(57)【要約】  患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予測または評価することおよび、任意に、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを更に含むことが可能である、単独でまたはＮＧＡＬの濃度を決定する方法と更に組み合わせて、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定する方法、ＮＧＡＬと反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分、およびアッセイのための指示書を含むキット、ＮＧＡＬと反応する自己抗体を単離する方法、ＮＧＡＬと反応する単離された自己抗体、ならびにＮＧＡＬアッセイの結果の信頼性を決定するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）またはこの断片と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定する方法であって、ＮＧＡＬ（またはこの断片）および少なくとも１種の検出可能な標識を用い、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度の直接的または間接的な指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルを、対照または較正物質（任意に、較正物質の各々のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する抗体の濃度が一連の較正物質中の他の較正物質と異なる一連の較正物質の一部である。）中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する抗体の存在、量または濃度の直接的または間接的な指標として生成されたシグナルと比較することを含むアッセイによって、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイすることを含み、その結果、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度が決定される、方法。
【請求項２】
下記の段落：
（ｉ）検出可能な標識を含み、少なくとも１種の自己抗体に結合するＮＧＡＬ（またはこの断片）に試験試料を接触させて、ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を形成させる段階、および
（ｉｉ）（ｉ）において形成されたＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体において検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出または測定することによって、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定し、その結果、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度が決定される段階
を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
下記の段落：
（ｉ）ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を形成するように、少なくとも１種の自己抗体に結合し、固相上に任意に固定されたＮＧＡＬ（またはこの断片）に試験試料を接触させる段階、
（ｉｉ）検出可能な標識を含み、自己抗体に結合している少なくとも１種の検出抗体にＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を接触させて、ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体／検出抗体複合体を形成させる段階、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において形成されたＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体／検出抗体複合体中において検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出または測定することによって、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する自己抗体の存在、量または濃度を決定し、その結果、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する自己抗体の存在、量または濃度が決定される段階
を含み、段階（ｉ）の後で非結合の少なくとも１種の自己抗体を除去すること、および段階（ｉｉ）の後で非結合の少なくとも１種の検出抗体を除去することを任意に更に含む、請求項１の方法。
【請求項４】
検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項１の方法。
【請求項５】
アクリジニウム化合物がアクリジニウム−９−カルボキサミドまたはアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである、請求項４の方法。
【請求項６】
検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項２の方法。
【請求項７】
アクリジニウム化合物がアクリジニウム−９−カルボキサミドまたはアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである、請求項６の方法。
【請求項８】
検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項３の方法。
【請求項９】
アクリジニウム化合物がアクリジニウム−９−カルボキサミドまたはアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである、請求項８の方法。
【請求項１０】
試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度を、事前に、同時にまたは事後に決定することを更に含み、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する少なくとも１種の特異的結合パートナーおよび少なくとも１種の検出可能な標識を用い、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度の直接的または間接的な指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルを、対照または（任意に、較正物質の各々のＮＧＡＬ濃度が一連の較正物質中の他の較正物質と異なる一連の較正物質の一部である。）較正物質中のＮＧＡＬの濃度の直接的または間接的な指標として生成されたシグナルと比較することを含むアッセイによってＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイすることを含み、その結果、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度が決定される、請求項１、４または５のいずれかの方法。
【請求項１１】
試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度を、事前に、同時にまたは事後に決定することを更に含み、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する少なくとも１種の特異的結合パートナーおよび少なくとも１種の検出可能な標識を用い、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度の直接的または間接的な指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルを、対照または（任意に、較正物質の各々のＮＧＡＬ濃度が一連の較正物質中の他の較正物質と異なる一連の較正物質の一部である。）較正物質中のＮＧＡＬの濃度の直接的または間接的な指標として生成されたシグナルと比較することを含むアッセイによってＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイすることを含み、その結果、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度が決定される、請求項２、６または７のいずれかの方法。
【請求項１２】
試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度を、事前に、同時にまたは事後に決定することを更に含み、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する少なくとも１種の特異的結合パートナーおよび少なくとも１種の検出可能な標識を用い、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度の直接的または間接的な指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルを、対照または（任意に、較正物質の各々のＮＧＡＬ濃度が一連の較正物質中の他の較正物質と異なる一連の較正物質の一部である。）較正物質中のＮＧＡＬの濃度の直接的または間接的な指標として生成されたシグナルと比較することを含むアッセイによってＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイすることを含み、その結果、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度が決定される、請求項３、８または９のいずれかの方法。
【請求項１３】
試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予測または評価することを更に含み、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを更に含む場合、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを任意に更に含む、請求項１、４、５または１０のいずれかの方法。
【請求項１４】
試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予測または評価することを更に含み、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを更に含む場合、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを任意に更に含む、請求項２、６、７または１１のいずれかの方法。
【請求項１５】
試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予測または評価することを更に含み、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを更に含む場合、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを任意に更に含む、請求項３、８、９または１２のいずれかの方法。
【請求項１６】
試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予測または評価することを更に含み、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを更に含む場合、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを任意に更に含む、請求項１０の方法。
【請求項１７】
試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予測または評価することを更に含み、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを更に含む場合、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを任意に更に含む、請求項１１の方法。
【請求項１８】
試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予測または評価することを更に含み、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを更に含む場合、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを任意に更に含む、請求項１２の方法。
【請求項１９】
自動化システムまたは半自動化システムにおける使用のために適合されている、請求項１、４、５、１０、１３または１６のいずれかの方法。
【請求項２０】
自動化システムまたは半自動化システムにおける使用のために適合されている、請求項２、６、７、１１、１４または１７のいずれかの方法。
【請求項２１】
自動化システムまたは半自動化システムにおける使用のために適合されている、請求項３、８、９、１２、１５または１８のいずれかの方法。
【請求項２２】
試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度について試験試料をアッセイするためのキットであって、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分、およびＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための指示書を含み、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分が、固相上に任意に固定されたＮＧＡＬ（またはこの断片）を含む組成物および／またはＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体に結合することができる抗体を含む組成物を含み、ＮＧＡＬ（またはこの断片）または前記抗体が、任意に検出可能であるように標識されている、キット。
【請求項２３】
ＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分、およびＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための指示書を含み、ＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分が、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する特異的結合パートナーを含む組成物を含み、ＮＧＡＬに対する特異的結合パートナーが、検出可能であるように任意に標識されている、請求項２２のキット。
【請求項２４】
ＮＧＡＬと反応する自己抗体を単離する方法であって、
（ｉ）ＮＧＡＬ（またはこの断片）が生物試料との接触の前または後に固相上に任意に固定されるＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する自己抗体を含むことが知られている生物試料にＮＧＡＬ（またはこの断片）を接触させる段階、
（ｉｉ）自己抗体が結合しているＮＧＡＬ（またはこの断片）を単離する段階、および
（ｉｉｉ）ＮＧＡＬ（またはこの断片）から自己抗体を単離しその結果、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する自己抗体が単離される段階
を含む、方法。
【請求項２５】
ＮＧＡＬまたはこの断片と反応する単離された自己抗体。
【請求項２６】
対象から得られた試験試料中のＮＧＡＬの量または濃度を検出または定量するために、事前に、同時にまたは事後に行われた別々のアッセイから得られた結果の信頼性を決定するための方法であって、
（ａ）ＮＧＡＬと反応する少なくとも１種の自己抗体の、試験試料中の量もしくは濃度を決定する段階、および
（ｂ）段階（ａ）における量または濃度を所定のレベルと比較する段階であって、段階（ａ）における量または濃度が所定のレベルと比較して高い場合、別々のアッセイによって決定されたＮＧＡＬの量または濃度が信頼できないと考えられ、前記量または濃度が所定のレベル以下である場合、別々のアッセイによって決定されたＮＧＡＬの量または濃度が信頼できると考えられる段階
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、単離されたヒト自己抗体、ならびにＮＧＡＬまたはこの断片に対するヒト自己抗体を検出するための、およびＮＧＡＬアッセイの結果の信頼性を決定するための関連するキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）は、ヒト好中球リポカリン（ＨＮＬ）、Ｎ−ホルミルペプチド結合タンパク質および２５ｋＤａのα２−ミクログロブリン関連タンパク質としても知られており、モノマーとして、ホモダイマーとしてまたはゼラチナーゼＢやマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）等のタンパク質とのヘテロダイマーとして存在し得る２４ｋＤａのタンパク質である。ＮＧＡＬは、感染症に伴うもの等の炎症を含む、多くの疾患（例えば、Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４８２：２９８−３０７（２０００）を参照されたい。）、障害および状態の診断および／または予測におけるマーカーである。ＮＧＡＬは、とりわけ、過敏性腸症候群（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１６６７１９号および米国特許出願公開第２００８／００８５５２４号を参照されたい。）、腎障害、腎疾患および腎傷害（例えば、米国特許出願公開第２００８／００９０３０４号、米国特許出願公開第２００８／００１４６４４号、米国特許出願公開第２００８／００１４６０４号、米国特許出願公開第２００７／０２５４３７０号および米国特許出願公開第２００７／００３７２３２号を参照されたい。）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症の敗血症、敗血症性ショックおよび多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）（例えば、米国特許出願公開第２００８／００５０８３２号および米国特許出願公開第２００７／００９２９１１号を参照、また、米国特許第６，１３６，５２６号も参照されたい。）、歯周疾患（例えば、米国特許第５，８６６，４３２号を参照されたい。）および静脈血栓塞栓性疾患（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２６９８３６号を参照されたい。）に対するマーカーである。その遊離型、非複合体型形態において、ＮＧＡＬは、卵巣癌、浸潤性および非浸潤性乳癌、ならびに乳癌の主要なリスク因子である異型乳管過形成に対するマーカーである（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１９６８７６号を参照、また、癌の増殖状況を評価することに関して、米国特許第５，６２７，０３４号および米国特許第５，８４６，７３９号も参照されたい。）。また、ＮＧＡＬは、ＭＭＰ−９と複合体を形成する場合、組織再造に関連する状態に対するマーカーでもある（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１０５１６６号および米国特許第７，１５３，６６０号を参照されたい。）。また、高レベルのＮＧＡＬ（例えば、約３５０μｇ／Ｌ（Ｘｕら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５：１２５−１３１（１９９５））は、ウイルス感染症と対立するものとして、細菌感染症の指標となることもできる（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１１５７２８号を参照されたい。）。
【０００３】
健康なヒトの血清中のＮＧＡＬのレベルは、約５０μｇ／Ｌから約１００μｇ／Ｌの範囲に及ぶ（Ｘｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７１：２４５−２５２（１９９４）およびＢｌａｓｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ２３５：１３７−１４５（１９９５））。ＮＧＡＬについての現在利用可能なアッセイ、例えば、治療的または予防的有効性の診断、予測および評価において使用されるものは、試験試料中の、例えば液体試料中の、特に患者の血清、血漿または尿の試料中のＮＧＡＬのレベルを評価する。かかるアッセイは、試験試料中のＮＧＡＬのレベルを、正常であると考えられるもの、所定の状態、障害もしくは疾患状態を示すと考えられるもの、または事前に患者から採取された試験試料中のＮＧＡＬのレベルと比較する。かかる比較に基づいて、診断、予測および治療的／予防的処置レジメン（例えば、使用する活性薬剤、または所定の活性薬剤の投与量）が決定される。不都合なことに、かかるアッセイによって得られた結果は、これまでに知られていなかった内在性抗ＮＧＡＬ抗体の存在によって、例えば偽陰性、偽陽性、不正確な定量化等の異常な結果につながり得る干渉を受けやすい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０１６６７１９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／００８５５２４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／００９０３０４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／００１４６４４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００８／００１４６０４号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００７／０２５４３７０号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００７／００３７２３２号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００８／００５０８３２号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００７／００９２９１１号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，１３６，５２６号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，８６６，４３２号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００７／０２６９８３６号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００７／０１９６８７６号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，６２７，０３４号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，８４６，７３９号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００７／０１０５１６６号明細書
【特許文献１７】米国特許第７，１５３，６６０号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００４／０１１５７２８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４８２：２９８−３０７（２０００）
【非特許文献２】Ｘｕら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５：１２５−１３１（１９９５）
【非特許文献３】Ｘｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７１：２４５−２５２（１９９４）
【非特許文献４】Ｂｌａｓｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ２３５：１３７−１４５（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述に鑑みて、ＮＧＡＬに対する単離されたヒト自己抗体を提供することは、本発明の開示の目的である。試験試料中のＮＧＡＬに対する自己抗体を検出するための方法およびキットを提供することは、本発明の開示の別の目的である。かかる方法およびキットは、試験試料中のＮＧＡＬ自己抗体の存在による異常な結果を最小限に抑え、それによって治療的／予防的有効性の診断、予測および評価を向上させるように、ＮＧＡＬおよび／または別のタンパク質と複合体を形成したＮＧＡＬの検出のための方法およびキットとともに使用することができる。これらのおよび他の目的および利点、ならびに更なる本発明の特徴は、本明細書において提供される詳細な説明から明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
試験試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）またはこの断片と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定する方法が提供される。この方法は、ＮＧＡＬ（またはこの断片）および少なくとも１種の検出可能な標識を用い、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度の直接的または間接的な指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルを、対照または較正物質中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する抗体の存在、量または濃度の直接的または間接的な指標として生成されたシグナルと比較することを含むアッセイによって、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイすることを含む。較正物質は、任意に、較正物質の各々の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する抗体の濃度が一連の較正物質中の他の較正物質と異なる、一連の較正物質の一部である。この方法は、自動化システムまたは半自動化システムにおける使用のために適合させることが可能である。
【０００８】
方法は、（ｉ）検出可能な標識を含み、少なくとも１種の自己抗体に結合するＮＧＡＬ（またはこの断片）に試験試料を接触させて、ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を形成させること、および（ｉｉ）（ｉ）において形成されたＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体において検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出または測定することによって、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定することを含むことができる。
【０００９】
方法は、（ｉ）ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を形成するように、少なくとも１種の自己抗体に結合する、固相上に任意に固定されたＮＧＡＬ（またはこの断片）に試験試料を接触させること、（ｉｉ）検出可能な標識を含み、自己抗体に結合している少なくとも１種の検出抗体にＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を接触させて、ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体／検出抗体複合体を形成させること、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）において形成されたＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体／検出抗体複合体中において検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出または測定することによって、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する自己抗体の存在、量または濃度を決定することを含むことができる。方法は、段階（ｉ）の後で非結合の少なくとも１種の自己抗体を除去すること、および段階（ｉｉ）の後で非結合の少なくとも１種の検出抗体を除去することを任意に更に含む。
【００１０】
方法は、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度を、事前に、同時にまたは事後に決定することを更に含むことができる。方法は、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する少なくとも１種の特異的結合パートナーおよび少なくとも１種の検出可能な標識を用い、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度の直接的または間接的な指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルを、対照または較正物質中のＮＧＡＬの濃度の直接的または間接的な指標として生成されたシグナルと比較することを含むアッセイによってＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイすることを含むことができる。較正物質は、任意に、較正物質の各々のＮＧＡＬ濃度が一連の較正物質中の他の較正物質と異なる、一連の較正物質の一部である。
【００１１】
方法は、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を診断すること、予測することまたは評価することを更に含むことができる。方法が、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを更に含む場合、方法は、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを任意に更に含む。
【００１２】
また、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度について試験試料をアッセイするためのキットも提供される。キットは、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分、およびＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための指示書を含む。ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分は、固相上に任意に固定されたＮＧＡＬ（またはこの断片）を含む組成物および／またはＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体に結合することができる抗体を含む組成物を含み、ＮＧＡＬ（またはこの断片）または抗体は、任意に検出可能であるように標識されている。
【００１３】
ＮＧＡＬと反応する自己抗体を単離する方法が、更に提供される。この方法は、（ｉ）ＮＧＡＬが生物試料との接触の前または後に固相上に任意に固定される、ＮＧＡＬと反応する自己抗体を含むことが知られている生物試料にＮＧＡＬ（またはこの断片）を接触させること、（ｉｉ）自己抗体が結合しているＮＧＡＬを単離すること、および（ｉｉｉ）ＮＧＡＬから自己抗体を単離することを含む。ＮＧＡＬと反応する単離された自己抗体が、なお更に提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明の開示は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）と反応するヒト血清および血漿中の内在性抗体、すなわち自己抗体の驚くべき予想外の発見に少なくとも部分的に基づく。
【００１５】
定義
（ａ）「好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）」は、ヒト好中球リポカリン（ＨＮＬ）、Ｎ−ホルミルペプチド結合タンパク質および２５ｋＤａのα２−ミクログロブリン関連タンパク質としても知られており、モノマーとして、ホモダイマーとしてまたはゼラチナーゼＢやマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）等のタンパク質とのヘテロダイマーとして存在し得る２４ｋＤａのタンパク質である。例示的なアミノ酸配列については、例えば、Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１４）：１０４２５−１０４３２（１９９３）を参照されたい。一般に、シグナルペプチドは、存在する場合、アミノ酸１−２０を含む。本明細書において適用される番号付与は、かかるシグナルペプチドが存在する場合も存在しない場合もあるという理解の下で、残基１−２０のシグナルペプチドを考慮している。
【００１６】
ＮＧＡＬポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｇｅｎｐｅｐｔ  ＣＡＡ５８１２７（配列番号１）、ＡＡＢ２６５２９、ＸＰ＿８６２３２２、ＸＰ＿５４８４４１、Ｐ８０１０８、Ｐ１１６７２、Ｘ８３００６．１、Ｘ９９１３３．１、ＣＡＡ６７５７４．１、ＢＣ０３３０８９．１、ＡＡＨ３３０８９．１、Ｓ７５２５６．１、ＡＤ１４１６８．１、ＪＣ２３３９、１ＤＦＶＡ、１ＤＦＶＢ、１Ｌ６ＭＡ、１Ｌ６ＭＢ、１Ｌ６ＭＣ、１ＮＧＬＡ、１ＱＱＳＡ、１Ｘ７１Ａ、１Ｘ７１Ｂ、１Ｘ７１Ｃ、１Ｘ８９Ａ、１Ｘ８９Ｂ、１Ｘ８９Ｃ、１Ｘ８ＵＡ、１Ｘ８ＵＢおよび１Ｘ８ＵＣとして記載されているものを含む任意のＮＧＡＬ配列であり得る。ＮＧＡＬポリヌクレオチドおよびポリペプチド（例えば、ポリアミノ酸）配列は、天然に見出されるもの、天然に見出された配列に基づくもの、単離されたもの、合成のもの、半合成のもの、組換えのものまたはその他である。一実施形態において、ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬ（「ｈＮＧＡＬ」としても知られている。）である。ＮＧＡＬポリペプチド配列は、成熟ヒトＮＧＡＬ配列（典型的には天然に見出される２０残基のアミノ酸シグナルペプチドを含まない、および／または他のあらゆるシグナルペプチド配列を差し引いた配列）であり得る。シグナルペプチドが存在する場合、それは、例えば、残基１から２０として番号付与され、同様の番号付与が、コードポリヌクレオチド配列について適用される。
【００１７】
同様に、ＮＧＡＬのＮ末端における開始Ｍｅｔ残基は、原核生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））において産生されたＮＧＡＬまたは（半合成を含む）合成のもしくは誘導された配列中のみに存在し、真核生物（例えば、ヒトを含む哺乳動物細胞および酵母細胞）において産生されたＮＧＡＬ中には存在しない。従って、開始Ｍｅｔ残基は、存在する場合、典型的には負の数として、例えば、残基−１としてカウントされるが、原核生物および真核生物の両バックグラウンドにおいてポリヌクレオチド配列が同じように複製および転写され、翻訳のレベルにおいて差異があるので、真核生物に対して原核生物のバックグラウンドまたは発現系においてポリヌクレオチド配列について同様の番号付与の調整は為されない。
【００１８】
従って、本明細書における開示は、原核生物および／または真核生物バックグラウンドにおいて存在するおよび／または産生される多数の異なるＮＧＡＬポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列（例えば、結果としての、コドン認識に対する最適化を伴って）を包含する。要するに、配列は、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）成熟ＮＧＡＬ配列中のＮ末端において存在する開始Ｍｅｔ残基、（ｃ）成熟ＮＧＡＬタンパク質より前にあるシグナルペプチドの開始点に存在する開始Ｍｅｔ残基、および（ｄ）当業者にとって明らかなもの等の他の変形物を保有もしくはコードしてもよく、または保有もしくはコードしなくてもよい。
【００１９】
例示的な配列としては、本明細書において記載されているもの、すなわち、配列番号１（シグナルペプチドを含むＮＧＡＬ野生型ポリペプチド）、配列番号２（原核生物において産生されＭｅｔ開始コドンが存在する場合にはＭｅｔ開始残基の後にあり得るが、Ｍｅｔ開始コドンが存在するかどうかに関わらず、真核生物において産生される場合にはＭｅｔ開始残基が存在しない、シグナルペプチドを１つも含まないＮＧＡＬ野生型ポリペプチド）および配列番号３（シグナルペプチドをコードするものを含むＮＧＡＬ野生型ポリヌクレオチド配列）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な配列としては、全て２００７年１０月１９日に出願された米国仮出願第６０／９８１，４７０号、米国仮出願第６０／９８１，４７１号および米国仮出願第６０／９８１，４７３号、ならびに全て２００８年４月１６日に出願された米国特許出願第１２／１０４，４０８号、米国特許出願第１２／１０４，４１０号および米国特許出願第１２／１０４，４１３号（それらの各々は、上記に関するそれらの教示について参照により完全に組み込まれている。）の内のいずれか１つ以上において記載されている任意の変異配列が更に挙げられる。
【００２０】
本明細書における「ＮＧＡＬ」の使用は、文脈と矛盾しない限り、ＮＧＡＬおよびこの断片を包含することが意図される。
【００２１】
本明細書における「ＮＧＡＬ断片」という用語は、本明細書において使用される場合、成熟ＮＧＡＬ（例えば、ヒトＮＧＡＬ）またはシグナルペプチドを含むＮＧＡＬの全体より少ない部分を含むポリペプチドを指す。特に、ＮＧＡＬ断片は、配列番号１または２の約５個から約１７８個までまたは約１７９個までの連続したアミノ酸を含む。特に、ＮＧＡＬ断片は、配列番号１または２の約５個から約１７０個までの連続したアミノ酸を含む。特に、ＮＧＡＬ断片は、配列番号１もしくは２の少なくとも約５個の連続したアミノ酸、配列番号１もしくは２の少なくとも約１０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２のアミノ酸の少なくとも約１５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約２０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約２５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２のアミノ酸の少なくとも約３０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約３５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約４０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約４５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約５０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約５５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約６０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約６５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約７０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約７５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約８０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約８５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約９０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約９５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１００個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１０５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１１０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１１５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１２０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１２５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１３０の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１３５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１４０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１４５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１５０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１６０個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１６５個の連続したアミノ酸残基、配列番号１もしくは２の少なくとも約１７０個の連続したアミノ酸残基または配列番号１もしくは２の少なくとも約１７５個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００２２】
ＮＧＡＬの断片は、ＮＧＡＬの連続または非直線状エピトープを含む。かかるエピトープ断片の厳密な境界は、当技術分野における通常の技術を使用して確認することができる。断片は、好ましくは、少なくとも約５個の連続したアミノ酸、例えば約１０個の連続したアミノ酸、約１５個の連続したアミノ酸または約２０個の連続したアミノ酸を含む。（野生型アミノ酸配列に関する。）かかる断片の例としては、アミノ酸
【００２３】
【化１】
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を含む断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
（ｂ）「ＮＧＡＬ類似体」は、ＮＧＡＬの生物学的に活性な類似体、例えば、ヒトＮＧＡＬの生物学的に活性な類似体を指す。類似体は、ＮＧＡＬの生物学的活性を消去しない切断、欠失、挿入、置換、置き換え、側鎖伸長および融合、例えば別のタンパク質との融合、ならびに前述のもののいずれかの組み合わせを含むことができる。例示的なＮＧＡＬ類似体としては、全て２００７年１０月１９日に出願された米国仮出願第６０／９８１，４７０号、米国仮出願第６０／９８１，４７１号および米国仮出願第６０／９８１，４７３号、ならびに全て２００８年４月１６日に出願された米国特許出願第１２／１０４，４０８号、米国特許出願第１２／１０４，４１０号および米国特許出願第１２／１０４，４１３号（それらの各々は、上記に関するそれらの教示について参照により完全に組み込まれている。）の内のいずれか１つ以上において記載されている任意の変異ＮＧＡＬ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
（ｃ）「ＮＧＡＬコンジュゲート」は、少なくとも１つの修飾部分またはそれに結合した少なくとも１つの反応性実体を含むＮＧＡＬまたはこの断片を指す。修飾部分の例としては、安定性、溶解性および／または生物学的活性に影響を及ぼす部分（例えば、親水性ポリマーまたはオリゴマー、両親媒性ポリマーまたはオリゴマーおよび親油性ポリマーまたはオリゴマー）、親水性部分、ポリエチレングリコール部分、生体適合性水溶性部分、ポリカチオン部分、両親媒性部分、ポリエチレングリコール／アルキル修飾部分等が挙げられるが、これらに限定されない。かかる修飾部分は、ＮＧＡＬまたはこの断片に共有結合することができる。修飾部分は、血液の成分、例えば血液タンパク質と、例えば前記成分に存在しているアミノ基、ヒドロキシル基またはチオール基を介して共有結合を形成することができる。アミノ基は、カルボキシ、ホスホリルまたはアシル等の反応性実体と共有結合を形成することができ、ヒドロキシル基は、活性化エステル等の反応性実体と共有結合を形成することができ、チオール基は、エステルまたは混合無水物等の反応性実体と共有結合を形成することができる。好ましい血液成分は、血清アルブミン、免疫グロブリンまたはこれらの組み合わせ等の移動性血液成分であり、好ましい反応性実体は、マレイミドまたはマレイミド含有基等の無水物を含む。
【００２６】
（ｄ）「ＮＧＡＬ誘導体」は、ＮＧＡＬ類似体、ＮＧＡＬコンジュゲートまたはＮＧＡＬの組換え型を指す。
【００２７】
（ｅ）「対照」は、ＮＧＡＬに対する抗体を含まないことが知られている組成物（「陰性対照」）またはＮＧＡＬに対する抗体を含むことが知られている組成物（「陽性対照」）を指す。陽性対照は、ＮＧＡＬ対する既知濃度の抗体を含むことができる。「対照」および「陽性対照」は、ＮＧＡＬに対する既知濃度の抗体を含む組成物を指すために、本明細書において交換可能に使用され得る。「陽性対照」は、アッセイの性能特性を確立するために使用することができ、試薬（例えば、分析物）の完全性の有用な指標である。
【００２８】
（ｆ）「一連の較正組成物」は、既知濃度のＮＧＡＬに対する抗体を含む複数の組成物（組成物の各々のＮＧＡＬに対する抗体の濃度は、一連の較正物質中の他の組成物と異なる。）を指す。
【００２９】
（ｇ）本明細書において記載されたイムノアッセイおよびキットの関連において、「品質管理試薬」としては、較正物質、対照および感受性パネルが挙げられるが、これらに限定されない。「較正物質」または「標準」は、典型的には、抗体や分析物等の分析物濃度の内挿のための較正（標準）曲線を確立するために（例えば、１種以上（例えば、複数））使用される。代替として、所定の正／負のカットオフ付近の単一の較正物質が使用され得る。多数の較正物質（すなわち、複数の較正物質または様々な量の（１種以上の）較正物質）は、「感受性パネル」を含むように一緒に使用され得る。
【００３０】
（ｈ）「所定のカットオフ」および「所定のレベル」は、一般に、所定のカットオフ／レベルに対してアッセイ結果を比較することによって診断／予測／治療効果の結果を評価するために使用されるアッセイカットオフ値を指し、ここで所定のカットオフ／レベルは、既に各種臨床パラメータ（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善等）と結びつけられているまたは関連づけられている。本発明の開示は、例示的な所定のレベルを提供する。しかし、カットオフ値がイムノアッセイの性質（例えば、用いられる抗体等）に応じて変化し得ることは、周知である。更に、この開示に基づいてそれらの他のイムノアッセイについてのイムノアッセイ特異的カットオフ値を得るために本明細書における開示を他のイムノアッセイに対して適合させることは、当技術分野における通常の技術の十分な範囲内である。所定のカットオフ／レベルの厳密な値はアッセイ間において変化する可能性があるが、本明細書において記載されている相関は一般に適用可能であるべきである。
【００３１】
（ｉ）「試料」、「試験試料」および「患者試料」は、本明細書において交換可能に使用され得る。試料（例えば、尿、血清または血漿の試料）は、当技術分野において知られている常法に従う手法を使用して対象または患者から得ることができる。試料は、患者から得られた状態のまま直接使用することができ、または本明細書において考察される何らかの方法もしくはそれ以外の場合当技術分野において知られている何らかの方法において試料の特性を改変するために、例えば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化および試薬の添加等によって前処理することができる。
【００３２】
（ｊ）「患者」および「対象」は、動物、例えば、トリ（例えば、カモまたはガチョウ）、サメ、クジラ、ならびに非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、サル、チンパンジーおよびヒト）を含む哺乳動物を指すために本明細書において交換可能に使用され得る。好ましくは、患者または対象は、ヒト、例えば、心臓血管疾患のリスクがあるヒト、心臓血管疾患を有するヒト、腎疾患のリスクがあるヒトまたは腎疾患を有するヒトである。
【００３３】
（ｋ）「少なくとも１種の成分」、「成分」および「複数の成分」は、一般に、本明細書において記載された方法および当技術分野において知られている他の方法に従って試験試料、例えば、患者の尿、血清または血漿試料のアッセイのためのキット中に含まれ得る捕捉抗体、検出抗体またはコンジュゲート抗体、較正物質、対照、感受性パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素用補助因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、（例えば、溶液としての）基質、停止液等を指す。幾つかの成分は、溶液中にあってよく、またはアッセイにおける使用のために再構成するために凍結乾燥されてもよい。
【００３４】
（ｌ）「抗体」（Ａｂ）および「複数の抗体」（Ａｂｓ）は、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全または部分的ヒト化）、動物抗体（例えば、限定されないが、トリ（例えば、カモまたはガチョウ）、サメ、クジラおよび非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス等）または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー等）を含む哺乳動物、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）および抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、二重ドメイン抗体（例えば、二重可変ドメイン抗体またはＤＶＤ−ＩｇＧ）、ならびに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片を指す。特に、抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち分析物結合部位を含む分子が挙げられる。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。バイオディスプレイを使用して調製されたコンビナトリアル抗体ライブラリのスクリーニングを介して親和性（すなわち、ＫＤ、ｋｄまたはｋａ）が増大したまたは改善された抗体は、「親和性成熟抗体」と称される。簡素化のために、分析物に対する抗体は、本明細書において、しばしば「抗分析物抗体」または「分析物抗体」（例えば、抗ＮＧＡＬ抗体またはＮＧＡＬ抗体）と称される。
【００３５】
（ｍ）「自己抗体」および「複数の自己抗体」は、抗体が産生される動物において天然に出現する分析物に結合する（または分析物「と反応する」）内在性抗体を指す。本開示の状況において、分析物は、ＮＧＡＬまたはこの断片である。自己抗体に関する「少なくとも１種」および「１種以上」の使用は、少なくとも１つまたは１つ以上の型または集団の自己抗体、すなわち、例えば、ＮＧＡＬまたはこの断片上の異なるエピトープと反応する自己抗体を意味する。簡素化のために、分析物に対する自己抗体は、本明細書において、しばしば「抗分析物自己抗体」または「分析物自己抗体」（例えば、抗ＮＧＡＬ自己抗体またはＮＧＡＬ自己抗体）と称される。
【００３６】
（ｎ）「標識」および「検出可能な標識」は、抗体と分析物の間の反応を検出可能にするために抗体または分析物に結合された部分を意味し、そのように標識された抗体または分析物は、「検出可能であるように標識された」と称される。標識は、視覚的手段または機器的手段によって検出可能なシグナルを生成することができる。各種標識は、シグナル生成物質、例えば、色素原、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物等を含む。標識の代表例としては、光を生成する部分（例えば、アクリジニウム化合物）および蛍光を生成する部分（例えば、フルオレセイン）が挙げられる。他の標識は、本明細書において記載されている。
【００３７】
（ｏ）「ＣＰＳＰアクリジニウム−９−カルボキサミド」は、９−［［（３−カルボキシプロピル）［（４−メチルフェニル）スルホニル］アミノ］−カルボニル］−１０−（３−スルホプロピル）アクリジニウム内塩を意味する。
【００３８】
（ｐ）「ＳＰＳＰアクリジニウム−９−カルボキサミド」は、９−［［［［４−（３−カルボキシプロピル）フェニル］スルホニル］（３−スルホプロピル）アミノ］カルボニル］−１０−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム内塩を意味する。
【００３９】
（ｑ）「トレーサー」は、標識にコンジュゲートした分析物または分析物断片、例えば、標識（例えば、フルオレセイン部分）にコンジュゲートしたＮＧＡＬ（またはこの断片）を意味し、ここで標識にコンジュゲートした分析物は、分析物に特異的な抗体上の部位に対して分析物と効果的に競合することができる。
【００４０】
（ｒ）「固相」は、不溶であり、または後続反応によって不溶となり得るあらゆる材料を指す。固相は、捕捉剤を誘引および固定するその固有の能力について選択され得る。代替として、固相は、これに、捕捉剤を誘引および固定する能力を有する連結剤を付着することができる。連結剤は、例えば、捕捉剤自体または捕捉剤にコンジュゲートした帯電物質に関して逆帯電した帯電物質を含むことができる。一般に、連結剤は、固相上に固定された（固相に結合した）および結合反応を通じて捕捉剤を固定する能力を有するあらゆる（好ましくは特異的な）結合パートナーであり得る。連結剤によって、アッセイの実施の前またはアッセイの実施の間に、捕捉剤が固相材料に間接的に結合することが可能になる。固相は、例えば、プラスチック、誘導体化されたプラスチック、磁性金属もしくは非磁性金属、ガラスまたはケイ素であり得、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップおよび当業者に知られている他の構成等であり得る。
【００４１】
（ｓ）「特異的結合パートナー」は、特異的結合ペアのメンバーである。特異的結合ペアは、化学的手段または物理的手段を通じて互いに特異的に結合する２個の異なる分子を含む。故に、一般的なイムノアッセイの抗原および抗体特異的結合ペアの他に、他の特異的結合ペアは、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素等を含むことができる。更に、特異的結合ペアは、元の特異的結合メンバーの類似体（例えば、分析物−類似体）であるメンバーを含むことができる。免疫反応性特異的結合メンバーとしては、単離されたものであっても、組換えにより作製されたものであっても、抗原、抗原断片および（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む）抗体、ならびにこれらの複合体および断片が挙げられる。
【００４２】
（ｔ）「過酸化水素生成酵素」は、過酸化水素をすることができる酵素を指す。過酸化水素生成酵素の例は、以下で表１において列挙される。
【００４３】
【表１】
2012507005.tif 000049
2012507005.tif 000050
2012507005.tif 000051
2012507005.tif 000052
2012507005.tif 000053
【００４４】
（ｕ）「心臓血管疾患」は、心臓、血管または循環を含む各種の臨床的な疾患、障害または状態を指す。疾患、障害または状態は、冠動脈、脳動脈または末梢動脈のアテローム硬化性障害に起因し得る。心臓血管疾患としては、冠動脈疾患、末梢血管疾患、アテローム硬化症、高血圧、心筋梗塞（すなわち、心筋の領域が、その領域への酸素の不十分な供給のために死滅するまたは損傷を受ける場合に出現する心臓発作（例えば、原発性または続発性））、心筋炎、急性冠動脈症候群、狭心症（すなわち、心筋の血管（冠状血管）を通る不十分な血流によって引き起こされる胸部不快感）、突然心臓死、脳梗塞、再狭窄、失神、虚血、一過性脳虚血発作、再灌流傷害、血管閉塞、頸動脈閉塞性疾患、心臓血管自己免疫疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。「心臓血管自己免疫疾患」によって、典型的な機能を損なう、心臓のまたは心臓に供給を行う血管のあらゆる構造的または機能的異常を含む、基礎自己免疫疾患に起因する、心臓の健康なまたは正常な状態からのあらゆる逸脱が意味される。心臓血管自己免疫疾患の例としては、心筋炎、心筋症および虚血性心疾患が挙げられ、各々は、基礎自己免疫疾患に起因する。「心筋炎」は、心筋の炎症を指す。心筋炎は、種々の状態、例えば、ウイルス感染症、サルコイドーシス、リウマチ熱、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス等）および妊娠によって引き起こされ得る。「心筋症」は、心筋の衰弱または心筋構造の変化を指す。心筋症は、不十分な心臓のポンピングまたは他の心臓機能異常をしばしば伴う。心筋症は、ウイルス感染症、心臓発作、アルコール症、長期の重症高血圧、栄養欠乏（特に、セレン、チアミンおよびＬ−カルニチン）、全身性エリテマトーデス、セリアック病および末期腎疾患によって引き起こされ得る。心筋症の型としては、拡張型心筋症、肥大型心筋症および拘束型心筋症が挙げられる。「拡張型心筋症」は、左心室の著しい拡張および不十分な機能によって特徴付けられる、全体的な、通常は特発性の心筋障害を指す。拡張型心筋症としては、虚血性心筋症、特発性心筋症、高血圧性心筋症、感染性心筋症、アルコール性心筋症、中毒性心筋症および周産期心筋症が挙げられる。「肥大型心筋症」は、異なる大きさに成長した右心室心筋および左心室心筋から生じた状態を指す。「拘束型心筋症」は、心筋が収縮の間に弛緩できない（十分に充満することを妨げる。）ことによって特徴付けられる状態を指す。「虚血性心疾患」は、多くの場合アテローム硬化症によって引き起こされる、心筋の血液供給の欠如または相対的欠乏のために心筋が損傷を受けるまたは非効率的に働くあらゆる状態を指し、この状態としては、狭心症、急性心筋梗塞症および慢性虚血性心疾患が挙げられる。
【００４５】
（ｖ）「心不全」は、心臓が身体の残りの部分に血液を効率的にポンピングすることができない状態を指す。心不全は、梗塞、心筋症（原発性もしくは続発性）、高血圧、冠動脈疾患、弁疾患、先天性欠損もしくは感染症による心臓に対する損傷または動脈の狭窄化に起因し得る。心不全は、慢性、うっ血性、急性、非代償性、収縮期または拡張期として更に記載され得る。Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類は、患者の機能的能力に基づいて疾患の重症度を記載しており、ＮＹＨＡのクラスは、処置または処置に対する応答の欠如に基づいて進行および／または消退し得る。心不全において、心臓血管疾患の「増加した重症度」は、例えばクラスＩＩＩまたはクラスＩＶへの増加したＮＹＨＡ分類によって示される疾患の増悪を指し、心臓血管疾患の「低下した重症度」は、例えばクラスＩＩＩまたはＩＶからクラスＩＩまたはＩへの低下したＮＹＨＡ分類によって示される疾患の改善を指す。
【００４６】
（ｗ）「自己免疫疾患」は、自己抗原に対する免疫寛容の喪失を指す。自己免疫疾患の診断のための幾つかの基準としては、（１）循環自己抗体の存在、（２）罹患した器官において認められた自己抗体、（３）同定された標的抗原、（４）抗原、血清または自己抗体移入による免疫化による動物モデルにおける誘発性および（５）免疫抑制療法または免疫吸着法に対する応答性が挙げられる。自己免疫疾患の他の特徴としては、その（ａ）女性における増加した有病率、（ｂ）家族内集積（しかし、これは疾患によって異なる。）、（ｃ）無症状のリスク（すなわち、自己抗体が疾患の何年か前に存在し得る。）、（ｄ）周期的性質および（ｅ）慢性的性質が挙げられる。
【００４７】
（ｘ）「自己免疫」は、例えば、宿主抗原と反応性の自己抗体またはＴリンパ球の存在によって特徴付けられる、宿主抗原に対する１つ以上の免疫応答を指す。
【００４８】
（ｙ）「腎疾患」は、例えば、急性腎不全、急性腎炎症候群、鎮痛薬ネフロパシー、アテローム塞栓性腎疾患、慢性腎不全、慢性腎炎、先天性腎炎症候群、末期腎疾患、グッドパスチャー症候群、間質性腎炎、腎癌、腎損傷（ｒｅｎａｌ  ｄａｍａｎｇｅ）、腎感染症、腎傷害、腎結石、ループス腎炎、膜性増殖性ＧＮ  Ｉ、膜性増殖性ＧＮ  ＩＩ、膜性腎症、微小変化群、壊死性糸球体腎炎、腎芽細胞腫、腎石灰沈着症、腎性尿崩症、腎症−ＩｇＡ、ネフローゼ（ネフローゼ症候群）、多発性嚢胞腎、連鎖球菌感染後ＧＮ、逆流性腎症、腎動脈塞栓症、腎動脈狭窄、腎乳頭壊死、尿細管性アシドーシスＩ型、尿細管性アシドーシスＩＩ型、腎臓灌流低下、腎部血栓症等を含む腎臓のあらゆる疾患、障害または損傷もしくは傷害を指す。
【００４９】
（ｚ）「リスク」は、現在出現しているまたは将来のいずれかの時点で出現する特定の事象の可能性または蓋然性を指す。「リスク層別化」は、医師が患者を特定の疾患、障害または状態を発生する低度、中等度、高度または最高度のリスクに分類することを可能にする既知の臨床的リスク因子のアレイを指す。
【００５０】
（ａａ）「約」は、示された値からのおよそ±１０％の変動を指す。特定の参照が為されるか否かにかかわらず、かかる変動は、本明細書において提供されているいかなる任意の値にも常に含まれると理解されるべきである。
【００５１】
（ｂｂ）本明細書において使用される「信頼性」という用語は、所定の結果または値（例えば、イムノアッセイまたは化学発光アッセイ等のアッセイから得られたもの）に対して、前記結果または値が正確であるまたは正しいという少なくとも約９０％の確実性（例えば、約９０％の確実性から約１００％の確実性）があること、好ましくは前記結果または値が正確であるまたは正しいという少なくとも約９５％の確実性（例えば、約９５％の確実性から約１００％の確実性）があることを意味する。
【００５２】
上記の用語法は、特定の実施形態を記載する目的のために提供される。この用語法は、限定することを意図するものではない。
【００５３】
試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定するための方法
【００５４】
本開示は、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定するための方法を提供する。本明細書において先だって示されているように、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する自己抗体の存在は、アッセイにおいて得られる偽陰性の結果の生成の一因となる可能性がある。本開示の方法は、ＮＧＡＬについてのアッセイを行う前に、同時にまたはその後で試験試料中の１種以上の自己抗体の存在、量または濃度を決定することを可能にする。ＮＧＡＬについてのアッセイによって事前に得られた結果の精度または信頼性は、本開示に従って、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定する方法によって評価することができる。
【００５５】
方法は、均一フォーマットまたは不均一フォーマットにおいて行うことができる。２つのフォーマットの間に本質的な差異が存在することは、当業者によって認識される。例えば、均一フォーマットは、複合体化していない結合パートナーおよび試験試料の他の成分から、試験試料中の対象となる分析物と対象となる分析物に対する特異的結合パートナーとの複合体を分離する１つ以上の段階を欠く。更に、均一アッセイは、検出可能な標識を用いる。検出可能な標識から生成されるシグナルの１つ以上の特徴は、試験試料中の対象となる分析物（すなわち、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する自己抗体）と対象となる分析物に対する特異的結合パートナー（例えば、ＮＧＡＬ（またはこの断片））との複合体の形成によって調節される。用いることができるかかる均一なアッセイの例としては、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、酵素増幅イムノアッセイ法（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、均一化学発光アッセイ等が挙げられるが、これらに限定されない。均一フォーマットにおいて、試験試料が対象から得られた後、第１の混合物が調製される。混合物は、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する自己抗体について評価される試験試料、および検出可能な標識によって標識された第１の特異的結合パートナーを含む。第１の特異的結合パートナーは、ＮＧＡＬ（またはこの断片）であり得る。
【００５６】
当技術分野において知られている任意の適切な検出可能な標識が使用され得る。例えば、ＦＰＩＡにおいて、蛍光標識が使用され得る（例えば、（参照により完全に本明細書に組み込まれる。）米国特許第５，５９３，８９６号、米国特許第５，５７３，９０４号、米国特許第５，４９６，９２５号、米国特許第５，３５９，０９３号および米国特許第５３５２８０３号を参照されたい。）。均一化学発光アッセイにおいて、検出可能な標識としてアクリジニウム化合物が使用され得る（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４−１３２８（２００６）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３−２３１７（２００４）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７−３９２１（２００４）およびＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）を参照されたい。）。好ましくは、アクリジニウム化合物は、アクリジニウム−９−カルボキサミドである。具体的には、アクリジニウム−９−カルボキサミドは、式Ｉ
【００５７】
【化２】
2012507005.tif 000054
（式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、オキソアルキルから成る群から各々独立して選択され、Ｒ３からＲ１５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から各々独立して選択され、更に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルの内のいずれかは、１個以上のヘテロ原子を含有してよく、ならびに、任意に、存在する場合、
【００５８】
【化３】
2012507005.tif 000055
は、アニオンである。）による構造を有する。アクリジニウム−９−カルボキサミドの調製方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４（１９９１）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：５６３６−５６３９（１９９８）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５：１０８９９−１０９１４（１９９９）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：７７９−７８１（１９９９）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：７１４−７２４（２０００）、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙら、Ｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、７７−１０５（２００２）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）、ならびに米国特許第５，４６８，６４６号、米国特許第５，５４３，５２４号および米国特許第５，７８３，６９９号（それらの各々は、上記に関するそれらの教示に関して参照により本明細書に完全に組み込まれている。）において記載されている。
【００５９】
あるいは、アクリジニウム化合物は、好ましくは、アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、式ＩＩ
【００６０】
【化４】
2012507005.tif 000056
（式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキルまたはオキソアルキルであり、Ｒ３からＲ１５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキルおよびオキソアルキルから成る群から各々独立して選択され、ならびに、任意に、存在する場合、
【００６１】
【化５】
2012507005.tif 000057
は、アニオンである。）による構造を有する。
【００６２】
式ＩＩのアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルの例は、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネート（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩから入手可能）である。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルの調製方法は、ＭｃＣａｐｒａら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４：１１１１−２１（１９６５）、Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２４５−２４９（２０００）、Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２３９−２４４（２０００）および米国特許第５，２４１，０７０号（各々は、上記に関するそれらの教示に関して参照により本明細書に完全に組み込まれている。）に記載されている。かかるアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、シグナルの強度および／またはシグナルの速度に関して、少なくとも１種のオキシダーゼによる分析物の酸化において生成された過酸化水素の効率的な化学発光指標である。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルについての化学発光の経過は迅速に、すなわち１秒未満で完了するが、一方でアクリジニウム−９−カルボキサミドの化学発光は２秒を超えて継続する。しかし、アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、タンパク質の存在下でその化学発光性を喪失する。故に、その使用は、シグナルの生成および検出の間にタンパク質が存在しないことを必要とする。試料中のタンパク質を分離するまたは除去するための方法は、当業者に周知であり、それらの方法としては、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィーおよび／または消化が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｗｅｌｌｓ、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３）を参照されたい。）。試験試料から除去されるまたは分離されるタンパク質の量は、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％とすることができる。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルに関する更なる詳細およびその使用は、２００７年４月９日に出願の米国特許出願第１１／６９７，８３５号に記載されている。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、脱気無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または水性コール酸ナトリウム等の任意の適切な溶媒中において溶解され得る。
【００６３】
上記の式に関して、「アルキル」は、１から１０個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。アルキルの代表例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルおよびｎ−デシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
「アルケニル」は、２から１０個の炭素を含有し、および２個の水素の除去によって形成された少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有する直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。アルケニルの代表例としては、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニルおよび３−デセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
「アルキニル」は、２から１０個の炭素原子を含有し、および少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含有する直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。アルキニルの代表例としては、アセチレニル、１−プロピニル、２−プロピニル、３−ブチニル、２−ペンチニルおよび１−ブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
「アリールアルキル（ａｒｙａｌｋｙｌ）」は、本明細書において定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加された本明細書において定義されるアリール基を意味する。アリールアルキルの代表例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピルおよび２−ナフト−２−イルエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
「アリール」は、フェニル基または縮合環の内の１つ以上がフェニル基である二環式もしくは三環式融合環系を意味する。二環式融合環系は、本明細書において定義されるシクロアルケニル基、本明細書において定義されるシクロアルキル基に融合したフェニル基、または別のフェニル基によって例示される。三環式融合環系は、本明細書において定義されるシクロアルケニル基、本明細書において定義されるシクロアルキル基に融合した二環式融合環系、または別のフェニル基によって例示される。アリールの代表例としては、アントラセニル、アズレニル、フルオレニル、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニルおよびテトラヒドロナフチルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアリール基は、アルコキシ、アルキル、カルボキシル、ハロおよびヒドロキシルから成る群から独立して選択された１個、２個、３個、４個または５個の置換基によって任意に置換され得る。
【００６８】
「シクロアルケニル」は、各五員環が１個の二重結合を有し、各六員環が１個または２個の二重結合を有し、各七員環および八員環が１個から３個の二重結合を有し、ならびに各九員環から十員環が１個から４個の二重結合を有する、３個から１０個の炭素原子および１個から３個の環を有する非芳香族環式または二環式環系を指す。シクロアルケニル基の代表例としては、シクロヘキセニル、オクタヒドロナフタレニル、ノルボルニレニル等が挙げられる。シクロアルケニル基は、アルコキシ、アルキル、カルボキシル、ハロおよびヒドロキシルから成る群から独立して選択された１個、２個、３個、４個または５個の置換基によって任意に置換され得る。
【００６９】
「シクロアルキル」は、３個から１２個の炭素原子を有する飽和単環式、二環式または三環式炭化水素環系を指す。シクロアルキル基の代表例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、ビシクロ［３．１．１］ヘプチル、アダマンチル等が挙げられる。本発明のシクロアルキル基は、アルコキシ、アルキル、カルボキシル、ハロおよびヒドロキシルから成る群から独立して選択された１個、２個、３個、４個または５個の置換基によって任意に置換され得る。
【００７０】
「スルホアルキル」は、アルキルが対象となる分子に結合している、スルホネート基が結合したアルキル基を指すが、一方で「カルボキシアルキル」は、１個以上のカルボキシ基によって置換されたアルキル基を指し、「オキソアルキル」は、１個以上のオキシ基によって置換されたアルキル基を指し、「アミノ」は、−ＮＲａＲｂ（式中、ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアルキルカルボニルから成る群から独立して選択される。）を意味し、「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（式中、ＲａおよびＲｂは、水素およびアルキルから成る群から独立して選択される。（を意味し、「アシル」は、ＲＣ（Ｏ）−を意味し、「アルキルカルボニル」は、カルボニル基を介して親分子部分に結合したアルキル基を意味し、「アルコキシ」または「アルコキシル」は、酸素原子を介して親分子部分に付加された、本明細書において定義されるアルキル基を意味し、その代表例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシおよびヘキシルオキシが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、「ヒドロキシル」は、−ＯＨ基を意味し、「カルボキシ」または「カルボキシル」は、−ＣＯ２Ｈを指し、「ハロゲン」は、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは−Ｆを意味し、「ハロゲン化物」は、二元化合物を意味し、その一方の部分はハロゲン原子であり、他方の部分はハロゲンよりも電気陰性度の低い元素または基、例えばアルキル基であり、「ニトロ」は、−ＮＯ２基を意味し、「スルホ」は、ＳＯ３Ｈを意味し、および「シアノ」は、−ＣＮ基を意味する。
【００７１】
「アニオン」は、無機酸または有機酸のアニオンを指す。例としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、メタンスルホン酸、ギ酸、酢酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、マンデル酸、フマル酸、乳酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、リン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、トリフルオロ酢酸、フルオロスルホン酸およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
化学発光アッセイは、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ５７９（１）：６１−６７（２００６）において記載されている方法に従って行うことができる。  任意の適切なアッセイフォーマットを用いることができるが、マイクロプレートケミルミノメータ（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、ＬＬＣ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）は、小体積の多数の試料のアッセイを迅速に可能にする。ケミルミノメータは、９６ウェル黒色ポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３７９２）を用いて多数の試薬注入器を備えることができる。各試料を別々のウェルに加え、その後、用いられるアッセイの種類によって決定される他の試薬の同時／連続の添加を行うことができる。望ましくは、アクリジニウムアリールエステルを用いる中性溶液または塩基性溶液中の擬似塩基の形成は、例えば酸性化によって回避される。次いで、化学発光応答がウェル毎に記録される。この点に関して、化学発光応答を記録するための時間は、用いられた試薬と特定のアクリジニウムの添加の間の遅延に一部依存する。例えば、アクリジニウムカルボキサミドからの発光は、試薬が迅速に連続して、例えば５秒以内に加えられる場合、擬似フラッシュであり得るが、過酸化水素生成酵素とアクリジニウムカルボキサミドの添加の間に２０秒等の遅延がある場合、アクリジニウムカルボキサミドからの発光は、長寿命の白熱光であり得る。
【００７３】
混合物を形成するために試験試料および検出可能な標識によって標識された第１の特異的結合パートナーを加える順序は重要でない。検出可能な標識によって標識された第１の特異的な結合パートナーおよび試験試料を加えて第１の混合物を形成した後、第１の特異的結合パートナー−自己抗体複合体が形成する。
【００７４】
過酸化水素は、上記のアクリジニウム化合物（具体的には、アクリジニウム化合物によって標識された第１の特異的結合パートナー）の添加の前に、同時に、またはその後で、混合物においてインサイチュで生成され得る、または混合物に提供もしくは供給され得る。過酸化水素は、多くの方法においてインサイチュで生成され得る。例えば、１種以上の過酸化水素生成酵素が第１の混合物に加えられ得る。混合物に加えるべき１種以上の過酸化水素生成酵素の量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００７５】
また、過酸化水素は、電気化学的にインサイチュで生成することもできる（例えば、Ａｇｌａｄｚｅら、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．３７：３７５−３８３（２００７）およびＱｉａｎｇら、Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６：８５−９４（２００２）を参照されたい。）。また、過酸化水素の光化学的生成もインサイチュで可能である（例えば、Ｄｒａｐｅｒら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １２：１２１−１２６（１９８３）を参照されたい。）。
【００７６】
代替として、過酸化水素の供給源が単に混合物に加えられてもよい。例えば、過酸化水素の供給源は、過酸化水素を含むことが知られている１種以上の緩衝液または他の溶液であり得る。この点に関して、過酸化水素の溶液は単純に加えることができる。
【００７７】
試料への、アクリジニウム、例えばアクリジニウム−９−カルボキサミドまたはアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルの添加、および少なくとも１種の塩基性溶液の同時またはその後の添加の際、自己抗体の存在を示す検出可能シグナル、すなわち化学発光シグナルが生成される。塩基性溶液は、少なくとも１種の塩基を含有し、１０以上、好ましくは１２以上のｐＨを有する。塩基性溶液の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび重炭酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。試料に加えられる塩基性溶液の量は、塩基性溶液の濃度に依存する。使用される塩基性溶液の濃度に基づいて、当業者は、試料に加える塩基性溶液の量を容易に決定することができる。
【００７８】
生成された化学発光シグナルは、当業者に知られている通常の技術を用いて検出され得る。生成されたシグナルの強度に基づいて、試料中の自己抗体の量が定量され得る。具体的には、試料中の自己抗体の量は、生成されたシグナルの強度に比例する。存在している自己抗体の量は、生成された光の量を抗ＮＧＡＬ抗体、例えばＮＧＡＬ自己抗体についての標準曲線と比較することによって、または参照標準との比較によって定量することができる。標準曲線は、質量分析、重量法および当技術分野において知られている他の技術によって、既知濃度の抗ＮＧＡＬ抗体、例えばＮＧＡＬ自己抗体の連続希釈物または溶液を用いて作成され得る。
【００７９】
不均一フォーマットにおいて、対象から試験試料が得られた後、第１の混合物が調製される。混合物は、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する自己抗体について評価される試験試料および第１の特異的結合パートナーを含み、第１の特異的結合パートナーおよび試験試料中に含まれている全ての自己抗体は、第１の特異的結合パートナー−自己抗体複合体を形成する。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは、ＮＧＡＬまたはこの断片である。混合物を形成するために試験試料および第１の特異的結合パートナーを加える順序は重要でない。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは固相上に固定される。（第１の特異的結合パートナーについての、および、任意に、第２の特異的結合パートナーについての）イムノアッセイにおいて使用される固相は、当技術分野において知られているあらゆる固相、例えば、限定されないが、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスクおよびチップであってもよい。
【００８０】
第１の特異的結合パートナー−自己抗体複合体を含有する混合物が形成された後、全ての非結合自己抗体は、当技術分野において知られている任意の技術を用いて複合体から除去される。例えば、非結合自己抗体は、洗浄によって除去され得る。
【００８１】
全ての非結合自己抗体が除去された後、第２の特異的結合パートナーを混合物に加えて、第１の特異的結合パートナー−自己抗体−第２の特異的結合パートナー複合体を形成する。第２の特異的結合パートナーは、好ましくは抗ヒト抗体である。更に、また好ましくは、第２の特異的結合パートナーは、検出可能な標識によって標識されている、または検出可能な標識を含有する。検出可能な標識に関して、当技術分野において知られている任意の検出可能な標識が使用され得る。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐ）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ等）、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、チオエステルまたはスルホンアミド、ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステル等）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート等））、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛でキャップされたセレン化カドミウム）、温度測定標識またはイムノポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識への導入、標識化手法および標識の検出は、Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）および（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎによって出版されたハンドブックとカタログの組み合わせである。）Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）において見出される。しかし、好ましくは、検出可能な標識は、化学発光アッセイにおいて使用され得るアクリジニウム化合物である。
【００８２】
第１の特異的結合パートナー−自己抗体−第２の特異的結合複合体の形成の後、当技術分野において知られている任意の技術を用いて、（標識されているか標識されていないかにかかわらず）全ての非結合の第２の特異的結合パートナーが複合体から除去される。例えば、非結合の第２の特異的結合パートナーは、洗浄によって除去され得る。
【００８３】
過酸化水素は、上記のアクリジニウム化合物（具体的には、アクリジニウム化合物によって標識された第２の特異的結合パートナー）の添加の前に、同時に、またはその後で、混合物においてインサイチュで生成され得る、または混合物に提供もしくは供給され得る。インサイチュで過酸化水素を生成する方法は、上記において記載されている。
【００８４】
アクリジニウム化合物（具体的には、アクリジニウム化合物によって標識された第２の特異的結合パートナー）および過酸化水素の、混合物において提供される、または供給される、またはインサイチュで生成されるタイミングおよび順序は重要でない。検出可能な標識によって標識された第２の特異的結合パートナーおよび試験試料を加えて第２の混合物を形成した後、第１の特異的な結合パートナー−自己抗体−第２の特異的結合パートナー複合体が形成する。
【００８５】
（上記の）試料への、アクリジニウム、例えばアクリジニウム−９−カルボキサミドまたはアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルの添加、および少なくとも１種の塩基性溶液の同時またはその後の添加の際、自己抗体の存在を示す検出可能シグナル、すなわち化学発光シグナルが生成される。生成された化学発光シグナルは、当業者に知られている常法に従う技術を用いて検出され得る。
【００８６】
検出可能な標識によって標識された全ての非結合の第２の特異的結合パートナーが除去された後、検出可能な標識から検出可能シグナルが生成または放出され、次いで測定される。検出可能な標識からシグナルを生成させ、得られた生成シグナルを測定するための方法は、当業者に周知である。例えば、化学発光シグナルは、塩基性溶液の添加の後に生成され得る。生成されたシグナルの強度に基づいて、試験試料中の自己抗体の量が定量され得る。具体的には、試験試料中に含まれている自己抗体の量は、生成されたシグナルの強度に比例する。具体的には、存在している自己抗体の量は、生成された光の量をＮＧＡＬ（もしくはこの断片）に対する自己抗体についての標準曲線と比較することに基づいて、または参照標準との比較によって定量され得る。標準曲線は、質量分析によって、重量測定によって、および当技術分野において知られている他の技術によって、既知濃度のＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する抗体の連続希釈物または溶液を用いて生成され得る。
【００８７】
従って、試験試料中のＮＧＡＬまたはこの断片と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定する方法が提供される。この方法は、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイすることを含む。このアッセイは、ＮＧＡＬ（またはこの断片）および少なくとも１種の検出可能な標識を用いる。このアッセイは、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度の直接的もしくは間接的な指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルを、対照または較正物質中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する抗体の存在、量または濃度の直接的もしくは間接的な指標として生成されたシグナルと比較することを含む。較正物質は、任意に、較正物質の各々のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する抗体の濃度が一連の較正物質中の他の較正物質と異なる、一連の較正物質の一部である。この方法は、自動化システムまたは半自動化システムにおける使用に適合させることが可能である。
【００８８】
方法は、（ｉ）検出可能な標識を含み、少なくとも１種の自己抗体に結合するＮＧＡＬ（またはこの断片）に試験試料を接触させて、ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を形成させること、および（ｉｉ）（ｉ）において形成されたＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体中において検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出または測定することによって、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度を決定することを含むことができる。好ましくは、検出可能な標識は、アクリジニウム化合物、例えば、アクリジニウム−９−カルボキサミドまたはアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである。
【００８９】
方法は、（ｉ）ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を形成するように、少なくとも１種の自己抗体に結合し、固相上に任意に固定されたＮＧＡＬ（またはこの断片）に試験試料を接触させること、（ｉｉ）検出可能な標識を含み、自己抗体に結合する少なくとも１種の検出抗体にＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体複合体を接触させて、ＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体／検出抗体複合体を形成させること、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）において形成されたＮＧＡＬ（またはこの断片）／自己抗体／検出抗体複合体において検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出または測定することによって、試験試料中の、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する自己抗体の存在、量または濃度を決定することを含むことができる。任意に、方法は、段階（ｉ）の後で非結合の少なくとも１種の自己抗体を除去すること、および段階（ｉｉ）の後で非結合の少なくとも１種の検出抗体を除去することを更に含む。好ましくは、検出可能な標識は、アクリジニウム化合物、例えば、アクリジニウム−９−カルボキサミドまたはアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである。
【００９０】
方法は、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度を決定することを更に含むことができる。方法は、ＮＧＡＬに対する少なくとも１種の特異的結合パートナーおよび少なくとも１種の検出可能な標識を用いる、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度の直接的もしくは間接的な指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルを、対照または（任意に、較正物質の各々のＮＧＡＬの濃度が一連の較正物質中の他の較正物質と異なる一連の較正物質の一部である。）較正物質中の、ＮＧＡＬの濃度の直接的もしくは間接的な指標として生成されたシグナルと比較することを含むアッセイによって、ＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイすることを含む。
【００９１】
例えば、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度は、ＮＧＡＬ自己抗体に関する上記のアッセイによって、または当技術分野において知られている任意のフォーマットを用いるイムノアッセイ、例えば、限定されないが、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、放射性同位体検出（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））および酵素検出（エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）またはＥＬＩＳＡ（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ））等のモノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ、競合的阻害イムノアッセイ（例えば、フォワードおよびリバース）、ならびに蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）によって決定され得る。化学発光微粒子イムノアッセイ、特にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動分析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いるものは、好ましいイムノアッセイの例である。
【００９２】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（それぞれｍＡｂおよびｐＡｂ）は、当技術分野において知られている方法に従ってイムノアッセイにおける使用のために作製することができる。例えばアジュバントを含む組成物中の、ＮＧＡＬ、例えば、組換えにより作製されたＮＧＡＬ、特に、組換えにより作製されたヒトＮＧＡＬは、宿主動物、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモットまたはウマの、１つ以上の部位に注射され得る。更なる注射を規則的または不規則な間隔で同一または他の部位に行い、その後放血を行って、抗体力価を、最適な力価が達されたと判定されるまで評価する。抗体は、宿主動物を放血させて大量の抗血清を得ることによって、または体細胞ハイブリダイゼーション技術もしくは当技術分野において知られている他の技術によって得られる。例えば、不死化細胞、例えば骨髄腫細胞による標準体細胞融合手法によって抗体産生細胞を融合してハイブリドーマ細胞を得ることができる。かかる技術は当技術分野において周知であり、それらの技術としては、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３））およびヒトｍＡｂｓを作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁（１９８５））が挙げられる。ｍＡｂハイブリドーマを作製するための技術は、当業者に周知である（例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたい。）。代替として、抗ＮＧＡＬ抗体は、多くの供給源の内のいずれか１つ、例えば、とりわけＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から商業的に得ることができる。
【００９３】
サンドイッチイムノアッセイフォーマットにおいて、典型的には少なくとも２種の抗体を用いて、対象となる分析物、この場合はＮＧＡＬ（またはこの断片）を分離し、定量する。更に具体的には、２種の抗体は、対象となる分析物上の異なるエピトープと結合し、それによって「サンドイッチ」と呼ばれるもの、すなわち、抗体−分析物−抗体を形成する。対象となる分析物に結合し、対象となる分析物との接触の前または後に典型的には基質に結合する１種以上の抗体は、「捕捉抗体」または「複数の捕捉抗体」と呼ばれ、一方、標識され、捕捉抗体が結合した分析物と結合する１種以上の他の抗体は、「検出抗体」、「複数の検出抗体」、「コンジュゲート」または「複数のコンジュゲート」と呼ばれる。好ましくは、分析物への１つの抗体の結合は、分析物へのいずれの他の抗体の結合とも干渉しない。また、好ましくは、少なくとも捕捉抗体は、試料中に存在すると思われる分析物、すなわちＮＧＡＬ（またはこの断片）の最大量のモル過剰量で存在する。検出抗体は、典型的には分析物−捕捉抗体複合体との接触の前に標識されるが、検出抗体は、分析物−捕捉抗体複合体の形成と同時に、またはその後に続いて標識され得る。
【００９４】
一般的に言って、ＮＧＡＬまたはこの断片についてアッセイされる（例えば、ＮＧＡＬまたはこの断片を含有することが推測される。）試験試料に、少なくとも１種の捕捉抗体（または抗体）および（第２の検出抗体または第３の検出抗体のいずれかである。）少なくとも１種の検出抗体を、同時または逐次的に、任意の順序で接触させることができる。例えば、試験試料に、最初に少なくとも１種の捕捉抗体を接触させ、次いで少なくとも１種の検出抗体を（逐次的に）接触させることができる。代替として、試験試料に、最初に少なくとも１種の検出抗体を接触させ、次いで少なくとも１種の捕捉抗体を（逐次的に）接触させることができる。更に別の代替において、試験試料を捕捉抗体および検出抗体に同時に接触させることができる。
【００９５】
サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、ＮＧＡＬまたはこの断片を含有することが推測される試験試料を、第１の抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）複合体の形成を可能にする条件下で少なくとも１種の第１の捕捉抗体に最初に接触させる。複数の捕捉抗体が用いられる場合、第１の多重捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは少なくとも１種の捕捉抗体は、試験試料中において予想されるＮＧＡＬ（またはこの断片）の最大量のモル過剰量で使用される。例えば、緩衝液（例えば、微粒子コーティング緩衝液）１ｍＬ当たり約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬの抗体が使用され得る。
【００９６】
１種の抗体のみによる結合が必要とされるという理由から小さい分析物を測定するために用いられる競合的阻害イムノアッセイは、逐次的および古典的なフォーマットを含む。逐次的な競合的阻害イムノアッセイにおいて、対象となる分析物に対する捕捉ｍＡｂは、マイクロタイタープレートのウェル上に被覆される。対象となる分析物を含有する試料がウェルに加えられる場合、対象となる分析物は捕捉ｍＡｂに結合する。洗浄後、既知量の標識された（例えば、ビオチンまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））分析物は、ウェルに加えられる。酵素標識のための基質は、シグナルを生成するために必要である。ＨＲＰのための適切な基質の例は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。洗浄後、標識された分析物によって生成されたシグナルが測定され、試料中の分析物の量に反比例する。古典的な競合的阻害イムノアッセイにおいて、対象となる分析物に対するｍＡｂは、マイクロタイタープレートのウェル上に被覆される。しかし、逐次的な競合的阻害イムノアッセイと異なり、試料および標識された分析物は、同時にウェルに加えられる。試料中のいかなる分析物も、捕捉ｍＡｂへの結合について、標識された分析物と競合する。洗浄後、標識された分析物によって生成されたシグナルが測定され、試料中の分析物の量に反比例する。
【００９７】
任意に、試験試料に少なくとも１種の捕捉抗体（例えば、第１の捕捉抗体）を接触させる前に、少なくとも１種の捕捉抗体を、試験試料からの第１の抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）複合体の分離を容易にする固体支持体に結合させることができる。捕捉抗体が結合する基質は、試料からの捕捉抗体−分析物複合体の分離を容易にする任意の適切な固体支持体または固相であってもよい。例としては、プレートのウェル、例えばマイクロタイタープレート、試験管、多孔性ゲル（例えば、シリカゲル、アガロース、デキストランもしくはゼラチン）、ポリマーフィルム（例えば、ポリアクリルアミド）、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズもしくは磁気ビーズ）、フィルタ／膜片（例えば、ニトロセルロースもしくはナイロン）、微粒子（例えば、ラテックス粒子、磁化可能微粒子（例えば、酸化第二鉄コアもしくは酸化クロムコアを有し、ホモポリマーコートもしくはヘテロポリマーコートを有し、約１−１０ミクロンの半径を有する微粒子）、ヒツジ赤血球または（ピルビンアルデヒドおよびホルムアルデヒドによって「固定」された赤血球である。）ＤＵＲＡＣＹＴＥＳ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））が挙げられる。基質は、抗原に結合するための適切な表面親和性を有し、検出抗体による接触を可能にする十分な多孔性を有する適切な多孔性材料を含むことができる。微孔性材料が一般に好ましいが、水和状態のゼラチン状材料が使用されてもよい。好ましくは、かかる多孔性基質は、約０．０１から約０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚みを有するシートの形態である。細孔径は非常に様々であってよいが、好ましくは、細孔径は約０．０２５から約１５ミクロン、より好ましくは約０．１５から約１５ミクロンである。かかる基質の表面は、基質との抗体の共有結合を引き起こす化学プロセスによって活性化され得る。一般に疎水性力を通じた吸着による基質への抗原または抗体の非可逆的結合が起こるが、かかる結合がＩＬ−１８に結合する抗体の能力に干渉しないという条件で、代わりに化学カップリング剤または他の手段を用いて抗体を基質に共有結合させることができる。代替として、抗体は、（例えば、Ｐｏｗｅｒ−Ｂｉｎｄ（商標）−ＳＡ−ＭＰストレプトアビジンによって被覆された微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて）ストレプトアビジンもしくはビオチンによってまたは抗種特異的ｍＡｂｓによって予め被覆された微粒子と結合させることができる。必要に応じて、基質を誘導体化させて、抗体上の様々な官能基との反応性を可能にすることができる。かかる誘導体化は、ある種のカップリング剤の使用を必要とするが、それらのカップリング剤の例としては、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
ＮＧＡＬ（またはこの断片）についてアッセイされる試験試料を少なくとも１種の捕捉抗体（例えば、第１の捕捉抗体）に接触させた後、混合物は、第１の抗体（または多重抗体）−ＮＧＡＬ（またはこの断片）複合体の形成を可能にするために温置される。温置は、約４．５から約１０．０のｐＨ、約２℃から約４５℃の温度で、約一（１）分間から約十八（１８）時間、好ましくは約１から約２４分間、最も好ましくは約４から約１８分間の期間実施され得る。本明細書において記載されているイムノアッセイは、１つの段階で（試験試料、少なくとも１種の捕捉抗体および少なくとも１種の検出抗体が全て、逐次的にもしくは同時に反応容器に加えられることを意味する。）または１つを超える段階、例えば２つの段階、３つの段階等で実施され得る。
【００９９】
（第１のまたは多重）捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）複合体の形成後、次いで、（（第１のまたは多重）捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／第２の抗体検出複合体の形成を可能にする条件下で）複合体を少なくとも１種の検出抗体に接触させる。少なくとも１種の検出抗体は、イムノアッセイにおいて使用される第２、第３、第４等の抗体であり得る。捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）複合体に複数の検出抗体を接触させる場合、次いで、（第１のまたは多重）捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／（多重）検出抗体複合体が形成される。捕捉抗体（例えば、第１の捕捉抗体）と同様に、少なくとも第２の（および後続の）検出抗体を捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）複合体と接触させる場合、（第１のまたは多重）捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／（第２のまたは多重）検出抗体複合体の形成のために、上記の条件と類似の条件下での温置の期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１種の検出抗体は、検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、（第１のまたは多重）捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／（第２のまたは多重）検出抗体複合体の形成の前に、同時にまたはその後に、少なくとも１種の検出抗体（例えば、第２の検出抗体）に結合させることができる。当技術分野において知られているあらゆる検出可能な標識が使用され得る（Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）およびＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６）を含む上記考察を参照されたい。）。
【０１００】
検出可能な標識は、直接またはカップリング剤を介して抗体に結合させることができる。使用され得るカップリング剤の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから商業的に入手可能なＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩）である。使用され得る他のカップリング剤は、当技術分野において知られている。検出可能な標識を抗体に結合するための方法は、当技術分野において知られている。更に、ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルまたはＳＰＳＰ−アクリジニウムエステル等、抗体への検出可能な標識のカップリングを容易にする末端基を既に含有する多くの検出可能な標識を購入または合成することができる。
【０１０１】
（第１のまたは多重）捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／（第２のまたは多重）検出抗体複合体は、標識の定量の前に試験試料の残部から分離され得るが、そうしなければならないというわけではない。例えば、少なくとも１種の捕捉抗体（例えば、第１の捕捉抗体）を固体支持体、例えばウェルまたはビーズに結合させる場合、固体支持体との接触から（試験試料の）液体を除去することによって分離が達成され得る。代替として、少なくとも第１の捕捉抗体を固体支持体に結合させる場合、それにＮＧＡＬ（またはこの断片）含有試料および少なくとも１種の第２の検出抗体を同時に接触させて、第１の（多重）抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／第２の（多重）抗体複合体を形成し、その後、固体支持体との接触からの液体（試験試料）の除去を行うことができる。少なくとも１種の第１の捕捉抗体を固体支持体に結合させない場合、（第１のまたは多重）捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／（第２のまたは多重）検出抗体複合体は、標識の量の定量のために試験試料から除去する必要はない。
【０１０２】
標識捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／検出抗体複合体（例えば、第１の捕捉抗体／ＮＧＡＬ（またはこの断片）／第２の検出抗体複合体）の形成の後、複合体の標識の量は、当技術分野において知られている技術を用いて定量される。例えば、酵素標識を用いる場合、標識複合体を、発色等の定量可能な反応を与えるその標識用の基質と反応させる。標識が放射性標識である場合、その標識は、シンチレーションカウンタを用いて定量される。標識が蛍光標識である場合、その標識は、（「励起波長」として知られている。）１つの色の光によって標識を刺激し、その刺激に応答して標識によって放出された（「発光波長」として知られている。）別の色を検出することによって定量される。その標識が化学発光標識である場合、その標識は、視覚的にまたはルミノメータ、Ｘ線用フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ等を用いることによって、放出された光を検出して定量される。一旦、複合体中の標識の量が定量化されると、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）の濃度は、既知濃度のＮＧＡＬ（またはこの断片）の連続希釈物を用いて生成された標準曲線を用いることによって決定される。ＮＧＡＬ（またはこの断片）の連続希釈物を用いる以外に、標準曲線は、重量測定によって、質量分析によって、および当技術分野において知られている他の技術によって生成され得る。
【０１０３】
ＮＧＡＬアッセイは、遊離ＮＧＡＬのみに結合し、メタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）またはゼラチナーゼＢに結合したＮＧＡＬ等の結合したＮＧＡＬを含まない捕捉抗体を利用するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）サンドイッチを用いることができる。捕捉された遊離ＮＧＡＬの量は、アクリジニル化抗ＮＧＡＬ  ｍＡｂによって検出され得る。
【０１０４】
ＦＰＩＡは、競合的結合イムノアッセイの原理に基づく。蛍光標識された化合物は、直線偏光によって励起される際、その回転速度に反比例した偏光度を有する蛍光を放出する。
【０１０５】
蛍光標識トレーサー−抗体複合体が直線偏光によって励起する場合、発蛍光団は、光を吸収する時間および光を放出する時間の間に回転を余儀なくされるので、放出光は高度に偏光したままである。「遊離」トレーサー化合物（すなわち、抗体に結合していない化合物）が、直線偏光によって励起する場合、その回転は、競合的結合イムノアッセイにおいて生成された対応するトレーサー−抗体コンジュゲートよりずっと速い。ＦＰＩＡは、特別な操作および廃棄を必要とする放射性物質がないので、ＲＩＡより有利である。更に、ＦＰＩＡは、容易におよび迅速に実施され得る均一アッセイである。
【０１０６】
方法は、試験試料を得た患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予測または評価することを更に含むことができる。方法が、試験試料を得た患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することを更に含む場合、方法は、必要に応じて有効性を向上させるために患者の治療的／予防的処置を改変することを任意に更に含む。
【０１０７】
本明細書において記載されている方法は、対象から得られた試験試料中のＮＧＡＬの量を検出するためのまたは定量するためのアッセイ（例えば、すなわち、事前に、同時にまたは事後に実施されたアッセイ）から得られた結果の信頼性を決定するために用いられ得る。具体的には、かかる方法は、同じ対象から試験試料を得ること（単一の試験試料が、対象から得られ、自己抗体アッセイとＮＧＡＬアッセイ間で分割され得る。）および本明細書において記載されているアッセイの内のいずれかまたは当技術分野において知られている自己抗体についての（イムノアッセイであってもなくてもよい。）任意の代替のアッセイを用いてＮＧＡＬと反応する少なくとも１種の自己抗体の存在または濃度を決定することを含む。少なくとも１種の自己抗体の濃度が所定のレベルと比較して高い場合、別々のアッセイによって決定されたＮＧＡＬの濃度は信頼できないと考えられる。しかし、少なくとも１種の自己抗体の濃度が所定のレベル以下である場合、別々のアッセイによって決定されたＮＧＡＬの濃度は信頼できると考えられる。
【０１０８】
一般に、所定のレベルは、ＮＧＡＬまたはこの断片と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイした際に得られた結果を評価するための基準として用いられ得る。一般に、かかる比較を行う際、所定のレベルは、疾患、障害もしくは状態（例えば、心臓血管疾患または腎疾患）の特定のステージもしくはエンドポイントと、または特定の臨床的徴候と、分析物（例えば、自己抗体）の存在、量もしくは濃度との連関または関連が為され得るように十分な数の回数および適切な条件下で特定のアッセイを行うことによって得られる。典型的には、所定のレベルは、参照対象（または対象の集団）のアッセイによって得られる。
【０１０９】
ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応性の少なくとも１種の自己抗体に関して、かかる自己抗体は、ＮＧＡＬが何らかの機能または影響を有する心臓血管系または他の主要な器官系、例えば排出系（例えば、腎臓）に関連付けられた種々のインビボでの標的を対象とすることができることが想定される。従って、特定の自己抗体は、所定のレベルに対して増加または減少し得る。
【０１１０】
特に、疾患の進行および／または処置をモニタするために用いられる所定のレベルに関して、ＮＧＡＬまたはこの断片と反応性の自己抗体の濃度または量は、「不変である」、「好ましい」（または「好ましく変更される」）または「好ましくない」（または「不利に変更される」）。一般に、本明細書において記載されている自己抗体は、ＮＧＡＬに特異的な心臓生理学的病状を伴うと考えられ、いわゆる正常母集団の低い割合（例えば、約５％未満、とりわけ約０．５％から約５％）において上昇し、ＮＧＡＬの存在に対して陽性反応を示している集団のより高い割合（約１５％未満、とりわけ約１０から約１５％）において上昇するので、ほとんどの場合、各場合において所定のレベルまたは以前の測定値に対して、「好ましくない」（「不利に変更される」）は、自己抗体の量または濃度の増加または上昇に対応し、「好ましい」（「好ましく変更される」）は、自己抗体の量または濃度の減少または低下に対応し得る。
【０１１１】
本明細書において使用されている「上昇」または「増加」という用語は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より高い、または別の参照レベルもしくは範囲（例えば、以前のまたはベースライン時の試料）より高い試験試料中の濃度または量を指す。「下降」または「低下」という用語は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より高い、または別の参照レベルもしくは範囲（例えば、以前のまたはベースライン時の試料）より高い試験試料中の濃度または量を指す。「変更」という用語は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）を超えて、または別の参照レベルもしくは範囲（例えば、以前のもしくはベースライン時の試料）を超えて変更（増加または減少）された試料の濃度または量を指す。
【０１１２】
ＮＧＡＬおよびこれと反応性の自己抗体のための典型的なまたは正常なレベルまたは範囲は、標準的技法に従って定義される。幾つかの例における自己抗体のレベルが非常に低いので、実験誤差または標本分散によって説明することができない、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲または参照レベルもしくは範囲と比較した何らかの正味の変化がある場合、いわゆる変更されたレベルまたは変更が生じたと考えることができる。従って、特定の試料中において測定されたレベルは、いわゆる正常な対象の類似の試料中において決定されたレベルまたはレベルの範囲と比較される。この状況において、「正常な対象」は、例えば、検出可能な心臓血管の病状または腎臓の病状のない個体であり、（「対照」と称されることもある。）「正常な」患者または集団は、例えば、検出可能な心臓血管または腎臓の病状を示さない患者または集団（複数可）である。更に、ＮＧＡＬに対する１種以上の自己抗体が、ヒト集団の大部分において高いレベルで通常見出されない場合、「正常な対象」は、実質的な検出可能な増加または上昇した濃度または量のＮＧＡＬ自己抗体のない個体であると考えることができ、（「対照」と称されることもある。）「正常な」患者または集団は、ＮＧＡＬ自己抗体の実質的な検出可能な増加または上昇した濃度または量を示さない患者または集団（複数可）である。「見かけ上正常な対象」は、自己抗体が評価されなかった、または評価されないでいる対象である。分析物が一般に検知されない（例えば、正常レベルがゼロであり、または正規母集団の約２５から約７５パーセント点の範囲内である。）が、試験試料中において検出される場合、ならびに分析物が正常レベルより高く試験試料中において存在する場合、分析物のレベルは「上昇する」と言われる。
【０１１３】
前述のように、本明細書において記載されているＮＧＡＬまたはこの断片と反応性の１種以上の自己抗体は、ＮＧＡＬが何らかの機能または影響を有する心臓血管系または他の主要な器官系（例えば、排出系、特に腎臓）に関連付けられた種々のインビボでの標的を対象とすることができると考えられる。従って、とりわけ、本開示は、例えば、本明細書において定義されている心臓血管疾患もしくは腎疾患を有する、または心臓血管疾患もしくは腎疾患を有するリスクがある対象についてのスクリーニングの方法を提供するものである。
【０１１４】
本明細書において記載されている試験方法の内のいずれかは、理学的検査を含むが限定されない１つ以上の他の試験および／または心臓血管疾患もしくは腎疾患の鑑別診断を可能にするための病歴の取得と共に実施され得る。これらの障害を診断する際に用いられる様々な試験およびパラメータは、当業者に周知である。更に、上記方法の内のいずれかは、無症状の対象、または心臓血管疾患もしくは腎疾患に関連する１つ以上のリスク因子を有する、またはそれらの疾患の症状を有する対象の試料において実施され得る。
【０１１５】
特定の実施形態において、対象が、ＮＧＡＬに対する好ましくないレベルの１種以上の自己抗体を有すると判定される場合、対象は、心臓血管疾患の１つ以上の更なる指標、例えば、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ（クレアチンキナーゼ筋肉−脳）、ＢＮＰ（脳ナトリウム排泄増加性ペプチド）、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、血液酸素レベル、心臓イメージング、心電図検査および当技術分野において知られている任意の他の指標について任意に評価される。代替としてまたはさらには、対象は、腎疾患の１つ以上の更なる指標、例えば、蛋白尿、血尿、血清クレアチン、シスタチンＣ、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ホモシステイン、異常に高度なボディマスインデックス（ＢＭＩ）、肥満および当技術分野において知られている他の指標について任意に評価される。
【０１１６】
しかし、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に対する好ましくないレベルの１種以上の自己抗体の以前の検出がなかった場合でも、かかる試験は任意に実施され得る。例えば、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応性の少なくとも１種の自己抗体の検出がない場合でも、心臓血管疾患または腎疾患に関連する１種以上のマーカーの測定と共に本明細書において記載されている方法の内のいずれかを用いることができる。心臓血管疾患に対するマーカーとしては、とりわけ、ナトリウム利尿ペプチドまたはこの断片（例えば、コンビネーション抗原／抗体アッセイまたは独立試験）ならびに（限定されないが）妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＩＬ−１０、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８／ＩＬ−１８ｂ）、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、ＩＣＡＭ−１（細胞間細胞接着分子−１）、ＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子−１）、脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、フィブリノゲン、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＬｐＰＬＡ２（リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２）、ＧＰ−ＢＢ（グリコーゲンホスホリラーゼアイソザイムＢＢ）、ＩＬ１ＲＡ、ＴＡＦＩ（トロンビン活性化線溶阻害因子）、可溶性フィブリン、抗ｏｘＬＤＬ（酸化低密度リポタンパク質に対する抗体）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）、凝血促進組織因子（ＴＦ）、ＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテアーゼ９）、Ａｎｇ−２（アンギオポエチン−２）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＶＬＤＬ（極低密度リポタンパク質）およびＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化因子抑制因子−１）が挙げられる。
【０１１７】
従って、一実施形態において、
（ａ）ＮＧＡＬと反応する少なくとも１種の自己抗体の、試験試料中の量または濃度を決定すること、および
（ｂ）前記量または濃度が所定のレベルと比較して高い場合、別々のアッセイによって決定されたＮＧＡＬの量または濃度が信頼できないと考えられ、（ａ）における量または濃度が所定のレベル以下である場合、別々のアッセイによって決定されたＮＧＡＬの量または濃度が信頼できると考えられる、（ａ）における量または濃度を所定のレベルと比較すること
を含む、対象から得られた試験試料中のＮＧＡＬの量または濃度を検出または定量するために、事前に、同時にまたは事後に行われた別々のアッセイから得られた結果の信頼性を決定するための方法が、本明細書において提供される。
【０１１８】
従って、対象が、心臓血管疾患もしくは腎疾患を有するか否か、または心臓血管疾患もしくは腎疾患を発生するリスクがあるか否かを決定するために、本明細書において記載されている方法を用いることもできる。具体的には、かかる方法は、
（ａ）（例えば、本明細書において記載されている方法または当技術分野において知られている方法を用いて）ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の、対象の試験試料中の濃度または量を決定する段階、および
（ｂ）段階（ａ）において決定されたヒトＮＧＡＬと反応性の１種以上の自己抗体の濃度もしくは量が所定のレベルに対して好ましい場合、対象が、心臓血管疾患もしくは腎疾患を有さない、または心臓血管疾患もしくは腎疾患のリスクがないと判定される、段階（ａ）において決定されたＮＧＡＬ（もしくはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の濃度もしくは量を所定のレベルと比較する段階
を含むことができる。しかし、段階（ａ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の１種以上の自己抗体の濃度もしくは量が所定のレベルに対して好ましくない場合、対象は、心臓血管疾患もしくは腎疾患を有する、または心臓血管疾患もしくは腎疾患のリスクがあると判定される。
【０１１９】
更に、対象における疾患の進行をモニタする方法が、本明細書において提供される。最適には、方法は、
（ａ）ＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の、対象の試験試料中の濃度または量を決定する段階、
（ｂ）ＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の、対象の後の試験試料中の濃度または量を決定する段階、および
（ｃ）段階（ａ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度もしくは量と比較した際に段階（ｂ）において決定された濃度もしくは量が変化しない、または好ましくない場合、対象における疾患が継続した、進行したもしくは悪化したと判定される、段階（ｂ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度もしくは量を、段階（ａ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度もしくは量と比較する段階
を含む。比較によって、段階（ａ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量と比較した際に、段階（ｂ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が好ましい場合、対象における疾患は、中断した、消退したまたは改善したと決定される。
【０１２０】
任意に、方法は、段階（ｂ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量を、例えば所定のレベルと比較することを更に含む。更に、任意に、方法は、比較が、段階（ｂ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が例えば所定のレベルに対して不利に変更されることを示す場合、ある期間にわたって１種以上の医薬組成物によって対象を処置することを含む。
【０１２１】
なお更に、方法を用いて、１種以上の医薬組成物による処置を受けている対象における処置をモニタすることができる。具体的には、かかる方法は、１種以上の医薬組成物を対象に投与する前に対象から第１の試験試料を提供することを含む。次に、（例えば、本明細書において記載されている方法または当技術分野において知られている方法を用いて）ＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の、対象の第１の試験試料中の濃度または量が決定される。ＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が決定された後、次いで、任意に、ＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が所定のレベルと比較される。第１の試験試料中において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が所定のレベルより低い場合、対象は、１種以上の医薬組成物で処置されない。しかし、第１の試験試料中において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が所定のレベルより高い場合、対象は、ある期間にわたって１種以上の医薬組成物で処置される。対象が１種以上の医薬組成物で処置される期間は、当業者によって決定され得る（例えば、この期間は、約七（７）日間から約二年間、好ましくは約十四（１４）日間から約一（１）年間であり得る。）。
【０１２２】
１種以上の医薬組成物による処置中に、次いで第２のおよび後続の試験試料が対象から得られる。試験試料の数および前記試験試料が対象から得られた時間は、重要でない。例えば、対象に１種以上の医薬組成物を最初に投与した七（７）日後に第２の試験試料を得ることができ、対象に１種以上の医薬組成物を最初に投与した二（２）週間後に第３の試験試料を得ることができ、対象に１種以上の医薬組成物を最初に投与した三（３）週間後に第４の試験試料を得ることができ、対象に１種以上の医薬組成物を最初に投与した四（４）週間後に第５の試験試料を得ることができる、等である。
【０１２３】
各第２のまたは後続の試験試料が対象から得られた後、ＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が、（例えば、本明細書において記載されている方法または当技術分野において知られている方法を用いて）第２のまたは後続の試験試料において決定される。次いで、第２のおよび後続の試験試料の内の各々において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が、第１の試験試料（例えば、最初に、任意に所定のレベルと比較された試験試料）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量と比較される。段階（ａ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量と比較した際に段階（ｃ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量が好ましい場合、対象における疾患は、中断した、消退したまたは改善したと判定され、対象に段階（ｂ）の１種以上の医薬組成物を投与することを継続するべきである。しかし、段階（ａ）において決定されたＮＧＡＬと反応性の少なくとも１種の自己抗体の濃度または量と比較した際に段階（ｃ）において決定された濃度もしくは量が変化しない、または好ましくない場合、対象における疾患は、継続した、進行したもしくは悪化したと決定され、より高濃度の、段階（ｂ）において対象に投与された１種以上の医薬組成物によって対象を処置するべきであり、または段階（ｂ）において対象に投与された１種以上の医薬組成物と異なる１種以上の医薬組成物によって対象を処置するべきである。具体的には、対象は、対象がその対象のＮＧＡＬ自己抗体レベルを低下または下降させるために事前に受けた１種以上の医薬組成物と異なる１種以上の医薬組成物によって処置され得る。
【０１２４】
一般に、反復試験（例えば、疾患進行および／または処置に対する応答のモニタリング）を行うことができるアッセイのために、第２のまたは後続の試験試料は、対象から第１の試験試料を得た後の適時において得られる。具体的には、対象の第２の試験試料は、対象から第１の試験試料を得た数分後、数時間後、数日後、数週間後または数年後に得ることができる。例えば、第２の試験試料は、対象から第１の試験試料を得た約１分後、約５分後、約１０分後、約１５分後、約３０分後、約４５分後、約６０分後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約７時間後、約８時間後、約９時間後、約１０時間後、約１１時間後、約１２時間後、約１３時間後、約１４時間後、約１５時間後、約１６時間後、約１７時間後、約１８時間後、１９時間後、約２０時間後、約２１時間後、約２２時間後、約２３時間後、約２４時間後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後、約６週間後、約７週間後、約８週間後、約９週間後、約１０週間後、約１１週間後、約１２週間後、約１３週間後、約１４週間後、約１５週間後、約１６週間後、約１７週間後、約１８週間後、約１９週間後、約２０週間後、約２１週間後、約２２週間後、約２３週間後、約２４週間後、約２５週間後、約２６週間後、約２７週間後、約２８週間後、約２９週間後、約３０週間後、約３１週間後、約３２週間後、約３３週間後、約３４週間後、約３５週間後、約３６週間後、約３７週間後、約３８週間後、約３９週間後、約４０週間後、約４１週間後、約４２週間後、約４３週間後、約４４週間後、約４５週間後、約４６週間後、約４７週間後、約４８週間後、約４９週間後、約５０週間後、約５１週間後、約５２週間後、約１．５年後、約２年後、約２．５年後、約３．０年後、約３．５年後、約４．０年後、約４．５年後、約５．０年後、約５．５年後、約６．０年後、約６．５年後、約７．０年後、約７．５年後、約８．０年後、約８．５年後、約９．０年後、約９．５年後または約１０．０年後の時点において対象から得ることができる。上記のアッセイは、疾患進行をモニタするために用いられる場合、急性状態を患っている対象における疾患の進行をモニタするために用いられ得る。救急状態としても知られている急性状態は、例えば心臓血管系または排出系を含む急性の生命を脅かす疾患または他の危険な医学的状態を指す。典型的には、救急状態は、（救急室、集中治療部、外傷センターまたは他の緊急治療環境を含むが、これらに限定されない。）病院をベースとする環境における緊急の医学的介入または医療補助者もしくは他の分野をベースとする医療従事者による管理を必要とするそれらの状態を指す。救急状態に対して、反復モニタリングが、一般に、より短い時間枠、すなわち、数分間、数時間または数日間（例えば、約１分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約３０分間、約４５分間、約６０分間、約２時間、約３時間、約４時間、４約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間または約７日間）の中で行われ、同様の最初のアッセイが、一般に、より短い時間枠、例えば、疾患または状態の発症の約数分間、数時間または数日間の中で行われる。
【０１２５】
また、アッセイは、慢性状態または非急性状態を患っている対象における疾患の進行をモニタするために用いることもできる。非救急状態または非急性状態は、例えば心臓血管系および／または排出系を含む急性の生命を脅かす疾患または他の危険な医学的状態以外の状態を指す。典型的には、非急性状態としては、より長期のまたは慢性の状態が挙げられる。非急性状態に対して、反復モニタリングが、一般に、より長い時間枠、例えば、数時間、数日間、数週間、数カ月間または数年間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３．０年間、約３．５年間、約４．０年間、約４．５年間、約５．０年間、約５．５年間、約６．０年間、約６．５年間、約７．０年間、約７．５年間、約８．０年間、約８．５年間、約９．０年間、約９．５年間または約１０．０年間）で行われ、同様の最初のアッセイが、一般に、より長い時間枠、例えば、疾患または状態の発症の約数時間、数日間、数カ月間または数年間の中で行われる。
【０１２６】
更に、上記のアッセイは、全血、血清または血漿である、対象から得られた第１の試験試料を用いて実施され得る。次いで、上記のアッセイは、全血、血清または血漿（例えば、尿）以外のものである対象から得られた第２の試験試料を用いて反復され得る。第１の試験試料および第２の試験試料を用いたアッセイから得られた結果が比較され得る。その比較を用いて、対象における疾患または状態の状況を評価することができる。
【０１２７】
更に、本発明の開示は、疾患（例えば、心臓血管疾患または腎疾患）に罹患しやすい、または疾患を患っている対象にとって処置が有利であり得るかどうかを決定する方法にも関する。特に、本開示は、ＮＧＡＬコンパニオン診断方法および製品に関する。従って、本明細書において記載されている「対象における疾患の処置をモニタする」方法は、更に最適には、治療のための候補を選択または同定することを包含することもできる。
【０１２８】
従って、特定の実施形態において、本開示はまた、心臓血管疾患もしくは腎疾患を有する、または心臓血管疾患もしくは腎疾患のリスクがある対象が治療のための候補であるかどうかを決定する方法をも提供する。一般に、その対象は、心臓血管疾患の何らかの症状を経験している対象、または心臓血管疾患もしくは腎疾患を有するまたは心臓血管疾患もしくは腎疾患のリスクがあると実際に診断されている対象、および／または本明細書において記載されているＮＧＡＬもしくはこの断片と反応性の少なくとも１種の自己抗体の好ましくない濃度もしくは量を示す対象である。
【０１２９】
方法は、本明細書において記載されているアッセイを任意に含み、分析物は１種以上の医薬組成物による（例えば、特にＮＧＡＬを含む作用機序に関連した医薬品による。）、免疫抑制療法を用いるまたは免疫吸着療法による対象の処置の前および後に評価され、または分析物はかかる処置の後に評価され、分析物の濃度または量は所定のレベルに対して比較される。処置の後に認められた分析物の量の好ましくない濃度によって、更なるまたは継続した処置を受けることが対象に有利ではないことが確認され、一方、処置の後で認められた分析物の好ましい濃度または量によって、更なるまたは継続した処置を受けることが対象に有利であることが確認される。この確認は、臨床試験の管理および改善された患者ケアの提供の助けとなる。
【０１３０】
本明細書におけるある種の実施形態は、心臓血管疾患または腎疾患を評価するために用いられる際に有利であるが、一方でアッセイおよびキットを、他の疾患、障害および状態、例えば、癌、敗血症、ならびにＮＧＡＬまたはそれに対する自己抗体の評価を伴う可能性があるあらゆる疾患、障害または状態におけるＮＧＡＬ自己抗体を評価するために任意に用いることもできることは、言うまでもない。
【０１３１】
より詳しくは、腎障害、腎疾患および腎傷害の評価（例えば、米国特許出願公開第２００８／００９０３０４号、米国特許出願公開第２００８／００１４６４４号、米国特許出願公開第２００８／００１４６０４号、米国特許出願公開第２００７／０２５４３７０号および米国特許出願公開第２００７／００３７２３２号を参照されたい。）の他に、本明細書において記載されているアッセイおよびアッセイ成分を、任意の他のＮＧＡＬもしくはＮＧＡＬ自己抗体アッセイまたはＮＧＡＬレベルもしくは濃度の評価が有益であることを証明することができる任意の他の状況、とりわけ、例えば、癌関連アッセイ（例えば、一般に、またはより具体的には、膵癌、乳癌、卵巣／子宮癌、白血病、大腸癌および脳癌が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１９６８７６号を参照、また、米国特許第５，６２７，０３４号および米国特許第５，８４６，７３９号も参照されたい。）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショックおよび多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）の診断（例えば、米国特許出願公開第２００８／００５０８３２号および米国特許出願公開第２００７／００９２９１１号参照、また、米国特許第６，１３６，５２６号を参照されたい。）、血液学的適用（例えば、細胞型の推定）、子癇前症、肥満（代謝症候群）、インスリン抵抗性、高血糖、組織リモデリング（（ＭＭＰ−９と複合体を形成する場合）、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１０５１６６号および米国特許第７，１５３，６６０号を参照されたい。）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症）、過敏性腸症候群（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１６６７１９号および米国特許出願公開第２００８／００８５５２４号を参照されたい。）、神経変性疾患、呼吸器疾患、炎症、感染症、歯周疾患（例えば、米国特許第５，８６６，４３２号を参照されたい。）および静脈血栓塞栓性疾患等の心臓血管疾患（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２６９８３６を参照されたい。）の評価において、任意に用いることもできる。
【０１３２】
更に、アッセイ希少試薬ＮＧＡＬ抗原、抗ＮＧＡＬ抗体およびＮＧＡＬアッセイに関する、全て２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／９８１，４７０号、米国仮特許出願第６０／９８１，４７１号および米国仮特許出願第６０／９８１，４７３号、ならびに全て２００８年４月１６日に出願された米国特許出願第１２／１０４，４０８号、米国特許出願第１２／１０４，４１０号および米国特許出願第１２／１０４，４１３号の教示の内のいずれも、本明細書において記載されている方法およびキットにおいて適用することができ、上記に関するそれらの教示に関して参照により完全に各々組み込まれている。
【０１３３】
ヒトＮＧＡＬまたはこの断片と反応性の単離された自己抗体
【０１３４】
また、単離されたヒトＮＧＡＬ自己抗体も提供される。単離されたヒトＮＧＡＬ自己抗体は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体またはＩｇＭ抗体であり得る。好ましくは、単離された自己抗体はＩｇＧ抗体である。自己抗体は、当技術分野において知られている常法に従う技術を用いて得ることができる。例えば、自己抗体は、かかる自己抗体をそれらの環境から、例えばヒトＮＧＡＬ自己抗体を含有する混合物から分離することによって得ることができる。かかる混合物は、通常の供血中に１以上の対象から得ることができる。更に、かかる混合物は、ヒトＮＧＡＬ（またはこの断片もしくは誘導体）による処置を受けている１以上の対象から得ることができる。代替として、混合物は、心臓血管疾患もしくは腎疾患の臨床徴候または正常集団についての臨床的に許容し得る値より高いＮＧＡＬの内在濃度を有する１以上の対象から得ることができる。かかる自己抗体を含有する混合物は、かかる対象からの新たに回収されたもしくは保存された血液、血漿または血清から得られ得、本明細書において記載されている方法を用いて容易に同定され得る。自己抗体は、通常の免疫グロブリン手法、例えば、塩分別（例えば、硫安沈殿）、免疫沈降、固相上のアフィニティーキャプチャー、ゲル電気泳動、透析またはクロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等）を用いて単離され得る。
【０１３５】
特に、本明細書において記載されている特異的結合パートナーは、自己抗体の単離および／または単離された自己抗体の同定の確認における標準技術を用いて用いられ得る。かかる自己抗体のアミノ酸配列は、当技術分野において知られている通常の技術を用いて、例えば自動エドマン分解によって決定され得る。代替として、かかる抗体のアミノ酸配列は、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６０：２３５−４９（２００２）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４：９９９−１００７（２０００）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３７：９５−１０４（２０００）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４：４９−５１（２０００）、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１３：１８１３−１８１７（１９９９）およびＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１３：１４１３−２２（１９９９）において記載されている質量分析の方法および技術を用いて決定され得る。
【０１３６】
一旦、自己抗体のアミノ酸配列が決定されると、当技術分野において知られている常法に従う技術を用いて自己抗体の核酸配列を決定することもできる。このように得られた核酸配列は、抗体工学の当業者に周知のように、ヒト細胞系もしくは非ヒト細胞系または非ヒト対象において自己抗体または自己抗体断片を発現させるために使用され得る。
【０１３７】
更に、一旦、単離されたＮＧＡＬ自己抗体のアミノ酸配列および核酸配列が得られたら、アミノ酸配列および核酸配列は、様々な固相法（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４（１９９５）を参照されたい。）を用いて直接合成され得、自動合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、その製造業者によって提供された指示書に従って達成され得る。更に、本明細書において記載されている単離された自己抗体から得ることができるアミノ酸配列を、他のサブユニットからの配列またはそのいずれかの部分による化学的方法を用いて、直接合成中に変更しておよび／または組み合わせて、変異体配列を作製することができ、故に変異体ヒトＮＧＡＬ自己抗体を作製することができる。
【０１３８】
本明細書において記載されているヒトＮＧＡＬ自己抗体は、種々の異なる目的のために使用され得る。例えば、これらの単離された自己抗体は、少なくとも１種のヒト抗ＮＧＡＬ自己抗体へのヒトＮＧＡＬまたはこの断片の結合を阻害する際に有用な作用物質を同定するためのスクリーニング方法において使用され得る。具体的には、かかるスクリーニング方法は、単離されたヒトＮＧＡＬ自己抗体を含む混合物を調製することを含む。かかる混合物を調製した後、この方法は、ヒトＮＧＡＬまたはこの断片および試験すべき少なくとも１種の薬剤（例えば、医薬組成物等）を、同時にまたは逐次的に、任意の順序において、混合物に加えることを含む。最終段階は、試験される薬剤がヒトＮＧＡＬ自己抗体へのＮＧＡＬまたはこの断片の結合を阻害するかどうかを判定することを含む。かかる方法は、一度に多数の薬剤のスクリーニングを可能にするために部分的にまたは完全に自動化され得ると考えられる。ヒトＮＧＡＬ自己抗体へのＮＧＡＬまたはこの断片の結合を阻害すると判定された薬剤は、ヒトにおける心臓血管疾患または腎疾患を処置する際における潜在的治療剤としての使用のための更なる試験のために選択される。更に、本明細書において記載されている単離された自己抗体を、心臓血管疾患または腎疾患を処置するために使用され得る医薬組成物において用いることもできる。かかる医薬組成物は、本明細書において記載されている単離された自己抗体および１種以上の医薬的に許容し得る賦形剤を含有する。
【０１３９】
上記に鑑みて、ＮＧＡＬまたはこの断片と反応する自己抗体を単離する方法が提供される。この方法は、（ｉ）ＮＧＡＬが生物学的試料との接触の前または後に固相上に任意に固定される、ＮＧＡＬ（またはこの断片）をＮＧＡＬと反応する自己抗体を含有することが分かっている生物学的試料に接触させる段階、（ｉｉ）自己抗体が結合したＮＧＡＬを単離する段階、および（ｉｉｉ）ＮＧＡＬから自己抗体を単離する段階を含む。また、ＮＧＡＬまたはこの断片と反応する単離された自己抗体も提供される。
【０１４０】
アッセイキット
【０１４１】
また、試験試料中のＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体の存在、量または濃度について試験試料をアッセイするためのキットも提供される。キットは、ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分およびＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための指示書を含む。ＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分は、固相上に任意に固定されたＮＧＡＬ（またはこの断片）を含む組成物および／またはＮＧＡＬ（またはこの断片）と反応する少なくとも１種の自己抗体と結合することができる抗体を含む組成物を含み、この抗体は、検出可能であるように任意に標識される。また、指示書は、自己抗体を定量するための標準曲線または参照標準を作製するための指示書を含むこともできる。かかる指示書は、任意に、印刷形態であることができ、またはＣＤ、ＤＶＤもしくは他のフォーマットの記録媒体であることができる。
【０１４２】
キットは、ＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための少なくとも１種の成分およびＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための指示書を更に含むことができる。ＮＧＡＬ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための前記少なくとも１種の成分は、ＮＧＡＬ（またはこの断片）に結合することができる抗体を含む組成物を含み、この抗体は、検出可能であるように任意に標識される。
【０１４３】
代替としてまたはさらには、キットは、較正物質もしくは対照、例えば、単離されたもしくは精製されたＮＧＡＬ抗体および／またはアッセイを行うための少なくとも１つの容器（例えば、既にＮＧＡＬで被覆されていてもよいチューブ、マイクロタイタープレートもしくはストリップ）および／または緩衝液、例えば、アッセイ緩衝液または洗浄緩衝液（それらの内のいずれか１つは、濃縮溶液、検出可能な標識（例えば、酵素標識）用基質溶液または停止液として提供され得る。）を含むことができる。好ましくは、キットは、アッセイを実施するために必要な全ての成分、すなわち、試薬、標準、緩衝液、希釈剤等を含む。
【０１４４】
キット中において提供されるあらゆる抗体、例えばＮＧＡＬに特異的な抗体は、検出可能な標識、例えば、発蛍光団、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識等を組み込むことができ、またはキットは、抗体を標識するための試薬もしくは抗体を検出するための試薬（例えば、検出抗体）および／または分析物を検出するための試薬もしくは分析物を標識するための試薬を含むことができる。抗体、較正物質および／または対照は、別々の容器中において提供され得、または適切なアッセイフォーマット中に、例えばマイクロタイタープレート中に予め分注され得る。
【０１４５】
任意に、キットは、品質管理成分（例えば、感受性パネル、較正物質および陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は、当技術分野において周知であり、種々の免疫診断製品のための添付文書上において記載される。感受性パネルのメンバーは、アッセイ性能特性を確立するために任意に使用され、更に任意に、イムノアッセイキット試薬の完全性およびアッセイの標準化の有用な指標である。
【０１４６】
また、キットは、診断アッセイを行うためまたは品質管理評価を容易にするために必要とされる他の試薬、例えば、緩衝液、塩、酵素、酵素補助因子、基質、検出試薬等を任意に含むこともできる。また、他の成分、例えば、試験試料の単離および／または処置のための緩衝液および溶液（例えば、前処置試薬）をキット中に含むこともできる。キットは、１種以上の他の対照を更に含むことができる。キットの成分の内の１種以上を凍結乾燥することができ、その場合、キットは、凍結乾燥された成分の再構成に適切な試薬を更に含むことができる。
【０１４７】
キットの様々な成分は、任意に、必要に応じて適切な容器、例えばマイクロタイタープレート中において提供される。キットは、試料を保持するまたは保存するための容器（例えば、尿試料のための容器またはカートリッジ）を更に含むことができる。適切な場合、キットは、任意に、反応容器、混合容器および試薬または試験試料の調製を容易にする他の成分を含むこともできる。キットは、試験試料を得ることを助けるための１つ以上の器具、例えば、注射器、ピペット、鉗子、測定用スプーン等を含むこともできる。
【０１４８】
好ましくは、検出可能な標識は、本明細書において記載されている少なくとも１種のアクリジニウム化合物である。キットは、少なくとも１種のアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１種のアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルまたは任意のそれらの組み合わせを含むことができる。検出可能な標識が少なくとも１種のアクリジニウム化合物である場合、キットはまた、過酸化水素の源、例えば、緩衝液、溶液、少なくとも１種の過酸化水素生成酵素を含む組成物またはインサイチュで過酸化水素を生成する別の手段、および／または少なくとも１種の塩基性溶液を含むこともできる。所望により、キットは、固相、例えば、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップを含むことができる。
【０１４９】
方法およびアッセイキットの適合
【０１５０】
キット（またはこの成分）、ならびに下記のアッセイによって試験試料中のＮＧＡＬ自己抗体の濃度を決定する方法は、例えば米国特許第５，０８９，４２４号および米国特許第５，００６，３０９号において記載されている、ならびに例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）により商業的に販売されている（固相が微粒子を含むものを含む）種々の自動化系および半自動化系における使用のために適合させることができる。
【０１５１】
非自動化系（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した自動化系または半自動化系間との間の差異の一部としては、（サンドイッチ形成および分析物の反応性に影響を及ぼし得る。）第１の特異的結合パートナー（例えばＮＧＡＬ）が結合する基質、ならびに捕捉段階、検出段階および／または任意の洗浄段階の長さおよびタイミングが挙げられる。ＥＬＩＳＡ等の非自動化フォーマットが、試料および捕捉試薬による相対的に長い温置時間（例えば、約２時間）を必要とする可能性があるのに対して、自動化フォーマットまたは半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、相対的に短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）についてはおよそ１８分間）を有する可能性がある。同様に、ＥＬＩＳＡ等の非自動化フォーマットは、コンジュゲート試薬等の検出抗体を相対的に長い温置時間（例えば、約２時間）温置する可能性があるのに対して、自動化フォーマットまたは半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標））は、相対的に短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）についておよそ４分間）を有する可能性がある。
【０１５２】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームとしては、限定されないが、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第５，２９４，４０４号を参照されたい。）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩ、ならびに他のプラットフォームが挙げられる。更に、アッセイ、キットおよびキット成分は、他のフォーマット中において、例えば、電気化学的アッセイ系または他のハンドヘルドアッセイ系もしくはポイントオブケアアッセイ系において用いられ得る。本発明の開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを行う商業的なＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイ系に適用可能である。免疫センサ、ならびに使い捨て試験器具におけるそれらの製造方法および操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号（それらは、同じことに関するそれらの教示のための参照により完全に組み込まれている。）において記載されている。
【０１５３】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）系に対する自己抗体アッセイの適合に関して、以下の構成が好ましい。微小加工されたシリコンチップは、一対の金電流測定作用電極および銀−塩化銀参照電極を用いて製造される。作用電極の内の１つにおいて、固定化された捕捉抗体を有するポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）が、その電極の上にパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着される。このチップは、イムノアッセイに適切なフルイディクスフォーマットを有するＩ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジ中に組み立てられる。カートリッジの試料保持チャンバの壁の一部に、アルカリホスファターゼ（または他の標識）によって標識された第２の検出抗体を含む層が存在する。カートリッジの液ポーチ内に、ｐ−アミノフェノールリン酸塩を含む水性試薬がある。
【０１５４】
操作時に、ＮＧＡＬ自己抗体を含有すると推測された試料は、試験カートリッジの保持チャンバに加えられ、カートリッジは、Ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）リーダ中に挿入される。第２の抗体（検出抗体）が試料中に溶解した後、カートリッジ内のポンプ要素が、チップを含有する管路内に試料を押し出す。ここで、ポンプ要素が振動して、ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ自己抗体および標識された検出抗体の間でのサンドイッチの形成を促進する。アッセイの最後から２番目の段階において、液体はポーチから管路の中に押し出されて、試料をチップから廃物チャンバの中に洗浄する。アッセイの最後の段階において、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールリン酸塩と反応してリン酸基を切断し、遊離したｐ−アミノフェノールを作用電極において電気化学的に酸化させる。測定された電流に基づいて、リーダは、埋め込まれたアルゴリズムおよび工場で決定された較正曲線によって試料中のＮＧＡＬ自己抗体の量を計算することができる。
【０１５５】
更に、本明細書において記載されている方法およびキットは、イムノアッセイを実施するための他の試薬および方法を必ず包含することは言うまでもない。例えば、コンジュゲート希釈剤および／または較正物質希釈剤として、例えば洗浄のために、当技術分野において知られている緩衝液および／または用いるために容易に調製され得るもしくは最適化され得る緩衝液等の様々な緩衝液が包含される。例示的なコンジュゲート希釈剤は、ある種のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において用いられ、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質遮断剤、抗微生物剤および洗浄剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）コンジュゲート希釈剤である。例示的な較正物質希釈剤は、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質遮断剤および抗微生物剤を含有する緩衝液を含む、ある種のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において用いられているＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ヒト較正物質希釈剤である。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例は、本開示を例示する役目をする。実施例は、いかなる形であれ主張された本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１５７】
（実施例１）
本実施例は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）を被覆したマイクロプレートの調製および特性評価について記載する。
【０１５８】
組換えＮＧＡＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を４μｇ／ｍＬの濃度にリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）中に溶解させた。ＮＧＡＬ溶液（１００μＬ／ウェル）を、２８０ｒｐｍで混合しながら３８℃で２時間マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ）に被覆した。それらのプレートを排液し、ＮＧＡＬ溶液を熱不活化ウシ血清アルブミンの溶液（ＢＳＡ、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ｗ／ｖ、３００μＬ／ウェル）と置き換えた。それらのプレートを２８０ｒｐｍで混合しながら３８℃で１時間温置し、次いで排液した。次いで、それらのプレートをスクロースの溶液（ＰＢＳ中の２％ｗ／ｖ、３００μＬ／ウェル）で洗浄し（３×）、排液し、乾燥窒素流下で乾燥した。
【０１５９】
アクリジニウム−９−カルボキサミドによって標識したマウス抗ＮＧＡＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００ｎｇ／ｍＬ）をＮＧＡＬ被覆マイクロプレート（１００μＬ／ウェル）に加え、それを続いて３７℃で１時間温置し、次いでＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液（６×、３５０μＬ）によって洗浄した。マイクロプレートを、２８℃で平衡化したＭｉｔｈｒａｓマイクロプレートリーダ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）中に装入した。各ウェルの化学発光シグナルを、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガー溶液（１００μＬ）およびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トリガー溶液（１００μＬ）の逐次的な添加の後２秒間記録した。ＮＧＡＬ反応性マウスモノクローナル抗体コンジュゲートは、１，７６３，２６８相対発光量（ＲＬＵ）および１．２％（ＣＶ）の平均シグナルで特異的にＮＧＡＬ被覆ウェルに結合した。
【０１６０】
（実施例２）
本実施例は、ＮＧＡＬと反応する自己抗体についてのヒト血漿の試験試料の分析について記載する。
【０１６１】
凍結した正常ドナー血漿試料を、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）標本バンクから入手し、使用前に２−８℃で解凍した。実施例１において記載したようにマイクロプレートを調製した。マウス抗ヒトＩｇＧ（亜型ＩｇＧ２ｂ、カッパ）を化学発光アクリジニウム−９−カルボキサミドによって標識した。この抗体は、ヒトＩｇＭもしくはＩｇＡ、またはウサギ、ヒツジもしくはヤギＩｇＧに対する著しい反応性を有さないのに対して、全てのヒトＩｇＧ亜型を認識した。試料（５μＬ）を、マイクロプレートウェル中においてＡｘＳＹＭ（登録商標）トロポニン−Ｉ  ＡＤＶプレ温置希釈剤（９５μＬ）によって希釈した。３７℃で２時間温置した後、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液（６×、３５０μＬ）によってプレートを洗浄した。次いで、マウス抗ヒトＩｇＧ特異的モノクローナル抗体−アクリジニウムコンジュゲート（１００μＬ）を加え、プレートを３７℃で１時間温置し、その後、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液（６×、３５０μＬ）によって最終の洗浄を行った。マイクロプレートを、２８℃で平衡化したＭｉｔｈｒａｓマイクロプレートリーダ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）中に装入した。各ウェルからの化学発光シグナルを、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガー溶液（１００μＬ）およびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トリガー溶液（１００μＬ）の逐次的な添加の後２秒間記録した。試験した集団についての一般的な統計量を表２および３において示す。
【０１６２】
【表２】
2012507005.tif 000058
【０１６３】
【表３】
2012507005.tif 000059
１９２の試料についての箱髭図を作成し、その中において２５パーセント点および７５パーセント点の間の差は８８５．０であり、それによって、離れ値が≧３，２２７．５（１７の離れ値、８．９％）であり、飛び離れ値が≧４，５５５．０（１１の離れ値、５．７％）であることが明らかになった。これらの結果によって、驚くべきことに、また予想外に、ＮＧＡＬと反応性の１種以上の自己抗体がヒト試料中において見出されることが確認される。
【０１６４】
明細書中において挙げられた全ての特許、特許出願刊行物、雑誌論文、教科書および他の刊行物は、本開示が関係する当業者の熟練度を示す。全てのかかる刊行物は、各個別の刊行物が具体的におよび個別に参照により組み込まれていることが示されているのと同じように、同程度に参照により本明細書に組み込まれている。
【０１６５】
本明細書において例示的に記載されている本発明は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素（複数可）または限定（複数可）の非存在下で、適切に実施され得る。従って、例えば、「含む」、「から実質的に成る」および「から成る」という用語のいずれかの本明細書における各例は、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。同様に、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって明らかに表されない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」に対する参照は、（本明細書において記載され、および／または、本開示を読んだ際に当業者に明らかとなる。）その型の１つ以上の方法および／または段階を含む。
【０１６６】
用いられた用語および表現は、説明の用語として用いられるものであって、限定の用語として用いられるものではない。この点に関して、ある種の用語は、「定義」の下で定義され、それ以外の場合、「詳細な説明」における他の場所で定義、記載または考察され、全てのかかる定義、記載および考察は、かかる用語に帰することが意図される。また、かかる用語および表現の使用において、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる均等物も除外することを意図するものでもない。更に、小見出し、例えば「定義」が「詳細な説明」において使用されているが、かかる使用は、参照を容易にするためのものに過ぎず、ある見出し内において行われた任意の開示をその見出しのみに限定することを意図するものではなく、１つの小見出しの下に為された任意の開示は、それぞれの全ての他の小見出し下における開示を構成することが意図される。
【０１６７】
主張された本発明の範囲内で、様々な修飾が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴の状況において具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾および変更を当業者が行使し得ることを理解すべきである。かかる修飾および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義されている本発明の範囲内にあると考えられる。
【配列表】
2012507005000001.app
【国際調査報告】
2012507005.tif 000060
2012507005.tif 000061