(57)【要約】本発明は一般に、新規ポリマー(SMAMP)ならびにそれらの合成および使用に関する。ポリマーはAMPの有望な性質を示す。特に、例えば、最小数のノルボルネン系構成要素を使用し、かつ/または、モノマー単位中のおよび/もしくはポリマー骨格に沿った疎水基および親水基の容易で独立した変動を可能にすることで、ポリマーの望ましい性質を微調節および選択する、SMAMPの合成を可能にする開環メタセシス重合(ROMP)プラットフォームが開発された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有するモノマー単位:
2012529557.tif 000113
式中、R1およびR2の一方は疎水基を含み、R1およびR2の他の一方は親水基を含み、かつXはC-R3、OまたはSであり、R3が水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基である。
【請求項２】
疎水基が置換または非置換アルキル基を含む、請求項1記載のモノマー。
【請求項３】
疎水基が置換または非置換C1〜C10アルキル基である、請求項2記載のモノマー。
【請求項４】
親水基がカチオン性である、請求項1記載のモノマー。
【請求項５】
親水基がアンモニウムイオン、スルホニウムイオン、グアニジウムイオン、ホスホニウムイオンならびにモノアルキルおよびジアルキル置換アミノ基より選択される基を含む、請求項1記載のモノマー。
【請求項６】
親水基がグアニジウムイオンである、請求項5記載のモノマー。
【請求項７】
XがOであり、R1が直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基であり、R2が
2012529557.tif 000114
またはグアニジウムイオンであり、pが1〜10の整数である、請求項1記載のモノマー。
【請求項８】
(I)中の両方の-C(=O)O-基がエキソ立体位置を占める、請求項1記載のモノマー。
【請求項９】
R1が直鎖状または分岐状C1〜C6アルキル基であり、pが1〜5の整数である、請求項7記載のモノマー。
【請求項１０】
XがC-R3であり、R1が直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基であり、R2が
2012529557.tif 000115
またはグアニジウムイオンであり、pが1〜10の整数である、請求項1記載のモノマー。
【請求項１１】
R3が水素である、請求項10記載のモノマー。
【請求項１２】
以下の構造を有するモノマー単位を含むポリマー:
2012529557.tif 000116
式中、R1およびR2の一方は疎水基を含み、R1およびR2の他の一方は親水基を含み、XはC-R3、OまたはSであり、R3は水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基である。
【請求項１３】
疎水基が置換または非置換アルキル基を含む、請求項12記載のポリマー。
【請求項１４】
疎水基が置換または非置換C1〜C10アルキル基である、請求項13記載のポリマー。
【請求項１５】
親水基がカチオン性である、請求項12記載のポリマー。
【請求項１６】
親水基がアンモニウムイオン、スルホニウムイオン、グアニジウムイオン、ホスホニウムイオンならびにモノアルキルおよびジアルキル置換アミノ基より選択される基を含む、請求項12記載のポリマー。
【請求項１７】
親水基がグアニジウムイオンである、請求項12記載のポリマー。
【請求項１８】
XがOであり、R1が直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基であり、R2が
2012529557.tif 000117
またはグアニジウムイオンであり、pが1〜10の整数である、請求項12記載のポリマー。
【請求項１９】
(II)中の両方の-C(=O)O-基がエキソ立体位置を占める、請求項12記載のポリマー。
【請求項２０】
R1が直鎖状または分岐状C1〜C6アルキル基であり、pが1〜5の整数である、請求項18記載のポリマー。
【請求項２１】
XがC-R3であり、R1が直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基であり、R2が
2012529557.tif 000118
またはグアニジウムイオンであり、pが1〜10の整数である、請求項12記載のポリマー。
【請求項２２】
R3が水素である、請求項21記載のポリマー。
【請求項２３】
nが約1〜約1,000の整数である、請求項12記載のポリマー。
【請求項２４】
nが約1〜約20の整数である、請求項23記載のポリマー。
【請求項２５】
nが約1〜約10の整数である、請求項23記載のポリマー。
【請求項２６】
共重合体である、請求項12記載のポリマー。
【請求項２７】
以下の構造モノマー単位を含む、請求項26記載の共重合体:
2012529557.tif 000119
式中、
X'およびX''の各々はC-R3、OまたはSであって、R3が水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基であり、
R1'およびR1''の各々は疎水基であり、R2'およびR2''の各々は親水基であり、但し、R1'およびR1''は同一ではなく、R2'およびR2''は同一であり、あるいはX'およびX''は同一ではなく、かつ
mおよびnの各々は約1〜約1,000の整数である。
【請求項２８】
mおよびnの各々が約1〜約20の整数である、請求項27記載のポリマー。
【請求項２９】
mおよびnの各々が約1〜約10の整数である、請求項27記載のポリマー。
【請求項３０】
親水基がカチオン性である、請求項27記載のポリマー。
【請求項３１】
親水基がアンモニウムイオン、スルホニウムイオン、グアニジウムイオン、ホスホニウムイオンならびにモノアルキルおよびジアルキル置換アミノ基より選択される基を含む、請求項27記載のポリマー。
【請求項３２】
親水基がグアニジウムイオンである、請求項27記載のポリマー。
【請求項３３】
(III)および(IV)中のすべての-C(=O)O-基がエキソ立体位置を占める、請求項27記載のポリマー。
【請求項３４】
R1'およびR1''の各々が独立して直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基であり;
R2'およびR2''の各々が独立して
2012529557.tif 000120
またはグアニジウムイオンであり、pが1〜10の整数である、
請求項27記載の共重合体。
【請求項３５】
X'およびX''の各々がOである、請求項34記載の共重合体。
【請求項３６】
X'およびX''の各々が独立してC-R3である、請求項34記載の共重合体。
【請求項３７】
X'およびX''の一方がOであり、他方がC-R3である、請求項34記載の共重合体。
【請求項３８】
R1'およびR1''の各々が独立して直鎖状または分岐状C1〜C6アルキル基である、請求項34記載の共重合体。
【請求項３９】
pが1〜5の整数である、請求項34記載の共重合体。
【請求項４０】
開環メタセシス重合によって調製されるポリマーであって、モノマー構造単位内で疎水基および親水基がポリマー骨格に隣接原子において結合するようにポリマー骨格に結合している疎水基および親水基を含むポリマー。
【請求項４１】
疎水基および親水基がエステル結合を経由してポリマー骨格に結合している、請求項40記載のポリマー。
【請求項４２】
疎水基が直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基を含み;
親水基が-NH3+基を含む、
請求項40記載のポリマー。
【請求項４３】
親水基が
2012529557.tif 000121
またはグアニジウムイオンを含み、pが1〜10の整数である、請求項42記載のポリマー。
【請求項４４】
共重合体である、請求項40記載のポリマー。
【請求項４５】
請求項12〜44のいずれか記載のポリマーを含む生成物。
【請求項４６】
請求項12〜44のいずれか記載のポリマーを開環メタセシス重合によって調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規抗菌ポリマーに関する。より詳細には、本発明は、抗菌ペプチドの合成模倣物である抗菌ポリマー、ならびに関連するその調製方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
天然抗菌ペプチド(AMP)は、生物が細菌性病原体による攻撃を受ける際の最初の防御線の一つである。これらの宿主防御ペプチドは広範な抗菌活性を示した(Brodgen, Nature Rev. Microbiol. 2005, 3, 238-250)。生物中でのAMPの産生は特定の抗体のそれよりもはるかに速やかであることから、AMPは先天免疫の重要な成分である。AMPは、ヒト、動物、植物および無脊椎動物を含む多くの種において見られる。特定の細胞構造を標的化する一般的な抗生物質とは異なって、AMPは、細菌の膜に対する直接作用を多くの場合で含む非受容体相互作用を使用する(Yang, et al, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 12141)。宿主生物の細胞は比較的影響されない。したがって、AMPは宿主生物内の細菌を選択的に攻撃することができる。AMPが細菌の膜化学構造全体または他の標的を変化させる場合にのみ、細菌はAMPに対して免疫性になる可能性があり、したがって、AMPに対する耐性獲得は他の抗生物質に比べて遅くなる(Zasloff, Nature 2002, 415, 389-395)。この有望な特徴が理由で、抗菌ペプチドの合成模倣物(SMAMP)に対する関心が高まっている。これらは、α-およびβ-アミノ酸、ペプトイド、芳香族オリゴマーならびに合成ポリマーでできているSMAMPを含む。
2012529557.tif 000002
【０００３】
大部分のAMPの1つの共通の特徴は、それらの正電荷および面両親媒性である。二次構造に関係なく、これらのペプチドはそれらの骨格に沿って一般に1つの疎水性面および1つの親水性面を示す(Brodgen, Nature Rev. Microbiol. 2005, 3, 238-250; Boman, Immunol. Rev. 2000, 173, 5; Hancock, et al., Trends Biotech. 1998, 16, 82)。親水性部分における正電荷が理由で、AMPは、タンパク質およびDNAを含む細菌性病原体または他のアニオン性標的のアニオン性外膜に優先的に結合する(Zasloff, Nature 2002, 415, 389-395; Yeaman, et al., Pharmacol. Rev. 2003, 55, 27)。多くの場合、それらの面両親媒性は、それらを細菌膜に挿入すること、および膜貫通孔が形成されるように膜の脂質機構をそれらが局所的に変化させることを可能にするが、他の作用機序も知られている。この相互作用は膜電位の崩壊、細胞質の漏出、および最終的には病原体細胞の死を導きうる(Yount, et al., Biopolymers (Peptide Sci.) 2006, 84, 435)。
【０００４】
望ましくかつ調節可能な抗菌性を有すると同時に調製が容易な新規SMAMPの必要性はまだ満たされていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、先進的なポリマー設計および合成方法を通じて得られ、AMPの有望な性質を示す、特定の新規ポリマー(SMAMP)に部分的に基づく。特に、例えば、SMAMPの合成を可能にする開環メタセシス重合(ROMP)プラットフォームが開発された。このプラットフォームは、最小数のノルボルネン系構成要素を使用し、モノマー単位中のおよび/またはポリマー骨格に沿った疎水基および親水基の容易で独立した変動を可能にすることで、ポリマーの望ましい性質、例えば効力および選択性を微調節および選択することを可能にする。
【０００６】
一局面では、本発明は一般に、以下の構造を有するモノマー単位に関する:
2012529557.tif 000003
式中、R1およびR2の一方は疎水基を含み、R1およびR2の他の一方は親水基を含み; XはC-R3、OまたはSであり、R3は水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基(例えばC1〜C6アルキルもしくはアルコキシ基)である。
【０００７】
疎水基は、置換または非置換アルキル基、例えば置換または非置換C1〜C10アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)を含みうる。親水基は、アンモニウムイオン、スルホニウムイオン、グアニジウムイオン、ホスホニウムイオンならびにモノアルキルおよびジアルキル置換アミノ基より選択される基を例えば含みうる。
【０００８】
特定の態様では、XはOであり; R1は直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2は
2012529557.tif 000004
またはグアニジウムイオン
2012529557.tif 000005
であり、pは1〜10の整数(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。
【０００９】
特定の態様では、XはC-R3であり; R1は直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2は
2012529557.tif 000006
またはグアニジウムイオン
2012529557.tif 000007
であり、pは1〜10の整数である。いくつかの態様では、R3は水素である。
【００１０】
別の局面では、本発明は一般に、以下の構造を有するモノマー単位を含むポリマーに関する:
2012529557.tif 000008
式中、R1およびR2の一方は疎水基を含み、R1およびR2の他の一方は親水基を含み; XはC-R3、OまたはSであり、R3は水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基である。
【００１１】
疎水基は、置換または非置換アルキル基、例えば置換または非置換C1〜C10アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)を含みうる。親水基は、アンモニウムイオン、スルホニウムイオン、グアニジウムイオン、ホスホニウムイオンならびにモノアルキルおよびジアルキル置換アミノ基より選択される基を例えば含みうる。
【００１２】
特定の態様では、XはOであり; R1は直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2は
2012529557.tif 000009
またはグアニジウムイオン
2012529557.tif 000010
であり、pは1〜10の整数(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。
【００１３】
特定の態様では、XはC-R3であり; R1は直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2は
2012529557.tif 000011
またはグアニジウムイオン
2012529557.tif 000012
であり、pは1〜10の整数である。いくつかの態様では、R3は水素である。
【００１４】
例えば、nは約1〜約1,000、例えば、約1〜約100; 約1〜約20; 約1〜約10; 約1〜約5; 約3〜約50; 約3〜約20; 約3〜約10; 約3〜約5の整数である。
【００１５】
いくつかの用途では、ポリマーは共重合体であることが好ましいことがある。特定の態様では、共重合体は以下の構造モノマー単位を含みうる:
2012529557.tif 000013
式中、X'およびX''の各々はC-R3、OまたはSであり、R3は水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基(例えばC1〜C6アルキルもしくはアルコキシ基)であり; R1'およびR1''の各々は疎水基であり、R2'およびR2''の各々は親水基であり、但し、R1'およびR1''は同一ではなく、R2'およびR2''は同一ではなく、あるいはX'およびX''は同一ではなく; mおよびnの各々は約1〜約1,000の整数である。
【００１６】
mおよびnの各々は約1〜約1,000、例えば、約1〜約100; 約1〜約20; 約1〜約10; 約1〜約5; 約3〜約50; 約3〜約20; 約3〜約10; 約3〜約5の整数である。
【００１７】
いくつかの態様では、R1'およびR1''の各々は独立して直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2'およびR2''の各々は独立して
2012529557.tif 000014
またはグアニジウムイオン
2012529557.tif 000015
であり、pは1〜10の整数(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。
【００１８】
いくつかの態様では、X'およびX''の各々はOである。いくつかの他の態様では、X'およびX''の各々は独立してC-R3である。いくつかの他の態様では、X'およびX''の一方はOであり、他方はC-R3である。
【００１９】
特定の態様では、(I)、(II)、(III)または(IV)中の1つまたは複数(例えばすべて)の-C(=O)O-基がエキソ立体位置を占める。
【００２０】
別の局面では、本発明は一般に、開環メタセシス重合によって調製されるポリマーであって、モノマー構造単位内で疎水基および親水基がポリマー骨格に隣接原子において結合するようにポリマー骨格に結合している疎水基および親水基を含むポリマーに関する。例えば、ポリマーにおいて、疎水基および親水基はエステル結合を経由してポリマー骨格に結合している。本発明のポリマーは、例えば約1,000〜約100,000、1,000〜50,000、1,000〜10,000の分子量Mnを有しうる。
【００２１】
本発明はまた、本発明のポリマーを含む生成物、および本発明のポリマーを例えば開環メタセシス重合によって調製するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】面両親媒性モノマーおよびポリマーを得るための「構築キット」アプローチの一態様を示す。
【図２】特定の例示的な生物学的データを示す。
【図３】例示的なプロピルオリゴマーの特定の特性決定データを示す。
【図４】特定の例示的な生物学的データを示す。
【図５】特定の例示的な生物学的データを示す。
【図６】プロピルオリゴマーの特定の特性決定を示す。
【図７】例示的な高活性ポリマーを示す。
【図８】例示的な中活性ポリマーおよび不活性ポリマーを示す。
【図９】特定のポリマーの例示的HC50曲線を示す。
【図１０】特定の細胞膜および細胞壁の形態の図解表現を示す。
【図１１】異なる分子量のSMAMPの特定の例示的な構造および抗菌性を示す。
【図１２】モデル膜上での特定の例示的な色素漏出実験を示す。
【図１３】ペプチドグリカンの存在下での色素漏出実験の結果の特定の合理化を模式的に示す。
【図１４】モデル膜上での特定の例示的な色素漏出実験を示す。
【図１５】SMAMPホモポリマー系列の特定の例示的なGPCデータを示す。
【図１６】特定の例示的な色素漏出曲線を示す。
【図１７】特定の例示的な構造比較を示す。
【図１８】局所的電荷余剰の特定の例示的な図画表現を示す。
【図１９】モデルポリマーの特定の例示的な構造を示す。
【図２０】特定の共重合体の特定の例示的な抗菌性および溶血性を示す。
【図２１】色素漏出実験の特定の例示的な図を示す。
【図２２】特定の例示的な色素漏出データを示す。
【図２３】特定の例示的な表現図画およびポリマー構造を示す。
【図２４】ポリノルボルネンを付与する特定の例示的な方法を示す。
【図２５】特定の例示的な50/50ランダム共重合体を示す。
【図２６】選択されたポリマーの特定の例示的なMICを示す。
【図２７】ポリマー相互作用に関する特定の例示的な図画を示す。
【図２８】ポリマー誘導性色素漏出の特定の例示的なグラフを示す。
【図２９】ポリマーの非存在下および存在下での染色大腸菌(E. coli)の特定の例示的な蛍光顕微鏡観察を示す。
【図３０】特定の例示的な合成スキームを示す。
【図３１】抗菌物質の特定の例示的な分子進化を示す。
【図３２】特定の例示的なMICおよびHC曲線を示す。
【図３３】特定の例示的なモノマーおよびポリマー合成を示す。
【図３４】ROMPに基づくSMAMPポリマーの特定の例示的なライブラリーを示す。
【図３５】SMAMPホモポリマーの3つの例示的系列の特定の例示的な生物学的データを示す。
【図３６】SMAMP共重合体の例示的系列の特定の例示的な生物学的データを示す。
【図３７】SMAMP共重合体の例示的系列の特定の例示的な生物学的データ、およびSMAMP-膜相互作の図を示す。
【図３８】SMAMP共重合体の3つの例示的系列の特定の例示的な生物学的データを示す。
【図３９】例示的なイミド系SMAMPポリマーの特定の例示的な生物学的データを示す。
【図４０】例示的なエステル系SMAMP共重合体の特定の例示的な生物学的データを示す。
【図４１】特定の例示的なMIC90データを示す。
【図４２】様々なSMAMPの生物学的性質の特定の例示的な分子量依存性を示す。
【図４３】特定の例示的な色素漏出割合対SMAMP濃度を示す。
【図４４】特定の例示的な蛍光顕微鏡画像を示す。
【図４５】特定の例示的な動的光散乱試験を示す。
【図４６】特定の例示的な色素漏出曲線および蛍光顕微鏡画像を示す。
【図４７】ポリマーの修飾の特定の例示的な模式表現を示す。
【図４８】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図４９】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図５０】特定の例示的なGPCトレースを示す。
【図５１】特定の例示的なMICおよびHC50データを示す。
【図５２】特定の例示的なMICおよびHC50データを示す。
【図５３】特定の例示的なMICおよびHC50データを示す。
【図５４】特定の例示的なGPCトレースを示す。
【図５５】複数のアミン官能基を有するノルボルネンモノマーの特定の例示的な化学構造を示す。
【図５６】特定の例示的な抗菌ポリノルボルネン誘導体を示す。
【図５７】特定の例示的な溶血活性(HC50)を示す。
【図５８】特定の例示的なカルセイン色素漏出割合データを示す。
【図５９】特定の例示的なカルセイン色素漏出割合データを示す。
【図６０】特定の例示的なGPC分析を示す。
【図６１】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図６２】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図６３】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図６４】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図６５】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図６６】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図６７】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図６８】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図６９】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図７０】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図７１】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図７２】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図７３】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図７４】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図７５】特定の例示的なNMRデータを示す。
【図７６】特定の例示的なNMRデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
特定の官能基および化学用語の定義を以下にさらに詳細に記載する。有機化学の一般的原理ならびに特定の官能性部分および反応性は"Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999に記載されている。
【００２４】
本発明の特定の化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在しうる。本発明は、本発明の範囲内にある、シスおよびトランス異性体、R-およびS-鏡像異性体、ジアステレオマー、(D)-異性体、(L)-異性体、そのラセミ混合物、および他のその混合物を含むすべてのそのような化合物を想定する。アルキル基などの置換基中にはさらなる不斉炭素原子が存在しうる。すべてのそのような異性体およびその混合物は本発明に含まれるように意図されている。
【００２５】
本開示の利点を考慮すれば、当業者は、本明細書に記載の合成方法が様々な保護基を利用することを認識するであろう。本明細書において使用する「保護基」という用語は、多官能性化合物中の別の反応部位において反応が選択的に行われうるように特定の官能性部分、例えばO、SまたはNが一時的に遮断されることを意味する。好ましい態様では、保護基が良好な収率で選択的に反応することで、計画される反応に対して安定な保護された基質が得られ、保護基は、他の官能基を攻撃しない容易に入手可能な、好ましくは無毒の試薬によって良好な収率で選択的に除去可能であるべきであり、保護基は、容易に分離可能な誘導体を形成し(より好ましくは新たな不斉中心の生成なしで)、保護基は、さらなる反応部位を回避するために最小限のさらなる官能基を有する。酸素、硫黄、窒素および炭素保護基を利用することができる。様々な官能基の例はProtective Groups in Organic Synthesis, Third Ed. Greene, T.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999に見ることができる。
【００２６】
本明細書に記載の化合物が任意の数の置換基または官能性部分で置換されうるということが認識されよう。
【００２７】
本明細書において使用する「アルキル」という用語は、非置換である(すなわち対応する数の炭素原子および水素原子を有する)かまたは当業者に公知の置換基で置換されていてもよい、飽和直鎖状または分岐状(環状を含む)炭化水素遊離基を意味する。例えば、アルキル基としては、1〜6個の炭素原子(すなわち1個、2個、3個、4個、5個または6個の炭素原子)および対応する数の水素原子から本質的になる飽和直鎖状または分岐状遊離基を意味する、(C1〜C6)アルキル(またはC1〜C6アルキル)が挙げられる。例示的な(C1〜C6)アルキル基としてはメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチルなどが挙げられる。無論、本開示の利点を考慮すれば他の(C1〜C6)アルキル基は当業者には容易に明らかであろう。
【００２８】
本明細書において使用する「疎水基」または「疎水性部分」という用語は、水に対するその基の親和性が低くなる性質(例えば低極性)を有する基を意味する。疎水基または疎水性部分の非限定的な例としては置換および非置換アルキル基(例えば6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個もしくは13〜30個またはそれ以上の炭素原子を有する直鎖状、分岐状または環状の低級アルキル基)、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、飽和または不飽和環状炭化水素、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、ならびに対応する置換された基が挙げられる。疎水基は、その基の疎水性を上回らない限り、いくつかの親水性の基または置換基を含有してもよい。さらなる変形では、疎水基は置換ケイ素原子を含みうるし、フッ素原子を含みうる。疎水性部分は直鎖状、分岐状または環状でありうる。
【００２９】
本明細書において使用する「親水基」または「親水性部分」という用語は、水に対するその基の親和性が高くなる性質(例えば高極性)を有する基を意味する。親水基または親水性部分の非限定的な例としてはヒドロキシル、メトキシ、フェニル、カルボン酸ならびにそのイオンおよび塩、カルボン酸のメチル、エチルおよびビニルエステル、アミド、アミノ、シアノ、イソシアノ、ニトリル、アンモニウムイオンまたは塩、スルホニウムイオンまたは塩、ホスホニウムイオンまたは塩、モノアルキルおよびジアルキル置換アミノ基、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリコシル基、糖、エポキシ基、アクリレート、スルホンアミド、ニトロ、-OP(O)(OCH2CH2N+RRR)O-、グアニジウム、アミネート、アクリルアミド、ピリジニウム、ピペリジン、ならびにその組み合わせが挙げられ、各Rは独立してHまたはアルキルより選択される。さらなる例としては、アルコール、カルボキシレート、アクリレートまたはメタクリレートで置換されたポリメチレン鎖が挙げられる。親水性部分としては内部アミノまたは置換アミノ基、例えば内部-NH-、-NC(O)R-または-NC(O)CH=CH2-基を有するアルキル鎖を挙げることもでき、RはHまたはアルキルである。親水性部分としてはポリカプロラクトン、ポリカプロラクトンジオール、ポリ(酢酸)、ポリ(酢酸ビニル)、ポリ(2-ビニルピリジン)、セルロースエステル、セルロースヒドロキシルエーテル、ポリ(L-リジンヒドロブロミド)、ポリ(イタコン酸)、ポリ(マレイン酸)、ポリ(スチレンスルホン酸)、ポリ(アニリン)またはポリ(ビニルホスホン酸)を挙げることもできる。親水基は、その基の親水性を上回らない限り、いくつかの疎水性の基または置換基を含有してもよい。
【００３０】
本明細書において使用するMIC90＝未処置の対照に比べて特定細菌の成長を90%減少させる最小阻止濃度。低MIC90値は高抗菌活性を示す。HC50＝ヒト赤血球の50%が溶解する溶血濃度。高HC50値を与える試料は低毒性を示す。選択性＝HC50/MIC90。高選択性値は、宿主生物による良好な耐容性と標的生物に対する高毒性との組み合わせを意味する。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は一般に、先進的なポリマー設計および合成方法を通じて開発された特定の新規ポリマー(SMAMP)に関する。特に、例えば、最小数のノルボルネン系構成要素を使用し、モノマー単位中のおよび/またはポリマー骨格に沿った疎水基および親水基の容易で独立した変動を可能にすることで、ポリマーの望ましい性質(例えば効力および選択性)を微調節および選択する、SMAMPの合成を可能にする開環メタセシス重合(ROMP)プラットフォームが開発された。ポリマーはAMPの有望な性質を示す。
【００３２】
一局面では、本発明は一般に、以下の構造を有するモノマー単位に関する:
2012529557.tif 000016
式中、R1およびR2の一方は疎水基を含み、R1およびR2の他の一方は親水基を含み; XはC-R3、OまたはSであり、R3は水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基(例えばC1〜C6アルキルもしくはアルコキシ基)である。
【００３３】
疎水基は、置換または非置換アルキル基、例えば置換または非置換C1〜C10アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)を含みうる。親水基は、アンモニウムイオン、スルホニウムイオン、グアニジウムイオン、ホスホニウムイオンならびにモノアルキルおよびジアルキル置換アミノ基より選択されうるカチオン性基を例えば含みうる。
【００３４】
特定の態様では、XはOであり; R1は直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2は
2012529557.tif 000017
またはグアニジウムイオン
2012529557.tif 000018
であり、pは1〜10の整数(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。
【００３５】
特定の態様では、XはC-R3であり; R1は直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2は
2012529557.tif 000019
またはグアニジウムイオンであり、pは1〜10の整数である。いくつかの態様では、R3は水素である。
【００３６】
別の局面では、本発明は一般に、以下の構造を有するモノマー単位を含むポリマーに関する:
2012529557.tif 000020
式中、R1およびR2の一方は疎水基を含み、R1およびR2の他の一方は親水基を含み; XはC-R3、OまたはSであり、R3は水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基である。
【００３７】
疎水基は、置換または非置換アルキル基、例えば置換または非置換C1〜C10アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)を含みうる。親水基は、アンモニウムイオン、スルホニウムイオン、グアニジウムイオン、ホスホニウムイオンならびにモノアルキルおよびジアルキル置換アミノ基より選択されうるカチオン性基を例えば含みうる。
【００３８】
特定の態様では、XはOであり; R1は直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2は
2012529557.tif 000021
またはグアニジウムイオンであり、pは1〜10の整数(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。
【００３９】
特定の態様では、XはC-R3であり; R1は直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2は
2012529557.tif 000022
またはグアニジウムイオンであり、pは1〜10の整数である。いくつかの態様では、R3は水素である。
【００４０】
例えば、nは約1〜約1,000、例えば、約1〜約100; 約1〜約20; 約1〜約10; 約1〜約5; 約3〜約50; 約3〜約20; 約3〜約10; 約3〜約5の整数である。
【００４１】
いくつかの用途では、ポリマーは共重合体であることが好ましいことがある。特定の態様では、共重合体は以下の構造モノマー単位を含みうる:
2012529557.tif 000023
式中、X'およびX''の各々はC-R3、OまたはSであり、R3は水素またはC1〜C12アルキルもしくはアルコキシ基(例えばC1〜C6アルキルもしくはアルコキシ基)であり; R1'およびR1''の各々は疎水基であり、R2'およびR2''の各々は親水基であり、但し、R1'およびR1''は同一ではなく、R2'およびR2''は同一ではなく、あるいはX'およびX''は同一ではなく; mおよびnの各々は約1〜約1,000の整数である。
【００４２】
mおよびnの各々は約1〜約1,000、例えば、約1〜約100; 約1〜約20; 約1〜約10; 約1〜約5; 約3〜約50; 約3〜約20; 約3〜約10; 約3〜約5の整数である。
【００４３】
いくつかの態様では、R1'およびR1''の各々は独立して直鎖状または分岐状C1〜C12アルキル基(例えばC1〜C6アルキル基)であり; R2'およびR2''の各々は独立して
2012529557.tif 000024
またはグアニジウムイオンであり、pは1〜10の整数(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。
【００４４】
いくつかの態様では、X'およびX''の各々はOである。いくつかの他の態様では、X'およびX''の各々は独立してC-R3である。いくつかの他の態様では、X'およびX''の一方はOであり、他方はC-R3である。
【００４５】
特定の態様では、(I)、(II)、(III)または(IV)中の1つまたは複数(例えばすべて)の-C(=O)O-基がエキソ立体位置を占める。
【００４６】
別の局面では、本発明は一般に、開環メタセシス重合によって調製されるポリマーであって、モノマー構造単位内で疎水基および親水基がポリマー骨格に隣接原子において結合するようにポリマー骨格に結合している疎水基および親水基を含むポリマーに関する。例えば、ポリマーにおいて、疎水基および親水基はエステル結合を経由してポリマー骨格に結合している。
【００４７】
本発明のポリマーは、例えば約1,000〜約100,000、1,000〜50,000、1,000〜10,000の分子量Mnを有しうる。
【００４８】
本発明はまた、本発明のポリマーを含む生成物、および本発明のポリマーを開環メタセシス重合によって調製するための方法に関する。
【００４９】
a. 高選択性抗菌ポリマー
合成AMPポリマーの利用は、例えば、医療用プラスチックからの細菌感染症がわれわれの病院における現在の重大問題である材料領域において新たな用途を開拓しうる。合成ポリマーは、AMPの重要な特徴である面両親媒性および正電荷を依然として提示しながら容易かつ大量に得ることができる。最近、ポリマーSMAMPがいくつか報告されているが、それらの全体的な活性および選択性は最適とはほど遠いものにとどまっている。例としては、DeGradoおよび共同研究者が報告した、両親媒性を調節するためにポリ(ブチルメタクリレート)と共重合されたポリ(アンモニウムメチルメタクリレート)塩に基づくSMAMP; Klajnertらが製造した樹状SMAMP; Liuらが合成した、ペプチド四量体に結合されたポリ(マレイン酸)からのSMAMP; Makovitzkiらが最近作製したリポペプチド系SMAMP; ならびにGellmanおよび共同研究者が提示した、良好な活性(大腸菌に対して12.5μg/mL、黄色ブドウ球菌(S. aureus)に対して3.1μg/mL)および最大32である細菌細胞対哺乳動物細胞の選択比を有するポリ(アミド)系ポリマーが挙げられる(Kuroda, et al., Polymer Prepr. 2004, 45, 610; Klajnert, et al., Int. J. Pharm. 2006, 309, 208; Liu, et al., J. Med. Chem. 2006, 49, 3436; Makovitzki, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 15997; Mowery, et al. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15474)。Tewおよび共同研究者は、アリールアミド、尿素およびポリ(フェニレンエチニレン)に基づく面両親媒性抗菌ポリマーを合成した(Tew, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 5110; Tang, et al., Chem. Commun. 2005, 12, 1537; Arnt, et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 7664; Arnt, et al., Langmuir 2003, 19, 2404)。
【００５０】
ポリ(ノルボルネン)誘導体に基づくSMAMPはTewおよびCoughlinによって既に記述された。彼らは、繰り返し単位内の疎水性部分および親水性部分の規定される比に応じて調節可能な抗菌活性を有する面両親媒性繰り返し単位を有するポリマーを報告した。彼らの最も選択的なポリマーは、ヒト赤血球に対する活性の百倍である細菌に対する活性を有していた(Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870)。また、彼らはごく最近、四級ピリジニウム基を有するポリ(ノルボルネン)(大腸菌に対する選択比が最大20)を報告した(Eren, et al., Macromol. Chem. Phys. 2008, 209, 516-524)。
【００５１】
既に報告されたポリ(ノルボルネン)系SMAMPは、繰り返し単位の両親媒性を調節する鋭意の合成努力を必要としたか、または共重合体合成を可能にしなかった。以前の研究は、親水性モノマーおよび疎水性モノマーのランダムの共重合体によっても抗菌活性が実現可能であることを示したが、面両親媒性モノマー、すなわち同一の重合可能な単位上に親水性カチオン性部分および疎水性部分を有するモノマーを有することで、抗菌活性のより正確な調節が可能になる(Kuroda, et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4128; Mowery, et al. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15474)。
【００５２】
(i) 最小数の構成要素を使用し、(ii) モノマー上の疎水性残基および親水性残基の容易で独立した変動を可能にする、開環メタセシス重合(ROMP)プラットフォームに基づく新規で独自のアプローチが本明細書に開示される。本発明者らの分子構築キットの重要成分を図1において強調する。親水性成分および疎水性成分は、重合可能なオキサノルボルネン基に結合され、独立に変動可能である。
【００５３】
ここに記載される分子構築キットは、調節可能な活性および選択性を有する合成面両親媒性抗菌ホモポリマーおよび共重合体のライブラリー全体の合成を可能にする。親水性成分および疎水性成分を独立して変動させることで、抗菌ポリマーのいっそう広範なライブラリーの今後の合成を可能にすることができる。こうして得られた3k系列のホモポリマーは、大腸菌および黄色ブドウ球菌に対する著しい抗菌活性を示すものであり、この活性は疎水性残基Rの変動によって二桁にわたって調節可能であった。10k系列のホモポリマーの一部は、大腸菌対哺乳動物細胞および大腸菌対黄色ブドウ球菌の二重選択性を示した。抗菌活性を調節するためのパラメータとして分子量が使用可能であることがさらに示された。黄色ブドウ球菌に対する最適活性は750g/mol〜1,100g/molであり、大腸菌に対する最適活性は3,000g/molおよび10,000g/molであることがわかった。黄色ブドウ球菌対赤血球の533超という高い選択比が、不活性/非溶血性モノマーと活性/溶血性モノマーとを共重合することで得られた。また、これらのポリマーは二重選択性であり、黄色ブドウ球菌対赤血球の選択比は533倍を超え、黄色ブドウ球菌対大腸菌の選択比は53倍を超えた。黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性形態MRSAが、抗生物質耐性「スーパーバグ」であり、入院患者にとって今日最も深刻な健康上の脅威の一つであることから、黄色ブドウ球菌に対するそのような高い選択比は特に興味深い。
【００５４】
これは今までのところ、どのようにしてカチオン性両親媒性ポリマーの生物学的性質を調節して第一に細菌対哺乳動物細胞の選択比を増大させ、第二に1つの細菌ファミリー対別の細菌ファミリーの選択比を増大させることができるかの明確な例である。多くの細菌種類が実は身体に有益であることから、この識別は抗菌作用物質にとって重要である。
【実施例】
【００５５】
実施例
モノマー合成
ROMPを経由して新規の合成抗菌ポリマーを得る上で、第1の課題は面両親媒性モノマーに向けての容易でモジュール式の合成経路を設計することであった(図1)。これらのモノマーを得るために行う3段階アプローチをスキーム1に提示する。第1の段階において、フランおよび無水マレイン酸がディールス・アルダー反応を経ることで、文献のエキソ付加体のみが得られた(Mantovani, et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2966)。この容易な段階によって、二重のおよび非対称的な官能化を可能にする、重合可能なオキサノルボルネン基および環状酸無水物を含有する化合物1が得られた。無水物1をアルコールで開環させて所望の疎水性部分Rを導入し、これをメチルからヘキシルに変動させて、異なる疎水性を有する1系列の半モノマー2a-fを得た。すべての化合物は結晶性で、したがって精製が容易であった。最後のステップにおいて、指定されたカチオン性基を結合させた。通常、ROMPは非保護アミンの存在をそれらの配位性が理由で許容しないことから、所望の親水基(NH3+)をその保護カルバミン酸tert-ブチル(NHBoc)形態で導入した(Slugovc, et al., Macromol. Rapid Commun. 2004, 25, 1283)。半モノマー2a-fとBoc保護2-アミノエタノールとをDCCカップリングによって反応させて、1系列の遮蔽された両親媒性モノマー3a-fを得た(スキーム1)。この最後の段階は、純粋な生成物を得るためのカラムクロマトグラフィーによる精製を必要とした。全3つの反応段階の全収率は約40%であった。
【００５６】
（スキーム１）モノマー合成
面両親媒性モノマーの疎水性成分を第2の反応段階において導入し(R＝メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソペンチルまたはヘキシル)、保護された親水性部分を最後の段階において結合させる。
2012529557.tif 000025
【００５７】
（スキーム２）ポリマー合成
ROMP重合の後にトリフルオロ酢酸とのポリマー類似加水分解を行って面両親媒性ポリマーを得る。
2012529557.tif 000026
【００５８】
ホモポリマー合成および分子量特性決定
モノマー3a-fから、約3,000g/mol (「3k」系列)および約10,000g/mol (「10k」系列)の分子量を有する2系列のホモポリマーを合成した。第三世代グラブス触媒(G3)を使用してスキーム2に示すモノマーの重合を行って、前駆体ポリマー4a-f(ジクロロ-ジ(3-ブロモピリジノ)-N,N'-ジメシチレノイミダゾリノ-Ru=CHPh、c.f. Love, et al., Angew. Chem. Internat. Ed. 2002, 41, 4035)を得た。面両親媒性SMAMP 5a-fをポリマー類似脱保護によって得た。NMRによれば、Boc保護基はトリフルオロ酢酸によって完全に除去された。アルキル残基によっては、得られたポリマーは後処理後に水溶性または水分散性となった。便宜上、これらのポリマーをここで化合物番号、例えば5a-fで呼ぶ代わりに、R＝プロピルおよび分子量3000g/molを有するポリマーをプロピル_3kと呼ぶ。有機可溶性前駆体ポリマーをDMF中でゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって分析した(表1a)。ポリスチレン標準物質を較正物質として使用するGPCにより得た分子量は、反応化学量論により予測される分子量よりも著しく大きい。G3触媒が定量的に反応開始させることは文献より周知であり、したがって不完全な開始がこの相違の原因であることはあり得ない(Slugovc, et al., Macromol. Rapid Commun. 2004, 25, 1283)。MALDI-TOF MS(マトリックス支援レーザーイオン化および脱離飛行時間型質量分析)によるBoc保護プロピル_3k試料(Mn, GPC＝9200g/mol)の分析によって、m/z＝3095における最大強度を伴う分布が得られ、これは標的分子量と見事に一致している。このことはGPCがこれらの構造の分子量を過大評価していることを意味しており、これは論じられるさらなるオリゴマーデータによってさらに裏付けられる。
【００５９】
（表１）ホモポリマー。a) GPC (DMF、0.01mol L-1 LiCl、PS標準物質)による前駆体ポリマー特性決定。b) 生物学的アッセイによる抗菌ホモポリマーの特性決定: 大腸菌および黄色ブドウ球菌の細菌成長に対する阻止活性(MIC90＝細菌成長の90%を防止する最小阻止濃度)および赤血球に対する溶血活性(HC50＝血液細胞の50%を溶解させる濃度)。
（表１ａ）
2012529557.tif 000027
（表１ｂ）
2012529557.tif 000028
【００６０】
ホモポリマーの生物活性
ホモポリマーの生物学的性質、すなわち大腸菌および黄色ブドウ球菌の成長に向かうそれらの抗菌活性MIC90ならびに赤血球に向かうそれらの溶血活性HC50を、既に記載のように試験した(MIC90＝細菌成長の90%を防止する最小阻止濃度、HC50＝血液細胞の50%を溶解させる溶血濃度、c.f. Rennie, et al., J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 2005, 32, 296)。HC50/MIC90は抗菌選択性を定量化する。これらのホモポリマーについて得られた生物学的データが表2に含まれる。MIC90およびHC50値も図2aおよび2bにプロットされる。細菌細胞対哺乳動物細胞の選択比が最高であるポリマーがエチル_3kであり、大腸菌および黄色ブドウ球菌の両方について選択比が28と良好であることが理解されうる。
【００６１】
天然宿主防御ペプチドマガイニンの誘導体MSI-78は10の選択比を有する(Gabriel, et al., Materials Sci. Engineering Rev. 2007, 57, 28)。図2aに示す3k系列では以下の傾向が観察される。無毒(HC50＝2000μg/mL)で不活性(MIC90＞200μg/mL)のメチル_3kから出発して、抗菌活性はプロピル_3kでピークに達し(MIC90＝大腸菌について6.25μg/mL)、そこでまたポリマーはより溶血性になり始める(HC50≦50μg/mL)。ブチル_3kからヘキシル_3kまで、ポリマーが不活性になるまで(MIC90＞200μg/mL)活性は再度減少するが、この時点では強力に溶血性である。黄色ブドウ球菌のMIC90も同一の傾向を示すが、活性は一般に比較的低い。10k系列のデータを図2bにまとめる。10kポリマーのMIC90は3k系列のそれと同様であり、プロピル_10kにおいて最大活性を示すが、これらの試料は、一般に3kポリマーよりも大腸菌に対する活性が低く、黄色ブドウ球菌に対しては不活性である。
【００６２】
これらの観察は、哺乳動物膜および細菌膜の異なる組成を考慮に入れることで合理化されうる。ヒト赤血球(RBC)はコレステロールおよびホスファチジルコリン(外葉)から主に構成される。対照的に、大腸菌のようなグラム陰性菌の膜はホスファチジルエタノールアミンおよびアニオン性荷電ホスファチジルグリセロール(PG)から大部分がなり、一方、黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性菌は、アニオン性荷電PGおよびカルジオリピンから主になる膜を有する。したがって、細菌膜はRBC膜よりもさらに負に荷電している(Som, et al., Journal of Physical Chemistry B 2008 3495-3502)。天然AMPについてまさに観察された通り、アニオン性表面電荷は正に荷電したSMAMPを引きつけることができる。それらの疎水性成分が理由で、それらは次に、SMAMPの面両親媒性が正しくバランスがとれている場合、脂質二重層に侵入することができる。メチル_3kのような過度に親水性のSMAMPは、脂質二重層の疎水性コアに侵入することができず、したがって不活性である。
【００６３】
あるいは、そのような親水性分子は、膜に吸着されるよりも溶液のままとどまることを選ぶことがある。また、それらの高い親水性はメチル_3kおよびエチル_3kがRBCを溶解させることを妨げ、より疎水性の高い類似体(以下プロピル_3k)のみが著しい溶血を引き起こす(図2a)。ヘキシル_3kのように過度に疎水性のSMAMPは強い膜活性を有し、結果として非常に溶血性が高い。3k系列の大腸菌および黄色ブドウ球菌に対する最大活性はプロピル_3kポリマーに由来した。このポリマーは細菌膜に侵入するために最適な面両親媒性を有するようである。
【００６４】
プロピル_3kが黄色ブドウ球菌に対する3k系列の最も毒性の高いポリマーであることもわかったが、10kポリマーはすべてこの病原体に対して不活性である(図2b)。これは以下のように合理化することができる。グラム陽性菌は、細胞膜の周りに15〜80nm厚で負に荷電したムレイン層を有する。高分子電解質の文献から周知のように、1個のポリイオンと反対に荷電したポリイオンとの複合体形成(シンプレックス形成)は本質的に不可逆的であるが、ポリイオンと比較的荷電していない種との複合体は可逆的である(Dautzenberg, et al., Polyelectrolytes. Hanser/Gardner: Munich, 1994)。したがって、負に荷電したムレイン層が正に荷電したSMAMPとポリイオン-ポリイオン複合体を形成すると仮定して、そのような複合体の解離は分子量の増大(SMAMP上の電荷の増加)に従ってますます困難になる。比較的高分子量のSMAMPは、グラム陽性菌のムレイン層に付着した後、細胞膜に到達し、その結果、それらの両親媒性に関係なく黄色ブドウ球菌細胞を死滅させない。図2bに示すデータと一致するように、適切に疎水性のポリマーは、外膜と細胞膜との間に位置するはるかに厚い(2nm)ムレイン層を有することから、グラム陰性菌に対して活性でありうる。例えば、プロピル_10kは大腸菌に対する3.75μg/mLに対するMIC90を有し、一方、黄色ブドウ球菌に対するそのMIC90は200μg/mLであり、結果として、黄色ブドウ球菌に対する活性よりも大腸菌に対する活性が50倍超も大きく、RBCに対する活性よりも大腸菌に対する活性が13倍も大きい、二重選択性のポリマーとなる。
【００６５】
オリゴマー合成、および生物学的活性に対する分子量の影響
すべてのモノマーを脱保護し(ポリマーについて記載のようにトリフルオロ酢酸で)、MIC90試験に供し、不活性であることがわかった(MIC90＞200μg/mL)。これは、任意の抗菌活性を得るには鎖長を最小限にすることが必要であることを示す。したがって、プロピルモノマーを例として選択して、低分子量オリゴマーを合成および分析した(表3a参照)。オリゴマー(明確さのために選択された試料)のGPCトレースをモノマーと共に図3aに示す。すべての試料のピーク最大値は予測された順序である。比較的高分子量のオリゴマーは比較的低分子量のそれよりも前に溶出する。MALDI-TOF MSを使用して実際のオリゴマー分子量を決定した。MALDI-TOF質量スペクトルのピークを図3bに分布関数(正規化強度対m/z)として示す。相対的ピーク強度および各ピークのm/z比から、平均分子量Mn、および試料の多分散性を計算した。カラム分解能が理由で多峰形であるように見えるいくつかのGPCトレースとは異なり、それらの分布は単峰形であった。これらのデータは表3aに含まれる。結果は、ポリ(スチレン)標準物質で較正されたGPC曲線が分子量を非常に過大評価している一方で、繰り返し単位nMALDIの平均数が繰り返し単位の計算数とはるかによく一致していることを再度示す。しかし、得られた最も小さいオリゴマーは、この特定の溶媒/触媒系の反応動態が理由で、2という目標の代わりに3.7という重合度を有していた。
【００６６】
（表３）オリゴマー
a) GPC (DMF、0.01mol L-1 LiCl、PS標準物質)による前駆体オリゴマー特性決定
b) 生物学的アッセイによる抗菌オリゴマーの特性決定: 大腸菌および黄色ブドウ球菌の細菌成長に対する阻止活性(MIC90＝細菌成長の90%を予防する最小阻止濃度)および赤血球に対する溶血活性(HC50＝血液細胞の50%を溶解させる濃度)
（表３ａ）
2012529557.tif 000029
（表３ｂ）
2012529557.tif 000030
【００６７】
プロピル系列の生物学的データを図4および表3bに要約する。本方法の誤差限界内で、すべてのオリゴマーはオリゴ5まで同等に非溶血性である。溶血活性は、オリゴ6で一桁増大し(HC50＝150μg/mL)、プロピル_3k (HC50＝50μg/mL)およびプロピル_10k (HC50＜50μg/mL)でさらに増大する。図4は、低分子量オリゴマーが大腸菌に対して不活性であることを示す。オリゴ5から出発して、大腸菌に対する活性の著しい増大(MIC90＝100μg/mL)が観察され、これは3.75μg/mLのMIC90を有するプロピル_10kで最大に達する。黄色ブドウ球菌では反対の傾向が観察される(図4)。最高の活性が小さいオリゴマーで見られた(MIC90＝オリゴ1およびオリゴ2についてそれぞれ6.25μg/mLおよび＜3.75μg/mL)。分子量がプロピル_10kまで増大するに従って、活性は漸進的に失われる(MIC90＝200μg/mL)。分子量に依存するプロピル系列の結果は、大腸菌または黄色ブドウ球菌のいずれか、および場合によっては一般にグラム陰性菌またはグラム陽性菌を選択的に標的化するためのパラメータとして分子量が使用可能であることを示す。
【００６８】
以前の研究は、いくつかのSMAMPがわずかに分子量に依存する活性を有することを示した。Ilkerらは、彼らの系について、生物活性が分子量に依存しない(Mnについて1600〜137000g/mol)と結論づけた。ポリ2およびポリ4(大腸菌に対してMIC90 200μg/mL)は分子量依存性を示さなかった。ポリ3は、それぞれ1,650g/mol〜57,200g/molの範囲のMnおよび25μg/mL〜80μg/mLのMIC90と共に報告された(Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870)。DeGradoが16μg/mLのMIC90を有するMnが約1600g/molのポリ(メタクリレート)共重合体を報告した一方、7900g/moLを超えるポリマーは大腸菌に対する80μg/mLのMIC90を示した(Kuroda, et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4128)。対照的に、オリゴ1は740g/molに等しいMnならびに黄色ブドウ球菌に対する3.75μg/mL未満および大腸菌に対する200μg/mLのMIC90を有し、一方、プロピル_10kは黄色ブドウ球菌に対する200μg/mLおよび大腸菌に対する3.75μg/mLのMIC90を有する。したがって、抗菌活性はこれらのSMAMPについて分子量依存的である。
【００６９】
共重合体合成による選択性の調節
高活性であるが溶血性の繰り返し単位の組み込みを、その組み込みがなければ不活性および非溶血性であるポリマーに行うことで、選択性を劇的に増大させることができる(Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870)。ここで、メチル_3kホモポリマーは不活性および無毒であるとみなされ、一方、プロピル_3kホモポリマーは活性および溶血性である。エチル_3kホモポリマーは最も高活性でもなければ最も高毒性でもないが、最も高い選択性を有する。したがって、メチル、エチルおよびプロピルモノマーを共重合用に選択した。約3000g/molの標的分子量および様々なモノマー供給比を有する3つの系列の共重合体を合成および試験した(表4a)。共重合体組成をNMR分光法によって点検したところ、ポリマー組成がモノマー供給比と一致していることが明らかになった。
【００７０】
（表４）共重合体。a) GPC (DMF、0.01mol L-1 LiCl、PS標準物質)による前駆体ポリマー特性決定。b) 生物学的アッセイによる抗菌共重合体の特性決定: 大腸菌および黄色ブドウ球菌の細菌成長に対する阻止活性。試料ラベリング: 例えばE1:P9は、10mol%エチルモノマーと90mol%プロピルモノマーとの共重合体である。
（表４３ａ）
2012529557.tif 000031
（表４ｂ）
2012529557.tif 000032
【００７１】
生物学的データを表4bおよび図5a〜5cにまとめる。エチル-プロピル系列では、いずれの共重合体も親エチル_3kポリマーの高選択性に達しなかった。プロピル含有量が増大するに従って、エチル-プロピル共重合体は活性が高くなるが、毒性も高くなる。両系列のメチル共重合体は予測された傾向を示した。それらは比較的活性の高いモノマーが少量(10mol%)であっても極めて活性になるが、非溶血性にとどまる。それらは黄色ブドウ球菌に対して強力に活性であり(MIC90＜3.75μg/mL)、大腸菌に対して完全に不活性なままである(MIC90＞200μg/mL)。これらの共重合体もやはり二重選択性であり、細菌細胞対哺乳動物細胞は533超、黄色ブドウ球菌対大腸菌は53超である。この二重選択性は、先に記載のそれとは逆である。
【００７２】
実験の詳細
一般
無水マレイン酸、フラン、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノール、イソペンタノール、1-ヘキサノール、エチルビニルエーテルおよびトリフルオロ酢酸(TFA)をAldrich、FlukaまたはAcrosから試薬グレードとして得て、受け取ったまま使用した。
【００７３】
第三世代グラブス触媒(ジクロロ-ジ(3-ブロモピリジノ)-N,N'-ジメシチレノイミダゾリノ-Ru=CHPh; G3)を、Grubbsらが既に記載したように合成した(Love, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 4035)。HPLCグレード溶媒N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、トルエン、酢酸エチルおよびヘキサンをAldrich、Fisher ScientificまたはAcrosから購入し、受け取ったまま使用した。THF (HPLCグレード、Fisher Scientific)を窒素下でナトリウム/ベンゾフェノンから蒸留した。ジクロロメタン(HPLCグレード、Fisher Scientific)を窒素下でCaH2から蒸留した。
【００７４】
PL Gel 5μmプレカラムおよび2本の10μm分析用Mixed-Dカラム(マサチューセッツ州アマースト、Polymer Laboratories)を備えたPL50 GPC設定(マサチューセッツ州アマースト、Polymer Laboratories)上で、ゲル浸透クロマトグラフィー(DMF/0.01M LiCl、ポリスチレン標準物質で較正、流量マーカーとしてトルエン、50℃)によって測定した。NMRスペクトルをBruker DPX300分光計(ウィスコンシン州マジソン、Bruker)上で記録した。高分解能質量スペクトルをJEOL JMS 700装置(マサチューセッツ州ピーボディ、JEOL)から得た。マトリックス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間型質量スペクトル(MALDI-TOF MS)をBruker Daltonics Reflex III(ウィスコンシン州マジソン、Bruker)上で測定した。ポリマー試料の生物活性(大腸菌(D31)および黄色ブドウ球菌(ATCC25923)の細菌成長の90%を阻止する最小濃度(MIC90)ならびに赤血球の50%を溶解させる濃度(HC50))を、既に報告された通り決定した(Rennie, et al., J. Industr. Microbio. Biotech. 2005, 32, 7, 296)。
【００７５】
モノマー合成
2012529557.tif 000033
(i) 無水マレイン酸(100g、1.02mol)をトルエン1Lに溶解させた。フラン150mL (140.7g、2.05mmol)を加えた。溶液を3日間攪拌した。次に生成物(1)を濾過し、トルエンで洗浄し、減圧乾燥させた。無色粉末を得た。収率および分光データは既に報告されたそれらと一致した(Mantovani, et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2966)。
【００７６】
(ii) 1 (5g、30.0mmol)をTHFに溶解させた。各アルコール2当量(例えばR＝イソペンチルの場合イソペンタノール5.26g (60mmol))および10mol% DMAPを加えた。終夜攪拌後、溶媒を室温で減圧蒸発によって除去した。未反応アルコールを動的減圧(5x10-2mbar)によって除去した。ジクロロメタン/ヘキサンからの結晶化によって、例えばR＝イソペンチルの場合、生成物(2) 4.7g (18.5mmol、62%)を得た。
2012529557.tif 000034
2012529557.tif 000035
【００７７】
(iii) 2a-f 1当量(例えばR＝イソペンチルの場合2g (7.88mmol))をジクロロメタン25mLに溶解させた。boc保護2-アミノエタノール1当量(1.27g、7.88mmol)およびDMAP 10mol%を加えた。溶液を0℃に冷却した。DCC 1当量(206.3g、7.88mmol)を加え、懸濁液を終夜攪拌した。次にそれをショートアルミナカラム(5cm中性Al2O3/ジクロロメタン)を通じて濾過した。溶媒を減圧蒸発によって除去し、粗生成物をクロマトグラフィー(15cmシリカゲル、酢酸エチル:ヘキサン 9:1〜1:1)にかけた。溶媒の蒸発によって純粋なモノマーを得た。収率は70〜80%の範囲であった。
2012529557.tif 000036
2012529557.tif 000037
【００７８】
ポリマー合成
2012529557.tif 000038
(i) モノマー3a-fおよび各量のG3触媒(詳細は表5参照)をジクロロメタン各1mLに溶解させ、3回の凍結融解サイクルに供した。激しく攪拌中のモノマー溶液にアルゴン下室温で触媒を一度に加えた。30分後、リビングポリマー鎖を過剰のエチルビニルエーテル(1mL、754mg、10.5mmol)で末端封止した。溶液を終夜攪拌した。溶媒の蒸発および乾燥後、各ポリマーのアリコートをGPCおよびNMR分析用に取得した。生成物は褐色固体であった。
【００７９】
（表５）ホモポリマー合成の実験パラメータ
2012529557.tif 000039
【００８０】
2012529557.tif 000040
2012529557.tif 000041
【００８１】
(ii) 粗ポリマーをジクロロメタン2mLに溶解させた。過剰のTFA (2mL、2.97g、26.0mmol)を加え、溶液を室温で終夜攪拌した。ロータリーエバポレーターにおけるジクロロメタン(2x15mL)およびメタノール(1x15mL)との共沸蒸留によって過剰の酸を除去した。試料を終夜減圧乾燥させ、溶解度に応じてMilli-Q水またはDMSO 30mLに溶解させた。12時間の透析後に水の導電率が0.1μSになるまで試料をMilli-Q水に対して透析した(全透析時間4〜7日)。次に加水分解ポリマーを凍結乾燥させた。
2012529557.tif 000042
2012529557.tif 000043
【００８２】
共重合体の合成、脱保護および特性決定
ホモポリマーと同一の方法を使用して共重合体を合成および加水分解した。各コモノマーをアルゴン下で別々にジクロロメタン0.7mLに溶解させた。モノマー溶液を混合し、ジクロロメタン1mL中の各量のG3触媒を一度に加えた。詳細を表6に示す。各繰り返し単位プロトンのNMR分光データは、ホモポリマー中の類似プロトンの割り当てと一致した。可能な場合(ピーク重複なし)は積分によって、共重合体組成がモノマー供給比と一致することを明らかにした。ホモポリマーについて記載したように脱保護を行った。
【００８３】
（表６）共重合体合成の実験パラメータ: a) エチル-プロピル共重合体、b) メチル-エチル共重合体、c) メチル-プロピル共重合体
2012529557.tif 000044
【００８４】
プロピルオリゴマー合成
ホモポリマーと同一の方法を使用してプロピルオリゴマーを合成および加水分解した。実験データは表7に含まれる。すべてのオリゴマーのMALDI-TOF MSスペクトルから得たGPCトレースおよび分布関数は図6に含まれる。
【００８５】
（表７）オリゴマー合成の実験パラメータ
2012529557.tif 000045
【００８６】
生物学的データ
MIC90およびHC50値の決定の代表的曲線をここに示す(Rennie, et al., J. Industr. Microbio. Biotech. 2005, 32, 7, 296)。成長%対濃度のプロットからMIC90データを得た。10成長%未満の濃度値をMIC90とした。不活性ポリマーおよび公知の活性を有するポリマーを有する対照を各プレート上に包含させることでデータ再現性を確実にした。さらに、データを四つ組で収集した。代表例を以下に示す(図7〜8)。異なる細菌についての用量反応挙動の一例を図7c)およびd)に示す。用量反応曲線の形状は両方の細胞について大部分は同一である。プロピル_3kなどの疎水性ポリマーは、比較的高い濃度において、これらの濃度における減少した溶解度または凝集に由来する人為的結果が理由で、時々比較的毒性が低くなるようである。細菌数をこれらのウェルにおいて決定する際に、残存する生菌またはCFUはゼロである。典型的なHC50曲線の例を図9に示す。HC50値は、50溶解%におけるデータの平均値とした。
【００８７】
報告されたMIC90 (表1b、32bおよび4b)と時々報告されるMIC100値との差を比較するために、表8はこれらのMIC100値を報告する。それらが本文中のMIC90値と異なる場合、それらを太字で強調する。
【００８８】
（表８）生物学的アッセイによる抗菌ホモポリマーの特性決定: 大腸菌および黄色ブドウ球菌の細菌成長に対する阻止活性(MIC100＝細菌成長の100%を予防する最小阻止濃度)および赤血球に対する溶血活性(HC50＝血液細胞の50%を溶解させる濃度)。a) ホモポリマー、b) オリゴマーおよびc) 共重合体。
2012529557.tif 000046
【００８９】
b. 二重選択性抗菌ポリマー
SMAMPの望ましい性質は高抗菌活性(低MIC90値)および低赤血球溶解(高いHC50値)であり、これらは細菌対哺乳動物宿主細胞の高選択比を導く。グラム陽性菌(例えば黄色ブドウ球菌)およびグラム陰性菌(例えば大腸菌)に対して同等に活性なSMAMPは文献に十分に記載されている(Gabriel, et al. Mater. Sci. Eng., R: Rep. 2007, 57, 28; Kuroda, et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4128; Sambhy, et al., Angew. Chem. Inter. Ed. 2008, 47, 1250; Mowery, et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15474)。
【００９０】
グラム陰性細胞とグラム陽性細胞との間の形態上の差は著しい。グラム陰性細胞(図10a)は外膜および細胞膜を有し、2つの膜の間の細胞膜周辺腔内の緩やかに架橋されたペプチドグリカンの薄層を伴う。他方、グラム陽性菌細胞(図10b)は、単一の二重層脂質膜を取り囲む20〜80nm厚の高度に架橋されたペプチドグリカン層を有する。さらに、膜は異なるリン脂質からなる。一般に、グラム陰性菌(具体的には大腸菌)膜はホスファチジルエタノールアミン(PE)およびホスファチジルグリセロール(PG)から主になり、一方、大部分の他のグラム陽性菌のように黄色ブドウ球菌の膜はカルジオリピン(CL)から主にできている(Alberts, et al. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition ed., Garland Science, New York, 2002; Som, et al, J. Phys. Chem. B 2008, 112, 3495)。
【００９１】
最近、Kallenbachらは、大腸菌対黄色ブドウ球菌の選択比が4である合成ペプチド(選択比が約40である天然AMPゲンタマイシンに匹敵する)を報告した(Liu, et al., ChemBioChem 2007, 8, 2063)。MuehleおよびTamは、グラム陰性菌のリポ多糖層への結合を通じたグラム陰性選択性を有するAMPの合成のための設計概念を報告した(Muhle, et al., Biochemistry 2001, 40, 5777)。
【００９２】
観察される二重選択性の分子起源は、細胞膜の一般的な構造上の差、具体的には異なる脂質組成である可能性がある。黄色ブドウ球菌のさらなるペプチドグリカン層は、多くのSMAMPに見られる分子量依存性の原因であるかのうせいがあり、すなわち、その抗菌活性は分子量の増大に従って失われる。細菌模倣モデル小胞上での色素漏出実験を使用したところ、モデルSMAMPの観察された二重選択性(図11)はこれら2つの細胞種類間の形態上の差に関連している(Lienkamp, et al, Chem. Eur. J. submitted)。
【００９３】
図11に示すSMAMPは、二重選択性であり、黄色ブドウ球菌に対して分子量依存的な抗菌活性を有することから、上記仮説を試験する上で好適なプローブであることがわかった。SMAMPがAMPと同様に細菌膜と相互作用することでその膜を腐敗させるということが一般に認められている(Ikeda, et al., Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1990, 1021, 56)。したがって、膜活性を精査する単層モデル小胞上での色素漏出実験を行った(Som, et al, J. Phys. Chem. B 2008, 112, 3495)(図14a)。
【００９４】
第1系列の実験において、PE/PG脂質を含有する大腸菌のモデル小胞、およびCL脂質からできている黄色ブドウ球菌のモデル小胞を、同一濃度のSMAMPに曝露した。得られた色素漏出データは、SMAMPがその分子量と無関係に両方のモデル膜に対して膜活性であることを示した(図14bおよび14c)。単一ポリマー濃度で得られた色素漏出データは膜活性の最も定量的な尺度では必ずしもないことから、濃度依存漏出曲線を得た(図12a)。このデータをヒル方程式にフィッティングすることで、ポリマー誘導性漏出50%を導くポリマー濃度EC50を得た(Som, et al, J. Phys. Chem. B 2008, 112, 3495)。EC50は、PE/PG小胞では1.57μg mL-1、CL小胞では2.64μg mL-1であった。さらに、いずれの小胞種類も同一の最大漏出を示す。したがって、SMAMPが黄色ブドウ球菌および大腸菌の模倣物に対して同等に膜活性であり、すなわち異なる膜組成が抗菌活性、具体的には大腸菌に対する不活性の観察される差の原因ではないことは明らかである。
【００９５】
膜試験は(SM)AMPの文献において一般的であるが、これらの単層小胞は細胞膜の極めて単純なモデルであると理解される。それらは1つの膜を伴う黄色ブドウ球菌の合理的なモデルである可能性があるが、大腸菌は二重膜構造を有する。このさらなる膜はSMAMP濃度の勾配を有効に作り出す(図10a)。外膜は、膜崩壊を引き起こす濃度c1を経るが、細胞膜周辺腔は、細胞膜を損傷させるには不十分である著しく減少した濃度c2を経る。脂質の異なる性質が観察される二重選択性には重要でないということを実験が証明したことから、二重膜構造が大腸菌に対するSMAMPの不活性の原因である可能性があり、これは、外膜の完全性の単なる損失だけでは大腸菌を死滅させるには十分ではないことを示した以前の観察と一致する(Shai, Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1999, 1462, 55)。
【００９６】
分子量の増大に従って観察される抗菌活性の損失について黄色ブドウ球菌中のペプチドグリカン層を試験するために、第2の系列の実験を設計した。図14cの色素漏出データによれば、黄色ブドウ球菌様膜について、すべてのSMAMPはそれらの分子量Mnと関係なく膜活性であった。SMAMPの比較的高Mnの試料が高架橋ペプチドグリカン層が理由で黄色ブドウ球菌の細胞膜に到達することができず(図10b)、これによって細胞膜におけるそれらの濃度c2が有効に減少し、それらはMIC90実験において不活性になるということを提示する。ペプチドグリカン層は、ペプチド鎖によって架橋されるβ-(1,4)-結合N-アセチルムラミン酸およびN-グルコサミンのアニオン性荷電交互共重合体からなる。この層とSMAMPとの間の相互作用の2つのMn依存的な様式が可能である。第一に、SMAMP-ペプチドグリカン結合が存在しうる。この結合の性質が何であれ、それを駆動するのが電荷であれ、極性であれ、疎水性であれ、鎖当たりの結合部位の数はMnに従って増大し、結合は徐々にさらに不可逆的になる。第二に、ペプチドグリカンはふるいとして単に作用しうる。したがって、SMAMPの寸法が重要でありうる。そのMnが高くなるほどその水力学的体積が大きくなり、これによって比較的大きいSMAMPがペプチドグリカンメッシュを通過することが妨げられる可能性がある。
【００９７】
この高架橋ペプチドグリカン層の模倣物として、黄色ブドウ球菌からのペプチドグリカン抽出物を色素漏出実験に使用した。この抽出物は、色素漏出実験に加える際に小胞の周りに稠密で均一な層を形成せず、したがって現実の黄色ブドウ球菌細胞のペプチドグリカン層の篩としてのふるい性の完全なモデルではないが、それはSMAMP-ペプチドグリカン結合を調査するための非常に良好なモデルである。
【００９８】
ペプチドグリカンの効果を調査し、SMAMP-ペプチドグリカン相互作用の2つの提示された様式を区別するために、以下の実験を設計した。(1) CL小胞をペプチドグリカン抽出物と共にそれぞれ10分間および24時間インキュベートした後、小胞をSMAMPに曝露した。抽出物それ自体は漏出を引き起こさなかったが、すべての分子量のSMAMPはいずれのインキュベーション時間でもその存在下で膜活性であった。(2) 異なる量のペプチドグリカン抽出物と共に24時間既にインキュベートした、一定濃度の3,000g/molポリマーを含む試料に、CL小胞を曝露した。ペプチドグリカンの濃度対誘導性漏出の割合をプロットすることで、ペプチドグリカン濃度依存曲線を得た(図12b)。データは、ポリマー-ペプチドグリカン比が漏出減少量に関して決定的に重要であることを示す。十分に高いペプチドグリカン濃度において、漏出はほぼ定量的に停止し、すなわち飽和に達した。(3) CL小胞と、既に決定された飽和量のペプチドグリカンと共にそれぞれ10分間および24時間インキュベートしたSMAMP溶液とを混合した。短いインキュベーション時間の場合、すべてのポリマーは抽出物の存在下で膜活性であった。これはペプチドグリカン-SMAMP複合体が形成されないことを意味した。しかし24時間後、図12cに示すように、すべての試料の膜活性が失われた。これは結合を示す。これらの実験の結果を図13に示す。SMAMP-ペプチドグリカン結合は生じはするが、それは相対的に遅いプロセスである。MIC90実験の時間尺度において、結合を理由とするMnの増加に伴うSMAMP活性の損失は、観察された抗菌活性の原因ではない。
【００９９】
結果は、非架橋ペプチドグリカンを有するCLモデル小胞が、異なるMnのポリマーを区別できないことを示す。というのも、添加されたペプチドグリカンが小胞上で均一層を形成せず、これが理由で高Mnおよび低Mnの両方のSMAMPが10分間インキュベートした際に活性であるためである。しかし親細菌において、ペプチドグリカン層は厚く均一であり、孔は有限のサイズを有し、これは小分子のみが容易に拡散しうることを意味する(図10b)。したがって、高分子量SMAMPはレプテーション様の様式でのみこの層を通過する可能性があり、これはポリマーコイルを解く必要があることを意味する。このプロセスが遅いことから、MICの時間尺度において抗菌活性は観察されない。これは、最大2nmの直径を有するタンパク質のみが、大腸菌および枯草菌(B. subtilis)から単離された架橋ペプチドグリカン層を通過できたという観察と一致する(Demchick, et al., J. Bacteriol. 1996, 178, 768)。
【０１００】
本明細書において論じる実験は、SMAMPにおける「二重選択性」の分子起源に対する洞察を示す。脂質組成は、大腸菌に対する抗菌活性の損失の決定的要因ではないことがわかった。黄色ブドウ球菌に関するMIC90データの分子量依存性が、ペプチドグリカン層への結合が理由ではなく、ふるい効果が理由である可能性が最も高いことがさらに示された。
【０１０１】
実施例
一般
すべての化学物質をAldrich、FlukaまたはAcrosから試薬グレードとして得て、受け取ったまま使用した。第三世代グラブス触媒(ジクロロ-ジ(3-ブロモピリジノ)-N,N'-ジメシチレノイミダゾリノ-Ru=CHPh; G3)を、Grubbsらが既に記載したように合成した(Klein, et al., Emerg. Infect. Dis. 2007, 13, 1840)。HPLCグレード溶媒N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)をAldrich、Fisher ScientificまたはAcrosから購入し、受け取ったまま使用した。THF (HPLCグレード、Fisher Scientific)を窒素下でナトリウム/ベンゾフェノンから蒸留した。ジクロロメタン(HPLCグレード、Fisher Scientific)を窒素下でCaH2から蒸留した。PL Gel 5μmプレカラムおよび2本の10μm分析用Mixed-Dカラム(マサチューセッツ州アマースト、Polymer Laboratories)を備えたPL50 GPC設定(マサチューセッツ州アマースト、Polymer Laboratories)上で、ゲル浸透クロマトグラフィー(DMF/0.01M LiCl、ポリスチレン標準物質で較正、流量マーカーとしてトルエン、50℃)によって測定した。NMRスペクトルをBruker DPX300分光計(ウィスコンシン州マジソン、Bruker)上で記録した。高分解能質量スペクトルをJEOL JMS 700装置(マサチューセッツ州ピーボディ、JEOL)から得た。マトリックス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間型質量スペクトル(MALDI-TOF MS)をBruker Daltonics Reflex III(ウィスコンシン州マジソン、Bruker)上で測定した。ポリマー試料の生物活性(大腸菌(D31)および黄色ブドウ球菌(ATCC25923)の細菌成長の90%を阻止する最小濃度(MIC90)ならびに赤血球の50%を溶解させる濃度(HC50))を、既に報告された通り決定した(Huang, Biochemistry 2000, 39, 8347)。蛍光測定をPerkin-Elmer-LS55発光分光計およびJobin Yvon Fluorolog-3上で行った。リン脂質1,1'-2,2'-テトラオレオイルカルジオリピンナトリウム塩(CL)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミン(PE)および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-rac-(1-グリセロール)](PG)をAvanti Polar Lipids, Inc.からクロロホルム溶液として得て、受け取ったまま使用した。黄色ブドウ球菌からのペプチドグリカン抽出物をFlukaから得て、受け取ったまま使用した。
【０１０２】
ポリマー合成
モデルSMAMPの合成をスキーム3に示す(Brodgen, Nature Rev. Microbiol. 2005, 3, 238)。特性決定結果を表9に示す。
【０１０３】
（スキーム３）ジアミンポリマー合成
2012529557.tif 000047
【０１０４】
（表９）ポリマーの分析結果
2012529557.tif 000048
【０１０５】
色素漏出実験
小胞調製
2つの緩衝液を調製した。緩衝液AはH2O 100mL(濃度＝10mmol L-1)中Na2HPO4 1mmol (142mg)からなり、これを次に0.1mol L-1 NaOHでpH＝7.0に調整した。緩衝液BはH2O 1L(濃度＝10mmol L-1)およびNaCl 90mmol (5.26g)(濃度＝90mmol L-1)中Na2HPO4 10mmol (1.42g)から作製した。カルセイン色素0.4mmol (249mg)を緩衝液A 10mLに溶解させた。すべてのカルセインが溶解し、pHが7.0になるまで0.1mol L-1 NaOHを滴下して、40mmol L-1溶液を得た。
【０１０６】
完全に清潔な丸底フラスコに脂質溶液を加えた。CL小胞としてはクロロホルム中CL 600μL (10mmol)を使用し、PE/PG 4:1小胞としてはクロロホルム中PE 297μL (8mmol)およびPG 159μL (2mmol)を混合した。溶媒を蒸発させて脂質膜を得て、これを緩衝液中カルセイン溶液1mLで水和させた。懸濁液を1時間攪拌した後、5回の凍結融解サイクル(室温で液体窒素/水)に供した。その後、400nmの孔径を有するポリカーボネート膜を通じてそれを10回押し出した(Avanti Polar Lipids Mini-Extruder、Whatman膜)。Sephadex G-50および溶離液としての緩衝液Bを使用して、色素充填小胞を過剰の色素から分離した。カラムからの小胞画分を色素漏出実験用に20倍希釈した。
【０１０７】
蛍光測定
既に記載されたように、ポリマー誘導性漏出を、波長515nmにおけるカルセイン蛍光強度の増大を記録することでモニタリングした(励起波長＝490nm、スリット幅3.0) (Som, et al., J. Phys. Chem. B 2008, 112, 3495)。色素漏出データを正規化するために、ポリマー添加なしのカルセイン蛍光のベースラインを各試料について観察した。また、各測定後、Trition X (DMSO中20%) 20μLを加えて、100漏出%に対応する蛍光強度を決定した。これらのデータ地点について、測定された蛍光強度を漏出%に変換した(図14a)。ポリマー試料を様々な濃度でDMSOに溶解させた。純粋なDMSOを事前に試験したところ、漏出を引き起こさないことがわかった。濃度依存EC50曲線について、800秒後の漏出割合を濃度に対して片対数プロットにおいてプロットした。ポリマー誘導性漏出50%に対応するEC50濃度をヒル方程式
2012529557.tif 000049
を使用して決定した。式中、y(c)は所与の濃度cにおける漏出割合であり、yminはポリマー添加なしに対応する漏出割合であり、ymaxは高ポリマー濃度(飽和)での漏出割合であり、nは、結合に関与する分子数の尺度として解釈可能なフィットパラメータである。各実験でのポリマーおよび小胞の正確な量を表10(ペプチドグリカンなしの実験)および表11(ペプチドグリカンありの実験)にまとめる。すべての試料を最大全体積2mLまで緩衝液Bで充填した。
【０１０８】
（表１０）
2012529557.tif 000050
【０１０９】
（表１１）
2012529557.tif 000051
【０１１０】
c. 有機対イオンおよび電荷密度の変動による抗菌性の操作
ポリマーの抗菌性に対する異なる対イオンの効果についてはそれほど多くの文献が存在せず、SMAMPの文献においては本質的に無視されてきた(Ilker, et al., Journal of the American Chemical Society 2004, 126, 15870; Lienkamp, et al., J Am Chem Soc 2008, 130, 9836; Gabriel, et al., Chemistry - A European Journal 2009, 15, 433)。これまで刊行された数少ない試験は、ポリマーの性質に対する異なる無機対イオンの効果を調査している。Kanazawaらは、ポリマー-対イオンシステムのイオン対の堅固さとその抗菌活性との間の逆相関を推論した(Cl-＞BF4-＞ClO4-＞PF6-) (Kanazawa, et al, Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry 1993, 31, 1441)。Chenらが彼らのポリカチオン性デンドリマーに対して塩化物対イオンよりも臭化物対イオンの方が活性が高いことを認識した一方で、Panarinらは塩化物、臭化物およびヨウ化物の間で著しい差を認識しなかった(Chen, et al., Biomacromolecules 2000, 1, 473; Panarin, et al., Makromol. Chem. Suppl. 1985, 9, 25)。これらの試験における「活性」のランキングは、時間死滅試験における相対細菌生存率に基づいた。しかし、これらの試験のいずれもMICデータに関して抗菌活性を定量化しなかった。これにより、抗菌活性が対イオン交換によって実際に影響される程度の評価が困難になり、これらの試験間の比較がいっそう困難になる。以前の例は無機対イオンに重点を置いていたが、本発明者らが知る限り、トシレートまたはヘキサノエートなどの異なる有機対イオンの効果は試験されていない。
【０１１１】
様々な疎水性の対イオンは、ポリマーの疎水性、したがって抗菌性を調節するための容易で万能な手段を提供しうる。疎水性を調節するこのアプローチは、モノマー合成およびポリマー合成の両方のレベルにおいて、疎水基の共有結合に比べて、必要な合成上の労力がはるかに少ない。例えば、疎水性有機対イオンによって親水性モデルSMAMPのトリフルオロ酢酸対イオンを置換することで、ポリマーの抗菌性およびその膜活性が影響されうる。
【０１１２】
疎水性などの抗菌性に対する分子電荷密度の効果も使用することができる。徐々に変動するカチオン性電荷を伴うがポリマー構造全体および疎水性に対する変化が最小限である一連のポリマーを作製した。黄色ブドウ球菌対哺乳動物細胞の選択比が650と高い共重合体が発見された。
【０１１３】
実施例
1. ジアミンホモポリマー合成
繰り返し単位当たり2個の電荷を有する主に親水性のモデルのポリマーを合成した(スキーム4)。Boc保護アミノエタノールによる無水物1の塩基触媒開環によってモノエステル2を得た。2と第2の当量のアルコールとのDCCカップリングによってジアミンモノマー3を得て、グラブス第三世代触媒を使用する開環メタセシス重合(ROMP)によってこれを重合した(Jennifer, et al., Angewandte Chemie International Edition 2002, 41, 4035)。得られたBoc保護前駆体ポリマー4をトリフルオロ酢酸(TFA)で脱保護してカチオン性SMAMP 5を得た(スキーム4)。ポリマー5の最適な活性を決定するために、ある範囲の分子量を合成した。保護ポリマー4をゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって特性決定した。すべてのポリマーは狭い多分散性を有していたが(1.07〜1.15、表12)、DMF中でのポリスチレン較正GPCはそれらの分子量を極めて過大評価した。このことは、それらのポリマーの分子量Mnが標的分子量に近いことを示したMALDI-TOF質量分析によって確認された。GPCから得られた分子量に対してMn.標的をプロットする際に直線が得られ、これは重合が制御されたことを示している(図15)。
【０１１４】
（スキーム４）SMAMP 5を得るためのジアミンモノマーの合成および重合
2012529557.tif 000052
【０１１５】
脱保護SMAMP (5)の生物活性MIC90およびHC50を、標準的手順を使用して試験した(Rennie, et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 2005, 32, 296)。結果を表12に要約し、ここでジアミン_3kは3000g/molの分子量を有するポリマー5の試料を意味する。データは、すべてのポリマーが大腸菌に対して不活性であったが、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性は3000g/molポリマーで最高であり、MIC90が15μg/mLであったことを示す。分子量が増加した際に、抗菌活性が失われた一方、溶血活性HC50は全分子量でほぼ同一であった。
【０１１６】
（表１２）SMAMPホモポリマーの特性決定
a)保護ポリマー4についてGPC分析を行った(DMF、0.01M LiCl中、ポリスチレン標準物質で較正)。
b)TFA対イオンを有する対応する脱保護ポリマー5について生物学的性質(最小阻止濃度、溶血活性および選択性)を決定した。
2012529557.tif 000053
【０１１７】
対イオンの効果
ジアミン_3kがこの系列の最も活性の高いポリマーであることがわかったため、イオン交換試験をこの試料について行った。脱保護条件の結果、ポリマーの最初の対イオンはTFAであった。ポリマー溶液にイオン交換カラムを通過させることで、TFAを水酸化物に交換した。イオン交換の直後、過剰の標的対イオンの酸形態(HX)を加えた。これによって、側鎖のアミド基転移または塩基触媒エステル加水分解などの副反応が生じうる前に水酸化物が中和され、X-が対イオンとして生じた。過剰の酸を透析によって除去した。この方法を使用して、疎水性有機対イオンX-＝ヘキサノエート、ドデカノエート、ベンゾエートおよびトシレートを導入した。凍結乾燥ポリマーの1H-NMRスペクトルは、対イオン交換が成功したことを明らかにした。これらの疎水性有機対イオンは、それらの分配係数が大きいことから選択した(この文脈において、分配係数は、非極性ポリマー骨格に近い対イオン濃度をMIC実験のバルク極性緩衝媒体中の対イオン濃度で割った値として規定される)。したがって、TFAなどの比較的親水性の高い対イオンとは異なって、それらはポリマー骨格から離れて拡散することはなく、抗菌性に対する対イオンの効果がMIC実験において観察される。イオン交換ポリマーの系列のMIC90結果を表13に要約する。ポリマー骨格から離れては確実に拡散できない共有結合「分子内対イオン」の効果を調査するために、モノエステル2も重合してポリマー6を得た。TFAによる脱保護後、双性イオン性ポリマー7を得た(スキーム5)。そのMICデータも表13に含まれる。ここで便宜上ポリマー7の3000g/mol試料を双性イオン_3kと呼ぶ。
【０１１８】
（スキーム5）双性イオン性ポリマー7の合成
2012529557.tif 000054
【０１１９】
（表１３）脱保護ポリマーについて決定された、双性イオン性およびイオン交換ポリマーの最小阻止濃度。イオン交換ポリマーはそれらの対イオンによって呼ばれ、例えば、トシレート_3kはトシレート対イオンを有する3000g/molジアミンポリマーである。ジアミン_3kは当初のTFA対イオンを有する。
2012529557.tif 000055
【０１２０】
表13は、有機対イオンの存在がポリマーの抗菌活性に影響することを示す。疎水性対イオンを有するすべてのポリマーは、大腸菌に対して不活性なままであり、ジアミン_3kよりも黄色ブドウ球菌に対する活性が著しく低かったが、200μg/mL未満の範囲内でのそれらの相対活性の間の区別を行うことはできなかった。疎水性対イオンがポリマー骨格に近くにとどまることをこのデータが確認するというだけでなく、実際にはそれらは抗菌活性を排除するほど強く結合する。
【０１２１】
これについては2つの解釈が可能である。第一に、SMAMPが細菌膜と相互作用できず、したがってMIC実験において不活性のように見えるほど、疎水性対イオンはポリマー可溶性を減少させるという可能性がある。第二に、ポリマーの正電荷全体が有効に遮蔽されてSMAMPが不活性になるほど堅固なイオン対を、対イオンがアンモニウム基と形成する可能性がある。これら2つの可能性を区別する1つの方法は色素漏出実験を行うことである(Abhigyan, et al., J Phys Chem B 2008, 112, 3495)。これらの実験はポリマーの膜活性を精査するように設計されている。難溶性のポリマーは色素漏洩実験において依然として活性である。というのも、これらの実験は感受性がはるかに高いためである。難溶性であり、したがってMIC実験において不活性であるが、色素漏出実験において著しい膜活性を保持するポリマーの一例は、既に報告されたヘキシル_3kである(Lienkamp, et al., J Am Chem Soc 2008, 130, 9836)。しかし、イオン交換ポリマーの対イオンがポリマー骨格の正電荷を遮蔽する場合、これらのポリマーはMICおよび色素漏出実験のいずれにおいても不活性である。標準的手順を使用して、黄色ブドウ球菌の細胞膜の主要成分であるカルジオリピンからできている色素担持単層小胞を得た。小胞からの自己消光色素の漏出は蛍光を導くものであり、漏出を時間関数としてモニタリングした(Som, et al., J Phys Chem B 2008, 112, 3495)。小胞をイオン交換ポリマーの20μg/mL溶液にt＝100秒の時点で曝露した。色素漏出実験におけるポリマー濃度は20μg/mLである。これにより、MIC実験においてポリマー対小胞の比がポリマー対細菌の比よりもはるかに大きくなる。このポリマー濃度はMIC実験における濃度よりも低いが、分子が膜破壊性である場合、このはるかに大きいポリマー対小胞の濃度比は漏出を示すと予測される(Som, et al., Biopolymers (Peptide Science) 2008, 90, 83)。得られた色素漏出曲線を、標準Triton X-100に正規化された時間に対する漏出%として図16に示す。黄色ブドウ球菌模倣小胞からの色素漏出結果は、それらの細菌に対するMIC傾向に密接に従う。疎水性対イオンを有するポリマーは膜不活性であった(5漏出%未満)一方、親ポリマーのジアミン_3kは膜活性を示した(50漏出%超)。
【０１２２】
図17に示すように、ヘキサノエート_3kおよびヘキシル_3kポリマーは、各々アミン基当たり1個のヘキシル鎖を含有することから構造的に同様であるが、ヘキシル_3k (MIC90＞200μg/mL)は20μg/mLにおいて38漏出%を引き起こし、一方、ヘキサノエート_3kは5漏出%未満を引き起こす。これは、疎水性対イオンが堅固なイオン対を形成し、それによりポリマーの正電荷を劇的に減少させることで膜活性、したがって抗菌活性の損失が生じるという第二の解釈を裏付ける。
【０１２３】
興味深いことに、50μg/mLのMICを有する双性イオン性試料(双性イオン_3k)は、イオン交換試料よりも膜活性が高い(図16)が、ジアミン_3kポリマーよりも活性が低い。他のアニオンはポリマー骨格上の正電荷に対して自由に拡散する可能性があるが、これは双性イオン性試料に組み込まれた対イオンではあり得ない。しかし、図18に示すように、双性イオン性ポリマーが構造的に不規則であることから、これは骨格に沿った不規則な全体的電荷分布を導いて、局所的なカチオン性およびアニオン性パッチを導く。これらの残存電荷が理由で、双性イオン_3kの抗菌活性も膜活性も完全に消失することはない。
【０１２４】
2. 共重合による電荷変動
ジアミンモノマー3と構造的に同様なモノアミン-アルキルモノマーとを共重合することで、繰り返し単位当たりの電荷は徐々に2から1に減少した(図19) (Lienkamp, et al., J Am Chem Soc 2008, 130, 9836)。
【０１２５】
モノアミン-アルキルモノマー上にメチルからブチルまで変動するRを有する4系列の共重合体を合成した。保護共重合体のポリマー特性決定データ、および脱保護共重合体の生物学的データを、表14および図20に要約する。特定のホモポリマーのデータが比較用に含まれる(Lienkamp, et al., J Am Chem Soc 2008, 130, 9836)。M9:D1はメチル:ジアミン＝9:1のモル比を有する共重合体を意味し、一方、メチルはモノアミン-メチルホモポリマーを意味する。
【０１２６】
（表１４）共重合体の特性決定
a)保護ポリマーについてGPC分析を行った(DMF、0.01M LiCl、ポリスチレン標準物質)。
b)対応する脱保護ポリマーについて生物学的性質(最小阻止濃度、溶血および選択性)を決定した。
2012529557.tif 000056
【０１２７】
このデータが示すように、すべてのメチルおよびエチル共重合体は非溶血性であり(図20aおよび20b)、大腸菌に対して不活性であり、一方、プロピルおよびブチル共重合体は非常に溶血性になるが同時にアルキルコモノマー含有量の増大に従って大腸菌に対してさらに活性が高くなる(図20cおよび20d)。これは、これらのポリマーの性質がそれらR基の疎水性に支配されることを意味している。一方、メチル共重合体は、メチルホモポリマーであってもそれらの大腸菌に対する活性が限定されること、およびそれらの高HC50値によって観察されるように、明らかに最も疎水性が低い。限定された疎水性が理由である活性のこの欠如は、逆相薄層クロマトグラフィーの結果ならびに水およびDMF中でのポリマー溶解度と一致しており、これらは、モノアミン-メチルホモポリマーの極性がジアミンホモポリマーのそれに密接に類似する一方、エチル〜ブチル誘導体の方が著しく疎水性が高いことを示した。
【０１２８】
これらの試験は、メチル共重合体が、生物活性に対する電荷密度の効果を調査するために最も適切なモデル系であることを確認する。
【０１２９】
1000μg/mLのHC50を有するジアミン_3kから出発して、溶血活性はこの系列を通じて2600μg/mLのHC50を有するM9:D1まで減少する。これと並行して、同一ポリマーでの黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性は15μg/mLから4μg/mLに増大した(表14参照)。電荷がさらに減少すると(M9:D1からメチルへ)、MICが4μg/mLから100μg/mLに突然上昇し、これは、黄色ブドウ球菌に対するHC50およびMIC90の両方の最適な値がM9:D1で得られることを示している。
【０１３０】
この試験においてさらに興味深いことは、メチル共重合体およびジアミン_3kが哺乳動物細胞よりも細菌細胞に対して選択的であるだけでなく、大腸菌よりも黄色ブドウ球菌に対して選択的でもあるという発見である(図20a)。M9:D1および他の細菌を用いるさらなるMIC実験は、このポリマーがグラム選択性を有することを明らかにした。グラム陰性の大腸菌、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)および肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)に対しては不活性であったが(後者の2生物についてMIC90＝100μg/mL)、グラム陽性の黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌(S. epidermis)、さらには多耐性MRSAに対しては活性であることがわかった(MIC90＝12.5μg/mL)。
【０１３１】
SMAMPの抗菌活性および溶血活性に影響するいくつかの重要なパラメータを調査したことをここに開示する。例えば、ROMP由来ジアミンポリマーの親水性対イオンを疎水性有機対イオンで交換することで、そのポリマーの抗菌性が大幅に減少した。抗菌活性のこの損失が、対イオンとのイオン対形成によるポリマー骨格の正電荷の損失が理由であることが、モデル小胞に関する色素漏出試験によって示された。疎水性を付加するが同時に必要最小限の分子電荷を保持する、対イオンの部分交換によって、活性ジアミン_3kポリマーの性質と不活性ヘキサノエート_3kポリマーの性質との間の調節可能な性質を有するポリマーが得られる可能性があるが、これを実現しかつ実験的に定量化することが困難であるということが予測される。
【０１３２】
それぞれ1個および2個の電荷を有する2つの構造的に同様のモノマーの共重合は、電荷密度が徐々に減少するが疎水性が多少なりとも一定である一連の共重合体を導いた。これらの結果は、所与の両親媒性の系について、好ましいHC50値および活性を得るには最小電荷閾値が必要であることを示す。その閾値を超えれば、ポリマーの生物学的性質はさらなる電荷増大に影響されない。ここで調査する特定のジアミン-メチル共重合体系では、M9:D1でこの閾値に到達し、繰り返し単位当たりの平均電荷は1.1である。共重合体系の電荷密度を最適化するプロセスにおいて、黄色ブドウ球菌対ヒト赤血球の選択比が650と印象的であるポリマーが得られた。さらに、MRSAを含む試験したすべての菌株についてこのポリマーがグラム選択性であることがわかったため、このSMAMPは材料用途において有望な候補となる。
【０１３３】
実施例
一般
すべての化学物質をAldrich、FlukaまたはAcrosから試薬グレードとして得て、受け取ったまま使用した。第三世代グラブス触媒(ジクロロ-ジ(3-ブロモピリジノ)-N,N'-ジメシチレノイミダゾリノ-Ru=CHPh; G3)を、Grubbsらが既に記載したように合成した(Love, et al, Angew. Chem. Internat. Ed. 2002, 41, 4035)。HPLCグレード溶媒をAldrich、Fisher ScientificまたはAcrosから購入し、受け取ったまま使用した。THF (HPLCグレード、Fisher Scientific)を窒素下でナトリウム/ベンゾフェノンから蒸留した。ジクロロメタン(HPLCグレード、Fisher Scientific)を窒素下でCaH2から蒸留した。PL Gel 5μmプレカラムおよび2本の10μm分析用Mixed-Dカラム(マサチューセッツ州アマースト、Polymer Laboratories)を備えたPL50 GPC設定(マサチューセッツ州アマースト、Polymer Laboratories)上で、ゲル浸透クロマトグラフィー(DMF/0.01M LiClおよびTHF、各々ポリスチレン標準物質で較正、流量マーカーとしてトルエン、50℃)によって測定した。NMRスペクトルをBruker DPX300分光計(ウィスコンシン州マジソン、Bruker)上で記録した。高分解能質量スペクトルをJEOL JMS 700装置(マサチューセッツ州ピーボディ、JEOL)から得た。マトリックス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間型質量スペクトル(MALDI-TOF MS)をBruker Daltonics Reflex III(ウィスコンシン州マジソン、Bruker)上で測定した。ポリマー試料の生物活性(大腸菌(D31)および黄色ブドウ球菌(ATCC25923)の細菌成長の90%を阻止する最小濃度(MIC90)ならびに赤血球の50%を溶解させる濃度(HC50))を、既に報告された通り決定した(Rennie, et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 2005, 32, 296)。Amberlite IRA67アニオン交換樹脂(Aldrich)を対イオン交換に使用した。1000Daの分子量カットオフを有するセルロースエステル透析管(SpectraPor6、SpectrumLabs)を使用して透析を行った。蛍光測定をJobin Yvon Fluorolog-3上で行った。リン脂質1,1'-2,2'-テトラオレオイルカルジオリピンナトリウム塩(CL)をAvanti Polar Lipids, Inc.からクロロホルム溶液として得て、受け取ったまま使用した。
2012529557.tif 000057
【０１３４】
モノマー
CH2Cl2に溶解させたエキソ-7-オキサビシクロ[2.2.1]ヘプタ-5-エン-2,3-ジカルボン酸無水物1 (5g、30.0mmol)からモノマー2を得た。N-(tert-ブトキシカルボニル)エタノールアミン1.1当量(5.32g、33mmol)および10mol% 4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)を加えた。終夜攪拌後、溶液を濃縮した。エーテルを加えてDMAP塩を析出させ、溶液を濾過した。DMAP塩がもはや析出しなくなるまでこの段階を繰り返し、純粋な双性イオンを得た。単離収率は60〜70%であった。
2012529557.tif 000058
計算値299.31g/mol、実測値272.1g/mol (M = t-ブチル)。
【０１３５】
中間体2を単離することなく、エキソ-7-オキサビシクロ[2.2.1]ヘプタ-5-エン-2,3-ジカルボン酸無水物1からワンポット合成でジアミンモノマー3を得た。1 (5g、30.0mmol)をCH2Cl2に溶解させた。N-(tert-ブトキシカルボニル)エタノールアミン1.1当量(5.32g、33mmol)および10mol% 4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)を加えた。室温で終夜攪拌後、溶液を0℃に冷却した。N-(tert-ブトキシカルボニル)エタノールアミン1.1当量(5.32g、33mmol)およびDCC (N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド) 1.0当量(6.19g、30mmol)を加え、混合物を終夜攪拌した。析出物をショートアルミナカラム(5cm中性Al2O3/ジクロロメタン)を通じて濾過し、透明溶液を得た。溶媒を減圧蒸発によって除去し、粗生成物をクロマトグラフィー(15cmシリカゲル、ヘキサン:酢酸エチル勾配、9:1〜1:1)にかけた。溶媒の蒸発によって純粋なモノマーを得た。単離収率は70〜80%であった。
2012529557.tif 000059
2012529557.tif 000060
計算値470.52g/mol、実測値471.23 g/mol。
【０１３６】
モノアミン-アルキルモノマー
共重合体M、E、PおよびB用のモノマー(R＝メチル、エチル、プロピルおよびブチル)を合成および特性決定した(Lienkamp, et al, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9836)。
【０１３７】
ホモ重合
モノマー(2、3または9)および各量のG3触媒(詳細は表15参照)をジクロロメタン各1mLに溶解させ、3回の凍結融解サイクルに供した。激しく攪拌中のモノマー溶液にN2下室温で触媒を一度に加えた。30分後、リビングポリマー鎖を過剰のエチルビニルエーテル(1mL、754mg、10.5mmol)で末端封止した。溶液を2時間攪拌した。溶媒の蒸発および乾燥後、各ポリマーのアリコートをGPCおよびNMR分析用に取得した。生成物は褐色固体であった。ポリマー4および10ではDMF (0.01M LiCl、ポリスチレン標準物質)中、ポリマー6ではTHF (ポリスチレン標準物質)中でGPCを行った。NMRおよびMALDI-TOFデータを以下に示す。
2012529557.tif 000061
2012529557.tif 000062
MALDI-TOF MS（ジアミン_3k）
Mn＝3409g/mol、Mw/Mn＝1.07、M繰り返し単位＝469.6g/mol。
2012529557.tif 000063
2012529557.tif 000064
MALDI-TOF MS: 該当なし。
【０１３８】
（表１５）ホモポリマー合成の実験パラメータ
2012529557.tif 000065
【０１３９】
ホモポリマー脱保護
粗ポリマー4および6をそれぞれジクロロメタン2mLに溶解させた。過剰のTFA (2mL、2.97g、26.0mmol)を加え、溶液を室温で終夜攪拌した。ロータリーエバポレーターにおけるジクロロメタン(2x15mL)およびメタノール(1x15mL)との共沸蒸留によって過剰の酸を除去した。試料を終夜減圧乾燥させ、溶解度に応じてMilli-Q水またはDMSO 30mLに溶解させた。12時間の透析後に水の導電率が0.1μSになるまでそれらをMilli-Q水に対して透析した(全透析時間4〜7日)。次に加水分解ポリマー(5および7)を凍結乾燥させた。
2012529557.tif 000066
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【０１４０】
共重合
ホモポリマーと同一の方法を使用して共重合体を合成した。試薬の具体的な量を表16に示す。各コモノマーをアルゴン下で別々にジクロロメタン0.7mLに溶解させた。モノマー溶液を混合し、ジクロロメタン1mL中の各量のG3触媒を一度に加えた。各繰り返し単位プロトンの1H-NMR分光データは、ホモポリマー中の類似プロトンの割り当てと一致した(Lienkamp, et al, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9836)。可能な場合(ピーク重複なし)は積分によって、共重合体組成がモノマー供給比と一致することを明らかにした。単純化するために、1H-NMRピーク位置を各繰り返し単位について別々に示す。
2012529557.tif 000070
R＝アミン: 上記参照(ポリマー5)
2012529557.tif 000071
【０１４１】
（表１６）共重合体合成の実験パラメータ
2012529557.tif 000072
【０１４２】
共重合体脱保護
ホモポリマーと同一の方法を使用して共重合体を脱保護し、1H-NMRによって特性決定した。やはりNMRピークを各繰り返し単位について別々に示す。
2012529557.tif 000073
R＝ジアミン: 上記参照(ポリマー6)。
2012529557.tif 000074
【０１４３】
イオン交換
20cmガラスカラムをAmberlite IRA樹脂で充填し、使用前に蒸留水500mLで洗浄した。ジアミン_3kポリマーを水に溶解させ(濃度＝1g/L)、カラムにゆっくり通過させ(1滴/分)、蒸留水200mLで洗い流した。回収直後、OH-対イオンを有するポリマーを含有する溶液を4つの部分に分割した。各対イオンのその酸形態(トルエンスルホン酸、安息香酸、ヘキサン酸およびドデカン酸)のDMSO溶液を10倍過剰で加えた。透析水の導電率が新鮮な蒸留水のそれ(0.1μS)と等しくなるまで、混合物を蒸留水10Lに対して透析した。次にポリマー溶液を凍結乾燥させた。イオン交換試料の親ポリマーのGPCデータをそれらの抗菌活性と共に表17に示す。1H-NMRはイオン交換が成功したことを明らかにした(それぞれ、トシレートおよびベンゾエートではさらなる芳香族シグナル、ヘキサノエートおよびドデカノエートでは脂肪族シグナル)。
【０１４４】
（表１７）
a) 保護親ポリマーのGPCデータ
b) 加水分解イオン交換ポリマーのMICデータ
2012529557.tif 000075
【０１４５】
小胞調製 
2つの緩衝液を調製した。緩衝液AはH2O 100mL(濃度＝10mmol L-1)中Na2HPO4 1mmol (142mg)からなり、これを次に0.1mol L-1 NaOHでpH＝7.0に調整した。緩衝液BはH2O 1L(濃度＝10mmol L-1)およびNaCl 90mmol (5.26g)(濃度＝90mmol L-1)中Na2HPO4 10mmol (1.42g)から作製した。緩衝液A 10mL中カルセイン色素0.4mmol (249mg)からカルセイン溶液を調製した。すべてのカルセインが溶解し、pHが7.0になるまで0.1mol L-1 NaOHを滴下して、40mmol L-1溶液を得た。
【０１４６】
完全に清潔な丸底フラスコにCL脂質溶液を加えた。クロロホルム中CL 600μL (10mmol)を使用した。溶媒を蒸発させて脂質膜を得て、これをカルセイン溶液1mLで水和させた。懸濁液を1時間攪拌した後、5回の凍結融解サイクル(室温で液体窒素/水)に供した。その後、400nmの孔径を有するポリカーボネート膜を通じてそれを10回押し出した(Avanti Polar Lipids Mini-Extruder、Whatman膜)。Sephadex G-50および溶離液としての緩衝液Bを使用して、色素充填小胞を過剰の色素から分離した。カラムからの小胞画分を色素漏出実験用に緩衝液Bによって20倍希釈した。
【０１４７】
色素漏出実験
ポリマー誘導性漏出を、波長515nmにおけるカルセイン蛍光強度の増大を記録することでモニタリングした(励起波長＝490nm、スリット幅3.0) (Eren, et al., Macromol. Chem. Phys. 2008, 209, 516)。色素漏出データを正規化するために、ポリマー添加なしのカルセイン蛍光のベースラインを各試料について観察した。また、各測定後、Triton X-100 (DMSO中20%) 20μLを加えて、100漏出%に対応する蛍光強度を決定した。これらのデータ地点について、測定された蛍光強度を漏出%に変換した。ポリマー試料を濃度2g/LでDMSOに溶解させた。純粋なDMSO、および各対イオンの酸形態を事前に試験したところ、漏出を引き起こさないことがわかった。小胞の1/20希釈液20μLを緩衝液B 1980μLに加えた。ポリマー溶液20μLをt＝100秒の時点で加えた後、Triton Xをt＝800秒の時点で加えた。この手順を図21に示す。
【０１４８】
d. 抗菌ポリマー中の面両親媒性モノマー対隔離型モノマー
抗菌ポリマーの両親媒性の改変は、最も一般的には2つの方法を通じて達成された(図23)。第一は「隔離型」モノマーの共重合であり、相対的に非極性のモノマーと遮蔽されたカチオン性モノマー(カチオン性基は重合後に生成される)とを重合することで、カチオン性両親媒性ランダム共重合体を生成する。ある範囲の疎水性を有する構造的に異なる非極性モノマーを使用するか、または供給比を調整することで、共重合体の両親媒性を直接的に変動させることができる。この戦略はDeGrado、GellmanおよびSenによって独立して、また本発明者らによって本報告において例示されている(それぞれ構造A〜D、図23)(Kuroda, et al. Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 4128-4129; Mowery, et al. Journal of the American Chemical Society 2007, 129, 15474-15476; Sambhy, et al. Angewandte Chemie, International Edition 2008, 47, 1250-1254)。
【０１４９】
「面両親媒性」(FA)モノマーを使用する第2の方法は、本発明者らの実験室において開発された選択であり、遮蔽されたカチオン性基および非極性基の両方を保有するモノマーの合成を包含する(Ilker, et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870-15875)。したがって、得られるポリマーのどの繰り返し単位もカチオン性基および調節可能な非極性部分を有する。ポリマーEの空間配置(図23)またはポリマーFのリンカー屈曲性は、それが細菌膜の両親媒性リン脂質二重層と相互作用するように適合する際に、荷電部分および非極性部分をポリマー骨格の対向側に場合によって位置づけることを可能にする。事実上、ポリマーそれ自体がFAとなりうる。一連のこれらの種類のポリマーの試験は、化合物が特定の細菌を優先的に標的化して哺乳動物の赤血球を標的化しない、いくつかの非常に選択的なポリマーの発見を導いた(図23)。
【０１５０】
1つのアプローチは、細菌の膜が、溶液中の予め組織化されたFA二次構造の助力なしでSMAMPの全体的に両親媒性の立体配座を誘導するというものである(Arnt, et al. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 2004, 42, 3860-3864; Arnt, et al. Langmuir 2003, 19, 2404-2408; Arnt, et al. Journal of the American Chemical Society 2002, 124, 7664-7665; Mowery, et al. Journal of the American Chemical Society 2007, 129, 15474-15476)。これらの場合、効力を示す上で、規定された二次構造(例えばヘリックスまたはβシート)に荷電基および非極性基の配向が必ずしも従わなくてもよいと仮定した。言い換えれば、ヒトのデフェンシンおよび両生類のマガイニンなどのAMPは十分に規定されたFA溶液構造を示すが、それは大部分のSMAMPの活性の要件ではないということがわかった。したがって、いくつかの系は、屈曲性ポリマーが全体的FA立体配座をおそらく達成できることを示した(Schmitt, et al. Journal of the American Chemical Society 2007, 129, 417-428; Kuroda, et al. Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 4128-4129; Arnt, et al. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 2004, 42, 3860-3864; Arnt, et al. Langmuir 2003, 19, 2404-2408; Arnt, et al. Journal of the American Chemical Society 2002, 124, 7664-7665)。
【０１５１】
第二は、電荷および非極性基の特定の空間配置が、Senおよび共同研究者が完全に示した生物活性に大きく影響するというアプローチである(Sambhy, et al. Angewandte Chemie, International Edition 2008, 47, 1250-1254)。彼らは、正電荷およびそれらの非極性アルキル末端の空間配置においてのみ異なるいくつかの系列のピリジニウムポリマーを精査した(ポリマーC、図23)。一部の共重合体は、カチオン性電荷および様々なアルキル基を同一ピリジニウム環上に含み、他の共重合体では、これらの基は異なる単位上に位置した。最も注目すべきことに、彼らの系は、電荷全体の効果(したがって全体的両親媒性)を精査し、荷電基および非荷電側基の配置をポリマーに沿って局所的に精査することがない多くの他の系と対照的である(Sambhy, et al. Angewandte Chemie, International Edition 2008, 47, 1250-1254)。
【０１５２】
空間配置は、ポリマーの活性を決定する上で意味がある。ポリノルボルネンの枠組み内で、これは、FAモノマーから構成されるポリマーと、荷電部分および非極性部分が異なるモノマー上に隔離されているポリマーとの間の直接比較を与える(図24)。全体的に、ポリアミンオキサノルボルネン(PAON)はほとんど抗菌活性および溶血活性を示さなかった。アミンおよび様々なアルキル鎖が異なるモノマー上に存在する新規共重合体は、強力で選択的なポリマーを獲得するという目的で広範な両親媒性を調査するために設計された。隔離型モノマーを共重合するこの戦略はPAONを活性ポリマーに変換し、一部のポリマーは有望な活性を有した。しかし、まさに同等のFAモノマーで構築されるポリマーよりも優れた選択性を有するポリマーは発見されなかった。色素充填リポソームを使用するポリマー誘導性漏出試験は、活性ポリマーの膜破壊機構を実証し、一方、共重合体の存在下での染色細胞の顕微鏡観察は、細胞凝集と共に、主要な死滅事象としての膜損傷を裏付ける。
【０１５３】
実施例
設計および合成
荷電基および非極性基を分割するモノマーを有するランダム共重合体(図25)を合成した。FAモノマーを使用する以前の系においてそうしたように合成初期に疎水性を導入する代わりに、普遍的なオキサノルボルネンイミド前駆体を使用し、異なるアルキル鎖で誘導体化した(図30)。1種のboc保護アミンオキサノルボルネンモノマー、および様々なアルキル鎖を保有する11種のモノマーを合成した。開始点として、グラブス第三世代触媒によって触媒される開環メタセシス重合を使用して、50/50mol%ランダム共重合体を2つの分子量において標的化した(Love, et al. Angewandte Chemie, International Edition 2002, 41, 4035-4037)。ゲル浸透クロマトグラフィーは、狭い多分散指数(1.04〜1.15)を有する単峰性シグナルを示した。この戦略では、コモノマーの供給比を変動させることだけで、広範な両親媒性を有するがほぼ同一数のアミン、したがって電荷を有する共重合体を容易に得ることができる。
【０１５４】
生物学的アッセイ
MICアッセイを使用して、グラム陰性Ecおよびグラム陽性Saに対するこれらのポリマーの抗菌性を評価した(表18)。PAONが両方の細菌に対して不活性である(MIC＝400μg/mL)ことがわかった一方で、低分子量共重合体のEcに対するMIC値は、中程度の疎水性のポリマー(A4、A4'、A5およびA5')が最も強力な活性を有する(MIC＝50μg/mL)という明らかな傾向を示した(表18および図26)。最も親水性の共重合体A1および最も疎水性の共重合体A12はPAONと同一の活性を示した。同様の傾向がSaに対して見られたが、これらの共重合体は一般にグラム陽性菌に対してわずかに優れて機能した。比較的高分子量の共重合体は大部分が、それらの比較的低分子量の類似体に比べてかなり不活性であった。これに比べ、FAモノマーで構築された以前のポリノルボルネンは、3.8μg/mLと低いMICを有するポリマーであると同定された。
【０１５５】
（表１８）抗菌活性および溶血活性
2012529557.tif 000076
aMICおよびHC値はμg/mLで報告する。Ec＝大腸菌、Sa＝黄色ブドウ球菌、選択性＝HC/MIC。選択性値は不活性モノマーについて示されない(MIC≧400μg/mL)。
【０１５６】
比較的疎水性の高い基をポリアミン上に組み込むことで、ヒト赤血球を溶解させる共重合体の能力が増大した。高溶血濃度(HC)は、哺乳動物細胞に対する非毒性の1つの尺度であり、自己滅菌表面および固定具用に開発されたポリマーとは対照的に、身体において使用可能なポリマーには重要である。低分子量共重合体では、望ましくない溶血活性(HC≦50μg/mL)を、A4およびA4よりも疎水性の高い共重合体について測定した。比較的高分子量の共重合体は、A3において早くも始まる望ましくない溶血活性を示した。最後に、10を超える選択性値(HC/MIC)(マガイニンはEcおよびSaの両方について10という選択比を有する)が、低分子量A1およびA3においてのみ観察された(Saの選択比＝両共重合体において20)。この値は、100超(図24の中心ポリマー)および533超(図23の構造Fのいくつかのポリマー)という以前の試験における最も選択的なポリマーに見られた値をはるかに下回る。
【０１５７】
荷電部分および非極性部分を分割するモノマーを使用して生物活性を調整する能力は有望であった。50/50から逸脱する供給比も調査した。不活性な低分子量A1および活性だが選択的ではないA5'の類似体を試験した(表19)。生物活性は劇的には向上しなかった。特に、A1にさらなる疎水性を組み入れることで活性が大きく向上することはほとんどなかった一方、A5'にさらなる電荷を付加することで共重合体の高溶血活性は排除されなかった。
【０１５８】
（表１９）非50/50共重合体(低分子量)のデータ
2012529557.tif 000077
【０１５９】
生物学的性質を調節する能力の欠如は驚くべきことであった。非極性部分の比の増大を経由してA1に疎水性を付加することは、いずれも活性である比較的疎水性の高い共重合体A4およびA5と同様の両親媒性に近い共重合体を理論的には生成するはずであると考えられた(表18)。言い換えれば、全体的両親媒性が活性の主要な決定要素である場合、非極性基の十分に高い比(＞50%)を有するA1共重合体は、いずれも50%の非極性比を有しかつ中程度に抗菌性であるA4またはA5の疎水性(したがって活性)に近づくはずである。同様に、比較的高いアミン対非極性モノマー比がA5'のHC値を相対的に疎水性の低いA1のそれ(HC＝2000μg/mL)に近づけることができると予測されたにもかかわらず、供給比調整を通じてA5'をより高親水性にすることは、意外にもその溶血活性を減少させなかった。
【０１６０】
非50/50共重合体に関するこれらの予測されない結果は、50/50共重合体と比較した際に、特にFAモノマーからのポリマーと比較した際に、電荷および非極性基の空間配置が重要であって単に全体的両親媒性が重要というわけではないという発見を裏付ける。実際、FAモノマーから作製されるポリマーがリン脂質二重層と相互作用するやり方において、隔離型モノマーの共重合ではおそらく達成できない著しく有益な効果が存在しうる。
【０１６１】
ランダム共重合の不完全な統計上の性質が理由で、ポリマー集合の少なくとも一部の割合において極性単位および非極性単位の流れが存在することがあるという可能性がありうる(図27Bは、3つのカチオン性基および隣接する非極性単位の区分の流れを示す)。この配置は、特にポリマーがFA単位のポリマー(図275A)についてここで推論されるように膜との緊密な接触を示すというよりむしろすべての繰り返し単位において輪になって膜に入りかつ膜から出るという場合、脂質膜二重層を破壊するには最適ではないことがある。FAモノマーからのポリマーでは、ポリマー集合の100%すべてが、理想的なカチオン性対疎水性比を含むモノマーを有する。これらの結果が理由で、膜活性ポリマーにおける抗菌活性および特異性が全体的電荷密度の問題であるとは考えられなかった。ここに提示される共重合体の系列は広範な全体的電荷密度を示した。局所的電荷密度、およびポリマーを通じたその密度の一貫性が非常に重要でありうる。
【０１６２】
膜試験
2つの実験、すなわち小胞色素漏出および蛍光顕微鏡観察を使用して、これらの共重合体の膜破壊活性を精査した。Ec脂質抽出物から構成される色素充填リポソームに対するポリマー誘導性漏出試験を行って、最も活性の高い共重合体が最も多くの色素放出を引き起こすことを示した(図28)。これらのEc小胞は膜を十分に擬態しているようであり、色素漏出結果はMIC値とほぼ一致する。しかし、PAONおよびA12の漏出能力を比較した際に理解できるように、それらはEcの完全な模倣物ではない。PAONおよびA12はEcに対する400のMICを有するが、A12ははるかに多くの色素放出を引き起こした。おそらく、高分子電解質と小胞膜との間の複雑な相互作用において、疎水性のより高いポリマーが、膜二重層に埋め込まれた長いアルキル脂質鎖とよりよく相互作用しうると考えなければならない。しかしA12は、疎水性がより低いが抗菌性がより高いA4およびA5ほど多くの漏出を引き起こさない。
【０１６３】
さらに、生Ec菌を二成分染料と共にインキュベートし、ポリマー有りまたは無しで処理した(図29)。染料は、すべての細胞を染色する能力を有する緑色発光染料(InvitrogenからのSYTO9)、および損傷した膜を有する細胞にのみ進入可能な赤色発光ヨウ化プロピジウム色素でできている。蛍光顕微鏡観察は、PAONが本質的に負の対照と同一のEcに対する効果を有することを示した。抗菌A4は、比較的激しい赤色発光を示しただけでなく、引き裂かれた膜の断片の凝集をおそらく理由とする細胞の凝集も示した。
【０１６４】
ここで、共通の共重合戦略(遮蔽されたアミンモノマーと異なる非極性モノマーとを異なる供給比で共重合すること)を使用して、いくつかの抗菌ポリアミンオキサノルボルネンを同定した。しかし、設計された「面両親媒性」モノマーを使用する別のスキームは、より良い活性および優れた選択性を有するポリマーを与えた。最適な疎水性が、最も活性の高い50/50共重合体について観察された。驚くべきことに、非50/50共重合体の調査は、向上した活性または選択性を導かなかった。この結果は、活性および選択性の高いポリマーを得る上で、局所的モノマーレベルの疎水性/親水性区域のバランスが、単なる全体的両親媒性または全体的電荷密度よりもはるかに決定的に重要であることを裏付ける。生物学的性質のより良い制御のためにFAモノマーを使用することができる。
【０１６５】
合成および特性決定
非極性オキサノルボルネンモノマーであるモノマー1〜12の合成は、既に報告されたエキソ-オキサノルボルネンイミドのN-アルキル化を包含した(図30)。典型的には、オキサノルボルネンイミド(1当量)をCH3CN (Fisher Scientific)に溶解させ、適切な臭化アルキル(1.2当量、Aldrich)およびK2CO3 (2当量、Fisher Scientific)を加え、激しく攪拌し、4〜8時間還流させる。次に不均一混合物を粗フリット漏斗を通じて濾過し、CH3CNを蒸発させる。残渣は典型的には油状物であり、これをEt2O (Fisher Scientific)に溶解させ、飽和食塩水で4回洗浄する。Et2OをNa2SO4 (Fisher Scientific)で乾燥させ、蒸発させた。次に、CH2Cl2/MeOH勾配を使用するシリカゲルクロマトグラフィーに固体を供して、純生成物を主のマーに応じて収率55〜82%で得た。モノマー1〜12のNMR特性決定を以下に示す。
【０１６６】
グラブス第三世代触媒[(H2Imes)(3-Br-py)2-(Cl)2Ru=CHPh]を使用する開環メタセシス重合(ROMP)によって、このモノマーを共重合した。重合後、試験管に適切なモノマー(全100mg)および触媒を加えた。試験管をセプタムで封止し、N2で5分間掃流した後、乾燥CH2Cl2 1mL (Acros、N2およびモレキュラーシーブ下で充填)を注入した。N2ラインを除去し、透明褐色溶液を28℃で30分間攪拌した後、エチルビニルエーテル0.4mLを注入してポリマーを反応停止させた。15分間攪拌後、攪拌中のペンタン300mLに溶液を滴下してポリマーを析出させた。ペンタン溶液をさらに30分間攪拌し、1時間妨害なしで静置した。次に析出物を微焼結漏斗で収集した。次にポリマーをCH2Cl2 1mLに再溶解させ、再析出させ、収集した後、8時間減圧乾燥させた。Boc保護PAONおよびA1〜A12のNMR特性決定を以下に示す。
【０１６７】
1:1 TFA:CH2Cl2 8mL中で100mgを2時間攪拌することで、Boc保護ポリマーを脱保護した。40℃に設定したロータリーエバポレーターで溶液を油状物に乾燥させ、さらなるCH2Cl2中で油状物を超音波処理し、溶媒を再度ロータリーエバポレーターで蒸発させることで残留TFAを除去した。得られた固体を減圧下に2時間配置した。最後に固体をH2O 4mLに完全に溶解させ、ポリエーテルスルホン(PES)シリンジフィルター(Whatman、直径25mm、孔径0.45μm)を通じて濾過し、48時間凍結乾燥させて、卵殻色の軟質固体を得た。最終脱保護ポリマーを-20℃で保存した。
【０１６８】
装置構成
ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)をBoc保護ポリマーについて、Waters示差屈折計検出器を備えたPolymer Lab LC1120ポンプを用いて行った。移動相をTHFとし、流量を1.0mL/分とした。105、104および103Å Polymer Labカラムを用いて分離を行い、狭い分子量のポリスチレン標準物質に対して分子量を較正した。Boc保護ポリマーはTHF可溶性であり、GPCを使用してMnおよび多分散指数(PDI)を概算した。1H-NMRおよび13C-NMRスペクトルをBruker DPX-300またはBruker Avance-400 NMR分光計上で得た。
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【０１６９】
共重合体のNMRデータ
NMRによる共重合体組成の決定にあたって、Boc保護荷電モノマーのt-ブチル基の積分値を、非極性モノマーに割り当てられたメチルシグナルと比較して、荷電:非極性モノマー比を得た。3.3〜3.5ppm範囲のプロトンシグナルを、試料における水シグナルによって不明瞭にした。以下のNMRデータは比較的高分子量についてのものであるが、低分子量類似体のシス:トランス比および荷電:非極性モノマー比も同様に示す。脱保護共重合体(TFA塩類似体) A1〜A12のNMRデータも示す。
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【０１７０】
微生物および溶血アッセイ
EcおよびSaの細菌懸濁液(大腸菌D31および黄色ブドウ球菌ATCC 25923)をミューラー・ヒントン培地(MHB)中37℃で終夜成長させ、新たなMHBによって600nmでの光学濃度(OD600) 0.001に希釈した。このOD600は初期細菌濃度約105細胞/mLを示した。この懸濁液を、DMSO (40mg/mLストック溶液)中に系列希釈で溶解した異なる濃度の新たに調製されたポリマー溶液と96ウェルプレート中で混合し、37℃で6時間インキュベートした。ポリマー溶液またはMHBのみの存在下でインキュベートした細菌懸濁液についてOD600を測定した。成長の90%超の阻止が6時間後に観察された濃度である最小阻止濃度(MIC)として抗菌活性を表した。すべての実験は四つ組で行った。
【０１７１】
溶血活性測定をすべてのポリマーについて行った。新たに取り込んだヒト赤血球(RBC、30μL)をトリス食塩水(10mMトリス、150mM NaCl、pH 7.2、孔径0.22μmのPES膜を通じて濾過) 10mLに懸濁させ、遠心分離(1500rpmで5分間)によって3回すすぎ、トリス食塩水で再懸濁させた。ポリマー溶液をDMSO中40mg/mLで調製し、必要に応じてさらに希釈した。異なる濃度を有する新たに調製したポリマー溶液を、上記で調製したRBC懸濁液100μLに加えて、96ウェルプレート上で最終容積200μLに達するようにした。得られた混合物を攪拌プレート上にて37℃で30分間維持した。次にプレートを遠心分離し(IEC Centra-4B、1500rpmで10分)、各ウェル中の上澄み液を新たなプレートに移した。放出されたヘモグロビンの414nmでの吸光度を測定することで溶血をモニタリングした。強力な界面活性剤であるTriton-X (Sigma-Aldrichからのポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル溶液(DMSO中20体積%) 10μLを、上記で調製したHRBC懸濁液に加えることで、100%溶血を得た。50%溶血を引き起こすために必要なポリマー濃度の上限をHC50として報告し、ポリマーを含有しないトリス食塩水からの吸光度を0%溶血として使用した。すべての実験は四つ組で行った。
【０１７２】
大きな単層小胞からの色素漏出
以下は大きな単層小胞(LUV)を作製する一般的手順である。Ec脂質(25mg、Avanti Polar Lipids, Inc.)のクロロホルム溶液を10mL丸底フラスコ中で混合し、クロロホルムを室温でロータリーエバポレーターによって除去して均一膜を形成した。フラスコを減圧下でさらに6時間配置した。乾燥した膜を、NaCl無添加のトリス緩衝液中の40mMカルセイン(Sigma-Aldrich)水溶液1mLで水和させた。カルセイン色素溶液は、pH＝7に調整した後で膜に加えた。液体窒素および温水を使用する5回の凍結融解サイクルに溶液を供した。全体積1mLの溶液を、2つの孔径400nm PC膜(Avanti Polar Lipids, Inc.)を通じた室温での押し出し(全15回の通過)に供した。最後に、トリス食塩水緩衝液で溶出するSephadex-25 (Sigma-Aldrich)で充填した小さなカラムを通じて溶液を加圧させて、捕集されないカルセイン色素を除去した。画分(各約5滴)を収集した。小胞溶液は、必要に応じて最大4日間、バイアル中に4℃で保存し、希釈することができる。
【０１７３】
界面活性剤なしで80任意単位未満、および界面活性剤の添加後に800任意単位超の蛍光強度を与える、希釈カルセイン担持小胞画分を使用した(励起＝490nmを使用、発光＝515nmでモニタリング)。完全な小胞破壊および漏出を引き起こす強力な界面活性剤として0.2% Triton-X 50μLを使用した。典型的には、選択された小胞画分を6倍希釈し、このストック溶液25μLをトリス食塩水緩衝液2mLに加える。80任意単位未満の蛍光強度が1分間にわたって安定であることを確認した後、ポリマーストック溶液25μLを加え(キュベット中最終濃度2.5μg/mL)、ピペッターの先端で短時間攪拌し、次に515nmでモニタリングする。5分後、Triton-Xを加え、対応する蛍光を100漏出%とした。
【０１７４】
染色細菌細胞の蛍光顕微鏡観察
100W水銀灯(Chin Technical Corp.)を備えたOlympus BX51 反射蛍光顕微鏡(ニューハンプシャー州ナシュア、Optical Analysis Corp.)を蛍光試験に使用した。1:1ヨウ化プロピジウム:SYTO9混合物中の蛍光色素としてBacLight(商標)キットL-7012 (Invitrogen Corp.)を使用して、ポリマーの存在下でのSaを調査した。可視化を容易にするために、約108細胞/mLの初期細菌濃度を顕微鏡試験に使用した(MICおよび殺菌動態試験よりも3桁高い)ことに言及することが重要である。色素混合物を細菌と共に室温で15分間インキュベートした後、ポリマー溶液(最終濃度75μg/mL)を加えた。細胞、色素およびポリマーの溶液を30分間静置した後、50μLをスライド上に配置し、カバーガラスを装着し、可視化した。緑色フィルター(励起/発光、420〜480nm/520〜800nm)または赤色フィルター(480〜550nm/590〜800nm)下で細菌を見た。
【０１７５】
e. ROMPに基づくSMAMP用プラットフォーム
AMPからフォルダマーを経由してROMPに基づくSMAMPへ−ある進化
AMPは、無脊椎動物からヒトまで多くの生物において見られる宿主防御ペプチドである。それらの重要な特徴は、図31に示すようにそれらが面両親媒性分子であるということである。それらは、親水性で正に荷電した基を有する面(青色)および疎水性面(緑色)を含む(Boman, Immunol. Rev. 2000, 173, 5)。分子の2つの対向側への親水性および疎水性側鎖のこの隔離は、ペプチドのアミノ酸配列により生じ、アミノ酸配列は骨格の立体配座、したがって分子の二次構造も決定する。大部分の伝統的な抗生物質が特定の分子標的を有する一方で、AMPは、細菌の膜に対する直接作用を含む非受容体相互作用を使用するが、いくつかの場合では細胞内標的が同定された(Brodgen, Nature Rev. Microbiol. 2005, 3, 238)。それらの面両親媒性は、それらが細胞膜に挿入されて膜脂質組織化を局所的に変化させることを可能にし、これは孔形成、膜破壊、または細胞生存能が損なわれるように膜弾性に影響を与える他の相互作用を導く。AMPによる膜貫通孔形成のためのいくつかの機構が提示された(カーペット、バレルステーブおよびドーナツ型孔モデル)(Brodgen, Nature Rev. Microbiol. 2005, 3, 238; Yang, et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 127, 12141; Zasloff, Nature 2002, 415, 389; Boman, Immunol. Rev. 2000, 173, 5; Hancock, et al., Trends Biotech. 1998, 16, 82; Yeaman, et al., Pharmacol. Rev. 2003, 55, 27)。カチオン性親水基と疎水基との間の慎重なバランスは、哺乳動物細胞の中性でホスファチジルコリンとコレステロールに富んだ表面と細菌の負に荷電した細胞表面とをAMPが区別することを可能にする。
【０１７６】
天然生物からのAMP抽出、または多段階合成におけるそれらの産生は、時間がかかって高価であることから、SMAMP研究は、AMPの抗菌活性を保持するがより少ない数の合成段階で大量に得られる分子のライブラリーを与えるプラットフォームのために注力した。したがって、α-およびβ-アミノ酸、ペプトイド、芳香族オリゴマー、ステロイドならびに合成ポリマーを含む多くの物質クラスが使用された。
2012529557.tif 000083
当初、AMP骨格のヘリックス状の強固さ(図31)が生物活性の必要条件であると考えられた。結果として、初期の研究は、天然構造において観察される側鎖の両親媒性αヘリックス配置を模倣することに重点を置くことで、天然アミノ酸に基づく多数の強力で選択的な抗菌ペプチドを導いた。βペプチドの利用可能性は、SMAMPの構築に必要な特徴を試験し、さらに解明するための別の手段を提供した。β3ペプチドは、約3残基の幾何学的繰り返しを有する「14ヘリックス」(繰り返し水素結合環内の14残基)の形をとる。したがって、適切に設計されたβペプチドの配列内の正確な3残基周期性を伴って極性および非極性側鎖が配置される場合、それらはヘリックスの対向側に隔離される。実際、hAla、hLeuおよび/またはhValから構成される繰り返しトリペプチド(βアミノ酸はβ3置換されていた)は抗菌活性を有することがわかった。一方、Gellmanおよび共同研究者は、環状βアミノ酸に基づく強力で選択性の高い抗菌ペプチドを記述した(Hamuro, et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 12200; Porter, et al., Nature 2000, 404, 565; Liu, et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 7553)。これらの研究は次に、βペプチドが形成する種々の異なるヘリックスの種類に拡張され、選択的で非毒性の化合物を得るには電荷、面両親媒性および適切な親水性/疎水性バランスが重要であることを示した。
【０１７７】
すべてのこれらの合成誘導体はヘリックス二次構造に重点を置いていたが、天然ペプチドの他の折り畳み形態が発見されたため、この二次構造要素の決定的に重要な役割は早い段階で疑問視された。合成類似体のコミュニティ内では、αヘリックス形成能力をほとんど有さないが強力な抗菌活性を有すると考えられる、D-アミノ酸置換を含有するジアステレオマーペプチドに関する初期の研究がこの結論を裏付けた(Shai, et al., Peptides 2001, 22, 1629; Hong, et al., Biochemistry 1999, 38, 16963; Oren, et al. Biochemistry 1997, 36, 1826)。全体的両親媒性が特定の折り畳み構造よりも重要であることのさらなる裏付けは、全体的に両親媒性のヘリックスの形をとる能力なしに選択的である抗菌作用物質であるスクランブル配列α/βペプチドに関する最近の研究に由来する(Schmitt, et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 417)。したがって、その配列の組成が標的膜への結合に貢献する限り、強固な立体配座の独自の要件はないようである。
【０１７８】
AMPの本質的な生物学的および物理化学的性質を獲得するはるかに単純なオリゴマーおよびポリマーの設計にこの一般的アプローチが拡張可能であるか否かには疑問がある。特に2つの設計戦略を考慮することができる。一方では、適切な枠組み上に親水基および疎水基を配置することで、天然AMPの両親媒性二次および三次構造を模倣することができる。この場合、予め組織化された骨格が、結合の望ましくない立体配座的エントロピーを最小化して良好な効力を導くことに役立つと考えられる。他方では、強固な立体配座が活性の絶対的な要件ではない場合、はるかに弾性の高い(共)重合体が、必要な立体配座の形をとりうると考えられることから、活性があると予測される可能性がある。いずれの場合でも分子量、電荷および親水性/疎水性バランスの慎重な考慮によって、最大活性のために構造を最適化することが重要である。
【０１７９】
おそらく、SMAMP設計単純化における最も進化的(革命的)な段階は、比較的複雑ではないが強固な芳香族分子骨格を目指してヘリックスモチーフを完全に無くすことであった。DeGradoおよびTewは、面両親媒性繰り返し単位を有するアリールアミド系オリゴマーSMAMPを開発した(Tew, et al., Proceed. Nat. Acad. Sci. USA 2002, 99, 5110; Liu, et al., Angew. Chem. Internat. Ed. 2004, 43, 1158; Breitenkamp, et al., Polymers Adv. Technol. 2005, 16, 189)。これらの分子は依然として強力に抗菌性であり、それらはヘリックス二次構造の制約を受けていなかったが、アリールアミド骨格およびそれらの官能基間の水素結合の強固さは、分子の一方の側が疎水基を含み、反対側が荷電親水基を含むことを確実にした。この研究は、ヘリックス骨格が必要ではないことを明らかに示した。フェニレンエチニレン骨格を有する分子を合成することで、骨格の構成上の制約がさらに緩和されうるか否かを試験した。これらの分子は芳香族骨格の強固さを依然として有していたが、分子内水素結合を有していなかった(Tew, et al., Biochim. Biophys. Acta-Biomembranes 2006, 1758, 1387; Arnt, et al., J. Polymer Sci.A - Polymer Chem. 2004, 42, 3860; Arnt, et al. J. Phys. Chem. B 2006, 110, 3527; Arnt, et al., Langmuir 2003, 19, 2404; Breitenkamp, et al., Polymers Adv. Technol. 2005, 16, 189; Arnt, et al., Macromolecules 2004, 37, 1283)。芳香族骨格は全体的な直鎖状立体配座を確実にしたが、繰り返し単位はそれらの単結合の周りを自由に回転した。これにより、それらの官能基が、細胞膜または同様の親水性-疎水性界面に接触した際に面両親媒性の立体配座に対して自ら配向された。フェニレンエチニレンポリマーは所望の抗菌活性を有していた。小角X線散乱によって、フェニレンエチニレントリマーであっても、モデル膜に曝露された際に孔を形成可能であることが示された(Yang, et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 127, 12141)。
【０１８０】
SMAMP設計における最後の変更は、強固な芳香族骨格を完全に取り除くこと、ならびに合成ポリマーが細胞と接触した際にそれらの官能基を面両親媒性および膜活性になるように自己配向させることを期待して合成ポリマーに疎水性および親水性繰り返し単位を備えさせることであった。いくつかのポリマーがこの考えに基づいて合成されており、官能基が適切にバランスが取れかつ位置づけられていれば、ポリマーが依然として素晴らしい抗菌性を示しながらこの最後の制約でさえ放棄可能であるということが示された(Sambhy, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 1250; Mowery, et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15474; Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870; Gabriel, et al., Chem. Eur. J. 2009, 15, 433; Lienkamp, et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9836)。
【０１８１】
抗菌ペプチドのROMPに基づく合成模倣物
過去5年間にわたって、ROMPに基づく多数のSMAMPが合成され、それらの生物学的性質および膜との相互作用の機構の両方が研究された。これらの化合物の構造を図34に要約する。この図は、調節可能な抗菌性および溶血性を有するポリマーのライブラリーをどのようにして漸進的な構造の変動によって得たか、および、それらのポリマーの構造-性質関係の調査がどのようにしてSMAMP設計の主要要素を解明する上で役立ったかを示す。
【０１８２】
リビング重合技術であり、広範な分子量にわたって低多分散を示す分子を与え、官能基許容性が高いことから、ROMPを合成プラットフォームとして選択した(Kiessling, et al., Vol. 3, Wiley-VCH, Weinheim, 2003; Trnka, et al., Acc. Chem. Res. 2001, 34, 18; Buchmeiser, Chemical Rev. 2000, 1565)。ROMPを通じて入手可能であった様々な分子、特に生理活性分子は他では検討されなかった(Smith, et al., Polymer Rev. 2007, 47, 419)。
【０１８３】
ROMPに基づくSMAMPの分野はIlkerらが開拓した(Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870)。彼らは、面両親媒性繰り返し単位を有するポリ(ノルボルネン)誘導体の系列(図34の系列1、ポリ1〜ポリ4)を報告した。このポリマー系列において繰り返し単位当たりの疎水性単位および親水性単位の比は徐々に変動しており、これらのポリマーの抗菌活性および溶血活性に対するこの変動の効果を試験し、ここで骨格修飾戦略を使用することで、異なる疎水基がモノマー合成の第1段階において結合しているポリマー系列にわたる所望の疎水性勾配を得た(図33a)。
【０１８４】
これらのポリマーは、良好な選択比(＞100)を有する高分子量SMAMP誘導体である。また、図34に示すように、ノルボルネン-イミド構造を有するこの親系列は、性質の微調節を可能にする多くのさらなる修飾、または特定の設計パラメータのさらに詳細な検査を導いた。
【０１８５】
骨格修飾が初期段階において生じ(図33a)、したがって各モノマーが異なる前駆体の調製を必要とすることから、そのポリマーの合成が比較的困難であるイミド系系列とは異なって、エステル系モノマー(図34における2)は同一前駆体から得ることができ、異なる親水基または疎水基の導入を導く決定的に重要な修飾は、最後の合成段階において独立していずれの順序でも導入される(図33b)。したがって、同一の前駆体から多種多様なモノマーを得ることができ、これはこのエステルに基づくプラットフォームを「分子構築キット」と呼ぶ理由である(上記セクションa; Lienkamp, et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9836参照)。
【０１８６】
構造修飾およびそれらのSMAMP活性に対する効果
面両親媒性ホモポリマーの系列における疎水性の増大
面両親媒性繰り返し単位を有し、疎水性を徐々に増大させる、3系列のポリマーが合成された(Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870; Lienkamp, et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9836; Eren, et al., Macromolecular Chem. Phys. 2008, 209, 516)。既に言及したポリ(ノルボルネン)イミド系列を図34において1として示す。分子のこの系列において、親水性カチオン性アンモニウム基は一定に維持され、骨格に結合した疎水基は修飾された。生物学的性質に関するこの構造修飾の結果を図35aに要約する(Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870)。Erenらは、系列1の最も親水性の高いポリマーであるポリ1に類似したポリ(オキサノルボルネン)誘導体の系列を合成した。彼らは、四級ピリジニウム基を含む異なる長さの側鎖を用いるイミドのアルキル化によって、異なる疎水性を得た(Eren, et al., Macromolecular Chem. Phys. 2008, 209, 516)。これにより、R＝エチル〜ドデシルおよびR＝フェニルエチルである系列3が得られた。これらの分子の生物学的データを図35bに示す。エステルに基づくプラットフォーム(図34の系列2)を使用したところ、R＝メチルからヘキシルへの疎水基の体系的変化は疎水性修飾ポリマーの第3の系列を導いた。この系列のMIC90およびHC50値を図35cに示す。図35a〜cを比較すると、これらのポリマーの抗菌活性および溶血活性において全体的に同一の傾向が観察される。HC50値は、最も親水性の高いポリマーについて最高であり、その後ポリマーがより疎水性になるに従って著しく減少し、これは疎水性の付加によってSMAMPの溶血性がますます高くなることを意味する。MIC90値は、比較的親水性の高いポリマーについて高い値で出発し、これはそれらが不活性であることを意味しており、その後、全3系列について最小を経験し、ポリ3(図35a)、オクチルイミド(図35b)およびプロピルエステル(図35c)がそれぞれ各系列において最も活性の高い構造となる。しかし、1つの地点において、SMAMPの溶解度が著しく減少するため、それは激しく凝集し、したがって細胞膜との相互作用には利用不可能になり、したがってMIC90値は再度上昇する。次に、活性の増大および溶解度の減少という重なり合う傾向は、ポリマーの全3系列についてMIC90データにおける最小観察値を導く。したがって、疎水性の増大によって、ポリマーは細菌および哺乳動物細胞の両方に対して毒性になる。
【０１８７】
共重合体−面両親媒性モノマー対隔離型モノマー
系列1におけるポリ3が最低のMIC90を有し、ポリ2が最高のHC50を有したことから、Ilkerらは、対応する2つのモノマーを異なる比で共重合することでこれらのポリマーの治療窓を増大させることを試み、それらの活性を試験した(Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870)。こうして得られた生物学的データを図36aに要約する。このデータから理解できるように、2:1〜9:1のモノマー供給比では、得られた共重合体は非溶血性にとどまったが、「抗菌」成分のモル比が10%の場合であっても活性になった。これは、大腸菌および黄色ブドウ球菌の両方に対する100という高い選択比を導いた。エステル系列(2)のモノマーを共重合した場合でも同様の結果が得られた。その系列のエチルホモポリマーは最高の選択性を有するホモポリマーであったが、メチルポリマーは最も溶血性が低く、プロピルポリマーは最も活性が高かった。したがって、これらのモノマーの共重合による体系的な性質の変動が予測された。こうして3つの共重合体系列(図34の系列4、R1/R2＝メチル/エチル、メチル/プロピルおよびエチル/プロピル)が得られた。これらの系列からの生物学的データを図36b〜dに要約する。エチルとメチル共重合体との共重合は、抗菌性をほとんど向上させず、HC50データの有意な差を示さなかった。同様に、エチルのプロピル共重合体への組み込みはそれらの毒性をより低くしたが、同時にそれらは活性を失った。他方、メチル-プロピル共重合体はポリ2-ポリ3共重合体と同一の傾向を示し、したがってその系列の直接の類似体と考えることができる。1:9〜9:1の供給比では、これらのポリマーは黄色ブドウ球菌に対して活性がより高くなり、同時に溶血性がより低くなった。それらのポリマーの選択比は533超であった。しかし、意外にもこれらのポリマーは大腸菌に対する活性を失い、したがって「二重選択性」SMAMPと呼ばれた。というのも、それらは細菌に対して活性であったが、哺乳動物細胞は溶解させず、1つの種類の細菌を別の種類よりも優先的に死滅させたためである。
【０１８８】
ポリ2-ポリ3共重合体およびエステル系共重合体(4)の共通の構造的特徴は、両方のコモノマーが面両親媒性であったということである。AMPからフォルダマーを経由してSMAMPに至る連続的な構造単純化は、多くの設計特徴、例えば骨格の強固性および芳香族基の存在が、細菌対哺乳動物細胞の高い選択比を得るために必須ではないことを示したが、Gabrielらは、モノマーレベルでの面両親媒性が決定的に重要であることを発見した(Gabriel, et al., Chem. Eur. J. 2009, 15, 433)。ポリ1〜4系列の時間のかかる合成手順を経る必要なしに調節可能な抗菌性を有するポリマー系列を得るために(図34)、1個の親水性単位(ポリ1モノマー)および疎水基を保有するコモノマーからのSMAMP共重合体を供給比1:1で作製した(図34の系列5)。これらのポリマーとポリ1〜4系列との間の高い構造的類似性が理由で、同様に調節可能な性質を有するポリマーをこのアプローチが導くと予測される可能性がある。しかし、これらの新規ポリマー(系列5)は、以前に発見された一般的傾向(疎水性の増大に従って減少するMIC90およびHC50値の最小値)に従ったが、これらポリマーの全体的選択比ははるかに低いままとどまり、最大選択比は20であった(図37a)。1:1モノマー供給比からの逸脱は選択比を向上させなかった。これは、統計的共重合体中の疎水基および親水基の流れを導く、2つの異なるモノマーに対する官能基の隔離の結果であると考えられた(図37b、上部)。したがって、これらのポリマーの局所的疎水性が均一でなかった一方で、面両親媒性モノマーからのポリマーは十分に規定された局所的疎水性を有する(図37b、下部)。これは、細菌膜と相互作用する際の隔離型SMAMPの活性減少を導いた(図37b)。
【０１８９】
親水性の付加
系列1、2および3の最も疎水性の低いポリマーが通常は溶血性も最も低いという観察(図35)は、活性だが毒性のポリマーの溶血活性を各モノマーと親水性コモノマーとの共重合によって減少させることができるという考えを導いた。系列1における最も活性および溶血性が高いポリマーであるポリ3の修飾を、非イオン性および双性イオン性親水性繰り返し単位を組み込むことで行った(Colak, et al., 2009, Biomacromolecules, 10, 353)。この戦略は、面両親媒性モノマーの系列におけるR基を変動させることで疎水性を改質させるという上記アプローチとは異なる。使用する親水性部分は、面両親媒性ではなく、各々が親水性を付与する多くの官能基を保有し、結果として、以前に使用した不活性コモノマーとは構造的に非常に異なっている。また、これらのコモノマーはすべて同一の電荷を有していた一方、Colakらが使用した親水性繰り返し単位は全体的に中性であった。選択された親水性部分は、糖残基、双性イオン性側鎖、および短いポリ(エチレングリコール)鎖であった(図34の系列6)。これらのポリマーの活性を図38a〜cにそれぞれ示す。データは実際、ポリ3の親水性を徐々に高くすることでその溶血活性が体系的に減少したことを示すが、活性成分であるアンモニウム基の希釈はこれらの分子をますます不活性にもし、したがってこれらのポリマーの選択性は低いままとどまった。
【０１９０】
電荷の効果
体系的電荷変動を伴う2つの系列を調査し、それらの一方はイミド系(図34の系列7)、他方はエステル系(図34の系列8)であった(Al-Badri, et al., Biomacromolecules 2008, 9, 2805; Lienkamp, et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9836)。イミド系系統では、ポリ1およびポリ3をそれぞれ出発点とした。繰り返し単位当たり2個および3個の電荷を保有する構造的に同様のポリマーを作製し(図34の系列7)、それらの生物学的性質をそれらの親化合物と比較した(Al-Badri, et al., Biomacromolecules 2008, 9, 2805)。これらのポリマーのデータを図39において報告する。活性かつ毒性である疎水性のポリ3は、電荷が2倍になった際に溶血性が大幅により低くなり、大腸菌に対する活性がより高くなった。しかし、電荷のさらなる付加は生物学的性質を向上させなかった。他方、既に親水性のポリ1の溶血活性は、さらなる電荷の付加の際に向上しなかったが、このポリマーは黄色ブドウ球菌に対して活性がより高くなった。
【０１９１】
電荷および親水性は、切り離すことが困難な2つのパラメータである。ポリマー系列にわたって電荷を増大させると、親水性も自動的に改変される。生物学的性質に対してこれが与える効果は、ポリマー系列の全体的な疎水性に依存する。ポリ1のような既に親水性のポリマーにおいて、電荷の付加は親水性を劇的に改変せず、したがってポリマーの全体的な性質は最小限に変化する。しかし、ポリ3における溶血活性の劇的上昇によってわかるように、ここでの電荷の付加は分子の全体的親水性に大幅に影響する。したがって、ポリ1系列はおそらく、生物学的性質に対する電荷の影響を切り分けるためのより良いモデルである。
【０１９２】
これらを考慮に入れてエステルプラットフォームを使用して、二重荷電繰り返し単位、および変動しうるR基(R＝メチル〜ブチル)を保有する単一荷電繰り返し単位からの共重合体の4つの系列を得た。こうして得られたポリマー系列は、各系列の間で異なる全体的な疎水性を有していた。さらに、異なるモノマー供給比は、「階段関数」(繰り返し単位当たり1個、2個または3個の電荷)とは対照的に、電荷密度を系にわたって連続的に変動させた。それらのポリマーの生物学的性質を図40に要約する。
【０１９３】
このデータが示すように、すべてのメチルおよびエチル共重合体は非溶血性であり、一方、プロピルおよびブチル共重合体はそれぞれ高いプロピルおよびブチルコモノマー含有量によって溶血性がより高くなる。したがって、それら2つの系列の性質は、それらR基の疎水性に支配される。モノアミン-メチルホモポリマーの疎水性がジアミンのそれに密接に類似する一方、エチル〜ブチルホモポリマーの疎水性が著しくより高いということが、補完的方法によってわかった。したがって、メチル共重合体が、電荷密度の増大による効果を試験するためのポリマーの好適なモデル系であることがわかった。実際、このポリマー系の性質(図40a)はポリ1誘導体の性質(図39)と非常に類似している。電荷の増大によって、溶血活性はわずかに影響されるが、黄色ブドウ球菌に対する活性は劇的に向上する。メチル-ジアミン系列において電荷が減少すると(図40aのM9:D1からメチルへ)、MICが4μg/mLから100μg/mLに突然上昇する。繰り返し単位当たりの電荷が1個から2個になると、ポリ1誘導体において同じことが見られる。これらの発見は、AMP文献のデータと共に、黄色ブドウ球菌に対するそれなりの活性を得るために超える必要がある特定の電荷閾値が存在するという推論を導いた(Pasupuleti, et al., Biochemistry 2008, 47, 9057)。この電荷閾値は、繰り返し単位当たりの特定の電荷数というよりむしろ、最小電荷密度、または単位体積当たりの電荷として理解すべきであり、繰り返し単位当たりの正確な電荷閾値数は、繰り返し単位の分子体積に応じて各SMAMP系列でわずかに異なる。分子レベルでは、この推論される電荷閾値は、細胞膜へのSMAMPの結合成功を誘発するために必要な最小電荷密度に変換される。この結合を可能にするために十分な電荷が存在すると、分子の疎水性は、SMAMPがどの程度活性であるかを決定する。黄色ブドウ球菌では、メチル-プロピル共重合体8は活性であり、大腸菌では、これらの細菌に対する活性が見られないことから、それらは十分に疎水性ではない。予備的証拠は、これらの分子が大腸菌に結合することを示しており、これは、これらの分子が大腸菌相互作用の電荷閾値に到達しなかったという解釈があり得ないことを意味する。
【０１９４】
対イオン効果
電荷と疎水性との間の相互作用をさらに精査するために、系列2ポリマーの生物学的性質に対する対イオン交換の効果を試験した。最も親水性の高いエステル系ポリマー(図34のポリマー9)の親水性対イオンを疎水性有機対イオン(例えばヘキサノエートおよびトシレート)に交換した。当初の考えは、これらの対イオンがポリマーに疎水性を付与してその活性をより高くするというものであったが、これらのポリマーのイオン交換が抗菌活性を完全に消去するということがわかった(図41)。色素漏出試験を使用したところ、親ポリマー9は膜活性であるがイオン交換ポリマーはそうではないということがわかった。これは、これらのポリマーのアンモニウム基および有機対イオンが、ポリマーの正電荷全体が遮蔽されるほど堅固なイオン対を形成することを意味した。
【０１９５】
分子量の効果
Ilkerらは、彼らのポリ3化合物について分子量依存性が低いことを発見したが、これはその時点では重要であると見なされなかった(図42a)(Ilker, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870)。ポリ2およびポリ4系列の場合、それらのポリマーが不活性な様式であったことから、傾向は観察されなかった。Erenの低分子量および高分子量ポリマー(それぞれMn約3000g/molおよび10000g/mol)は、活性様式であれ、不活性様式であれ、すべて同様の抗菌活性および溶血活性を有していた(Eren, et al., Macromolecular Chem. Phys. 2008, 209, 516)。「隔離型」共重合体について、Gabrielは、高分子量ポリマー(Mn約10,000g/mol)が低分子量ポリマー(Mn約3000g/mol)よりも2〜8倍活性が低いことを発見した(Gabriel, et al., Chem. Eur. J. 2009, 15, 433)。それらの一部は溶血性がわずかに比較的高かった。同一の一般的傾向は、Lienkampらが比較的高分子量のエステル系ポリマーについて発見した(図34の系列2、Mn約10,000g/mol、生物学的データは図42b)。それらのMn約3000g/mol類似体(図35c)と比較すると、これらのポリマーは大腸菌に対する活性が低かったが、例外としてプロピル_10kポリマーは、驚くべきことにその細菌種類に対して活性であった。さらに注目すべきことに、それらはすべて黄色ブドウ球菌に対して不活性であった(Lienkamp, et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9836)。同様に、ジアミンホモポリマー(図34のTFA対イオンを有するポリマー9、生物学的データは図42c)は、分子量による黄色ブドウ球菌に対する活性の体系的減少を、すべての分子量における大腸菌に対する不活性と共に示した。以下でさらに詳細に論じるように、これは、比較的高い分子量において、これらの特定のポリマーがグラム陽性菌のペプチドグリカン層に入り込むという仮説を導く。
【０１９６】
分子量の効果を特に低分子量領域においてさらに詳細に調査するために、プロピルポリマー系列2からの一連のオリゴマーを調製した(図42d)。このデータが示すように、溶血活性および抗菌活性の両方の分子量依存性は極めて非線形であり、関係する各細菌種で異なる。ここに提示される場合では、オリゴ1は大腸菌よりも黄色ブドウ球菌に対して選択的であり、一方プロピル_3kは反対の傾向を示す。
【０１９７】
ROMPに基づくSMAMPの機構試験
小胞実験および蛍光顕微鏡観察
SMAMPの分野において、SMAMP-膜相互作用を精査する最も有名な方法は、色素漏出実験である。この実験において、細菌および哺乳動物細胞膜の単純化モデルである色素充填脂質小胞を使用する。これらの小胞は細胞膜の主要な特徴を捉えており、それらは、グラム陽性生物のペプチドグリカン細胞壁、グラム陰性菌の二重膜構造、または細胞膜に見られる多くのタンパク質などの細胞特徴を欠いているが、膜とポリマーまたはタンパク質との相互作用を調査するために広く受け入れられている方法であり、化合物の膜破壊性をその生物活性に関連づけるために使用可能である(Tew, et al., Proceed. Nat. Acad. Sci. USA 2002, 99, 5110; Liu, et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 7553; Oren, Biochemistry 1997, 36, 1826)。これらのモデル小胞の脂質組成は、それらが模倣すると想定される細胞の種類と密接に一致するように選択された。したがって、その細胞の種類の細胞膜を構成する一次脂質を使用することで、表面電荷、流動性および脂質の湾曲などの性質をこれらの単純なモデル内でできるだけ密接に一致させた。例えば、黄色ブドウ球菌を模倣するために純粋なカルジオリピン小胞が最も一般的に使用され、一方、大腸菌を模倣するためにホスファチジルエタノールアミン(PE)およびホスファチジルグリセロール(PG)の混合物が使用され、ヒト赤血球を模倣するためにホスファチジルコリン(PC)が使用される(Som, et al., J. Phys. Chem. B 2008, 112, 3495)。あるいは、各細菌からの完全脂質抽出物も使用可能である。SMAMPに曝露される際の小胞からの自己消光色素の漏出は蛍光を導くものであり、漏出を時間関数としてモニタリングし、あるいはSMAMPに曝露される際の漏出割合をSMAMP濃度に対してプロットすることもできる(Som, et al., J. Phys. Chem. B 2008, 112, 3495)。
【０１９８】
Ilkerらは、中性コレステロール:PC小胞(赤血球の模倣物としての)の溶解および負に荷電したホスファチジルセリン:PC小胞の溶解を調査した。彼らは、ポリ2、ポリ3およびポリ2-3共重合体の溶解的性質がそれらの抗菌活性とよく一致し、ポリ2が不活性であり、他の2つのポリマーが著しい色素漏出を示すことを発見した(Ilker, et al., Macromolecules 2004, 37, 694)。Gabrielらも、大腸菌模倣PE:PG小胞を使用してポリ1〜ポリ3系列を試験し、それらの溶解挙動がMIC90傾向に正確に従うことを発見した。Erenらは、PC小胞(赤血球模倣物)および大腸菌抽出物に彼らのポリマーを曝露する効果を試験し、これらのポリマーの膜破壊性とそれらのHC50およびMIC90データとの間の高い相関をそれぞれ発見した(Eren, et al., Macromolecular Chem. Phys. 2008, 209, 516)。しかし、この特殊な場合において、PE:PG小胞に対する活性はMIC90データに相関していなかった。Al-Badriらも、PC小胞からの漏出と彼のポリマーの溶血データとの高い一致を発見した(Al-Badri, et al., Biomacromolecules 2008, 9, 2805)。彼らの試料はPE:PGおよびCL小胞の一般的傾向にも従い、すなわち、ポリ3由来試料はポリ1由来試料よりも膜破壊性が高かった。隔離型共重合体では、大腸菌に対するそれらの活性が、大腸菌脂質抽出物からできている小胞に対するそれらの膜破壊効力と一致していることがわかった[57] (Gabriel, et al., Chem. Eur. J. 2009, 15, 433)。Lienkampらは、黄色ブドウ球菌模倣CL小胞に対して彼らのポリマーを試験した。彼らは、黄色ブドウ球菌のMIC90とメチル〜ブチルホモポリマーの小胞漏出との間の高い相関を発見した(Lienkamp, et al., Chemistry Eur. J. 2009, submitted)。このデータ本体が示すように、全体として、SMAMPの色素漏出活性と対応する生物活性との間に高い相関が存在する。これは、すべてのそれらのポリマーの抗菌活性の機構が、細菌の細胞膜の破壊によるものであり、この破壊が次に膜電位の崩壊、細胞内容物の漏出、および最終的には細胞死を引き起こすという結論を導いた。
【０１９９】
色素漏出試験が細胞-SMAMP相互作用を擬態することに失敗する場合、このことは、単純な二重層膜によって適切に擬態されない細胞構造の他の成分、例えばグラム陽性菌のペプチドグリカン細胞壁が重要であることを示しうる。Lienkampらは、カルジオリピン(黄色ブドウ球菌模倣物)およびPE:PG(大腸菌模倣物)の両方の小胞に対する彼らのジアミンホモポリマー(図34のトリフルオロ酢酸対イオンを有するポリマー9、Mn約3000g/mol)の挙動を試験した(Lienkamp, et al., Chemistry Eur. J. 2009, submitted)。これらのポリマーは、第一に哺乳動物細胞よりも細菌に対し、そして大腸菌(MIC90＞200μg/mL)よりも黄色ブドウ球菌(MIC90＝15μg/mL)に対して「二重選択性」であることが以前に発見されていた(Lienkamp, et al., Chemistry Eur. J. 2009, submitted)。驚くべきことに、ポリマー9の3000g/mol試料のMIC90は大腸菌および黄色ブドウ球菌について劇的に異なっていたが、このポリマーは両方の小胞の種類に対してほぼ同一の溶解割合を示した(図43)。これは、2つの細菌の脂質組成の差がMIC90の観察される差の原因ではないことを示した。したがって、細胞選択性が、大腸菌が二重膜構造を有する一方で黄色ブドウ球菌が細胞膜を1つのみ有することによるものであると推論された。3000g/molポリマーが黄色ブドウ球菌に対して活性であるが50,000g/molポリマーが不活性であると観察されたことから、グラム陽性生物に見られるペプチドグリカン細胞壁が、大きいSMAMPにとって侵入不可能な障壁であると考えられた。これは結合または立体障害が理由である可能性がある。
【０２００】
他の場合では、色素漏出実験と生物学的データとの間の矛盾は、実験とは全く関係ないがSMAMP溶解度と関係があるという可能性がある。R＝ドデシルである系列5およびR＝ヘキシルである系列2の最も疎水性の高い2つのポリマーはMIC90-色素漏出相関に従わないが[57, 80]、両系列における他の分子は完全に従うということがわかった。いずれの場合でも、「奇妙な」ポリマーと同一のMIC90を有する同一系列の親水性ポリマーは、対応する疎水性ポリマーよりもはるかに少ない色素漏出を引き起こした(Gabriel, et al., Chem. Eur. J. 2009, 15, 433; Lienkamp, et al., Chemistry Eur. J. 2009, submitted)。このことの理由は、MIC実験の相対的に高い濃度での疎水性ポリマーの低溶解度である。色素漏出実験におけるSMAMP濃度は、これらの実験の方がはるかに感受性が高いと理解されることから、MIC実験におけるよりも通常は低く、これらの比較的低いポリマー濃度においても、ポリマー対小胞の比はMIC実験におけるポリマー対細菌の比よりもはるかに高い(Som, et al., Biopolymers 2008, 90, 83)。ポリマーが水性媒体中の低い溶解度を有する場合、それはMIC実験において比較的活性が低いようであるが、色素漏出実験においては依然として活性であり、これは2つの方法による結果の矛盾を引き起こす。
【０２０１】
膜-ポリマー相互作用を精査する別の方法は、いわゆる「生死」染色である。この多少なりとも誤解を招く名称は、緑色蛍光を与えるSYTO 9と赤色蛍光色素ヨウ化プロピジウムとの色素混合物と共に細胞をインキュベートする実験を意味する。SYTO 9は無傷細胞および膜損傷細胞の両方の膜を通じて拡散しうるが、ヨウ化プロピジウムは、損傷した細胞膜を有する細胞にのみ進入可能であり、結合部位をめぐって緑色色素と競合する。したがって、「生」細胞は、蛍光顕微鏡の緑色フィルターを使用する際に緑色で現れ、赤色フィルター下では赤色で現れず、一方、膜損傷「死」細胞は、赤色フィルターを適用する際に赤色で現れ、緑色フィルター下では色素の化学量論に応じて緑色で現れることもそうでないこともある。蛍光顕微鏡観察を使用したところ、系列5の抗菌活性ブチルポリマーが大腸菌において赤色蛍光および激しい凝集を引き起こす一方、不活性ポリ1がいずれも引き起こさないことがわかった(図44)(Gabriel, et al., Chem. Eur. J. 2009, 15, 433)。これは、活性SMAMPが細菌細胞膜を損傷させることをやはり示した。同一の方法を使用したところ、異なる分子量のポリマー9を比較した際に、SMAMP濃度と細菌凝集との間、およびSMAMP分子量と細菌凝集との間に相関が存在することが発見された。同一濃度において、分子量がより高いSMAMPは、分子量がより低いものよりも多くの細胞凝集を引き起こす。また、SMAMP濃度が高くなるほど、より多くの細胞凝集が観察された。
【０２０２】
他の技術
これまでのROMPに基づくSMAMPに関する最も詳細な物理試験において、HPLC、色素漏出試験、光散乱、等温熱量測定および蛍光顕微鏡観察を組み合わせてポリ1〜ポリ4系列のポリマー-膜相互作用の機構を調査した[83]。これらの方法の組み合わせによって、Gabrielらが、これまでになく詳細にSMAMP-細菌相互作用の機構を解明することが可能になった。予測通り、彼らはポリ1〜ポリ4のポリマーのHPLC溶出時間とアルキル側鎖長との間の線形相関を発見し、これは、疎水性がポリ1からポリ4にかけて増大するという直観的な仮定を証明した。上記で言及したように、彼らは、これらのポリマーの色素漏出データがそれらのMIC傾向に従うこと、すなわち不活性ポリ1が小胞を溶解させない一方で、ポリ2およびポリ3の膜活性がますます高くなることも示した(Gabriel, et al., Langmuir 2008, 24, 12489)。動的光散乱を使用して、小胞の水力学的半径に対するSMAMP添加の効果を時間関数としてモニタリングした。ポリ1に曝露された小胞の半径は不変のままであったが、ポリ2およびポリ3に曝露された小胞は経時的に著しく成長した(図45)。
【０２０３】
これもまた、ポリ1が膜活性でない一方で、ポリ2およびポリ3が明らかでそうであることを示しているが、光散乱試験は、それらのポリマーのMIC90の有意な差を捕捉していない(200対25μg/mL)。また、小胞成長が凝縮によるものかまたは小胞融合によるものかは明らかではない。したがって、色素標識小胞および染色細菌細胞に対する蛍光顕微鏡観察によって、この効果をさらに試験した(Gabriel, et al., Langmuir 2008, 24, 12489)。小胞の場合、他のSMAMPについて観察されたように、巨大な蛍光小胞がポリ3に対する露出の際に現れた一方、大腸菌が凝集する(Gabriel, et al., Chem. Eur. J. 2009, 15, 433)。これらの凝集現象は、SMAMPが単に非常に複雑な界面活性剤であるというだけではないことを強調する。界面活性剤は、小胞に加えられる際に、小胞融合または凝集を引き起こす代わりに、膜を単に溶解させる。また、界面活性剤は細胞を区別する能力を有さない。等温熱量測定を用いて膜-SMAMP相互作用をさらに試験した。これらの試験は、小胞とポリ1またはポリ4との間の結合相互作用はそれぞれ観察されないが、小胞とポリ2およびポリ3の両方との間に強力な結合事象が存在することを明らかにした(Gabriel, et al., Langmuir 2008, 24, 12489)。データとモデリングソフトウェアとのフィッティングは、小胞とSMAMPとの間の結合がエントロピー的に好ましいこと、および結合の全体的自由エンタルピーがポリ2およびポリ3の両方についてほぼ同一であることを明らかにした。しかし、結合化学量論において著しい差が観察された。小胞脂質対ポリマーのアンモニウム基の比はポリ2について0.4、活性がより高いポリ3について1.06であった。
【０２０４】
SMAMPを超えて−細胞侵入性ペプチド
最近、珍しいSMAMPが発見された(図34のポリマー10)。以前に論じられたすべてのROMPに基づくSMAMPはアミン基を正に荷電した部分として有していたが、このポリマーはグアニジウム基を含み、グラム陰性菌(大腸菌および霊菌(S. marcescens)、MIC90＝それぞれ6μg/mLおよび50μg/mL)およびグラム陽性菌(黄色ブドウ球菌および枯草菌、いずれもMIC90＝12μg/mL)の両方に対して広範な抗菌活性を有していた。これは、著しく低い溶血活性(HC50＝1500μg/mL)と共に、系列4および8のポリマーのみがグラム陽性菌に対して活性であったことから、広範なSMAMPについてこれまで観察された最高の選択比である、250という大腸菌対赤血球の選択比を与える。殺菌動態試験(時間死滅アッセイとしても知られる)を使用したところ、このポリマーが60分未満でMIC90の4倍の5対数減少を引き起こすことがわかった。これは、ポリマーが実際に殺菌性であり、単に静菌性というわけではないことを意味する。(Gabriel, et al., Biomacromolecules 2008, 9, 2980)。ポリ1、ポリ3およびポリマー10を用いる比較色素漏出試験は、このポリマーがその低MIC90値にもかかわらずモデル膜を溶解させないことを示した(図46a)。同様に、蛍光顕微鏡観察実験において観察されたように、活性ポリ3は膜損傷および細胞凝集を引き起こしたが(図46b、パネルCおよびD)、ポリマー10が引き起こした赤色蛍光(図46b、パネルEおよびF)は膜不活性ポリ1(図46b、パネルAおよびB)のそれと区別がつかなかった。これらは、このポリマーの抗菌活性が、他のSMAMPの場合のように、膜損傷、細胞内容物の漏出、および結果的な細胞死によるものではないことを示す。このSMAMPに含まれるグアニジウム基はポリ(アルギニン)および他の細胞侵入性ペプチドにも見られ、そのような細胞侵入性ペプチドは、膜を横切り、カーゴを細胞内に輸送し、DNAに結合することができることが知られている(Miyatake, et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12420; Henriques, et al., Biochemical J. 2006, 399, 1; Rothbard, et al., J. Med. Chem. 2002, 45, 3612; Futaki, et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 5836; Mitchell, et al., J. Peptide. Res. 2000, 56, 318; Sakai, et al., Soft Matter 2006, 2, 636; Pantos, et al., Biochim. Biophys. Acta 2008, 1778, 811; Schroeder, et al., J. Med. Chem. 2008, 51, 376; Deglane, et al., ChemBioChem 2006, 7, 684; Fillon, et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 11798; Funhoff, et al., Bioconjugate Chem. 2004, 15, 1212)。この文献本体および上記結果を考慮して、ポリマー10は、最初に細胞膜に損傷を引き起こすことなく進入し、次に細胞内標的、潜在的には細菌DNAと相互作用して細胞の死を導くことによって、抗菌活性を示しうると推論された(Gabriel, et al., Biomacromolecules 2008, 9, 2980)。
【０２０５】
開環メタセシス重合を合成プラットフォームとして使用して、多種多様な抗菌ペプチドの合成模倣物(SMAMP)を得た。これらの分子の全体的疎水性および電荷密度を慎重に調節することで、不活性/非溶血性から活性/非溶血性を経由して活性/毒性までの要求通りの性質を有するポリマーを得た。
【０２０６】
f. 親水性修飾および溶血活性
糖、双性イオンおよびポリエチレングリコール(PEG)部分を含む親水性の生体適合性官能基を組み込むことでポリ3というこの興味深いポリマーの性質を微調節するアプローチがここで開示される(図47)。炭水化物系の糖は、可溶化剤として使用されることに加えて、生体分子化学の適用分野において重要な役割を果たす(Dwek, Chemical Reviews 1996, 96, 683-720; Goto, et al. Journal of Controlled Release 1994, 28, 223-33)。PEGおよび様々な双性イオンは、化合物の水溶性を向上させるために広く使用されている(Travert-Branger, et al. Langmuir 2008, 24, 3016-3019; Guillemet, et al. Langmuir 2006, 22, 1875-1879)。これらすべての基は、同様の性質を有することから、それらが無毒であることがわかった多くの生物学的系において可溶化剤として互いに組み合わせて日常的に使用されており、したがってそれらはこの試験用の良好な候補となる(Travert-Branger, et al. Langmuir 2008, 24, 3016-3019; Narain, et al. Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry 2006, 44, 6558-6568; Yasugi, et al. Macromolecules 1999, 32, 8024-8032)。SMAMPの選択性に関する、全体的(または分子全体)というよりむしろ繰り返し単位レベルの面両親媒性の重要性は、Lienkampらが最近強調した(Lienkamp, et al. Journal of the American Chemical Society 2008, 130, 9836-9843)。同一モノマー上に疎水性単位および親水性単位を含有する容易に合成可能な構造は、SMAMPの選択性の調節成功を可能にした。Gabrielらも、親水性および疎水性モノマーのランダム共重合体に対する繰り返し単位レベルの面両親媒性アプローチの利点を強調した(Gabriel, et al. Biomacromolecules 2008, 9, 2980)。
【０２０７】
ここで、同一の疎水性骨格を有するが様々な親水性ペンダント基を有する面両親媒性モノマーをROMP経由でポリ3に組み込んだ(図47)。これらのポリマーの全体的生物活性に対する結果的な効果を、MICの決定と溶血活性(HC50)試験との組み合わせを経由して試験した。
【０２０８】
実施例
材料および装置構成
ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート(PEG-アクリレート)(99%)、トリフェニルホスフィン(Ph3P)(99%)、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)(94%)、第二世代グラブス触媒および3-ブロモピリジン(99%)をSigma-Aldrichから購入し、受け取ったまま使用した。マレイミド(98%)をAlfa Aesarから購入し、受け取ったまま使用した。1,2:3,4-ジ-O-イソプロピリデン-D-ガラクトピラノース(97%)、N,N-ジメチルエタノールアミン(99%)およびエチルビニルエーテル(EVE) (99%)をAcros Organicsから購入し、さらに精製せずに使用した。4-ブロモブタン酸tert-ブチルエステル(95%)をAstatech, Inc.から購入し、そのまま使用した。酢酸エチル、ヘキサン、無水ジエチルエーテル、メタノール、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、クエン酸およびトリフルオロ酢酸(TFA)をFisher Scientificから購入し、受け取ったまま使用した。テトラヒドロフラン(THF)をFisher Scientificから得て、使用前に窒素下でナトリウム/ベンゾフェノンから蒸留した。ジクロロメタン(DCM)(Fisher Scientific)を窒素下でCaH2から蒸留した。第三世代グラブス触媒(G3)(ジクロロ-ジ(3-ブロモピリジノ)-N,N'-ジメチレノイミダゾリノ-Ru=CHPh)を、既に刊行された手順に従って合成した(Love, et al. Angewandte Chemie, International Edition 2002, 41, 4035-4037)。
【０２０９】
1H NMRおよび13C NMRスペクトルをBruker DPX300分光計(ウィスコンシン州マジソン、Bruker)上で記録した。ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を、PL Gel 5μmプレカラムおよび2本の5μm Mixed Dカラムを備えたPolymer Laboratories PL-GPC50(マサチューセッツ州アマースト)装置を使用して行った。移動相をTHFとし、流量を1mL/分とし、トルエンを流量マーカーとして使用した。Knauer RI検出器を使用して狭い分子量のポリスチレン標準物質によって装置を較正した。高分解能質量スペクトルをJEOL JMS 700装置(マサチューセッツ州ピーボディ、JEOL)上で得た。
【０２１０】
M1の合成
イソプロピルフルベン(7.0g、58.3mmol)およびマレイミド(4.7g、48.6mmol)をシュレンクフラスコに装入し、トルエン(100mL)に溶解させた(Ilker, et al. Macromolecules 2004, 37, 694-700)。反応混合物を油浴中に135℃で配置し、12時間攪拌した後、室温に冷却した。過剰のトルエンを減圧除去してエキソ/エンド(1H NMRで9/1)生成物の混合物を得た。ジエチルエーテルからの結晶化によって純粋なエキソ生成物1を無色固体として単離した。収率: 60%。
2012529557.tif 000084
【０２１１】
N2雰囲気下、250mL丸底フラスコ中で化合物1 (2.0g、9.2mmol)、Ph3P (2.4g、9.2mmol)および1,2:3,4-ジ-O-イソプロピリデン-D-ガラクトピラノース(2.4g、9.2mmol)を乾燥THF (50mL)に溶解させた。次に溶液を氷浴中で0℃に冷却した。冷却した反応混合物にDIAD (1.8g、1.8mL、9.2mmol)を滴下した。添加が完了した後、氷浴を除去し、溶液を室温で24時間攪拌した。過剰のTHFを減圧除去して黄色油状物を得て、これをトルエンから再結晶させた。白色析出物を廃棄した後、濾液からの過剰のトルエンを減圧除去して油状物を得た。冷ジエチルエーテルからの結晶化によって純粋なM1を単離して無色固体を得た。収率: 50%。
2012529557.tif 000085
【０２１２】
M2の合成
N2雰囲気下、250mL丸底フラスコ中で化合物1 (4.0g、18.4mmol)、Ph3P (4.8g、18.4mmol)およびN,N-ジメチルエタノールアミン(1.6g、1.8mL、18.4mmol)を乾燥THF (150mL)に溶解させた。次に溶液を氷浴中で0℃に冷却した。冷却した反応混合物にDIAD (3.7g、3.6mL、18.4mmol)を滴下した。添加が完了した後、氷浴を除去し、溶液を室温で24時間攪拌した。過剰のTHFを減圧除去した。残留生成物を酢酸エチルから抽出してクエン酸溶液(pH＝4.0)に入れ、飽和NaHCO3溶液を加えることで溶液のpHを13.0に調整した。次に化合物2をヘキサン/ジエチルエーテル混合物で抽出した。過剰の溶媒を減圧除去して無色粉末を得た。収率＝70%。
2012529557.tif 000086
【０２１３】
化合物2 (2.0g、6.9mmol)を乾燥THF 50mLに溶解させた。溶液に4-ブロモブタン酸tert-ブチルエステル(3.1g、13.8mmol)を加え、反応混合物を50℃で36時間攪拌した。生成物を濾過し、過剰の乾燥THFで洗浄し、減圧乾燥させてM2を無色粉末として得た。収率＝65%。
2012529557.tif 000087
【０２１４】
ホモポリマーおよび共重合体の合成および脱保護
M1およびM2のホモ重合
第三世代グラブス触媒を開始剤として使用してすべてのモノマーを重合した。M1およびM2のホモ重合ならびに対応するポリマーの脱保護は同一の手順に従った。典型的な実験において、M1 (0.4g、0.8mmol)およびG3 (0.013g、0.014mmol)を別々の反応フラスコ中に秤量し、N2ガスで掃流した。モノマーをTHF 1mLに溶解させ、触媒をTHF 0.5mLに溶解させた。M2のホモ重合において、THFに不溶性であることからメタノール1mLにモノマーを溶解させた。3回の凍結ポンプ解凍サイクルによって両方の溶液を脱気した。両溶液を室温に昇温した後、モノマー溶液を触媒溶液にカニューレで加えた。反応混合物を60℃で2時間攪拌した。反応液を氷浴中で冷却し、EVE (0.3g、0.6mL、6.3mmol)を加えることで反応停止させた。反応混合物を1時間さらに攪拌した。得られたホモポリマーのポリ1およびポリ2を過剰のジエチルエーテルから析出させて濃褐色粉末を得た。収率＝95%。
2012529557.tif 000088
【０２１５】
ポリ1およびポリ2の脱保護
すべてのポリマーの脱保護反応は以下のように行った。典型的な手順において、ポリ1 0.25gを純粋なTFA 3mLに溶解させ、室温で24時間攪拌した。脱保護ポリマーをジエチルエーテルから析出させた。脱保護ポリ1を24時間減圧乾燥させた後、メタノール5mLおよびRO水25mLに溶解させ、凍結乾燥させてすべての有機溶媒を除去した。収率＝85%。
2012529557.tif 000089
【０２１６】
M1およびM2とM3との共重合
ポリ1およびポリ2のホモ重合について先に記載したものと同一の手順を、すべてのポリ3-co-ポリ1およびポリ3-co-ポリ2系列の合成に使用した。対応するモノマーを同一反応容器中で混合した後、触媒と反応させた。モノマーのモル量を所望の比で調整することで、様々な組成を有する共重合体を合成した。
【０２１７】
共重合体のモノマー組成を1H NMR分析によって定量化した。ポリ3-co-ポリ1試料では、脱保護後に骨格におけるメチルプロトン(0.92ppmで6H)の積分値をM3の-NH3 (7.88ppmで3H)プロトンと比較することで、共重合体組成を決定した。ポリ3-co-ポリ2の場合、骨格におけるメチルプロトン(0.92ppmで6H)の積分値とM2のtert-ブチル基のメチルプロトン(1.39ppmで9H)との比較により、共重合体組成を決定した。
2012529557.tif 000090
【０２１８】
ポリ3-co-ポリPの合成
ポリ3-co-ポリP共重合体の合成には後官能化アプローチを利用した。以前の文献の手順に従ってポリ3を合成および脱保護した。GPC分析によって繰り返し単位決定を行った。典型的な反応では、脱保護ポリ3 (0.15g、0.4mmol)をDMSO 10mLに溶解させた。トリエチルアミン(0.02g、0.20mmol)を反応混合物に加え、30分間攪拌した後、PEG-アクリレート(0.15g、0.3mmol)を加えた。反応混合物を室温で24時間攪拌した。冷ジエチルエーテルからの3回の結晶化によって純粋なポリマーを単離して淡褐色固体を得た。収率: 70%。
【０２１９】
0.75ppmにおいて現れる骨格のメチルプロトン(6H)の積分値対4.07ppmにおいて現れるPEG-アクリレートのエステル結合に隣接するメチレンピーク(2H)の比によって、共重合体組成を決定した。
2012529557.tif 000091
【０２２０】
ポリマーの合成および特性決定
繰り返し単位レベルの面両親媒性は、両親媒性構造を与える疎水性および親水性モノマーのランダム共重合体と比べてのSMAMPの全体的選択性に重要な影響を示す(Ilker, et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870-15875; Lienkamp, et al. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 9836-9843; Gabriel, et al. Biomacromolecules 2008, 9, 29808).; Sambhy, et al. Angew. Chemie, Int'l Ed. 2008, 47, 1250-1254)。共重合によるこれらの系の微調節によって選択性値を向上させることができる。疎水性骨格および様々な生体適合性の親水性ペンダント部分から構成されるモノマーを設計および合成した(図47)。
【０２２１】
様々な官能基を有するノルボルネン系モノマーを重合して明確に規定された系を得るためにROMPを使用することに成功した(Eren, et al. Macromolecular Chemistry and Physics 2008, 209, 516-524; Ilker, et al. Macromolecules 2004, 37, 694-700; Alfred, et al. Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry 2008, 46, 2640-2648)。しかし、ピリジン、二級アミン、チオールまたは安息香酸などの特定の添加剤の存在がROMPの動態を著しく遅くするかまたは停止させることがあることも報告された(Slugovc, Macromolecular Rapid Communications 2004, 25, 1283-1297; Colak, et al. Macromolecules 2008, 41, 8436)。したがって、これらの遅延効果を防止しかつROMPを成功裏に行うことができるように、保護基アプローチを利用して高官能化モノマー(M1〜M3)を合成した。保護基アプローチは、重合プロセスを容易にすることに加えて、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)および核磁気共鳴(NMR)による後のポリマー特性決定も容易にした。重合完了の際に、保護基を除去して対応する抗菌活性ポリマーを得た。
【０２２２】
モノマー合成の第1の段階は、生成物1を得るための、マレイミドとイソプロピルフルベンとのディールス・アルダー反応である。1と対応するアルコールとの光延カップリングを経由して、糖官能性ノルボルネン系モノマーM1を合成した(スキーム6)(Mitsunobu, Synthesis 1981, 1, 10-28)。同一の反応条件を使用することで2を得て、これを4-ブロモブタン酸tert-ブチルエステルでさらにアルキル化することで正に帯電したM2を四級アンモニウム塩として得て、脱保護の際に双性イオン官能基を得た(スキーム6)(Colak, et al. Macromolecules 2008, 41, 8436)。既に刊行された手順に従ってM3を合成した(Ilker, et al. Macromolecules 2004, 37, 694-700)。NMR技術を使用してすべてのモノマーを特性決定した。図48および49は、それぞれM1およびM2の得られた1H NMRスペクトルを示す。
2012529557.tif 000092
（スキーム6）M1およびM2の合成。(i) トルエン、135℃で12時間。(ii) THF、Ph3P、DIAD、室温で24時間。(iii) THF、50℃で36時間。
【０２２３】
第三世代グラブス触媒を開始剤として使用して、すべてのホモポリマー(ポリ1、ポリ2およびポリ3)、ならびにnが共重合体組成中のM3のモル分率を示し、mがM1、M2またはMP (PEG官能基)のモル分率を示す共重合体(ポリ3n-co-ポリ1m、ポリ3n-co-ポリ2mおよびポリ3n-co-ポリPmを合成した。反応完了の際に、過剰のエチルビニルエーテルの添加を経由して重合を終了させた。GPCによって決定される約3kDaの分子量および1.08〜1.15の範囲である狭い多分散指数を有するポリマーを、ROMPによって得た(表20参照)。トリフルオロ酢酸を使用してすべてのポリマーを脱保護して抗菌活性ポリマーを得た。
【０２２４】
対応する面両親媒性モノマーのランダム共重合によって、ポリ3n-co-ポリ1m(糖官能性)およびポリ3n-co-ポリ2m(双性イオン官能性)共重合体の合成を行った。得られたポリマーの両親媒性を変動させるために、異なるモル比のモノマーを共重合反応において使用した(表20)。モノマーおよび触媒の溶解度に応じて、異なる溶媒系を使用して、均一な反応媒体をすべての重合について設けた。THFのみを使用してポリ3n-co-ポリ1mを合成した一方、THF-メタノール溶媒混合物中でポリ3n-co-ポリ2mを合成した(スキーム7)。反応が2時間以内に完了するまで30分ごとにスペクトルを記録することにより、1H NMR分析を経由して共重合動態を試験した。両方のノルボルネンモノマーのアルケン官能基に対応する6.5ppmにおけるブロードなピークの強度の一定の減少は、共重合体形成の成功を示した。同一ピークの完全な消失、ならびにポリマー骨格の二重結合のシスおよびトランス立体配座に対応する約5.4および5.6 ppmにおける2つの新たなピークの同時の出現は、変換の完了を示した。
2012529557.tif 000093
（スキーム７）M1およびM2とM3との共重合ならびに得られたポリマーの脱保護
2012529557.tif 000094
【０２２５】
ポリ3n-co-ポリ1mの分子量特性決定を、THFを溶離液とするゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって行い、較正をポリスチレン標準物質に対して行った。実験での分子量は理論値(計算値)と一致していた(表20)。ポリ1 (M1のホモポリマー)および共重合体ポリ30.5-co-ポリ10.5の代表的GPCトレースを図50に示す。
【０２２６】
イオン凝集の形成またはクロマトグラフィーカラムの固定相との相互作用が理由で、荷電ポリマーのGPCが困難であることがよく知られている(Volet, et al. Journal of Liquid Chromatography 1994, 17, 559-577)。したがって、荷電ポリマーについてGPC分析を行う代わりに、1H NMR末端基分析をポリ3n-co-ポリ2m共重合体の分子量決定に使用した。フェニル末端基積分値対イソプロピルフルベン骨格のメチルプロトンの比によって重合度が得られ、これを使用してポリマーの全分子量を計算した。
【０２２７】
任意の官能化の前に、M3を重合して保護ポリ3を得て、次にこれを既に刊行された手順に従ってTFAで脱保護して抗菌活性ポリマーを得た(Ilker, et al. Macromolecules 2004, 37, 694-700)。正に荷電したアンモニウム基を中和してアミン官能基を得て、次にこれを使用して、マイケル付加を経由してアクリレート末端官能化PEGと反応させた(スキーム8)(Colak, et al. Journal of Applied Polymer Science 2007, 104, 2244-2253)。精製ポリマーの1H NMRスペクトルにおいて、残留アクリレートピークは観察されず、PEG-アクリレートのエステル結合に隣接するメチレンピークに対応する4.07ppmにおけるピークの出現は付加の成功を示した。
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（スキーム８）ポリ3n-co-ポリPm共重合体の合成。(i) トリエチルアミン、DMSO、室温、24時間。
【０２２８】
抗菌活性および溶菌活性の分析
ポリマーの生物活性を評価するために、大腸菌(E. coli)および黄色ブドウ球菌(S. aureus)に対する最小阻止濃度(MIC)ならびに溶血活性(HC50)を標準的手順に従って決定した(Rennie, et al. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 2005, 32, 296-300)。すべての分析は脱保護ポリマー試料を使用して行った。図51はポリ3n-co-ポリ1m系列の結果を示す。共重合体の糖含有量が0%から100%に増大した際に(ポリ1ホモポリマーに関して)、生物活性の線形減少が観察され、MIC値は50μg/mLから200μg/mLに増大した。この活性損失は、糖残基を含有する繰り返し単位の数が増大するに従ってポリマーの全体的正電荷が減少するという事実に起因する可能性がある。糖官能性ホモポリマーのポリ1が細菌に対して不活性であるということにも留意すべきである。しかし、その生体適合性および全体的中性電荷が理由で、哺乳動物細胞に対するその毒性HC50＝2000μg/mLはポリ3の毒性HC50＜1μg/mLよりもはるかに低い。したがって、ポリ3n-co-ポリ1m共重合体の糖含有量の増大は、それらの溶血性を向上させたが、抗菌活性の減少を引き起こした。
【０２２９】
同一の挙動がポリ3n-co-ポリ2m共重合体系列について、均等なコモノマー組成に到達するまで(ポリ30.5-co-ポリ20.5)観察された(図52)。双性イオン残基の数がさらに増大するに従って、溶血活性の増大に伴う抗菌活性の損失が観察された。双性イオン含有量の増大に伴う活性の損失についての可能な説明は、鎖内または鎖間会合を形成することで、ポリマー骨格の著しい立体配座変化を引き起こし、したがって全体的面両親媒性に影響する可能性の増大である可能性がある。
【０２３０】
最高の生物活性はポリ3n-co-ポリPm試料で観察された(図53)。PEG基を最大30%組み込んだ際に、ポリ3に比べて低いMIC値と、それに伴う溶血活性のわずかな向上が得られた。糖または双性イオン官能化共重合体とは対照的に、ポリ3n-co-ポリPm構造における各繰り返し単位上のアミン(一級または二級)の存在は、PEG含有量が増大した場合であっても全体的電荷が一定にとどまったことを示す。しかし、50%官能化後は、同一の活性損失が他のポリマーと同様に観察された。
【０２３１】
表20は、試験したすべてのSMAMPの得られたMICおよびHC50値、ならびにHC50およびMICの比を用いて計算した選択性値を要約する。結果をポリ3のそれと比較する場合、一般に同一の挙動がすべてのサンプルについて観察され、親水性の増大に従って生物活性が減少する。しかし、これらの親水性基の生体適合性が理由で、溶血活性の向上が観察され(ポリ30.5-co-ポリ20.5について0.02μg/mL未満から最大7.5μg/mL)、したがって選択性の増大が得られた。
【０２３２】
（表２０）ポリ3n-co-ポリ1m共重合体の生物活性データ
2012529557.tif 000096
a GPCによって決定された保護ポリマーのMn
b 1H NMRによって決定された脱保護ポリマーのMn
c 保護基の対応する重量を減算した後に報告されたMn
d PEG鎖の分子量を含むMn
【０２３３】
（表２１）すべてのポリ3-co-ポリ1およびポリ3-co-ポリ2共重合体系列ならびにそれらの対応するホモポリマーのM/I比の要約
2012529557.tif 000097
a X＝ポリ1について1、ポリ2について2
b GPCによって決定された保護ポリマーのMn
c 1H NMRによって決定された脱保護ポリマーのMn
【０２３４】
g. 電荷密度および溶血活性
1個、2個および3個のアミン基を保有するノルボルネンモノマーの系列を設計した(図55)。Boc保護モノマーのROMP、引き続く脱保護によって、各繰り返し単位上に複数のアミン基を有するSMAMPを得た(図56)。
【０２３５】
A1およびB1の合成は既に文献に報告された(図55)(Ilker, et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870-15875)。他のモノマーはノルボルネン誘導体と対応するアルコールとの光延カップリングによって調製した。グラブス第三世代触媒を使用するROMPを経由して、Boc保護ポリA1〜3およびポリB1〜3系列(図56)を調製した。GPCによって測定されるすべてのポリマーの数平均分子量(Mn)は約3kDaであり、多分散指数(PDI)は1.1であった。次に、ポリマーをトリフルオロ酢酸で処理することでアミン保護基を除去して、カチオン性ポリA1〜3およびポリB1〜3系列を得た。これらのモノマーおよびポリマーの合成および特性決定は補足情報において報告する。
【０２３６】
溶血活性および抗菌活性
ポリA1の生物活性は、それが非選択的に活性であることを示しており、これは、それが哺乳動物および細菌の両方の細胞膜を破壊することを意味する(Ilker, M. F.; Nusslein, K.; Tew, G. N.; Coughlin, E. B. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15870-15875)。ポリA1の毒性はその疎水性に起因した。ポリマー骨格は、ポリマーの全体的疎水性を増大させたイソブテニル官能基を含有する。モノマー当たりのアミン基の数を2倍または3倍にすることの、ポリA1〜3の生物活性に対する効果を調査した。
【０２３７】
結果は、アミン基の数の増大がポリA1の溶血挙動を有意に減少させることを示す(図57A)。溶血活性をヒト赤血球(RBC)に対して試験し、HC50値として報告した(HC50: ヒト赤血球の50%を溶解させるために必要な濃度)。ポリA1は非常に溶血性が高い(＜1μg/mL)。アミン基の数を2倍および3倍にした際に、ポリマーは非溶血性になり、HC50値はポリA2およびポリA3についてそれぞれ700および500μg/mLとなった。一方、細菌成長の90%を抑制するために必要な最小阻止濃度(MIC90)として報告されるポリA1〜3の抗菌活性を、グラム陰性菌(大腸菌)およびグラム陽性菌(黄色ブドウ球菌)に対して試験した(図57Bおよび57C)。MIC90は、アミン基の数を2倍または3倍にした際の抗菌活性の有意な変化を示さない。
【０２３８】
上記の結果は、アミン基の数を増大させる一方で疎水性部分を同一に維持することが、溶血に対して好ましい影響を有するがポリA1〜3の抗菌活性に対してほとんど影響を有さないことを示す。この観察は、ポリマーの疎水性成分と親水性成分との間のバランスを最適化することの重要性を強調する。ポリA2およびポリA3がはるかに溶血性が低かった一方で抗菌活性を保持したことから、アミン基の数の増大が非活性ポリマーのポリB1に与える影響を調査した。結果は、ポリB1〜3系列の溶血挙動の有意な変化を示さず、これらのポリマーの全体的親水性が理由で、それらは予測通りRBCに対して不活性なままである(図57A)。これらの新規ポリB誘導体の抗菌活性は大腸菌に対して不活性なままである(図57B)が、ポリB2およびポリB3は、アミン基の数を2倍または3倍にする際に、黄色ブドウ球菌に対して活性になった。これは、ポリB1の200μg/mL超からポリB2およびポリB3のそれぞれ25および15μg/mLへのMIC90値の減少によって明らかになった。
【０２３９】
モデル膜試験
SMAMPと異なる細胞膜との間の相互反応を理解することは重要な科学的関心事であるが、複雑な多成分の問題である(Som, et al. Biopolymers 2008, 90, 83-93)。細菌細胞壁および哺乳動物細胞膜は、細胞内成分および膜タンパク質の差を別にすれば、それらのリン脂質組成に関しても非常に異なる(Som, et al. J. Phys. Chem. B 2008, 112, 3495-3502)。RBC膜の外面は、アニオン性脂質を含まず、双性イオン性ホスファチジルコリン(PC)から主に構成される。他方では、グラム陽性菌(例えば黄色ブドウ球菌)の膜はアニオン性リン脂質(ホスファチジルグリセロール(PG)およびカルジオリピン(CL))から主に構成され、一方、大部分のグラム陰性菌の膜は双性イオン性脂質ホスファチジルエタノールアミン(PE)に富んでいる。例えば、大腸菌の細胞膜はPE 約80% およびPG 約20% から構成される(Gabriel, et al. Mater. Sci. Eng., R 2007, 57, 28-64)。SMAMP誘導性孔形成におけるPEの特定の役割が最近報告された(Yang, et al. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 12141-12147)。
【０２４０】
これらの新規SMAMPの膜活性を調査するために、3つの異なるカルセイン色素担持小胞からのポリマー誘導性漏出を試験した: (i) RBC外葉を模倣する100% PC小胞V1、(ii) 大腸菌脂質膜を模倣する20/80 PG/PE小胞V2、および(iii) 黄色ブドウ球菌脂質膜を模倣する100% CL小胞V3。PC小胞V1(RBC模倣物)に対するこれらのポリマーの膜活性をモニタリングした。これを図58に示す。溶血性ポリA1は、PC小胞に対して非常に膜活性が高いが、漏出活性は、アミン基の数を2倍(ポリA2)または3倍(ポリA3)する際に著しく減少する。非溶血性ポリB1〜3系列全体はPC小胞に対して不活性にとどまる。すべてのこれらの実験はポリA1〜3およびポリB1〜3系列の溶血活性に関連している。
【０２４１】
これらのSMAMPと細菌膜模倣物との相互作用を理解するために、PG/PE小胞(V2)およびCL小胞(V3)からのカルセイン色素漏出を試験した。ポリA1はV2およびV3の両方に対して約80%の漏出活性を示した。アミン基の数を2倍にすることで(ポリA2)、漏出活性はV2およびV3についてそれぞれわずかに15%および5%減少する(図59Aおよび59B)。アミン基の数を3倍にする際に(ポリA3)、V2に対する漏出活性はポリA2と同様になるが、V3に対する漏出活性ははるかに低くなる(図59Aおよび59B)。対照的に、ポリB1はV2およびV3の両方に対して不活性にとどまり、一方、ポリB2およびポリB3はこれらの小胞からの漏出活性の増大を示し、ポリB2が最も高活性である(図59Cおよび59D)。
【０２４２】
膜活性が疎水性に主に基づくとすれば、ポリA1はRBCに対して活性であると考えられ、ポリB1は不活性であると考えられる。ポリA1〜3系列において、アミン基の数を2倍または3倍にすることで、PC小胞に対する活性は減少し、これはHC50観察値と一致する。対照的にポリB1は、そのポリマーの親水性が理由で、アミン基の数を増大させる際にRBCまたはPC膜に対して親和性を示さず、非溶血性のままである。
【０２４３】
ポリA1〜3系列の抗菌活性は電荷密度を増加させる際には不変のままであるが、ポリB1〜3系列は大腸菌に対する活性は示さないが黄色ブドウ球菌に対する強化された活性を示す(図57Bおよび57C)。この減少は、それらの細胞膜の構造的構成の差が理由である可能性がある。大部分のグラム陽性菌は、負に荷電した脂質に富んでいる。これらの親水性の高いカチオン性ポリマー(ポリA3およびポリB2〜3)と、負に荷電したペプチドグリカンから構成されるムレイン外層とが相互作用することも可能である(Navarre, et al. J. Biol. Chem. 1999, 274, 15847-15856)。モデル膜活性は、これらのSMAMPの生物活性と一般に相関している。アニオン性CL小胞に対するポリA3およびポリB2〜3の膜活性の異例の減少(図59Bおよび59D)は、ポリA3およびポリB2〜3が膜脂質依存性でなく、むしろ他の細胞外および/または細胞内標的と相互作用しうることを示す。
【０２４４】
SMAMPの選択性を増大させるには、疎水性部分と親水性部分との間のバランスが存在しなければならない。ポリA1〜3の場合、アミン基の数を2倍または3倍にすることで無毒のポリマーが得られる。ポリA1の溶血は1μg/mL未満からポリA2の700μg/mLに向上した。ポリB1〜3系列は予測通り非溶血性にとどまるが、ポリB2およびポリB3はグラム陽性菌に対して強化された活性を示す。小胞試験における、ポリB2およびポリB3のこの強化された抗菌活性と、それらの溶血および膜活性の欠如との組み合わせは、これらのSMAMPが膜以外の他の細胞標的を有しうることを示唆している。
【０２４５】
実施例
装置構成
NMRスペクトルをBruker DPX-300MHz (1H NMR; 13C NMR、75MHz)分光計上で記録した。化学シフトを、重水素化溶媒の1H(残留プロトンの)および13Cシグナルを基準とするδ(ppm)で報告する。分子量および多分散指数(PDI)をGPCによって、THF中でポリスチレン標準物質に対して、カラム2本セット(Polymer Laboratories)および屈折率検出器(HP1047A)を備えたシステム上にて40℃、流量1mL/分で測定した。蛍光測定をJobin Yvon Fluorolog-3上で行った。
【０２４６】
材料
すべての試薬をAcros Organics、AldrichまたはStremのいずれかより購入し、さらに精製せずに使用した。リン脂質1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DOPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-rac-(1-グリセロール)](DOPG); 1,1'2,2'-テトラオレオイルカルジオリピン(TOCL)をAvanti Polar Lipids Inc.から購入した。カルセインをSigmaから購入し、最高グレードのすべての塩および緩衝液はSigma-Aldrichから入手可能であり、受け取ったまま使用した。ジクロロメタンおよびTHFをそれぞれCaH2およびナトリウムベンゾフェノンケチルで乾燥させた。化合物3、5、7および第三世代グラブス触媒を文献に従って合成した。モノマーA1〜2およびB2〜3をスキーム9に従って合成した(Davis, et al. Bioorg. Med. Chem. 1999,7, 2303; Stone, et al. J. Org. Chem. 1984, 49, 1849; Kwart, et al. J. Am. Chem. Soc. 1952, 74, 3094; Louie, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 247)。
【０２４７】
Boc保護ビスアミノアルコール2
ビス-アミン1 (3.00g、33.3mmol)の溶液を最小量の水(1mL)に溶解させ、ジ-tert-ブチルジカーボネート(16.0g、73.3mmol)のジオキサン(400mL)溶液に加えた。反応混合物を窒素下室温で24時間攪拌した。溶媒を減圧除去した。得られた固体をジクロロメタン(300mL)に溶解させ、水(300mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧除去して白色固体を得た。白色固体をエーテルで洗浄し、濾過した(9.18g、98%)。
2012529557.tif 000098
【０２４８】
Boc保護トリスアミノアルコール4
最小量の水(1mL)に溶解したトリス-アミン塩3 (3g、12.37mmol)の溶液を、トリエチルアミン(5.7mL、40.81mmol)およびジ-tert-ブチルジカーボネート(8.9g、40.81mmol)のジオキサン(200mL)溶液に加えた。反応混合物を窒素下室温で24時間攪拌した。溶媒を減圧除去した。得られた固体をジクロロメタン(250mL)に溶解させ、水(250mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧除去して白色固体を得た。白色固体をエーテルで洗浄し、濾過した(5.07g、95%)。
2012529557.tif 000099
【０２４９】
官能化ノルボルネン6
5 (6.81g、56.66mmol)およびマレイミド(5g、51.5mmol)のトルエン(200mL)溶液を密封管中で130℃に24時間加熱した。トルエンの減圧除去後、得られた固体を最小量のエーテルに溶解させた。連続再結晶によって純粋なエキソ異性体6 (3.6g、32%)を得た。
2012529557.tif 000100
【０２５０】
モノマーA2〜3およびB2〜3の一般的合成手順
化合物7または8、アルコール誘導体2または4、およびトリフェニルホスフィン1.1当量を装入した丸底フラスコにTHFを加えた。次に溶液混合物を氷浴に浸漬させ、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)1.1当量を滴下した。DIADの添加後、氷浴を除去し、反応液を室温で24時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、粗生成物をトルエンに溶解させ、-20℃で24時間維持した。副生成物(白色結晶)を濾去し、母液を濃縮した。生成物を冷無水ジエチルエーテル(-20℃)から結晶化させた。母液を濃縮し、得られた生成物をカラムクロマトグラフィーによって単離した。
【０２５１】
モノマーA2
ノルボルネン8 (2.37g、10.9mmol)、アルコール2 (5.44g、12.0mmol)、トリフェニルホスフィン(3.15g、12.0mmol)、DIAD (2.33mL、12.0mmol)。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、120g ISCOカラム、50:50酢酸エチル/ヘキサン)で精製した。収率; 2.88g、54%。
2012529557.tif 000101
【０２５２】
モノマーA3
ノルボルネン8 (1.00g、4.60mmol)、アルコール4 (2.19g、5.06mmol)、トリフェニルホスフィン(1.33g、5.06mmol)、DIAD (0.98mL、5.06mmol)。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、120g ISCOカラム、10:90アセトニトリル/ジクロロメタン)で精製した。収率; 1.75g、60%。
2012529557.tif 000102
【０２５３】
モノマーB2
オキサノルボルネン7 (4.00g、24.2mmol)、アルコール2 (7.73g、26.6mmol)、トリフェニルホスフィン(6.99g、26.6mmol)、DIAD (5.17mL、26.6mmol)。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、120g ISCOカラム、10:90アセトン/ジクロロメタン)で精製した。収率; 6.32g、60%。
2012529557.tif 000103
【０２５４】
モノマーB3
オキサノルボルネン7 (2.73g、16.5mmol)、アルコール4 (7.87g、18.2mmol)、乾燥THF (300mL)中トリフェニルホスフィン(4.78g、18.2mmol)、DIAD (3.54mL、18.2mmol)。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、120g ISCOカラム、20:80アセトン/ジクロロメタン)で精製した。収率; 6.89g、70%。
2012529557.tif 000104
【０２５５】
一般的重合手順
モノマーA2〜3およびB2〜3の重合をそれぞれ無水THFおよびCH2Cl2中で行った(スキーム10)。公知の量のモノマーをシュレンクフラスコ中に秤量し、窒素雰囲気下に配置し、無水CH2Cl2またはTHF(モノマー100mg当たり1mL)に溶解させた。別のシュレンクフラスコ中に所望の量の第三世代グラブス触媒を加え、窒素で洗い流し、最小量の無水CH2Cl2またはTHFに溶解させた。凍結ポンプ解凍サイクルによって両方のフラスコを3回脱気した。触媒を含むフラスコにモノマーをカニューレ経由で移した。重合が完了するまで(NMRおよびGPCでモニタリングされる通り)、反応液を攪拌した。A2〜3系列の重合を60℃で30分間行った一方、B2〜3系列の重合を室温で10分間行った。重合反応をエチルビニルエーテル(0.2mL)で反応停止させた。アリコートをGPC分析用に取得した。ポリA2〜3では、最初に溶媒THFを減圧除去した。次にポリマーをCH2Cl2に再溶解させ、ショートシリカプラグに通した。ポリB2〜3では、ポリマー溶液をショートシリカプラグに通過させて触媒を除去した。次に溶媒CH2Cl2を減圧除去した。
【０２５６】
ポリA2
モノマー:触媒比＝6:1; モノマーA2 (0.10g、0.20mmol)、グラブス第三世代触媒(0.030g、0.033mmol)。収率; 75%。
2012529557.tif 000105
【０２５７】
ポリA3
モノマー:触媒比＝5:1; モノマーA3 (0.10g、0.16mmol)、グラブス第三世代触媒(0.028g、0.032mmol)。収率; 80%。
2012529557.tif 000106
【０２５８】
ポリB2
モノマー:触媒比＝7:1; モノマーB2 (0.10g、0.22mmol)、グラブス第三世代触媒(0.028g、0.031mmole)。収率; 90%。
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【０２５９】
ポリB3
モノマー:触媒比＝5:1; モノマーB3 (0.10g、0.17mmol)、グラブス第三世代触媒(0.030g、0.034mmol)。収率; 85%。
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【０２６０】
一般的脱保護手順
すべてのポリマーを最小量のCH2Cl2に溶解させ、過剰量のトリフルオロ酢酸(TFA)を加えた。溶液を室温で6時間攪拌した。TFAを減圧除去し、ポリマーを蒸留水に溶解させ、ショートシリカプラグに通し、48時間凍結乾燥させた。
【０２６１】
リポソーム調製
以下の緩衝液を使用した: 緩衝液A、40mMカルセイン、10mM Na2HPO4、pH 7.0; 緩衝液B、10mM Na2HPO4、90mM NaCl、pH 7.0。均質で大きな単層小胞(LUV)を押出法によって調製した(Som, et al. J. Phys. Chem. B 2008, 112, 3495-3502)。小胞の略称を、対応する脂質組成、内部緩衝液および外部緩衝液と共に表22に列挙する。
【０２６２】
小胞調製の一般的手順
適切な容量の脂質ストック溶液(25mg/mL CHCl3)をCHCl3 2mL中に入れ、ゆっくりと減圧蒸発させた後、減圧下に2時間超配置して薄膜を調製した。次に薄膜を緩衝液A 1mLで1時間水和させた。得られた懸濁液を5回の凍結融解サイクル(液体窒素を凍結に、温水浴を融解に使用)に供し、小型押出機を使用してポリカーボネート膜(Whatman、孔径400nm)を通じて10回超押し出し、2対の膜支持体の間に積層させた。外部カルセインをゲル濾過(Sephadex G-50)によって緩衝液Bを使用して除去し、得られた1.0mL小胞溶液を緩衝液Bで20mLに希釈して、約0.5mMの最終脂質濃度を有するカルセイン担持LUVストック溶液を得た。一般的小胞調製手順に従って、小胞V1〜V3を適切な脂質比を使用して調製した。
【０２６３】
色素漏出アッセイ
蛍光キュベット(キュベット中最終脂質濃度5.0μM)中で、カルセイン担持LUV (20μL)を緩衝液B 1.98mLに加えた。蛍光発光強度It (λem＝510nm、λex＝450nm)を、ポリマーのDMSO溶液20μLおよび20% Triton X-100 50μLの添加中の時間関数(t)としてモニタリングした。対照実験を、DMSO 20μLのみを加えて行った。光束曲線を漏出活性割合Yに対して正規化し、ここでY＝[(It−I0)/(I∞−I0)]×100とした。I0は、試料(ポリA1〜3またはポリB1〜3)の添加前のItとし、I∞は、20% Triton-Xの添加後のItとする。
【０２６４】
抗菌試験
ポリA1〜3およびポリB1〜3の抗菌活性を、標準的方法を使用して評価した(Hamuro, et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 12200-12201)。ポリマーのストック溶液をDMSOで作製した後、96ウェルプレート中にてミュラー・ヒントン(MH)培地で一定の体積に希釈した。すべての細菌(使用する細胞系: 大腸菌D31および黄色ブドウ球菌ATCC25923)をストックグリセロール溶液または凍結ストックから取得し、MH培地中にて希釈し、37℃で終夜成長させた。これらの培養物のサブサンプルを3時間成長させ、OD600を測定した後、細胞を0.001 OD600に希釈した。次に希釈細胞溶液(約105細胞/mL)を96ウェルプレートに加え、37℃で6時間インキュベートした。MIC90報告値は、細胞成長の90%を阻止するために必要な最小濃度とする。実験は二つ組で実行した。結果を表23に示す。
【０２６５】
溶血試験
全血を遠心分離(3000rpm、10分)して血漿および白血球を除去することによって、新鮮なヒト赤血球を得た。RBC (1mL)をTBS緩衝液(10mMトリス緩衝液、pH＝7.0、150mM NaCl) 9 mLで希釈し、懸濁液をさらに40倍希釈してRBCストック懸濁液(血液細胞0.25%)を得た。このRBCストック(120μL)、TBS緩衝液(15μL)およびポリマーストック溶液(15μL)(または対照溶液)を200μL遠心分離管に加え、37℃で1時間インキュベートした。管を4000rpmで5分間遠心分離した。上澄み液(30μL)をTBS緩衝液(100μL)で希釈し、溶液のOD414をヘモグロビン濃度として測定した。DMSOのみを含有する対照溶液を0%溶血の基準として使用した。1% Triton X-100をRBCに加え、OD414を測定することによって、完全溶血を測定した。OD414対ポリA1〜3およびポリB1〜3系列の濃度の非線形指数関数カーブフィッティングプロットによって、RBCの50%を溶解させるために必要な溶血量HC50を決定した。結果を表23に示す。
【０２６６】
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（スキーム９）A2〜3およびB2〜3の合成; i＝H2O、ジ-tert-ブチルジカーボネート、ジオキサン、24時間、室温; ii＝H2O、TEA、ジ-tert-ブチルジカーボネート、ジオキサン; iii＝130℃で24時間; iv＝THF、Ph3P、DIAD、-10℃〜室温。
【０２６７】
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（スキーム１０）ポリA2〜3およびポリB2〜3の合成。重合は第三世代グラブス触媒を使用して行い、ポリA2〜3系列はTHF中60℃で行い、ポリB2〜3系列はCH2Cl2中室温で行った。
【０２６８】
（表２２）小胞組成
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【０２６９】
（表２３）抗菌活性および溶血活性
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【０２７０】
参照による組み入れ
特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文献の参照および引用を本開示において行った。すべてのそのような文献は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２７１】
等価物
代表例は、本発明を例示することに役立つように意図されており、本発明の範囲を限定するようには意図されておらず、またそのように構成されるべきではない。実際、本発明の様々な修正、ならびに本明細書において示されかつ記載される態様以外のその多くのさらなる態様は、本明細書における実施例ならびに本明細書において引用される科学文献および特許文献の参照を含む本文献の内容全体から、当業者に明らかになるであろう。実施例は重要な追加の情報、例示および指針を含んでおり、それらを本発明の様々な態様およびその等価物において本発明の実行に適応させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【国際調査報告】
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