(57)【要約】  本発明は、ＨＣＶに感染した細胞及びＨＣＶ感染に罹患している哺乳動物を、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックにより感染細胞をトランスフェクトすることによって治療する方法に関する。ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックはＢａｃｈ１タンパク質及びＨＣＶ遺伝子発現を有意に下方制御し、一方ＨＭＯＸ１遺伝子発現を上方制御する。ｍｉＲＮＡ−１９６は、Ｂａｃｈ１  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと結合してＢａｃｈ１の発現を低下させる。ｍｉＲＮＡ−１９６は、肝細胞でのＨＣＶ複製及びＨＭＯＸ１／Ｂａｃｈ１発現の制御において重要な役割を果たし得る。本発明はまた、Ｂａｃｈ１及びＨＣＶ遺伝子発現を下方制御し、一方ＨＭＯＸ１発現が増加するように治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６を含有する、ＨＣＶを発現する細胞の治療のための製剤を提供する。製剤は、ＨＣＶタンパク質を発現する肝細胞へのｍｉＲＮＡ−１９６ミミックのトランスフェクションを可能にするように適合される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶを発現する感染細胞においてＢａｃｈ１タンパク質の発現レベルを低下させることを含む、ＨＣＶ感染に罹患している哺乳動物を治療する方法。
【請求項２】
ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する細胞において前記Ｂａｃｈ１タンパク質の発現レベルを低下させることが、ｍｉＲＮＡ−１９６がＢａｃｈ１  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと結合してＢａｃｈ１の発現を低下させるようにｍｉＲＮＡ−１９６ミミックで前記細胞をトランスフェクトすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡ−１９６又はｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの増加又は過剰発現をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
インターフェロンβを投与することによってｍｉＲＮＡ−１９６を増加させる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｂａｃｈ１タンパク質の発現レベルが約１０％〜約７５％低下する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
トランスフェクションの２４時間後の前記Ｂａｃｈ１タンパク質の発現レベルが約５０％〜約６０％低下する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
トランスフェクションの４８時間後の前記Ｂａｃｈ１タンパク質の発現レベルが約６０％〜約７０％低下する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ＨＣＶに感染した細胞におけるＨＭＯＸ１遺伝子発現の増加を含む、ＨＣＶ感染に罹患している哺乳動物を治療する方法。
【請求項９】
前記細胞におけるＢａｃｈ１遺伝子発現の減少をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックで前記細胞をトランスフェクトすることによってＢａｃｈ１遺伝子発現を減少させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｍｉＲＮＡ−１９６の増加又は過剰発現をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が肝細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＭＯＸ１の発現が、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックでトランスフェクトしていない細胞におけるＨＭＯＸ１発現のレベルに比べて約２〜約３倍上昇する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＣＶレプリコン細胞及びＨＣＶ感染細胞におけるＨＣＶ  ＲＮＡの発現及びタンパク質発現を、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックで前記細胞をトランスフェクトすることによって低下させることを含む、ＨＣＶ感染に罹患している哺乳動物を治療する方法。
【請求項１５】
ｍｉＲＮＡ−１９６の増加又は過剰発現をさらに含む、請求項１４に記載の方法。  
【請求項１６】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルが１０〜６０％低下する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
トランスフェクションの２４時間後の前記ＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルが約４５〜約５５％低下する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
トランスフェクションの４８時間後の前記ＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルが約３５〜約４５％低下する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する細胞及びＣ型肝炎を有する哺乳動物の治療のための製剤であって、Ｂａｃｈ１及びＨＣＶ  ＮＳ５Ａの発現レベルが減少し、一方ＨＭＯＸ１発現が上昇する治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを含有し、ＨＣＶタンパク質を発現する肝細胞へのｍｉＲＮＡ−１９６ミミックのトランスフェクションを可能にするように適合された製剤。
【請求項２０】
前記ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックがＨＣＶタンパク質を発現する細胞中に放出され得るように前記ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックがリポソームに封入されている、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
前記製剤がカチオン性脂質を含有する、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
前記ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックがＨＣＶタンパク質を発現する細胞中に放出され得るように、カチオン性両親媒物質をさらに含有する、請求項１９に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫによって授与されたＲＯ１−ＤＫ３８８２５の下に米国政府の助成を受けて為された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般にＣ型肝炎感染の治療のための方法及び製剤に関する。より詳細には、本発明はＢａｃｈ１及び／又はＨＣＶを制御することに関する。Ｂａｃｈ１及びＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質をｍｉＲ−１９６によって減少させ、一方でＨＭＯＸ１を増加させることができる。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ ）の小さな（直径５０ｎｍ）、エンベロープを有するプラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスは、それらがすべて肝炎を引き起こすことから類似の名称を有するが、各々は遺伝的にも臨床的にも別個の異なるウイルスである。ＨＣＶは、Ｃ型肝炎として知られる血液由来の（すなわち血液が血液に混入することによって伝播される）感染症を引き起こす。この感染はしばしば無症候性であるが、ひとたび発症すると、慢性感染は肝臓の炎症を引き起こし得る（慢性肝炎）。この状態は、肝臓の瘢痕化（線維症）、そして進行した瘢痕化（肝硬変）へと進行し得る。一部の症例では、肝硬変を有する患者は肝不全又は肝癌を含む肝硬変の他の合併症を発現するに至る。
【０００４】
急性Ｃ型肝炎は、ＨＣＶによる感染後の最初の６か月を指す。感染した人々の約６０％〜７０％は、急性期の間は症状を発現しない。急性期症状を経験する少数の患者では、症状は一般に軽度で非特異的であり、Ｃ型肝炎の特異的診断に至ることはまれである。急性Ｃ型肝炎感染の症状としては、食欲減退、疲労、腹痛、黄疸、掻痒及びインフルエンザ様症状を含む。ＨＣＶは通常、感染後１〜３週間以内に血液中で検出可能であり、ウイルスに対する抗体は一般に３〜１２週間以内に検出可能である。ＨＣＶに感染した人の約１５〜４０％は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の正常化などの肝機能検査（ＬＦＴ）における正常化、並びに血漿ＨＣＶ−ＲＮＡクリアランス（自発的ウイルスクリアランス）によって示されるように、急性期の間に自らの体内からウイルスを除去する。ＨＣＶに感染した患者の残りの６０〜８５％は慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）を発症する。
【０００５】
慢性Ｃ型肝炎は、６か月以上持続するＨＣＶによる感染と定義される。慢性Ｃ型肝炎の自然経過は人によってかなり異なる。ＨＣＶに感染した実質的にすべての人々が、肝生検で炎症の痕跡を有する。しかし、肝臓の瘢痕化（線維症）の進行速度は個人間で大きなばらつきを示す。最近のデータは、未治療の患者において、おおよそ３分の１が２０年未満で肝硬変へと進行することを示唆する。さらに３分の１が３０年以内に肝硬変へと進行する。肝疾患を特異的に示唆する症状は、典型的には肝臓の実質的な瘢痕化が起こるまで存在しない。しかし、Ｃ型肝炎は全身性疾患であり、患者は、症状の不在から、進行した肝疾患の発症に先立つより症候性の疾病までにわたる広いスペクトルの臨床症状発現を経験し得る。慢性Ｃ型肝炎に関連する全身性徴候及び症状としては、疲労、著しい体重減少、インフルエンザ様症状、筋痛、関節痛、軽度間欠熱、掻痒、睡眠障害、腹痛（特に右上四半部）、食欲の変化、悪心、下痢、消化不良、認知変化、うつ病、頭痛、及び気分変動を含む。
【０００６】
ひとたび慢性Ｃ型肝炎が肝硬変へと進行すると、一般に、肝機能低下、又は門脈圧亢進症として知られる状態である、肝循環における血圧上昇のいずれかによって引き起こされる徴候及び症状が出現し得る。肝硬変の考えられる徴候及び症状としては、腹水（腹部における液体の貯留）、挫傷及び出血傾向、骨痛、静脈瘤（特に胃及び食道における静脈拡張）、脂肪便（脂肪便症）、黄疸、及び肝性脳症として知られる認知障害症候群を含む。
【０００７】
慢性Ｃ型肝炎は、他の形態の肝炎よりも、甲状腺機能亢進又は甲状腺機能低下を伴う甲状腺炎（甲状腺の炎症）、晩発性皮膚ポルフィリン症、クリオグロブリン血症（小血管性血管炎の形態）及び糸球体腎炎（腎臓の炎症）、特に膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）などの、ＨＣＶの存在に関連する肝臓外症状によって診断される。Ｃ型肝炎はまた、乾燥症候群、血小板減少症、扁平苔癬、糖尿病及びＢ細胞リンパ増殖異常症にも関連する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Ｃ型肝炎ウイルス感染は世界的な健康上の問題であり、そのためのワクチンは現在のところ使用可能ではない。慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）のための現在の標準的な治療はペグ化インターフェロン（ＩＦＮ）とリバビリンの併用であるが、患者の約５０％しかそのような治療に反応しない。加えて、この治療は高価であり、長期に及び、多くの不快な副作用を伴う。推定では世界中で１億５０００万〜２億人がＣ型肝炎に感染している。
【０００９】
そこで、ＨＣＶを標的する、すべての形態のＣ型肝炎の治療のための抗ウイルス治療及び処置を発見し、開発する必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質を発現するヒト肝細胞癌細胞におけるＢａｃｈ１タンパク質の発現レベルを低下させることによってＨＣＶ感染に罹患している細胞又は哺乳動物を治療する方法を提供することにより、前記の必要性の少なくとも一部に応えるものである。Ｂａｃｈ１タンパク質発現レベルの低下は、ｍｉＲＮＡ−１９６がＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと結合してＢａｃｈ１の発現を減少させるように、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックにより細胞をトランスフェクトすることによって達成され得る。ｍｉＲＮＡは単に、Ｂａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと有効に結合するためのマッチする「シード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）」を含有することしか必要としない。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、Ｂａｃｈ１発現レベルの低下を増大させるように上方制御又は過剰発現される。ｍｉＲＮＡ−１９６のレベルは、ｍｉＲＮＡ経路に侵入して、成熟ｍｉＲＮＡ−１９６として働く、合成ｍｉＲＮＡミミックによって上方制御される。
【００１１】
ＨＣＶ感染に罹患している哺乳動物はまた、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する細胞においてＨＭＯＸ１遺伝子発現を上方制御させることによっても治療できる。様々な実施形態において、ＨＭＯＸ１遺伝子発現の上方制御は、細胞におけるＢａｃｈ１遺伝子発現の下方制御を伴う。同様に、ｍｉＲＮＡ−１９６は、ＨＭＯＸ１を負に制御するＢａｃｈ１と結合することによって間接的にＨＭＯＸ１を上方制御する。各々の制御は、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックで細胞をトランスフェクトすることによって達成され得る。加えて、ＨＣＶに感染した、肝細胞などの細胞は、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを用いて細胞をトランスフェクトすることにより、感染細胞におけるＨＣＶの発現を減少させることによって治療できる。
【００１２】
もう１つの態様では、本発明は、ＨＣＶに感染した細胞をｍｉＲＮＡ−１９６ミミックによりトランスフェクトすることができるように、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを哺乳動物に投与するのに適した医薬製剤を提供する。これらの製剤の投与は、肝細胞においてＢａｃｈ１の発現を翻訳段階で抑制し、ＨＭＯＸ１を増加させ、そしてＨＣＶ複製を制御する。
【００１３】
重要な点として、本発明は、Ｂａｃｈ１遺伝子発現の減少、ＨＭＯＸ１遺伝子発現の増加、及びＨＣＶ遺伝子発現の減少を導く、Ｂａｃｈ１の３’−ＵＴＲにおける機能的ｍｉＲＮＡ−１９６結合部位を明らかにする。ｍｉＲＮＡ−１９６の使用は、ＨＣＶに感染した細胞及びＣ型肝炎（例えば慢性ＨＣＶ感染）を有する哺乳動物を治療するため、並びに、おそらく、酸化ストレス上昇を特徴とする他の疾患のための新しい付加的な治療を提供する。
【００１４】
本発明を概括的に述べたので、ここで付属の図面を参照するが、これらの図面は必ずしも一定の縮尺で描かれたものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、ｍｉＲ−１９６と標的される最初の推定上のＢａｃｈ１の３’−ＵＴＲ部位との間の最初のシード領域マッチの図式を示す。  図１Ｂは、ｍｉＲ−１９６と標的される推定上のＢａｃｈ１の３’−ＵＴＲ部位との間の２番目のシード領域マッチの図式を示す。
【図２】図２Ａは、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックでのトランスフェクションに関連する減少したＢａｃｈ１タンパク質レベルを示す。  図２Ｂは、ｍｉＲＮＡ−１９６阻害剤でのトランスフェクションに関連する増加したＢａｃｈ１タンパク質レベルを示す。  図２Ｃは、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックでのトランスフェクションによって変化しなかったＢａｃｈ１  ｍＲＮＡレベルを示す。
【図３】図３Ａは、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックに関連するＨＭＯＸ１のｍＲＮＡレベルの増加を示す。  図３Ｂは、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックでのトランスフェクションがＣｕｌｌｉｎ−３のｍＲＮＡレベルを変化させなかったことを示す。
【図４】図４Ａは、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックでのトランスフェクションに関連するＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質レベルの減少を示す。  図４Ｂは、ｍｉＲＮＡ−１９６阻害剤でのトランスフェクションに関連するＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質レベルの増加を示す。  図４Ｃは、Ｃｏｎ１（サブタイプ１ｂ）完全長レプリコン細胞における、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックでのトランスフェクションによるＨＣＶ−ＮＳ５Ａ及びコアｍＲＮＡレベルの減少を示す。
【図５】図５Ａは、ｍｉＲＮＡ−１９６についての２つのＢａｃｈ１の３’−ＵＴＲシードマッチ部位を示す。  図５Ｂは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によりｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１、ｐＲＬ−ＴＫ（ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ））及びｍｉＲ−１９６ミミック又は阻害剤で同時トランスフェクトした細胞において使用したホタルルシフェラーゼ（ｆ−ｌｕｃ）レポーター構築物、ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１の図式的表示を示す。  図５Ｃは、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックがｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１レポーターのｆ−ｌｕｃ活性を阻害したことを示す。  図５Ｄは、ｍｉＲＮＡ−１９６阻害剤がｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１レポーターのｆ−ｌｕｃ活性をわずかに上昇させたことを示す。
【図６】図６Ａは、Ｂａｃｈ１の３’−ＵＴＲの２つのシードマッチ部位における４個のヌクレオチドの置換を示す。  図６Ｂは、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックが、変異型ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１又はｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１、ｐＲＬ−ＴＫ（ウミシイタケ）、及びｍｉＲ−１９６ミミックで同時トランスフェクトした細胞においてｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−ＷＴのｆ−ｌｕｃ活性を低下させたが、ｐＧＬ−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔレポーターのｆ−ｌｕｃ活性は低下させなかったことを示す。    図６Ｃは、ｍｉＲ−１５５ミミックが、変異型ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１又はｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１、ｐＲＬ−ＴＫ（ウミシイタケ）、及びｍｉＲ−１５５ミミックで同時トランスフェクトした細胞においてｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−ＷＴとｐＧＬ−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔレポーターの両方のｆ−ｌｕｃ活性を低下させたことを示す。
【図７】図７Ａは、ｍｉＲＮＡ−１９６のシードマッチ部位に導入した４ヌクレオチド変異を示す。  図７Ｂは、ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１、ｐＲＬ−ＴＫ及び漸増濃度のミミック陰性対照、ｍｉＲ−１９６ミミック又は変異型ｍｉＲ−１９６で同時トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性を示す。
【図８】図８Ａは、変異型ｍｉＲＮＡ−１９６と変異型Ｂａｃｈ１の３’−ＵＴＲとの間のシードマッチの回復を示す。  図８Ｂは、変異型レポーター（ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔ）、ｐＲＬ−ＴＫ、及び変異型ｍｉＲＮＡ−１９６又は野生型ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックで４８時間同時トランスフェクトした細胞の測定されたルシフェラーゼ活性を示す。
【図９】図９Ａは、Ｊ６／ＪＦＨ１のＲＮＡでトランスフェクトしたＨｕｈ−７．５細胞における、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックによるＨＣＶ−Ｊ６／ＪＦＨ１のＲＮＡレベルの減少を示す。  図９Ｂは、培養上清中に分泌されたＪ６／ＪＦＨ１−Ｃ型肝炎ウイルスに感染したＨｕｈ−７．５細胞における、を示す。  図９Ｃは、培養上清中に分泌されたＪ６／ＪＦＨ１−Ｃ型肝炎位に感染したＨｕｈ−７．５細胞における、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックによるＨＣＶ−Ｊ６／ＪＦＨ１タンパク質レベルの減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の、すべてではないが一部の実施形態を示す付属の図面を参照して、本発明を以下でより詳細に説明する。実際上、これらの発明は多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書で述べる実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、この開示が、適用される法的必要条件を満たすために提供されるものである。
【００１７】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が、肝細胞において直接酸化ストレスを誘導することは認められている。同様に、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＭＯＸ１）が、抗酸化及び抗炎症活性を有する重要な細胞保護酵素であることも受け入れられている。ＨＭＯＸ１の存在又は使用は、それ自体、ＨＣＶによって誘導される酸化ストレスを無効にする又は軽減するための手段とみなすことができる。しかし、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）型哺乳動物転写リプレッサーであるＢａｃｈ１は、ＨＭＯＸ１を負に制御する。そこで、Ｂａｃｈ１レベルの低下は、単独で又はＨＭＯＸ１レベルの上昇と併せて、潜在的にＣ型肝炎の予防又は改善を導き得る。
【００１８】
Ｂａｃｈ１は、ｃａｐ’ｎ’ｃｏｌｌａｒ型の塩基性領域ロイシンジッパー因子ファミリー（ＣＮＣ−ｂＺｉｐ）に属する転写因子をコードする遺伝子である。コードされるタンパク質は、ＣＮＣ−ｂＺｉｐファミリー成員には異型である、ｂｒｏａｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ｔｒａｍｔｒａｃｋ，ｂｒｉｃ−ａ−ｂｒａｃ／ポックスウイルス及びジンクフィンガー（ＢＴＢ／ＰＯＺ）ドメインを含む。これらのＢＴＢ／ＰＯＺドメインは、タンパク質間相互作用並びにホモ及び／又はヘテロオリゴマーの形成を促す。このコードされるタンパク質がＭａｆＫとヘテロ二量体を形成する場合、それはＭａｆ認識エレメント（ＭＡＲＥ）のリプレッサーとして機能し、転写が抑制される。より明確には、Ｂａｃｈ１は、ＨＭＯＸ１遺伝子発現を負に制御するＨＭＯＸ１の哺乳動物転写リプレッサーである。Ｂａｃｈ１はＭａｆ関連癌遺伝子ファミリーと拮抗性ヘテロ二量体を形成する。これらのヘテロ二量体は、Ｍａｆ認識エレメント（ＭＡＲＥ）に結合し、Ｍａｆ含有ヘテロ二量体及び他の正の転写因子に応答する遺伝子（例えばＨＭＯＸ１及びＮＱＯ１）の発現を抑制する。
【００１９】
ｍｉＲＮＡは、一般に遺伝子発現の重要な制御因子であるとみなされる小さな非コードＲＮＡ（〜２２ヌクレオチド）である。本発明以前は、マイクロＲＮＡがＢａｃｈ１又はＨＣＶを制御するか否か、そしてどのようにして制御するかは概して不明であった。本発明は、初めて、ｍｉＲＮＡ−１９６が、Ｂａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに直接作用し、このタンパク質の発現を翻訳段階で抑制して、ＨＭＯＸ１を増加させることを認識する。加えて、ｍｉＲ−１９６はまた、ＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質発現も阻害する。従って、ｍｉＲＮＡ−１９６は、肝細胞でのＨＣＶの複製及びＨＭＯＸ１／Ｂａｃｈ１発現の制御において重要な、おそらく決定的と言えるほどの役割を果たす。従って、ＨＣＶに感染した細胞又は肝炎に罹患している哺乳動物は、感染細胞をｍｉＲＮＡ−１９６ミミックによりトランスフェクトするためにｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを投与することによって治療できる。好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９６の過剰発現及び感染細胞へのそのトランスフェクションは、Ｃ型肝炎感染を予防する又は改善するためのアプローチを有利に提供することができる。１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ−１９６のレベルは、ｍｉＲＮＡ経路に侵入して、成熟ｍｉＲＮＡ−１９６として作用する合成ｍｉＲＮＡミミックによって増加する。
【００２０】
上記で言及したように、ｍｉＲＮＡは、一般に遺伝子発現の重要な制御因子であるとみなされる小さな非コードＲＮＡ（〜２２ヌクレオチド）である。より詳細には、ｍｉＲＮＡは、主として翻訳抑制を介して遺伝子発現を制御する、約２１〜２３ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されるがタンパク質に翻訳されない遺伝子によってコードされ（非コードＲＮＡ）、その代わりにそれらは、プリｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物からプレｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造にプロセシングされ、そして最終的には機能性ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１又はそれ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に対して部分的に相補的であり、それらの主たる機能は遺伝子発現を減少させることである。ｍｉＲＮＡの機能は遺伝子制御にあると思われる。そのために、ｍｉＲＮＡは、１又はそれ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の一部に相補的である。動物ｍｉＲＮＡは通常、３’ＵＴＲ内の部位に相補的である。次に、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡへのアニーリングはタンパク質翻訳を阻害するが、時としてｍＲＮＡの切断を促進する。そのような場合、ｍｉＲＮＡの結合を介した二本鎖ＲＮＡの形成は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に類似したプロセスを介してｍＲＮＡ転写産物の分解を開始させる。しかし、また別の場合には、ｍｉＲＮＡ複合体は、ｍＲＮＡの分解を生じさせることなくタンパク質翻訳機構をブロックする又はさもなければタンパク質翻訳を妨げると考えられる。現在、標的遺伝子が下方制御される正確な機構は不明のままである。
【００２１】
本出願に関して、マイクロＲＮＡ模倣体（例えばｍｉＲＮＡ−１９６ミミック）は、それらの安定性を高め、活性を改善するためにＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ（登録商標）で化学修飾された二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。マイクロＲＮＡ模倣体（マイクロＲＮＡミミック）は、内因性前駆体ｍｉＲＮＡを模倣してｍｉＲＮＡ経路に侵入し、成熟ｍｉＲＮＡ種として作用する。
【００２２】
ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡヘテロ二本鎖の末端の６〜８塩基対の「シード領域」における配列相補性が、ｍｉＲＮＡ−標的ＲＮＡ相互作用の特異性を決定すると思われる。ｍｉＲ−１９６は、最初に、動物における数多くの発生プログラムのための決定的に重要な関連転写因子遺伝子の群である、ホメオボックス（ＨＯＸ）クラスターに対して広範で進化的に保存された相補性を有し、ＨＯＸ遺伝子発現を制御することが認められた。
【００２３】
発明人は、ｍｉＲＮＡ−１９６が、Ｂａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲを標的することによってＨＣＶゲノム並びにＨＭＯＸ１遺伝子の増加を標的にすることを提案する。従って、ＨＣＶに感染した細胞は、感染細胞をｍｉＲＮＡ−１９６ミミックでトランスフェクトすることによって治療できる。ＨＣＶ感染細胞をトランスフェクトすることにより、Ｂａｃｈ１発現レベルを低下させ、一方でＨＭＯＸ１レベルを上昇させることができる。好都合にも、ＨＭＯＸ１を負に制御するＢａｃｈ１の下方制御は、ＨＭＯＸ１の発現を上昇させるのに役立つ。上述したように、ＨＭＯＸ１は、ＨＣＶによって誘導される酸化ストレスを軽減する抗酸化作用を提供する。加えて、ｍｉＲＮＡ−１９６の増加はＩＦＮ−β治療によって誘導し得る。ｍｉＲＮＡ−１９６のこの誘導は、ヒト肝細胞癌細胞株Ｈｕｈ−７及び一次マウス肝細胞において認めることができる。
【００２４】
ｍｉＲＮＡの数は増大し続け、さらなるｍＲＮＡ及びそれらによって制御される候補遺伝子の同定が続いている。肝臓に関しては、ｍｉＲＮＡ−１２２が、肝細胞において発現される最も豊富なｍｉＲＮＡとして同定され、コレステロール代謝のいくつかの酵素に重要な作用を及ぼすことが示された。ｍｉＲＮＡ−１２２はまた、ＨＣＶ発現のために必要であることも示された。一般に、ｍｉＲＮＡ−１２２の作用はそのコグネイトシード配列結合部位の状況及び位置に依存し、５’領域内の部位は主として発現の増加に関連し、一方３’非翻訳領域内の部位は主として発現の抑制に関連する。本発明の実施形態は、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックをＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質発現の下方制御剤として利用することを含む。このタンパク質は、ＨＣＶの完全且つ正常な発現のために必須である。そこで、本発明の実施形態は、感染細胞又はＣ型肝炎に罹患している哺乳動物を治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６ミミックで治療する方法を含む。治療有効量は公知の管理投与法によって提供され得る。例えば、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを含有する治療薬は、本発明の様々な実施形態に従って局所、経腸的又は非経口的投与経路によって適用され得る。
【００２５】
今や、ＨＣＶ感染が感染肝細胞において、及び、おそらく他の感染細胞においても、酸化ストレスの上昇を生じさせることは一般的に認められている。そのような酸化ストレス上昇の１つの重要なメディエイターはＨＣＶコアタンパク質である。同様に、ＨＭＯＸ１が、過度の酸化ストレスの潜在的損傷作用から数多くの細胞及び組織を保護するのを助けることも広く認められている。上記で言及したように、ＨＭＯＸ１は、ＨＣＶによって誘導される酸化ストレスを無効にし得る又は軽減し得る抗酸化及び抗炎症活性を有する重要な細胞保護酵素である。より詳細には、ＨＭＯＸ１は、ヘム分解を触媒し、インビボで抗酸化及び抗炎症活性を有する第一鉄イオン、一酸化炭素及びビリベルジンを生成する、重要な細胞保護酵素である。ＨＭＯＸ１のこれらの有益な特性は、強力な酸化促進剤として作用し得る、「遊離」又は緩く結合したヘムを低減し、強力な抗酸化及び抗炎症及び抗線維形成作用を有する一酸化炭素、ビリベルジン及びビリルビンの産生を高めるＨＭＯＸ１の能力に基づく。
【００２６】
ＨＭＯＸ１遺伝子の発現の制御は複雑である。しかし、発明者は、ＨＭＯＸ１の制御のための重要な部位として、多くの種にわたってＨＭＯＸ遺伝子の５’非翻訳領域内の一連の拡大ＡＰ−１部位（抗酸化剤応答配列とも呼ばれる）、Ｍａｆタンパク質応答エレメント［ＭＡＲＥ］、及びメタロポルフィリン応答エレメント［ＭＰＲＥ］があることを示した。Ｂａｃｈ１は、ｃａｐ’ｎ’ｃｏｌｌａｒファミリーのジンク、ロイシンジッパータンパク質の成員である。Ｂａｃｈ１はＨＭＯＸ１遺伝子の発現の持続的抑制において鍵となる役割を果たす。小さなＭａｆタンパク質とヘテロ二量体を形成し、遺伝子の転写活性化をブロックすることによってそれを行う。Ｂａｃｈ１はいくつかのコンセンサス結合部位を含み（すべてＣＰモチーフを含有する）、それらは、ヘムと結合した場合、Ｍａｆタンパク質に対する親和性の著明な低下及びその後のＨＭＯＸ１遺伝子発現の活性の低下と上昇を伴う、タンパク質の立体配座の変化を導く。主要な刺激性Ｍａｆタンパク質の１つはＮｒｆ２である。Ｎｒｆ２の増加はＨＭＯＸ１遺伝子の発現上昇に結びつく。
【００２７】
上記を考慮して、ＨＭＯＸ１活性をＨＣＶ感染において上昇させ得る。それにもかかわらず、慢性Ｃ型肝炎の状況におけるＨＭＯＸ１の発現低下が臨床試験で同定されている。そこで、ＨＭＯＸ１遺伝子の発現がより低いレベルとなる遺伝的又は他の因子を有する患者は、ＨＣＶ急性暴露後に慢性Ｃ型肝炎感染を発症する危険度が高い及び／又はＨＣＶ感染により進行性肝疾患をより急速に発症する危険度がより高いと考えられる。
【００２８】
より低いレベルのＨＭＯＸ１遺伝子発現は慢性Ｃ型肝炎感染に相関すると考えられ、Ｂａｃｈ１はＨＭＯＸ１を負に制御する。従って、ＨＣＶに感染した細胞又はＣ型肝炎に罹患している哺乳動物を、感染細胞におけるＢａｃｈ１のレベルを低下させるように治療することは、ＨＣＶの影響を有利に軽減し得る。そこで、本発明の１つの実施形態は、慢性Ｃ型肝炎感染に罹患している哺乳動物を、ｍｉＲＮＡ−１９６がＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと結合してＢａｃｈ１の発現を低下させ、ＨＭＯＸ１を増加させように、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックで細胞をトランスフェクトすることによって治療するための方法を含む。好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９６は、Ｂａｃｈ１に結合し、ＨＭＯＸ１を増加させるためにより多くのｍｉＲＮＡ−１９６を提供するように過剰発現する。
【００２９】
本発明に従った１つの実施形態では、ＨＣＶ感染（例えば慢性Ｃ型肝炎）に罹患している哺乳動物をｍｉＲＮＡ−１９６で治療する。特に、感染細胞を、Ｂａｃｈ１の発現を減少させるｍｉＲＮＡ−１９６ミミックでトランスフェクトする。１つの特定実施形態では、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する感染細胞におけるＢａｃｈ１タンパク質発現レベルを、ｍｉＲＮＡ−１９６がＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと結合してＢａｃｈ１の発現を低下させるように、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックにより細胞をトランスフェクトすることによって低下させ得る。１つの好ましい方法では、Ｂａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと結合するｍｉＲＮＡ−１９６を過剰発現させる。１つの特定実施形態では、インターフェロンβを同時に投与することによってｍｉＲＮＡ−１９６を増加させる。もう１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ−１９６をまた、単独又はインターフェロンβと組み合わせたｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの投与によって増加させる。
【００３０】
感染細胞の個別の治療又はそのような感染細胞を担持する哺乳動物の治療は、治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを投与することでＢａｃｈ１タンパク質の発現レベルの有意の低下を提供し得る。「治療有効量」とは、感染細胞又は肝炎を有する哺乳動物への、１又はそれ以上の標的とする障害を治療する及び／又は予防するために有効なｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの量を意味する。一般的な指針として、ＨＣＶ感染の治療のためのｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの１日治療量は、一般に０．５〜５μｍｏｌ／ｋｇ体重、又は１．０〜４μｍｏｌ／ｋｇ体重、又は２〜３μｍｏｌ／ｋｇ体重となり得る。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの治療量は、０．１〜１μｍｏｌ／ｋｇ体重、又は０．２５〜１μｍｏｌ／ｋｇ体重、又は０．２５〜０．７５μｍｏｌ／ｋｇ体重となり得る。
【００３１】
様々な実施形態において、Ｂａｃｈ１タンパク質の発現レベルを約１０％〜約７５％、又は約２５％〜約６５％低下させることができる。他の実施形態では、トランスフェクションの２４時間後のＢａｃｈ１タンパク質の発現レベルは、約２５％〜約７５％、又は約５０％〜約６０％の低下となる。さらにもう１つの実施形態によれば、トランスフェクションの４８時間後のＢａｃｈ１タンパク質の発現レベルは、約４０％〜約８０％、又は約６０％〜約７０％の低下となる。
【００３２】
上記で論じたように、ＨＭＯＸ１遺伝子発現のレベルを上昇させることは、ＨＣＶによって誘導される酸化ストレスを無効にする又は軽減する上で有益であり得る。ｍｉＲＮＡ−１９６によりトランスフェクトした場合、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する細胞におけるＨＭＯＸ１遺伝子発現を有利に上昇させることができる。従って、本発明の１つの実施形態は、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する細胞においてＨＭＯＸ１遺伝子発現を増加させることにより、ＨＣＶに感染した細胞又はＨＣＶ感染に罹患している哺乳動物を治療する方法を含む。ＨＭＯＸ１遺伝子発現は、感染細胞を治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを用いてトランスフェクトすることによって増加する。１つの実施形態では、ＨＭＯＸ１の増加は、細胞におけるＢａｃｈ１遺伝子発現の減少を伴う。１つの好ましい実施形態では、この方法は、肝細胞を治療するためにｍｉＲＮＡ−１９６を増加又は過剰発現させることを含む。様々な実施形態において、ＨＭＯＸ１の発現は、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックによりトランスフェクトしていない細胞におけるＨＭＯＸ１発現のレベルに比べて約２〜約３倍上昇する。
【００３３】
Ｂａｃｈ１発現を抑制することに加えて、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現するヒト肝細胞におけるＨＣＶ非構造タンパク質５ａ（ＨＣＶ−ＮＳ５Ａ）の発現も抑制される。そこで、本発明の実施形態は、ＨＣＶ感染細胞をｍｉＲＮＡミミックにより治療することを含む。感染細胞を、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａの発現を減少するようにｍｉＲＮＡ−１９６ミミックによってトランスフェクトすることができる。好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９６を過剰発現させる。
【００３４】
本発明のある実施形態には、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックにより細胞をトランスフェクトすることにより、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する細胞におけるＨＣＶ−ＮＳ５Ａの発現を低下させることによってＨＣＶに感染した細胞又はＨＣＶ感染に罹患している哺乳動物を治療することが含まれる。すなわち、ある実施形態では、ＨＣＶ感染に罹患している哺乳動物を、ｍｉＲＮＡミミックを用いて細胞をトランスフェクトすることにより、ＨＣＶレプリコン細胞及びＨＣＶ感染細胞におけるＨＣＶのＲＮＡの発現及び／又はタンパク質発現を低下させることによって治療する。そのようなある１つの実施形態では、ＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルを１０〜６０％、又は２０〜５０％低下させる。別の実施形態では、トランスフェクションの２４時間後のＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルは約４５〜約５５％の低下となり、一方トランスフェクションの４８時間後のＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルは約３５〜約４５％の低下となる。
【００３５】
本出願全体を通して使用される「トランスフェクション」という用語は、ウイルスベクター又は他の導入手段を用いた真核細胞への外来性物質の導入を表す。動物細胞のトランスフェクションは、典型的には物質の取込みを可能にするために細胞形質膜に一過性の細孔又は「穴（ｈｏｌｅｓ）」をあけることを含む。遺伝物質（スーパーコイルプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ構築物など）、さらには抗体などのタンパク質をトランスフェクトし得る。電気穿孔に加えて、トランスフェクションは、カチオン性脂質を物質と混合してリポソームを作製し、それらを細胞形質膜と融合して、それらの積荷を内部に沈着させることによって実施できる。
【００３６】
トランスフェクションの１つの考えられる方法は、リン酸カルシウムを利用し得る。リン酸イオンを含有するＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨｅＢＳ）を、トランスフェクトしようとする物質を含有する塩化カルシウム溶液と組み合わせる。この２つを組み合わせた場合、正に荷電したカルシウムと負に荷電したリン酸の微細な沈殿物が形成され、トランスフェクトする物質をその表面に結合する。次に、沈殿物の懸濁液をトランスフェクトする細胞に添加する。そのプロセスは完全には理解されていないが、細胞は沈殿物の一部を取り込み、それと共にトランスフェクトする物質を取り込む。
【００３７】
他の方法は、高度に分岐した有機化合物（例えばデンドリマー）を使用して、遺伝物質（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）を結合し、それを細胞に入り込ませる。もう１つの方法は、リポソームによりトランスフェクトする方法、すなわちいくつかの点で細胞の構造に類似し、実際に細胞膜と融合することができ、遺伝物質を細胞内に放出する小さな膜結合体中に、トランスフェクトしようとする遺伝物質を封入することである。真核細胞については、細胞がより感受性であるため、脂質−カチオンに基づくトランスフェクションがより典型的に使用される。
【００３８】
もう１つの方法は、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーの使用である。負に荷電した遺伝物質はポリカチオンに結合し、その複合体がエンドサイトーシスを介して細胞によって取り込まれる。
【００３９】
トランスフェクションへの直接のアプローチは遺伝子銃であり、この場合、遺伝物質を不活性固体（一般的に金）のナノ粒子に結合して、次にそれを標的細胞の核に直接「撃ち込む」。遺伝物質はまた、ウイルスを担体として使用して細胞に導入することができる。そのような場合、その技術はウイルス形質導入と呼ばれ、細胞は形質導入されると言い表される。トランスフェクションの他の方法は、ヌクレオフェクション、電気穿孔、熱ショック、マグネトフェクション、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｈｉｌｙｍａｘ、Ｆｕｇｅｎｅ、ｊｅｔＰＥＩ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ又はＤｒｅａｍＦｅｃｔなどの専売トランスフェクション試薬を含む。
【００４０】
参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９４２，６３４号は、生物学的に活性な（治療）分子の細胞内への輸送を促進するカチオン性両親媒物質の使用を述べる。米国特許第５，９４２，６３４号はまた、１又はそれ以上のカチオン性両親媒物質の分散を治療分子と接触させることによって治療分子を組み込んだ治療組成物を作製する方法を教示する。細胞に送達できる治療分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びポリペプチドを含む。そのような組成物は、遺伝子治療、及びアンチセンスポリヌクレオチド又は生物活性ポリペプチドの細胞への送達を提供するために使用できる。
【００４１】
さらにもう１つの態様では、本発明は、Ｃ型肝炎、好ましくは慢性Ｃ型肝炎を有する細胞又は哺乳動物の治療のための医薬製剤を提供する。本発明による製剤は、Ｂａｃｈ１及び／又はＨＣＶ−ＮＳ５Ａが減少し、一方ＨＭＯＸ１発現が上昇するように、治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを含有すべきである。本発明に従った実施形態は、ＨＣＶを発現する肝細胞へのｍｉＲＮＡ−１９６ミミックのトランスフェクションを可能にするように適合される。本発明の製剤は、遺伝物質を標的細胞にトランスフェクトするための上記手段のいずれかを含み得る又は利用し得るが、それらに限定されない。
【００４２】
様々な実施形態によれば、本発明の製剤は経腸投与用の形態で提供され得る。例えば、本発明の実施形態による製剤は、経口投与用の錠剤、カプセル又は液体製剤の形態で提供され得る。最も好ましくは、しかし、製剤は静脈内注射用の液体製剤として提供される。
【００４３】
他の実施形態では、製剤は注射又は注入用の形態で提供され得る。例えば、本発明による様々な製剤は、静脈内（静脈内へ）、動脈内（動脈内へ）、筋肉内（筋肉内へ）、皮下（皮膚の下に）、皮内（皮膚自体の内部へ）、髄腔内（脊柱管内へ）、又は腹腔内（腹膜内への注入又は注射）に投与することができる。
【００４４】
本発明の実施形態による製剤により、感染細胞の個別の治療又はそのような感染細胞を保有する哺乳動物の治療は、治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを投与することでＢａｃｈ１及びＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルの有意の低下並びにＨＭＯＸ１レベルの上昇を提供し得る。「治療有効量」とは、感染細胞又は肝炎を有する哺乳動物への、１又はそれ以上の標的とする障害を治療する及び／又は予防するために有効なｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの量を意味する。一般的な指針として、ＨＣＶ感染の治療のためのｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの１日治療量は、一般に０．５〜５μｍｏｌ／ｋｇ体重、又は１．０〜４μｍｏｌ／ｋｇ体重、又は２〜３μｍｏｌ／ｋｇ体重となり得る。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの治療量は、０．１〜１μｍｏｌ／ｋｇ体重、又は０．２５〜１μｍｏｌ／ｋｇ体重、又は０．２５〜０．７５μｍｏｌ／ｋｇ体重となり得る。
【実施例】
【００４５】
Ｉ．材料及び実験
Ａ．試薬及び抗体
ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬はＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）より入手した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）より入手した。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステムはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より入手した。ＴＲＩｚｏｌはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し、ジェネティシン（Ｇ−４１８）はＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された。４〜１５％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＩｍｍｕｎＢｌｏｔ−ＰＶＤＦ膜はＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。マウス抗ＨＣＶ−ＮＳ５Ａ及びマウス抗ＨＣＶ−ＮＳ３モノクローナル抗体はＶｉｒｏｇｅｎ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）から購入した。ヤギ抗ヒトＢａｃｈ１及びＧＡＰＤＨポリクローナル抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。ＥＣＬ−ＰｌｕｓはＡｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。
【００４６】
Ｂ．細胞培養
９−１３細胞はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された。ヒト肝細胞癌Ｈｕｈ−７細胞集団である９−１３細胞株は、複製するＨＣＶ非構造領域を保持し、ＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂを安定に発現する。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び５００μｇ／ｍＬのＧ−４１８を添加したＤＭＥＭ中に維持した。Ｃｏｎ  １（サブタイプ１ｂ）完全長レプリコンＨｕｈ−７．５細胞（Ｃｏｎ１細胞）はＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）からであった。Ｃｏｎ１細胞株は、ポリペプチドのアミノ酸２２０４に高度適応性セリンのイソロイシンへの置換を有する完全長ＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンを含むＨｕｈ−７．５細胞集団である。Ｃｏｎ１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び選択抗生物質である７５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したＤＭＦＭ中に維持した。細胞を３７℃で９５％室内気及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気中に維持した。
【００４７】
Ｃ．マイクロＲＮＡ及び構築物
ｈａｓ−ｍｉＲＮＡ−１９６、ｈａｓ−ｍｉＲＮＡ−１６、特注作製された変異型ｈａｓ−ｍｉＲＮＡ−１９６及びｍｉＲＮＡミミック陰性対照（ＭＭＮＣ）のためのｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡミミックをＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）より入手した。マイクロＲＮＡミミックは、それらの安定性を高め、活性を改善するためにＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ（登録商標）で化学修飾された二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。マイクロＲＮＡミミックは、内因性前駆体ｍｉＲＮＡを模倣してｍｉＲＮＡ経路に侵入し、成熟ｍｉＲＮＡ種として作用する。加えて、以下のｍｉＲＮＡ阻害剤、ｈａｓ−ｍｉＲ−１９６及びｍｉＲＮＡ阻害剤陰性対照（ＭＩＮＣ）もＤｈａｒｍａｃｏｎより入手した。ｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡヘアピン阻害剤は、天然ｍｉＲＮＡ活性を抑制するように設計された最も新しい世代の合成オリゴヌクレオチド阻害剤である。ｐＲＬ−ＴＫベクターはＰｒｏｍｅｇａより入手した。ｐＲＬ−ＴＫレポーターベクターは、内部対照レポーターとしてウミシイタケルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡ（Ｒｌｕｃ）を含む。Ｂａｃｈ１の３’−ＵＴＲの１８３７ｂｐフラグメントを含むｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１ルシフェラーゼレポーター構築物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬによって提供された。変異型ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１はＧＥＮＥＷＩＺ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によって作製された。構築物を制限酵素消化及び配列決定によって確認した。
【００４８】
Ｄ．トランスフェクション及びルシフェラーゼ活性アッセイ
トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコールに従って使用して実施した。簡単に述べると、９−１３細胞を、ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１又は変異型ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ、ｐＲＬ−ＴＫ及び被検ｍｉＲＮＡで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採集し、溶解した。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを使用してルシフェラーゼレポーター活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して基準化し、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して全タンパク質を定量した。比較を容易にするため、ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１及びｐＲＬ−ＴＫトランスフェクションを受けた細胞についての値を１に設定した。
【００４９】
Ｅ．インビトロ転写、トランスフェクション及び感染
感染性Ｊ６（遺伝子型２ａ）からのコア−ＮＳ２領域及び感染性ＪＦＨ１（遺伝子型２ａ）からのＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域を有する完全長キメラゲノム、ＨＣＶ感染性クローンｐＪ６／ＪＦＨ１は、Ｃ．Ｍ．Ｒｉｃｅ（ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の好意により提供された。Ｊ６／ＪＦＨ１に基づく細胞培養産生ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）の作製は以前に報告されている。簡単に述べると、ｐＪ６／ＪＦＨ１プラスミドをＸｂａＩで線状化し、エタノール沈殿、プロテイナーゼＫでの消化及びフェノール−クロロホルム抽出によって精製した。線状化したプラスミドを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ−Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いたインビトロ転写のための鋳型として使用した。ＨＣＶのＲＮＡトランスフェクションのために、トランスフェクションの１日前にＨｕｈ−７．５細胞を２４穴プレートに播種し、７０〜８０％の集密度でトランスフェクトした。２μｇ／穴のＨＣＶのＲＮＡ及び４μＬ／穴のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用することにより、１：２のＲＮＡ／リポフェクタミン比で細胞を４８時間トランスフェクトした。ナイーブＨｕｈ−７．５細胞を感染するために、ＨＣＶのＲＮＡで４８時間トランスフェクトした細胞からの細胞培養上清を収集し、０．２０μｍフィルターでろ過して、ナイーブＨｕｈ−７．５細胞の培養物に添加した。
【００５０】
Ｆ．ウエスタンブロット
ウエスタンブロットを先に述べたように実施した。簡単に述べると、全タンパク質（３０〜５０μｇ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。ＩｍｍｕｎＢｌｏｔ−ＰＶＤＦ膜への電気泳動転写後、５％脱脂粉乳及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で膜を１時間ブロックし、その後４℃で一次抗体と共に一晩インキュベートした。一次抗体の希釈は以下の通りであった：抗Ｂａｃｈ１抗体については１：１０００、並びに抗ＨＣＶ−ＮＳ５Ａ及び抗ＧＡＰＤＨ抗体については１：２０００。次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（１：１０，０００希釈）と共に膜を１時間インキュベートした。最後に、製造者のプロトコールに従ってＥＣＬ−Ｐｌｕｓ化学発光システムで結合抗体を視覚化した。Ｋｏｄａｋ  １ＤＶ３．６コンピュータイメージングシステム（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用して、ウエスタンブロット法の後に得られた各々の特異的バンドの相対光学密度を測定した。
【００５１】
Ｇ．定量的ＲＴ−ＰＣＲ
被検細胞からの全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを先に述べたように合成した。使用したプライマーは以下の通りであった：Ｂａｃｈ１特異的センスプライマー５’−ＧＧＡＣＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＴＧＣＡＧ−３’（２２ｂｐ）、アンチセンスプライマー５’−ＴＧＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＣＡＣ−３’（２２ｂｐ）；ＨＭＯＸ１特異的センスプライマー５’−ＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧ−３’（１８ｂｐ）、アンチセンスプライマー５’−ＡＧＴＧＴＡＡＧＧＡＣＣＣＡＴＣＧＧＡＧＡＡ−３’（２２ｂｐ）；Ｃｕｌ３特異的センスプライマー５’−ＧＴＧＣＴＣＡＣＧＡＣＡＧＧＡＴＡ−３’（１７ｂｐ）、アンチセンスプライマー５’−ＧＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＴＡＧＡＡＣＣＴＴＣ−３’（２１ｂｐ）；ＧＡＰＤＨ特異的センスプライマー５’−ＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＣ−３’（１９ｂｐ）、アンチセンスプライマー５’−ＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧ−３’（１９ｂｐ）。ＣＦＸ９６ＴＭリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びｉＱ（商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒｍｉｘリアルタイムＰＣＲキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。鋳型及び逆転写酵素を含まない試料を陰性対照として含め、これは、予想されたように、無視し得るシグナル（Ｃｔ値＞３５）を生成した。倍数変化値を、同じ試料中のＧＡＰＤＨの量に対して基準化した後、比較Ｃｔ分析によって計算した。初期実験は、細胞のいくつかの処置及び操作はＧＡＰＤＨ遺伝子の発現に影響を及ぼさないことを示した。
【００５２】
Ｈ．統計解析
初期解析は、結果が正常に分布することを示した。そのため、パラメトリック統計法を使用した。試料間の差を分析するためにスチューデントｔ検定（２つの条件の比較の場合）又は分散分析（３以上の間での比較の場合）を使用した。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とみなした。実験を少なくとも３回反復して類似の結果を得た。すべての実験は各処置群について少なくとも三通りの試料を含んだ。１つの実験からの代表的結果を提示する。ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｒｙ，ＮＣ）からのＪＭＰ４．０．４ソフトウエアで統計解析を実施した。
【００５３】
ＩＩ．結果
Ａ．コンピュータによる解析はｍｉＲ−１９６とＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲの２つのシード領域マッチを予測する
潜在的ｍｉＲＮＡ標的を同定するためにバイオインフォマティクスアプローチを利用した。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ４．０データベースのオンライン検索は、少なくとも２つの推定上のｍｉＲＮＡ−１９６シードマッチ部位がＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ内に保持されることを明らかにした。図１Ａ及びＢに示すように、予測結合部位（２２８０〜２２８６ヌクレオチド）の一方はヒト、マウス、ラット、ニワトリ及びイヌにおいて高度に保存され、他方の推定上の部位（２１６１〜２１６６ヌクレオチド）はいずれの種においてもほとんど保存されていなかった。Ｎｒｆ２及びＨＭＯＸ１遺伝子では予測されたｍｉＲＮＡ−１９６結合部位は認められず、またＢａｃｈ１遺伝子のコード領域において推定上のｍｉＲＮＡ−１９６結合部位は認められなかった（データは示していない）。
【００５４】
Ｂ．ｍｉＲＮＡ−１９６は、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する９−１３細胞において転写リプレッサーＢａｃｈ１を減少させ、ＨＭＯＸ１を増加させる
推定上のｍｉＲ−１９６結合部位が機能性であることを実験的に立証するため、９−１３細胞をｍｉＲＮＡ−１９６特異的ミミック又は阻害剤によりトランスフェクトした。Ｂａｃｈ１タンパク質及びｍＲＮＡレベルを、それぞれウエスタンブロット法及びｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックによりトランスフェクトした９−１３細胞は、ｍｉＲＮＡミミック陰性対照（ＭＭＮＣ）と比較してトランスフェクションの２４時間後に約５５％及びトランスフェクションの４８時間後に約６４％のＢａｃｈ１タンパク質発現レベルの有意の低下を示した。モックトランスフェクションと比較して、ｍｉＲＮＡミミック陰性対照でトランスフェクトした細胞においてＢａｃｈ１タンパク質レベルへの影響は検出できなかった（図２Ａ）。ｍｉＲＮＡ−１９６特異的阻害剤によるｍｉＲＮＡ−１９６の減少は、ｍｉＲＮＡ阻害剤陰性対照と異なりＢａｃｈ１タンパク質レベルを有意に上昇させた（図２Ｂ）。しかし、９−１３細胞においてはＢａｃｈ１のｍＲＮＡレベルへのｍｉＲＮＡ−１９６の有意の作用は認められなかった。Ｂａｃｈ１のｍＲＮＡのレベルはｍｉＲＮＡ−１９６ミミックトランスフェクションで変化しなかった（図２Ｃ）。これらの結果は、ヒト肝細胞癌９−１３細胞ではＢａｃｈ１へのｍｉＲＮＡ−１９６の制御が翻訳レベルで起こり得ることを明らかにした。
【００５５】
Ｂａｃｈ１はＨＭＯＸ１遺伝子の広く確立された転写リプレッサーであるので、本発明は次に、ｍｉＲＮＡ−１９６によるＢａｃｈ１タンパク質の減少がＨＭＯＸ１遺伝子発現を上昇させ得るか否かを測定した。そこで、９−１３細胞をｍｉＲＮＡ−１９６ミミック又はｍｉＲＮＡミミック陰性対照で４８時間トランスフェクトした。４８時間後、ＨＭＯＸ１及びＣｕｌｌｉｎ３（Ｃｕｌ３、非特異的遺伝子対照）のｍＲＮＡのレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックは、図３Ａに示すように同じ量のｍｉＲＮＡミミック陰性対照と比較してＨＭＯＸ１  ｍＲＮＡレベルを２．４倍に有意に増加させた。図３Ｂに示すようにＣｕｌ３のｍＲＮＡレベルは増加しなかった。
【００５６】
Ｃ．ｍｉＲＮＡ−１９６は、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する９−１３細胞においてＨＣＶ非構造ＮＳ５Ａタンパク質発現を抑制する
本発明が成されるまでは、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現するヒト肝細胞癌細胞において、ｍｉＲＮＡ−１９６がＨＣＶ非構造ＮＳ５Ａタンパク質レベルを変化させるかどうかは不明であった。ｍｉＲＮＡ−１９６が、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現するヒト肝細胞癌細胞においてＨＣＶ非構造ＮＳ５Ａタンパク質レベルを変化させるか否かを測定するため、９−１３細胞をｍｉＲＮＡ−１９６ミミック又は阻害剤のいずれかによりトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間及び４８時間後に、ＮＳ５Ａ及びＧＡＰＤＨタンパク質レベルを分析するためにウエスタンブロットを実施した。５０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９６ミミックは、図４Ａに示すように同じ量のｍｉＲＮＡミミック陰性対照と比較して、トランスフェクションの２４時間後に約５２％、及び４８時間後に約３７％のＮＳ５Ａタンパク質発現レベルの有意の低下を生じさせた。これに対し、ｍｉＲＮＡ−１９６特異的阻害剤によるｍｉＲＮＡ−１９６の減少は、図４Ｂに示すようにＮＳ５Ａタンパク質レベルを２．２倍に有意に上昇させた。ｍｉＲＮＡ−１９６がＨＣＶ複製を阻害し得るか否かを評価するため、Ｃｏｎ１完全長ＨＣＶレプリコンＨｕｈ−７．５細胞を陰性対照又はｍｉＲＮＡ−１９６ミミックにより４８時間トランスフェクトした。図４Ｃに示すように、ｍｉＲＮＡ−１９６は、ｍｉＲＮＡミミック陰性対照（ＭＭＮＣ）と比較して、ウイルスＲＮＡレベルの有意の低下を生じさせた。
【００５７】
Ｄ．ｍｉＲ−１９６はＨＣＶ−ＪＦＨ１に基づく細胞培養系におけるＨＣＶ発現を阻害する
Ｈｕｈ−７．５細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によって２μｇ／穴のＨＣＶ−Ｊ６／ＪＦＨ１  ＲＮＡでトランスフェクトした。４８時間後、細胞をｍｉＲＮＡ−１９６ミミック又はｍｉＲＮＡミミック陰性対照（ＭＭＮＣ）でトランスフェクトした。ＨＣＶ感染のために、先に述べたように、ナイーブＨｕｈ−７．５をＪ６／ＪＦＨ１トランスフェクト細胞から採集した細胞培養上清１ｍＬと共に培養した。上清への暴露の４８時間後、細胞をｍｉＲＮＡ−１９６ミミック又はｍｉＲＮＡミミック陰性対照（ＭＭＮＣ）で４８時間トランスフェクトした。細胞を採集し、全ＲＮＡ及びタンパク質を抽出した。ＨＣＶのＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲによって定量し、ＨＣＶ−ＮＳ３及びＧＡＰＤＨタンパク質レベルをウエスタンブロット法によって測定した。
【００５８】
ｍｉＲＮＡ−１９６に対する完全なマッチが、ＨＣＶ−ＪＦＨ１ゲノム内のＨＣＶ−ＮＳ５Ａ遺伝子のコード領域において認められた。ＨＣＶ−Ｊ６／ＪＦＨ１細胞培養系におけるＨＣＶ発現へのｍｉＲＮＡ−１９６の減少作用が認められた。５０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９６は、Ｊ６／ＪＦＨ１でトランスフェクトしたＨｕｈ−７．５細胞ではほぼ７０％（図９Ａに示すように）、Ｊ６／ＪＦＨ１感染Ｈｕｈ−７．５細胞では〜５０％（図９Ｂに示すように）のＨＣＶ−Ｊ６／ＪＦＨ１のＲＮＡの有意の低下、及びＪ６／ＪＦＨ１感染Ｈｕｈ−７．５細胞ではＨＣＶ−ＮＳ３タンパク質の〜６０％の低下（図９Ｃに示すように）を導いた。これらの結果は、ＪＦＨ１細胞培養系での以前の所見と一致した。
【００５９】
Ｅ．ｍｉＲＮＡ−１９６は、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する９−１３細胞においてＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲと直接相互作用する
ｍｉＲＮＡ−１９６が、図５Ａに示すようにｍｉＲ−１９６についての２つの予測シードマッチ部位を含むＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲを標的することをさらに確認するため、より直接的でなく、特異的でない制御を及ぼすのではなく、ホタルルシフェラーゼ（ｆ−ｌｕｃ）オープンリーディングフレームの下流にＢａｃｈ１の３’−ＵＴＲを有する、ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１と称されるレポーター構築物（図５Ｂ）を使用した。９−１３細胞をｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１（ｆ−ｌｕｃ）、ｐＲＬ−ＴＫ（ウミシイタケ、トランスフェクション効率に関して基準化するため）、及びｍｉＲＮＡ陰性対照、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミック若しくは阻害剤又はｍｉＲＮＡ−１９６（Ｂａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ内に予測結合部位を有さない「陰性」ｍｉＲ）を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ルシフェラーゼレポーター活性を検定した。ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックトランスフェクションはレポーター活性を約５３％有意に低下させ、一方ｍｉＲＮＡミミック陰性対照及びｍｉＲＮＡ−１９６ミミックはレポータールシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった。加えて、ｍｉＲＮＡ−１９６阻害剤でトランスフェクトした細胞ではレポーター活性の有意の変化を認めなかった。図５Ｃに示すように、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックはｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１レポーターのｆ−ｌｕｃ活性を阻害し、一方ｍｉＲＮＡ−１９６阻害剤はｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１レポーターのｆ−ｌｕｃ活性をわずかに上昇させた。
【００６０】
次に、９−１３細胞を、ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔと称される４ヌクレオチド変異型Ｂａｃｈ１  ３’−ＵＴＲを含むＬｕｃレポーター構築物（図６Ａ）、及びｐＲＬ−ＴＫ、及びｍｉＲＮＡ−１９６ミミック又はｍｉＲＮＡ−１５５ミミック（ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−ＷＴ及びｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔ内に予測ｍｉＲ−１５５結合部位の変化を有さない「陰性」ｍｉＲ）で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＰｒｏｍｅｇａからのＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してルシフェラーゼレポーター活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性及び全タンパク質に対して基準化した。図６Ｂに示すように、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックはｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−ＷＴのｆ−ｌｕｃ活性を低下させたが、ｐＧＬ−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔレポーターのｆ−ｌｕｃ活性は低下させなかった。ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックトランスフェクションはルシフェラーゼ活性を用量依存的に有意に低下させたが、ｍｉＲＮＡ−１９６は、ｍｉＲＮＡ−１９６に対する変異型結合部位を含むレポーター構築物でトランスフェクトした細胞においてレポーター活性を変化させなかった。ｍｉＲＮＡ−１５５は、図６Ｃに示すようにｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−ＷＴ及びｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔの両方でレポーター活性を有意に低下させた。これらの結果は、ｍｉＲＮＡ−１９６がＢａｃｈ１遺伝子発現を直接制御し、ｍｉＲＮＡ−１９６がＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲを介してＢａｃｈ１の減少を媒介することを明らかにする。
【００６１】
ｍｉＲＮＡ−１９６とＢａｃｈ１−３’−ＵＴＲとの間の直接相互作用をさらに調べるため、４ヌクレオチド変異体を導入して、Ｂａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲについてのシードマッチ部位が消失した、図７Ａに示す変異型ｍｉＲＮＡ−１９６を作製した。細胞を、ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−ＷＴ、及びｐＲＬ−ＴＫ、及び漸増濃度のｍｉＲＮＡミミック陰性対照、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミック又は変異型ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックで同時トランスフェクトし、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。図７Ｂに示すように、ｍｉＲＮＡ−１９６は、我々の先の所見と一致して、用量依存的にルシフェラーゼ活性の有意の低下を生じさせたが、ｍｉＲＮＡ陰性対照及び変異型ｍｉＲ−１９６はルシフェラーゼレポーター活性に影響を及ぼさず、ｍｉＲ−１９６とＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲとの間の直接相互作用をさらに示唆した。
【００６２】
変異型ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１（ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔ）と相補的な塩基を含む変異型ｍｉＲＮＡ−１９６（ｍｉＲ−１９６−Ｍｕｔ）は、図８Ａに示すようにやはりそれらのシード領域において完全にマッチするので、変異型レポーター（Ｂａｃｈ１−３’−ＵＴＲ−Ｍｕｔ）活性へのその作用を回復するはずである。変異型ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックは、変異型ｍｉＲＮＡ−１９６に「適合する」ように変異した、変異型ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１によりトランスフェクトした細胞においてルシフェラーゼ活性を有意に阻害した。他方で、変異型レポーター（ｐＧＬ３−Ｂａｃｈ１−Ｍｕｔ）ルシフェラーゼ活性へのｍｉＲＮＡ−１９６野生型の有意の作用は認められなかった。従って、図８Ｂに示すようにｍｉＲＮＡ−１９６とＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲとの間の直接相互作用をさらに証明する。
【００６３】
上述した実験研究は、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックのトランスフェクションがＢａｃｈ１及びＨＣＶ非構造ＮＳ５Ａタンパク質レベルを有意に減少させ、ＨＭＯＸ１遺伝子発現を増加させたことを示す。それ自体で、ｍｉＲＮＡ−１９６は、肝細胞でのＨＣＶ複製及びＨＭＯＸ１／Ｂａｃｈ１発現の制御において重要な、おそらく決定的と言えるほどの役割を果たし得る。従って、ｍｉＲ−１９６の増加は、慢性Ｃ型肝炎及びおそらく他の肝障害の治療のための付加的な新しい治療アプローチを提供することができる。
【００６４】
本明細書で述べた本発明の多くの修正及び他の実施形態が、前記の説明及び付属の図面において提示される教示の恩恵を受ける、これらの発明が関連する分野の当業者に想起される。そのため、本発明は開示される特定実施形態に限定されるべきではないこと及び他の実施形態は付属の特許請求の範囲に包含されるものであることが了解されるべきである。特定の用語が本明細書で使用されるが、それらは単に一般的な説明的意味で使用され、限定を目的としない。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ−５Ｄ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年6月10日(2011.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶタンパク質を発現する細胞及びＣ型肝炎を有する哺乳動物の治療のための製剤であって、前記製剤は、ｍｉＲＮＡ−１９６を過剰発現又は上方制御し、かつ、Ｂａｃｈ１の発現を減少させるための治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを含有し、ＨＣＶタンパク質を発現する肝細胞へのｍｉＲＮＡ−１９６ミミックのトランスフェクションを可能にするように適合された製剤。
【請求項２】
ｍｉＲＮＡ−１９６の上方制御を補助するためにインターフェロンをさらに含有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックがＨＣＶタンパク質を発現する細胞中に放出され得るように前記ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックがリポソームに封入されている、請求項１〜２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４】
カチオン性脂質を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックがＨＣＶタンパク質を発現する細胞中に放出され得るように、前記製剤が、カチオン性両親媒物質、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リン酸カルシウム又はそれらの組合せをさらに含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
経口投与に好適な形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
錠剤、カプセル又は経口液体製剤の形態である、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
哺乳動物への注射又は注入に好適な形態である、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
Ｂａｃｈ１タンパク質発現レベルを約１０％〜約７５％低下させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
トランスフェクションの２４時間後にＢａｃｈ１タンパク質発現レベルを約５０％〜約６０％低下させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
トランスフェクションの４８時間後にＢａｃｈ１タンパク質発現レベルを約６０％〜約７０％低下させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
ＨＣＶに感染した細胞においてＨＭＯＸ１遺伝子発現を間接的に増加させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
ＨＭＯＸ１遺伝子発現が、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックによりトランスフェクトされていない細胞におけるＨＭＯＸ１発現のレベルに比べて約２〜約３倍上昇する、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックの前記治療有効量が０．５〜５μｍｏｌ／体重ｋｇである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
ＨＣＶタンパク質を発現する細胞及びＣ型肝炎を有する哺乳動物の治療のための製剤であって、Ｂａｃｈ１及びＨＣＶ−ＮＳ５Ａの発現レベルを下方制御する一方でＨＭＯＸ１発現を増加させるための治療有効量のｍｉＲＮＡ−１９６ミミックを含有し、ＨＣＶタンパク質を発現する肝細胞へのｍｉＲＮＡ−１９６ミミックのトランスフェクションを可能にするように適合された製剤。
【請求項１６】
前記ＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルが１０〜６０％低下する、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
トランスフェクションの２４時間後の前記ＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルが約４５〜約５５％低下する、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１８】
トランスフェクションの４８時間後の前記ＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質の発現レベルが約３５〜約４５％低下する、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１９】
ＨＣＶ遺伝子型２ａのｐＪ６／ＪＦＨ１株に感染した細胞を治療する方法であって、前記感染細胞におけるＢａｃｈ１の発現を減少させるためにｍｉＲＮＡ−１９６をＢａｃｈ１のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに結合させるように、ｍｉＲＮＡ−１９６ミミックにより前記細胞をトランスフェクトするステップを含む方法。
【請求項２０】
前記細胞におけるＨＭＯＸ１遺伝子発現の上方制御をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＨＣＶ感染の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製剤の使用。
【国際調査報告】
2012505233.tif 000015
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2012505233.tif 000017
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