(57)【要約】  本発明は、1セットのシグネチャー遺伝子のRNAレベルを判定することによって、結腸直腸癌細胞を型判別する方法に関する。前記型判別は、前記結腸直腸癌の再発のリスクを予測するのに使用することができる。本発明はさらに、前記セットのシグネチャー遺伝子のRNAレベルを正規化するのに使用することができる1セットの遺伝子、および前記セットのシグネチャー遺伝子を含むマイクロアレイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌を罹患しているか、またはこれを罹患している疑いのある個体のRNA試料を型判別するための方法であって、
a.前記個体に由来する、結腸直腸癌細胞を含むか、または結腸直腸癌細胞を含む疑いのある組織試料から調製されるRNA試料を提供するステップと;
b.前記RNA試料中の1セットの遺伝子についてのRNAレベルを判定するステップと;
c.前記セットの遺伝子について判定されたRNAレベルに基づいて前記RNA試料を型判別するステップと
を含み、前記セットの遺伝子は、Table 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つを含む方法。
【請求項２】
前記セットの遺伝子が、Table 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも10個を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記セットの遺伝子が、MCTP1、LAMA3、CTSC、PYROXD1、EDEM1、IL2RB、ZNF697、SLC6A12、IL2RA、CYXIP2、PIM3、LIF、M6PRBP1、CA438802、HSD3B1、ZBED4、PPARA、THNSL2を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記RNAレベルは、マイクロアレイ分析によって判定される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記試料における前記セットの遺伝子の判定されたRNAレベルを正規化するステップをさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記結腸直腸癌が、TNM病期分類システムによるTNM病期I、TNM病期II、またはTNM病期IIIの癌を含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記型判別が、低い転移能を有する癌細胞と、高い転移能を有する癌細胞を区別する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
結腸直腸癌を罹患している個体の分類方法であって、
(a)前記個体に由来する、結腸直腸癌細胞を含むか、または結腸直腸癌細胞を含む疑いのある組織試料から調製される、前記個体に由来するRNA試料を提供するステップと;
(b)前記試料中のTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つを含む1セットの遺伝子についてのRNAのレベルを判定するステップと;
(c)前記個体における該セットの遺伝子からの発現のレベルと、5年間の初期診断内に再発性疾患がない患者における前記セットの遺伝子からの発現のレベルとの間の類似値を求めるステップと;
(d)前記類似値が第1の類似閾値未満である場合、不良な予後を有するとして前記個体を分類し、前記類似値が前記第1の類似閾値を超える場合、良好な予後を有するとして前記個体を分類するステップと
を含む方法によって、不良な予後または良好な予後を有するとして前記個体を分類するステップを含む分類方法。
【請求項９】
前記セットの遺伝子についてのRNAの判定されたレベルが正規化されている、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
結腸直腸癌を罹患している個体に治療を割り当てる方法であって、
(a)請求項8または請求項9に従って、良好な予後または不良な予後を有するとして前記個体を分類するステップと;
(b)前記個体が、前記不良な予後を有するとして分類される場合、化学療法を割り当てるステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記結腸直腸癌が結腸癌を含む、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
結腸直腸癌を罹患しているか、またはこれを罹患している疑いのある個体のRNA試料を型判別するための結腸直腸遺伝子シグネチャーを開発する方法であって、非MSI結腸直腸癌から得られるRNA試料中の無遠隔転移生存期間に関連する1セットの遺伝子を判定するステップを含む方法。
【請求項１３】
結腸直腸癌を罹患しているか、またはこれを罹患している疑いのある個体のRNA試料を型判別するための結腸直腸遺伝子シグネチャーを開発する方法であって、B-Rafの600位にバリンを有する結腸直腸癌試料から得られるRNA試料中の無遠隔転移生存期間に関連する1セットの遺伝子を判定するステップを含む方法。
【請求項１４】
合計で100から12,000の間の核酸分子を含むヌクレオチドマイクロアレイであって、前記核酸分子の少なくとも2つは、Table 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つを含む1セットの遺伝子にハイブリダイズすることができる、ヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項１５】
低い転移能を有する結腸直腸癌細胞と高い転移能を有する結腸直腸癌細胞を区別するための、請求項14に記載のアレイの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、結腸直腸癌細胞を型判別するための方法に関する。本発明は、低い転移能(metastasizing potential)および高い転移能(metastatic potential)を有する結腸直腸癌細胞を区別するための手段および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に、100万を超える結腸直腸癌の新規症例が2002年に診断され、すべての新規癌症例の9%超を占めた(Riesら編  National Cancer Institute Bethesda、MD. 2006. 5-3-2006. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003)。結腸直腸癌は、肺および乳房に続いて、世界的に3番目に最も一般的な癌であり、すべての結腸直腸癌の3分の2が、より発展した領域において起こっている。すべての癌と同様に、生存時間の見込みは、癌が早期に検出される場合、患者にとって良好である。病期I患者は、約93%の生存率を有する一方で、5年生存率は、病期II患者において約80%に低下し、病期III患者において60%に低下する(Sobreroら、2006. The Lancet Oncology 7(6):515〜517頁)。
【０００３】
多数の臨床試験にもかかわらず、病期II結腸癌患者のためのアジュバント化学療法の利点は、依然として議論の余地がある(Andreら、2006. Annals of Surgical Oncology 13(6): 887〜898頁)。アジュバント療法を、病期IIの結腸癌または結腸直腸癌を有する患者における知見と比較する臨床試験のいくつかの分析およびメタ分析が実施された(概説については、Bensonら、2004. Journal of Clinical Oncology 22: 3408〜3419頁を参照)。患者の4分の3は、手術だけによって治癒し、したがって患者の25%未満が、追加の化学療法から利益を得る。結果として、アジュバント化学療法を受けている患者の数は、先進国の中で著しく変化し、公式の指針には、明らかな勧告がまったく示されてない(Van Cutsemら、2005. Annals of Oncology 16(補遺l):i18〜i19頁)。病期III患者について、アジュバント治療は、すべての患者に推奨されるが(Gillら、2004. Journal of Clinical Oncology 22: 1797〜1806頁)、T1またはT2 N1 MO腫瘍(病期IIIA)を有する患者は、病期IIB患者より有意に良好な生存率を有し、多くの患者は、追加の化学療法を必要としないことを示す。
【０００４】
したがって、再発性疾患を罹患する可能性がより高い患者のサブグループを識別することにより、手術後にアジュバント治療から利益を得る可能性がより高い患者を識別することが可能になる。予後を予測する臨床病理学的パラメータの識別に、多くの努力が払われている。再発のリスクを予測するための最も重要な要因は、緊急提示(emergency presentation)、低分化型腫瘍(組織学的悪性度)、および腫瘍浸潤の深度、ならびに隣接臓器への浸潤(T4)である(Van Cutsemら、2005. Annals of Oncology 16(補遺_1):i18〜i19頁; Le Voyerら、2003. Journal of Clinical Oncology 21: 2912〜2919頁)。不十分な数のリンパ節の評価は、追加のリスク要因であり、その理由は、調査されるリンパ節の数が少ないことは、5年生存率の減少に関連するためである。これらの臨床的パラメータは、転帰に相関することが示されているが、医師は、これらは、高いリスクの患者を正確に識別するのに不十分であることを認識する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO199820355
【特許文献２】WO2003068788
【特許文献３】US06204375
【特許文献４】DE10021390
【特許文献５】WO04083369
【特許文献６】US7138226
【特許文献７】WO2002103320
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Riesら編  National Cancer Institute Bethesda、MD. 2006. 5-3-2006. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003
【非特許文献２】Sobreroら、2006. The Lancet Oncology 7(6):515〜517頁
【非特許文献３】Andreら、2006. Annals of Surgical Oncology 13(6): 887〜898頁
【非特許文献４】Bensonら、2004. Journal of Clinical Oncology 22: 3408〜3419頁
【非特許文献５】Van Cutsemら、2005. Annals of Oncology 16(補遺l):i18〜i19頁
【非特許文献６】Gillら、2004. Journal of Clinical Oncology 22: 1797〜1806頁
【非特許文献７】Le Voyerら、2003. Journal of Clinical Oncology 21: 2912〜2919頁
【非特許文献８】Simonら、Design and Analysis of DNA Microarray Investigations、Springer-Verlag New York、(2003)
【非特許文献９】Kornら、Journal of Statistical Planning and Inference 124、379〜398頁(2004)
【非特許文献１０】Yangら  2005. Cancer Lett 226: 55〜63頁
【非特許文献１１】Elderingら、Nucleic Acids Res 2003; 31: e153
【非特許文献１２】Martin- Magnietteら、Bioinformatics 21:1995〜2000頁(2005)
【非特許文献１３】Yangら、Nucl Acids Res 30: 15(2002)
【非特許文献１４】Fanら、Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 5:4810〜3頁(2005)
【非特許文献１５】van 't Veerら、Nature 415: 484〜5頁(2002)
【非特許文献１６】Chih- Chung ChangおよびChih-Jen Lin、LIBSVM: a library for support vector machines、2001. http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm
【非特許文献１７】Gonzalez-Garciaら  2000. J Natl Cancer Inst 92: 5423頁
【非特許文献１８】Weng Lら、Bioinformatics 22:1111〜21頁(2006)
【非特許文献１９】Simonら、Cancer Informatics 2: 11〜17頁(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在の病理学的予測要因は、再発性疾患のリスクが増大している「高リスク」患者を識別するのに十分でない。したがって本発明の目的は、前記高リスク患者および低リスク患者を識別するために、結腸直腸癌を罹患している患者に由来する癌試料の型判別を可能にするための方法および手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、結腸直腸癌を罹患しているか、またはこれを罹患している疑いのある個体のRNA試料を型判別するための方法であって、前記個体に由来する、結腸直腸癌細胞を含むか、または結腸直腸癌細胞を含む疑いのある組織試料から調製されるRNA試料を提供するステップと;前記RNA試料中の1セットの遺伝子についてのRNAレベルを判定するステップと;前記セットの遺伝子について判定されたRNAレベルに基づいて前記RNA試料を型判別するステップとを含み、前記セットの遺伝子は、Table 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つを含む方法を提供する。
【０００９】
本研究は、疾患再発を予測し、治療決定をすることにおいて医師を補助するために、現在の臨床病理学的リスク評価に加えられるロバストな遺伝子発現シグネチャーを開示する。再発性疾患を罹患する可能性がより高い患者のサブグループを識別することにより、手術後にアジュバント化学療法から利益を得る可能性がより高く、治療されるべき患者を識別することが可能になる。
【００１０】
本遺伝子発現シグネチャーは、B-Raf中に活性化突然変異(BRAFmut)を有する癌細胞を含むトレーニングサンプルをかなりの程度まで除去した後に同定された。BRAFmut結腸癌試料は、遺伝子発現データ中で非常に多様であることが見出され、これは、より一般的な、予後関連遺伝子発現データをマスクした。理論によって束縛されることなく、前記多様な遺伝子発現は、BRAFmut結腸癌試料中の高い程度のマイクロサテライト不安定性(MSI)によって引き起こされる場合がある。BRAFmut結腸癌試料を除去した後に同定された、得られた遺伝子発現シグネチャーは、BRAFmutを有する癌細胞を含む試料、およびBRAFmutを有さない癌細胞を含む試料に対してロバストであり、これらに適用可能であることが見出された。
【００１１】
結腸直腸癌は、結腸および直腸を含む、大腸(large intestine)または大腸(large bowel)中に生じる1つの型の癌である。結腸癌および直腸癌は、共通の多くの特徴を有する。結腸直腸癌の大部分は腺癌である。これらは、結腸および直腸の壁の内側層に並ぶ細胞の癌である。他のあまり一般的ではない型の腫瘍も結腸および直腸内で発生する場合があり、例えば、腸の特殊化されたホルモン産生細胞から発生するカルチノイド腫瘍;腸の壁内の平滑筋細胞から発生する消化管間質腫瘍または平滑筋肉腫;ならびに一般にリンパ節内で発生するが、結腸および直腸または他の臓器内で開始する場合もある免疫系細胞の癌であるリンパ腫などである。
【００１２】
腺癌は通常、周囲の正常な大腸粘膜の表面上の目に見える突起部として定義される過形成である、結腸直腸ポリープとして開始する。結腸直腸ポリープは、腫瘍性(腺腫様ポリープ)、または悪性度をまったく有さない過形成性ポリープ、粘膜ポリープ、炎症性ポリープ、および過誤腫性ポリープを含む非腫瘍性として分類される。腺腫様ポリープまたは腺腫は、柄(有茎性)または広い、平らな基部(広基底性)によって腸壁に付着している。結腸直腸の過形成またはポリープは、発達して悪性腺癌になる場合がある。
【００１３】
野生型B-Raf遺伝子を有し、各患者の経過観察時間の長さ以内で患者中に転移を引き起こさなかった結腸直腸癌からの試料、および各患者の経過観察時間の長さ以内で患者中に転移を引き起こした結腸直腸癌からの試料を含む結腸直腸試料のトレーニングセットから単離したRNAを使用して、多変量コックス回帰に基づく方法を使用して遺伝子が選択された(Simonら、Design and Analysis of DNA Microarray Investigations、Springer-Verlag New York、(2003); Kornら、Journal of Statistical Planning and Inference 124、379〜398頁(2004))。生存時間が、癌再発がないものとして定義される場合に、患者の病期と無関係に、RNAレベルが患者の生存時間に有意に関係した遺伝子が選択された。Table 1(表1)に列挙された遺伝子のそれぞれは、生存時間の予測がつき、0.001の最小有意性閾値を有することが示された。
【００１４】
好適な実施形態では、1セットの少なくとも2つの遺伝子は、MCTP1(配列番号36)およびTHNSL2(配列番号13)を含む。MCTP1(配列番号36)とTHNSL2(配列番号13)の発現の比の決定は、より好適である。所定の閾値を超える、決定されたMCTP1/THNSLC2比を有する試料は、癌再発のリスクの低い試料を示す。高いMCTP1/THNSLC2比(低リスク)を有する試料は、87%の5年無遠隔転移生存率(DMSF)を示した。低いMCTP1/THNSLC2比(高リスク)を有する試料は、70%のDMFSを示した。
【００１５】
好適な実施形態では、本発明による1セットの遺伝子は、Table 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも3個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子には少なくとも4個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも5個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも6個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも7個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも8個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも9個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも10個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも15個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも20個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも25個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも30個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも40個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも50個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも60個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも70個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも80個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の100個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の150個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子の200個、より好適にはTable 1(表1)に列挙された遺伝子のすべてを含む。
【００１６】
本発明の方法において使用するのに好適なセットの遺伝子は、Table 1(表1)に列挙された最初の2個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の3個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の4個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の5個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の6個の順位付けされた遺伝子より好適には最初の7個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の8個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の10個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の15個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の20個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の30個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の40個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の50個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の60個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の70個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の80個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の90個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の100個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の150個の順位付けされた遺伝子、より好適には最初の200個の順位付けされた遺伝子、より好適にはTable 1(表1)に列挙された209個すべての遺伝子を含む。
【００１７】
さらに好適なシグネチャーは、Table 1(表1)中で、ZBED4、LIF、PIM3、IL2RA、PYROXD1、CTSC、EDEM1、M6PRBP1、SLC6A12、THNSL2、PPARA、ZNF697、LAMA3、CA438802、MCTP1、HSD3B1、CYFIP2、IL2RBと呼ばれ、「18遺伝子プロファイル」とも呼ばれる遺伝子を含む。
【００１８】
さらに好適なシグネチャーは、Table 1(表1)中で、ZBED4、LIF、IL18R1、PIM3、IL2RA、PYROXD1、CTSC、EDEM1、M6PRBP1、SLC6A12、THNSL2、KCNJ10、THC2663361、C10orf67、KIAA0040、BC040628、AK096685、PIGW、PPARA、COLQ、AK021427、C15orf27、PRDM4、LOC165186、ZNF697、CRYGA、EEPD1、LAMA3、NEDD8、CA438802、MCTP1、HSD3B1、CYFIP2、IL2RB、XKR3、NT_035113、THC2520461、およびTHC2662025と呼ばれる遺伝子を含む。
【００１９】
細胞試料は、結腸直腸癌細胞または結腸直腸癌細胞に由来する核酸を含む発現産物を含む臨床的に関連する試料である。
【００２０】
好適な実施形態では、本発明による細胞試料は、手術の間に大腸から直接得られる。代替の実施形態では、細胞試料は、結腸内視鏡検査の間に採取される生検試料から調製される。
【００２１】
生検は、深度が最大限でも10ミリメートル、より好適には最大限でも5ミリメートルであり、約2ミリメートル、より好適には約3ミリメートル、より好適には約4ミリメートル、より好適には約5ミリメートル、より好適には約6ミリメートル、より好適には約7ミリメートル、より好適には約8ミリメートル、より好適には約9ミリメートル、より好適には約10ミリメートルの好適な直径を有することがさらに好適である。しかし、サイズおよび総体積が等しい他の形態も可能である。
【００２２】
別の好適な実施形態では、結腸直腸癌を罹患している患者によって排泄された糞便または血液を含み、前記組織試料は、結腸直腸癌細胞または結腸直腸癌細胞に由来する核酸産物などの遺伝子発現産物を含む。ヒト糞便試料または血液試料に由来する細胞、またはRNAなどの遺伝子発現産物を精製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、特許出願第WO199820355号、同第WO2003068788号、およびYangら  2005. Cancer Lett 226: 55〜63頁に記載されており、これらは参照により本明細書に含まれている。
【００２３】
試料は、当業者に公知であるように、多数の方法で処理することができる。例えば、これらは、採取の時点で細胞または組織から新たに調製することができ、またはこれらは、試料調製のために処理されるまで-70℃で貯蔵される試料から調製することができる。あるいは、組織、生検、糞便、または血液の試料は、タンパク質またはRNAの品質を保存する条件下で貯蔵することができる。これらの保存条件の例は、例えば、ホルマリン(formaline)、RNase阻害剤、例えば、RNAsin (Pharmingen)またはRNasecure (Ambion)など、水溶液(aquous solution)、例えばRNAlater (Assuragen; US06204375)、Hepes-グルタミン酸緩衝液媒介有機溶媒保護効果(HOPE; DE10021390)、およびRCL2(Alphelys; WO04083369)など、ならびにユニバーサル分子固定液(Universal Molecular Fixative)(Sakura Finetek USA Inc.; US7138226)などの非水溶液を使用する固定である。
【００２４】
Table 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2個のRNAレベルは、当技術分野で公知の任意の方法によって判定することができる。遺伝子のRNAレベルを判定するための方法は、当業者に公知であり、これらにはそれだけに限らないが、ノーザンブロット法、定量的PCR、およびマイクロアレイ分析が含まれる。
【００２５】
ノーザンブロット法は、標識プローブをハイブリダイズすることによる特定遺伝子の核酸発現産物の定量化を含み、このプローブは、ゲル電気泳動によって核酸発現産物を分別した後、前記核酸発現産物と特異的に相互作用する。前記核酸発現産物と相互作用した標識プローブの定量化は、発現のレベルを判定するための尺度として役割を果たす。判定された発現のレベルは、試料同士間で発現レベルが異ならないことが知られている遺伝子の発現のレベルを比較することによって、2つの別個の試料の間の核酸発現産物の総量の差異について正規化することができる。
【００２６】
定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、核酸の発現のレベルを定量化するための代替の方法を提供する。qPCRは、生成物の量が反応の間にモニターされるリアルタイムPCR(rtPCR)、または最終的な生成物の量が求められるエンドポイント測定によって実施することができる。当業者に公知であるように、rtPCRは、すべての生成された二本鎖産物と相互作用し、増幅の間に蛍光の増大をもたらす核酸インターカレーター、例えば、臭化エチジウムもしくはSYBR(登録商標)Green I染料などを使用し、または対象とする遺伝子の生成された二本鎖産物と特異的に反応する標識プローブを使用することによって実施することができる。使用することができる代替の検出法は、デンドリマーシグナル増幅(dendrimer signal amplification)、ハイブリダイゼーションシグナル増幅、および分子指標によって提供される。
【００２７】
それだけに限らないが、PCR、ローリングサークル増幅、核酸配列ベース増幅、転写媒介増幅、およびリニアRNA増幅を含めて、当業者に公知の様々な増幅方法をqPCRに使用することができる。
【００２８】
複数の核酸遺伝子発現産物を同時に検出するために、ワンチューブアッセイにおいて最大45の対象とする転写物を正確に定量化する逆転写酵素-多重ライゲーション依存性増幅(rtMLPA)などのqPCR法(Elderingら、Nucleic Acids Res 2003; 31: e153)を使用することができる。
【００２９】
マイクロアレイベース分析は、選択された生体分子を使用し、これは、表面上に固定化される。マイクロアレイは通常、プローブと呼ばれる核酸分子を含み、これは、核酸発現産物にハイブリダイズすることができる。プローブは標識試料核酸に曝され、ハイブリダイズされ、プローブと相補性である、試料中の核酸発現産物の存在量が求められる。マイクロアレイ上のプローブは、DNA配列、RNA配列、またはDNAおよびRNAのコポリマー配列を含むことができる。プローブは、DNA類似体および/またはRNA類似体、例えば、ヌクレオチド類似体、またはペプチド核酸分子(PNA)、またはこれらの組合せなどを含むこともできる。プローブの配列は、ゲノムDNAの完全または部分的な断片とすることができる。配列は、合成オリゴヌクレオチド配列などのインビトロで合成されたヌクレオチド配列とすることもできる。
【００３０】
前記RNAレベルは、同時に判定されることが好適である。同時分析は、例えば、多重qPCR、およびマイクロアレイ分析によって実施することができる。マイクロアレイ分析により、多数の遺伝子、例えば、50超の遺伝子、100超の遺伝子、1000超の遺伝子、または10,000超の遺伝子などでさえの発現の核酸レベルを同時に判定することが可能になり、結腸直腸発現プロファイルを含む遺伝子を正規化するために、多数の遺伝子発現データの使用が可能になる。
【００３１】
好適な実施形態では、したがって、前記RNAレベルは、マイクロアレイ分析によって判定される。
【００３２】
前記プローブは、Table 1(表1)に列挙された遺伝子に特異的である。プローブは、これが、前記遺伝子のRNA産物、またはそのcDNA産物のヌクレオチド配列と完全に相補性であるヌクレオチドの連続ストレッチを含む場合、特異的となり得る。プローブは、これが、前記遺伝子のRNA産物、またはそのcDNA産物のヌクレオチド配列と部分的に相補性であるヌクレオチドの連続ストレッチを含む場合にも、特異的となり得る。部分的にとは、少なくとも20ヌクレオチドの連続ストレッチ中のヌクレオチドから最大5%が、前記遺伝子のRNA産物の対応するヌクレオチド配列と異なることを意味する。用語の相補性は、当技術分野で知られており、検出されるべき配列に、塩基対合則によって関連づけられる配列を指す。プローブの配列は、前記プローブとの非特異的なハイブリダイゼーションを最小にするように慎重に設計されることが好適である。プローブは、一本鎖核酸分子であるか、これを模倣することが好適である。ヌクレオチドの前記相補性連続ストレッチの長さは、15塩基から数キロ塩基の間で変化する場合があり、好ましくは20塩基から1キロ塩基の間、より好適には40から100塩基の間、最も好適には60ヌクレオチドである。最も好適なプローブは、遺伝子のRNA産物、またはそのcDNA産物のヌクレオチド配列と同一である60ヌクレオチドの連続ストレッチを含む。
【００３３】
Table 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つのRNAレベルを判定するために、RNA試料は、好ましくは直接または間接的に標識され、プローブと標識RNA試料中の相補性分子の間で二本鎖を形成することが好都合である条件下で、アレイ上のプローブと接触させられる。マイクロアレイを洗浄した後にプローブに付随したままである標識の量を求めることができ、この量は、前記プローブと相補性である核酸分子のRNAのレベルについての尺度として使用される。
【００３４】
Table 1(表1)に列挙された少なくとも2つの遺伝子についての判定されたRNAレベルは、正規化することによって、系統的偏りについて補正することができる。系統的偏りは、全体的な性能のアレイ間差異による変動をもたらし、これは、例えば、アレイ製作、染色、および走査の不一致、ならびに例えば、純度の変動に起因し得る標識RNA試料同士間の変動に起因する場合がある。系統的偏りは、マイクロアレイ実験において試料を取り扱う間に導入される場合がある。系統的偏りを低減するために、判定されたRNAレベルは、好ましくは、バックグラウンドの非特異的ハイブリダイゼーションについて補正され、例えば、Feature Extractionソフトウェア(Agilent Technologies)を使用して正規化される。ダイスワップ実験(Martin-Magnietteら、Bioinformatics 21:1995〜2000頁(2005))などの、当業者に知られており、または当業者が知ることになる他の方法も、染料の偏りによって導入される差異を正規化するのに適用することができる。発現レベルの正規化は、正規化された発現値をもたらす。
【００３５】
アレイデータを正規化するための従来法には大域解析が含まれ、これは、アレイ上の遺伝子マーカーの大部分は、試料同士間で差次的に発現されないという仮定に基づく[Yangら、Nucl Acids Res 30: 15(2002)]。あるいは、アレイは、正規化するのに使用される特定のプローブを含むことができる。これらのプローブは、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素などの、ハウスキーピング遺伝子に由来するRNA産物、およびRNAレベルが所与の細胞内で一定であり、前記細胞の発生段階または予後に依存しないと考えられている18S rRNAレベルを検出することが好ましい。
【００３６】
したがって、本発明による好適な方法は、前記試料中のTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つの前記セットの判定されたRNAレベルを正規化するステップをさらに含む。
【００３７】
前記正規化は、中央値センタリングを含むことが好ましく、中央値センタリングでは、アレイデータの「中心」が、遺伝子の大部分は条件間で変化しないという仮定の下で同じレベルに導かれる。前記正規化は、プリントチップ(print-tip)および強度依存性の偏りの両方を補正するために、Lowess(局所的重み付け分散プロット平滑化(LOcally WEighted Scatterplot Smoothing))局所回帰正規化(local regression normalization)を含むことが好ましい。
【００３８】
好適な実施形態では、RNAレベルが、一個体に由来する結腸直腸細胞を含む異なる組織試料同士間、および異なる個体に由来する結腸直腸細胞を含む組織試料同士間で大部分は一定である遺伝子が選択される。前記セットの正規化遺伝子のRNAレベルは、遺伝子同士間で異なることがさらに好適である。例えば、前記組織試料中の低RNAレベルを有する遺伝子、および高RNAレベルを有する遺伝子を選択することが好適である。前記組織試料中の低RNAレベルを有する遺伝子、中等度のRNAレベルを有する遺伝子、および高RNAレベルを有する遺伝子を選択することがより好適である。前記セットの正規化遺伝子のRNAレベルは、好ましくは、RNAレベルの全範囲にわたる正規化を可能にすることが当業者に明らかとなるであろう。
【００３９】
好適な方法は、前記遺伝子の相対的なRNAレベルについての加重値、およびそれによって、前記セットの遺伝子についての1セットの加重値を得るために、正規化された発現値のそれぞれに所定の定数を乗ずるステップをさらに含み、前記方法は、前記セットの加重値に基づいて前記試料を型判別するステップをさらに含む。
【００４０】
前記セットの加重値は、合計し、参照試料からの合計されたセットの加重値と比較することができる。前記合計されたセットの加重値は、型判別が分かっているRNA試料から得られる値によって決定される分類閾値と比較されることが好適である。
【００４１】
腺癌などの結腸直腸癌は、周囲組織の目に見える侵襲性に応じて段階づけられる。段階づけシステムは、TNM病期分類システムによって提供され、これは、腫瘍(T)、リンパ節への蔓延(N)、および遠位転移の存在(M)についてのデータを組み合わせる。TNM病期I結腸直腸癌は、蔓延し始め、粘膜下層または筋固有層に浸潤した癌として定義される。TNM病期IIは、筋固有層を通って漿膜下組織、または結腸周囲組織もしくは直腸周囲組織中に浸潤しているが、リンパ節に到達していない癌を定義する。病期IIIは、遠位転移の非存在下でリンパ節に蔓延した癌を定義する。病期IVは、遠位部位に蔓延した癌を定義する。
【００４２】
好適な実施形態では、本発明は、結腸直腸癌を罹患している個体を型判別する方法であって、前記結腸直腸癌は、TNM病期分類システムによって判定されるTNM病期I、TNM病期II、またはTNM病期III結腸直腸癌を含み、TNM病期IIおよびTNM病期IIIが好適な結腸直腸癌である方法を提供する。
【００４３】
本発明による方法における前記型判別により、低い転移能または癌再発の低いリスクを有する癌細胞と、高い転移能または癌再発の高いリスクを有する癌細胞の区別が可能になることが好適である。
【００４４】
低い転移能を有する癌細胞を、高い転移能を有する癌細胞と区別するために、Table 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つのRNAレベルを、参照試料中の前記遺伝子のRNAレベルと比較することができる。
【００４５】
参照試料は、健康な個体に由来する結腸直腸組織から単離されたRNA試料、または関連細胞株もしくは細胞株の混合物からのRNA試料であることが好ましい。前記参照試料は、結腸直腸癌を罹患している個体の癌性増殖からのRNA試料とすることもできる。結腸直腸癌を罹患している前記個体は、癌再発の増大したリスク、または癌再発の低いリスクを有する場合がある。
【００４６】
前記参照試料は、結腸直腸癌を罹患しており、癌再発の低いリスクを有する個体に由来するRNA試料であることが好適である。より好適な実施形態では、前記参照試料は、結腸直腸癌を罹患しており、癌再発の低いリスクを有する個体に由来する結腸直腸細胞を含む複数の組織試料からのプールされたRNA試料である。前記複数の組織試料は、10超の組織試料、より好適には20超の組織試料、より好適には30超の組織試料、より好適には40超の組織試料、最も好適には50超の組織試料を含むことが好適である。最も好適な参照試料は、癌再発の低いリスクを有する個体、および癌再発の高いリスクを有する個体に由来する結腸直腸癌細胞を含む複数の組織試料からのプールされたRNAを含む。
【００４７】
さらに好適な参照試料は、健康な個体に由来する結腸組織、または結腸癌患者に由来するいわゆる正常隣接組織から単離およびプールされたRNA、または一般的な細胞株もしくは細胞株混合物に由来するRNAを含む。細胞株または細胞株混合物に由来するRNAは、社内で製造し、または例えば、Stratagene Human Reference RNAなどの市販源から得ることができる。
【００４８】
試料の型判別は、様々な方法で実施することができる。1つの方法では、一試料の前記参照試料との類似性または相違点の尺度である係数が求められる。いくつかの異なる係数を、個体に由来するRNA試料中のRNA発現レベルと参照試料との間の相関関係を求めるのに使用することができる。好適な方法は、データの正規分布を仮定するパラメトリック法である。これらの方法の1つは、ピアソン積率相関係数であり、これは、2つの変数の共分散を、これらの変数の標準偏差の積で除することによって得られる。好適な方法は、コサイン角、アンセンタード相関(un-centered correlation)、より好適にはコサイン相関を含む(Fanら、Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 5:4810〜3頁(2005))。
【００４９】
参照試料との前記相関は、使用される遺伝子のセットについての全体的な類似性スコアを生成するのに使用されることが好ましい。類似性スコアは、個体に由来するRNA試料および参照試料における1セットの遺伝子のRNAレベルの平均相関の尺度である。前記類似性スコアは、例えば、前記個体のRNA試料中の遺伝子のセットのRNA発現レベルと前記参照試料との間の高い相関を示す+1から、逆相関関係を示し、したがって癌再発の増大したリスクを有することを示す-1の間の数値とすることができる(van 't Veerら、Nature 415: 484〜5頁(2002))。
【００５０】
別の態様では、本発明は、結腸直腸癌を罹患している個体の分類方法であって、前記個体に由来するRNA試料中のTable 1(表1)に列挙された少なくとも2つの遺伝子の1セットからのRNAレベルと、5年間の初期診断内に再発性疾患がない患者に由来するRNA試料中の前記セットの遺伝子からの発現のレベルとの間の類似値を求めるステップと、前記類似値が類似閾値未満である場合、不良な予後を有するとして前記個体を分類するステップと、前記類似値が類似閾値を超える場合、良好な予後を有するとして前記個体を分類するステップとを含む方法によって、不良な予後または良好な予後を有するとして前記個体を分類するステップを含む分類方法を提供する。
【００５１】
本発明は、良好な予後を有する結腸直腸癌患者に由来する試料と、不良な予後を有する結腸直腸癌患者に由来する試料を区別するのに有用な1セットのマーカーを提供する。本発明の方法では、これらのマーカーの発現レベルは、結腸癌に苦しんでいる個体が、良好または不良な臨床的予後を有することになるかを判定するのに使用される。一実施形態では、本発明は、結腸癌に苦しんでいる個体が、5年間の初期診断内に再発を経験する可能性があるかどうか(すなわち、個体が不良な予後を有するかどうか)を判定する方法であって、(1)個体から採取した試料におけるTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つの発現のレベルを、対照中の同じマーカーのレベルと比較するステップであって、前記対照のレベルは、不良な予後を有する個体中に見出されるものを表すステップと;(2)個体に由来する試料中の前記少なくとも2つの遺伝子からの各遺伝子の発現のレベルが、対照と有意に異なるかどうかを判定するステップとを含む方法を提供する。実質的な差異がまったく見出されない場合、患者は不良な予後を有し、実質的な差異が見出される場合、患者は良好な予後を有する。当業者は、前記対照レベルは、良好な予後を有する個体中に見出されるものを代わりに表すことができることが容易に分かるであろう。より具体的な実施形態では、両方の対照が実施される。プールが、純粋な「良好な予後」または「不良な予後」でない場合、既知の転帰を有する個体の1セットの実験は、プールに対して掛け合わせられることによって、良好な予後および不良な予後の群についての発現対照レベルが定義されるべきである。未知の転帰を有する各個体は、同じプールに対して掛け合わされ、得られる発現プロファイルがテンプレートと比較されることによって、その転帰が予測される。
【００５２】
結腸癌の不良な予後は、腫瘍が比較的攻撃的であることを示すことができる一方で、良好な予後は、腫瘍が比較的非攻撃的であることを示すことができる。
【００５３】
したがって、本発明は、結腸癌患者の治療の過程を決定する方法であって、Table 1(表1)の少なくとも2つの遺伝子の発現のレベルが、良好な予後発現パターンまたは不良な予後パターンを表す試料中のこれらの遺伝子のレベルと相関するかどうかを判定するステップと;治療の過程を決定するステップとを含み、発現が不良な予後パターンと相関する場合、腫瘍は、攻撃的な腫瘍として治療される方法を提供する。
【００５４】
疾患再発のリスクが高いまたは低いとして試料を分類する好適な方法は、疾患の進行と相関するとして同定されたすべての遺伝子を使用して、サポートベクターマシン(SVM)トレーニングから導出される分類テンプレートを使用する。テンプレート(シグネチャー)中の各遺伝子は、Chang & LinがSVMを実行することによって求められたような、対応する重み係数(weighing factor)を有する(Chih- Chung ChangおよびChih-Jen Lin、LIBSVM: a library for support vector machines、2001. http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm)。このアルゴリズムは、すべてのトレーニングセット試料にわたるシグネチャー遺伝子中に含まれる情報を分析し、再発を有する患者を、再発を有さない患者から最良に分離する分類テンプレートを構築する。Chih-Chung ChangおよびChih-Jen Linによって開発されたLIBSVMは、教師あり分類または回帰フレームワークにおける多くの問題を分析するための統合ソフトウェアである。
【００５５】
類似閾値は、癌再発のリスクの高い患者に由来するRNA試料と、癌再発のリスクの低い患者に由来するRNA試料の区別を可能にする任意の値である。
【００５６】
前記類似閾値は、最初の診断後の5年以内に既知の転移形成を有する患者の許容できる数が偽陰性として閾値超になり、最初の診断後の5年以内に既知の転移形成を有さない患者の許容できる数が、偽陽性として閾値値未満になる値に設定される。
【００５７】
類似性スコアは、ユーザーインターフェースデバイス、コンピューター判読可能な記憶媒体、またはローカルもしくはリモートコンピューターシステムに表示または出力される。
【００５８】
代替の実施形態では、本発明は、結腸直腸癌を罹患している個体の分類方法であって、(a)前記個体に由来する、結腸直腸癌細胞を含むか、または結腸直腸癌細胞を含む疑いのある組織試料から調製される前記個体に由来するRNA試料を提供するステップと;(b)前記試料中のTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つを含む1セットの遺伝子についてRNAのレベルを判定するステップと;(c)前記個体中の該セットの遺伝子からの発現のレベルと、5年間の初期診断内に再発性疾患がない患者における前記セットの遺伝子からの発現のレベルとの間の類似値を求めるステップと;(d)前記類似値が第1の類似閾値未満である場合、不良な予後を有するとして前記個体を分類し、前記類似値が前記第1の類似閾値を超える場合、良好な予後を有するとして前記個体を分類するステップとを含む方法によって、不良な予後または良好な予後を有するとして前記個体を分類するステップを含む分類方法を提供する。
【００５９】
好適な本発明の方法では、前記試料中のTable 1(表1)に列挙された遺伝子の少なくとも2つを含む1セットの遺伝子についてのRNAのレベルは、正規化されている。正規化は、大域解析および特定のプローブの使用を含めて、当業者に公知の任意の方法によって実施することができる。
【００６０】
さらに別の態様では、本発明は、結腸直腸癌を罹患している個体に治療を割り当てる方法であって、本発明の方法に従って、不良な予後または良好な予後を有するとして前記個体を分類するステップと、前記個体が不良な予後を有するとして分類される場合、アジュバント化学療法を割り当てるステップとを含む方法を提供する。
【００６１】
結腸直腸癌についての通常の治療は手術であり、前記個体が、不良な予後を有するとして分類される場合、その後に追加の治療が続く。前記追加の治療は、アジュバント化学療法および放射線療法から選択される。化学療法は、急速に分裂する、したがって影響されやすい癌細胞を排除するために、天然または非天然の化合物の使用を含む。化学療法化合物は、アルキル化剤、例えば、デカルバジン(decarbazine)およびシクロホスファミドなど;DNA架橋剤、例えば、シスプラチン、およびカルボプラチンなど;代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセート、5-フルオロウラシル(5FU)、およびメルカプトプリンなど;タキサンなどのアルカロイド剤(alkaloidic agent)、例えば、パクリタキセル、およびドセタキセル、ビンクリスチン、およびビンブラスチンなど;トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテシンおよびアムサクリンなど;アントラサイクリングリコシドなどの抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、およびエピルビシンなど;マイトマイシン(mytomycin);エフロールニチンなどのポリアミン生合成阻害剤;ミコフェノール酸および他のイノシン一リン酸脱水素酵素阻害剤;ならびにアントラピラゾール、例えば、ミトキサントロン、ピロキサントロン、およびロソキサントロンなどを含む。
【００６２】
修正TNM病期IIIまたはそれ以上を含む結腸直腸癌のための現在の標準的な外科的アジュバント治療は、FOLFOX4である。FOLFOXは、オキサリプラチン、ロイコボリン、および注入投与用5FUを組み合わせる。ロイコボリンは、化学療法、特に5FUの抗癌効果を増強するのに使用される薬物である。他の療法用途(uses)は、XELOX、オキサリプラチンおよびカペシタビンを含む併用療法;ならびに5-FU、ロイコボリン、およびイリノテカン、トポイソメラーゼ1阻害剤を組み合わせるFOLFIRIである。これらは、それだけに限らないが、血管新生を阻害するベバシズマズ、上皮成長因子受容体阻害剤であるセツキシマブ、および上皮成長因子受容体阻害剤であるパニツムマブを含めて、抗体ベース治療剤と組み合わせることができる。
【００６３】
結腸または直腸に由来する癌は、結腸直腸癌または腸癌と呼ばれる。前記癌は、結腸癌および直腸癌を含む。好適な実施形態では、本発明による結腸直腸癌は、結腸癌に関係する。別の好適な実施形態では、本発明による結腸直腸癌は、直腸癌に関係する。
【００６４】
さらに別の態様では、本発明は、療法に応答する確率が増大した患者を選択するために、本発明による結腸直腸癌細胞を型判別するための方法を提供する。本発明の方法は、ある特定の合併症のリスクにあるか、または特定の治療から優先的に利益を得る結腸直腸癌患者のサブセットを同定するための手段となることができる。結腸直腸サブタイプについての情報は、患者選択を改善し、ばらつきを低減し、関連した転帰尺度に集中することによって、将来の結腸直腸臨床試験の設計を実質的に改善することもできる。
【００６５】
さらなる態様では、本発明は、結腸直腸癌を罹患しているか、またはこれを罹患している疑いのある個体のRNA試料を型判別するための結腸直腸遺伝子シグネチャーを開発する方法であって、非マイクロサテライト不安定性(非MSI)結腸直腸癌から得られるRNA試料中の無遠隔転移生存期間に関連する1セットの遺伝子を判定するステップを含み、前記無遠隔転移期間は、2年、より好適には3年、より好適には4年、より好適には5年、より好適には5年超である方法を提供する。前記非MSI結腸直腸癌は、低レベルマイクロサテライト不安定性(MSI-L)結腸直腸試料を含まないことが好ましい。MSIは、ミスマッチ修復遺伝子MLH1、MSH2、MSH6、またはPMS2の1つにおける突然変異によって引き起こされることが多く、患者の腫瘍において高レベルマイクロサテライト不安定性(MSI高)をもたらす。MSI試験は、前記ミスマッチ修復遺伝子における突然変異分析に基づく。本発明は、好ましくは、結腸直腸癌を罹患しているか、またはこれを罹患している疑いのある個体のRNA試料を型判別するための結腸直腸遺伝子シグネチャーを開発する方法であって、B-Rafの600位にバリンを有する結腸直腸癌試料から得られるRNA試料中の無遠隔転移生存期間に関連する1セットの遺伝子を判定するステップを含み、前記無遠隔転移期間は、2年、より好適には3年、より好適には4年、より好適には5年、より好適には5年超である方法を提供する。
【００６６】
さらに別の態様では、本発明は、第1のセットの核酸分子を含む5から12,000の間の核酸分子を含み、前記第1のセットの各核酸分子は、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含むアレイを提供する。前記第1のセットのヌクレオチド配列は、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる2個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる3個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる4個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる5個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる6個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる10個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる18個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる38個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる44個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる50個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる100個のヌクレオチド配列、より好適には、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができる209個すべてのヌクレオチド配列を含むことが好ましい。最も好適な実施形態では、前記アレイは、Table 1(表1)に列挙された遺伝子から選択される異なる遺伝子にハイブリダイズすることができ、18遺伝子プロファイルに属すると示される、少なくとも18個のヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
好適な実施形態では、本発明によるアレイは、第2のセットの核酸分子をさらに含み、前記第2のセットの各核酸分子は、正規化遺伝子にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含み、前記正規化遺伝子のRNAレベルは異なっていることが好適である。
【００６８】
さらに別の態様では、本発明は、結腸直腸発現プロファイルを得るための、本発明によるアレイの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】目的変数なしの分析により、3つの結腸サブクラスが同定されることを示す図である。
【図２】5年無遠隔転移生存率(DMFS)との関連についての遺伝子の採点を示す図である。
【図３】18遺伝子プロファイルについての再発までの時間のKaplan Meier分析を示す図である。
【図４】病期IIおよびIII結腸試料における18遺伝子プロファイルについての再発までの時間のKaplan Meier分析を示す図である。
【図５】処置された、および未処置の結腸試料における18遺伝子プロファイルについての再発までの時間のKaplan Meier分析を示す図である。
【図６】バリデーションコホート内の低リスク患者および高リスク患者に対する治療利益を示す図である。
【図７】18遺伝子プロファイルによって低リスクおよび高リスクとして分類された試料間の区別を示す図である。
【図８】結腸予後についてのMCTP1/THNSL2比の使用を示す図である。
【図９】18遺伝子プロファイルを使用した、病期I結腸試料における、再発までの時間のKaplan Meier分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
(実施例)
(実施例1)
クラシファイヤー(classifier)の生成
患者
手術の時点で記録に残された臨床的情報および病理学的情報には、腫瘍の病期、グレード、サイズ、および位置が含まれる。さらに、リンパ節転移について評価されたリンパ節の数を、症例の95%において記載した。TNM病期分類システムによって腫瘍を段階づけした。すべての組織試料は、適切なインフォームドコンセントを伴った患者から収集した。本試験は、ヘルシンキ宣言の倫理基準に従って実施し、参加している医学センターおよび病院の医学倫理委員会(Medical Ethical Board)によって認可された。最大270カ月にわたって生存時間および再発について患者をモニターした。
【００７１】
突然変異分析
突然変異分析を、配列決定手法を使用してトレーニングセットおよびバリデーションセットを含むすべての試料に対して実施した。B-Raf突然変異を、cDNAの増幅後に、エクソン15において分析することによって、V600E活性化突然変異を検出した。使用したプライマーは、(プライマー1)5'-tgatcaaacttatagatattgcacgaおよび(プライマー2)5'- tcatacagaacaattccaaatgcであった。増幅された産物は、Macherey-Nagel NucleoFast(登録商標)精製キットを使用して精製した。B-Raf中のV600E活性化突然変異を含む試料は、試料のトレーニングセットからかなりの程度まで除去した。
【００７２】
マイクロサテライト不安定性(MSI)状態
MSI状態は、以前に記載されたもの(Gonzalez-Garciaら  2000. J Natl Cancer Inst 92: 5423頁)によって145人の患者(トレーニングセットにおいてn=90、およびバリデーションセットにおいてn=55)について判定した。簡単に言えば、6つのマイクロサテライトDNA領域を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、対にした正常組織および腫瘍組織から増幅し、産物を変性ポリアクリルアミド配列決定ゲル上で分離した。各マイクロサテライトの安定性は、正常なDNAと比較した、腫瘍DNAにおける移動度シフトバンドまたは追加のバンドの非存在(安定な)または存在(不安定な)によって採点した。バンドパターンを解釈することが困難であるか、または正常なDNAもしくは腫瘍DNAから増幅産物をまったく得られない場合、試料は、分析されないとして採点した。22人の患者に由来する試料を、MSI-高(MSI-H)として分類した。
【００７３】
マイクロアレイハイブリダイゼーション
凍結腫瘍試料からのトータルRNAのアリコートが、本試験において利用可能であった。トータルRNA 200ナノグラムを、Low RNA Input Fluorescent Labeling Kit (Agilent Technologies)を使用して増幅した。シアニン3-CTPまたはシアニン5-CTP(GE Health Care)を、インビトロ転写の間にcRNA中に直接組み込んだ。合計750ngのシアニン標識RNAを、Agilent 44kオリゴヌクレオチドマイクロアレイに対する標準参照とセ氏60度で17時間共ハイブリダイズし、Agilent標準ハイブリダイゼーションプロトコール(Agilent Oligo Microarray Kit、Agilent Technologies)に従って引き続いて洗浄した。
【００７４】
前記標準参照(結腸参照プール)は、44個の結腸直腸癌試料を含み、そのうち13個は、手術後5年以内に転位を発生させた患者から得、31個は、手術後5年以内に転移を発生させなかった患者から得た。
【００７５】
マイクロアレイ画像解析
スキャンした画像に対する蛍光強度を定量化し、バックグラウンドの非特異的ハイブリダイゼーションについて値を補正し、Agilent Whole Genome 44kマイクロアレイについて、製造者に推奨された設定によって、Agilent Feature Extractionソフトウェア(バージョン9.5.1.3)を使用して正規化した。このマイクロアレイについてのデフォルトの正規化手順は、線形成分およびLowess成分を含み、これは、Cy3/5染料取り込みにおける任意の差異を補正し、最終的なプロファイルを0で中心に置く(log10スケール、Cy5/Cy3)。このプロセスは、Agilent Feature Extraction Reference Guideに記載されている。例えば、R/Bioconductorソフトウェアに提供されているものなどの他の受託開発正規化手順も使用することができる。
【００７６】
データ前処理
Agendia XPrintソフトウェア(バージョン1.5.1)を使用して、またはR/Bioconductorソフトウェアにおいて利用可能なデータ分析手順を使用して、各ハイブリダイゼーションからの正常化された遺伝子発現比を組み合わせることによって、患者一人当たり1つの遺伝子発現プロファイルを生成した。アレイ上のシグネチャー遺伝子のそれぞれについて1つの発現比値を得るために、誤差重み付けした平均値を、同じ遺伝子に属するプローブについて、log10またはlog2の比として計算した。適切な相対的重みを確立するために、Rosetta誤差モデルを使用した。このモデルは、個々のプローブ測定における不確定度を補正する(Weng Lら、Bioinformatics 22:1111〜21頁(2006))。正規化し、誤差重み付けした対数比を含むテキストファイルを作成し、次いでこれを使用してさらに分析した。次いでデータを、BRB ArrayTools(Simonら、Cancer Informatics 2: 11〜17頁(2007))中に書き込んだ。アレイ上の各ユニークなプローブについて1つの発現比値を得るために、1回を超えて存在するすべてのプローブについて平均比値を計算した。あるいは、発現データをR/Bioconductorソフトウェア中に書き込み、分析した。
【００７７】
予後の遺伝子選択
全ゲノム遺伝子発現測定に基づく教師なし階層的クラスタリングは、3つの主な結腸分子サブクラスの存在を示した(図1を参照)。3つのクラスの生存時間分析により、1つサブタイプは、相対的な不良な転帰を有し(サブタイプC)、1つのサブタイプ(サブタイプA)は、良好な転帰を示すことが示された(1.8の5年無遠隔転移生存率Hazard比A対C、P=0.15)。これらのサブタイプのさらなる調査により、生存時間に関連したサブタイプAおよびCの両方は、活性化BRAF突然変異状態(BRAFmut)を有する試料、特に良好な転帰クラスについて富化されることが示された(残りのサブクラスBについての4%と比較して、良好な転帰クラスA:52%のBRAFmut、不良な転帰クラスC:22%のBRAFmut)。これらの知見は、クラスAおよびC内の試料は、活性化されたBRAF突然変異表現型に関連づけられると思われる異なる遺伝子表現パターンを示すことを示した。BRAFmutサブクラスは、マイクロサテライト不安定性(MSI)を有する結腸試料について明らかに富化された。したがって、観察される結腸クラスタリングは、2つの既知の異なる結腸腫瘍発生経路、すなわちMSS(サブタイプB)ならびにMSI由来(サブタイプA、およびおそらくサブタイプCも)を表す場合がある。
【００７８】
クラスターAおよびCは、全ゲノム教師なしクラスタリングに基づいて区別することができるので、良好な転帰および不良な転帰を有するBRAFmut試料間の差異は相対的に大きい。BRAFmut試料内のこの大きい差異は、混合された予後転帰を有する野生型BRAF試料の96%(100/104)を構成するサブタイプBを含めた、すべての結腸サブタイプについて明らかである、より一般的な予後関連遺伝子発現をマスクする場合がある。強いBRAFmut関連遺伝子発現差異を回避するために、予後関連遺伝子発現をサブタイプB試料のみ(n=104)の中でさらに調査し、引き続いてすべての試料(n=188)に適用した。
【００７９】
「リーブワンアウト」クロスバリデーション手順を使用して、すべての遺伝子は、5年無遠隔転移生存率(DMFS)とのその関連について採点した。1セットの209遺伝子は、少なくとも1つの反復(iteration)(Table 1(表1))においてロバストなDMFS関連を示した一方で、38非重複プローブ(44プローブの全セットから)は、すべての反復の50%を超えて、ロバストなDMFS関連を示した(図2を参照)。
【００８０】
選択される遺伝子が、診断上の用途に最適に適しており、異なるアレイ型および/または参照を使用して等しい読み取りをもたらすことを保証するために、本発明者らは、異なる低密度(LD)アレイ型で測定される発現を参照し、異なる参照(ユニバーサルヒト細胞株、UHR)を使用して、CRPに対してHDで測定される発現を確認した。38プローブのうちの18個が、LDにマッチし、両方のプラットフォームを使用して分析された128のトレーニングサンプルにわたって、非常に相関性の遺伝子発現の読み取り(R2>0.50)を示すことができた。18遺伝子またはORFに対応するこれらの18プローブを、後続のプロファイル開発に使用した(図7を参照)。
【００８１】
(実施例2)
クラシファイヤートレーニング
18個の同定された遺伝子を使用することによって、以前に定義された、乳癌の予後シグネチャーに類似した結腸の予後クラシファイヤーを構築した(WO2002103320;参照により本明細書に組み込まれている)。各試料について、低リスクスコアおよび高リスクスコアを、その試料中の18の遺伝子発現パターンに基づいて計算した。両スコアを組み合わせて最終的な指数にした。クラシファイヤー指数スコアについて最適な閾値を、最適な感受性および特異性に到達するように求めた。試料の指数が、閾値(-0.05)を超えた場合、これを高リスク試料とみなし、逆も同様にした。トレーニングコホートに対するプロファイル転帰の生存時間分析(リーブワンアウトクロスバリデーション手順を使用)は、3.41(P=1.4e-5)の危険率(HR)を示し、5年DMFS率は、低リスク試料について82%(95CI、76〜89%)であり、高リスク試料は50%(95%CI、38〜66%)であった。無疾患生存時間は、高リスククラスおよび低リスククラスの両方で相対的に低く、トレーニングコホート内の試料の大部分が、アジュバント化学療法を受けなかったためと思われる。BRAF野生型試料およびBRAFmut試料についての別個の分析により、18遺伝子プロファイルは、BRAF突然変異状態から独立していることが確認された(図3)。
【００８２】
(実施例3)
クラシファイヤー評価
18遺伝子プロファイルを、178の病期IIおよび病期IIIの結腸試料の独立したコホートに対してバリデートした。このプロファイルは、バリデーション試料の61%を低リスクとして、39%を高リスクとして分類した。低リスク試料および高リスク試料は、DMFSの有意な差異を示し、HRは3.19(P=8.5e-4)であった。5年DMFS率は、低リスク試料について89%(95CI、93〜95%)であり、高リスク試料について62%(95CI、50〜77%)であった。
【００８３】
病期II患者のみのサブ分析において、18遺伝子プロファイルは、HRが3.61(0=0.01)であり、5年DMFS率は、低リスク患者について91%(95CI、84〜98%)であり、高リスク患者について71.8%(95CI、57〜87%)であった。病期III患者のみのサブ分析において、18遺伝子プロファイルは、2.72(0=0.0045)を有し、5年DMFS率は、低リスク患者について84.3%(95CI、71.4〜97.2%)であり、高リスク患者について49.4%(95CI、27.4〜71.3%)であった。
【００８４】
次に、本発明者らは、18遺伝子プロファイルが、未処置の患者のみ、または、化学療法で処置した患者に由来する試料についても、予後力を示すかどうかを調査した。18遺伝子プロファイルは、未処置の試料(P=0.0082)、および処置された患者(P=0.016)の両方について有意な性能を示し、プロファイルの性能は、治療利益によって生じないことを示した(図5)。
【００８５】
MSI-Hを有する患者は、B-Raf突然変異(50%)の頻度が高く、主に18遺伝子プロファイル  低リスク(19/22=86%)であり、MSI-H患者の良好な予後は、遺伝子クラシファイヤーによって同定されることを示した。
【００８６】
他の臨床的要因に対するクラシファイヤーを比較するために、バリデーションセットからの結果のみを使用した。単変量解析において、18遺伝子プロファイルは、DMFSの最強の予測因子であった。病期およびリンパ節状態のみが、同様の規模の統計的有意性を示した。すべての試料、または病期IIもしくは病期III患者のみの多変量解析において、18遺伝子プロファイルは、最強の有意な独立した予後要因のままであった(Table 2(表2、3、4))。多変量解析について、単変量解析において0.1またはそれより良好なp値を有するすべての臨床的パラメータを含めた。
【００８７】
18遺伝子プロファイルからの結果を、ASCO勧告に基づく、現在使用されているリスク評価(ASCOリスク評価と呼ばれる)と比較した場合、18遺伝子プロファイルは、臨床的なリスク評価より性能が優れていた(Table 3(表5、6))。病期II患者についての多変量解析は、遺伝子発現プロファイルは、単独で(HR=3.56、95%CI 1.35〜9.39、p=0.010)、または組み合わせて(HR=3.6452、95%CI 1.3337〜9.3365、p=0.011)分析された、ASCO勧告において列挙された要因から独立して、遠位転移の発生についての最強の予測因子であることが示された。18遺伝子プロファイルおよびASCO判定基準の間に高い程度のリスク層別化の不一致があり、18遺伝子プロファイルは、臨床的なリスク評価を補完および改善することができることを示す。
【００８８】
病期II患者のサブグループにおいて、アジュバント化学療法を受けた41人の患者(36%)の中で、18遺伝子プロファイル指数によって28人(68%)が、低リスク指数として、13人(32%)が、高リスクとして分類され、化学療法投与も、有意な予後の要因でなかった。
【００８９】
(実施例4)
バリデーションコホート内の低リスク患者および高リスク患者に対する治療利益
化学療法の治療利益を、既処置対未処置の18遺伝子低リスクおよび高リスク患者の5年DM発生率を分析することによって判定した。治療利益は、低リスクと分類された患者にはなかった(病期II/III、-0%のDM;病期II、+2.7%のDM)。高リスク患者に対する治療利益は、観察された(病期II/III、-10.4%のDM;病期II、-9.5%のDM)。これらの結果(図6)は、高リスク患者は、化学療法から利益を得る可能性がより高いことを示す。
【００９０】
(実施例5)
結腸予後についてのMCTP1/THNSL2比
2遺伝子予後モデルの予後力を、MCTP1およびTHNSL2遺伝子を使用して例示した。MCTP1/THNSLC2比についての閾値を、188のトレーニングサンプルに対して求め、HRが3.1(P=6.8e-5)である有意な性能を示した。閾値を超える高いMCTP1/THNSLC2比を有する試料を、低リスクとして分類した。MCTP1/THNSLC2比モデルは、178の独立したバリデーション試料に対して確認し、2.3の有意なHRを示した(P=0.017)(図8)。高いMCTP1/THNSLC2比(低リスク)を有するバリデーション試料は、87%(95CI、80〜95%)の5年DMFSを示し、低いMCTP1/THNSLC2比(高リスク)を有する試料は、70%(95CI、60〜82%)のDMFSを示した。
【００９１】
(実施例6)
さらに、本発明者らは、30人の病期I結腸癌患者に対する18遺伝子プロファイルを調査した。一人の患者が、遠隔転移の発生を示した。この患者は、18遺伝子プロファイルによって高リスクとして正確に同定された(図9)。
【００９２】
【表１Ａ】
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【００９３】
【表１Ｂ】
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【００９４】
【表１Ｃ】
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【００９５】
【表１Ｄ】
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【００９６】
【表１Ｅ】
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【００９７】
【表１Ｆ】
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【００９８】
【表１Ｇ】
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【００９９】
【表１Ｈ】
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【０１００】
【表１Ｉ】
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【０１０１】
【表１Ｊ】
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【０１０２】
【表１Ｋ】
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【０１０３】
【表１Ｌ】
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【０１０４】
【表１Ｍ】
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【０１０５】
【表１Ｎ】
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【０１０６】
【表１Ｏ】
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【０１０７】
【表１Ｐ】
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【０１０８】
【表１Ｑ】
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【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
Table 3(表5、6):病期II患者(n=115)についての、ASCO勧告に記載されたパラメータによるリスク評価と比較した、18遺伝子プロファイルリスク評価。ASCO勧告は、評価されたリンパ節の全数が12未満であり、かつ/または腫瘍がT4病期であり、かつ/または組織学グレードが3であり、かつ/または患者が緊急提示または閉塞を有した場合、高リスクの病期II患者を定義する。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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