(57)【要約】  Ｐ−Ｓ−Ｒ結合を含む少なくとも１個のインターヌクレオチド結合と少なくとも２個のヌクレオシドとを有するオリゴヌクレオチドであって、Ｒが、式（Ｉ）【化１】2012513450.tif 000034（式中、Ａは、ジェミナル置換されたアルキレン基、好ましくはＣＨ２であり、ＸおよびＹは、ＳおよびＯから独立に選択され、Ｒ０は、場合により置換された炭素に結合した有機残基（特に、場合により置換されたアルキルまたはアリール等）、ＳＲｘ、ＯＲｘ、およびＮＲｘＲｙ（式中、Ｒｘおよび／またはＲｙは、Ｈおよび有機残基から選択され、少なくともＲｘはＨ以外の置換基である）からなる群から選択される）に相当する、オリゴヌクレオチド。本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチドの製造に有用な硫化剤およびその製造である。
2012513450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ−Ｓ−Ｒ結合を含む少なくとも１個のインターヌクレオチド結合と少なくとも２個のヌクレオシドとを有するオリゴヌクレオチドであって、Ｒが、式（Ｉ）
【化１】
2012513450.tif 000024
（式中、Ａは、ジェミナル置換されたアルキレン基、好ましくはＣＨ2であり、ＸおよびＹは、ＳおよびＯから独立に選択され、Ｒ0は、場合により置換された、炭素に結合した有機残基（特に、場合により置換されたアルキルまたはアリール等）、ＳＲｘ、ＯＲｘ、およびＮＲｘＲｙ（式中、Ｒｘおよび／またはＲｙは、Ｈおよび有機残基から選択され、少なくともＲｘはＨ以外の置換基である）からなる群から選択される）に相当する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
Ｒが、メチレンアシルオキシ基、メチレンカーボネート基、およびメチレンカルバメート基から選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
Ｒが、式−ＣＨ2−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ0（式中、Ｒ0は、飽和、不飽和、複素環式、または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である）に相当する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
Ｒが、式−ＣＨ2−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲｘＲｙ（式中、ＲxおよびＲｙは、アルキルまたは（ヘテロ）アリールから独立に選択され、好ましくは、ＲｘおよびＲｙがアルキルであるかまたはＲxおよびＲｙが一緒になってＯ、Ｎ、およびＳから選択されるさらなる環上ヘテロ原子を場合により含む３〜８員環を形成する）のメチレンカルバメート基に相当する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
Ｒが、式−ＣＨ2−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＯＲｘ（式中、Ｒｘは、場合により置換されたアルキル、シクロアルキルおよび（ヘテロ）アリール基から選択される）のメチレンカーボネート基に相当する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
Ｒxが、低級アルキルまたはシクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ７）、置換フェニルおよびナフチル基を含むフェニルから選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
２〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
リボヌクレオシド、２’−デオキシリボヌクレオシド、２’−置換リボヌクレオシド、２’−４’−ロックド−リボヌクレオシド、３’−アミノ−リボヌクレオシド、３’−アミノ−２’−デオキシリボヌクレオシドから選択されるヌクレオシドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
プロドラッグとしての、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１個のチオリン酸エステル結合を有する第２のオリゴヌクレオチドを生成させる方法であって、（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１のオリゴヌクレオチドを提供することと、（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドから少なくとも１個のＲ基を切断することによって少なくとも１個のホスホロチオエート結合を有する前記第２のオリゴヌクレオチドを生成させることとを含む、方法。
【請求項１１】
前記Ｒ基が、前記第１オリゴヌクレオチドを、好ましくはアルキル、シクロアルキル、および芳香族アミンから、より好ましくは第１級または第２級アルキルアミンから、最も好ましくはｎ−プロピルおよびｔｅｒｔ−ブチルアミンから選択される塩基と溶液中で反応させることによって切断される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩基が第１級ヒンダードアミンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記切断が、立体障害塩基および通常はＮ−複素芳香族塩基である活性化剤の存在下に実施される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の塩基が、アルキル基が直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ２０アルキルから選択される同一であるかまたは異なる置換基を有する第１級アルキルアミンである、請求項２４に記載の方法。前記第１の塩基が、アリール基が２および／または６位に直鎖または分岐のアルキルまたはアリール基を有する第１級アリールアミンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性化剤が、１，２，４−トリアゾールまたは他のトリアゾールおよびテトラゾール誘導体である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項１６】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを脱保護する方法であって、前記立体障害塩基がｔｅｒｔ−ブチルアミンである、方法。
【請求項１７】
少なくとも１個のチオリン酸エステル結合を有する前記第２のオリゴヌクレオチドを精製することをさらに含む、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のオリゴヌクレオチドを少なくとも沈殿させることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のオリゴヌクレオチドを溶媒で抽出することをさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のオリゴヌクレオチドを、好ましくは塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、アセトン、およびピリジンから選択される極性有機溶媒に溶解することを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
使用される溶媒の量が、約０．５（ｎ＋１）ｍＬ〜約２．０（ｎ＋１）ｍＬの範囲内にあり、好ましくは約１．０（ｎ＋１）ｍＬであり、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記溶液が、好ましくは炭化水素、エーテル溶媒、およびこれらの混合物から選択される非極性有機溶媒を用いて前記溶液が濁るまで処理される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
使用される溶媒の量が、約１（ｎ＋１）ｍＬ〜約４（ｎ＋１）ｍＬの範囲内にあり、好ましくは約２．０（ｎ＋１）ｍＬであり、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記濁った溶液が、沈殿剤で処理される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記沈殿剤が、好ましくはセライト、木炭、木材セルロース、およびシリカ、アルミナ等のクロマトグラフィー固定相から選択される不活性多孔質固体から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記沈殿剤が、約０．２５（ｎ＋１）ｇ〜約１．５（ｎ＋１）ｇの範囲内、好ましくは約０．７５（ｎ＋１）ｇの量で使用され、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記沈殿剤を添加した後、前記混合物が非極性有機溶媒の第２画分で処理され、前記画分の量が、通常は約１（ｎ＋１）ｍＬ〜約４（ｎ＋１）ｍＬの範囲内にあり、好ましくは約２．０（ｎ＋１）ｍＬであり、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記沈殿ステップにおいて得られた固体物質が、濾去および洗浄される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチド含有沈殿物から溶媒を用いて抽出される、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶媒が、好ましくはアセトニトリル、アセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯおよびピリジンから選択される極性有機溶媒と、好ましくは水である水性媒体との混合物を含み、極性有機溶媒／水性媒体の体積比が好ましくは約０．５〜約１．５、より好ましくは約０．７である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
好ましくは前記メチレンアシルオキシ基、前記メチレンカルバメート基、または前記メチレンカーボネート基から選択される前記Ｒ基が、人間の体内または動物の体内で切断される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３２】
式Ｒ”−Ｓ−Ｒ（式中、Ｒは、式（Ｉ）
【化２】
2012513450.tif 000025
（式中、Ａは、ジェミナル置換されたアルキレン基、好ましくはＣＨ2であり、ＸおよびＹは、ＳおよびＯから独立に選択され、Ｒ0は、場合により置換されたアルキルまたはアリール、ＳＲｘ、ＯＲｘ、およびＮＲｘＲｙ（式中、ＲｘおよびＲｙは、Ｈおよび有機残基から選択され、少なくともＲｘはＨ以外の置換基である）からなる群から選択される）に相当する）の硫化剤。
【請求項３３】
Ｒが、メチレンアシルオキシ基、メチレンカルバメート基、またはメチレンカーボネート基から選択され、Ｒ”は脱離基である、請求項３２に記載の硫化剤。
【請求項３４】
Ｒが、請求項１〜６のいずれか一項と同義である、請求項３２または３３に記載の硫化剤。
【請求項３５】
式（ＩＩ）
【化３】
2012513450.tif 000026
（式中、ＲAおよびＲBは、互いに同一であるかまたは異なっており、ＲAおよびＲBの少なくとも一方は、置換スルホニルまたはアシル基から選択され、前記ＲAおよびＲBは、場合により一緒になって環式置換基を形成している）に相当する、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の硫化剤。
【請求項３６】
Ｒ”が、スルホンアミド基、好ましくはＮ−置換−Ｎ−アルキルスルホニルである、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の硫化剤。
【請求項３７】
式（ＩＩＩ）
【化４】
2012513450.tif 000027
（式中、Ｒ1、Ｒ3、およびＲ4は、独立に、場合により不飽和または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基、好ましくは直鎖または分岐のアルキル基またはシクロアルキル基である）に相当する、請求項３６に記載の硫化剤。
【請求項３８】
Ｒ”がジカルボキシルアミドである、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の硫化剤。
【請求項３９】
式（ＩＶ）
【化５】
2012513450.tif 000028
（式中、Ｚは、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、
【化６】
2012513450.tif 000029
の群から選択される基であり、好ましくはＺは、
【化７】
2012513450.tif 000030
基である）に相当する、請求項３８に記載の硫化剤。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドの合成方法であって、前記オリゴヌクレオチドの前駆体の少なくとも１個のリンを含むインターヌクレオチド結合を硫化するために請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の硫化剤を用いることを含む、方法。
【請求項４１】
前記リンを含むインターヌクレオチド結合が、Ｈ−ホスホン酸ジエステル結合である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｈ−ホスホン酸モノエステル塩を、遊離ヒドロキシ基を有する保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと結合させることにより前記Ｈ−ホスホン酸ジエステル結合を形成することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記結合が、液相中で実施される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の硫化剤の合成方法であって、（ａ）ハロゲン化スルフリル、好ましくは塩化スルフリルを、式Ｒ−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか一項と同義であり、Ｒ2は、好ましくは場合により不飽和または芳香族であるＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基から選択される有機残基である）のチオアセタールと反応させることにより式Ｒ−Ｓ−Ｗ（式中、Ｗは、ハロゲン、好ましくはＣｌである）の中間体生成物を生成させることと、（ｂ）前記中間体生成物をＮ−スルホニル化合物またはＮ−アシル化合物と反応させることとを含む、方法。
【請求項４５】
前記チオアセタールが、式Ｒ1−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ2−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立に、場合により不飽和または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である）であり、前記チオアセタールが、塩化スルフリルと反応させることによって式Ｒ1−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ2−Ｓ−Ｃｌ（式中、Ｒ1は、独立に、場合により不飽和または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である）の中間体生成物を生成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）において、前記中間体が、式Ｒ3−Ｓ（Ｏ）2−ＮＨ−Ｒ4（式中、Ｒ3およびＲ4は、独立に有機残基、好ましくは、場合により不飽和または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である）のＮ−スルホニル化合物と反応される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｂ）において、前記中間体が、式
【化８】
2012513450.tif 000031
（式中、Ｚは、−ＣＨ2−ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、
【化９】
2012513450.tif 000032
の群から選択される基であり、好ましくは、Ｚは、
【化１０】
2012513450.tif 000033
基である）のＮ−アシル化合物と反応される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４８】
Ｒ1が、低級アルキルまたはシクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ７）、置換フェニルおよびナフチル基を含むフェニル基から選択され、より好ましくはエチル基である、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、低級アルキルまたはシクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ７）、置換フェニルおよびナフチル基を含むフェニル基から選択され、より好ましくはメチル基である、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１４０３９１号明細書の利益を主張するものであり、その全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【０００２】
本発明は、ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド、新規な硫化剤を用いたその調製、上記硫化剤、およびその調製に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドは様々な疾患（幾つか例を挙げると、癌、ウイルス感染、炎症性疾患等）の治療に幅広い可能性を持つバイオ医薬品に分類される。治療学におけるオリゴヌクレオチドを発展させる重要な手法には、特に、代謝抵抗性や化学的安定性を付与すると共に、生体内における作用部位への運搬を改善するためにオリゴマー骨格を修飾することが含まれる。修飾された骨格の化学的種類としては、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２０８、ｐｐ．３〜２６、２００２年参照）、ロックド核酸（ＬＮＡ）（ペテルセン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）およびベンゲル（Ｗｅｎｇｅｌ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１（２）、ｐｐ．７４〜８１、２００３年参照）、ホスホロチオエート（エクスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、１０（２）、ｐｐ．１１７〜２１、２０００年参照）、メチルホスホネート（チビヤナサン（Ｔｈｉｖｉｙａｎａｔｈａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１（３）、ｐｐ．８２７〜３８、２００２年参照）、ホスホロアミデート（グリャーズノフ（Ｇｒｙａｚｎｏｖ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４８９（１）、ｐｐ．１３１〜４０、１９９９年；プルーザン（Ｐｒｕｚａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３０（２）、ｐｐ．５５９〜６８、２００２年参照）、チオホスホロアミデート（グリャーズノフら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｈｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２０（４〜７）、ｐｐ．４０１〜１０、２００１年；ハーバート（Ｈｅｒｂｅｒｔ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１（４）、ｐｐ．６３８〜４２、２００２年参照）が挙げられる。ホスホロチオエートの形成は、Ｐ＝ＯをＰ＝Ｓ部分で置換することによってオリゴヌクレオチドに核酸分解耐性が付与される一方で、ほとんどの場合は天然のオリゴマーの生物学的特性は維持されることから、最も有用な修飾に属する。
【０００４】
ホスホロチオエートは酸化的硫化（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ）によって形成することができる（オリゴヌクレオチド合成、方法、および応用（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐ・ハーダウイジン（Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ）、分子生物学の手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２８８巻、第４章、ｐｐ．５１〜６３）。ホスホロチオエートの作製には、この反応に使用される亜リン酸エステルの性質および期待される生成物に応じて基本的に２種類の手法がある。そのうちの１つは、例えば、元素状硫黄、ジベンゾイルテトラスルフィド、３−Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬としても周知（アイヤー（Ｉｙｅｒ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５５、ｐｐ．４６９３〜４６９９（１９９０））、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、ジメチルチウラムジスルフィド（ＤＴＤ）、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、およびビス（Ｏ，Ｏ−ジイソプロポキシホスフィノチオイル）ジスルフィド（ステック試薬（Ｓｔｅｃ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）として周知を用いることによって無置換の硫黄原子をリンに導入することを含む。これらの反応のほとんどは、ホスホロアミダイト法により固体支持体上でオリゴヌクレオチドを自動合成する際に用いられ、オリゴマー伸長反応の際に形成される亜リン酸トリエステルを酸化的硫化することが含まれる。
【０００５】
ホスホロチオエートオリゴマーを作製するための第２の手法は、Ｈ−ホスホネート法と一緒に用いられ、これは、脂肪族または芳香族置換基を有する硫黄原子をリンに転移させる、Ｈ−ホスホン酸ジエステルと硫黄転移試薬（ｓｕｌｆｕｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒｅａｇｅｎｔ）との反応を含むものである。硫黄上の補助的な置換基は合成操作中に保護基の役割を果たし、通常は、オリゴヌクレオチド調製の最終段階で切断される。この方法は溶液中におけるオリゴヌクレオチド合成に特に適している。
【０００６】
無置換の硫黄原子を亜リン酸エステルに導入するために利用可能な試薬の選択肢が幅広いこととは対照的に、保護された硫黄でＨ−ホスホン酸エステルを硫化することが可能な基の範囲は限られている（例えば、ドリーフ（Ｄｒｅｅｆ）ら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、ｐｐ．４８１〜４８３、１９９０年、米国特許第６，５０６，８９４号明細書）。実際、各ステップでクロマトグラフィー精製を用いたオリゴヌクレオチドの液相合成におけるこの反応にはシアノエチルスルフィド基のみが幅広く使用されている。オリゴヌクレオチドの液相合成の重大な問題点は、基質の高い転化率を達成しながら、各合成ステップにおける精製の簡素化を促す（特にクロマトグラフィーを回避する）形態にある生成物を高純度で与える極めて優れた特異性を得ることが求められていることに関連している。経済的な液相合成を可能にする方法が存在しないことを考えると、現時点において液相技法は商業規模のオリゴヌクレオチド合成に用いられないようである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ここで本発明は、新規な硫化剤、その製造方法、ならびに経済的かつ簡便な、特に溶液中におけるホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドの合成および精製におけるその使用を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の開示
本発明は、特に、添付の特許請求の範囲に記載する発明に関する。本発明はまた、本明細書、特に実施例に実質的に記載する方法および試薬にも関する。
【０００９】
本発明は、Ｐ−Ｓ結合を形成する既存の方法と比較して、特にオリゴヌクレオチドの合成（好ましくはＨ−ホスホネート法を介して実施される）に関し多くの利点を有する。例えば、この新規な試薬を用いて例えばオリゴヌクレオチドに転移される残基Ｒは、オリゴヌクレオチドの晶析または沈殿を促進することができ、クロマトグラフィーを最小限にするかまたは一切用いることなく生成物を簡便に精製することを可能にする。この方法により作製された２個〜少なくとも１６個のヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチドは、必要とされるオリゴヌクレオチドを最終的に脱保護し終えるまでクロマトグラフィーで精製する必要がないことが判明した。この中間体であるオリゴマーは、所望に応じて５’および３’位を場合により脱保護し、さらにこの脱保護された粗生成物をより重合度の高いオリゴヌクレオチドに結合させるのに十分な純度で得ることができる。他の利点においては、クロマトグラフィーを用いない簡便な精製の効率を最大限にすることに関し改質された性質を有するオリゴヌクレオチドを形成するために使用することができる様々な硫化剤が本開示方法により得られる。本発明による方法のさらなる他の利点は、例えば硫黄を保護するアシルオキシメチレン基ＲＣ（Ｏ）−ＯＣＨ2の簡便な切断を、温和な条件下で、例えば第１級または第２級またはヒンダードアミン、例えばｎ−プロピルアミンまたはｔｅｒｔ−ブチルアミンを用いて容易に達成できることにある。アミンを用いた任意的な処理を行うと、硫黄−メチレン基等の自発的な切断が起こり、したがって、完全な（ｃｌｅａｎ）Ｐ＝Ｓ結合の形成が可能になる。この切断生成物は溶媒または水で洗浄することによって生成物から容易に除去することができる。例えばアシルオキシメチレン基は例えば塩基性非求核条件下において安定性を有するので、合成経路に沿った選択的脱保護反応を行うことが可能になり、したがって、例えば核酸塩基保護基の切断を阻止することによって、合成スキームの柔軟性がより高くなる。
【００１０】
オリゴヌクレオチドを特に溶液中で合成する経済的なプロセスを開発するための重要な要素は、オリゴヌクレオチド鎖伸長の各ステップにおける変換生成物の純度である。例え本発明による方法が高い収率および純度を確保しても、各伸長サイクルは通常３回のステップを含むので、そのままでは途中で蓄積されてしまうであろう不純物を少量でさえも除去することは有利である。ステップの回数が多いことから、各ステップでクロマトグラフィーを用いることは実際の大規模なオリゴヌクレオチド合成においては経済的に実現不可能であろう。したがって、本発明者らはまた、鎖伸長プロセス中に形成されるオリゴヌクレオチドを精製するためのクロマトグラフィーを用いない方法論も開示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の具体的な第１の目的は、Ｐ−Ｓ−Ｒ結合を含む少なくとも１個のインターヌクレオチド結合と少なくとも２個のヌクレオシドとを含むオリゴヌクレオチドであって、Ｒが、式（Ｉ）
【化１】
2012513450.tif 000003
（式中、Ａは、ジェミナル置換されたアルキレン基、好ましくはＣＨ2であり、ＸおよびＹは、ＳおよびＯから独立に選択され、Ｒ0は、場合により置換された、炭素に結合した有機残基（特に、場合により置換されたアルキルまたはアリール等）、ＳＲｘ、ＯＲｘ、およびＮＲｘＲｙ（式中、ＲｘおよびＲｙは、Ｈおよび有機残基から選択され、少なくともＲｘはＨ以外の置換基である）からなる群から選択される）に相当する、オリゴヌクレオチドを提供することにある。
【００１２】
本発明によるオリゴヌクレオチドは溶解性に関し有利な性質を有しており、したがって、例えば沈殿および抽出技法を併用することにより効率的な精製を効果的に達成することができる、Ｐ−硫化オリゴヌクレオチド合成の有益な合成中間体であることが判明した。本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、人体または動物の体内でＲ基を切断することによって生体内でホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを放出することができるプロドラッグとしても有効であると考えられている。
【００１３】
本発明の範囲における「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に核酸塩基に結合した糖単位を含むヌクレオシドモノマー単位のオリゴマーを指し、上記ヌクレオシドモノマー単位はインターヌクレオチド結合によって結合している。「インターヌクレオチド結合」とは、特に、天然の核酸中に典型的に存在するホスホジエステル結合または合成核酸および核酸類縁体中に典型的に存在する他の結合等の、２個のヌクレオシド部分の間の化学結合を指す。このようなインターヌクレオチド結合は、例えばリン酸または亜リン酸基を含んでいてもよく、このリン酸または亜リン酸基の１個またはそれ以上の酸素原子が置換基で修飾されているかまたは他の原子（例えば、硫黄原子またはモノ−もしくはジアルキルアミノ基の窒素原子）に置き換えられているかのいずれかである結合を含んでいてもよい。典型的なインターヌクレオチド結合は、リン酸のジエステルまたはその誘導体、例えば、リン酸エステル、チオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、ホスホロアミデート、チオホスホロアミデートである。
【００１４】
「ヌクレオシド」という用語は、特に、糖に結合した核酸塩基からなる化合物を指すと理解される。糖としては、これらに限定されるものではないが、リボース、２’−デオキシリボース等のフラノース環およびシクロヘキセニル、アンヒドロヘキシトール、モルホリノ等の非フラノース環（ｎｏｎ−ｆｕｒａｎｏｓｅ  ｒｉｎｇ）が挙げられる。以下に示すヌクレオシド中の糖の修飾、置換、および位置はフラノース環を参照して議論するものであるが、同一の修飾および位置が他の糖環の類似の位置にも適用される。糖はさらに修飾されていてもよい。糖の非限定的な修飾の例として、特に、例えば２’または３’位、特にフラノシル糖環の２’位の修飾（例えば、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ等）、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモ等）、２’−４’−および３’−４’−に結合したフラノシル糖環の修飾、フラノシル糖環内の修飾（例えば、環４’−ＯのＳ、ＣＨ2、ＮＲ、ＣＨＦ、またはＣＦ2による置換等）等を挙げることができる。
【００１５】
「核酸塩基」という用語は、特に相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログと対合することができる、特に窒素を含有する複素環式部分を指すと理解される。典型的な核酸塩基は、天然の核酸塩基（プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）等）ならびに他の合成および天然核酸塩基等の修飾された核酸塩基（５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、ならびにフッ素化された塩基等）である。さらなる修飾された核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）等の三環性ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）等のＧ−クランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐ）が挙げられる。他に可能性のある好適な塩基としては、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、非特異的塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｂａｓｅ）、および伸長された（ｓｉｚｅ−ｅｘｐａｎｄｅｄ）塩基が挙げられる。
【００１６】
「オリゴヌクレオチド」は、典型的には、約２〜約５０個の連続したサブユニットを有するヌクレオシドサブユニットポリマーを指す。ヌクレオシドサブユニットは、様々なサブユニット間結合によって結合することができる。さらに、「オリゴヌクレオチド」には、当業者に周知の、糖骨格（例えば、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート）、糖（例えば、２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ等の２’置換）、塩基、ならびに３’および５’末端の修飾が包含される。典型的には、本発明におけるオリゴヌクレオチドは、２〜３０個のヌクレオチドを含む。本発明の異なる実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシド、２’−デオキシリボヌクレオシド、２’−置換リボヌクレオシド、２’−４’−ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）−リボヌクレオシド、３’−アミノ−リボヌクレオシド、３’−アミノ−２’−デオキシリボヌクレオシドから選択されるヌクレオシドを含む。
【００１７】
本発明の一部のオリゴヌクレオチドにおいては、Ｒは、メチレンアシルオキシ基、メチレンカーボネート基、およびメチレンカルバメート基から選択される。
【００１８】
Ｒがメチレンアシルオキシ基である場合、これは、好ましくは、式−ＣＨ2−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ0（式中、Ｒ0は、飽和、不飽和、複素環式、または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である）に相当する。Ｒ0が飽和炭化水素残基である場合は、好ましくは直鎖、分岐、または環式アルキル残基から選択される。Ｒ0は、例えば、低級アルキルまたはシクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ７）残基から選択してもよい。具体的な飽和炭化水素残基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ．ブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルから選択される。メチル、エチル、またはｎ−プロピル基が好ましい。その中でもエチル基が特に好ましい。Ｒ0が芳香族残基である場合は、６〜１４個の炭素原子を有する芳香族系から適切に選択される。具体的な芳香族残基は、例えば、アリールもしくはヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、複素環、またはヘテロ置換基（ハロゲン、アミン、エーテル、カルボキシレート、ニトロ、チオール、スルホン酸、スルホン等）で置換されていてもよい、フェニルおよびナフチル基から選択される。フェニル基が好ましい。Ｒ0が複素環式残基の場合は、環上の炭素原子を介してカルボニル基に結合している、少なくとも１個の環上Ｎ、Ｏ、またはＳ原子を含む複素環から選択される場合が多い。この種の複素環式残基の具体的な例としては、ピリジンおよびフランが挙げられる。
【００１９】
特定の態様においては、オリゴヌクレオチドは、Ｐ−Ｓ−Ｒ結合を含む少なくとも２個のインターヌクレオチド結合と少なくとも３個のヌクレオチドとを有し、Ｒは本明細書に記載したメチレンアシルオキシ基である。
【００２０】
Ｒがメチレンカルバメート基である場合は、好ましくは、式−ＣＨ2−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲｘＲｙ（式中、ＲｘおよびＲｙは、アルキルまたは（ヘテロ）アリールから独立に選択される）に相当する。好ましくは、Ｒｘおよび／またはＲｙはアルキル基である。この場合、Ｒｘおよび／またはＲｙは、例えば、低級アルキルまたはシクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ７）残基から選択してもよい。具体的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルから選択される。メチル、エチル、またはｎ−プロピル基が好ましい。特定の好ましい態様においては、メチレンカルバメート基中のＲｘおよびＲｙは、両方共アルキル基であり、特に本明細書において上述したものである。その中でもＮ，Ｎ−ジメチルまたはＮ，Ｎ−ジエチル基が特に好ましい。本実施形態の他の態様においては、ＲｘおよびＲｙは、一緒になって、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるさらなる環上ヘテロ原子を場合により含む３〜８員環を形成する。具体例としては、Ｎ−ピペリジルまたはＮ−ピロリジル基が挙げられる。
【００２１】
Ｒがメチレンカーボネート基である場合は、好ましくは、式−ＣＨ2−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＯＲｘ（式中、Ｒｘは、場合により置換されたアルキル、シクロアルキル、および（ヘテロ）アリール基から選択される）に相当する。好ましくは、Ｒｘはアルキル基である。この場合、Ｒｘは、例えば、低級アルキルまたはシクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ７）残基から選択してもよい。具体的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルから選択される。メチル、エチル、またはｎ−プロピル基が好ましい。その中でもエチル基が特に好ましい。Ｒｘがアリール基である場合、６〜１４個の炭素原子を有する芳香族系から適切に選択される。具体的な芳香族残基は、フェニルおよびナフチル基から選択される。フェニル基が好ましい。Ｒｘが複素環式残基である場合、環上炭素原子を介してオキシカルボニル基に結合している、少なくとも１個の環上Ｎ、Ｏ、またはＳ原子を含む複素環から選択される場合が多い。この種の複素環式残基の具体例としては、ピリジンおよびフランが挙げられる。
【００２２】
Ｒがメチレンアシルオキシ基、メチレンカーボネート基、およびメチレンカルバメート基から選択される場合に本明細書において上に示した置換基Ｒｘ、Ｒｙ、およびＲ0の定義および優先順位は、式（Ｉ）中のＸおよび／またはＹが硫黄である場合に対応するチオ類似体にも同様に適用されると理解される。上述した置換基は、例えばハロゲンまたはアルコキシ置換基で場合により置換されていてもよいし、あるいはこれらが例えば懸垂ヘテロ原子（ｃａｔｅｎａｒｙ  ｈｅｔｅｒｏａｔｏｍ）、特に酸素をアルキル鎖中に含むことによって修飾されていてもよいことも理解される。
【００２３】
本発明の具体的な第２の目的は、式Ｒ”−Ｓ−Ｒ（式中、Ｒは、本発明によるオリゴヌクレオチドに関し上記と同義であり、Ｒ”は脱離基である）の硫化剤に関する。
【００２４】
本発明による硫化剤により、特に効率的な硫黄転移、特にオリゴヌクレオチド中においてＳ−保護されたホスホロチオエート型インターヌクレオチド結合を形成することが可能になることが見出された。本発明による硫化剤は、そこから保護基を選択的かつ効率的に切断することができる保護された硫黄を導入する。
【００２５】
本発明による硫化剤において、脱離基Ｒ”は、通常は求電子基である。多くの場合、Ｒ”は、硫黄に結合した求電子性窒素原子を含む基である。求電子性窒素原子は、少なくとも１個の電子引き抜き基で適切に置換されている。
【００２６】
本発明の硫化剤の特定の実施形態においては、硫化剤は、式（ＩＩ）
【化２】
2012513450.tif 000004
（式中、ＲAおよびＲBは、互いに同一であるかまたは異なっており、ＲAおよびＲBのうちの少なくとも１つは置換されたスルホニルまたはアシル基から選択され、上記ＲAおよびＲBは、場合により一緒になって環式置換基を形成する）に相当する。
【００２７】
ＲAおよびＲBの少なくとも一方（好ましくは一方）が置換されたスルホニルである場合、通常は、アルキルおよびアリールスルホニル基から選択される。ＲAおよびＲBの少なくとも一方がアルキルスルホニル基である（好ましい）場合、その中のアルキル置換基は、好ましくは低級アルキルまたはシクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ７）残基から選択される。具体的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルから選択される。メチル、エチル、またはｎ−プロピル基が好ましい。その中でもメチル基が特に好ましい。ＲAおよびＲBの少なくとも一方がアリールスルホニル基である場合、その中のアリール置換基は、例えば、場合により置換されたフェニル基である。ＲAおよびＲBの少なくとも一方（好ましくは両方）がアシル基である場合は、通常は、アルキルおよびアリールアシル基から選択される。ＲAおよびＲBの少なくとも一方がアルキルアシル基である（好ましい）場合、その中のアルキル置換基は、好ましくは低級アルキルまたはシクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ７）残基から選択される。具体的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルから選択される。メチル、エチル、またはｎ−プロピル基が好ましい。メチル基がその中でも特に好ましい。特に好ましい実施形態においては、ＲAおよびＲBは、一緒になって環式置換基、好ましくは４〜７員環を形成するアシル基である。
【００２８】
特定の実施形態においては、硫化剤は、式（ＩＩＩ）
【化３】
2012513450.tif 000005
（式中、Ｒ1、Ｒ3、およびＲ4は、独立に、場合により不飽和または芳香族であるＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基、好ましくは直鎖または分岐のアルキル基またはシクロアルキル基である）に相当する。
【００２９】
本発明によるさらなる特定の硫化剤の実施形態においては、Ｒ”はジカルボキシルアミドである。本実施形態の特定の態様においては、硫化剤は、式（ＩＶ）
【化４】
2012513450.tif 000006
（式中、Ｚは、
−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、
【化５】
2012513450.tif 000007
から選択される基であり、好ましくは、Ｚは
【化６】
2012513450.tif 000008
基である）に相当する。
【００３０】
本発明の具体的な第３の目的は、本発明による硫化剤の合成方法であって、（ａ）ハロゲン化スルフリル、好ましくは塩化スルフリルを、式Ｒ−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2（式中、Ｒは、上記と同義であり、Ｒ2は、有機残基（好ましくは、場合により不飽和または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基から選択される）である）のチオアセタールと反応させることにより式Ｒ−Ｓ−Ｗ（式中、Ｗは、ハロゲン、好ましくはＣｌである）の中間体生成物を生成させることと、（ｂ）上記中間体生成物をＮ−スルホニル化合物またはＮ−アシル化合物と反応させることとを含む、方法に関する。本発明のより具体的な実施形態においては、チオアセタールは、式Ｒ1−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ2−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立に、場合により不飽和または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である）であり、上記チオアセタールは、塩化スルフリルと反応させることによって、式Ｒ1−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ2−Ｓ−Ｃｌ（式中、Ｒ1は、独立に、場合により不飽和または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である）の中間体生成物を生成する。本発明の他の特定の実施形態においては、ステップ（ｂ）において、中間体は、式Ｒ3−Ｓ（Ｏ）2−ＮＨ−Ｒ4（式中、Ｒ3およびＲ4は、独立に、有機残基、好ましくは、場合により不飽和または芳香族のＣ１〜Ｃ２０炭化水素残基である）のＮ−スルホニル化合物と反応される。
【００３１】
本発明による硫化剤の合成方法において、ステップ（ａ）の反応は、通常、非プロトン性極性有機溶媒、例えばハロゲン系炭化水素溶媒等、特に塩化メチレン等の塩素系炭化水素溶媒中で行われる。
【００３２】
本発明による硫化剤の合成方法において、ステップ（ａ）の反応は、通常、−８０℃〜３０℃の温度で行われる。
【００３３】
本発明による硫化剤の合成方法において、ステップ（ｂ）の反応は、通常、非プロトン性極性有機溶媒、例えばハロゲン系炭化水素溶媒等、特に塩化メチレン等の塩素系炭化水素溶媒中で行われる。
【００３４】
本発明による硫化剤の合成方法において、ステップ（ｂ）は、通常は−２０℃〜５０℃、好ましくは０℃〜３０℃の温度で行われる。
【００３５】
本発明の具体的な第４の目的は、本発明による硫化剤を用いてオリゴヌクレオチドを製造する方法に関する。
【００３６】
通常、本発明による方法は、少なくとも（ａ）ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドから選択される２個の反応体の間にリンを含むインターヌクレオチド結合を形成する結合ステップと、（ｂ）本発明による硫化剤を用いて上記リンを含むインターヌクレオチド結合を硫化する硫化ステップとを含む。ステップ（ａ）および（ｂ）は、硫化されたオリゴヌクレオチドの３’または５’位を脱保護した後に繰り返してもよい。
【００３７】
上記製造方法のステップ（ａ）は、好ましくは、Ｈ−ホスホン酸モノエステル塩を、遊離ヒドロキシ基を有する保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと結合させることによってＨ−ホスホン酸ジエステル結合を形成することを含む。結合は、好ましくは液相で実施される。
【００３８】
ステップ（ａ）は、好ましくは、非プロトン性極性有機溶媒、例えばハロゲン系溶媒または窒素含有溶媒、より詳細にはＮ−複素環式溶媒または塩素系炭化水素、よりさらに詳細にはアセトニトリルおよびピリジン、好ましくはピリジン中で行われる。Ｈ−ホスホン酸ジエステルを形成する反応は、好ましくは、カルボン酸ハロゲン化物、特に塩化ピバロイルによって活性化される。
【００３９】
ステップ（ａ）は、通常、−４０℃〜３０℃、好ましくは０℃〜２０℃の温度で行われる。
【００４０】
本発明による方法のステップ（ａ）およびその具体的な実施形態においては、液体反応媒体は、通常、反応媒体の総質量に対し少なくとも２０質量％のＨ−ホスホネートオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、この含有量は少なくとも２０質量％である。液体反応媒体は、通常、Ｈ−ホスホネートオリゴヌクレオチドを反応媒体の総質量に対し最大で５０質量％含む。
【００４１】
ステップ（ａ）の結合生成物、特にＨ−ホスホン酸エステルは、ステップ（ｂ）において単離して硫化してもよい。また、これは、好ましくは単離を行うことなくステップ（ｂ）で使用してもよい。形成されたジエステルの硫化は、硫化剤を適切な溶媒に適切に溶解してその場で添加するかまたは形成されたジエステルを反応混合物から予備精製した後に実施してもよい。
【００４２】
ステップ（ｂ）は、好ましくは非プロトン性極性有機溶媒、例えば、ハロゲン系炭化水素溶媒、特に塩化メチレン等の塩素系炭化水素溶媒を含む溶媒中で実施される。特定の態様においては、ステップ（ｂ）は、ハロゲン系炭化水素溶媒および窒素含有溶媒、より詳細にはＮ−複素環式溶媒、好ましくはピリジンを含む溶媒混合物中で行われる。特に、ステップ（ａ）の結合生成物を単離することなく硫化する場合は、ピリジン／塩化メチレン混合物がその中でも特に好ましい。
【００４３】
ステップ（ｂ）は、通常、−４０℃〜３０℃、好ましくは０℃〜２０℃の温度で行われる。
【００４４】
ステップ（ｂ）において、硫化すべきインターヌクレオチド結合の量に対する硫化剤のモル比は、通常は少なくとも１であり、多くの場合は１．５〜４．０、好ましくは２．０〜３．０である。
【００４５】
ステップ（ｂ）において、中間体であるＨ−ホスホン酸ジエステルは、好ましくは活性化剤、特に塩基により活性化される。好適な塩基としては、アルキルアミン、特に第３級アルキルアミンが挙げられ、ジイソプロピルエチルアミンが好ましい。
【００４６】
第５の態様において、本発明は、本明細書において上述した少なくとも１個のＰ−Ｓ−Ｒ結合を有する本発明によるオリゴヌクレオチドを精製する方法に関する。本態様の一実施形態においては、この方法は、少なくとも第２のオリゴヌクレオチドを沈殿させることを含む。より具体的な実施形態においては、この方法は、第２のオリゴヌクレオチドを、特に沈殿ステップから回収した固体物質から、溶媒を用いて抽出することをさらに含む。抽出に好適な溶媒としては、極性有機溶媒が挙げられる。
【００４７】
この精製は、上述の方法に従い得られた保護されたオリゴヌクレオチドに沈殿および抽出技法を併用することにより効果的に達成することができることが見出された。正確な沈殿条件は、オリゴヌクレオチドの所与の配列および長さにより決定することができる。沈殿方法は、通常は、（ａ）オリゴヌクレオチドを極性有機溶媒に溶解することと、（ｂ）溶液が濁るまで非極性有機溶媒を加えることとを含む。
【００４８】
本発明によるオリゴヌクレオチドを、通常は沈殿させることによって単離および精製できることが見出された。
【００４９】
ステップ（ａ）においてオリゴヌクレオチドの溶解に使用される溶媒は、好ましくは塩化メチレンやクロロホルム等のハロゲン系炭化水素、アセトニトリルやピリジン等の窒素含有溶媒、およびアセトン等のカルボニル含有溶媒から選択される。
【００５０】
通常、ステップ（ａ）において使用される溶媒の量は、約０．５（ｎ＋１）ｍＬ〜約２．０（ｎ＋１）ｍＬの範囲にある。好ましくは、約１．０（ｎ＋１）ｍＬであり、ｎはホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である。
【００５１】
第２のオリゴヌクレオチドの溶液は、好ましくは、炭化水素、例えばヘキサン等のアルカン溶媒、エーテル溶媒、特にＭＴＢＥ、およびその混合物（好ましくは、ヘキサン／ＭＴＢＥ混合物）から選択される非極性有機溶媒で溶液が濁るまで処理される。他の特定の実施形態においては、濁った溶液は、次いで沈殿剤で処理される。
【００５２】
この場合、沈殿剤は、通常は不活性多孔質固体から選択され、好ましくは、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）、木炭、木材セルロース、およびシリカやアルミナ等のクロマトグラフィー固定相である。
【００５３】
この場合、沈殿剤は、通常は約０．２５（ｎ＋１）ｇ〜約１．５（ｎ＋１）ｇの範囲内の量、好ましくは約０．７５（ｎ＋１）ｇが使用され、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である。
【００５４】
好ましくは、沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｉｄ）を加えた後の混合物を、本明細書において上述した非極性有機溶媒の第２の画分で処理する。上記画分の量は、通常は、約１（ｎ＋１）ｍＬ〜約４（ｎ＋１）ｍＬの範囲、好ましくは、約２．０（ｎ＋１）ｍＬであり、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である。
【００５５】
沈殿後、特に沈殿剤を使用した場合は、得られた混合物を通常は固／液分離操作、好ましくは濾過等に付す。オリゴヌクレオチドは、通常、固／液分離操作から回収された固体から、特に沈殿剤から、好ましくはアセトン等のカルボニル型溶媒、アセトニトリル等の窒素含有溶媒、および塩化メチレンやクロロホルム等のハロゲン系炭化水素から選択される極性有機溶媒を用いて抽出することにより回収される。
【００５６】
上の沈殿処理から得られたオリゴヌクレオチドは、有機溶媒および水で分液することによりさらに精製してもよい。一般に、このステップは、水層に溶解する極性不純物を生成物から分離するものである。この実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、有機溶媒、特に、アセトニトリル、ＤＭＦ等のホルムアミド、およびピリジン等のＮ−複素環から選択される窒素含有溶媒、アセトン等のカルボニル型溶媒、またはＴＨＦ、またはＤＭＳＯ等の極性有機溶媒に適切に溶解される。
【００５７】
使用される有機溶媒の量は、通常は２．０（ｎ＋１）ｍＬ〜８．０（ｎ＋１）ｍＬの範囲内、好ましくは約４．０（ｎ＋１）ｍＬであり、ｎは、ホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である。溶液は、水性媒体、特に水で処理される。使用される水性媒体の量は、通常は有機溶媒の約０．５体積当量〜有機溶媒の約１．５体積当量、普通は有機溶媒の約０．７体積当量である。水性媒体で処理した後は、通常はオリゴヌクレオチド含有層を分離し、適切であれば、精製されたオリゴヌクレオチドを得るためにさらに処理してもよい。
【００５８】
本発明の具体的な第６の目的は、少なくとも１個のホスホチオエート基を有する第２のオリゴヌクレオチドを生成させる方法であって、（ａ）本発明による第１のオリゴヌクレオチドを提供することと、（ｂ）少なくとも１個のＲ基を上記第１のオリゴヌクレオチドから切断することによって少なくとも１個のチオリン酸エステル結合を有する上記第２のオリゴヌクレオチドを生成させることとを含む、方法に関する。本発明の特定の幾つかの実施形態においては、Ｒ基は、第１のオリゴヌクレオチドを、溶液中で、塩基（好ましくは、アルキル、シクロアルキル、および芳香族アミンから、より好ましくは、第１級、例えば第１級アルキルアミン（ここでアルキル基は、好ましくはＣ１〜Ｃ８直鎖もしくは分岐のアルキルから選択される同一または異なる置換基を有する）または第２級アルキルアミンから、最も好ましくは、ｎ−プロピルおよびｔｅｒｔ−ブチルアミンから選択される）と反応させることによって切断され、好ましくは、塩基は第１級ヒンダードアミンである。
【００５９】
特定の実施形態においては、本発明の第６の態様による切断は、立体障害塩基および活性化剤、通常はＮ−複素芳香族塩基の存在下に行われる。好ましくは、活性化剤は、１，２，４−トリアゾールまたは他のトリアゾールおよびテトラゾール誘導体であり、より好ましくは、この種の活性化剤は、立体障害塩基、特にｔｅｒｔ−ブチルアミンと一緒に使用される。
【００６０】
Ｓ−メチレン−エステル、−カーボネート、または−カルバメート基の脱保護は、例えば、保護されたヌクレオチドを、立体障害塩基（例えばｔ−ブチルアミン等）を用いて処理することによって達成してもよい。このような嵩高いアミンは、核酸塩基、特にカルボニル酸素が保護されているものとは反応しないので特に選択的である。実際、こうすることにより、起こり得る核酸塩基部分との副反応を制限するかまたは実質的に回避することが可能になる。立体障害アミンの、例えばＳ−メチレンプロパノエートとの標準的な条件下における反応性を改善するために、活性化剤を適切に添加してもよいことが見出された。好適な活性化剤の例としては、例えば、ジアゾール、トリアゾール、およびこれらの誘導体等のＮ−複素環式塩基が挙げられる。この実施形態により、特に完全（ｃｌｅａｎ）かつ高速かつ効率的な脱保護反応が可能になる。
【００６１】
本発明の一部の実施形態においては、脱保護法は、アニリンのアリール基の２および／または６位に直鎖または分岐のアルキルまたはアリール置換基を含む、例えば、２，６−ジメチルアニリンや２，６−ジエチルアニリン等の置換アニリンを塩基として用いることを含む。
【００６２】
第６の態様による脱保護は、好ましくは、非プロトン性極性有機溶媒、例えば窒素含有溶媒、より詳細にはＮ−複素環式溶媒、好ましくはピリジンを含む溶媒中で行われる。
【００６３】
第６の態様による脱保護は、通常は−１０℃〜５０℃、好ましくは０℃〜３０℃の温度で行われる。
【００６４】
本発明の第６の態様およびその特定の実施形態において、液体反応媒体は、通常は、第１のオリゴヌクレオチドを反応媒体の総質量に対し少なくとも２０質量％含む。好ましくは、この含有量は少なくとも５０％質量である。
【００６５】
本発明の第６の態様において、使用される塩基の量は、通常は５ｎ  ｍｍｏｌ〜１５ｎ  ｍｍｏｌの範囲、好ましくは約１０ｎ  ｍｍｏｌであり、ｎはホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である。
【００６６】
本発明の第６の態様において活性化剤が使用される場合、使用される活性化剤の量は、通常は０．５ｎ  ｍｍｏｌ〜３ｎ  ｍｍｏｌの範囲にあり、好ましくは１．５ｎ  ｍｍｏｌであり、ｎはホスホロチオエートトリエステル結合のミリモル数である。
【００６７】
以下の実施例は本発明を例示することを意図するものであって、その範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６８】
これらの実施例中および本明細書全体を通して用いる略語を以下のように定義する：
ＣＨ2Ｃｌ2は、ジクロロメタン、ＫＩはヨウ化カリウム、Ｎａ2Ｓ2Ｏ3はチオ硫酸ナトリウム、ＤＭＥはジメトキシエタン、ＤＩＰＥＡはジイソプロピルエチルアミン、ＮａＣｌは塩化ナトリウム、ＭＴＢＥはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ＥｔＯＡｃは酢酸エチル、ＨＣｌは塩酸、Ｎａ2ＳＯ4は硫酸ナトリウム、Ｎ2は二窒素（ｄｉｎｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂｒ2は臭素、ＳＯ2Ｃｌ2は塩化チオニル、ＮａＨＣＯ3は炭酸水素ナトリウム、ＣＤＣｌ3は重水素化クロロホルム、ＴＨＦはテトラヒドロフラン、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【００６９】
Ａｐ、Ｇｐ、Ｔｐは、上述のＡ、Ｇ、およびＴ核酸塩基にそれぞれ結合した、上述の２−デオキシリボース核酸塩基であり、Ａ、Ｇ、およびＴは、以下のように保護されている：
Ａｐは、ＡがＮ−（プリン−６−イル）ベンズアミドである２−デオキシリボース核酸塩基であり、Ｇｐは、ＧがＮ−（６−（２，５−ジクロロフェノキシ）−プリン−２−イル）イソブチルアミドである２−デオキシリボース核酸塩基であり、Ｔｐは、Ｔが５−メチル−４−フェノキシピリミジン−２−オンである核酸塩基である。
【００７０】
Ａｐ（Ｓ）、Ｇｐ（Ｓ）、およびＴｐ（Ｓ）は、それぞれ上述のＡｐ、Ｇｐ、およびＴｐの対応する４’Ｏ−Ｐ−チオメチルプロピオネートである。Ａｐ（Ｈ）、Ｇｐ（Ｈ）、およびＴｐ（Ｈ）は、それぞれ上述のＡｐ、Ｇｐ、およびＴｐの対応する４’Ｏ−Ｐ−Ｈホスホネートである。
【００７１】
ＤＭＴｒは、当業者に周知のビスパラ−メトキシトリチル保護基であり、上述の対応するオリゴヌクレオチドに結合している場合はその５−Ｏ’位に結合している。Ｌｅｖは、当業者に当業者に周知のペンタン１，４−ジオン保護基であり、上述の対応するオリゴヌクレオチドに結合している場合はその３−Ｏ’に結合している。
【００７２】
本発明の記載に使用される略語の慣例を以下の図においてさらに例示する。
【化７】
2012513450.tif 000009
【００７３】
実施例１：ビスクロロメチルジスルフィドの合成
【化８】
2012513450.tif 000010
１．０Ｌの丸底フラスコに無水ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）およびジメチルジスルフィド（２７．１ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）を加えた。Ｎ2雰囲気中、混合物を撹拌して−７８℃に冷却し、撹拌した混合物中にＣｌ2ガスをゆっくりとバブリングした。混合物が黄緑色のスラリーに変化したらＣｌ2ガスの添加を停止した。冷浴を取り除いて混合物を自発的に室温まで温めた。ＨＣｌガスが発生して溶液から放散されるに従い赤色溶液が形成された。この混合物にまず最初にＮ2を１５分間バブリングし、次いで回転蒸発によって揮発性のＣＨ2Ｃｌ2を除去した。残渣に新鮮なＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍＬ）を加えた。溶液を氷水浴中で撹拌した。ＫＩ（１３９．４ｇ、８４０ｍｍｏｌ）の水（２００ｍＬ）中水溶液を１５分間かけてゆっくりと加えた。冷浴を取り除き、混合物を室温で２時間撹拌した。有機層を分離し、氷水浴中で撹拌し、Ｎａ2Ｓ2Ｏ3飽和水溶液をＩ2の色が消失するまでゆっくりと加えた。有機層を分離した後、水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥した後、濃縮することにより、生成物（４２．２ｇ）を赤色油として得た。収率：（８７．３％）。この粗生成物をさらに精製することなく次のステップに用いた。
【００７４】
実施例２：ビス（プロピオニルオキシメチル）ジスルフィドの合成
【化９】
2012513450.tif 000011
１．０Ｌの丸底フラスコにヨウ化ナトリウム（１．５０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、ビスクロロメチルジスルフィド（１６．２ｇ、１００ｍｍｏｌ）、および無水ＤＭＥ（１５０ｍＬ）を加えた。室温で２０分間撹拌した後、混合物を氷水浴で冷却し、次いでＤＩＰＥＡ（４２．０ｍＬ、２４０ｍｍｏｌ）、次いでプロピオン酸（１６．４ｍＬ、２２０ｍｍｏｌ）を加えた。冷浴を取り除いて混合物を室温で１８時間撹拌した。溶媒の大部分を回転蒸発により除去した。残渣に酢酸エチル（４００ｍＬ）を加えた後、混合物を水（１５０ｍＬ×２）、次いで食塩水（８０ｍＬ）で洗浄した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製することによって所望の生成物（９．６２ｇ）を橙色油として得た。収率：（４０．４％）。
【００７５】
実施例３：Ｎ−メチルメタンスルホンアミドの合成
【化１０】
2012513450.tif 000012
メチルアミン水溶液（水中、４０％、１５２ｍＬ、１．７５ｍｏｌ）を氷水浴中で撹拌しながらメタンスルホニルクロリド（３８．７ｍＬ、５００ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下した。滴下中は内部温度を２０〜２４℃に維持した。滴下後、冷浴を取り除いて混合物を室温で一夜撹拌した。ＮａＣｌ（４０ｇ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ、１００ｍＬ×２）で抽出した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を蒸発させることにより所望の生成物（４８．７ｇ）を無色油として得た。収率：８９．２％。
【００７６】
実施例４：Ｎ−メチル−Ｎ−プロピオニルオキシメチルスルファニルメタンスルホンアミドの合成
【化１１】
2012513450.tif 000013
１００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにＮ−メチルメタンスルホンアミド（１．０９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．６６ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）、ビス（プロピオニルオキシメチル）ジスルフィド（１．２ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、および無水ＣＨ2Ｃｌ2（８ｍＬ）を加えた。Ｎ2中、混合物を室温で撹拌し、Ｂｒ2（０．８８２ｇ、５．５２ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2４ｍＬ中溶液を３０分間で加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。ＭＴＢＥ（１５ｍＬ）を加え、得られた混合物を濾過した。固体をＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）およびＭＴＢＥ（５ｍＬ）の混合物で洗浄した。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製することにより所望の生成物（１．６２ｇ）を無色油として得た。収率：７１．３％。
【００７７】
実施例５：クロロメチルプロピオネートの合成
【化１２】
2012513450.tif 000014
５００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにパラホルムアルデヒド（９０．１ｇ、３０００．０ｍｍｏｌ）、無水塩化亜鉛（８．１８ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）を加えた。この瓶を氷水浴に入れ、塩化プロピオニル（２６０．６ｍＬ、３０００．０ｍｍｏｌ）を１時間かけてゆっくりと加えた。添加後、混合物をＮ2中５０℃で１８時間撹拌した。混合物を蒸留することにより所望の生成物２１２．２ｇを無色油として得た。収率：５８％。
【００７８】
実施例６：プロピオン酸アセチルスルファニルメチルエステルの合成
【化１３】
2012513450.tif 000015
メカニカルスターラー、滴下漏斗、およびＮ2導入口を備えた２０００ｍＬの乾燥した三ツ口丸底フラスコに、クロロプロピオン酸メチル（１６８．０ｇ、１３７０．９ｍｍｏｌ）、無水ＣＨ2Ｃｌ2（１０００ｍＬ）、およびジイソプロピルエチルアミン（１９４．９ｇ、１５０８．０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を氷水浴で冷却して撹拌しながらチオ酢酸（９８．０ｍＬ、１３７０．９ｍｍｏｌ）を３０分間かけてゆっくりと加えた。添加後、混合物を撹拌し、室温までゆっくりと加温し、室温で一夜撹拌した。大部分のＣＨ2Ｃｌ2を回転蒸発させた。この混合物に、酢酸エチル（５００ｍＬ）およびＭＴＢＥ（５００ｍＬ）の混合物を加えた。混合物を濾過し、固体を酢酸エチル（１００ｍＬ）およびＭＴＢＥ（１００ｍＬ）の混合物で洗浄した。濾液を濃縮し、残渣を蒸留することにより所望の生成物（１６９．８ｇ）を黄色油として得た。収率：７６．４％。
【００７９】
実施例７：Ｎ−メチル−Ｎ−プロピオニルオキシメチルスルファニルメタンスルホンアミドの合成
【化１４】
2012513450.tif 000016
１０００ｍＬの乾燥した丸底フラスコに、プロピオン酸アセチルスルファニルメチルエステル（７０．０ｇ、４３１．５ｍｍｏｌ）、無水ＣＨ2Ｃｌ2（６００ｍＬ）を加えた。Ｎ2中、この溶液を氷水浴中で撹拌し、塩化スルフリル（３４．６ｍＬ、４３１．５ｍｍｏｌ）を加えた。添加後、冷浴を取り除いて混合物を室温で１．５時間撹拌した。混合物を回転蒸発することにより揮発性物質をすべて除去した。残渣を無水ＣＨ2Ｃｌ2８０ｍＬに溶解し、溶液Ａを得た。
【００８０】
別の１０００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにＮ−メチルメタンスルホンアミド（４９．５ｇ、４５３．１ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブ（４Å、活性化、５．０ｇ）、および無水ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）を加えた。Ｎ2中、溶液を氷水浴中で撹拌し、無水ピリジン（４１．９ｍＬ、５１７．８ｍｍｏｌ）を加えた。添加後、上の溶液Ａを１５分間かけてゆっくりと加えた。次いで、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌し、ヘキサン（２００ｍＬ）をゆっくりと加え、得られた混合物を室温で１０分間撹拌した。混合物を濾過し、固体を酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（８０ｍＬ）混合物で洗浄した。濾液を濃縮し、残渣を、シリカ８００ｇを用いたカラムでヘキサン（２Ｌ）から開始し、次いで酢酸エチル／ヘキサン（１：９、３Ｌ）、酢酸エチル／ヘキサン（２：８、４Ｌ）、および酢酸エチル／ヘキサン（３：７、２Ｌ）で順次溶出させることによって精製した。主要な不純物は酢酸エチル２０％で溶出し、生成物は酢酸エチル３０％で溶出する。収率：７４．４％。
【００８１】
実施例８：Ｎ−メタンスルホンアミドコハク酸イミドの合成
【化１５】
2012513450.tif 000017
マグネチックスターラー、熱電対、窒素ライン、および冷却用氷浴を備えた２５０ｍＬの三ツ口丸底フラスコに、アセチルスルファニルメチル９．８０３ｇ（６０．４３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン８０ｍＬ中溶液を装入した。フラスコの内容物を約０℃に冷却し、合計１１．３３ｇ（８３．９４ｍｍｏｌ、１．３８ｅｑ．）の二塩化スルフリルを、温度を０〜５℃に維持する速度でゆっくりと溶液に加えた。冷却浴を取り除き、反応混合物を室温でさらに１．５時間撹拌した。得られた黄色溶液をロータバップ（ｒｏｔａｖａｐ）で濃縮することにより粗精製アセチルメチルスルフェニルクロリド８．８８ｇを悪臭のある黄色の粘性油として得た。この物質を、コハク酸イミドをスルフェニル化するための次のステップに即座に使用した。
【００８２】
マグネチックスターラー、熱電対、窒素ライン、および冷却用氷浴を備えた２５０ｍＬの三ツ口丸底フラスコに、コハク酸イミド６．１２ｇ（６１．７６ｍｍｏｌ、１．０２ｅｑ．）およびトリエチルアミン８．１７ｇ（８０．７３ｍｍｏｌ、１．３３ｅｑ．）の無水ジクロロメタン８０ｍＬ中の混合物を装入した。この混合物を０℃に冷却し、粗精製アセチルメチルスルフェニルクロリド（８．８８ｇ）の無水ジクロロメタン２０ｍＬ中溶液を、予め冷却しておいたコハク酸イミドおよびトリエチルアミンの懸濁液に温度を０℃〜５℃の間に維持する速度でゆっくりと加えた。添加完了後、冷却浴を取り除き、得られた褐色懸濁液を室温でさらに２時間撹拌した。冷水（３００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ3（１００ｍＬ）を用いて反応混合物の反応を停止し、ジクロロメタン（３×８０ｍＬ）で抽出した。有機相を合一してＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータバップで濃縮することにより暗色の粘性油１３ｇを得た。この物質をシリカゲルカラム（１２０ｇ）でＥｔＯＡｃ−ヘキサン混合物（酢酸エチル０〜３０％）を溶出液として用いて精製した。スルフェンアミドＮ−メタンスルホンアミドコハク酸イミド４．１２ｇを白色固体として得た。Ｒｆ＝０．１６、３０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン中、収率：３２％。
【００８３】
実施例９：エチルアセチルスルファニルメチルカーボネートの合成
【化１６】
2012513450.tif 000018
１００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにクロロギ酸クロロメチル（１２．９ｇ、１００．０ｍｍｏｌ）、無水アセトニトリル（３００ｍＬ）を加える。溶液を氷水浴中で撹拌し、無水エタノール（４．６ｇ、１００．０ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（２３．７ｇ、３００ｍｍｏｌ）の混合物を２０分間かけてゆっくりと加える。添加後、混合物を室温で１時間撹拌する。ヨウ化ナトリウム（１．５０ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に加える。混合物を氷水浴中で撹拌し、チオ酢酸（７．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）を５分間かけて加える。添加後、冷浴を取り除き、混合物を室温で一夜撹拌する。ヘキサン（６００ｍＬ）を反応混合物に加えて濾過する。濾液を濃縮し、蒸留することによって所望の生成物を得る。
【００８４】
実施例１０：Ｎ−メチル−Ｎ−エトキシカルボニルオキシメチルスルファニルメタンスルホンアミドの合成
【化１７】
2012513450.tif 000019
５００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにエチルアセチルスルファニルメチルカーボネート（８．９ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）、無水ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）を加える。Ｎ2中、溶液を氷水浴中で撹拌し、塩化スルフリル（４．０ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）を加える。添加後、冷浴を取り除き、混合物を室温で１．５時間撹拌する。混合物を回転蒸発させて揮発性物質をすべて除去する。残渣を無水ＣＨ2Ｃｌ2５０ｍＬに溶解することにより溶液Ａを得る。
【００８５】
別の５００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにＮ−メチルメタンスルホンアミド（６．０ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブ（４Å、活性化、３．０ｇ）、および無水ＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ）を加える。Ｎ2中、混合物を氷水浴中で撹拌し、無水ピリジン（５．３ｍＬ、６５．０ｍｍｏｌ）を加える。添加後、上の溶液Ａを１０分間かけてゆっくりと加える。次いで、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌する。ヘキサン（２００ｍＬ）をゆっくりと加え、得られた混合物を室温で１０分間撹拌する。混合物を濾過し、固体を酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（６０ｍＬ）混合物で洗浄する。濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムで精製することにより所望の生成物を得る。
【００８６】
実施例１１：アセチルスルファニルメチルジメチルカルバメートの合成
【化１８】
2012513450.tif 000020
１００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにクロロギ酸クロロメチル（１２．９ｇ、１００．０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミン塩酸塩（８．１５ｇ、１００ｍｍｏｌ）、および無水アセトニトリル（ａｃｅｔｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）（３００ｍＬ）を加える。混合物を氷水浴中で撹拌し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４３．５ｍＬ、２５０ｍｍｏｌ）を３０分間かけてゆっくりと加える。添加後、混合物を室温で１時間撹拌する。ヨウ化ナトリウム（１．５０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に加える。混合物を氷水浴中で撹拌し、チオ酢酸（７．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）を５分間かけて加える。添加後、冷浴を取り除き、混合物を室温で一夜撹拌する。ヘキサン（３００ｍＬ）を反応混合物に加えて濾過する。濾液を濃縮し、蒸留することによって所望の生成物を得る。
【００８７】
実施例１２：Ｎ−メチル−Ｎ−ジメチルカルバモイルオキシメチルスルファニルメタンスルホンアミドの合成
【化１９】
2012513450.tif 000021
５００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにエチルアセチルスルファニルメチルジメチルカルバメート（８．９ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）、無水ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）を加える。Ｎ2中、溶液を氷水浴中で撹拌し、塩化スルフリル（４．０ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）を加える。添加後、冷浴を取り除き、混合物を室温で１．５時間撹拌する。混合物を回転蒸発させることにより揮発性物質をすべて除去する。残渣を無水ＣＨ2Ｃｌ2５０ｍＬに溶解し、溶液Ａを得る。
【００８８】
別の５００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにＮ−メチルメタンスルホンアミド（６．０ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブ（４Å、活性化、３．０ｇ）、および無水ＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ）を加える。Ｎ2中、混合物を氷水浴中で撹拌し、無水ピリジン（５．３ｍＬ、６５．０ｍｍｏｌ）を加える。添加後、上の溶液Ａを１０分間かけてゆっくりと加える。次いで、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌する。ヘキサン（１００ｍＬ）をゆっくりと加えて得られた混合物を室温で１０分間撹拌する。混合物を濾過し、固体を酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（６０ｍＬ）で洗浄する。濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムで精製することにより所望の生成物を得る。
【００８９】
実施例１３：中間体であるＨ−ホスホン酸エステルを単離する完全に保護されたジヌクレオチドホスホロチオエートの合成
【化２０】
2012513450.tif 000022
実施例１３−１：Ｈ−ホスホン酸エステル１を１．８６ｇ（２．６２ｍｍｏｌ、１．１５ｅｑ．）および３’−保護デオキシチミジン２を０．７８ｇ（２．２８ｍｍｏｌ）の混合物を無水ピリジン（３×２５ｍＬ）と一緒に共蒸発させた。油状の残渣を無水ピリジン１０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気中約０℃に冷却した。合計０．５６ｇ（４．６６ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）の塩化ピバロイルをシリンジで滴下し、得られた混合物を室温まで加温した。反応物をさらに１５分間撹拌した後、氷５０ｇおよび希釈した飽和ＮａＨＣＯ3（水８０ｍＬおよび炭酸水素ナトリウム２０ｍＬ）１００ｍＬで反応を停止した。有機物をジクロロメタン（２×８０ｍＬ）で抽出し、抽出液を冷水（７０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（３０ｍＬ）、および食塩水（１０ｍＬ）の混合物で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータバップで濃縮することにより粗生成物３を６．７４ｇを透明油として得た。31Ｐ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：８．５８（ｓ）および７．０６（ｓ）。
【００９０】
Ｈ−ホスホン酸エステル３（６．７４ｇ）の粗生成物の無水ピリジン２０ｍＬ中溶液をアルゴン雰囲気中約０℃に冷却した。合計１．２１ｇ（５．４３ｍｍｏｌ、２．３ｅｑ．）の試薬４を反応物に滴下し、５分後、ジイソプロピルエチルアミン０．５０２ｇ（３．８８ｍｍｏｌ、１．７ｅｑ．）もフラスコに加えた。反応物を室温まで加温し、さらに１時間撹拌した後、希釈された炭酸水素ナトリウムの冷溶液（１００ｍＬ）で反応を停止した。有機生成物をジクロロメタン（２×８０ｍＬ）で抽出し、水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機相をロータバップで濃縮し、粗生成物５を５．０２ｇ（ＨＰＬＣによる純度：約９０％）を黄色油として得た。31Ｐ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，δ）：２６．７７（ｓ），２６．６７（ｓ）。
【００９１】
実施例１３−２：方法Ａ(実施例１３−１)と同様にして、無水ピリジン２０ｍＬ中の塩化ピバロイル０．４９ｇ（４．０６ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）の存在下に、Ｈ−ホスホン酸エステル１（１．４９ｇ，２．１ｍｍｏｌ、１．０８ｅｑ．）を３’−保護デオキシチミジン２（０．６６ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）と反応させることにより、中間体であるＨ−ホスホン酸エステル３を得た。反応混合物を冷水／ＮａＨＣＯ3水／食塩水で反応停止した後、中間体３をジクロロメタン（３×３０ｍＬ）で抽出することにより単離した。有機抽出液を水（５０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ3水（２０ｍＬ）、および食塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥（約１分間）した後、有機相を元の量の約１／４まで濃縮し、０℃に冷却し、Ｓ転移試薬４（０．９６ｇ、４．３ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ．）を３に加えた後、ジイソプロピルエチルアミン（０．４５ｇ、３．４８ｍｍｏｌ、１．８ｅｑ．）を加えた。室温でさらに１時間撹拌した後、方法Ａに記載したように反応を停止した。有機相をロータバップで濃縮することによりＨＰＬＣ純度が９１％である粗生成物５を３．５５ｇを透明な黄色油として得た。
【００９２】
実施例１４：ＤＭＴｒ−Ａｐ（ｓ）Ｔ−Ｌｅｖの調製
６−Ｎ−（ベンゾイル（ｂｅｚｏｙｌ））−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン−３’Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（４．９４ｇ、６．０ｍｍｏｌ）および３’−Ｏ−レブリニルチミジン（１．７０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の混合物をピリジンと一緒に蒸発させることによって無水物にし、無水ピリジン（１２．５ｍＬ）で希釈し、Ｎ2中、０℃で撹拌した。次いで、塩化ピバロイル（１．２４ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を２分間かけてゆっくりと加えた。反応混合物を０℃で５分間撹拌し、塩化メチレン（１００ｍＬ）および１．２５Ｎ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（２×１００ｍＬ）で分液した。この緩衝液は、１．２５Ｎの酢酸ナトリウム水溶液１９０ｍＬおよび１．２５Ｎの酢酸水溶液１０ｍＬを混合することにより作製した。有機層を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣をトルエン５０ｍＬと一緒に共蒸発させ、無水塩化メチレン（２５ｍＬ）に溶解し、Ｎ2中、Ｎ−プロピオニルオキシメチルチオ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（２．０５ｇ、９．０ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（１．０ｍＬ）中溶液を用いて０℃で処理した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８７ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分間撹拌した後、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：２、３７．５ｍＬ）を１０分間で加え、次いでセライト（７．５ｇ）を加えた。混合物を撹拌し、追加分のＡ（３７．５ｍＬ）を３０分間で加えた。この撹拌をさらに３０分間継続し、混合物を濾過した。固体を、溶液ＡおよびＣＨ2Ｃｌ2から比率５：１で作製された溶媒の混合物（６０ｍＬ）で洗浄した。次いでこの固体を塩化メチレン（４×４０ｍＬ）で抽出した。塩化メチレンの濾液を濃縮した。残渣をアセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解し、氷水浴中で撹拌し、冷水（１４ｍＬ）を２０分間で加えた。下層を塩化メチレン（１００ｍＬ）および水（１：１）食塩水溶液（６０ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮することにより生成物（５．７ｇ）を白色固体として得た。収率：９７％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２６．７，２６．３。
【００９３】
実施例１５：ＤＭＴｒ−Ｇｐ（Ｈ）の調製
亜リン酸（７８．７ｇ、９６０．０ｍｍｏｌ）をピリジン（５００ｍＬ）と一緒に蒸発させることにより無水物にし、２’−デオキシ−６−Ｏ−（２，５−ジクロロフェニル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（６２．８ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）を加えて、混合物をピリジンと一緒に蒸発させることによって再び無水物にした。残渣を無水ピリジン（４８０ｍＬ）で処理し、塩化ピバロイル（６４．０ｍＬ、５２０．０ｍｍｏｌ）を３０分間かけて１０℃で加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌して濃縮した。残渣を塩化メチレン８００ｍＬに溶解し、冷水（８００ｍＬ）、炭酸水素トリエチルアンモニウム（２．０Ｎ、４００ｍＬ×２）で順次洗浄した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣を塩化メチレン８０ｍＬに溶解し、撹拌しながら溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：２、３６０ｍＬ）を２０分間かけて加えた後、セライト（８０ｇ）を加えた。次いで、さらなる溶液Ａ（３６０ｍＬ）を３０分間かけてゆっくりと加えた。混合物を濾過し、固体をＭＴＢＥ（３００ｍＬ）で洗浄した。次いで固体を塩化メチレン（２００ｍＬ×４）で抽出した。塩化メチレンの濾液を濃縮することにより生成物（７０．４ｇ）を白色の泡状物として得た。収率：９３％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２．７１。
【００９４】
実施例１６：ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔ−ＯＨの調製
２’−デオキシ−６−Ｏ−（２，５−ジクロロフェニル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン−３’Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（５４．９ｇ、５８．０ｍｍｏｌ）および３’−Ｏ−レブリニル−４−Ｏ−フェニルチミジン（２０．１ｇ、４８．３ｍｍｏｌ）の混合物をピリジンと一緒に蒸発させることにより無水物にし、無水ピリジン（１２１ｍＬ）で希釈した。Ｎ2中、この溶液を塩化ピバロイル（１１．８ｍＬ、９６．６ｍｍｏｌ）を用いて０℃で５分間処理した。さらに５分間撹拌した後、Ｎ−プロピオニルオキシメチルチオ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（２２．０ｇ、９６．６ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（２０ｍＬ）中溶液を加え、次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．４ｍＬ、４８．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、塩化メチレン６００ｍＬで希釈した。有機層を冷水（６００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム（５００ｍＬ×２）で順次洗浄し、乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）し、濃縮した。残渣を塩化メチレン９７ｍＬに溶解し、撹拌しながら溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：２、１９４ｍＬ）を２０分間で加えた後、セライト（７３ｇ）を加え、追加分の溶液Ａ（１９４ｍＬ）を３０分間で加えた。さらに３０分間撹拌した後、混合物を濾過した。固体をＭＴＢＥ：ヘキサン＝４：１（２００ｍＬ）で洗浄し、塩化メチレン（１５０ｍＬ×４）で抽出した。塩化メチレンの濾液を濃縮することにより生成物（６８．１ｇ）を黄色の泡状物として得た。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２６．９，２６．２。この生成物をさらに精製することなく次のステップに用いた。上の生成物（６４ｇ）の塩化メチレン１１７ｍＬ中溶液を０℃で撹拌しながら、ピリジン：酢酸：ヒドラジン一水和物＝３７．５ｍＬ：２５．０ｍＬ：２．５ｍＬ（５１．６ｍｍｏｌ）の冷混合物を加えた。０℃で１時間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン（２００ｍＬ）で希釈し、冷水（５００ｍＬ）で洗浄した。水層を塩化メチレン（１００ｍＬ）で逆抽出した。合一した塩化メチレン抽出液を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣をアセトニトリル２３５ｍＬに溶解し、氷水浴中で撹拌し、冷水（１８８ｍＬ）を３０分間かけてゆっくりと加えることによって処理した。下層の有機層を分離し、塩化メチレン２００ｍＬで希釈して乾燥した（無水Ｎａ2ＳＯ4）。これを濃縮した後、残渣を塩化メチレン９４ｍＬに溶解し、撹拌しながら溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：２、９４ｍＬ）を２０分間で加え、セライト（７０ｇ）を加え、再び溶液Ａ（９４ｍＬ）を３０分間で加えた。混合物を濾過し、固体をＭＴＢＥ：ヘキサン＝４：１（３００ｍＬ）で洗浄し、塩化メチレン（１５０ｍＬ×４）で抽出した。塩化メチレンの濾液を濃縮することにより生成物（５２ｇ）を黄色の泡状物として得た。収率：８７％。この生成物をそのまま次のステップに使用した。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２８．１，２５．３。
【００９５】
実施例１７：ＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖの調製
２’−デオキシ−６−Ｏ−（２，５−ジクロロフェニル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン−３’Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（４５．４ｇ、４８．０ｍｍｏｌ）および２’−デオキシ−３’−Ｏ−レブリニル−６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（１８．１ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）の混合物をピリジンと一緒に蒸発させることにより無水物にした。残渣を無水ピリジン（１００ｍＬ）で希釈し、得られた溶液を塩化ピバロイル（９．９ｍＬ、８０．０ｍｍｏｌ）を用いてＮ2中０℃で１０分間処理した。反応混合物を０℃でさらに５分間撹拌し、Ｎ−プロピオニルオキシメチルチオ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（１８．２ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（１０ｍＬ）中溶液、次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．０ｍＬ、４０．０ｍｍｏｌ）で処理した。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン６００ｍＬで希釈し、冷水（６００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム（３００ｍＬ×２）で順次洗浄した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣を塩化メチレン８０ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：２、１６０ｍＬ）で２０分間、次いでセライト（６０ｇ）および追加分の溶液Ａ（１６０ｍＬ）で３０分間かけて順次処理した。３０分間撹拌した後、混合物を濾過した。固体をＭＴＢＥ：ヘキサン＝４：１（２００ｍＬ）で洗浄し、塩化メチレン（１５０ｍＬ×４）で抽出した。塩化メチレンの濾液を濃縮した。残渣をアセトニトリル１６０ｍＬに溶解し、氷水浴中で撹拌し、冷水（１１２ｍＬ）で３０分間処理した。下層の有機層を分離し、塩化メチレン（３２０ｍＬ）および水（３２０ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮することにより生成物（６４．１ｇ）を黄色の泡状物として得た。この生成物をさらに精製することなく次のステップに用いた。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２６．２，２６．０。
【００９６】
上の生成物（６４．０ｇ）の塩化メチレン１２０ｍＬ中溶液を撹拌しながら０℃でピロール（１３．９ｍＬ、２００．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ジクロロ酢酸（１６．５ｍＬ、２００．０ｍｍｏｌ）を２０分間かけて加えた。０℃で１時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム（２００ｍＬ）を用いて反応混合物の反応を停止した。水層を塩化メチレン（６０ｍＬ×２）で抽出し、合一した塩化メチレン抽出液を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣を塩化メチレン８０ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、１００ｍＬ）で１５分間、セライト（６０ｇ）、および追加分の溶液Ａ（１００ｍＬ）で３０分間かけて順次処理した。混合物を濾過し、固体をＭＴＢＥ（１５０ｍＬ×２）で洗浄し、塩化メチレン（２００ｍＬ×４）で抽出した。塩化メチレンの濾液を濃縮し、アセトニトリル１６０ｍＬに溶解し、氷水浴中で撹拌し、冷水（１４４ｍＬ）で２０分間処理した。下層の有機層を分離し、塩化メチレン（３２０ｍＬ）および水（１：１）食塩水溶液（３２０ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）および濃縮して生成物（４０．５ｇ）をオフホワイトの固体として得た。収率：９２％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２６．４，２６．２。
【００９７】
実施例１８：ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（Ｈ）の調製
亜リン酸（２９．８ｇ、３６４．０ｍｍｏｌ）をピリジン（１８２ｍＬ）と一緒に蒸発させることにより無水物にした。残渣にＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔ−ＯＨ（３３．０ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）を加えて混合物を再びピリジンと一緒に蒸発させることによって無水物にした。混合物を無水ピリジン（１３０ｍＬ）で希釈し、塩化ピバロイル（２４．０ｍＬ、１９５．０ｍｍｏｌ）を１０℃で３０分間かけて加えた。混合物を室温で１６時間撹拌し、濃縮し、残渣を塩化メチレン４００ｍＬに溶解した。この溶液を冷水（４００ｍＬ）および炭酸水素トリエチルアンモニウム（２．０Ｎ、２００ｍＬ×３）で順次洗浄した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。トルエン１５０ｍＬと一緒に共蒸発させた後、残渣を塩化メチレン５２ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１，７８ｍＬ）で２０分間、セライト（３９ｇ）、および追加分の溶液Ａ（７８ｍＬ）で３０分間かけて順次処理した。混合物を濾過し、固体を溶液ＡおよびＣＨ2Ｃｌ2から比率５：１（１８０ｍＬ）で作製された溶媒混合物で洗浄した。固体を塩化メチレン（１５０ｍＬ×４）で抽出し、濾液を濃縮することにより生成物（３３．１ｇ）をオフホワイトの泡状物として得た。収率：８９％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２６．９，２５．４，３．０，２．９。
【００９８】
実施例１９：ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−ＯＨの調製
ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（Ｈ）のトリエチルアンモニウム塩（２８．６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）およびＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（１６．９ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）の混合物をピリジンと一緒に蒸発させることにより無水物にした。残渣を無水ピリジン（６２．０ｍＬ）で希釈し、塩化ピバロイル（４．８ｍＬ、３８．５ｍｍｏｌ）を用いてＮ2中０℃で５分間処理した。０℃でさらに１０分間撹拌した後、Ｎ−プロピオニルオキシメチルチオ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（７．０ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（１０ｍＬ）中溶液、次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．７ｍＬ、１５．４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン４５０ｍＬで希釈し、冷水（４５０ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム（３００ｍＬ×２）で順次洗浄した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。トルエン１００ｍＬと共蒸発させた後、残渣を塩化メチレン６２ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、１２４ｍＬ）で２０分間、次いでセライト（４６．２ｇ）、および追加分の溶液Ａ（１２４ｍＬ）で３０分間かけて順次処理した。３０分間撹拌した後、混合物を濾過し、固体を溶液Ａ：ＣＨ2Ｃｌ2＝６：１（１４０ｍＬ）で洗浄した。次いで、固体を塩化メチレン（１５０ｍＬ×４）で洗浄した。塩化メチレンの濾液を濃縮した。残渣をアセトニトリル１２３ｍＬに溶解し、氷浴中で撹拌しながら冷水（８６ｍＬ）で２０分間処理した。下層の有機層を分離し、塩化メチレン（３００ｍＬ）および水（１：１）食塩水溶液（２００ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）および濃縮して生成物ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（４３．４ｇ）を黄色の泡状物として得た。この生成物をさらに精製することなく次のステップに用いた。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．９−２５．８（ｍ）。
【００９９】
ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（３８．０ｇ）の塩化メチレン３８．０ｍＬ中溶液を０℃で撹拌しながら、ピリジン：酢酸：ヒドラジン一水和物＝１４．３ｍＬ：９．５ｍＬ：０．９５ｍＬ（１９．５ｍｍｏｌ）の冷混合物を加えた。０℃で４０分間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン（４５０ｍＬ）で希釈し、冷水（３００ｍＬ×２）および食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄した。塩化メチレン層を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。トルエン１００ｍＬと一緒に共蒸発させた後、残渣を塩化メチレン６０ｍＬに溶解し、撹拌しながら溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、９０ｍＬ）を２０分間かけて加えた後、セライト（４５ｇ）を加えた。混合物を撹拌し、さらに溶液Ａ（９０ｍＬ）を３０分間で加えた。混合物を濾過し、固体を、溶液ＡおよびＣＨ2Ｃｌ2から比率５：１（１５０ｍＬ）で作製された溶媒混合物で洗浄した。固体を塩化メチレン（１５０ｍＬ×４）で抽出し、抽出液を濃縮して、残渣をシリカショートカラムで酢酸エチル中アセトニトリルを０〜８０％の勾配で用いて精製した。生成物の画分を濃縮することにより生成物（２６．９ｇ）を黄色の泡状物として得た。収率：８２％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．６−２６．０（ｍ）。
【０１００】
実施例２０：ＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖの調製
ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（７．２ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン１４ｍＬ中溶液を０℃で撹拌しながら、ピロール（２．０ｍＬ、２８．４ｍｍｏｌ）、次いでジクロロ酢酸（２．３４ｍＬ，２８．４ｍｍｏｌ）を３分間かけて加えた。０℃で３０分間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン１４ｍＬで希釈し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）をゆっくりと加えた。水層を塩化メチレン（４０ｍＬ）で抽出し、合一した塩化メチレン抽出液を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣を塩化メチレン３０ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝２：１、４５．０ｍＬ）、セライト（９．０ｇ）、および再び溶液Ａ（４５．０ｍＬ）で３０分間かけて順次処理した。混合物を濾過し、固体をＭＴＢＥ（４０ｍＬ×２）で洗浄し、塩化メチレン（５０ｍＬ×４）で抽出した。塩化メチレン抽出液を濃縮し、残渣をアセトニトリル２８．４ｍＬに溶解し、氷浴中で撹拌しながら冷水（２８．４ｍＬ）で２０分間処理した。有機層を塩化メチレン（８０ｍＬ）で希釈し、乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮することにより生成物（５．７ｇ）を白色固体として得た。収率：９５％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．４−２６．２（ｍ）。
【０１０１】
実施例２１：ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（Ｈ）の調製
亜リン酸（４．７ｇ、５７．３ｍｍｏｌ）をピリジン（２９ｍＬ）と一緒に蒸発させ、ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−ＯＨ（８．７ｇ、３．５８ｍｍｏｌ）と混合した。混合物にピリジンを加えて蒸発させることにより無水物にし、無水ピリジン（２９．０ｍＬ）で希釈した。混合物を撹拌し、塩化ピバロイル（３．７５ｍＬ、３０．４ｍｍｏｌ）を１０℃で５分間かけて加えた。混合物を室温で６時間撹拌し、濃縮した。残渣を塩化メチレン２００ｍＬに溶解し、冷水（１００ｍＬ）、および炭酸水素トリエチルアンモニウム（２．０Ｎ、１００ｍＬ×３）で順次洗浄した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮することにより生成物（９．１５ｇ）をオフホワイトの泡状物として得た。収率：９８％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．５−２５．８（ｍ），２．９，２．８。
【０１０２】
実施例２２：ＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖの調製
ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（Ｈ）のトリエチルアンモニウム塩（１０．１ｇ、３．９ｍｍｏｌ）およびＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（６．７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の混合物をピリジンと一緒に蒸発させることにより無水物にし、無水ピリジン（１５．０ｍＬ）で希釈した。この混合物を撹拌しながら塩化ピバロイル（１．１ｍＬ、９．０ｍｍｏｌ）を０℃で２分間かけてゆっくりと加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、再び０℃に冷却し、Ｎ−プロピオニルオキシメチルチオ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（１．７０ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（２．０ｍＬ）中溶液、次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．７８ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、塩化メチレン３００ｍＬで希釈した。有機層を冷水（３００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム（２００ｍＬ）で順次洗浄し、乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣を塩化メチレン（２４ｍＬ）に溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、４８ｍＬ）で１０分間、セライト（１８ｇ）、および追加分の溶液Ａ（４８ｍＬ）で３０分間かけて順次処理した。３０分間撹拌した後、混合物を濾過し、固体をＭＴＢＥ：ヘキサン＝２：１（６０ｍＬ）で洗浄し、塩化メチレン（５０ｍＬ×４）で抽出した。塩化メチレン抽出液を濃縮し、残渣をアセトニトリル（４８ｍＬ）に溶解し、氷水浴中で撹拌しながら冷水（３４ｍＬ）で２０分間処理した。下層を分離し、塩化メチレン（１５０ｍＬ）および水（１：１）食塩水溶液（１６０ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）し、濃縮して、生成物（１１．７ｇ）を灰色固体として得た。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．７−２５．８（ｍ）。この生成物をさらに精製することなくそのまま次のステップに用いた。
【０１０３】
上の生成物（１１．２ｇ）の塩化メチレン１８ｍＬ中溶液を０℃で撹拌しながら、ピロール（２．８５ｍＬ、４１．１ｍｍｏｌ）、次いでジクロロ酢酸（３．２ｍＬ、３８．４ｍｍｏｌ）を５分間かけて加えた。０℃で４０分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム（４０ｍＬ）をゆっくりと加えながら反応混合物の反応を停止した。混合物を塩化メチレン２０ｍＬで希釈し、水層を分離し、塩化メチレン（４０ｍＬ）で抽出し、合一した塩化メチレン抽出液を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）および濃縮した。残渣を塩化メチレン２８ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、２８ｍＬ）で１０分間、セライト（１６．８ｇ）、および追加分の溶液Ａ（２８ｍＬ）で２０分間かけて順次処理した。混合物を濾過し、固体を溶液Ａ（４０ｍＬ）およびＭＴＢＥ（４０ｍＬ）で洗浄し、塩化メチレン（４×５０ｍＬ）で抽出した。塩化メチレン抽出液を濃縮してシリカゲルショートカラムで精製した。カラムを塩化メチレンで溶離した。濃縮後、生成物（８．７ｇ）を灰色固体として得た。収率：６６％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．８−２６．３（ｍ）。
【０１０４】
実施例２３：ＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１）の調製
ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（Ｈ）のトリエチルアンモニウム塩（６．８５ｇ、２．６４ｍｍｏｌ）およびＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（８．２ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）をピリジンと一緒に蒸発させることにより無水物にした。残渣に無水ピリジン（１４ｍＬ）を加え、得られた溶液をＮ2中０℃で撹拌し、塩化ピバロイル（０．８ｍＬ、６．４８ｍｍｏｌ）を３分間かけて加えることによって処理した。冷浴を取り除いて混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を０℃に冷却し、Ｎ−プロピオニルオキシメチルチオ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（１．２３ｇ、５．４０ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（２．０ｍＬ）中溶液、次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５６ｍＬ、３．２４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン２５０ｍＬで希釈し、冷却した半飽和炭酸水素ナトリウム（２５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣をトルエン５０ｍＬと一緒に共蒸発させ、塩化メチレン４３ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、４３ｍＬ）で２０分間、セライト（１９．４ｇ）、および追加分の溶液Ａ（４３ｍＬ）で３０分間かけて順次処理した。３０分間撹拌した後、混合物を濾過し、固体を、溶液ＡおよびＣＨ2Ｃｌ2から比率４：１で作製された混合物（１００ｍＬ×２）で洗浄した。固体を塩化メチレン（１００ｍＬ×４）で抽出し、抽出液を濃縮した。残渣をアセトニトリル６５ｍＬに溶解し、冷水（４６ｍＬ）を２０分間かけて加えながら処理した。下層の有機層を分離し、塩化メチレン（２００ｍＬ）および水（１：１）食塩水溶液（２００ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮することにより生成物（１２．８ｇ）を黄色の泡状物として得た。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝３０．０−２４．８（ｍ）。
【０１０５】
上の生成物を（１２．８ｇ）塩化メチレン２０ｍＬ中０℃で撹拌しながら、ピロール（２．６４ｍＬ、３８．０ｍｍｏｌ）、次いでジクロロ酢酸（３．０ｍＬ、３６．０ｍｍｏｌ）を加えた。さらに０℃で３０分間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン２００ｍＬで希釈し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム（１００ｍＬ）をゆっくりと加えた。有機層を分離し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）して、濃縮した。残渣を塩化メチレン４０ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、４０ｍＬ）で１０分間、セライト（２０ｇ）、および追加分の溶液Ａ（８０ｍＬ）を２０分間かけて加えながら順次処理した。混合物を濾過し、固体を溶液ＡおよびＣＨ２Ｃｌ２から比率５：１で作製された溶媒混合物（１２０ｍＬ）で洗浄した。固体を塩化メチレン（１００ｍＬ×４）で抽出し、抽出液を濃縮した。残渣をアセトニトリル７０ｍＬに溶解し、冷水（４９ｍＬ）を３０分間かけて加えて処理した。下層の有機層を分離し、塩化メチレン（１５０ｍＬ）および水（１：１）食塩水溶液（１５０ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮することにより、生成物（９．２ｇ）をオフホワイトの固体として得た。収率：７５％。この生成物をそのまま次のステップに用いた。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．７−２６．４（ｍ）。
【０１０６】
実施例２４：ＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ：（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）の調製
ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（Ｈ）のトリエチルアンモニウム塩（３．６４ｇ、１．４ｍｍｏｌ）およびＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（６．１ｇ、０．８９ｍｍｏｌ）の混合物をピリジンと一緒に蒸発させることにより無水物にした。残渣を無水ピリジン（１０ｍＬ）で希釈し、Ｎ2中０℃で塩化ピバロイル（０．３７ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を３分間かけてゆっくりと加えることによって処理した。冷浴を取り除き、混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を０℃に冷却し、Ｎ−プロピオニルオキシメチルチオ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（５６８．３ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（１．０ｍＬ）中溶液、次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２６ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン１２０ｍＬで希釈し、冷水（１２０ｍＬ）および半飽和炭酸水素ナトリウム（１２０ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して、濃縮した。残渣を塩化メチレン３２ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、３２ｍＬ）を２０分間かけて加え、セライト（１６．０ｇ）、および追加分の溶液Ａ（６４ｍＬ）を３０分間かけて加えて順次処理した。３０分間撹拌した後、混合物を濾過し、固体を、溶液ＡおよびＣＨ2Ｃｌ2から比率５：１で作製された溶媒混合物（６０ｍＬ）で洗浄した。固体を塩化メチレン（８０ｍＬ×４）で抽出し、抽出液を濃縮した。残渣をアセトニトリル４０ｍＬに溶解し、撹拌しながら冷水（２８ｍＬ）を２０分間かけて加えることによって処理した。下層である有機層を分離し、塩化メチレン（１５０ｍＬ）および水（１：１）食塩水溶液（１５０ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮することにより生成物（６．９２ｇ）を黄色固体として得た。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．６−２６．３（ｍ）。この生成物をさらに精製することなく次のステップで用いた。
【０１０７】
上の生成物の（６．９２ｇ）塩化メチレン１０ｍＬ中溶液を０℃で撹拌しながら、ピロール（１．７４ｍＬ、２５．０ｍｍｏｌ）、次いでジクロロ酢酸（２．０ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）を２分間かけて加えた。さらに０℃で３０分間撹拌した後、反応混合物を塩化メチレン１００ｍＬで希釈し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）をゆっくりと加えた。有機層を分離し、水層を塩化メチレン５０ｍＬで抽出した。合一したＣＨ2Ｃｌ2抽出液を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮した。残渣を塩化メチレン３２ｍＬに溶解し、溶液Ａ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、３２ｍＬ）を１０分間かけて加え、セライト（１６ｇ）、および追加分の溶液Ａ（６４ｍＬ）を３０分間かけて加えて順次処理した。混合物を濾過し、固体を、溶液ＡおよびＣＨ2Ｃｌ2から比率５：１で作製された溶媒混合物（９０ｍＬ）で洗浄した。固体を塩化メチレン（８０ｍＬ×４）で抽出し、抽出液を濃縮した。残渣をアセトニトリル４０ｍＬに溶解し、混合物を氷浴中で撹拌しながら冷水（２８ｍＬ）を１０分間かけて加えることによって処理した。下層の有機層を分離し、塩化メチレン（１００ｍＬ）および水（１：１）食塩水溶液（１００ｍＬ）で分液した。有機層を乾燥（無水Ｎａ2ＳＯ4）して濃縮することにより生成物（５．８ｇ）を黄色固体として得た。収率：７１％。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝２７．７−２６．３（ｍ）。
【０１０８】
実施例２５：完全に保護されたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートであるＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖの５’−ＯＨの完全な脱保護
完全に保護されたテトラマーであるＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ−Ｌｅｖ（１．３８ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）にピリジンを加えて蒸発させることにより無水物にした。残渣に１，２，４−トリアゾール（１９２．７ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ）、４Åモレキュラーシーブ（１．５ｇ）、および無水ピリジン（６．０ｍＬ）を加えた。この混合物をＮ2中で撹拌して０℃に冷却し、ｔｅｒｔ−ブチルアミン（１．９５ｍＬ、１８．６ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られた混合物を室温で４時間撹拌した。混合物を濾過し、モレキュラーシーブをピリジン（５ｍＬ×２）で洗浄した。濾液を合一し、濃縮して乾固させた。残渣にｓｙｎ−２−ピリジンアルドキシム（９０９ｍｇ、７．４４ｍｍｏｌ）、次いでアセトニトリル（１０ｍＬ）を加えた。混合物を撹拌して０℃に冷却し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（１．６７ｍＬ、１１．２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１５時間撹拌した後、ＭＴＢＥ（５０ｍＬ）を１０分間かけてゆっくりと加えた。さらに２０分間撹拌した後、上層の透明溶液を傾瀉し、残渣を酢酸エチル（２０ｍＬ）で洗浄した。残渣を蒸発させることにより残留溶媒を除去し、２８％アンモニア水（１０．０ｍＬ）および２−メルカプトエタノール（０．５ｍＬ）の混合物に溶解した。得られた混合物を５５℃で１５時間加熱した。混合物を冷却した後、イソプロパノール：ＴＨＦ＝１：３混合物（８０ｍＬ）に撹拌しながら１０分間かけて滴下した。さらに２０分間撹拌した後、上層の透明溶液を傾瀉し、残渣をＴＨＦ（２０ｍＬ）で洗浄した。残渣を逆相Ｃ１８クロマトグラフィーで精製した。得られた生成物をアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）（登録商標）ＩＲ−１２０（プラス（ｐｌｕｓ））イオン交換樹脂（ナトリウム形）のカラム（８ｃｍ×直径３ｃｍ）に適用した。カラムを水で溶出し、所望の画分を合一して凍結乾燥することにより生成物である完全に脱保護されたナトリウム形のオリゴヌクレオチドホスホロチオエート６８４ｍｇを白色固体として得た。収率：８３％。31Ｐ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，１２１．５ＭＨｚ）：δ＝５５．４−５４．６（ｍ）。
【０１０９】
実施例２６：以下の図式に示す完全に保護されたジヌクレオチドホスホロチオエートの合成
【化２１】
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５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−チミジン−３’−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（４２５．９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、３’−Ｏ−レブリニルチミジン（１７０．２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、および乾燥ピリジン（１０．０ｍＬ）の溶液を回転蒸発させることにより乾固させた。残渣をピリジン１０ｍＬに再び溶解し、再び回転蒸発させることにより乾固させた。残渣にモレキュラーシーブ（３００ｍｇ、活性化、３Å）および無水ピリジン（５．０ｍＬ）を加えた。混合物をＮ2中室温で撹拌し、塩化ピバロイル（０．２２ｍＬ、１．７５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で５分間撹拌した後、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピオニルオキシメチルスルファニルメタンスルホンアミド（２８４．１ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）溶液、次いでＤＩＰＥＡ（０．１７ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えた。混合物を濾過し、濾液を水（１５ｍＬ）、半飽和炭酸水素ナトリウム水（１５ｍＬ×２）、および食塩水（１５ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥および蒸発させることにより淡黄色油１．２１ｇを得た。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／アセトン）で精製することによって生成物（３８９ｍｇ）を無色の泡状物として得た収率：７４．４％。
【配列表】
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【国際調査報告】
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