(57)【要約】  白血球においてエピジェネティックマーカーを観察することによるアルツハイマー病の検出、診断、および／または進行モニタリングのための方法が様々な態様にしたがって提供される。アルツハイマー病の状態を決定するための方法が提供される。このように、これらの方法は、少なくとも1つの血液成分を含んでいるサンプルを基体に配置すること；このサンプルを標識して少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを同定すること；少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの量を決定すること；前記量を基準値と比較すること;およびアルツハイマー病の状態を決定することの工程を含みうる。
2012529659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の状態を決定するための方法であって、以下を含む方法：
少なくとも1つの血液成分を含んでいるサンプルを基体に配置すること；
前記サンプルを標識して、少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを同定すること;
前記少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの量を決定すること;
前記量を基準値と比較すること;および
アルツハイマー病の状態を決定すること。
【請求項２】
請求項1に記載の方法であって、さらに血液を少なくとも血液成分および他の血液成分に分離して、少なくとも1つの血液成分を含んでいるサンプルを基体上に作出することを含む方法。
【請求項３】
請求項1に記載の方法であって、少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの量を決定することは、前記標識の強度を測定することを含む方法。
【請求項４】
請求項1に記載の方法であって、さらに前記少なくとも1つのエピジェネティックマーカーに対して抗体を結合させることを含む方法。
【請求項５】
請求項1に記載の方法であって、さらに前記サンプルを提供する患者のための治療計画を準備することを含む方法。
【請求項６】
請求項5に記載の方法であって、さらに前記患者を治療物質で治療することを含む方法。
【請求項７】
請求項6に記載の方法であって、さらに以下を含む方法：
少なくとも1つの血液成分を含んでいる第2のサンプルを前記基体に配置すること；
前記第2のサンプルを標識化して、少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを同定すること;
前記少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの第2の量を決定すること;
前記第2の量を前記基準値と比較すること;および
前記治療物質の用量を決定すること。
【請求項８】
請求項6に記載の方法であって、さらに前記治療物質の有効性を評価することを含む方法。
【請求項９】
請求項8に記載の方法であって、前記治療物質の有効性を評価することは、さらに複数のエピジェネティックマーカーを時間で比較することを含む方法。
【請求項１０】
請求項5に記載の方法であって、さらに前記患者が特定の時間内でアルツハイマー病の臨床症状を発生する尤度を予測することを含む方法。
【請求項１１】
請求項10に記載の方法であって、前記尤度を予測することは、さらに複数の患者のエピジェネティックマーカー量を時間で比較することを含む方法。
【請求項１２】
請求項5に記載の方法であって、さらに前記患者のアルツハイマー病が進行する見込率を予測することを含む方法。
【請求項１３】
請求項1に記載の方法であって、さらに以下を含む方法：
少なくとも1つの血液成分を含んでいる第2のサンプルを前記基体に配置すること；
前記第2のサンプルを標識して、少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを同定すること;
前記少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの第2の量を決定すること;
前記第2の量を前記基準値と比較すること;および
さらにアルツハイマー病の状態を決定すること。
【請求項１４】
患者のアルツハイマー病の状態を決定するための方法であって、以下を含む方法：
患者から血液サンプルを採取すること;
白血球を前記血液サンプルから分離すること;
前記白血球における少なくとも1つのエピジェネティックマーカーに対して抗体を結合させること；
前記抗体に標識を付着させること;
前記標識の量を決定すること;および
前記患者のアルツハイマー病の状態を前記標識の量に基づいて決定すること。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法であって、さらに以下を含む方法：
前記白血球の第2の部分における第2のエピジェネティックマーカーに対して第2の抗体を結合させること；
前記第2の抗体に対して第2の標識を付着させること;
前記第2の標識の量を決定すること;および
前記患者のアルツハイマー病の状態を前記標識の量および前記第2の標識の量に基づいて決定すること。
【請求項１６】
請求項16に記載の方法であって、さらにアルツハイマー病の状態を前記標識の量に基づいておよび前記第2の標識の量に基づいて決定することを含む方法。
【請求項１７】
請求項14に記載の方法であって、さらに前記標識の量を参照と比較することを含む方法。
【請求項１８】
請求項17に記載の方法であって、前記参照は、前記エピジェネティックマーカーと比較された前記標識の量に関するキャリブレーション曲線である方法。
【請求項１９】
請求項14に記載の方法であって、前記少なくとも1つのエピジェネティックマーカーは、少なくとも1つのDNAメチル化マーカーおよびヒストン修飾マーカーである方法。
【請求項２０】
請求項14に記載の方法であって、前記抗体に対して標識を付着させることは、前記標識を含む抗体を前記抗体に対して結合させることを含む方法。
【請求項２１】
アルツハイマー病の状態を決定するためのシステムであって、当該装置が以下を含むシステム：
上部表面および底部表面を含む基体;
前記基体の上部表面における少なくとも1つの細部;
白血球を含むサンプル中の少なくとも1つのエピジェネティックマーカーに結合可能な少なくとも1つの抗体、前記少なくとも1つの抗体は少なくとも1つの細部に配置される;および
既知量の前記少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを含む基準値。
【請求項２２】
請求項21に記載のシステムであって、さらに以下を含むシステム：
前記基体の上部表面における第2の細部;
白血球を含むサンプル中の第2のエピジェネティックマーカーに結合可能な第2のもの、前記第2のものは前記第2の細部に配置される;および
既知量の前記第2のエピジェネティックマーカーを含む第2の基準サンプル。
【請求項２３】
請求項21に記載のシステムであって、前記基準値は、前記基体の上部表面における参照用細部に配置され、且つ前記少なくとも1つの細部に近接して配置されるシステム。
【請求項２４】
請求項21に記載のシステムであって、さらに前記少なくとも1つの抗体を同定可能な標識を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【発明者】
【０００１】
発明者:Diego Mastroeni (Surprise, AZ)、Joseph Rogers (Glendale, AZ), Andrew Grover (Peoria, AZ)、およびPaul D. Coleman (New River, AZ)
【関連出願の相互参照】
【０００２】
本出願は、米国特許商標局に2009年6月9日にDiego Mastroeni、Joseph Rogers、Andrew Grover、およびPaul D. Colemanによって出願された米国仮出願第61/185,344の優先権と利益を請求する出願であり、該出願は参照によって本出願に援用される。
【背景】
【０００３】
痴呆および老衰は、かつて自然の老化過程の一部と認識された。アロイスアルツハイマー博士は、1906年に老年痴呆を患う患者の剖検中に見つけた組織病理学的な変化を報告した。今日、これらの変化は、アルツハイマー病の特徴である神経原線維タングルおよびアミロイドプラークであると認識されている。アルツハイマー病は、最終的に痴呆および死にいたる進行性の神経変性を特徴とする。
【０００４】
今日、アルツハイマー病の最終的な病因は確立されたが、効率的な診断方法および治療様式は、疾患の原因（etiology）および病因の生物学的な基礎が複雑であることから課題を残している。科学者および臨床医は、生物学的に特異的なスクリーニング技術が存在しないことから信頼のおける診断用の検査を必要としている。アルツハイマー病の臨床診断技術は、例えば、鬱病、貧栄養（poor nutrition）、他の痴呆状態(例えば、痴呆を伴うパーキンソン病)、または薬物相互作用などの他の考えられる原因を排除することにより痴呆の症状を呈する個体をスクリーニングすることに依存する。これらの定性的で非特異的な方法は、治療があまり効果的ではない疾患の後期段階にいたるまで、アルツハイマー病の誤診断または無認識をしばしば生じる。アルツハイマー病を早期に検出して治療することは、症状をおくらせ、患者のクオリティオブライフを向上しうる治療を成功させるため常に一番に期待される事項である。生物学的な研究室での実験に基づく効率的な診断様式なしには、早期ステージでアルツハイマー病を検出して治療する能力に課題が残る。
【概要】
【０００５】
白血球においてエピジェネティックマーカーを観察することによるアルツハイマー病の検出、診断、および／または進行モニタリングのための方法が様々な態様により提供される。アルツハイマー病の状態を決定するための方法が提供される。このように、これらの方法は、少なくとも1つの血液成分を含んでいるサンプルをこのサンプルを標識する基体に配置して少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを同定すること；少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの量を決定すること；前記量を基準値と比較すること;およびアルツハイマー病の状態を決定することの工程を含みうる。
【０００６】
適用のさらなる領域は、本出願に提供される記載から明らかとなるだろう。前記記載および特定の例は例示の目的のみを意図しており、本発明の教示の範囲を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本出願に添付される図面は、例示の目的で添付され、本発明の教示の範囲を限定することを意図しない。本発明の教示は、詳細な記載および以下に説明する添付の図面からより完全に理解されるであろう:
【図１】図1は、本発明の様々な態様による様々な末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカー5-メチルシトシンの存在に関する生理的なデータに関する顕微鏡写真である。
【図２】図2は、本発明の様々な態様による、対照と比較したアルツハイマー病の患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカー5-メチルシトシンの存在における変化に関する生理的なデータに関する顕微鏡写真である。
【図３】図3は、本発明の様々な態様による、対照と比較したアルツハイマー病の患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーDOC1の存在における変化に関する生理的なデータに関する顕微鏡写真である。
【図４】図4は、本発明の様々な態様による、対照と比較したアルツハイマー病の患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーMBD2の存在における変化に関する生理的なデータに関する顕微鏡写真である。
【図５】図5は、本発明の様々な態様による、対照と比較したアルツハイマー病の患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーDNMT1の存在における変化に関する生理的なデータに関する顕微鏡写真である。
【図６】図6は、本発明の様々な態様による、様々な臨床で診断された神経学的な状態（neurological conditions）をともなう患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーHDAC1の存在における変化の定量に関する臨床および生理データを説明する棒グラフである。
【図７】図7は、本発明の様々な態様による、アルツハイマー病の臨床診断に関する末梢血白血球中の様々な例示的なエピジェネティックマーカーの存在における関連する変化の感受性および特異性に関する臨床および生理データを説明する表である。
【図８】図8は、本発明の様々な態様による、穏やかな認知障害、アルツハイマー病の1つを呈している患者、または非痴呆の正常な高齢者対照の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカー5-メチルシトシンの存在における変化に関する臨床および生理データに関する顕微鏡写真である。
【図９】図9は、本発明の様々な態様による、穏やかな認知障害、アルツハイマー病の1つを呈している患者、または非痴呆の正常な高齢者対照の末梢血白血球中のエピジェネティックマーカーDNMT1の存在における変化に関する臨床および生理データを説明する棒グラフである。
【図１０】図10は、本発明の様々な態様による、メチレンブルーに関する定量的なドットブロットおよびメチレンブルーに関するキャリブレーション曲線を説明する図である。
【図１１】図11は、本発明の様々な態様による、5-メチルシトシンに関する定量的なドットブロットおよび5-メチルシトシンに関するキャリブレーション曲線を説明する図である。
【詳細な記載】
【０００８】
以下の記載は、単なる例示であり、本発明の教示、適用、または用途を限定することを意図しない。図面をとおして、対応する参照番号が同様な、または対応する部分や特性を示すことが理解される。本発明の教示の様々な態様に示される特定の例の記載は、例示の目的のみが意図され、本出願に開示された教示の範囲を限定することを意図しない。また、記載の特性を有している複数の態様の記載は、付加的な特性を有している他の態様または記載の特性の異なる組み合わせを導入している他の態様を排除することを意図しない。
【０００９】
様々な態様によって、アルツハイマー病（以下、「AD」という）の進行を検出、診断、および／またはモニタリングするための方法、装置、システムおよびキットが提供される。様々な態様、すなわち、ADの進行を検出、診断、およびモニタリングするための方法およびシステムの詳細な記載は、本発明の様々な態様と一致する開示された方法やシステムの適用に一般化されうる特定の実施可能な開示として提供される。さらにまた、様々な態様の詳細な記載は、本出願の出願時に発明者に知られた最良の形態を含む。
【００１０】
本発明は、血液成分、例えば、白血球におけるエピジェネティック変化によるADの進行の検出、診断、およびモニタリングに関する。白血球は、任意の白血球サブタイプ、例えば、リンパ球、好中球、好塩基球、およびマクロファージを含みうる。本発明の代表的な態様において、方法は、白血球におけるエピジェネティック変化、例えば、DNAメチル化を検出することを含みうる。
【００１１】
本発明の様々な態様によると、DNAメチル化のレベルは、ADの患者の白血球において減少しうる。例示の態様において、DNAメチル化の減少は、疾患が従来方法の診断を用いて診断しうる程度にまでいまだ顕在化していないADの早期ステージの患者の白血球において検出されうる。
【００１２】
神経障害、例えば、ADの鑑別診断は、症状が明らかとなった際の精神的欠陥の原因を解明するための様々な従来方法の診断を行うことを含みうる。例えば、従来方法の診断は、ダメージが脳の特定の領域に発生したかどうかを決定するための臨床医による様々な定性的な検査、例えば、患者の問題解決能力、注意持続時間、計算能力、および記憶の評価の実施を含みうる。さらに、臨床医は、例えば、以前の心的外傷（trauma）、神経疾患の家族歴、薬物治療、および心理社会的な歴史、例えば、結婚歴、生活状態、雇用、性的過去（sexual history）、および鬱病などの心理学的な原因を示しうる重要な生命事象の指標などに関して、患者の病歴を調査することにより精神的欠陥（mental impairment）の原因を体系的に排除しうる。精神的欠陥または痴呆の別の原因を排除する方法により、臨床医はADを疑いはじめるだろう。
【００１３】
脳組織を神経原線維タングルやアミロイドプラークの存在に関して死亡後に検査するまで、ADを明確に診断できない。存命中の患者の脳組織の検査は一般的には可能ではない、または倫理的ではないが、ADの後期ステージの脳の幾つかの顕微鏡上の変化はコンピュータ断層撮影法(CT)スキャニング、核磁気共鳴映像法(MRI)、およびポジトロン放出断層撮影(PET)などの他の従来方法の診断を用いて検出しうる。CT、MRI、およびPET技術は、脳の萎縮、脳活動の変化、および血管構造などのADの後期ステージの特徴である脳における変化を示しうる。結果的に、このような技術は、変化が脳組織のニューロン細胞の内側で生化学的なレベルにとどまる疾患の早期ステージを検出することができない。
【００１４】
複数の生物学的な経路にまたがる、数千の遺伝子の発現の変化は、ADの脳の病理学的に脆弱な領域において報告された。例えば、エネルギー代謝、炎症、および細胞周期制御に関する分子経路への変化が報告されており、これらがADの病因に寄与すると信じられる。これらの遺伝子発現における変化は、ADに広く存在する。しかし、多くの異なる表面上無関係の分子経路をまたがる遺伝子発現の修飾を説明する共通の包括的な原則の解明を欠いている。
【００１５】
エピジェネティック機構は、異なる経路をまたがり細胞における全体的な遺伝子発現の調節に寄与すると考えられうる。例えば、ヒストンの修飾、非ヒストンタンパク質の結合、またはDNAメチル化などのクロマチンまたはDNA発現への変化を生じるエピジェネティック機構は、ADに特異的であろう遺伝子発現への全体的な変化を生じる能力を有するだろう。エピジェネティック機構は、ゲノムをとおした多くの生物学的な経路に関与する遺伝子の転写を修飾することによる細胞表現型における広範な変化を組織化するだろう。
【００１６】
エピジェネティック機構は、クロマチンのミクロ構造やマクロ構造、DNAの複合体、染色体タンパク質、およびヒストンタンパク質（ヒストンタンパク質は二本鎖DNAが傷ついた構造の周囲に共につなぎとめられる）における変化を伴うだろう。ヒストンタンパク質におけるコンホメーション変化またはDNAがヒストンの周囲を包む様式での修飾は、次に、他の遺伝子非損傷へのアクセスを残しつつ、幾つかの遺伝子への転写機構のアクセスを差次的に変化させる可能性がある。
【００１７】
ヒストンタンパク質を構成するアミノ酸のメチル化、リン酸化、ユビキチン結合、SUMO化、シトルリン化、ADPリボシル化、および他の翻訳後修飾を含むヒストンを修飾する複数の機構が存在するが、ヒストンアセチル化は最もユビキタスなものの1つであり、これに関する事項はかなり研究されている。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HATs)は、アセチル補酵素Aのヒストンタンパク質のN端におけるリジン残基への転移を触媒する。アセチル化の結果、ヒストンタンパク質の正電荷が中和され、相互作用したDNAの陰性に荷電したリン酸基とヒストンタンパク質尾部との相互作用が減少する。このクロマチンのコンホメーションの弛緩によって、複合体内での遺伝子へのアクセスや転写が許される。逆に、ヒストンデアセチラーゼ(HDACs)は、アセチル化されたヒストンタンパク質からアセチル基を補酵素Aに転移し、さらに凝縮したクロマチン状態を生じ、遺伝子転写を減少させるか、またはサイレンシングする。
【００１８】
DNAメチル化はDNAを修飾するエピジェネティック機構のタイプの1つを含み、これにより遺伝子発現の変化を生じる。DNA配列内で隣接するシトシン-グアニンジヌクレオチド(CpGs)は、DNAメチルトランスフェラーゼと称されるタンパク質によりメチル化されうる。シトシン-グアニンジヌクレオチドペア(CpGs)のメチル化は、メチル化されたCpG配列を含んでいる遺伝子のプロモーター領域への細胞の転写機構のアクセスを阻害しうる。メチル化は、遺伝子のコーディング領域内で、または遺伝子に隣接（flank）しうる反復DNA配列において生じる可能性がある。このようなメチル化は、プロモーター領域からある程度の距離で発生したとしても遺伝子発現を変化させうる。
【００１９】
高度にメチル化された遺伝子は、遺伝子発現の減少または抑制を示す可能性がある。逆に、CpGsを脱メチルして低メチル化されたDNAを誘発する機構によって、遺伝子発現のアップレギュレーションが導かれる可能性がある。しかしながら、低メチル化された遺伝子が抑制された遺伝子発現を示し、高メチル化された遺伝子がアップレギュレートされるとの例外が見出されているので、これらの傾向は普遍的ではない。結果的に、特定の遺伝子の発現や結果的なタンパク質レベルの変化は、その特定の遺伝子におけるメチル化の影響を検証するためにアッセイされなければならない。
【００２０】
DNAメチル化は、ヒストンアセチル化や他のヒストン修飾機構と高度に相互作用する。DNA内で近接するCpGsは、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNMT1、DNMT2、DNMT3a/b、およびDNMT4の作用でメチル化されうる。哺乳類において、DNMT1はDNA複製後にヘミメチル化されたDNAのメチル化の維持に主に関与するように見え、他方でDNMT3aおよびDNMT3bはデノボ（de novo）なメチル化に関与する。DNMT2はRNAメチルトランスフェラーゼであると典型的には考えられるが、5-シトシンDNAメチルトランスフェラーゼ活性も有し、DNAとの変性剤耐性の複合体を形成する。DNMTによりシトシンに移されるメチル基は、S-アデノシルメチオニンとの相互作用により最終的には葉酸、および更なる上流のホモシステイン-メチオニンサイクルに由来する。
【００２１】
これらのプロセスをとおして、ヒトゲノム内の約70%のCpGジヌクレオチドがメチル化される。メチル化は遺伝子上の任意のCpG部位で生じうるが、プロモーター領域内でのCpGリッチなストレッチ(CpGアイランド)に関して特に重要であろう。ヒトゲノムにおいて50,267ものCpGアイランドが存在し、28,890は単純な反復やマスクされた複雑さが低い配列である。
【００２２】
その機構によりDNAメチル化が遺伝子発現を修飾しうる、第2の関連する機構は、MeCP2などのメチル-シトシン結合複合体(MeCPs)によるものである。メチル化されたDNAと結合する場合、MeCP2は、HDACを補充することが示されており、先の述べたとおり、その後、より凝縮されたクロマチン状態や遺伝子転写の減少またはサイレンシングを誘発しうる。MeCP2遺伝子の変異は、神経発生の調節不全、精神遅滞、および運動不全をともなうレット症候群の原因である。
【００２３】
DOC1を含むMeCP1、10程の異なるペプチドから構成される高分子は、メチル化とヒストンアセチル化との間のメディエータとしても作用し、CpGジヌクレオチドを認識して結合し、HDACを補充し、転写抑制を誘発する。しかしながら、MeCP2とは異なり、MeCP1は、メチル化されたDNAに直接的に結合せず、単一のメチル-CpG-結合ドメインタンパク質（MBD2）と結合する。ヒストン修飾を誘導することに加えて、MBD2結合MeCP1は、DNMT1を補充することによりCpGsのメチル化状態の維持を助ける。DNMT1は、一方のDNA鎖でメチル基を欠損するが他方のDNA鎖でメチル基を欠損しないCpGsを認識して修復することができる。
【００２４】
上記で議論したエピジェネティック機構は、エピジェネティックマーカーに関して考慮できる。当業者に知られているとおり、「マーカー」の用語は、生化学検査、または分析用検査、またはその組み合わせにより検出しうる任意の特異的な形質として一般に認められている。例えば、マーカーは、サンプル中の酵素の存在または非存在を示しうる。また、幾つかのケースにおいて、マーカーを使用してサンプル中の酵素の濃度を決定しうる。また、マーカーは、例えば、サンプル中の生化学的な反応の活性を示しうる。さらに、マーカーは、例えば、サンプル中のタンパク質の存在または非存在を示しうる。また、幾つかのケースにおいて、マーカーを使用してサンプル中のタンパク質の濃度を決定しうる。本出願の明細書等に使用される「エピジェネティックマーカー」の用語は、少なくとも1つのDNAメチル化マーカーやヒストン修飾マーカーと規定される。DNAメチル化マーカーの例には、5-メチルシトシン、5-メチルシチジン、DNMT1、DNMT2、DNMT3a/b、MeCP、DOC1、MBD2、およびMBD3が含まれるが、これらに限定されない。ヒストン修飾マーカーの例には、HDAC1、HDAC2、およびHATが含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
DNAメチル化は、かつて細胞分裂の間にDNAメチル化を維持することについて研究された。しかしながら、DNAメチル化の役割は、ニューロエピジェネティックス（neuroepigenetics）の分野においてニューロンを含む分裂終了細胞（postmitotic cells）において解明された。DNAメチル化のニューロエピジェネティックス研究によって、ニューロンおよびシナプスの可塑性の媒介、例えば、マウスにおける幼少期のストレスから生じる生理、記憶、および行動の変化を生じる視床下部ニューロンへの持続的な修飾におけるその役割が説明された。
【００２６】
疾患によるダメージに脆弱であることが知られるアルツハイマー病を伴う患者の脳組織、例えば、嗅内皮質層IIニューロンは、DNAメチル化やDNAメチル化維持因子のマーカーに対する免疫反応性の顕著な減少を呈する。例えば、メチル化されたDNAに関するマーカーである5-メチルシトシンや5-メチルシチジンに対する抗体で標識されたニューロンは、疾患のない患者からのサンプルのものと比較してADを伴う患者からの脳組織サンプルにおいて免疫反応性の劇的な減少が明らかにされた。
【００２７】
脳組織中のマーカーの発生率の減少に基づくアルツハイマー病の診断法の開発は、侵襲性および脳組織をうる処理上のリスク、並びにそれに関連する高いコストなどの様々な理由のために現実性がない。早期ステージで疾患を検出することにより、このようなアプローチは非常に問題を含むものになり、というのも、その患者が、不確かな疾患の症状のみを呈するか、または全く症状がない可能性があるからであり、この状況が処理上のリスクおよび診断上のコストを正当化できないものにする。
【００２８】
このように、ADの特徴であるエピジェネティック変化を評価するための非侵襲性の診断技術の開発は、問題があり且つ脳組織において実施不可能である。血液、尿、口腔スワブ（mouth swab）、または毛髪のサンプルなど、医師の日常的な訪問時に採取しうる容易に入手可能な生物学的サンプルにおける診断技術に基づくことによって、簡便性、経費節減および処理上のリスクの低減化の点で利益が提供される。しかしながら、文献および他の医学の情報源によると、そのような診断技術は現在存在しない。
【００２９】
本出願の明細書等に開示のとおり、予想外の驚くべき結果が得られた。発明者は、患者の血液サンプルを分析することによるADの病的状態を決定するための方法を開発した。これらの驚くべき予想外の結果は、血液サンプルの白血球における全体的なDNAメチル化レベルが、他の疾患または非AD状態と比較して患者のADの病的状態に対して極端に高い特異性で関連しうるとの発見に関する。
【００３０】
本発明の様々な態様による様々な末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカー5-メチルシトシンの存在に関する生理的なデータを説明する顕微鏡写真100について図1を参照して説明する。本発明の様々な態様によると、免疫学的アッセイは、認知が正常な高齢者の患者の末梢血白血球のサンプルで行うことができる。免疫学的アッセイは、単離された白血球を基体、例えば、顕微鏡スライドに適用し、5-メチルシトシンに対する一次抗体での処理を含んでもよい。過剰な一次抗体は、洗浄して除去でき、次にレポーター分子が結合した二次抗体が適用される。色シグナル（colored signal）が、基体上の白血球細胞において発色し、顕微鏡を用いて観察できる。リンパ球105、好中球110、好塩基球115、およびマクロファージ120は、抗体に対して免疫反応性を示すことができ、図1に記載のとおり5-メチルシトシンの存在を示している。しかしながら、好酸球125は、これらの条件下で5-メチルシトシンと結合する抗体に対する免疫反応性を示さないことがある。
【００３１】
続いて図2に関して、顕微鏡写真200は、本発明の様々な態様による対照と比べたアルツハイマー病の患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカー5-メチルシトシンの存在における変化に関する生理的なデータを示す。様々な態様によると、5-メチルシトシンに対する一次抗体を用いる免疫学的アッセイは、認知が正常な90歳の患者(右欄に記載)およびADと診断された90歳の患者(左欄に記載)からの末梢血白血球のサンプルで行うことができる。図2に記載のとおり、顕微鏡写真200は、ADと診断された90齢の患者からの白血球205が、認知が正常な90歳の患者の白血球210と比較して免疫反応性が減少したことを示す。パネル(a)および(b)は例示の顕微鏡写真であり、40x拡大率で示される染色された白血球を記載し、パネル(c)および(d)は例示の顕微鏡写真を100x拡大率で示している。パネル(e)および(f)は、それぞれパネル(c)および(d)に示される箱で囲んだ部分を拡大した部分を示す。
【００３２】
図3に関して、顕微鏡写真300は、本発明の様々な態様による対照と比べたアルツハイマー病の患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーDOC1の存在における変化に関する生理的なデータを示す。様々な態様に説明されるとおり、および様々な態様にしたがって、従来の診断方法によりADと診断された二人の患者および二人の非罹患(ND)の高齢対照患者から単離された白血球のエピジェネティックマーカーDOC1に対する抗体との免疫反応性の間で差が観察できる。DOC1に対する一次抗体を用いる免疫学的アッセイは、各々の患者からの白血球で行うことができる。記載のとおり、ADの患者からの白血球310、315は、ND患者からの白血球300、305と比較して、DOC1に対する抗体への免疫反応性の減少を呈したので、ADの患者に関する白血球細胞に存在するDOC1の量の減少を示す。
【００３３】
次に図4に関して、顕微鏡写真400は、本発明の様々な態様による対照と比較してアルツハイマー病の患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーMBD2の存在における変化に関する生理的なデータを示す。エピジェネティックマーカーMBD2に対する一次抗体を用いる免疫学的アッセイは、従来の診断方法によりADと診断された二人の患者および二人のND対照患者の各々からの白血球で行うことができる。記載のとおり、ADを伴う患者からの白血球410、415は、ND患者からの白血球400、405と比較して、MBD2に対する抗体への免疫反応性の減少を呈したので、ADを伴う患者に関する白血球細胞に存在するMBD2量の減少を示す。
【００３４】
図5に関して、顕微鏡写真500は、本発明の様々な態様による対照と比較してアルツハイマー病の患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーDNMT1の存在における変化に関する生理的なデータを示す。エピジェネティックマーカーDNMT1に対する一次抗体を用いる免疫学的アッセイは、従来の診断方法によりADと診断された二人の患者および二人のND対照患者の各々からの白血球で行うことができる。記載のとおり、ADを伴う患者からの白血球510、515は、ND患者からの白血球500、505と比較して、DNMT1に対する抗体への免疫反応性の減少を呈したので、ADを伴う患者に関する白血球細胞に存在するDNMT1量の減少を示す。
【００３５】
図6は、本発明の様々な態様による様々な臨床で診断された神経学的な状態をともなう患者の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーHDAC1の存在における変化の定量に関する臨床および生理データを説明する棒グラフである。様々な態様によると、様々な神経学的な状態を伴う患者からのエピジェネティックマーカーと結合する抗体に対する末梢血白血球の免疫反応性を定量できる。エピジェネティックマーカーのレベルは、ニトロセルロース膜を細胞のタンパク質を含んでいる白血球からの細胞溶解産物でスポットしたタンパク質に関するドットブロットアッセイを行うことにより定量できる。細胞溶解産物をバキュームドットブロットマニフォールド（vacuum dot blot manifold）で膜上に乾燥させた。膜をエピジェネティックマーカーに対する一次抗体でインキュベーションし、洗浄し、レポーター分子が結合した二次抗体で処置した。色シグナルを発色させることができ、その強度を膜上で発色する基体の光学密度を測定するために備えたデンシトメーターを用いて測定した。
【００３６】
図6に記載のとおり、様々な神経学的な状態を伴う患者からのエピジェネティックマーカーHDAC1と結合する抗体に対する末梢血白血球の免疫反応性を定量できる。本出願の明細書等に議論されたとおり、HDAC1のレベルは、タンパク質に関するドットブロットアッセイを行うことにより定量できる。レベルの測定値または光学密度は、βアクチンをロードした対照の光学密度に対して標準化できる。ADと診断された患者のサンプル中の二次抗体からのシグナルの標準化した光学密度は、パーキンソン病と診断された患者のサンプルからのシグナルの約30%である。ADと診断された患者のサンプルの強度は、痴呆を伴う筋萎縮性側索硬化症と診断された患者のサンプルからのシグナルの約36%およびND対照である患者のサンプルからのシグナルの約40%である。記載のとおり、他の神経学的な状態を伴う患者または疾患を欠く患者からの白血球サンプルと比較してADの白血球サンプルにおけるHDAC1抗体への免疫反応性に関するシグナルにおいて顕著な減少が観察され、これにより他の状態からADを区別できる。
【００３７】
図7は、本発明の様々な態様によるアルツハイマー病の臨床診断に対する末梢血白血球における様々な例示的なエピジェネティックマーカーの存在における関連する変化の感受性および特異性に関する臨床および生理データを説明する表である。様々な態様にしたがうように、末梢血サンプルを、従来の診断方法によりアルツハイマー病と診断された51患者、他の神経学的な状態、例えば、パーキンソン病の患者、および正常な高齢者対照患者から得た。サンプルをエピジェネティックマーカー5-メチルシトシン、5-メチルシチジン、HDAC1、およびDNMT1に対する一次抗体での免疫学的アッセイを用いて抗体に対する免疫反応性をアッセイした。ADの検出に関して100%の特異性が観察され、エピジェネティックマーカーのレベルの減少により従来の診断方法でADと診断された全ての患者に関してADを決定するに至った。また、エピジェネティックマーカーに基づく診断はADの検出に関して75%〜100%の感度を示し、各白の血球サンプル中に存在するエピジェネティックマーカーのレベルによりADの患者と他の神経学的な状態の患者とが識別された。本出願の明細書等に記載のとおり、本発明の様々な態様は、患者サンプルからの白血球における複数のエピジェネティックマーカーを分析することを含んでもよい。また、さらに複数のエピジェネティックマーカーの分析の結果から病的状態を決定することを含んでもよい。
【００３８】
図8に関して、顕微鏡写真は、本発明の様々な態様による、穏やかな認知障害、アルツハイマー病の1つを呈している患者、または非痴呆の正常な高齢者対照の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカー5-メチルシトシンの存在における変化に関する臨床および生理データを示す。免疫学的アッセイを用いたエピジェネティックマーカー5-メチルシトシンに結合する抗体に対する免疫反応性は、穏やかな認知障害(MCI)またはADのうちの1つと診断された患者において観察できる。MCIを臨床的に診断でき、この患者の日常の活動は影響されないが、この患者は記憶、言語、注意、推理（reasoning）、判断、読み書きの障害を経験する可能性がある。MCIを伴う患者は正常な認知からアルツハイマー病の痴呆へと進行するリスクが高いと考えられ、MCI患者の30-40%が3年内に正式にアルツハイマー病と診断される（特に、この患者の主な欠陥は記憶に関連するものである）。
【００３９】
図8に記載のとおり、認知が正常の2患者からの対照の白血球800、805は、5-メチルシトシン結合抗体との免疫反応性が陽性であり、正常なDNAメチル化を呈している。ADを伴う2患者からの白血球810、815は、5-メチルシトシンの免疫反応性の顕著な減少を示す。しかしながら、MCIを伴う2患者からの白血球820、825は、5-メチルシトシン抗体に対して中等度の免疫反応性を示す。免疫反応性のレベルが中等度であることは、ADで観察されたDNAメチル化の減少したレベルに最終的には近づく可能性があるDNAメチル化の抑制量または異常量の指標（indicative）である。
【００４０】
図9に関して、棒グラフは、本発明の様々な態様による、穏やかな認知障害、アルツハイマー病の1つを呈している患者、または非痴呆の正常な高齢者対照の末梢血白血球におけるエピジェネティックマーカーDNMT1の存在における変化に関する臨床および生理データを説明する。MCIと診断された患者においてエピジェネティックマーカーDNMT1に結合する抗体への免疫反応性を観察できる。末梢血白血球は、従来の診断方法によりMCIまたはADと診断された患者から、およびND対照から単離された。免疫学的アッセイは、白血球サンプルにおいてDNMT1に対する一次抗体で行うことができる。スライドを顕微鏡を用いてブラインドで観察し、DNMT1抗体への視覚的な免疫反応性を有する細胞の総数を計算した。この数をスライド上の細胞の総数で割って免疫反応陽性の細胞の部分（fraction）を算出した。ND対照サンプルからの細胞の約50%は免疫反応性であった、このことはDNAメチル化に関する正常量のDNMT1を示している。しかしながら、ADサンプルの僅か約16-18%が免疫反応性であり、DNAメチル化に関して利用可能なDNMT1の量の減少を示している。DNMT1抗体免疫反応性の中等度レベルがMCIサンプルに関して観察され、利用可能なDNMT1量の減少を示している、しかし、ADレベルと同等に低いものではない。
【００４１】
例示的な態様に基づき且つ既に議論された図を参照して、2つの例示的な概念が示される。第1に、AD、ND、およびMCI患者におけるDNAメチル化の差は非常に劇的なものであり、それらを裸眼で見ることはできない。第2に、DNAメチル化に関する複数のマーカーは、全てこの差を示す。DNAメチル化は、複雑なプロセスである。これらの所見は、DNAメチル化自身がADにおいて非常に変化するのみならず、DNAメチル化を行い維持する分子にも同等に顕著な欠陥が存在することを示す。
【００４２】
それ故、様々な態様において、5-メチルシトシンマーカー、DNMT1マーカー、HDAC1マーカーおよび5-メチルシチジンマーカーを含む任意のエピジェネティックマーカーまたはその組み合わせを使用して、ADの病的状態を決定することができる。様々な態様において、5-メチルシトシンおよび5-メチルシチジンは、DNAメチル化の直接的な測定を提供できる。DNMT1およびHDAC1は、DNAメチル化の直接的な測定ではないが、これらの例示的なマーカーをさらに使用してADの病的状態を決定することができる。DNMT1はメチル化を行う分子であり、HDAC1はそのメチル化の維持に関与する分子である。様々な態様において、エピジェネティックマーカーにはDOC1、DNMT2、DNMT3a/b、HDAC2、MBD2、MBD3、RPL26、p66、MTA2、RbAp48、およびその組み合わせなどのマーカーが含まれうるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の様々な態様は、患者サンプル中の白血球の全体的なDNAメチル化の現状（present state）を観察することによりADの検出、診断、および／または進行をモニターするための方法を提供する。本発明の様々な態様によると、白血球の全体的なDNAメチル化の現状は、全体的なDNAメチル化の直接測定または全体的なDNAメチル化と関連する少なくとも1つのエピジェネティックマーカー（ヒストン関連マーカーを含む）の測定の何れかにより決定することができる。
【００４４】
例示の方法は、以下の工程を含みうる：
血液サンプルを集めること；
前記血液サンプルから白血球またはその一部を単離すること；
前記白血球に局在する少なくとも1つのエピジェネティックマーカーに抗体を結合させること；
前記エピジェネティックマーカーに結合した抗体を染色すること、または別の標識化をすること;
少なくとも1つのエピジェネティックマーカーに結合した標識からの染色またはシグナルの量を観察すること、または測定すること、または定量すること;および
前記標識からの染色またはシグナルの量と定性的または定量的な基準値とを比較すること。
【００４５】
方法の典型的な態様において、染色または標識は、エピジェネティックマーカー、例えば、メチル化されたDNA部位、またはDNAメチル化のエピジェネティック機構、例えば、これらに限定するものではないが、メチル化プロモーター、メチル化インヒビター、メチル化維持機構、およびヒストン関連マーカーと結合する抗体に対して結合できる任意の部分を含みうる。さらに、方法の他の例示の態様において、染色または標識は、エピジェネティックマーカーと結合する抗体に対して結合する抗体を含みうる。さらに様々な態様において、エピジェネティックマーカーは、少なくとも1つのDNAメチル化マーカーおよびヒストン修飾マーカーである。少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの例は、5-メチルシトシン、5-メチルシチジン、DOC1、DNMT1、DNMT2、DNMT3a/b、HDAC1、HDAC2、HAT1、MBD2、MBD3、RPL26、p66、MTA2、RbAp48、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
当該方法は、続く可視化または観察のための二次抗体を検出するために結合される可視の色素またはフルオロフォアなどの標識の付加を含んでもよい。例えば、係る標識は、視覚化されうる、または光学顕微鏡などで拡大して、または拡大なしでヒトの眼で観察されうる。別の例において、係る標識は、測定機、例えば、これらに限定されるものではないが、分光計、蛍光光度計、蛍光検出器、比色計、デンシトメーター、フローサイトメーターなど、免疫吸着アッセイまたは当業者に慣用される、または将来に作出される他の技術などの使用により、視覚化または観察されてよい。しかしながら、可視化または観察に関する如何なる方法も選択された染色または標識に大きく依存してよい。
【００４７】
本発明の様々な態様によると、免疫学的アッセイを使用して、白血球または白血球から抽出されたタンパク質またはDNAを含んでいるサンプルを分析すること、および少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの量の決定することができる。本発明の免疫学的アッセイの特定の形式は、本発明に重要な事項ではない。係る形式の例は、ELISA、放射免疫アッセイ、ドットブロットアッセイ、スロットブロットアッセイ、免疫沈降およびタンパク質定量、イムノPCR、およびウエスタンブロットを含む。
【００４８】
本出願の明細書等に記載される、DNAメチル化は、DNMT酵素ファミリーにより触媒されるメチル基のCpGジヌクレオチドにおけるシトシンの5-炭素への共有結合での付加に関するエピジェネティックな事象である。DNAメチル化分析のための方法は、全体的なおよび遺伝子特異的なDNAメチル化分析の２つのタイプに大まかに分けられる。様々な態様によると、全体的なDNAメチル化分析に関して、ゲノム中のメチルシトシンの全体レベルを測定する方法は、クロマトグラフに基づく方法およびメチル受容能力アッセイ（methyl accepting capacity assay）を含みうる。遺伝子特異的なDNAメチル化分析に関して、多数の技術が開発された。最も初期の研究は、メチル化感受性制限酵素を使用してDNAを消化し、続いてサザン検出またはPCR増幅を行った。最近、亜硫酸水素反応に基づく方法（bisulfite reaction based methods）は、例えば、DNAメチル化特異的PCR(MSP)、亜硫酸水素ゲノムシークエンシングPCR（bisulfite genomic sequencing PCR）などは非常に人気がある。その上、ゲノム中の未知のDNAメチル化のホットスポットまたはメチル化されたCpGアイランドを同定するために、幾つかのゲノムワイドなスクリーニング方法、例えば、メチル化のRestriction Landmark Genomic Scanning(RLGS-M)、およびCpGアイランドマイクロアレイが発明された。
【００４９】
さらに、白血球を含んでいるサンプルは、蛍光検出、DNAシークエンシングゲル、自動化DNAシークエンシング機におけるキャピラリー電気泳動法、マイクロチャンネル電気泳動法、および他の方法のシークエンシング、マススペクトロメトリー、飛行時間マススペクトロメトリー、四極子マススペクトロメトリー、磁力セクターマススペクトロメトリー（magnetic sector mass spectrometry）、電気セクターマススペクトロメトリー赤外スペクトロメトリー、紫外スペクトロメトリー、定電位電流測定（palentiostatic amperometry）を含むが、これらに限定されない少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの量を決定するための様々な方法により、またはサザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびＤＮＡ断片が「プローブ」および「標的」として有用であろうDNAマイクロアレイ、ELISA、蛍光定量法、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、SNP-IT、遺伝子チップ、HuSNP、ビーズアレイ、TaqManアッセイ、インベーダーアッセイ、MassExtend,またはMassCleave、TM、(hMC)法を含むDNAハイブリダイゼーション技術により分析できる。
【００５０】
末梢血からの白血球(WBC)または白血球（leukocyte）の単離は、広範囲にわたる様々な方法、例えば、これらに限定するものではないが、標準の密度勾配分離、市販の真空分離チューブシステム、セルソーティングシステム、または当業者に周知の他の技術を用いて達成することが可能である。
【００５１】
当業者に理解されうるように、血液を分画でき、血液の異なる画分を異なる医学的な要求のため使用できる。重力または遠心力の影響下で、血液は、自発的に三層に沈殿する。平衡状態で、低密度層は、血漿と称される淡黄色の清澄な液体である。底部（高密度層）は、酸素輸送のために特化した無核の赤血球(赤血球)を含んでいる深紅色の粘稠性の液体である。中間層は最小であり、赤血球層の上で且つ血漿層の下の薄白色のバンドとして出現し、これはバフィーコートと称される。バフィーコート自身は、2つの主要な成分である、有核の白血球(白色血液細胞)および血小板と称される無核の小体(または血小板)を有する。
【００５２】
また、当業者に理解されうるように、全血から白色細胞（white cells）を取得する1つの方法は、単純にEDTA血液（EDTA-blood）をシリコーン処理したガラスに定着させ、白血球リッチな上清をピペットでとることである。血液を分離してWBC成分または白血球を単離することは、当業者に周知である。しかしながら、様々な態様において、全血または白血球を含む血液の一部は、WBC成分または全血からの白血球または白血球を含む血液の一部を分離することなく、本出願の明細書等に記載された方法により分析できる。
【００５３】
様々な態様において、本発明は、ヒトのADの状態を決定するための方法を提供する。そのため、例示の方法は、次の工程を含みうる：少なくとも1つの血液成分を含んでいるサンプルを配置すること；前記サンプルを標識して少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを同定すること；少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの量を決定すること；前記量を基準値と比較すること;およびADの状態を決定すること。これらの例示の方法は、さらに血液を少なくとも血液成分や他の血液成分に分離して、少なくとも1つの血液成分を含んでいるサンプルを基体上に作出する工程を含みうる。例示の方法の様々な態様において、少なくとも1つの血液成分は、白血球を含む。サンプルは、患者から由来しうる。
【００５４】
さらにまた、これらの例示の方法は、患者のための治療計画を準備する工程を含んでもよい。加えて、これらの方法は、患者を治療物質（therapeutic substance）で治療する工程を含みうる。これらの方法は、さらに以下の工程を含みうる：
少なくとも1つの血液成分を含んでいる第2のサンプルを基体に配置すること；
前記第2のサンプルを標識化して、少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを同定すること;
前記少なくとも1つのエピジェネティックマーカーの第2の量を決定すること;
前記第2の量を前記基準値と比較すること;および
さらにADの状態を決定すること。第2のサンプルの分析は、前記サンプルと実質的に同時であってもよい、または前記分析は前記サンプルの分析後の後の時間であってもよい。これらの方法は、患者に投与する治療物質の用量を決定する工程を含んでもよい。様々な態様において、基準値（reference value）は、少なくとも1つのエピジェネティックマーカーに付着された標識の変化する量に関するキャリブレーション曲線を含む。これらの例示の方法は、標識の定量的な量を観察する工程を含みうる。これらの方法は、抗体を少なくとも1つのエピジェネティックマーカーと結合させることを含みうる。なおさらに、これらの方法は、標識を含んでいる抗体を導入して前記抗体に結合させる工程を含みうる。
【００５５】
様々な態様によると、本出願の明細書等に議論された任意の方法は、時間を超過して延長してもよく、例えば、第1の時点での更なるエピジェネティックマーカーの1つに関連する第1セットの患者の結果と第2の時点での更なるエピジェネティックマーカーの1つに関連する第2セットの患者の結果とを比較する長期的な研究である。係る比較は、ADが発生する予測または尤度（likelihood）の1つを提供できる。係る比較は、ADを発生する見込率（likely rate）を提供できる。なおさらに、係る比較は、治療物質の有効性を評価すること、同様に、係る治療物質の用量を調整することに有用でありうる。係る比較は、治療計画の一部であってもよい。係る結果は単一のポイントの測定から外挿により計算できるが、長期的なデータとしてある時間をへだてて取得される少なくとも2または3以上の測定が単一のポイントの外挿を確認する、またはアルツハイマー病の新しい状態を提供するだろう。例えば、測定は、1週〜2年隔てて取得できる。しかしながら、測定の頻度は、約3月毎、または約6月毎、または約年1回、または約年2回であってもよいだろう。様々な態様において、比較によって、差(T0-T1)または変化率(T0-T1)/時間（式中でT0=ゼロ時間でのマーカーの量または値、T1=時間1での量、および時間=測定間の時間数である）を提供できる。
【００５６】
以下の表1にリストされたものは、本発明の様々な態様により有用でありうる市販の抗体である。これらの市販の抗体は、白血球におけるエピジェネティックマーカーとの結合に有用であろう。これらの市販の抗体は、個々のエピジェネティックマーカーに特異的である。しかしながら、複数のこれらの市販の抗体またはリストされていない他の類似する抗体が様々な態様によるキットに含まれてもよい。
【表１】
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【００５７】
様々な態様において、本発明は、ヒト患者のADの状態を決定するための方法を提供する。その態様に応じて、例示の方法は、以下の工程を含みうる：
患者から血液サンプルを採取すること;
白血球を前記血液サンプルから分離すること;
第1の抗体を前記白血球における少なくとも1つのエピジェネティックマーカーに結合させること；
標識を含んでいる第2の抗体を前記第1の抗体と結合させること；
前記標識の量を決定すること;および
患者のADの状態を前記標識の量に基づいて決定すること。
【００５８】
これらの方法は、さらにEDTAを血液サンプル添加する工程を含みうるものであり、ここで、白血球を分離することは重力により行うことができる。しかしながら、非凝固血液において、白血球を分離することは、遠心により行うことができる。当業者に理解されうるように、血液サンプルに添加される際にEDTAは、少なくとも1つの保存剤や抗凝固剤でありうる。
【００５９】
これらの例示の方法は、以下の工程を含みうる：
第3の抗体を白血球の第2の部分における第2のエピジェネティックマーカーと結合させること；
第2の標識を含んでいる第4の抗体を前記第3の抗体と結合させること；
前記第2の標識の量を決定すること;および
患者のADの状態を前記標識の量および前記第2の標識の量に基づいて決定すること。
【００６０】
これらの例示の態様は、標識の量を参照と比較する工程を含みうる。様々な態様において、前記参照は、エピジェネティックマーカーに関するキャリブレーション曲線を含みうる。そのうえ、様々な態様において、少なくとも1つのエピジェネティックマーカーは、少なくとも1つのDNAメチル化マーカーやヒストン修飾マーカーである。
【００６１】
様々な態様において、マススペクトロメトリーを用いるプロテオーム技術を使用して、生物学的サンプルから由来するタンパク質抽出物中の特定のタンパク質またはペプチド（例えば、エピジェネティックマーカー）を同定し、定量しうる。幾つかの態様において、エピジェネティックマーカーは、理論的な質量と質量分析計を用いてサンプル中で実験的に得られたタンパク質またはペプチドの質量とを比較することにより同定しうる。タンパク質の質量を決定するため、そのアミノ酸配列をタンパク質、ペプチド、およびアミノ酸の質量を決定するプロテオームソフトウェアプログラムに提出してもよい。これらの質量を、次に質量分析により得られたデータと比較できる。別の態様において、未知の単離されたタンパク質の配列は、従来のアミノ酸配列技術（例えば、エドマン分解）でタンパク質をシークエンシングすることにより取得しうる。プロテオームソフトウェアプログラムは、次に既知のアミノ酸配列でタンパク質を切断するタンパク質の仮想的な酵素消化（例えば、酵素トリプシンによる）を行ってペプチド断片を産生してもよい。液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)システムに供試した場合、生じるペプチド断片は、由来するタンパク質を特異的に同定する特異的なペプチドマスフィンガープリント(PMF)を産生しうる。一態様において、未知の単離されたタンパク質のPMFを、シークエンシングなしで消化したタンパク質を質量分析計に適用することにより決定してその成分のペプチドの質量を決定し、そのペプチドマスをタンパク質データベースエントリーと比較してもよい。
【００６２】
一旦PMFがエピジェネティックマーカーに関して取得されたら、実際の生物学的サンプルからのエピジェネティックマーカーの定量を決定しうる。例えば、細胞溶解産物サンプルからのタンパク質画分は、タンパク質を特異的な位置で切断するタンパク分解酵素で消化されてもよい。生じる消化断片は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)またはエレクトロスプレーイオン化(ESI-MS)などの技術により質量分析計に導入しうる。これらのイオン化技術は荷電種を生じ、その質量は飛行時間(TOFs)、四極子、またはイオントラップなどのマス分析器により分けられ分析されうる。質量分析計とプロテオームデータ分析ソフトウェアプログラムとの組み合わせにより得られたデータは、加えた内部標準またはスペクトルカウンティングなどの技術を使用した場合にサンプル中のエピジェネティックマーカーレベルを定量しうる。
【００６３】
様々な態様において、抗体は、免疫蛍光顕微鏡観察を用いて細胞、組織、および生物学的液体、例えば、血液における特定の分子を同定するためのプローブとして使用しうる。特異的な抗原、例えば、エピジェネティックマーカーと結合する一次抗体は、色素、例えば、蛍光分子と一次抗体との直接的な共有結合で結合させた標識であってもよい。より一般的には、一次抗体の抗原への結合は、蛍光分子で標識した二次抗体により検出されえよく、その抗原は任意の他の抗体である）。標識した二次抗体は、蛍光抗免疫グロブリンと称されてもよい。蛍光分子が特定の波長、例えば、青色または緑色での光により励起されて、検出のための異なる波長の光の発光を生じる。蛍光分子は、クラゲ（Aequorea Victoria）からの緑色蛍光タンパク質などの任意の数の従来の蛍光分子を含みうる。蛍光に関する代替的な態様において、一次または二次抗体が酵素、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼにカップリングされる免疫組織化学が使用され、これによりインサイチューで無色基質を発色反応物へと転換する。エピジェネティックマーカーを同定する発色産物は、分光測定法などにより観察または定量されてもよい。
【００６４】
様々な態様において、免疫ブロットはウエスタンブロッティングとも称され、免疫ブロットを使用して細胞溶解産物中のエピジェネティックマーカーの存在や量を同定しうる。細胞（例えば、白血球）のサンプルを洗浄剤中で可溶化して、遊離可溶化タンパク質（free solubilized proteins）を産生しうる。タンパク質を次にゲル電気泳動に関するゲルに適用して、サイズに応じてタンパク質を分離しうる。ゲル中のタンパク質は、基体、例えば、ニトロセルロース膜に適用しうる。基体は抗体で処理でき、この抗体は彼等の特異的な抗原と膜において結合する。エピジェネティックマーカーは、次にプレートリーダーなどを用いることにより視覚化され、定量されてもよい。
【００６５】
様々な態様により、タンパク質ドットブロット法は、ウエスタンブロットと類似して、細胞溶解産物から単離されたタンパク質画分を特定の位置または「スポット」で膜、例えば、ニトロセルロースに適用する。しかしながら、タンパク質は、最初にゲル電気泳動で分離されない。タンパク質スポットを、標識された一次または二次抗体で処理して、抗原、例えば、エピジェネティックマーカーに対して抗体をハイブリダイズさせてよい。エピジェネティックマーカーを同定する蛍光分子または発色産物（colored product）の発生に際して、定量的な測定をスポットで分光計、例えば、プレートリーダーを用いて行うことができる。
【００６６】
加えて、様々な態様によると、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)を使用して、抗原、例えば、エピジェネティックマーカーを抗体を用いて検出してよい。抗原を検出するため、試験されるサンプル（例えば、白血球からのタンパク質画分）はプラスチックウェルの表面に被覆されてもよい。標識抗体（例えば、一次または二次抗体）は、非特異的な結合が阻止され（ブロッキングと称される）、抗原への結合のみが抗体を洗浄した後にウェルに保持されることを許容する条件下でウェルに添加されてもよい。結合抗体は、分光計、例えば、マルチウェルプレートリーダーにより観察および定量されうる酵素依存的な色の変化または蛍光反応で検出しうる。
【００６７】
また、様々な態様によると、生物学的サンプル、例えば、患者の血液から単離された白血球におけるエピジェネティックマーカーの量を定量するハイスループットな方法は、蛍光活性化セルソーティング(FACS)などのフローサイトメトリーを含みうる。フローサイトメトリーを使用して、液体、例えば、細胞培養培地または緩衝剤の流れのなかに標識抗体で処理した細胞を懸濁し、前記細胞を蛍光測定システムを通過させることによりサンプル中に存在する免疫反応細胞の数を計算しうる。各細胞の蛍光特性を決定して、サンプル中の全ての細胞の様々な蛍光強度を示しているグラフ、例えば、ヒストグラムを提供しうる。一態様において、閾値をサンプル中の免疫反応性である細胞のパーセンテージに基づいて病的状態の存在を決定するために適用しうる。
【００６８】
なおさらに様々な態様によると、エピジェネティックマーカーは、細胞のサンプル、組織、または生物学的サンプルにおいて、免疫蛍光顕微鏡を用いてエピジェネティックマーカーと結合した標識抗体の可視化により同定しうる。サンプルは、一次抗体、例えば、スライドが浸漬される緩衝剤中に希釈された抗体が適用される顕微鏡スライドに適用されてもよい。過剰な一次抗体を洗浄して除去し、標識二次抗体をスライドに適用してもよい。スライドを顕微鏡下、例えば、スライドに特定の波長の光を照射して蛍光を生じるよう構成された蛍光顕微鏡または共焦点蛍光顕微鏡下で視覚化してもよい。幾つかの態様において、蛍光の強度を顕微鏡の検出器で測定して、対照サンプルと比較した蛍光の強度を定量してもよい。
【００６９】
様々な態様によると、方法は、サンプル中のエピジェネティックマーカーの量を定量することを含みうる。例えば、本出願に記載される定量的なドットブロットアッセイを用いることは、エピジェネティックマーカーの定量分析に有用であろう。図10を参照して、メチレンブルーに関する定量的なドットブロット1010を示している図は、1μg、0.8μg、0.6μg、0.4μg、0.2μg、および0.1μgのドットブロットを含む。加えて、メチレンブルー標準1020に関するキャリブレーション曲線も図10に記載される。ニトロセルロース膜の定量的なドットブロット1010は、血液の白血球から抽出された様々な濃度のDNA(1μg、0.8μg、0.6μg、0.4μg、0.2 μg、および0.1μg)でスポットされ、膜をメチレンブルーとインキュベーションして総DNAが検出された。シグナルは、標準の濃度測定で記録された。メチレンブルーの定量を、メチレンブルー1020に関するキャリブレーション曲線で作った。
【００７０】
図11を参照して、5-メチルシトシンに関する定量的なドットブロット1030を示している図は、1μg、0.8μg、0.6μg、0.4μg、0.2μg、および0.1μgのドットブロットを含む。加えて、5-メチルシトシン1040に関するキャリブレーション曲線も図11に記載される。ニトロセルロース膜の定量的なドットブロット1010は、血液の白血球から抽出された様々な濃度のDNA(1μg、0.8μg、0.6μg、0.4μg、0.2μg、および0.1μg)でスポットされ、その膜が5-メチルシトシンとインキュベーションされて総DNAが検出された。5-メチルシトシンのシグナルも標準の濃度測定により読み出された。メチレンブルーのシグナルの定量化によって続く5-メチルシトシンの標準化が可能となり、これによりブロットにロードしたDNAの量が測定される。シグナル記録の分析によって、サンプルのDNAや5-メチルシトシンIR量の双方を検出するため100ng〜400ngのDNA濃度が直線に近い(R2>99)反応を呈することが示された。同一のアプローチを使用して、他のエピジェネティックマーカーに関するドットブロットアッセイを開発できる。
【００７１】
様々な態様において、本発明は、ヒトのADの状態を決定するために有用であるシステムおよび装置を提供する。当該態様において、例示のシステムおよび／または装置は、上部表面および底部表面を含んでいる基体;前記基体の表面に少なくとも1つの細部（detail）;白血球を含んでいるサンプル中の少なくとも1つのエピジェネティックマーカーと結合する能力がある少なくとも1つの抗体、前記少なくとも1つの抗体は少なくとも1つの細部に配置される;および、既知量の少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを含んでいる基準値を含んでもよい。これらの例示のシステムおよび／または装置は、さらに前記基体の表面に第2の細部;白血球を含んでいるサンプル中の第2のエピジェネティックマーカーと結合する能力がある第2の抗体、前記第2の抗体は第2の細部に配置できる;および、既知量の第2のエピジェネティックマーカーを含んでいる第2の基準サンプルを含んでもよい。一態様において、少なくとも1つの細部はスポットであり、少なくとも1つの抗体は前記基体の上部表面に結合する。別の態様において、少なくとも1つの細部はウェルであり、少なくとも1つの抗体はウェルに配置される。様々な態様において、サンプルは、患者の末梢血を含む。様々な例示の態様において、基準値は、基体の表面や少なくとも1つの細部の近くに配置される参照用細部（reference detail）に配置できる。これらの例示のシステムおよび／または装置は、さらに少なくとも1つのエピジェネティックマーカーを同定可能な標識を含んでもよい。なおさらに、これらの例示のシステムおよび／または装置は、さらに標識の量を測定可能な読み取り機を含んでもよい。システムおよび／または装置は、前記基体の上部表面の少なくとも一部にカバーシーリング（cover sealing）を含んでもよい。
【００７２】
様々な態様は、複数のサンプル部（sample portions）から複数の異なるエピジェネティックマーカーを検出できるマトリックスを含むシステムおよび／または装置を含む。例示の態様において、システムおよび／または装置は、さらに複数の異なるエピジェネティックマーカーの各々に関する基準値を含んでもよい。この態様の側面において、基準値は、マトリックスの作用領域の近くに配置できる。別の態様は、複数の異なるエピジェネティックマーカーを検出する各位置の近くにキャリブレーション曲線を含む。本出願に記載される様々な態様は、個人の家庭での使用または病院の病室または医師のオフィスにおいて使用できる。
【００７３】
様々な態様において、キットは、5-メチルシトシンに対する抗体、DNAメチル化に関与するペプチド、またはヒストンアセチル化に関与するペプチド、直接的(例えば、蛍光体、酵素、または発色剤に結合させた一次抗体を用いて)または間接的(例えば、蛍光体、酵素、または発色剤に結合させた二次抗体)な抗体の結合を検出する方法、およびADの様々な診断のための閾値の各々に対応する少なくとも1つの基準値を含んでもよい。
【００７４】
様々な態様において、キットは、エピジェネティックマーカーと結合する抗体と結合できる任意の部分を含みうる染色剤（stain）または標識を含んでもよい。さらに、キットの他の例示の態様において、染色剤または標識は、エピジェネティックマーカーと結合する抗体と結合する抗体を含んでもよい。さらにまた、キットは、染色剤または標識のためのキャリブレーション曲線を作るための材料を含んでもよい。しかしながら、キットは、基準値として使用できる予め作られた標準較正（standard calibration）を含んでもよい。キットは、本出願の明細書等に記載される様々な緩衝剤や他の試薬を含んでもよい。さらに、キットは、本出願の明細書等に記載される装置またはシステムを含んでもよい。最後に、キットは、個人の家庭での使用または病院での使用または医者の職場、訪問のうちの1つに特に有用であるように設計できる。
【００７５】
以下は、本発明の様々な態様の限定されない例である。これらの限定されない例において議論された物質の任意の組み合わせが、本発明の様々な態様によるキットに含まれてもよいことに注意すべきである。
【００７６】
例1:包括的な白血球のDNAメチル化状態の観察。7-10mlの全血を、17名の生存しているADおよび19名の生存しているND患者からEDTAチューブ中に集めた。白血球(WBC)を、EDTA全血からバフィーコートで単離し、RBCを溶血(冷、1X溶解溶液;NH4Cl)させ、2回の続く洗浄サイクルを冷リン酸緩衝塩類溶液(PBS)で行った。最終的な細胞ペレットを1mlの冷PBSに再懸濁し、100μlをスーパー・フロスト・プラス・スライド（SuperFrostPlus slide）に滴下し、免疫細胞化学染色の前に厳密に乾燥させた。幾つかのスライドを染色前に1週維持した。この手順によって、1年まで乾燥スライドの貯蔵が許容される。
【００７７】
5-メチルシトシン染色のためのスライドを、冷PBSで5分間ずつ3回リンスした。スライドを次に2%パラホルムアルデヒド(PBS)溶液で10分間固定し、PBSで1回、PBS-0.1% TritonX-100(PBST)で2回リンスした（各リンスを各々10分間行った）。スライドをPBST中に1%過酸化水素を含むものの中で30分間ブロックし、次にPBSTでの3回のリンスをこれまでのように行い、3%BSAブロッキング溶液(PBST中のBSA)で1時間、室温(RT)で静置した。この操作に続いて、これまでのとおり1回リンスした（PBST、10min）。スライドを次にプラスチックボックスに配置し、0.25%のBSA-PBST中に1:500の5-メチルシトシン抗体で満たし、RTで1時間静置した。ボックスを、次に湿度の供給源とともに4゜Cで一晩静置した。次の朝にスライドボックスを移し、RTに暖めた。スライドをこれまでのとおりPBSTで３回リンスした。それらをプラスチックボックスに配置し、0.25%BSA-PBST中に1:1000のビオチン化したウマ抗-ウサギIgGで満たし、RTで2時間静置した。スライドをこれまでのとおりPBSTでリンスし、調製したアビジンビオチン溶液(PBST中)で満たした。45分間のRTインキュベーションに続き、スライドをPBSTで1回リンスし、次に50mM Tris(ph7.6)緩衝剤で各10分間2回リンスした。それらを、DAB溶液(50mM Tris 緩衝剤中)を含むコープランドジャー（copland jar）に10分間、RTで配置した。スライドを次にこれまでのとおりTris緩衝剤でリンスし、次に段階的なアルコール(70%、90%、100%、およびNeoClearで2回)で各5分間、RTで処理した。過剰な溶液をNeoClearから除去し、さらに拭い取り、Permountの2-3滴を適用し、カバーガラスを付けた。スライドを顕微鏡の明視野で観察する前に少なくとも２時間乾燥させた。
【００７８】
明視野の顕微鏡観察下で、各サンプルを、臨床診断をブラインドして「十分な染色（substantial staining）」または「僅かな染色（sparse staining）」として定性的に評価し、非痴呆の患者における十分な染色の定性的な比較を評価した。すなわち、弱い染色（spare staining）を有するサンプルはアルツハイマー型であると考え、他方で十分な染色を有するサンプルは非痴呆であると考えた。全ての患者に関する臨床診断を取得し、検討した際に、比較した範囲に関する評価は、ADの17ケースのうち16ケース(94%の感度)および非痴呆の19ケースのうち19ケース(100%の特異性)に関して臨床診断と一致した。
【００７９】
例2:  包括的な白血球のDNAメチル化機構の観察。7-10mlの全血を、17名の生存しているADおよび19名の生存しているND患者からEDTAチューブ中に集めた。白血液細胞(WBC)を、EDTA全血からバフィーコートで単離し、RBCを溶血(冷、1X溶解溶液;NH4Cl)させ、2回の続く洗浄サイクルを冷リン酸緩衝塩類溶液(PBS)で行った。最終的な細胞ペレットを1mlの冷PBSに再懸濁し、100μlをスーパー・フロスト・プラス・スライドに滴下し、免疫細胞化学染色の前に厳密に乾燥させた。幾つかのスライドを染色前に1週維持した。この手順によって、1年まで乾燥させたスライドの貯蔵が許容される。
【００８０】
DNMT-1染色のためのスライドを、冷PBSで5分間ずつ3回リンスした。スライドを次に2%パラホルムアルデヒド(PBS)溶液で10分間固定し、PBSで1回、PBS-0.1% TritonX-100(PBST)で各リンスに付き10分間ずつ2回リンスした。スライドをPBST中の1%過酸化水素中で30minブロックし、次に、これまでのようにPBSTで3回リンスを行い、3%BSAブロッキング溶液(PBST中のBSA)で1時間、室温(RT)で静置した。この操作に続いて、これまでのとおり1回リンスした（PBST、10分間）。スライドを次にプラスチックボックスに配置し、0.25%BSA-PBST中に1:500のDNMT-1抗体で満たし、RTで1時間静置した。ボックスを、次に湿度の供給源とともに4゜Cで一晩静置した。次の朝にスライドボックスを、移しRTに暖めた。スライドをこれまでのとおりPBSTで3回リンスした。それらをプラスチックボックスに配置し、0.25%BSA-PBST中に1:1000のビオチン化したウマ抗-ウサギIgGをで満たし、RTで2時間静置した。スライドをこれまでのとおりPBSTでリンスし、調製したアビジンビオチン溶液(PBST中)で満たした。45分間のRTインキュベーションに続き、スライドをPBSTで1回リンスし、次に50mM Tris(ph 7.6)緩衝剤で10分間ずつ2回リンスした。それらをDAB溶液(50mM Tris緩衝剤中)を含むコープランドジャー（copland jar）に10分間、RTで配置した。スライドを次にこれまでのとおりTris緩衝剤でリンスし、次に段階的なアルコール(70%、90%、100%、およびNeoClearで2回)で各5分間、RTで処理した。過剰な溶液をNeoClearから除去し、さらに拭い取り、Permountの2-3滴を適用し、カバーガラスを付けた。スライドを顕微鏡の明視野で観察する前に少なくとも2時間乾燥させた。
【００８１】
明視野の顕微鏡観察下で、各サンプルを臨床診断をブラインドして「十分な染色」または「僅かな染色」として定性的に評価し、非痴呆の患者における十分な染色の定性的な参照に関して評価した。すなわち、僅かな染色を有するサンプルはアルツハイマー型であると考えられ、他方で十分な染色を有するサンプルは非痴呆であると考えられた。全ての患者に関する臨床診断を取得し、検討した際に、比較した範囲に関する評価は、ADの17ケースのうち16ケース(94%の感度)および非痴呆の19ケースのうち19ケース(100%の特異性)に関して臨床診断と一致した。
【００８２】
例3:  本発明の例示の態様と一致して、全体のDNAメチル化に関してドットブロット法が記載された。Hybond-ECLニトロセルロース膜を6xSSC緩衝剤で事前に湿らせ、DNAサンプルを0.4M NaOHを添加することにより変性し、次に100゜Cで10分間加熱した。DNA溶液の中和は、2M酢酸アンモニウム（pH7.0）の添加による。500μlのdH2Oで膜を再水和してドットブロットマニフォールドに配置後、200-500μlの変性DNAサンプルを、添加し、そして穏やかな減圧または重力の濾過により膜をとおして吸った。各ウェルに、500μlの2XSSC緩衝剤を添加し、減圧を適用した。サンプルウェルが空である場合、膜を取り除き、1時間RTで空気乾燥し、2枚の濾紙の間に配置し、減圧下80゜Cで2時間焼いた。CpGメチル化に関してプローブするため、ドットブロット緩衝剤(20 mM Tris、0.05% Tween-20)中の5%ミルクで膜を2時間ブロックし、次に1倍のドットブロット緩衝剤で洗浄した。1:1000で希釈された5-メチルシトシンマウスモノクローナル一次抗体(Aviva Systems Biology)とのインキュベーションを、ドットブロット緩衝剤および5%ミルク中でRTで2時間行った。5回(各5分間)の洗浄後、膜を、ドットブロット緩衝剤および5%ミルク中で1:5000のHRP結合型マウスモノクローナル二次抗体(Jacksons Immuno)と1時間、RTでインキュベーションし、次に5回洗浄(各5分間)した。膜を次にスーパー・シグナル・ウェスト・ピコ・化学発光基質（Super Signal West Pico Chemiluminescence Substrate(Thermo Scientific)）と1min、RTでインキュベーションし、アルファ・インノテック・アルファイース（Alpha Innotech AlphaEase）機器で可視化し、アルファ・インノテック・FC・ソフトウェア（Alpha Innotech FC）ソフトウェアを用いて分析した。全ての測定値はメチレンブルー標準に対して、FCソフトウェアを用いるAlphaEaseにより定量化することにより標準化され、この標準は(5-メチルシトシンデータを収集した後で)膜をdH2Oで洗浄して化学発光基質を除去し
、0.025% メチレンブルーで1分間インキュベーションし、dH2Oで1X洗浄することにより調製された。このDNA基体を用いて全体のDNAメチル化を測定する新規の方法に加えて、ペプチド測定に関する標準のドットブロットを使用して他のエピジェネティックマーカー、例えば、HDAC1およびDNMT1を定量できる。後者に関して、タンパク質抽出物がDNAの代わりにロードされ、ペプチドに適切な抗体が検出に利用されること以外は、類似する方法が用いられる。
【００８３】
前述の記載において、ADの検出、診断、および進行をモニターするための方法やシステムは、特定の態様を参照して記載されている。様々な修飾および変化をなしうるが、ADの検出、診断、および進行のモニターのための方法やシステムの範囲を逸脱せずに請求項に記載のようになされるだろう。明細書および図面は例であり、限定するというよりもむしろ、変更がADの検出、診断、および進行のモニターのための方法やシステムの範囲内に含まれることが意図される。従って、ADの検出、診断、および進行のモニターのための方法やシステムの範囲は、単に記載された例というよりむしろ請求項やそれらの適法な均等物により決定されるべきである。
【００８４】
特定の態様に関して、利益、他の利点および課題の解決策が記載される；しかしながら、特定の利益、利点または解決策の原因となって生じしうる、またはこれらをより顕著になしうる如何なる利益、利点または課題への解決策または如何なる構成も発行された特許における任意または全ての請求項の重要な特性または成分、必要とされる特性または成分、または必須の特性または成分と解釈してはならない。
【００８５】
「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「有する（having）」、「含んでいる（including）」、「含む（includes）」などの用語は、非排他的な包含を意味し、構成のリストを含むプロセス、方法、システム、物品（article）、組成物または装置が記載された構成のみならず、係るプロセス、方法、システム、物品、組成物または装置を明示的にリストしない、または係るプロセス、方法、システム、物品、組成物または装置に固有（inherent）ではない他の構成も含みうる。特異的に記載されたものに加えて、ADの検出、診断、および進行のモニターのための方法やシステムの実施に使用される構造（structures）、配置（arrangements）、用途（applications）、比（proportions）、構成（elements）、材料（materials）または成分（components）の他の組み合わせおよび／または変更は、同じ対象の一般的な原理を逸脱することなく、変動し、または特定の環境、製造仕様、設計上のパラメータまたは他の操作上の必要性に特に適用しうる。
【００８６】
本出願において参照された全ての文献および類似物は、これらに限定されるものではないが、特許、特許出願、論文、書籍、学術論文、およびインターネットウェブページを係る文献および類似物の形式と無関係に含み、任意の目的のためその全体が参照によって明示的に援用される。1または2以上の援用された文献および類似物が、これらに限定するものではないが、例として規定の用語、単語の用法、記載された技術などを含む本出願と異なる、または矛盾する場合には、本出願が制御する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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