(57)【要約】本発明は、キサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）抑制を通じて血中または尿中の尿酸を減少させ、痛風治療に効果を有する韓当帰抽出物を含む痛風治療用組成物に関する。また、本発明は、炎症誘発酵素Ｃｏｘ−２を抑制する効果を有する韓当帰抽出物を含む痛風における炎症予防用組成物に関する。本発明の韓当帰抽出物は、その主成分であるデカーシンとデカーシノールアンゲレートを９８重量％以上で構成した液体濃縮物であり、人間に投与するために抽出溶媒として水とエタノールだけで抽出し、また、純度を高めるために温度と溶解度差を用いた精製方法を使用したものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）抑制を通じた痛風治療に効果を有する韓当帰抽出物を含む、
痛風治療用組成物。
【請求項２】
韓当帰抽出物は、デカーシンおよびデカーシノールアンゲレートを９８重量％以上含むことを特徴とする、
請求項１に記載の痛風治療用組成物。
【請求項３】
キサンチン酸化酵素５０％抑制効果（ＩＣ５０）が１８．２μｇ／ｍｌであり、キサンチン酸化酵素９０％抑制効果（ＩＣ９０）が４４．７μｇ／ｍｌであることを特徴とする、
請求項１に記載の痛風治療用組成物。
【請求項４】
炎症誘発酵素Ｃｏｘ−２を抑制する効果を有する韓当帰抽出物を含む、
痛風における炎症予防用組成物。
【請求項５】
韓当帰抽出物はデカーシンおよびデカーシノールアンゲレートを９８重量％以上含むことを特徴とする、
請求項４に記載の痛風における炎症予防用組成物。
【請求項６】
キサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）抑制を通じた痛風治療に効果を有するＡＮＧＥＬＩＣＡ  ＧＩＧＡＳ  ＪＩＲＩ抽出物を含む、
痛風治療用組成物。
【請求項７】
ＡＮＧＥＬＩＣＡ  ＧＩＧＡＳ  ＪＩＲＩ抽出物は、デカーシンおよびデカーシノールアンゲレートを９８重量％以上含むことを特徴とする、
請求項６に記載の痛風治療用組成物。
【請求項８】
炎症誘発酵素Ｃｏｘ−２を抑制する効果を有するＡＮＧＥＬＩＣＡ  ＧＩＧＡＳ  ＪＩＲＩ抽出物を含む、
痛風における炎症予防用組成物。
【請求項９】
ＡＮＧＥＬＩＣＡ  ＧＩＧＡＳ  ＪＩＲＩ抽出物は、デカーシンおよびデカーシノールアンゲレートを９８重量％以上含むことを特徴とする、
請求項８に記載の痛風における炎症予防用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）の抑制を通じて血中または尿中の尿酸を減少させ、痛風治療に効果を有する韓当帰（ＡＮＧＥＬＩＣＡ  ＧＩＧＡＳ  ＮＡＫＡＩ）抽出物を含む痛風治療用組成物に関する。
【０００２】
また、本発明は、炎症誘発酵素Ｃｏｘ−２を抑制する効果を有する韓当帰抽出物を含む痛風における炎症予防用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
韓当帰は韓国が原産地であって、その使用範囲は補血剤として漢方薬剤に用いられてきた。最近の研究結果により、韓国産当帰の指標物質であるデカーシンとデカーシノールが血流改善作用と抗ヘリコバクター作用があると報告されており、本発明者らにより、純粋精製されたデカーシンが腎臓毒性の抑制と糖尿合併症による腎不全症の予防効果および糖尿性高血圧に効果があることを動物実験によって明らかにしたことがある（特許文献１参照）。
【０００４】
また、韓当帰抽出方法に関し、本発明者らは特許登録を受けており（特許文献２参照）、これを改善し、主成分を９５重量％以上含有するようにした韓当帰抽出物の抽出方法とそれを用いた抗酸化効果に対する特許を出願している（特許文献３参照）。
【０００５】
それのみならず、脂質代謝改善効果を有する、韓当帰および智異山自生韓当帰の抽出物とその抽出方法に対する特許も出願している（特許文献４参照）
また、本発明者は、既存の方法より簡便で抽出量を多量確保できる濃縮方法を確保して製造し、これを液剤に製造して実験動物に経口的に投与する時に腸管吸収が容易であることを確認することができた。
【０００６】
デカーシンとデカーシノールアンゲレート（ｄｅｃｕｒｓｉｎｏｌ  ａｎｇｅｌａｔｅ）は構造異性体として現在までよく知られてはいなかったが、本発明者らがその作用を研究してき、その分析法に関するのも確立して明らかにしたことがある（特許文献２参照）。
【０００７】
デカーシンは室温で固体として存在し得るが、デカーシノールアンゲレートは−７０℃においても液体として存在し、韓当帰ではデカーシンとデカーシノールアンゲレートの比率が約５７：４３程度であると本発明者らが明らかにしており、Ｍａｓｓ分析を通じた正確な含量および比率を調べてみた結果、デカーシン５０％〜５４．５％、デカーシノールアンゲレート４０％〜４２％、デカーシノール０．１％〜０．３％、デカーシノール誘導体約２％〜３％、その他１％〜２％で構成された精製物質であることを明らかにした。
【０００８】
痛風（Ｇｏｕｔ）は、血液中に尿酸が高い状態で長く持続して形成される尿酸の結晶体が体外に排出することができず、色々な組織に積もって多様な症状を誘発する代謝性疾患である。血中尿酸が増加する場合は、過度な尿酸の生産と腎臓による排せつ過程の異常から、十分に排出することができないために現れる。血中の尿酸数値が高いといって、直ちに痛風が発病するのではなく、高い尿酸数値によって尿酸結晶体が容易に形成され、色々な組織に蓄積した状態が１０年〜２０年間持続すれば、誘発因子によって痛風を起こすようになる。これは、主に４０代〜５０代の男性によく発病するが、食生活の変化および環境の変化によって発病年齢が益々低くなっており、女性は閉経期以後あるいは臓器移植後の免疫抑制剤の長期服用や利尿剤の長期服用によって腎機能が低下した女性に発病する可能性が高い。
【０００９】
このような痛風の原因を調べてみれば、我々の体を構成している大部分の細胞は核を有しており、これは、遺伝情報を含む核酸からなっている。核酸はプリン（ｐｕｒｉｎｅ）やピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）で構成されており、細胞寿命が終われば破壊され、核の中のプリン体が分解され、尿酸（ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）が大量に作られ、尿酸ナトリウムの結晶が組織に蓄積することによって炎症を起こす疾病であり、高尿酸血症、痛風性関節炎、痛風性腎疾患、痛風性腎結石症などを起こすと知られている（非特許文献１参照）。
【００１０】
プリン体の代謝過程中、アデニンはヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）とキサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ）を経て尿酸として作られ、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）は直接キサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ）に代謝されて尿酸に分解されるが、この時にキサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）が関与すると知られている。キサンチン酸化酵素がキサンチンを尿酸に転換させる時、スーパーオキシドラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｒａｄｉｃａｌ）を大量に生成することによって周辺細胞に酸化的ストレスを与え、痛風だけでなく、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、糖尿病などのような疾患を伴うようになると知られている（非特許文献２参照）。
【００１１】
【表２】
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尿酸が生成される経路は大きく外因性尿酸（摂取した食べ物に含まれたプリン体から由来）と内因性尿酸（身体で破壊される細胞から由来）に区分することができる。このように作られた尿酸の大部分は腎臓において複雑な過程を経て小便に排出されるが、生産と排出のバランスが崩れると問題が発生する。正常男性の場合には、血中尿酸濃度は７ｍｇ／ｄｌ〜８ｍｇ／ｄｌ以下、正常女性の場合には、血中尿酸濃度は６ｍｇ／ｄｌ以下である。
【００１２】
血中尿酸値は個人差があるが、８ｍｇ／ｄｌを超過すれば、痛みが現れ、心臓や腎臓、脳の血管障害を起こす危険があり、１０ｍｇ／ｄｌ以上であれば、発作が起こる。痛風は関節炎が最も一般的な症状であるが、急性または慢性的に腎機能の低下を招くこともある。
【００１３】
痛風治療時、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ、診断が確実ではない場合に使用）、非ステロイド性抗炎症薬（合併症がなく、診断が確実である場合に使用するか、消化性潰瘍、腎機能障害、浮腫悪化などの副作用の可能性が多い）、ステロイド（単発性関節炎において、関節腔内注射や筋肉注射として使用）を主に使用する。
【００１４】
しかし、現代医学的に痛風を根本的に治療する薬は開発されていない。但し、抗高尿酸剤として尿酸生成抑制剤である「アロプリノール（ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ）」と尿酸腎臓排せつ促進剤である「プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ）」などがあるが、アロプリノールの場合には皮膚発疹、胃腸障害、骨髄抑制、かゆみ症、吐き気、筋肉痛などのような深刻な副作用があるため、安全で副作用が少なく且つ痛風を予防し治療できる物質の発明が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０００／０２３０７４
【特許文献２】大韓民国登録特許１０−０５０９８４３
【特許文献３】大韓民国特許出願番号１０−２００７−４５４４１
【特許文献４】大韓民国特許出願番号１０−２００８−４１２２
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｙａｇｉ  Ｋ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，４５，ｐ３３７，１９８７
【非特許文献２】Ｓｔｏｒｃｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６９，ｐ２６２，１９８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記のように既存の痛風治療薬は過度な副作用があるため、副作用がなく、治療および予防が可能な新しい痛風治療用組成物を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記のような目的を達成するために、本発明は、キサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎ  ｏｘｉｄａｓｅ）の活性を抑制し、炎症誘発酵素であるＣｏｘ−２を抑制する効能を示し、体内において、オキソン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｏｘｏｎａｔｅ）によって増加した尿酸（ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）の量を低下させる効能を有する、デカーシンおよびデカーシノールアンゲレートを有効成分とする韓当帰抽出物を含む痛風治療用組成物および痛風における炎症予防用組成物を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の韓当帰抽出物は、キサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎ  ｏｘｉｄａｓｅ）の活性を抑制して、痛風時に増加する体内尿酸の量を低下させる効果があり、痛風における炎症誘発酵素であるＣｏｘ−２の活性を抑制する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】抽出精製されたデカーシンおよびデカーシノールアンゲレートが９８重量％含まれた韓当帰抽出物である。
【図２】抽出精製されたデカーシンおよびデカーシノールアンゲレートが９８重量％含まれたＡＮＧＥＬＩＣＡ  ＧＩＧＡＳ  ＪＩＲＩ抽出物である。
【図３】正常対照群（ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、高尿酸血症対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｏｒｌ）、アロプリノール投与群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、韓当帰抽出物投与群（Ｄｅｃｕｒｓｉｎ  ５０）の血中および尿中の尿酸濃度を示すグラフである。
【図４】正常対照群（ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、高尿酸血症対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｏｒｌ）、アロプリノール投与群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、韓当帰抽出物投与群（Ｄｅｃｕｒｓｉｎ  ５０）の炎症誘発酵素であるＣｏｘ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）の抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、キサンチン酸化酵素抑制（ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＸＯＩ）作用により、血中または尿中の尿酸を減少させて、痛風治療に効果を示す韓当帰抽出物に関する。また、本発明は、炎症誘発酵素抑制効果のある韓当帰抽出物に関する。
【００２２】
本発明の韓当帰抽出物は、本発明者らが出願した大韓民国特許出願１０−２００７−４５４４１の方法によって製造された。
【００２３】
１．韓当帰抽出物の製造
原料である韓国産および北朝鮮産韓当帰を４０メッシュ（４０ｍｅｓｈ）以下に細かく粉砕して、水分含量を５％以下に乾燥し、薬用アルコールまたは酒精アルコールを粉砕韓当帰の２倍から４倍添加して１２時間以上十分に抽出し、これを濾過して定量した。この場合には、濃縮物に含有されたデカーシンとデカーシノールアンゲレートの含量が３３％であった。
【００２４】
この濃縮物を蒸発乾燥して粘性の高い物質を得た。この物質１ｋｇ当たり薬用アルコールまたは酒精アルコール１リットルを入れて主成分を溶かし、−２０℃で１０時間放置して、生成された沈殿物を遠心分離して除去した後に上澄液を得た。上澄液を蒸発乾燥して濃縮物を得た。
【００２５】
この濃縮物に６０％エタノール５０リットルを入れて溶出した。この場合には、濃縮物に含有されたデカーシンとデカーシノールアンゲレートは３３０ｇであり、６０％エタノール５０リットルに溶けられる主成分の量も３３０ｇであることを利用した。
【００２６】
溶出後遠心分離して６０％エタノール層だけを得た。これを蒸発乾燥して濃縮物を得ることができた。これを９９％アルコールに溶かして上澄液を取り、最終濃縮物を得た（図１参照）。
【００２７】
このように濃縮した韓当帰抽出物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した代表的な結果は、デカーシンおよびデカーシノールアンゲレートの総含量は９８重量％を示し、この抽出物を用いて以下の実験を行った。
【００２８】
２．キサンチン酸化酵素抑制効果（Ｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）実験
本実験では、キサンチンを基質にし、キサンチン酸化酵素を酵素にして、酵素−基質反応実験を行った。キサンチン酸化酵素抑制活性はストライプらの方法（Ｓｔｒｉｐｅ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２４４．，ｐ３８５５−３８６３，１９６９）によって測定した。
【００２９】
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２５０μｌ、韓当帰抽出物溶液（デカーシンおよびデカーシノールアンゲレートの最終濃度が１、５、１０、１７．５、２０、５０μｇ／ｍｌになるように５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で薄めて製造した）３８５μｌ、キサンチン溶液３３０μｌを混合して反応液を製造した。
【００３０】
前記反応液にキサンチン酸化酵素溶液（最終濃度０．４Ｕ／ｍｌ）を３５μｌ添加し、３７℃培養器にて１５分間反応させた後、２９５ｎｍにおいて吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ、Ａｂ）を測定した。
【００３１】
また、韓当帰抽出物の各濃度（デカーシンおよびデカーシノールアンゲレートの最終濃度が１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１７．５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）に対してキサンチン酸化酵素溶液を入れていない反応液と、韓当帰抽出物を入れていない溶液に対してキサンチン酸化酵素溶液を入れた場合と入れていない場合の反応液も各々製造し、その時に入れていない韓当帰抽出物およびキサンチン酸化酵素に相応する量だけは５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、その結果、最終反応液の体積が１ｍｌになるようにした。
【００３２】
本発明のキサンチン酸化酵素抑制率は下記の公式によって測定計算し、その結果は表１の通りである。
【００３３】
抑制率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａ：組成物不在時の吸光度の変化（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｅｎｚｙｍｅ−Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍｅ）
Ｂ：組成物存在時の吸光度の変化（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｅｎｚｙｍｅ−Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍｅ）
【００３４】
【表１】
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また、韓当帰抽出物と同じ濃度でアロプリノールを標準抑制剤として用いて抑制効果を測定した結果、ＩＣ５０は３８．０μｇ／ｍｌであった。
【００３５】
すなわち、キサンチン酸化酵素抑制剤としてよく知られているアロプリノールのＩＣ５０は３８．０μｇ／ｍｌであったが、本発明の韓当帰抽出物のＩＣ５０は１８．２μｇ／ｍｌであり、また、既存文献によれば、アロプリノールのＩＣ９０は８０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌと報告されているが、本発明の韓当帰抽出物はＩＣ９０が約４４．７μｇ／ｍｌであり、よって、本発明の組成物のキサンチン酸化酵素抑制効果がより優れていると考えられる。
【００３６】
前記ＩＣ５０はキサンチン酸化酵素を５０％抑制する地点を意味し、これは、１００μｇ／ｍｌの緑茶抽出物、セイヨウサンザシ抽出物、昆布抽出物、ナツメ（Ｚｉｚｙｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂａ）抽出物、イチョウの葉抽出物のキサンチン酸化酵素抑制率を測定した結果、各々、９２％、８５％、６８％、６４％、７８％を示すこと（大韓民国登録特許第１０−０４９２４７０）と、長生紅プラティコドン（ｏｌｄ  ｒｅｄ  ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ）３０μｇ／ｍｌのキサンチン酸化酵素抑制率が６３．６％を示すこと（大韓民国登録特許第１０−０６６２２０６）と、アッケシソウ（Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ  ｈｅｒｂａｃｅａ）抽出物のキサンチン酸化酵素抑制率ＩＣ５０値が２１μＭ（大韓民国登録特許第１０−０５６９２４４）であることと比較してみる時、他のいずれの物質よりも優れていた。
【００３７】
３．痛風誘発動物モデルにおける血中および尿中の尿酸減少実験
本発明の韓当帰抽出物の抗痛風活性を確認するために、尿酸分解酵素抑制剤であるオキソン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｏｘｏｎａｔｅ）を投与して高尿酸血症を誘導した後、韓当帰抽出物の血中尿酸減少効果に対する実験を行った。陽性対照群には、尿酸合成抑制剤であるアロプリノール（ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ、Ｓａｍ  Ｉｌ  Ｐｈａｒｍ．）を投与した痛風疾患モデルを利用して比較実験を行った。
【００３８】
実験動物は、湿度５０±５％、温度２４℃〜２６℃に維持される飼育場（ＳＰＦ  ｃｈａｍｂｅｒ）で飼育された９週齢の雄ＳＤラット（ｓｐｒａｇｕｅ−ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ、ｍａｌｅ、２５０ｇ−２８０ｇ、Ｓａｍｔａｋｏ，Ｉｎｃ．）を使用し、飼料と水を十分に供給し、１週間実験室の環境に適応させた後に実験に用いた。
【００３９】
本実験では、尿酸分解酵素抑制剤であるオキソン酸カリウム（１５０ｍｇ／ｋｇ）を試料投与の１日前に腹腔内に投与して高尿酸血症を誘導した。オキソン酸カリウム投与後、高尿酸血症の誘導有無を確認するために、オキソン酸カリウム投与前後の尿酸含量を測定して比較した。
【００４０】
オキソン酸カリウムは、０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＣＭＣ−Ｎａ、０．５％  ＣＭＣ  ｗｉｔｈ  ０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５））で懸濁して用いた。
【００４１】
高尿酸血症が誘発された実験動物を４個のグループに分け、正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、高尿酸血症対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｏｒｌ）、アロプリノール投与群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、韓当帰抽出物投与群（Ｄｅｃｕｒｓｉｎ  ５０）に分けて、各グループ当たり７匹に設定して実験した。
【００４２】
高尿酸血症対照群は、韓当帰抽出物の代わりに同量の溶媒で代替して投与し、アロプリノールおよび韓当帰抽出物は、０．１％  ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎｅ  ｍｏｎｏｌｅａｔｅを含む０．０１Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅに懸濁して、高尿酸血症の誘発後、３日間経口投与した。
【００４３】
アロプリノール投与群は、市販薬の投与容量である５０ｍｇ／ｋｇを投与し、韓当帰抽出物も５０ｍｇ／ｋｇの濃度で３日間経口投与した。最後に経口投与した時点から２時間以内に各々の実験動物の小便（尿）を集め、直ちに解剖して血清を分離し、尿酸濃度を評価するために血液および尿中の尿酸の濃度を測定した（検査装置：ＤＲＩ−ＣＨＥＭ，ＦＵＪＩＦＩＬＭ，Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．３２００）。
【００４４】
血液および尿中の尿酸濃度は、高尿酸血症対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｏｒｌ）に比べて低い数値を示した（図３参照）。
【００４５】
韓当帰抽出物投与群（Ｄｅｃｕｒｓｉｎ  ５０）の血中および尿中の尿酸濃度は、対照薬物を投与したアロプリノール投与群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）よりは尿酸減少能力が多少落ちるが、これは、現在市販されているアロプリノールの多様な副作用を考えてみると、非常に有益な効果であると思われる。
【００４６】
４．痛風誘発動物モデルの肝細胞における炎症誘発抑制効果実験
本発明の韓当帰抽出物の炎症誘発酵素Ｃｏｘ−２抑制効果を確認するために、尿酸分解酵素抑制剤であるオキソン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｏｘｏｎａｔｅ）を投与して高尿酸血症を誘導した後、韓当帰抽出物の血中尿酸降下効果に対する陽性対照群として、尿酸合成抑制剤であるアロプリノールを投与した痛風疾患モデルを利用して比較実験を行った。対照群としてはβ−ａｃｔｉｎを利用した。
【００４７】
実験動物は、湿度５０±５％、温度２４℃〜２６℃に維持される飼育場（ＳＰＦ  ｃｈａｍｂｅｒ）で飼育された９週齢の雄ＳＤラット（ｓｐｒａｇｕｅ−ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ，ｍａｌｅ，２５０ｇ−２８０ｇ，Ｓａｍｔａｋｏ，Ｉｎｃ．）を使用し、飼料と水を十分に供給し、１週間実験室の環境に適応させた後に実験に用いた。
【００４８】
本実験では、尿酸分解酵素抑制剤であるオキソン酸カリウム（１５０ｍｇ／ｋｇ）を試料投与の１日前に腹腔内に投与して高尿酸血症を誘導した。オキソン酸カリウム投与後、高尿酸血症の誘導有無を確認するために、オキソン酸カリウム投与前後の尿酸含量を測定して比較した。
【００４９】
オキソン酸カリウムは、０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＣＭＣ−Ｎａ、０．５％  ＣＭＣ  ｗｉｔｈ  ０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５））で懸濁して用いた。高尿酸血症が誘発された実験動物を４個のグループに分け、正常対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、高尿酸血症対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｏｒｌ）、アロプリノール投与群（ｐｏｗｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、韓当帰抽出物投与群（Ｄｅｃｕｒｓｉｎ  ５０）に分けて、各グループ当たり７匹に設定して実験した。
【００５０】
高尿酸血症対照群は、韓当帰抽出物の代わりに同量の溶媒で代替して投与し、アロプリノール投与群および韓当帰抽出物投与群は、アロプリノールおよび韓当帰抽出物を各々０．１％  ｔｗｅｅｎ  ８０を含むＰＢＳに懸濁して、高尿酸血症誘発後、３日間経口投与した。アロプリノール投与群は、市販薬の投与容量である５０ｍｇ／ｋｇを投与し、韓当帰抽出物も５０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した。
【００５１】
３日間経口投与した後、実験動物を一晩絶食させた後、ドライアイスで麻酔し開腹して、肝（ｌｉｖｅｒ）を摘出して重さを測定した後、急速冷凍をして−８０℃で冷凍保管した。全体肝（ｌｉｖｅｒ）中の１００ｍｇを取り、ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを使ってタンパク質を分離した後、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙを利用してタンパク質を測定した。同量のタンパク質を、ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｌｕｏｒｉｄｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＰＶＤＦ）にトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。トランスファーが完了したＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅを、５％  ｎｏｎ−ｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋを含有したＰＢＳＴ（０．０１％  ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ−０．０１Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で非特異的タンパク質を遮断するために１時間程度反応させた。その次に、１次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を一晩反応させた後、各抗体に対する２次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧとａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧに１時間反応させた。各反応の間、ＰＢＳＴで５分ずつ５回ｗａｓｈｉｎｇした。最後のｗａｓｈｉｎｇが終われば、各抗体に対する対応タンパク質ｂａｎｄは、ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を利用して発現させた。
【００５２】
その結果、図４に示すように、韓当帰抽出物投与群が、アロプリノール投与群より、肝潮職において、Ｃｏｘ−２タンパク質の発現が抑制されることが確認され、特に陽性対照群であるアロプリノール投与群の場合、高尿酸血症対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｏｒｌ）に比べてＣｏｘ−２の発現をむしろ増加させており、これは、アロプリノールの副作用中の一部であると判断される。したがって、前記実験結果に基づき、韓当帰抽出物は、痛風による炎症反応を抑制する効果があるということが分かった。
【００５３】
また、本発明の実施例では韓当帰抽出物を用いて実験したが、ＡＮＧＥＬＩＣＡ  ＧＩＧＡＳ  ＪＩＲＩ抽出物を用いることができるということは勿論である（図２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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