(57)【要約】  本発明の主題は、対象の心臓血管系に対する影響に関して、食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤を分類するためのインビトロの方法であって、前記対象中の１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルを決定する工程を含む、前記方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心臓血管系に対する影響に関して、食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤を分類するためのインビトロの方法であって、前記対象中の１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルを決定する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルが食後に決定される、請求項１に記載のインビトロの方法。
【請求項３】
前記１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルが、１ｎｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下の感度を有するアッセイを用いて決定される、請求項１又は２に記載のインビトロの方法。
【請求項４】
更に：
ａ．前記対象中の１つ以上の心臓血管マーカーの基底レベルを決定する工程、
ｂ．前記１つ以上の心臓血管マーカーの食後のレベルを決定する工程、
ｃ．工程ａ及びｂで取得した数値から、前記１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルを計算する工程
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項５】
前記対象中の前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの５％超、好ましくは５〜２０％の食後の相対的な増大が、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤の前記対象の心臓血管系に対する正の影響と関連付けられ、前記対象中の前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの約５％の食後の相対的な増大又は低下が、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤の前記対象の心臓血管系に対する中程度の影響と関連付けられ、そして前記対象中の前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの５％超の食後の相対的な低下が、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤の前記対象の心臓血管系に対する負の影響と関連付けられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項６】
前記対象中の心臓血管マーカーの基底レベル及び食後のレベルが、免疫アッセイを用いて決定される、請求項４又は５に記載のインビトロの方法。
【請求項７】
前記心臓血管マーカーの１つがプロＡＮＰ又はその断片であって、より好ましくはＭＲ−プロＡＮＰであって、最も好ましくはＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項８】
前記対象の１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの基底レベルに対する変化を決定するためのアッセイの使用であって、前記アッセイが、前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの低下の検出を可能とし、且つ前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの増大の検出を可能とする、前記使用。
【請求項９】
前記変化が増大又は低下であり、前記アッセイが１ｎｍｏｌ／Ｌ以下の感度を有する、請求項８に記載のアッセイの使用。
【請求項１０】
前記対象の１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの基底レベルに対する食後の変化を決定するための、請求項８又は９に記載のアッセイの使用。
【請求項１１】
前記アッセイが免疫アッセイである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの変化が、対象の心臓血管系に対する影響に関して、食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤を分類するのに使用される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のアッセイの使用。
【請求項１３】
前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの変化が、糖尿病の薬剤を分類するのに使用される、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のアッセイの使用、又は請求項１〜７のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１４】
前記対象が、心臓血管系及び／又は代謝系に関連する医学的状態に罹患している人類である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のアッセイの使用、又は請求項１〜７及び１３のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１５】
前記対象が、糖尿病に罹患している人類である、請求項８〜１４のいずれか１項に記載のアッセイの使用、又は請求項１〜７及び１３〜１４のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１６】
１つ以上の前記マーカーが、ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン−１、バソプレシン、アドレノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）ペプチド、それらのプロペプチド、及びそれらの３アミノ酸以上の断片からなる群から選択される、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のアッセイの使用、又は請求項１〜７及び１３〜１５のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、対象の心臓血管系に対する影響に関して、食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤を分類するためのインビトロの方法であって、前記１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルを決定する工程を含む、前記方法、並びに当該方法の使用である。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は、しばしば肥満、インスリン過剰症及びインスリン耐性を伴う。この種類の高血圧は、ナトリウム貯留、血管内容積の増大、並びに心拍体積（ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｒｏｋｅ  ｖｏｌｕｍｅ）及び心拍出量（ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）の増大を特徴とする（Ｍｅｓｓｅｒｌｉ  ＦＨ，  ｅｔ  ａｌ．  １９８１  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ，  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｖｏｌｕｍｅ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｒｅｎｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １４１  ：８１−５；  Ｓｔｅｌｆｏｘ  ＨＴ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｉｎ  ｏｂｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ  ｏｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｋｅ  ｖｏｌｕｍｅ．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３４：１２４３−６）。心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）及び脳型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、心疾患又は急性心筋梗塞に関連する壁張力（ｗａｌｌ  ｓｔｒｅｓｓ）に応答して、それぞれＡＮＰとＮ末端プロＡＮＰ（ＮＴ−プロＡＮＰ）、そしてＢＮＰとＮ末端ｐｒｏＢＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）に切断されるプロホルモンとして、心筋細胞中で合成される（Ｒｕｓｋｏａｈｏ  Ｈ  ２００３  Ｃａｒｄｉａｃ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｓ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ２４：３４１−５６；  Ｐｏｔｔｅｒ  ＬＲ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ２７：４７−７２）。高いレベルのナトリウム利尿ペプチドは、新しい有望な心臓血管（ＣＶ）リスクマーカーであり、且つ高い血圧（ＢＰ）、左心室肥大、及びタンパク尿と関連している（Ｏｌｓｅｎ  ＭＨ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏ  ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓ  ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４６：６６０−６）。実際に、幾つかの大掛かりな研究において、死亡率とナトリウム利尿ペプチドレベルとの間に、独立した関連性が見出された（Ｗａｎｇ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｐｌａｓｍａ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：６５５−６３；  Ｂｉｂｂｉｎｓ−Ｄｏｍｉｎｇｏ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  ｂｒａｉｎ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ），  ｃａｒｄｉｏｖａｓ���ｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ，  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊａｍａ  ２９７：１６９−７６；  Ｋｉｓｔｏｒｐ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏ−ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ａｎｄ  ｕｒｉｎａｒｙ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ａｄｕｌｔｓ．  Ｊａｍａ  ２９３：１６０９−１６；  ｖｏｎ  Ｈａｅｈｌｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｉｄｒｅｇｉｏｎａｌ  ｐｒｏ−  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏ−Ｂ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ５０：１９７３−８０）。
【０００３】
最近の研究では、肥満においてナトリウム利尿ペプチドのレベルは抑制されることが報告されている（Ｗａｎｇ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｏｎ  ｐｌａｓｍａ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９：５９４−  ６００；  Ｄａｓ  ＳＲ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄａｌｌａｓ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２：２１６３−８）。肥満は塩の滞留及び心拍出量の増大に関連しているので、ナトリウム利尿ペプチドレベルの増大を引き起こすものと予想されていた。肥満がこれと反対の作用を有するという事実は、直感に反するように見え、非血行力学的要因によるものとされていた。そこで、Ｗａｎｇらは、この逆の関係は、肥満の対象中のナトリウム利尿ペプチドのクリアランスの増大を引き起こす、脂肪組織におけるナトリウム利尿ペプチドクリアランス受容体（ＮＰＲ−Ｃ）の発現の増大によるものと推察した（Ｗａｎｇ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｏｎ  ｐｌａｓｍａ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９：５９４−６００）。しかしながら、Ｄａｓらは、Ｄａｌｌａｓ心臓研究において、ＤＥＸＡにより除脂肪体重（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）及び脂肪体重（ｆａｔ  ｍａｓｓ）を決定し、脂肪体重よりもむしろ除脂肪体重の方が、ＢＮＰレベルの低下と関連していることを観察した（Ｄａｓ  ＳＲ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄａｌｌａｓ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２：２１６３−８）。
【０００４】
幾つかの研究において、ナトリウム利尿ペプチドと代謝症候群の更なる因子との間の関連性が観察された（Ｏｌｓｅｎ  ＭＨ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００８  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎ−  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏ  ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｘ．  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  ２６：２６−３４；  Ｗａｎｇ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１５：１３４５−  ５３）。胴囲の増大、トリグリセリドの増加、ＨＤＬの低下及び空腹時グルコースの増大（Ｗａｎｇ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１５：１３４５−５３）が、血漿ＡＮＰレベルの低下と関連しており、その関連性は、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ心臓研究におけるＢＮＰレベルの低下よりも若干弱かった。Ｄａｎｉｓｈの研究において、ＢＮＰとＢＭＩ、インスリン、グルコース、トリグリセリド及び高血圧との関連性が観察された（Ｏｌｓｅｎ  ＭＨ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏ  ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓ  ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４６：６６０−６）。これらの研究は、ナトリウム利尿ペプチドと幾つかの代謝症候群の特性との間の密接な関連性を実証したが、これらの関連性の背後のメカニズムは、解明されていない。
【０００５】
食後のインスリンレベルを低下させる食事的なアプローチは、血圧の減少において非常に効果的であり（Ａｐｐｅｌ  ＬＪ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔ，  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｉｎｔａｋｅ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｌｉｐｉｄｓ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＯｍｎｉＨｅａｒｔ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ｊａｍａ  ２９４：２４５５−６４）、食後の状態は、代謝症候群の初期において、特に動脈硬化の発症において、重要な役割を果たすと考えられている（Ｈａｎｅｆｅｌｄ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９９  Ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃａｒｏｔｉｄ  ｉｎｔｉｍａ−ｍｅｄｉａ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １４４：２２９−３５；  Ｈａｎｅｆｅｌｄ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  ３９：６２５−６）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、対象の心臓血管系に対する影響に関して、食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤を分類することであった。
【０００７】
驚くべきことに、インスリンは、ＡＮＰの抑制を誘導することが見出された。この関係は、代謝症候群における、インスリン耐性と高血圧との直接的な関連性を提供する。この関係の発見は、更に、対象の心臓血管系に対する影響に関して、食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤を分類するための方法、及びその使用を導き出す。
【０００８】
故に、本発明の主題は、対象の心臓血管系に対する影響に関して、食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤を分類するためのインビトロの方法であって、前記対象中の１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルを決定する工程を含む、前記方法である。
【０００９】
本発明において、「相対レベル」は、基底値に基づく相対濃度として規定され、数式として以下のように表現される：
【化１】
2012507021.tif 000002
ここで、Ｘは、１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの変化のパーセントの値である。
【００１０】
基底値に対する濃度の変化のパーセンテージとして特定される場合もあり、数式として以下のように表現される：
【化２】
2012507021.tif 000003
【００１１】
本発明に係る方法の好ましい態様において、１つ以上の心臓血管マーカーの食後の相対レベルが決定される。
【００１２】
本発明の文脈において、「食後」という用語は、食品及び／又は飲料及び／又は薬剤が対象に摂取され、あるいは投与された後の時間を意味し、食事及び／又は栄養計画の文脈において同様であってもよい。
【００１３】
本発明の文脈において、心臓血管マーカーは、ナトリウム利尿ペプチド（例えば心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳型ナトリウム利尿ペプチド）、アドレノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、エンドセリン、バソプレシンからなる群から選択される、心臓血管疾患（例えば心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全等）の診断及び／又は予測及び／又はモニタリングを提供するペプチド及び／又はタンパク質を意味する。前記心臓血管マーカーの基底レベルは、患者である対象の年齢、肥満度指数、特定の症状／家族歴の遺伝的素因、性別及び民族的背景等の要素に、並びに当該対象の全体的健康状態に依存する。しかしながら、本発明は、これとは対照的に、心臓血管マーカーの基底レベルから心臓血管マーカーの食後のレベルにかけての相対的な変化は、これらの要素から本質的に独立しており、対象に投与された食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤に強く依存するという知見に基づく。
【００１４】
本発明の方法の特に好ましい態様において、１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルは、１ｎｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、なおもより好ましくは１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下の検出感度の下限を有するアッセイを用いて決定される。更に、前記アッセイのアッセイ間の正確性は、通常の範囲内で、好ましくは＜３０％、より好ましくは＜２０％である。更に、前記アッセイのアッセイ内の正確性は、測定範囲内で、好ましくは＜１０％、より好ましくは＜５％である。ここで、「アッセイ内の正確性」は、特定のアッセイの単一バッチ内の測定間のばらつきを意味し、そして「アッセイ間の正確性」は、特定のアッセイの、異なる場所、日時に、異なる実施者により実施されてもよい、複数のバッチ内の測定間のばらつきを意味する。故に、上記用語は、関連するアッセイを用いて取得した結果の再現性の尺度に関連する。「測定範囲」は、アッセイの検出の上限及び下限を意味する。
【００１５】
前記アッセイは、少なくとも、変化及び差異（ｖａｒｉａｎｃｅ）の増大及び減少を検出するのに十分な感度である。健康な対象において、所定のバイオマーカーの通常の範囲は、ガウス分布に対応する。
【００１６】
更に、本発明の態様は：
ａ）前記対象中の１つ以上の心臓血管マーカーの基底レベルを決定する工程、
ｂ）前記１つ以上の心臓血管マーカーの食後のレベルを決定する工程、
ｃ）工程ａ及びｂで取得した数値から、前記１つ以上の心臓血管マーカーの相対レベルを計算する工程
を更に含む、本発明のインビトロの方法である。
【００１７】
ここで、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤の摂取、吸収又は他の方法での適用は、前記レベルの相対的な低下又は増大に関して、前記対象中の１つ以上の心臓血管マーカーのレベルに対する影響に関連する。
【００１８】
本発明の文脈において、「基底レベル」という用語は、食物、飲料、食事、栄養計画又は薬剤等の因子の影響を受けていない対象の、心臓血管ペプチド等の特定の化合物、分子又は代謝物の個体内のレベルを意味する。前記基底レベルは、絶食の約１２時間後の各対象について個別に決定される。ここで、絶食とは、対象が、水及び／又は必須の医薬を除き、一定の時間にわたり、食物、飲料又は薬剤を摂取あるいは消費しないことを意味する。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、前記対象中の前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの５％超、好ましくは５〜２０％の食後の相対的な増大は、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤の前記対象の心臓血管系に対する正の影響と関連付けられ、前記対象中の前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの約５％の食後の相対的な増大又は減少は、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤の前記対象の心臓血管系に対する中程度の影響と関連付けられ、そして前記対象中の前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの５％超の食後の相対的な低下は、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤の前記対象の心臓血管系に対する負の影響と関連付けられる。
【００２０】
前記心臓血管系に対する正の影響は、医学的には、前記対象の心臓血管系の改善、あるいは対象が健康な場合は、当該対象の健康状態の維持である。
【００２１】
前記心臓血管系に対する中程度の影響は、医学的には、前記対象の心臓血管系の健康状態の維持である。
【００２２】
前記心臓血管系に対する負の影響は、医学的には、前記対象の心臓血管系の健康状態の悪化である。
【００２３】
前記対象の心臓血管系の正の影響は、心臓血管のリモデリング及び心臓血管の機能の改善を含んでもよく、具体的には、及び好ましくは、心筋梗塞、高血圧、並びに心臓及び血管の機能不全及び心不全の発症を含んでもよい。
【００２４】
他の好ましい態様において、前記対象中の心臓血管マーカーの基底レベル及び心臓血管マーカーの食後レベルは、免疫アッセイを用いて決定される。
【００２５】
前記診断的アッセイは、診断分野で利用される任意の種類のものであることができ、酵素反応、発光、蛍光、又は放射化学に基づくアッセイ方法を含むが、それらに限定されない。好ましい検出方法として、ストリップ試験、放射性免疫アッセイ、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、イムノブロットアッセイ、酵素連結免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘベースビーズアッセイ、及びタンパク質マイクロアレイアッセイ等が挙げられる。更に、前記の種類のアッセイは、マイクロタイタープレートベース、チップベース、ビーズベースで行われることができ、ここでバイオマーカータンパク質は、表面に結合され、又は溶液であることができる。前記アッセイは、均一又は不均一なアッセイ、サンドウィッチアッセイ、競合及び非競合アッセイであることができる（Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｅｄ．  Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＬＴＤ，  Ｏｘｆｏｒｄ；  ３ｒｄ  ｅｄ．  （Ｍａｙ  ２００５），  ＩＳＢＮ−１３：  ９７８−００８０４４５２６７；  Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２００６  Ｆｅｂ；１０（ｌ）：４−１０．  ＰＭＩＤ：  １６３７６１３４）。
【００２６】
本発明の最も好ましい態様において、免疫アッセイとして、（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ  ＮＧ  ｅｔ  ａｌ；  ２００４  ＣｌｉｎＣｈｅｍ  ５０：２３４−６）に記載されるものが使用される。
【００２７】
本発明のインビトロの方法の特に好ましい態様において、前記心臓血管マーカーの１つは、プロＡＮＰである。なおもより好ましくは、前記マーカーの１つは、プロＡＮＰの中央領域（ｍｉｄｒｅｇｉｏｎａｌ）である。最も好ましくは、中央領域プロＡＮＰ５３−９０である。
【００２８】
本発明のインビトロ方法の他の好ましい態様において、前記１つ以上の心臓血管マーカーの食後レベルは、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画の投与後４時間以内、好ましくは２時間以内、より好ましくは１５〜６０分以内に決定される。
【００２９】
本発明のインビトロ方法の他の好ましい態様において、前記食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画の前記１つ以上の心臓血管ペプチドの相対レベルに対する食後の影響は、長期間にわたり、好ましくは１週間、より好ましくは１ヶ月、なおもより好ましくは２ヶ月、なおもより好ましくは半年の期間にわたりモニタリングされる。
【００３０】
本発明の主題は、更に、本発明の方法における、１ｎｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、なおもより好ましくは１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下の感度を有するアッセイの使用である。
【００３１】
本発明の方法の１つの側面において、前記対象の１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの基底レベルに対する変化が決定され、当該変化は低下である。
【００３２】
更に、本発明の主題は、前記対象の１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの基底レベルに対する変化を決定するためのアッセイの使用であって、ここで前記アッセイは、前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの低下を検出でき、且つ前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの増大を検出できる。
【００３３】
本発明において使用されるアッセイの１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの低下を測定する能力は、とりわけ重要であることに留意されたい。特に健康な対象では、当該低下によって、前記１つ以上の心臓血管マーカーが非常に低いレベルになる。故に、ここで使用されるアッセイは、健康な集団中で基底レベルが第９７．５パーセンタイル以内の対象において、前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの低下の測定が可能であるように、超高感度であることが好ましい。
【００３４】
更に、本発明の主題は、前記変化が増大又は低下であり、且つ前記アッセイが１ｎｍｏｌ／Ｌ以下の感度を有する、上記アッセイの使用である。
【００３５】
更に、本発明の主題は、前記対象の１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの基底レベルに対する食後の変化を決定するための、上記アッセイの使用である。
【００３６】
更に、本発明の主題は、前記対象の１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの基底レベルに対する変化（増大又は低下）を決定するための、１ｎｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、なおもより好ましくは１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下の検出感度を有するアッセイの使用である。本発明の好ましい態様において、前記１つ以上の心臓血管マーカーの食後の相対レベルが決定される。特に好ましい態様において、前記心臓血管マーカーの１つはプロＡＮＰである。なおもより好ましくは、前記マーカーの１つは、プロＡＮＰの中央領域である。最も好ましくは、中央領域プロＡＮＰ５３−９０である。
【００３７】
ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０は、プロ心房性利尿ペプチドの中央領域を意味し、プロ心房性利尿ペプチド（プロＡＮＰ）の第５３〜９０アミノ酸を含む。図１を参照されたい。
【００３８】
更に、本発明の主題は、前記対象の１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの基底レベルに対する食後の変化（増大又は低下）を決定するための、好ましくは、１ｎｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１００ｐｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌ以下、なおもより好ましくは１ｐｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以下の検出感度を有するアッセイの使用である。
【００３９】
前記アッセイは、免疫アッセイが好ましい。
【００４０】
更に、本発明の主題は、前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの変化が、対象の心臓血管系に対する影響に関して、食品及び／又は飲料及び／又は食事及び／又は栄養計画及び／又は薬剤を分類するのに使用される、上記で述べたアッセイの使用である。
【００４１】
特定の態様において、前記１つ以上の心臓血管マーカーのレベルの変化は、糖尿病薬剤を分類するのに使用される。
【００４２】
本発明の１つの態様において、前記対象は、健康な、又は症候の無い人類である。
【００４３】
本発明の他の態様において、前記対象は、心臓血管系及び／又は代謝症候群に関連する医学的状態に罹患した人類である。
【００４４】
本明細書中で使用されるとき、「代謝症候群」という用語は、心臓血管疾患及びＩＩ型糖尿病の幾つかのリスク因子の蓄積を意味し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  （ＡＨＡ）  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，  Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＮＨＬＢＩ）  （Ｇｒｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２：  ２７３５−３７５２）により定義され、当該文献は、本明細書中に参照により援用される。前記代謝症候群の重要な要素は、とりわけ、グルコース不寛容性及び脂質異常症、高血圧及び中心性肥満である。以下の５つの基準：胴囲の増大（女性で＞１０２ｃｍ、男性で＞８８ｃｍ）、トリグリセリドの増大（それぞれ≧１５０ｍｇ／ｄＬ／１．７ｍｍｏｌ／Ｌ、又は増大したトリグリセリドのための薬剤処理）、ＨＤＬ−コレステロールの低下（男性でそれぞれ＜４０ｍｇ／ｄＬ／１．０３ｍｍｏｌ／Ｌ；女性でそれぞれ＜５０ｍｇ／ｄＬ／１．３ｍｍｏｌ／Ｌ；又は低下したＨＤＬ−コレステロールのための薬物処理）、血圧の増大（最高血圧≧１３０ｍｍＨｇ、又は最低血圧≧８５ｍｍＨｇ、又は高血圧の病歴を持つ対象における抗高血圧薬物治療）、及び空腹時血糖の増大（＞１００ｍｇ／ｄＬ又は増大したグルコースのための薬物処理）の中で３つが該当した場合、代謝症候群と診断される。
【００４５】
幾つかの変更が加えられたより最近の定義は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｆ．ｏｒｇ／ｗｅｂｄａｔａ／ｄｏｃｓ／ＩＤＦ＿Ｍｅｔａ＿ｄｅｆ＿ｆｉｎａｌ．ｐｄｆ）により提供されている。
【００４６】
本発明の１つの態様において、前記対象は、糖尿病、具体的にはＩＩ型糖尿病に罹患した人類である。
【００４７】
本発明の好ましい態様において、前記心臓血管系及び／又は代謝系に関連する症状は、代謝症候群である。
【００４８】
また、前記心臓血管系及び／又は代謝系に関連する症状は、心臓血管系及び／又は代謝系の故障後の症状を含んでもよい。これらのケースにおいて、健康な食事が、対象の生存率を改善してもよい（ｄｅ  Ｌｏｒｇｅｒｉｌ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ  ｄｉｅｔ，  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：  ｆｉｎａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｙｏｎ  Ｄｉｅｔ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９９；  ９９（６）：  ７７９−８５）。
【００４９】
本発明の他の好ましい態様において、前記心臓血管系及び／又は代謝系に関連する症状は、心筋梗塞（ＭＩ）、冠動脈症候群、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化）、脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、末梢動脈疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、心筋症、ＩＩ型糖尿病、腎不全及び／又は以上の疾患の１つ以上の症状を有する対象、例えば肥満、高血圧、頭痛、腰痛及び呼吸困難からなる群から選択される。
【００５０】
本発明において、１つ以上のマーカーが、ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、バソプレシン（ＡＶＰ）、アドレノメデュリン（ＡＤＭ）、からなる群から選択されるペプチド、並びにそれらのプロペプチド及び３以上、好ましくは５超、より好ましくは６超、なおもより好ましくは７超、なおもより好ましくは１０超、なおもより好ましくは１２超、なおもより好ましくは１５超、最も好ましくは２０以上のアミノ酸の断片である。
【００５１】
ナトリウム利尿ペプチドは、ナトリウム利尿（尿を介してのナトリウムの排出）を誘発するペプチドを指す。種類としては：
・心房性ナトリウム利尿ペプチド
・脳型ナトリウム利尿ペプチド
・Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド
が挙げられる。
【００５２】
本発明において、前記マーカーは、ナトリウム利尿ペプチド、又はそのプロペプチド、又はその３以上、好ましくは５超、より好ましくは６超、最も好ましくは７超のアミノ酸の断片である。
【００５３】
本発明の非常に好ましい態様において、前記心臓血管マーカーの少なくとも１つは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、又はそのプロペプチド、又はその３以上、好ましくは５超、より好ましくは６超、最も好ましくは７超のアミノ酸の断片である。
【００５４】
特に好ましい態様において、前記心臓血管マーカーの少なくとも１つは、ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０、又はその３以上、好ましくは５超、より好ましくは６超、最も好ましくは７超のアミノ酸の断片である。
【００５５】
本発明の文脈において、ＡＶＰは、アルギニンバソプレシン（＝バソプレシン）又はその断片、又はその前駆体若しくはその断片に関する。好ましいＡＶＰの前駆体の断片は、Ｃ末端プロＡＶＰ（ＣＴ−プロＡＶＰ又はコペプチン）である。ＣＴ−プロＡＶＰ１０７−１４５（又はＣＴ−プレ−プロＡＶＰ１２６−１６４）は、本発明の文脈において、特に好ましいマーカーである。
【００５６】
本発明の文脈において、ＡＤＭは、アドレノメデュリン又はその断片、又はその前駆体若しくはその断片に関する。好ましいＡＤＭの前駆体の断片は、中央領域プロＡＤＭ（ＭＲ−プロＡＤＭ）である。ＭＲ−プロＡＤＭ２４−７１（又はＭＲ−プレプロＡＤＭ４５−９２）は、本発明の文脈において、特に好ましいマーカーである。
【００５７】
本発明の文脈において、ＥＴ−１は、エンドセリン１又はその断片、又はその前駆体若しくはその断片に関する。好ましいＥＴ−１の前駆体の断片は、Ｃ末端プロＥＴ−１（ＣＴ−プロＥＴ−１）である。ＣＴ−プロＥＴ−１１５１−１９５（又はＣＴ−プレプロＥＴ−１１６８−２１２）は、本発明の文脈において、特に好ましいマーカーである。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】プロＡＮＰの配列
【図２】プレ−プロＡＤＭの配列
【図３】プロＡＤＭの配列
【図４】ＭＲ−プロＡＤＭの配列
【図５】ＡＤＭの配列
【図６】プレ−プロＥＴ−１の配列
【図７】プロＥＴ−１の配列
【図８】ＥＴ−１の配列
【図９】ＣＴ−プロＥＴ−１の配列
【図１０】Ｂｉｇ−ＥＴ−１の配列
【図１１】プレ−プロＡＶＰの配列
【図１２】プロＡＶＰの配列
【図１３】ＡＶＰの配列
【図１４】ＣＴ−プレ−プロＡＶＰ（コペプチン）の配列
【図１５Ａ】非肥満且つ正常血圧の対象（黒色菱形）、正常血圧且つ中心性肥満の対象（白色菱形）、及び高血圧の対象（黒色三角形）の、血漿ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０を示す。＊は非肥満対肥満且つ正常血圧対象がｐ＜０．０５であること；†は肥満且つ正常血圧対高血圧対象がｐ＜０．００１であること；‡は高血圧対非肥満正常血圧対象がｐ＜０．０１であることを示す。
【図１５Ｂ】非肥満且つ正常血圧の対象（黒色菱形）、正常血圧且つ中心性肥満の対象（白色菱形）、及び高血圧の対象（黒色三角形）の、血清インスリンを示す。＊は非肥満対肥満且つ正常血圧対象がｐ＜０．０５であること；†は肥満且つ正常血圧対高血圧対象がｐ＜０．００１であること；‡は高血圧対非肥満正常血圧対象がｐ＜０．０１であることを示す。
【図１５Ｃ】高インスリン、正常血糖クランプにおける、血漿ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０の抑制を示す。
【図１５Ｄ】クランプの定常状態におけるグルコース注入速度（ＧＩＲ）の値がそれぞれ第２５未満及び第７５超のパーセンタイルとして規定される、インスリン感受性が低い及び高い対象の、デルタＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０を表す。データは、箱髭図により表される。前記箱は、第２５から第７５パーセンタイルまで延びる。中央に線が引かれ第５０パーセンタイルを示す。髭は、最低から最高値までの範囲を表す。
【図１６】Ｎ＝１０の対象において、ｏＧＴＴ後のＮＴ−プロＢＮＰ及びＭＲ−プロＡＮＰの相対濃度の比較を示す。
【実施例】
【００５９】
実験デザイン及び方法
実験プロトコル
実験プロトコルは、Ｐｏｔｓｄａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｉｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙの倫理委員会により承認された。実験の前に、全被験者から、書面による同意を得た。
【００６０】
実験デザイン
対象は、実施中の代謝症候群及び２型糖尿病の原因論のケースコントロール関連実験の一部である（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｂｅｒｌｉｎ−Ｐｏｔｓｄａｍ  Ｓｔｕｄｙ，  ＭＥＳＹ−ＢＥＰＯ）。ドイツのポツダム及びベルリンにおいて、一般集団からボランティアを集めた。ベースラインの試験として、人類学的測定、血液サンプリング、７５ｇ経口グルコース寛容性試験（ｏＧＴＴ）及び個別の生活習慣及び病歴の聞き取りを行った。この集団のサブグループ（ｎ＝３１）は、高インスリン、正常血糖クランプを受け、前記ｏＧＴＴ後の別の日に実施された。
【００６１】
対象
１０８人の非高血圧の対象（５５人が非糖尿病で、５３人が中心性肥満）、及び５４人の本態性高血圧の患者について、実験を行った。高血圧は、最高血圧が＞１４０ｍｍＨｇ、最低血圧が＞９０ｍｍＨｇ、又は抗高血圧治療を受けている者として定義された。薬剤処理を受けた高血圧の対象は、全員、実験前の６ヶ月間、安定な投薬を受けた。肝臓の酵素がそれぞれの正常の限度の２倍以上に増大した、又は血清クレアチニン濃度が増大した（＞１．３ｍｇ／ｄｌ）、又は全身の炎症、心不全及び末期の悪性疾患等の重篤な症状が認められた対象は、実験から除外した。全ての対象は、各人の通常の身体活動を維持し、且つｏＧＴＴ及びクランプ試験前の３日間、＞２００ｇの炭水化物を含む通常の食事を摂るように指示された。抗糖尿病治療を受けた、又は新たに２型糖尿病と診断された対象は、本実験から除外された。
【００６２】
グルコース代謝におけるかく乱の定義は、１９９７  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの、一昼夜の絶食後２時間の７５ｇ  ｏＧＴＴで得られるグルコース値の基準を基礎とした（２０００  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２３  Ｓｕｐｐｌ  １  ：Ｓ４−１９）。
【００６３】
実験手順
全ての試験は、１２時間の一昼夜の絶食後の朝に実施された。ＢＰは、患者を座らせて、Ｏｍｒｏｎ（登録商標）ＨＥＭ７０５ＣＰ血圧計（Ｏｍｒｏｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、訓練された看護士により測定された。２分置きに３回測定を行い、それらの平均から臨床的最高及び最低血圧を求めた。ｏＧＴＴのために、経口グルコース投与から０、３０、６０、９０、１２０及び１８０分後に静脈血液サンプルを採取した。正常グルコース、高インスリン血クランプ：
高インスリン血正常グルコースクランプは、１分間に身体表面積１m2あたり１００ｍＵのヒトインスリンを使用して（Ａｃｔｒａｐｉｄ；  Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）、且つ２０％のグルコースを可変供給（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）して（Ｓｅｒａｇ  Ｗｉｅｓｓｎｅｒ，  Ｎａｉｌａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、１２０分間実施された（ＤｅＦｒｏｎｚｏ  ＲＡ，  ｅｔ  ａｌ．  １９７９  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｌａｍｐ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２３７：Ｅ２１４−２３）。当該クランプの定常状態において、毛細血管中の血糖を、６０分間以上、５．５ｍｍｏｌ／ｌに調整した。推定された定常状態の間で１つの毛細血管中のグルコース濃度が＞１０％の偏差を有する状態を、非定常状態と定義した。当該クランプの毛細血管の血糖値を５分置きにモニタリングし、そのデータを使用して、グルコースの可変供給の調整による血漿グルコースを制御した。
【００６４】
解析手順
静脈血液サンプルを直ちに遠心分離し、解析するまで−７０℃で凍結した。毛細血管グルコース濃度は、Ｄｒ．  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｇ−Ｌのグルコースオキシダーゼ法を使用して決定した（Ｄｒ．  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ，  Ｆｒｅｉｔａｌ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。血清トリグリセリド、全コレステロール及びＨＤＬ−コレステロールを標準的な酵素アッセイにより決定し、そしてこれらのデータからＬＤＬ−コレステロールを算出した（臨床化学の認定研究施設）。ＨｂＡ１ｃは、Ｈｉ−Ａｕｔｏ  Ａ１Ｃ  ＨＡ−８１４０システム（Ｍｅｎａｒｉｎｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定された。血清インスリンは、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，  Ｍｅｒｃｏｄｉａ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定した。ホメオスタシスモデル評価インスリン耐性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）は、空腹時インスリン（ＩＬＶＬ）  ｘ  空腹時グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５で算出した（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＤＲ，  ｅｔ  ａｌ．  １９８５  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍａ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｎ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２８：４１２−９）。
【００６５】
ヒト血漿ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０は、既に記載された方法で決定した（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ  ＮＧ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｉｍｍｕｎｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｄｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏ−ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５０：２３４−６）。
【００６６】
ＮＴ−プロＢＮＰは、電気化学発光免疫アッセイ（ＥＬＩＣＩＡ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して決定した。
【００６７】
統計解析
出願人らは、実験集団を３つのグループ：本態性高血圧患者（ｎ＝５４）、非高血圧中心性肥満対象（ｎ＝５３）、及び非高血圧非中心性肥満対象（ｎ＝５３）に分けた。中心性肥満は、ＡＴＰ  ＩＩＩが定義する代謝症候群の基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  （ＮＣＥＰ）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ  （Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ）．  Ｔｈｉｒｄ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  （ＮＣＥＰ）  ｅｘｐｅｒｔ  ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｂｌｏｏｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  （Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ）．  Ｆｉｎａｌ  ｒｅｐｏｒｔ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２；  １０６：３１４３−３４２１）に従い診断した。
【００６８】
一般的特徴は、平均±ＳＤとして表示する。他のデータは、平均±ＳＥＭとして表示する。全てのデータを、解析前に対数変換した。ｏＧＴＴにおいて、０〜１８０分のデルタＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０を計算した。ＡＮＯＶＡ及びその後の多重グループ比較としてのＳｉｄａｋ試験により、グループの比較を行った。ｏＧＴＴの過程でのＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０のタイムコースの３つのグループ間での比較に、反復測定ＡＮＯＶＡ解析を使用した。Ｐｅａｒｓｏｎ相関により、相関解析を行った。クランプ実験において、インスリン感受性は、クランプ試験の定常状態（３０分以上）におけるグルコース注入速度（ＧＩＲ；ｍｇ／体重ｋｇ・分−１）を定常状態での循環インスリン濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）で割った値として求めた。対のサンプルにおいて、ノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ符号付き検定を使用して、ベースラインのデータ及び定常状態のデータを比較した。全ての解析において、ｐ＜０．０５で有意と見做した。全ての統計解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  １４用のＳＰＳＳを使用して実行した（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。
【００６９】
結果
試験集団の特徴を、表１にまとめている。肥満正常血圧対象は、非肥満正常血圧対象と比較して、よりインスリン耐性が高く：空腹時インスリン及び血中グルコース濃度が高く、ＨＤＬ−コレステロール濃度及びトリグリセリドレベルが低く、そしてＳＢＰ及びＤＢＰが高かった。年齢、ＨｂＡ１ｃレベル及びＳＢＰを除き、肥満かつ高血圧の対象は、肥満だが正常血圧の対象と比較して、ＢＭＩ、胴囲及びインスリン耐性において、同程度であった。
【００７０】
ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０の空腹時濃度は、非肥満正常血圧対象及び肥満高血圧対象（それぞれ６４．１±２５．６ｐｍｏｌ／１及び７７．５±３０．８ｐｍｏｌ／１）と比較して、肥満正常血圧対象で最低値となった（５３．９±２８．０ｐｍｏｌ／１）。年齢及びＢＭＩで補正を行った後も、その差は顕著であった。正常血圧の対象において、空腹時ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０レベルは、有意に、年齢（ｒ＝０．４２９，ｐ＜０．０００１）、ＨＤＬ−コレステロール（ｒ＝０．２７０，ｐ＝０．００６）と正に相関し、そしてＢＭＩ（ｒ＝−０．３１３，ｐ＝０．００１）、ＤＢＰ（ｒ＝−０．２５１，ｐ＝０．００９）、空腹時インスリン（ｒ＝−０．２７６，ｐ＝０．００４）、及びＨＯＭＡ−ＩＲ指数（ｒ＝−０．２６８，ｐ＝０．００５）と負に相関していた。対照的に、肥満で高血圧の対象において、ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０との正の相関は、年齢に限定されていた（ｒ＝０．５４６、ｐ＜０．０００１）。
【００７１】
全ての実験対象において、ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０のレベルは、経口グルコース投与後３０分で急速に低下し、そして試験期間中継続的に抑制されていた（ｐ＜０．０００１；基底レベル対ｏＧＴＴ後３０、６０、９０、１２０及び１８０分のレベル）。ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０の試験後の濃度は、非肥満正常血圧対象及び肥満高血圧対象と比較して、肥満正常血圧対象において、９０〜１８０分から顕著に低下した（図１５Ａ）。１８０分時点でのＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０の相対的な抑制は、非肥満正常血圧対象が２０．０  ±  １３．４  ％で、肥満正常血圧が２１．４  ±  １９．５  ％で、高血圧対象が２１．２  ±  １３．４％であった（顕著ではない）。肥満正常血圧対象において、インスリンの空腹時及びグルコース投与時のレベルは顕著に低下し（図１５Ｂ）、そして６０〜１８０分で正常血圧対象の空腹時及び投与後のＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０レベルと負に相関し（ｒ＝−０．１９８〜−０．３５８；ｐ＜０．０００１〜０．０５）、一方これらの相関は、高血圧の対象の場合よりも格段に弱かった。正常血圧及び高血圧の対象において、空腹時及び投与後の血液グルコースレベルと、ｏＧＴＴ中のＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０レベルとの間に、相関は無かった（データ無し）。
【００７２】
ＢＮＰは、健康な対象において生理的に軽微な役割しか果たさないと考えられているが、通常、ＡＮＰと同様に制御されている。そこで、我々は、ＮＴ−プロＢＮＰレベルが、経口グルコース投与に応答して減少するか否かを試験した。ＮＴ−プロＢＮＰレベルを１０人の対象において評価し、このサブグループ中で、ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０と比較した。実際に、グルコース投与後に、ＮＴ−プロＢＮＰの相対濃度も低下したが、ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０と比較して、反応は一時的で、僅かであった（図１６）。
【００７３】
３１人の肥満の対象（１７人の正常血圧対象及び１４人の高血圧対象）に、正常血糖高インスリン血クランプを実行した。正常血圧対象は、年齢、ＢＭＩ、胴囲及びインスリン感受性で、高血圧対象と同等であった（それぞれ平均±ＳＥで；  ３０．６  ±  ３．５  ｋｇ／m2対３２．０  ±  ３．４  ｋｇ／m2、ｐ  ＝  ０．３４１；  １０１．０  ±  ７．３ｃｍ対１０３．６  ±  ８．８  ｃｍ、ｐ  ＝  ０．５２６；  ６．１  ±  １．６  ｍｇ／体重ｋｇ  ｘ分−１対５．５  ±  ２．０  ｍｇ／体重ｋｇ  ｘ分−１、  ｐ  ＝  ０．３８８）。空腹時血糖、インスリン及びＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０レベルは、正常血圧と高血圧の対象との間で差は無かった（それぞれ平均±  ＳＥで；  ５．２  ±  ０．５  ｍｍｏｌ／ｌ対５．４  ±  ０．６  ｍｍｏｌ／ｌ、ｐ  ＝  ０．１４７；  ６６．０  ±  ４０．２  ｐｍｏｌ／ｌ対７６．２  ±  ３９．０  ｐｍｏｌ／ｌ、ｐ  ＝  ０．４７０；  ５９．５  ±  １８．３  ｐｍｏｌ／ｌ対６１．０  ±  ３１．５  ｐｍｏｌ／ｌ、ｐ  ＝  ０．８７４）。正常血糖クランプにおいて、循環インスリンレベルは、１２０分のクランプで、正常血糖対象で１２２３ｐｍｏｌ／ｌまで（７０８〜２１０６）、そして高血圧対象で１２４７ｐｍｏｌ／ｌまで（４３０〜１４７６）増大した（ｐ＝０．４８９）。両方のグループにおいて、１２０分のクランプで、ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０レベルは基底値と比較して顕著に低下したが、両方のグループ間で差は無かったｇｒｏｕｐｓ  （ΔＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０は１２０分のクランプで、正常血圧対象が１１．１  （−１．３〜２５．１）  ｐｍｏｌ／ｌ、高血圧対象で８．５  （−３５．２  −  ３４．６）  ｐｍｏｌ／ｌ、ｐ  ＝  ０．２９７）  （図１５Ｃ）。インスリン感受性が高い対象と低い対象（グルコース注入速度がそれぞれ第２５パーセンタイル未満及び第７５パーセンタイル超であるものとして決定される）との間で、ＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０の抑制の差は無かった（図１５Ｄ）。
【００７４】
健康な対象（ｎ＝２６４）における平均のＭＲ−プロＡＤＭは、０．３３  ｎｍｏｌ／Ｌ  （標準偏差０．０７  ｎｍｏｌ／Ｌ）、範囲０．１〜０．６４  ｎｍｏｌ／Ｌ、第９９パーセンタイルが０．５２  ｎｍｏｌ／Ｌ、第９７．５パーセンタイルが０．４９  ｎｍｏｌ／Ｌ、第２．５パーセンタイルが０．１７  ｎｍｏｌ／Ｌ、第１パーセンタイルが０．１４  ｎｍｏｌ／Ｌであった。このアッセイの検出の下限は、０．０８  ｎｍｏｌ／Ｌであった（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５１（１０）：１８２３−１８２９）。
【００７５】
健康な対象（ｎ＝３２５）におけるＭＲ−プロＡＮＰ５３−９０濃度の中央値は、４５ｐｍｏｌ／Ｌ、範囲９．６〜３１３ｐｍｏｌ／Ｌ、第９９パーセンタイルが１９７．５ｐｍｏｌ／Ｌ、第９７．５パーセンタイルが１６３．９ｐｍｏｌ／Ｌ、第２．５パーセンタイルが１８．４ｐｍｏｌ／Ｌ、第１パーセンタイルが１３．６ｐｍｏｌ／Ｌであった。このアッセイの検出の下限は、６．０ｐｍｏｌ／Ｌであった（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５０（ｌ）：２３４−  ２３６）。
【００７６】
健康な対象（ｎ＝３５９）におけるＣＴ−プロＡＶＰ濃度の中央値は、４．２ｐｍｏｌ／Ｌ、範囲１〜１３．８ｐｍｏｌ／Ｌ、第９９パーセンタイルが１３．５ｐｍｏｌ／Ｌ、第９７．５パーセンタイルが１１．２５ｐｍｏｌ／Ｌ、第２．５パーセンタイルが１．７ｐｍｏｌ／Ｌであった。このアッセイの検出の下限は、１．７ｐｍｏｌ／Ｌであった（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５２（１）：１１２−１１９）。３５９人中９人は、ＣＴ−プロＡＶＰ値が検出限界を下回り、それらは１．０  ｐｍｏｌ／Ｌとした。
【００７７】
健康な対象（ｎ＝３２６）における平均のＣＴ−プロＥＴ−１は、４４．３ｐｍｏｌ／Ｌ  （標準偏差１０．６ｐｍｏｌ／Ｌ）、範囲１０．５〜７７．４ｐｍｏｌ／Ｌ、第９９パーセンタイルが７２．８ｐｍｏｌ／Ｌ、第９７．５パーセンタイルが６６．６ｐｍｏｌ／Ｌ、第２．５パーセンタイルが２４．８ｐｍｏｌ／Ｌ、第１パーセンタイルが１７．４ｐｍｏｌ／Ｌであった。このアッセイの検出の下限は、０．４ｐｍｏｌ／Ｌであった（Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５２（６）：１１４４−１１５１）。
【００７８】
健康な対象（ｎ＝２２６４）における平均のＮＴ−プロＢＮＰ濃度は、５．９４ｐｍｏｌ／Ｌ  （標準偏差７．３６ｐｍｏｌ／Ｌ）、中央値が３．２５ｐｍｏｌ／Ｌ、第９７．５パーセンタイルが１９．９４ｐｍｏｌ／Ｌ、そして第９５パーセンタイルが１７．５８ｐｍｏｌ／Ｌであった。このアッセイの検出の下限は、０．５９ｐｍｏｌ／Ｌであった（Ａｓｓａｙ  ｐｒｏＢＮＰ  ＩＩ  ｃｏｂａｓ  ｂｙ  Ｒｏｃｈｅ；  ｍａｎｕａｌ  ２００７−０９  Ｖ２）。
【００７９】
【表１】
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他に言及されていない限り、数値は、平均±ＳＤである。全ての数値は調整されていない。非肥満非高血圧対象では、ａはｐ＜０．０００１；  ｂはｐ＜  ０．０１；  ｃはｐ＜０．０５であり、肥満非高血圧対象では、ｄはｐ＜０．０００１；  ｅはｐ＜０．０５である。肥満は、代謝症候群におけるＡＴＩＩＩ基準（胴囲が女性で＞８８ｃｍ、男性で＞１０２ｃｍ）による「中心性肥満」を指す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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