(57)【要約】  本発明は、１つの分析システムにおいて、生物学的試料に６種のフィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）が存在することを同時に検出ことによって、癌の検出、又は癌の進行の監視のための方法、システム及びキットである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の癌を検出する方法であって、
被験者から生物学的試料を得る工程と、
前記生物学的試料を、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と反応させる工程と、
前記抗体−ＦＤＰ複合体を検出する工程と、
被験者の癌を診断する工程と、
を含むことを特徴とする被験者の癌を検出する方法。
【請求項２】
前記抗体調製剤は、
さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体調製剤は、
ポリクローナル抗体調製剤である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酵素免疫測定法を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記診断する工程は、
さらに少なくとも１つの追加の診断テストを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）第１のサンプリング時点で被験者から第１の生物学的試料を得る工程と、
（ｂ）前記第１のサンプリング時点後の第２のサンプリング時点で前記被験者から第２の生物学的試料を得る工程と、
（ｃ）前記生物学的試料を、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と反応させる工程と、
（ｄ）前記抗体−ＦＤＰ複合体を検出する工程と、
（ｅ）前記第１の生物学的試料におけるＦＤＰの濃度に対する前記第２の生物学的試料におけるＦＤＰの濃度の比を求める工程と、
（ｆ）癌が進行したかを決定する工程と、
を含み、
適宜、第１、第２の時点後の時点で得られた追加の生物学的試料に対して（ａ）から（ｅ）までの工程を繰り返す、
ことを特徴とする患者の癌を監視する方法。
【請求項７】
前記抗体調製剤は、
さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体調製剤は、
ポリクローナル抗体調製剤である、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記反応させる工程及び前記検出する工程は、
酵素免疫測定法を含む、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記比が１．１５以上の場合に、癌が進行したとする、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記比が１．１５未満の場合に、癌が退縮したか安定であるとする、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
被験者の癌を検出するキットであって、
フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と、
検出系と、
ＦＤＰの測定及びＦＤＰの存在を癌に関連付けるための説明書と、
を含むことを特徴とする被験者の癌を検出するキット。
【請求項１３】
前記検出系は、
フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に特異的な検出抗体を含む
ことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記抗体調製剤は、
さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する、
ことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記抗体及び前記検出系は、酵素免疫測定法を含む、
ことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に対する抗体群の産生方法及び産生物、及び該抗体群自体と該抗体群に関連する使用方法、及び癌の検出、並びに、血清中のＦＤＰを免疫化学的に定量して癌治療の進捗を監視することに広く関連する。
【背景技術】
【０００２】
近時、癌についての理解が進展しているにも関わらず、癌の検査と発見に関する現在の技術は、改良の余地を残している。当技術分野において、抗体を使用して癌に関係する抗原の検出を試みることが、癌の検査として既知の方法である。抗原は、タンパク質、核酸又は多糖類のような高分子であって、体内で免疫反応を生じさせる。哺乳類や他の動物の免疫系には、例えば、癌に関連する抗原のような外来の物質を検出する機能があって、抗体を産生することによって抗原に対応する。該抗体は、標的に特異的であって、癌関連抗原に反応する。したがって、動物の循環血液内から癌関連抗原又は抗原を標的とする血中抗体の検出を検出することと、その個体に癌が存在することとの間には強い関連がある。結果として、このような抗原又は抗体の存在を検出する試験は、癌の検査及び診断において有効である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
標的として期待できる癌関連抗原の１つに、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）の両方を含むプールがある。健康な個体では、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物の産生は、いずれも制限されるが、癌患者では、プラスミンやスロンビンのようなタンパク質分解酵素が癌細胞から放出された際に、ＦＤＰが過剰に産生される。また、ＦＤＰは、血管生成や転移のような癌関連の他の過程における副産物として産生される。腫瘍から周囲の体液にＦＤＰが漏洩するので、膀胱癌患者の尿中、肺癌患者の血清中、及びその他の癌患者の血漿又は血清中でＦＤＰ濃度の上昇が観測される。癌の診断においてＦＤＰを定量することの有用性は、長年疑問視されてきた。ＦＤＰを要求される感度で量的に測定できるほどに改良された分析法が開発されなかったからである。現在のＦＤＰの分析は、通常、特定のＦＤＰの構成要素の１つ、例えば、このグループを代表するＤ−２量体を測定することに限られる。
【０００４】
癌は、組織因子（ＴＦ）と、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物を生成するパスウェイを調節するウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を介して、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）の濃度をともに上昇させる（図１）。プラスミンによってフィブリノーゲンが分解されると、第１段階の最終生成物として断片Ｄ及びＥが生成される。スロンビンは、凝固カスケードからのシグナルに応答して、フィブリノーゲンをフィブリンに変換する。プラスミンによってフィブリンが分解されると、第１段階の最終生成物としてＤ−２量体が生成される。癌によって誘導されたプラスミンによる分解を介して産生されるＦＤＰの組成は、フィブリンとフィブリノーゲンという２つの基質の相対的な量に影響される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）の、必須の３種のタイプの断片（断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体）と、任意に追加される３種のタイプの断片（断片Ｙと互いに区別可能な２つの型の初期のプラスミンの消化産物−ＩＰＤＰ）と、を含む定義された混合物から、合計６種のＦＤＰ成分を同時に検出することを含む癌の検出方法がここで開示される。該方法は、特異的なポリクローナル抗体群で生物学的試料に含まれる３種の必須ＦＤＰ抗原を同時に検出することを含み、該ポリクローナル抗体は、３種のＦＤＰ断片に対して特異的である。
【０００６】
本開示の１つの実施形態では、被験者の癌を検出する方法が提供され、該方法は、被験者から生物学的試料を得る工程と、前記生物学的試料を、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と反応させる工程と、前記抗体−ＦＤＰ複合体を検出する工程と、被験者の癌を診断する工程と、を含む。他の実施形態では、前記抗体調製剤は、さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する。また、他の実施形態では、前記抗体調製剤は、ポリクローナル抗体調製剤である。
【０００７】
他の実施形態では、該方法は、酵素免疫測定法を含む。
【０００８】
他の実施形態では、診断工程は、さらに少なくとも１つの追加の診断テストを含む。
【０００９】
本開示における１つの実施形態では、患者の癌を監視する方法が提供され、該方法は、（ａ）第１のサンプリング時点で被験者から第１の生物学的試料を得る工程と、（ｂ）前記第１のサンプリング時点後の第２のサンプリング時点で前記被験者から第２の生物学的試料を得る工程と、（ｃ）前記生物学的試料を、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と反応させる工程と、（ｄ）前記抗体−ＦＤＰ複合体を検出する工程と、（ｅ）前記第１の生物学的試料におけるＦＤＰの濃度に対する前記第２の生物学的試料におけるＦＤＰの濃度の比を求める工程と、（ｆ）癌が進行したかを決定する工程と、を含み、適宜、第１、第２の時点後の時点で得られた追加の生物学的試料に対して（ａ）から（ｅ）までの工程を繰り返す。
【００１０】
他の実施形態では、前記抗体調製剤は、さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する。また、他の実施形態では、前記抗体調製剤は、ポリクローナル抗体調製剤である。
【００１１】
他の実施形態では、該方法は、酵素免疫測定法を含む。
【００１２】
他の実施形態では、前記比が１．１５以上の場合に、癌が進行したとする。また、他の実施形態では、前記比が１．１５未満の場合に、癌が退縮したか安定であるとする。
【００１３】
本開示の１つの実施形態では、被験者の癌を検出するキットが提供され、該キットは、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と、検出系と、ＦＤＰの測定及びＦＤＰの存在を癌に関連付けるための説明書と、を含む。
【００１４】
他の実施形態では、前記検出系は、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に特異的な検出抗体を含む。また、他の実施形態では、前記抗体調製剤は、さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する。
【００１５】
他の実施形態では、前記抗体及び前記検出系は、酵素免疫測定法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、癌で誘導されるフィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）の産生を説明するための略図を示す。
【図２】図２は、ＦＤＰ免疫原ロット（０３、１３、１５、１７、１９、２１、２４及び２５の８ロット）の非還元（図２Ａ）及び還元（図２Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ＵＤは、非分解フィブリノーゲンを示し、Ｄは断片Ｄを示し、Ｅは断片Ｅを示す。
【図３】図３は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者（ｎ＝５）及び標準対照血清（ｎ＝５）由来のヒト血清試料（図３Ａはフィルムに約５秒間露光したもので、図３Ｂはフィルムに約３０秒間露光したものである）に対する抗ＦＤＰ抗体の結合のウェスタンブロット解析を示す。図３Ｃは、レーンごとに負荷されたタンパク質の総量を表す付随的なゲルのクマシーブルー染色を示す。ＦＤＰのサブタイプの位置は、ゲル上に示されている。
【図４】図４は、抗ＦＤＰポリクローナル抗体群（＋）とウサギＩｇＧ（−）結合ビーズを用いたヒト血清（通常及びＣＲＣ患者）における抗原の免疫沈降（ＩＰ）を示す。３つの試料、ＦＤＰ較正対照（ＦＤＰ）、健常ヒト血清（Ｎ４）及びＣＲＣ血清（Ｃ１５）が試験された。
【図５】図５は、抗ＦＤＰポリクローナル抗体群（図５Ａ）又はウサギＩｇＧ（対照）結合ビーズ（図５Ｂ）を用いた、５人のＣＲＣ患者及び５人の通常患者における免疫沈降されたＦＤＰ抗原を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）の検出は、多くの癌において、有用な臨床検査ツールとなり得る。ＦＤＰの濃度は、癌の発生、ステージ、進行、予後に相関する。現在のＦＤＰの分析は、通常は１種の特定のＦＤＰ成分、例えば、このグループの代表的なものであるＤ−２量体の測定に限られる。これに対し、ＦＤＰの有無又は濃度に癌の有無又は癌の進行がそれぞれ関連するので、本発明者は、複数のフィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物が同時に測定されるべきであると考えた。本開示の目的において、「癌の進行」という用語は、患者における癌の進行、退縮又は再発を含む。ここで開示される分析は、少なくとも３種のＦＤＰ抗原を特異的に認識する抗体調製剤を用い、該抗体調製剤は、癌の進行の検出と監視に特に有用である。これら３種の必須のＦＤＰは、Ｄ断片、Ｅ断片及びＤ−２量体（Ｘ断片としても知られる）である。癌を検出及び監視するために有用な追加的な３種のＦＤＰは、配列で同定される２種の初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）と断片Ｙである。本方法のある実施形態では、３種の必須のＦＤＰ抗原は、１つの分析でほぼ同時に検出される。他の実施形態では、４種、５種、又は６種のＦＤＰ抗原が同じ分析で同時に検出される。
【００１８】
ある実施形態では、開示された分析は、断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体を測定する。他の実施形態では、開示された分析は、断片Ｄ、断片Ｅ、Ｄ−２量体及び１種又は２種のＩＰＤＰを測定する。また、別の実施形態では、開示された分析は、断片Ｄ、断片Ｅ及び断片Ｙを測定する。さらに、別の実施形態では、開示された分析は、断片Ｄ、断片Ｅ、Ｄ−２量体、断片Ｙ及び１種又は２種のＩＰＤＰを測定する。
【００１９】
免疫測定法は、当技術分野でよく知られており、ここで開示されるアフィニティー精製した抗ＦＤＰ抗体は、種々の分析法で用いられ、該分析法は、これらに限定されないが、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットまたはスロットプロット、セファロースビーズ捕集系又は様々な迅速試験法、例えば、側方流動系又は流水系である。
【００２０】
ここで説明される方法の特別な特徴の１つは、捕捉及び／又は検出抗体が、３種、４種、５種又は６種のＦＤＰ抗原に特異的に結合できることである。抗体調製剤は、複数の抗体特異性を備えているので、ここでは、抗体調製剤を抗体群という。ある実施形態では、抗体調製剤は、３種、４種、５種又は６種のＦＤＰ抗原種を含む免疫原に対するポリクローナル抗体調製剤である。ポリクローナル抗体は、様々な生物種において生成され、その生物種は、これらに限定されないが、ウサギ、ヤギ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ニワトリ又はサメを含む。他の実施形態では、３種、４種、５種又は６種のＦＤＰ抗原に対して生成された抗体調製剤は、個々に調製され、混ぜ合わされて抗ＦＤＰ抗体群を形成する。
【００２１】
さらに、他の実施形態では、抗体調製剤は、モノクローナル、単一の特異的なポリクローナル、キメラ又はヒト化抗体又は抗体断片の群を含むことができ、該抗体群が１回の分析でほぼ同時に３種、４種、５種又は６種のＦＤＰ抗原と反応できる限り、各抗体は６種のＦＤＰ抗原のうち１種以上に反応する。このような抗体の調製液は、当技術分野でよく知られており、本明細書では、詳細には説明しない。
【００２２】
本開示は、ＦＤＰへの結合及び被験者における癌の存在又は進行を検出、あるいは監視するためのシステム及びキットも含む。１つの実施形態では、システムは、抗体群及び生物学的試料に含まれる３種、４種、５種又は６種のＦＤＰに結合し、検出し、被験者における癌の存在又は進行と３種、４種、５種又は６種のＦＤＰの存在とを関連付けるための検出試薬を含む。
【００２３】
１つの実施形態では、キットは、抗体群及び生物学的試料に含まれる３種、４種、５種又は６種のＦＤＰに結合し、検出し、被験者における癌の存在又は進行と３種、４種、５種又は６種のＦＤＰの存在とを関連付けるための検出試薬を含む。他の実施形態では、キットは、パッケージ又は容器に次の中から１つ又は複数のものを含むことができる。（１）生物学的試料からＦＤＰを捕捉するために３種、４種、５種又は６種のＦＤＰに結合する１つ又は複数の抗体群、（２）検出抗体、（３）（ａ）抗体群又は（ｂ）検出抗体の少なくとも１つを固定化するための固体支持体、（４）検出試薬、（５）洗浄液、及び（６）キットの構成品と生物学的試料を用いた分析を行うための説明書。構成品（１）から（６）の２つ以上が同じ容器に入った実施形態も用いられる。
【００２４】
キットが提供される場合、異なる試薬が別個の容器に梱包され、使用前に直接混ぜられたり、固体支持体に付着されたりしてもよい。このように構成品を別々に梱包することは、構成品の機能の強さを損なわずに長期間の保存を可能にする。
【００２５】
特定のキットに含まれる組成物は、これら種々の組成物の状態が維持され、容器の物質によって吸収されない、又は変化させられないような容器で提供される。
【００２６】
上述したように、キットは教材とともに提供されてもよい。説明書は、紙又はその他の媒体に印刷され、及び／又は、電子的に読み込み可能な媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、録音テープ、フラッシュメモリ装置などで提供されてもよい。詳細な説明は、キットに物理的に付属させられないので、使用者がキットの製造者又は代理店によって指定されるインターネットのウェブサイトを見るか、電子メールで提供される。
【００２７】
また、特許請求される方法は、システム及びキットは、様々な供給源由来の生物学的試料に含まれる癌関連ＦＤＰを検出するために用いられ、該供給源は、これらに限定されないが、血清、血液、血漿、唾液、痰、尿、腹水、腫瘍組織、脳脊髄液、膣又は直腸の分泌物、及び涙液を含む。
【００２８】
癌の検査に上記分析方法を用いた場合、各研究室は、地域個体群の検討に基づく各自の通常及び異常な範囲を決定しなければならない。実施例１１は、健常者と癌患者試料の典型的な分布を提供する。癌を有することが疑われる患者由来の生物学的試料に含まれるＦＤＰの濃度は、癌の存在に相関し、これは、あらかじめ決められた数値に基づいて通常の範囲を超える試料を同定することによる。
【００２９】
癌と診断された患者の監視に上記分析方法を用いた場合、ＦＤＰの濃度の評価よりも基準値が先に決められるべきである。最初の血清で得られるＦＤＰの値は、基準値となる。次に続く血清で得られる値は、次の比（Ｒ）を算出することで評価される。なお、式中のａは最初のＦＤＰの値、ｂは現在のＦＤＰの値である。
Ｒ  ＝  ｂ／ａ
基準のＦＤＰの値に対する現在のＦＤＰの値の比が１．１５より大きい場合、患者は、疾患の進行が予想されるが、ＦＤＰ抗原試験の結果は、これら癌患者における疾患の進行を監視するための標準的な他の臨床的な方法と併用されるべきである。
【実施例】
【００３０】
実施例で引用される利用可能な市販の試薬は、特に指定がない限り、製造者の説明書に従って用いられた。
【００３１】
（実施例１）
ＦＤＰ免疫原の調製
ＦＤＰ免疫原は、フィブリンとフィブリノーゲンの両方を含む精製されたヒトフィブリノーゲンを購入することで準備された。なお、この説明において、フィブリンとフィブリノーゲンをフィブリン／ノーゲン（ｆｉｂｒｉｎ／ｏｇｅｎ）と表記する。そして、フィブリン／ノーゲンは、HaverkateとTimanの方法（Thromb. Res. 10: 803-812, 1977）によってフィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）を形成するために、プラスミンと反応させられた。フィブリン／ノーゲンのプラスミン分解は、特定の時間だけ反応を行うことによって調節し、プロテアーゼ阻害剤のカクテルで反応を停止した。
【００３２】
特に、次の方法が用いられた。５０ｍｌの円錐管を用いて、２０ｍｌのＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ  塩化ナトリウムと２０ｍＭ  塩化カルシウムを含む５ｍＭ  ３−（Ｎ−モルフォリーノ）プロパン−スルホン酸、ｐＨ７．４）は、溶液が３７℃に達するまで３７℃のインキュベータで保温され（約２０−２５分）、精製されたヒトのフィブリン／ノーゲンが暖められたＭＯＰＳ緩衝液に加えられ、溶けるまで３７℃で撹拌された。１ｍｌのｐＨ７．４のＰＢＳがプラスミンを活性化するために加えられ、５ユニットのプラスミンがＭＯＰＳ溶液のフィブリン／ノーゲンに加えられた。そして、この混合液が、３時間、３７℃のインキュベータで撹拌された。分解されたＦＤＰは、撹拌機から回収され、２００μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルが加えられ、溶液が十分に混合された。次に、濃縮された保存用のＦＤＰ溶液の総タンパク質の濃度が測定され、変性及び還元状態下で４−２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥでＦＤＰ分解産物の証拠が検証された（図２参照）。得られたＦＤＰ溶液は、−４０℃で保存された。
【００３３】
また、このＦＤＰ免疫原は、抗体の免疫親和性による精製及びＦＤＰ較正、ＦＤＰ検出系における対照としても用いられた。
【００３４】
（実施例２）
ウサギ抗ＦＤＰ抗体の生成
ウサギは、実施例１に従って調製されたＦＤＰ免疫原で免疫された。各ウサギは、一次免疫付与として、１ｍｇの免疫原を含む１．０から１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水と同量の完全フロイントアジュバントとを含む乳剤を注射された。注射後３週で、各ウサギは採血され、血清についてＦＤＰに対する抗体が分析された。採血から１週で、１ｍｇの免疫原を含む１．０から１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水と同量の非完全フロイントアジュバントとを含む乳剤に注射によって、追加免疫が各ウサギに与えられた。ウサギは、追加免疫の予定にしたがって飼育され、生存できなくなるまで採血された。
【００３５】
免疫付与後、様々な時間間隔で得られたウサギの血清は、９６穴プレートシステムを用いた標準的な力価分析を行うことによって、ＦＤＰに対する抗体の濃度について分析された。血清の典型的な力価分析では、１０μｇの免疫原が９６穴マイクロタイタープレートの穴に固定され、ＦＢＳでブロックされ、さらに、様々なウサギ血清の１：１希釈系列で反応され、洗浄され、ヤギ抗ウサギ抗体（シグマ）と組み合わせた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で検出され、洗浄され、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液とともに保温され、停止液が加えられ、ＯＤ４５０ｎｍの値が測定された。力価は、希釈係数に対してＯＤ４５０ｎｍの値をグラフ化し、そして、曲線の変曲点を決定することによって求められた。
【００３６】
ウサギ抗ＦＤＰ抗体は、実施例６のように免疫親和性によって精製された。
【００３７】
（実施例３）
ニワトリ抗ＦＤＰ抗体の生成
ニワトリは、実施例１に従って調製されたＦＤＰ免疫原で免疫された。各ニワトリは、一次免疫付与として、１ｍｇの免疫原を含む１．０から１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水と同量の完全フロイントアジュバントとを含む乳剤を注射された（０日目）。各ニワトリは、３５、５６、７７及び９８日目に追加の免疫付与を受けた。ニワトリは、２６、４０、６０、８１及び１００日目に採血された（血清の収集）。血清の反応試験は４５日目に開始された。最初のＩｇＹの回収は、５３日目に行った。最初の親和性による精製は、５６日目に開始した。
【００３８】
免疫付与後、様々な時間間隔で得られたニワトリの血清は、９６穴プレートシステムを用いた標準的な力価分析を行うことによって、ＦＤＰに対する抗体の濃度について評価された。ニワトリ抗ＦＤＰ  ＩｇＹ抗体のサブセットは、分析の事前にＨＲＰと結合させた。血清の典型的な力価分析では、１０μｇの免疫原が９６穴マイクロタイタープレートの穴に固定され、ＦＢＳでブロックされ、さらに、様々なウサギ血清の１：１希釈系列で反応され、洗浄され、ＴＭＢ溶液と保温され、停止液が加えられ、ＯＤ４５０ｎｍの値が測定された。力価は、希釈係数に対してＯＤ４５０ｎｍの値をグラフ化し、そして、曲線の変曲点を決定することによって求められた。
【００３９】
ニワトリ抗ＦＤＰ抗体は、実施例６のように免疫親和性によって精製された。
【００４０】
（実施例４）
ヤギ抗ＦＤＰ抗体の生成
ヤギは、実施例１に従って調製されたＦＤＰ免疫原で免疫された。各ヤギは、一次免疫付与として、１ｍｇの免疫原を含む１．０から１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水と同量の完全フロイントアジュバントとを含む乳剤を注射された。注射後３週で、各ヤギは採血され、血清についてＦＤＰに対する抗体が分析された。採血から１週で、１ｍｇの免疫原を含む１．０から１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水と同量の非完全フロイントアジュバントとを含む乳剤に注射によって、追加免疫が各ヤギに与えられた。ヤギは、生存できなくなるまで、追加免疫と採血の計画にしたがって飼育された。
【００４１】
免疫付与後、様々な時間間隔で得られたヤギの血清は、９６穴プレートシステムを用いた標準的な力価分析を行うことによって、ＦＤＰに対する抗体の濃度について評価された。血清の典型的な力価分析では、１０μｇの免疫原が９６穴マイクロタイタープレートの穴に固定され、ＦＢＳでブロックされ、さらに、様々なヤギ血清の１：１希釈系列で反応され、洗浄され、ウサギ抗ヤギ抗体（シグマ）と組み合わせたＨＲＰで検出され、洗浄され、ＴＭＢ溶液と保温され、停止液が加えられ、ＯＤ４５０ｎｍの値が測定された。力価は、希釈係数に対してＯＤ４５０ｎｍの値をグラフ化し、そして、曲線の変曲点を決定することによって求められた。
【００４２】
ヤギ抗ＦＤＰ抗体は、実施例６のように免疫親和性で精製された。
【００４３】
（実施例５）
セファロースＣＬ  ４Ｂに結合したＦＤＰの調製
過ヨウ素酸酸化セファロース  ＣＬ  ４Ｂ（２０ｍｌ）がセファロースゲルの体積の１０倍のｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄された（例えば、２０ｍｌのセファロースゲルの１０倍は２００ｍｌ相当）。洗浄され、排水されたセファロース  ＣＬ  ４Ｂは、２０ｍｌ（１ゲルの体積）のプールされたＦＤＰ抗原（ＭＯＰＳ中のＦＤＰ、実施例１参照）の２．０ｍｇ／ｍｌ溶液と混ぜられた。
【００４４】
３．５ｍｌ（ゲルの体積の１／６）の０．１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム脱イオン（ＤＩ）水溶液がこの懸濁液に加えられ、該懸濁液は１６−２０時間、室温で振動された。そして、４０ｍｌ（ゲルの体積の２倍）の０．１ＭグリシンとｐＨ７．５のＰＢＳに溶解した０．１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液が懸濁液に加えられ、該懸濁液は継続的に室温でさらに２時間撹拌された。ＦＤＰが結合したセファロースＣＬ−４Ｂゲルは、１５分間脱気され、クロマトグラフカラムに重力流によって充填された。ゲルは、連続して次の溶液で洗浄された：ＤＩ水（ゲルの体積の１０倍）、ｐＨ７．５のＰＢＳ（ゲルの体積の１０倍）、ＰＢＳに溶解した０．５Ｍ塩化ナトリウム（ゲルの体積の１０倍）／ｐＨ３の０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ゲルの体積の１０倍）、ｐＨ７．５のＰＢＳ（ゲルの体積の１０倍）。使用しないときは、ゲルは、１週間までは、ＰＢＳに溶解した０．１％アジ化ナトリウムに４℃で保存された。
【００４５】
（実施例６）
ＦＤＰに対するポリクローナル抗体の免疫親和性による精製
ポリクローナル抗血清は、実施例５のように調製されたＦＤＰと結合したセファロース  ＣＬ  ４Ｂゲルカラムに流す前に０．２μｍシリンジフィルタでろ過された。ろ過されたポリクローナル抗血清が加えられ、その体積は、ゲルの体積（１ゲルの体積）とほぼ同じだった。ポリクローナル抗血清が加えられた後、ＦＤＰと結合したセファロース  ＣＬ  ４Ｂゲルカラムは再度ＰＢＳ（ゲルの５倍の体積）、ＰＢＳに溶解した０．５Ｍ塩化ナトリウム（ゲルの５倍の体積）溶液で洗浄された。カラムのＦＤＰに結合した免疫親和性によって精製された抗ＦＤＰ抗体が０．１Ｍ酢酸ナトリウム／ｐＨ３の０．１５Ｍ塩化ナトリウムで溶出された。溶離液は、監視のために画分チューブに集められ、後でタンパク質の濃度（ＯＤ２８０ｎｍが０．２より大きい）が検出された画分は、長期保存のためにＰＥＴＧボトルに移された。得られた抗体溶液のｐＨは、ｐＨ８．５の１Ｍトリス緩衝液を加えることによって中性にされた。
【００４６】
（実施例７）
ＦＤＰに対するウサギポリクローナル抗体の特性評価
実施形態では、捕捉抗体は親和性によって精製された、ＦＤＰに対するポリクローナルウサギ抗体である。ウサギは免疫付与され、抗体は実施例３のように単離された。
【００４７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、親和性によって精製された抗体の高い純度を示した。非還元の抗ＦＤＰ調製液における主要なタンパク質のバンドは、約１５２ｋＤａの分子量であって、それは、ウサギＩｇＧの分子量に一致する。還元条件では、１５２ｋＤａのタンパク質のバンドは消失し、同時に、約５９ｋＤａと３０ｋＤａの２つのタンパク質のバンドが現れ、それらは、それぞれＩｇＧの重鎖と軽鎖の分子量に近かった。したがって、抗ＦＤＰ抗体は、主にＩｇＧであって、ＩｇＭ（約９００ｋＤａの分子量）でもＩｇＡ（約３２０ｋＤａの２量体）でもない。親和性によって精製されたＦＤＰ抗体群の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、定性的に約９０％と見積もられた。
【００４８】
ＦＤＰ抗原への抗ＦＤＰ抗体の結合は、典型的なラングミュア吸着等温線に従う。このデータから、二重逆数プロットを用いて、抗体の結合定数が１．２５×１０−９Ｍと計算された。抗体調製剤は、ポリクローナルを元にしたため、本研究で得られた結合定数は、複合の結合定数、例えば、異なるクローンによって産生された抗体が寄与する結合定数の平均であった。
【００４９】
捕捉及び検出抗体は、いずれかのＥＬＩＳＡに基づく試験の特異性を保証する。ＦＤＰ抗体群がヒト血清試料でＦＤＰを捕捉することを確認するために、ＦＤＰ抗体群は、両方のウェスタンブロット（図３）と免疫沈降（ＩＰ）実験（図４と図５と表２）でヒト血清試料と交差反応された。加えて、ＦＤＰ抗体群によって免疫沈降されたタンパク質は、配列が決定され、質量分析を用いて同定された。
【００５０】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）と標準対照患者双方由来のヒト血清試料のウェスタンブロット分析が、ヒト血清におけるＦＤＰ抗原の数とその推定の分子量を決定するために用いられた。図３Ａ及び図３Ｂは、それぞれ５秒間及び３０秒間フィルムに露光させた同一ゲルのウェスタンブロットを示す。図３Ｃは、対応するクマシー染色ゲルを示す。図３では、ＣＲＣ血清試料において６種の主なＦＤＰ抗原が検出され、推定された分子量は、３４０、２６０−３２０、２２０、１５０、８０及び５０ｋＤａであった。これらのバンドは、非分解フィブリノーゲン、初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）、Ｄ−２量体断片／断片Ｘ、断片Ｙ、断片Ｄ及び断片Ｅに対応する。これに対して、約２２０ｋＤａで１つの主なバンドのみが標準対照血清で検出された。試験されたすべての血清試料について、標準対照由来よりもＣＲＣ患者由来の血清試料の反応の強度が十分に大きかった。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
表１に示したように、６種のＦＤＰ成分すべての平均シグナル密度は、５人の標準対照患者由来よりも５人のＣＲＣ患者由来の血清試料で有意に高かった（ｐ値≦０．０００００００５）。ウェスタンブロット（図３Ａ）における交差反応レベルの濃度測定解析は、シオン画像濃度ソフトウェア（シオン社）を用いた。抗ＦＤＰ群が個々のＦＤＰ濃度に基づいて癌と標準血清試料とを識別できることを図１は示している。
【００５３】
ヒト血清試料から捕捉されるＦＤＰ抗原の数と大きさを確認するために、セファロースビーズに結合したウサギ抗ＦＤＰ  ＩｇＧと対照ウサギＩｇＧのいずれか一方を用いて免疫沈降実験が行われた（図４及び５）。免疫沈降もＦＤＰ抗原を濃縮し、それらはクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで配列決定された。
【００５４】
製造者の説明書に従ってＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）Hz Immunoaffinity Kit（BIO-RAD社）を用いて、ウサギ抗ＦＤＰ  ＩｇＧ又は対照ウサギＩｇＧ抗体が、ＩｇＧの重鎖のＦｃ部分における保存された糖鎖部分を介してセファロースビーズに共有結合された。ヒト血清試料が無作為に選択され、ｐＨ７．４のＰＢＳで１番から１０番まで溶出された。溶出された血清試料は、抗ＦＤＰ結合ビーズ又は対照ウサギＩｇＧ結合ビーズのいずれか一方と保温された。さらに、２つのタイプのビーズが、調製されたＦＤＰの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液と保温され、ＩＰ反応に対する陽性対照とされた。溶出された血清と対照ウサギＩｇＧ結合ビーズとのＩＰ反応は、非特異的なウサギＩｇＧと血清抗原との偽陽性反応を認識するための対照とされた。ＩＰ反応は、回転装置において４℃に保温下、一晩行われた。ＩＰビーズは、ＰＢＳで５回洗浄され、抗原が、９５℃で８分間、非還元ラエムリ試料緩衝液において抽出された。そして、抗ＦＤＰ及び対照ウサギＩｇＧビーズから抽出された抗原は、４−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで行われた。図４は、２つの代表的な血清試料、標準患者４由来のＮ４及び結腸直腸癌患者１５由来のＣ１５に対する実験条件のすべてを示している。図５Ａ及び５Ｂは、ＩＰ分析における追加された５人の標準及び追加された５人の結腸直腸癌患者を示すことによってＩＰ反応の再現性を示している。
【００５５】
図４に示されたＩＰ実験の結果は、４種の主なＦＤＰ特異的抗原と１つの非特異的抗原とが抗ＦＤＰビーズ（＋）によって結腸直腸癌患者の血清から捕捉されたことを示す。この試料（Ｃ１５（＋）、右から２番目のレーン）から、４種の主なＦＤＰ特異的抗原の推定される分子量（ＭＷ）は、降順でそれぞれ３４０、３００、２２０、及び５０ｋＤａである。このレーンの１つの非特異的抗原は、約２５ｋＤａである。また、血清試料における対照レーンＮ４（−）及びＣ１５（−）（右から３番目と５番目のレーン）は２５ｋＤａのタンパク質との反応を示し、該タンパク質は、Ｎ４＋及びＣ１５（＋）（右から２番目と４番目のレーン）に示すように抗ＦＤＰビーズ（＋）に暴露されたＮ４及びＣ１５試料における２５ｋＤａのタンパク質に対応する。これらＮ４（−）、Ｎ４（＋）、Ｃ１５（−）、Ｃ１５（＋）のレーン全てにおける２５ｋＤａのタンパク質の存在は、血清試料とＩｇＧ結合ビーズのいずれかとの非特異的な相互作用のＩＰ反応から２５ｋＤａのタンパク質が抽出されたことを裏付ける。ＩＰ分析における陽性対照反応は指定されたＦＤＰ（−）とＦＤＰ（＋）（左から６番目と７番目のレーン）である。ビーズ対照レーン（ＦＤＰ（−））は、血清が関与しないＦＤＰ較正溶液と陰性対照ビーズとの相互作用を示さなかった。ＦＤＰ（＋）反応は、１つの小さいバンドと３つの大きいバンドを含む。１つの小さいバンドの推定分子量は、３４０ｋＤａであって、これは、非分解フィブリノーゲンの分子量に一致する。ＦＤＰ対照抗原溶液における３種の主なＦＤＰ特異的抗原の推定分子量は、２２０ｋＤａ（フィブリノーゲンの断片Ｘ又はＤ−２量体の分子量に一致）、８０ｋＤａ（フィブリノーゲンの断片Ｄ単量体の分子量に一致）及び５０ｋＤａ（フィブリノーゲンの断片Ｅ単量体に一致）である。抗ＦＤＰビーズは、結腸直腸癌患者のヒト血清から４種の主要なＦＤＰ抗原を捕捉した。一方、標準血清においては、同じビーズが約５３ｋＤａの１つの少ない（かすかなバンド）抗原を示した。ヒト血清試料（及びＦＤＰ）のＩＰ反応における抗ＦＤＰビーズと対照ビーズとを比較すれば、抗ＦＤＰ抗体群の特異性を確認できる。
【００５６】
図５は、ＦＤＰ抗原のパターンが複数の患者試料の間で再現性があることを示す。この実験において、追加の５人のＣＲＣ及び５人の標準患者（臨床試験試料から無作為に選択）由来の血清がそれぞれ、対照ウサギＩｇＧ及び抗ＦＤＰビーズ両方との免疫沈降反応で試験された。加えて、ＦＤＰ免疫抗原（較正溶液）が２つのタイプのビーズで試験された。図５ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＦＤＰ（陽性対照）、ＣＲＣ患者血清試料、及び標準血清試料由来の抽出されたＦＤＰ特異的抗原を含む。図５Ｂに示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥは、図５Ａと同じ順番の同じ試料からの対照ウサギＩｇＧビーズに結合している抗原を示す。
【００５７】
図５に示された実験は、ヒト血清中に４種の主なＦＤＰ特異的抗原、及び２５ｋＤａの１つの非特異的抗原があることを確認する。図５Ａでは、ＦＤＰ対照レーンは、調整された条件下でin vitroでフィブリンの及びフィブリノーゲンのプラスミン分解から得られ、３つの主なバンドと１つの薄いバンドとを含む。非還元試料のおおよその分子量に基づいて、主要なバンドは、ＦＤＰ対照試料からＦＤＰ抗体群によって捕捉され、相対的な分子量の降順で、フィブリノーゲン断片Ｄ−２量体、断片Ｄ単量体、及び断片Ｅ単量体に一致する。３４０ｋＤａの薄いバンドは、おそらく非分解フィブリノーゲンであって、そのおおよその分子量にも基づいている。ヒト血清由来のＦＤＰ特異的抗原は、約３４０、３００（２８０−３２０）、２１０、及び５０ｋＤａである。これらのバンドは、それぞれ非分解フィブリノーゲン、初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）、断片Ｄ−２量体／断片Ｘ、及び断片Ｅに対応する。ここ（及び他のＩＰ実験のすべて）でのＩＰ反応は、ＩＰ反応に同等の濃度の各血清試料を加えることによって標準化された。図５Ｂでは、主な抗原は約２５ｋＤａである。上述したように、これは、２５ｋＤａの血清タンパク質がビーズに結合したウサギＩｇＧのすべてと非特異的に反応することを示唆する。また、２５ｋＤａのタンパク質は、おそらく図５Ａに示されるビーズとの反応で結合したウサギ抗ＦＤＰ  ＩｇＧと非特異的に相互作用する。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
図５で示された本実験において、表２の濃度測定値に基づいて、ＣＲＣ患者血清からのＦＤＰ特異的抗原が、標準患者血清からのそれよりも６．６から９．８倍多かった。しかし、非特異的抗原（約２５ｋＤａ）は、０．９からほぼ１に相当する非癌に対する癌の比を有していた。表２に示されたように、すべてのＦＤＰ特異的抗原のシグナル密度の平均は、５人の標準対照患者由来よりも５人の結腸直腸癌患者由来の血清試料において有意に高かった（ｐ値≦０．００００３５）。癌患者の血清由来の非特異的な抗原バンドは、有意に標準対照のそれとの違いは有意ではなかった（ｐ＝０．５３）。表２は、抗ＦＤＰ抗体群は、それぞれのＦＤＰ濃度に基づいて癌と標準の血清試料とを識別できることを裏付けている。
【００６０】
（実施例８）
抗ＦＤＰ捕捉抗体の特性評価
実施例２及び７で説明された１つの実施形態において、捕捉抗体群が産生され、その特性が評価された。
【００６１】
（実施例９）
検出のため西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合体化されたＦＤＰ抗体
検出抗体は、分析において検出できるように、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて酵素標識された。すなわち、本実施例では、検出抗体は実施例２の方法に従って産生されたポリクローナルウサギ抗ヒトＦＤＰ抗体であった。抗体は、ウサギ抗血清の精製されたイムノグロブリン断片であって、非常に高い固有の酵素活性を有する西洋ワサビペルオキシダーゼと複合体化されている。
【００６２】
検出抗体免疫原は、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物両方を含んでいた。抗体は、ＦＤＰ断片のサブタイプであるＤ、Ｅ、Ｘ／Ｄ−２量体、及びＹに加えて、天然のヒトフィブリノーゲンと反応する。抗体を汚染する微量物質は、ヒト血漿タンパク質とともに固相吸着で取り除いた。抗体の特異性は、ウェスタンブロット分析で確認された。検出抗体は、捕捉抗体によって検出されたように、癌患者のヒト血清における同じく６種のＦＤＰ断片との交差反応性が確認された。
【００６３】
（実施例１０）
ＦＤＰに対する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）
ＦＤＰのＥＬＩＳＡは、酵素標識されたサンドイッチ免疫測定である。捕捉抗体（ポリクローナル、ウサギ抗ＦＤＰ）が実施例２、７及び８で説明されたようにウサギの血清から得られた。
【００６４】
例示的な実施例では、ＦＤＰ免疫測定は、９６穴のマイクロリットルプレート構成における着脱可能な一片の使用を含む。マイクロリットルプレートの穴は、親和性によって精製されたウサギ抗ＦＤＰ抗体で被覆された。ヒト血清試料が希釈され（１：２００）、穴に分注された。ＦＤＰは、マイクロリットルプレートの穴に固定された抗ＦＤＰ抗体によって、血清試料中から捕捉された。洗浄工程を経て、ＨＲＰ（検出抗体）と結合した抗ＦＤＰ抗体が穴に添加された。抗ＦＤＰ−ＨＲＰ複合体は、固定された抗ＦＤＰ抗体と免疫学的なサンドイッチを形成するために捕捉されたＦＤＰに結合する。第２の洗浄工程を経て、酵素基質であるＴＭＢが穴に添加された。評価項目は、０．１Ｎの塩酸で反応が停止された後のマイクロプレートリーダにおける４５０ｎｍの値とした。生じた色の強度は、血清中のＦＤＰの量に比例する。量は、精製されたＦＤＰ較正を用いた標準曲線に基づく補間によって定量された。
【００６５】
（実施例１１）
健常者及び良性疾患患者由来の血清中のＦＤＰの分布
健常群におけるＦＤＰ値の大体の分布を調べるために、当日、疾患でないと自覚していた２０９人の女性及び２１２人の男性の試料を用いた。被験者は、性別、さらに４０−６４歳及び６５歳以上の２つの群に年齢によって分けられた。分析値は重複して決定された。累積分布が実証された。各５パーセンタイルの順序統計量が決定された。
【００６６】
良性疾患の被験者由来の試料の多様性は、良性疾患における血清ＦＤＰ値の分布を調べるためにまとめられ、良性疾患は、癌が確認された患者にも存在しているかもしれない。試料は、全米各地の地理的に多様な場所から適切なインフォームドコンセントの下、ＩＲＢで認可された手順で収集された。下記の表３は、試料の数と良性疾患群の構成を示す。計４００人の患者が試験され、この群には７４人の健常試料が含まれていた。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
表４は、健常者と同様に試験された各良性群の特性を示す。健常群を除く全ての群において有意な分散が見られた。平均値は、高いＦＤＰ値を示した試料によって非対称の傾向がある。しかし、これら各群における中央値は、見なし健常者に対する基準範囲内で良好である。この試験における他の全ての実験のように、ＦＤＰ値は全ての被験者において２重に決定され、該被験者はＩＲＢで認可された手順に従って、承諾した。
【００６９】
良性疾患群の中央値が健常被験者の中央値と同程度の大きさであることを解析は示している。膵臓の良性疾患を除く全ての良性疾患は、健常群と似たような分布及び９５％信頼限界を有している。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
（実施例１２）
悪性疾患の被験者由来の血清におけるＦＤＰの分布
この研究は、４３９人の患者に対して行われ、該患者は、原発性悪性腫瘍と診断され、治療を受けていた。被験者は、肺／肝臓癌、乳／卵巣／子宮頸癌、胆嚢／胆道／膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌の５つの群に分けられた。ＦＤＰ分析は試料に対して２重に行われた。一元配置分散分析は、Tamhaneの事後検定で行われた。結果は、群間で有意差はなかった。詳細は、各癌について表５に示された。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
（実施例１３）
各疾患群におけるＦＤＰ値の割合の分布
上記の健常、良性及び疾患群それぞれに対して、各疾患群におけるＦＤＰ濃度の違いを調べるためにＦＤＰの値が解析された。統計における正確な９５％信頼区間を求めるために、StatXact（登録商標）ソフトウェアが本解析で用いられた。分布表は表６に示される。
【００７４】
【表６】
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【００７５】
（実施例１４）
結腸直腸癌と診断された患者の連続的な（長期的な）監視
本研究のこの部分の試料は、２つの既存の試料バンクから取得された。４８の一連のセットがフロリダ州ベロビーチのゲフィン癌センターから得られ、６４の一連のセットがテキサス州ヒューストンのＭＤアンダーソン癌センターにある血清バンクから得られた。
【００７６】
計４４５件の評価可能な所見の中で、１１２の評価可能な患者セットがあった。一連の監視研究における試料は、既に蓄積された試料であって、無分別に収集され、収集時点でバンクにおける結腸直腸癌と診断されたすべての患者を含むため、バイアスはなかった。患者毎の所見数の平均は、４．０である。
【００７７】
要するに、一連の試料は、１１２人の結腸直腸癌患者から集められ、結果的に４４５件の組み合わされた所見があり、該所見に対してＦＤＰの測定値と決定された疾患の進行が得られた。連続の観察は、少なくとも平均９ヶ月もの長期間に渡った。一連の監視セットにおけるＦＤＰ値の進行は、現在と過去の値（Ｙ）の間での割合変化として評価され、１５％がＦＤＰ分析における特定の疾患の進行に対する最小の割合であると決定された。臨床的な疾患の進行（Ｄ）は、医局の手順と、監視期間の間の標準治療であった臨床検査室における解析とに基づいて被験者の医師によって決定された。この解析の第１の目的は、感度と特異度の合計が１を超えることを示すことによって、ＦＤＰ分析が有益であることを示すことである。
【００７８】
治療に対する反応は、臨床検査及び画像解析（例えば、骨のスキャン、ＣＴスキャン、核磁気共鳴画像解析、Ｘ線検査、超音波検査）の結果に基づく医師による記録の中で提供される情報を用いて評価された。治療に対する反応は、以下のように定義される。
【００７９】
完全寛解又は疾患の証拠がない（ＣＲ又はＮＥＤ）：臨床検査及び画像解析、又は医師によって指示された他の診断法を根拠とする、臨床上の及び画像で測定可能なすべての疾患の完全な消失。
【００８０】
部分寛解（ＰＲ）：観察時点で転移のある患者において、初期の転移性病変のサイズの顕著な減少又は骨のスキャンで観察されたような少なくとも安定状態を示す骨転移。
【００８１】
安定（ＳＤ）：初期の転移性病変のサイズにほとんど変化がない、又は初期の転移性病変のサイズに顕著な変化がない、又は臨床検査及び画像解析、又は医師によって指示された他の診断法を根拠とする、新たな病変がない。
【００８２】
進行（ＰＤ）：臨床又は画像解析の結果、以前の検査で見られなかった病変の存在、又は初期のあるいは転移性病変のサイズの顕著な増大を明確に示す。
【００８３】
一連の試料が１１２人の結腸直腸癌の患者から収集され、ＦＤＰ分析及び疾患の進行に関する４４６組の所見が得られた。複数の患者は最初の検査でさえも進行の兆候を示していたため、来院のたびにＦＤＰ分析値と進行との関連を評価することにした。したがって、このデータから、後続のＦＤＰ分析の値と前回の値の比をとることによる変化が得られた。この測定は、進行に関する情報を得る手段として前回の測定値からの増加を決めることを目的とした。進行の証拠とされる意味のある増加は１５％以上の増加とした。したがって、もし比が１．１５以上の場合、ＦＤＰ分析の値は、陽性と見なされ、さもなければ陰性と見なされた。この決定は、来院時の進行か進行でないかの所見と組み合わされた。
【００８４】
最終の試料抽出から３３５組の所見が得られ、２つの方法、すなわち来院ごと及び患者ごとに評価された。最初の解析では、各試料について無作為に１回の来院を抽出し、その来院における感度又は特異度を記録することによって、各患者に対するブートストラップ方式の試料抽出を行った。進行があった場合は、感度は１になり、これは、ＦＤＰ分析値が前回の来院から１５％以上増加した場合で、そうでない場合は０となる。来院時に進行がなかった場合は、その来院において感度は記録されず、特異度が１として記録され、これは、ＦＤＰ分析値がその来院において１５％未満の増加だった場合で、そうでない場合は０である。来院ごとの解析では、感度に対して１３５の来院と特異度に対して１９８の来院とがあった。
【００８５】
第２の解析は、所定の患者の全ての来院を通しての進行の回数を基準として患者ごとに行われ、進行があった来院においてＦＤＰ分析値が少なくとも１５％増加した来院の回数を数えることによって、患者ごとの感度を計算するために用いられた。同様に、来院時に１５％増加より小さいＦＤＰ分析値であった回数を、来院時に進行のなかった回数で割ることによって、患者ごとの特異度を計算した。ここで、患者が毎回進行の場合、当該患者について特異度はなく、患者がまったく進行でない場合、当該患者について感度はない。この結果、１１２人の患者の試料に、少なくとも感度、特異度又はその両方があった。また、患者ごとの感度は推定７０で、患者ごとの特異度は推定８６であった。
【００８６】
陽性予測値（ＰＰＶ）及び陰性予測値（ＰＮＶ）も患者ごと及び来院ごとを基準として計算された。ＰＰＶは、ＦＤＰ分析値が１５％以上増加した場合の進行があった回数を割ることによって、ＮＰＶは、ＦＤＰ分析値が１５％以上増加しなかった場合の進行がなかった回数を割ることによって、計算される。
【００８７】
評価に用いることができる標本数が少ない場合及び標本が入り組んだ構造の場合、ブートストラップと呼ばれる統計手法が、関連のある集団特性の妥当な推定を得るために用いられる。このような計算方法は、３３３の所見から無作為に試料を抽出して差し替えることを繰り返し、感度と特異度の合計を計算し、そして、結果として得られる試料の度数分布を介して、統計的検定のαレベルに相当するパーセンタイルを除く合計を決定する。そのような試料は、自動的に患者間のあらゆる相関を含み、上述の帰無仮説の不偏検定を可能にする。ブートストラップ・サンプリングは、通常では、試行間において結果の分布が一貫するまで複数回繰り返される。
【００８８】
来院ごとのブートストラップ用試料は、１１２人の各患者について一回の来院を無作為に抽出して差し替えることによって２０００回実行された。各試料からの感度の平均、特異度の平均及び合計は、患者全員の感度又は特異度（１又は０の値）の合計、及び測定された感度又は特異度が得られた回数で割ることによって計算された。ある試料について感度と特異度の平均を求めた後、両者は合計を得るために足された。これにより、来院ごとの感度、特異度及び両者の合計の２０００ブートストラップ推定が得られた。変数による２０００の値の度数表示によって、片側及び両側９５％信頼限界等のブートストラップ推定を得ることができる。
【００８９】
試料抽出方法は、それぞれのｋ（１から７）回来院した患者ごとに１からｋの間の数を割り当てることによって行われた。１１２の所見の試料は、一様に０から１の間の無作為な数を発生することによって得られ、その数にｋを乗じて、その数の整数をとり、１を加えた。この処理は各患者に対して１からｋの間の無作為な数字を与えた。前回から変化したＦＤＰ分析比は、与えられた数に対応する患者の来院時について計算された。試料抽出では差し替えが行われ、処理が１１２回繰り返されたために、重複が許された。感度、特異度及び合計は、１１２の各試料について計算され、記録された。
【００９０】
３３３の来院ごとの評価値から計算された来院ごとの感度は、１００×８８／１３４＝６５．１９であり、特異度は、１００×１３３／１９９＝６７．３４、感度と特異度との合計は、１３２．５３であった。ＰＰＶは、１００×８８／１５３＝５７．５２及びＮＰＶは、１００×１３４／１８１＝７４．０３であった。
【００９１】
結腸直腸癌患者における疾患の進行に関する情報を得るためのＦＤＰ免疫測定法の有効性を評価するための統計解析の結果が下の表７に示されている。
【００９２】
【表７】
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【００９３】
試験がα＝０．０５又はα＝０．０２５で行われても、この解析からの感度と特異度の合計は、明らかに統計学的に有意に１００より大きい。合計の中央値は、おそらく約１３３となり、感度の中央値は約６５、特異度の中央値は約６７である。合計の片側５％信頼下限は、約１２０であって、片側２．５％信頼下限は、約１１８である。ＰＰＶ及びＮＰＶの中央値は、５回に渡ってそれぞれ約５９及び７３である。これらの値は、表７の上で与えられた来院ごとの値から求められたものと一貫性があることに留意されたい。２０００の試料に相当する５回の繰り返しは、結果が妥当で一貫性があることを示している。
【００９４】
患者ごとの分析に関して、１１２の患者ごとの評価値から計算された来院ごとの感度は、１００×４５．６８／６９＝６６．２１、特異度は、１００×５８．６３／８６＝６８．１８、感度と特異度の合計は、１３４．３９、ＰＰＶは、１００×５１．８３／９７＝５３．４４、及びＮＰＶは、１００×７１．６７／１０３＝６９．５８であった。
【００９５】
【表８】
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【００９６】
試験がα＝０．０５又はα＝０．０２５で行われても、この解析からの感度と特異度の合計は、明らかに統計学的に有意に１００より大きい。合計の中央値は、おそらく約１３４となり、感度の中央値は約６６、特異度の中央値は約６８である。合計の片側５％信頼下限は、約１２４であって、片側２．５％信頼下限は、約１２１である。ＰＰＶ及びＮＰＶの中央値は、５回に渡ってそれぞれ約５３及び６９である。これらの値は、表８の上で与えられた来院ごとの値から求められたものと一貫性があることに留意されたい。２０００の試料に相当する５回の繰り返しは、結果が妥当で一貫性があることを示している。
【００９７】
結腸直腸癌の試料の監視におけるＦＤＰ免疫測定法の有効性の上記分析からの結論は、次のようになる。これらのデータ及び分析は、ＦＤＰ分析が、前回の来院から１５％かそれ以上の変化がある場合、結腸直腸癌の進行に関して有益なデータをもたらすことを示す。ＦＤＰ免疫測定法の結果は、結腸直腸癌患者の監視において、標準の治療処置を組み合わせて用いられなければならない。
【００９８】
指定のない限り、明細書及び特許請求の範囲で用いられる含有物、分子量、反応条件の特性の量を表す全ての数字及びその他は、全ての実施例において「約」という用語で修飾され得るものとして理解される。それゆえに、反対に指定のない場合、明細書及び添付された特許請求の範囲で示される数値パラメータは、近似値であって、該近似値は、本発明によって得られる望ましい特性に依存して変更され得る。少なくとも、特許請求の範囲と同等の原理の適用を制限しようとする試みとしてでなくても、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効桁の数字の観点及び通常の四捨五入法を適用することによって、得られるべきである。数値範囲及び本発明の範囲を説明するパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の例を説明する数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も、本質的に、それぞれの試験における測定の標準偏差から必然的に生じるある程度の誤りを含む。
【００９９】
本発明の記載の前後関係で用いられる「ａ（１つ）」、「ａｎ（１つ）」、「ｔｈｅ（その、前記、該等）」及び類似する指示対象（特に以下の特許請求の範囲の前後関係において）は、単数、複数双方を含むものと理解される。ただし、これは特に指定がない限り、あるいは明らかに文脈と矛盾しない限りである。ここでの数値の範囲の記載は、単に、その範囲内の個々の数値単独で指定する省略方法を提供するために用いられる。ここで特に指定のない限り、個々の数値は、ここで個別に列挙されたように明細書に組み込まれる。ここで記載された全ての方法は、特に指定がない又は明らかに文脈と矛盾しない限り、あらゆる適した順序で行うことができる。ここでのいずれか及び全ての実施例又は例示の用語（例えば、「のような」）の使用は、単に本発明をより明らかにするためのものであって、本発明の範囲、すなわち特許請求の範囲を限定するものではない。明細書にない言及のないものは、本発明の実施のために必須の主張されない、いずれかの要素として理解されるべきである。
【０１００】
ここで開示された本発明の択一的な要素又は実施形態の分類は、限定として解釈されない。各群の要素は、個々に引用され、主張され、あるいは、群内の他の要素やここで記載された他の要素と様々に組み合わせられる。群の１つまたはそれ以上の要素は、利便性及び／又は特許性のために、群に含まれる、あるいは、群から除外されることが予期される。このような包含又は除外があった場合、本明細書は、変形としてその群を含む、ひいては添付の特許請求の範囲で用いられる全てのマルクーシュ群の記載を充足するとみなされる。
【０１０１】
本発明に係るある実施形態は、ここに開示され、本発明を実施するために、発明者が知り得た最良の形態を含む。もちろん、これら記載された実施形態における変形は、上記記載に基づいて当業者にとって明白である。発明者は、熟練の当業者が適切にそのような変形を行うことを期待しており、さらに、発明者は、発明がここで具体的に記載されたもの以外に実施されることを意図する。したがって、本発明は、全ての変形と適用法令によって許される限り、ここに添付される特許請求の範囲に列挙されるものと同等の対象を含む。さらに、特に指定がない又は明らかに文脈と矛盾しない限り、ここでの全ての可能な変形における上述の要素のあらゆる組み合わせが本発明に包含される。
【０１０２】
ここで開示された特定の実施形態は、「から成る」又は「必須の成分として成る」の用語を用いる特許請求の範囲にさらに限定されてもよい。特許請求の範囲で用いられる場合、出願されるか補正で追加されても、「から成る」の用語は、特許請求の範囲で特定されない、あらゆる要素、工程又は含有物を排除する。「必須の成分として成る」の用語は、特許請求の範囲を、特定の物質又は工程及び必要最小限で新しい特徴に実質的に影響しないものに限定する。主張するように本発明の実施形態は、ここに本質的に明白に記載され、使用可能である。
【０１０３】
さらに、本明細書において、複数の特許公報及び出版物が引用されている。上述の引用文献及び出版物それぞれは、そのまま引用することによってここに組み込まれる。
【０１０４】
最後に、ここで開示された本発明に係る実施形態は、本発明の本質の実例であることが理解される。他の変形が本発明の範囲内で使用され得る。したがって、例示であって、これに限定されないが、本発明の他の構成が、ここの内容にしたがって利用される。ゆえに、本発明は、示された及び説明されたものだけに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年3月29日(2012.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の癌を検出する方法であって、
前記被験者から得た生物学的試料を、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と反応させる工程と、
前記抗体−ＦＤＰ複合体を検出する工程と、
前記被験者の癌を検出する工程と、
を含むことを特徴とする被験者の癌を検出する方法。
【請求項２】
前記抗体調製剤は、
さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体調製剤は、
ポリクローナル抗体調製剤である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酵素免疫測定法を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験者の癌を検出する工程は、
さらに少なくとも１つの追加の診断テストを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）第１のサンプリング時点で被験者から得た第１の生物学的試料と前記第１のサンプリング時点後の第２のサンプリング時点で前記被験者から得た第２の生物学的試料とを、フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と反応させる工程と、
（ｂ）前記抗体−ＦＤＰ複合体を検出する工程と、
（ｃ）前記第１の生物学的試料におけるＦＤＰの濃度に対する前記第２の生物学的試料におけるＦＤＰの濃度の比を求める工程と、
（ｄ）癌が進行したかを決定する工程と、
を含み、
適宜、第１、第２の時点後の時点で得られた追加の生物学的試料に対して（ａ）から（ｃ）までの工程を繰り返す、
ことを特徴とする患者の癌を監視する方法。
【請求項７】
前記抗体調製剤は、
さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体調製剤は、
ポリクローナル抗体調製剤である、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記反応させる工程及び前記検出する工程は、
酵素免疫測定法を含む、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記比が１．１５以上の場合に、癌が進行したとする、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記比が１．１５未満の場合に、癌が退縮したか安定であるとする、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
被験者の癌を検出するキットであって、
フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に結合し、抗体−ＦＤＰ複合体を形成する抗体調製剤と、
検出系と、
ＦＤＰの測定及びＦＤＰの存在を癌に関連付けるための説明書と、
を含むことを特徴とする被験者の癌を検出するキット。
【請求項１３】
前記検出系は、
フィブリンの及びフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）に関連する少なくとも３種の抗原である断片Ｄ、断片Ｅ及びＤ−２量体に特異的な検出抗体を含む、
ことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記抗体調製剤は、
さらに適宜、断片Ｙ及び初期のプラスミンの消化産物（ＩＰＤＰ）の少なくとも１つに結合する、
ことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記抗体及び前記検出系は、酵素免疫測定法を含む、
ことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【国際調査報告】
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