(57)【要約】  本発明は、シデロフォア仲介性鉄取り込み、例えばスタフィロフェリン仲介性鉄取り込みを阻害することを含む、黄色ブドウ球菌を阻害する方法に関する。黄色ブドウ球菌を阻害するこのような方法は、スタフィロフェリンＡ及びＢの発現若しくは活性を阻害することによる又はスタフィロフェリンＡ及びＢの輸送を阻害することによる、スタフィロフェリンＡ及びスタフィロフェリンＢ仲介性取り込みの阻害を含む。提供される方法は黄色ブドウ球菌感染を治療するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）においてスタフィロフェリン仲介性鉄取り込みを阻害するステップを含む、黄色ブドウ球菌を抑制する方法。
【請求項２】
スタフィロフェリンＡ仲介性鉄取り込み及びスタフィロフェリンＢ仲介性鉄取り込みを阻害する、請求項１で定義される方法。
【請求項３】
スタフィロフェリンＡの産生を阻害し、且つスタフィロフェリンＢの産生を阻害する、請求項２で定義される方法。
【請求項４】
スタフィロフェリンＡ産生のために必要なＳｂｔポリペプチドの発現又は活性を阻害し、且つスタフィロフェリンＢ産生のために必要なＳｂｎポリペプチドの発現又は活性を阻害する、請求項３で定義される方法。
【請求項５】
ＳｂｔＡ、ＳｂｔＢ、ＳｂｔＣ及びＳｂｔＤの少なくとも１つの発現又は活性を阻害し、且つＳｂｎＡ、ＳｂｎＢ、ＳｂｎＣ、ＳｂｎＤ、ＳｂｎＥ、ＳｂｎＦ、ＳｂｎＧ、ＳｂｎＨ及びＳｂｎＩの少なくとも１つの発現又は活性を阻害する、請求項４で定義される方法。
【請求項６】
スタフィロフェリンＡの輸送を阻害し、且つスタフィロフェリンＢの輸送を阻害する、請求項２で定義される方法。
【請求項７】
Ｈｔｓ輸送系を阻害し、且つＳｉｒ輸送系を阻害する、請求項６で定義される方法。
【請求項８】
スタフィロフェリンＡの輸送のために必要なＨｔｓポリペプチドの発現又は活性を阻害し、且つスタフィロフェリンＢの輸送のために必要なＳｉｒポリペプチドの発現又は活性を阻害する、請求項７で定義される方法。
【請求項９】
ＨｔｓＡ、ＨｔｓＢ及びＨｔｓＣの少なくとも１つの発現又は活性を阻害し、且つＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣの少なくとも１つの発現又は活性を阻害する、請求項８で定義される方法。
【請求項１０】
ＦｈｕＣを阻害する、請求項６で定義される方法。
【請求項１１】
Ｓｂｔポリペプチドを、スタフィロフェリン生成物を生成するのに適した条件下で前記ポリペプチドに対する基質と混合するステップを含む、スタフィロフェリンＢを作製する方法。
【請求項１２】
前記Ｓｂｔポリペプチドがシンテターゼである、請求項１１で定義される方法。
【請求項１３】
前記ＳｂｔポリペプチドがＳｂｔＢ及びＳｂｔＤであり、前記基質がクエン酸及びＤ−オルニチンである、請求項１２で定義される方法。
【請求項１４】
Ｓｂｎポリペプチドを、スタフィロフェリンを生成するのに適した条件下で前記ポリペプチドに対する基質と混合するステップを含む、スタフィロフェリンＢを作製する方法。
【請求項１５】
前記Ｓｂｎポリペプチドがシンテターゼ及びデカルボキシラーゼである、請求項１４で定義される方法。
【請求項１６】
前記ＳｂｎポリペプチドがＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ、ＳｂｎＦ及びＳｂｎＨであり、前記基質がＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸、クエン酸及びα−ケトグルタル酸である、請求項１５で定義される方法。
【請求項１７】
ＳｂｔＡ、ＳｂｔＢ、ＳｂｔＣ及びＳｂｔＤの少なくとも１つの発現又は活性を阻害するステップを含む、黄色ブドウ球菌においてスタフィロフェリンＡ仲介性鉄取り込みを阻害する方法。
【請求項１８】
ＨｔｓＡ、ＨｔｓＢ及びＨｔｓＣの少なくとも１つの発現又は活性を阻害するステップを含む、黄色ブドウ球菌においてスタフィロフェリンＡ仲介性鉄取り込みを阻害する方法。
【請求項１９】
スタフィロフェリンＡの生産のために必要なＳｂｔポリペプチドの発現若しくは活性を阻害する又はスタフィロフェリンＡの輸送のために必要なＨｔｓポリペプチドの発現若しくは活性を阻害するステップと、スタフィロフェリンＢ産生のために必要なＳｂｎポリペプチドの発現若しくは活性を阻害する又はスタフィロフェリンＢの輸送のために必要なＳｉｒポリペプチドの発現若しくは活性を阻害するステップとを含む、請求項２で定義される方法。
【請求項２０】
ＨｔｓＡのリガンド結合領域を破壊することを含む、スタフィロフェリンＡ仲介性鉄取り込みを阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染性細菌における鉄取り込み経路、特に、このような細菌を抑制するためにシデロフォア仲介性鉄取り込み経路を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんど例外なく、鉄はすべての微生物にとっての必須栄養素である。生理的条件下では、鉄は主として不溶性の水酸化第二鉄（Ｆｅ３＋）として存在し、典型的には動物の体液を介した輸送と貯蔵のためにタンパク質と錯体を形成する。細胞内の鉄は、系統発生的に遍在性のクラスの球状鉄貯蔵タンパク質であるフェリチン、及びヘム結合タンパク質によって担持されるが、血清鉄は糖タンパク質、主にトランスフェリンによって結合される。低鉄血症として知られる、鉄捕捉亢進は、侵入病原体にとっての鉄利用能をさらに制限する自然免疫応答の一面である。これは、鉄含有糖タンパク質（ｆｅｒｒａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）のエンドサイトーシス、肝臓に局在するフェリチンの上昇、及び細網内皮系による細胞外環境への鉄放出の制限から起こる。その低い溶解度と厳密な囲い込みのために、ヒト組織における遊離鉄は微生物の生活を維持するために必要な閾値をはるかに下回る約１０−１８Ｍと推定され、鉄の獲得は全身感染の病原因子が直面する主要な課題となっている。
【０００３】
数多くの細菌、真菌及び植物は、低分子量で高親和性の鉄キレート物質、シデロフォアを分泌することによって鉄の制限を克服する。哺乳動物血清では、これらは宿主の鉄に関してトランスフェリンと競合し得る。鉄含有シデロフォアは対応する細胞表面受容体タンパク質によって認識され、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体により細胞質ゾル膜を通して輸送される。シデロフォア仲介性鉄取り込みは、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、敗血症大腸菌（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含む、多くのグラム陽性及びグラム陰性細菌病原体の病原性に有意に寄与する。
【０００４】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、共生生物並びにヒト及びウシを含むいくつかの哺乳動物種の病原体である。ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ及びラクダにおいて感染を引き起こす黄色ブドウ球菌分離株が報告されている。感染がヒトから他の動物に及びその逆にも伝播する人獣共通感染性の黄色ブドウ球菌分離株も報告されている。
【０００５】
黄色ブドウ球菌はヒト粘膜及び表皮表面にコロニーを形成する生物（ｃｏｌｏｎｉｓｔ）であり、外科的創傷及び移植医療装置の高頻度日和見病原体である。黄色ブドウ球菌は、アドヘシン、プロテアーゼ、ライシン及びスーパー抗原を含む多種多様な病原性因子を発現し、その多くは溶血などのプロセスを介して鉄利用能を改善するように働く。血液及び軟組織を介した全身播種は、急速な細菌増殖と組織破壊によって特徴づけられ、敗血症、心内膜炎及び壊死性肺炎を含む症候群として現れる。広範囲のブドウ球菌病原因子の協調発現は、鉄取り込み調節因子、Ｆｕｒによって仲介される現象である、鉄制限により誘導される。このＤＮＡ結合タンパク質は、Ｆｅ２＋を阻害補因子として認識する。可溶性鉄のレベル低下は、鉄応答性レギュロンのオペレーター領域内のＦｕｒボックスからのＦｕｒの解離及び転写の阻害を導く。
【０００６】
黄色ブドウ球菌は、軽度の皮膚病変、膿痂疹及び食中毒から、敗血症、心内膜炎、骨髄炎、肺炎、菌血症及びトキシックショック症候群などのより重篤な疾患に及ぶ広範囲の感染を引き起こす一般的なヒト病原体である。当初は、最悪の黄色ブドウ球菌感染でさえもペニシリンを使用して治療することができた。しかし、黄色ブドウ球菌のペニシリン耐性株が出現したことで、黄色ブドウ球菌感染を治療する上でのペニシリンの有効性は低下し、今日、院内感染で遭遇する黄色ブドウ球菌の大部分の株はペニシリンに応答しない。
【０００７】
１９６０年代に導入されたメチシリンは、黄色ブドウ球菌のペニシリン耐性という問題を概ね克服した。しかし、バンコマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド及びリンコサミドを含む、黄色ブドウ球菌に対して有効な多くの他の抗生物質に対する耐性と共に、メチシリン耐性がこの生物において出現した。実際に、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株は一般に多剤耐性である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は世界中で最も重要な院内病原体の１つとなり、深刻な感染コントロール上の問題を突き付けている。黄色ブドウ球菌感染の薬剤耐性は重大な治療上の困難さを課しているが、新しい治療薬が開発されない限りこれはさらに悪化すると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、黄色ブドウ球菌における必須の鉄取り込み経路についてのより十分な理解に基づく、黄色ブドウ球菌感染を治療する新規方法を開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
現在では、黄色ブドウ球菌のシデロフォア仲介性鉄取り込みに関与する遺伝子及びタンパク質が決定され、黄色ブドウ球菌感染を治療する新規方法の提供のために有用である。
【００１０】
従って、本発明の１つの態様では、スタフィロフェリン仲介性鉄取り込みを阻害することを含む、黄色ブドウ球菌を阻害する方法が提供される。
【００１１】
本発明のもう１つの態様では、機能性スタフィロフェリンを生成するためにＳｂｎ／Ｓｂｔポリペプチドをスタフィロフェリン産生基質と共にインキュベートすることを含む、スタフィロフェリンＡ及びスタフィロフェリンＢを包含するスタフィロフェリンを作製する方法が提供される。
【００１２】
本発明のこれらや他の態様を、以下の図面を参照して下記の詳細な説明で述べる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、血清中の黄色ブドウ球菌ｓｂｎオペロン欠失株の増殖低下をグラフで示し、挿入図は、ＦｅＣｌ３を添加した血清中での欠失株の増殖をグラフで示す。
【図２】図２は、鉄の存在下と不在下での野生型黄色ブドウ球菌（黒い棒）及び黄色ブドウ球菌ｓｂｎオペロン欠失株（灰色の棒）におけるシデロフォア産生を比較する棒グラフである。
【図３】図３は、Ｎｅｗｍａｎ株の配列決定された染色体からの遺伝子座番号を含む、黄色ブドウ球菌染色体のｓｂｔ−ｈｔｓ領域の概略図である。
【図４】図４は、推定上のＦｕｒボックス配列、ｓｂｔＡ、ｓｂｔＢ及びｈｔｓＡ遺伝子についての開始コドン（太字）並びにシャイン−ダルガーノ配列（Ｓ．Ｄ．）を同定する、ｓｂｔＡコード領域とｓｂｔＢＣＤコード領域の間の遺伝子間領域（Ａ）及びｓｂｔＤコード領域とｈｔｓＡＢＣコード領域の間の遺伝子間領域（Ｂ）を示す。
【図５】図５は、ｓｂｔ−ｈｔｓ遺伝子座、すなわちｓｂｔＡ（白い棒）、ｓｂｔＢ（灰色の棒）及びｈｔｓＡ（黒い棒）の転写が鉄及びＦｕｒによって調節されることを示す棒グラフである。
【図６】図６は、血清中の野生型黄色ブドウ球菌（●）、黄色ブドウ球菌ｓｂｔオペロン欠失株（ΔｓｂｔＡＢＣＤ：：Ｔｅｔ）（Δ）及び黄色ブドウ球菌タンデムｓｂｎ／ｓｂｔ遺伝子座突然変異株（ΔｓｂｎＡＢＣＤＥＦＧＨＩ：：Ｔｅｔ  ΔｓｂｔＡＢＣＤ：：Ｋａｎ）（○）の増殖を比較するグラフであり、挿入図は、ＦｅＣｌ３を添加した血清中でのタンデム欠失株の増殖をグラフで示す。
【図７】図７は、鉄の存在下と不在下での野生型黄色ブドウ球菌（黒い棒）と黄色ブドウ球菌ｓｂｔオペロン欠失株（灰色の棒）及び黄色ブドウ球菌タンデムｓｂｎ／ｓｂｔ遺伝子座突然変異株（白い棒）におけるシデロフォア産生を比較する棒グラフである。
【図８】図８は、黄色ブドウ球菌野生型（●）、ｓｉｒＡ：：Ｋｍ（□）、ΔｈｔｓＡＢＣ（△）及びタンデムｓｉｒＡ／ｈｔｓＡＢＣ（○）の増殖へのＡＢＣ輸送体遺伝子不活性化の作用をグラフで示す。
【図９】図９は、空クローニングベクター（ｐＬＩ５０）（Ａ）、黄色ブドウ球菌からのｓｂｔＡＢＣＤを含むプラスミド（ｐＥＶ９０）（Ｂ）及び表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からのｓｂｔＡＢＣＤを含むプラスミド（ｐＥＶ９５）（Ｃ）で形質転換した黄色ブドウ球菌野生型（●）、△ｓｂｎＡＢＣＤＥＦＧＨＩ：：Ｔｅｔ（□）、△ｓｂｔＡＢＣＤ：：Ｋｍ（△）及びタンデム△ｓｂｎ／△ｓｂｔ（○）の血清中での増殖をグラフで示す。
【図１０】図１０は、ヘムの不在下（Ａ）及びヘムに暴露した場合（Ｂ）の精製ＩｓｄＥ、ＨｔｓＡ及びＳｉｒＡタンパク質の吸収スペクトルを示す。
【図１１】図１１は、プロリン及び鉄の不在下と存在下での黄色ブドウ球菌野生型及びｓｂｎＢ突然変異株の細菌増殖を比較する棒グラフである。
【図１２】図１２は、ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰＡ）、Ｆｅ及びＳｂの不在下と存在下での黄色ブドウ球菌野生型、ｓｂｎＢ突然変異株及びｓｂｎＢを含むプラスミドを含むｓｂｎＢ突然変異株の細菌増殖を比較する棒グラフである。
【図１３】図１３は、Ａ型（斜線）、Ｂ型（黒ベタ）及びＣ型（垂直線）ＮＩＳシンテターゼ及びデカルボキシラーゼ（点線）を同定する黄色ブドウ球菌ｓｉｒ−ｓｂｎ遺伝子座の物理的地図、並びにスタフィロフェリンＢの構造（Ｂ）を示す。
【図１４】図１４は、鉄の存在下での増殖と同等のレベルに達する、インビトロで合成したスタフィロフェリンＢ（ＳＢ）の漸増量の存在下での鉄欠乏黄色ブドウ球菌△ｓｂｎ／△ｓｂｔ突然変異株の細菌増殖をグラフで示し（Ａ）；そして、鉄の存在下と不在下、及び鉄なしにスタフィロフェリンＢの存在下での△ｓｆａ△ｓｂｎ突然変異株の細菌増殖をグラフで比較する（Ｂ）。
【図１５】図１５は、カルボン酸基質、クエン酸塩（Ａ）、シトリル−Ｄａｐ（Ｂ）、シトリル−Ｄａｅ（Ｃ）及びα−ＫＧ（Ｄ）に対するＳｂｎ酵素の基質特異性を示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、スタフィロフェリンＢの生合成のための提案スキームを示す。
【図１７】図１７は、スタフィロフェリンＡの構造を示す。
【図１８】図１８は、インビトロで合成したスタフィロフェリンＡの存在下での、野生型黄色ブドウ球菌（Ａ）及びＳｉｒＡ突然変異株（Ｂ）の増殖、並びにＨｔｓ（Ｃ）及びＨｔｓＳｉｒ突然変異株（Ｄ）が増殖しないことを示す棒グラフである。
【図１９】図１９は、スタフィロフェリンＡの生合成のための提案スキームを示す。
【図２０】図２０は、結合領域内の残基（Ｂ）を含む、スタフィロフェリンＡ結合領域（ボックス４）を同定するＨｔｓＡ結晶構造の概略図（Ａ）及びスタフィロフェリンＢ結合領域（ボックス）を同定するＳｉｒＡ結晶構造の概略図（Ｃ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
シデロフォア仲介性鉄取り込み、例えばスタフィロフェリン仲介性鉄取り込みを阻害することを含む、黄色ブドウ球菌を抑制する方法が提供される。
【００１５】
シデロフォア仲介性鉄取り込みは、シデロフォアの生合成及び／又はシデロフォアの取り込み又は輸送を包含する。シデロフォア生合成及び取り込みの２つの経路が現在同定されている。１つの経路では、シデロフォア、スタフィロフェリンＡがＳｂｔポリペプチドによって産生され、Ｈｔｓポリペプチドによって細胞取り込みのために輸送される。もう１つの経路では、シデロフォア、スタフィロフェリンＢがＳｂｎポリペプチドによって産生され、Ｓｉｒポリペプチドによって細胞取り込みのために輸送される。
【００１６】
「スタフィロフェリンＡ」及び「スタフィロフェリンＢ」という用語は、高親和性α−ヒドロキシカルボキシレート鉄キレート化合物、又は、鉄（一般に第二鉄（Ｆｅ３＋）イオンの形態）に結合する黄色ブドウ球菌のシデロフォアを指す。スタフィロフェリンＡの構造を図１７に示し、スタフィロフェリンＢの構造を図１６に示す。
【００１７】
スタフィロフェリンＡは、本明細書では「ｓｂｔ」又は「ｓｆｎａ」遺伝子クラスターと称する遺伝子クラスターから発現されるＳｂｔポリペプチドによって産生され、ｈｔｓ遺伝子から発現されるＨｔｓＡＢＣポリペプチドによって細胞内に輸送される。
【００１８】
「ｓｂｔ」又は「ｓｆａ」遺伝子クラスターは、共通の染色体遺伝子座から単離された、スタフィロフェリンＡの生合成に関与するポリペプチドｓｂｔＡ、ｓｂｔＢ、ｓｂｔＣ及びｓｂｔＤをそれぞれコードする黄色ブドウ球菌遺伝子、すなわちｓｂｔＡ、ｓｂｔＢ、ｓｂｔＣ及びｓｂｔＤの群を指す。１つの実施形態では、ＳｂｔＢ及びＳｂｔＤはＮＩＳ（ＮＲＰＳ非依存性シデロフォア）シンテターゼであり、ＳｂｔＣはアミノ酸ラセマーゼであり、ＳｂｔＡは膜包埋シデロフォア流出タンパク質である。ｓｂｔ遺伝子の例示的なヌクレオチド配列及び対応してコードされるＳｂｔポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９３５１又はＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＣ＿００９６４１において遺伝子座ＮＷＭＮ＿２０７９、ＮＷＭＮ＿２０８０、ＮＷＭＮ＿２０８１及びＮＷＭＮ＿２０８２で見出される。Ｓｂｔポリペプチドの例示的なアミノ酸配列も、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤアクセッション番号ＢＡＦ６８３５１、ＢＡＦ６８３５２、ＢＡＦ６８３５３及びＢＡＦ６８３５４に認められる。
【００１９】
スタフィロフェリンＡは、その天然環境の外で、例えば組換えにより、それを内因性に発現しない細菌において並びに無細胞条件下で合成され得ると決定された。そこで、１つの実施形態では、ｓｂｔ遺伝子を、確立された技術を用いて選択細菌細胞にトランスフェクトし、発現のために、例えばＳｂｔ基質（例えばクエン酸、Ｄ−オルニチン）及び補因子（ＡＴＰ及びＭｇ２＋）を含む培地でインキュベートして、機能性スタフィロフェリンＡを生成し得る。もう１つの実施形態では、ＳｂｔＡ、ＳｂｔＢ、ＳｂｔＣ及びＳｂｔＤを含むＳｂｔポリペプチドを、例えば、クエン酸及びＤ−オルニチンなどのカルボン酸基質を含む、細胞の基本的機能生化学を模倣するように設計された条件下で無細胞環境においてインキュベートし、機能性スタフィロフェリンＡを生成し得る。さらなる実施形態では、ＳｂｔＢ及びＳｂｔＤなどのＳｂｔシンテターゼを単独で、クエン酸及びＤ−オルニチンなどのカルボン酸基質の存在下でインキュベートして、機能性スタフィロフェリンＡを生成し得る。Ｄ−オルニチンをＬ−オルニチンに置き換えた場合は、Ｄ−ラセミ化合物に変換するためにＳｂｔＣを添加し得る。これに関して、ｓｂｔ遺伝子又はＳｂｔペプチドは、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、Ｓ．ヘモリチカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）及びＳ．サプロフィチカス（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）のいずれか１つに由来し得るか、又はこれらの由来の組合せに由来し得る。
【００２０】
ＨｔｓＡＢＣ輸送体は、共通のプロモーターを有するｈｔｓＡ、ｈｔｓＢ及びｈｔｓＣを含む細菌遺伝子の群を包含する「ｈｔｓオペロン」によってコードされる。このオペロンは、ＡＢＣ輸送体としても知られる、鉄含有シデロフォア、すなわちスタフィロフェリンＡを黄色ブドウ球菌細胞に輸送する機能を果たすタンパク質系をコードする。ｈｔｓＡコード領域の上流にあるプロモーターエレメントは、Ｆｕｒタンパク質を介して鉄調節される。ｈｔｓＡ遺伝子はヘム又はシデロフォア結合タンパク質（ＨｔｓＡ）をコードし、ｈｔｓＢ及びｈｔｓＣはＡＢＣ輸送体の膜貫通成分（ＨｔｓＢ／Ｃ）をコードする。ｈｔｓ遺伝子の例示的なヌクレオチド配列及び対応してコードされるＨｔｓポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９３５１又はＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＣ＿００９６４１において遺伝子座ＮＷＭＮ＿２０７６、ＮＷＭＮ＿２０７７及びＮＷＭＮ＿２０７８で見出される。Ｈｔｓポリペプチドの例示的なアミノ酸配列も、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤアクセッション番号ＢＡＦ６８３４８、ＢＡＦ６８３４９及びＢＡＦ６８３５０で認められる。ｈｔｓによってコードされるシデロフォア輸送系は、以下で述べるようにＦｈｕＣ−ＡＴＰアーゼと相互作用する。
【００２１】
Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸、クエン酸、エチレンジアミン及びα−ケトグルタル酸から成るα−ヒドロキシカルボキシレートシデロフォアであるシデロフォア、スタフィロフェリンＢ（以前はスタフィロバクチンとも称された）は、「ｓｂｎ」遺伝子クラスターと称される遺伝子クラスターによって産生される。鉄含有スタフィロフェリンＢは、ＳｉｒＡＢＣ輸送体系を介して生物中に輸送される。
【００２２】
「ｓｂｎ」遺伝子クラスターは、共通のプロモーターを有する黄色ブドウ球菌遺伝子、すなわちｓｂｎＡ、ｓｂｎＢ、ｓｂｎＣ、ｓｂｎＤ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＦ、ｓｂｎＧ、ｓｂｎＨ及びｓｂｎｌの群を指す。ｓｂｎＡコード領域の上流にあるプロモーターエレメントは鉄により調節される。ｓｂｎ遺伝子の例示的なヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２５１０２２に見出される。ｓｂｎ遺伝子は、スタフィロフェリンＢの合成に関与するポリペプチド「ＳｂｎＡ」、「ＳｂｎＢ」、「ＳｂｎＣ」、「ＳｂｎＤ」、「ＳｂｎＥ」、「ＳｂｎＦ」、「ＳｂｎＧ」、「ＳｂｎＨ」及び「Ｓｂｎｌ」をそれぞれコードする。これらのポリペプチドについての配列情報は、国際公開広報第ＷＯ０６／０４３１８２号に見出され得る。従って、１つの実施形態では、ｓｂｎＡはシステインシンターゼをコードし、ｓｂｎＢはオルニチンシクロデアミナーゼをコードし、ｓｂｎＣは生合成タンパク質をコードし、ｓｂｎＤは流出タンパク質をコードし、ｓｂｎＥはシデロフォア生合成タンパク質をコードし、ｓｂｎＦはシデロフォア生合成タンパク質をコードし、ｓｂｎＧはアルドラーゼタンパク質をコードし、そしてｓｂｎＨはアミノ酸デカルボキシラーゼをコードする。
【００２３】
スタフィロフェリンＢは、その天然環境の外で、例えば組換えによりそれを内因性に発現しない細菌において並びに無細胞条件下で合成され得ると決定された。そこで、１つの実施形態では、ｓｂｎ遺伝子を、確立された技術を用いて選択細菌細胞にトランスフェクトし、発現のためにＳｂｎ基質（例えばクエン酸塩、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸、α−ケトグルタル酸塩、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋）を含む培地でインキュベートして、機能性スタフィロフェリンＢを生成し得る。もう１つの実施形態では、ＳｂｎＡ、ＳｂｎＢ、ＳｂｎＣ、ＳｂｎＤ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＦ、ｓｂｎＧ、ｓｂｎＨ及びｓｂｎＩを含むＳｂｎポリペプチドを、細胞の基本的機能生化学を模倣するように設計された条件下で無細胞環境において適切なＳｂｎ基質と共にインキュベートし、機能性スタフィロフェリンを生成し得る。さらなる実施形態では、ＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ及びＳｂｎＦなどのＳｂｎシンテターゼ、並びにＳｂｎＨなどのデカルボキシラーゼを単独で、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸、クエン酸及びα−ケトグルタル酸などの基質の存在下でインキュベートして、機能性スタフィロフェリンＢを生成し得る。
【００２４】
ＳｉｒＡＢＣ輸送体は、共通のプロモーターを有するｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣを含む遺伝子の群を包含する「ｓｉｒＡＢＣオペロン」によってコードされる。このオペロンは、ＡＢＣ輸送体としても知られる、鉄含有シデロフォアを黄色ブドウ球菌細胞に輸送する機能を果たすタンパク質系をコードする。ｓｉｒＡＢＣオペロン及びそれがコードするＳｉｒタンパク質の例示的なヌクレオチド及びポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２５１０２２及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７９５１８に見出され得る。ｓｉｒＡ遺伝子は細胞外タンパク質（ＳｉｒＡ）をコードし、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣはＡＢＣ輸送体の膜貫通ドメイン（ＳｉｒＢ／ＳｉｒＣ）をコードする。「ＳｉｒＡＢＣ鉄−シデロフォア輸送系」という用語は、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチドから成るＳｉｒＡＢＣ輸送体を指す。
【００２５】
ＦｈｕＣは、「ヒドロキサム酸鉄取り込み系」又は「ｆｈｕ系」のポリペプチドである。ｆｈｕ系は５つの遺伝子：ｆｈｕＣ、ｆｈｕＢ及びｆｈｕＧ、並びにｆｈｕＤ１及びｆｈｕＤ２によってコードされる。ｆｈｕＣ、ｆｈｕＢ及びｆｈｕＧはオペロン（ｆｈｕＣＢＧオペロン）中に存在し、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体の成分をコードする。ｆｈｕＣは、ｓｉｒとｈｔｓの両方によってコードされるシデロフォア輸送系と相互作用するＡＴＰアーゼをコードする。ｆｈｕＤ１及びｆｈｕＤ２は別々にコードされ、ヒドロキサム酸鉄錯体に高親和性で結合するリポタンパク質をコードする。ｆｈｕＣＢＧオペロンについての例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２５１２１６、ＡＡＦ９８１５３、ＡＡＦ９８１５４及びＡＡＦ９８１５５に認められ得る；ｆｈｕＤ１についてはアクセッション番号ＡＦ３２５８５４及びＡＡＫ９２０８５；そしてｆｈｕＤ２についてはアクセッション番号ＡＦ３２５８５５及びＡＡＫ９２０８６に見出され得る。「ＦｈｕＣ」、「ＦｈｕＢ」、「ＦｈｕＧ」、「ＦｈｕＤ１」及び「ＦｈｕＤ２」という用語は、それぞれｆｈｕＣ、ｆｈｕＢ、ｆｈｕＧ、ｆｈｕＤ１及びｆｈｕＤ２によってコードされるタンパク質を指す。
【００２６】
本発明の１つの態様に従って、黄色ブドウ球菌は、スタフィロフェリン仲介性鉄取り込み、すなわちスタフィロフェリンＡ仲介性鉄取り込み及びスタフィロフェリンＢ仲介性鉄取り込みを阻害することによって抑制され得る。黄色ブドウ球菌の抑制に関して本明細書で使用される「抑制される」という用語は、黄色ブドウ球菌の少なくとも部分的な増殖抑制を指し、完全な増殖抑制を含む。スタフィロフェリンＡ及びＢ鉄取り込みに関して本明細書で使用される「阻害すること」という用語は、黄色ブドウ球菌による鉄取り込みの、完全な阻害を含む、少なくとも部分的な阻害を指し、シデロフォア合成、シデロフォアの分泌及びシデロフォアの細胞取り込みの阻害を包含する。
【００２７】
スタフィロフェリン仲介性鉄取り込みの阻害は、スタフィロフェリンＡの産生のために必要なＳｂｔポリペプチドの少なくとも１つ、例えばＳｂｔＡ、ＳｂｔＢ、ＳｂｔＣ及びＳｂｔＤの少なくとも１つ、例えばＳｂｔＢ及びＳｂｔＤの発現又は機能を阻害し、且つスタフィロフェリンＢの産生のために必要なＳｂｎポリペプチドの少なくとも１つ、例えばＳｂｎＡ、ＳｂｎＢ、ＳｂｎＣ、ＳｂｎＤ、ＳｂｎＥ、ＳｂｎＦ、ＳｂｎＧ、ＳｂｎＨ及びＳｂｎＩの少なくとも１つ、例えばＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ、ＳｂｎＦ及びＳｂｎＨの発現又は機能を阻害することによって達成され得る。核酸レベルでは、シデロフォア合成を妨げるために、例えばアンチセンス及びＲＮＡ干渉技術（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ）を含む当分野において広く確立された方法を用いてＳｂｔ／Ｓｂｎ発現をブロックし得る。タンパク質レベルでは、各々のシデロフォアの合成を妨げるためにＳｂｔポリペプチドの１以上及びＳｂｎポリペプチドの１以上の機能を阻害し得る。
【００２８】
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的ｓｂｔ／ｓｂｎ核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を意味する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖類及び糖間（骨格）結合から成るヌクレオチド又はヌクレオシド単量体のオリゴマー又はポリマーを指す。この用語はまた、天然に存在しない単量体又は同様に機能するその部分を含む、修飾又は置換オリゴマーを包含する。このような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、細胞取り込みの増大、又はヌクレアーゼの存在下での安定性上昇などの特性のために天然に存在する形態よりも好ましいと考えられる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸又はデオキシリボ核酸であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含む天然に存在する塩基を包含し得る。オリゴヌクレオチドはまた、キサンチン、ヒポキサンチン及び２−アミノアデニンなどの修飾塩基を含み得る。本発明の他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸骨格、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式糖間結合内の修飾されたリン、酸素ヘテロ原子を含み得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート及びホスホロジチオエートを含み得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、治療用又は実験用試薬としてより適し得るヌクレオチド類似体を含み得る。オリゴヌクレオチド類似体の一例は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）中のデオキシリボース（又はリボース）リン酸骨格が、ペプチドにおいて認められるものと同様のポリミド（ｐｏｌｙｍｉｄｅ）骨格で置換されたペプチド核酸（ＰＮＡ）である。適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド長であり、機能性タンパク質を生じる標的遺伝子の転写を妨げるのに十分である。
【００２９】
もう１つの実施形態では、ＲＮＡ干渉技術（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ）を、Ｓｂｔ／Ｓｂｎポリペプチドの発現を妨げるために適用し得る。標的ｓｂｔ／ｓｂｎ遺伝子の領域と、少なくともそれに結合するために必要な程度まで一致する、ｓｉＲＮＡフラグメントなどの核酸フラグメントの適用を用いて発現をブロックし、シデロフォア産生の阻害を生じさせ得る。このようなブロッキングは、ｓｉＲＮＡフラグメントが標的遺伝子に結合し、それによって機能性Ｓｂｔ／Ｓｂｎポリペプチドを生じる遺伝子の翻訳を妨げる場合に起こる。適切なｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害するのに適した長さ、例えば少なくとも約１０〜１５ヌクレオチド長であり、所望条件下で、例えば細胞内で標的遺伝子にハイブリダイズするのに十分な標的遺伝子に対する相補性を含む。アンチセンス及びＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びＤＮＡウイルスベクター）又は微量注入などの物理的技術を含む当分野における技術を使用して組織又は細胞に導入し得る。
【００３０】
アンチセンス及びＲＮＡオリゴヌクレオチドは、化学合成、及び提供される配列情報に基づき当分野で公知の手順を用いた酵素的連結反応を使用して構築し得る。オリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を高めるように若しくはｍＲＮＡで形成される二本鎖若しくは天然遺伝子の物理的安定性を高めるように設計された、様々に修飾されたヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを使用して化学合成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、当分野で広く確立されている組換え技術を用いて生物学的に作製し得る。
【００３１】
Ｓｂｔ／Ｓｂｎポリペプチドの阻害は、ポリペプチドの機能に干渉する１以上の化合物を使用して達成され得る。そこで、標的Ｓｂｔ／Ｓｂｎポリペプチドの機能についての知識を考慮して、適切な阻害性化合物を同定又は開発し得る。例えば、ポリペプチドＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ及びＳｂｎＦは、スタフィロフェリンＢ合成のために必要なＮＩＳシンテターゼとして同定された。そこで、このようなシンテターゼを阻害するために有用な化合物はスタフィロフェリンＢ合成を阻害するのに適する。ＳｂｎＨのデカルボキシラーゼ活性の阻害もスタフィロフェリンＢ合成を阻害する。これに関して、基質類似体はシンテターゼ及び／又はデカルボキシラーゼ活性をブロックするために有用であり得る。
【００３２】
あるいは、Ｓｂｔ／Ｓｂｎポリペプチドは、スタフィロフェリン生合成のために必要な１以上の基質へのアクセスを制限することによって阻害され得る。これに関して、スタフィロフェリン合成のために必要な基質を産生する酵素を阻害してもよく、例えばＳｂｎＡ又はＳｂｎＢの阻害は、スタフィロフェリンＢ合成のために必要とされる基質、ジアミノプロピオン酸の合成を阻害する。
【００３３】
もう１つの実施形態では、スタフィロフェリン仲介性鉄取り込みの阻害は、Ｈｔｓ及びＳｉｒを介した鉄含有スタフィロフェリンの細胞への輸送を阻害することによって達成され得る。これに関して、鉄含有スタフィロフェリンＡの細胞への輸送のために必要なＨｔｓポリペプチド、例えばＨｔｓＡ、ＨｔｓＢ及びＨｔｓＣの少なくとも１つの発現又は機能、並びに鉄含有スタフィロフェリンＢの細胞への輸送のために必要なＳｉｒポリペプチド、例えばＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣの少なくとも１つの発現又は機能を阻害し得る。あるいは、スタフィロフェリンＡとスタフィロフェリンＢの両方の細胞への輸送を阻害するためにＦｈｕＣの発現を阻害し得る。
【００３４】
当業者が認識するように、スタフィロフェリン仲介性鉄取り込みは、（上述したように）スタフィロフェリンＡ及びＢの合成を阻害することによって、（上述したように）スタフィロフェリンＡ及びＢの細胞への輸送を阻害することによって、並びにスタフィロフェリンＢの細胞への輸送を阻害することと組み合わせてスタフィロフェリンＡの合成を阻害することによって、又はスタフィロフェリンＢの合成を阻害することと組み合わせてスタフィロフェリンＡの細胞への輸送を阻害することによって阻害され得る。
【００３５】
スタフィロフェリン仲介性鉄取り込みを調節する物質を同定するために、Ｓｉｒ又はＨｔｓポリペプチドの鉄輸送活性を調節する物質をスクリーニングするためのスクリーニングアッセイを開発し得る。例えば、Ｈｔｓタンパク質の鉄輸送活性を調節するための試験物質の適切な濃度を、当業者に公知の任意の方法によって測定し得る。１つの実施形態では、スクリーニングアッセイは、野生型Ｈｔｓ及びＳｂｔポリペプチドを発現する全黄色ブドウ球菌細胞を含み得る。Ｈｔｓ及び／又はＳｂｔポリペプチドの鉄輸送活性を変化させる化合物の能力は、細胞の分析によって検出できる。例えば、鉄輸送のアンタゴニストは、鉄富有培地での細胞の増殖又は分化（表現型）の変化を評価することによって検出できる。試験物質の存在下での野生型黄色ブドウ球菌株の増殖を、ＳｂｔＡ、ＳｂｔＢ、ＳｂｔＣ、ＳｂｔＤ、ＨｔｓＡ、ＨｔｓＢ又はＨｔｓＣ欠損黄色ブドウ球菌株の増殖と比較し得る。各々の培養物を化合物又は天然抽出物のライブラリーからの試験物質で処理し、特定物質が野生型及びＨｔｓ欠損株の増殖に及ぼす作用を観測し得る。細菌増殖はクレットメーター（Ｋｌｅｔｔ  ｍｅｔｅｒ）を用いて観測し得る。このようにして、ＨｔｓＡＢＣ／ｓｂｔＡＢＣＤ鉄シデロフォア輸送系に特異的に干渉する化合物を同定することができる。
【００３６】
もう１つの例として、黄色ブドウ球菌細胞を培養し、試験物質で処理して、その後原子吸光分光法技術を用いて細胞中の鉄の存在をスクリーニングし得る。あるいは、放射性標識鉄を使用することによって鉄輸送活性の阻害を測定し得る。ＨｔｓＡＢＣ鉄シデロフォア輸送系に干渉する化合物は、放射性標識鉄の取り込み低下を生じさせる。比較のための基線を提供する対照アッセイも実施できる。対照アッセイでは、黄色ブドウ球菌細胞における放射性標識鉄の取り込みを試験化合物の不在下で定量し得る。放射性標識鉄の例は、５９Ｆｅ又は５５Ｆｅを含み得る。
【００３７】
シデロフォア仲介性鉄取り込みに関与する核酸又はタンパク質の発現に干渉するアンタゴニストも同定し得る。このようなアンタゴニストを同定するために、黄色ブドウ球菌細胞を対象化合物で処理し、その後シデロフォア仲介性鉄取り込みに関与する核酸及び対応してコードされるタンパク質について、核酸発現又はタンパク質産生への化合物の作用を検定し得る。例えば、一段階グアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法などの任意の適切な技術を使用して、試験化合物の存在下又は不在下で培養した黄色ブドウ球菌細胞から全ＲＮＡを単離することができる。次に、ｓｉｒ、ｓｂｎ、ｈｔｓ、ｓｂｔ又はｆｈｕ核酸などの核酸の発現を、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）などの任意の適切な方法によって検定し得る。Ｓｉｒ、Ｓｂｎ、Ｈｔｓ、Ｓｂｔ又はＦｈｕポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルも、例えば、選択した試験物質の作用を対照試料と比較して測定するＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検定し得る。Ｓｉｒ、Ｓｂｎ、Ｈｔｓ、Ｓｂｔ又はＦｈｕポリペプチドの発現も、免疫検定法などの抗体ベースの方法を使用して、試験物質による黄色ブドウ球菌細胞の処理後に定量し得る。ウエスタンブロット法、放射免疫検定法、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）、「サンドイッチ」免疫検定法、免疫沈降アッセイ、プレシピチン反応、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散検定法、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫検定法及びプロテインＡ免疫検定法などの技術を使用した競合的及び非競合的アッセイ系を含むがこれらに限定されない、任意の適切な免疫検定法が使用できる。例えば、ＳｂｔＡ、ＳｂｔＢ、ＳｂｔＣ、ＳｂｔＤ、ＨｔｓＡ、ＨｔｓＢ又はＨｔｓＣポリペプチドを、二段階サンドイッチアッセイによって、試験物質で処理した黄色ブドウ球菌細胞から得た試料中で検出し得る。第一段階では、捕捉試薬（例えばＳｂｔＡ、ＳｂｔＢ、ＳｂｔＣ、ＳｂｔＤ、ＨｔｓＡ、ＨｔｓＢ又はＨｔｓＣ抗体のいずれか）を使用して特異的ポリペプチドを捕捉する。捕捉試薬は、場合により固相に固定し得る。第二段階では、直接又は間接標識した検出試薬を使用して捕捉したマーカーを検出する。１つの実施形態では、検出試薬は抗体である。ポリペプチド発現への試験物質の作用を測定するために、試験物質で処理した黄色ブドウ球菌細胞中に存在するＳｂｔＡ、ＳｂｔＢ、ＳｂｔＣ、ＳｂｔＤ、ＨｔｓＡ、ＨｔｓＢ又はＨｔｓＣポリペプチドの量を、未処理黄色ブドウ球菌細胞中に存在する量を参照することによって計算できる。
【００３８】
黄色ブドウ球菌によるシデロフォア仲介性鉄取り込みはまた、Ｈｔｓ及びＳｉｒポリペプチド内のシデロフォア結合領域、例えばＨｔｓＡ及びＳｉｒＡ内のシデロフォア結合領域に干渉することによって阻害され得る。以下の実施例で述べるように、これらのポリペプチド内の結合領域は同定されていて、取り込みのための鉄含有シデロフォアとＨｔｓ／Ｓｉｒ輸送系の相互作用を阻害するための標的領域として役立つ。そこで、この結合領域の決定に基づき、Ｈｔｓ／Ｓｉｒシデロフォア結合をブロックするアンタゴニストを容易に設計することができ、アンタゴニストはシデロフォアミメティック、免疫学的アンタゴニストなどを含み得る。
【００３９】
本発明の実施形態を以下の特定実施例を参照して説明するが、これらの実施例は限定として解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４０】
＜実施例２〜１０のための実験材料及び方法＞
細菌株、プラスミド及び増殖培地。この試験で使用する細菌株とプラスミドを表１に示す。細菌は、特に指示されない限り、３７℃で培養した。
【００４１】
【表１Ａ】
2012500226.tif 000002
【表１Ｂ】
2012500226.tif 000003
【表１Ｃ】
2012500226.tif 000004
【表１Ｄ】
2012500226.tif 000005
【００４２】
抗生物質を以下の濃度で使用した：大腸菌選択のためのアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びエリスロマイシン（３００μｇ／ｍＬ）；黄色ブドウ球菌選択のためのクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ネオマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びエリスロマイシン（３μｇ／ｍＬ）。分子遺伝学的操作のために、細菌をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（大腸菌）又はトリプティックソイブロス（黄色ブドウ球菌）中で増殖させた。鉄制限培地は、ｉ）０．１μＭエチレンジアミン−ジ−ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ）を含有する化学的組成の明らかなＴｒｉｓ最小コハク酸培地｛Ｓｅｂｕｌｓｋｙ，２００４  Ｎｏ．１２２７｝、ｉｉ）１％ｗ／ｖカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）を含有するＲＰＭＩブロス（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、又はｉｉｉ）６０：４０比率の補体不活性化ウマ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とＴＭＳブロスのいずれかであった。すべての溶液と培地は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して精製した水で作製した。
【００４３】
組換えＤＮＡ法。Ｑｉａｐｒｅｐミニスピンキット（Ｑｉａｇｅｎ）を指示されているように使用して細菌からプラスミドＤＮＡを単離した。黄色ブドウ球菌からのプラスミド単離のために、５０ｍｇ／ｍＬリソスタフィン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有するＰ１緩衝液中３７℃で３０分間インキュベートした後、溶解緩衝液Ｐ２を添加した。制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、クレノーフラグメント及びＰｗｏＩポリメラーゼはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓより入手し、オリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入した。
【００４４】
ｓｂｎオペロン欠失。ｓｂｎＡＢＣＤＥＦＧＨＩ：：Ｔｅｔノックアウト対立遺伝子は、ｓｂｎＡの上流及びｓｂｎＩのすぐ下流の領域に相同なＤＮＡ配列によって隣接される、制限酵素ＳｓｐＩ及びＮａｅＩでプラスミドｐＤＧ１５１３から切り出し、クレノー酵素で平滑末端化したテトラサイクリン耐性カセットから成った。ノックアウト対立遺伝子を温度感受性大腸菌／黄色ブドウ球菌シャトルベクターｐＡＵＬ−Ａにクローニングし、その後黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０を介して継代させた後、黄色ブドウ球菌ＲＮ６３９０に形質導入した。組換えＲＮ６３９０を３０℃で中間対数期まで培養した後、インキュベーション温度を４２℃に変えて、細菌をさらに１６時間インキュベートし、その後テトラサイクリンを含有するＴＳＡに塗布した。コロニーをエリスロマイシンに対する感受性に関してスクリーニングし、テトラサイクリン耐性カセットのいずれかの側での相同組換えを介した染色体へのノックアウト対立遺伝子の組込み後のｐＡＵＬ−Ａ骨格ＤＮＡの喪失を示した。ファージ８０αを使用した形質導入により、ｓｂｎ：：ｔｅｔ欠失を他の黄色ブドウ球菌バックグラウンドに動員した（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）。
【００４５】
ｓｂｔ遺伝子座欠失。ｓｂｔＡＢＣＤ：：Ｋａｎノックアウト対立遺伝子は、ｓｂｔＡ及びｓｂｔＤの下流領域に相同なＤＮＡ配列によって隣接されるプラスミドｐＤＧ７８０から切り出したカナマイシン耐性カセットから成り、これを大腸菌／黄色ブドウ球菌シャトルベクターｐＬＩ５０にクローニングした。黄色ブドウ球菌自殺ベクターを、ＮｓｉＩ消化及びクレノーフラグメントによるフィルイン後にｒｅｐＢ（グラム陰性レプリカーゼタンパク質をコードする）にフレームシフト突然変異を導入することによってこのプラスミドから作製した。黄色ブドウ球菌において補助なしには複製することができないこのプラスミドを、非修飾ｐＬＩ５０を含む黄色ブドウ球菌株ＲＮ４２２０に導入し、野生型ＲｅｐＢによるトランス相補性を介して複製を可能にした。次にこの構築物を黄色ブドウ球菌株ＲＮ６３９０に形質導入し、組換え細菌を、カナマイシン及びネオマイシンを含有するＴＳＡに塗布した。コロニーをクロラムフェニコールに対する感受性に関してスクリーニングし、カナマイシン耐性カセットのいずれかの側での相同組換え後のベクターＤＮＡの喪失を示した。ファージ８０αを使用した形質導入により、ｓｂｔ：：ｋａｎ欠失を他の黄色ブドウ球菌バックグラウンドに動員した。
【００４６】
ｈｔｓＡＢＣ：：Ｔｅｔ欠失。ｈｔｓＡＢＣ：：Ｔｅｔノックアウト対立遺伝子は、ｈｔｓＡＢＣの近傍の５’及び３’非コード領域を標的した。５’アームをＰＣＲ増幅し、ＳａｃＩ〜ＢａｍＨでプラスミドｐＵＣ１９にクローニングして、次にＰＣＲ増幅した３’アームをＢａｍＨＩ〜ＸｂａＩでクローニングした。テトラサイクリン耐性カセットを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩでプラスミドｐＤＧ１５１３から切り出し、ＳｍａＩ部位でアームにクローニングした。ノックアウト対立遺伝子を切り出し、シャトルベクターｐＡＵＬ−Ａ、ＳａｃＩ〜ＸｂａＩにクローニングした。黄色ブドウ球菌への継代と染色体組込みについての選択を、ｓｂｎオペロン突然変異に関して述べたように実施した。
【００４７】
相補ベクター。プラスミドｐＥＶ９０を使用して黄色ブドウ球菌ｓｂｔＡｓｂｔＢＣＤ：：Ｋｍ突然変異株を相補した。加えて、表皮ブドウ球菌８４６−１及びＳ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５からのｓｂｔＡｓｂｔＢＣＤを使用して相補を実施した。これらの遺伝子座をＰＣＲ増幅し、制限部位ＥｃｏＲＩとＳｍａＩの間（表皮ブドウ球菌）又はＢａｍＨＩとＳｍａＩの間（Ｓ．サプロフィチカス）でｐＬＩ５０にクローニングした。プラスミドｐＥＶ５５及びｐＥＶ９３を使用してｈｔｓＡＢＣ：：Ｔｅｔ突然変異株を相補した。ｈｔｓオペロンを黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ株（ｐＥＶ５５）又は表皮ブドウ球菌８４６−１（ｐＥＶ９３）からＰＣＲ増幅し、それぞれ制限部位ＳａｃＩとＳｍａＩの間又はＳａｃＩとＸｂａＩの間でｐＬＩ５０にクローニングした。ベクターを大腸菌ＤＨ５αにおいて構築し、黄色ブドウ球菌株ＲＮ４２２０に電気穿孔して、ファージ８０αを用いて黄色ブドウ球菌ＲＮ６３９０及びＮｅｗｍａｎ株系統に形質導入した。
【００４８】
増殖曲線。細菌をＴＭＳブロス中で１２時間培養し、次に１００μＭの２，２’ジピリジル（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＭＳブロス中で１２時間培養した。細胞を食塩水中で２回洗浄し、６０％ウマ血清／４０％ＴＭＳブロスに１：１００希釈した。鉄富有培地については、５０μＭのＦｅＣｌ３を添加した。培養物を、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃ装置（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ，ＵＳＡ）において一定の中等度振幅で振とうしながら増殖させた。３０分ごとに６００ｎｍで光学密度を測定した。
【００４９】
上清製剤及びプレートバイオアッセイ。黄色ブドウ球菌株を、０．１μＭのＥＤＤＨＡを含有するＴＭＳブロス中、通気しながら３７℃で４０時間増殖させた。細胞を遠心分離によって除去し、上清を凍結乾燥した。乾燥上清をメタノールで抽出し（もとの上清容積の半分）、Ｗｈａｔｍａｎ−Ｎｏ．１ろ紙に通して不溶性物質を除去し、回転蒸発させた。物質を水に溶解してもとの上清容積の５％にした。黄色ブドウ球菌の鉄制限増殖を促進する上清濃縮物の能力を、修正を加えて先に述べられているように（Ｓｅｂｕｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）実施したシデロフォアプレートバイオアッセイを用いて評価した。簡単に述べると、黄色ブドウ球菌株を、７．５μＭのＥＤＤＨＡを含有するＴＭＳ寒天に組み込んだ（１×１０４細胞／ｍｌ）。濃縮物（１０μＬ）を滅菌ペーパーディスクに添加し、次にそれをプレート上に置いた。３７℃で３６時間後、ディスクの周囲の増殖の半径を測定することによって増殖促進を定量した。
【実施例２】
【００５０】
＜黄色ブドウ球菌ｓｂｎ突然変異株は依然としてシデロフォアを産生する＞
完全なｓｂｎオペロンの欠失を含む（すなわちｓｂｎＡからｓｂｎＩ遺伝子までのすべてを欠失している）黄色ブドウ球菌の株を構築した。黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎバックグラウンドのｓｂｎ欠失株をＨ１３３１と称し、ＲＮ６３９０バックグラウンドのものをＨ１３２４と称した。血清中３７℃で培養した場合、Ｈ１３３１は、野生型Ｎｅｗｍａｎと比較して最初の１５時間のインキュベーションの間は著明な増殖低下を示し、その後最終的には約３０時間までにＮｅｗｍａｎと同じ細胞密度に増殖した（図１）。クロムアズロールＳアッセイ（Ｓｃｈｗｙｎ  ａｎｄ  Ｎｅｉｌａｎｄｓ，１９８７）を使用した鉄キレート活性についての、３５時間の時点からの使用済み培養上清の分析は、ＮｅｗｍａｎとＨ１３３１の間で同等のシデロフォア活性を明らかにした（図２）。血清増殖培地への鉄の添加はＨ１３３１の増殖低下を取り除き（図１、挿入図）、ＮｅｗｍａｎとＨ１３３１の両方においてシデロフォア産生を抑制した（図２）。最後に、どちらも鉄制限ＴＭＳ培地で培養した黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ及びＨ１３３１からの濃縮上清は、シデロフォアプレートバイオアッセイにおいて黄色ブドウ球菌の増殖を促進した（ＮｅｗｍａｎとＲＮ６３９０は等しく応答した）（表２）。これが株特異的現象によるものではないことを確実にするため、上述したすべての実験を、代わりにＲＮ６３９０遺伝子バックグラウンド（すなわちＲＮ６３９０とＨ１３２４）を用いて反復した。等しい結果が得られた（データは示していない）。
【００５１】
【表２】
2012500226.tif 000006
【００５２】
合わせて考慮すると、これらの所見は、黄色ブドウ球菌が少なくとも２つのシデロフォアを合成し、そのうちの１つは合成のためにｓｂｎオペロンの産物のいずれも必要としないことを示唆する。この付加的なシデロフォアの産生はｓｂｎ由来シデロフォア（スタフィロバクチン／スタフィロフェリンＢ）の不在を相殺するが、血清中での長期間のインキュベーション後に限られる。
【実施例３】
【００５３】
＜黄色ブドウ球菌における第二の鉄調節シデロフォア生合成遺伝子座も、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の間で保存されている＞
黄色ブドウ球菌ｓｂｎ欠失突然変異株は依然としてシデロフォアを産生したので、その産物がシデロフォアを合成することができる黄色ブドウ球菌の他の遺伝子座を決定した。利用可能な黄色ブドウ球菌ゲノム配列の検討により、シデロフォア生合成酵素をコードする潜在的可能性がある４つの遺伝子座が同定された；Ｎｅｗｍａｎ株では、これらのオープンリーディングフレームはＮＷＭＮ＿２０７９−ＮＷＭＮ＿２０８２と同定される（図３）。この遺伝子座を、ｓｂｔ、ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｗｏ（シデロフォア生合成２）と同定した。ｓｂｔ遺伝子座は、ヘムをブドウ球菌細胞に輸送すると先に提案したＡＢＣ輸送体の成分をコードする、ｈｔｓＡＢＣオペロンのすぐ上流のゲノム（ＮＷＭＮ＿２０７８−２０７６）に存在する。ｓｂｔＡは、おそらくｓｂｔＢ−ｓｂｔＤから成るポリシストロン性メッセージであるものから分岐的に転写される。
【００５４】
ブドウ球菌の中で、黄色ブドウ球菌種にのみ存在するｓｂｎオペロンと異なり、ｓｂｔ遺伝子座は、少なくともゲノム情報が入手可能である、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の間で保存されている。表３に示すように、予測Ｓｂｔ産物は、表皮ブドウ球菌、Ｓ．ヘモリチカス及びＳ．サプロフィチカスからの予測タンパク質産物と有意の類似性を共有し、これらのブドウ球菌属Ｓｂｔ産物の間での機能的類似性を示唆する。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
多様な配向のｓｂｔＡ遺伝子とｓｂｔＢ遺伝子の間の遺伝子間領域、及びｈｔｓＡＢＣオペロンのすぐ上流の領域は、コンセンサスＦｕｒボックス配列と高度に相同な１９−ｂｐ配列を含み（図３及び４参照）、ｓｂｔＡ、ｓｂｔＢ及びｈｔｓ転写産物が鉄取り込み調節因子（Ｆｕｒ）抑制タンパク質の活性を介して鉄調節されることを示唆する。シデロフォアが鉄制限の間黄色ブドウ球菌によってのみ作製されるという所見と一致して（図２）、及びｓｂｎオペロンについて認められた調節に類似して、ｓｂｔＡ及びｓｂｔＢの両転写産物は鉄及びＦｕｒ依存的に上方調節された（図５）。ｈｔｓＡＢＣオペロンも同様に調節されることが示された（図５）。
【実施例４】
【００５７】
＜野生型黄色ブドウ球菌バックグラウンドにおけるｓｂｔ遺伝子座の欠失は増殖欠損表現型を生じないが、ｓｂｎ遺伝子座欠失と組み合わせた場合は増殖に相加作用を及ぼす＞
上述したように、ｓｂｔ遺伝子は鉄制限条件下で発現され、それらの遺伝子の２つ（ｓｂｔＡ及びｓｂｔＣ）は、シデロフォア生合成酵素に類似性を有する産物をコードする。したがって、遺伝子座の欠失はシデロフォア産生の低下を導き、その結果として、鉄制限増殖培地（例えば血清）により増殖する能力が欠損した株が生じると推定され、これはｓｂｎオペロン欠失を保有する株について認められたものを模倣する（図１参照）。ｓｂｔＡＢＣＤ遺伝子クラスターの欠失を含むＮｅｗｍａｎ株である、Ｈ１６６５株を作製した。驚くべきことに、Ｈ１３３１株（ｓｂｎ遺伝子座欠失）と異なり、培養上清のエンドポイント分析が、野生型と比較してシデロフォア産生量の有意の減少を同定したという事実にも関わらず（図７）、血清中のＨ１６６５株において識別できる増殖減衰は存在しないことが認められた（図６）。Ｈ１６６５からの濃縮培養上清は、鉄制限野生型黄色ブドウ球菌株の増殖を速やかに促進することができ（表２）、少なくとも１つのシデロフォア分子（おそらく少なくともｓｂｎ遺伝子の産物によってコードされる）の存在を示唆した。
【００５８】
ｓｂｎ仲介性シデロフォア活性がｓｂｔ仲介性シデロフォア活性の喪失を代償することができるかどうかを調べるため、両方の欠失を１つの株、Ｈ１６６６内で組み合わせた。Ｈ１３３１株（Δｓｂｎ）又はＨ１６６５株（Δｓｂｔ）と比較して、Ｈ１６６６株（Δｓｂｎ  Δｓｂｔ）は血清中での増殖の重大な減衰が明らかになった（図６）。Ｈ１６６６の増殖は、しかし、増殖培地が鉄富有である場合は野生型レベルに回復し（図６、挿入図）、増殖欠損が単に利用可能な鉄を捕捉できないことによるものであることを指示した。Ｈ１６６６の鉄制限上清のエンドポイント分析は、シデロフォア活性がバックグラウンドレベルに低下したことを明らかにした（図７）。重要な点として、鉄制限Ｈ１６６６からの濃縮培養上清は、野生型黄色ブドウ球菌の鉄制限増殖を促進することができるいかなる分子も含有しなかった（表２）。
【００５９】
合わせて考慮すると、これらのデータは、黄色ブドウ球菌によるすべてのシデロフォア産生が、独立したシデロフォアの産生においてｓｂｎ及びｓｂｔ遺伝子座によって仲介されることを強く示唆する。潜在的な株特異的作用を排除するため、すべての欠失をＲＮ６３９０バックグラウンドで再構築し、同様の増殖及びシデロフォア活性傾向を認めた（データは示していない）。
【実施例５】
【００６０】
＜ｓｉｒＡＢＣ及びｈｔｓＡＢＣオペロンは、それぞれｓｂｎ由来シデロフォア及びｓｂｔ由来シデロフォアの輸送に関連するＡＢＣ輸送体をコードする＞
ｓｂｎオペロン内でコードされる酵素によって産生されるスタフィロバクチンの輸送は、ｓｂｎオペロンから分岐的に転写されるオペロンからコードされる、ＳｉｒＡＢＣ  ＡＢＣ輸送体によって仲介される（その内容が本明細書に組み込まれる、Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ａ；Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ｂ）。
【００６１】
次に、ＨｔｓＡＢＣはヘム輸送に関与することが以前に示唆されているが、ｈｔｓＡＢＣオペロンとｓｂｔ遺伝子座の関係（図３参照）を測定した。最初に、Ｈ８０３（ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）の血清中での増殖動態がＨ１３３１（Δｓｂｎ）で見られたものと非常に類似することが認められた（図８）。Ｈ１６６５（Δｓｂｔ）についての血清中での増殖低下の欠如と同様に、ｈｔｓＡＢＣ欠失株、Ｈ１２６２に関しても増殖低下は起こらなかった（図８）。また二重のシデロフォア生合成遺伝子座欠失を含む突然変異株（Ｈ１６６６（Δｓｂｎ  Δｓｂｔ））について認められた結果と類似して、同じ株（Ｈ１４９７）におけるｓｉｒＡ及びｈｔｓＡＢＣの不活性化は血清中での著しい増殖減衰をもたらす（図８）。ｓｂｔ遺伝子産物の機能に由来するシデロフォアの輸送におけるＨｔｓＡＢＣの役割についてのより直接的な証拠が、シデロフォアプレートバイオアッセイを通して得られた。鉄制限条件下で増殖させたＨ１３３１、Ｈ１６６５及びＨ１６６６の各々からの使用済み培養上清を濃縮し、野生型、ｓｉｒＡ：：Ｋｍ、ΔｈｔｓＡＢＣ及びｓｉｒＡ：：ＫｍΔｈｔｓＡＢＣ株に与えた。表４に示すように、野生型細胞によって産生された物質は、二重突然変異株ｓｉｒＡ：：ＫｍΔｈｔｓＡＢＣを除くすべての株の増殖を促進することができたが、Ｈ１３３１（Δｓｂｎ）に由来する物質は、野生型及びｓｉｒＡ：：Ｋｍ細胞の増殖だけを促進することができ、Ｈ１６６５（Δｓｂｔ）に由来する物質は、野生型及びｈｔｓＡＢＣ：：ｅｒｍ細胞の増殖だけを促進することができた。最後に、Ｈ１６６６からの濃縮使用済み培養上清は、野生型黄色ブドウ球菌を含む、いかなる黄色ブドウ球菌株の増殖も促進することができなかった（表２も参照のこと）。これは、ｓｂｎ及びｓｂｔ遺伝子が、それらのそれぞれのＳｉｒＡＢＣ及びＨｔｓＡＢＣ輸送系に対して重複しない特異性を有する異なる物質又はシデロフォアを産生することを指示する。
【００６２】
【表４】
2012500226.tif 000008
【実施例６】
【００６３】
＜表皮ブドウ球菌からのｓｂｔＡＢＣＤ及びｈｔｓＡＢＣは黄色ブドウ球菌突然変異株を相補する＞
上述したように、ブドウ球菌の中で黄色ブドウ球菌においてのみ認められるｓｉｒＡＢＣ及びｓｂｎＡ−Ｉと異なり、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）からのゲノム配列はｓｂｔＡＢＣＤのホモログを含む（表４参照）。ＣｏＮＳのｓｂｔホモログが黄色ブドウ球菌におけるものと機能的に類似するか否かを調べるため、表皮ブドウ球菌ｓｂｔ遺伝子が黄色ブドウ球菌ｓｂｔ増殖低下を相補するか否か、及び第二に、黄色ブドウ球菌ＨｔｓＡＢＣを介して輸送され得る産物が作製されるか否かを測定した。図９に示すように、シデロフォア欠損黄色ブドウ球菌突然変異株Ｈ１６６６（すなわちΔｓｂｎΔｓｂｔ）の血清中での増殖は、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌のいずれかからのｓｂｔ遺伝子座を含む場合に、等しく増大することができた。興味深いことに、多コピーｓｂｔ遺伝子はＨ１３３１（すなわちΔｓｂｎ）のより迅速な増殖を促進することができなかった。表皮ブドウ球菌からのｓｂｔ遺伝子が黄色ブドウ球菌からのｓｂｔ遺伝子によって産生されるのと同一（又は高度に類似の）分子を合成することの証拠は、Ｈ１６６６（すなわちΔｓｂｎΔｓｂｔ）において、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌のいずれからであっても、ｓｂｔ遺伝子はトランスで、野生型黄色ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌ΔｓｉｒＡの増殖を促進することができるが、黄色ブドウ球菌のΔｈｔｓＡＢＣ突然変異株の増殖は促進できない培養上清を生じるという結果から導かれる。
【実施例７】
【００６４】
＜黄色ブドウ球菌Ｈｔｓによるヘム結合又は輸送についての証拠の欠如＞
以前の報告は、ｈｔｓへのマリナー・トランスポゾンの挿入が、ヘムではなく、トランスフェリンから選択的に鉄を取り込む株をもたらすことを示し、ｈｔｓＡＢＣがヘムに特異的なＡＢＣ輸送体をコードするという示唆を導いた。しかし、黄色ブドウ球菌ＨｔｓＡＢＣが、ｈｔｓＡＢＣのすぐ上流の染色体から転写される遺伝子座である、ｓｂｔ遺伝子座の産物によって作製されるシデロフォア分子の輸送に関与することの証拠が本明細書で提供される。この実施例では、ＨｔｓＡＢＣによるヘム輸送又は、少なくとも、溶質結合タンパク質であるＨｔｓＡによるヘム結合についての直接の証拠を検証した。
【００６５】
液体増殖アッセイにおいて、唯一の鉄供給源としてヘムで増殖させた場合、ｈｔｓＡＢＣ欠失突然変異株、Ｈ１６６５の減衰を認めなかった（データは示していない）。さらに、図１０に示すように、ヘム結合機能に関して検定した場合、ヘムに結合することが証明されているリポタンパク質であるＩｓｄＥと比較して、ヘムは精製ＨｔｓＡにほとんど又は全く結合しない。これは、以前に考えられていたのとは異なり、Ｈｔｓが、ヘムではなく、シデロフォア結合鉄の輸送に関与することを指示する。
【実施例８】
【００６６】
＜いくつかの黄色ブドウ球菌Ｓｂｎ突然変異株は鉄制限増殖低下を示す＞
シデロフォア生合成のためのｓｂｎ（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と呼ばれる９遺伝子のオペロンが同定された。ｓｂｎ産物がシデロフォア産生において役割を果たすかどうかを調べるため、ｓｂｎＡ、ｓｂｎＢ、ｓｂｎＣ、ｓｂｎＤ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＦ及びｓｂｎＨを含むΔｓｂｎ黄色ブドウ球菌突然変異株を生成した。これらの突然変異株の各々に関する増殖アッセイは、これらの突然変異株のいずれもがスタフィロバクチンを作製せず、これらの突然変異株すべてがヒト又は動物血清のような鉄制限培地では増殖しにくいことを示した。そのため、少なくともｓｂｎＡ、ｓｂｎＢ、ｓｂｎＣ、ｓｂｎＤ、ｓｂｎＥ、ｓｂｎＦ、ｓｂｎＨ又はそれらのそれぞれのコードされるタンパク質産物は、スタフィロバクチン生合成の阻害剤にとっての候補標的である。そこで、ｓｂｎ核酸、対応してコードされるＳｂｎタンパク質産物、又は対応する黄色ブドウ球菌Ｓｂｎ突然変異株は、スタフィロバクチン生合成経路の阻害剤を同定するためのスクリーニング法において使用できる。さらに、ｓｂｎ酵素によって触媒される反応の成分、並びにＳｂｎ酵素自体を、Ｓｂｎ酵素の阻害剤についてのハイスループットスクリーニングにおける使用のための生化学的アッセイを開発するために使用し得る。
【実施例９】
【００６７】
＜ＳｂｎＡ及びＳｂｎＢを使用した生化学的アッセイ＞
実施例８で述べたようにいくつかのΔｓｂｎ黄色ブドウ球菌突然変異株は、例えばヒト又は動物血清において、鉄制限増殖低下表現型を産生する。増殖培養アッセイにおいてＳｂｎＡ及びＳｂｎＢ突然変異株を使用して、化合物を増殖培地に添加し、鉄制限表現型を克服する能力に関して試験した。図１１は、プロリンがＳｂｎＢ突然変異株の鉄制限増殖低下を克服できないことを示し、プロリンがスタフィロバクチン生合成において使用されるＳｂｎＢ仲介性酵素反応の産物ではないことを指示する。黄色ブドウ球菌ＳｂｎＡ及びＳｂｎＢ突然変異株の鉄制限増殖低下（スタフィロバクチンの産生の欠如に起因する）は、増殖培地への２，３−ジアミノプロピオン酸の添加によって克服され得る（図１２；ＳｂｎＡ突然変異株についてのデータは示していない）。このデータは、修飾アミノ酸、２，３−ジアミノプロピオン酸がスタフィロバクチンの成分であることを示す。
【００６８】
理論に拘束されることを望むものではないが、推定上のオルニチンシクロデアミナーゼ（ＯＣＤ）、ＳｂｎＢは、オルニチンをプロリンに変換して環化するので、ＮＨ３を遊離させると考えられる。予測されるＯ−アセチル−Ｌ−セリンスルフヒドリラーゼ、ＳｂｎＡは、Ｏ−アセチル−セリンをＮＡＤ＋依存的に２，３−ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰＡ）に変換する反応においてＮＨ３を利用し得る。
【００６９】
ＳｂｎＡ及びＳｂｎＢを過剰発現させ、精製して、これら２つのタンパク質を含むＨＰＬＣベースのアッセイを開発した。このＨＰＬＣベースのアッセイを使用して、ＳｂｎＡ及びＳｂｎＢを、反応基質としてＯ−アセチル−セリン、オルニチン及びＮＡＤ＋と一緒にした場合に産物ＤＡＰＡが産生されることを示した。いずれかの酵素を他方の単離において使用した場合、ＤＡＰＡは作製されない。これらの結果は、オルニチン及びＯ−アセチル−Ｌ−セリンのＳｂｎＡ及びＳｂｎＢ依存的消費並びにプロリンと２，３−ジアミノプロピオン酸の同時出現を確認する。さらに、このＨＰＬＣベースのアッセイにおいてＤＡＰＡの産生が観測できることは、このアッセイがＳｂｎＡ又はＳｂｎＢ酵素を標的する阻害剤についてのハイスループットスクリーニングのために使用できることを示す。
【実施例１０】
【００７０】
＜ＦｈｕＣはＳｉｒ及びＨｔｓシデロフォア輸送体の両方に対するＡＴＰアーゼである＞
ＦｈｕＣ突然変異株であるＨ１０７１株を、その鉄制限増殖低下がシデロフォア、スタフィロフェリンＡ及びスタフィロフェリンＢのいずれか１つの存在下で又は両方のシデロフォアの存在下で克服され得るか否かを調べるために検定した。具体的には、シデロフォアの１つ又は両方を産生する細胞培養物の上清濃縮物がＦｈｕＣ黄色ブドウ球菌突然変異株の鉄制限増殖を促進する能力を、シデロフォアプレートバイオアッセイを用いて評価した。
【００７１】
ＦｈｕＣ突然変異株は、いずれかのシデロフォア単独又は両方を使用した場合もプレートバイオアッセイにおいて増殖を示さなかった。このデータは、ＦｈｕＣが両方の黄色ブドウ球菌シデロフォアの輸送を活性化するＡＴＰアーゼであることを示す。
【実施例１１】
【００７２】
＜スタフィロフェリンＢの生合成＞
実験手順
細菌株、プラスミド及び標準増殖条件。
この試験で使用した細菌株及びプラスミドを表５に示す。
【００７３】
【表５】
2012500226.tif 000009
【００７４】
大腸菌をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で増殖させた。鉄取り込みの分析に直接関係しない実験については、黄色ブドウ球菌をトリプティックソイブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で増殖させた。Ｔｒｉｓ最小コハク酸培地（ＴＭＳ）を記述されているように（Ｓｅｂｕｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）調製し、鉄制限最小培地として使用した。ＴＭＳ中の遊離鉄のレベルをさらに制限するために、鉄キレート化合物２，２’−ジピリジル及びエチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシフェノール酢酸）（ＥＤＤＨＡ）  を文中で指示されているように添加した。必要な場合は、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を大腸菌株の増殖のために培地に添加した。黄色ブドウ球菌については、必要に応じてカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（４μｇ／ｍｌ）を増殖培地に添加した。固体培地は、１．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ寒天（Ｄｉｆｃｏ）の添加によって得た。特に明記されない限り、すべての細菌増殖は３７℃で実施した。増殖培地及び溶液の調製のために鉄非含有水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水ろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を通すことによって得た。
【００７５】
組換えＤＮＡ法
標準的なＤＮＡ操作を実施した。制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾酵素は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）及びＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｆｌａｍｂｏｒｏｕｇｈ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）より購入した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐプラスミドスピンカラム（ＱＩＡｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造者によって記述されているように使用して精製した。ポリメラーゼ連鎖反応は、ＰｗｏＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して実施した。
【００７６】
シデロフォアプレートバイオアッセイ
シデロフォアプレートバイオアッセイを記述されているように（Ｂｅａｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）実施した。各々のディスクの周囲の増殖ハローの直径によって測定される増殖促進を、３７℃で３６時間のインキュベーション後に測定した。
【００７７】
細菌増殖曲線
細菌をＴＭＳブロス中で１２時間培養し、次に１００μＭの２，２’−ジピリジル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＴＭＳブロス中で１２時間培養した。細胞を食塩水中で２回洗浄し、６０％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）−４０％ＴＭＳブロスに１：１００希釈した。鉄富有培地については、５０μＭのＦｅＣｌ３を添加した。培養物を、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ−Ｃ装置（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ，ＵＳＡ）において一定の中等度振幅で振とうしながら増殖させた。３０分ごとに６００ｎｍで光学密度を測定した。しかし、増殖曲線図の明瞭さのために、データは２時間間隔でのみ示している。
【００７８】
シデロフォア検出
シデロフォア活性のレベルを測定するため、クロムアズロールＳ（ＣＡＳ）シャトル溶液を記述されているように調製した。インビトロ合成したスタフィロフェリンＢの場合は、反応混合物５０μＬを取り、脱イオン水４５０μＬで希釈して、次に１ｍｌ分光光度計キュベット中のＣＡＳシャトル溶液５００μＬで希釈した。その後混合物を暗所で４５分間インキュベートした。シデロフォアの定量及び吸光度の読み取りを記述されているように（Ｂｅａｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）実施した。
【００７９】
タンパク質の過剰発現と精製
表１に示すプライマーを使用して黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎのゲノムから増幅したコード領域をｐＥＴ２８ａ（＋）にクローニングすることにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）においてタンパク質を発現させた。発現構築物を含む大腸菌細胞を、通気しながら３７℃で中間対数期まで増殖させた後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（０．５ｍＭ）を添加し、細胞を室温でさらに１６時間培養した。細胞を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールに再懸濁し、フレンチプレスにおいて１０，０００ｐｓｉで溶解して、溶解産物を１５，０００×ｇで１５分間遠心分離して破壊されていない細胞とデブリを除去した後、１５０，０００×ｇで６０分間遠心分離して不溶性物質を除去した。可溶性試料を緩衝液Ａで平衡させた１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐニッケルアフィニティーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、６ｘＨｉｓタグタンパク質を２０カラム容積に対して０〜８０％緩衝液Ｂの勾配でカラムから溶出した；緩衝液Ａは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、０ｍＭイミダゾールを含有し、緩衝液Ｂは、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールを含有した。タンパク質を４℃で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１０％グリセロールに透析した。ＥＳＩ−ＭＳ及びドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してタンパク質純度を確認した。発現構築物を保有する誘導培養物からのタンパク質収率は、１．５ｍｇ／Ｌ（ＳｂｎＣ）、１．５ｍｇ／Ｌ（ＳｂｎＥ）、３ｍｇ／Ｌ（ＳｂｎＦ）及び１７ｍｇ／Ｌ（ＳｂｎＨ）と測定された。
【００８０】
質量分析
濃縮培養上清試料のＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、先に記述されているように（Ｂｅａｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）実施した。
【００８１】
インビトロ反応産物の分析のために、１００００の分子量カットオフ値でセントリコンを使用して酵素を最初に除去した。Ｑ−ＴＯＦ（ｍｉｃｒｏ，Ｗａｔｅｒｓ）質量分析計に接続したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０  Ａカラム（１５０×１．０ｍｍ、４μｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＣａｐＬＣから成るＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに流出液を注入した。１％Ｂから出発して１５分で５０％Ｂに上昇し、次に５分で９５％Ｂに上昇して、５分間保持する勾配を用いて４０μＬ／分の流速で分離を実施した。溶媒Ａは水であり、溶媒Ｂは９５％アセトニトリルであり、どちらも０．１％ギ酸を含んだ。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析を、陰イオンモードにて２００〜７００ｍ／ｚのスキャン範囲で実施した。アルゴンを衝突ガスとして使用して６０〜５００ｍ／ｚの質量範囲で衝突解離を実施した。情報となるフラグメンテーションスペクトルを得るために２０〜３０ボルトの可変衝突エネルギーを適用した。ＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．０（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）によってデータを取得し、解析した。
【００８２】
インビトロでのスタフィロフェリンＢ生合成
反応物は、１００μＬの総容量中、５ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤａｐ−ＨＣｌ、１ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン、１ｍＭのα−ＫＧ、５μＭのＳｂｎＣ、５μＭのＳｂｎＥ、５μＭのＳｂｎＦから成り、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中で緩衝した。ＳｂｎＨの必要性を置き換えるＤａｅの能力を評価する場合は、１ｍＭ  Ｄａｅを添加してＳｂｎＨ及び上記反応混合物のピリドキサール−５’−リン酸成分を置換した。反応物を暗所にて室温で一晩インキュベートした。
【００８３】
基質選択性（ヒドロキサム酸形成）アッセイ
すべての反応を３００μＬ容量で実施し、以下は各反応に共通であった：２．２５ｍＭのＡＴＰ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭヒドロキシルアミン及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４。いずれの酵素がクエン酸を基質として利用するかを評価するため、５μＭのＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ又はＳｂｎＦを３ｍＭクエン酸及び上述した共通反応成分と共にインキュベートした。同様に、いずれの酵素がα−ＫＧを基質として利用するかを評価するため、５μＭのＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ又はＳｂｎＦを３ｍＭ  α−ＫＧ及び共通反応成分と共にインキュベートした。ＳｂｎＦ又はＳｂｎＣによる基質としてのシトリル−Ｄａｅの潜在的認識を評価するため、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中で緩衝した２．２５ｍＭのＡＴＰ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭのＤａｅ、５μＭのＳｂｎＥを含有する一晩反応物においてこの中間体を形成した。次にこの反応物を７０℃で加熱処理してＳｂｎＥを不活性化し、その後反応物を１４，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、沈降した酵素をペレット化した。この時点でシトリル−Ｄａｅ中間体を含有する上清を、新鮮５μＭのＳｂｎＦ又はＳｂｎＣ、２．２５ｍＭのＡＴＰ及び１５０ｍＭヒドロキシルアミンと共にインキュベートした。ＳｂｎＦ又はＳｂｎＣに対する基質としてのシトリル−Ｄａｐの潜在的認識を評価するため、この中間体を、Ｄａｅの代わりに５０ｍＭのＤａｐを使用したことを除き、上記のように形成した。各々の反応物について、１００℃で１０分間加熱することによって酵素をあらかじめ不活性化した二重の対照反応物を調製した。上述したすべての反応物を暗所にて室温で１時間インキュベートした後、０．７ＭのＨＣｌ中の１０％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ３及び３．３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸から成る停止溶液３００μＬを添加した。反応物を２０，０００×ｇで５分間遠心分離して沈殿物を除去し、ヒドロキサム酸鉄の形成を５４０ｎｍで分光光度的に検出した。この試験で報告した相対吸光度値は、実験反応物の吸光度から対照（煮沸した酵素）反応物の吸光度を差し引いて計算した。
【００８４】
ＳｂｎＥについての動力学の測定
（ｉ）シトリル−ヒドロキサム酸についての吸光係数の測定
一晩インキュベートした、２．２５ｍＭのＡＴＰ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭヒドロキシルアミン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び５μＭのＳｂｎＥを含有する一連の反応物を、１００μＭ〜３０ｍＭにわたる様々なクエン酸ナトリウム濃度に対して試験した。停止溶液を添加し、５４０ｎｍで吸光度を測定した後、吸光度とクエン酸ナトリウムの間で直線関係を確立した。シトリル−ヒドロキサム酸の吸光係数は０．４５ｍＭ−１ｃｍ−１と測定された。
【００８５】
（ｉｉ）Ｋｍ、Ｖｍａｘ及びｋｃａｔの測定
ＳｂｎＥ触媒作用の動力学パラメータを測定するため、５００μＭクエン酸塩を２．２５ｍＭのＡＴＰ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭヒドロキシルアミン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び３μＭのＳｂｎＥと共にインキュベートした。生じる産物の変換速度は１０分でなおまだ線形であり、約１４％の基質から産物への変換をもたらした。そのため、０．２５ｍＭ〜３０ｍＭにわたるクエン酸濃度を用いて１０分の時点で反応速度を分光光度的に測定した。各クエン酸濃度での反応速度値をミカエリス−メンテン式に適合させ、非線形回帰によって分析した。検出限界及びＳｂｎＣによって形成されるヒドロキサム酸産物の不安定性のため、この酵素についての動力学パラメータは評価しなかった。
【００８６】
コンピュータ解析
ＤＮＡ配列分析及びＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．）及びＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウエアパッケージを用いて実施した。データの解析及びグラフ作成アプリケーションについてはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用した。
【００８７】
実験結果
黄色ブドウ球菌ｓｂｎオペロンはスタフィロフェリンＢの産生に関連する。
黄色ブドウ球菌におけるｓｂｎオペロンの産物を使用してスタフィロフェリンＢを合成した。黄色ブドウ球菌Ｈ１６６１（ＲＮ６３９０  Δｓｆａ）からの鉄飢餓使用済み培養上清（注：シデロフォアの抽出及び分析を単純化するためにスタフィロフェリンＡ欠損遺伝子バックグラウンドを使用した）をスタフィロフェリンＢの存在に関して分析し、黄色ブドウ球菌Ｈ１６４９（ＲＮ６３９０  ΔｓｆａΔｓｂｎ）のものと比較した。Ｈ１６６１の鉄飢餓使用済み培養上清においてスタフィロフェリンＢ（［Ｍ−Ｈ］−＝４４７．１４）を検出したが、Ｈ１６４９では検出されず、ｓｂｎオペロンがこのシデロフォアの合成に関与することを確認した。これまでの結果は、Ｈ１６６１がシデロフォア特性を有する分子を合成する場合に予想されるように、Ｈ１６６１の培養上清は黄色ブドウ球菌の鉄飢餓増殖を促進し得るが、Ｈ１６４９は促進できないことを明らかにした。
【００８８】
スタフィロフェリンＢのインビトロ合成
スタフィロフェリンＢ生合成オペロンからの予測タンパク質産物のバイオインフォマティクス分析は、シデロフォアシンテターゼ酵素のＮＩＳファミリーに属する３つの酵素（ＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ及びＳｂｎＦ）を同定した。これらの酵素は、その後アミン基質によって認識されてアミドへの全体的縮合反応を生じさせる、アシル−アデニレート中間体を介して進行する反応において、カルボン酸基質のＡＴＰ及びＭｇ２＋依存性活性化を触媒すると考えられる。ＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ及びＳｂｎＦ酵素の活性を検討するため、及びスタフィロフェリンＢ合成におけるそれらの役割を調べるために、各々を大腸菌においてヘキサヒスチジンタグ誘導体として独立して過剰発現させ、その後ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。３つのシンテターゼをスタフィロフェリンＢ成分であるＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、クエン酸、１，２−ジアミノエタン（Ｄａｅ）及びα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）と共にインキュベートした場合、スタフィロフェリンＢに対応するイオンは形成されなかった。付加的な精製Ｓｂｎ酵素を反応物に加えた。注目すべき点として、推定上のＰＬＰ依存性デカルボキシラーゼであるＳｂｎＨを、反応物中で３つのシンテターゼ及び基質と組み合わせた場合、スタフィロフェリンＢのものに対応するイオンが生成された。ＡＴＰ、Ｍｇ２＋、ＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ、ＳｂｎＦ、ＳｂｎＨ、Ｄａｐ、クエン酸又はα−ＫＧのいずれかを反応物から除いた場合、スタフィロフェリンＢイオンは生成されなかった（データは示していない）。注目すべき点として、スタフィロフェリンＢ合成は反応物にＤａｅを添加しない場合も進行することができた。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いて、インビトロで生成したスタフィロフェリンＢが鉄飢餓黄色ブドウ球菌の使用済み培養上清から単離したものと同じであることを確認した。
【００８９】
インビトロ合成したスタフィロフェリンＢは生物学的に活性である
スタフィロフェリンＢをインビトロで作製できることを立証したので、この分子が黄色ブドウ球菌細胞によって産生されるスタフィロフェリンＢと同じ生物学的特性（すなわち鉄を細菌に送達する能力）を有することを示すことが重要であった。これは、完全な反応物（すなわちクエン酸、Ｄａｐ、α−ＫＧ、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋及びＳｂｎＣＥＦＨを含有するもの）に由来する酵素反応物質はシデロフォア欠損黄色ブドウ球菌（すなわちΔｓｆａΔｓｂｎ）の鉄飢餓増殖を濃度依存的に容易に促進することができるが、不完全反応物（すなわちＡＴＰ又は酵素を欠く）は促進できないことを示すことによって確認された（図１４Ａ）。このスタフィロフェリンＢ依存性増殖促進は、ｓｂｎオペロンから分岐的に転写されるｓｉｒＡＢＣオペロンによってコードされる（図１３Ａ）、ＡＢＣ輸送体ＳｉｒＡＢＣによって仲介された（図１４Ｂ）。
【００９０】
クエン酸非対称化酵素、ＳｂｎＥはスタフィロフェリンＢ合成を開始させる
黄色ブドウ球菌ＳｂｎＥは、６６ｋＤａの計算上の分子質量及び５．５２の推定ｐＩを有する５７８アミノ酸長である。ゲルろ過分析は、このタンパク質が溶液中で二量体として存在することを明らかにする。バイオインフォマティクス分析はこの酵素を、ＮＲＰＳ非依存性シデロフォア（ＮＩＳ）シンテターゼのｌｕｃＡ／ｌｕｃＣファミリー、より詳細にはＡ型サブファミリーに位置づける。Ａ型酵素は、クエン酸を含む縮合反応に特異的であり、クエン酸のプロキラルカルボキシメチル基の１つの立体特異的アデニル化を触媒し、それをＬ−セリンとの反応のために活性化してアクロモバクチン前駆体を形成する。
【００９１】
ＳｂｎＥの酵素活性を検定するため、ヒドロキシルアミン捕捉アッセイ（Ｋａｄｉ  ＆  Ｃｈａｌｌｉｓ，２００９に記載されている）を使用した。基本的に、このアッセイは特定のカルボン酸に対するシンテターゼの比活性を観測するために使用される。図１５に示すように、試験した３つのＮＩＳシンテターゼ（ＳｂｎＣ、ＳｂｎＥ及びＳｂｎＦ）のうちで、ＳｂｎＥだけが基質としてのクエン酸に対して高レベルの比活性を示した。スタフィロフェリンＢの構造（図１３Ｂ）において、クエン酸はＤａｐ及びＤａｅによっていずれかの側で連結される。Ｄａｐ又はＤａｅとクエン酸の縮合は、それぞれ［Ｍ−Ｈ］−＝２７７．０８又は［Ｍ−Ｈ］−＝２３３．０９のイオン種を生じさせる。ＬＣ−ＭＳを使用して、クエン酸及びＤａｅと共にインキュベートしたＳｂｎＥは陰イオンモードで２３３．０９のｍ／ｚを有する種を生じさせないことを明らかにした。これに対し、クエン酸及びＤａｐと共にインキュベートした場合、ＳｂｎＥは［３］（［Ｍ−Ｈ］−＝２７７．０８）のＡＴＰ依存性形成を触媒した。この種は、クエン酸とＤａｐのＳｂｎＥ触媒縮合から生じ、β−シトリル−Ｄａｐ中間体を形成した。この反応産物はＣＡＳ試薬と強く反応したが、黄色ブドウ球菌の鉄飢餓増殖を促進することはできなかった（データは示していない）。Ｄａｐとクエン酸のＳｂｎＥ依存性縮合は、反応物中のクエン酸をクエン酸−１，５−１３Ｃ２に置き換えた場合、大きさが２ａｍｕ増大したイオンが出現したことによってさらに確認された。ヒドロキシルアミンアッセイにおいてクエン酸に対し小さなレベルの活性を示したＳｂｎＦは（図１５）、β−シトリル−Ｄａｐ中間体を形成することができなかった。
【００９２】
ＳｂｎＥによるクエン酸の認識の動力学を、ヒドロキシルアミン捕捉アッセイを使用して測定し、結果は以下の通りであった：Ｋｍ＝０．９９ｍＭ±０．１２、Ｖｍａｘ＝０．０４ｍＭ／分±０．００２、及びＫｃａｔ＝１６．０８ｌ／分±０．８７。ミカエリス−メンテン動力学が３０ｍＭクエン酸という高い基質濃度まで認められた。
【００９３】
ＳｂｎＥがクエン酸とＤａｅの間の縮合反応も実施できるかどうかを調べることは興味深かった。この反応は起こるが、等モル濃度のクエン酸、Ｄａｐ及びＤａｅを提供した場合、ＳｂｎＥは容易にシトリル−Ｄａｐ中間体（［Ｍ−Ｈ］−＝２７７．１）を形成し、シトリル−Ｄａｅ（［Ｍ−Ｈ］−＝２３３．１）の形成と相関する質量イオン種を実質的に形成しないことが測定された。従って、これは、ＤａｐがＳｂｎＥに対する好ましいアミン基質であることを示唆する。
【００９４】
ＳｂｎＨはシトリル−Ｄａｐ中間体のピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性脱炭酸反応を実施する
ＳｂｎＨは４００アミノ酸長であり、４５．８ｋＤａの質量及び５．８５の推定ｐＩを有する。上述したように、データは、スタフィロフェリンＢ（ＳＢ）合成におけるＳｂｎＨの必須の役割を明らかにした。そのため、経路内のどの段階で脱炭酸反応が起こるかを定義することは興味深かった。上記のように、ＳｂｎＣＥＦＨの存在下では、ＳＢ生合成は基質であるクエン酸、Ｄａｐ及びα−ＫＧの存在に依存したが、Ｄａｅには依存しなかった。Ｄａｐの脱炭酸反応がＤａｅを生成するので、これは注目すべきである。しかし、Ｄａｅを含むがＳｂｎＨを欠くＳｂｎＣＥＦ含有酵素反応がＳＢの形成を生じさせないという事実に基づき、ＳｂｎＨによる遊離ＤａｐのＳｂｎＨ依存性脱炭酸反応は起こらないと考えられ、遊離Ｄａｅは構造に組み込まれないことを示唆する。ＳｂｎＥ、クエン酸及びＤａｐを含む反応にＳｂｎＨを加えた場合、［３］への脱炭酸反応が［４］を生じることと一致して、２３３．０９の［Ｍ−Ｈ］−を有する種が出現した（図１６参照）。このＳｂｎＨ依存性中間体のさらなる証拠は、クエン酸をクエン酸−２，４−１３Ｃ２に置き換えた反応における［Ｍ−Ｈ］−＝２３５．０９の種の出現である。
【００９５】
ＳｂｎＦはスタフィロフェリンＢ中間体を形成するために必要である
ＳｂｎＦは、６８．９ｋＤａの理論的質量及び５．０７の推定ｐＩを有する５９２アミノ酸長のタンパク質である。ゲルろ過分析は、ＳｂｎＦが溶液中で二量体であることを示す。バイオインフォマティクス分析は、スタフィロフェリンＢの公知の構造と共に、推定上のＣ型シンテターゼであるＳｂｎＦが、アミノ又はヒドロキシル含有基質と、既にモノアミドであるがまだ遊離プロキラルカルボキシルを有する２番目の基質との間でアミド結合を形成することを示す。そこで、得られたデータがＳｂｎＥ、ＳｂｎＨ、クエン酸及びＤａｐを含む反応からの［４］の生成と一致することを考慮すると、ＳｂｎＦはこの中間体にＤａｐの分子を付加するように働くことができると仮定され、これはスタフィロフェリンＢ（ＳＢ）の公知の構造と一致する。潜在的基質を、最初に基質捕捉（ヒドロキシルアミン）アッセイを用いて検討した。予想通り、ＳｂｎＦは、ＳｂｎＥ、クエン酸及びＤａｐを含む反応のシトリル−Ｄａｐ産物（［３］に対応する質量イオン２７７．１）と反応しなかった。次にＳｂｎＥ、ＳｂｎＨ、クエン酸及びＤａｐを含む反応の産物（シトリル−Ｄａｅ［４］と一致する２３３．１の質量イオンを生じる）を使用することを試みた。残念ながら、ＳｂｎＨに関連するＰＬＰがアッセイに干渉することが認められた。これを克服するため、ＬＣ−ＭＳ実験のための通常の反応設定と比較して１７倍モル過剰のＤａｅの存在下でＳｂｎＥをクエン酸と反応させることによってシトリル−Ｄａｅを生成した。この場合、ＳｂｎＦはシトリル−Ｄａｅ中間体に関して高レベルの活性を示した。ＳＢの構造において、Ｄａｅ分子はクエン酸及びＤａｐと結合している。そのため、ＳｂｎＦはシトリル−Ｄａｅ中間体を認識し、Ｄａｐと縮合したと仮定するのが妥当であった。この反応は、［Ｍ−Ｈ］−＝３１９．１の種を生成する。ＬＣ−ＭＳは、この種がＳｂｎＥ、ＳｂｎＨ、ＳｂｎＦ、クエン酸及びＤａｐを含むＡＴＰ依存性反応において出現することを確認した。２３３．１及び２７７．１の質量イオンもこれらの反応において検出可能であった。完全な反応物がクエン酸の代わりにクエン酸−２，４−１３Ｃ２を含む場合、２３３．１、２７７．１及び３１９．１の質量イオンは各々２質量単位高くシフトした。ＳｂｎＦがＳｂｎＥ触媒シトリル−Ｄａｐ産物と反応しなかったことを示すヒドロキシルアミンアッセイの結果と一致して、ＳｂｎＦをＳｂｎＥ、クエン酸及びＤａｐと反応させた場合、３６３．１の質量イオン（Ｄａｐ−シトリル−Ｄａｐ）は検出されなかった（データは示していない）。すべてを合わせると、データは、ＳｂｎＦが経路内でＳｂｎＥ及びＳｂｎＨの後に作用し、Ｄａｐの１つの分子を［４］と縮合することによって［５］を生成することと一致する（図１６）。
【００９６】
ＳｂｎＣはスタフィロフェリンＢの合成を完了する反応においてα−ＫＧを活性化する
ＳｂｎＣは、６６．４ｋＤａの質量及び４．９３の推定ｐＩを有する５８４アミノ酸長である。ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、ＳｂｎＣは溶液中で二量体であると測定された。ＳｂｎＣは、バイオインフォマティクス分析に基づきＢ型シンテターゼと同じ群に属し、これは、推定上、１つの基質のアミノ又はヒドロキシル基とα−ＫＧのＣ５カルボキシル基の間でのアミド結合形成を触媒することを意味する。ヒドロキシルアミン捕捉アッセイは、ＳｂｎＣはα−ＫＧを活性化するが、ＳｂｎＥ又はＳｂｎＦはα−ＫＧを活性化しないことを示した（図１５）。次にＬＣ−ＭＳを使用して、α−ＫＧ、クエン酸、Ｄａｐ、ＳｂｎＥ、ＳｂｎＨ及びＳｂｎＦを含む（すなわちＳｂｎＣを欠く）酵素反応物はスタフィロフェリンＢを形成しないが（バックグラウンドを上回る検出可能な陰イオンモードでｍ／ｚ＝４４７．１を有する種なし）、化合物［５］と相関するイオン種を形成することを明らかにした（図１６）。これらの結果は、ＳｂｎＣがスタフィロフェリンＢ生合成の最終段階でα−ＫＧを［５］と縮合することを示唆する（図１６）。
【００９７】
考察
スタフィロフェリンＡは、各々が１個のＤ−オルニチン分子にアミド結合した２分子のクエン酸から成る。遺伝子クラスターは、２つのＮＩＳシンテターゼ（ＳｂｔＢ及びＳｂｔＤ）、アミノ酸ラセマーゼ（ＳｂｔＣ）（おそらくＬ−オルニチンに特異的）並びに推定上の膜包埋シデロフォア流出タンパク質（ＳｂｔＡ）をコードする。スタフィロフェリンＡの生合成において、ＳｂｔＤは、クエン酸のＡＴＰ依存性アデニル化を利用して合成を開始させるために出現して中間体を形成し、この中間体は縮合反応においてＤ−オルニチンのδ−アミンによって捕捉され、アミド結合含有中間体を生じさせる。同様の反応機構で、次にＳｂｔＢが出現し、δ−シトリル−Ｄ−オルニチン中間体の遊離アミンと２番目のクエン酸分子とのＡＴＰ依存性縮合を触媒して、最終的なスタフィロフェリンＡシデロフォア構造を形成する。
【００９８】
Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、クエン酸、１，２−ジアミノエタン（Ｄａｅ）及びα−ＫＧから成るスタフィロフェリンＢの生合成は、ＮＩＳ依存的に合成される。ｓｂｎ遺伝子クラスターは３つのＮＩＳシンテターゼ（ＳｂｎＣＥＦ）をコードする。本明細書で述べるように、黄色ブドウ球菌ｓｂｔ欠失突然変異株（すなわちスタフィロフェリンＡを合成しない）は、容易に検出可能な量のスタフィロフェリンＢを生成する。ｓｂｔ及びｓｂｎ遺伝子クラスターの両方の欠失を含む突然変異株の培養上清ではシデロフォアが検出されなかったので、黄色ブドウ球菌におけるスタフィロフェリンＢ合成はｓｂｎ遺伝子に依存した。
【００９９】
スタフィロフェリンＢ生合成経路を明らかにするため、Ｓｂｎタンパク質を精製し、スタフィロフェリンＢ成分と反応させた。ＡＴＰ、Ｍｇ２＋及びスタフィロフェリンＢの４つの成分基質と共に３つのシンテターゼ（ＳｂｎＣＥＦ）をワンポットアッセイに含めてもスタフィロフェリンＢの形成を生じさせなかったことは注目すべきである。スタフィロフェリンＢは、ＰＬＰ依存性デカルボキシラーゼ、ＳｂｎＨをアッセイに含めた場合にのみ形成された。
【実施例１２】
【０１００】
＜スタフィロフェリンＡの生合成＞
反応産物、ＳｆａＤ、ＳｆａＢ、Ｄ−オルニチン、クエン酸、ＡＴＰ及びＭｇ２＋をペーパーディスクに載せ、それを、鉄源が供給されない限り増殖しない黄色ブドウ球菌を含ませた寒天プレート上に置いた。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした後、ディスクの周囲の増殖半径を測定した。
【０１０１】
無細胞系で合成したスタフィロフェリンＡは生物学的に活性であることが認められた。前記スタフィロフェリンＡは、Ｈｔｓ輸送体（スタフィロフェリンＡに特異的）を発現するすべての株、すなわち野生型黄色ブドウ球菌（図１８Ａ）及びＳｉｒＡ突然変異株（図１８Ｂ）の増殖を促進したが、Ｈｔｓに関して突然変異させた株、すなわちＨｔｓ突然変異株（図１８Ｃ）及びＨｔｓＳｉｒ突然変異株（図１８Ｄ）の増殖は促進しなかった。
【０１０２】
スタフィロフェリンＡ生合成の経路を図１９に示す。
【０１０３】
ＳｆａＤ、ＳｆａＢ、Ｄ−オルニチン、クエン酸、ＡＴＰ及びＭｇ２＋のいずれか１つを除くと、スタフィロフェリンＡ産生が排除されることが認められた。
【実施例１３】
【０１０４】
＜Ｈｔｓ及びＳｉｒシデロフォア結合ポケット＞
結晶化のためのＨｔｓＡを、３０℃で〜０．８の光学密度に増殖させ、その後０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導して、２５℃で一晩インキュベートした大腸菌ＥＲ２５６６細胞から発現させた。ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ）を用いて細胞を破砕し、１００，０００ｇで３０分間の遠心分離後に可溶性画分を単離した。ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して可溶性６ｘＨｉｓ−ＨｔｓＡを精製し、次にトロンビン消化によって６ｘＨｉｓタグを除去した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）で平衡させたＳｏｕｒｃｅ−１５Ｓカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び溶出のためのＮａＣｌ勾配（０〜５００ｍＭ）を使用して陽イオン交換クロマトグラフィーによってタンパク質をさらに精製した。すべての結晶化実験のためにＨｔｓＡを２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）に透析した。セレノメチオニン標識ＨｔｓＡを先に記述されている方法（Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）によって生成し、同様に天然ＨｔｓＡを精製した。
【０１０５】
Ａｐｏ−ＨｔｓＡ結晶を懸滴蒸気拡散によって室温で成長させた。ウェル溶液は、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）及び２４〜３０％  Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  ＥＤ−２００１を含んだ。懸滴は、２５ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液１μｌ及びウェル溶液１μｌから作製した。結晶を、１５％グリセロールを添加したウェル溶液に短時間液浸した後、液体窒素で瞬間凍結した。
【０１０６】
セレノメチオニン標識タンパク質結晶についての単波長異常分散データを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいてビームライン７−１を用いて収集した。データを、Ｍｏｓｆｌｍ及びＳＣＡＬＡを使用して処理し、積算した。結晶を非対称ユニット中１個の分子で空間群Ｐ２１において成長させた。位相をＳｏｌｖｅ及びＲｅｓｏｌｖｅを使用して決定し、０．４０のメリットという最初の数字は密度修正で０．８０に改良された。初期モデルはＡｒｐＷＡＲＰを用いて構築した。天然タンパク質の結晶Ｘ線回折データをＣａｎａｄｉａｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅにおいてビームライン０８ＩＤ−１を用いて収集し、ＨＫＬ２０００を使用して処理し、積算した。両方の構造について、手操作での構築と精密化を、それぞれＣｏｏｔ及びＲｅｆｍａｃ５を使用して完了した。結晶学的データ及び精密化統計値を表６に示す。
【０１０７】
【表６】
2012500226.tif 000010
【０１０８】
構造は残基Ｔｈｒ−３８〜Ｌｙｓ−３２７から成り、これは、おそらく共にフレキシブルアンカーを形成するＣｙｓ−２２脂質化部位の後の１５個のＮ末端残基を除く。ＨｔｓＡ及びＳｉｒＡは、単一αへリックス骨格によって架橋された混合α／β構造のＮ末端及びＣ末端ローブから成る（図２０）。リガンド結合溝は浅く、図２０Ｂに示すように大きな塩基性パッチによって占められている。全体的な折り畳みは、ＨｔｓＡをクラスＩＩＩペリプラズム結合タンパク質ファミリーに位置づける。
【０１０９】
溝内のリガンド結合を検討するため、リガンド結合ＣｅｕＥ、ＦｈｕＤ、ＳｈｕＴ、ＰｈｕＴ及びＩｓｄＥ構造をＨｔｓＡ及びＳｉｒＡに重ね合わせた。重ね合わせた場合、これらの構造に結合したリガンドは、結合溝内の高度に類似する側方位置で重なる。ＨｔｓＡの対応する領域は、主として溝に方向づけられた６つのＡｒｇ残基（Ａｒｇ−８６、１０４、１２６、２９９、３０４及び３０６）が寄与する正の静電ポテンシャルの大きなパッチを含む（図２０Ｂ）。リガンド結合溝における正に荷電した側鎖のこの配置は、陰イオン性スタフィロフェリンＡ分子との相互作用を促進する。スタフィロフェリンＡ配位残基がＹ２１４及びＨ２０９であることが指示される。
【０１１０】
合わせると、このデータは、初めて、その後の取り込みのためのシデロフォアとＨｔｓ及びＳｉｒ輸送系の各々との相互作用を阻害するための標的領域として役立つＨｔｓＡ及びＳｉｒＡ内の領域が同定されたことを示す。
【０１１１】
＜参照＞
【表７Ａ】
2012500226.tif 000011
【表７Ｂ】
2012500226.tif 000012
【０１１２】
本明細書で参照されるすべての文献の関連部分は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
2012500226.tif 000013
【図２】
2012500226.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2012500226.tif 000018
【図７】
2012500226.tif 000019
【図８】
2012500226.tif 000020
【図９】
2012500226.tif 000021
【図１０】
2012500226.tif 000022
【図１１】
2012500226.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
2012500226.tif 000025
【図１４】
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【図１５】
2012500226.tif 000027
【図１６】
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【図１７】
2012500226.tif 000029
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
2012500226.tif 000033
2012500226.tif 000034
2012500226.tif 000035
2012500226.tif 000036
2012500226.tif 000037
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