(57)【要約】  本発明は、α５β１に対する標的結合剤およびかかる薬剤の使用に関する。より具体的には、本発明は、α５β１に向けられた完全ヒトモノクローナル抗体に関する。説明される標的結合剤は、α５β１の活性および／または過剰産生に関連する疾患の治療に有用であり、かつ診断法として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００ピコモル濃度未満のＫｄで、α５β１インテグリンに特異的に結合する、標的結合剤。
【請求項２】
前記標的結合剤が、４０ピコモル濃度未満のＫｄで、α５β１インテグリンに結合する、請求項１に記載の標的結合剤。
【請求項３】
前記標的結合剤が、フィブロネクチン、フィブリン、接着分子Ｌ１−ＣＡＭ、Ｔｉｅ−２および／またはＦｌｔ１リガンドの、α５β１インテグリンへの結合を阻害する、請求項１または２に記載の標的結合剤。
【請求項４】
前記標的結合剤が、表１２および表１３に記載の重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の標的結合剤。
【請求項５】
前記標的結合剤が、ＭＡｂ．３Ｃ５または５Ｂ１１である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の標的結合剤。
【請求項６】
前記標的結合剤が、配列番号２２の配列を含むポリペプチドを含む、請求項１に記載の標的結合剤。
【請求項７】
前記標的結合剤が、配列番号２４の配列を含むポリペプチドを含む、請求項１に記載の標的結合剤。
【請求項８】
前記標的結合剤が、配列番号４８の配列を含むポリペプチドを含む、請求項１に記載の標的結合剤。
【請求項９】
前記標的結合剤が、配列番号５０の配列を含むポリペプチドを含む、請求項１に記載の標的結合剤。
【請求項１０】
α５β１インテグリンへの結合をめぐり、請求項１〜請求項９の標的結合剤のうちのいずれか１つと競合する、標的結合剤。
【請求項１１】
ａ）表１２または表１３に示されるＣＤＲ３配列か、
ｂ）表１２に示されるＣＤＲ３配列および表１３に示されるＣＤＲ３配列か、
ｃ）表１２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列か、または
ｄ）表１３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列か、または
ｅ）表１２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列か、または
ｆ）表１２に示される、ＭｃＡｂ．３Ｃ５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示されるＭｃＡｂ．３Ｃ５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、または
ｇ）表１２に示される、ＭｃＡｂ．５Ｂ１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示されるＭｃＡｂ．５Ｂ１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含むアミノ酸配列を含む、標的結合剤。
【請求項１２】
α５β１インテグリンに特異的に結合し、一連のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む標的結合剤であって、前記一連のＣＤＲは：
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列番号２５であり、
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列番号２６であり、
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列番号２７であり、
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列番号２８であり、
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列番号２９であり、および
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列番号３０である一連のＣＤＲからの１０個以下のアミノ酸置換を有する、標的結合剤。
【請求項１３】
α５β１インテグリンに特異的に結合する標的結合剤であって、一連のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、前記一連のＣＤＲは：
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列番号５１であり、
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列番号５２であり、
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列番号５３であり、
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列番号５４であり、
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列番号５５であり、および
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列番号５６である一連のＣＤＲからの１０個以下のアミノ酸置換を有する、標的結合剤。
【請求項１４】
前記標的結合剤が、モノクローナル抗体である、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の標的結合剤。
【請求項１５】
前記標的結合剤が、モノクローナル抗体のフラグメントである、請求項１４に記載の標的結合剤。
【請求項１６】
結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ＳｃＦｖＦｃ、またはｄＡｂからなる群から選択される、請求項１５に記載の結合フラグメント。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の標的結合剤をコードする核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
抗体を産生する方法であって、請求項１９に記載の宿主細胞を培養することと、細胞培養物から前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項２１】
哺乳動物における腫瘍性疾患を治療する方法であって、
腫瘍性疾患のための治療を必要とする動物を選択することと、治療的有効用量の請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の標的結合剤を、前記動物に投与することと、を含む、方法。
【請求項２２】
前記腫瘍性疾患が：黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮体癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、類表皮癌、および消化管間質腫瘍からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物における非腫瘍性疾患を治療する方法であって、
非腫瘍性疾患のための治療を必要とする動物を選択することと、治療的有効用量の請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の標的結合剤を、前記動物に投与することと、を含む、方法。
【請求項２４】
前記非腫瘍性疾患が：眼疾患、炎症性疾患、心血管疾患、および敗血症からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍性疾患の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の標的結合剤の使用。
【請求項２６】
非腫瘍性疾患の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の標的結合剤の使用。
【請求項２７】
癌の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の標的結合剤の使用。
【請求項２８】
薬学的に許容される担体を伴う、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の標的結合剤。
【請求項２９】
血管内皮成長因子のアンタゴニストと組み合わせた、請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載の標的結合剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的抗原α５β１インテグリン（α５β１）に対する標的結合剤およびかかる薬剤の使用に関する。幾つかの実施形態では、本発明は、α５β１に向けられた完全ヒトモノクローナル抗体およびこれらの抗体の使用に関する。本発明の態様はまた、かかる標的結合剤もしくは抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞株に関する。説明される標的結合剤および抗体は、α５β１の活性および／または過剰発現に関連する疾患の診断法として、およびその治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンスーパーファミリーは、１８本のα鎖および８本のβ鎖を利用するヘテロ二量体からなる、少なくとも２４のファミリーメンバーを含む（Ｈｙｎｅｓ，  （２００２）  Ｃｅｌｌ  １１０：  ６７３−８７）。この受容体のファミリーは、細胞表面上で発現され、細胞生存、増殖、移動、および分化、ならびに腫瘍浸潤および転移を調節する、細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス相互作用を媒介する（Ｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ，  （２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４：  ６７８−８６）。
【０００３】
インテグリンは、他の細胞受容体、成長因子、および細胞外マトリックスタンパク質に結合し、このうち多くのファミリーメンバーは、特定のタンパク質に対して重複する結合特異性を有する。この重複性は、重要な機能が、特定のインテグリンの不在時にも継続することを確実にし得る（Ｋｏｉｖｉｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  （２０００）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２５５：  １０−１７）。しかしながら、同様の特異性を備える個々のインテグリンの発現の時間的および空間的制限もまた、報告されており、リガンド結合に対する細胞応答を変化させ得る（Ｙｏｋｏｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：  ２４１４４−５０、Ｋｅｍｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９７）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２３４：  １５６−６４、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，  （２００６）  Ｊ．  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｍｅｄ．  ３５：  １−１０）。
【０００４】
インテグリンファミリーは、ヘテロ二量体のリガンド特異性に基づいて、複数のサブファミリーに分割することができる。１つのサブファミリーは、ＲＧＤトリペプチドを認識し、かつ、ＲＧＤトリペプチドに結合する全てのインテグリンからなる。これらの受容体には、αＩＩｂ／β３、ならびに全てのαＶおよびα５ヘテロ二量体が含まれる（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，  （２００６）  Ｊ．  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｍｅｄ．  ３５：  １−１０）。β１は、幾つかの他のα鎖と対形成することができるが、α５鎖は、β１鎖のみと対形成する。α５β１鎖ヘテロ二量体は、その一次リガンドとして、細胞外マトリックス構成成分であるフィブロネクチンに結合し、フィブリン（Ｓｕｅｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ  （１９９７）  ＪＢＣ，  ２７２，  ５３６０−５３６６）、接着分子Ｌ１−ＣＡＭ（Ｒｕｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）  ＪＣＢ，  １３１，  １８８１−１８９１）、およびＴｉｅ−２およびＦｌｔ１等の成長因子受容体（Ｃａｓｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＪＣＢ，  １７０，  ９９３−１００４、Ｏｒｒｅｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  ＪＣＳ，  １１６  ３４７９‐３４８９）に結合することが報告されている。
【０００５】
α５インテグリンサブユニットの発現は、ｍＲＮＡレベルで遍在することが報告されているが、タンパク質／受容体のレベルでの発現のレベルは、組織と細胞タイプによって異なる。加えて、インテグリンは、これらの組織内で、異なる「活性化」状態にある可能性が高く、このうち「活性な」α５β１は、成人における活発な組織再構築、または調節および病理に関連する。治療薬として特に興味深いのは、血管新生内皮細胞、マクロファージ／単球、平滑筋細胞、線維芽細胞、および腫瘍細胞上で発現されるα５β１の機能である。α５β１の発現は、しばしばその主なリガンドであるフィブロネクチンと一致し、それは脈管構造がより透過性であるか、または組織損傷が生じている多くの病的状態で見出される暫定的マトリックスの部分を形成する。受容体およびリガンドの共発現は、α５β１が機能的に活性な領域を決定する可能性が高い。
【０００６】
血管再構築におけるα５β１への要求は、よく確立されている（Ｗａｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｄｉｖａｌａ  （１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４，  ２７０−２７２）。α５ノックアウト（ＫＯ）マウスは、脈管構造を形成することができないため、胚性致死である（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １１９，  １０９３−１１０５）。これは単独で、血管再構築におけるα５β１の中心的役割を確立した。この観察と一致するように、α５β１機能は、脈管構造および胚様体において中心的役割を果たす（Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ａｒｔｅｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，  ２２，  ９２７−９３３）。一次α５β１リガンドである、フィブロネクチンのノックアウトはまた、脈管構造を形成することができない結果として、同様の胚致死性をもたらす。これは、αｖβ３またはαｖβ５等の他のインテグリン受容体のＫＯと対照をなし、それらの受容体は、血管新生プロセスにおいて同一の中心的役割を果たすとは思われない。α５β１発現は、種々の刺激に応答して、内皮細胞上で特異的に上方制御され（Ｃｏｌｌｏ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐｅｒ  （１９９９）  ＪＣＳ，  １１２，  ５６９−５７８）、内皮細胞中のα５β１の発現は、炎症および血管新生の両方の調節に関与する遺伝子の発現を促進することにおいて役割を果たす（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  （２００２）  ＭＣＢ，  ２２，  ５９１２−５９２２）。遺伝学的証拠と一致するように、α５β１は、血管新生プロセスにおける優性調節性インテグリンであると思われ、それは、発現されると、αωβ３等の他の内皮細胞インテグリンの活性を調節し（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  ＪＢＣ  ２７５，  ３３９２０−３３９２８）、アポトーシスを抑制する。α５β１の種々のアンタゴニスト（小分子、抗体、およびペプチド阻害剤）は、異なるインビトロおよびインビボ系における血管新生を低減させることが示されており（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈ  １５６，  １３４５−１３６２）、血管再構築を調節する中心的役割を裏付けている。次の国際特許出願：ＷＯ１９９９／５８１３９、ＷＯ２００４／０５６３０８、ＷＯ２００４／０８９９８８、ＷＯ２００５／０９２０７３、ＷＯ２００７／１３４８７６、およびＷＯ２００８／０６０６４５で、α５β１に向けられた抗体が開示されている。
【０００７】
α５β１は、細胞外マトリックスからのシグナル伝達を媒介すること、またさらに成長因子受容体からのシグナル伝達を調節することにおいても中心的役割を果たす。α５β１の関与は、アクチン重合、種々のチロシンキナーゼの活性化、ＥＲＫ活性化、アポトーシス促進誘因の下方制御を促進し、かつ、細胞周期進行を促進する（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，  １０２８−１０３２）。α５β１のシグナル伝達における一般的役割は、疾患病理の促進に関与する、種々の細胞タイプの機能を調節する受容体と一致する。内皮細胞機能を調節することに加えて、α５β１は、単球を含む白血球細胞上で大いに発現され、マクロファージからの血管新生ケモカインの産生を調節する（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６７，  ５３６２−５３６６）。さらに、α５β１は、リガンドに関与するとき、上皮細胞および線維芽細胞中の生存、細胞周期進行、ならびに遺伝子発現を調節する。
【０００８】
α５β１によって媒介される、生存促進性シグナル伝達および転写効果の結果として、それはまた、腫瘍細胞の生存および成長を促進することに関与している。特に、α５β１は、星状細胞腫（Ｍａｇｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ６６，  ６００２−６００７）および乳房（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ  （２００４）  Ｃａｎ  Ｒｅｓ，  ６４，  ８６７４−８６８１、Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｃａｎ  Ｒｅｓ，  ６６，  ３７１５−３７２５）腫瘍細胞の増殖を調節する。
【０００９】
α５β１に拮抗することは、修飾性または透過性脈管構造、腫瘍細胞を含む機能不全性または過剰増殖性上皮、および白血球によって促進される慢性炎症の疾患を伴う病理を促進することに関与する、多くのプロセスを調節する可能性が高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ１９９９／５８１３９
【特許文献２】ＷＯ２００４／０５６３０８
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８９９８８
【特許文献４】ＷＯ２００５／０９２０７３
【特許文献５】ＷＯ２００７／１３４８７６
【特許文献６】ＷＯ２００８／０６０６４５
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈｙｎｅｓ，  （２００２）  Ｃｅｌｌ  １１０：  ６７３−８７
【非特許文献２】Ｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ，  （２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４：  ６７８−８６
【非特許文献３】Ｋｏｉｖｉｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  （２０００）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２５５：  １０−１７
【非特許文献４】Ｙｏｋｏｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：  ２４１４４−５０
【非特許文献５】Ｋｅｍｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９７）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２３４：  １５６−６４
【非特許文献６】Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，  （２００６）  Ｊ．  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｍｅｄ．  ３５：  １−１０
【非特許文献７】Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，  （２００６）  Ｊ．  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｍｅｄ．  ３５：  １−１０
【非特許文献８】Ｓｕｅｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ  （１９９７）  ＪＢＣ，  ２７２，  ５３６０−５３６６
【非特許文献９】Ｒｕｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）  ＪＣＢ，  １３１，  １８８１−１８９１
【非特許文献１０】Ｃａｓｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＪＣＢ，  １７０，  ９９３−１００４
【非特許文献１１】Ｏｒｒｅｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  ＪＣＳ，  １１６  ３４７９‐３４８９
【非特許文献１２】Ｗａｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｄｉｖａｌａ  （１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４，  ２７０−２７２
【非特許文献１３】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １１９，  １０９３−１１０５
【非特許文献１４】Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ａｒｔｅｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，  ２２，  ９２７−９３３
【非特許文献１５】Ｃｏｌｌｏ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐｅｒ  （１９９９）  ＪＣＳ，  １１２，  ５６９−５７８
【非特許文献１６】Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  （２００２）  ＭＣＢ，  ２２，  ５９１２−５９２２
【非特許文献１７】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  ＪＢＣ  ２７５，  ３３９２０−３３９２８
【非特許文献１８】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈ  １５６，  １３４５−１３６２
【非特許文献１９】Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，  １０２８−１０３２
【非特許文献２０】Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６７，  ５３６２−５３６６
【非特許文献２１】Ｍａｇｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ６６，  ６００２−６００７
【非特許文献２２】Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ  （２００４）  Ｃａｎ  Ｒｅｓ，  ６４，  ８６７４−８６８１
【非特許文献２３】Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｃａｎ  Ｒｅｓ，  ６６，  ３７１５−３７２５
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、α５β１に特異的に結合し、α５β１を発現する細胞の増殖を阻害する標的結合剤に関する。これが達成され得るような機構は、リガンド結合を阻害すること、および／または腫瘍細胞増殖に関与する細胞シグナル伝達を阻害することを含み得、またそれに限定されない。標的結合剤はまた、腫瘍細胞接着を阻害する。標的結合剤は、腫瘍細胞増殖および血管新生を低減するのに有用である。
【００１３】
本発明の一実施形態では、標的結合剤は、１００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで、α５β１インテグリンに特異的に結合する。本発明の別の実施形態では、標的結合剤は、４０ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで、α５β１インテグリンに特異的に結合する。
【００１４】
本発明の一実施形態では、標的結合剤は、α５β１に特異的に結合し、フィブロネクチン、フィブリン、接着分子Ｌ１−ＣＡＭ、Ｔｉｅ−２および／またはＦｌｔ１リガンドの、α５β１への結合を阻害する。本発明の別の実施形態は、α５β１に結合し、細胞増殖に関与する下流細胞シグナル伝達を阻害する標的結合剤である。
【００１５】
幾つかの実施形態では、標的結合剤は、α５鎖またはα５β１ヘテロ二量体のいずれかに結合し、β１鎖のみとは交差反応しない。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、結合をめぐり、本明細書に記載される標的結合剤または抗体のいずれかと競合する標的結合剤である。
【００１７】
一実施形態では、標的結合剤は、約５００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫＤで、α５β１に結合する。別の実施形態では、標的結合剤は、約４００、３００、２００、または１００ｐＭ未満のＫＤで、結合する。一実施形態では、標的結合剤は、約７５、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ｐＭ未満のＫＤで、結合する。親和性および／または結合力測定値は、本明細書に記載される通り、ＦＭＡＴ、ＦＡＣＳ、および／またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定され得る。
【００１８】
別の実施形態では、標的結合剤は、一価親和性検定で測定されたとき、約４００、３００、２００、または１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１０、もしくは５ｐＭ未満のＫＤで、α５β１に結合する。一価親和性は、可溶性受容体を固定化抗体上に流すＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）検定において測定されてもよい。二価親和性検定と比較して、一価親和性検定によって報告されるＫＤは、実験上のアーティファクトによって影響を受ける可能性がはるかに低く、したがって、抗体の真の一価親和性にはるかに近いＫＤを報告することができる。二価親和性検定においては、固定化受容体の密度は、単一の抗体分子が流されるとき、それらが固定化受容体に２回結合および／または再結合する度合いに影響を与える。このため、二価親和性検定においては、受容体の密度は、報告されるＫＤに直接に影響を及ぼし得る。したがって、一価親和性検定は、より生物学的に意義のある、親和性の測定値を提供する。
【００１９】
別の実施形態では、標的結合剤は、飽和リガンドレベルでまたはそれに近いレベルで行われるとき、約４００、３００、２００、または１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１０、もしくは５ｐＭ未満のＩＣ５０で、受容体依存性またはリガンド誘発性シグナル伝達を阻害する。
【００２０】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤は、哺乳動物における腫瘍増殖および／または転移を阻害する。他の実施形態では、標的結合剤は、哺乳動物における炎症性障害に関連する症状を改善する。一実施形態では、標的結合剤は、哺乳動物におけるリウマチ性関節炎または乾癬から選択される、炎症性障害に関連する症状を改善する。改善され得る症状には、血管新生および滑膜炎が含まれるが、それらに限定されない。さらに他の実施形態では、標的結合剤は、哺乳動物における心血管疾患に関連する症状を改善する。改善され得る症状には、炎症および血管新生が含まれるが、それらに限定されない。幾つかの他の実施形態では、標的結合剤は、哺乳動物における敗血症に関連する症状を改善する。改善され得る症状には、無制御の血管透過性、血管漏出、および血管新生が含まれるが、それらに限定されない。幾つかの他の実施形態では、標的結合剤は、眼疾患に関連する症状を改善する。幾つかの他の実施形態では、標的結合剤は、虚血性網膜症または加齢黄斑変性等の眼疾患に関連する症状を改善する。改善され得る症状には、無制御の血管透過性および血管漏出が含まれるが、それらに限定されない。
【００２１】
本発明の一実施形態では、標的結合剤は、抗体である。本発明の一実施形態では、標的結合剤は、モノクローナル抗体である。本発明の一実施形態では、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態では、標的結合剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態では、標的結合剤は、ＩｇＧ２アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。このアイソタイプは、他のアイソタイプと比較して、エフェクター機能を誘発する潜在力が低減されており、それは低減された毒性をもたらし得る。本発明の別の実施形態では、標的結合剤は、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプと比較して、ＡＤＣＣを誘発する潜在力が増加されており、それは改善された有効性をもたらし得る。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ４と比較して、改善された安定性を有し、それは改善された生物学的利用能、または改善された製造の容易性もしくはより長い半減期をもたらし得る。一実施形態では、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体は、ｚ、ｚａ、またはｆアロタイプの抗体である。
【００２２】
別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１２および／または表１３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３配列のうちのどれでも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つを含む配列を含んでもよい。さらなる実施形態は、α５β１に特異的に結合し、表１２に示される相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のうちの１つを含む配列を含む、標的結合剤または抗体である。本発明の実施形態は、表１２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む、標的結合剤または抗体を含む。さらなる実施形態は、α５β１に特異的に結合し、表１２に示されるＣＤＲ配列のうちの２つを含む配列を含む、標的結合剤または抗体である。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１３に示されるＣＤＲ配列のうちの１つを含む配列を含む。本発明の実施形態は、表１３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む、標的結合剤または抗体を含む。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１３に示されるＣＤＲ配列のうちの２つを含む配列を含む。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに表１３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。幾つかの実施形態では、標的結合剤は、抗体である。ある実施形態では、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。他のある実施形態では、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体の結合フラグメントである。ある実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。他のある実施形態では、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体の結合フラグメントである。
【００２３】
当業者がＣＤＲ決定を容易に遂行できることに留意する。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ  （１９９１），１−３巻を参照されたい。Ｋａｂａｔは、多数の種抗体アイソタイプからの免疫グロブリン鎖の多重配列アライメントを提供する。アライメントした配列は、単一の付番方式である、Ｋａｂａｔ付番方式に従って番号が付けられる。Ｋａｂａｔ配列は、１９９１年の公開以来、更新されてきており、電子配列データベースとして入手可能である（ダウンロード可能な最新のバージョンは、１９９７年である）。Ｋａｂａｔに従って、Ｋａｂａｔ参照配列を用いたアライメントを行うことによって、任意の免疫グロブリン配列に番号を付けることができる。したがって、Ｋａｂａｔ付番方式は、免疫グロブリン鎖の番号付けのための統一体系を提供する。
【００２４】
一実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１２に示される重鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、抗体３Ｇ１１．１Ａ６、２Ｅ１０．１Ｂ９、２Ａ９．１Ａ１、２Ｃ５．２Ｂ１２、３Ｃ２．２Ａ８、３Ｃ５、８Ａ６．１Ａ３、２Ｆ５．１Ａ４、９Ｅ２．３Ａ８、７Ｂ２．３Ｂ１０、または５Ｂ１１の重鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。軽鎖混在は、当技術分野でよく確立されており、したがって、抗体３Ｇ１１．１Ａ６、２Ｅ１０．１Ｂ９、２Ａ９．１Ａ１、２Ｃ５．２Ｂ１２、３Ｃ２．２Ａ８、３Ｃ５、８Ａ６．１Ａ３、２Ｆ５．１Ａ４、９Ｅ２．３Ａ８、７Ｂ２．３Ｂ１０、もしくは５Ｂ１１、または本明細書に開示される別の抗体の重鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む、標的結合剤または抗体は、表１３に示される軽鎖配列、あるいは抗体３Ｇ１１．１Ａ６、２Ｅ１０．１Ｂ９、２Ａ９．１Ａ１、２Ｃ５．２Ｂ１２、３Ｃ２．２Ａ８、３Ｃ５、８Ａ６．１Ａ３、２Ｆ５．１Ａ４、９Ｅ２．３Ａ８、７Ｂ２．３Ｂ１０、もしくは５Ｂ１１、または本明細書に開示される別の抗体の軽鎖配列のうちのいずれか１つをさらに含んでもよい。幾つかの実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００２５】
一実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１３に示される軽鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、抗体３Ｇ１１．１Ａ６、２Ｅ１０．１Ｂ９、２Ａ９．１Ａ１、２Ｃ５．２Ｂ１２、３Ｃ２．２Ａ８、３Ｃ５、８Ａ６．１Ａ３、２Ｆ５．１Ａ４、９Ｅ２．３Ａ８、７Ｂ２．３Ｂ１０、または５Ｂ１１の軽鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。幾つかの実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００２６】
一実施形態では、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体、３Ｃ５または５Ｂ１１のうちの１つ以上を含む。ある実施形態では、標的結合剤は、モノクローナル抗体３Ｃ５である。他のある実施形態では、標的結合剤は、モノクローナル抗体５Ｂ１１である。さらなる実施形態では、標的結合剤は、上述のモノクローナル抗体のいずれからも誘導可能である。
【００２７】
一実施形態では、標的結合剤または抗体は、抗体３Ｇ１１．１Ａ６、２Ｅ１０．１Ｂ９、２Ａ９．１Ａ１、２Ｃ５．２Ｂ１２、３Ｃ２．２Ａ８、３Ｃ５、８Ａ６．１Ａ３、２Ｆ５．１Ａ４、９Ｅ２．３Ａ８、７Ｂ２．３Ｂ１０、または５Ｂ１１のＣＤＲのうちのいずれか１つから選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む配列を含んでもよい。一実施形態では、標的結合剤または抗体は、抗体３Ｇ１１．１Ａ６、２Ｅ１０．１Ｂ９、２Ａ９．１Ａ１、２Ｃ５．２Ｂ１２、３Ｃ２．２Ａ８、３Ｃ５、８Ａ６．１Ａ３、２Ｆ５．１Ａ４、９Ｅ２．３Ａ８、７Ｂ２．３Ｂ１０、または５Ｂ１１のＣＤＲのうちのいずれか１つから選択される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む配列を含んでもよい。
【００２８】
別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１２に示される完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む配列を含んでもよい。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１３に示される完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む配列を含んでもよい。一実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１２に示される完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む配列を含んでもよい。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１３に示される完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む配列を含んでもよい。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１２に示される完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む配列、ならびに表１３に示される完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含んでもよい。幾つかの実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００２９】
別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、一連のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含んでもよく、ここで一連のＣＤＲは：
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列番号２５であり、
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列番号２６であり、
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列番号２７であり、
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列番号２８であり、
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列番号２９であり、かつ
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列番号３０である、一連のＣＤＲからの１０個以下のアミノ酸置換を有する。
【００３０】
別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、一連のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含んでもよく、ここで一連のＣＤＲは：
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列番号５１であり、
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列番号５２であり、
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列番号５３であり、
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列番号５４であり、
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列番号５５であり、かつ
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列番号５６である、一連のＣＤＲからの１０以下のアミノ酸置換を有する。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態は、表１２または表１３に示される配列のうちのいずれか１つの配列の、フレームワーク領域およびＣＤＲ、具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に及ぶ、隣接した配列を含む配列を含む、標的結合剤または抗体である。一実施形態では、標的結合剤または抗体は、表１２または表１３に示されるモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１の配列のうちのいずれか１つの配列の、フレームワーク領域およびＣＤＲ、具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に及ぶ、隣接した配列を含む配列を含む、標的結合剤または抗体である。幾つかの実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３２】
一実施形態は、標的結合剤もしくは抗体、またはそれらの結合フラグメントを提供し、該薬剤もしくは抗体、またはそれらの結合フラグメントは、配列番号２２の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。一実施形態では、薬剤もしくは抗体、またはそれらの結合フラグメントは、配列番号２４の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。一実施形態では、標的結合剤もしくは抗体、またはそれらの結合フラグメントは、配列番号２２の配列を含む重鎖ポリペプチドおよび配列番号２４の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３３】
別の実施形態では、薬剤もしくは抗体、またはそれらの結合フラグメントは、配列番号４８の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。一実施形態では、薬剤もしくは抗体、またはそれらの結合フラグメントは、配列番号５０の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。一実施形態では、標的結合剤もしくは抗体、またはそれらの結合フラグメントは、配列番号４８の配列を含む重鎖ポリペプチドおよび配列番号５０の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３４】
一実施形態では、標的結合剤または抗体は、開示されるＣＤＲ、または重鎖もしくは軽鎖配列内で、２０、１６、１０、９個と同数の、もしくはそれよりも少ない、例えば、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を含む。かかる修飾は、潜在的に、ＣＤＲ内の残基において行なわれてもよい。幾つかの実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３５】
一実施形態では、標的結合剤または抗体は、本明細書に開示されるＣＤＲの変異体または誘導体、フレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ隣接した配列、本明細書に開示される軽鎖もしくは重鎖配列、または本明細書に開示される抗体を含む。変異体は、表１２または表１３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれかにおいて、２０、１６、１０、９個と同数の、もしくはそれよりも少ない、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６個のアミノ酸付加、置換、欠失、および／または挿入を有する配列、表１２または表１３に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ隣接した配列、本明細書に開示される軽鎖もしくは重鎖配列を含むか、または本明細書に開示されるモノクローナル抗体を共に含む、標的結合剤または抗体を含む。変異体は、表１２または表１３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれかとの、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、または約９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列、表１２または表１３に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ隣接した配列、本明細書に開示される軽鎖もしくは重鎖配列を含むか、または本明細書に開示されるモノクローナル抗体を共に含む、標的結合剤または抗体を含む。２個のアミノ酸配列の同一性％は、当業者に既知の任意の方法によって決定され得、ペアワイズタンパク質アライメントを含むが、それらに限定されない。一実施形態では、変異体は、天然産であるか、組み換えＤＮＡ技術または突然変異誘発技術を用いる天然配列のインビトロ操作によって導入される、本明細書に開示されるＣＤＲ配列、または軽鎖もしくは重鎖ポリペプチドの変化を含む。天然産変異体は、異種抗原に対する抗体の生成中に、対応する生殖細胞系ヌクレオチド配列内で、インビボで生成されるものを含む。一実施形態では、誘導体は、異種抗体であり得、それは２つ以上の抗体が共に結合される抗体である。誘導体は、化学修飾されている抗体を含む。例としては、水溶性ポリマー、Ｎ結合もしくはＯ結合炭水化物、糖、リン酸塩、および／または他のかかる分子等の１つ以上のポリマーの共有結合が挙げられる。誘導体は、結合される分子のタイプまたは位置のいずれかの点で、天然産または天然で出発する抗体とは異なる方法で修飾される。誘導体はさらに、抗体上に天然に存在する１つ以上の化学基の欠失を含む。
【００３６】
一実施形態では、標的結合剤は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例えば、（ｉ）１つがα５β１に対する特異性を備え、もう１つが第２の分子に対する特異性を備え、共に共役させられる２つの抗体、（ｉｉ）α５β１に特異的な１本の鎖および第２の分子に特異的な第２の鎖を有する単一の抗体、または（ｉｉｉ）α５β１および他の分子に対する特異性を有する１本鎖抗体、を含む二重特異性抗体が生成され得る。二重特異性抗体を作製する方法は、当業者に既知である：（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０５：５３７−５３９  （１９８３）、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：３６５５−３６５９  （１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １２１：２１０  （１９８６）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８（５）：１５４７−１５５３  （１９９２）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５２：５３６８  （１９９４）、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１号、同第９５，７３１，１６８号、同第４，６７６，９８０号、および同第４，６７６，９８０号、ＷＯ９４／０４６９０、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、および欧州特許第０３０８９号を参照されたい。）。例えば、（ｉ）および（ｉｉ）に関して、例えば、Ｆａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１  （１９９４）およびＷｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，上掲を参照されたく、（ｉｉｉ）に関しては、例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （Ｓｕｐｐｌ．）  ７：５１−５２  （１９９２）を参照されたい。いずれの場合も、第２の特異性は、重鎖活性化受容体に対して作製され得、制限なしに、ＣＤ１６もしくはＣＤ６４（例えば、Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ１８：１２７（１９９７）を参照されたい）、またはＣＤ８９（例えば、Ｖａｌｅｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ９０：４４８５−４４９２（１９９７）を参照されたい）を含む。
【００３７】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤または抗体は、配列番号２２を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号２２は、表１１の各行によって示される生殖細胞系および非生殖細胞系残基の組み合わせのうちのいずれか１個を含む。幾つかの実施形態では、配列番号２２は、表１１に示される生殖細胞系残基のうちのいずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、いずれか４個、いずれか５個、いずれか６個、いずれか７個、いずれか８個、いずれか９個、またはいずれか１０個を含む。他の実施形態では、標的結合剤または抗体は、ＶＨ４−３１、Ｄ２−２、およびＪＨ６Ｂ領域を備える生殖細胞系配列に由来し、ここで１つ以上の残基は、その位置で、対応する生殖細胞系残基を産生するために突然変異させられている。
【００３８】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤または抗体は、配列番号２４を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号２４は、表１０の各行によって示される生殖細胞系および非生殖細胞系残基の固有の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。幾つかの実施形態では、配列番号２４は、表１０に示される生殖細胞系残基のうちのいずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、または４個全てを含む。他の実施形態では、標的結合剤または抗体は、Ａ３およびＪＫ３領域を備える生殖細胞系配列に由来し、ここで１つ以上の残基は、その位置で、対応する生殖細胞系残基を産生するために突然変異させられている。
【００３９】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤または抗体は、配列番号２２および配列番号２４を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号２２は、表１１の各行によって示される生殖細胞系および非生殖細胞系残基のうちのいずれか１つの組み合わせを含み、配列番号２４は、表１０の各行によって示される生殖細胞系および非生殖細胞系残基の固有の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。幾つかの実施形態では、配列番号２２は、表１１に示される生殖細胞系残基のうちのいずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、いずれか４個、いずれか５個、いずれか６個、いずれか７個、いずれか８個、いずれか９個、またはいずれか１０個を含み、かつ、配列番号２４は、表１０に示される生殖細胞系残基のうちのいずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、または４個全てを含む。
【００４０】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤または抗体は、配列番号４８を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号４８は、表９の各行によって示される生殖細胞系および非生殖細胞系残基の固有の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。幾つかの実施形態では、配列番号４８は、表９に示される生殖細胞系残基のうちのいずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、いずれか４個、いずれか５個、または６個全てを含む。他の実施形態では、標的結合剤または抗体は、ＶＨ３−３３、Ｄ６−１３、およびＪＨ４Ｂ領域を備える生殖細胞系配列に由来し、ここで１つ以上の残基は、その位置で、対応する生殖細胞系残基を産生するために突然変異させられている。
【００４１】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤または抗体は、配列番号５０を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号５０は、表８の各行によって示される生殖細胞系および非生殖細胞系残基の固有の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。幾つかの実施形態では、配列番号５０は、表８に示される生殖細胞系残基のうちのいずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、または４個全てを含む。ある実施形態では、標的結合剤または抗体は、Ｌ１およびＪＫ４領域を備える生殖細胞系配列に由来し、ここで１つ以上の残基は、その位置で、対応する生殖細胞系残基を産生するために突然変異させられている。
【００４２】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤または抗体は、配列番号４８および配列番号５０を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号４８は、表９の各行によって示される生殖細胞系および非生殖細胞系残基の固有の組み合わせのうちのいずれか１つを含み、かつ、配列番号５０は、表８の各行によって示される生殖細胞系および非生殖細胞系残基の固有の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。幾つかの実施形態では、配列番号４８は、表９に示される生殖細胞系残基のうちのいずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、いずれか４個、いずれか５個、または６個全てを含み、かつ、配列番号５０は、表８に示される生殖細胞系残基のうちのいずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、または４個全てを含む。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は、α５β１への結合をめぐり、本発明の標的結合剤もしくは抗体と競合または交差競合する、標的結合剤または抗体である。本発明の別の実施形態では、α５β１への結合をめぐり、本発明の標的結合剤もしくは抗体と競合または交差競合する抗体が存在する。別の実施形態では、標的結合剤または抗体は、α５β１への結合をめぐり、完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のうちのいずれか１つと競合する。「競合する」とは、標的結合剤または抗体が、α５β１への結合をめぐり、完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のうちのいずれか１つと競合する、すなわち、競合は、一方向性であることを示す。
【００４４】
本発明の実施形態は、α５β１への結合をめぐり、完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のうちのいずれか１つと交差競合する標的結合剤または抗体を含む。「交差競合する」とは、標的結合剤または抗体が、α５β１への結合をめぐり、完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１のうちのいずれか１つと競合し、逆もまた同様である、すなわち、競合は、双方向性であることを示す。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の標的結合剤もしくは抗体のエピトープと同一のα５β１上のエピトープに結合する標的結合剤または抗体である。本発明の実施形態はまた、完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５もしくは５Ｂ１１のうちのいずれか１つと同一のα５β１上のエピトープに結合する標的結合剤または抗体も含む。本発明の他の実施形態は、本明細書に記載される標的結合剤もしくは抗体のいずれかをコードする単離された核酸分子、本明細書に記載される標的結合剤もしくは抗体をコードする単離された核酸分子を有するベクター、またはかかる核酸分子のいずれかで転換された宿主細胞を含む。本発明の実施形態は、α５β１に特異的に結合し、フィブロネクチン、フィブリン、接着分子Ｌ１−ＣＡＭ、ならびにＴｉｅ−２およびＦｌｔ１等の成長因子受容体の、α５β１への結合を阻害する、完全ヒト単離標的結合剤をコードする核酸分子を含む。本発明はまた、本明細書に定義される通り、厳格な条件下またはより低い厳格度のハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載される標的結合剤または抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドも包含する。
【００４６】
本明細書に記載される本発明の実施形態はまた、これらの抗体を産生するための細胞も提供する。細胞の例としては、α５β１に対する抗体を産生する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞の変異体（例えばＤＧ４４）、およびＮＳ０細胞等の、ハイブリドーマまたは組み換えにより作り出された細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞の変異体についてのさらなる情報は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｒｅｉｌｌｙ  （２００４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５，  ４５６−４６２で見出され得、該参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマから、あるいは遺伝子もしくは抗体をコードする遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされている、組み換え操作された細胞から製造され得る。
【００４７】
加えて、本発明の一実施形態は、核酸分子が抗体を産生するために発現され、続いて抗体が回収されるような条件下で宿主細胞を培養することによって、本発明の抗体を産生する方法である。本発明の実施形態はまた、抗体産生のために宿主細胞へトランスフェクトされるとき、抗体またはそのフラグメントの収率を増加させるために最適化された核酸配列を含む、本発明の抗体または抗体のフラグメントをコードする任意の核酸分子も含むことを理解すべきである。
【００４８】
本明細書のさらなる実施形態は、哺乳動物に、ヒトα５β１を発現する細胞、ヒトα５β１、精製ヒトα５β１、もしくはそれらのフラグメントを含有する単離された細胞膜、および／または１つ以上のオルソロガスな配列もしくはそのフラグメントで免疫付与することによって、α５β１に特異的に結合し、α５β１の生物学的活性を阻害する抗体を産生する方法を含む。
【００４９】
本発明の他の実施形態では、本発明の標的結合剤もしくは抗体またはそれらの結合フラグメント、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００５０】
本発明のまたさらなる実施形態は、動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することによって、腫瘍性疾患を患う動物を治療する方法を含む。ある実施形態では、該方法はさらに、腫瘍性疾患のための治療を必要とする動物を選択すること、および動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することを含む。
【００５１】
本発明のまたさらなる実施形態は、動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することによって、非腫瘍性疾患を患う動物を治療する方法を含む。ある実施形態では、該方法はさらに、非腫瘍性疾患のための治療を必要とする動物を選択すること、および動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することを含む。
【００５２】
本発明のまたさらなる実施形態は、動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することによって、悪性腫瘍を患う動物を治療する方法を含む。ある実施形態では、該方法はさらに、悪性腫瘍のための治療を必要とする動物を選択すること、および動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することを含む。
【００５３】
本発明のまたさらなる実施形態は、動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することによって、炎症性障害を患う動物を治療する方法を含む。ある実施形態では、該方法はさらに、炎症性障害のための治療を必要とする動物を選択すること、および動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することを含む。
【００５４】
本発明のまたさらなる実施形態は、動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することによって、α５β１発現に関連する疾患または病態を患う動物を治療する方法を含む。ある実施形態では、該方法はさらに、α５β１発現に関連する疾患または病態のための治療を必要とする動物を選択すること、および動物に、α５β１に特異的に結合する標的結合剤の治療的有効用量を投与することを含む。
【００５５】
悪性腫瘍は：黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮体癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌（胆管細胞癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、および類表皮癌からなる群から選択されてもよい。
【００５６】
治療可能な増殖性、血管新生、細胞接着、または浸潤関連疾患には、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、胆嚢癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮体癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌（胆管細胞癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、類表皮癌、および慢性骨髄性白血病を含む白血病等の腫瘍性疾患が含まれる。
【００５７】
一実施形態では、腫瘍性疾患は、黒色腫、結腸癌、または慢性骨髄性白血病である。
【００５８】
非腫瘍性疾患には、リウマチ性関節炎もしくは乾癬等の炎症性障害、アテローム性動脈硬化症等の心血管疾患、敗血症、虚血性網膜症等の眼疾患、または加齢黄斑変性（ＡＭＤ）が含まれる。
【００５９】
炎症性障害には、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎、および乾癬が含まれる。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、α５β１に単独で依存するか、または部分的に依存する腫瘍を有する患者において、α５β１を阻害する際の使用に好適である。
【００６１】
本発明のまたさらなる実施形態は、増殖性、血管新生、細胞接着、または浸潤関連疾患を患う動物の治療のための薬剤の調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。ある実施形態では、使用はさらに、増殖性、血管新生、細胞接着、または浸潤関連疾患のための治療を必要とする動物を選択することを含む。
【００６２】
本発明のまたさらなる実施形態は、腫瘍性疾患を患う動物の治療のための薬剤の調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。ある実施形態では、使用はさらに、腫瘍性疾患のための治療を必要とする動物を選択することを含む。
【００６３】
本発明のまたさらなる実施形態は、非腫瘍性疾患を患う動物の治療のための薬剤の調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。ある実施形態では、使用はさらに、非腫瘍性疾患のための治療を必要とする動物を選択することを含む。
【００６４】
本発明のまたさらなる実施形態は、悪性腫瘍を患う動物の治療のための薬剤の調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。ある実施形態では、使用はさらに、悪性腫瘍のための治療を必要とする動物を選択することを含む。
【００６５】
本発明のまたさらなる実施形態は、炎症性疾患を患う動物の治療のための薬剤の調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。ある実施形態では、使用はさらに、炎症性疾患のための治療を必要とする動物を選択することを含む。
【００６６】
本発明のまたさらなる実施形態は、α５β１発現に関連する疾患または病態を患う動物の治療のための薬剤の調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。ある実施形態では、使用はさらに、α５β１発現に関連する疾患または病態のための治療を必要とする動物を選択することを含む。
【００６７】
本発明のまたさらなる実施形態は、増殖性、血管新生、細胞接着、または浸潤関連疾患を患う動物の治療のための、本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００６８】
本発明のまたさらなる実施形態は、腫瘍性疾患を患う動物の治療のための、本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００６９】
本発明のまたさらなる実施形態は、非腫瘍性疾患を患う動物の治療のための、本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００７０】
本発明のまたさらなる実施形態は、悪性腫瘍を患う動物の治療のための、本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００７１】
本発明のまたさらなる実施形態は、α５β１発現に関連する疾患または病態を患う動物の治療のための、本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００７２】
一実施形態では、
増殖性、血管新生、細胞接着、もしくは浸潤関連疾患、
腫瘍性疾患、
非腫瘍性疾患、
悪性腫瘍、
炎症性障害、または
α５β１発現に関連する疾患もしくは病態の治療は、
上述の疾患または病態のいずれかを管理すること、改善させること、予防することを含む。
【００７３】
一実施形態では、腫瘍性疾患の治療は、腫瘍増殖の阻害、腫瘍増殖遅延、腫瘍の退縮、腫瘍の縮小、治療の中止後の腫瘍再増殖までの時間延長、腫瘍再発までの時間延長、疾患進行の減速を含む。
【００７４】
本発明の幾つかの実施形態では、治療される動物は、ヒトである。
【００７５】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７６】
本発明の幾つかの実施形態では、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１からなる群から選択される。
【００７７】
本発明の実施形態は、本明細書に記載される標的結合剤、および治療剤を含む共役体を含む。本発明の幾つかの実施形態では、治療剤は、毒素である。他の実施形態では、治療剤は、放射性同位体である。さらに他の実施形態では、治療剤は、薬学組成物である。
【００７８】
別の態様では、患者における癌細胞を選択的に死滅させる方法が提供される。該方法は、患者に、完全ヒト抗体共役体を投与することを含む。完全ヒト抗体共役体は、α５β１に結合し得る抗体、および薬剤を含む。薬剤は、癌細胞を死滅させるであろう毒素、放射性同位体、または別の物質のいずれかである。抗体共役体は、それによって癌細胞を選択的に死滅させる。
【００７９】
一態様では、α５β１に特異的に結合する共役完全ヒト抗体が提供される。薬剤は、抗体に結合され、抗体の細胞への結合は、薬剤の細胞への送達をもたらす。一実施形態では、上の共役完全ヒト抗体は、α５β１の細胞外領域に結合する。別の実施形態では、抗体および共役毒素は、α５β１を発現する細胞によって内在化される。別の実施形態では、薬剤は、細胞毒である。別の実施形態では、薬剤は、例えばサポリンもしくはアウリスタチン、緑膿菌外毒素、ゲロニン、リシン、カリケアマイシン、またはメイタンシンベースの免疫複合体等である。さらに別の実施形態では、薬剤は、放射性同位体である。
【００８０】
本発明の標的結合剤または抗体は、単独で投与され得るか、さらなる抗体もしくは化学療法薬、または放射線療法と組み合わせて投与され得る。例えば、細胞接着、浸潤、血管新生、もしくは増殖をブロックする、α５β１抗体のモノクローナル、オリゴクローナル、またはポリクローナル混合物が、腫瘍細胞増殖を阻害することが示される薬物と組み合わせて投与され得る。
【００８１】
本発明の別の実施形態では、本明細書に開示される抗体が、患者または患者の試料におけるα５β１のレベルを検出するために利用される、疾患または病態を診断する方法を含む。一実施形態では、患者の試料は、血液もしくは血清、または尿である。さらなる実施形態では、抗α５β１抗体を用いたα５β１の発現および／または過剰発現の特定を含む、リスク要因の特定、疾患の診断、および疾患の病期診断のための方法が提示される。幾つかの実施形態では、該方法は、患者に、細胞上のα５β１に選択的に結合する完全ヒト抗体共役体を投与することを含む。抗体共役体は、α５β１に特異的に結合する抗体、および標識を含む。該方法はさらに、患者における標識の存在を観察することを含む。特定の細胞タイプ上の比較的高量の標識は、比較的高い疾患のリスクを示し、比較的低量の標識は、比較的低い疾患のリスクを示すであろう。一実施形態では、標識は、緑色蛍光タンパク質である。
【００８２】
本発明はさらに、患者の試料におけるα５β１のレベルを検定する方法を提供し、それは、本明細書に開示される抗体を、患者からの生物学的試料と接触させること、および該試料における該抗体とα５β１との間の結合のレベルを検出することを含む。より特定の実施形態では、生物学的試料は、血液、血漿、または血清である。
【００８３】
本発明の別の実施形態は、血清または細胞を、本明細書に開示される抗体と接触させ、それ以降、α５β１の存在を検出することによって、細胞中のα５β１の発現に関連する病態を診断する方法を含む。一実施形態では、病態は、腫瘍性疾患を含むが、それに限定されない、増殖性、血管新生、細胞接着、または浸潤関連疾患であり得る。
【００８４】
別の実施形態では、本発明は、α５β１関連疾患のスクリーニングをするために、哺乳類組織、細胞、または体液におけるα５β１を検出するための検定キットを含む。キットは、本明細書に開示される抗体、および存在する場合、抗体のα５β１との反応を示す手段を含む。一実施形態では抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、α５β１に結合する抗体は、標識化されている。別の実施形態では、抗体は、標識化されていない一次抗体であり、キットはさらに、一次抗体を検出する手段を含む。一実施形態では、検出する手段は、抗免疫グロブリンである、標識化された第２の抗体を含む。抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種、および放射線不透性物質からなる群から選択されるマーカーで標識されてもよい。
【００８５】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、補体を結合させ、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を亢進させるために修飾され得る。他の実施形態では、標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を亢進させるために修飾され得る。さらに他の実施形態では、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を亢進させるために、かつ補体を結合させ、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を亢進させるために修飾され得る。
【００８６】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、補体を結合させ、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を低減させるために修飾され得る。他の実施形態では、標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を低減させるために修飾され得る。さらに他の実施形態では、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を低減させるために、かつ補体を結合させ、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を低減させるために修飾され得る。
【００８７】
ある実施形態では、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の半減期、および本発明の組成物の半減期は、少なくとも約４〜７日間である。ある実施形態では、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の平均半減期、および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約２〜５日間、３〜６日間、４〜７日間、５〜８日間、６〜９日間、７〜１０日間、８〜１１日間、８〜１２、９〜１３、１０〜１４、１１〜１５、１２〜１６、１３〜１７、１４〜１８、１５〜１９、または１６〜２０日間である。他の実施形態では、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の平均半減期、および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約１７〜２１日間、１８〜２２日間、１９〜２３日間、２０〜２４日間、２１〜２５日間、２２〜２６日間、２３〜２７日間、２４〜２８日間、２５〜２９日間、または２６〜３０日間である。またさらなる実施形態では、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の半減期、および本発明の組成物の半減期は、最長約５０日間であり得る。ある実施形態では、抗体の半減期および本発明の組成物の半減期は、当業者に既知の方法によって延長させられ得る。かかる延長は、次に抗体組成物の投薬の量および／または頻度を低減させ得る。改善されたインビボ半減期を備える抗体およびそれらを調製する方法は、米国特許第６，２７７，３７５号、ならびに国際公開ＷＯ９８／２３２８９およびＷＯ９７／３４６１に開示される。
【００８８】
別の実施形態では、本発明は、容器を含む製造品を提供する。容器は、本明細書に開示される標的結合剤または抗体を含有する組成物、ならびに組成物が、細胞接着、浸潤、血管新生、および／またはα５β１の発現または過剰発現によって特徴付けられる疾患を含むが、それらに限定されない増殖関連疾患を治療するために使用され得ることを示す添付文書またはラベルを含む。
【００８９】
他の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される標的結合剤または抗体を含有する組成物を含むキット、および組成物を、治療を必要とする被験体に投与するための使用説明書を提供する。
【００９０】
本発明は、変異型Ｆｃ領域を含むタンパク質の製剤を提供する。つまり、非天然産Ｆｃ領域、例えば１つ以上の非天然産アミノ酸残基、すなわち、特定の位置で通常見出されるアミノ酸以外のアミノ酸を含むＦｃ領域である。アミノ酸欠失、付加、および／または修飾を含むＦｃ領域もまた、本発明の変異型Ｆｃ領域に包含される。
【００９１】
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させることによって、増加させられてもよい。一実施形態では、Ｆｃ変異型タンパク質は、同等の分子と比較して、亢進された血清半減期を有する。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３９、３３０、および３３２からなる群から選択される１つ以上の位置で、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。任意に、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つ以上の位置で、さらなる非天然産アミノ酸をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１個の非天然産アミノ酸、およびＫａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択される１つ以上の位置で、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。
【００９３】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３４、２３５、および３３１からなる群から選択される１つ以上の位置で、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓからなる群から選択される、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。さらなる特定の実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３４Ｆ、２３５Ｆ、および３３１Ｓの非天然産アミノ酸残基を含む。別の特定の実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３４Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓの非天然産アミノ酸残基を含む。任意に、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つ以上の位置で、さらなる非天然産アミノ酸をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異体を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓからなる群から選択される、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含み、１つ以上の位置で、少なくとも１個の非天然産アミノ酸は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択される。
【００９４】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異型タンパク質製剤を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３９、３３０、および３３２からなる群から選択される１つ以上の位置で、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異型タンパク質製剤を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。任意に、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つ以上の位置で、さらなる非天然産アミノ酸をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異型タンパク質製剤を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含み、１つ以上の位置で、少なくとも１個の非天然産アミノ酸は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択される。
【００９５】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異型タンパク質製剤を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３４、２３５、および３３１からなる群から選択される１つ以上の位置で、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異型タンパク質製剤を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓからなる群から選択される、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含む。任意に、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つ以上の位置で、さらなる非天然産アミノ酸をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃ変異型タンパク質製剤を提供し、ここでＦｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓからなる群から選択される、少なくとも１個の非天然産アミノ酸を含み、１つ以上の位置で、少なくとも１個の非天然産アミノ酸は、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによって付番されるとき、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択される。
【００９６】
非天然産Ｆｃ領域を生成する方法は、当業者に既知である。例えば、アミノ酸置換および／または欠失は、部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８２：４８８−４９２（１９８５））、ＰＣＲ突然変異誘発（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ  “ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ｐｐ．１７７−１８３（１９９０））、およびカセット変異導入法（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ３４：３１５−３２３  （１９８５））を含むが、それらに限定されない突然変異誘発方法によって生成され得る。好ましくは、部位特異的突然変異誘発は、重複伸長ＰＣＲ法（Ｈｉｇｕｃｈｉ，  ｉｎ  “ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．６１−７０  （１９８９））によって行われる。重複伸長ＰＣＲ（Ｈｉｇｕｃｈｉ，同書）の技術もまた、任意の所望の突然変異を、標的配列（出発ＤＮＡ）に導入するために使用され得る。例えば、重複伸長法における、第１回のＰＣＲは、外部プライマー（プライマー１）および内部突然変異誘発プライマー（プライマー３）を用いて、ならびに別に第２の外部プライマー（プライマー４）および内部プライマー（プライマー２）を用いて標的配列を増幅することを含み、それによって２つのＰＣＲセグメント（セグメントＡおよびＢ）を産出する。内部突然変異誘発プライマー（プライマー３）は、所望の突然変異を特定する標的配列に対するミスマッチを含有するように設計される。第２回のＰＣＲにおいては、第１回のＰＣＲ（セグメントＡおよびＢ）の産物は、２つの外部プライマー（プライマー１および４）を用いて、ＰＣＲによって増幅される。得られた完全長のＰＣＲセグメント（セグメントＣ）は、制限酵素で分解され、得られた制限フラグメントは、適切なベクターにクローン化される。突然変異誘発の第１ステップとして、出発ＤＮＡ（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、抗体、または単にＦｃ領域をコードする）は、突然変異誘発ベクターに、作動可能にクローン化される。プライマーは、所望のアミノ酸置換を反映するように設計される。変異型Ｆｃ領域の生成に有用な他の方法は、当業者に既知である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、同第５，８８５，５７３号、同第５，６７７，４２５号、同第６，１６５，７４５号、同第６，２７７，３７５号、同第５，８６９，０４６号、同第６，１２１，０２２号、同第５，６２４，８２１号、同第５，６４８，２６０号、同第６，５２８，６２４号、同第６，１９４，５５１号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，２７７，３７５号、米国特許公開第２００４／０００２５８７号、およびＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１、ＷＯ９９／５８５７２、ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０２／０６０９１９、ＷＯ０４／０２９２０７、ＷＯ０４／０９９２４９、ＷＯ０４／０６３３５１を参照されたい）。
【００９７】
本発明の幾つかの実施形態では、本明細書に提供される抗体の糖鎖形成パターンは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を亢進させるために修飾される。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  ＪＢＣ．  ２７７：２６７３３、Ｓｈｉｎｋａｗａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  ＪＢＣ．  ２７８：３４６６、およびＯｋａｚａｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３３６：  １２３９を参照されたい。幾つかの実施形態では、Ｆｃ変異型タンパク質は、１つ以上の操作された糖型、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合された炭水化物組成物を含む。操作された糖型は、エフェクター機能を亢進することまたは低減することを含むが、それらに限定されない種々の目的に有用であり得る。操作された糖型は、当業者に既知の任意の方法によって、例えば、操作された発現株または変異型発現株を用いることによって、１つ以上の酵素、例えばＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）との共発現によって、種々の生物または種々の生物からの細胞株中のＦｃ領域を含む分子を発現することによって、またはＦｃ領域を含む分子が発現された後で、炭水化物を修飾することによって生成され得る。操作された糖型を生成する方法は、当業者に既知であり、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３）、米国特許第６，６０２，６８４号、米国特許出願第１０／２７７，３７０号、米国特許出願第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３０９５４Ａ１、Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，  Ｉｎｃ．  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）糖鎖付加工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載される方法を含むが、それらに限定されない。例えば、ＷＯ０００６１７３９、ＥＡ０１２２９１２５、ＵＳ２００３０１１５６１４、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  ＪＭＢ，  ３３６：  １２３９−４９を参照されたい。
【００９８】
Ｆｃ領域の糖鎖形成が、エフェクター機能を増加または減少させるために修飾され得ることもまた、当業者に既知である（例えば、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３、米国特許第６，６０２，６８４号、米国特許出願第１０／２７７，３７０号、米国特許出願第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３０９５４Ａ１、Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）糖鎖付加工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照されたい）。したがって、一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、アミノ酸残基の変化した糖鎖形成を含む。別の実施形態では、アミノ酸残基の変化した糖鎖形成は、低下したエフェクター機能をもたらす。別の実施形態では、アミノ酸残基の変化した糖鎖形成は、増加したエフェクター機能をもたらす。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、低減されたフコシル化を有する。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、アフコシル化される（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号を参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】１０μｇ／ｍＬのＬ２３０の存在時に、内皮細胞のフィブロネクチンへの結合に対する、阻害性α５β１抗体の効果を示す棒グラフである。抗体処置は、Ｘ軸上に示され、処置なしの対照と比較される。示される通り、ＩｇＧ１対照、３Ｃ５、および５Ｂ１１は、１０μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬで使用された。細胞数によって測定されたときの平均細胞接着は、平均値の標準偏差（エラーバー）と共に、Ｙ軸上に示される。
【図２】内皮細胞管形成共培養検定における、内皮細胞管形成に対する、阻害性α５β１抗体の効果を示す棒グラフである。抗体は、Ｘ軸上に示され、棒の各群における濃度は、左から右に、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、および０．０４μｇ／ｍＬである。長さ（ｍｍ）の観点から見た管形成の程度、および分岐は、Ｙ軸上に示される。示される値は、平均＋／−標準偏差である。血管長（ｍｍ）は、黒棒で、分岐は灰色の棒で示される。
【図３】インビボでの血管新生に対する、阻害性α５β１抗体の効果を示す棒グラフである。処置は、Ｘ軸上に示される：対照ビヒクルを週２回、３Ｃ５を２０ｍｇ／ｋｇで週２回（斜線棒）、３Ｃ５を１０ｍｇ／ｋｇで週２回（格子棒）、Ｙ軸は、平均血管密度＋／−標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本発明の実施形態は、α５β１に結合する標的結合剤に関する。幾つかの実施形態では、標的結合剤は、α５β１に結合し、フィブロネクチン、フィブリン、接着分子Ｌ１−ＣＡＭ、ならびにＴｉｅ−２およびＦｌｔ１等の成長因子受容体の、α５β１への結合を阻害する。一実施形態では、標的結合剤は、モノクローナル抗体、またはその結合フラグメントである。かかるモノクローナル抗体は、本明細書で抗α５β１抗体と称されてもよい。
【０１０１】
本発明の他の実施形態は、完全ヒト抗α５β１抗体、および治療的に有用な抗体調製物を含む。一実施形態では、本発明の抗α５β１抗体の調製物は、望ましい治療特性を有し、それは、α５β１に対する強力な結合親和性、およびインビトロおよびインビボでα５β１誘発性細胞活性を阻害する能力を含む。
【０１０２】
加えて、本発明の実施形態は、疾患を治療するためにこれらの抗体を用いる方法を含む。本発明の抗α５β１抗体は、α５β１媒介型腫瘍発生および健常な組織の腫瘍浸潤を予防するのに有用である。加えて、α５β１抗体は、ＡＭＤ等の眼疾患等の血管新生に関連する疾患、リウマチ性関節炎等の炎症性障害、ならびに心血管疾患および敗血症、ならびに腫瘍性疾患を治療するのに有用であり得る。この阻害機構を通じて治療可能な疾患には、腫瘍性疾患が含まれるが、それに限定されない。転移癌、リンパ性腫瘍、および血液癌を含む任意のタイプの悪性腫瘍によって特徴付けられる、任意の疾患もまた、この阻害機構によって治療され得る。ヒトにおける例示的癌としては、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳およびＣＮＳ癌（例えば、神経膠腫腫瘍）、子宮頸癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌；子宮体癌、食道癌；眼癌；頭頚部の癌；胃癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌、網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌；肉腫、皮膚癌；胃癌、精巣癌、甲状腺癌；子宮癌、泌尿器系の癌、ならびに他の癌および肉腫が挙げられる。イヌ、ネコ、および他のペットにおいて一般的に診断される悪性の障害には、リンパ肉腫、骨肉腫、乳腺腫瘍、マスト細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平上皮癌、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、細気管支腺癌、線維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小神経膠細胞腫、神経芽細胞腫、破骨細胞腫、口腔腫瘍、線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫、生殖器扁平上皮癌、伝染性性器腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、血管外皮腫、組織球腫、緑色腫（例えば、顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫、角膜扁平上皮癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃腫瘍、副腎腫瘍、口腔乳頭腫症、血管内皮腫および嚢腺腫、濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維肉腫、ならびに肺扁平上皮癌が含まれるが、それらに限定されない。フェレット等の齧歯類における例示的癌には、インスリノーマ、リンパ腫、肉腫、神経腫、膵臓島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫、および胃腺癌が含まれる。農業用家畜を侵す新生物には、白血病、血管外皮腫、およびウシ眼新生物（畜牛）；包皮線維肉腫、潰瘍性扁平上皮癌、包皮癌、結合組織新生物およびマスト細胞腫（ウマ）；肝細胞癌（ブタ）；リンパ腫および肺腺腫症（ヒツジ）；肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、細網内皮症、線維肉腫、腎芽腫、Ｂ細胞リンパ腫およびリンパ性白血症（鳥類）；網膜芽細胞腫、肝臓新生物、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、形質細胞様白血病および浮き袋肉腫（サカナ）、乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ）：細菌コリネバクテリウム・シュードツベルクローシスによって引き起こされるヒツジおよびヤギの慢性病、感染病、伝染病、ならびにヤーグジークテによって引き起こされるヒツジの伝染性肺腫瘍が含まれる。
【０１０３】
本発明の他の実施形態は、生物学的試料におけるα５β１の量を特異的に決定するための診断検定を含む。検定キットは、抗体を検出するために必要な標識と共に、本明細書に開示される標的結合剤または抗体を含み得る。これらの診断検定は、腫瘍性疾患を含むが、それに限定されない、細胞接着、浸潤、血管新生、または増殖関連疾患をスクリーニングするために有用である。
【０１０４】
本発明の別の態様は、アンタゴニストが、α５β１に結合する、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストである。一実施形態では、アンタゴニストは、抗体等の標的結合剤である。一実施形態では、アンタゴニストは、インビトロおよびインビボで、α５β１の生物学的活性に拮抗することができる。アンタゴニストは、本明細書に記載される抗体、例えば、抗体３Ｃ５または５Ｂ１１から選択されてもよい。
【０１０５】
一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、α５β１に結合し、それによって細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を阻害する。この阻害の作用の機構は、アンタゴニストのα５β１への結合を含んでもよく、また例えば、フィブロネクチン等の天然α５β１特異性リガンドの、α５β１への結合を阻害することを含んでもよい。特定の理論的考察に拘束されることを決して望むものではないが、α５β１の生物学的活性の拮抗作用がそれによって達成され得るような機構は、フィブロネクチンのα５β１への結合の阻害、および／またはα５β１−フィブロネクチン媒介シグナル伝達活性の阻害を含むが、それらに限定されない。
【０１０６】
一実施形態は、本明細書に上述されるような標的結合剤を産生するハイブリドーマである。一実施形態では、本明細書に上述されるような抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマである。一実施形態では、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生する。別の実施形態では、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５または５Ｂ１１の軽鎖および／または重鎖を産生する。代替的に、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体３Ｃ５もしくは５Ｂ１１と同一の１つまたは複数のエピトープに結合する抗体を産生してもよい。
【０１０７】
別の実施形態は、本明細書に上述されるような標的結合剤をコードする核酸分子である。一実施形態では、本明細書に上述されるような抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子である。一実施形態では、核酸分子は、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする。さらに別の実施形態は、抗体３Ｃ５または５Ｂ１１から選択される完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子である。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、核酸分子または本明細書に上述されるような分子を含むベクターであり、ここでベクターは、本明細書の上記で定義されるような標的結合剤をコードする。本発明の一実施形態は、核酸分子または本明細書に上述されるような分子を含むベクターであり、ここでベクターは、本明細書の上記で定義されるような抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする。
【０１０９】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に上述されるようなベクターを含む宿主細胞である。代替的に、宿主細胞は、２つ以上のベクターを含んでもよい。
【０１１０】
加えて、本発明の一実施形態は、核酸分子が標的結合剤を産生するために発現され、続いて標的結合剤が回収されるような条件下で宿主細胞を培養することによって、本発明の標的結合剤を産生する方法である。本発明の一実施形態は、核酸分子が抗体を産生するために発現され、続いて抗体が回収されるような条件下で宿主細胞を培養することによって、本発明の抗体を産生する方法である。
【０１１１】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１個の宿主細胞を、本明細書に上述されるような標的結合剤をコードする少なくとも１個の核酸分子でトランスフェクトし、宿主細胞中で核酸分子を発現させ、標的結合剤を単離することによって、標的結合剤を作製する方法を含む。一実施形態では、本発明は、少なくとも１個の宿主細胞を、本明細書に上述されるような抗体をコードする少なくとも１個の核酸分子でトランスフェクトし、宿主細胞中で核酸分子を発現させ、抗体を単離することによって、抗体を作製する方法を含む。
【０１１２】
別の態様に従って、本発明は、本明細書に記載されるようなアンタゴニストを投与することによって、α５β１の生物学的活性に拮抗する方法を含む。該方法は、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストの治療的有効用量を投与することを含んでもよい。
【０１１３】
本発明の別の態様は、本明細書に上述されるような標的結合剤を投与することによって、α５β１の生物学的活性に拮抗する方法を含む。該方法は、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤の治療的有効用量を投与することを含んでもよい。
【０１１４】
本発明の別の態様は、本明細書に上述されるような抗体を投与することによって、α５β１の生物学的活性に拮抗する方法を含む。該方法は、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効用量を投与することを含んでもよい。
【０１１５】
別の態様に従って、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストの治療的有効量を投与することによって、動物における疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を治療する方法が提供される。該方法は、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストの治療的有効用量を投与することを含んでもよい。
【０１１６】
別の態様に従って、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤の治療的有効量を投与することによって、動物における疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を治療する方法が提供される。該方法は、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤の治療的有効用量を投与することを含んでもよい。標的結合剤は、単独で投与され得るか、さらなる抗体もしくは化学療法薬、または放射線療法と組み合わせて投与され得る。
【０１１７】
別の態様に従って、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効量を投与することによって、動物における疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を治療する方法が提供される。該方法は、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効用量を投与することを含んでもよい。抗体は、単独で投与され得るか、さらなる抗体もしくは化学療法薬、または放射線療法と組み合わせて投与され得る。
【０１１８】
別の態様に従って、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストの治療的有効量を投与することによって、動物における癌を治療する方法が提供される。該方法は、癌のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗するアンタゴニストの治療的有効用量を投与することを含んでもよい。アンタゴニストは、単独で投与され得るか、さらなる抗体もしくは化学療法薬、または放射線療法と組み合わせて投与され得る。
【０１１９】
別の態様に従って、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤の治療的有効量を投与することによって、動物における癌を治療する方法が提供される。該方法は、癌のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤の治療的有効用量を投与することを含んでもよい。標的結合剤は、単独で投与され得るか、さらなる抗体もしくは化学療法薬、または放射線療法と組み合わせて投与され得る。
【０１２０】
別の態様に従って、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効量を投与することによって、動物における癌を治療する方法が提供される。該方法は、癌のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効用量を投与することを含んでもよい。抗体は、単独で投与され得るか、さらなる抗体もしくは化学療法薬、または放射線療法と組み合わせて投与され得る。
【０１２１】
別の態様に従って、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効量を投与することによって、動物における腫瘍細胞増殖、接着、浸潤および／または血管新生を低減または阻害する方法が提供される。該方法は、増殖、細胞接着、浸潤および／または血管新生の低減または阻害を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効用量を投与することを含んでもよい。抗体は、単独で投与され得るか、さらなる抗体もしくは化学療法薬、または放射線療法と組み合わせて投与され得る。
【０１２２】
別の態様に従って、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効量を投与することによって、動物における腫瘍増殖および／または転移を低減する方法が提供される。該方法は、腫瘍増殖および／または転移の低減を必要とする動物を選択すること、ならびに動物に、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の治療的有効用量を投与することを含んでもよい。抗体は、単独で投与され得るか、さらなる抗体もしくは化学療法薬、または放射線療法と組み合わせて投与され得る。
【０１２３】
本発明の別の態様に従って、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のための、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストの使用が提供される。一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１２４】
本発明の別の態様に従って、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤として使用するための、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストが提供される。一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１２５】
本発明の別の態様に従って、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤または抗体の使用が提供される。
【０１２６】
本発明の別の態様に従って、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤として使用するための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤または抗体が提供される。
【０１２７】
本発明の別の態様に従って、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤または抗体の使用が提供される。
【０１２８】
本発明の別の態様に従って、疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤として使用するための、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体が提供される。
【０１２９】
本発明の別の態様に従って、哺乳動物における癌の治療のための薬剤の製造のための、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストの使用が提供される。一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１３０】
本発明の別の態様に従って、哺乳動物における癌の治療のための薬剤として使用するための、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストが提供される。一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態では、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１３１】
本発明の別の態様に従って、哺乳動物における癌の治療のための薬剤の製造のための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤の使用が提供される。
【０１３２】
本発明の別の態様に従って、哺乳動物における癌の治療のための薬剤として使用するための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤が提供される。
【０１３３】
本発明の別の態様に従って、哺乳動物における癌の治療のための薬剤の製造のための、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体の使用が提供される。
【０１３４】
本発明の別の態様に従って、哺乳動物における癌の治療のための薬剤として使用するための、α５β１の生物学的活性に拮抗する抗体が提供される。
【０１３５】
別の態様に従って、動物における増殖、細胞接着、浸潤および／または血管新生の低減または阻害のための薬剤の製造のための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤または抗体の使用が提供される。
【０１３６】
別の態様に従って、動物における増殖、細胞接着、浸潤および／または血管新生の低減または阻害のための薬剤として使用するための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤または抗体が提供される。
【０１３７】
別の態様に従って、動物における腫瘍増殖および／または転移を低減するための薬剤の製造のための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤または抗体の使用が提供される。
【０１３８】
別の態様に従って、動物における腫瘍増殖および／または転移を低減するための薬剤として使用するための、α５β１の生物学的活性に拮抗する標的結合剤または抗体が提供される。
【０１３９】
一実施形態では、本発明は、α５β１に単独で依存するか、または部分的に依存する腫瘍を有する患者において、α５β１に拮抗する際の使用に特に好適である。本発明の別の態様に従って、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストを含む薬学組成物、および薬学的に許容される担体が提供される。一実施形態では、アンタゴニストは、抗体を含む。本発明の別の態様に従って、α５β１の生物学的活性のアンタゴニストを含む薬学組成物、および薬学的に許容される担体が提供される。一実施形態では、アンタゴニストは、抗体を含む。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、α５β１に特異的に結合する抗体の投与に続いて、血液からの過剰な循環抗体を除去するために、洗浄剤が投与される。
【０１４１】
抗α５β１抗体は、患者の試料におけるα５β１の検出に有用であり、したがって本明細書に記載されるような病状についての診断法として有用である。加えて、α５β１媒介型シグナル伝達活性を有意に阻害するそれらの能力に基づいて（下の実施例に示される通り）、抗α５β１抗体は、α５β１発現からもたらされる症状および病態を治療する際の治療効果を有する。特定の実施形態では、本明細書の抗体および方法は、α５β１誘導性細胞接着、浸潤、血管新生、増殖および／または細胞内シグナル伝達からもたらされる症状の治療に関する。さらなる実施形態は、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮体癌、腎臓癌、結腸癌、および膵臓癌等の腫瘍性疾患を含む、細胞接着、浸潤、血管新生および／または増殖関連疾患を治療するために、本明細書に記載される抗体ならびに方法を用いること含む。抗体はまた、関節炎、アテローム性動脈硬化症、および血管新生を伴う疾患における細胞接着ならびに／または浸潤を治療する際にも有用であり得る。
【０１４２】
本発明の別の実施形態では、細胞接着関連、浸潤関連、血管新生関連、または増殖関連疾患をスクリーニングするために、哺乳類組織、細胞、または体液中のα５β１を検出するための検定キットを含む。キットは、α５β１に結合する標的結合剤、および存在する場合、標的結合剤のα５β１との反応を示す手段を含む。一実施形態では、α５β１に結合する標的結合剤は、標識化される。別の実施形態では、標的結合剤は、標識化されず、キットはさらに、標的結合剤を検出する手段を含む。好ましくは、標的結合剤は、蛍光色素、酵素、放射性核種、および放射線不透過性物質からなる群から選択されるマーカーで標識化される。
【０１４３】
本発明の別の実施形態では、細胞接着関連、浸潤関連、血管新生関連、または増殖関連疾患をスクリーニングするために、哺乳類組織、細胞、または体液中のα５β１を検出するための検定キットを含む。キットは、α５β１に結合する抗体、および存在する場合、抗体のα５β１との反応を示す手段を含む。抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。一実施形態では、α５β１に結合する抗体は、標識化されている。別の実施形態では、抗体は、標識化されていない一次抗体であり、キットはさらに、一次抗体を検出する手段を含む。一実施形態では、該手段は、抗免疫グロブリンである、標識化された第２の抗体を含む。好ましくは、抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種、および放射線不透過性物質からなる群から選択されるマーカーで標識化される。
【０１４４】
本明細書に開示される抗体に関するさらなる実施形態、特徴等は、下でさらに詳細に提供される。
【０１４５】
（配列表）
本発明の実施形態は、下の表１に列挙される特定の抗体を含む。この表は、それぞれ対応する重鎖および軽鎖遺伝子ならびにポリペプチドの可変領域の配列番号と共に、各抗α５β１抗体の識別番号を報告する。各抗体は、識別番号を与えられている。
【表１】
2012513194.tif 000002
2012513194.tif 000003
【０１４６】
（定義）
特に定義しない限り、本明細書で使用される科学および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈が特に要求しない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して利用される命名、およびそれらの技術は、当業者に周知であり、一般的に使用されるものである。
【０１４７】
標準技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換に使用される（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に遂行される通りにもしくは本明細書に記載される通りに行われる。上述の技術および手順は、概して当業者に周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体にわたって引用および説明される、種々の一般的およびより特定の参考文献に記載される通りに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （２００１））を参照されたく、該参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬学化学に関連して利用される命名、ならびにそれらの臨床検査手順および技術は、当業者に周知であり、一般的に使用されるものである。標準技術は、化学合成、化学分析、薬剤、製剤、および送達、ならびに患者の治療に使用される。
【０１４８】
本開示に従って利用されるとき、次の用語は、特に指示がない限り、次の意味を有することを理解されたい：
アンタゴニストまたは阻害剤は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組み換えタンパク質、抗体、あるいはそのフラグメントまたはそれらの共役体もしくは融合タンパク質であってもよい。ＲＮＡｉの概説については、Ｍｉｌｈａｖｅｔ  Ｏ，  Ｇａｒｙ  ＤＳ，  Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ．  （Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００３  Ｄｅｃ；５５（４）：６２９−４８．  Ｒｅｖｉｅｗ）およびアンチセンスの概説についてはＯｐａｌｉｎｓｋａ  ＪＢ，  Ｇｅｗｉｒｔｚ  ＡＭ．  （Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ．  ２００３  Ｏｃｔ  ２８；２００３（２０６）：ｐｅ４７参照）を参照されたい。
【０１４９】
疾患関連の細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖は、任意の異常な、望ましくない、または病的な細胞接着および／もしくは浸潤および／もしくは血管新生および／もしくは増殖、例えば、腫瘍関連細胞接着および／もしくは浸潤および／もしくは血管新生および／もしくは増殖であり得る。細胞接着関連および／または浸潤関連および／または血管新生関連および／または増殖関連疾患には、白血病、多発性骨髄腫、またはリンパ腫等の非固形腫瘍、ならびに黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、膠芽腫、甲状腺の癌、胆管の癌、骨の癌、胃の癌、脳／ＣＮＳの癌、頭頚部の癌、肝臓系の癌、胃の癌、前立腺の癌、乳癌、腎臓の癌、精巣の癌、卵巣の癌、皮膚の癌、頸の癌、肺の癌、筋肉の癌、神経の癌、食道の癌、膀胱の癌、肺の癌、子宮の癌、外陰の癌、子宮内膜の癌、腎臓の癌、結腸直腸の癌、膵臓の癌、側膜／腹膜の癌、唾液腺の癌、および表皮の癌等の固形腫瘍が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５０】
化合物は、約２０００ダルトン未満の分子量を備える任意の低分子量化合物を指す。
【０１５１】
「α５β１」という用語は、α５β１タンパク質である分子を指す。
【０１５２】
「アロタイプ」という用語は、抗体遺伝子の対立型によって特定される抗原決定基に関して使用される。アロタイプは、異なる個体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列において若干の差異を示し、それによって抗血清が対立遺伝子の差異のみを認識する、サブクラスの対立遺伝子間の配列差異である。最も重要なタイプは、Ｇｍ（重鎖）およびＫｍ（軽鎖）である。Ｇｍ多型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ２分子のマーカーに対して、Ｇ１ｍ、Ｇ２ｍ、およびＧ３アロタイプと称されるアロタイプ抗原決定基をコードする対立遺伝子を有する、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、およびＩＧＨＧ３遺伝子によって決定される。現時点では、１８種類のＧｍアロタイプが知られている：  Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ、ｌ、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Ｌｅｆｒａｎｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｐｅｒｇａｍｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ｐｐ．４３−７８  （１９９０）、Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．：  ５０，  １９９−２１  １、双方とも参照によりその全体が組み込まれる）。
【０１５３】
ヒト免疫グロブリンの対立型は、明確に特徴付けられている（ＷＨＯ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  １９７６，  ３：  ３５７−３６２、ＷＨＯ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．  １９７６，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６，  ５９９−６０１、Ｅ．  ｖａｎ  Ｌｏｇｈｅｍ，  １９８６，  Ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ，  Ｍｏｎｏｇｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  １９：４０−５１、全ては、参照によりその全体が組み込まれる）。さらに、他の多型が特徴付けられている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ５４：１−９、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０１５４】
抗体等の標的結合剤に言及するとき、「中和」または「阻害する」という用語は、抗体の、標的抗原の活性を排除、低減、または有意に低減する能力に関する。したがって、本発明の「中和」抗α５β１抗体は、α５β１活性を排除または有意に低減することができる。例えば、中和α５β１抗体は、例えば、フィブロネクチン等の天然α５β１特異性リガンドの、α５β１への結合をブロックすることによって作用し得る。この結合をブロックすることによって、α５β１シグナル媒介型活性は有意にまたは完全に排除される。理想的には、α５β１に対する中和抗体は、細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を阻害する。
【０１５５】
「α５β１の生物学的活性のアンタゴニスト」は、α５β１の活性を、排除、低減、または有意に低減することができる。「α５β１の生物学的活性のアンタゴニスト」は、α５β１シグナル伝達を、排除、低減、または有意に低減することができる。「α５β１の生物学的活性のアンタゴニスト」は、細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を、排除または有意に低減してもよい。
【０１５６】
「α５β１シグナル伝達を低減する」とは、本発明の標的結合剤、抗体、またはアンタゴニストの非存在におけるシグナル伝達のレベルと比較した、α５β１シグナル伝達の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の低減を包含する。
【０１５７】
「ポリペプチド」という用語は、天然タンパク質、フラグメント、またはのポリペプチド配列の類似体を指す総称として本明細書で使用される。したがって、天然タンパク質、フラグメント、および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明に従った好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにκまたはλ軽鎖免疫グロブリン分子等の軽鎖免疫グロブリン分子を備えた重鎖免疫グロブリン分子を含む組み合わせ（および逆もまた同様である）によって形成される抗体分子、ならびにそれらのフラグメントおよび類似体を含む。本発明に従った好ましいポリペプチドはまた、ヒト重鎖免疫グロブリン分子またはそのフラグメントのみを含んでもよい。
【０１５８】
本明細書で対象物に適用して使用されるとき、「天然」または「天然産」という用語は、対象物が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、自然界の源から単離され得、研究所の人間によってまたは別の方法で意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然産とされる。
【０１５９】
本明細書で使用されるとき、「作動可能に結合された」という用語は、それらが意図される方法で機能することが可能である関係にあるように説明される、構成成分の位置を指す。例えば、コーディング配列に「作動可能に結合された」制御配列は、コーディング配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるような方法で結合されている。
【０１６０】
本明細書で言及されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー型であり、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型、あるいはＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖のいずれかを意味する。この用語は、ＤＮＡの１本鎖および２本鎖型を含む。
【０１６１】
本明細書で言及される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然産結合および非天然産結合によって共に結合された、天然産ヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、概して２００塩基以下の長さを含む、ポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長、最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常、例えば、プローブのために１本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子突然変異体の構築における使用のために、２本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１６２】
本明細書で言及される「天然産ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及される「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾された糖類または置換された糖類等を備えるヌクレオチドを含む。本明細書で言及される「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデート等のオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：９０８１  （１９８６）、Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０６：６０７７  （１９８４）、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９（１９８８）、Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９  （１９９１）、Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｐｐ．  ８７−１０８（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ  （１９９１））、Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，１５１，５１０号、Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３  （１９９０）を参照されたく、該参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドは、所望の場合、検出のための標識を含み得る。
【０１６３】
本明細書で言及される「選択的にハイブリッド形成する」という用語は、検出可能におよび特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらのフラグメントは、特記すべき量の、非特異的核酸への検出可能な結合を最小限に抑える、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、核酸鎖と選択的にハイブリッド形成する。当業者に既知であり、本明細書で説明されるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために、高い厳格度条件が使用され得る。概して、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または目的の抗体フラグメントおよび核酸の配列の間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％、およびより典型的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％の、好ましく増加した相同性を有するであろう。
【０１６４】
厳格なハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ  塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）（０．９Ｍ  ＮａＣｌ／９０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中、約４５℃でのフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、それに続く０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、約５０〜６５℃での１回以上の洗浄、６Ｘ  ＳＳＣ中、約４５℃でのフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、それに続く０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、約６０℃での１回以上の洗浄等の非常に厳格な条件、または当業者に既知の他の任意の厳格なハイブリダイゼーション条件を含むが、それらに限定されない（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら編  １９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  １，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ  ６．３．１〜６．３．６および２．１０．３頁を参照されたい）。それらの配列の間に、部分的なまたは完全な同一性が存在する場合、２つのアミノ酸配列は、「相同」である。例えば、８５％相同性は、２つの配列が最大マッチングで整列されるとき、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。ギャップ（マッチしている２つの配列のうちのいずれかにおける）は、マッチングを最大化する際に容認され、５以下のギャップ長が好まれるが、このうち２以下がより好まれる。代替的におよび好ましくは、この用語が本明細書で使用されるとき、それらが、突然変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティを備えたプログラムＡＬＩＧＮを用いて、５（標準偏差単位）を超えるアライメントスコアを有する場合、２つのタンパク質配列（または少なくとも約３０アミノ酸長の配列に由来するポリペプチド配列）は相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．，  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｐｐ．  １０１−１１０（第５巻，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  （１９７２））およびこの分冊の付録２、  １〜１０ページを参照されたい。２つの配列またはそれらの部分は、より好ましくは、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列されるとき、それらのアミノ酸が、５０％同一を超えるか、または５０％同一と等しい場合、相同である。２つのオルソロガスな配列内で、相同性の異なる領域が存在し得ることが理解されるべきである。例えば、マウスおよびヒトオルソログの機能的部位は、非機能的部位よりも高い程度の相同性を有し得る。
【０１６５】
本明細書で「に相当する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部と相同である（すなわち、同一である、厳密に進化的に関連しない）、またはポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列と同一であること意味するために使用される。
【０１６６】
対照的に、本明細書で「に相補的な」という用語は、相補的配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部と相同であること意味するために使用される。例示のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に相当し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【０１６７】
「配列同一性」という用語は、比較のウィンドウにわたって、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が同一（すなわち、ヌクレオチド単位で（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂａｓｉｓ）で、または残基単位で（ｒｅｓｉｄｕｅ−ｂｙ−ｒｅｓｉｄｕｅ  ｂａｓｉｓ））であることを意味する。「配列同一性の百分率」という用語は、比較のウィンドウにわたって最適に整列した２つの配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）またはアミノ酸残基が両配列内で生じている位置数を決定してマッチした位置数を得、マッチした位置数を、比較のウィンドウ内の全ての位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって、算出される。本明細書で使用されるとき、「実質的同一性」という用語は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位の比較のウィンドウにわたって、頻繁には少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位のウィンドウにわたって、参照配列と比較したときの、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示し、ここでポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、ここで配列同一性の百分率は、参照配列を、比較のウィンドウにわたって、総計２０パーセント以下となる参照配列の欠失または添加を含み得る配列と比較することによって算出される。参照配列は、より大きい配列のサブセットであってもよい。
【０１６８】
本明細書で使用されるとき、２０個の従来のアミノ酸およびそれらの略号は従来の用途に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  −  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （第２版，  Ｅ．Ｓ．  Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｇｒｅｎ編，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  Ｍａｓｓ．  （１９９１））を参照されたく、該参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。２０個の従来のアミノ酸、α−、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸等の非天然アミノ酸、および他の非従来型アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた、本発明のポリペプチドに好適な構成成分であり得る。非従来型アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法において、標準用途および慣例に従って、左手方向は、アミノ末端方向であり、右手方向は、カルボキシ末端方向である。
【０１６９】
同様に、特に指示がない限り、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は、５’末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と称され、ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【０１７０】
ポリペプチドに適用されるとき、「実質的同一性」という用語は、デフォルトギャップウェイトを用いて、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ等によって最適に整列させたときの、２つのペプチド配列が、少なくとも８０パーセント配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセント配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセント配列同一性、および最も好ましくは少なくとも９９パーセント配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。保存的アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の可換性に言及する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸基は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸基は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸基は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸基は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸基は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１７１】
本明細書で説明される通り、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における小規模な変形は、アミノ酸配列における変形が、本明細書に記載される抗体または免疫グロブリン分子に対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％配列同一性を維持することを条件として、本発明によって包含されるものとして企図される。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、関連する側鎖を有するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、概して次のファミリーに分割される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電性極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーとしては：セリンおよびトレオニンが、脂肪族−ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンおよびグルタミンが、アミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンが、脂肪族ファミリーであり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが、芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの単離された置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単離された置換、トレオニンのセリンでの単離された置換、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸での同様の置換が、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を伴わない場合、得られた分子の結合機能または特性に対して主な効果を有さないことを予想するのは理にかなっている。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特定の活性を検定することによって、容易に決定され得る。検定は、本明細書に詳述される。抗体もしくは免疫グロブリン分子のフラグメントまたは類似体は、当業者によって容易に調製され得る。好ましいフラグメントまたは類似体のアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能領域の境界付近で生じる。構造および機能領域は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データの、公開または専有の配列データベースとの比較によって、特定され得る。好ましくは、既知の構造および／または機能を備える他のタンパク質において生じる、配列モチーフまたは予測タンパク質配座領域を特定するために、コンピュータ化された比較方法が使用される。既知の３次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を特定する方法が知られている。Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）。したがって、上述の例は、当業者が、本明細書に記載される抗体に従って、構造および機能領域を定めるために使用され得る配列モチーフおよび配座構造を認識し得ることを示す。
【０１７２】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へと頻繁に脱アミド化される。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は、本発明の範囲に入る。
【０１７３】
概して、タンパク質中のシステイン残基は、それらが折り畳みタンパク質領域の一部であるとき、システイン−システインジスルフィド結合に従事するか、またはジスルフィド結合形成から立体保護されるかのいずれかである。タンパク質中のジスルフィド結合形成は、複合プロセスであり、それはその環境の酸化還元電位および特化したチオール−ジスルフィド交換酵素によって決定される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １０７，  ３０５−３２９，  １９８４、Ｈｏｕｅｅ−Ｌｅｖｉｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３５３，３５−４４，２００２）。システイン残基がタンパク質構造中の対を有さず、折り畳みによって立体保護されないとき、それは、ジスルフィドシャフリングとして知られるプロセスにおいて、溶液から遊離システインとのジスルフィド結合を形成し得る。ジスルフィドスクランブルとして知られる別のプロセスにおいては、遊離システインはまた、天然産ジスルフィド結合（抗体構造内に存在する結合等）に干渉し得、低結合、低生物学的活性および／または低安定性をもたらす。
【０１７４】
好ましいアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を低減させる、（２）酸化に対する感受性を低減させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および（４）かかる類似体の他の物理化学特性もしくは機能特性を与えるか、またはそれらを修飾する置換である。類似体は、天然産ペプチド配列以外の配列の、種々の突然変異を含み得る。例えば、単一または多重アミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）は、天然産配列内で行われ得る（好ましくは、分子内接触を形成する領域外のポリペプチドの部分において）。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特徴を実質的に変化させないはずである（例えば、置換アミノ酸は、親配列において生じるヘリックスを壊す傾向、または親配列を特徴付ける二次構造の他のタイプを崩壊させる傾向がないはずである）。当技術分野で認識されるポリペプチド二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｃ．  Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｔｏｏｚｅ編，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９１））、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載され、該参考文献は各々参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
変化は、１つ以上のアミノ酸残基を、非天然産アミノ酸もしくは非標準アミノ酸で置換すること、１つ以上のアミノ酸残基を、非天然産型もしくは非標準型へと修飾すること、または１つ以上の非天然産アミノ酸もしくは非標準アミノ酸を、配列に挿入することを含んでもよい。天然産アミノ酸は、それらの標準的１文字コードによって、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして特定される、２０個の「標準」Ｌ−アミノ酸を含む。非標準アミノ酸は、ポリペプチド骨格に組み込まれ得るか、または既存のアミノ酸残基の修飾からもたらされる、他の任意の残基を含む。非標準アミノ酸は、天然産または非天然産であってもよい。
【０１７６】
さらに、かかる方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を生成するための鎖内ジスルフィド結合に関与する、１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行うために使用され得る。
【０１７７】
「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗体に抗原結合特異性を与える、抗体の重鎖および軽鎖の高度可変領域を示すことが意図される。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  ＮＩＨ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、およびより最新版に従って定められてもよい。抗体は、典型的に３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含有する。場合により、ＣＤＲ（単数または複数）という用語は、それが認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性によって結合に関与する、アミノ酸残基の大部分を含有するこれらの領域の１つもしくは複数、またはさらに全体を示すために本明細書で使用される。
【０１７８】
重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きいサイズの変動性（本質的に、それを生み出す遺伝子の配列の機構に起因した、より大きい多様性）を有する。それは、２アミノ酸と同等の短かさであってもよいが、知られている最長サイズは、２６アミノ酸である。ＣＤＲ長もまた、特定の下層フレームワークが収容できる長さに従って異なってもよい。機能的に、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定において部分的に役割を果たす（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ７１：４２９８−４３０２，  １９７４、Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３３：７４７−７５３，  １９８６、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−９１７，  １９８７、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２：８７７−  ８８３，  １９８９、Ｃａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４４：１９６５−１９６８，  １９９０、Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ８７：４８１４−４８１７，  １９９０、Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４４：４８６３−４８６９，  １９９０、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７：１７０９−１７１９，  １９９１）。
【０１７９】
本明細書で言及される「一連のＣＤＲ」という用語は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。したがって、一連のＨＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指し、一連のＬＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す。
【０１８０】
それに対するアミノ酸配列が本明細書で提示される変異体、およびα５β１に対する標的薬剤および抗体で採用され得る変異体を含む、ＶＨおよびＶＬ領域ならびに本発明のＣＤＲの変異体は、配列変化または突然変異の方法によって、および所望の特徴を備える抗原標的をスクリーニングすることによって入手され得る。所望の特徴の例としては：抗原に特異的な既知の抗体と比較した、抗原に対する増加された結合親和性；活性が知られる場合、抗原に特異的な既知の抗体と比較した、抗原活性の増加された中和性；特定のモル比での抗原に対する、既知の抗体またはリガンドとの特異的競合能力；リガンド−受容体複合体を免疫沈降する能力；特異的エピトープに結合する能力；線形エピトープ、例えば、ペプチド結合スキャンを用いて、例えば、線形配座および／または拘束配座でスクリーニングされるペプチドを用いて特定されるペプチド配列；非連続残基によって形成される、配座エピトープ；α５β１、または下流分子の新たな生物学的活性を調節する能力；α５β１に結合および／または中和する能力および／または他の任意の所望の特性のための能力が含まれるが、それらに限定されない。
【０１８１】
ＣＤＲのアミノ酸配列内、抗体ＶＨ領域またはＶＬ領域内、ならびに抗原結合部位内で置換を行うために必要とされる技術は、当技術分野で利用可能である。本明細書に開示される抗体分子の変異体は、本発明で生成され、使用され得る。多変量データ解析技術を構造／特性−活性相関に適用する際の、計算化学の誘導に続いて（Ｗｏｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  −Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ編）、Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，  Ｈｏｌｌａｎｄ，  １９８４）、統計的回帰、パターン認識、および分類等の周知の数学的手法を用いて、抗体の定量活性−特性相関を導くことができる（Ｎｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；  第３版（Ａｐｒｉｌ  １９９８）、Ｋａｎｄｅｌ，Ａｂｒａｈａｍ  ＆  Ｂａｃｋｅｒ、Ｅｒｉｃ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ＰＴＲ，（Ｍａｙ  １１、１９９５）、Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｗｏｊｔｅｋ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ  ２２（Ｐａｐｅｒ））．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０００）、Ｗｉｔｔｅｎ，Ｉａｎ  Ｈ．＆  Ｆｒａｎｋ、Ｅｉｂｅ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ：  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｊａｖａ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １１、１９９９）、Ｄｅｎｉｓｏｎ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｔ．（編），Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｂａｎｉ  Ｋ．Ｍａｌｌｉｃｋ，Ａｄｒｉａｎ  Ｆ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ．Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  （Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；  （Ｊｕｌｙ  ２００２）、Ｇｈｏｓｅ，  Ａｒｕｐ  Ｋ．＆  Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ，  Ｖｅｌｌａｒｋａｄ  Ｎ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｔｏｏｌｓ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。場合によっては、抗体配列、機能的構造および３次元構造の経験ならびに理論モデルから、抗体の特性を導くことができ（例えば、推定接触残基または計算物理化学特性の分析）、これらの特性は、単独でまたは組み合わせで考慮され得る。
【０１８２】
ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む抗体抗原結合部位は、典型的にポリペプチドの６つのループによって形成される：軽鎖可変領域（ＶＬ）から３つ、および重鎖可変領域（ＶＨ）から３つ。既知の原子構造を備える抗体の分析は、抗体結合部位の配列と３次元構造との関係を解明している。これらの関係は、ＶＨ領域の第３領域（ループ）を除いて、結合部位ループが、少数の主鎖配座：正準構造のうちの１つを有することを暗示する。特定のループにおいて形成される正準構造は、そのサイズ、ならびにループおよびフレームワーク領域の両方における主要部位のある種の残基の存在によって、決定されることが示されている。
【０１８３】
この配列−構造関係の研究は、配列が知られているが、３次元構造が知られていない抗体における、残基の予測に使用され得、それはそのＣＤＲループの３次元構造を維持する際に重要であり、したがって結合特異性を維持する。これらの予測は、予測をリード最適化実験からの出力値と比較することによって裏付けられ得る。構造的アプローチにおいては、ＷＡＭ等の、無料公開のまたは商用のパッケージを用いて、抗体分子からモデルを作り出すことができる。次いで、ＣＤＲの各位置における可能な置換を評価するために、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）またはＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ等の、タンパク質可視化および分析ソフトウェアパッケージを使用してもよい。次いで、活性に対する最小限のまたは有益な効果を有するか、または他の望ましい特性を与える可能性が高い置換を行うために、この情報を使用してもよい。
【０１８４】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチドフラグメント」という用語は、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然産配列内の対応する位置と同一である場合の、ポリペプチドを指す。フラグメントは、典型的に少なくとも５、６、８、または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、通常少なくとも５０アミノ酸長、およびさらにより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で使用されるとき、「類似体」という用語は、推定アミノ酸配列の一部との実質的同一性を有し、次の特性のうちの少なくとも１つを有する、少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを指す：（１）好適な結合条件下でのα５β１への特異的結合、（２）適切なフィブロネクチン／α５β１結合をブロックする能力。典型的に、ポリペプチド類似体は、天然産配列に対して保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類似体は、典型的に少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長以上であり、しばしば完全長と同等の長さの天然産ポリペプチドであり得る。
【０１８５】
ペプチド類似体は、一般的に、テンプレートペプチドの特性に類似した特性を備える非ペプチド薬として、製薬業界で使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称される（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  １５：２９  （１９８６）、Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２  （１９８５）、およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９  （１９８７）、該参考文献は参照により本明細書に組み込まれる）。かかる化合物は、しばしばコンピュータ化された分子モデリングを用いて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に同様のペプチド模倣体は、同等の治療効果または予防効果を産生するために使用され得る。概して、ペプチド模倣体は、ヒト抗体等のパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に同様であるが、当技術分野で周知の方法によって、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群から選択される結合によって、任意に置換される１つ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の、同一のタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）との系統的置換は、より安定的なペプチドを生成するために使用され得る。加えて、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変形を含む拘束ペプチドは、例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、当業者に既知の方法によって生成され得る（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１：３８７  （１９９２）、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８６】
本明細書で使用されるとき、「抗体（単数および複数）」（免疫グロブリン）という用語は、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、多特異性抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびに可溶型または結合型の標識化され得る抗体ならびにそれらのフラグメント、変異体、または誘導体を、単独でまたは既知の技術によって提供される他のアミノ酸配列と組み合わせて包含する。抗体は、任意の種からの抗体であり得る。本明細書で使用されるとき、「抗体（単数および複数）」という用語は、その内部表面形状および荷電分布が抗原鎖の抗原決定基の特徴に相補的な３次元結合スペースを有する、ポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合領域からなるポリペプチド、またはポリペプチドの群を指す。天然抗体は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２本の同一軽（Ｌ）鎖および２本の同一重（Ｈ）鎖からなる。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的間隔の鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、１つの末端に、可変領域（ＶＨ）、続いて幾つかの定常領域を有する。各軽鎖は、１つの末端に可変領域（ＶＬ）、およびそのもう一つの末端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域と整列され、軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域と整列される。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、λ鎖またはκ鎖のいずれかとして分類される。κ軽鎖の可変領域はまた、本明細書でＶＫとしても示される。「可変領域」という用語はまた、重鎖または軽鎖の可変領域を説明するためにも使用される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変領域との界面を形成すると考えられる。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。かかる抗体は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス等を含むが、それらに限定されない、任意の哺乳動物に由来し得る。
【０１８７】
「抗体（単数または複数）」という用語は、本発明の抗体の結合フラグメントを含み、例示的フラグメントは、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、単一領域抗体、領域抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、所望の生物学的活性を示す抗体フラグメント、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）、二量体可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、線形抗体、１本鎖抗体分子、ならびに上のうちの任意の抗体フラグメントおよびエピトープ−結合フラグメントから形成される多特異性抗体を含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの分子であり得る。
【０１８８】
酵素、パパインを用いた抗体の分解は、「Ｆａｂ」フラグメントとしても知られる２つの同一の抗原−結合フラグメントおよび抗原結合活性を有さないが、結晶化する能力を有する「Ｆｃ」フラグメントをもたらす。酵素、ペプシンを用いた抗体の分解は、その中で抗体の分子の２本のアームが結合されたままであり、２つの抗原結合部位を含む、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをもたらす。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗原を架橋する能力を有する。
【０１８９】
本明細書で使用されるとき、「Ｆｖ」は、抗原認識および抗原結合部位の両方を保持する、抗体の最小のフラグメントを指す。この領域は、非共有または共有会合の、密着した１本の重鎖および１本の軽鎖可変領域の二量体からなる。各可変領域の３つのＣＤＲが、相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原−結合部位を定めるのは、この配置内である。集団的に、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変領域であっても（すなわち抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む、Ｆｖの半分）、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性となる。
【０１９０】
本明細書で使用されるとき、「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常領域および重鎖のＣＨ１領域を含む抗体のフラグメントを指す。
【０１９１】
本明細書で使用されるとき、「ｄＡｂ」は、ヒト抗体の最小の機能的結合単位である抗体のフラグメントを指す。「ｄＡｂ」は、単一領域抗体であり、抗体重鎖の可変領域（ＶＨ領域）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ領域）のいずれかを含む。各ｄＡｂは、６つの天然産ＣＤＲのうちの３つを含有する（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，  ５４４−５４６  （１９８９）、Ｈｏｌｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１，４８４−４９（２００３））。それらは、分子量が１１〜１５ｋＤａの範囲であり、フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）２よりも４倍小さく、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子のサイズの半分である。
【０１９２】
本明細書で使用されるとき、「ラクダ化」は、軽鎖を欠いているが、それにもかかわらず豊富な抗原結合レパートリーを有する重鎖二量体からなる抗体分子を指す（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ，  Ａｔａｒｈｏｕｃｈ  Ｔ，  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｇ，  Ｈａｍｅｒｓ  Ｃ，  Ｓｏｎｇａ  ＥＢ，  Ｂｅｎｄａｈｍａｎ  Ｎ，  Ｈａｍｅｒｓ  Ｒ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８）。
【０１９３】
「二重特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合部位を備える小型の抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で、軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。同一の鎖上の２つの領域の間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、その領域は、別の鎖の相補的領域と対になり、２つの抗原結合部位を作り出すことを強いられる。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）に、より完全に説明される。
【０１９４】
全抗体のフラグメントが抗原に結合する機能を果たし得ることが示されている。結合フラグメントの例としては、（Ｗａｒｄ，  Ｅ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，  ５４４−５４６）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１領域からなるＦａｂフラグメント；（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８，  ５５２−５５４）ＶＨおよびＣＨ１領域からなるＦｄフラグメント；（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，  ４８４−４９０）単一の抗体のＶＬおよびＶＨ領域からなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬ領域からなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，  Ｅ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，  ５４４−５４６  （１９８９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８，  ５５２−５５４、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，  ４８４−４９０］；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、つまり２つの結合されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｖｉｉ）その場所でＶＨ領域およびＶＬ領域が、２つの領域が共に抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって結合される、１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２，  ４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８８）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ８５，  ５８７９−５８８３）；（ｖｉｉｉ）二重特異性１本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／米国第９２／０９９６５号）；および（ｉｘ）「二重特異性抗体」、つまり遺伝子融合によって構成される多価または多特異性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．  （１９９３）  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二重特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬ領域を結合するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化され得る（Ｒｅｉｔｅｒ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  １４，  １２３９−１２４５，  １９９６）。ＣＨ３領域に結合されるｓｃＦｖを含むミニボディが作製されてもよい（Ｈｕ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５６，  ３０５５−３０６１）。結合フラグメントの他の例としては、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１領域のカルボキシル末端における幾つかの残基の付加のためにＦａｂフラグメントと異なるＦａｂ’、ならびに、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ’フラグメントであるＦａｂ’−ＳＨを含む。
【０１９５】
「可変」という用語は、可変領域のある部分が、抗体間の配列において大いに異なり、その特定の抗原に対する、特定の抗体の結合特異性に関与するという事実に言及する。しかしながら、変動性は、抗体の可変領域にわたって均等には分配されない。それは、軽鎖および重鎖可変領域の両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるセグメント中に集中する。可変領域のより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域は、各々４つのＦＲ領域を含み、βシート構造を結合する、また場合によってはβシート構造の部分を形成するループを形成する、３つのＣＤＲによって結合されるβシート配置を主に採用する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して結合され、他の鎖からのＣＤＲを用いて、抗体の抗原−結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  （１９９１）を参照されたい）。定常領域は、概して抗原結合に直接に関与しないが、抗原結合親和性に影響を及ぼし得、抗体のＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはアポトーシスへの関与等の種々のエフェクター機能を示し得る。
【０１９６】
本明細書で使用されるとき、「高度可変領域」という用語は、抗原への結合に関連する抗体のアミノ酸残基を指す。高度可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、および８９−９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変領域の残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  （１９９１））、ならびに／または「高度可変ループ」からのそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２６−３２（Ｌｌ）、５０−５２（Ｌ２）、および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変領域の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−９１７  （１９８７））を包含する。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲに隣接する可変領域残基である。ＦＲ残基は、キメラ、ヒト化、ヒト、領域抗体、二重特異性抗体、ワクチボディ、線形抗体、および二重特異性抗体に存在する。
【０１９７】
本明細書で使用されるとき、標的結合剤、標的結合タンパク質、特異的結合タンパク質、および同様の用語は、抗体、または標的部位に優先的に結合するそれらの結合フラグメントを指す。一実施形態では、標的結合剤は、１つの標的部位のみに特異的である。他の実施形態では、標的結合剤は、１つ以上の標的部位に特異的である。一実施形態では、標的結合剤は、モノクローナル抗体であってもよく、標的部位は、エピトープであってもよい。
【０１９８】
抗体の「結合フラグメント」は、組み換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素切断もしくは化学切断によって産生される。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および１本鎖抗体を含む。「二重特異性」および「二機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位の各々が同一であることが理解される。抗体は、過剰な抗体が対抗受容体に結合する受容体の量を、少なくとも約２０％、４０％、６０％、または８０％、およびより通常には約８５％超（インビトロ競合結合検定で測定したとき）低減するとき、受容体の対抗受容体への接着を実質的に阻害する。
【０１９９】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の３次元構造特徴、ならびに特定の荷電特徴を有してもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。抗体は、解離定数が、１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、および最も好ましくは１０ｎＭ以下であるとき、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０２００】
「幾何平均（Ｇｅｏｍｅａｎ）」（幾何平均（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ）としても知られる）という用語は、１０進数に再変換される、データセットの対数値の平均を指す。これは、少なくとも２つの測定値、例えば、少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回、より好ましくは少なくとも１０回の反復が存在することを必要とする。当業者であれば、反復回数が多いほど、幾何平均（Ｇｅｏｍｅａｎ）値はより強固になることを理解するであろう。反復回数の選択は、当業者の裁量に委ねられ得る。
【０２０１】
本明細書で「薬剤」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的物質から作製される抽出物を示すために使用される。
【０２０２】
α５β１ポリペプチドに関して、「活性な」または「活性」は、天然α５β１ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有する、α５β１ポリペプチドの一部分を指す。本明細書で使用されるとき、「生物学的」は、天然α５β１ポリペプチドの活性からもたらされる生物学的機能を指す。好ましいα５β１生物学的活性は、例えば、α５β１誘導性細胞接着ならびに浸潤および／または血管新生および／または増殖を含む。
【０２０３】
本明細書で使用されるとき、「哺乳動物」は、哺乳動物であると考えられる任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【０２０４】
本明細書で使用されるとき、「動物」は、哺乳動物であると考えられる動物を包含する。好ましくは、動物は、ヒトである。
【０２０５】
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を指す。
【０２０６】
本明細書で使用されるとき、「リポソーム」は、本発明のα５β１ポリペプチドまたはかかるα５β１ポリペプチドに対する抗体を含んでもよい薬物の、哺乳動物への送達に有用であり得る小胞を指す。
【０２０７】
本明細書で使用されるとき、「標識」または「標識化された」は、検出可能な部分の、ポリペプチドへの付加、例えば、放射標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識化された基またはビオチニル基の付加を指す。放射性同位体または放射性核種は、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉを含んでもよく、蛍光標識は、ローダミン、ランタニド蛍光体、またはＦＩＴＣを含んでもよく、酵素標識は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含んでもよい。
【０２０８】
さらなる標識には、例示として、かつ限定なしに：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼ等の酵素；色素；フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質」のためのＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミン等のさらなる蛍光標識または蛍光体；ランタニドクリプテートおよびキレート等のフルオロフォア、例えば、ユーロピウム等（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ａｎｄ  Ｃｉｓ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；イソルミノール、ルミノール、およびジオキセタン等の化学発光標識または化学発光体；感光剤；補酵素；酵素基質；ラテックスまたは炭素粒子等の粒子；金属ゾル；結晶子；リポソーム；色素、触媒、または他の検出可能な基でさらに標識化され得る細胞等；ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジン等の分子；例えば、緑膿菌外毒素（ＰＥまたはその細胞毒性フラグメントもしくは突然変異体）、ジフテリア毒素またはその細胞毒性フラグメントもしくは突然変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦ、リシンまたはその細胞毒性フラグメント、例えば、リシンＡ、アブリンまたはその細胞毒性フラグメント、サポリンまたはその細胞毒性フラグメント、ヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞毒性フラグメント、およびブリオジン１またはその細胞毒性フラグメントの群から選択される毒素部分等の毒素部分が含まれる。
【０２０９】
本明細書で使用されるとき、「医薬品または薬物」という用語は、患者に適切に投与されるとき、所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を指す。Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ  （Ｐａｒｋｅｒ，  Ｓ．編，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  （１９８５））、（参照により本明細書に組み込まれる）によって例示される通り、当技術分野における従来の用途に従って、他の化学用語が本明細書で使用される。
【０２１０】
本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋」とは、対象の種が存在している優性種であり（すなわち、それがモル濃度ベースで、組成物中の他の任意の個々の種よりも豊富にある）、好ましくは、実質的に精製された画分は、その中の対象の種が存在している全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル濃度ベースで）を含む組成物であることを意味する。概して、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在している全ての高分子種の約８０パーセント超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を含むであろう。最も好ましくは、対象の種は、組成物が本質的に単一の高分子種からなるような、本質的均一性（従来の検出方法によって、組成物中で汚染種が検出され得ない）に到達するまで精製される。
【０２１１】
「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学的被験体を含む。
【０２１２】
「抗体依存性細胞媒介型細胞毒性」および「ＡＤＣＣ」は、Ｉｇ  Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介型反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）の表３、４６４ページに要約される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を検定するために、米国特許第５，５００，３６２号、または同第５，８２１，３３７号に記載される検定等のインビトロＡＤＣＣ検定を行うことができる。かかる検定のための有用なエフェクター細胞には、抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的にまたは追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９８８）に開示される検定等の動物モデルにおいて、検定することができる。「補体依存性細胞毒性」および「ＣＤＣ」は、それによって抗体がそれらの細胞破壊機能を実行する機構を指す。それは、Ｃ１ｑ、つまり補体の第１構成成分の構成物の、抗原を備えた複合体中に存在するＩｇ、すなわちＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ領域への結合によって開始される（Ｈｕｇｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｎ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｇａｒｄｎｅｒ．  １９７９．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６：６９７）。Ｃ１ｑは、ヒト血清中に７０μｇ／ｍＬの濃度で存在する、約４１０ｋＤａの大型で構造的に複合体である糖タンパク質である（Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｎ．Ｒ．  １９８５．  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７：１５１）。２個のセリンプロテアーゼ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓと共に、Ｃ１ｑは、複合体Ｃ１、つまり補体の第１構成成分を形成する。Ｃ１ｑのＮ末端球状頭部のうちの少なくとも２つは、Ｃ１活性のために、したがって補体カスケードの開始のために、ＩｇｓのＦｃに結合されるはずである（Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｎ．Ｒ．  １９８５．  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７：１５１）。
【０２１３】
本明細書で使用されるとき、「抗体半減期」という用語は、抗体分子の投与後の平均生存時間の測定値である抗体の薬物動態学的特性を意味する。抗体半減期は、例えば、血清もしくは血漿中（すなわち、循環半減期）で、または他の組織中で測定されたとき、既知の量の免疫グロブリンの５０パーセントを、患者の体またはその特定の部分から排除するために必要とされる時間として示されることができる。半減期は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラスによって異なってもよい。概して、抗体半減期の増加は、投与された抗体の循環における、平均滞留時間（ＭＲＴ）の増加をもたらす。
【０２１４】
「アイソタイプ」という用語は、抗体の重鎖または軽鎖定常領域の分類を指す。抗体の定常領域は、抗原への結合には関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸の配列に依存して、所定のヒト抗体または免疫グロブリンを、免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てることができる。これらのクラスのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１（γ１）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）、およびＩｇＧ４（γ４）、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分割することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスの構造および３次元配置は、周知である。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭのみが、補体を活性化することが知られる。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいて媒介することが知られる。ヒト軽鎖定常領域は、２つの主なクラスである、κおよびλに分類されてもよい。
【０２１５】
所望により、例えば、異なるアイソタイプの生物学的特性を活用するために、α５β１に特異的に結合する抗体のアイソタイプをスイッチすることができる。例えば、状況によっては、α５β１に対する治療抗体としての抗体の生成に関連して、抗体が、補体を結合し、かつ補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与することができることが望ましい可能性がある。同様の能力がある幾つかの抗体のアイソタイプが存在し、それには、制限なしに、次のアイソタイプが含まれる：マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。他の実施形態では、α５β１に対する治療抗体としての抗体の生成に関連して、抗体がエフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与することができることが望ましい可能性がある。同様の能力がある抗体の幾つかのアイソタイプが存在し、それらは、制限なしに、次のアイソタイプを含む：マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。生成される抗体が、かかるアイソタイプを最初に有する必要はないが、むしろ抗体は、生成されるとき、任意のアイソタイプを有することができ、抗体は、当技術業界で周知の従来の技術を用いて、それ以降スイッチされたアイソタイプであり得ることは理解されよう。かかる技術は、とりわけ直接組み換え技術（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい）、細胞−細胞融合技術（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号および同第６，２０７，４１８号を参照されたい）の使用を含む。
【０２１６】
例として、本明細書で説明される抗α５β１抗体は、完全ヒト抗体である。抗体がα５β１への所望の結合を有する場合、それは、依然として同一の可変領域（抗体の特異性およびその親和性の一部を定める）を有しながら、容易にアイソタイプスイッチされてヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１、またはヒトＩｇＧ３アイソタイプを生成することができる。次いで、かかる分子は、補体を結合させ、ＣＤＣに関与すること、および／またはエフェクター細胞上でＦｃ受容体に結合し、ＡＤＣＣに関与することができるであろう。
【０２１７】
「全血検定」は、ナチュラルエフェクターの源として、非分画血液を使用する。血液は、多形核細胞（ＰＭＮ）および単核細胞（ＭＮＣ）等のＦｃＲ発現細胞エフェクターと共に、血漿中に補体を含有する。したがって、全血検定は、インビトロでのＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機構の両方の相乗効果の同時評価を可能にする。
【０２１８】
本明細書で使用されるとき、「治療的有効」量とは、被験体に、ある種の改善または利益を提供する量である。別の方法で述べると、「治療的有効」量とは、少なくとも１つの臨床症状において、ある種の緩和、軽減、および／または減少を提供する量である。本発明の方法によって治療することができる障害に関連する臨床症状は、当業者に周知である。さらに、当業者であれば、被験体にある種の利益が提供される限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
【０２１９】
本明細書で使用されるとき、「および／または」という用語は、２つの特定された特徴または構成成分の各々の、もう１つを共にした、またはもう１つを共にしない、特定の開示として捉えるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、各々が本明細書で個別に提示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特定の開示として捉えるべきである。
【０２２０】
（抗体構造）
塩基性抗体構造単位は、四量体を含むことが知られる。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、このうち各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定める。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを定める。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、このうち重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第７章（Ｐａｕｌ，  Ｗ．編，  第２版  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９））（全目的で参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０２２１】
したがって、インタクトな抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体の場合を除いて、２つの結合部位は同一である。
【０２２２】
鎖は全て、ＣＤＲとも呼ばれる３つの高度可変領域によって結合される、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープに結合することを可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の双方は、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。アミノ酸の各領域への割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９８７  ａｎｄ  １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０２２３】
二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む種々の方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７９：  ３１５−３２１（１９９０），Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。二重特異性抗体は、単一の結合部位を有するフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖ）の形態では存在しない。
【０２２４】
典型的に、ＶＨ領域は、ＶＬ領域と対形成されて、抗体抗原結合部位を提供するが、ＶＨまたはＶＬ領域は、抗原に結合するために単独で使用されてもよい。ＶＨ領域（表１２参照）は、ＶＨおよびＶＬ領域の双方を含む抗体抗原結合部位が形成されるように、ＶＬ領域（表１３参照）と対形成されてもよい。
【０２２５】
（ヒト抗体および抗体のヒト化）
本発明の標的結合剤は、ヒト抗体を含む。ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および／または定常領域を有する抗体に関連する問題の幾つかを回避する。かかるマウスまたはラット由来タンパク質の存在は、抗体の迅速なクリアランスをもたらし得るか、または患者の抗体に対する免疫応答の生成をもたらし得る。マウスまたはラット由来抗体の利用を回避するために、完全ヒト抗体は、齧歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するように、機能的ヒト抗体部位の、齧歯類、他の哺乳動物または動物への導入を通じて生成され得る。
【０２２６】
完全ヒト抗体を生成する１つの方法は、ヒト重鎖部位およびκ軽鎖部位の最大１０００ｋｂであるが１０００ｋｂ未満のサイズの生殖細胞系構成フラグメントを含有するように操作されたマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の使用による方法である。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：４８３−４９５（１９９８）を参照されたい。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株は、Ａｍｇｅｎ，  Ｉｎｃ．  （Ｆｒｅｍｏｎｔ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手可能である。
【０２２７】
次いで、かかるマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができ、かつマウス免疫グロブリン分子および抗体の産生には欠けている。同一の効果を達成するために利用される技術は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号、および１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３、および２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０に開示され、該出願および公開の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）もまた参照されたく、該参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の産生は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された同第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された同第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日に出願された同第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された同第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された同第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された同第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された同第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された同第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願され同た第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された同第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された同第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国公開第２００３／００９３８２０号、および米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、および同第５，９３９，５９８号、および日本特許第３  ０６８  １８０Ｂ２号、同第３  ０６８  ５０６Ｂ２号、および同第３  ０６８  ５０７Ｂ２号でさらに説明および記述される。また、１９９６年６月１２日に付与公開された欧州特許第ＥＰ０  ４６３  １５１Ｂ１号、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願ＷＯ９６／３４０９６、１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３、２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０も参照されたい。上で引用された特許、出願、および参考文献の各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２９】
代替的アプローチとしては、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．を含む他のアプローチは、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用している。ミニ遺伝子座アプローチでは、外因性Ｉｇ部位は、Ｉｇ部位からの断片（個々の遺伝子）の組み込みを通じて模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および通常第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）は、動物への挿入のためのコンストラクトへと形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらへの米国特許第５，５４５，８０７号ならびに各々ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙへの米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、および同第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓへの米国特許第５，５９１，６６９号、同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓらへの米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、および同第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉおよびＤｕｎｎ、およびＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌへの米国特許第５，６４３，７６３号、１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された同第０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された同第０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日に出願された同第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された同第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された同第０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日に出願された同第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日に出願された同第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された同第０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日に出願された同第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された同第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出願された同第０８／２０９，７４１号に記載され、該出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。また、欧州特許第０  ５４６  ０７３Ｂ１号、国際特許出願ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、およびＷＯ９８／２４８８４、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたく、該出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）も参照されたく、該参考文献���開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
Ｋｉｒｉｎはまた、微小核融合を通じて、その中で染色体の大きな断片または染色体全体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成を示している。欧州特許出願第７７３  ２８８号および同第８４３  ９６１号を参照されたく、該出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスとの交雑育種の結果であるＫＭ（商標）マウスが生成されている。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランス染色体およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖トランス遺伝子を有する（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  （２００２）  ４：９１−１０２）。
【０２３１】
ヒト抗体はまた、インビトロ方法によって導くことができる。好適な例としては、ファージディスプレイ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（かつてのＰｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、酵母ディスプレイ等が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３２】
（抗体の調製）
本明細書に記載される抗体は、下記の通り、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用を通じて調製された。かかるマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができ、かつマウス免疫グロブリン分子および抗体の産生には欠けている。同一の効果を達成するために利用される技術は、本明細書の背景の節における特許、出願、および参考文献に開示される。しかしながら、特に、マウスのトランスジェニック産生およびマウスのトランスジェニックからの抗体の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号、ならびに１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３および２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０に開示され、かかる出願および公開の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）も参照されたく、該参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３３】
かかる技術の使用を通じて、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産生されている。本質的に、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株は、目的の抗原で免疫付与され（例えば、α５β１）、リンパ性細胞（Ｂ細胞等）は、高度免疫付与されたマウスから回収され、回収されたリンパ球は骨髄タイプ細胞株と融合されて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製する。これらのハイブリドーマ細胞株は、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定するために、スクリーニングされ、選択される。α５β１に特異的な抗体を産生する多発性ハイブリドーマ細胞株の産生の方法が、本明細書に提供される。さらに、かかる抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含む、かかる細胞株から産生される抗体の特性が本明細書に提供される。
【０２３４】
代替的に、骨髄腫細胞に融合されてハイブリドーマを生成する代わりに、Ｂ細胞は、直接検定されることができる。例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、高度免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスから単離され得、抗体分泌血漿細胞へと増殖および分化することを可能にし得る。次いで、細胞上清からの抗体は、α５β１免疫原に対する反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングされる。上清はまた、さらにα５β１に対する機能的目的を有する領域への結合について、異なる抗体をさらにマッピングするために、α５β１のフラグメントに対する免疫反応性についてスクリーニングされ得る。抗体はまた、他の関連ヒトエンドグリコシダーゼについて、ならびにラット、マウス、およびカニクイザル等の非ヒト霊長類のα５β１のオルソログ、つまり種の交差反応性を決定する最終要素に対してスクリーニングされ得る。目的の抗体を含有するウェルからのＢ細胞は、個々のウェルまたはプールされたウェルのいずれかからハイブリドーマを作製するための融合を含む様々な方法によって、またはＥＢＶでの感染もしくは既知の不死化遺伝子によるトランスフェクションによって、不死化され、次いで好適な培地に播種され得る。代替的に、所望の特異性を備える単一の血漿細胞分泌抗体は、次いで、α５β１特異性溶血プラーク検定を用いて、単離される（例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８  （１９９６）を参照されたい）。溶解を標的とする細胞は、好ましくはα５β１抗原でコーティングされたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）である。
【０２３５】
目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌する血漿細胞を含有するＢ細胞培養物の存在時の、プラークの形成は、目的の血漿細胞を包囲するヒツジ赤血球の特異的なα５β１媒介型溶解を示す。プラークの中心の単一の抗原特異性血漿細胞は、単離され得、抗体の特異性をコードする遺伝情報は、単一の血漿細胞から単離される。逆転写、続いてＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡをクローン化することができる。次いで、かかるクローン化されたＤＮＡは、好適な発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡ等のベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常領域を含有するような、かかるｐｃＤＮＡベクターにさらに挿入され得る。次いで、生成されたベクターは、宿主細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ得、転写を誘導すること、形質転換体を選択すること、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅することに適切であるように改変された従来の栄養培地で培養され得る。
【０２３６】
理解されるであろうが、α５β１に特異的に結合する抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で発現され得る。特定の抗体をコードする配列は、好適な哺乳類宿主細胞を形質転換するために使用され得る。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中に（またはウイルスベクター中に）パッケージすること、および、宿主細胞にウイルス（またはベクター）を導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための任意の既知の方法によって、あるいは米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号によって例示される通り、当技術分野で既知のトランスフェクション手順によって、行うことができる（該特許は、参照により本明細書に組み込まれる）。使用される形質転換手順は、形質転換されようとしている宿主に依存する。異種性のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は、当業者に周知であり、デキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、１つまたは複数のポリヌクレオチドのリポソーム中への封入、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションを含む。
【０２３７】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当業者に周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および幾つかの他の細胞株を含むが、それらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む（Ｃｈａｄｄ，  Ｈ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｃｈａｍｏｗ，  Ｓ．Ｍ．，  （２００１）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １２：  １８８−１９４、Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｄ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｎ，  Ｌ，  （２００２）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １３：１１７、Ｌａｒｒｉｃｋ，  Ｊ．Ｗ．，  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｄ．Ｗ．，  （２００１）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １２：  ４１１−４１８）。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有し、構成的α５β１結合特性を備える抗体を産生するかを決定することを通じて選択される。
【０２３８】
細胞−細胞融合技術において、任意の所望のアイソタイプを備える重鎖を有する骨髄腫、ＣＨＯ細胞、または他の細胞株が調製され、また軽鎖を有する別の骨髄腫、ＣＨＯ細胞、または他の細胞株が調整される。その後、かかる細胞は、融合され得、インタクトな抗体を発現する細胞株は、単離され得る。
【０２３９】
したがって、上述の所望の「構造的」属性を満たす抗体候補が生成されるとき、それらは、概して、アイソタイプスイッチを通じて、所望の「機能的」属性の少なくともある種を提供され得る。
【０２４０】
（治療投与および製剤）
本発明の実施形態は、疾患の治療として有用である、抗α５β１抗体の滅菌された薬学製剤を含む。かかる製剤は、例えば、フィブロネクチン等の天然α５β１特異性リガンドの、α５β１への結合を阻害し、それによって効果的に、例えば、血清または組織α５β１発現が異常に上昇する場合等の病的状態を治療するであろう。抗α５β１抗体は、好ましくは、例えば、フィブロネクチン等の天然α５β１特異的リガンドを強力に阻害するための適切な親和性を有し、好ましくは、ヒトにおける低頻度の投薬を可能にするための適切な作用期間を有する。持続的作用期間は、皮下注射または筋肉内注射等の代替の非経口経路によって、より低い頻度で、より簡便な投薬スケジュールを可能にするであろう。
【０２４１】
滅菌製剤は、例えば、抗体の凍結乾燥および再構成前またはそれらに続く、滅菌ろ過膜を通すろ過によって、作り出すことができる。抗体は、通常、凍結乾燥形態でまたは溶液中で保管されるであろう。治療抗体組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器内、例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓等の、製剤の取り込みを可能にするアダプタを有する静注液バッグまたは小瓶に配置される。
【０２４２】
抗体投与経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、髄腔内、吸入、または病巣内経路による注射もしくは注入、腫瘍部位への直接注射、または下述のように徐放系による。抗体は、好ましくは注入によってまたはボーラス注射によって連続的に投与される。
【０２４３】
治療的に採用される抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の病態に依存するであろう。したがって、療法士が、最適な治療効果を得るために、必要に応じて用量を設定し、投与経路を修正することが好ましい。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する用量に到達するまで、抗体を投与する。この治療の進行は、従来の検定によってまたは本明細書に記載される検定によって、容易にモニターされる。
【０２４４】
本明細書に記載される通り、抗体は、薬学的に許容される担体との混合物中で調製され得る。この治療組成物は、静脈内に、または鼻もしくは肺を通じて、好ましくは液体または粉末エアロゾル（凍結乾燥）として、投与され得る。組成物はまた、所望に応じて、非経口でまたは皮下で投与されてもよい。全身投与される場合、治療組成物は、滅菌されており、発熱性物質が除去されており、ｐＨ、等張性、および安定性に当然の注意を払った、非経口的に許容される溶液であるべきである。これらの条件は、当業者に既知である。手短に述べると、本明細書に記載される化合物の用量製剤は、所望の純度を有する化合物を薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、保管または投与のために調製される。かかる物質は、採用される用量および濃度で、受容対象に対して無毒性であり、ＴＲＩＳ  ＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸塩等の緩衝剤；アスコルビン酸等の酸化防止剤；ポリアルギニン等の低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリジノン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、もしくはアルギニン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート薬剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオンならびに／またはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、もしくはポリエチレングリコール等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０２４５】
注射のための滅菌組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （第２０版，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （２００３））に記載される従来の薬務に従って製剤化され得る。例えば、水またはゴマ油、ピーナッツ油、もしくは綿実油等の天然産植物油、あるいはオレイン酸エチル等の合成脂肪ビヒクル等の薬学的に許容される担体中での活性な化合物の溶解液または懸濁液が望ましくあり得る。許容される薬務に従って、緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤等を組み入れることができる。
【０２４６】
好適な徐放性調製物の例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、造形品、薄膜、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  （１９８１）  １５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，  （１９８２）  １２：９８−１０５  によって記載されるポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリル酸）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸エステルのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  （１９８３）  ２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）、ＬＵＰＲＯＮ  Ｄｅｐｏｔ（商標）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドからなる注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
【０２４７】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーが、１００日間超にわたる分子の放出を可能にする一方で、ある種のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化されたタンパク質が長期間にわたって体内に残留するとき、それらは、３７℃での湿気への曝露の結果として、変性または凝集し得、生物学的活性の喪失および免疫原性の潜在的変化をもたらす。関与する機構に依存して、タンパク質安定化のための合理的戦略を考案することができる。例えば、凝集機構が、ジスルフィド相互変換を通じた分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、適切な添加剤を用いて、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、含水量を制御すること、および特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化が達成され得る。
【０２４８】
徐放性組成物はまた、懸濁液中で結晶を維持することができる好適な製剤に懸濁された、抗体の結晶の調製物も含む。これらの調製物は、皮下注射または腹腔内注射されるとき、徐放性効果を産生することができる。他の組成物はまた、リポソーム封入抗体も含む。かかる抗体を含有するリポソームは、それ自体が既知の方法によって調製される：米国特許第ＤＥ３，２１８，１２１号、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９８５）  ８２：３６８８−３６９２、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９８０）  ７７：４０３０−４０３４、欧州特許第５２，３２２号、欧州特許第３６，６７６号、欧州特許第８８，０４６号、欧州特許第１４３，９４９、第１４２，６４１号、日本特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号、ならびに欧州特許第１０２，３２４号。
【０２４９】
所定の患者のための抗体製剤の用量は、疾患の重症度およびタイプ、体重、性別、食生活、投与の時間および経路、他の投薬、ならびに他の関連する臨床要因を含む、薬物の作用を変更することが知られている種々の要因を考慮に入れて、主治医によって決定されるであろう。治療的に有効な用量は、インビトロまたはインビボ方法のいずれかによって決定されてもよい。
【０２５０】
本明細書に記載される、治療的に採用されようとしている抗体の効果的な量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の病態に依存するであろう。したがって、療法士が、最適な治療効果を得るために、必要に応じて用量を設定し、投与経路を修正することが好ましい。典型的な１日当たりの用量は、上述の要因に依存して、患者の体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから、最大１００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１００００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲に及び得る。用量は、上述の要因に依存して、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇの間であり得る。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する用量に到達するまで、治療抗体を投与するであろう。この治療の進行は、従来の検定によってまたは本明細書に記載される通りに、容易にモニターされる。
【０２５１】
本発明の抗体の用量は、反復されてもよく、投与は、少なくとも１日、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、３０日間、４５日間、２ヶ月間、７５日間、３ヶ月間、または少なくとも６ヶ月間、隔てられてもよい。
【０２５２】
本明細書の組成物および方法に従った治療用物質の投与は、改善された移送、送達、耐性等を提供するために、製剤に組み込まれる好適な担体、賦形剤、および他の薬剤と共に投与されることは理解されよう。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）等）、ＤＮＡ共役体、無水吸収ペースト、水中油型乳剤および油中水型乳剤、乳剤カルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。上述の混合物のうちのいずれも、製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されておらず、製剤が投与経路と生理学的に適合し耐用性があるという条件で、本発明に従った処置および治療に適切であり得る。また、Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”  Ｒｅｇｕｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３２（２）：２１０−８  （２０００）、Ｗａｎｇ  Ｗ．  “Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２０３（１−２）：１−６０  （２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ  “Ｌｉｐｉｄｓ，  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５２：２３８−３１１（１９９８）、ならびに薬剤師に周知の製剤、賦形剤、および担体に関連するさらなる情報についてのそれらの中の引用も参照されたい。
【０２５３】
（他の治療剤の設計および生成）
本発明に従って、および本明細書でα５β１に関して産生され、特徴付けられる抗体の活性に基づいて、抗体部分を越えた他の治療様式の設計が容易となる。かかる様式は、制限なしに、二重特異性抗体、免疫毒素、および放射標識治療剤等の先進抗体治療剤、単一領域抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｄＡｂ等の抗体フラグメント、ペプチド治療剤の生成、新規骨格中のα５β１結合領域、遺伝子療法、特に細胞内抗体、アンチセンス治療剤、ならびに小分子を含む。
【０２５４】
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはシトクロムＢ等の非抗体タンパク質骨格上でのＣＤＲの配列によって提供されてもよく（Ｈａａｎ  ＆  Ｍａｇｇｏｓ  （２００４）  ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，  １２（５）：  Ａ１−Ａ６、Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２８４：  １１４１−１１５１、Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７：  ４６３−４６９）、または所望の標的に対する結合特異性を与えるために、タンパク質骨格内のループのアミノ酸残基の無作為化または突然変異によって提供されてもよい。タンパク質中の新規結合部位を操作するための骨格は、Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ  （Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７：  ４６３−４６９）によって詳細に概説されている。抗体模倣のためのタンパク質骨格は、ＷＯ００３４７８４に開示され、該開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、ここで発明者は、少なくとも１つの無作為化ループを有する、フィブロネクチンタイプＩＩＩ領域を含むタンパク質（抗体模倣体）を説明する。１つ以上のＣＤＲ、例えば、一連のＨＣＤＲがそこへ移植される好適な骨格は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意の領域メンバーによって提供されてもよい。骨格は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であってもよい。非抗体タンパク質骨格の利点は、それが少なくとも幾つかの抗体分子よりも、より小さくおよび／またはより容易に製造できる骨格分子中の抗原結合部位を提供し得ることである。小サイズの結合メンバーは、細胞に侵入する能力、組織の深部を透過する能力、もしくは他の構造内の標的に到達する能力、または標的抗原のタンパク質空洞内で結合する能力等の有用な生理学的特性を与え得る。非抗体タンパク質骨格中での抗原結合部位の使用は、Ｗｅｓｓ，  ２００４  （Ｗｅｓｓ，  Ｌ．Ｉｎ：  ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，  Ｔｈｅ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，  １２（４２），  Ａ１−Ａ７，  ２００４）に概説されている。安定的な骨格および１つ以上の可変ループを有するタンパク質が典型的であり、ここで１つまたは複数のループのアミノ酸の配列は、標的抗原に結合する抗原結合部位を作り出すために、特異的にまたは無作為的に突然変異させられる。かかるタンパク質は、Ｓ．アウレウス、トランスフェリン、アルブミン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、１０番目フィブロネクチンタイプＩＩＩ領域）、リポカリン、ならびにγクリスタリンおよび他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）骨格（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）からのプロテインＡのＩｇＧ結合領域を含む。他のアプローチの例としては、分子内ジスルフィド結合を有するシクロチド−小タンパク質、Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉｘ）、およびアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）に基づく、合成「ミクロボディ」が挙げられる。
【０２５５】
抗体配列および／または抗原結合部位に加えて、本発明に従った標的結合剤は、例えば折り畳み領域等のペプチドまたはポリペプチドを形成する、または抗原に結合する能力に加えて分子に別の機能的特徴を与えるための、他のアミノ酸を含んでもよい。本発明の標的結合剤は、検出可能な標識を担持してもよく、または毒素もしくは標的部分または酵素と共役させられてもよい（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）。例えば、標的結合剤は、触媒部位（例えば、酵素領域において）ならびに抗原結合部位を含んでもよく、ここで抗原結合部位は、抗原に結合し、こうして抗原に対する触媒部位を標的とする。触媒部位は、例えば、切断によって、抗原の生物学的機能を阻害し得る。
【０２５６】
先進抗体治療剤の生成に関連して、補体結合が望ましい属性である場合、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、または放射標識の使用を通じて、細胞破壊のために、補体への依存を回避することが可能であり得る。
【０２５７】
抗体はまた、当技術業界で周知の技術を利用して、免疫毒素として作用するために修飾され得る。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）を参照されたい。また、米国特許第５，１９４，５９４号も参照されたい。放射標識抗体の調製に関連して、かかる修飾抗体はまた、当技術業界で周知の技術を利用して、容易に調製され得る。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６  （第２版，  Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ編，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ  （１９９６））を参照されたい。また、米国特許第４，６８１，５８１号、同第４，７３５，２１０号、同第５，１０１，８２７号、同第５，１０２，９９０（ＲＥ３５，５００）号、同第５，６４８，４７１号、および同第５，６９７，９０２号も参照されたい。各免疫毒素または放射標識化分子は、所望の多量体酵素サブユニットオリゴマー化領域を発現する細胞を死滅させる可能性が高いであろう。
【０２５８】
抗体が薬剤に結合されるとき（例えば、放射性同位体、薬学組成物、または毒素）、薬剤は、抗有糸分裂、アルキル化、抗代謝、抗血管新生、アポトーシス性、アルカロイド、ＣＯＸ−２、および抗生物質薬剤、およびそれらの組み合わせの群から選択される薬学特性を有することが企図される。薬物は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素化合物、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗代謝剤、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、オキサリプラチン、ドキソルビシンおよびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせの群から選択され得る。
【０２５９】
毒素の例としては、さらにゲロニン、緑膿菌外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、緑膿菌内毒素、カリケアマイシンおよびエスペラミシン等の分子のエンジインファミリーのメンバー、ならびにそれらの誘導体、組み合わせ、および修飾体が挙げられる。化学毒素はまた、ズオカルマイシン（例えば、米国特許第５，７０３，０８０号および米国特許第４，９２３，９９０号を参照されたい）、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シス−プラチナム、エトポシド、ブレオマイシン、および５−フルオロウラシルからなる群から選択され得る。化学療法剤の例としてはまた、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、サイトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照されたい）、メルファラン、および他の関連した窒素マスタードも挙げられる。好適な毒素および化学療法剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  １９９５）、およびＧｏｏｄｍａｎ  Ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  第７版  （ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  １９８５）に記載される。他の好適な毒素および／または化学療法剤は、当業者に既知である。
【０２６０】
放射性同位体の例としては、局在化ならびに／または治療に使用され得るγ放出体、陽電子放出体、およびＸ線放出体、ならびに治療に使用され得るβ放出体およびα放出体が挙げられる。診断法、予後診断法、および病期診断法に有用であるとして上述した放射性同位体はまた、治療法にも有用である。
【０２６１】
非限定的な抗癌剤または抗白血病剤の例としては、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、およびモルホリノ等のアントラサイクリン、ならびにそれらの置換誘導体、組み合わせ、および修飾体が挙げられる。例示的医薬品には、シス−プラチナム、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシ尿素、テモゾロマイド、サリドマイド、およびブレオマイシン、ならびにそれらの誘導体、組み合わせ、および修飾体が含まれる。好ましくは、抗癌または抗白血病は、ドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、またはモルホリノダウノルビシンである。
【０２６２】
本発明の抗体はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、非修飾抗体の半減期よりも長い半減期（例えば、血清半減期）を有する抗体を包含する。該抗体半減期は、約１５日間よりも長く、約２０日間よりも長く、約２５日間よりも長く、約３０日間よりも長く、約３５日間よりも長く、約４０日間よりも長く、約４５日間よりも長く、約２ヶ月間よりも長く、約３ヶ月間よりも長く、約４ヶ月間よりも長く、または約５ヶ月間よりも長くてもよい。哺乳動物、好ましくはヒトにおける、本発明の抗体またはそのフラグメントの増加された半減期は、哺乳動物における、該抗体または抗体フラグメントのより高い血清力価をもたらし、したがって、該抗体または抗体フラグメントの投与の頻度を低減させ、および／または投与される該抗体または抗体フラグメントの濃度を低減させる。増加されたインビボ半減期を有する抗体またはそのフラグメントは、当業者に既知の技術によって生成され得る。例えば、増加したインビボ半減期を備える抗体またはそのフラグメントは、Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するとして特定されるアミノ酸残基を修飾することによって（例えば、置換、欠失、または付加）、生成され得る（例えば、国際公開ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ０２／０６０９１９を参照されたく、該公開は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。増加されたインビボ半減期を備える抗体またはそのフラグメントは、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の、該抗体または抗体フラグメントポリマー分子に結合することによって、生成され得る。ＰＥＧは、多機能的リンカーを用いてまたは用いずに、ＰＥＧの、該抗体または抗体フラグメントのＮ末端またはＣ末端との部位特異的共役を通じて、またはリジン残基上に存在するεアミノ基を介してのいずれかで、該抗体または抗体フラグメントに結合され得る。生物学的活性の最小限の欠失をもたらす、線形または分枝ポリマー誘導体化が使用されるであろう。共役の程度は、ＰＥＧ分子の、抗体との適切な共役を確保するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法によって、綿密にモニターされるであろう。未反応のＰＥＧは、例えば、サイズ排除、またはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体−ＰＥＧ共役体から分離され得る。
【０２６３】
当業者であれば理解するであろうが、上の実施形態では、親和性値が重要であり得る一方で、抗体の特定の機能に依存して、他の要因も同様に重要またはより重要であり得る。例えば、免疫毒素（抗体に関連する毒素）について、抗体の標的への結合作用は、有用であり得るが、幾つかの実施形態では、所望の最終結果は、毒素の細胞への内在化である。このため、これらの状況では、高率の内在化を備える抗体が望ましくあり得る。したがって、一実施形態では、内在化において高い効率を備える抗体が企図される。内在化の高い効率は、内在化された抗体の百分率として測定され得、低値〜１００％であり得る。例えば、種々の実施形態では、０．１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９９、および９９〜１００％が高い効率であり得る。当業者であれば理解するであろうが、望ましい効率は、例えば、関連する薬剤、領域に投与され得る抗体の量、抗体−薬剤複合体の副作用、治療されようとしている問題のタイプ（例えば、癌タイプ）および重症度に依存して、異なる実施形態で異なり得る。
【０２６４】
他の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、α５β１の発現の変化に関連する疾患または障害をスクリーニングするために、哺乳類組織または細胞中のα５β１発現の検出のための検定キットを提供する。キットは、α５β１に結合する抗体および存在する場合、抗体の抗原との反応を示す手段を含む。
【０２６５】
（組み合わせ）
本明細書に定義される標的結合剤または抗体は、単独の療法として適用されてもよく、または本発明の化合物に加えて、従来の外科手術、または放射治療、または化学療法を伴ってもよい。かかる化学療法は、抗腫瘍薬剤の次のカテゴリーのうちの１つ以上を含んでもよい：
（ｉ）アルキル化剤（例えば、シス−プラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾロミド、およびニトロソ尿素類）；抗代謝剤（例えば、ゲムシタビンならびに５-フルオロウラシルおよびテガフール等のフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素等の抗葉酸剤）；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシン等のアントラサイクリン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン等のビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテール等のタキソイド類、ならびにポロキナーゼ阻害剤）；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシド等のエピポドフィル毒素、アムサクリン、トポテカン、ならびにカンプトテシン）等の、腫瘍内科学で使用されるような、他の抗増殖性／抗悪性腫瘍薬およびそれらの組み合わせ、
（ｉｉ）抗エストロゲン等の細胞分裂阻害剤（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、およびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、リュープロレリン、およびブセレリン）、プロゲストーゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール、およびエキセメスタンとして）、ならびにフィナステリド等の５α−還元酵素の阻害剤、
（ｉｉｉ）抗浸潤薬剤（例えば、４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際特許出願ＷＯ０１／９４３４１号）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ、ＢＭＳ−３５４８２５、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００４，  ４７，  ６６５８−６６６１）等のｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤、およびマリマスタット等のメタロプロテアーゼ阻害剤、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤、またはカテプシンの阻害剤、例えば、マトリプターゼ、ヘプシン、ウロキナーゼ等のセリンプロテアーゼの阻害剤、ヘパラナーゼの阻害剤）、
（ｉｖ）フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン、クロラムブシル、またはドキソルビシン等の細胞毒、ならびにフルダラビン＋シクロホスファミド、ＣＶＰ：シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＡＣＶＢＰ：ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンデシン＋ブレオマイシン＋プレドニゾン、ＣＨＯＰ：シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＣＮＯＰ：シクロホスファミド＋ミトキサントロン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ｍ−ＢＡＣＯＤ：メトトレキセート＋ブレオマイシン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋デキサメタゾン＋ロイコボリン、ＭＡＣＯＰ−Ｂ：メトトレキセート＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン固定用量＋ブレオマイシン＋ロイコボリン、またはＰｒｏＭＡＣＥ  ＣｙｔａＢＯＭ：プレドニゾン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋エトポシド＋シタラビン＋ブレオマイシン＋ビンクリスチン＋メトトレキセート＋ロイコボリン等のそれらの組み合わせ、
（ｖ）成長因子機能の阻害剤、例えば、かかる阻害剤は、成長因子抗体および成長因子受容体抗体を含み（例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２２５］、およびＳｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ．  ５４，ｐｐ１１−２９によって開示される任意の成長因子または成長因子受容体抗体）、かかる阻害剤はまた、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、表皮成長因子ファミリーの阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトシキ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトシキエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ-７７４）、および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）等のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤）、ラパチニブ等のｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤、肝細胞成長因子ファミリーの阻害剤、イマチニブ等の血小板由来性成長因子ファミリーの阻害剤、セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ファルネシル転移酵素阻害剤等のＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤、例えば、ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６））、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼを介した細胞シグナル伝達の阻害剤、肝細胞成長因子ファミリーの阻害剤、ｃ−キット阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体（インスリン様成長因子）キナーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８、およびＡＸ３９４５９）、ＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤等のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ならびにＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、例えば、ＡＢＴ−７３７等の生存シグナル伝達タンパク質の阻害剤も含む、
（ｖｉ）血管内皮成長因子の効果を阻害するような薬剤等の抗血管新生薬剤、［例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））および４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトシキ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトシキ）キナゾリン（ＺＤ６４７４；ＷＯ０１／３２６５１内の実施例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトシキ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１；ＷＯ００／４７２１２内の実施例２４０）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７；ＷＯ９８／３５９８５）およびＳＵ１１２４８（スニチニブ；ＷＯ０１／６０８１４）等のＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、国際特許出願ＷＯ９７／２２５９６、ＷＯ９７／３００３５、ＷＯ９７／３２８５６、ＷＯ９８／１３３５４、ＷＯ００／４７２１２、およびＷＯ０１／３２６５１に開示される化合物等の化合物、ならびに他の機構によって働く化合物（例えば、リノマイド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、およびアンギオスタチン）］、またはコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）もしくはＣＳＦ１受容体、
（ｖｉｉ）コンブレタスタチンＡ４等の血管損傷薬剤、ならびに国際特許出願ＷＯ９９／０２１６６、ＷＯ００／４０５２９、ＷＯ００／４１６６９、ＷＯ０１／９２２２４、ＷＯ０２／０４４３４、およびＷＯ０２／０８２１３に開示される化合物、
（ｖｉｉｉ）アンチセンス療法、例えば、Ｇ−３１３９（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）、抗ｂｃｌ２アンチセンス等の、上に列挙された標的に向けられた療法、
（ｉｘ）例えば、異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１もしくは異常ＢＲＣＡ２等の異常遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、またはバクテリアニトロ還元酵素を用いたアプローチ等のＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ治療）アプローチ、および多剤耐性遺伝子治療等の、化学療法または放射治療に対する患者耐性を増加させるアプローチを含む遺伝子治療アプローチ、ならびに
（ｘ）例えば、アレムツズマブ（キャンパス−１Ｈ（商標））での治療、ＣＤ５２指向性モノクローナル抗体、またはＣＤ２２指向性抗体での治療、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増加させる、エクスビボおよびインビボアプローチ、インターロイキン２、インターロイキン４、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子等のサイトカインでのトランスフェクション、ＣＴＬＡ−４機能を阻害するモノクローナル抗体での治療等のＴ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカイントランスフェクト樹状細胞等のトランスフェクトされた免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞株を用いるアプローチ、ならびに抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを含む免疫療法アプローチ、
（ｘｉ）ベルケイド（ボルテゾミブ）等のプロテアソーム阻害剤等の、タンパク質分解の阻害剤、
（ｘｉｉ）生物学的療法治療アプローチ、例えば、受容体リガンドを隔離するか、受容体へのリガンド結合をブロックするか、または受容体シグナル伝達を減少させるペプチドまたはタンパク質（抗体または可溶性外部受容体領域構築等）を使用するアプローチ（例えば、亢進された受容体分解または低減された発現レベルに起因して）。
【０２６６】
一実施形態では、本明細書に定義される抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、アルキル化剤（例えば、シス−プラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾロミド、およびニトロソ尿素類）；抗代謝剤（例えば、ゲムシタビンならびに５-フルオロウラシルおよびテガフール等のフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素等の抗葉酸剤）；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシン等のアントラサイクリン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン等のビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテール等のタキソイド類、ならびにポロキナーゼ阻害剤）；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシド等のエピポドフィル毒素、アムサクリン、トポテカン、ならびにカンプトテシン）等の、腫瘍内科学で使用されるような、他の抗増殖性／抗悪性腫瘍薬およびそれらの組み合わせでの治療を伴ってもよい。
【０２６７】
一実施形態では、本明細書に定義される抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、ゲムシタビンでの治療を伴ってもよい。
【０２６８】
かかる併用治療は、治療の個々の構成成分の同時の、連続的な、または単独の投薬によって達成されてもよい。かかる組み合わせ生成物は、本明細書に上述される用量範囲内で、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を、またその許容される用量範囲内で、他の薬学的に活性な薬剤を使用する。
【０２６９】
炎症性疾患、例えば、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、または乾癬の治療について、本発明の標的結合剤は、ピロキシカム、ジクロフェナク、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、およびイブプロフェン等のプロピオン酸、メフェナム酸等のフェナメート、インドメタシン、スリンダク、アザプロパゾン、フェニルブタゾン等のピラゾロン、アスピリン等のサリチル酸）等の局所的にまたは全身的に適用される、非選択的シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１／ＣＯＸ−２阻害剤；選択的ＣＯＸ−２阻害剤（メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、およびエトリコキシブ等）；一酸化窒素ドナー（ＣＩＮＯＤ）を阻害するシクロオキシゲナーゼ；副腎皮質ステロイド（局所、経口、筋肉内、静脈内、または関節内経路によって投与される）；メトトレキセート、レフルノミド；ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オーラノフィン、または他の非経口もしくは経口金調製物；鎮痛剤；ジアセレイン；ヒアルロン酸誘導体等の関節内療法；ならびにグルコサミン等の栄養補助剤を含む非ステロイド系抗炎剤（これ以降、ＮＳＡＩＤ）等の１つまたは複数の薬剤と組み合わされてもよい。
【０２７０】
本明細書に定義される標的結合剤または抗体は、ＶＥＧＦのアンタゴニストと組み合わせて適用されてもよい。本明細書に定義される標的結合剤または抗体、およびＶＥＧＦのアンタゴニストは、同時にまたは連続的な治療サイクルで投与され得る。かかる組み合わせ治療は、異常血管新生および／または血管透過性を有する疾患を治療するために有用である。一実施形態では、ＶＥＧＦのアンタゴニストは、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ＺＤ６４７４（４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトシキ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトシキ）キナゾリン）、またはＡＺＤ２１７１（４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトシキ−７−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）キナゾリン）である。
【０２７１】
本明細書に引用される全ての参考文献は、特許、特許出願、文書、テキストブック等を含み、それらの中で引用される参考文献は、それらがまだ引用されていない範囲にまで、ここでの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７２】
本出願は、全目的で参照により本明細書に組み込まれる、２００８年１２月２３日に出願された米国仮出願第６１／１４０，３３１号の優先権の利益を主張する。
【０２７３】
実施例
行われた実験および達成された結果を含む、次の実施例は、例示目的のみで提供され、本明細書の教示に対して限定的であるとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０２７４】
免疫付与および力価測定
（免疫付与）
可溶性α５β１および細胞結合α５β１（細胞表面でヒトα５β１を発現するＣＨＯトランスフェクタント）を用いて、それぞれ免疫付与を行った。ＣＨＯトランスフェクタントの生成のために、ヒト完全長α５β１  ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターに挿入した。ＣＨＯ細胞を、エレクトロポレーションを介して、一過性でトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析によって、免疫原目的に好適なレベルでの、細胞表面上のヒトα５β１の発現を確認した。一連の実験のために、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の２ｘ１０６細胞／マウス（群１および２）および可溶性タンパク質の１０μｇ／マウス（群３および４）の初期注射をＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）の免疫付与のために使用した。１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号、ならびに１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３および２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０に開示される該方法に従って、免疫付与を行い、該出願および公開の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。初期免疫付与に続き、群１および２に対して、１ｘ１０６細胞／マウスの１１回の後続の追加免疫付与を（細胞結合抗原）、および群３および４に対して、５μｇ／マウスの１３回の後続の追加免疫付与（可溶性抗原）を投与した。免疫付与プログラムを表２に要約する。
【０２７５】
（力価により回収するための動物の選択）
トランスフェクトされていない３００．１９細胞（Ａｍｇｅｎ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）またはヒトα５β１でトランスフェクトされた３００．１９細胞を用いて、天然抗原結合について、天然（細胞結合）抗原に対する抗体の力価をＦＡＣＳ染色によって試験した。実施例２に記載される通り、免疫付与プログラムの終了時に、エレクトロポレーションによって、免疫付与されたマウスの脾臓およびリンパ節から単離されたマウス骨髄腫細胞およびリンパ球を用いて融合を行った。
【表２】
2012513194.tif 000004
【実施例２】
【０２７６】
リンパ球の回収、Ｂ細胞単離、ハイブリドーマの融合および生成
免疫付与されたマウスを頚椎脱臼によって屠殺し、流入領域リンパ節を採取し、各コホートからプールした。３回の独立した採取を行った。採取１は、ＩＤ番号１５０９２７、１５０９２８、１５０９２９、１５０９３０、１５００３１を備える、群１からの５匹のマウスを使用した。採取２は、ＩＤ番号１５１０３７、１５１０３８、１５１０３９、１５１０４０、１５０５８８、１５０５８９を備える、群２からの６匹のマウスを使用した。第３採取は、ＩＤ番号１５０９３２、１５０９１９、１５０９２０、１５０９２１、１５０９２６を備える、群１からの５匹のマウスを使用した。
【０２７７】
リンパ系細胞をＤＭＥＭ中で粉砕することにより分離して、細胞を組織から放出させ、細胞をＤＭＥＭに懸濁させた。細胞を数え、１億リンパ球当たり０．９ｍＬのＤＭＥＭを細胞ペレットに添加して、細胞を緩やかにしかし完全に再懸濁させた。１億個の細胞当たり１００μＬのＣＤ９０＋磁気ビーズを用いて、磁気ビーズと共に４℃で１５分間、細胞をインキュベートすることによって、細胞を標識化した。最大１０８個の陽性細胞（または最大２ｘ１０９個の総細胞）を含有する磁気的に標識化された細胞懸濁液を、ＬＳ＋カラムに装填し、カラムをＤＭＥＭで洗浄した。総流出物をＣＤ９０陰性画分として収集した（これらの細胞のほとんどがＢ細胞であると予想された）。
【０２７８】
洗浄された濃縮６日目Ｂ細胞をＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ１５８０（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２３，  １９７９，  １５４８−１５５０）から購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞と、１：４の比率で混合することによって、融合を行った。細胞混合物を、４００ｘｇで４分間の遠心分離によって緩やかにペレット化した。上清のデカント後、細胞を、１ｍＬピペットを用いて緩やかに混合した。事前加熱されたＰＥＧ（１０６個のＢ細胞当たり１ｍＬ）を、緩やかに撹拌しながら１分間にわたって徐々に添加し、続いて１分間の混合を行った。次いで事前加熱されたＩＤＭＥＭ（１０６個のＢ細胞当たり２ｍＬ）を、緩やかに撹拌しながら２分間にわたって添加した。最後に、事前加熱されたＩＤＭＥＭ（１０６個のＢ細胞当たり８ｍＬ）を、３分間にわたって添加した。
【０２７９】
融合された細胞を、４００ｘｇで６分間、遠心機で沈降させ、１０６個のＢ細胞当たり２０ｍＬの選択培地（Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）、ＨＡ−アザセリンヒポキサンチンおよびＯＰＩ（オキザロ酢酸、ピルビン酸、ウシインスリン）（双方ともＳｉｇｍａより）、ならびにＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））に再懸濁させた。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、次いで２００ｍＬの選択培地に再懸濁させ、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養した。
【０２８０】
融合後３日目に、細胞を収集し、４００ｘｇで８分間、遠心機にかけ、１０６個の融合Ｂ細胞当たり１０ｍＬの選択培地に再懸濁させた。ハイブリドーマ集団のＦＡＣＳ分析を行い、その後細胞を凍結させた。
【０２８１】
ハイブリドーマを選択培地中で規定通りに増殖させた。潜在的に抗ヒトα５β１抗体を産生する、ハイブリドーマから収集した全ての上清を、後続のスクリーニング検定に供した。
【実施例３】
【０２８２】
抗体力価測定：３００．１９細胞の天然抗原結合
３００．１９細胞（Ａｍｇｅｎ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）についてＦＡＣＳ分析を行い、Ｂ３００．１９細胞上で発現されたα５β１に対する抗体の力価を測定した。３００．１９細胞（対照、およびヒトα５β１でトランスフェクトした）を５０，０００細胞／ウェルで播種し、９０μＬの試料上清（１：５０希釈で）で、４℃で１時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄し、５μｇ／ｍＬのＣｙ５共役ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および５μｇ／ｍＬの７−アミノ−アクチノマイシン（７ＡＡＤ）で、４℃で１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ分析を用いて、結合α５β１を検出した。陽性対照は、マウス抗α５β１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）であり、陰性対照には、示される通り、ヤギ抗ヒトおよび抗マウスＦｃ  Ｃｙ５結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のみ、さらに結合または無関係なマウスＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ２、無関係な上清が含まれた。最も高いＦＡＣＳ幾何平均蛍光を示す動物を、後続のハイブリドーマ生成のために選択した。表３は、３００．１９細胞の分析から得たＦＡＣＳデータを列挙する。
【表３】
2012513194.tif 000005
【０２８３】
細胞結合免疫原を受容した動物に由来する融合体のみをさらなるスクリーニングに進めた。
【実施例４】
【０２８４】
結合検定によるハイブリドーマ上清スクリーニング−ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞上で発現されたα５β１への結合
実施例１および２に記載される通りに得た、抗体を含有するハイブリドーマ上清を、固定化天然α５β１への結合を測定する検定によってスクリーニングした。採取された細胞から収集した上清を、分泌抗体のＨＥＫ  ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ１１２６８）細胞への結合を検定するために試験した。ＦＡＣＳ緩衝剤中の細胞を、４０μＬ／ウェルの容量の３８４ウェルＦＭＡＴプレートに、７５００細胞／ウェルの密度で播種した。次いで、１０μＬ／ウェルの上清を添加し、プレートを室温で約１．５時間インキュベートし、その後１０μＬ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、７５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度になるまで添加した。次いでプレートを４℃で１時間インキュベートし、ＦＭＡＴマクロ共焦点スキャナ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて蛍光を読み取った。３回の採取にわたって、合計１７９０個の抗原特異性ウェルを特定した。これらの的中の内訳は次の通りである；採取１−４５９個の天然結合ウェルを特定、採取２−８６０個の天然結合ウェルを特定、および採取３−４７１個の天然結合ウェルを特定。
【実施例５】
【０２８５】
抗体含有上清の相対的効力の決定：フィブロネクチンへのα５β１媒介型結合を阻害する能力
抗体がＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ２４３）のフィブロネクチンへの接着をどの程度ブロックするかによって、異なる抗体含有上清の相対的効力を検定した。プレートを、３〜５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンまたはＧＳＴ−フィブロネクチンタイプＩＩＩ領域９〜１０で一晩コーティングし、検定前に、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間、事前にブロッキングした。次いで細胞をペレット化し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、その後、細胞を次いでＨＢＳＳに１ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。最適な抗体を選択するために、細胞を、Ｖ底プレート中で、適切な抗体の存在中、４℃で６０分間インキュベートした。検定細胞の厳格度を高めるために、プレインキュベーションステップを除去し、結合親和性を高めるために、陽イオン条件を修正した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳを検定プレートから除去し、プレートをＰＢＳまたはＨＢＳＳで２回洗浄し、細胞−抗体混合物をコーティングされたプレートに移し、プレートを、１ｍＭまたは０．２ｍＭのいずれかのＭｎＣｌ２の存在中、３７℃で６０分間インキュベートした。次いでコーティングされたプレート上の細胞を、暖かいＨＢＳＳ中で４回洗浄し、それ以降、細胞を−８０℃で１時間凍結させた。細胞を室温で１時間解凍させ、次いで製造業者の指示に従って、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ染色／溶解緩衝剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、各ウェルに添加した。４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍ発光波長で、蛍光を読み取った。
【０２８６】
抗機能的抗体を特定するために、４分の１の上清希釈を用いて、完全長ＦＮでコーティングされたプレートへの添加前に、細胞上の抗体をプレインキュベーションして、ＭｎＣｌ２を１ｍＭ最終濃度で含み、２回の接着検定（表３のｎ＝１およびｎ＝２）を実行した。多くの中和抗体を特定し、これらのスクリーニングのために、接着の９０％阻害のカットオフを適用した。このデータに基づいて、合計１８８の上清をさらなるスクリーニングに進めた（採取１−１６Ａｂ；採取２−１１６Ａｂ；採取３−５６Ａｂ）。この群内で最適な抗体を特定するために、より高い親和性（または良好な会合速度）を備えた抗体を特定するよう試みるために細胞上のプレインキュベーションなしで、Ｋ５６２接着検定を３回目に実行した（表３、ｎ＝３）。上清を再び４分の１希釈で使用した。抗体および細胞（０．２ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する培地中）を、３μｇ／ｍＬのＧＳＴ−ＦＮＩＩＩ（９−１０）で一晩コーティングされたプレートに添加した。この検定で、ほとんどの抗体は、依然としてほぼ完全な阻害を示した。検定厳格度を高める試みで、ＧＳＴ−ＦＮＩＩＩ（９−１０）についてＫ５６２細胞（１ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する培地中）を用いて、より高希釈の上清で（１０分の１）、さらに２回の接着検定（表３、ｎ＝４およびｎ＝５）を実行した。この希釈で、抗体が、接着をブロックするそれらの能力において差異を有することが見出され、サブクローン化のための抗体のリードパネルの選択が可能となった。表４は、検定についての結果の要約を提供する。
【表４】
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【実施例６】
【０２８７】
α４β１インテグリンを超える機能的選択性のスクリーニング−抗体は、フィブロネクチンのＣＳ−１フラグメントへのＪ６細胞接着を阻害しない
抗体がα５またはα５β１に特異的である（かつβ１には結合しない）ことを裏付けるために、抗体をα４β依存性接着検定においてもスクリーニングした。このために、Ｊ６．７７ジャーカット細胞（Ａｍｇｅｎ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）の、フィブロネクチンのＣＳ−１フラグメントへの結合をブロックする、抗体の能力を試験した。プレートを、ＰＢＳ中の２．５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンのＧＳＴ−ＣＳ−１フラグメントで、４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロッキングした。次いで細胞をペレット化し、１％ＢＳＡ／ＨＢＳＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳに９ｘ１０５／ｍＬの濃度で再懸濁させた。細胞をＶ底プレートに分注し（１ウェル当たり３７．５μＬ）、１２．５μＬの上清またはＨＢＳＳの対照を各ウェルに添加し、次いで４℃で１時間インキュベートした。次いで検定プレートをＰＢＳで３回洗浄した。次いで細胞および抗体の混合物を検定プレートに移し、０．２ｍＭのＭｎＣｌ２の存在中、３７℃で４０分間インキュベートした。次いでコーティングされたプレート上の細胞を、暖かいＨＢＳＳ中で４回洗浄し、それ以降、細胞を−８０℃で１時間凍結させた。細胞を室温で１時間解凍させ、次いで製造業者の指示に従って、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ染色／溶解緩衝剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、各ウェルに添加した。４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍ発光波長で、蛍光を読み取った。この検定で、抗体の大部分は、ブロックをほとんどまたは全く示さず、それらの特異性が主にα５またはα５β１に対するものであることが示唆された（表５）。表５は、検定についての結果の要約を提供する。
【表５】
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【実施例７】
【０２８８】
α５β１への特異的結合−ＦＡＣＳによって分析されたとき、リード抗体は、Ａ５ヌルラインＨＴ２９に対する交差反応性を示さない
抗体がα５鎖にまたはα５β１ヘテロ二量体に結合することを裏付けるために、ＦＡＣＳによって、ヒト結腸小腸大腸癌グレードＩＩ細胞（ＨＴ２９細胞）への結合を検定した。ＨＴ２９（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−３８）細胞は、α５鎖を発現しないが、β１鎖を発現する。ＨＴ−２９細胞を、１％ＢＳＡおよび１ｍＭの最終ＭｎＣＬ２を備えたＨＢＳＳに６ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。１２．５μＬの一次抗体を、３７．５μＬの細胞に添加し、プレートを氷上で６０分間インキュベートした。上述の通り、様々な陰性対照を含めた（下に示される）。αｖβ６（Ｍａｂ２０７７、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に加えて、陽性対照抗体として、α５β１（Ｍａｂ１９０９、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびαｖ（Ｌ２３０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を含めた。１００μＬのＨＢＳＳ緩衝剤を添加して一次抗体を希釈し、細胞を１５００ｒｐｍで３分間の遠心分離によってペレット化し、５０μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃｙ５またはヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃｙ５二次抗体に２μｇ／ｍＬで再懸濁させた。次いでそれらを氷上でさらに７分間インキュベートし、１００μＬのＨＢＳＳ緩衝剤を添加して二次抗体を希釈した。最後に、細胞を１５００ｒｐｍで３分間の遠心分離によってペレット化し、ＨＢＳＳ緩衝剤／二次上清を除去し、添加した１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝剤中で２回洗浄し、細胞を再懸濁し、次いでＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ＨＴＳで読み取った。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて試料を分析した。データを表６で示し、抗体がα５β１に選択的であることを裏付けている。
【表６】
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【実施例８】
【０２８９】
リード抗体は、マカクα５β１に対する交差反応性を示さない
抗体がサルインテグリンに交差反応するかどうかを決定するために、精製マカクＴ細胞への結合を評価した。マカクＰＢＭＣを事前に全血液から精製し、凍結保管した。マカクＰＢＭＣを、１ｍＬ当たり４．８ｘ１０５個の生細胞の濃度で、１％ＢＳＡのＨＢＳＳおよび１ｍＭのＭｎ２＋を備えた接着緩衝剤（「ＦＡＣＳ緩衝剤」）に懸濁した。１２．５μＬの一次抗体を３７．５μＬの細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。示される通り、陽性および陰性対照を含めた。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝剤を添加して一次抗体を希釈し、細胞を洗浄し、２μｇ／ｍＬ（５０μＬ）の適切な二次抗体に１０μｇ／ｍＬの７ＡＡＤと共に再懸濁させ、氷上で７分間染色させた。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝剤を添加し、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤中で２回洗浄し、最後に上清を除去し、細胞を１００μＬの緩衝剤に再懸濁させた。
【０２９０】
試料をＨＴＳ  ＦＡＣＳ機械上で読み取り、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。表７に示すデータは、抗体がサルα５β１と交差反応することを裏付ける。
【表７】
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【実施例９】
【０２９１】
α５β１抗体の構造分析
ＤＮＡ配列を決定するために、抗体の可変重鎖および可変軽鎖の配列を読んだ。抗α５β１抗体についての完全配列情報を、各γ鎖およびκ鎖の組み合わせについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列と共に、配列表に提供する。重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡ配列を分析して、使用するＶＨ、Ｄ、ＪＨ、Ｖｋ、およびＪｋ遺伝子セグメントを決定した。次いで配列を翻訳して一次アミノ酸配列を決定し、生殖細胞系ＶＨ−Ｄ−ＪＨ配列またはＶｋ−Ｊｋ配列と比較してリード抗体配列の、生殖細胞系からの突然変異を評価した。
【０２９２】
表１２は、抗体重鎖領域を、それらの同族生殖細胞系重鎖領域と比較した表である。表１３は、抗体κ軽鎖領域を、それらの同族生殖細胞系軽鎖領域と比較した表である。
【０２９３】
免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）領域は、多発性生殖細胞系ＤＮＡセグメントによってコードされ、それはＢ細胞発生の間に、機能的可変領域（ＶＨＤＪＨまたはＶＫＪＫ）に結合される。α５β１に対する抗体反応の分子的および遺伝的多様性を詳細に研究した。
【０２９４】
特定の抗体が、アミノ酸レベルでそれぞれの生殖細胞系配列と異なる場合、親和性または効力を大幅に失うことなく、抗体配列を生殖細胞系配列に再び突然変異させることが可能であり得ることもまた理解されたい。生殖細胞系へのかかる逆突然変異が、抗体の親和性または効力に不都合な影響を及ぼさないとき、それらは、ヒト被験体における抗体の免疫原性のリスクを低減させる。かかる修正突然変異は、標準分子生物学的技術を用いて、１つ、２つ、もしくは３つ以上の位置で、または任意の突然変異された位置の組み合わせで起こすことができる。非限定的な例として、表１３は、ｍＡｂ３Ｃ２．２Ａ８（配列番号２０）の軽鎖配列が、ＦＲ２領域におけるＴｙｒからＰｈｅへの突然変異（突然変異１）、ＦＲ２領域におけるＧｌｎからＨｉｓへの突然変異（突然変異２）によって、対応する生殖細胞系配列（配列番号６２）と異なることを示す。したがって、ｍＡｂ３Ｃ２．２Ａ８の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列は、突然変異１の部位で生殖細胞系配列を産生するために、突然変異１を変化させるように修飾することができる。さらに、ｍＡｂ３Ｃ２．２Ａ８の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列は、突然変異２の部位で生殖細胞系配列を産生するために、突然変異２を変化させるように修飾することができる。またさらに、ｍＡｂ３Ｃ２．２Ａ８の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列は、それらの特定の部位で、生殖細胞系配列を産生するために、突然変異１および突然変異２の両方を変化させるように修飾することができる。下の表８〜１１は、ｍＡｂ３Ｃ５および５Ｂ１１についての生殖細胞系からの、かかる変形の位置を例示する。各行は、太字によって示される位置での生殖細胞系および非生殖細胞系残基の固有の組み合わせを表す。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【実施例１０】
【０２９５】
フィブロネクチンへのα５β１媒介型Ｋ５６３結合の、α５β１抗体阻害の効力（ＩＣ５０）決定
異なるクローン化された精製抗体の活性を裏付け、その相対的効力を決定するために、Ｋ５６２−フィブロネクチン接着検定の活性を決定した。プレートを、３〜５μｇ／ｍＬのＧＳＴ−フィブロネクチンタイプＩＩＩ領域９〜１０で一晩コーティングし、検定前に、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間、事前にブロッキングした。次いで細胞をペレット化し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、その後、細胞を次いでＨＢＳＳに１ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。最適な抗体を選択するために、細胞を、Ｖ底プレート中で、適切な抗体の存在中、４℃で６０分間インキュベートした。検定細胞の厳格度を高めるために、プレインキュベーションステップを除去した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳを検定プレートから除去し、プレートをＰＢＳまたはＨＢＳＳで２回洗浄し、細胞−抗体混合物をコーティングされたプレートに移し、プレートを１ｍＭのＭｎＣｌ２の存在中、３７℃で６０分間インキュベートした。次いでコーティングされたプレート上の細胞を、暖かいＨＢＳＳ中で４回洗浄し、それ以降、細胞を−８０℃で１時間凍結させた。細胞を室温で１時間解凍させ、次いで製造業者の指示に従って、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ染色／溶解緩衝剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、各ウェルに添加した。４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍ発光波長で、蛍光を読み取った。標準対照として、商用α５β１中和抗体ＩＩＡ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含めた。
【表１４】
2012513194.tif 000069
【実施例１１】
【０２９６】
クローン化された精製抗体は、α５インテグリンの選択的阻害を示すが、ｊ６細胞中のα４インテグリンの選択的阻害を示さない
抗体がα５またはα５β１に特異的である（かつβ１には結合しない）ことを裏付けるために、抗体をα４β依存性接着検定においてもスクリーニングした。このために、Ｊ６．７７ジャーカット細胞の、フィブロネクチンのＣＳ−１フラグメントへの結合をブロックする、抗体の能力を試験した。プレートを、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンのＧＳＴ−ＣＳ−１フラグメントで、４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロッキングした。次いで細胞をペレット化し、１％ＢＳＡ／ＨＢＳＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳに９ｘ１０５／ｍＬの濃度で再懸濁させた。細胞をＶ底プレートに分注し（１ウェル当たり３５ｕＬ）、抗体を、各ウェルに添加された３５μＬのＨＢＳＳ中、５μｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、次いで４℃で１時間インキュベートした。次いで検定プレートをＰＢＳで３回洗浄した。次いで細胞および抗体の混合物を検定プレートに移し、０．２ｍＭのＭｎＣｌ２の存在中、３７℃で４０分間インキュベートした。次いでコーティングされたプレート上の細胞を、暖かいＨＢＳＳ中で４回洗浄し、それ以降、細胞を−８０℃で１時間凍結させた。細胞を室温で１時間解凍させ、次いで製造業者の指示に従って、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ染色／溶解緩衝剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、各ウェルに添加した。４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍ発光波長で、蛍光を読み取った。この検定で、抗体の大部分は、ブロックをほとんどまたは全く示さず、それらの特異性が主にα５またはα５β１に対するものであることが示唆された。
【表１５】
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【実施例１２】
【０２９７】
リード抗体は、オステオポンチン（ＯＰＮ）およびビトロネクチン（ＶＮ）への、ＡＶＢ３およびＡＶＢ５媒介型接着を阻害しない
精製抗体が、ａｖインテグリンと交差反応しないまたはそれを阻害しないことを裏付けるために、ビトロネクチン（ＶＮ）およびオステオポンチン（ＯＰＮ）への、Ａ３７５Ｍ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６１９）接着をブロックする、クローンのより小さいサブセットの能力を評価した。プレートを、リン酸塩緩衝剤ｐＨ９．０中、１．２５μｇ／ｍＬの精製ヒトＶＮ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、または３１３ｎｇ／ｍＬのＧＳＴ  ＯＰＮａａ１７−１６８のいずれかで、４℃で一晩、コーティングした。次いで検定前に、プレートを洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間事前にブロッキングした。
【０２９８】
Ａ３７５Ｍ細胞を、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ（Ｈｅｐｅｓ改変）中で培養した。細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、ＨＢＳＳ中で３回洗浄し、次いでＨＢＳＳに適切な濃度（３５μＬのＨＢＳＳ中、３００００個の細胞）および３５μＬの２ｘ抗体で再懸濁させ、各抗体を５μｇ／ｍＬの最終濃度とした。細胞および抗体を４℃で４０分間共インキュベートした。次いで検定プレートをＨＢＳＳで３回洗浄し、細胞および抗体を検定プレートに移し、３７℃で４０分間インキュベートした。次いでプレートを暖かいＨＢＳＳ中で３回洗浄した。結合した細胞の数を決定するために、プレートを−８０℃で２０分間置き、室温で解凍させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ手順により、各ウェルに１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ染色／溶解緩衝剤を添加した。プレートの蛍光を、４８５ｎｍの励起および５３０の発光で読み取った。陽性対照として、商用ａｖインテグリン中性抗体Ｌ２３０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を含めた。まとめると、データは、これらの抗体が、ａｖｂ３およびａｖｂ５インテグリンよりも、α５β１インテグリンに特異的であることを裏付ける。
【表１６】
2012513194.tif 000071
【実施例１３】
【０２９９】
フィブロネクチンへの、ＨＵＶＥＣ細胞のα５β１媒介型接着の阻害
α５β１ブロック抗体がα５β１をブロックすることができるかどうかを決定するために、ＨＵＶＥＣに対する機能および接着検定を行った。黒色透明底プレートを、１ウェル当たり１００μＬのＧＳＴ融合タンパク質フィブロネクチンフラグメント９−１０で、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍＬで、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中、１％ＢＳＡでブロッキングした。１ウェル当たり２５０００個のＨＵＶＥＣ細胞を用いて、ＭＣＤＢ１３１培地中で接着検定を行った。ａｖインテグリン（それはフィブロネクチンにも結合する）をブロックするために、細胞をまた、１０ｕｇ／ｍＬのａｖインテグリンブロック抗体Ｌ２３０でもプレインキュベートした。細胞を３７℃で４５分間インキュベートし、非結合細胞を洗浄して取り除き、接着細胞を固着させ、Ｈｏｅｓｃｈｔで染色した。接着した細胞の数をＡｒｒａｙｓｃａｎ上で数えた。
【０３００】
図１のデータは、３Ｃ５および５Ｂ１１が、全てＨＵＶＥＣ細胞上のα５β１インテグリンの有効な阻害剤であることを示す。
【実施例１４】
【０３０１】
精製抗体の結合親和性の決定
α５β１に対する抗体の親和性を検定するために、ＦＡＣＳに基づいたＫＤ分析を用いた。抗体が組み換えインテグリンとよく相互作用しないため、典型的Ｂｉａｃｏｒｅ分析は意義がないと考えられる。α５β１を発現するＫ５６２細胞を、約２．５〜６百万細胞／ｍＬの濃度で、１ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＣａＣｌ２を含有するろ過されたＨＢＳ緩衝剤に再懸濁させた。細胞を氷上に保持した。ｍＡｂを、９６ウェルプレート中、１１ウェルにわたって連続希釈（２回）した。全てのｍＡｂを上述のＨＢＳ中で希釈した。さらなるＨＢＳおよび細胞を、最終容量が３００μＬ／ウェルとなり、各ウェルが約１４０，０００〜１５０，０００個の細胞を含有するように、各ウェルに添加した。各ｍＡｂについての最終分子濃度の範囲は、３Ｃ５：３．８ｎＭ〜７．５ｐＭ；５Ｂ１１：３．８ｎＭ〜７．３ｐＭであった。細胞をプレートシェーカー上で、４℃で５時間インキュベートし、次いで３回、遠心機にかけ／ＨＢＳで４℃で洗浄した。２５０μＬの９９ｎＭ  Ｃｙ５ヤギα−ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、番号１０９−１７５−００８）を各ウェルに添加し、振とうしながら４℃で４０分間インキュベートした。細胞を再び３回、遠心機にかけ／ＨＢＳで４℃で洗浄した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ＨＴＳフローサイトメトリー器具を用いて、７０００「イベント」の平均蛍光（Ｆ）を決定した。親和性を算出するために、データを、方程式：
【数１】
2012513194.tif 000072
【０３０２】
を用いて、Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ３．０ソフトウェアで、分子ｍＡｂ濃度の関数として平均蛍光のプロットに非線形でフィットさせた。
【０３０３】
この方程式において、Ｆ＝平均蛍光、ＬＴ＝総分子ｍＡｂ濃度、Ｐ’＝任意蛍光単位を結合ｍＡｂに関連付ける比例定数、Ｍ＝モル濃度単位の細胞濃度、ｎ＝１細胞当たり受容体数、Ｂ＝背景信号、およびＫＤ＝平衡解離定数である。各ｍＡｂ滴定曲線について、ＫＤの推定をＰ’、ｎ、Ｂ、として得、ＫＤを、非線形分析において自由に浮動させる（Ａ．Ｗ．  Ｄｒａｋｅ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．  Ｋｌａｋａｍｐ．Ａ  ｒｉｇｏｒｏｕｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００７，  Ｖｏｌ．  ３１８，  １５７−１６２．）。
【０３０４】
非線形フィット（緑色の線）での各プロットを下に示す。表は、フィットの９５％信頼区間と共に、親和性の減少する順に、各ｍＡｂについて得られたＫＤを列挙する。４パラメータモデルでの各滴定曲線ついての非線形フィットは、ＫＤについての妥当な９５％信頼区間を戻すことができた。これは、各曲線がある程度のＫＤ影響を有し、したがってＫＤについての戻り値が、化学量論的または部位結合解離定数のいずれかの許容される推定である可能性が最も高いことを暗示する。
【表１７】
2012513194.tif 000073
【実施例１５】
【０３０５】
３Ｃ５および５Ｂ１１は、内皮管形成のインビトロ共培養モデルにおいて血管新生を阻害する
α５β１インテグリンは、新生血管の形成を調節する役割を果たすと考えられる。抗体が内皮細胞機能を調節する潜在力を有するかどうかを理解するために、インビトロ共培養検定およびインビボ血管新生検定を用いて、抗体の、内皮細胞管形成に影響を及ぼす能力を評価した。
【０３０６】
インビトロ共培養検定：
内皮細胞を、単層または真皮線維芽細胞の支持細胞層上で培養し、１１日間の期間にわたって、内皮細胞管のネットワークが確立される。共培養キットをＴＣＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＵＫ）から購入し、製造業者の指示により行った。抗体を指示濃度で投薬し、培地を２〜３日毎に交換した。製造業者の指示により、管を、ＰＥＣＡＭ／ＣＤ３１に対する染色によって可視化し、ＫＳ４００上の神経突起成長アルゴリズムを用いて定量化した。
【実施例１６】
【０３０７】
精製抗体のインビボ有効性の決定：スフェロイドに基づいたインビボ血管新生検定に対する抗血管新生有効性の評価
抗体はマウスインテグリンと交差反応しないため、α５β１を標的とする抗体の、血管形成に及ぼす影響を、ヒト内皮細胞を播種したマトリゲルプラグにおいて評価した。このモデルで、ヒト内皮細胞は、機能的血管新生血管を形成し、抗体の治療的影響の研究を可能にする。１００個の内皮細胞（ＥＣ）を、プラスチック皿上に懸滴でピペッティングし、一晩スフェロイド形成させることによって、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）スフェロイドを以前記載された通り調製した（Ｋｏｒｆｆ  ａｎｄ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ：  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４３：  １３４１−５２，  １９９８）。翌日、以前記載された方法を用いて（Ａｌａｊａｔｉ  ｅｔ  ａｌ：  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：４３９−４４５，  ２００８）、ＥＣスフェロイドを採取し、マトリゲル／フィブリン溶液中で、スフェロイドとして１００，０００個のＥＣ、および１注入プラグ当たり２００，０００個の単一ＥＣの最終数に到達するまで単一ＨＵＶＥＣと混合した。ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦ−２を１０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）スフェロイド（１０００個のスフェロイド；１００細胞／スフェロイド）および懸濁液中のＨＵＶＥＣ（２００，０００個の細胞）を、ＶＥＧＦ−Ａ／ＦＧＦ−２（各々１０００ｎｇ／ｍＬ）を含有するマトリゲル／フィブリンマトリックスでＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下注射した。翌日（１日目）、処置を開始した。２１日目、研究を終了した。マトリックスプラグを除去し、４％ＰＦＡ中に固定した。全てのマトリックスプラグをパラフィン包埋し、組織学検査のために８〜１０μｍの厚さの薄片に切断した。血管を、ヒトＣＤ３４、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、および微小血管密度（ＭＶＤ）に対する染色によって可視化し、周皮細胞被覆を決定した。図３に例示するように、ＭＡｂ３Ｃ５は、インビボでの血管形成を阻害するのに有効である。
【実施例１７】
【０３０８】
３Ｃ５は、腫瘍細胞および宿主細胞の両方を標的とすることによって、Ｕ８７ＭＧおよびＡ５４９腫瘍の成長を阻害する
α５β１は、内皮細胞および腫瘍細胞を含む幾つかの異なる細胞タイプの機能を調節する役割を果たす。インビボ腫瘍細胞区画中の標的α５β１阻害の直接効果を調査するために、３Ｃ５がマウスインテグリンと交差反応しないという事実を利用し、増殖のヒト異種移植片に及ぼす影響を評価した。Ｕ８７−ＭＧおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を、それぞれ２．５ｘ１０６個の細胞のみ、および５０％マトリゲル中の１ｘ１０７個の細胞を、ヌード（ｎｕ／ｎｕ遺伝子型）マウスの後部脇腹に皮下注射することよって定着させた。腫瘍が定着したとき、２０ｍｇ／ｋｇを週２回腹腔内注射する投薬を開始した。
【０３０９】
宿主および腫瘍の両方において同時にα５β１を阻害する影響をモデル化するために、マウスα５鎖をヒトα５鎖で置換したＳＣＩＤマウスの株を繁殖させた。３Ｃ５の、ヒトａ５発現ＳＣＩＤ動物におけるＡ５４９の増殖に及ぼす影響を評価した。ヒトα５を発現するトランスジェニックマウスにＡ５４９腫瘍を移植し、２ｘ１０６個の細胞（マトリゲルなし）をＳＣＩＤ（α５β１  ｋｏ／ｋｉ／ＳＣＩＤ（ｈα５β１−ＳＣＩＤ））マウスの後部脇腹へ皮下注射することによって定着させた。腫瘍が定着したとき、２０ｍｇ／ｋｇを週２回腹腔内注射する投薬を開始した。
【０３１０】
データ（表１８）は、３Ｃ５が、腫瘍を標的とすることによって直接に、または宿主を標的とすることによって間接に、腫瘍増殖に影響を及ぼすことを示す。
【表１８】
2012513194.tif 000074
【実施例１８】
【０３１１】
ヒト患者における腫瘍細胞増殖の阻害
膵臓癌であると診断されたヒト癌患者の群を治療群に無作為化する。各患者群を、本明細書に記載されるα５β１に対する完全ヒトモノクローナル抗体の毎週の静脈内注射で治療する。各患者に、５ｍｇ／ｋｇ／週〜２０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲に及ぶ効果的な量の抗体を４〜８ヶ月間投薬する。対照群には、標準化学療法計画のみを付与する。
【０３１２】
治療計画中および後に周期的に、磁気共鳴画像装置（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。毎週の抗体治療を受容した患者が、抗体治療を受容しない患者と比較して、腫瘍サイズの優位な縮小、進行の時間遅延、または生存期間の延長を示すことが予想され得る。治療された一部の患者においては、腫瘍がもはや検出不可能であることが予想され得る。対照的に、対照群では、腫瘍サイズが増加または実質的に同一のままであることが予想され得る。
【実施例１９】
【０３１３】
ヒト患者における結腸癌の阻害
結腸癌であると診断されたヒト癌患者の群を治療群に無作為化する。各患者群を、本明細書に記載されるα５β１に対する完全ヒトモノクローナル抗体の週３回の静脈内注射で治療する。各患者に、５ｍｇ／ｋｇ／週〜２０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲に及ぶ効果的な量の抗体を４〜８ヶ月間投薬する。対照群には、標準化学療法計画のみを付与する。治療計画中および後に周期的に、磁気共鳴画像装置（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。週３回の抗体治療を受容した患者が、抗体治療を受容しない患者と比較して、腫瘍サイズの優位な縮小、進行の時間遅延、または生存期間の延長を示すことが予想され得る。治療された一部の患者においては、腫瘍がもはや検出不可能であることが予想され得る。対照的に、対照群では、腫瘍サイズが増加または実質的に同一のままであることが予想され得る。
【実施例２０】
【０３１４】
ヒト患者における黒色腫の阻害
黒色腫であると診断されたヒト癌患者の群を治療群に無作為化する。各患者群を、本明細書に記載されるα５β１に対する完全ヒトモノクローナル抗体の週３回の静脈内注射で治療する。各患者に、５ｍｇ／ｋｇ／週〜２０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲に及ぶ効果的な量の抗体を４〜８ヶ月間投薬する。対照群には、標準化学療法計画のみを付与する。治療計画中および後に周期的に、磁気共鳴画像装置（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。週３回の、α５β１に対する抗体での抗体治療を受容した患者が、抗体治療を受容しない患者と比較して、黒色腫の優位な縮小、進行の時間遅延、または生存期間の延長を示すことが予想され得る。治療された一部の患者においては、黒色腫病変がもはや検出不可能であることが予想され得る。対照的に、対照群では、黒色腫が増加または実質的に同一のままであることが予想され得る。
【実施例２１】
【０３１５】
ヒト患者における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の阻害
ＣＭＬであると診断されたヒト癌患者の群を治療群に無作為化する。各患者群を、本明細書に記載されるα５β１に対する完全ヒトモノクローナル抗体の週３回の静脈内注射で治療する。各患者に、５ｍｇ／ｋｇ／週〜２０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲に及ぶ効果的な量の抗体を４〜８ヶ月間投薬する。対照群には、標準化学療法計画のみを付与する。治療計画中および後に周期的に、磁気共鳴画像装置（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。週３回の抗体治療を受容した患者が、抗体治療を受容しない患者と比較して、ＣＭＬの優位な縮小、進行の時間遅延、または生存期間の延長を示すことが予想され得る。治療された一部の患者においては、ＣＭＬがもはや検出不可能であることが予想され得る。対照的に、対照群では、ＣＭＬが増加または実質的に同一のままであることが予想され得る。
【実施例２２】
【０３１６】
ヒト患者における腫瘍細胞増殖の阻害
ヒト患者は、悪性腫瘍であると診断される。この患者を、本明細書に記載されるα５β１に対する完全ヒトモノクローナル抗体の毎週の静脈内注射で８週間治療する。治療計画中および後に周期的に、磁気共鳴画像装置（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。腫瘍サイズの優位な縮小が見出されることが予想され得る。
【０３１７】
（生物学的材料の寄託）
２００９年１１月２６日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  （ＮＣＩＭＢ）  Ｌｔｄ．，  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，  Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，  Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  ＡＢ２１  ９ＹＡ，  ＵＫにおいて、ブダペスト条約の条件下で、３Ｃ５抗体軽鎖をコードするプラスミドを含有する、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０の寄託がなされ、アクセッション番号４１６６８を指定されている。
【０３１８】
同様に、２００９年１１月２６日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  （ＮＣＩＭＢ）  Ｌｔｄ．，  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，  Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，  Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  ＡＢ２１  ９ＹＡ，  ＵＫにおいて、ブダペスト条約の条件下で、３Ｃ５抗体重鎖をコードするプラスミドを含有する、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０の寄託がなされ、アクセッション番号４１６６９を指定されている。
【０３１９】
（等価物）
上述の明細書は、当業者が本発明を実践することを可能にするために十分であると考えられる。上述の説明および実施例はある種の好ましい本発明の実施形態を詳述し、発明者によって企図される最適な様式を説明する。しかしながら、上述が文章でどれほど詳述されているように見えようとも、本発明は多くの方法で実践されてもよく、本発明は添付の特許請求の範囲およびその任意の等価物に従って解釈されるべきであることは理解されよう。
【図１】
2012513194.tif 000075
【図２】
2012513194.tif 000076
【図３】
2012513194.tif 000077
【配列表】
2012513194000001.app
【国際調査報告】
2012513194.tif 000078
2012513194.tif 000079
2012513194.tif 000080