(57)【要約】本発明は、IGF-1R処置に対する癌細胞組織の応答を予測する方法に関する。本発明者らは、サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンの発現と、IGF-1R処置に対する癌細胞の応答との間の直接的関係を観察した。この観察は、癌がIGF-1R処置に応答するか否かを決定するために処置前に腫瘍細胞をスクリーニングすること、および／またはこれらのマーカーの発現の「前後」評価を実施することによりそのような処置の効力をモニタリングすることを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
IGF-1R処置に対する癌細胞組織の応答を予測する方法であって、
（a）該癌細胞組織におけるサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現を評価する工程；ならびに
（b）該癌細胞組織においてサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数が検出された場合に、良好な応答を予測する工程：
を含む方法。
【請求項２】
サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの二つ以上の発現が検出される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの三つ全ての発現が検出される、請求項3記載の方法。
【請求項４】
癌細胞組織におけるIGF-1Rの発現を評価する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現が、正常集団における平均発現と比べて上昇している、請求項1記載の方法。
【請求項６】
サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの三つ全ての発現が、正常集団における平均発現と比べて上昇している、請求項6記載の方法。
【請求項７】
癌細胞組織をIGF-1Rの阻害剤により処理する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
阻害剤がTKIである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
処理後に、癌細胞組織におけるサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現を評価する工程をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
対象由来の腫瘍の生検により癌細胞組織を入手する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
工程（b）の結果に基づき、対象のための処置を決定する工程をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
評価がRT-PCRを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
評価が免疫学的分析を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
癌組織が、肺癌組織、前立腺癌組織、膵臓癌組織、胃癌組織、食道癌組織、結腸癌組織、または乳癌組織である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
肺癌組織が非小細胞肺癌組織である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
対象におけるIGF-1R癌処置の結果を予測する方法であって、
（a）対象由来の癌細胞におけるサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現を評価する工程；
（b）サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現が検出された場合、IGF-1R癌処置により対象を処置するか、またはサバイビン、ErbB3、もしくはE-カドヘリンの発現が検出されない場合、非IGF-1R癌処置により対象を処置する工程：
を含む方法。
【請求項１７】
サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの二つ以上の発現が検出される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの三つ全ての発現が検出される、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
対象由来の癌細胞におけるIGF-1Rの発現を評価する工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現が、正常集団における平均発現と比べて上昇している、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの三つ全ての発現が、正常集団における平均発現と比べて上昇している、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
対象がヒト対象である、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
IGF-1R癌処置がTKIである、請求項16記載の方法。
【請求項２４】
対象由来の腫瘍の第一の生検により癌細胞を入手する工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２５】
工程（b）の後、対象由来の前記腫瘍の第二の生検により付加的な癌細胞を入手する工程、ならびに該第二の生検の癌細胞におけるサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現を評価する工程をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
非IGF-1R癌処置が、化学療法、放射線療法、および／または手術を含む、請求項16記載の方法。
【請求項２７】
評価がRT-PCRを含む、請求項16記載の方法。
【請求項２８】
評価が免疫学的分析を含む、請求項16記載の方法。
【請求項２９】
癌組織が、肺癌組織、前立腺癌組織、膵臓癌組織、胃癌組織、食道癌組織、結腸癌組織、または乳癌組織である、請求項16記載の方法。
【請求項３０】
肺癌組織が非小細胞肺癌組織である、請求項29記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2008年8月20日出願の米国仮出願第61/090,387号に対する優先権の恩典を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
I. 発明の領域
本発明は、一般に、腫瘍学および癌治療の領域に関する。より具体的には、本発明は、抗癌治療の効力を予測するバイオマーカーの評価に関する。
【背景技術】
【０００３】
II. 関連分野の説明
ソマトメジンとしても公知のインスリン様増殖因子には、インスリン様増殖因子-I（IGF-I）およびインスリン様増殖因子II（IGF-II）が含まれる（Klapper et al., 1983；Rinderknecht et al., 1978）。これらの増殖因子は、インスリン様増殖因子受容体-1（IGF-1R）（Sepp-Lorenzino, 1998）と名付けられた共通の受容体に結合することにより、腫瘍細胞を含む様々な細胞型に対して分裂促進活性を及ぼす（Macaulay, 1992）。IGFのIGF-1Rとの相互作用は、チロシン残基での受容体の自己リン酸化を誘発することにより、受容体を活性化する（Butler et al., 1998）。活性化された後、IGF-1Rが、次には、細胞内標的をリン酸化して、細胞シグナル伝達経路を活性化する。この受容体活性化は、腫瘍細胞の増殖および生存の刺激のために重大である。従って、IGF-1R活性の阻害は、ヒトの癌およびその他の増殖性疾患の増殖を処置するかまたは防止するために有益である可能性のある方法を表す。
【０００４】
IGF-I、IGF-II、およびそれらの受容体IGF1Rは、悪性表現型の重要なメディエーターであることを、いくつかの証拠系列が示している。IGF-Iの血漿レベルは、前立腺癌のリスクの最も強力な予測因子であることが見出されており（Chan et al., 1998）、類似の疫学的研究は、血漿IGF-Iレベルを、乳癌、結腸癌、および肺癌のリスクと強く関連づけている。いくつかの癌細胞株および腫瘍組織におけるIGF-1Rの過剰発現も証明されている。IGF1Rは、全ての乳癌細胞株の40％（Pandini et al., 1999）、肺癌細胞株の15％で過剰発現されている。乳癌腫瘍組織において、IGF1Rは6〜14倍過剰発現されており、IGF1Rは正常組織と比較して2〜4倍高いキナーゼ活性を示す（Webster et al., 1996；Pekonen et al., 1998）。結腸直腸癌組織生検材料の90パーセントが上昇したIGF-1Rレベルを示し、IGF-1R発現の程度が疾患の重度と相関している。初代子宮頸癌細胞培養物および子宮頸癌細胞株の分析は、IGF-1Rが、正常外頚部（ectocervical）細胞と比較して、それぞれ3倍および5倍過剰発現されていることを明らかにした（Steller, et al., 1996）。滑膜肉腫細胞におけるIGF-1Rの発現も、侵襲性表現型（即ち、転移および高い増殖速度；Xie et al., 1999）と相関した。
【０００５】
現在、IGF-1Rを標的とし、IGF-1Rの機能および／または発現を減少させる、いくつかの抗癌治療が公知であり、それらは、一部の癌患者の処置において有効である。しかしながら、癌患者の一部は、そのような処置に応答しないと予想される。少なくとも一つの初期の試みは、（i）チロシン896でのIRS-1リン酸化；（ii）チロシン612でのIRS-1リン酸化；（iii）任意のチロシンでのIRS-1リン酸化；（iv）IGF-II；（v）任意のチロシンでのIGF1Rリン酸化；または（vi）IGF1Rを発現していることが既知の腫瘍を有する患者または患者集団を選択することにより、これらのラインに沿って行われた（米国特許公開第2006/0140960号を参照のこと）。それにも関わらず、IGF-1Rを標的とする一つまたは複数の抗癌治療に対して応答する可能性が最も高い特定の癌集団および／または特定の癌患者を同定する、改善された方法が、当技術分野において、未だ必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
従って、本発明によると、（a）癌細胞組織におけるサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現を評価する工程；ならびに（b）癌細胞組織においてサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数が検出された場合に、良好な応答を予測する工程：を含む、IGF-1R治療に対する癌細胞組織の応答を予測する方法が提供される。方法は、サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの二つ以上の発現を評価してもよいし、またはサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの三つ全てを評価してもよい。方法は、癌細胞組織におけるIGF-1Rの発現を評価する工程をさらに含んでいてもよい。サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つ、二つ、または三つ全ての発現が、正常集団における平均発現と比べて上昇しているかもしれない。
【０００７】
方法は、TKIまたは抗IGF-1R抗体のようなIGF-1Rの阻害剤により癌細胞組織を処理する工程をさらに含み得る。方法は、処理後、癌細胞組織におけるサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現を評価する工程をさらに含み得る。方法は、対象由来の腫瘍の生検により癌細胞組織を入手する工程をさらに含み得る。方法は、工程（b）の結果に基づき、対象のための処置を決定する工程をさらに含み得る。評価は、RT-PCRを含む核酸に基づくアッセイを含んでいてもよいし、または免疫学的分析を含んでいてもよい。癌組織は、非小細胞肺癌組織を含む肺癌組織、前立腺癌組織、膵臓癌組織、胃癌組織、食道癌組織、結腸癌組織、または乳癌組織であり得る。
【０００８】
もう一つの態様において、（a）対象由来の癌細胞におけるサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現を評価する工程；（b）サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現が検出された場合、IGF-1R癌処置により対象を処置するか、またはサバイビン、ErbB3、もしくはE-カドヘリンの発現が検出されない場合、非IGF-1R癌処置により対象を処置する工程：を含む、対象におけるIGF-1R癌処置の結果を予測する方法が提供される。方法は、サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの二つ以上の発現を評価してもよいし、またはサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの三つ全ての発現を評価してもよい。方法は、癌細胞組織におけるIGF-1Rの発現を評価する工程をさらに含み得る。サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つ、二つ、または三つ全ての発現が、正常集団における平均発現と比べて上昇しているかもしれない。対象はヒト対象であり得る。IGF-1R癌処置は、TKIまたは抗IGF-1R抗体であり得る。非IGF-1R癌処置には、化学療法、放射線療法、および／または手術が含まれ得る。
【０００９】
方法は、対象由来の腫瘍の第一の生検により癌細胞を入手する工程をさらに含み得る。方法は、工程（b）の後、対象由来の腫瘍の第二の生検により付加的な癌細胞を入手する工程、ならびに第二の生検の癌細胞におけるサバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンのうちの一つまたは複数の発現を評価する工程をさらに含み得る。評価は、RT-PCRを含む核酸に基づくアッセイを含んでいてもよいし、または免疫学的分析を含んでいてもよい。癌組織は、非小細胞肺癌組織を含む肺癌組織、前立腺癌組織、膵臓癌組織、胃癌組織、食道癌組織、結腸癌組織、または乳癌組織であり得る。
【００１０】
本明細書に記載された任意の方法または組成物が、本明細書に記載された他の任意の方法または組成物に関して実行され得ることが企図される。
【００１１】
特許請求の範囲および／または本明細書において「を含む」という用語と共に使用された場合、「一つの（aまたはan）」という単語の使用は、「一つの（one）」を意味し得るが、「一つまたは複数の」または「少なくとも一つの」の意味とも一致する。「約」という用語は、一般に、明記された値プラスまたはマイナス5％を意味する。特許請求の範囲における「または」という用語は、代替物のみをさすことが明示されない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ、および「および／または」をさす定義を支持する。
【００１２】
本発明のその他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、本発明の本旨および範囲に含まれる様々な変化および修飾が、この詳細な説明から当業者には明白になるため、詳細な説明および具体例は、本発明の特定の態様を示し、例示のためにのみ与えられていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある種の局面をさらに証明するために含まれている。本発明は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの一つまたは複数を参照することにより、よりよく理解され得る。
【００１４】
【図１】NSCLCを有する患者に由来する原発腫瘍における遺伝子発現。原発腫瘍を、リアルタイムRT-PCRを使用して検査し、内部標準βアクチンに対して規準化した。R値およびp値は下記表2に示される。
【図２Ａ】IGF-1Rは、SCC組織像を有する患者において、より高い発現を有する。
【図２Ｂ】サバイビンは、SCC組織像を有する患者において、より高い発現を有する。
【図３】サバイビン発現は、IGF-1R TKIであるPPPの活性と関連する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
例示的な態様の説明
I. 本発明
過去十年間に、肺癌のための新規の処置のための標的として、いくつかの経路が同定された。その中の一つが、IGFR-1およびその下流標的である。IGFR-1は、癌細胞の癌化、増殖、および生存の促進に関連付けられている、染色体15q25-q26上に位置する遺伝子IGF1R遺伝子によりコードされる、膜貫通型ヘテロ四量体タンパク質である。IGF1Rの活性化は、Ras／Raf／マイトジェン活性化プロテインキナーゼおよびホスホイノシトール-3-キナーゼ（PI3K）シグナル伝達の改変をもたらす。これらの事象は、サバイビンの発現を増加させ、他方、IGF1rの阻害はサバイビンのダウンレギュレーションをもたらす。以前の研究は、IGFR-1の発現および活性化が、疾患進行、放射線療法に対する抵抗性の増加、および悪い予後と関連していることを示した。IGFR-1は、NSCLCにおいて、EGFR阻害剤のような、他の標的に対する薬剤に対する抵抗性にも関連していることが示唆されている。
【００１６】
この研究は、IGF1Rを標的とするいくつかの分子、チロシンキナーゼ阻害剤および抗体の開発をもたらした。これらの薬剤は第I〜第III相臨床試験において検査されている途中である。これらの試験において、扁平上皮癌を有する患者において、より高い応答が検出されることが観察され、このことから、扁平上皮癌組織像を有する患者のみを対象とする第III相臨床試験が設計された。最近の研究により、上皮間葉転換（EMT）に関与する分子が癌における標的治療に対する応答に影響を与えることが示されたが、応答と標的特徴との間の関係は未だ完全に理解されていない。従って、どの癌がIGF-1Rを阻害する薬剤による処置に対して感受性であるかを適切に同定し、それにより、有効でないであろう治療を投与することによる時間、費用、および合併症を回避する必要がある。
【００１７】
本発明において、本発明者らは、NSCLCを有する患者、特にSCCを有する患者に由来する原発腫瘍において、サバイビン、およびEMTに関与するその他のいくつかの分子の発現を、IGF-1Rの発現と相関させる。本発明者らはまた、NSCLC細胞株においてサバイビンの発現をサバイビンの活性と相関させる。最後に、提示された結果は、NSCLCを有する患者85人において、IGF-1Rが、サバイビン発現、E-カドヘリン発現、およびErbB3発現と相関することを示している。従って、これらの所見は、IGR-1R治療の効力を決定するために非侵襲的にアッセイすることができる標的を提供する。
【００１８】
II. 癌、IGF-1R、および標的処置
A. 癌
本発明において処置が企図される例示的な癌には、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、食道癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、および乳癌が含まれる。
【００１９】
癌は、初回診断後またはその後、治療または二つ以上の治療の組み合わせにより処置され得る。癌再発とは、手術、放射線療法、または化学療法のうちの一つまたは複数を含む任意の処置の後の、癌の再出現または患者が癌を有するとの再診断として定義され得る。再発した疾患を有する患者は、無疾患であると報告されていた必要はなく、患者は、最初の治療によるある程度の臨床的応答の後に、復活した癌増殖を示していればよい。
【００２０】
治療または臨床的応答は、安定型疾患、腫瘍退縮、腫瘍壊死、証明可能な癌の欠如、腫瘍のサイズもしくは量の低下、腫瘍増殖の阻止、腫瘍に関連した疼痛の低下、腫瘍に関連した病理の低下、腫瘍に関連した症状の低下、腫瘍の無進行、無病期間の増加、無進行期間の増加、寛解の誘導、転移の低下、または患者生存率の増加をもたらし得るが、これらに限定されない。
【００２１】
B. IGF-1R
インスリン様増殖因子1受容体（IGF-1R）は、IGF-1および関連増殖因子IGF-2により活性化される膜貫通型受容体である。それは、チロシンキナーゼ受容体の大きいクラスに属する。この受容体は、インスリンに分子構造が類似しているポリペプチドタンパク質ホルモンであるIGF-1の効果を媒介する。IGF-1は、成長において重要な役割を果たし、成人においても同化効果を有し続ける。即ち、骨格筋およびその他の標的組織の肥大を誘導することができる。IGF-1受容体を欠くマウスは、発生後期に死亡し、体重の劇的な低下を示すが、このことは、この受容体の強い成長促進効果を実証している。igf1rの機能的なコピーを一つのみ保持するマウスは、正常であるが、体重のおよそ15％の減少を示す。
【００２２】
2個のαサブユニットおよび2個のβサブユニットがIGF-1受容体を構成する。βサブユニットは細胞膜を貫通し、ジスルフィド結合により連結されている。この受容体は、インスリン受容体およびIGF-2R（および、それぞれのリガンドIGF-1およびIGF-2）、ならびにいくつかのIGF結合タンパク質からなるファミリーのメンバーである。IGF-1RおよびIRは、両方とも、自己リン酸化のためのリン酸を提供するために使用されるATPの結合部位を有する。IGF-1Rとインスリン受容体との間には60％の相同性がある。
【００２３】
IGF-1受容体を含むチロシンキナーゼ受容体は、細胞内のある種のタンパク質の特定のチロシンへのリン酸基の付加を引き起こすことにより、それらの活性を媒介する。このリン酸の付加は、「細胞シグナル伝達」カスケードと呼ばれるものを誘導し、IGF-1受容体の活性化の通常の結果は、有糸分裂能を有する細胞においては生存および増殖、骨格筋および心筋のような組織においては成長（肥大）である。胚発生の間、IGF-1R経路は発達中の肢芽と関連する。
【００２４】
IGFRシグナル伝達経路は、妊娠中および授乳中の乳腺組織の正常な発達において決定的に重要である。妊娠中は、管組織および腺組織を形成する上皮細胞の強烈な増殖が起こる。離乳後、細胞はアポトーシスを受け、組織が全て破壊される。いくつかの増殖因子およびホルモンが、この過程全体に関与しており、IGF-1Rは、細胞の分化において役割を有し、離乳が完了するまでのアポトーシスの阻害において枢要な役割を有すると考えられている。
【００２５】
IGF-1Rは、いくつかの癌、最も顕著には乳癌に関連付けられている。いくつかの場合、その抗アポトーシス特性は、癌性細胞が化学療法薬または放射線療法の細胞障害特性に抵抗することを可能にする。エルロチニブのようなEGFR阻害剤が、EGFRシグナル伝達経路を阻害するために使用されるその他の場合、IGF-1Rは、ヘテロ二量体の2分の1を形成し（エルロチニブの頁のEGFRシグナル伝達の説明を参照のこと）、適当な阻害剤の存在下でEGFRシグナル伝達が再開することを可能にすることにより、耐性を付与する。この過程は、EGFRとIGF-1Rとの間のクロストークと呼ばれる。それは、さらに、血管新生を促進する能力の推論により、最初の腫瘍の転移能を増加させることにより、乳癌に関連づけられている。
【００２６】
C. IGF-1R標的処置
現在、IGF1Rを標的とするいくつかの抗癌治療が公知である。例えば、抗IGF1R抗体は、Schering Corp（WO 2003/100008参照）；Pfizer（WO 2002/53596またはWO 2004/71529参照）；Pierre Fabre medicament（WO 2003/59951参照）、Pharmacia Corp.（WO 2004/83248参照）、Immunogen, Inc.（WO 2003/106621参照）、Hoffman La Roche（WO 2004/87756参照）、およびImclone Systems Inc.（IMC-A12；Burtrum et al.,2003参照）により開示されている。さらに、Novartisは、低分子IGFR阻害剤NVP-ADW-742を記載しており（WO 2002/92599参照）、Biotech Research Ventures PTE Ltd（WO 2003/39538参照）も同様である。Antisense Therapeutics Ltd.は、IGF1R発現を阻害するアンチセンス治療ATL-1101を記載している。
【００２７】
IGF-1Rおよびインスリン受容体の構造は、特に、ATP結合部位の領域およびチロシンキナーゼ領域において類似しているため、IGF-1Rの選択的阻害剤の合成は困難である。シクロリグナンであるピクロポドフィリン（PPP）は、ポドフィロトキシンのシス異性体である。Girnita et al. (2004)が、最初に、この薬剤のIGF-1Rに対する強力かつ選択的な作用を報告した。彼らは、ほぼ非毒性である（げっ歯動物においてLD50＞500mg/kg）この化合物が、IGF-1R活性を効率的に阻止し、pAktならびにリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（phosphorylated extracellular signal regulated kinase）1および2（pErk1/2）を低下させ、培養IGF-1R陽性腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、異種移植および同種移植を受けたマウスにおいて完全な腫瘍退縮を引き起こしたことを示した。著者らは、IGF-1Rに対する阻害効果を有するPPPまたは関連化合物が、抗癌剤の開発において検討されるべきであることを示唆した。その他の特定の阻害剤には、IRよりIGF-1Rに対してある程度の選択性を示すAG538およびAG1024のようなチロホスチン；IRよりIGF-1Rに対してはるかに大きな（100倍）選択性を示すNVP-AEW541のようなピロロ[2,3-d]-ピリミジン誘導体が含まれる。もう一つのIGF-1R治療はPQIPである。
【００２８】
前記のように、IGR-1R標的治療のもう一つのクラスには、MK-0646、AMB479、AVE1642のようなIGF-1Rに対する抗体が含まれる。各々、参照により組み入れられる、米国特許第7,371,378号；米国特許公開第2008/0181891号、第2008/0152649号、第2008/00669539号、および第2007/0243194号を参照のこと。
【００２９】
III. 標的遺伝子
上述のように、本発明は、IGF-1R阻害剤による処置に対する癌の感受性と関連していることが見出された三つの特定の標的遺伝子の発現レベルの評価を含む。これらの遺伝子、サバイビン、ErbB3、およびE-カドヘリンに関して以下に記述する。
【００３０】
A. サバイビン
バキュロウイルスIAPリピート含有5（Baculoviral IAP repeat-containing 5/BIRC5）とも呼ばれるサバイビンは、アポトーシス阻害タンパク質ファミリー（IAP）に属するヒト遺伝子である。サバイビンタンパク質は、カスパーゼ活性化を阻害し、従って、アポトーシスまたはプログラム細胞死の負の調節をもたらすよう機能する。このことは、サバイビン誘導経路の破壊が、アポトーシスの増加および腫瘍増殖の減少をもたらすことにより示された。サバイビンタンパク質は、大部分のヒトの腫瘍および胎児組織に高発現しているが、最終分化細胞には完全に欠如している。従って、この事実のため、癌細胞が標的とされ、正常細胞は影響を受けないため、サバイビンは、癌治療のための理想的な標的である。サバイビンの発現は、細胞周期によっても高度に調節され、G2〜M期にのみ発現される。サバイビンは、有糸分裂の間、チューブリンとの相互作用により、有糸分裂紡錘体に局在し、有糸分裂の調節に寄与する役割を果たし得ることが公知である。サバイビン調節の分子的な機序は、現在のところ未だ十分に理解されていないが、サバイビンの調節は、p53タンパク質に関連していると考えられる。
【００３１】
全てのIAPファミリータンパク質に共通の構造的な特色は、全てが、保存された亜鉛配位Cys/Hisモチーフを特徴とするバキュロウイルスIAPリピート（BIR）ドメインを、少なくとも1個、タンパク質のN末端側の半分に含有しているという点である。サバイビンは、ただ1個のBIRドメインを有するという点で、他のIAPファミリーメンバーから区別される。マウスおよびヒトのサバイビンのBIRドメインは、機能の可変性に影響を与えるかもしれない二点の違いを除いて、構造的に極めて類似している。ヒトサバイビンは、42アミノ酸を含む、延長されたC末端ヘリックスも含有している。サバイビンは、16.5kDaの大きさであり、IAPファミリーの中で最も小さいメンバーである。mRNAのアクセッション番号は、NM 001012270である。
【００３２】
B. ErbB3
ERBB3としても公知のV-erb-b2赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ3（トリ）は、ヒト遺伝子である。この遺伝子は、受容体チロシンキナーゼの表皮増殖因子受容体（EGFR）ファミリーのメンバーをコードする。この膜結合型タンパク質は、ニューレグリン結合ドメインを有するが、活性キナーゼドメインは有しない。従って、このリガンドに結合することはできるが、タンパク質リン酸化を通して細胞内へシグナルを伝達することはできない。しかしながら、それは、キナーゼ活性を有している他のEGF受容体ファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化は、経路の活性化をもたらし、それが、細胞の増殖または分化をもたらす。この遺伝子の増幅および／またはそのタンパク質の過剰発現は、前立腺、膀胱、および乳房の腫瘍を含む多数の癌で報告されている。異なるアイソフォームをコードする選択的転写スプライスバリアントが特徴決定されている。1個のアイソフォームは、膜間領域を欠き、細胞外に分泌される。この型は、膜結合型の活性をモジュレートするよう作用する。付加的なスプライスバリアントも報告されているが、それらは十分に特徴決定されていない。ERBB3は、活性化された場合、二量化、ならびにERBB1、ERBB2、およびERBB4によるその後のリン酸化のための基質になると考えられている。受容体チロシンキナーゼの多くと同様に、ERBB3は、細胞外リガンドにより活性化される。ERBB3と結合することが公知であるリガンドには、ヘレグリンが含まれる。ErbB3 mRNAのアクセッション番号はNM 001005915である。
【００３３】
C. E-カドヘリン
カドヘリンは、1型膜貫通型タンパク質のクラスである。それらは、細胞接着において重要な役割を果たし、組織内の細胞が結合し合うことを確実にする。それらは、機能するためにカルシウム（Ca2+）イオンに依存し、その名称はここに由来している。カドヘリンスーパーファミリーには、カドヘリン、プロトカドヘリン、デスモグレイン、およびデスモコリン等が含まれる。構造的には、それらは、細胞外Ca2+結合ドメインであるカドヘリンリピートを共有している。カドヘリン分子には複数のクラスが存在し、それらは各々、1文字接頭辞（関連している組織の型を一般に示す）により名付けられている。一つのクラス内のカドヘリンは、それ自体にのみ結合するであろう。例えば、N-カドヘリンはもう一つのN-カドヘリン分子にのみ結合するであろう。この特異性のため、同一の型のカドヘリン分子を発現する細胞の群は、発生中、共にクラスター形成する傾向があり、異なる型のカドヘリン分子を発現する細胞は、分離する傾向がある。カドヘリンファミリーの異なるメンバーは、異なる位置に見出される。E-カドヘリンは上皮組織に見出され；N-カドヘリンはニューロンに見出され；P-カドヘリンは胎盤に見出される。T-カドヘリンは、細胞質ドメインを有しておらず、細胞膜に繋ぎ止められなければならない。E-カドヘリンmRNAのアクセッション番号はNM 004360である。
【００３４】
E-カドヘリン（上皮）は、おそらく、最もよく理解されているカドヘリンである。それは、細胞外ドメイン内の5個のカドヘリンリピート（EC1〜EC5）、1個の膜貫通ドメイン、ならびにp120カテニンおよびβカテニンに結合する細胞内ドメインからなる。細胞内ドメインは、βカテニン結合にとって不可欠であり、従って、E-カドヘリン機能にとって不可欠な、高リン酸化領域を含有している。βカテニンは、αカテニンにも結合することができる。αカテニンはアクチン含有細胞骨格フィラメントの調節に参与している。上皮細胞において、E-カドヘリンを含有している細胞間ジャンクションは、しばしば、細胞骨格のアクチン含有フィラメントに隣接している。
【００３５】
E-カドヘリンは、哺乳動物発生の2細胞期に最初に発現され、8細胞期までにリン酸化され、8細胞期にコンパクションを引き起こす。成体組織において、E-カドヘリンは、上皮組織に発現しており、そこで、細胞表面上で5時間の半減期で絶えず再生されている。E-カドヘリンの機能または発現の喪失は、癌の進行および転移に関連付けられている。E-カドヘリンのダウンレギュレーションは、組織内の細胞接着の強度を減少させ、細胞運動性の増加をもたらす。これが、次には、癌細胞が基底膜を通過し、周辺組織に侵襲することを可能にし得る。
【００３６】
IV. 標的遺伝子発現の評価
前述のマーカーの発現レベルの評価は、定量的免疫組織化学（IHC）またはその他の抗体に基づくアッセイ（ウエスタンブロット、FIA、FISH、ラジオイムノアッセイ（RIA）、RIP、ELISA、イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、フルオロイムノアッセイ、イムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ゲル電気泳動）を使用する場合のように直接的なものであってもよいし、またはこれらの遺伝子の転写物を定量化することによる間接的なものであってもよい（インサイチューハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼプロテクション、ノーザンブロット、またはRT-PCRを含むPCR）。関連する方法論について以下に記述する。
【００３７】
A. 核酸に基づく診断
本発明は、標的タンパク質レベルの尺度としてmRNA発現を調査する方法も含む。mRNAは、標準的な方法論（Sambrook et al., 1989）に従って、癌細胞から単離される。RNAを相補的DNAに変換することが望まれる場合もある。一つの態様において、RNAは、完全細胞RNAであり；もう一つの態様において、それはポリA RNAである。通常、核酸は増幅される。
【００３８】
フォーマットに依って、関心対象の特定の核酸は、増幅を使用して直接試料において同定されるか、または増幅の後、第2の既知の核酸により同定される。次に、同定された産物が検出される。ある種の適用において、検出は、視覚的な手段（例えば、ゲルの臭化エチジウム染色）により実施され得る。あるいは、検出は、化学発光、放射標識の放射シンチグラフィ、もしくは蛍光標識を介した、または電気的もしくは熱的なインパルスシグナルを使用した系（Affymax Technology；Bellus, 1994）を介した、産物の間接的な同定を含んでいてもよい。
【００３９】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）、ノーザンブロッティング、ドットブロット分析を含み、当然、PCRおよびRT-PCRを含むが、これらに限定されない、多様な異なるアッセイが企図される。
【００４０】
1. プライマーおよびプローブ
プライマーという用語は、本明細書において定義されるように、鋳型依存性の過程において新生核酸の合成をプライミングすることができる核酸を包含するものとする。典型的には、プライマーは、10〜20塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列が利用されてもよい。プライマーは、二本鎖型または一本鎖型で提供され得るが、一本鎖型が好ましい。プローブは異なる定義を有するが、プライマーとして作用することができる。プローブは、おそらくプライミングが可能であるが、標的DNAまたは標的RNAと結合するように設計されたものであり、増幅過程において使用される必要はない。特定の態様において、プローブまたはプライマーは、放射性種（32P、14C、35S、3H、もしくはその他の標識）、フルオロフォア（ローダミン、フルオレセイン）、または化学発光（ルシフェラーゼ）により標識される。
【００４１】
2. 鋳型依存性の増幅法
多数の鋳型依存性の過程が、所定の鋳型試料の中に存在するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最も周知の増幅法のうちの一つは、各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号、ならびにInnis et al., 1990に詳細に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR（商標）と呼ばれる）である。
【００４２】
簡単に説明すると、PCR（商標）においては、マーカー配列の逆相補鎖上の領域に相補的な二つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸が、DNAポリメラーゼ、例えば、Taqポリメラーゼと共に、反応混合物に添加される。マーカー配列が試料中に存在する場合、プライマーがマーカーに結合し、ポリメラーゼが、ヌクレオチドを付加することにより、マーカー配列に沿ってプライマーの伸長を引き起こすであろう。反応混合物の温度を上下させることにより、伸長されたプライマーがマーカーから解離して反応産物が形成され、過剰のプライマーがマーカーおよび反応産物に結合し、その過程が繰り返される。
【００４３】
逆転写酵素PCR（商標）増幅法は、増幅されたmRNAの量を定量化するために実施され得る。RNAをcDNAへ逆転写する方法は周知であり、Sambrook et al., 1989に記載されている。逆転写のための他の方法は、耐熱性RNA依存性DNAポリメラーゼを利用する。これらの方法は1990年12月21日出願のWO 90/07641に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は当技術分野において周知である。
【００４４】
増幅のためのもう一つの方法は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるEPO No. 320 308に開示されたリガーゼ連鎖反応（「LCR」）である。LCRにおいては、二つの相補的なプローブ対が調製され、標的配列の存在下では、各対が、隣接するよう、標的の逆相補鎖に結合する。リガーゼの存在下で、二つのプローブ対が結合して、単一のユニットを形成する。PCR（商標）の場合と同様の温度サイクリングにより、結合しライゲートしたユニットが標的から解離し、次いで、過剰のプローブ対のライゲーションのための「標的配列」として機能する。米国特許第4,883,750号は、プローブ対を標的配列と結合させるためのLCRに類似した方法を記載している。
【００４５】
PCT出願No. PCT/US87/00880に記載されたQβレプリカーゼも、本発明において、さらにもう一つの増幅法として使用され得る。この方法においては、標的のものに相補的な領域を有するRNAの複製配列が、RNAポリメラーゼの存在下で、試料に添加される。ポリメラーゼが複製配列をコピーし、次いで、それが検出され得る。
【００４６】
制限部位の一つの鎖にヌクレオチド5'-[α-チオ]-三リン酸を含有している標的分子の増幅を達成するために、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼが使用される等温増幅法も、本発明における核酸の増幅において有用であり得る（Walker et al., (1992)）。
【００４７】
鎖置換増幅（SDA）は、複数回の鎖の置換および合成、即ち、ニックトランスレーションを含む、核酸の等温増幅を実施するもう一つの方法である。修復連鎖反応（Repair Chain Reaction/RCR）と呼ばれる類似の方法は、増幅の標的とされた領域の全体に数個のプローブをアニールさせ、続いて、4種の塩基のうちの2種のみが存在する修復反応を行うことを含む。他の2種の塩基は、容易な検出のため、ビオチン化誘導体として添加され得る。類似のアプローチがSDAにおいても使用される。標的特異的な配列は、循環プローブ反応（cyclic probe reaction/CPR）を使用しても検出され得る。CPRにおいては、非特異的なDNAの3'配列および5'配列ならびに特異的なRNAの中央配列を有するプローブを、試料中に存在するDNAにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、反応物をRNase Hにより処理し、消化後に放出される特徴的な産物としてプローブの産物が同定される。最初の鋳型が、循環しているもう一つのプローブにアニールし、反応が繰り返される。
【００４８】
GB出願No. 2 202 328およびPCT出願No. PCT/US89/01025（各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されたさらにもう一つの増幅法も、本発明に従って使用され得る。前者の出願においては、「修飾された」プライマーが、PCR（商標）様の鋳型依存性かつ酵素依存性の合成において使用される。プライマーは、キャプチャーモエティ（例えば、ビオチン）および／または検出モエティ（例えば、酵素）により標識することにより修飾され得る。後者の出願においては、過剰の標識されたプローブが試料に添加される。標的配列の存在下で、プローブは結合し、触媒的に切断される。切断後、標的配列が完全なまま放出され、過剰のプローブがそれに結合する。標識されたプローブの切断は、標的配列の存在を示すシグナルを与える。
【００４９】
その他の核酸増幅法には、核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence based amplification/NASBA）および3SRを含む、転写に基づく増幅系（transcription-based amplification systems/TAS）が含まれる（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Kwoh et al., 1989；GingerasらのPCT出願WO 88/10315）。NASBAにおいては、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、溶解緩衝液による処理、ならびにDNAおよびRNAの単離のためのミニスピンカラム、またはRNAの塩化グアニジニウム抽出により、増幅のための核酸を調製することができる。これらの増幅技術は、標的特異的な配列を有するプライマーのアニーリングを含む。重合の後、DNA/RNAハイブリッドをRNase Hにより消化し、二本鎖DNA分子を再び熱変性させる。いずれの例においても、第2の標的特異的なプライマーの添加により、一本鎖DNAを完全に二本鎖にし、続いて重合を行う。次いで、二本鎖DNA分子は、T7またはSP6のようなRNAポリメラーゼにより多重転写される。等温循環反応において、RNAが一本鎖DNAへ逆転写され、次いで、それが二本鎖DNAに変換され、次いで、T7またはSP6のようなRNAポリメラーゼにより再度転写される。得られた産物は、短縮されていても、または完全であっても、標的特異的な配列を示す。
【００５０】
DaveyらのEPO No. 329 822（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）は、本発明に従って使用され得る、一本鎖RNA（「ssRNA」）、ssDNA、および二本鎖DNA（dsDNA）を循環的に合成することを含む核酸増幅法を開示している。ssRNAは、逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）により延長される第1のプライマーオリゴヌクレオチドのための鋳型である。次いで、RNAは、リボヌクレアーゼH（RNase H、DNAまたはRNAのいずれかとの二重鎖であるRNAに特異的なRNase）の作用により、得られたDNA：RNA二重鎖から除去される。得られたssDNAは、鋳型との相同性の5'にRNAポリメラーゼプロモーター（例えば、T7 RNAポリメラーゼ）の配列も含む、第2のプライマーのための鋳型である。次いで、このプライマーは、DNAポリメラーゼ（例えば、大腸菌DNAポリメラーゼIの大きい「クレノウ」断片）により伸長され、プライマー間に最初のRNAのものと同一の配列を有し、一つの末端にプロモーター配列をさらに有する二本鎖DNA（「dsDNA」）分子をもたらす。このプロモーター配列は、適切なRNAポリメラーゼにより、DNAの多くのRNAコピーを作成するために使用され得る。次いで、これらのコピーは、再びサイクルに入り、極めて高速の増幅をもたらすことができる。酵素の適切な選択により、この増幅は、各サイクルで酵素を添加することなく等温で実施され得る。この過程の循環的な性質のため、出発配列はDNAまたはRNAのいずれかの形態であるよう選択され得る。
【００５１】
MillerらのPCT出願WO 89/06700（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）は、標的一本鎖DNA（「ssDNA」）へのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、それに続く、配列の多くのRNAコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームは循環的ではない、即ち、得られたRNA転写物から新たな鋳型は作製されない。その他の増幅法には、「RACE」および「one-sided PCR（商標）」（Frohman, 1990；Ohara et al., 1989；各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）が含まれる。
【００５２】
得られる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で、二つ（またはそれ以上の）オリゴヌクレオチドをライゲートさせ、それにより、ジオリゴヌクレオチドを増幅させることに基づく方法も、本発明の増幅工程において使用され得る（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Wu et al., (1989)）。
【００５３】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）またはキネティックポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、標的とされたDNA分子を増幅し同時に定量化するために使用される、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく実験技術である。それは、DNA試料中の特異的な配列の検出および定量化（絶対的なコピー数として、またはDNAインプットもしくは付加的な規準化遺伝子に対して規準化される場合、相対的な量として）の両方を可能にする。
【００５４】
その手法は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般的な原理に従い；その最も大きな特色は、増幅されたDNAが、各増幅サイクル後にリアルタイムに反応物中に蓄積する際に定量化されるという点である。二つの一般的な定量化の方法は、二本鎖DNAにインターカレートする蛍光色素の使用、および相補的DNAとハイブリダイズした場合に蛍光を発する修飾されたDNAオリゴヌクレオチドプローブの使用である。
【００５５】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、少量のメッセンジャーRNA（mRNA）を定量化するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせられることが多く、それにより、研究者は、特定の時点で、または特定の細胞もしくは組織型において、相対的な遺伝子発現を定量化することが可能になる。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応は、しばしば、RT-PCRとして販売されているが、同様にRT-PCRとして既知の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応と混同されるべきではない。
【００５６】
DNA結合色素は、PCR反応物中の全ての二本鎖（ds）DNAに結合し、色素の蛍光を引き起こす。従って、PCRの間のDNA産物の増加は蛍光強度の増加をもたらし、それが各サイクルで測定され、従って、DNA濃度の定量化を可能にする。しかしながら、SYBR GreenのようなdsDNA色素は、（「プライマーダイマー」のような）非特異的なPCR産物を含む全てのdsDNA PCR産物に結合するであろう。これは、意図された標的配列の正確な定量化に干渉するかまたはそれを防止する可能性がある。反応物は、蛍光dsDNA色素を添加して、通常通り調製される。
【００５７】
反応はサーモサイクラーにおいて実行され、各サイクルの後に、蛍光のレベルが検出器により測定される；色素は、dsDNA（即ち、PCR産物）と結合した場合にのみ、蛍光を発する。PCR中のdsDNA濃度は、標準希釈物を参照して決定され得る。
【００５８】
他のリアルタイムPCR法と同様に、入手された値は、それに関連した絶対単位を有しない（即ち、mRNAコピー／細胞）。上記のように、測定されたDNA/RNA試料の標準希釈物との比較は、標準物に対して相対的な試料の割合または比のみを与え、異なる組織または実験条件との相対的な比較のみを可能にするであろう。定量化における精度を確実にするため、安定的に発現される遺伝子に対して標的遺伝子の発現を規準化することが、通常、必要である。これは、実験試料間のRNAの量または質の可能性のある差を補正することができる。
【００５９】
蛍光レポータープローブの使用は、最も正確で、最も信頼性の高い方法であるのみならず、最も高価でもある。それは、プローブ配列を含有しているDNAのみを定量化するため、配列特異的なRNAまたはDNAに基づくプローブを使用する；従って、レポータープローブの使用は、特異性を有意に増加させ、ある程度の非特異的なDNA増幅の存在下ですら、定量化を可能にする。これは、全ての遺伝子が類似の効率で増幅されるのであれば、異なる色の標識を有する特異的なプローブを使用することにより、多重化、即ち、同一反応において数種の遺伝子をアッセイすることを可能にする可能性がある。
【００６０】
それは、プローブの一方の末端に蛍光レポーターを有し、反対の末端に蛍光消光剤を有する、RNAに基づくプローブを用いて、一般的に実施される。レポーターの消光剤への接近は、蛍光の検出を防止する；taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解は、レポーターと消光剤との接近を破壊し、従って、消光されていない蛍光の放出を可能にし、それが検出され得る。従って、各PCRサイクルにおけるレポータープローブにより標的とされた産物の増加は、プローブの分解およびレポーターの放出による蛍光の比例的な増加を引き起こす。
【００６１】
PCR反応物は、通常通り調製され（PCRを参照のこと）、レポータープローブが添加される。反応が始まると、PCRのアニーリング期に、プローブおよびプライマーの両方がDNA標的にアニールする。新たなDNA鎖の重合がプライマーから開始し、ポリメラーゼがプローブに到達すると、その5'-3エキソヌクレアーゼがプローブを分解し、蛍光レポーターを消光剤から物理的に分離し、蛍光の増加をもたらす。
【００６２】
蛍光はリアルタイムPCRサーモサイクラーにおいて検出され測定され、産物の指数関数的な増加に対応するその幾何学的な増加が、各反応におけるサイクル閾値（CT）を決定するために使用される。
【００６３】
伝統的な方法による遺伝子発現の定量化は、いくつかの問題を提示する。まず、ノーザンブロット上のmRNAまたはゲル上もしくはサザンブロット上のPCR産物の検出は、多くの時間を要し、正確な定量化を可能にしない。また、典型的なPCR反応の20〜40サイクルの間、産物の量は、入力鋳型／試料よりも反応混合物中のプライマーの量により決定されるプラトーに到達する。
【００６４】
反応の対数期の間に存在するDNAの相対濃度は、対数尺でサイクル数に対して蛍光をプロットすることにより決定される（従って、指数関数的に増加する量は、直線を与えるであろう）。バックグラウンドより高い蛍光の検出のための閾値が決定される。試料からの蛍光が閾値に達するサイクルは、サイクル閾値Ctと呼ばれる。DNAの量は対数期にサイクル毎に倍化するため、DNAの相対量が計算され得る。例えば、もう一つの試料よりCtが3サイクル早い試料は、23＝8倍多い鋳型を有している。
【００６５】
次いで、その結果を、既知量のRNAまたはDNAの段階希釈物（例えば、未希釈、1：4、1：16、1：64）のRT-PCRにより作製された標準曲線と比較することにより、RNAまたはDNAの量が決定される。前述のように、遺伝子発現を正確に定量化するためには、関心対象の遺伝子から測定されたRNAの量を、同一試料中で測定されたハウスキーピング遺伝子からのRNAの量で割り、異なる試料の間のRNAの量および質の可能性のある変動について規準化する。規準化において使用される参照（ハウスキーピング）遺伝子の発現が、全ての試料で極めて類似しているのであれば、この規準化は、異なる試料の間の関心対象の遺伝子の発現の正確な比較を可能にする。従って、この基準を満たす参照遺伝子を選択することは、極めて重要であり、そして、ある範囲の異なる条件または組織で等しい発現レベルを示す遺伝子は極めて少ないため、しばしば困難である。
【００６６】
3. ノーザンブロッティング
ブロッティング技術は当業者に周知である。サザンブロッティングは、標的としてのDNAの使用を含み、ノーザンブロッティングは、標的としてのRNAの使用を含む。各々、異なる型の情報を提供するが、cDNAブロッティングは、多くの局面において、RNA種のブロッティングに類似している。
【００６７】
簡単に説明すると、適当なマトリックス、しばしば、ニトロセルロースフィルターの上に固定化されたRNA種を標的とするために、プローブが使用される。分析を容易にするため、異なる種は空間的に分離されるべきである。これは、しばしば、核酸種のゲル電気泳動、それに続く、フィルター上への「ブロッティング」により達成される。
【００６８】
その後、ブロットされた標的を、変性および再ハイブリダイゼーションを促進する条件の下で、プローブ（通常標識されている）と共にインキュベートする。プローブは標的と塩基対合するよう設計されているため、プローブは、再生条件下で、標的配列の一部に結合するであろう。次いで、未結合のプローブを除去し、上記のように、検出を達成する。
【００６９】
4. 分離法
通常、特異的な増幅が起こったか否かを決定する目的のため、何らかの段階で、鋳型および過剰のプライマーから増幅産物を分離することが望ましい。一つの態様において、増幅産物は、標準的な方法を使用して、アガロースゲル電気泳動、アガロースアクリルアミドゲル電気泳動、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離される。Sambrook et al. (1989)を参照のこと。
【００７０】
あるいは、分離を行うためにクロマトグラフィ技術を利用してもよい。本発明において使用され得る多くの種類のクロマトグラフィが存在し（吸着クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、および分子ふるい）、カラムクロマトグラフィ、ペーパークロマトグラフィ、薄層クロマトグラフィ、およびガスクロマトグラフィを含む、それらを使用するための多くの専門の技術が存在する（Freifelder, 1982）。
【００７１】
5. 検出法
マーカー配列の増幅を確認するためには、産物を可視化することができる。一つの典型的な可視化法は、臭化エチジウムによるゲルの染色およびUV光下での可視化を含む。あるいは、増幅産物が、放射定量的または蛍光定量的に標識されたヌクレオチドにより組み込んで（integrally）標識される場合、増幅産物は、分離後に、X線フィルムに曝されるか、または適切な刺激スペクトルの下で可視化され得る。
【００７２】
一つの態様において、可視化は間接的に達成される。増幅産物の分離の後、標識された核酸プローブを、増幅されたマーカー配列と接触させる。プローブは、好ましくは、発色団とコンジュゲートしているが、放射標識されていてもよい。もう一つの態様において、プローブは、抗体またはビオチンのような結合パートナーとコンジュゲートしており、結合対のもう一方のメンバーが検出可能モエティを保持する。
【００７３】
一つの態様において、検出は、標識されたプローブによる。含まれる技術は、当業者に周知であり、分子的なプロトコルに関する多くの標準的な書籍に見出され得る。Sambrook et al. (1989)を参照のこと。例えば、発色団により標識されたまたは放射標識されたプローブまたはプライマーが、増幅中または増幅後に標的を同定する。
【００７４】
上記のものの一つの例は、核酸の自動化された電気泳動および転写のための装置および方法を開示している、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,279,721号に記載されている。装置は、ゲルの外的な操作なしに電気泳動およびブロッティングを可能にし、本発明に係る方法を実施するために理想的に適している。
【００７５】
さらに、上記の増幅産物は、標準的な配列分析技術を使用して、特定の種類の変動を同定するために、配列分析に供されてもよい。ある種の方法において、遺伝子の網羅的分析は、最適の配列決定のために設計されたプライマーセットを使用して、配列分析により実施される（Pignon et al, 1994）。本発明は、これらの型の分析のうちの任意のものまたは全てが使用され得る方法を提供する。本明細書に開示された配列を使用すれば、配列の増幅を可能にするためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができ、次いで、配列を直接配列決定により分析することができる。
【００７６】
6. キット成分
関心対象の遺伝子を検出し配列決定するために必要とされる必須の材料および試薬は、全て、キットへと組み立てられてもよい。これは、一般に、予め選択されたプライマーおよびプローブを含むであろう。増幅のために必要な反応混合物を提供するために、様々なポリメラーゼ（RT、Taq、Sequenase（商標）等）を含む核酸を増幅するために適当な酵素、デオキシヌクレオチド、および緩衝液も含まれ得る。そのようなキットは、一般に、適当な手段で、個々の試薬および酵素のための容器、ならびに各プライマーまたは各プローブのための容器を別個に含むであろう。
【００７７】
7. チップ技術
Hacia et al. (1996)およびShoemaker et al. (1996)により記載されたもののようなチップに基づくDNA技術が、本発明者らにより、特に企図される。簡単に説明すると、これらの技術は、多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析するための定量的な方法を含む。オリゴヌクレオチドにより遺伝子をタグ付けするか、または固定化されたプローブアレイを使用することにより、チップ技術を利用して、高密度アレイとして標的分子を分離し、ハイブリダイゼーションに基づきこれらの分子をスクリーニングすることができる。Pease et al. (1994)；Fodor et al. (1991)も参照のこと。
【００７８】
B. 免疫診断
ELISAおよびウエスタンブロッティングのような技術を通して、標的細胞のタンパク質含有量を特徴決定するため、本発明の抗体を使用することができる。これは、将来の癌の予測因子として、または本件においては腫瘍退縮ウイルスへの曝露に対する可能性の高い応答を予測するための戦略として、悪性病変の存在または欠如のスクリーニングを提供し得る。
【００７９】
ELISAアッセイにおける本発明の抗体の使用が企図される。例えば、抗腫瘍抑制因子抗体を、選択された表面、好ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面へ固定化する。不完全に吸着した材料を除去するために洗浄した後、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、または粉乳溶液のような、試験抗血清に関して抗原的に中性であることが既知の非特異的なタンパク質を、アッセイプレートウェルに結合させるかまたはコーティングすることが望ましい。これは、固定化表面上の非特異的な吸着部位のブロッキングを可能にし、従って、表面への抗原の非特異的な結合により引き起こされるバックグラウンドを低下させる。
【００８０】
抗体をウェルへ結合させ、バックグラウンドを低下させるため非反応性材料によりコーティングし、未結合の材料を除去するため洗浄した後、免疫複合体（抗原／抗体）形成が可能な様式で、固定化表面を、試験すべき試料と接触させる。
【００８１】
試験試料と結合した抗体との間の特異的な免疫複合体の形成およびその後の洗浄の後、それを一次抗体とは異なる腫瘍抑制因子に対して特異性を有する二次抗体に供することにより、免疫複合体形成の発生を決定することができ、その量すら決定することできる。適切な条件は、好ましくは、BSA、ウシγグロブリン（BGG）、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）／Tween（登録商標）のような希釈剤により試料を希釈することを含む。これらの添加される薬剤は、非特異的なバックグラウンドの低下を補助する傾向もある。次いで、重層された抗血清を、好ましくは約25〜約27℃程度の温度で、約2〜約4時間、インキュベートする。インキュベーション後、抗血清を接触させた表面を、免疫複合体化していない材料を除去するために洗浄する。好ましい洗浄法には、PBS／Tween（登録商標）またはホウ酸緩衝液のような溶液による洗浄が含まれる。
【００８２】
検出手段を提供するため、二次抗体は、好ましくは、適切な発色基質と共にインキュベートされた場合に発色する関連酵素を有するであろう。従って、例えば、免疫複合体形成の発生にとって好都合の時間および条件で、二次抗体が結合した表面を、ウレアーゼまたはペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトIgGと接触させ、インキュベートすることが望まれるであろう（例えば、PBS／Tween（登録商標）のようなPBS含有溶液での室温での2時間のインキュベーション）。
【００８３】
酵素タグ付き二次抗体と共にインキュベートした後、未結合の材料を除去するための洗浄に続いて、尿素およびブロモクレゾールパープル、または酵素標識がペルオキシダーゼである場合、2,2'-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン)-6-スルホン酸（ABTS）およびH2O2のような発色基質と共にインキュベートすることにより、標識の量を定量化する。次いで、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して、発色の程度を測定することにより、定量化を達成する。
【００８４】
先のフォーマットは、まず試料をアッセイプレートに結合させることにより改変されてもよい。次いで、一次抗体をアッセイプレートと共にインキュベートし、続いて、一次抗体に対する特異性を有する標識された二次抗体を使用して、結合した一次抗体を検出する。
【００８５】
抗体は、イムノブロットまたはウエスタンブロット分析においても使用可能である。抗体は、ニトロセルロース、ナイロン、またはそれらの組み合わせのような固体支持体マトリックスへ固定化されたタンパク質の同定のための高親和性一次試薬として使用されてもよい。免疫沈降後のゲル電気泳動に関して、これらは、抗原の検出において使用される二次試薬が有害なバックグラウンドを引き起こす場合、そのような抗原を検出するために使用するための一工程試薬として使用されてもよい。腫瘍抑制因子に対する、酵素、放射標識、または蛍光によりタグ付けされた二次抗体を含む、ウエスタンブロッティングと共に使用するための免疫学的検出法は、これに関して特に有用であると考えられる。
【００８６】
V. 代替癌治療
本発明のある種の態様によると、本出願人らは、IGF-1R阻害剤の使用を含まない癌処置の方法も提供する。そのような治療は、IGF-1R阻害剤が有効でないであろうことを本発明のアッセイが示す場合に、利用され得る。それらは、IGR-1R治療が適切であることを本発明が示す場合に、IGF-1R阻害剤との組み合わせ治療において使用されてもよい。
【００８７】
A. 治療用核酸
本明細書において、「治療用核酸」とは、疾患を処置するかまたは防止する目的のため対象に投与され得る核酸をさすものと定義される。本明細書における核酸は、過剰増殖性疾患の処置において有益であることが既知であるかまたは推測されるものである。治療的な利益は、例えば、核酸による特定の遺伝子の発現の改変の結果として生じ得る。特定の遺伝子の発現の改変とは、特定の遺伝子の発現の阻害または強化であり得る。本発明のある種の態様は、治療用核酸の投与に関する。
【００８８】
本願において、「遺伝子治療」という用語は、過剰増殖性疾患を処置する目的のための、または未処置のままにしておけば、過剰増殖性疾患をもたらす可能性のある状態を処置するための、そのような必要のある患者への治療用遺伝子またはその他の治療用核酸の送達として定義され得る。「治療用遺伝子」の定義には、「生物学的に機能性の等価な」治療用遺伝子が包含される。従って、治療用遺伝子のアミノ酸と同一であるかまたは機能的に等価である、アミノ酸の約70％〜約99％の相同性を有する配列は、タンパク質の生物学的活性が維持されているのであれば、生物学的に機能性の等価物である配列であろう。治療用遺伝子のクラスには、腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節因子、アポトーシス促進遺伝子、サイトカイン、毒素、抗血管形成因子、ならびに癌遺伝子、血管形成促進因子、増殖因子、アンチセンス転写物、リボザイム、およびRNAiを阻害する分子が含まれる。
【００８９】
治療用遺伝子の例には、p53、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11 IL-12、GM-CSF、G-CSF、チミジンキナーゼ、mda7、fus、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、シトシンデアミナーゼ、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、Rb、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはMCCが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
治療用遺伝子の他の例には、酵素をコードする遺伝子が含まれる。例には、ACP不飽和化酵素、ACPヒドロキシラーゼ、ADPグルコースピロホリラーゼ（pyrophorylase）、ATPアーゼ、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ヒアルロン（hyaluron）シンターゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、プラナーゼ（pullanase）、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、レポーター遺伝子、インターロイキン、またはサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
治療用遺伝子のさらなる例には、カルバモイルシンセターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンセターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ-1アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、低密度リポタンパク質受容体、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンβシンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルCoAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、β-グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、H-タンパク質、T-タンパク質、メンケス病銅輸送ATPアーゼ、ウィルソン病銅輸送ATPアーゼ、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、HSVチミジンキナーゼ、またはヒトチミジンキナーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【００９２】
治療用遺伝子には、ホルモンをコードする遺伝子も含まれる。例には、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、βエンドルフィン、βメラニン細胞刺激ホルモン、コレシストキニン、エンドセリンI、ガラニン、胃抑制ペプチド、グルカゴン、インスリン、リポトロピン、ニューロフィジン、ソマトスタチン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、βカルシトニン遺伝子関連ペプチド、悪性高カルシウム血症因子（hypercalcemia of malignancy factor）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、グルカゴン様ペプチド、パンクレアスタチン、膵臓ペプチド、ペプチドYY、PHM、セクレチン、血管作用性小腸ペプチド、オキシトシン、バソプレッシン、バソトシン、エンケファリンアミド、メトルフィナミド（metorphinamide）、αメラニン細胞刺激ホルモン、心房性ナトリウム利尿因子、アミリン、アミロイドP成分、コルチコトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出因子、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ニューロペプチドY、サブスタンスK、サブスタンスP、または甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンをコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
治療用遺伝子の他の例には、その組織に対する免疫応答を誘発するために使用され得る、過剰増殖組織に存在する抗原をコードする遺伝子が含まれる。抗癌免疫治療は、当技術分野において周知であり、例えば、各々、参照によりその全体が具体的に組み入れられる、PCT出願WO0333029、WO0208436、WO0231168、およびWO0285287に、より詳細に記載されている。
【００９４】
さらに他の治療用遺伝子は、アンチセンス、リボザイム、siRNA、および単鎖抗体のような阻害性分子をコードするものである。そのような分子は、癌遺伝子、細胞増殖の誘導因子、および血管形成促進因子のような過剰増殖遺伝子を阻害するために有利に使用され得る。
【００９５】
B. 手術
癌を有する者のおよそ60％が、予防的手術、診断的手術または病期決定のための手術、根治的手術、および緩和手術を含む、何らかの型の手術を受けるであろう。根治的手術は、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン治療、遺伝子治療、免疫療法、および／または代替治療のような他の治療と共に使用され得る癌処置である。
【００９６】
根治的手術には、癌性組織の全部または一部が物理的に除去され、切除され、かつ／または破壊される切除が含まれる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去をさす。腫瘍切除に加えて、手術による処理には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡下での手術（モース手術）が含まれる。本発明は、表在性癌、前癌、または偶発的な量の正常組織の除去と共に使用され得ることが、さらに企図される。
【００９７】
手術前、または癌性細胞、組織、もしくは腫瘍の一部もしくは全部の切除時の腫瘍内注射のため、体内に腔が形成されてもよい。処置は、付加的な抗癌治療の、これらの区域への灌流、直接注射、または局所適用により達成され得る。例えば、そのような処置は、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、もしくは7日毎、または1週間毎、2週間毎、3週間毎、4週間毎、および5週間毎、または1ヶ月毎、2ヶ月毎、3ヶ月毎、4ヶ月毎、5ヶ月毎、6ヶ月毎、7ヶ月毎、8ヶ月毎、9ヶ月毎、10ヶ月毎、11ヶ月毎、もしくは12ヶ月毎に繰り返され得る。これらの処置は、投薬量に関しても変動し得る。
【００９８】
C. 化学療法
多様な化学療法剤が、本発明に従って使用され得る。「化学療法」という用語は、癌を処置するための薬物の使用をさす。「化学療法剤」とは、癌の処置において投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞における活性の様式、例えば、細胞周期に影響を与えるか否か、そしてどの段階で細胞周期に影響を与えるか、により分類される。あるいは、薬剤は、DNAを直接架橋する能力、DNAへインターカレートする能力、または核酸合成に影響を与えることにより染色体および有系分裂の異常を誘導する能力に基づき、特徴決定され得る。大部分の化学療法剤が、以下のカテゴリーに分類される：アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、およびニトロソ尿素。
【００９９】
1. アルキル化剤
アルキル化剤は、ゲノムDNAと直接相互作用して、癌細胞が増殖するのを防止する薬物である。この化学療法薬のカテゴリーは、細胞周期上の全ての期に影響を与える薬剤を表し、即ち、それらは期特異的ではない。アルキル化剤は、慢性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、および特定の乳癌、肺癌、および卵巣癌を処置するために実行され得る。それらには、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（cytoxan）、ダカルバジン、イホスファミド、メクロレタミン（mustargen）、およびメルファランが含まれる。トログリタゾンは、これらのアルキル化剤（それらのうちのいくつかは以下に記述される）のうちの一つまたは複数と組み合わせて、癌を処置するために使用され得る。
【０１００】
2. 代謝拮抗薬
代謝拮抗薬は、DNAおよびRNAの合成を妨害する。アルキル化剤とは異なり、それらは、細胞周期上のS期に特異的に影響を及ぼす。それらは、乳房、卵巣、および胃腸管の腫瘍に加えて、慢性白血病に対抗するために使用されている。代謝拮抗薬には、5-フルオロウラシル（5-FU）、シタラビン（Ara-C）、フルダラビン、ゲムシタビン、およびメトトレキサートが含まれる。
【０１０１】
5-フルオロウラシル（5-FU）は、5-フルオロ-2,4(1H,3H)-ピリミジンジオンという化学名を有する。その作用機序は、デオキシウリジル酸のチミジル酸へのメチル化反応の阻止によると考えられている。従って、5-FUは、デオキシリボ核酸（DNA）の合成に干渉し、それより程度は低いが、リボ核酸（RNA）の形成も阻害する。DNAおよびRNAは、細胞の分裂および増殖のために不可欠であるため、5-FUの効果は、チミジン欠損を作出して細胞死をもたらすことであると考えられる。従って、5-FUの効果は、転移性癌の特徴である、急速に分裂している細胞において見出される。
【０１０２】
3. 抗腫瘍抗生物質
抗腫瘍抗生物質は、抗微生物活性および細胞障害活性の両方を有する。これらの薬物は、酵素および有糸分裂を化学的に阻害するか、または細胞膜を改変させることにより、DNAに干渉する。これらの薬剤は、期特異的ではなく、従って、細胞周期上の全ての期において作用する。従って、それらは、多様な癌のために広く使用されている。抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、およびイダルビシンが含まれ、それらのうちのいくつかは、より詳細に以下に記述される。新生物の処置のために臨床的環境において広く使用されている、これらの化合物は、アドリアマイシンについては21日間隔で25〜75mg/m2の範囲の用量で静脈内ボーラス注射により投与され、エトポシドについては35〜100mg/m2の範囲の用量で静脈内投与または経口投与される。
【０１０３】
4. 有糸分裂阻害剤
有糸分裂阻害剤には、細胞分裂または有糸分裂のいずれかのために必要とされるタンパク質合成を阻害することができる植物アルカロイドおよびその他の天然薬剤が含まれる。それらは、細胞周期の特定の期に作動する。有糸分裂阻害剤には、ドセタキセル、エトポシド（VP16）、パクリタクセル、タキソール、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。
【０１０４】
5. ニトロソ尿素
ニトロソ尿素は、アルキル化剤と同様に、DNA修復タンパク質を阻害する。それらは、脳腫瘍に加えて、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫を処置するために使用される。例には、カルムスチンおよびロムスチンが含まれる。
【０１０５】
6. その他の薬剤
使用され得るその他の薬剤には、ベバシズマブ（商品名Avastin（登録商標））、ゲフィチニブ（Iressa（登録商標））、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））、セツキシマブ（Erbitux（登録商標））、パニツムマブ（Vectibix（登録商標））、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））、およびGleevecが含まれる。さらに、増殖因子阻害剤および低分子キナーゼ阻害剤も、同様に、本発明における利用可能性を有する。Cancer: Principles and Practice of Oncology (7th Ed.), 2004およびClinical Oncology (3rd Ed., 2004)に記載された全ての治療が、参照により本明細書に組み入れられる。以下の付加的な治療も、同様に、包含される。
【０１０６】
免疫療法薬は、一般に、癌細胞を標的とし破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に頼る。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、治療のエフェクターとして単独で機能するかもしれないし、または細胞死滅を実際にもたらす他の細胞を動員するかもしれない。抗体は、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）にコンジュゲートし、単にターゲティング剤として機能するかもしれない。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を保持しているリンパ球であるかもしれない。様々なエフェクター細胞には、細胞障害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【０１０７】
従って、免疫療法は、p53遺伝子治療との組み合わせ治療の一部として使用され得る。組み合わせ治療の一般的なアプローチは以下に記述される。一般に、腫瘍細胞は、標的とすることが可能な、即ち、他の細胞の大半には存在しない何らかのマーカーを保持しているはずである。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのうちの任意のものが、本発明に関して標的とするのに適しているかもしれない。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、尿路腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbB、およびp155が含まれる。
【０１０８】
腫瘍壊死因子は、いくつかの種類の癌細胞を死滅させ、サイトカイン産生を活性化し、マクロファージおよび内皮細胞を活性化し、コラーゲンおよびコラゲナーゼの産生を促進し、炎症メディエーターであり、敗血症性ショックのメディエーターでもあり、異化、発熱、および睡眠を促進する糖タンパク質である。いくつかの感染因子は、TNF産生の刺激を通して腫瘍退縮を引き起こす。TNFは、有効な用量で単独で使用された場合には、著しく毒性であり得るため、最適の計画は、おそらく、他の薬物と組み合わせてより低い用量でそれを使用するであろう。その免疫抑制作用は、γインターフェロンにより強化されるため、その組み合わせは危険である可能性がある。TNFとインターフェロンαとのハイブリッドも、抗癌活性を保有することが見出されている。
【０１０９】
癌の処置における本明細書に記載された方法による性ホルモンの使用。本明細書に記載された方法は、特定の癌の処置に限定されないが、このホルモンの使用は、乳癌、前立腺癌、ならびに子宮内膜（子宮の裏打ち）の癌に関して利益を有する。これらのホルモンの例は、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲステロン、およびアンドロゲンである。
【０１１０】
コルチコステロイドホルモンは、いくつかの型の癌（リンパ腫、白血病、および多発性骨髄腫）の処置において有用である。コルチコステロイドホルモンは、他の化学療法剤の有効性を増加させることができ、従って、組み合わせ処置において使用されることが多い。プレドニゾンおよびデキサメタゾンが、コルチコステロイドホルモンの例である。
【０１１１】
D. 放射線療法
放射線治療とも呼ばれる放射線療法は、電離放射線による癌およびその他の疾患の処置である。電離放射線は、遺伝材料に傷害を与えることにより、処置される区域において細胞に損傷を与えるかまたは細胞を破壊するエネルギーを与え、これらの細胞が増殖し続けることを不可能にする。放射線は、癌細胞および正常細胞の両方に傷害を与えるが、後者は、自己を修復し適切に機能することが可能である。放射線療法は、皮膚、舌、喉頭、脳、乳房、または頚部の癌のような限局性固形腫瘍を処置するために使用され得る。それは、白血病およびリンパ腫（それぞれ、血液形成細胞およびリンパ系の癌）を処置するためにも使用され得る。
【０１１２】
本発明に従って使用される放射線治療には、γ線、X線の使用、および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の局部（directed）送達が含まれ得るが、これらに限定されない。マイクロ波およびUV照射のような他の型のDNA傷害因子も企図される。これらの因子は、全て、DNA、DNAの前駆物質、DNAの複製および修復、ならびに染色体の組み立ておよび維持に対して広範囲の傷害をもたらす可能性が最も高い。X線の線量範囲は、長期（3〜4週間）の場合の50〜200レントゲンの一日線量から、2000〜6000レントゲンの一回線量までの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は、広く変動し、同位体の半減期、放射される放射線の強度および型、ならびに腫瘍性細胞による取り込みに依る。
【０１１３】
放射線療法は、放射線の線量を癌部位に直接送達するための、放射標識された抗体の使用（放射免疫療法）を含み得る。抗体は、抗原（免疫系により外来として認識される物質）の存在に応答して身体により作成される高度に特異的なタンパク質である。いくつかの腫瘍細胞は、腫瘍特異的な抗体の産生を誘発する特異抗原を含有している。実験室においてこれらの抗体を大量に作成し、放射性物質に付着させることができる（放射標識として公知の過程）。体内に注入されると、抗体は能動的に癌細胞を捜し出し、癌細胞は、放射線の細胞死滅（細胞障害）作用により破壊される。このアプローチは、放射線による正常細胞への傷害のリスクを最小限に抑えることができる。
【０１１４】
原体照射は、通常の放射線療法処置と同一の放射線療法装置、リニアアクセラレーターを使用するが、癌の形に一致するよう形を改変させるために、X線ビームの軌道に金属ブロックが置かれる。これは、より高い放射線量が腫瘍に与えられることを確実にする。健康な周辺細胞および近傍の構造は、より低い放射線量を受容するため、副作用の可能性が低下する。マルチリーフコリメーターと呼ばれる装置が開発されており、金属ブロックの代替物として使用され得る。マルチリーフコリメーターは、リニアアクセラレーターに固定された多数の金属板からなる。金属ブロックの必要なしに、放射線療法ビームが処置区域に合わせてシェーピングされるよう、各層を調整することができる。放射線療法装置の正確なポジショニングは、原体照射処置にとって極めて重要であり、各処置の開始時に内臓の位置をチェックするため、特別のスキャニング装置が使用され得る。
【０１１５】
高分解能強度変調放射線療法も、マルチリーフコリメーターを使用する。この処置においては、処置が与えられる間、マルチリーフコリメーターの層が移動する。この方法は、処置ビームのより正確なシェーピングを達成する可能性が高く、放射線療法の線量が処置区域全体で一定となることを可能にする。
【０１１６】
原体照射および強度変調放射線療法は、放射線療法処置の副作用を低下させ得ることを調査研究は示しているが、処置区域の極めて正確なシェーピングにより、処置区域の直ぐ外側の微視的な癌細胞は破壊されなくなる可能性がある。これは、これらの専門的な放射線療法技術では、将来の癌再発のリスクが、より高くなり得ることを意味する。定位放射線治療は、脳腫瘍を処置するために使用される。この技術は、多くの異なる角度から放射線療法を差し向けるため、腫瘍に到達する線量が極めて高く、周辺の健康な組織に影響を与える線量が極めて低い。処置の前に、放射線療法が正確にターゲティングされることを確実にするため、いくつかのスキャンがコンピューターにより分析され、患者の頭部は放射線療法を受容する間、特別に作成されたフレームで固定される。数回の線量が与えられる。
【０１１７】
脳腫瘍およびその他の腫瘍のための定位放射線手術（ガンマナイフ）は、ナイフではなく、数百の異なる角度から極めて正確にターゲティングされたガンマ放射線療法のビームを使用する。約4〜5時間かかるが、1回の放射線療法セッションのみが必要とされる。この処置のためには、特別に作成された金属フレームを、頭部に取り付ける。次いで、処置が必要な正確な区域を見出すため、数回のスキャンおよびX線を実施する。脳腫瘍のための放射線療法においては、患者は、放射線療法ビームが通過できるようにするための数百の孔を有する大きいヘルメットを頭部に装着して横たわる。関連アプローチは、身体のその他の区域の腫瘍の処置のためのポジショニングを可能にする。
【０１１８】
科学者は、放射線治療の有効性を増加させるための手段も探究している。二つの型の治験薬が、放射線を受ける細胞に対する効果について研究中である。放射線増感剤は、腫瘍細胞が傷害を受ける可能性を高くし、放射線防御剤は、放射線の効果から正常組織を防御する。温熱療法（熱の使用）も、放射線に対して組織を感作するための有効性について研究中である。
【０１１９】
E. 組み合わせ治療
上記の治療のうちの任意のものが、癌細胞の死滅、癌細胞増殖の阻害、転移の阻害、血管形成の阻害を増加させるため、またはその他の方式で腫瘍細胞の悪性表現型の逆転もしくは低下を改善するため、IGF-1R治療と組み合わせられ得る。これらの組成物は、細胞を死滅させるかまたは細胞の増殖を阻害するのに有効な組み合わせ量で提供されるであろう。この過程は、細胞を、発現構築物および薬剤または因子と、同時に接触させることを含み得る。これは、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤と細胞を接触させることにより達成されてもよいし、または二つの別個の組成物または製剤（ここで、一方の組成物は発現構築物を含み、もう一方は薬剤を含む）と細胞を同時に接触させることにより、達成されてもよい。
【０１２０】
あるいは、遺伝子治療処置は、数分から数週間までの範囲の間隔で、もう一方の薬剤処置に先行するかまたは後続してもよい。薬剤が細胞に別々に適用される態様においては、一般に、有利に組み合わせられた効果を薬剤が細胞に対して発揮することができるよう、各送達の時点を著しく空けないことが確実にされるであろう。そのような場合、細胞を両モダリティと、相互の約12〜24時間以内、より好ましくは相互の約6〜12時間以内に接触させることが企図され、約12時間のみの遅延時間が最も好ましい。しかしながら、いくつかの情況においては、処置のための期間を著しく延ばし、それぞれの投与の間に数日（2日、3日、4日、5日、6日、または7日）〜数週間（1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間）を経過させることが望ましいかもしれない。
【０１２１】
いずれかの薬剤の複数回の投与が望まれることも考えられる。以下に例示されるような様々な組み合わせが利用され得る（ここで、IGF-1R治療が「A」であり、もう一方の薬剤が「B」である）：
2012500631.tif 000002
その他の組み合わせも企図される。この場合にも、細胞死滅を達成するため、両方の薬剤は、細胞を死滅させるのに有効な組み合わせ量で細胞に送達される。
【実施例】
【０１２２】
VI. 実施例
以下の実施例は、本発明の様々な局面をさらに例示するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施においてよく機能することが本発明者らにより発見された技術および／または組成物を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられることが、当業者により認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示された具体的な態様に多くの変化を加えても、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を入手することが可能であることを認識するべきである。
【０１２３】
実施例1−材料および方法
患者集団
コホートは、ステージI〜IIIの切除可能なNSCLCを有すると体系的に診断された、連続する85人の患者からなり、その腫瘍をMedical University of Gdansk（Poland）の組織バンクに収集した。患者の大半が、男性であり、扁平細胞組織像を有し、喫煙者であり、60歳を超えていた（表1）。原発腫瘍を手術時に新鮮凍結させ、-80℃で保管した。
【０１２４】
（表１）患者の特徴
2012500631.tif 000003
【０１２５】
細胞培養、薬物、およびMTTアッセイ、およびトランスフェクション
細胞株の培養およびMTTアッセイ（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドアッセイ）を以前に記載されたように実施した。簡単に説明すると、これらの組織像の15のNSCLC細胞株を使用した：扁平上皮癌、大細胞型腺癌、および細気管支肺胞上皮癌。細胞株を、2時間、IGF-1R TKIシクロリグナンであるピクロポドフィリン（PPP）により処理し、4日間のインキュベーション後にMTTにより分析した。
【０１２６】
RNA、プライマー、および定量的リアルタイムRT-PCR
RNAeasyキット（Qiagen）を使用して、NSCLC細胞株および患者の新鮮凍結腫瘍から、全RNAを調製した。AffinityScript（商標）QPCR cDNA Synthesis Kit（Stratagene, La Jolla, CA）を使用して、1μgの各試料からcDNAを転写した。定量的リアルタイムPCRを、Brilliant（登録商標）SYBR（登録商標）Green QPCR Core Reagent Kit（Stratagene）を使用して、1/20のcDNA反応物で実施した。増幅データをGENEAMP 5700 SDSソフトウェアを使用することにより分析し、設定されたサイクル閾値（Ct値）でサイクル数に変換し、標準に対して相対的に定量化した。20ng、4ng、0.8ng、0.16ngのヒト成人肺RNA（Clontech Lab. Inc）を、全ての実験において、標準として使用した。インプットcDNAの量を規準化するため、作成された産物の定量化された相対量を、βアクチンについて作成された量で割った。サイクリング条件は、50℃10秒および95℃10分、続いて、95℃15秒および60℃1分の46サイクルであった。全ての試料を、トリプリケートで実施した。以下のプライマーを使用した。E-カドヘリンについては、（順方向）
2012500631.tif 000004
、（逆方向）
2012500631.tif 000005
；ErbB3については、（順方向）
2012500631.tif 000006
、（逆方向）
2012500631.tif 000007
；EGFRについては、（順方向）
2012500631.tif 000008
、（逆方向）
2012500631.tif 000009
；サバイビンおよびβアクチンについては、（順方向）
2012500631.tif 000010
、（逆方向）
2012500631.tif 000011
；IGF1Rについては、（順方向）
2012500631.tif 000012
、（逆方向）
2012500631.tif 000013
；サバイビンについては、（順方向）
2012500631.tif 000014
、（逆方向）
2012500631.tif 000015
。
【０１２７】
実施例2−結果
NSCLCを有する患者、およびSCCを有する患者のサブセットにおける、IGF-1RとサバイビンとE-カドヘリンとErbB3との間の相関
上に示された実験プロトコルに従って、NSCLCを有する患者85人において、IGF-1Rとサバイビンとの間、IGF-1RとE-カドヘリンとの間、およびIGF-1RとErbB3との間に、有意な相関が検出された（それぞれ、r＝.28、p＝0.008；r＝.47、p＜0.001；r＝.35、p＝.001）（表2）。
【０１２８】
（表２）相関
2012500631.tif 000016
【０１２９】
表2は、r値（各ボックス内の上の数字）、p値（各ボックス内の中央の値）、および患者の数（下の数字）を示す。
【０１３０】
本発明者らは、次に、他の組織像を有する患者と比較して、SCC組織像を有する患者におけるサバイビンの発現を検査した。SCC組織像は、サバイビンおよびIGF-1R発現と有意に関連していることが見出された（それぞれ、p＝0.033、p＝0.007）。
【０１３１】
肺癌細胞系におけるサバイビンとPPPの活性との間の相関
15の肺癌株において、サバイビンの発現は、IGF-1R TKIであるPPPの活性と相関した（r＝0.81、p＜0.001）。
【０１３２】
本明細書に開示され特許請求の範囲に記載された組成物および／または方法は、全て、本開示を考慮して過度の実験なしに作成され実行され得る。本発明の組成物および方法は特定の態様に関して記載されたが、本発明の概念、本旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法の工程において、または方法の工程の順序において、組成物および／または方法に変化が適用され得ることは当業者に明白であろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連しているある種の薬剤が、本明細書に記載された薬剤の代わりに用いられても、同一または類似の結果が達成され得ることが明白であろう。当業者に明白なそのような類似の置換物および修飾は、全て、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の本旨、範囲、および概念に含まれると見なされる。
【０１３３】
VII. 参照
以下の参照は、本明細書に示されたものを補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供するという程度に、参照により具体的に本明細書に組み入れられる：
2012500631.tif 000017
2012500631.tif 000018
2012500631.tif 000019
【図１】
2012500631.tif 000020
【図２Ａ】
2012500631.tif 000021
【図２Ｂ】
2012500631.tif 000022
【図３】
2012500631.tif 000023
【配列表】
2012500631000001.app