(57)【要約】  本発明は、例えば、粘膜送達ペンタボディ複合体（ＭＤＰＣ）を投与することにより、鼻内及び／又は口腔粘膜抗体応答並びに体液性抗体応答を特異的に誘導する新規手法を提供する。ＭＤＰＣは、標的抗原と、標的抗原に強い親和性を有する粘膜送達ペンタボディ（ＭＤＰ）を混合することによって形成される複合体である。ＭＤＰは、五量体化ドメイン（コレラ毒素（ＣＴ）又は熱不安定毒素（ＬＴ）のＢサブユニットを含む、ＡＢ５毒素ファミリーのＢサブユニットを含み得る）への単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；標的抗原に特異的に結合する）の融合タンパク質である。五量体化ドメインは五量体に自己組織化することができ、それを介して五量体単一ドメイン抗体又はペンタボディが形成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原を動物に送達するための方法であって、粘膜送達ペンタボディ複合体（ＭＤＰＣ）を粘膜経路によって動物に投与することを含み、前記ＭＤＰＣが、
標的抗原及び
標的抗原に対して親和性を有する粘膜送達ペンタボディ（ＭＤＰ）
を含有し、前記ＭＤＰが、
五量体化ドメイン及び
前記五量体化ドメインに融合した単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）
を含有する融合タンパク質であり、
前記ｓｄＡｂが標的抗原に特異的に結合し、
前記五量体化ドメインがＡＢ５毒素のＢサブユニットを含有する、方法。
【請求項２】
前記Ｂサブユニットがコレラ毒素（ＣＴ）又は熱不安定毒素（ＬＴ）に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＤＰが、前記ｓｄＡｂを前記五量体化ドメインに連結するリンカーを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＤＰが五量体として自己組織化する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｓｄＡｂが前記五量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に融合している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的抗原が防御抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＤＰ及び前記標的抗原が高い親和性で複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的抗原を前記ＭＤＰと混合し、その前記ＭＤＰ混合物を前記動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＤＰ及び前記標的抗原を１：１〜１：５のモル比で混合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記粘膜経路が経鼻、経眼、経口、経直腸又は経膣である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が抗原特異的粘膜免疫応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が抗原特異的体液性免疫応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が抗原特異的細胞性免疫応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫応答が、粘膜部位における抗原特異的分泌型ＩｇＡ抗体応答を特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＤＰＣを含有する粘膜ワクチンであって、前記ＭＤＰＣが、
標的抗原及び
前記標的抗原に対して高い親和性を有する粘膜送達ペンタボディ（ＭＤＰ）
を含有し、前記ＭＤＰが、
五量体化ドメイン及び
前記五量体化ドメインに融合したｓｄＡｂ
を含有する融合タンパク質であり、
前記ｓｄＡｂが標的抗原に特異的に結合し、そして
前記五量体化ドメインがＡＢ５毒素のＢサブユニットを含有する、粘膜ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
国際公開第０３／０４６５６０号（米国特許出願第２００６００５１２９２号に相当する）は、一部には、抗体の結合特性を改善することに関する。この参考文献は粘膜ワクチンへの参照を含まない。
【背景技術】
【０００２】
粘膜ワクチン、例えばポリオワクチンが早期に成功を収めたにもかかわらず、有効で長時間持続する抗原特異的免疫応答の誘導はいまだ課題のままである（１）。大部分の抗原は有効な粘膜免疫を自発的には誘導しないので、有効な経口又は経鼻ワクチンを開発するには、典型的にはアジュバントが必要である。
【０００３】
現在試験される粘膜免疫系は、細菌の弱毒化突然変異株、抗原をミクロスフェアにリポソーム被包した種々の製剤（２）、脂質構造体及びウイルス粒子（３）を含む。試験された粘膜アジュバントは、ＣｐＧ  ＤＮＡ（４）、細菌毒素（５）、例えばコレラ毒素（ＣＴ）（６、７）、大腸菌熱不安定毒素（ＬＴ）（８、９）及びそれらの誘導体を含む。これらの中で、ＣＴ又はＬＴに基づくアジュバントが使用されてきた（１０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣＴ及びＬＴはどちらも、有核細胞上の細胞受容体ＧＭ１に結合するＢサブユニット五量体（１１）、及びＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ（１２）であり、毒性実体であるＡサブユニット単量体から成る。それ故、非毒性Ａサブユニット変異体を作製すること又はＢサブユニットだけを使用することによって毒素の毒性を低減する試みが為されてきた。ＣＴ又はＬＴのアジュバント性と毒性の分離が１つの理論であった。アジュバント性は保存されているが、はるかに低い毒性を有するＣＴ又はＬＴ変異体も期待された。ＣＴ及びＬＴの毒性低減はしばしばアジュバント性の喪失に結びつくが、ＣＴ変異体が生成され（１３〜１７）、試験されている。
【０００５】
もう１つの方策は、ＣＴ又はＬＴの非毒性受容体結合Ｂサブユニット五量体、それ故ＣＴＢ又はＬＴＢと呼ばれるものを使用することである。ＣＴＢ及びＬＴＢは、一部の症例ではホロ毒素のアジュバント性を保存することが報告されている。ＬＴＢをアジュバント添加したインフルエンザサブユニット抗原は、ｉ．ｎ．免疫後、防御性鼻内ＩｇＡを誘導することが認められた（１８）。しかし、抗原へのＣＴＢ又はＬＴＢの添加は、多くの報告された症例において有意の粘膜ＩｇＡを誘導しなかった。化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のＳｆｂＩタンパク質のフィブロネクチン結合ドメインはそれらの１つであった（１９）。
【０００６】
さらにもう１つの手法は、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）の２８ｋＤａグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのＴ細胞及びＢ細胞エピトープをＣＴＢに融合することであった（２０）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、粘膜送達ペンタボディ複合体（ＭＤＰＣ）を投与することにより、鼻内及び／又は口腔粘膜抗体応答並びに体液性抗体応答を特異的に誘導する新規手法を提供する。ＭＤＰＣは、標的抗原と、標的抗原に強い親和性を有する粘膜送達ペンタボディ（ＭＤＰ）を混合することによって形成される複合体である。ＭＤＰは、五量体化ドメインへの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；標的抗原に特異的に結合する）の融合タンパク質である。一部の実施形態では、五量体化ドメインは、ＡＢ５毒素ファミリーのＢサブユニット（２１）、特にコレラ毒素（ＣＴ）又は熱不安定毒素（ＬＴ）のＢサブユニットであり得る。五量体化ドメインは五量体に自己組織化することができ、それを介して五量体単一ドメイン抗体又はペンタボディが形成される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本研究において構築したｓｄＡｂ及びＣＴＢに基づくペンタボディ。（Ａ）３つの相補性決定領域に下線を付した、ＢＳＡ７、ＢＳＡ８、ＢＳＡ１２及びＢＳＡ１６の配列。（Ｂ）ｓｄＡｂ及びそれらのペンタボディの一次構造の概略図。ｏｍｐＡシグナルペプチドはタンパク質の分泌の間に除去される。ＣＴＢとｓｄＡｂは１５アミノ酸リンカー（Ｌ）によって連結され、ｃ−Ｍｙｃ検出タグ（ｍｙｃ）及び６×ヒスチジン精製タグで標識されている。（Ｃ）精製ＢＳＡ８、ＢＳＡ１２、ＢＳＡ１６、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６（レーン１〜６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【０００９】
【図２】ＢＳＡと本研究において構築した抗体との相互作用。（Ａ）１０、２０、４０、６０、８０及び１００ｎＭの濃度でのＢＳＡ８のＢＳＡへの結合。（Ｂ）１、２、５、１０、２０及び５０ｎＭの濃度でのＢＳＡ１２のＢＳＡへの結合。（Ｃ）２５、１００、３００、５００、１０００、２０００及び３０００ｎＭの濃度でのＢＳＡ１６のＢＳＡへの結合。（Ｄ）長い解離時間で、１０ｎＭでのＢＳＡ１２のＢＳＡへの結合。適合が妥当に良好であるＢ、Ｃ及びＤでは、実際のデータ点については白い円を使用し、１：１結合モデルの適合には実線を使用している。（Ｅ）１０ｎＭ Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６のＢＳＡへの結合；（Ｆ）１０ｎＭ Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８のＢＳＡへの結合；（Ｇ）１μＭ ＢＳＡのＣ３Ｃ−ＢＳＡ８、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６への結合、並びに（Ｈ）１．２μＭ ＢＳＡのＣ３Ｃ−ＢＳＡ８への結合。（Ｆ）及び（Ｈ）は、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８とＢＳＡとの間の相互作用を示すためであるが、使用したスケールにより（Ｅ）及び（Ｇ）では見えない。
【００１０】
【図３】ペンタボディとＢＳＡとの間でのタンパク質複合体の形成。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（商標）でのＢＳＡ（Ａ）及びペンタボディＣ３Ｃ−ＢＳＡ１２（Ｂ）のＳＥＣプロフィールを上のパネルに示す。Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８とＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６のプロフィールはＣ３Ｃ−ＢＳＡ１２のものと非常に類似しており、示していない。（Ｃ）１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ ８０μｌ及び１ｍｇ／ｍｌ Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ １６８μｌの混合物（モル比＝５：１）のＳＥＣプロフィール。Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２の容量を３：１（Ｄ）、２：１（Ｅ）及び１：１（Ｆ）のモル比を有するように調整した。同様に、３：１のモル比のＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６とＢＳＡ（Ｇ）及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ８とＢＳＡ（Ｈ）の混合物のＳＥＣプロフィールを示した。比較を容易にするため、すべてのグラフを１００に基準化した。Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２は、例えば、強固な複合体を形成することが示されている。
【００１１】
【図４】最初の免疫から５週間後のＢＳＡ特異的な全身及び粘膜免疫応答。５匹のマウスの群を、ＰＢＳ、ＢＳＡ単独（ＣＴＲＬ）で又は指示されている試薬を添加したＢＳＡで鼻腔内又は経口的に３回免疫した。各々のパネルの一番右側に、経口的ＢＳＡ／Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２免疫後のＢＳＡ特異的免疫応答を示す。
【００１２】
【図５】分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）を形成するために、ＭＤＰと標的抗原との間で強固な複合体の形成（ＢＳＡ／Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２相互作用の場合のように）が必要であることを示す概略図。免疫応答の誘導は、おそらく有核細胞上の細胞受容体ＧＭＩへのペンタボディの結合を通して媒介される。標的抗原、ＢＳＡ及び送達分子（例えばＣＴＢ）の間に相互作用がない場合又は標的抗原へのＭＤＰの親和性が、例えばＢＳＡ／Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１６の場合のように、強固なＭＤＰＣを形成するのに十分なほど強くない場合は、抗原特異的粘膜免疫応答はほとんど検出されなかった。標的抗原への単一ドメイン抗体の解離定数（ＫＤ）は、１０−７Ｍ又はそれ以下、好ましくは１０−９Ｍ又はそれ以下、又は最も好ましくは１０−１１Ｍ又はそれ以下であるべきである。
【００１３】
【図６】この図は、粘膜送達ペンタボディ複合体（ＭＤＰＣ）を示す。ＭＤＰＣは、標的抗原と粘膜送達ペンタボディ（ＭＤＰ）を含む複合体である。ＭＤＰは、五量体化ドメインに融合した単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の融合タンパク質である。ｓｄＡｂは、標的抗原に特異的に且つ高い親和性で結合する。五量体化ドメインは、ＡＢ５毒素ファミリーのＢサブユニットであり得る（２１）。（配列の簡単な説明）
【００１４】
配列番号：１は、例えば実施例３で考察するｓｄＡｂ「ＢＳＡ７」のアミノ酸配列を提供する。
【００１５】
配列番号：２は、例えば実施例３で考察するｓｄＡｂ「ＢＳＡ８」のアミノ酸配列を提供する。
【００１６】
配列番号：３は、例えば実施例３で考察するｓｄＡｂ「ＢＳＡ１２」のアミノ酸配列を提供する。
【００１７】
配列番号：４は、例えば実施例３で考察するｓｄＡｂ「ＢＳＡ１６」のアミノ酸配列を提供する。
【００１８】
配列番号：５は、低親和性ペンタボディ「Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８」のアミノ酸配列を提供する。
【００１９】
配列番号：６は、高親和性ペンタボディ「Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２」のアミノ酸配列を提供する。
【００２０】
配列番号：７は、低親和性ペンタボディ「Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１６」のアミノ酸配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、例えば、粘膜免疫応答並びに体液性抗体応答を誘導する粘膜送達ペンタボディを使用した、標的抗原の特異的鼻腔内及び／又は経口粘膜送達を提供する。本発明はまた、一部には、ペンタボディと共に抗原を送達することによって特異的粘膜免疫応答を誘導する新規手順に関する。
【００２２】
ペンタボディとは、五量体単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を指す。ｓｄＡｂは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）の可変領域を指す。従来のＩｇＧ由来のｓｄＡｂは、それらのＶＨ及びＶＬ対応物と対合させるために使用されるＶＨ又はＶＬの分子表面の疎水性部分のために凝集する傾向がある。
【００２３】
天然に軽鎖を欠く重鎖抗体（ＨＣＡｂ）が、ラクダ科の動物（２２）、例えばラクダ、ラマ及びアルパカ、並びにサメ（２３）において発見された。これらの重鎖だけのＩｇ分子の可変領域、またはＶＨＨは単に抗原結合だけに関与する。従来のＩｇＧ由来のｓｄＡｂと異なり、ラクダ科動物のＨＣＡｂからのｓｄＡｂは、軽鎖及びＣＨ１ドメインと相互作用する必要がない。従って、従来のＩｇＧではより疎水性の残基（Ｖａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｇｌｕ４５及びＴｙｒ４７）が通常使用される場合に、より親水性の残基が認められた（Ｐｈｅ３７、Ｇｌｕ４４、Ａｒｇ４５及びＧｌｙ４７）。結果として、ラクダ科動物のｓｄＡｂは、単独で発現される場合、通常は単量体タンパク質として存在する（２４）。本発明による使用のためのラクダ科動物ｓｄＡｂは、典型的には非凝集性で、高度に熱安定であり、高度に界面活性剤耐性で、比較的高いタンパク質分解耐性を有し、そして免疫ライブラリーからの単離により又はインビトロでの親和性成熟により、高い親和性を有する。ｓｄＡｂを志賀毒素１型のＢサブユニット（ｓｔｘ１−Ｂ）に融合することにより、五量体ｓｄＡｂ又はペンタボディ生成された。
【００２４】
ＯＨ１５７：Ｈ７を含む大腸菌の腸管出血性種によって産生される志賀毒素１型及び志賀毒素２型は、コレラ毒素（コレラ菌（Vibrio cholerae））、熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ及びＬＴ−ＩＩ）（大腸菌（Escherichia-coli））、百日咳毒素（百日咳菌（Bordetella pertussis））と共に、ＡＢ５毒素ファミリーの成員である（２１）。それらは、各々の毒素が、受容体結合に関与するＢサブユニット五量体及び毒性実体であるＡサブユニット単量体から成るので、このように分類される。ペンタボディは、相同な五量体を形成し、トリプシン及びケモトリプシン消化に対して比較的耐性であり、比較的良好な熱安定性（Ｔｍ＝５２℃）を有していた。また、ｓｔｘ１−Ｂの、その細胞受容体Ｇｂ３への結合能力を保持していた。Ｓｔｘ１Ｂとコレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）又は大腸菌熱不安定毒素のＢサブユニット（ＬＴＢ）は比較的低い配列同一性を有するが、３つのタンパク質は著明な構造類似性を共有する。
【００２５】
本発明は、一部には、ＣＴＢを五量体化ドメインとして使用してペンタボディを構築すること及び粘膜抗原送達のためのそのＧＭ１結合を利用することに関する。本技術を適用できる方法の一例は、標的抗原（この場合はＢＳＡがモデル抗原として選択される）に対するＣＴＢ−ペンタボディの構築及び抗原特異的粘膜免疫応答の誘導のためのその使用においてである。本明細書で述べる粘膜送達システムの一部の実施形態では、ＣＴＢ又はＬＴＢをペンタボディ複合体中で使用する。これは、抗原と粘膜表面を架橋するＣＴＢ−ペンタボディ又はＬＴＢ−ペンタボディの使用を可能にし、それによってワクチン製剤における付加的なアジュバントの必要性を排除する。従って、本発明は、一部には、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を用いた粘膜免疫応答の誘導のための新規方法に関する。
【００２６】
一部の実施形態は、五量体単一ドメイン抗体又は「ペンタボディ」によって標的抗原をＧＭ１発現細胞に連結することを含む。抗原としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対して種々の親和性を有する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を、ＢＳＡで免疫したラマの抗体レパートリーからファージディスプレイ技術を用いて惹起した。これらの抗体を、ＣＴＢに融合してペンタボディを作製することによって五量体化した。ＢＳＡを担持するペンタボディの能力はそれらの親和性によって直接決定されることが認められ、これは、マウスにおいてＢＳＡ特異的免疫応答を有するそれらの能力に影響を及ぼした。高親和性ペンタボディＣ３Ｃ−ＢＳＡ１２（配列番号：６）は、ＣＴによって媒介されるものと同等のＢＳＡ特異的分泌型ＩｇＡを誘導することができ、一方低親和性ペンタボディＣ３Ｃ−ＢＳＡ８（配列番号：５）及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６（配列番号：７）、並びにＣＴＢ単独は、ＩｇＡ産生を誘導するより低い能力を示した。
【００２７】
ＣＴＢ又はＬＴＢへの抗原特異的ｓｄＡｂの融合は、抗原とＣＴ又はＬＴ毒素のＢ又はＡサブユニットとの間で分子融合物を生成せずに抗原全体を粘膜表面に輸送することを可能にする。このプラットフォームは、さらなる適用のため及び粘膜ワクチンのさらなる開発のために使用できる。本明細書で報告する結果はまた、抗原がＣＴＢ−ペンタボディによって送達されて、抗原特異的粘膜免疫応答を誘導し得ることを明らかに示す。
【００２８】
一部の実施形態を要約すると、抗原への強力な結合を有するＣＴＢに基づくペンタボディによって粘膜免疫応答を誘導する、すなわち抗原を送達する新規手順が本明細書で提示される。生化学的結果（図２及び３）と免疫学的結果（図４）との比較も、粘膜免疫におけるＣＴＢの役割を例証する。一部の実施形態では、粘膜免疫応答を誘導するために、抗原をＭＤＰに強固に結合することができる、すなわち両者の間で強固な複合体が形成される（図５）。
【００２９】
本明細書ではＢＳＡを抗原として使用し、例示する。これは、本発明が様々な他の抗原に関して機能することを明らかにする。そのような他の抗原は、米国立アレルギー・感染症研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases）のウエブサイト上に列挙されている（新興及び再興感染症として）、以下の生物から得られるものを含む：
第I群−過去２０年間に新たに確認された病原体
アカントアメーバ症（Acanthamebiasis）
オーストラリアコウモリリッサウイルス（Australian bat lyssavirus）
非定型バベシア属（Babesia）
バルトネラ・ヘンセラ（Bartonella henselae）
エールリヒア症（Ehrlichiosis）
エンセファリトゾーン・クニクリ（Encephalitozoon cuniculi）
エンセファリトゾーン・ヘレム（Encephalitozoon hellem）
エンテロシトゾーン・ビエヌーシ（Enterocytozoon bieneusi）
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）
ヘンドラウイルス（Hendra）又はウマモービリウイルス（equine morbilli virus）
Ｃ型肝炎
Ｅ型肝炎
ヒトヘルペスウイルス８型
ヒトヘルペスウイルス６型
ライムボレリア症（Lyme borreliosis）
パルボウイルスＢ１９
第ＩＩ群−再興病原体
エンテロウイルス７１型
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）
ムンプスウイルス（Mumps virus）
Ａ群連鎖球菌属（Streptococcus、Group A）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
第ＩＩＩ群−バイオテロの潜在的可能性がある外的病原因子
ＮＩＡＩＤ−カテゴリーＡ
・炭疽菌（Bacillus anthracis）（炭疽）
・ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）毒素（ボツリヌス中毒）
・ペスト菌（Yersinia pestis）（ペスト）
・大痘瘡（Variola major）（痘瘡）及び他の関連ポックスウイルス
・野兎病菌（Francisella tularensis）（野兎病）
・ウイルス性出血熱
−アレナウイルス属（Arenaviruses）
・ＬＣＭ、フニンウイルス（Junin virus）、マチュポウイルス（Machupo virus）、グアナリトウイルス（Guanarito virus）
・ラッサ熱
−ブンヤウイルス属（Bunyaviruses）
・ハンタウイルス属（Hantaviruses）
・リフトバレー熱
−フラビウイルス属（Flaviruses）
・デング熱
−フィロウイルス（Filoviruses）
・エボラ出血熱
・マールブルグ熱
ＮＩＡＩＤ−カテゴリーＢ
・類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）
・コクシエラ・バーネッティイ（Coxiella burnetii）（Ｑ熱）
・ブルセラ種（Brucella）（ブルセラ症）
・鼻疽菌（Burkholderia mallei）（鼻疽）
・オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）（オウム病）
・リシン毒素（トウゴマ（Ricinus communis）由来）
・ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のε毒素
・ブドウ球菌（Staphylococcus）エンテロトキシンＢ
・発疹チフス（発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii））
・食品又は水由来の病原体
−細菌
・下痢原性大腸菌（Diarrheagenic E.coli）
・病原性ビブリオ菌（Pathogenic Vibrios）
・赤痢菌種（Shigella species）
・サルモネラ属
・リステリア菌（Listeria monocytogenes）
・カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）
・腸炎エルシニア（Yersinia enterocolitica）
−ウイルス（カリシウイルス属（Caliciviruses）、Ａ型肝炎）
−原生動物
・クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）
・シクロスポラ・カヤタネンシス（Cyclospora cayatanensis）
・ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）
・赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）
・トキソプラスマ（Toxoplasma）
−真菌
・微胞子虫類（Microsporidia）
・付加的なウイルス性脳炎
−西ナイルウイルス（West Nile virus）
−ラクロスウイルス（LaCrosse）
−カリフォルニア脳炎
−ＶＥＥ
−ＥＥＥ
−ＷＥＥ
−日本脳炎ウイルス（Japanese Encephalitis virus）
−キャサヌール森林病ウイルス（Kyasanur Forest virus）
ＮＩＡＩＤ−カテゴリーＣ
新興感染症の脅威、例えばニパーウイルス（Nipah virus）及び付加的なハンタウイルス
【００３０】
ＮＩＡＩＤ優先分野：
・ダニ媒介出血熱ウイルス（Tick-borne hemorrhagic fever viruses）
−クリミア−コンゴ出血熱ウイルス（Crimean-Congo Hemorrhagic Fever virus）
・ダニ媒介脳炎ウイルス（Tick-borne encephalitis viruses）
・黄熱病
・多剤耐性ＴＢ
・インフルエンザ
・他のリケッチア属
・狂犬病
・プリオン病
・チクングニヤウイルス（Chikungunya virus）
・重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）
・性感染病原体に関する研究を除く、抗菌剤耐性＊
−抗菌剤耐性の機序に関する研究
−病原体集団内での抗菌剤耐性遺伝子の出現及び／又は拡大の調査
−ヒト集団内での抗菌剤耐性病原体の出現及び／又は拡大の調査
−耐性機序を標的する治療手法に関する研究
−耐性出現を克服するための既存抗菌剤の改変
・広域スペクトル抗菌剤の開発を焦点とする、構築された脅威及び天然に生じる薬剤耐性病原体に関する、抗菌剤研究
・微生物、微生物産物及び抗原を認識し、それに応答する非適応免疫機序の検討と定義される、先天性免疫
・コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）（２００８年２月に追加）
・コクシジオイデス・ポサダシ（Coccidioides posadasii）（２００８年２月に追加）
【００３１】
上記で、特に注目すべき病原体の例に下線を付している（第Ｉ群及び第ＩＩ群の各々１つ、並びに第ＩＩＩ群の４つの病原体）。これら６つの例示的病原体／抗原対は、細菌、ウイルス及び毒素、並びに消化器経及び呼吸器系感染症を含む。これらについて、抗原／対を以下で括弧内に示す。さらなるそのような選択及び対合は、本開示を利用して当業者によって実施され得る。各病原体について、２以上の抗原が標的抗原として同定され得る。
Ｃ型肝炎（糖タンパク質Ｅ１及びＥ２）
黄色ブドウ球菌（ＰｓａＡ）
炭疽菌（炭疽）（炭疽毒素）
下痢原性大腸菌（志賀毒素）
カンピロバクター・ジェジュニ（ＭＯＭＰ）
インフルエンザ（ノイラミイニダーゼ、赤血球凝集素）
【００３２】
用語が本明細書で使用される場合、「動物」は、哺乳動物及びヒトを含む。この用語はまた、畜牛、乳牛、ブタ（hogs、pigs）、ウマ、ニワトリ、家禽及び生産動物を含む。獣医学適用に関しては、本発明はネコ、イヌ、ウサギ等を含む。
【００３３】
本明細書で参照するか又は引用するすべての特許、特許出願、仮出願及び公表文献は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
特に指示又は示唆されない限り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語は、本明細書で使用される場合「少なくとも１つ」を意味する。
【００３５】
以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定されるものとして解釈されるべきではない。特に明記されない限り、すべてのパーセンテージは重量比であり、すべての溶媒混合物比率は容積比である。
【実施例】
【００３６】
実施例１
実験材料
大腸菌ＴＧ１及びＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔ）から購入した。ベクターｐＳＪＦ２（２９）のように５×Ｈｉｓタグタンパク質を発現する代わりに６×Ｈｉｓタグタンパク質を発現する、発現ベクターｐＳＪＦ２Ｈは、Ｄｒ．Ｊ．Ｔａｎｈａ（ＩＢＳ，ＮＲＣ）の好意により提供された。ＣＴＢをコードするＤＮＡは、Ｄｒ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｕ．ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ）から贈られた。ＣＴタンパク質はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入し、組換えＣＴＢはＳＢＬ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ＡＢ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。５ｍｌ固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）Ｈｉｇｈ−Ｔｒａｐ（商標）キレート化アフィニティーカラムはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。
【００３７】
実施例２
ＢＳＡに特異的なｓｄＡｂの単離
雌性ラマをＢＳＡで免疫した。このラマのＶＨＨレパートリーからｓｄＡｂファージミドディスプレイライブラリーを構築し、このライブラリーをＢＳＡに対するｓｄＡｂの単離のために使用した。
【００３８】
ラマの免疫ファージディスプレイライブラリーを、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）マレイン酸無水物活性化マイクロタイタープレートウエルに前吸着させた１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡに対してパニングした。約１０１１ファージをウエルに添加し、抗原結合のために３７℃で２時間インキュベートした。未結合ファージを除去した後、ウエルを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）で、１回目のラウンドについては６回洗浄し、各追加ラウンドについて洗浄回数を１回ずつ増加した。１００ｍＭ トリエチルアミン１００μｌと共に１０分間インキュベートしてファージを溶出し、その後溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２００μｌで中和した。ファージをとりだし、Ｍ１３ＫＯ７を用いて増幅して、次のラウンドのパニングのために使用した。３回のラウンドのパニング後、溶出したファージを使用して対数期増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させ、Ｍ１３ＫＯ７によってとりだした。生じたファージをファージＥＬＩＳＡにおいて使用した。
【００３９】
ファージＥＬＩＳＡのために、９６穴プレートのウエルを５μｇ／ｍｌ ＢＳＡで一晩被覆し、次に１％カゼインを用いて３７℃で２時間ブロックした。ファージをカゼインで一晩前ブロックし、前ブロックしたウエルに添加して、１時間インキュベートした。陽性ファージクローンを標準ＥＬＩＳＡ手順によって検出し、この手順は、分析した３８のファージクローンのうち３５がＢＳＡに結合したことを明らかにした。
【００４０】
これらのクローンを配列決定のために送付した。これらのクローンの配列分析は、４つのｓｄＡｂ：ＢＳＡ７、ＢＳＡ８、ＢＳＡ１２及びＢＳＡ１６を明らかにした（図１Ａ）。
【００４１】
実施例３
ｓｄＡｂの構築、発現及び特性付け
４つのｓｄＡｂ（ＢＳＡ７、ＢＳＡ８、ＢＳＡ１２及びＢＳＡ１６；それぞれ配列番号：１〜４）をコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩ制限部位と隣接させた。生成物をｐＳＪＦ２ＨのＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＢＳＡ７、ｐＢＳＡ８、ｐＢＳＡ１２及びｐＢＳＡ１６を作製した。
【００４２】
すべてのクローンをＬＢ−アンピシリン２５ｍｌに接種し（３０）、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培養物２０ｍｌを使用して、０．４％ カザミノ酸、５ｍｇ／ｌ ビタミンＢ１及び２００μｇ／ｍｌ アンピシリンを添加したＭ９培地（０．２％グルコース、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、０．０５％ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）１ｌに接種し、２４時間培養した。次に、１０×ＴＢ栄養素（１２％トリプトファン、２４％酵母抽出物及び４％グリセロール）１００ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ アンピシリン２ｍｌ及び１Ｍ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍｌを培養物に添加し、２００ｒｐｍで振とうしながら２８℃でさらに６５〜７０時間インキュベーションを継続した。遠心分離によって大腸菌細胞を収集し、リゾチームで溶解した。細胞溶解産物を遠心分離し、透明な上清をＨｉｇｈ−Ｔｒａｐ（商標）キレート化アフィニティーカラムに負荷して、Ｈｉｓタグタンパク質を精製した。
【００４３】
４つのｓｄＡｂ遺伝子をペリプラズム発現ベクターｐＳＪＦ２Ｈにクローニングして、ｓｄＡｂ発現ベクターを作製し（図１Ｂ）、発現されたタンパク質を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。タンパク質３．１、１６．２及び６．２ｍｇを、それぞれｐＢＳＡ８、ｐＢＳＡ１２及びｐＢＳＡ１６の大腸菌培養物１ｌから得た（図１Ｃ）。ＢＳＡ７発現からはほとんどタンパク質が得られず、このタンパク質のさらなる分析は実施しなかった。
【００４４】
精製タンパク質をＨＢＳ−Ｅ緩衝液に対して透析した。凝集物の形成又はその不在を評価するため、先に述べられているように（３１）ＨＢＳ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（商標）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、ＢＳＡ８、ＢＳＡ１２及びＢＳＡ１６に関してサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（商標）カラムでのＢＳＡ８（１１．８７ｍｌ）、ＢＳＡ１２（１１．７２ｍｌ）及びＢＳＡ１６（１１．８０ｍｌ）の溶出容積は、同じ条件下で実施した分子量マーカーの溶出容積に基づき、３つのタンパク質すべてが単量体として存在することを示唆した。その３つのタンパク質のいずれにも凝集性は見られなかった。
【００４５】
実施例４
親和性測定
固定化ＢＳＡ及び他のＳＡに対するＢＳＡ８、ＢＳＡ１２及びＢＳＡ１６の相互作用についての結合動態を、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ） １７００ＲＵをリサーチグレードのＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ）に固定化した。エタノールアミンでブロックした表面を対照標準として使用した。固定化は、製造者によって供給されたアミンカップリングキットを使用して１０ｍＭ 酢酸ｐＨ４．５中５０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で実施した。抗体をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに通して、ＢＩＡＣＯＲＥ分析の前に単量体を分離した。
【００４６】
すべての場合に、分析は、０．００５％界面活性剤Ｐ２０を添加したＨＢＳ−Ｅ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中２５℃で、２０μｌ／分の流速にて実施した。表面を１００ｍＭ ＨＣｌで再生した（３秒間）。データをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウエアで解析した。
【００４７】
３つのｓｄＡｂ、ＢＳＡ８、１２及び１６のＢＳＡに対する親和性をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００を用いてＳＰＲによって測定した。３つのｓｄＡｂすべてがＢＳＡに特異的に結合した（図２）。ＢＳＡ１２（図２Ｂ）及びＢＳＡ１６（図２Ｃ）によってより高い結合能力（約１５０ＲＵ）が達成されたが、ＢＳＡ８のＢＳＡへの結合に関しては約４０ＲＵの応答だけが記録された（図２Ａ）。ＢＳＡ８は、５×１０−３ｌ／秒の解離速度（ｋｄ）及び１００ｎＭの範囲内の推定解離定数（ＫＤ）でＢＳＡへの結合を示した。ＳＰＲプロフィールが１：１結合モデルに適合しなかったため、正確なＫＤは測定できなかった（図２Ａ）。
【００４８】
ＢＳＡ１２はＢＳＡへの極めて強固な結合を有する（図２Ｂ）。非常に高い親和性の結合物に関してはより長い解離時間を必要とする、正確な親和性値を測定するため、１〜５０ｎＭの多数の濃度で５分間及び１０ｎＭで４時間、解離を再び観測した（図２Ｄ）。各々の結合を３回実施し、得られたデータは再現可能であった。これらの実験は、２．５×１０６Ｍ−１／秒のｋａ及び１×１０−５／秒のｋｄを明らかにし、４×１０−１２Ｍの算定ＫＤを与えた（表１）。極めて緩やかな解離速度にもかかわらず、相互作用は１：１結合モデルに良好に適合する（図２Ｄ）。
【表１】
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【００４９】
従って、一部の好ましい実施形態では、結合親和性（解離速度定数（モル）で表した）は、１０−７超、２．８×１０−７超及び４×１０−１２超であり得る。
【００５０】
実施例５
ペンタボディの構築、発現及び特性付け
ＣＴＢに基づくペンタボディを標準的な分子クローニング手順によって構築した。ＣＴＢをコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、それぞれ５’末端と３’末端でＢｂｓＩ制限部位及びリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳをコードするＤＮＡと隣接させた。ＢＳＡ８、ＢＳＡ１２及びＢＳＡ１６をコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、それぞれ５’末端と３’末端でリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳをコードするＤＮＡ及びＢａｍＨＩ制限部位と隣接させた。ＣＴＢと３つのｓｄＡｂをオーバーラップ伸長ＰＣＲによってＤＮＡレベルで融合させる。最終ＰＣＲ産物をＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、同じ酵素で消化したｐＳＪＦ２に連結して、クローンｐＣ３Ｃ−ＢＳＡ８、ｐＣ３Ｃ−ＢＳＡ１２及びｐＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６を作製した（図１）。
【００５１】
３つのタンパク質の発現を実施例３で述べたように実施した。ＣＴＢに基づくペンタボディを、ペプチドリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを用いて３つの単離ｓｄＡｂ、ＢＳＡ８、ＢＳＡ１２及びＢＳＡ１６の各々をＣＴＢのＣ末端に融合することによって構築した。生成されたクローンＣ３Ｃ−ＢＳＡ８、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６（図１Ｂ）は、それぞれ２８，２５７、２８，３９６及び２８，７８６ダルトンのサブユニット分子量を有する。３つのタンパク質を大腸菌において発現させ、ＩＭＡＣによって精製した（図１Ｃ）。タンパク質１０、２３及び７ｍｇをそれぞれＣ３Ｃ−ＢＳＡ８、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６から得た。
【００５２】
実施例６
標的抗原に対するペンタボディの親和性
３つのＣＴＢに基づくペンタボディの結合を評価するため、再びＳＰＲ分析を実施した。３つのタンパク質すべてが固定化ＢＳＡへの特異的結合を示した（図２）。それらの単量体対応物と同様に挙動して、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６は高い能力の結合（約７００ＲＵ、図２Ｅ）を達成したが、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８は高い能力の結合を示さなかった（約４５ＲＵ、図２Ｅ及び２Ｆ）。
【００５３】
Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２は、１０−５ｌ／秒より遅いｋｄでＢＳＡへの最も強固な結合を示した。これは、９×１０−６ｌ／秒というＢＳＡ１２のｋｄに非常に近い。この結果は、非常に低いｋｄを有するｓｄＡｂに関して、五量体化は見かけ上そのアビディティーを上昇させないことを示した。これは、五量体化によって機能的親和性の非常に大きな増大が達成され得る、低親和性ｓｄＡｂの五量体化とは異なる（例えばＣ３Ｃ−ＢＳＡ８及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６参照）。結合の多価的な性質の故に、結合の正確なｋｄは計算できなかった。
【００５４】
固定化ペンタボディへのＢＳＡの結合（図２Ｇ及び２Ｈ）は、単量体結合に関して認められたのと同様の結合パターンを明らかにした。しかし、解離速度は計算しなかった。ＢＳＡの小さな部分は二量体として存在する（図３Ａ）。
【００５５】
実施例７
ＢＳＡ−ペンタボディ複合体の形成
ＢＳＡ−ペンタボディ複合体の形成は、ＣＴＢ−ペンタボディを介した抗原の送達のために重要であり、これをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で試験した。３つのペンタボディとＢＳＡをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（商標）でのＳＥＣによって分析し、ＣＴＢのように五量体を形成するそれらの能力を測定した。３つのペンタボディすべてがＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（商標）カラムで約１３ｍｌの容積にて溶出した（図３Ｂ、３つのタンパク質はほとんど同一のグラフを有するので、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２のプロフィールだけを示した）。同じ条件下で試験した分子量マーカーに基づき、３つのタンパク質すべての実際の分子量を約２２０ｋＤａと決定した。この数はそれらのサブユニットの分子量の７〜８倍であるが、３つのタンパク質は、ＣＴＢの結晶構造に基づきまだ五量体とみなされる。
【００５６】
３つのタンパク質全部から単量体は認められなかった。グラフはまた、タンパク質が非常に小さな凝集体を形成することを示した（図３Ｂ）。
【００５７】
単量体ＢＳＡは６７ｋＤａの分子量を有し、ＣＴＢに基づくペンタボディは約１４３ｋＤａの推定分子量を有する。ＢＳＡ（図３Ａ）及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１２（図３Ｂ）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（商標）カラムで試験した場合、１４．０９及び１３．０３ｍｌの主要溶出ピークを有する。Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２とＢＳＡを５：１のモル比で、すなわちＢＳＡ１２とＢＳＡに関しては１：１のモル比で混合した場合、タンパク質複合体が形成された（図３Ｃ、９．８０ｍｌのピーク）が、大きなＢＳＡピークがまだ可視であった。３：１のペンタボディ：ＢＳＡ比では（図３Ｄ）、ＢＳＡのピークはほぼ完全に消失した。これは、１つのＣ３Ｃ−ＢＳＡ１２ペンタボディが約３個のＢＳＡ分子を担持できることを示唆する。ペンタボディ：ＢＳＡ比を２：１（図３Ｅ）及び１：１（図３Ｆ）にさらに低下させると、おそらくＢＳＡによるペンタボディ分子内のＢＳＡ結合部位の競合によって引き起こされた、複合体ピークの９．８からそれぞれ１０．１０及び１０．３２ｍｌへのシフトが生じた。
【００５８】
Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１６（図３Ｇ）及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ８（図３Ｈ）もＢＳＡと複合体を形成する。しかし、１４．０８ｍｌという遊離ＢＳＡピークの高さは、ＢＳＡの大部分が未結合のままであることを示唆する。加えて、タンパク質複合体ピークの位置も、ＢＳＡとＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６／Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８との結合と解離が絶え間なく起こっていることを示唆する。結論として、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２はＢＳＡと強固なタンパク質複合体を形成することができるが、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６は強固なタンパク質複合体を形成することができなかった。
【００５９】
実施例８
抗原特異的粘膜免疫応答の誘導
６〜８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ）から購入した。動物を、ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓの推奨に従ってｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ，Ｏｔｔａｗａにおいて飼育した。実験プロトコールは施設内動物実験委員会によって承認された。
【００６０】
マウスの群（ｎ＝５）を０、１４及び２１日目に経口（０．１ｍｌ）又は鼻腔内（５０μｌ）経路で様々なワクチン製剤によって免疫した。経口免疫については、１８ゲージの給餌針を介した強制栄養法によってワクチンを投与した。ｉ．ｎ．免疫については、注射用食塩水０．２５ｍｌ中０．１ｍｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇ体重のケタミン及びキシラジンのｉ．ｐ．注射によってマウスを麻酔し、Ｐ１００ピペッターを用いてマウス外鼻腔にワクチンを交互に投与した。ＣＴＢ ７．５μｇ、ペンタボディ７．５ｍｇ又はＣＴ １μｇを添加した又は添加していないＢＳＡ １０μｇをｉ．ｎ．免疫において使用した。経口免疫ではペンタボディ７５μｇを添加したＢＳＡ １００μｇを使用した。
【００６１】
３５日目に、免疫学的アッセイのための試料を収集した。血液を尾静脈から又は安楽死させたマウスの心穿刺によって収集し、血清を遠心分離によって分離した。糞便試料のために、３〜４の新鮮排泄されたペレットを氷上に保存した１．５ｍｌマイクロチューブに収集し、１０×（ｗ／ｖ）の抽出緩衝液（ＰＢＳ中の５％ウシ胎仔血清、０．０２％アジ化ナトリウム）中で強くボルテックスした。次にチューブを１６，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集した。Ｐ１００ピペットを使用して、ＰＢＳ ５０ｍｌ（ｐＨ７．２）を覚醒マウスの膣に緩やかに注入し、回収することによって（３〜４回）膣洗浄液試料を収集した。ＣＯ２窒息によってマウスを安楽死させた後、鼻洗浄液及び胆汁試料を収集した。胆汁を採取するため、胆嚢を０．５ｍｌマイクロチューブに入れ、抽出緩衝液０．１ｍｌを添加した。胆嚢を鋏で切断することによって「浸軟（macerated）」させた。チューブを穏やかにボルテックスし、遠心分離して（１０，０００×ｇで５分間）、上清を収集した。鼻洗浄液試料のために、上部気管に小さな切断部を作製し、洗浄チューブを頭部の方に０．５〜１０ｃｍ挿入した。鼻腔をＰＢＳ １ｍｌで洗い流し、鼻の前開口部から洗浄液を収集した。すべての試料をアッセイまで−２０℃で保存した。
【００６２】
ＢＳＡ特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を間接ＥＬＩＳＡ法によって測定した。簡単に述べると、９６穴平底Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ２（登録商標）マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、０．１Ｍ 重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）１００μｌ中の５μｇ ＢＳＡ／ウエルで４℃にて一晩被覆した。被覆したプレートを２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％脱脂乳で室温にて１時間ブロックした。適切に希釈した試料のアリコート（１００μｌ／ウエル）を２組ずつのウエルに添加し、プレートを室温で３時間インキュベートした。特に指示されない限り、ＥＬＩＳＡアッセイのために使用した試料希釈は、糞便及び鼻洗浄液ＩｇＡについては１：２、膣、血清及び胆汁ＩｇＡについては１：２０、そして血清ＩｇＧについては１：２０００であった。プレートを３回洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＡ（１：１０００）又はＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（１：３０００）を添加し（すべてＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡより）、プレートを室温で１時間インキュベートした。ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）の添加によって呈色反応を発現させ、自動ＥＬＩＳＡプレートリーダー（３５４型、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）及びＭｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｃｃｅｎｔ（登録商標）ソフトウエア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１０〜６０分間のインキュベーション期間後に４０５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。
【００６３】
この試験では、ＢＳＡを、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫するためのモデル抗原として使用した。ＣＴ、ＣＴＢ及びＣＴＢ−ペンタボディを、ＢＳＡ特異的免疫応答を誘導するか又は増強するそれらの能力を試験するために免疫の前にＢＳＡに添加した。オボアルブミン（ＯＶＡ）が、様々な免疫プラットフォームを試験する免疫学的検討においてモデル抗原としてしばしば使用されるが、ＯＶＡに対する多少のバックグラウンド免疫応答が存在する。これは、マウスＳＡとのその低い配列同一性（１５％）に起因すると考えられる。その代わりに、本発明者らは、配列同一性分析に基づき、ＢＳＡが誘導する低いバックグラウンド免疫により（マウスＳＡとの７０％の配列同一性）、ＢＳＡをモデル抗原として選択した。
【００６４】
ＢＳＡ単独で免疫した場合、血清、鼻洗浄液、糞便懸濁液、膣又は胆汁液中でＢＳＡ特異的抗体は検出できなかった（図４）。ＢＳＡへのＣＴＢの添加も、無視し得る量の糞便ＩｇＡを除き、検出可能な抗体応答を誘導しなかった。これに対し、アジュバントとしてのＣＴの添加は、すべてのマウスにおいてＢＳＡ特異的血清ＩｇＧ、血清ＩｇＡ、鼻内及び糞便ＩｇＡ並びに一部のマウスでは胆汁及び膣ＩｇＡを生じさせ、少なくともＢＳＡモデル抗原に関して、ＣＴは強力な粘膜アジュバントであるが、ＣＴＢはアジュバント性を有さないことを明らかにした。３つのＢＳＡ結合ＣＴＢ−ペンタボディと混合したＢＳＡによる免疫は多様な結果を与えた。３つのＣＴＢ−ペンタボディのうちの２つ、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ８及びＣ３Ｃ−ＢＳＡ１６は、ＢＳＡ特異的抗体力価にごくわずかな影響しか及ぼさなかった。しかし、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２と混合したＢＳＡによる免疫は、ＣＴをアジュバントとして添加したＢＳＡによって誘導されるものと同等の、血清中のＢＳＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ力価を誘導した。加えて、ＢＳＡに添加したＣ３Ｃ−ＢＳＡ１２は、実際に、ＣＴとＢＳＡよりも強力な鼻及び糞便のＢＳＡ特異的ＩｇＡ、並びに同様の膣及び胆汁のＢＳＡ特異的ＩｇＡ応答を誘導した（図４）。しかし、ＢＳＡに対する胆汁粘膜応答は、Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２群のマウスの１匹だけとＣＴ群からの２匹のマウスだけが応答したので、明瞭ではなかった。これらの結果は、ｓｄＡｂを介してＣＴＢに抗原を連結することが抗原特異的粘膜免疫応答を誘導する実行可能な方策であることを明らかに示した。この実験を１回反復し、同様の結果を認めた。
【００６５】
もう１つの実験では、５匹のマウスをＢＳＡ／Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２複合体で経口的に免疫した。この免疫は、消化器及び膣表面上並びに胆汁中で粘膜ＩｇＡ産生を生じさせた。しかし、存在する場合は、非常に低いＩｇＡ応答が鼻洗浄液中で認められた。従って、経口免疫は必ずしも鼻内ｓＩｇＡを誘導するわけではない。この所見は、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ（１）によって要約された文献におけるコンセンサスとは異なる。
【００６６】
これらの結果はまた、抗原送達におけるペンタボディの能力がｓｄＡｂの親和性に依存することを示す：Ｃ３Ｃ−ＢＳＡ１２は、ＢＳＡ特異的粘膜免疫応答を誘導するようにＢＳＡを送達することができる唯一のペンタボディであり（図４）、同時に３つのペプチドの中でより強力な結合体である。３つのｓｄＡｂの正確な親和性はまだ決定されないままである。
【００６７】
実施例９
さらなる適用
ペンタボディを形成する融合タンパク質の能力を評価した。この技術のもう１つの適用は、対象とする抗原を含有する複雑な植物細胞、細菌、酵母又は哺乳動物細胞抽出物中での抗原−ペンタボディの形成においてである。次に、ペンタボディのＢサブユニットに結合するアフィニティーマトリックスを使用して抗原−ペンタボディ複合体をマトリックスから精製することができる。その結果は、生産マトリックスからの抗原の迅速な捕捉、濃縮及び製剤である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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