(57)【要約】  膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成する自己集合したホモドデカマーとして、脂質膜に安定に組み込み可能にするための、二本鎖ＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタポリペプチドの新規修飾を利用する組成物及び方法を開示する。前記開孔部により、ｄｓＤＮＡのシークエンシング、ＳＮＰ検出、並びにアナライトの高感度親和性捕捉及びフィンガープリンティングのためのバイオセンサとして前記修飾タンパク質を使用することができ、また、例えば、治療用ナノ粒子（例えば、遺伝子送達）及びバイオリアクタを形成するためのリポソーム充填、並びに他の用途のために、電位駆動性溶質移動にも利用される。【選択図】図９Ａ
2012507565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝導性チャネル含有膜であって、
（ａ）膜層と、
（ｂ）前記膜層に組み込まれて、前記伝導性チャネル含有膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成する単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質と、
を含むことを特徴とする伝導性チャネル含有膜。
【請求項２】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、人工物である請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項３】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが、各々、
（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、
（ｂ）
（ｉ）４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個の隣接する非荷電アミノ酸のポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のアミノ末端及びカルボキシ末端のうちの少なくとも１つに融合している少なくとも１つの可撓性ドメイン、並びに
（ｉｉ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメイン
のいずれか又は両方と、
を含む請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項４】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが、各々、
（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、
（ｂ）
（ｉ）４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、又は１４個の隣接する非荷電アミノ酸のポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のアミノ末端及びカルボキシ末端のうちの少なくとも１つに融合している少なくとも１つの可撓性ドメイン、並びに
（ｉｉ）式Ｘ１ａ−Ｘ１ａ−Ｘ２ａ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ３−Ｘ２ｂ（式中、各Ｘ１ａは、独立して、任意の非荷電アミノ酸であるか又はアミノ酸は存在せず、各Ｘ１ｂは、独立して、任意の非荷電アミノ酸であり、Ｘ２ａは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸であり、Ｘ３は、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選択される負荷電アミノ酸であり、Ｘ２ｂは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸である）のポリペプチドを含み、且つ前記可撓性ドメインに融合している少なくとも１つの親和性／アラインメントドメイン
のいずれか又は両方と、
を含む請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項５】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが、各々、
（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、
（ｂ）
（ｉ）配列番号２３に記載の配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のカルボキシ末端に融合している少なくとも１つの可撓性ドメイン、並びに
（ｉｉ）前記可撓性ドメインに融合している少なくとも１つの親和性／アラインメントドメイン
のいずれか又は両方と、
を含む請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項６】
親和性／アラインメントドメインが、
（ｉ）配列番号２２［ＷＳＨＰＱＲＦＥＫ］に記載のＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、
（ｉｉ）３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するヒスチジン残基であるポリヒスチジンポリペプチドタグ、
（ｉｉｉ）３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するアルギニン残基であるポリアルギニンポリペプチド、
（ｉｖ）配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ［配列番号３９］で表されるＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド、
（ｖ）配列ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］で表されるペプチドタグ、
からなる群より選択されるポリペプチドを含む請求項３又は５に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項７】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが各々、
（ｉ）配列番号４１に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｋ２３４Ａ、
（ｉｉ）配列番号４２に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｋ２３４Ｃ、
（ｉｉｉ）配列番号４３に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／７６Ｓ／Ｃ２６５Ｓ／Ｋ２３４Ｃ、
（ｉｖ）配列番号４４に記載のΔ１−１４／ｇｐ１０−Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ、及び
（ｖ）配列番号４５に記載のＧｐ１０／Δ２８５−３０９−Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ、
からなる群より選択される請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項８】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが、（ｉ）配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉ）配列番号７［アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１［アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３］のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するファージラムダＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｖ）配列番号１２［アクセッション番号Ｐ５４３０９］に記載のアミノ酸配列を有するファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖ）配列番号１３［アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉ）配列番号１４［アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉ）ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉｉ）配列番号１５［アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｘ）配列番号１６〜１９（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０、ＡＡＳ７７１９１、ＡＡＵ０５２８７）に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、及び（Ｘ）配列番号２０［アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分からなる群より選択されるポリペプチドを各々含む請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項９】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、二本鎖ＤＮＡバクテリオファージＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質の全て又は膜貫通開孔部形成部分を含むポリペプチドを各々含むウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１０】
ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドが、（ｉ）配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉ）配列番号７［アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１［アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３］のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するファージラムダＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｖ）配列番号１２［アクセッション番号Ｐ５４３０９］に記載のアミノ酸配列を有するファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖ）配列番号１３［アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉ）配列番号１４［アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉ）ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉｉ）配列番号１５［アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｘ）配列番号１６〜１９（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０、ＡＡＳ７７１９１、ＡＡＵ０５２８７）に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、及び（ｘ）配列番号２０［アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部からなる群より選択される請求項３、４、又は５に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１１】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分を含むポリペプチドを各々含むウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１２】
ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドが、配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分を含む請求項３、４、又は５に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１３】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、検出可能な標識を含む請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１４】
検出可能な標識が、比色指示薬、ＧＣＭＳタグ化合物、蛍光指示薬、発光指示薬、リン光指示薬、放射測定指示薬、色素、酵素、酵素の基質、エネルギー転移分子、量子ドット、金属粒子、及び親和性標識からなる群より選択される請求項１３に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１５】
親和性標識が、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、アプタマー、抗体、レクチン、オリゴ糖、核酸、酵素、金属イオン結合ポリペプチド、配列番号２２［ＷＳＨＰＱＲＦＥＫ］に記載のＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するヒスチジン残基であるポリヒスチジンポリペプチドタグ、配列番号＿に記載のＳｔｒｅｐ−Ｉタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドタグ、Ｍｙｃペプチドタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、黄色ブドウ球菌プロテインＡ、プロテインＧ、ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド［配列番号３９］、アミノ酸配列ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］を有するペプチド、グルタレドキシン−２、及び親和性リガンドに特異的に結合するファージディスプレイされたペプチドからなる群より選択される請求項１４に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１６】
抗体が、インタクトな免疫グロブリン、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ）’２からなる群より選択される請求項１５に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１７】
膜層が、脂質層を含む請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１８】
脂質層が、両親媒性脂質を含む請求項１７に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項１９】
両親媒性脂質が、リン脂質を含み、脂質層が、脂質二重層を含む請求項１８に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項２０】
脂質層が、平面膜層及びリポソームからなる群より選択される請求項１７に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項２１】
リポソームが、多重膜リポソーム及び単層リポソームからなる群より選択される請求項２０に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項２２】
組み込まれているウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜層中において可動性である請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項２３】
電位が印加されたとき、開孔部を通って二本鎖ＤＮＡを移動させることができる請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項２４】
電位が印加されたとき、電圧依存的に開閉することなしに（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｏｌｔｇｅ  ｇａｔｉｎｇ）コンダクタンスが生じる請求項１に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項２５】
（ａ）両親媒性脂質及び有機溶媒を含む第１の溶液と固体基材とを接触させ、前記溶媒を実質的に除去することにより、前記固体基材上において乾燥両親媒性脂質を調製する工程と、
（ｂ）前記コネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成するのに十分な条件下及び時間で、水性溶媒、浸透圧剤、及びホモドデカマーであるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に自己集合可能な複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットポリペプチドを含む第２の溶液に、前記乾燥両親媒性脂質を再懸濁させて、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれている脂質二重層を含む膜を得て、伝導性チャネル含有膜を作製する工程と、
を含むことを特徴とする伝導性チャネル含有膜の製造方法。
【請求項２６】
（ａ）両親媒性脂質と少なくとも１つの溶媒とを含む混合物から溶媒を実質的に除去して、乾燥両親媒性脂質を得る工程と、
（ｂ）前記コネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成するのに十分な条件下及び時間で、水性溶媒、浸透圧剤、及びホモドデカマーであるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に自己集合可能な複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットポリペプチドを含む第２の溶液に、前記乾燥両親媒性脂質を再懸濁させて、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれている脂質二重層を含む膜を得て、伝導性チャネル含有膜を作製する工程と、
を含むことを特徴とする伝導性チャネル含有膜の製造方法。
【請求項２７】
両親媒性脂質が、リン脂質を含む請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎグリセロール−３−ホスホコリン、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンからなる群より選択される１以上のリン脂質を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
有機溶媒が、クロロホルム、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、、イソブタノール、ピリジン、及びジイソプロピルエーテルからなる群より選択される少なくとも１つの溶媒を含む請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３０】
浸透圧剤が、スクロース、グリセロール、マンニトール、及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１つの剤を含む請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットが、請求項３から１３のいずれかに記載のポリペプチドを含む請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３２】
脂質二重層が、リポソーム中に存在する請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３３】
リポソームが、多重膜リポソーム及び単層リポソームからなる群より選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
組み込まれているウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜層中において可動性である請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３５】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜に電位を印加したとき開孔部を通して二本鎖ＤＮＡを移動可能である請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３６】
電位を印加したとき電圧依存的に開閉することなしに伝導性チャネル含有膜においてコンダクタンスが生じる請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３７】
印加される電位が、（ｉ）−１００ｍＶ〜１００ｍＶの電位、（ｉｉ）−４００ｍＶ〜４００ｍＶの電位、（ｉｉｉ）−３００ｍＶ〜３００ｍＶの電位、（ｉｖ）−２００ｍＶ〜２００ｍＶの電位、（ｖ）−１５０ｍＶ〜１５０ｍＶの電位、（ｖｉ）−７５ｍＶ〜７５ｍＶの電位、及び（ｖｉｉ）−５０ｍＶ〜５０ｍＶの電位からなる群より選択される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）
（ｉ）両親媒性脂質と少なくとも１つの溶媒とを含む混合物から溶媒を実質的に除去して、乾燥両親媒性脂質を得る工程と、
（ｉｉ）コネクタタンパク質が、伝導性チャネル含有膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成するのに十分な条件下及び時間で、水性溶媒、浸透圧剤、及びホモドデカマーであるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に自己集合可能な複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットポリペプチドを含む第２の溶液に、前記乾燥両親媒性脂質を再懸濁させて、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれている脂質二重層を含む膜を得て、伝導性チャネル含有膜を作製する工程と、
を含む方法により伝導性チャネル含有膜を作製する工程と、
（ｂ）前記コネクタタンパク質の開孔部を通して核酸を電気泳動移動させるのに十分な条件下及び時間で、（ａ）に記載の伝導性チャネル含有膜を、１又は複数の核酸分子と接触させ、前記伝導性チャネル含有膜に電位を印加して、前記伝導性チャネル含有膜の片側に核酸分子を濃縮させる工程と、
を含むことを特徴とする伝導性チャネル含有膜の片側に核酸分子を濃縮する方法。
【請求項３９】
核酸の移動が、膜の片側に、且つ核酸濃度勾配に逆らって核酸を蓄積させる請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
伝導性チャネル含有膜、及び前記膜の片側に濃縮された核酸分子を含む核酸含有リポソームであって、請求項３８に記載の方法に従って作製されるリポソーム。
【請求項４１】
ナノ粒子である請求項４０に記載のリポソーム。
【請求項４２】
バイオリアクタである請求項４０に記載のリポソーム。
【請求項４３】
請求項４０に記載の１又は複数のリポソームを細胞に導入する工程を含む細胞に核酸を送達する方法。
【請求項４４】
インビトロにおいて１又は複数のリポソームに細胞が導入される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
インビボにおいて１又は複数のリポソームに細胞が導入される請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む単離タンパク質であって、前記サブユニットが、各々、
（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、
（ｂ）４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個の隣接する非荷電アミノ酸のポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のアミノ末端及びカルボキシ末端のうちの少なくとも１つに融合している少なくとも１つの可撓性ドメインと、
（ｃ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインと、
を含む融合タンパク質を含むことを特徴とする単離タンパク質。
【請求項４７】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む単離タンパク質であって、前記サブユニットが、各々、
（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、
（ｂ）４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、又は１４個の隣接する非荷電アミノ酸のポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のアミノ末端及びカルボキシ末端のうちの少なくとも１つに融合している少なくとも１つの可撓性ドメインと、
（ｃ）式Ｘ１ａ−Ｘ１ａ−Ｘ２ａ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ３−Ｘ２ｂ（式中、各Ｘ１ａは、独立して任意の非荷電アミノ酸であるか又はアミノ酸は存在せず、各Ｘ１ｂは、独立して任意の非荷電アミノ酸であり、Ｘ２ａは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸であり、Ｘ３は、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選択される負荷電アミノ酸であり、Ｘ２ｂは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸である）のポリペプチドを含み、且つ前記可撓性ドメインに融合している少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインと、
を含む融合タンパク質を含むことを特徴とする単離タンパク質。
【請求項４８】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む単離タンパク質であって、前記サブユニットが、各々、
（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、
（ｂ）配列番号２３に記載の配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のカルボキシ末端に融合している少なくとも１つの可撓性ドメインと、
（ｃ）前記可撓性ドメインに融合している少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインと、
を含む融合タンパク質を含むことを特徴とする単離タンパク質。
【請求項４９】
親和性／アラインメントドメインが、
（ｉ）配列番号２２［ＷＳＨＰＱＲＦＥＫ］に記載のＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、
（ｉｉ）３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するヒスチジン残基のポリヒスチジンポリペプチドタグ、
（ｉｉｉ）３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するアルギニン残基のポリアルギニンポリペプチド、
（ｉｖ）配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号３９］のＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド、及び
（ｖ）配列ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］のペプチドタグ
からなる群より選択されるポリペプチドを含む請求項４６又は４８に記載の単離タンパク質。
【請求項５０】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む単離タンパク質であって、前記サブユニットが各々、
（ｉ）配列番号４１に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｋ２３４Ａ、
（ｉｉ）配列番号４２に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｋ２３４Ｃ、
（ｉｉｉ）配列番号４３に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｃ７６Ｓ／Ｃ２６５Ｓ／Ｋ２３４Ｃ、
（ｉｖ）配列番号４４に記載のΔ１−１４／ｇｐ１０−Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ、及び
（ｖ）配列番号４５に記載のＧｐ１０／Δ２８５−３０９−Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ
からなる群より選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする単離タンパク質。
【請求項５１】
開孔部ドメインが、（ｉ）配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉ）配列番号７［アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１［アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３］のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するファージラムダＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｖ）配列番号１２［アクセッション番号Ｐ５４３０９］に記載のアミノ酸配列を有するファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖ）配列番号１３［アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉ）配列番号１４［アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉ）ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉｉ）配列番号１５［アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｘ）配列番号１６〜１９（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０、ＡＡＳ７７１９１、ＡＡＵ０５２８７）に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、及び（ｘ）配列番号２０［アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、からなる群より選択されるポリペプチドを含む請求項４６に記載の単離タンパク質。
【請求項５２】
開孔部ドメインが、二本鎖ＤＮＡバクテリオファージＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質の全て又は膜貫通開孔部形成部分を含むポリペプチドを含む請求項４６に記載の単離タンパク質。
【請求項５３】
開孔部ドメインが、（ｉ）配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉ）配列番号７［アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１［アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３］のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するファージラムダＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｖ）配列番号１２［アクセッション番号Ｐ５４３０９］に記載のアミノ酸配列を有するファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖ）配列番号１３［アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉ）配列番号１４［アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉ）ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉｉ）配列番号１５［アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｘ）配列番号１６〜１９（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０、ＡＡＳ７７１９１、ＡＡＵ０５２８７）に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、及び（ｘ）配列番号２０［アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、からなる群より選択されるポリペプチドを含む請求項４７又は４８に記載の単離タンパク質。
【請求項５４】
開孔部ドメインが、配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分を含むポリペプチドを含む請求項４６に記載の伝導性チャネル含有膜。
【請求項５５】
ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドが、配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分を含む請求項４６又は４８に記載の単離タンパク質。
【請求項５６】
（ｉ）ドデカマーであるウイルスコネクタタンパク質に自己集合し、且つ（ｉｉ）ウイルスのプロカプシドに組み込まれた後、ウイルスのｄｓＤＮＡをパッケージングすることができる請求項４６から４８のいずれかに記載の単離タンパク質。
【請求項５７】
少なくとも１つの検出可能な標識を含む請求項４６から４８及び５０のいずれかに記載の単離タンパク質。
【請求項５８】
検出可能な標識が、比色指示薬、ＧＣＭＳタグ化合物、蛍光指示薬、発光指示薬、リン光指示薬、放射測定指示薬、色素、酵素、酵素の基質、エネルギー転移分子、量子ドット、金属粒子、及び親和性標識からなる群より選択される請求項５７に記載の単離タンパク質。
【請求項５９】
親和性標識が、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、アプタマー、抗体、レクチン、オリゴ糖、核酸、酵素、金属イオン結合ポリペプチド、配列番号２２［ＷＳＨＰＱＲＦＥＫ］に記載のＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するヒスチジン残基であるポリヒスチジンポリペプチドタグ、Ｓｔｒｅｐ−Ｉタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドタグ、Ｍｙｃペプチドタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、黄色ブドウ球菌プロテインＡ、プロテインＧ、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号３９］のＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド、アミノ酸配列ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］を有するペプチド、グルタレドキシン−２、及び親和性リガンドに特異的に結合するファージディスプレイされたペプチドからなる群より選択される請求項５８に記載の単離タンパク質。
【請求項６０】
抗体が、インタクトな免疫グロブリン、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ）’２からなる群より選択される請求項５９に記載の単離タンパク質。
【請求項６１】
（ａ）アナライト分子が親和性／アラインメントドメインに特異的に結合するのに十分な条件下及び時間で、アナライト分子を含有する試験溶液を、膜層と、前記膜層中に組み込まれた１又は複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質とを含む伝導性チャネル含有膜と接触させる工程であって、前記ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成可能であり、且つウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを各々含み、前記サブユニットが、各々、（１）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（２）（ｉ）少なくとも１つの可撓性ドメイン、及び（ｉｉ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む工程と、
（ｂ）接触工程前の１又は複数の時点、及び接触工程後の１又は複数の時点において、印加された電位により生じるコンダクタンスシグナルを測定する工程であって、接触工程前のコンダクタンスシグナルに対する接触工程後のコンダクタンスシグナルの変化が、前記アナライト分子の前記コネクタタンパク質への結合を示すことから、前記アナライト分子の存在を検出する工程と、
を含むことを特徴とするアナライト分子の存在を検出する方法。
【請求項６２】
コンダクタンスシグナルの変化が、親和性／アラインメントドメインに対するアナライト分子の結合を示す請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）アナライト分子が親和性／アラインメントドメインに特異的に結合するのに十分な条件下及び時間で、アナライト分子を含有する試験溶液を、膜層と、前記膜層中に組み込まれた１又は複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質とを含む伝導性チャネル含有膜と接触させる工程であって、前記ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成可能であり、且つウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを各々含み、前記サブユニットが、各々、（１）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（２）（ｉ）少なくとも１つの可撓性ドメイン、及び（ｉｉ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む工程と、
（ｂ）接触工程前の１又は複数の時点、及び接触工程後の１又は複数の時点において、印加された電位により生じるコンダクタンスシグナルを測定して、コンダクタンスシグナルプロファイルを作成する工程であって、接触工程前のコンダクタンスシグナルに対する接触工程後のコンダクタンスシグナルの変化が、前記アナライト分子の前記コネクタタンパク質への結合を示す工程と、
（ｃ）（ｂ）で得られたコンダクタンスシグナルプロファイルを、前記アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルと比較して、前記アナライト分子を同定する工程と、
を含むことを特徴とするアナライトを同定する方法。
【請求項６４】
コンダクタンスシグナルの変化が、親和性／アラインメントドメインに対するアナライト分子の結合を示す請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
接触工程を１又は複数回繰り返す請求項６１又は６３に記載の方法。
【請求項６６】
比較工程が、（ｉ）（ｂ）に記載のコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル振幅と、アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル振幅とを比較すること、及び（ｉｉ）（ｂ）に記載のコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル持続時間と、アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル持続時間とを比較することのうちの１以上を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
電位の印加により、開孔部ドメインにおける電気化学的勾配に従ってイオン移動が生じる請求項６１又は６３に記載の方法。
【請求項６８】
アナライトが、核酸分子を含む請求項６１又は６３に記載の方法。
【請求項６９】
アナライトが、核酸分子を含み、比較工程が、前記核酸分子中に存在する少なくとも１つのヌクレオチドを同定することを含む請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
核酸分子の核酸配列を決定することを含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
核酸分子中の一塩基多型を同定することを含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
電圧依存的開閉が存在しない請求項６１又は６３に記載の方法。
【請求項７３】
伝導性チャネル含有膜が、請求項１から２４のいずれかに記載の伝導性チャネル含有膜である請求項６１又は６３のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
伝導性チャネル含有膜が、請求項２５から３５のいずれかに記載の方法に従って作製される請求項６１又は６３に記載の方法。
【請求項７５】
単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、請求項１０１から１１５のいずれかに係る単離タンパク質を含む請求項６１又は６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６１／１０９，６６９号の利益を主張する。
【０００２】
（配列表に関する記述）
本願に関連する配列表は、ハードコピーに代わりテキスト形式で提供され、参照することにより本明細書に援用されるものとする。配列表を含むテキストファイルの名称は、４８０２７８＿４０１ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ．である。前記テキストファイルは、１０２ＫＢであり、２００９年１０月３０日に作成されたものであり、本願の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国ＰＣＴ受理官庁に電子的に送信された。
【０００３】
（政府の権益に関する記述）
本発明は、ＮＩＨ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ／ＮＩＨ  Ｒｏａｄｍａｐ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈより授与された助成金番号ＰＮ２  ＥＹ  ０１８２３０、及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈより授与された助成金番号Ｒ０１−ＧＭ５９９４４の下、米国政府の援助を受けた。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００４】
本発明の実施形態は、一般に、バイオセンサの分野に関する。より詳細には、本明細書に記載される組成物及び方法は、ＤＮＡシークエンシング及び他の用途で用いるための、導電性開孔部を形成するために脂質膜に組み込まれ得る改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタに関する。
【背景技術】
【０００５】
微量の化学物質及び生化学物質の高感度検出及び特性評価は、現在の分析技術の所望の目標である。ロバストな分子センシング装置は、広範囲に及ぶ生物医学、工業、環境、法医学、安全、及び他の分野、例えば、疾患診断及び環境モニタリングのための非常に低濃度の病原体及び化学物質の検出及び同定において、ハイスループットＤＮＡシークエンシング及び他のゲノミクス用途等において利用される。
【０００６】
例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、若しくは他の病原性微生物、又は病原体関連抗原の検出、並びに抗体、癌マーカー、及び他のアナライトの検出を含む、特異的親和性リガンドによる対象アナライトの結合乃至「捕捉」を検出するために、分子内親和性結合相互作用、典型的には自然界においては非共有結合を使用する分析方法が報告されている（例えば、非特許文献１〜２３、一般的には、例えば、非特許文献２４〜２５を参照）。
【０００７】
親和性結合相互作用においてアナライトが関与した後に前記アナライトの存在を検出することに加えて、多くの場合、アナライトの単一又は複数パラメータの物理化学的プロファイルと、１以上の既知のレファレンス標準物質を用いて作成される種類に特徴的なプロファイルとを比較することによりアナライトの特性評価を行うことができる高度な技術が開発されており、これは「フィンガープリンティング」技術と呼ばれている（例えば、非特許文献２６〜４４）。
【０００８】
膜貫通チャネルの使用は、基質（アナライト）が結合した結果、チャネル（受容体）による電気コンダクタンスが変化（例えば、統計学的に有意に減少又は増加）することにより証明されるように、単一基質分子と受容体との間の個々の結合事象のリアルタイム観察に基づく電気化学的アプローチである、確率的アナライト検出（非特許文献４５）において示されている。ＤＮＡ、ＲＮＡ、薬剤、ペプチド、タンパク質、及びポリマーの輸送等の広範囲に及ぶプロセスが、例えば、個々の膜チャネルの電気生理学的測定を用いて、かかるアプローチにより研究されている（非特許文献４６〜５０）。
【０００９】
例えば、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの長さを測定するために、細菌の膜貫通細孔形成タンパク質である黄色ブドウ球菌のα−ヘモリシン（α−ＨＬ）チャネルに流れるイオン電流の一過的遮断が用いられている（非特許文献５１）。次いで、α−ヘモリシン（α−ＨＬ）細孔を通過するＤＮＡ移動速度を減速させて、膜貫通イオンチャネルの単一ヌクレオチド多形を区別する能力を示すために、ＤＮＡヘアピン分子が用いられている（非特許文献５２）。塩基対のスタッキング及び細孔内の鎖配向の検出についても研究されている（非特許文献５３〜５５）。アダプタ分子が共有結合しているα−ＨＬのチャネルは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣを区別することが示されている（非特許文献５６）。
【００１０】
研究されている他のタンパク質チャネルとしては、ポリエチレングリコールを検出するためのアラメチシン（非特許文献５７）及びｓｓＤＮＡを移動させるためにスメグマ菌から再改変されたＭｓｐＡタンパク質（非特許文献５８）が挙げられる。ナノ細孔を通過する核酸輸送に関する研究の大部分は、α−ＨＬに注目している。しかし、α−ＨＬ（１．５ｎｍ）及び他のチャネルの内径が限定されているため、一本鎖核酸の移動にＤＮＡ及びＲＮＡを利用することは制限されている（非特許文献５９）。ＭｓｐＡナノ細孔についても同様の制限が報告された（非特許文献５８）。
【００１１】
少数の他の膜細孔系において、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が膜を超えて輸送されるという証拠が提示されている（非特許文献６０〜６２）が、これら系はロバストではなく、不所望の電圧依存性開閉及び関連するシグナル変動のために、生物医学的用途等で広く使用するための候補としては不十分である。この理由のために、前記系の可能性は制限されると考えられ、研究者らは、ＤＮＡシークエンシングで使用することができる合成金属又はケイ素ナノ細孔の製作に方針変更している（非特許文献６３〜６５）。しかし、かかる合成ナノ細孔は、バッチ間で一定の性質を有する複製構造を確実に作製するのが困難であり、また細孔構造の修飾を改変する能力及び／又は広範囲に及ぶ化学的コンジュゲーションにより修飾するための基質として機能する能力に関する汎用性が欠けていることによる問題点を有する。結果として、現在入手可能なタンパク質ナノ細孔の優れた代替物が依然として探索されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｉｔｔｉｇｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．１９９８  Ｓｅｐ；５９（３）：３５２−６
【非特許文献２】Ｃｏｒｄｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９５  Ｊａｎ  １３；１７８（１）：１２１−３０
【非特許文献３】Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９０  Ｎｏｖ  ６；１３４（１）：７１−９
【非特許文献４】Ｎｅｒｕｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８４  Ｊｕｌ；２０（１）：１０９−１４
【非特許文献５】Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９  Ｏｃｔ；１６１（１）：３８−４３
【非特許文献６】Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｍａｙ；１４（５）：６１７−２３
【非特許文献７】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６  Ａｕｇ；４４（８）：２８７２−８
【非特許文献８】Ｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４  Ｊｕｎ；４２（６）：２６２９−３５
【非特許文献９】Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．２００１  Ｓｅｐ；６５（３）：２０８−１３
【非特許文献１０】Ｌｏａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．２０００  ＪｕＩ−Ｓｅｐ；４４（３）：４９８−５０６
【非特許文献１１】Ｌｕｂｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｍｅｄ．２０００  Ｓｅｐ；１０（３）：２１３−８
【非特許文献１２】Ｃｈａｎｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｕｂｅｒｃ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓ．２０００  Ａｐｒ；４（４）：３７７−８３
【非特許文献１３】Ｂｒｉｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８  Ａｐｒ；３６（４）：１０６４−９
【非特許文献１４】Ｖｙｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７  Ｊａｎ；６３（１−２）：９３−１０１
【非特許文献１５】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７  Ｊａｎ；３５（１）：２０８−１２
【非特許文献１６】Ｌａｉｒｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．１９９３  Ｊｕｎ；９（６）：５６５−７１
【非特許文献１７】Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３  Ｏｃｔ；３７（１−２）：１２７−３３
【非特許文献１８】ｖａｎ  Ｌｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．１９９２  Ｆｅｂ；１０８（１）：１６５−７４
【非特許文献１９】Ｗｏｌｆ−Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９０  Ｏｃｔ１９；１３３（２）：１９１−８
【非特許文献２０】Ｂａｒｓｏｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１９９０  Ｊｕｌ；７１（１）：１０７−１３
【非特許文献２１】Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８９  Ｊｕｎ；２７（６）：１２４３−９
【非特許文献２２】Ｈｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．１９８６；７（４）：３０９−３６
【非特許文献２３】Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−６５（１９９３）
【非特許文献２４】Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８
【非特許文献２５】Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ
【非特許文献２６】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９  ２３（２２）：３５３３−３５４２
【非特許文献２７】Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００９
【非特許文献２８】Ｌｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｅｐｔ．１８，２００９
【非特許文献２９】Ｗｅｉｎｋｏｐｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｊｕｎｅ  １８，２００９
【非特許文献３０】Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００９  ９（１１）：３０９０−９
【非特許文献３１】Ｏｒｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００９  ５７（１３）：５６６５−７２
【非特許文献３２】Ａｍｉｎｉ，Ｐｈａｒｍｅｕｒ  Ｓｃｉ  Ｎｏｔｅｓ．２００９（１）：１１−６
【非特許文献３３】Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．２００９  ３２（１）：１４２−６
【非特許文献３４】Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．２００９  １２１６（５）：８３０−６
【非特許文献３５】Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００３  ９３（８）：１００６−１３
【非特許文献３６】Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  １４（２０）：６６１０−７
【非特許文献３７】Ｐｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｚｈｏｎｇ  Ｙａｏ  Ｚａ  Ｚｈｉ．２００８  ３３（１４）：１６６２−８
【非特許文献３８】Ａｒｔｈｕｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００８，１４１：２５７−７０
【非特許文献３９】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅ  Ｐｕ  ２００８  ２６（１）：４３−９
【非特許文献４０】Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００８８０（７）：２４１９−２５
【非特許文献４１】Ｄａｍｏｄａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００７  ５（３−４）：１５２−７
【非特許文献４２】Ｆｅｌｌｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８  ７２（２）：１３３−４０
【非特許文献４３】Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｆ  Ｐｒｏｃ  ＩＥＥＥ  Ｅｎｇ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｓｏｃ．２００６  １：４５５６−９
【非特許文献４４】Ｄｅ  Ｖｕｙｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８  １２５（１）：７９−９０
【非特許文献４５】Ｂａｙｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｎａｔｕｒｅ  １３：２２５−２３０
【非特許文献４６】Ｔｈｉｅｆｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：１４４９
【非特許文献４７】Ｈｉｎｎａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ８３：８９９
【非特許文献４８】Ａｌｃａｙａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１１：２４６−５０
【非特許文献４９】Ｂｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６５：９７８
【非特許文献５０】Ｍｏｖｉｌｅａｎｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１０９１
【非特許文献５１】Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１３７７０−１３７７３（１９９６）
【非特許文献５２】Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２４８
【非特許文献５３】Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｎｕｃｌ  Ａｃ．Ｒｅｓ．３１：１３１１
【非特許文献５４】Ｈｏｗｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６３６
【非特許文献５５】ｄｅＧｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．３４：６４２５
【非特許文献５６】Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：２６５
【非特許文献５７】Ｂｅｚｒｕｋｏｖ，２０００  Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．１７４：１−１３
【非特許文献５８】Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：２０６４７
【非特許文献５９】Ｓｏｎｇ，１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１８５９
【非特許文献６０】Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２：１２７
【非特許文献６１】Ｍｏｂａｓｈｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｐｏｈｙｓ  ３１：３８９
【非特許文献６２】Ｃａｒｎｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６１２：１４４
【非特許文献６３】Ｓｍｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ，２００６  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ６：８９
【非特許文献６４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６２２
【非特許文献６５】Ｉｑｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｎａｔ．Ｎａｎｏ  ２：２４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
明らかに、ｄｓＤＮＡを収容可能な内腔を有する多様なアナライトの高感度検出及び特性評価のための汎用性膜伝導性チャネルプラットフォームを提供し、確実に且つ再現可能に組織化することができ、作動条件下で電圧依存的に開閉しづらく、また異なるアナライトの検出及び特性評価において使用するための多様な特異的親和性受容体を特徴とするよう容易に修飾することができる、改善された組成物及び方法が必要とされている。本明細書に開示される発明の実施形態は、かかる要求を満たし、且つ他の関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、特定の実施形態では、（ａ）膜層と、（ｂ）前記膜層に組み込まれて、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成する単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質と、を含む伝導性チャネル含有膜を提供する。特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、人工物である。特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットは、各々、（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（ｂ）（ｉ）４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個の隣接する非荷電アミノ酸のポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のアミノ末端及びカルボキシ末端のうちの少なくとも１つに融合している少なくとも１つの可撓性ドメイン、並びに（ｉｉ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む。特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、ウイルスＤＮＡパッケージングモータ連結タンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットは、各々、（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（ｂ）（ｉ）４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、又は１４個の隣接する非荷電アミノ酸のポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のアミノ末端及びカルボキシ末端のうちの少なくとも１つに融合している少なくとも１つの可撓性ドメイン、並びに（ｉｉ）式Ｘ１ａ−Ｘ１ａ−Ｘ２ａ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ３−Ｘ２ｂ（式中、各Ｘ１ａは、独立して、任意の非荷電アミノ酸であるか又はアミノ酸は存在せず、各Ｘ１ｂは、独立して、任意の非荷電アミノ酸であり、Ｘ２ａは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸であり、Ｘ３は、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選択される負荷電アミノ酸であり、Ｘ２ｂは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸である）のポリペプチドを含み、且つ前記可撓性ドメインに融合している少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットは、各々、（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２３に記載の配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のカルボキシ末端に融合している少なくとも１つの可撓性ドメイン、並びに（ｉｉ）前記可撓性ドメインに融合している少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む。特定の実施形態では、前記親和性／アラインメントドメインは、（ｉ）配列番号２２［ＷＳＨＰＱＲＦＥＫ］に記載のＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、（ｉｉ）３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するヒスチジン残基のポリヒスチジンポリペプチドタグ、（ｉｉｉ）３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するアルギニン残基のポリアルギニンポリペプチド、（ｉｖ）配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号３９］のＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド、及び（ｖ）配列ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］のペプチドタグから選択されるポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットは、各々、（ｉ）配列４１に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｋ２３４Ａ、（ｉｉ）配列番号４２に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｋ２３４Ｃ、（ｉｉｉ）配列番号４３に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｃ７６Ｓ／Ｃ２６５Ｓ／Ｋ２３４Ｃ、（ｉｖ）配列番号４４に記載のΔ１−１４／ｇｐ１０−Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ、及び（ｖ）配列番号４５に記載のＧｐ１０／Δ２８５−３０９−Ｓｔｒｅｐ−ＩＩから選択される。
【００１６】
特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、（ｉ）配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉ）配列番号７［アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１［アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３］のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するファージラムダＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｖ）配列番号１２［アクセッション番号Ｐ５４３０９］に記載のアミノ酸配列を有するファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖ）配列番号１３［アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉ）配列番号１４［アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉ）ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉｉ）配列番号１５［アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｘ）配列番号１６〜１９（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０；ＡＡＳ７７１９１；ＡＡＵ０５２８７）に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、及び（ｘ）配列番号２０［アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分から選択されるポリペプチドを各々含むウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む。
【００１７】
特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、二本鎖ＤＮＡバクテリオファージＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質の全て又は膜貫通開孔部形成部分を含むポリペプチドを各々含むウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む。特定の実施形態では、ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉ）配列番号７［アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１［アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３］のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するファージラムダＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｖ）配列番号１２［アクセッション番号Ｐ５４３０９］に記載のアミノ酸配列を有するファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖ）配列番号１３［アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉ）配列番号１４［アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉ）ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉｉ）配列番号１５［アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｘ）配列番号１６〜１９（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０；ＡＡＳ７７１９１；ＡＡＵ０５２８７）に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、及び（ｘ）配列番号２０［アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分から選択される。
【００１８】
特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分を含むポリペプチドを各々含むウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む。特定の実施形態では、ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドは、配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分を含む。特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、検出可能な標識を含み、前記標識は、特定の更なる実施形態では、比色指示薬、ＧＣＭＳタグ化合物、蛍光指示薬、発光指示薬、リン光指示薬、放射測定指示薬、色素、酵素、酵素の基質、エネルギー転移分子、量子ドット、金属粒子、及び親和性標識から選択することができる。特定の更なる実施形態では、前記親和性標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、アプタマー、抗体、レクチン、オリゴ糖、核酸、酵素、金属イオン結合ポリペプチド、配列番号２２［ＷＳＨＰＱＲＦＥＫ］に記載のＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するヒスチジン残基のポリヒスチジンポリペプチドタグ、Ｓｔｒｅｐ−Ｉタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドタグ、Ｍｙｃペプチドタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、黄色ブドウ球菌プロテインＡ、プロテインＧ、ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド［配列番号３９］、アミノ酸配列ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］を有するペプチド、グルタレドキシン−２、及び親和性リガンドに特異的に結合するファージディスプレイされたペプチドから選択される。特定の更なる実施形態では、前記抗体は、インタクトな免疫グロブリン、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ）’２から選択される。
【００１９】
上記伝導性チャネル含有膜に関連する特定の実施形態では、膜層は、脂質層を含む。更なる実施形態では、脂質層は、両親媒性脂質を含み、前記両親媒性脂質は、特定の更なる実施形態では、リン脂質を含み、脂質層は、脂質二重層を含む。特定の他の実施形態では、脂質層は、平面膜層及びリポソームから選択される。特定の実施形態では、リポソームは、多重膜リポソーム及び単層リポソームから選択される。特定の他の実施形態では、組み込まれたウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、前記膜層中において可動性である。特定の他の実施形態では、伝導性チャネル含有膜は、電位を印加したとき、開孔部を通して二本鎖ＤＮＡを移動可能である。特定の実施形態では、電位を印加したとき、電圧依存的に開閉することなしにコンダクタンスが生じる。
【００２０】
本発明の特定の他の実施形態によれば、（ａ）両親媒性脂質及び有機溶媒を含む第１の溶液と固体基材とを接触させ、前記溶媒を実質的に除去することにより、前記固体基材上において乾燥両親媒性脂質を調製する工程と、（ｂ）前記コネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成するのに十分な条件下及び時間で、水性溶媒、浸透圧剤、及びホモドデカマーであるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に自己集合可能な複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットポリペプチドを含む第２の溶液に、前記乾燥両親媒性脂質を再懸濁させて、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれている脂質二重層を含む膜を得て、伝導性チャネル含有膜を作製する工程と、を含む伝導性チャネル含有膜を作製する方法を提供する。
【００２１】
特定の他の実施形態では、（ａ）両親媒性脂質と少なくとも１つの溶媒とを含む混合物から溶媒を実質的に除去して、乾燥両親媒性脂質を得る工程と、（ｂ）前記コネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成するのに十分な条件下及び時間で、水性溶媒、浸透圧剤、ホモドデカマーであるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に自己集合可能な複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットポリペプチドを含む第２の溶液に、前記乾燥両親媒性脂質を再懸濁させて、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれている脂質二重層を含む膜を得て、伝導性チャネル含有膜を作製する工程と、を含む伝導性チャネル含有膜を作製する方法を提供する。
【００２２】
上記方法の特定の更なる実施形態では、両親媒性脂質は、リン脂質を含む。特定の更なる実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎグリセロール−３−ホスホコリン、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンから選択される１以上のリン脂質を含む。特定の実施形態では、有機溶媒は、クロロホルム、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ピリジン、及びジイソプロピルエーテルから選択される少なくとも１つの溶媒を含む。特定の実施形態では、浸透圧剤は、スクロース又は別の二糖、グリセロール、マンニトール、及びデキストランから選択される少なくとも１つの剤を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットは、上記ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットポリペプチドのいずれかを含む。特定の実施形態では、脂質二重層は、リポソーム中に存在し、前記リポソームは、特定の更なる実施形態では、多重膜リポソーム及び単層リポソームから選択される。特定の実施形態では、組み込まれたウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、膜層中において可動性である。特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、膜に電位を印加したとき開孔部を通して二本鎖ＤＮＡを移動可能である。特定の実施形態では、電位を印加したとき電圧依存的に開閉することなしに、伝導性チャネル含有膜においてコンダクタンスが生じる。特定の更なる実施形態では、印加される電位は、（ｉ）−１００ｍＶ〜１００ｍＶの電位、（ｉｉ）−４００ｍＶ〜４００ｍＶの電位、（ｉｉｉ）−３００ｍＶ〜３００ｍＶの電位、（ｉｖ）−２００ｍＶ〜２００ｍＶの電位、（ｖ）−１５０ｍＶ〜１５０ｍＶの電位、（ｖｉ）−７５ｍＶ〜７５ｍＶの電位、及び（ｖｉｉ）−５０ｍＶ〜５０ｍＶの電位から選択される。
【００２３】
本発明の特定の他の実施形態によれば、第１の側面と第２の側面とを含む伝導性チャネル含有膜の片側に核酸分子を濃縮させる方法であって、（ａ）（ｉ）両親媒性脂質と少なくとも１つの溶媒とを含む混合物から溶媒を実質的に除去して、乾燥両親媒性脂質を得る工程と、（ｉｉ）前記コネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成するのに十分な条件下及び時間で、水性溶媒、浸透圧剤、及びホモドデカマーであるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に自己集合可能な複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニットポリペプチドを含む第２の溶液に、前記乾燥両親媒性脂質を再懸濁させて、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれている脂質二重層を含む膜を得て、伝導性チャネル含有膜を作製する工程と、を含む方法により伝導性チャネル含有膜を作製する工程と、（ｂ）前記コネクタタンパク質の開孔部を通して核酸を電気泳動移動させるのに十分な条件下及び時間で、（ａ）に記載の伝導性チャネル含有膜を、１又は複数の核酸分子と接触させ、膜に電位を印加して、前記伝導性チャネル含有膜の片側に核酸分子を濃縮させる工程と、を含む方法を提供する。特定の更なる実施形態では、核酸の移動により、核酸の濃度勾配に逆らって、膜の片側に核酸が蓄積される。別の実施形態では、伝導性チャネル含有膜と、前記膜の片側に濃縮された核酸分子とを含む核酸含有リポソームであって、前述の方法に従って作製されるリポソームを提供する。特定の更なる実施形態では、リポソームはナノ粒子であり、特定の他の実施形態では、リポソームはバイオリアクタである。特定の他の実施形態によれば、細胞に１又は複数の上記リポソームを導入する工程を含む、細胞に核酸を送達する方法を提供する。１つの実施形態では、インビトロにおいて１又は複数のリポソームに細胞が導入され、別の実施形態では、インビボにおいて１又は複数のリポソームに細胞が導入される。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む単離タンパク質が提供され、前記サブユニットは、各々、（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（ｂ）４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個の隣接する非荷電アミノ酸のポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のアミノ末端及びカルボキシ末端のうちの少なくとも１つに融合している少なくとも１つの可撓性ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインとを含む融合タンパク質を含む。
【００２５】
別の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む単離タンパク質が提供され、前記サブユニットは、各々、（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（ｂ）４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、又は１４個の隣接する非荷電アミノ酸のポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のアミノ末端及びカルボキシ末端のうちの少なくとも１つに融合している少なくとも１つの可撓性ドメインと、（ｃ）式Ｘ１ａ−Ｘ１ａ−Ｘ２ａ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ３−Ｘ２ｂ（式中、各Ｘ１ａは、独立して任意の非荷電アミノ酸であるか又はアミノ酸は存在せず、各Ｘ１ｂは、独立して任意の非荷電アミノ酸であり、Ｘ２ａは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸であり、Ｘ３は、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選択される負荷電アミノ酸であり、Ｘ２ｂは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸である）のポリペプチドを含み、且つ前記可撓性ドメインに融合している少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインと、を含む。
【００２６】
１つの実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む単離タンパク質が提供され、前記サブユニットは、各々、（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（ｂ）配列番号２３に記載の配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのポリペプチドを含み、且つ（ａ）に記載のカルボキシ末端に融合している少なくとも１つの可撓性ドメインと、（ｃ）前記可撓性ドメインに融合している少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインと、を含む。特定の更なる実施形態では、前記親和性／アラインメントドメインは、（ｉ）配列番号２２［ＷＳＨＰＱＲＦＥＫ］に記載のＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、（ｉｉ）３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するヒスチジン残基のポリヒスチジンポリペプチドタグ、（ｉｉｉ）３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するアルギニン残基のポリアルギニンポリペプチド、（ｉｖ）配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号３９］のＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド、及び（ｖ）配列ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］のペプチドタグから選択されるポリペプチドを含む。
【００２７】
別の実施形態では、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含む単離タンパク質が提供され、前記サブユニットは、各々、（ｉ）配列４１に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｋ２３４Ａ、（ｉｉ）配列番号４２に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／Ｋ２３４Ｃ、（ｉｉｉ）配列番号４３に記載のＣ−Ｈｉｓ６−ｇｐ１０／７６Ｓ／Ｃ２６５Ｓ／Ｋ２３４Ｃ、（ｉｖ）配列番号４４に記載のΔ１−１４／ｇｐ１０−Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ、及び（ｖ）配列番号４５に記載のＧｐ１０／Δ２８５−３０９−Ｓｔｒｅｐ−ＩＩから選択されるポリペプチドを含む。
【００２８】
特定の実施形態では、開孔部ドメインは、（ｉ）配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉ）配列番号７［アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１［アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３］のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するファージラムダＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｖ）配列番号１２［アクセッション番号Ｐ５４３０９］に記載のアミノ酸配列を有するファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖ）配列番号１３［アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉ）配列番号１４［アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉ）ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉｉ）配列番号１５［アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｘ）配列番号１６〜１９（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０；ＡＡＳ７７１９１；ＡＡＵ０５２８７）に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、及び（ｘ）配列番号２０［アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分から選択されるポリペプチドを含む。
【００２９】
特定の実施形態では、開孔部ドメインは、二本鎖ＤＮＡバクテリオファージＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質の全て又は膜貫通開孔部形成部分を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、開孔部ドメインは、（ｉ）配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉ）配列番号７［アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１［アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３］のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するファージラムダＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｖ）配列番号１２［アクセッション番号Ｐ５４３０９］に記載のアミノ酸配列を有するファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖ）配列番号１３［アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉ）配列番号１４［アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７］に記載のアミノ酸配列を有するファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉ）ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｖｉｉｉ）配列番号１５［アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、（ｉｘ）配列番号１６〜１９（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０；ＡＡＳ７７１９１；ＡＡＵ０５２８７）に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分、及び（ｘ）配列番号２０［アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５］に記載のアミノ酸配列を有するファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分であるポリペプチドを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、開孔部ドメインは、配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドは、配列番号１［アクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］に記載のアミノ酸配列を有するバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの全て又は膜貫通開孔部形成部分を含む。特定の実施形態では、上記単離タンパク質は、（ｉ）ドデカマーであるウイルスコネクタタンパク質に自己集合し、且つ（ｉｉ）ウイルスのプロカプシドに組み込まれた後、ウイルスのｄｓＤＮＡをパッケージングすることができる。特定の実施形態では、前記単離タンパク質は、少なくとも１つの検出可能な標識を含み、前記標識は、特定の更なる実施形態では、比色指示薬、ＧＣＭＳタグ化合物、蛍光指示薬、発光指示薬、リン光指示薬、放射測定指示薬、色素、酵素、酵素の基質、エネルギー転移分子、量子ドット、金属粒子、及び親和性標識から選択される。特定の更なる実施形態では、親和性標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、アプタマー、抗体、レクチン、オリゴ糖、核酸、酵素、金属イオン結合ポリペプチド、配列番号２２［ＷＳＨＰＱＲＦＥＫ］に記載のＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の隣接するヒスチジン残基のポリヒスチジンポリペプチドタグ、Ｓｔｒｅｐ−Ｉタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドタグ、Ｍｙｃペプチドタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、黄色ブドウ球菌プロテインＡ、プロテインＧ、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号３９］のＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド、アミノ酸配列ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］を有するペプチド、グルタレドキシン−２、及び親和性リガンドに特異的に結合するファージディスプレイされたペプチドから選択される。特定の更なる実施形態では、抗体は、インタクトな免疫グロブリン、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ）’２から選択される。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、アナライト分子の存在を検出する方法であって、（ａ）アナライト分子が親和性／アラインメントドメインに特異的に結合するのに十分な条件下及び時間で、アナライト分子を含有する試験溶液を、膜層と、前記膜層中に組み込まれた１又は複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質とを含む伝導性チャネル含有膜と接触させる工程であって、前記ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成可能であり、且つ各々、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが、各々、（１）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（２）（ｉ）少なくとも１つの可撓性ドメイン、及び（ｉｉ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む工程と、（ｂ）接触工程前の１又は複数の時点、及び接触工程後の１又は複数の時点において、印加された電位により生じるコンダクタンスシグナルを測定する工程であって、接触工程前のコンダクタンスシグナルに対する接触工程後のコンダクタンスシグナルの変化が、前記アナライト分子の前記コネクタタンパク質への結合を示すことから、前記アナライト分子の存在を検出する工程と、を含む方法を提供する。更なる実施形態では、コンダクタンスシグナルの変化は、アナライト分子の親和性／アラインメントドメインへの結合を示す。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、アナライトを同定する方法であって、（ａ）アナライト分子が親和性／アラインメントドメインに特異的に結合するのに十分な条件下及び時間で、アナライト分子を含有する試験溶液を、膜層と、前記膜層中に組み込まれた１又は複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質とを含む伝導性チャネル含有膜と接触させる工程であって、前記ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成可能であり、且つ各々、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが、各々、（１）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（２）（ｉ）少なくとも１つの可撓性ドメイン、及び（ｉｉ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む工程と、（ｂ）接触工程前の１又は複数の時点、及び接触工程後の１又は複数の時点において、印加された電位により生じるコンダクタンスシグナルを測定して、コンダクタンスシグナルプロファイルを作成する工程であって、接触工程前のコンダクタンスシグナルに対する接触工程後のコンダクタンスシグナルの変化が、前記アナライト分子の前記コネクタタンパク質への結合を示す工程と、（ｃ）（ｂ）で得られたコンダクタンスシグナルプロファイルを、前記アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルと比較して、前記アナライト分子を同定する工程と、を含む方法を提供する。特定の更なる実施形態では、コンダクタンスシグナルの変化は、アナライト分子の親和性／アラインメントドメインへの結合を示す。
【００３３】
上記方法の特定の実施形態によれば、接触工程は、１又は複数回繰り返される。特定の実施形態では、比較工程は、（ｉ）（ｂ）に記載のコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル振幅と、アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル振幅とを比較すること、及び（ｉｉ）（ｂ）に記載のコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル持続時間と、アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル持続時間とを比較することのうちの１以上を含む。上記方法の特定の実施形態では、電位を印加すると、開孔部ドメインにおける電気化学勾配に従ってイオン移動が生じる。特定の実施形態では、アナライトは、核酸分子を含む。特定の実施形態では、アナライトは、核酸分子を含み、比較工程は、核酸分子中に存在する少なくとも１つのヌクレオチドを同定することを含む。特定の実施形態では、前記方法は、核酸分子の核酸配列を決定することを含む。特定の実施形態では、前記方法は、核酸分子中の一塩基多型を同定することを含む。特定の実施形態では、電圧依存的な開閉は存在せず、特定の実施形態では、印加される電位が、（ｉ）−１００ｍＶ〜１００ｍＶの電位、（ｉｉ）−４００ｍＶ〜４００ｍＶの電位、（ｉｉｉ）−３００ｍＶ〜３００ｍＶの電位、（ｉｖ）−２００ｍＶ〜２００ｍＶの電位、（ｖ）−１５０ｍＶ〜１５０ｍＶの電位、（ｖｉ）−７５ｍＶ〜７５ｍＶの電位、及び（ｖｉｉ）−５０ｍＶ〜５０ｍＶの電位から選択されるとき、電圧依存的な開閉は存在しない。上記方法の特定の実施形態では、伝導性チャネル含有膜は、上記伝導性チャネル含有膜である。上記方法の特定の実施形態では、伝導性チャネル含有膜は、上記方法に従って作製される。上記方法の特定の実施形態では、単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、上記単離タンパク質を含む。
【００３４】
本発明のこれら及び他の態様並びに実施形態は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照して明らかとなるであろう。本明細書に参照される及び／又は出願データシートに記載される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許文献は全て、各々が個々に組み込まれているかのように、その全体を参照することにより本願に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ｐｈｉ２９コネクタ及びＤＮＡパッケージングモータの構造を示す。図１Ａ：酸性（影付）、塩基性（斑点）、及び他（白色）のアミノ酸を示すｐｈｉ２９コネクタの側面図（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ５７，１２６０−１２６９（２００１）、Ｇｕａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５，６６３−６７６（２００２）、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．５，８５６−８６３（２００５））。図１Ｂ：チャネルの幅狭部及び幅広部の直径を示すコネクタの平面図。図１Ｃ：コネクタを通過するＤＮＡ移動を示すｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータの全体図。図１Ｄ及び図１Ｅ：アレイ形成前（ｄ）及び形成後（ｅ）のＣ末端が修飾されている精製コネクタのＴＥＭ画像。図１Ｆ：コネクタを示す、クマシーブルーで染色されたＳＤＳゲル。
【図２】図２は、２段階ＰＣＲにより６−Ｇｌｙ可撓性ドメイン及びＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ親和性／アラインメントドメインを含むようにＣ末端が修飾されている、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを高発現させるためのプラスミドコンストラクトの例を示す。図２Ａ：プライマー対Ｆ１−Ｒ１による第１のＰＣＲにおいて、リンカーをＧＰ１０遺伝子の３’末端に結合させた。第２のＰＣＲでは、それぞれＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を含むプライマー対Ｆ１−Ｒ２を用いてアミノ酸を下流に組み込んだ。図２Ｂ：第２のＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩの両方で切断し、ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にライゲーションさせた。図２Ｃ：プライマー配列。
【図３】図３は、Ｃ末端に６−Ｇｌｙ可撓性ドメイン及びＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ親和性／アラインメントドメインを有する、再改変されたｐｈｉ２９ｇｐ１０ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを含むプロカプシドのＤＮＡパッケージング活性を示す。レーン１：１ｋｂのＤＮＡラダー、レーン２：通常のプロカプシド、レーン３：再改変されたコネクタを有するプロカプシド、レーン４：ＡＴＰを含まない陰性対照ＤＮＡパッケージング。
【図４】図４は、Ｃ末端に６−Ｇｌｙ可撓性ドメイン及びＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ親和性／アラインメントドメインを有する再改変されているコネクタを含むプロカプシドのｐｈｉ２９ビリオン集合活性を示す。再改変されているプロカプシドのインビトロにおけるビリオン集合活性を、ｐＲＮＡの存在下におけるネイティブプロカプシドのビリオン集合活性と比較した。
【図５】図５は、修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０コネクタを含む巨大リポソームの画像を示す。図５Ａ（左）：コネクタを含まないＮＢＤ−ＰＥで標識されたリポソーム：脂質の落射蛍光画像。図５Ａ（中央）：ＦＩＴＣ標識コネクタにより再構成されたプロテオリポソームの落射蛍光画像。図５Ａ（右）：非特異的にリポソームと混合されたＦＩＴＣコネクタの落射蛍光画像。図５Ｂ：膜濾過により遊離コネクタの大部分を単離した。図５Ｃ：スクロース勾配沈降によるリポソーム／ＦＩＴＣコネクタ複合体の分離。上方の画分に遊離コネクタが現れたが、プロテオリポソームは、下方の画分に留まっていた。画分番号１〜１２は図示しない。図５Ｄ：脂質拡散により、光退色領域（黒）の蛍光強度が経時的に徐々に増加したことを示す、ＦＲＡＰ（光退色後蛍光回復）により示された蛍光（赤）脂質二重層の流動性。図５Ｅ：コネクタの平面脂質二重層への挿入を示す概略図。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｇは、修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０コネクタの二重層脂質膜（ＢＬＭ）への挿入を確認するためのコンダクタンスアッセイを示す。図６Ａは、コネクタのみ（上方）又はリポソームのみ（下方）を含むＢＬＭである。
【図６Ｂ】図６Ｂでは、コネクタ含有プロテオリポソームの添加により、複数の挿入が生じる（２００回以上の実験において再現）。挿入：１つのコネクタの挿入（上方）、及び２つのコネクタの同時挿入（下方）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、正電圧（上方）及び負電圧（下方）における１つのコネクタ挿入を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、複数のコネクタ挿入後の電流ジャンプの分布を示す。０．５ＭのＮａＣｌを含む５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．９）。
【図６Ｅ】図６Ｅは、単一コネクタチャネルの電流−電圧関係を示す。エラーバーは、４回の個別の実験において合計３８個の挿入されたコネクタから各印加電圧下で３個〜５個が挿入されることを表す。０．５ＭのＮａＣｌを含む５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．９）。
【図６Ｆ】図６Ｆは、コネクタが１個、２個、又は３個の場合の電流トレースの傾斜を示す。０．５ＭのＮａＣｌを含む５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．９）。
【図６Ｇ】図６Ｇは、ｄｓＤＮＡ（シス−チャンバ）の存在下における１個のコネクタの電流トレースの傾斜を示す。１ＭのＮａＣｌを含むＴＭＳ。
【図７】図７は、Ｃ末端に６−Ｇｌｙ可撓性ドメイン及びＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ親和性／アラインメントドメインを有する修飾ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの挿入により引き起こされるコンダクタンスステップの大きさのヒストグラムを示す。このデータは、４０回の個々の実験において合計２１３個の挿入から得られた。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｄは、二重層膜（ＢＬＭ）における修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０コネクタチャネルを通過するｄｓＤＮＡの移動を示す。図８Ａは、ＢＬＭがコネクタを含むが、ＤＮＡを含まないときの典型的な電流トレースを示す（対照）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、３個のコネクタを含むＢＬＭにおいてＤＮａｓｅで切断していない及び切断した４５ｐＭの二本鎖環状及び直線状プラスミドＤＮＡにより引き起こされる例示的遮断を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、−４０ｍＶ〜−７５ｍＶで直線状プラスミドｄｓＤＮＡにより引き起こされる電流遮断率（％）を示すヒストグラムを示す。ＤＮＡの移動実験は、４５回繰り返した。
【図８Ｄ】図８Ｄは、−４０ｍＶ〜−７５ｍＶで直線状プラスミドｄｓＤＮＡにより引き起こされる持続時間を示すヒストグラムを示す。ＤＮＡの移動実験は、４５回繰り返した。
【図９Ａ】図９は、−７５ｍＶにおける、修飾ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタ挿入及びＤＮＡ移動を示す連続電流トレースを示す。図９Ａは、４μＭの３５ｂｐのＤＮＡをバッファ中で予め混合した場合を示す（実施例２の「二本鎖ＤＮＡ移動実験」の方法２）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、コネクタが二重層脂質膜に挿入された後、４μＭの３５ｂｐＤＮＡを添加した場合を示す（実施例２の「二本鎖ＤＮＡ移動実験」の方法１）。電流トレースは、修飾コネクタ及びＤＮＡの添加を連続的に記録する（各トレースは、５０秒間の増加について記録した）。
【図９Ｃ】図９Ｃは、コネクタが二重層脂質膜に挿入された後、４μＭの３５ｂｐＤＮＡを添加した場合を示す（実施例２の「二本鎖ＤＮＡ移動実験」の方法１）。電流トレースは、修飾コネクタ及びＤＮＡの添加を連続的に記録する（各トレースは、５０秒間の増加について記録した）。
【図９Ｄ】図９Ｄは、コネクタが二重層脂質膜に挿入された後、４μＭの３５ｂｐＤＮＡを添加した場合を示す（実施例２の「二本鎖ＤＮＡ移動実験」の方法１）。電流トレースは、修飾コネクタ及びＤＮＡの添加を連続的に記録する（各トレースは、５０秒間の増加について記録した）。
【図９Ｅ】図９Ｅは、コネクタが二重層脂質膜に挿入された後、４μＭの３５ｂｐＤＮＡを添加した場合を示す（実施例２の「二本鎖ＤＮＡ移動実験」の方法１）。電流トレースは、修飾コネクタ及びＤＮＡの添加を連続的に記録する（各トレースは、５０秒間の増加について記録した）。
【図９Ｆ】図９Ｆは、コネクタが二重層脂質膜に挿入された後、４μＭの３５ｂｐＤＮＡを添加した場合を示す（実施例２の「二本鎖ＤＮＡ移動実験」の方法１）。電流トレースは、修飾コネクタ及びＤＮＡの添加を連続的に記録する（各トレースは、５０秒間の増加について記録した）。
【図１０】図１０は、修飾ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの開孔部により形成される伝導性膜貫通チャネルを通過する３５ｂｐＤＮＡの移動を示す。図１０Ａ：４μＭのＤＮＡの存在下における二重層について記録した典型的な電流トレース（１０ｋＨｚの周波数で低域濾波し、２００ｋＨｚのサンプリング周波数で獲得）。図１０Ｂ：３５ｂｐのｄｓＤＮＡの移動によるチャネル遮断の持続時間の比較。１ＭのＮａＣｌを含むＴＭＳバッファ、−７５ｍＶ。図１０Ｃ：５．５ｋｂｐのｄｓＤＮＡの移動によるチャネル遮断の持続時間の比較。１ＭのＮａＣｌを含むＴＭＳバッファ、−７５ｍＶ。
【図１１】図１１は、ＤＮＡ移動事象の定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）分析を示す。図１１Ａ：３連で実行した段階希釈物のＱ−ＰＣＲ増幅曲線。図１１Ｂ：各希釈物について、テンプレートの出発量の対数に対してプロットしたＣＴの標準曲線。図１１Ｃ：トランスチャンバからシスチャンバへと脂質膜におけるコネクタのうちの１つを通過するＤＮＡの合計数の定量分析（上方）。コネクタが存在しないことを除いて同条件下で陰性対照を実施した（下方）。エラーバーは、９回の個別の実験及び４回の陰性対照実験の平均の標準偏差を示す。
【図１２】図１２は、種々の条件下におけるＤＮＡ移動の定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）分析を示す。図１２Ａ：様々な数の、膜に組み込まれている伝導性チャネルを形成する修飾ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを通過するＤＮＡ移動のＱ−ＰＣＲ分析。エラーバーは、同一Ｑ−ＰＣＲ条件下における各サンプルの測定誤差を表す。図１２Ｂ：漏れが生じたときのＤＮＡ分子のＱ−ＰＣＲ分析。エラーバーは、３回の個別の実験の平均の標準偏差を表す。
【図１３】図１３は、図８を示す。図１３Ａ：バッファのコンダクタンスとコネクタチャネルのコンダクタンスとの関係。図１３Ｂ：コネクタチャネルのコンダクタンスと、異なる濃度のＮａＣｌを含有するバッファ中における挿入されたコネクタの数との関係。図１３Ｃ：１ＭのＫＣｌ及びＮａＣｌを含有するバッファ中におけるコンダクタンスの比較。
【図１４】図１４Ａは、コネクタを通過して移動するＤＮＡの概略図を示す。図１４Ｂは、ｄｓＤＮＡにより誘導される電流遮断のヒストグラムを示す。図１４Ｃは、可変数のチャネルを用いて経時的に移動したＤＮＡのＱ−ＰＣＲ分析を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｄは、折り畳まれている立体構造のＤＮＡの移動を示す。図１５Ａは、５〜７個の修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０ＤＮＡパッケージングモータコネクタチャネルを用いた、別々の電流水準における単一事象の電流遮断のヒストグラムを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、１２〜１４個の修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０ＤＮＡパッケージングモータコネクタチャネルを用いた、別々の電流水準における単一事象の電流遮断のヒストグラムを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、修飾コネクタチャネルを通過する折り畳まれているＤＮＡの移動の概略図を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ｐＨ８における５ｋｂｐのｄｓＤＮＡを用いて記録された事象の例を示す。
【図１６】図１６は、修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを通過する一方通行のＤＮＡ移動を示す。図１６Ａ：ＤＮＡが存在しない対照。図１６Ｂ：正電位におけるコネクタ挿入（上方）及び負電位におけるＤＮＡ移動（下方）。図１６Ｃ：負電位におけるコネクタ挿入（上方）及び正電位におけるＤＮＡ移動（下方）。図１６Ｄ：負電位におけるコネクタ挿入（上方）及び負電位におけるＤＮＡ移動（下方）。図１６Ｅ：負電位のみにおけるＤＮＡ移動を示す、−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶのランピング電位（２．２ｍＶ／ｓ）における単一コネクタを含む二重層の電流トレース。図１６Ｆ：正電位のみにおけるＤＮＡ移動を示す、−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶのランピング電位（２．２ｍＶ／ｓ）における単一コネクタを含む二重層の電流トレース。
【図１７】図１７は、複数の修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０コネクタ挿入事象におけるＤＮＡ移動を示す。「↓」は、コネクタ挿入の１つの配向を示し、「↑」は、コネクタ挿入の反対の方向を示す。図１７Ａ：３個のコネクタ全てを同じ方向に配向すると、コネクタ数と共にＤＮＡ移動速度が増加した。図１７Ｂ：第１のコネクタを反対の方向に配向すると、移動は観察されなかった。次いで、第２及び第３の挿入後に、それぞれＤＮＡ移動及び速度増加が観察された。図１７Ｃ：はじめのコネクタを２個挿入した後、移動は観察されなかった。次の２個の挿入後、両方においてＤＮＡが活発に移動した。図１７Ｄ：第１のコネクタのみがＤＮＡを移動させた。その理由は、第２及び第３のコネクタが挿入されたときもＤＮＡ移動速度が変化しなかったためである。
【図１８】図１８Ａは、膜層に組み込まれている突然変異（Ｋ２３４Ａ）修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタのコンダクタンスのヒストグラムを示す。図１８Ｂは、野生型ｐｈｉ２９コネクタのコンダクタンスのヒストグラムを示す。
【図１９】図１９は、抗Ｈｉｓタグ抗体をチャンバの片側に添加すると、段階的に、Ｃ末端にヘキサヒスチジン［配列番号２５］親和性／アラインメントドメインを有する配列番号１を含む修飾ｐｈｉ２９ｇｐ１０ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの開孔部により形成される伝導性チャネルが遮断されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書に開示される本発明の特定の実施形態は、単離二本鎖ＤＮＡバクテリオファージＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、予想外にも、修飾されリン脂質二重層膜等の膜層に組み込まれると、前記膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成することができ、また前記開孔部を通過して二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む広範囲に及ぶアナライト分子が移動し得るという驚くべき発見に基づいている。
【００３７】
これらウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタは、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−ＲＮＡ相互作用に関与するｄｓＤＮＡウイルスプロカプシド集合体の要素として既に特性評価されているが（例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．３４：２６９８）、本開示以前には、脂質膜の不可欠な要素として作用する能力を有するとは見なされてはいなかった。したがって、本明細書に開示される実施形態は、多数の有利な性質を有するバイオセンサを形成する膜貫通開孔部を提供するために、かかるコネクタタンパク質の従来認識されていなかった分子属性を利用する。
【００３８】
バクテリオファージｐｈｉ２９の例示的な非修飾ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質は、既に精製され、その三次元構造は、結晶学的に特性評価されている（例えば、Ｇｕａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３０：２８３参照；また、Ｍａｒａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １６：１２６７参照）。他のｄｓＤＮＡウイルスのＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質（例えば、Ｔ４、ラムダ、Ｐ２２、Ｐ２、Ｔ３、Ｔ５、及びＴ７）は、ｐｈｉ２９コネクタと僅かな配列相同性しか共有しておらず、また分子量も異なるにもかかわらず、基本構造は非常に類似している（例えば、Ｂａｚｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１０９−２９）。したがって、本明細書に記載される多数の好ましい実施形態は、ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＣＥ９６０３３［配列番号１］）並びに／又はその断片、変異体、及び誘導体を含むポリペプチドサブユニット（例えば、アクセッション番号ｇｉ２９５６５７６２、ｇｉ３１０７２０２３、ｇｉ６６３９５１９４、ｇｉ２９５６５７３９、ｇｉ１５７７３８６０４［配列番号２〜６］）について言及するが、本発明は、これらに限定されることを意図するものではない。
【００３９】
これに代えて、特定の他の実施形態では、限定されるものではないが、ファージラムダ、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ２２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、ＳＰＰ１、及びＴ７のいずれかから単離されたウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質、又は他の単離ｄｓＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質（例えば、Ｔ４（アクセッション番号ＮＰ＿０４９７８２）（Ｄｒｉｅｄｏｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５２：６４１）、ラムダ（アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３）（Ｋｏｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７４：４３３）、ＳＰＰ１（アクセッション番号Ｐ５４３０９）、Ｐ２２（アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１）（Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １３９：４６）、Ｐ２（アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７）、Ｐ３（Ｎｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０（３）：５６０−２）、Ｔ３（アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２）（Ｃａｒａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｊｌ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｒｅｓ  ９４：１０５）、Ｔ５（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０、ＡＡＳ７７１９１、ＡＡＵ０５２８７）、Ｔ７（アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５）（Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８５：２９９；Ａｇｉｒｒｅｚａｂａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４７：８９５））［配列番号７〜２０］）を含む他のｄｓＤＮＡウイルスから単離されたウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質の使用も考えられる。
【００４０】
理論に縛られるものではないが、これに関して、本明細書に例示されるｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質と同様に、実質的に構造が特性評価されているこれら及び他のｄｓＤＮＡウイルスパッケージングモータコネクタタンパク質を、本明細書の教示に従って修飾して、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成するために膜に組み込まれ得る単離ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質を得ることができると考えられる。したがって、ｐｈｉ２９コネクタタンパク質に関する本明細書の開示は、特定の実施形態では、本明細書で見出される教示に従ってかかる実施形態で使用するために修飾してもよい他の単離ｄｓＤＮＡウイルスパッケージングモータコネクタタンパク質のいずれかを用いることが考えられる関連する実施形態を例証することを意図するものである。
【００４１】
本明細書に更に詳細に記載するように、膜への組み込み（例えば、膜層への安定な膜貫通組み込み）及び機能的導電性膜貫通開孔部の形成という新規性質を有するよう人工的に改変されているかかるポリペプチドを含む、単離ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドは、新しい種類の導電性バイオセンサ、特定の実施形態では、電位に応答して膜層を超えて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を移動可能なバイオセンサを提供するための予想外且つ有利に優れた性質を示す。したがって、特定の実施形態は、ＤＮＡの配列を決定するためのこれらバイオセンサの使用を意図する。
【００４２】
背景技術について簡潔に述べると、直線状ｄｓＤＮＡウイルスのゲノムは、予め形成されているプロカプシドにパッケージングされる（Ｂｌａｃｋ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４３，２６７−２９２（１９８９）、Ｇｕｏ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｏｒ’ｓ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）５（１），１−３（１９９４）、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，８８６−９０３（２００７）、Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２００８））。このエントロピー的に好ましくないプロセスは、ＡＴＰ駆動モータにより行われる（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７，２２９−２３６（１９８７）、Ｃｈｅｍｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１２２，６８３−６９２（２００５）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，２７９６−２８０３（１９９６）、Ｓａｂａｎａｙａｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ  ９３，Ｌ１７−Ｌ１９（２００７））。バクテリオファージｐｈｉ２９では、２ｂｐ（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）又は２．５ｂｐ（Ｍｏｆｆｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５７，４４６−４Ｕ２（２００９））のＤＮＡをパッケージングするために、モータは１つのＡＴＰを用いる。このモータタンパク質のハブは、コネクタと呼ばれるトランケート型円錐構造（図１Ａ）であり、ｄｓＤＮＡは、成熟中にここから入り、感染中にここから出ることができる（Ｋｏｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７４，４３３−４４７（１９８４）、Ｒｉｓｈｏｖｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４５，１１−１７（１９９８）、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ５７，１２６０−１２６９（２００１）、Ｇｕａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５，６６３−６７６（２００２）、Ａｇｉｒｒｅｚａｂａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３４７，８９５−９０２（２００５））。コネクタは、１２個のＧＰ１０タンパク質サブユニットにより形成される中心チャネル（図１Ｂ）を有する。ウイルスのコネクタタンパク質は、僅かな配列相同性しか共有せず、分子量も異なるが、基本構造は非常に類似している（Ｂａｚｉｎｅｔ＆Ｋｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，１０９−１２９（１９８５））。ウイルスＤＮＡパッケージング及びプロカプシドの感染性バイロンへの変換を証明することにより、ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータは、所定の系においてインビトロで最初に集合し、依然として最もよく研究されているものの１つである（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，３５０５−３５０９（１９８６））。前記モータは、６つのｐＲＮＡ（パッケージングＲＮＡ）分子を利用して（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６，６９０−６９４（１９８７）、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２，１４９−１５５（１９９８）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２，１４１−１４７（１９９８）、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２６，５２７−５３７（２００７））、機械と連動させる（図１Ｃ）。
【００４３】
初めて本明細書に記載されるように、開孔部ドメインを保持し、且つ親和性／アラインメントドメイン及び可撓性ドメインのいずれか又は両方を含む融合タンパク質等の改変体及び突然変異体を含む、ｐｈｉ２９及び他の単離ｄｓＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタは、膜層に有用に組み込まれて、膜に電位を印加したとき伝導性チャネルとして使用可能な開孔部を形成することができる。タンパク質の結晶学的構造データが容易に入手可能である場合（例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ５７，１２６０−１２６９（２００１）、Ｇｕａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５，６６３−６７６（２００２）、Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，８−１８（２００８）、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．５，８５６−８６３（２００５））、ｐｈｉ２９コネクタ等の修飾単離二本鎖ＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタは、本明細書に開示される実施形態において使用するのに望ましい構造を有するよう改変してもよい（Ｊｉｍｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１１１３、Ｄｏｎａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．３：２３７８、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１８６８−１８７１（２００５）、Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６３８（２００５）、Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１２４４（２００６）、Ｄｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：１７６（２００７）、Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：２５９（２００７））。更に、ｐｈｉ２９コネクタの大規模製造及び精製手順が開発されている（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｉｂａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，２３５１−２３６５（１９８４）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４，２６９８−２７０９（２００６）、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ３，１００−１０７（２００９））。
【００４４】
したがって、本明細書に記載される実施形態は、例えば、アナライト（例えば、溶液中に提供される可溶性アナライトが好ましい）の迅速、特異的、且つ高感度検出及び／又は特性評価が望ましい場合のある任意の状況を含む、生物医学、臨床、工業、化学、薬学、環境、法医学、国家安全、毒物学、及び他の目的のための化学的及び生化学的アナライトの高感度検出及び特性評価を含む、多様な分子分析状況において利用される。本明細書に開示される組成物及び方法が、ｄｓＤＮＡシークエンシング、ハイスループットＤＮＡシークエンシング、ゲノミクス、ＳＮＰ検出、分子診断、及び他のＤＮＡシークエンシング用途を含む、以下により詳細に記載されるようなＤＮＡシークエンシングに用いられる実施形態が特に考えられる。
【００４５】
したがって、例示的なアナライトとしては、ＤＮＡ及びＲＮＡ（ｄｓＤＮＡ及びｄｓＲＮＡを含む）等の核酸が挙げられ、例えば、かかる核酸における一塩基多形（ＳＮＰ）及び／又は突然変異の検出及び同定、並びに核酸配列決定の少なくともいずれかに用いられる。本明細書に記載される組成物及び方法を用いて検出及び／又は特性評価可能である他の例示的なアナライトとしては、他のバイオポリマー（例えば、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、糖ペプチド、オリゴ糖、多糖類、脂質、糖脂質、リン脂質等）、他の生体分子（例えば、可溶性メディエータ、コファクター、ビタミン、生理活性脂質、代謝産物等）、天然化合物及び合成化合物を含む薬剤、他の薬学的剤、及び薬理活性剤、芳香剤、着香剤、保存剤、酸化防止剤、抗菌剤、安定剤、担体、賦形剤、修飾剤等の食品及び化粧品用剤、天然毒素及び合成毒素、染料、並びに他の化合物が挙げられる。
【００４６】
したがって、特定の実施形態では、本明細書の開示から、アナライトが、単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれて、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成する特定の膜層の完全性を損なわない溶媒に可溶性であることが好ましいと認識される場合、検出及び／又は特性評価されることが望ましい任意のアナライトを用いることができる。したがって、アナライトの選択は、用いられる特定の膜層の組成によって変化するため、溶媒選択に影響を与える場合がある。当業者は、任意の特定の組成の膜層と適合する溶媒を選択するために使用される基準についてよく理解している。好ましい実施形態では、膜層は、リン脂質二重層を含み、アナライトが提供される溶媒は、水性溶媒、例えば、水を含む溶媒を含む。
【００４７】
本明細書に開示される組成物及び方法は、特定の実施形態では、確立された電気生理学的機器及び方法を適応させることにより、本明細書に開示される単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれる膜層に対する電気コンダクタンスを測定することを含んでいてもよい。例えば、以下により詳細に記載されるように、膜貫通電位を発生させ、かかる膜に対するコンダクタンスを測定するためのパッチクランプ又は平面膜技術を変更してもよい。かかる方法の例示的な説明は、例えば、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１３７７０；Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：６８６；Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２２６８；Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．８５：３０５７；Ｈｒｏｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．８：６０２；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：８２０７；米国特許第６，２６７，８７２号；同第６，７４６，５９４号；及び同第６，９３６，４３３号にも見出すことができる。当業者は、これら及び類似の参照文献から一般的な方法論的アプローチを認識し、また、当業者は、多くの本明細書に記載されているタンパク質ナノ細孔よりも大きな内腔を有する開孔部を形成し、且つ多くの既に開示されているタンパク質ナノ細孔チャネルでみられるように電圧依存的開閉挙動により伝導性を不所望に妨害することなしに、広範囲に及ぶ印加電位に対する伝導性チャネルとして機能する、単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が組み込まれている新規伝導性チャネル含有膜の初めて本明細書に開示される利点は、本開示に一部由来することを更に理解する。したがって、例えば、一例であり限定するものではないが、本開示に基づいて当業者に明らかであるように、上記に参照された方法及び本明細書に記載の方法等の既知の電気生理学的方法を用ると、選択された実施形態では、−１００ｍＶ〜１００ｍＶの電位、−４００ｍＶ〜４００ｍＶの電位、−３００ｍＶ〜３００ｍＶの電位、−２００ｍＶ〜２００ｍＶの電位、−１５０ｍＶ〜１５０ｍＶの電位、−７５ｍＶ〜７５ｍＶの電位、−５０ｍＶ〜５０ｍＶ、又は使用される特定のコンダクタンス条件に従って変化し得る別の電圧範囲であってもよい電位を印加したとき、電圧依存的に開閉することなしに本明細書に開示される伝導性チャネル含有膜においてコンダクタンスが生じる。
【００４８】
更に、非限定的理論によれば、本伝導性チャネル含有膜は、本ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタにより形成される開孔部に一部由来し得る優れた検出感度を提供し、また特異的結合相互作用においてアナライトに会合する、広範囲に及ぶアナライトが接近可能な親和性相互作用ドメインのいずれか等、所望の機能性を有するよう改変又は突然変異させることができるタンパク質伝導性チャネルの安定な膜組み込みに一部由来し得る優れたアナライト特性評価能を提供する。
【００４９】
アナライトの検出方法では、これら及び関連する実施形態は、かかる特異的結合相互作用が存在しないときのコンダクタンスレベルに対する、組み込まれたコネクタタンパク質がアナライトと特異的結合相互作用によって会合しているときの、電位が印加される伝導性チャネル含有膜の開孔部におけるコンダクタンスレベルの変化（例えば、統計的に有意な増加又は減少）を観察することにより得られる感度について考える。したがって、特定の好ましい実施形態では、アナライト分子の存在を検出する方法であって、（ａ）アナライト分子が親和性／アラインメントドメインに特異的に結合するのに十分な条件下及び時間で、アナライト分子を含有する試験溶液を、膜層と、前記膜層中に組み込まれた１又は複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質とを含む伝導性チャネル含有膜と接触させる工程であって、前記ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成可能であり、且つ各々、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが、各々、（１）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（２）（ｉ）少なくとも１つの可撓性ドメイン、及び（ｉｉ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む工程と、（ｂ）接触工程前の１又は複数の時点、及び接触工程後の１又は複数の時点において、印加された電位により生じるコンダクタンスシグナルを測定する工程であって、接触工程前のコンダクタンスシグナルに対する接触工程後のコンダクタンスシグナルの変化が、前記アナライト分子の前記コネクタタンパク質への結合を示すことから、前記アナライト分子の存在を検出する工程と、を含む方法を提供する。特定の関連する更なる実施形態では、コンダクタンスシグナルの変化は、アナライト分子の親和性／アラインメントドメインへの結合を示す。
【００５０】
一例であり限定するものではないが、膜に組み込まれたコネクタタンパク質により形成される開孔部は、アナライトが存在し、且つチャネル伝導性膜に結合しているとき少なくとも部分的に遮断又は閉鎖されるので、その結果として膜に対するコンダクタンスが変化、典型的には減少すると考えられる。結合しているアナライトが存在しない場合、チャネルに対するコンダクタンスにこのような制限は存在しないので、結合している状態及び結合していない状態のアナライトが観察されるときのコンダクタンスの変化量が容易に検出可能である。以下の実施例に示すように、本伝導性チャネル含有膜は、非限定的理論によれば、伝導性膜貫通開孔部を形成している、膜に組み込まれた単一の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に結合している単一アナライト分子の量における、アナライト結合に関連するコンダクタンスの変化等の観察が可能になることにより、アナライトの検出感度を非常に高めると考えられる。特定の他の実施形態では、コンダクタンスシグナルは、本明細書に記載されるコネクタの複数の膜貫通開孔部により形成される複数の伝導性チャネルから検出され得る。
【００５１】
特定の概念的に関連する実施形態では、例えば、１又は複数の時点における本明細書に記載されるようなコンダクタンスの変化を含むコンダクタンスの振幅、及び１又は複数の時点における本明細書に記載されるようなコンダクタンスの変化を含むコンダクタンスの持続時間を反映する記録を収集することにより、コンダクタンスシグナルプロファイルが作成される場合、アナライトの存在又は欠如の単なる検出を超える情報を得ることができる。かかるシグナルプロファイルは、例えば、結合親和性及び／又は結合アビディティ（例えば、アナライトが多価である場合）等のコネクタタンパク質（１又は複数）との相互作用の過程におけるアナライトのあらゆる性質、また可能性として、特定のアナライト、特定のコネクタタンパク質、膜組成、溶媒条件、印加電位、及び他の因子によって変化し得る相対分子量、電荷、及び／又は疎水性等のアナライトの生理化学的性質を反映することができる。
【００５２】
特定の特に好ましい実施形態では、レファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルは、既知の分子構造のアナライトを用いて作成することができ、前記レファレンスプロファイルと、構造的情報を得ることが望まれるアナライトを含有する試験溶液の相互作用により生じるコンダクタンスシグナルプロファイルを比較してもよい。
【００５３】
したがって、これら及び関連する実施形態では、アナライトを同定する方法であって、（ａ）アナライト分子が親和性／アラインメントドメインに特異的に結合するのに十分な条件下及び時間で、アナライト分子を含有する試験溶液を、膜層と、前記膜層中に組み込まれた１又は複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質とを含む伝導性チャネル含有膜と接触させる工程であって、前記ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成可能であり、且つ各々、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含み、前記サブユニットが、各々、（１）アミノ末端及びカルボキシ末端を有する単離ウイルスコネクタタンパク質ポリペプチドを含む開孔部ドメインと、（２）（ｉ）少なくとも１つの可撓性ドメイン、及び（ｉｉ）少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む工程と、（ｂ）接触工程前の１又は複数の時点、及び接触工程後の１又は複数の時点において、印加された電位により生じるコンダクタンスシグナルを測定して、コンダクタンスシグナルプロファイルを作成する工程であって、接触工程前のコンダクタンスシグナルに対する接触工程後のコンダクタンスシグナルの変化が、前記アナライト分子の前記コネクタタンパク質への結合を示す工程と、（ｃ）（ｂ）で得られたコンダクタンスシグナルプロファイルを、前記アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルと比較して、前記アナライト分子を同定する工程と、を含む方法を提供する。
【００５４】
特定の更なる実施形態では、コンダクタンスシグナルの変化は、アナライト分子の親和性／アラインメントドメインへの結合を示す。アナライトを検出及び同定するための上記方法のいずれかでは、接触工程は、例えば、コンダクタンスシグナルプロファイルを作成するために１又は複数回繰り返してもよい。上述の通り、既知のアナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルと、試験アナライトの試験コンダクタンスシグナルプロファイルとの比較により、試験アナライトを同定することができ、このアプローチは、例えば、直線状ＤＮＡ分子が開孔部を通過して移動するときのコンダクタンスの一連の特徴的な変化を測定することによる、核酸分子における１以上の一塩基多形の同定、又は核酸分子（ｄｓＤＮＡを含む）の配列決定等の核酸分子の特性評価において使用できる。これら及び関連する実施形態では、本明細書の開示に基づいて、当業者は、容易に且つ過度の実験を行うことなしに、レファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルを作成し、それから、前記プロファイルと比較できる試験コンダクタンスシグナルプロファイルを作成できる条件（例えば、膜、コネクタタンパク質、溶液条件、印加電位の選択等）を決定することができることが理解されるであろう。
【００５５】
したがって、特定の実施形態では、比較工程は、（ｉ）試験コンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル振幅と、アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル振幅とを比較すること、及び（ｉｉ）試験コンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル持続時間と、アナライトのレファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルのコンダクタンスシグナル持続時間とを比較することのうちの１以上を含む。例えば、開孔部を通過してアナライトが完全に又は部分的に移動する特定の実施形態では、電位の印加により、開孔部ドメインにおける電気化学勾配に従ってイオン移動が生じる。したがって、本方法の特定の関連する実施形態では、アナライトは、核酸分子を含み、特定の他の関連する実施形態では、比較工程は、核酸分子中に存在する少なくとも１つのヌクレオチドを同定することを含み、特定の更なる実施形態では、前記方法は、核酸分子の核酸配列を決定することを含む。
【００５６】
本明細書に記載される特定の好ましい実施形態は、キメラ又は融合ポリペプチドサブユニット、即ち、当業者によく知られている組換え遺伝子改変技術の産物である自然界には存在しないポリペプチドのドデカマーを含む単離ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に関することが理解されるであろう。これら及び関連する実施形態では、前記融合ポリペプチドは、（ｉ）上記及び本明細書の他の箇所に論じられているポリペプチド（例えば、配列番号１〜２０に記載の任意のポリペプチド、又は変異体、断片、及び誘導体を含む他の関連するＤＮＡパッケージングモータコネクタポリペプチド）等の二本鎖ＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタポリペプチドの全て又は開孔部形成部分であり得る開孔部ドメインと、（ｉｉ）少なくとも１つの可撓性ドメイン及び少なくとも１つの親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方と、を含む。例示的なコネクタは、配列番号３１〜３５及び４１〜４５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドサブユニット等の、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタポリペプチドサブユニットのホモドデカマーを含んでいてもよい。
【００５７】
典型的には、可撓性ドメイン及び／又は親和性／アラインメントドメインは、開孔部ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に結合しているペプチド配列として存在してもよいが、本発明は、これらに限定されることを意図するものではなく、コネクタポリペプチド配列内の他の位置に可撓性ドメイン及び／又は親和性／アラインメントドメインを含むことも考えられる。本明細書の他の箇所に述べられているように、本ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタポリペプチドについての詳細な結晶学的構造データは入手可能であり、タンパク質に対する構造的修飾の影響を予測するための精巧な三次元構造タンパク質モデリングソフトウェアプログラムは、当該技術分野において周知である。
【００５８】
非限定的理論によれば、膜貫通開孔部を形成するために膜にコネクタを組み込むことがエネルギー的に好ましい方法で、それぞれ、親水性リン脂質極性頭基及び疎水性リン脂質脂肪アシル鎖と相互作用するコネクタポリペプチドの一部を修飾することにより、リン脂質二重層等の膜層の保持及び機能的組み込みのために本明細書に開示される単離ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質を安定化させることができる。タンパク質を膜に導入するため、及び前記タンパク質の膜への組み込みを判定するため、更には前記膜中における一体型タンパク質又は膜貫通タンパク質としての前記タンパク質の性質を確認するための組成物及び方法は、当該技術分野において既知であり、且つ本明細書に例証されており、また導電性膜貫通チャネル等のタンパク質の機能的組み込みを判定するための方法論についても同様である。
【００５９】
したがって、本明細書に提示されているように、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、又はそれ以上の隣接する非荷電アミノ酸等の非荷電アミノ酸の可撓性ドメイン（例えば、Ｇｌｙ６、配列番号２３）と、前記ドメインのＣ末端に結合している、式Ｉ：
Ｘ１ａ−Ｘ１ａ−Ｘ２ａ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ１ｂ−Ｘ３−Ｘ２ｂ［Ｉ］
（式中、各Ｘ１ａは、独立して任意の非荷電アミノ酸であるか又はアミノ酸は存在せず、各Ｘ１ｂは、独立して任意の非荷電アミノ酸であり、Ｘ２ａは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸であり、Ｘ３は、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選択される負荷電アミノ酸であり、Ｘ２ｂは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される正荷電アミノ酸である）により表されるペプチド、例えば、時に「Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ」タグと呼ばれるペプチドＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号２２）等の親和性／アラインメントドメインと、を含むＣ末端修飾は、脂質二重層において膜貫通チャネルとして保持されるのに助力する方法で、ｄｓＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの生理化学的性質に有利に影響を与えると考えられ、またアナライト等の溶質と相互作用するための周辺環境に前記タグを有利に曝露させると考えられる。したがって、例えば、非限定的な例示的例として、生理学的ｐＨ又は生理学的ｐＨ付近の緩衝溶液により提供される好適な条件下、且つ膜に電位が印加された状態で、電荷の相互作用は、伝導性チャネルと溶液中のＤＮＡとの係合に助力することができ、また電気拡散力は、本明細書に記載のようにｄｓＤＮＡを収容し得る伝導性チャネル開孔部を通過するＤＮＡの移動を促進することができる。
【００６０】
したがって、開孔部ドメインは、本明細書に記載のように任意のｄｓＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタポリペプチドにより提供され得、修飾されたコネクタの膜への組み込みと、膜の組み込み及び膜電位が印加されたときにコンダクタンスが生じ得る開孔部の確立の両方についての機能試験に関する本開示を考慮してかかるタンパク質の入手可能な構造特性評価から、開孔部形成部分は、集合したコネクタがこれら性質を示す必要がある場合があるので、かかるコネクタポリペプチドサブユニットの十分な部分を含むことが理解されよう。上述の通り、特定の実施形態では、約４個〜約１８個の隣接する非荷電アミノ酸の可撓性ドメインは、有利なことに、本明細書に提供されるウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタドメインに融合することができる。
【００６１】
また、上述の通り、親和性／アラインメントドメインは、介在する可撓性ドメインが存在する又は存在しないウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタポリペプチドサブユニット配列に融合することができる、膜層におけるコネクタの保持を促進する、及び／又は受容体、リガンド、結合部位、対抗受容体等の親水性相互作用ドメインを提供する、任意のポリペプチド又はポリペプチドドメインであってもよく、これは、アナライトの特異的結合に関与する、アナライトの伝導性チャネルとの相互作用を促進する、及び／又はその両方のために用いることができる。
【００６２】
特定の実施形態において本明細書で使用するために記載される例示的親和性／アラインメントドメインは、非限定的な例として、Ｃ末端親水性タグとして融合タンパク質コンストラクトに存在する「Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ」ペプチドタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ［配列番号２２］）（例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９３；６：１０９−２２；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６；２５５：７５３−６）、又は例えば、抗体若しくはその抗原結合部分（以下にも記載）等のコグネート結合パートナーとの特異的親和性結合相互作用に関与できると同定されている任意の多数の他の既知のペプチド、ポリペプチド、若しくは他の構造、ＤＲＡＴＰＹ［配列番号４０］を有する「ＡｖｉＤ」タグ（Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５６：５４）、グルタレドキシン−２（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ４５：３７）、又はアビジン、ストレプトアビジン、レクチン、抗体、受容体、細胞接着分子認識成分、レクチン、金属イオン結合ポリペプチド（例えば、ヘキサヒスチジン等のポリヒスチジン、又は３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、若しくは１２個の隣接するヒスチジン残基）、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、若しくは１２個の隣接するアルギニン残基のポリアルギニンポリペプチド、ＦＬＡＧペプチドタグ、抗体によって定義されるエピトープを有するＭｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン定常領域結合黄色ブドウ球菌プロテインＡ若しくはプロテインＧ、ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド（例えば、配列番号３９）、親和性リガンドに特異的に結合するファージディスプレイされたペプチド、アプタマー、又は本明細書に引用される参照文献に記載されているもの等の当該技術分野において既知である任意の他の多数の周知の親和性相互作用分子等である。全て又は一部を用いて親和性／アラインメントドメインを作製することができる他の受容体、結合ドメイン、リガンド、対抗受容体等としては、国際特許公開第２００５／０９７９９７号、同第２００２／０５６９１０号、同第２００５／０１７１４８号、及び同第２００５／０３７９８９号に開示されているものが挙げられる。特定の実施形態は、理解されているように、確立されている技術及び機器を用いて検出できる広範囲に及ぶ化学、生化学、放射化学、又はナノ分子部分のいずれであってもよい検出可能な標識を更に含む本明細書に提供されるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質を意図する。例示的な検出可能な標識は、当該技術分野において既知であり、国際特許公開第２００７／０７５２５３号及び米国特許出願公開第２００８／０１７６２０９号に記載されているものが挙げられる。
【００６３】
以下の実施例により詳細に記載されているように、特定の好ましい実施形態によれば、本明細書に記載される伝導性チャネル含有膜は、本明細書に記載されるように開孔部ドメインと可撓性ドメイン及び親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方とを有する融合タンパク質を含むポリペプチドサブユニットで構成されるコネクタが挙げられる、本明細書に提供される単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質を、リポソーム膜に組み込むことにより形成することができる。前記膜は、典型的には、適切な条件下で水性環境に曝露したとき二重層を形成する傾向がある、リン脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン、又は当業者によく知られている他のリン脂質のうちの１以上）等の両親媒性脂質を含む。
【００６４】
以下に記載のように、先ず、溶媒（例えば、クロロホルム、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ピリジン、ジイソプロピルエーテルのうちの１以上等の有機溶媒）が、（例えば、目視により残留溶媒が殆ど又は全く検出できないように、好ましくは、脂質調製品が乾燥しているとみなされるように）実質的に除去されている両親媒性脂質を提供し、次いで、水性溶媒、浸透圧剤、及びホモドデカマーコネクタタンパク質に自己集合可能な複数の単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタサブユニットポリペプチドを含む溶液に、乾燥した前記両親媒性脂質を再懸濁させることにより、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを効率よく膜に組み込むことができると理解されるであろう。理論に縛られるものではないが、浸透圧剤を含むと、有利なことに、実質的に球形であるリポソームの形成、大きさ、及び／又は前記リポソーム内の分子間動態に影響を与えることによって、機能的ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質が伝導性チャネルとして膜に組み込まれるのを促進すると考えられるが、伝導性チャネル含有膜を作製する他の方法を除外すべきではないことが認識される。これら及び関連する実施形態で用いることができる浸透圧剤の非限定的な例としては、スクロース、又は他の二糖類、グリセロール、マンニトール、及びデキストランが挙げられる。
【００６５】
特定の実施形態では、伝導性チャネル含有膜を含むリポソームは、例えば、核酸含有リポソームを得るために、コネクタ開孔部を通して、認知されている均衡原理に従って達成され得る核酸濃度を制限する核酸濃度勾配に逆らって、電位駆動的に移動させる等により、リポソームに濃縮又は蓄積されている核酸分子をインビトロ又はインビボで細胞に送達するためのビヒクルとして、リポソーム形態で用いることができる。かかるリポソームは、有利なことに、遺伝子治療及び関連するストラテジの分野で治療剤として利用することができる。広範囲に及ぶ製剤が、核酸含有リポソームをインビトロ及びインビボで治療的に投与するために利用可能であり、前記製剤は、本開示に従って作製されるリポソームと共に使用するために修飾してもよい。例えば、国際特許公開第２００２／０３４２３６号；同第２００２／０３６７６７号；同第２００３／０９４９６３号；同第２００５／０３４９７９号；同第２００５／１２０４６１号；同第２０００／０３６８３号；Ｌａｓｉｃ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１９９７，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；国際特許公開第９６／４０９６４号；同第１９９８／５１２７８号；同第２００９／０８６５５８号；米国特許出願公開第２００７／００４２０３１号；同第２００６／０２４００９３号；同第２００６／００８３７８０号；同第２００４／０１４２０２５を参照。多重膜リポソーム及び単層リポソームが考えられ、特定の実施形態では単層リポソームが好ましい。
【００６６】
また、本明細書に開示される伝導性チャネル含有膜により画定される膜結合区画を、バイオリアクタとして有利に使用することができる実施形態も考えられる。当業者に理解されているように、本教示によれば、本明細書に記載される伝導性チャネルを用いて、移動する化合物及び使用される具体的な伝導性チャネルの性質（例えば、親和性／アラインメントドメインの性質、コネクタの構造、膜の組成、コネクタの配向、印加電位等）によって、多数のアナライト、生体分子、合成小分子、イオン種、及び／又は他の溶質のいずれかを選択的に移動させることができる。したがって、リポソーム微粒子、ナノ微粒子、又は好適な装置内の平面膜の片側であり得る膜結合区画内において、核酸シークエンシング、ＳＮＰ決定、核酸増幅、核酸合成、ライゲーション又は切断、巨大分子の集合、アナライトの検出に有用な反応、又は任意の他の所望の生化学的若しくは合成的に改変された生体反応等の望ましい生体分子又は生化学反応にとって好ましい条件下で、１以上の所望の分子種を蓄積させることができる（例えば、均衡動態の関数として得ることができる濃度を制限する濃度勾配に逆らって電子拡散的に蓄積することができる所望の濃度で）。
【００６７】
また本明細書に記載されるように、特定の実施形態では、リポソームを形成するための、本明細書に記載される単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの膜層への組み込みを意図し、前記リポソームは、次いで、当該技術分野において既知である方法に従って人工膜融合操作を用いて、平面二重層膜（ＢＬＭ）系等の平面膜系に膜組み込み型コネクタを供与することができる。したがって、初めて本明細書に記載される伝導性チャネル含有膜は、例えば、リポソーム及び／又はナノ粒子（担体粒子を含む）の送達、平面膜層、マイクロ流体チャンバ、マイクロ細孔及びナノ細孔導電性チャンバ、パッチクランプ装置、及び本開示に基づいて、且つ当該技術分野における知見を考慮して適応し得るような本伝導性チャネル含有膜と共に使用するのに適合可能な任意の他の構成が挙げられるが、これらに限定されない、特定の目的のために及び／又は特定の機器での使用に適応させるために望ましく構成することができる。また、本明細書に記載されるように、特定の好ましい実施形態は、ＤＮＡシークエンシング、好ましくはｄｓＤＮＡシークエンシングを含む核酸シークエンシング及びＳＮＰ同定のための本伝導性チャネル含有膜の使用を意図し、特定の実施形態では、レファレンスコンダクタンスシグナルプロファイルと比較可能なコンダクタンスプロファイルを作成するために複数の時点においてコンダクタンス振幅及び／又は持続時間の変化を検出及び記録することに付随する電位駆動性移動により、本明細書に記載される伝導性チャネルを通過して移動するときのｄｓＤＮＡのリアルタイムフィンガープリンティングを含む。
【００６８】
抗体
上述の通り、本発明の特定の実施形態では、抗体を含む親和性／アラインメントドメインも意図され、前記抗体は、検出及び／又は同定が望まれるアナライトに特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、及び他の分子である抗アナライト結合分子を含む。かかる結合分子は、本明細書に記載されるように、アナライトの存在を検出する方法、又は（例えば、試験溶液中の）アナライトを同定する方法で用いることができる。本明細書に提供される抗体、又は別の親和性／アラインメントドメインは、抗原／アナライトと検出可能なレベルで反応（例えば、結合）するが、構造的に異なるか又は関連しない分子とは検出可能に反応しない場合、特定のコグネート抗原又はアナライト（例えば、対象アナライト）に特異的結合すると言われる。したがって、好ましい結合分子としては、抗体が挙げられ、前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、若しくはＣＤＲグラフト免疫グロブリン抗体、又は例えば、タンパク質分解により作製される又は組換えにより生成される免疫グロブリンＦ（ａｂ）’２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及び／又はＦｄ断片、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：４８４）及び二特異性抗体（Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１７７）等のこれらの抗原結合断片であってもよい。本発明に係る抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡ等の任意の免疫グロブリンのクラスに属していてもよい。前記抗体は、動物、例えば家禽（例えば、ニワトリ）若しくは哺乳類から得ることができるか、又は由来し、前記哺乳類としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は他の齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、又は他の霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、内在抗体であってもよく、又は抗体は、細胞膜を通過して容易に輸送され得るように修飾されていてもよい。
【００６９】
本明細書に提供される所望の抗体又は親和性／アラインメントドメインを同定及び調製するために、抗体（親和性／アラインメントドメインの例として、例示的及び非限定的に用いられる）のその特異的抗原（アナライトの例として、例示的及び非限定的に用いられる）に対する結合性は、一般的に、例えば、当業者が容易に実施することができる、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、放射性免疫測定、イムノブロット等が挙げられる従来の免疫検出法を用いて評価することができる。また、抗原／リガンドの立体構造エピトープに結合する抗体を検出するために用いられるとき、かかる免疫検出法は、潜在的に抗原を変性し、延いてはリガンド立体構造エピトープを変化若しくは破壊し得る任意の試薬又は条件を避けることが好ましい場合があることを当業者はよく理解するであろう。
【００７０】
当該技術分野において周知であり且つ本明細書に記載される方法を用いて、必要に応じて特定の抗原に対して特異的である抗体（ポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を含む）を作製することができる。また、抗体は、所望の性質を有するよう設計された、遺伝的に改変されている免疫グロブリン（Ｉｇ）又はＩｇ断片として生成することができる。例えば、例として、また限定するものではなく、抗体は、第１の哺乳類種由来の少なくとも１つの可変（Ｖ）領域ドメインと、第２の異なる哺乳類種に由来する少なくとも１つの定常領域ドメインとを有するキメラ融合タンパク質である組換えＩｇＧを含んでいてもよい（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−５５（１９８４）；Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４５９−７６（１９８９）；Ｗａｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２９２１−２９（１９９３）；米国特許第５，４８２，８５６号を参照）。最も一般的には、キメラ抗体は、マウス可変領域配列及びヒト定常領域配列を有する。かかるマウス／ヒトキメラ免疫グロブリンは、抗原に対する結合特異性を付与するマウス抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト由来Ｖ領域フレームワーク領域及びヒト由来定常領域にグラフトすることにより「ヒト化」されてもよい（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  ９：１３３−３９（１９９５）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：３７７−３８３（１９８９）；Ｂａｊｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９５−１０３（１９９５）；ＥＰ−０５７８５１５−Ａ３参照）。これら分子の断片は、タンパク質分解により、又は場合により、タンパク質分解後、ジスルフィド結合及びアルキル化を穏やかに還元することにより作製され得る。或いは、かかる断片は、組換え遺伝子改変技術によっても作製することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．Ｊ．，Ａｄａｉｒ，Ｊ．Ｒ．，（Ｅｄｓ．）１９９７  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。
【００７１】
免疫特異的である（即ち、特異的である親和性／アラインメントドメイン）、又は本明細書に提供されるコグネート抗原（即ち、アナライト）に特異的に結合する抗体は、好ましくは約１０４Ｍ−１以上、より好ましくは約１０５Ｍ−１以上、より好ましくは約１０６Ｍ−１以上、更により好ましくは約１０７Ｍ−１以上の親和性定数Ｋａで、抗原／アナライトと検出可能なレベルで反応するが、異なる又は関連しない構造を有する分子とは反応しない。また、そのコグネート抗原に対する抗体の親和性は、一般的に、解離定数ＫＤとして表され、抗体が、１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、又は１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する場合、抗体は抗原に対して特異的に結合する。結合パートナー又は抗体の親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄらにより記載されている技術（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０（１９４９））、又は表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）等の従来の技術を用いて容易に決定することができる。例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５（１９９３）参照。或いは、本明細書に記載される他の方法に従って決定することもできる。
【００７２】
抗体は、一般的に、当業者に既知である多様な技術のいずれかにより調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）参照。１つのかかる技術では、例えば、確立されている方法に従って好適なキャリア上のヘプテンとして、ポリクローナル抗血清に対する抗原として、抗原／アナライトの免疫原性形態で動物を免疫する。好適な動物としては、例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ等が挙げられ、また、マウス、ラット及びハムスター等の小さな哺乳類種、又は他の種を挙げることもできる。
【００７３】
免疫原は、精製された抗原、部分的に精製された抗原、又は対象アナライトを含んでもよいか、又は抗原（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は代謝産物である抗原）を発現している細胞、若しくは抗原がその免疫原性を高める方法で導入されている細胞を含んでもよい。ペプチド又はポリペプチド抗原は、標準的な組換え遺伝子技術を用いて、又は自然界に存在するタンパク質をタンパク質分解することにより、又は化学的に合成することにより、作製することができる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は液体クロマトグラフィー若しくは他の好適な方法等の多様な他の分離法のいずれか等、当該技術分野において既知である技術によりペプチドを単離することができる。
【００７４】
ポリペプチド又はペプチドである抗原に対する抗体を増加させるために、免疫原として有用なペプチドは、典型的には、ポリペプチド配列に由来する少なくとも４個又は５個の隣接するアミノ酸のアミノ酸配列を有していてもよく、好ましくはポリペプチド配列の少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、１９個、又は２０個の隣接するアミノ酸のポリペプチド配列を有する。特定の他の好ましいペプチド免疫原は、２１個〜２５個、２６個〜３０個、３１個〜３５個、３６個〜４０個、４１個〜５０個、又はそれ以上の、隣接するアミノ酸のポリペプチド配列を含んでいてもよい。また、免疫に有用なポリペプチド又はペプチドは、ホスト動物において抗原応答を生じさせる可能性が高いアミノ酸配列を決定するために、当業者に既知である方法に従って対象ポリペプチド抗原／アナライトの一次構造、二次構造、及び三次構造を分析することにより選択することができる。例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ，１９９１  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０１−２０７；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，１９８５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９３２−４０；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：８６３−６８（１９９５）；Ｋｏｌａｓｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｏｌｏｇｙ  ２６１：３１−４２（１９９９））参照。前記ポリペプチド又はペプチドは、生物学的に活性である形態のポリペプチド／アナライトの立体構造に近い方法で折り畳むのに十分な数のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００７５】
当該技術分野において周知の方法に従って、免疫原を調製し、動物を免疫することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）参照。免疫応答は、動物から定期的に採血し、回収した血液から血清を分離し、ＥＬＩＳＡ又はＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ拡散アッセイ等の免疫アッセイで前記血清を分析して、特異的抗体の力価を決定することによりモニタできる。一旦抗体力価を確立すると、動物から定期的に採血して、ポリクローナル血清を蓄積してもよい。次いで、抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体を、例えば、精製される抗体（１又は複数）の定常領域（重鎖又は軽鎖）に特異的に結合する黄色ブドウ球菌プロテインＡ又はプロテインＧ、又は好適な固体支持体上に固定化された抗原／アナライトを用いて、親和性クロマトグラフィーによりかかる抗血清から精製することができる。
【００７６】
また、抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体、又は所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生する不死真核細胞株であるハイブリドーマは、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７５））の技術、及び当業者によく知られているその改良法を用いて調製してもよい。例えば、ラット、ハムスター、又はマウス等の動物を、免疫原で免疫し；前記免疫された動物から抗原形成細胞、典型的には脾臓細胞を含むリンパ系細胞を得；かかる細胞を、選択剤感作骨髄腫（例えば、形質細胞腫）細胞融合パートナーと融合させることにより不死化することができる。
【００７７】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離することができるか、又はモノクローナル抗体を含有する腹水性流体の形成を促進するために処理された（例えば、プリスタンで刺激された）マウスから単離することもできる。抗体は、モノクローナル抗体（例えば、重鎖又は軽鎖アイソタイプ、結合特異性等）の具体的な性質に基づいて選択される適切なリガンドを用いて親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。固体支持体上に固定化される好適なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖又は重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、及び特異的抗体が望まれる抗原／アナライトが挙げられる。ヒトモノクローナル抗体は、当業者によく知られている多数の技術により作製することができる。
【００７８】
また、例えば、ヒト免疫グロブリンファージライブラリから、ウサギ免疫グロブリンファージライブラリから、及び／若しくはニワトリ免疫グロブリンファージライブラリから周知のファージディスプレイ技術を用いて（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０；米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：４７−５２及びこの中に引用されている参照文献；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１３６６８−７６（２０００）；Ｐｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：３２５−３５（２００３）；Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９−３１（２０００）参照）、又はリボソームディスプレイ（例えば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４１３０）、若しくは酵母ディスプレイ（例えば、Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８：３４８）等の他の方法により、抗体及び他の親和性／アラインメントドメインポリペプチドを同定及び単離することができる。非ヒト種又は非ヒト免疫グロブリンライブラリから単離された抗体は、本明細書に記載される方法及び当該技術分野において既知である方法に従って遺伝的に改変して、例えば、抗体又はその断片の親和性を最適化する、又はキメラ化する、又は「ヒト化」することができる。
【００７９】
特定の実施形態では、所望の特異性を有する抗体を産生している免疫動物に由来するＢ細胞が選択され、当該技術分野において既知である（国際公開第９２／０２５５１号、米国特許第５，６２７，０５２号、Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８（１９９６））、及び本明細書に記載される分子生物学的技術に従ってＢ細胞から軽鎖及び重鎖可変領域がクローニングされる。免疫動物に由来するＢ細胞は、対象抗原／アナライトに特異的に結合する抗体を産生している細胞を選択することにより、脾臓、リンパ節、又は末梢血サンプルから単離されることが好ましい。また、Ｂ細胞は、ヒトの、例えば末梢血サンプルから単離してもよい。
【００８０】
また、抗体断片は、特異的抗原と結合して複合体を形成するという点で抗体と同様に作用する任意の合成タンパク質、又は遺伝的に改変されているタンパク質であってもよい。例えば、抗体断片としては、軽鎖可変領域からなる単離断片、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーにより連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖタンパク質）、並びに超可変領域を模倣しているアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。かかる抗体断片は、少なくとも１つの可変領域ドメインを含むことが好ましい（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；欧州特許第Ｂ１−０３１８５５４号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；及び米国特許第５，４７６，７８６号参照）。
【００８１】
特定の実施形態では、抗原／アナライトに特異的に結合する抗体は、細胞内タンパク質として発現する抗体であってもよい。また、かかる細胞内抗体は、イントラボディとも呼ばれ、Ｆａｂ断片を含んでもよく、ＳｃＦｖ断片を含むことが好ましい（例えば、Ｌｅｃｅｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：４７６４−４９（２００１）参照）。ＣＤＲ領域に隣接するフレームワーク領域を、細胞内還元性環境におけるイントラボディの発現量及び溶解度が改善されるよう修飾してもよい（例えば、Ｗｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２７９５−８０３（２０００）参照）。例えば、細胞内の特定の標的抗原をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に融合することができるイントラボディの可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを構築することにより、特定の細胞の位置又はオルガネラにイントラボディを導くことができる（例えば、Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：１１８２−９１（１９９５）；Ｌｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１１９６−２０５（２０００）参照）。遺伝子治療用ベクター、又は脂質混合物（例えば、Ｉｍｇｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ製Ｐｒｏｖｅｃｔｉｎ（商標））を介する方法を含む当業者が利用可能な種々の技術により、又は光化学内在技術に従って、イントラボディを細胞に導入することができる。
【００８２】
本明細書に記載されるように、対象抗原／アナライトに特異的に結合する抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、多数の既知の発現ベクターを用いて、核酸の切り出し、ライゲーション、形質転換、及びトランスフェクションのための多様な周知の手順のいずれかに従って増殖及び発現させることができる。したがって、特定の実施形態では、抗体断片は、大腸菌等の原核生物ホスト中で発現することが好ましい場合がある（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５参照）。特定の他の実施形態では、抗体又はその断片は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、真菌（例えば、Ｎ．ｃｒａｓｓａ細胞等のＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ属細胞）、動物細胞（哺乳類細胞を含む）、又は植物細胞が挙げられる真核生物ホスト細胞中で発現させてもよい。好適な動物細胞の例としては、骨髄腫、ＣＯＳ、ＣＨＯ、又はハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、及びイネ細胞が挙げられる。対象抗原／アナライトに特異的に結合する抗体は、抗体のＫｄを測定するためのアッセイ等、上記のような抗体親和性を測定するためのアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【００８３】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、突然変異体ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド、及び当該技術分野において既知である配列と同一であるか若しくは類似しているアミノ酸配列領域を有する融合タンパク質、又はこれらの断片若しくは一部を含む。例えば、例示的であって限定するものではないが、突然変異体バクテリオファージｐｈｉ２９ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質［例えば、配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＣＥ９６０３３］又は改変バクテリオファージｐｈｉ２９ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド融合タンパク質（例えば、配列番号３１〜３５、及び４１〜４５）が、本発明に従って使用するために考えられ、前記タンパク質は、例えば、報告されているポリペプチドと少なくとも８０％の類似性（好ましくは８０％の同一性）、より好ましくは９０％の類似性（より好ましくは９０％の同一性）を有し、更により好ましくは本明細書に開示されるポリペプチド、及びかかるポリペプチドの一部と９５％の類似性（更により好ましくは９５％の同一性）を有するポリペプチドであり、突然変異体又は改変ｐｈｉ２９ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドのかかる一部は、概して、少なくとも１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、又はそれ以上のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２４０個、２６０個、２８０個、２８５個、２９０個、２９５個、２９６個、２９７個、２９８個、２９９個、３００個、３０１個、３０２個、３０３個、３０４個、３０５個、３０６個、３０７個、３０８個、３０９個、３１０個、３１１個、３１２個、３１３個、３１４個、３１５個、３１６個、３１７個、３１８個、３１９個、３２０個、３２１個、３２２個、３２３個、３２４個、３２５個、３２６個、３２７個、３２８個、３２９個、３３０個又はそれ以上のアミノ酸を含む。
【００８４】
同様に、特定の他の実施形態では、ファージＴ４ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド［配列番号７］、ラムダファージＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド［配列番号８〜１１］（アクセッション番号ｇｉ５４９２９５、ｇｉ６７２３２４６、ｇｉ１５８３７３１５、ｇｉ１６７６４２７３）、ファージＳＰＰ１ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド［配列番号１２］（アクセッション番号Ｐ５４３０９）、ファージＰ２２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド［配列番号１３］（アクセッション番号ＡＡＡ７２９６１）、ファージＰ２ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド［配列番号１４］（アクセッション番号ＮＰ＿０４６７５７）、ファージＰ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド（Ｎｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０（３）：５６０−２）、ファージＴ３ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド［配列番号１５］（アクセッション番号ＣＡＡ３５１５２）、ファージＴ５ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド［配列番号１６〜１９］（アクセッション番号ＡＡＸ１２０７８、ＹＰ＿００６９８０、ＡＡＳ７７１９１、ＡＡＵ０５２８７）、及びファージＴ７ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド［配列番号２０］（アクセッション番号ＮＰ＿０４１９９５）の突然変異型等の他の突然変異体二本鎖ＤＮＡバクテリオファージウイルスモータコネクタタンパク質も考えられる。
【００８５】
本発明の特定の実施形態は、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド、突然変異体ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド、及び改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタコネクタポリペプチド融合タンパク質に関し、特定の実施形態は、突然変異体ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチド、及び改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタポリペプチド融合タンパク質、例えば、本明細書に提供されるモータタンパク質コネクタの開孔部ドメインを含み、且つ本明細書に提供される可撓性ドメイン及び親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方も含むウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質融合ポリペプチド等のウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質をコードするコンストラクトに関し、また、特に、ホモドデカマーであるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に自己集合可能であり、且つ例えば及び特定の関連する実施形態では、かかるポリペプチドの断片、類似体、及び誘導体として発現可能なタンパク質をコードする組換えコンストラクトのポリペプチド産物を用いて伝導性チャネル含有膜を作製するための方法に関する。
【００８６】
また、かかる突然変異体ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドの変異体、断片、誘導体、トランケート型等も考えられ、その産生、構造の特性評価（例えば、本明細書に提供される開孔部ドメインと、可撓性ドメイン及び親和性／アラインメントドメインのいずれか又は両方との存在について）、及び機能試験（例えば、これも本明細書に記載されているように、脂質膜に組み込まれたときの開孔部形成性について）の常法も含めて、以下でより詳細に論じられる。特定の好ましい実施形態によれば、本明細書に開示される組成物及び方法において使用するための突然変異体ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタポリペプチドは、本明細書に提供されるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドサブユニット等の二本鎖ＤＮＡバクテリオファージＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える割合の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、例示的であって限定するものではないが、配列番号１〜２０、３１〜３５、及び４１〜４５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含んでもよい。
【００８７】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質又はポリペプチドに言及するとき、用語「断片」、「誘導体」、及び「類似体」とは、本明細書に記載される任意の突然変異体ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド、又はかかるポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能又は活性を保持している、かかるポリペプチドを含む融合タンパク質を指す。したがって、類似体は、前駆タンパク質部分を切断することにより活性化され、活性ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタポリペプチドを作製することができる前駆タンパク質を含み、前記ポリペプチドは、好ましい実施形態では、膜層に組み込まれて、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成する、及び／又は伝導性チャネル含有膜を得るためにかかる開孔部を形成し得るような、ホモドデカマーであるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に自己集合可能である。
【００８８】
本明細書に言及されるｃＤＮＡがコードするポリペプチド若しくは融合タンパク質、又はこれらのドメイン若しくは部分を含む、本明細書に記載されるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドの断片、誘導体、又は類似体と、そのヌクレオチドコード配列は、当該技術分野において既知である及び／又は本明細書に開示されるポリペプチド配列から推測することができ、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が、保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されており、且つかかる置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされているアミノ酸であってもなくてもよい配列、又は（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含む配列、又は（ｉｉｉ）突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド、又は前駆タンパク質配列の検出又は特定の機能変更のために使用されるアミノ酸を含む更なるアミノ酸が突然変異体ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドと融合している配列であってもよい。
【００８９】
当該技術分野において既知であるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存アミノ酸置換体と、第２のポリペプチドの配列とを比較することにより決定される。本明細書に開示される実施形態に係るポリペプチドをコードする核酸の断片又は部分を用いて、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする完全長核酸を合成することができる。本明細書で使用するとき、「同一性（％）」は、２以上のポリペプチドのアラインメントを行い、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／ＮＣＢＩデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）により提供されるデフォルトの重み付けに従って、配列ギャップ及び配列不一致に重みを加えるギャップＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２５：３３８９）を用いて配列解析したときの、対応するアミノ酸残基位置に存在する同一アミノ酸の割合を指す。
【００９０】
用語「単離」とは、物質が、元々存在していた環境（例えば、自然界に存在する場合、自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生存している動物の体内に存在する天然核酸若しくはポリペプチド、又は自然界に存在するインタクトなウイルスは単離されていないが、天然系において共存している物質の一部又は全てから分離された同核酸又はポリペプチドは、単離されている。かかる核酸は、ベクターの一部であってもよ、及び／又はかかる核酸若しくはポリペプチドは、組成物の一部であってもよいが、かかるベクター又は組成物は、その自然環境の一部ではないという点で依然として単離されている。
【００９１】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の産生に関与しているＤＮＡのセグメントを意味し、コード領域の前後に存在する「リーダー及びトレイラー配列」に加えて、個々のコードセグメント（エキソン）間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００９２】
本明細書に記載されるとき、特定の本発明の実施形態は、例えば、例示的であって限定するものではないが、得られる融合タンパク質の検出、機能変更、単離、及び／又は精製を可能にする、更なる機能的融合ポリペプチド配列に融合している、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドを発現させるための、更なる融合ポリペプチドをコードする配列にインフレームで融合している突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドのコード配列を有する核酸によりコードされる突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド及び融合タンパク質を提供する。
【００９３】
かかる融合タンパク質は、例えば、膜、例えば膜二重層中のリン脂質等の両親媒性膜成分との相互作用を変化させる（例えば、適切な対照に対して統計的に明らかに増加又は減少させる）方法で、タンパク質表面に露出している荷電及び／又は疎水性アミノ酸側鎖の利用可能性を変化させることによって、融合産物の挙動に影響を与える更なるポリペプチド配列を含有することにより、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドの機能を変化させることができる。非限定的な理論によれば、これら及び関連する実施形態では、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来する融合ポリペプチドは、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質配列のトランケーション、又は野生型ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質にはみられないポリペプチドドメイン（例えば、本明細書に提供される可撓性ドメイン又は親水性／アラインメントドメイン）の付加にもかかわらず、より安定な膜への組み込みを示すことができ、並びに／又は開孔部の大きさ増加、親水性、疎水性、中性、及び電荷アミノ酸側鎖の少なくともいずれかの分布変更、及び／若しくは伝導性開孔部構造の保存等の望ましい性質を有する開孔部を提供する方法で、膜に電位を印加したときコンダクタンスが生じ得る開孔部を形成し得る。
【００９４】
例示的ポリペプチド（例えば、本明細書に提供される突然変異体又は改変ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質サブユニット、例えば、本明細書に提供される可撓性ドメイン及び／又は親水性／アラインメントドメインを有するポリペプチド融合タンパク質）の三次元構造の決定は、選択された天然又は非天然アミノ酸による１以上のアミノ酸の置換、付加、欠失、又は挿入を、このように誘導された構造変異体が現在開示されている種の空間充填性を保持しているかどうかを判定するために実質的にモデル化することができるように、常法を用いて行うことができる。例えば、Ｄｏｎａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．３：２３７８；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１８６８−１８７１（２００５）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６３８（２００５）；Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１２４４（２００６）；Ｄｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：１７６（２００７）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：２５９（２００７）を参照。本明細書に提供される可撓性ドメイン又は親水性／アラインメントドメインの合理的設計のため等に、これら及び関連する実施形態で用いることができるコンピュータアルゴリズムの更なる幾つかの非限定的な例としては、エネルギー最小化立体構造の空間充填モデル（ファンデルワールス半径）から原子の大きさを決定するＤｅｓｋｔｏｐ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｅｒ（例えば、Ａｇｂｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，４０：４１６５０−５７（２００４）参照）；異なる化学基に対して親和性の高い領域を決定して、結合を促進しようとするＧＲＩＤ；数学的アラインメントを算出するモンテカルロ探索、並びにＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７）及び力場の算出及び分析を評価するＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１０６：７６５）（また、Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｃ３７６−３８６；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４６：４９−５４；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６４０−６４４；Ｂｕｒｂａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：９９−１１１；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．６１：１８５−１９０；及びＫｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．９：４７５−４８８も参照）が挙げられる。
【００９５】
１つの実施形態では、本発明は、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来する融合ポリペプチドで用いるためのトランケート型要素（例えば、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドの断片）を提供し、本発明の別の実施形態は、かかるトランケート型要素を有する突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００９６】
トランケート型分子は、完全長よりも短い分子を含む任意の分子、例えば、トランケート型ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質ポリペプチドサブユニットであってもよい。本発明により提供されるトランケート型分子は、トランケート型生物学的ポリマーを含んでもよく、本発明の好ましい実施形態では、かかるトランケート型分子は、トランケート型核酸分子又はトランケート型ポリペプチドであってもよい。トランケート型核酸分子は、既知の又は記載されている核酸分子の完全長ヌクレオチド配列よりも短く、ここでかかる既知の又は記載されている核酸分子は、当業者がそれを完全長分子とみなす限り、天然、合成、又は組換え核酸分子のいずれであってもよい。したがって、例えば、遺伝子配列に対応するトランケート型核酸分子は、コード配列、非コード配列、プロモータ、エンハンサ、及び他の制御配列、隣接配列等、並びに遺伝子の一部として認識される他の機能性及び非機能性配列を含む完全長遺伝子よりも短い。別の例では、ｍＲＮＡ配列に対応するトランケート型核酸分子は、種々の翻訳領域及び非翻訳領域に加えて、他の機能性及び非機能性配列を含み得る完全長ｍＲＮＡ転写産物よりも短い。
【００９７】
他の好ましい実施形態では、トランケート型分子は、特定のタンパク質又はポリペプチド要素の完全長アミノ酸配列よりも短いポリペプチドである。本明細書で使用するとき、「欠失」は、当業者に理解されるような一般的な意味を有し、例えば、本明細書に提供されるトランケート型分子の場合、対応する完全長分子に対して、末端領域又は非末端領域のいずれかの配列の１以上の部分を欠く分子を指すことができる。核酸分子又はポリペプチド等の直線状生物学的ポリマーであるトランケート型分子は、分子の末端からの欠失、又は分子の非末端領域からの欠失のうちの１以上を有してもよく、ここでかかる欠失は、１個〜１，５００個の隣接するヌクレオチド又はアミノ酸残基、好ましくは１個〜５００個の隣接するヌクレオチド又はアミノ酸残基、より好ましくは１個〜３００個の隣接するヌクレオチド又はアミノ酸残基の欠失であってもよく、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個〜４０個、４１個〜５０個、５１個〜７４個、７５個〜１００個、１０１個〜１５０個、１５１個〜２００個、２０１個〜２５０個、又は２５１個〜２９９個の隣接するヌクレオチド又はアミノ酸残基の欠失等を含む。特定の特に好ましい実施形態では、トランケート型核酸分子は、３個〜７５個の隣接するヌクレオチドの欠失を有し得る。特定の他の特に好ましい実施形態では、トランケート型ポリペプチド分子は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個〜４０個、又は４１個〜５０個の隣接する（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）アミノ酸の欠失を有し得る。
【００９８】
ネイティブなアミノ酸配列の変更は、多数の従来の方法のいずれにより行ってもよい。突然変異は、ネイティブな配列の断片にライゲーション可能な制限酵素部位に隣接する、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の位置に導入することができる。ライゲーション後、得られる再構成された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、又は欠失を有する類似体をコードする。
【００９９】
或いは、置換、欠失、又は挿入により既定のコドンを変更することができるオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発手順を使用して、変更遺伝子を提供することができる。かかる変更を行う例示的な方法は、Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号及び同第４，７３７，４６２号に開示されている。
【０１００】
例として、ＤＮＡの修飾は、オーバーラップ伸長（ＳＯＥ）によるＰＣＲスプライシング等、プライマーを用いてＤＮＡテンプレート中に変異を導入し増幅させるＤＮＡ増幅法の使用と組み合わせて、タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を行うことにより実施できる。部位特異的突然変異誘発は、典型的には、周知且つ市販されているＭ１３ファージベクター等の単鎖及び二本鎖型ファージベクターを用いて引き起こされる。単鎖ファージの複製起点を含む他の好適なベクターを用いてもよい（例えば、Ｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５：３，１９８７参照）。一般に、部位特異的突然変異誘発は、対象タンパク質をコードする単鎖ベクターを調製することにより実施される。単鎖ベクター中のＤＮＡに対して相同な領域内に所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、ベクターにアニーリングさせ、次いで、プライマーとして二本鎖領域を用いる大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ等のＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）を添加して、一方の鎖が変更配列をコードし、他方の鎖が元来の配列をコードするヘテロ二重鎖を生成させる。前記二重鎖を適切な細菌細胞に導入し、所望の突然変異を含むクローンを選択する。得られた変更ＤＮＡ分子は、適切なホスト細胞中で組換えＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を生成することができる。
【０１０１】
また、多様な、アミノ酸残基若しくは配列の付加又は置換、或いは生物活性に必要ではない末端若しくは内部残基又は配列の欠失をコードする等価なＤＮＡコンストラクトも、本発明の特定の実施形態に包含される。例えば、特定の考えられる実施形態によれば、生物活性にとって望ましくない、又は必須ではないＣｙｓ残基をコードする配列を変更して、前記Ｃｙｓ残基を欠失させるか又は他のアミノ酸に置換し、復元時に不正確な又は不所望の分子内ジスルフィド結合が形成されるのを防ぐことができる。
【０１０２】
ポリペプチドの修飾は、関連する技術分野の当業者に既知である任意の手段により行うことができる。本明細書において好ましい方法は、融合タンパク質をコードするＤＮＡの修飾、及び前記修飾ＤＮＡの発現に依存する。上記で論じた突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド融合体の１つをコードするＤＮＡは、以下に記載する方法を含む標準的な方法を用いて突然変異誘発することができる。例えば、多量体形成を促進し得るか、本明細書に記載される伝導性チャネル含有膜により検出されるアナライト上に存在する反応基との相互作用を仲介し得るか、又は特定の分子の立体構造を促進し得るシステイン残基、例えば、不所望の凝集体形成に関与するシステイン残基を、ポリペプチドから欠失させるか又は置換することができる。必要に応じて、かかる凝集体形成の一因となるシステイン残基は、システイン残基を欠失及び／又は置換し、得られるタンパク質が生理学的に許容可能なバッファ及び塩を含有する溶液中で凝集体を形成するかどうかを確認することにより、経験的に同定することができる。更に、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド融合体の断片を構築し用いてもよく、前記断片は、特定の好ましい実施形態では、かかるポリペプチドの膜貫通開孔部形成部分を含む断片を含む。かかる断片の設計、生成、及び試験は、例えば、本明細書で論じられるようなコンピュータでモデル化されたポリペプチド設計、組換え発現、膜層への機能的組み込み、及びコンダクタンス試験を含む当該技術分野において既知の技術と本開示とに基づいて行うことができる。
【０１０３】
アミノ酸の保存的置換は、周知であり、且つ概して、得られる突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。例えば、かかる置換は、概して、極性残基、荷電残基、疎水性残基、小残基等のグループ内で交換することにより行われる。必要に応じて、かかる置換は、例えば、本明細書に記載されるようなインビトロアッセイにおいて、ドデカマーの自己集合、膜層への組み込み、伝導性開孔部の形成、及び／又はアナライトの検出等の能力変化（即ち、統計的に有意な増加又は減少）について、得られる修飾タンパク質を単に試験することにより、経験的に決定することができる。
【０１０４】
本発明は、更に、配列間で少なくとも７０％、好ましくは８０％〜８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性が存在する場合、当業者に明らかであるように、本明細書に提供される突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補配列にハイブリダイズする核酸に関する。本発明は、具体的には、本明細書に言及される突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に関する。本明細書で使用するとき、用語「ストリンジェントな条件」とは、配列間で少なくとも９０％〜９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じる条件を意味する。本明細書に言及される突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸は、好ましい実施形態では、本明細書に記載される突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能又は活性（例えば、ドデカマーの自己集合、膜層への組み込み、伝導性開孔部の形成、アナライトを検出する能力）を保持しているポリペプチドをコードする。
【０１０５】
本明細書で使用するとき、特定のストリンジェンシーの条件下で「ハイブリダイズ」するとは、２つの単鎖核酸分子間で形成されるハイブリッドの安定性について記載するために用いられる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、典型的には、かかるハイブリッドがアニーリング及び洗浄されるイオン強度と温度条件で表される。典型的には、「高」、「中」、及び「低」ストリンジェンシーは、以下の条件又はそれと等価な条件を包含する：高ストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ又はＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃；中ストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ又はＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃；及び低ストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ又はＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃。当業者に既知であるように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄工程で用いられる時間、温度、及び／又は溶液濃度の変更により変化する場合があり、また好適な条件は、用いられるプローブ、及びブロットされるプロバンド核酸サンプルの具体的なヌクレオチド配列に部分的に依存する場合もある。したがって、好適にストリンジェントな条件は、１以上の特定のプロバンド配列にハイブリダイズするが、特定の他のプロバンド配列にはハイブリダイズしない能力に基づいて所望の選択性のプローブを同定する過度の実験を行うことなしに容易に選択できることが理解されるであろう。
【０１０６】
また、本明細書ではポリヌクレオチドとも呼ばれる本発明の核酸は、ＲＮＡ形態であってもよく、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含むＤＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード鎖であっても非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。特定の発明の実施形態に従って使用するための突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードするコード配列は、当該技術分野において既知であるウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質のコード配列の一部と同一である配列領域を含んでいてもよく、又は、遺伝子コードの重複性又は縮重の結果として、かかる理由のために前記ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質のポリペプチドと同じ領域をコードする、異なるコード配列を有していてもよい。
【０１０７】
特定の本発明の実施形態に従って使用するための突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸としては、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドのコード配列のみ；突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドのコード配列と、更なるコード配列；突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドのコード配列（及び任意に更なるコード配列）と、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドのイントロン、又はコード配列の５’及び３’非コード配列の少なくともいずれか等の非コード配列であって、例えば、制御される又は制御可能なプロモータ、エンハンサ、他の転写制御配列、リプレッサ結合配列、翻訳制御配列、又は任意の他の制御核酸配列であり得る１以上の制御核酸配列を更に含んでもよいが、これらに限定する必要はない配列；を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドを「コードする核酸」又は「コードするポリヌクレオチド」という用語は、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドのコード配列のみを含む核酸に加えて、更なるコード配列及び／又は非コード配列（１又は複数）を含む核酸も包含する。
【０１０８】
本明細書に記載されるように使用するための核酸及びオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において既知である任意の方法によって合成することができる（例えば、国際公開第９３／０１２８６号、米国特許出願第０７／７２３，４５４号、米国特許第５，２１８，０８８号、米国特許第５，１７５，２６９号、米国特許第５，１０９，１２４号参照）。本明細書に開示される実施形態で用いるためのオリゴヌクレオチド及び核酸配列の同定は、当該技術分野において周知の方法を含む。例えば、有用なオリゴヌクレオチドの所望の性質、長さ、及び他の特徴は、周知である。特定の実施形態では、合成オリゴヌクレオチド及び核酸配列は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、ホスフェートエステル等の結合、及びアンチセンスの適用において有用であることが証明されている他のかかる結合を含むことにより、内因性ホスト細胞の核酸分解酵素による分解に対する耐性を有するよう設計してもよい（例えば、Ａｇｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７−６６６５（１９７１）；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４（１９８５）；Ｍｏｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２（１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４０：１３７−１４３（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２（１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００（１９８９）；Ｓｔｅｉｎ  Ｉｎ：Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｈｅｎ，Ｅｄ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．９７−１１７（１９８９）；Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：７２３７−７２４６（１９８８））参照）。
【０１０９】
ホスト生物としては、インビトロ及びインビボ発現を含む、細菌（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシア及びピキア・パストリス）、昆虫細胞、及び哺乳類等の、本明細書に開示される本発明の特定の実施形態の組換えコンストラクトによりコードされる突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド産物の組換え生成を行うことができる生物が挙げられる。したがって、ホスト生物は、本明細書に提供される組成物の生成における構築、増殖、発現、又は他の工程のための生物を挙げることができる。本明細書において好ましいホスト生物は、大腸菌株である。
【０１１０】
所望の突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトは、適切なホストにおいて発現させるためにプラスミドに導入される。特定の好ましい実施形態では、ホストは、細菌ホストである。リガンド又は核酸結合ドメインをコードする配列は、特定のホストで発現させるためにコドンが最適化されていることが好ましい。したがって、例えば、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドが細菌中で発現する場合、コドンは、細菌の使用に対して最適化される。小さなコード領域の場合、単一オリゴヌクレオチドとして遺伝子を合成することができる。大きなタンパク質の場合、当該技術分野において既知である複数のオリゴヌクレオチドのスプライシング、突然変異誘発、又は他の技術を用いることができる。プロモータ及びオペレータ等の制御領域である、プラスミド中のヌクレオチド配列は、転写のために互いに機能的に連結している。また、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、分泌シグナルをコードするＤＮＡを含んでいてもよく、それによって得られるペプチドは、前駆体タンパク質である。得られるプロセシングされたタンパク質は、細胞周辺腔又は発酵培地から回収することができる。
【０１１１】
好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、転写ターミネータ配列も含む。本明細書で使用するとき、「転写ターミネータ領域」は、転写の終結を伝える配列である。完全な転写ターミネータは、挿入された突然変異体若しくは改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする遺伝子、又はプロモータ源と同じであってもよく、異なっていてもよいタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。転写ターミネータは、本明細書における発現系の任意成分であるが、好ましい実施形態では使用される。
【０１１２】
本明細書で使用されるプラスミドは、対象タンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡと機能的に連結しているプロモータを含み、プラスミドの所望の用途によって、上記のような好適なホスト（例えば、細菌、マウス、又はヒト）中でタンパク質を発現するように設計される。本明細書におけるタンパク質及びポリペプチドを発現させるための好適なプロモータは、広く入手可能であり、当該技術分野において周知である。制御領域に連結されている誘導性プロモータ又は構成プロモータが好ましい。かかるプロモータとしては、Ｔ７ファージプロモータ、並びにＴ３、Ｔ５、及びＳＰ６プロモータ等の他のＴ７様ファージプロモータ、大腸菌由来のｔｒｐ、ｌｐｐ、及びｌａｃＵＶ５等のｌａｃプロモータ、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のＰ１０又はポリヘドリン遺伝子プロモータ（例えば、米国特許第５，２４３，０４１号、同第５，２４２，６８７号、同第５，２６６，３１７号、同第４，７４５，０５１号、及び同第５，１６９，７８４号を参照）、並びに他の真核生物発現系由来の誘導性プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の発現では、かかるプロモータは、ｌａｃオペロン等の調節領域と機能的に連結するようプラスミドに挿入される。
【０１１３】
好ましいプロモータ領域は、大腸菌において誘導性且つ機能的であるプロモータ領域である。好適な誘導性プロモータ及びプロモータ領域の例としては、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １８：１１０９−１１１７，１９７９参照）に応答する大腸菌ｌａｃオペレータ；重金属（例えば、亜鉛）誘導に応答するメタロチオネインプロモータ金属制御エレメント（例えば、Ｅｖａｎｓ等による米国特許第４，８７０，００９号参照）；ＩＰＴＧに応答するファージＴ７ｌａｃプロモータ（例えば、米国特許第４，９５２，４９６号、及びＳｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９，１９９０参照）、及びＴＡＣプロモータが挙げられる。
【０１１４】
場合によって、プラスミドは、ホストにおいて機能することができる選択性マーカー遺伝子（１又は複数）を含んでいてもよい。選択性マーカー遺伝子としては、大多数の形質転換されていない細胞の中から形質転換されている細菌細胞を同定し且つ選択的に増殖させることができる表現型を細菌に付与する任意の遺伝子を含む。細菌ホスト用の好適な選択性マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、及びカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられる。
【０１１５】
また、プラスミドは、機能的に連結されているタンパク質を分泌するためのシグナルをコードするＤＮＡを含んでいてもよい。使用に好適な分泌シグナルは、広く入手可能であり、当該技術分野において周知である。大腸菌で機能することができる原核生物又は真核生物の分泌シグナルを使用することができる。本明細書において好ましい分泌シグナルとしては、以下の大腸菌遺伝子：ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＣ、ベータ−ラクタマーゼ、及びアルカリホスファターゼ等によりコードされるシグナルが挙げられるが、これらに限定されない（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８５）。更に、細菌のｐｅｌＢ遺伝子の分泌シグナル（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４３７９，１９８７）、ｐｈｏＡ分泌シグナル、及び昆虫細胞で機能することができるｃｅｋ２を使用することができる。最も好ましい分泌シグナルは、大腸菌ｏｍｐＡ分泌シグナルである。大腸菌ＹｅｂＦキャリアタンパク質を含む融合ドメイン（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００）であってもよい等、当業者に既知である他の原核生物及び真核生物分泌シグナルを使用してもよい（例えば、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８５参照）。本明細書に記載される方法を用いて、当業者は、酵母、昆虫、又は哺乳類細胞で機能し得る分泌シグナルを代わりに用いて、前記細胞からタンパク質を分泌させることができる。
【０１１６】
大腸菌細胞の形質転換に好ましいプラスミドとしては、ｐＥＴ発現ベクターが挙げられる（例えば、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−１２ａ−ｃ、ｐＥＴ−１５ｂ；米国特許第４，９５２，４９６号を参照；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）。他の好ましいプラスミドとしては、ｔａｃプロモータを含むｐＫＫプラスミド、特にｐＫＫ２２３−３が挙げられる（Ｂｒｏｓｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６９２９，１９８４；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；米国特許第５，１２２，４６３号、同第５，１７３，４０３号、同第５，１８７，１５３号、同第５，２０４，２５４号、同第５，２１２，０５８号、同第５，２１２，２８６号、同第５，２１５，９０７号、同第５，２２０，０１３号、同第５，２２３，４８３号、及び同第５，２２９，２７９号）。プラスミドｐＫＫは、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換することにより改変されている（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能；ｐＵＣ４Ｋから得た、例えば、Ｖｉｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８，１９８２）；及び米国特許第４，７１９，１７９号参照）。ｐＢｌｕｅＢａｃ（ｐＪＶＥＴＬ及びその誘導体とも呼ばれる）等のバキュロウイルスベクター、特にｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（例えば、米国特許第５，２７８，０５０号、同第５，２４４，８０５号、同第５，２４３，０４１号、同第５，２４２，６８７号、同第５，２６６，３１７号、同第４，７４５，０５１号、及び同第５，１６９，７８４号；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏから入手可能）も、昆虫細胞におけるポリペプチドの発現に用いることができる。他のプラスミドとしては、ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２等のｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡプラスミド（米国特許第４，５７５，０１３号参照；また、Ｄｕｆｆａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１５３：４９２−５０７，１９８７も参照）が挙げられる。
【０１１７】
ＤＮＡ分子は、細菌細胞、好ましくは大腸菌細胞で複製されることが好ましい。また、好ましいＤＮＡ分子は、細菌において代々前記ＤＮＡ分子を確実に維持するために、細菌の複製起点を含む。このように、細菌において複製することにより、大量のＤＮＡ分子を生成することができる。好ましい細菌の複製起点としては、ｆ１−ｏｒｉ及びｃｏｌ  Ｅ１複製起点が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいホストは、ｌａｃＵＶプロモータ等の誘導性プロモータに機能的に連結しているＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの染色体コピーを含む（米国特許第４，９５２，４９６号を参照）。かかるホストとしては、溶原菌である大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及びＢＬ２１（ＤＥ３）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬ２１（ＤＥ３）株が好ましい。ｐＬｙｓ株は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの天然阻害剤であるＴ７リゾチームを少量しか提供しない。
【０１１８】
また、提供されるＤＮＡ分子は、リプレッサタンパク質をコードする遺伝子を含んでいてもよい。リプレッサタンパク質は、リプレッサタンパク質が結合するヌクレオチドの配列を含むプロモータの転写を抑制することができる。プロモータは、細胞の生理学的条件を変化させることにより抑制解除され得る。例えば、オペレータと、又は制御タンパク質若しくはＤＮＡの他の領域と相互作用する能力を阻害する分子を増殖培地に添加することによるか、増殖培地の温度を変化させることにより、前記変化を生じさせることができる。好ましいリプレッサタンパク質としては、ＩＰＴＧ誘導に対して応答性である大腸菌ｌａｃＩリプレッサ、温度感受性λｃＩ８５７リプレッサ等が挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌ｌａｃＩリプレッサが好ましい。
【０１１９】
概して、本実施形態の組換えコンストラクトは、転写及び翻訳に必要なエレメントも含む。具体的には、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え発現コンストラクトが、ホスト細胞又は生物で発現することを目的とする場合、かかるエレメントが好ましい。本発明の特定の実施形態では、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする遺伝子の細胞種に好ましい発現又は細胞種に特異的な発現は、前記遺伝子をプロモータの制御下におくことにより達成可能である。プロモータの選択は、形質転換される細胞の種類、及び望ましい調節の程度又は調節の種類に依存する。プロモータは、構成的又は活性であってもよく、更に、細胞種特異的、組織特異的、個々の細胞特異的、事象特異的、一時的に特異的、又は誘導性であってもよい。細胞種特異的プロモータ及び事象種特異的プロモータが好ましい。構成的又は非特異的プロモータの例としては、ＳＶ４０初期プロモータ（米国特許第５，１１８，６２７号）、ＳＶ４０後期プロモータ（米国特許第５，１１８，６２７号）、ＣＭＶ初期遺伝子プロモータ（米国特許第５，１６８，０６２号）、及びアデノウイルスプロモータが挙げられる。ウイルスのプロモータに加えて、細胞のプロモータも、本発明の状況において許容できる。特に、所謂ハウスキーピング遺伝子の細胞プロモータが有用である。概して、ウイルスプロモータは、細胞プロモータよりも強いプロモータであるので、ウイルスプロモータが好ましい。特定のホストでの使用に適しているプロモータを当業者が容易に選択できるように、高等真核生物を含む多くの真核生物の遺伝子においてプロモータ領域が同定されている。
【０１２０】
誘導性プロモータを用いてもよい。これらプロモータとしては、デキサメタゾンにより誘導され得るＭＭＴＶ  ＬＴＲ（国際公開第９１／１３１６０号）；重金属により誘導され得るメタロチオネインプロモータ；及びｃＡＭＰにより誘導され得るｃＡＭＰ応答エレメントを含むプロモータが挙げられる。誘導性プロモータを用いることにより、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸配列は、本発明の発現コンストラクトによって細胞に送達され得、誘導物質を添加するまで静止状態に留まる。これにより、遺伝子産物の生成のタイミングを更に制御することができる。
【０１２１】
事象の種類に特異的プロモータは、腫瘍形成又はウイルス感染等の事象が発生したときにのみ活性化又はアップレギュレートされる。ＨＩＶ  ＬＴＲは、事象特異的プロモータの周知の例である。前記プロモータは、ウイルス感染時に生じるｔａｔ遺伝子産物が存在しない限り、不活性である。幾つかの事象特異的プロモータは、組織特異的でもある。
【０１２２】
更に、特定の細胞遺伝子と協調的に制御されるプロモータを用いてもよい。例えば、１以上の更なる内因性遺伝子又は外因的に導入された遺伝子の発現に呼応して、特定の突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることが望ましいとき、協調的に発現する遺伝子のプロモータを用いてもよい。
【０１２３】
プロモータに加えて、リプレッサ配列、ネガティブレギュレータ、又は組織特異的サイレンサを挿入して、例えば、実験又は治療ストラテジの一部として、膜貫通導電性を一過的に、及び／又は細胞種特異的に、組織特異的に、若しくは部位特異的に変化させることが望ましい場合があるホスト又はホスト細胞等、特定の状況において、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする遺伝子の非特異的発現を低下させることもできる。複数のリプレッサエレメントをプロモータ領域に挿入してもよい。転写の抑制は、リプレッサエレメントの配向又はプロモータからの距離に依存しない。リプレッサ配列の１つの種類は、インスレータ配列である。かかる配列は、転写を阻害し（Ｄｕｎａｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７：１８２−９，１９９７；Ｇｄｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：９３７８−８３，１９９６，Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：５３１２−２８，１９９６；Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇｅｙｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：６２５８−６７，１９９５；Ｋａｌｏｓ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：１９８−２０７，１９９５；Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７４：５０５−１４，１９９３）、バックグラウンド転写をサイレンシングする。
【０１２４】
リプレッサエレメントは、ＩＩ型（軟骨）コラーゲン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、アルブミン（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．３（９）：５７７−５８８，１９９２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ−２）（Ｍｉｓｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ１１９（２）：２９３−２９７，１９９２）遺伝子のプロモータ領域、及び６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ遺伝子（Ｌｅｍａｉｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１（２）：１０９９−１１０６）でも同定されている。更に、ネガティブレギュレータエレメントＴｓｅ−１が多数の肝臓特異的遺伝子で同定されており、肝細胞における遺伝子活性化のｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）介在性誘導をブロックすることが示されている（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ６１（５）：９０５−９１６，１９９０）。
【０１２５】
好ましい実施形態では、所望の産物の発現を増加させるエレメントが、コンストラクトに組み込まれる。かかるエレメントは、内部にリボソーム結合部位を含む（ＩＲＥＳ；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２０３：９９，１９９５；Ｅｈｒｅｎｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｓｅｍｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３：６５，１９９５；Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０：１０２，１９９６；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：６９４，１９９４）。ＩＲＥＳは、翻訳効率を高める。同様に、他の配列も発現を強化することができる。幾つかの遺伝子では、特に５’末端の配列は、転写及び／又は翻訳を阻害する。これら配列は、通常、ヘアピン構造を形成できるパリンドロームである。送達される核酸では、かかる配列はいずれも一般的に欠失している。転写又は翻訳産物の発現量をアッセイして、どの配列が発現に影響を及ぼすのかを確認する又は確かめる。転写量は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプローブプロテクション等を含む任意の既知の方法によりアッセイすることができる。タンパク質量は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫細胞化学、又は他の周知技術を含む任意の既知の方法によりアッセイすることができる。
【０１２６】
本発明の突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードするコンストラクトに他のエレメントを組み込んでもよい。好ましい実施形態では、前記コンストラクトは、ポリアデニル化配列を含む転写ターミネータ配列、スプライスドナー部位、スプライスアクセプタ部位、及びエンハンサを含む。また、哺乳類細胞又は他の真核生物細胞における前記コンストラクトの発現及び維持に有用な他のエレメントを組み込んでもよい（例えば、複製起点）。前記コンストラクトは、細菌細胞に都合のよいように作製されているので、細胞中で増殖するのに必要な、又は細胞中における増殖を強化するエレメントが組み込まれる。かかるエレメントとしては、複製起点、選択性マーカー等が挙げられる。
【０１２７】
本明細書に提供されるように、２以上の異なる制御を受けている核酸コンストラクトを同時に送達することにより、本発明の実施形態のコンストラクトを用いて細胞に送達される突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸の発現の制御レベルを追加することができる。かかる複数の核酸コンストラクトを使用するアプローチにより、ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質の発現を協調的に制御することができる。当業者は、プロモータ、エンハンサ、及び他の周知の遺伝子制御エレメントが挙げられるが、これらに限定されない好適な制御配列を選択することにより、同様の方法で、遺伝子発現を複数のレベルで制御することができることを理解する。
【０１２８】
また、本発明は、特定の実施形態では、ベクター、及び本発明の核酸を含む既知のベクターから調製されるコンストラクト、具体的には、本明細書に提供されるような特定の発明の実施形態に係る突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする任意の核酸を含む「組換え発現コンストラクト」に関し；また、本発明のベクター及び／又はコンストラクトを用いて遺伝的に改変されているホスト細胞に関する。突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドは、コンストラクトの性質（例えば、上記のように、プロモータの種類）、及び所望のホスト細胞の性質（例えば、有糸分裂後に最終分化するか活発に分裂しているか；例えば、発現コンストラクトがホスト細胞においてエピソームとして生じるか、ホスト細胞のゲノムに組み込まれるか）によって、適切なプロモータの調節下で実質的に任意のホスト細胞において発現することができる。原核生物及び真核生物ホストで使用するための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（２００１）に記載されている。
【０１２９】
典型的には、コンストラクトは、プラスミドベクターに由来する。好ましいコンストラクトは、修飾ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）であり、これは、アンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナル、及びＴ７プロモータ部位をコードする核酸配列を有する。他の好適な哺乳類発現ベクターが周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記；また、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；等のカタログを参照）。適切な選択剤（例えば、メトトレキサート）の適用後の遺伝子増幅に起因する、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドの生成量増加を促進するために、好適な制御調節下でジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする配列を含む本明細書において好ましいコンストラクトを調製することができる。
【０１３０】
一般に、組換え発現ベクターは、上記のように、ホスト細胞を形質転換させる複製起点及び選択性マーカーと、下流の構造遺伝子の転写を導くための高発現している遺伝子に由来するプロモータとを含む。異種構造配列は、適切な相で翻訳開始及び終結配列と組み立てられる。したがって、例えば、本明細書に提供される突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸は、ホスト細胞で発現させるための組換え発現ベクターとして、各種発現ベクターコンストラクトのうちの任意の１つに含まれていてもよい。
【０１３１】
適切なＤＮＡ配列（１又は複数）は、各種手順によりベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、当該技術分野において既知の手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１又は複数）に挿入される。クローニング、ＤＮＡの単離、増幅、及び精製のための標準的な技術、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等が関与する酵素反応のための標準的な技術、並びに各種分離技術が知られており、当業者によって一般的に使用されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００４  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（１９８５  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）等に多数の標準的な技術が記載されている。
【０１３２】
発現ベクターのＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を導くために、少なくとも１つの適切な発現調節配列（例えば、構成的プロモータ又は制御されているプロモータ）に機能的に連結している。かかる発現調節配列の例示的な例としては、上記のような真核生物細胞又はそのウイルスのプロモータが挙げられる。プロモータ領域は、選択性マーカーを含むＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、又は他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択することができる。真核生物プロモータとしては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクター及びプロモータの選択は、十分当業者に可能な範囲内であり、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結している少なくとも１つのプロモータ又は制御されているプロモータを含む特定の特に好ましい組換え発現コンストラクトの調製について、本明細書に記載されている。
【０１３３】
エンハンサ配列をベクターに挿入することにより、高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサは、シス作用エレメントのＤＮＡであり、通常、転写を増加させるためのプロモータとして作用する１０ｂｐ〜３００ｂｐのＤＮＡである。例としては、複製起点の１００ｂｐ〜２７０ｂｐ上流のＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサ、複製起点の上流のポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサが挙げられる。
【０１３４】
本明細書に提供されるように、特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターであってもよい（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０；Ｃｏｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｖａｒｍｕｓ，１９９６  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。例えば、レトロウイルスプラスミドベクター源となり得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び哺乳種腫瘍ウイルス等のレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介してホスト細胞のゲノムを複製し、前記ゲノムに組み込まれるＲＮＡウイルスである。このＤＮＡ中間体、又はプロウイルスは、ホスト細胞のＤＮＡに安定に組み込まれ得る。本発明の特定の実施形態によれば、発現コンストラクトは、外来タンパク質をコードする外来遺伝子が、正常レトロウイルスＲＮＡの代わりに組み込まれたレトロウイルスを含んでいてもよい。レトロウイルスＲＮＡが感染と同時にホスト細胞に侵入すると、外来遺伝子も前記細胞に導入され、次いで、レトロウイルスゲノムの一部であるかのようにホスト細胞のＤＮＡに組み込まれ得る。ホスト内でこの外来遺伝子が発現することにより、外来タンパク質が発現する。
【０１３６】
遺伝子治療のために開発された大部分のレトロウイルスベクター系は、マウスレトロウイルスに基づく。かかるレトロウイルスは、２つの形態、即ち、ビリオンと呼ばれる遊離ウイルス粒子として、又はホスト細胞のＤＮＡに組み込まれているプロウイルスとして存在する。ビリオン形態のウイルスは、レトロウイルスの構造及び酵素タンパク質（酵素逆転写酵素を含む）、２コピーのウイルスゲノムＲＮＡ、及びウイルスエンベロープ糖タンパク質を含有する源細胞の原形質膜の一部を含む。レトロウイルスゲノムは、４つの主な領域に分類される：転写の開始及び終結に必須であるシス作用エレメントを含み、且つコード遺伝子の５’及び３’の両方に存在する長末端反復配列（ＬＴＲ）と、３つのコード遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ。これら３つの遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖは、それぞれ、内部ウイルス構造、酵素タンパク質（インテグラーゼ等）、並びにウイルスの感染力及びホスト域特異性を付与するエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ７０及びｐ１５ｅと記載される）に加えて機能が同定されていない「Ｒ」ペプチドをコードする。
【０１３７】
本発明により提供される発現コンストラクトにおける使用を含む、レトロウイルスの使用に関する安全を考慮して、別々のパッケージング細胞株及びベクター生成細胞株が開発された。簡潔に述べると、この方法は、レトロウイルスベクター及びパッケージング細胞株（ＰＣＬ）という２つの構成要素を使用する。レトロウイルスベクターは、長末端反復配列（ＬＴＲ）、移入される外来ＤＮＡ、及びパッケージング配列（ｙ）を含む。このレトロウイルスベクターは、構造及びエンベロープタンパク質をコードする遺伝子がベクターゲノムに含まれていないので、単独では繁殖しない。ＰＣＬは、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖタンパク質をコードする遺伝子を含むが、パッケージングシグナル「ｙ」は含まない。したがって、ＰＣＬは、単独で空のビリオン粒子しか形成することができない。この一般的な方法の中で、レトロウイルスベクターは、ＰＣＬに導入されて、ベクター生成細胞株（ＶＣＬ）を作製する。このＶＣＬは、レトロウイルスベクターの（外来）ゲノムのみを含むビリオン粒子を作製するので、治療に使用するための安全なレトロウイルスベクターであると考えられている。
【０１３８】
「レトロウイルスベクターコンストラクト」とは、本発明の好ましい実施形態において、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする核酸配列等の対象配列（１又は複数）又は遺伝子（１又は複数）の発現を導くことができる構造体を指す。簡潔に述べると、レトロウイルスベクターコンストラクトは、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２の鎖のＤＮＡ合成起点、及び３’ＬＴＲを含んでいなくてはならない。例えば、タンパク質をコードする配列（例えば、所望の補助遺伝子又は代替遺伝子）、又は転写された分子としてそれ自体有用である配列（例えば、リボザイム又はアンチセンス配列として）を含む多種多様な異種配列が、ベクターコンストラクト内に含まれていてもよい。
【０１３９】
本発明のレトロウイルスベクターコンストラクトは、例えば、Ｂ、Ｃ、及びＤ型レトロウイルスに加えて、スプーマウイルス及びレンチウイルスを含む、多種多様なレトロウイルスから容易に構築することができる（例えば、ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５を参照）。かかるレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）等の保管場所又は収集物から容易に入手可能であるか、又は一般的に利用可能な技術を用いて既知の起源から単離することができる。本明細書に提供される開示に示される本発明のレトロウイルスベクターコンストラクト、パッケージング細胞、又は生成細胞を組み立て又は構築するために、任意の上記レトロウイルスを容易に利用することができ、また標準的な組換え技術を利用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｋｕｎｋｌｅ，ＰＮＡＳ８２：４８８，１９８５）。
【０１４０】
ウイルスベクターで使用するための好適なプロモータは、一般的に、Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：９８０−９９０（１９８９）に記載されているレトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモータ、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、又は任意の他のプロモータ（例えば、ヒストン、ｐｏｌ  ＩＩＩ、及びβ−アクチンプロモータが挙げられるが、これらに限定されない真核生物細胞プロモータ等の細胞プロモータ）を挙げることができるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモータとしては、アデノウイルスプロモータ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ、及びＢ１９パルボウイルスプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモータの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には明らかであり、制御性プロモータ又は上記プロモータのいずれかから選択することができる。
【０１４１】
上記のように、レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質導入し、生成細胞株を形成する。形質転換され得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５−１４（１９９０）に記載されているようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、及びＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該技術分野において既知である任意の手段を用いてパッケージング細胞を形質導入することができる。かかる手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、及びＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替方法では、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソームに封入するか、又は脂質とカップリングさせ、次いでホストに投与してもよい。
【０１４２】
生成細胞株は、突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸配列（１又は複数）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、かかるレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロ又はインビボのいずれかで、真核生物細胞に形質導入することができる。形質導入された真核生物細胞は、突然変異体若しくは改変ポリペプチド、又は融合タンパク質をコードする核酸配列（１又は複数）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、好ましい実施形態では、平滑筋細胞（例えば、動脈平滑筋細胞及び静脈平滑筋細胞を含む血管平滑筋細胞、胃腸管平滑筋細胞、呼吸器平滑筋細胞、泌尿生殖器平滑筋細胞）、線維芽細胞、筋線維芽細胞、軟骨細胞、周皮細胞、巨細胞、グリオーマ細胞、マクロファージ、及び内皮細胞が挙げられるが、本発明は、これらに限定されることを意図するものではないので、形質導入される細胞は、特定の実施形態では、例えば、胚幹細胞、並びに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨髄単球性細胞を含む循環末梢血単核及び多形核細胞、リンパ球、筋芽細胞、組織マクロファージ、樹状細胞、クップファー細胞、リンパ節及び脾臓のリンパ系細胞及び細網内皮、ケラチノサイト、内皮細胞、並びに気管支上皮細胞を含んでいてもよい。
【０１４３】
ウイルスベクターを用いて、発現コンストラクトをコードする組換え突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドを調製する本発明の実施形態の別の例として、１つの好ましい実施形態では、突然変異体又は改変ポリペプチドの発現を導く組換えウイルスコンストラクトにより形質導入されたホスト細胞は、ウイルスの出芽中ウイルス粒子により組み込まれたホスト細胞膜の一部に由来する、発現している突然変異体又は改変ポリペプチドを含むウイルス粒子を生成することができる。
【０１４４】
別の実施形態では、本発明は、発現コンストラクトをコードする上記組換え突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドを含むホスト細胞に関する。ホスト細胞は、例えば、クローニングベクター、シャトルベクター、又は発現コンストラクトであってもよい、これら及び関連する本発明の実施形態のベクター及び／又は発現コンストラクトを用いて遺伝的に改変されている（形質導入、形質転換、又はトランスフェクトされている）。ベクター又はコンストラクトは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態であってもよい。改変ホスト細胞は、プロモータを活性化するか、形質転換体を選択するか、又は突然変異体若しくは改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドをコードする遺伝子等の特定の遺伝子を増幅させるのに適するように変更された従来の栄養培地において培養することができる。発現について選択された特定のホスト細胞の培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、当業者に容易に明らかであろう。
【０１４５】
ホスト細胞は、哺乳類細胞等の高等真核生物細胞、又は酵母細胞等の下等真核生物細胞であってもよく、又はホスト細胞は、細菌細胞等の原核生物細胞であってもよい。本発明に係る適切なホスト細胞の例示的な例としては、大腸菌、ストレプトミセス属、ネズミチフス菌等の細菌細胞；酵母等の真菌細胞；ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ属Ｓｆ９等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、又は２９３細胞等の動物細胞；アデノウイルス；植物細胞；又はインビトロで増殖するように既に適応しているか、新たにインビトロで増殖するように確立された任意の好適な細胞が挙げられるが、これらに限定する必要はない。適切なホストの選択は、本明細書における教示から当業者の行い得る範囲内であると考えられる。
【０１４６】
また、多様な哺乳類細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させることができる。哺乳類発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ２３：１７５（１９８１）により記載されているサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、並びに例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、及びＢＨＫ細胞株等の適合可能なベクターを発現することができる他の細胞株が挙げられる。哺乳類の発現ベクターは、複製起点、好適なプロモータ及びエンハンサを含み、また、例えば、発現コンストラクトをコードする突然変異体又は改変ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質に由来するポリペプチドの調製に関して本明細書に記載されているような、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位、スプライスアクセプタ部位、転写終結配列、及び５’隣接非翻訳配列も含む。ＳＶ４０スプライス及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を用いて、必要な非翻訳遺伝子エレメントを提供することができる。コンストラクトのホスト細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、又はエレクトロポレーション等が挙げられるが、これらに限定されない、当業者によく知られている多様な方法により行うことができる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【０１４７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段明確に指示しない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」は、別段明確に指示しない限り、１以上のポリペプチド（即ち、複数のポリペプチド）、及び当業者に既知であるその等価物等に対する参照を含む。本明細書全体を通して「１つの実施形態」、「ある実施形態」、「別の実施形態では」、又は「幾つかの実施形態では」とは、その実施形態に関連して記載される特定の参照対象の特徴、構造又は特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な箇所で「１つの実施形態では」、「ある実施形態では」、又は「別の実施形態では」という句を用いても、必ずしも全て同じ実施形態に言及しているとは限らない。更に、特定の特徴、構造又は特性を１以上の実施の形態において任意の好適な方法で組み合わせてもよい。
【０１４８】
文脈において別段の要求がない限り、本願明細書および請求項全体を通して、用語「含む」及び「含んでいる」は、記述されている工程、構成要素、又は工程若しくは構成要素の群を含むが、任意の他の工程、構成要素、又は工程若しくは構成要素の群を除外するものではないことを意味すると理解されよう。「からなる」とは、「からなる」という句の後に記載されるいかなるものも含み、且つそれらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、記載される構成要素が必要又は必須であり、且つ他の如何なる構成要素も存在することはできないということを示す。「から本質的になる」とは、この句の後に記載される任意の構成要素を含み、且つ記載される構成要素についての開示で明記される活性又は作用に干渉しないか、又はその一因とならない他の構成要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」とは、記載される構成要素が必要又は必須であるが、他の構成要素を必要とせず、他の構成要素は、記載される構成要素の活性又は作用に影響を与えるか否かによって存在してもしなくてもよいことを示す。
【０１４９】
本発明の実施は、逆のことが具体的に示されない限り、当該分野の技術範囲内である、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、細胞生物学、幹細胞プロトコル、細胞培養、及びトランスジェニック生物学の従来の方法を使用し、これらの多くは、例示目的で以下に示される。かかる技術は、文献中で十分説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆Ｉｌ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，２００５）；Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００５）；Ｅｎｇｅｌｋｅ，ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｔｈｅ  Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ，２００３）；Ｇｏｔｔ，ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｄ���ｔｉｎｇ，ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００４）；Ｓｏｈａｉｌ，Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＣＲＣ，２００４）；Ｃｌａｒｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｎｓｅａｕ，ｍｉｃｒｏＲＮＡ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ＆Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ  ｓｅｒｉｅｓ；ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ，２００６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  ＣＣ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００２）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００６）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００６）；Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ  Ｅｄ．，２００６）；Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＤＪ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｇ．Ｐｈｉｎｎｅｙ，ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌ  Ｅｄｓ．，２００８）；Ｈ��ｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（ＣＡ．Ｋｌｕｇ，ａｎｄ  ＣＴ．Ｊｏｒｄａｎ  Ｅｄｓ．，２００１）；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋ．Ｄ．Ｂｕｎｔｉｎｇ  Ｅｄ．，２００８）Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｌ．Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ  Ｅｄ．，２００８）；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｙｒｏ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４）；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２）、及びＴｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ），４ｔｈ  Ｅｄ．，（Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２０００）を参照。
【実施例】
【０１５０】
（実施例１：単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質を用いる伝導性チャネル含有膜の構造体）
この実施例は、ｄｓＤＮＡファージｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングコネクタタンパク質を、親水性の特徴的な領域を含むように再設計することについて記載する。
【０１５１】
＜材料＞
リン脂質１，２−ジフィタノイル−ｓｎグリセロール−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−Ｓ−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン，トリエチルアンモニウム塩（ＮＢＤ−ＰＥ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ｎ−デカン及びクロロホルムは、それぞれ、Ｆｉｓｈｅｒ及びＴＥＤＩＡから購入した。
【０１５２】
＜ｐｈｉ２９コネクタの再改変＞
コネクタタンパク質の発現用プラスミドの構築及びドデカマーコネクタの集合については、既に報告されている（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．５，８５６−８６３（２００５））。次の、コネクタの末端修飾も、本明細書に開示される特定の可撓性ドメイン及び親和性／アラインメントドメインの使用を除いて、本質的に記載されている通りに行った（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ４，８−１８（２００８）；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４（１９），５４８２−５４９０（２００６）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４，２６９８−２７０９（２００６））。簡潔に述べると、プラスミドの１つの修飾は、例えば、２段階ＰＣＲにより行うことができる。先ず、プライマー対Ｆ１−Ｒ１を用いて、ＧＰ１０遺伝子を増幅させた。第１のＰＣＲ産物を、親和性タグ（Ｈｉｓ６−タグ及び／又はＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ、ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号２２）に加えて、それぞれＮｄｅＩ及びＸｈｏＩの制限酵素部位を含むプライマー対Ｆ１及びＲ２を用いる第２のＰＣＲ工程のテンプレートとして用いた。第２のＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで切断し、ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にライゲーションさせて、プラスミドを作製した。
【０１５３】
＜コネクタの発現及び精製＞
プラスミドｐＥＴｇｐ１０−Ｃ−ｓｔｒｅｐ−ＩＩ又は−Ｃ−Ｈｉｓ６を、タンパク質を発現させるために大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）に形質転換した。体積１０ｍＬの大腸菌培養物を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中にて３７℃で一晩インキュベートし、２５０ｒｐｍで撹拌した。５ｍＬの体積の前記培養物を、５００ｍＬの培地に接種し、細胞密度がＯＤ６００で０．５単位〜０．６単位に達したとき、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。ＩＰＴＧ誘導から３時間後、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＳ−７．５ロータ内で２０分間５，０００×ｇで遠心分離することにより細胞を回収し、使用まで−７０℃で保存した。
【０１５４】
Ｓｔｒｅｐ−ＩＩタグ付コネクタを、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて親和性クロマトグラフィーにより精製した。細胞をバッファＷ（１５％のグリセロール、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に再懸濁させ、透明になった溶解液をＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎセファロースカラムにロードし、バッファＷで洗浄した。Ｓｔｒｅｐ−ＩＩタグ付コネクタを、バッファＥ（１５％のグリセロール、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ｍＭのデスチオビオチン、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））により溶出した。Ｈｉｓタグ付コネクタは、本質的にＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）に記載されているようにニッケル親和性クロマトグラフィー（Ｎｏｖａｇｅｎ）で精製した。
【０１５５】
＜ｐｈｉ２９モータを用いたインビトロＤＮＡパッケージングアッセイ＞
プロカプシド、ＧＰ１６、及びＤＮＡ−ＧＰ３の精製（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，５０２４−５０３２（１９９５）；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，３５０５−３５０９（１９８６））、並びにインビトロでｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータを用いるＤＮＡパッケージング手順は、既に報告されている（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，５０１８−５０２３（１９９５））。簡潔に述べると、体積１０μＬの０．３μｇ／μＬの精製正常プロカプシド又は再改変プロカプシドＣ−Ｓｔｒｅｐを、室温で３０分間、ＴＭＳ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ）中で１００ｎｇのｐＲＮＡと混合した。ＴＭＳバッファ中にＭｇ２＋が存在することにより、ｐＲＮＡのプロカプシドへの結合が促進された。これらｐＲＮＡ富化プロカプシドを、反応バッファ（１０ｍＭのＡＴＰ／６ｍＭのスペルミジン／３ｍＭのβ−メルカプトエタノール−ＴＭＳ溶液）（３μＬ）、ＤＮＡ−ｇｐ３（１００ｎｇ）、及び０．５μｇ／μＬのＤＮＡパッケージング酵素ｇｐ１６（６μＬ）と混合した。次いで、混合物を室温で３０分間インキュベートした。ＤＮＡパッケージング効率を、ＤＮａｓｅ保護アッセイ（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８５，３９５−４００（１９９１））を用いてアガロースゲル電気泳動により検証した。プロカプシドにより保護されている、パッケージングされたＤＮＡがゲル上に示された。
【０１５６】
ＤＮＡ充填カプシドの生物学的活性を、感染性ｐｈｉ２９ビリオンに変換される能力について試験した。ＤＮＡパッケージングから３０分後、頸部、尾部、及び形態形成タンパク質を添加して、感染性ビリオンの集合を完成させ、次いで、これを標準的なプラーク形成によりアッセイした（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，５０１８−５０２３（１９９５））。
【０１５７】
＜コネクタの蛍光標識＞
Ｆｌｕｏｒｏ  Ｔａｇ（商標）ＦＩＴＣコンジュゲーションキット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてコネクタを標識した。カラムクロマトグラフィーを用いて、バッファＥを炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムバッファに交換した。ＦＩＴＣ溶液をコネクタ溶液に滴下し、穏やかに撹拌しながら２時間インキュベートした。カラムクロマトグラフィーにより遊離ＦＩＴＣを除去し、ＦＩＴＣで標識されたコネクタをＰＢＳで溶出した。ＦＩＴＣ−コネクタをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。標識効率を、フルオレセイン／タンパク質のモル比から決定し、ＵＶ−Ｖｉｓ分光測定により測定した。
【０１５８】
＜再改変コネクタを含む巨大脂質ベシクルの調製＞
蛍光巨大脂質ベシクルを調製するために、１ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＣ又はＤＰｈＰＣ１ｍＬと、１％（モル比）のＮＢＤ−ＰＥとをバイアル瓶中で混合した。クロロホルムを穏やかな窒素ガス流により蒸発させ、脂質の入ったバイアル瓶を、デシケータ内で一晩更に乾燥させた。脂質膜を再水和させるために、２００ｍＭ〜３００ｍＭのスクロース２ｍＬを、例示的浸透圧剤として用いて、ガラスから溶液にベシクルを出芽させた。次いで、バイアル瓶をパラフィルムで密封し、一晩保存した。溶液の中央からアリコートを取り、次いでペトリ皿に移した。沈降後、ｅｐｉ−蛍光顕微鏡でベシクルを観察した（図５）。
【０１５９】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの巨大ベシクルへの組み込みは、ＮＢＤ−ＰＥを用いなかったことを除いて上記の通り行った。体積１００μＬのＦＩＴＣ標識再改変コネクタを、最終的な脂質：コネクタのモル比が７５：１（又はＢＬＭ実験では、４，０００：１〜１６，０００：１もの低いモル比）になるように上記脱水和脂質に添加した（図５）。
【０１６０】
＜コネクタの平面二重層脂質膜への挿入＞
２段階アプローチを用いて、平面二重層脂質膜（ＢＬＭ）にコネクタを組み込んだ。第１の段階は、上記のような再改変コネクタを含む単層脂質ベシクルの調製であった。次の段階は、押し出されたリポソームの平面ＢＬＭへの融合であった（図５）。脂質二重層の流動性をＦＲＡＰ（光漂白後蛍光回復）により示した（図５Ｄ）。励起光の焦点を持続的に二重層に合わせて、色素を漂白した。光漂白された領域は暗くなる。しかし、光を消した後、蛍光脂質が光漂白された領域に拡散して戻ることにより、蛍光が徐々に回復された。
【０１６１】
標準的なＢＬＭチャンバ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＬＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ製ＢＣＨ−１Ａ）を用いて、水平ＢＬＭを形成した。直径７０μｍ〜１２０μｍ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｓｃｉ．ＬＬＣ製ＴＰ−０１）又は１８０μｍ〜２５０μｍ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｓｃｉ．ＬＬＣ製ＴＰ−０２）の開孔部を有するＴｅｆｌｏｎ（登録商標）薄膜を、仕切りとして用いて、チャンバをシス区画（ワーキングボリューム２５０μＬ）及びトランス区画（ワーキングボリューム２．５ｍＬ）に分離した。確実に開孔部の縁部全体を完全にコーティングするために開孔部に３％（ｗ／ｖ）のＤＰｈＰＣｎ−デカン溶液０．５μＬを２回予め塗布した後、これら区画に伝導性バッファ（５ｍＭのＴｒｉｓ／ｐＨ７．９、ＴＭＳ、又は５ｍＭのＨＥＰＥＳ／ｐＨ７．９と、様々な濃度のＮａＣｌ又はＫＣｌ）を充填した。
【０１６２】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを二重層に挿入する前段階として、仕切り上に二重層膜を形成した（図５Ｅ）。本明細書に記載する実験においては（約２８０回の別々のＢＬＭ実験）、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタが成功裏に挿入されたのは約４７％〜約８３％であった。
【０１６３】
単一コンダクタンス測定では、前もって調製しておいた巨大リポソーム／コネクタ複合体を、孔径２００ｎｍ〜４００ｎｍのポリカーボネート膜を用いて押し出して、小さな単層リポソームを作製した。使用前にＢＬＭ実験用にこのリポソーム原液を１０倍〜２０倍に更に希釈した。ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを挿入するために、希釈されたリポソーム溶液０．５μＬ〜２μＬをシスチャンバにロードした。
【０１６４】
２つの方法でコンダクタンスを測定した：第１の方法は、特定であるが一定の保持電位で誘導され、第２の方法は、ｐｈｉ２９ＧＰ１０ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを脂質膜に組み込んだ後、−１００ｍＶから開始して１００ｍＶまで上昇する（ｒａｍｐｉｎｇ）の走査電位により誘導される電流トレースの勾配から測定した（図６）。
【０１６５】
＜Ｑ−ＰＣＲ分析＞
Ｑ−ＰＣＲ分析では、コネクタ／リポソーム複合体をシス側に添加した（ワーキングボリューム５００μＬ）。１４１ｂｐのＤＮＡを、最終濃度が２５ｎＭになるように、トランス側に添加した。陰性対照として、コネクタ／リポソーム複合体を添加せずに、ＤＮＡを添加した。−９５ｍＶの電位を印加し、Ｑ−ＰＣＲ分析用に３０分間間隔でシス側からサンプルを回収した。ＤＮＡ濃度をＤＵ５３０ＵＶ／Ｖｉｓ分光計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）により測定した。絶対定量を用いて、回収したサンプル中のＤＮＡコピー数を測定した。既知の濃度の１０倍希釈された１４１ｂｐのＤＮＡを用いて検量線を作成した（図１１）。各希釈液を３連でアッセイした。Ｑ−ＰＣＲ反応にはｉＱＴＭ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いた。ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱＴＭ多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＱ−ＰＣＲを実施した。ＤＮＡテンプレートに対応するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＴＡ−３’［配列番号４８］及び５’−ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣ−３’［配列番号４９］であった（オリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（「ＩＤＴ」），Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡから購入した）。
【０１６６】
（実施例２：伝導性チャネル含有膜を形成するための、単離ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質のリポソームへの組み込み）
この実施例は、実施例１を含む上記のように設計及び調製された修飾ウイルスＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質のリポソーム及び脂質二重層への挿入と、得られる伝導性チャネルの特性評価について記載する。前記コネクタタンパク質により形成される脂質二重層を貫通するチャネルの存在を、単一チャネルコンダクタンス測定及びｄｓＤＮＡの移動により確認した。
【０１６７】
＜スクロース勾配沈降によるリポソーム／コネクタ複合体の分離及び検出＞
ＴＭＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）中で５％〜２０％の直線スクロース勾配沈降を実施して、遊離コネクタからリポソーム／コネクタ複合体を分離した。０．１ｍＬのサンプルを５ｍＬの遠心管の上部にロードした。ＳＷ５５ロータ内にて、２０℃で３０分間、２７，０００ｒｐｍのＢｅｃｋｍａｎ  Ｌ−８０超遠心分離機を用いてスピンさせた後、画分を前記遠心管の底部から回収し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図５Ｃ）。
【０１６８】
＜濾過＞
プロテオリポソームを０．４５μｍの酢酸セルロース膜（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）で濾過して、リポソーム／コネクタ複合体から遊離コネクタを分離した。体積５００μＬのコネクタが組み込まれているＤＯＰＣリポソームベシクル−２００ｍＭスクロース溶液を濾過管に添加し、同溶液を充填した。３，０００×ｇで１５分間スピンさせた後、２００μＬ未満の液体が保持されていた。このマイクロ濾過プロセスを５回繰り返した。フィルタの上に保持されていたリポソーム／コネクタ複合体を、蛍光顕微鏡で画像化した（図５）。
【０１６９】
＜移動実験のためのｄｓＤＮＡの調製＞
２本の単鎖ＤＮＡ、５’−ＴＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＧＴＴ  ＡＣ  −３’（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（「ＩＤＴ」），Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）及び５’−ＧＴＡ  ＡＣＧ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＡＡ−３’（ＩＤＴ）をアニーリングさせることにより、３５ｂｐのｄｓＤＮＡを調製した。前記アニーリングは、６５℃で３分間実施し、室温で２時間インキュベートした。１６％のＰＡＧＥゲルを用いてｄｓＤＮＡを精製した。ゲルからＤＮＡを取り出した後、エタノール沈殿により濃縮した。
【０１７０】
エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶにより平滑断端されている、インハウスで構築した環状プラスミドＣｘ４３から、直線状５．５キロベースのプラスミドＤＮＡを調製した。ＱＩＡＧＥＮ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｕｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した後、ＤＮＡ移動実験のためにＤＮＡをトランス側に直接添加した。
【０１７１】
＜電気生理学的測定＞
電流増幅機のヘッドステージに直接接続されているＡｇ／ＡｇＣｌ電極対を用いて、二重層脂質膜に対する電流トレースを測定し、Ａｘｏｎ  ＤｉｇｉＤａｔａ１３２２Ａ又はＡｘｏｎ  ＤｉｇｉＤａｔａ１４４０アナログ−デジタル変換機（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に連結されているＡｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂパッチクランプ増幅機を用いて前記トレースを記録した。報告される電圧は全て、トランス区画の電圧である。指定しない場合、データは、１ｋＨｚの周波数で低域通過濾波し、２ｋＨｚのサンプリング周波数で取得した。ＰＣＩａｍｐ９．１ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデータを収集し、データ解析にはソフトウェアＣｌａｍｐｆｉｔを用いた。
【０１７２】
＜二本鎖ＤＮＡ移動実験＞
ＤＮＡ移動実験では、特に記載しない場合、ＤＮＡをトランス側に添加した。Ｃ−Ｈｉｓ６タグ付コネクタ（Ｃ末端にヘキサヒスチジン修飾を有するウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタ）を用いて、移動事象を評価した。ＴＭＳ／１Ｍ  ＮａＣｌバッファをＤＮＡ移動バッファとして用いた。２つの方法を用いて、ＤＮＡを移動実験用チャンバに添加した。方法１：コネクタを挿入した後、０ｍＶの電圧下でＤＮＡを添加した。電圧を切り換えると、ＤＮＡは、ＤＮＡの自由拡散及び印加電圧によりコネクタチャネルに向かって移動した。方法２：コネクタを挿入する前に、チャンバ内でＤＮＡとバッファとを予め十分混合した。ＤＮＡの移動は、印加電圧に主に依存していた。全ての実験は、特に規定のない限り、方法１を用いて実施した。
【０１７３】
＜ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータコネクタタンパク質の修飾＞
一般的に、膜の細孔及びイオンチャネルは、膜にタンパク質を固定する疎水性ドメインを含む。ｐｈｉ２９コネクタの表面電荷の分析により、その中心表面領域が、それぞれ、幅広端及び幅狭端における２つ隣接層に比べて、僅かに疎水性を示すことが明らかになった（図１）（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓ．Ｄ５７：１２６０−６９；Ｇｕａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１５：６６３−６７６）。コネクタの精製を促進するために、Ｃ末端にＨｉｓ（Ｈｉｓ６）又はＳｔｒｅｐ−ＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）タグを含む親和性／アラインメントドメインを、親和性タグの可動性を改善するために６−グリシンリンカーを含む可撓性ドメインのすぐ下流に挿入した。６−グリシンリンカーを含むことにより、末端の可動性がもたらされた（図２）。均質に精製した後、改変ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタポリペプチドであるＧＰ１０は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察したとき（図１Ｄ及びＥ）、１２回折り畳まれた対称的な野生型コネクタと類似の形態を有するモータタンパク質コネクタドデカマー構造に自己集合することが見出された（図１Ｆ）。ネイティブ且つ標準のモータ構造の存在は、プロカプシドに組み込まれた後に二本鎖ＤＮＡをパッケージングする能力（図３）、及び得られるＤＮＡ充填カプシドを感染性ｐｈｉ２９ビリオンに集合させる能力（図４）により検証された。
【０１７４】
＜コネクタのリポソームへの再構成＞
例示的な浸透圧剤としてのスクロースの存在下においてコネクタと脂質とを共インキュベーションすることによる、コネクタをリポソームに再構成するための手順が開発された。このようなインキュベーションにより、コネクタの疎水性層が脂質分子の疎水性ドメインと相互作用する機会が与えられる。脱水−再水和法（Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，（１９９７），Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）は、直径５０μｍ以下の巨大リポソームの生成を導いた（図５）。コネクタタンパク質の脂質膜への挿入を、蛍光顕微鏡、濾過アッセイ、及び沈降分析により確認した（図５）。膜中におけるコネクタの存在は、蛍光顕微鏡で確認することができ、リポソーム周囲の明るい蛍光リングにより示される（図５）。前記蛍光リングは、蛍光脂質ＮＢＤ−ＰＥで作製されたリポソーム（図５Ａ）と外観が非常に類似していた。蛍光タグ付コネクタを、コネクタが挿入されていないリポソームと非特異的に混合したとき、蛍光リングは観察されなかった（図５）。孔径０．４５μｍの膜を用いて濾過することにより、又は５％〜２０％のスクロース勾配超遠心分離により（図５）、遊離コネクタを除去した。
【０１７５】
＜コネクタの平面脂質膜への組み込み＞
上記実験では、二重層表面に対する緩いコネクタの付着と、二重層に組み込まれたときのその開孔部の保持を介してチャネルを形成するための二重層膜に対するコネクタのきつい組み込みとを区別することができなかったので、単一チャネルコンダクタンスアッセイを実施した。結果は、コネクタタンパク質とリポソーム、又はコネクタタンパク質と平面脂質二重層との直接インキュベーションは、二重層膜におけるチャネル形成を導かないことを示した（図６Ａ）。二重層へのコネクタ挿入は、コネクタタンパク質で再構成されたプロテオリポソームが二重層に融合したときにのみ生じた（図６Ｂ及びＣ）。膜貫通正電圧又は負電圧下で、連続電流トレースに示されるように、コンダクタンスの不連続な段階的上昇を通してチャネル挿入が観察された（図６）。
【０１７６】
典型的には、１つのコネクタが二重層に挿入されると、５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）／０．５ＭのＮａＣｌ溶液の存在下で−４０ｍＶの電位にて約６５ｐＡ（１．６ｎＳに等しい）の電流増加が生じた。時に、２つのコネクタの膜挿入に起因する１３０．９ｐＡのジャンプも見られた（図６Ｄ）。ＴＭＳ／１Ｍ  ＮａＣｌ中でチャネルのコンダクタンスを測定したときも同様の結果が得られた（図７）。この場合、２つのコネクタ及び３つのコネクタの同時挿入は、それぞれ、４．７％及び１．９％発生した。
【０１７７】
コンダクタンス測定については、異なる電圧下でＩ−Ｖ曲線のプロットを得た（図６Ｅ）。１つの細孔当たりの平均コンダクタンスは、５ｍＭのＴｒｉｓ／０．５ＭのＮａＣｌ中１．５７±０．１６ｎＳ／細孔（合計３８個のコネクタが挿入）（図６Ｅ）、及びＴＭＳ／１ＭのＮａＣｌバッファ中３．２１±０．５１ｎＳ／細孔（合計２１３個のコネクタが挿入）であった（図７）。比較として、ランプ電圧下のコネクタチャネルについてもコンダクタンス測定を実施した（図６Ｆ及びＧ）。５ｍＭのＴｒｉｓ／０．５ＭのＮａＣｌ中に形成されるチャネルのコンダクタンスを表す近似曲線の傾斜は、それぞれ、１．５９ｎＳ／細孔１個、３．４０ｎＳ／細孔２個、及び４．９８ｎＳ／細孔３個であった。ＮａＣｌ濃度を１Ｍに上昇させたとき（１ＭのＮａＣｌを含むＴＭＳバッファ）、曲線の傾斜は、３．１２ｎＳ／細孔１個であった。５ｍＭのＨＥＰＥＳ／１ＭのＫＣｌのバッファも、コンダクタンス測定のために用いた（表１）。
【０１７８】
【表１】
2012507565.tif 000003
【０１７９】
異なるイオン強度の溶液を用いて、コネクタのチャネルコンダクタンスを黄色ブドウ球菌α−ヘモリシン（α−ＨＬ）と比較した（表１）。コネクタチャネルの幅狭端の直径は、３．６ｎｍであり、一方、α−ＨＬにより形成されるチャネルの直径は、僅か１．５ｎｍであることが報告されている（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１８５９）。したがって、コネクタとα−ＨＬとのチャネルの断面積比は、５．７であった。コネクタとα−ＨＬとの測定されたコンダクタンス比は、５．１であった（表１）。
【０１８０】
チャネルのコンダクタンスは、その断面積に比例するので、バッファ溶液中でウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタにより形成される開孔部の断面積は、α−ＨＬよりも約５．１倍大きいと結論付けることができ、これは両方のタンパク質の結晶データから得られる断面積の比を用いて十分比較した。更に、他の膜貫通タンパク質、又は大きなチャネルを有するイオンチャネルタンパク質、例えば、ストレプトリジン（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｃｅｌｌ  ９７：６４７）、Ｋｉｒ（Ｌｏｐａｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ７１：６８２）、ＶＤＡＣ（Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １２：４９５）、及び細菌のポーリン（Ｉｑｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：２４３）と比較して、前記コネクタチャネルは、更なる利点を有していた。例えば、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタチャネルは安定であり、既に報告されている膜貫通チャネルとは異なり、報告されている条件下で電圧ゲーティングを示さなかった。チャネルコンダクタンスは、均一であり、これは−１００ｍＶ〜１００ｍＶで印加電圧に直線的に応答することを示す（図６Ｆ及びＧ）。
【０１８１】
＜二本鎖ＤＮＡの移動＞
直線状及び環状プラスミドＣｘ４３のＤＮＡ（５．５ｋｂ）の両方を用いて、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタチャネルにより形成される開孔部を通過するｄｓＤＮＡの移動について調べた。直線状ＤＮＡプラスミドの場合、ＤＮＡの移動は、１個のコネクタ挿入の電流ジャンプを一過的に２５％〜４５％減少させる、多くの電流遮断を誘導した（図８）。３５ｂｐのｄｓＤＮＡの移動実験でも類似の結果が見られた（図９）。しかし、直線状Ｃｘ４３をシスチャンバに添加したとき、電圧を正電位に切り換えるまでかかる遮断は見られなかった（図６Ｇ）。短時間の遮断は、ＤＮＡ移動の発生に起因していた可能性がある。対照的に、ＤＮＡが存在しないとき、電流トレースは静止状態であった（図８、９）。時に、検出可能な最短時間、非特異的な遮断が観察された。これら非特異的な遮断は、ＤＮＡ移動事象に比べて稀にしか生じなかった。それらは、通常、サンプリング周波数の限界に極めて近い検出可能な時間を特徴としていた（図８Ｂ及び図６Ｇ）。環状プラスミドｄｓＤＮＡＣｘ４３を用いたとき、環状プラスミドの移動は観察されなかった（図８、左上）。興味深いことに、ＤＮａｓｅＩで分解した環状プラスミドを同量チャンバに添加したとき、一過的な遮断が突如生じた（図８Ｂ、左下）。ＤＮａｓｅＩで分解した直線状Ｃｘ４３を用いたときも同様の結果が観察された（図８Ｂ、右下）。上記結果は全て、直線状ｄｓＤＮＡのみがコネクタチャネルを通過することを確認した。
【０１８２】
時に、数ミリ秒〜数百ミリ秒の持続時間の遮断事象が、５％〜１５％の範囲で観察された（図８Ｃ、右）。これら事象は、ＤＮＡが存在しないときに生じることが見出されているので、ＤＮＡの移動以外の非特異的な遮断に起因していた（図９Ｂ）。更にリポソームをチャンバに添加した後、前記非特異的な遮断事象が増加するので、前記非特異的な遮断事象は、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタ開孔部（伝導性チャネル）と脂質又は脂質ミセルとの相互作用に起因していた可能性がある。前記非特異的な遮断の発生は、希釈したコネクタで再構成されたリポソームを用いたとき、及び／又は低い膜貫通電圧を印加したときに最低限に抑えることができた（図８Ｃ、左）。興味深いことに、時に、複数の遮断事象が同時に検出されることがあった（図８Ｂ、右上、及び図９）。これら事象を、複数の細孔条件下で記録した。ＤＮＡ添加前後の事象を記録した連続電流トレースも示した（図９Ｂ）。あるとき、３番目のウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの挿入後に、突如ＤＮＡ遮断が観察された。それに比べて、コネクタ挿入前にＤＮＡを予めバッファと混合したとき、最初の挿入が生じた直後にＤＮＡの遮断が観察された（図９Ａ）。この結果は、ＤＮＡチャンバ内に撹拌設備を備えていないと、ＤＮＡ移動を遅延させることを示した。
【０１８３】
遮断速度は、ＤＮＡ濃度及び膜貫通電圧という２つの要因に影響を受けていた。３つのウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタが挿入されている４５ｐＭのＤＮＡの存在下では、遮断速度は、約０．８遮断／秒〜約１遮断／秒であった（図８Ｂ、右上）。同数のウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタが挿入されているとき、４μＭのＤＮＡをチャンバ内に入れた場合、遮断速度は約５遮断／秒〜約５．８遮断／秒であった（図９Ａ及びＢ）。直線状Ｃｘ４３ＤＮＡでは、ランプ電圧が印加されるにつれて、遮断速度が増加した（図６Ｇ）。
【０１８４】
ＤＮＡ移動事象の持続時間（τｐ）を算出するために、３２％超の遮断エピソードを分類した、その理由は、この遮断割合がｄｓＤＮＡと細孔との断面積比に一致していると思われるためである。これら事象のヒストグラムは、図８Ｄに見られる。また、１２０ｍｓ〜９，８００ｍｓに分布する６個（−７５ｍＶ下）及び２０個（−４０ｍＶ下）の個々の中心から離れている事象は、明瞭にするためにグラフに含めなかったことに留意すべきである。−４０ｍＶにおけるの持続時間分布は、−７５ｍＶよりも広いように見える。−７５ｍＶ及び−４０ｍＶにおけるＤＮＡ遮断の平均持続時間は、それぞれ９．２ｍｓ及び２２．１ｍｓであった（−４０ｍＶ下では５０ｍｓ未満の事象のみを計算に用いた）。比較として、３５ｂｐのｄｓＤＮＡの持続時間の分布も含めた（図１０）。この場合の持続時間の平均は、０．５３ｍｓであった。したがって、ＤＮＡ移動の持続時間は、印加電圧及びＤＮＡの大きさに影響を受けると結論付けることができた。
【０１８５】
ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタにより形成されて伝導性チャネルを作製する開孔部のｄｓＤＮＡの通過を検証するために、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて、一定電圧下で１４１ｂｐのＤＮＡの移動を定量した。ＤＮＡをトランス側に添加し、３０分間間隔で定量のためにシス側からサンプルを採取した。比較のために、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの欠如下で対照実験を行った（図１１）。二重層脂質膜（ＢＬＭ）へのコネクタの挿入実験は、シスチャンバ内におけるＤＮＡ分子数の経時的な増加を示した（Ｎ＝９の実験）。対照的に、コネクタの欠如下では、シスチャンバ内のＤＮＡ分子数は、９０分間の時間経過中検出不可能なままであった（Ｎ＝４の実験）。更に、ＤＮＡ移動速度は、挿入されたウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタ数に影響を受けていた（図１２）。
【０１８６】
シスチャンバ内のＤＮＡコピー数の増加が、膜から漏出しているのではなく、ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの開孔部により形成された伝導性チャネルをＤＮＡが通過したことによるものであることを立証するために、ＢＬＭ又は仕切りの既知の漏出条件下で、３つの更なる実験を実施した。漏出が生じていたとき、シスチャンバ内の溶液１μＬ当たりのＤＮＡコピー数は、漏出の生じていなかった実験よりも約１０４倍〜約１０５倍多かった（図１２Ｂ）。
【０１８７】
（実施例３：核酸移動のためのｄｓＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの再改変）
二本鎖ＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの孔径及びコンダクタンスは、改変を通して調節されて、全て上に記載の通り、開孔部の寸法、表面のヒドロパシープロファイル、可撓性ドメインの移動の自由度、及び／又は親和性／アラインメントドメインと膜二重層との相互作用、並びに特定の親和性結合部位の性質を変化させる。膜層に組み込まれて伝導性チャネルを形成しているときの修飾コネクタの電気生理学的、化学的、及び機械的性質を、イオン強度、ｐＨ、及び温度等の異なる条件下で特性評価する。ＤＮＡを指向性膜貫通輸送するためのコネクタチャネルの配向は、本明細書に記載されるように決定され、縮合ｄｓＤＮＡの巨大リポソームへのロードは、膜貫通電位印加下で実施される。核酸のリポソーム内腔への一方向性膜貫通移動は、インビトロ及び／又はインビボにおけるレシピエント細胞への遺伝情報の送達に先行し、また、リポソーム又は膜結合バイオリアクタの作製にも先行する。
【０１８８】
（実施例４：単一分子分析においてアナライトの捕捉及びフィンガープリンティングを組み合わせるための統計的センシング装置としての、膜に組み込まれた修飾ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタ伝導性チャネル）
Ｈｉｓタグ／抗Ｈｉｓタグ抗体、Ｓｔｒｅｐタグ／ストレプトアビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、Ｓｔｒｅｐタグ／抗Ｓｔｒｅｐ抗体、及びＨｉｓタグ／ニッケルＮＴＡの対は、膜に組み込まれた修飾ｄｓＤＮＡウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタ膜貫通開孔部の、伝導性チャネルに基づく単一分子検出器としての有用性を示すためのモデル系として用いられる。コネクタは、Ｎ末端及び／又はＣ末端で、単鎖抗体である親和性／アラインメントドメインと、又はファージディスプレイにおける同定後所望の親和性結合特異性を有するペプチドと、又はＲＮＡアプタマーと融合することにより修飾され、且つアナライト捕捉（即ち、特定のアナライトが結合したときのコンダクタンスの検出可能な変化）及びアナライトのフィンガープリンティング（即ち、試験アナライトの特性評価をするために、既知のアナライトのレファレンスコンダクタンスプロファイルと比較される、既定の条件下で且つ複数の時点に亘って試験アナライトに応答して変化したコンダクタンスのコンダクタンスプロファイルの振幅及び／又は持続時間依存性作成）の両方が可能であるように上記の通り設計される。捕捉によるアナライト検出、及びフィンガープリンティングによるアナライトの特性評価の組み合わせにより、非常に低濃度で分子を同定するための感度向上（即ち、捕捉機能のみが存在する場合の能力よりも、統計的に有意に高い検出及び／又は特性評価能力）が得られる。アナライトの検出及び特性評価は、診断目的のために疾患の初期段階で行われ、アナライトの環境サーベイランスの感度が強化される。
【０１８９】
（実施例５：二本鎖ＤＮＡのセンシング及びフィンガープリンティング）
膜貫通伝導性チャネルを形成可能なＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの様々な可撓性ドメイン及び／又は親和性／アラインメントドメインを提供して、アナライトの検出及び特性評価の感度及び分解能を高めるためにチャネルの性質を調整する修飾を含む、ポリペプチド配列、寸法、ヒドロパシー、荷電性、伝導性、開孔部ドメイン（内腔）並びに／又はＮ末端及びＣ末端の少なくともいずれかの溶媒接近性に影響を与える様々な突然変異をポリペプチド配列中に生じさせる。変化したコンダクタンスの振幅及び持続時間の複数の時点に亘るプロファイル等のコンダクタンスプロファイルの作成を含むコンダクタンス測定を通して、幾つかの種類及び形状の核酸ポリマーの移動を特性評価する。癌細胞に由来するＤＮＡと伝導性チャネル含有膜とを接触させることによる、癌細胞におけるＤＮＡ不一致突然変異の検出について試験する。ＤＮＡの移動速度を低下させるための手順は、アッセイ条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン条件、印加電位の振幅）を変動させ、且つ修飾ＤＮＡパッケージングモータコネクタ組成物を変化させることにより開発される。制御されている方法でチャネル修飾化学物質により伝導性チャネルを誘導体化して、ｄｓＤＮＡの膜貫通（移動）を緩徐にし、コンダクタンスプロファイルを作成することにより単一ヌクレオチドを高精度で認識する。伝導性チャネル含有膜は、ハイスループットｄｓＤＮＡシークエンシング装置に組み込まれる。
【０１９０】
（実施例６：アナライトとしてのイオン）
二重層膜（ＢＬＭ）中の単一修飾ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタのコンダクタンスは、塩濃度の上昇と共に強固な直線関係で増加した（図１３）。更に、ＢＬＭ中のコネクタのコンダクタンスは、イオン依存性であると思われ、同濃度の塩を用いた場合、ＫＣｌ中のコンダクタンスは、ＮａＣｌ中のコンダクタンスよりも高い（図１３Ｂ及びＣ）。ＢＬＭ中のコネクタチャネルのかかる性質により、バッファ濃度を試験し、イオン種を区別し、そしてコンダクタンスを調整することが可能になる。
【０１９１】
（実施例７：アナライトとしてのＤＮＡ）
直線状及び環状プラスミドｄｓＤＮＡ（５．５ｋｂ）を両方用いて、実施例１及び２にも上記したように、膜に組み込まれた修飾ウイルスＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタにより形成される伝導性チャネルを通過するｄｓＤＮＡの移動について調べた。直線状ＤＮＡの移動は、約３０％、多数の電流遮断を誘導した（図８）。環状ｄｓＤＮＡを用いたとき、移動は見られなかった（図８）。しかし、ＤＮａｓｅＩで分解した後、直線状及び環状プラスミドＤＮＡの両方で、突如一過的な遮断が生じた（図８Ｃ及びＤ）。この結果は、直線状ｄｓＤＮＡのみがコネクタチャネルを通過するが、環状ＤＮＡは通過しないことを示した。ＤＮＡの移動は、ＳＹＢＲグリーンキットを用いて細孔を通過したＤＮＡサンプルを定量ＰＣＲすることにより確認された（図１４）。
【０１９２】
ＢＬＭ中の伝導性チャネルコネクタ開孔部は、その特徴的な持続時間に基づいて直線状ｄｓＤＮＡの大きさを区別し、また、直線状ｄｓＤＮＡと折り畳まれたｄｓＤＮＡとを区別した。５ｋｂｐのｄｓＤＮＡが印加電位下で伝導性チャネルを通過して移動したとき、異なる種類の電流遮断事象が見られた（図１５）。１Ｍのイオン強度の存在下におけるｄｓＤＮＡの持続長は、〜１５０ｂｐであり（Ｂａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：６１８５）、合成ナノ細孔を通過するＤＮＡの移動が観察されている（Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｐｈｙｓ  Ｒｅｖ  Ｅ  Ｓｔａｔ  Ｎｏｎｌｉｎ  Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔ  Ｐｈｙｓ  ７１（５  Ｐｔ  １）：５１９０３；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．４：２２９３）。単一移動事象（単一直線状事象Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型）から生じる電流遮断の不連続レベルにより、本明細書に記載される修飾ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタチャネルについても類似の観察結果が示された（図１５）。二重（及び三重）の事象は、同時に２つ（及び３つ）のチャネルを通過する２つ（及び３つ）のＤＮＡ分子の移動に起因していた（図１５Ｄ）。アナライトとして５００ｂｐのｄｓＤＮＡを用いた場合も同様の事象が観察された。
【０１９３】
ＢＬＭ中の修飾ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタチャネルを通過する一方通行の（一方向性）ＤＮＡ移動が見られた。シス及びトランスチャンバの両方において予め混合されたＤＮＡとともに、単一修飾ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタをＢＬＭに挿入した。印加電圧を正電位と負電位との間で変化させたとき、ＤＮＡ移動は、図１６に示すように一方向（正方向のみ又は負方向のみ）でのみ観察可能であった。非限定的理論によれば、ＤＮＡは、コネクタによって形成された伝導性チャネル開孔部を一方向にのみ通過することができると思われ、この解釈は、複数のコネクタ挿入を用いて実施されたｄｓＤＮＡ移動実験の結果と一致していた（図１７）。
【０１９４】
修飾ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタチャネルのアミノ酸配列を更に改変することにより、チャネルのコンダクタンスが変化した。コネクタチャネル（開孔部）内部の２３４位のリジンをシステイン（Ｋ２３４Ｃ）［配列番号４２］又はアラニン（Ｋ２３４Ａ）［配列番号４１］に置換したとき、ＢＬＭに挿入された単一修飾コネクタにより誘導された電流ジャンプは、野生型コネクタよりも小さかった（図１８）。
【０１９５】
（実施例８：アナライトとしての特異的に結合するポリペプチド（抗体））
この実施例は、本明細書に記載される修飾ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタの親和性／アラインメントドメインとの相互作用後に特異的に捕捉されるポリペプチドアナライト分子（抗体）のコンダクタンスプロファイル「フィンガープリント」の作成について記載する。
【０１９６】
ｐｈｉ２９ＤＮＡパッケージングモータタンパク質コネクタを、そのＣ末端における親和性／アラインメントドメインとしてＨｉｓ６−タグで上記のように再修飾した。再修飾されたコネクタは、ＢＬＭに挿入され、本質的に上に記載したようなアッセイ条件下で、印加電位下にて典型的な電流ジャンプを示した。特異的な抗Ｈｉｓタグ抗体をサンプルチャンバに添加したとき、電流の段階的増加が見られ、各小さな段階は、単一コネクタ細孔の合計電流ジャンプの約２０％であった（図１９）。電流ジャンプの段階的減少は、ドデカマーコネクタの１２個のＨｉｓタグ各々に１個の抗体分子が連続的に結合したことに起因しており、この連続的結合は、伝導性チャネルを形成する開孔部全体の大きさを減少させた。（ｉ）この種の抗体−抗原特異的結合相互作用を用いたアナライトの捕捉と、（ｉｉ）アナライトに特徴的なコンダクタンスプロファイル（例えば、図１９に示されるような遮断パターン）を作成することによるアナライトの「フィンガープリンティング」との組み合わせにより単一分子を同定するために、このアプローチが考えられる。
【０１９７】
上記様々な実施形態を組み合わせて、更なる実施形態を提供することができる。本明細書で参照される及び／又は出願データに記載される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許文献は、全体を参照することにより本明細書に援用する。様々な特許、出願、及び刊行物の概念を使用して更なる実施形態を提供する必要がある場合、実施形態の態様を変更してもよい。
【０１９８】
これら及び他の変更は、上記明細書を考慮して実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、用いられる用語は、明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、かかる特許請求の範囲が題された等価物の全ての範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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