(57)【要約】  粒子選別セル（１０）が、キャビティ（１２）と、キャビティ内に入る流体流（１４）の入口（１６）と、キャビティから出る流体流の第１の部分（２２）の第１の出口（１８）と、キャビティから出る流体流の第２の部分（２４）の第２の出口（２０）と、を備える。第２の出口は、第１の出口から、流れ方向（Ｘ）に対して横向きである第１の方向（Ｙ）にずれている。音響発生器（４０）が音響定常波を印加するために配置されている。定常波は、流れ方向とともに第１の方向に対して横向きである。制御器（４２）が、音響発生器の選択動作を、流体流に含まれる粒子（３２）に関係する入力データ信号（４４）に基づいて制御するために配置されている。粒子（３２）を選択的に分離して、第１の出口又は第２の出口内に入れることができる。【選択図】図１Ａ
2012501437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャビティ（１２）と、
前記キャビティ（１２）内に入る流体流（１４）の入口（１６）と、
前記キャビティ（１２）から出る前記流体流の第１の部分（２２）の第１の出口（１８）と、
前記キャビティ（１２）から出る前記流体流の第２の部分（２４）の第２の出口（２０）であって、
それによって、前記流体流（１４）は、前記入口（１６）と前記第１の出口（１８）及び第２の（２０）出口との間に流れ方向（Ｘ）を有し、
前記第２の出口（２０）は、前記第１の出口（１８）から、前記流れ方向（Ｘ）に対して横向きである第１の方向（Ｙ）にずれている、第２の出口（２０）と、
前記キャビティ（１２）内の前記流体流（１４）の分離ゾーン（３６）において音響定常波を印加するように配置された音響発生器（４０）であって、前記定常波は、前記流れ方向（Ｘ）とともに前記第１の方向（Ｙ）に対して横向きである、音響発生器（４０）と、
前記流体流（１４）に含まれる粒子（３２）に関係する入力データ信号（４４）に基づいて前記音響発生器（４０）の選択動作を制御するように配置された制御器（４２）であって、それによって、前記粒子（３２）を選択的に分離して、前記第１の出口（１８）又は前記第２の出口（２０）内に入れることができる、制御器（４２）と、を備える粒子選別セル（１０）。
【請求項２】
請求項１記載の粒子選別セル（１０）と、
前記入口（１６）に流体的に接続され、前記キャビティ（１２）内に連続した層流流体流を与えるために配置された流れ供給器（２）であって、前記流体流（１４）は物理特性界面（２６）を有し、前記物理特性界面（２６）は、法線が、流れ方向（Ｘ）に対して垂直に向けられ、前記音響定常波に対して本質的に垂直であり、前記流れ供給器（２）はさらに、粒子（３２）を、前記物理特性界面（２６）に隣接する前記層流流体流（１４）の中に、前記流れ方向（Ｘ）に分離された状態で与えるために配置されている、流れ供給器（２）と、
前記流体流（１４）の粒子の粒子特性及び個数の少なくとも一方を検出し、前記制御器（４２）に、粒子（３２）の粒子特性及び個数のうちの前記検出された少なくとも一方に応答して前記入力データ信号（４４）を供給するために配置された検出器（３４）と、を備える粒子選別システム（１）。
【請求項３】
前記検出器（３４）は前記分離ゾーン（３６）の上流に位置し、前記制御器（４２）は、前記入力データ信号が関係する粒子が前記分離ゾーン（３６）を通るときに、前記検出器（３４）がある特定の特性を検出したか、又は前記第１の粒子がある特定の個数間隔内にある場合に、前記音響定常波を印加するために配置されている、請求項２記載の粒子選別システム。
【請求項４】
前記物理特性界面（２６）は密度界面（２７）である、請求項３記載の粒子選別システム。
【請求項５】
前記密度界面（２７）の異なる側面上での密度は０．５％超だけ異なる、請求項４記載の粒子選別システム。
【請求項６】
前記音響発生器（４０）は、前記キャビティ（１２）の壁内に配置された圧電トランスデューサ（５８）を備える、請求項２記載の粒子選別システム。
【請求項７】
前記キャビティ（１２）の断面寸法は、層流を確実にするほどに十分に小さい、請求項２記載の粒子選別システム。
【請求項８】
前記音響定常波の周波数は１ＭＨｚを上回る、請求項２記載の粒子選別システム。
【請求項９】
連続した層流流体流（１４）を与えるステップ（２１０）であって、前記流体流（１４）は物理特性界面（２６）を有し、前記物理特性界面（２６）は、法線が流れ方向（Ｘ）に対して垂直に向けられている、ステップ（２１０）と、
粒子（３２）を、前記物理特性界面（２６）に隣接する前記層流流体流（１４）の中に、前記流れ方向（Ｘ）に分離された状態で与えるステップ（２１２）と、
前記粒子（３２）の第１の粒子と関係する入力データ信号（４４）を得るステップ（２１４）と、
前記入力データ信号（４４）に応答して、音響定常波を前記層流流体流（１４）の分離ゾーン（３６）において、前記第１の粒子が前記分離ゾーン（３６）を通るときに、選択的に印加するステップ（２１６）であって、前記音響定常波は、前記物理特性界面（２６）の法線に対して横向きであり、前記流れ方向（Ｘ）に垂直であり、前記音響定常波を印加しないときは、前記第１の粒子を分離して第１のフラクション内に入れ、前記音響定常波を印加すると、前記流れ方向（Ｘ）に対して横向きである前記第１の粒子の粒子流路を第２のフラクション内にずらすことが起こる、ステップ（２１６）と、を含む粒子選別のための方法。
【請求項１０】
前記粒子が、ビーズ、生体試料及び細胞からなるリストから選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記入力データ信号（４４）は粒子の粒子特性及び個数の少なくとも一方に関係する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記音響定常波の印加（２１６）を、ある特定の粒子特性が検出されたときに行なう、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記音響定常波の印加（２１６）を、ある特定の個数の粒子が前記検出器（３４）を通ったときに行なう、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記物理特性界面（２６）は密度界面（２７）である、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、粒子選別のための方法及び装置に関し、詳細には、音響波を用いる方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物学的な方法において、種々のタイプの粒子（通常、細胞）を互いに分離することが求められている。例えば、大規模な蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）が、細胞処理量として、最大で２００００粒子／秒でさえある処理量をもたらしている。しかしこのような機器は複雑で、高価で、よく教育されたオペレータが必要である。選別すべき粒子に対する環境も非常に過酷であることが多い。処理量が最も重要なパラメータではない用途では、もっと小さくて、それほど複雑でない、安価な解決法が好まれることになるであろう。またこのような小規模の解決法では、他のマイクロ流体モジュールとの一体化が可能になり、いわゆるラボ・オン・チップ解決法での複数のタスクが可能になる。
【０００３】
多くの小規模の粒子選別装置機器が提案されており、通常、オン・チップ配置として意図されている。技術の中には粒子間の物理的な違いに基づくものがあり、いわゆる無標識選別である。しかし選別は実際の粒子特性に依存しているため、このようなアプローチは、すべてのタイプの粒子に対して広く適用できるわけではない。定常波内の粒子に対する音響力に基づく無標識分離方法の一例が、米国特許第１９２９７５０号明細書に開示されている。国際公開第２００４／０２４２８７号において、流体中の粒子を平面境界に送るための装置が開示されている。単一の圧力ノードを伴う超音波定常波を用いて、粒子を定常波に沿って圧力ノード又はアンチ・ノードに向けて移動させる。
【０００４】
同様の技術が、米国特許出願公開第２００６／０１６３１６６号明細書において、このような定常波に対する応答が異なる粒子を分離するために用いられている。
【０００５】
別のグループの技術は標識化技術と呼ばれ、対象粒子が、ある段階において標識化される。このような標識の典型的な例は、対象粒子に選択的に取り付けられた蛍光物質である。粒子のストリームにおいて、標識化を検出し、連続的な選別において検出情報を利用し、ある切換器を用いて粒子を相応にずらす。切り替えは種々の技術（粒子又は粒子を含む流体を移動させること）によって行なうことができる。非排他的な例は、流体力学的切り替え、光学選別、動電学的選別、及び磁気選別である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００６９７１７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術の微小選別方法には、種々の不利点がある。そのうちの幾つかでは、粒子を不注意な取り扱い（例えば、高電界、高光強度、又は熱）に対してさらしてしまう。他の方法は、厳しい要求を例えば粒子が運ばれる流体に課していて（例えば動電学的方法）、その結果、他のシステムとの一体化が難しくなっている。さらに他の方法では可動部分を伴うため、目詰まりの原因となる場合がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、粒子選別のための装置及び方法であって、一般的に粒子特性には無関係であり、粒子を取り扱うために用いられる他の機器との一体化が容易である装置及び方法を提供することである。また装置は好ましくは、可動部分がなく、オン・チップ設計に適していなければならない。さらに選別原理は好ましくは、選別する粒子に対して優しくなければならない。好ましくは、選別は、粒子の連続流に対して行なわれなければならない。
【０００９】
前述の目的は、同封の特許請求の範囲による方法及び装置によって達成される。一般的に言えば、第１の態様によれば、粒子選別セルは、キャビティ、キャビティ内に入る流体流の入口、キャビティから出る流体流の第１の部分の第１の出口、及びキャビティから出る流体流の第２の部分の第２の出口を備える。流体流は、入口と第１及び第２の出口との間の流れ方向を有する。第２の出口は、第１の出口から、流れ方向に対して横向きである第１の方向にずれている。音響発生器が、キャビティ内の流体流の分離ゾーンにおいて音響定常波を印加するために配置されている。定常波は、流れ方向とともに第１の方向に対して横向きである。粒子選別セルはさらに、制御器であって、音響発生器の選択動作を、流体流に含まれる粒子に関係する入力データ信号に基づいて制御するために配置された制御器を備えている。こうして粒子を選択的に分離して、第１の出口又は第２の出口内に入れることができる。
【００１０】
第２の態様によれば、粒子選別システムが、第１の態様による粒子選別セルを備えている。粒子選別システムはさらに、流れ供給器であって、入口に流体的に接続され、連続した層流流体流をキャビティ内に与えるために配置された流れ供給器を備えている。流体流は物理特性界面を有している。物理特性界面は、法線が、流れ方向に対して垂直に向けられ、音響定常波に対して横向きである。流れ供給器はさらに、粒子を、物理特性界面に隣接する層流流体流の中に、流れ方向に分離された状態で与えるために配置されている。検出器が、流体流の粒子の粒子特性及び個数の少なくとも一方を検出するために、また制御器に、粒子の粒子特性及び個数のうち検出された少なくとも一方に応答して、入力データ信号を供給するために配置されている。
【００１１】
第３の態様によれば、粒子選別のための方法が、連続した層流流体流を与えることを含んでいる。流体流は物理特性界面を有している。物理特性界面の法線は、流れ方向に対して垂直に向けられている。本方法はさらに、粒子を、物理特性界面に隣接する層流流体流の中に、前記流れ方向に分離された状態で与えることを含む。粒子のうち第１の粒子に関係する入力データ信号を得る。音響定常波を、入力データ信号に応答して、層流流体流の分離ゾーンにおいて、第１の粒子が分離ゾーンを通るときに選択的に印加する。音響定常波は、物理特性界面の法線に対して横向きであるとともに、流れ方向に対して横向きである。音響定常波を印加しないときは、第１の粒子は第１のフラクションに分離される。音響定常波を印加すると、流れ方向に対して横向きである第１の粒子の粒子流路を第２のフラクション内にずらすことが起こる。
【００１２】
本発明に伴う１つの優位性は、本方法が、事実上すべてのタイプの粒子に対して適用可能であるということである。なぜならば、物理的な力は間接的にのみ粒子に印加されるからである。その結果、粒子自体に対する影響は一般的に非常に優しい。本発明による装置は、オン・チップ目的に対して容易にデザインされ、少なくとも最も基本的な概観において、本装置には可動部分がない。単純な物理特性界面（通常、密度界面）を用いることで、利用できる流体に対する制約が非常に小さくなるため、可能な他のシステムとの適合性が高まる。装置原理は小型でも容易に実現されるため、粒子輸送に必要な体積が減る。装置は、たとえ他のタイプの流れも取り扱えるとしても、連続流に対する動作にも適している。他の優位性について、本発明の異なる実施形態と関連して、さらに説明する。
【００１３】
本発明は、そのさらなる目的及び優位性とともに、以下の説明を添付図面とともに参照することによって、最良に理解される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】本発明の実施形態による粒子選別セルの概略図である。
【図１Ｂ】印加定常波を伴う図１Ａによる粒子選別セルの概略図である。
【図１Ｃ】図１Ａによる粒子選別セルの断面図である。
【図１Ｄ】本発明の実施形態による粒子選別システムの概略図である。
【図２Ａ】音響放射力の作用を例示する粒子選別セルのキャビティの断面である。
【図２Ｂ】音響放射力の作用を例示する粒子選別セルのキャビティの断面である。
【図２Ｃ】音響放射力の作用を例示する粒子選別セルのキャビティの断面である。
【図２Ｄ】音響放射力の作用を例示する粒子選別セルのキャビティの断面である。
【図３】本発明の別の実施形態による粒子選別セルの概略図である。
【図４】本発明のさらに別の実施形態による粒子選別セル試験機器の断面図である。
【図５】図４の粒子選別セル試験機器の別の断面図である。
【図６】本発明の実施形態による方法のステップを例示するフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図面の全体に渡って、同じ参照番号を、同様の又は対応する要素に対して用いる。
【００１６】
図１Ａに、本発明の実施形態による粒子選別セル１０を概略的に例示する。粒子選別セル１０は、キャビティ１２を備えている。キャビティ１２は、本実施形態においては、入口１６、第１の出口１８、及び第２の出口２０を有している。入口１６によって、流体流１４が、キャビティ１２に入ることができ、本質的に、入口１６と第１及び第２の出口１８、２０との間の流れ方向Ｘに流れることができる。第１及び第２の出口１８、２０は、第１の方向Ｙ（流れ方向Ｘに対して垂直）において互いにずれている。流体流１４は、第１及び第２の部分流れ２２及び２４にそれぞれ分割され、対応する出口１８、２０を通って出ていく。
【００１７】
流体流１４は、入口１６に与えられ、物理特性界面２６を有している。すなわち、物理特性界面２６の一方の側にある流体流１４の第１の流体成分２８の物理特性は、物理特性界面２６の反対側にある流体流１４の第２の流体成分３０とは異なっている。物理特性界面２６は、本実施形態においては、密度界面２７である。すなわち、密度界面２７の対向する側にある流体は、異なる密度を示す。しかし代替的な実施形態においては、物理特性界面２６は他のタイプ（例えば、粘度）とすることができる。また流体流１４は、選別すべき粒子３２を含んでいる。粒子３２は、流体流１４において物理特性界面２６に隣接して位置している。粒子を、物理特性界面２６のいずれかの側に与えることができる。
【００１８】
キャビティ１２は比較的小さい寸法である。試験機器としては、幅が第１の方向Ｙに通常１ｍｍのオーダーであるものを用いている。高さ寸法、すなわち、第１の方向Ｙ及び流れ方向Ｘの両方に垂直な寸法は通常、さらに小さい。高さ寸法によって、どの音響駆動周波数を用いるかが決まる。寸法が小さいほど、駆動周波数を高くすることができ、結果として、音響放射力を強くすることができる。寸法が小さいことで、付加的な外乱が加えられなければ、確実に層流がキャビティ１２を通って実現される。したがって、わずかな外部擾乱もなければ、流体流はキャビティを通り、物理特性界面２６は第１の方向Ｙにおいて同じ位置に保たれる。例示した実施形態においては、物理特性界面２６、したがってその付近における粒子は、このような状況の下では、キャビティ１２から第１の部分流れ２２の中で出口１８を出ていく。
【００１９】
検出器３４が、粒子選別セル１０の検出ゾーン３８内に位置している。検出ゾーンは、少なくとも、キャビティ１２のうち、流体流１４の物理特性界面２６が通過する部分に及んでいる。検出器３４は、本実施形態においては、流体流１４内の粒子３２の粒子特性を検出するために配置されている。検出器３４は、キャビティ１２の壁内に又は外部機器として、例えば光学的検出を行なうために設けることができる。また粒子選別セル１０には分離ゾーン３６もある。検出ゾーン３８は分離ゾーン３６の上流に位置している。音響発生器４０が、分離ゾーン３６内に設けられており、音響定常波を、分離ゾーン３６における（すなわちキャビティ１２内の）流体流１４を通して印加するために配置されている。通常、音響発生器は、音響波を効率的に印加するために、キャビティ壁としてか又はキャビティ壁と音響的に接触している状態で設けられている。
【００２０】
制御器４２が、音響発生器４０に接続され、音響発生器４０の選択動作を制御するように配置されている。選択動作は、流体流１４に含まれる粒子３２に関係する入力信号４４に基づいて行なわれる。本実施形態においては、入力信号４４は検出器３４によって与えられる。検出器３４が分離ゾーン３６の上流に位置しているので、音響発生器４０の動作を、当該粒子３２が分離ゾーン３６内へ移動した時間に適合させることができる。こうするためには、所定の流量が維持される必要がある。さらに、分離ゾーン３６内で各個々の粒子３２を別個に処理できるようにするために、各粒子３２間の距離は、少なくとも、分離ゾーン３６の流れ方向Ｘにおける長さに等しくなければならない。
【００２１】
図１Ｂに、音響発生器４０が動作している状況を例示する。定常音響波が、分離ゾーン３６において、流れ方向Ｘに対して垂直で物理特性界面２６と平行な第２の方向Ｚ（紙面の外に向く）に与えられる。言い換えれば、物理特性界面２６は、法線方向が、流れ方向Ｘと定常音響波の第２の方向Ｚとに対して垂直に向けられている。音響発生器４０から発生する音響信号の周波数は、流体の音の速さを考慮に入れて、Ｚ方向のキャビティ１２の寸法に適合するように調整される。図１Ｃに、キャビティ１２の分離ゾーン３６上流の断面を例示する。物理特性界面２６が線として示され、粒子３２が物理特性界面２６の付近に位置している。
【００２２】
図１Ｂにおいて分かるように、定常音響波を印加する結果、物理特性界面２６が移動することになる。少なくとも一部の物理特性界面２６は、第１の方向Ｙに、二重矢印４６で例示する距離だけ移動する。粒子３２は流体の移動に追随して、粒子３２も第１の方向Ｙに移動される。距離４６は、粒子３２の当初の位置と出口１８、２０間の分割点との間の距離４５よりも長い。この結果、粒子は今度は、代わりに、キャビティ１２から第２の部分流れ２４の中で出口２０を通って出ていく。このようにして、粒子３２に対する移動作用が達成される。これは粒子特性には、ほぼ無関係である。その代わり、粒子は、流体流１４の物理特性界面２６において生じる流体の移動に追随する。
【００２３】
以下でより詳細に説明するように、物理特性界面２６の異なる部分のずれは異なっている。これを、図１Ｂにおいて斜線領域で例示する。
【００２４】
図１Ｄに、粒子選別セル・システム１を概略的に例示する。粒子選別セル１０が、その入口１６を介して流れ供給器２に流体接続している。流れ供給器は、連続した層流流体流を粒子選別セル１０のキャビティ内に与えるために配置されている。第１の流体収集器３及び第２の流体収集器４が、粒子選別セル１０の出口１８、２０に流体的に接続されてる。音響発生器４０を動作させることによって、流体流に従う粒子を、収集器３、４のどちらかに選択的に選別することができる。
【００２５】
物理特性界面の第１の方向Ｙにおける移動は、音響放射力によって生じる。流体のうちの１つの中に存在する粒子は、その流れとともに移動する。このような力に対する理論モデルを、密度界面の場合に対して付録で説明している。以下、より概念的な説明を図２Ａ〜Ｄと関連して示す。
【００２６】
図２Ａに、キャビティ１２の断面を例示する。第１の流体成分２８が、第２の流体成分３０から物理特性界面２６によって分離されている。以下の説明では、密度界面２５を仮定している。第１の流体成分２８は、この実施形態においては、第２の流体成分３０よりも密度が高いと仮定している。粒子３２が、第１の流体成分２８内の密度界面２５近くに与えられている。
【００２７】
次に、図２Ｂについて考える。ここでは、定常音響波が第２の方向Ｚに印加されている。その結果、一次放射力が粒子３２に印加され（ＦＰ）、粒子３２を第２の方向Ｚに移動させる傾向がある。粒子３２が正の音響コントラスト因子を有する場合（これは典型的な状態であり、本実施形態において仮定している）には、一次放射力ＦＰはキャビティ１２の中央部分に向けられる。強力なＦＰは「プリ・フォーカシング効果」として作用して、粒子３２を流体流の中央部に集める。また音響放射力ＦＩが存在していて、粒子３２自体ではなく、密度界面２５に作用する。この音響放射力ＦＩは、第１の方向Ｙに方向付けられ、高密度流体成分（この実施形態においては、第１の流体成分２８）内に向けられている。音響放射力ＦＩは、例示したλ／２キャビティ１２の上壁及び下壁において最も高いと予想される。質量流量は保存されるので、反対方向の流れが流体流の中央部で生じなければならず、ここでは粒子３２がプリ・フォーカスされている。音響放射力ＦＩによって、密度界面が高密度流体成分の方にずれて、中央部分が他方の方向に押しやられ、それと一緒に粒子が引っ張られる。これは、粒子３２も第１の方向Ｙに沿ってずれ４６を受けることを意味する。
【００２８】
図２Ｃに、別の実施形態として、粒子を、代わりに低密度流体成分３０中に導入した場合を示す。密度界面２５のどちらの側に粒子が位置しようと、粒子は密度界面２５のずれに従うことが分かる。
【００２９】
図２Ｄの実施形態においては、粒子３２は脂質であり、負のコントラスト因子を有する。そしてこのことは、粒子３２が、この実施形態では、代わりにキャビティ１２の最上部及び最下部においてプリ・フォーカスされることを意味する。その結果、粒子は、正に向けられた音響放射力ＦＩの作用を受ける体積内に集められ、結果的に、粒子３２は高密度流体成分２８の方に引っ張られることになる。ここでも粒子３２のずれ４６が、しかし反対方向に実現される。
【００３０】
一次放射力ＦＰは複数の因子に依存する。例えば、粒子の体積及び音響のコントラスト因子である。プリ・フォーカシングの効果も流量に依存する。なぜならば、高流量では、力が粒子に作用する時間が短くなるために、フォーカシング効果は小さくなるからである。システムによっては、プリ・フォーカシング効果が小さすぎて、粒子を、第２の方向Ｚに限定された領域内に集めることはできない場合がある。このような場合は、最適なＦＰ位置の方にわずかだけシフトしたキャビティ高さに沿って位置する粒子が存在し、その結果、粒子は、第２の方向Ｚにおける場所に応じて、Ｙずれを受ける程度が異なることになる。極端な場合として、プリ・フォーカシングがなく、粒子が経路高さ全体に沿って分散されているときには、Ｙずれは種々の方向に起こる。音響定常波を印加しても、このような場合には、単に粒子をＹ方向に広げるだけで、分離を行なうことはできない。このようなシステムでは、何らかの他の形式の垂直位置決めを用いても良い。例えば煙突入口、又は経路構造内の尾根部分による流れ積層物などである。
【００３１】
図３に、粒子選別セル１０の別の実施形態を例示する。この粒子選別セル１０は、オン・チップ解決法として実現され、３つの部分入口４８Ａ、４８Ｂ、及び４８Ｃを有している。サンプル流５０（粒子が分散された第１の密度の流体を含む）を、狭い中央入口４８Ｂに与える。シース流５２（サンプル流５０内の流体と同じ流体を含むが、粒子がない）を、入口４８Ｃに与える。シャッフル流５４（シース流５２と比べて密度がわずかに異なる流体を含む）を、入口４８Ａに与える。部分入口４８Ａ〜Ｃが入口１６で合併して実際のキャビティ１２になると、シース流５２、サンプル流５０、及びシャッフル流５４が合併して１つの単一流体流１４になり、密度界面２５を有する。
【００３２】
本実施形態の粒子選別セル１０の反対側では、３つの出口１８、１９、２０が設けられている。キャビティ内に音響波を与えない場合、界面したがって粒子３２は、粒子選別セル１０から部分流体流２４の中で出口２０を通って出て行く。中程度のパワーを有する音響定常波を印加すると、密度界面２５したがって粒子３２は、第１の方向Ｙに短い距離だけずれて、粒子選別セル１０から部分流体流２３の中で出口１９を通って出て行く。強力な音響定常波を印加すると、界面２５のずれが大きくなって、粒子３２は、粒子選別セル１０から部分流体流２２の中で出口１８を通って出て行く。この実施形態によって、粒子をこのように、３つの異なるカテゴリに選別することができる。
【００３３】
当業者であれば分かるように、さらに多くの出口を有し、異なるパワーの音響波を印加することで分離された別個の粒子フラクションを処理することによって、これはさらに発展させることができ、達成可能なずれの精度のみによって限定される。したがって、現在の考え方を拡張して、標識化が異なる粒子を分離することまで進めることができる。複数の標識及び複数の出口を用いることで、複数のタイプの粒子を同時に選別することが、電圧を調整すること、したがってずれ量を調整することによって可能である。
【００３４】
ずれのサイズに影響を与える別の因子は、異なる部分流れ間での物理特性（特に密度）の違いのサイズである。流体流として密度界面上での密度の差がわずかに０．５％のものにおいてずれが観察されているが、好ましくは、流体流として、１〜２５ｍｍ／ｓの範囲にあり、経路幅及び高さがそれぞれ１ｍｍ及び７０μｍのものに対して、密度差は少なくとも１％、さらにより好ましくは２〜５％の範囲でなければならない。このように要求される界面を、例えばセル・バッファの場合に得ることは難しくはない。したがってセルを、選別プロセスで用いるべき普通のセル・バッファ内で容易に分解できる場合がある。
【００３５】
本発明の実施形態による粒子選別システムの試験機器を、作製及び試験している。図４は、試験機器の分離ゾーンを通る断面図である。ガラス板５２及びプリント回路基板５４が、真ちゅう製ホルダ５０によって一緒にクランプされている。キャビティ１２は、ガラス板５２内の凹部５３として設けられている。凹部５３の最上層は音響波に対する反射構造として働く。構造は、ホウケイ酸塩ガラス・ウェハをウェット・エッチングして、反射体厚さ１００１μｍ及び７１μｍ経路深さにすることによって作製した。経路高さによって、定常波に対する共鳴条件が決まる。キャビティ高さの好ましい範囲は１０〜１００μｍの範囲であるが、より小さいキャビティ及びより大きいキャビティの両方とも用いることができる。経路サイズは、背圧及び粒子サイズを大きくすることによって下方限定される。また小さいキャビティ内の定常波に対して要求される高周波における吸音を高めることによって、限定が課される場合がある。経路サイズは、層流条件を維持することによって上方限定される。加えて、音響キャビテーションを回避することが必要であり、したがって駆動周波数は好ましくは、１ＭＨｚよりも高くなければならない。
【００３６】
キャビティエンクロージャは好ましくは、キャビティ内に高音響エネルギーを閉じ込められるように高音響反射材からなる。しかし、エネルギー閉じ込めがより低く、トランスデューサ用の駆動電圧がより高い場合には、他の経路材料を用いても良い。ガラスを用いる場合、ガラス・ウェット・エッチングは通常、等方的なので、キャビティデザインは、結晶学的方向に対して特定の角度に限定されない。これは、例えばシリコンの場合と同様である。
【００３７】
圧電セラミック・トランスデューサ５８は、この実施形態においては、音響発生器４０として設けられる。表面圧電セラミック・トランスデューサ５８は、分離ゾーンにおけるキャビティ１２の１つの壁を構成する。この特定の実施形態における圧電トランスデューサ５８は、小型の単層チタン酸ジルコン酸鉛超音波トランスデューサで、寸法は９００ｘ９００ｘ２００μｍ３であった。トランスデューサを、１．５ｍｍ厚のプリント回路基板５４上に導電性の銀ペイントによって取り付けた。エポキシをトランスデューサの周りに注入して、硬化後、表面を研磨した。トランスデューサ５８の最上部電極をＡｕの蒸着によって堆積させた。５μｍ厚のパリレンＣコーティングを、経路再組立て中に金属表面を保護するために、またサンプルとエポキシとの間の接触を防止するために加えた。コーティング・ステップによって、装置の生体適合性が向上した。なぜならば、ガラス及びパリレンＣは両方とも不活性材料と考えられるからである。
【００３８】
トランスデューサ領域は比較的小さいために、作用はキャビティの小さい部分（分離ゾーン）に位置することになる。このように励起領域が小さい場合は、トランスデューサを流体と直接接触させることによって、キャビティの他の部分において音響定常波が支持される危険が最小になる。
【００３９】
トランスデューサは、本実施形態においては、厚膜処理によって画定されるＰＺＴ材料に基づく圧電トランスデューサである。別の代替案はＳＡＷ（表面弾性波）例えばＡＩＮ、圧電性ポリマー、又は複合トランスデューサーである。移動を導入する他の方法を用いても良い。例えば静電偏向又はメンブレン移動である。トランスデューサは一体化されていても良いし外付けでも良い。本実施形態においては、トランスデューサは最下部経路壁内に一体化されている。複数のトランスデューサを用いても良い。トランスデューサが直列に位置していれば、ずれ応答が増す場合がある。
【００４０】
トランスデューサ裏面における高反射率を確実にするために、プリント回路基板５４内に凹部５７も設けると、その結果、空気体積５６が増える。
【００４１】
図５に、図４の試験機器の断面図を例示する。ここでは、４つの部分入口４８Ａ〜Ｄを示している。部分入口４８Ｃはシャッフル流入口であり、部分入口４８Ｂはサンプル流入口であり、部分入口４８Ａはシース流入口であり、すべてガラス板５２を通して供給される。このことを波線の孔によって示す。部分入口４８Ｄは、キャビティ１２の平面内に設けられた付加的なシース流入口である。シャッフル流体の量を、実験中に、サンプル流体の量の２倍と５倍の間で変化させた。各シース流内の流体の量は、サンプル流体の量の１０倍であった。また出口１８及び２０は、説明図に垂直な方向にＰＣＢ５４を通って出ている。入口４８Ａ〜Ｄと出口１８及び２０には、望ましい側から、すなわちガラス板５２又はＰＣＢ５４を通して、供給することができる。
【００４２】
実験中に、１７％グリセロールの脱イオン水溶液を、シャッフル流体及びサンプル流体として用いた。シース流体は脱イオン水からなっていた。シリンジ・ポンプを用いて流れを駆動した。評価中に、キャビティ内の全体積流量として６．９〜１０４．０μＬ／分を用いた。これは、レイノルズ数として０．２〜３に対応する。
【００４３】
第１の評価の際、粒子は、９．９μｍ及び１．９μｍの共重合体粒子を、１７％グリセロールの脱イオン水溶液中で分解したものであった。粒子は、緑色蛍光を発し、容易に検出することができる。これらの実験で用いた検出器は、高感度冷却ＣＣＤカメラを伴う倒立顕微鏡であった。負のコントラスト因子を伴う粒子を調べるために、脂質水溶液のサンプル流も調査した。生体細胞も試験した。Ｓｙｔｏ１３標識化ねずみの神経細胞（直径１０〜１５μｍ）を用いた。
【００４４】
蛍光標識された入力粒子又は細胞を検出ゾーン内で検出して、自動切り替えを、トランスデューサに正弦波信号を供給することによって行なった。正弦波信号は、細胞がトランスデューサに達するのに必要な時間に対応する遅延時間を伴うものであった。細胞の識別は、検出ゾーン内での強度が閾値を超えたときに行なった。実験中に、毎秒約５つの画像を処理した。自動切り替えの評価を、出口内で粒子を分析することによって行なった。
【００４５】
トランスデューサの励起は、高周波発電機及び自社製増幅器を用いて行なった。トランスデューサにおける電圧は８Ｖピーク・ツー・ピークであった。この励起信号を、細胞の音響捕捉を回避するために、流速が小さいときには小さくした。本実施形態における最適な駆動周波数は１０．３ＭＨｚであると確認された。音響の観点から、音響キャビテーションを回避するためには、駆動周波数は好ましくは、１ＭＨｚよりも高くなければならない。
【００４６】
分離能力を確かめた。例えば、９．９μｍ粒子の軌跡のずれを測定したところ、不攪乱軌跡に対して最大で７３０μｍであることが分かった。前述したように、軌跡は密度界面のずれに追随する。
【００４７】
粒子の出口位置を、流体速度を上げて評価した。最大理論速度は、同時に１つの粒子をトランスデューサ上方に据えることができるサンプル濃度を用いるという仮定に近くなるように仮定することができる。２７粒子／秒をもたらすある特定の流速の場合は粒子ずれは２２０μｍであった、２粒子／秒の対応する流れの場合は粒子ずれは６５０μｍであった。
【００４８】
滞留時間（すなわち、規定された流体体積がトランスデューサ上方に位置する時間）が、ずれのレベルに影響した。流速が大きくるほど、ずれのレベルが小さくなることが観察された。ずれが飽和することが低速度で観察された。またずれのレベルは、トランスデューサ表面に対する（すなわち、第２の方向Ｚにおける）入口位置に依存することも観察されている。
【００４９】
図６に、本発明の実施形態による方法のステップのフロー図を例示する。粒子を選別するための方法はステップ２００から開始する。ステップ２１０では、連続した層流流体流を与える。流体流は物理特性界面を有している。物理特性界面の法線方向は、流れ方向に垂直に向けられている。ステップ２１２では、粒子を、物理特性界面に隣接する層流流体流の中に与える。また粒子を流れ方向に分離する。ステップ２１４では、ある特定の粒子に関係する入力データ信号を得る。ステップ２１６では、音響定常波を、層流流体流の分離ゾーン内で、入力データ信号に応答して選択的に印加する。印加を調整して、当該粒子が分離ゾーンを通るときに起こるようにする。物理特性界面の法線は、音響定常波及び流れ方向に対して横向きである。音響定常波を印加しないとき、当該粒子を分離して第１のフラクション内に入れることができる。音響定常波を印加すると、流れ方向に対して横向きである当該粒子の粒子流路が第２のフラクション内にずれる。ステップ２９９で、手順は終了する。
【００５０】
本発明は、粒子の標識化された選別と組合せることに適している。また本発明は、固有の信号応答（例えば自己蛍光又は化学発光）を有する粒子に対して用いても良い。粒子自体に容易に検出可能な特性がない場合には、粒子を何らかの方法で標識化して選別を容易にしなければならない。標識化を例えば蛍光種を用いて行なうことは、生物学的応用において広く用いられており、本発明と関連させた場合にも有利に用いることができる。また他の標識化技術も用いることができる。例えば着色色素である。またビーズ又は他の種類の材料科学サンプルをコーティングして、小粒子に選択的に結合することもでき、小粒子はその結果、検出が可視化される。サンドイッチＥＬＩＳＡの考え方を用いても良い。実際の選別は、粒子特性自体に主に依存するわけではなく、音響発生器用の制御ユニットに送られる入力データ信号にのみ依存する。
【００５１】
本発明は、粒子のカウントを行なうために用いることもできる。検出器が、粒子の存在を検出するために配置されている場合、検出器は、検出器を通る検出粒子の個数をカウントしても良い。したがって、音響発生器の制御ユニットに対する入力データ信号を、検出器を通った粒子の個数を用いて支援しても良い。この技術は、ある特定の個数の粒子を異なるフラクションに（例えば、サンプル調製の一部として）分離するために用いることもできる。例えば、サンプルとして正確に１０００個の粒子を有するものが要求された場合、検出器は通過粒子の個数をカウントしても良く、粒子１００１個が検出されたときに、音響発生器を起動して、この粒子と後続の粒子を、それまで用いた出口から離れるようにずらす。
【００５２】
異なる種類の粒子に対する一般的な適用性があるために、本発明は、多くの異なる用途において非常に有用なものとなっている。粒子のずれの原因は、物理特性が異なる流体間の流体界面に作用する音響放射力から生じる流体運動である。粒子の大きなずれを達成することができる。さらに、ずれ方向が定常波方向に垂直であるため、最大ずれは、定常波内の音響ノードとアンチ・ノードとの間の距離（流体中の４分の１波長の範囲である）によって限定されない。これは、他の多くの音響分離技術を制限しているものである。粒子は、例えば細胞又は他の任意の生体試料又はビーズとすることができる。
【００５３】
物理特性界面の位置は、前述したほとんどの実施形態において、その法線方向が、音響発生器表面（すなわち、通常はキャビティ表面）の法線方向に本質的に垂直となる所である。また音響放射力は、物理特性界面の法線が発電機表面の法線に平行である場合にも予想して良い。これらの２つの場合は２つの両極端であって、中間の角度において上述の各表現の寄与があると予想しても良い。しかし、２つの流体間で音響エネルギーが相対的に増大することは、このような実施形態に対しては異なっている場合がある。
【００５４】
本発明によって、例えば、細胞又は他の粒子を個々に取り扱うことが、音響発生器の好ましい小型の領域に起因して適度に集中した場合に可能になる。これらの原理による装置は、例えば単一チップ上で複数の動作を行なうために、種々のタイプの粒子を取り扱う際に他のステップと容易に統合することができる。より大きいサイズのＦＡＣＳと比べて、本発明による装置は、はるかに低価格で実現することができ、それほど熟練したオペレータを必要とはせず、それほどかさばらない。他の微小ＦＡＣＳ解決法と比べたときに、本方法は、高電界に基づく分離方法と比べて優しい。他の必要な外部計測器との一体化も簡単である。さらに可動部品が全くない。
【００５５】
本発明には、多くの応用分野がある。本発明を、例えば、生細胞を死細胞から選別するために用いることもできる。細胞移植に関する用途では、取り扱いが優しいことが喜ばれる。また本方法は、タンパク質生産用の組み換え細胞を他の細胞から選別するために容易に用いることができる。例えば骨髄又はＣＳＦ（脳脊髄液）において幹細胞を普通の細胞から選択することができる。幹細胞は総数のほんのわずかな割合を構成するにすぎず、ここで示した装置によって効率的に、容易に分離することができる。
【００５６】
前述した実施形態は、本発明の少数の説明例として理解すべきものである。当業者であれば分かるように、種々の変更、組合せ、及び変形を、本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に施しても良い。特に、異なる実施形態における異なる部分解決法を、技術的に可能であれば、他の構成において組合せることができる。しかし本発明の範囲は添付の請求項によって規定される。付録
超音波音場が起動するとすぐに、流体は流体−流体界面において音響放射力を受け、その結果、流体の対流運動が起こる。数パーセントの範囲の密度差が、例えばシャッフル流とサンプル流との間の界面にあれば、効果的な流体運動を発生させるのに十分である。流体界面に作用する音響放射力ＦＩ、
【００５７】
【数１】
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【００５８】
によって、流体界面に垂直な（ここでの場合はＹ方向の）流体の移動が生じる。λは音響波の波長、ｖｔは音響発生器表面における粒子速度振幅、ρ０１及びρ０２は、それぞれ、音がない場合の第１の流体成分及び第２の流体成分の密度である。ＱＳＷは、第１の流体成分に対するＱ因子、Ｑ２は、第２の流体成分に対するＱ因子である。上述の式では、密度界面において段階的な密度差があることを仮定しており、力は、放射力によって生じる任意の対流運動によって密度差が減少するにつれて、小さくなる。粘性力は、簡単にするために省略しているが、効果を小さくするように作用し、流体運動とともに増加する。
【００５９】
流体中の粒子は、ストークス抗力ＦＳにより経路内で流体運動が起こる結果、経路内でずれていると予想される。ストークス抗力ＦＳは、流体界面における音響放射力に起因する速度ｖＦｙを伴う第１の方向の流体の移動に対して、以下のように表される。
【００６０】
【数２】
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【００６１】
ηは流体の粘度、ｒは球状粒子の半径である。同様の体積の粒子又は細胞はすべて、同じ量だけずれると予想される。ストークス抗力は、周囲の媒体と異なる速度を有する粒子に作用する。付加的な効果（例えば、重力、及び初期の前方への流体運動からの運動量）も、粒子軌跡に影響を与える場合がある。しかし粒子が非常に重くて小さい場合を除いて、粒子は、自らが分解している媒体の軌跡に従うる。
【００６２】
加えて、粒子に対する一次放射力によって、第２の方向Ｚに事前位置合わせが生じる。粒子に対する一次放射力（ＦＰ）は、以下のように表現される場合がある。
【００６３】
【数３】
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【００６４】
ここで、ｒは粒子の半径、ｐａは音誘発圧力振幅、ρ０は流体の密度、ｃ０は流体の音の速度、ｆ１及びｆ２は、以下のように定義される。
【００６５】
【数４】
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【００６６】
及び
【００６７】
【数５】
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【００６８】
ここで、ρは粒子の密度、ｃは粒子の音の速度である。ｆ１及びｆ２を含む括弧は、音響コントラスト因子と言われる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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