(57)【要約】本発明は、以下の一般式を有するペプチド又はペプチド誘導体に関する：Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ2−Ｋ3−Ｐ4−Ｐ5−Ｙ6−Ｌ7−Ｐ8−Ｒ9−Ｐ10−Ｘ2−Ｐ12−Ｐ13−Ｒ14−Ｘ3−Ｉ16−Ｐ17／Ｙ17−Ｎ18−Ｎ19−Ｘ4−Ｓｕｂ2、但し、Ｘ1は非極性かつ疎水性の基又は正に帯電した基であり、Ｄ2はアスパラギン又はグルタミンであり、Ｋ3、Ｘ2及びＸ4は正に帯電した基であり、Ｘ3は正に帯電した基、プロリン又はプロリン誘導体であり；Ｌ7及びI16は非極性かつ疎水性の基であり、Ｙ6及びＹ17はチロシンであり、Ｒ9及びＲ14はアルギニンであり、Ｎ18及びＮ19はアスパラギン又はグルタミンであり、Ｐ4、Ｐ5、Ｐ8、Ｐ10、Ｐ12、Ｐ13及びＰ17はプロリン、ヒドロキシプロリン又はその誘導体であり、場合によりＤ2、Ｐ4、Ｐ5、Ｐ8、Ｐ10、Ｐ12、Ｐ13、Ｐ17及びＹ17から選択される１又は２の基が任意の基で置換されており、及び／又はＰ13及びＰ14が交換されており、Ｓｕｂ1は遊離又は修飾されたＮ末端であり、及びＳｕｂ2は遊離又は修飾されたＣ末端である。本発明は、さらに、医学における、抗生物質としての、消毒剤又は清浄剤における、保存剤としての又は包装材における、医薬研究における、又はスクリーニング法における、ペプチド及びペプチド誘導体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列を含有するペプチド又はペプチド誘導体：
Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ2−Ｋ3−Ｐ4−Ｐ5−Ｙ6−Ｌ7−Ｐ8−Ｒ9−Ｐ10−Ｘ2−Ｐ12−Ｐ13−Ｒ14−Ｘ3−Ｉ16−Ｐ17／Ｙ17−Ｎ18−Ｎ19−Ｘ4−Ｓｕｂ2
但し、Ｘ1は、非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基、又は正の正味電荷若しくは生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基であり；
Ｄ2は、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり；
Ｋ3は、正の正味電荷又は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基、好ましくはリジン又はアルギニンであり；
Ｘ2及びＸ4は、互いに独立して、正の正味電荷又は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基から選択され；
Ｘ3は、正の正味電荷又は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基又はプロリン又はプロリン誘導体であり；
Ｌ7は、非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基、好ましくはロイシン、イソロイシン及びバリンから選択され；
I16は、非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基、好ましくはロイシン、イソロイシン、tert-ブチルグリシン及びバリンから選択され；
Ｙ6及びＹ17は、いずれの場合にもチロシンであり、Ｒ9及びＲ14は、いずれの場合にもアルギニンであり、Ｎ18はアスパラギン又はグルタミンであり、Ｎ19は、アスパラギン又はグルタミンであるか、或いは存在せず、Ｐ4、Ｐ5、Ｐ8、Ｐ10、Ｐ12、Ｐ13及びＰ17は、互いに独立して、プロリン及びプロリン誘導体、又はヒドロキシプロリン及びヒドロキシプロリン誘導体から選択され；
Ｓｕｂ1は、アミノ酸Ｘ1の遊離Ｎ末端又は修飾されたＮ末端アミノ基であり；
Ｓｕｂ2は、Ｃ末端アミノ酸の遊離Ｃ末端カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又は修飾されたＣ末端カルボキシル基である。
【請求項２】
Ｐ13及びＰ14が交換されており、及び／又はＤ2、Ｐ4、Ｐ5、Ｐ8、Ｐ10、Ｐ12、Ｐ13、Ｐ17及びＹ17から選択される１又は２の残基が任意の残基で置換されている、請求項１に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項３】
Ｎ末端が、直接又はリンカーを介して別のペプチドに連結されている、請求項１又は２に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項４】
Ｓｕｂ2において少なくとも１つの追加の残基Ｘ5及び／又はＸ6を含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体であって、Ｘ5がプロリン、プロリン誘導体、及び正の正味電荷を有するか又は生理的条件下で正に帯電する側鎖を有する構成ブロックから選択され、かつＸ6がプロリン、プロリン誘導体、極性構成ブロック又は疎水性構成ブロックから選択される、上記ペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項５】
残基Ｘ1が、アルギニン、リジン、δ−ヒドロキシリジン、ホモアルギニン、２，４−ジアミノ酪酸、β−ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、アルギナル、２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、ニトロアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン、ε−Ｎ−メチルリジン、アロ−ヒドロキシリジン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、オルニチン、ｓｙｍ−ジメチルアルギニン、ａｓｙｍ−ジメチルアルギニン、２，６−ジアミノヘキシン酸、ｐ−アミノ安息香酸、３−アミノチロシン，バリン、イソロイシン、ロイシン、及びメチオニン、アラニン、フェニルアラニン、Ｎ−メチルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、１−アミノシクロヘキシルカルボン酸、Ｎ−メチルイソロイシン、ノルロイシン、ノルバリン及びＮ−メチルバリンから選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項６】
残基Ｘ2及び／又は残基Ｘ4が、互いに独立して、アルギニン、リジン、δ−ヒドロキシリジン、ホモアルギニン、β−ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、アルギナル、２，４−ジアミノ酪酸、２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、ニトロアルギニン、ニトロソアルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ε−Ｎ−メチルリジン、アロ−ヒドロキシリジン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、オルニチン、ｓｙｍ−ジメチルアルギニン、ａｓｙｍ−ジメチルアルギニン、２，６−ジアミノヘキシン酸、ｐ−アミノ安息香酸，及び３−アミノチロシンから選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項７】
残基Ｘ3が、アルギニン、リジン、δ−ヒドロキシリジン、ホモアルギニン、β−ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、アルギナル、２，４−ジアミノ酪酸、β−ホモアルギニン、２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、ニトロアルギニン、ニトロソアルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ε−Ｎ−メチルリジン、アロ−ヒドロキシリジン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、オルニチン、ｓｙｍ−ジメチルアルギニン、ａｓｙｍ−ジメチルアルギニン、２，６−ジアミノヘキシン酸、ｐ−アミノ安息香酸，３−アミノチロシン、プロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、シス−３−ヒドロキシプロリン、トランス−３−ヒドロキシプロリン、β−シクロヘキシルアラニン、３，４−シス−メタノプロリン、３，４−デヒドロプロリン、ホモプロリン及び擬似プロリンから選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項８】
配列番号５〜９、１４〜２６、２９、３０、３２、３３、３６、３８、４０、４１、４４〜４６、４９、５０、５３〜５９、６１〜８５、９３、９４、１０１、１０２及び１０７〜１１２を含む配列から成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項９】
抗細菌ペプチド及び細胞貫通性ペプチドを含有するペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１０】
前記抗細菌ペプチドが、アピダエシン、ドロソシン、フォルマエシン１、ピロコリシン及びメタルニコウィン１を含む群から選択される、請求項９に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１１】
前記抗細菌ペプチドが、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体を含む、請求項９に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１２】
前記細胞貫通性ペプチドが、ペネトラチン、Ｔａｔペプチド、モデル両親媒性ペプチド、トランスポータン、ＳｙｎＢ及びシス−γ−アミノ−１−プロリン含有ペプチドを含む群から選択される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１３】
配列番号９５〜１０２及び１０６を含む群から選択される請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１４】
ペプチド主鎖のペプチド結合の少なくとも１つが化学的に修飾されていることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１５】
Ｘ6−Ｘ7の間の結合が、生理的条件下で切断することができない化学結合であることを特徴とする、請求項１４に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１６】
化学的に修飾された結合が、還元アミド結合、アルキル化アミド結合又はチオアミド結合から選択されることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１７】
タンパク質に連結されているか、又はポリマーに結合されているか、又はキャリアに結合されている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
【請求項１８】
少なくとも２つのペプチド又はペプチド誘導体が共に連結されている多量体であって、該ペプチド又はペプチド誘導体の少なくとも一つが、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド誘導体であることを特徴とする、上記多量体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の少なくとも一つのペプチド、ペプチド誘導体又は多量体を含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチド誘導体又は多量体を製造する方法であって、ペプチド又はペプチド誘導体又は多量体が化学合成又は組換え法によって製造されることを特徴とする、上記方法。
【請求項２１】
医薬品の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチド誘導体又は多量体の使用。
【請求項２２】
消毒剤及び／又は清浄剤としての、保存剤としての、及び／又は包装材における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチド誘導体又は多量体の使用。
【請求項２３】
微生物、細菌又は真菌の感染の治療に用いるための請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチド誘導体及び／又は多量体。
【請求項２４】
微生物、細菌又は真菌による汚染を取り除くための請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチド誘導体及び／又は多量体の使用。
【請求項２５】
医薬研究又はスクリーニング法における請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチド誘導体又は多量体の使用。
【請求項２６】
以下の工程を含む、抗細菌作用又は抗真菌作用を有する物質を同定するための方法：
（ｉ）以下を用いて競合アッセイを実施すること：
（ａ）請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチド誘導体又は多量体に感受性がある微生物、
（ｂ）請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチド誘導体又は多量体、及び
（ｃ）（ｂ）及び（ｃ）に（ａ）を接触させることによって試験すべき少なくとも１つの物質；及び
（ｉｉ）微生物上におけるペプチド、ペプチド誘導体又は多量体の結合を競合的に置き換える試験物質を選択すること。
【請求項２７】
微生物が、エシェリシア・コーライ (Escherichia coli)、エンテロベクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、モルガネラ・モルガニイ(Morganella morganii)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、アシネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)、シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)及びヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)を含む属の群から選択される種である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチド又は多量体をコードする核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の１以上の核酸を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に薬剤に用いるための抗生物質ペプチド及びペプチド誘導体に関する。
【０００２】
本発明は、さらに、たとえば、細菌又は真菌のような微生物を破壊するための組成物及び方法、並びに微生物感染を治療する方法に関する。本発明は、さらに、活性物質をスクリーニングする方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
抗生物質による治療法の著しい進歩にもかかわらず、細菌及び真菌の重篤な感染の発生は深刻化する問題となっている。米国では、毎年、４０００万人を超える人が病院に収容され、これらの患者のうち２００万人を超える者が病院内で感染している。抗生物質耐性の細菌がこれらの症例の５０〜６０％に関与する（トーマス・エー（Tomasz A.）、複数の抗生物質耐性の病原性細菌−ロックフェラー大学のワークショップにおける報告（Multiple-Antibiotic-Resistant Pathogenic Bacteria -A Report on the Rockefeller-University Workshop）、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン(New England Journal of Medicine)、330: 1247-51, 1994）。これらの院内感染疾患は米国では６０，０００〜７０，０００の死亡及びドイツでは１０，０００までの死亡をもたらすと推定されている（ウェンツェル・アール・ピー（Wenzel R P.）、院内感染の血液感染症の死亡率−新しい人口動態統計の必要性（The Mortality of Hospital-Acquired Blood-Stream Infections - Need for A New Vital Statistic.）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・エピデミオロジー(International Journal of Epidemiology) 17: 225-7, 1988）。１９７０年代では耐性のグラム陰性細菌が主要な問題であったが、この１０年間、幾つかの抗生物質に耐性であるグラム陽性細菌が関与する症例が増えている（モエラーリング・アール・シー(Moellering R C.)、グラム陽性好気性感染による耐性の出現：我々はこれからどこへ向かうのか？序論：グラム陽性球菌における抗菌剤耐性の問題(Emerging resistance with gram-positive aerobic infections: Where do we go from here? Introduction: Problems with antimicrobial resistance in gram-positive cocci.)、クリニカル・インフェクシャス・ディジーズ(Clinical Infectious Diseases) 26: 1177-8, 1998）。耐性株の現在の急速な進展には、グラム陽性及びグラム陰性の双方の病原体が関与する（ハンド・ダブリュ・エル(Hand W L.)、抗生剤耐性における現在の挑戦(Current challenges in antibiotic resistance.)、アドールセント・メディスン(Adolescent Medicine) 11: 427-38, 2000）。耐性は先ず、単一の突然変異が臨床的に重要なレベルに達するのに十分であった種、たとえば、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス；Staphylococcus aureus）及び緑膿菌(シュードモナス・アエルギノーザ; Pseudomonas aeruginosa)において発生し、次に、複数の突然変異を必要とする種、大腸菌(E. coli)及び淋菌(ナイセリア・ゴノレア; Neisseria gonorrhoeae)に生じた。このことは主として、フルオロキノロン抗生物質の頻繁な使用による（フーパー・ディー・シー(Hooper D C.)、フルオロキノロン耐性の新たなメカニズム(Emerging mechanisms of fluoroquinolone antibiotics)、エマージング・インフェクシャス・ディジーズ(Emerging Infectious Diseases) 7: 337-41, 2001）。グラム陰性細菌における耐性の発生の別の重要な原因は、大腸菌(エシェリシア・コーライ；Escherichia coli)及びクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)における広範囲にわたるラクタマーゼである（ジョーンズ・アール・エヌ(Jones R N.)、院内感染の病原体の間での耐性パターン−過去数年にわたる傾向(Resistance patterns among nnosocomial pathogens-Trends over the past few years.)、チェスト(Chest) 119: 397S-404S, 2001）。軟性下疳の原因菌であるヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)の臨床的に関わりのある株のほぼ半分は、この細菌をアモキシシリン、アンピシリン及び幾つかのそ���ほかのβ−ラクタムに対して耐性にする遺伝子を持っている（プラチャヤシチカル・ブイ(Prachayasittikul V)、ラワング・アール(Lawung R)、及びブロウ・エル(Bulow L.)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)におけるエピソームの特性及び可動性β−ラクタマーゼ・プラスミド(Episome profiles and mobilizable beta-lactamase plasmid in Haemophilus ducreyi.)、ザ・サウスイースト・アジアン・ジャーナル・オブ・トロピカル・メディスン・アンド・パブリック・ヘルス(Southeast Asian J Trop Med Public Health) 31: 80-4, 2000）。同様に、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム(Salmonella enterica serovar typhimurium)のテトラサイクリンに対する耐性は１９４８年のゼロパーセントから１９９８年には９８％に上昇した（チューバー・エム(Teuber M.)、食物が媒介する病原体による抗生物質耐性の蔓延(Spread of antibiotic resistance with food-borne pathogens.)、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンス(Cellular and Molecular Life Sciences) 56: 755-63, 1999）。
【０００４】
このことは、新しい抗生物質のさらなる検索の必要性を説明している。誘導可能な抗細菌ペプチドは、現代の生化学、免疫学及び活性物質の研究が一体となる研究の分野を代表する。１３個から１００個を超えるアミノ酸の大きさにわたるペプチド抗生物質が、植物、動物及び微生物から単離されている（ボマン・エイチ・ジー(Boman H G.)、ペプチド抗生物質及び先天性免疫におけるその役割(Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity.)、アニュアル・レビュー・オブ・イミュノロジー(Annual Review of Immunology) 13: 61-92, 1995）。単一の動物は、およそ６〜１０個のペプチド抗生物質を有し、各ペプチドは完全に異なった活性スペクトルを示すことが多い（バラ・ディー(Barra D)、シマコ・エム(Simmaco M)、及びボマン・エイチ・ジー(Boman H G.)、遺伝子がコードするペプチド抗生物質及び先天性免疫。微小動物は防衛費を有するか？(Gene-encoded peptide antibiotics and innate immunity. Do 'animalcules' have defense budgets?) フェブス・レターズ(Febs Letters) 430: 130-4, 1998）。よく研究されているデフェンシン、セクロピン及びマゲイニンを含む圧倒的な数の抗細菌ペプチドは、「溶解性／イオン性」("lytic/ionic")のメカニズムによって作用することが知られている。細菌の細胞質膜に対する透過性の効果はこれら「溶解性」ペプチドの作用の共通するメカニズムとして議論されている（ラドトケ・エス(Ludtke S)、ヒー・ケー(He K)、及びフアング・エイチ(Huang H.)、マゲイニン２によって生じる膜の薄化(Membrane thinning caused by magainin 2.)、バイオケミストリー(Biochemistry) 34: 16764-9, 1995; ウィムレイ・ダブリュ・シー(Wimley W C)、セルステッド・エム・イー(Selsted M E)、及びホワイト・エス・エイチ(White S H.)、ヒトのデフェンシンと脂質二重層との間の相互作用−多量体の孔の形成の証拠(Interactions Between Human Defensins and Lipid Bilayers - Evidence for Formation of Multimeric Pores.)、プロテイン・サイエンス(Protein Science) 3: 1362-73, 1994;シャイ・ワイ(Shai Y.)、膜貫通のポリペプチド間の分子認識(Molecular Recognition Between Membrane-Spanning Polypeptides.)、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシズ(Trends in Biochemical Sciences) 20: 460-4, 1995）。脂質二重層に親水性のイオン（プロトン）チャンネルを形成するカチオン性の両親媒性構造が、この活性の基礎である。プロトンの流出のために、多数の基礎的な生命過程に必要である膜電位が妨害され、その結果、細胞が殺傷される。これらのペプチドによる膜の妨害は、キラル分子の認識に左右されるので、一般的な両親媒性構造又は基本正味電荷(basic net charge)を取除かないアミノ酸の交換は、機能的に認容される（ウェイド・ディー（Wade D）ら、すべてのＤアミノ酸を含有するチャンネル形成性の抗生物質ペプチド(All-D Amino Acid-Containing Channel-Forming Antibiotic Peptides)、米国化学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America） 87: 4761-5, 1990;ステイナー・エイチ(Steiner H)、アンドリュー・ディー(Andreu D)、及びメリフィールド・アール・ビー(Merrifield R B.)、セクロピンとセクロピン類似体の結合及び作用−昆虫由来の抗細菌ペプチド(Binding and Action of Cecropin and Cecropin Analogs - Antibacterial Peptides from Insects.)、バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta) 939: 260-6, 1988）。高い濃度にてこれらの溶解性ペプチドは哺乳類の膜に対して毒性���用を有することが多く、それは、予定される医薬品としての適合性を制限している。α−螺旋状の抗菌ペプチドの配列にプロリンを挿入すると、プロリン残基の数の関数として大腸菌の細胞質膜を透過性にするペプチドの能力が低下する。これを調べると、少なくとも一部のグラム陰性病原体に関する、最も活性が高い、天然の抗細菌ペプチドの一部が、プロリン−リッチ・ペプチドのファミリーに属することは驚くべきことである（オトボス・エル(Otvos L)ら、改善されたプロテアーゼ耐性を有する昆虫のペプチドは細菌感染に対してマウスを保護する(Insect peptides with improved protease-resistance protect mice against bacterial infection.)。プロテイン・サイエンス(Protein Science) 9: 742-9, 2000）。
【０００５】
上述の副作用は、哺乳類の類似体との交差反応を示すことなく、細菌のタンパク質又はそのほかの細胞内若しくは細胞外の成分を特異的に認識する、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）によって克服される。この事は、元々昆虫から単離されたアピダエシン、ドロソシン及びピロコリシンを含むプロリン−リッチの抗菌ペプチドに当てはまると思われる。大きさ及び生化学的な特性における膨大な変異と共に、構造−活性(structure-activity)及び立体配置−活性(conformation-activity)の関係が抗細菌ペプチド研究の焦点であることは驚くべきことではない。生物学的な強さに関する天然の抗細菌ペプチドのレパートリーを完全に検討することは一般的な生化学的疑問にとってだけでなく、医薬業界についての一定の関心にとっても重要である。ペプチドに基づいた抗生物質による試験管内試験の問題にかかわらず、一部の天然の、カチオン性の抗細菌ペプチドは臨床試験フェーズにすでに到達している（ボマン・エイチ・ジー(Boman H G.)、ペプチド抗生物質及び先天性免疫におけるその役割(Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity.)。アニュアル・レビュー・オブ・イミュノロジー(Annual Review of Immunology) 13: 61-92, 1995）。これらペプチドの一部は早期の臨床試験相において局所(topical)（局所;local）剤としての活性を示したが、他方は、全身性療法において活性があった。たとえば、髄膜炎菌血症の非経口治療に使用されるカチオン性タンパク質、ｒＢＰＩ２１は、臨床試験の第３相を完了している（ボマン・エイチ・ジー(Boman H G.)、ペプチド抗生物質及び先天性免疫におけるその役割(Peptide Antibiotics and Their Role in Innate Immunity.)。アニュアル・レビュー・オブ・イミュノロジー(Annual Review of Immunology) 13: 61-92, 1995）。
【０００６】
プロリン−リッチ・ペプチドのファミリー（例えば、アピダエシン、ドロソシン及びピロコリシン）は、膜の透過化だけでなく、１以上の標的タンパク質に立体特異的に結合することによって細菌を殺傷する。これらの可能性がある相互作用のパートナー、従来の熱ショックタンパク質であるＤｎａＫは十分に検討されているが（クラゴル・ジー(Kragol G)ら、プロリン−リッチ・ペプチド、ピロコリシンの抗細菌活性についての決定的な残基の同定(Identification of crucial residues for the antibacterial activity of the proline-rich peptide, pyrrohocoricin.)。、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry) 269: 4226-37, 2002;クラゴル・ジー(Kragol G)ら、抗細菌ペプチド、ピロコリシンはＤｎａＫのＡＴＰアーゼ作用を阻害し、シャペロン介助のタンパク質の折り畳みを妨害する(The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding.)。バイオケミストリー(Biochemistry) 40: 3016-26, 2001）、プロリン−リッチ・ペプチドによって阻害され、正しいタンパク質の折り畳みがおそらく妨害され、最終的に細胞死をもたらす。さらに、プロリン−リッチ・ペプチドは、メリチン又はグラミシジンのような定義された二次構造を有するＡＭＰとは全く対照的に、真核生物の細胞に溶血性の効果も毒性の効果も試験管内では有さないと思われる。抗菌活性と共に、哺乳類血清（２５％）における安定性は、新しいペプチドを基にした抗生物質の開発に主として決定的な影響を有する。たとえば、ドロソシンは１時間以内に分解されるが、ピロコリシンはプロテアーゼに対してはるかにさらに安定であり、半減期は１２０分である。
【０００７】
シュナイダー(Schneider)及びドーン(Dorn)（シュナイダー・エム(Schneider M)及びドーン・エー(Dorn A.) カメムシであるオンコペルタス・ファシアタス（昆虫綱：半翅目）における２種類のシュードモナス種の差次的感染性と免疫応答(Differential infectivity of two pseudomonas species and the immune response in the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus (Insecta: Hemiptera).)。ジャーナル・オブ・インバーテブレート・パソロジー(Journal of Invertebrate Pathology) 78: 135-40, 2001）による生物実験では、ナガカメムシ科(Lygaeidae family）のカメムシであるオンコペルタス・ファシアタス(Oncopeltus fasciatus)の若齢幼虫と蛹に２つの異なったグラム陰性シュードモナス菌種(Pseudomonas species)を感染させ、その免疫応答を解析した。ヒトの病原体である緑膿菌(シュードモナス・アエルギノーザ;Pseudomonas aeruginosa)によるオンコペルタス・ファシアタス(O. fasciatus)の若齢幼虫の感染は、４８時間後、全個体の死亡を生じたが、病原性の低いシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)で感染させた個体は少なくとも９６時間生き残った。次いでカメムシの若齢幼虫に先ずシュードモナス・プチダ(P. Putida)を感染させ、２４時間後、シュードモナス・アエルギノーザ(P. aeruginosa)を感染させると、二重感染させた個体の最初の２４時間の生存率は有意に７３％に上昇した。侵入してきた微生物に対する先天性の免疫系の範囲内で昆虫が自己防御する、抗細菌ペプチドの合成の考えられる誘導を次いで検討した。４種のペプチド（オンコペルタス抗細菌ペプチド１〜４）を分子量１５、８、５又は２ｋＤａで同定し、抗細菌作用に関与するように保持した。エドマン（Edman）法による配列分析により、ペプチド１（１５ｋＤａ）について長さ３４のアミノ酸の部分配列に加えて、プロリン−リッチ２ｋＤａのペプチド４の不完全配列が見出された。１１位及び１９位から開始するＣ末端配列におけるアミノ酸は決定的に同定することはできなかった。正確な分子量は不明である。
【０００８】
抗生物質ペプチドの現在知られている配列の選択を表１に示す：
【０００９】
【表１】
2012516142.tif 000002
【００１０】
［１］キャスティールズ・ピー(Casteels P)、アンプ・シー(Ampe C)、ヤコブス・エフ(Jacobs F)、バエック・エム(Vaeck M)、及びテンプスト・ピー(Tempst P.)、アピダエシン−ミツバチ由来の抗細菌ペプチド(Apidaecins - Antibacterial Peptides from Honeybees.)。エンボ・ジャーナル(Embo Journal)、８：２３８７−９１，１９８９
［２］ブレット・ピー(Ｂｕｌｅｔ Ｐ)ら、ショウジョウバエの新規誘導抗細菌ペプチドは、Ｏ−グリコシル化置換を有する(A Novel Inducible Antibacterial Peptide of Drosophila Carries an O-Glycosylated Substitution.)。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)，２６８：１４８９３−７，１９９３
［３］マッキントッシュ・ジェー・エー(Mackintosh J A)ら、２つの誘導Ｏ−グリコシル化プロリン−リッチ抗細菌ペプチドの、アリであるミルメシア・グローサ(Myrmecia gulosa)からの単離(Isolation from an ant Myrmecia gulosa of two inducible O-glycosylated proline-rich antibacterial peptides.)。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)、２７３：６１３９−４１，１９９８
［４］コシアンシック・エス(Cociancich S)ら、半翅目の昆虫、吸汁性の虫、ピロコリス・アプテルスに由来する新規誘導抗細菌ペプチド(Novel Inducible Antibacterial Peptides from A Hemipteran Insect, the Sap-Sucking Bug Pyrrhocoris-Apterus.)。バイオケミカル・ジャーナル(Biochemical Journal)、３００：５６７−７５，１９９４
［５］チャーニッシュ・エス(Chernysh S)、コシアンシック・エス(Cociancich S)、ブリアンド・ジェー・ピー(Briand J P)、ヘトル・シー(Hetru C)、及びブレット・ピー(Bulet P)、半翅目の昆虫パロメナ・プラシナ(Palomena prasina)の誘導抗細菌ペプチド：プロリン−リッチ・ペプチドの独特のファミリー及び新規昆虫デフェンシンの同定(The inducible antibacterial peptides of the hemipteran insect Palomena prasina: Identification of a unique family of proline-rich peptides and of a novel insect defensin.)。ジャーナル・オブ・インセクト・フィシオロジー(Journal of Insect Physiology)、４２：８１−９，１９９６
［６］シュナイダー・エム及びドーン・エー(Schneider M ＆ Dorn A.)、カメムシであるオンコペルタス・ファシアタス（昆虫綱：半翅目）における２種類のシュードモナス種の差次的感染性と免疫応答(Differential infectivity of two pseudomonas species and the immune response in the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus (Insecta: Hemiptera).)。ジャーナル・オブ・インバーテブレート・パソロジー(Journal of Invertebrate Pathology) 78: 135-40, 2001
【００１１】
新しい抗細菌及び抗真菌化合物、新しい抗細菌及び抗真菌医薬組成物、及びその使用方法、並びに新しい医薬抗生物質を検出するための活性物質をスクリーニングするために用いることができる化合物に対する要求が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明によって解決されるべき課題は、高い安定性を有する新規抗生物質ペプチドを提供すること、グラム陽性細菌に対するＡＭＰの作用スペクトルを拡大することにより最新の広いスペクトルの抗生物質を利用可能にすること、及び真核生物の細胞にペプチドを導入することにより隠れた細菌と対抗することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題は、以下の一般式を有する、本発明に係るペプチド及びペプチド誘導体によって解決される：
Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ2−Ｋ3−Ｐ4−Ｐ5−Ｙ6−Ｌ7−Ｐ8−Ｒ9−Ｐ10−Ｘ2−Ｐ12−Ｐ13−Ｒ14−Ｘ3−Ｉ16−Ｐ17／Ｙ17−Ｎ18−Ｎ19−Ｘ4−Ｓｕｂ2（式１）
但し、Ｘ1は、非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基、又は正の正味電荷若しくは生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基であり；
Ｄ2は、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり；
Ｋ3は、正の正味電荷又は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基、好ましくはリジン又はアルギニンであり；
Ｘ2及びＸ4は、互いに独立して、正の正味電荷又は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基から選択され；
Ｘ3は、正の正味電荷又は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基又はプロリン又はプロリン誘導体であり；
Ｌ7及びＩ16は、互いに独立して、非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基、好ましくはロイシン、イソロイシン及びバリンから選択され；
Ｙ6及びＹ17は、いずれの場合にもチロシンであり、Ｒ9及びＲ14は、いずれの場合にもアルギニンであり、Ｎ18はアスパラギン又はグルタミンであり、Ｎ19は、アスパラギン又はグルタミンであるか、或いは存在せず、Ｐ4、Ｐ5、Ｐ8、Ｐ10、Ｐ12、Ｐ13及びＰ17は、互いに独立して、プロリン及びプロリン誘導体、又はヒドロキシプロリン及びヒドロキシプロリン誘導体から選択され、
任意にＰ13及びＰ14は交換され、及び／又は任意にＤ2、Ｐ4、Ｐ5、Ｐ8、Ｐ10、Ｐ12、Ｐ13、Ｐ17及びＹ17から選択される１又は２の残基は任意の残基で置換され；
Ｓｕｂ1は、アミノ酸Ｘ1の遊離Ｎ末端又は修飾されたＮ末端アミノ基であり；
Ｓｕｂ2は、Ｃ末端アミノ酸の遊離Ｃ末端カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又は修飾されたＣ末端カルボキシル基である。
【００１４】
特に好ましい実施態様では、Ｉ16は、ロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン及びバリンを含む群から選択される。
【００１５】
一実施態様では、Ｐ17が存在する場合、Ｎ19は存在しない。
【００１６】
一般式１〜３の１つを有するペプチド及びペプチド誘導体が好ましい：
Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ2−Ｋ3−Ｐ4−Ｐ5−Ｙ6−Ｌ7−Ｐ8−Ｒ9−Ｐ10−Ｘ2−Ｐ12−Ｐ13−Ｒ14−Ｘ3−Ｉ16−Ｙ17−Ｎ18−Ｘ4−Ｓｕｂ2（式２）
Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ2−Ｋ3−Ｐ4−Ｐ5−Ｙ6−Ｌ7−Ｐ8−Ｒ9−Ｐ10−Ｘ2−Ｐ12−Ｐ13−Ｒ14−Ｘ3−Ｉ16−Ｙ17−Ｎ18−Ｎ19−Ｘ4−Ｓｕｂ2（式３）
Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ2−Ｋ3−Ｐ4−Ｐ5−Ｙ6−Ｌ7−Ｐ8−Ｒ9−Ｐ10−Ｘ2−Ｐ12−Ｐ13−Ｒ14−Ｘ3−Ｉ16−Ｐ17−Ｎ18−Ｘ4−Ｓｕｂ2（式４）
【００１７】
Ｘ1は、非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基、又は正の正味電荷若しくは生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基であり；
Ｄ2は、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり；
Ｋ3は、正の正味電荷又は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基、好ましくはリジン又はアルギニンであり；
Ｘ2及びＸ4は、互いに独立して、正の正味電荷又は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基から選択され；
Ｘ3は、正の正味電荷若しくは生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する残基又はプロリン又はプロリン誘導体であり；
Ｌ7及びＩ16は、互いに独立して、非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基、好ましくは、ロイシン、イソロイシン及びバリンから選択される。
【００１８】
特に好ましい実施態様では、Ｉ16は、ロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン及びバリンを含む群から選択される。
【００１９】
Ｙ6及びＹ17は、いずれの場合にもチロシンであり、Ｒ9及びＲ14は、いずれの場合にもアルギニンであり、Ｎ18及びＮ19は、いずれの場合にもアスパラギン又はグルタミンであり、Ｐ4、Ｐ5、Ｐ8、Ｐ10、Ｐ12、Ｐ13及びＰ17は、互いに独立して、プロリン及びプロリン誘導体、又はヒドロキシプロリン及びヒドロキシプロリン誘導体から選択される。
【００２０】
任意に、Ｄ2、Ｐ4、Ｐ5、Ｐ8、Ｐ10、Ｐ12、Ｐ13、Ｐ17及びＹ17から選択される１又は２の残基は、任意のアミノ酸残基、好ましくは中性残基、特に好ましくは、中性の極性残基で置換される。
【００２１】
さらに、Ｐ13及びＰ14は任意に交換される。
【００２２】
正の正味電荷又は生理的条件下で正に荷電する側鎖を有する残基は、アルギニン、リジン、δ−ヒドロキシリジン、ホモアルギニン、２，４−ジアミノ酪酸、β−ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、アルギナル（アルギニンの−ＣＯＯＨが−ＣＨＯで置換されている）、２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、ニトロアルギニン（好ましくは、Ｎ（Ｇ）−ニトロアルギニン）、ニトロソアルギニン（好ましくは、Ｎ（Ｇ）−ニトロソアルギニン）、メチルアルギニン（好ましくは、Ｎ−メチル−アルギニン）、ε−Ｎ−メチルリジン、アロ−ヒドロキシリジン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、オルニチン、ｓｙｍ−ジメチルアルギニン、ａｓｙｍ−ジメチルアルギニン、２，６−ジアミノヘキシン酸、ｐ−アミノ安息香酸及び３−アミノチロシン、並びにそれほど好ましくもないが、ヒスチジン、１−メチルヒスチジン、及び３−メチルヒスチジンを含む群から好ましくは選択される。Ｘ1、Ｘ2及びＸ3は好ましくは、互いに独立して、このリストから選択される。
【００２３】
プロリン誘導体と言う用語は、好ましくは官能基の構造的修飾によってプロリンから得られる、プロリンに由来するアミノ酸残基を表す。好ましいプロリン誘導体は、β−シクロヘキシルアラニン、３，４−シス−メタノプロリン、３，４−デヒドロプロリン、ホモプロリン、又は擬似プロリン(pseudoproline)を含む群から選択される。ヒドロキシプロリンと言う用語は、とりわけ、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、シス−３−ヒドロキシプロリン、及びトランス−３−ヒドロキシプロリンを含む。ヒドロキシプロリン誘導体と言う用語は、相応して、好ましくは官能基の構造的修飾によってヒドロキシプロリンから得られる、ヒドロキシプロリンに由来するアミノ酸残基を表す。好ましいヒドロキシプロリン誘導体は、ヒドロキシ−β−シクロヘキシルアラニン、及びヒドロキシル基で置換された前述のプロリン誘導体から選択される。
【００２４】
中性残基は、生理的条件下において帯電しない側鎖を有する残基である。
【００２５】
極性残基は好ましくは、側鎖に少なくとも１つの極性基を有する。これらは好ましくは、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミン基、アミド基又はエステル基、或いは水素結合を形成できるそのほかの基を含む群から選択される。
【００２６】
好ましい中性の極性残基は、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、シトルリン、Ｎ−メチルセリン、ホモセリン、アロ−トレオニン、及び３，５−ジニトロチロシン及びβ−ホモセリンを含む群から選択される。
【００２７】
好ましい実施態様では、Ｐ5は、β−シクロヘキシルアラニン、３，４−シス−メタノプロリン、３，４−デヒドロプロリン、ホモプロリン、又は擬似プロリン(pseudoproline)、シス−４−ヒドロキシプロリン、シス−３−ヒドロキシプロリン、トランス−３−ヒドロキシプロリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、シトルリン、Ｎ−メチルセリン、ホモセリン、アロ−トレオニン及び３，５−ジニトロチロシン及びβ−ホモセリンを含む群から選択される。
【００２８】
非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基は、好ましくは０を超える、特に好ましくは３を超えるハイドロパシー指標(hydropathy indexZ)を有する、生理的条件下において帯電しない残基である。好ましい非極性かつ疎水性の側鎖は、１〜１０、好ましくは２〜６の炭素原子を有するアルキル、アルキレン、アルコキシ、アルケノキシ、アルキルスルファニル及びアルケニルスルファニルの残基、又は５〜１２の炭素原子を有するアリール残基を含む群から選択される。好ましい非極性かつ疎水性の側鎖を有する残基は、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、Ｎ−メチルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、１−アミノシクロヘキシルカルボン酸、Ｎ−メチルイソロイシン、ノルロイシン、ノルバリン及びＮ−メチルバリンから選択される。
【００２９】
「生理的条件」は、ｐＨ６〜８のｐＨ、３０℃〜４０℃の温度、好ましくは３７℃の温度、７．４のｐＨ及び３００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を意味する。
【００３０】
本発明に係るペプチド又はペプチド誘導体は、好ましくは少なくとも１９のアミノ酸残基、好ましくは５０までのアミノ酸残基を含有する。
【００３１】
Ｓｕｂ1は、アミノ酸Ｘ1の遊離Ｎ末端又は修飾されたＮ末端アミノ基である。Ｓｕｂ2は、Ｃ末端アミノ酸の遊離Ｃ末端カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又は修飾されたＣ末端カルボキシル基である。「修飾されたＮ末端アミノ基」及び「修飾されたＣ末端カルボキシル基」は、アミノ基又はカルボキシル基が改変されている（たとえば、還元される又は置換されている）ことを意味する。
【００３２】
従って、Ｓｕｂ1は、一般式ＮＲ1Ｒ2を有する、アミノ酸Ｘ1の遊離Ｎ末端又はＮ末端アミノ基の修飾（アミノ酸Ｘ1のＮ末端アミノ基をＳｕｂ1で置換する）を表す。Ｓｕｂ1＝ＮＲ1Ｒ2であり、式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立であって、好ましくは水素から、又は以下の基から選択される：
（ｉ）直鎖、分枝鎖、環状又は複素環のアルキル基、たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル又はシクロヘキシル；
（ｉｉ）直鎖、分枝鎖、環状又は複素環のアルカノイル基、たとえば、アセチル、又はメタノイル（ホルミル）、プロピオニル、ｎ−ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル又はシクロヘキサノイル；
（ｉｉｉ）リポーター基、好ましくは蛍光色素（たとえば、フルオレセイン、アレクサ４８８（Ａｌｅｘａ４８８））又はビオチン；
（ｉｖ）たとえば、グアニジン、エチレングリコールオリゴマー、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、デスモシニー(desmosinee)又はイソデスモシニー(isodesmosinees)に基づく、ＣＯＲ3（以下を参照）と共に、環状ペプチドを得るためのＮ末端とＣ末端との間のリンカー；
（ｖ）たとえば、チオール含有ペプチドに結合させるためのヨード−、ブロモ−若しくはクロロ−アルカン酸（たとえば、ヨード酢酸）又はマレイミド、或いはキャリアタンパク質として第２のペプチド若しくはペプチド誘導体（たとえば、活性エステル、アルデヒド又はチオエステルとして）を結合させるための別の反応性基（たとえば、アミノ基、チオール基）に基づく、特定の化学反応又は酵素反応によって、さらなるペプチド又はペプチド誘導体（Ｙ1）を結合させるためのリンカー；
（ｖｉ）別のペプチド又はペプチド誘導体Ｙ1が結合した（ｖ）に記載のリンカー。
【００３３】
Ｎ末端の修飾の例は、アセチル化された、ホルミル化された、又はグアニル化されたＮ末端である。
【００３４】
好ましくは、Ｓｕｂ1を介して別のペプチド又はペプチド誘導体Ｙ1が結合している。Ｙ1は好ましくは、生体ポリマー（たとえば、ペプチド）であり、式１〜４のいずれか１つに係る抗菌ペプチドを細菌に導入し、従って該細菌に対する抗菌ペプチドの活性を高める、及び／又はそれを哺乳類細胞に導入し、従って哺乳類細胞の中に隠れる細菌を処理することを可能にする、生体高分子（例えば、ペプチド）である。Ｙ1はＳｕｂ1を介して、永続的に（たとえば、Ｓｕｂ1＝ＮＨ2についてのペプチド結合若しくはアミジン結合、又はＳｕｂ1＝ＳＨについてのチオエーテル、ヨードアセテート又はマレイミド）、又は特定の条件下で開裂可能である化合物（たとえば、ジスルフィド結合又は酸に不安定なリンカー）によって、ペプチドのＸ1に結合される。Ｙ1について好ましい配列は、細胞貫通ペプチド（cell-penetrating peptide; ＣＰＰ）であり、たとえば、ペネトラチン、Ｔａｔペプチド、モデル両親媒性ペプチド(model amphipathic peptides)及びトタンスポータン(transportans)である（ランゲル・ユー(Langel, U.)、細胞貫通性ペプチドのハンドブック(in Handbook of Cell-Penetrating Peptides)。5-28 (シーアールシー−テイラー・アンド・フランシス・グループ(CRC - Taylor & Francis Group), 2006）。
【００３５】
リンカーとは、２つの物質を結合させるために用いられる分子又は分子の基を意味し；好ましいリンカーは、好ましくは１０〜２０の炭素原子を有する架橋分子（たとえば、ポリエチレングリコール）によって連結される、２つの反応性基（たとえば、ヨードアセテート、マレイミド、イミド−又はＮＨｓ−エステル又はヒドラジド）を含有する。
【００３６】
Ｓｕｂ2は、Ｃ末端アミノ酸の遊離Ｃ末端カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、又は好ましくは一般式ＣＯＲ3（Ｒ3は最後のアミノ酸のヒドロキシル基を置換する）、Ｘ5−ＣＯＲ3、Ｘ6ＣＯＲ3若しくはＸ5Ｘ6−ＣＯＲ3を有する、修飾されたＣ末端カルボキシル基である。
【００３７】
ＣＯＲ3は好ましくは以下の基から選択される：
（ｉ）カルボキシル（Ｒ3は遊離ヒドロキシル基である）、エステル（Ｒ3はアルコキシ基である）、アミド（Ｒ3はアミンである）又はイミド；
（ｉｉ）Ｓｕｂ1と共にＮ末端とＣ末端とを架橋して環状ペプチドを形成するリンカー；
（ｉｉｉ）Ｒ3が、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ及びＧｌｎを含む群から選択される追加のアミノ酸残基であるか、或いはＲ3が好ましくは２〜６のアミノ酸を有するペプチドであって、そのうちの少なくとも１つのアミノ酸がＰｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＧｌｎを含む群から選択される上記ペプチドであり、但し、後者が、カルボキシル（Ｒ3は遊離ヒドロキシル基である）、エステル（Ｒ3は、たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール又はブタノールのようなアルコールである）、アミド（Ｒ3はアミドである）、又はイミド（Ｒ3は、たとえば、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン又はシクロヘキシルアミンのようなアルキルアミン又はジアルキルアミンである）を有する群からのメンバーによって置換されている、ＣＯＲ3；
（ｉｖ）Ｒ3が、二量体又はオリゴマーの構造を形成する追加の分枝アミノ酸、たとえば、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、デスモシニー(desmosinee)、イソデスモシニー(isodesmosinee)、又はこれらの分枝アミノ酸の組み合わせである、ＣＯＲ3；
（ｖ）たとえば、チオール含有ペプチドに結合させるためのヨード−、ブロモ−若しくはクロロ−アルカン酸（たとえば、ヨード酢酸）又はマレイミド、或いはキャリアタンパク質として第２のペプチド若しくはペプチド誘導体（たとえば、活性エステル、アルデヒド又はチオエステルとして）を結合させるための別の反応性基（たとえば、アミノ基、チオール基）に基づく、特定の化学反応又は酵素反応によって、さらなるペプチド又はペプチド誘導体（Ｙ1）を結合させるためのリンカー；
（ｖｉ）別のペプチド又はペプチド誘導体Ｙ1が結合した（ｖ）に記載のリンカー。
【００３８】
このように、エステル（Ｒ3＝アルコキシ）、アミド（Ｒ3＝アミン、たとえば、−ＮＨ2）若しくはイミド（Ｒ2＝アルキルアミン、たとえば、−ＮＨＣ3Ｈ7）、又はＰｒｏ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ及びＶａｌを含む群から選択されたさらなるアミノ酸により伸長されているペプチド、或いはエステル、アミド又はイミドとしてＣ末端上で今一度修飾されているものなどのＣ末端ペプチド誘導体を得ることができる。さらに、ペプチドのＮ末端又はＣ末端の修飾によってペプチド誘導体を形成することができる。これらの改変は、たとえば、追加のアルキル基若しくはアルカノイル基（直鎖、分枝、環状又は複素環状のいずれか）又は追加のグアニジノ基又は追加の高分子又はリポーター残基であることができ、それは、永続的に、又は特定の条件下で開裂可能である化合物（たとえば、ジスルフィド結合又は酸に不安定なリンカー）によって結合される。
【００３９】
Ｃ末端の修飾は好ましくは、チオエステル合成及びそれに続く１級アミンによる置換によって生じる。
【００４０】
本発明に係るペプチド又はペプチド誘導体を形成する天然アミノ酸、非天然アミノ酸又はアミノ酸誘導体（たとえば、イミノ酸）はすべて、Ｌ型又はＤ型構造ｓのいずれかであることができる。しかしながら、特に特定されない限り、配列における構成ブロックは好ましくはＬ型構造である。
【００４１】
Ｘ5及びＸ6は任意で追加の残基である。Ｘ5及びＸ6が存在しない場合、前述の配列における最後のアルギニン（Ａｒｇ）は、遊離Ｃ末端カルボキシル基を有するか、又はＳｕｂ2に連結されている。
【００４２】
Ｘ5及びＸ6の少なくとも一方の残基が存在する場合、ペプチドは、たとえば、以下の一般式の１つを有する。
Ｙ1−Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｐ−Ｘ2−Ｐ−Ｐ−Ｒ−Ｘ3−Ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−ＣＯＲ3（式５）
Ｙ1−Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｐ−Ｘ2−Ｐ−Ｐ−Ｒ−Ｘ3−Ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｘ4−Ｘ5−ＣＯＲ3（式６）
Ｙ1−Ｓｕｂ1−Ｘ1−Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｐ−Ｘ2−Ｐ−Ｐ−Ｒ−Ｘ3−Ｉ−Ｙ−Ｎ−Ｘ4−Ｘ6−ＣＯＲ3（式７）
【００４３】
Ｘ5は、プロリン、プロリン誘導体又は極性側鎖を持つ中性の残基（たとえば、アスパラギン、グルタミン）から選択される。好ましい残基Ｘ5は、プロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、シス−３−ヒドロキシプロリン、トランス−３−ヒドロキシプロリン、β−シクロヘキシルアラニン、３，４−シス−メタノプロリン、３，４−デヒドロプロリン、ホモプロリン、擬似プロリン(pseudoproline)、並びにアスパラギン、グルタミン、シトルリン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルグリシン、ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｎ−エチルアスパラギン、Ｎ−エチルグリシン、ホモセリン、ペニシルアミン、テトラヒドロピラニルグリシン、アロ−トレオニン、及び３，５−ジニトロチロシンを含む群から選択される。
【００４４】
Ｘ6は、プロリン、プロリン誘導体、極性残基（たとえば、セリン）又は疎水性残基から選択される。好ましい残基Ｘ6は、プロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、シス−３−ヒドロキシプロリン、トランス−３−ヒドロキシプロリン、β−シクロヘキシルアラニン、３，４−シス−メタノプロリン、３，４−デヒドロプロリン、ホモプロリン、又は擬似プロリン(pseudoproline)、セリン、トレオニン、δ−ヒドロキシリジン、シトルリン、ホモセリン、又はアロ−トレオニン、並びにフェニルアラニン、Ｎ−メチルロイシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、シクロヘキシルアラニン、アラニン、β−アラニン、１−アミノシクロヘキシルカルボン酸、Ｎ−メチルイソロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、Ｎ−メチルバリンを含む群から選択され、或いはそれは、好ましくはプロリン、イソロイシン又は上述の残基の１つから選択される、好ましくは１〜３の残基を有する短いペプチドである。
【００４５】
或いはＸ6は、幾つかのペプチド単位を含有する分枝リンカーである。これは、たとえば、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、デスモシニー(desmosinee)、イソデスモシニー(isodesmosinne)などの幾つかのアミノ基を含有するアミノ酸の残基によって形成される。
【００４６】
Ｃ末端アミノ酸は、たとえば、式１〜４におけるＸ4、式６におけるＸ5、又は式５及び７におけるＸ6である。
【００４７】
本発明に係るペプチド及びペプチド誘導体は、プロリン−リッチ抗菌ペプチド「オンコペルタス（Oncopeltus）の抗細菌ペプチド４」の以前不完全に決定された配列に比べて、向上した抗細菌活性、より広い作用スペクトル及びより高いプロテアーゼ耐性を示す。
【００４８】
本発明に係るペプチド及びペプチド誘導体の好ましい例は、配列番号５〜９、１４〜２６、２９、３０、３２、３３、３６、３８、４０、４１、４４〜４６、４９、５０、５３〜５９、６１〜８５、９３、９４、１０１、１０２、１０７〜１１２（実施例１の表２を参照）に記載の配列から選択される。
【００４９】
配列ＶＤＫＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＲＲＩＹＮＲ−ＮＨ2（配列番号１８）を有する特に好ましいペプチドを、以下、オンコシンと呼ぶ。本発明に係るそのほかのペプチド及びペプチド誘導体は、以下、オンコシン誘導体と呼ぶ。
【００５０】
抗細菌活性又は抗真菌活性を高め、そのほかの細菌又は真菌対する活性スペクトルを拡げ、かつ安定性を向上させるように修飾された本発明に係るペプチド及び／又は多量体ペプチド構築物は、高い抗菌及び／又は抗真菌の有効性と哺乳類血清における良好な代謝安定性とを特徴とする。
【００５１】
１１位（Ｘ2）、１５位（Ｘ3）及び１９位（Ｘ4）における適切な修飾は、以下に議論される通り、かつ実施例に示されるように、種々の細菌に対して天然のオンコペルタス（Oncopeltus）４の配列の抗細菌活性を向上させる。
【００５２】
さらに、残基Ｓｕｂ1-Ｘ1、Ｘ3及びＸ4は、タンパク質分解に対してＮ末端及びＣ末端のペプチド配列をさらに安定化することが可能であり、従って血清における半減期を増加させることができる。
【００５３】
本発明に係る配列は、正に帯電した残基Ｘ2（１１位）を有する。
【００５４】
本発明に係る好ましい例は、正に帯電した残基Ｘ3（１５位）を有する配列であって、たとえば、配列番号１８、２９、３２、３３、４６、５０、５４〜５９、６２、６５〜７４、７８、７９、８２、１０７、１０９、１１１及び１１２に記載の配列から選択される配列であり、又は残基Ｘ3（１５位）としてのヒドロキシプロリンを有する配列であって、たとえば、配列番号２５及び６３に記載の配列から選択される配列である。
【００５５】
本発明に係る配列は、正に帯電した残基Ｘ4（１９位）を有する。
【００５６】
さらに、Ｃ末端のカルボキシル基は好ましくは修飾されている。驚くべきことに、これは、血清におけるペプチドの高い半減期をもたらす。
【００５７】
Ｎ末端及びＣ末端の修飾は、例えばＳｕｂ1を介したＹ1の、例えば（場合により多量体ペプチド又はタンパク質を創出する）他のアミノ酸配列、又はキャリア若しくは標識の機能を有する他の生体分子などの他の基に対するペプチドの結合を可能にする。特定の実施態様では、キャリア分子は、哺乳類細胞において細菌感染と闘うために、或いは抗菌ペプチドがそれ自体では侵入することができない細菌（たとえば、グラム陽性細菌）に抗細菌ペプチド及びペプチド誘導体を輸送するために、シャトルとして機能する。前記細胞貫通性ペプチド（cell-penetrating peptides;ＣＰＰ）の例は、たとえば、ペネトラチン(penetratins)、Ｔａｔペプチド、モデル両親媒性ペプチド(model amphipathic peptides)及びトタンスポータン(transportans)である。さらに、感染の部位は、結合した構造（標的分子）によって認識され得るので、その結果、抗生物質は、細菌と闘うために（細菌）細胞の近傍にもたらされる。これらの標的分子は、たとえば、グラム陰性細菌の外側を形成するリポ多糖類（ＬＰＳ）分子に結合することが知られている分子である。このアプリケーションのための既知の化合物は、たとえば、アンカーペプチドであり、たとえば、ラクトバチラス（Lactobacillus）のＡｃｍＡモチーフ又はリポ多糖類に対する抗体である。この最後に言及した変異体が、固有の抗生物質効果を有し、従って本発明に係るペプチドの活性を高めるために用いることができるので、好ましい。
【００５８】
Ｎ−末端アミノ酸、すなわちＳｕｂ1−Ｘ1が、生理的条件下、すなわちヒトの生体内において正に帯電する残基を有すれば有利である。
【００５９】
Ｎ末端の安定化を達成する例は、たとえば、オルニチン又はリジン（Ｓｕｂ1−Ｘ1＝アシル−Ｏｒｎ又はアシル−Ｌｙｓ）などの正に帯電したアミノ酸のα−アミノ基のアシル化（Ｓｕｂ1＝アシル−ＮＨ−）、たとえば、アセチル化（Ｓｕｂ1＝アセチル−ＮＨ−）である。このアシル化（好ましくはアセチル化）は、アミノ酸の側鎖における正の電荷を完全なままにする。
【００６０】
本発明のさらに好ましい例は、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4（１１位、１５位及び１９位）において正に帯電した残基を有する配列であって、たとえば、配列番号１８、２２、５８、６２、６３、６５〜７４、７８、７９、８２及び８３に記載の配列から選択される配列である。
【００６１】
本発明のさらに好ましい例は、プロリンの代わりにヒドロキシプロリンを有する配列であって、たとえば、配列番号２１、２２及び２４に記載の配列から選択される配列である。
【００６２】
特に好ましい例は、１１位、１５位及び１９位（Ｘ2、Ｘ3及びＸ4）において正に帯電したアミノ酸（たとえば、オルニチン、アルギニン又はリジン）を有し、かつ修飾されたＣ末端を有するペプチドであり、特に、配列番号１８、６３、７１、７２、７４に記載のペプチドである。
【００６３】
特に好ましいペプチドは、１５位（残基Ｘ3）においてオルニチン、１１位及び１９位（残基Ｘ2及びＸ4）においてアルギニンを含有し、かつ配列番号７１に係るプロピルアミドとしてのＣ末端（残基Ｓｕｂ2）を含有する。
【００６４】
別の特に好ましいペプチドは、１５位及び１９位（残基Ｘ3及びＸ4）においてオルニチン、１１位（残基Ｘ2）においてアルギニン、及びアミドとしてのＣ末端（残基Ｓｕｂ2）を含有する。この種の好ましいペプチドは配列番号７２に記載の配列を有する。
【００６５】
別の特に好ましいペプチドは、１１位（残基Ｘ2）においてアルギニン、１５位（残基Ｘ3）においてトランス−４−ヒドロキシプロリン、及び１９位（残基Ｘ4）においてオルニチン、並びにアミドとしてのＣ末端（残基Ｓｕｂ2）を含有する。この種の好ましいペプチドは配列番号６３に記載の配列を有する。
【００６６】
別の特に好ましいペプチドは、１５位及び１９位（残基Ｘ3及びＸ4）においてオルニチン、１１位（残基Ｘ2）においてアルギニン、１８位においてアスパラギンの代わりにグルタミンを含有し、かつアミドとしてのＣ末端（残基Ｓｕｂ2）を含有する。この種の好ましいペプチドは配列番号７４に記載の配列を有する。
【００６７】
本発明に係るＣ末端のアミド（Ｓｕｂ＝−ＮＨ2）への改変は、驚くべきことに大腸菌(E. coli)及びミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対する抗生物質作用を有意に高めることが実施例から理解することができる。Ｃ末端にアミドを有する好ましい配列は、配列番号１８、２２、５０、５４〜５７、６１〜６３、６５〜７０、７２〜７９及び８２である。
【００６８】
Ｃ末端の分解を抑える修飾、たとえば、配列番号５８及び７１に記載のＣ末端（Ｓｕｂ2）におけるイソプロピルアミド並びに８位及び／又は１３位におけるトランス−４−ヒドロキシプロリンも好ましい。実験結果は、６位及び７位のアミノ酸も明らかに抗生物質作用に非常に重要であることを示している。従って、これら６位及び／７位における個々のアミノ酸のアラニンによる置換は、オンコシンの抗生物質活性に比べて有効性を破壊する。
【００６９】
本発明の最も好ましい例は、以下の利点を提供するペプチドである：
（ｉ）哺乳類血清における増加した半減期及び
（ｉｉ）１以上の細菌株、特にヒトの病原体又は真菌又はそのほかの微生物の感染に対する高い抗菌活性及び
（ｉｉｉ）ペプチドが赤血球を含むヒトの細胞に対して毒性がないこと。
【００７０】
抗菌ペプチドは、哺乳類細胞及び血液細胞に有毒作用を有することなく特定の細胞内の細菌の標的分子を阻害するために、細胞膜を通過し、かつ細胞質に侵入しなければならないので、抗菌ペプチドの作用は非常に複雑である。別の重要な点は、ペプチダーゼ又はプロテアーゼによる分解に対するペプチド又はペプチド誘導体の安定性である。従って、理想的なペプチドは、高い抗菌活性を有し（低いＭＩＣ値）、細胞毒性を有さず、溶血活性を有さず、かつ血中で数時間の半減期を有する。天然のオンコペルタス（Oncopeltus）４−配列と比べて、本発明に係るペプチド誘導体は、２０倍を超える高い抗菌活性を示す。Ｃ末端は好ましくは、修飾され（アミド、アルキルアミド、エステル）、１４位以降のＣ末端領域は、たとえば、非タンパク新生アミノ酸による１５位及び／又は１９位（Ｘ3及びＸ4）の置換によって改変される。Ｎ末端では、良好な活性を達成するのに正の電荷が好まれる。天然のオンコペルタス（Oncopeltus）４−配列の１位（Ｘ1）におけるバリンは、好ましくは遊離であり、又はアルギニン、リジン若しくはオルニチンのようなアセチル化塩基性残基で置換されている。驚くべきことにタンパク質の高い安定性をもたらすオルニチンが特に好ましい。同様の理由で、オンコペルタス（Oncopeltus）４−配列の１５位及び１９位が好ましくは置換され、それは驚くべきことにペプチドの高い安定性をもたらす。例は、トランス−４−ヒドロキシプロリン（Ｘ3）及びオルニチン（Ｘ4）についての１５位及び１９位（Ｘ3及びＸ4）の置換又は双方ともオルニチンへの置換であり、それは予想外にも、２５％血清における半減期を、１０倍を越えて、すなわち、３０分未満から６時間を超えるまで増やす。遊離の酸からプロピルアミドへのＣ末端の転換も血清での安定性に増大をもたらす。
【００７１】
好ましくは、細胞貫通性ペプチドの配列が、本発明に係るペプチド及びペプチド誘導体に結合される。この結合は好ましくは、リンカー、たとえば、アセチル基又はアルキル基を介して行われる。結合は好ましくは、本発明に係るペプチド及びペプチド誘導体のＮ末端で行われる。好ましくは、このために、プロリン−リッチ・ペプチド又はペプチド誘導体は、Ｎ末端にて、ヨードアセテートで誘導体化され、細胞貫通性ペプチド配列は、システイン残基によってＣ末端にて伸ばされる。次いでこのシステイン残基のチオール基がアセチル基とのチオエーテル架橋を形成する。
【００７２】
細胞貫通性ペプチド（cell-penetrating peptide;ＣＰＰ）は、相対的に短いポリカチオン性又は疎水性のペプチドであり、その結合によって原核細胞及び真核細胞について細胞膜を通過することが可能になる。ＣＰＰは、異なった配列及び長さを有することができる。しかしながら、ほとんどの場合、それらは、およそ１０〜４０のアミノ酸の配列を含有し、正に帯電したアミノ酸（たとえば、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）が豊富である。これらの短い配列は、細胞膜の通過に関与し、「タンパク質形質導入ドメイン（protein transduction domain;ＰＴＤ）」と呼ばれる。
【００７３】
好ましい細胞貫通性ペプチドは、ペネトラチン、Ｔａｔペプチド、モデル両親媒性ペプチド、トタンスポータン（ゼラチンに由来する）、ＳｙｎＢ（プロテグリンに由来する）及びシス−γ−アミノ−１−プロリン含有ペプチドから選択される。
【００７４】
本発明に従って使用される細胞貫通性ペプチドの配列は、好ましくは８〜２０のアミノ酸残基の長さであり、残基の３０％〜９０％は生理的条件下において正に帯電する側鎖を有する。残りの残基は好ましくは中性である。好ましい細胞貫通性ペプチドの配列は、以下から選択される：
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ（配列番号１０５）（ペネトラチン）、
ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ−ＮＨ2（配列番号１２４）（モデル両親媒性ペプチド）、
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２５）（Ｔａｔペプチド）。
【００７５】
さらに好ましい細胞貫通性ペプチド配列は、文献（ランゲル・ユー(Langel, U.)、細胞貫通性ペプチドのハンドブック(in Handbook of Cell-Penetrating Peptides)。5-28 (シーアールシー−テイラー・アンド・フランシス・グループ(CRC - Taylor & Francis Group), 2006), (プジャルズ・エス(Pujals S)、ギラルト・イー(Giralt E.)プロリン−リッチ両親媒性細胞貫通ペプチド（Proline-rich, amphipathic cell-penetrating peptides）。 アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビュー（Adv Drug Deliv Rev.）60(4-5): 473-84, 2008)及び(ファレラ−シンフレウ・ジェー(Farrera-Sinfreu J)、ギラルト・イー(Giralt E)、ロヨ・エム（Royo M）、アルベリシオ・エフ(Albericio F.)細胞貫通性プロリン−リッチ・ペプチド模倣体(Cell-penetrating proline-rich peptidomimetics.)。メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Methods Mol Biol.） 386: 241-67, 2007）に提供されており、この関係によりこれらは本明細書において援用される。
【００７６】
前記ペプチド誘導体の好ましい例では、ＡＭＰは、チオエーテル結合の形成と共に、ヨードアセチル（Ｓｕｂ1）を介してペネトラチン−システイン（Ｙ1）によって１位（Ｘ1）の前においてＮ末端で伸長された。この種の好ましい例は好ましくは、配列番号１０１及び１０２に記載の配列から選択される。
【００７７】
たとえば、ペネトラチンなどの細胞貫通ペプチド配列の結合を介して、驚くべきことに、グラム陰性及びグラム陽性細菌に対する活性が高められ、作用スペクトルがほかのグラム陽性及びグラム陰性の細菌まで拡大され、さらに、細胞毒性もなく哺乳類細胞に抗菌ペプチドが導入されるので、これらの細胞の中で隠された細菌、真菌又はウイルスに到達することもできる。
【００７８】
ペネトラチンは、ショウジョウバエ（ドロソフィラ・メラノガスター；Drosophila melanogaster）のアンテナペディアのホモドメイン（転写因子のＤＮＡ結合領域）の部分配列Ｒ４３〜Ｋ５８に相当する。ペネトラチンの配列（好ましくは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ；配列番号１０５）はカチオン性アミノ酸が豊富であり、その点で、多数のＡＭＰの配列に類似する。
【００７９】
本発明では、細菌及び哺乳類の細胞双方にＡＭＰを導入するのに細胞貫通性ペプチド配列を利用する。ペネトラチンに結合して、ＡＭＰは、そこで感染を治療するために真核細胞に輸送される。さらに、ＡＭＰと細胞内標的分子の相互作用によって毒性効果を検討することができる。
【００８０】
チオエーテル架橋を介した、本発明に係る抗菌ペプチドとのペネトラチンの結合は本発明の一部を形成する。
【００８１】
このために、ペネトラチンのＣ末端をシステインによって伸長させ、ヨード酢酸でＮ末端を標識した抗菌ペプチドに結合させた。
【００８２】
オンコシン及びその誘導体と同様に、本発明によれば、そのほかの抗菌ペプチド、好ましくは、プロリン−リッチ・ペプチド又はペプチド誘導体、たとえば、アピダエシン(apidaecin)、ドロソシン(drosocin)、フォルマエシン１(formaecin 1)、ピロコリシン(pyrrhocoricin)及びメタルニコウィン１(metalnikowin 1)もまた細胞貫通性ペプチド配列、たとえば、ペネトラチンによって対応するように修飾することができる。
【００８３】
好ましいアピダエシン誘導体は、ＰＴＣ／ＥＰ２００８／０５９５１２（２００８年７月２１日出願）に言及されており、この関係でこの文献は本明細書において援用される。
【００８４】
前記ペプチド誘導体の好ましい例は、配列番号９５〜１００及び１０６に記載の配列から選択される。
【００８５】
本明細書において言う「ペプチド」という表現は、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸の配列を表し、ここで、アミノ酸は好ましくは、２０種類の天然に存在するペプチドを形成するアミノ酸から選択され、アミノ酸はＬ型構造又はＤ型構造であることができ、イソロイシンとスレオニンの場合、Ｄ−アロ構造（２つのキラル中心のうち１つのみの反転）であることもできる。
【００８６】
本発明の説明において用いられる、ペプチド誘導体（又はペプチド模倣体）と言う表現は、上記のＮ末端又はＣ末端においてＹ1、Ｓｕｂ1及びＳｕｂ2によって修飾されたペプチドのみを含むのではない。加えて、それは、化学基による１以上のアミノ酸残基の置換及び／又は修飾によって改変されたペプチドであって、前記化学基は、天然のタンパク質を形成するアミノ酸残基とは異なり、たとえば、非タンパク新生性のα−アミノ酸、β−アミノ酸、又は改変された主鎖を有するペプチドである、上記ペプチドを含む。「改変された主鎖」という用語は、少なくとも１つのペプチド結合が化学的に修飾されている、すなわち、生理的条件下で開裂可能ではない結合で置換されており、かつエンドプロテアーゼによって切断できないことを意味する。
【００８７】
好ましくは、非開裂性の結合は、修飾されたペプチド結合であり、たとえば、還元されたペプチド結合、アルキル化アミド結合、又はチオアミド結合である。還元されたアミド結合は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）がヒドロキシル基（ＨＣＯＨ）又はメチレン基（ＣＨ2）に還元されているペプチド結合である。アルキル化アミド結合は、窒素原子（Ｎ−α）又は炭素原子（Ｃ−α）のいずれかでアルキル化されたペプチド結合である。アルキル残基は好ましくは１〜３の炭素原子を有する。例はＮ−メチル化である。
【００８８】
さらに、「改変された主鎖」と言う用語は、先行するアミノ酸残基のＣＯＯＨ基及び次のアミノ酸残基のＮＨ2基の双方と共有結合を形成するのに好適であり、かつ、それ故にペプチド主鎖構造、たとえば、糖アミノ酸−ジペプチド同配体、アザペプチド、６−ホモポリマー、γ−ペプチド、Ｙ−ラクタム類似体、オリゴ（フェニレン・エチレン）、ビニログスルホンペプチド、ポリ−Ｎ−置換グリシン又はオリゴカルバメートを必ずしも保持しないそのほかの基を含む。
【００８９】
主鎖の修飾は、１４位〜１９位、Ｒ−Ｘ3−Ｉ16−Ｙ17−Ｎ18−Ｘ4に存在する。従って好ましくは、Ｘ3−Ｉ16（たとえば、Ａｒｇ−Ｉｌｅ）、Ｎ18−Ｘ4（たとえば、Ａｓｎ−Ａｒｇ）、Ｘ4−ＮＨ2（たとえば、Ａｒｇ−ＮＨ2）、Ｘ6−Ｘ7（たとえば、Ａｒｇ−Ｌｅｕ又はＡｒｇ−Ｉｌｅ）の間の結合の少なくとも１つが修飾される。これらの結合は好ましくは、還元されたアミド結合、アルキル化アミド結合又はチオアミド結合から選択される。
【００９０】
本発明に係るペプチド及びペプチド誘導体は、直鎖であることができ、すなわち、配列の最初と最後のアミノ酸とが遊離のＮＨ2基とＣＯＯＨ基とを有し、或いはＳｕｂ1及びＳｕｂ2で修飾されている配列であることができる。或いは、ペプチドは環状であることができ、すなわち、最初と最後のアミノ酸がペプチド結合又はリンカーを介して連結されている。
【００９１】
上述の新規の抗生物質として活性のある化合物を製造する方法も本発明の一部を形成する。
【００９２】
本発明のペプチド又はペプチド誘導体は、合成で、又は適用可能な場合従来の方法によって組換えで製造することができる。本発明を実施する具体的な例は、実験セクションにおいて以下で詳細に開示される。好ましくは、本発明のペプチド又はペプチド誘導体は、たとえば、メリフィールド（Merrifield）（メリフィールド・アール・ビー(Merrifield R B.) 固相ペプチド合成１：テトラペプチドの合成（Solid-phase peptide synthesis. 1. Synthesis of a Tetrapeptide）。、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(Journal of the American Chemical Society) 85: 2149-&, 1963）によって記載されたような既知の合成法によって従来のように製造される。
【００９３】
或いは、本発明に記載されるペプチドは、上記のペプチドの１つをコードする核酸配列を含有するＤＮＡ断片をクローニングし、たとえば微生物又は宿主細胞で発現させる、組換え技術によって製造される。コードする核酸配列は合成で（ステマー・ダブリュ・ピー・シー(Stemmer W P C)、クラメリ・エー(Crameri A)、ハ・ケー・ディー(Ha K D)、ブレナン・ティー・エム(Brennan T M)及びハイネカー・エイチ・エル(Heyneker H L.) 多数のオリゴデオキシリボヌクレオチドからの遺伝子及びプラスミド全体の単一工程の組立(Single-Step Assembly of a Gene and Entire Plasmid from Large Number of Oligodeoxyribonucleotides) ジーン(Gene) 164: 49-53, 1995）製造することができ、又は既存の核酸配列（たとえば、野生型オンコペルタス(Oncopeltus)４をコードする配列）の部位特異的突然変異によって得ることができる。従って、コーディング配列は、既知の技法によるポリメラーゼ鎖反応において相応して作製されるプライマーを用いてｓＲＮＡ（又はＤＮＡ）によって増幅することができる。たとえば、アガロースゲル電気泳動による精製の後、ＰＣＲ産物は、ベクターに連結され、最終的に相当する組換えプラスミドによって宿主細胞が形質転換される。種々の宿主細胞、たとえば、大腸菌(E. coli)、バチラス(Bacillus)、ラクトバチラス（Lactobacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）、又はＣＯＳ−１細胞）、酵母細胞（たとえば、サッカロマイセス(Saccharomyces)、シゾフィラム(Schizophyllum)）、昆虫細胞又はウイルスの発現系（たとえば、バキュロウイルス系）について組換え技法が知られている。さらに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の製造及び精製に好適な宿主細胞及び方法は、当業者によって文献から選択され得る（ゲシング・エム・ジェー(Gething M J)及びサムブルック・ジェー(Sambrook J.) ＲＮＡ遺伝子のクローニングしたＤＮＡコピーからのインフルエンザ凝集素の細胞表面での発現(Cell-Surface Expression of Influenza Hemagglutinin from a Cloned Dna Copy of the Rna Gene)。ネイチャー(Nature) 293: 620-5, 1981）。従来の組換え製造の後、本発明のペプチドは、従来の細胞溶解法によって宿主細胞から、又は従来の方法、たとえば、液体クロマトグラフィ、特にアフィニティクロマトグラフィによって細胞培地から単離することができる。抗菌ペプチドは個々のペプチドとして又はオリゴマーとして発現させることができる。オリゴマーは、Ｎ末端又はＣ末端を介して連結されている幾つかのペプチド配列を含有することができ、或いは組換えペプチド又はタンパク質の構築物のより簡易な精製を可能にするＮ末端若しくはＣ末端のタグを含有することができる。配列をさらに修飾し、かつそれ故に所望の非天然ペプチド配列を得るために、分子生物学の従来の技法及び部位特異的突然変異誘発を使用することができる。これらの組換え技法はすべて当業者に既知であり、アピダエシン（マエノ・エム・タグチ・エス及びモモセ・エイチ（Maeno M, Taguchi S, & Momose H.） ストレプトマイセスの分泌発現系を用いた抗細菌ペプチド、アピダエシンの製造(Production of Antibacterial Peptide Apidaecin Using the Secretory Expression System of Streptomyces.)。バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Bioscience Biotechnology and Biochemistry) 57: 1206-7, 1993）、ペリネリン（ゾウ・キュー・エフ、ルオ・エックス・ジー、イェ・エル及びジィ・ティー（Zhou Q F, Luo X G, Ye L, & Xi T.）融合発現による大腸菌における新規抗菌ペプチド、ペリネリンの高レベルの産生(High-level production of a novel antimicrobial peptide perinerin in Echerichia coli by fusion expression.)。カレント・マイクロバイオロジー(Current Microbiology) 54: 366-70, 2007）、及びデフェンシン（シ・エル・ジー、リウ・エックス・シー、ル・ワイ・ワイ、ワング・ジー・ワイ、及びリ・ダブリュ・エム（Si L G, Liu X C, Lu Y Y, Wang G Y, & Li W M.）大腸菌における活性のあるヒトβ−デフェンシン−３の可溶性発現及び宿主細胞の増殖に対するその効果(Soluble expression of active human beta-defensin-3 in Escherichia coli and its effects on the growth of host cells.)。チャイニーズ・メディカル・ジャーナル(Chinese Medical Journal) 120: 708-13, 2007）を含む多数の抗菌ペプチドにすでに適用されている。
【００９４】
天然に生じないアミノ酸を遺伝子技法によってペプチドに導入することも可能である。このことは、ノレン（Noren）ら及びエルマン（Ellman）らによって詳細に記載された（ノレン・シー・ジェー、アンソニーカヒル・エス・ジェー、グリフィス・エム・シー、及びシャルツ・ピー・ジー(Noren C J, Anthonycahill S J, Griffith M C, & Schultz P G.)非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的取り込みについての一般的方法（General Method for Site-Specific Incorporation of Unnatural Amino-Acids Into Proteins）。サイエンス（Science） 244: 182-8, 1989; エルマン・ジェー、メンデル・ディー、アンソニーカヒル・エス、ノレン・シー・ジェー、及びシャルツ・ピー・ジー（Ellman J, Mendel D, Anthonycahill S, Noren C J, & Schultz P G.）非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入のための生合成法（Biosynthetic Method for Introducing Unnatural Amino-Acids Site-Specifically Into Proteins.）。メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 202: 301-36, 1991）。
【００９５】
次に、宿主細胞の培養物又は試験管内翻訳系からペプチドを単離することができる。これは、従来技術で既知であるタンパク質の精製と単離の通常の技法で達成することができる。そのような技法は、たとえば、免疫吸着又はアフィニティクロマトグラフィを含むことができる。迅速な結合と精製を可能にするタグ（たとえば、ヒスチジンタグ）によって、合成中にペプチドを提供することも可能である。その後、酵素によってタグを分離して活性のあるペプチド配列を得ることができる。
【００９６】
ペプチド自体がコード又は発現され得ないが、コード可能で発現可能なペプチドによく類似しているならば、方法を先ず、類似のペプチドに適用することができ、その後１以上の工程にて化学的に又は酵素を用いて所望のペプチド又はペプチド模倣体にそれを変換することができる。ここで記載されるペプチドを製造するこれらの方法のもう少し包括的な説明は、文献（アンダーソン・ダブリュ・エフ（Anderson W F.）ヒトの遺伝子治療(Human gene therapy.)。ネイチャー（Nature） 392: 25-30, 1998; 医薬バイオテクノロジー(Pharmaceutical Biotechnology)(クロメリン・ディー・ジェー・エー及びシンデラー・アール・ディー(Crommelin D J A & Sindelar R D)編) pp. 8-20, 53-70, 123-152, 167-180) ハーウッド・アカデミック・パブリッシャー(Harwood Academic Publishers), 1997; タンパク質合成：方法及びプロトコール(Protein Synthesis：Methods and Protocols) (マーティン・アール(Martin R)編) 1-144, ハマナ・プレス（Humana Press）, 1998; アミノ酸とペプチド合成(Amino Acid and Peptide Synthesis)(ジョーンズ・ジェー(Jones J)編) 1-89, オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Oxford University Press）, 1997; 固相ペプチド合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)(フィールズ・ジー・ビー(Fields G B)編) 1-780, アカデミック・プレス(Academic Press), 1997）に記載されている。
【００９７】
本発明に係るペプチド及びペプチド誘導体は、個々に、併用で、多量体として又は分枝多量体として使用することができる。本発明に係るペプチドの理に適った併用は、本発明に係るペプチドが、連続して一緒に又はスペーサーを介して、たとえばペプチド二量体又はペプチド三量体など（多量体）の形態で、個々のペプチドが一緒につなぎ合わされて結合しているコンカテマーを含む。この多量体は、式１〜４のいずれかに記載の同一の配列又は異なった配列を有するペプチド又はペプチド誘導体から構成され得る。
【００９８】
個々のペプチド又はペプチド誘導体は、生体適合性タンパク質、たとえば、ヒト清アルブミン、ヒト化抗体、リポソーム、ミセル、合成ポリマー、ナノ粒子、及びファージに結合させることができる。或いは、本発明に係るペプチド又はペプチド誘導体が個々に組み合わせられる多量体は、３以上のペプチドが一の中心に結合したデンドリマー又はクラスターの形態で製造することができる。
【００９９】
一実施態様では、上記式１〜４のいずれかに記載の幾つかのペプチド又はペプチド誘導体は、多量体の構築物又は配置として製造することができる。従って、たとえば、２以上のペプチドを一緒に連結する又はそれらをキャリアに結合するために、任意に、アミノ酸（たとえば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−）又はアミノ酸若しくは他の化合物に基づいた他のスペーサーをＮ末端又はＣ末端に連結することができる。この配置では、キャリアタンパク質に結合させた上記合成ペプチドの１以上の形態が想定される。或いは、配置は、任意にキャリアタンパク質に結合される、それぞれが複数の抗原ペプチドとして発現される、幾つかのペプチドを含有する。別の変異体では、選択されたペプチドが連続して連結され、組換えのタンパク質又はポリペプチドとして発現される。一実施態様では、幾つかのペプチドを、その間にスペーサーとしてアミノ酸有するか或いは有さずに、連続して連結し、さらに大きな組換えタンパク質を得る。或いは、組換えタンパク質はキャリアタンパク質に融合することができる。
【０１００】
別の実施態様では、多量体の構築物は、一のペプチドが任意のアミノ酸を介して他のペプチドに結合されている、上記で定義されたペプチドの少なくとも２つ（式１〜４のいずれかの同一又は異なったペプチドであり得る）を含有する。これらペプチドのさらなるアミノ酸に任意の数のさらなるペプチドを連結することができる。少なくとも２つのペプチドを含有する多量体配置の別の実施態様では、第２の又はさらなるペプチドが、基本構造のほかのペプチドの分枝構造に結合される。或いは、各さらなるペプチドは、Ｓｕｂ1基又はＳｕｂ2基を介して配置の別のペプチドに共有結合される。
【０１０１】
多量体の構築物又は少なくとも２つのペプチドを有する配置の別の実施態様では、少なくとも１以上のペプチドがキャリアに連結される。別の実施態様では、言及されるペプチドの１以上が、キャリアタンパク質に融合されている合成ペプチドである。さらに、直鎖ポリペプチドに順次隣接する配列を有するか又は有さずに上述のペプチドの幾つかを組み合わせる代替がある。ペプチド又はポリペプチドのいずれかが同一のキャリアに結合され、又は異なったペプチドが個々にペプチドとして、１又は異なった免疫学的に不活性のキャリアタンパク質に結合される。
【０１０２】
好適なキャリアは、安定性、投与若しくは製造を改善し、又はペプチドの活性スペクトルを改変するか若しくは改善する。キャリアの例は、ヒトアルブミン、ポリエチレングリコール、又は他の生体ポリマー、又はそのほかの天然に存在する若しくは非天然に存在するポリマーである。一実施態様では、キャリアの主成分は好ましくは、ペプチドの安定性を高めるタンパク質又は他の分子である。当業者は、キャリアとペプチドの好適な結合単位を容易に選択することができる。
【０１０３】
別の実施態様では、ペプチドは、多重抗原ペプチド（multiple antigenic peptide;ＭＡＰ）の形態で配置され、たとえば、タム(Ｔａｍ)ら（タム・ジェー・ピー、モラ・エー・エル、及びラオ・シー(Tam J P, Mora A L, & Rao C.)粘膜免疫への新規アプローチとしての脂質化（Lipidation as a novel approach to mucosal immunization.）。ワクチン抗原に対する免疫応答の調節（Modulation of the Immune Response to Vaccine Antigens） 92: 109-16, 1998）によって記載された「ＭＡＰ」の概念によってそれを構築することができる。この系はリジン残基の中央単位を使用し、本発明に係る同一ペプチドの幾つかのコピーがその上で合成される（たとえば、ポスネット・ディー・エヌ、マクグラス・エイチ、及びタム・ジェー・ピー(Posnett D N, Mcgrath H, & Tam J P.) 抗ペプチド抗体を産生する新規の方法−Ｔ細胞抗原受容体β鎖に対する部位特異的抗体の産生（Novel Method for Producing Anti-Peptide Antibodies - Production of Site-Specific Antibodies to the T-Cell Antigen Receptor Beta-Chain.）。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry) 263: 1719-25, 1988を参照のこと）。各ＭＡＰは、本発明に係る１以上のペプチドの幾つかのコピーを含有する。ＭＡＰの一実施態様は少なくとも３つ、好ましくは４つ以上のペプチドを含有する。当業者は、上記式で特定されるペプチドに係るどんな数の多量体化合物も容易に製造することができる。そのような多量体の配置及び構築物はすべて本発明の一部を形成する。
【０１０４】
多量体の形態でのさらなる組合せは、粒子の表面において製造することができ、この場合、ペプチド又はペプチド模倣体はその表面に提示される。そして、粒子は、ペプチド又はペプチド模倣体のキャリアとして機能することができ、検出可能なマーカーとして同時に作用することができる。多量体は、たとえば、ペプチド又はペプチド模倣体の鎖のＮ末端のＮ末端ビオチン化及びそれに続くストレプトアビジンとの複合体化によって得ることができる。ストレプトアビジンは、高親和性で、４つのビオチン分子又は複合体と結合することができるので、この方法によって非常に安定な四量体ペプチド複合体を得ることができる。多量体は、本発明に係る同一の又は異なったペプチド又はペプチド模倣体から製造することができる。好ましくは、本発明に係る多量体は、２以上のペプチド又はペプチド模倣体を含有し、この場合、各成分は、生物致死性活性（標的認識、抗菌活性、精製）に寄与する。
【０１０５】
本発明の別の目的は、医学又は製薬学における、たとえば、抗生物質による治療のための、又は抗菌（特に細菌致死）活性を有する組成物における、本発明に係るペプチド又はペプチド誘導体の使用である。
【０１０６】
本発明はまた、微生物、細菌又は真菌の感染の治療に用いるための本発明に係るペプチド、ペプチド誘導体及び／又は多量体も含む。
【０１０７】
本発明はさらに、他の活性医薬成分の存在とは無関係に、本発明に係る１以上のペプチド若しくはペプチド誘導体、又は多量体構築物を含有する医薬組成物に関する。
【０１０８】
医薬として及び／又は抗生物質として用いることができる有効物質の製造のための、本発明に係るペプチドの使用も本発明の一部である。
【０１０９】
ペプチドは、医薬品において個々に使用することもできる。或いは、免疫応答を誘導すること無しに、薬物動態又は生体利用効率を高めるために、上記１以上のペプチドを別の化合物に融合又は抱合させることができる。任意の数の個々のペプチド又は多量体構築物を一緒に混合して単一組成物を製造することができる。
【０１１０】
本発明に係る医薬組成物は、治療的有効量の、本発明の１以上のペプチド又はペプチド誘導体を含有する。いったん構成されると、本発明に係る医薬組成物を直接対象に投与し、微生物（特に細菌）の感染を治療することができる。このために、治療的有効な量の、本発明に係る組成物が、治療されるべき対象に投与される。
【０１１１】
本発明に係る組成物は、細菌又は真菌に感染したヒトを含む哺乳類の感染を治療することが意図される。
【０１１２】
本発明に係る少なくとも１つの、又は代わりに幾つかのペプチド又は多量体構築物を薬理学的に許容可能なビヒクル又はそのほかの成分と混合して、抗菌（特に抗細菌又は真菌殺傷）作用を有する組成物を形成することができる。そのような組成物の使用のために、選択されたペプチドが好ましくは、上述のように合成で又は組換えで製造される。
【０１１３】
この組成物の直接的な投与は、組織へ、局所的に（皮膚の表面上で）又は幾つかのそのほかの投与経路、たとえば、経口、非経口、皮下、舌下、病変内、腹腔内、静脈内、筋肉内、肺又は間質の経路によって行われる。
【０１１４】
医薬組成物はさらに適切かつ薬学上許容可能なビヒクル、充填剤又は溶媒を含有することができ、カプセル、錠剤、トローチ、被覆錠剤、丸薬、ドロップ、座薬、粉剤、スプレー、ワクチン、軟膏、ペースト、クリーム、吸入剤、貼付剤、エアゾル、などの形態を有することができる。薬学上許容可能な賦形剤には、特定の投与量について最も好適であり、同時に、ペプチド、ペプチド模倣体（ペプチド誘導体）、ペプチド複合体又はペプチド模倣体複合体と混合可能であるものに応じて、溶媒、希釈剤、又はたとえば、分散助剤や懸濁助剤のような液体結合剤、界面活性剤、等張有効物質、増粘剤、又は乳化剤、保存剤、内包剤、固体結合剤又は流動促進剤をが含まれる。
【０１１５】
従って、医薬組成物は好ましくは、薬学上許容可能なビヒクルを含有する。用語「薬学上許容可能なビヒクル」はまた、たとえば、抗体又はポリペプチド、遺伝子又はそのほかの治療剤などの、治療組成物の投与のためのビヒクルも含む。この用語は、処方が投与されている個体にとって危険である抗体の産生をそれ自体誘発せず、かつ不合理な毒性を有さない任意の医薬ビヒクルを指す。好適な「薬学上許容可能なビヒクル」は、大きな、ゆっくり分解する高分子、たとえば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活化されたウイルス構成物であることができる。前記ビヒクルは当業者によく知られている。
【０１１６】
ペプチドの塩又は機能的に同等の化合物は、既知の方法で製造することができ、それは、通常、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド複合体又はペプチド模倣体複合体が、薬学上許容可能な酸と混合されて酸塩を形成するか、又は薬学上許容可能な塩基と混合されて塩基性塩を形成することを意味する。酸又は塩基が薬学上許容可能かどうかは、適用と処方を知る当業者によって容易に立証することができる。たとえば、生体外適用に許容可能である酸及び塩基のすべてを治療用処方に移すことができるとは限らない。特定の適用によって、薬学上許容可能な酸は、有機の性質及び無機の性質の双方であることができ、たとえば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、シュウ酸、ピルビン酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、桂皮酸、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、及びチオシアン酸であることができ、それらは、ペプチド及び機能的に同等の化合物の遊離のアミノ基と共にアンモニウム塩を形成する。ペプチド及び機能的に同等の化合物の遊離のカルボキシル基と共にカルボン酸塩を形成する薬学上許容可能な塩基は、エチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、及びそのほかのモノ−、ジ−及びトリアルキルアミン並びにアリールアミンを含む。さらに薬学上許容可能な溶媒が含まれる。
【０１１７】
薬学上許容可能な塩、たとえば、無機酸の塩、たとえば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などを使用することができるが；有機酸の塩、たとえば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩なども使用することができる。薬学上許容可能な成分の詳細な議論は、レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）(マック・パブ・コ（Mack Pub. Co.）,エヌ・ジェー（N.J.）, 1991)に提供されている。
【０１１８】
治療組成物における薬学上許容可能なビヒクルは、たとえば、水、塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含有することができる。たとえば、湿潤剤又は乳化剤などの他の賦形剤も添加することもでき；ｐＨ緩衝物質及び類似の化合物が前記剤に存在することができる。通常、治療組成物は、液体形態でも、又は注射用の懸濁液としても調整され、さらに、注射の前にキャリア液体に溶解又は懸濁するための固形形態もまた想定される。「薬学上許容可能なビヒクル」の定義にはリポソームも含められる。
【０１１９】
治療処置のために、上述のペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド複合体又はペプチド誘導体複合体を製造し、これを必要とする対象に投与することができる。ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド複合体又はペプチド誘導体複合体は、適切な形態において、好ましくは投与形態に適合させ、かつ所望の治療に適切な用量で存在する医薬組成物として、対象／患者に投与することができる。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、たとえば、従来の抗生物質（たとえば、バンコマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、ペニシリン）などの他の活性化合物、又は他の抗菌活性化合物、たとえば真菌殺傷剤（たとえば、イトラコナゾール又はミコナゾール）を含有することができる。感染に伴う症状、たとえば、発熱（サリチル酸）又は発赤を緩和するそのほかの化合物も添加することができる。
【０１２１】
感染の治療のための又は生物学的戦いにおける治療上の使用と並行して、消毒剤及び／又は清浄剤（たとえば、細菌殺傷性組成物）において本発明に係るペプチド又はペプチド誘導体を使用することがさらに可能であり、表面及び／又は物体を殺菌する及び／又は清浄化するためにそれらを使用することができる。適用の別の分野は、包装であり、この場合、ペプチドは包装材に結合されるか、若しくはそれに組み入れられ、又は微生物によって容易に分解され得るそのほかの物質のための保存剤として結合される。本発明に係るペプチド又はペプチド誘導体は、接触の際、又は摂取しても毒性作用を有さないので、特に食品の包装に好適である。
【０１２２】
本発明の別の目的は、有効で治療上活性のある量の、本発明に係る薬学上活性のある組成物を投与することを含む、微生物（特に、細菌又は真菌）に感染している哺乳類を治療するための方法である。
【０１２３】
本発明との関連で、細菌感染又は真菌感染は、とりわけ、尿生殖路の感染、血液の感染（「血流感染」）、敗血症、気道感染、腹膜炎、創傷感染、消化器の感染及び髄膜炎を含む群から選択することができる。
【０１２４】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、細菌の増殖及びコロニー形成を減らす若しくは完全に防ぐことができる、又は測定可能な治療上の若しくは予防上の成功を達成することができる、治療剤、すなわち、本発明に係るペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド複合体又はペプチド模倣体複合体の量を示す。効果は、たとえば、細菌活性を調べることによって、又は細菌感染の程度及び度合いのそのほかの好適な評価方法によって、培養物の生検について決定することができる。対象についての正確な有効量は、その体重及び健康状態、疾患と治療剤の種類と程度、又は治療のために選択された幾つかの治療剤の併用に左右される。特に、本発明に係る組成物は、細菌感染及び／又は生物学的若しくは身体的な随伴作用（たとえば、発熱）を軽減又は防止するために使用することができる。内科医によって初回量を確立する方法は従来技術から知られる。確立された用量は安全で且つ奏功でなければならない。
【０１２５】
抗細菌的に有効な用量に必要とされる、本発明に係るタンパク質、ペプチド又は核酸の量は、感染の原因となる病原体、感染の重症度、及び患者の年齢、体重、性別、一般的な身体状態などを考慮に入れて確立することができる。顕著な副作用なしで抗細菌及び抗真菌として有効であるのに必要な有効成分の量は、使用される医薬処方及び、たとえば、抗生物質、抗真菌剤などのようなそのほかの成分の存在に左右される。本発明に係る適用の面積については、有効な用量は、治療される個体における０．０１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは０．５μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間のペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド複合体又はペプチド模倣体複合体であることができる。
【０１２６】
本発明に係るペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド複合体又はペプチド模倣体複合体の初回量は、繰り返し投与によって任意でモニターすることができる。投与の回数は、上記で特定された因子に依存し、好ましくは、約３日〜最大１週間の治療期間にわたって１日当たり１〜６回である。
【０１２７】
別の代わりの組成物では、本発明に係るペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド複合体又はペプチド模倣体複合体又は混合物は、対象の体内に導入されているマトリクスからの制御された放出又は連続放出によって投与される。
【０１２８】
一実施態様では、本発明に係る化合物が皮膚を介して投与される。この投与方法は、非侵襲性であり、患者に優しく、同時に、経口投与に比べて、特に化合物が消化器系の環境で安定でない場合、又は大きすぎて腸管から効率的に吸収されない場合、化合物の高い生体利用効率を明らかにもたらす。皮膚を介した吸収は、たとえば、鼻、頬、舌下、歯肉又は膣において可能である。相当する投与形態は既知の技法によって得ることができ；それらは、鼻内ドロップ、鼻内スプレー、インプラント、フィルム、貼付剤、ジェル、軟膏又は錠剤に加工することができる。好ましくは、皮膚を介した吸収については、医薬ビヒクルは、皮膚に付着し、それによって吸収による取り込みを高めるように、吸収表面との投与形態の接触時間を延ばす１以上の成分を含有する。
【０１２９】
別の実施態様では、化合物は、肺の経路、たとえば、吸入剤、噴霧剤、エアゾルスプレー、又は乾燥粉末吸入剤によって規定された量で投与される。適切な製剤は、既知の方法及び技法によって調製することができる。場合によっては、経皮送達又は直腸送達、並びに眼における適用が好適な場合もある。
【０１３０】
本発明に係る物質にとって進歩した薬剤送達又はターゲティング法によってさらに効率的に投与されることが有利であってもよい。従って、消化管が回避されるべきであれば、投与形態は生体利用効率を高める任意の物質又は混合物を含有することができる。このことは、たとえば、酵素阻害剤又は抗酸化剤によって分解を低減することによって達成することができる。化合物の生体利用効率が吸収に対する障壁、一般に粘膜の透過性を高めることによって達成されるのであればさらに良好である。浸透を促進する物質は種々の方法で作用することができ；一部は粘膜の流動性を高めるが、ほかは粘膜細胞間の間隙を拡大する。
【０１３１】
さらに、そのほかは、粘膜における粘液の粘度を低減する。好ましい吸収促進剤には、コール酸誘導体、リン脂質、エタノール、脂肪酸、オレイン酸、脂肪酸誘導体、ＥＤＴＡ、カルボマー、ポリカルボフィル及びキトサンなどの両親媒性の物質が含まれる。
【０１３２】
本発明に係るペプチド、ペプチドの誘導体、複合体又は多量体を使用することができる適応症は、グラム陽性及びグラム陰性最近の双方による細菌感染であり、たとえば、エシェリシア・コーライ（大腸菌）(Escherichia coli)、エンテロベクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、モルガネラ・モルガニイ(Morganella morganii)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、シゲラ・ディセンテリアエ(Shigella dysenteriae)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、アシネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、アグロバクテリウム‐ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)、ヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)又はプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)による細菌感染である。
【０１３３】
本発明はまた、生化学、バイオテクノロジー、医学若しくは薬学の研究における、又は特に潜在的な抗細菌作用若しくは抗真菌作用を有する物質を同定するためのスクリーニングにおける、本発明に係るペプチド、ペプチド誘導体又は多量体の使用に関する。
【０１３４】
従って、本発明はまた、以下を含む、抗細菌作用又は抗真菌作用を有する化合物を同定する方法にも関する：
（ｉ）以下を用いて競合アッセイを実施すること：
（ａ）本発明に係るペプチド、ペプチド誘導体又は多量体に感受性がある微生物、
（ｂ）本発明に係るペプチド、ペプチド誘導体又は多量体、
（ｃ）（ｂ）及び（ｃ）に（ａ）を接触させることによって試験すべき少なくとも１つの化合物；及び
（ｉｉ）微生物から本発明に係るペプチド、ペプチド誘導体又は多量体を競合的に置き換える試験化合物を選択すること。
【０１３５】
このスクリーニング法は、病原体の未知の受容体との結合について本発明に係るペプチド又は多量体構築物と競合することができる試験化合物を同定する。このように、ハイ・スループットスクリーニングにおいてペプチドと同一部位に特異的に結合する小分子を効果的に同定することができる。試験化合物は、おそらく、元のペプチド配列と同じ作用機序を有するので、本発明に係るペプチド又はペプチド誘導体によって撲滅される多重耐性微生物に対しても活性がある。
【０１３６】
スクリーニング法は既知の方法によって実施されるが、少なくとも１つの本発明に係るペプチド、ペプチド誘導体又は多量体を使用する。好ましくは、このために、本発明に係るペプチド、ペプチド誘導体又は多量体には、蛍光性、放射性、又はそのほかの検出可能なマーカーが具備される。標識されたペプチド、ペプチド誘導体又は多量体の微生物への結合挙動は、試験物質の存在下及び非存在下において比較される。
【０１３７】
好ましくは、本発明に係るペプチド又は多量体構築物との結合に競合する試験化合物が次いで同定され、それらの抗細菌作用又は抗真菌作用について試験される。
【０１３８】
一実施態様では、二量体（ＢＩＦＣ;bimolecular fluorescence complementation：二分子蛍光補完）の形成後の競合アッセイにおいて蛍光を測定する。この方法によって細胞内のタンパク質相互作用の直接的な視覚化が可能になり、それは、大腸菌(E. coli)における天然の及び人工的な標的分子を伴ったｃ−Ａｂ１チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインの例について明らかにされた（モレル・エム、エスパルガロ・エー、アビレス・エフ・エックス、及びベンチュラ・エス（Morell M, Espargaro A, Aviles F X, & Ventura S.） 二分子蛍光補完による一時的なタンパク質−タンパク質相互作用の検出：Ａｂ１−ＳＨ３の場合(Detection of transient protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation: The Ab1-SH3 case.)。プロテオミクス(Proteomics) 7: 1023-36, 2007）。この試験系は、十分に感度が高いので大腸菌における低レベルの発現のタンパク質の相互作用でも検出することができる。それは、ＳＨ３がパートナーに結合した後、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の２つの断片の付加体形成に基づく。これら２つのタンパク質は互いに結合すると直ちに、ＹＦＰの２つの断片が複合体を形成するが、その複合体の構造は天然タンパク質と極めて類似するものである。個々の断片は蛍光を発しないので、これは、ＹＦＰ複合体の観察される蛍光から知ることができる。本発明において記載されるペプチド及びペプチド誘導体との結合部位で競合する化合物を検索するのに類似の構築物を設計することもできる。ハイ・スループットスクリーニングは、当業者によって３８６ウェル・マイクロタイタープレートに容易に移すことができる。
【０１３９】
別の実施態様では、病原体の未知の受容体からペプチドを競合的に置き換える試験化合物の能力を測定するために、適切な競合アッセイにおいてペプチドが用いられる。所望であれば、選択されたペプチドに結合することが分かっている微生物（たとえば、細菌、ウイルス、又は真菌）、たとえば、大腸菌（E. coli）又は肺炎桿菌(クレブシエラ・ニューモニエ;K. pneumoniae)の株は、（選択されるアッセイによって）たとえばＥＬＩＳＡ方式において適切な表面に直接又は間接的に固定化することができる。固定化のための相応する表面は周知である。たとえば、不活性粒子（「ビーズ」）を使用することができる。しかしながら、リガンドもまた９６ウェル・マイクロタイタープレートに結合することができる。次いで、選択した量の試験化合物と本発明に係るペプチドを固定化させた微生物と接触させ、微生物への結合についてペプチドと競合する化合物を選択する。細菌又は真菌における受容体結合についてペプチドと競合するこれら試験化合物が同定された場合、それらのさらなる抗細菌作用又は抗真菌作用についてそれらを調査することができる。これについての好適な方法は実施例において以下に説明されている。
【０１４０】
別の側面では、本発明は、その配列が本発明にかかるペプチド又は多量体をコードする、単離された核酸分子を提供する。本発明に係る抗細菌又は抗真菌のペプチド又は多量体構築物をコードする核酸は、宿主細胞においてその発現を制御する調節配列と動作可能に連結される。本発明の別の目的は、上述の核酸分子で形質移入又は形質転換された宿主細胞である。
【０１４１】
以下の実施例によって、本発明をそれに限定することなく、本発明を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】寒天拡散アッセイにおける大腸菌(E. coli)BL21 AIに対するオンコシン類似体（Ａｌａ−スキャン）の抗菌活性を示す。斜交平行棒は部分阻害を示す。
【図２】寒天拡散アッセイにおけるミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)ATCC 10240に対するオンコシン類似体（アラニン−スキャン）の抗菌活性を示す。
【図３】５，６−カルボキシフルオレセイン標識オンコシン（ＣＦ−オンコシン、配列番号９４）及びペネトラチン−オンコシン（ＣＦ−ペネトラチン−オンコシン、配列番号１０２）と共にインキュベートした後のＨｅＬａ細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。上の列：位相差、下の列：蛍光（５１７ｎｍでの放射）。Ａ，Ｂ：ＣＦ−オンコシンとインキュベートしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ；Ｃ，Ｄ：ＣＦ−ペネトラチン−オンコシンとインキュベートしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ；Ｅ，Ｆ：ＣＦ−オンコシンとインキュベートしたＨｅＬａ；Ｇ、Ｈ：ＣＦ−ペネトラチン−オンコシンとインキュベートしたＨｅＬａ。棒は２０μｍに相当する。
【図４】大腸菌(E. coli)BL21 AIの共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す。ペプチド濃度は３０μmol／Ｌ；ＴＡＭＲＡ濃度は１８０μmol／Ｌ；上の列：位相差、下の列：蛍光。Ａ、Ｂ：ＣＦ−オンコシンと２０分間インキュベート；Ｃ、Ｄ：ＣＦ−オンコシンと５０分間インキュベート；Ｅ、Ｆ：ＣＦ−ペネトラチン−オンコシンと５０分間インキュベート；Ｇ、Ｈ：ＣＦ−ペネトラチンホモダイマーと９０分間インキュベート。棒は５μｍに相当する。
【図５】ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)10240の共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す。ペプチド濃度は３０μmol／Ｌ；ＴＡＭＲＡ濃度は１８０μmol／Ｌ。上の列：位相差、下の列：蛍光。Ａ、Ｂ：ＣＦ−ピロコリシン；Ｃ、Ｄ：ＣＦ−ペネトラチン−ピロコリシン；Ｅ、Ｆ：ＣＦ−ドロソシン；Ｇ、Ｈ：ＣＦ−ペネトラチン−ドロソシン；Ｉ、Ｊ：ＣＦ−ペネトラチンホモダイマー。棒は５μｍに相当する。
【図６】「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")を用いて測定したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（網目のカラム）及びＨｅＬａ細胞（黒色のカラム）に対する抗菌ペプチドの細胞傷害性試験の結果を示す。培地中の６００μｇ／ｍＬのオンコシン、オンコシンR15O R19O、ドロソシン及びアピダエシン１ｂ（配列番号１８、７２、８９及び８７）との２４時間のインキュベート後の試験。陽性対照は、１２％のＤＭＳＯ及び１００μｇ／ｍＬのメリチン。陰性対照１２％ＰＢＳに対して正規化。
【図７】「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")を用いて測定したＨｅＬａ細胞に対するペネトラチン構築物の細胞傷害性試験の結果を示す。培地中の５０〜４００μｇ／ｍＬのペネトラチン−ドロソシン（配列番号９６）、ペネトラチン−アピダエシン１ｂ（配列番号９４）、ペネトラチン−ピロコリシン（配列番号９８）、ペネトラチン−オンコシン（配列番号１００）、ペネトラチンホモダイマー（配列番号１０２）、ペネトラチン（配列番号１０５）との２４時間のインキュベート後の試験。陰性対照は１２％ＰＢＳであり、陽性対照は１２％ＤＭＳＯである。
【図８】「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")を用いて測定したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するペネトラチン構築物の細胞傷害性試験の結果を示す。培地中の５０〜４００μｇ／ｍＬのペネトラチン−ドロソシン（配列番号９６）、ペネトラチン−アピダエシン１ｂ（配列番号９４）、ペネトラチン−ピロコリシン（配列番号９８）、ペネトラチン−オンコシン（配列番号１００）、ペネトラチンホモダイマー（配列番号１０２）、ペネトラチン（配列番号１０５）、ペネトラチン−ｔａｕ（配列番号１０６）との２４時間のインキュベート後の試験。１２％ＰＢＳを陰性対照として用い、１２％ＤＭＳＯを陽性対照として用いた。
【図９】ペプチド、すんわちオンコシン、ドロソシン、及びアピダエシン１ｂ（配列番号１８、８９及び８７）についての溶血試験の結果を示す。ペプチドの希釈系列は４．７〜６００μｇ／ｍＬ。陽性対照：メリチン及びトリトンＸ−１００（登録商標）、陰性対照：ＰＢＳ。
【図１０】「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")を用いて測定したＨｅＬａ細胞に対する抗菌ペプチドについての細胞傷害性試験の結果を示す。培地中６００μｇ／ｍＬのオンコシン及びオンコシン誘導体（配列番号１８、６３、７２、１０７〜１１０）、並びに比較例のアピダエシン１ｂ及びドロソシン（配列番号８７及び８９）との２４時間のインキュベート後の試験。陽性対照は１２％ＤＭＳＯ及び１００μｇ／ｍＬのメリチンである。陰性対照１２％ＰＢＳに対して正規化した。図は３つ組での２つの独立した試験の平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１４３】
実施例１．ペプチド合成
ペプチド合成のための化学薬品はすべて、特に言及しない限り、最高純度でフルカ・ケミー社(Fluka Chemie GmbH)（スイス、ブッシュ(Buchs)）から入手した。
【０１４４】
Ｆｍｏｃ／tＢｕストラテジー（フィールズ・ジー・ビー及びノーブル・アール・エル(Fields G B & Noble R L.) ９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸を利用した固相ペプチド合成(Solid-Phase Peptide Synthesis Utilizing 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-acids.)。インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ(International Journal of Peptide and Protein Research) 35: 161-214, 1990）を用いて、Ｓｙｒｏ２０００多重ペプチド合成ロボット（ドイツ、ウィッテンのマルチシンテック社(MultiSynTech GmbH)）において、従来の固相ペプチド合成によって、ペプチド及びペプチド誘導体すべてを合成した。標準的なＦｍｏｃアミノ酸はすべて、マルチシンテック社(MultiSynTech GmbH)（ドイツ、ウィッテン）、又はオルペゲン製薬会社(Orpegen Pharma GmbH)（ドイツ、ハイデルベルグ）から入手した。２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸（Ａｇｐ；アイリス・バイオテック社（Iris Biotech GmbH）、ドイツ、マルクトレドヴィッツ;Marktredwitz）、β−ホモアルギニン（βHar、フルカ・ケミー社(Fluka Chemie GmbH)、スイス、ブッシュ(Buchs)）、ホモアルギニン（Har）、Ｎ−メチルアルギニン（N−Me−Arg）及びニトロアルギニン（Arg(NO2)，バケム社(Bachem AG)、スイス、ブベンドルフ(Bubendorf)）は特別なアルギニン類似体として用いた。トランス−４−ヒドロキシプロリン（t-4-Hyp）及び２，３−ジアミノプロピオン酸（Dap）は、ノババイオケム(Novabiochem)（メルクバイオサイエンス社、ドイツ、ダルムシュタット（Darmstadt））から入手した。
【０１４５】
ペプチドは、ワング樹脂(Wang resin)（１．２３ｍｍｏｌ／ｇ）において酸として、又はマルチシンテック社(MultiSynTech GmbH)（ドイツ、ウィッテン）からのリンク−アミド  ４−メチルベンジルヒドリルアミン(Rink-amide 4-methylbenzylhydrylamine）（ＭＢＨＡ）樹脂（０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）において酸アミドとして合成した。１級アミンによる後者の官能化については、ペプチドチオエステルとしてペプチドを誘導体化し、このために、最初のアミノ酸を４−スルフアミノ−ブチリル−アミノメチル樹脂（ＳＡＢ  ＡＭ、１．１ｍｍｏｌ／ｇ；ノババイオケム(Novabiochem)、メルクバイオサイエンス社、ドイツ、ダルムシュタット）に結合させた。
【０１４６】
ワング樹脂(Wang resin)上で、第１のＣ末端アミノ酸（５当量（ｅｑ））をジクロロメタン（ＤＣＭ；オランダ、バルケンサワード(Valkenswaard)のバイオソルブ・ビー・ブイ(Biosolve BV)）において、５ｅｑの２，６−ジクロロベンゾイルクロリド及び８．２５ｅｑのピリジンと結合させた（シエバー・ピー(Sieber P.)９−フルオレニルメトキシカルボニル−アミノ酸の４−アルコキシベンジルアルコール樹脂へのアンカリングのための改善された方法(An Improved Method for Anchoring of 9-Fluorenylmethyoxycarbonyl-Amino Acids to 4-Alkoxybenzyl Alcohol Resins.)。テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron Letters) 28: 6147-50, 1987）。Ｃ末端アミノ酸（５ｅｑ）によるＳＡＢ ＡＭ樹脂の官能化は、ＤＣＭ中で、５ｅｑの（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ、ノババイオケム(Novabiochem)、メルクバイオサイエンス社、ドイツ、ダルムシュタット）及び１０ｅｑのＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）による活性化によって−２０℃にて行った（バックス・ビー・ジェー及びエルマン・ジェー・エー(Backes B J & Ellman J A.) 固相合成のためのアルカンスルホンアミドのセーフティ・キャッチ・リンカー(An Alkanesulfonamide Safety-Catch Linker for Solid-Phase Synthesis.)。ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(The Journal of Organic Chemistry) 64: 2322-30, 1999）。
【０１４７】
先にロードされたワング（Wang）及びＳＡＢ ＡＭの樹脂上における自動合成で記載されたように、各場合、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：バイオソルブ・ビー・ブイ(Biosolve BV)、バルケンサワード（Valkenswaard）、オランダ）における、８ｅｑのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）による、０．５ｍｏｌ／Ｌの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）に溶解した８ｅｑのアミノ酸の活性化によって、第１のアミノ酸をリンク−アミド樹脂(Rink-amide resin)に結合させた。
【０１４８】
使用した側鎖保護基は、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、及びＧｌｎについてはトリフェニルメチル（トリチル）、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ及びＴｈｒについてはｔｅｒｔ−ブチルエーテル（tＢｕ）、Ａｓｐ及びＧｌｕについてはｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＯtＢｕ），Ａｒｇについてはω−Ｎ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（ｐｂｆ）、βＨａｒ及びＨａｒについてはω−Ｎ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ及びＡｇｐについてはｔｅｒｔ−ブチロキシ−カルボニル（Ｂｏｃ）、又はＮ−Ｍｅ−Ａｒｇについてはω−Ｎ−４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニル−スルホニル（Ｍｔｒ）であった。一時的なＦｍｏｃ保護基は、ＤＭＦ中４０％のピペリジン（ｖ／ｖ）（バイオソルブ・ビー・ブイ(Biosolve BV)、バルケンサワード（Valkenswaard）、オランダ）で５分間、再び、ＤＭＦ中２０％新鮮ピペリジンで１０分間によって切断した。
【０１４９】
８ｅｑの酢酸、蟻酸、又はヨード酢酸を０．５mol／ＬのＨＯＢＴ／ＤＭＦに溶解し、ＤＭＦ中で８ｅｑのＤＩＣによってそれらを活性化することによってペプチド又はペプチド誘導体のＮ末端をアセチル化、ホルミル化又はヨードアセチル化した。ガウセポール(Gausepohl)ら(ガウセポール・エイチ、ピエルス・エイチ、及びフランク・アール・ダブリュ(Gausepohl, H., Pieles, H., & Frank, R.W.)  ペプチド：化学、構造及び生物学(in Peptides: chemistry, structure and biology)(スミス・ジェー・エー及びリビエール・ジェー・イー編(eds. Smith, J.A. & Rivier, J.E.)) 523 (エスコム、ライデン(ESCOM, Leiden), 1992))に従って、それぞれＤＭＦ中の１０ｅｑの２−（1Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ，ドイツ、ウィッテンのマルチシンテック社(MultiSynTech GmbH)）とＤＩＰＥＡによってペプチド又はペプチド誘導体のＮ末端をグアニジン化した。ＤＭＦ中で５ｅｑのＨＢＴＵと１０ｅｑのＤＩＰＥＡを用いて、蛍光色素５，６−カルボキシフルオレセインによってＮ末端を修飾した。
【０１５０】
カイザー試験(Kaiser test)によってＮ末端修飾の完全性を検証した。このために、９５℃にて比率（１：１：２）でのエタノール（ドイツ、カールスルーエ(Karlsruhe)のカール・ロス社＋Co. KG(Carl Roth GmbH + Co. KG）)中の０．２８mol／Ｌのニンヒドリン（ドイツ、シールズ(Seelze)のリエデル・デ・ハエン(Riedel de Haen）と、ピリジン中０．２ｍｍｏｌ／Ｌのシアン化カリウムと、エタノール中７６％のフェノールと共に少量の樹脂をインキュベートした。遊離１級アミノ基を示す青着色が出現した場合、カップリングを繰り返した。
【０１５１】
ペプチド又はペプチド誘導体の合成の完了時、ＤＭＦ及びＤＣＭで樹脂を慎重に洗浄し、真空下で乾燥させた。８７．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）において水とｍ−クレゾールとチオアニソールとエタンジチオール（５：５：５：２．５）の混合物によって室温にて４時間、樹脂に結合したペプチドを切断し、同時に側鎖を脱保護した。冷ジエチルエーテルによってペプチド及びペプチド誘導体を沈殿させ、３０００＊ｇにて遠心分離した。ペレットを冷エーテルで２回洗浄し、乾燥させ、０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解した（ＵＶ分光法）。試料を−２０℃で保存した。
【０１５２】
ＳＡＢ ＡＭ樹脂上でのペプチドの切断に先立って、Ｆｍｏｃ基の切断後、ＤＭＦ中２０ｅｑのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（ＢｏＣ2Ｏ、スイス、ブッシュ(Ｂｕｃｈｓ)のフルカ・ケミー社(Fluka Chemie GmbH）と１０ｅｑのＤＩＰＥＡによってＮ末端を保護した。アルキル化によってスルファミルリンカーを活性化するために、洗浄した樹脂にＤＭＦ中１００ｅｑのヨードアセト二トリルと２０ｅｑのＤＩＰＥＡを加えた（テルヤ・ケー、マーフィ・エー・シー、バーリン・ティー、アペラ・イー、及びマズール・エス・ジェー(Teruya K, Murphy A C, Burlin T, Appella E, & Mazur S J.) ｐ５３Ｃ末端断片のＦｍｏｃに基づく化学合成と超コイルＤＮＡへの選択的結合及びそのリン酸化誘導体とアセチル化誘導体(Fmoc-based chemical synthesis and selective binding to supercoiled DNA of the p53 C-terminal segment and its phosphorylated and acetyleated derivatives.)。ジャーナル・オブ・ペプチド・サイエンス(Journal of Peptide Science) 10: 479-93, 2004）。ペプチドの切断については、ＤＭＦ中５０ｅｑのプロピルアミン（１０％ｖ／ｖ）を樹脂に加えた。ＤＭＦを除いた後、原料ペプチドを８７．５％のＴＦＡ中の水とｍ−クレゾールとチオアニソールとエタンジチオール（５：５：５：２．５）の溶液に溶解し、側鎖保護基とＮ末端Ｂｏｃ保護基すべてを分離した。冷ジエチルエーテルによってペプチドを沈殿させ、３０００×ｇにて遠心分離した。沈殿物を冷エーテルで２回洗浄し、乾燥させ、０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解した（ＵＶ分光法）。試料を−２０℃で保存した。
【０１５３】
ジュピター（Jupiter）C18 5μｍ 300Å、２５０×１０ｍｍ又はジュピター(Jupiter) C18 １５μｍ ３００Å、２５０×２１ｍｍのカラム（米国、トランス(Torrance)のフェノメネックス社(Phenomenex Inc.)）を伴うアクタ（Ａｋｔａ）ＨＰＬＣシステム（ドイツ、フライブルク(Freiburg)のアマシャムバイオサイエンス社）のＲＰ−ＨＰＬＣによって、切断されたペプチド及びペプチド誘導体を精製した。
【０１５４】
各場合に使用した溶媒は、０．１％ＴＦＡ水溶液（溶離液Ａ）と０．１％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル水溶液（バイオソルブ・ビー・ブイ(Biosolve BV)、バルケンサワード（Valkenswaard）、オランダ）（溶離液Ｂ）であった。典型的な線形勾配は、５％の溶離液Ｂで開始し、溶出は１０ｍＬ／分（２５０×２１ｍｍのカラム）又は５ｍＬ／分（２５０×１０ｍｍのカラム）の流速にて１分間当たり１％のＢの増加により行った。検出は、２２０、２３０及び２４０μｍで行った。ジュピター(Jupiter)Ｃ１８ ５μｍ、３００Å、１５０×４．６ｍｍのカラム（米国、トランス(Torrance)のフェノメネックス社(Phenomenex Inc.)）を伴う同一のＨＰＬＣシステムで、精製されたペプチドを解析した。５〜９５％のＢの直線勾配にて１ｍＬ／分の流速で３０分間それを溶出し、２２０ｎｍで検出した。加えて、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、４７００プロテオミック・アナライザー、アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems GmbH)、ドイツ、ダルムシュタット(Darmstadt)）によって純度を判定した。このために、マトリクス（０．１％ＴＦＡ水溶液中５０％アセト二トリルでの５．３ｍｇ／ｍＬ）として０．５μＬのα−シアノヒドロキシ桂皮酸（ドイツ、ブレーメン(Bremen)のブルッカー・ダルトニック社(Bruker Daltonik GmbH）と共に０．５μＬのペプチド溶液を共結晶化した。
【０１５５】
窒素の下、４℃にて脱気したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）にて精製ペネトラチン−Ｃｙｓモノマーを４ｅｑの精製したヨードアセチル化ＡＭＰと共にインキュベートすることによってペネトラチン誘導体のチオエーテル結合を実施した。ＲＰ−ＨＰＬＣによって反応をモニターし、ペネトラチン−Ｃｙｓモノマーの完全な反応の後、ペネトラチン構築物が精製された。並行して、（ペネトラチン−Ｃｙｓ）2ダイマーを得た。
【０１５６】
プロリン−リッチ抗菌ペプチド「オンコペルタス(Oncopeltus)抗菌ペプチド４」の不完全に決定された配列から出発して、Ｃ末端アミノ酸Ｎ18Ｎ19Ｒ20によってペプチド４の第一の誘導体（表２）を最初に合成し、カルボキシル機能は変えなかった。１１位での修飾の中で、カチオン性アミノ酸Ｌｙｓ及びＡｒｇは驚くべき良好な特性を示した。誘導体は、低いマイクロモル範囲で大腸菌(E. coli)及びミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対して抗菌活性を示した。Ｃ末端のさらなる誘導体化については、Ａｒｇ１１で誘導体化された配列を選択し、ＡｓｎとＡｒｇの異なった配置を有する誘導体を合成した。ＡｓｎによってＣ末端で短縮された誘導体（配列番号１８）は、驚くべき高い活性を示した。Ｃ末端酸アミドとして、さらに、それは驚くべき高い血清安定性を達成した。配列ＶＤＫＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＲＲＩＹＮＲ−ＮＨ2（配列番号１８）を有するペプチドを以後オンコシンと呼ぶが、主として血清安定性だけでなく抗菌活性に関してもさらに改善した。
【０１５７】
【表２】
2012516142.tif 000003
*比較例
【０１５８】
【表３】
2012516142.tif 000004
2012516142.tif 000005
2012516142.tif 000006
2012516142.tif 000007
2012516142.tif 000008
【０１５９】
アミノ酸残基については一文字表記を用いたが、アミノ酸鎖におけるＯはオルニチンを表し；
プロピルは、Ｃ末端上のプロピルアミドを表し（Ｓｕｂ2＝ＯＲ3＝ＮＨＣ3Ｈ7）；Ａｃ＝アセチル基、ｆｏｒ＝ホルミル基、ｇｕａｎ＝グアニジノ基、及びＣＦ＝５，６−カルボキシフルオレセイン、修飾されたＮ末端の例（Ｎ末端アミノ酸の修飾されたα−アミノ基、Ｓｕｂ1＝アセチル−ＮＨ、ホルミル−ＮＨ、グアニジノ、又は５，６−カルボキシフルオレセイン）、
βＨａｒ：β−ホモアルギニン、アルギニンに対するβ−アミノ酸同族体（ホモログ）、
Ａｇｐ：２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、Ｈａｒ：ホモアルギニン、及びＡｒｇ（ＮＯ2）：ニトロアルギニンはアルギニンの同族体（ホモログ）である、
Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ：Ｎ−メチル−アルギニン−ペプチド結合上でメチル化されたアルギニン、
４ｔＨｙｐ：トランス−４−ヒドロキシプロリン、
Ｔｌｅ：ｔｅｒｔ−ブチルグリシン
Ｄａｐ（Ａｃ）：側鎖にアセチル化されたアミノ官能基を有する２，３−ジアミノプロピオン酸、
（ＣＨ2ＣＯ）：システインのＳＨ基に対するアセチルリンカー、
ｆ：α−アミノカプロン酸
小文字は対応するＤ−アミノ酸を示す、
比較例は＊で印を付ける。
【０１６０】
実施例２：安定性
２５％マウス血清における血清安定性
マウス血清及び２５％マウス血清（オーストリア、パスチング(Pasching)のピーエーエー・ラボラトリーズ社(PAA Laboratories GmbH)）において、ホフマンら(Hoffmann)（ホフマン・アール、バスコ・エム、及びオトボス・エル（Hoffmann R, Vasko M, & Otvos L.）ホスホペプチドの血清安定性(Serum stability of phosphopeptides)。アナリティカ・ケミカ・アクタ(Analytica Chimica Acta) 352: 319-25, 1997）に従って二重判定として血清安定性試験を行った。このために、ペプチド及びペプチド模倣体を水に溶解し、マウス血清を加え、ペプチド濃度を７５μｇ／ｍＬに調整した。連続して振盪しながら混合物を３７℃でインキュベートした。０、３０、６０、１２０、２４０、及び３６０分後、各場合でアリコートを取り出し、１５％トリクロロ酢酸（ドイツ、カールスルーエ(Karlsruhe)のカール・ロス社(Carl Roth GmbH ＆ Co.)）水溶液と混合した。氷上でさらに１０分間インキュベートした後、沈殿した血清タンパク質を遠心した（ドイツ、ハンブルグのエッペンドルフ、ミニスピン、１３４００ｒｐｍ、５分間）。上清を取り出し、１mol／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（フルカ・ケミー社(Fluka Chemie GmbH)、スイス、ブッシュ(Buchs)）によって中和し、分析まで−２０℃で保存した。
【０１６１】
イオン対合剤としての０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＵＶ等級、フルカ・ケミー社(Fluka Chemie GmbH)、スイス、ブッシュ(Buchs)）の存在下で線形のアセトニトリル勾配（オランダ、バルケンサワード(Valkenswaard)のバイオソルブ・ビー・ブイ(Biosolve BV)）を伴ったＲＰ−ＨＰＬＣによって上清を分析した。マトリクス（０．１％ＴＦＡ水溶液中５０％アセト二トリルでの５．３ｍｇ／ｍＬ）としてのα−シアノヒドロキシ桂皮酸（ドイツ、ブレーメン(Bremen)のブルッカー・ダルトニック社(Bruker Daltonik GmbH)）と共に分画を共結晶化し、陽イオン反射モードで直列質量分光計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ、４７００プロテオミクス・アナライザー；ドアプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems GmbH)、ドイツ、ダルムシュタット(Darmstadt)）によって解析した。次いで個々の時点で、完全なペプチド、その分解産物又は代謝体の比率を同定し、定量することができた。使用した対照（コントロール）は、２５％マウス血清の水溶液であり、同一時間間隔で並行して分析した。
【０１６２】
表４は、２５％マウス血清におけるオンコシン（配列番号１８）及び選択されたオンコシン誘導体の半減期を示す。リストにある配列番号１４及び１９を有するオンコペルタス(Oncopeltus)４誘導体は最低の安定性を有し、半減期は３０分未満である。ここで、１９位のアルギニン（残基Ｘ4）を先ず切断する。分解産物ＶＤＫＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＲＲＩＹＮ−ＯＨ（配列番号２８）の安定性はそのとき、１２０分まで上昇したが、この断片は、非常に低い抗菌活性（大腸菌(E. coli)で６４μｇ／ｍＬ）しか有さなかった。オンコシンにおけるＣ末端（Ｓｕｂ2）のアミド化では、大腸菌(E. coli)及びミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対する活性（それぞれ４及び８μｇ／ｍＬ）に加えて、安定性もペプチド誘導体にとって驚くべき高い値である６０分に増大する。プロピルアミドによるアミド化（配列番号５８）を介して、オンコシンの半減期はさらに１２０分に延びた。
【０１６３】
【表４】
2012516142.tif 000009
＊比較例
【０１６４】
非タンパク新生性アミノ酸オルニチン（配列番号６１）についての１９位（残基Ｘ4）の置換は安定性を１２０分の半減期に増大させた。Ａｒｇ１５のオルニチンへの置換は、このオンコシン誘導体（配列番号５０）の安定性を９０分の半減期に増大させた。１５位（残基Ｘ3）においてプロリン（配列番号６０）又はβ−ホモアルギニン（配列番号６２）を有する誘導体は、１２０又は１５０分後まで半分に分解されなかった。４−トランス−ヒドロキシプロリン（配列番号２４）における１３位でのプロリンの置換は、オンコシンの安定性に何ら否定的な効果を有さなかった。
【０１６５】
１５位及び１９位（残基Ｘ3及びＸ4）においてこれら修飾を組合せることによって、３６０分を超える半減期が判定された、非常に安定な誘導体を合成することが可能であった。大腸菌(E. coli)に対する４又は８ｍｇ／ｍＬのＭＩＣ値を持つＯｒｎ１９及びＨｙｐ１５又はＯｒｎ１５を有する、好ましい例となる配列番号６３及び７２の活性はオンコシンに匹敵する。Ｏｒｎ１５とプロピルアミド化Ｃ末端との組合せ（配列番号７１）は、本発明の非常に好ましい別の例を表す。
【０１６６】
１００％マウス血清における血清安定性
【表５】
2012516142.tif 000010
【０１６７】
１５位及び１９位においてアルギニン残基をオルニチン又はトランス−４−ヒドロキシプロリン（配列番号６３及び７２）に置換することによって、２５％マウス血清の水溶液における半減期は６時間を超えて増やすことができた（上記参照）。１００％マウス血清におけるインキュベートの後、Ｒ15Ｏ及びＲ19Ｏの置換では、１７５分の半減期がこれらの配列について判定された。Ｒ15Ｈｙｐ及びＲ19Ｏ（配列番号６３）を置換することによって、使用したペプチドの６０％が４８０分後依然として検出された。Ｒ13Ｈｙｐ、Ｒ15Ｈｙｐ、Ｒ19Ｏ及びＩ16Ｔｌｅを有するオンコシンの別の誘導体（配列番号１１０）は、４８０分後、ペプチドの元々の量の６０％又は７０％を依然として含有していた。大腸菌(E. coli)に対する双方の誘導体の活性は４μｇ／ｍＬと２μｇ／ｍＬで非常に良好だった。
【０１６８】
細菌のプロテアーゼに対する安定性
細菌溶解物の調製
細菌溶解物については、５００ｍＬの栄養ブロス(nutrient broth)（カールスルーエ(Karlsruhe)のカール・ロス社＋Co. KG(Carl Roth GmbH + Co. KG））に大腸菌（E. coli）ＢＬ２１Ａ１を植菌し、３７℃にて一晩インキュベートした。ＪＬＡ−１０．５００ローター付きのベックマン・アバンティ（商標）Ｊ−２０−ＸＰ遠心機(Beckman AvantiTM J-20-XP centrifuge)（米国、フラートン(Fullerton)のベックマン・コールター（Beckman Coulter））において５０００ｒｐｍ、４℃で２５分間、２×２５０ｍＬの細菌懸濁液を遠心した。ペレットをそれぞれ３０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁し、ベックマン・アレグラ（商標）２ＩＲ遠心機(Beckman AllegraTM 2IR centrifuge)（米国、フラートン(Fullerton)のベックマン・コールター（Beckman Coulter））で再び遠心した。ペレットをそれぞれ１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、氷上で２×５分（７５０Ｗ；振幅４０％；２秒オン／３秒オフ）、超音波（ビブラ−セル（商標）マイクロチップ(Vibra-cellTM microtip、フィッシャー・バイオブロック・サイエンティフィック(Fisher Bioblock Scientific)イルカーチ(Illkirch)、フランス）で粉砕した。細菌溶解物を合わせ、１ｍＬのアリコートを１５４００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心した（ベックマン・アレグラ（商標） (Beckman AllegraTM)）。上清を取り出し、−２０℃で保存した。細菌溶解物中のタンパク質含量は、ブラッドフォード(Bradford)によるタンパク質測定によって決定した。
【０１６９】
ブラッドフォード（Bradford）によるタンパク質測定[エム・エム・ブラッドフォード(M.M. Bradford); (1976): アナリティッシュ・バイオケミー(Analytische Biochemie), 72, 248-254]
標準系列のためのストック溶液として２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡのＰＢＳ溶液を調製した。これをＰＢＳで希釈して１０〜１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの６種の標準溶液を得た。分析する試料からＰＢＳの希釈系列を調製した。各場合、５０μＬの試料又は標準溶液をピペットでポリスチレン製のマイクロプレートに入れた。ブラッドフォード（Bradford）試薬については、０．０１％のクマシーブリリアントブルーＧ２５０を５％エタノールに溶解し、８．５％のｏ−リン酸を加え、２回蒸留した水で満たした。次いで混合物を６０℃で１時間インキュベートし、室温でさらに１２時間静置し、次いで濾過した。２００μＬのブラッドフォード（Bradford）試薬を各ウエルに加え、暗所で１５分間インキュベートした。ブランク値（５０μＬのＰＢＳ＋２００μＬのブラッドフォード（Bradford）試薬）に対して５９５ｎｍで吸収を測定した。
【０１７０】
細菌溶解物における安定性の測定
タンパク質含量が１．５ｍｇ／ｍＬ又は０．５ｍｇ／ｍＬの細菌溶解物における０．１５μｇ／ｍＬのペプチドの溶液を３７℃でインキュベートした。０、３０、６０、１２０、２４０、又は３６０分後に、それぞれから２００μＬを取り出し、１５％トリクロロ酢酸５０μＬでタンパク質を沈殿させた。次いで、４℃にて１０分間それをインキュベートし、その後ミニスピン卓上遠心機で１３０００ｒｐｍにて５分間遠心した。上清から２１０μＬを取り、１mol／Ｌの水酸化ナトリウム溶液で中和した。完全なペプチド及び分解産物をＨＰＬＣで解析した。０．１％トリクロロ酢酸（ＴＦＡ）を伴った３％アセトニトリル水溶液６０μＬを溶液に加え、２５０μＬの混合物を注入した。クロマト分画の後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって構成成分を同定した。
【０１７１】
【表６】
2012516142.tif 000011
【０１７２】
細菌プロテアーゼに対する安定性を検討するために、大腸菌(E. coli)ＢＬ２１  Ａ１の一晩の培養物から溶解物を調製し、ペプチドをその中でインキュベートした。ブラッドフォード（Bradford）タンパク質測定法を用いて、タンパク質の濃度を０．５又は１．５ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０１７３】
天然のオンコシン（配列番号１８）については、タンパク質総濃度０．５ｍｇ／ｍＬの溶解物において６０分の半減期が判定された。Ｒ15Ｏ及びＲ19Ｏを置換することによって（配列番号７２）、半減期は１１５分に倍加した。次の工程では、プロリンエンドペプチダーゼの切断部位の１３位におけるプロリンをトランス−４−ヒドロキシプロリンに置換し（配列番号１０７）、その安定性は２１５分にさらに増大した。Ｐ13Ｈｙｐ、Ｒ15ｈｙｐ及びＲ19Ｏを組合せることによって２４０分を超える半減期が達成された。
【０１７４】
Ｒ15Ｏ及びＲ19Ｏを有する別の誘導体では、１６位のイソロイシンをｔｅｒｔ−ブチルグリシンに置換し（配列番号１０９）、その安定性は２４０分を超えて増大した。Ｐ13Ｈｙｐ、Ｒ15ｈｙｐ、Ｒ19Ｏ及びＩ16Ｔｌｅの組合せを有する誘導体（配列番号１１０）も、０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の溶解物で２４０分を超える半減期を達成した。驚くべきことに、オンコシン誘導体は大腸菌(E. coli)に対する抗細菌活性に陽性の効果を有し、配列番号１０８及び１１０のＭＩＣ値を２μｇ／ｍＬに低下させた。
【０１７５】
実施例３：抗細菌試験
阻害ゾーン試験（寒天拡散アッセイ）
精製したペプチド及びペプチド誘導体を水で最終濃度５００μｇ／ｍＬに希釈した。試験微生物を、対数増殖相での培養物から、およそ３×１０5細胞／ｍＬの濃度で１％トリプシンの大豆ブロス（Soy broth）及び１．２％アガロース（フルカ・ケミー社(Fluka Chemie GmbH)、スイス、ブッシュ(Buchs)）のプレートに塗布した。３ｃｍの間隔で、各場合において、１０μＬのペプチド水溶液（５００μｇ／ｍＬ）又は対照としての１０μＬの水及び抗生物質水溶液を一滴ずつ加えた。３７℃にて２０時間インキュベートした後、阻害ゾーンの直径（ＩＺＤ）を測定した。試験はすべて好気性条件で行った。
【０１７６】
オンコシン配列のアラニン・スキャン用いて、アラニンへの置換が大腸菌(E. coli)ＢＬ２１  Ａ１（図１）及びミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)１０２４０（図２）に対する抗菌活性の顕著な低下をもたらす、様々な残基を同定した。
【０１７７】
図１及び図２では、オンコシンの配列ＶＤＫＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＲＲＩＹＮＲ（配列番号１８）がＸ軸にプロットされている。各アミノ酸は、この位置で置換されたアラニンを有する対応するペプチドを表す。たとえば、欄ＶａＩＩは、ペプチドＡＤＫＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＲＲＩＹＮＲ−ＮＨ2（配列番号２９）を表し、ＩＺＤの値はＹ軸上に割り振られている。阻害ゾーンの直径が大きければ大きいほど、ペプチドの活性は高い。
【０１７８】
大腸菌(E. coli)ＢＬ２１  Ａ１に対する寒天拡散アッセイでは（図１）、位置Ｌｙｓ３、Ｔｙｒ６−Ａｒｇ９及びＡｒｇ１１でのアラニンの置換は、オンコシン（ＩＺＤ１．７ｃｍ）に比べて活性を顕著に低下させた。これらの誘導体（配列番号３１、３４〜３７及び３９）は寒天プレート上での大腸菌(E. coli)の増殖を部分的にしか阻害せず、１．０〜１．２ｃｍの直径で阻害ゾーンを超えて増殖することもあった。ペプチドＡｌａ１５は、増殖なしで最小の阻害ゾーンを有した（１．３ｃｍ、配列番号４３）。ほかの位置はすべて活性を低下させることなく変更することができ、活性の増大、スペクトルの拡大、安定化及び生体内の良好な分布を達成することができる。プロテアーゼに対して安定なアミノ酸が組み込まれ、抗菌活性を失うことなく血清安定性が高められる場合、陽性の効果はここでは主としてＮ末端Ｖａｌ１とＣ末端Ａｒｇ１９で達成された。
【０１７９】
グラム陽性細菌ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対する寒天拡散アッセイ（図２）は、アラニン置換の結果、抗菌活性には陽性の効果と陰性の効果があることを示した。活性に重要な位置は、配列全体にわたって分布しており；ここでは、ペプチドは、オンコシン（１．８ｃｍ）に比べて最小限に小さな阻害ゾーンで増殖を完全に阻害する。主として、Ｌｙｓ又はＡｒｇの置換、すなわちペプチドにおける正の帯電の喪失は抗菌活性を低下させる。活性の最大の増大は、０．７ｃｍにてＩｌｅ１６とＡｓｎ１８の置換（配列番号４４、４６）によって達成された。これらの位置での変化は、各場合、Ｏｒｎ１５とＯｒｎ１９を持ち、１６位でＬｅｕの置換（配列番号７３）又は１８位でＧｌｎの置換（配列番号７４）がある実施例で見出される。配列番号７４は、これら３つの置換によってオンコシンに相当する活性を達成するが、Ｇｌｎ１８はオルニチン置換の小さな陰性効果を代償する。
【０１８０】
増殖阻害アッセイ
抗菌ペプチド及びペプチド誘導体の最小阻害濃度（minimum inhibitory concentration;ＭＩＣ）を微量希釈アッセイで決定した。これらは、無菌の平底９６ウェル・マイクロタイタープレート（ポリスチレン製、グレイナー・バイオ-ワン社(Greiner Bio-One GmbH)、フリッケンハウゼン(Frickenhausen)、ドイツ）におけるペプチドの連続希釈とウエル当たり１００μＬの総容積を使用した。ペプチド又はペプチド模倣体の水溶液を１％ＴＳＢ水溶液で希釈して２５６μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。５０μＬのペプチド又はペプチド模倣体の溶液を各系列の最初のウエルにピペットで入れ、撹拌した。この溶液から５０μＬを第２のウエルに移し、撹拌し、再び５０μＬを次のウエルに移し、以下同様にした。最初のウエルでの２５６μｇ／ｍＬから始まって１２番目のウエルにおける１２５ｎｇ／ｍＬまでの倍々希釈系列を得る。たとえば、大腸菌(E. coli)ＢＬ２１  Ａ１のような細菌を栄養ブロス（nutrient broth）（ドイツ、カールスルーエ(Karlsruhe)のカール・ロス社＋Co. KG(Carl Roth GmbH + Co. KG））において３７℃で一晩培養した。５×１０6個の細菌／ｍＬの１％ＴＳＢ懸濁液５０μＬをマイクロタイタープレートの各ウエルに加えたので、１２８μｇ／ｍＬ（ウエル１）〜６２．５ｎｇ／ｍＬ（ウエル１２）の最終濃度のペプチド又はペプチド模倣体を各系列で確立した。プレートを３７℃にて２０時間インキュベートし、次いでＴＥＣＡＮマイクロタイタープレート分光光度計（テカン・トレーディング社(Tecan Trading AG)、スイス、マンネドルフ(Mannedorf)）によって５９５ｎｍにて吸収を測定した。ペプチド及びペプチド模倣体すべてのＭＩＣ値は３つ組(triplicate)で決定した。無菌水を陰性対照として使用した。ＭＩＣ値は、３７℃にて２０時間のインキュベート時間の後細菌の増殖が認められない最低のペプチド濃度を表す。
大腸菌(Escherichia coli)ＢＬ２１  Ａ１及びミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)ＡＴＣＣ  １０２４０に対するペプチド及びペプチド模倣体のＭＩＣ値は表７に示されている。
【０１８１】
【表７】
2012516142.tif 000012
2012516142.tif 000013
2012516142.tif 000014
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2012516142.tif 000016
【０１８２】
Propyl（プロピル）は、Ｃ末端上のプロピルアミドを表し（Ｓｕｂ2＝ＯＲ3＝ＮＨＣ3Ｈ7）；Ａｃ＝アセチル基、ｆｏｒ＝ホルミル基、ｇｕａｎ＝グアニジノ基及びＣＦ＝５，６−カルボキシフルオレセインは修飾されたＮ末端の例である（Ｎ末端アミノ酸の修飾されたα−アミノ基、Ｓｕｂ1＝アセチル−ＮＨ、ホルミル−ＮＨ、グアニジノ、又は５，６−カルボキシフルオレセイン）、
βＨａｒ：β−ホモアルギニン、アルギニンに対するβ−アミノ酸同族体(homolog)、
Ａｇｐ：２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、Ｈａｒ：ホモアルギニン、及びＡｒｇ（ＮＯ2）：ニトロアルギニンはアルギニンの同族体(homolog)である、
Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ：Ｎ−メチル−アルギニン−ペプチド結合上でメチル化されたアルギニン、
４ｔＨｙｐ：トランス−４−ヒドロキシプロリン、
Ｔｌｅ：ｔｅｒｔ−ブチルグリシン
Ｄａｐ（Ａｃ）：側鎖においてアセチル化されたアミノ官能基を有する２，３−ジアミノプロピオン酸、
（ＣＨ2ＣＯ）：システインのＳＨ基に対するアセチルリンカー
ｆ：α−アミノカプロン酸
小文字は対応するＤ−アミノ酸を示す。
【０１８３】
配列番号２は、天然のオンコペルタス(Oncopeltus)４の配列に相当する。配列番号１は、天然のオンコペルタス(Oncopeltus)４の配列のＮ末端が短縮された誘導体である。配列番号１、２、３、４、１０〜１３、１７、２８、３１、３４、３５、３９及び４８を有する配列は比較例であり、これら及びそのほかは表７では＊で印が付けられている。配列番号８〜９、８０、８１及び８５を有する配列は、本発明のあまり好ましくない例である。表７に示されるそのほかの配列は本発明に係る好ましいペプチド又はペプチド誘導体である。最も好ましい例は、配列番号１８、２２、２４、２６、２９、５８、６２、６３、６５〜７１、７４、７９、８２及び１０７〜１１２である。
【０１８４】
当初の配列（配列番号２）におけるＰｒｏ１１（残基Ｘ2）をカチオン性アミノ酸Ｌｙｓ及びＡｒｇ（配列番号８及び１４）に置換することによって、驚くべきことに、大腸菌(E. coli)ＢＬ２１  Ａ１及びミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)10240に対する高い活性が達成された。プロリン−リッチＡＭＰ（配列番号４）におけるこの位置で頻繁に生じるＨｉｓ（配列番号５）及びＴｈｒの置換は陽性の効果を有さなかった。１１位でのＡｒｇによる誘導体は、８μｇ／ｍＬ（大腸菌；E. coli）で今のところ最低のＭＩＣを有するので、Ｃ末端で改変された。Ｃ末端のアミド化は、１つの希釈工程によってミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対する活性を否定的に変更したにすぎなかった。最後の位置又は最後から２番目の位置においてＡｒｇがないので正の荷電を欠くペプチド誘導体（配列番号２７、２８、４７、５１）は、主にミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対する活性を８〜１６倍喪失し、好ましい例には含まれない。
【０１８５】
１９位（残基Ｘ4）においてＡｒｇを、かつ２０位においてＡｓｎを有する配列番号１６は配列番号１４と同じくらい活性がある。意外にも、Ｃ末端（Ｓｕｂ2）のアミド化は、活性に陰性の影響を有さない（配列番号１５）。Ｃ末端（Ｓｕｂ2）のアミド化は、高い活性をもたらしさえする（配列番号１９と配列番号１８を比較）。Ｃ末端のアミド化はさらに、安定性に対して有意に陽性の効果を有する。従って、アミド化されたペプチド誘導体は、遊離の酸機能を有する、対応するペプチドよりも３０分まで長い半減期を有する（実施例２）。ペプチド誘導体、配列番号１８は、大腸菌(E. coli)又はミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対してそれぞれ４又は８μｇ／ｍＬで最低のＭＩＣ値を有し、２５％マウス血清水溶液で６０分間の半減期を有し、オンコシンとして指名された（表４）。
【０１８６】
血清安定性試験では、オンコシンは１５位（残基Ｘ3）及び１９位（残基Ｘ4）においてＣ末端で切断され、ペプチドＶＤＫＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＲ−ＯＨ（配列番号１２６に相当する）及びＶＤＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＲＲＩＹＮ−ＯＨ（配列番号２８に相当する）が主な分解残物として同定された。６４μｇ／ｍＬのＭＩＣを有し、Ａｒｇ１９によって短縮された誘導体は、大腸菌(E. coli)に対して非常に低い抗菌活性を依然として有するにすぎなかった。１９位（残基Ｘ4）においてアルギニン又はそのほかのカチオン性アミノ酸を有する誘導体は、驚くべきことに、高い安定性を示した。しかしながら、大腸菌(E. coli)に対して１６μｇ／ｍＬのＭＩＣを有し、１９位でＨｉｓを有する誘導体（残基Ｘ4；配列番号５３）は、オンコシンより４倍低い活性を有した。好ましい例は、そのＭＩＣがオンコシンの値に相当し、従って意外にもペプチドの活性に負の効果を有さない、１９位（残基Ｘ4）におけるＡｇｐ、Ａｒｇ（ＮＯ2）、Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ及びＨａｒによる置換（配列番号５４〜５７）、置換されたペプチド誘導体である。好ましい、一番安価な例は、配列番号５０におけるＡｒｇ１９のオルニチンへの置換である。この誘導体は、ほとんど同じ活性でオンコシン（６０分）よりもはるかに安定である。Ｃ末端の安定化についての別の好ましい例は、プロピルアミド（配列番号５８）のようなカルボキシル官能基（Ｓｕｂ2）のアミド化であった。抗菌活性は維持され、半減期も１２０分を超える。
【０１８７】
１９位（残基Ｘ4）で安定化された誘導体では、さらなる例において１５位（残基Ｘ3）がアルギニン誘導体又はそのほかのカチオン性アミノ酸で置換された。好ましい例は、Ａｇｐ、Ａｒｇ（ＮＯ2）、Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ、Ｈａｒ及びＯｒｎの様々な組合せを伴った配列番号６５〜７０である。最も費用効率が高い好ましい例は、１５位と１９位（残基Ｘ3及びＸ4）においてオルニチンを有し、３６０分を超える半減期を有し、かつオンコシン（大腸菌(E. coli)で８μｇ／ｍＬのＭＩＣ）に匹敵する活性を有する配列番号７２である。配列番号７４は、Ｏｒｎ１５及びＯｒｎ１６に加えて１８位のグルタミンのアスパラギンへの置換を有し、その結果、やや高い活性を生じた（大腸菌(E. coli)で４μｇ／ｍＬのＭＩＣ）。配列番号７１における１５位（残基Ｘ3）でのＯｒｎとプロピルアミンを有するＣ末端（Ｓｕｂ2）のアミド化との組合せは、驚くべき高い活性（大腸菌(E. coli)で４μｇ／ｍＬ）と非常に高い血清安定性（＞３６０分）とを持つ別の非常に好ましい例である。１９位（残基Ｘ4）におけるＯｒｎと組合せて好ましい配列番号６３にてヒドロキシプロリンによる１５位（残基Ｘ3）での非カチオン性の置換を行った。この誘導体も高い活性（大腸菌(E. coli)で４μｇ／ｍＬ、ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)で８μｇ／ｍＬ）及び優れた安定性（＞３６０分）を有する。オンコシンの４、８又は１３位（配列番号２１〜２４）におけるプロリンのヒドロキシプロリンによる置換は、ＭＩＣ値に影響を何ら有さず、１５位（残基Ｘ3）での第２の不安定な切断部位のプロテアーゼ耐性を低下させない。ヒドロキシプロリンによるこの置換は、ＭＩＣ値に対する影響も血清安定性に対する影響も有さないが、意外にも、この置換は細胞毒性と溶血性を低下させる。
【０１８８】
オンコシンにおけるＮ末端の修飾の好ましい例は、オンコシンに対する同様の活性を有し、１位（残基Ｘ1）でＯｒｎの置換を有する配列番号８２である。Ｎ末端アミノ官能基のアセチル化、メタノイル化（ホルミル化）又はグアニジン化（Ｓｕｂ1；配列番号８０、８１、８３、８４、８５）は、活性をたとえば、１２８μｇ／ｍＬ又は３２（大腸菌(E. coli)又はミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)；配列番号８１）に低下させた。
【０１８９】
抗菌ペプチドのＮ末端のアミノ官能基にチオエーテル架橋を介してペネトラチンを結合させた。この修飾は、今までミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対してほとんど活性がなかったペプチドの活性スペクトルを拡大することができ、この細菌を含めることができた。ピロコリシン（配列番号９１）についてのＭＩＣ値は、ペネトラチン−ピロコリシン（配列番号９８）についての１２８μｇ／ｍＬから４μｇ／ｍＬに最大級に低下したが、これは活性における３２倍の増大と同等である。ペネトラチン−アジダエシン（８μｇ／ｍＬ、配列番号９４）もまた、未修飾のアピダエシン１ｂ（６４μｇ／ｍＬ、配列番号８７）よりも８倍活性が高い。８μｇ／ｍＬのＭＩＣ値を有するオンコシン（配列番号１８）については、活性にて４μｇ／ｍＬへの２倍の増大がペネトラチン−オンコシン（配列番号１００）で認められた。ドロソシン（０．５μｇ／ｍＬ、配列番号８９）の高い活性は、ペネトラチン−ドロソシン構築物（１μｇ／ｍＬ、配列番号９６）において維持された。
【０１９０】
１３位及び１５位でのプロリンのトランス−４−ヒドロキシプロリンへの置換及びＡｒｇ１９のオルニチンへの置換（配列番号１０８）は驚くべきことに、２μｇ／ｍＬで、天然のオンコシン配列（４μｇ／ｍＬ、配列番号１８）に比べて、大腸菌(E. coli)に対する活性の増大をもたらす一方で、安定性は高いままである。１６位のイソロイシンをｔｅｒｔ−ブチルグリシン置換すると（配列番号１１０）、大腸菌(E. coli)に対する２μｇ／ｍＬのＭＩＣ値は維持される。それは、ここで関心が持たれる主な高い安定性である。
【０１９１】
配列番号１０７を有するペプチドの活性は、オンコシン（配列番号１８）と同様の、ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対する抗生物質作用を示す。配列番号１１３〜１１８の配列は比較例である。Ｄ−アミノ酸で合成された誘導体（配列番号１１５及び１１６）は、大腸菌(E. coli)には活性を示さず、ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対して軽い活性（６４又は１２８μｇ／ｍＬ）を示すにすぎない。
【０１９２】
天然の順序でＤ−アミノ酸を有するＤ−ペプチドすべて（配列番号１１５及び１１６）及びレトロ−インバース合成ペプチド(retro-inverse synthesized peptides)（配列番号１１７及び１１８）は大腸菌(E. coli)に対してわずかな活性（６４〜２５６μｇ／ｍＬ）を示すにすぎない。しかしながら、Ｄ−アミノ酸で合成されたペプチド（配列番号１１５〜１１８）はすべて依然として１６〜３２μｇ／ｍＬのＭＩＣ値を有し、ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対して相対的に良好な活性を示し、それは、５つの正の正味電荷を有するＬ−ペプチドの領域に位置する。ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に対する正味電荷に依存した活性及びＤ−ペプチドのＭＩＣ値は、このグラム陽性細菌における標的タンパク質に非特異的な作用機序を示しているものと考えられる。
【０１９３】
【表８】
2012516142.tif 000017
【０１９４】
表８に示すペプチドは、たとえば、エシェリシア・コーライ(E. coli) DSM 10233、クレブシエラ・ニューモニエ(K. pneumoniae)DSM 681及びシュードモナス・アエルギノーザ（P. aeruginosa）DSM 3227のような病原性細菌に対するＭＩＣについて検討された。１５位で４−トランス−ヒドロキシプロリンを有する誘導体（配列番号６３、１０８、１１３及び１１４）はすべて、１〜４μｇ／ｍＬのＭＩＣ値を有し、驚くべきことにオンコシン（配列番号１８）よりも１６倍まで高い、大腸菌(E. coli)ＤＳＭ１０２３３に対する活性を有する。
【０１９５】
表１０は、多重耐性細菌株に対する一部のペプチド及びペプチド誘導体のＭＩＣ値を提供する。試験はこの場合、１％ＴＳＢと同等であるミュエラー-ヒントン(Mueller-Hinton)培地（１／４濃縮）で行った。調べた耐性細菌株の一部を表９に示し、調べたペプチドを表１１に示す。
【０１９６】
【表９】
2012516142.tif 000018
【０１９７】
【表１０】
2012516142.tif 000019
ｎ．ｄ．：未測定
＊比較のためのアピダエシン１ｂ（配列番号８７）及びドロソシン（配列番号８９）
【０１９８】
【表１１】
2012516142.tif 000020
【０１９９】
好ましい例、配列番号１８、２２及び２４は、驚くべきことに、３つの異なったグラム陰性の多重耐性細菌種、すなわち大腸菌(E. coli)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)及びサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)に対して少なくとも高い又はさらに高い活性を示した。オンコシンは、β−ラクタマーゼを過剰産生する大腸菌(E. coli)Ｄ３１に対して２μｇ／ｍＬ、フルオロキノロン耐性のクレブシエラ・ニューモニエ(K. pneumoniae)012-3132に対して４μｇ／ｍＬ、及び多重耐性サルモネラ・チフィムリウム(S. typhimurium)ATCC 700408細菌に対して０．２５μｇ／ｍＬのＭＩＣ値を有した。１つの例外（配列番号１５）と共に、試験したアミド化ペプチドはすべて大腸菌(E. coli)及びクレブシエラ・ニューモニエ(K. pneumoniae)の株に対して良好なＭＩＣ値を示した。オンコシン（配列番号１８）を導く、配列番号２からのＡｓｎ１９の欠失は、驚くべきことにペプチドの活性をさらに高めた。Ｃ末端のアミド化は、大腸菌(E. coli)及びクレブシエラ・ニューモニエ(K. pneumoniae)に対する活性を高めるだけでなく、さらにオンコプレタス(Oncopeltus)４又はオンコシン誘導体の安定性も高める。
【０２００】
シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)及びプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)と共に、さらなるグラム陰性細菌を試験し、好ましい例、配列番号１８及び２４の活性を決定した。オンコシン（配列番号１８）は、シュードモナス・アエルギノーザ（P. aeruginosa）39324（ＭＩＣ：４μｇ／ｍＬ）に対して及びプロテウス・ミラビリス(P. mirabilis)とプロテウス・ブルガリス(P. vulgaris)に対して（１２８μｇ／ｍＬ）活性があった。オンコシンはまた、グラム陽性スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)15305細菌に対して１６μｇ／ｍＬで活性があった。従って、本発明に係るペプチドは、驚くべき広い作用スペクトルを示す。
【０２０１】
【表１２】
2012516142.tif 000021
【０２０２】
オンコシンの誘導体は、大腸菌(E. coli)DSM 10233、クレブシエラ・ニューモニエ(K. pneumoniae)DSM 681及びシュードモナス・アエルギノーザ（P. aeruginosa）DSM 3227のような病原性細菌に対して非常に良好な活性を示す。１５位における４−トランス−ヒドロキシプロリンによる置換（配列番号６３及び１０８）は、大腸菌(E. coli)DSM 10233に対して１〜４μｇ／ｍＬの間で驚くべき高いＭＩＣ値をもたらし、これらは、オンコシン（配列番号１８）より１６倍高い。これらの誘導体がまた、クレブシエラ・ニューモニエ(K. pneumoniae)DSM 681及びシュードモナス・アエルギノーザ（P. aeruginosa）DSM 3227に対して高い活性を示し、本発明に係るペプチドの広い作用スペクトルを説明している。
【０２０３】
実施例４：蛍光顕微鏡
ＨｅＬａ細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェル・マイクロタイタープレート（グレイナー・バイオ-ワン社(Greiner Bio-One GmbH)、フリッケンハウゼン(Frickenhausen)、ドイツ）に入れ、一晩インキュベートした。翌日、５，６−カルボキシフルオレセイン標識ペプチド又はペネトラチン構築物を新鮮培地に溶解し（４０μmol／Ｌ）、細胞をその中で２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡によってＰＢＳ中で調べた。
蛍光顕微鏡のパラメータ
顕微鏡：レイカ(Ｌｅｉｃａ)ＤＭＩ６０００Ｂ（レイカ・マイクロシステムズ社(Leica Mikrosystems GmbH)、ヴェッツラー(Wetzlar)、ドイツ）
光源：金属ハロゲンランプ付きのレイカ（Ｌｅｉｃａ）ＥＬ６０００
対物：エヌ・プラン・エル（Ｎ  ＰＬＡＮ  Ｌ）２０ｘ０．４０ｃｏｒｒ
ソフトウエア：レイカ・アプリケーション・スイート(Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ)  ２．１．８．；アドビ・フォトショップ(Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ)  ＣＳ
【０２０４】
図３の蛍光顕微鏡写真は、４０μmol／Ｌの５，６−カルボキシフルオレセイン標識オンコシン（配列番号９４）と共にインキュベートした後、ＨｅＬａ細胞又はＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では蛍光を検出できないことを示す（図３Ｂ及びＦ）。さらに、５，６−カルボキシフルオレセイン標識アピダエシン１ｂ、ピロコリシン及びドロソシン（配列番号８８、９０及び９２）について、蛍光が検出されず、つまり抗菌性プロリン−リッチ・ペプチドの内部移行は検出することができなかった。対照的に、５，６−カルボキシフルオレセイン標識ペネトラチン−オンコシン（配列番号１０２）と共に双方の細胞株をインキュベートした後、細胞内部での強い蛍光が顕微鏡写真で認められ（図３Ｄ及びＥ）、構築物全体の内部移行の証拠を提供している。
【０２０５】
アピダエシン１ｂ、ピロコリシン及びドロソシンを伴ったペネトラチン構築物（配列番号９６、９８及び１００）も双方の細胞に内部移行し、明確な蛍光を示す。
【０２０６】
実施例５：共焦点レーザー走査顕微鏡
細菌
一晩培養した細菌懸濁液を１５０×１０6個の細胞／ｍＬに希釈し、５，６−カルボキシフルオレセイン標識ペプチド及びペネトラチン構築物を加えた（３０μmol／Ｌの最終濃度）。細菌外の分子の蛍光を消光させるために、６０ｅｑの５，６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ；メルク、ドイツ、ダルムシュタット(Darmstadt)）を加えた。レイカ・マイクロシステムズ社(Leica Microsystems GmbH)（ヴェッツラー(Wetzlar)、ドイツ）からのＴＣＳ  ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡によって、細菌における標識ペプチドの内部移行の結果生じた蛍光を直ちに調べた。
【０２０７】
５，６−カルボキシフルオレセイン標識オンコシンとの２０分間のインキュベートの後、ペプチドは細菌の膜に蓄積した（図４Ｂ）。細胞の外に残る、５，６−カルボキシフルオレセインとＴＡＭＲＡとの間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を介した消光効果がそのために失われ、蛍光シグナルを検出することができる。さらに３０分後、ペプチドは細胞の内部に蓄積した（図４Ｄ）。５，６−カルボキシフルオレセイン標識アピダエシン１ｂ、ピロコリシン及びドロソシンの配列（配列番号９６、９８及び１００）も大腸菌(E. coli)に内部移行し、明確な蛍光を生じる。対照的に、標識したペネトラチン構築物はさらにゆっくりと細胞の内部に達し、匹敵するインキュベート時間ではるかに弱い蛍光を生じる（図４Ｆ）。この所見は決定された最小阻害濃度と相関する。従って、オンコシンのペネトラチン構築物（配列番号１００）は、３２μｇ／ｍＬでオンコシン（４μｇ／ｍＬ、配列番号１８）よりも８倍高いＭＩＣ値を有し、大腸菌(E. coli)に対してかなり低い活性を有した（表７）。９０分後でさえ、ペネトラチンのホモダイマーの侵入は蛍光顕微鏡により検出できなかった（図４Ｈ）。このことは、ペネトラチン構築物では、代表的なプロリン−リッチ・ペプチド配列はペネトラチンを貨物として細菌細胞に輸送することを示している。
【０２０８】
対照的に、５，６−カルボキシフルオレセイン標識ペネトラチンのホモダイマーは、グラム陽性のミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)の細胞に侵入し、１時間のインキュベートの後、そこで明確な蛍光シグナルを生じる（図５Ｊ）。標識されたピロコリシンは同じインキュベート時間の後、ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)で検出することはできない（図５B）。標識したペネトラチン−ピロコリシンにおけるトランスポータとしてのペネトラチンと共に、誘導体はミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)に蓄積し、強い蛍光シグナルを生じる（図Ｄ）。ＭＩＣ値は、ピロコリシンの１２８μｇ／ｍＬからペネトラチン−ピロコリシンの４μｇ／ｍＬに低下し、それは、活性における３２倍の増大に相当する（表７）。並行して、ペネトラチン−アピダエシン誘導体（８μｇ／ｍＬ）についてアピダエシン１ｂの活性（６４μｇ／ｍＬ）に対する８倍の増大が測定された。
【０２０９】
ＨｅＬａ細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞
マトテク社(MatTek Corporation)（米国、マサチューセッツ州、アシュランド）のガラス底の培養皿にて細胞を培養し、５，６−カルボキシフルオレセイン標識ペネトラチン構築物（ＳＨ−ＳＹ５Ｙには１０μmol／Ｌ、ＨｅＬａには７μmol／Ｌ）と共に２時間又は２４時間インキュベートした。培地を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄し、新鮮培地を加えた。細胞核を染色するために、色素ヘキスト(Hoechst)33342（フルカ・ケミー社(Fluka Chemie GmbH)、ブッシュ(Buchs)、スイス）を加え、さらに１５分間インキュベートした。ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡によって直ちに蛍光を分析した。画像はすべて逐次走査方式で記録し、画像の群をレイカ・アプリケーション・スイート・アドバンスト・フローレセンス1.7.1ソフトウェア(Leica Application Suite Advanced Fluorescence 1.7.1)（レイカ・マイクロシステムズ；Leica Microsystems）及びアドビ・フォトショップCS(Adobe Photoshop CS)（アドビ・システムズ社(Adobe Systems GmbH)、ミュンヘン、ドイツ）によって解析した。
【０２１０】
結果は、５，６−カルボキシフルオレセイン−ペネトラチンによってＮ末端で延長された抗菌ペプチドは２時間以内に細胞に浸透することを示している。逆に、ペネトラチンの配列なしで５，６−カルボキシフルオレセインで標識されただけの抗菌ペプチドは、細胞で検出することができず、すなわち、これらのペプチドは、外部細胞膜を介して試験された細胞株に浸透することはできない。細胞内部への輸送はペネトラチンの配列を介してのみ行われる。色素ヘキスト(Hoechst)33342による細胞核の染色及び色素ミトトラッカーレッドCMXRos（MitoTracker Red CMXRos）によるミトコンドリアの染色は、これらの区画におけるペプチドの局在を除外した。かなり長いインキュベート時間（２４時間）の後、５，６−カルボキシフルオレセインによってもたらされた蛍光は細胞核の近傍に濃縮された。ゴルジ体を染色することによって部分的な共局在を検出することができた。
【０２１１】
実施例６：細胞傷害性
ＨｅＬａ細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞によるＭＴＴアッセイ
ロッシュ・ダイアグノスティックス社(Roche Diagnostics GmbH)（ドイツ、マンハイム）の「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")によってペプチド、ペプチド模倣体及びペネトラチン構築物の細胞傷害性を測定した。この方法は、代謝的に活性のある細胞の細胞性オキシドレダクターゼによる黄色のメチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウム・ブロミド（ＭＴＴ）の還元に基づく（ビスティカ・ディー・ティー（Vistica D T）ら、 細胞生存率のためのテトラゾリウムに基づくアッセイ-ホルマザン産生に影響する選択されたパラメータの重要な調査(Tetrazolium-Based Assays for Cellular Viability - A Critical Examination of Selected Parameters Affecting Formazan Production.)、キャンサー・リサーチ(Cancer Research) 51: 2515-20, 1991;スラター・ティー・エフ、サウヤー・ビー、及びストラウリ・ユー(Slater T F, Sawyer B, & Strauli U.) コハク酸−テトラゾリウム還元酵素系に関する研究：３．４つの異なったテトラゾリウム塩のカップリングの点(Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. 3. Points of Coupling of 4 Different Tetrazolium Salts.)。バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta) 11: 383-&, 1963; ベリッジ・エム・ブイ及びタン・エー・エス(Berridge M V & Tan A S.)、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム・ブロミド（ＭＴＴ）の細胞性還元の特性評価−ＭＴＴ還元における細胞内局在、基質依存性、及びミトコンドリア電子輸送の関与(Characterization of the Cellular Reduction of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Mtt) - Subcellular Localization, Substrate Dependence, and Involvement of Mitochondrial Electron Transport in Mtt Reduction.)。 アーカイブ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Archives of Biochemistry and Biophysics) 303: 474-82, 1993）。水不溶性の紫色のホルマザン生成物の形成は、生存細胞の数に比例し、細胞溶解後、光度計で検出することができる。
【０２１２】
５％ＣＯ2及び９５％湿度のもと、３７℃で、フィルター栓付きの細胞培養ビン（２５ｃｍ2）又は９６ウェル・マイクロタイタープレート（グレイナー・バイオ-ワン社(Greiner Bio-One GmbH)、フリッケンハウゼン(Frickenhausen)、ドイツ））において細胞培養を行った。培地及び添加剤はすべてピーエーエー・ラボラトリーズ (PAA Laboratories)（オーストリア、パスチング(Pasching)）から入手した。各場合、５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ／グルタミン培地（ＨｅＬａ）又は１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓＦ−１２培地（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）に、１％の非必須アミノ酸と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを加えた。
【０２１３】
ＨｅＬａ細胞又はＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２×１０4個の細胞／ウエルの濃度で無菌の９６ウェル・マイクロタイタープレートに入れ、一晩インキュベートした。無菌のＰＢＳで細胞を１回洗浄し、１００μＬの新鮮培地に溶解したペプチドを加えた。培地中１２％のＰＢＳ又は１２％のＤＭＳＯをそれぞれ陰性対照又は陽性対照として役立てた。インキュベート（２４時間）の後、１０μＬのＭＴＴ試薬を０．５ｍｇの最終濃度になるように加え、３７℃にてさらに４時間インキュベートした。０．０１mol／Ｌの塩酸中の１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液によって、細胞と結晶性ホルマザンを溶解し、16時間後、パラディグム（商標）マイクロプレート・リーダー(ParadigmTM Microplate Reader)（ベックマン・コールター社（Beckman Coulter GmbH）、ワルズ(Wals)、オーストリア）によって５９０ｎｍと６５０ｎｍにて吸収を測定した。
【０２１４】
驚くべき結果は、６００μｇ／ｍＬで試験した抗菌プロリン−リッチ・ペプチドはどれもＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞又はＨｅＬａ細胞に毒性効果を有さないことを示している（図６）。実験は、３つ組測定として独立して３回行い、代謝的に活性のある細胞の比率を培地中１２％のＰＢＳの陰性対照に対して正規化した。結果は、１時間のインキュベート時間後これらの細胞の内部にこれらペプチドの蛍光標識誘導体が検出できなかった事実（実施例５を参照）によって裏付けられている。従って、外部細胞膜における細胞外標的分子又は受容体との相互作用もＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びＨｅＬａ細胞について除外することができた。
【０２１５】
３つ組測定として希釈系列５０〜４００μｇ／ｍＬの３回の独立した実験でペネトラチン構築物の細胞傷害性試験を行った。ペネトラチン・モノマー（配列番号１０５）と、対照として役立つペネトラチン−tau配列は、４００μｇ／ｍＬの最高濃度までＨｅＬａ細胞に対して毒性作用を示さなかった（図６）。抗菌ペプチドを伴ったペネトラチン構築物では、１００〜４００μｇ／ｍＬの間で無視できるほど小さな毒性効果が認められた。ペネトラチン・ホモダイマー（配列番号１０３）は４００μｇ／ｍＬでほぼ１００％毒性であったが、ペネトラチン−ドロソシン及びペネトラチン−オンコシン（配列番号９７及び１０１）はわずかな毒性を示した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞による検討では、ペネトラチン・モノマーとペネトラチン−ｔａｕ構築物は４００μｇ／ｍＬで増殖する細胞の比率を７０％に低下させた。ペネトラチン−ＡＭＰの構築物はすべて驚くべきことに好ましい濃度で毒性作用を示さなかった。
【０２１６】
溶血試験
ペプチド及びペプチド誘導体の細胞傷害性を調べる別の可能なものは溶血試験である。ヒト赤血球（ライゲ・ティー・エス及びハンセン・ピー・アール(Ryge T S & Hansen P R.) 位置走査コンビナトリアルライブラリから同定された強力な抗菌リジン−ペプトイドハイブリッド(Potent antibacterial lysine-peptoid hybrids identified from a positional scanning combinatorial library.)。バイオオーガニック・アンド・メディスナル・ケミストリー(Bioorganic & Medicinal Chemistry) 14: 4444-51, 2006）において溶血活性を調べるが、それはライプツィヒ(Leipzig)大学病院（ドイツ）が塩化ナトリウム−アデニン−グルコース−マンニトール緩衝液（４℃で保存）でのヒト赤血球濃縮物を利用可能とした。１０００ｇにて赤血球を遠心し、１０倍容量の冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。赤血球をＰＢＳ中最終濃度１％に希釈した。９６ウェル・ポリプロピレン製マイクロタイタープレート（グレイナー・バイオワン社(Greiner Bio-One GmbH）の各Ｖ字型ウエルに１００μＬの赤血球懸濁液をピペットで入れた。次いで、ＰＢＳに溶解したペプチド１００μＬを各位置に加え、７つの希釈工程で６００μｇ／ｍＬ〜４．７μｇ／ｍＬの希釈系列を得た。マイクロタイタープレートを37度で1時間インキュベートし、次いで１０００×ｇにて遠心した。上清から１００μＬを取り、９６ウェル平底ポリスチレン製マイクロタイタープレート（レイナー・バイオワン社(Greiner Bio-One GmbH）に移し、サンライズ・マイクロタイタープレートリーダー(Sunrise microtiter plate reader)（テカン・トレーディング社(Tecan Trading AG)、マンネドルフ(Mannedorf)、スイス）にて405ｎｍで吸収を測定し、ヘム基の放出を評価した。ＰＢＳ又は０．１％トリトンＸ−１００（登録商標）（（ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール；スイス、ブッシュ（Ｂｕｃｈｓ）のフルカ・ケミー社(Fluka Chemie GmbH)）及びメリチン（ドイツ、タウフカーチェン(Taufkirchen)のシグマ-アルドリッチ-ラボルケミカリエン(SIGMA-Aldrich-Laborchemikalien)）を陰性対照又は陽性対照として用いた。溶血試験はすべて２つ組判定として独立して２回行い、溶血の程度は以下の方程式から判定した（パーク・ワイ(Park Y)ら Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−リッチ抗菌ペプチド：活性とメカニズム(A Leu-Lys-rich antimicrobial peptide activity and mechanism.)。バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ-プロテインズ・アンド・プロテオミクス(Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics) 1645: 172-82, 2003）。
（Ｅヘ゜フ゜チト゛−ＥPBS）／（Ｅトリトン−ＥPBS）×１００％
Ｅ＝４０５ｎｍにおける吸光度(extinction)
【０２１７】
分析した抗菌プロリン−リッチ・ペプチドはいずれも６００μｇ／ｍＬの濃度まで溶血活性は示さなかった（表１２）。このことは、測定されるＭＩＣ値より１００倍高い濃度であってもヒト赤血球の溶解は認められなかった。ペプチドすべての溶血率は、トリトンＸ−１００（登録商標）に比べて約１％にすぎず、それはこの試験の誤差限界内である。非イオン性界面活性剤、トリトンＸ−１００（登録商標）は、１時間以内にこの試験設定で赤血球細胞を完全に破砕するので陽性対照として用いた。ミツバチ毒であるメリチンは、α−螺旋状ペプチドとして、生体膜に強い溶解作用を有し、５μｇ／ｍＬの濃度でさえも原核細胞及び真核細胞の膜を破砕する。この細胞試験は、ペプチド及びペプチド誘導体が、ヒト赤血球に対して副作用を有することなく血中で高い濃度で使用できることを示している。
【０２１８】
【表１３】
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【０２１９】
図の説明：
図１は、寒天拡散アッセイにおける大腸菌(E. coli)BL21 AIに対するオンコシン類似体（Ａｌａ−スキャン）の抗菌活性を示す。斜交平行棒は部分阻害を示す。
図２は、寒天拡散アッセイにおけるミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)ATCC 10240に対するオンコシン類似体（アラニン−スキャン）の抗菌活性を示す。
図３は、５，６−カルボキシフルオレセイン標識オンコシン（ＣＦ−オンコシン、配列番号９４）及びペネトラチン−オンコシン（ＣＦ−ペネトラチン−オンコシン、配列番号１０２）と共にインキュベートした後のＨｅＬａ細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。上の列：位相差、下の列：蛍光（５１７ｎｍでの放射）。Ａ，Ｂ：ＣＦ−オンコシンとインキュベートしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ；Ｃ，Ｄ：ＣＦ−ペネトラチン−オンコシンとインキュベートしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ；Ｅ，Ｆ：ＣＦ−オンコシンとインキュベートしたＨｅＬａ；Ｇ、Ｈ：ＣＦ−ペネトラチン−オンコシンとインキュベートしたＨｅＬａ。棒は２０μｍに相当する。
図４は、大腸菌(E. coli)BL21 AIの共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す。ペプチド濃度は３０μmol／Ｌ；ＴＡＭＲＡ濃度は１８０μmol／Ｌ；上の列：位相差、下の列：蛍光。Ａ、Ｂ：ＣＦ−オンコシンと２０分間インキュベート；Ｃ、Ｄ：ＣＦ−オンコシンと５０分間インキュベート；Ｅ、Ｆ：ＣＦ−ペネトラチン−オンコシンと５０分間インキュベート；Ｇ、Ｈ：ＣＦ−ペネトラチンホモダイマーと９０分間インキュベート。棒は５μｍに相当する。
図５は、ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)10240の共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す。ペプチド濃度は３０μmol／Ｌ；ＴＡＭＲＡ濃度は１８０μmol／Ｌ。上の列：位相差、下の列：蛍光。Ａ、Ｂ：ＣＦ−ピロコリシン；Ｃ、Ｄ：ＣＦ−ペネトラチン−ピロコリシン；Ｅ、Ｆ：ＣＦ−ドロソシン；Ｇ、Ｈ：ＣＦ−ペネトラチン−ドロソシン；Ｉ、Ｊ：ＣＦ−ペネトラチンホモダイマー。棒は５μｍに相当する。
図６は、「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")を用いて測定したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（網目のカラム）及びＨｅＬａ細胞（黒色のカラム）に対する抗菌ペプチドの細胞傷害性試験の結果を示す。培地中の６００μｇ／ｍＬのオンコシン、オンコシンR15O R19O、ドロソシン及びアピダエシン１ｂ（配列番号１８、７２、８９及び８７）との２４時間のインキュベート後の試験。陽性対照は、１２％のＤＭＳＯ及び１００μｇ／ｍＬのメリチン。陰性対照１２％ＰＢＳに対して正規化。
図７は、「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")を用いて測定したＨｅＬａ細胞に対するペネトラチン構築物の細胞傷害性試験の結果を示す。培地中の５０〜４００μｇ／ｍＬのペネトラチン−ドロソシン（配列番号９６）、ペネトラチン−アピダエシン１ｂ（配列番号９４）、ペネトラチン−ピロコリシン（配列番号９８）、ペネトラチン−オンコシン（配列番号１００）、ペネトラチンホモダイマー（配列番号１０２）、ペネトラチン（配列番号１０５）との２４時間のインキュベート後の試験。陰性対照は１２％ＰＢＳであり、陽性対照は１２％ＤＭＳＯである。
図８は、「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")を用いて測定したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するペネトラチン構築物の細胞傷害性試験の結果を示す。培地中の５０〜４００μｇ／ｍＬのペネトラチン−ドロソシン（配列番号９６）、ペネトラチン−アピダエシン１ｂ（配列番号９４）、ペネトラチン−ピロコリシン（配列番号９８）、ペネトラチン−オンコシン（配列番号１００）、ペネトラチンホモダイマー（配列番号１０２）、ペネトラチン（配列番号１０５）、ペネトラチン−ｔａｕ（配列番号１０６）との２４時間のインキュベート後の試験。１２％ＰＢＳを陰性対照として用い、１２％ＤＭＳＯを陽性対照として用いた。
図９は、ペプチド、すんわちオンコシン、ドロソシン、及びアピダエシン１ｂ（配列番号１８、８９及び８７）についての溶血試験の結果を示す。ペプチドの希釈系列は４．７〜６００μｇ／ｍＬ。陽性対照：メリチン及びトリトンＸ−１００（登録商標）、陰性対照：ＰＢＳ。
図１０は、「細胞増殖キットＩ」("Cell Proliferation Kit I")を用いて測定したＨｅＬａ細胞に対する抗菌ペプチドについての細胞傷害性試験の結果を示す。培地中６００μｇ／ｍＬのオンコシン及びオンコシン誘導体（配列番号１８、６３、７２、１０７〜１１０）、並びに比較例のアピダエシン１ｂ及びドロソシン（配列番号８７及び８９）との２４時間のインキュベート後の試験。陽性対照は１２％ＤＭＳＯ及び１００μｇ／ｍＬのメリチンである。陰性対照１２％ＰＢＳに対して正規化した。図は３つ組での２つの独立した試験の平均値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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