(57)【要約】  組換えクローンが誘導物質の存在下で蛍光を示すか、または色を示すことを特徴とする、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクター。修飾されたベクターを含む組換えクローンであって、興味ある遺伝子と関連する終止コドンの適当なサプレッサー株において蛍光または色を示す組換えクローンの同定および選択のための方法。興味ある遺伝子および修飾されたベクターを含む組換えクローンの製造方法であって、レポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを含む特定のプライマーを使用して、興味ある遺伝子を増幅し；修飾されたベクターに増幅された興味ある遺伝子をクローニングし、クローン化された修飾されたベクターにて終止コドンサプレッサー宿主細胞を形質転換することを含み、該終止コドンサプレッサー宿主細胞は興味ある遺伝子で使用される終止コドンに対して特異的であり、該組換えクローンは使用されるレポーター遺伝子に依存して蛍光または色のいずれかを示す方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えクローンが誘導物質の存在下で蛍光を示すか、または色を示すことを特徴とする、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクター。
【請求項２】
終止コドンがＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡから選択される、請求項１に記載の修飾されたベクター。
【請求項３】
レポーター遺伝子が、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ遺伝子、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）、置換されたｐ−ニトロフェニルリン酸およびそれらの変異体を含む群から選択される、請求項１に記載の修飾されたベクター。
【請求項４】
ベクターがプラスミド、コスミドおよびファージから選択される、請求項１に記載の修飾されたベクター。
【請求項５】
組換えクローンが興味ある遺伝子と関連する終止コドンの適当なサプレッサー株において蛍光または色を示す、請求項１に記載の修飾されたベクターを含む組換えクローンの同定および選択のための方法。
【請求項６】
終止コドンがＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡから選択され得る、請求項５に記載の組換えクローンの同定および発現のための方法。
【請求項７】
レポーター遺伝子が、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ遺伝子、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）、置換されたｐ−ニトロフェニルリン酸およびそれらの変異体であってもよい、請求項５に記載の組換えクローンの同定および発現のための方法。
【請求項８】
（ａ）ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを導入し；
（ｂ）プライマーを使用してレポーター遺伝子を増幅し；
（ｃ）ベクターにおけるレポーター遺伝子をクローニングする；
ことを含む、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターの製造方法であって、
修飾されたベクターは、非サプレッサー株宿主に導入されたとき、誘導時に蛍光または色を示さない方法。
【請求項９】
終止コドンがＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡから選択される、請求項８に記載の修飾されたベクターの製造方法。
【請求項１０】
レポーター遺伝子が、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｂｅｔａ−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）、ベータグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）、置換されたｐ−ニトロフェニルリン酸およびそれらの変異体であってもよい、請求項８に記載の修飾されたベクターの製造方法。
【請求項１１】
興味ある遺伝子および修飾されたベクターを含む組換えクローンの製造方法であって、該方法は：
（ａ）レポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを含む特定のプライマーを使用して、興味ある遺伝子を増幅し、
（ｂ）修飾されたベクターに増幅された興味ある遺伝子をクローニングし、
（ｃ）クローン化された修飾されたベクターで終止コドンサプレッサー宿主細胞を形質転換する
ことを含み、
該終止コドンサプレッサー宿主細胞は、興味ある遺伝子で使用される終止コドンに対して特異的であり、該組換えクローンは、使用されるレポーター遺伝子に依存して蛍光または色のいずれかを示す方法。
【請求項１２】
終止コドンが、レポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なるＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡから選択される、請求項１１に記載の組換えクローンの製造方法。
【請求項１３】
レポーター遺伝子が、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｂｅｔａ−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）、ベータグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）、置換されたｐ−ニトロフェニルリン酸およびそれらの変異体から選択される、請求項１１に記載の組換えクローンの製造方法。
【請求項１４】
組換えクローンが、非サプレッサー宿主細胞において発現される場合、蛍光または色を示さず、興味あるタンパク質を生産する、請求項１１に記載の組換えクローンの製造方法。
【請求項１５】
修飾されたベクターを含む組換えクローンの同定および発現のためのキットであって、該修飾されたベクターが終止コドンを有するレポーター遺伝子を含むキット。
【請求項１６】
終止コドンがＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡから選択される、請求項１５に記載の組換えクローンの同定および発現のためのキット。
【請求項１７】
レポーター遺伝子が、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ遺伝子、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）、置換されたｐ−ニトロフェニルリン酸およびそれらの変異体であってもよい、請求項１５に記載の組換えクローンの同定および発現のためのキット。
【請求項１８】
レポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを有する興味ある遺伝子をさらに含む、請求項１５に記載の組換えクローンの同定および発現のためのキット。
【請求項１９】
蛍光または発色組換えクローンを使用して融合タンパク質として発現される外来タンパク質の溶解度を示すためのキットであって、色の強度が、請求項１に記載の修飾されたベクターを使用して同定およびスクリーニングされた組換えクローンを使用して発現される外来タンパク質の溶解度指標により示されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子をライゲートすることにより製造され、それにより宿主細胞に導入されたときに蛍光または色を示さない、修飾されたベクターに関する。本発明は、また、修飾されたベクターを生産する方法ならびに組換えクローンの同定およびスクリーニングの方法に関する。また、該ベクターを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分子クローニングは、個々の遺伝子およびその産物の構造、機能および調節を理解するための努力において重要なツールである。分子クローニングは、自ら複製する能力を有さない大量の同一のＤＮＡフラグメントを生産するために、細菌細胞の迅速な増殖を活用するための手段を提供する。分子クローニングの力は驚くべきものである。すなわち、クローン化ヒトＤＮＡの一本鎖フラグメントを増幅するために加工された細菌細胞１リットルによって、人体全体に含まれる全細胞から精製することができる特定のＤＮＡセグメントの量の約１０倍を生産することができる。
【０００３】
組換えＤＮＡは、２つの部分、すなわち、ベクターおよび興味ある遺伝子（ＧＯＩ）であるパッセンジャー配列からなる。ベクターは、ベクターにおける複製配列の起点の存在によって複製機能に寄与する。ベクターおよびパッセンジャーＤＮＡを結合するプロセスは、ライゲーションと呼ばれる。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ酵素は、ＡＴＰエネルギーを使用することによりライゲーションプロセスを行い、ベクターとパッセンジャー配列との間にホスホジエステル結合を作る。ベクターおよびパッセンジャーＤＮＡフラグメントが同じ制限エンドヌクレアーゼの作用により作製されるとき、それらは、それらそれぞれの末端の適合性によって、塩基対合により結合する。次に、このような構築物を原核生物細胞に形質転換し、ここに、該構築物および本質的には該パッセンジャー配列の無制限のコピーが細胞内で作られる。
【０００４】
次の工程は、非組換え体から組換えクローンをスクリーンニングし、同定することである。組換えクローンをスクリーニングするために開発された方法は多数存在し、該方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ブルー・ホワイトスクリーニング、何らかの外来遺伝子の挿入時に不活化される致死遺伝子を有するベクター、クローニング時に蛍光または色のいずれかが消失するレポーター遺伝子の使用、および当分野の他の方法を含む。
【０００５】
一般的に使用されるレポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｂｅｔａ−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）、ベータグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）、ヒト増殖ホルモン遺伝子（ｈＧＨ）およびベータ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｅｔａ−ｌａｃ）である。ウミシイタケ(Renilla)のような他の供給源およびプチロサルクス(Ptilosarcus)由来のＧＦＰも使用され得る。細菌、酵母および哺乳動物宿主細胞を含む宿主細胞、ならびにそれぞれのルシフェラーゼおよびＧＦＰならびにルシフェラーゼおよびＧＦＰの組合せをコードする核酸の発現のためのプラスミドは、選択された宿主細胞または宿主、例えば、ヒトおよび他の哺乳動物における発現のために最適化されたコドンの置換によりこれらの宿主において使用されてもよく、または発光特性を変化させるように変異させることができる。
【０００６】
他方では、組換え株の直接選択（ポジティブ選択）を可能にする種々のクローニングベクターが、科学文献において記載されている。
【０００７】
組換えプラスミド（興味ある遺伝子を有する）を有する細菌性形質転換体をスクリーニングするプロセスは、視覚的に検出可能なレポーター遺伝子を有するベクターの使用により、より迅速かつ簡単にされる。ブルー・ホワイトスクリーニングは、ベクターに基づく遺伝子クローニングにおける成功したライゲーションの検出を可能にする、このような分子技術の一例である（Gronenborn and Messing, 1978）。この技術の根幹を成す分子メカニズムは、クローニングベクターで達成されるサブユニット相補性と組み合わせられた、宿主として働く大腸菌の実験室株において存在するｌａｃオペロンの遺伝子工学に基づく。
【０００８】
例えば、市販されているベクターｐＢＬＵＥｓｃｒｉｐｔが内部のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）においてＬａｃＺタンパク質のサブユニットをコードし、宿主株の染色体が残存Ｏサブユニットをコードし、ラクトース代謝に関与する機能性ベータガラクトシダーゼ酵素を形成する。そのため、正しい型のベクターおよびコンピテント細胞の選択が、ブルー・ホワイトスクリーニングに関する重要な問題である。マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、異なる制限酵素により開裂することができ、その結果、外来ＤＮＡをｌａｃＺ遺伝子内に挿入することができ、したがって機能性ベータガラクトシダーゼの生産が破壊される。ベクターのみを含む大腸菌細胞が、ベータガラクトシダーゼにより代謝される無色の修飾されたガラクトース糖である人工基質Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  Ｒガラクトシド）の存在下で増殖されるとき、コロニーは、青色の最終産物を生じる活性酵素の生産によって青色になる。他方では、外来ＤＮＡの断片がＭＣＳに挿入されたとき、ｌａｃＺ遺伝子は、活性なタンパク質フラグメント、したがって機能性ベータガラクトシダーゼを作ることができず、その結果として、クローン化された外来ＤＮＡを含む細菌のコロニーは白色っぽく見える。Ｌａｃオペロンの誘導物質として機能するイソプロピル  ｂ  Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、青色の表現型を増強するために、いくつかの株に使用することができる。
【０００９】
ブルー・ホワイトスクリーニング技術は、クローンの選択のための方法よりはむしろスクリーニング方法（識別）に関する。識別は、色に基づいてクローン集団内の組換え体を同定することに基づく。組換え体を作製するために使用されるベクターにおいてＬａｃＺ遺伝子は、非機能性であり得、ベータ−ガラクトシダーゼを生産することができない。結果として、これらの細胞は、Ｘ−ｇａｌを青色物質に変換することができないので、プレート上で見られる白色コロニーは、組換え体ではなく単なるバックグラウンドベクターである場合があり、かくして、誤った結果をもたらすことがある。さらに、この複雑な手順は、非常に高価で、不安定で、かつ扱いにくい基質Ｘ−ｇａｌの使用を必要とする。
【００１０】
ｌａｃＺおよび多数の他の系は大腸菌のようなグラム陰性細菌に対して広範囲に使用されるが、グラム陽性細菌において形質転換された組換え体をスクリーニングするために利用できる選択としては限定される。
【００１１】
１９９８年にＣｈａｆｆｉｎおよびＲｕｂｅｎｓは、組換えプラスミドを同定するために、アルカリホスファターゼ遺伝子ｐｈｏＺの妨害を利用するグラム陽性クローニングベクターｐＪＳ３を開発した。マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を、ｐｈｏＺの推定シグナルペプチドをコードする領域より遠位に挿入した。誘導体ｐｈｏＺ遺伝子（ｐｈｏＺＭＣＳ）から発現されるアルカリホスファターゼは、天然のタンパク質のものと同様の活性を維持し、細胞は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Ｘ−ｐ）を含む寒天上で青色コロニーの表現型を示した。ｐｈｏＺのＭＣＳへの外来ＤＮＡの導入は、Ｘ−ｐを含む寒天上で白色コロニーの表現型を生じ、組換えプラスミドを含む形質転換体と自己−アニール化または無傷ベクターを維持するものとの識別を可能にした。このクローニングベクターは、グラム陽性細菌における組換えＤＮＡ実験の効率を改善させた。
【００１２】
組換えクローンのスクリーニングおよび同定のための他の方法は、クラゲのオワンクラゲ(Aqueorea victoris)から得られた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用することによる。それは、遺伝子発現、タンパク質局在化、タンパク質−タンパク質相互作用をモニタリングするためのレポーター分子である。ＧＦＰは、細菌、酵母、粘菌、植物、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよび哺乳動物細胞において発現されている。Inouye et al (1997)には、組換えプラスミドをスクリーニングするための指標として、変異オワンクラゲ(Aequorea)ＧＦＰタンパク質を有する細菌クローニングベクターが記載されている。ｐＧＲＥＥＮｓｃｒｉｐｔ  Ａは、大腸菌において発現されるとき、自然光において黄色および長波長−ＵＶ下で強い緑色蛍光を示すコロニーを生産した。挿入された外来遺伝子は、ＧＦＰ生産の不活化により引き起こされる蛍光の喪失に基づいて選択される。
【００１３】
組換えクローンのスクリーニングおよび同定のために、ＧＦＰ遺伝子または蛍光を有する他の何らかのレポーター遺伝子を使用することによる蛍光技術およびｌａｃＺ遺伝子を使用する色技術（ブルー・ホワイトスクリーニング技術）を使用すると、誤った結果と関連することが観察されている。ブルー・ホワイトスクリーニング技術は、組換えクローンに対して白色コロニーおよび非組換えに対して青色コロニーを与える。しかし、それと共に、いくつかの薄い青色コロニーも見られる。発明者らは、白色コロニーが組換えクローンを含まない場合もあることも観察した。したがって、この技術は正確なスクリーニングを提供せず、約５−１０％の偽陽性を与える(Godisak R etal, Beyond pUC: Vectors for cloning unstable DNA)。この技術は、青色を増強するためにプレートを４０℃で維持しなければならないので、扱いにくい。また、この技術は、ＸｇａｌおよびＩＰＴＧのような高価な誘導物質の使用を必要とする。同様の誤った結果が、ＧＦＰ遺伝子およびその変形が組換えクローンのスクリーニングおよび同定のための蛍光技術において使用される場合に見出されている。
【００１４】
したがって、組換えクローンのスクリーニングおよび同定のために一般的に使用される方法は、偽陽性結果の問題と関連する。したがって、組換えクローンのスクリーニングおよび同定の既存の技術と関連するすべての不都合を克服する必要がある。さらに、クローニングベクターおよび発現ベクターの両方として作用するベクターを提供することが必要である。
【００１５】
ＵＳ２００６００９９６７３は、終止コドン抑制による新規組換え遺伝子発現方法を記載している。それは、翻訳停止シグナルにより上流に配置された興味ある遺伝子から分離される選択可能なマーカータンパク質をコードする遺伝子を含み、それにより両方の遺伝子が翻訳的にライゲートされている、新規組換え遺伝子発現ベクターに基づく新規組換え遺伝子発現方法を記載している。結果として、該選択可能なマーカー遺伝子の発現は、該興味ある遺伝子の発現率と比較して減少され得る。それは、また、構築物においてサプレッサーエレメント（ＳＥＣＩＳ）を使用して終止コドンを抑制することによる、該興味ある遺伝子の発現を記載している。さらに、リボソームの自然エラー率によって、融合タンパク質（興味ある遺伝子およびレポーター遺伝子のタンパク質）が合成され、融合タンパク質合成は、純粋に宿主の自然エラー率に依存する。
【００１６】
しかしながら、本発明は、２つの終止コドンを使用する。終止抑制は、非常に指向性／指示的である。特定のサプレッサー細胞系が形質転換のために使用されるクローンの選択中の第１の終止コドンは、融合タンパク質を生産し、それは、使用されるレポーター遺伝子の型に依存して選択プロセスに役立つ。第２の終止コドンは、非サプレッサー細胞系における真の興味あるタンパク質のために主に使用される。
【００１７】
したがって、本発明は、クローニング時に細胞に蛍光を発せさせ、偽陽性結果がない新規なベクターを構築することによって、先行技術と関連する不都合を克服する。このように、単一クローンは、直接、スクリーニングおよび発現試験のために使用することができる。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の目的
したがって、本発明の１つの目的は、マルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子をライゲートすることにより製造された修飾されたベクターであって、宿主細胞に導入されたときに蛍光または色を示さない修飾されたベクターである。本発明の他の目的は、興味ある遺伝子を含む組換えクローンの同定およびスクリーニングのための方法であって、修飾されたベクター中の終止コドンを、レポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを有する興味ある遺伝子と置き換えることを含み、それにより、該組換えクローンが、興味ある遺伝子と関連する終止コドンの適当な抑制株において蛍光または色を示し、非サプレッサー株における発現時に蛍光または色を示さず、真の興味あるタンパク質が得られる方法である。
【００１９】
本発明の他の目的は、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターである。
【００２０】
本発明の他の目的は：
（ａ）ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを導入し、
（ｂ）プライマーを使用してレポーター遺伝子を増幅し、
（ｃ）ベクターにおけるレポーター遺伝子をクローニングする、
ことを含む、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターの製造方法であって、
該修飾されたベクターは、非サプレッサー大腸菌宿主に導入されたとき、誘導時に発現されるとき蛍光または色を示さない、方法である。
【００２１】
本発明の他の目的は、興味ある遺伝子および修飾されたベクターを含む組換えクローンの製造方法であって、該方法は：
（ａ）レポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを含む特定のプライマーを使用して、興味ある遺伝子を増幅し、
（ｂ）修飾されたベクターに該増幅された興味ある遺伝子をクローニングし、
（ｃ）クローン化された修飾されたベクターで終止コドンサプレッサー宿主細胞を形質転換する
ことを含み、
該終止コドンサプレッサー宿主細胞は、興味ある遺伝子で使用される終止コドンに対して特異的であり、該組換えクローンは、使用されるレポーター遺伝子に依存して蛍光または色のいずれかを示す方法である。
【００２２】
本発明の他の目的は、終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターを含む組換えクローンの同定および発現のためのキットである。
【００２３】
本発明の他の目的は、組換えクローンを使用して発現される外来タンパク質の溶解度を示すためのキットであって、外来タンパク質は修飾されたベクターを使用して同定されスクリーニングされた組換えクローンを使用して発現されるキットである。
【００２４】
発明の概要
したがって、本発明の１つの局面は、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子をライゲートすることにより製造され、それにより、宿主細胞に導入されたとき、蛍光または色を示さない修飾されたベクターに関する。
【００２５】
本発明の他の態様において、興味ある遺伝子を含む組換えクローンの同定およびスクリーニングのための方法であって、該方法は、修飾されたベクターにおける終止コドンを、レポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを有する興味ある遺伝子と置き換えることを含み、それにより、組換えクローンが、興味ある遺伝子と関連する終止コドンの適当な抑制株において蛍光または色を示し、非サプレッサー株における発現において蛍光または色を示さず、真の興味あるタンパク質が得られる方法が提供される。
【００２６】
本発明の他の態様において、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターが提供される。
【００２７】
本発明の他の態様において、
（ａ）ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを導入し、
（ｂ）プライマーを使用してレポーター遺伝子を増幅し、
（ｃ）ベクターにおけるレポーター遺伝子をクローニングする、
ことを含む、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターの製造方法であって、
該修飾されたベクターは、非サプレッサー大腸菌宿主に導入されたとき、誘導時に発現されるとき蛍光または色を示さない方法が提供される。
【００２８】
本発明の他の態様において、興味ある遺伝子および修飾されたベクターを含む組換えクローンの製造方法であって、該方法は：
（ａ）レポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを含む特定のプライマーを使用して、興味ある遺伝子を増幅し、
（ｂ）修飾されたベクターに該増幅された興味ある遺伝子をクローニングし、
（ｃ）クローン化された修飾されたベクターで終止コドンサプレッサー宿主細胞を形質転換する
ことを含み、
該終止コドンサプレッサー宿主細胞は、興味ある遺伝子で使用される終止コドンに対して特異的であり、該組換えクローンは、使用されるレポーター遺伝子に依存して蛍光または色のいずれかを示す方法が提供される。
【００２９】
本発明の他の態様において、修飾されたベクターを含む組換えクローンの同定および発現のためのキットであって、該修飾されたベクターが終止コドンを有するレポーター遺伝子を含むキットを提供する。
【００３０】
本発明の他の態様において、組換えクローンを使用して発現される外来タンパク質の溶解度を示すためのキットであって、外来タンパク質が修飾されたベクターを使用して同定されスクリーニングされた組換えクローンを使用して発現されるキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＭＣＳの上流にＴＡＡ導入を有するｐＥＴ２１ａベクターのプラスミドマップ。
【図２】ｐＢＡＤ２４−ＧＦＰのクローンの制限解析。
【図３】ｐＢＡＤ２４−ＧＦＰクローン（ｐＬＵＢＴ１３３）のプラスミドマップ。
【図４】ｐＬＵＢＴ１３３からのＧＦＰ挿入物の放出。
【図５】ｐＥＴ２１ａ  ＧＦＰの確認のためのコロニーＰＣＲスクリーニング。
【図６】ｐＥＴ２１ａ−ＧＦＰクローン（ｐＬＵＢＴ１６６）のプラスミドマップ。
【図７】修飾されたｐＥＴ２１ａ−ＧＦＰの確認のためのコロニーＰＣＲスクリーニング。
【図８】ｐＥＴ２１ａ修飾−ＧＦＰクローン（ｐＬＵＢＴ１７９）のプラスミドマップ。
【図９】ｐＥＴ２１ａ−ＧＦＰおよびｐＥＴ２１修飾−ＧＦＰクローンにおけるＧＦＰ発現。
【図１０】酵素ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの二重消化(double digestion)によるクローン５、６、７、８、２０におけるＮｄｅＩ修飾の確認。
【図１１】ｐＬＵＢＴ  １８９のプラスミドマップ。
【図１２】ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＬＵＢＴ１８９。
【図１３】ＧＦＰ  ＰＣＲによるｐＢＡＤ２４におけるＧＦＰフラグメント挿入の確認。
【図１４】ｐＬＵＢ１９１のプラスミドマップ。
【図１５】アンバーストップにおけるＳＡＫ  ＰＣＲ。
【図１６】発光コロニーは＃１、４、８、９、１０などであり、非発光コロニーは＃５、６、１８、４２および４８である。
【図１７】ＳＡＫ遺伝子およびＧＦＰ遺伝子に関するＰＣＲ。
【図１８】非アンバーサプレッサー株におけるＳＡＫ−ＧＦＰ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＦ。
【図１９】ｐＬＵＢＴ１９１および１９６の構築に関する略図。
【図２０】融合タンパク質ＳＡＫ−ＧＦＰおよびＧＣＳＦ−ＧＦＰの相対的蛍光強度。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
全ての文献に記載されているベクターおよび市販されているベクターは、挿入不活化による色消失またはクローニング時の蛍光消失のいずれかを有する。これらの方法は、色または蛍光消失が完全に達成されない、すなわち、バックグラウンド色または蛍光の可能性があるため、偽陽性結果を生じ得る。
【００３３】
したがって、本発明は、組換え細胞が蛍光または色を示し、非組換え細胞が蛍光または色を示さない、組換えクローンのスクリーニングおよび同定のための修飾されたベクターの構築を含む。これは、先行技術と関連する偽陽性結果を回避する。このベクターは、さらに発現試験のために使用することができる。
【００３４】
本発明に関して、ベクターはプラスミド、ファージ、コスミドなどから選択されるが、限定はしない。
【００３５】
本発明において使用するために適当なベクターは多数あり、ベクターのリストは当分野で見い出すことができる。ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓおよび発現ベクターを製造している他の会社から市販されている。細菌プロモーターを有するすべてのベクターが使用され得る。
【００３６】
特に適当なベクターは、原核、真核およびウイルス配列を含むプラスミドベクターである。これらのベクターのリストは、Gene Transfer and Gene Expression: A Laboratory Manual, Ed. Kriegler, M., Stockton Press, New York (1990)およびMolecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Supplement 29, section 9.66, Ed. Asubel, F. M. et al., John Wiley & Sons (2001)において見出すことができる。
【００３７】
修飾されたベクターは、終止コドンを有するレポーター遺伝子を含むように修飾されたベクターに関する。
【００３８】
１つのコドンはＡ、Ｔ、ＣまたはＧの３つの塩基からなるグループであり、タンパク質の構成要素である１つのアミノ酸をコードする。
【００３９】
終止コドンは、リボソームがタンパク質の末端に到達したとき、コードを翻訳することを停止する。終止コドンには、３つの異なる形態−ＴＧＡ、ＴＡＧおよびＴＡＡがある。終止コドンは、タンパク質の末端に到達し、コードを翻訳することを停止しなければならない細胞機構を伝える。本発明においてさらに好ましくは、終止コドンは、レポーター遺伝子のみ、ＴＡＡである。
【００４０】
レポーター遺伝子は、他の遺伝子、とりわけその調節領域を評価するために一般的に使用される細胞型において内因的に発現されない遺伝子を意味する。レポーター遺伝子の発現は、遺伝子を有する細胞の表現型の特徴を変化させる。典型的なレポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｂｅｔａ−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）、ベータグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）、置換されたｐ−ニトロフェニルリン酸およびそれらの変異体である。
【００４１】
本発明の他の態様は、組換えクローンの同定およびスクリーニングのための方法であって、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子をライゲートして、修飾されたベクターを製造することを含む方法に関する。修飾されたベクターは、宿主細胞に導入されたとき、終止コドンの存在によって蛍光または色を示さない。
【００４２】
使用されるレポーター遺伝子およびベクターは、上記のものおよび先行技術に記載されているものであり得る。
【００４３】
本発明は、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターを含む。
【００４４】
本発明の他の態様は、
（ａ）ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを導入し、
（ｂ）プライマーを使用してレポーター遺伝子を増幅し、
（ｃ）ベクターにおけるレポーター遺伝子をクローニングする、
ことを含む、ベクターのマルチクローニングサイトの上流に終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターの製造方法であって、
該修飾されたベクターは、非サプレッサー大腸菌宿主に導入されたとき、誘導時に発現されるとき蛍光または色を示さない方法を提供することである。
【００４５】
本発明の他の態様において、興味ある遺伝子および修飾されたベクターを含む組換えクローンの製造方法であって、該方法は：
（ａ）修飾されたベクターで使用される終止コドンと異なる終止コドンを含む特定のプライマーを使用して、興味ある遺伝子を増幅し、
（ｂ）修飾されたベクターに該増幅された興味ある遺伝子をクローニングし、
（ｃ）クローン化された修飾されたベクターでサプレッサー宿主細胞を形質転換する
ことを含み、
該終止コドンサプレッサー宿主細胞は、興味ある遺伝子で使用される終止コドンに対して特異的であり、該組換えクローンは、使用されるレポーター遺伝子に依存して蛍光または色のいずれかを示す方法を提供する。
【００４６】
組換えクローンの同定後、これらの組換えクローンは、非サプレッサー宿主細胞を使用して発現された。組換えクローンは、蛍光または色を示さず、興味あるタンパク質を発現する。
【００４７】
本発明は、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）プライマーを使用するベクターのマルチクローニングサイトの上流への終止コドンの導入であって、コドンの１つが終止コドンと置き換えられている導入を含む。前記終止コドンのいずれかを使用することができる。終止コドン組み込みは、ＤＮＡ配列分析を使用して確認された。非常に好ましい終止コドンはＴＡＡコドンである。部位特異的変異誘発は、当該分野で既知のいずれかの方法によって行われ得る。
【００４８】
次の工程は、修飾されたベクターを得るために、ベクターにおけるレポーター遺伝子をクローニングすることを含む。第１に、レポーター遺伝子をＰＣＲ技術を使用することにより増幅し、終止コドンを有するベクターにクローニングした。本発明に対して非常に好ましいレポーター遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子またはベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子である。クローン化された修飾されたベクター、すなわち、形質転換体で宿主細胞を形質転換し、クローンを消化およびＰＣＲによるＧＦＰ挿入の存在に関して試験した。このレポーター遺伝子を修飾されていないベクターにも挿入した。結果は、終止コドンは修飾されたベクターにおいてＧＦＰ翻訳を妨げたが、修飾されていないベクターにおいてＧＦＰ翻訳が生じたことを示す。したがって、修飾されたベクター由来の組換えクローンは、蛍光を示さず、修飾されていないベクターの場合、ＵＶ光放射下で蛍光を示した。
【００４９】
細菌発現系において任意の外来遺伝子をクローニングするために、ＮｄｅＩは、開始コドンを提供し、Ｎ末端において余分なアミノ酸の付加を避けるため、好ましい制限酵素認識部位である。構築された修飾されたベクターにおいて、２つのＮｄｅＩ部位があり、１つはＭＣＳに存在して外来遺伝子をクローニングするために必要であり、もう１つはＧＦＰ遺伝子に存在し、外来遺伝子のクローニング戦略に干渉する。したがって、ＧＦＰ遺伝子におけるＮｄｅＩ部位を、部位特異的変異誘発によりアミノ酸を変化させることなしに変化させた。ＧＦＰの修飾されたＮｄｅＩ部位を伴うこのベクターを、興味ある遺伝子をクローニングするために使用した。ＮｄｅＩ部位の修飾がＧＦＰの発光に影響しないことを独立した実験により確認した。
【００５０】
本発明は、興味ある遺伝子を含む組換えクローンの同定およびスクリーニングのための方法であって、ベクターのマルチクローニングサイトおよび修飾されたベクターにおける終止コドンを、レポーター遺伝子で使用されるものと異なる終止コドンを有する興味ある遺伝子と置き換えることを含む方法を含む。興味ある遺伝子を含む上記ベクターは、興味ある遺伝子で使用される終止コドンに特異的であるサプレッサー株に導入されたとき、蛍光または色を示すが、同定された組換えクローンが発現のためのサプレッサー細胞に導入されたとき、蛍光または色を示さず、真の興味あるタンパク質が得られる。
【００５１】
本発明は、本出願時の当業者に既知の興味ある遺伝子の使用を含む。
【００５２】
本発明は、上記修飾されたベクターへの外来遺伝子のクローニングを含む。あらゆる興味ある遺伝子を使用することができる。本発明は、興味ある遺伝子を含む組換えクローンのスクリーニングおよび同定のための費用対効果の良いプロセスを提供する。本発明を例示するために、スタフィロキナーゼ遺伝子（ＳＡＫ）をクローニングした。
【００５３】
ＧＦＰ融合タンパク質を生産するように修飾されたベクターのＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位においてレポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを有するスタフィロキナーゼ遺伝子のクローニング。非常に好ましい終止コドンは、ＴＡＧアンバーコドンである。
【００５４】
ＳＡＫ遺伝子が正しいフレームに挿入されたとき、組換え体は、アンバーサプレッサー株に移されると（ＴＡＧアンバーコドンが使用されるため）発光し、選択することができる。非アンバーサプレッサー株に導入されたとき、それらは組換えスタフィロキナーゼのみを作り、蛍光または色を示さない。サプレッサー株の使用は、興味ある遺伝子で使用される終止コドンの型に依存する。
【００５５】
細菌細胞系の選択は、終止コドンに依存し、使用され得る大腸菌の種々の型は、アンバーサプレッサー、オーカーサプレッサーおよびオパールサプレッサー大腸菌である。
【００５６】
本発明の他の態様において、終止コドンを有するレポーター遺伝子を含む修飾されたベクターを含む組換えクローンの同定および発現のためのキットを提供する。
【００５７】
本発明の修飾されたベクターは、有利には、複数パーツのキット（好ましくは、クローニングおよび発現キット）において、終止コドンを有するレポーター遺伝子と組み合わされる。
【００５８】
終止コドンは、リボソームがタンパク質の末端に到達したときに、コードの翻訳を停止する。終止コドンには、３つの異なる形態−ＴＧＡ、ＴＡＧおよびＴＡＡの形式がある。終止コドンは、タンパク質の末端に到達し、コードを翻訳することを停止しなければならない細胞機構を伝える。あらゆる終止コドンを使用することができる。本発明に関してさらに好ましくは、修飾されたベクターを構築するためにレポーター遺伝子において使用される終止コドンはＴＡＡであり、興味ある遺伝子で使用される終止コドンはＴＡＧである。
【００５９】
レポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｂｅｔａ−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）、ベータグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）、置換されたｐ−ニトロフェニルリン酸およびそれらの変異体であり得る。好ましくは、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）が使用される。
【００６０】
本発明のキットは、さらにレポーター遺伝子で使用される終止コドンと異なる終止コドンを有する興味ある遺伝子を含む。先行技術に記載されているあらゆる興味ある遺伝子を使用することができる。
【００６１】
このキットは、以下のために使用することができる：
（１）偽陽性を完全に避けることができる
（２）キットは、２つの異なる細菌細胞系における組換えクローンのスクリーニング、同定および発現の費用対効果の良い方法を提供する
（３）このキットは、クローニング後に得られる色または蛍光の性質を利用する
（４）このキットは、レポーター遺伝子、特にＧＦＰがＮ末端に任意のサイズの遺伝子を有する融合タンパク質としてクローニングするとき、蛍光を発することが知られているため、あらゆるサイズの遺伝子のクローニングに適用することができる
（５）ＤＮＡ製造およびその発現試験のために処理する必要があるのは蛍光クローン（これは組換え体たけを示す）だけなので、このキットは非常に多くの時間を節約できる。
【００６２】
本発明の他の態様において、組換えクローンを使用して発現される外来タンパク質の溶解度を示すためのキットであって、外来タンパク質が修飾されたベクターを使用して同定されスクリーニングされる組換えクローンを使用して発現されるキットを提供する。
【００６３】
ＧＦＰ蛍光の強度がＧＦＰの溶解度に依存することが見出されている。それは、可溶型で発現されるとき最も発光し、溶解度の減少とともに減少する。（Davis and Vierstra, 1998）。したがって、興味あるタンパク質の溶解度は、融合タンパク質の溶解度に影響し、それによりＧＦＰ蛍光強度に影響する。したがって、融合タンパク質の相対的蛍光強度から、興味あるタンパク質の溶解性を定性的に評価することができる。
【００６４】
これは他の全てのレポーター遺伝子に適用できる。
【００６５】
初期の報告から、ＧＦＰ遺伝子において２つのｏｍｐＴプロテアーゼ部位が存在するため、ＧＦＰ発現がＯｍｐＴプロテアーゼにより影響されることが示唆されている（Shi and Su, 2001）。ＯｍｐＴ発現は２８℃で低下することが報告されており、したがってＧＦＰ発現はこの温度でより顕著であり得る（Stathopoulous et al, 1999, Ogawa et al, 1995）。最終濃度０．１から０．５ｍＭの塩化亜鉛および塩化銅のようなＯｍｐＴの阻害剤も報告されている（Baneyx and Georgieu, 1990）。
【００６６】
ＬＥ３９２は、アンバーサプレッサー株であり、ｌｏｎプロテアーゼおよびＯｍｐＴプロテアーゼを発現することが知られている。ＧＦＰ安定性を妨げかねないこれらのプロテアーゼの発現を最小限にするために、発明者らは、形質転換後に以下の条件でＧＦＰを発現するように、ＬＥ３９２を使用することを決定した。
【００６７】
ＳＡＫのような外来遺伝子の導入後、ライゲーション混合物をコンピテントＬＥ３９２細胞に導入し、次にプレートを標準の３７℃の代わりに３０℃でインキュベートした。
【００６８】
本発明の好ましい態様は、非限定的な例において以下に記載されている。
ＧＦＰ遺伝子は、既知のＴ７発現ベクターから発現させた。終止コドンをこのベクターにおけるＧＦＰ遺伝子の前に導入すると、非発光形質転換体を生じたが、ＧＦＰに関するＰＣＲに陽性となった。次に、ベクターにおけるＮｄｅＩ部位が外来遺伝子をクローニングするために利用することができるように、ＧＦＰ遺伝子におけるＮｄｅ１部位を部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）により修飾した。ＧＦＰ遺伝子の３’末端にアンバー終止コドンを有し、５’のＮｄｅＩ部位でクローニングされるこの構築物を用いて外来遺伝子をクローニングした。ＧＦＰフラグメントをＭＣＳおよび必要な変化と共に、ｐＢＡＤ２４ベクターにサブクローニングした。この構築物は、タンパク質発現のために比較的安価な誘導物質により誘導することができる誘導プロモーターを有する。ＤＨ５アルファ、ＪＭ１０９およびＬＥ３９２のようなアンバーサプレッサー細胞系を、この構築物で形質転換させた。組換え体をＵＶ光下における発光の存在について確認することによりスクリーニングし、次にＤＮＡ製造のために接種させた。これらのＤＮＡをＢＬ２１シリーズのような非アンバーサプレッサー株に導入し、次に誘導物質で誘導し、現在の細胞系における終止コドンとしてのアンバーコドンの認識により、正しいサイズの天然タンパク質を得た。このように、単一クローンを、直接、スクリーニングおよび発現試験のために使用することができる。
【実施例】
【００６９】
実施例１：ｐＥＴ２１ａベクターのＭＣＳへの終止コドンの導入：（ｐＬＵＢＴ１７６）
終止コドンには、３つの型ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡがある。この特定の実施例のために、終止コドンとしてＴＡＡを使用する。しかし、本発明は、また、先行技術で既知の他のあらゆる終止コドンおよび他のあらゆるベクターを使用して実施することができる。
Novagen, USAのｐＥＴ２１ａベクターのＭＣＳは以下のとおりである：
【表１】
2012501192.tif 000002
終止コドンを、ＣＡＡをＴＡＡに修飾することにより、ＳＤＭプライマーＬＵＢＴ１６８および１６９を使用して塩基（下線で示されている）においてｐＥＴ２１ａベクターに導入した。配列は以下のとおりである
【表２】
2012501192.tif 000003
【００７０】
部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）は、既知の方法を使用することによるＳｔｒａｔａｇｅｎｅキットを使用することにより実施した。ＳＤＭ条件は以下のとおりである。すなわち、９５℃３０秒の第１の変性、次に９５℃３０秒、５５℃１分および６８℃６分を１５サイクル（製造業者の指示のとおり）。ＳＤＭ後、ＰＣＲ反応物を１時間３７℃でＤｐｎ１消化に付した。反応混合物を６５℃２０分間で不活化し、冷却し、次にコンピテントＤＨ５アルファ細胞に導入した。ＴＡＡ組み込みを、選択された形質転換体のＤＮＡ配列分析により確認した。図１は、ｐＥＴ２１ａベクターのＭＣＳへのＴＡＡ導入のプラスミドマップを示す。
【００７１】
実施例２：ｐＢＡＤ２４ベクターへのレポーター遺伝子のクローニング：（ｐＬＵＢＴ１３３）
レポーター遺伝子、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｂｅｔａ−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）、ベータグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質）を使用することができる。これまでに既知の他のあらゆるレポーター遺伝子も使用することができる。しかし、本実施例において、レポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を使用する。
【００７２】
ＧＦＰ遺伝子をプライマーＬＵＢＴ７５／ＬＵＢＴ７６を使用してＰＣＲ増幅した。これらの配列は以下のとおりである：
【表３】
2012501192.tif 000004
【００７３】
ＰＣＲ増幅をBangalore Genei Pvt. Ltd, Bangalore, IndiaのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用い、以下の増幅条件で実施した。すなわち、５分９５℃の第１の変性後、９５℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃３０秒からなる３０サイクルを続けた。増幅されたＧＦＰ遺伝子を精製し、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで消化し、同様の部位においてｐＢＡＤ２４ベクター（National Institute of Genetics, Japan）にクローニングした。図２は、ｐＢＡＤ２４−ＧＦＰのクローンの制限解析を示す。
【００７４】
形質転換体を直接、プラスミドＤＮＡ製造物に接種し、該クローン由来のＤＮＡを適当な制限酵素での消化により、ＧＦＰ挿入の存在に関して調べた。
【００７５】
実施例３：ｐＥＴ２１ａおよびｐＥＴ２１ａ修飾ベクターにおけるＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてのＧＦＰのサブクローニング：（それぞれｐＬＵＢＴ１６６およびｐＬＵＢＴ１７９）
ＧＦＰをｐＬＵＢＴ１３３（図３）からＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩとして切り出し（図４はｐＬＵＢＴ１３３からのＧＦＰ挿入物の放出を示す）、ｐＥＴ２１ａ（図６）、および修飾ｐＥＴ２１ａ（図８）（ＭＣＳにおける終止コドンＴＡＡを有する）の同様の部位にクローニングした。
【００７６】
ｐＥＴ２１ａ−ＧＦＰおよびｐＥＴ２１ａ修飾−ＧＦＰのクローンをＧＦＰ  ＰＣＲにおいてスクリーニングし（それぞれ図５、図７）、ＰＣＲ陽性を示すクローンのＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞ＢＬ２１Ａ１（Invitrogen, USA）に導入した。次に、アラビノースはＢＬ２１Ａ１細胞におけるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに対する誘導物質として作用するため、該細胞をＬＢ／ａｍｐアラビノースプレート上に置いた。
【００７７】
ｐＥＴ２１ａ−ＧＦＰは蛍光を示すが、ｐＥＴ２１ａ−修飾−ＧＦＰは終止コドンの存在によって蛍光を示さないことを見出した（図９）。該結果は、終止コドンＴＡＡは予期されるとおりＧＦＰ翻訳を妨げ、したがって、このＤＮＡで形質転換されたコロニーは何ら蛍光を示さないが、通常のｐＥＴ２１ａにおける同じフラグメントはＵＶ光下で発光を示したことを示す。
【００７８】
実施例４：ＳＤＭによるＧＦＰ遺伝子のＮｄｅＩ部位修飾
部位特異的変異誘発を、ＧＦＰ遺伝子に存在するＮｄｅＩ部位を修飾し、外来遺伝子のクローニング戦略を妨げるために行った。したがって、ｐＬＵＢＴ１７９クローンのＧＦＰ遺伝子におけるＮｄｅＩ部位を、プライマーＬＵＢＴ１８８／１８９を使用してＳＤＭにより変異させた。
【表４】
2012501192.tif 000005
９５℃−３０秒
９５℃−３０秒
５５℃−１分  １５サイクル
６８℃−６分
【００７９】
ＳＤＭ後、修飾されたｐＬＵＢＴ１７９を得るために、ライゲーション反応混合物をＤＨ５αコンピテント細胞に導入し、形質転換体をＮｄｅＩでの線形化により確認した。クローンをＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの二重消化によりさらに確認し（図１０）、新規構築物をｐＬＵＢＴ１８９として命名した（図１１）。
【００８０】
実施例４：ｐＢＡＤ２４ベクターへのＮｄｅＩ修飾ＧＦＰの導入
一般的に使用されるプロモーターベース系の下の原核生物発現ベクターとして製造するため、Ｔ７プロモーターの下のＮｄｅＩ修飾ＧＦＰをベクターｐＢＡＤ２４中に置いた。
【００８１】
ｐＬＵＢＴ１８９をＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＧＦＰ遺伝子を有するフラグメント（図１２）（７７０ｂｐ）を放出させた。次にそれを精製し、ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢＡＤ２４ベクターとライゲートし、ライゲーション混合物をＤＨ５ａコンピテント細胞を形質転換するために使用した。
【００８２】
ＧＦＰ特異的プライマーＬＵＢＴ１２８および１２９をそれぞれフォワードおよびリバースプライマーとして使用して、形質転換体をコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。いくつかのコロニーがＧＦＰ  ＰＣＲに対して陽性であったが（図１３）、誘導物質の存在下で何ら蛍光を示さなかった。
ＬＵＢＴ１２８：ＧＦＰスクリーニングのためのフォワードプライマー−配列番号８
【表５】
2012501192.tif 000006
ＬＵＢＴ１２９：ＧＦＰスクリーニングのためのリバースプライマー−配列番号９
【表６】
2012501192.tif 000007
【００８３】
該構築物は、ｐＬＵＢＴ１９１と命名し（図１４）、アラビノースプロモーターの下にＧＦＰを有するが、Ｎ末端にＴＡＡ終止を有するので、誘導物質の存在下でさえ発光しないＧＦＰのクローンを与える。
【００８４】
実施例５：上記ベクターへの外来遺伝子のクローニング
修飾されたベクターにおけるクローニングに、あらゆる外来遺伝子を使用することができる。本実施例において、ＧＦＰ−終止ベクター（ＬＵＢＴ１９１）を使用した。本実施例において使用される外来遺伝子はスタフィロキナーゼ遺伝子である。しかしながら、他のあらゆるレポーター遺伝子を含有するベクターも、外来遺伝子をクローニングするために使用することができる。
【００８５】
修飾されたベクターのＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位にて、３’末端にアンバー終止コドンを有するスタフィロキナーゼ遺伝子（ＳＡＫ遺伝子）のクローニングを行った。ＳＡＫ遺伝子が正しいフレームに挿入されたとき、組換えクローンは、アンバーサプレッサー株に移されるとＵＶ下で発光し、スクリーニングされ、選択された。組換えクローンが非アンバーサプレッサー株に導入されたとき、クローンは発光せず、組換えスタフィロキナーゼのみ発現する。外来遺伝子をクローニングするための工程は以下のとおりである。
【００８６】
スタフィロキナーゼ遺伝子を、アンバー終止コドンを含む特定のプライマーを使用して合成遺伝子から増幅し、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＬＵＢＴ１９１にクローニングした。
増幅のためのプライマー：
外来遺伝子のためのプライマーはアンバーサプレッサーコドンを有さなければならない。
ＬＵＢＴ００９：スタフィロキナーゼ遺伝子のためのフォワードプライマー−配列番号１０
【表７】
2012501192.tif 000008
ＬＵＢＴ１８７：アンバー終止５’を有するスタフィロキナーゼ遺伝子のためのリバースプライマー−配列番号１１
【表８】
2012501192.tif 000009
【００８７】
ＰＣＲ条件：
スタフィロキナーゼ遺伝子を、以下の増幅条件でBangalore Genei Pvt. Ltd (Bangalore, India)のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅させた。４分９４℃の第１の変性、次に９４℃３０秒、５７℃３０秒および７２℃３０秒の３０サイクル。７分７２℃の最終延長後、ＰＣＲ増幅生成物を１％アガロースゲル上で確認し（図１５）、精製し、次にＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＦＰ終止ベクターｐＬＵＢＴ１９１の同様の部位にライゲートした。
【００８８】
ｐＬＵＢＴ１９１およびＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化ＳＡＫフラグメントのライゲーション混合物で以下の遺伝子型、ｇｌｎＶ４４  ＳｕｐＦ５８（ｌａｃＹ１またはＡｌａｃＺＹ）  ｇａｌＫ２  ｇａｌＴ２２  ｍｅｔＢ１  ｔｒｐＲ５５  ｈｓｄＲ５１４（ｒＫ  −ｍＫ  ＋）を有する確立されてたアンバーサプレッサー株であるコンピテントＬＥ３９２細胞を形質転換した。
【００８９】
形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１３ｍＭのＬ（＋）アラビノースを含むＬＢ寒天プレート上にレプリカプレーティングした(replica plated)。
【００９０】
３０℃で一晩インキュベーション後、プレートをＵＶ下に暴露し、いくつかのコロニーは他のものと比較してＵＶ暴露時に蛍光を発した（図１６）。発光コロニーはｐＬＵＢＴ１９１−Ｓａｋのクローンである。
【００９１】
発光コロニーが組換えクローンであり、非発光コロニーが非組換えクローンであることを確認するために、発光および非発光コロニーのサンプルを採取し、ＧＦＰ特異的プライマーならびにスタフィロキナーゼ特異的プライマーを用いるＰＣＲスクリーニングに付した。
【００９２】
発光コロニーは、組換えクローンであるため、ＳＡＫ特異的およびＧＦＰ  ＰＣＲ陽性の両方の性質を呈し、ＵＶ下で発光しない非組換えクローンは、ＧＦＰ  ＰＣＲのみ示すが、ＧＦＰ遺伝子のＮ末端にＴＡＡ終止コドンを有するため発光しないことが見出された。したがって、５つの発光コロニーおよび５つの非発光コロニーを選択し、ＳＡＫ特異的およびＧＦＰ特異的プライマーを用いるＰＣＲに付した。
【００９３】
発光細胞は、ＳＡＫに対してＰＣＲ陽性であり（図１７）（パネルＡ、レーン２−６）、非発光コロニーは、ＳＡＫに対してＰＣＲ陰性である（図１７）（パネルＡ、レーン７−１１）。他方では、全てのコロニーは、ＧＦＰ  ＰＣＲに対して陽性である（図１７）（パネルＢ）。
【００９４】
したがって、外来遺伝子クローニングのためのツールとして、クローニング媒体としてアラビノースプロモーター下に修飾され構築されたベクターｐＬＵＢＴ１９１を使用したとき、組換えクローンのみが発光することを見出した。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位における外来遺伝子の挿入によって、終止コドンＴＡＡは除去され、クローンは、ＰＣＲ、制限解析などを行う必要性なく、蛍光または他のものに基づいて直接、選択された。
【００９５】
実施例６：非アンバーサプレッサー大腸菌株ＢＬ２１におけるＳＡＫ−ＧＦＰ融合物の発現
ＳＡＫおよびＧＦＰ発光陽性クローン＃４および＃８ならびに非発光＃５クローンのＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（非アンバーサプレッサー大腸菌Ｂ株）に導入し、ＳＡＫの発現を１３ｍＭのＬ（＋）アラビノースで誘導した。ＳＡＫはＧＦＰ融合物としてアンバー終止と共にクローニングされるため、これらの細胞において無傷のＳＡＫ遺伝子単独の発現がもたらされる。異種タンパク質の発現をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。タンパク質合成がアンバー終止で停止したことが分かり、タンパク質の分子サイズ（１５ｋＤａ）をＳＤＳＰＡＧＥにおいて観察した（図１８）。
【００９６】
非発光クローンは、ｐＬＵＢＴ１９１においてＧＦＰ遺伝子のＮ末端にＴＡＡを有する非組換えであるため、ＳＡＫを発現しなかった。
【００９７】
本発明の適用は、以下の利点を有することを含む：
（１）市販されている他の全てのベクターは、クローニング時に色の消失または蛍光の消失を示すが、本発明の修飾されたベクターは、クローニング後に色または蛍光を示すため、組換えクローンの同定およびスクリーニングについて矛盾がなく信頼できる結果を提供する。
（２）本発明において、サプレッサー株に導入されたとき、組換え体はＵＶ光下で蛍光または色を示すが、非組換え体は蛍光または色を示さない。
（３）偽陽性を完全に回避する（市販されているベクターで不可能である）。
（４）先行技術で見出されている他のあらゆるレポーター遺伝子を、同じベクターまたは異なるベクターにおいてＧＦＰ遺伝子の代わりに使用することができる。
（５）異なる誘導物質を、使用されるプロモーターの型に基づいて使用することができる。
（６）本発明は、また、２つの異なる細菌細胞系におけるスクリーニングおよび発現のために同じベクターを使用する。
（７）Ｎ末端にあらゆるサイズの遺伝子を有する融合タンパク質としてクローニングされるとき、ＧＦＰが蛍光を発することが知られているため、本発明はあらゆるサイズの遺伝子のクローニングのために使用することができる。
（８）挿入がない自己連結ベクター分子はＵＶ光下で発光しないため、本発明のこのベクターを使用するライゲーション混合物は、先行技術において行われるような脱リン酸化する必要がない。
（９）組換え体のみが発光し、発明者らの全実験ではこの対照が絶対的にきっちりと漏れがないことを示すので、対照ライゲーション（すなわち、ベクター単独でのライゲーション）について全く行う必要がないため、本発明は費用対効果が良いプロセスである。
（１０）組換え体をスクリーニングするために通常使用される制限解析、ＰＣＲなどの費用が回避されるので、本発明のベクターは費用対効果が良い。
（１１）蛍光または色の観察のみで組換えクローンと非組換えクローンとを区別するため、本発明は時間を節約する方法である。
（１２）さらに、ＧＦＰ蛍光は可溶型で発現されるとき最も発光するため、外来遺伝子のクローニング後の、蛍光の強度は、融合タンパク質の溶解度の程度も示す。本発明は、蛍光の強度に基づく外来遺伝子の溶解度を示す初めてのベクターの報告である。
【００９８】
実施例６：興味あるタンパク質の比溶解度の定性的評価
興味あるタンパク質の溶解度は、融合タンパク質の溶解度に対する効果を有し、それによりＧＦＰ蛍光強度に影響する。したがって、融合タンパク質の比蛍光強度から、興味あるタンパク質の溶解度性質を定性的に評価することができる。この仮説を立証するために、ｈＧＣＳＦ（大腸菌において不溶性集合体として生産される）およびＳＡＫ（大腸菌において溶性タンパク質として生産される）をアンバー終止を有するＧＦＰ融合物としてクローニングした。両方の構築物をコンピテントＬＥ３９２大腸菌細胞（アンバーサプレッサー株）に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１３ｍＭのＬ（＋）アラビノースを含むＬＢ−寒天半固体培地上に播種した。ＵＶ暴露時における、融合タンパク質の溶解度に依存する蛍光強度の差を見出した。結果は、ＳＡＫ−融合物発光がｈＧＣＳＦ−融合物よりも輝いていることを示した（図２０）。これは、ＳＡＫタンパク質がｈＧＣＳＦを越えるより良い溶解度を有するためである。
【図１】
2012501192.tif 000010
【図２】
2012501192.tif 000011
【図３】
2012501192.tif 000012
【図４】
2012501192.tif 000013
【図５】
2012501192.tif 000014
【図６】
2012501192.tif 000015
【図７】
2012501192.tif 000016
【図８】
2012501192.tif 000017
【図９】
2012501192.tif 000018
【図１０】
2012501192.tif 000019
【図１１】
2012501192.tif 000020
【図１２】
2012501192.tif 000021
【図１３】
2012501192.tif 000022
【図１４】
2012501192.tif 000023
【図１５】
2012501192.tif 000024
【図１６】
2012501192.tif 000025
【図１７Ａ】
2012501192.tif 000026
【図１７Ｂ】
2012501192.tif 000027
【図１８】
2012501192.tif 000028
【図１９】
2012501192.tif 000029
【図２０】
2012501192.tif 000030
【配列表】
2012501192000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月27日(2011.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012501192000001.app
【国際調査報告】
2012501192.tif 000035
2012501192.tif 000036
2012501192.tif 000037
2012501192.tif 000038
2012501192.tif 000039
2012501192.tif 000040