療効果をモニタすることを可能にする。
【００８８】
そのように得られたデータ及び／又は情報は、更に、本願明細書において記載されるような、例えば組織染色、免疫化学又は免疫組織化学等の組織学的応用によって確認され得、そして、このように本発明の方法及び用途の更なるステップとして実行され得る。
【００８９】
代わりに又は加えて、そのように得られたデータ及び／又は情報は、抗血管新生剤の効果を明らかにするように、ｍＲＮＡ発現プロファイリングによって確認され得、そして、このように本発明の方法及び用途の追加ステップとして実行され得る。
【００９０】
本質的には、本発明の方法及び用途は、腫瘍形成の間、血管新生をモニタするために適切であり、好ましくは高い信号対バックグラウンド比を有する。それは、このように腫瘍脈管構造の比較を可能にして、そして、腫瘍血管形成を阻害及び／又は腫瘍血管を異化する抗血管新生剤の、異なる能力又は効率を示すことが可能である。
【００９１】
用語「抗体」は、本願明細書において使用する場合、免疫グロブリン又はその断片を言及し、そして、抗原結合断片又は抗原結合ドメインを含んで成るいかなるポリペプチドも含む。該用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、移植、及びインビトロ生成の抗体を含むが、これに限定されるものではない。言葉「インタクト」によって先行されないならば、用語「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂのような抗体断片、及び抗原結合機能を保持する他の抗体断片を含む。典型的には、この種の断片は、抗原結合ドメインを含む。
【００９２】
抗体、別名免疫グロブリンは、典型的には、それぞれおよそ２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖及びそれぞれおよそ５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖から成る、四量体のグリコシル化タンパク質である。ラムダ及びカッパと称される２種類の軽鎖が、抗体で見られることが出来る。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に従い、免疫グロブリンは、５つの主要なクラスに割り当てられることが出来て：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＭ、またこれらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に、更に分けられることが出来る。各軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）及び定常的（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）を含む。各重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３又は４のＣドメイン（ＣＨｓ）及びヒンジ領域を含む。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは、ＣＨ１に指定される。ＶＨ及びＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と呼ばれている比較的保存された配列の４つの領域から成り、そして、それは超可変配列（相補性決定領域、ＣＤＲｓ）の３つの領域のための足場を形成する。ＣＤＲｓは、抗原との、抗体の特異的な相互作用に対して責任があるほとんどの残基を含む。ＣＤＲｓは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称される。従って、重鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３と称され、その一方で、軽鎖上のＣＤＲ構成要素はＬ１、Ｌ２及びＬ３と称される。
【００９３】
ＣＤＲ３は、典型的には、抗体結合部位内の、分子多様性の最大の源である。Ｈ３は、例えば、２アミノ酸残基程短くあり得、又は２６アミノ酸を超えることが出来る。免疫グロブリンの異なるクラスの、サブユニット構造及び三次元構成は、当分野で公知である。抗体構造の再考察のためには、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow等, 1988を参照のこと。当業者は、各サブユニット構造、例えばＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造が、活性断片、例えば抗原に結合するＶＨ、ＶＬ又はＣＤＲサブユニットの一部、又は例えばＦｃ受容体及び／又は補体に結合及び／又はを活性化するＣＨサブユニットの一部を含むことを認識する。ＣＤＲｓは、典型的には、カバットＣＤＲｓを言及し、Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et alに記載されている。抗原結合部位を特徴づける別の基準は、超可変ループに関し、Chothia. See, e.g., Chothia, D.等; J. MoI. Biol. 1992, Vol. 227: 799-817; and Tomlinson等, EMBO J. 1995, Vol. 14: 4628-4638に記載されている。更に別の基準は、Oxford Molecular's AbM antibody modelling softwareによって用いられるＡｂＭ定義である。例えばProtein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)を参照のこと。カバットＣＤＲｓに関して記載されている実施態様は、あるいは、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ又はＡｂＭに定義されるループに対する類似に記載される関係を使用して実施されることが出来る。
【００９４】
Ｆａｂ断片（抗原を結合する断片）は、定常領域の間で、ジスルフィド結合によって、共有結合で連結される、ＶＨ-ＣＲＩ及びＶＬ-ＣＬドメインを含む。Ｆｖ断片はより小さく、非共有結合的に連結されるＶＨ及びＶＬドメインから成る。非共有結合連結されたドメインが分離する傾向を解消するために、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）が造られることが出来る。ｓｃＦｖは、（１）ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に、又は（２）ＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に連結する可撓性ポリペプチドを含む。１５-ｍｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドがリンカーとして用いられ得るが、他のリンカーが、当分野において周知である。
【００９５】
アセンブリ及び体細胞突然変異の後の抗体遺伝子の配列は非常に多様であり、これらの様々な遺伝子は、１０１０の異なる抗体分子をコードすると推定される（Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio等, Academic Press 1995, San Diego, CA）。
【００９６】
用語「抗原結合ドメイン」及び「抗原結合断片」は、抗体及び抗原の間の、特異的な結合に対して責任のあるアミノ酸を含む抗体分子の一部を言及する。抗体によって、特異的に認識されまた結合される、抗原の一部は、「エピトープ」と称される。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）から成ることが出来る；しかしながら、両方とも含む必要はない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を持ち、しばしばインタクトな抗原結合ドメインの、幾つかの抗原結合機能を保持する。抗体の抗原結合断片の例は、（１）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価の断片；（２）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を有する二価の断片；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の単腕のＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ward等, Nature 1989, Vol. 341: 544-546）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を用いて、一価の分子を形成するためにＶＬ及びＶＨ領域が対になる、単タンパク質鎖を造らせるような合成リンカーによって、それらは連結されることが出来る（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えばBird等, Science 1988, Vol. 242: 423-426; and Huston等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, Vol. 85: 5879-5883を参照）。それらの抗体断片は、当業者に周知である一般的な技術を用いて得られ、そして断片は、インタクトな抗体と同様な様式において、機能のために評価される。
【００９７】
用語「ヒト抗体」は、当分野において周知であるヒトの生殖細胞系免疫グロブリン配列に、実質的に対応している可変及び定常領域を有する抗体を含み、例えば、カバット等によって記載されているものを含む（Kabat,等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1991 NIH Publication No. 91: 3242を参照）。本発明の方法及び用途に適用されるヒト抗体は、ヒトの生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含み得、（例えば、インビトロでのランダム又は部位特定変異生成又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される変異）、例えば、ＣＤＲｓ、特にはＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体は、ヒトの生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基と交換される、少なくとも１、２、３、４、５又はそれ以上の位置を有することが出来る。
【００９８】
当業者に周知の数多くの方法が、抗体又はその抗原結合断片を得ることに利用出来る。例えば、抗体は、組換えＤＮＡ法を使用して製造されることが出来る（米国特許第４８１６５６７号）。モノクローナル抗体はまた、周知の方法に従い、ハイブリドーマの生成によって製造されることが出来る（例えば、Kohler and Milstein, Nature 1975, Vol. 256: 495-499を参照）。このように形成されたハイブリドーマは、それから、標準の方法、例えば酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラスモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））分析等を使用してスクリーニングされ、特定の抗原と特異的に結合する抗体を生産する一又は複数のハイブリドーマが識別される。特定の抗原のいかなる形態も免疫原として用いられることが出来、例えば、組換え抗原、天然に生じる型、それらのいかなる変異体又は断片、並びにそれらの抗原性ペプチドである。
【００９９】
抗体を作る１つの例示的な方法は、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリ等の、タンパク質発現ライブラリをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えば、Ladner等, U.S. Patent No. 5,223,409; Smith, Science 1985, Vol. 228:1315-1317; Clackson等, Nature 1991, Vol. 352: 624-628; Marks等, J. MoI. Biol. 1991, Vol. 222: 581-597; 国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９１／１７２７１号；国際公開第９２／２０７９１号；国際公開第９２／１５６７９号；国際公開第９３／０１２８８号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／０９６９０号；及び国際公開第９０／０２８０９号に記載されている。
【０１００】
ディスプレイライブラリの使用に加えて、特定の抗原が、非ヒト動物、例えば齧歯動物、例えばマウス、ハムスター又はネズミ等を免疫化するために、用いられることが出来る。一実施態様では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも１部を含む。例えば、ヒトのＩｇ座の大きな断片を有する、マウス抗体生産を欠いた、マウス株を設計することが可能である。ハイブリドーマ技術の使用により、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異性モノクローナル抗体が製造されまた選択され得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ, Green等, Nature Genetics 1994, Vol. 7: 13-21, 米国特許出願公開第２００３−００７０１８５号，１９９６年１０月３１日公開の国際公開第９６／３４０９６号, 及び１９９６年４月２９日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号を参照。
【０１０１】
別の実施態様では、モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得られ、そして例えば、ヒト化、脱免疫化、キメラ等の修飾抗体が、当分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して生産されることが出来る。キメラ抗体を作る種々の方法が記述されて来た。例えば、Morrison era/., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda等, Nature 1985, Vol. 314: 452, Cabilly等,米国特許第４８１６５６７号; Boss等, 米国特許第４８１６３９７号; Tanaguchi等, European Patent Publication EP 171 496; European Patent Publication 0 173 494, United Kingdom Patent GB 2177096Bを参照。例えば、ヒト化抗体はまた、例えば、ヒト重及び軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重及び軽鎖遺伝子を発現することが出来ないトランスジェニック・マウスを使用して生産されることが出来る。Winterは、本願明細書において記載されているヒト化抗体を調製するために用いられることが出来る、例示的なＣＤＲ-移植方法を記載する（米国特許第５２２５５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲｓの全てが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部と交換され得、又は、幾つかのＣＤＲｓだけ非ヒトＣＤＲｓと交換され得る。ヒト化抗体を所定の抗原に結合するために必要な数のＣＤＲｓを置換することだけが必要である。
【０１０２】
ヒト化抗体又はそれらの断片は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインからの等価配列と交換することによって生産されることが出来る。ヒト化抗体又はそれの断片を生成する例示的な方法は、Morrison, Science 1985, Vol. 229: 1202-1207;Oi等, BioTechniques 1986, Vol. 4: 214;及び米国特許第５５８５０８９号；米国特許第５６９３７６１号；米国特許第５６９３７６２号；米国特許第５８５９２０５号；及び米国特許第６４０７２１３号によって提供されている。これらの方法は、単離、操作、及び重又は軽鎖のうちの少なくとも１つからの、免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全て又は一部をコードする核酸配列を発現することを含む。このような核酸は、他の源からと同じく、上記したように、所定の標的に対する抗体を生産するハイブリドーマから得られることが出来る。ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡは、それから適当な発現ベクターにクローン化されることが出来る。
【０１０３】
ヒト化抗体は、保存的置換、共通配列置換、生殖細胞系置換及び／又は復帰変異の導入によって最適化されることが出来る。このような変更された免疫グロブリン分子は、当分野で周知の幾つかの技術の何れかによって作られることが出来（例えば、Teng等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1983, Vol. 80: 7308-7312; Kozbor et al, Immunology Today 1983, Vol. 4: 7279; Olsson等, Meth. Enzymol. 1982, Vol. 92: 3-16）、またＰＣＴ国際公開第９２／０６１９３号又は欧州出願公開第０２３９４００号の教示に従って作られることが出来る。
【０１０４】
抗体又はそれらの断片は、ヒトのＴ細胞エピトープの特定の欠失又は国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号において開示される方法による「脱免疫化」によって修飾されることが出来る。簡潔には、抗体の重及び軽鎖可変ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析されることが出来る：これらのペプチドが潜在的Ｔ細胞エピトープを表す（国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号において定義される）。潜在的Ｔ細胞エピトープの検出のために、「ペプチド・スレディング」と呼ばれるコンピュータ・モデリング方法が適用されることが出来、更に、ヒトのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースが、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフのために検索されることが出来、国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号に記載される。これらのモチーフは、１８の主要ＭＨＣクラスＩＩＤＲアロタイプの何れかと結合して、そして潜在的Ｔ細胞エピトープを選定する。検出される潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメインの少数のアミノ酸残基を置換することによって、好ましくは一つのアミノ酸置換によって、除去されることが出来る。一般的には、保存的置換が成される。しばしば、しかし、排他的にでないが、ヒト生殖細胞系抗体配列の位置に共通のアミノ酸が、用いられる。ヒト生殖細胞系配列は、例えば、Tomlinson et at., J. MoI. Biol. 1992, Vol. 227: 776-798; Cook, G. P.等, Immunol. Today 1995, Vol. 16(5): 237-242; Chothia, D.等, J. MoI. Biol. 1992, Vol. 227: 799-817; and Tomlinson等, EMBO J. 1995, Vol. 14: 4628-4638に開示される。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合的なディレクトリを提供する(compiled by Tomlinson, LA.等. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)。これらの配列が、例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲｓ等の、ヒト配列の源として使用されることが出来る。コンセンサスヒトフレームワーク領域が、また、使用されることが出来、例えば、米国特許第６３０００６４号に記載されている。
【０１０５】
同様に、本発明のキット、方法及び用途に適用される抗体は、変更された免疫グロブリン定常又はＦｃ領域を含むことが出来る。例えば、本願明細書の教示に従って生産される抗体は、例えば補体等のエフェクター分子及び／又はＦｃ受容体に、より強力に又はより特異的に結合することが出来、それは、例えばエフェクター細胞活性、溶解、補体媒介活性、抗体クリアランス、及び抗体半減期等の、抗体の幾つかの機能を制御する。抗体（例えばＩｇＧ抗体）のＦｃ領域と結合する典型的なＦｃ受容体は、限定するものではないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲｌｌｌ及びＦｃＲｎサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子多様体及び選択的スプライシング形態を含む。Ｆｃ受容体は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 1991, Vol. 9: 457-92; Capel等, lmmunomethods 1994, Vol. 4: 25-34 and de Haas等, J. Lab. Clin. Med. 1995, Vol. 126: 330-41において、総説される。
【０１０６】
更なる抗体生産技術は、Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow等, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照のこと。本発明のキット、方法及び用途に適用される抗体は、特定の源の何れか、生産方法、又は抗体の他の特別な特徴に限られる必要はない。
【０１０７】
「二重特異性」又は「二機能性抗体」は、２つの異なる重／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含む、様々な方法によって生産されることが出来る。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 1990, Vol. 79: 315-321; Kostelny等, J. Immunol. 1992, Vol. 148: 1547-1553を参照のこと。一実施態様では、二重特異性抗体は、第二の結合ドメインポリペプチドに免疫グロブリン定常領域を介して連結された、第一の結合ドメインポリペプチド、例えばＦａｂ’断片等を含む。
【０１０８】
小モジュール免疫薬（Small Modular lmmunopharmaceuticals） （ＳＭＩＰＴＭ）は、結合ドメインポリペプチドを含んでなる多様体分子の例を提供する。ＳＭＩＰｓ及びそれらの用途及び応用は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号，同第２００３／０１３３９３９号，同第２００４／００５８４４５号，同第２００５／０１３６０４９号，同第２００５／０１７５６１４号，同第２００５／０１８０９７０号，同第２００５／０１８６２１６号，同第２００５／０２０２０１２号，同第２００５／０２０２０２３号，同第２００５／０２０２０２８号，同第２００５／０２０２５３４号，及び同第２００５／０２３８６４６号、及びそれらの関連対応特許メンバに開示され、その全内容を出典明示によりここに援用する。
【０１０９】
ＳＭＩＰＴＭは、結合ドメイン-免疫グロブリン融合タンパク質を一般的には意味し、これは、免疫グロブリンヒンジ又はヒンジ作用領域ポリペプチドに、融合又はそれ以外で連結された、結合ドメインポリペプチドを含み、そして、免疫グロブリン重鎖からの一又は複数の、天然の又は設計された定常領域、ＣＨ１以外であって、例えば、ＩｇＧ及びＩｇＡ１のＣＨ２及びＣＨ３領域及びＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４領域、を含んでなる領域に融合又はそれ以外で連結される（例えば、Ledbetter, J.等による米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号を参照のこと。これは、より完全な説明のために、引用によりここに援用される）。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、天然の又は操作された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常ポリペプチド（又は、全体的にあるいは部分的にＩｇＥに由来する構造物の場合はＣＨ３）を含み、これはヒンジ領域ポリペプチド及び天然の又は操作された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（又は、全体的にあるいは部分的にＩｇＥに由来する構造物の場合はＣＨ４）に融合又はそれ以外で連結され、これはＣＨ２定常領域ポリペプチドに融合又はそれ以外で連結される（又は、全体的にあるいは部分的にＩｇＥに由来する構造物の場合はＣＨ３）。
【０１１０】
本発明のキット、方法及び用途に適用される抗体は、抗ＣＤ３１抗体である。原則として、周知の又は新しく調製された各抗ＣＤ３１抗体が適切である。抗ＣＤ３１抗体は、本願明細書において記載されている方法及び使用で適用される時に、高い信号対バックグラウンド比を有する場合、適切である。
【０１１１】
「抗ＣＤ３１」とは、ＣＤ３１を指向する、ＣＤ３１と結合する又は、ＣＤ３１と反応する抗体を意味する。指向する、結合する、又は反応するというのは、抗体がＣＤ３１と特異的に結合することを含む。これの関連において、用語「特異的に」とは、抗体はＣＤ３１タンパク質と反応するが、基本的に別のタンパク質とは反応しないことを意味する。例えば、ヒトＣＤ３１を指向する抗ＣＤ３１抗体は、マウスＣＤ３１タンパク質と好ましくは基本的に結合しない。同様に、マウスＣＤ３１に向けられる抗ＣＤ３１抗体は、ヒトＣＤ３１と好ましくは基本的に結合しない。このように、用語「別のタンパク質」は、抗ＣＤ３１抗体が指向するＣＤ３１タンパク質に、非常に関連した又は相同であるタンパク質を含む、いかなるタンパク質も含む。例えば、抗ＣＤ３１抗体がヒトのＣＤ３１を指向する場合、それが他の生物又は種からのＣＤ３１に基本的には結合しないことが好ましい。
【０１１２】
用語「基本的には結合しない」とは、本発明のキット、用途及び方法に適用される抗ＣＤ３１抗体は、別のタンパク質に結合しないことを意味し、つまり、３０％未満、好ましくは２０％、より好ましくは１０％、特に好ましくは９、８、７、６又は５％未満の交差反応性を示す。
【０１１３】
抗体が、本明細書で定義されるように特異的に反応するかは、容易に試験されることが出来、とりわけ、前記抗体のＣＤ３１タンパク質との反応と、前記抗体の他のタンパク質（一又は複数）との反応とを比較することによって成される。
【０１１４】
従って、本発明のキット、方法及び用途に適用される抗ＣＤ３１抗体は、好ましくは、ＣＤ３１に対する特異的な結合を呈する又はに特異的に結合する。本発明のキット、方法及び用途に適用される抗ＣＤ３１抗体に関連して使用される場合、用語「特異的な結合」又は「特異的に結合する」とは、２つの分子を言及し、つまり、細胞、好ましくは血管新生における腫瘍血管形成に関与する内皮細胞上に発現されるＣＤ３１、及び生理学的条件下で比較的に安定である複合体を形成する、ＣＤ３１に結合する抗体。特異的な結合は、通常、高親和性及び低から中のキャパシティを有し、通常、低親和性及び中から高のキャパシティを有する非特異的結合と区別される。一般的には、結合親和性が、約１０−１１〜１０−８Ｍ（ＫＤ）、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍである時に、結合は特異的であるとされる。
【０１１５】
ＣＤ３１は、分化分子の一群である。それは、また、血小板内皮細胞接着分子（platelet endothelial cell adhesion molecule）に対してＰＥＣＡＭ-１と呼ばれている。更に、それは、ＦＬＪ５８３９４としても知られている。このように、「ＣＤ３１」、「ＰＥＣＡＭ-１」及び「ＦＬＪ５８３９４」は、本出願において互換的に使われる。ヒトＣＤ３１タンパク質配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、受託番号ＮＰ_０００４３３で入手可能である。他種からのＣＤ３１は、当分野で周知の手段によって得られることが出来る。
【０１１６】
ＣＤ３１は、体から老いた好中球を取り除くことにおいて腫瘍な役割を果たす。マクロファージは、いかなる通過好中球も触診し、細胞が健康であるか又は摂取されなければならないかどうか決めなければならない。
【０１１７】
成熟形態において、ヒトＣＤ３１は、７１１アミノ酸配列を有し（ポリペプチド分子量：７９，５７８ダルトン）、配列番号：１１に表される。この配列は単なる例示的な配列であり、それは、用語「ＣＤ３１」が、ＣＤ３１を発現する、全哺乳類種からの分子を含むからである。
【０１１８】
通常、ＣＤ３１は、その分子量の約３９％が糖質に起因する程度にグリコシル化され、そして成熟したタンパク質は９つの推定アスパラギン連結グルコシル化部位を有する。全てのこれらの部位は、糖タンパク質細胞外ドメインに存在し、５７４のアミノ酸を有する。ＣＤ３１は、また、１９アミノ酸の膜貫通部及び１１８アミノ酸の細胞質ドメインを含む。ドメインのこの構成は、他の膜内在性糖タンパク質に典型的である細胞膜内のＰＥＣＡＭ-１に対する配向と整合する。
【０１１９】
本発明の関係において、ＣＤ３１が、可視化のために、つまり、被験体おける、腫瘍脈管構造のインビボ画像処理及び／又は抗血管新生剤の治療効果をモニタすることにおいて、特に有用なマーカーであることが分かっており、これは、ＣＤ３１が、血管新生の間、特に本願明細書において記載される血管新生の間、発現されるマーカーであるからである。
【０１２０】
用語「ＣＤ３１」は、本願明細書において用いられる場合、ＣＤ３１の全ての形（野生型、スプライシング異型、断片、誘導体、相同体、配列番号：１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも４０、５０、６０、好ましくは７０、より好ましくは８０は、更に好ましくは９０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質）を含み、ＣＤ３１の形態は、細胞の表面に発現されるのが好ましい。特に好ましいのは、内皮細胞、好ましくは、血管新生における血管形成、特に腫瘍形成における血管形成に関与する内皮細胞によって発現される、ＣＤ３１タンパク質である。
【０１２１】
ＣＤ３１を発現する細胞は、例えば、ニワトリ又はゼブラフィッシュ細胞等の哺乳動物細胞又は非哺乳類細胞であり、好ましくは、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、チンパンジ又はヒト細胞のような哺乳動物細胞であり、ヒト細胞が特に好ましい。
【０１２２】
本発明において、ＣＤ３１タンパク質の他の例示は、ＣＤ３１の一部に対応する、又は天然分子と一致することのないＣＤ３１を含む分子、及び以下に記載するように、ＣＡＭの接着促進活性を示す分子である。これらの中で、多様体は、膜貫通又は細胞内部分は持たない、ＣＤ３１の細胞外ドメイン：つまりＣＤ３１の「水溶性受容体」形に、該当するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
【０１２３】
本発明の他のＣＤ３１タンパク質は、ＣＡＭ様の接着促進活性を保持したＣＤ３１の断片である。本発明の中で同様になものは、（ｉ）ＣＤ３１アミノ酸配列の一部に該当し、（ｉｉ）後述するようなＣＤ３１に特有の活性を保持した合成ポリペプチドである。
【０１２４】
ポリペプチドが、本発明のＣＤ３１タンパク質であるかどうかは、ＣＤ３１活性のためのアッセイの手段によって通常決定されることが出来る。２つのこのような活性は、化学誘引物への応答における細胞の接着に依存した動き（走化性）、及び内皮細胞-細胞接着のそれぞれの仲介である。前者の活性は、Ohto,等, Blood 1985, Vol. 66: 873-881に従い、問題の合成ポリペプチドを結合する抗体が、また、例えば大腸菌エンドトキシン等の、適切な刺激に応じる好中球又は単球の走化性を阻害するかどうか決定することによって、評価されることが出来る。内皮細胞間の接着を調停する能力は、通常の方法で同様に評価されることが出来、つまり、ポリペプチド認識抗体が、分散された内皮細胞の適切な基質へのアンカリング、及び／又はその後の細胞間接合の形成を阻害するかどうか試験することによって評価される。
【０１２５】
「画像処理」は、本願明細書において用いられる場合、ヒトの体（又はその一部）の画像を作ることに使用される何れかの技術及び工程を意味し、好ましくは臨床目的（疾病を明らかにするか、診断するか、又は調べるための医学処置）又は医学（通常の解剖及び生理学の研究を含む）のためである。好ましくは、画像処理は、本発明の方法及び用途で適用される場合、被験体の腫瘍脈管構造の画像を作るために用いられる。
【０１２６】
画像処理は、本発明に関連してインビボで成される。「インビボ画像処理」とは生体において、画像処理又は走査技術を使用して、興味のリガンドを局在化することを意味する。従って、インビボ画像処理に適用される本発明の方法及び用途は、部分的の又は死んだ生物においては実行されない。
【０１２７】
本発明の関連において、興味のリガンドは、ＣＤ３１であって、局在化、つまり当分野で周知の適切な画像処理又は走査技術によって検出される、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体に結合されるＣＤ３１であり、近赤外線の蛍光画像処理が好ましい。
【０１２８】
本発明の方法及び使用法は、非観血的（非侵襲性）である。「非観血的（非侵襲性）」とは、被験体の皮膚に、例えば切開等の何の切断もなく、また、粘膜又は皮膚損傷、又は天然又は人工の体開口部を超えた内部体腔と何の接触もないことを意味する。例えば、鼓膜又は鼻内部を通る画像処理又は創傷包帯の交換は、全て、「非侵襲性」の定義を外れる。
【０１２９】
「脈管構造」は、本願明細書において用いられる場合、器官又は体の一部における血管の配置又は分布を意味する（例えば脳、肺、腎臓、又は心臓自体の脈管構造）。脈管構造は、器官又は体の一部の血管のネットワークである；それは、大動脈から動脈、毛細管及び静脈まで体の全ての血管を含む。
【０１３０】
脈管構造は、血管新生によって血管が形成された場合にのみ形を成すことが出来る。本願明細書において説明されるように、腫瘍は血管新生を始めることが出来、これにより血管は形成される。これらの血管は、それから脈管構造を構成する。従って、本願明細書において使われる場合、用語「脈管構造」は、血管新生の過程、従って、例えば腫瘍血管等の血管の形成、を含む。
【０１３１】
用語「腫瘍脈管構造」は、腫瘍の脈管構造を意味し、好ましくは本願明細書において記載される腫瘍のものである。従って、本願明細書の他で説明されるように、被験体は、本願明細書において使用される場合、好ましくは腫瘍を有する。
【０１３２】
血管は、内皮で裏打ちされる管であり、中を血液が循環し、また内皮細胞、すなわち脈管構造細胞によって作られる。体内の輸送に使用される循環系は、体内の血液の流れを制御する多くの管から成り、これらが血管であり、主に動脈及び静脈から成る。
【０１３３】
腫瘍血管は、血管周囲脱離、血管拡大及び不規則な形状を有する。腫瘍血管は、通常の組織のように平滑でなく、また全ての組織に酸素を与えるようには十分には秩序だっていないと考えられている。内皮前駆細胞は、骨髄から形成され、そして、成長する血管に組み込まれる。それから、腫瘍細胞を形成するために、内皮細胞は分化し、血管周囲空間に遊走する。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍成長に導く血管の形成において重要な役割を果たし、それは血管が拡張ことを可能にする。それは、発芽血管新生と呼ばれる。
【０１３４】
このように、本発明は、また、インビボ画像処理の方法及び用途、つまり、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することによって腫瘍の進行の間、血管新生をモニタすることを検討する。ＣＤ３１は、特に適切な血管新生マーカーである。
【０１３５】
本願明細書において言及されるように、ＣＤ３１は、腫瘍脈管構造を可視化するために特に有用なマーカーであり、これは、ＣＤ３１は、血管新生の間、発現されるマーカーだからであり、これにより血管の形成となる。
【０１３６】
「血管新生」は、薄壁の内皮細胞に裏打ちされた構造の形成であり、筋平滑筋壁（muscular smooth muscle wall）及び周皮細胞（線維芽細胞）を有する場合とそうでない場合がある。
【０１３７】
本願明細書において用いられる場合、前記用語は、既存の血管からの新しい血管の成長を含む生理学的過程も意味する。本発明に関することにおいて、用語「血管新生」によって、好ましくは、腫瘍形成の間の血管新生が意味される。従って、前記用語は、血管新生の過程のみを意味するのではなく、脈管形成及び／又は動脈形成の過程も意味する。
【０１３８】
「脈管形成」は、循環する又は組織定在の内皮幹細胞からの、脈管構造の形成であり（血管芽細胞）、デノボで内皮細胞に増殖する。この形は、特に、脈管系の胚性発生に関係する。
【０１３９】
「動脈新生」は、中膜に加えて外膜を加工する中型血管の形成である。
【０１４０】
血管新生は、成長及び発達における通常のプロセスであり、創傷治癒においても同様である。血管新生は、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）等の、様々な成長因子によって促進される。血管新生刺激因子に対する初期の反応は、例えばマトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのメンバー等の、プロテアーゼによる内皮細胞基底膜の劣化である。ＭＭＰｓは、コラーゲン及び他の細胞外マトリックス構成要素を劣化させる。基底膜バリアを破壊することは、内皮細胞が、既存の血管から血管新生刺激へ遊走し、増殖することを可能にする（Marsh, Stem Cells 1997; Vol. 15: 180-189）。血管細胞接着分子は、細胞-細胞外マトリックス相互作用を仲介することによって、内皮細胞遊走に貢献する。主要メディエータの一つは、インテグリンαｖβ３であり、例えばフィブロネクチン等のタンパク質の受容体である。インテグリンαｖβ３のアンタゴニストは、新しい血管の成長を阻害し、細胞接着が血管新生における重要なステップであることを示唆する（Brooks等, Cell 1994; Vol. 79: 1157-1164）。
遊走及び増殖の後、内皮細胞は、明瞭なルーメンを有する管を組み立てる。成熟した血管を造ることにおける重要な工程は、間葉細胞の動員と、新しく形成する脈管構造を安定させると考えられる平滑筋細胞様周皮細胞への、それらのその後の分化である。これらの周皮細胞は、内皮叢によって段階的に引き寄せられ、血管樹の漸進的な被覆へと導く（Benjamin等, Development 1998; Vol. 125:1591-1598）。この期間の間、非被覆の毛細管の後退が生じ、周皮細胞被覆の取得の後停止する。血管新生の後期は、従って、非保護血管が取り除かれ、周皮細胞に覆われた血管が安定化し、不安定化及び後退しにくくなる、再構築ステップによって特徴づけられる。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、おそらく内皮細胞源に由来し、内皮細胞と結合する周皮細胞を動員し血管安定性を増加する（Lindahl等, Science 1997; Vol. 277: 242-245）。血管新生における上記の工程は、また、図１において例示される。
【０１４１】
第２の態様において、本発明は、被験体における、抗血管新生剤の治療効果をインビボでモニタする非観血法に関し、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することを含んでなる。
【０１４２】
用語「抗血管新生剤の治療効果をインビボでモニタする」とは、血管新生、好ましくは腫瘍の進行の間の血管新生に対する、抗血管新生剤の治療効果ををモニタすることを含む。
【０１４３】
従って、本発明は更に、インビボ画像に対する方法及び用途、つまり、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することによって、血管新生に関して、抗血管新生剤の治療効果をモニタすることを想定する。ＣＤ３１は、特に適切な血管新生マーカーである。
【０１４４】
蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することによる、被験体における腫瘍脈管構造のインビボ画像処理の非観血法の関連において記載される実施態様は、また、本発明の第二態様にあてはまる。
【０１４５】
用語「モニタする」は、本発明の方法及び用途に関連して使用される場合は、血管、特に血管及び／又は脈管構造、特には腫瘍脈管構造が、適切な手段及び方法によってインビボで可視化されることを含む。脈管構造、好ましくは腫瘍脈管構造の 増加又は減少が、内皮細胞表面のＣＤ３１への、結合（又は非結合）による、時間にわたった、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体からの信号によって、可視化されることが出来る。つまり、血管が少ない程、抗体によって提供される信号は少なく、又は同様に、血管が多い程、抗体によって提供される信号が多くなる。それは、血管新生、好ましくは腫瘍の進行の間の血管新生がモニタされること、及び／又は腫瘍脈管構造における抗血管新生作用の治療効果及び／又は血管新生がモニタされることを含む。それは、腫瘍及び／又は腫瘍血管のサイズがモニタ及び／又は計測されることを更に含む。
【０１４６】
ここで使用しているように、抗血管新生剤の「治療有効性」は、血管新生を低減するか又は防止することにおいて、被験体（例えばヒト患者）に単回又は複数回投与する際の、抗血管新生剤の有効性の程度に関連する。腫瘍形成における、血管新生の低減又は防止は、腫瘍治療における尺度である。
【０１４７】
抗血管新生剤での治療効果は、治療効果を示す全ての確立した方法及び方法によって検出されうる。例えば、治療効果は、罹患組織／器官の外科的切除又は生検によって検出され、その後免疫組織化学（ＩＨＣ）又は同様な免疫学的技術によって分析される。あるいは、抗血管新生剤の治療効果の間接的な測定として、治療手段が既に有効か否か診断するために、（存在するならば）患者の血清における腫瘍マーカーが検出されるこも想定される。加えて、又は代わりに、それぞれの患者の一般的な概要（身体状態（fitness）、健康状態（well-being）腫瘍に媒介される病気の減少等）を評価することも可能であり、これは、また、技術者が治療効果が既に存在するか評価することを助ける。技術者は、彼又は彼女が治療効果を観察することを可能にする数多くの他の方法を認識する。癌療法では、治療効果は、例えば、疾患進行（ＴＴＰ）の時間の評価及び／又は奏効率（ＲＲ）の決定により、測定されることが出来る。具体的には、抗血管新生剤は、腫瘍の低減又は、より好ましくは除去を導き得る。このように、抗血管新生剤の治療効果は、ＴＴＰ及び／又はＲＲに基づいて測定／判定され得る。
【０１４８】
用語「処置（治療）」は、治療的又は予防的手段を意味する。処置は、腫瘍形成を防止、低減及び／又は治癒するために、又はそのような処置をしない場合に予想される生存率を超えるように被験体の生存率を延長するために、固形腫瘍のような腫瘍を有する被験体に、又は最終的に腫瘍を形成すると考えられる被験者に施される。本発明の目的では、腫瘍を有する被験体は癌を患う。従って、本発明の方法及び用途は、癌を患う被験体に適用される。
【０１４９】
幾つかの実施態様では、被験体は固形腫瘍を有する。固形腫瘍は、通常嚢胞又は液状領域を含まない、異常な組織塊である。固形腫瘍は、良性（癌でない）又は悪性（癌）であり得る。
【０１５０】
例えば、固形腫瘍は、消化管癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣がん、肝癌、膀胱ガン、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、並びに頭頸部癌の群から選択される腫瘍を意味する。
【０１５１】
本発明のために、固形腫瘍は、少なくとも１ｍｍ、好ましくは２ｍｍのサイズを有する。このサイズで、固形腫瘍が、増殖して生存するためには、増殖因子の十分な供給及び毒素分子の除去、並びに十分な酸素供給に依存する。固形腫瘍では、例えば酸素は、約１５０〜２００のμｍだけ毛細管から放射状に広まることが出来、従って腫瘍は、血管からの酸素の供給に依存し、従って、本願明細書において記載されるように血管新生を開始する。
【０１５２】
直径約１又は２ｍｍを越える、腫瘍塊の拡張は、十分な血液供給の発達に依存する。従って、腫瘍は、それ自信に血液を供給することを始め、よって、腫瘍血管新生の現象が生じる。本発明の方法及び用途により、被験体における、腫瘍脈管構造を画像処理及び／又はの抗血管新生剤の治療効果をモニタすることが可能であり、これにより、癌の処置におけるサポートを提供することが可能である。
【０１５３】
被験体における、腫瘍脈管構造のインビボ画像処理又は抗血管新生剤の治療効果のインビボモニタのための、本発明の方法及び用途は、腫瘍のサイズをモニタすることを可能にする。それ故、抗血管新生剤を用いた被験体の処置の間及び／又は後、このような薬剤が腫瘍のサイズを低減するかに関して、結果が出されることが出来る。従って、本発明の方法及び用途が、腫瘍脈管構造のインビボ画像処理又は被験体における抗血管新生剤の治療効果をインビボでモニタすることに適用される時、それらは腫瘍のサイズをモニタ及び／又は測定することにも適用出来る。このように、「腫瘍脈管構造のインビボ画像処理」及び「抗血管新生剤の治療効果のインビボ画像処理」は、また、腫瘍のサイズをモニタ及び／又は測定することを含む。
【０１５４】
腫瘍のサイズが、例えばコンピュータ断層撮影等の一般的な画像処理技術によって測定される場合、腫瘍がまだ「活性」であるかどうか、つまりそれが代謝的に活性又は生きているかについて何の結論も出されることが出来ないという不利益がある。例えば、腫瘍は、例えば抗血管新生剤で処置された後大きいサイズを有し得、それは処置が成功ではなかっと結論を出され得る。しかしながら、実際は処置は成功であって、なぜなら腫瘍は、たとえ未だ大きいとしても、血管新生においてもはや活性ではないからである。このように、偽陽性結果に達するかもしれない。同様に、もし、腫瘍がサイズでは小さいが、血管新生において活性である場合、偽陰性結果に達し得る。
【０１５５】
しかしながら、本発明により、本願明細書において記載されている方法及び用途は、腫瘍のサイズをモニタ及び／又は測定するだけでなく、腫瘍の血管新生活性を測定及び／又はモニタすることも可能にする。このように、それは、腫瘍サイズ及び血管新生活性間の相関を作ることが可能になる。具体的には、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体は、十分に安定であり、腫瘍が外植及び／又は生検され、例えば上記されるように、インビボで分析されることが出来る。より詳しくは、抗ＣＤ３１抗体の信号が決定されることが可能であり、従って、腫瘍がサイズにおいて未だ大きい又はその逆の場合にも関係なく、腫瘍の処置が成功であったかどうかに関して、結論を出すことが可能である。
【０１５６】
用語「癌」は、無秩序な細胞増殖によって典型的には特徴づけられる、被験体における生理学的状態を言及又は記載する。癌又は腫瘍の例は、これに限定されるものではないが、癌、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫及び滑液細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ及び小島細胞癌を含む）、中皮腫、シュワン腫（聴神経腫瘍を含む）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び、白血病又はリンパ系腫瘍を含む。このような癌のより特定な例は、扁平上皮細胞癌（例えば上皮の扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜ガン、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣がん、肝癌、膀胱ガン、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸ガン、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（kidney）又は腎性（renal）癌、前立腺ガン、外陰部癌、甲状腺ガン、肝癌、肛門の癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、並びに頭頸部癌を含む。
【０１５７】
ここで使用しているように、用語「抗血管新生剤」は、血管の増殖及び形成の原因となる、血管新生を低減又は防止する分子を意味する。本発明による抗血管新生剤は、従って、原発腫瘍の成長を停止又は阻害、転移の編成を防止又は低減、二次的な成長の出現を防止することが出来る。血管新生阻害剤は、また、血管新生活性が生じている、非腫瘍性疾患の治療に役立つ。
【０１５８】
抗血管新生剤は、例えば、ＶＥＧＦ-Ａの阻害剤、例えば商用名Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で販売される抗体、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２又はアンジオポエチンの阻害剤等である。阻害剤は、例えば、抗体、ｓｉＲＮＡ又は小分子である。更に、様々な抗血管新生剤が、本発明で役に立ち、通常の方法によって調製されることが出来る。この種の抗血管新生剤は、これに限定されるものではないが、小分子；血管新生因子、転写因子、及び抗体のドミナントネガティブ型等のタンパク質；ペプチド及びペプチド模倣物；及びリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸分子、及び血管新生因子及び受容体、転写因子、及び抗体及びそれらの抗原結合断片のドミナントネガティブ型をコードする核酸分子を含む。例えば、Hagedorn and Bikfalvi, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2000, Vol. 34: 89-110, and Kirsch等, J. Neurooncol. 2000, Vol. 50: 149-163を参照されたい。
【０１５９】
抗血管新生剤の抗血管新生効果は、例えば増殖分析及び走化性分析等の、多くのインビトロ及びインビボ生物検定を用いて試験されることが出来る。増殖分析は、培養された毛細管内皮細胞を使用し、増加した細胞数か放射標識又は修飾されたヌクレオシドの組込みを測定し、Ｓ期の細胞を検出する。対照的に、走化性分析は、多孔質膜円板によって内皮細胞と試験溶液を分離し、バリアを超えた内皮細胞の遊走は、試験溶液に存在する化学遊走物質を示す（Hanahan and Folkman, Cell 1996; Vol. 86: 353-364）。これらの分析によって、更なる抗血管新生剤が、同定され得る。
【０１６０】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が、インビボ乳癌血管新生を含む、多くの種類の癌の血管新生にとって、重要であることが示されてきた（Borgstrom等, Anticancer Res. 1999, Vol. 19: 4213-4214）。ＶＥＧＦの生物学的効果は、内皮細胞の増殖、生存、遊走及び管形成の刺激、及び脈管透過性の調節を含む。本発明に有用である抗血管新生剤は、例えば、ＶＥＧＦ又は別の血管新生因子の発現又はシグナル伝達を低減する阻害剤又は中和抗体であり、例えば抗ＶＥＧＦ中和モノクローナル抗体等である（Borgstrom等, supra, 1999）。抗血管新生剤は、また、別の血管新生因子、例えばＦＧＦ-１（酸性）、ＦＧＦ-２（塩基）、ＦＧＦ-４又はＦＧＦ-５等の線維芽細胞成長因子ファミリー（Slavin等, Cell Biol. Int. 1995, Vol. 19: 431-444; Folkman and Shing, J. Biol. Chem. 1992, Vol. 267: 10931-10934）、又は内皮細胞に特有のタンパク質Ｔｉｅ２を通してシグナルを送る因子、アンジオポイエチン-１等の血管新生因子を阻害することが出来る。
【０１６１】
様々な他の分子が、また、本発明において有用な抗血管新生剤として機能することが出来、限定するものではないが、アンジオスタチン；アンジオスタチンのクリングルペプチド；エンドスタチン；アナステリン、フィブロネクチンのヘパリン結合断片；変性型アンチトロンビン；コラゲナーゼ阻害剤；基底膜代謝回転阻害剤；血管新生抑制ステロイド；血小板第４因子及びそれの断片及びペプチド；トロンボスポンジン及びそれの断片及びペプチド；及びドキソルビシン(O'Reilly等, Cell 1994, Vol. 79: 315-328); O'Reilly等, Cell 1997, Vol. 88: 277-285; Homandberg等, Am. J. Path. 1985, Vol. 120: 327-332; Homandberg等, Biochim. Biophys. Acta 1986, Vol. 874: 61-71; and O'Reilly等, Science 1999, Vol. 285: 1926-1928)を含む。本発明において有用な、市販の抗血管新生剤は、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン、メタスタチン、及び２ＭＥ２（EntreMed; Rockville, Md.）；及びアバスチンなどの抗ＶＥＧＦ抗体（Genentech; South San Francisco, Calif.）；及びＶＥＧＦＲ-２阻害剤、例えばＳＵ５４１６、ＶＥＧＦＲ-２の小分子阻害剤（SUGEN; South San Francisco, Calif.）及びＳＵ６６６８(SUGEN)、ＶＥＧＦＲ-２の小分子阻害剤、血小板由来増殖因子及び線維芽細胞成長因子を含む。これらの及び他の抗血管新生剤は、通常の方法によって調製されることができ、そして本願明細書において使われるように、用語「抗血管新生剤」によって包含されることが理解される。
【０１６２】
本発明の方法及び用途の好ましい態様では、被験体の固形腫瘍は、異種移植片、好ましくはヒト異種移植片である。
【０１６３】
この態様は、合成物、すなわち（潜在的）抗血管新生剤、の抗血管新生効果、を試験することの前臨床モデルを考える。従って、固形腫瘍異種移植片、好ましくはヒトからの固形腫瘍を有する被験体は、非ヒト哺乳類であり、好ましくは齧歯動物、例えばウサギ、ラット及びマウスであり、好ましくはマウス、又はチンパンジーである。この態様において適用される抗ＣＤ３１抗体は、基本的に他のタンパク質、例えばヒトＣＤ３１と結合しない、マウスＣＤ３１を指向する抗ＣＤ３１抗体である。最も好ましくは、この抗体は、Acris Antibodies, 32052 Herford, Germany(clone 2H8, catalogue No. SM007A)から得られることが出来る。それは、ハムスター抗マウスＣＤ３１抗体である。この抗体は、また、Bogen等, Am. J. Pathol 1992, Vol. 141: 843-854; Bogen等, J. Exp. Med. 1994, Vol. 179: 1059-1064 and Ishikaw等, Jpn J Pharmacol. 2002, Vol. 88: 332-340に記載されている。
【０１６４】
特には、マウスへのＣａｌｕ３細胞の皮下細胞接種の後、腫瘍は最初の均一の広がりを示したことを発明者は観察した。７日目、腫瘍サイズ測定の第一日目では、平均腫瘍体積は、後に続くものより高かった（図１１を参照）。細胞は、固形腫瘍の形成する協調様式で、最初に自信を配置する必要がある。研究３５日目、治療の開始では、腫瘍は、およそ１５０のｍｍ３の平均腫瘍体積に達した。この時点までで、第一回目の測定は別にして、腫瘍は、１週あたり約４０−５０のｍｍ３の腫瘍成長率で指数関数的な成長を示した。７日目では、腫瘍は、明らかな血管新生を示さなかった。それらは、腫瘍の典型的な色を示さず、これは機能的な血液供給が築かれていなことを示す。新しく形成された血管は、腫瘍の周りに検出されることが出来なかった（図１２を参照）。１４日目、皮下に接種されたヒト腫瘍細胞の周りの領域に、腫瘍の周りに約１ｍｍの赤いゾーンが表れた。このゾーンは、多くの交錯する血管の密集ネットワークを形成する、充血した（engorged）小さい毛細管から成った。２１日目で、血管充血（vascular engorgement）は、大きな血管に達した（図１２を参照）。Ｑｔｒａｃｋｅｒ７０５非標的量子ドットを用いて得られた画像処理結果は、マウス組織における脈管変化及び腫瘍組織周辺及び内部での血管の成長を示した（図１３を参照）。研究３５日目では、腫瘍血管の数は増加し、そして腫瘍は、赤みがかった色を示し、これは腫瘍内での確立された血液供給を示唆する。
【０１６５】
アルカリホスファターゼ・システムを使用し、続いてスライド・スキャナを用いたマウス内皮ＣＤ３１＋細胞の可視化が成された免疫組織化学評価は、腫瘍全体内での血管分布のより良好な可視化を可能にした。７日目のクリオスライド（Cryoslides ）は、マウス組織がどのように、ヒト腫瘍に組み込まれるかについて示した（図１４Ａを参照）。ネズミのストローマ細胞は、ヒトの癌組織に遊走し、最初の血管を腫瘍に連結した。２１日目での確立したヒト腫瘍の血管分布パターンは、腫瘍輪郭での血管の集積を見せた（図１４Ｂを参照）。主要動脈が腫瘍端で集まり、腫瘍の内側の部分は、小充血毛細管によって充満された。腫瘍形成の最初の３５日の間の、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、血管新生成長因子の遺伝子発現における劇的な変化を見せなかった。
７、１４、２１、２８及び３５日目では、それぞれ３つの腫瘍が外植されて、本願明細書において記載される、ｍＲＮＡ摘出のために準備された。ローディング・コントロールとしてβ-アクチンの検出が含まれた。ＶＥＧＦ（ヒト）は、血管新生発展に関与する、２つの主要なスプライスバリアントを呈した。これらのスプライスバリアントは、腫瘍形成の異なる状態において変化した。７日目では、概して、スプライスバリアント５（４６２ｂｐ）のレベルは後の段階より高く、スプライスバリアント６（３６５ｂｐ）の発現は、腫瘍形成の初期において低い（図１５を参照）。Ａｎｇ２（ヒト）のレベルは、７日目から３５日目まで、漸進的に増加したが、ＶＥＧＦ（マウス）レベルは変わらなかった（図１５を参照）。Ａｎｇ２（マウス）は完全に不在（データは示さない）であったか、又は不適当なＲＴ-ＰＣＲ状態が使用された。血管新生成長因子の存在が、標的特異的な治療抗体を用いた抗血管新生治療の適用のための根拠である。
【０１６６】
アルカリホスファターゼ・システムを使用し、続いてスライド・スキャナを用いたマウス内皮ＣＤ３１＋細胞の可視化が成された免疫組織化学評価は、腫瘍全体内での血管分布のより良好な可視化を可能にした。７日目のクリオスライド（Cryoslides ）は、マウス組織がどのように、ヒト腫瘍に組み込まれるかについて示した（図１４Ａを参照）。ネズミのストローマ細胞は、ヒトの癌組織に遊走し、最初の血管を腫瘍に連結した。２１日目での確立したヒト腫瘍の血管分布パターンは、腫瘍での血管の集積を見せた（図１４Ｂを参照）。主幹動脈（Major arteries）が腫瘍端で集まったが、腫瘍の内側部分は、小充血毛細管によって充満された。
【０１６７】
腫瘍形成の最初の３５日の間の、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、血管新生成長因子の遺伝子発現における劇的な変化を見せなかった。７、１４、２１、２８及び３５日目では、それぞれ３つの腫瘍が外植されて、ｍＲＮＡ摘出のために準備された。ローディング・コントロールとしてβ-アクチンの検出が含まれた。ＶＥＧＦ（ヒト）は、血管新生発展に関与する、２つの主要なスプライスバリアントを呈した。これらのスプライスバリアントは、腫瘍形成の異なる状態において変化した。７日目では、概して、スプライスバリアント５（４６２ｂｐ）のレベルは後の段階より高く、スプライスバリアント６（３６５ｂｐ）の発現は、腫瘍形成の初期で低い（図１５を参照）。Ａｎｇ２（ヒト）のレベルは、７日目から３５日目まで、漸進的に増加したが、ＶＥＧＦ（マウス）レベルは変わらなかった（図１５を参照）。Ａｎｇ２（マウス）は完全に不在（データは示さない）であったか、又は不適当なＲＴ-ＰＣＲ状態が使われた。血管新生成長因子の存在が、標的特異的な治療抗体を用いた抗血管新生治療の適用のための根拠である。
【０１６８】
研究３５日目に、マウスは、それらの体重及び腫瘍サイズに従い、統計学的によく分散したグループにランダム化された。治療的抗体を用いた処置のために、各グループは、Ｃａｌｕ３腫瘍を有する１０匹のＢａｌｂｃ／ヌードマウスから成り、治療抗体を使用した処置は、６週の期間適用された。腫瘍サイズ及び体重測定は、週に一度行われた。全治療グループは、コントロールｍａｂに対して、２７−５０％の範囲の平均腫瘍成長阻害を示した（図２０を参照）。体重測定は、マウスの全般的な状態をモニタするために実施された。異常は、観察されなかった（図２１を参照）。１つのグループ内で均一な分布が観察されなかったので、両計測はノンパラメトリック手法（中央値）で分析された。
【０１６９】
治療対コントロール比（ＴＣＲ）及び両側、ノンパラメトリック信頼区間（ＣＩ）は、ＳＡＳプログラムＴＵＭＧＲＯ及びＡＵＣ評価を使用して決定された。このノンパラメトリック分析は、５％の有意水準を用いて（ａ）、ｍａｂ４を用いた治療グループ６だけが、コントロールｍａｂと比較して統計学的に有意であることを示した。治療グループ２−４は、統計学的に有意でなかった（図２２を参照）。
【０１７０】
抗ＣＤ３１を用いた血管モニタリングの事前研究は、抗ＣＤ３１抗体が、腫瘍脈管構造の画像処理ために最高の薬剤であることを示した。この薬剤は、マウス内皮ＣＤ３１受容体を標的とし、高い信号対バックグラウンド比で一血管を可視化する。従って、抗ＣＤ３１抗体にたいしての画像処理は、腫瘍脈管構造を画像処理するための適切な方法となる。各治療グループの３匹のマウスが選択され、３５、４９及び７９日目に、抗ＣＤ３１抗体が５０μｇ／マウスで静脈注射された。近赤外線イメージングが、試薬注射２４時間後、動物を麻酔した後に行われた。研究の間、イメージング結果を変造する腫瘍潰瘍化がみられたので、何匹かのマウスは除外されなければならなかった。腫瘍脈管構造の増加又は減少は、ＭＡＥＳＴＲＯシステムの比較画像ツールを用いて可視化された（図２３を参照）。
【０１７１】
コントロールｍａｂ及びｍａｂ１治療グループは、３５日目から７９日目まで、腫瘍血管の明らかな増加を示したが、ｍａｂ２＋３を用いた組合せ治療及びｍａｂ４は、腫瘍脈管構造の減少を示した。腫瘍領域は、手動で測定領域を引くことによって定量化され、そして、信号強度は強度値（全信号／露光時間）において評価された。３５日目から４９日目及び４９日目から７９日目のＣＤ３１信号の平均変化が、チャート２８にプロットされた。全治療グループが、３５日目から４９日目に腫瘍脈管構造の増加を見せた。グループ１（コントロールｍａｂ）及びグループ３（ｍａｂ２）において、ＣＤ３１腫瘍信号は着実に加速したが、グループ５及び６では腫瘍脈管構造は有意に減少した（図２４を参照）。
【０１７２】
最後のインビボ画像処理研究の直後に、腫瘍は外植され（７９日目）、エクスビボ研究のために、ホルマリンに固定されパラフィンに包埋された。蛍光顕微鏡検査は、コントロールｍａｂで処置された腫瘍に多数の明確な毛細管を示した。幾らかの腫瘍血管が、ｍａｂ２で処置されたマウスにおいて観察された。対照的に、治療グループ５及び６は、他の治療グループと比較して、腫瘍において明らかにより少なく明瞭でない血管を有した。それらは低い微小血管密度を示し、毛細管は、概してより小さく、また構造化されておらず、そして、それらはより弱い抗ＣＤ３１蛍光信号を呈した。組織化学的ＨＥ-染色は、ｍａｂ４を用いた治療グループにおいて、最高９０％の、腫瘍内壊死領域を示した。腫瘍壊死のそれらの領域は、他の治療グループよりグループ５及び６において、著しく高かった。対照的に、コントロールグループの腫瘍は、インタクトな腫瘍細胞によって、連続的に分布された（図２５を参照）。
【０１７３】
パラフィン切片における血管密度は、カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトで決定された。血管領域は、治療抗体で処置されたグループよりコントロール治療グループにおいて、８．８％有意に大きかった。２．８％の毛細管領域が、ｍａｂ２の治療グループで観察されたが、ｍａｂ４を用いて処置されたグループでは０．９％だけの血管の存在が算出された。
【０１７４】
治療の間の、血管新生成長因子のｍＲＮＡ発現プロファイルは、発現パターンに何れの変化も示さなかった。７９日目では、それぞれ３つの腫瘍が、外植されて、ｍＲＮＡ摘出のために準備された。ローディングコントロールとして、βアクチンの検出が含まれた。前述したように、ＶＥＧＦ（ヒト）は２つの主要スプライスバリアントを呈したが、この時点で、交代性は現れなかった。ＶＥＧＦ（ヒト）のレベルは、Ａｎｇ２（ヒト）及びＶＥＧＦ（マウス）と同様に、全ての治療グループにおいて同等だった（図２７を参照）。Ａｎｇ２（マウス）は、完全に不在（データは示さない）、又は不適当なＲＴ-ＰＣＲ状態が使われた。
【０１７５】
全ての治療グループは、コントロール群と比較して５０％までの腫瘍阻害を見せる。しかしながら、統計学的に有意の腫瘍阻害は、治療グループにおいてのみ観察され、グループｍａｂ２及びグループｍａｂ４の腫瘍体積は、類似した成長曲線展開を見せる。血管新生パターンが類似であると、類似した抗ＣＤ３１信号を現すと仮定されることが出来た。しかしながら、抗ＣＤ３１を用いた血管モニタリングは、グループｍａｂ２における腫瘍脈管構造の増加及びｍａｂ４を用いるグループにおける抗ＣＤ３１信号の減少を示す（図２４を参照）。更にまた、ｍａｂ４で処置された腫瘍は、最高９５％の壊死領域を示し、適切な血管形成の滅失又は阻害を示唆する。治療グループｍａｂ２は、およそ７０％の壊死領域、及びグループｍａｂ４よりほぼ３倍高い血管密度を呈する（図２６を参照）。これらの結果は、腫瘍脈管構造及び腫瘍体積間に相関がないことを示唆する。ｍａｂ４及びｍａｂ２は、分子レベルで腫瘍血管形成を阻害する能力において異なるが、腫瘍体積は著しくは異ならないことを示す。
血管新生成長因子のｍＲＮＡ発現が、標的特異的抗体を用いた処置の間、調整されることが出来るという仮定は、確認されることができなかった。ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２のｍＲＮＡ発現は、異なる治療グループにおいて、上方調整も下方調整も成されなかった。しかしながら、より正確な分析のために、ｍＲＮＡ発現は、より定量的評価を可能にする光サイクラ・システムを使用して実施されるべきだろう。治療抗体の異なる腫瘍阻害効果は、適用ｍａｂの用量によって説明されることができた。Ｍａｂ１は、例えば、５ｍｇ／ｋｇの濃度で注射され、最小の腫瘍抑制を示した。対照的に、１３，３ｍｇ／ｋｇでのマブ４は、最も高い腫瘍抑制を示した。しかしながら、用量は、予備有効性研究に基づいて選択された。Ｍａｂ１は、より高い濃度では、重大な副作用を引き起こし、従って、前臨床研究は終了されなければならなかった。抗体ベースの血管新生効果の比較のための更なる研究が、等しい抗体濃度で実施されるべきだろう。Ｍａｂ４。抗ＣＤ３１抗体を用いた血管形成の異なる時点でのモニタリングは、コントロール治療グループにおいて腫瘍脈管構造の増加を示したが、Ｍａｂ２＋３及びＭａｂ４を用いた治療グループは、治療の間、腫瘍脈管構造の顕著な減少を示す。外植された腫瘍組織の組織学的ＨＥ-染色は、Ｍａｂ２＋３及びＭａｂ４で処置された腫瘍における、高い壊死領域を示す（図３０を参照）。これらのグループの血管密度は、コントロールＭａｂで処置されたグループより、ずっと小さい（図２６を参照）。
【０１７６】
グループＭａｂ２及びグループＭａｂ４の腫瘍体積は、類似した成長曲線展開を示す。血管新生パターンが類似であると、類似した抗ＣＤ３１信号を現すと仮定されることが出来た。しかしながら、抗ＣＤ３１を用いた血管モニタリングは、グループｍａｂ２での腫瘍脈管構造の増加及びｍａｂ４を用いるグループでの抗ＣＤ３１信号の減少を示す（図２４を参照）。更にまた、ｍａｂ４で処置された腫瘍は、最高９５％の壊死領域を示し、適切な血管形成の滅失又は阻害を示唆する。治療グループｍａｂ２は、およそ７０％の壊死領域、及びグループｍａｂ４よりほぼ３倍高い血管密度を呈する（図２６を参照）。これらの結果は、腫瘍脈管構造及び腫瘍体積間に相関がないことを示唆する。ｍａｂ４及びｍａｂ２は、分子レベルで腫瘍血管形成を阻害する能力において異なるが、腫瘍体積は有意に異ならないことを示す。  血管新生成長因子のｍＲＮＡ発現が、標的特異的抗体を用いた処置の間、調整されることが出来るという仮定は、確認されることができなかった。ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２のｍＲＮＡ発現は、異なる治療グループにおいて、上方調整も下方調整も成されなかった。しかしながら、より正確な分析のために、ｍＲＮＡ発現は、より定量的評価を可能にする光サイクラ・システムを使用して実施されるべきだろう。治療抗体の異なる腫瘍阻害効果は、適用ｍａｂの用量によって説明されることができた。例えば、Ｍａｂ１は、５ｍｇ／ｋｇの濃度で注射され、最小の腫瘍抑制を示した。対照的に、１３，３ｍｇ／ｋｇでのｍａｂ４は、最も高い腫瘍抑制を示した。
【０１７７】
上記の提示された結果は、本願明細書において記載されている蛍光標識抗ＣＤ３１抗体によって可視化されることが出来る抗血管新生効果を、薬剤が有するかどうかに関して決定することに、齧歯動物、好ましくはマウス異種移植片腫瘍モデルが適しているを示す。
【０１７８】
従って、本発明は、組成物が抗血管新生効果を有するかどうか決定する方法にも関連し、固形腫瘍、好ましくはヒトからの固形腫瘍を有する齧歯動物、好ましくはマウスを提供すること、潜在的抗血管新生効果を有する薬剤を動物に投与すること、及び蛍光標識抗ＣＤ３１抗体を検出することによって、動物おける潜在的抗血管新生効果モニタすることを含んでなる。
【０１７９】
すなわち、抗血管新生剤の効果は、時間にわたった、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体信号の増加又は減少によって示され、比較されることが出来る。特に、腫瘍に血液を供給する血管の増加又は減少は、ＣＤ３１への抗ＣＤ３１抗体の結合（又は非結合）によって可視化されることが出来、すなわち、血管が少ない程、抗体によって提供される信号は少なく、又は同様に、血管が多い程、抗体によって提供される信号が多くなる。従って、信号が少ない程、薬剤の抗血管新生効果が高い。
【０１８０】
第３の態様では、本発明は、本願明細書において記載されている方法に用いられる蛍光標識抗ＣＤ３１抗体に関する。
【０１８１】
第４の態様では、本発明は、本願明細書に記載される方法において用いられるキットに関し、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体及び被験体における抗体を検出するための近赤外線蛍光画像処理の手段を含む。これらの手段は、本願明細書に記載されており、例えば、好ましい実施態様であるＭＡＥＳＴＲＯシステムである。
【０１８２】
別の態様では、本発明は、被験体における、腫瘍脈管構造のインビボ画像処理ための診断用組成物の調製のための、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体の用途に関する。
【０１８３】
更なる態様において、本発明は、被験体における、抗血管新生剤の治療効果をインビボでモニタするための診断用組成物の調製のための、蛍光標識抗ＣＤ３１抗体の用途に関する。
【０１８４】
本願明細書において提供された実施態様は、変更すべきところは変更した前述された態様に対して等しく想定される。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１：血管新生におけるプロセス。（ａ）血管新生成長因子が内皮細胞上のそれらの受容体と結合し、シグナル伝達経路を活性化する。（ｂ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ´ｓ）が活性化され、細胞外マトリックスを劣化させ、細胞が、既存の毛細管の壁から遊走して増殖することを可能にする。（ｃ）インテグリンαＶβ３が内皮細胞によって発現され、細胞外マトリックスへのそれらの接着及びそれらの遊走を促進する。（ｄ）アンジオポエチン-１（Ａｎｇ１）が、内皮細胞上のＴｉｅ２受容体と結合する。この相互作用が、血管の発芽、周皮細胞の動員、及び血管の生存及び安定を刺激すると考えられる。（ｅ）内皮細胞は、周皮細胞前駆体の化学遊走物質であるＰＤＧＦ-ＢＢを放出する。それらの細胞は、内皮細胞と会合し周皮細胞に分化する。
【図２】図２：血管新生スイッチのバランス仮説。正常に休止した脈管構造は、血管新生スイッチ機構によって制御される形態形成プロセスである、新しい毛細管の発芽をするよう、活性化されることが出来る。血管新生の誘導因子及び阻害因子の相対バランスの変化が、スイッチを活性化することが出来る。
【図３】図３：ＲＰＭＩ  １６４０培地におけるＣａｌｕ３の増殖。３４日目に、細胞集団は、〜１．３＊１０９の総数に達し、これは１５０匹のマウスの接種に十分である。接種までに（細胞継代番号６）、細胞生存率は約８４％であり、対数関数表はおよそ３．５日（８４時間）の世代間隔を示す。
【図４】図４：マウスモデル。（Ａ）Ｂａｌｂｃ／ヌードマウス。（Ｂ）Ｓｃｉｄ  Ｂｅｉｇｅマウス。
【図５】図５：ＭＡＥＳＴＲＯシステムは互いに連結された３つのメインモジュールから基本的に構成される。（Ｉ）所望の波長範囲の励起光を準備する照明モジュール、（ＩＩ）試験動物が置かれ麻酔され、注入プローブの放出光がＣＣＤカメラによって検出される画像処理モジュール（ＩＩＩ）デジタルマルチスペクトルデータを取得し分析するワーキングステーション及び分析モジュール。
【図６】図６：ＭＡＥＳＴＲＯシステムによるインビボでの画像処理及びスペクトル分離。（Ａ）白色光での研究動物の画像。（Ｂ）赤フィルタセットを使用して生成されたＲＧＢ画像。（Ｃ）標的特異性標識抗体の分離グレースケール画像（分離画像）。（Ｄ）組織自己蛍光の分離グレースケール画像（分離画像）。（Ｅ）分離グレースケール画像のオーバレイ（分離合成画像）、（Ｆ）疑似カラーでの標識抗体の信号強度の図示。（Ｇ）非特異性標識信号を低減するための検出限度の決定。
【図７】図７：標的特異性信号強度の定量化。測定される領域を示すオーバレイを有するグレースケール画像。領域上に引かれた点線は領域を示し、長径及び短径が重心から引かれる。システムは、ピクセル及びｍｍ２で各領域を算出する。
【図８】図８：Ｎｕａｎｃｅカメラを用いたマルチスペクトル画像処理。組織切片を、２つの特異的標識（Ｄａｐｉ、ａｌｅｘａ６４７）で染色し、Ｎｕａｎｃｅシステムによって検査する。（Ａ）非フィルタ処理自己蛍光のため制限された特異的可視化を示すＲＧＢ図。（Ｂ）分離及び高コントラスト色での可視化後の３つの特定の放出スペクトルのオーバーレイ（合成画像）が、各単一要素の優れた可視化を示す。（Ｃ）ａｌｅｘａ６４７のシグナル。（Ｄ）赤血球特異的自己蛍光。（Ｅ）Ｄａｐｉで染色された核。（Ｆ）組織自己蛍光。
【図９】図９：免疫組織化学。アルカリホスファターゼ・システムを使用したマウス内皮細胞の検出。（Ａ）マウス内皮細胞。（Ｂ）ＣＤ３１受容体。（Ｃ）抗ＣＤ３１抗体。（Ｄ）アルカリホスファターゼ（Ｅ）とコンジュゲートしたヤギ抗ハムスターＩｇＧ２次抗体。（Ｆ）永続的な赤溶液を用いたインキュベーションによる可視化。
【図１０】図１０：血管密度のエクスビボな定量化。腫瘍の外植、固定、パラフィン浸透の後、Ｎｕａｎｃｅシステム（４０倍拡大）を使用して画像が撮られた。（Ａ）オリジナルの蛍光画像。抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０信号は黄で示され、自己蛍光赤血球は明るい青で表される。（Ｂ）分離された抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０信号（黄）。（Ｃ）抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０（黒）の変換され反転された２値画像。（Ｄ）手動で決定された血管領域（赤）。
【図１１】図１１：ヌードマウスに皮下移植されたＣａｌｕ３腫瘍の腫瘍サイズ測定腫瘍は指数関数的な成長を示した。３５日目では、腫瘍サイズは、およそ４０−２００ｍｍ３の範囲になった。ランダム化プロセスでは、マウスは各々１０匹のマウスを有する６つのグループに最適に分配され、治療的抗体で処置された。
【図１２】図１２：腫瘍形成及び腫瘍活性化毛細管成長の写真実証。腫瘍接種後２１日目、血液通路（青矢印）が既存の大きなマウス血管（緑矢印）に達し、腫瘍は、それ自身に酸素及び重要な栄養分を供給する血液システムを確立した。
【図１３】図１３：インビボでの非標的血管可視化。２１日目、腫瘍周りの脈管構造（青矢印）が、Ｑｔｒａｃｋｅｒ７０５（２ｎｍｏｌ／マウス）非標的量子ドットの尾静脈注入及びＭＡＥＳＴＲＯシステムを用いた２４時間後の可視化の後、可視化となった。量子ドット７０５は、増加組織透過のための赤方偏移放出を有する強い蛍光を呈する小さいナノクリスタルであり、動物の血液システム中を最高３時間循環する。腫瘍は黒領域として示され、機能的な腫瘍血液システムの確立を示唆する。
【図１４】図１４：全腫瘍切片における血管分布。マウスは腫瘍外植の２４時間前に、非標識抗マウスＣＤ３１抗体が注入された。（Ａ）７日目でのＣＤ３１の可視化（ピンク）及びヘマトキシリンでの対比染色（紫）。拡大画像は構造化されていない腫瘍組織（紫）に遊走したネズミストロマ細胞（明るい紫）を示す。（Ｂ）接種後２１日目でのＣＤ３１＋内皮細胞（ピンク）の可視化及びヘマトキシリン（紫）による対比染色は、腫瘍輪郭での主要血管を示した。
【図１５】図１５：腫瘍形成間の様々な血管新生成長因子の発現。ｍＲＮＡ発現が、５つの異なる時点で外植された３つの腫瘍を用いて決定された。ゲル電気泳動は、ＶＥＧＦ（ヒト）及びβ-アクチンに１％ゲル、ＶＥＧＦ（マウス）及びＡｎｇ２（ヒト）に及び１，５％を使用して実行された。ＶＥＧＦ（ヒト）及びＶＥＧＦ（マウス）は腫瘍サイズ依存発現を示したが、ＶＥＧＦ（マウス）レベルは同じままであった。
【図１６】図１６：血管新生モニタリングのための注入可能な造影剤。動物は、ｍａｂ３-ａｌｅｘａ６４７、抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０及びｍａｂ７-ａｌｅｘａ７００を５０μｇ／マウスで、Ｉｎｔｅｇｒｉｓｅｎｓｅ６８０を２ｎｍｏｌ／マウスで注入され、薬剤注入後２４時間で撮像された。マウスＡ及びＤはＫｐｌ４腫瘍を有するＳｃｉｄ  ｂｅｉｇｅマウスであり、Ｂ及びＣはＣａｌｕ３腫瘍を有するＢａｌｂｃ／ヌードマウスである。腫瘍は、外植され、２４時間ホルマリンに固定され、そしてパラフィンに包埋された。Ｎｕａｎｃｅ画像は４０倍拡大で撮られた。（Ａ−Ｄ）インビボでのＮＩＲＦ画像処理。深い赤は高い試薬濃度の領域を表し、青は低濃度の領域を表す。（Ａ-４０ｘ-Ｄ-４０ｘ）Ｎｕａｎｃｅのエクスビボ画像処理は、腫瘍における造影剤（赤い蛍光）を局在化することを可能にする。明るい青蛍光（ＤＡＰＩ）は細胞核を示す。黄（Ｂ-４０ｘ）及び青（Ｃ-４０ｘ）は腫瘍組織を表す。
【図１７】図１７：２つの標的特異性抗体を用いたインビボライブ画像処理。（Ａ−Ｃ）２信号画像におけるＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０（緑の蛍光）及びハーセプチン-ａｌｅｘａ７００（赤の蛍光）の分離。（Ｄ-４０ｘ）エクスビボでのＮｕａｎｃｅ画像は、腫瘍細胞を標的とするハーセプチン（赤の蛍光）を明らかにし、血管（緑の蛍光）が主に腫瘍端で観察される。黄の蛍光は赤血球を表す。（Ｅ−Ｆ）抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０の強度は、ハーセプチン-ａｌｅｘａ７００から生じているものよりずっと弱い。抗ＣＤ３１-ａｌｅｘａ６１０はマウス体の全体によく分布されるが、主に腫瘍、肺及び膀胱である。ハーセプチン-ａｌｅｘａ７００はあまり分布されず、腫瘍及び肝臓／腎臓に高く局在化された。
【図１８】図１８：ヒト異種移植片における時間依存性抗体分布。Ｈ３２２Ｍ腫瘍を有するＳｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスは、ＩｎｔｅｇｒｉＳｅｎｓｅ６８０（２ｎｍｏｌ／マウス）が注入され、そして異なる時点で画像化された。動力学は、循環試薬からの信号及び非特異的結合が時間と共に次第に減少することを示した。
【図１９】図１９：組織深度に依存する試薬信号強度。ｍａｂ３-ａｌｅｘａ６４７が５０μｇ／マウスで、Ｃａｌｕ３を有するＢａｌｂｃ／ヌードマウスに静脈内注射された。ＮＩＲＦ画像処理は腫瘍領域内で最も高い濃度を示した。Ｎｕａｎｃｅエクスビボ画像処理は、（Ａ）肝臓（Ｂ）腎臓及び（Ｃ）脾臓での類似した信号強度を実証した。（Ｄ）肺の薬剤濃度は、腫瘍及び排泄器官より低かった。
【図２０】図２０：治療グループ１−６の増殖曲線。全グループが、コントロールｍａｂと比較して、ｍａｂ４を用いた最大５０％までの腫瘍阻害を示した。
【図２１】図２１：体重曲線。
【図２２】図２２：治療の統計分析。分析が、ＳＡＳプログラムのＡＵＣ評価を用いてコントロールｍａｂと比較して実行された。
【図２３】図２３：異なる治療グループの腫瘍脈管構造の比較。マウスは抗ＣＤ３１抗体（５０匹のμｇ／マウス）が注入され、注入後２４時間で画像化され比較画像処理ツールを用いて比較された。
【図２４】図２４：治療中のＣＤ３１信号の相対的変化。治療グループは、治療の最初の２週間、腫瘍領域内での抗ＣＤ３１信号の増加を示した（黄の棒）。対照的に、７９日目及び４７日目との間に、ｍａｂ２＋３及びｍａｂ４を用いた治療は腫瘍脈管構造を有意に減らしたが、コントロールグループ及びｍａｂ２を用いた治療は腫瘍血管形成を加速した（紫の棒）。
【図２５】図２５：抗ＣＤ３１の蛍光顕微鏡検査及び組織化学染色。４４日間の処置の後、マウスは抗ＣＤ３１抗体を注入され、殺され、腫瘍は取り除かれた。下列は、エクスビボ蛍光研究を表す。抗ＣＤ３１抗体で染色された血管は（黄色）コントロールｍａｂを用いて処置されたグループにおいて、ずっと多く存在した。腫瘍毛細管の別の証拠は自己蛍光性の赤血球の出現である（明るい青）。上列は、ＨＥ染色された腫瘍切片を示す。コントロール腫瘍は若干の壊死領域を示したが、腫瘍壊死は、抗血管新生抗体で処置されたグループにおいて極めて加速された。
【図２６】図２６：エクスビボでの血管密度の定量化。
【図２７】図２７：治療中の様々な血管新生成長因子のｍＲＮＡ発現パターン。ｍＲＮＡ発現は７９日目に３つの腫瘍を用いて決定された。ゲル電気泳動が、ＶＥＧＦ（ヒト）及びβ-アクチンに対して１％ゲル、ＶＥＧＦ（マウス）及びＡｎｇ２（ヒト）に対して及び１，５％を使用して実行された。
【図２８】図２８：抗マウスＣＤ３１エクスビボ蛍光画像処理。腫瘍は薬剤注入後２４時間で外植された。抗マウスＣＤ３１抗体（赤の蛍光）は、腫瘍血管新生をモニタするために最高の造影剤である。それは腫瘍血管の正確な輪郭を示す。青の蛍光は腫瘍細胞核を表し、黄の蛍光は赤血球自己蛍光に該当する。
【図２９】図２９：ＦＭＴ三次元画像処理技術。（Ａ）２次元画像処理は腫瘍領域において最も高い抗体濃度を示す（白円）。（Ｂ）ＦＭＴ画像前方側面。（Ｃ）ＦＭＴ画像＋３０°側面。（Ｄ）ＦＭＴ画像−３０°側面。
【図３０】図３０：コントロールｍａｂ、ｍａｂ２（処置グループ３）及びｍａｂ４（処置グループ６）の腫瘍サイズ測定及びエクスビボ分析。
【図３１】図３１：Ｃｙ５標識抗ＣＤ３１の使用による血管の検出。（Ａ）Ｃｙ５標識された抗ネズミＣＤ３１抗体が、Ｃａｌｕ３異種移植片ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに５０μｇ／マウス（２ｍｇ／ｋｇ）の濃度で注入された。４８時間後にインビボ画像が取得された。（Ｂ）その１５分後腫瘍は外植され、組織スライド切片が蛍光顕微鏡検査によって分析された。血管内の赤血球（黄色）は血管が機能的であることを示し、血管壁（赤）はＣｙ５標識抗ＣＤ３１抗体を用いて染色された。
【０１８６】
以下の実施例は、本発明の限定として解釈されるべきではなく、単に本発明を例示する。
【０１８７】
（実施例）
１． 細胞株
１．１ Ｃａｌｕ３（白人、腺癌、肺、ヒト）
ヒトＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）細胞株Ｃａｌｕ３は、中外製薬（Kamakura, Japan）から得られた。その特徴は、動物実験における遅い増殖パターンであって、細胞培養においてと同様であり、ここでは細胞は、単層に増殖し、細胞培養フラスコの底に強く接着する。インビボでは、腫瘍は高い血管新生パターンを呈し、従って、この研究において使用される主要な細胞株である。細胞株は培養され、マウスに注入され、異なる血管新生プローブで画像化されて、ロシュ（Roche）によって開発された治療抗体で処置された。
【０１８８】
１．２ ＫＰＬ-４
乳癌細胞株ＫＰＬ-４を、炎症性皮膚転移を持つ乳癌患者の悪性胸水から単離した。細胞株は、また、中外製薬（Kamakura, Japan）から得た。ＫＰＬ-４異種移植片を、血管新生のモニタに特異的なインビボ画像処理パラメータ試薬の最適化のために使用した。
【０１８９】
１．３ Ｈ３２２Ｍ
第２の「非小細胞肺細胞株」は、Ｈ３２２Ｍであった。これも、中外製薬（Kamakura, Japan）から得られる。この細胞株が、インビボ生命画像処理パラメータの最適化のために使用されるＫＰＬ-４異種移植片のように同様に使用された。
【０１９０】
２． 抗体及び蛍光造影剤
2012532846.tif 000003
【０１９１】
３． ＰＣＲプライマ
ｍＲＮＡ発現研究のために、ＲＴ-ＰＣＲが、ＴＩＢ  ＭＯＬＢＩＯＬ  ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ）から得られた標的特異性プライマを使用して実行された。ヒトＶＥＧＦ-Ａ遺伝子発現は、７つの異なるスプライスバリアントを示し、その内６つはＶＥＧＦ-Ａ特異性プライマを用いて検出された。
2012532846.tif 000004
これらのプライマの使用により、所望の断片は
2012532846.tif 000005
のサイズを有するべきである。
【０１９２】
４． 方法
４．１ 細胞株
Ｃａｌｕ３細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭのＬ-グルタミンで補充されたＲＰＭＩ１６４０培地を用い、Ｔ７５細胞培養フラスコで、５％ＣＯ２、３７°Ｃで培養された。増殖が遅いＮＳＣＬＣ細胞が、トリプシンを用いて７日期間で分けられ、形態的評価が、通常の光学顕微鏡を使用して実行され、Vi-CellTM 細胞生存率分析機（Cell Viability Analyzer）によって計測された。細胞は、およそ３，５日の世代間隔で、指数関数的増殖を示し、３５日目に、細胞はトリプシン処理され、洗われ、計測され、５＊１０６／１００μｌまで希釈された。
【０１９３】
４．２ マウスモデル
注入されたヒト腫瘍細胞に対する免疫反応を回避するために、雌のＢａｌｂｃ／ヌードマウス（図６Ａを参照）が選択され、４−５週間目の年であり、Bomholtgard（Ry, Denmark）から得られた。これらの動物は、胸腺を欠き、成熟Ｔ細胞を生産することが出来なく、これにより、免疫不全であり、異種移植片研究に適当である。予備試験のために、ＫＰＬ４又はＨ３２２Ｍ腫瘍が注入された、Charles River（Sulzfeld, Germany）からのＳｃｉｄ  Ｂｅｉｇｅマウス（図６Ｂを参照）が用いられる。Ｓｃｉｄ  Ｂｅｉｇｅマウスは、遺伝子の常染色体劣性変異「Ｓｃｉｄ」及び「Ｂｅｉｇｅ」双方を所有する。「Ｓｃｉｄ」マウスはＢ及びＴリンパ球に影響を及ぼす重度の複合免疫不全を示すが、「Ｂｅｉｇｅ」変異はＮＫ細胞だけに影響を及ぼす。Ｓｃｉｄ  Ｂｅｉｇｅマウスは、体毛皮から生じる自己蛍光信号を減らすために、画像処理実験のために剃られる。全ての動物は、研究の全時間にわたって、食品及び水の自由な摂取を提供される。インビボでのライブ画像処理実験のために、麻酔が、適当な麻酔ボックスに入れられたイソフルランの吸入によって実行される。全ての研究は、動物の権利福祉規則に従って実施され、自治体の承認を得た。
【０１９４】
４．３ 腫瘍及びトランスポンダー接種
指数関数的に増殖するＣａｌｕ３細胞は、収集され、ＰＢＳで洗われて、経験のある研究室技術者によって、麻酔されたマウスの側腹部領域に、体積０．１ｍｌ、総数５＊１０６の腫瘍細胞が皮下注射された。全研究の間、Ｂａｌｂｃ／ヌードマウスの簡単な識別のため、トランスポンダが注入され、これも、トランスポンダ注入機器を使用して皮下に注入される。全ての実験的研究は、専門的なガイドライン（GV-Solas, Felasa, TierschG）に従って実行された。実験的研究のプロトコルは、自治体によって審査され承認された（登録番号２１１−２５３１．２−２２／２００３）。
【０１９５】
４．４ 腫瘍サイズ及び体重
腫瘍サイズ及び体重は、キャリパー及びバランスを用いて、ｍｍ及びｇにおいて計測された。結果は、ローカル・データ・ベースに移された。プログラムで使用される、腫瘍体積算出のための式は、楕円形腫瘍の算出のための近似である。それは、腫瘍の長さＬ（長軸）と幅Ｗ（短軸、マウス本体と平行）を使用する。
2012532846.tif 000006
【０１９６】
４．５ ランダム化
治療的抗体を用いた治療のための、統計学的によく分布されたグループを得るために、動物はランダム化される必要がある。このランダムで均一な分布は、「Ｐｈａｓｉｓ」（Pharmacology Animal study Information System）と呼ばれるインターナルソフトウェア・ベースシステムを使用して行われる。治療の開始の少し前に、マウスは、それらの体重及び腫瘍のサイズに従い分類される。システムは、１つのグループにおいて、最大及び最小の腫瘍間に最小の距離を見いだす。ランダム化ツールは、均一で、そして最も重要である、治療の開始点として比較可能なグループ化を与える。
【０１９７】
４．６ 抗体の非経口注入
治療中の治療的抗体の腹膜内（ｉ．ｐ．）注入は、１．０ｍｌの注射器及び１８Ｇ-カニューレを使用して行われ、マウスの腹腔の下部に、２００μｌの体積において適用される。蛍光標識抗体の静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、１．０ｍｌの注射器及び２７Ｇ-カニューレを使用して実施され、２００μｌの体積において、マウス尾部静脈に注入される。
【０１９８】
４．７ ＭＡＥＳＴＲＯ（登録商標）を用いたインビボライブ画像処理
ＭＡＥＳＴＲＯシステムは、非侵襲性のインビボ蛍光測定を可能にする、平面蛍光反射画像処置システムである。このマルチスペクトルの分析において、一連の画像が、特定の波長で捕えられる。捕えられる波長の範囲は、標本に存在する標識の予想されるスペクトル放出範囲を包含しなければならない。結果は「イメージキューブ」と呼ばれる、一連の画像であり、自己蛍光及び特定の標識双方の個々のスペクトルを決定するために使用されるのが、この一連の画像の中のデータである。生物学的対象の多くの標識は、非常に類似した発光スペクトルを有し、高価な狭帯域フィルタを使用した分離が難しい又は不可能である。一つのロングパス発光フィルタは、多くの放出フィルタの集合と置き換えられる。皮膚、毛皮、皮脂腺の天然の自己蛍光に加えて、片利共生生物（菌類、ダニ、その他）及び摂取食物（葉緑素）からの異なる自己蛍光も存在する。マルチスペクトル分析は、所望の信号及びの自己蛍光の放出スペクトルが既知である限りは、放出された蛍光光の線形信号の混成の数学的な分解（非混合）によって、標本に適用された特定の標識からのこれらの信号を全て分離することが出来る。
【０１９９】
（測定）
照明モジュールは、白色光を発生するキセノン灯（Cermax）を備える。下流に連結された励起フィルタ（実験者によって選ばれる）を通して、光は実験のために所望の波長範囲に区切られ、そして、画像処理モジュールに光ファイバを経て伝導される。ここでは、制限された光は、麻酔された試験動物を照らす、４つの光ファイバに分配される。ＭＡＥＳＴＲＯシステムは、自動的に最適露光時間を選択するので、露光過度の危険がない。活性化された蛍光プローブの放出された蛍光光は、放出フィルタ（表１を参照）によって選択され、液晶（ＬＣ）を通って高感度冷却ＣＣＤカメラに伝導される。液晶は、カメラを、特定波長の選択的な画像の記録を可能にする。波長測定範囲は、選択されたフィルタセット（青、緑、黄色、赤、深い赤、ＮＩＲ）に依存し、画像は１０ｎｍごとに記録される。各一つの画像のスペクトル情報は、「イメージキューブ」と呼ばれる一つの「画像パッケージ」に組み込まれる（表１を参照）。
【０２００】
（分析）
各記録は、４０９６の異なるグレイスケールにおいて図示されることが出来る、１２ビットの白黒の画像から成り、従って、放出強度における最小差間を区別することが出来る。対照的に、ヒトの目は、３０-３５の間グレイスケールを区別することが可能である。放出強度に対するこれらの値（グレイスケール）が、波長範囲に対して示され、そして、その結果、各プローブ及び組織自己蛍光の発光スペクトルを得る。ソフトウェアは、３つの基本的な色（赤い、緑の、青い）をイメージキューブのために使用される波長範囲に再分割し、それによって、白黒画像がカラー画像（ＲＧＢ画像、図６Ｂを参照）に変わる。これらの得られたマルチスペクトル情報から、システムは、注入されたプローブ及び何れの由来からの自己蛍光を区別することが可能である。プログラムはスペクトルライブラリを使用し、ここでは各純プローブからの単スペクトル及び何れの注入無しの実験動物（Balbc/ヌード or Scid Beigeマウス）を画像処理することにより得られるスペクトル（マウス自己蛍光）である。純画像及び自己蛍光の正確なスペクトルを知ることによって、システムは、全画像を所望のスペクトルに対してフィルタし、色をそれらの各々に割り当てることが可能である。生成された画像（分離合成画像（unmixed composite image））は、存在スペクトルを異なる色で示す。プローブ信号の強度分布を可視化するために、信号を疑似色で図示することが可能であるが、低強度は青、そして、高強度の領域は赤である。それの他に、プローブの信号強度の検出限度を決めることが出来て、巡回プローブの信号及び非特異的な結合を低減することを可能にする。
【０２０１】
（比較及び定量化）
画像の蛍光色素分子領域を比較するＭＡＥＳＴＲＯの能力は、治療の間、腫瘍蛍光信号強度を比較することを容易にする。プログラムは、腫瘍領域（比較画像）における異なる信号強度の比較のためのツールを提供する。全ての画像は最適露光時間で撮られるので、それらは信号の強度に依存して異なる。信頼性が高い比較のためには、画像は１つの露光時間に標準化され、信号強度における違いの図示となる。測定領域を手動で描き変更することにより、信号強度は強度値において定量化されることが出来る。一旦測定領域が腫瘍周辺で選ばれると、複製され、比較される次の画像へ移されることが出来る。各領域は、現行設定（ステージ高さ（stage height）及びビニング）に基づいて、ピクセル及びｍｍ２において算出される。結果として、それは、作られた測定領域内で、平均信号、トータル信号、最大信号、及び平均信号／露光時間（１／ｍｓ）に関する情報を伝える。
【０２０２】
４．８ 腫瘍外植
動物が犠牲にされ、そして腫瘍が、専門のガイドライン（GVSolas、Felasa、TierschG）に従って外植される。動物を殺した後、腫瘍は、例えばメスを使用して外植されて、包埋カセットに移されるか、又は免疫組織化学応用にはイソペンタンを用いて、ＰＣＲ応用にはイソペンタン無しで液体窒素において瞬間冷凍される。
【０２０３】
４．９ 腫瘍固定及びパラフィン切片
外植された腫瘍は包埋カセットに入れられ、そして、好ましくはおよそ２４時間、ホルマリンにおける連続的な撹拌の下、インキュベートされる。その後、ホルマリンは廃棄され、腫瘍は蒸留水で洗われ、続いて腫瘍の脱水及びパラフィンの浸透となる（表５を参照）。全てのインキュベーション工程は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ（登録商標）VIP Vacuum Infiltration Processorを使用して実行される。
2012532846.tif 000007
パラフィン浸透の後、腫瘍は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ（登録商標）パラフィン包埋ステーションを用いて、流動パラフィンに包埋され、最終的な組織学的ブロックとなる。厚さ２-８μｍの範囲のパラフィン切片が、ミクロトームを使用してこれらのブロックから得られる。それらは、切断され、ガラススライド上に取り込まれ、３７の°Ｃで一晩空気乾燥され、続いて、脱パラフィン及びＨＥ-染色される（表１０を参照）。スライドは、Ｎｕａｎｃｅシステムで検査される。
【０２０４】
４．１０ ヘマトキシリン-エオシン染色
ヘマトキシリン及びエオシン染色液は、生検又は手術化合物における異常な組織変化を調べるために、組織学において最も一般的に用いられる染料の一つである。ヘマトキシリンは、ログウッド木の木材から得られる。酸化されると、それはヘマテイン、深い青紫色の化合物を形成し、適切な媒染剤（最も一般的にはＦｅ（ＩＩＩ）又はＡｌ（ＩＩＩ）ミョウバン）と共に使用されヘマラムを形成し（表６を参照）、顕微鏡下で検査する前に細胞核を染色する。染色の間、正に帯電したミョウバン複合体は、核酸の負に帯電したリン酸基と相互に作用する。最終的な青色は、水道水用い、ブルーイングによって得られる。染色は、光学顕微鏡を使用し、所望の染色グレードで検査されるべきであり、好ましい染色強度で停止されるべきである。
2012532846.tif 000008
エオシンは、ヘマトキシリン染色に対する対比染色としてしばしば使用される合成赤色染料である。エオシンは、酸性染料であり、負に荷電し、静電吸着により正の基に結合し、細胞の塩基部分（コラーゲン、細胞質の塩基部分）を示す。
2012532846.tif 000009
【０２０５】
４．１１ 切片の供給
ＨＥ染色後、組織切片は、脱水され（表８を参照）、およそ１００μｌＣｙｔｏｓｅａｌＴＭ固定剤が供給され、グラスカバースリップでカバーされる。
2012532846.tif 000010
【０２０６】
４．１２ Ｎｕａｎｃｅ（登録商標）エクスビボ画像処理
Ｎｕａｎｃｅカメラを用いたマルチスペクトル画像処理技術は、パラフィン又は凍結切片において高感度画像を得、スペクトル放出の微妙な差の定量的及び高感度の測定を可能にする。Ｎｕａｎｃｅは、２つの利点がある。第一に、明視野画像処理が可能であり、また優れたカラーカメラとして作用することが出来る。第２に、蛍光顕微鏡検査において、多くの組織切片でそうである、自己蛍光であるサンプルにおいて、Ｎｕａｎｃｅは、フィルタ・セット及びマルチスペクトル分析を用いて、組織の自己蛍光を興味がある信号から分離する。機能は、フィルタセット及びマルチスペクトル分析を使用するＭＡＥＳＴＲＯシステムに類似する。
【０２０７】
（測定）
パラフィン・スライドは、標本ステージに配置されて、焦点に合わせられる。蛍光顕微鏡のＵＶ-ランプは、広い範囲の紫外線スペクトルを発する。励起フィルタは、光を所望の波長範囲に区切り、ビームスプリッタによって組織切片上に集められる。切片に含まれる蛍光プローブは、光を吸収し、蛍光色素分子特定の波長の光を発する。最適露光時間は、Ｎｕａｎｃｅシステムによって自動的に設定される。下流に連結された放出フィルタは、ちょうど規定された波長が通過することを可能にし、それらはカメラによって認識される。Ｎｕａｎｃｅカメラは高感度の、冷却ＣＣＤカメラであり、液晶フィルタを具備する。このカメラシステムは、記載のＭａｅｓｔｒｏシステム（チャプター４．７）と同一である。マルチスペクトル画像処理及び分析は、同じバックグラウンドに基づき、類似の放出スペクトルを有する蛍光プローブの分離及び組織自己蛍光の除去を可能にする。
【０２０８】
（分析）
Ｎｕａｎｃｅシステムも、また、スペクトルライブラリで動作している。蛍光プローブ及び自己蛍光の純単一スペクトルが、異なるシグナルを分離し可視化するために必要である（図８を参照）。これを実行するために、各蛍光色素分子の単一スペクトルが、適切なフィルタセットを使用して測定され、組織切片は、組織自己蛍光を明らかにするために、何れの標識も使用せずに測定される。これらのスペクトルがシステムに移され、分離され、異なった色で可視化される（図８を参照）。
【０２０９】
４．１３免疫組織化学
全体腫瘍切片を通して、腫瘍血管を可視化するために、非標識内皮抗体（ハムスター抗マウスＣＤ３１）が、濃度５０μｇ／マウスで、マウスに注入される。腫瘍は、注入２４時間に外植されて、液体窒素及びイソペンタンにおいて瞬間冷凍された後、薄片にされる。非標識血管マーカは、２次抗体（ヤギ抗ハムスターＩｇＧ）アルカリホスファターゼ・システムを使用して識別される。スライド・スキャナは、全腫瘍切片の可視化を可能にする。
【０２１０】
（凍結切片）
免疫組織化学への適用のために、腫瘍は、切除後すぐに、イソペンタン及び液体窒素において瞬間冷凍され、切片化されるまで−２０の°Ｃで保持される。短時間で、１０μｍ腫瘍冷凍切片が、Ｃｒｙｏｓｔａｔ (2800 Frigocut)を用いて、−１８°Ｃの最適切断温度で切片化され、１分間アセトンによって固定され、空気乾燥され、免疫組織化学への適用のために使用された。
【０２１１】
（免疫組織化学手順及びスライドスキャン）
切片は、Ｄａｋｏ洗浄緩衝液で５分間調整され、２次抗体の非特異性結合を防ぐために２０分間の１０％ヤギ血清でブロックされた。スライドは、２分間２度すすがれ、ヤギ抗ハムスターＩｇＧ２次抗体（ＡＰコンジュゲート）の１時間のインキュベーションの後、１／２００希釈された。切片は、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ含有のＤａｋｏ洗浄緩衝液で５分間３度洗浄された。可視化のために、スライドは、永続的な赤溶液を用いて１０分間２度インキュベートされ、蒸留水ですすがれ、そして、少なくとも５分間青染色された。組織切片は、脱水され（表８を参照）、およそ１００のμｌのＣｙｔｏｓｅａｌＴＭ封入剤が供給され、ガラスカバースリップでカバーされた。ＭＩＲＡＸ  ＳＣＡＮは、外部走査カメラを具備し、スライドをデジタル化することを可能にする。これは、スライド上の標本を検出し、一定な高品質走査をし、全体腫瘍組織サンプルを定量化することを可能にする。
【０２１２】
４．１４ ｍＲＮＡ発現プロファイリング
腫瘍形成及び腫瘍血管成長の間、様々な血管新生成長因子（ＶＥＧＦＡ、ＡＮＧ２）の発現プロファイルを決定するために、ＲＴ-ＰＣＲが実行される。ヒト材料から生じるＲＮＡ発現と、マウス自身から生じる発現とのバランスを明らかにするために、マウス及びヒト特異性プライマが使用される。ＲＮＡ抽出。外植された腫瘍は、ＭａｇＮＡライザーＬＣグリーンビーズに入れられ、液体窒素において瞬間冷凍された。溶解緩衝液の適切な体積（腫瘍の重さに依存する）の添加により、サンプルは、迅速調製器具（fast prep instrument）において、腫瘍組織の完全な破砕までホモジナイズされた。遠心分離工程は、管の底にデブリを沈殿化することで、澄みを採り、ＭａｇＮＡ  ｐｕｒｅ  ＬＣシステムを用いたｍＲＮＡ摘出を開始するためにサンプルカートリッジに入れることを容易にする。システムは、組織サンプルからのｍＲＮＡ単離のためのプログラムを選択することにより、自動的に動作する。
【０２１３】
（Ｍａｇｎａ Ｐｕｒｅ ＬＣ ｍＲＮＡ単離キットＩＩ（組織）を用いたＭａｇＮＡ  ｐｕｒｅ ＬＣシステム手順）
１）  溶解物上澄みがサンプルカートリッジへピペットで移される
２）  サンプルは、ｍＲＮＡ´ｓのポリＡ末端にハイブリダイズするビオチン標識オリゴ（ｄＴ）を含有するキャプチャバッファで希釈される
３）  ＳＭＰｓ（ストレプトアビジン磁性粒子）添加後、オリゴ（ｄＴ）-ｍＲＮＡ複合体が捕獲されてビーズ面上へ固定される
４）  ゲノムＤＮＡは、デオキシリボヌクレアーゼＩを用いインキュベーションにより除去される
５）  吸着ｍＲＮＡを有するＳＭＰｓが、反応管の外部から磁石を適用することにより、プロセシングカートリッジのウェルから回収される
６＋７）洗浄緩衝液を用いた繰り返し洗浄工程は、タンパク質、細胞膜等の非結合物質を除去し、カオトロピック塩濃度を低減させる
８）  精製ｍＲＮＡは、溶出カートリッジのウェルにＳＭＰｓから７０°Ｃで溶出され、ＳＭＰｓは反応管に残る。
【０２１４】
（ｍＲＮＡの定量化）
精製ｍＲＮＡ収率は、ナノドロップ１０００（NanoDrop 1000）分光光度計を用いて得られる。何れの希釈も無しで、１μｌのみの使用により非常に正確なＵＶ／Ｖｉ分析を可能にする。ｍＲＮＡは、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで測定され、結果として、プログラムは、ｎｇ／μｌにおけるｍＲＮＡ収率及びｍＲＮＡの質に対する値を示す（高品質：１．８−２．２のＯＤ２６０／２８０比率）。
【０２１５】
（ＲＴ-ＰＣＲ）
ＲＴ-ＰＣＲは２つの工程で実行される：一本鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用した一本鎖ｃＤＮＡ合成と、その後のハイ・フィデリティＰＣＲマスターミックス（High Fidelity PCR Master Mix）を使用したポリメラーゼ連鎖反応。
（ｃＤＮＡ合成のための成分）
ｍＲＮＡは、オリゴ-ｐ（ｄＴ）１５プライマを用いてポリ（Ａ）-ｍＲＮＡの３´末端で一本鎖ｃＤＮＡに転写される。
2012532846.tif 000011
（ｃＤＮＡ合成反応：）
2012532846.tif 000012
（ＰＣＲの成分）
2012532846.tif 000013
（ＰＣＲ反応）
2012532846.tif 000014
アニール温度はプライマごとに異なる（チャプター３を参照）。
【０２１６】
（ゲル電気泳動）
断片の分離および視覚化は、臭化エチジウム含有のアガロースゲル（１−２％）中での電気泳動分離によって実施される。ゲル中の架橋ポリマは、断片重量及び組成に基づいて多孔性を呈する。ゲルマトリックスにおいて核酸を移動させるために起電力が使用される。ウェルにサンプルを配し電流を印加することによって、分子は、それらの質量電荷比によって決定される異なる割合で、陰極の方へゲルを移動させる。正に荷電した蛍光剤である臭化エチジウムは、実施の間、核酸の塩基対中にインターカレートし、分離された断片を可視化する。ゲルは紫外線に曝露され、カメラが写真として蛍光画像を記録する。分子サイズマーカーが、分離された断片のおおよそのサイズを特定するために使用される。
【０２１７】
４．１４ 統計的分析  
原発腫瘍増殖に関するデータが、統計学的に分析された。簡単には、ランダム化された２サンプル設計において、治療対コントロール比（ＴＣＲ）：
2012532846.tif 000015
及びその両側、ノンパラメトリック（１-ａ）信頼区間（ＣＩ）が、決定された。計算は、ＳＡＳバージョン９．１（SAS Inc. Cary,）を使用して、特別なＳＡＳプログラムＴＵＭＧＲＯ（バージョン３．０）によって実施された。システムは、測定データの「エンドポイント」評価（ＥＰ）及び「曲線下面積」評価（ＡＵＣ）を可能にする。ＥＰ評価は腫瘍測定の最終日の値を用いるが、ＡＵＣ評価は全てのデータを含む。
【０２１８】
４．１６ エクスビボでの血管定量化
パラフィン切片における血管密度の定量化は、カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを使用して行われる。プログラムの裏にある基本的概念は、ｋ−平均クラスタリングを用いて抗ＣＤ３１信号を分離することである（図１０Ｂを参照）。フィルタ処理された特定の信号は二値画像に変換され、妨害信号を取り除くために「浸食」される（浸食関数（erosion function））。画像を反転させた後（図１０Ｃを参照）、手動で血管外観の領域を定めることが可能である。プログラムは、関心の領域を赤に示し（図１０Ｄを参照）、そして、記録された画像内で血管領域のパーセンテージを算出する。
【０２１９】
本明細書は、明細書内で引用される引例の教示を踏まえて、最も完全に理解される。明細書内での実施態様は、本発明の実施態様の説明を提供するものであって、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。熟練した技術者は、多くの他の実施態様が本発明によって包含されると容易に認識する。本開示において引用される全ての刊行物及び特許が、出典明示によりその全内容がここに援用される。引用により援用される材料が、本発明と相反する又は矛盾する場合は、本明細書はそれらのいかなる材料に優先する。本願明細書におけるいかなる参照の引用も、そのような参照が本発明に対する先行技術であるという承認でない。
【０２２０】
特に明記しない限り、請求の範囲を含む本明細書において使用される、成分、反応条件等は、全てにおいて、用語「約」により修飾されるとして理解されるものである。従って、これとは異なる記載が無い限りは、数値パラメータはおおよそであって、本発明によって所望される特性に基づいて変化し得る。請求の範囲の均等論の適用を制限するものではないが、少なくとも、各数値パラメータは、有効数字及び通常の端数処理を考慮して解釈されるべきである。
【０２２１】
特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」なる用語は、該一連のなかの全要素に言及していると理解されなければならない。当業者は、常套的な実験のみを使用して、本願明細書に記載される本発明の特定の実施態様の多くの均等物を認識又は確認するであろう。このような均等物は、本発明により包含されるものとする。
【０２２２】
本明細書及び続く請求項にわたり、文脈が特に限定しない限り、語「含む（comprise）」、及び「含む（comprises）」及び「含んで成る（comprising）」等の変異形は、明記された数字又は工程、又は数字もしくは工程の群の包含を意味し、いかなる他の数字又は工程、又は数字もしくは工程の群を除外するのではないことが理解される。
【０２２３】
幾つかの文書が、本明細書の全体を通して引用される。本願明細書において引用される各文書（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、指示等を含む）は、前後の位置に関係無く、出典明示によりその全内容がここに援用される。本願明細書において何も、本発明が、従来技術によるそのような開示に先行するする権利がないという承認として解釈されるものではない。
【０２２４】
本願明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が特に指示しない限り複数形を含む。従って、例えば、「試薬（a reagent）」への言及は、一又は複数のそのような異なる試薬を包含し、「方法（the method）」への言及は、均等の工程及び当業者に周知の方法を含み、本願明細書において記載されている方法の修飾及び置換が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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