(57)【要約】本発明は、新規なタンパク質及びその薬学的使用に関する。本発明は、更に詳しくは、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合されたＨＬＡ−Ｇ抗原のドメインを含む、新規な融合タンパク質に関する。本発明は、このようなポリペプチドを産生する方法、このようなポリペプチドを含む薬学的組成物、及び器官／組織拒絶反応を含む種々の疾患を処置するためのそれらの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンのＦｃドメインの配列を含む第２ポリペプチドに連結されたＨＬＡ−Ｇ抗原のドメインの配列を含む第１ポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
第１ポリペプチドは、融合ポリペプチドのＮ−末端であり、そして第２ポリペプチドは、Ｃ末端である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
第２ポリペプチドが、ヒト又はマウス免疫グロブリンの配列を含む、請求項１又は２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、好ましくはＩｇＧである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ｇ抗原が、ヒトＨＬＡ−Ｇ抗原である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＨＬＡ−Ｇ抗原のドメインが、少なくともα１ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記第１ポリペプチドが、
−  ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１、α２及びα３ドメインのアミノ酸配列、
−  ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１及びα３ドメインのアミノ酸配列、又は
−  ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１及びα２ドメインのアミノ酸配列
から選ばれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記第１ポリペプチドと第２ポリペプチドが、直接又はスペーサーを介して連結されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
β２ミクログロブリンの配列を含む第３ポリペプチドを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
−  配列番号４又はそのアミノ酸残基２１〜６５６を含むＨＬＡ−Ｇ１−Ｂ２Ｍ−Ｆｃ
−  配列番号６又はそのアミノ酸残基２１〜３５１を含むＨＬＡ−Ｇa１−Ｆｃ及び、
−  配列番号２又はそのアミノ酸残基２５〜４５２）を含むＨＬＡ−Ｇ６−Ｆｃ、
から選ばれる融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸分子又は請求項１２に記載のベクターを含むリコンビナントホスト細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載のリコンビナントホスト細胞を核酸分子の発現を可能にする条件下に培養し、そして産生されたポリペプチドを回収することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドの二量体。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項１７】
器官又は組織拒絶反応を処置するための、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置するための、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なタンパク質及びその薬学的使用に関する。本発明は、更に詳しくは、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合されたＨＬＡ−Ｇ抗原のドメインを含む新規な融合タンパク質に関する。本発明は、このようなポリペプチドを産生する方法、該ポリペプチドを含む薬学的組成物及び器官／組織拒絶反応を含む種々の疾患を処置するためのその使用にも関する。
【０００２】
技術背景
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原は、３つの主要なクラス、即ち、クラスＩ抗原、クラスＩＩ抗原、（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲ）、及びクラスＩＩＩ抗原に分類される。
【０００３】
クラスＩ抗原は、在来の抗原、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを含み、これらは３つの球状ドメイン（［α］１、［α］２及び［α］３）を示し、そしてクラスＩ抗原は非在来の抗原ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ及びＨＬＡ−Ｇも含む。
【０００４】
ＨＬＡ−Ｇは、正常なヒト胎盤及び胸腺上皮細胞の絨毛外栄養膜(extravillous trophoblasts)により発現されている非クラシックＨＬＡ−ＡクラスＩ分子である。ＨＬＡ−Ｇ抗原は、本質的に、胎盤の栄養膜細胞層細胞(cytotrophoblastic cells)により発現され、そして母体の免疫系から胎児を保護する（母親による拒絶反応の不存在）免疫モデュレーション剤(immunomodulatory agents)として機能する。ＨＬＡ−Ｇ遺伝子の配列は、記載されており(例えば、 Geraghty et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145-9149 ; Ellis; et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735)そして４３９６塩基対を含む。この遺伝子は、８つのエキソン、７つのイントロン及び３’非翻訳端部からなり、これらは、それぞれ、下記のドメイン：エキソン１：シグナル配列、エキソン２：α１細胞外ドメイン、エキソン３：α２細胞外ドメイン、エキソン４：α３細胞外ドメイン、エキソン５：膜貫通領域、エキソン６：細胞質ドメインＩ、エキソン７：細胞質ドメインＩＩ（非翻訳）、エキソン８：細胞質ドメインＩＩＩ（非翻訳）及び３’非翻訳領域に対応する。
【０００５】
ＨＬＡ−Ｇの７つのアイソフォームが同定されており、その中でも４つは膜結合しており（ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３及びＨＬＡ−Ｇ４）そして３つは可溶性である（ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７）（例えば、Carosella et al., Blood 2008, vol. 111, p 4862参照)。
【０００６】
成熟ＨＬＡ−Ｇ１タンパク質アイソフォームは、３つの細胞外ドメイン（α１〜α３）、膜貫通領域及び細胞質ドメインを含む。
【０００７】
ＨＬＡ−Ｇ２タンパク質アイソフォームはα２ドインを含まない、即ち、α１ドメインとα３ドメインが直接連結されており、次いで膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが続く。
【０００８】
ＨＬＡ−Ｇ３タンパク質アイソフォームは、α２及びα３ドメインの両方を欠いており、即ち、それは膜貫通ドメインに直接連結されたα１ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
【０００９】
ＨＬＡ−Ｇ４タンパク質アイソフォームは、α３ドメインを欠いており、即ち、それはα１ドメイン、α２ドイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
【００１０】
可溶性ＨＬＡ−Ｇアイソフォームは、すべて膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠いている。更に詳しくは：
ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質アイソフォームは、α１ドメイン、α２ドイン及びα３ドメイン、ならびにイントロン４によりコードされている２１アミノ酸残基の余分のＣ末端ペプチド配列を含有する（転写スプライシング及びＲＮＡ成熟後のイントロン４保存の結果として）。
ＨＬＡ−Ｇ６タンパク質アイソフォームは、α２なしのＨＬＡ−Ｇ５に相当し、即ち、ＨＬＡ−Ｇ６は、α１ドメイン及びα３ドメイン、ならびにイントロン４によりコードされている２１アミノ酸残基の余分のＣ末端ペプチド配列を含有する（転写スプライシング及びＲＮＡ成熟後のイントロン４保存の結果として）。
ＨＬＡ−Ｇ７タンパク質アイソフォームは、α１ドメインのみ及びイントロン２によりコードされている２つの追加のＣ末端アミノ酸残基を含有する（転写スプライシング及びＲＮＡ成熟後のイントロン２保存の結果として）。
【００１１】
これらのアイソフォームのすべては、例えば、Kirszenbaum M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213; European Application EP 0 677 582; Kirszenbaum M. et al., Human Immunol., 1995, 43, 237-241; Moreau P. et al., Human Immunol., 1995, 43, 231-236)に記載されている。
【００１２】
これまでの研究は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質が、増殖性Ｔリンパ球応答、細胞傷害性Ｔリンパ球媒介細胞溶解及びＮＫ細胞媒介細胞溶解などの同種異系応答(allogeneic responses)を阻害することができることを示した(Rouas-Freiss N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254 ; Semin Cancer Biol 1999, vol 9, p. 3)。結果として、ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、同種異系又は異種の(xenogenic)器官／組織移植における移植片拒絶反応を処置するために提唱された。ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、癌(EP1 054 688)、炎症性障害(inflammatory disorders) (EP1 189 627)、更に一般的には、免疫関連疾患の処置のためにも提唱された。ＨＬＡ−Ｇを特定の細胞又は組織にターゲティングするために、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を特定のリガンドに融合させることも提唱された(WO2007091078)。しかしながら、このようなターゲティング融合が有効であることを示すための結果又は実験的データは提供されていないことに留意するべきである。
【００１３】
ＨＬＡ−Ｇアイソフォームは、２つのＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインのシステイン残基４２間の分子間ジスルフイド橋の形成の結果として二量体コンホメーションを取ると思われる。(Apps et al., Eur. J. Immunol. 2007, vol. 37 p. 1924; WO2007/011044)。ＨＬＡ−Ｇ二量体のレセプター結合部位は、対応する一量体のレセプター結合部位よりもより近接可能であり(accessible)であり、その結果二量体は一量体よりも高いアフィニティー及び遅い解離速度を有するであろうということが提唱された。しかしながら、特にＨＬＡ−Ｇの可溶性形態に関してどのコンホメーションが薬学的目的に対して最も有功であるかということも、いかに適切なＨＬＡ−Ｇ二量体又はオリゴマーが産生されうるかも明らかではない。
【００１４】
発明の概要
本発明は、新規なタンパク質又はポリペプチド、該タンパク質又はポリペプチドを含む薬学的組成物、及びその使用に関する。更に詳しくは、本発明は、ＨＬＡ−Ｇ由来の配列及び免疫グロブリンＦｃフラグメント由来の配列を含む新規な融合ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、機能的に活性な二量体複合体を形成することができそしてｉｎ  ｖｉｖｏで器官拒絶反応を効率的に阻害することができる。したがって、これらのポリペプチドは、このような障害及び他の免疫関連の疾患を処置するための薬物候補を表す。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、免疫グロブリンのＦｃドメインの配列を含む第２ポリペプチドに連結されたＨＬＡ−Ｇ抗原のドメインの配列を含む第１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドにある。
【００１６】
開示されたとおり、融合ポリペプチドに含有されたＨＬＡ−Ｇドメインは、ＨＬＡ−Ｇ抗原の細胞外部分のすべて又は一部、典型的には、ＨＬＡ−Ｇのα１、α２及び／又はα３ドメインのすべて又は機能的部分を含むことができる。特定の態様においては、Ｆｃドメインは、本発明の２つの融合ポリペプチド間の二量体（ホモ二量体又はヘテロ二量体）の形成を可能とするのに十分な及び／又は免疫グロブリンのエピトープ／抗原特異的ドメインを含有しない、配列を含む。
【００１７】
特定の態様においては、本発明の融合ポリペプチドは、β２ミクログロブリンの配列を含む第３ポリペプチドドメインを更に含む。
【００１８】
本発明の他の目的は、分泌を引き起こすシグナルペプチド配列を更に含む、成熟前の形態の上記したポリペプチドである。
【００１９】
本発明の更なる目的は、上記した融合ポリペプチドをコードする核酸分子にある。
【００２０】
本発明は、上記した核酸分子を含むベクターにも関する。
【００２１】
本発明の他の目的は、上記した核酸分子又はベクターを含むリコンビナントホスト細胞である。
【００２２】
本発明の更なる目的は、核酸分子の発現を可能とする条件下に本発明のリコンビナントホスト細胞を培養しそして産生されたポリペプチドを回収することを含む、上記したポリペプチドを産生する方法である。
【００２３】
本発明は、更に、本発明のポリペプチドの二量体（例えば、ホモ二量体又はヘテロ二量体）に関する。
【００２４】
本発明は、本発明の融合ポリペプチド又はその二量体に特異的に結合する抗体にも関する。
【００２５】
本発明は、一量体又は多量体としての上記したポリペプチドを含む薬学的組成物にも関する。
【００２６】
本発明は、上記したポリペプチドをコードする核酸を含む薬学的組成物又はこのようなポリペプチドを発現するリコンビナント細胞にも関する。
【００２７】
本発明は、更に、器官／組織拒絶反応、炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置するためのこのようなポリペプチド又は薬学的組成物に関する。
【００２８】
本発明の更なる目的は、器官／組織拒絶反応を処置することを必要とする被検体に、有効量の本発明のポリペプチド又は組成物を投与することを含む、器官／組織拒絶反応を処置する方法にも関する。更に詳しくは、この方法は、組織／器官移植の前、移植期間中及び／又は移植の後に被検体に前記ポリペプチド又は組成物を投与することを含む。
【００２９】
本発明の更なる目的は、移植片に対する免疫寛容を促進することを必要とする被検体に有効量の上記したポリペプチド又は組成物を投与することを含む、被検体における移植片に対する免疫寛容を促進する方法である。
【００３０】
本発明は、任意の哺乳動物被検体において、好ましくはヒト被検体において使用されうる。更に下記するとおり、本発明のポリペプチドは、移植の後ｉｎ  ｖｉｖｏで組織拒絶反応を実質的に阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＨＬＡ−Ｇ−Ｆｃ融合タンパク質は二量体を形成することができる。
【図２】ＨＬＡ−Ｇ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬＴ２レセプターを介してシグナリングを誘導する。
【図３】ＨＬＡ−Ｇ６−Ｆｃはｉｎ  ｖｉｖｏで移植片生存を促進する。
【図４】ＨＬＡ−Ｇ１−Ｂ２Ｍ−Ｆｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植片生存を促進する。
【図５】ＨＬＡ−Ｇ１−Ｆｃはｉｎ  ｖｉｖｏで移植片生存を促進する。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＬＡ−Ｇ抗原又はその一部を含む融合ポリペプチドに関する。本発明の融合ポリペプチドは、生物学的に活性な二量体を形成することができそしてｉｎ  ｖｉｖｏで移植片拒絶反応を有効に阻害することが示された。更に詳しくは、本発明者等は、このようなＨＬＡ−Ｇ抗原を免疫グロブリンのＦｃドメインに融合させることにより、強い免疫寛容を誘導する能力を有しそしてｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性なコンホメーションを取ることができる生物学的に活性なタンパク質を発生させることができることを見出した。これらの結果は驚くべきことである。なぜならば、ＨＬＡ−Ｇドメインはこのような二量体形成性部分に融合されたことは決してないからであり、そしてこのような二量体内のＨＬＡ−Ｇドメインの空間的位置は天然に存在するＨＬＡ−Ｇ複合体の空間的位置とは異なるからである。得られた結果は、本発明の融合ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで高い免疫調節活性を示し、したがって免疫関連障害を処置するための、特に被検体における望まれない又は有害な免疫応答を減少させるための新規な医薬を表すことを示す。
【００３３】
したがって、本発明の第１の目的は、
−  免疫グロブリンのＦｃドメインの配列を含む第２ポリペプチドに連結された
−  ＨＬＡ−Ｇ抗原のドメインの配列を含む第１ポリペプチド、
を含む融合ポリペプチドにある。
【００３４】
本発明に関して、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミン結合を介して又は改変されたペプチド模倣結合を介して相互に連結されうるアミノ酸残基のポリマーを含む分子を、相互に交換可能に表す。該タンパク質又はポリペプチドにおけるアミノ酸残基は、天然のアミノ酸残基又は非天然のもしくは改変されたアミノ酸残基であることができる。それらは、Ｌ及び／又はＤコンホメーションにあることができる。また、ポリペプチド又はタンパク質は、末端で保護されていてもよく及び／又は例えば側部の機能(lateral functions)の化学的もしくは物理的変更により改変されていてもよい。
【００３５】
本発明の融合ポリペプチド内で、種々のポリペプチドドメインが互いに共有結合で連結されており、そのため、それらは最も好ましくはリコンビナント技術による単一の分子として産生される。
【００３６】
本発明の融合タンパク質内で種々の配置が可能である。特に、種々のドメインをＣ末端もしくはＮ−末端に位置させることができ、そして直接又はスペーサー基を介して相互に連結させることができる。最も好ましい態様においては、第１のポリペプチド（即ち、ＨＬＡ−Ｇ由来の配列）は、融合ポリペプチドのＣ末端に位置している第２ポリペプチド（Ｆｃ由来の配列）のＮ−末端に位置している。実施例に示されたとおり、このようなコンホメーションは、ポリペプチドの二量体化及びｉｎ  ｖｉｖｏで効率的な生物学的な活性を可能とする。
【００３７】
種々のポリペプチドドメイン間のカップリングは、直接、即ち介在配列なしであることができ（介在アミノ酸残基はカップリング／クローニングのために又は例えば制限酵素（１つ又は複数）に対応してクローニング工程の結果として存在することができるけれども）、又は間接的である、即ち、介在する配列（スペーサー基）を伴うことができる。後者の場合に、スペーサー基は、可変長、典型的には４〜２０アミノ酸残基を有することができ、そして好ましくは生物学的に不活性であるべきである。このようなスペーサー基の例は、（Ｇ４Ｓ）ｎモチーフであり、ここでｎは１〜４の整数である。
【００３８】
本発明の融合タンパク質の好ましい態様においては、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドは直接連結されている。更に詳しくは、ＨＬＡ−Ｇ由来の配列のＣ末端残基は、Ｆｃ由来の配列のＮ−末端残基に連結されている。
【００３９】
融合ポリペプチドに含有されるＨＬＡ−Ｇドメインは、ＨＬＡ−Ｇ抗原の細胞外部分のすべてもしくは一部、典型的には、ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１、α２及び／又はα３ドメインのすべて又は機能的部分を含むことができる。ＨＬＡ−Ｇ１のアミノ酸配列は、例えば、上記に引用されたGeraghty et al. 又は; Ellis; et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735,に記載されている。α１、α２及び／又はα３ドメインのアミノ酸配列は、上記刊行物に直接由来することができる。これらの配列は、オンラインでも入手可能である（例えば、Genebank numbers for HLA-G: first cloning of genomic sequence: Geraghty et al, PNAS 1987: PubMed ID : 3480534, GeneID: 3135 ; First cloning of HLA-G1 cDNA: Ellis et al Journal of Immunology 1990. PubMed ID : 2295808参照)。更に、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７の配列は、US5,856,442, US6,291,659, FR2,810,047, or Paul et al., Hum. Immunol 2000; 61: 1138).からも入手可能である。
【００４０】
示されたとおり、本発明の融合ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｇ抗原の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む。好ましい態様においては、ＨＬＡ−Ｇ抗原はヒトＨＬＡ−Ｇ抗原である。
【００４１】
特定の態様においては、本発明の融合ポリペプチドは、少なくともヒトＨＬＡ−Ｇ抗原のα１ドメインのアミノ酸配列を含む。
【００４２】
他の特定の態様にしたがえば、本発明の融合ポリペプチドの第１ポリペプチドは：
−  ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１、α２及びα３ドメインのアミノ酸配列、
−  ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１及びα３ドメインのアミノ酸配列、
−  ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１及びα２ドメインのアミノ酸配列、
−  ＨＬＡ−Ｇ５のアミノ酸配列、
−  ＨＬＡ−Ｇ６のアミノ酸配列、又は
−  ＨＬＡ−Ｇ７のアミノ酸配列、
からなる群より選ばれる。
【００４３】
ヒトＨＬＡ−Ｇのα１ドメインのアミノ酸配列の特定の例は、配列番号６に与えられる（アミノ酸残基２１〜１１０）。ヒトＨＬＡ−Ｇ６のアミノ酸配列の特定の例は、配列番号２に与えられる（アミノ酸残基２５〜２２7）。ヒトＨＬＡ−Ｇのα１、α２及びα３ドメインのアミノ酸配列の特定の例は、配列番号４に与えられる（アミノ酸配列１３５〜４１２）。ＨＬＡ−Ｇ抗原の天然変異体が、例えば、本願に包含される多形の結果として存在することは理解されるべきである。ある（例えば１〜１０、好ましくは１〜５、最も好ましくは１、２、３、４、又は５）アミノ酸残基を欠いているか及び／又はある（例えば１〜１０、好ましくは１〜５、最も好ましくは１、２、３、４、又は５）アミノ酸置換又は挿入を含有する上記配列の変異体も本発明に包含される。
【００４４】
本発明の融合ポリペプチドの第２ポリペプチドドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメインのアミノ酸配列を含む。免疫グロブリンのＦｃ領域は、典型的には重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む。Ｆｃドメインは、好ましくは、本発明の２つの融合ポリペプチド間の二量体（ホモ二量体又はヘテロ二量体）の形成を可能とするのに十分な配列を含む。Ｆｃドメインは、ヒト起源又は動物起源の、例えば、限定することなく、げっ歯類、ウマ又は霊長類起源の免疫グロブリンに由来することができる。典型的には、第２ポリペプチドは、前記免疫グロブリンのエピトープ／抗原特異的ドメインを含まない。好ましくは、第２ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインのアミノ酸配列を含みそして免疫グロブリンの機能的可変ドメイン又は抗原結合部位を欠いている。
【００４５】
Ｆｃドメインは、種々の血清型の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＥに由来することができる。Ｆｃドメインの配列は、好ましくは、ＩｇＧに由来する。このようなＦｃドメイン配列の例は、本願において与えられる。特に、ヒトＩｇＧのＦｃドメインの特定の例は、配列番号２（アミノ酸残基２３５〜４５２）において与えられる。マウスＩｇＧのＦｃドメインの特定の例は、配列番号６（アミノ酸残基１２０〜端部）において与えられる。配列変動は、得られる配列が二量体を形成する能力を保持しているかぎり、Ｆｃドメイン配列内で許容されうることは理解されるべきである。免疫グロブリンのＦｃドメインの配列は、当技術分野で知られている技術にしたがって任意の既知の免疫グロブリンの配列から得られうる。Ｆｃドメインの配列は、データベースから得ることもできそしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで二量体化するその能力について試験されうることは理解されるべきである。
【００４６】
したがって、本発明の特定の態様は、ペプチド結合を介して互いに連結された第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、第１ポリペプチドが第２ポリペプチドのＮ−末端に位置しており、第２ポリペプチドは、融合ポリペプチドのＣ末端に位置しており、そして第１ポリペプチドは少なくともＨＬＡ−Ｇ抗原のα１ドメインの配列を含みそして第２ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃドメインの配列を含む、融合ポリペプチドに関する。
【００４７】
本発明のこのような融合ポリペプチドの特定の例は、
−  配列番号６のＨＬＡ−Ｇα１−Ｆｃ（又はその残基２１〜３５１）及び
−  配列番号２のＨＬＡ−Ｇ６−Ｆｃ（又はその残基２５〜４５２）、
である。
【００４８】
ＨＬＡ−Ｇα１−Ｆｃにおいて、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインは、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメインに直接融合される。介在するアミノ酸残基１１１〜１１９が、２つのドメイン間に存在する。アミノ酸残基１〜２０は、インターロイキン−２タンパク質のシグナルペプチド配列に対応する。したがって、成熟形態におけるＨＬＡ−Ｇα１−Ｆｃは、配列番号６のアミノ酸残基２１〜３５１を含む。
【００４９】
ＨＬＡ−Ｇ６−Ｆｃにおいて、ＨＬＡ−Ｇ６の配列は、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメインに直接融合される。介在するアミノ酸残基２２８〜２３４が、２つのドメイン間に存在する。アミノ酸残基１〜２４は、ＨＬＡ−Ｇのシグナルペプチド配列に対応する。したがって、成熟形態におけるＨＬＡ−Ｇ６−Ｆｃは、配列番号２のアミノ酸残基２５〜４５２を含む。
【００５０】
実施例に記載のとおり、これらのポリペプチドは両方ともｉｎ  ｖｉｖｏで移植片免疫寛容を促進することができる。特に、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインのみを含むＨＬＡ−Ｇα１−Ｆｃは、意外にも、ｉｎ  ｖｉｖｏでの移植片拒絶反応を遅延させることにおいて最も有功であった。
【００５１】
上記したとおり、本発明の融合ポリペプチドは、追加の機能的ドメイン（１つ又は複数）を含むことができる。これに関して、特定の態様においては、本発明の融合ポリペプチドは、β２ミクログロブリンの配列を含む第３ポリペプチドドメインを含む。ＨＬＡ−ＧのＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームは、細胞表面におけるβ２ミクログロブリンと複合体を形成する。この複合体を模倣するために、本発明は、融合ポリペプチドにおいて、生物学的に活性な複合体の形成を可能とするように配置されたβ２ミクログロブリンの配列を含むことを提唱する。
【００５２】
β２ミクログロブリンのポリペプチド配列は、存在するとき、最も好ましくは、融合ポリペプチドのＮ−末端部分に位置しており、そしてそれは下記のスキーム：
Ｂ２Ｍ配列−ＨＬＡ−Ｇ配列−Ｆｃドメイン
にしたがって第１ポリペプチド配列に連結されている。
【００５３】
更に、最も好ましい態様においては、Ｂ２Ｍ配列は、スペーサー基を介してＨＬＡ−Ｇ配列に連結されて、ポリペプチドの正しいリフォールディングを可能とする。最も好ましくは、スペーサー基は、８〜２０アミノ酸残基、更に好ましくは８〜１５、なお更に好ましくは８〜１２アミノ酸残基を含む。特定の態様においては、スペーサー基は、配列（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは２又は３である）を有する。
【００５４】
本発明のこのような融合ポリペプチドの特定の例は：
−  配列番号４のＨＬＡ−Ｇ１−Ｂ２Ｍ−Ｆｃ（又はその残基２１〜６５６）
である。
【００５５】
ＨＬＡ−Ｇ１−Ｂ２Ｍ−Ｆｃにおいて、Ｂ２Ｍ配列はペプチドリンカー（１２０〜１３４）を介してＨＬＡ−Ｇ１のα１−α２−α３ドメインに融合されておりそしてＨＬＡ−Ｇ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２のＦｃ配列に連結されている。アミノ酸残基１〜２０は、Ｂ２Ｍのシグナルペプチド配列に対応する。したがって、成熟形態において、ＨＬＡ−Ｇ１−Ｂ２Ｍ−Ｆｃは配列番号４のアミノ酸残基２１〜６５６を含む。
【００５６】
本発明の更なる目的は、上記したポリペプチドの二量体である。二量体は、例えば２つの同一融合ポリペプチド間のホモ二量体、又はＦｃドメインを含む２つの異なる融合ポリペプチド間のヘテロ二量体であることができる。
【００５７】
本発明の融合ポリペプチドは、人工的合成、リコンビナント技術及び／又はそれらの組み合わせなどの、それ自体当技術分野で知られている技術を使用して得ることができる。実施例で示されたとおり、典型的な態様においては、ドメインは、キメラコード化ポリヌクレオチドから出発して、融合ポリペプチドの形態において好ましくは直接に、リコンビナント技術により産生される。
【００５８】
これに関して、本発明の更なる目的は、上記した融合ポリペプチドをコードする核酸分子である。核酸は、例えば、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡであることができる。それは、遺伝子工学、化学的又は酵素的合成等などのそれ自体当技術分野で知られている技術により産生されうる。特定の態様においては、核酸は、更に、融合ポリペプチドをコードする配列に作用可能に連結された(operably linked)、分泌のためのリーダーペプチドをコードする配列を含む。結果として、このような核酸の発現は、選ばれたホスト細胞による融合ポリペプチドの分泌をもたらす。リーダーペプチドは、種々の起源のものによることができ、例えばヒト又は哺乳動物遺伝子、例えばＢ２Ｍ、インターロイキン、ＨＬＡ−等からのものであることができる。本発明の核酸の特定の例は、配列番号１、３又は５を含む核酸分子である。
【００５９】
本発明の更なる目的は、上記した核酸を含むベクターにある。ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスベクター、人工的染色体等などのクローニング及び／又は発現ベクターであることができる。このようなベクターの特定の例は、pFUSEプラスミド、pUCプラスミド、pcDNAプラスミド、pBRプラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ラムダファージベクター等を含む。ベクターは、調節配列、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点等を含むことができる。ベクターは、遺伝子治療アプローチにおいて、リコンビナント技術によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又はｉｎ  ｖｉｖｏで直接、本発明のポリペプチドを産生するために使用されうる。
【００６０】
本発明の更なる目的は、上記した核酸又はベクターを含むリコンビナントホスト細胞である。ホスト細胞は、真核細胞又は原核細胞であることができる。原核生物ホストの例は、任意のバクテリア、例えばE. coliを含む。真核細胞の例は、酵母、真菌、哺乳動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞を含む。本発明のリコンビナント細胞は、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、プロトプロストトランスフォーメーション等などの当技術分野でそれ自体知られているトランスフォーメーション技術により作成されうる。これらの細胞は、任意の適当な培養培地中に維持されそして培養されうる。
【００６１】
本発明のリコンビナント細胞は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はex vivoで本発明のポリペプチドを産生するため、又は細胞治療産物としてｉｎ  ｖｉｖｏで本発明のポリペプチドを産生するために使用されうる。
【００６２】
これに関して、本発明の目的は、上記したポリペプチドを産生する方法であって、核酸分子の発現を可能とする条件下に本発明のリコンビナントホスト細胞を培養し、産生されたポリペプチドを回収することを含む方法にある。ポリペプチドは、遠心、ろ過、クロマトグラフィー技術等などの当技術分野でそれ自体知られている技術を使用して回収及び／又は精製されうる。
【００６３】
産生されると、本発明のポリペプチドは、それらの性質を改良するため、例えばそれらの薬物動態学的性質を改良するために改変されうる。この点について、本発明のポリペプチドは、例えば末端保護基（例えば、アミド、エステル）を付加することにより、プロテアーゼに対するそれらの安定性又は耐性を増加させるために改変されうる。本発明のポリペプチドは、ポリペプチド密度を増加させるために担体支持体上にコーティングされることもできる。
【００６４】
本発明の更なる目的は、上記したポリペプチド及び好ましくは薬学的に許容されうる賦形剤もしくは担体を含む薬学的組成物である。
【００６５】
本発明の更なる目的は、上記した核酸及び好ましくは薬学的に許容されうる賦形剤もしくは担体を含む薬学的組成物である。
【００６６】
本発明の更なる目的は、上記したリコンビナント細胞及び好ましくは薬学的に許容されうる賦形剤もしくは担体を含む薬学的組成物である。
【００６７】
適当な賦形剤又は担体は、緩衝剤、安定剤、希釈剤、塩、保存剤、乳化剤、甘味料等などの任意の薬学的に許容されうるビヒクルを含む。賦形剤は、典型的には、既知の技術にしたがって調製されうる等張性水性溶液又は非水性溶液を含む。適当な溶液は、例えば、リン酸緩衝溶液、塩化物溶液、リンゲル液などの緩衝液を含む。薬学的調製物は、典型的には、注射可能な組成物、好ましくは液体の注射可能な組成物の形態にあるが、錠剤、ゲルール(gelules)、カプセル剤、シロップ剤などの他の形態を意図することもできる。本発明の組成物は、好ましくは、多数の異なる経路により、例えば、全身系、非経口、経口、直腸、鼻又は膣経路により投与されうる。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下注射などの注射により投与される。経皮投与も意図される。特定の投薬量は、病理学的状態、被検体、処置の期間、他の有効成分の存在等に依存して医師により調節されうる。典型的には、組成物は、融合ポリペプチド１０ng〜１００mg、更に好ましくは、１μg〜５０mg、なお更に好ましくは、１００μg〜５０mgの単位用量を含む。
【００６８】
本発明の組成物は、好ましくは、有効量で、即ち、時間に対して疾患の進行を少なくとも減少させるか又は防止するのに十分な量で投与される。この点で、本発明の組成物は、好ましくは、被検体におる有害なもしくは望まれない免疫応答の減少を可能とする量で使用される。
【００６９】
上記したとおり、本発明の融合ポリペプチドは、強い免疫調節活性を有しそして異常なもしくは望まれない免疫応答と関連した種々の疾患状態を処置するのに使用されうる。更に詳しくは、本発明のポリペプチドは、特に器官／組織拒絶反応、炎症性疾患又は自己免疫疾患などの免疫関連障害を処置するために適当である。
【００７０】
実験の節に開示されたとおり、本発明のポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの同種異系の又は異種の移植片拒絶反応を実質的に阻害することができる。
【００７１】
したがって、本発明の目的は、移植片拒絶反応を処置するための上記したポリペプチド又は組成物にある。
【００７２】
本発明の更なる目的は、移植片拒絶反応を処置することを必要とする被検体に有効量の上記した組成物を投与することを含む、被検体における移植片拒絶反応を処置する方法にある。
【００７３】
処置するという用語は、例えば、受け取る被検体内の移植片免疫寛容の促進を表す。処置は、移植の前、移植期間中及び／又は移植の後に行うことができ、そして現存の免疫抑制剤に代わる治療として又は実際の免疫抑制剤との組み合わせた治療として使用されうる。本発明は、同種異系、半同種異系又は異種移植にすら適用可能でありそして、限定するものではないが、心臓、皮膚、腎臓、肝臓、肺、肝臓−腎臓等を含む固体組織、液体組織又は細胞を含む移植された任意のタイプの器官又は組織のために使用されうる。
【００７４】
本発明の更なる目的は、被検体における器官又は組織を移植するための改良された方法であって、この改良が有効量の上記した組成物を、移植の前、移植期間中及び／又は移植の後に被検体に投与することを含む方法である。
【００７５】
本発明の更なる目的は、被検体における移植片免疫寛容を促進するための方法であって、有効量の上記した組成物を、移植の前、移植期間中及び／又は移植の後に被検体に投与することを含む方法である。
【００７６】
本発明の更なる目的は、被検体における移植片拒絶反応を減少させるための方法であって、有効量の上記した組成物を、移植の前、移植期間中及び／又は移植の後に被検体に投与することを含む方法である。
【００７７】
本発明の更なる目的は、自己免疫疾患を処置するための上記したポリペプチド又は組成物にある。本発明は、自己免疫疾患を処置することを必要とする被検体に有効量の上記した組成物を投与することを含む、被検体における自己免疫疾患を処置する方法にもある。自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ、クローン病又は多発性硬化症であることができる。このような疾患状態において、本発明は、病理の原因となる有害な免疫応答を減少させることを可能とする。
【００７８】
本発明の他の目的は、炎症性疾患を処置するための上記したポリペプチド又は組成物にある。
【００７９】
本発明の更なる目的は、炎症性疾患を処置することを必要とする被検体に、有効量の上記した組成物を投与することを含む、被検体における炎症性疾患を処置する方法にある。
【００８０】
実際に投与される組成物の量は、処置されるべき状態（１つ又は複数）、投与される正確な組成、個々の患者の年齢、重量及び応答、患者の症状の重症さ及び選ばれる投与経路を含む問題とされる状況に照らして、医師により決定されそして適合されうる。したがって、上記投薬量の範囲は本明細書における教示のための一般的ガイダンス及び支持を与えることを意図するが、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００８１】
本発明の更なる局面及び利点は、本願を説明するものであって本願の範囲を限定するものではないと考えられる下記の実施例において開示される。
【００８２】
実施例
物質及び方法
ＰＣＲによる増殖
ＤＮＡ２０ng、各プライマー２００nM、ｄＮＴＰ(Invitrogen)２００μM、ＰＣＲバッファー１０Ｘ(Perkin Elmer)２．５μl、Ｔａｑポリメラーゼ(Perkin Elmer)２．５単位及び水２７μlを含有する最終容積５０μlにおいて、GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer)でＰＣＲを行った。
【００８３】
使用したプログラムは下記のとおりであった：
９４℃で５分間のＤＮＡ変性,次いで、
９４℃で３０秒
５８℃で３０秒
７２℃で１分
で３０サイクル、であった。
最後のサイクルの終わりに７２℃で５分の工程を行った。
【００８４】
ベクター
pFUSE-hFc1 及び pFuse-mFc2ベクターの両方とも、会社(InvivoGen)から購入した。
【００８５】
酵素による消化
酵素制限消化を、製造者（Invitrogen）により推奨されたとおりに行った。典型的には、適当なバッファー中でＤＮＡ１μg及び制限酵素５単位を使用して３7℃で１時間消化を行った。
【００８６】
ライゲーション
発現ベクターへのＰＣＲフラグメントのライゲーシヨンを、製造者により推奨されたとおりにPromegaからのＴ４ＤＮＡリガーゼにより行った。HLA-G5-β2ミクログロブリン構築のために、pcDNA３．１D/V.5-His-Topo(Invitrogen)へのＰＣＲフラグメントのライゲーションを、３．１方向性ＴＯＰＯ（登録商標）発現キット(3.1 Directional TOPO（登録商標）Expression Kit)(Invitrogen)により直接行った。
【００８７】
プラスミド精製
プラスミド精製を、製造者により推奨されたとおりGenElute（商標）プラスミドミディプレップ(GenEluteTM Plasmid Midiprep) (Sigma)により行った。
【００８８】
タンパク質産生
融合タンパク質の産生のために、HEK293T又は HELA細胞をリポフェクタミン法（invitrogen)を使用して多様な構築物によりトランスフェクションし、そして１０％ウシ胎仔血清及び０．３Ｍグルタミンを補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコの改変されたイーグル培地）中で３７℃、５％ＣＯ２に保った。４８時間後、上清を回収し、０．２μMフィルターを通してろ過し、次いで実験のため又はストックを作成するために使用した。
【００８９】
実施例１：ＨＬＡ−Ｇ６−Ｆｃのクローニング及び合成
リーダー配列、α１、α３及びイントロン４のＨＬＡ−Ｇ  ｃＤＮＡ配列をＨＬＡ−Ｇ６からのｐｃＤＮＡのテンプレートを使用してＰＣＲにより増幅した。この配列をＰＣＲにより増幅して、下記のプライマー：
【表１】
2012507994.tif 000002
を使用してＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を導入した。
【００９０】
この増幅した配列をＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素により消化し、次いでＡｇｅＩ及びＸｈｏＩで前もって消化されたｐＦＵＳＥ−ｈＦｃ１ベクターにライゲーションした。得られるｃＤＮＡ配列は配列番号１に記載されておりそしてアミノ酸配列は配列番号２に記載されている。
【００９１】
タンパク質を物質及び方法に開示されているとおりに産生させた。
【００９２】
実施例２：ＨＬＡ−Ｇ１−Ｂ２Ｍ−Ｆｃのクローニング及び合成
ヒトβ２ミクログロブリンをコードする配列を、停止コドンを除去しそしてアミノ酸配列（ＧＧＧＳ）ｘ２に対応するスペーサーを導入することを可能とするプライマー
【表２】
2012507994.tif 000003
を使用してＰＣＲにより増幅した。
【００９３】
並行して、ＨＬＡ−Ｇ１のα１、α２、α３ドメインに対応するｃＤＮＡ配列を、ペプチドリーダー配列及び停止コドンを除去することを可能とするプライマー
【表３】
2012507994.tif 000004
を使用してＰＣＲにより増幅した。β２ミクログロブリン及びＨＬＡ−Ｇ１ＰＣＲフラグメントのα１、α２、α３ドメインの両方をＥａｇＩ制限酵素で消化し、精製しそして相互にライゲーシヨンした。次いで得られたβ２ミクログロブリン／α１、α２、α３ドメイン融合配列を、ＭｌｕＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で消化し、そして前もってＭｌｕＩ及びＸｈｏＩで消化されているＰＧＥＭＴ／イージーベクター(Promega)にライゲーションした。次いでこの構築物を、プライマー
【表４】
2012507994.tif 000005
を使用してＰＣＲにより増幅した。次いで、増幅された得られたフラグメントをＡｇｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、そしてヒトＦｃ  ＩｇＧ２(Invitrogen, Toulouse, France)をコードするｃＤＮＡと位相を一致させる(in phase)ために、ベクターｐＦＵＳＥ−ｈＦｃ１のクローニング部位ＡｇｅＩ及びＸｈｏＩに導入した。得られるｃＤＮＡ配列は配列番号３に記載されておりそしてアミノ酸配列は配列番号４に記載されている。
【００９４】
タンパク質を物質及び方法に開示されたとおりに産生させた。
【００９５】
実施例３：ＨＬＡ−Ｇα１−Ｆｃのクローニング及び合成
ＨＬＡ−Ｇα１ドメインのｃＤＮＡ配列を、プライマー
【表５】
2012507994.tif 000006
を使用するＰＣＲにより増幅した。制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶによるα１ＰＣＲフラグメント及びｐＦＵＳＥ−ｍＦＣ２ベクター(Invitrogen)の制限酵素消化の後、α１ＰＣＲフラグメントを、ＩＬ−２のシグナル配列及びマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域を含有するｐＦＵＳＥ−ｍＦＣ２ベクターにライゲーションした。得られるｃＤＮＡ配列は配列番号５に記載されておりそしてアミノ酸配列は配列番号６に記載されている。
【００９６】
タンパク質を物質及び方法に開示されたとおりに産生させた。
【００９７】
実施例４：ＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質は二量体を形成する
図１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による、ＨＬＡ−Ｇ−β２ミクログロブリン／Ｆｃ二量体（「還元されていない」（左の）及び一量体（還元された（右の））タンパク質移動を示す。上清に存在するＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃタンパク質を、プロテインＧセファロースビーズ（GE Healthcare）により免疫沈降させた。免疫沈降物をＰＢＳ１Ｘで３回洗浄した。次いでタンパク質を、ジチオトレイトール１０mMを含有するサンプルバッファーとのインキュベーションにより溶離させ（「還元した」）又は溶離せず（非還元）、煮沸し、ポリアクリルアミドゲルでクロマトグラフィーにかけそしてHybond ECLニトロセルロース膜（Amersham Pharmacia Bioscience）上に転写した。ＰＢＳ１Ｘ中の５％脱脂乳とのインキュベーションの後、膜を抗ＨＬＡ−Ｇ（４Ｈ８４）抗体と一夜インキュベーションしそしてセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲーションされたヤギ抗マウス二次抗体を使用して現した。膜をＥＣＬ検出システム（Amersham Pharmacia Bioscience）により現した。
【００９８】
示された結果は、本発明のＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃタンパク質の二量体を形成する能力を示す。
【００９９】
実施例５：ＨＬＡ−Ｇ−Ｆｃ融合タンパク質はＩＬＴ２レセプターを介するシグナリングを誘導する
この実施例は、ＩＬＴ２レセプターへの結合及びその後のシグナリングを決定するための、ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイにおける本発明のＨＬＡ−Ｇ−Ｆｃ融合タンパク質の効果を説明する。
【０１００】
物質
サルフェートラテックスビーズ４％ｗ／ｖ５μm(Invitrogen)
AffiniPure コート抗マウスＩｇＧＦｃフラグメント１．８mg／ml（Jackson ImmunoResearch）
AffiniPure コート抗ヒトＩｇＧＦｃフラグメント１．３mg／ml（Jackson ImmunoResearch）
Helaネガティブコントロール
ＨＬＡ−Ｇ１−ｂ２ｍ／ｈＦｃ１  １．５μg／ml
ＨＬＡ−Ｇ６／Ｆｃ０．５μg／ml
ＮＦＡＴＧＦＰレポーター細胞
【０１０１】
方法
ＮＦＡＴＧＦＰレポーター細胞を、試験の前に２日間培養した。簡単に言えば、レポーター及びＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質コーテッドビーズを１：５の割合で、１６時間共培養し、次いでＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより分析した。
【０１０２】
結果
結果を図２に示しそして融合タンパク質がＧＦＰ発現を誘導することができることを示し、これは、融合タンパク質が機能的に活性であることを示す。
【０１０３】
実施例６：同種異系皮膚移植に対するＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質の効果
物質
サルフェートラテックスビーズ４％ｗ／ｖ５μm(Invitrogen)
AffiniPure コート抗マウスＩｇＧＦｃフラグメント１．８mg／ml（Jackson ImmunoResearch）
AffiniPure コート抗ヒトＩｇＧＦｃフラグメント１．３mg／ml（Jackson ImmunoResearch）
Helaネガティブコントロール
ＨＬＡ−Ｇ１−ｂ２ｍ／ｈＦｃ１  １．５μg／ml
α１／ｍｆｃ２  １．５μg／ml
ＨＬＡ−Ｇ6／Ｆｃ０．５μg／ml
【０１０４】
方法
すべてのＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質について、１０８サルフェートラテックスビーズを、AffiniPure コート抗マウス（又は抗ヒト）ＩｇＧＦｃフラグメント２０μg／mlで３７℃で２時間コーティングし、次いでＢＳＡ（２mg／ml）と２時間インキュベーションした。洗浄の後、ビーズをＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質０．５μg／mlと４℃で１６時間インキュベーションした。次いでビーズを、１ｘＰＢＳにより２回洗浄した。５ｘ１０６サルフェートラテックスビーズに対して、ＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質（１μg／ml）５mlを使用した。ＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質ではなくて１ｘＰＢＳ又はＨｅＬａネガティブコントロールを使用したことを除いて同じ方法で、ネガティブコントロールとして、サルフェートラテックスビーズを調製した。サルフェートラテックスビーズ（５×１０６）を、皮膚移植の前の日に腹腔内に注射した。
【０１０５】
特定の病原体を含まないＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）（８〜１０週齢）マウス及びＩＬＴ４トランスジェニックマウス（Ｈ−２ｂ）（８〜１０週齢）を、研究全体にわたり皮膚移植片受容者として使用した。受容者マウスは、ＨＬＡ−Ｇカップリングされたミクロスフェアを受け取った。ドナー皮膚は、ＭＨＣクラスＩＩ異種Ｂ６ＣＨ−２ｂｍ１２（ｂｍ１２、Ｈ−２ｂ）マウスからのものであった。同種異系皮膚移植は、標準方法により行われた。簡単に言えば、ドナーマウス（１２〜１４週齢）の尾部からの皮膚（１．０cm２）を、受容者、麻酔されたマウスの側腹部に移植した。移植片を、ガーゼ及び硬膏剤で被覆し、それらを１０日目に除去した。移植片を、拒絶反応（移植された組織の８０％が壊死しておりそしてサイズが減少している、と定義される）まで毎日スコアをつけた。すべての皮膚移植生存データをカプラン・マイヤー生存分析（Kaplan Meier Survival Analysis）により検定した。
【０１０６】
結果
結果を図３〜５に示す。それらは、すべての融合タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏでの移植片免疫寛容を実質的に改良することができたことを示す。特に、それらは、融合タンパク質が免疫寛容を５０％まで改良することができる（例えば図５参照）ことを示し、これは非常に驚くべきことでありそして本質的である。モデルにおける移植片生存の各日は、ヒト被検体における移植片生存の約少なくとも１カ月に対応し、したがって本発明のタンパク質は、ヒト被検体において少なくとも１０カ月移植片生存を改良すると考えられる。
【０１０７】
【表６】
2012507994.tif 000007
2012507994.tif 000008
2012507994.tif 000009
2012507994.tif 000010
2012507994.tif 000011
【図１】
2012507994.tif 000012
【図２】
2012507994.tif 000013
【図３】
2012507994.tif 000014
【図４】
2012507994.tif 000015
【図５】
2012507994.tif 000016
【配列表】
2012507994000001.app
【国際調査報告】
2012507994.tif 000017
2012507994.tif 000018
2012507994.tif 000019