(57)【要約】  本発明は、乳児用シリアルの分野に関する。特に、本発明は、乳児の免疫系を強化するために使用することができ、及び／又は炎症性疾患を治療若しくは予防するために使用することができる、乳児用シリアルの分野に関する。例えば、これらの利点は、プロバイオティクス微生物によって実現することができる。本発明の実施形態は、非増殖性プロバイオティクス微生物、例えば、生物活性のある熱処理されたプロバイオティクス微生物を含む乳児用シリアルに関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも０．４８ｇ／１００ｋＪのタンパク質源、最大で１．１ｇ／１００ｋＪの脂質源、炭水化物源及び非増殖性プロバイオティクス微生物を含む、乳児用シリアル。
【請求項２】
２２０〜２４０ｋＪ／１５ｇのエネルギー密度、０．８〜１．２ｇ／１５ｇのタンパク質源、０．１〜０．３ｇの脂肪源及び１２．３〜１２．７ｇ／１５ｇの炭水化物源を有し、米粉、トウモロコシマルトデキストリン、ビタミンＣ、及び鉄を含む、４〜６カ月の月齢の乳児に投与される、請求項１に記載の乳児用シリアル。
【請求項３】
２２０〜２４０ｋＪ／１５ｇのエネルギー密度、１．５〜１．９ｇ／１５ｇのタンパク質源、０．２〜０．４ｇの脂肪源及び１１．１〜１１．５ｇ／１５ｇの炭水化物源を有し、コムギ粉、コムギからのセモリナ、鉄、ビタミンＣ、ナイアシン、ビタミンＢ６、チアミン、及びトウモロコシマルトデキストリンを含む、６〜１２カ月の月齢の乳児に投与される、請求項１に記載の乳児用シリアル。
【請求項４】
プレバイオティクス、例えば、オリゴフルクトース及びイヌリンをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳児用シリアル。
【請求項５】
約１５ｇの乳児用シリアルを９０ｍＬの水と混合するものとする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の乳児用シリアル。
【請求項６】
約１０６〜１０１２ｃｆｕに相当する量の非増殖性プロバイオティクス微生物を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳児用シリアル。
【請求項７】
非増殖性プロバイオティクス微生物が、熱処理によって、好ましくは少なくとも１秒間の少なくとも７１．５℃の高温処理によって非増殖性にされた、請求項１〜６のいずれか一項に記載の乳児用シリアル。
【請求項８】
熱処理が、約１〜１２０秒間の約７１．５〜１５０℃の高温処理であり、好ましくは高温／短時間（ＨＴＳＴ）処理又は超高温（ＵＨＴ）処理である、請求項７に記載の乳児用シリアル。
【請求項９】
炎症性疾患の予防又は治療において使用するための、請求項８に記載の乳児用シリアル。
【請求項１０】
熱処理が、約７０〜１５０℃の温度範囲で約３分〜２時間、好ましくは５分〜４０分間、８０〜１４０℃の範囲で行われる、請求項７に記載の乳児用シリアル。
【請求項１１】
免疫防御不全と関連する疾患の予防又は治療において使用するための、請求項１０に記載の乳児用シリアル。
【請求項１２】
プロバイオティクスの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的には全てが非増殖性である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の乳児用シリアル。
【請求項１３】
プロバイオティクス微生物が、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、プロピオニバクテリウム属、又はこれらの組合せ、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・ジアセチラクティス、ラクトコッカス・クレモリス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・デルブレッキー、エシェリキア・コリ、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の乳児用シリアル。
【請求項１４】
プロバイオティクス微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・ジョンソニーＬａ１、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９８３、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・ブルガリカスＮＣＣ１５、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７、又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の乳児用シリアル。
【請求項１５】
１日用量当たり約０．００５ｍｇ〜１０００ｍｇの非増殖性微生物を含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の乳児用シリアル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳児用シリアルの分野に関する。特に、本発明は、乳児の免疫系を強化するために使用することができ、及び／又は炎症性疾患を治療若しくは予防するために使用することができる、乳児用シリアルの分野に関する。例えば、これらの利点は、プロバイオティクス微生物によって実現することができる。本発明の実施形態は、非増殖性プロバイオティクス微生物、例えば、生物活性のある熱処理されたプロバイオティクス微生物を含む乳児用シリアルに関する。
【０００２】
新生児は通常、母乳栄養を、又は母乳の内容とできるだけ近く、母乳と似ている液体の乳児用栄養調製粉乳を授乳される。母乳栄養及び／又は乳児用調製乳の投与は典型的には、乳児期の１年目の間に続く。
【０００３】
しかし、典型的には４〜６カ月の月齢で、乳児は、他の食物に対する興味及び準備を発達させる。他の食物に対する興味及び準備の徴候は、乳児が座り、頭の動きを制御でき始めることである。乳児は食物を口の前から後ろへ移動させることができ、その結果、舌の協調によって乳児はスプーンから飲み込むことが可能となる。
【０００４】
固形食の導入は、乳児が食物との積極的な関係を築くために重要である。食物との積極的な関係は、成長する幸福な乳児への、生涯に亘る健康的な食習慣を発達させる第１のステップである。
【０００５】
この段階で、乳児が乳児用シリアルを摂取し始めることが推奨される。
【０００６】
乳児用シリアルは、乳児が味、テクスチャ、及び栄養を体験することを助ける。しかし、乳児の消化管はまた発達途中であり、新しい挑戦である固形食に対処しなくてはならない。
【０００７】
腸管内菌叢の一部としてのプロバイオティクスは、胃が食物をより容易に許容することを助け、且つ、例えば、免疫系をまたブーストすることができる。この点において新しい画期的な製品は、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）培養物を含むＮｅｓｔｌｅ乳児用シリアルである。これらの培養物は健康な消化管内菌叢を維持し、健全な成長及び発達のサポートを助ける。
【０００８】
一般に、プロバイオティクスは、乳児にとって安全であると考えられる。しかし特別な状況下で、例えば乳児が、免疫系の欠損を患っている場合、医師の同意なしで乳児のためのプロバイオティクスを使用しないことが望ましい場合がある。
【０００９】
したがって当技術分野で、プロバイオティクスが提供できる利点を与え、免疫系の欠損を有する乳児が懸念なしに摂取できる乳児用シリアルが求められている。
【００１０】
本発明者らは、この必要性に取り組んだ。
【００１１】
工業規模で生産することが簡単であり、理想的にはより長い保存寿命又は上昇した温度によって活性を喪失しない一方で、乳児にとって消化するのに容易であり、味、テクスチャ及び栄養を体験することを可能にし、プロバイオティクスの利点を実現する乳児用シリアルを提供することは、結果的に本発明の目的であった。
【００１２】
本発明者らは、独立請求項の主題によって本発明の目的を達成できたことを見出したことに驚かされた。従属請求項は、本発明のアイデアをさらに発展させる。
【００１３】
本発明者らは、非増殖性プロバイオティクス微生物を含む乳児用シリアルを提供する。
【００１４】
本発明者らは、例えば、免疫向上作用に関して、及び／又は抗炎症作用に関して、非増殖性プロバイオティクス微生物が、増殖性プロバイオティクス微生物より有効でさえあり得ることを見出して驚いた。
【００１５】
プロバイオティクスが、「十分量で投与されたときに健康上の利益を宿主に与える生きた微生物」（ＦＡＯ／ＷＨＯガイドライン）として定義されることが多いため、これは驚くべきことである。公開された文献の大部分は、生きたプロバイオティクスについて論じている。さらに、いくつかの研究は非増殖性細菌によって実現される健康上の利益を調査したが、これらの研究の大部分は、例えば熱処理によるプロバイオティクスの不活性化は、これらの健康上の利益と称されるものの損失をもたらすことを示した（Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ，Ｄ．ら、２００４、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２６：５２０〜５２８；Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏら、２００５、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１９７〜２０４；Ｇｉｌｌ，Ｈ．Ｓ．及びＫ．Ｊ．Ｒｕｔｈｅｒｆｕｒｄ、２００１，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．８６：２８５〜２８９；Ｋａｉｌａ，Ｍ．ら、１９９５、Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ  ７２：５１〜５３）。いくつかの研究は、死んだプロバイオティクスがいくらかの健康効果を保持し得ることを示した（Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ，Ｄ．ら、２００４、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２６：５２０〜５２８；Ｇｉｌｌ，Ｈ．Ｓ．及びＫ．Ｊ．Ｒｕｔｈｅｒｆｕｒｄ、２００１，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．８６：２８５〜２８９）が、明らかに生きているプロバイオティクスが今までのところ当技術分野でより能力があると見なされてきた。
【００１６】
結果的に、本発明者らは、非増殖性プロバイオティクス微生物を含む乳児用シリアルを今や提供する。これらの非増殖性プロバイオティクス微生物は、まだ生物活性がある。
【００１７】
本発明の一実施形態は、少なくとも０．４８ｇ／１００ｋＪのタンパク質源、最大で１．１ｇ／１００ｋＪの脂質源、炭水化物源及び非増殖性プロバイオティクス微生物を含む乳児用シリアルである。
【００１８】
乳児用シリアルは、当技術分野において公知である。乳児用シリアルは、乳児に投与されるシリアル含有組成物である。乳児用シリアルは通常、スプーンを使用して投与され、例えば、乳児のための乾燥シリアルとして提供し得る。またすぐ食べられる乳児用シリアルは、本発明の範囲内である。国際食品規格は、乳児用シリアルがどのような成分を含有すべきかのガイドラインを提供する。
【００１９】
「乳児」とは、月齢１２カ月以下の人を意味する。
【００２０】
典型的には、乳児用シリアル中に存在するタンパク質、炭水化物及び脂質のカロリー密度並びに量及び種類は、乳児の必要性に応じて注意深く調節すべきであり、乳児の発達段階及び年齢によって決まる。
【００２１】
乳児の栄養の必要量は、乳児の発達及び年齢と共に変化し、乳児用シリアルの組成は、理想的にはこの変化を反映することは周知である。
【００２２】
したがって、４〜６カ月の月齢の乳児に投与される本発明による乳児用シリアルは、２２０〜２４０ｋＪ／１５ｇのエネルギー密度、０．８〜１．２ｇ／１５ｇのタンパク質源、０．１〜０．３ｇの脂肪源及び１２．３〜１２．７ｇ／１５ｇの炭水化物源を有し得る。このような乳児用シリアルは、例えば、米粉、トウモロコシマルトデキストリン、ビタミンＣ、及び鉄を含有し得る。
【００２３】
６〜１２カ月の月齢の乳児に投与される本発明による乳児用シリアルは、２２０〜２４０ｋＪ／１５ｇのエネルギー密度、１．５〜１．９ｇ／１５ｇのタンパク質源、０．２〜０．４ｇの脂肪源及び１１．１〜１１．５ｇ／１５ｇの炭水化物源を有し得る。このような乳児用シリアルは、例えば、小麦粉、小麦からのセモリナ、鉄、ビタミンＣ、ナイアシン、ビタミンＢ６、チアミン、及びトウモロコシマルトデキストリンを含有し得る。
【００２４】
乳児用シリアルは、乾燥重量ベースで最終混合物の少なくとも２５重量％を構成し得る１種又は複数の粉砕したシリアルから調製し得る。
【００２５】
本発明の乳児用シリアルは、米のシリアル又は小麦のシリアルなど単一の穀物から調製されることが好ましい。単一の穀物の組成物は、アレルギー反応をもたらす可能性が低いためである。
【００２６】
本発明の乳児用シリアルは、プレバイオティクスをさらに含有し得る。プレバイオティクスは、プロバイオティクスを非増殖性とする前に、プロバイオティクスの増殖をサポートし得る。「プレバイオティクス」とは、腸内の健康に有益な微生物及び／又はプロバイオティクスの増殖を促進する、消化できない食品を意味する。プレバイオティクスは、プレバイオティクスを摂取した人の胃及び／若しくは腸上部で分解、又は消化管内で吸収されず、胃腸の微生物叢及び／又はプロバイオティクスによって発酵される。プレバイオティクスは、例えば、Ｇｌｅｎｎ  Ｒ．Ｇｉｂｓｏｎ及びＭａｒｃｅｌ  Ｂ．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９５  １２５：１４０１〜１４１２によって定義されている。
【００２７】
本発明によって使用し得るプレバイオティクスは特に限定されず、腸内でプロバイオティクス又は健康に有益な微生物の増殖を促進する全ての食品が含まれる。好ましくは、プレバイオティクスは、フルクトース、ガラクトース、マンノースを任意選択で含有するオリゴ糖；食物繊維、特に、可溶性繊維、大豆繊維；イヌリン；又はこれらの混合物からなる群から選択され得る。好ましいプレバイオティクスは、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）、アラビノキシロオリゴ糖（ＡＸＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）、大豆オリゴ糖、グリコシルスクロース（ＧＳ）、ラクトスクロース（ＬＳ）、ラクツロース（ＬＡ）、パラチノースオリゴ糖（ＰＡＯ）、マルトオリゴ糖、ガム及び／又はその水解物、ペクチン及び／又はその水解物である。例えば、乳児用シリアルは、オリゴフルクトース、イヌリン又はこれらの組合せを含有し得る。
【００２８】
典型的には、乳児用シリアルは、摂取の前に、水と混合される。例えば、１５ｇの本発明の乳児用シリアルは、９０ｍＬの水と混合することができる。
【００２９】
本発明による乳児用シリアルは、任意の有効量で、例えば、約１０６〜１０１２ｃｆｕ／ｇ乾燥重量に相当する量で、非増殖性プロバイオティクス微生物を含み得る。
【００３０】
「非増殖性」プロバイオティクス微生物には、熱処理されたプロバイオティクス細菌が含まれる。これには、不活性化された、死んだ、生存不能、並びに／又はＤＮＡ、代謝物、細胞質化合物、及び／若しくは細胞壁材料などのフラグメントとして存在する微生物が含まれる。
【００３１】
「非増殖性」とは、古典的な蒔きかたによって生存細胞及び／又はコロニー形成単位を検出することができないことを意味する。このような古典的な蒔き方は、微生物学の書籍：Ｊａｍｅｓ  Ｍｏｎｒｏｅ  Ｊａｙ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、Ｄａｖｉｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｅｎ．２００５、Ｍｏｄｅｒｎ  ｆｏｏｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．７９０頁に要約されている。典型的には、生存細胞が存在しないことは、下記のように示すことができる：異なる濃度の細菌調製物（「非増殖性」試料）の播種、並びに適切な条件（少なくとも２４時間の好気性及び／又は嫌気性雰囲気）下でのインキュベーション後に、寒天プレート上で目に見えるコロニーがない、又は液体増殖培地の混濁度の増加がない。
【００３２】
プロバイオティクスは、本発明の目的のために、「宿主の健康又は幸福に対して有益な作用を有する微生物細胞調製物又は微生物細胞の成分」と定義される（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓ、Ｏｕｗｅｈａｎｄ  Ａ．Ｂｅｎｎｏ  Ｙ．ら、「Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｈｏｗ  ｓｈｏｕｌｄ  ｔｈｅｙ  ｂｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ」  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９：１０  １０７〜１０）。
【００３３】
非増殖性プロバイオティクス微生物を使用する可能性は、いくつかの利点を提供する。重度の免疫不全乳児において、生きたプロバイオティクスの使用は、菌血症が発生する潜在的な危険性によって例外的な場合に限定されることがある。非増殖性プロバイオティクスは、何の問題もなしに使用し得る。
【００３４】
さらに、非増殖性プロバイオティクス微生物を提供することは、乳児の健康上の利益を保持する一方で高温の再構成（ｈｏｔ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を可能にする。
【００３５】
本発明の組成物は、健康上の利益を少なくとも部分的に生じさせるのに十分な量の、非増殖性プロバイオティクス微生物を含む。これを達成するのに適当な量は、「治療有効用量」と定義される。この目的のための有効な量は、乳児の体重及び身体全体の健康状態などの当業者には公知のいくつかの要因、並びに食品マトリックスの作用によって決まる。
【００３６】
予防的用途において、本発明による組成物を、疾患を起こしやすい又はそうでなければ疾患の危険性がある消費者に、その疾患が発生する危険性を少なくとも部分的に減少させるのに十分な量で投与する。このような量は、「予防有効用量」として定義される。ここでまた、正確な量は、乳児の健康状態及び体重などのいくつかの要因、並びに食品マトリックスの作用によって決まる。
【００３７】
当業者は、治療有効用量及び／又は予防有効用量を適切に調節することができる。
【００３８】
一般に、本発明の組成物は、非増殖性プロバイオティクス微生物を治療有効用量及び／又は予防有効用量で含有する。
【００３９】
典型的には、治療有効用量及び／又は予防有効用量は、１日用量当たり約０．００５ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の非増殖性プロバイオティクス微生物である。
【００４０】
数値量に関して、「短時間高温」処理された非増殖性微生物は、組成物中に１０４〜１０１２当量ｃｆｕ／ｇ乾燥組成物に相当する量で存在し得る。明らかに、非増殖性微生物は、コロニーを形成しない。したがって、数値量に関しては、１０４〜１０１２ｃｆｕ／ｇの増殖性細菌から得られる非増殖性微生物の量と理解される。これには、不活性化された、生存不能、又は死んだ、又はＤＮＡ若しくは細胞壁若しくは細胞質化合物などのフラグメントとして存在する微生物が含まれる。すなわち、組成物が含有する微生物の量は、全ての微生物が、実際は不活性化された、又は死んだ、断片化された、又はこれらの状態の任意若しくは全ての混合物などの非増殖性であろうとなかろうと関わりなく、生きているかのように、微生物の量のコロニー形成能（ｃｆｕ）に関して表される。
【００４１】
好ましくは、非増殖性微生物は、１０４〜１０９ｃｆｕ／ｇ乾燥組成物に相当する量で、よりさらに好ましくは１０５〜１０９ｃｆｕ／ｇ乾燥組成物に相当する量で存在する。
【００４２】
プロバイオティクスは、当技術分野において公知の任意の方法によって非増殖性にし得る。
【００４３】
プロバイオティクス菌株を非増殖性にするのに今日利用可能な技術は通常、熱処理、γ−照射、紫外線、又は化学試剤（ホルマリン、パラホルムアルデヒド）の使用である。
【００４４】
食品産業の工業的状況において比較的容易に適用される、プロバイオティクスを非増殖性にする技術を使用することが好ましいであろう。
【００４５】
プロバイオティクスを含有する今日市場にある大部分の製品は、それらの生産の間に熱処理される。したがって、プロバイオティクスがそれらの有益な特性を保持若しくは改善し、又はさらに消費者のために新しい有益な特性を得る一方で、生産される製品と一緒に又は少なくとも同様の方法で、プロバイオティクスを熱処理できることは好都合であろう。
【００４６】
しかし文献においては、熱処理によるプロバイオティクス微生物の不活性化は、プロバイオティクス活性の少なくとも部分的な損失と一般に関連付けられる。
【００４７】
本発明者らは今驚いたことに、プロバイオティクス微生物を例えば、熱処理によって非増殖性にすることは、プロバイオティクスの健康上の利益の損失をもたらさず、それとは反対に、既にある健康上の利益を増強させ、健康上の新たな利益さえ生じさせ得ることを、見出した。
【００４８】
したがって、本発明の一実施形態は、非増殖性プロバイオティクス微生物が熱処理によって非増殖性とされた乳児用シリアルである。
【００４９】
このような熱処理は、少なくとも７１．５℃で少なくとも１秒間行い得る。
【００５０】
長時間熱処理又は短期間熱処理を行い得る。
【００５１】
今日の工業規模において、通常、ＵＨＴ様熱処理などの短期間熱処理が好ましい。この種の熱処理は細菌負荷を減少させ、処理時間を短縮し、それによって栄養素が損なわれることを減少させる。
【００５２】
本発明者らは、高温で短時間熱処理されたプロバイオティクス微生物が、それらの当初の特性に関わらず抗炎症性免疫プロファイルを示すことを初めて明らかにする。特に、この熱処理によって、新規な抗炎症性プロファイルが発生し、又は既にある抗炎症性プロファイルが増強される。
【００５３】
したがって、たとえ生きた対応物が抗炎症性菌株でなくても、典型的な産業上利用可能な熱処理に相当する特定の熱処理パラメーターを使用することによって、抗炎症性免疫プロファイルを有する非増殖性プロバイオティクス微生物を生じさせることは今や可能である。
【００５４】
したがって、例えば、熱処理は、約１〜１２０秒間の約７１．５〜１５０℃の高温処理でもよい。高温処理は、高温／短時間（ＨＴＳＴ）処理又は超高温（ＵＨＴ）処理でもよい。
【００５５】
プロバイオティクス微生物は、約１〜１２０秒の短期間、約７１．５〜１５０℃の高温処理に曝し得る。
【００５６】
より好ましくは、微生物は、約１〜３０秒の短期間、約９０〜１４０℃、例えば９０°〜１２０℃の高温処理に曝し得る。
【００５７】
この高温処理によって、微生物は少なくとも部分的に非増殖性となる。
【００５８】
高温処理は通常の大気圧で行い得るが、また高圧下で行い得る。典型的な圧力範囲は、１〜５０バール、好ましくは１〜１０バール、さらにより好ましくは２〜５バールである。明らかに、熱が加えられるとき、プロバイオティクスは、液体又は固体である培地中で熱処理されることが好ましい。したがって、加えられる理想的な圧力は、微生物がその中に供給される組成物の性質及び使用される温度によって決まる。
【００５９】
高温処理は、約７１．５〜１５０℃、好ましくは約９０〜１２０℃、さらにより好ましくは約１２０〜１４０℃の温度範囲で行い得る。
【００６０】
高温処理は、約１〜１２０秒、好ましくは、約１〜３０秒、さらにより好ましくは約５〜１５秒の短期間で行い得る。
【００６１】
この所与の時間枠は、プロバイオティクス微生物が所与の温度に曝される時間を意味する。微生物がその中に供給される組成物の性質及び量によって、及び使用する加熱装置の構造によって、熱を加える時間は変化し得ることに留意されたい。
【００６２】
しかし典型的には、本発明の組成物及び／又は微生物は、高温短時間（ＨＴＳＴ）処理、瞬間殺菌又は超高温（ＵＨＴ）処理によって処理される。
【００６３】
ＵＨＴ処理は、組成物を短時間、概ね１〜１０秒間、乳中の細菌胞子を殺すのに必要とされる温度である１３５℃（２７５°Ｆ）を超える温度で加熱することによる組成物の少なくとも部分殺菌を伴う、超高温加工（ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）又は超熱処理（ｕｌｔｒａ−ｈｅａｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（両方とも、ＵＨＴと省略）である。例えば、１３５℃を超える温度を使用してこのように乳を加工することは、必要な保持時間（２〜５秒まで）で細菌負荷の減少を可能にし、それによって連続流れ操作が可能となる。
【００６４】
２つの主要なタイプのＵＨＴシステム（直接及び間接システム）がある。直接システムにおいて、製品はスチームインジェクション（ｓｔｅａｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）又はスチームインフュージョン（ｓｔｅａｍ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によって処理され、一方では間接システムにおいて、製品を、平板熱交換器、多管式熱交換器又はかき取り表面熱交換器を使用して熱処理する。ＵＨＴシステムの組合せは、製品調製の工程において、任意のステップで又は複数のステップで適用し得る。
【００６５】
ＨＴＳＴ処理は、下記のように定義される（高温／短時間）：乳中の生存している微生物の数の９９．９９９９％を殺す、５対数の減少を達成するように設計される低温殺菌法。これはほぼ全ての酵母、カビ及び一般の腐敗細菌を破壊するのに十分であると考えられ、一般の病原性耐熱生物の十分な破壊をまた確実なものとする。ＨＴＳＴ工程において、乳を７１．７℃（１６１°Ｆ）に１５〜２０秒間加熱する。
【００６６】
瞬間殺菌法は、果汁及び野菜汁、ビール及び乳製品などの腐敗しやすい飲料の低温殺菌の方法である。腐敗微生物を殺し、製品をより安全なものとし、それらの保存寿命を延ばすために、瞬間殺菌は容器への充填の前に行う。液体は、７１．５℃（１６０°Ｆ）〜７４℃（１６５°Ｆ）の温度に約１５〜３０秒間曝される間、制御された連続流れで移動する。
【００６７】
本発明の目的のために、「短時間高温処理」という用語には、例えば、高温短時間（ＨＴＳＴ）処理、ＵＨＴ処理、及び瞬間殺菌法が含まれる。
【００６８】
このような熱処理は改善された抗炎症性プロファイルを有する非増殖性プロバイオティクスを提供するため、本発明の乳児用シリアルは、炎症性疾患の予防又は治療において用い得る。
【００６９】
本発明を用いて調製される組成物によって治療又は予防することができる炎症性疾患は、特に限定されない。例えば、これらは、敗血症などの急性炎症；火傷；及び炎症性腸疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸嚢炎などの慢性炎症；壊死性腸炎；ＵＶ又は化学物質が誘発する皮膚炎、湿疹、反応性皮膚などの皮膚炎；過敏性腸症候群；眼炎；アレルギー、喘息；並びにこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【００７０】
プロバイオティクス微生物を非増殖性とするために長時間熱処理が使用される場合、このような熱処理は、約７０〜１５０℃の温度範囲で約３分〜２時間、好ましくは８０〜１４０℃の範囲で５分〜４０分行い得る。
【００７１】
従来技術は一般に、長時間熱処理によって非増殖性とされた細菌が通常、それらのプロバイオティクス特性の発揮に関して生細胞より効率的でないことを教示するが、本発明者らは、熱処理されたプロバイオティクスが、生きた対応物と比較して免疫系を刺激することにおいて優れていることを示すことができた。
【００７２】
本発明はまた、少なくとも約７０℃での少なくとも約３分間の熱処理によって非増殖性とされたプロバイオティクス微生物を含む乳児用シリアルに関する。
【００７３】
非増殖性プロバイオティクスの免疫向上作用は、インビトロ免疫プロファイリングによって確認された。使用されたインビトロモデルは、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカインのプロファイリングを使用し、当技術分野で免疫調節性化合物の試験のための標準モデルとしてよく受け入れられている（Ｓｃｈｕｌｔｚら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０、１６５〜１７３；Ｔａｙｌｏｒら、２００６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ、３６、１２２７〜１２３５；Ｋｅｋｋｏｎｅｎら、２００８、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４、１１９２〜１２０３）。
【００７４】
インビトロＰＢＭＣアッセイは、幾人かの著者／研究チームによって、例えば、プロバイオティクスを、その免疫プロファイル、すなわち、その抗炎症性又は炎症誘発性の特徴によって分類するために、使用されてきた（Ｋｅｋｋｏｎｅｎら、２００８、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４、１１９２〜１２０３）。例えば、このアッセイは、大腸炎のマウスモデルにおけるプロバイオティクス候補の抗炎症作用の予測を可能にすることが示されてきた（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。さらに、このアッセイは、臨床試験における読み出し情報として通常使用され、臨床成果と一貫する結果をもたらすことが示された（Ｓｃｈｕｌｔｚら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０、１６５〜１７３；Ｔａｙｌｏｒら、２００６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ、３６、１２２７〜１２３５）。
【００７５】
アレルギー性疾患は過去数十年に亘り着実に増加してきており、ＷＨＯによって流行病と現在見なされている。一般的に、アレルギーは、免疫系のＴｈ１及びＴｈ２応答の間の不平衡に起因し、Ｔｈ２メディエーターの産生への強力な偏りをもたらすと考えられている。したがって、免疫系のＴｈ１及びＴｈ２アームの間の適切な平衡を回復することによって、アレルギーを軽減、下方制御又は予防することができる。これは、Ｔｈ２応答を減少させ、又は少なくとも一時的に、Ｔｈ１応答を増強する必要性を意味する。後者は、例えばより高いレベルのＩＦＮγ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２を伴うことが多い免疫ブースト反応の特徴であろう。（Ｋｅｋｋｏｎｅｎら、２００８、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４、１１９２〜１２０３；Ｖｉｌｊａｎｅｎ  Ｍ．ら、２００５、Ａｌｌｅｒｇｙ、６０、４９４〜５００）
【００７６】
したがって、本発明の乳児用シリアルは、免疫防御不全と関連する疾患を治療又は予防することを可能とする。
【００７７】
結果的に、本発明を用いて調製される組成物によって治療又は予防することができる免疫防御不全と関連している疾患は、特に限定されない。
【００７８】
例えば、これらの疾患は、感染症、特に、細菌、ウイルス、真菌及び／又は寄生虫の感染症；食細胞欠損；ストレス又は免疫抑制薬、化学療法又は放射線療法によって誘発されるものなどの低いレベルから重症レベルまでの免疫抑制；新生児の免疫系などのより免疫適格性ではない免疫系の自然状態；アレルギー；並びにこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【００７９】
本発明に記載する乳児用シリアルはまた、ワクチン、特に経口ワクチンへの患者の反応の増強を可能とする。
【００８０】
任意の量の非増殖性微生物が有効である。しかし、プロバイオティクスの少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的には全てが非増殖性である場合が一般に好ましい。
【００８１】
本発明の一実施形態において、全ての微生物は、非増殖性である。
【００８２】
結果的に、本発明の乳児用シリアルにおいて、プロバイオティクスの少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的には全ては、非増殖性である。
【００８３】
全てのプロバイオティクス微生物を、本発明の目的のために使用し得る。
【００８４】
例えば、プロバイオティクス微生物は、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、プロピオニバクテリウム属、又はこれらの組合せ、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ジアセチラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブレッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び／又はこれらの混合物からなる群から選択し得る。
【００８５】
本発明による乳児用シリアルは、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・ジョンソニーＬａ１、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９８３、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・ブルガリカスＮＣＣ１５、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７、又はこれらの組合せからなる群から選択される非増殖性プロバイオティクス微生物を含み得る。
【００８６】
全てのこれらの菌株は、ブダペスト条約により寄託されていたか、及び／又は市販のものである。
【００８７】
菌株を、ブダペスト条約の元で下記のように寄託した。
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ  ３００１：ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ  ２７０５：ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８
ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ  ２９５０：ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５
ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ  ２８１８：ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４６
ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ  ２４６１：ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６
ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ  ４００７：ＣＧＭＣＣ１．３７２４
ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ  ２０１９：ＣＮＣＭ  Ｉ−１４２２
ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ  ２０５９：ＣＮＣＭ  Ｉ−４１５３
ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ  ２２８７：ＣＮＣＭ  Ｉ−４１５４
ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ  ４００６：ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８
ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ  １８２５：ＡＣＡ−ＤＣ  ６００２
ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ  ３００９：ＡＴＣＣ  ７００３９６
ラクトバチルス・ブルガリカスＮＣＣ  １５：ＣＮＣＭ  Ｉ−１１９８
ラクトバチルス・ジョンソニーＬａ１：ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ  １７９８３：ＤＳＭ  １７９８３
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ５５７３０：ＡＴＣＣ  ５５７３０
エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅ１９１７：ＤＳＭ  ６６０１
【００８８】
当業者は、本明細書に記載されている本発明の全ての特徴を、開示されているような本発明の範囲から逸脱することなく自由に合わせることができることを理解するであろう。
【００８９】
本発明のさらなる利点及び特徴は、下記の実施例及び図から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１Ａ】「短時間高温」で処理されたプロバイオティクスの抗炎症性免疫プロファイルの増強を示す。
【図１Ｂ】「短時間高温」で処理されたプロバイオティクスの抗炎症性免疫プロファイルの増強を示す。
【図２】「短時間高温」で処理された後、抗炎症性となった、すなわちインビトロで顕著な抗炎症性免疫プロファイルを示す非抗炎症性プロバイオティクス菌株を示す。
【図３Ａ】「短時間高温」で処理された後、インビトロで増強した又は新しい抗炎症性免疫プロファイルを示す、市販の製品中で使用されているプロバイオティクス菌株を示す。
【図３Ｂ】「短時間高温」で処理された後、インビトロで増強した又は新しい抗炎症性免疫プロファイルを示す、市販の製品中で使用されているプロバイオティクス菌株を示す。
【図４Ａ】高温での熱処理によって、インビトロで増強した又は新しい抗炎症性免疫プロファイルを示す、乳製品スターター菌株（すなわち、Ｌｃ１スターター菌株）を示す。
【図４Ｂ】高温での熱処理によって、インビトロで増強した又は新しい抗炎症性免疫プロファイルを示す、乳製品スターター菌株（すなわち、Ｌｃ１スターター菌株）を示す。
【図５】ＨＴＳＴ処理で処理された後に、インビトロで抗炎症性免疫プロファイルを示す、非抗炎症性プロバイオティクス菌株を示す。
【図６】生菌及び熱処理された（１４０℃、１５秒間）形態の、プロバイオティクス及び乳製品スターター菌株によって生じた、ＰＢＭＣデータ上の主成分分析（ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０）。各点は、そのＮＣＣ番号又は名称によって同定される、生菌又は熱処理された１つの菌株を表す。
【図７】生菌株及び熱処理された（８５℃、２０分）菌株のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比を示す。全体的に、８５℃での２０分間の熱処理は、本発明の「短時間高温」処理とは対照的に、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比の増加をもたらす（図１、２、３、４及び５）。
【図８】熱処理された細菌で刺激されたヒトＰＢＭＣからの、インビトロサイトカイン分泌の増強を示す。
【図９】食塩水で誘発されたＯＶＡ感作マウス（陰性対照）、ＯＶＡで誘発されたＯＶＡ感作マウス（陽性対照）、及びＯＶＡで誘発され、熱処理された又は生菌のビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０で処置されたＯＶＡ感作マウスにおいて観察された下痢の激しさの割合を示す。結果は、下痢の激しさ（４つの独立の実験から計算した平均±ＳＥＭ）の割合として示され、１００％の下痢の激しさは、陽性対照（感作かつアレルゲンによって誘発された）群において発生した症状に相当する。
【００９１】
実施例１
【００９２】
方法
【００９３】
細菌調製物：
【００９４】
生きたプロバイオティクスによってもたらされる宿主の免疫系に対する健康上の利益は一般に、菌株特異的であると見なされる。インビトロで高レベルのＩＬ−１０及び／又は低レベルの炎症促進性サイトカインを誘発するプロバイオティクス（ＰＢＭＣアッセイ）は、インビボで強力な抗炎症性菌株であることが示されてきた（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。
【００９５】
熱処理されたプロバイオティクスの抗炎症性特性を調査するため、いくつかのプロバイオティクス菌株を使用した。これらは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）、及びエシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅであった。Ｎｅｓｔｌｅ  Ｌｃ１発酵製品を生産するために商業的に使用されるいくつかの菌株を含めたいくつかのスターター培養菌株（ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・ブルガリカスＮＣＣ１５及びラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７）もまた試験した。
【００９６】
細菌細胞は、５〜１５Ｌのバイオリアクター中で各菌株について最適化した条件で培養した。全ての典型的な細菌増殖培地が使用可能である。このような培地は、当業者には公知である。ｐＨを５．５に調節したとき、３０％塩基溶液（ＮａＯＨ又はＣａ（ＯＨ）２）を連続的に加えた。適当なとき、ヘッドスペースをＣＯ２でガス処理することによって嫌気性条件を維持した。エシェリキア・コリを、標準的な好気条件下で培養した。
【００９７】
細菌細胞を、遠心分離（５，０００×ｇ、４℃）によって集められ、概ね１０９〜１０１０ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度に達するように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に適当な容量で再懸濁された。調製物の一部は、−８０℃で１５％グリセロールと共に冷凍された。別の部分の細胞を、以下によって熱処理された。
超高温：１４０℃、１５秒間；間接スチームインジェクションによる。
高温短時間（ＨＴＳＴ）：７４℃、９０℃及び１２０℃、１５秒間、間接スチームインジェクションによる。
ウオーターバス中で長時間低温（８５℃、２０分）。
【００９８】
熱処理した上で、試料は使用されるまで−８０℃で冷凍保存された。
【００９９】
細菌調製物のインビトロ免疫プロファイリング：
【０１００】
生細菌調製物及び熱処理された細菌調製物の免疫プロファイル（すなわち、インビトロでヒト血液細胞からの特定のサイトカインの分泌を誘発する能力）を評価した。ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、血液フィルターから単離した。細胞密度勾配による分離の後、単核細胞を集め、ハンクス平衡塩類溶液で２度洗浄した。次いで、細胞は、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）が添加されたＩｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させた。次いで、ＰＢＭＣ（７×１０５細胞／ウェル）を、生細菌及び熱処理された細菌（７×１０６ｃｆｕ／ウェル当量）と共に４８ウェルプレート中で３６時間インキュベートした。生細菌及び熱処理された細菌の作用は、２つの別々の実験に分割した８人の個々のドナーからのＰＢＭＣ上で試験された。３６時間のインキュベーション後、培養プレートは冷凍され、サイトカイン測定まで−２０℃で保持された。サイトカインプロファイリングは、生細菌及びそれらの熱処理された対応物について平行（すなわち、ＰＢＭＣの同じバッチ上の同じ実験で）で行った。
【０１０１】
３６時間のインキュベーション後の細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０）のレベルは、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１０、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ１２ｐ４０、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦα、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ）によって決定された。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αは、炎症性サイトカインであり、一方、ＩＬ−１０は、強力な抗炎症メディエーターである。結果は、４人の個別のドナーの平均（ｐｇ／ｍｌ）＋／−ＳＥＭとして表すが、各々４人のドナーで行う２つの個別の実験の代表である。ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、各菌株についてインビボの抗炎症作用の予測値として計算する（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。
【０１０２】
各菌株についてのＥＬＩＳＡ（上記を参照されたい）によって決定したサイトカインの数値（ｐｇ／ｍｌ）を、ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ  ｖ５．１０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ、Ｓｉｎｔ−Ｍａｒｔｅｎｓ−Ｌａｔｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に移した。主成分分析（ＰＣＡ、ディメンショニング技術）を、このセットのデータで行った。数字についての平均の引き算、及び数字についての分散値による割り算を、主成分分析に含めた。
【０１０３】
結果
【０１０４】
超高温（ＵＨＴ）／高温短時間（ＨＴＳＴ）様処理によって生じた抗炎症性プロファイル
【０１０５】
調査中のプロバイオティクス菌株を、一連の熱処理（超高温（ＵＨＴ）、高温短時間（ＨＴＳＴ）及び８５℃に２０分間）に曝し、それらの免疫プロファイルを、インビトロでの生細胞の免疫プロファイルと比較した。生きた微生物（プロバイオティクス及び／又は乳製品スターター培養物）は、ヒトＰＢＭＣと共にインキュベートしたとき、異なるレベルのサイトカイン産生を誘発した（図１、２、３、４及び５）。これらの微生物の熱処理は、温度依存的態様でＰＢＭＣによって産生されたサイトカインのレベルを変更させた。「短時間高温」処理（１２０℃又は１４０℃、１５秒間）は、抗炎症性免疫プロファイルを有する非増殖性細菌を生じさせた（図１、２、３及び４）。実際に、ＵＨＴ様処理した菌株（１４０℃、１５秒）は、ＩＬ−１０産生をさらに維持又は誘発する一方で、より少ない炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０）を誘発した（生きた対応物と比較して）。このように得られたＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、生細胞と比較して、任意のＵＨＴ様処理した菌株についてより低かった（図１、２、３及び４）。この観察はまた、ＨＴＳＴ様処理によって処理された、すなわち１２０℃に１５秒間（図１、２、３及び４）、又は７４℃及び９０℃に１５秒間（図５）曝露された細菌についても有効であった。熱処理（ＵＨＴ様又はＨＴＳＴ様処理）は、プロバイオティクス菌株（図１、２、３及び５）及び乳製品スターター培養物（図４）のインビトロ免疫プロファイルに対して同様の作用を有した。生きたプロバイオティクス及び熱処理された（１４０℃、１５秒）プロバイオティクス並びに乳製品スターター菌株によって産生されたＰＢＭＣデータ上の主成分分析によって、生菌株はｘ軸に沿って至る所に分布することが明らかになり、これは菌株がインビトロで低（左側）から高（右側）までの炎症性サイトカインの誘発物質という、非常に異なる免疫プロファイルを示すことを例示する。熱処理された菌株はグラフの左側上に集団を作り、炎症性サイトカインは熱処理された菌株によってより少なく誘発されることを示す（図６）。対照的に、８５℃で２０分間熱処理された細菌は、生細胞よりもより多い炎症性サイトカインを、及びより少ないＩＬ−１０を誘発し、より高いＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比をもたらす（図７）。
【０１０６】
抗炎症性プロファイルは、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様処理によって増強又は生じる。
【０１０７】
ＵＨＴ及びＨＴＳＴ処理された菌株は、それらの各々の当初の免疫プロファイル（生細胞）に関わらず、抗炎症性プロファイルを示す。インビボで抗炎症性であることが公知であり、インビトロで抗炎症性プロファイルを示すことが知られているプロバイオティクス菌株（ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８）は、「短時間高温」処理後に、増強された抗炎症性プロファイルをインビトロで示すことが示された。図１に示されているように、ＵＨＴ様処理されたビフィドバクテリウム属菌株のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、生きた対応物のより低く、したがって、ＵＨＴ様処理された試料の改善された抗炎症性プロファイルを示した。より顕しくは、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様処理によって抗炎症性プロファイルが生じたことは、非抗炎症性の生菌株についてまた確認された。生きているラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７及びラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１は共に、高いＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比をインビトロで示す（図２及び５）。２つの生菌株は、マウスにおいてＴＮＢＳ誘発大腸炎に対して保護作用がないことが示された。ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７及びラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１によって誘発されたＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、「短時間高温」処理（ＵＨＴ又はＨＴＳＴ）後に劇的に減少し、ビフィドバクテリウム属菌株で得られたＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比と同じぐらい低いレベルに達した。これらの低いＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、ＩＬ−１０分泌についての変化なし（ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７）又は劇的な誘発（ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１）と合わせて、低レベルのＩＬ−１２ｐ４０産生によるものである（図２）。
【０１０８】
結果として、
生きた微生物の抗炎症性プロファイルは、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様熱処理によって増強させることができ（例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８）、
抗炎症性プロファイルは、非抗炎症性の生きた微生物（例えば、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、乳製品スターターであるストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９）からＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様熱処理によって生じさせることができ、
抗炎症性プロファイルはまた、プロバイオティクスのエシェリキア・コリ菌株を含めた市販の製品から単離した菌株について示された（図３Ａ及びＢ）。
【０１０９】
ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理の影響は、全ての試験したプロバイオティクス及び乳製品スターター、例えば、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属及びストレプトコッカス属について同様であった。
【０１１０】
ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理を、異なるインビトロ免疫プロファイルを示すいくつかのラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属及びストレプトコッカス属に適用した。全ての菌株は、ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理後に、生きた対応物より低い炎症性サイトカインを誘発し（図１、２、３、４、５及び６）、これは、結果として得られた非増殖性細菌の免疫特性に対するＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理の作用が、全てのプロバイオティクス、特にラクトバチルス属及びビフィドバクテリウム属及び特定のエシェリキア・コリ菌株、並びに全ての乳製品スターター培養物、特にストレプトコッカス属、ラクトコッカス属及びラクトバチルス属に一般化することができることを示す。
【０１１１】
実施例２
【０１１２】
方法
【０１１３】
細菌調製物：
【０１１４】
非増殖性プロバイオティクスの免疫向上特性を調査するために５種のプロバイオティクス菌株を使用した。３種のビフィドバクテリウム属（ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０）及び２種のラクトバチルス属（ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７）。
【０１１５】
細菌細胞を、バッチ発酵において、ＭＲＳ上で３７℃にて１６〜１８時間、ｐＨ制御なしで増殖させた。細菌細胞は遠心分離（５，０００×ｇ、４℃）され、１０Ｅ１０ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度に達するように食塩水に希釈する前、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁された。ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７は、ウオーターバス中にて８５℃で２０分間熱処理された。ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０は、水バス中にて９０℃で３０分間熱処理された。熱処理された細菌の懸濁液は分取され、使用するまで−８０℃で冷凍保存された。生細菌は、使用するまで−８０℃でＰＢＳ−グリセロール１５％中に保存された。
【０１１６】
細菌調製物のインビトロ免疫プロファイリング
【０１１７】
生細菌調製物及び熱処理された細菌調製物の免疫プロファイル（すなわち、インビトロでヒト血液細胞から特定のサイトカインの分泌を誘発する能力）を評価した。ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、血液フィルターから単離した。細胞密度勾配による分離の後、単核細胞を集め、ハンクス平衡塩類溶液で２度洗浄した。次いで、細胞は、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）が添加されたＩｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁された。次いで、ＰＢＭＣ（７×１０５の細胞／ウェル）を、生細菌及び熱処理された細菌（７×１０６ｃｆｕ／ウェル当量）と共に４８ウェルプレート中で３６時間インキュベートした。生細菌及び熱処理された細菌の作用を、２つの別々の実験に分割した８人の個別のドナーからのＰＢＭＣ上で試験した。３６時間のインキュベーション後、培養プレートは冷凍され、サイトカイン測定まで−２０℃で保存された。サイトカインプロファイリングは、生細菌及びそれらの熱処理された対応物について平行（すなわち、ＰＢＭＣの同じバッチでの同じ実験において）で行った。
【０１１８】
３６時間のインキュベーション後の細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０）のレベルは、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１０、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ１２ｐ４０、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ）によって決定された。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αは、炎症性サイトカインであり、一方ＩＬ−１０は、強力な抗炎症メディエーターである。結果は、４人の個別のドナーの平均（ｐｇ／ｍｌ）＋／−ＳＥＭとして表すが、各々４人のドナーで行う２つの個別の実験の代表である。
【０１１９】
アレルギー性下痢症の予防における、生菌及び熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０のインビボ作用
【０１２０】
ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０のＴｈ１促進作用を試験するために、アレルギー性下痢症のマウスモデルを使用した（Ｂｒａｎｄｔ  Ｅ．Ｂら、ＪＣＩ２００３；１１２（１１）：１６６６〜１６６７）。感作（１４日の間隔で、オボアルブミン（ＯＶＡ）及び硫酸アルミニウムカリウムの２回の腹腔内注射；０日目及び１４日目）に続き、雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、６回（２７日目、２９日目、３２日目、３４日目、３６日目、３９日目）ＯＶＡで経口的に誘発し、その結果一過的臨床症状（下痢症）及び免疫パラメーターの変化（総ＩｇＥ、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ、マウス肥満細胞プロテアーゼ１、すなわち、ＭＭＣＰ−１の血漿濃度）がもたらされた。生菌又は９０℃で３０分間熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０を、ＯＶＡ感作の４日前に（−３日目、−２日目、−１日目、０日目）及び１１日目、１２日目、１３日目及び１４日目、並びに誘発期間の間に（２３〜３９日目）、胃管栄養法によって投与した。概ね１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）又は当量ｃｆｕ／マウスの１日当たり細菌量を使用した。
【０１２１】
結果
【０１２２】
熱処理後の「炎症誘発性」サイトカインの分泌の誘発
【０１２３】
熱処理された菌株のヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）によるサイトカイン分泌を刺激する能力をインビトロで評価した。熱処理された細菌によるＰＢＭＣの刺激による４つのサイトカインに基づいた免疫プロファイルを、同じインビトロアッセイにおいて生細菌細胞によって誘発される免疫プロファイルと比較した。
【０１２４】
熱処理された調製物を蒔き、生菌数が存在しないことについて評価した。熱処理された細菌調製物は、プレーティング後にコロニーを産生しなかった。
【０１２５】
生きたプロバイオティクスは、ヒトＰＢＭＣと共にインキュベートされるときに、異なる、かつ菌株依存的なレベルのサイトカイン産生を誘発した（図８）。プロバイオティクスの熱処理は、生きた対応物と比較すると、ＰＢＭＣによって産生されるサイトカインのレベルを変更した。熱処理された細菌は、生きた対応物よりも炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０）をより誘発した。対照的に、これらのデータは、熱処理された細菌は、生細胞と比較して同様又はより低い量のＩＬ−１０を誘発した（図８）。熱処理された細菌が生きた対応物よりも免疫系をより刺激することができ、したがって弱体化した免疫防御をより向上できることを示す。すなわち、インビトロデータは、熱処理後の菌種の増強された免疫向上作用を例示する。
【０１２６】
（生細胞と比較した）熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０の、免疫系に対する増強された作用を例示するために、生きている及び熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０（菌株Ａ）の両方を、アレルギー性下痢症の動物モデルにおいて試験した。
【０１２７】
陽性対照群と比較して、下痢の激しさは、熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０による処置後に有意に及び一貫して減少（４１．１％±４．８）し、一方では下痢の激しさは、生菌のビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０による処置後に２０±２８．３％のみ低下した。これらの結果は、熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０が、その生きた対応物よりアレルギー性下痢に対して増強された保護作用を示すことを示す（図９）。
【０１２８】
結果として、プロバイオティクスが免疫防御を増強する能力は、熱処理の後に改善することが示された。
【０１２９】
実施例３及び４
【０１３０】
下記の組成物を調製し得る。
【０１３１】
４〜６カ月の月齢の乳児用：
【０１３２】
成分：米粉、トウモロコシマルトデキストリン、ビタミンＣ、ミネラル（鉄）。
【０１３３】
【表１】
2012526760.tif 000002
【０１３４】
６〜１２カ月の月齢の乳児用：
【０１３５】
成分：コムギ粉、セモリナ（コムギ）、ミネラル（鉄）、ビタミン［Ｃ、ナイアシン、Ｂ６、チアミン］、トウモロコシマルトデキストリン。
【０１３６】
【表２】
2012526760.tif 000003
【図１】
2012526760.tif 000004
【図２】
2012526760.tif 000005
【図３】
2012526760.tif 000006
【図４】
2012526760.tif 000007
【図５】
2012526760.tif 000008
【図６】
2012526760.tif 000009
【図７】
2012526760.tif 000010
【図８】
2012526760.tif 000011
【図９】
2012526760.tif 000012
【国際調査報告】
2012526760.tif 000013
2012526760.tif 000014
2012526760.tif 000015
2012526760.tif 000016