(57)【要約】本発明は、Ｔヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１（ＣＢＤ１）ペプチドのカベオリン１結合ドメイン又は前記ＣＢＤ１の変異体を有するキメラペプチドに関する。一態様において、Ｔエピトープは、破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０からなる群より選択されるペプチド由来である。これらのキメラペプチド並びに医薬及び免疫原性組成物を含む組成物並びにこれらのキメラペプチドを含むワクチンも本発明の部分である。ＨＩＶ−１活性に対する中和抗体を誘導するための方法及びＨＩＶ−１感染を処置又は予防するためのキメラペプチドの使用も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメイン（ＣＢＤ１）又は前記ＣＢＤ１の変異体を含む、から本質的になる又はなるキメラペプチド。
【請求項２】
Ｔヘルパーエピトープが、破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０からなる群より選択されるペプチド由来である、請求項１記載のキメラペプチド。
【請求項３】
ＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインがＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）から本質的になる、請求項１又は２記載のキメラペプチド。
【請求項４】
ＣＢＤ１の変異体が以下：
ａ）ＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；
ｂ）ＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；
ｃ）ＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは０〜３、好ましくは１〜３の数である；及び
ｄ）ＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである
の間から選ばれる、請求項１又は２記載のキメラペプチド。
【請求項５】
ＣＢＤ１の変異体がＩＷＮＮＭＴＷ（配列番号５０）、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号２３）、及びＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号５１）の中から選ばれる、請求項４記載のキメラペプチド。
【請求項６】
Ｔヘルパーエピトープペプチドが、配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２）から本質的になる破傷風毒素Ｔｅｔ８３０ペプチド、配列ＫＱＩＩＮＭＷＱＶＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号３）から本質的になるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０４２１−４３６ペプチド、又は配列ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号４）から本質的になるＨＩＶ−１  Ｇａｇ２９８−３１２ペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項記載のキメラペプチド。
【請求項７】
カベオリン１結合ドメインｇｐ４１ペプチド及びＴヘルパーエピトープが、ジリシンリンカー（ＫＫ）又はグリシンプロリンリンカー（ＧＰＧＰＧ）から選択されるペプチドリンカーにより連結される、請求項１〜６のいずれか一項記載のキメラペプチド。
【請求項８】
【表３５】
2012500829.tif 000040
及びそれらの混合物から本質的になる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載のキメラペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載のキメラペプチド及びその混合物のＣＢＤ１ベースのペプチドＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号２３）、（ｐ６２）ＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷＮＮＭ（配列番号２４）の決定基に対するモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド、又は請求項９記載のモノクローナル抗体、及び生理学的に許容可能な希釈剤を含む組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド、又は請求項９記載のモノクローナル抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド、又は請求項９記載のモノクローナル抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド及び薬学的に許容可能な担体を含むワクチン。
【請求項１４】
配列番号１２（Ｋ２７Ｗ）、配列番号３５（Ｋ２４Ｗ）、配列番号１６（Ｋ３０Ｗ（Ｇ））、及び配列番号３８（Ｋ２７Ｗ（Ｇ））からなる、請求項１０〜１３のいずれか一項記載の組成物又はワクチン。
【請求項１５】
配列番号３１（Ｃ１７Ｋ）に定義するペプチド、配列番号３２（Ｃ１０Ｍ）に定義するペプチド、及び／又は配列番号３９（ＣＢＤ１／Ａ）に定義するペプチドをさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか一項記載の組成物又はワクチン。
【請求項１６】
配列番号１２（Ｋ２７Ｗ）、配列番号３５（Ｋ２４Ｗ）、配列番号１６（Ｋ３０Ｗ（Ｇ））、及び配列番号３８（Ｋ２７Ｗ（Ｇ））並びに配列番号３１（Ｃ１７Ｋ）からなる、請求項１５記載の組成物又はワクチン。
【請求項１７】
医薬としての使用のための、請求項１〜８のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド又は請求項９記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
ＨＩＶ−１に対する中和抗体の誘導に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載のキメラペプチド又は少なくとも１つのキメラペプチド。
【請求項１９】
ＨＩＶ−１の中和に使用するための、請求項９記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
ＨＩＶ−１又はＡＩＤＳ又はＨＩＶ−１感染の処置に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載のキメラペプチドもしくはいくつかのキメラペプチド、又は請求項９記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
ＨＩＶ−１に対する中和抗体を誘導するため又はＨＩＶ−１を処置するため又はＨＩＶ−１感染を処置するための医薬の製造のための、請求項１〜８のいずれか一項記載の少なくとも１つのキメラペプチド、好ましくは１つのキメラペプチドもしくは複数のキメラペプチドの使用。
【請求項２２】
ＨＩＶ−１を中和するため、ＨＩＶ−１を処置するため、又はＨＩＶ−１感染を処置するために使用するための、請求項９記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】
ＨＩＶ−１感染の予防法に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の少なくとも１つのキメラペプチド、好ましくは１つのキメラペプチド若しくは複数のキメラペプチド、又は請求項９記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の属する技術分野
本発明は、破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０からなる群より選択されるペプチドのＴヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインを有するキメラペプチドに関する。これらのキメラペプチド又はタンパク質を含む組成物、並びにこれらのキメラペプチド又はタンパク質を含む薬学的な免疫原性組成物及びワクチンも本発明の部分である。ＨＩＶ−１活性を中和する方法及びＨＩＶ−１活性に対する中和抗体を誘導するためのキメラペプチドの使用並びにＨＩＶ−１感染を処置する方法も開示される。
【０００２】
２．発明の背景及び関連する先行技術
Pasteur Instituteでの１９８３年のBarre-Sinousi、Chermann、及びMontagnierによるＬＡＶの発見及び単離以降、ＡＩＤＳの大きな副作用のない有効な処置及び予防についての研究は困難なものであった。
【０００３】
「高活性抗レトロウイルス治療」として当技術分野において公知である、逆転写酵素とＨＩＶのプロテアーゼ酵素を標的とする薬物の組み合わせを用いてＡＩＤＳ患者を処置することは、血中でのウイルス負荷を低レベルにするために有効である。
【０００４】
そのため、１９９６年以降、抗レトロウイルス薬物、例えばジドブジン（ＡＺＴ）、リトナビル、サキナビル、ラミブジン、アンプレナビル、アバカビル、インジナビル、ネルフィナビルなどを、一般的に、２つの逆転写酵素インヒビター及び１つのプロテアーゼインヒビターを使用した三剤治療において使用し、患者のＨＩＶ量を低下させた。しかし、これらの薬物のいずれも完全にはウイルスを除去しない。
【０００５】
さらに、三剤治療に関連する重大な問題が残っている。ＨＩＶ感染者が一定のスケジュールで一生にわたり薬物を服用しなければならないだけではないが、これらの薬物は非常に高価であるだけでなく（年１０，０００ドル又はそれ以上）、有毒である。それらの有毒な性質のため、抗レトロウイルス薬物は、嘔気、嘔吐、下痢、貧血、リポジストロフィー、糖尿病様の疾患、脆弱骨、しびれ、手又は足における刺痛又は疼痛、及び心疾患を含む周知の副作用を有する。これらの副作用の結果として、多くのＡＩＤＳ患者がそれらの医薬の服用を止める。
【０００６】
それらの有毒な効果の他、高度活性レトロウイルス治療での主要な課題の１つが薬物耐性である。ＨＩＶは常に突然変異することが周知であるため、何十億という新しいＨＩＶウイルスが体内において毎日産生される。これらの突然変異はウイルスの一部分を変化させ、しばしば薬物を無効にする。抗レトロウイルス薬物の代替物は、ＨＩＶに対する有効なワクチンを開発することであろう。
【０００７】
現在、優れたＨＩＶワクチン製剤はＴ細胞応答を刺激し、抗ＨＩＶ抗体を誘発する成分を有するべきであると広く考えられている。現在、Ｔ細胞応答を刺激するために設計された２５を上回るＨＩＶワクチンが臨床試験中である一方で、広域中和抗体及び／又はＨＩＶ−１の初代分離株による感染を阻害する抗体の産生を刺激することが可能であるワクチンは未だに記載されていない。そのため、初代ＨＩＶ単離株を阻害する中和抗体を刺激することが可能であるワクチンの設計が、ＨＩＶワクチン研究の最優先事項の１つであると思われる（McMichael, 2006; Zwick and Burton, 2007）。
【０００８】
外部エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０が、中和抗体の開発のために広く研究されてきた。しかし、そのような抗体は、ｇｐ１２０の配列変動性の結果ある単離株にのみ特異的であり、そのため、限定された作用を有する；特に、それらは初代単離株を中和しない。代替戦略が、現在、受容体、共受容体結合部位、及び、また、ＣＤ４へのｇｐ１２０の結合に続いて剥き出しになる潜在エピトープに対する中和抗体の刺激について評価されている（Lin and Nara, 2007; McMichael and Hanke, 2003）。ｇｐ１２０とは対照的に、膜貫通型エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１は、保存ドメインがあるので研究対象に良い代替糖タンパク質を提供する。しかし、この場合における問題は、戦略的エピトープがｇｐ１２０により覆われるうる、及び／又は潜在エピトープであると考えられることである（Wyatt and Sodroski, 1998）。例外は、中和ヒト抗体２Ｆ５及び４Ｅ１０のエピトープを持つｇｐ４１外部ドメインのＣ末端半分である。ｇｐ４１のサブユニットがワクチンの候補であると考えられてきた；しかし、Ｎ−ＨＲ及びＣ−ＨＲ領域に対して惹起された抗体が、生理学的条件下で非中和的であることが示された。同様に、中和ヒトモノクローナル抗体２Ｆ５及び４Ｅ１０のエピトープに対する中和抗体を誘導する全ての試みが失敗している（Lin and Nara, 2007; Zwick and Burton, 2007）。
【０００９】
全ての単一のＨＩＶ単離株において保存されているＨＩＶ−１膜貫通型エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１中の戦略的エピトープが同定されている（Hovanessian et al., 2003, 2004a; Hovanessian et al., 2004b）。このエピトープ（ＣＢＤ１エピトープと名付けられている）に対応する合成ペプチドが、次に、種々のＴリンパ球及びマクロファージ向性ＨＩＶ−１単離株並びにクレードＡ〜Ｇの初代単離株による初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１感染を阻害する抗体のウサギにおける産生を繰り返し誘発することが示された。
【００１０】
免疫血清を用いてプレインキュベートされたウイルス粒子がそれらの感染性を失って、ウイルス産生培養物への免疫血清の添加は、欠陥ウイルス粒子の産生をもたらす（Hovanessian et al., 2004b）。カベオリン結合ドメインは、従って、ＨＩＶ粒子上、及び、またウイルス感染細胞上に剥き出しになっている。抗ＣＢＤ１抗体はＨＩＶ感染サイクルで２つの別々のステップで作用する：１）それらはＨＩＶ粒子による細胞の感染を予防する；及び２）それらはＨＩＶ産生細胞で原形質膜でｇｐ４１の凝集を起こし、ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体を欠損したウイルス粒子の産生に導く。
【００１１】
ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の外部ドメインにおける高度に保存されたＢ細胞エピトープ、ＣＢＤ１エピトープ、及び種々のＨＩＶ−１単離株を阻害する抗体の産生を誘発するこのエピトープに対応するペプチドの能力は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳについての普遍的な合成Ｂ細胞エピトープワクチン候補の開発のための有望な展望を提供した（Hovanessian et al., 2003, 2004a; Hovanessian et al., 2004b）。
【００１２】
しかし、より良好な免疫原性防御を提供する改良されたＨＩＶ−１ワクチンが依然として必要とされている。
【００１３】
そのため、組成物、より具体的には、広域中和活性を誘導する免疫原性組成物及び／又はＨＩＶ−１の初代単離株による感染を阻害する抗体を提供することが本発明の目的である。
【００１４】
哺乳動物において、ＨＩＶ特異的な広域反応性中和抗体の誘導を誘発することが可能である普遍的なＢ細胞エピトープワクチンを提供することは、本発明の別の目的である。
【００１５】
より大量に、及びより低いコストで作製することができる高精製ペプチドを含むワクチンを提供することは、本発明のさらに別の目的である。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、種々のＨＩＶ−１単離株及びクレードの間で保存された性質のために、広域中和抗体を誘発する、より少ない副作用の免疫原性組成物を提供する。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、ＨＩＶ感染個体における処置用ワクチンとして適用する免疫原性組成物又はワクチン製剤を提供することである。なぜなら、ＨＩＶ感染個体は、天然抗ＣＢＤ１抗体を産生する能力を欠くと思われるからである。
【００１８】
本発明の別の目的は、組成物、医薬組成物、免疫原性組成物における、及びワクチンとして使用することができるキメラペプチド又はキメラタンパク質を提供することである。
【００１９】
記載するペプチド及びキメラペプチドに対する抗体及び特にモノクローナル抗体は、本発明の別の目的である。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、ＨＩＶ−１を中和する方法を提供することであり、前記方法は、そのような処置を必要とする哺乳動物に対して、本発明の少なくとも１つのキメラペプチドを投与することを含む。ＨＩＶ−１を中和する際に使用するための本発明の少なくとも１つのキメラペプチドも開示される。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、ＨＩＶ−１を中和することができる抗体を誘導するための方法であり、前記方法は、そのような処置を必要とする哺乳動物に対して、Ｔヘルパーエピトープを含む少なくとも１つのペプチドと共に、本発明の少なくとも１つのペプチドを投与することを含む。
【００２２】
ＨＩＶ−１に対する中和抗体を誘導するための医薬の製造のための本発明に記載される少なくとも１つのキメラペプチドの使用は、本発明のさらに別の目的である。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、ＨＩＶ−１感染を予防するための少なくとも１つのキメラペプチドの使用である。
【００２４】
これら並びに他の態様及び目的は、本発明により達成され、本発明の概要、好ましい実施態様の記載、及び請求の範囲により証明される通りである。
【００２５】
発明の概要
本発明は、このように、Ｔヘルパーエピトープペプチドに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメイン（ＣＢＤ１）又はＣＢＤ１の変異体を含むキメラペプチドに関する。別の態様において、本発明は、破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ  １２０からなる群より選択されるＴヘルパーエピトープペプチドに融合された、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメイン又はＣＢＤ１の変異体を含むキメラペプチドに関する。
【００２６】
本発明の別の態様において、キメラペプチドにおけるＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインは、ＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）からなる又は本質的になる。
【００２７】
さらに別の態様において、キメラタンパク質におけるＴヘルパーエピトープペプチドは、配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２）からなる又は本質的になる破傷風毒素Ｔｅｔ８３０ペプチド、配列ＫＱＩＩＮＭＷＱＶＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号３）からなる又は本質的になるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０４２１−４３６ペプチド、又は配列ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号４）からなる又は本質的になるＨＩＶ−１  Ｇａｇ２９８−３１２ペプチドである。
【００２８】
本発明のキメラペプチドは、ジリシンリンカー（ＫＫ）又はグリシンプロリンリンカー（ＧＰＧＰＧ）を有し、それはカベオリン１結合ドメインｇｐ４１ペプチドをＴヘルパーエピトープに結合する。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、
【表１】
2012500829.tif 000002
及びその混合物、並びに
【表２】
2012500829.tif 000003
及びその混合物、並びに前述のペプチドのいずれかの混合物の群より選択されるキメラペプチドを提供する。本発明は、また、以下：Ｃ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｉ−Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｗ−Ｍ−Ｑ−Ｗ−Ｄ−Ｋ（配列番号３１）、Ｃ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｉ−Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｍ（配列番号３２）及びＣ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｉ−Ａ−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ａ−Ｍ−Ｑ−Ａ−Ｄ−Ｋ（配列番号３９）のペプチドに関する。
【００３０】
配列番号２〜４の少なくとも１つに融合された、配列番号５〜２５の、配列番号３１〜３８及び５２〜５９の、並びに配列番号３９の少なくとも１つのキメラペプチド、及び配列番号２２〜２４のペプチド、又は配列番号１、２６〜３０の少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つ及びそれらの混合物に対する抗体、特にモノクローナル抗体も本発明の別の態様を形成する。
【００３１】
少なくとも１つのキメラペプチド、好ましくは本明細書に記載する１つのキメラペプチド又は複数のキメラペプチド、又は本明細書に記載する抗体もしくはモノクローナル抗体、及び生理学的に許容可能な希釈剤を含む組成物も本発明のさらに別の態様である。
【００３２】
さらに別の態様において、少なくとも１つのキメラペプチド、好ましくは本明細書に記載する１つのキメラペプチドもしくは複数のキメラペプチド又は本明細書に記載する抗体、特にモノクローナル抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物又は医薬組成物を提供する。
【００３３】
少なくとも１つのキメラペプチド、好ましくは本明細書に記載する１つのキメラペプチドもしくは複数のキメラペプチド又は本明細書に記載する抗体、特にモノクローナル抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含むワクチンは、本発明のさらに別の態様を形成する。
【００３４】
そのような処置を必要とする哺乳動物に対して、少なくとも１つのキメラペプチド、好ましくは本明細書に記載する１つのキメラペプチド又は複数のキメラペプチド及びその混合物を投与すること、次にＴヘルパーエピトープをさらに投与すること（又はその逆）を含む、ＨＩＶ−１感染を処置する又はＨＩＶ−１活性を中和するための方法は、本発明のさらに別の態様である。
【００３５】
医薬としての使用のため、又はＨＩＶ−１の中和における使用のため、又はＡＩＤＳ及びＨＩＶ−１感染の症状の処置における使用のための本明細書に記載する１つのキメラペプチド、もしくは複数のキメラペプチド、又は本明細書に記載する抗体、特にモノクローナル抗体は、本発明の別の態様である。
【００３６】
ＨＩＶ−１を中和又は処置するための医薬の製造のため、又はＨＩＶ−１感染についての予防としての、少なくとも１つのキメラペプチド、又は好ましくは本明細書に記載する１つのキメラペプチド、又は複数のキメラペプチド又は本明細書に記載する抗体、特にモノクローナル抗体は、本発明のさらに別の態様である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１はＨＩＶ−１  ｇｐ４１の模式図であり、保存されたカベオリン結合モチーフ（ＷＸＸＸＸＷＸＸＷ；配列番号４１）の位置を示す。ｇｐ４１外部ドメインの重要な機能ドメインは以下である：ＨＩＶ標的細胞の膜に挿入される融合ペプチド（ＦＰ）；原形質膜における足場に関与する膜貫通領域（ＴＭ）、コイルドコイルを特徴とする２つの疎水性７個繰り返しドメイン（Ｎ−ＨＲ及びＣ−ＨＲ）、ＦＰと連携すると思われるＴＭ（Ｐ−ＴＭ）に隣接する保存されたトリプトファンリッチドメイン。Ｐ−ＴＭ（ＬＷＹＩＫ）の最後の５つのアミノ酸はコレステロールに結合する。Ｐ−ＴＭは、また、２つの広域中和ヒトモノクローナル抗体（それぞれ２Ｆ５及びｍＡｂ  ４Ｅ１０）のコアとなる代表的なＥＬＤＫＷＡ及びＮＷＦＤＩＴエピトープを含む。合成ペプチドＴ−２０は、ｇｐ４１媒介性の融合プロセスのインヒビターとして臨床において使用される。ＣＤは細胞質内ドメインを表す。参考文献については、（Rey-Cuille et al., 2006）を参照のこと。
【図２】図２は、種々のＨＩＶ−１単離株由来の、ｇｐ４１の外部ドメインにおけるＣＢＤ１ドメインの保存された配列である。ＣＢＤ１ペプチドの配列は、以下のアミノ酸に対応する：Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ。ＣＢＤ１は、ｇｐ４１外部ドメインにおけるコンセンサス配列中のアミノ酸残基６１８−６３３に位置付けられる。カベオリン結合モチーフにおける３トリプトファン残基（ボールド体のＷ）は、ＨＩＶ−１の８５０超の単離株の間で保存されている。保存率が、一部のアミノ酸残基について角括弧内に与えられ、他については、最も高頻度なアミノ酸が角括弧内に与えられる。６２５ＮＭＴ６２７配列は、恐らくはＮ結合グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｔ）の存在のために高度に保存されており、それはｇｐ４１外部ドメインにおけるＮ結合グリコシル化部位の１つである。ＣＢＤ１ペプチドにおける他の残基、Ｓ６１８／Ｍ６２９／Ｑ６３０／Ｄ６３２は９０−９７%保存されているのに対し、Ｅ６２０／Ｑ６２１／Ｎ６２４／Ｋ６３３は若干可変性であるが、しかし、それらの変動は大部分が半保存的である。比較的保存されたＭ６２６残基は、ＨＩＶ−１  Ｏ型におけるＬである。
【図３】図３は、非免疫原性対応物と比較して免疫原性を示すＴヘルパー及びＢ細胞エピトープを含む、配列のその部分を例示する３つのＣＢＤ１又はＣＢＤ１ベースのペプチドの配列である。
【図４】図４は、５回目の免疫化の１０日後にアジュバントとしてＣＦＡを使用した免疫化マウスにおける抗ＣＢＤ１キメラペプチド抗体での結果を示すグラフである。免疫血清を、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）及びＣ１３Ｋペプチドに対するＥＬＩＳＡにより滴定した。縦軸は、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）ペプチドに対する免疫血清の１６，０００倍希釈で観察されたＯＤ値である。横軸は、種々のペプチドを用いて免疫化されたマウス群を示す。
【図５】図５は、５回目の免疫化の１０日後にアジュバントとしてＣＦＡを使用した免疫化マウスにおける抗Ｃ１３Ｋキメラペプチド抗体での結果を示すグラフである。免疫血清を、Ｃ１３Ｋペプチドに対するＥＬＩＳＡにおいて滴定した。縦軸は、Ｃ１３Ｋペプチドに対する免疫血清の１６，０００倍希釈で観察されたＯＤ値である。横軸は、種々のペプチドを用いて免疫化されたマウス群を示す。
【図６】図６は、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）ペプチド及びＣＢＤ１ベースのペプチドに対して惹起されたモノクローナル抗体によるＨＩＶ−１感染の中和を示すグラフである。ＨＩＶ−１  ＢＺ  １６７を、初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染の前に、３７℃で４５分間、各々のモノクローナル抗体調製物の種々の希釈物（ＰＢＳ中）でインキュベートした。結果を、２００及び４００倍希釈でのモノクローナル抗体１．１．１、５Ｂ１５、６Ａ１４（Ｆ６．４ともいう）、及び６Ｂ９について提示する。ウサギＬ血清をＣＢＤ１ペプチドに対して惹起された。ＨＩＶ−１産生を、感染後５日目に、培養液中のｐ２４濃度をモニターすることにより観測した。
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）エピトープに対して惹起されたモノクローナル抗体のＨＩＶ−１中和活性を示すグラフである。ＨＩＶ−１  ＢＺ  １６７を、ＨｅＬａ  Ｐ４細胞の感染の前に、３７℃で４５分間、各々のモノクローナル抗体調製物の種々の希釈でインキュベートした。βガラクトシダーゼの活性を感染後４８時間に測定した。破線は、５０%阻害効果のＯＤを与える。ＣＢＤ１、ＣＢＤ２、Ｃ１３Ｋ、及びｐ６２ペプチドに対するＥＬＩＳＡにおける各々のモノクローナル抗体調製物の力価を、下記の各々のグラフに与える。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）エピトープに対して惹起されたモノクローナル抗体のＨＩＶ−１中和活性を示すグラフである。ＨＩＶ−１  ＢＺ  １６７を、ＨｅＬａ  Ｐ４細胞の感染の前に、３７℃で４５分間、各々のモノクローナル抗体調製物の種々の希釈物でインキュベートした。βガラクトシダーゼの活性を感染後４８時間に測定した。破線は、５０%阻害効果のＯＤを与える。ＣＢＤ１、ＣＢＤ２、Ｃ１３Ｋ、及びｐ６２ペプチドに対するＥＬＩＳＡにおける各々のモノクローナル抗体調製物の力価を、下記の各々のグラフに与える。
【図８】図８は、ウサギ、モルモット、及びマウスにおいてＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）ペプチドに対して惹起された免疫血清の精密エピトープマッピングを示すグラフである。２匹の動物の群を、説明文に記載するＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化した。５回目の免疫化から１０日後に、免疫血清を、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）、Ｃ１３Ｋ、ＣＢＤ２、ｐ６３６２（ｐ６２ともいう）、ｐ６３６４、及びｐ６３６５ペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験した。ＣＢＤ１ペプチドとの反応に対する各々のペプチドとの反応率を、種々のペプチドに対する免疫血清の１６，０００倍希釈で観察されたＯＤ値を考慮に入れて与える。
【図９Ａ】図９Ａは、皮内（ｉ．ｄ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）のいずれかで免疫化されたマカクにおけるＣＢＤ１ペプチドに対する細胞性免疫を示すグラフである。マカクを、実施例９に記載する［ＭＦ５９  ＋  ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］を使用し、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて免疫化した。応答が、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて、示した週（横軸）にサンプリングされたＰＢＭＣを刺激することにより得られた。結果を、試験に含まれた動物由来のＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）数として表わす。１３５０４及び１３５３５は、それぞれｉ．ｄ．及びｉ．ｍ．経路によりアジュバント［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］単独（ペプチド無し）で注射された対照動物である。垂直の矢印はワクチン接種の週数を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、皮内（ｉ．ｄ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）のいずれかで免疫化されたマカクにおけるＣＢＤ１ペプチドに対する細胞性免疫を示すグラフである。マカクを、実施例９に記載する［ＭＦ５９  ＋  ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］を使用し、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて免疫化した。応答が、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて、示した週（横軸）にサンプリングされたＰＢＭＣを刺激することにより得られた。結果を、試験に含まれた動物由来のＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）数として表わす。１３５０４及び１３５３５は、それぞれｉ．ｄ．及びｉ．ｍ．経路によりアジュバント［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］単独（ペプチド無し）で注射された対照動物である。垂直の矢印はワクチン接種の週数を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、皮内（ｉ．ｄ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）のいずれかで免疫化されたマカクにおけるＣＢＤ１ペプチドに対する細胞性免疫を示すグラフである。マカクを、実施例９に記載する［ＭＦ５９  ＋  ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］を使用し、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて免疫化した。応答が、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて、示した週（横軸）にサンプリングされたＰＢＭＣを刺激することにより得られた。結果を、試験に含まれた動物由来のＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）数として表わす。１３５０４及び１３５３５は、それぞれｉ．ｄ．及びｉ．ｍ．経路によりアジュバント［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］単独（ペプチド無し）で注射された対照動物である。垂直の矢印はワクチン接種の週数を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて免疫化したマカクの血清における抗ＣＢＤ１抗体価を示すグラフである。マカクを、アジュバント［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］を用いた皮内（ｉ．ｄ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）経路を介して、０、４、８、１２、及び１６週目にＣＢＤ１ペプチド（２００μg）を用いて免疫化した。垂直の矢印はワクチン接種の日数を示す。２４週間にわたり２週間間隔で採取した放血からの免疫血清を、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドに対するＥＬＩＳＡによりアッセイした。力価は、ＯＤ値≧０．１を与える抗ＣＢＤ１ペプチド抗体の希釈に対応する。ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドとの反応性は、アジュバント単独を用いて注射された対照マカクからの血清では観察されなかった（示さず）。＊マカクＭ１３２８４及びＭ１１３２１は、ＣＢＤ１ペプチドに対するＴ細胞応答を示した（図９に提示する）。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて免疫化したマカクの血清における抗ＣＢＤ１抗体価を示すグラフである。マカクを、アジュバント［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］を用いた皮内（ｉ．ｄ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）経路を介して、０、４、８、１２、及び１６週目にＣＢＤ１ペプチド（２００μg）を用いて免疫化した。垂直の矢印はワクチン接種の日数を示す。２４週間にわたり２週間間隔で採取した放血からの免疫血清を、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドに対するＥＬＩＳＡによりアッセイした。力価は、ＯＤ値≧０．１を与える抗ＣＢＤ１ペプチド抗体の希釈に対応する。ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドとの反応性は、アジュバント単独を用いて注射された対照マカクからの血清では観察されなかった（示さず）。＊マカクＭ１３２８４及びＭ１１３２１は、ＣＢＤ１ペプチドに対するＴ細胞応答を示した（図９に提示する）。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて免疫化したマカクの血清における抗ＣＢＤ１抗体価を示すグラフである。この組の免疫化は、最初の試験でのマカクの５回目の注射から４ヶ月後に開始された。マカクの両群を、アジュバントとして混合物［ＣｐＧ＋Montanide ISA 51］を使用し、遊離ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）及びＴｅｔペプチド（２００μg＋１５０μg）又はＴｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１（３５０μg）を用いて皮下に免疫化した。マカクを０、２８、及び５７日目に免疫化した（矢印により示す）。０、１５、２８、４３、５７、７１、８６、及び９８日目の血清を、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）及びＴｅｔペプチドに対するＥＬＩＳＡにより滴定した。力価は、ＥＬＩＳＡにおいてＯＤ値≧０．１を与える抗ＣＢＤ１ペプチド抗体の希釈に対応する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて免疫化したマカクの血清における抗ＣＢＤ１抗体価を示すグラフである。この組の免疫化は、最初の試験でのマカクの５回目の注射から４ヶ月後に開始された。マカクの両群を、アジュバントとして混合物［ＣｐＧ＋Montanide ISA 51］を使用し、遊離ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）及びＴｅｔペプチド（２００μg＋１５０μg）又はＴｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１（３５０μg）を用いて皮下に免疫化した。マカクを０、２８、及び５７日目に免疫化した（矢印により示す）。０、１５、２８、４３、５７、７１、８６、及び９８日目の血清を、ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）及びＴｅｔペプチドに対するＥＬＩＳＡにより滴定した。力価は、ＥＬＩＳＡにおいてＯＤ値≧０．１を与える抗ＣＢＤ１ペプチド抗体の希釈に対応する。
【図１２】図１２は、マカク免疫血清によるＨＩＶ−１感染の中和を示すグラフである。遊離ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）及びＴｅｔペプチド［Ｔｅｔ＋ＣＢＤ１］又は共有結合したＴｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いて免疫化したマカクからの免疫血清（８６日目に放血）を、２００及び４００倍希釈（それぞれヒストグラム１及び２）で初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１感染を阻害する能力について試験した。縦軸は、感染後５日目でのＥＬＩＳＡによる主要ウイルスコアタンパク質ｐ２４の濃度を測定することによりモニターされたＨＩＶ−１の産生（ng/ml）を与える。ＰＩＳは、マカク１３４５０の免疫前血清を表す。ＰＢＳは対照感染を表わし、そこではリン酸緩衝食塩水を希釈血清の代わりに加えた。破線はＨＩＶ−１産生の５０%阻害を表す。
【図１３】図１３は、遊離ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）及びＴｅｔペプチド又は融合Ｔｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドを用いた免疫化後のマカクからの連続放血の抗ＨＩＶ活性を示すグラフである。１回目、２回目、及び３回目の免疫化（それぞれヒストグラム１、２、及び３）から２週間後に対応する１５、４３、及び７１日目での放血を、４００倍の血清希釈で初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１感染を阻害する能力について試験した。ヒストグラムＣが対照感染を表わすのに対し、ヒストグラムＢは免疫化前（０日目）の血清サンプルを表わす。
【図１４】図１４は、遊離の又はＴヘルパーエピトープに融合されたＣＢＤ１（Ｃ１８Ｋ）ペプチドに対してマカクにおいて惹起された免疫血清の交差反応性プロファイルを示すグラフである。３回目の免疫化から４週間後（８６日目）の免疫化されたマカクからの免疫血清を、ＣＢＤ１（ｇｐ４１におけるアミノ酸残基６１８−６３３）、Ｃ１３Ｋ、ＣＢＤ２、ｐ６３６２、ｐ６３６３、ｐ６３６４、ｐ６３６５、ｐ９１２７、及び組換えｇｐ４１（アミノ酸残基５８６−６８２）に対するＥＬＩＳＡにより試験した。種々のペプチドに対する免疫血清の８，０００倍希釈で観察されたＯＤ値を使用し、ＣＢＤ１ペプチドとの反応性により各々のペプチドの反応性を割ることにより算出された比×１００により得られた交差反応性を推定した。免疫血清はＣＢＤ２ペプチドと交差反応しなかった。
【図１５Ａ】図１５Ａは、遊離の又はＴｅｔペプチドと融合されたＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化されたマカクにおける抗ＣＢＤ１及び抗Ｃ１３Ｋペプチド抗体の動態を示すグラフである。遊離［ＣＢＤ１＋Ｔｅｔ］及びＴＴ−ＫＫ−ＣＢＤ１ペプチドを用いてそれぞれ免疫化されたマカクＭ１１６３５及びＭ１３２８４からの異なる日の免疫血清を、ＣＢＤ１及びＣ１３Ｋペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験した。縦軸は、ＯＤ値≧０．１を与える免疫血清の希釈に対応する、抗ＣＢＤ１（暗いヒストグラム）及び抗Ｃ１３Ｋ（明るいヒストグラム）抗体の力価を与える。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、遊離の又はＴｅｔペプチドと融合されたＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化されたマカクにおける抗ＣＢＤ１及び抗Ｃ１３Ｋペプチド抗体の動態を示すグラフである。遊離［ＣＢＤ１＋Ｔｅｔ］及びＴＴ−ＫＫ−ＣＢＤ１ペプチドを用いてそれぞれ免疫化されたマカクＭ１１６３５及びＭ１３２８４からの異なる日の免疫血清を、ＣＢＤ１及びＣ１３Ｋペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験した。縦軸は、ＯＤ値≧０．１を与える免疫血清の希釈に対応する、抗ＣＢＤ１（暗いヒストグラム）及び抗Ｃ１３Ｋ（明るいヒストグラム）抗体の力価を与える。
【図１６】図１６は、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）ペプチド及びＣＢＤ１ベースのペプチドに対して惹起された免疫血清によるＨＩＶ−１感染の阻害を示すグラフである。種々のペプチド（ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２７Ｗ（Ｇ）、Ｋ３０Ｗ（Ｇ）；横軸）を用いて免疫化された個々のマウスからの免疫血清（放血５）を、表４の説明文に記載した通りに、ＨＩＶ−１感染を阻害する能力について試験した。ＨＩＶ−１  ＢＺ  １６７を、初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染の前に、３７℃で４５分間、各々の免疫血清（それぞれヒストグラム１及び２）の２００倍及び８００倍希釈でインキュベートした。ヒストグラムＣは、２つの免疫前血清を２００倍希釈で使用した対照感染を表わす。混合物は、１／１／１／１／１比のＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２７Ｗ（Ｇ）、及びＫ３０Ｗ（Ｇ）ペプチドを用いて免疫化されたマウスからのプール血清を表す。免疫血清の混合物を、２００、８００、１６００、及び３２００倍希釈（それぞれヒストグラム１、２、３、及び４）で試験した。破線はＨＩＶ−１感染の５０%阻害を表す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）又はＣＢＭベースのペプチドに対して惹起されたマウス免疫血清を用いて処理されたＨＩＶ−１感染培養物における感染が低下したウイルス粒子の産生を示すグラフである。（Ａ）培養上清におけるｐ２４の濃度により測定されたＨＩＶ−１産生。ＣＤ４＋Ｔリンパ球をＨＩＶ−１ＢＺ１６７を用いて感染させ、そして２日後、それらを、種々のペプチド：ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２７Ｗ（Ｇ）、Ｋ３０Ｗ（Ｇ）（ヒストグラム１及び２にそれぞれ示す通り２００及び８００倍希釈）を用いて免疫化された個々のマウスからの免疫血清（放血Ｓ５）を用いて処理した。感染後５日目に、ＨＩＶ−１の産生を、ビリオンｐ２４（ng/ml、縦軸）の濃度を測定することによりモニターした。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）又はＣＢＭベースのペプチドに対して惹起されたマウス免疫血清を用いて処理されたＨＩＶ−１感染培養物における感染力が低下したウイルス粒子の産生を示すグラフである。（Ｂ）免疫血清の存在において産生されたＨＩＶ−１粒子の感染性は低い。感染ＣＤ４＋Ｔリンパ球からの培養上清を感染後５日目（セクションＡに記載されている通り）に培養物から回収し、１０倍希釈し、ＨｅＬａ  Ｐ４Ｃ５細胞を使用することによる１回感染性アッセイにおいてビリオン感染性について試験した。ヒストグラム上の図中の線は、ウイルス感染の非存在において生じるバックグラウンドレベルを示す。３連サンプルでの平均±ＳＤを示す。
【図１８】図１８は、カクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いてそれぞれ免疫化されたマウスの２群からのプール免疫血清のＨＩＶ−１  ＢＺ１６７中和活性を示すグラフである。８匹のマウスの２群を、アジュバントとしてＣＦＡを使用したカクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いて免疫化した。４回の皮下注射投与を１ヶ月間隔で行った。４回目の免疫化から２週間後、各群の免疫血清の５０〜１００μlの一定分量を集め、１０ng/mlのｐ２４抗原等価物でＣＤ４＋Ｔリンパ球の初代ＨＩＶ−１  ＢＺ１６７（クレードＢ）感染を阻害する能力についてアッセイした。プール血清を１００、２００、４００、及び８００倍希釈で使用した。ＨＩＶ−１の産生を、感染後５日目の培養上清においてＨＩＶ−１主要コアタンパク質（ng/ml、縦軸）の濃度を測定することによりモニターした。３連サンプルでの平均を示す。ヒストグラムＣ１及びＣ２は、免疫前血清を１００倍希釈で使用した対照感染を表わす。ＨＩＶ−１  ＢＺ１６７感染の５０%阻害（ＩＤ５０）を与えるカクテルＡ及びカクテルＢプール血清希釈を、それぞれ３００及び４００倍希釈と推定した。ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染は、パラグラフ「方法」の２．３に記載する通りであった。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＨＩＶ−１  ＫＮＨ１２０７及びＨＩＶ−１  ＵＳ１に対するカクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いてそれぞれ免疫化されたマウスの２群からのプール免疫血清の中和活性を示すグラフである。８匹のマウスの２群を、テキストにおいて及び図１８の説明文に記載される通りに、カクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いて免疫化した。カクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いて免疫化されたマウスからのプール血清を、ＨＩＶ−１ワクチン候補を試験するために現在使用されているＨＩＶ−１単離株の国際パネル［AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIHから得られる］の２つ：ＨＩＶ−１  ＫＮＨ１２０７（クレードＡ）（Ａ）及びＨＩＶ−１  ＵＳ１（クレードＢ）（Ｂ）によるＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染を阻害する能力についてアッセイした。ウイルス感染はｐ２４抗原等価物５０ng/mlで、プール血清を１００、２００、４００、及び８００倍希釈で使用した。ＨＩＶ−１の産生を、感染後７日目の培養上清においてＨＩＶ−１主要コアタンパク質（ng/ml、縦軸）の濃度を測定することによりモニターした。ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染は、パラグラフ「方法」の２．３に記載する通りであった。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＨＩＶ−１  ＫＮＨ１２０７及びＨＩＶ−１  ＵＳ１に対するカクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いてそれぞれ免疫化されたマウスの２群からのプール免疫血清の中和活性を示すグラフである。８匹のマウスの２群を、テキストにおいて及び図１８の説明文に記載される通りに、カクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いて免疫化した。カクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いて免疫化されたマウスからのプール血清を、ＨＩＶ−１ワクチン候補を試験するために現在使用されているＨＩＶ−１単離株の国際パネル［AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIHから得られる］の２つ：ＨＩＶ−１  ＫＮＨ１２０７（クレードＡ）（Ａ）及びＨＩＶ−１  ＵＳ１（クレードＢ）（Ｂ）によるＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染を阻害する能力についてアッセイした。ウイルス感染はｐ２４抗原等価物５０ng/mlで、プール血清を１００、２００、４００、及び８００倍希釈で使用した。ＨＩＶ−１の産生を、感染後７日目の培養上清においてＨＩＶ−１主要コアタンパク質（ng/ml、縦軸）の濃度を測定することによりモニターした。ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染は、パラグラフ「方法」の２．３に記載する通りであった。
【００３８】
発明の好ましい実施態様
本明細書において使用する「キメラペプチド」又は「融合タンパク質」は互換的に使用され、このペプチド又はタンパク質は、自然では一緒に連結されない２つ又はそれ以上のペプチド配列を連結することにより作製されることを意味する。キメラペプチドは、わずか５０のアミノ酸、又はわずか４０のアミノ酸、又はわずか３０のアミノ酸、又はわずか２５のアミノ酸、又はわずか２０のアミノ酸のサイズを有する。一般的に、キメラペプチドは、５０〜５０のアミノ酸残基又は５〜４０のアミノ酸残基又は５〜３０のアミノ酸残基又は５〜２０のアミノ酸残基又は１０〜５０のアミノ酸残基又は１０〜４０のアミノ酸残基又は１０〜３０のアミノ酸残基又は１０〜２０のアミノ酸残基を有する。
【００３９】
一実施態様において、本発明のキメラペプチドは化学的に合成される。従って、本発明のキメラペプチドは、翻訳後修飾を持たず、特にそのアミノ酸残基はグリコシル化により修飾されない。別の態様において、ＮＴＸモチーフ（図２のペプチドの残基６２５〜６２７）はグリコシル化さない。
【００４０】
いくつかのキメラペプチドは、本明細書に記載するものである。「いくつか」は、１〜２０、１〜１０、１〜８、又は１〜５のキメラペプチドを意味する。
【００４１】
本明細書において使用する「融合された」という用語は、２つのペプチドが連結されて単一のペプチドを形成するように連結されることを意味する。ペプチドは、種々の結合を通じて化学的に又はペプチド結合により遺伝的に連結又は融合させることができる。
【００４２】
本明細書において使用する「予防」という用語は、ＨＩＶ−１について又はＨＩＶ感染に対する予防又は防御的処置を意味する。
【００４３】
本明細書において使用する「処置する」という用語は、ＨＩＶ−１ウイルスを減弱させることを意味する。この点において、ＨＩＶ−１ウイルスの量は、処置をしない場合と比較して５０%超減少する。別の態様において、ＨＩＶ−１ウイルスの量は、処置をしない場合と比較して７５%超減少する。さらに別の態様において、ＨＩＶ−１ウイルスの量は、処置をしない場合と比較して１００%減少する。
【００４４】
本明細書において使用する「中和抗体」という用語は、ウイルスの複製サイクルがウイルス感染の初期段階において阻害される、もしくは、ウイルス放出が遮断されるような方法でＨＩＶ−１粒子に影響を与える、又は、感染性のない欠陥ウイルス粒子の産生を起こすモノクローナル又はポリクローナルのいずれかの抗体を意味する。
【００４５】
「エピトープ」及び「決定基」という用語は互換的に使用され、抗体の抗体結合部位により特異的に結合される抗原性分子（例、ペプチド）の部分を定義する。エピトープという用語は、連続アミノ酸が抗体により認識される線形エピトープ、並びに、適切な立体配置又は立体構造をとる範囲で、抗体がアミノ酸を認識する立体構造エピトープの両方を包含する。結果的に、一部のエピトープにおいて、立体構造（三次元構造）はアミノ酸配列（一次構造）と同じくらい重要である。
【００４６】
本明細書において使用する「特異的に」という用語は、抗原の抗体認識に言及する場合、無関係のペプチド、即ち、ＣＢＤ１ドメインに関連又は由来しないペプチドと交差反応が起こらないことを意味する。
【００４７】
本明細書において使用する「哺乳動物」は、皮膚が毛で覆われ、雌においては、仔を育てるための乳汁を産生する乳線を特徴とする、哺乳類（ヒトを含む）の種々の温血脊椎動物のいずれかを意味する。
【００４８】
「受動ワクチン」という用語は、個体への投与時にＨＩＶ感染に対して一時的な防御を与えるワクチンを意味する。
【００４９】
本明細書において使用する「ＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメイン」又は「ＣＢＤ１」は、配列番号１（Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）で定義され、図２において提示される、ｇｐ４１外部ドメインにおけるコンセンサス配列のアミノ酸残基６１８〜６３３からなるペプチドを意味する。ＣＢＤ１ドメイン又はＣＢＤ１変異体を含む又はそれから本質的になるペプチドは、全長ｇｐ４１ペプチド並びに全長ＨＩＶ−１エンベロープ（ｇｐ１６０）を除外する。
【００５０】
本明細書において使用する「ペプチド変異体」は、一端又は両端でのアミノ酸残基の付加により修飾された、及び／又はアミノ酸残基の置換、特に半保存的置換により修飾されたペプチドを意味する。従って、変異体は、その特定の連続配列［配列識別番号（配列番号）で定義される］が、１〜６の追加アミノ酸（１、２、３、４、５、又は６残基）を、これらの追加アミノ酸がＨＩＶ−１活性に対する中和抗体を誘導する能力に影響を与えないという条件で、その配列番号により特定される特定配列の一端又は両端のいずれかに含めることができるペプチドである。残基のそのような付加は、ペプチドの配列に関する、「本質的になる」という用語により包含される。ペプチド変異体は、先の定義の代わりに又はそれと組み合わせて、アミノ酸置換がＨＩＶ−１活性に対する中和抗体を誘導する能力に影響を与えないという条件で、その１〜６のアミノ酸（１、２、３、４、５、又は６）が他の半保存的アミノ酸残基により置換されたペプチドも意味する。例えば、非極性（即ち、疎水性）アミノ酸残基はアラニン（Ａｌａ又はＡ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）を含む；極性中性アミノ酸残基はグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）を含む；正電荷を持つ（即ち、塩基性）アミノ酸残基はアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）を含む；並びに負電荷を持つ（即ち、酸性）アミノ酸残基はアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）を含む。
【００５１】
本明細書において使用する「ＣＢＤ１変異体」、「ＣＢＤ１由来のペプチド」、及び「ＣＢＤ１ベースのペプチド」という用語は互換的に使用され、先のパラグラフにおいて定義する通り、ＣＢＤ１の変異体を意味する。そのようなＣＢＤ１変異体の例は、その配列がＸｎＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫＸｍ（配列番号２５）からなるペプチドを含み、ここで、ｎが６つの追加アミノ酸を超えないという条件で、Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎ及びｍが独立して０〜６の整数である。ＣＢＤ１変異体の別の例は、その配列が配列番号１に対応するペプチドを含み、それにおいて、以下の表の位置の内の１〜６のアミノ酸残基（１、２、３、４、５、又は６）が置換されている。位置６２３、６２８、及び６３１におけるトリプトファン残基が置換されていることを除く（図２）。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
より具体的には、本発明は、Ｔヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインを含む又はそれから本質的になるもしくはなるキメラペプチドに関する。
【００５４】
ＨＩＶ−１  ｇｐ４１（ＣＢＤ１）ペプチドのカベオリン１結合ドメインは、当技術分野において公知であり、ＥＰ  １  ４６６  ９２４に記載される。この結合ドメインの合成ペプチドは、アミノ酸位置６１８〜６３３からのＨＩＶ−１のｇｐ４１中の領域に対応する、ＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する（Hovanessian et al., 2004）。ＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）の別々の結合モチーフが、全ての単一のウイルス単離株において保存されている（Hovanessian et al.，上記）。
【００５５】
そのため、本発明のキメラペプチドはＣＢＤ１ペプチド及びまたＣＢＤ１変異体を含む。これらのペプチド変異体は、ＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）の別々の結合モチーフの全て又は一部分を保持し、それにおいてトリプトファン残基の１〜３が保持される。そのため、本発明の変異体の１つがアミノ酸配列ＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）を有し、ここでＸは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６（１、２、３、４、５、又は６）の数である。別の実施態様において、本発明の変異体は配列：ＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）を有し、ここでＸは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である。さらに別の態様において、本発明の変異体は配列：ＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）を有し、ここでＸ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは０〜３、好ましくは１〜３の数である。
【００５６】
別の実施態様において、本発明はキメラタンパク質に関し、それにおいてＣＢＤ１ペプチド変異体はアミノ酸ＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）を有し、ここでＸは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋ（即ち、Ａｓｐ−Ｌｙｓ）である。
【００５７】
本発明のキメラタンパク質は、上に記載した通り、Ｔヘルパーエピトープペプチドに融合されたＣＢＤ１ペプチド又はＣＢＤ１変異体を有する。この融合は化学融合を介しうるが、それにおいてキメラペプチドを、当技術分野において公知の標準方法を使用して（例えばＦｍｏｃ化学の使用などにより）合成するか、又は、それは遺伝子工学的に融合されうるのに対し、ペプチドは組換え産生され、融合はペプチド結合による。
【００５８】
任意のＴヘルパーエピトープペプチドを、Ｔヘルパーによって、ＣＢＤ１ドメインを認識でき、ＨＩＶ−１活性を中和できる抗体の誘導が確実になる限り、キメラタンパク質において使用することができる。そのようなＴヘルパーエピトープは、ヒト、動物、植物、細菌、又はウイルス由来の任意のタンパク質でありうる。特定の実施態様において、Ｔヘルパーエピトープは非天然（即ち、合成）である。本発明において使用することができるＴヘルパーエピトープの例は以下：
−  ＯＶＡｐ３２３−３３６（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥ）、オボアルブミン由来の強力なＴヘルパーエピトープ、
−  ＰＡＤＲＥペプチドａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａＺＣ（Ｘ＝Ｌ−シクロヘキシルアラニン、Ｚ＝アミノカプロン酸）、非天然の汎（pan）ＨＬＡ  ＤＲ結合エピトープ；又は
−  Ｇａｇ、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、及びポリメラーゼタンパク質を含むＨＩＶ−１タンパク質由来のエピトープ
である。
【００５９】
特定の実施態様において、本発明のキメラペプチドは、破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ  １２０からなる群より選択されるペプチドのＴヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインを含む又はそれから本質的になるもしくはなる。
【００６０】
一実施態様において、本発明のキメラタンパク質の一部分を形成するＴヘルパーエピトープペプチドは、破傷風毒素ペプチド、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチド、又はＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ  １２０ペプチドより選択される。一実施態様において、Ｔヘルパーエピトープタンパク質は、配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２）を含む又はそれからなるもしくは本質的になる破傷風毒素Ｔｅｔ８３０ペプチド、配列ＫＱＩＩＮＭＷＱＶＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号３）を含む又はそれからなるもしくは本質的になるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０４２１−４３６ペプチド、又は配列ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号４）を含む又はそれからなるもしくは本質的になるＨＩＶ−１  Ｇａｇ２９８−３１２ペプチドである。
【００６１】
さらに別の実施態様において、Ｔヘルパーエピトープペプチドは配列番号２、３、又は４の変異体であり、それは１〜３（１、２、又は３）の追加アミノ酸をこれらの配列のＮ又はＣ末端に有する。
【００６２】
ＣＢＤ１ペプチド又はＣＢＤ１ペプチド変異体を、リンカーを介してＴヘルパーエピトープに融合することができる。任意のリンカーを本発明において使用することができる（例えば、配列ＫＫ、ＧＰＧＰＧ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＡ、ＧＡ、ＧＤ、ＧＳＧＧＧＧ、ＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＳ、ＧＰＳＬ、ＲＳ、ＲＲ、ＫＫＫ、ＫＫＡＡ、ＶＥ、及びＡＡＹを有するペプチドなど）。一態様において、ＣＢＤ１ペプチド又はＣＢＤ１ペプチド変異体をＴヘルパーエピトープに連結するために使用されるリンカーは、ジリシンリンカー（ＫＫ）又はグリシンプロリンリンカー（ＧＰＧＰＧ）である。キメラペプチドは、また、スペーサーとして、ベータ、ガンマ、及びデルタアミノ酸を使用することにより設計されうる；例えばデルタアミノバレリン酸、ガンマアミノ酪酸、及びイプシロンアミノカプロン酸など。
【００６３】
本発明は、このように、Ｔヘルパーエピトープ、特に破傷風毒素ペプチド、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−ｐ２４ペプチド、又はＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ  １２０ペプチドより選択されるペプチドのＴヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１ペプチドのカベオリン１結合ドメイン（又は変異体）を含む又はそれから本質的になるもしくはなるキメラペプチドに対する抗体に関する。これらの抗体は、キメラペプチドのＣＢＤ１部位を認識する。これらの抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、又はオリゴクローナルでありうる。別の態様において、これらの抗体は中和抗体である。さらなる態様において、抗体はモノクローナル（ｍＡｂ）であり、ＨＩＶ−１を中和することができる。抗体は、配列番号２〜４の少なくとも１つに融合された配列番号５〜２５の、配列番号３１〜３８及び５２〜５９の又は配列番号３９の少なくとも１つのキメラペプチド、配列番号１又は２６〜３０の少なくとも１つのペプチド、又は配列番号１又は２６〜３０のペプチドの少なくとも１つに及びそれらの混合物に対することができる。特定の態様において、抗体は以下：
−  配列番号５〜２５の、配列番号３１〜３８及び５２〜５９の、又は配列番号３９のキメラペプチドのＣＢＤ１部位中に位置付けられる決定基；
−  配列番号１又は２６〜３０のペプチドの決定基；
−  配列番号１又は２６〜３０において定義されるペプチド中に位置付けられる決定基で、前記ペプチドがＴヘルパーエピトープに融合されている；
−  配列番号１又は２６〜３０において定義されるペプチド中に位置付けられる決定基で、前記ペプチドが、破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ  １２０からなる群より選択されるＴヘルパーエピトープに融合されている；
−  配列番号１又は２６〜３０において定義されるペプチド中に位置付けられる決定基で、前記ペプチドが配列番号２〜４の少なくとも１つのペプチドに融合されている
に対し、それらを認識する。
【００６４】
別の態様において、配列番号２２〜２４の少なくとも１つに対するモノクローナル抗体が、提供される。
【００６５】
本発明の抗体は、遊離ウイルス上及びＨＩＶ−１感染細胞上の両方で、ｇｐ４１タンパク質、及び特にＣＢＤ１ペプチドの少なくとも１つのエピトープ又は決定基を認識する能力を有する。ＨＩＶ−１の中和に対する本発明の抗体の効果は、このように、以下：
−  ＨＩＶ−１不含ウイルスを中和し、新たな正常細胞の感染を予防すること；及び
−  ＡＤＣＣ（抗体依存的な細胞媒介性の細胞毒性）及びＣＤＣ（補体依存的な細胞毒性）機構に関与するエフェクター細胞又は分子を動員し、細胞毒性及び感染細胞の破壊に導くこと
により得ることができる。
【００６６】
これらの抗体は、当技術分野において公知の従来方法により作製することができ、さらに公知の方法により精製することができる。一態様において、本発明の抗体及びモノクローナル抗体は、哺乳動物に、特にヒトに、本発明のキメラペプチドを投与することにより得られる。投与後に得られた抗体は、キメラペプチドのＣＢＤ１部位、特にこのキメラペプチドのＣＢＤ１部位の少なくとも１つの決定基を認識する能力を有する。単一のキメラペプチドが、同じキメラペプチド上の異なる決定基を認識する異なる抗体の産生を誘導することができることを理解すべきである（例えば、表１０及び１１中のＣ１７Ｋを参照のこと。３つの異なるモノクローナル抗体を誘導し、各々が異なる決定基を認識する）。そのような決定基は、表１１の最後の列に開示する決定基（配列番号４８〜５１）から本質的になりもしくはなり、あるいは、以下の配列：
【表４】
2012500829.tif 000005
に含まれる又はそれから本質的になるもしくはなる。
【００６７】
本発明は、また、ＨＩＶ−１を中和する抗体及びモノクローナル抗体を産生するための方法に関し、（ａ）哺乳動物に本発明の少なくとも１つのキメラペプチドを投与すること；及び（ｂ）所望の決定基に対する特異性を有する抗体又はモノクローナル抗体を回収することを含む。抗体の回収は、少なくとも１つのキメラペプチドが投与された哺乳動物からのサンプル（例、血液）を、所望の決定基を含む種々のペプチドと接触させ、そして抗体を溶出することにより実施してよい。一態様において、サンプルを、所望の決定基を含むペプチドが固定されている複合体と接触させる。一態様において、抗体を回収するために使用する決定基は、表１１の最後の例に開示される決定基（配列番号４８〜５１）又は配列番号１、５、６、９、１１、１２、１４、２０、２３、２４、３１〜３８、５２〜５９、４０、又は４３に含まれる又はそれから本質的になるもしくはなる決定基である。
【００６８】
さらなる態様において、本発明は、また、哺乳動物、例えばヒトに対する少なくとも１つのキメラペプチドの投与によって、ＨＩＶ−１を中和することができる抗体の誘導が導かれたことを検査するための方法に関する。前記方法は、（ａ）本発明の少なくとも１つのキメラペプチドを用いて投与された患者からのサンプルを準備すること；（ｂ）ペプチドに対する抗体の結合を可能にする条件において、前記サンプルを、ＣＢＤ１決定基を含むペプチドと接触させること；及び（ｃ）可能な場合、各々のペプチドについて、抗体／ペプチド複合体の形成を同定することを含む。一態様において、中和抗体の誘導を検査するために使用する決定基は、表１１の最後の例に開示される決定基（配列番号４８〜５１）又は配列番号１、５、６、９、１１、１２、１４、２０、２３、２４、３１〜３８、５２〜５９、４０、又は４３に含まれる又はそれから本質的になるもしくはなる決定基である。
【００６９】
本発明の抗体及びモノクローナル抗体を免疫療法において使用し、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−１感染を治療又は予防することができる。抗体は、このように、単独で又は固形粒子マトリクスに結合させて、免疫療法において使用することができる。抗体（ポリクローナル、モノクローナル、又はオリゴクローナル抗体を問わず）、制限された特異性を伴う抗体、及び／又は中和抗体は、薬学的に許容可能な賦形剤と共に投与することができる。
【００７０】
少なくとも１つ、好ましくは上に記載する１つのキメラペプチド、いくつかのキメラペプチドもしくはキメラペプチド変異体、又は上に記載する抗体、及び生理学的に許容可能な希釈剤を含む組成物又は医薬組成物は、本発明の別の実施態様である。このように、Ｔヘルパーエピトープ、特に破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０からなる群より選択されるペプチドのＴヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチド（又は変異体）のカベオリン１結合ドメインを含む又はそれから本質的になるもしくはなるキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤を含む又はそれから本質的になるもしくはなる組成物又は医薬組成物を提供する。
【００７１】
より具体的には、本発明の組成物は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；又は
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；
のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる。
【００７２】
別の実施態様において、本発明は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；又は−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる組成物又は医薬組成物に関する。
【００７３】
別の態様において、本発明は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；又は
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６及び／又は配列番号２７のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる医薬的組成物又は組成物に関する。
【００７４】
さらに別の態様において、本発明の変異体キメラペプチドを含む又はそれから本質的になるもしくはなる組成物又は医薬的組成物は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、
式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは０〜３、好ましくは１〜３の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは０〜３、好ましくは１〜３の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは０〜３、好ましくは１〜３の数である；
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６〜２８の少なくとも１つのキメラペプチドとの混合物、
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を有する。
【００７５】
さらに別の実施態様において、本発明の変異体キメラペプチドを含む又はそれから本質的になるもしくはなる組成物又は医薬組成物は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；又は
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６〜２９の少なくとも１つのキメラペプチドとの混合物、
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を有する。
【００７６】
上のキメラペプチド式における記号「−」は、ペプチドが融合されていることを意味することに注意すべきである。
【００７７】
本発明の種々のキメラペプチド（上に定義する）を含む特定の混合物は、組成物、医薬又は免疫原性組成物又はワクチンにおいて使用可能であり、配列番号１２（Ｋ２７Ｗ）、配列番号３５（Ｋ２４Ｗ）、配列番号１６（Ｋ３０Ｗ（Ｇ））、及び配列番号３８（Ｋ２７Ｗ（Ｇ））、並びに場合により配列番号３１（Ｃ１７Ｋ）からなるものである。
【００７８】
【表５】
2012500829.tif 000006
及びその混合物、並びに
【表６】
2012500829.tif 000007
及びその混合物、及び上記のペプチドのいずれかの混合物の群より選択されるキメラペプチド；及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤を含む又はそれから本質的になるもしくはなる組成物又は医薬組成物は、本発明の別の態様である。
【００７９】
これらの組成物又は医薬組成物は、また、Ｃ１８Ｋペプチド（配列番号４２）、配列番号３１（Ｃ１７Ｋ）に定義するペプチド、配列番号３２（Ｃ１０Ｍ）に定義するペプチド、及び／又は配列番号３９（ＣＢＤ１／Ａ）に定義するペプチドを、記載するキメラペプチドの１つ又はいくつかと一緒にさらに含みうる。
【００８０】
上に開示するキメラペプチド又はキメラペプチド変異体に対して惹起された抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、制限された特異性を有する抗体及び／又は中和抗体などを含む又はそれから本質的になるもしくはなる組成物又は医薬組成物も本発明の実施態様の部分である。別の態様において、ペプチドＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号２３）、（ｐ６２）ＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷＮＮＭ（配列番号２４）、上に記載するキメラペプチド及びキメラペプチド変異体並びにその混合物に対する抗体は、本発明の別の態様である。さらに別の態様において、ペプチドＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号２３）、（ｐ６２）ＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷＮＮＭ（配列番号２４）、上に記載するキメラペプチド及びキメラペプチド変異体並びにその混合物に対するモノクローナル抗体、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤は、本発明の部分である。
【００８１】
生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤は、緩衝剤、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、水、エタノールなど及びその組み合わせでありうる。
【００８２】
また、アジュバントは、組成物又は医薬組成物を含むことができる。種々のアジュバントが当技術分野において公知であり、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、Montanide ISA（不完全SEPPICアジュバント）、ムラミルペプチド、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）（Ｎα−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｎｅ−ステオロイル−Ｌ−リシン）、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＰＧ  ＯＤＮ）、例えばＣＰＧ  ＯＤＮ１８２６及びＣＰＧ  ＯＤＮ２００７など、並びにＭＦ５９（それは、水中の５%スクアレン（w/v）、０．５%  Tween（登録商標）80（w/v）、及び０．５%  Span（w/v）を含む界面活性剤で安定化された水中油型乳剤である）を含む。
【００８３】
上に記載するキメラペプチドもしくはキメラペプチド変異体又は上に記載する抗体及び生理学的に許容可能な希釈剤を含む免疫原性組成物は、本発明の別の実施態様である。Ｔヘルパーエピトープ、特に破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０からなる群より選択されるペプチドのＴヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインを含む又はそれから本質的になるもしくはなるキメラペプチドを含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物は、本発明の別の態様である。
【００８４】
より具体的には、本発明の組成物は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；又は
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；
のキメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる。
【００８５】
別の実施態様において、本発明は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；又は−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物に関する。
【００８６】
別の態様において、本発明は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；又は
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６及び／又は配列番号２７のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物に関する。
【００８７】
さらに別の態様において、本発明の変異体キメラペプチドを含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、
式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは１〜３の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは１〜３の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは１〜３の数である；
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６〜２８の少なくとも１つのキメラペプチドとの混合物、
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を有する。
【００８８】
さらに別の実施態様において、本発明の変異体キメラペプチドを含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；又は
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６〜２９の少なくとも１つのキメラペプチドとの混合物、
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を有する。
【００８９】
上のキメラペプチド式における記号「−」は、ペプチドが融合されていることを意味することに注意すべきである。
【００９０】
【表７】
2012500829.tif 000008
及びその混合物、並びに
【表８】
2012500829.tif 000009
及びその混合物、及び上記のペプチドのいずれかの混合物の群より選択されるキメラペプチド；及び生理学的に許容可能な希釈剤又は医薬的に許容可能な賦形剤を含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物は、本発明の別の態様である。
【００９１】
これらの免疫原性組成物は、また、Ｃ１８Ｋペプチド（配列番号４２）、配列番号３１（Ｃ１７Ｋ）に定義するペプチド、配列番号３２（Ｃ１０Ｍ）に定義するペプチド、及び／又は配列番号３９（ＣＢＤ１／Ａ）に定義するペプチドを、記載するキメラペプチドの１つ又はいくつかと一緒にさらに含みうる。
【００９２】
上に開示するキメラペプチド又はキメラペプチド変異体に対して惹起された抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、制限された特異性を有する抗体及び／又は中和抗体などを含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物も本発明の実施態様の部分である。別の態様において、ペプチドＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号２３）、（ｐ６２）ＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷＮＮＭ（配列番号２４）、上に記載するキメラペプチド及びキメラペプチド変異体並びにその混合物の少なくとも１つに対する抗体は、本発明の別の態様である。さらに別の態様において、ペプチドＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号２３）、（ｐ６２）ＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷＮＮＭ（配列番号２４）、上に記載するキメラペプチド及びキメラペプチド変異体並びにその混合物の少なくとも１つに対するモノクローナル抗体、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤は、本発明の部分である。
【００９３】
生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤は、緩衝剤、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、水、エタノールなど及びその組み合わせでありうる。
【００９４】
また、アジュバントは、組成物又は医薬組成物の部分を含むことができる。種々のアジュバントが当技術分野において公知であり、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、Montanide ISA（不完全SEPPICアジュバント）、ムラミルペプチド、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）（Ｎα−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｎｅ−ステオロイル−Ｌ−リシン）、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＰＧ  ＯＤＮ）、例えばＣＰＧ  ＯＤＮ１８２６及びＣＰＧ  ＯＤＮ２００７など、並びにＭＦ５９（それは、水中の５%スクアレン（w/v）、０．５%  Tween（登録商標）80（w/v）、及び０．５%  Span（w/v）を含む界面活性剤で安定化された水中油型乳剤である）を含む。
【００９５】
さらに別の実施態様において、本発明は、上に記載するキメラペプチドもしくはキメラペプチド変異体又は上に記載する抗体、及び生理学的に許容可能な希釈剤を含むワクチンに関し、本発明の別の実施態様である。ワクチンは、Ｔヘルパーエピトープ、特に破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０からなる群より選択されるペプチドのＴヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインを含む又はそれから本質的になるもしくはなるキメラペプチドを含む又はそれから本質的になるもしくはなる。
【００９６】
より具体的には、本発明の組成物は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；又は
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号２６）；
のキメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる。
【００９７】
別の実施態様において、本発明は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭ（配列番号２７）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数である；又は−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチンに関する。
【００９８】
別の態様において、本発明は、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷ（配列番号２８）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜３の数である；又は
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６及び／又は配列番号２７のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチンに関する。
【００９９】
さらに別の態様において、本発明のワクチンは、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、
式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは１〜３の数である；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは１〜３の数である；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺｐ（配列番号２９）、式中、Ｘ及びＺは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ｐは１〜３の数である；又は
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６〜２８の少なくとも１つのキメラペプチドとの混合物、
を有する本発明の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチン。
【０１００】
さらに別の実施態様において、以下の式：
−  Ｔヘルパー破傷風毒素エピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；
−  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４ペプチドのＴヘルパーエピトープＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；
−  ＴヘルパーＨＩＶ−１エピトープＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ１２０ペプチドＸｎＷＮＮＭＴＷＭＱＷＺ（配列番号３０）、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜６の数であり、ＺはＤ−Ｋである；又は
−  その混合物、又は、上に開示する、配列番号２６〜２９の少なくとも１つのキメラペプチドとの混合物、
を有する本発明の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチン。
【０１０１】
上のキメラペプチド式における記号「−」は、ペプチドが融合されていることを意味することに注意すべきである。
【０１０２】
【表９】
2012500829.tif 000010
及びその混合物、並びに
【表１０】
2012500829.tif 000011
及びその混合物、及び上記のペプチドのいずれかの混合物の群より選択されるキメラペプチド；及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチン（カクテル又はカクテルワクチンとも呼ばれる）は、本発明の別の態様である。
【０１０３】
これらのワクチンは、また、Ｃ１８Ｋペプチド（配列番号４２）、配列番号３１（Ｃ１７Ｋ）に定義するペプチド、配列番号３２（Ｃ１０Ｍ）に定義するペプチド、及び／又は配列番号３９（ＣＢＤ１／Ａ）に定義するペプチドを、記載するキメラペプチドの１つ又はいくつかと一緒にさらに含みうる。
【０１０４】
上に開示するキメラペプチド又はキメラペプチド変異体に対して惹起された抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、制限された特異性を有する抗体及び／又は中和抗体などを含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチンも本発明の実施態様の部分である。別の態様において、ペプチドＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号２３）、（ｐ６２）ＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷＮＮＭ（配列番号２４）、上に記載するキメラペプチド及びキメラペプチド変異体並びにそれらの混合物の少なくとも１つに対する抗体は、本発明の別の態様である。さらに別の態様において、ペプチドＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号２３）、（ｐ６２）ＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷＮＮＭ（配列番号２４）、上に記載するキメラペプチド及びキメラペプチド変異体並びにその混合物の少なくとも１つに対するモノクローナル抗体、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤は、本発明の部分である。
【０１０５】
生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤は、緩衝剤、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、水、エタノールなど及びその組み合わせでありうる。
【０１０６】
また、アジュバントは、組成物又は薬学的組成物の部分を含むことができる。種々のアジュバントが当技術分野において公知であり、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、Montanide ISA（不完全SEPPICアジュバント）、ムラミルペプチド、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）（Ｎα−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｎｅ−ステオロイル−Ｌ−リシン）、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＰＧ  ＯＤＮ）、例えばＣＰＧ  ＯＤＮ１８２６及びＣＰＧ  ＯＤＮ２００７など、並びにＭＦ５９（それは、水中の５%スクアレン（w/v）、０．５%  Tween（登録商標）80（w/v）、及び０．５%  Span（w/v）を含む界面活性剤で安定化された水中油型乳剤である）を含む。
【０１０７】
本発明は、また、ＨＩＶ−１感染を処置又は中和するための方法に関し、前記方法は、そのような処置を必要とする哺乳動物に対して、生理学的に許容可能な賦形剤中の上に記載するキメラペプチドもしくはキメラペプチド変異体又は上に記載する抗体を投与することを含む。この点において、配列番号２〜４の少なくとも１つのＴヘルパーペプチドに融合された配列番号５〜２５の少なくとも１つ又は配列番号３１〜３９及び５２〜５９の少なくとも１つ並びにその混合物、又は配列番号１、又は配列番号２６〜３０の少なくとも１つ及びそれらの混合物を含む、それから本質的になる又はなるキメラペプチドのいずれかをＨＩＶ−１感染を処置するための方法において使用することができる。
【０１０８】
本発明は、また、そのような処置を必要とする哺乳動物に対して、本発明に記載される抗体を投与することによる、ＨＩＶ−１感染を処置するための方法を包含する。この点において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、制限された特異性を有する抗体、及び／又は中和抗体でありうる。
【０１０９】
本発明は、また、ＨＩＶ−１活性を中和するための方法に関し、前記方法はそのような処置を必要とする哺乳動物に対して、配列番号２〜４の少なくとも１つのＴヘルパーエピトープペプチドに融合された配列番号５〜２５、又は配列番号３１〜３９及び５２〜５９、又は配列番号１の少なくとも１つ、又は配列番号２６〜３０の少なくとも１つ及びそれらの混合物のキメラペプチドを含む、それから本質的になる又はなるキメラペプチドを投与すること、次にＴヘルパーエピトープをさらに投与することを含む。
【０１１０】
上に記載する通り、ある態様において、Ｔヘルパーエピトープは、破傷風毒素ペプチド、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ペプチド、及びＨＩＶ−１  Ｇａｇペプチド由来でありうる。より具体的には、これらのペプチド、配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２）を含む又はそれからなるもしくは本質的になる破傷風毒素Ｔｅｔ８３０ペプチド、配列ＫＱＩＩＮＭＷＱＶＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号３）を含む又はそれからなるもしくは本質的になるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０４２１−４３６ペプチド、又は配列ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号４）を含む又はそれからなるもしくは本質的になるＨＩＶ−１  Ｇａｇ２９８−３１２ペプチドである。
【０１１１】
ペプチドのＴヘルパーエピトープ、特に破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ  １２０の群より選択されるペプチドのＴヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインを含む又はそれから本質的になるもしくはなるキメラペプチドを、医薬として、ＨＩＶ−１の中和のために又はＨＩＶ−１もしくはＡＩＤＳもしくはＨＩＶ感染の処置のために又はＨＩＶ−１の予防法として使用することができる。より具体的には、配列番号２〜４の少なくとも１つのＴヘルパーエピトープペプチドに融合された配列番号５〜２５の少なくとも１つ又は配列番号３１〜３９及び５２〜５９もしくは配列番号１の少なくとも１つ、又は配列番号２６〜３０の少なくとも１つのキメラペプチド又はペプチド変異体を、医薬として、ＨＩＶ−１の中和のために又はＨＩＶ−１もしくはＡＩＤＳもしくはＨＩＶ感染の処置のために又はＨＩＶ−１の予防として使用することができる。又は、配列番号２〜４の少なくとも１つのＴヘルパーエピトープペプチドに融合された、本明細書に記載される、及び、配列番号２２〜２４のペプチドに対する又は配列番号５〜２５の少なくとも１つ又は配列番号３１〜３８及び５２〜５９又は配列番号３９もしくは配列番号１の少なくとも１つ、又は配列番号２６〜３０の少なくとも１つのキメラペプチド又はキメラペプチド変異体及びそれらの混合物に対する抗体、特にモノクローナル抗体を、医薬として、ＨＩＶ−１の中和のために又はＨＩＶ−１もしくはＡＩＤＳもしくはＨＩＶ感染の処置のために又はＨＩＶ−１の予防として使用することができる。
【０１１２】
Ｔヘルパーエピトープ、特に破傷風毒素、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖ−ｇｐ  １２０の群より選択されるペプチドのＴヘルパーエピトープに融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１ペプチドのカベオリン１結合ドメインを含む又はそれから本質的になるもしくはなるキメラペプチドを、医薬の製造ために、ＨＩＶ−１の中和のために又はＨＩＶ−１もしくはＡＩＤＳもしくはＨＩＶ感染の処置のために又はＨＩＶ−１の予防のために使用することができる。より具体的には、配列番号２〜４の少なくとも１つのＴヘルパーエピトープペプチドに融合された配列番号５〜２５の少なくとも１つ又は配列番号３１〜３９及び５２〜５９もしくは配列番号１の少なくとも１つ、又は配列番号２６〜３０の少なくとも１つのキメラペプチド又はペプチド変異体を、医薬の製造において、ＨＩＶ−１の中和のために又はＨＩＶ−１もしくはＡＩＤＳもしくはＨＩＶ感染の処置のために又はＨＩＶ−１の予防法のために使用することができる。又は、配列番号２〜４の少なくとも１つのＴヘルパーエピトープペプチドに融合された、本明細書に記載される、及び、配列番号２２〜２４のペプチドに対する又は配列番号５〜２５の少なくとも１つ又は配列番号３１〜３８及び５２〜５９又は配列番号３９もしくは配列番号１、又は配列番号２６〜３０の少なくとも１つのキメラペプチド又はキメラペプチド変異体及びそれらの混合物に対する抗体、特にモノクローナル抗体を、医薬の製造において、ＨＩＶ−１の中和のために又はＨＩＶ−１もしくはＡＩＤＳもしくはＨＩＶの処置のために又はＨＩＶ−１の予防のために使用することができる。
【０１１３】
本発明の多数の実施態様が記載されている。しかしながら、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができることが作製されうることが理解されるであろう。
【０１１４】
実施例
材料及び方法
以下の材料及び方法を、実施例を通じて使用した。
【０１１５】
１．材料
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、スクアレン、Tween 80、及びSpan 85（w/v）をSigmaから購入した。Imject（登録商標）マレイミド活性化ＫＬＨ（mcKLH；Pierce Biotechnology）をＣＢＤ１ペプチドのための担体タンパク質として試験した。ＣＢＤ１エピトープの領域でのＨＩＶ−１  ＭＮ  ｇｐ４１の配列からのオーバーラップペプチドをAIDS Research and Reference Program/NIAID、NIH（AIDS/NIH）から得た。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１組み換えフラグメント５８６−６８２をViral Therapeutics, Inc.から購入した。
【０１１６】
ペプチド
免疫グレードの純度（８０〜９０%純粋）の全てのペプチドが、NeoMPS（Strasbourg, France）により合成された。ＣＢＤ１ペプチドはｇｐ４１のアミノ酸位置６１８〜６３３である：ＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（配列番号１）（Hovanessian et al., 2004）。ＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ）のＮ末端のシステイン残基を、Pierce Biotechnologyから購入されたImject（登録商標）活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にそれを結合するために加えた。Ｔヘルパーエピトープペプチドのアミノ酸配列は以下である：（１）破傷風毒素Ｔｅｔ８３０ペプチド、ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２）、（２）ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０４２１−４３６ペプチド、ＫＱＩＩＮＭＷＱＶＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号３）及び（３）ＨＩＶ−１  Ｇａｇ２９８−３１２ペプチド、ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号４）。
【０１１７】
ＣＢＤ１及びＣＢＤ１ベースのペプチドの配列を、太文字の保存トリプトファン残基と共に以下に提供する。キメラペプチドを、ジリシンリンカー（ＫＫ）又はグリシンプロリン（ＧＰＧＰＧ）スペーサーを使用して合成した（Lennon-Dumenill et al., 2002; Livingston et al., 2002）。
【０１１８】
【表１１】
2012500829.tif 000012
カベオリン１結合モチーフベースのペプチドの配列は以下：
【表１２】
2012500829.tif 000013
である。
【０１１９】
システイニルＣＢＤ１ペプチドを供給者（Pierce Biotechnology）の指示に従ってｍｃＫＬＨに結合した。
【０１２０】
アジュバント
完全及び不完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ及びＩＦＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰという）（Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン水和物）、ＭＤＰ誘導体（ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）という）（Ｎα−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｎｅ−ステアロイル−Ｌ−リシン）及び水酸化アルミニウム（ミョウバン）をSigmaから購入した。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（マウス用のＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６；ウサギ及びモルモット用のＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００７；マカク用のＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０３）をColey Pharmaceutical Group（USA）から購入した。界面活性剤で安定化した水中油型乳剤ＭＦ５９を実験室で調製した。それは、水中の５%スクアレン（w/v）、０．５%  Tween 80（w/v）、０．５%  Span 85（w/v）（O'Hagan and Rappuoli, 2004）からなる。Montanide ISA  ５１は、好意により、SEPPIC（フランス）により提供された。
【０１２１】
２．方法
２．１  動物の免疫化及びＥＬＩＳＡ
ウサギ（Fauves de Bourgogne、６週齢）及びモルモット（３５０〜４００g）をAnimal Production Center(Olivet, France）から購入した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）をCharles River Laboratories（France）から購入した。動物を約２〜３週間の間隔で５回、ＣＢＤ１又はＣＢＤ１由来ペプチドを用いて、ＣＦＡ及びＩＦＡ（本明細書で提示する実験データのために）又は他のアジュバント（データ提示せず）を使用して免疫化した。そのような懸濁液を、１５０μl、３００μl、及び５００μlの全容積中で、等しい抗原／アジュバントの割合（１Ｖ／１Ｖ）で、それぞれマウス、モルモット、及びウサギにおいて投与した。
【０１２２】
ウサギを５回の注射にＣＦＡを使用して皮内に免疫化し、モルモットを最初の３回を筋肉内免疫化、それに続くＣＦＡを使用した２回の腹腔内注射でしたのに対し、マウスを、示した通りに、ＣＦＡを使用した最初の皮下免疫化、それに続くＣＦＡ及びＩＦＡを使用した腹腔内注射で免疫化した。
【０１２３】
免疫血清を、２μMの種々のペプチド（示す通り）を用いてコーティングし、３７℃で６０分間インキュベートした９６ウェルプレート（Maxisorp, Dynatech）を使用したＥＬＩＳＡにより滴定した。免疫血清を階段希釈で加え、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したマウス抗ウサギ（Sigma）又はヤギ抗モルモット（Sigma）又はヒツジ抗マウス（Amersham）免疫グロブリンを加えた。インキュベーション及び洗浄に続き、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸（ＯＰＤ）基質を、記載されている通りにウェルに加えた（Hovanessian et al., 2004; Rey-Cuille et al., 2006）。発色に続き、反応を４５０nmで定量した。抗体価は、０．１に等しいＯＤ値（４５０nmで測定）を与えるそれぞれのウサギ血清の逆希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）に対応する。マウス及びモルモットの免疫血清におけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２サブクラス抗体の割合を、それぞれヤギ抗マウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体（Sigma）並びにヤギ抗モルモットＩｇＧ１及びＩｇＧ２（Nordic Immunology）抗体を使用して決定した。これらのヤギ抗体を、次に、ＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Sigma）により検出した。
【０１２４】
２．２．マカクの免疫化及びＥＬＩＳＡ
体重４〜６kgの成体雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、Mauritius繁殖コロニーから輸入し、非ヒト霊長類ケア（ＥＥＣ指令Ｎ８６−６０９、１９８６年１１月２４日）のための欧州ガイドラインに従って維持し、扱った。動物を、免疫化及び血液サンプル採取のためにケタミン・クロルハイドレート（ｋｅｔａｍｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｈｙｄｒａｔｅ）（１０〜１５mg/kg）を用いて鎮静させた。第１組の免疫化において、動物を、皮内（ｉ．ｄ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）経路を介して、アジュバント［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］を使用し、システイニルＣＢＤ１ペプチド（２００μg）を用いて免疫化した。対照マカクを、アジュバント単独を用いて注射した。第２組の免疫化において、動物を、アジュバントとして［ＣｐＧ＋Montanide ISA５１］で構成される混合物を使用し、Ｔｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１（４００μg）を用いて又はＣＢＤ１＋ＴｅｔＡ８３０ペプチド（２００μg＋１５０μg）を用いて皮下に免疫化した。各々の免疫化のために、１容積のアジュバント混合物と１容積の免疫原からなる５００μlを投与した。一般的に、動物を、免疫応答をモニターするために、各々の免疫化後１５日目に放血した。
【０１２５】
免疫血清を、２μＭの種々のペプチド（示す通り）を用いてコーティングし、３７℃で６０分間インキュベートした９６ウェルプレート（Maxisorp, Dynatech）を使用したＥＬＩＳＡにより滴定した。免疫血清を階段希釈で加え、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（GE Healthcare, UK Limited）を結合したヒツジ抗ヒトＩｇＧを加えた（抗サル抗体を用いたサルＩｇＧの検出は、抗ヒト抗体と比較し、より高いバックグラウンドレベルを与えることに注意すべきである）。インキュベーション及び洗浄に続き、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸（ＯＰＤ）基質を、記載されている通りにウェルに加えた（Hovanessian et al., 2004; Rey-Cuille et al., 2006）。発色に続き、反応を４５０nmで定量した。抗体価は、０．１に等しいＯＤ値（４５０nmで測定）を与えるそれぞれのウサギ血清の逆希釈に対応する。
【０１２６】
２．３．初代Ｔリンパ球におけるＨＩＶ感染のアッセイ
ＣＤ４＋Ｔリンパ球を、１０%熱不活化ウシ胎児血清及び５０IU/mlのペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。ＣＤ４＋リンパ球を、Dynabeads M-450 CD8（Dynal（登録商標）Invitrogen）を使用してＣＤ８＋細胞の除去後、ＰＢＭＣから調製した。ＰＨＡを用いた３日間の刺激後、細胞を、ＩＬ−２を含む新鮮培養液中に懸濁させ、７２時間後に初代ＨＩＶ−１単離株ＢＺ１６７を用いて感染させた（Hovanessian et al., 2004; Rey-Cuille et al., 2006）。ＨＩＶ感染に対する抗ＣＢＤ１免疫血清の阻害活性を、許容細胞とのインキュベーション（３７℃、９０分間）前に免疫血清の種々の希釈物を用いた所与のＨＩＶ単離株のプレインキュベーション（３７℃、２０分間）によりアッセイした。そのような初代ＣＤ４＋細胞におけるウイルス産生の最大ピークは、感染後４〜５日目に起こる。細胞を３日目に継代し、ウイルス産生をＥＬＩＳＡにより培養上清においてモニターし、ＨＩＶ主要コアタンパク質ｐ２４の濃度を測定する（HIV-1 p24 ELISAキット、Perkin-Elmer）。異なる実験において得られた値は、３連のサンプルのng/mlで平均値±ＳＤある。
【０１２７】
２．４．単回ＨＩＶ−１感染性アッセイ
ＨＩＶ感染性のアッセイのために、階段希釈の培養上清を使用し、ＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）の制御下にあるＬａｃＺ遺伝子を含むＨｅＬａ  Ｐ４細胞に感染させた。ＨＩＶ−１の侵入及び複製は、ＨＩＶ−１  ＬＴＲの活性化をもたらし、β−ガラクトシダーゼの発現に導く。感染から４８時間後、細胞を洗浄し、β−ガラクトシダーゼ活性を記載のように５７０nm波長のフィルターを使用して測定する（Nisole et al., 2000）。
【０１２８】
２．５．ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
皮内（ｉ．ｄ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）に免疫化されたマカクにおけるＣＢＤ１ペプチドに対する細胞性免疫応答。応答は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ＣＢＤ１ペプチドを用いて、示された日にサンプリングされたＰＢＭＣを刺激することにより得られた。MultiScreen 96ウェルろ過プレート（Millipore, Guyancourt, France）を３５%エタノール水を用いて３０秒間湿らせ、次に滅菌パイロジェフリー水を用いて３回洗浄し、続いてＰＢＳを用いて追加洗浄した。プレートを、次に、ＰＢＳ中の濃度１０μg/mlのサルＩＦＮ−γ（クローンGZ4、Mabtech AB, Sophia Antipolis, France）に対するモノクローナル抗体を用いて４℃で一晩インキュベーションしてコーティングした。
プレートを、ＰＢＳを用いて６回洗浄し、次に、１０%熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Laboratoires Eurobio；培養液）が添加されたglutamax-1（Invitrogen）を含むRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）1640培地で３７℃で２時間インキュベーションしてブロッキングした。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を密度匂配遠心により回収し、２×１０５個の細胞を各ウェルに加えた。ペプチドを、次に、３連で、培養液中に最終濃度１μMで加えた。ホルボール１２ミリスチン酸１３アセテート（ＰＭＡ）（Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France）＋イオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ）（Sigma-Aldrich）（それぞれ最終濃度０．１μＭ及び１μＭ）を陽性対照として使用した。培養液単独を陰性対照として使用した。プレートを、５%  ＣＯ２を含む雰囲気において３７℃で１８時間インキュベートした。それらを次にＰＢＳを用いて５回洗浄し、０．５%  ＦＣＳを含むＰＢＳにおいて濃度１μg/mLのビオチン化抗ＩＦＮ−γ抗体（クローン７−Ｂ６−１、Mabtech AB）を用いて４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳを用いて５回洗浄し、０．２５μg/mLのアルカリホスファターゼ−ストレプトアビジンコンジュゲート（Sigma-Aldrich）を用いて３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳを用いて５回洗浄した。スポットを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Sigma-Aldrich）を８０μl／ウェルで加えることにより発色した。スポットを、ＫＳソフトウェアを使用しAutomated Elispot Reader System（Carl Zeiss, Le Pecq, France）を用いてカウントした。結果を、３連のウェルでの１０６個のＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＩＦＮ−γＳＦＣ／ＰＢＭＣ１００万個）の平均値として表わす。バックグラウンドを、非刺激サンプルにおけるＩＦＮ−γ  ＳＦＣ／ＰＢＭＣ１００万個の平均数の２倍として計算した。バックグラウンドの除去後に５０超のＩＦＮ−γ  ＳＦＣ／ＰＢＭＣ１００万個を産生するサンプルを陽性としてスコアした。
【０１２９】
実施例１  −  ペプチド配列の生成
以下の実施例における全てのペプチドを、当技術分野において公知の方法を使用し、NeoMPS（Strasbourg, France）により合成した。全てのペプチドが、８０%〜９０%の免疫グレードの純度であった。
【０１３０】
別途示さない限り、実施例２、３、４、５、６、８、１０、及び１１（並びに図４、５、７、１６、及び１７）において、「ＣＢＤ１」という用語は、ＣＢＤ１ベースのペプチドＣ１７Ｋ（配列番号３１）を指す。実施例９（及び図９〜１５）において、「ＣＢＤ１」という用語は、ＣＢＤ１ベースのペプチドＣ１８Ｋ（配列番号４２）を指す。
【０１３１】
実施例２  −  遊離ペプチドとして又は担体タンパク質に結合されたＣＦＡを用いてアジュバント化されたＣＢＤ１ペプチドの免疫原性の比較
一連の実験をウサギにおいて実施し、遊離ペプチドとして又は担体タンパク質（例えばストレプトアビジン及びオボアルブミンなど）に結合した、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いてアジュバント化されたＣＢＤ１ペプチドの免疫原性を比較した。
【０１３２】
免疫血清の阻害活性を、Hovanessian et al., 2004bにより記載される通りに、初代ＨＩＶ−１  ＢＺ  １６７単離株を用いた初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染に対する異なる希釈でアッセイした。
【０１３３】
ＣＢＤ１ペプチド用の担体タンパク質としてのＫＬＨの有効性を評価するために、ウサギを、アジュバントとしてＣＦＡを使用し、システイニル−ＣＢＤ１ペプチド又はＫＬＨに結合したシステイニル−ＣＢＤ１ペプチドのいずれかを用いて注射した。ＫＬＨ結合ＣＢＤ１ペプチドは、非常に弱い免疫原であることが見出された（表１）。ＫＬＨ結合ＣＢＤ１ペプチドの反応性の欠如は、ＫＬＨに結合した場合でのその構造の喪失に起因しうる。なぜなら、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＣＢＤ１抗体はＫＬＨ−ＣＢＤ１構築物と弱く反応するからである。いずれにせよ、システイニルＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ及びＣ１８Ｋ）は、それらが中和抗体の産生を誘発するので、より高い免疫原性を有することが示された。結果的に、さらなる免疫化実験において、遊離システイニル−ＣＢＤ１ベースのペプチド（即ち、担体タンパク質なし）を使用した。
【０１３４】
システイニル−ＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ、Ｃ１８Ｋ）がより高い免疫原性を有するのに対し、オバルブミンに結合した場合、それらの免疫原性は５０%だけ低下する。他方で、遊離ビオチニル−ＣＢＤ１ペプチドは免疫原性を示さないのに対し、その免疫原性は、ストレプトアビジンに結合した場合、システイニル−ＣＢＤ１ペプチドのそれと同程度である（Hovanessian et al., 2004b）。ストレプトアビジンに結合したシステイニル−ＣＢＤ１ペプチド及びビオチニル−ＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化されたウサギからの免疫血清は、ＨＩＶ−１感染を阻害する能力を有する（表１）。
【０１３５】
【表１３】
2012500829.tif 000014
【０１３６】
ウサギにおける別の一連の実験において、種々のアジュバント：ＣＦＡ、ＡＬＵＭ、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）、及びＭＦ−５９（Chironにより開発された水中油型乳剤；Ott et al., 2000 p. 211-228を参照のこと）を使用し、システイニル−ＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ、Ｃ１８Ｋ）の免疫原性について研究した。ＡＬＵＭの他、全ての他のアジュバントが、ＣＢＤ１エピトープに対する特異的抗体の開発のために免疫応答を効率的に刺激した。最善のアジュバント活性が、ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）及びＭＦ−５９の混合物を使用して観察された（データ示さず）。
【０１３７】
実施例３  −  種々のアジュバントを使用したマウスにおけるシステイニル−ＣＢＤ１ペプチドの免疫原性
これらの実験の目的は、ヒトにおいて適合性があるアジュバント、ＭＦ−５９、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、及びＭＤＰ−Ｌｙｓを使用し、マウスにおけるＣＢＤ１ペプチドに対する体液性及び細胞性免疫応答をモニターすることである。１群当たり６匹の動物を、ＭＦ−５９、［ＭＦ−５９＋ＣｐＧ  ＯＤＮ］、又は［ＭＦ−５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ］中で製剤化された５０μgのＣＢＤ１ペプチドを用いて、両側の前脛骨筋中に筋肉内注射により２又は３週間の間隔で４回免疫化した。６匹のマウスの群に、［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ］又は［ＭＦ５９＋ＣｐＧ］のいずれかにおいて製剤化されたＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ）を用いて筋肉内注射した。各群の対照動物に、陰性対照としてアジュバント調製物のみを用いて注射した。マウスの異なる群を、最終注射から１０日後に心穿刺によって放血させ、脾臓を除去し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びサイトカイン分泌評価を実施した。５回目の免疫化から１０日後、免疫血清を、ＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ）に対するＥＬＩＳＡにより試験した。平均ＯＤ値±ｓ．ｄ．は、各群の１／８０００希釈での免疫血清の平均値に対応する。結果を表２に示す。
【０１３８】
【表１４】
2012500829.tif 000015
【０１３９】
これらの試験は、有意な免疫細胞応答が、ＣＢＤ１ペプチドを用いた免疫化に応答して開始されないことを示した（示さず）。しかし、免疫化されたマウスは、各々の追加免疫ー注射後に増加されたＣＢＤ１ペプチド特異的抗体を生成した。より重要なことに、これらの実験によって、ＣｐＧ  ＯＤＮがＭＤＰ−Ｌｙｓよりもずっと免疫増強性の高いアジュバントであることが指摘された。実際に、［ＭＦ−５９＋ＣｐＧ  ＯＤＮ］を用いてアジュバント化されたＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化されたマウスは、［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ］中でアジュバント化されたＣＤＢ１ペプチドを用いて免疫化されたマウスと比較し、数倍高い抗ＣＢＤ１抗体力価を誘発した（表２）。
【０１４０】
実施例４  −  モルモットにおけるＣＦＡを用いてアジュバント化されたＣＢＤ１ペプチドの免疫原性
ＣＦＡを用いてアジュバント化されたＣＢＤ１ペプチドの免疫原性を、モルモットにおいて、ＣＢＤ２ペプチド、ＣＢＤ１／Ａペプチド（それにおいて３つの保存された芳香族トリプトファン残基がアラニンに変化している）、及びＣＢＤ１ペプチドの最後の１２のアミノ酸残基を含むＣ１３Ｋペプチドと並行して研究した（表３）。
【０１４１】
２匹のモルモットの群をペプチド（１回の免疫化当たり７５μg）：ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）、Ｃ１３Ｋ、ＣＢＤ１／Ａ、又はＫＬＨに結合したＣＢＤ１（ＣＢＤ１−ＫＬＨ）を用いて免疫化した。５回目の免疫化（放血５）から１０日後、免疫血清を、ＣＢＤ１、Ｃ１３Ｋ、ＣＢＤ１／Ａ、及びＣ１０Ｍペプチド並びにＣＢＤ１−ＫＬＨ構築物に対するＥＬＩＳＡにより試験した。抗ＣＢＤ１抗体の力価は、０．１に等しいＯＤ４５０nm値を与える免疫血清の逆希釈に対応する。免疫血清を、初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１  ＢＺ１６７感染を阻害する能力についてアッセイした（Hovanessian et al., 2004; Rey-Cuille et al., 2006）。ＨＩＶ−１産生を、感染後５日目の初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球の培養上清においてｐ２４の濃度を測定することによりモニターした。免疫血清の５０倍希釈で生じるＨＩＶ感染のパーセント阻害を、表３に提示する。
【０１４２】
【表１５】
2012500829.tif 000016
【０１４３】
種々の動物における強力な抗体応答を誘発するＣＢＤ１ペプチド（ＣＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ）の能力は、この１７のアミノ酸ペプチドが免疫優性Ｂ細胞エピトープを含むはずであり、また、ＣＤ４＋細胞により認識される主要組織適合性複合体クラスＩＩのＴ細胞エピトープとオーバーラップすることを示す（Hovanessian et al., 2004; Rey-Cuille et al., 2006）。興味深いことに、ＣＢＤ１ペプチドの最後の１２のアミノ酸にカベオリン１結合モチーフを含むＣ１３Ｋペプチド（ＣＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ）は、モルモット（表３）、マウス、及びウサギ（データ示さず）において全く免疫原性を示さない。免疫原性のこの喪失は、ＣＢＤ１ペプチドのＮ末端部分が、Ｔヘルパーエピトープとしての役割を果たすことを示唆する。
【０１４４】
ＣＦＡを用いてアジュバント化されたＣＢＤ１ペプチドの免疫原性を、モルモットにおいて、ＣＢＤ１／Ａペプチド（それにおいて３つの保存された芳香族トリプトファン残基がアラニンに変化している）と並行して研究した（表３）。ＣＢＤ１ペプチドは、等しく十分にＣ１３Ｋペプチドと反応する高力価抗体を誘発し、このように、３つの保存されたトリプトファン残基を含むＣＢＤ１ペプチドのＣ末端部分が免疫優性Ｂ細胞エピトープであることを示す。Ｃ１３Ｋペプチドの他、抗ＣＢＤ１免疫血清はＣＢＤ１／Ａペプチドとわずかに交差反応し、それは、Ｃ１０Ｍペプチド（ＣＳＬＥＱＩＷＮＮＭ）との同様の交差反応性を考慮すると、ＣＢＤ１ペプチドのＮ末端の１０アミノ酸残基の認識に起因すると思われる。ＣＢＤ１／Ａペプチドもモルモット（表３）において及びウサギにおいて（提示しない）免疫原性を示した。なぜなら、それはＣＢＤ１／Ａペプチドに対する高力価抗体を誘発したからである。抗ＣＢＤ１免疫血清とは対照的に、しかし、抗ＣＢＤ１／Ａ免疫血清とＣ１３Ｋペプチドとの反応性は非常に弱かった。抗ＣＢＤ１／Ａ免疫血清とＣＢＤ１ペプチドとのわずかな交差反応性は、Ｃ１０Ｍペプチドとの反応性により例示される通り、Ｎ末端部分の認識に起因するはずである。これらの観察は、ＣＢＤ１ペプチドのＮ末端部分が追加のＢ細胞エピトープを提供することを示す。
【０１４５】
ペプチドの免疫原性は、担体タンパク質に結合した場合、しばしば改善される。この目的のために、アジュバントとしてＣＦＡを使用したＣＢＤ１ペプチド用の担体タンパク質としてのＫＬＨの有効性を研究した。しかし、２〜３週間の間隔での５回の免疫化後でさえ、ＫＬＨに結合したＣＢＤ１ペプチドが、モルモット（表３）及びウサギ（示さず）の両方において免疫原性を示さないことが見い出された。その構造のため、ＣＢＤ１ペプチドは、細胞膜中に侵入し、界面のカベオリン１と相互作用し、免疫原性を示す能力を有することが最近報告された（Benferhat et al., 2008）。結果的に、ＣＢＤ１ペプチドは、ＫＬＨに結合した場合、その構造及び免疫原性を失う。これを支持し、遊離ＣＢＤ１ペプチドに対して惹起された抗ＣＢＤ１抗体は、免疫原として使用されたＫＬＨ結合ＣＢＤ１ペプチドを認識しない（表３）。
【０１４６】
モルモットにおいて惹起された種々の免疫血清（放血Ｓ５）を、ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１感染を阻害する能力について試験した。５０倍希釈では、２匹のモルモットからの抗ＣＢＤ１免疫血清が、ＨＩＶ感染を６６%及び５７%阻害した。しかし、抗ＣＢＤ１／免疫血清は、明らかな中和活性を有さなかった。この後者は、ＨＩＶ中和抗体の開発するためのカベオリン１結合モチーフ中の保存されたＷ残基の重要性を指摘する。
【０１４７】
実施例５  −  ＣＢＤ１ペプチドの免疫原性並びにウサギ、モルモット、及びマウスにおいてＣＢＤ１ペプチドに対して惹起された免疫血清の微細エピトープマッピング
２匹の動物（ウサギ、モルモット、及びマウス）の群を、ＣＦＡを使用し、２〜３週間の間隔で、ＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ；ウサギ、モルモット、及びマウスにおいてそれぞれ１５０、７５、５０μg/注射）を用いて免疫化した。５回目の免疫化から１０日後、免疫血清を、ＣＢＤ１ペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験した。モルモット及びマウスの免疫血清におけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２サブクラス抗体の割合を、特異的抗体によりモニターした。力価は、０．１に等しいＯＤ４５０nm値を与える免疫血清の逆希釈に対応する。ＨＩＶ−１中和活性（表１においてモニター）をＩＤ５０（阻害希釈５０）として表わし、それはＨＩＶ−１感染の５０%阻害をもたらす免疫血清の希釈を指す。
【０１４８】
【表１６】
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【０１４９】
２匹の動物（ウサギ、モルモット、及びマウス）の群を、上に記載する通りに、ＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化した。５回目の免疫化から１０日後、免疫血清を、以下に記載するＣＢＤ１、Ｃ１３Ｋ、ＣＢＤ２、ｐ６３６２、ｐ６３６４、及びｐ６３６５ペプチド（図８に示す）に対するＥＬＩＳＡにより試験した。ＣＢＤ１ペプチドとの反応性に対する各ペプチドとの%反応性を、種々のペプチドに対する免疫血清の１６，０００倍希釈で観察されたＯ．Ｄ．値を考慮に入れることにより与える。結果を図８に示す。
【０１５０】
アジュバントとしてＣＢＤ１ペプチド及びＣＦＡを使用した同様の免疫化条件下で、モルモットからの抗ＣＢＤ１免疫血清のＨＩＶ中和活性が、ＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化されたウサギ及びマウスからのものと比較し、数倍低いことが見い出された（表４）。この目的のために、抗ＣＢＤ１免疫血清の微細エピトープマッピングを、カベオリン１結合モチーフＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（図８）の種々のセグメントを含むＣＢＤ１、Ｃ１３Ｋ、ＣＢＤ２、及び３つのオーバーラップペプチド（ｐ６３６２、ｐ６３６４、及びｐ６３６５）を使用したＥＬＩＳＡにより行った。ウサギ及びモルモットからの抗ＣＢＤ１免疫血清は、カベオリン１結合モチーフを含むＣ１３Ｋペプチドとの強力な交差反応性により（カベオリン１結合モチーフを含むが、しかし、Ｎ及びＣ末端修飾アミノ酸残基内にあるｐ６３６４ペプチドとの別々の交差反応性と共に）、マウス免疫血清から区別することができる。
【０１５１】
他方で、マウスからの抗ＣＢＤ１免疫血清は、モチーフのＮ末端部分を含むｐ６３６２ペプチドとの強力な交差反応性によりウサギ及びモルモットから区別することができる。特に興味深いのは、抗ＣＢＤ１モルモット免疫血清と、モチーフのＣ末端部分を含むｐ６３６５ペプチドとの強力な交差反応性である（図８）。なぜなら、モルモット免疫血清は、ウサギ及びマウス抗ＣＢＤ１免疫血清と比較し、低下したＨＩＶ−１中和活性を一貫して現したからである（表４）。
【０１５２】
これらの結果によって、所与のＣＢＤ１ベースのペプチドに対し、ウサギ、モルモット、及びマウスからの抗ＣＢＤ１免疫血清の交差反応性プロファイルにおいて有意差が示された。そのような差は、恐らくは、ＣＢＤ１ペプチド免疫原に対するこれらの動物での固有の免疫応答における変動を反映する。例えば、ＣＢＤ１ペプチドのプロセシングは、種々の動物においてわずかに異なりうる。そのため、代替ＨＬＡクラスＩＩアグレトープが生成される。差は、マウスと比較し、モルモットからの免疫血清における抗ＣＢＤ１反応性抗体のＩｇＧサブクラス分布でも観察された。実際に、血清ＩｇＧ１及びＩｇＧ２濃度の分析によって、ＩｇＧ２抗体が、マウスと比較し、モルモットにおいてＩｇＧ１抗体よりも優性であることが示され、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１比はそれぞれ３．７５〜４．１０及び０．９６〜１．１５であった（表４）。
【０１５３】
種々の抗ＣＢＤ１免疫血清とＣＢＤ２ペプチドとの交差反応性は、ＣＢＤ１及びＣＢＤ２が相同カベオリン１結合モチーフを共有するという事実にもかかわらず、ほとんど無視できる。抗ＣＢＤ１免疫血清とＣＢＤ２ペプチドとの交差反応性のこの欠如によって、過去に報告された通り、ＣＢＤ１及びＣＢＤ２ペプチドの間での立体構造の差の存在がさらに確認される（Benferhat et al., 2008; Rey-Cuille et al., 2006）。
【０１５４】
実施例６  −  ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１  ＢＺ１６２感染の阻害
モルモットの免疫血清（放血Ｓ５）を、次に、ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１  ＢＺ１６２感染を阻害するための能力について試験した。１００倍希釈では、ＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化されたモルモットＡ２及びＦ１６からの免疫血清によってＨＩＶ感染がそれぞれ６６%および５７%阻害された。ＣＢＤ１／ＡペプチドはＣＢＤ１ペプチドと同程度に免疫原性を示したが、ＣＢＤ１／Ａペプチドを用いて免疫化されたモルモットＤ７及びＤ８からの免疫血清は、１００倍希釈ではＨＩＶ−１感染と阻害しなかった（表３を参照こと）。この後者は、中和抗体の開発用のカベオリン１結合モチーフ中の保存されたＷ残基の重要性を指摘する。
【０１５５】
実施例７  −  ＣＢＤ１又はＣＢＤ１ベースのペプチドに融合されたＴヘルパーエピトープを含むキメラペプチドの構築
ＣＢＤ１ペプチド、Ｃ１７Ｋ及びＣ１８Ｋが、それ自体で種々の動物（マウス、モルモット、ウサギ）において強い抗体応答を誘発することが可能であるという事実は、それがＴ細胞エピトープと共にＢ細胞エピトープを含むことを示す。他方で、最後の１２のアミノ酸に対応するＣ１３Ｋペプチドは、マウス、モルモット、及びウサギにおいて全く免疫原性を示さない。Ｎ末端の５〜６アミノ酸残基の非存在における免疫原性のこの喪失は、ＣＢＤ１ペプチドのこの部分がＴヘルパーエピトープの役割を果たし、保存されたＣＢＭを含む部分が、図３に示す通り、Ｂ細胞エピトープの役割を果たす。
【０１５６】
ＣＢＤ１ペプチドの免疫原性を増強し、Ｃ１３Ｋペプチドが免疫原性を示すようにするために、Ｔヘルパーエピトープを有するいくつかの構築物を生成した。この目的のために、Ｃ１７Ｋ／Ｃ１８ＫのＮＨ２末端及びＣＢＤ１ペプチドの最後の１２のアミノ酸残基Ｉ−Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｗ−Ｍ−Ｑ−Ｗ−Ｄ−Ｋに融合された３つの公知のＴヘルパーエピトープを使用した。
【０１５７】
この実施例において使用された３つのＴヘルパーエピトープは以下：
１）Ｔｅｔ８３０：ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２）。これは、多数のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する破傷風毒素からの「乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」Ｔ細胞エピトープである（Slingluff et al., 2001）。
２）ｇｐ１２０４２１−４３６：ＫＱＩＩＮＭＷＱＷＧＫＡＭＹＡ（配列番号３）。これは、ヒト、マウス、及びマカクにおいてヘルパーＴ細胞エピトープ機能を現すＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中の４番目の定常ドメインである（Egan et al., 2004）。
３）Ｇａｇ２９８−３１２：ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号４）。これは、１３のヒトＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合するＨＩＶ−ＧａｇヒトＤＲスーパーモチーフ（ＣＮ末端コアタンパク質ｐ２４に位置する）である（Wilson et al., 2001）。
である。
【０１５８】
ＣＢＤ１ベースのペプチドを伴う共線形Ｔヘルパーエピトープを、ジリシン（−ＫＫ−）リンカーを使用して合成し、それはリソソームプロテアーゼカテプシンＢ（ＭＨＣ−ＩＩ抗原提示に関連する抗原プロセシングのための重要なプロテアーゼの１つ）の標的配列である（Lennon-Dumenill et al., 2002）。また、ＧＰＧＰＧスペーサーを使用してペプチドが合成され、それは、一方では、潜在的な接合エピトープの形成を妨げ（Livingston et al., 2002）、他方では、延長３鎖形成を促進するグリシン残基及びプロリン残基によってキメラペプチドにおけるＢ細胞エピトープの立体構造を保持することができた（Liu et al., 2005）。
【０１５９】
粘膜免疫の誘導のための候補ワクチンを提供しうるペプチドキメラを生成する目的のために、Ｃ１３Ｋペプチド配列で構成されるＡ３０ＫペプチドキメラのＮ末端に融合されたインテグリン結合モチーフＲＧＤ（Yano et al., 2005; Yano et al., 2003）及び破傷風ペプチドを含むＲ３３Ｋペプチドを構築した。ペプチド抗原へのＲＧＤモチーフの付加によって、それらの免疫原性の潜在力が顕著に増強され、特に、アジュバントなしで経鼻免疫化を可能にする（Yano et a!., 2005）。
【０１６０】
種々のキメラ構築物の配列は以下：
【表１７】
2012500829.tif 000018
2012500829.tif 000019
である。
【０１６１】
全てのペプチドを、Ｆｍｏｃ化学（NeoMPS SA, Strasbourgによる）を使用して合成した。
【０１６２】
実施例８  −  Ｔヘルパーエピトープと融合されたＣＢＤ１、ＣＢＤ１及びＣＢＭベースのペプチドの免疫原性及びＨＩＶ−１中和活性
マウスにおけるＴヘルパーエピトープと融合されたＣＢＤ１、ＣＢＤ１及びＣＢＭ由来ペプチドの免疫原性、及びＨＩＶ−１感染を阻害する誘発抗体の能力を、２組の実験において研究した。
【０１６３】
実施例８Ａ
ＣＢＤ１ペプチドに融合されたＴｅｔＡ８３０、ｇｐ１２０４２１−４３６、及びＧａｇ２９８−３１２  Ｔヘルパーペプチドを使用した第１組の実験（表５並びに図４及び５にまとめる）。
６匹のマウスの群を、種々のペプチド（Ｃ１７Ｋ、Ｃ１８Ｋ及びＣ１３Ｋのキメラペプチドについては７５μg：Ａ３６Ｋ、Ａ３５Ｋ、Ｋ３６Ｋ、Ｋ３５Ｋ、Ａ３０Ｋ、Ｋ２９Ｋ、Ｋ３０Ｋ、及びＲ３３Ｋペプチドについては１５０μg）と完全フロイントアジュバントを使用して皮下に免疫化した。５回目の免疫化から１０日後、１６，０００倍希釈の免疫血清を、ＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ）に対するＥＬＩＳＡにより試験した。ＯＤ４５０nm値±ｓ．ｄ．は、各群における６つの血清サンプルの平均値に対応する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２サブクラス抗体の割合を、特異的抗体によりモニターした。各群からのプール血清を、初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１  ＢＺ１６７感染を阻害する能力について、ＣＢＤ１ペプチドに対するＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＨＩＶ−１産生を、以前に記載された通りに（Hovanessian et al., 2004b）、感染後５日目の培養上清においてｐ２４の濃度を測定することによりモニターした。中和活性をＩＤ５０（阻害希釈５０）として表わし、それはＨＩＶ１感染の５０%阻害をもたらす免疫血清の希釈を指す。それぞれのプール血清の２００倍希釈での培養液におけるＨＩＶ−１産生の%阻害も提示する。結果を以下の表５に示す。
【０１６４】
【表１８】
2012500829.tif 000020
【０１６５】
結果は、ＴヘルパーエピトープＴｅｔＡ８３０、ｇｐ１２０４２１−４２６、及びＧａｇ２９８−３１２を含むこれらの種々のペプチドの存在が依然として免疫原性であり、１００〜３５０倍の範囲の免疫血清希釈でＨＩＶ産生に対して５０%阻害効果を示すＨＩＶ中和抗体の産生を誘発することを示す（表５）。Ｃ１３Ｋペプチドはそれ自体では免疫原性を示すことなく、しかし、Ｔヘルパーエピトープ（ペプチドＡ３０Ｋ、Ｋ２９Ｋ、Ｋ３０Ｋ、Ｒ３３Ｋ）と融合された場合、それはＣ１３Ｋペプチド並びに元のＣＢＤ１ペプチドの両方と反応する高力価抗体の産生を誘発する（図４及び５を参照こと）。免疫血清とＣＢＤ１ペプチドとの反応性は特異的である。なぜなら、それらはＣＢＤ２ペプチドと反応しないからである。種々のＴヘルパーエピトープが、免疫血清とＴヘルパーエピトープペプチド、ＴｅｔＡ８３０、ｇｐ１２０４２１−４２６、及びＧａｇ２９８−３１２との低い又は非特異的反応性により説明される通り、免疫原性がないことに注意すべきである（データ示さず）。
【０１６６】
Ａ３５Ｋペプチド（ＴｅｔＡ８３０−ＫＫ−ＣＢＤ１ペプチドで構成される）を用いて免疫化されたマウスにおける抗ＣＢＤ１ペプチド抗体の産生は、ＣＢＤ１ペプチド単独のそれと比較し、少なくとも３倍低いのに対し（表５）、ＨＩＶ−１感染の中和の程度における差は２つの免疫血清の間で２倍未満であった（表５）。一般的に、厳密な相関は抗ＣＢＤ１抗体価とＨＩＶ−１中和活性の間で明らかでなく、このように、中和活性は少ない割合の全抗ＣＢＤ１抗体に対応することが指摘された。この後者は、恐らくは、ＥＬＩＳＡアッセイによって、特定の立体構造（天然ｇｐ４１分子におけるＣＢＤ１エピトープの立体構造とわずかに異なりうる）を有しうる所与のペプチドとの反応性がモニターされるという事実に起因する。
【０１６７】
ウサギ及びモルモットにおいて惹起された抗ＣＢＤ１抗体は、Ｃ１３Ｋペプチドと強く反応する（表３、Rey-Cuille et al., 2006を参照）。しかし、マウスにおいて惹起された抗ＣＢＤ１抗体は、Ｃ１３Ｋペプチドと非常に弱く反応するが、それらは強力な抗ＨＩＶ阻害効果を発揮する（表３、図４及び５）。マウスとウサギ／モルモットの間でのこれらの差は、恐らくは、Ｃ１７Ｋペプチドに対するこれらの動物の固有の免疫応答、及びＣＢＤ１ペプチド中の固有のＮ末端Ｔヘルパーエピトープがこれらの動物において機能するプロセスに起因する。これに従い、オーバーラップペプチドを使用したウサギ、モルモット、及びマウスからの種々の免疫血清での微細エピトープマッピングによって、所与のＣＢＤ１又はＣＢＤ１ベースのペプチド免疫原に関連するこれらの動物の間での有意差を明らかにした（図８）。
【０１６８】
実施例８Ｂ
５匹のマウスの群を、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２３Ｍ、Ｋ３０Ｗ（Ｇ）、及びＫ２７Ｗ（Ｇ）構築物についてのＣＢＭ  ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷの異なるサイズフラグメントに融合されたＧａｇ２９８−３１２Ｔヘルパーペプチドで構成される種々のキメラペプチドを使用して皮下に免疫化したのに対し、Ｋ２７Ｗ−２については、モチーフは二次コンセンサス配列に対応するＩＷＤＮＭＴＷＭＥＷであった。唯一の除外は、Ｃ１０Ｍペプチド（Ｃ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｉ−Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｍ）に結合されたＧａｇ２９８−３１２ペプチドで構成されるＫ２７Ｍキメラペプチドであった。それはＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ）の最初の９つのアミノ酸残基に対応する。この実施例についてのペプチドを、以下の表６に示す。
【０１６９】
【表１９】
2012500829.tif 000021
【０１７０】
４回目の免疫化から２週間後、免疫血清を、それぞれのペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験し、初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１  ＢＺ１６７感染を阻害する能力についてアッセイした（表６、表７）。免疫化されたマウスからの免疫血清を表６に記載する。放血Ｓ４を、種々のペプチドに対するＥＬＩＳＡにより滴定した。ＯＤ４５０nm値±ｓ．ｄ．は、６，０００倍希釈での各群における５つの血清サンプルでの平均値に対応する。Ｋ２７Ｗペプチドに対して惹起された免疫血清の反応性は、同種のＫ３０Ｗ（Ｇ）ペプチドより高い；２つのペプチドの間での唯一の違いはリンカーである。抗Ｋ２７Ｗ免疫血清は、そのそれぞれの免疫原（Ｋ−Ｋリンカーを有する）及びＧ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇリンカーを有するその同種のＫ３０Ｗ（Ｇ）ペプチドと強く反応する。同様に、抗Ｋ２４Ｗ免疫血清は、そのそれぞれの免疫原（Ｋ−Ｋリンカーを有する）及びＧ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇリンカーを有するその同種のＫ２７Ｗ（Ｇ）ペプチドと強く反応する。
【０１７１】
Ｋ２３Ｍペプチドは弱い免疫原であることが見い出された。なぜなら、５匹の免疫化マウスの内のわずか１匹がペプチド特異的抗体を生成したからである。全ての他のペプチドは、ペプチド−免疫原特異的抗体の産生により説明される通り、高免疫原性を示した（表７）。
【０１７２】
ペプチドキメラＫ２７Ｗ及びＫ２４Ｗは、それぞれＫ３０Ｗ（Ｇ）及びＫ２７Ｗ（Ｇ）と同種である。それらの間の差は、単にペプチドリンカーＫ−Ｋ又はＧ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇである。配列Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｗ−Ｍ−Ｑ−Ｗ及びＩ−Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｗは、Ｋ−Ｋリンカーと比較し、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇリンカーを有するキメラにおいてより良好に提示されると思われる。従って、抗Ｋ２７Ｗ及び抗Ｋ２４Ｗ免疫血清とＧ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ結合Ｋ３０Ｗ（Ｇ）及びＫ２７Ｗ（Ｇ）ペプチドとの反応性は、Ｋ２７Ｗ及びＫ２４Ｗペプチドのそれと比較し、それぞれ一貫してより高い。他方で、抗Ｋ３０Ｗ（Ｇ）及びＫ２７Ｗ（Ｇ）は、同種のＫ２７Ｗ及びＫ２４Ｗペプチドと反応せず、このように、Ｋ−Ｋ及びＧ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇリンカーにより惹起される重要な立体構造の違いが明らかになる（表７）。それらの同種のＧ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ結合Ｋ３０Ｗ（Ｇ）及びＫ２７Ｗ（Ｇ）ペプチドの他、Ｋ２７Ｗ及びＫ２４Ｗが他のペプチド［二次コンセンサスカベオリン１結合モチーフＷ−Ｄ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｗ−Ｍ−Ｅ−Ｗ（それにおいてＮ及びＱがそれぞれＤ及びＥに変化している）を含むＫ２７Ｗ−２ペプチド含む］と交差反応した。この後者は、立体構造エピトープを有するそのような抗体の反応性と一致する。
【０１７３】
【表２０】
2012500829.tif 000022
【０１７４】
５匹のマウスの群を、種々のペプチド（Ｃ１７Ｋについては７５μg：Ｋ２７Ｗ、Ｋ２７Ｗ−２、Ｋ３０Ｗ（Ｇ）、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２７Ｗ（Ｇ）、Ｋ２７Ｍ、及びＫ２３Ｍについては１５０μg）と完全フロイントアジュバントを使用して皮下に免疫化した。Ｃ１０Ｍ群について、免疫原混合物は、７５μgのＣ１０Ｍペプチド（Ｃ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｉ−Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｍ）と７５μgのＧａｇ２９８−３１２ペプチド（Ｋ−Ｒ−Ｗ−Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｋ−Ｉ−Ｖ−Ｒ−Ｍ−Ｙ）であった。５回目の免疫化から２週間後、免疫血清を、それぞれのペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験した。ＯＤ４５０nm値は、６，０００倍希釈での各群における５つの血清サンプルでの平均値に対応する。各群からのプール血清を、初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１  ＢＺ１６７感染を阻害する能力についてアッセイした（表８）。ＨＩＶ−１産生を、以前に記載された通りに（Hovanessian et al., 2004b）、感染後５日目の培養上清においてｐ２４の濃度を測定することによりモニターした。ＨＩＶ−１中和活性をＩＤ５０（阻害希釈５０）として表わし、それはＨＩＶ−１感染の５０%阻害をもたらす免疫血清の希釈を指す。それぞれのプール血清の２００倍希釈での培養液におけるＨＩＶ−１産生の%阻害も提示する。この混合物は、星印により指定したＣ１７Ｋ／Ｋ２７Ｗ／Ｋ３０Ｗ（Ｇ）／Ｋ２４Ｗ（１／１／１／１）を用いて免疫化されたマウスからのプール血清を表す。
【０１７５】
【表２１】
2012500829.tif 000023
【０１７６】
Ｃ１０Ｍペプチドは免疫原性を示さなかった。しかし、Ｇａｇ  ＴヘルパーエピトープＫ２７Ｍに結合した場合、次に、高力価抗体が免疫化されたマウスにおいて生成された。抗Ｋ２７Ｍ抗体はＣ１０Ｍペプチドと強く反応した（示さず）。Ｋ２７Ｗ−２、Ｋ３０（Ｇ）、Ｋ２７Ｗ（Ｇ）、及びＣ１７Ｋに対して惹起された免疫血清は、他のペプチドと有意に交差反応せず、そのため、ＣＢＭの１０アミノ酸残基内での複数の決定基の存在が明らかとなった。免疫原性を示した最小配列は、Ｋ２４Ｗキメラにより提示されるＩ−Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｗ配列である（表６）。
【０１７７】
免疫血清の大部分が、１００〜４５０倍の範囲の免疫血清希釈で、ＨＩＶ産生に対して５０%阻害効果を示すＨＩＶ−１中和活性を現した（表８）。最高ＩＤ５０値が、Ｋ２４Ｗ及びＫ２７Ｗ−２、それに続きＫ２７Ｗ及びＣ１７Ｋについて観察された。興味深いことに、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ３０Ｗ（Ｇ）、及びＣ１７Ｋ（１／１／１／１：星印により指定）を用いて免疫化されたマウスからの免疫血清の混合物は、ＨＩＶ−１感染に対する相乗的な中和活性をもたらし、ＩＤ５０値はプール血清の＞８００倍希釈であった。プール血清の２００倍希釈では、ＨＩＶ−１感染に対する阻害効果は＞９８%であった。
【０１７８】
同様の実験を、ＣＢＤ１、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２７Ｗ（Ｇ）、及びＫ３０Ｗ（Ｇ）ペプチドを用いて免疫化されたマウスの各群からの個々の免疫血清を使用して実施した。典型的な実験での結果を図１６に提示し、種々の免疫血清のＩＤ５０阻害効果が、異なるペプチドに対して惹起された５つの免疫血清の混合物により少なくとも４倍増加されることを示す。個々の免疫血清の２００及び８００倍希釈で、ＨＩＶ−１感染に対する阻害効果はそれぞれ７０〜９０%及び５０%未満であるのに対し、そのような血清の混合物についてのＩＤ５０値は３２００倍未満の希釈で観察される（図１６）。
【０１７９】
Ｔリンパ球のＨＩＶ−１産生培養物に抗ＣＢＤ１抗体を添加することによって欠陥ウイルス粒子の産生が起こる。なぜなら、抗ＣＢＤ１抗体によって原形質膜においてｇｐ４１の凝集が起こり、ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体を欠損したウイルス粒子の産生をもたらすからである。結果的に、そのようなウイルス粒子は感染性が低い（Hovanessian et al., 2004）。図１７は、これがＣＢＭ由来キメラペプチドに対して惹起される抗体にも当てはまることを実証する。この目的のために、ＨＩＶ−１産生に対する免疫血清の作用が、ＣＤ４＋Ｔリンパ球のウイルス感染から２日後に加えられた場合に試験された。これらの実験条件下で、感染後５日目にＨＩＶ−１主要コアタンパク質ｐ２４によりモニターされたウイルス産生に対する明らかな効果はない（図１７Ａ）。そのような感染細胞の培養上清を１０倍希釈し、ＨｅＬａ  Ｐ４Ｃ５細胞を使用することにより、単回感染性アッセイにおいてビリオン感染性について試験した（図１７Ｂ）。結果は、ＨＩＶ−１粒子が、２００倍希釈の免疫血清の存在において産生され、免疫前血清を用いて処理された培養物から回収された対応するビリオンと比較し、少なくとも５０%低い感染性を示す。
【０１８０】
従って、ウイルス感染の阻害に加えて、種々のＣＢＭベースのキメラペプチドに対して惹起されたマウス免疫血清が、ＨＩＶ−１産生細胞に対して作用する能力を有し、感染力の低下したウイルス粒子の産生をもたらす。
【０１８１】
これらの結果の有意性：
抗ＣＢＭ抗体が、ＨＩＶ−１産生細胞培養物に加えられた場合、欠損ウイルス粒子の産生を起こすことができたとの観察（図１７）は、別々の中和決定基に対するそのような抗体が、ＨＩＶ−１産生細胞の表面上に発現されるｇｐ４１と反応することもできることを指摘する。結果的に、そのような抗体は、Ｆｃ媒介性のエフェクター系、例えば抗体依存的な細胞性の及び補体媒介性の細胞毒性などによりインビボでＨＩＶ感染細胞の除去を引き起こしうる（Parren and Burton, 2001）。他方で、ＨＩＶ偽ウイルス粒子に対する応答において最近報告されているように、欠陥ＨＩＶ粒子は、ウイルスタンパク質に対する体液性及び細胞性免疫応答の生成のための宿主免疫系に関与しうる。（Chen et al., 2005）。
【０１８２】
上の実験から下すことのできる結論は以下のとおりである。高親和性の及び防御的な中和抗体を誘導することができるペプチドワクチンは、部分的に、天然タンパク質における対応する領域の三次元構造を模倣する抗原エピトープの設計に依存しなくてはならない。ここで、ＣＢＤ１ペプチド及びＣＢＤ１由来ペプチドが、そのままで又はＴヘルパーエピトープに融合して、ＨＩＶ−１感染を中和することが可能な抗体を誘導する能力を有する立体構造エピトープを生成することが示された。ＣＢＭ由来ペプチドは、Ｔヘルパーエピトープと融合後にのみ免疫原性を示す。
【０１８３】
原形質膜においてカベオリン１に結合する能力により、ＣＢＤ１ペプチドはエンドソーム経路により取り込まれ、抗原提示細胞の原形質膜へのそれらの輸送中にタンパク分解酵素によりプロセシングされＨＬＡクラスＩＩ分子と相互作用する別々のオーバーラップフラグメント（又は決定基）を与えることができる。そのようなプロセシングされたペプチドは、次に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の原形質膜上に存在するＴ細胞受容体により特定されうる。この後者は、オーバーラップ決定基の生成を説明しうる。
【０１８４】
ＨＩＶ−１感染に対して中和活性を発揮しながらの種々の免疫血清の交差反応性の欠如（表６及び７）、及び別々のＣＢＤ１及びＣＢＭベースのペプチドと交差反応しない中和モノクローナル抗体の単離（表１０）から、ＣＢＤ１エピトープがいくつかの関連する立体構造（特異的ＣＢＤ１及びＣＢＭベースのペプチドにより模倣される）を有することを示唆することが理にかなう。結果的に、そのようなペプチドによって、ＣＢＭの特定の立体構造に対する抗体を誘導することができた。
【０１８５】
特定の決定基と反応する免疫血清の混合物により観察されたＨＩＶ中和における相乗作用は、ＣＢＤ１エピトープに対して効率的な体液性免疫応答を得るために、種々のＴヘルパーペプチドを有するＣＢＤ１及びＣＢＭ由来ペプチドのカクテルを、候補ワクチン調製のために考慮すべきであることを示唆する。
【０１８６】
実施例９  −  ＣＢＤ１ペプチドはアカゲザルにおいて中和抗体を誘発する。
体重４〜６kgの成体雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、Mauritius繁殖コロニーから輸入し、非ヒト霊長類ケア（ＥＥＣ指令Ｎ８６−６０９、１９８６年１１月２４日）のための欧州ガイドラインに従って維持し、扱った。動物を、免疫化及び血液サンプルの採取のためにケタミン・クロルハイドレート（１０〜１５mg/kg）を用いて鎮静させた。第１組の免疫化において、動物を、皮内（Ｉ．Ｄ．）又は筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路を介して、アジュバント［ＭＦ５９＋ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）］を使用し、システイニルＣＢＤ１ペプチド（２００μg）を用いて免疫化した。対照マカクを、アジュバント単独を用いて注射した。この実施例において、ＣＢＤ１は、配列番号４２において定義される、Ｃ１８ＫペプチドＣＫＳＬＥＱＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫを指す。
【０１８７】
第２組の免疫化において、動物を、アジュバントとして［ＣｐＧ＋Montanide ISA５１］で構成される混合物を使用し、Ｔｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１（４００μg）を用いて又はＣＢＤ１＋ＴｅｔＡ８３０ペプチド（２００μg＋１５０μg）を用いて皮下に免疫化した。各々の免疫化のために、１容積のアジュバント混合物と１容積の免疫原からなる５００μlを投与した。一般的に、動物を、免疫応答をモニターするために、各々の免疫化後１５日目に放血した。
【０１８８】
免疫血清を、２μＭの種々のペプチド（示す通り）を用いてコーティングし、３７℃で６０分間インキュベートした９６ウェルプレート（Maxisorp, Dynatech）を使用したＥＬＩＳＡにより滴定した。免疫血清を階段希釈で加え、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（GE Healthcare, UK Limited）を結合したヒツジ抗ヒトＩｇＧを加えた（抗サル抗体を用いたサルＩｇＧの検出は、抗ヒト抗体と比較し、より高いバックグラウンドレベルに与えることに注意すべきである）。インキュベーション及び洗浄に続き、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸（ＯＰＤ）基質を、記載されている通りにウェルに加えた（Hovanessian et al., 2004; Rey-Cuille et al., 2006）。発色に続き、反応を４５０nmで定量した。抗体価は、０．１に等しいＯＤ値（４５０nmで測定）を与えるそれぞれのウサギ血清の逆希釈に対応する。
【０１８９】
マカクにおけるＣＢＤ１ペプチドの免疫原性
合計８匹の動物をこの試験において使用した。３匹の動物の２群に、０、４、８、１２、及び１６週目に、［ＭＤＰ−Ｌｙｓ＋ＭＦ−５９］アジュバント中で製剤化されたＣＢＤ１ペプチド（２００μg）を用いて筋肉内又は皮内経路を介して注射した。対照として、２匹のマカクを、アジュバント製剤単独を用いて筋肉内又は皮内のいずれかに注射した。血清及びＰＢＭＣを０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２週目に回収し、ＥＬＩＳＡにより抗体の力価を試験し、また、ＣＢＤ１ペプチドに特異的なＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔを実施することにより細胞性免疫応答をモニターした。
【０１９０】
有意なレベルの抗ＣＢＤ−１体液性応答は、ＣＢＤ１ペプチドを用いた３回目の免疫化まで、免疫化された動物において生成されなかった（図１０Ａ、１０Ｂ）。５回の免疫化後、３匹の皮内注射されたマカクの内の２匹が、３匹の筋肉内注射された動物（マカクＭ１１４２１）の内の１匹と比較し、高い抗体価を与えた（マカクＭ１３５１０及びＭ１３２８４）。従って、皮内注射が、筋肉内注射と比較し、注射のより効率的な経路であることが可能でありうる。各群において、免疫化された動物の間に弱い応答を示すものがあった：皮内注射された群におけるマカクＭ１３２４６は弱い体液性応答を与え、筋肉内注射された群におけるマカクＭ１１６３５及びＭ１１４５０はそれぞれ弱及び無応答を与えた。動物における免疫応答のこの弱さ又は欠如は、ＣＢＤ１ペプチド免疫原に対する最適な体液性応答を与えるために霊長類においてＭＨＣ拘束性があるはずであることを示唆した。実際に、ＣＢＤ１ペプチドは、この実験において使用されるマカク集団の全てのＭＨＣ分子により結合できない可能性がある。Ｔ細胞へのＣＢＤ１ペプチド提示における欠損は、効率的なＴヘルパー応答の非存在を反映しうる。
【０１９１】
ＣＢＤ１ペプチドに対する細胞性免疫応答に関し、各群における３匹の免疫化された動物の内のわずか１匹が、ＣＢＤ１エピトープに対する有意なレベルのＴ細胞応答を与えた（図９）。この後者は、皮内に免疫化されたマカクＭ１３２８４における３回目の免疫化後、及び筋肉内に免疫化されたマカクＭ１３４２１における２回目の免疫化後に観察された。Ｔ細胞応答の生成は、これらの２匹の動物において抗ＣＢＤ１抗体の産生と相関したが、高い抗体価を産生したマカクＭ１３５１０は有意なＴ細胞応答を現さなかった。４回目の免疫化後、全ての免疫化された動物が、アジュバント混合物により媒介されうる非特異的なＴ細胞応答を生成した。なぜなら、同様の非特異的なＴ細胞応答が、アジュバント混合物のみを用いて注射された対照マカク（Ｍ１３５３５及びＭ１３５０４）においても生成されたからである（示さず）。［ＭＤＰ−Ｌｙｓ（Ｌ１８）＋ＭＦ−５９］アジュバントが、非特異的なＴ細胞応答の生成を起こす機構が依然として研究されていない。他方で、これらの同じマカクにおいて生成する体液性応答が２４週間の試験期間にわたりＣＢＤ１免疫原に特異的であったことに注意すべきである（図１０）。実際に、ＣＢＤ１ペプチドと反応したマカク免疫血清が、ＨＩＶ−２の膜貫通型エンベロープ糖タンパク質中の潜在的カベオリン１結合ドメインに対応する同種のＣＢＤ２ペプチド（ＣＳＬＴＰＩＷＮＮＭＴＷＱＥＷＥＲ）と交差反応しなかった（データ示さず）。
【０１９２】
破傷風毒素からの乱雑なＴヘルパーエピトープに関連するＣＢＤ１ペプチドの免疫原性
マカクにおけるＣＢＤ１ペプチドに対する潜在的なＭＨＣ拘束を克服するために、破傷風毒素からの「乱雑な」Ｔ細胞エピトープ（ＴｅｔＡ８３０：ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ）（多数のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する）を使用した（Jackson et al., 2002）。ジリシンリンカー（ＫＫ）（ＭＨＣ−ＩＩ抗原提示に関連する抗原プロセシングに関与するリソソームプロテアーゼカテプシンＢの標的配列である）を介してＣＢＤ１ペプチドと融合された、ＴｅｔＡ８３０、ヘルパーエピトープで構成されるＴｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１共線形キメラを構築した（Lennon-Dumenill et al., 2002; Yano et al., 2005）。ジリシンモチーフは、また、小胞体における保持及び免疫原の半減期の延長に関与しうる（Steinhilb et al., 2002）。
【０１９３】
いくつかの免疫化実験において、Ｔｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１キメラが、マウス、モルモット、及びウサギにおいて抗ＣＢＤ１抗体の産生を誘発することにより免疫原性を示すことが初めて示された（示さず）。ＣＢＤ１ペプチド単独を用いて過去に免疫化されたマカクの２群におけるＣＢＤ１ペプチドの免疫原性に対するＴｅｔ  Ｔヘルパーエピトープの効果を試験した。この第２組の免疫化は、最初の試験に記載するマカクの５回目の注射から４ヶ月後に開始した。興味深いことに、有意なレベルの抗ＣＢＤ１抗体が、反応性が高いレスポンダーと考えられたそれらのマカクにおいて４ヶ月後に依然として存在した（表９）。抗ＣＢＤ１抗体のこの持続性は、ＣＢＤ１ペプチドを用いた免疫化がＢ細胞記憶応答を誘発することができたことを示唆する。
【０１９４】
マカクの２群は、アジュバントとして混合物［ＣｐＧ＋Montanide ISA  ５１］を使用し、融合された（Ｔｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１）又は遊離の（ＣＢＤ１＋Ｔｅｔ）ペプチドのいずれかである破傷風Ｔヘルパーエピトープペプチドに関連するＣＢＤ１ペプチドを用いて皮下に免疫化した。ＣｐＧ及びMontanideの選択は、アジュバントとしてのそれらの有効性並びに種々の第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相ヒトワクチン接種治験における臨床的安全性に基づいた（Kleinman et al., 1991; Kreig, 2007; Peek et al., 2008）。マカクを０、２８、及び５７日目に３回免疫化し、ＣＢＤ１及びＴｅｔペプチドに対するＥＬＩＳＡにより滴定するために、血清を０、１５、２８、４３、５７、７１、８６、及び９８日目に回収した（表９、図１１）。遊離の又は融合されたＣＢＤ１ペプチドを有するＴｅｔ  Ｔヘルパーエピトープの投与が、最初の免疫化から１５日後という早期に全てのマカクの間で顕著に抗ＣＢＤ１抗体応答を増強し、２回目の免疫化後にプラトーに達すると思われた。印象的なのは、第１組の免疫化試験における弱い及び非応答動物マカク、マカクＭ１３２４６、Ｍ１１６３５、及びＭ１１４５０が、Ｔヘルパーペプチドの存在において非常に強いＣＢＤ１特異的な体液性応答を生成した。
【０１９５】
ＣＢＤ１ペプチドと対照的に、各群における３匹の免疫化されたマカクの内のわずか１匹が、高レベルの抗Ｔｅｔペプチド抗体を生成した（表９）。さらに、所与の免疫血清においてＴｅｔ及びＣＢＤ１ペプチドに対する抗体価において直接的な相関はなかった。例えば、ＣＢＤ１ペプチドに対して強い応答を生成したマカクＭ１３２４６、Ｍ１１６３５、及びＭ１３４５０は、Ｔｅｔペプチドに対して比較的低い又は無体液性応答を生成した。
【０１９６】
マカク免疫血清のＨＩＶ中和活性
初代ＨＩＶ−１単離株による初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球の感染を阻害するマカク免疫血清の能力を試験した。一貫して、本発明者らは、そのような培養物におけるＨＩＶ−１感染が、対照マカク血清の＜２００倍希釈存在において３０〜５０%、免疫前又はアジュバント単独を用いて注射されたマカクからで増強されることを観察した。ウイルス産生に対するこの増強効果は、培養における初代ヒトＴリンパ球細胞の増殖に及ぼすマカク血清の刺激効果に起因しうる。この理由のため、ＨＩＶ感染に対するマカク免疫血清の阻害効果を、２００及び４００倍希釈でアッセイした。
【０１９７】
図１２は典型的なウイルス中和実験の結果を示し、それにおいてＴリンパ球のＨＩＶ−１感染が、３回目の免疫化から４週間後に得られたマカク免疫血清の非存在又は存在において行われた。ウイルス産生を、次に、感染後５日目の培養液においてＨＩＶ主要コアタンパク質ｐ２４の濃度を測定することによりモニターした。予想外に、遊離のＣＢＤ１及びＴｅｔペプチドを用いて免疫化された３匹のマカクの全てとは対照的に、Ｔｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１キメラペプチドを用いて免疫化された３匹のマカクの内のわずか１匹からの免疫血清がＨＩＶ−１中和活性を現した。
ＨＩＶ−１阻害効果は、２００倍希釈と比較し、４００倍でより顕著であり、それはマカク血清のより高い希釈での固有の増強効果の完全な喪失に起因しうる。ＨＩＶ−１感染の阻害の程度は、中和活性を現したマカクの免疫血清の４００倍希釈で６０〜７５%であった（図１３）。
【０１９８】
マカクＭ１３２４６及びＭ１３５１０免疫血清のＨＩＶ−１中和活性の欠如（図１２）は、抗ＣＢＤ１抗体の存在にもかかわらず（図１１、表９）、中和抗体が全抗ＣＢＤ１抗体の小さな割合に対応することを示唆する。これに従い、中和は、最初の免疫化後に、Ｍ１３２８４、Ｍ１３４２１、及びＭ１３４５０免疫血清を用いて観察されなかったが、高力価な抗ＣＢＤ１抗体が産生された。同様に、マカクＭ１３２８４及びＭ１３２４１における抗ＣＢＤ１力価が、２回目の免疫化後にプラトーに達したが、それぞれの中和活性は、２回目の免疫化と比較し、３回目の後でより高かった（図１３、表９）。
【０１９９】
マカク免疫血清の微細エピトープマッピング
キメラＴｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１ペプチドと比較し、遊離のＣＢＤ１及びＴｅｔペプチドを用いて免疫化されたマカクにおいて誘導された免疫体液性応答を特徴付けるために、免疫血清の反応性を、種々のＣＢＤ１関連ペプチドに対して試験した：ＣＢＤ１ペプチドのＣ末端部分に対応するＣ１３Ｋペプチド、ＨＩＶ−２におけるＣＢＤ１ペプチドホモログであるＣＢＤ２ペプチド、Ｎ及びＣ末端が改変されたアミノ酸残基内のカベオリン１結合モチーフとオーバーラップするアミノ酸配列を有する一連のペプチド、及びｇｐ４１の組換え調製物（図１４）。これらの試験によって、中和及び非中和マカク免疫血清の交差反応性プロファイルにおける主要な違いが明らかになった。実際に、非中和免疫血清（マカクＭ１３２４６及びＭ１３５１０）を、種々のオーバーラップペプチドｐ６３６２、ｐ６３６３、ｐ６３６４、ｐ６３６５、及びｐ９１２７並びに組換えｇｐ４１との強い交差反応性により、中和免疫血清（マカクＭ１１６３５、Ｍ１３４２１、Ｍ１３４５０、及びＭ１３２８４）から区別した。この広いスペクトルの交差反応性は特異的である。なぜなら、免疫血清のいずれもＣＢＤ２ペプチドと反応しなかったからである。これらの結果は、融合されたＴｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１ペプチドよりむしろ、遊離のＣＢＤ１及びＴｅｔペプチドの同時免疫化が、中和抗体の生成に有利に働くことを説明する。
【０２００】
ＣＢＤ１又はＴｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１免疫原に対して惹起された免疫血清でのＥＬＩＳＡにおける注目すべき違いは、ＣＢＤ１ペプチドの最後の１２残基と同一であるアミノ酸配列を有するＣ１３Ｋペプチドとの交差反応性である。図１５は、それぞれ遊離の及び融合されたＣＢＤ１ペプチドを用いて免疫化されたマカクＭ１１６３５及びＭ１３２８４における抗ＣＢＤ１及び抗Ｃ１３Ｋ抗体の産生の動態を示す。一貫して、Ｔｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１により誘導された抗体は、Ｃ１３Ｋペプチドと強く交差反応した。これらの抗Ｃ１３Ｋ反応性抗体は、抗ＣＢＤ１反応性抗体の産生と比較し、免疫化の期間中に遅い時間に生成された（図１５）。両方の免疫血清がＨＩＶ−１感染に対する中和活性を現したため、Ｃ１３Ｋとの交差反応性の有意性をさらに研究しなければならない。興味深いことに、高力価Ｃ１３Ｋ反応性抗体も、Ｔｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１を用いて免疫化されたウサギ、モルモット、及びマウスにおいて産生された（未発表の結果）。従って、Ｎ末端Ｔヘルパーエピトープの存在は、ＣＢＤ１ペプチドに対する最終的な免疫応答に有意に影響を与える。この後者は、キメラＴｅｔ−ＫＫ−ＣＢＤ１ペプチドに関連して提示される場合、ＣＢＤ１配列における代替ＨＬＡクラスＩＩアグレトープの生成により説明されうる。
【０２０１】
【表２２】
2012500829.tif 000024
【０２０２】
実施例１０  −  特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成することによるＣＢＤ１エピトープにおける複数のオーバーラップする中和決定基の存在の確認
中和抗体を誘導することができるペプチドワクチンは、部分的に、天然タンパク質における対応する領域の三次元構造を模倣する抗原エピトープの設計に依存しなくてはならない。
【０２０３】
Ｔヘルパーエピトープに融合されたＣＢＤ１ペプチド及びＣＢＭ由来ペプチドが、関連するＣＢＭ由来ペプチドと交差反応しないＨＩＶ中和抗体を誘発するという実証は、別々の及びオーバーラップする中和決定基の存在を示し、それらは恐らくはＣＢＤ１エピトープの動的立体構造の特徴の反映である。従って、ＣＢＤ１ペプチド及びＣＢＭ由来ペプチドは、天然ＨＩＶ−ｇｐ４１タンパク質におけるＣＢＤ１エピトープの動的構造により生成される別々の柔軟な立体構造を模倣する能力を有する。これに従い、ＣＢＤ１ペプチド及び異なるＣＢＭ由来ペプチドに対して惹起された中和免疫血清の混合物は、ＨＩＶ−１感染に対する相乗的な中和活性をもたらす（表７及び８）。結果的に、同時にいくつかの別々の立体構造決定基に対する抗体の反応性は、強い中和活性をもたらす。
【０２０４】
ＣＢＤ１エピトープにおけるオーバーラップする立体構造決定基の存在は、免疫原としてＣＢＤ１ペプチド並びに種々のＣＢＤ１及びＣＢＭ由来ペプチドを使用することによるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成により確認される。全体で、１９のｍＡｂが、異なる程度のＨＩＶ−１中和活性に基づき単離された。これらのｍＡｂは、種々のＣＢＤ１及びＣＢＭベースのペプチドとの交差反応性によって１１のサブグループに特徴付けられ、このように、ＣＢＤ１エピトープにおける別々の立体構造決定基の存在を説明する。
【０２０５】
マウスの４連続の免疫化を、ＣＢＤ１ペプチド、並びにＣＢＤ１及びＣＢＭ由来ペプチドを使用して行った。いくつかのモノクローナル抗体を単離し、ｇｐ４１中のカベオリン１結合ドメインの種々のオーバーラップセグメントを含む種々のペプチドとの反応性について特徴付けた。単離ｍＡｂを、ＣＢＤ１ペプチド並びに種々のＣＢＤ１及びＣＢＭベースのペプチドとの反応性に従って、１１の主なサブグループにグループ化することができる：ＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）、Ｃ１３Ｋ、ＣＢＤ２、ｐ６２、Ｃ１０Ｍ、Ｋ２７Ｍ、Ｋ２９Ｋ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２７Ｗ（Ｇ）、Ｋ３０Ｗ（Ｇ）、及びＫ２７Ｗ（表１０）。
【０２０６】
【表２３】
2012500829.tif 000025
【０２０７】
ＥＬＩＳＡにおける種々のペプチドＣＢＤ１（Ｃ１７Ｋ）、Ｃ１３Ｋ、ＣＢＤ２、ｐ６３６２、Ｃ１０Ｍ、Ｋ２７Ｍ、Ｋ２９Ｋ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２７Ｗ（Ｇ）、及びＫ３０Ｗ（Ｇ）との各ｍＡｂの反応性に基づき、決定基のペプチド配列を定義した（表１１）。所与の配列であるが、異なるペプチドにおける反応する異なるｍＡｂの能力は、同じ配列の別々の立体構造決定基との反応性を示す（表１１）。これらの１１のオーバーラップ決定基は以下である：ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ（３つの立体構造における）、ＩＷＮＮＭ（２つの立体構造における）、ＳＬＥＱＩＷＮＮＭ（３つの立体構造における）、ＩＷＮＮＭＴＷ（２つの立体構造における）、及びＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷ。
【０２０８】
【表２４】
2012500829.tif 000026
【０２０９】
ｍＡｂ  １．１．１、１．１．２、Ｅ５．４、Ｈ１８．１、８１．４、及びＵ．１３は、それぞれＣ１３Ｋ、ＣＢＤ２、Ｋ２９Ｋ、Ｋ２７Ｗの間で２つ、３つ、及び４つのペプチドとの反応性から推定された決定基ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫの３つの別々の立体構造と反応する。
【０２１０】
ｍＡｂ  ４．１、１６．２、及びＨ２１．３は、それぞれＣ１７Ｋ、Ｋ２７Ｍ、及びＣ１０Ｍの間で１つ、２つ、及び３つのペプチドとのそれらの反応性から推定された決定基ＳＬＥＱＩＷＮＮＭの３つの別々の立体構造と反応する。
【０２１１】
ｍＡｂ  ５Ｂ１５、６Ｂ９、及びＥ５．１は、それぞれＣ１７Ｋ、Ｃ１３Ｋ、Ｃ１０Ｍ、及びＫ２７Ｗ（Ｇ）の間で２つ及び４つのペプチドとの反応性から推定された決定基ＩＷＮＮＭの２つの別々の立体構造と反応する。
【０２１２】
ｍＡｂ  Ｎ．１．１、Ｎ１．３、及びＦ１．１、Ｆ１．３、Ｆ６．４、及びＨ３．１は、ペプチドＫ２７Ｗ（Ｇ）及びＫ３０Ｗ（Ｇ）のいずれか１つ又は両方とのそれらの反応性から推定された決定基ＩＷＮＮＭＴＷの２つの別々の立体構造と反応する。
【０２１３】
ｍＡｂ  ９．１は、Ｋ２７Ｗ又はＫ３０Ｗ（Ｇ）ペプチドとのその強い反応性から推定された別々の決定基ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷと反応する。
【０２１４】
ＣＢＤ１ペプチド並びにＣＢＤ１及びＣＢＭベースのキメラペプチドに対して惹起されたＨＩＶ中和ｍＡｂの単離によって、ＡＩＤＳワクチン製剤のための効率的なＢ細胞エピトープとしてのＣＢＤ１エピトープの重要性が指摘される。
【０２１５】
ｍＡｂの大部分が、初代ＣＤ４＋Ｔリンパ球培養物においてＨＩＶ−１  ＢＺ１６７感染を阻害する能力を有し、ＩＤ５０値は１００〜５００倍希釈の範囲である。図６に、ｍＡｂ  １．１．１、５Ｂ１５、６Ａ１４（Ｆ６．４ともいう）、及び６Ｂ９について得られた代表的な結果を示す。
【０２１６】
興味深いことに、ＣＢＤ１エピトープに対するｍＡｂは、ＨＩＶ−１ＬＴＲの制御下に細菌のｌａｃＺ遺伝子を含むＨｅＬａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−ｌａｃＺ細胞の単一サイクルのＨＩＶ感染を阻害する能力を有する（Nisole et al., 1999）。ＨＩＶ侵入のこの実験モデルにおいて、ｍＡｂの中和活性が１０〜１００倍希釈で観察された（図７）。同様の実験条件下で、ヒトｍＡｂ  ２Ｆ５が効果を有さなかったが、ｍＡｂ  ２Ｆ５がＣＤ４＋Ｔリンパ球において同じＨＩＶ−１単離株を阻害することに注意すべきである。ｍＡｂ  ２Ｆ５と比較し、抗ＣＢＤ１  ｍＡｂによるＨｅＬａ  Ｐ４細胞中へのＨＩＶ侵入の阻害におけるこの違いは、依然として明らかとなっていない。
【０２１７】
ＣＢＤ１、ＣＢＤ２、Ｃ１３Ｋ、及びｐ６３６２ペプチドに対する各ｍＡｂ調製物の力価を、図７におけるグラフの下に与える。本発明者らが種々の免疫血清を用いて観察していた通り、種々のｍＡｂの抗体の力価は、ＨＩＶ感染の阻害の程度に厳密に相関しない。この後者は、恐らくは、ＥＬＩＳＡアッセイによって、特定の立体構造（天然ｇｐ４１分子におけるＣＢＤ１エピトープの立体構造とわずかに異なりうる）を有しうる所与のペプチドとの反応性がモニターされるという事実に起因する。いずれの場合でも、ＣＢＤ２ペプチドとの反応性の欠如は、しばしば、ＨＩＶ感染に対するより低い阻害活性と相関する。ｍＡｂ  Ｋ２９Ｋ３−２−４を産生するハイブリドーマは、ＣＢＤ１ペプチドに対し特異的であるが、しかし、非常に低い力価のために選択された。このｍＡｂは、４０倍希釈でＨｅＬａ  Ｐ４モデルにおけるＨＩＶ−１侵入を阻害するのに対し、それは７５倍希釈でＴリンパ球におけるＨＩＶ感染を阻害する。
【０２１８】
実施例１１．ＡＩＤＳ患者における治療用ワクチンとしてのＣＢＤ１ペプチド、又はＣＢＤ１及びＣＢＭベースのペプチドの適用
非常に低い割合のＨＩＶ−１感染者だけが、低いＥＬＩＳＡ力価を伴うＣＢＤ１ペプチドに対する抗体を有することが過去に示された（Hovanessian et al., 2004b）。この目的のために、ジスルフィドループを含むｇｐ４１における免疫原性エピトープ（ペプチド６００〜６１２）及びｇｐ４１におけるカベオリン１結合ドメイン、即ち、ＣＢＤ１エピトープ（ペプチド６１８〜６３３）に対するＩｇＧ抗体の存在をＥＬＩＳＡにより試験した。ヒトＨＩＶ−１陽性及び陰性の血清を、１０００倍希釈で試験した。４５０nm±Ｓ．Ｄ．（括弧中）で測定されたＯＤ値の平均値を、各群（ｎ＝試験された血清の数）について与える。各アッセイでのカットオフ点を、各国からの３０人の非ＨＩＶ感染者からの血清を用いて決定した（Hovanessian et al., 2004b）。
【０２１９】
結果によって、ＨＩＶ−１感染者からの非常に低い割合の血清だけがＣＢＤ１ペプチドと弱く反応するのに対し、免疫優性エピトープ（ペプチド６００〜６０２）とのこれらの同じ血清の反応性が大きく上昇することが示された（表１２）。
【０２２０】
【表２５】
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【０２２１】
血清がｇｐ４１免疫優性ペプチド（ペプチド６００〜６１２）について全て高度に陽性である７５人のＨＩＶ−１陽性者の別の集団において、わずか２つの血清が、ＥＬＩＳＡにおいてＣＢＤ１ペプチド（Ｃ１７Ｋ）について陽性であることが見い出された。これらの２つの血清の精密エピトープマッピングを、種々のオーバーラップＣＢＤ１及びＣＢＭベースのペプチドを使用したＥＬＩＳＡにより行った（表１３）。
【０２２２】
これらの２つの血清を、ＣＢＤ１、ＣＢＤ２、ｐ６２、及びＣ１０Ｍペプチド並びにＣＢＤ１ベースのペプチド：Ｃ１３Ｋ、Ｋ２９Ｋ、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ２３Ｍ、及びＫ２７Ｍに対するＩｇＧ抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより試験した。これらの２つの血清の抗ＣＢＤ１ペプチド抗体の力価は、それぞれ６，４００及び１２，８００であった。各血清の力価は、ＥＬＩＳＡにおいてＯＤ値０．２を与える血清の希釈に対応した。結果を表１３に示す。
【０２２３】
【表２６】
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【０２２４】
結果は、ＣＢＤ１ペプチドについて陽性である２つの血清が、実際にそのＮ末端部分と反応することを示した。反応性は、保存されたカベオリン結合モチーフの種々のセグメントに対応するペプチドを用いて観察されなかった。
【０２２５】
これらの結果は、従って、ＨＩＶ−１感染者が、保存されたカベオリン１結合モチーフ（ＣＢＭ）（中和抗体の作用のためのＣＢＤ１エピトープにおける決定基である）に対して抗体を産生しないことを示す。ＨＩＶ−１感染者におけるＣＢＤ１エピトープに対する天然抗体の産生の欠如は、Ｎ６２５のＮ結合グリコシル化に起因しうるが（Johnson et al., 2001）、それは免疫応答の生成を妨げうる（Rudd et al., 2001）。
【０２２６】
ＣＢＤ１及びＣＢＤ１ベースのペプチドがマカクにおいて免疫原性を示し、中和抗体を産生するとの事実、及びいくつかの地域からのＨＩＶ−１感染者におけるＣＢＤ１エピトープに対する抗体の欠如から、ＣＢＤ１ベースのワクチンがＡＩＤＳ患者における治療用ワクチンとしての適用を有しうる。
【０２２７】
実施例１２  −  ＨＩＶ／ＡＩＤＳのためのワクチン候補としてのオーバーラップするＣＢＤ１ベースのペプチドの混合物の免疫原性及び有効性
実施例８（上）において、ＣＢＭベースのペプチドＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷ及びＩＷＮＮＭＴＷは、Ｔヘルパーエピトープに融合された場合、初代Ｔリンパ球培養物においてＨＩＶ−１感染を中和することが可能である高力価なＣＢＭ特異的抗体を誘導することにより免疫原性であることが示された。所与のペプチドに対して惹起された中和免疫血清は、関連するＣＢＭ由来ペプチドと交差反応せず、このように、ＣＢＤ１における別々の中和立体構造エピトープの存在を示唆する（表７）。ＣＢＤ１におけるいくつかの別々のオーバーラップエピトープの存在は、ＣＢＭ由来キメラペプチドに対して生成されたマウスモノクローナル抗体により確認された。
【０２２８】
これらの結果は、ＣＢＤ１が、ＨＩＶ−１に対する潜在的な中和抗体の標的を表すいくつかのオーバーラップＢ細胞エピトープを含むことを指摘する。これに従い、種々のペプチドに対して惹起された中和免疫血清の混合物は、ＨＩＶ−１感染に対する相乗的な中和活性をもたらす（表８）。免疫血清の混合物における特異的抗体が、ＣＢＭ内で同時に別々のエピトープと反応することにより強いＨＩＶ−１中和を発揮しうることが可能でありうる。それは、恐らくは、天然ＨＩＶ−ｇｐ４１タンパク質におけるＣＢＤ１の動的構造により生成される。
【０２２９】
従って、ＣＢＤ１及びＣＢＭ（カベオリン１結合モチーフ）ベースのペプチドは、ＨＩＶ−１のｇｐ４１におけるＣＢＤ１の別々の動的な立体構造を模倣し、このように、中和抗体の誘導を媒介する。このこと及びＣＢＤ１における別々のエピトープと反応する免疫血清の混合物により観察されるＨＩＶ中和における相乗作用が、ＣＢＭ由来ペプチドキメラのカクテルがＨＩＶ−ＡＩＤＳ感染に対する効率的な体液性免疫応答を誘発するために、候補ワクチン製剤として考慮すべきであることを示唆する。
【０２３０】
この実施例において、マウスにおけるそのようなカクテル−ワクチン製剤の免疫原性について着手されており、免疫原性及び有効性試験が、現在、ヒトでの使用のために許容可能なアジュバントを使用し、カニクイザルにおいて評価されている。
【０２３１】
Ａ．マウスにおけるＣＢＤ１ベースのカクテルペプチドの免疫原性
８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス（６〜８週齢）の２群を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用し、カクテルＡ及びカクテルＢペプチド（以下で記載する）を用いて免疫化した。４回の皮下注射が１ヶ月間隔で投与された。
【０２３２】
カクテルＡペプチド：Ｃ１７Ｋ  ＋  Ｋ２７Ｗ＋  Ｋ２４Ｗ  ＋  Ｋ３０Ｗ／Ｇ  ＋  Ｋ２７Ｗ／Ｇ（カクテル中の各ペプチドは８０μg／マウス／注射であった）
【０２３３】
【表２７】
2012500829.tif 000029
【０２３４】
カクテルＢペプチド：Ｋ２７Ｗ＋  Ｋ２４Ｗ  ＋  Ｋ３０Ｗ／Ｇ  ＋  Ｋ２７Ｗ／Ｇ（カクテル中の各ペプチドは８０μg／マウス／注射であった）
【０２３５】
【表２８】
2012500829.tif 000030
【０２３６】
Ｇａｇ２９８−３１２の配列を伴う：Ｋ−Ｒ−Ｗ−Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｎ−Ｋ−Ｉ−Ｖ−Ｒ−Ｍ−Ｙ（配列番号４）。
【０２３７】
Ａ．１．カクテルＡ及びカクテルＢペプチドを用いて免疫化されたマウスにおける体液性応答
４回目の免疫化から２週間後、免疫血清を、カクテルＡ及びカクテルＢペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験した。抗カクテルＡ及び抗カクテルＢ抗体の力価は、０．１に等しいＯＤ４５０nm値を与える免疫血清の逆希釈に対応する。ＥＬＩＳＡのための実験条件を、上の方法のポイント２．１に記載した。結果を表１４に提示する。マウスにおける個々のペプチドの免疫原性を、実施例８Ｂ及び表８に記載している。
【０２３８】
【表２９】
2012500829.tif 000031
【０２３９】
マウスの免疫血清におけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラス抗体の割合を、ヤギ抗マウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体（Sigma）を使用して決定した。個々のマウスにおいてそれぞれのカクテル免疫原に対するＥＬＩＳＡにより推定されるＩｇＧ２／ＩｇＧ１比は、＜０．０４であった。
【０２４０】
各群の個々のマウスの間で抗体価の程度にいくらかの変動性があったが、抗体価は大きく上昇し、１００，０００〜２，０００，０００の範囲であった。マウスの免疫血清におけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラス抗体の割合に関する試験によって、カクテルＡ及びカクテルＢペプチドに対して生成された免疫血清における抗体サブタイプは主にＩｇＧ１型であることが示され、その割合は種々の個々の免疫血清において＞９６%であった。Ｇａｇ  Ｔヘルパーエピトープは、免疫血清とＴヘルパーエピトープペプチドＧａｇ２９８−３１２との反応性の欠如により説明される通り、免疫原性でないことにも注意すべきである（示さず）。
【０２４１】
カクテルＡ又はカクテルＢのいずれかで一緒に投与された場合での個々のペプチドの免疫原性を次に研究した。この目的のために、４回目の免疫化から２週間後、マウスの各群における免疫血清を、個々のペプチド、即ち、Ｃ１７Ｋ、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ３０Ｗ／Ｇ、及びＫ２７Ｗ／Ｇペプチドに対するＥＬＩＳＡにより試験した（カクテルＡについては表１５及びカクテルＢについては表１６）。各ペプチドに対する抗体力価は、０．１に等しいＯＤ４５０nm値を与える免疫血清の逆希釈に対応する。ＥＬＩＳＡのための実験条件を、上の方法のポイント２．１に記載した。
【０２４２】
【表３０】
2012500829.tif 000032
【０２４３】
【表３１】
2012500829.tif 000033
【０２４４】
マウスを、カクテルＡペプチドを用いて免疫化した場合、それらは全て高力価な抗Ｃ１７Ｋ抗体を生成し、一方、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ３０Ｗ／Ｇ、及びＫ２７Ｗ／Ｇペプチドに対する抗体の産生は異なる個人の間で変動した（表１５）。これらの４つの後者のペプチドの内、１つのペプチドに対して高力価な抗体を産生する所与のマウスの能力は、他の３つのペプチドに対する体液性免疫応答を生成する能力と体系的に相関し、そのため、個々のペプチドのプロセシングが個々のマウスの間でわずかに異なりうることを示す。カクテルＢペプチドを用いて免疫化されたマウスにおいて、カクテルＢ（Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｋ３０Ｗ／Ｇ、Ｋ２７Ｗ／Ｇ）の個々のペプチドに対して高力価な抗体を生成するマウスナンバー２の免疫血清は、Ｃ１７Ｋペプチドと交差反応した（表１６）。一般的に、Ｋ２７Ｗ及びＫ２４Ｗペプチドは、カクテルＢで一緒に投与された場合、Ｋ３０Ｗ／Ｇ及びＫ２７Ｗ／Ｇペプチドよりも良好な免疫原であると思われた。
【０２４５】
それにもかかわらず、免疫血清とＫ３０Ｗ／Ｇ及びＫ２７Ｗ／Ｇペプチドとの低い反応性が、これらのペプチドの立体構造の結果でありうることに注意すべきである。最後に、表１４及び１５に提示する抗体価は、Ｃ１７Ｋペプチドの非存在下において、Ｋ３０Ｗ（Ｇ）及びＫ２７Ｗ（Ｇ）ペプチドに対するカクテルＢの投与により惹起された免疫応答が比較的弱いのに対し、Ｋ２４Ｗ及びＫ２７Ｗペプチドは依然として強い免疫原である。従って、カクテル免疫原におけるＣ１７Ｋペプチドの存在は、Ｋ３０Ｗ（Ｇ）及びＫ２７Ｗ（Ｇ）ペプチドに対する抗体応答に有利に働きうる。
【０２４６】
Ａ．２．カクテルＡ及びカクテルＢペプチドをそれぞれ用いて免疫化されたマウスの２群からのプール免疫血清のＨＩＶ−１中和活性
４回目の免疫化から２週間後、各群の免疫血清を集め、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の初代ＨＩＶ−１  ＢＺ１６７（クレードＢ）感染を阻害する能力についてアッセイした。ＨＩＶ−１の産生を、感染後５日目の培養上清においてＨＩＶ−１主要コアタンパク質ｐ２４の濃度を測定することによりモニターした（図１８）。カクテルＡ及びカクテルＢペプチドとのそれらの強い反応性と一致し（表１４）、いずれかのカクテルペプチドに対して惹起された免疫血清が中和抗体を誘発し、それらは用量依存的な様式でＨＩＶ−１感染を阻害した（図１８）。ＨＩＶ−１  ＢＺ１６７感染の５０%阻害（ＩＤ５０）を与えるカクテルＡ及びカクテルＢプール血清希釈を、それぞれ３００及び４００倍希釈と推定した。
【０２４７】
カクテルＡ及びカクテルＢ免疫化マウスからのプール血清の中和効果を、ＨＩＶ−１ワクチン候補を試験するために現在使用されるＨＩＶ−１単離株の国際パネルからのいくつかのＨＩＶ単離株を使用してさらに研究した：ＨＩＶ−１  ＫＮＨ１２０７（クレードＡ）、ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ（クレードＢ）、ＨＩＶ−１  ＵＳ１（ＧＳ  ００４；クレードＢ）、ＨＩＶ−１  ５６３１３（９８ＵＳ−ＰＳＣ５０１６；クレードＣ）、ＨＩＶ−１  ９８ＵＧ−５７１２８（クレードＤ）。カクテルＡ及びカクテルＢ免疫化マウスからのプール免疫血清は、これらの異なるＨＩＶ−１単離株によるＣＤ４＋Ｔリンパ球のウイルス感染を阻害し、ＩＤ５０値は１５０〜３５０倍希釈の範囲であった。ウイルス中和の例を、図１９Ａ及び１９Ｂにおいて、ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＨＩＶ−１  ＫＮＨ１２０７及びＨＩＶ−１  ＵＳ１感染に対して提示する。
【０２４８】
Ｂ．カニクイザルにおけるＣＢＤ１ベースのペプチドカクテルワクチン製剤の免疫原性及び有効性
ＣＢＤ１ベースのペプチドカクテルワクチン製剤の免疫原性及び有効性を、カニクイザルにおいて２相で評価した：
１．免疫化動物におけるカクテルワクチン製剤に対する体液性及び細胞性免疫応答をモニターすることによる；及び
２．ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を発現する複製能力のあるキメラサル／ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）免疫化動物を投与することによる。
【０２４９】
合計１２匹のマカクが、この試験において使用された：
−  免疫原及びアジュバントを用いて免疫化された６匹のマカク；
−  対照ＰＢＳ及びアジュバントを用いて注射された６匹の対照マカク；
【０２５０】
体重４〜６kgの成体雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、Ｍａｕｒｉｔｉｕｓ繁殖コロニーから輸入し、非ヒト霊長類ケア（ＥＥＣ指令Ｎ８６−６０９、１９８６年１１月２４日）のための欧州ガイドラインに従って維持し、扱った。動物を、免疫化及び血液サンプルの採取のためにケタミン・クロルハイドレート（１０〜１５mg/kg）を用いて鎮静させた。免疫化は、アジュバントとして［ＣｐＧ＋Montanide ISA  ５１］で構成される混合物を使用した免疫原カクテルの皮下注射により行った。各々の免疫化のために、１容積のアジュバント混合物と１容積の免疫原からなる５００μlを投与した。
【０２５１】
免疫原混合物のためのペプチドのカクテルは、以下であった：
【０２５２】
【表３２】
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【０２５３】
ペプチドを蒸留水中で４mg/mlで調製した（最初に、最終容積の１０%のＤＭＳＯを用いて可溶化）。次に、ペプチドを集め、６匹のマカクに皮下注射するために（５回の免疫化のために）、ＣＢＤ１カクテル免疫原において各ペプチドの正確な量を与えた。使用したアジュバントは、免疫増強剤［ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０３、５００μg/マカクで使用］を用いる送達系［Montanide ISA  ５０  ＶＧ、５０%で使用］で構成される混合物であった。
【０２５４】
２相の試験：
第Ｉ相において、マカクは、０、４、１０、１６、及び２２〜２６週目に５回の皮下注射を受け、血漿又は血清、及びＰＢＭＣを免疫化から２及び４週間（及び適用可能な場合は６週間）後に回収し、ＥＬＩＳＡにより抗体の力価を試験し、また、ＣＢＤ１エピトープ特異的ＩＦＮ−γ産生を、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを使用してモニターした。
【０２５５】
第ＩＩ相において、６匹のワクチン接種されたマカク及び６匹の対照マカクを、最後のワクチン追加免疫から８〜１０週間後にＨＩＶ−１Ｒ５エンベロープ糖タンパク質を発現するＳＨＩＶ１６２Ｐ４を用いて直腸内経路により投与した。
【０２５６】
サルでの抗原投与後の経過観察は、ウイルス抗原に対するセロコンバージョンを試験すること、血漿（定量ＲＴ−ＰＣＲによる）及び細胞性（ＰＢＭＣにおける定量ＰＣＲ−ＤＮＡ）ウイルス負荷をモニターすること、循環ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球をカウントすることを含む完全な血液学を含む。抗原投与後のＴ細胞免疫は、ＣＢＤ１ペプチドを用いた及びＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２７抗原を用いたＰＢＭＣの特定刺激に応答したＩＦＮ−γ及びＩＬ−４分泌を試験することによりモニターされうる。
【０２５７】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：
免疫化マカクにおけるＣＢＤ１ベースのペプチドに対する細胞性免疫応答を、示した日にサンプリングされたＰＢＭＣをＣＢＤ１ベースのペプチド（カクテル免疫原中）を用いて刺激することにより、先に記載した（上の方法のポイント２．５）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてモニターする。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのために試験されるペプチドは以下である：Ｃ１７Ｋ、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２４Ｗ、Ｇａｇ２９８−３１２：Ｋ−Ｒ−Ｗ−Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｎ−Ｋ−Ｉ−Ｖ−Ｒ−Ｍ−Ｙ（配列番号４）、ＴｅｔＡ８３０：Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ（配列番号２）及びｇｐ１２０４２１−４３６：Ｋ−Ｑ−Ｉ−Ｉ−Ｎ−Ｍ−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ａ−Ｍ−Ｙ−Ａ（配列番号３）（対照ペプチドとして）。
【０２５８】
Ｃ．種々のＴヘルパーエピトープを使用したＣＢＭ由来ペプチドのカクテル
Ｃ１３Ｋペプチド（ＣＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ）（配列番号３３）は、Ｃ１７Ｋペプチドのより短いバージョンであり、それ自体は種々の動物において免疫原性を示さない。しかし、ジリシンリンカーを使用してＴヘルパーエピトープペプチドと融合された場合、このＣ１３Ｋペプチドは免疫原性を示す。従って、ＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＤＫ配列（配列番号２３）に融合された、ＴヘルパーエピトープペプチドＴｅｔＡ８３０、ｇｐ１２０４２１−４３６、及びＧａｇ２９８−３１２でそれぞれ構成されるＡ３０Ｋ、Ｋ２９Ｋ、及びＫ３０Ｋキメラペプチドは、高力価のＨＩＶ−１中和抗体を誘導する（実施例８Ａ及び表５）。
【０２５９】
Ｔヘルパーエピトープペプチドのアミノ酸配列は以下：
１）破傷風毒素ＴｅｔＡ８３０ペプチド、ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２）；
２）ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０４２１−４３６ペプチド、ＫＱＩＩＮＭＷＱＶＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号３）；及び
３）ＨＩＶ−１  Ｇａｇ２９８−３１２ペプチド、ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ（配列番号４）
である。
【０２６０】
さらに、ＣＢＭベースのペプチドＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷ（配列番号５１）及びＩＷＮＮＭＴＷ（配列番号５０）がＧａｇ２９８−３１２Ｔヘルパーエピトープに融合された場合、初代Ｔリンパ球培養物においてＨＩＶ−１感染を中和することが可能である高力価のＣＢＭ特異的抗体を誘導する（実施例８）。結果的に、そのようなＣＢＭベースのペプチドＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷ及びＩＷＮＮＭＴＷは、最終的なＭＨＣ拘束を克服しうる免疫原を生成するために、ＴｅｔＡ８３０及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０４２１−４３６Ｔヘルパーエピトープでキメラペプチドを構築するためにも使用されうる。キメラＣＢＭベースのペプチドにおけるいくつかのＴヘルパーエピトープの使用は、ヒト被険者におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分を覆うために、考慮すべき重要なパラメータである。
【０２６１】
以下の相補的ペプチドは、ＨＩＶワクチンカクテル製剤中に含まれうるペプチドの例である。ＣＢＭベースのペプチドを有する共線形Ｔヘルパーエピトープは、上に記載する通りに、ジリシン（−ＫＫ−）リンカー及びＧＰＧＰＧスペーサーを使用して合成されうる：
【０２６２】
【表３３】
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【０２６３】
【表３４】
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【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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