(57)【要約】  （１）迅速Ｔ細胞媒介応答の惹起不全、（２）Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無応答もしくはその双方の誘導、または（３）単球、マクロファージ、樹状細胞および／または例えば細胞内病原体を死滅させるのに必要とされるような他のＡＰＣの活性化不全から起こる感染または疾患を処置するための方法および組成物。該方法および組成物は、ＰＤ−１と結合してそれを遮断し、阻害的シグナル伝達を回避または低減することによるか、またはＰＤ−Ｌ１などのＰＤ−１のリガンド(Hgands)と結合し、それにより、そのリガンドがＰＤ−１と結合して（このにまたは部分的に）阻害シグナルを送達しないようにすることにより、望ましくないＴ細胞阻害の問題を解決する。この免疫応答は種々の親和性（すなわち、必要とされるものよりも高いまたは低い）で結合するアンタゴニストを提供することにより、また、投与される薬剤の用量を変えることにより、また、投与計画中、間欠的投与を行うことにより、また、その組合せにより（再び投与される前にそれが結合されている分子から薬剤の解離をもたらす（初回刺激と追加免疫を用いる抗原惹起で見られるものに類似））調節され得る。いくつかの場合では、免疫系を刺激した後に、その刺激を取り去ることが特に望ましいことがある。
2012500855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を調節する方法であって、疾病病原体または感染細胞に対する免疫応答誘導する、増大させる、または増強するのに有効な量のＰＤ−１アンタゴニストを投与することを含んでなり、その分子の用量、その分子の投与時期、および／またはその分子の親和性によりリガンドのＰＤ−１受容体への間欠的接近を可能にする、方法。
【請求項２】
ＰＤ−１アンタゴニストが内因性ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１との結合を阻害または低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＤ−１アンタゴニストが内因性ＰＤ−Ｌ２と、ＰＤ−１との結合を阻害または低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＰＤ−１アンタゴニストがＰＤ−１と結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＰＤ−１アンタゴニストがＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７．１、およびその断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分子がＰＤ−１またはそのリガンドとインビボ投与後、３か月以内の期間結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１を超えるＰＤ−１アンタゴニストが投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
感染が慢性ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、マイコプラズマ感染、寄生虫感染であり、感染の急性期に毒素により媒介される疾患を誘発するか、または感染がＴ細胞応答の低下を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ウイルス感染が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス(respiratory synticial virus)、脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、および乳頭腫ウイルスによる感染である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
寄生虫感染がマラリアまたはリーシュマニアである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
細菌感染が、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、ブドウ状球菌(Staphylococcus)、リステリア菌(Listeria)、およびクラミジア・トラコマチス(Clamydia trachomatis)からなる群から選択される細菌により引き起こされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
疾病に対する免疫応答を増強するためにＰＤ−１アンタゴニストと組み合わせて疾病抗原を投与することさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＤ−１アンタゴニストがＰＤ−１リガンドの融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
融合タンパク質が、ＰＤ−１と結合し得るＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインまたはその断片を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
融合タンパク質が配列番号８３のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＤ−１アンタゴニストとともに、免疫調節剤、Ｔｒｅｇの機能を枯渇させる、または阻害する薬剤、および共刺激分子からなる群から選択される付加的な有効薬剤を投与することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
付加的な有効薬剤がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの機能を枯渇させる、または阻害する薬剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの機能を枯渇させる、または阻害する薬剤がシクロホスファミドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗原提示細胞機能を増強させるための請求項１の方法であり、ＡＰＣをＰＤ−１アンタゴニストと、ＡＰＣにおけるＰＤ−１のシグナル伝達を阻害、低減、もしくは遮断する、または罹患細胞または感染細胞の除去を増強するのに有効な量で接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２０】
ＰＤ−１アンタゴニストを１以上の疾病抗原と組み合わせて含んでなる、組成物。
【請求項２１】
ＰＤ−１アンタゴニストをワクチンと組み合わせて含んでなる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２００８年８月２５日に出願された米国仮出願第６１／０９１，５０２号公報、２００８年８月２５日に出願された米国仮出願第６１／０９１，６９４号公報、２００８年８月２５日に出願された米国仮出願第６１／０９１，７０９号公報、２００８年８月２５日に出願された米国仮出願第６１／０９１，７０５号公報、２００９年１月５日に出願された米国仮出願第６１／１４２，５４８号公報、および２００９年４月１日に出願された米国仮出願第６１／１６５，６５２号公報の優先権および利益を主張するものであり、これらは許容される場合には引用することにより本発明の開示の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、癌または感染などの疾患、特に、Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無応答もしくはその双方または細胞内病原体、すなわち例えばリーシュマニアがＡＰＣ（例えば、単球、樹状細胞、マクロファージ）または上皮細胞上でＰＤ−１リガンドをアップレギュレートすることにより免疫応答を逃れる疾患を含む疾患を処置するための免疫調節組成物および方法に関する。
【０００３】
背景技術
微生物感染に対する宿主の耐性には、二つの主要な重複する防御系、先天免疫、および適応免疫が組み込まれている。ウイルス、細菌、および寄生虫を包含する細胞内病原体は、感染後の初期に即座に、感染宿主において非特異的体液性応答と細胞エフェクター応答を刺激する活性化シグナルを中継する。これらの先天的防御応答の助けで、微生物の増殖速度が数日間遅れ、その間に適応系の免疫が誘導され、長期間病原体と対抗するよう促される（適応的／長期免疫）。これらの免疫応答はＴ細胞により媒介される。多くの細胞内病原体に関して、感染防御免疫は、前もって感染と闘う手助けをするように他の免疫細胞を刺激するサイトカインなどの化合物を産生するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の生成、病原体に感染した宿主細胞を排除するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により主として媒介される細胞媒介応答、およびＴヘルパー細胞により媒介される抗体応答の双方を必要とする。しかしながら、それらの生物が初期の免疫活性化を迂回し、エフェクター免疫応答および長期メモリー応答を損なえば、感染が確立され、持続する。これが急性および慢性感染を招く。
【０００４】
研究によれば、初期の免疫破壊は多くの場合、クラスＩ  ＭＨＣ分子による抗原プロセシングおよび／または提示に関与する細胞内経路を標的とすることが証明されている。これの結果、初期の免疫活性化が不十分となり、また、その生物に対する一次応答がほとんど、または全く無くなる。これによりこれらの生物は確立され、細胞内病原体では、免疫系から「隠れた」ままとなる。さらに最近の研究では、多くの場合でこれらの病原が低いが測定可能な特異的免疫応答を刺激することが示されている。しかしながら、Ｔ細胞が病原体と闘うことにより「消耗」し、時間が経つにつれ段階的に有効性が低くなるという顕著な変化を受ける場合には、慢性感染が起こる。これはＴ細胞の消耗として知られる現象である。
【０００５】
Ｂ７タンパク質は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に免疫応答を刺激または阻害する第二のシグナルを与える働きをする。ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（ＰＤ−ＤＣ）は、共通の受容体ＰＤ−１と結合するＢ７ファミリーの分子の阻害メンバーである。ＰＤ−Ｌ１は多様な組織および細胞種で広く発現されるが、ＰＤ−Ｌ２の発現は主として活性化された樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージに限られる。ＣＤ２８ファミリー受容体のメンバーであるＰＤ−１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、ＤＣおよびマクロファージで誘導的に発現される。Ｔ細胞の消耗は、Ｔ細胞機能に負の調節を行う、ＰＤ−１受容体を介した阻害的Ｔ細胞シグナル伝達により生じることが示されている。
【０００６】
そのリガンドによるＰＤ−１結合の主要な結果は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）下流でのシグナル伝達の阻害である。よって、ＰＤ−１を介したシグナル伝達は通常、Ｔ細胞に対して、Ｔ細胞増殖の低下またはＴ細胞活性におけるその他の低下をもたらす抑制または阻害シグナルを与える。ＰＤ−１のシグナル伝達は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）により提示されるペプチド抗原と近接したリガンドとの結合を必要とすると考えられ、これはＴＣＲと結合されている(Freeman Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105:10275-10276 (2008))。ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞において阻害的シグナル伝達を引き起こす主要なＰＤ−１リガンドである。
【０００７】
多くの細胞内病原体に対する一次免疫応答およびエフェクター免疫応答が不十分な結果として、とりわけヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、結核菌(M. tuberculosis)、Ｃ．トラコマチス(C. trachomatis)、マラリアなどのこれら多くの生物に対する効果的なワクチンは存在しない。慢性感染が定着し、宿主免疫系がこれらの慢性または潜在感染を排除できない場合に重大な問題となる。抗原／ワクチンに対する不十分な一次応答およびエフェクター応答はまた、急性免疫が必要とされる場合（それ以外の点で有効なワクチンが作製可能な場合であっても）、例えば、インフルエンザなどの地域流行／汎流行的大発生または感染性病原体（例えば、炭疽）によるバイオテロ攻撃の、ならびに免疫系が未発達または弱まっている小児および高齢者集団において問題となる。
【０００８】
ワクチンの免疫原性および保護を改善するための一つのアプローチがアジュバントの使用である。アジュバントは免疫応答を改善するためにワクチンに加えられる成分である。開発され、試験されているほとんどのアジュバントは主として先天的免疫応答（抗原特異的でない）、抗体応答および極めて少ない場合であるが、弱いＴ細胞応答を惹起する。利用可能なアジュバントに、一次応答を増大させ、細胞内病原体に対する防御免疫を惹起するのに必要とされるものである、強力なエフェクター応答または迅速なＴ細胞増殖応答を誘導するものはない。
【０００９】
よって、本発明の一つの目的は、一次免疫応答およびエフェクター免疫応答の双方を増強するワクチンアジュバントを提供することである。
【００１０】
もう一つの目的は、より迅速な防御誘導ならびに慢性感染に対する強力なエフェクター応答をもたらす組成物を提供することである。
【００１１】
別の目的は、Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無応答またはその双方を誘導する感染を処置するための組成物および方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、単球、樹状細胞、マクロファージを含む抗原提示細胞の細胞内感染を処置するための組成物および方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１３】
（１）迅速Ｔ細胞媒介応答の惹起不全、（２）Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無応答もしくはその双方の誘導、または（３）単球、マクロファージ、樹状細胞、および／または例えば細胞内病原体を死滅させるのに必要とされるような他のＡＰＣの活性化不全から起こる感染または疾患を処置するための方法および組成物。これらは急性（例えば、毒素誘発性）、慢性、遅発性、または潜在感染により引き起こされ得る。本発明の方法および組成物は、ＰＤ−１と結合してそれを遮断し、阻害的シグナル伝達を回避または低減することによるか、またはＰＤ−Ｌ１などのＰＤ−１のリガンドと結合してそれを遮断し、それにより、そのリガンドがＰＤ−１と結合して（完全にまたは部分的に）阻害シグナルを送達しないようにすることにより、望ましくないＴ細胞阻害の問題を解決する。これらの分子は一般にＰＤ−１アンタゴニストと呼ばれ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１などのリガンドと直接結合する両化合物を含む。いずれの場合でも、Ｔ細胞の増殖または活性化などのＴ細胞応答が増強される。さらに、ＰＤ−１アンタゴニストは、細胞内病原体によりアップレギュレートされている、抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、上皮細胞などのＡＰＣ）で発現されるＰＤ−１リガンドと結合してそれを遮断することもできる。
【００１４】
免疫応答を増強する、または増大させ得るには、１）Ｔ細胞活性を阻害する分子に干渉すること、例えば、分子がＰＤ−１であり、ａ）受容体（ＰＤ−１）を遮断するか、もしくはｂ）リガンド（Ｂ７−Ｈ１もしくはＢ７−ＤＣ）を遮断する場合、または２）Ｔ細胞活性を活性化させる分子を増大させる、例えば、分子がＣＤ２８であり、アゴニストが加えられる場合の、二つの機構がある。免疫応答は、投与される薬剤の用量を変えることにより、投与計画中、間欠的投与を行うことにより、またその組合せにより（再び投与される前に分子から薬剤の解離をもたらす（初回刺激と追加免疫を用いる抗原惹起で見られるものに類似））、種々の親和性（すなわち、必要とされるものよりも高いまたは低い）で結合するアンタゴニストを提供することにより調節され得る。いくつかの場合では、免疫系を刺激した後にその刺激を取り去ることが特に望ましいことがある。その結合相手に対するアンタゴニストの親和性を用いて、解離に必要な時間を決定することができる（親和性の高い薬剤は親和性の低い薬剤よりも解離に時間がかかる）。また、ＰＤ−１またはリガンドのいずれかと結合する、また同じ分子に異なる親和性で結合するアンタゴニストの組合せを用いて、免疫刺激の程度を調節することもできる。
【００１５】
これらの組成物は、（ｉ）ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘導することなくＰＤ−１と結合してそれを遮断し、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２などのリガンドの結合を妨げ、それにより、ＰＤ−１により媒介される阻害シグナルの活性化を妨げるか、または（ｉｉ）ＰＤ−１のリガンドと結合し、ＰＤ−１受容体との結合を回避し、それにより、ＰＤ−１のより媒介される阻害シグナルの活性化を妨げるＰＤ−１アンタゴニストを含む。
【００１６】
好ましい組成物は、十分なＴ細胞応答の欠如、Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無応答、ならびに単球、マクロファージ、樹状細胞および他のＡＰＣの活性化、または被験体におけるこれらの影響の総てを低減するまたは克服するのに有効な量の非抗体ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質（ＰＤ−Ｌ２−Ｉｇ）を含む。ＰＤ−１アンタゴニストはまた、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１タンパク質、断片、変異体または融合物も含む。これらのＰＤ−Ｌ１断片は非機能的ＰＤ−Ｌ１断片とも呼ばれる。ＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、融合タンパク質、および非機能的ＰＤ−Ｌ１断片は、ＰＤ−１の内因性リガンドがＰＤ−１と相互作用しないようにすることにより、Ｔ細胞においてＰＤ−１を介して起こる阻害的シグナル伝達を阻害または低減することができる。さらなる好ましいＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−１のリガンドと結合し、Ｔ細胞上の内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げるＰＤ−１またはその可溶性断片が含まれる。これらのＰＤ−１断片は可溶性ＰＤ−１断片とも呼ばれる。その他のＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合を妨げるＢ７．１またはその可溶性断片が含まれる。
【００１７】
さらなる実施形態としては、阻害的シグナル伝達を生じることなくＰＤ−１受容体と、またはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２などのＰＤ−１受容体のリガンドのいずれかと結合してそれを遮断する抗体が含まれる。ＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、融合タンパク質および非機能的ＰＤ−Ｌ１断片はまた、Ｔ細胞またはＡＰＣ上の別の受容体と結合することによってＴ細胞を活性化することもできる。
【００１８】
アンタゴニストの作用は、Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無応答、またはその双方を克服する手助けをするとともに、感染または癌により誘導される単球、マクロファージ、樹状細胞、および他のＡＰＣを活性化する。ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドまたは融合タンパク質で処置可能な代表的感染としては、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、寄生虫、原虫、または真菌により引き起こされる感染が挙げられる。処置可能な例示的ウイルス感染としては、限定されるものではないが、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、またはヒト乳頭腫ウイルスにより引き起こされる感染が挙げられる。処置可能な他の感染としては、プラスモジウム、マイコプラズマ、結核菌(M. tuberculosis)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、ブドウ状球菌(Staphylococcus)、およびＣ．トラコマチス(C. trachomatis)により引き起こされるものが挙げられる。
【００１９】
ＰＤ−１アンタゴニストは、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、および腫瘍特異的抗原などの１以上の抗原を含有するワクチンと組み合わせて、または交互に投与することができる。ＰＤ−１アンタゴニストは、被験体において一次免疫応答およびエフェクター細胞応答を増強するためにワクチンとともに有効なアジュバントとして使用することができる。処置される好ましい被験体は免疫系が弱まっているか、または免疫不全であり、６５歳を超えるか、または２歳未満である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ−Ｂは、ＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡにおけるＢ７−ＤＣ−ＩｇのＰＤ−１への結合を示すグラフである。
【図２】図２は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞と結合することを示すグラフである。
【図３】図３は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＰＤ−１との結合に関してＢ７−Ｈ１と競合することを示すグラフである。
【図４】図４は、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せ処置が腫瘍モデルにおいて抗原特異的メモリーＣＴＬの生成をもたらしたことを示す。
【図５】図５は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＨＳＶ−２ウイルス粒子の放出を低減し、ＨＳＶ−２ワクチンの存在下でマウスの生存率を高めたことを示す。
【発明の具体的説明】
【００２１】
Ｉ．定義
本明細書において「単離された」とは、その化合物が天然に存在する場合と異なる環境にある、例えば、ペプチドをそれが天然には見られない濃度まで濃縮することなどによってその天然環境から分離された目的化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか）を表すことを意味する。「単離された」とは、目的化合物が有意に富化された、かつ／または目的化合物が部分的または有意に精製されたサンプル内にある化合物を含むことを意味する。「有意に」とは、統計学的に有意に大きいことを意味する。
【００２２】
本明細書において「ポリペプチド」とは、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）とは無関係に任意の長さのアミノ酸鎖を意味する。
【００２３】
本明細書において「変異体」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列に比べて少なくとも一つのアミノ酸配列の変更を含む。
【００２４】
本明細書において「アミノ酸配列の変更」とは、例えば、１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入であり得る。
【００２５】
本明細書において「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントが、その挿入されたセグメントの複製を生じるように挿入することができるプラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。本明細書に記載のベクターは発現ベクターであり得る。
【００２６】
本明細書において「発現ベクター」とは、１以上の発現制御配列を含むベクターである。
【００２７】
本明細書において「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【００２８】
本明細書において「機能的に連結される」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝構築物に組み込まれることを意味する。
【００２９】
本明細書においてポリペプチドの「断片」とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。一般に、断片はアミノ酸５個以上の長さである。
【００３０】
本明細書において「価数」とは、分子当たりに利用可能な結合部位の数を意味する。
【００３１】
本明細書において「保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する置換である。
【００３２】
本明細書において「非保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性または嵩が有意に変化するものである。
【００３３】
本明細書において「単離された核酸」とは、哺乳類ゲノムにおいてその核酸の一端または両端に通常隣接している核酸をはじめ、哺乳類ゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を意味する。
【００３４】
本明細書において、核酸に関して「単離された」は任意の非天然核酸配列を含む（このような非天然配列は天然には見られず、天然ゲノムには直接連続する配列を持たないため）。
【００３５】
本明細書において「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入できる原核細胞および真核細胞を意味する。
【００３６】
本明細書において「形質転換させる」および「トランスフェクトする」とは、当該技術分野で知られているいくつかの技術によって核酸（例えばベクター）を細胞に導入することを包含する。
【００３７】
本明細書において「抗体」とは、完全分子ならびに抗原−結合部位を含むその断片の双方を含むことを意味する。これらには完全抗体のＦｃ断片を欠いたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。
【００３８】
「免疫細胞」とは、免疫応答に役割を果たす造血系起源の細胞を意味する。免疫細胞は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞および骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球）を含む。
【００３９】
「Ｔ細胞」とは、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を意味する。Ｔ細胞とは、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、およびＴｈ１７細胞を含む。
【００４０】
「Ｔ細胞細胞傷害性」とは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化により媒介されるいずれの免疫応答も含む。例示的免疫応答としては、サイトカインの産生、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、グランザイムまたはパーフォリンの産生、および感染性病原体の排除が含まれる。
【００４１】
「免疫細胞」とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびリンパ球を意味する。
【００４２】
「阻害的シグナル伝達」とは、Ｔ細胞の増殖を低減することによるものであれ、他のいずれかの阻害機構によるものであれ、Ｔ細胞応答を抑制する、またはそうでなければ低減する作用を有するＰＤ−Ｌ１または他のリガンドによるＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を意味する。
【００４３】
ＩＩ．ＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用に干渉するのに好ましいＰＤ−１アンタゴニスト化合物は、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとしても知られる）、ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン、ＰＤ−Ｌ２の融合タンパク質、およびＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合してそれを遮断し、するＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合を妨げるその変異体である。さらなるＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１の断片、ＰＤ−１のリガンドと結合し、Ｔ細胞上の内因性ＰＤ−１受容体と結合するのを妨げるＰＤ−１または可溶性その断片、ならびにＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合を妨げることができるＢ７．１または可溶性その断片が含まれる。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは被験体におけるＴ細胞傷害性を高める。この多機能性ＰＤ−１アンタゴニストは被験体において強力な免疫応答を誘導し、Ｔ細胞の消耗およびＴ細胞の無応答を克服する助けをする。
【００４４】
ＰＤ−１アンタゴニストはＰＤ−１のリガンドと結合し、それと相互作用するか、またはリガンドとＰＤ−１受容体の結合を阻害するか、またはＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達に結びつくことなくＰＤ−１受容体と直接結合する。好ましい実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストはＰＤ−１と直接結合し、ＰＤ−１阻害的シグナル伝達を遮断する。他の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストはＰＤ−１のリガンドと結合し、リガンドがＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発するのを低減または阻害する。さらに別の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１受容体以外の受容体と結合することによりＴ細胞を活性化することができる。
【００４５】
ＰＤ−１アンタゴニストは小分子アンタゴニストであり得る。「小分子」とは、１００ダルトンを超え、約２，５００ダルトン未満、好ましくは１００〜２０００ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約１２５０ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約１０００ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約７５０ダルトンの間、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの間の分子量を有する小有機化合物を意味する。これらの小分子は多くの場合、環状炭素または複素環式構造および／または１以上の官能基で置換された芳香族または多環芳香族構造を含む。これらの小分子アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２などのＰＤ−１のリガンドと結合し、そのリガンドがＰＤ−１と相互作用しないようにすることにより、またはＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１受容体と直接結合することにより、ＰＤ−１受容体シグナル伝達を低減するか、またはそれと干渉する。
【００４６】
例示的ＰＤ−１アンタゴニストとしては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１またはＢ７−１ポリペプチド、およびその変異体、断片または融合タンパク質が挙げられる。さらなる実施形態としては、これらのタンパク質のいずれかと結合する抗体が挙げられる。
【００４７】
Ａ．ＰＤ−Ｌ２に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
１．ＰＤ−１と結合する、ＰＤ−Ｌ２に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１アンタゴニストは免疫細胞上のＰＤ−１と結合し、阻害的ＰＤ−１のシグナル伝達を遮断する。ＰＤ−１のシグナル伝達は、ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１、一般に、ＰＤ−Ｌ１）が免疫シナプス内でＴＣＲ：ＭＨＣ複合体と近接してＰＤ−１と結合する必要があると思われる。よって、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を遮断し、場合により、Ｔ細胞膜上でのＰＤ−１とＴＣＲの同時結合を妨げるタンパク質、抗体または小分子は有用なＰＤ−１アンタゴニストである。
【００４８】
代表的なポリペプチドアンタゴニストとしては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、その断片、その融合タンパク質、およびその変異体が挙げられる。ＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を遮断するＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは好ましい実施形態の一つである。他の実施形態としては、ＰＤ−１の天然リガンドが結合しないように、かつ、シグナル伝達を誘発しないようにするＰＤ−１アンタゴニストが含まれる。ある特定の実施形態では、開示されたＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、免疫シナプスに関してペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの同時結合が存在しないので、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がないと考えられる。ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞の増殖を減衰する負のシグナルを伝達するので、ＰＤ−１のシグナル伝達経路を阻害すれば、そうでなければ減衰される細胞を活性化させることができる。
【００４９】
２．例示的ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドＰＤ−１アンタゴニスト
ネズミＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化１】
2012500855.tif 000003
（配列番号１）または
【化２】
2012500855.tif 000004
（配列番号２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００５０】
ヒトＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化３】
2012500855.tif 000005
（配列番号３）または
【化４】
2012500855.tif 000006
（配列番号４）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００５１】
非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化５】
2012500855.tif 000007
（配列番号５）または
【化６】
2012500855.tif 000008
（配列番号６）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
配列番号１、３、および５はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００５２】
Ｂ．ＰＤ−Ｌ１に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
１．ＰＤ−１受容体と結合するＰＤ−Ｌ１に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１受容体と結合する他のＰＤ−１アンタゴニストとしては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、その断片、その融合タンパク質およびその変異体が挙げられる。これらのＰＤ−１ポリペプチドアンタゴニストはＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断し、ＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がない。一つの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、免疫シナプスに関してペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの同時結合が存在しないので、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がないと考えられる。ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞の増殖を減衰する負のシグナルを伝達するので、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを用いてＰＤ−１のシグナル伝達を阻害すれば、そうでなければ減衰される細胞を活性化することができる。
【００５３】
２．例示的ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドＰＤ−１アンタゴニスト
ネズミＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、
【化７】
2012500855.tif 000009
（配列番号７）または
【化８】
2012500855.tif 000010
（配列番号８）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００５４】
ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、
【化９】
2012500855.tif 000011
（配列番号９）
【化１０】
2012500855.tif 000012
（配列番号１０）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００５５】
配列番号７および９はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００５６】
Ｃ．Ｂ７．１およびＰＤ−１に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
１．ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と結合するＢ７．１およびＰＤ−１に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
他の有用なポリペプチドとしては、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２などのＰＤ−１リガンドと結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより阻害的シグナル伝達を妨げることができるＰＤ−１受容体タンパク質、またはその可溶性断片が含まれる。このような断片はまた、場合により天然リガンドとの結合を増大させるＡ９９Ｌ突然変異などの突然変異を含む、ＰＤ−１タンパク質の可溶性ＥＣＤ部分も含む。ＰＤ−Ｌ１はまた、タンパク質Ｂ７．１と結合することも示されている(Butte, et al., Immunity, 27(1): 111-122 (2007))。よって、ＰＤ−Ｌ１リガンドと結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより阻害的シグナル伝達を妨げることができるＢ７．１またはその可溶性断片もまた有用である。
【００５７】
２．例示的Ｂ７．１ポリペプチドＰＤ−１アンタゴニスト
ネズミＢ７．１ポリペプチドは、
【化１１】
2012500855.tif 000013
（配列番号１１）または
【化１２】
2012500855.tif 000014
（配列番号１２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００５８】
ヒトＢ７．１ポリペプチドは、
【化１３】
2012500855.tif 000015
（配列番号１３）または
【化１４】
2012500855.tif 000016
（配列番号１４）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
配列番号１１および１３はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００５９】
３．例示的ＰＤ−１ポリペプチドＰＤ−１アンタゴニスト
ヒトＰＤ−１ポリペプチドは、
【化１５】
2012500855.tif 000017
（配列番号１５）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６０】
非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１ポリペプチドは、
【化１６】
2012500855.tif 000018
（配列番号１６）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
配列番号１５および１６はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００６１】
Ｄ．ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。本明細書において、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【００６２】
有用な断片は、それらの天然リガンドと結合する能力を保持するものである。全長ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片であるＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは一般に、全長ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドに比べてその天然リガンドと結合する能力の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントを有する、またはさらには１００パーセントを超える。
【００６３】
例えば、ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１の有用な断片は、ＰＤ−１と結合する能力を保持するものである。ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１断片は一般に、全長ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１に比べてＰＤ−１と結合する能力の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントを有する、またはさらには１００パーセントを超えるものである。
【００６４】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片は可溶性断片を含む。可溶性ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド断片は、産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得るＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片である。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの可溶性断片は、該ポリペプチドの細胞外ドメインの一部または全部を含み、細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインの一部または全部を欠く。一実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド断片はＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの全細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは膜貫通ドメイン由来の１、２、３、４または５個のアミノ酸を含み得ると考えられる。あるいは、細胞外ドメインはＣ末端、Ｎ末端または双方から除去された１、２、３、４、または５個のアミノ酸を有し得る。
【００６５】
一般に、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドまたはその断片は、シグナル配列をコードする配列を含む核酸から発現される。このシグナル配列が一般に未熟なポリペプチドから切断されて、シグナル配列を欠く成熟ポリペプチドが生じる。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドのこのシグナル配列は、そのポリペプチドの発現レベル、分泌、溶解度または他の特性に影響を与えるために標準的な分子生物学的技術を用いて別のポリペプチドのシグナル配列で置換することができる。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドシグナル配列を置換するために用いられるシグナル配列は当該技術分野で知られているいずれのものであってもよい。
【００６６】
１．ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
ａ．ヒトＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはヒトＰＤ−Ｌ２またはその断片の細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化１７】
2012500855.tif 000019
（配列番号１７）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００６７】
別の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化１８】
2012500855.tif 000020
（配列番号１８）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６８】
このシグナル配列は成熟タンパク質では除去されると考えられる。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができると考えられる。配列番号１９は、シグナル配列を含まない配列番号１８のヒトアミノ酸配列を示す。
【化１９】
2012500855.tif 000021
（配列番号１９）
【００６９】
別の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはヒトＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化２０】
2012500855.tif 000022
（配列番号２０）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００７０】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化２１】
2012500855.tif 000023
（配列番号２１）（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７１】
ｂ．非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一つの実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインまたはその断片を含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化２２】
2012500855.tif 000024
（配列番号２２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００７２】
別の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、非ヒト霊長類アミノ酸配列：
【化２３】
2012500855.tif 000025
（配列番号２３）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７３】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からの融合タンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号２４は、シグナル配列を含まない配列番号２３の非ヒト霊長類アミノ酸配列を示す。
【化２４】
2012500855.tif 000026
（配列番号２４）
【００７４】
別の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化２５】
2012500855.tif 000027
（配列番号２５）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００７５】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、非ヒト霊長類アミノ酸配列：
【化２６】
2012500855.tif 000028
（配列番号２６）（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７６】
ｄ．ネズミＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはネズミＰＤ−Ｌ２またはその断片の細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化２７】
2012500855.tif 000029
（配列番号２７）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００７７】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化２８】
2012500855.tif 000030
（配列番号２８）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７８】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号２９は、シグナル配列を含まない配列番号２８のネズミアミノ酸配列を示す。
【化２９】
2012500855.tif 000031
（配列番号２９）
【００７９】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはネズミＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化３０】
2012500855.tif 000032
（配列番号３０）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００８０】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化３１】
2012500855.tif 000033
（配列番号３１）（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００８１】
ｄ．ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン断片
ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインは、シグナルペプチドまたはＰＤ−Ｌ２の推定膜貫通ドメイン由来の１以上のアミノ酸を含み得る。分泌の際に切断されるシグナルペプチドのアミノ酸の数は発現系および宿主によって異なり得る。さらに、ＰＤ−１と結合する能力を保持するＣ末端またはＮ末端から１以上のアミノ酸を欠くＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインの断片を使用することもできる。
【００８２】
第一の融合相手として使用することができるネズミＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５３の
【化３２】
2012500855.tif 000034
が挙げられる。
【００８３】
ネズミＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの： 
配列番号１の
【化３３】
2012500855.tif 000035
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【００８４】
第一の融合相手として使用することができるヒトＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの： 
配列番号５６の
【化３４】
2012500855.tif 000036
が挙げられる。
【００８５】
ヒトＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号３の
【化３５】
2012500855.tif 000037
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号３内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【００８６】
第一の融合相手として使用することができる非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５の
【化３６】
2012500855.tif 000038
が挙げられる。
【００８７】
非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号５の
【化３７】
2012500855.tif 000039
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号５内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【００８８】
ＰＤ−Ｌ２タンパク質はまた、配列番号３（ヒト全長）のアミノ酸２０−１２１または配列番号２３（細胞外ドメインまたはＥＣＤ）のアミノ酸１−１０２のＰＤ−１結合断片も含む。その特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドまたはＰＤ−１結合断片はまた、配列番号３の残基１１０−１１４にアミノ酸ＷＤＹＫＹを、または配列番号２３の残基９１−９５にＷＤＹＫＹを組み込んでいる。限定されない例として、このようなＰＤ−１結合断片は、配列番号３のアミノ酸２０−１２１の配列の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含んでなり、このようなＰＤ−１結合断片のそれぞれの好ましい実施形態は、部分断片として配列番号３の残基１１０−１１４に見られるアミノ酸ＷＤＹＫＹ、または配列番号２３の残基９１−９５に見られるＷＤＹＫＹを含んでなる。
【００８９】
２．ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン
一つの実施形態では、変異体ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは細胞外ドメインの全部または一部を含む。ＰＤ−Ｌ１の代表的な細胞外ドメインのアミノ酸配列は、
【化３８】
2012500855.tif 000040
（配列番号３２）
と８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有し得る。
【００９０】
ＰＤ−Ｌ１の膜貫通ドメインは配列番号９の２３９番のアミノ酸で始まる。ＰＤ−Ｌ１の好適な断片は、シグナルペプチド配列、例えば、配列番号９またはその変異体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続するアミノ酸、膜貫通ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸、またはその組合せを含み得る。
【００９１】
ネズミＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは以下のアミノ酸配列：
【化３９】
2012500855.tif 000041
（配列番号３３）
を有する。
【００９２】
ネズミＰＤ−Ｌ１の膜貫通ドメインは配列番号７の２４０番のアミノ酸で始まる。ある特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、シグナルペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続するアミノ酸、膜貫通ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続するアミノ酸、またはその組合せを有するネズミＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含む。
【００９３】
３．Ｂ７．１細胞外ドメイン
ａ．ネズミＢ７．１細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミＢ７．１またはその断片の細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化４０】
2012500855.tif 000042
（配列番号３４）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９４】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化４１】
2012500855.tif 000043
（配列番号３５）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００９５】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号３６は、シグナル配列を含まない配列番号３５のネズミアミノ酸配列を示す。
【化４２】
2012500855.tif 000044
（配列番号３６）
【００９６】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはネズミＢ７．１のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化４３】
2012500855.tif 000045
（配列番号３７）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９７】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化４４】
2012500855.tif 000046
（配列番号３８）（Ｂ７．１Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００９８】
ｂ．ヒトＢ７．１細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはヒトＢ７．１またはその断片の細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化４５】
2012500855.tif 000047
（配列番号３９）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９９】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化４６】
2012500855.tif 000048
（配列番号４０）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１００】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号４１は、シグナル配列を含まない配列番号４０のヒトアミノ酸配列を示す。
【化４７】
2012500855.tif 000049
（配列番号４１）
【０１０１】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはヒトＢ７．１のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化４８】
2012500855.tif 000050
（配列番号４２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１０２】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化４９】
2012500855.tif 000051
（配列番号４３）（Ｂ７．１Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１０３】
３．Ｂ７．１細胞外ドメイン断片
共刺激ポリペプチドドメインとして使用することができるネズミＢ７．１の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号１１の
【化５０】
2012500855.tif 000052
が挙げられる。
【０１０４】
ネズミＢ７．１のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号１１の
【化５１】
2012500855.tif 000053
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１１内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１０５】
共刺激ポリペプチドドメインとして使用することができるヒトＢ７．１の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号１３の
【化５２】
2012500855.tif 000054
が挙げられる。
【０１０６】
ヒトＢ７．１のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号１３の
【化５３】
2012500855.tif 000055
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１３内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１０７】
Ｅ．変異体
１．変異体ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１  ＰＤ−１アンタゴニスト
さらなるＰＤ−１アンタゴニストとしては、生理学的条件下でＰＤ−１と結合する能力を保持し、ＰＤ−１に対する結合が増強されるか、またはＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を促進する能力が低減されるように突然変異誘発されたＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１、ポリペプチドおよびその断片が含まれる。一つの実施形態は、ＰＤ−１を活性化し、Ｔ細胞へ阻害シグナルを伝達するポリペプチドの能力を非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１に比べて阻害または低減する１以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む単離されたＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを提供する。該ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはいずれの起源種のものであってもよい。一つの実施形態においては、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは哺乳類種に由来する。好ましい実施形態では、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはヒトまたは非ヒト霊長類起源のものである。
【０１０８】
別の実施形態においては、変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ＰＤ−１に対して野生型または非変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１と同じ結合活性を有するが、非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに比べてＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を刺激する能力を持たないか、または１０％未満である。他の実施形態では、該変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは野生型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１よりもＰＤ−１に対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれを超える結合活性を有し、非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに比べてＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を刺激する能力が５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満である。
【０１０９】
変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、または挿入の任意の組合せを有し得る。一つの実施形態では、単離されたＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１変異型ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が野生型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するように、ある整数のアミノ酸変化を有する。好ましい実施形態では、Ｂ７−Ｈ１変異型ポリペプチドは、野生型ネズミ、非ヒト霊長類またはヒトＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
配列同一性％は、コンピュータープログラムまたは直接的配列比較を用いて計算することができる。２配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、限定されるものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられる（例えば、D. W. Mount, 2001, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 参照）。ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用可能である。
【０１１１】
アミノ酸配列比較のためのパラメーター例としては以下のものが挙げられる：１）Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970))からのアルゴリズム、２）Hentikoff and Hentikoff (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:10915-10919 (1992))からのＢＬＯＳＳＵＭ６２比較マトリックス、３）ギャップペナルティー＝１２、および４）ギャップレングスペナルティー＝４。これらのパラメーターを用いる有用なプログラムは、「ギャップ」プログラム(Genetics Computer Group, Madison, Wis.)として公的に入手可能である。上述のパラメーターはポリペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップに対するペナルティーは無い）。
【０１１２】
あるいは、ポリペプチド配列同一性は、次式：同一性％＝（同一の残基の数）／（アミノ酸残基のアライメント長）＊１００を用いて計算することができる。この計算では、配列長は内部ギャップを含むが、末端ギャップは含まない。
【０１１３】
ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸置換は「保存的」または「非保存的」であり得る。本明細書において、「保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する置換であり、「非保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性、または嵩が有意に変更されるものである。非保存的置換は、（ａ）例えば、シートまたはらせんコンフォメーションのような置換領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの効果がより有意に異なる。
【０１１４】
保存的アミノ酸置換の例としては、置換が以下の５群中のものが挙げられる：１）小さな脂肪族、非極性またはやや極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、２）極性、負電荷を有する残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）、極性、正電荷を有する残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、大きな脂肪族、非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）、および大きな芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。非保存的アミノ酸置換の例としては、１）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）から（またはにより）置換される場合、２）システインまたはプロリンが他の残基から（またはにより）置換される場合、３）電気的に陽性の側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニルまたはヒスチジル）が電気的に陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）から（またはにより）置換される場合、または４）嵩高の側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）から（またはにより）置換される場合が挙げられる。
【０１１５】
しかしながら、挙げられたアミノ酸位置における置換は、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体を用いて行うことができると理解される。例えば、挙げられた位置における置換は、任意の天然アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、セリン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン）を用いて行うことができる。
【０１１６】
本明細書に記載される置換はマウス、非ヒト霊長類およびヒトＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１に関するものであるが、当業者ならば他種（例えば、ラット、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、またはウシ）由来の相当するポリペプチドにおいても等価の変更を容易に行うことができることを注記する。しかしながら、結合は種特異的な成分であることから、ＰＤ−１アンタゴニストをヒト投与する場合にはヒトを使用するのが好ましい。
【０１１７】
一つの実施形態においては、開示されている単離された変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはＰＤ−１のアンタゴニストであり、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合してそれを遮断する。ＰＤ−１シグナル伝達によるＴ細胞の減衰を妨げることにより、より多くのＴ細胞の活性化に利用可能である。Ｔ細胞阻害を妨げると、ＰＤ−１アンタゴニストと接触していないＴ細胞に比べて、Ｔ細胞応答が高まるか、Ｔ細胞の増殖が増大し、Ｔ細胞によるサイトカインの産生および／または分泌が高まるか、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能が刺激されるか、またはＴ細胞の生存が促進される。この相互作用から生じるＴ細胞応答は一般に、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの非存在下での応答よりも大きい。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの非存在下でのＴ細胞の応答は応答性がないか、またはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの存在下よりも有意に低いものであり得る。このＴ細胞の応答は、エフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答、１以上のエフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答を助けるヘルパー応答、または抑制的応答であり得る。
【０１１８】
２分子間の結合親和性を測定する方法は技術分野でよく知られている。ＰＤ−１に対する変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの結合親和性を測定する方法としては、限定されるものではないが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、表面プラズモン共鳴、蛍光異方性、アフィニティークロマトグラフィー、および親和性選択−質量分析が挙げられる。
【０１１９】
本明細書に開示される変異型ポリペプチドは全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。好ましい断片は、ＰＤ−１と結合するのに有効な細胞外ドメインの全部または一部を含む。本明細書において、断片とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【０１２０】
２．変異型Ｂ７．１およびＰＤ−１アンタゴニスト
さらなるＰＤ−１アンタゴニストとしては、生理学的条件下でＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合する能力を保持するか、またはＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１に対する結合が増強されるように改変されているＢ７．１およびＰＤ−１ポリペプチドおよびその断片が含まれる。このような変異体ＰＤ−１タンパク質としては、天然リガンドに対する結合を増強する、Ａ９９Ｌ突然変異などの突然変異を含むＰＤ−１タンパク質の可溶性ＥＣＤ部分が挙げられる(Molnar et al., Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1) and its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 July 2008))。Ｂ７．１およびＰＤ−１ポリペプチドはいずれの起源種のものであってもよい。一つの実施形態では、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドは哺乳類種に由来する。好ましい実施形態では、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドはヒトまたは非ヒト霊長類起源のものである。
【０１２１】
変異型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、または挿入の任意の組合せを有し得る。一つの実施形態では、単離されたＢ７．１またはＰＤ−１変異型ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が野生型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するように、ある整数のアミノ酸変化を有する。好ましい実施形態では、Ｂ７．１またはＰＤ−１変異型ポリペプチドは、野生型ネズミ、非ヒト霊長類、またはヒトＢ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２２】
Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドにおけるアミノ酸置換は「保存的」または「非保存的」であり得る。保存的および非保存的置換は上記に定義されている。
【０１２３】
一つの実施形態においては、開示されている単離された変異型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドはＰＤ−１のアンタゴニストであり、ＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合し、それによりそれらの内因性ＰＤ−１との結合を遮断する。ＰＤ−１シグナル伝達によるＴ細胞の減衰を妨げることにより、より多くのＴ細胞を活性化に利用可能とする。Ｔ細胞阻害を妨げると、ＰＤ−１アンタゴニストと接触していないＴ細胞に比べて、Ｔ細胞応答が高まるか、Ｔ細胞の増殖が増大するか、Ｔ細胞によるサイトカインの産生および／または分泌が高まるか、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能が刺激されるか、またはＴ細胞の生存が促進される。この相互作用から生じるＴ細胞応答は一般に、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの非存在下での応答よりも大きい。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの非存在下でのＴ細胞の応答は、応答性がないか、またはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの存在下よりも有意に低いものであり得る。このＴ細胞の応答は、エフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答、１以上のエフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答を助けるヘルパー応答、または抑制的応答であり得る。
【０１２４】
変異体ポリペプチドは全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。好ましい断片は、ＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合するのに有効な細胞外ドメインの全部または一部を含む。本明細書において、断片とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【０１２５】
Ｆ．融合タンパク質
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、第一のポリペプチドドメインと第二のドメインとを含む融合タンパク質である。この融合タンパク質はＴ細胞受容体に結合することができるか、あるいは好ましくはこの融合タンパク質は、例えばＰＤ−１と競合的に結合することによって、Ｔ細胞と結合して、Ｔ細胞への阻害的シグナル伝達を遮断することができる。開示されている組成物は、天然阻害リガンドとＰＤ−１との結合に干渉することにより、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を有効に遮断する。好適な共刺激ポリペプチドとしては、阻害性Ｔ細胞シグナル伝達受容体に対する結合親和性が増強または低下されたＰＤ−１などの変異型ポリペプチドおよび／またはその断片が含まれる。
【０１２６】
融合タンパク質はまた場合により、第一のポリペプチドドメインを抗原結合ドメインから分離するペプチドまたはポリペプチドリンカードメインを含んでもよい。
【０１２７】
本明細書に開示される融合タンパク質は式Ｉ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
（式中、「Ｎ」は融合タンパク質のＮ末端を表し、「Ｃ」は融合タンパク質のＣ末端を表し、「Ｒ１」はＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１、もしくはＰＤ−１ポリペプチドまたは抗原結合標的化ドメインであり、「Ｒ２」はペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ３」は標的化ドメインまたは抗原結合標的化ドメインであり、ここで、「Ｒ１」が抗原結合標的化ドメインである場合には、「Ｒ３」はポリペプチドドメインであり、「Ｒ１」がＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドドメインである場合には、「Ｒ３」は抗原結合標的化ドメインである）
で表されるものである。好ましい実施形態では、「Ｒ１」はＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１、またはＰＤ−１ポリペプチドドメインであり、「Ｒ３」は抗原結合標的化ドメインである。
【０１２８】
場合により、融合タンパク質はさらに、２以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインを含む。該融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインは別個のドメインであってもよいし、あるいはまたその融合タンパク質の他のドメイン（ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１もしくはＰＤ−１ポリペプチドドメイン、抗原結合標的化ドメインまたはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）の一つに含まれていてもよい。
【０１２９】
融合タンパク質は二量体化または多量体化されていてもよい。二量体化または多量体化は二量体化または多量体化ドメインを介して２以上の融合タンパク質間で生じ得る。あるいは、融合タンパク質の二量体化または多量体化は化学的架橋によっても生じする。形成される二量体または多量体は、ホモ二量体／ホモ多量体またはヘテロ二量体／ヘテロ多量体であり得る。
【０１３０】
融合タンパク質のモジュール性およびそれらの種々の組合せでの二量体化または多量体化能は、腫瘍細胞の微小環境または免疫調節組織に対する免疫応答を増強する働きをする標的化分子に豊富な選択肢を与える。
【０１３１】
１．抗原結合標的化ドメイン
融合タンパク質はまた抗原結合標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、感染性疾患を引き起こす病原体に応答したＴ細胞の活性化の調節に関与する免疫組織に特異的な抗原、リガンドまたは受容体と結合する。
【０１３２】
標的化ドメイン
標的化のための抗原、リガンド、および受容体
一つの実施形態においては、融合タンパク質は、感染性疾患を引き起こす病原体に応答したＴ細胞の活性化の調節に関与する免疫組織により発現される抗原と特異的に結合するドメインを含む。
【０１３３】
標的化ドメインの分子種
リガンドおよび受容体
一つの実施形態においては、疾病標的化ドメインは、罹患細胞で特異的に発現されるか、または正常組織に比べて罹患細胞で過剰発現される細胞表面抗原もしくは受容体と結合するリガンドである。罹患細胞はまた、増殖および発達に影響を及ぼす微小環境中に多数のリガンドを分泌する。限定されるものではないが、増殖因子、サイトカインおよびケモカイン（上記に示されるケモカインを含む）をはじめとする、罹患細胞により分泌されるリガンドと結合する受容体は、開示されている融合タンパク質に用いるのに好適である。罹患細胞により分泌されるリガンドは、分泌されたリガンドと結合する受容体の可溶性断片を用いて標的化され得る。可溶性受容体断片は産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得る断片ポリペプチドであり、全細胞外ドメインまたはその断片を含む。
【０１３４】
単鎖ポリペプチド抗体
別の実施形態では、疾病関連標的化ドメインは、罹患細胞で特異的に発現されるか、または正常組織に比べて罹患細胞で過剰発現される細胞表面抗原または受容体と結合する単鎖抗体である。単鎖ドメイン抗体は共阻害性受容体アンタゴニストドメインに関して上記されている。
【０１３５】
Ｆｃドメイン
別の実施形態では、疾病または疾病関連標的化ドメインは、罹患細胞で発現されるＦｃ受容体と結合する免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインである。Ｆｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、ＦｃはＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の二つの定常領域免疫グロブリンドメインとＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを意味する。好ましい実施形態では、Ｆｃドメインはヒトまたはネズミ免疫グロブリンに由来する。より好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＩｇＧ１またはネズミＩｇＧ２ａに由来する。
【０１３６】
一つの実施形態においては、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３域は、
【化５４】
2012500855.tif 000056
（配列番号４４）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１３７】
配列番号４４によりコードされるヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化５５】
2012500855.tif 000057
（配列番号４５）
を有する。
【０１３８】
別の実施形態においては、ネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、
【化５６】
2012500855.tif 000058
（配列番号４６）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１３９】
配列番号４６によりコードされるネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化５７】
2012500855.tif 000059
（配列番号４７）
を有する。
【０１４０】
一つの実施形態においては、Ｆｃドメインは、腫瘍もしくは腫瘍関連新生血管系で特異的に発現されるか、または正常組織に比べて腫瘍もしくは腫瘍関連新生ポリペプチド血管系で過剰発現される特異的Ｆｃ受容体との結合を増強する１以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。好適なアミノ酸置換は上記のように保存的および非保存的置換を含む。
【０１４１】
非ホジキンリンパ腫またはワルデンストロームマクログロブリン血症に対してリツキシマブ（キメラマウス／ＣＤ２０に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体）で処置された患者における治療結果は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して明瞭な内因的親和性を有するＦｃγ受容体の対立遺伝子変異体の個々の発現と相関していた。特に、Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）を活性化する低親和性の高親和性対立遺伝子を有する患者はより高い奏功率を示し、非ホジキンリンパ腫の場合には、無進行生存を改善した。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、低親和性阻害Ｆｃ受容体ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）との結合を低減し、かつ低親和性活性化Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）との野生型レベルの結合を保持するか、またはそれとの結合を増強する以上のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み得る。
【０１４２】
好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＤ１６Ａとの結合を増強するアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。ＣＤ１６Ａとの結合を増強し、ＣＤ３２Ｂとの結合を低減するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの多数の置換が当該技術分野に知られており、Stavenhagen, et al., Cancer Res., 57(18):8882-90 (2007)に記載されている。ＣＤ３２Ｂとの結合が低減され、かつ／またはＣＤ１６Ａとの結合が増強されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの変異体の例は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩまたはＰ２９６Ｌ置換を含む。これらのアミノ酸置換はヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインにいずれの組合せで存在してもよい。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン変異体はＦ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、およびＹ３００Ｌ置換を含む。別の実施形態においては、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン変異体はＦ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ２９６Ｌ置換を含む。
【０１４３】
グリコホスファチジルイノシトールアンカードメイン
別の実施形態においては、疾病または疾病関連新生血管系標的化ドメインは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの翻訳後付加のためのシグナルを与えるポリペプチドである。ＧＰＩアンカーは、多くの真核生物のタンパク質のＣ末端に翻訳後に付加される糖脂質構造である。この修飾は細胞膜の外片に付着タンパク質をしっかり固定する。ＧＰＩアンカーは、Ｔ細胞に対する提示のために細胞表面にＴ細胞受容体結合ドメインを付着させるのに使用することができる。この実施形態では、ＧＰＩアンカードメインはＴ細胞受容体結合ドメインに対してＣ末端にある。
【０１４４】
一つの実施形態においては、ＧＰＩアンカードメインは、ポリペプチドが真核生物系で発現される場合にＧＰＩアンカーの翻訳後付加のためにシグナルを伝達するポリペプチドである。アンカーの付加はＧＰＩアンカーシグナル配列により決定され、アンカー付加の部位における小アミノ酸のセット（ω部位）とそれに続く親水性スペーサーからなり、疎水性ストレッチで終わる(Low, FASEB J., 3:1600-1608 (1989))。このシグナル配列の切断は、保存された中央成分(Low, FASEB J., 3:1600-1608 (1989))を有するが、可変の末梢部分(Homans et al., Nature, 333:269-272 (1988))を有するアンカーを付加する前にＥＲで起こる。ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端は、ホスホエタノールアミン橋を介して保存性の高いコアグリカン、マンノース（α１−２）マンノース（α１−６）マンノース（α１−４）グルコサミン（α１−６）ミオイノシトールに連結される。リン脂質テールはＧＰＩアンカーを細胞膜の付着させる。このグリカンコアは、ホスホエタノールアミン基、マンノース、ガラクトース、シアル酸または他の糖などの側鎖で様々に修飾することができる。第一のマンノース残基に付着されている最も一般的な側鎖は別のマンノースである。グリカンコアの第三のマンノースに付着されているＮ−アセチルガラクトサミン含有多糖などの複合側鎖が哺乳類アンカー構造に見られる。コアグルコサミンの修飾はまれである。タンパク質および起源種によって、ホスホイノシトール環の脂質アンカーはジアシルグリセロール、アルキルアシルグリセロールまたはセラミドである。これらの脂質種は炭素１４〜２８個の範囲で長さが異なり、飽和であっても不飽和であってもよい。多くのＧＰＩアンカーはまた、イノシトール環の２−ヒドロキシルにパルミチン酸などの付加的脂肪酸を含む。この余分な脂肪酸により、ＧＰＩアンカーはＰＩ−ＰＬＣによる切断に耐性となる。
【０１４５】
ＧＰＩアンカーは、ＧＰＩ翻訳後修飾を行うことができる真核生物系でＧＰＩアンカードメインを含む融合タンパク質を発現させることよって達成することができる。ＧＰＩアンカードメインは腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインとして使用することもできるし、あるいはすでに別個の腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインを含む融合タンパク質に追加することもできる。
【０１４６】
別の実施形態においては、ＧＰＩアンカー部分は、インビトロ酵素的または化学的工程を介して、単離されたＴ細胞受容体結合ドメインに直接付加される。この実施形態では、ＧＰＩアンカーは、ＧＰＩアンカードメインを必要とすることなくポリペプチドに付加することができる。ＧＰＩアンカー部分は、Ｔ細胞受容体結合ドメインおよび腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインを有する、本明細書に記載の融合タンパク質に付加することができる。あるいは、ＧＰＩアンカーは、腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインをコードする融合相手を必要とすることなく、Ｔ細胞受容体結合ドメインポリペプチドに直接付加することができる。
【０１４７】
２．ペプチドまたはポリペプチドリンカードメイン
融合タンパク質は場合により、共刺激ポリペプチドドメインを抗原結合標的化ドメインから分離するペプチドまたはポリペプチドリンカードメインを含む。
【０１４８】
抗体のヒンジ領域
一つの実施形態においては、リンカードメインは免疫グロブリンのヒンジ領域を含む。好ましい実施形態では、ヒンジ領域はヒト免疫グロブリンに由来する。ヒンジが由来し得る好適なヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＡが挙げられる。好ましい実施形態では、ヒンジ領域はヒトＩｇＧに由来する。
【０１４９】
別の実施形態においては、リンカードメインは、上記のような免疫グロブリンのヒンジ領域を含み、さらに１以上の付加的な免疫グロブリンドメインを含む。一つの実施形態では、付加的ドメインは免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。本明細書においてＦｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、ＦｃＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の二つ二つの定常領域免疫グロブリンドメインとＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを意味する。好ましい実施形態では、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。より好ましい実施形態では、ＦｃドメインはＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＩｇＧに由来する。
【０１５０】
別の実施形態においては、リンカードメインは免疫グロブリンのヒンジ領域と、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメインまたは免疫グロブリン軽鎖のＣＬドメインのいずれかを含む。好ましい実施形態では、ＣＨ１またはＣＬドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。ＣＬドメインはκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかに由来するものであり得る。より好ましい実施形態では、ＣＨ１またはＣＬドメインはヒトＩｇＧに由来する。
【０１５１】
免疫グロブリンヒンジ領域および他のドメインのアミノ酸配列は当該技術分野でよく知られている。
【０１５２】
他のペプチド／ポリペプチドリンカードメイン
他の好適なペプチド／ポリペプチドリンカードメインは、天然または非天然ペプチドまたはポリペプチドを含む。ペプチドリンカー配列は少なくともアミノ酸２個の長さである。好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドドメインは柔軟なペプチドまたはポリペプチドである。「柔軟なリンカー」とは、柔軟なリンカーの非存在下で二つの連結されたポリペプチドが持つものよりも、それにより連結された二つのポリペプチドの回転自由度を高めるペプチド結合により連結された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。このような回転自由度は、柔軟なリンカーによって各接近標的抗原に連結された２以上の抗原結合部位をより有効とする。柔軟なペプチド／ポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７４）、Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７５）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号７６）、および（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４（配列番号７７）が挙げられる。さらなる柔軟なペプチド／ポリペプチド配列も当該技術分野でよく知られている。
【０１５３】
３．二量体化および多量体化ドメイン
融合タンパク質は場合により、２以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをする二量体化または多量体化ドメインを含む。融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインは分離ドメインであってもよいし、あるいはまた融合タンパク質の他のドメイン（Ｔ細胞共刺激／共阻害受容体結合ドメイン、腫瘍／腫瘍新生血管系抗原結合ドメインまたはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）の一つの中に含まれてもよい。
【０１５４】
二量体化ドメイン
「二量体化ドメイン」とは、少なくとも二つのアミノ酸残基または少なくとも二つのペプチドもしくはポリペプチド（同じまたは異なるアミノ酸配列を持ち得る）の会合によって形成される。これらのペプチドまたはポリペプチドは共有結合的会合および／または非共有結合的会合によって互いに相互作用し得る。好ましい二量体化ドメインは、融合タンパク質相手上のシステインと分子間ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも一つのシステインを含む。二量体化ドメインは、融合タンパク質相手の間でジスルフィド結合が形成できるように１以上のシステイン残基を含み得る。一つの実施形態では、二量体化ドメインは一つ、二つ、または３つ〜約１０のシステイン残基を含む。好ましい実施形態では、二量体化ドメインは免疫グロブリンのヒンジ領域である。この特定の実施形態では、二量体化ドメインは融合タンパク質のリンカーペプチド／ポリペプチド内に含まれる。
【０１５５】
さらなる二量体化ドメインの例も当該技術分野で知られており、限定されるものではないが、コイルドコイル、アシッドパッチ(acid patches)、ジンクフィンガー、カルシウムハンド、ＣＨ１−ＣＬ対、米国特許第５，８２１，３３３号公報に記載されている操作された「こぶ(knob)」および／または「突起(protruberance)」を有する「境界」、ロイシンジッパー（例えば、ｊｕｎおよび／またはｆｏｓ由来）（米国特許第５，９３２，４４８号公報）、ＳＨ２（ｓｒｃホモロジー２）、ＳＨ３（ｓｒｃホモロジー３）(Vidal, et al., Biochemistry, 43, 7336-44 ((2004))、ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）(Zhou, et al., Nature, 378:584-592 (1995))、ＷＷ(Sudol, Prog. Biochys. Mol. Bio., 65:113-132 (1996))、ＰＤＺ(Kim, et al., Nature, 378: 85-88 (1995)、 Komau, et al., Science, 269:1737-1740 (1995))１４−３−３、ＷＤ４０(Hu, et al., J Biol Chem., 273, 33489-33494 (1998))ＥＨ、Ｌｉｍ、イソロイシンジッパー、受容体二量体対（例えば、インターロイキン−８受容体（ＩＬ−８Ｒ）、ならびにインテグリンヘテロ二量体、例えば、ＬＦＡ−１およびＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａまたはその二量体化領域、二量体リガンドポリペプチド（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）(Arakawa, et al., J. Biol. Chem., 269(45): 27833-27839 (1994)およびRadziejewski, et al., Biochem., 32(48): 1350 (1993))が挙げられ、親和性が変更されたこれらのドメインの変異体であってもよい。これらのポリペプチド対は、酵母二つのハイブリッドスクリーンを含む当該技術分野で知られている方法によって同定することができる。酵母ツーハイブリッドスクリーンは米国特許第５，２８３，１７３号公報および同第６，５６２，５７６号公報に記載されており、双方とも引用することにより本明細書の開示の一部とされる。相互作用ドメイン対の間の親和性はKatahira, et al., J. Biol. Chem., 277, 9242-9246 (2002) の記載を含む、当該技術分野で知られている方法を用いて決定することができる。あるいは、ペプチド配列のライブラリーを、例えばＷＯ０１／００８１４号公報に記載されている方法を用いてヘテロ二量体形成に関してスクリーニングすることもできる。タンパク質−タンパク質相互作用に関する有用な方法はまた米国特許第６，７９０，６２４号公報にも記載されている。
【０１５６】
多量体化ドメイン
「多量体化ドメイン」とは、三つ以上のペプチドまたはポリペプチドを共有結合的会合および／または非共有結合的会合によって互いに相互作用させるドメインである。好適な多量体化ドメインとしては、限定されるものではないが、コイルドコイルドメインが挙げられる。コイルドコイルは、通常、７つのアミノ酸（ヘプタッドリピート）または１１のアミノ酸（ウンデカドリピート）の配列に、３および４残基の間隔を置いた主として疎水性の残基の連続パターンを有し、組み立てられて（折りたたまれて）多量性のらせん束を形成するペプチド配列を意味する。３および４残基おきのいくつかの不規則な分布を含む配列を有するコイルドコイルも意図される。疎水性残基は特に、疎水性アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐである。主として疎水性とは、残基の少なくとも５０％が記載の疎水性アミノ酸から選択されるべきであることを意味する。
【０１５７】
コイルドコイルドメインはラミニンに由来してもよい。細胞外間隙で、ヘテロ三量体コイルドコイルタンパク質ラミニンは基底膜の形成に重要な役割を果たす。明らかに、多機能オリゴマー構造はラミニン機能に必要である。コイルドコイルドメインはまた、３つ（ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２）または５つ（ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４およびＴＳＰ−５）の鎖が接続されたトロンボスポンジンまたは平行５鎖コイルドコイル(Malashkevich ,et al., Science, 274: 761-765 (1996))へと折りたたまれるＣＯＭＰ（ＣＯＭＰｃｃ）(Guo, et at., EMBO J., 1998, 17: 5265-5272)に由来してもよい。
【０１５８】
他のタンパク質に由来するさらなるコイルドコイルドメインおよびポリペプチドの多量体化を媒介する他のドメインも当該技術分野で知られており、開示されている融合タンパク質で用いるのに好適である。
【０１５９】
４．融合タンパク質例
ＰＤ−Ｌ２
代表的なネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、
【化５８】
2012500855.tif 000060
（配列番号５２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１６０】
配列番号７９によりコードされているネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化５９】
2012500855.tif 000061
（配列番号５３）
を有する。
【０１６１】
シグナル配列を含まない配列番号５３のネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【化６０】
2012500855.tif 000062
（配列番号５４）
である。
【０１６２】
代表的なヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、
【化６１】
2012500855.tif 000063
（配列番号５５）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１６３】
配列番号８２によりコードされているヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化６２】
2012500855.tif 000064
（配列番号５６）
を有する。
【０１６４】
シグナル配列を含まない配列番号８３のヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は
【化６３】
2012500855.tif 000065
（配列番号５７）
である。
【０１６５】
代表的な非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化６４】
2012500855.tif 000066
（配列番号８６）
を有する。
【０１６６】
シグナル配列を含まない配列番号８６の非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２  融合タンパク質のアミノ酸配列は
【化６５】
2012500855.tif 000067
（配列番号８７）
である。
【０１６７】
Ｇ．ＰＤ−１受容体アンタゴニストをコードする単離された核酸分子
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド、その変異体およびその融合タンパク質をコードする単離された核酸配列が開示される。本明細書において「単離された核酸」とは、哺乳類ゲノムにおいてその核酸の一端または両端に通常隣接している核酸をはじめ、哺乳類ゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を意味する。
【０１６８】
単離された核酸は、例えば、天然ゲノムにおいてそのＤＮＡ分子にすぐ隣接して通常見られる核酸配列の一つが除去されているか、または存在しない限り、ＤＮＡ分子であってもよい。よって、単離された核酸としては、限定されるものではないが、他の配列とは独立した分離分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸またはｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるゲノムＤＮＡ断片）ならびにベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）に、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡが挙げられる。さらに、単離された核酸としては、ハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子などの操作核酸が挙げられる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーの中の数百から数百万の他の核酸に存在する核酸、またはゲノムＤＮＡ制限消化を含むゲルスライスは単離された核酸とはみなさない。
【０１６９】
核酸はセンス配向であってもアンチセンス配向であってもよく、あるいはＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１またはＢ７．１ポリペプチドまたはその変異体をコードする参照配列と相補的であってもよい。参照配列としては、例えば、当該技術分野で知られており、上記に述べられているヒトＰＤ−Ｌ２、ヒトＰＤ−Ｌ１、またはネズミＰＤ−Ｌ２およびネズミＰＤ−Ｌ１のヌクレオチド配列が含まれる。
【０１７０】
核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体であり得る。核酸類似体は塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖において修飾することができる。このような修飾は例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善することができる。塩基部分における修飾としては、デオキシチミジンをデオキシウリジン、デオキシシチジンを５−メチル−２’−デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシシチジンにいうものが挙げられる。糖部分の修飾としては、リボース糖の２’ヒドロキシルの修飾による２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖の形成が挙げられる。デオキシリボースリン酸主鎖は、各塩基部分が６員のモルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸主鎖がシュードペプチド主鎖で置換され、４つの塩基が保持されているペプチド核酸を生成するように修飾することができる。例えば、Summerton and Weller (1997) Antisence Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195、およびHyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23参照。さらに、デオキシリン酸主鎖は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート主鎖、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステル主鎖で置換することができる。
【０１７１】
Ｈ．ＰＤ−１受容体アンタゴニストを発現するベクターおよび宿主細胞
上記の核酸は、細胞で発現させるためにベクターに挿入することができる。本明細書において「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントが、挿入されたセグメントの複製が起こるように挿入され得る、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは発現ベクターであり得る。「発現ベクター」とは、１以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【０１７２】
ベクター中の核酸は１以上の発現制御配列に機能的に連結させることができる。本明細書において「機能的に連結される」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が挙げられる。プロモーターは、一般に、転写が開始する点の上流１００ヌクレオチド以内（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位付近）のＤＮＡ分子の領域からなる発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、そのポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターの下流１〜約１５ヌクレオチドの間に置く必要がある。エンハンサーは、時間、場所、およびレベルに関して発現特異性を与える。プロモーターとは異なり、エンハンサーは転写部位から様々な距離に位置する場合にも機能し得る。エンハンサーはまた、転写開始部位から下流に位置してもよい。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへ転写することができ、それがコード配列によりコードされているタンパク質へ翻訳され得る場合に、「機能的に連結され」かつ細胞内の発現制御配列の「制御下」にある。
【０１７３】
好適な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。多くのベクターおよび発現系がNovagen (Madison, WI)、Clontech (Palo Alto, CA)、Stratagene (La Jolla, CA)およびInvitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)などの会社から市販されている。
【０１７４】
発現ベクターはタグ配列を含み得る。タグ配列は一般に、コードされているポリペプチドとの融合物として発現される。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含むポリペプチド内のいずれの位置にでも挿入することができる。有用なタグの例としては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、Ｆｌａｇ（商標）タグ(Kodak, New Haven, CT)、マルトースＥ結合タンパク質およびタンパク質Ａが挙げられる。一実施形態では、変異体ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、Ｉｇ重鎖定常領域の１以上のドメインをコードする、好ましくは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に相当するアミノ酸配列を有する核酸を含むベクター内に存在する。
【０１７５】
発現される核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することができる。「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入可能な原核生物のおよび真核細胞を含むものとする。本明細書において「形質転換される」および「トランスフェクトされる」は、多くの技術の一つによって核酸分子（例えばベクター）を細胞に導入することを包含する。特定の技術に限定されるものではないが、これらの技術の多くは当該技術分野で十分に確立されている。
【０１７６】
原核細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介形質転換により核酸で形質転換させることができる。核酸は、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを含む技術によって哺乳類細胞へトランスフェクトすることができる。宿主細胞（例えば、原核細胞または真核細胞、例えばＣＨＯ細胞）を用いて、例えば、本明細書に記載のＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを生産することができる。
【０１７７】
Ｉ．抗体ＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−１のエピトープと反応性のあるモノクローナルおよびポリクローナル抗体が開示されている。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）およびそれらの製造および使用方法は、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)、米国特許第４，３７６，１１０号公報、Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、 Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, N.Y. (1980)、 H. Zola et al., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, 1982に記載されている。
【０１７８】
ＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を遮断し、かつ、現行使用されているものよりも親和性が低く、投与後３か月、２か月、１か月、３週間、２週間、１週間、または数日未満の期間で抗体を解離させる抗体が免疫応答の増強、増進、または刺激に好ましい。
【０１７９】
本発明の別の実施形態は、Ｂ７−ＨなどのＰＤ−１のリガンドと結合する架橋したＰＤ−１受容体と結合する抗体を含んでなる二重特異性抗体を含む。好ましい実施形態では、このＰＤ−１結合部分は、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を低減または阻害する。
【０１８０】
イムノアッセイ法は、Coligan, J. E. et al., eds., Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, New York 1991 (または最新版)、 Butt, W. R. (ed.) Practical Immunoassay: The State of the Art, Dekker, N.Y., 1984、 Bizollon, Ch. A., ed., Monoclonal Antibodies and New Trends in Immunoassays, Elsevier, N.Y., 1984、 Butler, J. E., ELISA (Chapter 29), In: van Oss, C. J. et al., (eds), Immunochemistry, Marcel Dekker, Inc., New York, 1994, pp. 759-803、 Butler, J. E. (ed.), Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1991、 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986、 Work, T. S. et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY, (1978) (Chapter by Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques")に記載されている。
【０１８１】
抗イディオタイプ抗体は、例えば、Idiotypy in Biology and Medicine, Academic Press, New York, 1984、 Immunological Reviews Volume 79, 1984、 Immunological Reviews Volume 90, 1986、 Curr. Top. Microbiol., Immunol. Volume 119, 1985、 Bona, C. et al., CRC Crit. Rev. Immunol., pp. 33-81 (1981)、 Jerme, N K, Ann. Immunol. 125C:373-389 (1974)、 Jerne, N K, In: Idiotypes--Antigens on the Inside, Westen-Schnurr, I., ed., Editiones Roche, Basel, 1982, Urbain, J. et al., Ann. Immunol. 133D:179-(1982)、 Rajewsky, K. et al., Ann. Rev. Immunol. 1:569-607 (1983)に記載されている。
【０１８２】
これらの抗体は異種、同種異系、同系、またはその改変形態（ヒト化またはキメラ抗体など）であり得る。特定の抗体、例えば、抗ＰＤ−Ｌ２抗体のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体も含まれる。「抗体」との用語は、完全分子ならびに抗原結合部位を含み、かつ、およびＰＤ−１アンタゴニストエピトープと結合することができるその断片の双方を含むことを意味する。これらには、完全抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に排除され、完全抗体よりも低い非特異的組織結合性を持ち得るＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる(Wahl et al., J. Nuc. Med. 24:316-325 (1983))。また、Ｆｖ断片も含まれる(Hochman, J. et al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135、 Sharon, J. et al.(1976) Biochemistry 15:1591-1594)。これらの種々の断片は、プロテアーゼ切断または化学的切断などの常法を用いて作製される（例えば、Rousseaux et al., Meth. Enzymol., 121:663-69 (1986)参照）。
【０１８３】
ポリクローナル抗体は、ウサギ、ヤギ、齧歯類などの免疫動物から血清として得られ、それ以上処理することなくそのまま用いてもよく、あるいは硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーなどの慣例の富化または精製方法を施してもよい。
【０１８４】
免疫原は、完全なＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−１または断片またはその誘導体を含む。好ましい免疫原は、ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全部または一部を含み、ここで、これらの残基はグリコシル化などの翻訳後調節を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、例えば、慣例の組換え法を用いたクローン化遺伝子の発現または起源細胞からの単離などの当該技術分野で知られている種々の方法で生産される。
【０１８５】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975）により紹介された手順およびその改変法（上記の参照を参照）などの慣例のハイブリドーマ技術を用いて生産され得る。動物、好ましくはマウスを上記のような免疫原に感作させることにより初回刺激し、刺激動物に所望の抗体応答を惹起させる。初回刺激動物のリンパ節、脾臓、または末梢血からのＢリンパ球を、一般にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの誘導促進剤の存在下で骨髄腫細胞と融合させる。多くのネズミ骨髄腫細胞系統はいずれもがこのような使用に利用できる：Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−ｋ０Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４またはＨＬ１−６５３骨髄腫系統（ATCC, Rockville, Md.から入手可能）。その後の工程は、融合されてない親骨髄腫細胞と、ドナーリンパ球細胞とがやがて死に至り、ハイブリドーマ細胞だけが生き残るような選択培地で増殖させることを含む。これらをクローニングし、増殖させ、それらの上清を、例えば、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を用いたイムノアッセイ技術によって所望の特異性の抗体が存在するか否かをスクリーニングする。例えば、制限希釈によって陽性クローンをサブクローニングし、モノクローナル抗体を単離する。
【０１８６】
これらの方法に従って生産されたハイブリドーマは、当該技術分野で知られている技術（一般に、Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)参照）を用いて、インビトロまたはインビボ（腹水中）で増殖させることができる。一般に、個々の細胞系統を培養で増殖させ、高濃度の単一モノクローナル抗体を含む培養培地を、デカンテーション、濾過または遠心分離によって採取することができる。
【０１８７】
抗体は、正常な多量体構造の代わりに単鎖抗体またはｓｃＦｖとして生産してもよい。単鎖抗体は、着目するＩｇに由来する超可変領域を含み、完全なＩｇのサイズの一部でありつつ、天然Ｉｇの抗原結合部位を再形成する(Skerra, A. et al. Science, 240: 1038-1041 (1988)、 Pluckthun, A. et al. Methods Enzymol. 178: 497-515 (1989)、 Winter, G. et al. Nature, 349: 293-299 (1991))。好ましい実施形態では、抗体は慣例の分子生物学的技術を用いて生産される。
【０１８８】
ＩＩＩ．製造方法
ＰＤ−１アンタゴニストの生産方法
ポリペプチドおよびその変異体
単離されたＰＤ−１アンタゴニストまたはその変異体は、例えば、化学的合成または宿主細胞での組換え生産によって得ることができる。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを組換え生産するためには、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いて、細菌または真核生物宿主細胞（例えば、昆虫、酵母、または哺乳類細胞）に形質転換、形質導入またはトランスフェクションを行うことができる。一般に、核酸構築物は、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された調節配列を含む。調節配列（本明細書では発現制御配列とも呼ばれる）は一般に遺伝子産物をコードしないが、それらが機能的に連結されている核酸配列の発現に影響を与える。
【０１８９】
ポリペプチドを発現および生産するのに有用な原核生物系および真核生物系は当該技術分野でよく知られており、例えば、ＢＬ−２１などの大腸菌(Escherichia coli)株、およびＣＨＯ細胞などの培養哺乳類細胞が挙げられる。
【０１９０】
真核生物宿主細胞では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを発現させるために多くのウイルスに基づく発現系が利用可能である。ウイルスに基づく発現系は当該技術分野でよく知られており、限定されるものではないが、バキュロウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルス、またはワクシニアに基づくウイルスベクターが挙げられる。
【０１９１】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを安定発現する哺乳類細胞系統は、適当な制御エレメントと選択マーカーを備えた発現ベクターを用いて作出することができる。例えば、真核生物発現ベクターｐＣＲ３．１(Invitrogen Life Technologies) およびｐ９１０２３（Ｂ）（Wong et al. (1985) Science 228:810-815参照）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）での変異体共刺激ポリペプチドの発現に好適である。エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストランまたは他の好適なトランスフェクション方法による発現ベクターの導入の後、安定な細胞系統を選択することができる（例えば、Ｇ４１８、カナマイシンまたはハイグロマイシンに対する抗生物質耐性による）。トランスフェクト細胞は、目的のポリペプチドが発現されるように培養することができ、このポリペプチドを例えば、細胞培養上清または溶解細胞から回収することができる。あるいは、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、（ａ）増幅された配列をｐｃＤＮＡ３(Invitrogen Life Technologies)などの哺乳類発現ベクターに連結し、（ｂ）インビトロにおいてコムギ胚芽抽出液またはウサギ網状赤血球溶解液を用いて転写および翻訳することによって生産することもできる。
【０１９２】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、例えば、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、およびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を用いて単離することができる。例えば、細胞培養上清または細胞質抽出液中のＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、Ｇタンパク質カラムを用いて単離することができる。いくつかの実施形態では、変異体ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ポリペプチドを親和性マトリックスに捕捉させるアミノ酸配列を含むように「操作」することができる。ポリペプチドの精製を助けるために、例えば、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、ポリヒスチジン、またはＦｌａｇ（商標）(Kodak)などのタグを使用することができる。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含むポリペプチド内のいずれの位置にも挿入することができる。有用であり得る他の融合物としては、アルカリ性ホスファターゼなど、ポリペプチドの検出を助ける酵素を含むことができる。共刺激ポリペプチドを精製するのに、イムノアフィニティークロマトグラフィーを使用することもできる。
【０１９３】
変異体ポリペプチドを作出するためにランダム突然変異を導入する方法は当該技術分野で知られている。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２と相互作用するペプチドをスクリーニングするためにランダムペプチドディスプレーライブラリーを使用することができる。このようなランダムペプチドディスプレーライブラリーを作出およびスクリーニングするための技術は当該技術分野で知られており（Ladnerら、米国特許第５，２２３，４０９号公報、Ladnerら、米国特許第４，９４６，７７８号公報、Ladnerら、米国特許第５，４０３，４８４号公報、およびLadnerら、米国特許第５，５７１，６９８号）、ランダムペプチドディスプレーライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットが市販されている。
【０１９４】
Ｂ．ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをコードする単離された核酸分子の生産方法
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、限定されるものではないが、一般的分子クローニングおよび化学的核酸合成技術を含む標準的技術によって生産することができる。例えば、変異体共刺激ポリペプチドをコードする単離された核酸を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。ＰＣＲは、標的核酸が酵素的に増幅される技術である。一般に、着目する領域の末端から、またはそれを超える配列情報を用いれば、増幅される鋳型の反対側の鎖と配列が同一であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含め、ＤＮＡならびにＲＮＡから特定の配列を増幅させることができる。プライマーは一般に１４〜４０ヌクレオチドの長さであるが、１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチドの範囲の長さであってもよい。一般的なＰＣＲ技術は、例えば、PCR Primaer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。鋳型の供給源としてＲＮＡを用いる場合には、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。単離された核酸を得るために、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続配列複製または核酸配列に基づく増幅を使用することもできる。例えば、Lewis (1992) Genetic Engineering News 12:1、 Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878、およびWeiss (1991) Science 254:1292-1293参照。
【０１９５】
単離された核酸は、単一の核酸分子としてか、またはオリゴヌクレオチド系列としてのいずれかで化学的に合成することができる（例えば、３’から５’方向への自動ＤＮＡ合成のためのホスホルアミダイト技術を使用）。例えば、所望の配列を含み、各対が短い相補的セグメント（例えば約１５ヌクレオチド）を含み、その結果、オリゴヌクレオチド対がアニーリングされる際に二重らせんが形成される、長いオリゴヌクレオチド（例えば＞１００ヌクレオチド）の１以上の対を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼオリゴヌクレオチドを延長するのにも使用することができ、その結果、オリゴヌクレオチド対につき一つの一本鎖、二本鎖核酸分子が得られ、次にこれをベクターに連結することができる。また、単離された核酸は突然変異誘発により得ることもできる。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをコードする核酸は、ＰＣＲを介したオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発および／または部位特異的突然変異誘発を含む標準的技術を用いて変異させることができる。Short Protocols in Molecular Biology. Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, edited by Ausubel et al, 1992参照。修飾可能なアミノ酸位置の例としては、本明細書に記載されているものが含まれる。
【０１９６】
ＩＶ．処方物   
Ａ．ＰＤ−１アンタゴニスト処方物
ＰＤ−１アンタゴニストを含有する医薬組成物が提供される。ペプチドまたはポリペプチドを含有する医薬組成物は非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮（受動的またはイオン泳動もしくはエレクトロポレーションを使用）または経粘膜（鼻腔、膣、直腸または舌下）投与経路による投与用であり得る。また、組成物は生浸食性インサートを用いて投与してもよいし、適当なリンパ系組織（例えば、脾臓、リンパ節もしくは粘膜に関連するリンパ系組織）に直接送達、または器官もしくは腫瘍に直接送達してもよい。これらの組成物は各投与経路に適当な剤形で処方することができる。ペプチドまたはポリペプチドでないＰＤ−１受容体のアンタゴニストを含有する組成物はさらに腸内投与用に処方することもできる。
【０１９７】
本明細書において「有効量」または「治療上有効な量」とは、処置される障害の１以上の症状を処置、阻害または緩和するのに、またはそうでなければされる所望の薬理学的および／または生理学的作用を提供するのに十分な用量を意味する。厳密な用量は、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健全性など）、疾患および行われる処置などの種々の要因によって異なる。ＰＤ−１アンタゴニストの治療上有効な量は、免疫応答を活性化、増強、増大または持続させ、かつ／またはＴ細胞の消耗および／またはＴ細胞の無応答を克服または緩和し、かつ／または単球、マクロファージ、樹状細胞および他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化する。
【０１９８】
好ましい実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、腫瘍モデリングおよびバイオアベイラビリティからの外挿に基づき、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与される。最も好ましい範囲は５〜２０ｍｇＰＤ−１アンタゴニスト／ｋｇである。一般に、静脈注射または注入では、別の経路によって投与する場合よりも用量は低くなり得る。
【０１９９】
１．非経口投与用処方物
好ましい実施形態においては、ペプチドおよびポリペプチドを含有するものを含む開示されている組成物は、非経口注射により水溶液として投与される。処方物はまた懸濁液またはエマルションの形態であってもよい。一般に、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含み、場合により薬学上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む医薬組成物が提供される。このような組成物は無菌水、緩衝生理食塩水（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨおよびイオン強度、ならびに場合により、洗剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、ＴＷＥＥＮ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、および保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーン油などの植物油、ゼラチン、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。処方物は凍結乾燥させ、使用直前に再溶解／再懸濁させてもよい。処方物は例えば、細菌保持フィルターによる濾過、除菌剤の組成物への配合、組成物の照射または組成物の加熱によって除菌してもよい。
【０２００】
２．制御送達ポリマーマトリックス
１以上のＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−１アンタゴニストをコードする核酸を含有する組成物は徐放性処方物として投与することができる。徐放性ポリマーデバイスはポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）の移植または注射（微粒子）後に長時間全身への放出を行うことができる。マトリックスは、ペプチドが固体ポリマーマトリックス内に分散されているマイクロスフェア、またはコアがポリマー剤皮とは異なる材料のものであり、そのコア（本質的に液体であっても固体であってもよい）内にペプチドが分散もしくは懸濁されているマイクロカプセルなどの微粒子の形態であってもよい。本明細書で特に定義されない限り、微粒子、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルは互換的に用いられる。あるいは、ポリマーは数ナノメートルから４センチメートルの範囲の薄スラブもしくはフィルムとしての鋳物、摩砕もしくは他の標準的な技術によって製造された粉末、またはさらにはヒドロゲルなどのゲルであってもよい。マトリックスはまた、免疫応答を調節するため、免疫不全患者（カテーテルが挿入されている高齢者または未熟児など）における感染予防のため、またはただれ、床ずれ潰瘍などの治癒を促進するために用いられるマトリックスの場合と同様に治癒における補助とするために医療機器の内外に組み込むことができる。
【０２０１】
非生分解性マトリックスでも生分解性マトリックスでもＰＤ−１アンタゴニストまたはそれらをコードする核酸の送達に使用することができるが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然ポリマーであっても合成ポリマーであってもよいが、分解および放出特性の特徴付けがより良いため、合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。直線的放出が最も有用である場合もあるが、パルス放出または「バルク放出」がより有効な結果をもたらす場合もある。ポリマーはヒドロゲル（一般に最大約９０重量％の水を吸収する）の形態であってもよく、場合により多価イオンまたはポリマーで架橋されていてもよい。
【０２０２】
マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、および当業者に知られている他の方法によって形成させることができる。生浸食性マイクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987)、 Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987)、およびMathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988)に記載されているような、薬物送達用のマイクロスフェアを作製するために開発されたいずれかの方法を用いて製造することができる。
【０２０３】
徐放性経口処方物が望ましい場合がある。ＰＤ−１阻害的シグナル伝達のアンタゴニストは、拡散または溶脱機構のいずれかによる放出を可能とする不活性マトリックス、例えば、フィルムまたはガム中に配合することができる。また、緩徐崩壊マトリックスを処方物に配合してもよい。別の徐放性形態としては、水を入り込ませて浸透圧作用により単一の小開口部から薬剤を押し出す半透膜に薬剤が封入されるものがある。経口処方物では、放出の場所は胃、小腸（十二指腸、空腸もしくは回腸）または大腸であり得る。好ましくは、この放出は有効剤（もしくは誘導体）の保護によるか、または腸などの胃環境を超えた有効剤の放出によるかのいずれかで、胃環境の有害な影響を回避する完全な胃耐性を確保するためには、腸溶コーティング（すなわち、少なくともｐＨ５．０までは不透性）が不可欠である。これらのコーティングは混合フィルム、またはBanner Pharmacapsから市販されているものなどのカプセル剤として使用可能である。
【０２０４】
これらのデバイスは移植または注射領域を処置するために局所放出用に処方することができ、一般に、全身処置用の用量よりもはるかに低い用量を送達する。これらのデバイスはまた、全身送達用に処方することもできる。これらは埋植または皮下注射することができる。
【０２０５】
３．腸内投与用処方物
ＰＤ−１のアンタゴニストはまた、経口送達用にも処方することができる。経口固体剤形は当業者に知られている。固体剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ剤、カシェ剤、ペレット、粉末もしくは顆粒、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の特定の調製物、もしくはリポソームへの材料の組み込みが挙げられる。このような組成物は本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed. (2005, Lippincott, Williams & Wilins, Baltimore, Md. 21201) pages 889-964参照。組成物は液体形態で調製してもよいし、あるいは乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）形態であってもよい。リポソームまたはポリマーカプセル封入を組成物の処方に用いてよい。Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics, G. S. Banker and C. T. Rhodes編 Chapter 10, 1979も参照。一般に、処方物は有効剤と、胃環境でＰＤ−１アンタゴニストを保護し、腸で生活性材料を放出する不活性成分を含む。
【０２０６】
薬学上許容されるエマルション、溶液、懸濁液、およびシロップを含む経口投与用の液体剤形は、不活性希釈剤、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤などのアジュバント、ならびに甘味剤、香味剤、および芳香剤を含む他の成分を含み得る。
【０２０７】
Ｂ．ＰＤ−１アンタゴニストを含むワクチン
ワクチンは、感染細胞を排除するために強いＴ細胞応答を必要とする。ＰＤ−１アンタゴニストは、一次免疫応答およびエフェクター細胞の活性と、数とを促進、増大、または増強するためにワクチンの成分として投与することができる。ワクチンは抗原、ＰＤ−１アンタゴニスト（またはその供給源）、および場合により他のアジュバントおよび標的化分子を含む。ＰＤ−１アンタゴニストの供給源は、開示されているＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質、その変異体、ＰＤ−Ｌ１断片、ＰＤ−１断片、ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸、ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質、その変異体、ＰＤ−Ｌ１断片またはＰＤ−１断片、または上記のＰＤ−１のポリペプチドリガンドを発現するベクターを含む宿主細胞のいずれかを含む。
【０２０８】
１．抗原
抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖類、糖類、脂質、核酸、またはその組合せであり得る。抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫、原虫、真菌、ヒストプラズマ、組織、または形質転換細胞に由来するものであり得、全細胞またはその免疫原成分、例えば、細胞壁成分またはその分子成分であり得る。
【０２０９】
好適な抗原は当該技術分野で知られており、商業的官業および科学ソースから入手可能である。一つの実施形態においては、抗原は不活性化または弱毒された完全な生物である。これらの生物はウイルス、寄生虫および細菌などの感染性生物であり得る。これらの生物は腫瘍細胞または淋病もしくはマラリアなどのウイルスまたは細胞内病原体に感染した細胞であり得る。抗原は腫瘍または腫瘍またはウイルスもしくは細菌源に由来する精製または部分精製ポリペプチドであり得る。抗原は、異種発現系においそのポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを発現させることにより産生された組換えポリペプチドであってもよい。抗原は、抗原タンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡであってもよい。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡなどのベクターＤＮＡの形態であってもよい。
【０２１０】
抗原は単一の抗原として提供されてもよいし、あるいは組合せで提供されてもよい。抗原はまた、ポリペプチドまたは核酸の複合体混合物として提供されてもよい。
【０２１１】
ｉ．ウイルス抗原
ウイルス抗原は、限定されるものではないが、以下のウイルス科：アレナウイルス科、アルテリウイルス科、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス科、バルナウイルス科、ビルナウイルス科、ブロモウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス科、カルラウイルス科、カリモウイルス科、サーコウイルス科、コモウイルス科、コロナウイルス科（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスなどのコロナウイルス）、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス科、ディアンソウイルス科(Dianthoviridae)、エナノウイルス科、フィロウイルス科（例えば、マールブルグウイルスおよびエボラウイルス（例えば、ザイール株、レストン株、コートジボワール株またはスーダン株））、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス１、デング熱ウイルス２、デング熱ウイルス３およびデング熱ウイルス４）、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科（例えば、ヒトヘルペスウイルス１、３、４、５および６、ならびにサイトメガロウイルス）、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型およびＢ型およびＣ型インフルエンザウイルス）、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよびヒト呼吸器多核体ウイルス（respiratory synticial virus））、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルスおよびアフトウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、ワクシニアウイルスおよびスモールポックスウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（例えば、レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１およびＨＩＶ  ２）、ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルスなど）、トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）、トリウイルス科のいずれかに由来するウイルスを含む任意のウイルスから単離することができる。好適なウイルス抗原はまた、デングタンパク質Ｍ、デングタンパク質Ｅ、デングＤ１ＮＳ１、デングＤ１ＮＳ２、およびデングＤ１ＮＳ３の全部または一部を含む。
【０２１２】
ウイルス抗原は、乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス、すなわち、単純ヘルペス１および２、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス、パラインフルエンザ、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(cytomeglavirus)、エプスタイン・バーウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどの特定の株または株の組合せに由来し得る。
【０２１３】
ｉｉ．細菌抗原
細菌抗原は、限定されるものではないが、アクチノミセス属、アナベナ属、バチルス属、バクテロイデス属、デロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、サイトファガ属、ディノコッカス属、エシェリキア属、フランシセラ属、ハロバクテリア属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属、Ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩＢ）、ハイフォミクロビウム属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、Ａ型、Ｂ型およびＣ型髄膜炎球菌、メタノバクテリウム属、球菌属、ミオバクテリウム属(Myobacterium)、マイコプラズマ属、ミクソコッカス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、オシラトリア属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ロドスピリルム属、リケッチア属、サルモネラ菌属、赤痢菌属、スピリルム属、スピロヘータ属、ブドウ状球菌属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、スルフォロブス属、サーモプラズマ属、チオバチルス属およびトレポネーマ属、ビブリオ属、およびエルシニア属を含む任意の細菌に由来し得る。
【０２１４】
ｉｉｉ．寄生虫抗原
寄生虫の抗原は、限定されるものではないが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、リケッチア・リケッチイ(Rickettsia ricketsii)、発疹熱リケッチア(Rickettsia typhi)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、クラミジア・シッタシ(Chlamydial psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydial trachomatis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)、およびマンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)などの寄生虫から得ることができる。これらには胞子虫抗原、マラリア原虫抗原、例えば、スポロゾイト周囲タンパク質、スポロゾイト表面タンパク質、肝臓段階抗原、頂端膜関連タンパク質またはメロゾイト表面タンパク質の全部または一部が含まれる。
【０２１５】
ｉｖ．腫瘍抗原
抗原は、限定されるものではないが、α−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、β−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２および３、ネオ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｂａｇｅ−１、Ｇａｇｅ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−Ａ１、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ−Ｃ２、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ−１／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、ＳＳＸ−２、およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトタンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳなどの腫瘍関連高原または腫瘍特異的抗原を含む腫瘍抗原であり得る。また、ＢＣＧなどの腫瘍抗原は、アジュバントに対する免疫刺激剤として使用することもできる。
【０２１６】
２．アジュバント
場合により、ワクチンはアジュバントを含み得る。アジュバントは、限定されるものではないが、以下の１以上であり得る：オイルエマルション（例えば、フロイントのアジュバント）、サポニン処方物、ウィロソーム(virosomes)およびウイルス様粒子、細菌および細菌誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化毒素および解毒誘導体、ミョウバン、ＢＣＧ、無機物含有組成物（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩）、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩など）、生体接着剤および／または粘膜接着剤、微粒子、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物、ポリホスファゼン、ムラミルペプチド、イミダゾキノロン化合物、および界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）。
【０２１７】
アジュバントはまたサイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などの免疫調節剤を含み得る。変異体ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドの他、Ｂ７ファミリーの他のポリペプチドを含む他の共刺激分子を投与してもよい。このようなタンパク質性アジュバントは全長ポリペプチドもしくはその活性断片として、またはプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡの形態で提供されてよい。
【０２１８】
ＩＶ．使用方法
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドおよびその断片、ならびにこれらのポリペプチドおよび融合タンパク質をコードする核酸、またはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを発現する細胞は、抗原に対する一次免疫応答を増強するとともにＴ細胞の抗原特異的増殖の増強、Ｔ細胞によるサイトカイン生産の増強および分化刺激などのエフェクター機能を増強するために使用することができる。ＰＤ−１アンタゴニスト組成物は、それを必要とする被験体に、Ｔ細胞の消耗および／またはＴ細胞の無応答を克服するのに有効な量で投与することができる。Ｔ細胞の消耗またはＴ細胞の無応答の克服は、既知の技術を用いてＴ細胞機能を測定することにより決定することができる。好ましいＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合し、かつＴ細胞を共刺激する能力を保持するように操作される。
【０２１９】
ＰＤ−１アンタゴニストのインビトロ適用は、例えば、免疫機構の基礎的科学研究において、またはＴ細胞機能の研究もしくは例えば受動免疫療法に用いる活性化Ｔ細胞の生産のために有用であり得る。さらに、ＰＤ−１アンタゴニストは、Ｔ細胞が得られた被験体において着目する抗原に対する免疫性を試験すべく設計されたインビトロアッセイ（例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ）に加えることができる。このようなアッセイへのＰＤ−１アンタゴニストの付加は、より強力な、従ってより検出の容易なインビトロ応答をもたらすと考えられる。
【０２２０】
Ａ．免疫増強のためのＰＤ−１アンタゴニストの投与
ＰＤ−１アンタゴニストは一般に、インビボおよびエクスビボにおいて免疫応答刺激治療薬として有用である。好ましい実施形態においては、これらの組成物は、Ｔ細胞の消耗またはＴ細胞の無応答が既に起こり、その感染が長期にわたって宿主に残存する感染を処置するのに有用である。処置される例示的感染は、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはヒト乳頭腫ウイルスにより引き起こされる慢性感染である。他の感染もＰＤ−１アンタゴニストを用いて処置可能であると考えられる。開示されている組成物はワクチンの一部としても有用である。好ましい実施形態では、治療または予防される疾患の種類は、細菌、ウイルス、原虫、蠕虫、または細胞内に侵入する、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球により攻撃される、他の微生物病原体により引き起こされる慢性感染性疾患である。
【０２２１】
ヒトおよび動物モデルにおける慢性感染は、宿主免疫応答の、機能的なＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞集団の生成および維持不全に関連し、その結果として、感染性を中和するための抗体応答も不十分となる。この機能の欠損はＴ細胞の消耗と呼ばれる。Ｔ細胞の無応答は、リンパ球が抗原と遭遇した後に内因的に機能的に活性化されるが、長期間、低応答状態で生存を維持するという耐性機構である。慢性感染を処置するための一つの方法は、消耗したＴ細胞を活性化すること、または被験体におけるＴ細胞の消耗を逆転させるとともにＴ細胞の無応答を克服することである。Ｔ細胞の消耗の逆転は、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（ＰＤ−Ｌ２）の間の相互作用に干渉することによって達成することができる。急性の、多くの場合致死的な病原体の作用は、毒素、またはその毒素により引き起こされる損傷の前に十分な免疫応答を惹起することができない他の因子によって媒介され得る。これは、ＰＤ−１とそのリガンドの間の相互作用に干渉し、より有効な迅速免疫応答を可能とすることにより克服され得る。
【０２２２】
ウイルス感染は主としてＴ細胞により排除されるので、感染力のあるウイルス病原体のより迅速な、または十分な排除がヒトまたは動物被験体に有益となる状況では、Ｔ細胞活性の増強が治療上有用である。よって、ＰＤ−１アンタゴニストは、限定されるものではないが、免疫不全（例えば、ＨＩＶ）、乳頭腫（例えば、ＨＰＶ）、ヘルペス（例えば、ＨＳＶ）、脳炎、インフルエンザ（例えば、ヒトＡ型インフルエンザウイルス）、および風邪（例えば、ヒトライノウイルス）ウイルス感染を含む、局所または全身ウイルス感染の処置のために投与することができる。例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト組成物を含む医薬処方物は、ヘルペス病巣または帯状疱疹または性器疣贅などのウイルス性皮膚疾患を処置するために局所投与することができる。ＰＤ−１アンタゴニスト組成物の医薬処方物はまた、限定されるものではないが、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、風邪または脳炎を含む全身性ウイルス性疾患を処置するためにも投与することができる。
【０２２３】
処置可能な代表的感染としては、限定されるものではないが、アクチノミセス属、アナベナ属、バチルス属、バクテロイデス属、デロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、サイトファガ属、ディノコッカス属、エシェリキア属、フランシセラ属、ハロバクテリア属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属、Ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩＢ）、ヒトプラズマ属、ハイフォミクロビウム属、レジオネラ属、リーシュマニア属、レプトスピラ属、リステリア属、Ａ型、Ｂ型およびＣ型髄膜炎球菌、メタノバクテリウム属、球菌属、ミオバクテリウム属(Myobacterium)、マイコプラズマ属、ミクソコッカス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、オシラトリア属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ロドスピリルム属、リケッチア属、サルモネラ菌属、赤痢菌属、スピリルム属、スピロヘータ属、ブドウ状球菌属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、スルフォロブス属、サーモプラズマ属、チオバチルス属およびトレポネーマ属、ビブリオ属、エルシニア属、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、リケッチア・リケッチイ(Rickettsia ricketsii)、発疹熱リケッチア(Rickettsia typhi)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、クラミジア・シッタシ(Chlamydial psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydial trachomatis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、ブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplas
ma gondii)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)およびマンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)を含む微生物により引き起こされる感染が挙げられる。
【０２２４】
Ｂ．ワクチンにおけるＰＤ−１アンタゴニストの使用
ＰＤ−１アンタゴニストまたはそれをコードする核酸は単独で投与してもよいし、あるいは他の好適な処置と組み合わせて投与してもよい。一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは上記のようなワクチン組成物とともに、またはワクチン阻害剤の一成分として投与することができる。ワクチン組成物の好適な成分は上記されている。開示されているＰＤ−１アンタゴニストはワクチン投与の前、ワクチン投与と同時、またはワクチン投与の後に投与することができる。一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニスト組成物はワクチン投与と同時に投与される。
【０２２５】
ＰＤ−１アンタゴニスト組成物は、被験体において次に感染性病原体に曝された際の耐性を付与する予防ワクチンとともに、またはウイルスに感染した被験体におけるウイルス抗原などの既存の抗原に対する被験体の免疫応答を誘発または増強するために使用できる治療ワクチンとともに投与してもよい。
【０２２６】
予防的、治療的または脱感作免疫応答の所望の結果は、当該技術分野でよく知られている原理に従い、疾患によって異なり得る。例えば、感染性病原体に対する免疫応答は感染性病原体の定着および複製を完全に防ぐことができ、「無菌免疫(sterile immunity)」および疾病症状の非存在に影響を及ぼす。しかしながら、感染性病原体に対するワクチンは、それが症状の数、重篤度または持続時間を軽減するか、症状を有する集団中の個体数を少なくするか、または感染性病原体の伝染を軽減すれば、有効であると見なせる。同様に、癌、アレルゲン、または感染性病原体に対する免疫応答は疾患を完全に治療する場合、症状を緩和する場合、または疾患に対する全体的な治療的介入の一つの態様である場合がある。
【０２２７】
ＰＤ−１アンタゴニストは、少なくとも一つの成分抗原または抗原組成物に対し、ＰＤ−１アンタゴニストを用いずに対応する組成物で得られるエフェクター細胞応答に比べて向上したエフェクター細胞応答（ＣＤ４Ｔ細胞免疫応答など）を誘導する。「向上したエフェクター細胞応答」との用語は、ワクチン組成物の投与後にヒト患者で得られる、ＰＤ−１アンタゴニストを用いずに同じ組成物の投与後に得られるものよりも高いエフェクター細胞応答（ＣＤ４応答など）を意味する。例えば、ヒト患者においてＰＤ−１アンタゴニスト、好ましくはＰＤ−Ｌ２−Ｉｇと抗原調製物を含有する免疫原組成物を投与した際に、アジュバントを含まないその抗原調製物を含有する免疫原組成物の投与後に誘導される応答に比べて高いＣＤ４Ｔ細胞応答が得られる。このような処方物は有利には、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される抗原エピトープを検出することができる抗抗原エフェクター細胞応答を誘導するために用いられる。
【０２２８】
この向上したエフェクター細胞応答は、免疫刺激されていない患者、すなわち、その抗原に対して血清陰性である患者で得ることができる。この血清陰性は、患者がその抗原に直面したことがない（いわゆる「ナイーブ」患者）か、あるいはまた、かつて遭遇したその抗原に応答できなかった結果であり得る。この向上したエフェクター細胞応答は、高齢者、一般に６５歳以上、または高リスクな医学的状態を有する６５歳より若い成人（「高リスク」成人）、または２歳未満の小児など、免疫不全被験体で得られるのが好ましい。
【０２２９】
向上したエフェクター細胞応答は、以下のサイトカインのいずれかを産生する細胞：（１）少なくとも二つの異なるサイトカイン（ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）を産生する細胞、（２）少なくともＣＤ４０Ｌと別のサイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）を産生する細胞、（３）少なくともＩＬ−２と別のサイトカイン（ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）を産生する細胞、（４）少なくともＩＦＮ−γと別のサイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０Ｌ）を産生する細胞、および（５）少なくともＴＮＦ−αと別のサイトカイン（ＩＬ−２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γ）の数を測定することにより評価することができる。
【０２３０】
向上したエフェクター細胞応答は、上記のサイトカインのいずれかを産生する細胞がワクチン組成物の投与後に、ＰＤ−１アンタゴニストを含まない組成物を投与した場合に比べて多い量である際に存在する。一般に、上記の５つの条件のうち少なくとも一つ、好ましくは二つが満たされる。特定の実施形態では、４つ総てのサイトカインを産生する細胞が、ワクチン接種群で非ワクチン接種群に比べて多い数で存在する。
【０２３１】
免疫原組成物は、皮内、粘膜、例えば、鼻内、経口、筋肉内、または皮下などのいずれの好適な送達経路によって投与してもよい。当該技術分野では他の送達経路もよく知られている。免疫原組成物にとっては筋肉内送達経路が好ましい。皮内送達はもう一つの好適な経路である。皮内送達には、例えば短針デバイスなどの任意の好適なデバイスが使用可能である。皮内ワクチンはまた、針の皮膚への有効侵入長を制限するデバイスにより投与してもよい。また、液体ジェット式注射器によって、または角質層を穿孔し、真皮に達するジェットを生じる針によって、液体ワクチンを真皮へ送達するジェット注射デバイスを使用することもできる。ジェット注射デバイスは当該技術分野で既知である。皮膚の外層から真皮へと粉末形態のワクチンを加速化するために圧縮ガスを用いる弾道粉末／粒子送達デバイスも使用可能である。さらに、皮内投与の従来のＭａｎｔｏｕｘ法で、通常のシリンジを使用することもできる。
【０２３２】
もう一つの好適な投与経路は皮下経路である。皮下送達には、例えば、従来の針などの好適なデバイスを使用することができる。好ましくは、無針ジェット式注射器が用いられる。無針注射器は当該技術分野で既知である。より好ましくは、デバイスは液体ワクチン処方物が予め充填されている。
【０２３３】
あるいは、ワクチンは鼻腔内投与される。一般に、ワクチンは鼻咽頭領域に、好ましくは肺へ吸入されずに、局所投与される。ワクチン処方物を、肺に入ることなく、または実質的に入ることなく鼻咽頭領域へ送達する鼻腔内送達デバイスを用いるのが好ましい。ワクチンの鼻腔内投与に好ましいデバイスはスプレーデバイスである。鼻腔スプレーデバイスは市販されている。ネブライザーは容易に肺へ吸入される可能性のある極めて微細なスプレーを生じるので、鼻腔粘膜に十分に達しない。従って、ネブライザーは好ましくない。鼻腔用の好ましいスプレーデバイスは、デバイスの性能が、使用者がかける圧力に依存しないデバイスである。これらのデバイスは圧力閾値デバイスとして知られる。閾値圧力がかけられた場合にのみノズルから液体が放出される。これらのデバイスは規則的な液滴サイズを有するスプレーを達成することを容易とする。本発明とともに用いるのに好適な圧力閾値デバイスは当該技術分野で公知であり、市販されている。
【０２３４】
好ましい鼻腔デバイスは、１〜２００μｍ、好ましくは１０〜１２０μｍの範囲の液滴（液体として水を用いて測定）を生じる。１０μｍを下回ると吸入のリスクがあるので、１０μｍ未満の液滴が約５％を超えないことが望ましい。１２０μｍを超える液滴は、１２０μｍを超える液滴ならびにそれより小さい液滴は拡散しないので、１２０μｍを超える液体が約５％を超えないことが望ましい。
【０２３５】
二用量送達(bi-dose delivery)は、ワクチンとともに用いるための鼻腔内送達系のもう一つの特徴である。二用量デバイスは、単回ワクチン用量の二つの分割量を含み、一つの分割用量は各鼻孔に投与するためのものである。一般に、二つの分割用量は単一のチャンバー内に存在し、このデバイスの構成は単一の分割用量を一度に効率的に送達することを可能とする。あるいは、ワクチンの投与に一用量デバイスを用いてもよい。
【０２３６】
免疫原組成物は数日、数週間または数ヶ月の間にわたって２回以上で与えることができる。一つの実施形態では、異なる投与経路が用いられ、最初に筋肉内投与を行ってよく、場合によりＰＤ−１アンタゴニストを含んでもよい追加免疫組成物が、例えば皮内、皮下、または鼻腔内などの異なる経路により投与してよい。
【０２３７】
免疫原組成物により付与された向上したエフェクター細胞応答は１回の投与の後に得られるのが理想的であり得る。この単回用量アプローチは、バイオテロリストの攻撃および流行を含む、急速に進行する大発生に極めて関連が強い。ある特定の状況では、特に、高齢者集団、または特定の抗原に対して初めてワクチン接種される年少の小児（９歳未満）では、２回用量の同じ組成物を投与することが有益であり得る。同じ組成物の２回目の用量（なお、最初のワクチン接種用の組成物とみなされる）は、進行中の一次免疫応答中に投与することができ、初回投与から十分な時間間隔が置かれる。一般に、２回目の用量の組成物は、未応答または応答が不十分な個体において免疫系の刺激を助けるために、初回用量の数週間、または約１か月、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間後に投与される。
【０２３８】
特定の実施形態においては、免疫原組成物の投与は、代わりにまたはその上に、アジュバントを含む免疫原組成物を投与した患者において、アジュバントを含まない組成物で免疫された個体において誘導されたＢメモリー細胞応答に比べて向上したＢメモリー細胞応答を誘導する。向上したＢメモリー細胞応答は、インビトロ分化の刺激により測定される、抗原遭遇時に抗体分泌血漿細胞へと分化し得る末梢血Ｂリンパ球の頻度の増加を意味するものとする（実施例の節、例えば、Ｅｌｉｓｐｏｔ  Ｂ細胞記憶の方法を参照）。
【０２３９】
さらに別の実施形態では、免疫原組成物は一次免疫応答ならびにＣＤ８応答を増強する。初回ワクチン接種用の免疫原組成物の１回用量を投与すると、良好な血清保護がもたらされ、アジュバントを含まない処方物で得られるものに比べて、特定の抗原に対して向上したＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞免疫応答が誘導される。この結果、全体的な罹患率および死亡率が引き下げられ、また、肺炎および他のインフルエンザ様疾患のための緊急入院が防げる。この方法により、−アジュバントを含まない処方物で誘導される応答に比べて、より長い時間持続する、例えば、初回ワクチン接種後なお１年存在するＣＤ４Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【０２４０】
好ましくは、無刺激被験体で得られる向上したＣＤ４Ｔ細胞免疫応答などのＣＤ４Ｔ細胞免疫応答は、交差反応性ＣＤ４Ｔヘルパー応答の誘導を含む。特に、交差反応性ＣＤ４Ｔ細胞の量が増す。「交差反応性」ＣＤ４応答とは、例えばインフルエンザ株の間で共有されているエピトープを標的化するＣＤ４Ｔ細胞を意味する。
【０２４１】
この用量のＰＤ−１アンタゴニストはヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強する。特に、好適なＰＤ−１アンタゴニスト量は、アジュバントを含まない組成物に比べて、または別のＰＤ−１アンタゴニスト量のアジュバントを含む組成物に比べて、組成物の免疫能を向上させるものである。通常、免疫原組成物の用量は約０．５ｍｌ〜約１ｍｌの範囲である。一般的なワクチン用量は０．５ｍｌ、０．６ｍｌ、０．７ｍｌ、０．８ｍｌ、０．９ｍｌ、または１ｍｌである。好ましい実施形態では、ワクチン組成物１ｍｌ当たりに終濃度５０μｇのＰＤ−１アンタゴニスト、好ましくはＰＤ−Ｌ２−Ｉｇ、ワクチン用量０．５ｍｌ当たり２５μｇが含まれる。他の好ましい実施形態では、ワクチン組成物１ｍｌ当たり終濃度３５．７μｇまたは７１．４μｇのＰＤ−１アンタゴニストが含まれる。具体的には、０．５ｍｌのワクチン用量は、１用量当たり２５μｇまたは５０μｇのＰＤ−１アンタゴニストを含む。さらに別の実施形態では、この用量は１００μｇ以上である。免疫原組成物は通常、一元放射免疫拡散法（ＳＲＤ）(J. M. Wood et al.: J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247、 J. M. Wood et al., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)により測定した場合、１５μｇの抗原成分を含む。
【０２４２】
被験体に免疫原組成物を再接種することができる。一般に、再接種は初回接種の少なくとも６か月後、好ましくは８〜１４か月後、より好ましくは１０〜１２か月後前後で行われる。
【０２４３】
再接種用の免疫原組成物（追加免疫組成物）は、不活性されているか、または生きた状態で弱毒されている、いずれの種類の抗原調製物も含み得る。それは、初回接種用に用いた免疫原組成物と同じ種類の抗原調製物、例えば、スプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物、完全ビリオン、精製サブユニットワクチンまたはウィロソーム(virosome)を含み得る。あるいは、追加免疫組成物は、初回接種用に用いたものと別の種類の抗原、すなわち、スプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物、完全なビリオン、精製サブユニットワクチン、またはウィロソームを含み得る。
【０２４４】
ウイルスに対するワクチンに関して、使用する場合、追加免疫組成物は一般に次のウイルスシーズン、例えば、最初の免疫原組成物のおよそ１年後に投与する。追加免疫組成物はまた、その後毎年（３回目、４回目、５回目の接種など）与えてもよい。追加免疫組成物は初回接種に用いた組成物と同じであってもよい。
【０２４５】
好ましくは、再接種は以下のいずれか、好ましくは二つまたは総てを誘導する：ＰＤ−１アンタゴニストを含まない抗原調製物での初回接種の後に誘導された同等の応答に比べて（ｉ）抗原調製物に対する向上したエフェクター細胞応答、または（ｉｉ）向上したＢ細胞メモリー応答、または（ｉｉｉ）向上した体液性応答。好ましくは、ＰＤ−１アンタゴニストを含有する免疫原性抗原調製物を再接種した後に誘導される免疫応答は、アジュバントを含まない組成物を再接種した後に誘導される対応する応答よりも高い。
【０２４６】
免疫原組成物は一価または多価、すなわち、二価、三価、または四価であり得る。好ましくは、その免疫原組成物は三価または四価である。多価とは、一般に異なる種または株からの抗原の供給源の数を意味する。ウイルスに関しては、少なくとも一つの株が汎流行的大発生に関連するか、または汎流行的大発生に関連する可能性がある。
【０２４７】
Ｃ．標的化抗原提示細胞
別の実施形態は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を１以上の開示されているＰＤ−１アンタゴニストと、ＡＰＣにおけるＰＤ−１シグナル伝達を阻害、低減または遮断するのに有効な量で接触させることを提供する。ＡＰＣにおけるＰＤ−１シグナル伝達の遮断は、細胞内病原体または細胞内病原体に感染した細胞の排除を増強するＡＰＣを活性化する。
【０２４８】
Ｄ．組合せ療法
ＰＤ−１アンタゴニスト組成物はそれを必要とする被験体に単独で、または１以上の付加的治療薬と組み合わせて投与することができる。付加的治療薬は処置される症状、障害、または疾患に基づいて選択される。例えば、ＰＤ−１アンタゴニストは免疫応答を増強または促進する働きをする１以上の付加的薬剤と同時に投与することができる。
【０２４９】
Ｅ．結合特性の調節
ＰＤ−１アンタゴニストの結合特性は投与される用量および用量計画に関連する。ＭＤＸ−１１０６などの既存の抗体ＰＤ−１アンタゴニストは、１回投与の後少なくとも３ヶ月間、Ｔ細胞上のＰＤ−１分子の６０〜８０％を持続的に占有することを示す(Brahmer, et al. J. Clin. Oncology, 27:(155) 3018 (2009))。好ましい実施形態では、開示されているＰＤ−１アンタゴニストは、免疫細胞上のＰＤ−１分子の、より短期またはより低パーセンテージの占有を示すＰＤ−１との結合特性を有する。例えば、開示されているＰＤ−１アンタゴニストは一般に、１回用量の投与後１週間、２週間、３週間またはさらには１か月で、免疫細胞上のＰＤ−１分子の占有率５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％未満を示す。他の実施形態では、開示されているＰＤ−１アンタゴニストはＰＤ−１に対してＭＤＸ−１１０６よりも低い結合親和性を有する。ＭＤＸ−１１０６などの抗体に関して、ＰＤ−１−Ｉｇ融合タンパク質はその受容体に対して比較的低い親和性を有し、従って、比較的速い解離速度を有するはずである。
【０２５０】
他の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、次の投与の前に減衰される周期的に増強される免疫応答を惹起するために数日、数週間、または数ヶ月間にわたって間欠的に投与され、これにより、免疫応答を誘導する、免疫応答を刺激する、または免疫応答を増強する働きをすることができる。
【実施例】
【０２５１】
本発明は、以下の非限定的実施例を参照すればさらに理解される。
【０２５２】
実施例１：Ｂ７−ＤＣのＰＤ−１への結合
ヒトＢ７−ＤＣ−ＩｇのＰＤ−１結合活性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＢｕｐＨ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ／Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｐＨ９．４バッファー(Pierce)で希釈した０．７５μｇ／ｍＬの組換えヒトＰＤ−１／Ｆｃ(R&D Systems)１００μＬで２時間コーティングした後、ＢＳＡ溶液(Jackson ImmunoResearch)を用いて９０〜１２０分間ブロックした。連続誘導体希釈したヒトＢ７−ＤＣ−ＩｇならびにヒトＩｇＧ１イソ型対照を９０分間結合させた。結合したＢ７−ＤＣ−Ｉｇは、１００μＬの０．５μｇ／ｍＬビオチン結合抗ヒトＢ７−ＤＣクローンＭＩＨ１８(eBioscience)、次いで１：１０００希釈ＨＲＰ−ストレプトアビジン(BD Bioscience)およびＴＭＢ基質(BioFX)を用いて検出した。プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取り、データを、ＳｏｆｔＭａｘで４パラメーターロジスティック適合を用いて解析した。
【０２５３】
ネズミＢ７−ＤＣ−ＩｇのＰＤ−１結合活性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、ＢｕｐＨ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ／Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｐＨ９．４バッファー(Pierce)で希釈した０．７５μｇ／ｍＬの組換えマウスＰＤ−１／Ｆｃ(R&D Systems) １００μＬを用いて２時間コーティングし、次いでＢＳＡ溶液(Candor-Bioscience)を用いて９０分間ブロックした。連続希釈したネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（野生型、ならびにＰＤ−１への低減された結合のために選択されたＤ１１１ＳおよびＫ１１３Ｓ変異株）、ならびにネズミＩｇＧ２ａイソ型対照を９０分間結合させた。結合したＢ７−ＤＣ−Ｉｇは、１００μＬの０．２５μｇ／ｍＬビオチン結合抗マウスＢ７−ＤＣクローン１１２(eBioscience)、次いで１：２０００希釈ＨＲＰ−ストレプトアビジン(BD Bioscience)およびＴＭＢ基質(BioFX)を用いて検出した。プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取り、データを、ＳｏｆｔＭａｘで４−パラメーターロジスティック適合を用いて解析した。
【０２５４】
図１Ａおよび１Ｂは、ＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡにおける、ＯＤ４５０対Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）の量の線グラフを示す。図１Ａは、４つの異なるロットのヒトＢ７−ＤＣ−Ｉｇの結合を示す。図４Ｂは、野生型ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（円）、ＤＳ変異株（Ｄ１１１Ｓを置換したＢ７−ＤＣ−Ｉｇ、三角）、およびＫＳ変異株（Ｋ１１３Ｓを置換したＢ７−ＤＣ−Ｉｇ、四角）、およびネズミＩｇＧ２ａイソ型対照（ひし形）の結合を示す。
【０２５５】
実施例２：Ｂ７−ＤＣのＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞への結合
Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを、最初にアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合させ、次いでＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統またはＰＤ−１を発現しない親ＣＨＯ細胞とともに種々な濃度でインキュベートした。結合は、フローサイトメトリーにより分析した。図２は、プローブ濃度（ｘ軸）の関数としての、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ−ＡＰＣの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）（ｙ軸）を示す。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ−ＡＰＣはＣＨＯ．ＰＤ−１細胞（黒円）に結合するが、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞には結合しない（灰色三角）。
【０２５６】
実施例３：ＰＤ−１への結合に関するＢ７−ＤＣ−ＩｇのＢ７−Ｈ１との競合
Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇを、最初にアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合させた。Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣをプローブおよび細胞混合物に加える前に、種々の濃度の非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを、最初に、ＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統とインキュベートした。図３は、加えた非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇコンペティターの濃度（ｘ軸）の関数としての、Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）（ｙ軸）を示す。非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ濃度が増加するにつれて、ＣＨＯ細胞に結合するＢ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣ量は減少し、このことは、ＰＤ−１への結合に関してＢ７−ＤＣ−ＩｇがＢ７−Ｈ１と競合することを実証している。
【０２５７】
実施例４：シクロホスファミドとＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せが腫瘍特異的メモリー細胞傷害性Ｔリンパ球を生成する
９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下に１．０×１０５のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を移植した。腫瘍移植後１０日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを投与した。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置は１日後である１１日目に開始した。マウスを、１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇを用いて、１週間に２用量、４週間にわたり合計８用量で処置した。ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置投与計画を受けたマウスの７５％において４４日までに定着腫瘍が根絶され、一方、対照ＣＴＸ単独群のマウスは全例が、腫瘍増殖の結果死亡したか、または腫瘍がＩＡＣＵＣにより承認されたサイズを超えたため安楽死させた。
【０２５８】
上記実験でＣＴ２６結腸直腸定着腫瘍を根絶したマウスに、４４日目および７０日目に１×１０５個のＣＴ２６細胞を再負荷した。再負荷により腫瘍が増殖しなかったことは、シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せ処置が、長期にわたる抗腫瘍免疫を発展させたことを示唆している。ビヒクル対照群のマウスは全例が腫瘍を発現した。これにより、定着腫瘍に対する処置の有効性、ならびにＢ７−ＤＣＩｇの併用処置が腫瘍抗原に対する記憶応答をもたらしたことが示された。
【０２５９】
上記実験でＣＴ２６結腸直腸定着腫瘍を根絶したマウスに、４４日目に２．５×１０５個のＣＴ２６細胞を再負荷した。７日後、マウスの脾臓を単離した。マウス脾細胞を、Ｇｏｌｇｉ遮断薬(BD BioScience)の存在下、５または５０μｇ／ｍＬのオバアルブミン（ＯＶＡ）またはＡＨ１ペプチドとともに６時間パルス処理し、ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞を評価することによりメモリーＴエフェクター細胞を分析した。図４の結果は、ＣＴ２６腫瘍根絶マウスにおいて多量のＣＴ２６特異的Ｔエフェクター細胞が存在することを示している。
【０２６０】
実施例５：Ｂ７−ＤＣ−ＩｇはＨＳＶウイルス粒子の放出を低減し、マウスの生存率を高めた
８〜１０週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスをまず、ビヒクル（白四角）または３００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（黒四角）とともに４×１０４用量の弱毒ＨＳＶ−２生ワクチンで免疫した（図５Ａおよび５Ｂ）。１か月後、総てのマウスを５×１０５ＰＦＵのＨＳＶ−２  Ｇ−６株を腟内投与した。図５Ａは、ウイルス投与後９時間、１日、２日、３日、４日および５日目における膣領域のスワブのウイルス粒子力価を示す。図５Ｂは、ウイルス投与後１２日目におけるマウスの生存率を示す。これにより、ワクチンとともにＢ７−ＤＣ−Ｉが存在すると、ウイルス量を低減し、動物の生存率を高めることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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