(57)【要約】  本発明は、遺伝子発現生成物に基づくバイオマーカーおよびEGFR発現癌の治療における抗EGFR抗体の有効性の決定方法に関する。本発明はさらに、EGFR発現癌に罹患した患者の特異的抗EGFR抗体治療に対する感受性または耐性の予測に関する。本発明は、好ましくはKRAS野生型腫瘍を有する患者で抗EGFR抗体による治療の臨床成果のより良好な予測を可能にするそれぞれのバイオマーカーの識別に関する。この状況下では、本発明は、特に抗EGFR抗体c225／セツキシマブ（Erbitux(商標)）および結腸直腸癌（CRC）罹患患者での前記の使用に関する。
2012529895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
EGFR抗体治療のための候補である、KRAS野生型EGFR発現腫瘍を罹患する患者が、抗EGFR抗体による治療に応答する可能性を予測するin vitroの方法であって、前記患者の腫瘍サンプル由来の核酸サンプルをPCRまたはRNAもしくはDNAアレイまたは比較可能な診断ツールもしくは装置に付することによって、前記患者から入手した組織サンプルにおいて1つまたは2つ以上の予後遺伝子またはその発現生成物の発現レベルを決定する工程を含み、
（i）ADAMDEC1、BSDC1、C1orf144、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、GOSR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URM1、ZFYVE26、RGMB、SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL、NOSIP、PITX2、POF1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、SOX4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDR1、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38およびSHROOM2から成る遺伝子群から選択される遺伝子または遺伝子生成物の高発現は参照値と比較して患者が前記治療に応答するであろうことを示し、さらに
（ii）C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAP1、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIP1、PHGDH、PPP1R9A、QPCT、RABEP1、RPA1、RPL22L1、SKP1、SLC25A27、SLC25A46、SOCS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EXOC6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2Kから成る遺伝子群から選択される遺伝子または遺伝子生成物の高発現は参照値と比較して患者が前記治療に応答しないであろうことを示す、前記可能性を予測するin vitroの方法。
【請求項２】
EGFR抗体による治療がファーストライン治療法として選択され、群(i)の遺伝子から選択される遺伝子または遺伝子発現生成物が、ADAMDEC1、BSDC1、C1orf144、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、GOSR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URM1、VAV3およびZFYVE26の1つまたは2つ以上であり、さらに、群(ii)の遺伝子から選択されるものが、C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAP1、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIP1、PHGDH、PPP1R9A、QPCT、RABEP1、RPA1、RPL22L1、SKP1、SLC25A27、SLC25A46、SOCS6、TPD52、TGFA、ZDHHC2およびZNF654の1つまたは2つ以上である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抗EGFR抗体による治療が、患者が化学療法難治性腫瘍を進行させた後の化学療法剤との併用療法であり、さらに群(i)から選択される遺伝子または遺伝子発現生成物が、RGMB、SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL、NOSIP、PITX2、POF1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、SOX4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDR1、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38およびSHROOM2の1つまたは2つ以上であり、さらに、群(ii)から選択されるものが、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EXOC6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2Kの1つまたは2つ以上である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
臨床応答が全生存期間（OS）であり、群（i）から選択される遺伝子が、EPDR1、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、SHROOM2、STK38およびVAV3の1つまたは2つ以上であり、さらに群（ii）から選択されるものが、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15およびTPK1の1つまたは2つ以上であるか、または前記群の各々のそれぞれの遺伝子発現生成物である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
臨床応答が進行停止生存期間（PFS）であり、群（i）から選択される遺伝子が、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL、NOSIP、PITX2、POF1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、SOX4、THEM2、VAV3およびZNF337の1つまたは2つ以上であり、さらに群（ii）から選択されるものが、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EXOC6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS1、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2およびZDHHC14の1つまたは2つ以上であるか、または前記群の各々のそれぞれの遺伝子発現生成物である、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
臨床的全応答（OR）が安定的病状または進行性病状に対する部分的応答として測定され、群（i）から選択される遺伝子が、VAV3、RGMBおよびSPIRE2の1つまたは2つ以上であり、さらに群（ii）から選択されるものが、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2Kの1つまたは2つ以上であるか、または前記群の各々のそれぞれの遺伝子発現生成物である、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
参照値が、1つまたは2つ以上の特定の機能的または臨床的特性、および／または参照患者もしくは参照患者グループから入手した特定の発現プロファイルによって規定される、請求項1−6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
参照値が、前記遺伝子または遺伝子生成物を発現しないか、またはほとんど発現しない参照患者または患者グループから入手される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
参照値が、コントロール遺伝子の発現閾値または群（ii）から選択した遺伝子の遺伝子発現と比較した群（i）から選択した遺伝子の遺伝子発現の比であるか、または参照値が、決定されるべき特定の臨床応答パラメータによりまたは特定の治療前条件もしくは治療条件により規定される発現閾値である、請求項1−8のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
臨床応答パラメータが、進行停止生存期間（PFS）、全生存期間（OS）、部分的応答（PR）、安定的病状（SD）、進行性病状（PD）または前記の組合せである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
組織サンプルが、抗EGFR抗体による治療の前に患者から採取される、請求項1−10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
さらに別の組織サンプルが、抗EGFR抗体による治療時に患者から採取される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
患者の治療時に入手された遺伝子または遺伝子発現生成物の発現レベルが、前記患者の治療を開始する前に入手された値と比較される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
患者サンプルが腫瘍組織に由来する、請求項1−13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
患者サンプルが血漿に由来する、請求項1−13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子によってコードされる発現タンパク質のレベルが決定される、請求項1−15のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
KRAS野生型EGFR発現癌を罹患する患者が、抗EGFR抗体による治療に治療的に応答する可能性を予測するin vitroの方法であって、
（a）前記患者の腫瘍組織に由来する生検組織サンプルまたは血漿で診断手段および／または診断装置によって、ADAMDEC1、BSDC1、C1orf144、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、GOSR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URM1、ZFYVE26、RGMB、SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL、NOSIP、PITX2、POF1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、SOX4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDR1、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38、SHROOM2から成る群（i）および／または、C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAP1、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIP1、PHGDH、PPP1R9A、QPCT、RABEP1、RPA1、RPL22L1、SKP1、SLC25A27、 SLC25A46、SOCS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EXOC6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2Kから成る群（ii）から選択される1つまたは2つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；（b）前記患者の腫瘍由来組織サンプルまたは血漿を前記抗EGFR抗体にex vivoで曝露する工程；（c）工程（b）の前記暴露組織サンプルで、工程（a）で指定した1つまたは2つ以上のバイオマーカーの発現レベルを再度測定する工程；および（d）工程（b）および（c）で測定した発現レベルの差異を計算する工程を含み、工程（a）と比較して工程（c）で得られた群（i）のバイオマーカーの発現レベルが増加していることが前記患者が前記抗EGFR抗体による治療に治療的に応答する可能性が高いことを示し、さらに工程（a）と比較して工程（c）で得られた群（ii）のバイオマーカーの発現レベルが増加していることが前記患者が前記抗EGFR抗体による治療に治療的に応答する可能性が低いことを示す、前記可能性を予測するin vitroの方法。
【請求項１８】
遺伝子または遺伝子発現生成物が、TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9A、VAV3およびKLK6から成る群から選択される、請求項1−17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
群（i）の遺伝子または遺伝子発現生成物の1つがTGFaである、請求項1−17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
VAV3およびTGFaの発現レベルが決定される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
群（ii）の遺伝子または遺伝子発現生成物の1つがAREGまたはEREGである、請求項1−17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
TGFa、および、AREGまたはEREG、並びに場合によってVAV3および／またはEGFの発現レベルが決定される、請求項19−21のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
KRAS野生型EGFR発現腫瘍を罹患する患者が、腫瘍組織でさらに追加のEGFR変異を有する、請求項1−22のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
EGFR変異がR521K多形性である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
抗EGFR抗体がc225（セツキシマブ）である、請求項1−24のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
患者が罹患する腫瘍が、結腸直腸癌（CRC）または転移性結腸直腸癌（mCRC）である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
さらに別にAREGおよび／またはEREGまたはそれらの発現生成物の発現レベルが決定され、さらに群（i）および／または群（ii）の遺伝子または遺伝子発現生成物の1つまたは2つ以上と比較される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
AREGおよび／またはEREG並びにTGFAおよび／またはVAV3の少なくとも1つ、および／またはEGF、またはそれらの発現生成物の発現レベルが決定される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
以下の遺伝子TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3によって示されるか、または前記とハイブリダイズする、固相表面に固定されたポリヌクレオチドの配置物を含むDNAまたはRNAアレイ。
【請求項３０】
さらに、以下の遺伝子SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、IKK相互作用タンパク質をコードする遺伝子、EDEM3、LY6G6Dによって示されるか、または前記とハイブリダイズするポリヌクレオチドの編成を含む、請求項29に記載の遺伝子アレイ。
【請求項３１】
さらに別に、遺伝子AREGおよび／またはEREGおよび／またはTGFAとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項29または30に記載の遺伝子アレイ。
【請求項３２】
遺伝子TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、IKK相互作用タンパク質をコードする遺伝子、EDEM3、LY6G6D、AREG、EREGおよびTGFAによって示されるか、または前記とハイブリダイズするポリヌクレオチドの配置物から成るDNAまたはRNAアレイ。
【請求項３３】
固相表面に固定されたポリヌクレオチドの編成を含むDNAまたはRNAアレイであって、前記ポリヌクレオチドがアレイ上で編成された遺伝子によって示されるかまたは前記とハイブリダイズし、前記ポリヌクレオチドの編成が以下から成る群から選択される、前記DNAまたはRNAアレイ：
（a）ADAMEC1、C7orf46、CAST、DHCR7、ERAP1、FADS1、INSIG2、KLK6、MIDN、PHGDN、PPP1R9A、QPCT、RABEP1、RPL22L1、SLC25A27、SOCS6、SQLE、TNFRSF1B、TPD52、ZDHHC2； 
（b）GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、MAPK6、PROSC、RGMB、RWDD2B、SERTAD2、SPIRE2；
（c）ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、KCNK5、PGM2L1、RALBP1、SHROOM2、TNFSF15；
（d）ACSL5、C1QC、CBALES1、CDK6、EHBP1、ETS2、EXOC6、EXT1、FMNL2、HDAC2、JUN、MED17、MTHFS、PITX2、POF1B、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、SLC44A3、SOX4、TK2、TNFSF15、ZDHHC14；
（e）ZDHHC14、TK2、PRR15、MTHFS、CABLES1、EHBP1、MED17、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PGM2L1、RGMB、 ADAMEC1、ERAP1、FADS1、KLK6、PHGDH、PPP1R9A、QPCT、SLC25A27、TNFRSF1B、ZDHHC2。
【請求項３４】
さらに遺伝子AREGおよび／またはEREGおよび／またはTGFAによって示されるか、または前記とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項33に記載の遺伝子アレイ。
【請求項３５】
遺伝的抗EGFR抗体バイオマーカーのリアルタイムPCR増幅キットであって、請求項1で指定した群（i）および／または群（ii）の遺伝子の1つまたは2つ以上のDNAまたはRNAを含む第一のパッケージ、前記第一のパッケージの前記DNA／RNAと特異的にハイブリダイズするPCRプライマーを含む第二のパッケージ、ウェルプレートを含む第三のパッケージ、並びにそれによってリアルタイムPCR増幅を実施することができる診断手段および溶媒を含む第四のパッケージを含む、前記リアルタイムPCR増幅キット。
【請求項３６】
第一のパッケージが、以下の遺伝子TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、IKK相互作用タンパク質をコードする遺伝子、EDEM3、LY6G6D、AREG、EREGおよびTGFA、場合によってさらに別にAREGまたはEREGのDNA／RNAを含む、請求項35に記載のキット。
【請求項３７】
ADAMDEC1、BSDC1、C1orf144、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、GOSR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URM1、ZFYVE26、RGMB、SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL、NOSIP、PITX2、POF1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、SOX4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDR1, KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38、SHROOM2；
C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAP1、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIP1、PHGDH、PPP1R9A、QPCT、RABEP1、RPA1、RPL22L1、SKP1、SLC25A27、SLC25A46、SOCS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EXOC6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2Kから成り、場合によってAREGおよび／またはEREGが組み合わされる群から選択される、1つもしくは2つ以上の遺伝的バイオマーカー、または遺伝子アレイ、または前記バイオマーカーの1つもしくは2つ以上を含む遺伝的抗EGFR抗体バイオマーカーのリアルタイムPCR増幅用キット、または前記のそれぞれのタンパク質発現生成物、の使用であって、医薬的有効性および／または治療に用いようとする抗EGFR抗体に対するKRAS野生型EGFR発現癌罹患患者の臨床応答の予測を目的とし、前記予測が、基本的臨床決定パラメータから決定される閾値に対する発現レベルの差異の計算からもたらされる、前記使用。
【請求項３８】
以下のバイオマーカーの少なくとも1つが用いられる、請求項37に記載の使用：TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、IKK相互作用タンパク質をコードする遺伝子、EDEM3、LY6G6D、TGFA、またはAREGおよび／またはEREGを含む前記の組合せ。
【請求項３９】
TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、IKK相互作用タンパク質をコードする遺伝子、EDEM3、LY6G6D、TGFAまたは前記の組合せから成り、場合によってさらに別にAREGおよび／またはEREGを含む群から選択される、1つもしくは2つ以上の遺伝的バイオマーカー、または遺伝子アレイ、または前記バイオマーカーの1つもしくは2つ以上を含む遺伝的抗EGFR抗体バイオマーカーのリアルタイムPCR増幅用キット、の使用であって、患者の腫瘍サンプルで1つまたは2つ以上の前記遺伝子または遺伝子生成物が発現または過剰発現するときに、前記患者でKRAS野生型EGFR発現CRCまたはmCRCを治療するための抗EGFR抗体である医薬の製造を目的とする、前記使用。
【請求項４０】
タンパク質発現生成物が、血漿を含む患者の体液で決定される、請求項37−39のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
意図される基本的治療がファーストライン治療である、請求項37−40のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
意図される基本的治療が、前記抗EGFR抗体治療と化学療法剤との併用療法であり、前記患者が化学療法剤難治性癌を進行させている、請求項37−41のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
抗EGFR抗体がc255（セツキシマブ）である、請求項37−42のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
癌が結腸直腸癌（CRC）または転移性結腸直腸癌（mCRC）である、請求項37−43のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４５】
請求項37から39のいずれか１項で指定した遺伝子または遺伝子生成物のタンパク質発現生成物と特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用であって、治療に用いようとする抗EGFR抗体の医薬的有効性および／または前記抗体に対するKRAS野生型EGFR発現癌罹患患者の臨床応答のin vitro決定を目的とする、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、EGFRを発現する癌の治療で抗EGFR抗体の有効性を決定するための、遺伝子または遺伝子生成物に基づくバイオマーカーおよび方法に関する。本発明はさらに、EGFR発現癌に罹患する患者の特異的抗EGFR抗体による治療に対する当該患者の感受性または耐性の予測に関する。本発明は、好ましくはKRAS野生型腫瘍を有する患者における抗EGFR抗体治療の臨床成果のより良好な予測を可能にするそれぞれのバイオマーカーの識別に関する。この関係では、本発明は特に、抗EGFR抗体c225／セツキシマブ（Erbitux(商標)）および特に結腸直腸癌（CRC）罹患患者における前記の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は癌の治療に一般的に用いられる。抗体は国の健康管理当局に負担を負わせる高価な薬剤であり、さらにしばしば望ましくない副作用を引き起こすので（この副作用は重篤でしばしば死に至る病にある患者に対して更なる負担およびストレスを引き起こす）、特異的抗体薬による特定の患者の治療が、患者の症状を真に改善するかまたは治癒させ得るか否かを前もっと知ることは極めて望ましいことであろう。既にいくらかの臨床パラメータおよび組織学パラメータが存在し、これらは、特定の薬剤または治療スケジュールが疾患の治療を成功させ得るか否かの予後判定に用いられている。しかしながら、腫瘍は、非常に頻繁に多様な遺伝的パターン（前記はある個体と別の個体で変化し得る）を引き出すことが示された。したがって、特定の薬剤または特定の治療は第一の患者では臨床症状を改善するが、同じ癌に罹患している第二の患者には効果が低いかまたは有効でないことがある。例えば、結腸直腸癌に罹患している患者はある種の抗体薬に様々に応答し得る。最悪の事例では特定の患者グループは当該薬剤に全く応答しないが、一方、別のグループの患者は、腫瘍の種々の遺伝的パターンおよび傾向に応じて当該薬剤に対して満足な治療応答を引き出す。
最新分子生物学および生化学は、その活性が腫瘍細胞の行動、それらの分化の状態、およびある種の治療薬（例えば抗体）に対するそれらの感受性または耐性に影響を及ぼす何百もの遺伝子を明らかにしたが、これら遺伝子は通常、薬剤治療について日常的な臨床決定を下す目的ではこれまで利用されてこなかった。例外は、乳癌におけるErbB2（Her2）タンパク質発現の利用で、Her2アンタゴニスト薬、ハーセプチン(商標)（Herceptin(商標)、Genentech）に関して患者が選別される。別の例外は、EGFR発現腫瘍のKRAS遺伝子における変異は抗EGFR抗体に対する感受性または応答の欠如を伴うという発見である（Allegra et al. 2009, J Clin Oncol（Epub ahead of print））。
【０００３】
新規な予後および予測マーカー（治療法に対する患者の選別を容易にするであろう）が、治療（例えば小分子または生物学的分子薬剤）に対する患者の応答をより正しく予測するために必要とされる。患者のサンプルの分類は、癌の診断および治療の重大な局面である。患者の応答と分子的マーカーおよび遺伝的マーカーとの密接な関係は、非応答生患者における治療の開発に新しい機会を開くか、または有効性におけるより高い信頼性のゆえに他の治療選択肢からある治療をひときわ目立たせることができる。さらにまた、ある薬剤もしくは薬剤の組合せまたは特定の施療法に良好に応答しそうな患者を予め選別することによって、臨床試験で必要とされる患者数を削減することができ、また臨床開発プログラムの完了に必要とされる時間を短縮できる。
上皮成長因子レセプター（EGFR）およびその下流のシグナリングエフェクター、特にRas/Raf/MAPキナーゼ経路のメンバーは、正常および悪性の両方の上皮細胞生物学において重要な役割を果たし（Normanno et al. 2006, Gene 366:2-16）、したがって治療薬開発のための標的となった。
EGFRを認識し、これを阻害するいくつかのモノクローナルキメラ、ヒト化抗体または完全にヒトのモノクローナル抗体が開発された。ところで、市場化されている抗体の2つの例はセツキシマブ（ERBITUX(商標)）およびパニツムマブ（VECTIBIX(商標)）である。
抗EGFR抗体c225（セツキシマブ）、キメラIgG1（EGF媒介腫瘍細胞増殖をin vitroで阻害し、ヒト結腸直腸腫瘍増殖をin vivoで阻害することが示された）は、2003年に人目をひく承認を得た。その配列は最初WO96/40210で開示された。前記抗体は、一般的に全ての抗EGFR抗体と同様に、つまるところある種の化学療法剤（すなわちドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソールおよびシスプラチン）と相乗的に作用し、異種移植マウスモデルでヒト腫瘍をin vivoで根絶するようである（例えばEP0667165）。さらにまた、抗EGFR抗体c225と第二のヒト化抗EGFR抗体マツズマブ（Mab h425）との組合せはin vitroモデルで相乗効果を有することが示され、これら2つの抗体は同じレセプターに対して作製されたが、当該レセプターの異なるエピトープと結合することが示された。
【０００４】
抗EGFR抗体（セツキシマブまたはそれぞれの小分子阻害剤を含む）を処置された患者の約75%が、多かれ少なかれ激甚な皮膚発赤を治療開始後非常にすみやかに生じた。たいがいは耐え得るものであり処理可能でもあるが、ほぼ10%の患者は、激しい症状のために投与中断および／または投与削減を必要とし、いくらかの患者は治療を中断する。ますます明白となった、EGFR阻害剤に対する皮膚毒性と好ましい臨床成果との切り離せない関係は、治療効果を受けている患者で発赤の“獲得”を望ましいものであるが潜在的にやっかいな毒性にし、時にはこれら薬剤の有用性を制限する。それにもかかわらず、抗EGFR抗体処置中の皮膚発赤の出現は、前記抗体（例えばセツキシマブ）による処置に対する治療応答の信頼できる代用マーカーと考えることができる。
しかしながら、皮膚発赤出現を代用マーカーとして選択することは最適ではない。なぜならば、一般的に抗EGFR抗体処置に応答しない癌患者の識別は長期間当該薬剤を当該患者に投与した後に可能となるからである。
したがって、EGFR発現腫瘍ではKRAS遺伝子および遺伝子生成物の変異（コドン12/13）が、転移性結腸直腸癌のEGFR阻害剤処置に対する非感受性の原因であるという発見は、処置が成功するかしないかの予測を改善すると考えることができる。WO2008/112269は、パニツムマブ（ヒト抗EGFR抗体）はKRAS野生型腫瘍患者でのみ有効であると報告している。Khambata-Fordら（2007, J Clin Oncol 25:3230）は、エピレグリンおよびアンフィレグリンの高い遺伝子発現レベルを示す転移性結腸直腸癌患者は、野生型KRAS腫瘍の患者と同様に、セツキシマブ治療に対して病状制御を受ける可能性がより高いと記載している。
前記の最近の進歩にもかかわらず、癌治療における主要な試みは、最適な成果を得るために、病理発生的マーカーおよび／または遺伝的マーカーに基づいて特定の治療スケジュールのために患者を選別するに留まっている。EGFR発現腫瘍の増殖を阻害する抗EGFR抗体によりEGFR発現腫瘍を治療するという状況下で、これら抗体による意図する処置に対して患者が応答できるか否かを知ることおよびより正しく理解することは、特に、KRAS野生型腫瘍グループにおいてすら全患者が抗EGFR抗体および他のEGFR阻害剤の治療に良好に応答する（約40%）わけではないという最新の発見を考慮すれば有益であろう。
したがって、多様な治療選択肢に対する患者の応答についての予測情報（個体ごとに異なる腫瘍遺伝子型を含む）を同時に提供することができる診断試験、診断方法および診断ツールが希求されている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、抗EGFR抗体の癌治療における有効性決定のための予測バイオマーカーを開示する。
本発明のある実施態様では、KRAS野生型患者またはKRAS遺伝子に変異を有する患者の腫瘍の治療で、抗EGFR抗体の有効性を投与前に予測するために用いることができる特異的なバイオマーカーが記載される。
本発明のさらに別の実施態様では、KRAS遺伝子に変異をもたない（KRAS野生型）患者（通常は抗EGFR抗体療法に統計的には陽性応答を示すが個体ごとには必ずしもそうではない）の腫瘍の治療で、抗EGFR抗体の有効性または有効性の程度をより正確に予測するために用いることができる特異的なバイオマーカーが開示される。
本発明の別の実施態様は、結腸直腸癌（CRC）（好ましくは転移性結腸直腸癌（mCRC））、頭部および頸部の扁平上皮癌（SCCHN）または非小細胞性肺癌（NSCLC）を罹患する患者で、抗EGFR抗体治療に対し良好応答（陽性マーカー）または不良応答（陰性バイオマーカー）を示す可能性が高いバイオマーカーに関する。
【０００６】
本発明の具体的な実施態様では、抗EGFR抗体セツキシマブ（Erbitux(商標)）による、腫瘍（固形腫瘍または転移性腫瘍）関連療法の有効性または非有効性について予測するバイオマーカーが開示される。
本発明の好ましい実施態様では、抗EGFR抗体セツキシマブ（Erbitux(商標)）による、腫瘍（固形腫瘍または転移性腫瘍）関連療法の有効性または非有効性について予測するバイオマーカーが開示され、この場合、前記腫瘍はCRC、mCRC、SCCHNまたはNSCLCである。
本発明の好ましい実施態様では、抗EGFR抗体セツキシマブ（Erbitux(商標)）による、腫瘍（固形腫瘍または転移性腫瘍）関連療法の有効性または非有効性について予測するバイオマーカーが開示され、この場合、前記腫瘍はCRC、mCRC、SCCHNまたはNSCLCであり、前記癌を罹患する患者は、好ましくは個体ごとにKRAS野生型遺伝子パターンを示す。
別の実施態様では、本発明は、KRAS野生型EGFR発現腫瘍を罹患する患者（EGFR抗体治療の候補である）が前記抗EGFR抗体治療に応答するかまたは応答しない可能性を診断手段および／または診断装置によって予測するin vitroの方法に関する。
本発明にしたがえば、前記方法は、1つまたは2つ以上の予後遺伝子またはその遺伝子生成物の発現レベルを前記患者から入手した組織サンプルで決定する工程を含み、関連する臨床参照値と比較して前記遺伝子／遺伝子生成物の高発現または低発現は、患者が前記治療に対して応答する可能性があること、または前記治療に対して応答しない可能性があることを示す。
【０００７】
抗EGFR抗体、好ましくはセツキシマブによる治療に応答する可能性が高いまたは確かに応答する腫瘍患者のサンプルで高い発現を生じる遺伝子または遺伝子生成物は、本発明にしたがえば、ADAMDEC1、BSDC1、C1orf144、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、GOSR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URM1、ZFYVE26、RGMB、SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL、NOSIP、PITX2、POF1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、SOX4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDR1、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38およびSHROOM2から成る遺伝子の群から選択される。
抗EGFR抗体、好ましくはセツキシマブによる治療に応答する可能性が低いまたは応答しない腫瘍患者のサンプルで高い発現を生じる遺伝子または遺伝子生成物は、本発明にしたがえば、C7orf46、CAST、 DCP2、DIP2B、ERAP1、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIP1、PHGDH、PPP1R9A、QPCT、RABEP1、RPA1、RPL22L1、SKP1、SLC25A27、SLC25A46、SOCS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EXOC6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2Kから成る遺伝子の群から選択され、これらの遺伝子発現は、患者が参照値と比較して前記治療に応答しない可能性があることを示す。
【０００８】
本発明の別の実施態様では、平均を超えて発現され、さらに患者がそれぞれの抗EGFR抗体（例えばセツキシマブ）による治療に応答する可能性があるかまたは強力に応答する可能性があることを示す好ましいバイオマーカーは、EPDR1、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、SHROOM2、STK38、RGMB、SPIRE2およびVAV3から成る群、または前記群のそれぞれの遺伝子発現生成物から選択される。
本発明の別の実施態様では、平均を超えて発現され、さらに患者がそれぞれの抗EGFR抗体（例えばセツキシマブ）による治療に応答する可能性がないかまたは強力に応答する可能性がないことを示す好ましいバイオマーカーは、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2Kから成る群、または前記群のそれぞれの遺伝子発現生成物から選択される。
【０００９】
さらに別の実施態様では、抗EGFR抗体に対する患者の陽性応答を予測する本発明の好ましいバイオマーカーはVAV3であり、抗EGFR抗体に対する患者の陰性または無視し得る応答を予測する本発明の好ましいバイオマーカーはTGFaである。
別の実施態様では、それぞれの方法が適用され、この場合、患者が、（臨床平均または標準的応答および／またはそれぞれの平均患者コホートから算出した発現値と比較して）、抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に対しておそらく良好にまたは顕著にまたは強力に応答するであろうということを示す、上記および請求の範囲に指定される少なくとも1つの相当にまたは高度に発現される第一のマーカーが使用され、さらに患者が、（臨床平均または標準的応答および／またはそれぞれの平均患者コホートから算出した発現値と比較して）、抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に対しておそらく良好にまたは顕著にまたは強力に応答しないであろうということを示す、上記および請求の範囲に指定される少なくとも1つの相当にまたは高度に発現される第二のマーカーが使用される。
別の実施態様では、KRAS野生型EGFR発現腫瘍を罹患し、EGFR抗体治療の候補である患者が、前記抗EGFR抗体治療に応答するであろうという可能性を予測するin vitroの方法ために、それぞれの方法が適用され、この場合、上記および下記に指定される1つまたは2つ以上のバイオマーカーの発現レベルが、腫瘍患者の抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に関連して、AREGおよび／またはEREGと一緒に決定される。
【００１０】
好ましくはそれぞれの方法が適用され、この場合、VAV3およびARAGまたはEREGの遺伝子または遺伝子生成物の発現レベルが、腫瘍患者（好ましくはCRCまたはmCRC腫瘍患者）の抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に関連して決定される。
さらに別の具体的な実施態様では、それぞれの方法が適用され、この場合、VAV3およびARAGまたはEREGの遺伝子または遺伝子生成物の発現レベルが、腫瘍患者（好ましくはCRCまたはmCRC腫瘍患者）の抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に関連して決定される。
本発明の別の好ましい実施態様では、それぞれの方法が適用され、この場合、TGFaおよびARAGまたはEREGの遺伝子または遺伝子生成物の発現レベルが、腫瘍患者（好ましくはCRCまたはmCRC腫瘍患者）の抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に関連して決定される。
本発明の別の好ましい実施態様では、それぞれの方法が適用され、この場合、VAV3およびTGFaの遺伝子または遺伝子生成物の発現レベルが、腫瘍患者（好ましくはCRCまたはmCRC腫瘍患者）の抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に関連して決定される。
本発明の別の好ましい実施態様では、それぞれの方法が適用され、この場合、VAV3、TGFaおよびARAGまたはEREGの遺伝子または遺伝子生成物の発現レベルが、腫瘍患者（好ましくはCRCまたはmCRC腫瘍患者）の抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に関連して決定される。
【００１１】
さらに別の特徴では、本発明は、KRAS野生型EGFR発現癌に罹患する患者が抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）治療に治療的に応答する可能性を予測するin vitroの方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：（a）前記患者の腫瘍組織に由来する生検組織サンプルまたは血漿で診断手段および／または診断装置によって、  ADAMDEC1、BSDC1、C1orf144、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、GOSR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URM1、ZFYVE26、RGMB、SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL、NOSIP、PITX2、POF1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、SOX4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDR1、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38、SHROOM2から成る群（i）および／または、C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAP1、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIP1、PHGDH、PPP1R9A、QPCT、RABEP1、RPA1、RPL22L1、SKP1、SLC25A27、SLC25A46、SOCS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、 TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EXOC6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2Kから成る群（ii）から選択される1つまたは2つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；（b）前記患者の腫瘍由来組織サンプルまたは血漿を前記抗EGFR抗体にex vivoで曝露する工程；（c）工程（b）の前記暴露組織サンプルにける工程（a）に指定した1つまたは2つ以上のバイオマーカーの発現レベルを再度測定する工程；および（d）工程（b）および（c）で測定した発現レベルの差異を計算する工程であって、工程（a）と比較して工程（c）で得られた群（i）のバイオマーカーの発現レベルが増加していることは前記患者が前記抗EGFR抗体治療に治療的に応答する可能性が大きいことを示し、工程（a）と比較して工程（c）で得られた群（ii）のバイオマーカーの発現レベルが増加していることは前記患者が前記抗EGFR抗体治療に治療的に応答する可能性が低いことを示す。
【００１２】
別の特徴では、本発明は、上記および下記に開示するそれぞれのin vitroの方法に関し、この場合、患者はKRAS野生型EGFR発現腫瘍に罹患しているだけでなく、さらに別に腫瘍組織のEGFR遺伝子に変異を示す。具体的な実施態様では、この変異は、抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）の投与に付随する皮膚発赤の原因である。この変異は好ましくはEGFRにおけるR521K多形性を引き起こす。
別の特徴では、本発明は、上記および下記に開示するそれぞれのin vitroの方法に関し、この場合、患者はKRAS野生型EGFR発現腫瘍（特にCRC／mCRC）に罹患しているだけでなく、さらにまた腫瘍組織のBRAF遺伝子に変異を示す。
さらに別の特徴では、本発明は、以下の1つまたは2つ以上の遺伝子よって示されるか、または前記とハイブリダイズするポリヌクレオチドの配置物を含むDNAまたはRNAアレイに関し、この場合前記遺伝子または遺伝子生成物は固相表面に固定される：
ADAMDEC1、BSDC1、C1orf144、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、GOSR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URM1、ZFYVE26、RGMB、SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL、NOSIP、 PITX2、POF1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、SOX4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDR1、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38、SHROOM2、C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAP1、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIP1、PHGDH、PPP1R9A、QPCT、RABEP1、RPA1、RPL22L1、SKP1、SLC25A27、SLC25A46、SOCS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EXOC6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLT1B、HSPA5、LEPROTL1、LIMS1、MAPK6、MYO6、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、SOCS5、TERF2IP、TIAL1、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPAおよびUBE2K。
好ましい実施態様では、前記DNAまたはRNAアレイは、以下の遺伝子の1つまたは2つ以上を含むか、または前記遺伝子とハイブリダイズする：TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、IKK相互作用タンパク質をコードする遺伝子、EDEM3、LY6G6D、さらに場合によって付加されるAREGおよび／またはEREGおよび／またはTGFA。
別の好ましい実施態様では、本発明のDNAまたはRNAアレイは、以下の遺伝子によって示されるか、または前記とハイブリダイズする以下のポリヌクレオチドの編成から成っている：
（a）TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、IKK相互作用タンパク質をコードする遺伝子、EDEM3、LY6G6D、AREG、EREGおよびTGFA；または
（b）TNFRSF1B、DNAJC8、VAV3、ARAGまたはEREG、TNFa；または
（c）VAV3；ARAGまたはEREG、TNFa；または
（d）VAV3、TNFa；または
（e）ARAGまたはEREG、TNFa。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】基準サンプルにおける発現が、野生型KRAS遺伝子をもつ患者のセツキシマブ単独療法の6週間後の病状制御と有意に関係する遺伝子（p<0.002、中庸（moderated）t-検定）。臨床試験EMR62202-045（転移性CRCのファーストライン治療）に基づく。
【図１−２】図１−１続き。
【図２】基準サンプルにおける発現が、セツキシマブ単独療法の6週間後の病状制御と有意に関係する遺伝子（p<0.002、中庸t-検定）。臨床試験EMR62202-045（転移性CRCのファーストライン治療）に基づく。
【図３】臨床試験EMR62202-502（イリノテカン難治性転移性CRC患者のセツキシマブ＋イリノテカン治療）、野生型KRAS遺伝子をもつ患者の解析：基準サンプルにおける発現が最良の全応答と有意に関係する遺伝子（p<0.002、ウェルヒ（Welch）t-検定）。
【図４−１】臨床試験EMR62202-502（イリノテカン難治性転移性CRC患者のセツキシマブ＋イリノテカン治療）：基準サンプルにおける発現が最良の全応答と有意に関係する遺伝子（p<0.002、ウェルヒt-検定）。
【図４−２】図４−１続き。
【図５】臨床試験EMR62202-502（イリノテカン難治性転移性CRC患者のセツキシマブ＋イリノテカン治療）、野生型KRAS遺伝子をもつ患者の解析：基準サンプルにおける発現が全生存期間と有意に関係する遺伝子（p<0.002、コックス（Cox）プロポーショナルハザード回帰）。
【図６】臨床試験EMR62202-502（イリノテカン難治性転移性CRC患者のセツキシマブ＋イリノテカン治療）：基準サンプルにおける発現が全生存期間と有意に関係する遺伝子（p<0.002、コックスプロポーショナルハザード回帰）。
【図７】臨床試験EMR62202-502（イリノテカン難治性転移性CRC患者のセツキシマブ＋イリノテカン治療）：基準サンプルにおける発現が進行停止生存期間と有意に関係する遺伝子（p<0.002、コックスプロポーショナルハザード回帰）。
【図８−１】臨床試験EMR62202-502（イリノテカン難治性転移性CRC患者のセツキシマブ＋イリノテカン治療）、野生型KRAS遺伝子をもつ患者の解析：基準サンプルにおける発現が進行停止生存期間と有意に関係する遺伝子（p<0.002、コックスプロポーショナルハザード回帰）。
【図８−２】図８−１続き。
【図９】腫瘍生検サンプルの肝臓組織夾雑の程度を判定するために用いたアフィメトリクス（Affymetrix）プローブセット。
【図１０−１】基準発現データとKRAS野生型腫瘍患者の6週時の病状制御との密接な関係：p<0.002の57プローブセット。ログ比値は、病状制御を示す患者の平均log2 発現レベル−進行性病状を示す患者の平均log2 発現レベルであり、サンプルの肝臓夾雑の程度について調節されている。
【図１０−２】図１０−１続き。
【図１１−１】基準から4週までの発現の治療中変化と最良の全応答との密接な関係を示す47のプローブセット。ログ比値は、部分的応答を示す患者の治療中変化の平均−安定的または進行性病状を示す患者の治療中変化の平均を表し、サンプルの肝臓夾雑の程度について調節されている。
【図１１−２】図１１−１続き。
【図１２】候補遺伝子発現の基準から4週までの治療中変化と最良の全応答との密接な関係を示す47のプローブセット。ログ比値は、部分的応答を示す患者の治療中変化の平均−安定的または進行性病状を示す患者の治療中変化の平均を表し、サンプルの肝臓夾雑の程度について調節されている。
【図１３】候補遺伝子の基準発現とKRAS野生型状況の腫瘍での6週時における病状制御との密接な関係。ログ比値は、病状制御を示す患者の平均log2 発現レベル−進行性病状を示す患者の平均log2 発現レベルであり、サンプルの肝臓夾雑の程度について調節されている。
【図１４−１】ルミネクス血漿プロテオミクスデータの統計的解析の結果。解析は基準サンプルと4週時サンプルとの間の全般的変化、全患者とともにKRAS野生型腫瘍をもつ患者における治療中変化と6週時の応答との密接な関係に言及する。これら解析の各々について、log2 比値、p-値およびq-値が各測定タンパク質について提供される。log2 比値は、4週時サンプルと基準サンプルとの間のlog2 濃度の平均差（一般的な差）または応答者と非応答者との間のこれら平均差間の相違（応答との密接な関係）を意味する。
【図１４−２】図１４−１続き。
【図１４−３】図１４−２続き。
【図１４−４】図１４−３続き。
【図１５】抗体試薬および免疫組織化学アッセイの条件。
【図１６】結腸直腸癌（青色の枠）および正常な肝臓（紫色の枠）でもっぱら発現される遺伝子の発現を基準にした、高い（緑色）、中等度（赤色）および低い（黒色）肝臓夾雑を有するRNAサンプルの識別。カラースケールは、標準化後の絶対的成分シグナル強度を反映する。
【図１７】基準から4週までの発現の治療中変化と最良の全応答（部分的応答対安定的病状＋進行性病状）との密接な関係。P<0.002の47のプローブセットが示されている。遺伝子の名称、続いてエレメントIDが画像の右側に提示されている。エレメントの強度は、基準の遺伝子発現に対する4週の遺伝子発現のlog2 比を表す。略語：PD、進行性病状；SD、安定的病状；PR、部分的応答。
【図１８】候補遺伝子発現の基準から4週までの治療中変化と最良の全応答（部分的応答対安定的病状＋進行性病状）との密接な関係。遺伝子の名称、続いてエレメントIDが画像の右側に提示されている。エレメントの強度は、基準の遺伝子発現に対する4週の遺伝子発現のlog2 比を表す。略語：PD、進行性病状；SD、安定的病状；PR、部分的応答。
【図１９】候補遺伝子の基準発現とKRAS野生型状況の腫瘍の病状制御（部分的応答＋安定的病状対進行性病状）との密接な関係。遺伝子の名称、続いてエレメントIDが画像の右側に提示されている。強度スケールは、全サンプルにおける各プローブセットの平均に対する各エレメントのlog2 比を反映する。略語：PD、進行性病状；SD、安定的病状；PR、部分的応答。
【図２０】セツキシマブ（Erbitux）治療mCRC患者におけるKRAS状況と応答率および進行停止生存との相関性。
【図２１−１】選別EGFRシグナリング経路関連マーカーの皮膚（A）および腫瘍（B）サンプルにおける免疫組織化学解析：週4／基準サンプル対間の変化。
【図２１−２】図２１−１続き。
【図２１−３】図２１−２続き。
【図２１−４】図２１−３続き。
【図２２】KRAS腫瘍の変異状況に一致する、進行停止生存月数に対する進行停止患者の割合。
【図２３】基準遺伝子発現データとKRAS野生型腫瘍患者の6週時の病状制御（部分的応答＋安定的病状対進行性病状）との密接な関係。P<0.002の57のプローブセットが示されている。遺伝子の名称、続いてエレメントIDが画像の右側に提示されている。カラースケールは、全サンプルにおける各プローブセットの平均に対する各エレメントのlog2 比を反映する。略語：PD、進行性病状；SD、安定的病状；PR、部分的応答。
【図２４−１】基準サンプルのAREG（エレメント205239_at）、EREG（エレメント205767_at）およびTGFA（エレメント205016_at）発現レベルであって、前記は全患者（それぞれパネルA、CおよびE）およびKRAS野生型腫瘍患者（それぞれパネルB、DおよびF）の6週時の応答に一致する。P-値は病状制御との密接な関係を意味する（部分的応答、PRおよび安定的病状、SDに対し進行性病状、PD）。
【図２４−２】図２４−１続き。
【図２４−３】図２４−２続き。
【図２５−１】治療目的（intention to treat（ITT））集団の45人の患者（パネルA）および24人のKRAS野生型腫瘍ITT患者（パネルB）における、血漿タンパク質濃度の基準から4週までの治療中変化と6週時の応答（部分的応答（PR）対安定的病状（SD）＋進行性病状（PD））との密接な関係。P<0.01の全てのタンパク質が示されている。エレメントの強度は、基準時のタンパク質濃度に対する4週時のタンパク質濃度のlog2 比を表す。
【図２５−２】図２５−１続き。
【図２６】VAV3と応答との密接な関係を示すボックスプロット。PD：進行性病状、PR：部分的応答、SD：安定的病状。緑色のドット：KRASおよびBRAF野生型腫瘍患者、赤色ドット：KRAS変異患者、黒色ドット：BRAF変異患者、青色ドット：未知の変異状況。p-値はウェルヒt-検定による。
【図２７】VAV3発現によって階層化した概算進行停止生存分布関数を示すカプラン-メイヤープロット。患者は、彼らの基準VAV3発現レベルが患者全体の中央値レベルより上か下かに応じて、高または低VAV3発現者としてそれぞれ分類された。p-値はコックスプロポーショナルハザードモデルから誘導される。
【図２８】VAV3発現によって階層化した概算全生存分布関数を示すカプラン-メイヤープロット。患者は、彼らの基準VAV3発現レベルが患者全体の中央値レベルより上か下かに応じて、高または低VAV3発現者としてそれぞれ分類された。p-値はコックスプロポーショナルハザードモデルから誘導される。
【図２９】VAV3発現およびKRAS変異状況によって階層化した概算進行停止生存分布関数を示すカプラン-メイヤープロット。患者は4つの階層に分類され、KRAS変異状況および基準VAV3発現（中央値より上または下）の全ての可能な組み合わせを表す。
【図３０】Vav3は活性化EGFRと相互作用する。VAV3およびEGFRを単独または組み合わせてHEK293細胞にトランスフェクトした後、細胞を溶解して免疫沈澱（IP）およびウェスタンブロット（WB）に付した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
EGFRを標的とする免疫グロブリン（Ig）G1モノクローナル抗体は、固形癌治療のために承認された最初のモノクローナル抗体であった。
セツキシマブ治療からもっとも顕著に利益を得る患者を識別するために、セツキシマブ応答を予測する利用可能なバイオマーカーに関する徹底的な研究が実施された。免疫組織化学によって判定される腫瘍のEGFR発現は、CRCにおけるEGFR標的治療の有効性について期待に反するバイオマーカーであることが判明した。より有望なデータがKRAS遺伝子の変異に関して報告された（KRAS遺伝子はEGFRシグナリングカスケードのリガンド依存レセプター活性化を細胞内経路につなぐGDP/GTP結合タンパク質をコードする）。
任意抽出C0.17試験（その前の化学療法が不成功に終わったmCRC患者でのセツキシマブ単独療法を吟味する）とともに、多数の臨床試験（転移性CRC（mCRC）のファーストライン治療に関する2つの任意抽出試験EMR62202-047およびEMR62202-013を含む）のKRAS変異状況の過去に遡った解析は、KRASのコドン12/13の変異状況はCRCにおけるセツキシマブの活性を予測することを示した。その腫瘍がKRASについて野生型である患者の亜集団で腫瘍の応答が優先的に認められ、KRASのコドン12/13に変異をもつ患者はセツキシマブ療法から利益を受けない。KRASの変異状況は、したがってCRCにおけるセツキシマブ活性の強力な予測バイオマーカーであるようで、有意な利益を誘導する可能性がない亜集団を治療から除外することを可能にする。
【００１５】
さらにまた、KRAS野生型腫瘍をもつCRC患者の約60%（全てというわけではない）がセツキシマブ治療から確かに利益を受ける。KRAS野生型腫瘍をもつ患者の約40%はセツキシマブ治療に応答せず、これらの患者の相当な部分が疾患の早期の進行を示し、全生存期間は短い。
したがって、KRAS変異状況に加えて、CRC患者のセツキシマブ治療の臨床成果をより良好に予測するために用いることができる更に別のバイオマーカーを同定し使用することが希求される。さらにまた、KRAS変異状況に加えて、CRC治療におけるセツキシマブの有効性のより良好な予測を可能にするバイオマーカーの同定が希求される。
一般的な患者集団およびKRAS野生型腫瘍をもつ患者で、その発現が応答、進行停止生存または全生存と密接に関係する遺伝子を同定するために、新鮮な凍結肝転移生検サンプルのマイクロアレイ解析が2つのセツキシマブCRC試験EMR62202-502およびEMR62202-045で実施された。CRCにおけるセツキシマブ治療の有効性の予測バイオマーカーとして、さらにCRCのセツキシマブ治療から最大の利益を得る患者のより良好な識別のためにこれらの遺伝子の発現を用いることができる。
【００１６】
上記に記載した遺伝子の発現を、CRC患者におけるセツキシマブおよび他の抗EGFR治療抗体の有効性を予測するバイオマーカーとして用い、病院での治療の決定（すなわち患者にセツキシマブまたは他の抗EGFR治療抗体を投与するか否かの決定）を容易にする。日常的臨床作業での適用は以下のとおりである：
１．ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）または新鮮な腫瘍生検サンプル（後者は液体窒素に直接凍結するかまたはRNA-レーター（later）で処理してRNAの完全性を保存する必要がある）からこれらの遺伝子のmRNA発現を解析する。生検サンプルは原発腫瘍または転移から入手できる。mRNA発現の解析は、PCR系方法（例えばリアルタイムPCR、qPCR）によって遺伝子特異的プライマーを用いて問題の遺伝子を増幅するか、または問題の遺伝子のmRNAを遺伝子アレイ上の遺伝子特異的固定ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズさせることによって実施される。
２． FFPEまたは新鮮な腫瘍生検サンプル（後者は液体窒素中に直接凍結するかまたはRNA-レーター（later）で処理してRNAの完全性を保存する必要がある）からこれらの遺伝子のタンパク質発現を解析する。生検サンプルは原発腫瘍または転移から入手できる。タンパク質発現の解析には、例えば免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ルミネックス、ブロッティングおよび膜上のタンパク質の検出、質量分析法のような方法が含まれる。
可溶性タンパク質については、例えばELISA、ルミネックス、質量分析法のような方法論を含む、血漿または血清のタンパク質発現の解析が実施される。
【００１７】
日常的臨床作業のための診断アッセイを確立するために、候補遺伝子またはタンパク質の発現レベルを、同じアッセイ方法を用いて同じ生検サンプルから評価される別の遺伝子およびタンパク質（または遺伝子およびタンパク質の組み合わせ）の発現に対して正規化する必要がある。これらの“正規化”遺伝子またはタンパク質は、患者間の多様性が非常に低いことが判明している細胞性ハウスキーピング遺伝子を含むことができる。或いは、“予後良好”（最終的に我々が用いる用語はいずれでもよい（例えば“感受性”））グループの遺伝子またはタンパク質（または遺伝子またはタンパク質の組み合わせ）の発現レベルと“予後不良”（または例えば“耐性”）グループの遺伝子またはタンパク質（または遺伝子またはタンパク質の組み合わせ）の発現レベルとの比を決定してもよい。後者のアプローチは、抗EGFR療法の有効性に直接結び付く遺伝子またはタンパク質の発現レベルのみを用いるという利点を提供する。このアプローチは広い動的範囲をもたらし、適切なハウスキーピング遺伝子またはタンパク質に左右されない。
【００１８】
診断アッセイを実行する前に、それぞれの抗EGFR療法による患者の治療について肯定の決定の引き金となるために達成されなければならない閾値を規定する必要がある。この閾値は、最良の可能な方法としての抗EGFR治療から利益を受ける患者と利益を受けない患者を弁別する。そのような閾値は、抗EGFR療法で治療された患者の腫瘍サンプルの“トレーニングセット”から誘導されねばならない。続いて、前記閾値は、治療から最大の利益を得る患者を選別するその能力、または利益を受けない患者を除外するその能力を証明するために、十分な数の患者に由来する種々の腫瘍サンプルセットで十分にその有効性を実証しなければならない。
セツキシマブによるCRCの治療に関する2つの別個の臨床試験（EMR62202-502およびEMR62202-045）で、上記および下記に記載した遺伝子の発現は、応答および／または進行停止生存および／または全生存と密接に関係することが判明した。
−EGFR遺伝子の増幅は、抗EGFR療法に対し好ましい成果を予測する可能性がある；
−その後の試験はEGFR遺伝子の増幅の傾向が低いことを見出した；
−方法論／比較能力の問題；
−K-Ras変異はEGFR遺伝子増幅を示す患者で利益を“覆す”；
−皮膚発赤は、これまでのところErbitux活性（mCRC、NSCLC）についての最良の予測バイオマーカーである；
−ErbituxのPhIII試験FLEX：皮膚発赤の早期開始（最初の21日）は長期の全生存（OS）と密接に関係する；
−BRAF変異は5%の患者で見出される；
−BRAFおよびKRAS変異は互いに排他的である；
−BRAFはErbituxの有効性のための予測マーカーではなく予後不良マーカーのようである；
−mCRCにおけるAREGおよびEREG発現はKRAS変異状況とは無関係である；
−AREGおよびEREG発現状況とKRAS変異状況の組み合わせによりさらに予測能力が追加される。
【００１９】
本発明の実験にしたがえば、セツキシマブ治療は、基底ケラチノサイトにおけるp-EGFR、p-MARKおよび増殖の実質的なダウンレギュレーション並びにp27Kip1およびp-STAT3レベルの実質的なアップレギュレーションと密接に関係した。これらの作用で顕著な相違は異なる投与スケジュールおよび投与レベルについて認められなかった。セツキシマブ単独療法相で、応答は、その腫瘍がKRAS野生型である患者のみで達成された（8/29対0/19（KRAS変異腫瘍について）；P=0.015）。進行停止生存は、KRAS変異腫瘍と比較してKRAS野生型患者でより長期であった（ログランク、P=0.048）。ゲノミクス／プロテオミクス解析によって応答と密接に関係する候補マーカーが同定された。
セツキシマブ単独療法のフェースI用量増加トライアルで実施したこの解釈試験は、ファーストラインセッティングにおいてセツキシマブ応答性mCRCを予測する治療前バイオマーカーを同定するために、ファーマコゲノミクスおよびファーマコプロテオミクス解析を利用する、我々の知るところでは最初の試みを構成する。
前記臨床試験（別のところで報告される）は、mCRC患者へのファーストライン療法として400−700mg/m2の用量で2週間毎にセツキシマブを安全に投与できることを示した。最高投与用量でもMTDに至らず、種々の用量レベルにおいて副作用の発生率および重篤度またはセツキシマブの活性に顕著な相違は存在しなかった。標的の影響の測定に皮膚を用いたとき、バイオマーカーの薬理学的消長を評価するIHCデータは、全用量増加グループにわたってEGFR経路内のシグナリングタンパク質の一貫した阻害を示した。これらのデータは1週間毎および2週間毎の投与スケジュールの機能的等価性を支持する生物学的な論理根拠を提供する。
【００２０】
シングルアームおよび任意抽出mCRC試験の遡及的解析によって、KRAS腫瘍におけるコドン12および13の変異状況はセツキシマブ活性の強力な予測因子であり、治療有益性は野生型状況と厳密に結びついていることが確認された4,7-13。この試験は、mCRC患者のファーストライン治療におけるセツキシマブ単独療法に対するKRAS変異状況への影響を初めて示した。単独薬剤または化学療法との併用としてセツキシマブで治療された以前の一連の化学療法難治性患者から得られたデータと合致して8,11,13、単独療法における目標の応答は、KRAS野生型腫瘍の患者でのみ観察され（29人の患者のうち8人、28%）、当該遺伝子に変異を有する腫瘍をもつ患者では応答は観察されなかった（19人のうち0人）（P=0.015）。KRAS野生型腫瘍をもつ患者（55%）およびKRAS変異腫瘍をもつ患者（32%）における最高の全応答率（FOLFIRI添加後の応答を含む）は、CRYSTALおよびOPUS試験で得られた結果と比肩し得る（後者の試験ではセツキシマブはファーストライン療法としてそれぞれFOLFIRIおよびFOLFOXと併用された4,12）。この試験でファーストライン治療として化学療法と一緒にセツキシマブを投与されたKRAS変異腫瘍をもつ患者で観察された応答は、化学療法の作用にほぼ帰することができる。全PFSは、その腫瘍がKRAS野生型の患者で顕著に延長され、セツキシマブ治療に関する予測バイオマーカーとしてのKRAS腫瘍の変異状況の臨床的重要性が示された。
KRAS野生型腫瘍患者の一部分はセツキシマブ治療から利益を受けないように思われる。したがって、セツキシマブに応答する患者に対する治療のより正確な調節を促進するさらに別の予測バイオマーカーを同定することが可能である。最近、PTEN脱レギュレーション19-21と同様にBRAF18およびP13K19,20変異のマイナスの予測値が予備的に記載された。セツキシマブの臨床活性との仮説的関係が示された他の分子マーカーには、VEGF、IL8、EGFRおよびPTGS2(COX2)の腫瘍発現レベル22；治療中のVEGFの循環レベル23；PTGS2およびEGFRの構成的多形性24；およびTP53腫瘍変異状況25が含まれる。
【００２１】
一連の抗ガン剤にとって、高処理能力のゲノミクス技術は予測バイオマーカー検索でますます利用が増えている26-29。セツキシマブの場合には、EGFRリガンドのAREG（アンフィレグリン）およびEREG（エピレグリン）をコードする遺伝子の腫瘍における高レベル発現はmCRC患者の臨床活性と密接に関係することが、マイクロアレイ10,30（未選別集団およびKRAS野生型腫瘍をもつ集団）および定量的逆転写PCR31（セツキシマブ＋イリノテカンを投与された患者）アプローチによって示された。同様に、このファーストライン治療の試験で、AREGおよびEREG発現は、全集団およびKRAS野生型腫瘍の亜集団の両集団において疾患が進行していない患者の腫瘍で上昇するようである。対照的に、TGFa（TGF-αをコードする）は、疾患が進行していない患者で発現レベルの低下を示した。KRAS野生型腫瘍の包括的遺伝子発現解析によって、6週時の病状制御と仮説的に密接な関係を有する57遺伝子が同定された（P＜0.002）。これらの候補の中で、6つの遺伝子（TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、GOSR2、PPP1R9AおよびKLK6）は偽発見率が0.1未満であることが見出された。KRAS野生型mCRCにおけるセツキシマブ有効性の予測を改善するこれら仮説的バイオマーカーの価値をさらに探究する必要がある。
【００２２】
血漿タンパク質のルミネックス解析は、セツキシマブ単独療法による治療の間にアンフィレグリンおよびTGF-αのレベルが大きく増加することを示した（この傾向はEGFについてもまた観察された）。これらEGFRリガンドのアップレギュレーションはEGFR阻害に対する代償性反応であるかもしれない。興味深いことに、アンフィレグリンレベルの増加は、セツキシマブ治療に応答する患者で有意に低かった。胎児性癌抗原および癌抗原125および19-9の有意な低下が、応答者のセツキシマブ単独療法下で観察された。注目に値すべきことにはまた、IL-8の低下は、KRAS野生型腫瘍の場合と同様に、全ての腫瘍において応答と有意に密接な関係を示した。IL-8は、腫瘍細胞の増殖および生存を促進し、さらに腫瘍の微小環境に重要な影響を与える前炎症性サイトカインである32。IL-8は、セツキシマブ有効性の予測バイオマーカーであるように思われる。
さらにまた本発明にしたがえば、EGFRおよびVAV3の直接的相互作用が、EGFRおよびVAV3がHEK293細胞で発現されるときに検出できた。このことは、EGFRシグナリングにおけるVAV3の直接的および顕著な役割、並びに観察される高VAV3発現レベルと抗EGFRセツキシマブ療法の活性の調節との間の直接的連関を示している。
本発明は、ファーストラインセッティングにおける単独薬剤としての抗EGFR抗体（好ましくはセツキシマブ）による治療（2週間毎および1週間毎の投与）が、KRAS野生型腫瘍を有するmCRC患者に利益を与えることを初めて示す。さらにまた、この初期相における試験の包括的遺伝子発現解析によって、ある種の遺伝子の発現およびセツキシマブの臨床活性に関して多数の興味深い結果が得られた。これらの観察は、種々の方法論を用いてより大きな患者群で有効性の立証を可能にする。これらの試験の結果は、種々の癌（特にCRCまたはmCRC）に罹患する患者でのセツキシマブまたは同様な活性を有する抗EGFR抗体による治療を最適化するための論理的基礎を提供する。
【００２３】
EGFR経路の構成要素の免疫組織化学的解析
評価マーカーの薬理学的消長における変化を解析するための、評価可能な基準／4週の皮膚生検サンプル対が35人の患者から利用可能であった。p-EGFR、p-MAPKおよび増殖（Ki67染色により判定）の実質的ダウンレギュレーションが、基準サンプルと比較して4週サンプルで観察された。並行して、p27Kip1およびp-STAT3の実質的なアップレギュレーションが観察された。種々の投与スケジュールおよび用量レベルの解析で、患者群の間でこれらマーカーレベルの変化に関係する相関的相違は、基準対治療中時点について存在しなかった（図21A）。
評価可能な基準／4週の腫瘍生検サンプル対が17人の患者から利用可能であった。増殖の低下およびp-EGFRおよびp-MAPKの顕著なダウンレギュレーションが治療後腫瘍細胞で観察された（図21B）。しかしながら、p27Kip1、p-STAT3およびp-AKTレベルはセツキシマブ治療によって顕著には改変されなかった（データは示されていない）。利用可能な腫瘍生検サンプル対の数が少なかったので、用量グループおよび応答変数に関するバイオマーカーレベルの変化を比較することはできなかった。
【００２４】
KRAS変異解析
KRASコドン12または13の変異が19/48（40%）の患者サンプルで検出された（G12V（9人の患者）、G13D（5人の患者）、G12D（4人の患者）、G12A（1人の患者））。セツキシマブ単独療法相で、48人の患者の中で8人の部分的応答（PR）があった。いずれも、その腫瘍がKRASについて野生型の患者であった（8/29；28%）。その腫瘍がKRAS変異を有する19人の患者では応答は報告されなかった（P=0.015）（表1）。試験全体（単独療法および併用療法相）では、応答は、KRAS野生型患者の16/29（55%）およびKRAS変異腫瘍患者の6/19（32%）で観察された（P=0.144）。PFSは、その腫瘍が変異を有する患者と比較して、その腫瘍がKRAS野生型である患者で有意に延長された（図22；中央値9.4対5.6カ月、ハザード比0.47；ログランクP=0.048）。
【００２５】
遺伝子発現のマイクロアレイ解析
基準および4週時点に由来する合計106の腫瘍サンプルをアフィメトリクスジーンチップ（Affymetrix GeneChip）HG-U133 Plus2.0アレイとハイブリダイズさせた。一般的品質管理パラメータを基準にして4アレイを更なる解析から除外し、24サンプルを正常な肝臓組織の夾雑を理由に除外して（図16：追加材料）、それ以上解析しなかった。デュープリケートを除外した後、42人のITT患者由来の62アレイデータセット（基準36、4週26；20対）を解析に残した。
解析を実施する腫瘍サンプルのために、54,675プローブセットから得られたデータを多様性、シグナル強度およびプローブセット注釈を基準にプレフィルター処理した（追加方法参照）。このプロセスは、この腫瘍発現解析を15,230プローブセット（10,538遺伝子を表す）に制限する。応答に一致するプレフィルター処理基準データの包括的な比較では：6週時の進行性病状（PD；n=12）対病状制御（n=23、1人の患者は評価不能）および最良全応答については：PDおよび安定的病状（SD）（n=19）対PR（n=14；3人の患者は評価不能）、P値の分布（データは示されていない）は本質的には偶然によって予想されるとおりであり、応答を予想する遺伝子発現プロファイルは包括的集団については識別できないことを示唆している。しかしながら、KRAS野生型腫瘍の解析に限定したとき（PDの8人の患者対病状制御の11人の患者）、6週時の病状制御と仮説的に密接な関係を有する発現パターンをもつ57プローブセットが同定された（p<0.002；図23）。偽発見率（FDR）閾値に0.1をあてがい（FDRの定義については追加方法のセクションを参照されたい）、6遺伝子が病状制御と有意に関係することが見出された（TNFRSF1B、P=6.90E-07；DNAJC8、P=1.60E-06；ECSIT、P=6.80E-06；GOSR2、P=3.90E-05（前記は病状制御を示す患者でより高い発現を示す）並びにPPP1R9A、P=8.90E-07およびKLK6、P=3.00E-05（前記はPDを示す患者でより高い発現を示す）。
応答と密接な関係を示す治療中変化を、基準時および4週時のサンプルが利用可能な患者のデータを用いて精査した。PD（n=8）と比較して、6週時の病状制御と厳密な関係を有するように思われる発現変化は識別できなかった。化学療法との併用を考慮したとき、PR（n=7）対SD/PD（n=13）のプロファイルの比較によって、治療中変化で相違を示す47プローブセットが明らかになった（p<0.002、中庸t-検定、図17参照）。
KRAS野生型腫瘍患者では（分析した患者の完全セットと同様に）、基準EREG（エピレグリン）およびAREG（アンフィレグリン）発現レベルはセツキシマブに応答する腫瘍の場合よりも高かった（図24；図18）。これらの発見はKhambata-Fordら10が報告した結果と一致する。TGFA（TGFA-α）は反比例の発現パターンを示す（図24；図18）。とりわけEGFRシグナリングに直接または間接的に関与することが判明している遺伝子、例えばFRBBレセプター並びにリガンドERBB3（HER3）およびERBB2（HER2）は、最良の全応答としてPRを示す腫瘍でより強いダウンレギュレーションの傾向を示した（図19）。
【００２６】
血漿プロテオミクス
ルミネックス技術を用いて、血漿中の97の異なるタンパク質の濃度を解析した。前記タンパク質群は、EGFRリガンド、他の増殖因子、インターロイキンおよび多様な他の候補タンパク質を含んでいた。セツキシマブ単独療法相中、基準と4週時との間におけるインターロイキン(IL)-8、マクロファージ炎症タンパク質(MIP)-αとともに、腫瘍マーカー胎児性癌抗原、癌抗原125および19-9の血漿レベルの低下は、6週時における応答と有意な関係を示した（p<0.01）（図25A）。アンフィレグリンの血漿濃度における全般的な高い増加は、セツキシマブ単独療法に対する部分的応答を示す患者で弱かった（p<0.01）（図25）。6週時における応答との密接な関係はまた、解析をKRAS野生型腫瘍患者に限定したとき、胎児性癌抗原、癌抗原19-9、IL-8およびアンフィレグリンについても見出された（24患者のデータ、図25B）。さらにまた、TGF-αおよびEGFレベルの一般的増加（応答とは別個）および可溶性EGFRの低下が、セツキシマブ単独療法治療の最初の4週間に血漿で観察された。
精査した遺伝子およびセツキシマブ投与転移性結腸直腸癌（mCRC）患者における発現レベルと治療の成功との間で密接な関係を示す候補の中で、VAV3が特に興味深かった。EMR62202-502臨床試験では、高い腫瘍性VAV3mRNA発現レベルは、イリノテカン併用セツキシマブに対するより良好な応答と極めて密接な関係を有するだけでなく（図26）、進行停止生存（PFS）（図27）および全生存（OS）（図28）ともまた極めて密接な関係を示した。さらにまた、高い腫瘍性VAV3発現レベルは、特にKRAS野生型腫瘍患者で応答およびPFS延長と密接に関係することが見出された（図1および図29参照）。したがって、VAV3発現は、KRAS野生型腫瘍患者のセツキシマブ療法の臨床成果を予測する良好なバイオマーカー候補のようであり、このことは、セツキシマブ療法から最も利益を受ける患者の選別の更なる最適化に役立つであろう。
興味深いことに、EGFRとVAV3がHEK293細胞で発現されるとき、EGFRとVAV3との直接的相互作用を検出できた（図30）。このことは、EGFRシグナリングにおけるVAV3に対する直接的役割、およびVAV3発現レベルと抗EGFR療法の活性の調節との間の直接的な結びつきを示唆する。
【実施例】
【００２７】
臨床試験：
EMR62202-502：この任意抽出試験では、イリノテカンを含む治療法が不成功であった、EGFR発現mCRCを有する患者（pts）におけるセツキシマブ用量増加を精査した。イリノテカン（180mg/m2を2週間毎）とともにセツキシマブ（初回用量400mg/m2続いて250mg/m2/週（W））を開始してから22日後に、患者がグレード（G）1を超える皮膚反応、G2を超える他の任意のセツキシマブ関連副作用を示さず、さらにイリノテカンに対して耐性を示した場合に、Ptsを任意抽出した。任意抽出は、標準的セツキシマブ用量（アームA；250mg/m2/W）または用量増加（アームB；毒性がG2を超えるまで、腫瘍応答または用量＝500mg/m2に達するまで、セツキシマブ用量を2週間毎に50mg/m2ずつ増加させる）に対して実施した。任意抽出を実施しなかったPtsには標準的セツキシマブ用量を維持した。第一の目標は、治療前および治療中に採取した皮膚および腫瘍生検サンプルで、EGFRおよび下流のシグナリングマーカーに対する用量増加の影響を標準的セツキシマブ治療スケジュールのそれと比較することであった。第二の目標は、腫瘍生検サンプルおよび血漿サンプルでのPK、有効性、安全性、耐性、バイオマーカー解析であった。KRAS変異状況は腫瘍生検サンプルから解析した。
EMR62202-045：この試験では、転移性結腸直腸癌患者での2週間毎のセツキシマブ投与における安全性および薬理学的動態を調査した。第二の目的は、バイオマーカーの薬理学的動態の解析を含んでいた。患者は、セツキシマブの単独療法を6週間、続いてセツキシマブ＋FOLFIRIの投与を症状進行まで施された。コントロールアームの患者は、初回用量として400mg/m2、続いて250mg/m2/Wを投与され、用量増加アームの患者は、400−700mg/m2を2週間毎に投与された。KRAS変異状況は腫瘍生検サンプルから解析した。
遺伝子発現（マイクロアレイ）解析のための腫瘍材料：
EMR62202-502：腫瘍材料は、切開手術、内視鏡法、コア採取/細針による生検サンプルによって、基準時（治療前）に、22日目に、さらに可能な場合には用量増加アーム（アームB）の患者の病状進行時に採取した。サンプルは液体窒素で瞬間凍結させた。
EMR62202-045：腫瘍材料は、切開手術、内視鏡法、コア採取/細針による生検サンプルによって、基準時に、4週時に、さらに可能な場合には病状進行時に採取した。サンプルは液体窒素で瞬間凍結させた。
【００２８】
RNA発現プロファイリング
マイクロアレイ解析に関連する実験手順は追加方法のセクションで詳述される。簡単に記せば、瞬間凍結腫瘍生検サンプルをホモゲナイズし、RNeasy Micro Kit(商標)（Qiagen, Hilden）を用いて全RNAを抽出した。アレイハイブリダイゼーション実験用ビオチニル化標的cRNAは、アフィメトリクス2サイクル真核細胞標的標識プロトコルにしたがって全サンプルから調製した。解析する各腫瘍について、このcRNA増幅/標識プロセスの最初のcDNA合成反応には全RNAの50ngを最初に加えた。標識cRNAを続いてアフィメトリックスジーンチップHG-U133Plus2.0遺伝子発現アレイと16時間45℃で60rpmにてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイをアフィメトリクスフリューディクス（Affymetrix Fluidics）ステーション450上で染色し、シグナルはジーンチップスキャナーを用いて定量した。品質管理および未加工発現データの前処理は、専売アフィメトリクスGCOSソフトおよびバイオコンダクター（Bioconductor）パッケージ、affyPLMを用いて実施した。
EMR62202-502：結局、全品質管理チェックおよび前処理工程が実施され、治療目的（ITT）集団の47人の対象者に由来する合計68のアレイデータセットが更なる解析のために適格であった。35人の対象者由来の基準サンプルが利用可能であった。
EMR62202-045：結局、全品質管理チェックおよび前処理工程が実施され、42人のITT患者に由来する合計62のアレイデータセットが更なる解析のために適格であった。36人の対象者由来の基準サンプルが利用可能であった。
統計解析は、2つの試験の少なくとも1つで多様性およびシグナル強度を基準にした初期フィルターをパスした、信頼できる遺伝子注釈を有する全てのアフィメトリクスプローブセットについて実施した（16414アフィメトリクスプローブセットは10785の遺伝子を表す）。
その発現が臨床応答と密接に関係する遺伝子が、応答者と非応答者との間で（EMR62202-502）またはセツキシマブ単独療法6週間後の病状制御患者と進行性病状患者との間で（EMR62202-045）ウェルヒt-検定比較によりそれぞれ同定された。その発現が、進行停止生存または全生存と密接に関係する遺伝子が、コックスプロポーショナルハザード回帰を用いて同定された（EMR62202-502）。これらの解析は、完全な患者セットとともにKRAS野生型腫瘍患者だけについても実施された。
両臨床試験にまたがる応答関連遺伝子を同定するためのメタ解析を、検定統計量としてシングルスタディ・ワンサイドp-値の結果を用い、さらにこれら結果のゼロ分布からp-値を誘導して実施した。
0.01未満から0.0001の範囲のp-値、特に0.01未満、好ましくは0.005、より好ましくは0.002、もっとも好ましくは0.0005または0.0001のp-値（臨床応答との密接な関係についてのメタ解析から、および進行停止および全生存との密接な関係についてのEMR62202-502の解析から）は統計的に有意と考えられる。この基準は、前記比較の少なくとも1つで179の既知遺伝子を表す200のアフィメトリクスプローブセットについて充足された。
【００２９】
患者の適格性および試験の設計
適格性の基準および試験の設計は別の文書で詳細に報告した。簡単に記せば、試験は以下のように2つの部分に分割した：6週間継続するセツキシマブ単独療法相および併用療法相（この間、患者は、単独療法相の場合と同じ用量／スケジュールのセツキシマブおよびイリノテカン系スケジュールのFOLFIRIを投与された）。患者は、標準的な1週間毎のスケジュールおよび用量のセツキシマブ（400mg/m2、続いて1週間毎に250mg/m2の用量）、または400から700mg/m2の種々のコホートによる2週間毎のスケジュールに基づくセツキシマブ用量増加治療のどちらかに連続的に割り当てられた。臨床応答は、セツキシマブ単独療法の6週間後に最良の全応答として報告された（単独療法および併用療法相）。
【００３０】
患者材料の収集および保存
皮膚生検サンプルは基準時および26−28日目（4週時）入手した。皮膚発赤がある場合、サンプルは発赤の無い領域から採取した。生検サンプルは、直ちにその体積の20倍以上の4℃の中性緩衝ホルムアルデヒド溶液に浸漬し、8−16時間室温で保持した。固定標本はエタノール連続希釈液を用いてキシレンまで脱水し、真空下で60℃にてパラフィンワックスに縦向きに包埋した。腫瘍材料は、切開手術、内視鏡法、またはコア採取/細針による生検によって、基準時に、4週時に、さらに可能な場合には病状進行時に採取した。1時点につき1サンプルを以前13aに記載したようにホルマリン固定およびパラフィン包埋し、さらに3サンプルを液体窒素で瞬間凍結した。正常DNAを提供するために、10mLの全血を各患者から基準時に入手し、-20℃以下で使用まで保存した。ルミネクス解析のために基準時および4週時に血漿（2.5mL）を収集し、-80℃で保存した。
【００３１】
免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織の免疫組織化学的（IHC）解析を用いて、以下のタンパク質の発現を精査した：EGFR、ホスホ(p)-EGFR、p-MAPK、Ki67（MIB1）、p27Kip1（CDKN1B）およびp-STA3（皮膚および腫瘍生検）；HER2、p-HER2およびp-AKT（腫瘍生検）。免疫組織化学的解析は以前13aに記載したように実施した。使用した抗体および方法の詳細は追加の方法のセクションで提供されている。
【００３２】
KRAS変異解析
FFPE患者由来アーカイブ腫瘍組織は治療目的（ITT）集団に由来する48人の患者から入手可能であった。DNAを抽出し、以前12に記載されたように、Chenら（200414）から応用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クランピングおよびメルティングカーブ技術を用いて、KRASコドン12および13変異の存在についてスクリーニングした（LightMix, k-ras Gly12, TIB MOLBIOL, Berlin, Germany）。
【００３３】
RNA発現プロファイル作成
マイクロアレイ解析に関連する実験手順は追加の方法のセクションに詳述されている。簡単に記せば、瞬間凍結腫瘍生検サンプルを均質化し、RNeasy Micro Kit(商標)（Qiagen, Hilden）を用いて全RNAを抽出した。アレイハイブリダイゼーション実験用ビオチニル化標的cRNAは、アフィメトリクス2サイクル真核細胞標的標識プロトコルにしたがって全サンプルから調製した。解析する各腫瘍について、このcRNA増幅/標識プロセスの最初のcDNA合成反応には全RNAの50ngを最初に加えた。標識cRNAを続いてアフィメトリックスジーンチップHG-U133Plus2.0遺伝子発現アレイと16時間45℃で60rpmにてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイをアフィメトリクスフリューディクスステーション450上で染色し、シグナルはジーンチップスキャナーを用いて定量した。生の発現データの品質管理は専売アフィメトリクスGCOSソフトおよびバイオコンダクターパッケージ、affyPLMを用いて実施した15。個々のサンプルから複製アレイが入手可能な場合は、品質管理評価がもっともよいデータセットを解析のために選択した。プローブレベル強度の生データの前処理はGCRMAアルゴリズム16を用いて実施した。
【００３４】
プロテオミクス解析
血漿由来の97タンパク質（HumanMAPバージョン1.6プラスアンフィレグリン、ベータセルリン、EGFR、ヘパリン結合(HB)-EGF、エピレグリン、インターロイキン-18、形質転換増殖因子(TGF)-α、およびスロンボスポンジン-1）の多重解析をルミネクスxMAP(商標)の技術プラットフォームを用いて、（追加方法のセクションに記載したように）Rules-Based Medicine（Austin, Texas, US）にて実施した。ベータセルリンおよびHB-EGFは、この試験に後の方で登録された患者由来の23サンプルでのみ評価された。
【００３５】
統計解析
応答率および進行停止生存（PFS）（セツキシマブの最初の輸液からセツキシマブとFOLFIRIとの併用下で放射線学的に確認された最初の病状進行までの期間と定義される）が、その腫瘍が野生型またはKRASに関して変異体である患者について、フィッシャーの正確確率検定およびログランク検定を用いてそれぞれ比較された。
IHC、マイクロアレイおよびプロテオミクスに関するデータ（追加の方法を参照されたい）の統計的解析はいずれもバイオコンダクターソフトウェア15およびSASバージョン9.1を用いて実施した。仮説を打ち立てるものとしてこれらの実地調査的解析を吟味した。
【００３６】
参考文献（関連文献および／または本明細書使用文献）
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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