(57)【要約】  ヒト対象におけるパピローマウイルス感染の病期を決定するための方法およびキットが開示される。該方法は、タンパク質を含む組織サンプルまたはタンパク質を含む細胞サンプルからなるサンプルを上記ヒト対象から得る工程と；上記サンプルを、１種以上の組み換えＨＰＶタンパク質と特異的に結合する１種以上の抗体と接触させる工程と；上記抗体に特異的に結合する、上記サンプル中の少なくとも１種のタンパク質の存在、非存在または量を決定する工程と；上記ヒト対象における上記パピローマウイルス感染の病期を、上記１種以上のタンパク質の上記決定された存在、非存在または量を基準として決定する工程とを含む。【選択図】図１Ａ、図１Ｂ
2012526286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象におけるパピローマウイルス感染の病期を決定するための方法であって：
タンパク質を含む組織サンプルまたはタンパク質を含む細胞サンプルからなるサンプルを前記ヒト対象から得る工程と；
前記サンプルを、１種以上の組み換えＨＰＶタンパク質と特異的に結合する第１の１種以上の抗体と接触させる工程において、前記複数の組み換えＨＰＶタンパク質が、組み換えパピローマウイルスＥ６遺伝子産物、組み換えパピローマウイルスＥ７遺伝子産物、組み換えパピローマウイルスＬ１遺伝子産物、組み換えパピローマウイルス切断Ｌ１遺伝子産物、および組み換えパピローマウイルスＬ２遺伝子産物からなる群から選択され、ここで、前記接触が、前記複数の抗体の特異的結合を促進する条件下に起こる、工程と；
前記第１の１種以上の抗体のうちの１種以上に特異的に結合する、前記サンプル中の第１の１種以上のタンパク質の存在、非存在または量を、前記接触されたサンプルに対する前記第１の１種以上の抗体のうちの１種以上の特異的結合の尺度を少なくとも部分的に基準として決定する工程と；
前記ヒト対象における前記パピローマウイルス感染の病期を、前記サンプル中の前記１種以上のタンパク質の前記決定された存在、非存在または量を基準として決定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の１種以上のタンパク質が、パピローマウイルスＥ６遺伝子産物、パピローマウイルスＥ７遺伝子産物、パピローマウイルスＬ１遺伝子産物、パピローマウイルス切断Ｌ１遺伝子産物、およびパピローマウイルスＬ２遺伝子産物からなる群から選択される１種以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の１種以上のタンパク質が、パピローマウイルスＥ６遺伝子産物およびパピローマウイルスＥ７遺伝子産物からなる群から選択される１種以上のタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルを第２の１種以上の抗体と接触させる工程と；
前記サンプル中の、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐＲＢ、ｐ５３、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ｆ活性化細胞周期タンパク質、サイクリン依存性キナーゼ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、Ｋｉ−６７（ＭＩＢ−Ｉ）、ＭＹＣタンパク質、サイクリン−Ａ、サイクリン−Ｂ、サイクリン−Ｅ、テロメラーゼ−ＴＥＲＣ、ＭＣＭ２、ＴＯＰ２Ａ、熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、ＣＡ９／ＭＮ、Ｉａｍｉｎｉｎ５、ｂｒｎ−３ａ、ＣＤＫ  Ｎ２、トポイソメラーゼ２Ａ、ミクロソームメンテナンスタンパク質−２、ミクロソームメンテナンスタンパク質−４、ミクロソームメンテナンスタンパク質−５、スルビビン、ＶＥＧＦ、ｐ２７（ｋｉｐ１）、およびｐ２１（ｗａｆ）からなる群から選択される第２の１種以上のタンパク質の存在、非存在または量を、前記接触されたサンプルに対する前記第２の複数の抗体のうちの１種以上の特異的結合の尺度を基準にして決定する工程と
をさらに含み、前記ヒト対象を、パピローマウイルス感染に関してスクリーニングする前記工程が、前記第２の１種以上のタンパク質の前記決定された存在、非存在または量をさらに基準とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記１種以上のタンパク質が、ｐ１６ＩＮＫ４ａを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルがインサイチュにある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、組織サンプルを含み、前記決定工程が、免疫組織化学アッセイを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、細胞サンプルを含み、前記決定工程が、免疫細胞化学アッセイを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記病期を決定する工程が、ＨＳＩＬの存在または非存在を決定する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記病期を決定する工程が、後期段階ＨＰＶ感染の存在または非存在を決定する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記病期を決定する工程が、高度異形成の存在または非存在を決定する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記病期を決定する工程が、≧ＣＩＮ２の病期の存在または非存在を決定する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記病期が、≧ＣＩＮ２または＜ＣＩＮ２である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記≧ＣＩＮ２が、ＣＩＮ２／３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記病期がＨＳＩＬである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記病期が、後期段階ＨＰＶ感染である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記病期が、高度異形成である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組み換えＨＰＶタンパク質は、以下のプロセス：
前記パピローマウイルス遺伝子産物ならびにＨＩＳ標識、ＧＳＴ標識、およびＭＢＰ標識からなる群から選択される親和性標識を含む融合タンパク質をコードする組み換え構築物を与える工程と；
前記組み換え構築物を宿主細胞において発現させる工程と；
前記宿主細胞から調製された抽出物を、親和性樹脂によって、前記親和性樹脂が前記親和性標識と特異的に結合する条件下にインキュベートする工程と；
前記組み換えＨＰＶタンパク質を前記親和性樹脂から溶離する工程と
を含むプロセスであって、前記組み換え構築物を前記宿主細胞において発現させる前記工程は、前記溶離工程が、前記組み換えＨＰＶタンパク質を１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度で含む組成物を生成するようなタンパク質発現レベルを結果として生じ、前記組み換えＨＰＶタンパク質は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定されるように少なくとも９０％の純度で前記組成物中に存在し、前記組み換えＨＰＶタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるように、実質的に可溶性の単量体形で前記組成物中に存在する、プロセス；
によって作製される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記パピローマウイルスが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４３、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５３、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−５９、およびＨＰＶ−６６からなる群から選択される１種以上のウイルスを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記パピローマウイルスが、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８からなる群から選択される１種以上のウイルスを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組み換えパピローマウイルスＥ６遺伝子産物が、組み換えＨＰＶ−１６Ｅ６遺伝子産物または組み換えＨＰＢ−１８Ｅ６遺伝子産物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組み換えパピローマウイルスＥ７遺伝子産物が、組み換えＨＰＶ−１６Ｅ７遺伝子産物または組み換えＨＰＶ−１８Ｅ７遺伝子産物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞サンプルが、正常細胞、ＡＳＣ−ＵＳ細胞、ＡＳＣ−Ｈ細胞、ＬＳＩＬ細胞、ＨＳＩＬ細胞、ＡＤＣ細胞、ＡＧＣ細胞またはＳＣＣ細胞を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組織サンプルが、良性、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、ＳＣＣ、ＡＧＣまたはＡＤＣである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞サンプルを含む第２サンプルを前記ヒト対象から得る工程と；
前記サンプルにおいて細胞学的パパニコロウ塗沫アッセイを実施する工程と
をさらに含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
核酸を含む第２サンプルを前記ヒト対象から得る工程と；
前記サンプルにおいてヒトパピローマウイルスについて核酸ハイブリダイゼーションアッセイを実施する工程と
をさらに含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法を実施する試薬と；
該方法を実施するための指示書と
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびＨＰＶ関連癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニング、および診断に有用な新規の抗体およびアッセイ」のタイトルで、２００９年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／２１５，５８９号の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法および子宮頸癌におけるその適用」のタイトルで、２００６年１１月１３日に出願された米国特許出願第１１／５５９，３６６号、「ＨＰＶ検出のためのタンパク質チップ」のタイトルで、２００８年４月１４日に出願された米国特許出願第１２／０８２，７４０号、「ＨＰＶ検出のための抗体およびアッセイ」のタイトルで、２００８年６月１３日に出願された米国出願第６１／１３１，９９１号、「ＨＰＶ関連子宮頸癌の初期段階状態および後期段階の検出、スクリーニング、および診断に有用な、ＨＰＶタンパク質に対する新規モノクローナル抗体」のタイトルで、２００８年２月２２日に出願された米国出願第６１／１９２，９１２号、「ＨＰＶタンパク質に対する新規モノクローナル抗体」のタイトルで、２００９年６月１０日に出願された米国出願第１２／４５６，０５３号、「初期段階および後期段階のＨＰＶ感染のインサイチュでの検出」のタイトルで、２００９年６月１０日に出願された米国出願第１２／４５６，０５４号、「初期段階および後期段階のＨＰＶ感染のインサイチュでの検出」のタイトルで、２００９年６月１０日に出願された米国出願第１２／４５６，０５５号、「初期段階および後期段階のＨＰＶ感染の検出」のタイトルで、２００９年６月１０日に出願された米国出願第１２／４５６，０７６号、「ＨＰＶ関連癌の検出、スクリーニングおよび診断」のタイトルで、２００８年１１月１２日に出願された米国出願第６１／１９９，０１３号、および「ＨＰＶ関連癌の検出、スクリーニングおよび診断」のタイトルで、２００９年１１月１２日に出願された米国出願第米国出願第１２／５９０，７４７号と相互に関連する。上記相互関連出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
子宮頸癌は、毎年約５０万の新たな事例および約２５万の死亡を伴う、全世界の女性の癌死亡の第２の最も一般的な原因である。米国では、子宮頸癌の死亡率は、前癌状態が癌に発展する前に前癌状態を検出してその治療介入および処置に至る子宮頸癌スクリーニングプログラムの成功により、実質的に減少している。子宮頸癌スクリーニングのための現在のパラダイムは、Ｐａｐ試験に基づいており、Ｐａｐ試験とは、細胞を子宮頸部から擦り取り、ヒトまたは機械のいずれかによって微視的に検査して、異形成細胞の成長を示す変化を検出するという細胞学に基づく試験である。該試験は、かなりの観察者間変動を伴う主観的なものであり、低い感度および高い偽陽性結果によって制限される。子宮頸部細胞診における偽陰性率の報告は、低くて１．６％から大体２８％まで広範に変動している。約４００万の異常なＰａｐ試験が、各年、米国において、意義不明の異型扁平細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）と診断されており、異型扁平細胞は、高度扁平上皮内病変（ＡＳＣ−Ｈ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、または異型腺細胞（ＡＧＣ）を除外できない。
【０００４】
現在の診療ガイドラインでは、これらの事例は、膣鏡診に持ち込まれて、子宮頸部生検において臨床的に有意な高度病変（ＣＩＮ２／３）または子宮頸部新生物を有するであろう患者の小集団をさらに同定する。ＡＳＣ−ＵＳの細胞学的診断を有する患者（米国では毎年２００万事例を超える）は、子宮頸部生検において、潜在するＣＩＮ２／３の確率を５％〜１７％しか有さず、ＬＳＩＬ（米国では毎年約１６０万事例）においては、ＣＩＮ２／３が最大で２５％において見られたことが報告された。これらのデータは、ＡＳＣ−ＵＳまたはＬＳＩＬを有する約３００万の事例について、膣鏡診が必要でないことを示唆している。膣鏡による生検は、診断基準であると歴史的に考えられてきたが、最近の報告では、子宮頸部生検は、サンプリングまたは診断誤差のために３３％〜５０％の高度疾患を見落とし得ることが示されている。結果として、偽陽性の子宮頸部細胞診結果と偽陰性の生検結果とを区別することが困難である場合がある。したがって、治療介入からの利益を最も享受することができる患者をトリアージする、高度異形成を同定するための試験が強く必要とされている。
【０００５】
最も軽度の子宮頸部異形成は、子宮頸癌に至ることなく自発的に退行するが、異形成は、さらなる用心が必要とされることを示すものとして機能し得る。ＣＩＮ１は、最も一般的で最も良性の形態の子宮頸部上皮内新生物であり、通常は２年以内に自発的に消散する。このため、ＬＳＩＬの結果は、単なる「経過を観察する」考え方で管理され得る。しかし、１２〜１６％の確率で、より重篤な異形成に進行するため、医師は、生検と共に膣鏡診を実施することによって、より積極的に結果を追求しようとする場合がある。異形成が進行すると、処置が必要である場合がある。したがって、必要とされるのは、ＨＰＶ癌タンパク質をインサイチュで検出する方法である。ＡＳＣ−ＵＳもしくはＬＳＩＬ、またはＣＩＮ１の患者において、あるいは迅速な治療介入の利益を享受し、「様子を見る」ことに関する不安を回避することができる患者において、高度異形成細胞を検出して、これらの潜在するＣＩＮ２を同定することが、特に有益であろう。
【０００６】
上皮の増殖を誘発する、特定の上皮細胞でのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染は、子宮頸部の発癌に重要な役割をする。確認されている子宮頸癌事例の約９９％が、生検で確認された扁平上皮内病変（ＳＩＬ）または子宮頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）を伴うＨＰＶ感染と関連することが見出されている。性的接触を通じて主に伝染されるＨＰＶ感染の発生は、若い女性の間で最も多く、約２０００万の性的に活発な男性および女性が現在感染している。人口の約１％が生殖器疣を有し、女性の４％が、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）もしくは高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）または意義不明の異型扁平細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）などの子宮頸部前癌状態の病変を有する。
【０００７】
年齢が３５〜４０歳である女性に優先的に観察されるこれらの病変の存在は、侵襲性子宮頸癌へと進行する高いリスクがある。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の持続的な感染は、前癌状態の上皮内病変を発展させるのに必須であると一般に考えられている。ＬＳＩＬを有する女性の高リスク型ＨＰＶの感染は、ＨＳＩＬに進行する場合も、進行しない場合もある。実際、いくらかはＨＳＩＬに進行するが、ＬＳＩＬのヒト対象の大部分において、寛解が起こる。子宮頸癌の９９．７％がＨＰＶ陽性であるが、ＨＳＩＬまたは癌に発展するのに必要な遺伝子の発現を容易にするためには、ウイルスゲノムの宿主ゲノム内への組み込みが必要とされる。実際、持続的なＨＰＶ感染を有する女性１０人につき１人だけが、より高度のＣＩＮ病変、例えば、子宮頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）グレード２およびグレード３（それぞれＣＩＮ２およびＣＩＮ３）に発展する場合があり、これらの上皮内病変事例の一部が、最終的に子宮頸癌に進行する場合がある。
【０００８】
ＨＰＶ感染によって引き起こされる病期として、初期段階ＨＰＶ感染、後期段階ＨＰＶ感染、意義不明の異型扁平細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）が挙げられ、異型扁平細胞は、ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、異型腺細胞（ＡＧＣ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、軽度、中程度もしくは重篤な細胞異形成をそれぞれ表す子宮頸部内新生物ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、侵襲性子宮頸癌、腺癌腫、または扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）を除外できない。
【０００９】
これまで、子宮頸癌のスクリーニングは、パパニコロウ（Ｐａｐ）塗沫による従来の細胞診に基づいており、疑わしい塗沫は、膣鏡診および／または組織学的生検によって追跡調査されている。細胞学的スクリーニングの使用は、子宮頸癌の死亡率の著しい低下をもたらす。しかし、主観的な試験基準に起因して、Ｐａｐ塗沫試験の欠点として、サンプルを得ることの困難さ、観察者間および内での低い一致、高い偽陰性（最大で２０％）及び偽陽性率、高度に訓練された人材が配置されている専門研究所の要求、および大部分のＨＰＶ感染者を同定できないことが挙げられる。現在のスクリーニングを改善して、罹患した女性への不必要な医療的治療介入および精神的苦痛を回避するために、より再現可能なアッセイが必要とされている。現在の子宮頸部細胞診スクリーニングは、３０％〜８７％の範囲の感度および８６％〜１００％の範囲の特異性を有する。
【００１０】
核酸法によるＨＰＶ感染の検出が開発されているが、その高いコストや、アッセイ操作手順、設備、機器および高度に訓練された人材に対する要求だけでなく、ＣＩＮに対する非常に低い陽性予測値に起因して、理想的でない。さらに、ＤＮＡ試験は、ＬＳＩＬとＨＳＩＬとの診断も、ＣＩＮ病変と形質転換しない潜在的なまたは寛解されたウイルス感染との診断も区別できない。Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡの検出のためのアッセイは、より高い陽性予測値を有するＨＰＶ  ＤＮＡ試験と同等の感度を示唆した。しかし、Ｅ６／Ｅ７癌タンパク質のインサイチュでの直接検出を示す報告は限られている。必要とされるのは、臨床検査室または医院の日常的な診療において実施することができ、初期段階の上皮病変を検出することが可能である、またはＬＳＩＬとＨＳＩＬとを見分けることができる、または子宮頸癌に進行するリスクを予測することができる、低コストの、簡単な、感度の高い特異的なアッセイである。
【００１１】
ＨＰＶに対するモノクローナル抗体の産生のための公知のプロトコルは、抗ＨＰＶモノクローナル抗体の産生に一般に好適でなく、一般のヒト集団のスクリーニングのための免疫細胞化学的診断試験において用いられ得ない。その理由は、これらのプロトコルによって産生される抗体が、感染したヒト細胞において天然ＨＰＶタンパク質と必ずしも反応し得ないからである。さらに、先の抗体によって認識された抗原決定基は、臨床試料のサンプリング、固定および保存に関与する標準的な手順に耐性がある抗原決定基では必ずしもあり得ない。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によってヒト対象においてＨＰＶ関連抗体またはウイルスタンパク質の存在を検出する他の試みは、極めて低いアッセイ感度を一般にもたらし、そのため、商業的に好適な診断試験を開発することができない。これらのＥＬＩＳＡアッセイの大部分は、ヒト対象からの抗体と良好に相互作用することまたはこれに強く特異的に結合することができない単一のウイルスタンパク質または短いペプチド断片を標的としている。アッセイの特異性および感度がかなり低いため、ＨＰＶ関連の侵襲性子宮頸癌を有することが確認されている患者からのサンプルを用いても、患者のサンプルの５５％しかＨＰＶ感染に陽性であることが見出されなかった。試験集団が一般のスクリーニングからのものであるとすると、軽度もしくは前癌状態であってもまたはそうでなくても、アッセイの感度は臨床診療に適用するには低すぎるであろう。したがって、臨床サンプル用の診断ツールとして利用可能な成功裏のＥＬＩＳＡアッセイは存在していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
１００を超えるＨＰＶ感染型のうちの約１５型のみが、ＣＩＮまたは子宮頸癌に高いリスクで発展すると考えられている。また、子宮頸癌事例の７０％程度ならびにＣＩＮ２およびＣＩＮ３の事例の５０％が、高リスクＨＰＶ型−１６およびＨＰＶ型−１８感染によるものである。しかし、いくらかのＨＰＶ型の感染は子宮頸癌に決して進行し得ないが、いくらかの進行性子宮頸癌の事例は、低リスクＨＰＶ型による感染と関係する。高リスク型のＨＰＶ感染を正しく同定するよりもむしろ、特定の発癌タンパク質の発現を伴うＨＰＶ感染を同定することが重要となっている。したがって、ＨＰＶ癌タンパク質を子宮頸癌バイオマーカーとして検出して、ＨＳＩＬ、前癌状態、または子宮頸癌を発生するリスクをより良好に同定することが必要とされている。
【００１３】
適切なアッセイ、例えばＨＰＶイムノアッセイを開発することが、かかるＨＰＶ癌タンパク質の検出または子宮頸癌のバイオマーカーに必要とされている。ＣＩＮ２およびＣＩＮ３病変におけるＥ６／Ｅ７癌タンパク質の存在は、進行するリスクが高いことを示すことが明らかであった。しかし、インサイチュでのＥ６／Ｅ７癌タンパク質の検出に利用可能な抗体は限られている。したがって、侵襲性子宮頸癌および／または子宮頸癌ならびに他のＨＰＶ関連癌への悪性転換のリスクをスクリーニングするために、癌タンパク質を子宮頸癌バイオマーカーとして検出し、ＨＳＩＬもしくは≧ＣＩＮ２（ＣＩＮ２およびこれより高度）または前癌状態を同定するための抗体および免疫学的アッセイを開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
種々の実施形態は、組み換えＨＰＶタンパク質に対する種々のモノクローナル抗体および細胞内タンパク質に対する抗体を用いた、ＨＰＶタンパク質および細胞内タンパク質のインサイチュでの検出のための種々のイムノアッセイを提供する。種々の実施形態はまた、子宮頸部細胞または子宮頸部組織におけるＨＰＶタンパク質およびＨＰＶ感染に罹患した細胞内タンパク質の存在、ならびに限定されないが、膀胱癌、頭頸部癌、肺癌などを含めた他のＨＰＶ関連癌を検出するための、ＨＰＶ免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイ、ＨＰＶ免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイも提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、高度異形成細胞を有するヒト対象をスクリーニングする方法は、限定されないが子宮頸癌、膀胱癌、肺癌、頭頸部癌などを含めた組織を含有するスライド上の生体サンプルに存在する１種以上のパピローマウイルス型から１種以上のパピローマウイルスタンパク質をインサイチュで検出し、また、該サンプルに存在する１種以上のパピローマウイルス型からＨＰＶ感染に罹患した１種以上の細胞内タンパク質をインサイチュで検出する、１種以上の免疫組織学的アッセイによって行われる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、高度異形成細胞を有するヒト対象をスクリーニングする方法は、１種以上の抗体を用いて、薄層のヒト細胞を含有するスライド上の生体サンプルに存在する１種以上のパピローマウイルス型から１種以上のパピローマウイルスタンパク質をインサイチュで検出し、また、該サンプルに存在する１種以上のパピローマウイルス型からＨＰＶ感染に罹患した１種以上の細胞内タンパク質をインサイチュで検出する免疫細胞学的アッセイによって行われる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７  ＩＣＣアッセイが提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＩＣＣアッセイは、Ｐａｐ塗沫試験と共に用いられる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、１種以上の抗体は、１種以上の精製された組み換えパピローマウイルスタンパク質に対して生成され、ここで、少なくとも１種の抗体は、パピローマウイルス癌タンパク質を認識することが可能である。いくつかの実施形態において、１種以上の抗体は、作用物質によって標識され、ヒト対象の生体サンプルからの１種以上のヒト細胞は、液体系溶液中に調製されて、１種以上の抗体と、生体サンプルの１種以上のヒト細胞に存在する１種以上のパピローマウイルス型からの１種以上のパピローマウイルスタンパク質との結合が、標識された１種以上の抗体と反応する作用物質の存在によって検出され得るようになる。いくつかの実施形態において、作用物質は、比色分析剤、蛍光色素原、ならびに１種以上のフローサイトメトリーアッセイにおける１種以上のヒト細胞のその後の分離および同定のための他の作用物質を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、免疫組織化学アッセイを実施するためのキットが提供される。キットは、前抗体ブロッキング溶液、後抗体ブロッキング溶液、一次抗体としての抗ＨＰＶ抗体、ＨＲＰもしくはビオチンとコンジュゲートした抗マウスもしくは抗ウサギ免疫グロブリン、または二次抗体としての他の作用物質、検出される二次抗体の基質として用いられる適切な作用物質を含有する溶液を含んでいてよい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、免疫細胞化学アッセイを実施するためのキットが提供される。キットは、前抗体ブロッキング溶液、後抗体ブロッキング溶液、一次抗体としての抗ＨＰＶ抗体、ＨＲＰもしくはビオチンとコンジュゲートした抗マウスもしくは抗ウサギ免疫グロブリン、または二次抗体としての他の作用物質、検出される二次抗体の基質として用いられる適切な作用物質を含有する溶液を含んでいてよい。
【００２２】
一実施形態は、ヒト対象におけるパピローマウイルス感染の病期を決定するための方法であって：タンパク質を含む組織サンプルまたはタンパク質を含む細胞サンプルからなるサンプルを上記ヒト対象から得る工程と；上記サンプルを、１種以上の組み換えＨＰＶタンパク質と特異的に結合する第１の１種以上の抗体と接触させる工程において、上記複数の組み換えＨＰＶタンパク質が、組み換えパピローマウイルスＥ６遺伝子産物、組み換えパピローマウイルスＥ７遺伝子産物、組み換えパピローマウイルスＬ１遺伝子産物、組み換えパピローマウイルス切断Ｌ１遺伝子産物、および組み換えパピローマウイルスＬ２遺伝子産物からなる群から選択され、ここで、上記接触が、上記複数の抗体の特異的結合を促進する条件下に起こる、工程と；上記第１の１種以上の抗体のうちの１種以上に特異的に結合する、上記サンプル中の第１の１種以上のタンパク質の存在、非存在または量を、上記接触されたサンプルに対する上記第１の１種以上の抗体のうちの１種以上の特異的結合の尺度を少なくとも部分的に基準として決定する工程と；上記ヒト対象における上記パピローマウイルス感染の病期を、上記サンプル中の上記１種以上のタンパク質の上記決定された存在、非存在または量を基準として決定する工程とを含む方法を提供する。
【００２３】
一実施形態において、第１の１種以上のタンパク質は、パピローマウイルスＥ６遺伝子産物、パピローマウイルスＥ７遺伝子産物、パピローマウイルスＬ１遺伝子産物、パピローマウイルス切断Ｌ１遺伝子産物、およびパピローマウイルスＬ２遺伝子産物からなる群から選択される１種以上のタンパク質を含む。
【００２４】
一実施形態において、第１の１種以上のタンパク質は、パピローマウイルスＥ６遺伝子産物およびパピローマウイルスＥ７遺伝子産物からなる群から選択される１種以上のタンパク質を含む。
【００２５】
一実施形態において、該方法は、上記サンプルを第２の１種以上の抗体と接触させる工程と；上記サンプル中の、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐＲＢ、ｐ５３、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ｆ活性化細胞周期タンパク質、サイクリン依存性キナーゼ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、Ｋｉ−６７（ＭＩＢ−Ｉ）、ＭＹＣタンパク質、サイクリン−Ａ、サイクリン−Ｂ、サイクリン−Ｅ、テロメラーゼ−ＴＥＲＣ、ＭＣＭ２、ＴＯＰ２Ａ、熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、ＣＡ９／ＭＮ、Ｉａｍｉｎｉｎ５、ｂｒｎ−３ａ、ＣＤＫ  Ｎ２、トポイソメラーゼ２Ａ、ミクロソームメンテナンスタンパク質−２、ミクロソームメンテナンスタンパク質−４、ミクロソームメンテナンスタンパク質−５、スルビビン、ＶＥＧＦ、ｐ２７（ｋｉｐ１）、およびｐ２１（ｗａｆ）からなる群から選択される第２の１種以上のタンパク質の存在、非存在または量を、上記接触されたサンプルに対する上記第２の複数の抗体のうちの１種以上の特異的結合の尺度を基準にして決定する工程と；上記ヒト対象を、パピローマウイルス感染に関して、上記第２の１種以上のタンパク質の上記決定された存在、非存在または量をさらに基準にしてスクリーニングする工程とをさらに含む。
【００２６】
一実施形態において、１種以上のタンパク質は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを含む。
【００２７】
一実施形態において、サンプルは、インサイチュにある。
【００２８】
一実施形態において、サンプルは、組織サンプルを含み、上記決定工程は、免疫組織化学アッセイを含む。
【００２９】
一実施形態において、サンプルは、細胞サンプルを含み、上記決定工程は、免疫細胞化学アッセイを含む。
【００３０】
一実施形態において、上記病期を決定する工程は、ＨＳＩＬの存在または非存在を決定する工程を含む。
【００３１】
一実施形態において、上記病期を決定する工程は、後期段階ＨＰＶ感染ＨＳＩＬの存在または非存在を決定する工程を含む。
【００３２】
一実施形態において、上記病期を決定する工程は、高度異形成の存在または非存在を決定する工程を含む。
【００３３】
一実施形態において、病期は、≧ＣＩＮ２または＜ＣＩＮ２である。
【００３４】
一実施形態において、病期は、≧ＣＩＮ２は、ＣＩＮ２／３である。
【００３５】
一実施形態において、病期は、ＨＳＩＬである。
【００３６】
一実施形態において、病期は、後期段階ＨＰＶ感染である。
【００３７】
一実施形態において、病期は、高度異形成である。
【００３８】
一実施形態において、組み換えＨＰＶタンパク質は、以下のプロセス：上記パピローマウイルス遺伝子産物ならびにＨＩＳ標識、ＧＳＴ標識、およびＭＢＰ標識からなる群から選択される親和性標識を含む融合タンパク質をコードする組み換え構築物を与える工程と；上記組み換え構築物を宿主細胞において発現させる工程と；上記宿主細胞から調製された抽出物を、親和性樹脂によって、上記親和性樹脂が上記親和性標識と特異的に結合する条件下にインキュベートする工程と；上記組み換えＨＰＶタンパク質を上記親和性樹脂から溶離する工程とを含むプロセスであって、上記組み換え構築物を上記宿主細胞において発現させる上記工程は、上記溶離工程が上記組み換えＨＰＶタンパク質を１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度で含む組成物を生成するようなタンパク質発現レベルを結果として生じ、上記組み換えＨＰＶタンパク質は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定されるように少なくとも９０％の純度で上記組成物中に存在し、上記組み換えＨＰＶタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィによって決定されるように、実質的に可溶性の単量体形で上記組成物中に存在する、プロセスによって作製される。
【００３９】
一実施形態において、パピローマウイルスは、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４３、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５３、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−５９、およびＨＰＶ−６６からなる群から選択される１種以上のウイルスを含む。
【００４０】
一実施形態において、パピローマウイルスは、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８からなる群から選択される１種以上のウイルスを含む。
【００４１】
一実施形態において、組み換えパピローマウイルスＥ６遺伝子産物は、組み換えＨＰＶ−１６Ｅ６遺伝子産物または組み換えＨＰＢ−１８Ｅ６遺伝子産物である。
【００４２】
一実施形態において、組み換えパピローマウイルスＥ７遺伝子産物は、組み換えＨＰＶ−１６Ｅ７遺伝子産物または組み換えＨＰＶ−１８Ｅ７遺伝子産物である。
【００４３】
一実施形態において、細胞サンプルは、正常細胞、ＡＳＣ−ＵＳ細胞、ＡＳＣ−Ｈ細胞、ＬＳＩＬ細胞、ＨＳＩＬ細胞、ＡＤＣ細胞、またはＳＣＣ細胞を含む。
【００４４】
一実施形態において、組織サンプルは、良性、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、ＳＣＣ、またはＡＤＣである。
【００４５】
一実施形態において、該方法は、細胞サンプルを含む第２サンプルを上記ヒト対象から得る工程と、上記サンプルにおいて細胞学的パパニコロウ塗沫アッセイを実施する工程とをさらに含む。
【００４６】
一実施形態において、該方法は、核酸を含む第２サンプルを上記ヒト対象から得る工程と、上記サンプルにおいてヒトパピローマウイルスについてＤＮＡ試験を実施する工程とをさらに含む。
【００４７】
本発明の先に列挙した特徴が詳細に理解され得るように、本発明のより具体的な記載が、先に簡単にまとめられてはいるが、実施形態を参照してなされてよく、そのいくつかは添付の図面において説明される。しかし、添付の図面は、いくつかの実施形態の典型的な実施形態を説明しているのみであり、したがって、実施形態の範囲を限定するとみなされてはならず、本発明は他の等価な効果的な実施形態を認め得ることに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】図１Ａは、抗ＨＰＶ  Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた液体系溶液において、ＣＩＮ２と診断された臨床サンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、抗ＨＰＶ  Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた液体系溶液において、ＣＩＮ２と診断された別の臨床サンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図２】図２は、抗ＨＰＶ  Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた液体系溶液において、ＣＩＮ３と診断された臨床サンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、図２に示したものと同じ抗ＨＰＶ  Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた別の液体系溶液において、ＣＩＮ３と診断された別の臨床サンプルのＩＣＣ染色の結果からの代表画像を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、抗ＨＰＶ  Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた、図３Ａ〜３Ｄに示したものと同じＣＩＮ３サンプルからのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、同じ抗ＨＰＶ  Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた、図４Ａに示したものと同じＩＣＣ染色結果の別の画像を示す。
【図５】図５は、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いた、図３Ａ〜３Ｄに示したものと同じＣＩＮ３サンプルからのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、抗ＨＰＶ  Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた液体系溶液において、扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）と診断された臨床サンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、抗ＨＰＶ  Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた、図６Ａに示したものと同じＳＣＣサンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いた、図６Ａに示したものと同じＳＣＣサンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、抗ＨＰＶ  Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた液体系溶液において、正常と診断された臨床サンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、抗ＨＰＶ  Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた、図７Ａに示したものと同じ臨床サンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ〜８Ｂ：子宮頸癌組織およびその隣接する正常組織における抗Ｅ６抗体を用いたＩＨＣの画像。
【図８Ｃ−Ｄ】図８Ｃ〜８Ｄ：子宮頸癌およびその隣接する正常組織における抗Ｅ７抗体を用いたＩＨＣの画像。
【図９Ａ−Ｃ】図９Ａ〜９Ｃ：子宮頸癌サンプル：陽性１０×（左）、陽性２０×（中央）、陰性２０×（右）における抗Ｅ６抗体によるＩＨＣの画像。
【図９Ｄ−Ｆ】図９Ｄ〜９Ｆ：子宮頸癌サンプル：陽性１０×（左）、陽性２０×（中央）、陽性４０×（右）における抗Ｅ７抗体によるＩＨＣの画像。
【図９Ｇ−Ｉ】図９Ｇ〜９Ｉ：子宮頸癌サンプル：陽性１０×（左）、陽性２０×（中央）、陰性２０×（右）におけるｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体によるＩＨＣの画像。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
種々の実施形態は、高リスクおよび低リスクＨＰＶ型に感染した高度異形成細胞が１種以上の抗体によって検出され得るようなバイオマーカーとしてのＨＰＶ癌タンパク質に対する種々のイムノアッセイおよびモノクローナル抗体を提供する。種々の実施形態は、ＨＰＶ癌タンパク質の存在を検出して、組織または子宮頸部細胞において高度または前癌状態の病変からの高度異形成細胞をインサイチュで同定するＨＰＶ免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイおよびＨＰＶ免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイを提供する。種々の実施形態はまた、高度異形成細胞のインサイチュでの検出に関して、組み合わされたＨＰＶウイルスマーカーおよび細胞マーカーをＩＨＣまたはＩＣＣアッセイに用いることで、単一のＨＰＶウイルスマーカーまたは単一の細胞マーカーをＩＨＣまたはＩＣＣアッセイに用いる方法と比較して、より高い感度を得る方法も提供する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、パピローマウイルス感染に関してヒト対象をスクリーニングする方法は、薄層のヒト細胞を含有するスライド上での免疫細胞学的アッセイであって、スライド上の生体サンプルに存在する１種以上のパピローマウイルスタンパク質をインサイチュで検出するアッセイによって行われる。薄層は、子宮頸部細胞の単層である。
【００５１】
１種以上の精製された組み換えパピローマウイルスタンパク質に対して生成された、またはＨＰＶ感染に罹患した１種以上の細胞内タンパク質に対して生成された１種以上の抗体を用いて薄層のヒト細胞を染色するために、少なくとも１種の抗体が、パピローマウイルス癌タンパク質を認識することが可能である。パピローマウイルス癌タンパク質として、限定されないが、ＨＰＶ−１６Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ−１６Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ−１８Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ−１８Ｅ７タンパク質、およびこれらの組み合わせが挙げられる。細胞マーカーとして、限定されないが、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐＲＢ、ｐ５３、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ｆ活性化細胞周期タンパク質、サイクリン依存性キナーゼ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、Ｋｉ−６７（ＭＩＢ−Ｉ）、ＭＹＣタンパク質、サイクリン−Ａ、サイクリン−Ｂ、サイクリン−Ｅ、テロメラーゼ−ＴＥＲＣ、ＭＣＭ２、ＴＯＰ２Ａ、熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、ＣＡ９／ＭＮ、Ｉａｍｉｎｉｎ５、ｂｒｎ−３ａ、ＣＤＫ  Ｎ２、トポイソメラーゼ２Ａ、ミクロソームメンテナンスタンパク質−２、ミクロソームメンテナンスタンパク質−４、ミクロソームメンテナンスタンパク質−５、スルビビン、ＶＥＧＦ、ｐ２７（ｋｉｐ１）、およびｐ２１（ｗａｆ）が挙げられる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、薄片の臨床組織サンプルを含有するスライドにおける１種以上の免疫組織化学アッセイを行って、１種以上の精製された組み換えパピローマウイルスタンパク質に対して生成された、またはＨＰＶ感染に罹患した１種以上の細胞内タンパク質に対して生成された１種以上の抗体を用いてヒト細胞を染色させた。少なくとも１種の抗体が、パピローマウイルス癌タンパク質を認識して、スライド上の薄片の臨床組織サンプルに存在する１種以上のパピローマウイルス型から１種以上のタンパク質をインサイチュで検出することが可能である。パピローマウイルス癌タンパク質として、限定されないが、ＨＰＶ−１６Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ−１６Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ−１８Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ−１８Ｅ７タンパク質、およびこれらの組み合わせが挙げられる。細胞マーカーとして、限定されないが、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐＲＢ、ｐ５３、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ｆ活性化細胞周期タンパク質、サイクリン依存性キナーゼ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、Ｋｉ−６７（ＭＩＢ−Ｉ）、ＭＹＣタンパク質、サイクリン−Ａ、サイクリン−Ｂ、サイクリン−Ｅ、テロメラーゼ−ＴＥＲＣ、ＭＣＭ２、ＴＯＰ２Ａ、熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、ＣＡ９／ＭＮ、Ｉａｍｉｎｉｎ５、ｂｒｎ−３ａ、ＣＤＫ  Ｎ２、トポイソメラーゼ２Ａ、ミクロソームメンテナンスタンパク質−２、ミクロソームメンテナンスタンパク質−４、ミクロソームメンテナンスタンパク質−５、スルビビン、ＶＥＧＦ、ｐ２７（ｋｉｐ１）、およびｐ２１（ｗａｆ）が挙げられる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、細胞学的パパニコロウ塗沫試験の結果と１種以上の免疫組織学的アッセイの結果とを比較するために、臨床サンプルにおける細胞学的パパニコロウ塗沫アッセイも実施された。ヒト対象から臨床サンプルにおけるパピローマウイルスゲノムの存在を検出するために、臨床サンプルにおける核酸ハイブリダイゼーションアッセイも実施された。
【００５４】
種々の実施形態は、種々の方法、検出アッセイ、キット、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ポリペプチド、組み換えタンパク質、ならびにＨＰＶ感染（例えば、一般のＨＰＶ感染、ならびに種々のＨＰＶ遺伝子型、高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶによる感染を含む）を検出するのに有用な核酸に一般に関する。バイオマーカーとして有用である、ＨＰＶタンパク質に対する種々の新規のモノクローナル抗体、および、ＨＰＶウイルスタンパク質、ＨＰＶ癌タンパク質を検出し、子宮頸癌を早期にスクリーニングし、≧ＣＩＮ２の病期を診断するための有用なツールが提供される。本明細書に記載されているツールはまた、ＨＰＶ感染の早期の臨床スクリーニングならびに子宮頸癌および他のＨＰＶ関連癌の一般の診断にも用いられ得る。
【００５５】
いくつかの実施形態において、１種以上の精製された組み換えパピローマウイルスタンパク質として、パピローマウイルスＥ６タンパク質、パピローマウイルスＥ７タンパク質、パピローマウイルスＬ１タンパク質およびこれらの組み合わせが挙げられる。組み換えパピローマウイルスタンパク質として、限定されないが、組み換えＨＰＶ−１６Ｅ６タンパク質、組み換えＨＰＶ−１６Ｅ７タンパク質、組み換えＨＰＶ−１８Ｅ６タンパク質、組み換えＨＰＶ−１８Ｅ７タンパク質、およびＨＰＶ−１６Ｌ１タンパク質、組み換えＨＰＶ−１８Ｌ１タンパク質、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態は、高リスクおよび低リスクＨＰＶ型による感染が単一のモノクローナル抗体によって検出され得るような、ＨＰＶウイルスタンパク質に対する種々のモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態はまた、１種以上のＨＰＶ型を検出するための非ＨＰＶ型の特異的なモノクローナル抗体を提供する。１種以上のパピローマウイルス型として、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−５９、およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４３、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−５３、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、およびＨＰＶ−５６、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５７】
いくつかの実施形態において用いられる種々の用語の定義：
【００５８】
ＮＩＬＭ：悪性の上皮内病変に対して陰性。ＮＩＬＭは、新生物の細胞痕跡が存在しないときに用いられる；これは、有機体および／または他の非新生物性所見、例えば反応性／修復性変化を含み得る。
【００５９】
ＡＳＣ−ＵＳ：意義不明の異型扁平細胞。細胞は、他に特定されない限り、通常、中間体または表面扁平細胞のサイズであり、示唆されているがＬＳＩＬまたはＳＩＬの診断ではない核変化を有する。
【００６０】
ＡＳＣ−Ｈ：異型扁平細胞は、ＨＳＩＬを除外できない。細胞は、通常、化生細胞のサイズであり、単一でもクラスターでも見られ得る；これらは、示唆されているが、ＨＳＩＬの診断ではない。
【００６１】
ＬＳＩＬ：ＨＰＶ細胞変性効果／軽度異形成／ＣＩＮ１を包含する軽度扁平上皮内病変。
【００６２】
ＨＳＩＬ：中程度異形成／ＣＩＮ２および重篤な異形成／ＣＩＳ／ＣＩＮ３ならびに浸潤が疑われる特徴を有するＨＳＩＬを包含する高度扁平上皮内病変。
【００６３】
扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）：近隣の組織、血管、リンパ管およびリンパ節に局所的に侵襲性である、子宮頸部の癌。その進行した段階において、処置することは困難であり得、致命的な結果であることが判明する場合がある。浸潤の段階または程度に応じて、子宮頸部の侵襲性癌は、局所切除、子宮摘出、広範子宮摘出、放射線、および化学療法によって処置され得る。
【００６４】
腺癌腫：大部分の子宮頸部癌は、外面皮膚を作り上げる扁平細胞からのものであるが、子宮内に至る子宮頸部管の内側を覆う粘液産生細胞から生ずる偶発癌が存在する。この腺型は、「扁平細胞癌腫」と対照的に「腺癌腫」と呼ばれる。腺癌腫は、検出するのが困難であり得る。扁平細胞癌とは異なり：腺癌腫前駆体は、存在する場合、Ｐａｐ塗沫において同定することが困難であり得る。扁平細胞異形成から子宮頸部の扁平細胞癌への遅い進行は、腺癌腫におけるほど均一なものではない。
【００６５】
米国では、大部分のＰａｐ結果は正常であるが、約４００〜５００万の異常なＰａｐ試験結果が毎年見出されている。最も異常な結果は、軽度の異常（ＡＳＣ−ＵＳ、典型的には、Ｐａｐ結果の２〜５％）またはＬＳＩＬ（結果の約２％）であり、ＨＰＶ感染を示している。大部分の軽度子宮頸部異形成が、子宮頸癌に至ることなく自発的に退行するが、異形成は、さらなる用心が必要とされることを示すものとして機能し得る。ＣＩＮ１は、最も一般的で最も良性の形態の子宮頸部上皮内新生物であり、通常は２年以内に自発的に消散する。このため、ＬＳＩＬの結果は、単なる「経過を観察する」考え方で管理され得る。しかし、１２〜１６％の確率で、より重篤な異形成に進行するため、医師は、生検と共に膣鏡診を実施することによって、より積極的に結果を追求しようとする場合がある。異形成が進行すると、処置が必要である場合がある。したがって、ＨＰＶ癌タンパク質をインサイチュで検出するＰａｐ塗沫試験と共にＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７  ＩＣＣアッセイを提供することが有用であり、ＡＳＣ−ＵＳもしくはＬＳＩＬ、またはＣＩＮ１の患者において、あるいは迅速な治療介入の利益を享受し、「様子を見る」ことに関する不安を回避することができる患者において、高度異形成細胞を検出して、これらの潜在するＣＩＮ２を同定することが、特に有益である。
【００６６】
高度扁平上皮内病変またはＨＳＩＬもしくはＨＧＳＩＬは、インサイチュでの中程度または重篤な子宮頸部上皮内新生物または癌腫を示している。これは、Ｐａｐ試験にしたがって通常診断される。これらの病変が侵襲性子宮頸部癌に至る可能性があるいくつかの事例において、適切に追求されない場合。ＨＧＳＩＬは、癌が存在しないことを意味する。ＨＧＳＩＬの結果を有する全ての女性のうち、２％以下が、この時点で侵襲性子宮頸癌を有するが、約２０％は、処置されることなく進行して侵襲性子宮頸癌を有するようになる場合がある。この進行に対処するために、ＨＧＳＩＬは、通常、生検と共に迅速な膣検診を受けて、異形成組織をサンプリングまたは除去する。この組織は、病理学試験に送られて、Ｐａｐ塗沫結果よりも確実である組織学的分類に割り当てられる。ＨＧＳＩＬは、ＣＩＮ２またはＣＩＮ３の組織学的分類に一般に相当する。したがって、ＨＥ（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）を伴うＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７  ＩＨＣアッセイまたはＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７癌タンパク質をインサイチュで検出するためのＰａｐ試験を伴うＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７  ＩＣＣアッセイを提供することが有益であり、ＣＩＮ２／ＣＩＮ３患者を同定するのに特に有益である。
【００６７】
いくつかの実施形態において、１種以上の抗体と、生体サンプル中に存在する１種以上のパピローマウイルス型からの１種以上のタンパク質との結合は、顕微鏡下で検査され、標識された１種以上の抗体と反応する作用物質の存在を検出し、ここで、該作用物質として、比色分析剤、蛍光色素原、およびこれらの組み合わせが挙げられる。生体サンプルとして、子宮頸部細胞、子宮頸部組織、子宮頸部スワブ、体液、血清、血液、腫瘍、細胞培養、生検を含むもの、およびこれらの組み合わせが挙げられる。生体サンプルは、異常なＰａｐ試験結果に起因する照会としての人々の群、または子宮頸癌の日常的なスクリーニングのための一般の集団から得られ得る。
【００６８】
説明例１
【００６９】
いくつかの実施形態は、剥脱した子宮頸部細胞におけるＨＰＶタンパク質および細胞内タンパク質の検出を含むイムノアッセイに向けられる。例として、ＩＣＣアッセイの結果は、ＨＰＶ  Ｅ６およびＨＰＶ  Ｅ７タンパク質が、抗ＨＰＶ  Ｅ６または抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いて、スライド上に固定された単一細胞についてインサイチュで検出され得ることを実証する。ＨＰＶ  Ｅ６またはＨＰＶ  Ｅ７癌タンパク質のインサイチュでの存在は、種々の液体系溶液中の種々の段階の子宮頸部擦過物サンプルから検出され得る。同じ子宮頸部擦過物サンプルもまた、標準のパパニコロウ染色によって処理して、ＩＣＣ染色結果とＰａｐ塗沫結果とを比較した。
【００７０】
例えば、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質は、それぞれ、陽性率が増加する、子宮頸部擦過物の正常な、ＡＳＣ−ＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２／３サンプルにおいて検出される。Ｐａｐ塗沫ＨＳＩＬ（ＣＩＮ２／３）によって診断されたサンプルについては約９２％の陽性率であるが、Ｐａｐ塗沫によって正常であると診断されたサンプルの１５％のみが、同じ抗ＨＰＶＥ６抗体を用いたＩＣＣによって陽性に染色した。ＡＳＣ−ＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプルについて、これらのサンプルの約３３％〜３８％が、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬサンプルに用いられているのと同じ抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体によって陽性に染色され、これらのＡＳＣ−ＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプル対象における発癌タンパク質の発現が、潜在する≧ＣＩＮ２（ＣＩＮ２およびこれより高度）であり得ること、およびさらなる癌の進行について追跡調査される必要があることを示している。ＡＳＣ−ＵＳと診断されたＰａｐ粉末、および（抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体によって）陰性であるとされたＩＣＣ染色を有するサンプルについて、進行性の病変に発展するリスクをほとんど有さない場合がある。データが示しているように、いくつかの実施形態に記載されている抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体を用いたＩＣＣ染色法は、７４％の特異性を有して≧ＣＩＮ２について９３％のアッセイ感度を提供する。同様のＩＣＣ結果がまた、抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いた、同じサンプルにおいても見られる。これらのデータは、いくつかの実施形態に記載されているＥ６またはＥ７抗体およびＥ６  Ｅ７  ＩＣＣ試験が、１）補助試験としてＰａｐ異常な患者をトリアージするために、および２）日常的なＰａｐ試験を伴う、一般の集団からの子宮頸癌のスクリーニングのための共試験に、ＨＰＶ癌タンパク質を検出するバイオマーカーとして有用であり得ることを示唆する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、免疫細胞学的アッセイを実施するためのキットが提供される。キットは、前抗体ブロッキング溶液、後抗体ブロッキング溶液、一次抗体としての抗ＨＰＶ抗体、ＨＲもしくはビオチンとコンジュゲートされた抗マウスもしくは抗ウサギ免疫グロブリン、または二次抗体としての他の作用物質、検出される二次抗体の基質として用いられる適切な作用物質を含有する溶液を含んでいてよい。
【００７２】
いくつかの実施形態において、臨床サンプルにおける核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、ヒト対象からの臨床サンプルにおけるパピローマウイルスゲノムの存在を検出する。核酸ハイブリダイゼーションアッセイとして、ポリメラーゼ鎖反応、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡチップアッセイ、放射性核酸ハイブリダイゼーションおよび検出アッセイ、ならびに非放射性核酸ハイブリダイゼーションおよび検出アッセイが挙げられる。
【００７３】
加えて、Ｐａｐ正常なサンプルを、ＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７  ＩＣＣによっても試験すると、抗ＨＰＶ抗体を用いた陰性の染色（４４のうち４４）が見られた。これらのデータは、いくつかの実施形態に記載されているＩＣＣ染色アッセイが非常に特異的であることを示している。同じサンプルにおけるＨＰＶ  ＤＮＡ試験結果と比較して、Ｐａｐ塗沫の正常なサンプルの１６％（３７のうち７）は、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験において陽性を示す。この研究において用いられる高度ＨＰＶ  ＤＮＡ試験は、ＦＤＡに認可されたＨＰＶ  ＤＮＡ試験、ＨＣ２であった。これらのＨＰＶ  ＤＮＡは陽性であるがＰａｐは正常でＨＰＶ  ＩＣＣは陰性のサンプルについて、これらは、ＨＰＶ  ＤＮＡアッセイについて偽陽性であること、またはＨＰＶ発癌タンパク質の検出可能な発現を有さずにＨＰＶ  ＤＮＡについて陽性であることが可能である。したがって、本明細書に記載されているＨＰＶ  ＩＣＣアッセイは、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験と比較して子宮頸癌のスクリーニングについてより良好な臨床的関連を提供する。
【００７４】
説明例２
【００７５】
いくつかの実施形態は、子宮頸癌におけるＨＰＶ癌タンパク質および細胞内タンパク質の検出を含むイムノアッセイに向けられる。子宮頸癌の腫瘍細胞において発現されるＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７発癌タンパク質は、特異的な抗Ｅ６および抗Ｅ７抗体を用いたＩＨＣアッセイによって試験される大部分のサンプルにおいて検出され得る。これらの結果が病因を強化し、ＨＰＶ癌タンパク質の分子メカニズムが大部分の子宮頸癌事例において機能する。研究結果は、それぞれ、無調節なウイルスＥ６およびＥ７癌タンパク質の発現によるｐ５３およびｐＲＢタンパク質の機能的不活性化をさらに実証し、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現を結果としてもたらす。
【００７６】
実証されたデータのように、抗Ｅ６抗体を用いたＨＰＶ  ＩＨＣのアッセイ感度は、１００％の特異性（３個の正常な子宮頸部組織のうち０個）を有して、約９２．１％（２０３個の子宮頸癌組織のうちの１８７個）である。１６個のＩＨＣ  Ｅ６陰性サンプルの中で、１５個が、抗ｐ１６抗体を用いたＩＨＣにおいて陽性を示す。組み合わされたＥ６およびｐ１６  ＩＨＣアッセイは、９９．５％のアッセイ感度（２０３個のサンプルのうち２０２個がＥ６またはｐ１６  ＩＨＣ陽性である）を提供する。
【００７７】
抗ｐ１６抗体を用いたＨＰＶ  ＩＨＣのアッセイ感度は、約９１．３％（２０８のうち１９０）である。１８個のＩＨＣ  ｐ１６陰性サンプルの中で、１７個のサンプルが、抗Ｅ６抗体を用いたＩＨＣにおいて陽性を示す。組み合わされたｐ１６およびＥ６  ＩＨＣアッセイは、９９．５％のアッセイ感度（２０３個のサンプルのうち２０２個がｐ１６またはＥ６  ＩＨＣ陽性である）を提供する。
【００７８】
抗Ｅ７抗体を用いたＨＰＶ  ＩＨＣのアッセイ感度は、約７６．２％（２０２のうち１５４）である。４８個のＩＨＣ  Ｅ７陰性サンプルの中で、２８個のサンプルが、Ｅ６およびｐ１６の両方において陽性を示し、５個のサンプルが、Ｅ６陽性およびｐ１６陰性を示し、１４個のサンプルが、Ｅ６陰性およびｐ１６陽性を示し、唯１個のサンプルが、Ｅ６、Ｅ７、およびｐ１６において全て陰性である。組み合わされたＥ６、Ｅ７およびｐ１６  ＩＨＣアッセイは、９９．５％のアッセイ感度（２０２個のサンプルのうち２０１個がＥ６、Ｅ７またはｐ１６  ＩＨＣ陽性である）を提供する。
【００７９】
子宮頸癌におけるＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７癌タンパク質およびｐ１６細胞内タンパク質の相違発現を示すサンプルについて、種々の経路が、これらの個々の事例に関する癌の発生に関与する可能性がある。データは、複数のバイオマーカー（すなわち、組み合わされたＥ６およびｐ１６  ＩＨＣアッセイ）が、９９．５％（１００％に近い）の子宮頸癌を検出することが要求されることを示唆している。
【００８０】
ＨＰＶ癌タンパク質および細胞内タンパク質は、両方が、発癌において重要な役割をし、ＨＰＶ関連癌の診断のためのバイオマーカーとして機能する。種々のＨＰＶ関連癌において研究されているさらなるバイオマーカーは、オーダーメイド医療を提供することを助けるであろう。
【００８１】
したがって、いくつかの実施形態は、抗体産生ハイブリドーマ細胞を精製されたＨＰＶ１６Ｅ６組み換えタンパク質および精製されたＨＰＶ１８Ｅ６組み換えタンパク質によってスクリーニングすることによって、２種の異なるＨＰＶ型、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方からのＥ６タンパク質における共通抗原決定基を認識することが可能なモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態は、ＨＰＶ１６Ｅ７およびＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質における共通抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を提供する。例として、モノクローナル抗体は、種々の生体サンプル、細胞株、さらに／または種々の段階の上皮内病変（ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬ、ＡＳＣ−ＵＳ）ならびに種々の子宮頸癌、扁平細胞癌腫（ＳＣＣ、一般的な癌の型）および腺癌腫（ＡＤＣ、腺癌の型）の臨床サンプルにおいて試験するのに用いられた。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ヒト対象のパピローマウイルス感染をスクリーニングする方法は、ヒト対象から臨床サンプルを得る工程と、種々のＨＰＶ組み換えタンパク質および癌タンパク質に特異的な研究室で生成した抗体を用いて、ヒト対象からの臨床サンプルにおいて１種以上の免疫学的アッセイを実施する工程とを含み、ヒト対象におけるＨＰＶタンパク質およびＨＰＶ抗体の存在からＨＰＶ感染の存在を検出し、これをスクリーニングする。いくつかの実施形態において、ヒト対象におけるＨＰＶタンパク質は、限定されないが、種々のＨＰＶ早期および後期タンパク質に対する種々のポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含めた、ＨＰＶ組み換えタンパク質に対する抗体を用いて検出される。
【００８３】
例示的な発癌性Ｅ６またはＥ７初期段階遺伝子のクローニングが本明細書に記載されている。ＨＰＶ−１６Ｅ６、Ｅ７またはＬ１遺伝子のアミノ酸コード領域を含有するＤＮＡ断片は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた。ＤＮＡ断片は、ヒスチジン標識発現ベクター内にサブクローニングされて、Ｅ６またはＥ７組み換えタンパク質の発現のためのプラスミドＤＮＡを生成した。中でも、ヒスチジン標識（例えば、Ｈｉｓ６、Ｈｉｓ８など）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を有する他の型の発現ベクターも用いた。加えて、ＤＮＡ断片は、他の発現系、すなわち、ｅ．ｂａｃｉｌｏｂｉｒｕｓ、酵母菌などにサブクローニングされて、種々のＨＰＶ型および菌株からＥ６またはＥ７組み換えタンパク質を発現することができる。例えば、バキュロウイルスにおいて発現されたＨＰＶ１６からのＬ１組み換えタンパク質が得られ、ＨＰＶ−１６−Ｌ１−バキュロとして設計された。
【００８４】
Ｅ６またはＥ７組み換えタンパク質は、ＩＰＴＧ駆動の誘導を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現された。３７℃において２時間タンパク質発現を誘導した後に、供給者（それぞれＡｍｅｒｓｈａｍおよびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって推奨されている標準のプロトコルを用いてＥ６またはＥ７組み換えタンパク質を得、約１ｍｇ／Ｌの最終濃度に精製した。タンパク質精製カラムにおけるより長い誘導時間およびリフローは、より高いタンパク質収量を生成し、かなり濃縮され精製された組み換えタンパク質を約２〜１０ｍｇ／Ｌの収量で生じることが見出された。組み換えＧＳＴ−Ｅ６またはＨｉｓＥ６タンパク質の純度は、ＰＡＧＥ分析に基づいて９０％を超えることが推定された。組み換えＥ６またはＥ７融合タンパク質は、臨床サンプルにおいてＥ６またはＥ７抗体の存在を検出するのに用いられ、また、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体の産生のための免疫原としても用いられた。
【００８５】
クローニング、および免疫学的アッセイを行うための基本的な技術は、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８９；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ならびに当該分野において知られている他の本およびマニュアルに見出すことができる。関連する免疫学的アッセイ、組織および／もしくは子宮頸部細胞のための免疫組織化学、ならびに／または免疫細胞学的アッセイ後のフローサイトメトリは、「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法および子宮頸癌におけるその適用」のタイトルで、２００６年１１月１３日に出願された米国特許出願第１１／５５９，３６６号、「ＨＰＶ検出のためのタンパク質チップ」のタイトルで、２００８年４月１４日に出願された米国特許出願第１２／０８２，７４０号、「ＨＰＶ検出のための抗体およびアッセイ」のタイトルで、２００８年６月１３日に出願された米国出願第６１／１３１，９９１号、および「ＨＰＶ関連子宮頸癌の初期段階状態および後期段階の検出、スクリーニングおよび診断に有用な、ＨＰＶタンパク質に対する新規モノクローナル抗体」のタイトルで、２００８年２月２２日に出願された米国出願第６１／１９２，９１２号、「ＨＰＶタンパク質に対する新規モノクローナル抗体」のタイトルで、２００９年６月１０日に出願された米国出願第１２／４５６，０５３号、「初期段階および後期段階のＨＰＶ感染のインサイチュでの検出」のタイトルで、２００９年６月１０日に出願された米国出願第１２／４５６，０５４号、「初期段階および後期段階のＨＰＶ感染のインサイチュでの検出」のタイトルで、２００９年６月１０日に出願された米国出願第１２／４５６，０５５号、「初期段階および後期段階のＨＰＶ感染の検出」のタイトルで、２００９年６月１０日に出願された米国出願第１２／４５６，０７６号、「ＨＰＶ関連癌の検出、スクリーニングおよび診断」のタイトルで、２００８年１１月１２日に出願された米国出願第６１／１９９，０１３号、および「ＨＰＶ関連癌の検出、スクリーニングおよび診断」のタイトルで、２００９年１１月１２日に出願された米国出願第米国出願第１２／５９０，７４７号と相互に関連する。上記相互関連出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
種々の実施形態はまた、一般のＨＰＶ感染ならびに種々のＨＰＶ遺伝子型、高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶによる感染を検出するのに有用な、種々の方法、検出アッセイ、キット、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ポリペプチド、組み換えタンパク質、ならびに核酸も提供する。加えて、ＨＰＶタンパク質の存在を検出する際のアッセイまたはサンプルフォーマットは、限定されず、子宮頸部組織、子宮頸部細胞、子宮頸部擦過物、血清、体液などに用いられ得る。有用なスクリーニングまたは診断アッセイは、ＩＨＣ、ＩＣＣ、フローサイトメトリ、ビーズにカップリングした抗体、迅速な試験、タンパク質チップ、ドットブロット、スロット、ならびに従来のＥＬＩＳＡアッセイであり得る。ＨＰＶタンパク質は、病理学者によるスコアリングの後、ＩＨＣ染色によって証明されるように上皮組織に存在することが、いくつかの実施形態に記載されている抗体によって検出され得る。
【００８７】
種々のＨＰＶ遺伝子型からのＨＰＶ  ＤＮＡ、ゲノム、早期ウイルスタンパク質、後期段階ウイルスタンパク質、癌タンパク質、および／またはカプシドタンパク質の検出は、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８９；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ならびに当該分野において知られている他の本およびマニュアルにしたがった種々のインビトロおよびインビボ方法ならびに検出アッセイによって実施され得、ＨＰＶ感染の一般の臨床スクリーニングにおいて非常に有用であり得る。
【００８８】
免疫学的アッセイによるＨＰＶ抗体および／または癌タンパク質の検出は、ＨＰＶ感染の早期臨床スクリーニングおよび子宮頸癌の一般の診断において用いられ得る。変更されたレベルのＨＰＶタンパク質および宿主タンパク質の匹敵する検出は、同じまたは異なるアッセイにおいて実施され得る。これは、子宮頸部のＨＰＶ関連癌腫、ならびにＨＰＶ感染によって誘導される上皮細胞の異常に関連するこれらの事例、前悪性および悪性ＨＰＶ関連上皮細胞病変、ならびにＨＰＶ−関連子宮頸部癌腫および腺癌腫を発生するリスクのあるこれらのものの診断においても用いられ得る。本明細書において記載されている方法は、独立して用いられても、従来の細胞学的パパニコロウ塗沫試験または組織学的試験に対する補助スクリーニングツールとして用いられてもよく、これらの結果は、患者の経過観測の管理と比較され得る。
【００８９】
より詳細な例
【００９０】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は、子宮頸部異形成および癌において重要な病因的役割をすることが認知されている。ウイルスゲノムの翻訳または転写などの下位の事象を検出しない、２種のＦＤＡ承認されたＨＰＶ  ＤＮＡ試験が存在する。これらの試験は、ＨＰＶ  ＤＮＡの存在を検出することができるが、真の前癌状態と自己限定性のＨＰＶ感染とを区別することができない。したがって、自己限定性の感染を有するこれらのＨＰＶ感染個体と臨床的に有意な疾患との間で区別するための臨床的必要性が存在する。さらに、分子診断補助剤を同定して、高度異形成および癌腫の検出のための子宮頸部細胞診試験の特異性を改善し、偽陰性の子宮頸部細胞診試験結果のリスクを低減する重大な臨床的必要性も存在する。癌の発生に寄与するメカニズムは、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７癌遺伝子の作用に大部分が起因する。これらの癌タンパク質は、主要な細胞周期チェックポイントで作動する腫瘍抑制遺伝子を不活性化する。ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７は、転写因子Ｅ２Ｆを放出してアポトーシスを誘導する腫瘍抑制因子であるｐ５３および網膜芽腫（ＲＢ）それぞれと相互作用してこれらを劣化させる。複数の目的で役に立つＥ７はまた、細胞周期遺伝子も刺激し、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤の機能もブロックし、腫瘍形成に寄与する異数性も誘導する。前癌状態の病変において、Ｅ６およびＥ７タンパク質は、良性組織において見られるよりもかなり高いレベルで発現され、この増加したＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７癌タンパク質発現は、前癌状態へのＨＰＶ感染の進行を示す。治療剤は、Ｅ７の機能をブロックすることが効果的に見出された。したがって、Ｅ７癌タンパク質を高度ＣＩＮ２／３に特異的なバイオマーカーとして検出する能力は、専門家が、１）ＨＰＶ感染を真の前癌状態の病変と区別すること、２）子宮頸部組織における高度異形成細胞および腫瘍細胞を同定すること、３）良性のＨＰＶ感染を有する女性における不必要な膣鏡および生検を防止することを可能にし得る重大な前進である。Ｅ６およびＥ７癌タンパク質は、単離するのが歴史的に困難であった。本発明者らは、ＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７癌タンパク質に対してかなり特異的な独自抗体を開発した。子宮頸癌に加えて、ＨＰＶ  ＤＮＡの存在は、下方の肛門性器路（肛門、外陰、膣および陰茎、ならびにいくつかの口腔、頭頸部、および皮膚癌からの腫瘍組織において検出された。本発明者らが開発したＥ６  Ｅ７バイオマーカーは、複数の集団および器官部位においてＨＰＶ感染に関連する癌／前癌状態を検出するのに有用であることが予想される。技術的課題は、子宮頸部細胞学的サンプルにおいて、ＨＰＶ関連癌タンパク質が一般に、形態学的に正常な細胞と形態学的に異常である少量分との混合物に起因して低いレベルで存在することである。
【００９１】
子宮頸癌の発病における主要な因子であるＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７癌遺伝子は、異形成および悪性細胞において過剰発現される。Ｅ６およびＥ７遺伝子の両方が、増殖刺激活性を有する。これらの遺伝子およびこれらのそれぞれのタンパク質は、悪性転換について有意な役割をする。これらの接合機能は、形質転換活性の増加を結果としてもたらすが、それぞれが自身の発癌経路を持ち、それぞれがヒト細胞を独立して不死化することができる。そのため、Ｅ６およびＥ７癌タンパク質の各々は、子宮頸癌の主要なマーカーとして処理されなければならない。Ｅ６またはＥ７癌タンパク質は、多機能性タンパク質として作用して、発癌に必要な複数の重大な細胞経路を無秩序にする。発癌性ＨＰＶ型のＥ６およびＥ７癌タンパク質の過剰発現は、子宮頸癌に非常に特異的なマーカーであることが示唆された。したがって、組織におけるＥ６およびＥ７癌タンパク質の検出は、高リスクＨＰＶの検出または他の内因性細胞周期マーカーよりも、真の前癌状態を同定するためのより直接的かつ特異的な試験であることを約束する。しかし、臨床診断に好適なバイオマーカーとしての抗Ｅ６抗Ｅ７抗体を開発することに誰もが未だ成功していない。
【００９２】
現在のＨＰＶ  ＤＮＡ試験は、高リスクＨＰＶ型による感染を検出するが、良性ＨＰＶ感染と高度の前癌状態の病変とを区別することができない。他の発展途上のバイオマーカーアッセイ、例えばｐ１６およびｐｒｏＥｘＣは、ＨＰＶ感染に特異的でない内因性細胞マーカーを検出する。癌遺伝子転写産物を検出するＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７  ｍＲＮＡ試験は、ＰａｐおよびＨＣ２試験に対して改善された特異性を実証するが、試験手順は、高価で高機能の器具類を必要とする。加えて、ｍＲＮＡ試験は、極めて低い存在度および特有のＲＮＡ分解傾向に起因して日常的な臨床診断に良好であることはない。インサイチュでのハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織におけるＨＰＶ  ＤＮＡまたはＥ７  ｍＲＮＡを検出するが、臨床検査室において広範に採用されてはいない。ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７癌タンパク質は、Ｅ６  Ｅ７  ｍＲＮＡの試験よりも良好なバイオマーカーとして機能する。なぜなら、ＩＨＣが、ＩＳＨよりもロバストであり、癌タンパク質が、アポトーシスおよび異常な細胞成長に関与するＲＢ腫瘍抑制因子タンパク質と直接相互作用してこれをブロックする癌遺伝子の実際の最終産物であるからである。しかし、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７のためのＩＨＣは、インビトロ診断に未だ利用可能でない。これまでは、限定された抗ＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７抗体のみが利用可能である。本発明者らの抗ＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７抗体は、非変性ＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７組み換えタンパク質に対して産生されている。本発明者らが開発した特異的な抗Ｅ７抗体を用いて、本発明者らは、ＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７タンパク質を主要な因子として直接検出して、高度のＣＩＮ２／３を同定する診断試験のためのロバストなＩＨＣプラットホームを開発することを目的とする。本発明者らは、このプラットホームが、細胞学的サンプルにおいて前癌状態の病変を良性のＨＰＶ感染と区別することができるロバストなＨＰＶ  Ｅ７イムノアッセイに拡大され、これにより、スクリーニング設定における医療的治療介入の利益を享受し得るものを同定することができると構想する。
【００９３】
詳細例１
【００９４】
いくつかの実施形態は、ＨＰＶタンパク質に対するモノクローナル抗体に向けられる。多量の精製された組み換えＨＰＶタンパク質を免疫原としてネイティブコンホメーションで得ることは、臨床サンプルにおいてＨＰＶタンパク質を検出するのに特異的な抗体を生成する際の第１の重大なステップとなる。Ｅ６およびＥ７は、タンパク質精製の間の望ましくない凝集、タンパク質の不安定性、低レベルの発現、および精製されたタンパク質の低い免疫原性応答に起因して、単離および精製することが非常に困難であることが知られている。本発明者らは、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７組み換えタンパク質を変性されていない可溶性形態で産生するための技術的障壁を克服した。本発明者らが開発した精製方法が、抗ＨＰＶ抗体に結合するネイティブ形態に密接に近いコンホメーションを結果として生じることを実証するために、本発明者らは、精製された組み換えＨＰＶタンパク質を試験するためのヒトＨＰＶ抗体を含有するＨＰＶ感染した子宮頸部サンプル（ＰＣＲによって高リスクＨＰＶ陽性）を用いた。ＨＰＶ感染を検出するためのかかる精製されたＥ６およびＥ７組み換えタンパク質を用いた研究により、これらのタンパク質が、ＨＰＶ感染に対するヒト免疫応答によって産生される抗ＨＰＶ抗体に結合することが確認された。これらの結果は、かかる精製された組み換えＨＰＶタンパク質が、抗血清を生じる、および天然ＨＰＶウイルスタンパク質をインビボで認識することができる抗体を生成するための免疫原としての使用に好適であることを示唆している。本発明者らは、変性されていない可溶性のＥ６およびＥ７組み換えタンパク質を抗原刺激に用い、これにより、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７癌タンパク質に対してかなり特異的な独自抗体を開発した。
【００９５】
最初の研究は、種々の用途：子宮頸癌組織におけるＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット、および免疫組織化学（ＩＨＣ）を介した、本発明者らの新規の抗Ｅ６および抗Ｅ７抗体の使用を支持した。臨床サンプルからの検証結果は、本発明者らの抗Ｅ７モノクローナル抗体が、子宮頸部組織における高度異形成の同定のためのバイオマーカーとして用いられ得ること、および臨床診断のために潜在的にさらに発展され得ることを示唆している。
【００９６】
ＨＰＶ組み換えタンパク質は、いずれの種類のＨＰＶウイルスタンパク質、限定されないが、Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２を含めた早期遺伝子および／または後期遺伝子のＨＰＶタンパク質であってもよく、種々のＨＰＶ型からであってもよい。いくつかの実施形態は、組み換えタンパク質、例えば、部分配列または全長配列のＨＰＶ発癌タンパク質を含有する組み換えハイブリッドタンパク質を提供する。例えば、全長Ｅ６、Ｅ７、および／またはＬ１ポリペプチド配列は、タンパク質精製の間の望ましくない凝集、タンパク質の不安定性、低レベルの発現、および精製されたタンパク質の低い免疫原性応答に起因して、得ることおよび精製することが非常に困難であることが見出されている。例えば、多くの早期Ｅ６癌タンパク質は、多くのシステインアミノ酸を含有するため、Ｅ６癌タンパク質の正確なトポロジーは、多くのジスルフィド結合の適正な形成を必要とする。加えて、早期Ｅ６およびＥ７タンパク質の小さなペプチドを用いたある一定の免疫学的アッセイが、極めて低いアッセイ特異性および感度を結果としてもたらすことが知られており、そのため商業化された診断ツールとして好適でなかった。
【００９７】
ＨＰＶ組み換えタンパク質は、抗血清を生成するための、およびハイブリドーマ細胞株からのモノクローナル抗体のスクリーニングのための免疫原として用いるのに生成された：種々の組み換えタンパク質のクローニングおよび産生は、ＨＰＶ１６Ｅ６およびＨＰＶ１８Ｅ６遺伝子、ＨＰＶ１６Ｅ７およびＨＰＶ１８Ｅ７遺伝子、ＨＰＶ１６Ｌ１およびＨＰＶ１８Ｌ１遺伝子によってコードされる遺伝子を含む。かなり望ましいコンホメーションを有するネイティブ形態に（またはこれに近接して）大部分がある組み換えタンパク質を提供するために、大腸菌において発現される組み換えＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７またはＬ１タンパク質を、可溶分から精製し、次いで濃縮し、ＰＢＳによって透析して免疫原として用いた。マウスの免疫付与および融合を標準的な手順によって行い、ＥＬＩＳＡにおいて、本発明者らのスクリーニング基準を満たしたクローンを選択した。各ハイブリドーマ細胞株を組織培養において成長させ、腹水生成のためにマウスに注入した。腹水を収集し、アイソタイプ化し、ＨＰＶイムノアッセイでの使用のためのタンパク質Ｇカラムによって精製した。
【００９８】
子宮頸癌から高リスク型として同定されている１５型による性器感染において同定されている４０を超えるＨＰＶ型が存在し、中でも、ＨＰＶ１６型が子宮頸癌事例の約５０％を占め、１８型がさらに２０〜２５％を占める。しかし、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８感染を含めた多くのＨＰＶ感染が自己限定性であるため、組織におけるＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７癌タンパク質の検出は、ＨＰＶ型に関わらず、高度異形成細胞を同定する最も直接的かつロバストな試験であり得る。本発明者らの目標は、癌の発生に関連する最も高リスクのＨＰＶ型と反応することが可能であるＨＰＶ  Ｅ７特異的モノクローナル抗体を得ることであった。本発明者らは、ＨＰＶ１６型および１８型（子宮頸癌事例の約７５％を占める）からのＨＰＶ組み換えタンパク質を有するハイブリドーマクローンをスクリーニングし、大部分または全ての高リスクＨＰＶ型から関連するタンパク質を検出することが可能であるクローンを同定した。加えて、本発明者らは、関連しないＨＰＶタンパク質を有するハイブリドーマクローンをスクリーニングし、ＨＰＶ構造タンパク質との非特異的結合を有するものを排除した。ハイブリドーマスクリーニングにおいて用いられる精製された組み換えヒトパピローマウイルスタンパク質として、限定されないが、ＨＰＶ１６Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８Ｅ６タンパク質、およびＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質が挙げられる。本発明者らのＩＨＣ結果を、試験した組織からのＨＰＶ遺伝子型決定データと比較すると、本発明者らの抗Ｅ７抗体は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８だけでなく、１６型と密接に関係する追加の高リスク型（すなわち、３１、３３、３５、５２、５８型）および１８型と密接に関係する追加の高リスク型（すなわち、４５型）も含めた一般的な高リスク型の大部分を同定する。
【００９９】
いくつかの実施形態は、ＣＩＮ２／３のためのＥ７抗体を開発することにある３つの課題を解決することに向けられる。第１に、ＨＰＶタンパク質は、単離するのが困難であるような少量で臨床サンプル中に存在する。第２に、それぞれ、区別できるＥ７コード配列を有する、多くのＨＰＶ型が存在する。第３に、ＨＰＶタンパク質は、抗体産生のための免疫原として用いられる、ＨＰＶ感染した培養された細胞株から大量産生かつ精製されることに成功していない。小さな合成ペプチドまたは変性組み換えタンパク質のいずれかに対して産生される公知の抗ＨＰＶ抗体は、臨床診断における使用に一般に好適でない。なぜなら、感染したヒト細胞における天然のＨＰＶウイルスタンパク質と必ずしも反応しないからである。別の技術的課題は、ホルマリン固定およびパラフィン埋込の際に、天然で感染したヒト組織において起こるコンポメーション変化であり、タンパク質を、臨床的に関係するサンプルにおいて検出することを困難にする。これらの因子は、変性組み換えタンパク質または合成ペプチドから産生される利用可能な抗体がＩＨＣのために働かないという事実に関する説明を提供する。加えて、Ｅ７タンパク質の小さなペプチドを用いたある一定の免疫学的アッセイが、極めて低いアッセイ特異性および感度を結果としてもたらすことも知られていた。したがって、インビトロ診断のための臨床サンプルに存在するウイルスタンパク質を検出することが可能である抗ＨＰＶ抗体を生成するための免疫原として精製されたネイティブ形態で利用可能なＥ６またはＥ７タンパク質は存在しない。
【０１００】
詳細例２−免疫細胞化学アッセイ（ＩＣＣ）
【０１０１】
いくつかの実施形態は、剥離された子宮頸部細胞におけるＨＰＶタンパク質および細胞内タンパク質の検出を含むイムノアッセイに向けられる。サンプル調製：液体系溶液から収集した子宮頸部擦過物細胞を、２部（１部は細胞学的パパニコロウ染色用、別の１部は、いくつかの実施形態に記載されているＨＰＶ抗体を用いた免疫細胞化学的な染色用）に分割した。Ｐａｐ塗沫結果において、パパニコロウ染色サンプルを、０〜１７にスコアリングした。スコア１（１）〜３（３）は、正常であると考えられ、スコア４（４）以上は異常であると考えられる。Ｐａｐ塗沫報告の解釈は、時折、意義を唱えられ得る。Ｂｅｔｈｅｓｄａ２００１システムに基づくと、陰性のＰａｐ塗沫は、陰性上皮内病変または悪性を含む場合があり、異常なＰａｐ塗沫は、異形成または病変の発生における種々の段階の扁平細胞を含む場合がある。例えば、ＬＳＩＬ：軽度の扁平上皮内病変、ＨＳＩＬ：高度の扁平上皮内病変、ＣＩＮ１：子宮頸部上皮内新生物；軽度の細胞異常性、ＣＩＮ２：より侵攻性であると見られる病変を有する子宮頸部上皮内新生物、ＣＩＮ３：侵攻性形態の異形成を有する子宮頸部上皮内新生物。侵襲性癌は、扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）、腺癌腫（ＡＤＣ）などを含み得る。意義不明の異常な細胞として、ＡＳＣ−ＵＳ、意義不明の異型扁平細胞、重要でない場合がありその意義が不明であるＰａｐ塗沫における普通でないまたは異型の細胞、およびＡＧＵＳ（意義不明の異型腺）が挙げられる。同定された異常な細胞について、ＨＰＶ  ＩＣＣ染色は、ＨＰＶ感染の状況および／またはＨＰＶ癌タンパク質の発現について追加の情報を提供し得る。したがって、ＨＰＶ  ＩＣＣ染色アッセイは、パパニコロウ染色と比較して、ＰａｐＬＳＩＬもしくはＨＳＩＬサンプルからの高度異形成細胞、および／またはＡＳＣ−ＵＳもしくはＡＧＵＳのような意義不明の異常な細胞を同定するのに非常に有用である。
【０１０２】
ＩＣＣ法を用いたイムノアッセイの例として、子宮頸部擦過物からの細胞を収集し、遠心分離し、洗浄し、免疫染色した後に、本明細書に記載されているＩＣＣ手順に付す。液体系溶液によって収集された子宮頸部擦過物を、製造指示にしたがって処理した。次いで、子宮頸部細胞を、サイトスピンまたはｔｈｉｎ  ｐｒｅｐ技術によって単層中に処理した。次いで、スライド上の単層の細胞を固定し、抗ＨＰＶ抗体によって染色し、続いてＨＰＶ  ＩＣＣプロトコルに付す。染色された細胞を顕微鏡下で可視化する。
【０１０３】
いくつかの実施形態においてＩＣＣアッセイを実施するためのキットが提供される。キットは、前抗体ブロッキング溶液、後抗体ブロッキング溶液、一次抗体としての抗ＨＰＶ抗体、ＨＲＰもしくはビオチンとコンジュゲートした抗マウスもしくは抗ウサギ免疫グロブリン、または二次抗体としての他の作用物質、検出される二次抗体の基質として用いられる適切な作用物質を含有する溶液を含んでいてよい。
【０１０４】
抗ＨＰＶ抗体はまた、ＨＲＰもしくはビオチン、または適切な作用物質を基質として用いて検出される他の作用物質によって直接標識されていてもよい。前抗体ブロッキング溶液は、ある一定のタンパク質、ＢＳＡ、血清または他の作用物質を含有して、一次抗体の非特異的結合から細胞をブロックすることができる。後抗体ブロッキング溶液は、一次抗体のインキュベーションと共に用いられる極少量のブロッキングタンパク質または血清を有する前抗体ブロッキング溶液と同様の溶液を含有し得る。ＨＰＶ抗体を含有する溶液は、試薬を用いる準備ができている、濃縮形態であっても希釈形態であってもよい。二次抗体を含有する溶液は、試薬を用いる準備ができている、濃縮形態であっても希釈形態であってもよい。基質として用いられる適切な作用物質を含有する溶液は、一成分または二成分としてＤＡＢ（３．３’−ジアミノベンジジン）を含んでいても、一成分としてもしくは二成分としてまたは他の基質としてＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）を含んでいてもよい。
【０１０５】
子宮頸部擦過物からのヒト細胞が処理されてスライド上の単層または薄層の細胞内に固定されたら、免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイを、前抗体ブロッキング溶液によって一定期間ブロックすること、続いてＨＰＶ抗体によってインキュベートすることによって実施する。次いでスライドをＰＢＳもしくはＨ２Ｏ、または他の任意の結合されていないＨＰＶ抗体を取り除くための他の溶液によって３〜５回洗浄する。次いでスライドを二次抗体、例えば抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰによってインキュベートし、その後、洗浄、および検出に適切な基質の結合が続く。基質の例として、ＤＡＢは、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下に酸化され、褐色のアルコール不溶性沈澱物の析出を酸素活性の部位にてもたらす。沈殿物は、存在する酵素の量に応じて淡琥珀色から濃琥珀色までの範囲の色であり得る。顕微鏡下で見られた琥珀色の沈澱物は、ＨＰＶ抗体と細胞に存在するＨＰＶタンパク質との特異的結合を示す。アッセイは、室温以上で実施されて、結合反応を加速することができる。このＨＰＶ  ＩＣＣアッセイは、手動で実施されてもＩＣＣの自動化によって操作されてもよく、これにより、ＨＰＶ感染についてスクリーニングし、子宮頸部擦過物からの上皮細胞に局在化したＨＰＶ癌タンパク質をインサイチュで検出する有力なツールを提供する。
【０１０６】
ＨＰＶ  ＩＣＣアッセイが、種々の病期からの異形成細胞を同定することができることを実証するために、軽度、中程度、重篤な、または侵襲性の新生物からの全てのサンプルを試験した。これらのサンプルとして、限定されないが、例えば、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬまたはＡＳＣ−ＵＳが挙げられる。本明細書に記載されているＩＣＣアッセイが、種々の液体系溶液中の種々の段階からの種々のサンプル源について染色するのに用いられ得ることを実証するために、種々の液体系溶液中の種々の段階のサンプルも調製して、いくつかの実施形態において、ＩＣＣアッセイを実施した。
【０１０７】
中程度異形成は、子宮頸部の表面が成長するはずである場合よりも早く中程度に成長して、軽度の段階を超えて進行したことを意味する。子宮頸部の生検は、有意に成熟せずに、皮膚の表面を通って途中まで成長している未成熟の基底細胞を示す。中程度異形成は重要である。なぜなら、これらの変化が進んで、処置しないと侵襲性子宮頸癌に進行し得るかなり高いリスクがあるからである。この理由のために、中程度異形成は、「高度」病変、またはＨＧＳＩＬとして知られている。この状態の別の同義語は、「ＣＩＮ２」（子宮頸部上皮内新生物、異型度ＩＩ）である。Ｐａｐ塗沫における中程度異形成は、膣鏡診による子宮頸部のさらなる研究が必要とされることを通常示す。中程度異形成が確認されると、ひいては、通常は処置される。処置は、結手術、ＬＥＥＰ、またはレーザを含んでいてよい。処置の後、再発（約１０％の確率）するときには、再発が直ちに診断されてさらなる処置が実施されることを確実にするような追跡調査として常習的なＰａｐ塗沫が通常得られる。
【０１０８】
ＨＰＶ  ＩＣＣアッセイがＨＳＩＬ細胞を検出することができることを実証するために、図１Ａは、パパニコロウ染色によってＣＩＮ２と診断され、別の液体基溶液中で調製された子宮頸部擦過物細胞が、抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色され得ることを示す。図１Ａに示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比（黒矢印として示される）を有して互いに接続形態にある、ＣＩＮ２のＨＳＩＬの異常な細胞は、核および細胞質に陽性に染色される。これらの結果は、ＩＣＣアッセイにおいて、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いることによって、存在するＨＰＶ  Ｅ７タンパク質が、種々の液体系溶液源中の中間段階の新生物からの異常な細胞において、インサイチュで検出され得ることを実証する。
【０１０９】
図１Ｂは、別の液体基溶液中で調製された子宮頸部擦過物細胞の別のＣＩＮ２サンプルが、抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色され得ることを示す。図１Ｂに示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比（黒矢印として示される）を有して互いに接続形態にある、ＣＩＮ２のＨＳＩＬの異常な細胞は、核および細胞質に陽性に染色された。これらの結果は、ＩＣＣアッセイにおいて、存在するＨＰＶ  Ｅ６タンパク質が、本明細書に記載されているマウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体を用いて、種々の液体系溶液源中の中間段階の新生物からの異常な細胞において、インサイチュで検出され得ることを実証する。
【０１１０】
異常な細胞は、下層の組織に基底膜を経て侵入するとき、癌であると考えられる。重篤な異形成については、癌であるとは考えられないが異形成にある異常な細胞が基底膜を通って侵入していない前癌状態の問題である。したがって、定義により、これらは癌でない。インサイチュの癌腫は、皮膚の全厚に延在する異常な細胞が存在することを意味する。これらの細胞は、個々に癌細胞のように見える。インサイチュの癌腫は、重篤な異形成、またはＣＩＮ３と臨床的に等価であると多くの著者によって考えられており、直ちに注意深く評価されるべきである。処置は、異常な細胞を凍結させ（凍結手術）、異常な細胞を蒸発させ（レーザ）、または電気外科的ワイヤループ（ＬＥＥＰ）によって異常な細胞を削り落とすことによって異常な細胞を排除することを含んでいてよい。いくつかの状況において、問題を排除するには子宮頸部円錐切除の形態のより高価な手術が必要とされる。
【０１１１】
本明細書に記載されているＩＣＣアッセイが液体系溶液中の重篤な子宮頸部内新生物細胞に用いられ得ることを実証するために、種々の液体系溶液中のＣＩＮ３の子宮頸部擦過物サンプルも、いくつかの実施形態に記載されているＩＣＣアッセイを実施するために調製した。図２は、（パパニコロウ染色によってＣＩＮ３と診断された）子宮頸部擦過物細胞が抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色され得ることを示す。図３Ａ〜３Ｄは、同じ抗ＨＰＶ  Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた、別のＣＩＮ３サンプルのＩＣＣ染色結果を示す。図３Ａ〜３Ｄに示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比（黒矢印として示される）を有して互いに接続形態にある、ＣＩＮ３のＨＳＩＬの異常な細胞は、核および細胞質に陽性に染色された。これらの結果は、ＩＣＣアッセイにおいて、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質の存在が、本明細書に記載されているマウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体を用いて、種々の液体系溶液源中の中間段階の新生物からの異常な細胞において、インサイチュで検出され得ることを実証する。これらの結果はまた、ＩＣＣアッセイにおいて、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質の存在が、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体を用いて、液体系溶液のＣＩＮ３からの異常な細胞において検出され得ることも実証する。
【０１１２】
図４Ａおよび４Ｂは、図３Ａ〜３Ｄに示すのと同じＣＩＮ３サンプルからの抗ＨＰＶ  Ｅ７  マウスモノクローナル抗体を用いた、ＩＣＣ染色の２つの代表的な画像を示す。該画像は、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比（黒矢印として示される）を有して互いに接続形態にある、ＣＩＮ３のＨＳＩＬの異常な細胞が、核および細胞質に陽性に染色されたことを実証する。これらの結果は、ＩＣＣアッセイにおいて、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質の存在が、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いて、種々の液体系溶液源中の中間段階の新生物からの異常な細胞において、インサイチュで検出され得ることを実証する。これらの結果は、ＩＣＣアッセイにおいて、存在するＨＰＶ  Ｅ７タンパク質が、本明細書に記載されているマウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いて、液体系溶液のＣＩＮ３からの異常な細胞において検出され得ることも実証する。
【０１１３】
ｐ１６が後期段階の新生物において過剰発現されることを確認するために、ＩＣＣ染色を、図３および４に示すのと同じＣＩＮ３サンプルにおいて、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いて実施した。図５は、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いた、同じＣＩＮ３サンプルからのＩＣＣ染色の結果を示す。図に示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比（黒矢印として示される）を有して互いに接続形態にある、ＣＩＮ３のＨＳＩＬの異常な細胞は、核および細胞質に陽性に染色された。これらの結果は、ｐ１６タンパク質の存在が、中間から後期段階の新生物からの異常な細胞において、インサイチュで検出され得ることを実証する。図２〜５に提示されているこれらの全ての結果は、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、およびｐ１６タンパク質の存在が、ＩＣＣアッセイにおいて、本明細書に記載されているマウスモノクローナル抗体を用いて、液体系溶液の、ＣＩＮ３からの異常な細胞において、インサイチュで検出され得ることも実証する。
【０１１４】
子宮頸部の癌は、生殖器に影響する最も一般的な形態の癌の中にある。該癌は、近隣の組織、血管、リンパ管およびリンパ節に局所的に侵襲性である。該癌は、その進んだ段階において、処置するのが困難であり得、致命的な結果であることが判明する場合がある。子宮頸部の癌を発生する前に、異形成として知られる可逆性である前癌状態の変化の期間が通常存在する。大部分の子宮頸部癌は外面皮膚を作り上げる扁平細胞からのものであるが、子宮内に至る子宮頸部管の内側を覆う粘液産生細胞から生ずる偶発癌が存在する。この腺型は、「扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）」と対照的に「腺癌腫（ＡＤＣ）」と呼ばれる。扁平細胞癌とは異なり、腺癌腫前駆体は、存在する場合、Ｐａｐ塗沫において同定することが困難であり得、これにより腺癌腫を検出することを困難にする。扁平細胞異形成から子宮頸部の扁平細胞癌への遅い進行は、腺癌腫におけるほど均一なものではない。その結果、子宮頸部の腺癌腫は、扁平細胞癌腫よりも進んだ段階において頻繁に検出される。処置は、より一般的な扁平細胞癌の処置と同様である。しかし、腺癌腫は、より多くの場合においてより進んだ段階で見出されるため、より侵攻性の処置が必要とされることが多い。したがって、いくつかの実施形態に記載されているＨＰＶ  ＩＣＣアッセイを用いて、液体基溶液中の腺癌腫細胞の早期スクリーニングからＨＰＶタンパク質の存在を検出することが重要になる。
【０１１５】
本明細書に記載されているＩＣＣアッセイを適用して液体系溶液中の子宮頸癌細胞を検出することができることを実証するための例として、種々の液体系溶液中の種々の癌腫の子宮頸部擦過物サンプルも調製し、いくつかの実施形態に記載されているＩＣＣアッセイを実施した。例として、図６Ａは、最も一般的な子宮頸癌型の１種である、（パパニコロウ染色によって扁平細胞癌腫と診断された）ＳＣＣが、抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色され得ることを示す。図６Ｂは、図６Ａと同じＳＣＣサンプルにおける、抗ＨＰＶ  Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色の結果を示す。ｐ１６も後期段階の新生物において過剰発現されることを確認するために、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色を、図６Ａおよび６Ｂにおいて用いられたのと同じＳＣＣサンプルにおいて実施した。図６Ｃは、図６Ａおよび６Ｂにおいて用いたのと同じＳＣＣサンプルにおいて抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色の結果を示す。図６Ａ〜Ｃに示すように、ＨＳＩＬ  ＳＣＣ細胞は、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比（黒矢印として示される）を有して互いに接続形態にあり、核および細胞質に陽性に染色された。これらの結果は、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、およびｐ１６タンパク質の存在が、ＩＣＣアッセイにおいて、本明細書に記載されているマウスモノクローナル抗体を用いて、液体系溶液の種々の型の子宮頸癌からの異常な細胞において、インサイチュで検出され得ることを実証する。
【０１１６】
本明細書に記載されているＩＣＣ染色が、ＨＰＶ抗体と、子宮頸部擦過物細胞のインサイチュで存在するＨＰＶタンパク質との特異的結合から得られることを実証するために、ＩＣＣアッセイにおいて試験するための液体系溶液からの正常な子宮頸部細胞も得た。図７Ａは、抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＩＣＣによって陰性に染色された、液体基溶液中で調製された、パパニコロウ染色によって診断された正常な子宮頸部擦過物細胞を示す。ＩＣＣ染色もまた、図７Ｂに示すのと同じ抗ＨＰＶ  Ｅ７モノクローナル抗体を用いて、同じサンプルにおいて実施した。ＩＣＣアッセイは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ６またはマウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いた陰性染色結果を示し、これにより、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質もＨＰＶ  Ｅ７タンパク質も、正常な子宮頸部擦過物細胞においてインサイチュで存在しないことを実証している。したがって、これらの結果は、いくつかの実施形態に記載されているＩＣＣアッセイが、本明細書に記載されているＨＰＶ特異的抗体を用いたＨＰＶタンパク質の検出に特異的な染色方法であることを示す。
【０１１７】
免疫系障害を含めた多くの因子が軽度異形成の発生に寄与するが、ＨＰＶによる感染は、恐らく最も重要な因子である。軽度異形成は、生ずる場合、持続的な特徴ではない。軽度異形成は退行するまたは進行するいずれかの可能性があり、女性の子宮頸部（およびＰａｐ塗沫）に一時期存在するが、持続しない。これは、これらの変化の必要条件であるＨＰＶウイルスが子宮頸部皮膚細胞内に潜伏している可能性があるという事実に由来する。ＨＰＶは、女性の免疫系によるチェックによって正常に保たれ、免疫系撹乱の度に、より迅速な成長をもたらす細胞メカニズムを再活性化することができる。軽度異形成を示す単一のＰａｐ塗沫を生ずる女性には、一般的に以下の基本的に３種のアプローチが存在する：１）６ヶ月、Ｐａｐが繰り返される。これらのＰａｐの異常の大部分は、特に若い女性の間で、自己限定性ＨＰＶ感染となる。他に処置することなく繰り返されたＰａｐ塗沫により、これらの多くの子宮が治癒することが考慮され、他のより高価な治療介入を回避する。他方で、繰り返されるＰａｐアプローチの主な不利点は、膣検診をいずれにせよ最終的に必要とする大部分の女性にとって、分かってはいるが解決されない健康問題に対する種々の程度の不安に付されているということである。２）迅速な膣鏡診。多くの女性は、直ぐ調査されることなく異常が簡単に観察されることに対して不安を感じるであろう。このアプローチに対する主な不利点は、偽陽性のＰａｐ塗沫を有する女性さえも中程度に費用の掛かる評価を受けるであろうことである。３）診察および処置。膣鏡による評価および対象とされる生検、続いての数日または数週間後の処置の形態の代わりに、一部の医師は、膣鏡診によって子宮頸部を評価すると同時にＬＥＥＰが適切である女性にＬＥＥＰ手順を直ちに実施することを好む。しかし、とりわけ、大部分の患者にとって、過剰処置である。
【０１１８】
ＡＳＣ（異型扁平細胞）の報告は、細胞学者が、完全に正常でないＰａｐ塗沫を説明するのに用いる方法である。しかし、彼らは、どの種の異常であるか、またはどのように有意であるかを確実に言うことはできない。ＡＳＣ  Ｐａｐは、２つの型に再分割される：ＡＳＣ−ＵＳ（意義不明）、ＡＳＣ−Ｈ（高度ＳＩＬを除外できない）。ＡＳＣと診断された女性の中で、子宮頸部の高度病変を有する少数の女性が存在する。ＡＳＣ−ＵＳを有する女性の５％〜１７％が、存在する高度ＳＩＬを有し得る（ＣＩＮ２またはＣＩＮ３）。ＡＳＣ−Ｈを有する女性の２４％〜９４％が、高度ＳＩＬを有し得る。したがって、ＨＳＩＬに進行するＡＳＣ  Ｐａｐの可能性が無視できない。子宮頸部の侵襲性癌のリスクは、あらゆるＡＳＣ  Ｐａｐを有する女性の中の約０．１％〜０．２％である。
【０１１９】
ＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７免疫細胞化学的（ＩＣＣ）アッセイは、ＨＰＶ感染を検出するだけでなく、ＨＰＶ発癌タンパク質をインサイチュで検出する。したがって、種々の特異的かつ一般的な抗ＨＰＶ抗体と組み合わせたＩＣＣアッセイは、標準的なＨＰＶ  ＤＮＡ試験またはＰａｐ塗沫アッセイと比較して、インサイチュのＨＰＶ検出に有力なツールであり得る。
【０１２０】
表１は、液体系溶液中の種々の子宮頸部擦過物サンプルにおいてマウス抗ＨＰＶ  Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＨＰＶ  Ｅ６ＩＣＣアッセイの結果を示す。紹介外来から得た合計で８５個のサンプルをＴｈｉｎＰｒｅｐで収集した。表１における結果は、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質が、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体を用いた免疫細胞化学的（ＩＣＣ）アッセイによって、スライドに固定された単一細胞においてインサイチュで検出され得ることを実証する。ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のインサイチュでの存在は、種々の液体系溶液中の種々の段階の子宮頸部擦過物サンプルから検出され得る。同じ子宮頸部擦過物サンプルもまた、標準のパパニコロウ染色によって処理し、ＩＣＣ染色結果とＰａｐ塗沫結果とを比較した。表１に示すように、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質は、それぞれ、陽性率を増加させながら、正常、ＡＳＣ−ＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬの子宮頸部擦過物サンプルに存在する。
【０１２１】
Ｐａｐ  ＨＳＩＬまたはＣＩＮ２／３を有するサンプルについては約１００％の陽性率であるが、正常なＰａｐを有すると診断されたサンプルは１４％のみが、同じ抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体を用いたＩＣＣによって陽性染色した。ＡＳＣサンプルについては、約３３％のＡＳＣ−ＵＳおよび約５０％のＡＳＣ−Ｈが、表１に示すＬＳＩＬ、ＨＳＩＬサンプルに用いたのと同じ抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体によって陽性染色し、これらのＡＳＣ−ＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプル対象における発癌タンパク質の発現が、さらなる疾患の進行について追跡調査されることを示している。Ｐａｐ  ＡＳＣ−ＵＳおよびＨＰＶ  Ｅ６  ＩＣＣ染色が陰性であるサンプルについては、進行性病変を発生するリスクが少ない場合がある。これらの結果は、本明細書に記載されているＨＰＶ  Ｅ６  ＩＣＣアッセイが、疾患の管理の決定をするためにＨＰＶ感染のさらなる情報を提供するのに非常に有用であることを示唆する。
【０１２２】
表１．液体系溶液中の種々の子宮頸部擦過物サンプルにおけるマウス抗ＨＰＶ  Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色
【表１】
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【０１２３】
表２は、表１からのＩＣＣ染色結果のまとめを示す。データが示すように、いくつかの実施形態に記載されている抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体を用いたＩＣＣ染色法は、≧ＣＩＮ２について６６％％の特異性で９５％のＩＣＣアッセイ感度を提供する。これらのデータは、このアッセイが、５０％のＰＰＶ（陽性予測値）および９８％のＮＰＶ（陰性予測値）を有してＨＰＶタンパク質を検出して、日常的なＰａｐ染色と共に、異常なＰａｐを有する患者をトリアージする、または一般の集団からの子宮頸癌をスクリーニングするのに有用であり得ることを示唆する。
【０１２４】
表２．液体系溶液中のＣＩＮ２の子宮頸部擦過物サンプルにおけるマウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ６抗体を用いたＩＣＣ染色結果のまとめ
【表２】
2012526286.tif 000004
【０１２５】
ＨＰＶ  ＩＣＣアッセイの別の例として、表３および表４は、抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色の結果を示す。データが示すように、ＨＰＶ抗Ｅ７は、示されるＨＰＶ抗Ｅ６に匹敵するＩＣＣ結果を与える。表３は、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質が、それぞれ、陽性率を増加させながら、子宮頸部擦過物の正常な、ＡＳＣ−ＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬサンプルにおける子宮頸部擦過物に存在することを示す。Ｐａｐ  ＨＳＩＬ塗沫によって診断されたサンプルについては約９４％の陽性率であるが、Ｐａｐ塗沫によって正常であると診断されたサンプルの１１％のみが、同じ抗ＨＰＶＥ７抗体を用いたＩＣＣによって陽性に染色した。ＡＳＣ−ＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプルについて、これらのサンプルの約４０％が、表３に示されるＣＩＮ１、ＣＩＮ２／３サンプルについて用いたのと同じ抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体によって陽性に染色され、これらのＡＳＣ−ＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプル対象における発癌タンパク質の発現がさらなる癌の進行について追跡調査されることを示している。ＡＳＣ−ＵＳおよびＩＣＣ染色（抗ＨＰＶ  Ｅ７）陰性と診断されたＰａｐ塗沫を有するサンプルについては、進行性病変を発生するリスクが少ない場合がある。
【０１２６】
表３．液体系溶液中の種々の子宮頸部擦過物サンプルにおけるマウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色結果
【表３】
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【０１２７】
表４は、表３からのＩＣＣ染色結果のまとめを示す。データが示すように、いくつかの実施形態に記載されている抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色法は、ＨＳＩＬ＋について６７％の特異性で９１％のＩＣＣアッセイ感度を提供する。これらのデータは、このアッセイが、５１％のＰＰＶおよび９５％のＮＰＶを有してＨＰＶタンパク質を検出して、日常的なＰａｐ染色と共に、異常なＰａｐを有する患者をトリアージする、または一般の集団からの子宮頸癌をスクリーニングするのに有用であり得ることを示唆する。
【０１２８】
表４．液体系溶液中の≧ＣＩＮ２の子宮頸部擦過物サンプルにおけるマウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色結果のまとめ
【表４】
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【０１２９】
別の例として、紹介外来から得た合計で２００＋のＰａｐ細胞診サンプルの事例をＴｈｉｎＰｒｅｐで収集した。関連する組織学的結果と、Ｐａｐ試験、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験との組み合わせは、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７癌タンパク質および細胞内タンパク質の発現の分析と相関した。液体基溶液中の種々の段階の子宮頸部擦過物サンプルについての抗Ｅ６、抗Ｅ７および抗ｐ１６抗体を用いたＩＣＣ結果を有する合計で１１７の事例を、Ｐａｐ試験、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験、および組織学の結果によって分析した。例として、表５は、Ｅ６、Ｅ７、またはｐ１６抗体を用いたＰａｐ、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験、およびＩＣＣ試験からの結果の相関を示す。
【０１３０】
表５．抗ＨＰＶ抗体、抗ｐ１６抗体を用いたＨＰＶ  ＤＮＡ試験およびＩＣＣ試験と比較して種々の段階の異常を有する４８事例のＰａｐ塗沫サンプルを示すＩＣＣ染色結果のまとめ
【表５】
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【０１３１】
表５のデータは、抗ＨＰＶ抗体を用いたＩＣＣ染色が、抗ｐ１６のみを用いたＩＣＣと比較して、陽性率に関してＨＰＶ  ＤＮＡ試験とより良好な相関を有することを実証する。結果は、ＨＰＶタンパク質のインサイチュでの早期検出に使用され得ることを示唆する。偽陽性サンプル、例えば、Ｐａｐ正常の、ＨＰＶ陽性サンプルについて、ＩＣＣは、ＨＰＶ発癌タンパク質発現の発現を確認することができる。偽陰性サンプル、例えば、Ｐａｐ正常の、ＨＰＶ陰性サンプルであるが、ＩＣＣ陽性サンプルについては、ＩＣＣは、存在する場合には病変の進行を確認するための追跡調査を必要とする。しかし、ＨＰＶ  ＤＮＡ陽性サンプルによるＡＳＣ−ＵＳまたはＣＩＮの大部分の事例は、抗Ｅ６抗体を用いたＨＰＶ  ＩＣＣによって陽性を示す。ｐ１６  ＩＣＣと比較して、ＨＰＶ  ＩＣＣは、Ｐａｐ塗沫の異常性と、より良好な相関を有する。
【０１３２】
表６．診断基準としてＰａｐ試験を用いた、ＨＰＶ  ＤＮＡ  試験とＥ７  ＩＣＣ試験との比較
【表６】
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【０１３３】
ＨＰＶ  ＤＮＡとＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７癌タンパク質の発現との相関を分析するために、例として、表６は、表５に示す４８事例から、異なるカテゴリーのＰａｐ試験結果の中のＨＰＶ  ＤＮＡと比較したＨＰＶ  Ｅ７  ＩＣＣの陽性率をさらに実証する。表６に示されたデータのように、Ｐａｐ  ＮＭＬ、ＡＳＣ−ＵＳ、ＬＳＩＬ、およびＨＳＩＬのそれぞれについて、２１％、５１％、２５％および８４％の陽性率を示すＥ７  ＩＣＣ試験と比較して、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験は、５７％、８３％、１００％および８３％の陽性率を示す。これらのデータは、照会外来からの患者に関するＨＰＶ  ＤＮＡ試験の高い陽性率を実証し、Ｐａｐ異常な患者をトリアージするのに有用でないことを示している。データが示すように、ＡＳＣ−ＵＳの８３％がＨＰＶ  ＤＮＡ陽性であるため、ＡＳＣ−ＵＳ／ＨＰＶ陰性患者の１７％しか不必要な膣検診から救われ得ない。しかし、ＬＳＩＬの１００％がＨＰＶ  ＤＮＡ陽性であり、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験は、ＬＳＩＬ患者をトリアージするのに推奨されないことを示している。しかし、ＡＳＣ−ＵＳの５０％およびＬＳＩＬの２５％のみがＥ７陽性である。これは、Ｅ７  ＩＣＣ試験が、Ｐａｐ異常なＡＳＣ−ＵＳおよびＬＳＩＬ患者をトリアージするのにより良好な試験として機能して、不必要な膣鏡診または過剰な試験を有意に回避することを示唆する。ＨＳＩＬ群については、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験およびＥ７  ＩＣＣ試験の両方が８３％の陽性率を示す。ＨＳＩＬ／ＨＰＶ  ＤＮＡ陰性については、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験では偽陽性であり得る。なぜなら、Ｅ７  ＩＣＣ試験において陽性を示すからである。ＨＳＩＬ／ＨＰＶ  ＤＮＡ陽性については、Ｅ７  ＩＣＣ陰性であるが、ＣＩＮ２を超えた、組織学による真のＨＳＩＬであるときに、さらなる確認を必要とする。
【０１３４】
表６からのＨＰＶ  ＤＮＡ試験およびＥ７  ＩＣＣ試験の感度および特異性をさらに分析するために、表７および表８は、切除したＰａｐ  ＨＳＩＬを用いたそれぞれＥ７  ＩＣＣ試験およびＨＰＶ  ＤＮＡ試験の結果を示す。
【０１３５】
表７．診断基準としてＰａｐ試験を用いた、Ｅ７  ＩＣＣとＨＰＶ  ＤＮＡ試験との比較（表６から合計で４８事例）
【表７】
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【０１３６】
表８．切除したＨＳＩＬを用いたＰａｐ試験と比較したＨＰＶ  ＤＮＡ試験結果のまとめ（表６から合計で４８事例）
【表８】
2012526286.tif 000010
【０１３７】
表８に示すデータのように、ＨＰＶ  ＤＮＡ法は、１５％のＰＰＶおよび９３％のＮＰＶを有して３１％の特異性を有する≧ＣＩＮ２について８３％の感度を提供する。抗ＨＰＶ  Ｅ７モノクローナル抗体によるＩＣＣ染色を用いた同じ研究からの同じ患者についての表７と比較して、これら２つの方法は、同じアッセイ感度（８３％）を有する。しかし、抗Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色アッセイは、より高い特異性（７４％対３１％）、より良好なＰＰＶ（３１％対１５％）、およびより良好なＮＰＶ（９７％対９３％）を実証する。したがって、これらの結果は、ＨＰＶ  ＤＮＡ法と比較して、ＨＰＶ  Ｅ７  ＩＣＣアッセイが、日常的なＰａｐ塗沫染色と共に、一般の集団から、子宮頸癌のスクリーニングのためのＨＰＶタンパク質を検出するより良好な方法であり得ることを示す。したがって、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７は、高度異形成を同定するためのより良好なバイオマーカーとして機能し、医療的治療介入からの利益を享受し得る患者に効果的な疾患管理を提供する。
【０１３８】
ＨＰＶ  Ｅ７  ＩＣＣデータを組織学結果によってさらに分析するために、別の例として、表９および表１０は、診断基準として組織学を用いたＨＰＶ  Ｅ７  ＩＣＣ染色の結果を示す。表９は、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質が、それぞれ、陽性率を増加させながら、正常、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２／３の子宮頸部擦過物サンプルに存在することを示す。Ｐａｐ塗沫がＣＩＮ２／３であると診断されたサンプルに関して約９４％の陽性率であるが、組織学的結果ＮＩＬ（正常）と診断されたサンプルの２３％は、同じ抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いたＩＣＣによって陽性に染色した。ＣＩＮ１サンプルについては、これらのサンプルの約４０％が、同じ抗ＨＰＶ  Ｅ７によって陽性に染色され、これらのＣＩＮ１サンプル対象における発癌タンパク質の発現が、さらなる癌の進行について追跡調査されることを示している。組織学によってＮＩＬ／ＣＩＮ１およびＩＣＣ陰性染色（抗ＨＰＶ  Ｅ７）であるとされたサンプルについては、進行性病変を発生させるリスクが低い場合がある。
【０１３９】
表９．組織学と比較した、マウス抗ＨＰＶ  Ｅ７モノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色の結果。ＬｉｑｕｉｄＰｒｅｐにおいて収集されたサンプルによる、照会外来から得られた合計で１０５の事例
【表９】
2012526286.tif 000011
【０１４０】
表１０は、表９からのＩＣＣ染色結果のまとめを提示する。示されているデータのように、いくつかの実施形態に記載されている抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色法は、７４％の特異性を有して≧ＣＩＮ２に関して９３％のＩＣＣアッセイ感度を提供する。これらのデータは、このアッセイが、５７％のＰＰＶおよび９７％のＮＰＶを有して、日常的なＰａｐ塗沫染色と共に、一般の集団からの子宮頸癌のスクリーニングのためのＨＰＶタンパク質を検出するのに有用であり得ることを示唆する。
【０１４１】
表１０．液体系溶液中の子宮頸部擦過物サンプルにおける、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ  Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色結果のまとめ
【表１０】
2012526286.tif 000012
【０１４２】
いくつかの実施形態に記載されているＨＰＶ  ＩＣＣアッセイが、初期段階の子宮頸癌のスクリーニングに好適であるかを試験するために、Ｐａｐ正常サンプルをＨＰＶ  ＩＣＣアッセイとＨＰＶ  ＤＮＡ試験とを比較するために用いた。表１１に示されているデータのように、試験された全てのＰａｐ塗沫正常のサンプル（４４のうち４４）が、抗ＨＰＶ抗体を用いて陰性に染色する。これらのデータは、いくつかの実施形態に記載されているＩＣＣ染色アッセイが非常に特異的であることを示す。同じサンプルにおけるＨＰＶ  ＤＮＡ試験結果と比較して、Ｐａｐ塗沫正常のサンプルの１６％（４４のうち７）が、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験において陽性に示す。この研究に用いた高度のＨＰＶ  ＤＮＡ試験は、唯一のＦＤＡに認可されたＨＰＶ  ＤＮＡ試験、ＨＣ２であった。ＨＰＶ  ＤＮＡが陽性であるがＰａｐは正常でありＨＰＶ  ＩＣＣ陰性であるこれらの７個のサンプルについて、これらは、ＨＰＶ  ＤＮＡアッセイにおいて偽陽性であり得るか、またはＤＮＡがＨＰＶ感染について検出され得るがＨＰＶ発癌タンパク質を発現しないという事実に起因するかのいずれかである。これらのデータは、本明細書に記載されているＨＰＶ  ＩＣＣアッセイがＨＰＶ  ＤＮＡ試験と比較してより良好な陽性予測値を提供することを示す。したがって、ＨＰＶ  ＩＣＣアッセイは、子宮頸癌のスクリーニングに、より良好な臨床的関連を提供する。
【０１４３】
表１１．診断基準としてＰａｐ試験を用いた、異なる抗ＨＰＶ抗体による、Ｐａｐ正常サンプルにおけるＩＣＣ染色とＨＰＶ  ＤＮＡ試験（ＨＣ２）との比較。一般のスクリーニング集団からの合計で４４事例の正常なＰａｐ塗沫。サンプルをＬｉｑｕｉｄＰｒｅｐ溶液において収集した。
【表１１】
2012526286.tif 000013
【０１４４】
詳細例３−免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）
【０１４５】
いくつかの実施形態は、ヒト対象のパピローマウイルス感染をスクリーニングする方法であって、ヒト対象の臨床組織サンプルから１種以上の組織細胞を含有する薄片を準備する工程と、薄片をスライド上に適用する工程と、臨床組織サンプルの薄片を含有するスライド上で１種以上の免疫組織化学アッセイを行う工程と、１種以上の精製された組み換えパピローマウイルスタンパク質に対して生成された１種以上の抗体を用いて薄層のヒト細胞を染色する工程とを含み、少なくとも１種の抗体は、パピローマウイルスの早期タンパク質を認識すること、およびスライド上の薄片の臨床組織サンプルに存在する１種以上のパピローマウイルス型から１種以上のタンパク質をインサイチュで検出することが可能である方法に向けられる。
【０１４６】
サンプル調製：４ミクロンに薄片化されたパラフィン組織ブロックをスライド上に置き、６０℃で一晩中ベークした。脱パラフィン／水和物部を脱マスキングし、続いて標準のＩＨＣ染色手順に付した。ＨＰＶタンパク質に対する、精製されたモノクローナル抗体を希釈して、一次抗体として用いた。染色手順の後、二次抗体溶液、洗浄が続き、続いて各片への適切な基質試薬であった。片が生成するとすぐに、スライドをｄＨ２Ｏに浸し、片をヘマトキシリンによって対比染色し、カバースリップを脱水して搭載した。例えば、ＬＳＩＬ：軽度の扁平上皮内病変を含有する子宮頸部組織。ＨＳＩＬ：高度の扁平上皮内病変。ＣＩＮ１：子宮頸部上皮内新生物、軽度の細胞異常。ＣＩＮ２：より侵攻性とみられる病変を有する子宮頸部上皮内新生物。ＣＩＮ３：侵攻性形態の異形成を有する子宮頸部上皮内新生物。扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）および腺癌（ＡＤＣ）のような侵襲性癌。同定された異形成細胞に関して、ＨＰＶ  ＩＨＣ染色は、ＨＰＶ感染の状態および／またはＨＰＶ癌タンパク質の発現に関するさらなる情報を提供することができる。したがって、ＨＰＶ  ＩＨＣ染色アッセイは、確認試験として非常に有用である。さらに、子宮頸部異形成の種々の段階におけるＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７癌タンパク質の過剰発現は、ＣＩＮの進行および／または子宮頸癌の発生を示し得る。
【０１４７】
一旦組織を処理して固定したら、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを、抗原回復緩衝液によって長時間、スライド上の組織をボイルすることによって実施する。次いで、スライドを室温まで冷却して、前抗体ブロッキング溶液によって長時間ブロッキングし、次いでＨＰＶ抗体によってインキュベートした。次いでスライドをＰＢＳもしくはＨ２Ｏ、またはいずれの未結合のＨＰＶ抗体も取り除く他の溶液によって３〜５回洗浄した。次いでスライドを二次抗体、例えば、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ、続いて検出に適切な基質によってインキュベートした。例として、ＤＡＢをペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下に酸化すると、褐色の析出、アルコール不溶性沈澱を酵素活性部位において生ずる。沈澱は、存在する酵素の量に応じて淡琥珀色から濃琥珀色の色範囲であり得る。顕微鏡下で見られた琥珀色沈澱は、ＨＰＶ抗体と細胞中に存在するＨＰＶタンパク質との特異的結合を示す。アッセイを室温以上で実施して結合反応を加速することができる。このＩＨＣアッセイは、手動で実施されてもＩＣＣの自動化によって操作されてもよく、これにより、子宮頸部組織からの上皮細胞におけるＨＰＶ感染およびＨＰＶ癌タンパク質の局在化をインサイチュで検出する有力なツールを提供する。
【０１４８】
いくつかの実施形態は、子宮頸癌組織におけるＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７およびｐ１６タンパク質の検出を含むＩＨＣアッセイに向けられる。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色アッセイを実証する手順の例は：Ａ）組織アレイの調製：組織スライドをパラフィン埋込組織ブロックから薄片化した。各組織マイクロアレイは、２２の子宮頸部扁平細胞癌腫または腺癌腫および陰性対照としての３の正常な上皮を含有する。８７コアのパラフィン埋込ブロックをグループ化し、薄片化して４つのマイクロメータ単位の組織スライドとした。各組織マイクロアレイは、合計して２６の子宮頸部扁平細胞癌腫または腺癌腫のうちの３の複製コアおよび陰性対照として合計して３の正常なサンプルのうちの３の複製コアを含有する。合計で２２０の事例を合計で９個のスライド上に配列させた。Ｂ）免疫組織化学法：合計で２２０の事例の子宮頸癌組織を有する９個の組織マイクロアレイをＥ６、Ｅ７およびｐ１６  ＩＨＣについて試験した。全長ＨＰＶ型１６Ｅ６、Ｅ７およびＨＰＶ型１８Ｅ６、Ｅ７の組み換えタンパク質を産生し、精製して、ポリクローナル抗体の産生のためにおよびいくつかの実施形態に記載されているモノクローナル抗体のためにウサギおよびマウスに免疫を与えた。かかる抗体、およびクローンＥ６Ｈ４からｐ１６ＩＮＫ４ａのヒトタンパク質を用いて、ＩＨＣプロトコルを開発して組織マイクロアレイを染色した。研究は、各腫瘍対象からの３個のサンプルを含んだ。結果を解明するために、Ｅ６およびＥ７タンパク質について、所与のサンプルについて少なくとも１０％の腫瘍細胞が染色されて強度がスコア１、２または３であるとき；サンプルが陽性のＥ６／Ｅ７発現を有するとされる。ｐ１６ＩＮＫ４ａについて、「陽性」の評定は、試料が細胞の連続的な染色を示すとき（すなわち、拡散染色パターン）とされ、「陰性」の評定は、試料が陰性染色反応または単離された細胞もしくは小さな細胞クラスターの染色（すなわち、焦点染色パターン）のいずれかを示すときとされる。Ｃ）ＤＮＡタイプ：ＨＰＶ  ＤＮＡタイピングの各事例をＰＣＲ  ＳＰＦｌＯ−ＬｉＰＡ２５（バージョン１：Ｌａｂｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｄｔｓ．、（ライスワイク（オランダ））製）（２５の高および低リスクＨＰＶ型を検出する逆ハイブリダイゼーション技術）によって同定した。アッセイをＨＰＶ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｔａｌａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、バルセロナ（スペイン））において実施した。
【０１４９】
例として、図８Ａ〜８Ｂは、子宮頸癌組織およびその近隣の正常な組織における、抗Ｅ６抗体を用いたＩＨＣの画像を示す。図８Ｃ〜８Ｄは、子宮頸癌組織およびその近隣の正常な組織における、抗Ｅ７抗体を用いたＩＨＣの画像を示す。結果は、子宮頸癌サンプルにおける陽性染色、および近隣の正常な組織における陰性染色を示す。別の例として、図９は、異なる倍率による子宮頸癌サンプルにおけるＩＨＣの画像を示す。図９Ａ〜Ｃ、抗Ｅ６抗体によるＩＨＣ：陽性１０×（Ａ）、陽性２０×（Ｂ）、陰性２０×（Ｃ）。図９Ｄ〜Ｆ、抗Ｅ７抗体によるＩＨＣ：陽性１０×（Ｄ）、陽性２０×（Ｅ）、陽性４０×（Ｆ）。図９Ｇ〜Ｉ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体によるＩＨＣ：陽性１０×（Ｇ）、陽性２０×（Ｈ）、陰性２０×（Ｉ）。
【０１５０】
ＩＨＣ染色の結果を、認定された病理学者によってスコアリングし、スコア０〜３の強度、および染色された腫瘍細胞の百分率を与えた。結果を解明するために、陽性結果を、染色された少なくとも１０％の腫瘍細胞および１、２または３のスコア強度を有するサンプルにおいてＥ６／Ｅ７とした。ｐ１６ＩＮＫ４ａについて、「陽性」の評定は、試料が細胞の連続的な染色を示すとき（すなわち、拡散染色パターン）とされ、「陰性」の評定は、試料が陰性染色反応または単離された細胞もしくは小さな細胞クラスターの染色（すなわち、焦点染色パターン）のいずれかを示すときとされる。データを分析して、ｐ１６によるＰＣＲおよびＩＨＣ染色と比較したアッセイ感度および特異性を得た。統計的有意性も分析した。
【０１５１】
表１２は、抗Ｅ６、Ｅ７、およびｐ１６抗体を用いたＩＨＣのアッセイ感度を示す。結果は、抗Ｅ６抗体を用いたＨＰＶ  ＩＨＣのアッセイ感度が約９２．１％（２０３のうち１８７）であることを実証する。抗Ｅ７抗体を用いたＨＰＶ  ＩＨＣのアッセイ感度は、約７６．２％（２０２のうち１５４）である。抗ｐ１６抗体を用いたＨＰＶ  ＩＨＣのアッセイ感度は、約９１．３％（２０８のうち１９０）である。
【０１５２】
表１２．単一マーカーを用いたＩＨＣアッセイの結果のまとめ
【表１２】
2012526286.tif 000014
【０１５３】
Ｅ６、Ｅ７およびｐ１６タンパク質の発現の相関を表１３〜１５に示す。表１３において、合計２０３個のサンプルをＥ６またはｐ１６のいずれかを用いたＩＨＣアッセイにおいて分析した。１８７個のＩＨＣ  Ｅ６陽性サンプルの中で、１７０個のサンプルが、ｐ１６  ＩＨＣにおいて陽性を示す。１６個のＩＨＣ  Ｅ６陰性サンプルの中で、１５個のサンプルが、ｐ１６  ＩＨＣにおいて陽性を示す。１８５個のＩＨＣ  ｐ１６陽性のサンプルの中で、１７０個のサンプルが、Ｅ６  ＩＨＣにおいて陽性を示す。１８個のＩＨＣ  ｐ１６陰性サンプルの中で、１７個のサンプルが、Ｅ６  ＩＨＣにおいて陽性を示す。Ｅ６  ＩＨＣおよびｐ１６  ＩＨＣの両方において陰性である唯１個のサンプルが存在する。したがって、組み合わされたＥ６およびｐ１６  ＩＨＣアッセイは、９９．５％のアッセイ感度（２０３個のサンプルのうち２０２個がＥ６またはｐ１６  ＩＨＣ陽性である、表５）を提供する。
【０１５４】
表１３．ＩＨＣアッセイにおけるＥ６およびｐ１６タンパク質の発現の結果の相関
【表１３】
2012526286.tif 000015
【０１５５】
表１４において、合計２０２個のサンプルをＥ６またはＥ７のいずれかを用いたＩＨＣアッセイにおいて分析した。１８６個のＩＨＣ  Ｅ６陽性サンプルの中で、１５３個のサンプルが、Ｅ７  ＩＨＣにおいて陽性を示す。１６個のＩＨＣ  Ｅ６陰性サンプルの中で、１個のサンプルがＥ７  ＩＨＣにおいて陽性を示す。１５４個のＩＨＣ  Ｅ７陽性サンプルの中で、１５３個のサンプルが、Ｅ６  ＩＨＣにおいて陽性を示す。４８個のＩＨＣ  Ｅ７陰性サンプルの中で、３３個のサンプルが、Ｅ６  ＩＨＣにおいて陽性を示す。Ｅ６  ＩＨＣおよびＥ７  ＩＨＣの両方において陰性である１５個のサンプルが存在する。したがって、組み合わされたＥ６およびＥ７  ＩＨＣアッセイは、９２．５％のアッセイ感度（２０２個のサンプルのうち１８７個がｐｌ６またはＥ６  ＩＨＣ陽性である、表５）を提供する。
【０１５６】
表１４．ＩＨＣアッセイにおけるＥ６およびＥ７タンパク質の発現の結果の相関
【表１４】
2012526286.tif 000016
【０１５７】
表１５において、合計２０２個のサンプルをＥ７またはｐ１６のいずれかを用いたＩＨＣアッセイにおいて分析した。１５４個のＩＨＣ  Ｅ７陽性サンプルの中で、１４２個のサンプルが、ｐ１６  ＩＨＣにおいて陽性を示す。４８個のＩＨＣ  Ｅ７陰性サンプルの中で、４２個のサンプルが、ｐ１６  ＩＨＣにおいて陽性を示す。１８４個のＩＨＣ  ｐｌ６陽性サンプルの中で、１４２個のサンプルがＥ７  ＩＨＣにおいて陽性を示す。１８個のＩＨＣ  ｐｌ６陰性サンプルの中で、１２個のサンプルが、Ｅ７  ＩＨＣにおいて陽性を示す。Ｅ７  ＩＨＣおよびｐ１６  ＩＨＣの両方において陰性である６個のサンプルが存在する。組み合わされたＥ７およびｐ１６  ＩＨＣアッセイは、９７．０％のアッセイ感度（２０２個のサンプルのうち１９６個が、ｐ１６またはＥ７  ＩＨＣ陽性である、表５）を提供する。
【０１５８】
表１５．ＩＨＣアッセイにおけるＥ７およびｐ１６タンパク質の発現の結果の相関
【表１５】
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【０１５９】
子宮頸癌の腫瘍細胞において発現されるＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７発癌タンパク質は、特異的な抗Ｅ６および抗Ｅ７抗体を用いたＩＨＣアッセイによって試験される大部分のサンプルにおいて検出され得る。これらの結果が病因を強化し、ＨＰＶ癌タンパク質の分子メカニズムが大部分の子宮頸癌事例において機能する。研究結果は、それぞれ無調節なウイルスＥ６およびＥ７癌タンパク質の発現によるｐ５３およびｐＲｂタンパク質の機能的不活化を実証し、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現をもたらす。この研究において、表１２に示すように、Ｅ６抗体の感度（９２％）は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体の感度（９１％）に匹敵する。Ｅ７抗体の感度は比較的低い（７６％）が、アッセイは、さらに最適化され得る。子宮頸癌におけるＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７癌タンパク質およびｐ１６細胞内タンパク質の発現の相違が示されているＩＨＣ結果を有するサンプルについては、これらの個々の事例において種々の経路が癌の発生に関与する可能性がある。したがって、ＨＰＶ癌タンパク質および細胞内タンパク質の両方が、発癌において重要な役割を果たして、ＨＰＶ関連癌の診断のバイオマーカーとして機能する。種々のＨＰＶ関連癌においてさらなるバイオマーカーを用いた研究は、オーダーメイド医療を提供するのを助け得る。
【０１６０】
ｐ１６は、現在の診療において許容されているマーカーであるが、試験される全ての事例に完全であるというわけではない。表１３は、１８個のｐ１６  ＩＨＣ陰性サンプルの中で、１７個のサンプルが、抗Ｅ６抗体を用いたＩＨＣにおいて陽性を示すことを示す。表１５は、１８個のｐ１６  ＩＨＣ陰性サンプルの中で、１２個のサンプルが、抗Ｅ７抗体を用いたＩＨＣにおいて陽性を示すことを示す。したがって、表１６に示すように、組み合わされたマーカーｐ１６＋Ｅ６を用いたＩＨＣアッセイは、ｐ１６のみを用いたときの９１．３％と比較して９９．５％のアッセイ感度を提供する。組み合わされたマーカーｐ１６＋Ｅ７を用いたＩＨＣアッセイは、ｐ１６のみを用いたときの９１．３％と比較して９７．０％のアッセイ感度を提供する。いずれの事例においても、マーカーとｐ１６などの細胞内タンパク質およびＥ６またはＥ７などの癌タンパク質との組み合わせを用いたＩＨＣアッセイは、子宮頸癌の検出する際に増加したアッセイ感度を提供する。
【０１６１】
表１６．単一または組み合わされたマーカーを用いたＩＨＣアッセイの感度のまとめ
【表１６】
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【０１６２】
単一マーカーＥ７を用いたＩＨＣアッセイは、表５に示すように、Ｅ６またはｐ１６を用いたＩＨＣアッセイと比較して、７６．２％と比較的低い感度を与える。組み合わされたマーカーを用いたアッセイは、感度を増加させ得る。表１５および表１６からの結果を組み合わせると、４８事例のＥ７  ＩＨＣ陰性サンプルの中で、３３個のサンプルがＥ６  ＩＨＣ陽性であり（表１５）、４８事例のＥ７  ＩＨＣ陰性サンプルの中で、４２個のサンプルが、ｐ１６  ＩＨＣ陽性である（表１６）ことが示される。加えて、これらのサンプルのうち２８個が、Ｅ６およびｐ１６の両方において陽性である（データ示さず）。これにより、Ｅ６  ＩＨＣ陽性またはｐ１６  ＩＨＣ陽性のいずれかである４７のＥ７  ＩＨＣ陰性の事例、およびＥ６、Ｅ７、またはｐ１６  ＩＨＣにおいて陰性である唯１個のサンプルが残される。したがって、表１６に示すように、Ｅ７  ＩＨＣについての感度は７６．２％と比較的低いが、この感度は、組み合わされたマーカーＥ６＋Ｅ７を用いると９２．５まで増加され得、組み合わされたマーカーＥ７＋ｐ１６を用いると９７．０％まで増加され得る。さらに、３種全てのマーカーが用いられるとき、ＩＨＣアッセイの感度は、９９．５％までさらに増加され得る。いずれの事例においても、マーカーとｐ１６などの細胞内タンパク質、またはＥ６もしくはＥ７などのいくらかの他の癌タンパク質との組み合わせを用いたＩＨＣアッセイは、増加したアッセイ感度を提供する。
【０１６３】
単一マーカーＥ６を用いたＩＨＣアッセイは、表１６に示すように、９２．１％の感度を提供する。組み合わされたマーカーを用いたアッセイは、感度を増加させたことが示されている。表１３は、１６個のＥ６  ＩＨＣ陰性サンプルの中で、１５個のサンプルが、抗ｐ１６抗体を用いたＩＨＣにおいて陽性を示すことを示す。表３は、１６個のＥ６  ＩＨＣ陰性サンプルの中で、１個のサンプルが、抗Ｅ７抗体を用いたＩＨＣにおいて陽性を示すことを示す。したがって、表１６に示すように、組み合わされたマーカーＥ６＋ｐ１６を用いたＩＨＣアッセイは、Ｅ６のみを用いたときの９２．１％と比較して９９．５％のアッセイ感度を提供する。組み合わされたマーカーＥ６＋Ｅ７用いたＩＨＣアッセイは、Ｅ６のみを用いたときの９２．１％と比較して９２．５％のアッセイ感度を提供する。いずれの事例においても、マーカーと、ｐ１６などの細胞内タンパク質またはＥ６もしくはＥ７などのいくらかの他の癌タンパク質との組み合わせを用いたＩＨＣアッセイは、増加したアッセイ感度を提供する。
【０１６４】
これらのデータは、９９．５％（１００％に近い）の子宮頸癌を検出するには１を超えるバイオマーカーが必要とされることを示唆する。
【０１６５】
表１７は、ＨＰＶ  ＤＮＡタイピング法およびＥ６  ＩＨＣ法からの結果の比較を示す。合計２０２個のサンプルを試験した。これらの１６３個のサンプルの中で、１６２個の陽性および１個の陰性は、Ｅ６  ＩＨＣ法およびＨＰＶ  ＤＮＡ法の間でのアッセイの一致（８１％、１６３／２０２）を示す。９２％（１６２／１７７）のＨＰＶ  ＤＮＡ陽性は、Ｅ６  ＩＨＣ陽性である。８７％（１６２／１８６）のＥ６  ＩＨＣ陽性は、ＨＰＶ  ＤＮＡ陽性である。１８６事例がＥ６  ＩＨＣ陽性であり、１７７事例のみがＨＰＶ  ＤＮＡタイピングの陽性である。Ｅ６  ＩＨＣ法は、子宮頸部生検組織において、ＨＰＶ  ＤＮＡタイピング法のアッセイ感度（８７．６％、２０２のうち１７７）と比較してより良好なアッセイ感度（９２％、２０２のうち１８６）を提供する。Ｅ６  ＩＨＣ陰性である１６個のサンプルについて、１５個のサンプルがＨＰＶ  ＤＮＡタイピング陽性である。ＨＰＶ  ＤＡＮタイピング陰性である２５個のサンプルについて、２４個のサンプルがＥ６  ＩＨＣ陽性である。これにより、試験された２０２個のサンプルのうち、Ｅ６  ＩＨＣおよびＨＰＶ  ＤＮＡの両方のタイピングで陰性である唯１個のサンプルが残される。したがって、Ｅ６  ＩＨＣ法およびＨＰＶ  ＤＮＡ法の両方を一緒に組み合わせると、アッセイ感度が９９．５％（２０１／２０２）まで増加する。これらの結果は、Ｅ６  ＩＨＣが優れていることを示し、ある単一マーカーよりも簡素で、ロバストで、より良好な感度を提供する（Ｅ６  ＩＨＣについて９２％であるのに対してＨＰＶ  ＤＮＡタイピングについては８７．６％）。組み合わされた方法は、アッセイ感度を９９．５％までさらに増加させる。
【０１６６】
表１７．ＨＰＶ  ＤＮＡタイピング法およびＥ６  ＩＨＣ法の比較
【表１７】
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【０１６７】
この研究において試験された全ての事例は、組織学によって確認された子宮頸癌である。表１８は、１７７のＨＰＶ  ＤＮＡ子宮頸癌事例の中での癌型分布を示す。８４％（１４９／１７７）の事例が扁平細胞癌腫であり、１１％（２０／１７７）が腺癌腫であり、３．４％（６／１７７）が腺扁平であり、１．１％（２／１７７）が他の癌型である。Ｅ６過剰発現（Ｅ６＋）を有するサンプルについて、扁平細胞癌腫の９２．６％（１３８／１４９）、腺癌腫の８０％（１６／２０）、および腺扁平の１００％（６／６）が、Ｅ６  ＩＨＣ陽性である。
【０１６８】
表１８．Ｅ６  ＩＨＣおよびＨＰＶ  ＤＮＡ試験されたサンプルにおける癌の特性決定（組織学診断）
【表１８】
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【０１６９】
子宮頸癌の腫瘍細胞において発現されるＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７発癌タンパク質が、特異的な抗Ｅ６および抗Ｅ７抗体を用いたＩＨＣアッセイによって試験された大部分のサンプルにおいて検出され得ることをまとめるために。これらの結果が病因を強化し、ＨＰＶ癌タンパク質の分子メカニズムが大部分の子宮頸癌事例において機能する。研究結果は、それぞれ無調節なウイルスＥ６およびＥ７癌タンパク質の発現によるｐ５３およびｐＲｂタンパク質の機能的不活化を実証し、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現をもたらす。この研究において、Ｅ６抗体の感度（９２％）は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体の感度（９１％）と同等である。しかし、組み合わされたＥ６およびｐ１６  ＩＨＣは、感度をさらに増加させて９９．５％とする。
【０１７０】
子宮頸癌組織のためのＨＰＶ  ＤＮＡタイピング法と比較して、Ｅ６  ＩＨＣは優れており、簡素かつロバストなアッセイと共により高い感度を提供する。組み合わされたＩＨＣおよびＨＰＶ  ＤＮＡタイピング法は、アッセイ感度を９９．５％までさらに増加させる。子宮頸癌におけるＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７癌タンパク質およびｐ１６細胞内タンパク質の発現の相違が示されているＩＨＣ結果を有するサンプルについては、これらの個々の事例において種々の経路が癌の発生に関与する可能性がある。データは、複数のバイオマーカー（すなわち、組み合わされたＥ６およびｐ１６  ＩＨＣアッセイ）が、単一バイオマーカー、Ｅ６のみまたはｐ１６のみのいずれかを用いるのと比較して、子宮頸癌のより高い感度を得るのを助けることを示唆する。
【０１７１】
高度ＣＩＮ病変において、Ｅ６およびＥ７は、宿主基底上皮細胞において強く発現され、これらの複製競合宿主細胞の細胞周期制御を実質的に妨げる。ＨＰＶ癌タンパク質の発現は、宿主細胞におけるＧ１−Ｓ期調節を妨げる。ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７タンパク質は、Ｅ７によるｐＲＢの不活性化およびＥ６によるｐ５３の分解などの過剰の細胞相互作用を標的とする。高レベルのＨＰＶ  Ｅ７タンパク質は、ｐＲＢを不活性化し、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ結合の破壊をもたらす。通常、ｐＲＢのＥ２Ｆへの結合は、Ｅ２Ｆ駆動の細胞周期活性化をブロックする。細胞を複製する際、Ｅ２Ｆは、ＲＢのリン酸化反応によって調節される。ＲＢリン酸化反応は、数種のキナーゼ阻害剤（ＩＮＫ）によって制御されるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ４、ＣＤＫ６）によって普通は媒介される。
【０１７２】
Ｒｂ／Ｅ２Ｆ抑制の損失および遊離Ｅ２Ｆによる強い活性化の結果として、宿主細胞タンパク質、ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現が強く過剰発現される。さらに、Ｓ期遺伝子は、連続的に活性化される。なぜなら、Ｃｄｋ４／６のｐ１６ＩＮＫ４ａ媒介抑制がｐＲｂ宿主細胞タンパク質において下流効果を有さないからである。Ｅ７依存性Ｅ２Ｆ放出は、ｐＲｂのリン酸化反応によって媒介されないため、拮抗的調節によるｐ１６ＩＮＫ４ａ発現は、活性化された細胞周期において効果を有さない。生理学的条件下で、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、細胞が、老化組織におけるテロマーの実質的短縮などのゲノムストレス状態を経るとき発現される。また、アポトーシスは、ｐ５３のＨＰＶ  Ｅ６媒介分解によって無効にされる。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤である、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現は、調節されていないＨＰＶ癌遺伝子発現の直接の結果である。
【０１７３】
さらに、増殖および宿主細胞ゲノム複製にとって重要である宿主細胞タンパク質は、ＨＰＶ感染の結果として過剰発現され得る。これらの宿主細胞タンパク質として、限定されないが、ｋｉ６７（ＭＩＢ−Ｉ）、ＭＹＣ細胞癌遺伝子、サイクリンタンパク質（例えば、サイクリンＡ、Ｂ、Ｅなど）、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６ＩＮＫ４ａ、テロメラーゼ（例えば、ＴＥＲＣ）、複製複合体タンパク質（例えば、ＭＣＭ５、ＣＤＣ６、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）、ＭＣＭ２、ミニ染色体維持タンパク質２、４、および５など）が挙げられる。
【０１７４】
結果として、例えばＥ６、Ｅ７、Ｌ１などのＨＰＶタンパク質またはこれらのＨＰＶ感染による免疫反応の検出のための免疫学的アッセイは、ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ、迅速な免疫学的スクリーニングアッセイ、およびさらなる多重化タンパク質チップアッセイなど、ならびにこれらの組み合わせにおいて実施され得る。本発明の実施形態は、早期遺伝子（例えば、Ｅ６およびＥ７）および後期遺伝子（例えば、Ｌ１）によってコードされるＨＰＶウイルスタンパク質を検出するために開発された抗体、抗原または免疫複合体アッセイを含めた、１種以上のアッセイにおいて用いられるＨＰＶタンパク質の種々のポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。加えて、一形式、例えばマイクロプレート形式における、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、タンパク質またはこれらの抗体のための開発された抗体、抗原、または免疫複合体アッセイは、ＨＰＶ感染によって誘導されるＥ６、Ｅ７、Ｌ１タンパク質または抗体の直接測定のための一段階の免疫クロマトグラフィアッセイ内に採用され得る。本明細書に提供されている１種以上の免疫学的アッセイは、簡素な機器によるまたはさらなる機器によらない使い易い手順を使用して、短時間で実施することを目的とする。種々の免疫学的アッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの結果と、ヒト対象に関する細胞学的および組織学的データならびに人口学的情報との比較は、ＨＰＶ感染および／または子宮頸癌を診断する際に相関および精度を立証する機能を果たす。
【０１７５】
異形成細胞の早期診断は、子宮頸癌の成功裏の予防および処置に重要である。子宮頸癌を予防するためのストラテジーは、広範の世界的集団の対象を過去のもしくは存在するＨＰＶ感染および／または前癌状態の病変について密接に追跡調査することに加えた、該集団をカバーする改善されたＨＰＶ試験／スクリーニングを必要とする。重要なことに、１２〜１５歳の女性におけるＨＰＶによる感染が、侵襲性癌の前に発生する必要があることが知られている。したがって、本明細書に記載されているような、高度異形成または前癌状態の細胞用のＨＰＶ関連バイオマーカーをアッセイして、初期段階にある女性を前スクリーニングし、後期段階において診断されるとき癌の悪性腫瘍を処置する化学療法または放射線に頼らなければならないというよりはむしろ医療的治療介入の利益を享受して子宮頸癌の発生を予防できる、これらの潜在する高度ＣＩＮを同定することができることが重要である。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【国際調査報告】
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