(57)【要約】  本発明は、特に物質の感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果を調査するために、透過性中間膜を介して相互に連絡することができる第１及び第２の区画を含み、それにより第１の区画が表皮モデルを有し、第２の区画が免役細胞に基づく細胞培養物を有する細胞培養システムに言及する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の物質の感作、アレルゲン性又は刺激性効果を決定する細胞培養システムであって、
ａ）表皮モデルを含む第１の区画と、
ｂ）免疫細胞に基づく細胞培養物を含む第２の区画と、
を含み、
前記第１及び第２の区画が透過性中間膜によって分離され、前記第１の区画に導入されたアレルゲン性又は刺激性薬剤が前記第２の区画の前記免疫細胞を活性化する
細胞培養システム。
【請求項２】
前記免疫細胞が、抗原提示細胞である、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項３】
前記抗原提示細胞が、マクロファージ又は樹状細胞である、請求項２に記載の細胞培養システム。
【請求項４】
前記免疫細胞が、リンパ球である、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項５】
前記リンパ球が、Ｂリンパ球又はＴリンパ球である、請求項４に記載の細胞培養システム。
【請求項６】
前記免疫細胞が、整合する組織適合性抗原を示す、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項７】
前記細胞培養物が、実質的に組織細胞を含まない、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項８】
前記免疫細胞が、ヒトに由来する、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項９】
前記免疫細胞が、血液から分離される、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項１０】
前記表皮モデルが、層状構造を有する、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項１１】
前記表皮モデルが、多層性である、請求項１０に記載の細胞培養システム。
【請求項１２】
前記表皮モデルが、角質層、淡明層、顆粒層、有棘層及び基底層から成るグループから選択される少なくとも１つの表皮層を含む、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項１３】
前記表皮モデルが、生きている表皮細胞を含む、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項１４】
前記生きている表皮モデルが、ケラチノサイトである、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項１５】
前記表皮モデルが、実質的に免疫細胞を含まない、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項１６】
前記表皮モデルが、動物表皮モデルである、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項１７】
前記動物表皮モデルが、ヒト表皮モデルである、請求項１６に記載の細胞培養システム。
【請求項１８】
前記１つ又は複数の物質が、少なくとも１つの化粧用薬剤を含む、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項１９】
前記１つ又は複数の物質が、少なくとも１つの薬理活性薬剤を含む、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項２０】
前記第２の区画が、水性媒体で満たされる、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項２１】
１つ又は複数の物質の感作、アレルゲン性又は刺激性効果を調べるための、請求項１に記載の細胞培養システムを使用する方法であって、
前記第１の区画を前記物質と接触させること、及び
前記第２の区画内のアレルゲン反応を検出すること、
を含む、使用方法。
【請求項２２】
薬剤の感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果を調べる方法であって、
ａ）第１の区画に含まれる表皮モデルの表面を前記薬剤と接触させること、及び
ｂ）第２の区画に含まれる免疫細胞の細胞培養物の活性を決定すること、
を含み、
前記第１及び第２の区画が透過性中間膜によって分離され、
前記第２の区画に活性化した免疫細胞が存在することが、前記薬剤がアレルゲン性又は刺激性薬剤であることを示す方法。
【請求項２３】
前記免疫細胞が、血液から分離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞培養物が、抗原提示細胞及びリンパ球を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原提示細胞が、分化条件下の単球に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫細胞の前記活性が、前記細胞培養物の上清を調べることによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞の前記活性が、活性化した免疫細胞によって生成される物質をアッセイすることによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
活性化した免疫細胞によって生成される前記物質が、シグナルトランスデューサ、受容体、メッセンジャー、酵素及び抗体から成るグループから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫細胞の前記活性が、前記表皮モデルのケラチノサイトからのメッセンジャー物質をアッセイすることによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫細胞の前記活性が、前記免疫細胞の増殖を確認することによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫細胞の前記活性が、前記免疫細胞の表面マーカを測定することによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫細胞の前記活性が、前記免疫細胞のシグナル変換成分を測定することによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫細胞の前記活性が、前記免疫細胞の細胞内サイトカインを測定することによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫細胞の前記活性が、前記免疫細胞内のメッセンジャーＲＮＡのレベルを分析することによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００８年９月１０日出願の米国仮出願第６１／０９５，８３４号に対する優先権を主張し、その全開示は参照により本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーはアトピーを含む免疫系の疾患である。アレルギー反応は、アレルゲンとして知られる環境物質に反応して生じ、これらの反応は後天性で予想可能であり、急速である。アレルギーは、ＩｇＥとして知られるタイプの抗体による、マスト細胞と呼ばれる特定の白血球と好塩基球との過剰活性化と、その結果としての極端な炎症反応を特徴とする。一般的なアレルギー反応は、湿疹、蕁麻疹、枯草熱、喘息、食物アレルギー、及びスズメバチ及びミツバチなどの有刺昆虫の毒液に対する反応を含む。
【０００３】
様々なタイプのアレルゲンが知られている。吸入されるアレルゲンは、埃又はエアロゾル、例えば花粉又はハウスダストを含む。食物アレルゲンは、食物に含まれ、過感作（アレルギー反応）によって身体が反応する物質である。医薬品アレルゲンは、医薬品内の特定の活性物質、例えば抗生物質又は鎮痛薬を含む。アレルゲン性物質のうち特に重要なグループは接触アレルゲンである。これらは、皮膚接触を通して作用される人々にアレルギー反応を引き起こす。特定の金属及び発香物質が接触アレルゲンに属する。
【０００４】
この数十年、特に西洋の工業諸国では、アレルゲン数の突然の増加が観察されている。多くのアレルゲン性物質は、化粧品又は他の局所的に施用される物質の成分（局所外用組成物）である。化粧品又は局所剤は、動物実験によってそのアレルゲン特性が試験される。しかし、このようにして得られた所見は限られた価値しかない。何故なら、実験動物は、常に人間と同じアレルゲンに反応するとは限らず、その逆もあり得るからである。この状況は、偽陽性及び偽陰性の結果を生じることが多い。一方では、動物試験に伴う実際的及び倫理的懸念もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アレルゲン活性の試験の状況に鑑み、アレルゲン活性を決定する効果的な新しいツール及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般に、様々な物質の感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果を決定する細胞培養システムに関する。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、物質の感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果を決定する細胞培養システムであって、ａ）表皮モデルを含む第１の区画と、ｂ）免疫細胞に基づく細胞培養物を含む第２の区画とを含み、第１及び第２の区画が透過性中間膜によって分離され、第１の区画に導入されたアレルゲン性又は刺激性薬剤が第２の区画の免疫細胞を活性化する細胞培養システムである。特定の実施形態では、免疫細胞は、抗原提示細胞、例えばマクロファージ及び／又は樹状細胞である。特定の実施形態では、免疫細胞は、リンパ球、特にＢリンパ球及び／又はＴリンパ球である。特定の実施形態では、免疫細胞は、整合する組織適合性抗原を示す。特定の実施形態では、免疫細胞培養物は実質的に組織細胞を含まない。特定の実施形態では、免疫細胞はヒトに由来する。特定の実施形態では、免疫細胞は血液から分離される。特定の実施形態では、表皮モデルは層状構造を有する。特定の実施形態では、表皮モデルは多層性であり、例えば表皮モデルは角質層、淡明層、顆粒層、有棘層及び基底層から成るグループから選択される少なくとも１つの表皮層を含むことができる。特定の実施形態では、表皮モデルは生きている表皮細胞、例えばケラチノサイトを含む。特定の実施形態では、表皮モデルは実質的に免疫細胞を含まない。特定の実施形態では、表皮モデルは動物表皮モデル、例えばヒト表皮モデルである。特定の実施形態では、１つ又は複数の物質は少なくとも１つの化粧用薬剤を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数の物質は少なくとも１つの薬理活性薬剤を含む。特定の実施形態では、第２の区画は水性媒体で満たされる。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、１つ又は複数の物質の感作、アレルゲン性又は刺激性効果を調べるために本明細書に記載する細胞培養システムのいずれかを使用する方法であって、第１の区画を物質と接触させること、及び第２の区画内のアレルゲン反応を検出すること、を含む方法である。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、薬剤の感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果を調べる方法であって、ａ）第１の区画に含まれる表皮モデルの表面を薬剤と接触させること、及びｂ）第２の区画に含まれる免疫細胞の細胞培養物の活性を決定すること、を含み、第１及び第２の区画が透過性中間膜によって分離され、第２の区画に活性化した免疫細胞が存在することは、薬剤がアレルゲン性又は刺激薬剤であることを示す方法である。特定の実施形態では、免疫細胞は血液から分離される。特定の実施形態では、細胞培養物は抗原提示細胞及びリンパ球を含む。特定の実施形態では、抗原提示細胞は分化条件下の単球に由来する。特定の実施形態では、免疫細胞の活性は、細胞培養物の上清を調べることによって決定される。特定の実施形態では、免疫細胞の活性は、活性化した免疫細胞によって生成される物質をアッセイすることによって決定される。特定の実施形態では、活性化した免疫細胞によって生成される物質は、シグナルトランスデューサ、受容体、酵素及び抗体から成るグループから選択される。特定の実施形態では、免疫細胞の活性は、表皮モデルのケラチノサイトからのメッセンジャー物質をアッセイすることによって決定される。特定の実施形態では、免疫細胞の活性は、免疫細胞の増殖を確認することによって決定される。特定の実施形態では、免疫細胞の活性は、免疫細胞の表面マーカを測定することによって決定される。特定の実施形態では、免疫細胞の活性は、免疫細胞のシグナル変換成分を測定することによって決定される。特定の実施形態では、免疫細胞の活性は、免疫細胞の細胞内サイトカインを測定することによって決定される。特定の実施形態では、免疫細胞の活性は、免疫細胞内のメッセンジャーＲＮＡのレベルを分析することによって決定される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、アレルゲン専用の体外調査モデルを提供するものである。本明細書で使用する「アレルゲン」とは、個体の過敏性反応を刺激する可能性がある非寄生性抗原である。本明細書に記載するのは、最新技術で周知の欠点を回避し、しかし同時に化粧品及び局所剤の承認試験の分野における現在の開発を考慮しながら、アレルギーにつながり得る被験者、例えばヒトの複雑な生理的状態を十分に模倣する材料及び方法である。
【００１１】
本明細書に記載するのは、物質の感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果を調査するのに有用で、第１及び第２の区画を含み、その区画間の連絡が可能な細胞培養システムである。第１の区画は表皮モデルを含み、第２の区画は免疫細胞を含む。２つの区画間の連絡は、区画を透過性中間膜で分離することによって可能になる。本明細書で使用する「連絡」とは、例えばメッセンジャー又はシグナル伝達分子、例えばケモカイン、サイトカイン又は感作、アレルゲン性及び／又は刺激性物質が２つの区画の間を通過することによる２つの区画の細胞間の分子連絡を指す。一実施形態では、第１の区画は表皮モデルのみを含み、第２の区画は、免疫細胞に基づく細胞培養物のみを含む。
【００１２】
本発明は、主に接触アレルゲン性及び刺激原の調査に適した細胞培養システムを提供する。そのために、第１の区画の表皮モデルは、自然の皮膚のモデル構造として特に有利である。このような状態で、透過性中間膜がある表皮モデルは、接触アレルゲンの活性を評価するモデルを提供する。表皮モデルを含む第１の区画に物質を導入し、その物質がアレルゲンである場合、その物質又はその物質によって誘発されたシグナルが、免疫細胞を活性化する第２の区画に送られる。本明細書で使用する「活性化する」とは、生体内で活性化した免疫細胞を模倣するように、細胞の状態に対する任意の数の変化（例えば免疫細胞集団の膨張、特異な分子シグナルの生成及び／又は放出、細胞表面受容体の内容の変化、遺伝子発現パターンの変化、及び当業者に周知の他の測定可能な変化）を意味する。
【００１３】
免疫細胞の活性化は、例えば免疫細胞の増殖、及びメッセンジャー物質及び免疫グロブリン、特に免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の生成及び排出を評価することによって決定することができる。細胞培養システムの免疫細胞が被検査物質と接触していた場合、第２の区画内にそれが存在すると、アレルゲンの性質であると仮定して、上述した免疫反応を引き起こし、より強力になる。これらのプロセスを記録して評価し、アレルゲン又はアレルゲン性の程度を識別することができる。
【００１４】
細胞培養システムで、表皮モデルが免疫細胞に近いことは、皮膚及び免疫系の自然の構成を反映したものである。細胞培養システムで、第２の区画の免疫細胞は、中間膜によって第１の区画の表皮モデルから分離されている。この装置は、物質の検査を妨害するような表皮モデルと免疫細胞との不注意な反応を防止することができる。したがって、細胞表皮モデルと免疫細胞は異なる起源とすることができ、特に異なるドナーの起源を持つことができる。
【００１５】
一実施形態では、免疫細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ及び／又は樹状細胞である。ＡＰＣは有用である。何故なら、これは免疫系の他の細胞に対するアレルゲンの提示に係わっているからである。アレルゲンの提示は、アレルゲンに特異なリンパ球の活性化を引き起こす。この種の活性化は、特に細胞の増殖として、及びメッセンジャー物質及び免疫グロブリン、特にＩｇＥの生成及び排出に現れる。アレルゲンに特異的なＴリンパ球は、ＩｇＥとともにアレルゲン性物質の初期識別に、又は適宜その再識別に寄与する。
【００１６】
第２の区画の免疫細胞は、ＡＰＣの前駆細胞とすることができる。例えば単球は、それを特定の条件下でＡＰＣに分化することができれば、適切な前駆細胞と見なすことができる。単球の培養に関する当業者であれば、前駆細胞を細胞培養システムで有用である細胞に成熟できることが理解されよう。分化を達成するために、特異的に分化を誘導することが分かっている様々なサイトカインが存在する状態で、例えば前駆細胞をインキュベートすることができる。前駆細胞は、例えばＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦが存在する状態でマクロファージを生成するようにインキュベートすることができる。樹状細胞に分化する目的では、前駆細胞を、特にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４などが存在する状態でインキュベートすることができる。分化は、例えば約５日から約２０日の期間にわたって、約７日から１８日の期間、又は約１０日から１４日の期間で実施することができる。
【００１７】
第２の区画の免疫細胞は、リンパ球、例えばＢリンパ球及び／又はＴリンパ球であってもよい。Ｂリンパ球とＴリンパ球は両方とも、アレルゲン性物質の初期識別及び再識別に重要である。一実施形態では、第２の区画の細胞培養物は、ＡＰＣ、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を含むものである。
【００１８】
免疫細胞は、例えば整合する組織適合性抗原（主な組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原）を示すことがある。これによって、免疫細胞間の拒絶反応を避けることが可能になる。さもなければ、この種の拒絶反応によって起こり得る感作、アレルギー及び／又は刺激反応の調査が困難になる。さらに、実際に感作されるＡＰＣ並びにＢ及びＴリンパ球のＭＨＣ抗原が同一である、例えば同じドナーに由来する場合しか、正確な抗原提示が行われない。
【００１９】
第２の区画の細胞培養物は組織細胞を含み得る。適切な組織細胞は、例えばケラチノサイト及び／又は線維芽細胞である。また、組織細胞は主分離物であってもよい。あるいは、第２の区画の細胞培養物は、組織細胞を実質的に含まなくてもよい。
【００２０】
免疫細胞は、例えば１人のドナーに、特に１人の同じドナーに由来してもよい。特定の実施形態では、免疫細胞は血液から、特に患者の血液から分離される。免疫細胞は、健康な人の血液から又はアレルギーの素因がある人から分離することができる。
【００２１】
特定の実施形態では、細胞培養システムは、ヒト由来の細胞にのみ関与する。これによって、特に効果的な方法でヒトの生体の生体内状態をシミュレートすることが可能になる。この方法で、ヒトへの感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果に関して細胞培養システムの補助により取得した結果の有効性をさらに高めることが可能である。細胞培養システムの細胞、特に表皮モデル及び／又は免疫細胞の細胞を細胞系として増殖させることができる。
【００２２】
一実施形態では、免疫細胞は被験者の血液から分離される。特に、免疫細胞は当技術分野で周知の道具及び方法の補助により、特に遠心分離技術の補助により分離することができる。考慮すべき遠心分離技術の１つは、例えば密度遠心分離である。しかし、他の遠心分離技術も使用することができる。あるいは、免疫細胞は適切な選別方法、例えば磁気ビーズ及び／又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）方法によって分離することができる。
【００２３】
細胞の表皮モデルは、個体の表皮細胞、例えばケラチノサイトを含むことができる。表皮モデルは、層状、例えば多層構造を有する。特に、表皮モデルは、分化した多層構造を有することができる。さらなるタイプでは、表皮モデルは、角質層、淡明層、顆粒層、有棘層及び基底層のグループから少なくとも１つの表皮層を表す。表皮モデルは、主に生きている表皮細胞、特に生きているケラチノサイトを含む。表皮モデルは、角質表面及びその下の表皮ケラチノサイト層で構成することができる。特定の実施形態では、表皮モデルは実質的に免疫細胞を含まない。表皮モデルは動物由来とすることができ、ヒト由来であることが好ましい。
【００２４】
免疫細胞の活性化に及ぼす物質の影響を評価することに加えて、関連するポテンシャルがある特定の物質が、特に表皮モデルのケラチノサイトに追加的な反応を誘発することができ、これは不適合反応の検出を有意に改良する。
【００２５】
本明細書で使用する物質の「感作」効果とは、感作事象を誘発することを指す。本明細書の「感作」とは、物質、特にアレルゲンとの初期接触で所与の生体内に生じる免疫反応を指す。これは主に、最初に少数のＢリンパ球及びＴリンパ球の活性化を伴い、これが次に大幅に倍増する（オリゴクローン性一次応答）。この活性化プロセスの最後に、リンパ球の大部分は免疫系によって除去される。しかし、アレルゲンに特異的な記憶細胞が形成され、これは元のアレルゲンに特異的な細胞より有意に多い数で長期間にわたって存在し続ける。
【００２６】
感作の結果として生じるアレルギーは、特異的なアレルゲンに対する免疫系の過剰防御反応であり、これは関連するアレルゲンと繰り返し接触した後に発生する。一次感作と対照してみると、過剰な二次免疫反応は、整合する抗原受容体を有する多くのＢリンパ球及びＴリンパ球の記憶細胞によって引き起こされる（オリゴクローン性二次応答）。すなわち、この反応はアレルゲンと新たに接触する度に強化される。
【００２７】
対照的に、刺激性効果は刺激原によって誘発される組織細胞への損傷から起きる。刺激の第１の相では、組織細胞自体がメッセンジャー物質、例えばリンパ球活性化因子インタロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）及びケモカインインタロイキン−８（ＩＬ−８）としても周知のリンパ球由来の好中球活性化ペプチドを放出する。放出されたメッセンジャー物質は、免疫系の細胞を引きつけ、それを活性化する。刺激原の刺激性効果が継続し、さらに強力になると、組織細胞が死ぬ。次にこれは、（壊死プロセスという意味で）細胞内成分の放出を引き起こす。これは免疫系細胞の二次活性化を強化する。刺激を伴う効果は主に抗原に特異的ではない。主に、関与するのはマクロファージ及び顆粒球である。
【００２８】
被検査物質、すなわち潜在的なアレルゲン性薬剤又は刺激原は、例えば植物抽出物及び／又は油、化粧品及び／又はその成分、又は薬理学的に活性な外皮用薬剤（局所剤）、特に皮膚に局所的に施用される医薬品及び／又は他の成分とすることができる。
【００２９】
さらなるタイプでは、第１の区画は細胞培養システムの上部区画として、第２の区画は下部区画として設計される。細胞培養システムは、例えば市販されているＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）システムの方法で設計することができる。少なくとも第２の区画は水のような、すなわち水性媒体を含むことができる。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、特に本明細書に記載する細胞培養システムを使用する場合に、物質の感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果を検査するプロセスである。このような方法は、ａ）被検査物質を、免疫細胞に基づく細胞培養物と連絡している表皮モデルの表面に透過性中間膜を介して加えること、及びｂ）細胞培養物の感作、アレルゲン性及び／又は刺激反応を検査すること、を含むことができる。
【００３１】
細胞培養物の上清を調べて、例えば免疫細胞の活性状態を決定することができる。免疫細胞によって形成される物質、例えばメッセンジャー物質、シグナルトランスデューサ（シグナル変換分子又はシグナル変換成分）、受容体、酵素及び／又は抗体は、例えば細胞培養物の上清（細胞培養媒体）内で、又は細胞内成分として調べることができる。メッセンジャー物質（例えば媒介物）は、例えばサイトカイン及び／又はケモカインとすることができる。メッセンジャー物質の濃度は主に、培養物の上清内及び／又は細胞内で決定される。シグナルトランスデューサ及び／又は受容体の密度は、例えば免疫細胞上及び／又は免疫細胞内で決定される。メッセンジャー物質は、例えばインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）、ＩＬ−４及び／又はＥｏｔａｘｉｎであってもよい。適切な受容体は、例えば表面受容体であってもよい。受容体は、リンパ球の表面受容体、例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１５２及びＣＤ１５４である。シグナルトランスデューサの幾つかの例は、核因子カッパベータ（ＮＦκβ）、ゼータ関連タンパク（ＺＡＰ−７０）及び活性化したＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）である。潜在的に適切な酵素は、例えばホスホリパーゼ、シクロオキシゲナーゼ、タンパク質キナーゼ、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、トリプターゼ、カスパーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、キナーゼ及び／又はシグナルの生成にとって重要な他の酵素とすることができる。抗体は主にＩｇＥ又はＩｇＧ４である。
【００３２】
表皮モデル、特にケラチノサイト内に位置付けられた表皮細胞による細胞活性を示す特徴を評価することができる。適切な調査方法は、電気泳動プロセス、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、アレイ技術、放射分析法、組織学的染色法、フローサイトメトリー法及び／又は様々な異なるブロット法を含む。電気泳動法は、例えばゲル電気泳動法、例えば２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（２Ｄｐａｇｅ）を含む。ウェスタンブロット分析も検出方法として使用することができる。電気泳動法をブロット法と組み合わせることも可能である。アレイ技術は、例えば免疫固相アレルゲン性チップ（ＩＳＡＣ）を含む。
【００３３】
免疫細胞によって形成される抗体は、適切な免疫測定法によって検出することができる。免疫測定法の例は、例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及び放射性アレルゲン吸着試験（ＲＡＳＴ）を含む。
【００３４】
免疫細胞が分泌する物質も検出して、免疫細胞の活性の状態を決定することができる。分泌物は、例えばタンパク質及び／又はペプチドであってもよい。タンパク質は、例えば受容体及び／又は酵素が活性したタンパク質であってもよい。分泌物は、例えば糖化タンパク質及び／又はペプチドであってもよい。分泌物は、例えばメッセンジャー物質であってもよい。メッセンジャー物質は、分子量が小さいか、又は大きい化合物であってもよい。メッセンジャー物質は、例えばラジカル酸素化合物、リポイド化合物、生体アミン、サイトカイン、成長因子及び／又はケモカイン、可溶性受容体、又はさらに膜小胞（例えばエキソソーム）であってもよい。
【００３５】
分泌化合物の検出は、細胞培養物の上清中で分泌物の濃度を決定することによって行うことができる。分泌物を検出する技術は、当業者には周知である。分泌物は、転写レベル、翻訳レベル及び／又は翻訳後レベルで検出することができる。排出物は、アレイ技術の補助で、特に例えば多重ビーズアレイ又は平面アレイの補助により検査することができる。
【００３６】
免疫細胞の活性状態の決定は、例えば免疫細胞、特にリンパ球の増殖を検出することによって行うことができる。アレルゲンとの最初の接触又は繰り返しの接触は、特にＢリンパ球及びＴリンパ球を刺激して増殖させる。
【００３７】
本明細書に記載する細胞培養システムは、潜在的なアレルゲンが呈するアレルゲン性の重症度を評価する。本明細書に記載するアレルゲン識別方法は、定量的であり得る。様々な抗原／アレルゲンから収集したデータを編集し、例えばアレルゲン性の基準スケールを決定することができる。アレルゲン反応の重症性は、モデルのアレルゲン反応によって決定することができ、重症性は本明細書に記載する因子、例えば細胞膨張の測定、放出された因子の検出などによって決定される。潜在的なアレルゲンによって生成されたアレルゲン反応を例えば基準アレルゲンスケールと比較して、当業者なら潜在的アレルゲンによって引き起こされたアレルゲン性の程度を決定することができる。
【００３８】
最後に、本発明は、物質の感作、アレルゲン性及び／又は刺激性効果を調べるために本発明による細胞培養システムを使用することに言及する。検査した物質によって誘発されたアレルギーと刺激とを区別するのに適切な細胞培養システムを作成することには特定の利点がある。同様に、本発明による細胞培養システムは、複数の細胞培養システムを使用した並行検査を実行するのに適切である。
【００３９】
（実施例）
分離したばかりのケラチノサイトを準備するために、外科的手段によって取得した皮膚材料を酵素消化プロセスにかける。次に、例えばこの方法で取得したケラチノサイトを、区画として働く底に膜があるディッシュ（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌｓ（登録商標））へと移す。この培養容器は、ケラチノサイトを培養するために牛胎児の血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸及び成長因子を含む適切な培養媒体を含む。培養媒体は、十分に３次元分化して表皮の同等物になるまで、細胞の培養物中に定期的に新しくする。分化した表皮は複数の細胞層、特に増殖、非増殖及び角質細胞層を含む。
【００４０】
免疫細胞を準備するために、例えば白血球を被験者の末梢血から取得する。細胞はフィコール勾配を介して濃縮される。次に、区画として働くマルチウェルプレート内で白血球を繁殖させる。各マルチウェルプレートは、適切な増殖媒体を含み、それは例えば血漿又は血清、ビタミン、及び／又は他の必須成分、例えばアミノ酸、ヌクレオチド及び抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシンなど）のような必要な添加物を示す。
【００４１】
分化した表皮培養物を入れた区画を、白血球培養物を入れた区画内に取り付けて、細胞培養システムを形成する。細胞培養システムは、２つの異なる細胞集団（例えば表皮細胞と白血球）の同時培養物であり、これにより表皮培養物を入れた区画が上部区画となり、白血球を入れた区画が下部区画となる。検査される物質（例えば潜在的にアレルゲン性薬剤又は刺激原）を、上部区画の表皮培養物の表面に施用する。次に、同時培養物を特定の時間だけインキュベートする。感化の潜在性を決定するために、下部区画内の白血球の増殖、リンパ球の媒介物の合成及び／又は白血球の細胞活性のパラメータを測定する。また、上部区画で刺激のパラメータを検査することができる。
【００４２】
（他の実施形態）
他の実施形態は、当業者には明白であろう。以上の詳細な説明は、明快さのみのために提供されており、単に例示的に過ぎないことを理解されたい。本発明の精神及び範囲は以上の例に限定されず、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
2012501660.tif 000002
2012501660.tif 000003
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