(57)【要約】  本発明は試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスを検出するためのプライマー、プローブ、プライマーセット、プライマーとプローブのセット、方法及びキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスの増幅用プライマーであって、前記プライマーが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及びその相補配列から構成される群から選択される配列を有する前記プライマー。
【請求項２】
試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスの検出用プローブであって、前記プローブが配列番号７、配列番号８及びその相補配列から構成される群から選択される配列を有する前記プローブ。
【請求項３】
試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスの増幅用プライマーセットであって、前記プライマーセットが、
（ａ）配列番号１、配列番号２、その相補配列及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のフォワードプライマーと；
（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、その相補配列及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のリバースプライマー
を含む前記プライマーセット。
【請求項４】
試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスを検出するためのプライマーとプローブのセットであって、前記セットが、
（ａ）配列番号１及び配列番号２又はその相補配列の配列を有する２個のフォワードプライマーと、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６又はその相補配列の配列を有する４個のリバースプライマーと；
（ｂ）配列番号７及び配列番号８又はその相補配列の配列を有する２個のプローブ
を含む前記プライマーとプローブのセット。
【請求項５】
試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスの検出方法であって、前記方法が、
（ａ）配列番号１及び配列番号２又はその相補配列から構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のフォワードプライマーと、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６又はその相補配列から構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のリバースプライマーとに増幅条件下で試験サンプルを接触させ、第１の標的配列を作製する段階と；
（ｂ）試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスの存在の指標として第１の標的配列と少なくとも１個のプローブのハイブリダイゼーションを検出する段階
を含み、少なくとも１個のプローブが配列番号７もしくは配列番号８又はその相補配列から構成される群から選択される配列を有する前記方法。
【請求項６】
増幅条件が試験サンプルを適切な増幅試薬の存在下で実施される増幅反応に付す工程を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
増幅反応が、
ａ）ＰＣＲ；
ｂ）リアルタイムＰＣＲ；又は
ｃ）逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
の少なくとも１種を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１個のプローブを検出可能なラベルで標識する請求項５に記載の方法。
【請求項９】
検出可能なラベルを少なくとも１個のプローブに直接結合する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能なラベルを少なくとも１個のプローブに間接的に結合する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
検出可能なラベルが直接検出可能である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
検出可能なラベルが間接的に検出可能である請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
検出可能なラベルが少なくとも１個のプローブの５’末端に結合した蛍光部分を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１個のプローブが更に少なくとも１個のプローブの３’末端に結合したクエンチャー部分を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
更に、
（ａ）配列番号１又はその相補配列の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号３又はその相補配列の配列を有するリバースプライマーとに増幅条件下で試験サンプルを接触させ、第２の標的配列を作製する段階と；
（ｂ）試験サンプル中のＨＣＶの存在の指標として第２の標的配列と配列番号７又はその相補配列の配列を有するプローブのハイブリダイゼーションを検出する段階
を含む請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスの検出用キットであって、
（ａ）配列番号１、配列番号２、その相補配列及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のフォワードプライマーと；
（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、その相補配列及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のリバースプライマーと；
（ｃ）増幅試薬
を含む前記キット。
【請求項１７】
更に少なくとも１個のプローブを含み、前記少なくとも１個のプローブが配列番号７、配列番号８及びその相補配列から構成される群から選択される請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルスを検出するためのプライマー、プローブ、プライマーセット、プライマーとプローブのセット、方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はフラビウイルス科ヘパシウイルス属のメンバーである。ヌクレオチドレベルで相互に約２５〜３５％相違する６種類のクレードのＨＣＶが現在確認されている。ＨＣＶの代表的な遺伝子型としては、ＨＣＶ−１０、ＨＣＶ−１１、ＨＣＶ−１ａ、ＨＣＶ−１ｂ、ＨＣＶ−２ａ、ＨＣＶ−２ｂ、ＨＣＶ−３ａ、ＨＣＶ−４ａ、ＨＣＶ−５ａ及びＨＣＶ−６ａが挙げられる。ＨＣＶは非経口伝播型非Ａ非Ｂ肝炎の主因として認められている。慢性ＨＣＶ感染は慢性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌に至る可能性がある。ＨＣＶ感染は通常では感染血液との接触により（例えば静注薬物使用により）生じるが、ＨＣＶが性感染する場合や、分娩時に母子感染する場合もある。
【０００３】
世界人口の約３％（１億７千万人）がＨＣＶに感染している。急性ＨＣＶ感染は無症状であるか、又は軽度の臨床症状しか生じないが、急性感染者の７５％〜８５％で慢性ＨＣＶ感染が発生し、慢性感染者の６０％〜７０％で慢性肝疾患が発症する（ＣＤＣ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＣＶ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｒｂｉｄ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９８，４７（ＲＲ−１９）：１−３９）。慢性Ｃ型肝炎は米国における肝移植の筆頭原因である。ＨＣＶの正確な検出法はＨＣＶ感染の予防と治療を助長する強力な手段となろう。
【０００４】
ＨＣＶゲノムは約３０１０〜３０３３アミノ酸の巨大なポリプロテインをコードする線状プラスセンス１本鎖ＲＮＡの９．６ｋｂ分子を含む（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４，３５９−３６２；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７，９５２４−９５２８）。ＨＣＶゲノムは遺伝子型間で相当の配列多様性を示すが、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲは比較的高度に保存されており、これらの領域が複製、翻訳及び／又はパッキングプロセスの制御に重要な機能的役割をもつのではないかと考えられる（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９）２５４，２８８−２９６；Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）２２３，２５５−２６１）。５’ＵＴＲは配列内リボソーム進入部位と、ＨＣＶゲノム翻訳を制御すると思われる多数の宿主細胞因子の結合部位を含む（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９）２５４，２８８−２９６）。３’ＵＴＲ領域は２１〜３９ヌクレオチド（ｎｔ）の高度可変配列と、これに続く可変長（７３〜９８ｎｔ）のＵＣリッチ配列と、３’
末端の高度に保存された９８ｎｔ配列の３領域を含む（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１（１１），８６９８−８７０６）。
【０００５】
オリゴヌクレオチドベースの各種ＨＣＶ検出法が考案されている。米国特許第５，７１４，５９６号はサンプル中のＨＣＶ変異体を同定するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのプローブハイブリダイゼーションアッセイ用として、ＨＣＶとフラビウイルス間で保存されたコーディング配列に特異的なオリゴマーを使用することを教示している。５’ＵＴＲ領域と３’ＵＴＲ領域が保存されていることが確認されると、これらの領域はサンプル中のＨＣＶの検出用アッセイの重要な標的となった。例えば、米国特許第５，８３７，４４２号はＨＣＶの５’ＵＴＲの１領域の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを教示している。また、米国特許第６，２９７，００３号は同一又は代替種における相補的配列及び関連クローンをスクリーニングするために３’ＵＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを教示している。更に、多数の製造業者が各種ＨＣＶアッセイを開発しており、ＨＣＶ感染個体に由来するヒト血清及び血漿中のＨＣＶを検出するためにＨＣＶの５’ＵＴＲを標的とするＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＤｅｓＰｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）；５’ＵＴＲ及びコア領域を標的とすることによりＨＣＶを検出するために分岐ＤＮＡ標識配列を使用するＢａｙｅｒ  Ｖｅｒｓａｎｔ（登録商標）ＨＣＶ  ＲＮＡ  ３．０アッセイ（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）；５’ＵＴＲを標的とするＣｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒバージョン２．０アッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）及びＣｈｉｒｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）アッセイ；並びにＨＣＶの３’ＵＴＲを標的とするために定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用するＡｐａｔｈ  ３’−ＵＴＲ（Ａｐａｔｈ，ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＥｒａＧｅｎ  ＨＣＶ（ＥｒａＧｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）アッセイが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，７１４，５９６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８３７，４４２号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２９７，００３号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＣＤＣ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＣＶ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｒｂｉｄ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９８，４７（ＲＲ−１９）：１−３９
【非特許文献２】Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４，３５９−３６２
【非特許文献３】Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７，９５２４−９５２８
【非特許文献４】Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９）２５４，２８８−２９６
【非特許文献５】Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）２２３，２５５−２６１
【非特許文献６】Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１（１１），８６９８−８７０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、このような方法にも拘わらず、高スループットで効率的なワークフロー環境でより高い臨床感度と特異性を提供する新規方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１態様において、本発明は試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の増幅用プライマーに関する。前記プライマーは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６並びにその相補配列から構成される群から選択される配列を有する。
【００１０】
別の態様において、本発明は試験サンプル中のＨＣＶの検出用プローブに関する。前記プローブは配列番号７、配列番号８及びその相補配列から構成される群から選択される配列を有する。
【００１１】
更に別の態様において、本発明は試験サンプル中のＨＣＶの増幅用プライマーセットに関する。前記プライマーセットは、
（ａ）配列番号１、配列番号２、その相補配列及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のフォワードプライマーと；
（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、その相補配列及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のリバースプライマー
を含む。
【００１２】
更に別の態様において、本発明は試験サンプル中のＨＣＶの検出方法に関する。前記方法は、
（ａ）配列番号１及び配列番号２又はその相補配列から構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のフォワードプライマーと、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６又はその相補配列から構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のリバースプライマーとに増幅条件下で試験サンプルを接触させ、第１の標的配列を作製する段階と；
（ｂ）試験サンプル中のＨＣＶの存在の指標として第１の標的配列と少なくとも１個のプローブのハイブリダイゼーションを検出する段階
を含み、少なくとも１個のプローブは配列番号７及び配列番号８又はその相補配列から構成される群から選択される配列を有する。
【００１３】
上記方法において、増幅条件は試験サンプルを適切な増幅試薬の存在下で実施される増幅反応に付す工程を含む。更に、増幅反応はＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（限定されないが、例えばＴａｑ−Ｍａｎ（登録商標）アッセイ）又は逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の少なくとも１種を使用する工程を含むことができる。
【００１４】
上記方法では、少なくとも１個のプローブを検出可能なラベルで標識する。当分野で公知の通り、検出可能なラベルは少なくとも１個のプローブに直接結合することができる。更に、検出可能なラベルは直接検出可能なものとすることができる。例えば、検出可能なラベルは少なくとも１個のプローブの５’末端に結合した蛍光部分から構成することができる。更に、少なくとも１個のプローブは３’末端に結合したクエンチャー部分も含むことができる。検出可能なラベルとクエンチャー部分を５’末端と３’末端で逆にしてもよい。更に本願では、プローブがその標的配列に結合していない間は、クエンチャーが検出可能なラベルの検出を阻止するように、検出可能なラベルとクエンチャー部分を可逆的に近接するように維持することも想定される。検出されたラベルを定量することにより、標的ＨＣＶコピー数を決定できる。本願での使用に想定される定量アッセイを２〜３例挙げると、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ及び不均一検出システムが挙げられる。
【００１５】
あるいは、検出可能なラベルを少なくとも１個のプローブに間接的に結合することもできる。あるいは、検出可能なラベルを間接的に検出可能なものとすることもできる。
【００１６】
更に、上記方法は、
（ａ）配列番号１又はその相補配列の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号３又はその相補配列の配列を有するリバースプライマーとに増幅条件下で試験サンプルを接触させ、第２の標的配列を作製する段階と；
（ｂ）試験サンプル中のＨＣＶの存在の指標として第２の標的配列と配列番号７又はその相補配列の配列を有するプローブのハイブリダイゼーションを検出する段階
を含む。
【００１７】
更に別の側面において、本発明は試験サンプル中のＨＣＶの検出用キットに関する。前記キットは、
（ａ）配列番号１、配列番号２、その相補配列及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のフォワードプライマーと；
（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、その相補配列及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のリバースプライマーと；
（ｃ）増幅試薬
を含む。
【００１８】
上記キットは更に少なくとも１個のプローブを含むこともでき、前記少なくとも１個のプローブは配列番号７、配列番号８及びその相補配列から構成される群から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は試験サンプル中のＨＣＶを増幅及び／又は検出するために使用することができるプライマー、プローブ、プライマーセット及びプライマーとプローブのセットに関する。本発明は本願に記載するプライマーとプローブのセットを使用して試験サンプル中のＨＣＶを検出する方法にも関する。本発明は試験サンプル中のＨＣＶ配列の検出用キットにも関する。
【００２０】
本発明のプライマーとプローブのセットは高い臨床感度及び特異性を達成する。最後に、本発明のプライマーとプローブのセットは高スループットで効率的なワークフローを提供する。
【００２１】
Ａ．定義
本願で使用する単数形の不定冠詞と定冠詞はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数の記載を包含する。本願で数値範囲を記載する場合には、同一精度の両端間の各数値が明白に想定される。例えば、６〜９の範囲では、６と９以外に７と８の数値も想定され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０の数値が明白に想定される。
【００２２】
ａ）アンプリコン
本願で使用する「アンプリコン」なる用語は増幅反応の産物を意味する。アンプリコンの１例はＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ギャップＬＣＲ、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）等の結果として生成されるＤＮＡ又はＲＮＡ産物（通常は遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡのセグメント）である。
【００２３】
ｂ）増幅、増幅法又は増幅反応
本願で使用する「増幅」、「増幅法」又は「増幅反応」なる用語は同義に使用し、試験サンプル中の特定核酸（全種のＤＮＡ又はＲＮＡ）配列（例えば標的配列又は標的核酸）の集団の発現量を増加する方法又は工程を意味する。本発明で使用することができる増幅法の例としては、限定されないが、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられ、いずれも当業者に公知である。
【００２４】
ｃ）増幅条件
本願で使用する「増幅条件」なる用語はプライマー配列のアニーリング及び／又は伸長を促進する条件を意味する。このような条件は当分野で周知であり、選択する増幅法により異なる。例えば、ＰＣＲ増幅条件は一般に熱サイクリング（例えば２以上の温度間の反応混合物のサイクリング）を含む。等温増幅反応では、熱サイクリングなしに増幅が生じるが、反応を開始するために初期温度上昇が必要な場合もある。増幅条件は全反応条件を包含し、限定されないが、温度及び温度サイクリング、緩衝液、塩、イオン強度、ｐＨ等が挙げられる。
【００２５】
ｄ）増幅試薬
本願で使用する「増幅試薬」なる用語は増幅反応で使用される試薬を意味し、限定されないが、緩衝液、試薬、逆転写酵素及び／又はポリメラーゼもしくはエキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素、酵素補因子（例えばマグネシウムやマンガン）、塩類、並びにデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（例えばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）及びデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ））が挙げられる。増幅試薬は利用する増幅法に応じて当業者が容易に選択することができる。
【００２６】
ｅ）直接検出可能及び間接的に検出可能
検出可能なラベル又は検出可能な部分に関して本願で使用する「直接検出可能」なる用語は検出可能なラベル又は検出可能な部分を検出可能にするために他の反応又は操作を必要としないことを意味する。例えば、蛍光部分は蛍光分光法により直接検出可能である。他方、検出可能なラベル又は検出可能な部分に関して本願で使用する「間接的に検出可能」なる用語は検出可能なラベル又は検出可能な部分が他の反応又は操作後に検出可能になることを意味する。例えば、ハプテンは蛍光色素等のレポーターに結合した適切な抗体と反応後に検出可能になる。
【００２７】
ｆ）フルオロフォア、蛍光部分、蛍光ラベル又は蛍光色素
「フルオロフォア」、「蛍光部分」、「蛍光ラベル」及び「蛍光色素」なる用語は本願では同義に使用し、ある波長の電磁波の量子を吸収し、これに応答して一般には前記波長よりも長い別の波長の１個以上の光子を放出する分子を意味する。各種構造及び特徴の多数の蛍光色素が本発明の実施で使用するのに適している。核酸分子を蛍光標識するための方法と材料は公知である（Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９２−１９９４，”５ｔｈ  Ｅｄ．，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．参照）。好ましくは、蛍光ラベル又は部分は高い効率で吸光・発光し（例えば、使用する励起波長でモル吸光係数が高く、蛍光量子収率が高い）、光安定性である（例えば、分析を行うために必要な時間内で光励起後にさほど分解しない）。蛍光色素のうちには、それ自体直接検出可能ではなく、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれるプロセスで別の蛍光色素にエネルギーを移動し、検出されたシグナルを第２の色素から発生するものがある。このようなＦＲＥＴ蛍光色素対も「蛍光部分」なる用語に含まれる。物理的に連結した蛍光レポーター／クエンチャー部分の使用も本発明の範囲内に含まれる。これらの側面では、蛍光レポーターとクエンチャー部分がプローブの両端等で極近接するように維持されているとき、クエンチャー部分はレポーター部分から蛍光シグナルが検出されないようにする。ＤＮＡポリメラーゼによる開裂後のように２部分が物理的に分離されると、レポーター部分からの蛍光シグナルは検出可能になる。
【００２８】
ｇ）ハイブリダイゼーション
本願で使用する「ハイブリダイゼーション」なる用語はワトソン・クリック塩基対合又は非カノニカル塩基対合により複合体を形成するために十分に相補的な核酸配列間の複合体の形成を意味する。例えば、プライマーが標的配列（鋳型）と「ハイブリダイズ」するとき、このような複合体（ないしハイブリッド）はＤＮＡ合成を開始するために例えばＤＮＡポリメラーゼにより必要とされるプライミング機能を行うために十分に安定している。当業者に自明の通り、相互にハイブリダイズする配列は安定なハイブリッドを形成するために完全な相補性をもつ必要はない。多くの状況では、ミスマッチが塩基の約１０％未満であるならば、安定なハイブリッドが形成されよう。従って、本願で使用する「相補的」なる用語は、一般に約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％  約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％以上の相同度が存在する場合に、アッセイ条件下でその相補配列と共に安定なデュプレクスを形成するオリゴヌクレオチドを意味する。少なくとも所望レベルの相補性をもつ配列同士が安定にハイブリダイズし、それよりも相補性の低い配列同士がハイブリダイズしないようにハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定及び調節する方法は当業者に自明である。ハイブリダイゼーション条件及びパラメータの例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”１９８９，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪを参照されたい。
【００２９】
ｈ）標識又は検出可能なラベルで標識
本願で使用する場合、「標識」なる用語と「検出可能なラベル（又は物質もしくは部分）で標識」なる用語は本願では同義に使用し、ある物質（例えばプライマー又はプローブ）を例えば別の物質（例えば増幅産物ないしアンプリコン）と結合後に可視化できることを意味する。好ましくは、検出可能なラベルはその強度が結合した物質の量に相関（例えば比例）する測定可能なシグナルを発生するように選択される。プライマーやプローブ等の核酸分子を標識及び／又は検出するための各種システムが当分野で周知である。標識核酸は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的又は他の手段により直接又は間接的に検出可能なラベルの付加又はこのようなラベルとの共役により作製することができる。適切な検出可能な物質としては、限定されないが、放射性核種、フルオロフォア、化学発光物質、微粒子、酵素、色差ラベル、磁気ラベル、ハプテン、分子ビーコン、アプタマービーコン等が挙げられる。
【００３０】
ｉ）プライマー
「プライマー」なる用語はヌクレオチドと核酸重合剤（例えばＤＮＡ依存性又はＲＮＡ依存性ポリメラーゼ）の存在下で適切な増幅条件（例えば緩衝液、塩、温度及びｐＨ）下においたときに核酸（全種のＤＮＡ又はＲＮＡ）の相補鎖であるプライマー伸長産物の合成開始点として機能することが可能なオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは１本鎖でも２本鎖でもよい。２本鎖の場合には、伸長産物を作製するために使用する前にその鎖の分離を可能にするように先ずプライマーを処理（例えば変性）すればよい。このような変性工程は一般には熱を使用して実施されるが、アルカリを使用して実施した後に中和してもよい。本発明のプライマーは約１５〜約５０ヌクレオチド長、好ましくは約２０〜約４０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２２〜約３０ヌクレオチド長とすることができる。本発明のプライマーは本願により詳細に記載するヌクレオチドに加え、他のヌクレオチドも含むことができる。例えば、ＳＤＡで使用されるプライマーは標的結合配列の５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができ（米国特許第５，２７０，１８４号及び５，４５５，１６６号参照）、ＮＡＳＢＡ用及びＴＭＡ用プライマーはプライマーの標的結合配列に連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むことができる。選択した増幅反応で使用するためにこのような特殊配列を標的結合反応と連結する方法は当業者に周知である。
【００３１】
「フォワードプライマー」なる用語は標的配列（例えば鋳型鎖）とハイブリダイズ（又はアニール）するプライマーを意味する。「リバースプライマー」なる用語は標的配列の相補鎖とハイブリダイズ（又はアニール）するプライマーを意味する。フォワードプライマーはリバースプライマーに対して５’側で標的配列とハイブリダイズする。
【００３２】
ｊ）プライマーセット
本願で使用する「プライマーセット」なる用語は、共働して該当標的配列又は標的核酸（例えばＨＣＶ内の標的配列）の増幅を開始することが可能な２個以上のプライマーを意味する。所定態様において、「プライマーセット」なる用語は増幅しようとする標的配列又は標的核酸の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマー（ないしフォワードプライマー）と、増幅しようとする標的配列又は標的核酸の相補配列とハイブリダイズする３’（下流）プライマー（ないしリバースプライマー）を含む１対のプライマーを意味する。このようなプライマーセット又はプライマー対はＰＣＲ増幅反応で特に有用である。
【００３３】
ｋ）プローブ
本願で使用する「プローブ」なる用語は適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列の少なくとも一部（例えば、増幅された標的配列の一部）と選択的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを意味する。本発明のプローブは約１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは約１２〜３５ヌクレオチド長、最も好ましくは１４〜２５ヌクレオチド長である。所定の場合では、プローブを検出可能なラベルで標識することができる。
【００３４】
ｌ）プライマーとプローブのセット
本願で使用する「プライマーとプローブのセット」なる用語は、共働して標的配列又は標的核酸の増幅を開始することが可能な２個以上のプライマーと、標的配列又は標的核酸を検出することが可能な少なくとも１個のプローブを含む組合せを意味する。プローブは一般に増幅産物（ないしアンプリコン）の鎖とハイブリダイズし、当業者に公知の日常的技術を使用して検出することが可能な増幅産物／プローブハイブリッドを形成する。
【００３５】
ｍ）標的配列又は標的核酸
「標的配列」なる用語と「標的核酸」なる用語は本願では同義に使用し、その有無を検出することが所望されるものを意味する。本発明の関連では、標的配列は１個以上のプライマーと共に複合体を形成する核酸配列を含むことが好ましい。標的配列は更に適切な増幅条件下でプローブと共に安定なハイブリッドを形成するプローブハイブリダイズ領域を含むことができる。当業者に自明の通り、標的配列は１本鎖でも２本鎖でもよい。本発明の関連では、該当標的配列はＨＣＶの３’ＵＴＲ内に位置する。
【００３６】
ｎ）試験サンプル
本願で使用する「試験サンプル」なる用語は一般にＨＣＶ配列等の該当検体を含むか否かを試験する生物材料及び／又は該当検体を含む疑いのある生物材料を意味する。試験サンプルは子宮頚管、膣もしくは肛門スワブないしブラシ擦過検体や、限定されないが、全血、血清、血漿、間質液、唾液、水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、母乳、腹水、粘液、鼻汁、喀痰、腹腔液、膣液、経血、羊水、精液等を含む体液等の任意生物ソースに由来することができる。試験サンプルは生物ソースから採取したまま使用してもよいし、サンプルの特性を改変するように前処理後に使用してもよい。例えば、このような前処理としては、血液からの血漿調製、粘液希釈等が挙げられる。前処理方法としては更に、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、凍結乾燥、妨害成分の不活性化、試薬添加、溶解等も挙げられる。更に、液体媒体を形成したり、検体を遊離させるように固体試験サンプルを改変すると有益な場合もある。好ましくは、サンプルは血漿とすることができる。
【００３７】
Ｂ．プライマー、プローブ及びプライマーとプローブのセット
１態様において、本発明は試験サンプル中のＨＣＶを増幅するための１種以上のプライマーに関する。前記１種以上のプライマーとしては、下表１に示す配列のいずれか、下表１に示す配列のいずれかの相補配列並びに下表１に示す配列及び／又はその相補配列の任意組合せを含むか又はそれらから構成される配列を有するプライマーが挙げられる。下表１の候補プライマー配列は後記実施例３、表９に示すように、交差遺伝子型特異性を示す。
【００３８】
【表１】
2012513757.tif 000002
１側面において、本発明は試験サンプル中のＨＣＶの増幅用プライマーセットであって、表１に記載するプライマーの１種以上を含むプライマーセットに関する。具体的には、前記プライマーセットは、
（ａ）配列番号１及び配列番号２、その相補配列（例えば、配列番号１又は配列番号２の１種以上の相補配列）並びにその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のフォワードプライマーと；
（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、その相補配列（例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６の１種以上の相補配列）及びその任意組合せから構成される群から選択される配列を有する少なくとも１個のリバースプライマー
を含むことができる。
【００３９】
別の態様において、本発明は試験サンプル中のＨＣＶを検出するための１種以上のプローブに関する。前記１種以上のプローブとしては、下表２に示す配列のいずれか、下表２に示す配列のいずれかの相補配列並びに下表２に示す配列及び／又はその相補配列の任意組合せを含むか又はそれらから構成される配列を有するプローブが挙げられる。例えば、前記１種以上のプローブは下表２に示す単独プローブでもよいし、下表２に示すプローブの１種（例えば配列番号７又は配列番号８）の単独相補配列でもよいし、下表２に示す全プローブの相補配列（配列番号７及び８の相補配列）でもよいし、その任意組合せ及び／又は下表２に示すプローブの相補配列の組合せ（例えば（ａ）配列番号７と配列番号８；（ｂ）配列番号７と配列番号８の相補配列；（ｃ）配列番号７の相補配列と配列番号８；及び（ｄ）配列番号７の相補配列と配列番号８の相補配列）でもよい。
【００４０】
【表２】
2012513757.tif 000003
【００４１】
別の態様において、本発明は試験サンプル中のＨＣＶを検出するためのプライマーとプローブのセットであって、上記表１に示したプライマーの１種以上と、上記表２に示したプローブの１種以上を含むセットに関する。例えば、プライマーとプローブのセットは、
（ａ）配列番号１及び配列番号２又はその相補配列の配列を有する少なくとも１個のフォワードプライマーと、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又はその相補配列の配列を有する少なくとも１個のリバースプライマーと；
（ｂ）配列番号７、配列番号８又はその相補配列の配列を有する少なくとも１個のプローブ
を含むことができる。
【００４２】
１態様において、プライマーとプローブのセットは、
（ａ）配列番号１又はその相補配列の配列を有する１個のフォワードプライマーと、配列番号３又はその相補配列の配列を有する１個のリバースプライマーと；
（ｂ）配列番号８又はその相補配列の配列を有する１個のプローブ
を含む。
【００４３】
本発明のプライマーとプローブに基づいて１個以上のオリゴヌクレオチドアナログを作製することができる。このようなアナログはペプチド核酸ないし「ＰＮＡ」（例えば、天然核酸のリン酸糖鎖主鎖の代わりにペプチド様主鎖をもつ分子）等の代替構造を含むことができる。これらの代替構造も本発明に含まれる。同様に、当然のことながら、本発明のプライマーとプローブはこれらの配列の特性に負の影響を与えない範囲で核酸塩基の欠失、付加及び／又は置換を含むことができる。特に、このような変異の結果、本願に記載するプライマーとプローブのハイブリダイジング特性が有意に低下しないようにすべきである。
【００４４】
本発明のプライマーとプローブは当分野で公知の各種方法のいずれかにより作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”１９８９，２．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”１９９０，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ），”１９９３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；“ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，”１９９５，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；及び“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”２００２，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（Ｅｄ．），５．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪ参照）。例えば、本願に記載するプライマーとプローブは、例えばＮａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９７９，６８：９０−９８；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９７９，６８：１０９−１５１及びＢｅｌｏｕｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３４４０−３４４４に記載されているように鋳型に基づく化学合成と重合により作製することができる。
【００４５】
合成はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の市販品等のオリゴ合成装置で実施することができる。あるいは、本発明のプライマーとプローブは、例えばＭｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）及び他の多数の企業を含む当分野で周知の各種商業ソースから注文作製してもよい。
【００４６】
必要又は所望される場合、本発明のプライマーとプローブの精製は当分野で周知の各種方法のいずれかにより実施することができる。プライマーとプローブの精製は天然アクリルアミドゲル電気泳動、例えばＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，１９８３，２５５：１３７−１４９に記載されているようなアニオン交換ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣ（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９７９，７：１０６７−１０８０参照）により実施することができる。
【００４７】
先述のように、当分野で公知の数種の手段のいずれかを使用して修飾型プライマー及びプローブを作製することができる。このような修飾の非限定的な例としては、メチル化、アナログによる天然ヌクレオチドの１個以上の置換、及び例えば非荷電結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート等）又は荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）による修飾等のヌクレオチド間修飾が挙げられる。プライマー及びプローブは例えば蛋白質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレーター（例えばアクリジン、プソラレン等）、（例えば金属、放射性金属、酸化性金属等をキレート化するための）キレート剤、及びアルキル化剤等の１種以上の他の共有結合部分を含むことができる。メチルもしくはエチルホスホトリエステル又はアルキルホスホロアミデート結合の形成によりプライマー及びプローブを誘導体化してもよい。更に、本発明のプライマー及び／又はプローブは検出可能なラベルで修飾してもよい。
【００４８】
上記に示唆したように、本発明の所定態様では、プライマー及び／又はプローブを１種以上の増幅／検出法で使用する前に検出可能なラベル又は部分で標識することができる。本願に記載する方法で使用するには、１個以上のラベルを検出可能なラベル又は部分で標識することが好ましい。検出可能なラベルの役割は増幅した標的配列（例えばアンプリコン）の可視化及び／又は検出を可能にすることである。好ましくは、検出可能なラベルはその強度が分析下の試験サンプル中の増幅産物の量に相関（例えば比例）する測定可能なシグナルを発生するように選択される。
【００４９】
１個以上の標識プローブと検出可能なラベルの結合は共有的でも非共有的でもよい。標識プローブは検出可能な部分の付加又はこのような部分との共役により作製することができる。ラベルは核酸配列に直接結合することもできるし、（例えばリンカーを介して）間接的に結合することもできる。種々の長さのリンカーないしスペーサーアームが当分野で公知で市販されており、立体障害を減らすように、又は得られる標識分子に他の有用もしくは望ましい性質を付与するように選択することができる（例えば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１９９５，９：１４５−１５６参照）。
【００５０】
プライマー及び／又はプローブ等のオリゴヌクレオチドの標識方法は当業者に周知である。標識プロトコルとラベル検出技術の解説については、例えばＬ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００２，３９：１１４−１２９；ｖａｎ  Ｇｉｊｌｓｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，２００１，１：８１−９１；及びＪｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，３５：１３５−１５３を参照されたい。標準核酸標識方法としては、放射性物質の添加、蛍光色素（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８５，１３：２３９９−２４１２参照）又は酵素（Ｃｏｎｎｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９８５，１３：４４８５−４５０２参照）の直接結合；免疫化学的又は他のアフィニティ反応により核酸分子を検出可能にする化学修飾（Ｂｒｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９７８，５：３６３−３８４；Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８０，２６：１−４５；Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８１，７８：６６３３−６６３７；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８３，１１：６１６７−６１８４；Ｂｒｉｇａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９８３，１２６：３２−５０；Ｔｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１：３４６６−３４７０；Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９８４，１５：６１−７２；及びＡ．Ｈ．Ｈｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９８７，１６９：３５７−３６８参照）；並びにランダムプライミング、ニック翻訳、ＰＣＲ及びターミナルトランスフェラーゼによるテーリング等の酵素介在標識法（酵素標識の解説については、例えばＴｅｍｓａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，５：２２３−２３２参照）が挙げられる。
【００５１】
本発明では、多様な検出可能なラベルのいずれも使用することができる。適切な検出可能なラベルとしては、限定されないが、各種リガンド、放射性核種ないし放射性同位体（例えば、３２Ｐ，３５Ｓ，３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ，１３１Ｉ等）；蛍光色素；化学発光物質（例えばアクリジニウムエステル、安定化ジオキセタン等）；分光分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（例えば量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば金、銀、銅及び白金）又はナノクラスター；酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；色差ラベル（例えば色素、金コロイド等）；磁気粒子（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））；及びビオチンとジオキシゲニン、又は他のハプテンと抗血清もしくはモノクローナル抗体用蛋白質が利用可能である。
【００５２】
所定態様では、該当プローブを蛍光標識する。多様な化学構造及び物理的特性の多数の公知蛍光標識部分が本発明の実施で使用するのに適切である。適切な蛍光色素としては、限定されないが、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡから市販されているＱｕａｓａｒ（登録商標）色素、フルオレセイン及びフルオレセイン色素（例えばフルオレセインイソチオシアニン（ＦＩＴＣ）、ナフトフルオレセイン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン（例えばＦＡＭ）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリスリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えばカルボキシテトラメチルローダミンないしＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンないしＴＭＲ）、クマリン及びクマリン色素（例えばメトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン及びアミノメチルクマリンないしＡＭＣＡ）、オレゴングリーン色素（例えばオレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、シアニン色素（例えばＣｙ−３（登録商標）、Ｃｙ−５（登録商標）、Ｃｙ−３．５（登録商標）、Ｃｙ−５．５（登録商標））、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えばＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５）、ＩＲ色素（例えばＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００）等が挙げられる。使用可能な他の適切な蛍光色素と、蛍光色素をプローブ等のオリゴヌクレオチドに結合又は付加するための方法の例はＲＰ  Ｈａｕｇｌａｎｄ，“Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ”，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．（Ｊｕｎｅ  １９９２））に記載されている。蛍光色素と標識キットは例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から市販されている。
【００５３】
蛍光基（供与体）のうちには、それ自体直接検出可能ではなく、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プロセスで別の蛍光基（受容体）にエネルギーを移動し、検出可能な蛍光シグナルを第２の基から発生するものがある。これらの態様では、プローブは例えば、増幅された標的配列とハイブリダイズすると、検出可能になる。本発明で使用するのに適したＦＲＥＴ受容体／供与体対の例としては特に、例えばフルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／ＦＩＴＣ、ＩＡＥＤＡＮＳ／５−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン、Ｂ−フィコエリスリン／Ｃｙ−５及びＥＤＡＮＳ／Ｄａｂｃｙｌが挙げられる。
【００５４】
ＦＲＥＴ対としては物理的に連結した蛍光レポーター／クエンチャー対の使用も挙げられる。例えば、検出可能なラベルとクエンチャー部分を各々プローブの５’末端又は３’末端に結合し、従って、検出可能なラベルとクエンチャー部分をプローブの両端に配置してもよいし、プローブの長手方向に相互に離間して配置してもよい。この間にプローブはその標的配列と結合していないので、検出可能なラベルとクエンチャー部分はクエンチャーが検出可能なラベルの検出を阻止するように可逆的に近接するように維持される。プローブが標的配列と結合すると、検出可能なラベルとクエンチャー部分は分離されるので、適切な条件下で検出可能なラベルを検出することが可能になる。
【００５５】
このようなシステムを（例えば米国特許第５，２１０，０１５号、５，８０４，３７５号、５，４８７，７９２号及び６，２１４，９７９号に記載されているような）ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで使用することや、（例えばＴｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，１４：３０３−３０８；Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，１６：４９−５３；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９：１２２８−１２２９；Ｓｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５：１１５３８−１１５４３；Ｍａｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ，１９９９，１４：１５１−１５６；並びに米国特許第５，８４６，７２６号、５，９２５，５１７号、６，２７７，５８１号及び６，２３５，５０４号に記載されているような）分子ビーコンとして使用することは当業者に周知である。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイフォーマットでは、増幅反応産物が「リアルタイム」で形成されるにつれて検出することができ、即ち、反応混合物が増幅条件下にある間に増幅産物／プローブハイブリッドが形成及び検出される。
【００５６】
本発明の所定態様において、ＰＣＲ検出プローブは５’末端を蛍光部分で標識し、３’末端をクエンチャー部分で標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）様プローブであり、あるいは蛍光部分とクエンチャー部分を逆に配置してもよく、あるいは蛍光部分の満足な検出を可能にするようにプローブが標的配列とハイブリダイズするときに適切な分離が得られるように配列の長手方向に配置してもよい。ＴａｑＭａｎ（登録商標）様プローブで使用するのに適した適切なフルオロフォアとクエンチャーは米国特許第５，２１０，０１５号、５，８０４，３７５号、５，４８７，７９２号及び６，２１４，９７９号、並びにＷＯ０１／８６００１に開示されている。クエンチャーの例としては、限定されないが、ＤＡＢＣＹＬ（例えば４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸スクシンイミジルエステル）、ジアリールローダミンカルボン酸スクシンイミジルエステル（ないしＱＳＹ−７）、及び４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸スクシンイミジルエステル（ないしＱＳＹ−３３）（いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（現在はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡと合併）の製品）、クエンチャー１（Ｑ１；Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡの製品）、又は「Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ」ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２及びＢＨＱ−３（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡの製品）が挙げられる。所定態様において、ＰＣＲ検出プローブは５’末端をＦＡＭで標識し、３’末端をＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）又はＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）で標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）様プローブである。
【００５７】
通常型又は修飾型ヌクレオチドの「テール」を検出用プローブに付加することもできる。テールに相補的であり、１個以上の検出可能なラベル（例えばフルオロフォア、酵素又は放射性標識した塩基）を含む核酸との第２のハイブリダイゼーションにより、アンプリコン／プローブハイブリッドの可視化が可能になる。
【００５８】
特定標識技術の選択は状況により異なり、標識方法の容易さと費用、使用する種々の検出可能なラベル間のスペクトル間隔、所望されるサンプル標識品質、ハイブリダイゼーション反応（例えばハイブリダイゼーション工程の速度及び／又は効率）に及ぼす検出可能な部分の影響、使用する増幅方法の種類、検出システムの種類、検出可能なラベルにより発生されるシグナルの種類と強度等の数個の因子により決定することができる。
【００５９】
Ｃ．増幅方法
試験サンプル中のＨＣＶ標的配列を増幅するための本発明のプライマー又はプライマーセットの使用は特定核酸増幅技術又はその特定変法に限定されない。実際に、本発明のプライマー及びプライマーセットは当分野で公知の各種核酸増幅法のいずれでも利用することができる（例えば、Ｋｉｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５２：３０７−３１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，２．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（Ｅｄ．），２００２，５．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪ参照）。
【００６０】
このような核酸増幅法としては、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。ＰＣＲは多数の文献に記載されており、限定されないが、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（Ｅｄ．），１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；“ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ”，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（Ｅｄ．），１９９５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；“Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＣＲ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），１９９１，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２４：１６３；並びに米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号及び４，８８９，８１８号等が挙げられる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９１，８８：７２７６−７２８０参照）や逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ないしＲＴ−ＰＣＲ、例えば米国特許第５，３２２，７７０号及び５，３１０，６５２号に記載）等のＰＣＲの変法も含まれる。
【００６１】
一般に、ＰＣＲでは、対象から得られた過剰の試験サンプルに１対のプライマーを添加し（従って、試験サンプルと接触させ）、標的核酸の相補鎖とハイブリダイズさせる。標的配列を鋳型としてプライマーを各々ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させる。伸長産物は元の標的鎖から解離（変性）後にそれ自体標的となる。次に新規プライマーをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより伸長させ、アンプリコン数を指数的に増加するようにサイクルを反復する。ＰＣＲ反応でプライマー伸長産物を生成することが可能なＤＮＡポリメラーゼの例としては、限定されないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、各種ソース（例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手可能なＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ｒＴｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（「ベント」ポリメラーゼ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）が挙げられる。ＲＮＡ標的配列は上記のように、先ずｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ）した後にＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施することにより増幅することができる。あるいは、米国特許第５，３２２，７７０号に記載されているように単一酵素を両方の工程で使用してもよい。
【００６２】
上記酵素熱増幅法以外に、本発明のプライマー及びプライマーセットを使用してＨＣＶ配列を増幅するために等温酵素増幅反応を利用することもできる（Ａｎｄｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１９：２９−４４）。これらの方法としては、限定されないが、転写介在増幅法（ＴＭＡ；ＴＭＡはＫｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：１１７３−１１７７；Ｇｉａｃｈｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，４０：２４０８−２４１９；及び米国特許第５，３９９，４９１号に記載されている）；自家持続配列複製法（３ＳＲ；３ＳＲはＧｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：１８７４−１８４８；及びＦａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９１，１：２５−３３に記載されている）；核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ；ＮＡＳＢＡはＫｉｅｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１，３５：２７３−２８６；及び米国特許第５，１３０，２３８号に記載されている）及び鎖置換増幅法（ＳＤＡ；ＳＤＡはＷａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９２，８９：３９２−３９６；ＥＰ  ０  ５００  ２２４  Ａ２に記載されている）が挙げられる。
【００６３】
Ｄ．検出方法
本発明の所定態様において、本願に記載するプローブは増幅反応により生成された増幅産物を検出するために使用される。本願に記載するプローブは各種周知均一又は不均一法を使用して利用することができる。
【００６４】
均一検出法としては、限定されないが、プローブに結合され、標的配列の存在下でシグナルを発生するＦＲＥＴラベルの使用、分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，１４：３０３−３０８；Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，１６：４９−５３；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９：１２２８−１２２９；Ｓｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５：１１５３８−１１５４３；Ｍａｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ，１９９９，１４：１５１−１５６；並びに米国特許第５，８４６，７２６号、５，９２５，５１７号、６，２７７，５８１号及び６，２３５，５０４号参照）、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（米国特許第５，２１０，０１５号、５，８０４，３７５号、５，４８７，７９２号及び６，２１４，９７９号並びにＷＯ０１／８６００１参照）が挙げられる。これらの検出技術を使用すると、増幅反応産物が形成されるにつれて、即ちリアルタイムで検出することができる。その結果、反応混合物が増幅条件下にある間に増幅産物／プローブハイブリッドが形成され、検出される。
【００６５】
所定態様において、本発明のプローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで使用される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、蛍光シグナルの発生をモニターすることにより熱サイクリングと共に分析を実施する。アッセイシステムは標的コピー数の決定を可能にする定量データを生成することができる。例えば、未知サンプルを比較することができる１個以上のＨＣＶ配列の予め定量された懸濁液の系列希釈を使用して標準曲線を作成することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）は例えば上記のように蛍光レポーター色素とクエンチャー部分の両方で標識したプローブを消化するために内在５’ヌクレアーゼ活性をもつＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して好適に実施される。プローブが消化されるにつれて増幅サイクル中に生じる蛍光の変化を測定し、蛍光部分とクエンチャー部分を分離し、標的配列の増幅に比例する蛍光シグナルを増加させることにより、アッセイ結果が得られる。
【００６６】
均一検出方法の他の例としては、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（ＨＰＡ）が挙げられる。このようなアッセイでは、非ヌクレオチドリンカーアーム化学（米国特許第５，５８５，４８１号及び５，１８５，４３９号参照）を使用して高度化学発光性分子であるアクリジニウムエステル（ＡＥ）でプローブを標識する（Ｗｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９８３，２９：１４７４−１４７９；Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，３４：２０８７−２０９０参照）。アルカリ過酸化水素によるＡＥ加水分解により化学発光が誘起されると、Ｎ−メチルアクリドンが励起された後、光子を放出しながら失活する。標的配列の不在下ではＡＥ加水分解は迅速である。他方、プローブが標的配列と結合しているときにす、ＡＥ加水分解速度は著しく低下する。従って、ハイブリダイズしたＡＥ標識プローブとハイブリダイズしていないプローブを物理的分離の必要なしに溶液中で直接検出することができる。
【００６７】
不均一検出システムも当分野で周知であり、一般に増幅配列を反応混合物中の他の物質から分離するために捕捉剤を利用する。捕捉剤は一般に１個以上の特定結合配列をコーティングした固体支持体材料（例えばマイクロタイターウェル、ビーズ、チップ等）を含む。結合配列は本発明のオリゴヌクレオチドプローブに付加するテール配列に相補的なものとすることができる。あるいは、結合配列はプローブのテール配列に相補的な配列をそれ自体含む捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的なものとすることができる。捕捉剤に結合した増幅産物／プローブハイブリッドを残りの反応混合物から分離後、本願に記載する方法等の任意検出方法を使用して増幅産物／プローブハイブリッドを検出することができる。
【００６８】
Ｅ．試験サンプル中のＨＣＶの検出
本発明は試験サンプル中のＨＣＶの存在の検出方法を提供する。更に、１個以上のＨＣＶ配列の予め定量された懸濁液の系列希釈を使用して作成した標準曲線又は他の標準化ＨＣＶプロファイルと試験サンプル検出値を比較することにより、試験サンプル当たりのＨＣＶ濃度を定量することができる。
【００６９】
一般に、本発明の方法は先ず対象から試験サンプルを採取する。該当対象としては、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、非ヒト霊長類及び好ましくはヒト等の任意哺乳動物が挙げられる。試験サンプルは当業者に公知の日常的技術を使用して対象から採取することができる。好ましくは、試験サンプルは少なくとも１種のＨＣＶ遺伝子型を含んでいるか、又は前記遺伝子型を含んでいる疑いがある。
【００７０】
対象から試験サンプルを採取した後、本願に開示するプライマーセット又はプライマーとプローブのセットの少なくとも１種からのプライマー（及び場合により１個以上のプローブ）と試験サンプルを接触させ、反応混合物を形成する。次に反応混合物を増幅条件下に置く。プライマーは試験サンプル中の相補的ＨＣＶ核酸とハイブリダイズする。サンプル中のＨＣＶ核酸とハイブリダイズしたプライマーを増幅し、少なくとも１個の増幅産物（即ち少なくとも１個の標的配列）を生成する。
【００７１】
少なくとも１個の増幅産物と本発明のプローブの少なくとも１個（例えば本願に記載するプライマーとプローブのセットからの１個以上のプローブ）のハイブリダイゼーションを検出することにより、少なくとも１個の増幅産物を検出する。具体的には、配列番号７、配列番号８又はその相補配列の配列を有するプローブの１個以上で少なくとも１個の増幅産物が検出されたならば、試験サンプル中に少なくとも１種のＨＣＶ遺伝子型が存在すると判定する。
【００７２】
Ｆ．キット
別の態様において、本発明は本願に記載する方法によるＨＣＶ検出に有用な材料及び試薬を含むキットを提供する。前記キットは診断検査所、実験研究所又は開業医が使用することができる。所定態様において、キットは本願のセクションＢに記載したプライマーセット又はプライマーとプローブのセットの少なくとも１種と、場合により増幅試薬を含む。各キットは特定増幅法の適した増幅試薬を含むことが好ましい。従って、ＮＡＳＢＡ用キットは標的結合配列に連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターと共にプライマーを含むことが好ましく、ＳＤＡ用キットは標的結合配列の５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマーを含むことが好ましい。同様に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ等の５’ヌクレアーゼアッセイ用にキットを利用する場合には、本発明のプローブは少なくとも１個の蛍光レポーター部分と少なくとも１個のクエンチャー部分を含むことができる。
【００７３】
適切な増幅試薬としては更に、例えば緩衝液、試薬、逆転写酵素及び／又はポリメラーゼ活性もしくはエキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素、酵素補因子（例えばマグネシウムやマンガン）、塩類、増幅反応を実施するのに適したデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の１種以上が挙げられる。
【００７４】
手法に応じて、キットは更に洗浄用緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、標識緩衝液、検出手段及び他の試薬の１種以上を含むことができる。緩衝液及び／又は試薬はキットを利用する特定増幅／検出技術に合わせて最適化することが好ましい。手法の各工程を実施するためのこれらの緩衝液及び試薬のプロトコルもキットに含むことができる。
【００７５】
更に、増幅の失敗による偽陰性試験結果の発生を防ぐため、細胞妥当性、サンプル抽出等を確認するために、増幅効率試験等の内部対照をキットに加えてもよい。最適な内部対照配列は増幅反応で標的核酸配列と競合しないように選択される。このような内部対照反応は当分野で公知である。
【００７６】
更に核酸抽出前に増幅前の試験サンプルから核酸を単離するための試薬をキットに加えてもよい。
【００７７】
試薬は固体（例えば凍結乾燥）又は液体形態で供給することができる。本発明のキットは場合により各緩衝液及び／又は試薬用の各種容器（例えばバイアル、アンプル、試験管、フラスコ又はボトル）を含むことができる。各成分は一般に夫々の容器に分注又は濃縮形態で提供するのに適切である。増幅／検出アッセイの所定工程を実施するのに適した他の容器も提供することができる。個々の容器を市販用に密封状態に維持することが好ましい。
【００７８】
キットは更に、本願に記載する増幅試薬とプライマーセット又はプライマーとプローブのセットを使用するため、即ち試験サンプルを処理し、核酸を抽出し、及び／又は試験を実施するため、並びに得られた結果を解釈するための説明書と、法令による注意書きを含むことができる。このような説明書は場合により印刷物でもよいし、ＣＤ、ＤＶＤ又は他のフォーマットの記録媒体でもよい。
【００７９】
非限定的な例示として、本願開示の実施例を以下に記載する。
【実施例１】
【００８０】
材料及び方法
Ａ．ＨＣＶプライマー及びプローブの設計
実施例で使用した全オリゴヌクレオチドは当業者に公知の標準オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成した。全プローブは１本鎖オリゴヌクレオチドであり、当分野で公知の日常的技術を使用して５’末端をフルオロフォアで標識し、３’末端をクエンチャー部分で標識した。例えば、配列番号８では、５’ラベルをＦＡＭとし、３’ラベルをＢＨＱ１−ｄＴ等のＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）とする。プライマー（配列番号１及び配列番号３）は標識しない。
【００８１】
Ｂ．リアルタイムＰＣＲ
核酸を捕捉して粒子を洗浄し、未結合サンプル成分を除去する磁気微粒子技術を使用してサンプルからＨＣＶ  ＲＮＡを抽出、濃縮、精製した（例えば米国特許第５，２３４，８０９号参照）。結合した核酸を溶出させ、ＰＣＲ反応混合物にそのまま加えた。単一管反応で逆転写ＰＣＲ反応とリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。配列番号１（フォワード）と配列番号３（リバース）を含むＨＣＶプライマーミックス（本願では「ＨＣＶプライマーミックス」と総称する）を使用し、ＨＣＶゲノム配列を増幅した。ＨＣＶ特異的プローブ（配列番号８）を使用してＨＣＶ  ３’ＵＴＲのシグナルを発生させた。プライマーとプローブ以外に、ＰＣＲ反応はｒＴｔｈ酵素１０単位、（活性化試薬として）塩化マンガン２．５ｍＭ、及び他の増幅試薬（Ｂｉｃｅｎｅ緩衝液中に０．３ｍＭ  ｄＮＴＰ類，１５ｎＭ  ＲＯＸ参照色素、２００ｎＭアプタマーを含有）から構成した。溶出した核酸５０μＬと上記ＰＣＲ反応混合物５０μＬを９６ウェル反応プレートの各ウェルに加え、光学接着カバーで密閉した。このプレートを以下のように増幅した。
【００８２】
９５℃、４５秒及び６２℃、３０分を１サイクル；９５℃、４５秒及び６０℃、４５秒を５０サイクルのサイクリング条件を使用してＡｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔ機器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）でリアルタイム増幅／検出を実施した。５０サイクルの読取り工程（６０℃）中に蛍光測定値を記録した。
【実施例２】
【００８３】
感度
他のＨＣＶ検出アッセイに対する本願に開示するアッセイ（「３’ＵＴＲアッセイ」）の相対感度を判定するために、各種起源のＨＣＶ標的を使用して検出限界性能を評価した。
【００８４】
Ａ．合成ＲＮＡ構築物に対する感度
（実施例１のＨＣＶプライマーミックスとリアルタイムＰＣＲを使用して）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイと３’ＵＴＲアッセイの検出限界を比較する試験で、Ａｐａｔｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列の両方を含むインビトロＲＮＡ構築物標的を使用した。（下記）表３では、３’ＵＴＲアッセイとＲｅａｌＴｉｍｅアッセイのどちらも１５３．７７ＩＵ／ｍｌでは３／３のヒットを示し、２．９７ＩＵ／ｍｌでは夫々３／３のヒットと１／３のヒット、２．００ＩＵ／ｍｌでは各々１／３のヒットを示した。
【００８５】
【表３】
2012513757.tif 000004
表３からのデータは合成ＲＮＡ構築物標的を使用した場合のＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイの予想検出限界３．３１ＩＵ／ｍｌと本願に開示する３’ＵＴＲ  ＨＣＶアッセイの２．０５ＩＵ／ｍｌに対応する（下表４参照）。
【００８６】
【表４】
2012513757.tif 000005
表３及び４の上記データは、本願に開示する３’ＵＴＲアッセイが（５’ＵＴＲを標的とする）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイと同等の感度であることを立証している。従って、これらのデータは、本願に開示する３’ＵＴＲアッセイが３’ＵＴＲを標的としながら５’ＵＴＲアッセイと同等感度でＨＣＶを検出するための代替アッセイとなることを立証している。
【００８７】
Ｂ．検体由来ＨＣＶに対する感度
ＰｒｏＭｅｄＤｘ（Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）から入手した患者検体に由来する遺伝子型３をもつ高力価ＨＣＶウイルス溶出液を系列希釈し、（実施例１のＨＣＶプライマーミックスとリアルタイムＰＣＲを使用して）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイにより定量した。この希釈系列を使用し、本願に開示する３’ＵＴＲアッセイの検出限界性能をＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイの検出限界性能に比較した。
【００８８】
【表５】
2012513757.tif 000006
表５からのデータは検体由来ＨＣＶを使用した場合のＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイの予想検出限界１．２６ＩＵ／ｍｌと本願に開示する３’ＵＴＲ  ＨＣＶアッセイの９．２６ＩＵ／ｍｌに対応する（下表６参照）。
【００８９】
【表６】
2012513757.tif 000007
表５及び６の上記データは先に開示したデータと一致し、本願に開示する３’ＵＴＲアッセイが（５’ＵＴＲを標的とする）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイと同等の感度であることを立証している。
【実施例３】
【００９０】
複数遺伝子型検出
本願に開示する３’ＵＴＲアッセイが各種ＨＣＶ遺伝子型を検出する能力を判定するために、ＨＣＶ遺伝子型１〜６に相当するＴｅｒａｇｅｎｉｘ（Ｆｔ．Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ，ＦＬ）からの３２個の患者検体を作製し、（実施例１のＨＣＶプライマーミックスとリアルタイムＰＣＲを使用して）３’ＵＴＲアッセイを使用して定量した。全検体結果を先に得られたＲｅａｌＴｉｍｅアッセイ（５’ＵＴＲ）結果と比較した（表７）。
【００９１】
【表７】
2012513757.tif 000008
2012513757.tif 000009
表７の結果は、本願に開示する３’ＵＴＲアッセイがＨＣＶ遺伝子型１〜６を検出できることを立証している。更に、各遺伝子型に対する本願に開示する３’ＵＴＲアッセイの感度はＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイの感度と同等である。
【実施例４】
【００９２】
代替ＨＣＶプライマーミックス−複数リバースプライマー
以下の実施例では配列番号１（フォワード）、配列番号３（リバース）及び配列番号６（リバース）を含むＨＣＶプライマーミックスを使用してＨＣＶゲノム配列を増幅した。ＨＣＶ特異的プローブ（配列番号７）を使用してＨＣＶ  ３’ＵＴＲのシグナルを発生させた。本実施例にも上記ＰＣＲ反応及びサイクリング条件を適用する。本願に開示する３’ＵＴＲアッセイとＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイの両方で遺伝子型１ａと遺伝子型３の２個の高力価検体の希釈液を試験した。
【００９３】
【表８】
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第２のリバースプライマー（配列番号６）を添加すると、（表８で認められる）ＨＣＶ遺伝子型３検体３個で認められた閾値サイクル遅延が部分的に補償され、本願に開示する３’ＵＴＲアッセイの感度は増加する。認められる感度増加は配列番号３によるミスマッチを補償する第２のリバースプライマー（配列番号６）により標的配列の増幅が向上することにより達成されると考えられる。
【００９４】
当業者に容易に理解される通り、本発明は記載した目的を実施し、結果及び利点を得ると共に、内在する目的を実施し、結果及び利点を得るために好適である。本願に記載する分子複合体と方法、手法、処理、分子及び特定化合物は好ましい態様の現在の代表例であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者に容易に理解される通り、本発明の範囲と趣旨から離れずに本願に開示するような発明に各種置換及び変更を実施することができる。
【００９５】
本明細書に記載する全特許及び刊行物は本発明が属する分野の当業者の水準を示す。全特許及び刊行物を本願に援用する。
【００９６】
本願に具体的に記載する発明は本願に具体的に開示しない全要素、限定の不在下で適切に実施することができる。使用した用語及び表現は限定ではなく、説明として使用しており、このような用語及び表現を使用する場合には、表示及び記載した構成又はその部分の等価物を排除する意図はない。当然のことながら、特許請求の範囲に記載する発明の範囲内で各種変更が可能である。従って、好ましい態様により本発明を具体的に開示したが、当然のことながら、当業者は本願に開示する概念の他の構成、変更及び変形を利用することができ、このような変更及び変形も以下の特許請求の範囲に記載する本発明の範囲に含まれるとみなされる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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