(57)【要約】膵臓癌および前立腺癌、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および去勢抵抗性前立腺癌を発症する素因を診断するための客観的方法を、本明細書において説明する。一態様において、診断法は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを使用してＣ１２ＯＲＦ４８の発現レベルを決定する工程を含む。本発明は、ｓｉＲＮＡなどの生成物、およびそれらを含有している組成物も特徴とする。本発明は、がん、例えば、膵臓癌および前立腺癌などのＣ１２ＯＲＦ４８関連疾患の治療において有効な治療剤をスクリーニングする方法、ならびに細胞増殖を阻害して、１つまたは複数の疾患の症状を治療または軽減する方法をさらに提供する。本発明はまた、二本鎖分子などの生成物、ならびにそれらを含有しているベクターおよび組成物も特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の生物学的試料におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、前記遺伝子の正常対照レベルと比較した前記レベルの増加が、対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示し、前記発現レベルが、以下からなる群より選択される任意の１つの方法によって決定される、方法：
（ａ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法、
（ｂ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する方法、および
（ｃ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する方法。
【請求項２】
前記増加が前記正常対照レベルより少なくとも１０％大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者由来の生物学的試料が生検材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
がんが膵臓癌および前立腺癌の群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
膵臓癌が膵管腺癌であり、前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下からなる群より選択される試薬を含む、がんを診断するためのキット：
（ａ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【請求項７】
試薬が前記遺伝子の遺伝子転写物に対するプローブである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
試薬が前記遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体である、請求項６に記載のキット。
【請求項９】
以下の工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の過剰発現に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはがん細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によってコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチドと試験化合物との間の結合活性を検出する工程；および
（ｃ）ポリペプチドに結合する化合物を選択する工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子もしくはＰＡＲＰ１遺伝子の過剰発現に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはがん細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している細胞と接触させる工程；および
（ｂ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程。
【請求項１１】
以下の工程を含む、がんを治療もしくは予防するか、またはがん細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８によってコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、ポリペプチドの生物学的活性を抑制する化合物を選択する工程。
【請求項１２】
生物学的活性が細胞増殖活性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の過剰発現に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはがん細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に、試験化合物を接触させる工程；
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下でのレベルと比較して、前記レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを低下させる化合物を選択する工程。
【請求項１４】
がんが膵臓癌および前立腺癌の群より選択される、請求項９、１０、１１、および１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
膵臓癌が膵管腺癌であり、前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、かつＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子であって、該センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、または１５からなる標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖が該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、二本鎖分子。
【請求項１７】
約１９〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載の二本鎖分子。
【請求項１８】
一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写物である、請求項１７に記載の二本鎖分子。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドが下記一般式を有する、請求項１８に記載の二本鎖分子：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、または１５を含むヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【請求項２０】
センス鎖核酸とアンチセンス鎖核酸とを含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々または両方を含み、かつＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害するベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、または１５のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖が該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、ベクター。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドが、約１９〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
二本鎖分子が、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写物である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドが、下記一般式を有する、請求項２２に記載のベクター：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、または１５を含むヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【請求項２４】
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している細胞と接触して細胞増殖を阻害する、薬学的に有効な量の、Ｃ１２ＯＲＦ４８に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子を含むベクターと、薬学的に許容可能な担体とを対象に投与する工程を含む、対象におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の過剰発現に関連したがんを治療または予防する方法。
【請求項２５】
二本鎖分子が請求項１６に記載の二本鎖分子であり、ベクターが請求項２０に記載のベクターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
がんが膵臓癌および前立腺癌の群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
膵臓癌が膵管腺癌であり、前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している細胞と接触して細胞増殖を阻害する、薬学的に有効な量の、Ｃ１２ＯＲＦ４８に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子を含むベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の過剰発現に関連したがんを治療または予防するための組成物。
【請求項２９】
二本鎖分子が請求項１６に記載の二本鎖分子であり、ベクターが請求項２０に記載のベクターである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
がんが膵臓癌および前立腺癌の群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
膵臓癌が膵管腺癌であり、前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドとＰＡＲＰ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）試験剤の存在下で、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを、試験剤の非存在下で検出された結合レベルと比較する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）で試験剤の非存在下で検出された結合レベルと比較して、結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験剤を選択する工程。
【請求項３３】
Ｃ１２ＯＲＦ４８の機能的等価物がＰＡＲＰ１結合ドメインを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によってコードされるポリペプチドを使用してがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）ＰＡＲＰ１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの存在下で、試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）ＰＡＲＰ１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出されたポリペプチドの生物学的活性と比較して、ＰＡＲＰ１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験化合物を選択する工程。
【請求項３５】
生物学的活性が自己修飾活性である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は、２００８年８月２８日付で出願された米国特許仮出願第６１／１９０，５２９号の恩典を主張するものである。その内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、がん、特に、膵臓癌および前立腺癌、例えば、膵管腺癌および去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法、ならびにそれらを発症する素因を診断する方法に関する。本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８の過剰発現に関連したがん、特に、膵臓癌および前立腺癌、例えば、膵管腺癌および去勢抵抗性前立腺癌の治療および予防のための候補化合物をスクリーニングする方法にも関する。さらに、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子発現を低下させる二本鎖分子およびその使用に関する。特に、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８に関する。
【背景技術】
【０００３】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、西洋諸国におけるがんによる死因のうち４番目に多いものであり、一般的な悪性病変の中で最も高い死亡率を示し、５年生存率はわずか５％である（DiMagno EP, et al., Gastroenterogy 1999；117：1464-84（非特許文献１）、Zervos EE, et al., Cancer Control 2004；11：23-31（非特許文献２））。２００７年、米国においては、３７，１７０例の新たな膵臓癌例が診断されており、およそ等しい数の死亡が膵臓癌に起因すると推定されている（Jemal A, et al., CA Cancer J Clin 2007；57：43-66（非特許文献３））。ＰＤＡＣ患者の大多数が、現在のところ有効な治療が利用可能でない進行期において診断される。外科的切除術のみが、わずかな治癒の可能性を与えるが、根治手術を受けたＰＤＡＣ患者の８０〜９０％が播種性または転移性の疾患により死亡する（DiMagno EP, et al., Gastroenterogy 1999；117：1464-84（非特許文献１）、Zervos EE, et al., Cancer Control 2004；11：23-31（非特許文献２））。放射線を伴うまたは伴わない、手術および５−ＦＵまたはゲムシタビンを含む化学療法の近年の進歩は、患者の生活の質を向上させることはできるが（DiMagno EP, et al., Gastroenterogy 1999；117：1464-84（非特許文献１）、Zervos EE, et al., Cancer Control 2004；11：23-31（非特許文献２））、極めて高い侵襲性および化学療法抵抗性のため、それらの治療は、ＰＤＡＣ患者の長期生存率に対しては極めて限定された効果しか及ぼさない。したがって、ほとんどの患者の管理は、対症療法的な措置に焦点が置かれる（DiMagno EP, et al., Gastroenterogy 1999；117：1464-84（非特許文献１）、Zervos EE, et al., Cancer Control 2004；11：23-31（非特許文献２））。
【０００４】
他方、前立腺癌（ＰＣ）は、男性における最も一般的な悪性病変であり、米国および欧州におけるがんに関連する死因の第２位である（Jemal A, et al., CA Cancer J Clin 2007；57：43-66（非特許文献３））。ＰＣの発生率は、西洋式の食事の普及および老齢人口の急増により、ほとんどの先進国で顕著に増加している（Gronberg H, Lancet 2003；361：859-64（非特許文献４）、Hsing AW et al., Epidemiol Rev 2001；23：3-13）。血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を使用するスクリーニングは、ＰＣの早期検出の劇的な改善をもたらし、外科的療法および／または放射線療法により治癒可能な限局性疾患を有する患者の割合の増加をもたらした（Gronberg H, Lancet 2003；361：859-64（非特許文献４）、Hsing AW et al., Epidemiol Rev 2001；23：3-13）。しかしながら、これらのＰＣ患者の２０％〜３０％は、依然として疾患の再発を被る（Scher HI, et al., J Clin Oncol 2006；23：8253-61（非特許文献６））。アンドロゲン／アンドロゲン受容体（ＡＲ）シグナル伝達経路がＰＣの発症および進行において中心的な役割を果たしており、ＰＣの増殖は通常アンドロゲン依存性である（Hsing AW, et al., Epidemiol Rev 2001；23：3-13（非特許文献５）、Scher HI, et al., J Clin Oncol 2006；23：8253-61（非特許文献６））。したがって、疾患が再発または進行した患者のほとんどは、外科的または内科的な去勢により精巣のアンドロゲン産生を抑制するアンドロゲン除去療法によく応答する。それにもかかわらず、これらの患者は、最終的には、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）と称される、アンドロゲン除去療法（去勢）に対する耐性、およびより侵襲性の表現型を獲得する。このＣＲＰＣに対しては、ドセタキセルとプレドニゾンとの併用などの極めて限定された選択肢しか存在せず（Tannock IF, et al., N Engl J Med 2004；351：1502-12（非特許文献７））、それらもやはりＣＲＰＣに対しては最小限の効果しか示さない。したがって、ＣＲＰＣの分子標的を同定し、これらの分子を標的とするＣＲＰＣ用の新規療法を開発することが、最も要求されている。
【０００５】
両疾患のこの惨憺たる情況を克服するため、優れた分子標的に対する新規な分子療法の開発が、緊急に必要とされている。この方向性で、がん細胞集団を可能な限り濃縮するためのレーザーマイクロビームマイクロダイセクションと組み合わせて、３０，０００を超える遺伝子からなるゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、ＰＤＡＣ細胞（Nakamura T, et al., Oncogene 2004；23：2385-400（非特許文献８））およびＣＲＰＣ細胞（Tamura K, et al., Cancer Res 2007；67：5117-25（非特許文献９）、ＷＯ２００８／１０２９０６（特許文献１））の詳細な発現プロファイルが、以前に作成された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００８／１０２９０６
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】DiMagno EP, et al., Gastroenterogy 1999；117：1464-84
【非特許文献２】Zervos EE, et al., Cancer Control 2004；11：23-31
【非特許文献３】Jemal A, et al., CA Cancer J Clin 2007；57：43-66
【非特許文献４】Gronberg H, Lancet 2003；361：859-64
【非特許文献５】Hsing AW, et al., Epidemiol Rev 2001；23：3-13
【非特許文献６】Scher HI, et al., J Clin Oncol 2006；23：8253-61
【非特許文献７】Tannock IF, et al., N Engl J Med 2004；351：1502-12
【非特許文献８】Nakamura T, et al., Oncogene 2004；23：2385-400
【非特許文献９】Tamura K, et al., Cancer Res 2007；67：5117-25
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８が幾つかのがん細胞において過剰発現されているという、マイクロアレイ分析およびＲＴ−ＰＣＲを通した発見に関する。本明細書において証明されるように、がん細胞株におけるｓｉＲＮＡによる内在性Ｃ１２ＯＲＦ４８の機能的ノックダウンは、がん細胞増殖の劇的な抑制をもたらし、このことから、がん細胞の生存能の維持におけるその必須の役割が示唆される。Ｃ１２ＯＲＦ４８は成人正常器官にはほとんど発現していないため、副作用が最小である新規治療アプローチのための適切かつ有望な分子標的であると考えられる。
【０００９】
したがって、生検材料などの対象由来の生物学的試料におけるＣ１２ＯＲＦ４８の発現レベルを決定することにより、対象におけるがん、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を診断するか、またはそれらの素因を決定する方法を提供することが、本発明の目的である。正常対照レベルと比較したＣ１２ＯＲＦ４８の発現のレベルの増加は、対象が、がん、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクを有することを示す。本発明の方法においては、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を適切なプローブによって検出することが可能であり、あるいは、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質を抗Ｃ１２ＯＲＦ４８抗体によって検出することが可能である。
【００１０】
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する剤を同定する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。さらに、本発明は、がん、例えば、膵臓癌および前立腺癌、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）などのＣ１２ＯＲＦ４８関連疾患を治療および／もしくは予防するための候補剤、またはこれらの細胞の増殖を阻害するための候補剤を同定するための方法を提供する。本発明の方法はインビトロまたはインビボで実施され得る。Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルおよび／またはその遺伝子産物の生物学的活性の、試験剤の非存在下のものと比較した減少は、その試験剤が、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の阻害剤であり、したがって、がん性細胞、例えば、膵臓癌細胞または前立腺癌細胞、特に、ＰＤＡＣおよびＣＲＰＣの細胞などのＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子を過剰発現している細胞の増殖を阻害するために使用され得ることを示す。候補剤は、膵臓癌または前立腺癌、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）または去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の症状を低下させるために使用され得る。
【００１１】
さらに、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現および／またはＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質の機能を阻害する作用物質を投与することにより、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を過剰発現しているがん性細胞の増殖を阻害する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。好ましくは、作用物質は阻害性核酸（例えば、アンチセンス、リボザイム、二本鎖分子）である。作用物質は、二本鎖分子を提供するための核酸分子またはベクターであってもよい。二本鎖分子を、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で標的細胞へ導入することによって、遺伝子の発現を阻害することができる。本発明は、例えば、膵臓癌または前立腺癌、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）または去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）に罹患した患者のための治療的または予防的な方法に関連して、対象におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子を過剰発現しているがん性細胞の増殖を阻害する方法も提供する。
【００１２】
さらに、膵臓癌または前立腺癌、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）または去勢抵抗性前立腺癌の治療および／または予防のために好適な薬学的組成物を提供することが、本発明のさらなる目的であり、そのような組成物は、薬学的に許容可能な担体と、本発明の二本鎖分子またはそれらをコードするベクターのうちの１つまたは複数を含む活性作用物質とを含む。本発明の二本鎖分子は、細胞へ導入された場合に、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現を阻害することができ、かつＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子を過剰発現しているがん性細胞の増殖を阻害することができる。そのような分子の例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、１１３３〜１１５１位のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、または１３１０〜１３２８位のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に対応する配列を標的とするものが含まれる。本発明のそのような分子はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖は標的配列を含む配列を含み、該アンチセンス鎖はセンス鎖に相補的な配列を含む。分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。
【００１３】
さらに、膵臓癌または前立腺癌、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）または去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を診断するための検出試薬および／または検出キットを提供することが、本発明のさらなる目的であり、そのような検出試薬および／または検出キットは、抗Ｃ１２ＯＲＦ４８抗体を含む。
【００１４】
本発明の１つまたは複数の局面が、ある特定の目的を満たすことができ、その他の１つまたは複数の局面が、その他のある特定の目的を満たすことができることが、当業者によって理解されるだろう。各目的は、本発明の全ての局面に、そのすべての点で、同等に当てはまるとは限らない。そのため、先の目的は、本発明のいずれか１つの局面に関して、別の選択肢において考慮され得る。以下の詳細な説明を添付の図面および実施例と共に参照することにより、本発明のこれらおよびその他の目的および特色が、より完全に明白になるだろう。しかしながら、上記の発明の概要および以下の詳細な説明は、いずれも、好ましい態様のものであって、本発明または本発明のその他の別の態様を限定するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
以下の図面の簡単な説明、ならびに本発明およびその好ましい態様の詳細な説明を考慮することにより、本発明の様々な局面および用途が、熟練した当業者には明白になるだろう。
【００１６】
【図１】ＰＤＡＣ細胞およびＣＲＰＣ細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８の過剰発現を示す図である。パート（Ａ）は、同様に顕微解剖された正常膵管細胞（「Ｎ．Ｐ．」）、完全正常膵組織（「膵臓」）、ならびに生命維持に不可欠な器官（「心臓」、「肺」、「肝臓」、および「腎臓」）と比較して、顕微解剖されたＰＤＡＣ細胞（左から右へレーン１〜９）においてＣ１２ＯＲＦ４８が過剰発現されていることを実証している、半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＡＣＴＢの発現を定量対照とした。パート（Ｂ）は、同様に顕微解剖された正常前立腺上皮細胞（「ＮＰｒｏ」）、完全正常前立腺組織、脳、ならびに生命維持に不可欠な器官（「心臓」、「肺」、「肝臓」、および「腎臓」）と比較して、顕微解剖されたＣＲＰＣ細胞（左から右へレーン２〜６）においてＣ１２ＯＲＦ４８が過剰発現されていることを実証している、半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＡＣＴＢの発現を定量対照とした。パート（Ｃ）は、Ｃ１２ＯＲＦ４８がヒト成人器官のうち精巣において発現を示したことを証明している、Ｃ１２ＯＲＦ４８発現に関する多組織ノーザンブロット分析の結果を示す。パート（Ｄ）は、幾つかのＰＤＡＣ細胞株（ＫＬＭ−１、ＰＫ−５９、ＰＫ−４５Ｐ、およびＳＵＩＴ２）はＣ１２ＯＲＦ４８を強く発現しているが、その他の正常成体器官はＣ１２ＯＲＦ４８を発現していないことを証明している、Ｃ１２ＯＲＦ４８発現に関するノーザンブロット分析の結果を示す。パート（Ｅ）は、ほとんどの前立腺癌細胞株がＣ１２ＯＲＦ４８を強く発現したことを示している、Ｃ１２ＯＲＦ４８発現に関するノーザンブロット分析の結果を示す。
【図２】がん細胞の増殖に対するＣ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。パート（Ａ）は、ＰＤＡＣ細胞株ＭｉａＰａＣａ２（左）およびＰＫ−５９（右）における、ｓｉ＃５９５、ｓｉ＃１１３３、およびｓｉ＃１３１０によるＣ１２ＯＲＦ４８発現に対するノックダウン効果を裏付けたが、ｓｉ＃８５１または陰性対照ｓｉＥＧＦＰではそうではない、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＡＣＴＢをＲＮＡを定量化するために使用した。パート（Ｂ）は、Ｃ１２ＯＲＦ４８に対する示されたｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ＃５９５、ｓｉ＃１１３３、ｓｉ＃８５１、ｓｉ＃１３１０、または陰性対照ｓｉＥＧＦＰ）によりトランスフェクトされたＭｉａＰａＣａ２細胞（左）およびＰＫ−５９細胞（右）の各々のＭＴＴアッセイの結果を示す。ジェネテシンと共に６日間インキュベートした後の各平均値がＳＤ（標準偏差）を示すエラーバーと共にプロットされている。Ｙ軸は、マイクロプレートリーダにより測定された、４９０ｎｍ、および参照としての６３０ｎｍにおける吸光度を意味する。これらの実験は三連で実施した。パート（Ｃ）は、Ｃ１２ＯＲＦ４８に対する示されたｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ＃５９５、ｓｉ＃１１３３、ｓｉ＃８５１、ｓｉ＃１３１０、または陰性対照ｓｉＥＧＦＰ）の各々によりトランスフェクトされたＭｉａＰａＣａ２細胞（左）およびＰＫ−５９細胞（右）のコロニー形成アッセイの結果を示す。細胞を、ジェネテシンと共に２週間インキュベートした後、０．１％クリスタルバイオレット染色により可視化した。
【図３】Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質が核に局在することを示す図である。パート（Ａ）は、外来性Ｃ１２ＯＲＦ４８がＣＯＳ７細胞において過剰発現されていることを裏付ける、抗ＨＡタグ付き抗体を使用したウェスタンブロット分析の結果を示す。パート（Ｂ）は、外来性Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質が核に局在することを示している、免疫細胞化学分析の結果を示す。緑色シグナルは、抗ＨＡにより染色されたＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質を示し、ＤＡＰＩ染色（青色）は細胞内の核を表した。パート（Ｃ）は、ＰＤＡＣ細胞株の内在性Ｃ１２ＯＲＦ４８を検出する抗Ｃ１２ＯＲＦ４８抗体を使用したウェスタンブロット分析の結果を示す。Ｃ１２ＯＲＦ４８は、ＰＤＡＣ細胞株ＫＬＭ１、ＳＵＩＴ２、およびＰＫ−１に高度に発現しているが、非がん性細胞株（ＨＥＫ−２９３およびＣＯＳ７）ではほとんど検出不可能であった。βアクチンを負荷対照とした。パート（Ｄ）は、抗Ｃ１２ＯＲＦ４８抗体を使用した免疫組織化学研究の結果を示す。ＰＤＡＣ細胞の核において、Ｃ１２ＯＲＦ４８の強い陽性の染色が観察された（Ｃ１ ４０倍、Ｃ２ ４０倍）。正常膵組織の腺房細胞および正常管上皮細胞は、染色を全くまたはほとんど示さなかった（Ｎ ４０倍）。全部で、３３／６２（５３％）のＰＤＡＣ組織が、Ｃ１２ＯＲＦ４８について陽性の染色を示した。
【図４】Ｃ１２ＯＲＦ４８のＰＡＲＰ１との相互作用を示す図である。パート（Ａ）は、ＨＥＣＫ２９３細胞において、１１０ｋＤａのバンドが、異なって、Ｃ１２ＯＲＦ４８−Ｆｌａｇと免疫共沈降したことを示している、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色の結果を示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって、この１１０ｋＤａのバンドに対応するタンパク質としてＰＡＲＰ１タンパク質が同定された。パート（Ｂ）は、ＨＥＣＫ２９３細胞においてＰＡＲＰ１タンパク質がＣ１２ＯＲＦ４８−Ｆｌａｇと免疫共沈降することを裏付ける、抗ＰＡＲＰ１抗体を使用したウェスタンブロット分析の結果を示す。パート（Ｃ）は、Ｆｌａｇ−Ｃ１２ＯＲＦ４８発現ベクターおよび／またはＰＡＲＰ１−Ｍｙｃ発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞へコトランスフェクトした結果を示す。Ｆｌａｇ−Ｃ１２ＯＲＦ４８および／またはＰＡＲＰ１−Ｍｙｃを含有しているタンパク質複合体を、ｃ−Ｍｙｃ抗体によって免疫沈降させた。抗Ｆｌａｇ抗体を使用したウェスタンブロッティングは、両方の発現ベクターをコトランスフェクトした場合に、Ｆｌａｇ−Ｃ１２ＯＲＦ４８がＰＡＲＰ１−Ｍｙｃと免疫共沈降することを示した。
【図５】Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１をノックダウンするためのｓｉＲＮＡ二重鎖によるアポトーシスの誘導を示す図である。パート（Ａ）は、Ｃ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトしたＫＬＭ−１細胞におけるｓｕｂＧ１集団の割合（６５％）が、対照ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトした細胞（２７％）と比較して増加していることを検出している、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。パート（Ｂ）は、ＰＡＲＰ１−ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトしたＫＬＭ−１細胞におけるｓｕｂＧ１集団の割合（７９％）が、対照ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトした細胞（４０％）と比較して増加していることを検出している、検出ＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図６】Ｃ１２ＯＲＦ４８がインビトロのＰＡＲＰ１自己修飾を正に調節することを示す図である。精製した組換えＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質の非存在下または存在下で、［３２Ｐ］ＮＡＤ＋の取り込みによってＰＡＲＰ１自己修飾を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。レーン１、精製組換えＨｉｓタグ付きＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質単独；レーン２、Ｈｉｓタグ付きＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質およびＰＡＲＰ１タンパク質の両方；レーン３、ＰＡＲＰ１タンパク質単独。［３２Ｐ］ＮＡＤ＋の取り込みによって反映されたＰＡＲＰ１自己修飾は、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の非存在下と比較して、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の存在下で強く増強された。
【図７】Ｃ１２ＯＲＦ４８ノックダウンが、がん細胞抽出物中のＰＡＲＰ１活性を低下させ得ることを示す図である。パート（Ａ）は、ＫＬＭ−１細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８／ＰＡＲＰ１  ｓｉＲＮＡのノックダウン効果を裏付ける、抗Ｃ１２ＯＲＦ４８抗体（上）および抗ＰＡＲＰ１抗体（下）を使用したウェスタンブロット分析の結果を示す。パート（Ｂ）は、Ｃ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡまたはＰＡＲＰ１−ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされたＫＬＭ−１細胞の抽出物においてヒストンＨ１をポリ（ＡＤＰ−リボシル）化するＰＡＲＰ１活性が、対照ｓｉＲＮＡと比較して、それぞれ５９．２％および５５．５％減少したことを示している、ビオチン化ＡＤＰ−リボースのヒストンＨ１タンパク質への取り込みに基づく比色定量ＰＡＲＰアッセイの結果を示す。パート（Ｃ）は、ＳＵＩＴ−２細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８／ＰＡＲＰ１  ｓｉＲＮＡのノックダウン効果を裏付ける、抗Ｃ１２ＯＲＦ４８抗体（上）および抗ＰＡＲＰ１抗体（下）を使用したウェスタンブロット分析の結果を示す。パート（Ｄ）は、Ｃ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡまたはＰＡＲＰ１−ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされたＳＵＩＴ２細胞の抽出物においてヒストンＨ１をポリ（ＡＤＰ−リボシル）化するＰＡＲＰ１活性が、対照ｓｉＲＮＡと比較して、それぞれ６５．２％および４７．１％減少したことを示している、比色定量ＰＡＲＰアッセイの結果を示す。パート（Ｅ）は、抗ｐＡＤＰｒ抗体を使用したウェスタンブロット上でのＰＡＧＥの後、ＰＡＲと示されるＰＡＲＰ１酵素反応生成物が検出されたことを示す。Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１のノックダウンで、細胞抽出物中のＰＡＲＰ１活性は劇的に減少した。
【図８】Ｃ１２ＯＲＦ４８の過剰発現が細胞抽出物中のＰＡＲＰ１の活性を増強し得ることを示す図である。パート（Ａ）は、Ｃ１２ＯＲＦ４８発現ベクターのトランスフェクションから１２時間後、２４時間後、および４８時間後にそれぞれ細胞を収集し、抗Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリクローナル抗体を使用してＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質の発現を検出したことを示す。パート（Ｂ）は、細胞抽出物中のＰＡＲＰ１活性を比色定量ＰＡＲＰアッセイを使用することにより測定したことを示す。Ｃ１２ＯＲＦ４８発現と調和して、ＨＥＫ２９３細胞抽出物中のＰＡＲＰ１活性も増強された（Ｐ＜０．０００１、モックトランスフェクションと対比）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
態様の説明
本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試行において使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本材料および本方法を記載する前に、本発明が、本明細書に記載された特定のサイズ、形、寸法、材料、方法論、プロトコル等に限定されず、これらがルーチンの実験法および最適化に従い変動し得ることを理解されたい。また、明細書中で使用される用語は、特定の形式または態様を記載するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。
【００１８】
本明細書中で言及された各々の公開、特許、または特許出願の開示は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなる記載も、先行発明のため、本発明がそのような開示に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきではない。
【００１９】
矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図していない。
【００２０】
定義
「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」という単語は、本明細書で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも１つの」を意味する。
【００２１】
「単離された」および「精製された」という用語は、物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して本明細書で使用される場合、その物質が、天然起源では通常含まれ得る物質を少なくとも１つ実質的に含まないことを示す。したがって、単離されたまたは精製された抗体とは、タンパク質（抗体）が由来する細胞もしくは組織起源に由来する、炭水化物、脂質、もしくはその他の混入タンパク質などの細胞物質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合には、前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない抗体をさす。「細胞物質を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドが単離されたまたはポリペプチドが組換えにより作製された細胞の細胞成分からポリペプチドが分離されている、ポリペプチドの調製物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まないポリペプチドには、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、または５％未満の異種タンパク質（本明細書中、「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが組換えにより作製される場合には、それは、好ましくは、培養培地も実質的に含まず、そのようなポリペプチドには、タンパク質調製物の容積の約２０％、１０％、または５％未満の培養培地を含むポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合には、それは、好ましくは、前駆化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まず、そのようなポリペプチドには、タンパク質調製物の容積の（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％未満の、タンパク質の合成に関与する前駆化学物質またはその他の化学物質を含むポリペプチド調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が、単離または精製されたポリペプチドを含有していることは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後の単一バンドの出現によって示され得る。好ましい態様において、本発明の抗体は、単離または精製されている。
【００２２】
ｃＤＮＡ分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合には、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まない可能性があり、または、化学合成された場合には、前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離または精製されている。
【００２３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをさすために、交換可能に本明細書中で使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーのみならず、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体などの天然には存在しない残基である、アミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００２４】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸をさし、かつ、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をさす。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造（水素に結合したα炭素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をさす。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸と異なる構造を有するが、類似した機能を有する化学物質をさす。
【００２５】
アミノ酸は、本明細書中、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨された、それらの一般的に公知の３文字記号または１文字記号により言及される場合もある。
【００２６】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特に指定のない限り、交換可能に使用され、アミノ酸と同様に、それらの一般的に認められている１文字表記により言及される。アミノ酸と同様に、それらには、天然に存在する核酸ポリマーおよび天然には存在しない核酸ポリマーの両方が包含される。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから構成され得る。
【００２７】
他に定義されない限り、「がん」という用語は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を過剰発現しているがんをさす。Ｃ１２ＯＲＦ４８を過剰発現しているがんの例には、膵臓癌および前立腺癌、より具体的には、膵管腺癌および去勢抵抗性前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子またはＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質
本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８をコードする遺伝子が、非がん性組織と比較して、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）において過剰発現されているという発見に一部基づく。Ｃ１２ＯＲＦ４８のｃＤＮＡは３，１８９ヌクレオチド長である。Ｃ１２ＯＲＦ４８の核酸配列およびポリペプチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０および１１にそれぞれ示される。付加的な配列データも、以下のアクセッション番号を介して入手可能である。
Ｃ１２ＯＲＦ４８：ＮＭ＿０１７９１５
【００２９】
本発明の一局面によると、機能的等価物も「Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチド」であると見なされる。本明細書において、タンパク質の「機能的等価物」とは、そのタンパク質と等価な生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の生物学的能力を保持している任意のポリペプチドが、本発明において、そのような機能的等価物として使用され得る。そのような機能的等価物には、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、付加されているか、または挿入されているものが含まれる。あるいは、ポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも呼ばれる）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性、さらに好ましくは９６％〜９９％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されていてもよい。他の態様において、ポリペプチドは、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の天然に存在するヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、それを作製するために使用された細胞もしくは宿主、または利用された精製法に依って、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態における変動を有していてもよい。にもかかわらず、本発明のヒトＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質のものと等価な機能を有する限り、それは本発明の範囲内である。
【００３１】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、その標的配列、典型的には核酸の複雑な混合物中にある標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能にハイブリダイズしない条件をさす。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下で変動する。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲の案内は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍとは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの５０％が、標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、核濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される）。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのため、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、５０℃での０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳによる洗浄。
【００３２】
本発明との関連において、ヒトＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件を、当業者はルーチンに選択することができる。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を使用して、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを実施し、標識されたプローブを添加し、６８℃で１時間以上加熱することにより、ハイブリダイゼーションを実施することができる。例えば、低ストリンジェントな条件においては、以下の洗浄工程を実施することができる。例示的な低ストリンジェントな条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。多くの場合、高ストリンジェンシー条件が好んで使用される。例示的な高ストリンジェンシー条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳで２０分間、室温での３回の洗浄、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、３７℃での３回の洗浄、および１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、５０℃での２回の洗浄が含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などの幾つかの因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があり、当業者は、必要なストリンジェンシーを達成するために適切に因子を選択することができる。
【００３３】
一般的に、タンパク質内の１つ、２つ、または複数のアミノ酸の改変は、タンパク質の機能に影響を与えない。実際に、変異したタンパク質または改変されたタンパク質（すなわち、１つ、２つ、または幾つかのアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入、および／または付加により改変されているアミノ酸配列から構成されたペプチド）は、元の生物学的活性を保持することが公知である（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81： 5662-6 （1984）；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10：6487-500 （1982）；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79： 6409-13 （1982））。したがって、タンパク質の変化が類似の機能を有するタンパク質をもたらす場合、単一のアミノ酸、もしくは少ない比率のアミノ酸を変えるアミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、または「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明との関連において許容可能であることを、当業者は認識するであろう。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、Ｃ１２ＯＲＦ４８配列内の１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されているアミノ酸配列を有しうる。
【００３４】
タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の５％以下を変えることが一般的に好ましい。したがって、好ましい一態様において、そのような変異体において変異させるべきアミノ酸の数は、一般的には、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは５または６アミノ酸以下、さらに好ましくは３または４アミノ酸以下である。
【００３５】
変異させられるアミノ酸残基は、好ましくは、アミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異させられる（保存的アミノ酸置換として公知のプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通に有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有している側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有している側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有している側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有している側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族を含有している側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。例えば、以下の８つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有している：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００３６】
そのような保存的に改変されたポリペプチドは、本Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質は、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の生物学的活性が少なくとも１つ保持される限り、非保存的改変を含む。さらに、改変されたタンパク質は、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを除外しない。
【００３７】
さらに、本発明のＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子には、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質のそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドが包含される。Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためには、ハイブリダイゼーションに加えて、タンパク質をコードするＤＮＡの配列情報（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）に基づき合成されたプライマーを使用した、遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。ヒトＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子およびヒトＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質と機能的に等価なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、それぞれ、通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは、典型的には４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％〜９５％以上、さらに好ましくは９６％〜９９％以上の相同性をさす。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従い、決定され得る。
【００３８】
がんを診断する方法
Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現は、膵臓癌および前立腺癌、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）において特異的に上昇することが見出された（図１）。したがって、本明細書中で同定されるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物は、膵臓癌および前立腺癌、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）などのがんのマーカーとして診断的に利用可能であり、試料中のＣ１２ＯＲＦ４８の発現を測定することにより、それらのがんを診断することが可能である。より具体的には、本発明は、対象におけるＣ１２ＯＲＦ４８の発現レベルを決定することにより、がん、より具体的には、ＰＤＡＣまたはＣＲＰＣの存在、またはそれらを発症する素因を検出、診断、および／または決定する方法を提供する。本発明との関連において、「がん」という用語は、ＰＤＡＣおよびＣＲＰＣを含む、本発明の方法によって診断可能な膵臓癌および前立腺癌を示す。
【００３９】
本発明によれば、対象の状態を検査するための中間結果を提供することができる。そのような中間結果は、医師、看護師、またはその他の実務者が、対象が疾患に罹患していることを決定するのを補助するため、付加的な情報と組み合わせられてもよい。すなわち、本発明は、がんを検査するための診断マーカーＣ１２ＯＲＦ４８を提供する。
【００４０】
あるいは、本発明は、対象由来の膵組織試料または前立腺組織試料におけるがん細胞を検出または同定する方法を提供し、該方法は、遺伝子の正常対照レベルと比較した発現レベルの増加が、該組織におけるがん細胞の存在または疑いを示す、対象由来の生物学的試料におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む。
【００４１】
そのような結果は、対象が疾患に罹患していると診断する上で、医師、看護師、またはその他の医療実務者を補助するため、付加的な情報と組み合わせられてもよい。換言すると、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するために有用な情報を、医師に提供することができる。例えば、本発明によれば、対象から入手された組織におけるがん細胞の存在に関して疑いがある場合、組織病理学、公知の血中腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む、疾患の異なる局面に加えて、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを考慮することにより、臨床的な決定に到達することができる。例えば、幾つかの周知の血中診断用膵臓腫瘍マーカーは、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＤＵＰＡＮ−２、ＩＡＰ、ＫＭＯ−１、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＮＳＥ、ｓＩＣＡＭ−１、ＳＬＸ、Ｓｐａｎ−１、ＳＴＮ、ＴＰＡ、ＹＨ−２０６、およびエラスターゼ１である。あるいは、ＢＦＰ、ＩＡＰ、αマクログロブリン、ＰＡＰ、ＰＩＰＣ、ＰＳＡγ−Ｓｍ、およびＴＰＡなどの血中診断用前立腺腫瘍マーカーも、周知である。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現分析の結果は、対象の疾患状態のさらなる診断のための中間結果として役立つ。
【００４２】
本発明にとって特に関心対象であるのは、以下の［１］〜［１０］の方法である：
［１］対象由来の生物学的試料におけるＣ１２ＯＲＦ４８の発現レベルを決定する工程を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、遺伝子の正常対照レベルと比較したレベルの増加が、対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有することを示す、方法；
［２］発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、［１］に記載の方法；
［３］発現レベルが、
（ａ）Ｃ１２ＯＲＦ４８の配列を含むｍＲＮＡを検出する方法、
（ｂ）Ｃ１２ＯＲＦ４８のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する方法、および
（ｃ）Ｃ１２ＯＲＦ４８のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物学的活性を検出する方法
の中から選択される方法によって検出される、［１］に記載の方法；
［４］がんが膵臓癌または前立腺癌である、［１］に記載の方法；
［５］膵臓癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である、［４］に記載の方法；
［６］前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である、［４］に記載の方法；
［７］発現レベルが、遺伝子の遺伝子転写物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより決定される、［３］に記載の方法；
［８］発現レベルが、遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を、該遺伝子の発現レベルとして検出することにより決定される、［３］に記載の方法；
［９］生物学的試料が生検材料、痰、または血液を含む、［１］に記載の方法；
［１０］対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、［１］に記載の方法；
［１１］対象由来の生物学的試料ががん細胞を含む、［１］に記載の方法；ならびに
［１２］対象由来の生物学的試料ががん性上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
【００４３】
がんを診断する本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【００４４】
本方法によって診断される対象は、好ましくは、哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
診断を実施するためには、診断すべき対象から生物学的試料を収集することが好ましい。Ｃ１２ＯＲＦ４８の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を、決定のための生物学的試料として使用することができる。生物学的試料には、がんを診断することが望まれるかまたはがんに罹患していることが疑われる体組織、ならびに生検材料、血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくは、がん性上皮細胞、またはがん性であることが疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含有している。さらに、必要であれば、得られた体組織および体液から細胞を精製し、次いで、それを生物学的試料として使用してもよい。
【００４６】
本発明によると、対象由来の生物学的試料におけるＣ１２ＯＲＦ４８の発現レベルが決定される。当技術分野で公知の方法を使用して、転写（核酸）産物レベルで、発現レベルを決定することができる。例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを使用して定量することができる。検出は、チップ上またはアレイ上で実施されてもよい。アレイの使用は、Ｃ１２ＯＲＦ４８を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながんに特異的な遺伝子）の発現レベルを検出するために好ましい。当業者は、Ｃ１２ＯＲＦ４８の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｃＤＮＡをプローブとして使用することができる。必要であれば、色素、蛍光、および同位体などの好適な標識によりプローブを標識し、ハイブリダイズした標識の強度として、遺伝子の発現レベルを検出してもよい。
【００４７】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを使用して、Ｃ１２ＯＲＦ４８の転写産物を定量することもできる。そのようなプライマーも、利用可能な遺伝子の配列情報に基づき調製され得る。例えば、実施例で使用されるプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４）が、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出のために利用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
【００４８】
特に、本発明の方法のために使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件の下で、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーが、その標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件をさす。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的なハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍとは、平衡時に、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。概して標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合には少なくとも約６０℃であるものである。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。
【００４９】
あるいは、本発明の診断のために、翻訳産物を検出することもできる。例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の量を決定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を決定する方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルであってもよいしまたはポリクローナルであってもよい。さらに、断片がＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、検出のために使用することができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本発明においては、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。
【００５０】
翻訳産物に基づきＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質に対する抗体を使用した免疫組織化学分析を介して染色の強度を観察することができる。すなわち、強い染色の観察は、増加したタンパク質の存在を示し、同時に、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の高い発現レベルを示す。
【００５１】
さらに、診断の正確性を改善するために、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルに加えて、他のがん関連遺伝子、例えば、がんにおいて異なって発現されることが公知の遺伝子の発現レベルも決定することができる。
【００５２】
生物学的試料におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルから、例えば、１０％、２５％、もしくは５０％増加している場合；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増加している場合、増加していると見なされ得る。
【００５３】
疾患状態（がん性であるか非がん性であるか）が既知である対象から以前に収集され保管されていた試料を使用することによって、試験生物学的試料と同時に対照レベルを決定することができる。あるいは、疾患状態が既知である対象由来の試料において、以前に決定されたＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づき、統計的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞からの発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の一局面によると、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと、生物学的試料におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを比較してもよい。患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野で公知の任意の方法によって入手され得る。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を、標準値として使用することができる。
【００５４】
本発明との関連において、非がん性であることが既知の生物学的試料から決定された対照レベルは、「正常対照レベル」と呼ばれる。他方、対照レベルががん性生物学的試料から決定される場合、それは「がん性対照レベル」と呼ばれる。
【００５５】
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して増加しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、対象は、がんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有すると診断され得る。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似性は、対象が、がんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示す。
【００５６】
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルとの間の差は、細胞のがん性状態または非がん性状態によって発現レベルが異ならないことが既知の対照核酸、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化され得る。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
がんを診断するためのキット
本発明は、がんの予後の評価および／またはがん治療の効力のモニタリングにおいても有用であり得る、がんを診断するためのキットを提供する。好ましくは、がんは膵臓癌または前立腺癌である。より具体的には、キットは、好ましくは、以下の群から選択され得る、対象由来の生物学的試料におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現を検出するための試薬を少なくとも１つ含む：
（ａ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【００５８】
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子のｍＲＮＡを検出するための好適な試薬には、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡに特異的に結合するかまたはＣ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡを特異的に同定する核酸が含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドの例は、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブである。当技術分野で周知の方法に基づき、これらの種類のオリゴヌクレオチドを調製することができる。必要であれば、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡを検出するための試薬を、固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡを検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００５９】
他方、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質を検出するための好適な試薬には、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルであってもよいしまたはポリクローナルであってもよい。さらに、断片がＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本発明においては、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。さらに、直接結合または間接標識技術を介して、シグナル生成分子によって抗体を標識してもよい。標識、および抗体を標識して抗体とその標的との結合を検出する方法は、当技術分野で周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。さらに、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００６０】
さらに、生物学的試料において、例えば、発現されたＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質による細胞増殖活性を測定することによって、生物学的活性を決定してもよい。例えば、細胞を、対象由来の生物学的試料の存在下で培養し、次いで、増殖のスピードを検出するか、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、生物学的試料の細胞増殖活性を決定することができる。必要であれば、Ｃ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡを検出するための試薬を、固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の生物学的活性を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００６１】
キットは、前記試薬を複数含有していてもよい。さらに、キットは、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子に対するプローブまたはＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質に対する抗体を結合させるための固体マトリックスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性の対照試薬、ならびにＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでいてもよい。例えば、がんに罹患しているかまたは罹患していない対象から入手された組織試料が、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含んでいてもよい。これらの試薬等は、ラベルを有する容器に保持され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラス、またはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。
【００６２】
本発明の一態様として、試薬がＣ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡに対するプローブである場合、少なくとも１つの検出部位が形成されるよう、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックスの上に固定化することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、核酸（プローブ）を各々が含有している複数の部位を含んでいてもよい。テストストリップは、陰性対照および／または陽性対照のための部位も含有していてもよい。あるいは、対照部位は、テストストリップから分離されたストリップの上に位置していてもよい。任意で、異なる検出部位は、固定化された核酸を、異なる量、含有していてもよい。すなわち、第１の検出部位に、より高い量を含有し、その後の部位に、より少ない量を含有していてもよい。試験試料の添加時、検出可能シグナルを示す部位の数が、試料中に存在するＣ１２ＯＲＦ４８のｍＲＮＡの量の定量的な指標を提供する。検出部位は、任意の適切に検出可能な形で配置され得、典型的には、テストストリップ幅にわたるバーまたはドットの形である。
【００６３】
本発明のキットは、さらに、陽性対照試料またはＣ１２ＯＲＦ４８標準試料を含んでいてもよい。Ｃ１２ＯＲＦ４８陽性試料を収集することにより本発明の陽性対照試料を調製してもよく、次いで、これらのＣ１２ＯＲＦ４８レベルをアッセイする。あるいは、陽性試料またはＣ１２ＯＲＦ４８標準物が形成されるよう、精製されたＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質またはＣ１２ＯＲＦ４８ポリヌクレオチドを、Ｃ１２ＯＲＦ４８を発現していない細胞に添加することもできる。本発明において、精製されたＣ１２ＯＲＦ４８は、組換えタンパク質であり得る。陽性対照試料のＣ１２ＯＲＦ４８レベルは、例えば、カットオフ値より大きい。
【００６４】
抗がん化合物のスクリーニング
本発明との関連において、本スクリーニング方法により同定される剤には、任意の化合物、または幾つかの化合物を含む組成物が含まれる。さらに、本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤は、単一の化合物であっても、または化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを前記方法において使用する場合には、化合物を逐次的に接触させてもよいし、または同時に接触させてもよい。
【００６５】
任意の試験剤、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製されたタンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー等などの核酸構築物を含む）、および天然化合物を、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。本発明の試験剤は、（１）生物学的ライブラリ、（２）空間的にアドレス可能なパラレルな固相または液相のライブラリ、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティクロマトグラフィ選択を使用する合成ライブラリ法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法の多数のアプローチのいずれかを使用して入手され得る。アフィニティクロマトグラフィ選択を使用する生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12： 145-67）。分子ライブラリの合成法の例は、当技術分野で見い出され得る（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90： 6909-13；Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91： 11422-6；Zuckermann et al., J Med Chem 37： 2678-85, 1994；Cho et al., Science 1993, 261： 1303-5；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33： 2059；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33： 2061；Gallop et al., J Med Chem 1994, 37： 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13： 412-21を参照されたい）、またはビーズ上（Lam, Nature 1991, 354： 82-4）、チップ上（Fodor, Nature 1993, 364： 555-6）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89： 1865-9）、もしくはファージ上（Scott and Smith, Science 1990, 249： 386-90；Devlin, Science 1990, 249： 404-6；Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87： 6378-82；Felici, J Mol Biol 1991, 222： 301-10；米国特許出願第２００２１０３３６０号）に提示され得る。
【００６６】
本スクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング方法によって入手される剤に含まれる。
【００６７】
さらに、スクリーニングされた試験剤がタンパク質である場合、タンパク質をコードするＤＮＡを入手するためには、タンパク質の全アミノ酸配列を決定して、タンパク質をコードする核酸配列を推定することもできるし、または入手されたタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、その配列に基づきオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、そのプローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを入手することもできる。入手されたＤＮＡは、がんを治療または予防するための候補である試験剤の調製における有用性に関して確認される。
【００６８】
本明細書に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤は、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよく、またはインビボで元のタンパク質の生物学的活性を欠くその部分ペプチドに特異的に結合する抗体であってもよい。
【００６９】
試験剤ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、本スクリーニング方法のための試験剤の同定およびそのような剤のライブラリの構築に関するさらなる指針を以下に提供する。
【００７０】
（ｉ）分子モデリング
試験剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知の化合物の分子構造、および／またはＣ１２ＯＲＦ４８の分子構造の知識により容易になる。さらなる評価のために好適な試験剤を予備スクリーニングするための１つのアプローチは、試験剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングを利用する。
【００７１】
コンピュータモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造の可視化、およびその分子と相互作用する新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元構築物は、典型的には、選択された分子のＸ線結晶学的分析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全にするための化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能にする。一方または両方に軽微な変化が加えられた場合に、分子−化合物相互作用がどのようになるかを予測するには、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要とされ、それらは、通常、分子設計プログラムと使用者との間のユーザーフレンドリーなメニュー方式のインターフェースと連結される。
【００７２】
上記に概説された分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓが含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学の機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、相互作用的構築、改変、可視化、および分子の互いの挙動の分析を可能にする。
【００７３】
特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを主題として、多数の論文が発表されており、その例には、Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97： 159-66；Ripka, New Scientist 1988, 54-8；McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29： 111-22；Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291： 189-93；Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236： 125-40, 141-62；および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111： 1082-90が含まれる。
【００７４】
化学物質をスクリーニングし図示するその他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc.（Mississauga，Ontario，Canada）、およびHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）などの会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31： 722-9；Meng et al., J Computer Chem 1992, 13： 505-24；Meng et al., Proteins 1993, 17： 266-78；Shoichet et al., Science 1993, 259： 1445-50を参照されたい。
【００７５】
推定上の阻害剤が同定されたならば、以下に詳述されるように、同定された推定上の阻害剤の化学構造に基づき、多数のバリアントを構築するため、コンビナトリアルケミストリー技術を利用することができる。その結果得られた推定上の阻害剤または「試験剤」のライブラリは、がん、特に膵臓癌および前立腺癌などの治療および／もしくは予防、ならびに／またはそれらの術後再発の予防に適した試験剤を同定するため、本発明の方法を使用してスクリーニングされ得る。
【００７６】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成
試験剤のコンビナトリアルライブラリは、既知の阻害剤に存在しているコア構造の知識を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製され得る。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを容易にする適度のサイズにライブラリを維持することが可能になる。あるいは、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を簡便に合成することにより、単純な、特に短い、重合体分子ライブラリを構築することもできる。この後者のアプローチの一例は、６アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。そのようなペプチドライブラリは、６アミノ酸配列のあらゆる順列を含み得る。この種類のライブラリは、線形コンビナトリアルケミカルライブラリと称される。
【００７７】
コンビナトリアルケミカルライブラリの調製は、当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれかにより作製され得る。コンビナトリアルケミカルライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37： 487-93；Houghten et al., Nature 1991, 354： 84-6を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作製するためのその他の化学を使用することもできる。そのような化学には、ペプチド（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば、ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90： 6909-13）、ビニロガス（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114： 6568）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114： 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116： 2661）、オリゴカルバメート（Cho et al., Science 1993, 261： 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59： 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement；Sambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14（3）： 309-14およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274： 1520-22；米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1； 6（6）： 624-31.；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
コンビナトリアルライブラリの調製のための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を参照されたい）。さらに、コンビナトリアルライブラリ自体も多数市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｅｘｔｏｎ，  ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  ＭＤ等を参照されたい）。
【００７９】
（ｉｉｉ）その他の候補
もう１つのアプローチは、ライブラリを作製するために組換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249： 386-90；Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87： 6378-82；Devlin et al., Science 1990, 249： 404-6）を使用すれば、極めて大きいライブラリを構築することができる（例えば、１０６〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用し、Ｇｅｙｓｅｎの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23： 709-15；Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102： 259-74）；およびＦｏｄｏｒらの方法（Science 1991, 251： 767-73）がその例である。Ｆｕｒｋａら（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR： 013； Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37： 487-93）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびＲｕｔｔｅｒら（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を作製する方法を記載している。
【００８０】
アプタマーは、特定の分子標的に強固に結合する核酸から構成された巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249：505-510 （1990））は、アプタマーの選択のためのＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法においては、核酸分子の大きなライブラリ（例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【００８１】
Ｃ１２ＯＲＦ４８と結合する化合物のスクリーニング
本発明との関連において、正常器官では発現が見られないにもかかわらず、膵臓癌および前立腺癌においてＣ１２ＯＲＦ４８の過剰発現が検出された（図１）。したがって、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子、およびその遺伝子によりコードされるタンパク質を使用して、Ｃ１２ＯＲＦ４８と結合する化合物をスクリーニングする方法を、本発明は提供する。がんにおけるＣ１２ＯＲＦ４８の発現のため、Ｃ１２ＯＲＦ４８と結合する化合物は、がん細胞の増殖を抑制することが期待され、したがって、がんを治療または予防するのに有用である。したがって、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドを使用して、がん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供し、ここで、該がんは膵臓癌細胞または前立腺癌細胞である。このスクリーニング方法の１つの特定の態様は、以下の工程を含む：
（ａ）試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）前記ポリペプチドと試験化合物との間の結合活性を検出する工程；および
（ｃ）前記ポリペプチドと結合する試験化合物を選択する工程。
【００８２】
本発明との関連において、治療効果は、試験剤または試験化合物とＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質との結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物がＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質と結合する場合には、その試験剤または試験化合物を、必要な治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物がＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質と結合しない場合には、その試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【００８３】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【００８４】
スクリーニングに使用されるＣ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは自然界由来のタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであり得る。試験化合物と接触させられるポリペプチドは、例えば、精製されたポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【００８５】
タンパク質、例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに結合するタンパク質を、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドを使用してスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。そのようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により、特に、以下のように実施され得る。Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドをコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、およびｐＣＤ８などの外来遺伝子の発現ベクターに挿入することにより、宿主（例えば、動物）細胞等において発現させる。
【００８６】
発現に使用されるプロモーターは、一般に使用され得る任意のプロモーターであってよく、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson （ed.）, Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 （1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91： 217-23 （1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108： 193 （1991））、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152： 684-704 （1987））、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8： 466 （1988））、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84： 3365-9 （1987））、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1： 385-94 （1982））、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9： 946 （1989））、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等を含み得る。
【００８７】
外来遺伝子を発現させるための宿主細胞への遺伝子の導入は、任意の方法、例えば、エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15： 1311-26 （1987））、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7： 2745-52 （1987））、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12： 5707-17 （1984）；Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4： 1641-3 （1984））、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76： 1025-37 （1994）；Lamb et al., Nature Genetics 5： 22-30 （1993）：Rabindran et al., Science 259： 230-4 （1993））等に従い実施され得る。
【００８８】
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、特異性が明らかなモノクローナル抗体のエピトープを導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Experimental Medicine 13： 85-90 （1995））。マルチクローニング部位の使用により、例えば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現し得るベクターが、市販されている。また、融合によりＣ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドの特性が変化しないよう、数個〜十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することにより調製された融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープと、これらを認識するモノクローナル抗体とを、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13： 85-90 （1995））。
【００８９】
免疫沈降においては、適切な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物に、これらの抗体を添加することにより、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチド、該ポリペプチドとの結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。免疫沈降は、上記エピトープに対する抗体を使用する以外に、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに対する、上記のように調製され得る抗体を使用して実施されてもよい。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えば、プロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースにより、免疫複合体を沈降させることができる。Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によりコードされるポリペプチドが、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製される場合には、グルタチオン−セファロース４Ｂなどのこれらのエピトープと特異的に結合する物質を使用して、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同様に免疫複合体を形成させることができる。
【００９０】
免疫沈降は、例えば、文献中の方法に従ってまたは準じて実施され得る（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York （1988））。
【００９１】
免疫沈降したタンパク質の分析には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般に使用され、結合したタンパク質は、適切な濃度を有するゲルを使用して、タンパク質の分子量により分析され得る。Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに結合したタンパク質は、クーマシー染色または銀染色などの一般の染色法によって検出することが困難であるため、細胞を、放射性同位体３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有している培養培地中で培養し、細胞内のタンパク質を標識し、タンパク質を検出することにより、タンパク質の検出感度を改善することができる。タンパク質の分子量が明らかである場合には、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製し、その配列を決定することができる。
【００９２】
Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに結合するタンパク質を、該ポリペプチドを使用してスクリーニングする方法として、ウエストウエスタンブロット分析（Skolnik et al., Cell 65： 83-90 （1991））を使用することができる。特に、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される培養細胞から、ｃＤＮＡライブラリを、ファージベクター（例えば、ＺＡＰ）を使用して調製し、ＬＢ−アガロース上でタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質をフィルタ上に固定し、精製され標識されたＣ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドを上記フィルタと反応させ、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに結合したタンパク質を発現しているプラークを標識によって検出することにより、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドに結合するタンパク質を入手することができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの間の結合を利用するか、またはＣ１２ＯＲＦ４８と特異的に結合する抗体、もしくはＣ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドと融合させられるペプチドもしくはポリペプチド（例えば、ＧＳＴ）を利用することにより、標識され得る。放射性同位体または蛍光等を使用する方法も、使用することができる。
【００９３】
あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68： 597-612 （1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10： 286-92 （1994）」）。
【００９４】
ツーハイブリッドシステムにおいては、本発明のポリペプチドをＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される細胞からのｃＤＮＡライブラリを、ライブラリが、発現された場合にＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域に融合するよう、調製する。次いで、ｃＤＮＡライブラリを上記酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するｃＤＮＡを、検出された陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、その２つの結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にする）。上記の単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入し、タンパク質を発現させることにより、ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を調製することができる。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等も使用することができる。
【００９５】
アフィニティクロマトグラフィを使用して、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する化合物をスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティカラムの担体上に固定化し、本発明のポリペプチドに結合可能なタンパク質を含有している試験化合物をカラムに適用することができる。本明細書中の試験化合物は、例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物を負荷した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合には、入手されたタンパク質のアミノ酸配列を分析し、配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、オリゴＤＮＡをプローブとして使用してｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを入手する。
【００９６】
本発明においては、結合した化合物を検出または定量化する手段として、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを使用してもよい。そのようなバイオセンサーを使用した場合、極微量のポリペプチドのみを使用して、標識することなく、本発明のポリペプチドと試験化合物との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを使用して、本発明のポリペプチドと試験化合物との間の結合を評価することが可能である。
【００９７】
タンパク質だけでなくＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質に結合する化学化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化されたＣ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドを合成化学化合物または天然物質バンクまたはランダムファージペプチドディスプレイライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、およびコンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを使用したスクリーニング方法（Wrighton et al., Science 273： 458-64 （1996）；Verdine, Nature 384： 11-13 （1996）；Hogan, Nature 384： 17-9 （1996））が当業者に周知である。
【００９８】
Ｃ１２ＯＲＦ４８の生物学的活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明との関連において、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質は、がん細胞の細胞増殖を促進する活性を有すると特徴づけされる（図２）。この生物学的活性を指標として使用して、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８を発現しているがん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、ならびに、がん、特に、膵臓癌および前立腺癌を含むがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。したがって、本発明は、以下のような工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によりコードされるポリペプチドを使用して、がんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出されるポリペプチドの生物学的活性と比較して、Ｃ１２ＯＲＦ４８のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制する該試験化合物を選択する工程。
【００９９】
本発明によると、細胞増殖を促進する活性の抑制に関する試験化合物、またはＣ１２ＯＲＦ４８に関連したがん（例えば、膵臓癌および前立腺癌）を治療もしくは予防するための候補化合物の治療効果を、評価することができる。したがって、本発明は、以下のような工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその断片を使用して、細胞増殖を抑制するための候補化合物、またはＣ１２ＯＲＦ４８に関連したがんを治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法も提供する：
（ａ）試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）（ｂ）の生物学的活性を試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【０１００】
本発明との関連において、治療効果は、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害する場合には、その試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害しない場合には、その試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【０１０１】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の生物学的活性を抑制する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。そのような生物学的活性には、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の細胞増殖活性が含まれる。例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質を使用することができ、これらのタンパク質と機能的に等価なポリペプチドも使用することができる。そのようなポリペプチドは、細胞により内因的にまたは外因的に発現され得る。
【０１０２】
このスクリーニングにより単離される化合物は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によりコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することにより、その機能を阻害する分子をさす。この用語は、Ｃ１２ＯＲＦ４８をコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子もさす。さらに、このスクリーニングにより単離される化合物は、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０１０３】
本方法において検出される生物学的活性が細胞増殖である場合、それは、例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドを発現している細胞を調製し、試験化合物の存在下で細胞を培養し、細胞周期等を測定する、細胞増殖のスピードを決定することにより、および、例えば図２に示される生存細胞またはコロニー形成活性を測定することにより、検出され得る。Ｃ１２ＯＲＦ４８を発現している細胞の増殖のスピードを低下させる化合物を、膵臓癌および前立腺癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。より具体的には、方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８を過剰発現している細胞と接触させる工程；
（ｂ）細胞増殖活性を測定する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下での細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を低下させる試験化合物を選択する工程。
好ましい態様において、本発明の方法は、以下の工程をさらに含みうる：
（ｄ）Ｃ１２ＯＲＦ４８を全くまたはほとんど発現していない細胞に対して効果を及ぼさない試験化合物を選択する工程。
【０１０４】
本明細書中で定義される「生物学的活性を抑制するかまたは低下させる」という語句は、化合物の非存在下と比較した、Ｃ１２ＯＲＦ４８の生物学的活性の、好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制である。
【０１０５】
Ｃ１２ＯＲＦ４８とＰＡＲＰ１との結合を指標として使用するスクリーニング
本発明において、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質がＰＡＲＰ１タンパク質と相互作用することが確認された（図４）。したがって、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質とＰＡＲＰ１タンパク質との結合を指標として使用して、そのようなＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質とＰＡＲＰ１タンパク質との間の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質とＰＡＲＰ１タンパク質との結合を指標として使用して、そのようなＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質とＰＡＲＰ１タンパク質との間の結合を阻害するための化合物をスクリーニングするための方法を提供する。さらに、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８を発現しているがん細胞、例えば、膵臓癌細胞および前立腺癌細胞の増殖を阻害するかまたは低下させるための化合物、ならびに、がん、例えば、膵臓癌または前立腺癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法も提供する。具体的には、本発明は、以下の［１］〜［５］の方法を提供する：
［１］以下の工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドとＰＡＲＰ１ポリペプチドとの間の結合を妨害する剤または化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する工程；および
（ｄ）結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験剤または試験化合物を選択する工程。
［２］以下の工程を含む、がんの治療または予防において有用な剤または化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する工程；および
（ｄ）結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験剤または試験化合物を選択する工程。
［３］Ｃ１２ＯＲＦ４８の機能的等価物がＰＡＲＰ１結合ドメインを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＰＡＲＰ１の機能的等価物がＣ１２ＯＲＦ４８結合ドメインを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［５］がんが膵臓癌および前立腺癌からなる群より選択される、［１］に記載の方法。
【０１０６】
本発明によると、細胞増殖を阻害するための試験剤もしくは試験化合物、またはＣ１２ＯＲＦ４８関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。より具体的には、方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試験剤または試験化合物の存在下で、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチド間の結合のレベルを検出する工程；および
（ｃ）Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質とＰＡＲＰ１タンパク質との結合レベルを、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する工程；および
（ｄ）（ｃ）の結合レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【０１０７】
本発明との関連において、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはＰＡＲＰ１ポリペプチドの機能的等価物とは、それぞれ、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）またはＰＡＲＰ１ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）と等価な生物学的活性を有するポリペプチドである。
【０１０８】
Ｃ１２ＯＲＦ４８のＰＡＲＰ１との結合をモジュレートする、例えば、阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。
【０１０９】
スクリーニングに使用されるポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは自然界由来のタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであり得る。上記の任意の試験化合物がスクリーニングに使用され得る。
【０１１０】
タンパク質、例えば、ポリペプチドに結合するタンパク質を、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドもしくはＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはそれらの機能的等価物を使用してスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。そのようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降、ウエストウエスタンブロッティング分析（Skolnik et al., Cell 65： 83-90 （1991））、細胞を利用するツーハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68： 597-612 （1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10： 286-92 （1994）」）、アフィニティクロマトグラフィ、および表面プラズモン共鳴現象を使用したバイオセンサーを使用して実施され得る。上記の任意の試験化合物を使用することができる。幾つかの態様において、この方法は、候補化合物のＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質もしくはＰＡＲＰ１タンパク質との結合を検出する工程、またはＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質のＰＡＲＰ１タンパク質との結合のレベルを検出する工程をさらに含む。Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質および／またはＰＡＲＰ１タンパク質を発現している細胞には、例えば、がん、例えば、肺癌から樹立された細胞株が含まれ、そのような細胞は、これらの２つの遺伝子を発現している限り、本発明の上記スクリーニングのため使用され得る。あるいは、細胞を、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質およびＰＡＲＰ１タンパク質の発現ベクターの両方または一方によりトランスフェクトして、これらの２つの遺伝子を発現させてもよい。Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質のＰＡＲＰ１タンパク質との結合は、抗Ｃ１２ＯＲＦ４８抗体および抗ＰＡＲＰ１抗体を使用した免疫沈降アッセイにより検出され得る（図４）。
【０１１１】
ＰＡＲＰ１の生物学的活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明との関連において、ＰＡＲＰ１活性がＣ１２ＯＲＦ４８ノックダウンにおいて劇的に減少することが確認された（図７Ｅ）。この活性を指標として使用して、Ｃ１２ＯＲＦ４８およびＰＡＲＰ１を発現しているがん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、ならびに、がん、特に、膵臓癌および前立腺癌を含むがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を、本発明は提供する。したがって、本発明は、以下の工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によりコードされるポリペプチドを使用して、がんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験化合物を、ＰＡＲＰ１のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの存在下で、Ｃ１２ＯＲＦ４８のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）ＰＡＲＰ１のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出されるポリペプチドの生物学的活性と比較して、ＰＡＲＰ１のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験化合物を選択する工程。
【０１１２】
本発明によると、ＰＡＲＰ１の自己修飾活性の抑制に関する試験化合物、またはＣ１２ＯＲＦ４８に関連したがん（例えば、膵臓癌および前立腺癌）を治療もしくは予防するための候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明は、以下のような工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその断片およびＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその断片を使用して、自己修飾活性を抑制するための候補化合物、またはＣ１２ＯＲＦ４８に関連したがんを治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法も提供する：
（ａ）試験化合物を、ＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的断片の存在下で、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）のＰＡＲＰ１ポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）（ｂ）の生物学的活性を試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【０１１３】
本発明との関連において、治療効果は、Ｃ１２ＯＲＦ４８により増強されるＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的断片の自己調整活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、ＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的断片の自己調整活性を抑制または阻害する場合には、その試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、ＰＡＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的断片の自己調整活性を抑制または阻害しない場合には、その試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【０１１４】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。ＰＡＲＰ１タンパク質の自己調整活性を抑制する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質およびＰＡＲＰ１タンパク質を使用することができ、これらのタンパク質と機能的に等価なポリペプチドも使用することができる。そのようなポリペプチドは、細胞により内因的にまたは外因的に発現され得る。
【０１１５】
このスクリーニングにより単離される化合物は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によりコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することにより、その機能を阻害する分子をさす。この用語は、Ｃ１２ＯＲＦ４８をコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子もさす。さらに、このスクリーニングにより単離される化合物は、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドとＰＡＲＰ１とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０１１６】
本方法において検出される生物学的活性が自己調整である場合、それは、例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリペプチドおよびＰＡＲＰ１ポリペプチドを発現している細胞を調製し、試験化合物の存在下で細胞を培養し、細胞周期等の測定する、ＰＡＲＰ１の自己調整を決定することにより、および生存細胞またはコロニー形成活性を測定することにより、検出され得る。Ｃ１２ＯＲＦ４８を発現している細胞のＰＡＲＰ１の自己調整を低下させる化合物を、膵臓癌および前立腺癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０１１７】
より具体的には、方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８およびＰＡＲＰ１を過剰発現している細胞と接触させる工程；
（ｂ）ＰＡＲＰ１の自己調整活性を測定する工程；ならびに
（ｃ）試験化合物の非存在下での細胞増殖活性と比較して、自己調整活性を低下させる試験化合物を選択する工程。
好ましい態様において、本発明の方法は、以下の工程をさらに含む：
（ｄ）Ｃ１２ＯＲＦ４８を全くまたはほとんど発現していない細胞に対して効果を及ぼさない試験化合物を選択する工程。
【０１１８】
本明細書中で定義される「自己調整を抑制するかまたは低下させる」という語句は、化合物の非存在下と比較した、Ｃ１２ＯＲＦ４８の生物学的活性の、好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制である。
【０１１９】
Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現を変える化合物のスクリーニング
本発明において、ｓｉＲＮＡによるＣ１２ＯＲＦ４８の発現の減少は、がん細胞増殖の阻害をもたらす（図２）。したがって、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現を阻害する化合物は、がん細胞の増殖を抑制すると予想され、したがって、がん、特に、膵臓癌および前立腺癌などのがんを治療または予防するのに有用である。したがって、本発明は、がん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法も提供する。本発明との関連において、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の工程を含み得る：
（ａ）候補化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８を発現している細胞と接触させる工程；および
（ｂ）対照と比較して、Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程。
【０１２０】
本発明によると、細胞増殖の阻害に関する試験剤もしくは試験化合物、またはＣ１２ＯＲＦ４８関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびＣ１２ＯＲＦ４８関連疾患を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【０１２１】
本発明との関連において、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の工程を含み得る：
（ａ）試験剤または試験化合物を、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している細胞と接触させる工程；
（ｂ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを検出する工程；および
（ｃ）（ｂ）の発現レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【０１２２】
本発明との関連において、治療効果は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを低下させる場合には、その試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現レベルを低下させない場合には、その試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【０１２３】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。Ｃ１２ＯＲＦ４８を発現している細胞には、例えば、膵臓癌および前立腺癌から樹立された細胞株、またはＣ１２ＯＲＦ４８発現ベクターによりトランスフェクトされた細胞株が含まれ；そのような細胞のいずれかを、本発明の上記スクリーニングのために使用することができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー分析により推定され得る。本明細書中で定義される「発現レベルを低下させる」とは、Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現レベルの、化合物の非存在下での発現レベルと比較した、好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％低下したレベル、および最も好ましくは９５％低下したレベルである。本明細書中の化合物には、化学化合物、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は前記説明にある。スクリーニング方法において、Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現レベルを低下させる化合物を、膵臓癌および前立腺癌の治療または予防に使用される候補化合物として選択することができる。
【０１２４】
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）Ｃ１２ＯＲＦ４８の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞に、候補化合物を接触させる工程；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる候補化合物を選択する工程。
【０１２５】
本発明によると、細胞増殖の阻害に関する試験剤もしくは試験化合物、またはＣ１２ＯＲＦ４８関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびＣ１２ＯＲＦ４８関連疾患を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。本発明との関連において、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の工程を含み得る：
（ａ）Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とから構成されたベクターが導入された細胞に、試験剤または試験化合物を接触させる工程；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現または活性を検出する工程；および
（ｃ）（ｂ）の発現レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【０１２６】
本発明との関連において、治療効果は、レポーター遺伝子の発現または活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる場合には、その試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現または活性を低下させない場合には、その試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【０１２７】
好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が含まれるがこれらに限定されず、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＣ１２ＯＲＦ４８の転写調節領域と接続することにより調製され得る。本明細書中のＣ１２ＯＲＦ４８の転写調節領域は、転写開始部位から少なくとも５００ｂｐ上流、好ましくは１，０００ｂｐ、より好ましくは５，０００ｂｐまたは１０，０００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含有しているヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離されてもよいし、またはＰＣＲによって増幅させられてもよい。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域と接続することにより調製され得る。転写調節領域を同定するための方法、およびアッセイプロトコルも周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０１２８】
レポーター構築物を含有しているベクターを、宿主細胞に感染させ、レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を使用して）検出する。本明細書中で定義される「発現または活性を低下させる」とは、レポーター遺伝子の発現または活性の、化合物の非存在下と比較した、好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは９５％の低下である。
【０１２９】
本発明との関連において、がんを治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物の治療的可能性は、がんの治療剤を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングにより評価され得る。例えば、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質と結合する化合物が、上記のがんの活性を阻害する場合、そのような化合物はＣ１２ＯＲＦ４８特異的な治療効果を有していると結論付けることができる。
【０１３０】
二本鎖分子
本明細書で使用される場合、「単離二本鎖分子」という用語は標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味し、例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および短鎖干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ二本鎖ＲＮＡ分子をさす。ＤＮＡが、ＲＮＡが転写される鋳型である技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＲＮＡは、Ｃ１２ＯＲＦ４８のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、Ｃ１２ＯＲＦ４８のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように（例えばヘアピン）、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれであってもよい。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、かつその相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成している、２つのＲＮＡ分子の構築物をさす。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡをさす。該領域の相補性および配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１および第２の領域はループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される二本鎖ポリヌクレオチド分子を意味し、ＲＮＡおよびＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ。本明細書において、ハイブリッドは、ＤＮＡから構成されるポリヌクレオチドとＲＮＡから構成されるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を含む鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有し得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、Ｃ１２ＯＲＦ４８のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、Ｃ１２ＯＲＦ４８のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように（例えばヘアピン）、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれであってもよい。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、かつ該相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成している、２つの分子の構築物をさす。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方が、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成されるか（キメラ分子）、またはもう一つの選択肢として分子の一方がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡをさす。該領域の相補性および配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１および第２の領域はループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「単離核酸」は、その元の環境（例えば、天然物の場合は自然環境）から取り出した核酸であり、したがって、その自然状態から合成的に変化させた核酸である。本発明との関連において、単離核酸の例としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその誘導体が挙げられる。
【０１３８】
標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする、Ｃ１２ＯＲＦ４８に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常一本鎖であるｍＲＮＡ転写物と結合し、それにより、翻訳に干渉し、したがって、タンパク質の発現を阻害することにより、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子によってコードされるＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質の産生を減少させるかまたは阻害する。本明細書中で証明される通り、膵臓癌細胞株におけるＣ１２ＯＲＦ４８の発現はｄｓＲＮＡによって阻害された（図２）。したがって、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現を阻害することができる単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、後述されるものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計され得る。Ｃ１２ＯＲＦ４８標的配列の例には、例えば、以下のようなヌクレオチドが含まれる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１１３３〜１１５１位）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１３１０〜１３２８位）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の６０６〜６２４位）
【０１３９】
同様に、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする、ＰＡＲＰ１に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常一本鎖であるｍＲＮＡ転写物と結合し、それにより、翻訳に干渉し、したがって、タンパク質の発現を阻害することにより、ＰＡＲＰ１遺伝子によってコードされるＰＡＲＰ１タンパク質の産生を減少させるかまたは阻害する。本明細書中で証明される通り、膵臓癌細胞株におけるＰＡＲＰ１の発現は、ｄｓＲＮＡによって阻害された（図７）。したがって、本発明は、ＰＡＲＰ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に、ＰＡＲＰ１遺伝子の発現を阻害することができる単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、後述のものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計され得る。ＰＡＲＰ１標的配列の例には、例えば、以下のようなヌクレオチドが含まれる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２６８５〜２７０３位）
【０１４０】
本発明において特に関心対象であるのは、以下の［１］〜［１８］の二本鎖分子である：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成され、細胞に導入された場合にＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子；
［２］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１１３３〜１１５１位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１３１０〜１３２８位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の６０６〜６２４位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２６８５〜２７０３位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡに対して作用する、［１］に記載の二本鎖分子；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の二本鎖分子；
［４］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［３］に記載の二本鎖分子；
［５］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［４］に記載の二本鎖分子；
［６］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［５］に記載の二本鎖分子；
［７］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の二本鎖分子；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、［７］に記載の二本鎖分子；
［９］介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１０］一般式：５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］と相補的な配列を含むアンチセンス鎖である）を有する、［９］に記載の二本鎖分子；
［１１］ＲＮＡから構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１２］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１４］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１３］に記載の二本鎖分子；
［１５］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１６］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡである、［１５］に記載の二本鎖分子；
［１７］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから構成される、［１６］に記載の二本鎖分子；ならびに
［１８］３’オーバーハングを含有する、［２］に記載の二本鎖分子。
【０１４１】
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
【０１４２】
細胞において標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば米国特許第６，５０６，５５９号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトから入手可能である（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）。
【０１４３】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
【０１４４】
標的部位の選択
１．  転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、それぞれのＡＡの存在とその３’側に隣接した１９個のヌクレオチドとを記録する。Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．は、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および開始コドン近くの領域（７５塩基以内）に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これは、これらの領域に調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２．  潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でのＮＣＢＩサーバーにあるＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25（17）:3389-402）。
３．  合成のために適格である標的配列を選択する。評価するために、遺伝子の長さに沿って標的配列を幾つか選択するのが一般的である。
【０１４５】
上記のプロトコルを使用して、本発明の単離二本鎖分子の標的配列を、以下のように設計した。
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、および１４、ならびに
ＰＡＲＰ１に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５。
【０１４６】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力について調査した。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する：
Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１１３３〜１１５１位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１３１０〜１３２８位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の６０６〜６２４位）、ならびに
ＰＡＲＰ１に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２６８５〜２７０３位）。
【０１４７】
本発明の二本鎖分子は単一の標的Ｃ１２ＯＲＦ４８もしくはＰＡＲＰ１遺伝子配列を対象としてもよく、または複数の標的Ｃ１２ＯＲＦ４８もしくはＰＡＲＰ１遺伝子配列を対象としてもよい。
【０１４８】
上述のＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、標的配列の核酸配列および／または該標的配列に相補的な配列のいずれかを含有する単離ポリヌクレオチドを含む。Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の配列、ならびに／またはこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されず、上述の核酸配列における軽微な改変は、改変された分子がＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限りは許容可能である。本明細書において、核酸配列と関連して使用される「軽微な改変」という句は、配列に対する核酸の１つ、２つ、または幾つかの置換、欠失、付加、または挿入を示す。
【０１４９】
本発明との関連において、核酸の置換、欠失、付加、および／または挿入に対し適用される「幾つか」という用語は、３〜７個、好ましくは３〜５個、さらに好ましくは３〜４個、さらに好ましくは３個の核酸残基を意味しうる。
【０１５０】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。本明細書の以下の実施例では、Ｃ１２ＯＲＦ４８もしくはＰＡＲＰ１遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖、またはそれに対して相補的なアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子を、標準的な方法に従って、膵臓癌細胞株（例えば、ＭｉａＰａＣａ２、ＰＫ５９、ＫＬＭ１、およびＳＵＩＴ２を用いる）におけるＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子産物の産生を低減させる能力に関して、インビトロで試験した。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べた、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子産物の低減は、例えば、実施例１における「半定量ＲＴ−ＰＣＲ」の項で述べられたＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１のｍＲＮＡに対するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいてＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子産物の産生を低減する配列は、続いて、細胞増殖に及ぼすこれらの阻害効果に関して試験することができる。インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列は、続いて、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認するために、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いて、これらのインビボ能力に関して試験することができる。
【０１５１】
単離ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはそれらの誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される場合、「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドユニット間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対合を表し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが改変ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合することができる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含有しない安定二本鎖を形成する。さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。好ましい態様において、このような二本鎖は１０個のマッチ毎にわずか１個のミスマッチしか含有していない。特に好ましい態様では、二本鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖はミスマッチを含有しない。
【０１５２】
ポリヌクレオチドは好ましくは、Ｃ１２ＯＲＦ４８では３，１８９ヌクレオチド長未満、およびＰＡＲＰ１では４，００１ヌクレオチド長未満である。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子に関して、５００ヌクレオチド長未満、２００ヌクレオチド長未満、１００ヌクレオチド長未満、７５ヌクレオチド長未満、５０ヌクレオチド長未満、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離ポリヌクレオチドは、Ｃ１２ＯＲＦ４８もしくはＰＡＲＰ１遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、または該二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子の形成に使用される場合、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長く、好ましくは２１ヌクレオチドより長くてもよく、およびより好ましくは、約１９〜２５ヌクレオチドの長さを有する。したがって、本発明は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズすることで、ヌクレオチド対１９〜２５個の長さを有する二本鎖分子を形成する。
【０１５３】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含有し得る。当技術分野において公知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性、および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる他の種類の化学修飾にも気づくであろう（ＷＯ０３／０７０７４４、ＷＯ２００５／０４５０３７）。一態様では、分解耐性の改善または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、非限定的に、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ塩基残基の組み込みが挙げられる（米国特許出願第２００６０１２２１３７号）。
【０１５４】
別の態様では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的指向化効率を増大させるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、非限定的に、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３’または５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド、ならびに２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（ＷＯ２００４／０２９２１２）。別の態様では、標的ｍＲＮＡにおける、および／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性の増減に修飾を用いることができる（ＷＯ２００５／０４４９７６）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドオーバーハングヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られた分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持していれば、任意の公知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に利用することができる。
【０１５５】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、すなわちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）およびＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）から構成されるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方上でＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。
【０１５６】
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該標的遺伝子の発現を阻害することが可能であれば、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドがＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドがＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、のいずれであってもよい。二本鎖分子の安定性を向上するためには、分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する事が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、分子は発現の十分な阻害を誘導する範囲内でＲＮＡである事が必要である。
【０１５７】
キメラ型二本鎖分子の好ましい例では、二本鎖分子の上流部分領域（すなわちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域は、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。あるいは、センス鎖の５’末端および／またはアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域が、上流部分領域と称される。すなわち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから構成される。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型の二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’：アンチセンス鎖。
【０１５８】
上流部分領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９個〜１３個のヌクレオチドから構成されるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、ポリヌクレオチドの少なくとも上流半分の領域（センス鎖では５’側領域およびアンチセンス鎖では３’側領域）がＲＮＡであり、もう半分がＤＮＡである、１９個〜２１個のヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現阻害効果が非常に高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号）。
【０１５９】
本発明との関連において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えば低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびＤＮＡおよびＲＮＡからなる低分子のヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成することができる。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる、タイトなヘアピンターン（ｔｉｇｈｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｔｕｒｎ）を作る、ＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分けられる。一般的に、ヘアピン構造は、細胞機構によってｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡに切断され、続いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に適合するｍＲＮＡと結合してこれを切断する。
【０１６０】
任意のヌクレオチド配列から構成されるループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列との間に位置し得る。したがって、本発明は、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、［Ａ］は標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である）を有する二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、
Ｃ１２ＯＲＦ４８に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、および１４のヌクレオチド、および
ＰＡＲＰ１に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のヌクレオチド
の中から選択され得る。
【０１６１】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、二本鎖分子が標的となるＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持していれば、これらの例から改変された配列であってもよい。［Ａ］領域は［Ａ’］領域とハイブリダイズし、［Ｂ］領域から構成されるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、すなわちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中から選択することができる（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｂ／ｔｂ＿５０６．ｈｔｍｌ）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【０１６２】
ヘアピンループ構造を有する本発明の好ましい二本鎖分子の例は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ、およびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
５’−ＣＡＣＡＧＵＡＵＣＵＣＣＵＡＧＵＣＡＡ−［Ｂ］−ＵＵＧＡＣＵＡＧＧＡＧＡＵＡＣＵＧＵＧ−３’（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に関する）；
５’−ＧＵＵＧＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＧＧＡＵＵ−［Ｂ］−ＡＡＵＣＣＡＡＡＵＣＣＵＧＡＧＣＡＡＣ−３’（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に関する）；
５’−ＣＵＡＧＵＣＡＡＣＵＡＣＵＧＧＡＵＵＵ−［Ｂ］−ＡＡＡＵＣＣＡＧＵＡＧＵＵＧＡＣＵＡＧ−３’（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に関する）；および
５’−ＧＡＵＡＧＡＧＣＧＵＧＡＡＧＧＣＧＡＡ−［Ｂ］−ＵＵＣＧＣＣＵＵＣＡＣＧＣＵＣＵＡＵＣ−３’（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に関する）。
【０１６３】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「ｕ」を３’オーバーハングとして標的配列のアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加される「ｕ」の数は少なくとも２、概して２〜１０、好ましくは２〜５である。付加される「ｕ」は二本鎖分子のアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。
【０１６４】
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で公知の化学合成方法を使用するのが好ましい。化学合成方法に従って、センスおよびアンチセンスの一本鎖ポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングの具体的な例では、合成一本鎖ポリヌクレオチドは好ましくは少なくとも約３：７、より好ましくは約４：６、最も好ましくは実質的に等モル量（すなわち約５：５のモル比）のモル比で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の通常利用される方法によって精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用するか、または残存一本鎖ポリヌクレオチドが、例えば適当な酵素による分解によって任意で取り除かれる方法が挙げられる。
【０１６５】
Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよく、このためこれらの発現は独立に、または時間的もしくは空間的様式で調節することができる。二本鎖分子は、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１遺伝子の鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって細胞内で転写することができる。
【０１６６】
本発明の二本鎖分子を含有するベクター
本明細書に記載の二本鎖分子を１つまたは複数含有するベクター、および該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。
【０１６７】
本発明にとって特に関心対象であるのは、以下の［１］〜［１０］のベクターである：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖とから構成され、細胞に導入された場合にＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクター；
［２］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１１３３〜１１５１位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１３１０〜１３２８位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の６０６〜６２４位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２６８５〜２７０３位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡに対して作用する二本鎖分子をコードする、［１］に記載のベクター；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［１］に記載のベクター；
［４］約１００ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［３］に記載のベクター；
［５］約７５ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［４］に記載のベクター；
［６］約５０ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［５］に記載のベクター；
［７］約２５ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［６］に記載のベクター；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチド長である二本鎖分子をコードする［７］に記載のベクター；
［９］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載のベクター；ならびに
［１０］一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する二本鎖分子をコードするベクターであって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、および８の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［９］に記載のベクター。
【０１６８】
本発明のベクターは、好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入された場合に、ベクターが前記分子を発現するであろうことを示す。好ましい態様では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節要素を含む。そのような本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに使用でき、またはがんを治療するための活性成分として直接使用することができる。
【０１６９】
本発明のベクターは、例えば、両方の鎖が（ＤＮＡ分子の転写によって）発現されるような方法で制御配列がＣ１２ＯＲＦ４８配列と機能的に連結するように、Ｃ１２ＯＲＦ４８配列を発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされたＤＮＡの３’末端と隣接するプロモーター配列）によって転写され、ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えばクローニングされたＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズし、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。あるいは、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物は、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ発現した後、二本鎖分子構築物を形成するために利用する。さらに、クローニングされた配列は二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、すなわち標的遺伝子のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
【０１７０】
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる（例えば相同的な組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１７１】
本発明のベクターは例えば、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを含む。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニアまたは鶏痘が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現する細胞に導入すると、組換えワクシニアウイルスは前記分子を発現し、それにより細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin）（ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１７２】
本発明の二本鎖分子を使用して、がん細胞の増殖を阻害するかまたは低下させ、がんを治療する方法
本発明において、Ｃ１２ＯＲＦ４８についての４つの異なるｄｓＲＮＡおよびＰＡＲＰ１についての１つのｄｓＲＮＡを、細胞増殖を阻害する能力について試験した。膵臓癌細胞株における遺伝子の発現を効果的にノックダウンした、Ｃ１２ＯＲＦ４８についての４つのｄｓＲＮＡ（図２および７）ならびにＰＡＲＰ１についてのｄｓＲＮＡ（図７）は、細胞増殖の抑制と一致した。
【０１７３】
したがって、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１の発現の阻害を介して、それぞれ、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子またはＰＡＲＰ１遺伝子の機能障害を誘導することにより、細胞増殖、すなわち、膵臓癌および前立腺癌の細胞増殖を阻害する方法を提供する。Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子またはＰＡＲＰ１遺伝子の発現は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子もしくはＰＡＲＰ１遺伝子を特異的に標的とする本発明の前記二本鎖分子のいずれか、または該二本鎖分子のいずれかを発現し得る本発明のベクターによって阻害され得る。
【０１７４】
本二本鎖分子および本ベクターの、がん性細胞の細胞増殖を阻害するそのような能力は、それらが、がんを治療するための方法に使用され得ることを示す。したがって、１２ＯＲＦ４８遺伝子またはＰＡＲＰ１遺伝子は正常器官ではほとんど検出されなかったため（図１）、本発明は、有害作用なしに、Ｃ１２ＯＲＦ４８もしくはＰＡＲＰ１遺伝子に対する二本鎖分子、または該分子を発現するベクターを投与することによって膵臓癌および前立腺癌を有する患者を治療する方法を提供する。
【０１７５】
本発明にとって特に関心対象であるのは、以下の［１］〜［３６］の方法である：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成され、かつＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子を過剰発現している細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８の発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子を、少なくとも１つ、投与する工程を含む、がん細胞の増殖を阻害してがんを治療するための方法であって、該がん細胞またはがんが少なくとも１つのＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している、方法；
［２］二本鎖分子が、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１１３３〜１１５１位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１３１０〜１３２８位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の６０６〜６２４位）、ならびにＰＡＲＰ１遺伝子についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２６８５〜２７０３位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］に記載の方法；
［３］前記センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の方法；
［４］治療されるがんが膵臓癌および／または前立腺癌である、［１］に記載の方法；
［５］膵臓癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）であり、前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である、［４］に記載の方法；
［６］複数種の二本鎖分子が投与される、［１］に記載の方法；
［７］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の方法；
［８］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［７］に記載の方法；
［９］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の方法；
［１０］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［９］に記載の方法；
［１１］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［１０］に記載の方法；
［１２］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載の方法；
［１３］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する方法であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［１２］に記載の方法；
［１４］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の方法；
［１５］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含有している、［１］に記載の方法；
［１６］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１５］に記載の方法；
［１７］センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１６］に記載の方法；
［１８］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１５］に記載の方法；
［１９］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、［１８］に記載の方法；
［２０］隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドから構成される、［１９］に記載の方法；
［２１］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有している、［１］に記載の方法；
［２２］二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む組成物に含有されている、［１］に記載の方法；
［２３］二本鎖分子がベクターによりコードされる、［１］に記載の方法；
［２４］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１１３３〜１１５１位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１３１０〜１３２８位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の６０６〜６２４位）、ならびにＰＡＲＰ１についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２６８５〜２７０３位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２３］に記載の方法；
［２５］ベクターによりコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２４］に記載の方法；
［２６］治療されるがんが膵臓癌および／または前立腺癌である、［２３］に記載の方法；
［２７］膵臓癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）であり、前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である、［２６］に記載の方法；
［２８］複数種の二本鎖分子が投与される、［２３］に記載の方法；
［２９］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２５］に記載の方法；
［３０］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［２９］に記載の方法；
［３１］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［３０］に記載の方法；
［３２］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［３１］に記載の方法；
［３３］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［３２］に記載の方法；
［３４］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［２３］に記載の方法；
［３５］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する方法であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［３４］に記載の方法；ならびに
［３６］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む組成物に含有されている、［２３］に記載の方法。
【０１７６】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子を発現している細胞の増殖は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはそれらを含有している組成物と、細胞を接触させることにより阻害され得る。さらに、細胞をトランスフェクション剤と接触させることもできる。好適なトランスフェクション剤は当技術分野で公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、その細胞が、分子に曝露されていない細胞と比較して、より低い速度で増殖するか、または減少した生存能を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを使用して、測定され得る。
【０１７７】
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現している限り、任意の種類の細胞の増殖を、本方法によって抑制することができる。例示的な細胞には、膵臓癌細胞または前立腺癌細胞、特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）または去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）が含まれる。
【０１７８】
したがって、Ｃ１２ＯＲＦ４８に関連した疾患に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有する患者を、本二本鎖分子の少なくとも１つ、該分子の少なくとも１つを発現している少なくとも１つのベクター、または該分子の少なくとも１つを含有している少なくとも１つの組成物の投与によって治療することができる。例えば、膵臓癌または前立腺癌に罹患している患者が、本方法によって治療され得る。がんの種類は、診断される腫瘍の特定の種類によって、標準的な方法によって同定され得る。好ましくは、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノアッセイによって、患者由来の生検材料におけるＣ１２ＯＲＦ４８の発現を検出することにより選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、対象由来の生検試料を、当技術分野で公知の方法、例えば、免疫組織化学分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子の過剰発現について確認する。
【０１７９】
複数種の二本鎖分子（またはそれを発現するベクターまたはそれを含有している組成物）の投与を通して、細胞増殖を阻害し、それによりがんを治療する本方法によると、分子は各々、異なる構造を有するが、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１の同一の標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用しうる。あるいは、複数種の二本鎖分子は、同一の遺伝子の異なる標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用しうる。あるいは、例えば、この方法は、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１の１つ、２つ、またはそれ以上の標的配列に対する指向性を有する二本鎖分子を利用してもよい。
【０１８０】
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、該分子と対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成する形態で、細胞に直接導入することができる。あるいは、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクターとして細胞に導入することができる。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｅｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ  ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を利用することができる。
【０１８１】
治療は、臨床的利点、例えばＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子の発現の低減、または対象におけるがんのサイズ、有病率、もしくは転移能の減少をもたらす場合に、「有効」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、治療ががんの形成を遅らせるもしくは防ぐか、またはがんの臨床症状を防ぐかもしくは緩和するという意味である。有効性（Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓｎｅｓｓ）は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法に関連して求められる。
【０１８２】
本発明の方法および組成物が予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の文脈で有用であるという点で、そのような用語は、疾患による死亡または罹患の負担を低減する任意の活性を意味するよう本明細書において互換的に用いられる。予防は、「一次的、二次的、および三次的な予防レベルで」行うことができる。一次的な予防は疾患の発症を回避するのに対して、二次的および三次的なレベルの予防は、機能を回復することおよび疾患に関連する合併症を低減することにより、疾患の進行および症状の出現の予防、ならびに既に確立された疾患の悪影響の低減を目的とする活動を包含する。あるいは、予防は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば、腫瘍の増殖および転移を低減することを目的とする広範な予防的療法を含み得る。
【０１８３】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または手術後のその再発の予防は、以下の工程のいずれかを含む：がん細胞の外科的除去、がん細胞の増殖阻害、腫瘍の退縮または退行、がんの発生の寛解および抑制の誘導、腫瘍退行、ならびに転移の低減または阻害等。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを減少させ、およびがんに付随する検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の低減または改善は、１０％、２０％、３０％、またはそれ以上の低減を含む効果的な治療および／または予防、または安定している疾患を構成する。
【０１８４】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１のｍＲＮＡを分解することが理解される。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、本発明の二本鎖分子によって、触媒的様式で標的ｍＲＮＡの分解が起こると考えられている。したがって、標準的ながん治療に比べて、本発明は治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くで必要とされる二本鎖分子の有意に少ない送達を必要とする。
【０１８５】
当業者は、例えば対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状、および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的または全身的のいずれであるかなどの因子を考慮して、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を容易に求めることができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、がん部位またはその近くにおいて約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである細胞内濃度である。より多くのまたはより少ない量の二本鎖分子を投与することができることが意図される。特定の状況において必要とされる正確な用量は、当業者により容易にかつルーチン的に決定されうる。
【０１８６】
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子とは異なる薬剤と併用して対象に投与することもできる。あるいは、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するために設計された別の治療法と併用して対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するまたはがん転移を予防するのに現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および化学療法剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンを用いた治療）と併用して投与することができる。
【０１８７】
本方法において、二本鎖分子は、送達試薬と共にネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとしてのいずれかで対象に投与することができる。
【０１８８】
本発明の二本鎖分子と共に投与するのに好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）、またはリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０１８９】
リポソームは、特定の組織、例えば膵臓または前立腺の腫瘍組織への二本鎖分子の送達に役立ち、二本鎖分子の血液半減期も増大させ得る。本発明の文脈における使用に好適なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成してもよく、概してこれには、中性または負に帯電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールが含まれる。一般的には、所望のリポソームサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの因子を考慮して、脂質の選択が導かれる。リポソームを調製するのに、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）で記載されるような様々な方法が知られている。
【０１９０】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または血管内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１９１】
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを避けるように改変される。一態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１９２】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用される場合、オプソニン化阻害部分は、例えば脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、膜と化学的にまたは物理的に接着する場合に、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えば米国特許第４，９２０，０１６号（その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分を用いて改変されたリポソームは、非改変リポソームよりも非常に長く循環中に留まる。この理由から、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０１９３】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。したがって、そのような微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は、効率的にこれらのリポソームを集積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減が、肝臓および脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分を用いて改変された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【０１９４】
リポソームを改変するのに好適なオプソニン化阻害部分は、好ましくは、分子量が約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびＰＥＧまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐、または樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えばカルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖状または分岐状）；または、例えばカルボン酸基の結果として生じた連結を有するカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
【０１９５】
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を用いて改変したリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０１９６】
オプソニン化阻害部分は、多くの公知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃でＮａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比のテトラヒドロフランおよび水を用いて、還元アミノ化によってステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１９７】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で検討されている。少なくとも１つの本発明の二本鎖分子を発現するそのようなベクターもまた、直接、またはＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えばポリリシン）、またはリポソームを含む好適な送達試薬と共に、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野の技術範囲内である。
【０１９８】
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子をがん部位に送達するのに好適な任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば、二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０１９９】
好適な腸内投与経路としては、経口、直腸、または鼻腔内送達が挙げられる。
【０２００】
好適な非経口投与経路としては、膀胱内および血管内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル点滴注入）；周囲組織および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによって）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（例えば、多孔性、非孔性、またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）による、がん部位の領域またはその近くの領域への直接適用；ならびに吸入が挙げられる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がんの部位でまたはその近くで行われることが好ましい。
【０２０１】
本発明の二本鎖分子は、単回投与または複数回の投与で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続投与で行うか、または複数回の注入によって送達することができる。薬剤の注射は、がん部位の組織、またはがん部位の近くの組織に直接行うことが好ましい。がん部位の組織にまたはがん部位の近くの組織に剤を複数回注射することが特に好ましい。
【０２０２】
当業者は容易に、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するのに適当な投与計画を決定することもできる。例えば、二本鎖分子は、例えばがん部位でのまたはその近くでの単回注射または沈着として、対象に１回で投与することができる。あるいは、二本鎖分子は、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の間、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与計画では、二本鎖分子は１日１回７日間、がん部位にまたはその近くに注射される。投与計画に複数回の投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことが理解される。
【０２０３】
本発明の二本鎖分子を含有している組成物
上記に加えて、本発明は、本二本鎖分子または該分子をコードするベクターのうちの少なくとも１つを含む薬学的組成物も提供する。本発明にとって特に関心対象であるのは、以下の［１］〜［３６］の組成物である：
［１］Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１の発現および細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離された二本鎖分子を含む、がん細胞の増殖を阻害してがんを治療するための組成物であって、該がんおよびがん細胞が少なくとも１つのＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子またはＰＡＲＰ１遺伝子を発現し、さらに該分子が、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、組成物；
［２］二本鎖分子が、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１１３３〜１１５１位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１３１０〜１３２８位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の６０６〜６２４位）、ならびにＰＡＲＰ１についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２６８５〜２７０３位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］に記載の組成物；
［３］二本鎖分子、センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の組成物；
［４］治療されるがんが膵臓癌および／または前立腺癌である、［１］に記載の組成物；
［５］膵臓癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）であり、前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である、［４］に記載の組成物；
［６］複数種の二本鎖分子を含有している、［１］に記載の組成物；
［７］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の組成物；
［８］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［７］に記載の組成物；
［９］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の組成物；
［１０］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［９］に記載の組成物；
［１１］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［１０］に記載の組成物；
［１２］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載の組成物；
［１３］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する組成物であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［１２］に記載の組成物；
［１４］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の組成物；
［１５］二本鎖分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、［１］に記載の組成物；
［１６］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１５］に記載の組成物；
［１７］センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１６］に記載の組成物；
［１８］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１５］に記載の組成物；
［１９］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、［１８］に記載の組成物；
［２０］隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドから構成される、［１９］に記載の組成物；
［２１］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有している、［１］に記載の組成物；
［２２］トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む、［１］に記載の組成物；
［２３］二本鎖分子がベクターによりコードされ、かつ組成物に含有されている、［１］に記載の組成物；
［２４］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の５９５〜６１３位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１１３３〜１１５１位）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１３１０〜１３２８位）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の６０６〜６２４位）、ならびにＰＡＲＰ１についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２６８５〜２７０３位）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２３］に記載の組成物；
［２５］ベクターによりコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２４］に記載の組成物；
［２６］治療されるがんが膵臓癌および／または前立腺癌である、［２３］に記載の組成物；
［２７］膵臓癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）であり、前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である、［２６］に記載の組成物；
［２８］複数種の二本鎖分子が投与される、［２３］に記載の組成物；
［２９］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２５］に記載の組成物；
［３０］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［２９］に記載の組成物；
［３１］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［３０］に記載の組成物；
［３２］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［３１］に記載の組成物；
［３３］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［３２］に記載の組成物；
［３４］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［２３］に記載の組成物；
［３５］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する組成物であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［２３］に記載の組成物；ならびに
［３６］トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む、［２３］に記載の組成物。
【０２０４】
本発明の好適な組成物は以下でより詳細に説明される。
【０２０５】
本発明の二本鎖分子は、好ましくは、当技術分野で公知の技術に従って、対象に投与する前に薬学的組成物として調合することができる。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありかつパイロジェンを含まないことを特徴とする。本明細書で使用される場合、「薬学的製剤」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.（1985）（その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のように当技術分野の技術範囲内である。
【０２０６】
本発明の薬学的製剤は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合して、本発明の二本鎖分子もしくはこれをコードするベクターの少なくとも１つ（例えば０．１重量％〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含有する。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝水、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０２０７】
本発明によれば、組成物は、複数種類の二本鎖分子を含有することができ、それらの分子のそれぞれが、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１の同じ標的配列または異なる標的配列に対する指向性を有し得る。例えば、組成物は、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１に対する指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。あるいは、例えば組成物は、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１から選択される、１つ、２つ、またはそれ以上の標的配列に対する指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。
【０２０８】
さらに本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有することができる。例えばベクターは、１つ、２つ、または幾つかの種類の本発明の二本鎖分子をコードすることができる。あるいは、本発明の組成物は、複数種類のベクターを含有することができ、それらのベクターのそれぞれは異なる二本鎖分子をコードする。
【０２０９】
さらに、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「二本鎖分子を使用してがんを治療する方法」の項を参照されたい。
【０２１０】
本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤も含み得る。好適な薬学的賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性がある緩衝剤（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤（ｃｈｅｌａｎｔ）の添加物（例えばＤＴＰＡもしくはＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、または任意でカルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加物（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、もしくは乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
【０２１１】
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
【０２１２】
例えば、経口投与用の固体薬学的組成物は、上記で列挙された担体および賦形剤のいずれかと、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含み得る。エアロゾル（吸入）投与用の薬学的組成物は、上記のようにリポソームに封入された０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体、例えば鼻腔内送達ではレシチンが含まれ得る。
【０２１３】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性のある成分を含有することができる。例えば組成物は、がんを治療するのに従来使用される化学療法剤を含有することができる。
【０２１４】
別の態様において、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現を特徴とする膵臓癌および前立腺癌の治療用の薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用を提供する。例えば、本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８を発現している膵臓癌および前立腺癌の治療用の薬学的組成物の製造のための、細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８遺伝子またはＰＡＲＰ１遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、該分子は、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される配列を標的とする。
【０２１５】
本発明は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子またはＰＡＲＰ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に薬学的または生理学的に許容可能な担体を調合する工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現を特徴とする膵臓癌または前立腺癌の治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、該分子は、活性成分として、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される配列を標的とする。
【０２１６】
別の態様において、本発明は、活性成分を薬学的または生理学的に許容可能な担体と混和する工程を含む、Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現を特徴とする膵臓癌または前立腺癌の治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、該活性成分は、Ｃ１２ＯＲＦ４８遺伝子またはＰＡＲＰ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子は、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、８、１４、および１５の中から選択される配列を標的とする。
【０２１７】
本発明の局面を以下の実施例で説明するが、これらは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定する意図はない。
【０２１８】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下で説明する。
【実施例】
【０２１９】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０２２０】
一般的方法
１．細胞株
ＰＤＡＣ細胞株ＫＬＭ−１、ＳＵＩＴ−２、ＫＰ−１Ｎ、ＰＫ−１、ＰＫ−４５Ｐ、およびＰＫ−５９は、東北大学医用細胞資源センター（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（仙台、日本）から提供された。ＭＩＡＰａＣａ−２およびＰａｎｃ−１は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入した。ＣＯＳ７細胞およびＰＣ細胞株ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＰＣ−３、およびＤＵ−１４５も、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入し、ＬＮＣａＰ由来ＣＲＰＣ細胞株Ｃ４−２Ｂは、ＶｉｒｏＭｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，  ＭＮ）から購入した。ＫＬＭ−１、ＳＵＩＴ−２、ＰＫ−１、ＰＫ−４５Ｐ、ＰＫ−５９、およびＰａｎｃ−１は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で培養し、ＣＯＳ７、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２Ｂ、２２Ｒｖ１、ＰＣ−３、およびＤＵ−１４５は、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で培養した。培地は、全て、１０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んでいた。細胞は、５％ＣＯ２を含む加湿空気の雰囲気で３７℃で維持した。
【０２２１】
２．半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
凍結したＰＤＡＣ組織またはＣＡＰＣ組織由来のがん細胞および正常上皮細胞の精製は、以前に記載されている（Nakamura T, et al., Oncogene 2004；23：2385-400；Tamura K, et al., Cancer Res 2007；67：5117-25）。精製されたがん細胞および正常上皮細胞に由来するＲＮＡを、２回の、Ｔ７に基づくインビトロ転写を使用したＲＮＡ増幅（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に供した。ヒトがん細胞株由来の全ＲＮＡは、製造業者の推奨に従い、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。定量対照としてβアクチン（ＡＣＴＢ）をモニタリングすることにより、その後のＰＣＲ増幅のための、各一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈物を調製した。プライマー配列のセットは、
ＡＣＴＢについては、
５’−ＴＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および
逆方向５’−ＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
Ｃ１２ＯＲＦ４８については、
５’−ＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）および
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＧＧＴＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
であった。全ての反応が、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ，  ＣＡ）上での、９４℃で２分間の初期変性、その後の９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１分間の２３サイクル（ＡＣＴＢについて）、２８サイクル（Ｃ１２ＯＲＦ４８について）を含んでいた。
【０２２２】
３．ノーザンブロッティング分析
７種類のＰＤＡＣ細胞株（ＫＬＭ−１、ＰＫ−５９、ＰＫ−４５Ｐ、ＭＩＡＰａＣａ−２、Ｐａｎｃ−１、ＰＫ−１、およびＳＵＩＴ−２）ならびに７種類の成人正常組織（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡから入手した心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、精巣、および膵臓）に由来するポリＡ＋ＲＮＡ  １μｇを膜にブロットした。前立腺癌については、５種類のＰＣ細胞株（２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２Ｂ、ＤＵ１４５、およびＰＣ−３）ならびに６種類の成人正常組織（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡから入手した心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、および前立腺）に由来するポリＡ＋ＲＮＡ  １μｇを膜にブロットした。これらのノーザンブロット膜およびヒトＭＴＮブロット膜（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、Ｍｅｇａ  Ｌａｂｅｌキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を使用して標識された３２Ｐ標識ＧＡＢＲＰプローブと、１６時間ハイブリダイズさせた。上記のＣ１２ＯＲＦ４８用のプライマーを使用することにより、Ｃ１２ＯＲＦ４８のプローブｃＤＮＡを、３０５塩基対のＰＣＲ産物として調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を、製造業者の指示に従って実施した。ブロットを、−８０℃、１０日間のオートラジオグラフィーに供した。
【０２２３】
４．Ｃ１２ＯＲＦ４８に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）発現ベクター
ＰＤＡＣ細胞における内在性Ｃ１２ＯＲＦ４８の発現をノックダウンするために、ｐｓｉＵ６ＢＸ３．０ベクターを、以前に記載したように（Tamura K, et al., Cancer Res 2007; 67： 5117-25）、標的遺伝子に対する低分子ヘアピン型ＲＮＡの発現のために使用した。Ｕ６プロモーターを、終結シグナルとしての５個のチミジンおよびジェネテシンによる選択のためのｎｅｏカセット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に、遺伝子特異的な配列（短いスペーサーＴＴＣＡＡＧＡＧＡによって同配列の逆相補配列から分離された、標的転写物由来の１９ｎｔ配列）の上流にクローニングした。Ｃ１２ＯＲＦ４８についての標的配列は、
５’−ＣＡＣＡＧＴＡＴＣＴＣＣＴＡＧＴＣＡＡ−３’（＃５９５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＡＣ−３’（＃８５１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
５’−ＧＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＴ−３’（＃１１３３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、
５’−ＧＣＡＧＣＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＡＣＣＡ−３’（＃１３１０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、および
陰性対照としての５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（ｓｉＥＧＦＰ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
であった。ヒトＰＤＡＣ細胞株ＰＫ−５９およびＭｉａＰａＣａ２を、１０ｃｍディッシュ上にプレーティングし、製造業者の指示に従ってＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、これらのｓｉＲＮＡ発現ベクターによりトランスフェクトし、その後、１５０μｇ／ｍｌ（ＰＫ−５９用）または８００μｇ／ｍｌ（ＭｉａＰａＣａ２用）のジェネテシン（ＧＩＢＣＯ）による選択を行った。７日後、上記プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによってＣ１２ＯＲＦ４８に対するノックダウン効果を分析するため、１０ｃｍディッシュから細胞を採集した。ジェネテシンを含有している適切な培地で２週間培養した後、コロニー形成アッセイのために、細胞を１００％メタノールで固定し、０．１％のクリスタルバイオレット−Ｈ２０で染色した。トランスフェクションの６日後に、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学研究所、熊本県、日本）を使用して、ＭＴＴアッセイにおいて細胞生存能を測定した。４９０ｎｍにおける吸光度、および参照としての６３０ｎｍにおける吸光度を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で測定した。
【０２２４】
５．免疫細胞化学
製造業者が推奨する手順に従いＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用することにより、ＣＯＳ７細胞を、ＨＡタグ付きＣ１２ＯＲＦ４８発現ベクターによりトランスフェクトし、処理の７２時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により、室温で１分間、透過処理した。非特異的結合を、室温で３０分間の、３％ＢＳＡを含有しているＰＢＳでの処理によりブロッキングした。細胞を、１％ＢＳＡを含有しているＰＢＳで希釈した（１：１０００）ウサギ抗ＨＡ抗体（３Ｆ１０，Ｒｏｃｈｅ）と共に、室温で６０分間、インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、室温で６０分間、ＦＩＴＣ結合型二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）により細胞を染色した。ＰＢＳで洗浄した後、検体を、４’，６’−ジアミジン−２’−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有しているＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）を用いてマウントし、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｅｉｃａ，  Ｂｅｎｓｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で可視化した。
【０２２５】
６．Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質に特異的な抗体の産生および免疫組織化学染色
ｐＥＴ２１ａ（＋）ベクターを使用して、それぞれ、Ｎ末端のＴ７タグおよびＣ末端のヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）とインフレームで、Ｃ１２ＯＲＦ４８の二つの断片（コドン１〜１５０および３２８〜４９８）を発現するようプラスミドを設計した。二つの組換えタンパク質を大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ−ｐｌｕｓ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で発現させ、供給元のプロトコルに従い、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂アガロース（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して精製した。精製された組換えタンパク質を共に混合し、次いで、ウサギの免疫感作に使用した。その後、供給元の指示に従いＡｆｆｉｇｅｌ  １５ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して、抗原アフィニティカラムで免疫血清を精製した。適切なインフォームドコンセントの下で大阪府立成人病センター（Ｏｓａｋａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）で切除された外科的検体から、ＰＤＡＣ由来の慣例的な組織切片を入手した。切片を脱パラフィン処理し、クエン酸緩衝液ｐＨ６．０中で１０８℃で１５分間オートクレーブ処理した。内在性ペルオキシダーゼ活性を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）中での３０分間のインキュベーションにより失活させた。ブロッキングのためウシ胎仔血清中でインキュベートした後、切片を、ウサギ抗Ｃ１２ＯＲＦ４８ポリクローナル抗体（１：２５００希釈）と共に、室温で１時間、インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて免疫検出を実施した。最後に、３，３’−ジアミノベンジジンを用いて反応物を発色させた。ヘマトキシリンを使用して対比染色を実施した。
【０２２６】
７．Ｃ１２ＯＲＦ４８と相互作用するタンパク質の免疫沈降および質量分析
ｐＣＡＧＧＳｎ３ｘＦｌａｇ−Ｃ１２ＯＲＦ４８−ＨＡまたは空ｐＣＡＧＧＳｎ３ＦＨモックを、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、溶解緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、０．４％ＮＰ−４０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ］）で溶解させた。細胞抽出物を、６０μｌのＣＬ−４Ｂセファロース（Ｓｉｇｍａ）と共に、４℃で１時間インキュベートすることにより、予備浄化した。遠心分離の後、上清を、３０μｌ抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−アガロース（Ｓｉｇｍａ）と共に、４℃で１時間インキュベートした。次いで、８，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によってビーズを収集し、１ｍＬの免疫沈降緩衝液で５回洗浄した。５％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でタンパク質を分離し、銀染色キットで染色した。Ｃ１２ＯＲＦ４８を用いてトランスフェクトされた細胞抽出物に特異的に見出されたタンパク質バンドを切り出し、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。
【０２２７】
切り出されたバンドを、３７℃で３０分間、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）を含む１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Ｓｉｇｍａ）で還元し、２５℃で暗所で４５分間、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムを含む５０ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）でアルキル化した。ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，  ＣＡ）を１：２０の最終の酵素対タンパク質比で添加した。３７℃で１６時間、消化を実施した。得られたペプチド混合物を、３００ｎｌ／分の全流速で、３０分で、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中５．４％から２９．２％アセトニトリルまでという直線勾配を使用して、１００μｍ×１５０ｍｍ  ＨｉＱ−Ｓｉｌ  Ｃ１８Ｗ−３カラム（ＫＹＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、東京、日本）上で分離した。溶出ペプチドを、マトリックス溶液（７０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中の４ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＳＩＧＭＡ）、０．０８ｍｇ／ｍｌのクエン酸アンモニウム）と自動的に混合し、ＭａＰ（ＫＹＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＭＡＬＤＩターゲットプレートへスポッティングした。質量分析を、４８００  Ｐｌｕｓ  ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）上で実施した。ＭＳ／ＭＳピークリストを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｉｌｏｔバージョン２．０．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）によって作成し、タンパク質データベース検索のためローカルＭＡＳＣＯＴ検索エンジンバージョン２．２．０３（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）にエクスポートした。
【０２２８】
Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質とＰＡＲＰ１タンパク質との間の相互作用を確認するため、Ｆｌａｇ−Ｃ１２ＯＲＦ４８発現ベクターおよび／またはＰＡＲＰ１−Ｍｙｃ発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞へコトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を上記のように溶解させ、ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて免疫沈降させた。共沈殿したタンパク質を、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）およびｃ−Ｍｙｃ抗体を使用してイムノブロットした。
【０２２９】
８．フローサイトメトリー
ＫＬＭ−１細胞を、Ｃ１２ＯＲＦ４８  ｓｉＲＮＡ二重鎖（５’−ＣＵＡＧＵＣＡＡＣＵＡＣＵＧＧＡＵＵＵ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＰＡＲＰ１  ｓｉＲＮＡ二重鎖（５’−ＧＡＵＡＧＡＧＣＧＵＧＡＡＧＧＣＧＡＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、および陰性対照としてのｓｉＥＧＦＰ二重鎖（５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＵＵＣＵＵＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を用いて、それぞれトランスフェクトした。処理の７２時間後、細胞をトリプシン処理し、収集し、ＰＢＳ中７０％エタノールを用いて４℃で固定し、ＰＢＳで２回すすぎ、０．５ｍｇの煮沸されたＲＮａｓｅを含有している５００μｌのＰＢＳと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を、２５μｇのヨウ化プロピジウムを含有しているＰＢＳ  ５００μｌで染色した。各集団内のｓｕｂ−Ｇ１核（アポトーシス細胞）の比率を、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって、少なくとも２×１０４個の細胞から決定した。
【０２３０】
９．インビトロＰＡＲＰ−１自己ポリ（ＡＤＰ−リボシル）化アッセイ
インビトロＰＡＲＰ１自己修飾アッセイを、以前に記載されたように実施した（１０）。簡単に説明すると、精製されたＣ１２ＯＲＦ４８組換えタンパク質２００ｎｇおよび組換えヒトＰＡＲＰ１（Ａｌｅｘｉｓ）２５ｎｇを、１０μｇ／ｍｌの超音波処理されたＤＮＡが添加された結合緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）中で、３７℃で１０分間インキュベートした。５μＣｉ（０．２５μＭ）の３２Ｐ標識ＮＡＤ＋を添加することにより反応を開始させ、さらに１０分間、３７℃でインキュベートした。ＳＤＳ試料緩衝液を用いて反応を終結させた後、タンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分画した。ポリ（ＡＤＰ−リボシル）化タンパク質を、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【０２３１】
１０．細胞抽出物中のＰＡＲＰ活性
ＫＬＭ−１およびＳＵＩＴ−２を、Ｃ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡ、ＰＡＲＰ１−ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＥＧＦＰ（対照として）を用いてトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後に収集した。抗Ｃ１２ＯＲＦ４８抗体および抗ＰＡＲＰ１抗体（ＴＲＥＶＩＧＥＮ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を使用したウェスタンブロット分析により、ＫＬＭ−１細胞およびＳＵＩＴ−２細胞における発現に対するノックダウン効果が確認された。細胞抽出物中のＰＡＲＰ１活性を、ヒストンＨ１タンパク質へのビオチン化ＡＤＰ−リボースの取り込みに基づくｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＰＡＲＰ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＲＥＶＩＧＥＮ）を使用してアッセイした。細胞抽出物を、ヒストンおよびビオチン化ポリＡＤＰ−リボースでコーティングされた９６穴プレートに入れ、１時間インキュベートし、ストレプトアビジン−ＨＲＰにより処理し、分光計で４５０ｎｍで読み取った。ＰＡＲＰ１酵素活性は、アフィニティ精製された抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）マウスモノクローナル抗体（ＴＲＥＶＩＧＥＮ）を使用することによっても確認された。２５μｇの細胞抽出物または５ｎｇの組換えヒトＰＡＲＰ１（ＴＲＥＶＩＧＥＮ）を、１０μｇ／ｍｌの超音波処理されたＤＮＡおよび２００μＭのＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ）が添加された結合緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）中で、３７℃で２０分間インキュベートした。
【０２３２】
結果
ＰＤＡＣ細胞およびＰＣ細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８の過剰発現
ＰＤＡＣ細胞（Nakamura T, et al., Oncogene 2004;23:2385-400）およびＣＲＰＣ細胞（Tamura K, et al., Cancer Res 2007;67:5117-25）の、本発明者らのゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイ分析によってスクリーニングされた多数のトランス活性化された遺伝子のうち、Ｃ１２ＯＲＦ４８に本発明者らは焦点を当てた。顕微解剖されたＰＤＡＣ細胞集団９集団のうち５集団（図１Ａ）および顕微解剖されたＣＲＰＣ細胞集団５集団のうち２集団（図１Ｂ）において、Ｃ１２ＯＲＦ４８過剰発現がＲＴ−ＰＣＲによって確認された。プローブとしてＣ１２ＯＲＦ４８  ｃＤＮＡ断片を使用したノーザンブロット分析によって、精巣にのみ約４ｋｂの転写物が同定され、肺、心臓、肝臓、腎臓、および脳を含むその他の器官には発現が観察されなかった（図１Ｃ）。幾つかのＰＤＣＡ細胞株（図１Ｄ）および前立腺癌細胞株（図１Ｅ）におけるＣ１２ＯＲＦ４８発現も調査したところ、調査された多くのＰＤＡＣ細胞株または前立腺癌細胞株において、明らかに発現が見出された。
【０２３３】
がん細胞の増殖に対するＣ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡの効果
がん細胞におけるＣ１２ＯＲＦ４８発現の生物学的意義を調査するために、Ｃ１２ＯＲＦ４８転写物に特異的な４つのｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、高レベルのＣ１２ＯＲＦ４８を内因的に発現しているＰＤＡＣ細胞株ＭｉａＰａＣａ２細胞またはＰＫ−５９細胞へトランスフェクトした。ｓｉ＃５９５（標的配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ｓｉ＃１１３３（標的配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびｓｉ＃１３１０（標的配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をトランスフェクトした場合、ＲＴ−ＰＣＲによってノックダウン効果が観察されたが、ｓｉ＃８５１（標的配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）または陰性対照ｓｉＥＧＦＰ（標的配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の場合には観察されなかった（図２Ａ、左）。ＭｉａＰａＣａ２を使用したコロニー形成アッセイおよびＭＴＴアッセイ（図２Ｂ、２Ｃ、左）は、ｓｉ＃５９５、ｓｉ＃１１３３、およびｓｉ＃１３１０を用いてトランスフェクトされた細胞の数の劇的な低下を明らかにしたが、それと比較して、ｓｉ＃８５１およびｓｉＥＧＦＰにはノックダウン効果が観察されなかった。これらのｓｉＲＮＡ発現ベクターをＰＫ−５９細胞へトランスフェクトした場合にも、類似した結果が得られた（図２Ａ、Ｂ、およびＣ、右）。
【０２３４】
Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質は核に局在している
Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質は、何らかの予測された有意なモチーフまたはドメインを有していたが、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により核に局在していることが予測された。細胞内局在を確認するために、Ｃ１２ＯＲＦ４８発現ベクターをＣＯＳ７細胞へトランスフェクトし（図３Ａ）、抗ＨＡタグ抗体を使用した免疫細胞化学分析を実施した。図３Ｂに示されるように、免疫細胞化学分析は、外来性Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質が核に局在していることを明白に示し、そのことから、クロマチンまたはＤＮＡ構造との関連が示唆された。タンパク質レベルでのその発現を調査するために、本発明者らがＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質に特異的なポリクローナル抗体を作製し、ウエスタンブロット分析を実施したところ、本発明者らが調査した全ＰＤＡＣ細胞株のほとんどで内在性Ｃ１２ＯＲＦ４８が検出された（図３Ｃ）。ＰＤＡＣ細胞株におけるＣ１２ＯＲＦ４８発現は、非がん性細胞株（ＨＥＫ−２９３およびＣＯＳ７）における発現より高かった。臨床的なＰＤＡＣ組織切片を使用した免疫組織化学分析も実施したところ、ＰＤＡＣ細胞の核に強力な陽性の染色が見出されたが（図３Ｄ中のパネルＣ１〜Ｃ２）、正常膵組織には染色が検出されないかまたは極めて限定された染色が検出された（図３Ｄ中のＮ）。まとめると、ＰＤＡＣ組織６２のうち３３（５３％）が、Ｃ１２ＯＲＦ４８について陽性の染色を示した。
【０２３５】
Ｃ１２ＯＲＦ４８の相互作用タンパク質としてのＰＡＲＰ１の同定
Ｃ１２ＯＲＦ４８の生物学的機能が全体として未知であるので、Ｃ１２ＯＲＦ４８と相互作用するタンパク質を、免疫沈降および質量分析によって検索した。Ｃ１２ＯＲＦ４８−Ｆｌａｇ発現ベクターまたは空ベクター（モック対照）によりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の溶解物を抽出し、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２−アガロースを用いて免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で銀染色した。およそ１１０ｋＤのタンパク質が、Ｆｌａｇタグ付きＣ１２ＯＲＦ４８プラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞溶解物の免疫共沈降物の中に観察されたが、モック対照プラスミドによりトランスフェクトされたものには観察されず（図４Ａ）、本発明者らは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析のため、この１１０ｋＤのバンドを抽出した。質量分析によって、Ｃ１２ＯＲＦ４８と相互作用する候補タンパク質としてＰＡＲＰ１が同定された。この結果は、抗ＰＡＲＰ１抗体を使用したウエスタンブロット分析によって確認された（図４Ｂ）。さらに、物理的相互作用を確認するために、Ｍｙｃタグ付きＰＡＲＰ１発現ベクターおよび／またはＦｌａｇタグ付きＣ１２ＯＲＦ４８発現ベクターをＨＥＣＫ２９３に入れ、反対に、抗Ｍｙｃ抗体を使用して免疫沈降を実施し、次いで、抗Ｆｌａｇ抗体を使用して沈降物をイムノブロットした。結果は、Ｃ１２ＯＲＦ４８がＰＡＲＰ１と共沈降することを示した（図４Ｃ）。
【０２３６】
オリゴＣ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡ二重鎖またはオリゴＰＡＲＰ１−ｓｉＲＮＡ二重鎖によるアポトーシスの誘導
ＦＡＣＳ分析により、対照ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞と比較して、より大きな割合のｓｕｂＧ１集団が、Ｃ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡ（図５Ａ）またはＰＡＲＰ１−ｓｉＲＮＡ（図５Ｂ）を用いてそれぞれトランスフェクトされたＫＬＭ−１細胞において検出された。他のＰＤＡＣ  ＳＵＩＴ−２細胞においてノックダウンした場合にも、類似した結果が観察された（データ非提示）。
【０２３７】
Ｃ１２ＯＲＦ４８はインビトロでＰＡＲＰ１自己修飾を正に調節することができる
ＰＡＲＰ１がポリ（ＡＤＰ−リボシル）化することができる主要なタンパク質は、ＰＡＲＰ１自体である。ＰＡＲＰ１とＣ１２ＯＲＦ４８との間の相互作用の機能的な結果を調査するために、［３２Ｐ］ＮＡＤ＋の取り込みによってＰＡＲＰ１自己修飾を測定し、精製されたＣ１２ＯＲＦ４８タンパク質の非存在下または存在下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって可視化した。図６に示されるように、ＰＡＲＰ１自己修飾は、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の非存在下と比較して、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の存在下で強力に増強された。
【０２３８】
Ｃ１２ＯＲＦ４８はがん細胞抽出物中のＰＡＲＰ１活性を調節することができる
がん細胞におけるＰＡＲＰ１活性に対するＣ１２ＯＲＦ４８の機能的意義について調査するために、Ｃ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡ、ＰＡＲＰ１−ｓｉＲＮＡ、および対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞抽出物において、ヒストンＨ１タンパク質に対するビオチン化ＡＤＰ−リボースの取り込みに基づく比色定量ＰＡＲＰアッセイを使用することにより、ＰＡＲＰ１活性を調査した。まず、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１に対するｓｉＲＮＡ二重鎖のＫＬＭ−１細胞へのトランスフェクションが、それらのタンパク質発現を減少させることを確認した（図７Ａ）。比色定量ＰＡＲＰアッセイにより、Ｃ１２ＯＲＦ４８−ｓｉＲＮＡまたはＰＡＲＰ１−ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＫＬＭ−１細胞抽出物において、ヒストンＨ１をポリ（ＡＤＰ−リボシル）化するＰＡＲＰ１活性が、対照ｓｉＲＮＡと比較して、それぞれ５９．２％および５５．５％減少することが見出された（図７Ｂ）。他のＰＤＡＣ細胞株ＳＵＩＴ−２細胞においては、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１のノックダウンで、それぞれ６５．２％および４７．１％、ＰＡＲＰ１活性が減少することも観察された（図７Ｃ、Ｄ）。さらに、抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）抗体を使用したウエスタンブロット分析によっても、Ｃ１２ＯＲＦ４８またはＰＡＲＰ１のノックダウンで、細胞抽出物中のＰＡＲＰ１活性が劇的に減少することが確認された（図７Ｅ）。これらの所見から、ヒストンＨ１、およびＰＡＲＰ１自体を含むその他の標的タンパク質に対するＰＡＲＰ１のポリ（ＡＤＰ−リボシル）化活性をＣ１２ＯＲＦ４８が調節し得ることが示された。次に、Ｃ１２ＯＲＦ４８をＨＥＫ２９３細胞において過剰発現させ、ＰＡＲＰ活性を比色定量ＰＡＲＰアッセイによって同様に調査した。外来性Ｃ１２ＯＲＦ４８発現は時間依存的に（図８Ａ）、かつＣ１２ＯＲＦ４８発現と一致して誘導され、ＨＥＣＫ２９３細胞抽出物におけるＰＡＲＰ１活性も時間依存的に増強された（図７Ｂ、Ｐ＜０．０００１、モックトランスフェクションと対比）。総合すると、本発明者らの所見は、Ｃ１２ＯＲＦ４８がインビボおよびインビトロの両方でＰＡＲＰ１酵素活性を正に調節し得ることを示唆している。
【０２３９】
考察
本発明においては、マイクロアレイ分析を通して、ＰＤＡＣ細胞およびＣＲＰＣ細胞において過剰発現されるとして、１つの新規な標的遺伝子であるＣ１２ＯＲＦ４８が同定され、その過剰発現が、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＰＤＡＣ細胞およびＣＲＰＣ細胞において確認された。成人正常器官の中では精巣に限定的に発現していたことから、Ｃ１２ＯＲＦ４８は、有害作用が最小限である、新規治療アプローチのための適切かつ有望な分子標的であると考えられる。さらに、膵臓癌細胞株におけるｓｉＲＮＡによる内在性Ｃ１２ＯＲＦ４８の機能的ノックダウンは、膵臓癌細胞増殖の劇的な抑制をもたらし、このことから、がん細胞の生存能の維持におけるその必須の役割が示唆された。
【０２４０】
本発明者らは、Ｃ１２ＯＲＦ４８がポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ１）と相互作用し得ることを見出した。ヒストンの次に豊富な核タンパク質であるＰＡＲＰ１は、ＡＤＰ−リボース単位の、ＡＤＰ−リボースのモノマー、オリゴマー、またはポリマーとしての、ドナーＮＡＤ＋分子から標的タンパク質への転移を触媒する固有の酵素活性を保有している。ＰＡＲＰ１はクロマチン弛緩を媒介し、誘導可能遺伝子の転写を活性化する。現在までのところ、ＰＡＲＰ１は、ＤＮＡ修復、細胞死経路、クロマチンリモデリング等において重大な役割を果たすことが周知である。しかしながら、ゲノムの完全性が維持される生理的条件の下でのＰＡＲＰ１のクロマチン依存性遺伝子調節活性に関する知識は顕著に不足している。
【０２４１】
これらの結果は、まとまりとして、Ｃ１２ＯＲＦ４８およびＰＡＲＰ１の両方が核タンパク質であることも示唆した。Ｃ１２ＯＲＦ４８はインビトロでＰＡＲＰ１自己修飾を正に調節することができた。さらに、Ｃ１２ＯＲＦ４８タンパク質の抑制は、ヒストンＨ１をポリ（ＡＤＰ−リボシル）化する活性のみならず、ＰＡＲＰ１自体を含むその他の標的に対する活性である、がん細胞抽出物中のＰＡＲＰ１の活性も低下させることができた。さらに、本発明者らは、Ｃ１２ＯＲＦ４８の過剰発現が、細胞抽出物中のＰＡＲＰ１活性を増強し得ることも調査した。これらのデータは、全て、Ｃ１２ＯＲＦ４８が、ＤＮＡ修復、転写調節、クロマチン修飾、およびＰＡＲＰ１活性の調節を通した細胞シグナル伝達に関与している可能性を暗示した。
【０２４２】
産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイとの組み合わせを使用した、本明細書に記載されたがんの遺伝子発現分析により、Ｃ１２ＯＲＦ４８が、がんの予防および治療のための標的遺伝子として同定された。異なる発現に基づき、本発明は、がん、特に、膵臓癌および前立腺癌の同定および検出のための分子診断マーカーとしてのＣ１２ＯＲＦ４８の有用性を確認する。
【０２４３】
本明細書に提供されたデータは、がんの包括的な理解を増し、新規診断戦略の開発を容易にし、治療薬および予防剤用の分子標的の同定のための手掛かりを提供する。そのような情報は、腫瘍形成のより深い理解に寄与し、がんの診断、治療、および最終的には予防のための新規戦略を開発するための指標を提供する。
【０２４４】
本明細書中に引用された全ての特許、特許出願、および公開は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０２４５】
さらに、詳細にかつ具体的な態様を参照しながら本発明を説明したが、上記の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を例示するためのものであることを理解されたい。ルーチンな実験を通して、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを、当業者は容易に認識するだろう。したがって、本発明は、上記の説明によって定義されるのではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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