(57)【要約】本発明は、核酸アレイおよび核酸アレイを用いる方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）幾何学的バリアを含む固体支持体；
ｂ）固体支持体上に並べられた流動性脂質二重層；
ｃ）少なくとも１つの核酸分子；および
ｄ）脂質二重層に核酸分子を付着させるための連結
を含むアレイ。
【請求項２】
バリアが非直線である、請求項１のアレイ。
【請求項３】
バリアが、機械的バリア、化学的バリア、タンパク質バリア、またはその組み合わせを含む、請求項１のアレイ。
【請求項４】
機械的バリアが固体支持体上のスクラッチである、請求項３のアレイ。
【請求項５】
化学的バリアが、金属、酸化金属、またはその組み合わせを含む、請求項３のアレイ。
【請求項６】
金属が、クロム、アルミニウム、金、またはチタンを含む、請求項５のアレイ。
【請求項７】
酸化金属が、酸化クロム、酸化アルミニウム、または酸化チタンを含む、請求項５のアレイ。
【請求項８】
バリアが反復三角波を含む、請求項１のアレイ。
【請求項９】
バリアが、幾何学的バリアの頂点を連結することによってナノウェルを形成する、請求項１のアレイ。
【請求項１０】
ナノウェルが核酸進入のためのナノポアを含む、請求項９のアレイ。
【請求項１１】
連結がニュートラアビジンおよびビオチン間で形成される、請求項１のアレイ。
【請求項１２】
核酸分子が、水力学的な力、電気泳動的な力、またはその組み合わせの適用によって、幾何学的バリアに沿って整列する、請求項１のアレイ。
【請求項１３】
幾何学的バリアが核酸分子（単数または複数）の側方置換を調節する、請求項１のアレイ。
【請求項１４】
幾何学的バリアがナノファブリケーションによって生成される、請求項１のアレイ。
【請求項１５】
ナノファブリケーションが電子ビーム・リソグラフィーを含む、請求項１４のアレイ。
【請求項１６】
核酸分子の一端に連結が付着している、請求項１のアレイ。
【請求項１７】
核酸分子が、脂質二重層に、その輪郭に沿って可逆的に付着する、請求項１６のアレイ。
【請求項１８】
核酸分子の両端に連結が付着している、請求項１のアレイ。
【請求項１９】
核酸分子端に各々異なる連結が付着している、請求項１８のアレイ。
【請求項２０】
核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項１のアレイ。
【請求項２１】
ＤＮＡ分子が約２０〜約１００，０００塩基対を含む、請求項２０のアレイ。
【請求項２２】
核酸分子が標識にカップリングしている、請求項１のアレイ。
【請求項２３】
標識が蛍光標識である、請求項２２のアレイ。
【請求項２４】
固体支持体がＳｉＯ２を含む、請求項１のアレイ。
【請求項２５】
脂質二重層が双性イオン性脂質を含む、請求項１のアレイ。
【請求項２６】
請求項１のアレイを含むミクロ流体フローセル。
【請求項２７】
ステージング領域、二股ナノチャネル、少なくとも１対の平行チャネル、少なくとも１つのポア、またはその組み合わせをさらに含む、請求項２６のミクロ流体フローセル。
【請求項２８】
請求項１の核酸分子が、水力学的な力、電気泳動的な力、またはその組み合わせの適用によって、幾何学的バリアに沿って整列する、請求項２６のミクロ流体フローセル。
【請求項２９】
水力学的な力が、接線、垂直、またはその組み合わせである、請求項２８のミクロ流体フローセル。
【請求項３０】
電気泳動的な力が、接線、垂直、またはその組み合わせである、請求項２８のミクロ流体フローセル。
【請求項３１】
複数の核酸から長さ特異的な核酸を単離するための方法であって：
ａ）請求項２６のミクロ流体セルを提供し、ここで付着した核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）第一の水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して垂直に適用して、ナノウェルに対して、付着したＤＮＡ分子を局在させて；
ｃ）第二の水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、平行チャネル対内で、付着したＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて；そして
ｄ）ＤＮＡ分子を視覚化する
工程を含む、前記方法。
【請求項３２】
第二の水力学的な力または電気泳動的な力を、支持体表面に対して接線方向に連続して適用する工程を場合によって含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
核酸およびポリペプチド間の相互作用を分析するための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここで付着した核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）付着したＤＮＡ分子にポリペプチドを接触させ、ここでポリペプチドはポリペプチドの視覚化を可能にする第二の蛍光標識にカップリングされており；
ｃ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、付着したＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて； 
ｄ）ＤＮＡ分子およびポリペプチドを視覚化し；そして
ｅ）ＤＮＡ分子がポリペプチドと相互作用するかどうかを決定する
工程を含み、
ＤＮＡ分子の長さに沿ったいずれかの場所にポリペプチドが局在していれば、相互作用の指標となる
前記方法。
【請求項３４】
決定が、ＤＮＡ分子に沿ったポリペプチドの静的局在または動的局在を観察する工程を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡ分子に沿ったポリペプチドの静的局在が、ＤＮＡ分子およびポリペプチド間の結合の指標となる、請求項３４の方法。
【請求項３６】
ＤＮＡ分子に沿ったポリペプチドの動的局在が、ＤＮＡ分子に沿ったポリペプチドの結合および移動の指標となる、請求項３４の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドが特定のＤＮＡ構造に結合するかどうかを決定する工程をさらに含み、ＤＮＡ分子上の特定の位置でのポリペプチドの整列が、特定のＤＮＡ構造への結合の指標となる、請求項３３の方法。
【請求項３８】
核酸分子およびポリペプチド間の相互作用を破壊する核酸配列を同定するための方法であって：
ａ）請求項１の第一のアレイを提供し、ここで第一のアレイは、同一核酸分子の第一の集団を含み、そして核酸分子は第一の蛍光標識にカップリングされており；
ｂ）請求項１の第二のアレイを提供し、ここで第二のアレイは、同一核酸分子の第二の集団を含み、核酸分子は第一の蛍光標識にカップリングされており、そして核酸分子の第二の集団は、核酸分子の第一の集団と少なくとも１ヌクレオチド異なり；
ｃ）アレイにポリペプチドを接触させ、ここでポリペプチドはポリペプチドの視覚化を可能にする第二の蛍光標識にカップリングされており；そして
ｄ）核酸分子の第一の集団および核酸分子の第二の集団がポリペプチドと相互作用するかどうかを決定する
工程を含み、
核酸分子の第一の集団の長さに沿ったいずれかの場所にポリペプチドが局在していれば、第一の集団およびポリペプチド間の相互作用の指標となり、そして核酸分子の第二の集団の長さに沿ってポリペプチドの局在が存在しなければ、第二の集団が、第一の核酸分子およびポリペプチド間の相互作用を破壊する核酸配列を含む指標となる
前記方法。
【請求項３９】
ＤＮＡ分子の構造を改変するポリペプチドを同定するための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここで核酸はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、ＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて； 
ｃ）ＤＮＡ分子の長さを視覚化し；
ｄ）ＤＮＡ分子にポリペプチドを接触させ、ここでポリペプチドは、ポリペプチドの視覚化を可能にする第二の蛍光標識に場合によってカップリングされ；
ｅ）ＤＮＡ分子の長さを視覚化し、そして場合によってポリペプチドを視覚化し；そして
ｆ）ＤＮＡ分子が接触工程後に長さを変化させたかどうかを決定する、ここでＤＮＡ分子の長さの増加または減少が、ポリペプチドがＤＮＡ分子の構造を改変する指標となる
工程を含む、前記方法。
【請求項４０】
ポリペプチドおよび核酸の相互作用を破壊する剤を同定するための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここで核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）ＤＮＡ分子にポリペプチドを接触させ、ここでポリペプチドは、ＤＮＡ分子と相互作用可能であり、そしてポリペプチドの視覚化を可能にする第二の蛍光標識にカップリングされ；
ｃ）ＤＮＡ分子およびポリペプチドに剤を接触させ；
ｄ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、付着したＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて；
ｅ）ＤＮＡ分子およびポリペプチドを視覚化し；そして
ｆ）剤がＤＮＡ分子およびポリペプチド間の相互作用を破壊するかどうかを決定する、ここでＤＮＡ分子の長さに沿ったいずれかの場所にポリペプチドが局在していなけれれば、剤がＤＮＡ分子およびポリペプチド間の相互作用を破壊する指標となる
工程を含む、前記方法。
【請求項４１】
核酸分子の配列を決定するための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここで核酸分子は一本鎖ＤＮＡ分子であり；
ｂ）ヌクレオチド類似体のコレクションを提供し、ここで各ヌクレオチド・タイプは、異なる蛍光標識にカップリングされ；
ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを提供し；
ｄ）ＤＮＡ分子由来の蛍光シグナルを視覚化し、ここでシグナルは、ポリメラーゼによって付加されたヌクレオチドの同一性の指標となり；そして
ｅ）工程ｄ）を場合によって反復する
工程を含む、前記方法。
【請求項４２】
アレイが複数の同一ＤＮＡ分子を含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
アレイが複数の異なるＤＮＡ分子を含む、請求項４１の方法。
【請求項４４】
核酸分子をマッピングするための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここで核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、ＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて； 
ｃ）ＤＮＡ分子の長さを視覚化し；
ｄ）ＤＮＡ分子に制限酵素を接触させ；そして
ｅ）接触工程後のＤＮＡ分子の長さの変化を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項４５】
核酸分子をマッピングするための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここでアレイは複数の同一核酸分子を含み、核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）ＤＮＡ分子に異なるタイプのポリペプチドを接触させ、ここで各タイプの集団は、第一の蛍光標識ではない蛍光標識にカップリングされ；
ｃ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、ＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて；そして
ｄ）ポリペプチドの結合位置を視覚化し、それによって核酸分子をマッピングする
工程を含む、前記方法。
【請求項４６】
核酸分子をマッピングするための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここでアレイは複数の同一核酸分子を含み、核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）ＤＮＡ分子に複数のＤＮＡプローブを接触させ、ここで各ＤＮＡプローブは、第一の蛍光標識ではない蛍光標識にカップリングされ；
ｃ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、ＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて；そして
ｄ）ＤＮＡプローブの結合位置を視覚化し、それによって核酸分子をマッピングする
工程を含む、前記方法。
【請求項４７】
核酸分子をマッピングするための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここでアレイは複数の異種核酸分子を含み、核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）ＤＮＡ分子に複数のＤＮＡプローブを接触させ、ここで各ＤＮＡプローブは、第一の蛍光標識ではない蛍光標識にカップリングされ；
ｃ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、ＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて；そして
ｄ）ＤＮＡプローブの結合位置を視覚化し、それによって核酸分子をマッピングする
工程を含む、前記方法。
【請求項４８】
ｅ）ＤＮＡ分子に制限酵素を接触させ；
ｆ）関心対象の消化されたＤＮＡ分子を収集し；そして
ｇ）接触工程後のＤＮＡ分子の長さの変化を決定する
工程をさらに含む、請求項４６または４７の方法。
【請求項４９】
核酸分子を、脂質二重層に、その輪郭に沿って可逆的に付着する工程を場合によって含む、請求項４８の方法。
【請求項５０】
１以上のポリペプチドおよび核酸間の相互作用を破壊する１以上の剤を同定するための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここでアレイは複数の同一核酸分子を含み、核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）ＤＮＡ分子に１以上のポリペプチドを接触させ、ここで１以上のポリペプチドは、各々、異なる既知の位置で、ＤＮＡ分子と相互作用可能であり、そして１以上のポリペプチドは、ポリペプチドの視覚化を可能にする第二の蛍光標識にカップリングされ；
ｃ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、付着したＤＮＡ分子を所望の配向に整列させ、そしてＤＮＡ分子およびポリペプチドを視覚化して；
ｄ）アレイに第一の剤を接触させ；
ｅ）ＤＮＡ分子およびポリペプチドを視覚化し；
ｆ）第一の剤がＤＮＡ分子および１以上のポリペプチド間の相互作用を破壊するかどうかを決定し、ここでＤＮＡ分子の長さに沿って１以上のポリペプチドが局在していなけれれば、剤がＤＮＡ分子および１以上のポリペプチド間の相互作用を破壊した指標となり；そして
ｇ）場合によって、アレイに第二の剤を接触させ、そして工程ｅ）およびｆ）を反復する
工程を含む、前記方法。
【請求項５１】
剤がライブラリー由来である、請求項４０または請求項５０の方法。
【請求項５２】
工程が自動化されている、請求項３３、３８〜４１、４４〜４７、または５０の方法。
【請求項５３】
場合によって、水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向で連続して適用する工程を含む、請求項３３、３８〜４１、４４〜４７、または５０の方法。
【請求項５４】
核酸およびポリペプチド間の相互作用が、転写中のプロモーター−エンハンサー相互作用を含む、請求項３３の方法。
【請求項５５】
核酸およびポリペプチド間の相互作用が、ミスマッチＤＮＡ修復複合体を含む、請求項３３の方法。
【請求項５６】
ミスマッチＤＮＡ修復複合体がＭｓｈ２−Ｍｓｈ６を含む、請求項５５の方法。
【請求項５７】
核酸分子を、脂質二重層に、その輪郭に沿って可逆的に付着させるための方法であって：
ａ）請求項１のアレイを提供し、ここで核酸はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；
ｂ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、ＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて； 
ｃ）有効濃度のカルシウムを緩衝液流動に添加し、ここでカルシウム濃度は少なくとも約１ｍＭであり；そして
ｄ）場合によって緩衝液からカルシウムを洗い流す
工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本明細書に引用されるすべての特許、特許出願および刊行物は、その全体が本明細書に援用される。これらの刊行物の開示は、その全体が、本明細書に記載されそして請求される本発明の日付時点で、当業者に知られるような技術分野の状態をより十分に記載するため、本出願に援用される。
【０００２】
[0002]本特許開示は、著作権保護の対象である主題を含有する。米国特許商標局ファイルまたは記録に表れる通りである、特許文書または特許開示の誰による複製再現にも、著作権の所持者は異議を唱えないが、別の点ではあらゆる著作権権利を保持する。
【０００３】
政府の所有権
[0003]本明細書記載の本研究は、全体として、または部分的に、米国衛生研究所助成金ＰＡ−０３−０５８、ＧＭ０７４７３９、ＧＭ０８２８４８によって補助された。したがって、米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]近年の研究は、天然に近い条件下の水性環境において、個々の生物学的巨大分子の詳細な照合を可能にする技術の使用の劇的な増加に直面している。この増加は、非常に高感度の実験ツール、例えば原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、レーザーおよび磁気ピンセット、ならびに蛍光に基づく光学検出の開発および利用可能性に起因しうるものであり、これらはすべて、タンパク質フォールディングおよびアンフォールディング、ＤＮＡ動力学、ならびにタンパク質−核酸相互作用などの生物学的現象を研究するのに用いられてきている。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]本発明は、部分的に、核酸分子を支持体上に並べ、そして位置的に整列させて、個々の核酸分子の分析を可能にしうるという発見に基づく。したがって、１つの側面において、本発明は、支持体、および支持体に付着した核酸分子を含むアレイを特徴とする。核酸分子を、連結、例えば同族結合タンパク質、例えばニュートラアビジンおよびビオチン、または抗体および抗原（例えば抗ジゴキシゲニン抗体およびジゴキシゲニン）間の連結；または架橋連結、例えばジスルフィド連結またはグルタルアルデヒドを用いた一級アミン間のカップリングによって、支持体に付着させてもよい。いくつかの態様において、核酸分子は一端で付着する。いくつかの態様において、核酸分子は両端で付着する。いくつかの態様において、核酸分子は、脂質二重層に、その輪郭に沿って可逆的に付着する。
【０００６】
[0006]アレイにはさらに、支持体上に沈着したコーティング物質、例えば脂質、例えば脂質層、例えば脂質二重層が含まれる。１つの態様において、脂質は双性イオン性脂質である。１つの態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を脂質二重層に添加する。例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％（ｗ／ｗ）またはそれより多いＰＥＧが脂質二重層中に含まれてもよい。
【０００７】
[0007]支持体は、例えば、ガラス、石英ガラス（ＳｉＯ２）、水晶、ホウケイ酸ガラス、ポリジメチルシロキサン、重合ラングミュアーブロジェット膜、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、修飾シリコン、またはポリマー（例えば（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、またはポリカーボネート）であってもよい。１つの態様において、支持体は石英ガラスである。支持体は、例えば、円板、正方形、四角形、球または円であってもよい。支持体は、本明細書記載の方法で使用するのに適していてもよい。１つの態様において、支持体は、蛍光顕微鏡法に用いられるスライドである。
【０００８】
[0008]核酸分子は、例えば一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡであってもよい。核酸分子は、長さ約１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００、５００００、１０００００、２０００００、またはそれより多いヌクレオチドであってもよい。支持体に付着可能な核酸分子の数は、支持体のサイズによって、そしてアレイの設計によって決定可能である。いくつかの態様において、約５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、５０００、またはそれより多い核酸分子を支持体に付着させる。
【０００９】
[0009]核酸分子を標識、例えば蛍光標識、例えばＹＯＹＯ１、または本明細書に記載する他の蛍光標識、あるいは量子ドットにカップリングさせてもよい。
[0010]別の側面において、本発明は、支持体、支持体上に並べられた脂質二重層、および連結によって脂質二重層に付着した核酸分子を含むアレイを特徴とする。１つの態様において、ポリペプチド、例えばニュートラアビジンを脂質頭基に連結し、そして同族ポリペプチド、例えばビオチンを核酸分子に連結する。ニュートラアビジンおよびビオチン間の連結によって、核酸分子を脂質二重層に付着させる。いくつかの態様において、核酸分子は一端で付着する。いくつかの態様において、核酸分子は両端で付着する。
【００１０】
[0011]１つの態様において、支持体にはさらに、脂質拡散を防止する拡散バリア、例えば非直線機械的、化学的、またはタンパク質バリアが含まれる。拡散バリアは非直線の幾何学的拡散バリアを含む。例えば、非直線拡散バリアは、ナノメートルスケールの間隔を反復する鋸歯パターンを生じる反復三角波、または多様な角度の一連の反復を含んでもよい。非直線拡散バリアはまた、ターン、ベンド、カーブ、または中断も含んでもよい。１つの態様において、バリアはその全長に渡って非直線である。別の態様において、バリアは少なくとも１つの角を含む。さらなる態様において、バリアは約１８０°未満の少なくとも１つの角を含む。別の態様において、バリアは多様な度合いの少なくとも１つの角を含む。いくつかの態様において、バリアは多様な度合いの多数の角を含む。別の態様において、拡散バリアは非直線のナノスケールバリアである。非直線機械的バリアは、例えば、支持体上の粗いスクラッチまたはエッチであり、例えばスクラッチまたはエッチが直線でないようなものであってもよい。タンパク質バリアには、例えばフィブロネクチンが含まれる。タンパク質バリアを支持体、例えば本明細書記載の支持体上に、よく定義されたパターンで沈着させてもよい。タンパク質バリアは、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０μｍまたはそれより厚い厚みを有してもよい。１つの態様において、化学バリアを含むバリア物質は、金属、例えば、クロム、アルミニウム、金、チタン、白金、オスミウム、またはニッケルを含んでもよい。別の態様において、バリア物質は、酸化金属、例えば酸化アルミニウム、または酸化チタンを含んでもよい。さらなる態様において、固体支持体は、非直線の幾何学的バリアを含む。別の態様において、バリアは反復三角波を含む。他の態様において、バリアは非直線幾何学的バリアの頂点を連結することによってナノウェルを形成し、一方、いくつかの態様において、ナノウェルは核酸進入のためのナノポアを含む。いくつかの態様において、非直線幾何学的バリアは核酸分子（単数または複数）の側方置換を調節する。非直線幾何学的バリアは、例えば電子ビーム・リソグラフィーまたはフォトリソグラフィー技術を含むナノファブリケーションによって生成されてもよい。例えば、金属、例えばクロムの薄い１００ｎｍバリアを置くことが可能なナノファブリケーション技術を用いてもよい。
【００１１】
[0012]別の側面において、本発明は、支持体、本明細書記載の拡散バリア、支持体上に並べられた脂質二重層、および連結によって拡散バリアに付着した核酸分子を含むアレイを特徴とする。１つの態様において、拡散バリアをタンパク質、例えばビオチンにカップリングする。次いで、同族タンパク質、例えばニュートラアビジンをビオチン化拡散バリアに直接結合させ、そして同族タンパク質、例えばニュートラアビジンに結合させることによって、拡散バリアにビオチン化核酸分子を付着させる。いくつかの態様において、核酸分子は一端で付着する。いくつかの態様において、核酸分子は両端で付着する。
【００１２】
[0013]別の側面において、本発明は、本明細書記載のアレイを含むセル、例えばフローセル、例えばミクロ流体フローセルを特徴とする。流体を脂質二重層と相互作用させ、例えば脂質二重層上に流動させるように、フローセルを配置してもよい。いくつかの態様において、本明細書記載の支持体には、さらに２つの開口部、例えば入口ポートおよび出口ポートが含まれる。セル、例えばフローセルには、支持体、ならびに支持体に対してその周囲長で接着性に付着して支持体およびカバーの間にチャンバーを生成するカバー、例えばガラスカバー、例えばガラスカバースリップが含まれる。入口ポートおよび出口ポートはチャンバー内に開口し、水力学的な力が、チャンバー内に、そして支持体上に沈着した脂質二重層上に適用されることを可能にする。例えば、緩衝液は、脂質二重層上を流動し、そして出口ポートを通じてチャンバーから出て行くように、入口ポートを通じてチャンバー内に押し込まれてもよい。１つの態様において、フローセルは、ステージング領域、二股ナノチャネル、少なくとも１対の平行チャネル、少なくとも１つのポア、またはその組み合わせをさらに含む。別の態様において、本発明の核酸分子は、水力学的な力、電気泳動的な力、または２つの力の組み合わせの適用によって、非直線幾何学的バリアに沿って整列する。
【００１３】
[0014]１つの態様において、アレイの核酸分子は、フローセルへの水力学的な力、電気泳動的な力、または両方の組み合わせの適用によって、所望の配向に配置される。例えば、フローセルへの水力学的な力の適用、例えば本明細書記載の緩衝液の導入に際して、核酸分子は、水力学的な力の方向に整列する。核酸分子が一端で付着している態様において、水力学的な力は、水力学的な力の流動方向への、核酸分子の非付着端の伸長を生じる。核酸分子が脂質二重層の脂質頭部に付着している態様において、核酸分子は、脂質頭部が非直線幾何学的拡散バリアと出会うまで水力学的な力の方向に流動し、所望の位置で、所望の配向での核酸分子の伸長を生じるであろう。
【００１４】
[0015]１つの側面において、本発明は、複数の核酸から長さ特異的な核酸を単離するための方法を提供する。該方法は、ａ）本発明のミクロ流体セルを提供し、ここで付着した核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；ｂ）第一の水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して垂直に適用して、ナノウェルに対して、付着したＤＮＡ分子を局在させて；ｃ）第二の水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、平行チャネル対内で、付着したＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて；そしてｄ）ＤＮＡ分子を視覚化する工程を含む。１つの態様において、該方法は、第二の水力学的な力または電気泳動的な力を、支持体表面に対して接線方向に連続して適用する工程を場合によって含んでもよい。
【００１５】
[0016]別の側面において、本発明は、個々の核酸分子を視覚化するための方法を特徴とする。該方法には、核酸分子（蛍光標識にカップリングされている）を、本明細書に記載するように、支持体に、脂質二重層に、または非直線幾何学的拡散バリアに付着させて、アレイを形成する工程が含まれる。次いで、該アレイをフローセルに含ませ、そして核酸分子を本明細書に記載するように、所望の配向に整列させる。次いで、特定の蛍光標識の励起波長で、光源、例えばレーザーを用いて、アレイを励起させ、そして生じた蛍光を放出波長で検出する。蛍光シグナルの検出は、顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を利用する。別の態様において、励起および検出は、本明細書に記載するような、全反射照明蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦＭ）によって仲介される。
【００１６】
[0017]別の側面において、本発明は、核酸およびポリペプチド間の相互作用を分析するための方法を特徴とする。該方法には、例えば、本明細書に記載するようなフローセル内のアレイを提供する工程が含まれる。水力学的な力の適用によって、核酸分子を所望の配向に整列させてもよく、そして本明細書に記載するように核酸分子を視覚化してもよい。次いで、例えばアレイに渡る水力学的な力を仲介する緩衝液に添加することによって、ターゲットポリペプチドをフローセルに添加する。１つの態様において、ターゲットポリペプチドを、核酸分子にカップリングした蛍光標識とは異なる蛍光標識にカップリングする。核酸分子へのターゲットポリペプチドの局在を視覚化してもよく、そしてこうした局在は、ターゲットポリペプチドおよび核酸分子間の相互作用の指標となる。
【００１７】
[0018]１つの態様において、アレイからのシグナルを長期に渡って連続して収集し、核酸分子上のターゲットポリペプチドの移動の決定を可能にする。
[0019]１つの態様において、ポリペプチドの添加前および後に核酸分子の長さを決定し、ここでポリペプチドが核酸分子の長さの変化を引き起こすならば、例えば短くするかまたは長くするならば、ポリペプチドが核酸分子の構造的変化を引き起こす指標となる。
【００１８】
[0020]別の側面において、本発明は、核酸分子およびポリペプチド間の相互作用を破壊する、核酸配列、例えば核酸配列中の突然変異を同定するための方法を特徴とする。該方法には、本明細書に記載するような第一のフローセル内の第一のアレイを提供する工程が含まれる。第一のアレイは、第一の蛍光標識にカップリングした同一核酸分子の第一の集団を含有する。該方法にはまた、本明細書に記載するような第二のフローセル内の第二のアレイを提供する工程も含まれる。第二のアレイは、第一の蛍光標識にカップリングした同一核酸分子の第二の集団を含有する。別の態様において、核酸分子の第二の集団のヌクレオチド配列は、核酸分子の第一の集団のヌクレオチド配列と少なくとも１ヌクレオチド異なる。次いで、例えばアレイに渡る水力学的な力を仲介する緩衝液に添加することによって、ポリペプチドをフローセルに添加する。本発明の態様において、ポリペプチドを第二の蛍光標識、例えば核酸分子にカップリングした蛍光標識とは異なるものにカップリングさせる。アレイ上の核酸分子へのポリペプチドの局在を視覚化してもよく、そして第一のアレイの核酸分子にポリペプチドが局在しているが、第二のアレイのものには局在していないならば、第二のアレイの核酸分子が、第一のアレイの核酸分子およびポリペプチド間の相互作用を破壊する核酸配列、例えば突然変異を含有する指標となる。
【００１９】
[0021]別の側面において、本発明は、ポリペプチドおよび核酸の相互作用を破壊する剤を同定するための方法を特徴とする。該方法には、例えば、本明細書に記載するようなフローセル内のアレイを提供する工程が含まれる。水力学的な力の適用によって、核酸分子（第一の蛍光標識にカップリングしている）を所望の配向に整列させてもよく、そして本明細書に記載するように核酸分子を視覚化してもよい。次いで、例えばアレイに渡る水力学的な力を仲介する緩衝液に添加することによって、ポリペプチドをフローセルに添加する。別の態様において、ポリペプチドを、核酸分子にカップリングした蛍光標識とは異なる蛍光標識にカップリングさせる。別の態様において、ポリペプチドは、核酸分子に結合することが知られるポリペプチドである。核酸分子へのポリペプチドの局在を視覚化してもよい。次いで、例えば緩衝液に添加することによって、候補剤、例えば化合物または薬剤をフローセルに添加し、そしてポリペプチドの局在が視覚化されるかどうかを決定する。核酸分子の長さに沿ったいずれかの場所でのポリペプチドの局在の喪失を引き起こす剤は、剤が核酸分子およびポリペプチド間の相互作用を破壊する剤である指標となる。
【００２０】
[0022]別の側面において、本発明は、核酸分子を配列決定するための方法を特徴とする。該方法には、例えば一本鎖核酸分子、例えば一本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程が含まれる。一本鎖核酸分子をＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオチド類似体の混合物、例えば蛍光標識ｄＮＴＰと混合する。別の態様において、各ｄＮＴＰ、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを異なる蛍光標識にカップリングさせる。一本鎖ヌクレオチド分子へのヌクレオチド類似体の付加を可能にする条件下で、混合物を反応させる。次いで、反応した核酸分子を本明細書に記載するようなアレイに添加する。水力学的な力の適用によって核酸分子を所望の配向に整列させてもよく、そして本明細書に記載するように、核酸分子を視覚化してもよい。
【００２１】
[0023]１つの態様において、核酸分子は同一であり、そしてアレイに渡って、特定のヌクレオチドに相当する色の平行なラインによって配列を決定してもよい。１つの態様において、核酸分子は異なる。
【００２２】
[0024]別の側面において、本発明は、例えば、制限酵素、蛍光タンパク質とのハイブリダイゼーション、または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いた、単一ＤＮＡ分子のハイスループット物理的マッピングのための方法を特徴とする。１つの態様において、核酸分子をマッピングするための方法は、（ａ）本明細書記載の本発明のアレイを提供し、ここでアレイは複数の異種核酸分子を含み、そして核酸分子はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；（ｂ）ＤＮＡ分子に複数のＤＮＡプローブを接触させ、ここで各ＤＮＡプローブは、第一の蛍光標識ではない蛍光標識にカップリングされ；（ｃ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、ＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて；そして（ｄ）ＤＮＡプローブの結合位置を視覚化する工程を含む。いくつかの態様において、複数の核酸分子は、異種核酸分子を含む。他の態様において、複数の核酸分子は、同一（例えば均質）核酸分子を含む。本発明のさらなる態様において、該方法はさらに：（ｅ）ＤＮＡ分子に制限酵素を接触させ；（ｆ）関心対象の消化されたＤＮＡ分子を収集し；そして（ｇ）接触工程後のＤＮＡ分子の長さの変化を決定する工程を含む。該方法は、場合によって、例えば、有効濃度のカルシウムを含有するフローセル緩衝液に、ＤＮＡ分子を曝露することによって、核酸分子を、脂質二重層に、その輪郭に沿って可逆的に付着させる工程を含んでもよい。ＤＮＡ分子は、緩衝液中に存在するカルシウムが洗い流された際に、脂質二重層からそれ自体が剥がれることも可能である。１つの態様において、カルシウム濃度は、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約１．５ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約４．５ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５．５ｍＭ、少なくとも約６ｍＭ、少なくとも約６．５ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ、少なくとも約７．５ｍＭ、少なくとも約８ｍＭ、少なくとも約８．５ｍＭ、少なくとも約９ｍＭ、少なくとも約９．５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、または少なくとも約１０．５ｍＭである。
【００２３】
[0025]別の側面において、本発明は、平行に配置された本明細書記載の複数のミクロ流体フローセルを特徴とする。複数のフローセルを、本明細書記載の任意の方法で平行して用いてもよい。
【００２４】
[0026]別の側面において、本発明は、核酸における突然変異を検出するための本明細書記載のアレイを用いる診断法を特徴とする。限定されるわけではないが、核酸の配列決定またはハイブリダイゼーション法のいずれかを含む多様な方法において、検出を達成してもよい。
【００２５】
[0027]本発明の１つの側面は、核酸分子を、脂質二重層に、その輪郭に沿って可逆的に付着させるための方法を特徴とする。該方法は：（ａ）請求項１のアレイを提供し、ここで核酸はＤＮＡ分子の視覚化を可能にする第一の蛍光標識にカップリングされたＤＮＡ分子であり；（ｂ）水力学的な力または電気泳動的な力を支持体表面に対して接線方向に適用して、ＤＮＡ分子を所望の配向に整列させて；（ｃ）有効濃度のＣａ２＋を緩衝液流動に添加し；そして（ｄ）場合によって緩衝液からＣａ２＋を洗い流す工程を含む。１つの態様において、カルシウム濃度は、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約１．５ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約４．５ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５．５ｍＭ、少なくとも約６ｍＭ、少なくとも約６．５ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ、少なくとも約７．５ｍＭ、少なくとも約８ｍＭ、少なくとも約８．５ｍＭ、少なくとも約９ｍＭ、少なくとも約９．５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、または少なくとも約１０．５ｍＭである。
【００２６】
[0028]別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の一般の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書記載のものと類似であるかまたは同等の方法および物質が、本発明の実施または試験において使用可能であるが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本明細書に完全に援用される。矛盾がある場合、定義を含めて、本明細書が統制するであろう。さらに、物質、方法、および実施例は、例示のみであり、そして限定を意図しない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、そして請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】[0029]図１Ａ〜Ｃは、拡散バリアで整列した脂質束縛ＤＮＡ分子の図である。図１Ａは、ＤＮＡの単一分子を画像化するのに用いられる全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の図を示す。ＴＩＲＦＭによって画像化するためには、これらの研究で用いる長いＤＮＡ分子（４８ｋｂ）は、エバネッセント場内に閉じ込められたままであるために、試料チャンバー表面に対して平行に伸長しなければならない。
【図１Ｂ】[0029]図１Ａ〜Ｃは、拡散バリアで整列した脂質束縛ＤＮＡ分子の図である。図１Ｂ〜Ｃは、バリアに沿った石英ガラススライド表面上の二重層、および水力学的な力の適用に対する、束縛されたＤＮＡ分子の反応を示す。図１Ｂ〜Ｃの上部および下部パネルは、それぞれ、側面および上面からの図を示す。緩衝液流動がない場合（図１Ｂ）、ＤＮＡ分子は表面に束縛されるが、エバネッセント場内に閉じ込められないし、またバリアで整列もしない。図１Ｃに示すように、流動を適用した際、ＤＮＡ分子は、拡散バリアに出会うまで二重層を通じて引っ張られ、バリアに出会った時点で、互いに関して整列し、そしてＤＮＡ分子のカーテンを形成する。
【図１Ｃ】[0029]図１Ａ〜Ｃは、拡散バリアで整列した脂質束縛ＤＮＡ分子の図である。図１Ｂ〜Ｃは、バリアに沿った石英ガラススライド表面上の二重層、および水力学的な力の適用に対する、束縛されたＤＮＡ分子の反応を示す。図１Ｂ〜Ｃの上部および下部パネルは、それぞれ、側面および上面からの図を示す。緩衝液流動がない場合（図１Ｂ）、ＤＮＡ分子は表面に束縛されるが、エバネッセント場内に閉じ込められないし、またバリアで整列もしない。図１Ｃに示すように、流動を適用した際、ＤＮＡ分子は、拡散バリアに出会うまで二重層を通じて引っ張られ、バリアに出会った時点で、互いに関して整列し、そしてＤＮＡ分子のカーテンを形成する。
【図１Ｄ】[0030]図１Ｄは、数千のＤＮＡ分子を示すスライドの図であり（上部パネル）、ここで水力学的な力の存在下で、ＤＮＡ分子は、拡散バリアの前縁に沿って組織化される。
【図１Ｅ】[0031]図１Ｅは、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の概観図である。
【図２】[0032]図２は、パターン形成されたクロム拡散バリアの画像である。所望のバリアパターンの全体の設計を図２Ａに示し、そしてバリアの重要な特徴を示す。単一のバリアセットの拡大した光学的画像を図２Ｂに示し、そして０．５％ローダミン−ＤＨＰＥを含有する二重層の沈着後のバリアセットの複合蛍光画像を図２Ｃに示す。図２Ｄは、石英ガラス上に沈着した２ｘ３シリーズのクロム製バリアセットの１０倍拡大光学的画像を示す。上流および下流領域を示し、そして矢印は、緩衝液がバリアパターンに対して流動する方向を示す。
【図３】[0033]図３は、バリア性質決定のためのより高倍の画像である。図３Ａは、表面上の高さ３１ｎｍのクロムバリアを含む石英ガラスの１０．５ｘ１０．５μｍ領域のＡＦＭ画像を示す。上から見たクロムバリアのＳＥＭ画像を図３Ｂに示す。図３Ｂ中のスケールバーは、１００ｎｍ増分に分けられる。比較のため、図３Ｃ〜Ｄは、それぞれ、表面を手動でエッチングすることによって作製されたバリアのＡＦＭおよびＳＥＭ画像を示す。図３Ｄ中のスケールバーは、５μｍ増分に分けられる。手動でエッチングしたバリアの幅は、λ−ＤＮＡ分子の実際の長さに匹敵することに注目されたい。
【図４】[0034]図４は、ナノスケール拡散バリアで組み立てられたＹＯＹＯ１染色λ−ＤＮＡカーテンの画像である。図４Ａは、バリアで整列した後、６０倍で画像化されたＤＮＡ分子を示す。緩衝液流動の方向は、上部から底部であり、そして点線は、画像が多数のバリアセットを持つ表面から得られることを強調する。この単一の画像におよそ８０５のＤＮＡ分子がある（第一列、第二列、第三列、第四列、および第五列に、それぞれ、〜１５０、１８５、１８５、１５５、および１３０の分子）。図４Ｂは、緩衝液流動を停止した直後のＤＮＡ分子の反応を示す。これは、分子が表面から迅速に引っ込み、束縛された端のみがエバネッセント場内に残ることを示す。図４Ｃでは、ＤＮＡ分子はクロムバリアから拡散し始め、そして図４Ｄは、緩衝液流動が再開された直後、ＤＮＡ分子のバリアでの再整列を引き起こした、同じ視野を示す。図４Ｅ〜Ｇは、それぞれ、緩衝液流動がある、緩衝液流動がない、および次いで流動再開後の、１０倍で示す２ｘ３シリーズのバリアセットを示す。１０倍画像での一様でない蛍光シグナルは、エバネッセント場での不均一性による。
【図５Ａ】[0035]図５は、λ−ＤＮＡカーテンの物理的マッピングを示す。〜２１ｋｂの束縛産物を生じるＥｃｏＲＩでの完全消化前（図５Ａ）および消化後（図５Ｂ）の、分子の左端で束縛されたλ−ＤＮＡのカーテンを示す。
【図５Ｂ】[0035]図５は、λ−ＤＮＡカーテンの物理的マッピングを示す。〜２１ｋｂの束縛産物を生じるＥｃｏＲＩでの完全消化前（図５Ａ）および消化後（図５Ｂ）の、分子の左端で束縛されたλ−ＤＮＡのカーテンを示す。
【図５Ｃ】[0035]図５は、λ−ＤＮＡカーテンの物理的マッピングを示す。図５Ｃ〜Ｄは、３．５ｋｂの束縛産物を生じるはずである、ＥｃｏＲＩでの消化前および消化後の、右端で束縛されたλ−ＤＮＡを示す。
【図５Ｄ】[0035]図５は、λ−ＤＮＡカーテンの物理的マッピングを示す。図５Ｃ〜Ｄは、３．５ｋｂの束縛産物を生じるはずである、ＥｃｏＲＩでの消化前および消化後の、右端で束縛されたλ−ＤＮＡを示す。
【図５Ｅ】図５は、λ−ＤＮＡカーテンの物理的マッピングを示す。図５Ｅの画像およびヒストグラムは、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＰｖｕＩ、およびＳｐｈＩでの一連の連続消化後の、左端で束縛された未切断λ−ＤＮＡの長さ分布（バリア縁からＤＮＡ端までを測定）を示す。
【図５Ｆ】図５は、λ−ＤＮＡカーテンの物理的マッピングを示す。図５Ｆ〜Ｇのヒストグラムは、それぞれ左または右端いずれかで束縛されたλ−ＤＮＡを用いた部分的ＥｃｏＲＩ消化の結果を示す。ピーク値から外れた断片は、レーザーが誘導するＹＯＹＯ１染色ＤＮＡの二本鎖ブレークまたは未切断ＤＮＡ分子のためのいずれかであった。
【図５Ｇ】図５は、λ−ＤＮＡカーテンの物理的マッピングを示す。図５Ｆ〜Ｇのヒストグラムは、それぞれ左または右端いずれかで束縛されたλ−ＤＮＡを用いた部分的ＥｃｏＲＩ消化の結果を示す。ピーク値から外れた断片は、レーザーが誘導するＹＯＹＯ１染色ＤＮＡの二本鎖ブレークまたは未切断ＤＮＡ分子のためのいずれかであった。
【図６】[0036]図６は、幾何学的ナノウェルのための設計戦略を示す。図６Ａは、ＴＩＲＦＭ顕微鏡およびエバネッセント場を生じるのに用いられる照明幾何学の単純化した図を示す。ＤＮＡカーテンを作製するため、石英ガラス試料チャンバーの表面に、支持された脂質二重層をコーティングし、そしてＤＮＡ分子を二重層内の脂質に一端で係留する。図６Ｂは、緩衝液流動の存在下および非存在下（それぞれ右および左のパネル）の側面から見た表面の例示を示す。表面上に設計されたバリアは二重層を破壊し、そして流動を適用すると、ＤＮＡ分子はその縁に対して集積する。非直線幾何学的バリアのパターンは、図６Ｃの上から見たときに明らかになり、そしてＤＮＡ分子は隣接する三角形の頂点内に装填される。
【図７】[0037]図７は、幾何学的ナノウェルを持つ拡散バリアの画像である。図７Ａは、平行バリアが鋸歯パターンで作製されて、幾何学的ナノウェルを形成する、２つのバリアパターンの画像を示す。この画像は、０．１％ローダミン−ＤＨＰＥ（赤で示される）を含有する支持された脂質二重層の沈着後、１０倍で収集され、そしてバリア自体は、脂質によって覆われないため、黒く見える。図７Ｂは、１μｍ間隔で反復する代表的な非直線の幾何学的パターンを持つ、高さ２０ｎｍのクロムバリアを伴う石英ガラスの１０ｘ１０μｍ領域のＡＦＭ画像を示す。上から見たクロムバリアのＳＥＭ画像を図７Ｃ〜Ｈに示す。これらのパターンのピークからピークまでの距離は、図７Ｃ〜Ｈに関して、それぞれ、２０００、１０００、７５０、５００、３５０、および２００ｎｍである；ＳＥＭ画像を同じ倍率で示し、そして２００ｎｍスケールバーを、参照のため、各々に示す。
【図８】[0038]図８は、異なる分離距離を持つＤＮＡカーテンを示す。異なるパネルは、示すように、２０００、１０００、７５０、５００、３５０、および２００ｎｍの間隔を持つ非直線の幾何学的バリアパターンを用いて調製したＹＯＹＯ１染色ＤＮＡカーテン由来の割面の例を示す。同じカーテンの蛍光横断面を得てもよい。横断面測定から強度ヒストグラムを生成してもよい。
【図９】[0039]図９は、非直線の幾何学的バリアパターンを用いて、ＤＮＡスリッページが除去されることを示す。図９Ａの左パネルは、滑らかな直線バリア縁で組み立てられたＤＮＡカーテン由来の割面の単一の１００ミリ秒画像を示す。ＤＮＡ分子は、ＹＯＹＯ１で染色された２０ｋｂ  ＰＣＲ産物で構成される。図９Ａの右のパネルは、カーテンの横断面の１３．５秒に渡るキモグラム（示す通り）を示し、ＤＮＡ分子の側方スリッページを例示する。図９Ｂの左のパネルは、１μｍ間隔での非直線の幾何学的バリアで組み立てられたＤＮＡカーテンを示す。ＤＮＡ分子の長さは、示す通り、４８．５、３４、２１、１１、および５ｋｂであり、そして４８．５ｋｂ  λ−ＤＮＡより短い断片は、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺを用いたλの制限消化によって生成された。図９Ｂの右のパネルは、これらのＤＮＡの側方運動が、非直線の幾何学的バリアパターンでは除去されたことを示す、１３．５秒キモグラムを示す。
【図１０】[0040]図１０は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの動的光学的制限マッピングの画像である。図１０Ａ〜Ｂに示すキモグラムは、ＥｃｏＲＩのみまたはＢａｍＨＩのみのいずれかを用いたリアルタイム制限消化の代表的な例を示す。各キモグラムセットの下のヒストグラムは、各消化経過中に観察されるＤＮＡ断片の測定された長さに相当する。
【図１１Ａ】[0041]図１１Ａ〜Ｄは、流動（Ｆ）の非存在下および存在下での、ゲート化ナノウェルの図である。図は一定の縮尺ではなく、バリアの寸法を改変して、特定の実験必要条件を満たしてもよく、そして設計はナノファブリケーション技術（電子ビーム・リソグラフィーなど）に頼ることに注目されたい。
【図１１Ｂ】[0041]図１１Ａ〜Ｄは、流動（Ｆ）の非存在下および存在下での、ゲート化ナノウェルの図である。図は一定の縮尺ではなく、バリアの寸法を改変して、特定の実験必要条件を満たしてもよく、そして設計はナノファブリケーション技術（電子ビーム・リソグラフィーなど）に頼ることに注目されたい。
【図１１Ｃ】[0041]図１１Ａ〜Ｄは、流動（Ｆ）の非存在下および存在下での、ゲート化ナノウェルの図である。図は一定の縮尺ではなく、バリアの寸法を改変して、特定の実験必要条件を満たしてもよく、そして設計はナノファブリケーション技術（電子ビーム・リソグラフィーなど）に頼ることに注目されたい。
【図１１Ｄ】[0041]図１１Ａ〜Ｄは、流動（Ｆ）の非存在下および存在下での、ゲート化ナノウェルの図である。図は一定の縮尺ではなく、バリアの寸法を改変して、特定の実験必要条件を満たしてもよく、そして設計はナノファブリケーション技術（電子ビーム・リソグラフィーなど）に頼ることに注目されたい。
【図１２Ａ】[0042]図１２Ａは、二重束縛ＤＮＡのカーテンを作製するためのＤＮＡラックの図である。図は、ＤＮＡラックを含むバリア要素の全体の設計を示す。ガイドチャネルを用いて、ゲート化ナノポアを通じ、そしてステージング領域内に、脂質に係留されたＤＮＡ分子を導く。数百または数千のＤＮＡ分子をステージング領域内に装填し、そして装填されたならば、二股ナノチャネルを通じて、これらの分子をラック領域内に押し込む。圧力に基づくフィルター／出口ポートは、これらのチャネルの端にある。
【図１２Ｂ】[0043]図１２Ｂは、ラックにどのようにＤＮＡを装填するかを示す図である。まず、ＤＮＡ分子を両端で、ミクロ流体試料チャンバーの表面をコーティングする脂質二重層に係留する。次いで、緩衝液流動を用いて、これらの分子をステージング領域内に押し込み、そしてステージング領域が十分な数のＤＮＡ分子で装填されたならば、緩衝液流動を終結させてもよい。ＤＮＡ分子は、ゲート化ナノポアを通じて、拡散して戻ることは容易には出来ないため、ステージング領域内に保持される。この段階で、接線方向の力を適用して（緩衝液流動または電気泳動のいずれか）、この力がＤＮＡ分子を二股ナノチャネルを通じて押し込む（図の右側に向けて）。ＤＮＡ分子は、（ｉ）壊れた、（ｉｉ）長すぎた、（ｉｉｉ）一端のみで係留された、または（ｉｖ）係留された両端が二股の同じ側に通過した場合に、出口ポートを通過し、そして廃棄される。対照的に、ＤＮＡ分子は、両端が二重層に係留され、個々の分子の端が、二股の別個の側を通過し、そしてＤＮＡがラックの内部縁を分ける距離より長いが、圧力に基づくフィルター／出口ポートの寸法によって設計される長さよりも短いた場合、ラック内に保持されるであろう。全体の設計の寸法を調整して、任意の所望のＤＮＡ基質に適応させることも可能である。
【図１３】[0044]図１３は、拡散バリアで整列した脂質束縛ＤＮＡ分子のＤＮＡラック設計図である。図１３Ａは、ＤＮＡの単一分子を画像化するのに用いられる、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の図を示す。ＴＩＲＦＭによって画像化するためには、これらの研究に用いる長いＤＮＡ分子（４８ｋｂ）は、エバネッセント場内に閉じ込められたままであるために、試料チャンバー表面に対して平行に伸長されなければならない。図１３Ｂ〜Ｃは、石英ガラススライド表面上の二重層、ならびに直線バリアおよびナノチャネルによって分離された一連の整列五角形で構成される単一バリアセットの漫画での例示を示す。やはり示すのは、水力学的な力の適用に対する束縛ＤＮＡ分子の反応である。それぞれ、マゼンタの円は、ビオチン化端であり、そして赤い正方形は、ＤＮＡのジゴキシゲニン標識端である。図１３Ｂ〜Ｃの上部および下部パネルは、それぞれ、側面および上部からの図を示す。緩衝液流動の非存在下（図１３Ｂ）、ＤＮＡ分子は表面に束縛されるが、エバネッセント場内に閉じ込められず、またバリアで整列もしない。図１３Ｃに示すように、流動を適用した際、ＤＮＡ分子は、直線拡散バリアに出会うまで、二重層を通じて引っ張られ、バリアに出会った時点で、互いに関して整列し、そしてＤＩＧ標識端は、抗体でコーティングされた五角形に係留される。直線バリアおよび五角形の間に位置するＤＮＡは、ナノチャネルを通過し、そして次に利用可能な、パターンを形成する直線バリアに向かう。図１３Ｄの図は、全体のパターン内で、隣接するバリアセット間で用いられる多様な間隔を強調する。
【図１４】[0045]図１４は、ＤＮＡラック要素のナノファブリケーションおよび性質決定を示す。図１４Ａは、異なるバリアセット間に多様な間隔を持つ、表面パターンの割面からの低倍率（２０ｘ）光学的画像を示す。第一および第二のパターン間の距離は１００μｍであり、そして第二および第三のパターン間の距離は２００μｍであった。１００倍で収集した単一バリアセットのより高解像度の光学的画像を図１４Ｂに示し、そして関連するパターン寸法を示す。ＡＦＭ画像を図１４Ｃに示し、直線バリアおよび五角形の高さ、ならびにこれらの２つのバリア要素間の距離を強調する。単一直線バリアおよびアレイ化五角形を含むパターンのＳＥＭ画像を図１４Ｄに示す。
【図１５】[0046]図１５は、二重束縛ＤＮＡのカーテンを示す。図１５Ａは、二重束縛カーテンの例を示す。ＤＮＡ分子をＹＯＹＯ１で染色し、そしてニュートラアビジン−ビオチン相互作用を通じて、脂質二重層に一端で係留し、そして抗体−ハプテン連結を通じて、もう一端で係留した。「二重束縛ＤＮＡ」と示された領域中の各垂直線は、単一蛍光ＤＮＡ分子に相当する。図１５Ｂ〜Ｃは、より高流動力の短時間の適用を通じて、抗体でコーティングした五角形に、分子の第二端を係留させる前（上部パネル）およびさせた後（下部パネル）の、直線バリアの前縁で整列したＤＮＡカーテンのＴＩＲＦＭ画像での例を示す。最初の整列に用いた流速は、２０μｌ／分であり、そしてＤＮＡの第二の端で係留するのに用いた流速は、２〜３ｍｌ／分（示す通り）であった。すべての画像は、緩衝液流動の非存在下で撮影した。図１５Ａ〜Ｂで示す実験は、Ｔｉ−Ａｕで作製されたバリアおよび五角形、ＤＩＧ標識ＤＮＡ分子および抗ＤＩＧコーティング五角形を用い、一方、図１５Ｃに示す実験は、Ｃｒバリアおよび五角形、ＢｒｄＵ標識ＤＮＡ分子および抗ＢｒｄＵコーティング五角形（示す通り）を示す。すべての画像において、直線バリア（Ｌ）および五角形（Ｐ）の位置を強調する。直線バリア上に位置する明るい蛍光シグナルは、二重層にビオチン化端で係留されたのみのＤＮＡから生じる。
【図１６】[0047]図１６は、ＤＮＡ分子の定義された配向を示す。この図は、ＤＮＡ中央に印を付ける、単一ＤＩＧ−Ｑドットタグを持つ、２つの単一束縛ＤＮＡカーテンの例を示す。分子がすべて同じ配向にあることの検証を提供するため、二重束縛カーテンを用いて、これを反復する必要がある。
【図１７】[0048]図１７は、１Ｄタンパク質拡散を視覚化するためのＤＮＡラックの使用を示す。図１７Ａは、ＱＤ標識されたＭｌｈ１−Ｐｍｓ１が結合した二重束縛ＤＮＡカーテンの例を示す。ＤＮＡを緑で示し、そしてタンパク質をマゼンタで示す。この画像は、１分間ビデオから取った単一の１００ミリ秒画像に相当する。図１７Ｂは、小文字および対応する矢頭で示すような、図１７Ａ内由来の個々のＤＮＡ分子から作製した５つの代表的なキモグラムを示す。
【図１８】[0049]図１８は、ＤＮＡラック設計図である。拡散バリアで整列した脂質束縛ＤＮＡ分子の概念図。図１８Ａは、ＤＮＡの単一分子を画像化するのに用いる全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の図を示す。ＴＩＲＦＭによって画像化するためには、これらの研究に用いる長いＤＮＡ分子（４８ｋｂ）は、エバネッセント場内に閉じ込められたままであるために、試料チャンバー表面に対して平行に伸長されなければならない。図１８Ｂ〜Ｃは、石英ガラススライド表面上の二重層、ならびに直線バリアおよびナノチャネルによって分離された一連の整列五角形で構成される単一バリアセットの漫画での例示を示す。やはり示すのは、水力学的な力の適用に対する束縛ＤＮＡ分子の反応である。それぞれ、マゼンタの円は、ビオチン化端であり、そして赤い正方形は、ＤＮＡのジゴキシゲニン標識端である。図１８Ｂ〜Ｃの上部および下部パネルは、それぞれ、側面および上部からの図を示す。緩衝液流動の非存在下、ＤＮＡ分子は表面に束縛されるが、エバネッセント場内に閉じ込められず、またバリアで整列もしない。図１８Ｃに示すように、流動を適用した際、ＤＮＡ分子は、直線拡散バリアに出会うまで、二重層を通じて引っ張られ、バリアに出会った時点で、互いに関して整列し、そしてＤＩＧ標識端は、抗体でコーティングされた五角形に係留される。直線バリアおよび五角形の間に位置するＤＮＡは、ナノチャネルを通過し、そして次に利用可能な、パターンを形成する直線バリアに向かう。
【図１９】[0050]図１９Ａ〜Ｄは、ＤＮＡの二重束縛カーテンを示す画像である。
【図２０】[0051]図２０Ａ〜Ｂはフローセルの設計を示す。
【図２１】[0052]図２１は、ＤＮＡラックの設計および製作を示す。２つの直交性チャネルを持つフローセルを図２１Ａに示し、そして色分けされた矢頭は、２つの入口ポートとそれに沿った対応する出口ポートを示す。スライド表面上のラックの５ｘ５アレイ化パターンを示す低倍率（１０ｘ）光学的画像を図２１Ｂに示す。パターンは、示すように、交差緩衝液チャネルの接合部に位置する。各スライド上に５ｘ５アレイが２５あり、したがって、総数６２５の個々のＤＮＡラックが２ｍｍ２の表面積を網羅する。図２１Ｃは、ラック要素のアレイ化パターンの割面を含む低倍率ＳＥＭ画像を示す。図２１Ｄは、単一ラックパターンの高倍率ＳＥＭ画像を示す。単一ラックパターンの高倍率（１００ｘ）光学的画像を図２１Ｅに示し、そして直線バリア、五角形のアンカー、および隣接する五角形間のチャネルをすべて示す。２つの別個の入口チャネル各々からの緩衝液流動の方向に対するバリアの配向を強調する、色分けされた矢頭もまた示す。図２１Ｆは、金属パターンの高さを例示するラインプロフィールとともに単一ラックの割面からのＡＦＭ画像を示す。
【図２２】[0053]図２２は、ＤＮＡの十字パターンを示す。この画像は、十字ＤＮＡ分子の例を含有する。ＤＮＡ（緑）をＹＯＹＯ１で染色し、そしてＤＮＡ分子間の接合点を赤い矢頭で示す。
【図２３】[0054]図２３は、ナノファブリケーションで製作したＤＮＡカーテンを用いて測定された、タンパク質結合分布を示す。図２３Ａ〜Ｂは、それぞれ、一過性に停止した緩衝液流動の前および後の、ＤＮＡカーテンに結合した、蛍光タグ化Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ３の例を示す。タンパク質をマゼンタで示し、そしてＤＮＡ分子を緑で示す。図２３Ｃは、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ３結合分布のキモグラムを示し、そして記載するようにタンパク質の位置を測定した。
【図２４Ａ】[0055]図２４Ａ〜Ｄは、異なる分離距離のＤＮＡカーテンを示す写真画像である。パネル図２４Ａ〜Ｂは、それぞれ、緩衝液流動の存在下での、および流動を中断した直後の、１０００ｎｍ間隔で、バリアで組み立てられたＤＮＡカーテンの例を示す。分子は、ＹＯＹＯ１で染色した４８．５ｋｂ  λ  ＤＮＡである。
【図２４Ｂ】[0055]図２４Ａ〜Ｄは、異なる分離距離のＤＮＡカーテンを示す写真画像である。パネル図２４Ａ〜Ｂは、それぞれ、緩衝液流動の存在下での、および流動を中断した直後の、１０００ｎｍ間隔で、バリアで組み立てられたＤＮＡカーテンの例を示す。分子は、ＹＯＹＯ１で染色した４８．５ｋｂ  λ  ＤＮＡである。
【図２４Ｃ】[0055]図２４Ａ〜Ｄは、異なる分離距離のＤＮＡカーテンを示す写真画像である。分子は、ＹＯＹＯ１で染色した４８．５ｋｂ  λ  ＤＮＡである。図２４Ｃ〜Ｄは、それぞれ、緩衝液流動の存在下での、および流動を中断した直後の、１９００ｎｍ間隔で、バリアで組み立てられたＤＮＡカーテンを示す。
【図２４Ｄ】[0055]図２４Ａ〜Ｄは、異なる分離距離のＤＮＡカーテンを示す写真画像である。分子は、ＹＯＹＯ１で染色した４８．５ｋｂ  λ  ＤＮＡである。図２４Ｃ〜Ｄは、それぞれ、緩衝液流動の存在下での、および流動を中断した直後の、１９００ｎｍ間隔で、バリアで組み立てられたＤＮＡカーテンを示す。
【図２４Ｅ】[0056]図２４Ｅは、異なる分離距離を持つＤＮＡカーテンを示す一連の写真画像である。これらは、示すように、１９００、１０００、７５０、５００、３５０、および２００ｎｍの間隔の非直線幾何学的バリアパターンを用いて調製されたＹＯＹＯ１染色ＤＮＡカーテンからの割面の例を示す。ここで用いるＤＮＡ分子は、ヒトβ−グロビン遺伝子座由来の２３ｋｂ  ＰＣＲ産物である。
【図２４Ｆ】[0057]図２４Ｆは、図２４Ａ〜Ｅに記載したものと同じカーテンの蛍光横断面のグラフを示し、そして隣接するＤＮＡピークのいくつかの代表的な例の間の距離をマイクロメートルで示すグラフである。これらの画像は、示す間隔で、ナノウェルバリアの異なるセットを含有する単一のフローセルから収集した。
【図２４Ｇ】[0058]図２４Ｇは、１９００、１０００、７５０、および５００ｎｍの間隔で、非直線の幾何学的バリアパターンを用いて作製したＤＮＡカーテンの横断面からのフーリエ変換の標準化パワースペクトルを示すグラフである。３５０および２００ｎｍバリアパターン上では、この分析を行うには光学的解像度が不十分であることに注目されたい。バリア設計に基づく所定の距離の値、ＦＴ分析によって見出されたピーク分離、および対応する観察される分離距離をすべて示す（挿入図）。
【図２５】[0059]図２５は、滑らかなバリア縁で組み立てられた異なるＤＮＡカーテンからの割面の単一の１００ｍｓ画像を示す写真画像である。ＹＯＹＯ１染色分子は、示すように、４８．５ｋｂ  λ  ＤＮＡまたは２３ｋｂ  ＰＣＲ産物のいずれかで構成される。右のパネルは、１３．５ｓの期間に渡る同じ画像からの横断面のキモグラムを示し、バリア縁に沿ったＤＮＡ分子の側方スリッページを例示する。ＤＮＡスリッページは、図９Ｂに示すように、非直線の幾何学的バリアパターンでは除去される。
【図２６Ａ】[0060]図２６Ａは、ナノウェル間が１．９μｍ間隔のバリアで、異なるＤＮＡ密度で組み立てられたＤＮＡカーテンの例を示す写真画像を提供する。同じ画像の蛍光横断面を図２６Ｂに示し、そして着色されたバーは、示すように、１、２、３、および＞３のＤＮＡいずれかの、ナノウェルあたりに装填された異なる数のＤＮＡに関して観察された相対的蛍光シグナル強度（任意単位）を強調する。これは、ナノウェル内への単一ＤＮＡ分子の装填を要約する。
【図２６Ｂ】[0060]図２６Ａは、ナノウェル間が１．９μｍ間隔のバリアで、異なるＤＮＡ密度で組み立てられたＤＮＡカーテンの例を示す写真画像を提供する。同じ画像の蛍光横断面を図２６Ｂに示し、そして着色されたバーは、示すように、１、２、３、および＞３のＤＮＡいずれかの、ナノウェルあたりに装填された異なる数のＤＮＡに関して観察された相対的蛍光シグナル強度（任意単位）を強調する。これは、ナノウェル内への単一ＤＮＡ分子の装填を要約する。
【図２６Ｃ】[0061]図２６Ｃは、ナノウェル内のＤＮＡ占有状態の分布を示すヒストグラムである。本明細書で用いた条件下では、４４％のナノウェルが単一ＤＮＡ分子で装填された。
【図２６Ｄ】[0062]図２６Ｄは、幾何学的ナノウェル内に装填される単一ＤＮＡ分子のリアルタイムＡＶａＩ制限消化を示す写真画像と、キモグラムの示す横断面から取ったシグナル強度の対応するグラフである。ＡＶａＩの注入を緑の矢印で示し、そして個々のＤＮＡ切断事象を白の矢印で示す。２３ｋｂ  ＤＮＡには３つのＡＶａＩ切断部位があるが、注入した酵素が低濃度であるため、一部のみが切断されることに注目されたい。
【図２６Ｅ】[0062]図２６Ｅは、２つのＤＮＡ分子が単一のナノウェル内に装填された際の、同じＡＶａＩ消化の結果を示す写真画像である。ここでは、第一の切断事象が減少を引き起こすが、下流ＹＯＹＯ１シグナルの完全な喪失は引き起こさない。
【図２７Ａ】[0063]図２７は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの動的光学的制限マッピングの写真画像を示す。図２７Ａ〜Ｂのキモグラムは、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩのいずれかを用いたλファージゲノムのリアルタイム制限消化の代表的な例を示す。λの図を左に示し；ＤＮＡの束縛端を示し、キロ塩基（ｋｂ）での予測される切断部位およびマイクロメートル（μｍ）での観察される断片長もまた示す。
【図２７Ｂ】図２７は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの動的光学的制限マッピングの写真画像を示す。図２７Ａ〜Ｂのキモグラムは、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩのいずれかを用いたλファージゲノムのリアルタイム制限消化の代表的な例を示す。λの図を左に示し；ＤＮＡの束縛端を示し、キロ塩基（ｋｂ）での予測される切断部位およびマイクロメートル（μｍ）での観察される断片長もまた示す。
【図２８】[0064]図２８は、ＤＮＡカーテン上の蛍光タグ化組換えヌクレオソームの視覚化を示す。図２８Ａは、実験設計を示し；ナノファブリケーションおよびＤＮＡカーテン組み立ての完全な詳細は、Ｆａｚｉｏら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．  ２４，  １０５２４−１０５３１（２００８））に見出されうる。ＱＤタグ化ヌクレオソームが結合したＹＯＹＯ１染色ＤＮＡカーテン（緑）を図２８Ｂに示す。各カーテンの束縛端をＴ１〜Ｔ４として示し、そして矢印は流動方向を示す。１つのＤＮＡ分子上の５つのヌクレオソームを例示するキモグラムを図２８Ｃに示す。流動が一時的に中断されると（赤い矢頭）ヌクレオソームは消失し、そして流動が再開すると（緑の矢頭）再出現し、これらがＤＮＡに結合しているのであり、そして脂質二重層と相互作用しないことが検証される。レーザーが誘導するＤＮＡの光切断を回避するため、ＹＯＹＯ１を伴わずに収集された、より長いキモグラムを図２８Ｄに示す。挿入図は、流動が一過性に中断された３０秒間のウィンドウを強調する。他のシグナルギャップはＱＤ点滅から生じる。２５分間の観察中、０．９％のヌクレオソーム（５８０のうち５）が移動し、そして／またはＤＮＡから解離し、そして残りの９９．１％が安定であった。
【図２９Ａ】[0065]図２９Ａは、バクテリオファージλ−ＤＮＡ上の予測されるおよび観察されるヌクレオソーム分布パターンを示すグラフを示す。λ−ＤＮＡのＳｅｇａｌ（マゼンタ）およびＦＫＦＭ（緑）モデルによって予測されるヌクレオソーム分布を示す。非対称性に分布し、そしてファージ・ゲノムの３．２％を含む５量体以上のポリ（ｄＡ−ｄＴ）トラクト（灰色のバー）の分布を重ねたλのＡＴ含量を示す（青い線：  １００ｂｐウィンドウで計算する）。観察されるヌクレオソーム分布を下部パネルに示し、そしてこれは、標準的なヌクレオソームおよびＨ２ＡＺを所持するヌクレオソーム（図３８Ａ〜Ｂ）両方からのデータで構成される。理論的なデータを１ｂｐ解像度で示し、そして観察されるデータを７５８ｂｐビンにコンパイルする。図３１は、予測される位置が、実験データと同じ解像度にビニングされる例を示す。
【図２９Ｂ】[0066]図２９Ｂは、ＳｅｇａｌおよびＦＫＦＭ予測に比較した、ポリ（ｄＡ−ｄＴ）分布および観察されるヌクレオソーム分布のピアソン相関分析を示すグラフである。
【図３０Ａ】[0067]図３０Ａは、セントロメア・ヌクレオソームに関する熱力学的景観を示す。緩衝液流動の存在下および非存在下での写真画像を示し（第一列）；第二列には集団分布ヒストグラムを示し；第三列には標準的／Ｈ２ＡＺ分布でのオーバーレイのグラフを示し；そして第四列にはＣｓｅ４を所持するヌクレオソームに関する相関分析を示すグラフを示す。
【図３０Ｂ】[0068]図３０Ｂは、セントロメア・ヌクレオソームに関する熱力学的景観を示す。緩衝液流動の存在下および非存在下での写真画像を示し（第一列）；第二列には集団分布ヒストグラムを示し；第三列および第四列には、それぞれ、標準的／Ｈ２ＡＺおよびＣｓｅ４分布でのオーバーレイのグラフを示し；そして第五列にはＣｓｅ４／Ｓｃｍ３を所持するヌクレオソームに関する相関分析を示すグラフを示す。
【図３１】[0069]図３１は、ヒトβ−グロビンＤＮＡ上の予測されるおよび観察されるヌクレオソーム分布パターンを示す。図３１Ａは、８２ｋｂヒトβ−グロビン遺伝子座の概観を示し、この研究で用いた２３ｋｂ断片（染色体１１  ５，２０５，９４１〜５，２２９，２５９）の詳細を強調する。Ｓｃｈｏｎｅｓら（Ｃｅｌｌ．  １３２，８８７−８９８（２００８））からのｉｎ  ｖｉｖｏヌクレオソーム位置（紫）、ならびにＣｏｒｆｕ  δβ−サラセミア患者で見られるδ−グロビン遺伝子の大部分および上流配列の〜６ｋｂに渡る〜７．２ｋｂ欠失もまた示す。大きい目盛りは１ｋｂ間隔であり、そして小さい目盛りは２００ｂｐの細分である。２３ｋｂ断片に関するＳｅｇａｌ（マゼンタ）およびＦＫＦＭ（緑）モデルによって予測されるヌクレオソーム分布パターンを、単一分子画像化によって決定されるヌクレオソーム沈着の観察されるパターン（青）とともに図３１Ｂに示す。図３１Ｃは、Ｓｅｇａｌ（左のパネル）およびＦＫＦＭモデル（右のパネル）からの結果と比較した、β−グロビン遺伝子座に関する観察されたデータのピアソン相関分析を示すグラフである。
【図３２】[0070]図３２は、ＤＮＡカーテンの単一分子集団測定を伴うターゲット部位分布パターンの決定を示す。図３２Ａは、単一蛍光ＱＤを用いて、末端または内部位置で標識されたＤＮＡの例を示す。ＤＮＡをＹＯＹＯ１で染色し、そして緑で示し、そしてＱＤをマゼンタで示す。上部パネルは、ＤＮＡを伸長するための緩衝液流動の適用中に獲得される画像を示し、そして下部パネルは、ＤＮＡ分子またはＱＤのいずれもが表面に非特異的に結合していないことを検証するため、一過性に緩衝液流動を終結させた後に取られた対照画像を示す。λ−ＤＮＡの右端の１２ヌクレオチド・オーバーハングにジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、末端標識ＤＮＡ基質を作製した。ビオチン化λ−ＤＮＡをニック形成酵素Ｎｂ．ＢｓｍＩおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）で処理して、２６，１５１〜２６，１６６ｂｐの１６ｂｐ領域に隣接してニックを生成することによって、内部標識ＤＮＡ基質を構築した。１６ｂｐギャップに相補的なＤＩＧタグ化オリゴヌクレオチドを最終濃度５００ｎＭまで添加し、そして５５℃で３０分間インキュベーションして交換を可能にした。反応を室温まで冷却した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを添加した。ＤＩＧタグ化ＤＮＡ基質をＤＮＡカーテンに組み立て、ＹＯＹＯ１で染色し、そして抗ＤＩＧ  ＱＤで標識した。操作したタグの位置を例示するヒストグラムを図３２Ｂに示す。ヌクレオソーム位置アッセイのものと同一の条件下でデータを収集し、そして方法に記載するように、タグの位置を測定した。内部タグは、実際の位置の３７ｂｐ以内に位置し、そして末端タグは、既知の位置の１５３ｂｐ以内に位置した。
【図３３Ａ】[0071]図３３Ａ〜Ｃは、組換えヌクレオソームの性質決定を示すブロットの写真画像である。図３３Ａは、ＦＬＡＧ−Ｈ２Ｂで作製された精製ヒストン八量体のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。単一分子アッセイのため、４８．５ｋｂ  λ−ＤＮＡ、またはＥｘｐａｎｄ  ２０ｋｂ  ＰＬＵＳ  ＰＣＲ系（Ｒｏｃｈｅ）を用いて作製されたヒトβ−グロビン遺伝子座の２３ｋｂ  ＰＣＲ断片によってヌクレオソームを組み立てた。塩透析を用いてヌクレオソームを組み立てた（以下を参照されたい）。ＤＮＡ対ヒストン八量体の比は多様であり、そして小球菌ヌクレアーゼアッセイを用いて、ヌクレオソーム組み立てを検証した（図３３Ｂ）。
【図３３Ｂ】[0071]図３３Ａ〜Ｃは、組換えヌクレオソームの性質決定を示すブロットの写真画像である。図３３Ａは、ＦＬＡＧ−Ｈ２Ｂで作製された精製ヒストン八量体のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。単一分子アッセイのため、４８．５ｋｂ  λ−ＤＮＡ、またはＥｘｐａｎｄ  ２０ｋｂ  ＰＬＵＳ  ＰＣＲ系（Ｒｏｃｈｅ）を用いて作製されたヒトβ−グロビン遺伝子座の２３ｋｂ  ＰＣＲ断片によってヌクレオソームを組み立てた。塩透析を用いてヌクレオソームを組み立てた（以下を参照されたい）。ＤＮＡ対ヒストン八量体の比は多様であり、そして小球菌ヌクレアーゼアッセイを用いて、ヌクレオソーム組み立てを検証した（図３３Ｂ）。
【図３３Ｃ】[0071]図３３Ａ〜Ｃは、組換えヌクレオソームの性質決定を示すブロットの写真画像である。図３３Ｃは、ゲルシフトアッセイおよびより小さいＰＣＲ断片を用いた抗体特異性対照を示す。６０１ヌクレオソーム配置配列のコピーを含有する２８０ｂｐ  ＤＮＡ基質をＰＣＲによって調製した。ヌクレオソーム組み立て反応は、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ７．８］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の３μｇのＤＮＡおよび１．５〜２倍モル過剰のヒストン八量体を含有した。段階的な塩勾配（１Ｍ  ＮａＣｌで２時間、０．８Ｍ  ＮａＣｌで２時間、０．６Ｍ  ＮａＣｌで２時間、０．４Ｍ  ＮａＣｌで２時間、そして０．２Ｍ  ＮａＣｌで１２時間）に対して反応を透析し、そして４％ポリアクリルアミド上のゲルシフトによって、ヌクレオソーム形成を検証した。抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体のいずれかと０．５〜１μｇのヌクレオソームを、１：１比で、４℃で１５分間インキュベーションした後、ゲルシフトによって、抗体結合および特異性もまた検証した。
【図３３Ｄ】[0072]図３３Ｄ〜Ｅは、単一分子画像化のためのヌクレオソーム再構築に対応するグラフである。
【図３３Ｅ】[0072]図３３Ｄ〜Ｅは、単一分子画像化のためのヌクレオソーム再構築に対応するグラフである。
【図３４Ａ】[0073]図３４Ａは、異なるヌクレオソーム濃度での予測される分布を示す。Ｓｅｇａｌアルゴリズムは、ＤＮＡ上のヌクレオソーム密度を調整するための濃度パラメータを含有する（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｉｅ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｎｕｃｌｅｏ＿  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照されたい）。図３４Ａは、各パネルの上部左隅に示すような濃度パラメータの範囲でのλ−ＤＮＡに関する予測を含有する。実験データとの相関測定のために用いる予測データセットをアステリスク（＊）で示す。
【図３４Ｂ】[0074]図３４Ｂは、異なるヌクレオソーム濃度での予測される分布を示す。ＦＫＦＭアルゴリズムは、ＤＮＡ上のヌクレオソーム密度を調整するための濃度パラメータを含有する（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｉｅ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｎｕｃｌｅｏ＿  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照されたい）。図３４Ｂは、各パネルの上部左隅に示すような濃度パラメータの範囲でのλ−ＤＮＡに関する予測を含有する。実験データとの相関測定のために用いる予測データセットをアステリスク（＊）で示す。
【図３４Ｃ】[0075]図３４Ｃ〜Ｄは、異なるヌクレオソーム濃度での予測される分布を示す。ＳｅｇａｌおよびＦＫＦＭアルゴリズムは、ＤＮＡ上のヌクレオソーム密度を調整するための濃度パラメータを含有する（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｉｅ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｎｕｃｌｅｏ＿  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照されたい）。図３４Ｃ〜Ｄは、各パネルの上部左隅に示すような濃度パラメータの範囲での各モデルに関するβ−グロビンＤＮＡに関する予測を含有する。実験データとの相関測定のために用いる予測データセットをアステリスク（＊）で示す。
【図３４Ｄ】[0075]図３４Ｃ〜Ｄは、異なるヌクレオソーム濃度での予測される分布を示す。ＳｅｇａｌおよびＦＫＦＭアルゴリズムは、ＤＮＡ上のヌクレオソーム密度を調整するための濃度パラメータを含有する（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｉｅ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｎｕｃｌｅｏ＿  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照されたい）。図３４Ｃ〜Ｄは、各パネルの上部左隅に示すような濃度パラメータの範囲での各モデルに関するβ−グロビンＤＮＡに関する予測を含有する。実験データとの相関測定のために用いる予測データセットをアステリスク（＊）で示す。
【図３５】[0076]図３５は、同じ解像度でビニングされる、予測された分布分析および観察されたデータのグラフを示す。図３５Ａ〜Ｂは、それぞれ、λ−ＤＮＡおよびヒトβ−グロビンＤＮＡ断片に関する、７５８ｂｐビンに分割される、ＳｅｇａｌおよびＦＫＦＭ予測ならびに観察されるヌクレオソーム位置を示す。
【図３６】[0077]図３６は、予測されるアルゴリズムの反相関のグラフを示す。λ−ＤＮＡ（図３６Ａ）およびヒトβ−グロビンＤＮＡ断片（図３６Ｂ）に関して、互いに対するＳｅｇａｌおよびＦＫＭＫ予測の相関分析。
【図３７】[0078]図３７は、ヒストン変異体を宿するヌクレオソームの性質決定に用いたブロットの写真画像を示す。図３７Ａは、示すように、Ｈ２ＡＺ、Ｃｓｅ４、またはＣｓｅ４／Ｓｃｍ３（ヘキサソーム）のいずれかで作製した再構成および精製ヒストン八量体のクーマシー染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。ゲルシフトアッセイおよび２８０ｂｐ  ６０１  ＰＣＲ断片を用いた抗体特異性対照を図３７Ｂに示す。小球菌ヌクレアーゼ・フットプリント・アッセイを用いて、λ−ＤＮＡ上のヌクレオソーム形成を検証した。図３７Ｃ。
【図３８Ａ】[0079]図３８Ａは、標準的およびＨ２ＡＺヌクレオソームの比較のグラフを示す。グラフは、λ−ＤＮＡに関するＳｅｇａｌおよびＦＫＦＭ予測を、標準的およびＨ２ＡＺ含有ヌクレオソームの分布ヒストグラム、ならびに重ね合わせデータセットとともに示す。
【図３８Ｂ】[0080]図３８Ｂは、標準的およびＨ２ＡＺヌクレオソームの比較のグラフを示す。グラフは、観察される分布および２つのモデルからの理論的予測の間の相関を示す。
【図３９】[0081]図３９は、ＤＮＡラック要素のナノファブリケーションおよび性質決定を示す。図３９Ａは、異なるバリアセット間の多様な間隔を伴う表面パターンの割面からの低倍率（２０Ｘ）光学的画像を示す。第一および第二のパターン間の距離は１００μｍであり、そして第二および第三のパターン間の距離は２００μｍであった。１００倍で収集した単一バリアセットのより高次の解像度の光学的画像を図３９Ｂに示し、そして相当するパターン寸法を示す。ＡＦＭ画像を図３９Ｃに示し、直線バリアおよび五角形の高さ、ならびにこれらの２つのバリア要素間の距離を強調する。単一直線バリアを伴うパターンのＳＥＭ画像（図３９Ｄ）およびアレイ化五角形（図３９Ｅ）を示す。
【図４０】[0082]図４０は、二重束縛ＤＮＡのカーテンを示す。二重束縛ＤＮＡのカーテン。図４０Ａは、緩衝液流動の非存在下（上部パネル）および存在下（下部パネル）での、単一束縛カーテンの例を示す。図４０Ｂは、いかなる緩衝液流動も非存在下での、二重束縛ＤＮＡカーテンの例を示し、ＤＮＡ分子が連続した水力学的な力の非存在下であってさえ、伸長したままであることを例示する。図４０Ｃは、直線バリアおよび多角形アレイ間の分離距離の関数としての第二のＤＮＡ端の相対的係留効率を示し、ピーク束縛効率が１３μｍに相当することを明らかにするが、これは、ＤＮＡの完全輪郭長に比較して、そのおよそ８０％の伸長に等しい。図４０Ｄは、定義された時間間隔後に係留されたままである、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡのパーセントを示す。
【図４１Ａ】[0083]図４１は、ＤＮＡ分子の定義された配向を示す略図である。この図は、ＤＮＡの中央に印を付ける、単一のＤＩＧ−Ｑドットタグを含む、２つの単一束縛ＤＮＡカーテンの例を示す。図４１Ａは、２つの別個の位置で、抗ＤＩＧでタグ付けされた量子ドットで標識されたＤＮＡ基質の略図を示す。基質＃１は、２６，１６６ｂｐ位で標識され、そして基質＃２は、３３，７９１ｂｐ位で標識される。示すように、ＤＮＡ分子端をビオチンおよびフルオレセインで標識する。
【図４１Ｂ】[0083]図４１は、ＤＮＡ分子の定義された配向を示す略図である。この図は、ＤＮＡの中央に印を付ける、単一のＤＩＧ−Ｑドットタグを含む、２つの単一束縛ＤＮＡカーテンの例を示す。図４１Ｂは、基質＃１または基質＃２のいずれかを用いて作製される単一束縛ＤＮＡカーテンを示し、そしてビオチン・タグ、未結合（ｆｒｅｅ）ＤＮＡ端、および量子ドット・タグの位置の例を示す。下部パネルは、２つの異なる基質の量子ドット・タグの測定される分布を示し、別個の位置であることを強調する。
【図４１Ｃ】図４１は、ＤＮＡ分子の定義された配向を示す略図である。この図は、ＤＮＡの中央に印を付ける、単一のＤＩＧ−Ｑドットタグを含む、２つの単一束縛ＤＮＡカーテンの例を示す。図４１Ｃは、ＤＮＡ分子が両端を介して表面に係留されることを除いて、同じタイプの分析を示す：ビオチン・タグ化端は二重層にカップリングされ、そしてバリアに沿って整列し、そしてフルオレセイン・タグ化端は、抗体でコーティングされた多角形に係留される。単一束縛ＤＮＡと同様に、量子ドットの位置を下部パネルにマッピングする。
【図４２】[0084]図４２は、１Ｄタンパク質拡散を視覚化するためのＤＮＡラックの使用を示す。図４２Ａは、ＱＤ標識Ｍｌｈ１が結合する二重束縛ＤＮＡカーテンの例を示す。ＤＮＡを緑で示し、そしてタンパク質をマゼンタで示す。この画像は、１分間ビデオから取った単一の１００ミリ秒画像に相当する。図４２Ｂは、小文字および対応する矢頭で示すような、図４２Ａ内由来の個々のＤＮＡ分子から作成した代表的なキモグラムを示す。図４２Ｃは、ＤＮＡ収集の経過中に破壊されたＤＮＡ分子の例を示し、ＤＮＡおよび結合したタンパク質の両方が、表面から迅速に拡散することを示す。
【図４３】[0085]図４３Ａ〜Ｃは、試料チャンバー表面へのＤＮＡの、その輪郭に沿った可逆的な係留を示す図である。
【図４４】[0086]図４４Ａ〜Ｂは、均一なＤＮＡ分子の非破壊的マッピングを示す図である。
【図４５】[0087]図４５Ａ〜Ｃは、不均一なＤＮＡ分子の非破壊的マッピングを示す図である。
【図４６】[0088]図４６は、エッチング法によって（図４６Ａ）またはリソグラフィー技術によって（図４６Ｂ〜Ｃ）のいずれかでのバリアの形成を示す図である。
【図４７】[0089]図４７は、Ｓｅｇａｌら  Ｎａｔｕｒｅ．  ４４２，  ７７２−７７８（２００６）およびＦｉｅｌｄら  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．  ４，  ｅ１０００２１６（２００８）によって報告されるような理論的ヌクレオソーム分布を示すグラフである。
【図４８】[0090]図４８は、複製後ミスマッチ修復の概観を示す図である。
【図４９】[0091]図４９は、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６がどのようにＤＮＡ分子を調査するかを示す図である。
【図５０】[0092]図５０は、単一分子レベルでのタンパク質−ＤＮＡ相互作用の動力学を探査する（ｐｒｏｂｉｎｇ）ためのＴＩＲＦＭに基づく実験設計を示す。図５０Ａは、ビオチン化λ−ＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）が、そうでなければ脂質二重層でコーティングされているミクロ流体試料チャンバー表面上の固体アンカーポイントで、両端で束縛されたことを示す。Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６を量子ドット（ＱＤ）で標識し、そして試料チャンバー内に注入した。図５０Ｂは、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６（マゼンタ）が結合したＹＯＹＯ１染色ＤＮＡ（緑）の画像を示す。ＤＮＡが破壊されると、ＤＮＡおよび結合したタンパク質の両方が試料チャンバー表面から拡散する。
【図５１】[0093]図５１は、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６拡散の一般的な特性を示すグラフを示す。図５１Ａは、４つの異なるＭｓｈ２−Ｍｓｈ６複合体に関する代表的なＭＳＤプロットを示すグラフである。図５１Ｂは、追跡したタンパク質から計算した拡散係数のヒストグラムである。このグラフは、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＡＤＰ（Ｎ＝９７；赤で示す）または１ｍＭ  ＡＴＰ（Ｎ＝２８；青で示す）のいずれかを含有する緩衝液中のＭｓｈ２−Ｍｓｈ６の１２５の追跡した複合体から得た累積情報を示す。図５１Ｃは、１２０秒の期間後の開始点からのＭｓｈ２−Ｍｓｈ６の純置換のプロットを示す。図５１Ｄは、１２０秒間の期間に渡って、ＤＮＡに沿って前後に移動する際の、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６が移動する範囲を示す。図５１Ｅは、１２０秒間の間にＭｓｈ２−Ｍｓｈ６が横切る見かけ上の累積距離のヒストグラムである。図５１Ｆは、総時間によって割った、移動累積距離から計算した、タンパク質の平均の見かけ上の速度を示すヒストグラムである。すべてのプロットに関する平均および標準偏差は、ビニングされたデータに対するガウスフィットから決定した。
【図５２】[0094]図５２は、切断活性化のための機構を示す図である。
【図５３】[0095]図５３は、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６のハイスループット単一分子分析を示すグラフを示す。
【図５４】[0096]図５４は、ＡＤＰ／ＡＴＰ交換が仲介する解離が内部位置からそしてＤＮＡ端から起こりうることを示す。図５４Ａは、１つのＤＮＡ分子および結合したＭｓｈ２−Ｍｓｈ６を示すキモグラムの例を示す。矢頭は、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６の解離を強調する。図５４Ｂは、ＡＴＰを試料チャンバー内に注入した後の５１０の総Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６複合体の振る舞いを要約する（３回の別個の実験に由来する）。「解離前に移動した距離」（ｘ軸）は、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６がＤＮＡから離れる前に移動した距離に対応する。ＤＮＡ上の内部位置から生じる解離事象を赤で色づけし（Ｎ＝１４９）、そしてＤＮＡ分子端で生じる事象を青で色づけする（Ｎ＝８８）。
【図５５】[0097]図５５は、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６によるＤＮＡスキャニングのモデルを示す。生物物理学的モデルは、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６（マゼンタ）およびＤＮＡ基質（シアン）間の相互作用を示す。ＤＮＡの下側は、ベンディング傾向を記載するエネルギー景観であり（Ｖｌａｈｏｖｉｃｅｋら、２００３）、ここで、景観の最小部は、本質的に屈曲しているかまたは非常に柔軟性である領域に相関する。景観中の深い低下に相当する位置（例えば損傷またはニック）は、拡散するタンパク質と好ましく相互作用し、そしてエネルギー最小部の深さは、任意の所定の部位にタンパク質がどのくらい長く留まるかを決定するであろう。深いトラップに位置するタンパク質は、ＡＤＰのＡＴＰに対する交換によって駆動される反応において、逃れうるであろう。
【図５６】[0098]図５６は、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１の拡散を視覚化するのに用いられる二重ＤＮＡ束縛カーテンの一例の写真画像を示す。
【図５７】[0099]図５７は、Ｍｌｈ１の拡散を視覚化するのに用いられる二重ＤＮＡ束縛カーテンの一例の写真画像を示す。
【図５８】[00100]図５８Ａ〜Ｂは、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１がＤＮＡ上で拡散し、そしてＭｓｈ２−Ｍｓｈ６よりも迅速に移動することを示すグラフを示す。
【図５９】[00101]図５９は、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１がブロックされたＤＮＡ端から解離しないことを示す例および写真画像である。
【図６０】[00102]図６０は、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１が未結合ＤＮＡ端から解離することを示す例および写真画像である。
【図６１】[00103]図６１は、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１複合体が互いをバイパスしうることを示す例および写真画像である。
【図６２】[00104]図６２は、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６複合体が、どのようにゲノムをスキャンしうるかを示す略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
[00105]本発明は、部分的に、核酸分子を支持体上に並べ、そして非直線の幾何学的拡散バリア、例えば非直線の幾何学的ナノバリアに沿って位置的に整列させて、個々の核酸分子の分析を可能にしうるという発見に基づく。本明細書記載の方法および組成物には、支持体、コーティング物質、例えば脂質二重層、および支持体に直接付着したか、連結を通じて支持体に付着したか、または連結を通じて脂質層に付着した核酸分子が含まれる。核酸は、一方で支持体に付着しながら特異的ターゲットと相互作用可能であり、そして核酸分子およびターゲットの適切な標識によって、ターゲットおよび核酸分子間の相互作用部位を得ることも可能である。核酸分子は位置的に定義されるため、相互作用部位は、各相互作用の特異性を定義するであろう。その結果、支持体上の核酸分子との相互作用パターンのマップは、核酸分子およびターゲット間の特異的相互作用に対する情報に変換可能である。
【００２９】
[00106]本発明は、部分的に、「ハイスループット」単一分子研究に有用な技術に基づき、この技術は、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を伴う多様な系に適用可能である。例えば、蛍光ヌクレオソームが再構成されてきており、そしてＤＮＡカーテンを用いて、本質的なエネルギー景観を定義可能であることを以下の実施例に示している。本発明はまた、ＤＮＡ上のタンパク質の１次元拡散の直接の視覚化を可能にするアッセイにも基づく。例えば、ミスマッチ修復に関与するタンパク質、例えばＭｓｈ２−Ｍｓｈ６およびＭｌｈ１−Ｐｍｓ１は、どちらもＤＮＡ上で拡散するが、異なる特性を有し、別個の機構を通じてＤＮＡに沿って移動することが示唆される（本明細書で論じる実施例を参照されたい）。
【００３０】
[00107]定義
[00108]本明細書において、「幾何学的拡散バリア」、「幾何学的バリア」、および「幾何学的バリアパターン」は、非直線の滑らかでない拡散バリアである。例えば、非直線の幾何学的拡散バリアは、多様な角度の一連の角反復を含みうる。非直線の幾何学的拡散バリアはまた、ターン、ベンド、カーブ、または中断も含んでもよい。１つの態様において、非直線の幾何学的拡散バリアはその全長に渡って非直線である。別の態様において、非直線の幾何学的拡散バリアは少なくとも１つの角を含む。さらなる態様において、バリアは約１８０°未満の少なくとも１つの角を含む。別の態様において、非直線の幾何学的拡散バリアは多様な度合いの少なくとも１つの角を含む。いくつかの態様において、非直線の幾何学的拡散バリアは多様な度合いの多数の角を含む。非直線の幾何学的拡散バリアはまた、ナノメートルスケールの間隔を反復する鋸歯パターンを生じる反復三角波などの反復する非直線の幾何学的形状も含んでもよい（例えば、間隔は、少なくとも約５ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約２５ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約２５０ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約３５０ｎｍ、少なくとも約４００ｎｍ、少なくとも約４５０ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、少なくとも約６００ｎｍ、少なくとも約７００ｎｍ、少なくとも約７５０ｎｍ、少なくとも約８００ｎｍ、少なくとも約９００ｎｍ、少なくとも約１０００ｎｍ、少なくとも約１５００ｎｍ、または少なくとも約２０００ｎｍ間隔である）。反復三角波の隣接する三角形各々の頂点は、非直線の幾何学的バリア内のナノスケールウェルを形成してもよい。このウェルを、「幾何学的ナノウェル」と呼んでもよい。反復三角波の隣接する三角形各々の頂点は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約２５０ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約３５０ｎｍ、少なくとも約４００ｎｍ、少なくとも約４５０ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、少なくとも約６００ｎｍ、少なくとも約７００ｎｍ、少なくとも約７５０ｎｍ、少なくとも約８００ｎｍ、少なくとも約９００ｎｍ、少なくとも約１０００ｎｍ、少なくとも約１５００ｎｍ、または少なくとも約２０００ｎｍのピーク間距離を有しうる。
【００３１】
[00109]支持体の調製
[00110]本質的に、本明細書記載の組成物および方法中で、任意の考えられうる支持体を使用してもよい。支持体は、例えば、粒子、鎖、沈降物、ゲル、シート、管、球、コンテナ、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、プレート、またはスライドとして存在する、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらのいずれの組み合わせであってもよい。支持体は、任意の好適な形状、例えば円板、正方形、球または円であってもよい。支持体およびその表面は、本明細書記載の反応を実行する硬い担体を形成してもよい。支持体は、例えば重合ラングミュアーブロジェット膜、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、修飾シリコン、あるいは非常に多様なゲルまたはポリマー、例えば（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはその組み合わせのいずれか１つであってもよい。他の支持体物質は、この開示を再検討した際、当業者には容易に明らかであろう。いくつかの態様において、支持体はＳｉＯ２から作製され、そして平坦である。
【００３２】
[00111]いくつかの態様において、支持体はリンカーでコーティングされ、これに核酸分子が付着する。こうしたリンカーは、例えば化学的またはタンパク質リンカーであってもよい。例えば、支持体は、ニュートラアビジンまたは抗体などのタンパク質でコーティングされてもよい。
【００３３】
[00112]いくつかの態様において、支持体には、拡散バリア、例えば機械的、化学的バリア、またはタンパク質バリアが含まれる。拡散バリアは、脂質二重層の沈着前に、支持体上にバリア物質を適用することによって調製可能であり；次いで二重層がバリア周囲に形成される。機械的バリアは、例えば支持体上のスクラッチまたはエッチであってもよく、これが脂質拡散を物理的に防止する。
【００３４】
[00113]化学的バリアの場合、バリアの化学的性質が脂質拡散を防止する際の主な要因であり、そしてその表面トポグラフィーは主な要因ではない［Ｐｏｗｅｌｌら，  （２００２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．  １０：１２６２−１２６３］。例えば、化学的バリアは、金属、酸化金属、またはその組み合わせを含んでもよい。１つの態様において、金属は、クロム、アルミニウム、金、またはチタンを含む。別の態様において、酸化金属は、酸化クロム、酸化アルミニウム、または酸化チタンを含む。二重層自体の厚さ（例えば６〜８ｎｍ）と類似の、または二重層より薄い、バリア物質を作製してもよい。
【００３５】
[00114]多様な方法によって、タンパク質バリアを支持体、例えばＳｉＯ２支持体上に沈着させてもよい。例えば、マイクロコンタクト・プリンティングと呼ばれるプロセスによって、タンパク質バリアをよく定義されたパターンで沈着させてもよい［Ｋａｔｏら，  （２０００）．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ４５：１３３−１３７；  Ｄａｖｉｅｓら，  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．  ７：２７３−２８２］。マイクロコンタクト・プリンティングは、支持体上に特定のパターンを生成するためのスタンプとして、ＰＤＭＳ（ポリ［ジメチルシロキサン］）テンプレートを用いる。ＰＤＭＳスタンプは、１μｍ程度に小さく、そして約５〜１０ｎｍの厚さの特徴を伴うパターンで、タンパク質をＳｉＯ２支持体にトランスファーしうる［Ｋａｔｏら，  （２０００）．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ４５：１３３−１３７；  Ｄａｖｉｅｓら，  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．  ７：２７３−２８２］。例えば、Ｄａｖｉｅｓら，  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．  ７：２７３−２８２に記載されるようなソフト−リソグラフィーによって、マイクロコンタクト・プリンティングに用いるＰＤＭＳスタンプを作製してもよい。作製したら、ＰＤＭＳをタンパク質溶液とインキュベーションし、乾燥させ、そして次いで支持体、例えばＳｉＯ２と接触させて置いた結果、ＰＤＭＳスタンプからのタンパク質「インク」を支持体にトランスファーし、そしてスタンプ設計によって定義されるパターンを生じてもよい。例えば、タンパク質バリアをフィブロネクチンから作製してもよい。
【００３６】
[00115]１つの態様において、電子ビーム・リソグラフィーを用いて、不活性二重層上に懸濁されたＤＮＡの分子カーテンを作製するため、ナノメートル（ｎｍ）スケール特徴を持つ、脂質拡散に対するクロムバリアを設計してもよい。バリアの形状および二重層の流動性を用いて、よく定義されたパターンへのＤＮＡの組織化を導き、ここですべての分子は同じ配向に配置され、そして互いに関して整列する。これらのバリアは単純でそして頑強であり、蛍光ＤＮＡ分子の光学的画像化に干渉せず、そしてミクロ流体試料チャンバーの表面上のあらかじめ定義された位置で正確に構築可能である。別の態様において、バリアは図４６に示すように生成可能である。
【００３７】
[00116]次いで、支持体を物質層に付着させる。１つの態様において、物質は、支持体を不活性にするものである。例えば、物質は、例えば脂質二重層を形成する脂質であってもよい。別の態様において、層は、双性イオン性脂質で作製される。リポソームを支持体に適用することによって、脂質二重層を支持体上に沈着させてもよい。例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）または０．５％ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン−ＰＥ）と９９．５％ＤＯＰＣ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、アラバマ州アラバスター）から、既知の方法によって、リポソームを産生してもよい。いくつかの態様において、脂質二重層には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれてもよい。例えば、量子ドットを用いて核酸分子および／またはポリペプチドを標識する態様において、ＰＥＧは、脂質二重層中に含まれてもよい。ＰＥＧはまた、アレイに添加される試薬に対して不活性である二重層の表面を構成するために含まれてもよい。
【００３８】
[00117]核酸分子の束縛
[00118]本明細書に記載するように、核酸分子を、支持体に、脂質二重層に、または非直線の幾何学的拡散バリアに付着させて、アレイを形成してもよい。核酸分子の一端でまたは両端でのいずれかの連結によって、核酸分子を付着させてもよい。例えば、脂質二重層の沈着前に、タンパク質が支持体上にコーティングされる場合、支持体上にコーティングされたタンパク質に結合する同族タンパク質に、核酸を連結してもよい。１つの態様において、支持体はニュートラアビジンでコーティングされ、そして核酸分子リンカーはビオチンである。一般の当業者に知られる標準的分子生物学技術を用いて、リンカーを核酸分子に付加してもよい。
【００３９】
[00119]あるいは、核酸分子を脂質二重層に連結してもよい。１つの態様において、脂質二重層を支持体上に沈着させ、そしてタンパク質、例えばニュートラアビジンを脂質頭基に連結する。次いで、ビオチン化核酸分子を導入して、核酸分子を脂質二重層に連結する。
【００４０】
[00120]他の態様において、核酸分子を非直線の幾何学的拡散バリアに連結してもよい。１つの態様において、拡散バリアは、支持体上に沈着されたタンパク質、例えばビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。次いで、ニュートラアビジンがビオチン化ＢＳＡタンパク質バリアに直接結合し、そしてビオチン化核酸分子がビオチン化ＢＳＡタンパク質バリアに連結される。他の既知のタンパク質−同族タンパク質対を本明細書記載の方法で用いてもよい。例えば、抗体、例えば抗ジゴキシゲニン抗体をタンパク質バリアとして用い、そして同族抗原、例えばジゴキシゲニンを核酸分子に連結してもよい。別の態様において、核酸分子の一端を、連結によって、例えば支持体に、または非直線の幾何学的拡散バリアに付着させる。さらなる態様において、核酸分子の両端を、連結によって、例えば支持体に、非直線の幾何学的拡散バリアに、または２つの表面の組み合わせに付着させる。二重束縛ＤＮＡ基質は、１Ｄ拡散を視覚化するために使用可能である。例えば、ＤＮＡ分子を両端でビオチン化してもよい。一定の中程度の水力学的流動力を適用しながら、ＤＮＡを不活性脂質二重層上に懸濁する。ＤＮＡおよび表面間の唯一の相互作用は、分子のビオチン化端を通じる。例えば、ＤＮＡ分子の８０％の伸長は、〜０．５ｐＮの力に対応する（例えばＤＮＡが変形されていない場合）。
【００４１】
[00121]いくつかの態様において、核酸分子の両端を、バリア、不活性支持体、またはその組み合わせに付着させると、図１３、１８、および２１に示すような「ラック」、例えばＤＮＡラックを生成することも可能である。いくつかの態様において、核酸分子を有効カルシウム濃度に曝露することによって、本明細書記載のアレイの脂質二重層に核酸分子（例えばＤＮＡ分子）の全輪郭長を可逆的に係留することによって、「ラック」を生成することも可能である（例えば、図４３Ｃを参照されたい）。１つの態様において、カルシウム濃度は、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約１．５ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約４．５ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５．５ｍＭ、少なくとも約６ｍＭ、少なくとも約６．５ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ、少なくとも約７．５ｍＭ、少なくとも約８ｍＭ、少なくとも約８．５ｍＭ、少なくとも約９ｍＭ、少なくとも約９．５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、または少なくとも約１０．５ｍＭである。
【００４２】
[00122]核酸分子およびポリペプチドの標識
[00123]別の態様において、核酸分子またはポリペプチドに付着した１以上の標識を検出することによって、付着した核酸分子および／または相互作用する核酸分子またはポリペプチドを視覚化する。当業者に周知の多くの手段のいずれによって標識を取り込んでもよい。アレイ上の核酸分子を、核酸分子の全長を標識する、非特異的標識、例えば色素、例えば蛍光色素、例えばＹＯＹＯ１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、オレゴン州ユージーン）、ＴＯＴＯ１、ＴＯ−ＰＲＯ、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩおよびエチジウムブロミドにカップリングしてもよい。核酸分子はまた、本明細書に記載するような量子ドットで標識してもよい。
【００４３】
[00124]別の態様において、既知の方法を用いて、核酸分子、例えばアレイ上の核酸分子またはターゲット核酸分子を、定義される位置で標識にカップリングしてもよい。試料核酸調製中の増幅工程中に、標識を取り込んでもよい。例えば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅産物を提供するであろう。標識デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で核酸分子を増幅する。
【００４４】
[00125]あるいは、核酸分子に、または増幅完了後の増幅産物に、直接、標識を付加してもよい。核酸に標識を付着させる手段には、例えば、ニック・トランスレーション、または核酸をキナーゼ処理し、そして続いて、試料核酸を標識（例えばフルオロフォア）に連結する核酸リンカーを付着（連結）させることによる、末端標識（例えば標識ＲＮＡを用いる）が含まれる。
【００４５】
[00126]本明細書に記載する方法および組成物で用いるのに適した検出可能標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能ないかなる組成物も含まれる。有用な標識には、標識ストレプトアビジン・コンジュゲートで染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）、放射標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで一般的に用いる他のもの）、およびコロイド金（例えば４０〜８０ｎｍ直径サイズ範囲の金粒子は、高効率で緑色光を散乱させる）または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス）ビーズなどの比色標識が含まれる。こうした標識の使用を解説する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が含まれる。
【００４６】
[00127]いくつかの態様において、蛍光標識を用いる。核酸分子をすべて、単一標識、例えば単一蛍光標識で標識してもよい。あるいは、異なる核酸分子は異なる標識を有する。例えば、１つの核酸分子は、緑色蛍光標識を有し、そして第二の核酸分子は赤色蛍光標識を有してもよい。使用可能な適切な色素原には、色が観察されうるように別個の波長範囲の光を吸収するか、あるいは特定の波長または波長範囲の照射で照射された際に光を放出する、分子および化合物、例えば蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）が含まれる。
【００４７】
[00128]非常に多様な適切な色素が利用可能であり、これらは主に、環境によって最小限にしか吸収されずに、強力な色を提供するように選択される。例示的な色素タイプには、キノリン色素、トリアリールメタン色素、アクリジン色素、アリザリン色素、フタレイン、昆虫色素、アゾ色素、アントラキノイド色素、シアニン色素、フェナザチオニウム色素、およびフェナゾキソニウム色素が含まれる。
【００４８】
[00129]単独で、あるいは消光剤分子と組み合わせてのいずれかで、非常に多様な蛍光物質が使用可能である。関心対象の蛍光物質は、特定の一級官能性を有する多様なカテゴリーに属する。これらの一級官能性には、１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ’−ジアミノスチルベン、ピレン、四級フェナントリジン塩、９−アミノアクリジン、ｐ，ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボシアニン、マロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビスベンゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン（ｈｅｌｌｅｂｒｉｇｅｎｉｎ）、テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチレート、ストロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタンおよびフラビンが含まれる。連結のための官能性を有するかまたはこうした官能性を取り込むよう修飾可能である個々の蛍光化合物には、例えば、塩化ダンシル；フルオレセイン、例えば３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロール；ローダミンイソチオシアネート；Ｎ−フェニル１−アミノ−８−スルホナトナフタレン；Ｎ−フェニル２−アミノ−６−スルホナトナフタレン：４−アセトアミド−４−イソチオシアナト−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；ピレン−３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレン−６−スルホネート；Ｎ−フェニル，Ｎ−メチル−２−アミノアフタレン−６−スルホネート；エチジウムブロミド；ステブリン；アウロミン（ａｕｒｏｍｉｎｅ）−０，２−（９’−アントロイル）パルミテート；ダンシル・ホスファチジルエタノールアミン；Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン；Ｎ，Ｎ’−ジヘキシルオキサカルボシアニン；メロシアニン、４（３’ピレニル）ブチレート；ｄ−３−アミノデスオキシ−エキレニン；１２−（９’アントロイル）ステアレート；２−メチルアントラセン；９−ビニルアントラセン；２，２’（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンゾキサゾール；ｐ−ビス［２−（４−メチル−５−フェニル−オキサゾリル）］ベンゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェナジン；レチノール；ビス（３’−アミノピリジニウム）１，１０−デカンジイルジイオダイド；ヘリブリエニン（ｈｅｌｌｉｂｒｉｅｎｉｎ）のスルホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド；Ｎ−［ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）−フェニル］マレイミド；Ｎ−（４−フルオランチル）−マレイミド；ビス（ホモバニリン酸）；レサザリン；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３ベンゾオキサジアゾール；メロシアニン５４０；レソルフィン；ローズベンガル；および２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノンが含まれる。
【００４９】
[00130]標識は「直接標識」、すなわち核酸分子に直接付着しているかまたは核酸分子内に取り込まれている検出可能標識であってもよい。あるいは、標識は、「間接標識」、すなわち支持体に付着した後に核酸分子に連結した標識であってもよい。間接標識は、支持体に付着する前に、核酸分子に付着している結合部分に付着してもよい。核酸を標識し、そして標識され、ハイブリダイズした核酸を検出する方法の詳細な概説に関しては、Ｍ．  ＡｎｄｅｒｓｏｎのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．，（１９９９））、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （第３版，  ２００１）を参照されたい。
【００５０】
[00131]既知の方法を用いて、ポリペプチドを例えば本明細書記載の蛍光標識にカップリングすることによって、ポリペプチドを視覚化してもよい。あるいは、本明細書に記載するような量子ドット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの他の標識を用いてもよい。
【００５１】
[00132]核酸分子およびポリペプチドの検出
[00133]上に論じるように、蛍光標識の使用は、本発明の態様である。標準的方法を用いて、核酸分子および／またはターゲット、例えば第二の核酸分子またはポリペプチドの位置を決定する。例えば、標識によって放出されるシグナルにより、本明細書に記載するアレイ上の核酸分子の位置を検出してもよい。他の例において、アレイ上の核酸分子およびターゲット核酸分子またはポリペプチドが標識されている場合、アレイ上の核酸分子およびターゲットの両方の位置が、有意なシグナルを示すであろう。標識を用いるのに加えて、他の方法を用いてマトリックスをスキャンして、相互作用、例えば本明細書記載のアレイ上の核酸分子およびターゲット間の相互作用がどこで起こるかを決定してもよい。相互作用のスペクトルは、もちろん、多数の条件各々で生じる相互作用の反復スキャンによって、一時的な方式で決定可能である。しかし、各個々の相互作用を別個に試験する代わりに、多数の相互作用を、アレイ、例えば本明細書記載のアレイ上で同時に決定してもよい。
【００５２】
[00134]特定の態様において、特定の蛍光標識の励起波長の光源で、アレイを励起させ、そして発光波長で生じた蛍光を検出する。特定の態様において、励起光源は蛍光標識の励起に適したレーザーである。
【００５３】
[00135]蛍光シグナルの検出は、顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を利用してもよい。アレイ上の核酸分子および／またはターゲットによって生じる蛍光シグナルを自動的に記録する自動化データ獲得系が取り付けられた光トランスデューサー（例えば光電子倍増管、固体状態アレイ、またはｃｃｄカメラ）を、顕微鏡に装備してもよい。こうした自動化系は当該技術分野に知られる。シグナル検出のための自動化共焦点顕微鏡と組み合わせたレーザー発光の使用によって、約１００μｍより優れた、約５０μｍより優れた、そして約２５μｍより優れた解像度での検出が可能になる。
【００５４】
[00136]検出法はまた、アレイ上の特定の位置でのシグナルが真に陽性であるかまたは偽のシグナルでありうるかを決定するため、いくつかのシグナル・プロセシングも取り込んでもよい。例えば、実際の陽性シグナルを有する領域からのシグナルは、広がる傾向があり、そして実際にはシグナルを持たないはずの隣接領域中に陽性シグナルを提供する可能性もある。これは、例えば、スキャニング系が、そのピクセル密度において、２つの領域を分離するのに十分に高い解像度で、適切に区別しない場合に起こりうる。したがって、空間的領域に渡るシグナルをピクセルごとに評価して、陽性シグナルの位置および実際の度合いを決定してもよい。真の陽性シグナルは、理論的に、各ピクセル位置で均一なシグナルを示すはずである。したがって、実際のシグナル強度とともにピクセルの数をプロットすることによるプロセシングは、明らかに均一なシグナル強度を有するはずである。シグナル強度がかなり広い拡散を示す領域は疑わしい可能性もあり、そしてスキャニング系がこれらの位置をより注意深くスキャンするようにプログラミングしてもよい。
【００５５】
[00137]全反射照明蛍光顕微鏡法
[00138]全反射照明蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦＭ）を用いて、本明細書記載の核酸分子およびポリペプチドを検出する。ＴＩＲＦＭのため、レーザービームは顕微鏡スライドを通して導かれ、そしてスライド、および蛍光試料を含有する緩衝液間の界面に反射する。入射角が臨界角［θｃ＝ｓｉｎ−１（ｎ２／ｎ１）；式中、ｎ１およびｎ２は、それぞれ、スライドおよび水性試料の屈折率である］より大きい場合、すべての入射光は界面から反射される。しかし、照射領域は、スライドの試料側に存在する。これは、エバネッセント波と呼ばれ、そしてその強度は、表面から離れると指数関数的に減衰する［Ａｘｅｌｒｏｄ，  Ｄ．，  （１９８９）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３０：２４５−７０；  Ｆｏｒｋｅｙら，  （２０００）  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ７４：１−３５．］。大部分の適用に関して、エバネッセント波は、水性媒体内におよそ１００ｎｍ浸透する。溶液中の混入物およびバルク分子が照射されず、そして検出されるシグナルに寄与しないため、この幾何学は、慣用的な蛍光顕微鏡法に比較して、バックグラウンドシグナルを数桁減少させ、そして単一の蛍光分子の検出を容易に可能にする。［Ｆｏｒｋｅｙら，  （２０００）  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ７４：１−３５］。ＴＩＲＦＭを用いて、本明細書記載のアレイを視覚化することによって、単一の視野内で、整列した数百のＤＮＡ分子を同時に監視することが可能である。
【００５６】
[00139]本明細書記載の方法は、本明細書に記載するような脂質二重層の沈着によって不活性となった支持体で構成されるミクロ流体フローセルを用いる。例えば、ＤＮＡ分子を不活性脂質二重層の上に懸濁してもよい。水力学的な力を本明細書記載のアレイに適用することによって、例えばＴＩＲＦＭによる検出に最適な所望の配向で、付着した核酸分子を整列させる。１つの態様において、水力学的な力を用いて、ナノスケール拡散バリア、例えば非直線の幾何学的拡散バリアの前縁に沿ってＤＮＡ分子を組織化してもよい。別の態様において、電気泳動的な力を用いて、バリアの縁に沿って、ＤＮＡ分子を組織化してもよい。本明細書記載のアレイを用いた単一の実験において、数千のＤＮＡ分子を視覚化してもよい。すべての分子を互いに物理的に整列させる。
【００５７】
[00140]本明細書記載の方法で使用可能なミクロ流体フローセルを図２０に示す。一般的に、本明細書記載の支持体をカバースリップ、例えばガラスカバースリップで覆って、試料チャンバーを形成し、そして支持体は入口ポートおよび出口ポートを含有して、ここを通じて水力学的な力が適用される。水力学的な力は、例えば本明細書記載の脂質二重層上を流動する緩衝溶液によって仲介されてもよい。７６．２ｘ２５．４ｘ１ｍｍ（ＬｘＷｘＨ）石英ガラススライドから例示的なミクロ流体フローセルを構築してもよい（ＥＳＣＯ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ニュージャージー州オークリッジ）。ダイアモンドでコーティングした錐（１．４ｍｍ  Ｏ．Ｄ．；Ｅｕｒｏｔｏｏｌ、ミズーリ州グランドビュー）を用いて、スライドを通じて入口および出口ホールを開けてもよい。ホウケイ酸ガラスカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、および例えば両面テープ（〜２５μｍ厚、３Ｍ、米国）またはポリエチレン・ガスケットから、試料チャンバーを用意してもよい。あらかじめ形成された接着性リング（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ワシントン州オークハーバー）を用いて、入口および出口ポートを取り付け、そして真空下、１２０℃で２時間、硬化させてもよい。例示的な試料チャンバーの寸法は、３．５ｘ０．４５ｘ０．００２５ｃｍ（ＬｘＷｘＨ）である。例示的なフローセルの総体積は、〜４μｌである。シリンジポンプ（Ｋｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ホリストン）を用いて、試料チャンバーへの緩衝液送達を調節する。この例示的な装置は、限定することを意味せず、そして当業者は行いうる修飾を認識するであろう。
【００５８】
[00141]全反射照明蛍光顕微鏡を図１Ｅに示す。例示的な顕微鏡は、修飾Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｕ倒立顕微鏡である［Ｇｒｏｖｅｓら，  （１９９８）  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １４：  ３３４７−３３５０］。４８８ｎｍレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）および５３２ｎｍレーザー（ＣｒｙｓｔａＬａｓｅｒ、ネバダ州リノ）を、無彩色の対物レンズ（２５ｘ；  Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ、メリーランド州マーロウハイツ）を用いて、ピンホール（１０μｍ）を通じて焦点を合わせ、次いで、別の無彩色レンズ（ｆ＝２００ｍｍ）で平行にした。ビームを焦点レンズ（ｆ＝５００ｍｍ）に向け、そしてフローセルの最上部に置いた特注石英ガラスプリズム（Ｊ．Ｒ．    Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ，  Ｉｎｃ）を通過させた。対物レンズ（１００ｘ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ，  ＮＡ  １．４，  Ｎｉｋｏｎ）を通じて蛍光画像を収集し、ノッチフィルター（Ｓｅｍｒｏｃｋ、ニューヨーク州ロチェスター）を通過させ、そして背部を薄くした（ｂａｃｋ−ｔｈｉｎｎｅｄ）ＥＭＣＣＤ（Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｂ，  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，  アリゾナ州ツーソン）で捕捉した。画像獲得およびデータ分析は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、ペンシルバニア州ダウニントン）で行った。蛍光分子の始まりから終わりまでのｙ座標中の相違を計算することによって、すべてのＤＮＡ長の測定を行った。４つの異なる分子の束縛端を手動で追跡することによって、脂質束縛ＤＮＡ基質に関する拡散概算を行い、そして：  Ｄ＝ＭＳＤ／４ｔ；式中、ＭＳＤ（平均二乗変位）は、時間間隔ｔ（０．１２４秒）に渡って測定される平均ステップサイズの平方である、を用いて拡散係数を計算した［Ｋｅｌｍａｎ，  Ｚ．，  （１９９７）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：６２９−６４０．］。
【００５９】
[00142]核酸分子およびポリペプチドを視覚化するための方法
[00143]本明細書記載のアレイを用いて、個々の核酸分子、例えば標識にカップリングした核酸分子を検出することも可能である。例えば、本明細書記載のミクロ流体フローセルの一部としてアレイを構築してもよい。核酸分子、例えば標識核酸分子を、本明細書に記載するような支持体に、脂質二重層に、または非直線の幾何学的拡散バリアに、付着させてもよい。水力学的な力の適用、例えば本明細書に記載するような緩衝液の導入に際して、核酸分子は水力学的な力の方向に整列し、核酸分子の付着していない端が、水力学的な力の流動方向に伸長する。例えば本明細書に記載するようなＴＩＲＦＭを用いて、水力学的な力の適用前および／または後に、アレイ上の個々の核酸分子を視覚化してもよい。
【００６０】
[00144]いくつかの態様において、アレイ上の核酸分子とターゲットポリペプチドの相互作用を決定する。本明細書に記載するような水力学的な力の適用前および／または後に、核酸分子を視覚化してもよい。ターゲットポリペプチドとの相互作用を視覚化するため、ポリペプチドを標識にカップリングし、そして水力学的な力を仲介する緩衝液の構成要素として、アレイ、例えばアレイを含むミクロ流体セル内に導入してもよい。例えば本明細書に記載するようなＴＩＲＦＭによって、個々の核酸分子および個々のターゲットポリペプチドを視覚化してもよく、そして核酸分子およびポリペプチド由来のシグナルの同時局在によって、相互作用を決定してもよい。長期に渡ってシグナルを収集することによって、こうした相互作用をさらに分析してもよい。こうした方法を用いて、本明細書に記載するように、例えば、個々の核酸分子の長さに沿ったポリペプチドの移動を視覚化することも可能である。
【００６１】
[00145]化合物のハイスループットスクリーニングのための方法
[00146]本明細書記載の方法および組成物を用いて、核酸分子およびポリペプチド間の相互作用に影響を及ぼす、例えば該相互作用を破壊する、化合物、例えば薬剤化合物に関してスクリーニングしてもよい。例えば、本明細書記載のミクロ流体フローセルの一部としてアレイを構築してもよい。核酸分子、例えば標識核酸分子を、本明細書に記載するような支持体に、脂質二重層に、または非直線の幾何学的拡散バリアに、付着させてもよい。ターゲットポリペプチドとの相互作用を視覚化するため、ポリペプチドを標識にカップリングし、そして水力学的な力を仲介する緩衝液の構成要素として、アレイ、例えばアレイを含むミクロ流体セル内に導入してもよい。いくつかの態様において、ポリペプチドは核酸分子と相互作用することが知られ、そして相互作用は本明細書に記載されるように視覚化される。例えば、ポリペプチドは、ＤＮＡ複製、組換えおよび／または修復に関与するタンパク質であってもよい。次いで、候補化合物を、例えば水力学的な力を仲介する緩衝液の構成要素として、アレイに添加してもよく、そして個々の核酸分子およびポリペプチド間の相互作用に対する化合物の影響を視覚化してもよい。相互作用を破壊する化合物を視覚的に同定可能である。こうした方法を自動化してもよい。
【００６２】
[00147]例えば、本明細書記載の方法を用いて、癌、例えば乳房、前立腺、肺、気管支、結腸、直腸、膀胱、腎臓、膵臓、口腔、咽頭、卵巣、皮膚、甲状腺、胃、脳、食道、肝臓、子宮頸、喉頭、柔組織、精巣、小腸、肛門、肛門管、肛門直腸、膣、胆嚢、骨、関節、下咽頭、目、鼻、鼻腔、子宮、胃腸管の癌；非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病および球性リンパ球性白血病を治療する療法化合物に関してスクリーニングしてもよい。
【００６３】
[00148]核酸分子のハイスループット配列決定のための方法
[00149]本明細書記載の方法および組成物を用いて、核酸分子を配列決定することも可能である。同一核酸分子、例えば一本鎖ＤＮＡ分子を用いて、または異なる核酸分子、例えば一本鎖ＤＮＡ分子を用いて、本明細書記載のアレイを構築してもよい。ＤＮＡ分子を支持体に付着させる前に、オリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡ分子にアニーリングさせる。次いで、蛍光ｄＮＴＰ混合物と一緒にポリメラーゼを添加する。こうした方法は当該技術分野に知られる。ＤＮＡ鎖の伸長を終結させない蛍光ヌクレオチド類似体を用いる。次いで、ＤＮＡ分子を支持体に付着させ、そして本明細書に記載するようにアレイを視覚化する。成長中の鎖内に取り込まれるヌクレオチドの色が、ＤＮＡ分子の配列を明らかにする。アレイ内のＤＮＡ分子のすべてが同一である場合、重合中の第一のヌクレオチドの取り込みは、アレイに渡って水平に伸びる蛍光の線を生じるであろう。続くヌクレオチド付加もまた、水平線を生じ、そして各線の色はＤＮＡ配列に対応するであろう。異なるＤＮＡ分子を配列決定する場合、同一のＤＮＡ分子を配列決定する際に同一色の線が見られるのとは異なり、アレイに渡る、異なる蛍光ヌクレオチドの取り込みとして、ＤＮＡ配列中の相違が明らかになる。いくつかの態様において、これらの方法を自動化する。
【実施例】
【００６４】
[00150]本発明のより完全な理解を容易にするため、以下に実施例を提供する。以下の実施例は、本発明を作製し、そして実施する例示的な様式を例示する。しかし、本発明の範囲は、これらの実施例に開示する特定の態様に限定されず、別の方法を利用して類似の結果を得ることも可能であるため、こうした実施例は例示目的のためのみである。
【００６５】
実施例１：  ＤＮＡカーテンおよびナノスケールカーテンロッド：単一分子画像化のためのハイスループットツール。
[00151]タンパク質−ＤＮＡ複合体の単一分子視覚化は、伝統的な生化学的アッセイがアクセス不能な反応機構および巨大分子動力学の詳細を明らかにしうる。しかし、これらの技術はしばしば、明確に単一の事象を見るために設計された実験から、統計的に適切な情報を収集するのが本質的に困難であるために、制限される。単一分子法のスループット能力を増加させる新規アプローチは、これらの技術を、異なるタイプのＤＮＡ処理を伴う多様な生物学的な疑問に、より容易に適用可能にする潜在能力を有する。本明細書において、本発明者らは、そうでなければ、支持される脂質二重層でコーティングされている石英ガラススライド上に、戦略的な位置で配置される、ナノファブリケーションで製作されたクロムバリアの前縁に沿って、ＤＮＡ分子をカーテン状に組織化するための方法を提示する。ＤＮＡカーテンを構成する個々の分子は、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦＭ）によって視覚化され、数千の完璧に整列した分子を同時に画像化することが可能になる。これらのＤＮＡカーテンは、頑強でそして強力な実験プラットフォームを提示し、個々のタンパク質−ＤＮＡ相互作用のリアルタイムでの大規模な平行データ獲得の前触れとなる。
【００６６】
[00152]単一分子技術は、以前にはアクセス不能であった生物学の側面への多くの洞察を明らかにしてきており、そしてこの分野は、現在、すべての生物学的巨大分子を研究しうる方法に非常に影響を及ぼそうとしている。しかし、多くの単一分子法は、より広い適用を制限する不都合な点を持っており、そして将来の課題を満たすには、広範囲の生化学的系に容易に適用可能な、より頑強で、使いやすい、ハイスループット実験プラットフォームの開発が必要であろう。
【００６７】
[00153]例えば、多くの単一分子技術の一般的な問題の１つは、研究中の巨大分子を固体支持体表面に係留する必要があることであり、こうした支持体は、細胞環境内ではどんなものも遭遇する可能性が低い。生物学的特性を妨害しうる、表面との非特異的相互作用を最小限にすることが必須である。表面を不動態化するための伝統的なアプローチには、非特異的なブロッキング剤（例えばＢＳＡまたはカゼイン）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での共有修飾が含まれてきた（Ａ１、Ａ２）。非特異的ブロッキングタンパク質は、しばしば、他の分子の表面吸着を防止するのに十分によくは働かない（Ａ３）。ＰＥＧ化された表面は、タンパク質または核酸および下層表面間の非特異的相互作用を防止するのに十分であるが、すべての場合で、ＰＥＧ単独では十分でない可能性がある。より最近、単一分子分析には、小胞被包反応が用いられてきた（Ａ４、Ａ５）。小胞被包は、脂質膜によって提供される天然環境を利用する、非常に有望なアプローチであるが、小胞内に閉じ込め不能である巨大分子を伴う生化学的実験、または高分子量構成要素の連続的な添加を必要とする実験に関しては、限定された能力しか持たない。
【００６８】
[00154]単一分子技術はまた、任意の所定の時間に、１つのみまたはせいぜい数分子のみを画像化するよう設計された方法を用いて、統計的に適切な情報を収集するのが困難であることによっても妨害される。これは、研究中の反応が、長いＤＮＡ基質を使用する必要がある場合、特に反応自体が非効率的であり、そして／または稀な中間体を伴う場合、問題となりうる。多くの長いＤＮＡ分子を表面に係留するための方法が文献に存在し、そして各々は、特定の条件には大きな能力を有するが、これらもまた、生化学的適用に関して特定の欠点を有する。例えば、Ｂｅｎｓｉｍｏｎらは、「ＤＮＡコーミング」（Ａ６）を開発し、これは強力なツールに発展している（（Ａ７）に概説される）。コーミングされたＤＮＡを疎水性ガラススライド上に係留し、そして後退する空気−水メニスカスで整列させ、多数の接触点でガラスに接着し、そして通常のＢ−ＤＮＡの長さを超えて〜１５０パーセント伸びた分子を生じる。コーミングに必要な疎水性表面および生じるＤＮＡ変形は、多くのタンパク質とは適合不能である。さらに、コーミングされたＤＮＡ分子が共通の方向に沿って整列する一方、その端は、互いに対して整列せず、また配列に関して定義されるＤＮＡの配向も整列しない。別の洗練されたアプローチにおいて、Ｋａｂａｔａおよび同僚らは、λ−ＤＮＡの「ベルト」を、誘電泳動によって２つのアルミニウム電極間で伸長させうると報告し、これを用いて、蛍光顕微鏡法によって、ＲＮＡＰおよびＥｃｏＲＩの運動を視覚化した（Ａ８、Ａ９）。しかし、これらのベルト中の分子は、配列に関して同じ方向に配向されず、ＤＮＡがどのようにアルミニウムに連結されるかは不明なままであり、そしてこの技術のより広い使用は実現されてきていない（Ａ１０）。近年、ＧｕａｎおよびＬｅｅは、分子コーミングに基づく興味深い方法で、ＤＮＡ分子の非常に順序だったアレイをＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）上にスタンプ可能であることを立証した（Ａ１１）。この技術は有望であるが、修飾されていないＰＤＭＳへのタンパク質吸着が、生化学的適用に制限を提示しうる。Ｐｒｅｎｔｉｓｓおよび同僚らは、ガラス表面に係留されたＤＮＡ分子の未結合端に磁気ビーズを連結するアプローチを用いた（Ａ１２）。Ｋｉｍらは、同様のアプローチを報告し、この中で、ＰＥＧ化された表面にλ−ＤＮＡの分子を係留し、そしてＤＮＡを緩衝液流動で伸長させた（Ａ１３）。これらの例の各々において、Ｋｉｍらは、〜１００―２００分子を同時に検出したが、視野を１０倍拡大する必要があり、したがって、係留されるＤＮＡの密度は非常に低いままであった（Ａ１３）。最後に、Ｓｃｈｗａｒｔｚおよび同僚らは、単一ＤＮＡ分子光学的マッピング技術を開発した（Ａ１４、Ａ１５）が、これらのアプローチは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用のリアルタイム生化学的分析には適用不能でありうる。
【００６９】
[00155]これらの課題に取り組むため、本発明者らは、単一視野内での約１００の個々のＤＮＡ分子の同時画像化を可能にする「ＤＮＡカーテン」を開発した（Ａ１６）。カーテンは、ビオチン化ＤＮＡ分子の一端を、広範囲の生物学的分子と適合する不活性環境を提供する脂質二重層に係留することによって組み立てられる（Ａ１７）。二重層はまた、脂質束縛ＤＮＡ分子が長距離を二次元で移動することも可能にする。本発明者らは、水力学的な力を用いることによって、この運動を利用して、フローセル表面内に手動でエッチングされ、そして緩衝液流動の方向に垂直に配向されるミクロスケールの拡散バリアで、ＤＮＡ分子を組織化した。二重層内の脂質は、エッチングされたバリアを横断できず（Ａ１８）、したがって、脂質束縛ＤＮＡ分子は、これらのバリアの前縁に沿って集積する（Ａ１６）。このアプローチの欠点は、手動的エッチングによって、ミクロスケールの拡散バリアの寸法および位置に対する、使用者の調節が非常に制限されることである。エッチングされたバリアはまた、光学的表面の品質も損ない、光散乱、ＤＮＡの不均一な整列、非特異的タンパク質吸着、表示画面の非効率的なカバー、および高い失敗率などの問題につながる。総合すると、これらの問題は、単一分子生物学的研究のためのＤＮＡカーテンの使用を蝕みうる。
【００７０】
[00156]本研究において、本発明者らは、不活性二重層上に懸濁されたＤＮＡの分子カーテンを作製するため、ナノメートル（ｎｍ）スケールの特徴を持つ、脂質拡散に対するクロムバリアを操作するために電子ビーム・リソグラフィーを用いる。バリアの形状および二重層の流動性を用いて、ＤＮＡをよく定義されたパターンに組織化し、この中で、すべての分子が同じ配向に配置され、そして互いに対して整列する。これらのバリアは、単純でそして頑強であり、蛍光ＤＮＡ分子の光学的画像化に干渉せず、そしてミクロ流体試料チャンバー表面上のあらかじめ定義された位置で正確に構築されうる。これらのナノスケールバリアを用いて、本発明者らは、同時に数百、そしてさらに数千の、整列したＤＮＡ分子を、単一の視野中で画像化することが可能である。ＤＮＡのこれらの均一なパターンは、ユニークでそして強力な実験プラットフォームを提供し、数千の個々の分子からの大規模な平行データ獲得を可能にし、そして多数の潜在的な適用を提供する。
【００７１】
[00157]結果
[00158]脂質核酸に対するナノスケールバリア。支持された二重層内に脂質を囲うための機械的または化学的バリアの使用が、Ｓ．Ｇ．  Ｂｏｘｅｒおよび同僚らによって開発されている（Ａ２０）。これらの研究に刺激され、本発明者らは、脂質拡散に対する機械的バリアを用いて、ＤＮＡ分子を石英ガラス表面上の定義された位置でカーテンに組織化することもまた可能であることを立証した（Ａ１６）。本発明者らは、これらのカーテンが、単一分子レベルでのタンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究するための、非常に有効な実験プラットフォームとして働くことを示した（Ａ２１〜２３）。このアプローチの背後にある一般的な原理を図１に示す。カーテンを作製するため、ＤＮＡをまず、試料チャンバー表面をコーティングする、支持された脂質二重層に、一端で係留する（図１Ｂおよび１Ｃ）。水力学的な力の非存在下では、分子はランダムに表面上に分布するが、エバネッセント場の浸透深さ（〜１５０〜２００ｎｍ）によって定義される検出体積外にある（Ａ２４）。流動を適用すると、ＤＮＡは、二重層に一端が係留されたまま、試料チャンバーに押し込まれる。バリアは、ＤＮＡの経路中の戦略にしたがった位置で、流動方向に対して垂直に配向される（図１Ｂおよび１Ｃ）；これは分子の移動を停止し、分子がバリアの縁で集積するようにして、表面に平行に伸長させ、ＴＩＲＦＭによる全輪郭長に沿った視覚化を可能にする（Ａ１６）。
【００７２】
[00159]過去には、本発明者らは、ダイアモンド先端スクライバーで表面に手動で引っかき傷をつけることによって調製した、マイクロメートル・スケールの拡散バリアを用いた（Ａ１６、Ａ１９、Ａ２１〜２３）。手動エッチングは単純であるが、調節が困難であるため、本質的に問題がある。代替法として、本発明者らは、ＤＮＡ分子をカーテンに組織化し、利用可能な表面積を最も効率的に使用可能にする、正確にナノスケールでパターン化されたバリアを生成するため、リソグラフィー技術を適用しようと試みた。図２Ａは、ブラケット型バリアの一連の組み合わせで構成される、所望の表面パターンの漫画表示を示し、そして設計の重要な特徴を示す。流動方向に平行に配向されたガイドチャネルは、二重層に束縛された、近づいてくるＤＮＡ分子を効率的に捕捉することを確実にする。垂直なバリアが、ＤＮＡ分子が整列する「カーテンロッド」を形成する。ガイドチャネルの平行なバリアはまた、緩衝液流動が一過性に中断した際に、垂直なバリアの縁から分子が滑り落ちることを防止する（以下を参照されたい）。総合すると、これらの特徴は、束縛されたＤＮＡ分子をカーテンに組織化することも可能であり、ここですべての構成要素分子は、同じ配向で整列する。
【００７３】
[00160]直接書き込み電子ビーム（Ｅ−ビーム）リソグラフィーによって調製された前述の設計要素を持つクロムバリアパターンの光学的画像を図２Ｂに示す。蛍光脂質（０．５％ローダミン−ＤＨＰＥ）を含有する、支持された二重層の沈着後に６０倍で収集された同じタイプのバリアの蛍光画像によって、脂質が石英ガラスをコーティングするが、これらがクロムバリアを覆わないことが確認される（図２Ｃ）（Ａ２０）。図２Ｄの画像は、クロムバリアセットの２ｘ３シリーズを含む石英ガラス表面の割面を示す。図３Ａは、高さ３１ｎｍの代表的な単一バリアを示す原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示し、そして本発明者らはまた、２０．５ｎｍから最大１７３ｎｍまでの範囲のバリアを含む機能的パターンも作製した。バリアの高さは、表面上で蒸発するクロムの量によって支配され、そして特定の実験必要条件に必要とされるように、正確に調節可能である。図３Ｂは、幅１００±９ｎｍを表す平行クロムバリアの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。比較点として、図３Ｃ〜Ｄは、それぞれ、手動でエッチングされたバリアのＡＦＭおよびＳＥＭ画像を示す。非常に均一なクロムバリアと対照的に、エッチングされたバリアの幅は、約〜５−１０μｍであり、そしてこれらはまた、先に報告されたように、非常に不規則なトポロジーを有する。
【００７４】
[00161]ナノスケールカーテンロッドでのＤＮＡカーテンの組み立て。ＤＮＡカーテンを組み立てるため、四価ニュートラアビジンを通じてビオチン化λ−ＤＮＡを二重層に束縛し、このニュートラアビジンを次に、ビオチン化頭基を有する脂質サブセットに付着させる。流動力の適用によって、ＤＮＡ分子を拡散バリアの方向に押し込む。緩衝液流動を最初に適用すると、ＤＮＡはバリアパターンに押し込まれ、ここで、ガイドチャネル端に集積する。すべての分子がバリア内に集積したら、流動を短期間止め、分子が二重層内に自由に拡散するのを可能にする。この工程によって、ＤＮＡ分子が二重層内を側方拡散することが可能になり、したがってＤＮＡがバリア各々に沿って均一に分布するようになる。ＤＮＡ分子はそれ自体、バリアセット内に保持され、これは、ガイドチャネル開口部の外にＤＮＡ分子が拡散するのに十分なほど長時間は流動が停止されないためである。次いで、流動を再開して、ＤＮＡの分布を評価してもよく、そして必要であれば、短い間隔でこのプロセスを反復して、バリア縁に沿ったＤＮＡの均一な分布（ｄｉｓｂｕｒｓｅｍｅｎｔ）を達成する（材料および方法を参照されたい）。
【００７５】
[00162]図４Ａは、５列のバリアセット内で、カーテンに組織化されたＹＯＹＯ１染色λ−ＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）を含む画像を示す。この視野には、λ−ＤＮＡの〜８０５の個々の分子がある。流動が一過性に止められると、ＤＮＡ分子は、表面から、そしてエバネッセント場の外に拡散する（図４Ｂ）。これは、ＤＮＡ分子が一端でのみ試料チャンバー表面に係留されることを検証するのに用いられる対照である。表面に非特異的に吸着する分子はいずれも、流動が一過性に中断した際に伸長したままであり、そして必要であれば、これらの分子をいかなるさらなる分析からも排除してもよい。流動が数秒より長く停止した場合、係留されたＤＮＡ分子はまた、バリア縁から移動し、これらがクロムストリップに不可逆的に係留されておらず、また別の方式で表面に固定されてもいないことを示す（図４Ｃ）。流動が再開すると、ＤＮＡ分子は拡散バリア内に再び押し込まれる（図４Ｄ）。連続緩衝液流動が維持されるならば、λ−ＤＮＡ分子は側方拡散せず、むしろ、バリア縁に沿った単一の視野に留まり、個々の分子を長期に渡って容易に追跡可能であることを確実にする。しかし、より短いＤＮＡ断片は、λ−ＤＮＡに用いたのと同じ流動条件下では、バリアに対して押された際に、側方拡散を示す（以下を参照されたい）。
【００７６】
[00163]図４Ｅ〜Ｇは、１０倍で見たλ−ＤＮＡカーテンを含有する６列バリアパターンの２ｘ３アレイを示す。バリアセットあたり、これらの４８．５ｋｂ  ＤＮＡ分子がおよそ１，０００あり、そして総含量少なくとも６，０００の個々のＤＮＡ分子に対応する６セットのバリアがこの単一の視野にある。表面に適用されるＤＮＡの量、ビオチン化脂質の割合、バリアセット間の間隔、バリアの数、およびガイドチャネル開口部の幅はすべて、任意の所定のバリアで整列するＤＮＡの総量に影響する。必要に応じてこれらの変数のいずれを調節して、ＤＮＡ分子の数を調整することも可能である。
【００７７】
[00164]ＤＮＡカーテンの配向特異性および光学的制限マッピング。カーテンの設計は、ビオチン・タグの位置に基づいて、同じ配列配向ですべて整列したＤＮＡ分子を生じなければならない。ＤＮＡのある割合が未標識端を通じて二重層に結合するならば、ＤＮＡのこの第二の集団は、ビオチンタグを通じて係留された分子に対して逆の配列配向を有するであろう。ＤＮＡに結合するタンパク質の配列依存性の振る舞いを探査することを意図する将来の実験のためには、整列を検証することが非常に重要である。λ−ＤＮＡは、分子の左端から、２１，２２６ｂｐ、２６，１０６ｂｐ、３１，７４７ｂｐ、３９，１６８ｂｐおよび４４，９７２ｂｐに位置する５つのＥｃｏＲＩ制限部位を有する。分子が所定の配向にある場合、左端で係留されたλ−ＤＮＡの完全ＥｃｏＲＩ消化は、およそ２１ｋｂの束縛された断片を生じ、そして下流断片はすべて、試料チャンバーから洗い流されるであろう。同様に、右端でビオチン化されたλ−ＤＮＡで構成されるカーテンのＥｃｏＲＩ消化は、３．５ｋｂの最終長に相当する、はるかにより短い断片を生じるはずである。図４Ａ〜Ｄは、これらの予測を確認し、カーテンを構成するＤＮＡ分子のすべてが同じ配向で束縛されていることを証明する。
【００７８】
[00165]光学的制限マッピングは、巨大ＤＮＡ分子の物理的分析の強力な技術に発展してきており（Ａ１４、Ａ１５、Ａ２５）、そしてＤＮＡカーテンは、すべての分子が定義された配向で組織化されるため、特異的制限部位の位置をマッピングするための非常に単純なプラットフォームを提供する。図５Ｅに示すように、フローセル内に所望の酵素を連続して導入することによって、ＤＮＡカーテン内で、単一の制限部位の異なる組み合わせを容易にマッピングすることも可能である。この例では、カーテンをＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＰｖｕＩ、およびＳｐｈＩで連続して切断し、そして生じるＤＮＡ断片の観察される長さ（μｍ）を測定し、そしてヒストグラムとしてプロットして、切断部位の位置を例示した。ここに示すように、完全な制限消化は、その長さがＤＮＡのビオチン化端に最も近い切断部位に対応する、束縛されたＤＮＡ断片を残し、そして他の下流断片はいずれも洗い流される。完全な制限消化は、単一の切断部位しか明らかに出来ず、そしてこれを用いて、ＤＮＡ分子全体の多数の同一制限部位をマッピングすることは不可能である。対照的に、１以上の制限酵素を用いた部分的消化は、その長さがＤＮＡ分子中に存在する各制限部位の各々に対応する別個の断片の集団を生じるはずである。この予測を検証するため、本発明者らは、右または左端のいずれかで束縛されたＤＮＡ分子で作製されたカーテンの部分的ＥｃｏＲＩ消化を行った。次いで、生じるＤＮＡ断片の見かけの長さを測定し、そしてその分布をヒストグラムとしてプロットした（図５Ｆ〜Ｇ）。この部分的消化戦略は、ファージλゲノム内のすべての５つのＥｃｏＲＩ部位を同定するのに十分であった。総合すると、これらの実験は、ＤＮＡカーテンの光学的マッピングによって、巨大分子内の制限部位の位置を、迅速に同定可能であることを立証する。
【００７９】
[00166]上記に報告するＤＮＡ断片長はミクロンで示され、そして実際の輪郭長の直接測定ではなく、見かけの観察される値に相当する。ミクロンまたは塩基対で、任意のＤＮＡ断片の実際のサイズを概算するためには、分子が完全に伸長していないという事実のために、ミクロンでのＤＮＡの観察される輪郭長を補正しなければならない。この研究で調べたＤＮＡ分子の平均伸長＜ｘ＞／Ｌは、およそ０．８０であり、≒０，６ｐＮの張力に相当する。すべての異なる測定されたＤＮＡ断片のμｍでの輪郭長の、ミクロンまたは塩基対いずれかでのサイズに基づく完全に伸長されたＤＮＡ断片の既知の長さに対するプロットを、ＤＮＡ断片の実際のサイズを概算する較正曲線として用いてもよい。この経験的な関係は、比較的大きな束縛されたＤＮＡ断片においては、塩基対数を概算するのに十分であるが、ＤＮＡが経験する張力（そしてしたがって平均の伸長される長さ）は分子がより短くなるに連れて減少するため、より短いＤＮＡ分子（≦９ｋｂ）ではこの関係が破綻することが注目される。例えば、上述のＳｐｈＩの〜２．２ｋｂ断片は、測定するには短すぎた。さらに、より小さいＤＮＡ断片は、バリア縁に沿って側方拡散する傾向があるため、これらを直接カウントすることが困難になる。これらの２つの効果の結果として、より短い断片に関して観察される長さは、近似でしかなく、そして観察される総数は、未切断ＤＮＡ分子の最初の数に基づいた。これらのより短い断片長の測定はこの研究の範囲を超えるが、にもかかわらず、シグナル強度データの厳密な分析を含め、そして／または伸長されるポリマーに対する剪断流の影響に適合させることによって、こうした測定は可能であるはずであり、そして別のバリア設計を用いて、側方移動を制限することもまた可能でありうる。
【００８０】
[00167]考察
[00168]本明細書において、本発明者らは、拡散バリアのアレイを操作するため、ナノリソグラフィーを適用し、これを用いて、支持された脂質二重層でコーティングされた表面上に、ＤＮＡカーテンを組織化する。これらのツールを用いて、本発明者らは、すべて正確に同じ配向で配置された数千の個々の完璧に整列したＤＮＡ分子を、ＴＩＲＦＭを用い、リアルタイムで視覚化することも可能である。これらのナノファブリケーションで製作したＤＮＡカーテンは、単一分子ＤＮＡ画像化のいくつかの現在の限定を克服する多くの利点を提供する。該方法は単純でそして頑強であり、フローセルは再利用可能であり、バリア自体は非常に均一であり、そしてこれらは、石英ガラスの光学的品質を損なわず、またシグナル検出に干渉しない。さらに、二重層は、細胞膜とよく似た不活性環境を提供し、そして多くの生物学的巨大分子と適合可能であり、ＤＮＡカーテンが、ある範囲の生化学的系を画像化するのに使用可能であることを確実にする（Ａ１７、Ａ２０）。
【００８１】
[00169]バリアパターンをナノファブリケーションで製作するための直接書き込み電子ビーム・リソグラフィーは、多大な再現性、正確性、設計柔軟性を提供し、そしてデバイスを試作するのに好適である。リソグラフィー技術の使用によって課される空間的制約以外には、全体的パターンに対する、実質的な制限なしに、バリア設計の重要な要素（バリアの高さ、バリアの幅、バリアの形状、バリアの材料、隣接するバリア間の分離距離、ガイドチャネル形状または幅など）をすべて調整して、任意の所望の支持体および／または実験的必要条件に適合させることも可能である。本明細書に提示するバリアの形状および寸法は、λ−ＤＮＡ分子を視覚化するために特別に構築された。例えば、これらのセット内の平行バリアは、１６μｍの距離で互いに分離されて、最大限の表面カバーを可能にする。さらに、ナノリソグラフィーの使用によって与えられる設計柔軟性によって、任意の所望の支持体に適合し、そして／またはこうした支持体を操作するため、はるかにより複雑なバリア要素の開発が導かれる。
【００８２】
[00170]本発明者らの主な意図は、タンパク質−ＤＮＡ相互作用の単一分子分析のための大規模な平行データ収集を容易にする新規ツールを生成することであるが、ＤＮＡカーテンが多数の他の潜在的適用を提供することもまた明らかである。例えば、該カーテンは、長いＤＮＡ分子の物理的マップの迅速な生成を可能にし、そして本発明者らは、制限エンドヌクレアーゼ切断に基づく一連の光学的マッピングアッセイを用いて、これを立証した。ミクロ流体試料チャンバー内でこれらの反応を行い、そしてＤＮＡは一端で係留されるのみであるため、クローニングおよびさらなる分析のために十分な量で、遊離した断片を収集するのは、容易であることがわかるはずである。同様に、また、これらのカーテンを用いて、関心対象の任意のＤＮＡ結合タンパク質が蛍光標識でタグ化可能である限り、該タンパク質の結合部位のマップを生成することも可能である。最後に、カーテン内でのＤＮＡ分子の完璧な整列によって、データ評価が非常に容易になり、そしてこれは自動化画像分析のための将来の潜在能力を提供する。
【００８３】
[00171]材料および方法
[00172]Ｅ−ビーム・リソグラフィーによるバリア構築。石英ガラススライドをＮａｎｏＳｔｒｉｐ溶液（ＣｙａｎＴｅｋ社）で２０分間清浄化し、次いでアセトンおよびイソプロパノールでリンスし、そしてＮ２で乾燥させた。スライドに、アニソール中に３％加えた分子量２５Ｋ、およびアニソール中に１．５％加えた４９５Ｋのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）の二重層を、その後、Ａｑｕａｓａｖｅ導電性高分子（三菱レーヨン）の層をスピン・コーティングした。ランプ速度３００ｒｐｍ／ｓを用いて、４０００ｒｐｍで４５秒間、各層をスピンした。パターン生成装置およびリソグラフィー調節系（Ｊ．Ｃ．  Ｎａｂｉｔｙ，  Ｉｎｃ．）を装備したＦＥＩ  Ｓｉｒｉｏｎ走査型電子顕微鏡を用いて、Ｅ−ビーム・リソグラフィーによって、パターンを書いた。パターンを書いた後、Ａｑｕａｓａｖｅを脱イオン水で洗い流し、そして試料をＮ２で乾燥させた。イソプロパノール対メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の３：１溶液を用いて、５℃で１分間超音波攪拌して、レジストを発展させた。次いで、支持体をイソプロパノールでリンスして、そしてＮ２で乾燥させた。Ｓｅｍｉｃｏｒｅ電子ビーム蒸発装置を用いて、クロムの薄層を沈着させた。リフトオフを達成するため、コーティングされた支持体を６５℃のアセトン槽中に３０分間浸し、そして次いで穏やかに超音波処理した。リフトオフ後、試料をアセトンでリンスして、散在したクロム片を除去し、そしてＮ２で乾燥させた。Ｈｉｔａｃｈｉ  ４７００走査型電子顕微鏡およびＰＳＩＡ  ＸＥ−１００走査プローブ顕微鏡を非接触モードで用いてバリアを画像化した。１０倍または２０倍（示す通り）のいずれかで、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＭＥ６００を用いて、バリアの光学的画像を取った。
【００８４】
[00173]脂質二重層およびＤＮＡカーテン。先に記載されるように、フローセルおよびＤＮＡカーテンを構築した（Ａ１６）。すべての脂質を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入し、そしてリポソームを先に記載されるように調製した。簡潔には、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、０．５％ビオチン化ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（キャップビオチニル））、および８％  ｍＰＥＧ５５０−ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］）の混合物。リポソームを試料チャンバーに３０分間適用した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で、過剰なリポソームをフラッシュした。次いで、フローセルを緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）でリンスし、そして１５分間インキュベーションした。次いで、緩衝液Ａ中のニュートラアビジン（６６０ｎＭ）を試料チャンバー内に注入し、そして１０分間インキュベーションした。さらなる緩衝液Ａで完全にリンスした後、ＹＯＹＯ１であらかじめ染色した（６００塩基対あたり１色素）ビオチン化λ−ＤＮＡ（〜１０ｐＭ）を試料チャンバー内に注入し、１０分間インキュベーションし、そして緩衝液を０．１ｍｌ／分でフラッシュすることによって、未結合ＤＮＡを除去した。画像化のため、緩衝液はまた、１％（ｗ／ｖ）グルコース、６０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、グルコースオキシダーゼ（１００単位／ｍｌ）およびカタラーゼ（１，５６０単位／ｍｌ）で構成される酸素除去系とともに、１００ｐＭ  ＹＯＹＯ１も含有した。緩衝液流動を適用すると、脂質に束縛されたＤＮＡ分子が、拡散バリアの前縁に沿って整列した。流動を５分間停止して、ＤＮＡがバリア中央に向かって拡散するのを可能にした。０．１ｍｌ／分で３０秒間、流動を開始し、そしてＤＮＡカーテンが、拡散バリアに沿って均一な密度で形成されるまで、流動オン・オフ周期を３〜５回反復した。
【００８５】
[00174]ＴＩＲＦＭ。この研究で用いる顕微鏡の基本的設計は先に記載されている（Ａ１９）。プリズム面でのビーム強度は、〜１０−１５ｍＷであった。背後から照射されるＥＭＣＣＤ検出装置（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｂ）を用いて、画像を検出した。示すように、６０ｘ浸水対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、１．２ＮＡ、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ）または１０ｘ対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、０．４５ＮＡ、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ）を用いて、ＴＩＲＦＭ画像を収集した。
【００８６】
[00175]制限酵素。完全消化のため、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えた反応緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中の７００μｌの所望の制限酵素を、０．２ｍｌ／分で注入した。すべての制限酵素をＮＥＢから購入し、そして用いた酵素の量は以下の通りであった：  ＮｈｅＩ（１００単位／ｍｌ）；  ＸｈｏＩ（１００単位／ｍｌ）；  ＥｃｏＲＩ（１００単位／ｍｌ）；  ＮｃｏＩ（５０単位／ｍｌ）；  ＰｖｕＩ（５０単位／ｍｌ）；およびＳｐｈＩ（５０単位／ｍｌ）。制限酵素注入の前およびすべての酵素溶液が流れていった後に、ＤＮＡ分子の画像を収集した。部分的消化のため、ＥｃｏＲＩの量を２０単位／ｍｌに減少させ、そして７００μｌを０．４ｍｌ／分で注入した。
【００８７】
[00176]参考文献
【００８８】
【化１−１】
2012500620.tif 000002
【００８９】
【化１−２】
2012500620.tif 000003
【００９０】
【化１−３】
2012500620.tif 000004
【００９１】
[00177]ＹＯＹＯ１で染色したＤＮＡカーテン。Ｅ−ビーム・リソグラフィーを用いて、石英ガラススライド上に、定義されたパターンでクロムナノスケールバリアを生成した。次いで、ＹＯＹＯ１で染色したλ−ＤＮＡを、ナノスケールバリアの縁に沿って、カーテンに組み立てた。１秒あたり１０フレームの獲得速度で、６０倍の倍率で画像を収集し、そして右下隅にタイムスタンプを示す。動画は、緩衝液流動が始まり、そしてＤＮＡが伸長すると同時に始まる。流動が停止すると、すべてのＤＮＡ分子は表面およびバリア縁から拡散することが示される。流動の非存在下では、エバネッセント場の浸透深さによって定義される励起体積の外にあるため、ＤＮＡの全長は見られない。最後に流動を再開してＤＮＡを再伸長する。
【００９２】
[00178]より低い倍率でのＹＯＹＯ１染色ＤＮＡカーテンの画像化。１０倍の倍率で画像を捕捉し、そして完全視野は、４ｘ６アレイのバリアを有するスライド表面からの２ｘ３アレイのバリアを示す。１秒あたり１０フレームで、動画を収集し、そして右下隅にタイムスタンプを示す。動画は、緩衝液流動が始まり、そしてＤＮＡが伸長すると同時に始まり、流動が停止すると、ＤＮＡは表面およびバリア縁から拡散することが示され、そして最後に流動を再開してＤＮＡを再伸長させる。
【００９３】
実施例２：側方分散が調節されたＤＮＡカーテンを組み立てるための幾何学的ナノウェルの平行アレイ
[00179]個々の分子の分析は、生物学的研究のための重要なツールに発展しており、そして実験設計戦略にアプローチする概念的に新しい方法を提示する。しかし、これらの技術を、生物学的研究コミュニティ内で広く利用可能にするためには、より頑強な方法が必要である。この目的を達成するのを補助するため、本発明者らは、脂質二重層でコーティングした表面上の操作された拡散バリアで組織化された数千の個々のＤＮＡ分子で構成されるカーテンを組み立てて、そして視覚化するため、ナノファブリケーション技術を単一分子光学的顕微鏡法と組み合わせた。本明細書において、本発明者らは、ＤＮＡの単一分子を装填可能な数千のナノスケールウェルで構成される非直線の幾何学的バリアパターンを実行する、この技術の重要な拡張を提示する。本発明者らは、これらの幾何学的ナノウェルを用いて、操作されたバリアパターンの縁に沿って組み立てられたカーテン内の個々のＤＮＡ分子の側方分布を正確に調節可能であることを示す。ナノウェルの寸法によって影響される、ユーザーが定義する距離によって、ＤＮＡカーテンを構成する個々の分子を互いに分離してもよい。本発明者らは、動的光学的制限マッピングと本発明者らが称する、これらのパターン化されたＤＮＡカーテンのリアルタイム制限アッセイにおける、より広い有用性を立証し、このマッピングを用いて、巨大ＤＮＡ分子内の切断部位の完全なセットを迅速に同定可能である。
【００９４】
[00180]生物学における進歩は、しばしば、異なる科学的専門分野を一緒にして、共通のゴールを達成する、新規技術の同時確立を通じてのみ可能となる。この一般原則は、単一分子研究に関して特に真実であることが証明されており、該研究では物理、化学、および生物学の側面がすべて計り知れない貢献をしてきており、これが非常に高感度の検出光学、頑強な蛍光タグ、および個々の分子を表面に係留するための化学反応の発展につながってきた。総合すると、これらの技術的成果は、個々の巨大分子を単離し、視覚化し、そして操作するための新規アプローチを可能にする一方で、同時に、重要な生物学的問題に取り組むことを可能にし、そして研究の新たな手段を開き、大量の新規情報をすでに明らかにしてきた。核酸およびタンパク質−核酸相互作用の研究において、これほど明白なことはない（Ｂ１〜５）。それでも、これらのアプローチが、特定の反応機構のより多くの詳細を明らかにするにつれて、これらの技術のスループット能力が低く、そして技術的な性質が困難であることによって、これらの技術のより広い実行が妨害されたままであり；その結果、大部分の研究は、限られた特殊化された実験室で行われる、比較的単純なモデル系に制限されている。
【００９５】
[00181]これらの技術をより広くアクセス可能にする努力の中で、本発明者らは、ナノスケール・エンジニアリング、ミクロ流体学、および不活性脂質二重層でコーティングした表面を、光学顕微鏡法と統合して、非常に多様な生物学的適用に受け入れられる頑強な実験プラットフォームを用いて、リアルタイムでの、数千の個々のタンパク質−ＤＮＡ複合体からの大規模な平行データ獲得のために使用可能なＤＮＡ分子のカーテンを作製するためのハイスループット法を開発した（Ｂ６、Ｂ７）。これらのＤＮＡカーテンは、互いに関して完璧に整列した数千の個々のＤＮＡ分子の同時視覚化を可能にし、そしてまた、ＤＮＡに結合した蛍光タンパク質のリアルタイム検出も可能にする（Ｂ８〜１１）。しかし、このアプローチになお残る制限は、ＤＮＡカーテンを構成する各分子間の側方分離に対する調節の欠如である。これは、特に、所望の実験の実行またはそれに続くデータ分析のいずれかが、カーテン内の重複する分子の存在によって混乱させられる場合には、潜在的に問題を提示しうる。さらに、比較的大きいλ−ＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）基質は、一定の緩衝液流動が維持される限り、滑らかなクロムバリアに沿って、固定された側方位置に留まるが、より小さいＤＮＡ断片は、バリアに沿ってかなりの側方移動を示す。脂質二重層は、クロムバリアの縁で流体のままであり（Ｂ１２）、そしてより短いＤＮＡの観察される可動性は、滑らかなバリア縁に沿った、脂質アンカーのスリッページから生じる。これは、研究のターゲットとなる分子がバリア縁に沿って不可避的にスリップし、そして互いに衝突し、そして／またはバイパスし、わずか数秒より長い期間に渡って、類似の見かけの分子を互いに区別することを非常に困難にするため、単一分子データ分析には特に問題である。総合すると、これらの複雑な状態は、特に、ファージλゲノムよりも長さが短いＤＮＡ基質を用いる場合に、ＤＮＡカーテンで行いうる実験に対してかなりの設計制約を課す可能性もある。
【００９６】
[00182]これらの問題を解決する努力の中で、本発明者らは、ＤＮＡカーテン内の分子の位置を調節しうる新規バリア設計を開発しようとした。本明細書において、本発明者らは、ナノリソグラフィーによって作製した単純な非直線の幾何学的バリアパターンを用いて、ＤＮＡ分子間の正確に調節された側方置換を伴う整列ＤＮＡカーテンを構築可能であることを示すことによって、脂質に束縛されたＤＮＡ分子が、バリア縁に沿ってスライドしうる事実を利用する。これらのバリアは、ナノメートルスケールの特徴を持つ反復三角波（鋸歯パターン）からなり、ここで、各隣接三角の頂点が小さなウェルを形成し、本発明者らはこのウェルを幾何学的ナノウェルと呼ぶ。本発明者らは、ＤＮＡの単一分子をナノウェル内に装填可能であり、そして連続した緩衝液流動が維持される限り、連続した観察および分析のためにＤＮＡが無期限に維持されうることを示す。カーテン内の各ＤＮＡ分子間の最小分離距離は、非直線の幾何学的バリアパターン内の隣接するナノウェル間の距離によって定義され、そして各ウェル内のＤＮＡ分子の総数は、表面に適用されるＤＮＡの量によって調節される。タンパク質−ＤＮＡ相互作用の単一分子生化学的研究のために明白に設計されているが、これらの非直線の幾何学的バリアパターンを伴って作製されたＤＮＡカーテンは、多数の他の潜在的な適用を有する。そのより広い有用性の例として、本発明者らは、動的光学的制限マッピングアッセイにおいて、幾何学的ナノウェルを伴って作製されたＤＮＡカーテンを用い、該アッセイは、リアルタイムデータ収集を用いて、２分以内で起こる反応において、ファージλゲノム内の特異的切断部位の全セットを同定する。
【００９７】
[00183]材料および方法
[00184]Ｅ−ビーム・リソグラフィーによるバリア構築。石英ガラススライドをＮａｎｏＳｔｒｉｐ溶液（ＣｙａｎＴｅｋ社、カリフォルニア州フレモント）で２０分間清浄化し、次いでアセトンおよびイソプロパノールでリンスし、そしてＮ２で乾燥させた。スライドに、アニソール中の３％の２５Ｋおよび４９５Ｋの分子量のポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、マサチューセッツ州ニュートン）の二重層をスピン・コーティングした。ランプ速度３００ｒｐｍ／ｓを用いて、４，０００ｒｐｍで４５秒間、各層をスピンした。パターン生成装置およびリソグラフィー調節系（Ｊ．Ｃ．  Ｎａｂｉｔｙ，  Ｉｎｃ．、モンタナ州ボーズマン）を装備したＦＥＩ  Ｓｉｒｉｏｎ走査型電子顕微鏡を用いて、Ｅ−ビーム・リソグラフィーによって、パターンを書いた。イソプロパノール対メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の３：１溶液を用いて、５℃で２分間超音波攪拌して、レジストを発展させた。次いで、支持体をイソプロパノールでリンスして、そしてＮ２で乾燥させた。Ｓｅｍｉｃｏｒｅ電子ビーム蒸発装置を用いて、クロムの薄層を沈着させた。リフトオフを達成するため、コーティングされた支持体を７５℃のアセトン槽中に３０分間浸し、そして次いで穏やかに超音波処理した。リフトオフ後、試料をアセトンでリンスして、散在したクロム片を除去し、そしてＮ２で乾燥させた。Ｈｉｔａｃｈｉ  ４７００走査型電子顕微鏡およびＰＳＩＡ  ＸＥ−１００走査プローブ顕微鏡を非接触モードで用いてバリアを画像化した。１０倍または２０倍（示す通り）のいずれかで、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＭＥ６００を用いて、バリアの光学的画像を取った。
【００９８】
[00185]脂質二重層およびＤＮＡカーテン。クロムナノスケール拡散バリアを伴って、石英ガラススライド（Ｇ．  Ｆｉｎｋｅｎｂｅｉｎｅｒ，  Ｉｎｃ．）からフローセルを組み立てた。ダイアモンドが先端についた錐（１．４ｍｍ  Ｏ．Ｄ．；  Ｋａｓｓｏｙ）を装備した高速正確ボール盤でスライドを通じて穴をあけることによって、入口および出口ポートを作製した。２％（ｖ／ｖ）Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ、１Ｍ  ＮａＯＨ、および１００％  ＭｅＯＨ中に連続して浸すことによって、スライドを清浄化した。各洗浄間に、ろ過滅菌水でスライドをリンスし、そして使用するまで、１００％  ＭｅＯＨ中に保存した。組み立て前に、窒素流下でスライドを乾燥させ、そして真空オーブン中で、少なくとも１時間、ベーキングした。ホウケイ酸ガラスカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および両面テープ（〜２５μｍ厚、３Ｍ）から、試料チャンバーを用意した。熱融解性接着剤（ＳｕｒｅＢｏｎｄｅｒスティックのり、ＦＰＣ社）を用いて、入口および出口ポート（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を取り付けた。試料チャンバーの総体積は〜４μｌであった。シリンジポンプ（Ｋｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および作動注入バルブ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、試料送達、緩衝液選択および流速を調節した。フローセルおよびプリズムを、コンピュータ調節フィードバック制御を備えた特注のヒーター中に搭載して、必要に応じて、２５〜３７℃（±０．１℃）の間で試料の温度を調節した。
【００９９】
[00186]先に記載されるように、ＤＮＡカーテンを構築した（Ｂ７）。すべての脂質を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入し、そしてリポソームを先に記載されるように調製した。簡潔には、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン）、０．５％ビオチン化ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（キャップビオチニル））、および８％  ｍＰＥＧ５５０−ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］）の混合物。リポソームを試料チャンバーに３０分間適用した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で、過剰なリポソームをフラッシュした。次いで、フローセルを緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）でリンスし、そして１５分間インキュベーションした。次いで、緩衝液Ａ中のニュートラアビジン（６６０ｎＭ）を試料チャンバー内に注入し、そして１０分間インキュベーションした。さらなる緩衝液Ａで完全にリンスした後、１〜２ｎＭのＹＯＹＯ１であらかじめ染色したビオチン化λ−ＤＮＡ（１０ｐＭ）を試料チャンバー内に注入し、１０分間インキュベーションし、そして緩衝液を０．１ｍｌ／分でフラッシュすることによって、未結合ＤＮＡを除去した。緩衝液流動を適用すると、脂質に束縛されたＤＮＡ分子が、拡散バリアの前縁に沿って整列した。流動を５分間停止して、ＤＮＡがバリア中央に向かって拡散するのを可能にした。０．１ｍｌ／分で３０秒間、流動を開始し、そしてＤＮＡカーテンが、拡散バリアに沿って均一な密度で形成されるまで、流動オン・オフ周期を３〜５回反復した。
【０１００】
[00187]ＴＩＲＦＭ画像化。この研究で用いる顕微鏡の基本的設計は先に記載されている（Ｂ１１）。簡潔には、系は、特注照射系を備えたＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｕ倒立顕微鏡周囲に構築される。４８８ｎｍ、２００ｍＷダイオード励起固体レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＣＤＨＲ）を励起供給源として用いた。減光フィルターを用いて、レーザーを必要に応じて減弱させ、そしてレーザーは遠隔操作される鏡（Ｎｅｗ  Ｆｏｃｕｓ）によってＤＮＡカーテン上を中心とした。プリズム面でのビーム強度は、〜１０−１５ｍＷであった。背後から照射されるＥＭＣＣＤ検出装置（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｂ）を用いて、画像を検出した。別に示さない限り、６０ｘ浸水対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、１．２ＮＡ、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ）を用いて、ＴＩＲＦＭ画像を収集した。
【０１０１】
[00188]結果
[00189]設計戦略。本発明者らは、脂質拡散に対する機械的バリアを用いて、単一分子レベルでのタンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究するためのユニークでそして有効な実験プラットフォームとして働くカーテンに、ＤＮＡ分子を組織化可能であることを示した（Ｂ６〜１１）。ＤＮＡカーテンを作製するための全体の戦略を図６に示す。ＤＮＡ分子をまず、一端で、試料チャンバー表面をコーティングする、支持された脂質二重層に係留し、そして水力学的な力の適用を用いて、脂質に束縛されたＤＮＡ分子を脂質拡散バリアに向かって押し込む。支持される二重層内の脂質は、これらの機械的バリアを横断不能である（Ｂ１３〜１５）。その結果、バリア（カーテンロッド）はまた、ＤＮＡ分子の前方向の動きを停止し、これらをバリア縁に集積させ、ここでＤＮＡ分子はエバネッセント場内に伸長する。本発明者らが先に示すように、λ−ＤＮＡ分子（４８．５ｋｂ）を、これらのバリアエッジに沿ってカーテンに組み立て、そして分子が固定された側方位置に残ることも可能である（Ｂ６）。
【０１０２】
[00190]全長λファージゲノムと対照的に、より小さいＤＮＡ分子は、滑らかなバリア縁に沿って側方に拡散する（以下を参照されたい）。これは、脂質二重層が、バリア縁でも流体のままであるためであり（Ｂ１２）、そして水力学的な力により、より短いＤＮＡ上に生じる張力は、分子がバリアに沿ってスライドする傾向を克服するには不十分であるためである。さらに、これらのクロムバリアは、流動力に対して正確に垂直に配向するよう設計され、そしてこれらが流動方向に対して数度ずれている場合、より小さいＤＮＡ分子は、バリア縁に沿って迅速にスリップする。より小さいＤＮＡ基質を用いる際のこれらの潜在的な設計欠点を考慮して、本発明者らは、バリア縁に沿った分子のスリッページを排除しうる新規バリア設計を探し求めた。本発明者らは、バリア縁に沿ったＤＮＡ分子の位置が、バリア自体の形状を改変することによって、受動的に調節可能であると結論づけた。例えば、ＤＮＡ分子は滑らかな縁に沿って運動しうるため、単純な反復三角波で構成される非直線の幾何学的バリアパターンは、運動を制限するであろう（図６Ｂおよび図６Ｃ）。これは、流動する緩衝液から生じる水力学的な力が、分子が二重層内を側方に移動するいかなる傾向も克服するために十分な力で、各三角の頂点内にＤＮＡ分子を押し入れるはずであるためである（図６Ｂ）。本発明者らは、これらの三角形の特徴を幾何学的ナノウェル（配列決定ゲルのウェルに概念的に似ている）と呼ぶが、これは、連続流動力が維持される限り、各ウェル内に装填されたＤＮＡ分子が、遊離してバリアに沿って側方移動することがないであろうためである。側方スリッページを排除することに加え、パターン内の隣接する三角形のピーク間距離は、カーテンを構成するＤＮＡ分子の最小側方分離に影響するはずである。例えば、５００ｎｍ間隔で反復される非直線の幾何学的パターンは、互いに５００ｎｍ離れたＤＮＡ分子を生じるはずである。分離は、ウェルのいくつかが占められていない場合、５００ｎｍより大きいであろうが、この場合であっても、距離は５００ｎｍで割れる定義された増分（すなわち、５００、１０００、１５００、２０００ｎｍなど）で生じるはずである。これが真実であるならば、これらの非直線の幾何学的バリアパターンは、カーテンを構成する個々のＤＮＡ各々の配置に渡る正確な調節を与えるであろう。
【０１０３】
[00191]本明細書で試験する非直線の幾何学的バリアパターンの例を図７に示す。本発明者らは、石英ガラススライド上で、鋸歯パターンに配置された幅１００ｎｍおよび高さ３０ｎｍであるクロムバリアを操作することによって、電子ビーム（Ｅ−ビーム）リソグラフィーを用いて、これらの所望の設計特徴を達成した。図７Ａは、バリアセット対の光学的画像を示し、そしてフローセルに組み立てられたならば、クロムバリアは、水力学的な力に対して垂直に配向され、各三角形の頂点は、緩衝液が流動するのと同じ方向を指すであろう（図６に示す通り）。図７Ｂは、１μｍのピーク間間隔の、非直線の幾何学的バリアパターンのＡＦＭ画像を示し、そして高さがちょうど２０ｎｍであることを示す。２０００、１０００、７５０、５００、３５０、および２００ｎｍのピーク間距離を持つ非直線の幾何学的バリアのＳＥＭ画像の例を図７Ｃに示す。これらの画像は、本発明者らが標準的なリソグラフィー技術を用いて、本発明者らが望む設計のナノメートルスケール特徴を有する、正確な非直線の幾何学的パターンを持つクロムバリアを構築するため、標準的リソグラフィー技術を用いてもよいことを示す。
【０１０４】
[00192]分子間の定義される側方分離を伴うＤＮＡカーテン。本発明者らが予測するように、カーテン内のＤＮＡ分子が、実際、幾何学的ナノウェル内に維持されるならば、パターン設計内の三角形の隣接する頂点間の距離は、個々のＤＮＡ分子間の分離距離に反映されるはずである。図９は、隣接ナノウェル間が２０００、１０００、７５０、５００、３５０、および２００ｎｍ離れている非直線の幾何学的バリアパターンで作製されるＤＮＡカーテンの例を示す（図９Ａ、左のパネル）。上に示すように、これらのカーテンは、挿入色素ＹＯＹＯ１で蛍光染色された２０ｋｂ  ＤＮＡで構成される。この設計パターンが、所望の間隔のＤＮＡ分子を生じることを検証するため、本発明者らは、バリア縁に沿った側方位置に対して、染色されたＤＮＡのシグナル強度をプロットし、そしてこれらのプロットは、非直線の幾何学的バリアパターンの設計からの値と一致するピーク間頻度を明らかにした（図９Ａ、中央のパネル）。２０００、１０００、７５０、５００、３５０、および２００ｎｍバリアは、パターン設計に対応する平均分離距離を生じた。このデータによって、非直線の幾何学的バリアパターンが、非直線の幾何学的拡散バリアに沿ったＤＮＡ分子のスリッページを防止することが立証され、そしてまた、隣接するナノウェル間の距離が、ＤＮＡカーテンを構成する個々の分子間の側方分離の度合いに影響することもまた確認される。
【０１０５】
[00193]いくつかの異なるパラメータを調節することによって、カーテンを構成するＤＮＡ分子の数を変化させることも可能であり、このうち最も単純なものは、試料チャンバー内に注入されるＤＮＡの量である（Ｂ６、Ｂ７）。これらの非直線の幾何学的拡散バリアパターンを用いると、あまりに多くのＤＮＡが存在していた場合、ＤＮＡの多数の分子が各幾何学的ナノウェル内に集積するであろう。この問題を回避するため、１つ未満のＤＮＡ分子がナノウェルあたりに見られるように、比較的少量のＤＮＡを用いてこれらの実験を行った。言い換えると、ナノウェルのいくつかは占有されないままであり、多くのウェルは単一のＤＮＡ分子を有し、そしてウェルのいくつかは２つの（またはそれより多い）ＤＮＡ分子を有するであろう。これは、各ウェル中のＤＮＡの蛍光強度を測定することによって確認可能であり、そして２つの分子を宿するナノウェルは、１つのみを宿するものの２倍明るく、したがって、容易な区別が可能である。図９Ｂは、ＤＮＡ分子あたりの総統合強度のヒストグラムを示し、顕著なピークおよびより顕著でないピークを明らかにする。さらに、幾何学的ナノウェルの総数およびバリアセット内のＤＮＡ分子の総数の集計。これらの値はまた、図９Ａに示す蛍光横断面にも反映され、ナノウェルあたりに装填されるＤＮＡ分子の数が調節可能であり、そして１より多いＤＮＡを有するナノウェルはいずれも、シグナル強度に基づいて容易に同定可能であり、そして必要であればさらなる分析からは排除されうることのさらなる証拠を提供する。
【０１０６】
[00194]ＤＮＡ分子は幾何学的ナノウェル内に維持される。上に示すように、滑らかな直線クロムバリアに沿って整列したＤＮＡ分子は、バリア縁に沿って側方にスリップする可能性もあり、そしてこの効果は、より短いＤＮＡ分子で非常に顕著でありうる。この問題を例示するため、λ  ＤＮＡから得られる２０ｋｂ  ＰＣＲ  ＤＮＡ断片をＹＯＹＯ１で標識した（（Ｂ１６）、そして材料および方法を参照されたい）。これらの分子を滑らかなバリアの縁に沿って整列させて、１３．５分間の経過に渡って視覚化した。次いで、カーテンの横断面から、長期に渡るＤＮＡ分子の側方位置を例示するキモグラムを生成した。図９Ａに示すように、分子の標識端は、わずか数秒に渡る期間であってさえ、バリア縁に沿ったＤＮＡの側方スリッページと一致する大きな移動を示した。非直線の幾何学的バリアパターンで作製されたＤＮＡカーテンを、対応するキモグラムとともに、図９Ｂに示す。滑らかな直線バリアで観察された移動とは対照的に、非直線の幾何学的パターンで整列したＤＮＡ分子は、側方スリッページのいかなる証拠もまったく示さなかった。連続した、より短い長さのＤＮＡ分子を用いた類似の実験では、３４、２１、１１、および５ｋｂ  ＤＮＡ断片の側方移動もまた、非直線の幾何学的バリアパターンでは排除されたことが明らかになった（図９Ｂ）。このデータは、非直線の幾何学的バリアパターンが、バリア縁に沿ったＤＮＡ分子の移動を制限するのに非常に有効であることを示す証拠を提供し、さらに、分子自体が幾何学的ナノウェル内に装填されることをさらに示す。
【０１０７】
[00195]動的光学的制限マッピング。これらの非直線の幾何学的バリアパターンを用いると、一定の流動力によって維持された場合、バリア縁に沿った側方移動を排除することによって、比較的小さいＤＮＡ断片であっても研究が可能になる。本発明者らが先に示したように、カーテンの設計はまた、ＤＮＡの特定の端のビオチンタグの位置に基づいて、すべて、同じ配列配向を持って整列したＤＮＡ分子を生じる（Ｂ６）。この完璧な整列の結果、カーテン内のＤＮＡ分子の制限消化は、最も上流の切断部位に対応する長さの、束縛された同一断片を生じる（Ｂ６）。完全消化を用いて、同じ制限酵素によって切断される多数の部位を同定することは不可能であり、これは、ＤＮＡが切断されるとすぐに、下流のＤＮＡが試料チャンバーからフラッシュされるためである。しかし、部分的制限消化を用いて、長さがＤＮＡに渡る切断部位の分布を反映するようなＤＮＡ分子の混合集団を生成することも可能である。
【０１０８】
[00196]原理的には、ＤＮＡの完全制限消化はまた、これらの中間の長さ各々に対応する断片すべてを明らかにすることも可能であるが、消化がリアルタイムで見られ、そして切断速度がデータ獲得頻度より緩慢である場合のみである。この場合、個々の切断事象各々の後、下流断片は、試料チャンバーから緩衝液流動によって直ちにフラッシュされ、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ビオチン化断片を残し、その短くなった長さが切断部位の位置に対応する。ＤＮＡの係留された端に比較して最も上流の部位で特定の分子が切断されるまで、同じＤＮＡに対してこれを反復して行ってもよい。これらのＤＮＡカーテンで視覚化されうるＤＮＡ分子が多数であることから、ＤＮＡ内の潜在的な部位すべてを検出することが可能になり、そして幾何学的ナノウェルは、ＤＮＡ分子が切断された後、前後にスリップすることを防止する。最終的には、すべてのＤＮＡ分子が最も上流の制限部位に対応する最終長にまで切断される。本発明者らは、このリアルタイム消化を動的光学的制限マッピングと称し、そしてこうしたアッセイの例を図１０に示す。ここで、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そして消化物をリアルタイムで観察した。図１０Ｂは、消化前のＤＮＡを示し、そして図１０Ｃは、消化が完了した後のＤＮＡを示し、すべてのＤＮＡが最終的に切断された（２１ｋｂ断片に対応する）ことを示し、そしてすべての分子が同一配向であることが確認される。図１０Ｃは、消化反応中の個々のＤＮＡ分子から作製されたキモグラムの例を示す。これらのキモグラムは、５つのＥｃｏＲＩ部位各々が同定可能である例を提供するため、選択された。この消化に必要な総時間は、わずか３０秒間であり、そして本発明者らは、さらに最適化すると、この時間を有意に減少させうると予期している。中間時点で観察される、生じた断片の長さを測定し、そしてその分布を図１０Ｄにヒストグラムとしてプロットし、このヒストグラムは、λファージゲノム中の５つのＥｃｏＲＩ切断部位すべてを明らかにする。このアッセイは、滑らかな直線バリア設計では不可能であり、これは断片長が短くなるにつれて、ＤＮＡ分子が迅速に前後にスリップし始め、したがって、長期に渡る同じＤＮＡ分子の測定を妨げるためである。したがって、このリアルタイム動的光学的制限マッピングアッセイは、非直線の幾何学的バリアパターンと組み合わせて用いると非常に容易であり、これは、消化中により短くなるにつれてＤＮＡ分子が移動することが、ナノウェルによって防止されるためである。
【０１０９】
[00197]考察
[00198]単一分子生化学に対するハイスループットアプローチは、以前の伝統的なアンサンブルアプローチではアクセス不能であった、反応機構および巨大分子動力学の多くの新規詳細を明らかにする潜在能力を有する。これらの技術をより広く適用可能にする努力の中で、本発明者らは、ナノスケール操作を用いて、本発明者らがＤＮＡカーテンと呼ぶハイスループットアプローチを確立し、この技術は、リアルタイムで見られる数千の個々の分子からの大規模な平行データ獲得を容易にする。本明細書において、本発明者らは、非直線の幾何学的バリアパターンを用いて、流動性脂質二重層に束縛されたＤＮＡ分子のカーテンを整列させることも可能であり、そしてバリアの幾何学がカーテンを構成する個々の分子間の側方距離に影響することを示した。本発明者らは、ＤＮＡの単一分子を幾何学的ナノウェル内に装填することも可能であり、ＤＮＡがこのウェル内でさらなる分析および実験のために保持されることも可能であることを立証する。この研究は、分子カーテンに組み立てられるＤＮＡ分子の側方拡散を調節する、非常に単純でそして頑強な手段を提供することによって、ナノファブリケーションの力を単一分子生物学に向ける。
【０１１０】
[00199]本発明者らの先の研究において、本発明者らは、ＤＮＡカーテンがタンパク質−ＤＮＡ相互作用の分析に好適であり、特にＤＮＡに沿ったタンパク質の側方移動を伴う系で、好適であることを立証した（Ｂ８、Ｂ９）。これらの実験の１つの複雑な点は、観察中のタンパク質がごく近接して並んだ２つの（またはそれより多い）ＤＮＡ分子と相互作用する可能性を、常に明白には排除できない点である。ＤＮＡカーテンの密度を減少させてこの問題の軽減を補助することは可能であるが、それでもなお、観察中の特定のタンパク質が、特定のＤＮＡ分子に結合していることを立証するのは常には可能ではない。さらに、本発明者らのＤＮＡカーテンアッセイは、大規模な平行データ獲得を可能にする能力があることが立証されているが、自動化画像分析プログラムは、２以上の同一の物体が任意の有意な度合いに重複している場合には、これらを容易には区別できないため、生じたデータの評価は困難なままである。非直線の幾何学的バリアパターンの出現によって、ＤＮＡ分子は互いに固定された距離で維持され、そして標識ＤＮＡの蛍光強度に基づいて特定のウェル中に１つの分子のみが装填されることが検証可能であるため、これらの問題は排除される。さらに、本明細書で用いる非直線の幾何学的パターンは非常に単純であり、その上、表面上の定義された位置にＤＮＡ分子を導くのに非常に有効である。個々のＤＮＡを幾何学的ナノウェル内に装填し、そして維持することができれば、将来的には、これらの単一分子を個々に取り扱うかまたは単離することが可能になる可能性があり、そして本発明者らは、ナノリソグラフィーによって提供される柔軟性によって、脂質に係留されたＤＮＡ分子のさらにより複雑な操作のために使用可能な、込み入ったバリアパターンの構築が可能であると想定する。この研究の主な動機は、引き続き、タンパク質−ＤＮＡ相互作用の単一分子光学的検出のための頑強なハイスループット・ツールを開発することであるが、本発明者らは、ＤＮＡカーテンおよび幾何学的ナノウェルが、巨大ＤＮＡ分子の物理的分析に関する多くの潜在的な適用を有すると想定する。例えば、ゲノム研究の大きな側面は、依然として、巨大ＤＮＡ断片の性質決定であり、そしてこれらの分子を操作し、分析し、そして単離するための多くのアプローチが開発されてきている（Ｂ１７〜２１）。本発明者らは、これらの非直線の幾何学的パターンで構成されたＤＮＡカーテンを用いて、束縛されたＤＮＡ分子の光学的制限マップを生じることも可能であり、そしてこれらのアッセイはミクロ流体系の背景で行われるため、さらなるアッセイのため、切断されたＤＮＡを容易に単離可能であることを示した。ＤＮＡ分子を迅速にマッピングするため、このタイプのリアルタイム制限消化画像化を用いてもよく、そしてカーテン中に整列する分子が多数であることから、１回のみの実行から、統計的に適切なデータの獲得が確実になる；本発明者らは、これを動的光学的制限マッピングと称する。最後に、これらの完璧に整理されたＤＮＡ基質は、ほとんどまたはまったくユーザーの介入を伴わない、完全に自動化されたデータ分析のため、厳密な機械視覚技術を適用する将来の潜在能力を、ここで提供する��
【０１１１】
[00200]参考文献
【０１１２】
【化２】
2012500620.tif 000005
【０１１３】
実施例３：表面係留ＤＮＡ分子を捕捉し、そして整列させるための拡散ゲート化ナノウェル。
[00201]本発明者らは、先に、ナノファブリケーションで製作したバリアを用いて、脂質拡散を調節して、ＤＮＡの分子カーテンを整列させることも可能であり、これをＴＩＲＦ顕微鏡法によって視覚化して、そしてＤＮＡ分子自体の物理的分析に用いてもよいし、またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を探査するためのツールとして利用してもよいことを立証した。この技術の利点は、該技術が、これらの研究を単一分子レベルであるが、大規模な平行データ獲得を可能にするハイスループット形式で行うことを可能にすることである。しかし、これらの先のバリアパターンの１つの欠点は、これらが、整列したＤＮＡ分子の可動性を閉じ込めるために、水力学的な（または電気泳動的な）力の連続した適用を必要とすることである。この力の非存在下では、ＤＮＡ分子はバリア縁から拡散して、そしてＤＮＡループの形成を伴う生化学的な相互作用（例えばプロモーターに結合したＲＮＡポリメラーゼ、および遠位エンハンサー要素に結合した転写因子の間の相互作用）を探査することが困難になる。この問題を克服するため、本発明者らは、構成要素分子が定義された位置にトラップされる、ＤＮＡカーテンを整列させるための技術を開発した。単一ＤＮＡ分子を個々の幾何学的ナノウェル内に導くのに用いられる、長く狭い進入孔を含有するバリアパターンを用いてこれを達成する。緩衝液流動の非存在下では、ＤＮＡ分子は脂質コーティング表面から拡散するが、これらは数十分までの範囲の時間スケールに渡って、幾何学的ナノウェルから逃れ出ることができない。これらのバリア設計は、同じＤＮＡ鎖に沿って結合した遠位構成要素の会合を伴う、任意のタンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究するのに理想的である。
【０１１４】
[00202]図１１Ａは、適用される緩衝液流動における変化に対する、表面に束縛されたＤＮＡ分子（全体に緑色で示される）の反応を例示する。流動が維持されている場合、ＤＮＡ分子は表面に対して平行に伸長可能であり、そしてエバネッセント場の浸透深さによって定義される検出体積内に維持される。流動が中断すると、ＤＮＡは、場の外に拡散し、分子の輪郭長に沿った遠位位置間の長距離相互作用（すなわちＤＮＡルーピング）が可能になる。流動を再開すると、分子は再び、その全輪郭に沿って見ることが可能になり、ＤＮＡルーピングによってもたらされる任意の影響の評価が可能になる。図１１Ｂ〜Ｃは、ゲート化ナノポアで構成される非直線の幾何学的バリアに比較した、通常の直線拡散バリア（黒で示すバリア）で組み立てられるＤＮＡカーテンを用いて、一過性に緩衝液流動を止めた結果を示す。図１１Ｂに示すような通常の直線バリア縁を用いると、図１１Ａに示すように、流動の終結によってＤＮＡ分子が表面から拡散することが可能になるが、ＤＮＡはまた、バリアの縁自体からも拡散する。その結果、流動を再開すると、緩衝液流動を停止する前に存在していた順序に比較して、縁に沿ったＤＮＡ分子の順序が異なる。この例では、個々のＤＮＡ分子を番号付け、順序の変化を強調する。これは、流動が一過性に中断する前および後で、分子を互いに区別するのを非常に困難にするかまたは不可能にする（すなわち、分子がすべて配列である場合、分子１を他の４つのＤＮＡ分子のいずれから区別することもできない）。対照的に、図１１Ｃのゲート化幾何学的ナノウェルで捕捉されそして整列したＤＮＡ分子は、流動が終結しても個々のナノウェルから拡散しない。これは、非直線の幾何学的バリアを含むナノウェルからの束縛されたＤＮＡの拡散が、ナノポアの長く狭い幾何学によって阻害されるためである。図１１Ｄは、ナノポア進入チャネル内にＤＮＡを導くのに用いられるガイドチャネル、およびナノポア末端に備わる幾何学的ナノウェルを含めて、ゲート化ナノウェルの詳細を強調する。
【０１１５】
[00203]使用：緩衝液流動の非存在を必要とする工程を伴う、連続分析のためのＤＮＡ捕捉；ＤＮＡルーピングの物理的分析；ＤＮＡルーピングを必要とするタンパク質−タンパク質相互作用の分析；ならびにより複雑な混合集団からの単一ＤＮＡ分子の選択的操作および単離を可能にするであろう。
【０１１６】
実施例４：二重束縛ＤＮＡ分子のカーテンを整列させるためのナノファブリケーションで製作したラック
[00204]ここで、本発明者らは、ミクロ流体試料チャンバーの表面上の流動性脂質二重層に係留されたＤＮＡ分子の複雑な操作を可能にする、異なる非直線の幾何学的バリアパターンの組み合わせを提示する（図１２Ａ〜Ｂを参照されたい）。非直線の幾何学的バリア要素には、ナノポア・ゲート化ステージング領域が含まれ、これを用いて、両端が二重層に係留され、そして水力学的な力を用いてステージング領域内に押し込まれた直線ＤＮＡ分子を、不可逆的に捕捉する。捕捉されたら、緩衝液流動または電場のいずれかを用いて生成され、接線方向に適用される力を用いて、垂直方向にＤＮＡ分子を駆動する。これは、ＤＮＡ分子をステージング領域の一面に押しつけ、ここでＤＮＡ分子は二股ナノチャネルと遭遇して、このチャネルが同じＤＮＡ分子の各々の端を一対の平行チャネル（ＤＮＡラック）に沿って導き、二重束縛ＤＮＡ分子が所望の長さに伸びるように設計された、ユーザーが定義した距離でＤＮＡが分離される。各チャネル末端の出口ポートは、張力に基づく選択を用いて、ＤＮＡをいずれも保持しつつ、同時に破壊された分子をいずれも取り除くよう設計される。分子がラック内で整列したならば、伸長された立体配置で維持され、そして流動または電気泳動的な力のいずれかの非存在下で、ＴＩＲＦＭによって視覚化されうる。二重束縛ＤＮＡカーテンのこれらの整列したアレイは、妨害する水力学的な力の非存在下で、ＤＮＡ分子またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を分析するための理想的なハイスループット形式を提供する。
【０１１７】
[00205]使用：妨害する水力学的なまたは電気泳動的な力の非存在下で行わなければならないＤＮＡまたはタンパク質−ＤＮＡ相互作用の任意の生化学的／生物物理学的研究（例えば、転写中のプロモーター−エンハンサー相互作用）；タンパク質による一次元拡散およびターゲット部位結合の研究（すなわちどこでそしてどのように転写因子またはＤＮＡ修復タンパク質がＤＮＡに結合するかを視覚化する）；ならびに単一ＤＮＡ分子のサイズ選択的分画（任意の所望のＤＮＡまたはさらにある範囲の異なるサイズのＤＮＡ分子に適合するようにラック要素を設計してもよい）。
【０１１８】
実施例５：個々のタンパク質−ＤＮＡ相互作用を画像化するための整列しそして係留されたＤＮＡ分子のナノファブリケーションで製作したラック。
[00206]ここで、本発明者らは、支持体自体が互いに対して整列し、そしてそうでなければ不活性脂質二重層でコーティングされるミクロ流体試料チャンバー表面に、両端が係留された伸長した立体配置で維持される、ＤＮＡカーテンを構築する新規戦略を開発する。これは、異なる官能性要素を伴う金属バリアパターンのナノファブリケーションで製作したラックの使用を通じて達成され、バリアパターンと官能性要素は一緒に、数百の個々のＤＮＡ分子の整列および係留を可能にする。脂質拡散に対する直線バリアを用いて、ＤＮＡを整列させ、そして抗体をコーティングした五角形が、分子の未結合端のための固体アンカーポイントを提供する。ＤＮＡを伸長させるための連続緩衝液流動の使用を必要としない条件下で、全反射照明蛍光顕微鏡法を用いて、係留されたＤＮＡのこれらの二重束縛カーテンを視覚化してもよい。これは、外部から適用される水力学的な力の適用を通じた研究下で、タンパク質の振る舞いを妨害することなくデータを獲得する潜在能力を提供する。本発明者らは、ＤＮＡに沿ったミスマッチ修復タンパク質の運動を監視する１Ｄ拡散アッセイにおいて、これらのＤＮＡラックを使用可能であることの原理の証明を提供する。
【０１１９】
[00207]脂質拡散に対する直線バリアを用いて、ＤＮＡを整列させ、そして抗体をコーティングした五角形が、分子の未結合端のための固体アンカーポイントを提供する。ＤＮＡを伸長させるための連続緩衝液流動の使用を必要としない条件下で、全反射照明蛍光顕微鏡法を用いて、係留されたＤＮＡのこれらの二重束縛カーテンを視覚化してもよい。これは、外部から適用される水力学的な力の適用を通じた研究下で、タンパク質の振る舞いを妨害することなくデータを獲得する潜在能力を提供する。本発明者らは、ＤＮＡに沿ったミスマッチ修復タンパク質複合体Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６の移動を監視する１Ｄ拡散アッセイにおいて、これらのＤＮＡラックを使用可能であることの原理の証明を提供する。
【０１２０】
[00208]タンパク質およびＤＮＡ間の動的相互作用は、多くの生物学的プロセスの根底にあり、そしてこうしたものとして、徹底的な研究の対象である。多くの研究室は、現在、リアルタイムでの単一分子レベルのタンパク質−ＤＮＡ複合体の視覚化を可能にする新規実験法を用いて、これらの問題に取り組んでおり、そしてこれらの実験から集められた情報は、多くの異なるタイプの反応の詳細な機構的モデルを構築するのに用いられている。しかし、多くの単一分子技術の１つの大きな欠点は、これらが本質的に、個々の反応を探査するように設計されており、そしてその結果、統計的に適切なデータを集めることが困難でありうることである。これらの実験がしばしば技術的に要求が厳しいという事実によって、この困難はしばしば悪化する。したがって、単一分子法のスループット能力を増加させることが可能であり、そしてこれらのアプローチをより容易にそして異なるタイプのＤＮＡ処理を伴う生物学的反応により容易に適用可能にする新規アプローチを確立することは非常に好適である。
【０１２１】
[00209]これらの技術をよりアクセス可能にする努力の中で、本発明者らは、ナノスケール操作、ミクロ流体学、および脂質二重層をコーティングした表面を、単一分子光学顕微鏡法と統合して、数千の個々のＤＮＡ分子で構成される分子カーテンを作製するためのハイスループット法を開発した（Ｃ１〜３）。これらの実験プラットフォームの重要な側面は、これらが、個々の脂質に束縛されたＤＮＡ分子の組織化を調節するため、脂質二重層の流体の性質を利用することである（Ｃ４、Ｃ５）。これは、まず、わずかな割合のビオチン化頭基を含有する二重層で試料チャンバー表面をコーティングすることによって達成され、そして次いで、ビオチン−ニュートラアビジン連結を通じて、ＤＮＡ分子をその一端で二重層に連結する。脂質に束縛されたこれらのＤＮＡ分子を、水力学的な力の適用を通じて、ミクロまたはナノスケールいずれかの脂質拡散バリア（例えば直線または非直線の幾何学的バリア）のいずれかの前縁に押しつけることによって、分子カーテンに組み立てる。本発明者らの最初の研究において、ダイアモンド先端スクライバーで石英ガラス表面に手動でエッチングすることによって作製した、脂質拡散に対するマイクロスケールバリアを用いて、脂質に束縛された数百のＤＮＡ分子を整列させることが可能であることを立証した（Ｃ３）。より最近、本発明者らは、ＤＮＡ分子の位置および側方分布の両方に対する、はるかにより正確な調節を可能にする、ナノスケール寸法のバリアを製作するための方法を確立した（Ｃ１、Ｃ２）。これらのナノファブリケーションで製作したＤＮＡカーテンは、互いに対して完璧に整列した数千の個々のＤＮＡ分子の同時視覚化を可能にし、そしてこれを、非常に多様な生物学的適用に受け入れられる頑強な実験プラットフォームを用いた、リアルタイムでの、数千の個々のタンパク質−ＤＮＡ複合体からの大規模な平行データ獲得に用いてもよい。
【０１２２】
[00210]本発明者らはまた、これらのＤＮＡカーテンが、単一分子レベルでのタンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究するのに非常に好適であることもまた示しており、そして本発明者らは、これらのツールを、クロマチン・リモデリング、相同ＤＮＡ組換え、および複製後ミスマッチ修復などの生物学的系に適用してきた（Ｃ６〜９）。この実験プラットフォームは、ＤＮＡに結合した蛍光タンパク質のリアルタイム検出に特に適用可能である。しかし、これらの先のＤＮＡカーテンは、データ収集中に水力学的な力の連続適用を必要とし、これはＤＮＡの一端のみが脂質二重層に係留されているためである。緩衝液流動が終結すると、ＤＮＡは伸長したままではなくなり、そしてその結果、エバネッセント場の浸透深さによって定義される検出体積外に漂流するため、その全輪郭長に沿って視覚化することは不可能である。緩衝液流動の必要性は、多くのタイプの測定には問題にはならないが、結合したタンパク質またはタンパク質複合体の振る舞いに潜在的に影響を及ぼす可能性もあり、そしてこの影響の度合いは、観察中の分子の水力学的直径に比例して増減しうる。緩衝液流動の影響は、一次元拡散によって、ＤＮＡ上でスライドするタンパク質を伴う測定中に特に明らかであり、これは、スライディングタンパク質がＤＮＡに沿って移動する方向に、適用される流動力が、強いバイアスを掛けうるためである。
【０１２３】
[00211]緩衝液流動の必要性は、多くのタイプの測定には問題にはならないが、結合したタンパク質またはタンパク質複合体の振る舞いに潜在的に影響を及ぼす可能性もあり、そしてこの影響の度合いは、観察中の分子の水力学的直径に比例して増減しうる。緩衝液流動の影響は、一次元拡散によって、ＤＮＡ上でスライドするタンパク質を伴う測定中に特に明らかであり、これは、スライディングタンパク質がＤＮＡに沿って移動する方向に、適用される流動力が、強いバイアスを掛けうるためである。
【０１２４】
[00212]ここで、本発明者らは、ミクロ流体試料チャンバー表面に両端が係留された伸長された立体配置で保持され、そして不活性二重層上に懸濁された、整列したＤＮＡ分子のカーテンを作製するための新規方法を開発しようとした。これを達成するため、本発明者らは、別個の官能要素を伴う金属バリアの新規パターンを開発した。これらの金属パターンは、脂質拡散に対する直線バリア、およびアレイ化された五角形を含む非直線の幾何学的バリアの両方を取り込み、そしてこれらの要素は一緒に、長いＤＮＡ分子を整列させ、そして束縛するように働く。まず、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を通じて、流動性脂質二重層に、一端でＤＮＡ分子を係留し、そして直線バリアに押し込む水力学的な力を用いることによって、互いに対して、まず整列させる。アレイ化五角形は、直線バリアの下流の定義された距離に位置する固体アンカーポイントとして働き、そしてジゴキシゲニンまたはブロモデオキシウリジンのいずれかに対して向けられる抗体でコーティングされ、これらはＤＮＡ分子の未結合端に共有結合する。重要なことに、表面に連結されたならば、ＤＮＡ分子は、伸長された状態で維持され、そしてエバネッセント場の浸透深さによって定義される検出体積内に閉じ込められ、適用される水力学的な力が存在しない場合であってさえ、その全輪郭長に渡った連続観察が可能になる。
【０１２５】
[00213]材料および方法
[00214]ナノファブリケーション。石英ガラススライドをＮａｎｏＳｔｒｉｐ溶液（ＣｙａｎＴｅｋ社、カリフォルニア州フレモント）で２０分間清浄化し、次いでアセトンおよびイソプロパノールでリンスし、そしてＮ２で乾燥させた。スライドに、アニソール中の３％の分子量２５Ｋ、およびアニソール中の１．５％の４９５Ｋのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、マサチューセッツ州ニュートン）の二重層を、その後、Ａｑｕａｓａｖｅ導電性高分子（三菱レーヨン）の層をスピン・コーティングした。ランプ速度３００ｒｐｍ／ｓを用いて、４，０００ｒｐｍで４５秒間、各層をスピンした。パターン生成装置およびリソグラフィー調節系（Ｊ．Ｃ．  Ｎａｂｉｔｙ，  Ｉｎｃ．、モンタナ州ボーズマン）を装備したＦＥＩ  Ｓｉｒｉｏｎ走査型電子顕微鏡を用いて、Ｅビーム・リソグラフィーによって、非直線の幾何学的バリアおよび直線バリアのための多角形パターンを書いた。パターンを書いた後、Ａｑｕａｓａｖｅを脱イオン水で洗い流した。イソプロパノール対メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の３：１溶液を用いて、５℃で１分間超音波攪拌して、レジストを発展させた。次いで、支持体をイソプロパノールでリンスして、そしてＮ２で乾燥させた。Ｓｅｍｉｃｏｒｅ電子ビーム蒸発装置を用いて、クロムまたはチタンのいずれかの３〜５ｎｍ接着層の上に１５〜２０ｎｍの金の層を沈着させた。９：１比の塩化メチレン対アセトン中、８０℃でリフトオフを達成した。あるいは先に記載するように、１５〜２０ｎｍのクロム層のみでバリアを作製した。リフトオフ後、試料をアセトンでリンスして、散在したクロム片を除去し、そしてＮ２で乾燥させた。Ｈｉｔａｃｈｉ  ４７００走査型電子顕微鏡およびＰＳＩＡ  ＸＥ−１００走査プローブ顕微鏡を非接触モードで用いてバリアを画像化した。５０倍または１００倍（示す通り）のいずれかで、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＭＥ６００を用いて、バリアの光学的画像を取った。
【０１２６】
[00215]脂質二重層およびＤＮＡカーテン。クロムナノスケール拡散バリアを伴って、石英ガラススライド（Ｇ．  Ｆｉｎｋｅｎｂｅｉｎｅｒ，  Ｉｎｃ．）からフローセルを組み立てた。ダイアモンドが先端についた錐（１．４ｍｍ  Ｏ．Ｄ．；  Ｋａｓｓｏｙ）を装備した高速正確ボール盤を用いて、スライドを通じて穴をあけることによって、入口および出口ポートを作製した。２％（ｖ／ｖ）Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ、１Ｍ  ＮａＯＨ、および１００％  ＭｅＯＨ中に連続して浸すことによって、スライドを清浄化した。各洗浄間に、ろ過滅菌水でスライドをリンスし、そして使用するまで、１００％  ＭｅＯＨ中に保存した。組み立て前に、窒素流下でスライドを乾燥させ、そして真空オーブン中で、少なくとも１時間、ベーキングした。ホウケイ酸ガラスカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および両面テープ（〜２５μｍ厚、３Ｍ）から、試料チャンバーを用意した。熱融解性接着剤（ＳｕｒｅＢｏｎｄｅｒスティックのり、ＦＰＣ社）を用いて、入口および出口ポート（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を取り付けた。試料チャンバーの総体積は〜４μｌであった。シリンジポンプ（Ｋｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および作動注入バルブ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、試料送達、緩衝液選択および流速を調節した。フローセルおよびプリズムを、コンピュータ調節フィードバック制御を備えた特注のヒーター中に搭載して、必要に応じて、２５〜３７℃（±０．１℃）の間で試料の温度を調節した。各使用後に、スライドをＭｅＯＨ中に浸して、ポートおよびテープを取り除き、水でリンスし、Ｎａｎｏｓｔｒｉｐで簡単に（１５〜２０分間）洗浄し、そして最後に水でリンスした。この方法は、再使用のためにスライド表面を清浄化するのに十分であり、そして各スライドを多数回用いてもよく、光学表面または金属パターンの性質は低下していく。
【０１２７】
[00216]先に記載されるように、ＤＮＡカーテンを構築した。すべての脂質を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入し、そしてリポソームを先に記載されるように調製した。簡潔には、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン）、０．５％ビオチン化ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（キャップビオチニル））、および８〜１０％  ｍＰＥＧ  ５５０−ＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］）の混合物。ｍＰＥＧは、二重層形成またはＤＮＡカーテンの組み立てに影響を及ぼさず、むしろ量子ドット（タンパク質−ＤＮＡ相互作用の本発明者らの研究において使用する）の非特異的吸着に対して表面をさらに不動態化するように働く。リポソームを試料チャンバーに２００μｌで３回注入し、その後、５分間インキュベーションした。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に加えて１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ  １ｍｌで、過剰なリポソームをフラッシュし、そして二重層をさらに３０分間インキュベーションした。次いで、２５μｇ／ｍｌの抗ＤＩＧ  Ｆａｂ（Ｒｏｃｈｅ）または抗ＢｒｄＵ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を加えた緩衝液Ａを試料チャンバー内に注入し、そして３０分間インキュベーションした。次いで、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する緩衝液Ｂ  １ｍｌで試料チャンバーをフラッシュし、そしてさらに５分間インキュベーションした。次いで、ニュートラアビジン（３３０ｎＭ）を含有する緩衝液Ａ  １ｍｌを試料チャンバー内に注入し、そして２０分間インキュベーションした。次いで、３ｍｌの緩衝液Ｂでフローセルをリンスして、いかなる未結合ニュートラアビジンも除去した。ビオチンで一端をそしてジゴキシゲニンでもう一端を標識し（以下を参照されたい）、そして１〜２ｎＭのＹＯＹＯ１であらかじめ染色したλ−ＤＮＡ（２０ｐＭ）１ｍｌを、５回の２００μｌアリコットとして試料チャンバー内に注入し、各注入後に２〜３分間のインキュベーション期間を置いた。次いで、０．０２ｍｌ／分の流速を用いて、直線バリアでＤＮＡを整列させ、そして次いで、この速度を２〜３ｍｌ／分に増加させて、ＤＮＡ分子の第二端を係留した。
【０１２８】
[00217]ＤＮＡ基質。λファージゲノム（４８．５ｋｂ）の末端の１２ヌクレオチドのオーバーハングにオリゴヌクレオチドを連結することによって、ＤＮＡ基質を作製した。連結混合物（総体積１ｍｌ）は、４ｎＭ  λ  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＭビオチン化オリゴヌクレオチド（５’−ｐＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＣ［ＢｉｏＴＥＧ］−３’［配列番号１］）、１μＭ  ＢｒｄＵ標識オリゴヌクレオチド（またはＤＩＧ標識オリゴヌクレオチド；５’−ｐＧＧＧ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＣＣＴ［ＢｒｄＵ］−３’［配列番号２］または５’−ｐＧＧＧ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＣＣＴ［ＤＩＧ］−３’［配列番号３］）、および１ｘリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）を含有した。反応混合物を６５℃で１０分間温め、そして次いでゆっくりと室温に冷却した。冷却後、リガーゼを添加し（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ）またはＴａｑリガーゼ（４０Ｕ／μｌ）；ＮＥＢ）、そして混合物を４２℃で一晩インキュベーションした。次いでＴ４リガーゼで行った反応を６５℃で１０分間熱不活性化し、そして連結されたＤＮＡ産物を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００ＨＲカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）実行上で精製した。精製ＤＮＡを−２０℃で保存した。
【０１２９】
[00218]λ上の２６，１５１〜２６，１６６位に相補的なＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを挿入するため、５００μｌのＤＮＡ（２００ｐＭ；末端でビオチンおよびＢｒｄＵで標識する（上述の通り））をニック形成酵素Ｎｂ．ＢｓｍＩおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（各５０Ｕ；ＮＥＢ）と、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液中、５５℃で２時間インキュベーションした。次いで、１μＭのオリゴヌクレオチド（５’−ｐＣＡＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＴＴ［ＤＩＧ］−３’（配列番号４））を１０ｍＭ  ＥＤＴＡとともに溶液に添加し、そして混合物を５５℃で２０分間インキュベーションし、そして次いで１時間の経過に渡って室温にゆっくりと冷却させた。２，０００単位のＴ４リガーゼおよびさらなる１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２と一緒にＡＴＰを１ｍＭの最終濃度まで添加した。次いで、反応を室温で９０分間インキュベーションした。さらなるＥＤＴＡ（Ｃｆ＝２０ｍＭ）を溶液に添加し、そしてニック形成酵素およびリガーゼを８０℃で２０分間熱変性させた。この方法をまた、同じＤＮＡ中の２６，１５１〜２６，１６６および３３，７７９〜３３，７９１にオリゴヌクレオチドを同時に挿入するのに用いた。
【０１３０】
[00219]λ上の３３，７７９〜３３，７９１位のみにオリゴヌクレオチドを挿入するため、５００μｌ  ＤＮＡ（２００ｐＭ；ビオチンおよびＢｒｄＵで末端を標識する）をニック形成酵素Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（５０Ｕ；ＮＥＢ）と、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液中、５５℃で２時間インキュベーションした。８０℃で２０分間のインキュベーションによって酵素を熱変性させた。１μＭのオリゴヌクレオチド（５’−ｐＴＴＣ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＴＴ［ＤＩＧ］−３’［配列番号５］）を溶液に添加し、そして混合物を５５℃で２０分間インキュベーションし、次いで１時間の経過に渡って、室温にゆっくりと冷却した。次いで、２，０００単位のＴ４リガーゼと一緒にＡＴＰを１ｍＭの最終濃度まで添加し、そして反応を室温で９０分間インキュベーションした。次いで、６５℃で２０分間インキュベーションすることによって、リガーゼを熱変性させた。
【０１３１】
[00220]ＴＩＲＦＭおよび１Ｄ拡散アッセイ。本研究で用いる顕微鏡は、先に記載されてきている（Ｃ３）。簡潔には、系は、特注照射系を備えたＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｕ倒立顕微鏡周囲に構築される。４８８ｎｍ、２００ｍＷダイオード励起固体レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＣＤＨＲ）を励起供給源として用いた。減光フィルターを用いて、レーザーを必要に応じて減弱させ、そしてレーザーは遠隔操作される鏡（Ｎｅｗ  Ｆｏｃｕｓ）によってＤＮＡカーテン上を中心とした。プリズム表面でのビーム強度は、〜１０−１５ｍＷであった。背後から照射されるＥＭＣＣＤ検出装置（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｂ）を用いて、画像を検出した。別に示さない限り、６０ｘ浸水対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、１．２ＮＡ、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ）を用いて、ＴＩＲＦＭ画像を収集した。
【０１３２】
[00221]結果
[00222]ＤＮＡラックの設計要素。本発明者らは、脂質二重層の連続性を破壊する機械的バリアを用いて、整列したＤＮＡ分子の分子カーテンを構築可能であることを先に立証した（Ｃ１〜３）。本発明者らはまた、これらのＤＮＡカーテンが、ＴＩＲＦＭによって視覚化された際に単一分子レベルでタンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究するためのユニークでそして好適なツールを提供することも示した。ここで、本発明者らは、本発明者らの先の研究を拡大し、そして分子の両端がフローセル表面に係留されたＤＮＡカーテンを作製するのに使用可能なＤＮＡ「ラック」と称する新規バリア要素の開発を示す。図１３および１８に一般的な設計の概観を示し、そして、この設計は、以下に記載するように、２つの別個のパターン要素の組み合わせを利用する。カーテンを作製するため、ＤＮＡの一端をまず、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を通じて、試料チャンバー表面をコーティングする、支持された脂質二重層に係留する（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。水力学的な力の非存在下では、分子はランダムに表面上に分布するが、主にエバネッセント場の浸透深さ（〜１５０−２００ｎｍ）によって定義される検出体積外にある。流動を適用すると、ＤＮＡは、二重層に一端が係留されたまま、試料チャンバーに押し込まれる。第一のパターン要素は脂質拡散に対する直線バリアであり、該バリアは、ＤＮＡの経路中の戦略にしたがった位置で、流動方向に対して垂直に配向される（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）；これらの直線バリアは脂質束縛ＤＮＡ分子の移動を停止し、次いで分子がバリアの縁で集積するようにして、表面に平行に伸長させる。
【０１３３】
[00223]パターンの第二の要素は、直線バリアの後ろに配置され、そして小さいナノチャネルによって互いに分離される、一連のアレイ化五角形（例えば非直線の幾何学的バリア）である。五角形の非直線の幾何学的形状は、漏斗として作用するよう意図され、そして五角形の前縁で集積せずに、むしろパターン中の次の連続する直線バリアと出会うまで表面に沿って押されるように、ナノチャネルを通じて、いかなる脂質束縛ＤＮＡ分子も導く。直線バリアおよび五角形の間の距離は、実験のために用いようとするＤＮＡの長さに関して最適化される。五角形自体は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）に対して向けられる抗体でコーティング可能な広い表面を提示し、ジゴキシゲニンは、ビオチンタグを所持する端と反対のＤＮＡ端に共有結合される。ＤＩＧにカップリングしたＤＮＡ端が、抗体でコーティングされた五角形と出会うと、これらは固定され、そしてＤＮＡは緩衝液が試料チャンバーを通じて押されていない場合であっても、表面に平行に伸長されたままであるはずである。連続した直線バリア各々の間の距離は、二重層に係留される分子の総数が各バリアの上流の二重層によって含まれる面積に正比例するため、整列したＤＮＡの密度に影響を及ぼすはずである。フローセル表面上で隣接するバリアセット間の総距離を変化させると、多様な密度の二重束縛ＤＮＡカーテンが生じ、使用者が、実験のための適切な分子数を含む領域に関して表面をスキャンすることが可能になる。したがって、隣接するバリアセット間が０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５μｍいずれかの分離距離であるパターンを設計した（図１３Ｄ）。
【０１３４】
[00224]図１４および１９は、Ｅビーム・リソグラフィーによって作製されるＤＮＡラックの性質決定を示し、そしてその機能に関して必須と見なされるパターン幾何学の特異的な特徴を強調する。図１４Ａは、全体のパターン設計の低倍率光学的画像を示し、パターン内のバリアセット間の間隔が多様であることを示す。必須のパターンパラメータの寸法を含む、より高い倍率の光学的画像を図１４Ｂに示す。図１４Ｃは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いたこれらのパラメータの測定を示す。図１４Ｄは、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を用いたパターンの性質決定を示す。これらの画像から示されるように、明記されるように、パターン要素の高さは、約２０〜２５ｎｍであり、ナノチャネルの幅は５００ｎｍであり、そして直線バリアの前縁および五角形アレイの中心の間の距離は１２または１３μｍのいずれかであった。この距離は、λ−ＤＮＡで使用するために特に選択され、λ−ＤＮＡは４８，５０２塩基対であり、完全伸長輪郭長はおよそ１６．５μｍであり、したがって、１１〜１３μｍは、それぞれ、完全輪郭長のものの〜７０％から８０％の平均伸長長に対応する。
【０１３５】
[00225]二重束縛ＤＮＡカーテンの組み立ておよび性質決定。全体の設計は、金属性五角形の曝露された表面に対する、選択的であるが非特異的な抗体の吸着に頼るが、抗体は、不活性脂質二重層と相互作用してはならない。ＤＮＡカーテンを組み立てるため、フローセル表面をまず、先に記載するように、脂質二重層でコーティングし、但し、抗体沈着前に用いるすべての緩衝液からＢＳＡを除くことを例外とした。表面上で二重層が組み立てられたら、抗ＤＩＧ  Ｆａｂ断片または抗ＢｒｄＵ  ＩｇＧを試料チャンバー内に注入し、ここでこれらを、曝露された金属バリアに非特異的に吸着させた。抗体は、直線バリアならびに五角形両方に潜在的に結合可能であるが、直線バリアの表面積が非常に小さいため、より多くの抗体がはるかに大きい五角形に選択的に吸着されることを確実にするはずである。簡単なインキュベーション後、遊離Ｆａｂをフローセルからリンスして取り除き、そして０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する緩衝液と交換し、ＢＳＡは、残った曝露された表面いずれも不動態化する非特異的ブロッキング剤として働いた。次いで、蛍光挿入色素ＹＯＹＯ１で染色されたＤＮＡを、試料チャンバー内に注入し、緩衝液流動を伴わずに簡単にインキュベーションし、そして次いで、緩衝液流動を適用して、係留された分子を直線バリア内に押し込んだ。次いで、緩衝液流動を終結させて、そして係留されたＤＮＡ分子をＴＩＲＦＭによって画像化した。
【０１３６】
[00226]図１５Ａに示すように、この方法は、試料チャンバーを通じて緩衝液が流動しない場合であってさえ、完全に伸長しそして可視のままである、ＤＮＡ分子のカーテンを生じた。ＤＩＧ標識端によって係留されなかったＤＮＡ分子はいずれも、直線バリア近傍に残るが、完全輪郭長ではなく、分子末端のみが観察されうる。これらの単一束縛ＤＮＡ分子は、バリア縁から次第に拡散して、そしてまた、単に緩衝液流動の方向を逆転させることによって、押されることも可能であった（図１５）が、二重束縛ＤＮＡ分子は元来の位置に係留されたままであり、カーテンを構成する分子が、所望の立体配置で係留されるというさらなる構造を提供した。異なるバリア位置各々でのＤＮＡ分子の数は、隣接する直線バリア間の距離に比例した。単一ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で末端標識されたＤＮＡ、および抗ＢｒｄＵ抗体でコーティングされた五角形で類似の結果を得た（以下を参照されたい）が、ＢｒｄＵに係留されたＤＮＡ端は、五角形から解離する傾向がより大きかった。最後に、対照実験によって、ＤＮＡの両端を効率的に係留するには、ＤＩＧ標識およびＦａｂ断片の両方の存在が必要であることが検証された。
【０１３７】
[00227]バリア間で係留されたＤＮＡが、不活性二重層上に懸濁されるのではなく、その全輪郭長に沿って、試料チャンバー表面に非特異的に接着するならば、二本鎖切断の導入は、表面からの分子の撤退を引き起こさないはずである。対照的に、ＤＮＡが、設計されるようにビオチンおよびＤＩＧタグ化端によって係留され、そして二重層上に懸濁されるのみである場合、鎖中の二重鎖破壊は、表面からの分子の撤退を引き起こすはずである。ＤＮＡ分子がランダムに破壊される場合、これらはエバネッセント場から拡散し、そして視野から消えていくにつれて、表面から直ちに撤退しうる。ＤＮＡ分子は、係留された端を通じてのみ、試料チャンバー表面と相互作用可能であり、そして脂質二重層と非特異的に相互作用することは出来ない。
【０１３８】
[00228]ＤＮＡの定義された配向。ＤＮＡの２つの端を係留するのに用いた示差化学反応は、カーテン内のＤＮＡ分子の配向を定義すると予測された。特に、ビオチン化端は、直線バリアの縁で係留され、そしてもう一方の端は五角形で係留されるはずであり、そしてこの設計に基づいて、すべての分子は、正確に同じ配向にあるはずである。ＤＮＡ分子を予期されるように整列させると、フルオロフォアは、ＤＮＡ内の単一の特異的部位に位置し、そしてその中心からのオフセットはＤＮＡカーテンに渡る蛍光の「線」として現れるはずである。線は、伸長されたＤＮＡ分子の長軸に垂直に配向され、そして蛍光タグの既知の位置と正確に一致するはずである。対照的に、ＤＮＡ分子がランダムに配向している場合、蛍光タグは、ＤＮＡの２つのありうる配向の各々の境界を定める２つの線として現れるはずである。ＤＮＡが正しく配向されていることを確認するため、ＢｒｄＵを用いて分子を未結合端で標識し、そしてＤＩＧで特定の内部位置で標識した。オリゴヌクレオチド置換戦略（材料および方法を参照されたい）を用いて、内部標識を作製した。単一端で係留されたＤＮＡカーテンを用いた実験によって、蛍光タグが、オリゴヌクレオチド配列によって影響されるように、ＤＮＡ分子内の単一位置に存在することを確認した。抗ＢｒｄＵ抗体でコーティングされた五角形を用いて、二重束縛カーテンを組み立て、そして組み立て後、ＤＩＧタグは、抗ＤＩＧコーティングＱドットで標識された。図１６に示すように、抗ＤＩＧ  Ｑドットは、すべて互いに整列し、ＤＮＡ分子の配向が確認された。
【０１３９】
[00229]ＤＮＡ上でスライディングするタンパク質の画像化。これらの二重束縛ＤＮＡカーテンを開発する主な動機は、ＤＮＡに沿ったタンパク質の移動を視覚化するように設計された実験で使用するためであった。本発明者らは、先に、タンパク質複合体Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６が二重鎖ＤＮＡに沿って１次元で拡散しうることを立証した（Ｃ６）（また、図５０、５１、５２、５３、５４、および５５も参照されたい）。Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６は、複製後ミスマッチ修復機構の本質的な構成要素であり、そして生合成ＤＮＡ複製エラーを位置決定し、そしてその修復を開始するのに関与する。本発明者らのＭｓｈ２−Ｍｓｈ６を用いた最初の研究は、そうでなければ脂質二重層でコーティングされた石英ガラス表面に非特異的に吸着されたニュートラアビジンに、どちらかの端で束縛されたＤＮＡ分子に頼った。
【０１４０】
[00230]このアプローチを用いて、本発明者らは、拡散測定を行うのに適した、フローセルあたりわずか１０〜３０のＤＮＡ分子を得るであろう。これらの二重束縛ＤＮＡ分子は、ランダムに分布し、そして全表面を視覚的にスキャンすることによって、使用前に手動で位置決定しなければならず、これらの１Ｄ拡散測定を技術的に要求が厳しいものにしていた。上述のように、操作された表面を用いて、本発明者らはここで、フローセルあたり数千の分子を視覚化することも可能である。ここで、本発明者らは、ＤＮＡの係留されたカーテンが、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を視覚化するのに適していることを立証する。
【０１４１】
[00231]これらの実験のため、本発明者らは、ミスマッチ修復タンパク質複合体Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１を用い、そしてＭｌｈ１サブユニット内に設計されたＦＬＡＧエピトープタグを通じて、該複合体を単一量子ドットで標識した。標識タンパク質を、二重束縛ＤＮＡ分子のカーテンを含有するフローセル内に注入し、そして６０秒間の期間に渡ってビデオを収集した。図１７Ａに示すように、本発明者らは、表面で整列し、そして係留されたＤＮＡ分子に対するＭｌｈ１−ＰＭｓ１の結合を容易に検出可能である。単一視野中に観察されるのはおよそ１００のＤＮＡ分子および２５０のＤＮＡ結合性タンパク質であり、二重束縛ＤＮＡ分子を作製するための本発明者らの先の技術に比較して、このアプローチが改善されていることを例示する。ＤＮＡに結合したタンパク質は、ＤＮＡ分子に沿って迅速に拡散し、そしてこの移動は、ＤＮＡカーテン内の分子の代表的な例から作製されるキモグラムで明らかであった（図１７Ｂ）。裸のＤＮＡ分子の場合のように、ＤＮＡ鎖が破壊されると、タンパク質に結合したＤＮＡ分子もまた視野から引っ込み、表面との非特異的相互作用がないことが検証される。
【０１４２】
[00232]また、Ｍｌｈ１拡散ならびにＭｌｈ１−Ｐｍｓ１複合体の拡散を視覚化するために用いる二重束縛カーテンに関するさらなる研究に関しては、図５６、５７、５８、５９、６０、６１および６２も参照されたい。
【０１４３】
[00233]考察
[00234]本明細書において、本発明者らは、拡散バリアのアレイ、その後、五角形のアンカーポイントのアレイをナノファブリケーションで製作する、直接書き込みＥビーム・リソグラフィーを使用し、これらは一緒に、ミクロ流体試料チャンバー表面上で、両端でＤＮＡカーテンを係留する異なる官能性の特徴を利用する。本発明者らは、これらのパターン化された表面をＤＮＡ「ラック」と呼び、これはＤＮＡが伸長し、そしてＴＩＲＦＭによって視覚化可能なフローセル表面に係留されているためである。これらのデバイスの重要な側面は、石英ガラス表面が、支持された脂質二重層でコーティングされ、そしてＤＮＡ分子がこの二重層上に懸濁され、これらが生物学的分子の範囲と適合する不活性微小環境内で維持されることを確実にすることである。本発明者らは、これらのツールを広視野ＴＩＲＦ顕微鏡法と一緒に用いて、すべて同じ配向で配置され、そして両端で試料チャンバー表面に係留されている、数百の個々の完璧に整列したＤＮＡ分子を視覚化可能であることを立証した。先のナノファブリケーション製作デバイスと同様、この新規アプローチは単純でそして頑強であり、フローセルは再利用可能であり、バリア自体は均質であり、そしてこれらは、石英ガラスの光学的性質を損なわないし、またシグナル検出に干渉しない。
【０１４４】
[00235]これらのＤＮＡラックの有用性の第一の概念的な立証として、本発明者らは、本明細書において、これらを用いて、ＤＮＡ結合タンパク質の１Ｄ拡散を画像化可能であることを示す。本発明者らのこれらの実験に対する先のアプローチは、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を通じて表面にランダムに係留されたＤＮＡに頼り、これは視野あたり１〜３分子のＤＮＡより多くは生じず、そしてフローセル全表面上にわずか〜１０−３０の二重束縛ＤＮＡ分子しか存在しなかった。さらに、本発明者らの先の研究において、ＤＮＡの配向は、分子がＤＮＡのいずれかの端に位置するビオチンで係留されているため、定義不能であった。したがって、分子はフローセル表面上でランダムに配向し、配列特異的事象を精査するために、異なるＤＮＡ分子を局在させ、そして互いに比較することが困難であった。この元来のアプローチは、本発明者らの最初の研究に有用であることが立証されたが、分析を通じて、十分なデータを収集するのは、退屈であり、そして困難なままであった。本明細書で示すように、本発明者らは、現在、視野あたり約百のＤＮＡ分子を視覚化することが可能であり、数千の分子がフローセルの表面上に存在し、そしてこれらのＤＮＡ分子はすべて、正確に同じ配向で整列し、これが、将来の研究のため、１Ｄ拡散測定および直接の分子間比較を行うであろう。
【０１４５】
[00236]参考文献：
【０１４６】
【化３】
2012500620.tif 000006
【０１４７】
実施例６：交差するＤＮＡ分子のアレイに沿ったＭｓｈ２−Ｍｓｈ６およびＭｌｈ１−Ｐｍｓ１可動性の機構の評価
[00237]複製後ミスマッチ修復（ＭＭＲ）中、タンパク質は、ＤＮＡらせんに沿って、長距離に渡って情報をコミュニケーションしなければならない。理論に束縛されることなく、バルク生化学的研究からの証拠によって、このコミュニケーションが、主に、ＤＮＡに沿ったタンパク質の運動を伴う機構を通じて起こることが立証される。これと一致して、本発明者らは、単一分子光学顕微鏡法を用いて、ＭＭＲタンパク質Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６およびＭｌｈ１−Ｐｍｓ１がどちらも、スライディングと最も一致する機構によってＤＮＡに沿って移動しうることを立証した。バルク生化学的研究または本発明者らの単一分子観察はいずれも、ホッピング、ジャンピングおよび／またはセグメント間トランスファーなどの他の機構を完全に排除できなかった。ここで、本発明者らは、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６および／またはＭｌｈ１−Ｐｍｓ１が、１以上のこれらの別の機構を使用しつつ、ＤＮＡに沿って移動可能であるかどうかを決定することを可能にするアッセイを考案した。この新規アッセイは、そうでなければ脂質二重層でコーティングされているミクロ流体試料チャンバー表面上に懸濁された十字パターンに、個々のＤＮＡ分子を配置するための、ナノファブリケーションで製作した金属性構造に頼る。本発明者らは、これらの基質を用いて、タンパク質が交差ＤＮＡ分子間の接合部を過ぎてスライドするにつれて、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６および／またはＭｌｈ１−Ｐｍｓ１が、ＤＮＡの一方の鎖から別の鎖に直接トランスファー可能であるかどうかを決定する。
【０１４８】
[00238]ＭＭＲは、細菌からヒトまで保存される。ＭＭＲは、ＭｕｔＳα（Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６を含む）、ＭｕｔＬα（Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１を含む）、ＥｘｏＩ、ＲＰＡ、ＰＣＮＡ、ｐｏｌδなどの多様なタンパク質を伴い、このうちＭｕｔＳαおよびＭｕｔＬαを本明細書に論じる。このプロセスにおける欠陥は、突然変異頻度の１００〜１０００ｘの増加を生じる。例えば、ＭＭＲにおける欠陥は、高発癌症候群、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）と関連する。最大９０％のＨＮＰＣＣ症例は、ＭＳＨ２またはＭＬＨ１における突然変異による。
【０１４９】
[00239]ゲノム処理を伴う生化学的反応は、しばしば、タンパク質がＤＮＡ鎖に沿った長い距離に渡る制御情報とコミュニケーションすることを必要とする。複製後ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、複製エラーの修復中、長距離のＤＮＡに渡って、タンパク質が仲介するシグナル伝達を必要とする、進化的生化学的経路である（例えば図４８を参照されたい）。ＭＭＲは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）で最も研究されてきており、ここで、タンパク質ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、およびＭｕｔＨは、新規に合成された娘ＤＮＡの一過性非メチル化状態を利用することによって、鎖特異的修復の開始を促進する。ＭｕｔＳは、ミスマッチＤＮＡに結合し、そしてＭｕｔＬとともに、ＭｕｔＨニック形成エンドヌクレアーゼを活性化する。これは、最も近いヘミメチル化ｄＧＡＴＣでの娘鎖の切断を導き、これは親ＤＮＡおよびエラー含有娘鎖間の区別を可能にする、鎖識別シグナルとして働く。ＭｕｔＨによって生じるニックは、他のタンパク質の進入点を提供し、これが経路の下流工程を完成させる。鎖識別シグナルは、ミスマッチの最大〜２ｋｂ遠くに位置してもよく、そしてなお再構成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で、修復を誘発しうる。さらに、娘鎖の除去が起こると、ミス対形成塩基の元来の位置をバイパスした後にしか、切除機構は停止しない。これらの知見は、遠位鎖識別シグナルでの事象とミスマッチ結合を協調させるには、ＤＮＡらせんに沿ったコミュニケーションが必要であること、および関与するタンパク質は、全プロセスを通じてどの鎖がどれであるかの記録を付けなければならないことを強調する。
【０１５０】
[00240]真核生物において、ＭＭＲは、最大１１の異なるタンパク質を伴い、これにはＭｓｈ２−Ｍｓｈ６（ＭｕｔＳα）およびＭｌｈ１−Ｐｍｓ１（ＭｕｔＬα）が含まれ、これらはどちらも修復反応の最初の段階に必要である。癌関連突然変異がＭＳＨおよびＭＬＨ遺伝子にマッピングされ、ゲノム維持におけるこれらのタンパク質の重要性が示される。Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６は、２つのＭｕｔＳ相同体で構成されるヘテロ二量体であり、そして最初のミスマッチ認識および結合に必要である。Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１は、ミスマッチ認識後にＭｓｈ２−Ｍｓｈ６と相互作用し、そして修復経路において、下流工程と協調すると考えられる。ＡＴＰ結合および加水分解は、これらのタンパク質−タンパク質相互作用を制御するのに必要な、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１におけるコンホメーション変化を誘発しうる。ＭｕｔＨの相同体は真核生物では見られないが、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１自体が、潜在性のエンドヌクレアーゼであり、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ミスマッチＤＮＡ、およびＡＴＰの存在下で活性化される。このエンドヌクレアーゼ活性は、修復中に娘ＤＮＡ鎖をプロセシングするのに必要である。娘鎖がどのように同定されるのかは明らかでないままであり、これは真核生物における鎖識別シグナルが知られていないためである。遅延鎖中、または複製再開中間体の誘導鎖上に存在する３’ヒドロキシル中の隣接する岡崎断片間のあらかじめ存在するニックは、鎖識別に関与することも可能であり、ここでも、ＤＮＡらせんに沿った長距離コミュニケーションに関する必要性が強調される。ＭｕｔＬファミリーメンバーの構造は、Ｇｕａｒｎｅら（（２００４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２３：  ４１３４−４１３５）およびＫｏｓｉｎｓｋｉら（（２００５）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ３５１：  ８９５−９０９）に見られうる。
【０１５１】
[00241]ＭＭＲタンパク質が、損傷、および遠位鎖識別シグナル間で情報をコミュニケーションすることが必要である。このコミュニケーションが起こる機構は、徹底的な研究の主題であった。１Ｄ拡散がＭＭＲタンパク質機能の複合的な側面であるという考えを支持する証拠が集積してきている（図４９を参照されたい）。これを支持するため、本発明者らは、全反射照明蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦＭ）を用いて単一分子レベルでＭｓｈ２−Ｍｓｈ６を視覚化し、そしてタンパク質がＤＮＡに沿って１次元で迅速に拡散しうることを立証した。本発明者らはまた、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１もまた、ＤＮＡ上で拡散可能であり、そしてＭｌｈ１−Ｐｍｓ１は、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６よりも桁違いに速く移動することも立証した。これらのタンパク質の側方運動は、損傷認識、鎖識別シグナルを位置決定するのに必要な認識後工程、および／または娘ＤＮＡ鎖のプロセシングに寄与することも可能である。機械的な見方からは、結合したＤＮＡ鎖と結合したままで、タンパク質が移動するスライディング機構を通じて、拡散が起こるようである。しかし、本発明者らは、ジャンピング、ホッピング、および／またはセグメント間トランスファーを明白には排除できず、これらはすべて高エネルギー補因子の必要性を伴わずに、ＤＮＡに沿ってタンパク質が受動的に移動するのを可能にする。これらの機構の共通の側面は、これらが各々、中間体状態を起動しなければならないことであり、ここでタンパク質はＤＮＡ基質から部分的にまたは完全に離れ、そしてしたがって、第二のＤＮＡ部位との相互作用を確立可能である。その結果、ホッピング、ジャンピング、および／またはセグメント間トランスファーは、１つのＤＮＡ鎖から別のものに、タンパク質が直接トランスファーすることを可能にしうる。対照的に、純粋にスライディング機構を通じてＤＮＡに沿って移動するタンパク質は、１つのＤＮＡから次のものに直接トランスファーすることが不可能であり、これはタンパク質が、本質的に、運動するにつれて支持体と結合したままでなければならないためである。
【０１５２】
[00242]Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６およびＭｌｈ１−Ｐｍｓ１がスライディングを通じてＤＮＡに沿って移動するのかどうか、あるいはホッピング、ジャンピング、および／またはセグメント間トランスファーが、観察される運動に寄与するのかどうかを決定するため、本発明者らは、タンパク質が一方の鎖から次の鎖に直接トランスファー可能であるかどうかを調べるため、２つの交差ＤＮＡ分子上のタンパク質を直接視覚化しようとした。不活性脂質二重層上に懸濁され、そしてミクロ流体試料チャンバー表面に係留された十字ＤＮＡ分子のナノファブリケーションパターンを用いて、これを達成した。次いで、本発明者らは単一分子光学顕微鏡法を用いて、交差ＤＮＡ分子を横断する際の個々の蛍光タンパク質の移動を視覚化した。タンパク質運動の９０°ターンがＤＮＡの交差接合部と一致するため、本発明者らは、ＤＮＡ分子間のタンパク質の直接トランスファーを伴ういかなる事象も明白であると結論づけた。こうした事象の存在は、元来結合していたＤＮＡが放出される、３Ｄ構成要素を伴うタンパク質運動の機構を議論する明白な読み出しを提供するであろう。対照的に、交差ＤＮＡ鎖間のタンパク質トランスファーが接合部で存在しないと、観察される側方運動が、純粋にスライディング機構であり、タンパク質がＤＮＡと連続した中断されない接触にあり続けることが強く主張される。
【０１５３】
[00243]結果
[00244]十字ＤＮＡパターンの設計および製作。遠位ＤＮＡ部位間のタンパク質が仲介するコミュニケーションを精査するのに、鎖で連結されたプラスミドを用いた実験が用いられてきており、そしてこれらの研究の洗練された例には、プロモーター−エンハンサー相互作用、制限エンドヌクレアーゼ、および部位特異的組換えが含まれた。本発明者らは単一分子画像化と適合する形式で、ＤＮＡの交差分子を用いた実験を考案しようとした。不活性脂質二重層上に懸濁されるＤＮＡの十字パターンを操作するための設計戦略を図２１に例示する。交差ＤＮＡ分子のアレイを作製するためのアプローチは、ビオチン−ニュートラアビジン連結を介して脂質二重層に一端で係留されたＤＮＡ分子の組織化を調節するため、水力学的な力および拡散バリア（例えば非直線の幾何学的ナノスケール拡散バリア）の組み合わせに頼った。現在の設計の重要な特徴は、異なるパターンの要素が正方形に組織化され、ここで２つの隣接する側は、直線バリアで構成され、そして他の２つの側は、アレイ化五角形で構成される非直線の幾何学的バリアである。パターンは、各直線バリアの各々が２つの緩衝液入口チャネルの１つに対して垂直に配向されるように、４チャネルのフローセルの中央に配置される。直線要素は拡散バリアとして働き、二重層内の脂質が横断することは不可能である。五角形のアレイは、直線バリアの下流に位置し、そしてＤＮＡのもう一方の端の固体付着点として働く。五角形は、ジゴキシゲニンに対して向けられる抗体で非特異的にコーティングされ、該抗体はＤＮＡの未結合端に共有結合する。脂質束縛ＤＮＡ分子が直線拡散バリア内に押し込まれると、ＤＮＡは表面に平行に伸長し、そして次いで、ＤＩＧで標識されたＤＮＡの未結合端が、曝露された五角形表面に吸着された抗体に結合する。五角形の三角形の面は、各隣接五角形の間のチャネル内にＤＮＡを注ぎ込むように設計され、正方形パターン内部でのＤＮＡ分子の集積を最小限にする。
【０１５４】
[00245]図２１Ｂ〜Ｅは、Ｅビーム・リソグラフィーによって石英ガラス表面上に沈着した金（Ａｕ）の薄層で作製したパターンのＳＥＭ（走査型電子顕微鏡法）、光学的およびＡＦＭ（原子間力顕微鏡法）画像の例を示す。重要なパターンパラメータの寸法を示す。直線バリア要素は幅約１００ｎｍであった。五角形は長さ２μｍおよび幅１μｍであり、そして各五角形は、最も近いものから幅４００ｎｍのチャネルで分離されていた。異なる金属性要素の高さは約２０〜２５ｎｍであり、そして直線バリア要素の前縁およびアレイ化五角形の中央間の距離は１２μｍであった。この距離は、五角形内のどこに末端が係留されるかに応じて、係留された分子が全長の〜７０−８０％に伸長されるように、λ−ＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ、１６．５μｍ）とともに使用するために特に選択された。この距離は、ＤＮＡがその天然の長さを超えて伸長されないように、そしてＢ型幾何学の変形を回避するように選択された。さらに、本発明者らは、同じ度合いに伸長されたＤＮＡを用いて、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６およびＭｌｈ１−Ｐｍｓ１の両方を用いた１Ｄ拡散実験を先に行っていた。
【０１５５】
[00246]十字ＤＮＡカーテンの組み立ては、所望の支持体立体配置を達成するため、異なる構成要素の連続添加を伴った。まず、フローセル表面を最初にわずかな割合（０．５％）のビオチン化脂質を含有する脂質二重層でコーティングした。不活性二重層は、曝露された石英ガラスを覆うが、金表面パターンを覆って形成することは出来ず、金属表面は溶液に曝露されたままになる。次いで、抗ＤＩＧ  Ｆａｂ断片を試料チャンバー内に注入し、そして短期間インキュベーションして、これらが脂質二重層によって保護されないいかなる表面にも接着することを可能にする。はるかにより小さい直線バリアに対して、五角形の表面積が広いため、五角形がより多くの抗体で選択的にコーティングされることが確実になる。次いで、試料チャンバー表面は、ＢＳＡを含有する緩衝液でブロッキングされ、そしてニュートラアビジンが二重層にカップリングされて、ＤＮＡに対して可動性付着点を提供した。最後に、一端がビオチンに標識され、そしてもう一端がジゴキシゲニンで標識されたλ−ＤＮＡを試料チャンバー内に注入し、そして直線バリア要素内に押し込んだ。分子が直線バリアと出会うと、分子は伸長して、そして未結合端が五角形に接着する。図２２は、整列し、そして金属性ラックに係留された、ＹＯＹＯ１染色ＤＮＡ分子の例を示す。ＤＮＡの一端は、ビオチン−ニュートラアビジン連結を通じて脂質二重層に連結され、そしてＤＮＡのもう一端は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識され、そして非特異的に吸着された抗ＤＩＧ  Ｆａｂ断片を通じて、五角形にカップリングされた。画像獲得中には緩衝液の流動はなく、ＤＮＡ分子がビオチン化およびジゴキシゲニン標識端の両方によって係留されていることが確認された。本明細書に示すように、係留されたＤＮＡ分子は、互いに対して９０°に配向され、これらが交差点でのみ物理的に近接していることを保証する。
【０１５６】
[00247]ＤＮＡに沿ったＭｓｈ２−Ｍｓｈ６の側方運動は、３Ｄ構成要素を伴わない。
[00248]本発明者らは先に、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６が１Ｄ拡散によってＤＮＡに沿って移動しうること、および観察される運動が、タンパク質がリン酸主鎖を連続して辿る回転構成要素を伴う機構と一致することを示した。さらに、本発明者らは、この運動が、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６およびリン酸主鎖間の連続接触を伴うようであり、直線運動がＤＮＡに沿ったいかなるホップまたはジャンプも含む明らかな証拠はなかった。
【０１５７】
[00249]Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１は、交差ＤＮＡ分子間で直接トランスファー可能である（または不可能である）。
[00250]本発明者らの先の研究は、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１がまた、ＤＮＡに沿ってスライドするが、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６よりおよそ一桁、迅速に移動可能であることを示し、これらの２つのタンパク質複合体が、原理的に別個の機構を通じて移動することが示唆された。これらの２つのタンパク質複合体の構造もまた、著しく異なる。Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６は、リン酸主鎖との緊密な接触を通じてＤＮＡに結合する、小型のヘテロ二量体複合体である。Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１は、ＤＮＡを取り囲むと考えられる長いリンカーアームによって分離されるＮおよびＣ末端ドメインを有する。興味深いことに、バルク生化学的実験によって、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１が緊密にそして非特異的にＤＮＡに結合し、環状基質に強い優先性を持ち、そして数分に渡る時間スケールに渡って解離しないことが明らかになった。しかし、明らかに緊密な結合アフィニティにもかかわらず、Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１は、溶液中の競合剤ＤＮＡにトランスファー可能であり、過剰な競合剤ＤＮＡの添加が、最初に結合した基質からの解離を誘発することが示唆された。
【０１５８】
[00251]方法
[00252]タンパク質。先に記載されるように、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からＨＡタグ化Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６およびＦＬＡＧタグ化Ｍｌｈ１−Ｐｍｓ１を精製した。適切なように、抗ＨＡまたは抗ＦＬＡＧいずれかにコンジュゲート化された量子ドット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタンパク質複合体を標識した。先に記載されるように、エピトープタグ化タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＭＲに関して完全に機能し、そして標識されたタンパク質は、ゲルシフトおよびフィルター結合アッセイにおいて、野生型ＤＮＡ結合活性を維持した。
【０１５９】
[00253]ナノファブリケーション。石英ガラススライドをＮａｎｏＳｔｒｉｐ溶液（ＣｙａｎＴｅｋ社、カリフォルニア州フレモント）で２０分間清浄化し、次いでアセトンおよびイソプロパノールでリンスし、そしてＮ２で乾燥させた。スライドに、アニソール中の３％の分子量２５Ｋ、およびアニソール中の１．５％の４９５Ｋのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、マサチューセッツ州ニュートン）の二重層を、その後、Ａｑｕａｓａｖｅ導電性高分子（三菱レーヨン）の層をスピン・コーティングした。ランプ速度３００ｒｐｍ／ｓを用いて、４，０００ｒｐｍで４５秒間、各層をスピンした。パターン生成装置およびリソグラフィー調節系（Ｊ．Ｃ．  Ｎａｂｉｔｙ，  Ｉｎｃ．、モンタナ州ボーズマン）を装備したＦＥＩ  Ｓｉｒｉｏｎ走査型電子顕微鏡を用いて、Ｅビーム・リソグラフィーによって、五角形パターンおよび非直線の「Ｖ」型の非直線幾何学的バリアを形成する直線要素を書いた。パターンを書いた後、Ａｑｕａｓａｖｅを脱イオン水で洗い流した。イソプロパノール対メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の３：１溶液を用いて、５℃で１分間超音波攪拌して、レジストを発展させた。次いで、支持体をイソプロパノールでリンスして、そしてＮ２で乾燥させた。Ｓｅｍｉｃｏｒｅ電子ビーム蒸発装置を用いて、クロムまたはチタンのいずれかの３〜５ｎｍの接着層の上に金の１５〜２０ｎｍ層を沈着させた。９：１の比の塩化メチレン対アセトン中、８０℃でリフトオフを達成した。リフトオフ後、スライドをアセトンでリンスして、そしてＮ２で乾燥させた。Ｈｉｔａｃｈｉ  ４７００走査型電子顕微鏡およびＰＳＩＡ  ＸＥ−１００走査プローブ顕微鏡を非接触モードで用いてバリアを画像化した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＭＥ６００を用いて、バリアの光学的画像を取った。
【０１６０】
[00254]十字ＤＮＡの組み立て。クロムナノスケール拡散バリアを伴って、石英ガラススライド（Ｇ．  Ｆｉｎｋｅｎｂｅｉｎｅｒ，  Ｉｎｃ．）からフローセルを組み立てた。ダイアモンドが先端についた錐（１．４ｍｍ  Ｏ．Ｄ．；  Ｋａｓｓｏｙ）を装備した高速正確ボール盤を用いて、スライドを通じて穴をあけることによって、入口および出口ポートを作製した。２％（ｖ／ｖ）Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ、１Ｍ  ＮａＯＨ、および１００％  ＭｅＯＨ中に連続して浸すことによって、スライドを清浄化した。各洗浄間に、ろ過滅菌水でスライドをリンスし、そして使用するまで、１００％  ＭｅＯＨ中に保存した。組み立て前に、窒素流下でスライドを乾燥させ、そして真空オーブン中で、少なくとも１時間、ベーキングした。ホウケイ酸ガラスカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および両面テープ（〜２５μｍ厚、３Ｍ）から、試料チャンバーを用意した。熱融解性接着剤（ＳｕｒｅＢｏｎｄｅｒスティックのり、ＦＰＣ社）を用いて、入口および出口ポート（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を取り付けた。試料チャンバーの総体積は〜４μｌであった。シリンジポンプ（Ｋｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および作動注入バルブ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、試料送達、緩衝液選択および流速を調節した。フローセルおよびプリズムを、コンピュータ調節フィードバック制御を備えた特注のヒーター中に搭載して、必要に応じて、２５〜３７℃（±０．１℃）の間で試料の温度を調節した。各使用後に、スライドをＭｅＯＨ中に浸して、ポートおよびテープを取り除き、水でリンスし、Ｎａｎｏｓｔｒｉｐで簡単に（１５〜２０分間）洗浄し、そして最後に水でリンスした。この方法は、再使用のためにスライド表面を清浄化するのに十分であり、そして各スライドを多数回用いてもよいが、光学表面または金属パターンの性質は低下していく。
【０１６１】
[00255]先に記載されるように、ＤＮＡカーテンを構築した。すべての脂質を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入し、そしてリポソームを先に記載されるように調製した。簡潔には、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン）、０．５％ビオチン化ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（キャップビオチニル））、および８％  ｍＰＥＧ５５０−ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］）の混合物。ｍＰＥＧは、二重層形成またはＤＮＡカーテンの組み立てに影響を及ぼさず、むしろ量子ドット（タンパク質−ＤＮＡ相互作用の本発明者らの研究において使用する）の非特異的吸着に対して表面をさらに不動態化するように働く。リポソームを試料チャンバーに３０分間適用した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で、過剰なリポソームをフラッシュした。次いで、フローセルを緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）でリンスし、そして１５分間インキュベーションした。次いで、３０μｇ／ｍｌの抗ＤＩＧ  Ｆａｂ（Ｒｏｃｈｅ）を加えた緩衝液Ａを試料チャンバー内に注入し、そして２０分間インキュベーションした。次いで、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを加えた緩衝液Ａで試料チャンバーを５分間フラッシュした。次いで、緩衝液Ａ中のニュートラアビジン（３３０ｎＭ）を試料チャンバー内に注入し、そして２０分間インキュベーションした。０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを加えたさらなる緩衝液Ａで完全にリンスした後、ビオチンで一端をそしてジゴキシゲニンでもう一端を標識し、そして１〜２ｎＭのＹＯＹＯ１であらかじめ染色したλ−ＤＮＡ（１５〜２０ｐＭ）を試料チャンバー内に注入し、１０分間インキュベーションし、そして０．１ｍｌ／分で緩衝液をフラッシュすることによって、未結合ＤＮＡを取り除いた。緩衝液流動の適用によって、脂質束縛ＤＮＡ分子は拡散バリアの前縁に沿って整列した。
【０１６２】
[00256]ＴＩＲＦＭおよびデータ分析。本研究で用いる顕微鏡の基本設計は、先に記載されてきている。簡潔には、系は、特注照射系を備えたＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｕ倒立顕微鏡周囲に構築される。本研究のため、４８８ｎｍ、２００ｍＷダイオード励起固体レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＣＤＨＲ）を励起供給源として用いた。レーザーを必要に応じて減弱させ、そしてレーザーは遠隔操作される鏡（Ｎｅｗ  Ｆｏｃｕｓ）によってＤＮＡカーテン上を中心とした。プリズム面でのビーム強度は、〜１０−１５ｍＷであった。背後から照射されるＥＭＣＣＤ検出装置（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｂ）を用いて、画像を検出した。別に示さない限り、６０ｘ浸水対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、１．２ＮＡ、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ）を用いて、ＴＩＲＦＭ画像を収集した。
【０１６３】
実施例７：ナノファブリケーションで製作したＤＮＡカーテンを用いたタンパク質−ＤＮＡ相互作用の視覚化
[00257]制限酵素およびＭｓｈ２−Ｍｓｈ３。完全消化のため、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えた反応緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中の７００μＬの所望の制限酵素を、０．２ｍＬ／分で注射した。すべての制限酵素をＮＥＢから購入し、そして用いた酵素の量は以下の通りであった：  ＮｈｅＩ（１００単位／ｍｌ）；  ＸｈｏＩ（１００単位／ｍｌ）；  ＥｃｏＲＩ（１００単位／ｍｌ）；  ＮｃｏＩ（５０単位／ｍｌ）；  ＰｖｕＩ（５０単位／ｍｌ）；およびＳｐｈＩ（５０単位／ｍｌ）。制限酵素注入の前およびすべての酵素溶液が流れていった後に、ＤＮＡ分子の画像を収集した。部分的消化のため、ＥｃｏＲＩの量を２０単位／ｍｌに減少させ、そして７００μＬを０．４ｍＬ／分で注入した。
【０１６４】
[00258]Ｓｕｒｔｅｅｓ，  Ｊ．  Ａ．；  Ａｌａｎｉ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００６，  ３６０，  ５２３−５３６に記載されるように、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ３を精製し、そしてＭｓｈ２−Ｍｓｈ３を用いたＴＩＲＦＭ実験を、本質的に、本発明者らがＭｓｈ２−Ｍｓｈ６を用いて以前公開した実験に関して記載するように行った（Ｇｏｒｍａｎ，  Ｊ．ら  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ２００７，  ２８，  ３５９−３７０）。簡潔には、５０ｍＭ  ＮａＣｌを加えた緩衝液Ａ中で、１：２のタンパク質：量子ドット比で、抗ＨＡ抗体コンジュゲート化量子ドットとＨＡタグ化Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ３をインキュベーションした。次いで、５０μＬの１．５ｎＭ量子ドットタグ化Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ３を、０．１ｍＬ／分で注入して、効率的な結合を可能にした。データ収集のため、流速を０．４ｍＬ／分に増加させ、そして記載されるように結合分布を定量化した（Ｐｒａｓａｄ，  Ｔ．  Ｋ．；  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｒ．  Ｂ．；  Ｖｉｓｎａｐｕｕ，  Ｍ．  Ｌ．；  Ｃｈｉ，  Ｐ．；  Ｓｕｎｇ，  Ｐ．；  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｅ．  Ｃ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００７，  ３６９，  ９４０−９５３）。
【０１６５】
[00259]これらのＤＮＡカーテンは、個々の分子レベルでタンパク質−ＤＮＡ相互作用の分析に有用であり、そして単一実験実行で、統計的に適切な情報を提供可能である。この有用性を立証するため、本発明者らは、遺伝子組換え中の小さい挿入／欠失ループの複製後ミスマッチ修復およびＤＮＡプロセシングに関与するタンパク質複合体である、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ３の結合分布を調べた（Ｓｕｒｔｅｅｓ，  Ｊ．  Ａ．；  Ａｌａｎｉ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００６，  ３６０，  ５２３−５３６；  Ｌａｎｇｓｔｏｎ，  Ｌ．  Ｄ．；  Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｌ．  Ｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００５，  ２４，  ２２１４−２２２３）。この実験のため、Ｍｓｈ２上にＨＡエピトープタグを所持する組換えＭｓｈ２−Ｍｓｈ３を、抗ＨＡタグ化量子ドットで標識した（Ｇｏｒｍａｎ，  Ｊ．；  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，  Ａ．；  Ｓｕｒｔｅｅｓ，  Ｊ．  Ａ．；  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｊ．；  Ｒｅｉｃｈｍａｎ，  Ｄ．  Ｒ．；  Ａｌａｎｉ，  Ｅ．；  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｅ．  Ｃ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ２００７，  ２８，  ３５９−３７０）。次いで、タグ化タンパク質を、ＤＮＡカーテンを含有する試料チャンバー内に注入し、そして未結合タンパク質を緩衝液流動によって除去した。次いで、緩衝液流動の存在下および非存在下で、ＤＮＡ分子および残りの結合タンパク質を視覚化した（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。緩衝液流動におけるこの一過性の中断を対照として用いて、観察中のタンパク質がＤＮＡにのみ結合して、そしてフローセル表面に結合しないことを検証する（図２３、パネルＡおよびＢを比較されたい）。図２３Ａおよび図２３Ｃに示すように、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ３はλ−ＤＮＡのカーテンに結合するが、損傷を受けていないホモ二重鎖ＤＮＡ基質に対してはいかなる好ましい領域または部位も示さなかった。６０倍で収集されたこの単一視野中には２２６の個々のＤＮＡ分子および５４８の複合体があり、単一のタンパク質−ＤＮＡ複合体を見るためのこのアプローチの統計的な力を強調する。
【０１６６】
実施例８：分子間の定義された側方分離を伴うＤＮＡカーテン
[00260]図２４Ａ〜Ｄは、隣接する幾何学的ナノウェル間の１０００ｎｍ間隔（図２４Ａ〜Ｂ）または１９００ｎｍ間隔（図２４Ｃ〜Ｄ）のいずれかを伴う非直線の幾何学的拡散バリアで組み立てられるＹＯＹＯ１染色ＤＮＡカーテンの代表的な例を示す。緩衝液流動の存在下で、ＤＮＡ分子は表面に沿って伸長するが、流動が停止されると、視野外に拡散し、これらが二重層に非特異的に吸着しているのではないことが検証される。これらの画像は、非直線の幾何学的バリアパターンを用いてＤＮＡカーテンを調製可能であることを示し、そしてまたＤＮＡ分子間の距離がナノウェルの空間的制約によって影響されることも示す（図２４Ａおよび図２４Ｃを参照されたい）。カーテン内のＤＮＡ分子が、実際に、本発明者らが予測したように、幾何学的ナノウェル内に維持されるならば、パターン設計内の三角形の隣接する頂点間の距離は、個々のＤＮＡ分子間の分離距離に反映されるはずである。
【０１６７】
[00261]図２４Ｅは、隣接するナノウェル間の分離が１９００、１０００、７５０、５００、３５０、および２００ｎｍである、非直線の幾何学的バリアパターンで作製されたＤＮＡカーテンの例を強調する。これらのカーテンは、挿入色素ＹＯＹＯ１で蛍光染色された２３ｋｂ  ＤＮＡで構成される。この設計パターンが、所望の間隔を持つＤＮＡ分子を生じることを検証するため、本発明者らは、バリア縁に沿ったＤＮＡの側方位置に対して、染色されたＤＮＡのシグナル強度をプロットし、そしてこれらのプロットによって、ピーク間距離が、非直線の幾何学的バリアパターンの設計からの値と一致することを確認した（図２４Ｆ）。１９００、１０００、７５０、５００、３５０、および２００ｎｍバリアは、パターン設計に対応する分離距離を生じた。１９００、１０００、７５０、５００、および３５０ｎｍ間隔の幾何学的ナノウェルに関して、本発明者らは、隣接するウェル内に装填されたＤＮＡ分子間の距離を解像可能であった。２００ｎｍナノウェル間隔に関しては、分子の間隔が近いことが蛍光シグナルの重複につながったため、隣接するウェル内に装填されたＤＮＡ分子を解像することは不可能であった。しかし、より低濃度のＤＮＡでは、本発明者らは、ＤＮＡ分子間の観察される間隔が２００ｎｍに分割可能な間隔で生じることを確認可能であり（図２４Ｆ、下部パネル）、２００ｎｍのナノウェルが機能していることが示される。同様に、本発明者らは、カーテン内のＤＮＡの分布パターンを検証するため、フーリエ変換（ＦＴ）分析を用いた。図２４Ｇに示すように、ＦＴ由来のパワースペクトルのピーク間分離は、非直線の幾何学的バリアパターンの設計に基づいて予期される値の５％以内に相関した。総合すると、これらのデータは、隣接するナノウェル間の距離が、ＤＮＡカーテンを構成する個々の分子間の側方分離を支配することを立証する。
【０１６８】
[00262]上に示すように、滑らかな直線クロムバリアに沿って整列したＤＮＡ分子は、バリア縁に沿って側方にスリップする可能性もあり、そしてこの効果は、より短いＤＮＡ分子でより顕著になる。この問題を例示するため、４８．５ｋｂ  λ  ＤＮＡまたはヒトβ−グロビン遺伝子座由来の２３ｋｂ  ＰＣＲ  ＤＮＡ断片のいずれかをＹＯＹＯ１で標識し（実施例２の材料および方法を参照されたい）、そしてこれらの分子を滑らかなバリアの縁に沿って整列させた。次いで、カーテンの横断面から、１３．５ｓの期間に渡ってＤＮＡ分子の側方位置を例示するキモグラムを生成した。図２５に示すように、蛍光標識分子は、数秒のみに渡る期間に渡っていても、バリア縁に沿ったＤＮＡの側方スリッページと一致する動きを示した。さらに、滑らかなバリア縁に沿って整列したＤＮＡ分子の側方運動（時間で割った位置の変化）の定量化によって、平均１．６ｘ１０−３±２．１ｘ１０−３μｍ２／ｓの広範囲の値が生じた。５００ｎｍ間隔の非直線の幾何学的バリアパターンを用いて作製されたＤＮＡカーテンを、対応するキモグラムとともに図９Ｂに示す。滑らかなバリアで観察される移動とは対照的に、非直線の幾何学的パターンで整列したλ  ＤＮＡ分子は、同じ１３．５ｓ期間に渡って側方スリッページの証拠をまったく示さなかった。配列がより短い長さであるＤＮＡ分子を用いた類似の実験によって、３４、２１、１１、および５ｋｂ  ＤＮＡ断片の側方移動もまた、非直線の幾何学的バリアパターンで排除されることが明らかになった（図９Ｂ）。これらのＤＮＡ分子の側方運動の定量化によって、わずか２．００ｘ１０−６（１．７３ｘ１０−６）の値が生じ、ＤＮＡが有効に固定されたことが立証された。これらのＤＮＡ分子は、何十分に渡る、はるかにより長い期間に渡ってさえ安定なままであり、そしてこれは異なるバリア寸法各々に関して真実であった。このデータは、非直線の幾何学的バリアパターンが、バリア縁に沿ったＤＮＡ分子の側方移動を有効に制限することを示す証拠を提供する。
【０１６９】
[00263]図２６Ａは、隣接する幾何学的ナノウェル間の間隔が１９００ｎｍであるように、バリアで組み立てられた異なる量のＤＮＡのＹＯＹＯ１染色ＤＮＡカーテンの割面を示す。バリア自体の設計が、異なるＤＮＡ濃度の勾配を有効に提供するため、これらの３つの画像は単一バリアセットから収集された。これは、束縛されたＤＮＡ分子をナノウェル含有バリアに導くガイドチャネル開口部がすべて類似の幅である一方、バリアセット内の異なる列が増分性により広くなるために起こる。ＤＮＡ分子の蛍光横断面を図２６Ｂに示し、そして異なる数のＤＮＡ分子に対応する相対的シグナル強度を水平バーに示す。単一ＤＮＡ分子は、観察される相対シグナル強度が最低であるため、容易に同定された（図２６Ａ〜Ｂの上部、中央および下部パネルを比較されたい）。多数のＤＮＡ分子を含むナノウェルはまた、１以上のさらなるＤＮＡ分子と一致した相対シグナル強度での明らかな増分性増加を示すため、容易に同定された（図２６Ｂの上部、中央、および下部パネルを比較されたい）。図２６Ｃは、ナノウェルあたりのＤＮＡ分子数のヒストグラムを示し、ＤＮＡカーテンを組み立てるために用いる条件下で、大部分のナノウェル（４４％）が１つのＤＮＡ分子のみを含有する一方、８％がＤＮＡをまったく持たず、１３％が２つのＤＮＡ分子を有し、１８％が３つのＤＮＡ分子を有し、そして１７％が４つ以上のＤＮＡ分子を有することを示す。
【０１７０】
[00264]１つのみのＤＮＡから生じる際の最低相対的シグナル強度の割り当てをさらに確認するため、非常に低い濃度の制限エンドヌクレアーゼＡＶａＩを用いて、リアルタイムでＤＮＡ分子を部分消化した（図２６Ｄ〜Ｅ、そして以下を参照されたい）。１つのＤＮＡ分子のみがナノウェル中に存在する場合、ＡｖａＩ切断によって遊離したＹＯＹＯ１染色ＤＮＡ断片は緩衝液流動によって洗い流されるであろうため、確率論的な切断事象は、対応する切断部位より下流のＤＮＡのいずれもが完全にそしてほぼ瞬間的に喪失することと一致するであろう。対照的に、多数のＤＮＡ分子が単一のナノウェル中に存在する場合、ＡＶａＩによる単一の確率論的切断事象は、すべての下流シグナルの瞬間的な喪失を生じず、むしろ、１つのＤＮＡ分子のみの喪失に対応する切断部位下流のシグナル強度の減少を生じるであろう。図２６Ｄに示すように、ナノウェル中に単一のＤＮＡが装填される場合、制限酵素による切断は、対応する下流ＤＮＡ断片の即時喪失を導く。対照的に、多数のＤＮＡ分子がナノウェル中に存在する場合（図２６Ｅ；この例において、２つの分子がナノウェル中にある）、１つのＤＮＡ分子のみが消化の経過中に切断されるため、制限酵素による切断は、下流シグナルの増分的減少を生じる。これらの部分的制限消化による結果によって、最低のＹＯＹＯ１蛍光シグナルがＤＮＡの１つの分子のみに対応することが確認された。
【０１７１】
実施例９：動的光学的制限マッピング
[00265]上に示すように、これらの非直線の幾何学的バリアパターンは、バリア縁に沿った側方可動性を排除することによって、比較的小さいＤＮＡ断片であっても研究を可能にする。本発明者らはまた、幾何学的ナノウェルに単一ＤＮＡ分子を装填可能であることも立証した。先の研究において、本発明者らは、カーテンの設計がまた、ＤＮＡの特異的末端でのビオチンタグの位置に基づいて、すべてが同じ配列配向で整列したＤＮＡ分子も生じることを示した。この一貫した整列の結果、カーテン内のＤＮＡ分子の完全制限消化は、その長さが最上流の切断部位に対応する、同一の束縛された断片を生じる。高濃度の制限酵素での完全な消化を用いて、同じ制限酵素によって切断される多数の部位を同定することは不可能であり、これはＤＮＡが切断されると直ちに、下流ＤＮＡが試料チャンバーからフラッシュされるためである。上に示すように、低濃度の酵素で行われる制限消化は、確率論的切断事象を明らかにすることも可能であり、これを用いて、これらの中間長各々に対応する断片すべてを明らかにすることも可能である。しかし、これは、消化がリアルタイムで見られ、そしてすべての部位を検出するために、十分な数の分子が観察され、そして切断速度がデータ獲得頻度より緩慢である場合にのみ当てはまる。これらの基準が満たされた場合、個々の切断事象各々に続いて、緩衝液流動によって、下流断片が試料チャンバーから直ちにフラッシュされ、その短くなった長さが切断部位の位置に対応する、損なわれていないビオチン化断片が残る。係留されたＤＮＡ端に対して最も上流部位で特定の分子が切断されるまで、同じＤＮＡに対してこれを反復して行ってもよい。これらのＤＮＡカーテンで視覚化可能なＤＮＡ分子の数が多数であることから、ＤＮＡ内の潜在的な部位すべてを検出することが可能となり、そして幾何学的ナノウェルは、ＤＮＡ分子が切断された後に、ＤＮＡ分子が前後にスリップすることを妨げる。最終的に、すべてのＤＮＡ分子が最上流の制限部位に対応する最終長にまで切断されるであろう。本発明者らは、このリアルタイム消化を動的光学的制限マッピングと呼び、そしてそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いたこうしたアッセイの例を図２７Ａ〜Ｂに示す。５つのＥｃｏＲＩ部位または５つのＢａｍＨＩ部位の各々が同定可能である例を提供するため、これらのキモグラムを選択した。この消化に必要な総時間は、わずか１２０ｓ未満であった。このアッセイは、滑らかなバリア設計では不可能であり、これは、断片長が短くなればなるほど、ＤＮＡ分子が迅速に前後にスリップし始め、こうして長期に渡る同じＤＮＡ分子の測定に干渉するためである。こうしてこのリアルタイム動的光学的制限マッピングアッセイは、幾何学的ナノウェルで構成されるバリアパターンと組み合わせて用いた際に非常に容易になる。
【０１７２】
実施例１０：ハイスループット単一分子画像化は、本質的なヌクレオソーム景観を明らかにする
[00266]ヌクレオソームは真核クロマチンにおける組織化の基本的な単位であり、そしてＤＮＡ代謝のすべての側面に寄与する。クロマチン構造の重要性から、本質的な配列優先性に基づく、ゲノムに渡るヌクレオソーム分布を予測するためのコンピュータ法を確立する努力が行われてきた。本明細書において、本発明者らは、ナノファブリケーションで製作したＤＮＡカーテンのハイスループット単一分子画像化を用いて、モデル支持体上のヌクレオソーム沈着に関する本質的なエネルギー景観を直接決定する。次いで、本発明者らは、コンピュータ内での予測が、実験的に得られる本質的なエネルギー景観のコース・グレイン（ｃｏｕｒｓｅ−ｇｒａｉｎ）特徴を正確に反映するかどうかを調べる。本発明者らの結果は、ヌクレオソーム分布パターンがＳｅｇａｌらＤ１の広く引用されるモデルからの予測とは反相関するが、ＦｉｅｌｄらＤ２のより最近のモデルと強く相関したことを示す。理論によって束縛されることなく、これらの発見は、ＤＮＡが標準的なヌクレオソームの分布を支持するのに必要な本質的な配置情報を含有することを強調し、そしてこのプロセスにおいて、排他的な配列が有意な役割を果たすことを示す。本発明者らはまた、本質的な景観が、構成物のヒストン同一性に広く独立性であり、そして変異体ヒストンＨ２ＡＺまたはＣｅｎＨ３を含有するヌクレオソームは、標準的なヌクレオソームに関して観察されるパターンとよく相関し、これらが異なるｉｎ  ｖｉｖｏ分布にもかかわらず、類似の熱力学的原理に供されることも示す。しかし、非ヒストンタンパク質Ｓｃｍ３は、本質的な景観を劇的に改変し、セントロメア・ヌクレオソームがポリ（ｄＡ−ｄＴ）リッチ配列の排他的な効果を克服することを可能にする。最後に、本発明者らは、ヒトＤＮＡにおけるシス制御配列が、本質的な景観中のピークと一致する一方、谷が非制御領域に対応することを示し、そして本発明者らは、脊椎動物ゲノムにおけるヌクレオソーム沈着パターンが、現在の理論によって計上されていない外因性の要因およびありうる内因性の配列要素の両方によって影響を受けていることを主張する証拠を提示する。
【０１７３】
[00267]ゲノム全体のヌクレオソームの分布は、ＤＮＡ転写、修復、および染色体分離に関する広範囲の結果を有するＤ３〜５。ヌクレオソームは、〜１４７塩基対（ｂｐ）のＤＮＡからなり、各ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の２つを含有する八量体の周囲に〜１．７ターンで巻き付けられるＤ５、Ｄ６。ゲノム全体のヌクレオソーム位置のコンピュータ内モデルを開発することに非常に関心が持たれてきているが、この最初のものはＳｅｇａｌらＤ１から来ており、そしてＧＣジヌクレオチドと反対の相にある１０ｂｐ周期性を持つＡＡ／ＴＴ／ＡＴジヌクレオチドを含有する屈曲可能ＤＮＡのヌクレオソームの普遍的な優先性に基づいて確率論的ヌクレオソーム分布を計算したＤ３、Ｄ７（図４７もまた参照されたい）。理論によって束縛されることなく、これは、ゲノムがヌクレオソーム分布に影響する情報を本質的にコードすることを主張し、そしてクロマチンリモデリングタンパク質などの外因性の因子が安定状態位置を確立する際に限定された役割を果たすことを仮定する、「第二の遺伝暗号」のアイディアを支持した。しかし、理論によって束縛されることなく、集積する証拠によって、ポリ（ｄＡ−ｄＴ）などの排除シグナルもまた、ヌクレオソーム分布に影響を及ぼすことが立証されるＤ５、Ｄ８〜１０が、これらの配列は元来のＳｅｇａｌ予測には計上されていなかった。Ｓｅｇａｌおよび同僚らのより最近のモデルは、Ｆｉｅｌｄ、ＫａｐｌａｎおよびＦｏｎｄｕｆｅ−Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆ（ＦＫＦＭ）モデルと称されるべきものであるが、該モデルは、単離されたヌクレオソーム由来の〜２０００倍多い配列情報を用いて、パターンマッチングアルゴリズムをトレーニングし、そしてまたリンカーＤＮＡにおいて濃縮されたモチーフからの排除効果を含めたＤ２（図４７もまた参照されたい）。
【０１７４】
[00268]本質的な景観を予測するための一般的なツールとしてのこれらのモデルの相対的性能は、まだ完全には研究されていないが、これに刺激されて、本発明者らは、全反射照明蛍光顕微鏡法を用いたハイスループット単一分子画像化による予測を検証しうるかどうかを調べた。このアッセイのため、ＤＮＡをミクロ流体チャンバー表面上の脂質二重層に係留し、そして水力学的な力を用いて、ナノファブリケーションで製作したバリアに沿ったカーテンになるように数千の分子を整列させて、リアルタイムで見る（図２８Ａおよび図３２）Ｄ１１。ヌクレオソームを伴うカーテンを作製するため、ＦＬＡＧ−Ｈ２Ｂを含有する組換えＳ．セレビシエ八量体を塩透析によってビオチン化λ−ＤＮＡ上に沈着させ（図３３）、これを熱力学的に好ましい分布になるよう反復しＤ５、Ｄ１２、そしてヌクレオソームを、ｉｎ  ｓｉｔｕで、抗ＦＬＡＧ量子ドット（ＱＤ；図２８Ｂ）で標識した。水力学的な力を一過性に止めると、カーテンのエントロピー崩壊が誘発され、ＤＮＡおよびヌクレオソームが、エバネッセント場によって定義される検出体積外に漂流し、このことは、分子がビオチンタグを介してのみ係留されることを立証した（図２８Ｂ〜Ｄ）。分布分析のため、ＤＮＡあたり〜５ヌクレオソームを生じるように条件を選択し、これは４８．５ｋｂ基質の〜１．５％カバーと同等であり、そして時間経過はヌクレオソームが実験中に移動もまた解離もしないことを確認した（図２８Ｂ〜Ｄ）。
【０１７５】
[00269]λ−ＤＮＡは、ヌクレオソームを配置する進化的圧力にはさらされていないが、ファージゲノムの分析によって、モデル基質としてのその使用の利点が明らかになった：ＳｅｇａｌおよびＦＫＦＭモデルは、ヌクレオソーム分布パターンに関する顕著に似ていない予測を生じた（図２９Ａ、図３４Ａ〜Ｂ、および図３５Ａ）。ピアソン相関分析によって、これらの予測が実際に反相関であることが明らかになった（ｒ＝−０．７６、ｐ＜０．０００１；図３６）。対照的な予測は、Ｓｅｇａｌモデルがポリ（ｄＡ−ｄＴ）トラクトに相関し（ｒ＝０．６０、ｐ＜０．０００１）、一方、ＦＫＦＭモデルがこれらの同じ特徴と反相関する（ｒ＝−０．６８、ｐ＜０．０００１；図２９Ｂ）という観察によって立証されるように、排他的な配列に起因する。２つのモデルによって生じる異なる分布は、相対的性能を評価するための手段を提供した。予測を試験するため、本発明者らは、１，２４８の標準的ヌクレオソームおよびヒストン変異体Ｈ２ＡＺを含有する１，２１０のヌクレオソームの位置を測定し（総数Ｎ＝２，４５８；図２９および図３７〜３８を参照されたい）；これらの位置のヒストグラムは、ヌクレオソーム沈着に関する、熱力学的に好ましい本質的なエネルギー景観のコース・グレイン・プロフィールに相当する（図２９Ａ）。観察されるヌクレオソーム分布は、Ｓｅｇａｌ予測（ｒ＝―０．５５、ｐ＜０．０００１；図２９Ｂ）およびポリ（ｄＡ−ｄＴ）分布（ｒ＝−０．３２、ｐ＜０．０１）の両方と反相関するが、ＦＫＦＭモデルと顕著な類似を所持した（ｒ＝０．６３、ｐ＜０．０００１；図２９Ａ〜Ｂ、および図３５）。これらの結果は、元来のＳｅｇａｌモデルの限界を強調するが、洗練されたＦＫＦＭモデルを、ヌクレオソーム結合部位の本質的なエネルギー景観を予測するための一般的な手段として支持する。Ｓ．セレビシエ由来の配列でトレーニングしたアルゴリズムが、λ−ＤＮＡの本質的な景観を予測しうるという事実は、酵母における安定状態ヌクレオソーム位置が、主に、本質的な配列効果に影響されることをさらに立証する。
【０１７６】
[00270]真核ゲノム内の情報は、ヒストン変異体のターゲティングされた沈着を通じて強化される。ヒストンＨ２ＡＺは、遺伝子制御に影響を及ぼすＨ２Ａの保存された系譜であるＤ１３〜１８。ＣｅｎＨ３（酵母におけるＣｓｅ４）は、セントロメア特異的エピジェネティックマーカーとして働くＨ３変異体であるＤ１９〜２１。Ｃｓｅ４は、ヒト・セントロメア中のＣｅｎＨ３と交換可能であり、高度の機能的保存があることが示されるＤ２２。Ｈ２ＡＺおよびＣｅｎＨ３のｉｎ  ｖｉｖｏ沈着は、外因性因子を必要とするＤ４、Ｄ２１、Ｄ２３が、変異体が、標準的ヌクレオソームによる好ましい結合を支持するのと同じエネルギー景観に供されるかどうかは不明である。Ｈ２ＡＺを所持するヌクレオソームは、標準的ヌクレオソームと同じ分布傾向を示し、Ｈ２ＡＺが熱力学的配列優先性を改変しないことを立証する（図２９、および図３７〜３８）。ｉｎ  ｖｉｖｏでポリ（ｄＡ−ｄＴ）リッチＣＥＮ  ＤＮＡに結合し、そしてＨ２Ａ／Ｈ２Ｂが非ヒストンタンパク質Ｓｃｍ３と交換されている異常なヘキサソームを形成するＣｓｅ４に関する本質的な景観が達成されてきているＤ２１。セントロメア・ヌクレオソームが、部位優先性に関して標準的なヌクレオソームと同じ原理にしたがうのであれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分布は類似になるはずである。
【０１７７】
[00271]あるいは、セントロメア・ヌクレオソームが同じ熱力学的原理にしたがわない場合、これらは別個の分布パターンを示すはずである。図３０Ａに示すように、Ｃｓｅ４は、総ヌクレオソームの〜７％を、λ−ＤＮＡの左側１０ｋｂから離れて再分布させ（図３０Ａ）、本質的な景観のわずかな混乱を反映する。しかし、Ｃｓｅ４ヌクレオソームの全体の分布（Ｎ＝２，０３３）はなお、標準的ヌクレオソームのものと相関し（ｒ＝０．５８、ｐ＜０．０００１）、ＦＫＦＭ予測と相関し（ｒ＝０．５９、ｐ＜０．０００１）、そしてＳｅｇａｌ予測と反相関した（ｒ＝−０．５５、ｐ＜０．０００１）。これらの知見は、Ｃｓｅ４単独では本質的な景観を劇的には改変しないことを立証し、これは〜１．７ターンのＤＮＡがなおセントロメアＨ３変異体を宿する八量体の周囲に巻き付くという物理的予測からは合理的である（図３７Ｃ）。対照的に、Ｃｓｅ４およびＳｃｍ３の両方を含有するヌクレオソームは、改変された景観を示し、これは理論的モデル（図３０Ｂ）、また標準的／Ｈ２ＡＺ分布（ｒ＝０．３０、ｐ＝０．０１６；図３０Ｂ）のいずれとも有意には相関しなかった。また、Ｃｓｅ４／Ｓｃｍ３分布は、Ｃｓｅ４八量体分布（ｒ＝０．３１、ｐ＝０．０１３）またはポリ（ｄＡ−ｄＴ）トラクト（ｒ＝０．１１，ｐ＝０．３８７）とも有意に相関しなかった。すべての他のヌクレオソームは、λ−ＤＮＡのポリ（ｄＡ−ｄＴ）リッチ中心内で占有減少を示した（図２９Ａおよび図３０Ａ）が、この忌避（ａｖｅｒｓｉｏｎ）は、Ｓｃｍ３によって軽減され（図３０Ｂ）、Ｓｃｍ３がＤＮＡ結合の機構を改変することが示唆された。この結論は、Ｓｃｍ３を所持するヌクレオソームが改変されたＭＮアーゼフットプリントを示すという発見によって支持される（図３７）。理論によって束縛されることなく、これらの発見は、Ｓ．セレビシエ中のポリ（ｄＡ−ｄＴ）リッチＣＥＮ配列が部分的に通常の八量体ヌクレオソームを排除する一方、Ｓｃｍ３はその阻害を抑制し、したがって動原体組み立てのためのユニークなセントロメア景観を確実にするというアイディアを支持する。
【０１７８】
[00272]上述の研究はすべて、単純なモデル基質としてファージλ  ＤＮＡを利用した。より複雑な真核生物基質の本質的な景観を決定するため、本発明者らはヒトβ−グロビン遺伝子座由来の２３ｋｂ断片を試験した（図３１Ａ）。この基質に関する２つの理論的な分布を比較すると、これらが再び反相関していることが明らかになった（ｒ＝−０．７４、ｐ＜０．０００１；図３１Ａ；図３６）。β−グロビンＤＮＡはλ−ファージの偶然の非対称性を欠くが、ＦＫＦＭモデルはなお、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから得られるコース・グレイン景観で識別可能な配置されたヌクレオソームの４つの主なクラスターを予測する（図３１Ａ、図３５Ｂ）。図３１Ｃに示すように、β−グロビン基質に結合したヌクレオソーム（Ｎ＝１，０６３）の分布は、Ｓｅｇａｌ予測に弱く反相関した（ｒ＝−０．３７、ｐ＝０．０４）が、ＦＫＦＭ予測に相関した（ｒ＝０．６５、ｐ＜０．０００１）。本発明者らのデータおよび理論的な予測の間の一致は分子の左半分に沿って優れており、ＤＮＡの起源に関わらず、ヌクレオソームがＦＫＦＭモデルによって定義されるのと類似の熱力学的規則にしたがうことが示唆された。β−グロビンＤＮＡの右半分に沿った本質的なプロフィールは、幾分広く（図３５）、これは、ヒトＤＮＡ中には現在の理論によって計上されないさらなる特徴が存在することを暗示する。特に、本質的な景観内のすべてのピークは、制御配列と一致し、これにはＡγ−およびδ−グロビン遺伝子、ならびに非コーディングψβグロビン遺伝子のプロモーター近位領域が含まれた。本質的な景観中のさらなるピークは、グロビン遺伝子スイッチング中に胎児γ−グロビン遺伝子をサイレンシングするのに必要であり、そしてＣｏｒｆｕ  δβサラセミア患者で欠失しているリプレッサーＢＣＬ１１Ａの結合部位を含有する領域内のδ−グロビン遺伝子から〜２．６ｋｂ上流の遺伝子間発生段階特異的プロモーターを含んだ（図３１Ａ〜Ｂ）Ｄ２４〜２６。
【０１７９】
[00273]対照的に、本質的な景観内の谷は、転写されず、そして非制御性のＤＮＡに対応した。このデータは、ヒトβ−グロビン遺伝子座内のシス制御領域が、熱力学的に好ましいヌクレオソーム結合部位と平衡を保つことを明らかにする。理論によって束縛されることなく、この進化的に駆動される構造は、制御配列内の正確なヌクレオソーム配置がゲノムの他の領域に比較してはるかにより重要でありうるために生じてきたＤ１３、Ｄ２７、Ｄ２８。この組織上の関連が真核生物ＤＮＡの本質的な景観を定義する一般的な傾向であるかどうかはまだ決定されていない。興味深いことに、β−グロビン遺伝子座に渡るヌクレオソームの位置がＣＤ４＋  Ｔ細胞でマッピングされてきているＤ２９が、これらの位置および理論的なＦＫＦＭ予測間には明らかな相関はなかった（図３１Ａ〜Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｖｏヌクレオソーム分布もまた、実験的に観察される本質的な景観のコース・グレイン特徴とは完全には一致しないが、ψβ−およびδ−グロビン遺伝子のプロモーター近接領域は、本質的な景観に基づいて、配置されるヌクレオソームによって占有された（図３１Ａ〜Ｂ）。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏデータは、Ａγ−グロビン遺伝子を含む領域中の実験的に定義される本質的な景観内と逆説的に類似でなく、熱力学的に好ましい配列単独では、ヒトゲノム内のヌクレオソーム占有を予測不能であることを例示する。したがって、ヒトゲノムにおいてｉｎ  ｖｉｖｏヌクレオソーム分布パターンを確立するために、外因性因子がより広く行き渡った役割を果たしているに違いない。
【０１８０】
[00274]方法
[00275]記載されるように、ヒストンを大腸菌において発現し、封入体から精製し、そして再構成した（図３３）Ｄ３０。Ｈ２ＡＺをｐＥＴ−１００／Ｄ−ＴＯＰＯ内にクローニングし、そして同じ方法を用いて精製した（図３７）Ｄ３０。記載されるようにＣｓｅ４を精製し、そして再構成した（図３７）Ｄ２１。Ｓｃｍ３は細胞溶解後に可溶性のままであり、そしてこれを硫酸アンモニウム沈殿し（４５％飽和）、アンフォールディング緩衝液（７Ｍグアニジニウム−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中に再懸濁し、そして尿素緩衝液（７Ｍ尿素、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に対して透析した。尿素緩衝液中のＮｉ−ＮＴＡアガロース上でＳｃｍ３を精製し、２００ｍＭイミダゾールで溶出し、そして５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを加えた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．８］に対して透析し、次いで凍結乾燥させ、そして−２０℃で保存した。塩透析によってＤＮＡ上にヌクレオソームを沈着させ（図３３、図３７）、そして記載されるように、ＤＮＡをカーテンに組み立てたＤ１１。抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）にコンジュゲート化された２ｎＭ  ＱＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、７０５ｎｍ発光）で、ヌクレオソームを標識した。４８８ｎｍレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＣＤＨＲ）によって照射し、浸水対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、１．２ＮＡ、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ、６０ｘ）を用いて、画像を収集した。二色鏡（６３０ｎｍ  ＤＣＸＲ、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＹＯＹＯ１およびＱＤ発光を分離し、そしてＥＭＣＣＤ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｂ）で記録した。４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中、０．４ｍｌ／分の流速で、位置分析のための画像を獲得した。流動を一過性に中断して、非特異的に結合したＱＤを分析から排除した。隣接する近隣分子からよく解像された全長ＤＮＡ分子のみを、分布測定に用いた。Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏを用いて、ヌクレオソーム位置測定および統計分析を行った。実験データの半分で構成されるランダムセットに対して、すべての相関傾向を交差検証した。
【０１８１】
[00276]ナノファブリケーションで製作したＤＮＡカーテン。電子ビーム・リソグラフィーを用いて、ミクロ流体試料チャンバーの石英ガラス表面上にクロム拡散バリアをナノファブリケーションで製作した。次いで、スライド表面上に沈着した流動性脂質二重層に、ビオチン−ニュートラアビジン連結を通じて、ＹＯＹＯ１で染色したλ−ＤＮＡ分子（緑）を係留した。緩衝液流動を適用して、ナノファブリケーションで製作したバリアの前縁に沿ってＤＮＡ分子を整列させ、そして試料チャンバー表面に対して平行にＤＮＡを伸長させ、分子を、エバネッセント場の浸透深さによって定義される励起体積内に閉じ込めた。緩衝液流動を一過性に中断すると、エントロピー力によりＤＮＡ分子が破壊され、そして試料チャンバー表面から離れていき、分子が脂質二重層と非特異的に相互作用していないことが立証された。
【０１８２】
[00277]ＤＮＡカーテンおよび蛍光ヌクレオソームの視覚化。ＤＮＡが、塩透析を通じて沈着したヌクレオソームによってあらかじめ結合されていることを除いて、記載されるようにＹＯＹＯ１染色ＤＮＡカーテン（緑）を組み立てた。蛍光量子ドット（マゼンタ）を用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕでヌクレオソームを標識した。緩衝液流動を一過性に中断すると、ヌクレオソームに結合したＤＮＡ分子がエントロピー力によって破壊され、そして試料チャンバー表面から離れていくことから、分子が脂質二重層と非特異的に相互作用していないことが立証され、そしてヌクレオソームがＤＮＡに結合していることが検証された。
【０１８３】
[00278]参考文献
【０１８４】
【化４−１】
2012500620.tif 000007
【０１８５】
【化４−２】
2012500620.tif 000008
【０１８６】
【化４−３】
2012500620.tif 000009
【０１８７】
実施例１１：個々のタンパク質−ＤＮＡ相互作用を画像化するための、整列しそして係留されたＤＮＡ分子のナノファブリケーションで製作したラック
[00279]生物学的巨大分子の単一分子研究は、実験設計およびデータ獲得を容易にする新規アプローチから利益を得ることも可能である。本明細書において、本発明者らは、基質が互いに関して整列し、そして伸長された立体配置で維持されるＤＮＡの分子カーテンを構築する新規戦略を開発する。重要なことに、ＤＮＡの両端は、そうでなければ不活性脂質二重層でコーティングされたミクロ流体試料チャンバーの表面に係留される。これは、２つの別個の官能性要素を伴う金属バリアパターンのナノファブリケーションで製作したラックの使用を通じて達成される。脂質拡散に対する直線バリアをまず用いて、ＤＮＡを整列させる。次いで、抗体でコーティングした五角形が、整列したＤＮＡ分子の未結合端に対する固体アンカーポイントを提供する。これらのデバイスによって、数百の個々のＤＮＡ分子の整列および係留が可能になり、これを次いで、ＤＮＡを伸長させるのに緩衝液流動の連続した適用を必要としない条件下で、全反射照明蛍光顕微鏡法を用いて、視覚化してもよい。これは、外因性に適用される水力学的な力に対する必要性を排除することによって、研究中のタンパク質の振る舞いを妨害することなく、画像化およびデータ獲得を行う、潜在能力を提供する。本発明者らは、ＤＮＡに沿った量子ドットタグ化タンパク質の運動を監視する１Ｄ拡散アッセイにおいて、これらのＤＮＡラックが使用可能であるという証明を提供する。
【０１８８】
[00280]序論
[00281]タンパク質およびＤＮＡ間の動的相互作用は、多くの生物学的プロセスの根底にあり、そしてこうしたものとして、徹底的な研究の対象である。多くの研究室は、現在、リアルタイムでの単一分子レベルのＤＮＡ分子またはタンパク質−ＤＮＡ複合体の視覚化を可能にする新規実験法を用いて、これらの問題に取り組んでおり、そしてこれらの実験から集められた情報は、多くの異なるタイプの反応の詳細な機構的モデルを構築するのに用いられているＥ１〜４。同様に、ミクロおよびナノスケールデバイスは、個々のＤＮＡ分子の操作および分析のため、ますます強力なツールとなってきているＥ５〜７。しかし、多くの単一分子技術の１つの大きな欠点は、これらが本質的に、個々の反応を探査するように設計されており、そしてその結果、統計的に適切なデータを集めることが困難でありうることである。これらの実験が技術的に要求が厳しいという事実によって、この困難はしばしば悪化する。したがって、単一分子法のスループット能力を増加させることが可能である一方、同時に、これらのアプローチをより容易にそしてまた、異なるタイプのＤＮＡ処理を伴う生物学的反応により容易に適用可能にする新規アプローチを確立することは好適である。
【０１８９】
[00282]単一分子画像化技術をよりアクセス可能にする努力の中で、本発明者らは、ナノスケール操作、ミクロ流体学、および脂質二重層をコーティングした表面を、単一分子光学顕微鏡法と統合して、数千の個々のＤＮＡ分子で構成される分子カーテンを作製するためのハイスループット法を開発したＥ８〜１０。これらの実験プラットフォームの重要な側面は、これらが、ミクロ流体試料チャンバーの石英ガラス表面を不動態化するため、不活性脂質二重層を利用することである。固体支持体上に沈着した人工的脂質膜が多くのタイプの生化学的研究に有用であることが立証されているＥ１３〜１５。人工膜の重要な側面は、二重層の化学的性質が、構成要素脂質を注意深く選択することによって容易に調節可能であることであるＥ１１、Ｅ１３。さらに、人工膜は、化学的または機械的バリアを用いて区分化可能なものでありＥ１２、Ｅ１６、Ｅ１７、そしてまた、脂質に係留された分子の分布は、光化学調節、電場、または水力学的な力を用いて操作可能であるＥ１８〜２１。総合すると、上述の特徴は、脂質膜に係留された分子の組織化を調節するための潜在能力を示唆し、そしてしたがって、本発明者らは、表面に係留されたＤＮＡ分子の２次元組織化を調節するのに、脂質二重層の連続性を破壊する機械的バリアが使用可能であることを立証したＥ８〜１０。この調節された組織化は、まず、わずかな割合のビオチン化頭基を含有する二重層で試料チャンバー表面をコーティングすることによって達成され、そしてビオチン−ニュートラアビジン連結を通じて、ＤＮＡ分子をその一端で二重層に連結するＥ８〜１０。脂質に束縛されたＤＮＡ分子を、水力学的な力の適用を通じて、ミクロまたはナノスケール脂質拡散バリアのいずれかの前縁に押しつけることによって、分子カーテンに組み立てる。本発明者らは、ダイアモンド先端スクライバーで石英ガラス表面に手動でエッチングすることによって作製した、脂質拡散に対するマイクロスケールバリアを用いて、脂質に束縛された数百のＤＮＡ分子を整列させることが可能であることを立証し、そしてこれらをＤＮＡカーテンと呼んだＥ１０、Ｅ２２〜２５。より最近、本発明者らは、電子ビーム（ｅビーム）リソグラフィーを使用して、カーテン内のＤＮＡ分子の位置および側方分布の両方に対する、はるかにより正確な調節を可能にする、ナノスケール寸法のバリアを製作したＥ８、Ｅ９。これらのナノファブリケーションで製作したＤＮＡカーテンは、互いに対して完璧に整列した数千の個々のＤＮＡ分子の同時視覚化を可能にし、そしてこれを、非常に多様な生物学的適用に受け入れられる頑強な実験プラットフォームを用いた、リアルタイムでの、数千の個々のタンパク質−ＤＮＡ複合体からの大規模な平行データ獲得に用いてもよい。本発明者らはまた、これらのＤＮＡカーテンが、単一分子レベルでのタンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究するのに好適であることもまた示しており、そして本発明者らは、これらのツールを、ヌクレオソームおよびクロマチン・リモデリング、相同ＤＮＡ組換え、および複製後ミスマッチ修復などの生物学的系に適用してきたＤ２２−２６。
【０１９０】
[00283]本発明者らの先のＤＮＡカーテン設計は、データ収集中の水力学的な力の連続適用を必要とし、これはＤＮＡの一端のみが脂質二重層に係留されているためである。緩衝液流動が終結すると、ＤＮＡは伸長したままではなくなり、そしてその結果、エバネッセント場の浸透深さによって定義される検出体積外に漂流するため、その全輪郭長に沿って視覚化することは不可能である。緩衝液流動の必要性は、多くのタイプの測定には問題にはならないが、結合したタンパク質またはタンパク質複合体の振る舞いに潜在的に影響を及ぼす可能性もあり、そしてこの影響の度合いは、観察中の分子の水力学的直径に比例して増減しうるＥ２７、Ｅ２８。緩衝液流動の影響は、一次元拡散によって、ＤＮＡ上でスライドするタンパク質を伴う測定中に特に明らかであり、これは、スライディングタンパク質がＤＮＡに沿って移動する方向に、適用される流動力が、強いバイアスを掛けうるためであるＥ２７。
【０１９１】
[00284]ここで、本発明者らは、ミクロ流体試料チャンバー表面に両端が係留された伸長された立体配置で保持され、そして不活性二重層上に懸濁された、整列したＤＮＡ分子のカーテンを作製するための新規方法を開発しようとした。これらのＤＮＡの二重束縛カーテンは、ＤＮＡ分子に沿った受動的タンパク質運動を見るために設計した実験で使用することを特に意図された。この設計を達成するため、本発明者らは、電子ビームまたはナノインプリント・リソグラフィーのいずれかを用いて作製した、金属バリアの新規パターンを開発した。これらの金属パターンは、脂質拡散に対する直線バリア、およびアレイ化された五角形の両方を取り込み、そしてこれらの別個の機能要素は一緒に、長いＤＮＡ分子を整列させ、そして束縛するように働く。まず、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を通じて、流動性脂質二重層に、一端でＤＮＡ分子を係留し、そして直線バリア内に押し込む水力学的な力を用いることによって、互いに対して、まず整列させる。アレイ化五角形は、直線バリアの下流の定義された距離に位置する固体アンカーポイントとして働き、そしてジゴキシゲニンまたはブロモデオキシウリジンのいずれかに対して向けられる抗体でコーティングされ、これらはＤＮＡ分子の未結合端に共有結合する。重要なことに、表面に連結されたならば、ＤＮＡ分子は、不活性脂質二重層上に懸濁され、伸長された状態で維持され、そしてエバネッセント場の浸透深さによって定義される検出体積内に閉じ込められたままであり、適用される水力学的な力が存在しない場合であってさえ、その全輪郭長に渡った連続観察が可能になる。
【０１９２】
[00285]材料および方法
[00286]電子ビーム・リソグラフィー。石英ガラススライドをＮａｎｏＳｔｒｉｐ溶液（ＣｙａｎＴｅｋ社、カリフォルニア州フレモント）で２０分間清浄化し、次いでアセトンおよびイソプロパノールでリンスし、そしてＮ２で乾燥させた。スライドに、アニソール中の３％の分子量２５Ｋ、およびアニソール中の１．５％の４９５Ｋのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、マサチューセッツ州ニュートン）の二重層を、その後、Ａｑｕａｓａｖｅ導電性高分子（三菱レーヨン）の層をスピン・コーティングした。ランプ速度３００ｒｐｍ／ｓを用いて、４，０００ｒｐｍで４５秒間、各層をスピンした。パターン生成装置およびリソグラフィー調節系（Ｊ．Ｃ．  Ｎａｂｉｔｙ，  Ｉｎｃ．、モンタナ州ボーズマン）を装備したＦＥＩ  Ｓｉｒｉｏｎ走査型電子顕微鏡を用いて、Ｅビーム・リソグラフィーによって、多角形パターンおよび直線バリアを書いた。パターンを書いた後、Ａｑｕａｓａｖｅを脱イオン水で洗い流した。イソプロパノール対メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の３：１溶液を用いて、５℃で１分間超音波攪拌して、レジストを発展させた。次いで、支持体をイソプロパノールでリンスして、そしてＮ２で乾燥させた。Ｓｅｍｉｃｏｒｅ電子ビーム蒸発装置を用いて、クロムまたはチタンのいずれかの３〜５ｎｍの接着層の上に金の１５〜２０ｎｍ層を沈着させた。９：１の比の塩化メチレン対アセトン中、８０℃でリフトオフを達成した。あるいは、先に記載されるように、クロムの１５〜２０ｎｍ層のみでバリアを作製したＥ８、Ｅ９。リフトオフ後、試料をアセトンでリンスして、散在したクロム片を除去し、そしてＮ２で乾燥させた。Ｈｉｔａｃｈｉ  ４７００走査型電子顕微鏡およびＰＳＩＡ  ＸＥ−１００走査プローブ顕微鏡を非接触モードで用いてバリアを画像化した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＭＥ６００を用いて、バリアの光学的画像を取った。
【０１９３】
[00287]ナノインプリント・リソグラフィー。電子ビーム・リソグラフィー、リフトオフ、および誘導カップリングプラズマエッチングを用いて、ナノインプリント・マスターを製作した。簡潔には、二酸化シリコンの薄いコーティングを伴うシリコン・ウエハー上に、ポリ−メチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、２５Ｋおよび４９５Ｋ）の二重層をスピンした。Ｎａｂｉｔｙナノパターン生成系を装備したＦＥＩ  Ｓｉｒｉｏｎ  ＳＥＭによってパターンを書き、次いでイソプロパノール：メチルイソブチルケトン（３：１）の混合物中、５℃の超音波処理槽中で現像した。イソプロパノールで試料をリンスし、そしてＮ２で乾燥させた。Ｓｅｍｉｃｏｒｅ  Ｅビーム蒸発装置を用いて、マスター上に２０ｎｍ  Ｃｒを蒸発させた。アセトン中、６５℃でリフトオフを行った。パターン化マスターを、Ｏｘｆｏｒｄ  ＩＣＰエッチツールを用いて、３００Ｗの出力で９０秒間、Ｃ４Ｆ８：Ｏ２（９：１）の混合物中、１００ｎｍの深さにプラズマエッチングした。ナノインプリント・マスターをフッ素化自己組み立て単層（Ｎａｎｏｎｅｘ、ニュージャージー州プリンストン）でコーティングして、マスターおよびレジスト間の接着を防止した。
【０１９４】
[00288]ナノインプリンティングされたバリアを作製するため、ＰＭＭＡ  ３５Ｋ（Ｍｉｃｒｏｒｅｓｉｓｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）を石英ガラス顕微鏡スライド上にスピンコーティングし、そしてホットプレート上、１８０℃で５分間ベーキングした。ナノインプリントを２段階で行った：１２０ｐｓｉの圧および１２０℃のプレ温度の２分間のプレインプリント期、その後、４８０ｐｓｉの圧および１９０℃の温度の５分間のインプリント期。これはガラス遷移温度よりはるかに高くＰＭＭＡを加熱し、そして鋳型に一致させるのを可能にした。インプリンティング後、脱スカム（ｄｅｓｃｕｍ）プロセスを行って、〜１０ｎｍの残渣ＰＭＭＡを除去した。ＣＨＦ３：Ｏ２（１：１）および全部で４０秒間（２０秒間を２回反復）の２００Ｗの出力下、誘導結合プラズマ中で、脱スカムを行った。脱スカム後、１５〜２０ｎｍのＣｒを試料上で蒸発させ、そしてアセトン中、６５℃で数時間リフトオフを行い、その後、超音波処理して散在金属片を除去した。次いで、ナノパターン化されたスライドをアセトン中でリンスし、そしてＮ２で乾燥させた。
【０１９５】
[00289]脂質二重層およびＤＮＡカーテン。クロムナノスケール拡散バリアを伴って、石英ガラススライド（Ｇ．  Ｆｉｎｋｅｎｂｅｉｎｅｒ，  Ｉｎｃ．）からフローセルを組み立てた。ダイアモンドが先端についた錐（１．４ｍｍ  Ｏ．Ｄ．；  Ｋａｓｓｏｙ）を装備した高速正確ボール盤を用いて、スライドを通じて穴をあけることによって、入口および出口ポートを作製した。２％（ｖ／ｖ）Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ、１Ｍ  ＮａＯＨ、および１００％  ＭｅＯＨ中に連続して浸すことによって、スライドを清浄化した。各洗浄間に、ろ過滅菌水でスライドをリンスし、そして使用するまで、１００％  ＭｅＯＨ中に保存した。組み立て前に、窒素流下でスライドを乾燥させ、そして真空オーブン中で、少なくとも１時間、ベーキングした。ホウケイ酸ガラスカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および両面テープ（〜２５μｍ厚、３Ｍ）から、試料チャンバーを用意した。熱融解性接着剤（ＳｕｒｅＢｏｎｄｅｒスティックのり、ＦＰＣ社）を用いて、入口および出口ポート（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を取り付けた。試料チャンバーの総体積は〜４μｌであった。シリンジポンプ（Ｋｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および作動注入バルブ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、試料送達、緩衝液選択および流速を調節した。フローセルおよびプリズムを、コンピュータ調節フィードバック制御を備えた特注のヒーター中に搭載して、必要に応じて、２５〜３７℃（±０．１℃）の間で試料の温度を調節した。各使用後に、スライドをＭｅＯＨ中に浸して、ポートおよびテープを取り除き、水でリンスし、Ｎａｎｏｓｔｒｉｐで簡単に（１５〜２０分間）洗浄し、そして水でリンスした。この方法は、再使用のためにスライド表面を清浄化するのに十分であり、そして各スライドを多数回用いてもよく、光学表面または金属パターンの性質は低下しない。
【０１９６】
[00290]第二のＤＮＡ末端を係留するのに必要なさらなる工程を例外として、先に記載されるように、ＤＮＡカーテンを構築したＥ８、Ｅ９。すべての脂質を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入し、そしてリポソームを先に記載されるように調製した。簡潔には、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン）、０．５％ビオチン化ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（キャップビオチニル））、および８〜１０％  ｍＰＥＧ５５０−ＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］）の混合物。ｍＰＥＧは、二重層形成またはＤＮＡカーテンの組み立てに影響を及ぼさず、むしろ量子ドット（タンパク質−ＤＮＡ相互作用の本発明者らの研究において使用する）の非特異的吸着に対して表面をさらに不動態化するように働く。２００μｌの３回の注入、その後、５分間インキュベーションして、リポソームを試料チャンバーに適用した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に加えて１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ  １ｍｌで、過剰なリポソームをフラッシュし、そして二重層をさらに３０分間インキュベーションした。次いで、２５μｇ／ｍｌの抗ＤＩＧ  Ｆａｂ（Ｒｏｃｈｅ）、抗フルオレセイン（Ｓｉｇｍａ）、または抗ＢｒｄＵ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を加えた緩衝液Ａを試料チャンバー内に注入し、そして３０分間インキュベーションした。次いで、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する緩衝液Ｂ  １ｍｌで試料チャンバーをフラッシュし、そしてさらに５分間インキュベーションした。次いで、ニュートラアビジン（３３０ｎＭ）を含有する緩衝液Ａ  １ｍｌを試料チャンバー内に注入し、そして２０分間インキュベーションした。次いで、３ｍｌの緩衝液Ｂでフローセルをリンスして、いかなる未結合ニュートラアビジンも除去した。ビオチンで一端をそしてジゴキシゲニン、フルオレセインまたはブロモデオキシウリジンのいずれか（示す通り）でもう一端を標識し、そして１〜２ｎＭのＹＯＹＯ１であらかじめ染色したλ−ＤＮＡ（２０ｐＭ）１ｍｌを、５回の２００μｌアリコット中で試料チャンバー内に注入し、各注入後に２〜３分間のインキュベーション期間を置いた。次いで、０．０２ｍｌ／分の流速を用いて、直線バリアでＤＮＡを整列させ、そして次いで、この速度を２〜３ｍｌ／分に増加させて、ＤＮＡ分子の第二端を係留した。
【０１９７】
[00291]ＤＮＡ基質。λファージゲノム（４８．５ｋｂ）の末端の１２ヌクレオチドのオーバーハングにオリゴヌクレオチドを連結することによって、ＤＮＡ基質を作製した。連結混合物（総体積１ｍｌ）は、４ｎＭ  λ  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＭビオチン化オリゴヌクレオチド（５’−ｐＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＣ［ＢｉｏＴＥＧ］−３’（配列番号１））、１μＭフルオレセイン標識オリゴヌクレオチド（またはＤＩＧ標識オリゴヌクレオチド；  ５’−ｐＧＧＧ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＣＣＴ［蛍光］−３’（配列番号６）または５’−ｐＧＧＧ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＣＣＴ［ＤＩＧ］−３’（配列番号３））、および１ｘリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）を含有した。反応混合物を６５℃で１０分間温め、そして次いでゆっくりと室温に冷却した。冷却後、リガーゼを添加し（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ）またはＴａｑリガーゼ（４０Ｕ／μｌ）；ＮＥＢ）、そして混合物を４２℃で一晩インキュベーションした。次いでＴ４リガーゼで行った反応を６５℃で１０分間熱不活性化し、そして連結されたＤＮＡ産物を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００ＨＲカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）実行上で精製した。精製ＤＮＡを−２０℃で保存した。
【０１９８】
[00292]λ上の２６，１５１〜２６，１６６位に相補的なＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを挿入するため、５００μｌのＤＮＡ（２００ｐＭ；末端でビオチンおよびフルオレセインで標識する（上述の通り））をニック形成酵素Ｎｂ．ＢｓｍＩおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（各５０単位；ＮＥＢ）と、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液中、５５℃で２時間インキュベーションした。続いて、１μＭのオリゴヌクレオチド（５’−ｐＣＡＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＴＴ［ＤＩＧ］−３’（配列番号４））を１０ｍＭ  ＥＤＴＡとともに溶液に添加し、そして混合物を５５℃で２０分間インキュベーションし、そして次いで１時間の経過に渡って室温にゆっくりと冷却させた。２，０００単位のＴ４リガーゼおよびさらなる１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２と一緒にＡＴＰを１ｍＭの最終濃度まで添加した。次いで、反応を室温で９０分間インキュベーションした。さらなるＥＤＴＡ（Ｃｆ＝２０ｍＭ）を溶液に添加し、そしてニック形成酵素およびリガーゼを８０℃で２０分間熱変性させた。
【０１９９】
[00293]λ上の３３，７７９〜３３，７９１位にオリゴヌクレオチドを挿入するため、５００μｌ  ＤＮＡ（２００ｐＭ；ビオチンおよびフルオレセインで末端を標識する（上述の通り））をニック形成酵素Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（５０単位；ＮＥＢ）と、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液中、５５℃で２時間インキュベーションした。８０℃で２０分間のインキュベーションによって酵素を熱変性させた。１μＭのオリゴヌクレオチド（５’−ｐＴＴＣ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＴＴ［ＤＩＧ］−３’（配列番号５））を溶液に添加し、そして混合物を５５℃で２０分間インキュベーションし、次いで１時間の経過に渡って、室温にゆっくりと冷却した。次いで、２，０００単位のＴ４リガーゼと一緒にＡＴＰを１ｍＭの最終濃度まで添加し、そして反応を室温で９０分間インキュベーションした。次いで、６５℃で２０分間インキュベーションすることによって、リガーゼを熱変性させた。
【０２００】
[00294]ＴＩＲＦＭおよび１Ｄ拡散アッセイ。本研究で用いる顕微鏡の基本的設計は、先に記載されてきているＥ１０。簡潔には、系は、特注照射系を備えたＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｕ倒立顕微鏡周囲に構築される。この研究のため、４８８ｎｍ、２００ｍＷダイオード励起固体レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＣＤＨＲ）を励起供給源として用いた。減光フィルターを用いて、レーザーを必要に応じて減弱させ、そしてレーザーは遠隔操作される鏡（Ｎｅｗ  Ｆｏｃｕｓ）によってＤＮＡカーテン上を中心とした。プリズム面でのビーム強度は、〜１０−１５ｍＷであった。背後から照射されるＥＭＣＣＤ検出装置（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｂ）を用いて、画像を検出した。別に示さない限り、６０ｘ浸水対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、１．２ＮＡ、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ）を用いて、ＴＩＲＦＭ画像を収集した。
【０２０１】
[00295]結果
[00296]ＤＮＡラックの設計要素。ここで、本発明者らは、本発明者らの先の研究を詳述し、そして分子の両端がフローセル表面に係留されたＤＮＡカーテンを作製するのに使用可能なＤＮＡ「ラック」と称する新規バリアパターンの開発を示す。図１８に一般的な設計の概観を示し、そして、この設計は、以下に記載するように、２つの別個のパターン要素の組み合わせを利用する。原理的には、ＤＮＡの一端をまず、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を通じて、試料チャンバー表面をコーティングする、支持された脂質二重層に係留する（図１８Ｂ〜Ｃ）。水力学的な力の非存在下では、分子はランダムに表面上に分布するが、主に、エバネッセント場の浸透深さ（〜１５０〜２００ｎｍ）によって定義される検出体積外にある。流動を適用すると、ＤＮＡは、二重層に一端が係留されたまま、試料チャンバーに押し込まれる。バリアは、ＤＮＡの経路中の戦略にしたがった位置で、流動方向に対して垂直に配向される（図１８Ｂ〜Ｃ）；これらの直線バリアは脂質束縛ＤＮＡ分子の移動を停止し、次いで分子がバリアの前縁で集積するようにして、次いで、表面に平行に伸長させる。パターンの第二の要素は、直線バリアの後ろに配置され、そして小さいナノチャネルによって互いに分離される、一連のアレイ化五角形である。五角形の非直線の幾何学的形状は、漏斗として作用するよう意図され、そして五角形の前縁で集積せずに、むしろパターン中の次の連続する直線バリアと出会うまで表面に沿って押されるように、チャネルを通じて、いかなる脂質束縛ＤＮＡ分子も導く。直線バリアおよび五角形の間の距離は、実験のために用いようとするＤＮＡの長さに関して最適化される。五角形自体は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）に対して向けられる抗体でコーティング可能な広い表面を提示し、ジゴキシゲニンは、ビオチンタグを所持する端と反対のＤＮＡ端に共有結合される。ＤＩＧにカップリングしたＤＮＡ端が、抗体でコーティングされた五角形と出会うと、これらは固定され、そしてＤＮＡは緩衝液が試料チャンバーを通じて押されていない場合であっても、表面に平行に伸長されたままであるはずである。
【０２０２】
[00297]先に記載されるようなＥビーム・リソグラフィーＥ８、Ｅ９、またはナノインプリント・リソグラフィーＥ２９、Ｅ３０のいずれかによって、所望の設計特徴を達成するのに必要なバリアパターンを作製した。図３９は、Ｅビーム・リソグラフィーによって作製されたＤＮＡラックの性質決定を示し、そしてその機能に非常に重要と見なされるパターン幾何学の特異的な特徴を強調する。図３９Ａは、非常に重要なパターンパラメータの寸法を含めて、全体のパターン設計の光学的画像を示す。図３９Ｂは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いたこれらのパラメータの測定を示す。図３９Ｃは、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を用いたパターンの性質決定を示す。これらの画像から立証されるように、パターン要素の高さは約２０ｎｍであり、チャネルの幅は５００ｎｍであり、そして直線バリアの前縁および五角形の後ろの間の光学的距離は〜１３μｍであった（以下を参照されたい）。この距離はλ−ＤＮＡとともに使用するために特異的に選択され、該ＤＮＡは４８，５０２塩基対であり、完全に伸長された輪郭長はおよそ１６．５μｍであり、したがって、１１〜１３μｍが全輪郭長の平均伸長長の、それぞれ〜６５−７９％に対応するであろう。
【０２０３】
[00298]二重束縛ＤＮＡカーテンの組み立ておよび性質決定。ＤＮＡラックの全体の設計は、金属性五角形の比較的広く曝露された表面に対する、選択的であるが非特異的な抗体の吸着に頼り、そして抗体は、不活性脂質二重層と相互作用してはならない。パターンのすべてのナノファブリケーションで製作した要素は、同じ材料で作製され、したがって抗体は、潜在的に、直線バリアならびに五角形の両方に潜在的に結合しうる。しかし、各五角形は、１．５５μｍ２の表面積を有し、そして各２６０μｍの長さの直線バリアに対して、１６７の五角形がある。これは、全直線バリアに関して総面積がわずか３６μｍ２であるのに比較して、五角形に関しては３７２μｍ２に対応する。直線バリアの総表面積がより小さいため、より多くの抗体が、五角形によって含まれるはるかにより広い面積に吸着することが保証されるはずである。
【０２０４】
[00299]ＤＮＡカーテンを組み立てるため、フローセル表面をまず、先に記載するように、脂質二重層でコーティングしＥ８、Ｅ９、但し、抗体沈着前に用いるすべての緩衝液からＢＳＡを除くことを例外とした。表面上で二重層が組み立てられたら、抗ＤＩＧ  Ｆａｂ断片または抗フルオレセインＩｇＧを試料チャンバー内に注入し、ここでこれらを、曝露された金属バリアに非特異的に吸着させた。簡単なインキュベーション後、遊離抗体をフローセルからリンスして取り除き、そして０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する緩衝液と交換し、ＢＳＡは、残った曝露された表面いずれも不動態化する非特異的ブロッキング剤として働いた。次いで、蛍光挿入色素ＹＯＹＯ１で染色されたＤＮＡを、試料チャンバー内に注入し、緩衝液流動を伴わずに簡単にインキュベーションし、そして次いで、緩衝液流動を適用して、係留された分子を直線バリア内に押し込んだ。次いで、緩衝液流動を終結させて、そして係留されたＤＮＡ分子をＴＩＲＦＭによって画像化した。図４０に示すように、この方法は、試料チャンバーを通じて緩衝液が流動しない場合であってさえ、完全に伸長しそして可視のままである、ＤＮＡ分子のカーテンを生じた。ＤＩＧ標識端によって係留されなかったＤＮＡ分子はいずれも、直線バリア近傍に残るが、完全輪郭長ではなく、分子末端のみが観察されうる。これらの単一束縛ＤＮＡ分子は、バリア縁から次第に拡散して、そしてまた緩衝液流動の方向を逆転させることによって、バリア縁から押しやられることも可能であった（図４０）が、二重束縛ＤＮＡ分子は元来の位置に係留されたままであり、カーテンを構成する分子が、所望の立体配置で係留されるというさらなる構造を提供した。
【０２０５】
[00300]異なるバリア位置各々でのＤＮＡ分子の数は、隣接する直線バリア間の距離に比例する。二重束縛ＤＮＡ分子の数は長期に渡ってゆっくりと減少し、ＤＩＧ標識分子に関しては＞１時間の半減期であった。最後に、対照実験によって、ＤＩＧ標識およびＦａｂ断片両方の存在が、ＤＮＡの二つの端を効率的に係留するために必要であることを検証した。およそ７０％の係留ＤＮＡが特異的抗体：ハプテン相互作用に起因しうると考えられ、残りの３０％は抗体でコーティングされた五角形へのＤＮＡ端の非特異的係留のためであった。それぞれ、単一ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）またはフルオレセイン部分いずれかで末端標識された基質、および抗ＢｒｄＵ抗体または抗フルオレセイン抗体でコーティングされた五角形（以下を参照されたい）を用いて、類似の二重束縛ＤＮＡカーテンを作製可能であった。フルオレセインに係留されたＤＮＡの半減期は、ＤＩＧに係留されたＤＮＡのものに匹敵した。しかし、ＢｒｄＵに係留されたＤＮＡ分子は、五角形から解離する傾向がより大きく、わずか約数分の半減期を示した。
【０２０６】
[00301]ＤＮＡの定義された配向。ＤＮＡの２つの端を係留するのに用いた示差化学反応は、カーテン内の分子の配向を定義すると予測された。特に、ビオチン化端は、直線バリアの縁で係留され、そしてもう一方の端は五角形で係留されるはずであり、そしてこの設計に基づいて、すべての分子は、正確に同じ配向にあるはずである。ＤＮＡ分子を予期されるように整列させると、フルオロフォアは、ＤＮＡ内の単一の特異的部位に位置し、そしてその中心からのオフセットはＤＮＡカーテンに渡る蛍光の「線」として現れるはずである。線は、伸長されたＤＮＡ分子の長軸に垂直に配向され、そして蛍光タグの既知の位置と正確に一致するはずである。対照的に、ＤＮＡ分子がランダムに配向している場合、蛍光タグは、ＤＮＡの２つのありうる配向の各々の境界を定める２つの線として現れるはずである。ＤＮＡが正しく配向されていることを確認するため、フルオレセインを用いて分子を未結合端で標識し、そしてＤＩＧを用いて特定の内部位置で標識した。ニック形成エンドヌクレアーゼでＤＮＡの特定の部位にニックを形成し、そして生じたニックに隣接する短いｓｓＤＮＡ断片をＤＩＧタグ化オリゴヌクレオチドで置換する、オリゴヌクレオチド置換戦略（材料および方法を参照されたい）を用いて、内部標識を作製した。単一端で係留されたＤＮＡカーテンを用いた実験によって、蛍光タグが、オリゴヌクレオチド配列によって影響されるように、ＤＮＡ分子内の単一位置に存在することを確認した（図４１Ａ）。次いで、抗ＢｒｄＵ抗体でコーティングされた五角形を用いて、二重束縛カーテンを組み立て、そして組み立て後、ＤＩＧタグは、抗ＤＩＧコーティングＱドットで標識された。図４１Ｂに示すように、抗ＤＩＧ  Ｑドットは、すべて互いに整列し、ＤＮＡ分子の配向が確認された。これらの結果は、ＤＮＡの反対の端の別個の官能基によって定義されるように、ラック要素を通じて表面に係留されたＤＮＡ分子が、すべて同じ配向にあることを立証する。
【０２０７】
[00302]ＤＮＡ上でスライディングするタンパク質の画像化。多くの生物学的反応はＤＮＡに沿ったタンパク質運動に依存し、そしてこれらのプロセスはしばしば、受動的拡散を伴うＥ２７。これらの二重束縛ＤＮＡカーテンを開発する主な動機は、ＤＮＡに沿ったタンパク質の運動を視覚化するように設計された実験で使用するためであった。本発明者らは、先に、タンパク質複合体Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６が二重鎖ＤＮＡに沿って１次元で拡散しうることを立証したＥ２２。Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６は、複製後ミスマッチ修復機構の本質的な構成要素であり、そして生合成ＤＮＡ複製エラーを位置決定し、そしてその修復を開始するのに関与する。本発明者らのＭｓｈ２−Ｍｓｈ６を用いた最初の研究は、そうでなければ脂質二重層でコーティングされた石英ガラスに非特異的に吸着されたニュートラアビジンに、どちらかの端で束縛されたＤＮＡ分子に頼った。このアプローチを用いて、本発明者らは、拡散測定を行うのに適した、フローセルあたりわずか１０〜３０のＤＮＡ分子を得るであろう。これらの二重束縛ＤＮＡ分子は、ランダムに分布し、そして全表面を視覚的にスキャンすることによって、使用前に手動で位置決定しなければならず、これらの１Ｄ拡散測定を、技術的に要求が厳しく、そして時間が掛かるものにしていた。上述のように、操作された表面を用いて、本発明者らはここで、フローセルあたり数千の分子を視覚化することも可能である。ここで、本発明者らは、ＤＮＡの係留されたこれらのカーテンが、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を視覚化するのに適していることを立証する。
【０２０８】
[00303]ＤＮＡラックを用いてＤＮＡに沿ったタンパク質の１Ｄ拡散を研究可能であるかどうかを決定するため、本発明者らはミスマッチ修復タンパク質Ｍｌｈ１を用い、そしてＦＬＡＧエピトープタグを通じて該タンパク質を単一量子ドットで標識した；量子ドットタグ化Ｍｌｈ１の完全分析は別の箇所に示されるであろう。標識タンパク質を、二重束縛ＤＮＡ分子のカーテンを含有するフローセル内に注入し、そして６０秒間の期間に渡ってビデオを収集した。図４２Ａに示すように、本発明者らは、表面上に整列し、そして係留されたＤＮＡ分子に対するＭｌｈ１の結合を容易に検出可能であった。この単一視野中には７９のＤＮＡ分子および２３５のＤＮＡ結合タンパク質があり、二重束縛ＤＮＡ分子を作製するための本発明者らの先の技術に比較して、このアプローチの劇的な改善を例示するＥ２２、Ｅ２３。ＤＮＡに結合したタンパク質は、ＤＮＡ分子に沿って迅速に拡散し、そしてこの運動は、ＤＮＡカーテン内の分子の代表的な例から作製したキモグラムにおいて明らかであった（図４２Ｂ）。
【０２０９】
[00304]タンパク質結合分子が、不活性二重層上に懸濁されるのではなく、その全輪郭長に沿って、試料チャンバー表面に非特異的に連結されるならば、ＤＮＡが分解されるかまたは別の方式でアンカーポイントの１つから脱離したとしても、分子は視野内に留まるはずである。対照的に、タンパク質がＤＮＡとのみ相互作用する場合、ＤＮＡの脱離は、表面からの分子の撤退および視野からの消失を引き起こすはずである。図４２Ｃに示すように、ＤＮＡ分子がランダムに表面から脱離する際、タンパク質はエバネッセント場の浸透深さによって定義される検出体積外に漂流するにつれて、視野から直ちに消失した。このデータは、蛍光タグ化タンパク質がＤＮＡに結合し、ＤＮＡ分子はそのアンカー端を通じて試料チャンバーと相互作用しているだけであり、そして量子ドットタグ化タンパク質またはＤＮＡのいずれも、脂質二重層と非特異的に相互作用しなかったことを示す。
【０２１０】
[00305]考察
[00306]単一分子研究によって、慣用的な生化学的または生物物理的アプローチを通じては不可能な方式で、生物学的反応を探査する、多くのユニークな機会が提供される。本発明者らは、ミクロ流体試料チャンバーの範囲内で、表面に係留されたＤＮＡ分子の空間的組織化を調節するための新規技術を開発している。多数の長いＤＮＡ分子を表面に係留するための方法が文献に存在するＥ３１〜３６。しかし、これらの方法はいずれも、タンパク質生化学および単一分子蛍光画像化の両方と適合する実験プラットフォームを用いて、すべて同じ配向で整列した数百のＤＮＡ分子をパターン化する能力を提供しない。本発明者らのユニークなアプローチは、ミクロおよびナノスケールの正確さで、ＤＮＡ基質の分布を調節することを可能にする表面操作技術に基づく。本発明者らはここで、拡散バリアのアレイ、その後、五角形アンカーポイントのアレイを製作するため、直接書き込みＥビーム・リソグラフィーを使用し、これらは一緒に、ミクロ流体試料チャンバー表面上で、両端でＤＮＡカーテンを係留する異なる官能性の特徴を利用する。本発明者らは、パターン化された表面をＤＮＡ「ラック」と呼び、これはＤＮＡが伸長し、そしてＴＩＲＦＭによって視覚化可能なフローセル表面に係留されているためである。これらのデバイスの重要な側面は、石英ガラス表面が、支持された脂質二重層でコーティングされ、そしてＤＮＡ分子がこの二重層上に懸濁され、これらが生物学的分子の範囲と適合する不活性微小環境内で維持されることを確実にすることである。本発明者らは、これらのツールを広視野ＴＩＲＦ顕微鏡法と一緒に用いて、すべて同じ配向で配置され、そして両端で試料チャンバー表面に係留されている、数百の個々の完璧に整列したＤＮＡ分子を視覚化可能であることを立証した。先のナノファブリケーション製作デバイスと同様、この新規アプローチは単純でそして頑強であり、フローセルは再利用可能であり、バリア自体は均質であり、そしてこれらは、石英ガラスの光学的性質を損なわないし、またシグナル検出に干渉しない。
【０２１１】
[00307]第一の概念的な立証として、本発明者らは、本明細書において、二重束縛ＤＮＡカーテンを用いて、ＤＮＡ結合タンパク質の１Ｄ拡散を画像化可能であることを示す。本発明者らのこれらの実験に対する先のアプローチは、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を通じて表面にランダムに係留されたＤＮＡに頼り、これは視野あたり１〜３分子のＤＮＡより多くは生じず、そしてフローセル全表面上にわずか〜１０−３０の二重束縛ＤＮＡ分子しか存在しなかった。さらに、先の研究において、ＤＮＡの配向は、分子がＤＮＡのいずれかの端に位置するビオチンで係留されているため、定義不能であった。したがって、分子はフローセル表面上でランダムに配向され、配列特異的事象を精査するために、異なるＤＮＡ分子を局在させ、そして互いに比較することが困難であった。この元来のアプローチは、本発明者らの最初の研究に有用であることが立証されたが、分析を通して、十分なデータを収集するのは、退屈であり、そして困難なままであった。本明細書で示すように、本発明者らは、現在、視野あたり約百のＤＮＡ分子を視覚化することが可能であり、数千の分子がフローセルの表面上に存在し、そしてこれらのＤＮＡ分子はすべて、正確に同じ配向で整列し、これが、将来の研究のため、１Ｄ核酸測定および直接の分子間比較を行うであろう。
【０２１２】
[00308]参考文献
【０２１３】
【化５−１】
2012500620.tif 000010
【０２１４】
【化５−２】
2012500620.tif 000011
【０２１５】
実施例１２：試料チャンバー表面に対する、その輪郭に沿ったＤＮＡの可逆的係留
[00309]脂質二重層、ＤＮＡカーテン、およびＤＮＡ基質を上記実施例に記載するように調製した。
【０２１６】
[00310]ＤＮＡを図４３Ａに示すように脂質二重層に付着させる。次いで、水力学的な力または電場のいずれかを用いて、拡散バリア縁（例えば直線拡散バリアまたは非直線の幾何学的拡散バリア）でＤＮＡを整列させる（図４３Ｂ）。次いで、約１ｍＭのカルシウム溶液をフローセル内に注入する。ＤＮＡは、ＤＮＡの全輪郭長全体で脂質二重層に係留される（図４３Ｃ）。以下のカルシウム濃度、例えば少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約１．５ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約４．５ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５．５ｍＭ、少なくとも約６ｍＭ、少なくとも約６．５ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ、少なくとも約７．５ｍＭ、少なくとも約８ｍＭ、少なくとも約８．５ｍＭ、少なくとも約９ｍＭ、少なくとも約９．５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、または少なくとも約１０．５ｍＭのカルシウム濃度を用いてもよい。
【０２１７】
[00311]この系を用いるいくつかの利点は以下の通りである：ＤＮＡ分子を係留するための第二のバリア表面に対する必要性が除去される；ＤＮＡは流動が減少するかまたは除去されても係留されたままである；ＤＮＡの係留はカルシウムを欠く緩衝液でのフローセルの洗浄に際して完全に可逆的である；そして系は、制限酵素での切断後の断片の操作および／または収集を可能にするであろう。
【０２１８】
実施例１３：ＤＮＡ分子の非破壊的マッピング
[00312]脂質二重層、ＤＮＡカーテン、およびＤＮＡ基質を上記実施例に記載するように調製した。
【０２１９】
[00313]均質なＤＮＡ分子の試料を図４４Ａに示すように脂質二重層に付着させる。水力学的な力または電場のいずれかを用いて、特定のターゲット配列に対して向けられる蛍光タグ化オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ（タンパク質−核酸）を、拡散バリア（例えば直線拡散バリアまたは非直線の幾何学的拡散バリア）縁で整列したＤＮＡ分子にハイブリダイズさせてもよい（図４４Ｂ）。この系を用いる利点には、ＤＮＡを切断する必要を伴わずに実行可能な、ゲノミクス適用のためのＤＮＡのコースマッピングが含まれる。このタイプのマッピング技術は、他の研究者によって用いられているが、ＤＮＡカーテンの背景ではない。ＤＮＡカーテン設計（上面図、図４４Ｂ）は、実施するものに対して２つの潜在的な利点を提供する：（１）ＤＮＡ分子が整列しているため、データ分析がより容易である；そして（２）制限酵素で切断することによる分析後に、ＤＮＡを収集可能である。例えば、付着点のすぐ右に、単一の特異的切断部位を設計してもよい。他の単一分子ＤＮＡマッピング技術で、使用者が分析後にＤＮＡを採取することを可能にするものはない。
【０２２０】
[00314]不均一なＤＮＡ分子（例えばゲノムＤＮＡの不均一調製物）の試料を図４５Ａに示すように脂質二重層に付着させてもよい。水力学的な力または電場のいずれかを用いて、特定のターゲット配列に対して向けられる蛍光タグ化オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ（タンパク質−核酸）を、拡散バリア（例えば直線拡散バリアまたは非直線の幾何学的拡散バリア）縁で整列したＤＮＡ分子にハイブリダイズさせてもよい（図４５Ｂ）。次いで、個々のＤＮＡ分子に命名するかまたは番号付けしてもよく、そしてこれらのＤＮＡ分子の組織化スキームから、重複するシグナルに基づいて、ＤＮＡマップを生成してもよい（図４５Ｂ、上面図）。ＤＮＡマップの例は図４５Ｃに見られる。この系を用いる利点には、ＤＮＡを切断する必要を伴わずに実行可能な、ゲノミクス適用のためのＤＮＡのコースマッピングが含まれる。特に、この系は、ゲノムＤＮＡのより複雑な混合物のマッピングを可能にする。〜１０−３００ｋｂのサイズ範囲でありうる断片で構成されるゲノムＤＮＡの清浄な試料を調製する必要がある。また、ＤＮＡが一端（両端ではない）で、タグ（ビオチンまたは当該技術分野で用いられる別のタグなど）で標識されることを確実にする必要もある。これによって、ＤＮＡ分子が表面に係留されることが可能になり、そしてこれは、異なる末端配列を有する不均一なＤＮＡ試料に関しては、ささいなことではない。
【０２２１】
同等物
[00315]当業者は、日常的な実験以上のものを用いずに、本明細書記載の特定の物質および方法に対する多くの同等物を認識するかまたは解明することも可能であろう。こうした同等物は、本発明の範囲内と見なされ、そして以下の請求項に含まれる。
【図１Ａ】
2012500620.tif 000012
【図１Ｂ】
2012500620.tif 000013
【図１Ｃ】
2012500620.tif 000014
【図１Ｄ】
2012500620.tif 000015
【図１Ｅ】
2012500620.tif 000016
【図２】
2012500620.tif 000017
【図３】
2012500620.tif 000018
【図４】
2012500620.tif 000019
【図５Ａ】
2012500620.tif 000020
【図５Ｂ】
2012500620.tif 000021
【図５Ｃ】
2012500620.tif 000022
【図５Ｄ】
2012500620.tif 000023
【図５Ｅ】
2012500620.tif 000024
【図５Ｆ】
2012500620.tif 000025
【図５Ｇ】
2012500620.tif 000026
【図６】
2012500620.tif 000027
【図７】
2012500620.tif 000028
【図８】
2012500620.tif 000029
【図９】
2012500620.tif 000030
【図１０】
2012500620.tif 000031
【図１１Ａ】
2012500620.tif 000032
【図１１Ｂ】
2012500620.tif 000033
【図１１Ｃ】
2012500620.tif 000034
【図１１Ｄ】
2012500620.tif 000035
【図１２Ａ】
2012500620.tif 000036
【図１２Ｂ】
2012500620.tif 000037
【図１３】
2012500620.tif 000038
【図１４】
2012500620.tif 000039
【図１５】
2012500620.tif 000040
【図１６】
2012500620.tif 000041
【図１７】
2012500620.tif 000042
【図１８】
2012500620.tif 000043
【図１９】
2012500620.tif 000044
【図２０】
2012500620.tif 000045
【図２１】
2012500620.tif 000046
【図２２】
2012500620.tif 000047
【図２３】
2012500620.tif 000048
【図２４Ａ】
2012500620.tif 000049
【図２４Ｂ】
2012500620.tif 000050
【図２４Ｃ】
2012500620.tif 000051
【図２４Ｄ】
2012500620.tif 000052
【図２４Ｅ】
2012500620.tif 000053
【図２４Ｆ】
2012500620.tif 000054
【図２４Ｇ】
2012500620.tif 000055
【図２５】
2012500620.tif 000056
【図２６Ａ】
2012500620.tif 000057
【図２６Ｂ】
2012500620.tif 000058
【図２６Ｃ】
2012500620.tif 000059
【図２６Ｄ】
2012500620.tif 000060
【図２６Ｅ】
2012500620.tif 000061
【図２７Ａ】
2012500620.tif 000062
【図２７Ｂ】
2012500620.tif 000063
【図２８】
2012500620.tif 000064
【図２９Ａ】
2012500620.tif 000065
【図２９Ｂ】
2012500620.tif 000066
【図３０Ａ】
2012500620.tif 000067
【図３０Ｂ】
2012500620.tif 000068
【図３１】
2012500620.tif 000069
【図３２】
2012500620.tif 000070
【図３３Ａ】
2012500620.tif 000071
【図３３Ｂ】
2012500620.tif 000072
【図３３Ｃ】
2012500620.tif 000073
【図３３Ｄ】
2012500620.tif 000074
【図３３Ｅ】
2012500620.tif 000075
【図３４Ａ】
2012500620.tif 000076
【図３４Ｂ】
2012500620.tif 000077
【図３４Ｃ】
2012500620.tif 000078
【図３４Ｄ】
2012500620.tif 000079
【図３５】
2012500620.tif 000080
【図３６】
2012500620.tif 000081
【図３７】
2012500620.tif 000082
【図３８Ａ】
2012500620.tif 000083
【図３８Ｂ】
2012500620.tif 000084
【図３９】
2012500620.tif 000085
【図４０】
2012500620.tif 000086
【図４１Ａ】
2012500620.tif 000087
【図４１Ｂ】
2012500620.tif 000088
【図４１Ｃ】
2012500620.tif 000089
【図４２】
2012500620.tif 000090
【図４３】
2012500620.tif 000091
【図４４】
2012500620.tif 000092
【図４５】
2012500620.tif 000093
【図４６】
2012500620.tif 000094
【図４７】
2012500620.tif 000095
【図４８】
2012500620.tif 000096
【図４９】
2012500620.tif 000097
【図５０】
2012500620.tif 000098
【図５１】
2012500620.tif 000099
【図５２】
2012500620.tif 000100
【図５３】
2012500620.tif 000101
【図５４】
2012500620.tif 000102
【図５５】
2012500620.tif 000103
【図５６】
2012500620.tif 000104
【図５７】
2012500620.tif 000105
【図５８】
2012500620.tif 000106
【図５９】
2012500620.tif 000107
【図６０】
2012500620.tif 000108
【図６１】
2012500620.tif 000109
【図６２】
2012500620.tif 000110
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月28日(2010.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｂ】
2012500620.tif 000111
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｃ】
2012500620.tif 000112
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2012500620.tif 000113
【国際調査報告】
2012500620.tif 000114
2012500620.tif 000115
2012500620.tif 000116