(57)【要約】  本発明は特定の細胞遺伝学的な異常の同定する事と遺伝子発現プロファイリングによりリスクを検討する事に基づく多発性骨髄腫の治療の結果を予測する方法を提供する。また、単独で結果に影響を与える変数を同定するため使用する統計方法も提供する。さらに骨髄腫患者の治療の方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫に罹患した対象のため低リスク予後から高リスク予後まで形質転換する可能性を予測する方法であって、該方法は、
化学療法剤の投与前に腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
対象に対し単一の化学療法剤の服用投与する工程、
化学療法剤の投与後の腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る工程、および
遺伝子発現プロファイルを投与前後で比較する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
遺伝子がＣＯＸ６Ｃ，ＮＯＬＡ１，ＣＯＰＳ５，ＳＯＤ１，ＴＵＢＡ６，ＨＮＲＰＣ，ＰＳＭＢ２，ＰＳＭＣ４，ＬＯＣ４００６５７，Ｃ１ｏｒｆ３１，ＦＵＮＤＣ１，ＳＵＭＯ１，ＰＳＭＢ４，ＰＳＭＢ３，ＥＮＳＡ，ＰＳＭＢ４，ＣＯＭＭＤ８，ＭＲＰＬ４７，ＰＳＭＣ５，ＰＳＭＡ４，ＰＳＭＤ４，ＮＭＴ１，ＰＳＭＢ７，ＮＸＴ２，ＳＬＣ２５Ａ１４，ＰＳＭＤ２，ＳＮＲＰＤ１，ＣＨＯＲＤＣ１，ＰＳＭＤ１４，ＬＡＰ３，ＰＳＭＡ７，ＵＢＰＨ，ＢＩＲＣ５，ＳＴＡＵ２，ＡＬＤＯＡ，ＴＭＣ８，Ｃ１ｏｒｆ１２８，ＦＬＮＡ，ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂからなるグループから選択される遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象のための予測において形質転換のリスクに対し発現量が増加した遺伝子表現プロファイルとの相関関係に基づきスコアを与える工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
形質転換のリスクが多変量解析を用い同定されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
発現量が高い遺伝子の高活性化を抑制する事により高リスク状態へ形質転換するのを防ぐため効果的な治療法を設計する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍細胞遺伝子がプロテアソーム遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化学療法剤がボルテゾミブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子発現が核酸またはタンパク質レベルで同定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
化学療法剤の投与後の遺伝子発現プロファイルをおよそ４８時間で得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象において潜在的に侵攻性の多発性骨髄腫腫瘍細胞を同定するための方法であって、該方法は、
対象で多発性骨髄腫腫瘍細胞における最初の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
単一の化学療法剤を腫瘍細胞と接触させる工程、および
化学療法剤と接触後の多発性骨髄腫腫瘍細胞における第２の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
を含み、最初のプロファイルと比較し第２番目のプロファイルでの遺伝子発現量の増加は腫瘍細胞が潜在的に侵攻性な腫瘍細胞である事を示すことを特徴とする方法。
【請求項１１】
遺伝子がＣＯＸ６Ｃ、ＮＯＬＡ１、ＣＯＰＳ５、ＳＯＤ１、ＴＵＢＡ６、ＨＮＲＰＣ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＣ４、ＬＯＣ４００６５７、Ｃ１ｏｒｆ３１、ＦＵＮＤＣ１、ＳＵＭＯ１、ＰＳＭＢ４、ＰＳＭＢ３、ＥＮＳＡ、ＰＳＭＢ４、ＣＯＭＭＤ８、ＭＲＰＬ４７、ＰＳＭＣ５、ＰＳＭＡ４、ＰＳＭＤ４、ＮＭＴ１、ＰＳＭＢ７、ＮＸＴ２、ＳＬＣ２５Ａ１４、ＰＳＭＤ２、ＳＮＲＰＤ１、ＣＨＯＲＤＣ１、ＰＳＭＤ１４、ＬＡＰ３、ＰＳＭＡ７、ＵＢＰＨ、ＢＩＲＣ５、ＳＴＡＵ２、ＡＬＤＯＡ、ＴＭＣ８、Ｃ１ｏｒｆ１２８、ＦＬＮＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂからなるグループから選択される遺伝子であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第２のプロファイルの遺伝子の活性レベルに基づく高リスク予測に対象が形質転換する可能性を予測する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞遺伝子がプロテアソーム遺伝子であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
化学療法剤がボルテゾミブであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子発現が核酸またはタンパク質レベルで同定されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
化学療法剤の投与後の遺伝子発現プロファイルをおよそ４８時間で得ることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
対象の多発性骨髄腫を治療するための方法であって、該方法は、
対象において多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に侵攻性かどうかを同定する工程、
潜在的侵攻性腫瘍細胞において遺伝子の活性化を抑制するのに効果的な一つまたはそれ以上の抗癌剤から成る化学療法を設計する工程、および
対象に一つまたはそれ以上の抗癌剤を投与する工程、そしてそれにより多発性骨髄腫を治療する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に侵攻性かどうかを同定する請求項１７に記載の方法であって、該方法は、
対象で多発性骨髄腫腫瘍細胞における最初の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
単一の化学療法剤を腫瘍細胞と接触させる工程、および
化学療法剤と接触後の多発性骨髄腫腫瘍細胞における第２の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
を含み、最初のプロファイルと比較し第２番目のプロファイルでの遺伝子の活性化は腫瘍細胞が潜在的に侵攻性な腫瘍細胞である事を示すことを特徴とする方法。
【請求項１９】
遺伝子がＣＯＸ６Ｃ、ＮＯＬＡ１、ＣＯＰＳ５、ＳＯＤ１、ＴＵＢＡ６、ＨＮＲＰＣ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＣ４、ＬＯＣ４００６５７、Ｃ１ｏｒｆ３１、ＦＵＮＤＣ１、ＳＵＭＯ１、ＰＳＭＢ４、ＰＳＭＢ３、ＥＮＳＡ、ＰＳＭＢ４、ＣＯＭＭＤ８、ＭＲＰＬ４７、ＰＳＭＣ５、ＰＳＭＡ４、ＰＳＭＤ４、ＮＭＴ１、ＰＳＭＢ７、ＮＸＴ２、ＳＬＣ２５Ａ１４、ＰＳＭＤ２、ＳＮＲＰＤ１、ＣＨＯＲＤＣ１、ＰＳＭＤ１４、ＬＡＰ３、ＰＳＭＡ７、ＵＢＰＨ、ＢＩＲＣ５、ＳＴＡＵ２、ＡＬＤＯＡ、ＴＭＣ８、Ｃ１ｏｒｆ１２８、ＦＬＮＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂからなるグループから選択される遺伝子であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞遺伝子がプロテアソーム遺伝子であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
化学療法剤がボルテゾミブであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子発現が核酸またはタンパク質レベルで同定されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
化学療法剤の投与後の遺伝子発現プロファイルをおよそ４８時間で得ることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
抗癌剤がボルテゾミブまたはサリドマイドまたはその組合せである請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
多発性骨髄腫に罹患した対象のため低リスク予後から高リスク予後まで形質転換する可能性を予測する方法であって、該方法は、
対象に対し単一の化学療法剤の服用投与する工程、
化学療法剤の投与前と投与後の腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る工程、および
遺伝子発現プロファイルを投与前後で比較する工程、
を含み、投与前のプロファイルと比較し投与後に得たプロファイルにおいて認められる遺伝子発現量の減少は高リスク予後に向かう形質転換の可能性を示すことを特徴とする方法。
【請求項２６】
発現量が減少した遺伝子が、ＦＯＳＢ、ＬＯＣ６４４２５０、Ｃ１７ｏｒｆ６０、ＬＺＴＲ２、ＰＤＥ４Ｂ、ＳＴＡＵ２、ＰＤＥ４Ｂ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＴＡＧＡＰ、ＬＯＣ６４３３１８、ＣＩＳＨ、ＮＲ４Ａ１、ＭＧＣ６１５９８、ＡＮＫＲＤ３７、ＫＩＡＡ１３９４、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＴＢＣ１Ｄ９、ＣＲＹＧＳ、ＰＤＥ４Ｂ、ＺＮＦ７１０、ＲＢＭ３３、ＳＴＸ１１、ＫＩＡＡ１７５４、ＲＰＬ４１、ＷＩＲＥ、ＬＡＰＴＭ４Ａ、ＫＬＨＬ７、Ｃ９ｏｒｆ１３０、Ｃ１４ｏｒｆ１００からなるグループから選択される遺伝子であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象のための予測において形質転換のリスクに対し発現量が減少した遺伝子表現プロファイルとの相関関係に基づきスコアを与える工程をさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
形質転換のリスクが多変量解析を用い同定されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
発現量が低い遺伝子の高活性化により高リスク状態へ形質転換するのを防ぐため効果的な治療法を設計する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
化学療法剤がボルテゾミブであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子発現が核酸またはタンパク質レベルで同定されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
化学療法剤の投与後の遺伝子発現プロファイルをおよそ４８時間で得ることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
対象において潜在的に侵攻性の多発性骨髄腫腫瘍細胞を同定する方法であって、該方法は、
対象で多発性骨髄腫腫瘍細胞における最初の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
単一の化学療法剤を腫瘍細胞と接触させる工程、および
化学療法剤と接触後の多発性骨髄腫腫瘍細胞における第２の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
を含み、最初のプロファイルと比較し第２番目のプロファイルでの遺伝子発現の低下は腫瘍細胞が潜在的に侵攻性な腫瘍細胞である事を示すことを特徴とする方法。
【請求項３４】
遺伝子がＦＯＳＢ、ＬＯＣ６４４２５０、Ｃ１７ｏｒｆ６０、ＬＺＴＲ２、ＰＤＥ４Ｂ、ＳＴＡＵ２、ＰＤＥ４Ｂ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＴＡＧＡＰ、ＬＯＣ６４３３１８、ＣＩＳＨ、ＮＲ４Ａ１、ＭＧＣ６１５９８、ＡＮＫＲＤ３７、ＫＩＡＡ１３９４、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＴＢＣ１Ｄ９、ＣＲＹＧＳ、ＰＤＥ４Ｂ、ＺＮＦ７１０、ＲＢＭ３３、ＳＴＸ１１、ＫＩＡＡ１７５４、ＲＰＬ４１、ＷＩＲＥ、ＬＡＰＴＭ４Ａ、ＫＬＨＬ７、Ｃ９ｏｒｆ１３０、Ｃ１４ｏｒｆ１００からなるグループから選択される遺伝子であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第２のプロファイルの遺伝子の活性レベルに基づく高リスク予測に対象が形質転換する可能性を予測する工程をさらに含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
化学療法剤がボルテゾミブであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子発現が核酸またはタンパク質レベルで同定されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
化学療法剤の投与後の遺伝子発現プロファイルをおよそ４８時間で得ることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
対象の多発性骨髄腫を治療するための方法であって、該方法は、
対象において多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に侵攻性かどうかを同定する工程、
潜在的侵攻性腫瘍細胞において遺伝子の活性化を抑制するのに効果的な一つまたはそれ以上の抗癌剤から成る化学療法を設計する工程、および
対象に一つまたはそれ以上の抗癌剤を投与する工程、そしてそれにより多発性骨髄腫を治療する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に侵攻性かどうかを同定する請求項３９に記載の方法であって、該方法は、
対象で多発性骨髄腫腫瘍細胞における最初の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
単一の化学療法剤を腫瘍細胞と接触させる工程、および
化学療法剤と接触後の多発性骨髄腫腫瘍細胞における第２の遺伝子発現プロファイルを得る工程、
を含み、最初のプロファイルと比較し第２番目のプロファイルでの遺伝子の抑制は腫瘍細胞が潜在的に侵攻性な腫瘍細胞である事を示すことを特徴とする方法。
【請求項４１】
遺伝子がＦＯＳＢ、ＬＯＣ６４４２５０、Ｃ１７ｏｒｆ６０、ＬＺＴＲ２、ＰＤＥ４Ｂ、ＳＴＡＵ２、ＰＤＥ４Ｂ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＴＡＧＡＰ、ＬＯＣ６４３３１８、ＣＩＳＨ、ＮＲ４Ａ１、ＭＧＣ６１５９８、ＡＮＫＲＤ３７、ＫＩＡＡ１３９４、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＴＢＣ１Ｄ９、ＣＲＹＧＳ、ＰＤＥ４Ｂ、ＺＮＦ７１０、ＲＢＭ３３、ＳＴＸ１１、ＫＩＡＡ１７５４、ＲＰＬ４１、ＷＩＲＥ、ＬＡＰＴＭ４Ａ、ＫＬＨＬ７、Ｃ９ｏｒｆ１３０、Ｃ１４ｏｒｆ１００からなるグループから選択される遺伝子であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
化学療法剤がボルテゾミブであることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
遺伝子発現が核酸またはタンパク質レベルで同定されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
化学療法剤の投与後の遺伝子発現プロファイルをおよそ４８時間で得ることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
抗癌剤がボルテゾミブまたはサリドマイドまたはその組合せであることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の補助金に関する説明
本発明は部分的に国立衛生研究所CA55819の補助を受けた。よって連邦政府は本発明においていくらかの権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本国際出願は米国特許法（３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１９（ｅ））に基づき仮出願中の整理番号61/204,154の一部継続出願の優先権の利益を請求するものである。その内容は参照する事により本書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の分野
本発明は一般的にがん研究分野に関するものである。より具体的には、本発明は多発性骨髄腫患者に対する治療の結果と薬剤に対する潜在的な抵抗性を予測することに関するものである。 遺伝子発現プロファイリングを利用することにより骨髄腫患者はある化学療法剤に耐性を有するかどうか、そして特定の治療法が有益であるかどうかを事前に知る事ができる可能性がある。
【０００４】
関連技術の考察
化学療法に対する作用と抵抗性のメカニズムは十分に理解されておらず、有効性の計測は臨床結果データに一般的に依存する。近年の進展により、遺伝子発現プロファイリング（GEP）予測は短期間のみならず持続的な治療効果をより正確に定義づけるのに用いることが可能である事が示唆されている。より詳細には、多発性骨髄腫（MM）の症例において、間接的に骨髄支質（ストロマ）も同時に間接的に標的とする事により抗腫瘍効果を有する、例えば免疫変調性薬剤、サリドマイドとレナリドマイド、そしてプロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブのような新規薬剤の発見により患者の予後は顕著に改善された。
【０００５】
最近の研究により多発性骨髄腫患者のCD138で精製した形質細胞（PC）を用いた遺伝子発現プロファイリング解析が最も正確に予後の予測可能であることを示唆する結果が得られた。ベースラインの遺伝子発現の特徴を用いる70遺伝子モデルを用いると、新規に疾患であると診断されたおよそ15%が高リスク群であると同定される。この高リスクモデルは主に染色体1q21の増幅と1p13の欠失に起因するコピー数感受性の遺伝子の発現変化により結果が左右される。骨髄腫で唯一頻発する高レベルのコピー数増幅である染色体1q21-23の増幅領域には、10Mb以上のDNAと100以上の遺伝子が含まれる。この領域における候補遺伝子には、IL6R、MCL1、BCL9、CKS1BとPSMD4が含まれ、内２つの遺伝子は近年の70遺伝子のリスクモデルの構成要素である。PSMD4はマルチ・サブユニット・プロテアソーム複合体の制御構成要素であるタンパク質をコードする。最初のプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブは新たに多発性骨髄腫であると診断された患者において治療成績を改善することが示唆されている。
【０００６】
上記のように、70とわずか17の遺伝子を含むベースラインの腫瘍細胞遺伝子の特徴から、未治療症例および既に治療を受けた症例群、何れにおいても骨髄腫患者のリスクグループを識別することが可能である。しかしながら、クローン進化であるか、または診断時に検知不能であった侵攻性のクローンが存在し、その増殖により、低リスク症例とし予測した集団が170遺伝子で定義した低リスクから高リスクに時間とともにシフトする事に伴い侵攻性の臨床経過をたどった。この様な患者集団を正確に同定することが形質転換に対し先手を打つための第一歩となる。
【０００７】
インビトロにおける単一の化学療法剤の短期のトライアル処理後の腫瘍細胞の遺伝子発現パターンの変化は、これらの潜伏性の侵攻性細胞に影響を与える可能性がある。インビトロのテストとは異なり、臨床薬剤投与もまたホスト・インタラクションの過程において腫瘍細胞の撹乱を評価することを可能にする。サリドマイド、レナリドマイドとデキサメタゾンの単一投与の後、インビボで誘導される48時間の遺伝子発現プロファイリングの変化と、骨髄腫患者の臨床結果が相関するという最近の観察結果を基に、そのような短期腫瘍細胞遺伝子発現プロファイリングとプロテオミックな変化が、既に確立されている17-遺伝子に基づくベースライン予測モデルを凌ぐほど臨床結果予測の精度を上げることが可能かどうか解析された。
【０００８】
組合せ化学療法にボルテゾミブを加える事により本薬剤を使用しない同様の治療法で治療した患者において臨床結果が改善されることは、現在よく知られている。Total Therapy 3（TT3）へのボルテゾミブの併用は遺伝子発現プロファイリングで低リスク疾患であるとされた患者の予後を根本的に変化させ、予測された4年生存率は85%である。完全寛解（CR）を達成しているそれらの患者のうち、90%は再発しなかった。対照的に、高リスクの骨髄腫患者の15%は3年生存率が50％を切り、その行く末は悲惨なままである。
【０００９】
高リスクの多発性骨髄腫は染色体1qにマッピングされる遺伝子の発現増加と1pにマッピングされる遺伝子の発現減少により決定される70遺伝子の発現モデルにより定義される。CGH法を用いたゲノムワイドのコピー数の解析により1q21が骨髄腫ゲノムにおいて唯一認められる増幅のホットスポットとして明らかとなった。1q21コピー数と生存率の間には逆相関関係が認められる。Total Therapy 3におけるボルテゾミブの導入は1q21コピー数の予後診断の閾値をTotal Therapy 2において3であったものを4に引き上げ、1q21増幅部位（アンプリコン）に存在する遺伝子がプロテアソーム阻害と他の化学療法に対する多発性骨髄腫細胞の感度を決定する可能性があり、ボルテゾミブの追加が他の薬剤では達成し得ないこの阻害性のレベルを越えることが示唆された。1q21増幅部位（アンプリコン）に存在する100以上の遺伝子のうち、プロテアソーム遺伝子であるPSMD4は、70遺伝子モデルによる高リスク症例の同定に関与したコピー数増加により生じる遺伝子発現の活性化を示したたった2つの遺伝子の内の1つである。
【００１０】
PSMD4のようなプロテアソーム遺伝子の高活性化はTT3におけるボルテゾミブの追加にもかかわらず高リスクとされた患者における予後不良のメカニズムの説明を可能にする。実際、PSMB5の多型と点突然変異は、プロテアソーム阻害に対する抵抗性の増加と関連することが認められた。インビボでのサリドマイド、デキサメタゾンとレナリドマイド曝露の前後の多発性骨髄腫腫瘍細胞における遺伝子発現プロファイリングを行い、臨床効果に関与する発現が変化する遺伝子を同定する事が可能である。たとえば、デキサメタゾンの短期のインビトロ曝露後のグルココルチコイド受容体の活性化は、Total therapy 2を受けている患者における長期曝露での臨床結果の改善と関与することが認められた。このように、デキサメタゾンの標的であるグルココルチコイド受容体の分子変異は、薬剤併用化学療法における本薬剤の有効性のバイオマーカーである。
【００１１】
ボルテゾミブはプロテアソームを標的とし、ベースライン・サンプルにおいて活性化したPSMD4発現は芳しくない結果と相関し、ベルケイドの腫瘍細胞への短期間のインビボ曝露がプロテアソーム阻害に対し急速なゲノム反応へと誘導することが可能となり、そしてこの情報の読み取りがボルテゾミブに対する感度と抵抗性の測定を行う事を可能にするため、ボルテゾミブは治療法に含まれる。
【００１２】
例えばボルテゾミブとその派生物のような新規薬剤が生存率に与えるインパクトは小さくないが、まず最初に低リスクとして診断された一部の患者を含む骨髄腫患者の亜母集団においていまだその生存率は非常に低い。それらの患者を治療することの第一歩は、先制的にボルテゾミブのような特定の薬剤に抵抗性を持つ個人を特定することである。
【００１３】
高リスクの骨髄腫患者を同定し特定の薬剤に対する化学療法の抵抗性を予測する方法を提供することが先行技術では不足している。本発明はこの長年に渡る要求と欲求とを技術的に満たすものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は多発性骨髄腫に罹患した対象のため低リスク予後から高リスク予後まで形質転換する可能性を予測する方法の確立を目的とし、化学療法剤の投与前に腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る事、そして対象に対し単一の化学療法剤の服用投与する事、化学療法剤の投与後の腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得、そして、遺伝子発現プロファイルを投与前後で比較する事から成る。投与前のプロファイルと比較し投与後に得たプロファイルにおいて認められる遺伝子発現量の増加は高リスク予後に向かう形質転換の可能性を示す。
【００１５】
本発明はまた対象において潜在的に侵攻性である多発性骨髄腫腫瘍細胞を同定するため、その対象において多発性骨髄腫腫瘍細胞の最初の遺伝子発現プロファイルを得る事、単一の化学療法剤を腫瘍細胞に接触させる事、化学療法剤での接触後、多発性骨髄腫腫瘍細胞の第2の遺伝子発現プロファイルを得る事から成る方法についても提供し、最初のプロファイルと比較し、第2のプロファイルの遺伝子の発現増加が腫瘍細胞が潜在的に侵攻性の腫瘍細胞であることの指標となる。
【００１６】
本発明はまた対象において多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に侵攻性かどうかを同定する事、潜在的に侵攻性の腫瘍細胞において遺伝子の活性化を抑制するのに効果的な一つまたはそれ以上の抗癌剤から成る化学療法的療法を設計する事、対象に一つまたはそれ以上の抗癌剤を投与する事、そしてそれにより多発性骨髄腫を治療する事から成る多発性骨髄腫の治療法を提供する。
【００１７】
本発明は多発性骨髄腫に罹患した対象のため低リスク予後から高リスク予後まで形質転換する可能性を予測する方法の確立を目的とし、化学療法剤の投与前に腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る事、そして対象に対し単一の化学療法剤の服用投与する事、化学療法剤の投与後の腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得、そして、遺伝子発現プロファイルを投与前後で比較する事から成る。投与前のプロファイルと比較し投与後に得たプロファイルにおいて認められる遺伝子発現量の低下は高リスク予後に向かう形質転換の可能性を示す。
【００１８】
本発明はまた対象において潜在的に侵攻性である多発性骨髄腫腫瘍細胞を同定するため、その対象において多発性骨髄腫腫瘍細胞の最初の遺伝子発現プロファイルを得る事、単一の化学療法剤を腫瘍細胞に接触させる事、化学療法剤での接触後、多発性骨髄腫腫瘍細胞の第2の遺伝子発現プロファイルを得る事から成る方法についても提供し、最初のプロファイルと比較し、第2のプロファイルの遺伝子発現量の減少が腫瘍細胞が潜在的に侵攻性の腫瘍細胞であることの指標となる。
【００１９】
本発明はまた対象において多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に侵攻性かどうかを同定する事、潜在的に侵攻性の腫瘍細胞において遺伝子の活性化に効果的な一つまたはそれ以上の抗癌剤から成る化学療法的療法を設計する事、対象に一つまたはそれ以上の抗癌剤を投与する事、そしてそれにより多発性骨髄腫を治療する事から成る多発性骨髄腫の治療法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
前述した本発明の特徴、長所と目的が明白となり、詳細に理解されるよう、ここに添付の図面を加えた。これらの図面は明細事項の一部を構成する。しかしながら添付した図面は本発明の好ましい実施形態を例示するものであり、発明の範囲には制限する事が考慮されていない点に注意が必要である。
【図１】図1A-1Bはトレーニングセット（UARK2003-33、n=142）における80遺伝子の発現レベルのヒートマップを示す。図1A：各々の遺伝子（行）の平均中心をとりスケーリングしたポスト・ボルテゾミブの80遺伝子発現レベルのヒートマップ。 群平均法とピアソン相関関係測定基準を用いた階層的クラスター解析による結果順に遺伝子を配置する。各カラム（段）（サンプル）は値が小さいものから昇順でポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコア（PBS）により並べ、緑の三角形により示す。黄色の横線は、2つの主要な遺伝子クラスターを分断し、上部のクラスターは赤い縦線で示されるプロテアソームのサブユニットをコードする多くの遺伝子から成る。黄色の縦線は、ポスト・ボルテゾミブの80遺伝子のスコアにより定義された高リスクと低リスクのグループを分断する。図1B：カラム（サンプル）と行（遺伝子）を 上部パネルと同様に配置した80の遺伝子のベースライン発現のヒートマップ。データは各遺伝子ごとに平均中心をとり、スケーリングした。
【図２】図2は80の選択された遺伝子のIngenuity Pathway解析（IPA）からの統計的に有意なタンパク質ユビキチン化経路を示す。赤色で満たされた形はポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスク群で活性化した遺伝子を示す。
【図３Ａ】図3A-3Dはトレーニングセット（UARK2003-33）における生存率解析を示す。図3Aはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア（PBR）により同定した高リスク、低リスクグループにおける無症候生存率（EFS）のカプラン・マイアー曲線を示す。図3Bはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスクグループにおけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図3Cはベースラインの70遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコアを統合させ同定した4つのリスク群における無症候生存率のカプラン・マイアー曲線を示す。図3Dはベースラインの70遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコアを統合させ同定した4つのリスク群におけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図3Cと図3Dにおいて、その違いはログランク検定で有意ではないものの、ベースラインの70遺伝子スコア-低/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-高リスクグループはベースラインの70遺伝子スコア-高/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-低リスクグループより低い生存率を持つように見える。
【図３Ｂ】図3A-3Dはトレーニングセット（UARK2003-33）における生存率解析を示す。図3Aはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア（PBR）により同定した高リスク、低リスクグループにおける無症候生存率（EFS）のカプラン・マイアー曲線を示す。図3Bはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスクグループにおけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図3Cはベースラインの70遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコアを統合させ同定した4つのリスク群における無症候生存率のカプラン・マイアー曲線を示す。図3Dはベースラインの70遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコアを統合させ同定した4つのリスク群におけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図3Cと図3Dにおいて、その違いはログランク検定で有意ではないものの、ベースラインの70遺伝子スコア-低/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-高リスクグループはベースラインの70遺伝子スコア-高/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-低リスクグループより低い生存率を持つように見える。
【図３Ｃ】図3A-3Dはトレーニングセット（UARK2003-33）における生存率解析を示す。図3Aはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア（PBR）により同定した高リスク、低リスクグループにおける無症候生存率（EFS）のカプラン・マイアー曲線を示す。図3Bはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスクグループにおけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図3Cはベースラインの70遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコアを統合させ同定した4つのリスク群における無症候生存率のカプラン・マイアー曲線を示す。図3Dはベースラインの70遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコアを統合させ同定した4つのリスク群におけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図3Cと図3Dにおいて、その違いはログランク検定で有意ではないものの、ベースラインの70遺伝子スコア-低/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-高リスクグループはベースラインの70遺伝子スコア-高/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-低リスクグループより低い生存率を持つように見える。
【図３Ｄ】図3A-3Dはトレーニングセット（UARK2003-33）における生存率解析を示す。図3Aはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア（PBR）により同定した高リスク、低リスクグループにおける無症候生存率（EFS）のカプラン・マイアー曲線を示す。図3Bはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスクグループにおけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図3Cはベースラインの70遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコアを統合させ同定した4つのリスク群における無症候生存率のカプラン・マイアー曲線を示す。図3Dはベースラインの70遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブの80遺伝子スコアを統合させ同定した4つのリスク群におけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図3Cと図3Dにおいて、その違いはログランク検定で有意ではないものの、ベースラインの70遺伝子スコア-低/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-高リスクグループはベースラインの70遺伝子スコア-高/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-低リスクグループより低い生存率を持つように見える。
【図４】図4A-4Bは、テストセット（UARK2006-66）における80遺伝子発現レベルのヒートマップを示す。図4A：昇順でポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア（PBS）により並べられたカラム（サンプル）と図1のトレーニング・セットの場合と同様に並べられた列（遺伝子）のテストセットにおける80遺伝子48時間-発現レベルのヒートマップ。 図4B： 図1のトレーニング・セットの場合と同様に並べられたカラム（サンプル）と列（遺伝子）のベースライン80-遺伝子発現レベルのヒートマップ。
【図５】図5はトレーニングセットとテストセットにおいてポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアの分布を示し、赤い縦線はポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定された高リスクと低リスクグループとを2.48で分断する。
【図６Ａ】図6A-6Bは、テストセット（UARK2006-66）における生存率解析を示す。図6Aはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスク予測グループにおける無症候生存率のカプラン・マイアー曲線を示す。図6Bはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスク予測グループにおけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。
【図６Ｂ】図6A-6Bは、テストセット（UARK2006-66）における生存率解析を示す。図6Aはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスク予測グループにおける無症候生存率のカプラン・マイアー曲線を示す。図6Bはポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスク予測グループにおけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。
【図６Ｃ】図6Cはベースライン70-遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコアにより同定した4つのリスクグループにおける無症候生存率のカプラン・マイアー曲線を示す。図6Dはベースライン70遺伝子スコアとPBRとを統合する事により同定した4つのリスクグループにおけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図6Cと図6Dにおいて、その違いはログランク検定で有意ではないものの、BLR-低/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-高リスクグループはベースラインの70遺伝子スコア-高/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-低リスクグループより低い生存率を持つように見える。
【図６Ｄ】図6Cはベースライン70-遺伝子スコアとポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコアにより同定した4つのリスクグループにおける無症候生存率のカプラン・マイアー曲線を示す。図6Dはベースライン70遺伝子スコアとPBRとを統合する事により同定した4つのリスクグループにおけるOSのカプラン・マイアー曲線を示す。図6Cと図6Dにおいて、その違いはログランク検定で有意ではないものの、BLR-低/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-高リスクグループはベースラインの70遺伝子スコア-高/ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコア-低リスクグループより低い生存率を持つように見える。
【図７Ａ】図7Aはトレーニングセットおよびテストセットを統合した分子サブグループにおけるポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコアにより同定された高リスクと低リスクの分布を示す（ｐ値<0.001）。
【図７Ｂ】図7Bはトレーニングセットおよびテストセットを統合した分子サブグループにおけるベースライン70遺伝子スコアにより同定された高リスクと低リスクの分布を示す（ｐ値<0.001）。
【図８Ａ】図8A-8Bは、質量分析により示されるプロテアソーム・タンパク質におけるボルテゾミブの影響を示す。RNAとタンパク質レベルによりボルテゾミブ後のプロテアソーム活性化の代表例を示す。
【図８Ｂ】図8A-8Bは、質量分析により示されるプロテアソーム・タンパク質におけるボルテゾミブの影響を示す。RNAとタンパク質レベルによりボルテゾミブ後のプロテアソーム活性化の代表例を示す。
【図９】図9は4%の高リスクとして同定されたTotal Therapy 2（TT2）（n=351）におけるベースライン80遺伝子スコアにより同定した高リスクおよび低リスクグループによるカプラン・マイアー曲線を示す。
【図１０】図10は、ボルテゾミブ（Bor）、デキサメタゾン（Dex）、サリドマイド（Thal）とメルファラン（Mel）の短期曝露後、選択したプロテアソーム遺伝子（PSMB2、PSMB3、PSMC5とPSMD14）における遺伝子発現変化の棒グラフを示す。この図よりプロテアソーム遺伝子がデキサメタゾンとサリドマイドの後で変化せず、メルファランの場合では、いくつかののプロテアソーム遺伝子（例えばPSMB3とPSMD14）の変化はボルテゾミブの後の変化と比較して逆である事が明らかである。このことはプロテアソーム遺伝子の活性化がボルテゾミブに特異的である事を示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のその他、更なる側面や特徴、そして 長所は現時点で望ましい実施形態の記述から明らかとなる。これらの実施形態は、開示の目的のため与えられるものである。
【００２２】
本特許請求項および／または本明細書中で使用される用語“ａ”または“ａｎ”が“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（成り立っている）”という単語とともに使用される場合、“一つ”という意味を持つが、また“一つまたはそれ以上”、“少なくとも一つ”の意味と同じである。本発明のいくつかの実施形態は一致するかまたは原則的に本発明の一つまたはそれ以上の要素、方法段階、そして／または方法と一致する。ここに記述される他のどんな方法または組成はここに記載されるその他の方法や組成に関しても実行に移す事が出来るものと考えられる。
【００２３】
本特許請求項で使用される用語“ｏｒ”は本開示では他の選択肢と“ａｎｄ／ｏｒ”のみが言及される定義を支持するが、他の選択肢が明確に示されないかまたはその選択肢が互いに相容れない限り“ａｎｄ／ｏｒ”を意味するよう使用される。
【００２４】
本発明の1つの実施形態において、多発性骨髄腫に罹患した対象のため低リスク予後から高リスク予後まで形質転換する可能性を予測する方法を提供する。その方法は化学療法剤の投与前に腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る事、そして対象に対し単一の化学療法剤の服用投与する事、化学療法剤の投与後の腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得、そして、遺伝子発現プロファイルを投与前後で比較する事から成る。投与前のプロファイルと比較し投与後に得たプロファイルにおいて認められる遺伝子発現量の増加は高リスク予後に向かう形質転換の可能性を示す。関連した実施形態において、遺伝子はCOX6C、NOLA1、COPS5、SOD1、TUBA6、HNRPC、PSMB2、PSMC4、LOC400657、C1orf31、FUNDC1、SUMO1、PSMB4、PSMB3、ENSA、PSMB4、COMMD8、MRPL47、PSMC5、PSMA4、PSMD4、NMT1、PSMB7、NXT2、SLC25A14、PSMD2、SNRPD1、CHORDC1、PSMD14、LAP3、PSMA7、UBPH、BIRC5、STAU2、ALDOA、TMC8、C1orf128、FLNA、HIST1H3Bからなるグループから選択される。 遺伝子は、プロテオゾーム遺伝子である可能性がある。化学療法剤は、ボルテゾミブである可能性がある。遺伝子発現は、核酸またはタンパク質レベルで同定される可能性がある。化学療法剤の投与後の遺伝子発現プロファイルは、およそ48時間で得られる可能性がある。
【００２５】
もう一つの関連した実施形態において、形質転換の可能性を予測する方法は、遺伝子発現が増加し活性化を抑制することにより高リスク状態に形質転換するのを防ぐ効果的な治療法を設計するステップをさらに含む可能性がある。
【００２６】
もう一つの関連した実施形態において、形質転換の可能性を予測する方法は、対象のための予測において形質転換のリスクに活性化した遺伝子表現プロファイルの相関関係に基づくスコアを与えることを更に含む。 形質転換のリスクは多変量解析を使用し同定される可能性がある。
【００２７】
本発明のもう1つの実施形態において、対象で潜在的に侵攻性の多発性骨髄腫腫瘍細胞を同定し、対象で多発性骨髄腫腫瘍細胞の最初の遺伝子発現プロファイルを得る事、単一の化学療法剤を腫瘍細胞と接触させる事、そして、化学療法剤と接触の後の多発性骨髄腫腫瘍細胞の第2の遺伝子発現プロファイルを得る事から成る方法を提供する。最初のプロファイルと比較し第2番目のプロファイルでの遺伝子の発現量増加は腫瘍細胞が潜在的に侵攻性な腫瘍細胞である事を示す。遺伝子は、COX6C、NOLA1、COPS5、SOD1、TUBA6、HNRPC、PSMB2、PSMC4、LOC400657、C1orf31、FUNDC1、SUMO1、PSMB4、PSMB3、エンサ、PSMB4、COMMD8、MRPL47、PSMC5、PSMA4、PSMD4、NMT1、PSMB7、NXT2、SLC25A14、PSMD2、SNRPD1、CHORDC1、PSMD14、LAP3、PSMA7、UBPH、BIRC5、STAU2、ALDOA、TMC8、C1orf128、FLNA、HIST1H3Bからなるグループから選択される。腫瘍細胞遺伝子は、プロテオゾーム遺伝子である可能性がある。 化学療法剤は、ボルテゾミブである可能性がある。遺伝子発現は、核酸またはタンパク質レベルで同定される可能性がある。第2の遺伝子発現プロファイルは化学療法剤投与のおよそ48時間後に得られる可能性がある。
【００２８】
関連した実施形態において、対象で潜在的に侵攻性の多発性骨髄腫腫瘍細胞を同定する方法に、第2のプロファイルの遺伝子の活性レベルに基づく高リスク予測に対象が形質転換する可能性を予測するステップがさらに含まれる可能性がある。
【００２９】
本発明のさらにもう一つの実施形態において、対象の多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に侵攻性かどうかを同定する事、潜在的に侵攻性の腫瘍細胞の遺伝子活性を抑制するのに効果的な一つまたはそれ以上の抗癌剤から成っている化学療法的療法を設計する事、そして対象に一つまたはそれ以上の抗癌剤を投与する事からなる、対象で多発性骨髄腫を治療する方法があり、それにより多発性骨髄腫の治療を行う。  
【００３０】
関連した実施形態において、多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に積極的かどうか同定するステップが、対象で多発性骨髄腫腫瘍細胞の最初の遺伝子発現プロファイルを得る事、単一の化学療法剤を腫瘍細胞と接触させる事、そして、化学療法剤と接触の後の多発性骨髄腫腫瘍細胞の第2の遺伝子発現プロファイルを得る事から成る可能性がある。最初のプロファイルと比較し第2番目のプロファイルでの遺伝子の活性化は腫瘍細胞が潜在的に侵攻性な腫瘍細胞である事を示す。遺伝子は、COX6C、NOLA1、COPS5、SOD1、TUBA6、HNRPC、PSMB2、PSMC4、LOC400657、C1orf31、FUNDC1、SUMO1、PSMB4、PSMB3、ENSA、PSMB4、COMMD8、MRPL47、PSMC5、PSMA4、PSMD4、NMT1、PSMB7、NXT2、SLC25A14、PSMD2、SNRPD1、CHORDC1、PSMD14、LAP3、PSMA7、UBPH、BIRC5、STAU2、ALDOA、TMC8、C1orf128、FLNA、HIST1H3Bからなるグループから選択される。腫瘍細胞遺伝子は、プロテオゾーム遺伝子である可能性がある。 化学療法剤は、ボルテゾミブである可能性がある。遺伝子発現は、核酸またはタンパク質レベルで同定される可能性がある。第2の遺伝子発現プロファイルは化学療法剤投与のおよそ48時間後に得られる可能性がある。抗癌剤はボルテゾミブまたはサリドマイドまたはその組合せである可能性がある。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態において、多発性骨髄腫の対象において低リスク予後から高リスク予後まで形質転換する可能性を予測する事、化学療法剤の投与の前に腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る事、対象に化学療法剤の単回の服用を投与する事、化学療法剤投与後、腫瘍細胞遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る事、そして前後の遺伝子発現プロファイル比較する事から成る方法がある。薬剤投与前のプロファイルと比較し投与後得たプロファイルで遺伝子の発現量の減少した遺伝子は高リスク予後に変化する可能性を示す。遺伝子は、FOSB、LOC644250、C17orf60、LZTR2、PDE4B、STAU2、PDE4B、GABARAPL1、TAGAP、LOC643318、CISH、NR4A1、MGC61598、ANKRD37、KIAA1394、ACVR1C、TBC1D9、CRYGS、PDE4B、ZNF710、RBM33、STX11、KIAA1754、RPL41、WIRE、LAPTM4A、KLHL7、C9orf130、C14orf100からなるグループから選択される。化学療法剤は、ボルテゾミブである可能性がある。遺伝子発現は、核酸またはタンパク質レベルで同定される可能性がある。化学療法剤投与後の遺伝子発現プロファイルは、およそ48時間後に得られる可能性がある。
【００３２】
関連した実施形態において、形質転換の可能性を予測する方法は、対象のために予後において形質転換するリスクに発現量の低下した遺伝子発現プロファイルの相関関係に基づいたスコアを与えるステップをさらに含む。形質転換のリスクが多変量解析を用い同定される可能性がある。
【００３３】
関連した実施形態において、形質転換の可能性を予測する方法は、発現量の減少した遺伝子を高活性化することにより高リスク状態に形質転換するのを防ぐため効果的な治療法を設計するステップをさらに含む。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態において、対象で潜在的に侵攻性の多発性骨髄腫腫瘍細胞を同定する事、対象で多発性骨髄腫腫瘍細胞の最初の遺伝子発現プロファイルを得る事、単一の化学療法剤を腫瘍細胞と接触させる事、そして、化学療法剤と接触の後の多発性骨髄腫腫瘍細胞の第2の遺伝子発現プロファイルを得る事から成る方法がある。最初のプロファイルと比較し第2番目のプロファイルでの遺伝子発現量の減少は腫瘍細胞が潜在的に侵攻性な腫瘍細胞である事を示す。遺伝子は、FOSB、LOC644250、C17orf60、LZTR2、PDE4B、STAU2、PDE4B、GABARAPL1、TAGAP、LOC643318、CISH、NR4A1、MGC61598、ANKRD37、KIAA1394、ACVR1C、TBC1D9、CRYGS、PDE4B、ZNF710、RBM33、STX11、KIAA1754、RPL41、WIRE、LAPTM4A、KLHL7、C9orf130、C14orf100からなるグループから選択される可能性がある。 化学療法剤は、ボルテゾミブである可能性がある。遺伝子発現は、核酸またはタンパク質レベルで同定される可能性がある。第2の遺伝子発現プロファイルは、化学療法剤投与のおよそ48時間後に得られる可能性がある。
【００３５】
関連した実施形態において、対象で潜在的に侵攻性の多発性骨髄腫腫瘍細胞を同定する方法に、第2のプロファイルの遺伝子の抑制レベルに基づく高リスク予測に対象が形質転換する可能性を予測するステップがさらに含まれる。
【００３６】
本発明のもう一つの実施形態において、対象の多発性骨髄腫を治療する方法を提供する。その方法は対象の多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に侵攻性かどうかを同定する事、潜在的に侵攻性の腫瘍細胞の遺伝子を活性化するために効果的な一つまたはそれ以上の抗癌剤から成る化学療法を設計する事、そしてそれによって多発性骨髄腫を治療している対象に一つまたはそれ以上の抗癌剤を投与する事からなる方法である。遺伝子は、FOSB、LOC644250、C17orf60、LZTR2、PDE4B、STAU2、PDE4B、GABARAPL1、TAGAP、LOC643318、CISH、NR4A1、MGC61598、ANKRD37、KIAA1394、ACVR1C、TBC1D9、CRYGS、PDE4B、ZNF710、RBM33、STX11、KIAA1754、RPL41、WIRE、LAPTM4A、KLHL7、C9orf130、C14orf100からなるグループから選択される可能性がある。
【００３７】
関連した実施形態において、多発性骨髄腫腫瘍細胞が潜在的に積極的かどうか同定するステップが、対象で多発性骨髄腫腫瘍細胞の最初の遺伝子発現プロファイルを得る事、単一の化学療法剤を腫瘍細胞と接触させる事、そして、化学療法剤と接触の後の多発性骨髄腫腫瘍細胞の第2の遺伝子発現プロファイルを得る事から成る可能性がある。最初のプロファイルと比較し第2番目のプロファイルでの遺伝子の抑制は腫瘍細胞が潜在的に侵攻性な腫瘍細胞である事を示す。 化学療法剤は、ボルテゾミブである可能性がある。遺伝子発現は、核酸またはタンパク質レベルで同定される可能性がある。第2の遺伝子発現プロファイルは化学療法剤投与のおよそ48時間後に得られる可能性がある。抗癌剤はボルテゾミブまたはサリドマイドまたはその組合せである可能性がある。
【００３８】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を例示する目的で挙げ、どのような方法においても本発明を制限することを意味しない。当事者はすぐに本発明が対象に対し施行するのに非常に適している事を高く評価し、最終的にそれら対象と同様にここで言及した様な利点を獲得し、最終的にここで固有の利点を獲得するであろう。当業者に生じうる要求の範囲により定義されるように、本発明の精神の範囲内で変更と他の用途への使用が包含される。
【実施例】
【００３９】
（実施例1）ボルテゾミブ薬理ゲノミクスは薬剤耐性のメカニズムを同定し、Total Therapy 3で治療した多発性骨髄腫において生存率を予測する
多発性骨髄腫患者の予後はCD138精製した形質細胞の遺伝子発現プロファイリング解析により最も正確に得る事が可能である。そして、70-遺伝子ベースライン・リスク・モデル（BLR）を用い15%の非常に低い生存率を持つ高リスクグループの識別を可能にするものである。Total Therapy 3（TT3）におけるトランスレーショナル研究は、短期のボルテゾミブ処理により誘導された遺伝子発現プロファイリングの変化がボルテゾミブの新しい作用メカニズムに対する我々の理解を進展したかどうか解析できるようデザインされた。
【００４０】
薬理ゲノミクスPharmacogenomic（PG）研究は、2つのTT3トライアルの一部とし行われ（2003-33、n=303; 2006-66、n=177）、2003-33（トレーニングセット）を受ける142人の患者と2006-66（テストセット）を受ける127人の患者においてボルテゾミブ・投与試験（1.0mg/m2）前と48時間後の形質細胞を得て行われた。トレーニングセットのポスト・ボルテゾミブで顕著に変化した1051の遺伝子の中で、80遺伝子は無症候生存率とかなり相関しているものとして同定された。経時的にリスクスコアを計算し、無症候生存率を区別するための最適なカットオフ値を同定した。バイナリリスクスコアの単独予後予測力が2006-66においてテストされた。標準的な予後変数と70-遺伝子ベースライン・リスク・モデルとを関連づけ、ポスト・ボルテゾミブのリスクの役割の同定に多変量解析（MV）が用いられた。
【００４１】
2003-33（3年  OS： 95%対45%（p<0.0001）; 3年  無症候生存率： 90%対35%（p<0.0001））における判別力は、2006-66（18ヶ月  OS： 100%対65%（p=0.0004）; 18ヶ月  無症候生存率： 95%対45%（p<0.0001））において確認された。70-遺伝子ベースライン・リスク・モデルを再検討する中でPBRを評価し、2003-33の12/26と2006-66の7/21は高いポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子バイナリスコアを持ち、低い70-遺伝子ベースライン・リスクがあるものとして見なされた。反対に、2003-33のと14/106と2006-66の8/126は、低いポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子バイナリスコアを持ち、高い70-遺伝子ベースライン・リスクがあるものとして考えられた。8つの分子サブグループ・モデルでは、高いポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子バイナリスコアは、増殖（PR）サブグループ（2003-33の7/15、2006-66の8/18）において過度に高く、Low Bone 病（LB）グループ（0/28）では全く認められなかった。多変量解析で、ポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子バイナリスコアは2003-33（OS： HR=3.17、p=0.006、R2=55%; 無症候生存率： HR=4.40、p0.001、R2=48%）、および2006-6（OS： HR=13.00、p=0.002、R2=48%; 無症候生存率： HR=15.57、p0.001、R2=55%）においてOSと無症候生存率では独立した逆変数であった。したがって、薬理ゲノミクス研究は強固な80-遺伝子PBRモデルを先例のない予後識別力があるものと同定し、低リスクから高リスクまで主にBLR指定を変化させる事により多変量解析から70-遺伝子由来のBLRを一掃した。高いPBR（18%）は、ボルテゾミブの標的であるプロテアソーム遺伝子の発現量の増加の道をたどった。
【００４２】
PSMD4は1q21増幅部位に位置し、その活性化した発現がTotal Therapy 2（TT2）において増加したリスクと相関しているとすると、PSMD4 GEPはTotal Therapy 3（TT3）において誘導、強化とその維持においてボルテゾミブの使用により認められる増加した効果から恩恵を得る可能性のある患者を同定する為の有用なバイオマーカーとなりうる。さらにまた、小児急性リンパ性白血病と骨髄腫における観察に基づいた抵抗性関連のゲノム情報のバイアスの無い読み取りが、インビボでのボルテゾミブの投与試験投与により明らかとなった。
【００４３】
この問題を分析しボルテゾミブの作用のメカニズムの分子基礎を検索すべく、CD138精製で選択した形質細胞のゲノムワイドなmRNA発現プロファイリングをボルテゾミブの短期投与試験の前後において行った。目的はサリドマイド、デキサメタゾンとレナリドマイドの解析と同様に、すべての遺伝子をログランク検定において競合させる事が可能な広域に渡りバイアスの無い方法により、薬剤により発現が変化し、薬剤での治療後表現レベルが臨床結果と関連が認められた遺伝子を同定することである。ボルテゾミブの48時間の暴露後、発現が変化した合計80の遺伝子が同定され、薬剤処理後の発現レベルは臨床結果と相関が認められた。このリストには、投与試験の後、発現が増加したPSMD4を含むプロテアソーム遺伝子の著しく過剰発現した遺伝子が含まれる。
【００４４】
一貫して、Ingenuity Pathway 解析（図2）は、プロテアソーム経路でこの80-遺伝子リストの有意な関係を明らかにした。重要なことに、短期サリドマイド、デキサメタゾンまたはレナリドマイド（Burington et al., 2009）はプロテアソーム遺伝子の活性化との関連は認められず、この現象がボルテゾミブ特異的であったことを示唆した。同じ治療法（TT3B）で治療された新たに疾患であると診断された別々のコホートで、80遺伝子モデルの有効性が立証された。そのモデルはまたベースラインTT3とTT3Bサンプルにおいて結果を予測することも可能であった。そして、治療ナイーブ（投薬を受けていない）病気のプロテアソーム遺伝子の高発現がTT3/T3B療法を含むボルテゾミブにおける結果に対しても相関を示した。
【００４５】
80遺伝子モデルが70遺伝子モデルにより提供されたものを上回るさらなる予後に対する情報をもたらすかどうか決定するため70遺伝子と80遺伝子モデルによる高リスク対低リスク予測の後、カプランマイヤー解析を行った。TT3とTT3Bにおいて、70-遺伝子モデルにより高リスクとして考られ、80-遺伝子モデルでは低リスクであると考えられた症例のうちのほんの一部の患者のみが、両モデルにより高リスクとして考えられていた症例に対し顕著に結果が改善され享受を受けた事がこれらの研究より明らかとなった。それにもかかわらず両方のモデルによりこれまで彼らの病気が両方のモデルでの低リスクであると予測されたそれらの病気のものには遠く及ぶものではない。
【００４６】
しかしながら、この現象は、TT2で治療される患者では観察されなかった。具体的には、70-遺伝子モデルで低リスクとされ、80遺伝子モデルで低リスクであると予測された症例において両方のモデルにより高リスクとされた患者に類似した臨床結果を得た。さらに両方のモデルにより低リスクであると予測された患者にとりそれらの優れた結果は、TT2とTT3に類似していた。 同様に、両方のモデルにより高リスクの疾患に罹患した患者は、同等に悪い結果となった。70遺伝子高リスク/80遺伝子低リスクの病気に罹患した患者の改善された生存率が両方のモデルで低リスクの患者よりまだ劣っていたことは注目に値する。これらのデータは70遺伝子モデルにより同定されたように高リスクの病気のサブセットにおいてTT3が結果を改善したことを意味し、これらの症例は低リスク疾患において低レベル、高リスク疾患において高レベルの活性を持つのに対し中間のプロテアソーム活性を持つ。
【００４７】
この結果から鑑みて、PSMD4遺伝子の段階的な発現量により臨床結果をモデル化する事が可能であり、この段階的な遺伝子発現がPSMD4領域のコピー数の増加に関連がある可能性が考えられた。そこで、新たに多発性骨髄腫であると診断された600の症例において1q21のコピー数の増幅の検索を行うべく中間期FISHと遺伝子発現プロファイリングを行った。1q21領域のコピー数が2から3〜4、またはそれ以上増加するに従い、BCL9では認められなかったが、IL6R、CKS1BそしてMCL1の発現量も PSMD4のmRNAレベルと同様に徐々に増加することを証明することができた。1q21領域の2から3、そして4以上のコピー数と一致するPSMD4遺伝子発現プロファイリングの最適なカット値を同定し、それらのカット値はTT2とTT3における臨床結果と相関を示した。結果より、最も低い三分位値のPSMD4遺伝子発現プロファイリングを持つ症例がTT2とTT3で同等にうまくいくことが明らかとなった。
【００４８】
期待した通り、中央の三分位値のPSMD4を持つ患者は同じグループがTT2で治療した同じグループと関連のあるTT3により顕著な改善を経験し、そして、最も高い三分位値のPSMD4発現はTT2とTT3両方で見通しの暗い予後と相関した。重要なことに、70遺伝子高リスク/80遺伝子低リスクであるほとんどの数の症例において、PSMD4の三分位値は中間値であった。3つの分子変数（PSMD4遺伝子発現のカット値、1q21領域の2、3そして4以上のコピー数解析のためのFISHと統合した70/80-遺伝子モデル）により多発性骨髄腫における結果に相関した共通の生物学的現象（すなわち1q21領域のコピー数におけるバリエーション）を同定したように思われた。全部で3つの変数の相対的な予後の影響は標準的な変数で多変量コックス回帰解析において評価した。
【００４９】
結果より統合した70/80-遺伝子モデルが予後の非依存性を維持することが明らかとなった。重要なことに、それはdelTp53とMSサブタイプを持つ疾患のTT3において、現在認知されている改善された結果より非依存的であった。R2統計によってもまた統合70/80-遺伝子モデルのみが唯一TT3トライアルにおいて結果ばらつきがこれまで先例のない50%という割合であることが明らかにされた。これらのデータは疾患の分類、予測と予後の手段を提供し、そしてここで明らかにされるものとして、作用メカニズム発見の可能性をも提供する遺伝子発現プロファイリングの驚くべき力を示す。データより、ボルテゾミブの治療用量におけるインビボでのトライアルでの薬理ゲノミクス研究を通し曝露した多発性骨髄腫腫瘍細胞における遺伝子である免疫プロテアソームでは認められないが、プロテアソームの発現量は増加する事が明らかにされ、改善された結果はTT2と比較してTT3との相関がより強く認められた。そしてそれ故、治療過程を通してボルテゾミブを使用する利点は本疾患の重複領域であるにマッピングされるコピー数感受性遺伝子であるプロテアソーム遺伝子であるPSMD4の発現量の変動を追跡できることである。実際、4つまたはそれ以上の1q21領域のコピー数と一致し、最も高レベルのPSMD4発現を持つ症例では改善が認められなかったが、TT3で使用された服用と日程においてボルテゾミブ+THALの包含が1q21のトリソミーと一致し、極端でないPSMD4発現を持つ疾患の臨床結果を改善することをこれらのデータは明らかにした。多発性骨髄腫細胞において（おそらくPSMD4のコピー数と活性の増加により引き起こされる）相対的なプロテアソーム活性が多剤化学療法と組み合わしたボルテゾミブ+THALによりアポトーシスと効果的な腫瘍細胞根絶における腫瘍細胞の相対的な感受性を決定する可能性をこれらのデータは示唆する。プロテアソームの高活性化の影響を克服することを目的とする新規の治療的戦略は、多発性骨髄腫における高リスクを打開するための中核を成す可能性が考えられる。
【００５０】
患者と方法
Total Therapy 3の詳細は、当技術分野において既に知られている。手短に言えば、タンデム移植プログラムを行うプロトコル2003-33に登録されている303人の新たに骨髄腫として診断された患者にメルファランをベースとした移植の前後にVTD-PACE（ボルテゾミブ、サリドマイド、デキサメタゾン; シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシドの4日間の持続性点滴）のそれぞれ2サイクルの導入化学療法を行い、VTDでのメンテナンスを続ける。プロトコルの薬理ゲノミクスの見地からボルテゾミブ（1.0mg/m2）の投与試験における服用前および48時間後に得たCD138で精製した形質細胞の遺伝子発現プロファイリング解析が必要であった。ボルテゾミブにより誘導された遺伝子発現プロファイリングの変化の予測結果の観察は2003-33のトライアルで得られた薬理ゲノミクスデータを追認するため、拡張TT3プロトコル（2006-66）において177人の追加患者の増加（発生）に対する論的根拠を提供した。2003-33と2006-66を受けるそれぞれ275人と169人の患者において、遺伝子発現プロファイリング・ベースライン・データが利用可能であり、その内の142人と128人に関してはベースラインとテスト-投与後48時間の一対のサンプルが存在した。
【００５１】
両研究は施設内倫理委員会の承認を得、患者にはプロトコルが検討中であるという性質を承認するインフォームドコンセントを行った。登録患者の少なくとも80%の記録は、連邦政府公認の検査チームにより毒性と有効性データ同様、プロトコル厳守がなされているかどうか監査を受けた。
【００５２】
遺伝子発現プロファイリング
UARK2003-33に登録される303人の患者の内142人とUARK2006-66にいる177人のうちの128人においてボルテゾミブの1.0mg/m2のインビボでの曝露前と曝露48時間後に吸引した骨髄から多発性骨髄腫形質細胞を精製した。RNAを腫瘍細胞から抽出し、Affymetrix U133Plus2.0マイクロアレイに供した。Miltenyi AutoMacs装置（Miltenyi社、Bergisch Gladbach、ドイツ）を用いCD138ベースの免疫磁気ビーズによる選択によりヘパリンで凝血防止した骨髄（BM）吸引物から、多発性骨髄腫形質細胞を分離した。抹消血単核細胞をフィコール勾配遠心分離により得た。RNAを精製後、cDNA合成し、cRNA調合液とHuman Genome U133Plus 2.0 GeneChipマイクロアレイ（アフィメトリクス社、サンタクララ、CA）にハイブリザイズした。
【００５３】
統計方法
Affymetrix U133Plus2.0マイクロアレイは、MAS5.0ソフトウェアを用い前処理を行いノーマライズ（標準化）した。 トレーニングセットとしてUARK2003-33プロトコル（n=142）のデータを用い、0.22の false discovery rateで 各遺伝子において0.005のｐ値カットオフでｔ検定を適用することにより、ベースラインと比較してボルテゾミブの48時間後に発現レベルが顕著に変化した1051の遺伝子を同定した。その後、これらの1051の各遺伝子について、コックス回帰モデルにより無症候生存率と相関させ、ｐ値により遺伝子をランク付けした。 生存率に含まれる様々な潜在的意味を検索するべく、2セットの共変量を各々の遺伝子のコックス・モデルを用い検討した。（（a) ベースラインの発現と比較した48時間後のパーセント変化、および（b) 48時間の発現量）
【００５４】
1051の各遺伝子に適切な（適応する）モデル(a)は最小値0.94のq値を持ち、それはたとえ最も有意な遺伝子を選択しても偽陽性である可能性が94%である事を意味する。適切なモデル(b)は最小値.005を持つモデル(a)より顕著に少さいq値であった。これにより48時間後の発現がパーセント変化と比較し、より生存率と相関する事が明らかとなった。したがって、モデル(a)よりモデル(b)を選択し、48時間後の発現のp値により遺伝子をランクづけした。
【００５５】
一旦遺伝子がランク付けされると、Shaughnessy et al （2007）が報告している通り、遺伝子の上位x数を選択し、各々の患者のために大まかなスコアを計算することにより生存率を予測することが可能となる。特定の患者のスコアは善玉遺伝子と悪玉遺伝子の発現量の差を平均値として同定し、善玉遺伝子は良好な結果（危険率またはHR<1）と悪玉遺伝子は良くない結果（HR >=1）と相関する。スコアは症候を呈し、より高いスコアを持つものはより高いリスクを持つという様な方法で計算する。
【００５６】
高リスクおよび低リスクグループに所属する患者を特徴づけるため、2つのグループの結果において生じる生存率の違いを最大にする最適のカット値を同定する事により連続した大まかなスコアを二分することが可能である。カット値より大きい得スコアを持つ患者は、高リスクグループに、低いスコアを持つものは低リスクグループに割り当てた。強固なモデルを構築すべく、同時に選択した80の遺伝子に対し遺伝子スコアと最適なカット値を計算し、スコアを二分するため、10倍のクロス確認（相互検証）アプローチ（表1）を使用した。一旦モデルの選択が完了すると、それから、ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアの独立した予後予測力を他の予後因子とともに無症候生存率とOSの多変量解析において解析した。最終的にUARKの2006-66のプロトコル（n=128）のテストセットにおいてこのスコアをテストした。 
【００５７】
【表１】
2012514460.tif 000002
【００５８】
ボルテゾミブ・テスト-投与の48時間後の遺伝子発現の変化
142人の患者のトレーニングセット2003-33を使用し異なる発現を呈する80の遺伝子が同定され（表2）、その48時間の発現レベルは無症候生存率と相関した。図1Aは48時間後の80-遺伝子発現レベルのヒートマップを示す。そして、各々の遺伝子の平均中心をとりスケーリングした。ヒートマップにより多数のプロテアソームのサブユニットをコードする遺伝子からなる上部の遺伝子集団を含み2つの主要な遺伝子集団の存在が明らかとなった。高リスクグループは、42の悪い遺伝子（プロテアソームをコードする遺伝子を含む）の発現量の増加と38の良い遺伝子の発現量の減少を特徴とする。Ingenuity Pathway解析に供する事で、免疫プロテアソームのアセンブリが自己抑制的となり、プロテアソーム・サブユニットが選択的に高活性化する事によりプロテアソーム経路が優位に影響を受けることが確認された（図2）。
【００５９】
【表２−１】
2012514460.tif 000003
【００６０】
【表２−２】
2012514460.tif 000004
【００６１】
【表２−３】
2012514460.tif 000005
【００６２】
ポスト・ボルテゾミブリスクモデルはUARK2003-33において生存率結果に影響を及ぼす
無症候生存率に関与する80の遺伝子のうち、38遺伝子は良好な結果（HR<1.0）となり、42遺伝子は良好でない結果（HR>=1.0）と関連した。80遺伝子48時間の発現レベルと定められた2.48の分岐している最適切られた点を基に大まかなスコアを計算した。 2.48以上の80遺伝子スコアを持つ患者は高リスクとされ、残りは低リスクとされた。無症候生存率とOSは両方とも、116人の低リスク患者と比較し、26人の高リスク患者の間で著しく劣っていた（図3A-3B）。
【００６３】
70遺伝子ベースラインスコア（BLR）に照らしてポスト・ボルテゾミブ80遺伝子二進数スコア（PBR）を検索すると、3つの遺伝子（BIRC5、PSMD4とKIAA1754）のみが両方のモデルに共通であったが、PBRがBLR(p<.001)と高度に相関する事が認められた。臨床結果に関係して、BLR-高/PBR-高スコアを持つ患者はによるそれらには最悪の結果であったが、BLR-低/PBR-低スコアを持つ患者は高い生存率を示した（図3C-3D）。BLRの意味あいは低いBLRが特徴である患者においてPBR-高スコアにより逆に修正され、そして、逆もまた同様で、言い換えればPBRが低くければ、BLR-高スコアを持つ患者の予後は顕著に向上した。
【００６４】
UARK2006-66におけるポスト・ボルテゾミブ80遺伝子モデルの確認
図4A-4Bで示されるように、テストセットでのベースラインとポスト・ボルテゾミブ80遺伝子発現レベルは図1A-1Bのトレーニングセットにおけるそれらと高い類似性を示す。テストセットとトレーニングセットにおける80遺伝子から生じたリスクスコアの分布はほぼ重ね合わせる事が可能であり（図5）、ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子モデルの更なる確認をもたらした。実際に、無症候生存率とOSは21人の80-遺伝子で同定した高リスク骨髄腫の患者の間で顕著に低くなっており（図6A-6B）、70-遺伝子ベースのモデル（図6C-6D）と同時に解析すると、（トレーニングセットでのように）更なるリスク定義与えるものであった。
【００６５】
骨髄腫分子サブタイプ間のポスト・ボルテゾミブ80遺伝子由来の高リスク分布
両方のTT3プロトコルに渡り本解析を行うことにより、CD-2とLBサブタイプにおいて高リスクのものの過少発現とPR（34の16）、MF（18の6つ）とMSサブタイプ（33の8つ）での過剰発現が明らかとなった（図7A）。類似した結果がベースライン70遺伝子スコアにおいても観察された（図7B）。
【００６６】
多変量解析
次にポスト・ボルテゾミブ80遺伝子の予後予測を多変量コックス回帰分析により検索した。分布が一変量で、無症候生存率とOS両方で非常に有意な場合、ポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコアの調節を行うと、悪い影響は中期細胞遺伝学的な異常（CA）と相関し、70-遺伝子により同定した高リスクはもはや低い結果とはならなかった。表3はテストセットから得た結果を示し、ポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコアとdelTP53は段階を追って行った回帰分析により選択した。これは80-遺伝子スコアが独立して優れた予後予測力を持つ事を示す。
【００６７】
プロテアソーム・タンパク質もまたポスト・ボルテゾミブで増加する。
GEPから派生したデータの更なる確認のため、プロテアソーム・タンパク質におけるボルテゾミブの影響についても質量分光により解析した（図8A）。 ボルテゾミブの後、RNAとタンパク質レベル両方でプロテアソームが活性化した代表例は、図8A-8Bに示す。
【００６８】
変化の大きさとベースライン80遺伝子の発現
ポスト・ボルテゾミブ80遺伝子で同定した高リスクグループが「悪玉」遺伝子の発現量の増加と「善玉」遺伝子の発現量の低下により特徴づけられるということから（図1A-1B）、ベースラインからポスト・ボルテゾミブまでの発現の変化を各々の遺伝子ごとにさらに検索した。解析を行うと低リスクと高リスクグループにおける遺伝子発現がそれぞれ平均で、悪玉遺伝子は1.07から1.21倍（ｐ値<.0001）増加し、善玉遺伝子は1.09から1.22倍（ｐ値= .03）減少した。明らかに個々の遺伝子の全体的な変化としては目立ったものは無かったが、高リスクのグループでは低リスクグループより多くの変化が認められた（表2）。
【００６９】
ベースラインとボルテゾミブ投与後48時間における80の遺伝子との高い類似性により、ベースライン80遺伝子スコアがポスト・ボルテゾミブ80遺伝子スコアとして同様に生存率の予測となりうる場合があることが示唆された。ベースライン80-遺伝子スコアのこの予後予測力は、無症候生存率とOS両方のためにｐ値0.0001以下でトレーニングセットとテストセット両方において確認された。臨床結果の変動を説明する事が出来るレベルの基準尺度として、テストセットにおいてのベースラインおよびポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコア両方のR2値を算出し、それぞれ、無イベント生存率では25%と36%の値、OSでは32%と49%の値を得た。重要なことに、ポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコアがない場合、ベースライン80-遺伝子スコアは、トレーニングセットとテストセット両方において回帰モデルからベースライン70遺伝子スコアに置き換える事が可能である。 しかしながら、ベースラインとポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコア両方がモデルである場合、ポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコアだけが選択される（表3）。合わせて考えると、たとえ80-遺伝子発現の48時間-ポスト-ボルテゾミブの平均倍数変化が比較的小さかったとしても、ポスト・ボルテゾミブ80-遺伝子スコアが実際に、ベースライン80-遺伝子スコアよりも臨床結果の変化の度合いを捕える際、強力な予測因子であることを、これらのデータは示唆する。
【００７０】
【表３−１】
2012514460.tif 000006
【００７１】
【表３−２】
2012514460.tif 000007
【００７２】
他のプロトコルまたは病気セッティングにおけるテスト
テストセットにおいてベースライン80遺伝子スコアがベースライン70遺伝子スコアを圧倒するという概念は、それがMMに対し強固なベースラインリスクスコアであり、48時間の発現が利用不可能である場合使用可能であるという事を示唆する。Total Therapy 2（98-026; n=351）においてベースライン80遺伝子モデルをテストし、無症候生存率（図9）とOS（データは示さない）両方において予測された高リスクと低リスクグループは有意な差を示した。70-遺伝子スコアがTT2において効果的に再発後の生存リスクを識別するとすでに報告されている。80-遺伝子モデルをまたそのセッティングにおいてもテストし、実際に、70-遺伝子スコア（両p< 0.001）と同様に、再発時点での80-遺伝子スコアは再発後の生存を予測した。しかしながら、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫と小胞リンパ腫でテストした場合、経時的でもなくバイナリでもない80遺伝子スコアは生存率と相関した。このことは80遺伝子モデルがMM以外のがんに一般化されない可能性があることを示唆する。
【００７３】
（実施例2）プロテアソーム遺伝子の活性化はボルテゾミブに特有で、Total Therapy 2（1998-26、TT2）とメルファラン（2008-1、Total Therapy 4［TT4］）におけるデキサメタゾンとサリドマイドでのテスト-投与後には認められない
以前の研究において、サリドマイドとデキサメタゾンの治療未経験症例への短期曝露により変化する遺伝子を同定するのに、薬理ゲノミクスが利用された。 ボルテゾミブにより変化した遺伝子のうちこれらの薬剤により変化した遺伝子と重複したものはほとんど発見されなかった。最も明らかな相違点は、サリドマイドまたはデキサメタゾンの曝露後ではプロテアソーム成分をコードする遺伝子が全く活性化しなかった点である（図10）。 Total Therapies 4の一部として行われたメルファランPGの場合、ボルテゾミブ処理後の変化と比較し逆に変化した（逆比例した）PSMB2とPSMD14以外は、大部分のプロテアソーム遺伝子において変化が認められなかった。これらのデータはボルテゾミブにより誘導された遺伝子変化がそれ自身のターゲット（プロテアソーム）遺伝子の高活性化と関与する劣悪な予後と関係がある革新的な新規の薬剤に特異的である事を示すものである。
【００７４】
考察
本発明では投与試験の48時間以内で、ボルテゾミブは免疫プロテアソーム遺伝子サブユニットを犠牲にし、プロテアソーム遺伝子の高活性化を誘導し、70-遺伝子で同定したリスクに依存せずTT3において短期間の無症候生存率と全体的な生存率と関連が認められる事を確認した。実際、低リスク患者は段階を上げ、高リスク患者は段階を下げ、80-遺伝子で同定したリスクモデルは70-遺伝子モデルにより提供されるものに対し修正を行った。さらにプロテオミクス・レベルで確認し、プロテアソームの高活性化がベースラインにおいてすでに重篤なプロテアソーム遺伝子の発現レベルが認められる症例に作用した。この事はまたベースラインに対し80遺伝子由来のポスト・ボルテゾミブ・モデルを使用させ、そして、重要なことに、80-遺伝子で同定したベースラインモデルは対象の9%を高リスクとして区分した。 しかしながら、ポスト・ボルテゾミブ由来の80-遺伝子モデルと競合させる場合、ベースライン高リスクの80-遺伝子は多変量解析において一つも残らなかった（表3）。
【００７５】
TT2におけるサリドマイドとデキサメタゾンとTotal Therapy 4におけるメルファラン（10mg/m2）のテスト投与の比較薬理ゲノミクス解析において、ボルテゾミブにより誘発された遺伝子の変化は薬剤特異的であることが示された。ボルテゾミブの短期暴露後のプロテアソーム遺伝子の高活性化は、ベースラインにおいても識別可能なこの薬剤に対する耐性の新規のメカニズムの存在を示唆する。発病時期と80遺伝子で同定したリスクグループ間のCRのレベルがほぼ一致している事を考慮すれば、70遺伝子モデルの場合のように、そのような患者の低い臨床結果は、プロトコルで治療の行われない段階の間における骨髄腫の再増殖を反映する。このように、用量-密度とより少ない用量強化療法の基礎を提供すべくTotal Therapy 5において現在調査中である。
【００７６】
下記の参考文献をここでは引用した。
1.  Shaughnessy et al. Blood, 109, 2276-2284 (2007).
【図１】
2012514460.tif 000008
【図２】
2012514460.tif 000009
【図３Ａ】
2012514460.tif 000010
【図３Ｂ】
2012514460.tif 000011
【図３Ｃ】
2012514460.tif 000012
【図３Ｄ】
2012514460.tif 000013
【図４】
2012514460.tif 000014
【図５】
2012514460.tif 000015
【図６Ａ】
2012514460.tif 000016
【図６Ｂ】
2012514460.tif 000017
【図６Ｃ】
2012514460.tif 000018
【図６Ｄ】
2012514460.tif 000019
【図７Ａ】
2012514460.tif 000020
【図７Ｂ】
2012514460.tif 000021
【図８Ａ】
2012514460.tif 000022
【図８Ｂ】
2012514460.tif 000023
【図９】
2012514460.tif 000024
【図１０】
2012514460.tif 000025
【国際調査報告】
2012514460.tif 000026
2012514460.tif 000027
2012514460.tif 000028
2012514460.tif 000029