(57)【要約】上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に結合し、ＥｐＣＡＭに結合する既知の抗体に対して特定の利点、例えば、本発明の抗体は良好な親和性、良好な交差反応プロファイル、ならびに優れたＡＤＣＣおよびＣＤＣＣ活性を示す、抗体を開示する。特定の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体を開示する。本発明は、よって、特に癌の治療における、これらの抗体およびその全使用に関する。本発明は、よって、癌治療のための新しい抗体ベースの組成物、方法、併用プロトコルを提供する。新しい抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用した有利な免疫抱合体組成物および方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｐＣＡＭに結合し、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの重鎖可変領域と、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの軽鎖可変領域とを含む抗体であって、前記重鎖可変領域は、
（ｃ）配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3であって、前記実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含有する配列であるか、または前記実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列の保存アミノ酸置換を含有する配列である、ＶＨ  ＣＤＲ3
を含む、抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変領域ＣＤＲの1つ以上は、
（ａ）配列番号5のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ1、および
（ｂ）配列番号6のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ2
から成る群より選択され、
前記実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含有する配列であるか、または前記実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列の保存アミノ酸置換を含有する配列である、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲの1つ以上は、
（ｄ）配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ1、
（ｅ）Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｘ5  Ａ  Ｘ7（配列番号37）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有し、Ｘ5およびＸ7は、任意のアミノ酸であり得るＶＬ  ＣＤＲ2、および
（ｆ）Ｑ  Ｘ2  Ｙ  Ｎ  Ｘ5  Ｗ  Ｐ  Ｐ  Ｘ9  Ｘ10  Ｔ（配列番号89）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有し、Ｘ2、Ｘ5、Ｘ9、およびＸ10は、任意のアミノ酸であり得るＶＬ  ＣＤＲ3
から成る群より選択され、
前記実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含有する配列であるか、または前記実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列の保存アミノ酸置換を含有する配列である、請求項1または請求項2に記載の抗体。
【請求項４】
前記（ｅ）のＶＬ  ＣＤＲ2において、
Ｘ5は、ＲもしくはＴ、好ましくはＴであり、かつ／または
Ｘ7は、ＴもしくはＳ、好ましくはＳであり、かつ／あるいは
前記（ｆ）のＶＬ  ＣＤＲ3において、
Ｘ2は、ＱもしくはＨもしくはＫ、好ましくはＱであり、
Ｘ5は、ＮもしくはＤ、好ましくはＮであり、
Ｘ9は、ＧもしくはＴもしくはＳもしくはＭもしくはＡ、好ましくはＡであり、かつ／または
Ｘ10は、ＦもしくはＷもしくはＹ、好ましくはＹである、請求項3に記載の抗体。
【請求項５】
前記（ｅ）のＶＬ  ＣＤＲ2は、配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有し、かつ／あるいは前記（ｆ）のＶＬ  ＣＤＲ3は、配列番号10、30、43、56、69、もしくは82のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する、請求項3または請求項4に記載の抗体。
【請求項６】
前記重鎖ＣＤＲドメイン（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のそれぞれのうちの1つ、ならびに／または前記軽鎖ＣＤＲドメイン（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のそれぞれのうちの1つを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項７】
前記3つの軽鎖可変領域ＣＤＲは、配列番号8、9、および10、または配列番号8、29、および30、または配列番号8、29、および43、または配列番号8、29、および56、または配列番号8、29、および69、または配列番号8、29、および82、あるいはそれらに実質的に相同な配列である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項８】
前記重鎖可変領域は、配列番号3のアミノ酸配列、またはそれに少なくとも70％、80％、90％、95％、または98％の配列同一性を有する配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項９】
前記軽鎖可変領域は、配列番号4、27、40、53、66、もしくは79のアミノ酸配列、またはそれに少なくとも70％、80％、90％、95％、もしくは98％の配列同一性を有する配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体は、配列番号21、36、49、62、75、もしくは88のアミノ酸配列、またはそれに少なくとも70％、80％、90％、95％、もしくは98％の配列同一性を有する配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体は、ヒトおよびサルの双方のＥｐＣＡＭに結合することが可能である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号5のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ1、配列番号6のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ2、配列番号7のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3、配列番号8のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ1、配列番号9のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ2、および配列番号10のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ3を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体、または前記抗体とＥｐＣＡＭへの結合において競合することができる抗体。
【請求項１３】
前記抗体は、完全ヒト抗体である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体は、抗体重鎖定常領域および／または抗体軽鎖定常領域の全てもしくは一部を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体はＩｇＧ抗体である、請求項14に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体は、配列番号24のアミノ酸配列、またはそれに少なくとも70％、80％、90％、95％、もしくは98％の配列同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号25、51、64、もしくは77のアミノ酸配列、またはそれに少なくとも70％、80％、90％、95％、もしくは98％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖とを含む、請求項14または請求項15に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体は、抗体の抗原結合断片である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体の前記抗原結合断片は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一ドメイン抗体、ＴａｎｄＡｂｓダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ[minibody]、二特異性抗体[diabody]、二重特異性抗体断片[bispecific antibody fragment]、バイボディ[bibody]、トリボディ[tribody]、ｓｃ−二特異性抗体[sc-diabody]、カッパ（ラムダ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰ、ＤＡＲＴ、または1つ以上のＣＤＲを含む小抗体模倣物[small antibody mimetic]である、請求項17に記載の抗体。
【請求項１９】
少なくとも第2の診断剤または治療剤に結合させた請求項1〜18のいずれか1項の抗体を含む免疫抱合体。
【請求項２０】
前記抗体は、放射線治療剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘発剤、抗チューブリン剤、抗細胞もしくは細胞障害性薬物、ステロイド、サイトカイン、ケモカイン、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、別の抗体、または血液凝固剤に結合される、請求項19に記載の免疫抱合体。
【請求項２１】
前記抗体は別の抗体に結合され、前記免疫抱合体は二重特異性抗体または二特異性抗体を含む、請求項20に記載の免疫抱合体。
【請求項２２】
請求項1〜21のいずれか1項に記載の抗体を含む結合タンパク質。
【請求項２３】
少なくとも、請求項1〜18のいずれか1項に記載の第1の抗体またはその免疫抱合体を含む組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、薬学的に許容される組成物である、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、少なくとも第2の治療剤をさらに含む、請求項23または請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列領域を含む核酸分子。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド配列領域は、配列番号1のヌクレオチド配列、および任意に配列番号2、26、39、52、65、もしくは78のヌクレオチド配列、またはそれらに少なくとも70％の配列同一性を有する配列を含む、請求項26に記載の核酸分子。
【請求項２８】
請求項26または請求項27に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項26もしくは請求項27に記載の核酸分子、または請求項28に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞またはウイルス。
【請求項３０】
少なくとも第1の容器に、
（ａ）請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体、
（ｂ）請求項19〜21のいずれか1項に記載の免疫抱合体、
（ｃ）請求項23〜25のいずれか1項に記載の組成物、
（ｄ）請求項26または請求項27に記載の核酸分子、
（ｅ）請求項28に記載の発現ベクター、
（ｆ）請求項29に記載の宿主細胞、または、
（ｇ）請求項29に記載のウイルス
を含むキット。
【請求項３１】
抗体を産生する方法であって、
（ａ）前記コードされた抗体を発現するのに効果的な条件下で、請求項26もしくは請求項27に記載の核酸分子、または請求項28に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記宿主細胞から前記発現した抗体を得ることと
を含む方法。
【請求項３２】
ＥｐＣＡＭに結合する方法であって、ＥｐＣＡＭを含む組成物を、請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体、またはその免疫抱合体と接触させることを含む方法。
【請求項３３】
ＥｐＣＡＭを検出する方法であって、ＥｐＣＡＭ／抗体複合体の形成を可能にするのに効果的な条件下で、ＥｐＣＡＭを含有すると疑われる組成物を、請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体、またはその免疫抱合体と接触させることと、そのように形成された前記複合体を検出することと、を含む方法。
【請求項３４】
動物における癌を診断する方法であって、
（ａ）ＥｐＣＡＭ／抗体複合体の形成を可能にするのに効果的な条件下で、動物、または前記動物から採取した試験試料を、請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体、またはその免疫抱合体と接触させることを含む方法。
【請求項３５】
前記方法は、
（ｂ）前記試験試料中の抗体−抗原複合体の存在、および／または量、および／または位置を測定するか、または検出すること、ならびに、
任意に、
（ｃ）前記試験試料中の抗体−抗原複合体の前記存在および／または量を対照と比較すること、をさらに含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
癌を治療する方法であって、動物に請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体、またはその免疫抱合体を、前記動物の癌を治療するのに効果的な量で投与することを含む方法。
【請求項３７】
第2の治療剤を前記動物に投与することをさらに含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記動物はヒト対象である、請求項34〜37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
療法、撮像、または診断に使用するための、請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体またはその免疫抱合体。
【請求項４０】
癌の療法、撮像、または診断に使用するための、請求項39に記載の抗体または免疫抱合体。
【請求項４１】
前記癌の治療のための薬剤の製造において、請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体またはその免疫抱合体の使用。
【請求項４２】
前記癌は、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、胆嚢癌、膵臓癌、肺癌、胃組織もしくは内臓の癌、好ましくは胃癌もしくは食道癌、肝臓癌、好ましくは肝細胞癌、腎臓癌、好ましくは腎細胞癌、皮膚腫瘍、頭頚部癌、好ましくは膠腫、唇癌、口癌、膣癌、および子宮頸部癌からなる群より選択される、請求項39もしくは請求項40の抗体もしくは免疫抱合体、または請求項36〜38のいずれか1項に記載の方法、または請求項41に記載の使用。
【請求項４３】
第2の治療剤の使用をさらに含む、請求項39もしくは請求項40もしくは請求項42の抗体もしくは免疫抱合体、または請求項36〜38のいずれか1項に記載の方法、または請求項41に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に結合する結合タンパク質、およびその全使用に関する。特に、本発明は、ＥｐＣＡＭに結合する抗体または抗体断片、および癌の治療を含むその使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
2000年、推定2200万人が全世界で癌に罹患し、620万人の死亡がこのクラスの疾患によるものであった。毎年、1000万を超える新しい症例があり、この推定は、今後15年間で50％増えると予測されている（ＷＨＯ、Ｗｏｒｌｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔ．Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｗ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋｌｅｉｈｕｅｓ，ｅｄｓ．ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｙｏｎ，2003）。全死亡人口の約13％が癌によるものである。 American Cancer Society" 米国癌学会によると、2007年に、世界で760万人が癌により死亡した。
【０００３】
最も一般的な現在の癌治療は、一般に、侵襲性外科手術、放射線療法、および化学療法に限られており、これらの全ては、重度の副作用の可能性、非特異的毒性、ならびに／または個人の身体像および／もしくは生活の質に対する変化による心的外傷のいずれかをもたらす。癌は、化学療法に対して不応性になり、さらなる治療オプションおよび成功の可能性を低減する可能性がある。乳癌等の比較的治療成功率の高い一部の癌は、発現率も非常に高く、よって、主な死亡率の原因である。
【０００４】
現在の治療は、それらの有効性の欠如により、ならびに／またはそれらが高い罹患率、および重度の副作用を有するためのいずれかにより、患者の必要性と一致しない、より多くの癌の例が存在する。よって、より安全な有効性プロファイルを有する癌治療の必要性は明らかである。
【０００５】
現在の多くの癌治療の不十分な原因の1つは、患部組織および細胞に対するそれらの選択性の欠如である。外科的切除は、常に、「安全域」として、明らかに正常な組織の除去を伴い、これは罹患率および合併症のリスクを増加する可能性がある。また、常に、腫瘍細胞が散在する場合があり、患部内臓または組織の機能を維持する、もしくは回復させる可能性がある健康な組織の一部も除去する。放射線および化学療法は、それらの非特異的な作用様式により、多くの正常な細胞を殺滅するか、または損傷する。これは、重度の吐き気、体重損失および体力の減少、毛髪脱落等の重篤な副作用をもたらし、また後の人生において二次性の癌を発症するリスクを増加させる。癌細胞に対してより大きい選択性を有する治療は、正常な細胞を損傷せずに残し、よって、成果、副作用プロファイル、および生活の質を向上する。
【０００６】
癌治療の選択性は、癌細胞上にのみ、もしくはその大半に存在する分子に特異的であるか、または癌細胞上に高レベルで存在する、もしくは癌細胞で過剰発現する抗体を使用することにより、改善することができる。よって、癌を含む種々の疾患の、例えば、抗体を含む免疫療法治療は、現在、非常に活発な研究および開発領域であり、良好な治療計画の実現に関して、非常に有望である。そのような抗体は、免疫系を調節し、患者自身の免疫系による癌の認識および破壊を強化するために使用することができる。
【０００７】
現在までに試験された大半の抗体は、マウスモノクローナル抗体、時折、分子操作による「ヒト化」の形態で、既知の癌マーカーに対して産生されてきた。残念なことに、これらの抗体は、ヒト患者の免疫系によって外来タンパク質として認識されるマウスタンパク質である。免疫応答および抗体反応を確実にすることは、有効性の損失、または副作用をもたらす可能性がある。
【０００８】
ＥｐＣＡＭ（ＣＤ326）は、ＥＧＰ−2、17−1Ａ、ＨＥＡ125、ＭＫ−1、ＧＡ733−2、ＥＧＰ34、ＫＳＡ、ＴＲＯＰ−1、ＥＳＡ、ＴＡＣＳＴＤ1、およびＫＳ1／4とも称され、最初に識別された腫瘍関連抗原のうちの1つである。ＥｐＣＡＭ抗原は、カドヘリン、セレクチン、またはインテグリン等の接着分子の主なファミリーのいずれの構成要素でないという点で独特である。26ａａのみが細胞質に面する、314アミノ酸（ａａ）のＩ型膜タンパク質である。ＥｐＣＡＭは、カドヘリン媒介細胞−細胞接触に干渉する同種親和性細胞接着分子として機能すると仮定されてきた。ＥｐＣＡＭは、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＡ、およびＥを上方制御し、細胞周期を促進し、細胞増殖を強化する（Ｍｕｎｚら，2004，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  23：5748−58）。
【０００９】
ＥｐＣＡＭは、異なる起源のヒト癌上に大量に、かつ均一に発現する（Ｗｅｎｔら，2006，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  94128−35）。前立腺癌および子宮頸部上皮肉腫瘍の免疫組織化学試験は、疾患が進行し、増殖するにつれて、ＥｐＣＡＭの発現が増加し得ることを示した。この明らかな過剰発現は、浸潤性乳癌および卵巣癌を有する患者において報告され、低無病生存率および全般的な生存率の強力な判断材料であった（Ｓｐｉｚｚｏら，2004，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  86：207−13、Ｓｐｉｚｚｏら，2006，Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  103：483−8）。ＥｐＣＡＭ過剰発現と疾患の進行との間の同様の相関関係は、胆嚢癌に罹患している患者においても観察され得る（Ｖａｒｇａら，2004，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ10：3131−6）。加えて、ＥｐＣＡＭは、結腸癌、乳癌、膵臓癌、および前立腺癌から単離された、癌開始細胞または癌肝細胞において過剰発現する（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，2007，Ｎａｔｕｒｅ445：106−10、Ｍａｒｈａｂａら，2008，Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ8：784−804）。これらのデータは、頻度の高いヒトの癌の治療を標的とする免疫治療としての、ＥｐＣＡＭの潜在的な有用性を見事に強調する。
【００１０】
ＥｐＣＡＭは、癌対象免疫療法用に検証された標的でもある。この点において、これらのうちのいくつかは種々の理由により臨床試験において機能しなかったことに留意するべきだが、ＥｐＣＡＭに対する多数の抗体が免疫療法に使用されている。これらのＥｐＣＡＭ抗体は、裸抗体、免疫毒素、および二重または三重特異性抗体を含む、多数の形式を取る（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｉｒｅｓ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，2007，96：417−423）。
【００１１】
二重特異性抗体のアプローチ（例えば、ＭＴ110抗体についてはＭｉｃｒｏｍｅｔ、およびカツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標））についてはＴｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａにより使用されるような）は、いくつかの利点がある一方で、単一特異性形式、すなわち、1つの抗体特異性のみが存在する形式で治療効果を有することができる抗体の開発もまた、非常に望ましい。同様に、二重または三重特異性抗体の作用メカニズムは、基本的に、単一特異性形式と異なるため、直接的な比較は単純に不可能であるか、または適切ではない。
【００１２】
臨床試験で使用されてきたＥｐＣＡＭ抗体の別の形式は、免疫毒素形式（例えば、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）／Ｖｉｃｉｎｉｕｍ（商標）についてはＶｉｖｅｎｔｉａにより使用されるような）、すなわち、抗体部分が毒素分子に抱合され、腫瘍細胞の殺滅をもたらす形式である。Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）／Ｖｉｃｉｎｉｕｍ（商標）は、ヒト化ｓｃＦｖ（ＭＯＣ31由来）とシュードモナス外毒素との融合タンパク質である（Ｄｉ  Ｐａｏｌｏら，2003，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ9：2837−48）。この抗体は、臨床においていくつかの有望な結果を示したが、免疫原性の副作用により、全身投与は不可能であり、腫瘍部位への直接／局所投与が必要とされる。同じく、免疫毒素の作用メカニズムは、基本的に、裸抗体と異なるため、直接的な比較は、あまり可能ではないか、または適切ではない。
【００１３】
現在臨床試験中の最も効果的な裸形式の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＭＴ201（アデカツムマブ、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ，Ｉｎｃ．により開発され、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏにライセンス譲渡された）であり、これは完全ヒトＩｇＧ1モノクローナル抗体である。この抗体は、前立腺癌および転移性乳癌における第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験において、いくつかの有望な結果を示し、今までのいくつかの他の裸ＥｐＣＡＭ抗体（例えば、ＩＮＧ−1、Ｘｏｍａ，Ｉｎｃ．の高親和性ヒト操作されたＩｇＧ1）の場合と異なり、患者は、膵炎の徴候を示さなかった。他の試験された抗ＥｐＣＡＭ抗体は、臨床的な欠点を示した。例えば、良性の安全プロファイルを有するにも関わらず、エドレコロマブ（17−1Ａ、Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））は、境界域の臨床活性しか示さず、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応により、急速に中和される。ＭＯＣ31（Ｖｉｖｅｎｔｉａにより使用されているヒト化型）は、大規模に研究された別の抗ＥｐＣＡＭ抗体であり、マウス可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有するキメラ抗体である。
【発明の概要】
【００１４】
ＥｐＣＡＭは、広範な正常上皮上に発現するため、高親和性抗ＥｐＣＡＭ  ＭＡｂ  ＩＮＧ−1に見られる、ＥｐＣＡＭ特異的免疫毒素（Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）／Ｖｉｃｉｎｉｕｍ（商標））および三機能抗体（Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標））の全身性非耐容性、ならびに急性膵炎は、正常なＥｐＣＡＭ発現組織の側副損傷と一致するように思われる。一方、エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））およびアデカツムマブ（ＭＴ201）は、耐容性が優れているように思われ、大半の正常なＥｐＣＡＭ発現組織を無視するように見える。よって、抗ＥｐＣＡＭ抗体の治療能は明らかであり、課題は、当該分野において公知の特性、特に現在の明白な先導治療薬であるＭＴ201に対して、代替的な、または改善された特性を示す抗ＥｐＣＡＭ抗体を開発することである。
【００１５】
本発明は、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を識別し、従来の抗体、特に、上述のＭＴ201およびＭＯＣ31に対して改善された特性を示す。例えば、本発明の抗体は、良好な親和性、良好な交差反応プロファイル、ならびに優れたＡＤＣＣおよびＣＤＣＣ活性を示す。加えて、好ましくは、そのような抗体は、完全ヒトタンパク質のため、患者の免疫系に完全に適合する。本発明の抗体は、診断的もしくは治療的使用（特に、癌について）のために、または他の抗体を操作する、もしくは標的抗原、二重特異性抗体等のＥｐＣＡＭ、免疫毒素、または抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）において分子を結合するための基礎として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、クローン3−17ＩのｓｃＦｖ形態の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ＳｃＦｖ遺伝子は、Ｎｃｏ／ＮｏｔＩ部位を介してｐＨＯＧ21プラスミドベクター（3．7Ｋｂ）の中にクローン化された。開始遺伝子クローン化（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩ）に使用された制限部位は下線付きである。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列はイタリック体で示される。
【図２】図2は、天然にＥｐＣＡＭ+ＫａｔｏＩＩＩ細胞株に結合する3−17Ｉ  ＩｇＧ、ＭＯＣ31  ＩｇＧ、およびＭＴ201  ＩｇＧのフローサイトメトリー分析を示す。抗緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）抗体は、陰性対照として使用される。ＭＦＩ＝中間蛍光強度。
【図３Ａ．３Ｂ．３Ｃ】図3Ａ、3Ｂおよび3Ｃは、非還元および還元条件下でヒト（Ｈｕ）およびカニクイザル（Ｃｙ）のＥｐＣＡＭ−Ｆｃ変種に結合する3−17Ｉ  ＩｇＧ（図3Ａ）、ＭＴ201  ＩｇＧ（図3Ｂ）、およびＭＯＣ31  ＩｇＧ（図3Ｃ）のウェスタンブロット結合分析を示す。Ｍ＝分子量マーカー。
【図４Ａ．４Ｂ．４Ｃ】図4Ａ、4Ｂおよび4Ｃは、ヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭ−Ｆｃ変種に対する3−17Ｉ  ＩｇＧ（図4Ａ）、ＭＴ201  ＩｇＧ（図4Ｂ）、およびＭＯＣ31  ＩｇＧ（図4Ｃ）のＥＬＩＳＡ結合分析を示す。ＭＡＸＩ−Ｓｏｒｂプレートを、1μｇ／ｍｌの濃度でヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭ−Ｆｃでコーティングした。抗体は、133ｎＭ〜32ｆＭの2倍希釈で添加された。
【図５Ａ．５Ｂ】図5Ａおよび5Ｂは、組み換えヒトＥｐＣＡＭ抗原（図5Ａ）、または組み換えカニクイザルＥｐＣＡＭ抗原（図5Ｂ）に結合する3−17Ｉ  ＩｇＧのＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す。示される結合曲線は、7．8、3．9、2．0、0．98、0．49、および0．24ｎＭの3−17Ｉ  ＩｇＧ濃度に対応する。
【図６Ａ．６Ｂ．６Ｃ】図6Ａ、6Ｂおよび6Ｃは、3−17Ｉ  ＩｇＧが、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ＭＤＡ−ＭＢ−453（図6Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−231（図6Ｂ）、およびＢＴ−474（図6Ｃ）細胞において、ＡＤＣＣを誘発することを示す。さらに、これらのデータは、3−17Ｉ  Ｉｇが陽性対照抗体であるＭＴ201  ＩｇＧに対して優れたＡＤＣＣ活性を保有することを実証する。
【図７Ａ．７Ｂ】図7Ａおよび7Ｂは、3−17Ｉ  ＩｇＧがヒト血清の存在下、細胞株のＫＡＴＯ  ＩＩＩ（図7Ａ）およびＭＴ−3（図7Ｂ）において、ＣＤＣを誘発することを示す。さらに、これらのデータは、ＣＤＣの誘発において、陽性対照抗体であるＭＴ201  ＩｇＧに対する3−17Ｉ  ＩｇＧの優位性を明らかに実証する。
【図８】図8は、ｓｃＦｖ発現ベクターを示す。図8Ａは、ｓｃＦｖ発現ベクターであるｐＨＯＧ21を示す。ＡｐＲ（アンピシリン耐性遺伝子）、ＣｏｌＥ1（ＤＮＡ複製元）、ｆＩＩＧ（ファージｆ1の遺伝子間領域）、ｃ−ｍｙｃ（モノクローナル抗体の9Ｅ10により認識されるエピトープをコードする配列）、Ｈｉｓ6（6つのヒスチジン残基をコードする配列）、ｐｅｌＢ（細菌のペクチン酸リアーゼの単一ペプチドをコードする配列）、Ｐ／Ｏ（野生型ｌａｃプロモーターオペレーター）。図8Ｂは、Ｃ末端コード領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図９】図9は、ヒトＥｐＣＡＭ−Ｆｃに対する12−Ｃ15  ＩｇＧ、16−Ｇ5  ＩｇＧ、および17−Ｃ20  ＩｇＧのＥＬＩＳＡ結合分析を示す。ＭＡＸＩ−Ｓｏｒｂプレートを、1μｇ／ｍｌの濃度のヒトＥｐＣＡＭ−Ｆｃでコーティングした。抗体は、133ｎＭ〜65ｐＭの2倍希釈で添加された。
【図１０Ａ．１０Ｂ】図10Ａおよび10Ｂは、ヒトＥｐＣＡＭ−Ｆｃ（図10Ａ）、およびカニクイザルＥｐＣＡＭ−Ｆｃ（図10Ｂ）に対する、3−17Ｉ  ｓｃＦｖ、7−Ｆ17  ｓｃＦｖ、17−Ｃ20  ｓｃＦｖ、および24−Ｇ6  ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ結合分析を示す。ＭＡＸＩ−Ｓｏｒｂプレートを、5μｇ／ｍｌの濃度のヒトまたはカニクイザルのＥｐＣＡＭ−Ｆｃでコーティングした。抗体は、667ｎＭ〜3．2ｎＭの2倍希釈で添加された。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ＥｐＣＡＭ、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むそれらのＶHおよびＶLドメインに結合する本発明の抗体分子のアミノ酸ならびに／またはＤＮＡ配列は、本明細書に列挙される種々の配列番号に記載される。本明細書に記載される全ての特異的抗体は、それらのＶＨドメインにおいて同一のＣＤＲを有するが、それらのＶＬドメインにおいて僅かに異なるＣＤＲを有する。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、配列番号5のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ1ドメインを含むＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供する。
【００１９】
代替的に、または加えて、本発明の実施形態において、ＥｐＣＡＭに結合する抗体は、配列番号6のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ2ドメインを含む。
【００２０】
代替的に、または加えて、本発明の実施形態において、ＥｐＣＡＭに結合する抗体は、配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ3ドメインを含む。抗体のＣＤＲ3ドメインは、抗原結合に特に重要であることが多いため、配列番号7に基づくそのようなＶＨ  ＣＤＲ3ドメインの存在は、本発明の抗体において、特に好ましい。実際、そのような配列は、本明細書に記載される全ての特異的抗体に存在する。
【００２１】
代替的に、または加えて、本発明の実施形態において、ＥｐＣＡＭに結合する抗体は、配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ1ドメインを含む。
【００２２】
代替的に、または加えて、本発明の実施形態において、ＥｐＣＡＭに結合する抗体は、配列番号9のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ2ドメインを含む。本発明の代替的な実施形態において、抗体は、配列番号29のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ2ドメインを含む。
【００２３】
代替的に、または加えて、本発明の実施形態において、ＥｐＣＡＭに結合する抗体は、配列番号10のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ3ドメインを含む。本発明の代替的な実施形態において、抗体は、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含む、軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ3ドメインを含む。
【００２４】
よって、特定の実施形態において、本発明は、1つ以上の重鎖ＣＤＲドメインを含むＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供し、重鎖ＣＤＲドメインは、
（ａ）配列番号5のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ1ドメイン、
（ｂ）配列番号6のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ2ドメイン、および
（ｃ）配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ3ドメインから成る群より選択される。
【００２５】
特定の実施形態において、本発明は、1つ以上の軽鎖ＣＤＲドメインを含むＥｐＣＡＭに結合する抗体も提供し、軽鎖ＣＤＲドメインは、
（ａ）配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、軽鎖ＣＤＲ1ドメイン、
（ｂ）配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含む、軽鎖ＣＤＲ2ドメイン、および
（ｃ）配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ3ドメインから成る群より選択される。
【００２６】
特定の好ましい実施形態において、ＥｐＣＡＭに結合する抗体は、
（ａ）配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ3、および
（ｂ）配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ3の双方を含む。
【００２７】
より好ましくは、配列番号5のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ1ドメイン、および／または配列番号8のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ1ドメイン、および／または配列番号6のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ2ドメイン、および／または配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ2ドメインも存在する。
【００２８】
好ましい一実施形態において、配列番号5のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ1、配列番号6のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含むＣＤＲ2、および配列番号7のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含むＣＤＲ3は、個別に、または組み合わせで存在する。
【００２９】
また別の好ましい実施形態において、配列番号8のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含むＣＤＲ2、および配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82のアミノ酸配列、もしくはそれらに実質的に相同な配列を含むＣＤＲ3は、個別に、または組み合わせで存在する。
【００３０】
あるいは、特定の実施形態において、本発明は、
配列番号7のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ3ドメイン、および／または配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ3ドメインを含む、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供する。
前記抗体は、任意に、
配列番号6のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ2ドメイン、および／または配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ2ドメインをさらに含む、ならびに／あるいは
配列番号5のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ1ドメイン、および／または
配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ1ドメインをさらに含む。
【００３１】
あるいは、特定の実施形態において、本発明は、
配列番号6のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ2ドメイン、および／または配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ2ドメインを含む、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供する。
前記抗体は、任意に、
配列番号7のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ3ドメイン、および／または配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ3ドメインをさらに含む、ならびに／あるいは
配列番号5のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ1ドメイン、および／または
配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ1ドメインをさらに含む。
【００３２】
あるいは、特定の実施形態において、本発明は、
配列番号5のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ1ドメイン、および／または配列番号8のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ1ドメインを含む、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供する。
前記抗体は、任意に、
配列番号7のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ3ドメイン、および／または配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ3ドメインをさらに含む、ならびに／あるいは
配列番号6のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ2ドメイン、および／または
配列番号もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ2ドメインをさらに含む。
【００３３】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号5、6、7、8、9、および10、または前述の配列番号のうちのいずれか1つに実質的に相同な配列から成る群より選択されるＣＤＲのうちの1つ以上を含む。他の好ましいＣＤＲは、配列番号29（ＶＬ  ＣＤＲ2において）、および配列番号30、43、56、69、および82（ＶＬ  ＣＤＲ3において）から成る群より選択される。
【００３４】
他の特定の好ましい抗体は、配列番号5、6、もしくは7、または前述の配列番号のうちのいずれか1つに実質的に相同な配列の重鎖ＣＤＲのうちの2つ以上を含む。特に好ましい結合分子は、配列番号5、6、および7、または前述の配列番号のうちのいずれか1つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ1、およびＣＤＲ2、およびＣＤＲ3、またはそれらに実質的に相同な配列のそれぞれのうちの1つ）の重鎖ＣＤＲのうちの3つを含む。
【００３５】
特定の好ましい抗体は、配列番号8（ＶＬ  ＣＤＲ1において）、9、もしくは29（ＶＬ  ＣＤＲ2において）、または10、30、43、56、69、もしくは82（ＶＬ  ＣＤＲ3において）、または前述の配列番号のうちのいずれか1つに実質的に相同な配列の軽鎖ＣＤＲのうちの2つ以上を含む。特に好ましい結合分子は、配列番号8（ＶＬ  ＣＤＲ1において）、9もしくは29（ＶＬ  ＣＤＲ2において）、10、30、43、56、69、もしくは82（ＶＬ  ＣＤＲ3において）、または前述の配列番号のうちのいずれか1つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ1、およびＣＤＲ2、およびＣＤＲ3、またはそれらに実質的に相同な配列のそれぞれのうちの1つ）の軽鎖ＣＤＲのうちの3つを含む。
【００３６】
特定のより具体的に好ましい抗体は、配列番号8（ＶＬ  ＣＤＲ1において）、9もしくは29（ＶＬ  ＣＤＲ2において）、または10、30、43、56、69、もしくは82（ＶＬ  ＣＤＲ3において）、またはそれらの配列のいずれか1つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ1、およびＣＤＲ2、およびＣＤＲ3、またはそれらに実質的に相同な配列のそれぞれのうちの1つ）の軽鎖ＣＤＲのうちの3つ、ならびに配列番号5、6、もしくは7、またはそれらの配列のいずれか1つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ1、およびＣＤＲ2、およびＣＤＲ3、またはそれらに実質的に相同な配列のそれぞれのうちの1つ）の重鎖ＣＤＲのうちの3つを含む。
【００３７】
特定の特に好ましい抗体は、
配列番号5の重鎖ＣＤＲ1ドメイン、
配列番号6の重鎖ＣＤＲ2ドメイン、および
配列番号7の重鎖ＣＤＲ3ドメイン、
または前述の配列のいずれか1つに実質的に相同な配列を含む、
ならびに／あるいは
配列番号8の軽鎖ＣＤＲ1ドメイン、
配列番号9の軽鎖ＣＤＲ2ドメイン、および
配列番号10の軽鎖ＣＤＲ3ドメイン、
または前述の配列のいずれか1つに実質的に相同な配列を含む。
【００３８】
代替的な好ましい軽鎖ＣＤＲの組み合わせは、配列番号8（ＶＬ  ＣＤＲ1において）、および配列番号29（ＶＬ  ＣＤＲ2において）、および配列番号30、もしくは配列番号43、もしくは配列番号56、もしくは配列番号69、もしくは配列番号82（ＶＬ  ＣＤＲ3において）、または前述の配列のいずれか1つに実質的に相同な配列である。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、ＥｐＣＡＭに結合し、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの重鎖可変領域と、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの軽鎖可変領域とを含む抗体を提供し、上記重鎖可変領域は、
（ｃ）配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3を含む。
【００４０】
さらなる実施形態において、本発明は、ＥｐＣＡＭに結合し、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの重鎖可変領域と、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの軽鎖可変領域とを含む抗体を提供し、上記重鎖可変領域は、
（ａ）配列番号5のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＨ  ＣＤＲ1、
（ｂ）配列番号6のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＨ  ＣＤＲ2、および
（ｃ）配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3含む。
【００４１】
本実施形態の好ましい態様において、上記軽鎖可変領域ＣＤＲの1つ以上は、
（ｄ）配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ1、
（ｅ）配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同である配列を有するＶＬ  ＣＤＲ2、および
（ｆ）配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82、またはそれらに実質的に相同な配列を有するＶＬ  ＣＤＲ3から成る群より選択される。
【００４２】
本実施形態のさらに好ましい態様において、上記軽鎖可変領域ＣＤＲのうちの2つは、
（ｄ）配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ1、
（ｅ）配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＬ  ＣＤＲ2、および
（ｆ）配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82、またはそれらに実質的に相同な配列を有するＶＬ  ＣＤＲ3から成る群より選択される。
【００４３】
本実施形態のまたさらに好ましい態様において、上記軽鎖可変領域ＣＤＲのうちの3つは、
（ｄ）配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ1、
（ｅ）配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同である配列を有するＶＬ  ＣＤＲ2、および
（ｆ）配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82、またはそれらに実質的に相同な配列を有するＶＬ  ＣＤＲ3から成る群より選択される。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明は、ＥｐＣＡＭに結合し、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの重鎖可変領域と、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの軽鎖可変領域とを含む抗体を提供し、上記軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号8のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ1、
（ｉｉ）配列番号9もしくは配列番号29のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同である配列を有するＶＬ  ＣＤＲ2、および
（ｉｉｉ）配列番号10、配列番号30、配列番号43、配列番号56、配列番号69、もしくは配列番号82、またはそれらに実質的に相同な配列を有するＶＬ  ＣＤＲ3を含む。
【００４５】
本実施形態の好ましい態様において、上記重鎖可変領域ＣＤＲの1つ以上は、
（ｉ）配列番号5のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＨ  ＣＤＲ1、
（ｉｉ）配列番号6のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＨ  ＣＤＲ2、および
（ｉｉｉ）配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3から成る群より選択される。
【００４６】
本実施形態のさらに好ましい態様において、上記重鎖可変領域ＣＤＲのうちの2つは、
（ｉ）配列番号5のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＨ  ＣＤＲ1、
（ｉｉ）配列番号6のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＨ  ＣＤＲ2、および
（ｉｉｉ）配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3から成る群より選択される。
【００４７】
本実施形態のまたさらに好ましい態様において、上記重鎖可変領域ＣＤＲのうちの3つは、
（ｉ）配列番号5のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＨ  ＣＤＲ1、
（ｉｉ）配列番号6のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同である配列を有するＶＨ  ＣＤＲ2、および
配列番号7のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3から成る群より選択される。
【００４８】
本発明の特定のさらに好ましい実施形態は、ＥｐＣＡＭに結合し、
配列番号5、6、もしくは7、または配列番号5、6、もしくは7のうちの1つ以上に実質的に相同な配列の重鎖ＣＤＲのうちの1つ、2つもしくは3つを含むＶＨドメイン、および／または
配列番号8（ＶＬ  ＣＤＲ1において）、9もしくは29（ＶＬ  ＣＤＲ2において）、または10、30、43、56、69、もしくは82（ＶＬ  ＣＤＲ3において）、またはそれらの配列のうちの1つ以上に実質的に相同な配列の軽鎖ＣＤＲの1つ、2つもしくは3つを含む、ＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【００４９】
特に好ましいＶＨドメインは、配列番号5、6、および7、または配列番号5、6、もしくは7のうちの1つ以上に実質的に相同な配列の重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、およびＣＤＲ3、またはそれらに実質的に相同な配列のそれぞれのうちの1つ）のうちの3つを含む。
【００５０】
特に好ましいＶＬドメインは、配列番号8（ＶＬ  ＣＤＲ1において）、9もしくは29（ＶＬ  ＣＤＲ2において）、または10、30、43、56、69、もしくは82（ＶＬ  ＣＤＲ3において）、またはこれらの配列のうちの1つ以上に実質的に相同な配列の軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、およびＣＤＲ3、またはそれらに実質的に相同な配列のそれぞれのうちの1つ）のうちの3つを含む。
【００５１】
本発明のより具体的に好ましい実施形態は、ＥｐＣＡＭに結合し、
配列番号5、6、および7の3つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメイン、ならびに
3つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。好ましい実施形態において、軽鎖ＣＤＲのうちの1つ、2つ、または3つは、配列番号8、9、および10に定義される通りである。それらに実質的に相同な配列も含まれる。
【００５２】
代替的なＶＬドメインにおいて、軽鎖ＣＤＲのうちの1つ、2つ、または3つは、配列番号8、29および30、8、29および43、8、29および56、8、29、および69、ならびに8、29および82に定義される通りである。それらに実質的に相同な配列も含まれる。
【００５３】
本発明の特定の好ましい実施形態は、配列番号3のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を含むＶＨドメイン、および／または配列番号4、27、40、53、66、もしくは79のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を含むＶＬドメインを含む、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供する。
【００５４】
さらに好ましい実施形態は、配列番号3のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、および3つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供する。好ましくは、上記ＶＬドメインは、配列番号4、27、40、53、66、または79のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明の他の実施形態は、ＥｐＣＡＭに結合し、
配列番号8、9、および10の3つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメイン、および
3つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインを含む抗体を提供する。好ましい実施形態において、重鎖ＣＤＲのうちの1つ、2つ、または3つは、配列番号5、6、および7に定義される通りである。
【００５６】
さらなる好ましい実施形態は、配列番号4、27、40、53、66、または79のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、および3つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインを含む、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供する。好ましくは、上記ＶＨドメインは、配列番号3のアミノ酸配列を有する。
【００５７】
またさらなる実施形態において、本発明は、配列番号21のアミノ酸配列を含む（上記抗体は、本明細書において3−17Ｉ  ＳｃＦｖとも称される）、もしくはＥｐＣＡＭに結合するその断片、またはそれに実質的に相同な配列を含む、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供する。
【００５８】
本発明の他の抗体は、配列番号36のアミノ酸配列（上記抗体は、本明細書において、7−Ｆ17  ｓｃＦｖとも称される）、配列番号49（上記抗体は、本明細書において、12−Ｃ15  ｓｃＦｖとも称される）、配列番号62（上記抗体は本明細書において、16−Ｇ5  ｓｃＦｖとも称される）、配列番号75（上記抗体は、本明細書において、17−Ｃ20  ｓｃＦｖとも称される）、および配列番号88（上記抗体は、本明細書において、24−Ｇ6  ｓｃＦｖとも称される）のアミノ酸配列を含むか、もしくはＥｐＣＡＭに結合するその断片、またはそれらに実質的に相同な配列を含む。
【００５９】
本発明は、図1に示される一本鎖形態であるモノクローナル抗体3−17Ｉ（配列番号21および配列番号20）、ならびに実施例1および表1に記載される完全長ＩｇＧ形態により例示される。3−17Ｉ抗体は、配列番号3のＶＨドメイン、および配列番号4のＶＬドメインを含む。3−17Ｉ抗体のＣＤＲドメイン、ＶＨ、およびＶＬドメインを表1および図1に示す。これらのＣＤＲドメイン、またはＶＨおよびＶＬドメイン（もしくはそれらに実質的に相同な配列）を含む抗体は、本発明の好ましい態様である。
【００６０】
本発明の他の例示的な抗体は、7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、および24−Ｇ6である。7−Ｆ17抗体は、配列番号3のＶＨドメイン、および配列番号27のＶＬドメインを含む。12−Ｃ15抗体は、配列番号3のＶＨドメイン、および配列番号40のＶＬドメインを含む。16−Ｇ5抗体は、配列番号3のＶＨドメイン、および配列番号53のＶＬドメインを含む。17−Ｃ20抗体は、配列番号3のＶＨドメイン、および配列番号66のＶＬドメインを含む。24−Ｇ6抗体は、配列番号3のＶＨドメイン、および配列番号79のＶＬドメインを含む。よって、これらの抗体は、3−17Ｉと同じ重鎖を有するが、それぞれ、表2、3、4、5、および6に示される配列の異なる軽鎖を有する。これらのＣＤＲドメイン、またはＶＨおよびＶＬドメイン（もしくはそれらに実質的に相同な配列）を含む抗体は、本発明の好ましい態様である。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号21（アミノ酸）に示される3−17Ｉ抗体のｓｃＦｖ形態であり、これは、好ましくは、配列番号20（核酸）によりコードされる。本発明の別の実施形態は、配列番号36（アミノ酸）に示される7−Ｆ17抗体のｓｃＦｖ形態であり、これは、好ましくは、配列番号35（核酸）によりコードされる。本発明の別の実施形態は、配列番号49（アミノ酸）に示される12−Ｃ15抗体のｓｃＦｖ形態であり、これは、好ましくは、配列番号48（核酸）によりコードされる。本発明の別の実施形態は、配列番号62（アミノ酸）に示される16−Ｇ5抗体のｓｃＦｖ形態であり、これは、好ましくは、配列番号61（核酸）によりコードされる。本発明の別の実施形態は、配列番号75（アミノ酸）に示される17−Ｃ20抗体のｓｃＦｖ形態であり、これは、好ましくは、配列番号74（核酸）によりコードされる。本発明の別の実施形態は、配列番号88（アミノ酸）に示される24−Ｇ6抗体のｓｃＦｖ形態であり、これは、好ましくは、配列番号87（核酸）によりコードされる。
【００６２】
本発明の別の好ましい実施形態は、好ましくは配列番号22（核酸）によりコードされる、配列番号24（アミノ酸）に示される重鎖と、好ましくは配列番号23（核酸）によりコードされる、配列番号25（アミノ酸）に示される軽鎖の、完全長ＩｇＧ形態の3−17Ｉ抗体である。完全長ＩｇＧ形態の7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、および24−Ｇ6抗体も、好ましい実施形態である。
【００６３】
よって、本発明の好ましい抗体は、3−17ＩのＶＨおよびＶＬドメインを含む、すなわち、配列番号3および配列番号4、またはそれらに実質的に相同な配列を含む。他の好ましい抗体は、7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、および24−Ｇ6のＶＨおよびＶＬドメイン、またはそれらに実質的に相同な配列を含む。
【００６４】
本明細書に記載される本発明の実施形態の全てにおいて、ＶＬ  ＣＤＲ2ドメインは、Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｘ5  Ａ  Ｘ7（配列番号37）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する、または含み、Ｘ5およびＸ7は、任意のアミノ酸であり得る。これらの実施形態において、Ｘ5は、ＲもしくはＴ、好ましくはＴであり得る。Ｘ7は、ＴもしくはＳ、好ましくはＳであり得る。よって、好ましいＶＬ  ＣＤＲ2は、Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｒ／Ｔ  Ａ  Ｔ／Ｓ（配列番号38）のアミノ酸配列を有する、または含む。表7も参照のこと。
【００６５】
本明細書に記載される本発明の実施形態の全てにおいて、ＶＬ  ＣＤＲ3ドメインは、Ｑ  Ｘ2  Ｙ  Ｎ  Ｘ5  Ｗ  Ｐ  Ｐ  Ｘ9  Ｘ10  Ｔ（配列番号89）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を有する、または含み、Ｘ2、Ｘ5、Ｘ9、およびＸ10は、任意のアミノ酸であり得る。これらの実施形態において、Ｘ2は、Ｑ、もしくはＨ、もしくはＫ、好ましくはＱであり得る。Ｘ5は、ＮもしくはＤ、好ましくはＮであり得る。Ｘ9は、ＧもしくはＴ、もしくはＳ、もしくはＭ、もしくはＡ、好ましくはＡであり得る。Ｘ10は、ＦもしくはＷ、もしくはＹ、好ましくはＹであり得る。よって、好ましいＶＬ  ＣＤＲ3は、Ｑ  Ｑ／Ｈ／Ｋ  Ｙ  Ｎ  Ｎ／Ｄ  Ｗ  Ｐ  Ｐ  Ｇ／Ｔ／Ｓ／Ｍ／Ａ  Ｆ／Ｗ／Ｙ  Ｔ（配列番号90）のアミノ酸配列を有する、または含む。表7を参照のこと。
【００６６】
実質的に相同な配列の特定の例は、開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一性を有する配列である。
【００６７】
特定の実施形態において、ＥｐＣＡＭに結合する本発明の抗体は、配列番号4、27、40、53、66、もしくは79のアミノ酸配列に対して少なくとも約70％もしくは75％、より好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％もしくは95％、最も好ましくは少なくとも約97％、98％、もしくは99％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む、少なくとも1つの軽鎖可変領域、および／または配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも約70％もしくは75％、より好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％もしくは95％、最も好ましくは少なくとも約97％、98％、もしくは99％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む、少なくとも1つの重鎖可変領域を含む。
【００６８】
実質的に相同な配列の他の好ましい例は、開示されるアミノ酸配列の保存アミノ酸置換を含有する配列である。
【００６９】
実質的に相同な配列の他の好ましい例は、開示されるＣＤＲ領域のうちの1つ以上において、1つ、2つ、または3つ、好ましくは1つまたは2つの変更されたアミノ酸を含有する配列である。そのような変更は、保存もしくは非保存アミノ酸置換、またはそれらの混合であってもよい。
【００７０】
全てのそのような実施形態において、好ましい変更は、保存アミノ酸置換である。
【００７１】
全ての実施形態において、実質的に相同な配列を含有する抗体は、ＥｐＣＡＭを結合する能力を維持し、好ましくは、本明細書に記載される他の特性のうちの1つ以上、例えば、少なくともヒトＥｐＣＡＭ、好ましくはヒトおよびサルのＥｐＣＡＭに結合する能力を維持する。
【００７２】
本発明の他の実施形態は、ＥｐＣＡＭに結合し、本発明の抗体、本発明のＶＨもしくはＶＬドメイン、または本発明のＣＤＲのうちの1つ以上を含む、結合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、そのような結合タンパク質は抗体である。そのような結合タンパク質に使用するためのＶＨ、ＶＬ、およびＣＤＲドメインの好ましい組み合わせは、本明細書の別の箇所で説明される。
【００７３】
本発明の好ましい抗体は、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの重鎖可変領域と、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの軽鎖可変領域とを含む。これらのＣＤＲの例示的な、好ましい配列は、本明細書に記載される。
【００７４】
本明細書に使用される、「ＥｐＣＡＭ」という簡潔な用語は、特に記載のない限り、または科学的用語により明確にされない限り、上皮細胞接着分子を意味する。ＥｐＣＡＭは、ＥＧＰ−2、17−1Ａ、ＨＥＡ125、ＭＫ−1、ＧＡ733−2、ＥＧＰ34、ＫＳＡ、ＴＲＯＰ−1、ＥＳＡ、ＴＡＣＳＴＤ1、またはＫＳ1／4とも称される場合がある。
【００７５】
ＥｐＣＡＭは、哺乳類種にわたって保存されるため、「ＥｐＣＡＭ」は、ＥｐＣＡＭの任意の形態を指す場合もある（Ｔｒｚｐｉｓら，2008，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ17：229−238）。本発明の抗体または抗体断片は、よって、例えば、ヒト、サル（例えば、カニクイザル）、ウシ（ウシ属）、マウス、ラット、ハムスター、フェレット、モルモット、および／またはウサギのＥｐＣＡＭに結合してもよい。好ましくは、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトＥｐＣＡＭに結合する。特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトおよびサル（例えば、カニクイザル）のＥｐＣＡＭに結合する。特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトおよびマウスのＥｐＣＡＭに結合する。特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒト、サル、およびマウスのＥｐＣＡＭに結合する。ＥｐＣＡＭは、遊離型ＥｐＣＡＭ、例えば、組み換えされた、または精製されたＥｐＣＡＭであるか、または例えば、細胞の表面上に天然形態で存在し得る。
【００７６】
本発明の抗体または結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭの断片、特に細胞外ドメインを含む、もしくはそれから成る断片にも結合することができる、またはＥｐＣＡＭもしくはＥｐＣＡＭの断片を含む実体に結合することができる。実際、本発明の抗体のエピトープは、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインに位置する。
【００７７】
本発明の抗体もしくは抗体断片に関して、本明細書に使用される、「ＥｐＣＡＭに結合する」または「抗ＥｐＣＡＭ」という用語は、以下のうちの1つ以上、好ましくは以下のうちの2つ以上、最も好ましくは以下の全てが可能である抗体または抗体断片を意味する：
（ａ）遊離ＥｐＣＡＭ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイもしくはＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより評価される、固体支持体上で、例えば、組み換えにより発現するＥｐＣＡＭに結合する、
（ｂ）      例えば、非還元条件下で、ウェスタンブロットにおいて、ＥｐＣＡＭへの結合により評価される、立体構造的依存性（例えば、非線形）ＥｐＣＡＭエピトープに結合する、
（ｃ）例えば、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学検査により評価される、細胞の表面上に発現するＥｐＣＡＭに結合する、
（ｄ）少なくともヒトＥｐＣＡＭ、より好ましくは、ヒトおよびサルのＥｐＣＡＭ、またはヒトおよびマウスのＥｐＣＡＭ、最も好ましくは、ヒト、サル、およびマウスのＥｐＣＡＭに結合する、
（ｅ）本明細書の別の箇所でも説明される、10ｎＭ以下、好ましくは5ｎＭ以下、より好ましくは3ｎＭ以下、または2ｎＭ以下、最も好ましくは1ｎＭ以下の結合親和性（Ｋｄ）でヒトＥｐＣＡＭに結合する、
（ｆ）本明細書の別の箇所でも説明される、同様の親和性で、例えば、10ｎＭ以下、好ましくは5ｎＭ以下、より好ましくは3ｎＭ以下、または2ｎＭ以下、例えば、1ｎＭ以下のＫｄで、ヒトおよびサルのＥｐＣＡＭ、またはヒトおよびマウスのＥｐＣＡＭに結合する。
【００７８】
本発明の好ましい抗体、または抗体断片は、以下のうちの1つ以上、好ましくは以下のうちの2つ以上、最も好ましくは以下の機能特性の全ても可能である：
（ｇ）腫瘍を有する動物への投与により、腫瘍に局在される、
（ｈ）本明細書の別の箇所に記載される、腫瘍細胞のＡＤＣＣを誘発する、
（ｉ）本明細書の別の箇所に記載される、腫瘍細胞のＣＤＣを誘発する、
（ｊ）ｉｎ  ｖｉｖｏで、抗腫瘍作用を誘発する。
【００７９】
これらの好ましい特性についてのさらなる情報は、本明細書の別の箇所に記載される。他の好ましい特性は、本発明の抗体が投与された時の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの有意な毒性の不在、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの有意な他の副作用、例えば、他の抗ＥｐＣＡＭ抗体で観察された、例えば、膵炎または正常組織に対する他の側副損傷等の副作用の不在を含む。本発明の抗体は、またＥｐＣＡＭの機能も阻害する、もしくは有意に低下させる、またはＥｐＣＡＭのその天然リガンドとの相互作用も防止する、もしくは低下させる。本発明の抗体の別の好ましい（しかし、必須ではない）特性は、単一特異性形式、すなわち、1つの抗体特異性のみが存在する形式で、治療効果を有する能力である。
【００８０】
したがって、本発明を考慮すると、様々な抗ＥｐＣＡＭ抗体が作製され、癌の治療を含む、種々の実施形態において使用することができる。
【００８１】
本願全体を通して使用される、［ａ」および［ａｎ」という用語は、上限が後に特に記載される場合を除き、「少なくとも1つ」、「少なくとも第1」、「1つ以上」、または「複数」の参照構成要素もしくはステップを意味するという意味で使用される。したがって、本明細書に使用される、「抗体」は、「少なくとも第1の抗体」を意味する。本開示を考慮すると、操作可能な限度およびパラメータの組み合わせは、任意の単一製剤の量と同様に、当業者に公知である。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態は、本発明の少なくとも1つの抗ＥｐＣＡＭ抗体、またはその抗原結合断片を含む。
【００８３】
本明細書に定義される、本発明の抗体、またはその一部、もしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらに実質的に相同な核酸分子は、またさらに本発明の態様を形成する。好ましい核酸分子は、配列番号21に提示されるアミノ酸配列をコードする配列（好ましくは、配列番号20によりコードされる）を含む。他の好ましい核酸分子は、配列番号36に提示されるアミノ酸配列をコードする配列（好ましくは、配列番号35によりコードされる）、または配列番号49に提示されるアミノ酸配列をコードする配列（好ましくは、配列番号48によりコードされる）、または配列番号62に提示されるアミノ酸配列をコードする配列（好ましくは、配列番号61によりコードされる）、または配列番号75に提示されるアミノ酸配列をコードする配列（好ましくは、配列番号74によりコードされる）、または配列番号88に提示されるアミノ酸配列をコードする配列（好ましくは、配列番号87によりコードされる）を含む。他の好ましい核酸分子は、配列番号24のアミノ酸配列を有する重鎖をコードする配列（好ましくは、配列番号22によりコードされる）を含む、および／または配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖（好ましくは、配列番号23によりコードされる）、もしくは配列番号51のアミノ酸配列を有する軽鎖（好ましくは、配列番号50によりコードされる）、もしくは配列番号64のアミノ酸配列を有する軽鎖（好ましくは、配列番号63によりコードされる）、もしくは配列番号77のアミノ酸配列を有する軽鎖（好ましくは、配列番号76によりコードされる）をコードする配列を含む。
【００８４】
他の好ましい核酸分子は、本発明の抗体のＩｇＧ形態、例えば、実施例1に記載されるもの、またはマウスキメラ形態をコードする配列を含む。
【００８５】
上に示す通り、本発明により包含される他の核酸分子は、本発明のヒト抗体の一部もしくは断片をコードするもの、例えば、抗体の重鎖をコードするもの（例えば、配列番号22等の、配列番号24をコードするもの）、または抗体の軽鎖をコードするもの（例えば、配列番号23等の、配列番号25をコードするもの）である。他の好ましい核酸分子は、本発明の抗体のＶＨ領域をコードするもの（例えば、配列番号1等の、配列番号3をコードするもの）である。他の好ましい核酸分子は、本発明の抗体のＶＬ領域をコードするもの（例えば、配列番号2等の配列番号4をコードするもの、配列番号26等の配列番号27をコードするもの、配列番号39等の配列番号40をコートするもの、配列番号52等の配列番号53をコードするもの、配列番号65等の配列番号66をコードするもの、または配列番号78等の配列番号79をコードするもの）である。
【００８６】
よって、本明細書に定義される、本発明の抗体の断片、またはそれに実質的に相同な配列、またはそのような断片をコードする配列を含む核酸分子は、またさらに本発明の態様を形成する。
【００８７】
高親和性抗ＥｐＣＡＭ抗体は、悪性組織と正常組織を識別することができないため、非耐容性毒性プロファイルを有すると、一般的に考えられている。したがって、治療域は、エドレコロマブおよびＭＴ201等の低親和性抗体についてのみ存在し得る。一方、低親和性抗体は、腫瘍根絶において、比較的、低い有効性を有する。例えば、Ｍｉｒｃｒｏｍｅｔのウェブサイトによれば、アデカツムマブ（ＭＴ201）は、転移性乳癌および前立腺癌の治療の第ＩＩ相試験において、単一製剤としての主要評価項目を欠く（すなわち、第24週で、25％の臨床利益率）。
【００８８】
本発明の抗体は、ＩｇＧ形式である時、独特なＥｐＣＡＭ結合親和性の特色を有する。平衡で算出された親和性（ＫD）は高く見えるが（約1ｎＭ）、速度論の構成要素（オン率およびオフ率）は、親和性に対して異なって寄与する。本発明の抗体は、標的細胞の迅速な認識および結合を決定する、非常に高いオン率（ほぼ107  Ｍ-1ｓ-1）、そして同時に、細胞表面上で3〜4分の半減期を有する迅速な抗体解離を決定する、比較的高いオフ率（10-2−10-3  ｓ-1）を有する。この独特の結合プロファイルは、高い抗腫瘍有効性の低毒性プロファイルとの組み合わせをもたらす可能性がある。この速度論プロファイルは、従来の技術において示されるものとははっきりと異なり、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される時、抗体の異なる（および優れた可能性がある）薬物動態をもたらす可能性がある。
【００８９】
オン率、および特にオフ率を決定する任意の適切な方法を使用することができる。しかしながら、好ましくは、速度定数は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ100モデルの1：1結合モデル（例えば、ラングミュア結合モデル）等の、市販の結合モデルソフトウェアを使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、一定濃度の固定された抗原（ＥｐＣＡＭ）に対して、種々の濃度の試験抗体を試験することにより決定される。適切なアッセイは、例示目的のため、実施例3に記載される。好ましくは、定数は、固体支持体、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上に抗原（ＥｐＣＡＭ）を固定し、抗体の抗原への結合を評価することにより決定される。好ましくは、結合親和性は、他の温度、例えば、室温、例えば25℃の温度で評価されてもよいが、37℃（例えば、体温）で評価される。
【００９０】
代替的に、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の表面上のオフ率および抗体半減期は、細胞表面維持アッセイを実施することにより決定することができる （Ａｄａｍｓら，1998，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ77：1405−12、Ｌｅ  Ｇａｌｌら，1999，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  453：164−8）。後者の方法は、治療条件下のヒト患者における実状態をより適切に模倣することを可能にする。
【００９１】
本発明の抗体は、ＩｇＧ形式である時、ＥｐＣＡＭに対して比較的高い結合親和性を有する、すなわち、1×10-8Ｍまたは1×10-9Ｍ以下の範囲のＫｄを有する。よって、本発明の抗体は、ＩｇＧ形式である時、ＥｐＣＡＭ（好ましくはヒトＥｐＣＡＭ）に対して、20ｎＭ、15ｎＭ、もしくは10ｎＭ未満、より好ましくは10、9．5、9、8．5、8、7．5、7、6．5、6、5．5、5、4．5、4、3．5、3、2．5、2、1．5、1、0．9、0．8、0．7、0．6、0．5、0．4、0．3、0．2、もしくは0．1ｎＭ未満のＫｄに相当する結合親和性を有する。しかしながら、本明細書の別の箇所に記載される、適切な機能特性を有するならば、高いＫｄを有する抗体が、本発明において同等に使用され得る。
【００９２】
Ｋｄを決定する任意の適切な方法が使用され得る。しかしながら、好ましくは、Ｋｄは、例えば、ラインウィーバーバーク法を使用して、または好ましくは、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ100モデルの1：1結合モデル（例えば、ラングミュア結合モデル）等の、市販の結合モデルソフトウェアを使用することにより、飽和曲線を確立するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて種々の濃度の固定された抗原（ＥｐＣＡＭ）に対して、種々の濃度の試験抗体を試験することにより決定される。よって、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイは、Ｋｄを測定するために好ましく、適切なアッセイは、例示目的のため、実施例3に記載される。好ましくは、Ｋｄは、固体支持体、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上に抗原（ＥｐＣＡＭ）、好ましくは遊離抗原、例えば、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインを含む遊離ＥｐＣＡＭまたは分子を固定し、抗体の抗原への結合を評価することにより決定される。好ましくは、結合親和性は、他の温度、例えば、室温、例えば25℃の温度で評価されてもよいが、37℃（例えば、体温）で評価される。好ましくは、抗体のＩｇＧ形態は、結合親和性を決定するために使用される。
【００９３】
本明細書の別の箇所で説明される、本発明の好ましい抗体は、ヒトＥｐＣＡＭおよびサルＥｐＣＡＭの双方に結合する。種間、特にヒトと前臨床動物モデルとして一般に使用される種との間のそのような交差反応性は、前臨床試験から臨床使用へのより効率的な転換を可能にするため、重要な利点である。例えば、使用される特定の動物モデルに存在する天然のＥｐＣＡＭと交差反応する抗体を有することは、このモデルにおける結果がヒト患者における状態を反映する可能性が高く、それによって、例えば、行われる投与のより正確な評価、および任意の潜在的な関連する、もしくは問題のある副作用を識別する可能性を高めることができることを意味する。抗体がサルおよびヒトの双方のＥｐＣＡＭに対して類似する親和性を有する場合、これは特にそうである。
【００９４】
例えば、本発明の抗体のヒトＥｐＣＡＭおよびサルＥｐＣＡＭの双方に結合する能力は、そのような抗体が、治療の有害な副作用を評価し、適切な容認される用量を見つけるために、前臨床毒性試験において試験され得ることを意味する。
【００９５】
加えて、ヒトＥｐＣＡＭおよびマウスＥｐＣＡＭの双方に結合する能力は、マウスモデル、例えば、免疫応答性マウスを使用するマウス同系モデルにおいて、本発明のそのような抗体により示される結果が、ヒト対象における抗体の活性の典型である可能性が高いことを意味する。抗体がマウスおよびヒトの双方のＥｐＣＡＭに対して類似する親和性を有する場合、これは特にそうである。この理由は、ヒトＥｐＣＡＭに結合できるが、マウスＥｐＣＡＭに結合できない抗体が、マウスモデルにおいて、ヒト腫瘍細胞により発現されるＥｐＣＡＭに結合するが、内因性マウスＥｐＣＡＭに結合することができないためである。これは、確かに、腫瘍および内因性ＥｐＣＡＭにより発現されるＥｐＣＡＭが存在するであろうヒト患者における状態と異なる。
【００９６】
そのような状態に欠点があるとすれば、ヒトＥｐＣＡＭに結合するが、マウスＥｐＣＡＭに結合しない、または著しく低い親和性で結合する抗体は、易感染性マウス（例えば、ヌードもしくはＳＣＩＤマウス）のヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、良好に機能するかもしれないが、これは、より多くのＥｐＣＡＭが存在するヒト系において、類似する性能に反映されないかもしれないことである。つまり、ヒトＥｐＣＡＭに結合できるが、マウスＥｐＣＡＭに結合できない抗体によるマウス異種移植系で見られた抗腫瘍作用は、臨床の現実性より良く見えるかもしれない。逆に、ヒトおよびマウスの双方のＥｐＣＡＭに結合できる抗体を用いて作業する場合、これは、マウスモデル系に存在する全ての形態のＥｐＣＡＭに結合し、抗体がヒトに投入される時の状態のより典型である可能性がある。抗体がマウスおよびヒトの双方のＥｐＣＡＭに対して類似する親和性を有する場合、これは特にそうである。
【００９７】
本発明の3−17Ｉ抗体（および本発明の他の好ましい抗体）により示される、サルおよびヒトのＥｐＣＡＭに対する類似する親和性は、従来の抗体であるＭＯＣ31（ヒトＥｐＣＡＭよりサルＥｐＣＡＭに対して、非常に低い親和性を有する）に対して、明らかに有利であり、サルＥｐＣＡＭに対して検出可能な結合を示さないＭＴ201に対しても有利である。
【００９８】
よって、本発明の好ましい抗体は、例えば、本明細書に記載される、類似する親和性で、または類似するオン率もしくはオフ率で、ヒトおよびサルのＥｐＣＡＭ、またはヒトおよびマウスのＥｐＣＡＭに結合する。
【００９９】
「類似する親和性」、「類似するオン率」、または「類似するオフ率」とは、ヒトＥｐＣＡＭ、および他の関心の種（例えば、サルまたはマウス）のうちの1つ以上についての、抗体の必要に応じた結合親和性、オン率、またはオフ率が、比較可能である、例えば、20以下の相違の因数であるという意味でもある。より好ましくは、結合親和性間の相違は、15未満の因数、より好ましくは10未満の因数、より好ましくは5、4、3、または2未満の因数である。
【０１００】
本発明の抗体は、分析された公知の抗ＥｐＣＡＭ抗体に対する異なるエピトープに結合する可能性があると考えられる。確かに、ヒトＥｐＣＡＭ上のＭＯＣ31エピトープは、ＥｐＣＡＭを還元条件に曝した後でも存在するため、エピトープは、ＭＯＣ31抗体のエピトープと異なるように見え、一方、本発明の好ましい抗体である3−17Ｉのエピトープは、そのような条件下で、明らかに破壊される（実施例3を参照）。加えて、本発明の抗体、例えば、3−17Ｉにより認識されたエピトープは、ＭＴ201抗体により認識されたエピトープと異なる場合があるようである。結果は、3−17Ｉ抗体（および本発明の他の抗体）が、ヒトおよびサルの双方のＥｐＣＡＭに結合し、一方、ヒトＥｐＣＡＭにのみ結合するＭＴ201抗体は、これの間接的証拠であることを示す。
【０１０１】
よって、本発明のまたさらなる実施形態は、抗体、好ましくは単離された抗体、より好ましくは、ヒト抗体を提供し、これは、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインのエピトープに結合し、ＥｐＣＡＭへの結合において、本明細書に記載される3−17Ｉ抗体（すなわち、配列番号4のＶＬ、および配列番号3のＶＨを含む抗体）と競合する能力、または3−17Ｉと同じＣＤＲを含む抗体、すなわち、配列番号8、9、および10のＶＨ  ＣＤＲ配列と、配列番号5、6、および7のＶＨ  ＣＤＲ配列とを含む抗体と競合する能力を有する。7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、または24−Ｇ6抗体とＥｐＣＡＭへの結合において競合する抗体も、好ましい。
【０１０２】
同じエピトープ／抗原への結合は、当該分野において周知の、説明される方法、例えば、結合アッセイ、例えば、競合阻害アッセイを使用することにより容易に試験することができる。よって、当業者は、結合アッセイが、本発明の抗体および抗体断片と同じ結合特異性を有する、他の抗体および抗体断片を識別するために使用することができることを理解するだろう。以下に記載するように、競合結合アッセイは、そのような他の抗体を見出すために使用することができる。以下に記載される方法は、単に、適切な競合アッセイの実施例の1つである。当業者は、他の適切な方法および変形を認識するであろう。
【０１０３】
フローサイトメトリーを使用して競合アッセイを実施する前に、少量の試験される抗体を、例えば、ビオチン化により標識するべきである。一定の数の腫瘍細胞、例えば、乳癌細胞に対する最大下結合を付与する、ビオチン化産物の機能（細胞結合特性の維持）および本発明のビオチン化抗体（Ａｂ1）の最低濃度を決定する。総数106細胞を、指数関数的に成長する培養物から採取し、種々の抗体濃度で、4℃で1時間、インキュベートする。細胞を洗浄し、4℃でさらに1時間、適切な検出抗体とともにインキュベートする。洗浄後、細胞をフローサイトメトリーで分析する。各試験抗体において、抗体濃度に対して中央蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットすることによって、データから飽和曲線を作製した。
【０１０４】
競合アッセイにおいて、腫瘍細胞、例えば乳癌細胞を上述のように調製し、一定濃度の標識（ビオチン化）抗体（ｂｉｏ−Ａｂ1）と増加濃度の非標識競合抗体との混合物を用いて、二つ組で処理する。一定濃度は、上で決定された一定数の腫瘍細胞に対して適切な蛍光シグナルを生成する、抗体の最低濃度である。理想的には、ｎＭでのこの一定濃度は、平衡（ＫD）での、処理された抗体の親和性を下回るべきである。この場合、記載される方法は、競合抗体の親和性を推定するために使用することができる （Ｓｃｈｏｄｉｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ，1993，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ268：25722−7）。抗体混合物は、4℃で1時間、標的細胞とインキュベートされる。細胞を洗浄し、ビオチン化抗体の細胞結合を、ＦＩＴＣ標識されたストレプトアビジンとともにインキュベートすることにより、明らかにする。各試験試料（ｂｉｏ−Ａｂ1＋Ａｂ2）の中央蛍光読み取りから背景蛍光（ＰＢＳ−5％ＦＣＳ）を取り去った後、以下の式に従い、各Ａｂ2濃度「ｃ」の阻害のパーセントを算出する。
【０１０５】
阻害％＝（1−ＭＦＩbio-Ab1+Ab2“c"／ＭＦＩbio-Ab1）×100
が計算される。
【０１０６】
阻害パーセントを対照値と比較し、対照阻害パーセントと統計的に有意な相違を有する阻害パーセントは、試験抗体が同じエピトープ／抗原に結合することができることを示す。好ましくは、統計的に有意な相違は、＜0．05の確率値である。統計的有意を決定する適切な方法は、当該分野において周知であり、十分に説明されており、これらのいずれかを使用することができる。好ましくは、試験抗体は、ＥｐＣＡＭに結合する本発明の抗体の量を、少なくとも約95％減少させる。
【０１０７】
好ましくは、そのような抗体は、本明細書の別の箇所で定義される、他の結合および機能特性のうちの1つ以上、例えば、上記の特徴（ａ）〜（ｊ）を有する。
【０１０８】
本発明の抗体は、ＥｐＣＡＭに結合する。よって、本発明の抗体または結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＥｐＣＡＭを検出するために使用することができる。ＥｐＣＡＭは腫瘍細胞上で過剰発現するため、本発明の抗体または結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍細胞を検出するために使用することができる。加えて、抗体の腫瘍細胞に局在する能力は、本発明の抗体が、腫瘍細胞が存在する身体部位を標的とすることができることを意味し、よって、抗体は標的部位で作用することができる。例えば、抗体は、例えば、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣを活性化する、または誘発することによって、抗腫瘍作用自体を、すなわち、裸抗体として誘発する場合がある。裸Ａｂとして作用するこの能力は、非常に有利である。代替的に、または加えて、抗体は、さらなる治療分子、例えば、本明細書に記載される毒素または他の抗癌分子に抱合されることによって、抗腫瘍作用を誘発することができる。
【０１０９】
本発明の抗体は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍細胞、例えば、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞、例えば、乳癌細胞または胃癌細胞のＡＤＣＣを誘発する能力を有する。ＡＤＣＣの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、実施例4に記載される。よって、本発明の抗体は、例えば、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の腫瘍細胞の殺滅をもたらす可能性がある。そのような試験またはアッセイに使用することができる適切な腫瘍細胞の例は、実施例4に提供されるが、一般に、ＥｐＣＡＭを発現する任意の腫瘍細胞を使用することができる。例えば、本発明の3−17Ｉ抗体は、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも30％、40％、50％、または60％の乳癌細胞株であるＢＴ−474の殺滅、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも30％、40％、50％、60％、または70％の乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−453の殺滅、およびヒトＰＢＭＣの存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−231の殺滅をもたらす能力を有することを示した。そのような殺滅のレベルは、本発明の抗体において好ましい。そのような殺滅のレベルは、臨床試験の過程にある現在最も優れた抗ＥｐＣＡＭ抗体（すなわち、ＭＴ201）において観察されるものより有意に高く、実施例4を参照のこと。
【０１１０】
本発明の抗体は、好ましくは、そのようなＡＤＣＣレベルを達成するために必要な低濃度の抗体に関して、特に有力であることも示す。同様に、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、実施例4に記載される。よって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞、例えば、乳癌細胞の半最大細胞溶解（ＥＣ50）に必要な抗体濃度は、好ましくは、30ｎｇ／ｍｌ、25ｎｇ／ｍｌ、20ｎｇ／ｍｌ、15ｎｇ／ｍｌ、10ｎｇ／ｍｌ、5ｎｇ／ｍｌ、2ｎｇ／ｍｌ、1ｎｇ／ｍｌ、0．5ｎｇ／ｍｌ、または0．25ｎｇ／ｍｌ未満、または0．20ｎｇ／ｍｌ、もしくは0．15ｎｇ／ｍｌである。例えば、本発明の3−17Ｉ抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−453細胞において0．08ｎｇ／ｍｌ程度、Ｂ7474細胞において0．12ｎｇ／ｍｌ、およびＭＤＡ−ＭＢ−231細胞において15ｎｇ／ｍｌのＥＣ50を有することを示し、その全ては、ＭＴ201の平行実験において測定されたＥＣ50値より有意に低い。同様に、これらの結果は、本発明の好ましい抗体が、従来の抗体であるＭＴ201に対して明らかに優れていることを示す。
【０１１１】
本発明の抗体は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍細胞、例えば、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞、例えば、乳癌細胞または胃癌細胞のＣＤＣを誘発する能力を有する。ＣＤＣについての適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、実施例4に記載される。よって、本発明の抗体は、例えば、ヒト血清の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも70％、80％、90％、95％、または最大100％までの腫瘍細胞の殺滅をもたらす可能性がある。そのような試験またはアッセイに使用することができる適切な腫瘍細胞の例は、実施例4に提供されるが、一般に、ＥｐＣＡＭを発現する任意の腫瘍細胞を使用することができる。例えば、本発明の3−17Ｉ抗体は、ヒト血清の存在下のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも70％、80％、90％、または95％の乳癌細胞株であるＭＴ−3の殺滅をもたらす能力を有することを示し、実際には、ほぼ100％の殺滅を示し、また、ヒト血清の存在下のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも70％、80％、90％、または95％の胃癌細胞株であるＫＡＴＯＩＩＩの殺滅をもたらす能力を示し、実際には、これも、ほぼ100％の殺滅を示した。そのような殺滅のレベルは、本発明の抗体において好ましく、臨床試験の過程にある現在最も優れた抗ＥｐＣＡＭ抗体（すなわち、ＭＴ201）において観察されるものと比較可能であり、実施例4を参照のこと。
【０１１２】
本発明の抗体は、好ましくは、そのようなＣＤＣレベルを達成するために必要な低濃度の抗体に関して、特に有力であることも示す。同様に、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、実施例4に記載される。よって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍細胞、例えば、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞、例えば、乳癌細胞または胃癌細胞の半最大細胞溶解（ＥＣ50）に必要とされる抗体濃度は、好ましくは、60ｎｇ／ｍｌ、50ｎｇ／ｍｌ、40ｎｇ／ｍｌ、30ｎｇ／ｍｌ、25ｎｇ／ｍｌ、20ｎｇ／ｍｌ、15ｎｇ／ｍｌ、10ｎｇ／ｍｌ、5ｎｇ／ｍｌ、2ｎｇ／ｍｌ、1ｎｇ／ｍｌ、0．75ｎｇ／ｍｌ、0．5ｎｇ／ｍｌ、0．4ｎｇ／ｍｌ、または0．3ｎｇ／ｍｌ未満である。例えば、本発明の3−17Ｉ抗体は、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞において0．28ｎｇ／ｍｌ程度、およびＭＴ−3細胞において0．38ｎｇ／ｍｌのＥＣ50を有することを示し、その全ては、ＭＴ201の平行実験において測定されたＥＣ50値より有意に低い。再び、これらの結果は、本発明の好ましい抗体が、従来の抗体であるＭＴ201に対して明らかに優れていることを示す。
【０１１３】
よって、本発明の抗体は、少なくとも従来の抗体であるＭＴ201に対して改善されたＡＴＣＣおよびＣＤＣ活性を示し、これは、この点において、特に有効であると認識される。そのような効果は、本発明の抗体が、腫瘍細胞と戦うための患者の免疫系を動員するために使用され得る（すなわち、さらなる活性剤を必要とせずに、治療上有用であり得る）ことを実証する。そのような高レベルに、およびそのような高効力でＡＴＣＣを誘発する能力は、明らかに有利な特性である。
【０１１４】
よって、本発明の好ましい抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発する能力を有する。ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイすることが可能である。
【０１１５】
よって、本発明の好ましい抗体は、抗腫瘍活性を示す。そのような抗腫瘍活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイすることが可能である。
【０１１６】
本発明の抗体は、好ましくは、腫瘍細胞、例えば、乳癌細胞の成長を阻害する能力を有する。上記阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証されてもよい。
【０１１７】
好ましくは、上記の能力および特性は、適切な対照レベルと比較される時、測定可能なレベルまたは有意なレベルで、より好ましくは、統計的に有意なレベルで観察される。適切な有意なレベルは、本明細書の別の箇所で説明される。より好ましくは、上記の能力および特性の1つ以上は、従来の抗体において観察される能力と比較される時、測定可能に良い、またはより好ましくは有意に良いレベルで観察される。
【０１１８】
抗体によっては、それらが結合する細胞の中に取り込まれることが可能である。よって、本発明のいくつかの実施形態において、抗体は内部に取り込まれることが可能である。この特性は、抗体分子に結合する任意の他の製剤が抗体分子によって取り込まれるはずであるため、免疫抱合体における使用において、特に有利である。他の実施形態において、有意な取り込みは見られない。
【０１１９】
以下の本発明に記載の組成物、免疫抱合体、製薬、組合物、カクテル、キット、第1および第2の治療使用、ならびに全ての方法の説明において、「抗体」および「免疫抱合体」という用語、または抗原結合領域もしくはその断片は、特に記載のない限り、または科学的用語により明確にされない限り、様々な抗ＥｐＣＡＭ抗体、ならびに特定の3−17Ｉ、7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、または24−Ｇ6抗体を指す。
【０１２０】
本明細書に使用される、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むヒト抗原結合ドメインを含む、任意の免疫学的な結合剤または分子を広範に指す。重鎖の定常ドメインの種類により、全抗体は、5つの主要クラスである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの1つに割り当てられ、本発明の抗体は、これらのクラスのうちの任意の1つであり得る。これらのうちのいくつかは、さらにＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4等のサブクラス、またはアイソタイプに分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および3次元構成は周知である。
【０１２１】
一般に、抗原結合領域以外の全抗体が、本発明において使用される場合、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは、生理学的状態において最も一般的な抗体であり、また研究室で最も容易に作製されるため、好ましい。しかしながら、いくつかの実施形態において、ＩｇＡ抗体が好ましい。
【０１２２】
哺乳類の抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列、およびそれらの可変ドメインのフレームワーク領域のいくつかのアミノ酸に基づき、2つの明確に異なる種類である、カッパ（κ）およびラムダ（λ）のうちの1つに割り当てられる。本発明の抗体において、κまたはλ軽鎖定常領域の使用に対して、基本的に優先性はない。
【０１２３】
当業者により理解されるように、「抗体」という用語により包含される免疫学的結合試薬は、全抗体、二量体、三量体、および多量体抗体、二重特性抗体、キメラ抗体、組み換えおよび改変抗体、ならびにそれらの断片を含む、全てのヒト抗体、およびそれらの抗原結合断片に及ぶ。
【０１２４】
よって、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指し、本用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2等の抗原結合ドメイン、単一ドメイン抗体（ＤＡＢｓ）、ＴａｎｄＡｂｓダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単一鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ、二特異性抗体、二重等異性抗体断片、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）（それぞれ、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合、二重特異性、または三重特異性）、ｓｃ−二特異性抗体、カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞係合物、Ｔ細胞を誘引するためのｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム型）、ＤＶＤ−Ｉｇ（双対変数ドメイン抗体、二重特異性形式）、ＳＩＰ（小免疫タンパク質、ミニボディの一種）、ＳＭＩＰ（「小モジュール免疫薬」）ｓｃＦｖ−Ｆｃダイマー、ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化二特異性抗体「二重親和性再標的化」）、1つ以上のＣＤＲを含む小抗体模倣物等を含む抗体断片を含む。
【０１２５】
種々の抗体ベースの構造体および断片を調製し、使用するための技法は、当該分野において周知である（Ｋａｂａｔら，1991を参照、明確に、参照により本明細書に組み込まれる）。特に、二特異性抗体は、第ＥＰ404，097号および第ＷＯ93／11161号にさらに記載され、一方、直鎖状抗体はＺａｐａｔａら（1995）にさらに記載される。
【０１２６】
抗体は、従来の技法を使用して断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2断片は、抗体をペプシンで処理することにより生成することができる。ジスルフィド架橋を還元するために、得られたＦ（ａｂ’）2断片を処理し、Ｆａｂ’断片を産生することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成をもたらすことができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂｓ、ＴａｎｄＡｂｓ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、二特異性抗体、二重特性抗体断片、ならびに他の断片は、組み換えによる技法によって合成されるか、または化学的に合成することもできる。抗体断片を産生するための技法は、当該分野において周知であり、十分に説明されている。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎら，2006、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，2005、Ｌｅ  Ｇａｌｌら，2004、Ｒｅｆｆ＆Ｈｅａｒｄ，2001、Ｒｅｉｔｅｒら，1996、およびＹｏｕｎｇら，1995のそれぞれは、有効な抗体断片の産生をさらに説明し、それを可能にする。
【０１２７】
抗体または抗体断片は、天然に産生されるか、または完全に、または部分的に合成により産生することができる。よって、抗体は、任意の適切な供給源、例えば、組み換え供給源からであり得る、および／または遺伝子導入動物、もしくは遺伝子導入植物において、またはＩｇＹ技法を使用することにより、卵子において産生され得る。よって、抗体分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて産生することができる。
【０１２８】
好ましくは、抗体または抗体断片は、3つのＣＤＲドメインを含む抗体軽鎖可変領域（ＶL）と、3つのＣＤＲドメインを含む抗体重鎖可変領域（ＶH）とを含む。上記ＶＬおよびＶＨは、一般に、抗原結合部位を形成する。
【０１２９】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する、最小限の抗体断片である。この領域は、密接した、非共有結合会合で、1つの重鎖と、1つの軽鎖の可変ドメインのダイマーを有する。各可変ドメインの3つの高度可変領域（ＣＤＲ）が相互作用して、ＶH−ＶLダイマーの表面上の抗原結合部位を画定するのは、この構成においてである。集合的に、6つの高度可変領域（ＣＤＲ）は、抗原結合特異性を抗体に付与する。
【０１３０】
しかしながら、抗体の軽鎖可変ドメインからの3つのＣＤＲと、重鎖可変ドメインからの3つのＣＤＲの存在は、抗原結合に必ずしも必要ではないことは、当該分野において十分に説明されている。よって、上記の古典的な抗体断片より小さい構築物は、有効であることが知られている。
【０１３１】
例えば、ラクダ抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，1993、Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら，1997）は、広範な抗原結合レパートリーを有するが、軽鎖に欠けている。また、ＶＨドメインのみ（Ｗａｒｄらｌ，1989、Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，1995）またはＶＬドメインのみ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎら、2001）を含む単一ドメイン抗体による結果は、これらのドメインが許容可能な高い親和性で抗原に結合できることを示す。よって、3つのＣＤＲは、効果的に、抗原を結合することができる。
【０１３２】
単一ＣＤＲ、または2つのＣＤＲが効果的に抗原を結合することも知られている。第1の実施例として、ＶＨ  ＣＤＲ3領域がＧＦＰ等の異種タンパク質の中に挿入され、異種タンパク質に抗原結合能を付与することを示すことによって例証されるように、単一ＣＤＲは、異種タンパク質の中に挿入され、異種タンパク質に抗原結合能を付与することができる（Ｋｉｓｓら，2006、Ｎｉｃａｉｓｅら，2004）。
【０１３３】
2つのＣＤＲが効果的に抗原に結合し、親抗体によって保有されるより優れた特性をさらに付与することができることは、さらに公知である。例えば、親抗体からの2つのＣＤＲ（ＶＨ  ＣＤＲ1およびＶＬ  ＣＤＲ3領域）は、親分子の抗原認識特性を維持するが、腫瘍に浸透する能力に優れていることが示された（Ｑｉｕら，2007）。天然の親抗体に類似する様式でＣＤＲを配向するように、適切なリンカー配列とこれらのＣＤＲドメイン（例えば、ＶＨ  ＦＲ2から）を結合することは、さらに良好な抗原認識を産生した。したがって、親抗体に見られる立体構造を保持するように、適切なフレームワーク領域を用いて配向される2つのＣＤＲドメイン（好ましくは、ＶＨドメインから1つとＶＬドメインから1つ、より好ましくは、2つのＣＤＲドメインのうちの1つがＣＤＲ3ドメインである）を含む抗原結合抗体模倣物を構築することが可能であることは、当該分野において公知である。
【０１３４】
よって、本発明の好ましい抗体は、6つのＣＤＲ領域（軽鎖から3つ、および重鎖から3つ）を含み得るが、6つのＣＤＲ領域より少ない、または1つもしくは2つ程度のＣＤＲ領域の抗体も、本明細書により包含される。加えて、重鎖または軽鎖のみからのＣＤＲを有する抗体も含まれる。
【０１３５】
ＥｐＣＡＭに結合する本発明の好ましい抗体は、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの重鎖可変領域と、3つのＣＤＲを含む少なくとも1つの軽鎖可変領域とを含み、上記重鎖可変領域は、
（ｃ）配列番号7のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3、または
（ａ）配列番号5のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ1、
（ｂ）配列番号6のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ2、および
（ｃ）配列番号7のアミノ酸配列、もしくはそれに実質的に相同な配列を有するＶＨ  ＣＤＲ3を含む。
【０１３６】
本明細書において、3−17Ｉ、7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、および24−Ｇ6の6つの抗体クローンを例証し、それらの全ては、ＥｐＣＡＭに結合し、それらの全ては、同じ重鎖ＣＤＲドメイン（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を共有する。同じ重鎖ＣＤＲドメインを有し、ＥｐＣＡＭに結合する7つの他の抗体クローンも識別された。よって、これらの重鎖ＣＤＲドメインは、ＥｐＣＡＭ結合に重要であると考えられる。抗体のＣＤＲ3ドメインは、抗原特異性に特に重要であることが多いため、配列番号7に基づくそのようなＶＨ  ＣＤＲ3ドメインの存在は、本発明の抗体において特に好ましい。
【０１３７】
特定の重鎖ＣＤＲ領域と組み合わせて使用するための、好ましい軽鎖ＣＤＲ領域は、本明細書の別の箇所に記載される。しかしながら、本発明の重鎖可変領域と組み合わせて使用するための3つのＣＤＲを含む他の軽鎖可変領域も含まれる。本発明の重鎖可変領域と組み合わせて使用することができ、ＥｐＣＡＭの結合する抗体を生じる適切な軽鎖可変領域は、当業者によって容易に識別され得る。
【０１３８】
例えば、本発明の重鎖可変領域は、単一軽鎖可変領域、または軽鎖可変領域のレパートリーと組み合わせることができ、ＥｐＣＡＭへの結合について試験される抗体をもたらす。
【０１３９】
所望する場合、本発明の好ましい軽鎖可変領域と組み合わせて使用するための代替的な重鎖可変領域を識別するために、類似する方法を使用することができる。
【０１４０】
特定の実施形態において、抗体または抗体断片は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域等の重鎖定常領域の全て、または一部を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ1重鎖定常領域、またはその一部である。さらに、抗体または抗体断片は、カッパ軽鎖定常領域、もしくはラムダ軽鎖定常領域の全て、または一部、あるいはその一部を含むことができる。そのような定常領域の全て、または一部は、天然に産生されるか、または完全に、もしくは部分的に合成であり得る。そのような定常領域における適切な配列は、当該分野において周知であり、十分に説明されている。重鎖および軽鎖からの定常領域の完全な補体が、本発明の抗体に含まれる場合、そのような抗体は、通常、本明細書において、「完全長」抗体、または「全」抗体と称される。
【０１４１】
Ｆｃ領域を含有する抗体は、特定の使用、特に、Ｆｃ領域がＡＤＣＣおよびＣＤＣ等のエフェクター機能を媒介する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療の使用に好ましい。
【０１４２】
アミノ酸または核酸配列に関連して本明細書に使用される、「実質的に相同」という用語は、開示されるアミノ酸または核酸配列に対して、少なくとも70％もしくは75％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは、少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有する配列を含む。本発明の実質的に相同な配列は、よって、本発明の配列に対する単一もしくは複数の塩基、またはアミノ酸改変（付加、置換、挿入、または欠失）を含む。アミノ酸レベルでの、好ましい実質的に相同な配列は、本発明の配列を構成するフレームワーク領域のうちの1つ以上、および／またはＣＤＲのうちの1つ以上で、最大5、例えば、1、2、3、4、もしくは5のみ、好ましくは1、2、もしくは3、より好ましくは、1もしくは2の改変されたアミノ酸を含有する。上記改変は、保存もしくは非保存アミノ酸であり得る。好ましくは、上記改変は、保存アミノ酸置換である。特定の残基がＸとして定義され、そして実質的に相同な配列が言及される本発明の実施形態において、実質的に相同な配列のアミノ酸置換は、Ｘ残基以外の残基、例えば、Ｘ残基以外の1つ、2つ、または3つの残基に位置するか、または置換は、Ｘ残基、例えば、1つ、2つ、または3つのＸ残基に位置し得る。
【０１４３】
実質的に相同な核酸配列は、少なくとも適度に厳密なハイブリッド形成条件下で、開示される核酸配位列（またはそれらの相補的配列）とハイブリッド形成する、例えば、本発明の軽鎖もしくは重鎖のＣＤＲ、本発明の軽鎖もしくは重鎖の可変領域、または本発明の抗体（もしくはそれらの相補的配列とハイブリッド形成する）のうちの1つ以上をコードするヌクレオチドとハイブリッド形成するヌクレオチド配列も含む。
【０１４４】
「実質的に相同」という用語は、実質的に同じ方式で、本発明のタンパク質または核酸分子と実質的に同じ機能を行う、本発明のアミノ酸およびヌクレオチドの配列の修飾物または化学的同等物も含む。例えば、任意の実質的に相同な抗体（またはそれをコードする実質的に相同な核酸）は、上述のように、ＥｐＣＡＭに結合する能力を維持するはずである。好ましくは、任意の実質的に相同な抗体は、例えば、本明細書の別の箇所に定義されるような抗体の機能的能力、例えば、少なくともヒトおよびサルのＥｐＣＡＭに結合する能力を維持するべきである。好ましくは、任意の実質的に相同な抗体は、問題の抗体によって認識されるＥｐＣＡＭの同じエピトープ、例えば、本明細書に記載される、本発明のＣＤＲドメイン、または本発明のＶＨおよびＶＬのドメインによって認識される同じエピトープに特異的に結合する能力を維持するべきである。同じエピトープ／抗原に結合することは、当該分野において周知の、十分に説明される方法、例えば、結合アッセイ、例えば、競合アッセイを使用することにより容易に試験することができる。他の機能特性の維持も、当該分野において周知の、十分に説明される方法により、容易に試験することができる。
【０１４５】
よって、結合アッセイは、「実質的に相同」な抗体が本発明の抗体および抗体断片と同じ結合特異性を有するかを試験するために使用することができ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイは、そのような「実質的に相同」な抗体がＥｐＣＡＭに結合できるかを確立するために容易に使用することができることを、当業者は理解するだろう。以下に概説するように、競合結合アッセイは、「実質的に相同」な抗体が、本発明の抗体によって認識される、実質的に同じＥｐＣＡＭのエピトープに特異的に結合する能力を維持する、または本発明の種々の抗体（例えば、3−17Ｉ）の1つ以上と競合する能力を有するかを試験するために使用することができる。以下に記載する方法は、単に、適切な競合アッセイの一実施例である。当業者は、他の適切な方法および変形を認識しているだろう。
【０１４６】
例示的な競合アッセイは、種々の濃度の試験抗体（例えば、実質的に相同な抗体）の存在下で、本発明の種々の有効濃度の抗体のＥｐＣＡＭへの結合を評価することも含む。そのため、試験抗体により誘発された結合の阻害量を評価することができる。増加濃度で本発明の抗体への競合の増加を示す（すなわち、試験抗体の増加濃度が、ＥｐＣＡＭに結合する本発明の抗体の量において、対応する減少をもたらす）試験抗体は、実質的に同じエピトープに結合する証拠である。好ましくは、試験抗体は、ＥｐＣＡＭに結合する本発明の抗体の量を有意に減少させる。好ましくは、試験抗体は、ＥｐＣＡＭに結合する本発明の抗体の量を、少なくとも約95％減少させる。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイは、そのような競合アッセイにおける結合の阻害を評価するのに適切であるが、他の適切な技法も当業者に周知であろう。
【０１４７】
本発明のタンパク質の実質的に相同な配列は、これに限定されないが、保存アミノ酸置換、または例えば、異なるリンカー配列が使用されるＦｖ抗体、または抗原の結合に起因しないタグ配列もしくは他の構成要素が付加される抗体、例えば、抗体のＶＨ、ＶＬもしくはＣＤＲに影響を及ぼさない改変、または1つのタイプもしくは形式の抗体分子または断片から、別のタイプもしくは形式の抗体分子または断片への改変（例えば、ＦａｂからｓｃＦｖへの変換またはその逆）、または抗体分子の特定のクラスもしくはサブクラスの抗体分子への変換（例えば、抗体分子のＩｇＧまたはそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ1またはＩｇＧ3への変換）を含む。
【０１４８】
本明細書に使用される、「保存アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基と置換されるものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されており、塩基側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【０１４９】
相同性は、任意の従来の方法によって評価することが可能である。しかしながら、配列間の相同性の程度を決定するための、配列の多重アライメントを行うコンピュータプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、1994）は、有用である。所望する場合、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムは、配列のうちの1つの全長の少なくとも50％がアライメントに含まれる、2つの配列間で最高位の一致が得られるように、ＢＬＯＳＵＭ62スコアマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，1992）、ならびに10のギャップ開始ペナルティーおよび0．1のギャップ伸長ペナルティーとともに使用することができる。配列を整合するために使用され得る他の方法は、最高位の一致が2つの配列間で得られ、同一アミノ酸の数が2つの配列間で決定されるように、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（1981）により改訂されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（1970）のアライメント法である。2つのアミノ酸配列間でパーセント同一性を算出するための他の方法は、一般に、当該分野において認識されており、例えば、Ｃａｒｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ（1988）によって説明されるもの、およびＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，ｅ．ｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，1988，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓによって説明されるものを含む。
【０１５０】
一般に、コンピュータプログラムは、そのような計算のために利用される。ＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，1988）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，1988；  Ｐｅａｒｓｏｎ，1990）、およびギャップＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，1997）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，1984）等の配列の対を比較し、整合するプロブラムも、本目的において有用である。さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＤａｌｉサーバは、タンパク質配列の構造ベースのアライメントを提供している（Ｈｏｌｍ，1993、1995、1998）。
【０１５１】
基準点を提供する目的において、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％相同性を有する本発明に従う配列、配列同一性等は、デフォルトパラメータを用いたＡＬＩＧＮプログラム（例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバ、ＩＧＨ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅのインターネット上で利用可能）を使用して決定することが可能である。
【０１５２】
「少なくとも適度に厳密なハイブリッド形成条件」とは、溶液中の2つの相補的核酸分子間の選択的なハイブリッド形成を促進する条件が選択されるという意味である。ハイブリッド形成は、核酸配列分子の全て、または一部に生じる可能性がある。ハイブリッド形成部分は、通常、長さが少なくとも15（例えば、20、25、30、40、または50）ヌクレオチドである。核酸の二重鎖またはハイブリッドの安定性は、ナトリウム含有緩衝剤が、ナトリウムイオン濃度、および温度の関数（Ｔｍ＝81．5℃−16．6（Ｌｏｇ10［Ｎａ＋］）＋0．41（％（Ｇ＋Ｃ）−600／ｌ）、または類似する方程式）であるＴｍにより決定されることを、当業者は認識するだろう。したがって、ハイブリッド安定性を決定する洗浄条件のパラメータは、ナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子と類似するが、同一ではない分子を識別するために、1％のミスマッチは、Ｔｍにおいて約1℃の減少をもたらすと想定され得る。例えば、＞95％同一性を有する核酸分子が求められる場合、最終洗浄温度を約5℃減少させる。これらの判断に基づき、当業者は、適切なハイブリッド形成条件を容易に選択することができるだろう。好ましい実施形態において、厳密なハイブリッド形成条件が選択される。例として、厳密なハイブリッド形成を実現するために、以下の条件を利用する：上の方程式に基づき、5×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／5×デンハート溶液／1．0％のＳＤＳで、Ｔｍ−5℃でハイブリッド形成した後、60℃で0．2×のＳＳＣ／0．1％のＳＤＳで洗浄した。適度に厳密なハイブリッド形成条件は、42℃で、3×ＳＳＣの洗浄ステップを含む。さらなる例として、「ハイブリッド形成される」配列は、非厳密性の条件下（例えば、室温で、6×ＳＳＣ、50％ホルムアルデヒド）で結合（ハイブリッド形成）し、厳密性の低い条件下（例えば、室温で2×ＳＳＣ、より好ましくは、42℃で2×ＳＳＣ）、もしくは厳密性の高い条件下（例えば、65℃で2×ＳＳＣ）（ＳＳＣ＝0．15ＭのＮａＣｌ、0．015Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ7．2）で洗浄されるそれらの配列である。
【０１５３】
しかしながら、同等の厳密性が、別の緩衝剤、塩類、および温度で実現され得ることを理解する。ハイブリッド形成条件に関するさらなるガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，1989，6．3．1−6．3．6、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，1989，Ｖｏｌ．3において見出すことができる。
【０１５４】
一般的に、厳密性の高い条件下でハイブリッド形成される配列が好ましく、またコードが縮退しなければ、厳密性の高い条件下でハイブリッド形成するであろう配列も好ましい。
【０１５５】
他の好ましい実施形態において、3−17Ｉ、7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、または24−Ｇ6等の、元の抗ＥｐＣＡＭ抗体と比較して、強化された、または優れた特性を有する第2世代抗体を提供する。例えば、第2世代抗体は、異なる結合親和性または優れた速度定数（例えば、オン率および／またはオフ率）、優れた交差反応プロファイル、腫瘍細胞を標的とする優れた能力、例えば、改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣを誘発する能力、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける改善された腫瘍の治療、または高産生レベルを有する可能性がある。
【０１５６】
有効な第2世代抗体を識別するための比較は、例えば、本明細書または当該分野においてに詳細に記載される種々のアッセイのうちの1つ以上を使用することにより、容易に実施され、定量化される。3−17Ｉ抗体（または抗体7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、または24−Ｇ6）により例示される、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体と比較して、強化された生物学的特性、または少なくとも約2倍、5倍、10倍、20倍、好ましくは少なくとも50倍の活性を有する第2世代抗体は、本発明により包含される。
【０１５７】
本発明の抗体、結合タンパク質、および核酸分子は、ヒトもしくは動物の身体内、またはヒトもしくは動物の身体に由来する組織試料内の原位置で存在し得る、任意のそのような構成要素と区別されるため、一般に、「単離された」または「精製された」分子である。しかしながら、配列は、ヒトもしくは動物の身体に認められる配列に対応するか、またはそれに実質的に相同であり得る。よって、核酸分子または配列およびタンパク質またはポリペプチド、例えば、抗体に関して本明細書に使用される、「単離される」または「精製される」という用語は、それらの天然環境から単離される、精製される、または実質的に含まれない、例えば、ヒトもしくは動物の身体から単離される、または精製される（実際、天然に生じる場合）時の、そのような分子を指すか、または技術的プロセスより産生された時の、すなわち、組み換え、および合成により産生された分子を含む、そのような分子を指す。
【０１５８】
よって、核酸分子に関連して使用される時、そのような用語は、他の核酸／遺伝子、またはポリペプチド等と自然に会合する物質を実質的に含まない核酸を指す場合がある。これらの用語は、組み換えＤＮＡ技法により産生される時、細胞物質または培養培地を実質的に含まない、または科学的に合成される時、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸も指す場合がある。単離された、または精製された核酸は、核酸が由来する核酸を天然に隣接する配列（すなわち、核酸の5’端および3’端に位置する配列）、または例えば、遺伝子組み換えにより核酸を隣接するように作製された配列（例えば、タグ配列、または治療価値をもたない配列）を実質的に含まない場合もある。
【０１５９】
よって、軽鎖ＣＤＲ1、2、および3、重鎖ＣＤＲ1、2、および3、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、ならびに完全長抗体を含む本発明の結合タンパク質もしくは抗体等の、タンパク質またはポリペプチド分子に関して使用される時、「単離された」または「精製された」という用語は、通常、それが由来する供給源からの細胞物質またはタンパク質を実質的に含まないタンパク質を指す。特に、タンパク質がヒトまたは動物に投与されるいくつかの実施形態において、そのような単離された、または精製されたタンパク質は、組み換え技法により産生された時の培養培地、または化学的に合成された時の化学的な前駆体もしくは化学物質を実質的に含まない。そのような単離された、または精製されたタンパク質は、単離された核酸分子について、上述のもの等の、隣接配列を含まない場合もある。
【０１６０】
本明細書に使用される、「核酸配列」または「核酸分子」という用語は、自然に生じる塩基、糖類、および糖間（骨格）連結から成る、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのモノマーの配列を指す。本用語は、非天然モノマー、もしくはその一部を含む、修飾された、または置換された配列も含む。本発明の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）、またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む、自然に生じる塩基を含み得る。本配列は、修飾された塩基を含む場合もある。そのような修飾された塩基の例としては、アザおよびデアザのアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル、ならびにキサンチンおよびハイポキサンチンを含む。核酸分子は、二重鎖または一本鎖であり得る。核酸分子は、完全に、もしくは部分的に、合成または組み換えであり得る。
【０１６１】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗体、より好ましくは完全ヒト抗体である。この点において、ヒト抗体は、一般に、ヒトの治療における使用において、少なくとも3つの潜在的な利点を有する。第1に、ヒト免疫系は、外来性として抗体を認識するべきではない。第2に、ヒト循環における半減期は、自然に生じるヒト抗体と類似し、用量の少ない、低頻度の投与を可能にする。第3に、エフェクタータンパク質がヒトであるため、例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）により、標的細胞をより効率的に破壊するために、ヒト免疫系の他の部分と良好に相互作用するだろう。
【０１６２】
しかしながら、ヒト抗体は、一般に、これらの利点を示すように認識されるが、それらを良好なヒト治療の候補になるように、十分に高い親和性および適切な特性を有するヒト抗体の開発は、決して容易ではないことは公知である。したがって、当該分野では、今でも、安全かつ効果的なヒトの治療用の抗ＥｐＣＡＭに欠いており、そのような製剤の開発に対する課題を伴う。
【０１６３】
抗体分子および結合タンパク質に関連して本明細書に使用される、「ヒト」という用語は、第1に、ヒトレパートリーから単離された、もしくはそれに由来する、またはヒト、例えば、ヒト生殖系列もしくは体細胞に認められる配列に由来する、もしくはそれに対応する、可変領域（例えば、ＶH、ＶL、ＣＤＲ、またはＦＲ領域）、ならびに任意に、定常抗体領域を有する抗体および結合タンパク質を指す。3−17Ｉ抗体（および7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、または24−Ｇ6抗体）は、可変領域がヒトレパートリーから単離された、そのようなヒト抗体分子の例である。
【０１６４】
本発明の「ヒト」抗体および結合タンパク質は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基、例えば、ランダムに導入された変異、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける部位特異的変異、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローン化またはＰＣＲにより導入された変異を含む。そのような変異の特定の例は、少数の抗体または結合タンパク質の残基、例えば、最大5つ、例えば、5つ、4つ、3つ、2つ、もしくは1つの抗体または結合タンパク質の残基、好ましくは、例えば、最大5つ、例えば、抗体または結合タンパク質のＣＤＲのうちの1つ以上を構成する5つ、4つ、3つ、2つ、もしくは1つの残基において、保存置換または他の変異を含む変異である。そのような「ヒト」抗体の特定の例は、潜在的に免疫原性部位の量を減少させるために、標準的な修飾法に曝された抗体および可変領域を含む。
【０１６５】
よって、本発明の「ヒト」抗体は、ヒトにおいて認められる配列に由来する、および関連する配列を含むが、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない可能性がある。加えて、本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、ヒト配列から識別されるヒトコンセンサス配列、またはヒト配列に実質的に相同な配列を含むタンパク質を含む。
【０１６６】
加えて、本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、それら自身がヒト抗体分子において組み合わせで認められるＶH、ＶL、ＣＤＲ、またはＦＲ領域の組み合わせに限定されない。よって、本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、ヒトにおいて必ずしも天然に存在しないそのような領域の組み合わせを含む、またはそれに対応することができる。
【０１６７】
好ましい実施形態において、ヒト抗体は、完全ヒト抗体である。本明細書に使用される、「完全ヒト」抗体とは、実質的にヒト以外の抗体配列、または任意のヒト以外の抗体配列を含まずに、上に定義される「ヒト」可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲを含む抗体である。例えば、「実質的にヒト以外の抗体配列を含まない」ヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲを含む抗体は、最大5つ、例えば、約5つ、4つ、3つ、2つ、または1つのアミノ酸が、ヒト抗体配列によってコードされないアミノ酸である、抗体、ドメイン、および／またはＣＤＲである。よって、「完全ヒト」抗体は、「ヒト化」抗体と区別され、これは、特定のアミノ酸がヒト抗体に通常存在するアミノ酸とより良好に対応するように変更された、実質的にヒト以外の可変領域ドメイン、例えば、マウス可変領域ドメインに基づく。
【０１６８】
本発明の「完全ヒト」抗体は、単一鎖抗体である等の、任意の他の実質的な抗体配列を含まない、ヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲであり得る。代替的に、本発明の「完全ヒト」抗体は、1つ以上のヒト抗体定常領域と一体となる、またはそれに操作可能に結合される、ヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲであり得る。特定の好ましい完全ヒト抗体は、ＩｇＧ定常領域の完全補体を伴うＩｇＧ抗体である。
【０１６９】
他の実施形態において、本発明の「ヒト」抗体は、一部がヒトのキメラ抗体である。本明細書に記載される、「一部がヒトのキメラ」抗体とは、ヒト以外の種、例えばラットもしくはマウスの定常領域の全て、または一部に操作可能に結合される、またはその上にグラフトされる「ヒト」可変領域ドメインおよび／もしくはＣＤＲを含む抗体である。そのような一部がヒトのキメラ抗体は、例えば、前臨床試験において使用される場合があり、定常領域は、好ましくは、前臨床検査において使用される動物と同じ種である。これらの一部がヒトのキメラ抗体は、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏの診断においても使用され得、ヒト以外の種の定常領域は、抗体検出のためのさらなる選択股を提供する場合がある。
【０１７０】
本明細書に使用される、「断片」という用語は、生物学的関連の断片、例えば、抗原結合に起因する、例えば、抗原結合部位の一部を形成する、および／またはＥｐＣＡＭ抗原の機能の阻害もしくは低下に起因する断片を指す。特定の好ましい断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域（ＶHドメイン）および／または軽鎖可変領域（ＶLドメイン）を含む。他の好ましい断片は、本発明の抗体の重鎖ＣＤＲの（もしくは本発明のＶHドメインの）うちの1つ以上、または本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲの（もしくは本発明のＶLドメインの）うちの1つ以上を含む。特定の好ましい断片は、長さが少なくとも5つのアミノ酸であり、少なくとも1つのＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ3領域、より好ましくは重鎖ＣＤＲ3領域を含む。
【０１７１】
本発明の抗体が定義される配列のいずれかの断片を含む（例えば、配列番号21、36、49、62、75、または88の断片を含む）、例えば、本発明のＶHおよび／もしくはＶLドメインを含む抗体である、または本発明の1つ以上のＣＤＲを含む抗体もしくは結合タンパク質である本発明の実施形態において、これらの領域／ドメインは、一般に、各領域／ドメインがその生物学的機能を実施することができ、かつ抗原結合に寄与することが維持されるように、抗体または結合タンパク質内で分離される。よって、ＶHおよびＶLドメインは、好ましくは、適切な足場配列／リンカー配列によって分離され、ＣＤＲは、好ましくは、自然に生じる抗体および／または有効な操作された抗体に認められるもの等の、適切なフレームワーク領域によって分離される。よって、本発明のＶH、ＶL、および個々のＣＤＲ配列は、好ましくは、抗原結合を可能にするように、適切なフレームワークまたは足場内に提供されるか、または組み込まれる。そのようなフレームワーク配列または領域は、適切な足場を形成するのに適切に、自然に生じるフレームワーク領域であるＦＲ1、ＦＲ2、ＦＲ3、および／もしくはＦＲ4に対応するか、または例えば、種々の自然に生じるフレームワーク領域を比較することによって識別されるコンセンサスフレームワーク領域に対応する場合がある。代替的に、非抗体足場またはフレームワーク、例えば、Ｔ細胞レセプターフレームワークを使用することができる。
【０１７２】
フレームワーク領域に使用することができる適切な配列は、当該分野において周知であり、十分に説明されており、これらのいずれかを使用することができる。フレームワーク領域に好ましい配列は、本発明のＶHおよび／またはＶLドメインを構成するフレームワーク領域のうちの1つ以上（すなわち、1、2、3、または4）、すなわち、配列番号21、36、49、62、75、もしくは88、または表1〜6に開示されるフレームワーク領域、またはそれらに実質的に相同なフレームワーク領域のうちの1つ以上、特に、抗原特異性の保持を可能にするフレームワーク領域、例えば、実質的に同じ、または同じ3Ｄ構造の抗体をもたらすフレームワーク領域である。特定の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変軽鎖（配列番号15、16、17、および18）および／または可変重鎖（配列番号11、12、13、および14）の4つ全て、配列番号21（表1にも示される）のＦＲ領域、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域は、本発明の抗体に認められる。可変軽鎖フレームワーク領域の他の好ましい組み合わせは、表2〜6に示される。
【０１７３】
加えて、本発明の好ましい抗体は、本発明のＶH、ＶL、またはＣＤＲから構成されるが、本発明の抗体は、本明細書に概説される本発明の抗体のＥｐＣＡＭ結合特性または抗ＥｐＣＡＭ特性がまだ存在するならば、本発明ではない他のＶH、ＶL、またはＣＤＲと組み合わせて、本発明の1つ以上のＶH、ＶL、またはＣＤＲも包含することに留意するべきである。
【０１７４】
本明細書に使用される、「重鎖相補性決定領域」（「重鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の重鎖可変領域（ＶHドメイン）内の超可変性の領域を指す。重鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端までの重鎖ＣＤＲ1、重鎖ＣＤＲ2、および重鎖ＣＤＲ3と称される、3つのＣＤＲを有する。重鎖可変領域は、4つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端までのＦＲ1、ＦＲ2、ＦＲ3、およびＦＲ4）も有する。これらのフレームワーク領域は、ＣＤＲを分離する。
【０１７５】
本明細書に使用される、「重鎖可変領域」（ＶHドメイン）という用語は、抗体分子の重鎖の可変領域を指す。
【０１７６】
本明細書に使用される、「軽鎖相補性決定領域」（「軽鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の軽鎖可変領域（ＶLドメイン）内の超可変性の領域を指す。軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端までの軽鎖ＣＤＲ1、軽鎖ＣＤＲ2、および軽鎖ＣＤＲ3と称される、3つのＣＤＲを有する。軽鎖可変領域は、4つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端までのＦＲ1、ＦＲ2、ＦＲ3、およびＦＲ4）も有する。これらのフレームワーク領域は、ＣＤＲを分離する。
【０１７７】
本明細書に使用される、「軽鎖可変領域」（ＶLドメイン）という用語は、抗体分子の軽鎖の可変領域を指す。
【０１７８】
ＣＤＲの位置を定義するために、必要に応じて、本明細書は、Ｋａｂａｔ命名法に従うことに留意するべきである（Ｋａｂａｔら、1991、具体的に、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７９】
当業者は、軽鎖および重鎖ＣＤＲ、軽鎖および重鎖の可変領域、抗体、抗体断片、ならびに免疫抱合体等の、本発明のタンパク質およびポリペプチドが、当該分野において周知の、十分に説明されるいくつかの方式のいずれかにより調製され得るが、最も好ましくは組み換え法を使用して調製されることを理解するだろう。
【０１８０】
本発明の抗体の軽鎖および重鎖の可変領域をコードする核酸断片は、適切な方法、例えば、クローン化、または合成によって得られるか、またはそれによって産生され得る。そのような配列は、例えば、当該分野において周知の、十分に説明された方法を使用して、例えば、ヒト生殖細胞遺伝子からの適切な配列をクローン化した後、生殖細胞配列に任意の必要な修飾を行い、本発明の配列を得ることにより、調製することができる。この完全配列は、次いで、さらなるクローン化および操作、例えば、適切な発現ベクターの中にクローン化するための、適切な制限部位を含有するプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅することができる。1つの可変領域につき5〜7の重複プライマーが、通常、十分であり、これによって、この技法を非常に効率的で正確なものにする。
【０１８１】
本発明の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸断片が得られたら、これらの断片は、例えば、可変領域断片を、適切な定常領域ドメインを有する完全長抗体分子に、または例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片等の、本明細書の別の箇所に記載される抗体断片の特定の形式に変換するために、標準的な組み換えＤＮＡ法によりさらに操作することができる。通常、またはこのさらなる操作手順の一部として、本発明の抗体分子をコードする核酸断片は、一般に、本発明の抗体の産生を促進するために、適切な発現ベクターの中に組み込まれる。
【０１８２】
可能な発現ベクターは、ベクターが使用される宿主細胞に適合するならば、コスミド、プラスミド、または修飾されたウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）を含むが、これらに限定されない。発現ベクターが「宿主細胞の形質転換に適切」であるとは、発現ベクターが、本発明の核酸分子、および核酸分子に操作可能に連結される、発現のために使用される宿主細胞に基づき選択された制御配列を含むことを意味する。操作可能に連結とは、核酸が核酸の発現を可能にする様式で、制御配列に連結されることを意味することが意図される。
【０１８３】
本発明は、したがって、本発明の核酸分子、またはその断片、および本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な制御配列を含有する、組み換え発現ベクターに関する。
【０１８４】
適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類、または昆虫の遺伝子を含む、種々の供給源に由来し得る（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，1990に記載される制御配列を参照）。適切な制御配列の選択は、以下に記載されるように選択される宿主細胞に依存し、当業者によって、容易に達成され得る。そのような制御配列の例としては、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が挙げられる。加えて、選択される宿主細胞、および利用されるベクターにより、複製元、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導能を付与する配列等の、他の配列が発現ベクターの中に組み込まれ得る。
【０１８５】
本発明の組み換え発現ベクターは、本発明の組み換え分子を用いて形質転換または形質移入された、宿主細胞の選択を促進する選択マーカー遺伝子も含有する場合がある。選択マーカー遺伝子の例は、特定の薬物に耐性を付与するネオマイシンおよびハイグロマイシン、β−ガラクトシターゼ、クロラムフェニコロールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルのルシフェラーゼ、または好ましくはＩｇＧのＦｃ部等の免疫グロブリンもしくはその一部等の、タンパク質をコードする遺伝子である。選択マーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシターゼ、クロラムフェニコロールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルのルシフェラーゼ等の、選択マーカータンパク質の濃度の変化により監視される。選択マーカー遺伝子がネオマイシン等の抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換細胞は、Ｇ418を用いて選択することができる。選択マーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生存し、一方、他の細胞は死滅する。これは、本発明の組み換え発現ベクターの発現の可視化する、およびアッセイする、特に、発現および表現型の変異の作用を決定することを可能にする。選択マーカーは、関心の核酸とは別のベクター上に導入することができることを理解するだろう。
【０１８６】
組み換え発現ベクターは、組み換えタンパク質の発現の増加、組み換えタンパク質の溶解性の増加を提供し、親和性精製におけるリガンドとして作用する（例えば、精製および／または識別を可能にする適切な「タグ」、例えば、Ｈｉｓタグもしくはｍｙｃタグが存在し得る）ことにより、標的組み換えタンパク質の精製に役立つ融合部分をコードする遺伝子も含有する場合がある。例えば、タンパク質分解性切断部位は、標的組み換えタンパク質に付加され、融合タンパク質の精製後、融合部分からの組み換えタンパク質の分離を可能にする。典型的な融合発現ベクターは、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを組み換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭａｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、およびｐＲＩＴ5（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【０１８７】
組み換え発現ベクターは、宿主細胞に導入され、形質転換された宿主細胞を産生することができる。「〜で形質転換された」、「〜を形質移入された」、「形質転換」、および「形質移入」という用語は、当該分野における多くの可能な技法のうちの1つにより、核酸（例えばベクター）の細胞への導入を包含することが意図される。本明細書に使用される、「形質転換された宿主細胞」という用語は、本発明の組み換え発現ベクターで形質転換されたグリコシル化ができる細胞も含むことが意図される。原核生物細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたはカルシウム−塩化物媒介形質転換により、核酸で形質転換することができる。例えば、核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション法、エレクトロポレーション、または微量注入法等の、従来の技法を介して、哺乳類細胞に導入することができる。形質転換および形質移入宿主細胞に適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、1989、および他の研究教本に見出すことができる。
【０１８８】
適切な宿主細胞は、広範な真核生物宿主細胞および原核生物細胞を含む。例えば、本発明のタンパク質は、酵母細胞または哺乳類細胞において発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，1990に見出すことができる。加えて、本発明のタンパク質は、大腸菌等の原核生物細胞において発現させることができる（Ｚｈａｎｇら、2004）。
【０１８９】
本発明を実行するのに適切な酵母および真菌宿主細胞は、出芽酵母、ピキア属もしくはクリベロマイセス、および種々の種類のコウジカビ属を含むが、これらに限定されない。酵母である出芽酵母で発現させるためのベクターの例としては、ＹｅｐＳｅｃ1（Ｂａｌｄａｒｉら、1987）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，1982）、ｐＪＲＹ88（Ｓｃｈｕｌｔｚら、1987）、およびｐＹＥＳ2（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。酵母および真菌の形質転換のプロトコルは、当業者に周知である（Ｈｉｎｎｅｎら、1978、Ｉｔｏら、1983、およびＣｕｌｌｅｎら1987を参照）。
【０１９０】
本発明を実行するのに適した哺乳類細胞は、特に、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ1650または1651）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ6281）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ61）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ2）、293（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．1573）、ＮＳ−1細胞、ＮＳ0（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−11177）、ＨＥＫ−293（ヒト腎臓、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−11268）、およびＰｅｒ．Ｃ6（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを含む。哺乳類細胞において発現を導くための適切な発現ベクターは、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス40等のウイルス性物質に由来する）、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ8（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，1987）およびｐＭＴ2ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、1987）が挙げられる。
【０１９１】
本明細書に提供される教示を考えると、プロモーター、ターミネーター、および適切な型の発現ベクターを、植物、鳥類、および昆虫細胞に導入するための方法も、容易に達成することができる。例えば、一実施形態内で、本発明のタンパク質は、植物細胞から発現され得る（アグロバクテリウムリゾゲネスベクターの使用を概説するＳｉｎｋａｒら、1987を参照、また特にＰＡＰＳ2022、ＰＡＰＳ2023、およびＰＡＰＳ2034を含む、植物細胞の発現ベクターの使用を説明するＺａｍｂｒｙｓｋｉら、1984も参照）。
【０１９２】
本発明を実行するための適切な昆虫細胞は、カイコ、イラクサギンウワバ、またはスポドプテラ種からの細胞および細胞株を含む。培養された昆虫細胞（ＳＦ9細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、1983）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ1989）を含む。本発明の組み換えタンパク質の発現に適切ないくつかのバキュロウイルス−昆虫細胞発現系は、ＰＣＴ／ＵＳ／02442に記載される。
【０１９３】
代替的に、本発明のタンパク質は、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびブタ等のヒト以外の遺伝子導入動物において発現させることもできる（Ｈａｍｍｅｒら、1985、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、1983、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、1985、Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  1985、および米国特許第4，736，866号）。
【０１９４】
本発明のタンパク質は、固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（1964）、Ｆｒｉｓｃｈｅら、1996）または均一溶液中での合成（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ，1987）等のタンパク質の化学において周知の技法を使用して、化学合成により調製もされ得る。
【０１９５】
タンパク質等の他の分子に抱合される本発明の抗体およびタンパク質を含む、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質は、組み換え技法による融合によって調製することができる。得られた融合タンパク質は、本明細書に記載される選択されたタンパク質、もしくはマーカータンパク質、またはタグタンパク質に融合された本発明の抗体、またはタンパク質を含有する。本発明の抗体およびタンパク質は、公知の技法により、他のタンパク質にも抱合され得る。例えば、タンパク質は、第ＷＯ90／10457号に記載される、ヘテロ二機能性チオール含有リンカー、Ｎ−スクシンイミジル−3−（2−ピリドイルジチオ−プロピオン酸塩）またはＮ−スクシンイミジル−5チオ酢酸塩を使用して結合され得る。融合タンパク質または抱合体を調製するために使用され得るタンパク質の例としては、免疫グロブリン、ホルモン、成長因子、レクチン、インスリン、低密度リポタンパク質、グルカゴン、エンドルフィン、トランスフェリン、ボンベシン、アシアロ糖タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、および切断型ｍｙｃが挙げられる。
【０１９６】
第1の抗ＥｐＣＡＭ抗体核酸セグメントの調製様式に関係なく、さらなる適切な抗体核酸セグメントは、標準的な分子生物学技法により容易に調製され得る。任意の変種、変異体、または第2世代抗ＥｐＣＡＭ抗体核酸セグメントが本発明の使用に適切であることを確認するために、核酸セグメントは、本発明に従う抗ＥｐＣＡＭ抗体の発現を確認するために試験される。好ましくは、変種、変異体、または第2世代核酸セグメントは、標準的なハイブリッド形成条件下、より好ましくは標準的な厳密なハイブリッド形成条件下で、ハイブリッド形成を確認するためにも試験されるだろう。例示的な適切なハイブリッド形成条件は、約50℃で、約7％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約0．5ＭのＮａＰＯ4、約1ｍＭのＥＤＴＡでのハイブリッド形成、および約42℃で、約1％のＳＤＳでの洗浄を含む。
【０１９７】
種々の抗体は容易に調製され得るが、本発明の治療方法は、患者において、治療有効量の本発明の少なくとも第1の抗ＥｐＣＡＭ抗体を発現する、少なくとも第1の核酸セグメントまたは分子を動物または患者に提供することにより行うことができる「抗ＥｐＣＡＭ抗体を発現する核酸セグメントまたは分子」は、一般に、少なくとも発現構築物または発現ベクターの形態であり、ウイルス内、もしくは組み換え宿主細胞内に含まれる発現構築物または発現ベクターの形態であり得る。本発明の好ましい遺伝子療法ベクターは、一般に、組み換えレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、アデノ会合ウイルス（ＡＡＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等内に含まれる等の、ウイルスベクターである。
【０１９８】
またさらなる態様は、本発明の核酸セグメントまたは分子のうちの1つ以上を含む、発現構築物もしくは発現ベクターを提供する。好ましくは、発現構築物または発現ベクターは、組み換え体である。好ましくは、上記構築物またはベクターは、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な制御配列をさらに含む。
【０１９９】
またさらなる態様は、本発明の1つ以上の発現構築物または発現ベクターを含む、宿主細胞またはウイルスを提供する。本発明の核酸分子のうちの1つ以上を含む、宿主細胞またはウイルスも提供する。本発明の抗体を発現する宿主細胞またはウイルスは、またさらなる態様を形成する。
【０２００】
本発明のまたさらなる態様は、本発明の宿主細胞を培養するステップを含む、本発明の抗体を産生する方法を提供する。好ましい方法は、（ｉ）コードされた抗体またはタンパク質の発現に適した条件下で、組み換え発現ベクターのうちの1つ以上、または本発明の核酸配列のうちの1つ以上を含む宿主細胞を培養する、および任意に、（ｉｉ）宿主細胞から、または成長培地／上澄みから、抗体もしくはタンパク質を単離する、または得るステップを含む。そのような産生方法は、抗体もしくはタンパク質産物の精製、および／または抗体もしくは産物を、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤等の、少なくとも1つのさらなる組成物を含む組成物に製剤化するステップも含む場合がある。
【０２０１】
本発明の抗体またはタンパク質が2つ以上のポリペプチド鎖（例えば、Ｆａｂ断片等の特定の断片）で構成される時の実施形態において、全てのポリペプチドは、好ましくは、同じ、または異なる発現ベクターのいずれかから宿主細胞中に発現し、そのため、完全タンパク質、例えば、本発明の結合タンパク質は、宿主細胞中で構築され、そこから単離または精製され得る。
【０２０２】
本発明の抗体は、ＥｐＣＡＭに結合するさらなる抗体を産生するためにも使用され得る。そのような使用は、例えば、新しい抗体を形成するために、親抗体のアミノ酸配列において1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入を含み、上記親抗体は、本明細書の別の箇所で定義される本発明の抗体のうちの1つであり、得られた新しい抗体を試験して、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を識別する。そのような方法は、全てがＥｐＣＡＭに結合するそれらの能力について試験され得る、複数の新しい抗体を形成するために使用することができる。好ましくは、1つ以上のアミノ酸の上記付加、欠失、置換、または挿入は、ＣＤＲドメインのうちの1つ以上で起こる。
【０２０３】
親抗体に対するそのような修飾または変異は、当該分野において周知の、十分に説明された技法を使用する任意の適切な様式で、例えば、ランダムもしくは定方向変異誘発の方法を実行することにより実行することができる。定方向変異誘発が使用される場合、変異誘発に適切な残基を識別するための戦略の1つは、結合タンパク質−抗原複合体、例えば、Ａｂ−Ａｇ複合体の結晶構造の分解能を利用して、抗原結合に関与する主な残基を識別する（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，1996）。続いて、これらの残基は、相互作用を強化するために変異され得る。代替的に、1つ以上のアミノ酸残基は、単純に、定方向変異誘発、および評価されるＥｐＣＡＭへの結合に対する作用の標的とされ得る。
【０２０４】
ランダム変異誘発は、例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖混合、または変異誘発物である大腸菌株による等の、任意の適切な方式で実行され得る。
【０２０５】
よって、本発明のＶHドメインの1つ以上は、任意の適切な供給源からの単一ＶLドメインまたはＶLドメインのレパートリーと組み合わされ、得られた新しい抗体は、ＥｐＣＡＭに特異的である抗体を識別するために試験され得る。逆に、本発明のＶLドメインの1つ以上は、任意の適切な供給源からの単一ＶHドメインまたはＶHドメインのレパートリーと組み合わされ、得られた新しい抗体は、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を識別するために試験され得る。
【０２０６】
同様に、本発明のＶHおよび／もしくはＶLドメインのうちの1つ以上、または好ましくは、3つ全てのＣＤＲは、必要に応じて、単一ＶHおよび／もしくはＶLドメイン、またはＶHおよび／もしくはＶLドメインのレパートリーの中にグラフトされ、得られた新しい抗体は、ＥｐＣＡＭに結合する抗体を識別するために試験され得る。
【０２０７】
軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ、特にＣＤＲ3の標的変異は、抗体の親和性を増加するのに有効な技法であることが示され、好ましい。好ましくは、ＣＤＲ3の3〜4つのアミノ酸のブロック、または「ホットスポット」と呼ばれる特定の領域が、変異誘発の標的とされる。
【０２０８】
「ホットスポット」は、体細胞超変異がｉｎ  ｖｉｖｏ（および以下Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，1995）で起こる配列である。ホットスポット配列は、特定のコドンにおいてコンセンサスヌクレオチド配列として定義され得る。コンセンサス配列は、テトラヌクレオチド、ＲＧＹＷであり、Ｒは、ＡもしくはＧのいずれかであり得、Ｙは、ＣもしくはＴであり得、Ｗは、ＡもしくはＴのいずれかであり得る（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，1995）。加えて、ヌクレオチドＡＧＹによりコードされるセリン残基は、潜在的なホットスポット配列に対応するＴＣＮによりコードされるものに対して、可変ドメインのＣＤＲ領域に優性に存在する（Ｗａｇｎｅｒら，1995）。
【０２０９】
よって、本発明の各抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲのヌクレオチド配列は、ホットスポット配列およびＡＧＹコドンの存在についてスキャンされ得る。次いで、軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域の識別されたホットスポットは、任意に、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎ  Ｔｉｃｓ  データベース（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ｖｑｕｅｓｔ／）を使用して、重鎖および軽鎖の胚の配列と比較される（Ｄａｖｉｅｓら、1990）。生殖系列と一致する配列は、体細胞変異が起こらなかったことを示し、よって、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる体細胞事象を模倣するランダム変異が導入され得るか、または代替的に、部位特異的変異誘発が、例えば、ホットスポットおよび／またはＡＧＹコドンで実行され得る。逆に、異なる配列は、いくつかの体細胞変異が既に起こったことを示す。ｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異が最適であったかどうかは未定である。
【０２１０】
変異に好ましいホットスポットは、露出アミノ酸をコードするもの、および好ましくは、抗原結合部位の一部を形成するアミノ酸をコードするものである。他の変異に好ましいホットスポットは、非保存アミノ酸をコードするものである。ＣＤＲ内に埋没された、または保存されたアミノ酸をコードするホットスポットは、好ましくは、変異誘発されない。これらの残基は、通常、全体的な構造に重要であり、これらは埋没されているため、抗原と相互作用する可能性は低い。
【０２１１】
アミノ酸およびタンパク質ドメインの上述の操作を実行する方法は、当業者に周知である。例えば、上記操作は、得られる発現したタンパク質のアミノ酸配列が同時に適切な方式で修飾されるように、適切な結合タンパク質およびそのドメインをコードする核酸分子が修飾される核酸レベルで、遺伝子組み換えにより都合よく実行することができる。
【０２１２】
これらの方法により産生された新しい抗体は、好ましくは、改善された機能特性、例えば、親抗体よりＥｐＣＡＭに対して高い、または強化された親和性（または少なくとも同等の親和性）を有し、本明細書の別の箇所に記載される、本明細書の抗体と同じ方式で処理され、使用され得る（たとえば、組成物等における治療、診断）。代替的に、または加えて、新しい抗体は、本明細書の別の箇所に記載される、1つ以上の他の改善された機能特性を有する。
【０２１３】
これらの方法により産生された、得られた、または得ることができる新しい抗体は、本発明のまたさらなる態様を形成する。
【０２１４】
ＥｐＣＡＭに結合する1つ以上の抗体の能力を試験することは、任意の適切な方法により実行することができ、これは当該分野において周知であり、十分に説明されている。ＥｐＣＡＭ試料、例えば、種々の種からの組み換えＥｐＣＡＭは、商業的に入手可能（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）であるか、または当該分野において入手可能なＥｐＣＡＭ分子の配列情報（実施例を参照）から容易に生成することができ、これらは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ等の従来の方法により、結合をアッセイするために容易に使用することができ、これは、例えば、ＥｐＣＡＭが固体支持体に結合され、抗体のそれに結合する能力が標準的な技法により測定される。代替的に、ＥｐＣＡＭへの結合は、ウェスタンブロット法により評価することができる。ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインを含むＥｐＣＡＭ試料は、理想的には、これらの目的のために使用される。
【０２１５】
代替的に、高レベルのＥｐＣＡＭを発現する（例えば、ＫａｔｏＩＩＩ等の胃癌株、ＭＴ−3、ＢＴ474、ＭＤＡ−ＭＢ−453、およびＭＤＡ−ＭＢ−231等の乳癌細胞株）、または高レベルのＥｐＣＡＭを発現するように操作された細胞は、例えば、フローサイトメトリーまたはＩＨＣを使用して、ＥｐＣＡＭに結合する抗体について評価するために使用することができる。
【０２１６】
適切なＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、およびＢＩＡｃｏｒｅアッセイは、実施例において説明される。アッセイにおいて、抗体のＥｐＣＡＭ、例えば、特定の種のＥｐＣＡＭに結合する能力は、一般に、適切な対照、例えば、ＥｐＣＡＭに結合しない抗体と比較して、ＥｐＣＡＭへの測定可能な、そして好ましくは有意な結合を示す抗体の能力を指す。ＥｐＣＡＭ、例えば、特定の種のＥｐＣＡＭに結合しないと考えられる抗体において、一般に、そのような抗体は、例えば、適切な対照、例えば、ＥｐＣＡＭに結合しない抗体より測定不可能な、または有意に高くない、または異ならないレベルでの、ＥｐＣＡＭへの有意でない、または検出不可能な、または測定不可能な結合を示す。
【０２１７】
本明細書に言及される任意の統計的分析において、好ましくは、適切な対照に対する統計的に有意な相違は、＜0．1、好ましくは＜0．05、より好ましくは＜0．01の確率値を有する。統計的有意性を決定するための適切な方法は、当該分野において周知であり、十分に説明されており、これらのいずれかを使用することができる。
【０２１８】
本発明は、本発明の少なくとも1つの抗体、または抗体断片を含む組成物をさらに提供し、任意に、希釈剤を含む。そのような組成物は、薬学的に許容される組成物、または研究試験において使用するための組成物であり得る。薬学的組成物に関して、これらは、好ましくは、静脈内投与、またはさらに皮下投与等の、非経口投与用に製剤化され得る。
【０２１９】
本発明は、数多くの、本発明のヒト抗体、および抗体断片の方法および使用を提供する。全ての方法に関して、「ａ」および「ａｎ」という用語は、特に記載のない限り、記載される方法において、「少なくとも1つ」、「少なくとも第1」、「1つ以上」、または「複数」のステップを意味するように使用される。これは、治療方法における投与ステップに特に適切である。よって、異なる用量が本発明に利用されるだけでなく、異なる数の用量、例えば、注入は、最大複数注入まで使用することができ、それを含む。併用療法は、抗ＥｐＣＡＭ治療抗体の投与前、その投与後、またはその投与中に使用、投与され得る。
【０２２０】
重要な生物学的意味合いを有する、本発明の抗体または免疫抱合体の種々の有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法および使用を提供する。第1に、ＥｐＣＡＭを含む（またはＥｐＣＡＭを含むと思われる）組成物を、本発明の少なくとも第1の抗ＥｐＣＡＭ抗体、またはその抗原結合断片と効果的に接触させることを一般に含む、ＥｐＣＡＭに結合する方法、および使用を提供する。本発明の抗体、またはその免疫抱合体は、よって、結合アッセイに使用することができる。よって、適切に有用な結合アッセイは、免疫ブロット法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学法、蛍光活性化組織分類法（ＦＡＣＳ）、免疫沈降法、親和性クロマトグラフィー等の、当該分野において通常利用されるものを含む。
【０２２１】
ＥｐＣＡＭ／抗体複合体の形成を可能にし、そのように形成された複合体を検出するのに効果的な条件下で、ＥｐＣＡＭを含有すると思われる組成物を、本発明の少なくとも第1の抗体、または免疫抱合体、またはその抗原結合断片と接触させることを一般に含む、ＥｐＣＡＭを検出する方法、およびそれにおける使用を提供する。生物学的試料に関連して、例えば、腫瘍の診断、およびそれに基づく診断キットに使用され得る検出方法および使用も提供する。
【０２２２】
本発明の方法および使用は、特に、ＥｐＣＡＭに関連する任意の疾患もしくは状態、またはＥｐＣＡＭが生物学的役割、例えば、ＥｐＣＡＭの存在もしくは過剰発現、または例えば、ＥｐＣＡＭ活性の阻害が有利であるかもしれない、ＥｐＣＡＭの異常な活性に関連する疾患を有する、もしくはそれを発症する恐れのある動物および患者に使用することが意図される。好ましい例は、癌もしくは細胞癌、好ましくは、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、胆嚢癌、膵臓癌、肺癌、胃組織もしくは内臓（例えば、胃、食道）癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、皮膚新生物、頭頚部癌（膠腫）、唇癌、口癌、膣癌および子宮頸部癌から成る群より選択される1つ以上の癌もしくは細胞癌である。本明細書において、「腫瘍」への任意の言及は、「癌」または「細胞癌」も指す。原発腫瘍からの転移を減少させることができるため、転移性癌も治療することができる。特に、術後に患者に残った、いわゆる微小残存病変（ＭＲＤ）は、抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた免疫治療に適している。
【０２２３】
検出可能なレベル、好ましくは高度に検出可能なレベルのＥｐＣＡＭ発現を示す腫瘍を有する患者は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた治療に特に適切である可能性がある。加えて、非常に高レベルのＨｅｒ−2を発現しない、よって、ハーセプチン療法の理想的な候補ではない腫瘍を有する患者は、そのような抗ＥｐＣＡＭ療法に特に適している場合がある。腫瘍は、当該分野において周知の適切な方法により、発現レベルについて試験され得る。
【０２２４】
よって、本発明は、そのような疾患を有する動物、または患者に治療有効量の本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体、またはそのような抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原結合断片もしくは免疫抱合体を投与することを含む、上に定義される疾患を治療する方法、およびそれにおける使用をさらに提供する。
【０２２５】
本発明のまたさらなる態様は、治療法、撮像、および診断に使用するための組成物、または薬剤の製造における、本発明の抗体、またはそのような抗体の抗原結合断片もしくは免疫抱合体の使用を提供する。
【０２２６】
またさらなる態様は、療法、診断、または撮像において使用するための、本発明の抗体、またはそのような抗体の抗原結合断片もしくは免疫抱合体を提供する。
【０２２７】
加えて、本発明は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、緩衝剤、または安定剤を有する、本発明の抗体、またはそのような抗体の抗原結合断片もしくは免疫抱合体を含む組成物を提供する。
【０２２８】
本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法は、一般に、哺乳類において実行される。例えば、ヒト、および任意の家畜、飼育、または研究室動物の、任意の哺乳類を治療することが可能である。特定の例としては、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、およびサルが挙げられる。しかしながら、好ましくは、哺乳類はヒトである。
【０２２９】
よって、本明細書に使用される、「動物」または「患者」という用語は、例えば、ヒトおよび任意の家畜、飼育、または研究室動物の、任意の哺乳類を含む。特定の例としては、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、およびサルが挙げられる。しかしながら、好ましくは、動物または患者は、ヒト対象である。
【０２３０】
本発明は、非抱合型または裸抗体およびその断片を使用する抗癌方法、ならびに本発明の抗体またはその抗原結合断片が治療剤または診断剤に操作可能に結合される、免疫抱合体を使用する癌標的方法の双方を関連付ける。特に記載のない限り、または科学的用語により明確にされない限り、本明細書に使用される、「抗体およびその断片」という用語は、したがって、「非抱合型もしくは裸」抗体または断片を意味し、これは、別の製剤、特に治療剤または診断剤に結合されない。これらの定義は、単に例として、抗体の生物学的な半減期、親和性、または他の特性を改善するような修飾、または抗体と他のエフェクターとの組み合わせ等の、抗体の修飾を排除しない。
【０２３１】
本発明の抗癌治療方法および使用は、非抱合型もしくは裸抗体および免疫抱合体の双方の使用も包含する。免疫抱合体ベースの抗癌治療方法において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片は、好ましくは、第2の抗癌剤（抗ＥｐＣＡＭ抗体自体、第1の抗癌剤である）に操作可能に結合される。結合された抗癌剤は、直接的または間接的に抗癌作用を有するものであり得る。
【０２３２】
前述の治療方法および使用は、一般に、薬理学的に有効な組成物の動物または患者への、経皮的、筋肉内、静脈内注射等の全身的投与を含む。しかしながら、治療剤が腫瘍部位または複数の部位に局在化される、任意の投与形態が容認される。したがって、他の適切な送達経路は、経口、鼻腔、または呼吸および局所を含む。
【０２３３】
本明細書に使用される、「投与」とは、療法、例えば、抗腫瘍作用を及ぼすのに効果的な量および時間期間での、抗ＥｐＣＡＭ抗体療法の提供または送達を意味する。タンパク質様治療法の受動的投与は、ある程度、その単純性および再現性のため、一般に、好ましい。
【０２３４】
しかしながら、本明細書において、「投与」という用語は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体が腫瘍に送達されるか、または提供される任意の、および全ての手段を指すのに使用される。したがって、「投与」は、腫瘍への送達をもたらすの効果的な様式で、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体を産生する細胞の提供を含む。そのような実施形態において、選択的透過膜、構造、または埋め込み型デバイス、一般に、療法を中止するために除去できるものに、細胞を製剤化またはパッケージすることが望ましい。これは、用量を密接に監視し、制御することができる非侵襲性方法を意味するため、本発明の外来性抗ＥｐＣＡＭ抗体は、それでも一般に、好ましい。
【０２３５】
本発明の治療方法および使用は、腫瘍の近くでのそれらの発現、または腫瘍へのそれらの局在化をもたらすのに効果的な様式で、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体をコードする核酸の提供にも及ぶ。患者の細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ操作を含む、裸ＤＮＡ送達、組み換え遺伝子およびベクター、細胞ベースの送達等の、任意の遺伝子療法の技法を利用することができる。
【０２３６】
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、腫瘍に他の治療剤または診断剤を送達するために使用することもできる。そのような実施形態において、他の治療剤または診断剤は、一般に、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体に操作可能に結合される。
【０２３７】
本明細書に使用される、「療法」または「治療」という用語は、予防的療法を含み、これは、疾患の防止をもたらす場合がある。「療法」および「治療」という用語は、疾患との戦いまたはその治癒を含むが、疾患またはそれに関連する徴候のうちの1つ以上を制御する、減少させる、または軽減することも含む。本発明の抗体は、例えば、ＥｐＣＡＭレベルが変更される疾患における予測用途にも使用され得る。よって、本発明の抗体は、癌を予知するために使用することができる。
【０２３８】
本発明に使用される「治療有効量」とは、動物または患者に投与した時、腫瘍細胞の少なくとも一部を特異的に殺滅させる、腫瘍細胞の少なくとも一部においてアポトーシスを特異的に誘発する、腫瘍の少なくとも一部において壊死を特異的に誘発する、および／または腫瘍の退縮もしくは寛解を誘発するのに効果的な本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体、またはその免疫抱合体の量である。そのような作用は、好ましくは、正常で健康な組織において、細胞への結合をほとんど、もしくは全く示さない、またはそれをほとんど、もしくは全く殺滅せずに、かつ動物または患者の正常で健康な組織に無視できる、もしくは管理しやすい副作用を及ぼす一方で、達成される。
【０２３９】
殺滅もしくはアポトーシスの誘発、または腫瘍細胞の壊死の誘発、または腫瘍の退縮もしくは寛解の誘発に関して本明細書に使用される、「優先的に」および「特異的に」という用語は、よって、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその免疫抱合体が、実質的に腫瘍部位に限定され、実質的に動物または対象の正常で健康な組織において破壊および／または組織壊死をもたらすまでに及ばない腫瘍破壊および／または腫瘍壊死を達成するように機能することを意味する。したがって、健康な細胞および組織の構造および機能は、本発明の実践により実質的に損なわれないままである。
【０２４０】
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体または治療複合体は、好ましくは、1つ以上の放射線治療剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘発剤、抗チューブリン剤、抗細胞もしくは細胞障害剤、ステロイド、サイトカイン、ケモカイン、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、別の抗体（例えば、二重特異性抗体または二特異性抗体）、または血液凝固剤（凝固因子）に連結される。
【０２４１】
よって、本発明は、抗ＥｐＣＡＭ抗体が少なくとも他の1つの治療剤または診断剤に操作可能に結合される、種々の抱合された抗体およびその断片を提供する。「免疫抱合体」という用語は、抗体の別の効果的な製剤との操作会合を定義するように広範に使用され、単に任意の種類の操作会合を指すように意図されず、特に化学的「抱合」に限定されない。組み換え融合タンパク質は、特に想定される。送達薬剤または標的製剤が標的に結合することができ、治療剤または診断剤が送達時に十分に機能的であれば、結合様式は適切である。
【０２４２】
抗体上の炭水化物部分を介した製剤の結合も想定される。Ｏ連結型およびＮ連結型の双方のグリコシル化は、抗体に自然に生じる。組み換え抗体は、所望する場合、さらなるグリコシル化部位を再作製または作製するように修飾することができ、これは、単純に、適切なアミノ酸配列（ＸはＰｒｏではない、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ等）を抗体の一次配列中に操作することにより達成される。
【０２４３】
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体または治療抱合体で使用するための現在の好ましい製剤、ならびに関連する方法および使用は、抗体の作用を補足する、または強化するもの、および／または特定の腫瘍型もしくは患者について選択されるものである。「抗体の作用を補足する、または強化する治療剤」は、放射線治療剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘発剤、抗チューブリン剤、抗細胞もしくは細胞障害剤、ステロイド、凝固剤、サイトカイン、ケモカイン、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、別の抗体（例えば、二重特異性抗体または二特異性抗体）を含み、それらのうちの任意の1つ以上は、それと使用するのに好ましい。
【０２４４】
現在の好ましい抗血管新生剤は、アンジオスタチン、エンドスタチン、アンジオポエチン、バスキュロスタチン、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、およびマスピンのうちのいずれか1つを含む。
【０２４５】
本明細書に使用される、「抗チューブリン剤」とは、細胞有糸分裂を阻害する、好ましくは、細胞有糸分裂に必要なチューブリン活性、好ましくはチューブリン重合もしくは脱重合を直接的または間接的に阻害する、任意の製剤、薬物、プロドラッグ、またはそれらの組み合わせを意味する。現在の好ましい抗チューブリン剤は、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびコンブレスタチンのうちの1つ以上を含む。
【０２４６】
好ましい製剤の本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体との結合または会合により「免疫抱合体」を得、そのような免疫抱合体は、強化された、およびさらには相乗的な抗腫瘍特性を有することが多い。
【０２４７】
例えば、アウリスタチン、カリケアマイシンマイタンシノイド、またはアルキル化剤を用いた抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）も、本発明の使用に適切である。
【０２４８】
抗細胞もしくは細胞障害剤の使用は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体「免疫毒素」をもたらし、一方、凝固因子の使用は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体「コアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄｓ）」をもたらす。
【０２４９】
1つ以上の放射線治療剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘発剤、抗チューブリン剤、抗細胞もしくは細胞障害剤、ステロイド、サイトカイン、ケモカイン、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、別の抗体（例えば、二重特異性抗体または二特異性抗体）、および凝固因子の組み合わせ等の、少なくとも2つの治療剤の使用も想定される。
【０２５０】
特定の用途において、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体治療は、細胞の成長もしくは細胞分裂を殺滅する、または抑制する能力を有する細胞障害剤、細胞分裂阻害剤、または抗細胞剤に操作可能に結合される。適切な抗細胞剤は、化学療法剤、ならびに細胞毒および細胞分裂阻害剤を含む。細胞分裂阻害剤は、好ましくは、細胞が細胞サイクルを中止するように、一般に、標的細胞の自然な細胞サイクルを妨害するものである。
【０２５１】
例示的な化学療法剤としては、ステロイド等のホルモン、サイトカイン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、またはアミノプテリン等の抗代謝物、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ビンカアルカロイド、抗生物質、デメコルチン、エトポシド、ミトラマイシン、ならびにクロラムブシルおよびメルファラン等の抗腫瘍アルキル化剤等が挙げられる。特定の好ましい抗細胞剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン／アドリアマイシン等のＤＮＡ合成阻害剤である。概して、タキソール／パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、コンブレスタチン、およびドキソルビシン／アドリアマイシンは、現在の好ましい抗癌剤である。
【０２５２】
現在のサイトカインおよびケモカインの好ましい薬剤は、ＩＬ−2、ＩＬ−12、ＴＮＦ−α、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＬＥＣ（肝臓発現ケモカイン）である。現在、サリチリハラミド（ｓａｌｉｃｙｌｉｈａｌａｍｉｄｅ）、コンカナマイシン、またはバフィロマイシン等のＶ型ＡＴＰａｓｅ阻害剤も、プシンベリン、ぺデリン、イルシニアスタチンＡ等のタンパク質合成阻害剤であるため、好ましい。
【０２５３】
特定の治療用途において、毒素部分は、他の候補製剤と比較して、大半の毒素の細胞殺滅作用を送達する能力が非常に大きいため、好ましい。したがって、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体構築物における特定の好ましい抗細胞剤は、植物、真菌、または細菌由来の毒素である。例示的な毒素は、エピポドフィロトキシン、細菌外毒素もしくは細菌外毒素の脂質Ａ部分、サポリンもしくはゲロニン等のリボソーム不活性タンパク質、ａ−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、胎盤リボヌクレアーゼ等のリボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、およびシュードモナス外毒素を含む。現在の好ましい例は、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア、シュードモナス、および百日咳毒素である。
【０２５４】
特定の好ましい毒素は、リシンＡ鎖等のＡ鎖毒素である。最も好ましい毒素部分は、「脱グリコシル化Ａ鎖」（ｄｇＡ）と呼ばれる、炭水化物残基を修飾、または除去するように処理されたリシンＡ鎖であることが多い。脱グリコシル化リシンＡ鎖は、その極端な効力、長い半減期のため、およびそれを臨床グレードおよび規模に製造することが経済的に実現可能であるため、好ましい。組み換えおよび／または切断されたリシンＡ鎖も使用され得る。
【０２５５】
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体治療は、凝固、すなわち血液凝固を促進することが可能である成分を含んでもよい。ここで、標的抗体は、例えば、別の抗体を介して、直接的または間接的に凝固を刺激する因子に直接的または間接的に連結され得る。
【０２５６】
そのような使用に好ましい凝固因子は、ＶＩＩ因子を活性する能力が欠損している切断されたＴＦ（ｔＴＦ）、二量体、三量体、重量体／多量体ＴＦ、および変異ＴＦ等の組織因子（ＴＦ）ならびにＴＦ誘導体である。他の適切な凝固因子は、ＩＩ／ＩＩａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子、およびＸ／Ｘａ因子等のビタミンＫ依存性血液凝固薬、Ｇｌａ修飾を欠損するビタミンＫ依存性凝固因子、ラッセルクサリヘビ毒液Ｘ因子活性化因子、トロンボキサンＡ2およびトロンボキサンＡ2合成酵素等の血小板活性化化合物、ならびにα2−抗プラスミン等の線維素溶解阻害剤を含む。一般に、現在、切断された組織因子（ｔＴＦ）が好ましい。
【０２５７】
免疫抱合体および免疫毒素の調製は、一般に、当該分野において周知である（例えば、米国特許第4，340，535号を参照）。以下の特許のそれぞれは、免疫毒素生成、精製、および使用に関して、本教示をまたさらに補足する目的で、参照により本明細書にさらに組み込まれる：米国特許第6，004，554号、第5，855，866号、第5，965，132号、第5，776，427号、第5，863，538号、第5，660，827号、および第6，051，230号。
【０２５８】
種々の化学療法剤および他の薬理的製剤も本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体治療に適切に抱合され得る。抗体に抱合された例示的な抗悪性腫瘍剤は、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、およびビンブラスチンを含む。さらに、ネオカルチノスタチン、マクロマイシン、トレニモン、α−アマニチン等の他の製剤の結合が説明されている（例えば、米国特許第5，660，827号、第5，855，866号、および第5，965，132号を参照；それぞれ、本明細書に組み込まれる）。
【０２５９】
コアグリガンドの調製も容易に実践される。1つ以上の凝固因子の本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体との操作会合は、免疫毒素について上述されるもの等の、直接連結であり得る。代替的に、操作会合は、抗体が凝固因子に結合する第2の結合領域、好ましくは、抗体または抗体の抗原結合部位に操作可能に結合される等の、間接的結合であり得る。凝固因子は、その機能的凝固部位と異なる部位、特に共有結合連結が分子を結合するために使用される部位で、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体に結合されるべきである。
【０２６０】
二重特異性または三重特異性の抗体も、本発明の方法に利用することができる。そのような抗体において、1つのアームはＥｐＣＡＭに結合し、かつ、本発明の抗体である。二重特異性または三重特異性の抗体の他のアームにおける特異性の好ましい例のいくつかは、腫瘍血管新生を遮断するための、抗−ＣＤ3、−ＣＤ16、−ＣＤ28、−ＮＫＧ2Ｄ、ＮＫｐ30、ＮＫｐ44、ＮＫｐ46、または抗−ＶＥＧＦである。二重特性抗体を調製するための方法は、当該分野において周知であり、十分に説明されている。
【０２６１】
免疫抱合体、免疫毒素、およびコアグリガンドの調製において、組み換え発現を利用することができる。選択された本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体をコードする核酸配列、および治療剤、毒素または血液凝固剤を発現ベクターのフレーム内に結合する。よって、組み換え発現は、核酸の翻訳をもたらし、所望の免疫抱合体を得る。化学架橋剤およびアビジンビオチン架橋も、治療剤を本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体に結合する場合がある。
【０２６２】
本発明の組成物および方法は、他の治療学および診断学と併用して使用することができる。生物学的製剤、好ましくは、本発明に従う抗ＥｐＣＡＭ抗体と「組み合わせて」使用するための診断剤または治療剤に関して、「組み合わせて」という用語は、様々な実施形態を網羅するために簡潔に使用される。よって、「組み合わせて」という用語は、特に記載のない限り、または科学的用語により明確にされない限り、種々の形式の組み合わされた組成物、製薬、カクテル、キット、方法、ならびに第1および第2の薬剤使用に適用される。
【０２６３】
本発明「組み合わされた」実施形態は、よって、例えば、本発明の抗ＥｐＣＡＭが裸抗体であり、それに操作可能に結合されない製剤または治療剤と組み合わせて使用される場合を含む。そのような場合において、製剤または治療剤は、非標的または標的形態で使用され得る。「非標的形態」において、製剤、特に治療剤は、一般に、当該分野におけるそれらの標準的な使用に従い使用される。「標的形態」において、製剤は、一般に、製剤または治療剤を血管新生疾患部位または腫瘍に送達する、個別の抗体または標的領域に操作可能に結合される。診断剤および治療剤の双方のそのような標的形態の生物学的製剤の使用も、当該分野において極めて標準的である。
【０２６４】
本発明の他の「組み合わされた」実施形態において、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、抗体が、それ自身、製剤または治療剤と操作可能に会合する、または組み合わされる、免疫抱合体である。操作結合は、本明細書に記載され、また当該分野において公知である、直接的または間接的結合の全ての形態を含む。
【０２６５】
特に、治療剤と併用した本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体に関して、「組み合わされた」使用は、組み合わされた組成物、製薬、カクテル、キット、方法、ならびに第1および第2の薬剤使用も含み、治療剤はプロドラッグの形態である。そのような実施形態において、プロドラッグを薬物の機能的な形態に変換することができる活性化成分は、同様に、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体と操作可能に会合され得る。
【０２６６】
特定の好ましい実施形態において、治療組成物、組合物、製薬、カクテル、キット、方法、ならびに第1および第2の薬剤使用は、「プロドラッグ併用」である。当業者により理解されるように、「プロドラッグ併用」という用語は、特に記載のない限り、本発明の抗体がプロドラッグを活性薬物に変換することができる組成物に操作可能に結合されることを意味し、抗体がそのプロドラッグ自体に結合されることではない。しかしながら、本発明のプロドラッグ実施形態がプロドラッグ併用として使用される必要は要求されない。したがって、プロドラッグは、ＡＤＥＰＴおよび他の形態を含む、当該分野において使用される任意の様式で使用され得る。
【０２６７】
よって、組み合わされた組成物、製薬、カクテル、キット、方法、ならびに第1および第2の薬剤使用が記載される場合、好ましくは診断剤に関して、より好ましくは治療剤に関して、併用は、裸抗体および免疫抱合体である抗ＥｐＣＡＭ抗体を含み、いくつかの抱合型または非抱合型形態において、ある形態の抗体およびある形態の生物学的製剤、診断剤または治療剤の全体的な提供が達成される限り、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態の実践は、裸抗体または免疫抱合体、および生物学的製剤、診断剤、または治療剤の投与前、同時投与、または連続投与を含む。
【０２６８】
腫瘍に対する本発明の作用の前述および他の説明は、操作、結合される製剤の種類等の組み合わせ形式を簡潔に説明するためである。この説明的アプローチは、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の有益な特性の過小評価または過度の単純化のいずれかとして解釈されるべきではない。したがって、そのような抗体自体は抗腫瘍特性を有し、そのような抗体の免疫抱合体はそれらの特性を維持し、それらを結合された製剤の特性と組み合わせ、さらに抗体と任意の結合された製剤の組み合わされた作用は、通常強化される、および／または拡大されることを理解する。
【０２６９】
したがって、本発明は、任意に、少なくとも第1の組成物または容器に、治療有効量の少なくとも第1の本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体、またはそのような抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原結合断片もしくは免疫抱合体、ならびに治療有効量の少なくとも第2の生物学的製剤、成分、または系を含む、組成物、薬学的組成物、治療キット、および医薬カクテルを提供する。
【０２７０】
「少なくとも第2の生物学的製剤、成分、または系」とは、治療剤もしくは診断剤、または成分もしくは系であることが多いが、それである必要はない。例えば、少なくとも第2の生物学的製剤、成分、または系は、抗体を修飾する、および／または他の製剤を抗体に結合するための成分を含む場合がある。特定の好ましい第2の生物学的製剤、成分、または系は、プロドラッグ、またはプロドラックを作製し使用するための成分であり、プロドラッグ自体を作製するための成分、および本発明の抗体をそのようなプロドラッグまたはＡＤＥＰＴ実施形態において機能するように適応させるための成分を含む。
【０２７１】
治療剤または診断剤が少なくとも第2の生物学的製剤、成分、または系を含む場合、そのような治療剤および／または診断剤は、通常、癌の治療または診断に関連して使用するためのものである。
【０２７２】
よって、特定の実施形態において、「少なくとも第2の抗癌剤」は、治療キットまたはカクテルに含まれる。「少なくとも第2の抗癌剤」という用語は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体が第1の抗癌剤であることに関して選択される。本発明の抗体は、よって、化学療法剤、放射線治療剤、サイトカイン、抗血管新生剤、アポトーシス誘発剤、または抗癌免疫毒素もしくはコアグリガンドと組み合わされる場合があり、そのいくつかの例は、本明細書の別の箇所に記載される。
【０２７３】
他の例示的な抗癌剤は、例えば、ネオマイシン、ポドフィロトキシン、ＴＮＦ−α、αvβ3拮抗剤、カルシウムイオノフォア、カルシウム流動誘発剤、およびそれらの任意の誘導体またはプロドラッグを含む。現在の好ましい抗チューブリン剤は、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびコンブレスタチン、またはそれらの誘導体もしくはプロドラッグを含む。
【０２７４】
本発明の組成物、キット、および／または薬剤に関して、組み合わされた有効量の治療剤は、単一容器もしくは容器手段内に含まれるか、または個別の容器もしくは容器手段内に含まれ得る。カクテルは、一般に、混合使用のため、一緒に混合される。静脈内投与用に製剤化された製剤が好まれることが多い。撮像成分も含まれ得る。キットは、少なくとも第1の抗体、および含まれる1つ以上の他の生物学的製剤を使用するための説明書も含む。
【０２７５】
一般的に、少なくとも第2の抗癌剤（または任意の他の第2の製剤）は、単一薬学的組成物から、またはほぼ同時に投与される2つの薬学的組成物から等の、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体と実質的に同時に、動物または患者に投与され得る。
【０２７６】
代替的に、少なくとも第2の抗癌剤（または任意の他の第2の製剤）は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の投与と遂次的時間で、動物または患者に投与され得る。本明細書に使用される、「遂次的時間」とは、「時差的」を意味し、そのため、少なくとも第2の抗癌剤は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の投与と異なる時間で、動物または患者に投与される。一般に、2つの製剤は、2つの製剤がそれらのそれぞれの治療効果を発揮できるように、効果的に間隔をあけた時間で投与される、すなわち、これらは「生物学的に効果的な時間間隔」で投与される。少なくとも第2の抗癌剤（または他の第2の製剤）は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体前の生物学的に効果的な時間で、またはその治療剤後の生物学的に効果的な時間で、動物または患者に投与され得る。
【０２７７】
したがって、本発明は、腫瘍を有する動物または患者を治療するための方法を提供し、
（ａ）動物または患者を、実質的に腫瘍量を低減する第1の治療に曝すことと、
（ｂ）実質的に、少なくとも第1の本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体、その抗原結合断片、またはその免疫抱合体を投与することとを含み、任意に、抗体または断片は、第2の治療剤と操作可能に会合される。
【０２７８】
好ましい第1の治療は、外科的切除および化学療法介入を含む。
【０２７９】
特定の他の実施形態において、本発明の抗体および免疫抱合体は、1つ以上の診断剤、通常、癌の診断剤に関連して使用するための診断剤と組み合わされ得る。よって、様々な診断組成物、キット、および方法が本発明内に含まれる。
【０２８０】
またさらなる態様は、本明細書に定義される、適切な量の本発明の抗体または他のタンパク質を対象に投与することと、対象における本発明の抗体または他のタンパク質の存在、および／または量、および／または位置を検出することとを含む、対象の診断方法または撮像方法である。
【０２８１】
上述の使用および方法に従う撮像または診断に適切な疾患は、本明細書の別の箇所に記載される、任意の疾患、好ましくは任意の癌を含む。
【０２８２】
一実施形態において、本発明は、疾患、例えば、動物における癌を診断する方法を提供し、
（ａ）上記動物から採取した試験試料を本発明の抗体、またはその免疫抱合体と接触させるステップを含む。
【０２８３】
さらなる実施形態において、本発明は、疾患、例えば、動物における癌を診断する方法を提供し、
（ａ）      上記動物から採取した試験試料を本発明の抗体、またはその免疫抱合体と接触させるステップと、
（ｂ）試験試料における抗体−抗原複合体の存在、および／もしくは量、および／もしくは位置を測定する、または検出するステップと、任意に、
（ｃ）試験試料における抗体−抗原複合体の存在、および／または量を対照と比較するステップとを含む。
【０２８４】
上記の方法において、上記接触ステップは、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で実行される。適切な条件は、当業者により容易に判断され得る。
【０２８５】
上記の方法において、適切な試験試料、例えば、疾患に罹患したと思われる生検細胞、組織もしくは臓器、または組織学的切片が使用され得る。
【０２８６】
特定の上記方法において、試験試料における任意の量の抗体−抗原複合体の存在は、疾患の存在を示すだろう。好ましくは、陽性診断が行われるために、試験試料における抗体−抗原複合体の量は、適切な対照試料に認められる量より多い、または増加している、好ましくは有意に多い、または増加している。より好ましくは、有意に多いまたは増加したレベルは、統計的に有意であり、好ましくは＜0．05の確率値を有する。統計的有意性を決定する適切な方法は、当該分野において周知であり、十分に説明されており、それらのいずれかを使用することができる。
【０２８７】
適切な対照試料は、当業者により容易に選択され得、例えば、特定の疾患の診断の場合、適切な対照はその疾患を有さない対象からの試料である。適切な対照「値」も、例えば、当該分野において公知の正常な対象についての範囲を参照することにより、毎回の検査で、対照「試料」を行うことなく、容易に決定することができる。
【０２８８】
診断または撮像用途に使用するために、本発明の抗体は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ等の放射線不透過もしくは放射線同位元素、放射性放射体（例えば、α、β、またはγ放射体）、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン等の蛍光（フルオロフォア）または化学発光（発色団）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシターゼ、もしくは西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素、撮像剤、または金属イオン、または特定の同族の検出可能部分に結合することにより検出できるビオチン等の化学部分、例えば、標識されたアビジン／ストレプトアビジン等の検出可能なマーカーで標識され得る。標識を抗体または抗体断片等の結合タンパク質に結合する方法は、当該分野において周知である。そのような検出可能マーカーは、試験試料における結合タンパク質−抗原複合体の存在、量、または位置を検証することを可能にする。
【０２８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用に好ましい検出可能なマーカーは、ビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）、もしくは鉛（ＩＩ）等のＸ線検出可能化合物、銅67、ガリウム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビジウム103、テクネチウム99m、もしくはイットリウム90等の放射性イオン、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジウム（ＩＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、もしくはイッテルビウム（ＩＩＩ）等の核磁気スピン共鳴アイソトープ、またはローダミンもしくはフルオレセインを含む
本発明は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に産生する標識に結合される、本発明の抗体を含む診断剤または撮像剤も含む。適切な標識は、本発明の別の箇所に記載される。
【０２９０】
癌治療は、
（ａ）本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体に操作可能に結合された診断剤を含む、腫瘍を有する動物または患者に診断量の少なくとも第1の検出可能な標識された本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体を投与し、それによって、腫瘍の検出可能な画像を形成することにより、腫瘍の画像を形成することと、
（ｂ）      実質的に、同じ動物または患者に治療的に最適な量の少なくとも本発明の第1の裸抗ＥｐＣＡＭ抗体、またはそのような抗体を使用する治療剤−抗体構築物を投与し、それによって、抗腫瘍作用をもたらすことによっても行うことができる。
【０２９１】
本発明は、本発明の抗体、免疫抱合体、もしくは組成物のうちの1つ以上、または本発明の抗体をコードする核酸分子のうちの1つ以上、または本発明の核酸配位列を含む1つ以上の組み換え発現ベクター、または本発明の組み換え発現ベクターもしくは核酸配列を含む、1つ以上の宿主細胞またはウイルスを含むキットをさらに含む。好ましくは、上記キットは、本明細書に記載される方法および使用、例えば、本明細書に記載される治療方法、診断方法、または撮像方法に使用するためであるか、または本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは方法に使用するためである。そのようなキットの抗体は、好ましくは、本明細書の別の箇所に記載される抗体抱合体であってもよく、例えば、検出可能な部分に抱合されるか、または免疫抱合体であってもよい。好ましくは、上記キットは、例えば、診断における、キット成分の使用説明書を含む。好ましくは、上記キットは、本明細書の別の箇所に記載される疾患、例えば、癌を診断するため、または治療するためのものであり、任意に、そのような疾患を診断するための、または治療するためのキットの使用説明書を含む。
【０２９２】
本明細書に定義される本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ用途およびアッセイの分子ツールとしても使用することができる。抗体は抗原結合部位を有するため、これらは特定の結合対の構成要素として機能することができ、これらの分子は特定の結合対構成要素が必要とされる任意のアッセイにおいて使用することができる。
【０２９３】
よって、本発明のまたさらなる態様は、本明細書に定義される、本明細書の抗体を含む試薬、および例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイにおける分子ツールとしてのそのような抗体の使用を提供する。
【０２９４】
【表１−１】
2012529281.tif 000002
【０２９５】
【表１−２】
2012529281.tif 000003
【０２９６】
【表１−３】
2012529281.tif 000004
【０２９７】
【表１−４】
2012529281.tif 000005
【０２９８】
【表１−５】
2012529281.tif 000006
【０２９９】
【表１−６】
2012529281.tif 000007
【０３００】
【表２−１】
2012529281.tif 000008
【０３０１】
【表２−２】
2012529281.tif 000009
【０３０２】
【表３−１】
2012529281.tif 000010
【０３０３】
【表３−２】
2012529281.tif 000011
【０３０４】
【表３−３】
2012529281.tif 000012
【０３０５】
【表３−４】
2012529281.tif 000013
【０３０６】
【表３−５】
2012529281.tif 000014
【０３０７】
【表４−１】
2012529281.tif 000015
【０３０８】
【表４−２】
2012529281.tif 000016
【０３０９】
【表４−３】
2012529281.tif 000017
【０３１０】
【表５−１】
2012529281.tif 000018
【０３１１】
【表５−２】
2012529281.tif 000019
【０３１２】
【表５−３】
2012529281.tif 000020
【０３１３】
【表６−１】
2012529281.tif 000021
【０３１４】
【表６−２】
2012529281.tif 000022
【０３１５】
【表７】
2012529281.tif 000023
【実施例】
【０３１６】
本発明は、図を参照して、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。
【０３１７】
実施例1：新規抗体
癌治療として使用することができるさらなる腫瘍特異的抗体の必要性を考慮して、ＨＴ29等の結腸癌細胞株を特異的に認識するヒト抗体が識別された。抗体は、特異的にＥｐＣＡＭに結合することができる。抗体の単一鎖形態を、ｃ−ｍｙｃおよび6ｘＨｉｓタグエピトープを含有するｐＨＯＧ21プラスミドにクローン化した（図8）。ＴＧ1細菌を形質転換し、ＩＰＴＧ誘発によりｓｃＦｖを発現させた。精製されたｓｃＦｖの結合は、Ｅａｓｙｃｙｔｅフローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーにより確認された。
【０３１８】
配列決定
クローンを産生する抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列を配列決定した。抗体は、3−17Ｉ（ｓｃＦｖ）と表される。3−17Ｉ（ｓｃＦｖ）の軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を図1および表1に示す。3−17Ｉの軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域を表1に示す。
【０３１９】
この抗体のＩｇＧ形態も作製された。ＩｇＧ形態はＩｇＧ1イソ型であり、2本の重鎖と2本の軽鎖とを含む。各重鎖は、配列番号3のＶＨドメインおよびＩｇＧ1定常領域を含む。各軽鎖は、配列番号4のＶＬドメインおよびカッパ軽鎖定常領域を含む。抗体のＩｇＧ形態の成分は、Ｌａｒｓ  Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、ＪＩＭ  204（1997）77−87により発表されたベクターに基づき、本引用に記載される方法を使用して、ベクター中にクローン化された。ベクターは、標準的なＣＭＶプロモーターを含有する。ＩｇＧリーダー配列（ｍｇｗｓｃｉｉｌｆｌｖａｔａｔｇｖｈｓ）を各ベクターに導入した。ＶＨおよびＶＬドメインは、それぞれ、ＰＣＲにより導入されたＢｓｍＩおよびＢＳｉＷＩ部位中に、ヒトＩｇＧ1およびカッパ遺伝子のゲノムコピー（イントロン＋エクソン）を含有する別個のベクター中にクローン化された。ＩｇＧ1ベクターはハイグロマイシン耐性遺伝子を含有し、一方、カッパベクターはネオマイシン耐性遺伝子を含有する。ＨＥＫ293／Ｔ細胞を過渡的に形質移入し、5〜6日後、プロテインＡを介してＩｇＧを精製した後、サイズ排除により単量体のＩｇＧ画分を単離した。
【０３２０】
3−17Ｉ  ＩｇＧ抗体の完全な重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
【０３２１】
3−17Ｉ  ＩｇＧ重鎖（アミノ酸配列）（配列番号24）
【０３２２】
【化１】
2012529281.tif 000024
【０３２３】
3−17Ｉ  ＩｇＧ軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号25）
【０３２４】
【化２】
2012529281.tif 000025
【０３２５】
ＥｐＣＡＭに結合し、3−17Ｉと同一の重鎖配列であるが、異なる軽鎖配列を有する、12の関連する抗体も識別された。これらの関連する抗体のうちの5つ（7−Ｆ17、12−Ｃ15、16−Ｇ5、17−Ｃ20、および24−Ｇ6）の配列を表2〜6に提示する。
【０３２６】
実施例2：3−17Ｉ  ＩｇＧのＫａｔｏＩＩＩ細胞への結合
3−17Ｉ  ＩｇＧのＥｐＣＡＭ陽性細胞への結合を分析するために、フローサイトメトリー分析を実施した。陽性対照として、抗ＥｐＣＡＭキメラ（マウス可変／ヒト定常ドメイン）および、完全ヒト抗体であるＭＯＣ31およびＭＴ201を、それぞれ使用した。
【０３２７】
ＭＴ201  ＩｇＧおよびＭＯＣ31ＩｇＧ抗体の完全な重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。定常領域は太字イタリック体である。
【０３２８】
ＭＴ201  ＩｇＧ重鎖（アミノ酸配列）
【０３２９】
【化３】
2012529281.tif 000026
【０３３０】
ＭＴ201  ＩｇＧ軽鎖（アミノ酸配列）
【０３３１】
【化４】
2012529281.tif 000027
【０３３２】
これらの配列は、ＭＴ201のアミノ酸配位列から推定され、第ＷＯ98／46645号およびＲａｕｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（2001）50：141−150に示されるように、ＨＤ69とも称される。
【０３３３】
ＭＯＣ31  ＩｇＧ重鎖（アミノ酸配列）
【０３３４】
【化５】
2012529281.tif 000028
【０３３５】
ＭＯＣ31  ＩｇＧ軽鎖（アミノ酸配列）
【０３３６】
【化６】
2012529281.tif 000029
【０３３７】
これらの配列は、Ｂｅｉｂｏｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，296巻，  2000年2月25日発行，833−849ページに示されるように、ＭＯＣ31アミノ酸配列から推定された。
【０３３８】
抗緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）抗体を陰性の対照として使用した。フローサイトメトリー用に、ＫａｔｏＩＩＩ細胞（ＡＴＣＣ番号（胃癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−103））を標準的な条件下で成長させ、培養フラスコから採取し、ＰＢＳで2回洗浄し、0．2％のＢＳＡおよび0．09％のＮａＮ3を含むＰＢＳ中に再懸濁し、最後に、ウェル当り1×105細胞で、Ｖ字形の96ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分配した。細胞を400×ｇで5分間遠心分離した後、4℃で45分間、50μＬの各異なる抗体希釈（全ての希釈剤は0．2％のＢＳＡおよび0．09％のＮａＮ3を含むＰＢＳで作製された）とともにインキュベートした。0．2％のＢＳＡおよび0．09％のＮａＮ3を含むＰＢＳ中で洗浄した後、細胞を10μｇ／ｍＬのＲＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ，Ｄuｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、30分間、4℃で染色した。染色した細胞を洗浄し、0．2％のＢＳＡよび0．09％のＮａＮ3を含む200μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で分析するために、Ｕ字形96ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に移した。図2に示される結果は、抗体3−17ＩがＭＯＣ31と比較可能な親和性で、天然のＥｐＣＡＭ+ＫａｔｏＩＩＩ細胞株と特異的に相互作用することを明らかに実証する。逆に、抗体ＭＴ201は、ＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞への非常に弱い結合を実証した。
【０３３９】
実施例3：3−17Ｉ  ＩｇＧの結合特徴
3−17ＩのＥｐＣＡＭに結合する能力を決定するために、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、およびＢＩＡｃｏｒｅアッセイを実施した。
【０３４０】
ウェスタンブロット分析
抗体3−17Ｉ、ＭＴ201、およびＭＯＣ31のヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭへの結合特異性および交差反応性を分析するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロット分析を、還元条件および非還元条件下で実施した。全ての抗体はＩｇＧ形態であり、過渡的に形質移入されたＨＥＫ−293細胞において産生された。次いで、抗体をプロテインＡセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で精製した後、2つの連続して連結されたサイズ排除カラムのＳｕｐｅｒｄｅｘ  200およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  75上で分画した。得られたＩｇＧ調製物は、＞95％純度の単量体であるように思われた。組み換えヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭ抗原もＨＥＫ−293細胞において産生され、プロテインＡセファロースカラム上で、1ステップで精製された。抗原調製物の決定された純度は、90％を上回った。双方のＥｐＣＡＭ構築物は、ＩｇＧ1からのヒトＦｃ領域に融合したＥｐＣＡＭの細胞外ドメインから成る。
【０３４１】
ヒトＥｐＣＡＭ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＰ−002345から、カニクイザルはＣＳ611076から算出された。ヒトＥｐＣＡＭ／Ｆｃ融合物およびカニクイザルＥｐＣＡＭ／Ｆｃ融合物のアミノ酸配列を以下に示す。
【０３４２】
【化７】
2012529281.tif 000030
【０３４３】
【化８】
2012529281.tif 000031
【０３４４】
組み換えヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭ−Ｆｃ抗原の試料は、ＳＤＳ−ＰＡＡゲル（1μｇ／ウェル）上に充填される前に還元されたか、または非還元されたかのいずれかであった。試料を二組で行った。エレクトロブロット後、膜をＰＢＳ（遮断溶液）中の5％のスキムミルクパウダー（Ｍｅｒｃｋ  製品番号1．15363．0500）で1時間遮断した。次いで、膜を、遮断溶液中に希釈された1μｇ／ｍｌの濃度で、ＩｇＧｓ3−17Ｉ（図3Ａ）、ＭＴ201（図3Ｂ）、またはＭＯＣ31（図3Ｃ）とともにインキュベートした。膜結合ＩｇＧを検出するために、フィルタを遮断溶液に1：5000に希釈したヤギ抗ヒトカッパＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号2060−05）とともに1時間インキュベートした。
【０３４５】
全インキュベーションの間に、膜をＰＢＳ−Ｔ（0．05％のＴｗｅｅｎ−20で補充されたＰＢＳ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃09−9410−100）で3回、5分間洗浄した。全てのインキュベーションは、特に指定されない限り、1時間、室温で実施された。
【０３４６】
製造者の推奨に従い希釈されたＤＡＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃1856090）基質を使用して、ウェスタンブロットを展開した。
【０３４７】
対照において、ＳＤＳ−ＰＡＡゲルをクマシーインスタントブルー（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ＃ＩＳＢ01Ｌ）で染色し、ＥｐＣＡＭ変種の負荷量を検証した。膜への良好な移動は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抱合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号2040−05）を伴う膜上でのＥｐＣＡＭ−Ｆｃの検出およびＤＡＢ染色（データ示さず）により検証された。ＥｐＣＡＭ−Ｆｃの予測されたサイズは、非還元、および還元条件下で、それぞれ約110ｋＤａおよび55ｋＤａであった。
【０３４８】
ウェスタンブロット分析は、抗体3−17Ｉが、非還元条件下で、ヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭの双方に等しく良好に結合したことを実証した。逆に、3−17Ｉ  ＩｇＧの還元された任意のＥｐＣＡＭ抗原への結合は観察されなかった。抗体ＭＯＣ31は、異なる抗原結合パターンを実証した。3−17Ｉ  ＩｇＧと異なり、非還元および還元条件下の双方で、ヒトＥｐＣＡＭに結合した。カニクイザルの抗原でも確認されたが、非還元条件下のみであった。加えて、カニクイザルの抗原染色の弱いバンド強度は、ヒト抗原よりカニクイザルＥｐＣＡＭへの結合が弱いことを示した。抗体ＭＴ201  ＩｇＧは、非還元条件下で、ヒトＥｐＣＡＭに結合したことを実証したのみであった。本抗体のカニクイザル抗原への結合は検出されなかった。
【０３４９】
これらの結果は、ＭＯＣ31およびＭＴ201の双方が、ヒトＥｐＣＡＭ上で3−17Ｉと異なるエピトープに結合することを示す。この痕跡は、3−17ＩおよびＭＯＣ−31と比較した時に、特に強い。
【０３５０】
ＥＬＩＳＡおよび交差反応性
3−17Ｉ、ＭＴ201、およびＭＯＣ31のヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭへの特異性および親和性を決定するために、一連のＥＬＩＳＡ実験を実施した。ＩｇＧ1形式の全ての抗体、ならびにヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭ抗原を、前述に示すように産生し、精製した（実施例1および実施例2、ならびに実施例3の始めを参照）。
【０３５１】
抗体クローン12−Ｃ15  ＩｇＧ、16−Ｇ5  ＩｇＧ、および17−Ｃ20  ＩｇＧのヒトＥｐＣＡＭに対する特異性をＥＬＩＳＡ実験において決定した。ヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭに対する、ｓｃＦｖ形式の抗体クローン7−Ｆ17、17−Ｃ20、および24−Ｇ6の特異性および親和性は、ＥＬＩＳＡ実験において決定された。
【０３５２】
ＩｇＧ形式の抗体のＥＬＩＳＡにおいて、ＭＡＸＩ−ｓｏｒｂプレートを、4℃で一晩、ＰＢＳ中で、1μｇ／ｍｌ（ウェル当り100μｌ）のヒトもしくはカニクイザルのＥｐＣＡＭ−Ｆｃでコーティングした。プレートを2時間、3％のＢＳＡを含むＰＢＳで遮断した。試験されたＩｇＧは、133ｎＭ〜32ｆＭの2倍希釈で添加され、1時間、室温でインキュベートされた。結合ＩｇＧの検出のため、ヤギ抗ヒトカッパＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ2060−05）を遮断溶液に1：5000希釈で添加し、1時間、室温でインキュベートした。
【０３５３】
ｓｃＦｖ形式の抗体のＥＬＩＳＡにおいて、ＭＡＸＩ−ｓｏｒｂプレートを、4℃で一晩、ＰＢＳ中で、5μｇ／ｍｌ（ウェル当り100μｌ）のヒトもしくはカニクイザルのＥｐＣＡＭ−Ｆｃでコーティングした。プレートを2時間、ＰＢＳ中4％のスキムミルク（Ｍｅｒｃｋ  製品番号1．15363．0500）で遮断した。試験されたｓｃＦｖは、667ｎＭ〜3．2ｎＭの2倍希釈で添加され、1時間、室温で、0．125μｇのマウス抗ｃＭｙｃ  ＩｇＧ（クローン9Ｅ10  Ｄｉａｔｅｃ）とともにインキュベートされた。結合ｓｃＦｖの検出のため、ウサギ抗マウス−ＨＲＰ抗体（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｐ0260）を遮断溶液に1：3000希釈で添加し、1時間、室温でインキュベートした。
【０３５４】
全てのインキュベーション間で、プレートをＰＢＳ−Ｔ（0．05％のＴｗｅｅｎ−20、Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃09−9410−100）で3回洗浄した。全てのインキュベーションは、特に指定されない限り、1時間、室温で実施された。
【０３５５】
ＩｇＧ形式の抗体のＥＬＩＳＡは、1−ステップＡＢＴＳキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｒｏｄ＃37615）、および25分のインキュベーション時間を使用して展開された。吸光度は、ＳＬＴ  ＳＰＥＣＴＲＡプレートリーダー上で測定された。ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、回収されたＥＬＩＳＡデータ上の1現場モデルの非線形適合を使用して親和性を推定するために使用された。
【０３５６】
ｓｃＦｖ形式の抗体のＥＬＩＳＡは、ＴＭＢ基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｐｒｏｄ＃34021）および10分のインキュベーション時間を使用して展開された。Ｈ2ＳＯ4を添加することにより反応を停止させた。吸光度は、ＳＬＴ  ＳＰＥＣＴＲＡプレートリーダー上で測定された。ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、回収されたＥＬＩＳＡデータ上の1現場モデルの非線形適合を使用して親和性を推定するために使用された。
【０３５７】
結論：
ＥＬＩＳＡデータは、3−17Ｉ  ＩｇＧのヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭの双方への同等に良好な結合を実証した（図4Ａ）。逆に、ＭＯＣ31抗体は、ヒトおよびカニクイザルの抗原に対して、顕著に異なる結合パターンを示し（図4Ｃ）、よって、カニクイザルＥｐＣＡＭに対して非常に低い親和性を示した。興味深いことに、抗体ＭＴ201は、ヒトＥｐＣＡＭに対して比較的弱い結合のみを示し、この抗体のカニクイザル抗原への結合は、検出されなかった（図4Ｂ）。
【０３５８】
抗体クローン12−Ｃ15、16−Ｇ5、および17−Ｃ20のＩｇＧ形式も、ヒトＥｐＣＡＭに結合した（図9）。抗体クローン7−Ｆ17、17−Ｃ20、および24−Ｇ6のｓｃＦｖ形式は、ヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭに結合し、ヒトおよびカニクイザルの双方のＥｐＣＡＭに対するｓｃＦｖ形式の3−17Ｉの親和性と比較可能であった、ヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭの双方に対する親和性を示した（図10Ａおよび図10Ｂ）。
【０３５９】
親和性
3−17ＩのヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭへの結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ100（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して分析された。ヒトＦｃ（ＩｇＧ1）に融合したヒトまたはカニクイザルのＥｐＣＡＭの細胞外ドメインは、100ＲＵの密度で、ＣＭ5チップ（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に結合された。流速50μｌ／分、37℃で、標準的な技法を使用して、ＳＰＲ試験を実施した。データは、ＢＩＡｃｏｒｅソフトウェアの1：1ラングミュア結合モデルを使用して分析された。
【０３６０】
動態分析からの結果は、3−17Ｉ  ＩｇＧがほぼ同じオン率（ｋon）およびオフ率（ｋoff）値で、ヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭに結合し、よって、1ｎＭに近い平衡定数（ＫD）を提供することを実証した（図5Ａおよび図5Ｂならびに表8を参照）。
【０３６１】
【表８】
2012529281.tif 000032
【０３６２】
よって、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定されるように、ヒトおよびサルの双方のＥｐＣＡＭへの結合に対する本発明の3−17Ｉ  ＩｇＧ抗体の結合親和性は、約1ｎＭである。ＢＩＡｃｏｒｅにより測定されるように、ヒトＥｐＣＡＭに対するＭＯＣ31  ＩｇＧの結合親和性は、類似する、すなわち、ＫD＝3ｎＭであるように、当該分野において説明される（Ｒｏｏｖｅｒｓら，1998，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，78：1407−1416）。しかしながら、上のＥＬＩＳＡデータに見られるように、サルＥｐＣＡＭに対するＭＯＣ31ＩｇＧの結合親和性は、3−17Ｉより非常に低い。ＢＩＡｃｏｒｅにより測定されるように、ヒトＥｐＣＡＭに対するＭＴ201  ＩｇＧの結合親和性は、非常に低い、すなわち、ＫD＝175ｎＭであるように、当該分野において説明される（Ｎａｕｎｄｏｒｆら，2002，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，100：101−110）。
【０３６３】
実施例4：3−17Ｉ  ＩｇＧはＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する
3−17Ｉ  ＩｇＧのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを介して標的細胞死滅を媒介する能力を決定するために、機能アッセイを実施した。これらの試験からの結果は、3−17Ｉ  ＩｇＧがＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介することを示す。加えて、これらのデータは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの双方の誘発において、ＭＴ201  ＩｇＧに対する3−17Ｉ  ＩｇＧの優位性を明らかに示す。
【０３６４】
ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）
3−17Ｉ  ＩｇＧのＡＤＣＣを誘発する能力は、ＥｐＣＡＭの面密度において100倍を超える様々な相違を網羅する、3つの異なる乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−231、ＭＤＡ−453、およびＢＴ−474を使用して分析された（Ｐｒａｎｇら、2005）。これら全ての細胞株上でＡＤＣＣを誘発することがＰｒａｎｇらによって報告されたため、ＭＴ201  ＩｇＧが陽性対照抗体として使用された。ＭＤＡ−ＭＢ−453（乳房乳腺、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−131）、ＭＤＡ−ＭＢ−231（乳房乳腺、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−26）、およびＢＴ−474（乳房乳腺、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−20）細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。
【０３６５】
ＭＤＡ−ＭＢ−453およびＢＴ−474細胞はＲＰＭＩ−1640培養培地で維持され、ＭＤＡ−ＭＢ−231細胞は、ライボビッツ培養培地で維持された。全ての培地は、10％のウシ対胎仔血清  （ＦＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンで補充された。全ての細胞培地および補充物は、ＰＡＡ（Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）から得た。標準条件下で培養された標的細胞は、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡにより採取され、遠心分離により沈降され、ＲＰＭＩ−1640培養培地に2回再懸濁された。2．5×106細胞を含有する1ｍｌをカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて10μＭの最終濃度に混合した後、垂直回転ホイール上（7ｒｐｍ）で、37℃で30分間インキュベートした。細胞を10％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−1640で3回洗浄し、細胞密度を1ｍｌ当り3ｘ105に調節した。
【０３６６】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離により、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なボランティア1人の血液から調製した。単離したＰＢＭＣを10％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−1640で洗浄し、1ｍｌ当り6×106細胞で再懸濁した。50μｌの各標的細胞懸濁液およびエフェクター細胞懸濁液を96−ウェルマイクロタイタープレートの同じウェルに添加して、20：1のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）細胞（Ｅ：Ｔ）の割合にする。
【０３６７】
抗体希釈は、各濃度において四組で20μｌの容量で添加された。ついで、マイクロタイタープレートを37℃で4時間インキュベートし、3時間45分後に20μｌの0．9％のＴｒｉｔｏｎＸ−100をウェルのいくつかに添加し、標的細胞の完全な溶解を達成した。次いで、各試料の100μｌの上澄みを黒色のマイクロタイタープレートに移動し、蛍光（励起：488ｎｍ、発光：518ｎｍ）をＴＥＣＡＮ  Ｍ200プレートリーダーで分析した。抗体を含まない試料の蛍光強度を、他の全ての試料の強度から引いた。抗体を含む試料の溶解のパーセントは、トリトンＸ−100で処理した後、100％の細胞溶解の試料の蛍光強度に基づき推定された。用量反応曲線は、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の3パラメータ適合モデルを使用して、非線形回帰分析により作製された。
【０３６８】
図6Ａ、6Ｂ、および6Ｃに示される結果は、3−17Ｉ  ＩｇＧが、ヒトＰＢＭＣの存在下で、3つ全ての細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−453（図6Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−231（図6Ｂ）、およびＢＴ−474（図6Ｃ）においてＡＤＣＣを誘発したことを明らかに実証する。ＥＣ50値は、これらの細胞株において、それぞれ、0．08ｎｇ／ｍｌ、15ｎｇ／ｍｌ、および0．12ｎｇ／ｍｌであると推定された。達成された最大殺滅は、それぞれ、75％、92％、および61％であった。対照の抗体ＭＴ201は、非常に劣るＡＤＣＣ活性を実証し、ＭＤＡ−ＭＢ−453およびＢＴ−474細胞株おいて、それぞれ、7ｎｇ／ｍｌおよび382ｎｇ／ｍｌのＥＣ50値、ならびに56％および33％の最大殺滅であった。最も低いＥｐＣＡＭ発現レベルのＭＤＡ−ＭＢ−231細胞の殺滅は、抗体ＭＴ201において観察されなかった。これらのデータは、ＡＤＣＣの誘発において、ＭＴ201  ＩｇＧに対する3−17Ｉ  ＩｇＧの優位性を明らかに示す。
【０３６９】
ＣＤＣ（補体依存性細胞障害）
3−17Ｉ  ＩｇＧの補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を誘発する能力は、2つの細胞株ＫＡＴＯ  ＩＩＩおよびＭＴ−3を使用して分析された。3つの関連する抗体クローン12−Ｃ15  ＩｇＧ、16−Ｇ5  ＩｇＧ、および17−Ｃ20  ＩｇＧも、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞株を使用して、ＣＤＣを誘発するそれらの能力について試験された。ＭＴ201  ＩｇＧは、これらの細胞株上でＣＤＣを誘発することがＰｒａｎｇら（2005）によって報告されたため、陽性対照抗体として使用された。ＫＡＴＯ  ＩＩＩ（胃癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−103）およびＭＴ−3（乳癌、ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ403）細胞株は、それぞれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ＫＡＴＯ  ＩＩＩおよびＭＴ−3細胞は、それぞれ、20％および10％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−1640培養培地で維持された。全ての培地をペニシリンおよびストレプトマイシンで補充した。全ての細胞培地および補充物は、ＰＡＡ（Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）から得た。
【０３７０】
標準条件下で培養された標的細胞は、遠心分離により沈降され、ＲＰＭＩ−1640培養培地に2回再懸濁された。12．5×106細胞を含有する5ｍｌをカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と混合し、10μＭの最終濃度にした後、垂直回転ホイール上（7ｒｐｍ）で、37℃で30分間インキュベートした。細胞を10％の熱不活性ウシ胎仔血清（ｈｉＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−1640で3回洗浄し、細胞密度を4ｘ106／ｍｌに調節した。25μｌの標的細胞の懸濁液を、10％のｈｉＦＣＳを含むＲＰＭＩ−1640中の25μｌのヒト血清および50μｌの抗体希釈液と混合した。3−17Ｉ  ＩｇＧ抗体を使用する実験において、ウェルの最終抗体濃度は、0．8ｎｇ／ｍｌ〜50μｇ／ｍｌの範囲であった。抗体クローン12−Ｃ15  ＩｇＧ、16−Ｇ5  ＩｇＧ、および17−Ｃ20  ＩｇＧを使用する実験において、ウェルの最終抗体濃度は、0．19μｇ／ｍｌ〜1．5μｇ／ｍｌの範囲であった。四組でアッセイを実施した。20μｌの0．9％のトリトンＸ−100をいくつかのウェルに添加して、標的細胞の完全な溶解を達成し、次いで、プレートを37℃で1時間インキュベートした。10％のｈｉＦＣＳを含む100μｌのＲＰＭＩ−1640をウェルに添加し、容量を増加させ、次いで、細胞を遠心分離により沈殿させた。100μｌの上澄みを黒色のマイクロタイタープレートに移し、蛍光（励起：488ｎｍ、発光：518ｎｍ）を、ＴＥＣＡＮ  Ｍ200プレートリーダーを使用して分析した。抗体を含まない試料の蛍光強度を、他の全ての試料の強度から引いた。抗体を含む試料の溶解のパーセントは、トリトンＸ−100で処理した後、100％の細胞溶解の試料の蛍光強度に基づき推定された。用量反応曲線は、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の3パラメータ適合モデルを使用して、非線形回帰分析により作成された。
【０３７１】
図7Ａおよび図7Ｂに示される結果は、3−17Ｉ  ＩｇＧが、ヒト血清の存在下、細胞株ＫＡＴＯ  ＩＩＩ（図7Ａ）およびＭＴ−3（図7Ｂ）においてＣＤＣを誘発したことを明らかに実証する。ＣＤＣ活性は、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞株の抗体クローン12−Ｃ15  ＩｇＧ、16−Ｇ5  ＩｇＧ、および17−Ｃ20  ＩｇＧにおいても実証された。
【０３７２】
双方の抗体3−17Ｉ  ＩｇＧおよびＭＴ201は、補体によって標的細胞の100％溶解を誘発することができたが、殺滅作用は、顕著に異なる抗体濃度で達成された。3−17Ｉ  ＩｇＧのＥＣ50値は、ＫＡＴＯ  ＩＩＩおよびＭＴ−3において、それぞれ0．28ｎｇ／ｍｌおよび0．38ｎｇ／ｍｌであると推定されたが、対照抗体のＭＴ201は、250倍高い濃度でのＣＤＣを示し、同じ2つの細胞株において、それぞれ、76ｎｇ／ｍｌおよび89ｎｇ／ｍｌのＥＣ50値であった。これらのデータは、ＣＤＣの誘発において、ＭＴ201  ＩｇＧに対する3−17Ｉ  ＩｇＧの優位性を明らかに示す。
【０３７３】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されるものに対して補助的な例示的手順または他の詳細を提供する限り、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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【配列表フリーテキスト】
【０３７４】
配列番号１９：リンカー
配列番号３７：
コンセンサス配列
Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい
Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号３８：
コンセンサス配列
Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい
Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号８９：
コンセンサス配列
Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい
Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい
Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい
Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号９０：
コンセンサス配列
XaaはGlnまたはHisまたはLysであってよい
XaaはAsnまたはAspであってよい
XaaはGlyまたはThrまたはSerまたはmetまたはAlaであってよい
XaaはPheまたはTrpまたはTyrであってよい
配列番号９２：MT201  IgG軽鎖
配列番号９３：MOC31  IgG重鎖
配列番号９４：MOC31  IgG軽鎖
配列番号９５：ヒト  EpCAM/Fc 融合物
配列番号９６：カニクイザル  EpCAM/Fc 融合物
配列番号９７：制限部位を有する scFV 3-17I
【図１】
2012529281.tif 000033
【図２】
2012529281.tif 000034
【図３Ａ】
2012529281.tif 000035
【図３Ｂ】
2012529281.tif 000036
【図３Ｃ】
2012529281.tif 000037
【図４Ａ】
2012529281.tif 000038
【図４Ｂ】
2012529281.tif 000039
【図４Ｃ】
2012529281.tif 000040
【図５Ａ】
2012529281.tif 000041
【図５Ｂ】
2012529281.tif 000042
【図６Ａ】
2012529281.tif 000043
【図６Ｂ】
2012529281.tif 000044
【図６Ｃ】
2012529281.tif 000045
【図７Ａ】
2012529281.tif 000046
【図７Ｂ】
2012529281.tif 000047
【図８】
2012529281.tif 000048
【図９】
2012529281.tif 000049
【図１０Ａ】
2012529281.tif 000050
【図１０Ｂ】
2012529281.tif 000051
【配列表】
2012529281000001.app
【国際調査報告】
2012529281.tif 000052
2012529281.tif 000053
2012529281.tif 000054
2012529281.tif 000055