(57)【要約】  本発明は、満腹を促進するために使用することができる、コレシストキニン（ＣＣＫ）放出活性が増強されたタンパク質加水分解組成物を提供する。
2012513771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解組成物の可溶性画分であって、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の前記タンパク質加水分解組成物が、１００ｎＭのホルボール１２−ミリスタート−１３−アセタートで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるコレシストキニンの５０％と実質的に同等以上の効力でコレシストキニン放出活性を刺激する、前記タンパク質加水分解組成物の可溶性画分。
【請求項２】
約０．０５％〜約３５％の加水分解度を有する、請求項１に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項３】
大豆、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、卵、動物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質材料に由来する、請求項１に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項４】
大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、卵、乳製品、動物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質材料と組み合わせた大豆タンパク質材料に由来する、請求項１に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項５】
大豆タンパク質材料に由来し、約０．０５％〜約３５％の加水分解度を有する、請求項１に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項６】
細胞と、約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解組成物の可溶性画分とを接触させることを含む、細胞のコレシストキニン放出活性の増大方法であって、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の前記タンパク質加水分解組成物が、１００ｎＭのホルボール１２−ミリスタート−１３−アセタートで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるコレシストキニンの５０％と実質的に同等以上の効力でコレシストキニン放出活性を刺激する、前記方法。
【請求項７】
タンパク質加水分解組成物が約０．０５％〜約３５％の加水分解度を有する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質加水分解組成物が大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、卵、乳製品、動物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質材料と組み合わせた大豆タンパク質材料に由来する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質加水分解組成物が大豆タンパク質材料に由来する請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
大豆タンパク質材料が大豆抽出物、豆乳、豆乳粉末、大豆カード、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、全脂大豆粉、単離大豆タンパク質、大豆タンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
大豆タンパク質加水分解組成物がタンパク質出発材料に酵素消化を受けさせることによって製造される請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
酵素が、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）からのセリンプロテアーゼ（ＳＰ１）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのセリンプロテアーゼ、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのサブチリシンプロテアーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのトリプシン様プロテアーゼ、アクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）からのリジルエンドペプチダーゼ、サブチリシンプロテアーゼ２、メタロプロテアーゼ１、アスパラギン酸プロテアーゼ１、ブロメライン、サブチリシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるエンドペプチダーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素がエキソペプチダーゼをさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質加水分解組成物の可溶性画分を被験者に投与することを含む、被験者の満腹の促進方法であって、前記組成物が、約１００，０００ダルトン未満の平均サイズおよび約０．０５％〜約３５％の加水分解度を有するポリペプチド断片の混合物を含み、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の前記タンパク質加水分解組成物が、１００ｎＭの１２−ミリスタート−１３−アセタートで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるコレシストキニンの５０％と実質的に同等以上の効力でコレシストキニン放出活性を刺激し、投与される前記量が前記被験者による満腹感をもたらす、前記方法。
【請求項１５】
（ａ）食用材料と、
（ｂ）約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解組成物の可溶性画分と
を含み、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の前記タンパク質加水分解組成物が、１００ｎＭの１２−ミリスタート−１３−アセタートで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるコレシストキニンの５０％と実質的に同等以上の効力でコレシストキニン放出活性を刺激する食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００８年１２月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１４１，９３１号（これは、参照によってその全体が本明細書に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、タンパク質加水分解物に関する。特に、本タンパク質加水分解物は、一般に、増強されたコレシストキニン（ＣＣＫ）放出活性を有する。本タンパク質加水分解物を用いて、栄養分を提供すると共に満腹を促進することができる。
【背景技術】
【０００３】
肥満および肥満に関連する疾患の割合は、米国および世界中で上昇している。根底にある原因は１つではないが、寄与する因子は、多くの人々の速いペースで追い立てられているライフスタイル、およびそれに伴うファーストフードの消費であり得る。ほとんどのファーストフードは脂肪および／または糖が多い傾向にある。
【０００４】
肥満の蔓延と戦うための１つの実行可能な標的は、コレシストキニン（ＣＣＫ）であり得る。ＣＣＫは、タンパク質または脂質の豊富な食事に応答して腸細胞により循環内に分泌されるペプチドホルモンである。このペプチドホルモンは、タンパク質および脂質の消化に関与するいくつかの生理的過程を仲介する。十二指腸および腸の粘膜によるＣＣＫの分泌は、十二指腸に入る脂肪またはタンパク質の豊富な糜粥によって刺激される。ＣＣＫは次に、直接および／または間接的な生理作用および神経作用によって満腹を誘発し、食物摂取を低下させる。いくつかの直接的な作用としては、胃排出の阻害、胃酸分泌の阻害、および胆嚢収縮の刺激が挙げられる。神経経路を刺激するＣＣＫの能力と組み合わせて、ＣＣＫの放出は「満腹」の感覚を生じさせるので、通常、より少ないカロリーの消費がもたらされる。
【０００５】
従って、「持ち運んで（ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｏ）」消費することができ、栄養があって容易に入手可能な食品が必要とされている。この食品は美味しいだけでなく、栄養的に十分でなければならない。すなわち、この食品は脂肪が少なく、タンパク質が多く、そしてビタミンおよび酸化防止剤が多くなければならない。さらに、この食品がＣＣＫの放出を増強すれば、同様に非常に有益であろう。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の種々の態様の中で、１つの態様は、コレシストキニン（ＣＣＫ）放出活性を有するタンパク質加水分解組成物を包含する。本タンパク質加水分解組成物は約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片の混合物を含み、タンパク質加水分解組成物の可溶性画分は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度において、１００ｎＭのホルボール１２−ミリスタート−１３−アセタート（ＰＭＡ）で４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの５０％と実質的に同等以上の効力でＣＣＫ放出活性を刺激する。
【０００７】
本発明の別の態様は、細胞のＣＣＫ放出活性の増大方法を提供する。本方法は、細胞と、タンパク質加水分解組成物の可溶性画分とを接触させることを含む。本タンパク質加水分解組成物は約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片の混合物を含み、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度において、本タンパク質加水分解組成物は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの５０％と実質的に同等以上の効力でＣＣＫ放出活性を刺激する。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、被験者の満腹の促進方法を包含する。本方法は、ある量のタンパク質加水分解組成物を被験者に投与することを含み、投与される量は、被験者による満腹感をもたらす。本タンパク質加水分解組成物は約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片の混合物を含み、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度において、本タンパク質加水分解組成物は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの５０％と実質的に同等以上の効力でＣＣＫ放出活性を刺激する。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は、食用材料とタンパク質加水分解組成物の可溶性画分とを含む食品を提供する。本タンパク質加水分解組成物は約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片の混合物を含み、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度において、本タンパク質加水分解組成物は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの５０％と実質的に同等以上の効力でＣＣＫ放出活性を刺激する。
【００１０】
カラー図面の参照
本出願は、カラーで作成された少なくとも１枚の写真を含有する。カラー写真付きの本特許出願公報のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】胃および上部小腸内の消化を模倣するためにペプシンまたはペプシンおよびパンクレアチンの組み合わせを用いたそれぞれの消化によって調製された大豆およびカゼイン塩タンパク質加水分解物によるＣＣＫ放出の刺激を示す。タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞の培地に添加し、対照反応混合物（タンパク質基質の不在下で酵素を含有する）の同等の希釈において酵素対照を添加した。ペプシンまたはペプシンおよびパンクレアチン酵素により生成された異なるタンパク質加水分解物により刺激されたＳＴＣ−１細胞の培地中に放出される％ＣＣＫが、対照の１００ｎＭのＰＭＡ（１００％として設定した）と比較してプロットされる。細胞培地単独および２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を負のバックグラウンド対照として用いた。ＰＭＡ対照は、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する細胞培地中の１００ｎＭのＰＭＡで構成された。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、以下のように計算した。％CCK放出＝（ng CCKサンプルウェル − ng CCKBSAコントロールウェル）／（ng CCKPMAウェル − ng CCKBSAコントロールウェル）ｘ 100ペプシンおよびペプシン−パンクレアチンによるインタクトな大豆タンパク質の消化は、インタクトなカゼイン塩タンパク質の同等の消化よりも著しく強力なＣＣＫ放出活性を有するペプチドをもたらす。
【図２】強力なＣＣＫ放出加水分解物（ＳＵＰＲＯ（登録商標）９５０／ＦＸＰ９５０）の接線流ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）からの画分を含有するクーマシー染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲルの画像を示す。この加水分解物は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）からのＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）による約９．６％の％加水分解度への消化によって生成される。レーンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤはそれぞれ、未分画サンプル、１００ｋＤａよりも大きい画分、１０〜１００ｋＤａの画分、および１０ｋＤａ未満の画分の１％（ｗ／ｖ）スラリーの１０μＬのサンプルを表す。レーンＥおよびＦはそれぞれ、１０〜１００ｋＤａの画分および１０ｋＤａ未満の画分の５％（ｗ／ｖ）スラリーの１０μＬのサンプルを表す。分子量標準のサイズは左側に示される。
【図３】実施例２に記載される加水分解タンパク質調製物であるＳＵＰＲＯ（登録商標）９５０／ＦＸＰ９５０の１０〜１００ｋＤａの画分のペプシンおよびペプシン−パンクレアチン消化調製物によるＣＣＫ放出の刺激を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｈは、種々の大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。図４Ａ〜４Ｈに示される異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られる異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する、異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、１００％に設定した１００ｎＭのＰＭＡによって放出される％ＣＣＫと比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、図１について記載されるように計算される。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によってＣＣＫを誘発する。それぞれの大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。図４Ａは、Ａｌｃａｌａｓｅで処理された大豆タンパク質加水分解物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｈは、種々の大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。図４Ａ〜４Ｈに示される異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られる異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する、異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、１００％に設定した１００ｎＭのＰＭＡによって放出される％ＣＣＫと比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、図１について記載されるように計算される。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によってＣＣＫを誘発する。それぞれの大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。図４Ｂは、ブロメラインで処理された大豆タンパク質加水分解物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｈは、種々の大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。図４Ａ〜４Ｈに示される異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られる異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する、異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、１００％に設定した１００ｎＭのＰＭＡによって放出される％ＣＣＫと比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、図１について記載されるように計算される。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によってＣＣＫを誘発する。それぞれの大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。図４Ｃは、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）からのセリンプロテアーゼで処理された大豆タンパク質加水分解物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｈは、種々の大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。図４Ａ〜４Ｈに示される異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られる異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する、異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、１００％に設定した１００ｎＭのＰＭＡによって放出される％ＣＣＫと比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、図１について記載されるように計算される。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によってＣＣＫを誘発する。それぞれの大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。図４Ｄは、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）２で処理された大豆タンパク質加水分解物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜Ｈは、種々の大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。図４Ａ〜４Ｈに示される異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られる異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する、異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、１００％に設定した１００ｎＭのＰＭＡによって放出される％ＣＣＫと比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、図１について記載されるように計算される。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によってＣＣＫを誘発する。それぞれの大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。図４Ｅは、Ｓ２で処理された大豆タンパク質加水分解物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜Ｈは、種々の大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。図４Ａ〜４Ｈに示される異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られる異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する、異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、１００％に設定した１００ｎＭのＰＭＡによって放出される％ＣＣＫと比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、図１について記載されるように計算される。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によってＣＣＫを誘発する。それぞれの大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。図４Ｆは、ＭＰ１で処理された大豆タンパク質加水分解物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。
【図４Ｇ】図４Ａ〜Ｈは、種々の大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。図４Ａ〜４Ｈに示される異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られる異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する、異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、１００％に設定した１００ｎＭのＰＭＡによって放出される％ＣＣＫと比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、図１について記載されるように計算される。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によってＣＣＫを誘発する。それぞれの大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。図４Ｇは、ＴＬ１で処理された大豆タンパク質加水分解物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。
【図４Ｈ】図４Ａ〜Ｈは、種々の大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。図４Ａ〜４Ｈに示される異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られる異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する、異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、１００％に設定した１００ｎＭのＰＭＡによって放出される％ＣＣＫと比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、図１について記載されるように計算される。ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によってＣＣＫを誘発する。それぞれの大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。図４Ｈは、ＡＳＰ−１で処理された大豆タンパク質加水分解物についてのＣＣＫ放出の刺激を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
タンパク質は、一般に、ヒトを含む動物の腸管（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｋ）内の腸内分泌細胞によるＣＣＫの放出を刺激することが知られている（Ｌｉｄｄｌｅ，Ｒ．Ａ．ら，（１９８６年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｂｕｔ  Ｎｏｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，ｏｒ  Ｆａｔｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５１（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４）：Ｇ２４３−Ｇ２４８）。腸内に入るタンパク質は、ペプシンおよび膵臓からの消化酵素の混合物（パンクレアチン）などの酵素による消化を経験するので、図１では、これらの酵素により消化されたインタクトな大豆タンパク質が、腸内分泌細胞におけるＣＣＫ放出活性を有するペプチドをもたらすことを示す。また図１は、これらの同じ酵素で処理されたカゼインナトリウムが、インタクトな大豆タンパク質の消化後に生成されるものと比較して弱いＣＣＫ放出活性を有するペプチドをもたらすことも示す。図１のデータを得るために使用された、生体内の胃および上部腸管の消化を模倣する大豆タンパク質およびカゼイン塩の消化方法は、Ｓｃｈａｓｔｅｅｎ（Ｓｃｈａｓｔｅｅｎ，Ｃ．Ｓ．ら，（２００７年）Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｗｉｔｈ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｔｒｕｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｍｅａｌ．Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８６（２），３４３−３４８）、およびＨｉｇａｋｉ（Ｈｉｇａｋｉ，Ｎ．ら，（２００６年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０（１２），２８４４−２８５２）の既に公開された手順を修正したものである。タンパク質サンプルを２０体積の０．０１ＭのＨＣｌ中に可溶化し、ペプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ♯Ｐ７０１２）により、１：２００（ｗ／ｗ）の酵素−基質比、ｐＨ２．３および３７℃において４時間消化した。ペプシン消化の後、２．５ＭのＮａＯＨを混合物に添加して、ｐＨを８．０に調整し、パンクレアチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ♯Ｐ３２９２）を１：２００（ｗ／ｗ）の比率で添加し、消化をさらに４〜１８時間継続させた。加水分解度は、第１級アミン基とｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）との反応により、酸加水分解（１１０℃で２４時間）後のサンプル中に存在する第１級アミンの総量に対して決定した（「ＯＰＡ法」として知られている）。タンパク質加水分解物を２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞の培地に添加し、対照反応混合物（タンパク質基質の不在下で酵素を含有する）の同等の希釈において酵素対照を添加した。ペプシンおよびペプシン−パンクレアチン処理されたタンパク質サンプルにより刺激されたＳＴＣ−１細胞の培地中に放出される％ＣＣＫが、正の対照の１００ｎＭのＰＭＡにより放出されるＣＣＫの量（１００％に設定）と比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫは、以下のように計算される。
％CCK放出＝（ng CCKサンプルウェル − ng CCKBSAコントロールウェル）／
（ng CCKPMAウェル − ng CCKBSAコントロールウェル）ｘ 100
【００１３】
実施例において説明されるように、商業的な原料加工において使用可能な酵素による約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片へのタンパク質の酵素消化は、ＣＣＫ放出活性が増強された組成物をもたらすことが発見された。ＣＣＫは中枢神経系により満腹を促進し、胃排出も遅くするので、タンパク質加水分解組成物は様々な食品に含有されて、満腹を促進すると共に栄養分を提供することができる。
【００１４】
（Ｉ）タンパク質加水分解物の調製方法
本発明の一態様は、１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解物の調製方法を提供する。本方法は、タンパク質材料と、タンパク質材料を所望のサイズのポリペプチド断片に切断する１つまたは複数の酵素とを接触させることを含む。反応物および反応パラメータは以下により詳細に説明される。
【００１５】
（ａ）タンパク質材料
適切なタンパク質材料の非限定的な例としては、大豆または非大豆タンパク質（例えば、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦など）などの植物タンパク質と、卵タンパク質、ゼラチンなどの動物タンパク質とが挙げられる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、タンパク質材料は大豆に由来し得る。様々な大豆タンパク質材料を本発明の方法で使用して、大豆タンパク質加水分解物を生成することができる。一般に、大豆タンパク質材料は、当該技術分野において既知の方法に従って、全大豆から得ることができる。全大豆は、標準の大豆（すなわち、非遺伝子改変大豆）、遺伝子改変大豆（例えば、変性油を有する大豆、変性炭水化物を有する大豆、変性タンパク質サブユニットを有する大豆など）またはこれらの組み合わせでよい。大豆タンパク質材料の適切な例としては、大豆抽出物、豆乳、豆乳粉末、大豆カード、大豆粉、大豆タンパク質単離物、大豆タンパク質濃縮物、大豆ホエータンパク質、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００１７】
一実施形態では、本方法で使用される大豆タンパク質材料は、大豆タンパク質単離物（単離大豆タンパク質、またはＩＳＰとも呼ばれる）であり得る。一般に、大豆タンパク質単離物は、無水ベースで少なくとも約９０％の大豆タンパク質のタンパク質含量を有する。大豆タンパク質単離物はインタクトな大豆タンパク質を含んでもよいし、あるいは部分的に加水分解された大豆タンパク質を含んでもよい。大豆タンパク質単離物は、高含量の７Ｓ、１１Ｓ、２Ｓなどの種々のサブユニットを有し得る。本発明において使用することができる大豆タンパク質単離物の非限定的な例は例えばＳｏｌａｅ，ＬＬＣ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されており、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ、ＳＵＰＲＯ（登録商標）６２０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）７６０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）６７０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）７１０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＥＸ３３、ＳＵＰＲＯ（登録商標）３１３が含まれる。
【００１８】
別の実施形態では、大豆タンパク質材料は、無水ベースで約６５％から約９０％未満のタンパク質含量を有する大豆タンパク質濃縮物であり得る。本発明において有用である適切な大豆タンパク質濃縮物の例としては、ＡＬＰＨＡ（登録商標）ＤＳＰ−Ｃ、ＰｒｏｃｏｎTM、ＡＬＰＨＡ（登録商標）１２およびＡＬＰＨＡ（登録商標）５８００が挙げられ、これらはＳｏｌａｅ，ＬＬＣから市販されている。あるいは、大豆タンパク質濃縮物は、大豆タンパク質材料源として大豆タンパク質単離物の一部を代用するために大豆タンパク質単離物とブレンドされてもよい。
【００１９】
さらに別の実施形態では、大豆タンパク質材料は、無水ベースで約４９％〜約６５％のタンパク質含量を有する大豆粉であってもよい。大豆粉は、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、または全脂大豆粉であり得る。大豆粉は、大豆タンパク質単離物または大豆タンパク質濃縮物とブレンドされてもよい。
【００２０】
大豆粉が使用される場合、出発材料は、通常、脱脂大豆粉またはフレークである。全脂大豆は、約４０質量％のタンパク質および約２０質量％の油を含有する。これらの全脂全大豆は、脱脂大豆粉またはフレークが出発タンパク質材料を形成する場合には、従来の方法によって脱脂され得る。例えば、大豆は洗浄され、皮が剥かれ、破砕され、一連のフレーキングロールを通過させられ、そして次にヘキサンまたは他の適切な溶媒の使用による溶媒抽出を受けて油が抽出され、「使用済フレーク」が製造され得る。脱脂フレークは大豆粉を製造するために粉砕され得る。この方法はまだ全脂大豆粉と共に使用されていないが、全脂大豆粉もタンパク質源として役立つことができると考えられる。しかしながら、全脂大豆粉が加工される場合、油を除去するために３段階遠心分離などの分離工程を用いる必要がある可能性が最も高い。
【００２１】
別の代替の実施形態では、大豆タンパク質材料は、遠心分離機における沈降に基づいて主要画分（１５Ｓ、１１Ｓ、７Ｓ、および２Ｓ）に分離された大豆貯蔵タンパク質であり得る。一般に、１１Ｓ画分はグリシニンが非常に豊富であり、７Ｓ画分はベータ−コングリシニンが非常に豊富である。
【００２２】
別の実施形態では、タンパク質材料は、大豆以外の植物に由来してもよい。非限定的な例として、適切な植物には、アマランス、クズウコン、大麦、ソバ、キャノーラ、キャッサバ、ヒヨコマメ（ガルバンゾ）、マメ科植物、ヒラマメ、ルピナス、トウモロコシ、キビ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、ライ麦、モロコシ属、ヒマワリ、タピオカ、ライ小麦、小麦、およびこれらの混合物が含まれる。特に好ましい植物タンパク質には、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、およびこれらの組み合わせが含まれる。一実施形態では、植物タンパク質材料は、キャノーラミール、キャノーラタンパク質単離物、キャノーラタンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであり得る。別の実施形態では、植物タンパク質材料は、トウモロコシまたはコーンタンパク質粉末、トウモロコシまたはコーンタンパク質濃縮物、トウモロコシまたはコーンタンパク質単離物、トウモロコシまたはコーン胚芽、トウモロコシまたはコーングルテン、トウモロコシまたはコーングルテンミール、トウモロコシまたはコーン粉、ゼインタンパク質、またはこれらの組み合わせであり得る。さらに別の実施形態では、植物タンパク質材料は、大麦粉末、大麦タンパク質濃縮物、大麦タンパク質単離物、大麦ミール、大麦粉、またはこれらの組み合わせであり得る。代替の実施形態では、植物タンパク質材料は、ルピナス粉、ルピナスタンパク質単離物、ルピナスタンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであり得る。別の代替の実施形態では、植物タンパク質材料は、オートミール、オート麦粉、オート麦タンパク質粉、オート麦タンパク質単離物、オート麦タンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであり得る。さらに別の実施形態では、植物タンパク質材料は、エンドウ豆粉、エンドウ豆タンパク質単離物、エンドウ豆タンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであり得る。さらに別の実施形態では、植物タンパク質材料は、ポテトタンパク質粉末、ポテトタンパク質単離物、ポテトタンパク質濃縮物、ポテト粉、またはこれらの組み合わせであり得る。さらなる実施形態では、植物タンパク質材料は、米粉、米ミール、米タンパク質粉末、米タンパク質単離物、米タンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであり得る。別の代替の実施形態では、植物タンパク質材料は、小麦タンパク質粉末、小麦グルテン、小麦胚芽、小麦粉、小麦タンパク質単離物、小麦タンパク質濃縮物、可溶化小麦タンパク質、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００２３】
他の実施形態では、タンパク質材料は動物源に由来してもよい。一実施形態では、動物タンパク質材料は卵に由来し得る。適切な卵タンパク質の非限定的な例としては、粉末卵、乾燥卵固形分、乾燥卵白タンパク質、液体卵白タンパク質、卵白タンパク質粉末、単離オボアルブミンタンパク質、およびこれらの組み合わせが挙げられる。卵タンパク質は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、または他の鳥の卵に由来してもよい。代替の実施形態では、タンパク質材料は乳製品源に由来し得る。適切な乳製品タンパク質には、無脂肪乾燥粉乳、乳タンパク質単離物、乳タンパク質濃縮物、酸カゼイン、カゼイン塩（例えば、カゼインナトリウム、カルシウムカゼインなど）、ホエータンパク質単離物、ホエータンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせが含まれる。乳タンパク質材料は、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、ラクダ科動物、ヤク、水牛などに由来してもよい。さらなる実施形態では、タンパク質は、陸生動物または水生動物の筋肉、臓器、結合組織、または骨格に由来し得る。一例として、動物タンパク質は、ウシまたは他の動物の骨、結合組織、臓器などから抽出されるコラーゲンの部分加水分解によって製造されるゼラチンであり得る。
【００２４】
また本発明の方法では、大豆タンパク質材料および少なくとも１つの他のタンパク質材料の組み合わせも使用され得ることが想定される。すなわち、本タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料および少なくとも１つの他のタンパク質材料の組み合わせから調製されてもよい。一実施形態では、本タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物材料、乳製品、および卵からなる群から選択される１つの他のタンパク質材料との組み合わせから調製することができる。別の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物材料、乳製品、および卵からなる群から選択される２つの他のタンパク質材料との組み合わせから調製することができる。さらなる実施形態では、本タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物材料、乳製品、および卵からなる群から選択される３つ以上の他のタンパク質材料との組み合わせから調製することができる。
【００２５】
組み合わせて使用される大豆タンパク質材料および他のタンパク質材料の濃度は異なり得るであろう。大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約９９％の範囲であり得る。一実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約２０％の範囲であり得る。別の実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約２０％〜約４０％の範囲であり得る。さらに別の実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約４０％〜約８０％の範囲であり得る。さらなる実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約８０％〜約９９％の範囲であり得る。同様に、（少なくとも１つの）他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約９９％の範囲であり得る。一実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約２０％の範囲であり得る。別の実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約２０％〜約４０％の範囲であり得る。さらに別の実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約４０％〜約８０％の範囲であり得る。さらなる実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約８０％〜約９９％の範囲であり得る。
【００２６】
（ｂ）タンパク質スラリー
本発明の方法では、通常、タンパク質材料は水中に混合または分散されて、約１質量％〜約４０質量％のタンパク質（「現状のまま（ａｓ  ｉｓ）」に基づいて）を含むスラリーを形成する。一実施形態では、スラリーは、約１質量％〜約５質量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。別の実施形態では、スラリーは、約６質量％〜約１０質量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。さらなる実施形態では、スラリーは、約１１質量％〜約１５質量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。さらに別の実施形態では、スラリーは、約１６質量％〜約２０質量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。さらに別の実施形態では、スラリーは、約２１質量％〜約４０質量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。水は、エタノールやグリセロールなどの食品グレードの分散剤を含んでいてもよい。
【００２７】
タンパク質材料が水中に分散された後、推定される内在性プロテアーゼ阻害剤を不活性化するために、タンパク質材料のスラリーを約７０℃〜約９０℃で約２分〜約２０分間加熱してもよい。通常、タンパク質スラリーのｐＨおよび温度は、加水分解反応を最適化するように、そして特に、加水分解反応において使用される消化酵素がその最適な活性レベル付近で機能することを保証するように調整される。タンパク質スラリーのｐＨは、当該技術分野において一般に知られている方法に従って調整および監視することができる。タンパク質スラリーのｐＨは、約３．０〜約１１．０に調整および保持され得る。他の実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨは、約３．０〜約４．０、約５．０〜約６．０、および約７．０〜約８．０に調整および保持され得る。別の実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨは、約８．０〜約９．０に調整および保持され得る。代替の実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨは、約９．０〜約１０．０、および約１０．０〜約１１．０に調整および保持され得る。タンパク質スラリーの温度は、当該技術分野において既知の方法に従って、加水分解反応の間約２５℃〜約８０℃に調整および保持することができる。
【００２８】
（ｃ）酵素消化
加水分解反応は、一般に、酵素または酵素の組み合わせをタンパク質材料のスラリーに添加することによって開始される。通常、酵素は、約３．０〜約１１．０のｐＨおよび約２５℃〜約８０℃の温度において最適な活性を有する食品グレードの酵素でよい。酵素は、植物、動物、または微生物に由来することができる。
【００２９】
酵素は、典型的にはエンドペプチダーゼであろう。エンドペプチダーゼは、ＮおよびＣ末端から離れたペプチド鎖の内部領域において優先的に作用する。いくつかのエンドペプチダーゼが本発明の方法で使用するのに適している。一実施形態では、エンドペプチダーゼは、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）からのセリンプロテアーゼであり得る（参照によってその全体が援用される国際公開第２００５０３５７４７号パンフレットにおける配列番号２）。別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）からＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）として入手可能なバチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのサブチリシンプロテアーゼであり得る。さらに別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、グルタミルエンドペプチダーゼ（「ＧＥ」と命名）とも呼ばれるバチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのセリンプロテアーゼであり得る（米国特許第４，２６６，０３１号明細書、米国特許第５，８７４，２７８号明細書、および米国特許第５，４５９，０６４号明細書、ならびに国際公開第０１／１６２８５号パンフレット、国際公開第９２／１３９６４号パンフレット、国際公開第９１／１３５５３号パンフレット、および国際公開第９１／１３５５４号パンフレット（そのそれぞれは、参照によってその全体が援用される）において開示され、特徴付けられるようなＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ８００５７）。さらに別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのトリプシン様プロテアーゼ（「ＴＬ１」と命名）であり得る（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｎｏ．Ｐ３５０４９）（米国特許第５，２８８，６２７号明細書および米国特許第５，６９３，５２０号明細書、そのそれぞれは参照によってその全体が本明細書に援用される）。代替の実施形態では、エンドペプチダーゼは、アクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）からのリジルエンドペプチダーゼ（「ＬＥ」と命名）であり得る（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１５６３６）。さらなる実施形態では、エンドペプチダーゼは、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのサブチリシンプロテアーゼのより精製した形態（「Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２」と命名）であり得る。さらに他の実施形態では、エンドペプチダーゼは、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）からのトリプシン様プロテアーゼであり得る（ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＤＺ８０５７７）。適切な酵素には、さらに、サブチリシンプロテアーゼ２（Ｓ２）、メタロプロテアーゼ１（ＭＰ１）、およびアスパラギン酸プロテアーゼ１（ＡＳＰ−１）が含まれる。他の適切な酵素としては、ブロメライン、サブチリシン、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、およびエラスターゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、エンドペプチダーゼの組み合わせが使用され得る。
【００３０】
さらなる実施形態では、エンドペプチダーゼは、少なくとも１つのエキソペプチダーゼと組み合わせられてもよい。一般に、エキソペプチダーゼは、ＮまたはＣ末端におけるポリペプチド鎖の末端付近のみに作用する。自由Ｎ末端に作用するものは、単一のアミノ酸残基（すなわち、アミノペプチダーゼ）、ジペプチド（すなわち、ジペプチジル−ペプチダーゼ）、またはトリペプチド（すなわち、トリペプチジル−ペプチダーゼ）を遊離させる。自由Ｃ末端に作用するエキソペプチダーゼは、単一のアミノ酸（すなわち、カルボキシペプチダーゼ）またはジペプチド（すなわち、ペプチジル−ジペプチダーゼ）を遊離させる。いくつかのエキソペプチダーゼは、ジペプチド（すなわち、ジペプチダーゼ）に特異的であるか、あるいは、イソペプチド結合によって置換、環化または連結された末端残基を除去する。イソペプチド結合は、カルボキシル基のα−アミノ基への結合以外のペプチド結合であり、この酵素群はオメガペプチダーゼを特徴とする。
【００３１】
本発明の方法において使用するのに適したエキソペプチダーゼの非限定的な例としては、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）からのカルボキシペプチダーゼＤ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ２ＴＺ１１）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）からのカルボキシペプチダーゼＹ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ２ＴＹＡ１）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）からのアミノペプチダーゼ（参照によってその全体が援用される国際公開第９６／２８５４２号パンフレット）、およびバチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのアミノペプチダーゼ（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ６５ＤＨ７）が挙げられる。
【００３２】
タンパク質材料に添加される酵素の量は、所望の加水分解度および加水分解反応の持続時間に依存して異なり得るであろう。量は、タンパク質材料１キログラムあたり酵素タンパク質約１ｍｇ〜約５０００ｍｇの範囲であり得る。別の実施形態では、量は、タンパク質材料１キログラムあたり酵素タンパク質１０ｍｇ〜約２０００ｍｇの範囲であり得る。さらに別の実施形態では、量は、タンパク質材料１キログラムあたり酵素タンパク質約５０ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得る。
【００３３】
当業者により認識されるように、加水分解反応の持続時間は、酵素、タンパク質材料、および所望の加水分解度に依存して異なり得るであろう。一般的に言えば、加水分解反応の持続時間は、数分〜長時間（例えば、約３０分〜約４８時間など）の範囲であり得る。加水分解反応を終了させるために、組成物は、酵素を不活性化するのに十分に高い温度まで加熱されてもよい。例えば、組成物を約９０℃の温度まで加熱すると、ほとんどの酵素が実質的に熱不活性化されるであろう。その他の不活性化方法には、使用される酵素に応じて、１０℃よりも低い温度への冷却および／または約３．０よりも低いｐＨへの低下が含まれる。
【００３４】
タンパク質材料および酵素の種々の組み合わせは表Ａに示される。
【００３５】
2012513771.tif 000003
2012513771.tif 000004
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【００３６】
（ＩＩ）タンパク質加水分解物
タンパク質加水分解組成物は一般にＣＣＫの放出を増強し、それにより、消費される際に満腹を促進する。実施例で説明されるように、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の大豆タンパク質加水分解組成物はＣＣＫ放出活性を刺激する。０．５〜８ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質で添加される最適な加水分解物のＣＣＫ刺激効果は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの５０％と同等以上である。
【００３７】
一実施形態では、タンパク質加水分解組成物の可溶性画分は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの約５０％〜約１００％のＣＣＫ放出活性を刺激し得る。別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物の可溶性画分は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの約１００％〜約２００％のＣＣＫ放出活性を刺激し得る。さらなる実施形態では、タンパク質加水分解組成物の可溶性画分は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの約２００％〜約３００％のＣＣＫ放出活性を刺激し得る。さらに別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物の可溶性画分は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの約３００％〜約５００％のＣＣＫ放出活性を刺激し得る。さらに別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物の可溶性画分は、１００ｎＭのＰＭＡで４時間刺激されたＳＴＣ−１細胞によって放出されるＣＣＫの約５００％〜約１０００％のＣＣＫ放出活性を刺激し得る。
【００３８】
本タンパク質加水分解組成物の加水分解度は、タンパク質材料源、使用されるプロテアーゼ、および加水分解反応条件に依存して異なり得るであろう。加水分解度（ＤＨ）は、出発ペプチド結合数に対して、切断されたペプチド結合の割合を指す。例えば、５００のペプチド結合を含有する出発タンパク質が、５０のペプチド結合が切断されるまで加水分解されると、得られる加水分解物のＤＨは１０％である。加水分解度は、当業者に知られているトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、比色分析法またはオルト−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）法用いて決定することができる。加水分解度が高い程、タンパク質の加水分解の程度は大きい。通常、タンパク質がさらに加水分解されるにつれて（すなわち、ＤＨが高い程）、ペプチド断片の分子量は低下し、それに応じてペプチドプロファイルが変化する。ＤＨは加水分解物全体（すなわち、全画分）において測定されてもよいし、あるいはＤＨは、加水分解物の可溶性画分（すなわち、約５００〜約１０００×ｇで約５〜約１０分間の加水分解物の遠心分離後の上澄み画分）において測定されてもよい。
【００３９】
典型的には本発明のタンパク質加水分解組成物のそれぞれは、約０．０５％〜約３５％の範囲の加水分解度を有するであろう。一実施形態では、本タンパク質加水分解組成物の加水分解度は、約０．０５％〜約１％の範囲であり得る。別の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物の加水分解度は、約１％〜約１０％の範囲であり得る。さらなる実施形態では、本タンパク質加水分解組成物の加水分解度は、約１０％〜約２０％の範囲であり得る。さらに別の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物の加水分解度は、約２％〜約３５％の範囲であり得る。一実施形態では、本タンパク質加水分解組成物の加水分解度は、約０．２％〜約１５％の範囲であり得る。別の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物の加水分解度は、約０．２％〜約３％の範囲であり得る。
【００４０】
一般に、タンパク質加水分解組成物は、タンパク質出発材料と比較して、様々な長さおよび分子量のポリペプチド断片の混合物を含むであろう。ペプチド断片の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィにより測定される場合に、７５ダルトン（すなわち、遊離グリシン）から１００，０００ダルトンを超えるまでの範囲であり得る。一般に、タンパク質加水分解組成物のポリペプチド断片は、約１００，０００ダルトン未満の平均サイズを有するであろう。一実施形態では、本タンパク質加水分解組成物のポリペプチド断片の平均サイズは、約５０，０００〜約１００，０００ダルトンであり得る。別の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物のポリペプチド断片の平均サイズは、約５０，０００ダルトン未満であり得る。さらなる実施形態では、本タンパク質加水分解組成物のポリペプチド断片の平均サイズは、約１０，０００ダルトン未満であり得る。さらに別の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物のポリペプチド断片の平均サイズは、約４，０００ダルトン未満であり得る。さらに別の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物のポリペプチド断片の平均サイズは、約２，０００ダルトン未満であり得る。
【００４１】
（ＩＩＩ）タンパク質加水分解物を含む食品
本発明のさらなる態様は、食用材料および本明細書に記載されるタンパク質加水分解組成物を含む食品である。
【００４２】
食用材料と組み合わせるための特定のタンパク質加水分解組成物の選択は、所望の食品に依存して異なり得るであろう。いくつかの実施形態では、本タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質に由来し得る。他の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物は、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、卵、またはこれらの組み合わせに由来し得る。代替の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物は、異なるタンパク質加水分解物の組み合わせを含むことができる。例えば、大豆タンパク質加水分解組成物は、トウモロコシタンパク質加水分解組成物と組み合わせられてもよい。あるいは、大豆タンパク質加水分解組成物は、キャノーラタンパク質加水分解組成物および小麦タンパク質加水分解組成物と組み合わせられてもよい。
【００４３】
さらに他の実施形態では、本タンパク質加水分解組成物は、大豆と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、乳製品、および卵からなる群から選択される少なくとも１つの他のタンパク質源との組み合わせに由来し得る。
【００４４】
さらなる実施形態では、本タンパク質加水分解組成物は、さらに、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、乳製品、および卵からなる群から選択される少なくとも１つの非加水分解タンパク質を含むことができる。適切な非加水分解タンパク質の非限定的な例としては、乾燥粉乳、無脂肪乾燥粉乳、乳タンパク質、酸カゼイン、カゼイン塩（例えば、カゼインナトリウム、カゼインカルシウムなど）、ホエータンパク質濃縮物、ホエータンパク質単離物、および大豆タンパク質単離物が挙げられる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、食品中に含有されるタンパク質加水分解組成物は、被験者の胃および／または腸におけるタンパク質消化によって「活性」ペプチドに転化される「プレペプチド」を含んでもよい。他の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、被験者の胃または腸における胃における付加的なタンパク質消化を必要としない「活性」ペプチドを含む。
【００４６】
適切な食用材料の選択も所望される食品によって異なるであろう。食用材料は、植物由来材料（例えば、野菜ジュース、シリアル製品など）、動物由来材料（例えば、乳製品、卵製品など）、または植物由来材料または動物由来材料から単離されたバイオマテリアル（すなわち、タンパク質、炭水化物、脂質など）などであり得る。
【００４７】
一実施形態において、前記食品は液体飲料であってもよい。液体飲料の非限定的な例としては、果実ジュース、果実ドリンク、果実風味のドリンク、野菜ドリンク、栄養ドリンク、エネルギードリンク、スポーツドリンク、豆乳ドリンク、風味付けされた大豆ドリンク、米ミルクベースのドリンク、風味付けされたミルクドリンク、ヨーグルトベースのドリンク、調製粉乳、茶ベースの飲料、コーヒーベースの飲料、食事代用ドリンク（ｍｅａｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｄｒｉｎｋ）、プロテインシェーク（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｈａｋｅ）、栄養補助飲料、体重管理飲料、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４８】
飲料食品を含む食用材料は異なり得るであろう。適切な食用材料の非限定的な例としては、果実ジュース、野菜ジュース、スキムミルク、低脂肪乳、２％乳、全乳、クリーム、エバミルク（ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ  ｍｉｌｋ）、ヨーグルト、バターミルク、チョコレート、ココア粉末、コーヒー、茶などが挙げられる。
【００４９】
前記飲料食品は、さらに、甘味剤（例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトデキストリン、スクラロース、コーンシロップ、蜂蜜、メープルシロップなど）、風味剤（例えば、チョコレート、ココア、チョコレートフレーバー、バニラ抽出物、バニラフレーバー、果実フレーバーなど）、乳化または増粘剤（例えば、レシチン、カラギナン、セルロースガム、セルロースゲル、デンプン、アラビアガム、キサンタンガムなど）、安定剤、脂質材料（例えば、キャノーラ油、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、脂肪粉末など）、防腐剤（例えば、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸など）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウムなど）、着色剤、ビタミン、ミネラル、およびこれらの組み合わせを含むことができる。
【００５０】
別の実施形態では、食品は、グラノーラバー、シリアルバー、栄養バー、またはエネルギーバーなどの食品バーであり得る。さらに別の実施形態では、食品は、シリアルベースの製品であり得る。シリアルベースの食品の非限定的な例としては、朝食用シリアル、パスタ、パン、焼成製品（すなわち、ケーキ、パイ、ロール、クッキー、クラッカー）、およびスナック製品（例えば、チップス、プレッツェルなど）が挙げられる。シリアルベースの食品の食用材料は、小麦（例えば、漂白小麦粉、全粒小麦粉、小麦胚芽、小麦フスマなど）、コーン（例えば、コーン粉、コーンミール、コーンスターチなど）、オート麦（例えば、膨化オート麦、オートミール、オート麦粉など）、米（例えば、膨化米、米粉、米デンプン）などに由来し得る。さらに別の実施形態では、食品は、「固形の」乳製品ベースの製品であり得る。適切な「固形の」乳製品ベースの食品の非限定的な例としては、ハードチーズ製品、ソフトチーズ製品、アイスクリーム製品、ヨーグルト製品、フローズンヨーグルト製品、ホイップした乳製品様の製品、シャーベットなどが挙げられる。代替の実施形態では、食品は栄養補助食品であり得る。栄養補助食品は液体でも固体でもよい。別の代替の実施形態では、食品は、食肉製品または食肉類似製品であり得る。食肉食品の例としては、加工肉、ひき肉、および全筋肉製品が挙げられるがこれらに限定されない。食肉材料は、動物肉でもシーフード肉でもよい。食肉類似品は、動物またはシーフード肉の食感を模倣するテクスチャ化植物または乳製品タンパク質であり得る。食肉類似品は、食肉食品中の食肉材料の一部でも全てでもよい。
【００５１】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語が以下に定義される。
【００５２】
「加水分解度」（ＤＨ）という用語は、加水分解された特定のペプチド結合の割合（すなわち、インタクトなタンパク質中に存在するペプチド結合の総数のうちの切断された数）を指す。％ＤＨは、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法またはオルト−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）法のいずれかを用いて推定した。これらの手順は正確で再現可能であり、そして食品タンパク質加水分解物の加水分解度を決定するために一般的に適用可能な手順である。
【００５３】
「エンドペプチダーゼ」という用語は、オリゴペプチドまたはポリペプチド鎖中の内部ペプチド結合を加水分解する酵素を指す。エンドペプチダーゼの群は、酵素サブクラスＥＣ  ３．４．２１−２５（国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）酵素分類システム）を含む。
【００５４】
「エキソペプチダーゼ」という用語は、アミノ末端またはカルボキシル末端もしくはこれらの付近でタンパク質および／またはペプチドを加水分解する酵素を指す。エキソペプチダーゼの群は、酵素サブクラスＥＣ  ３．４．１１−１８（国際生化学・分子生物学連合酵素分類システム）を含む。
【００５５】
「食品グレードの酵素」は、一般に安全と認められる（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ）（ＧＲＡＳ）と認可されており、ヒトなどの生物体により消費される場合に安全な酵素である。通常、酵素および酵素が由来し得る製品は、適用可能な法的規制ガイドラインに従って製造される。
【００５６】
「加水分解物」は、化合物が水の影響によって切断されたときに得られる反応生成物である。タンパク質加水分解物は、熱的、化学的、または酵素的な分解の後に生じる。反応の間、タンパク質はポリペプチドおよび／または遊離アミノ酸に分解される。これらの生成物は水または水系緩衝溶液中に可溶性または不溶性であり得る。
【００５７】
本明細書で使用される「ＯＰＡ法」は、以下の手順を指す：６５℃で５分間振とうさせることによって、０．２５ｇｍの大豆タンパク質加水分解物を５０ｍｌの抽出緩衝液（０．０２５Ｎの水酸化ナトリウム中１％のＳＤＳ、０．６ｍＭのＤＴＴ）中に溶解し、次に２５℃に冷却した。次に、サンプルを５０００×ｇで５分間遠心分離して、溶解しない材料を除去した。次に、サンプルの０．２ｍｌのアリコート、セリン標準（脱イオン水中３．６ｍＭ）、および抽出緩衝液（ブランクとして使用）を試験管に移し（３通り）、１０ｍｌのＯＰＡ呈色試薬（０．０１２ＭのＯＰＡ、０．１Ｍの四ホウ酸ナトリウム、２％のＳＤＳ）で希釈し、ボルテックスして混合した。反応を３０分間継続させ、その時点で、分光光度計において３４０ｎｍで吸光度を測定した。Ｎｉｅｌｓｅｎ（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｍら（２００１年）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ”，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．６６（５）：６４２−６４６）によって記載されるように、それぞれの３通りのサンプルの平均を用いて％ＤＨを決定した。
【００５８】
「ペプチド」は、アミノ酸、一般に２０以下のアミノ酸の短いポリマーである。「ポリペプチド」は、２０よりも多いアミノ酸のポリマーである。これらのポリマーはいずれも一次構造のみを含有する。ポリペプチドは、タンパク質の合成の間に最初に形成され、その天然状態への「折り畳み」（すなわち、二次、三次、および四次構造の形成）においてタンパク質になる。本出願において、ポリペプチドへの言及は、タンパク質の加水分解からの長鎖ポリマーの生成を意味する。
【００５９】
「タンパク質」は、その天然（すなわち、非変性）状態において活性分子を形成するアミノ酸のポリマーである。タンパク質の天然状態は、一次、二次、三次、および／または四次構造を有することができる。タンパク質の一次構造は、そのアミノ酸配列である。タンパク質は通常二次構造を有し、これは、鎖内のアミノ酸の相互作用から形成される。これらの構造は水素結合によって形成され、αへリックス、またはβシートとして知られている相互作用アミノ酸の「シート」のいずれかである。またタンパク質は、通常、三次構造も有する。三次構造はアミノ酸残基の鎖内相互作用によって形成され、イオン相互作用、疎水性相互作用、または他の化学的相互作用によって生じる。いくつかのタンパク質は１つまたは複数の「サブユニット」を含有し、これは、分子的に相互作用をして四次構造を形成する。タンパク質サブユニットは単一のポリペプチド鎖で構成され、二次および（通常）三次構造を含有する。
【００６０】
本明細書で使用される「大豆タンパク質単離物」または「単離大豆タンパク質」という用語は、無水ベースで少なくとも約９０％の大豆タンパク質のタンパク質含量を有する大豆材料を指す。大豆タンパク質単離物は、子葉から大豆の皮および胚を除去し、子葉をフレークまたは粉砕し、フレークまたは粉砕子葉から油を除去し、子葉の大豆タンパク質および炭水化物を子葉繊維から分離し、次いで大豆タンパク質を炭水化物から分離することによって大豆から形成される。
【００６１】
本明細書で使用される「大豆タンパク質濃縮物」という用語は、無水ベースで約６５％から約９０％未満までの大豆タンパク質のタンパク質含量を有する大豆材料である。大豆タンパク質濃縮物は、大豆子葉繊維、通常、無水ベースで約３．５質量％から約２０質量％までの大豆子葉繊維も含有する。大豆タンパク質濃縮物は、大豆の皮および胚を除去し、子葉をフレークまたは粉砕し、フレークまたは粉砕子葉から油を除去し、大豆タンパク質および大豆子葉繊維を子葉の可溶性炭水化物から分離することよって大豆から形成される。
【００６２】
本明細書で使用される「大豆粉」という用語は、全脂大豆粉、酵素活性大豆粉、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、およびこれらの混合物を指す。脱脂大豆粉は、粒子がＮｏ．１００メッシュ（米国基準）スクリーンを通過できるようなサイズを有する粒子で形成された、好ましくは約１％未満の油を含有する脱脂大豆材料の砕いた形態を指す。大豆ケーク、チップ、フレーク、ミール、または材料の混合物は、従来の大豆粉砕方法を用いて大豆粉に砕かれる。大豆粉は、無水ベースで約４９％〜約６５％の大豆タンパク質含量を有する。好ましくは、粉は非常に細かく粉砕され、最も好ましくは、約１％未満の粉が３００メッシュ（米国基準）スクリーン上に保持されるように粉砕される。全脂大豆粉は、元の油の全て（通常、１８％〜２０％）を含有する粉砕した全大豆を指す。粉は酵素活性でもよいし、あるいは熱加工またはトーストして酵素活性を最小限にしてもよい。酵素活性大豆粉は、その天然酵素を中和しないために最小限に熱処理された全脂大豆粉を指す。
【００６３】
本明細書で使用される「豆乳」という用語は、以下の：細かく粉砕された大豆、大豆粉、大豆フレーク、大豆濃縮物、単離大豆タンパク質、大豆ホエータンパク質の任意の１つまたは複数の水性混合物、ならびに以下の：大豆、大豆フレークおよび大豆粉の任意の１つまたは複数の水性抽出物を指し、ここで、不溶性材料は除去されている。豆乳は、脂肪、炭水化物、甘味料、着色剤、安定剤、増粘剤、風味剤、酸、および塩基を含むがこれらに限定されない付加的な成分を含んでもよい。
【００６４】
本明細書で使用される「豆乳粉末」という用語は、脱水した豆乳を指す。豆乳は、スプレー乾燥、トレイ乾燥、トンネル乾燥、および凍結乾燥を含むがこれらに限定されない多数の方法によって脱水することができる。
【００６５】
本明細書で使用される「簡易化トリニトロベンゼンスルホン酸（Ｓ−ＴＮＢＳ）法」という用語は、正確で再現可能であり、そして食品タンパク質加水分解物の加水分解度を決定するために一般的に適用可能な手順を指す。このために、０．１ｇの大豆タンパク質加水分解物を１００ｍＬの０．０２５ＮのＮａＯＨ中に溶解した。加水分解物溶液のアリコート（２．０ｍＬ）を８ｍＬの０．０５Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）と混合した。２ｍＬの緩衝加水分解物溶液を０．２０ｍＬの１０％のトリニトロベンゼンスルホン酸で処理した後、暗所において室温で１５分間インキュベーションした。４ｍＬの０．１Ｍ亜硫酸ナトリウム−０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（１：９９比）を添加することにより反応を失活させ、４２０ｎｍで吸光度を読み取った。０．１ｍＭのグリシン溶液を標準として用いた。以下の計算を用いてグリシン標準溶液の回収パーセントを決定した：［（４２０ｎｍにおけるグリシンの吸光度−４２０ｎｍにおけるブランクの吸光度）×（１００／０．７１０）］。９４％以上の値が許容可能であると考えた（Ｊｅｎｓ  Ａｄｌｅｒ−Ｎｉｓｓｅｎ（１９７９年）“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ  ｂｙ  Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ，”Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２７（６）：１２５６−１２６２）。
【００６６】
本発明またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合に、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、その要素が１つまたは複数存在することを意味するものとする。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」および「ｈａｖｉｎｇ」という用語は包括的であり、記載される要素以外に付加的な要素が存在し得ることを意味するものとする。
【００６７】
本発明の範囲から逸脱することなく上記の化合物、製品および方法には種々の変化がなされ得るので、上記の説明および以下に示される実施例に含有される全ての事項は例示として解釈されるべきであり、限定の意味で解釈されるべきではないことが意図される。
【００６８】
以下の実施例は、本発明の種々の反復を説明する。
【実施例１】
【００６９】
実施例１．ＣＣＫ放出活性の初期スクリーニング
細胞ベースのアッセイを用いて、大豆タンパク質／大豆ペプチドの複合混合物がＣＣＫの放出を刺激するかどうかを決定した。初めに、４０個の異なるサンプルをアッセイして、どれが最高のＣＣＫ刺激活性を有するかを決定した。種々の調製物への暴露の後に、細胞生存率も評価した。
【００７０】
各凍結乾燥サンプルのアリコート（０．１ｇ）を５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、４．３ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．４ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２）中、２０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）のストック濃度に再構成した。約１５分間穏やかに混合した後、サンプルを４℃で一晩水和させ、次に、４℃において１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して、不溶性材料を除去した。上澄み画分を無血清培地中に１：１０で希釈し、約２ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＣＣＫ放出について３通りでアッセイした。天然の腸内ＣＣＫ産生細胞の多くの特徴を示すマウス腸内分泌細胞株であるＳＴＣ−１細胞（Ｒｉｎｄｉら，１９９０年，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１３４９−１３６４、Ｃｈａｎｇら，１９９４年，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２２１：３３９−４３７）を標準条件下で大豆タンパク質サンプルに４時間暴露した。負の対照は無血清培地中の２ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、正の対照は、無血清培地中の２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ｗ／ｖ）中の１００ｎＭのＰＭＡであった。細胞−条件培地を除去し、競合酵素アッセイを用いてＣＣＫレベルを測定した。（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを用いて、細胞生存率を評価した（Ｖｅｌｌｏｍｅｎ  Ｋ−Ｓ，Ｈｏｎｋａｋｏｓｋｉ  ＰおよびＵｒｔｔｉ  Ａ（２００４年）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｅｆｆｌｕｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＭＴＴ  Ａｓｓａｙ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｙ  Ｌｅａｄ  ｔｏ  Ｕｎｄｅｒｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２３：１８１−１８８）。
【００７１】
ＣＣＫ刺激活性を有する初期サンプルは全て加水分解物であった。初期サンプルセットにおいて、非加水分解タンパク質サンプルは、基礎レベルを超えてＣＣＫ放出を刺激しなかった。これは、図１においてインタクトな大豆およびカゼイン塩タンパク質について見ることができる。初期サンプルのどれに対して暴露しても、細胞生存率または代謝活性における有意な損失は検出されなかった。
【００７２】
４０個のサンプルを、新しいサンプル調製物を用いてこの細胞ベースのアッセイにより再スクリーニングした。放出されたＣＣＫの絶対量は異なったが、同じ１１個のサンプルが上位の刺激物として位置付けられた（対照ＰＭＡの％は３０％以上であった）。
【実施例２】
【００７３】
実施例２．強力なＣＣＫ放出サンプルの分画
サンプル９（すなわち、ＳＵＰＲＯ（登録商標）９５０／ＦＸＰ９５０、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）で加水分解された単離大豆タンパク質である）は、最高のＣＣＫ放出活性のうちの１つを有した。このサンプル中のペプチドの分子量を見積もるために、接線流ろ過によって分画した。このために、１００ｋＤａのＭＷＣＯフラットシート膜を備えた接線流ろ過装置（Ｌａｂ  ２０、Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ，ＵＫ）を用いてサンプルの５％のスラリーを分画した。残留物（すなわち１００ｋＤａよりも大きい画分）を捕集し、１０ｋＤａのＭＷＣＯフラットシート膜を備えた同じろ過装置を用いて透過物を分画して、１０〜１００ｋＤａの画分および１０ｋＤａ未満の画分を形成した。画分を凍結乾燥し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、無血清培地中に希釈し、上記で詳述されるように、それぞれの４つの濃度（ｗ／ｖ）をＳＴＣ−１細胞におけるＣＣＫ放出活性についてアッセイした。
【００７４】
表１は結果を示す。１０〜１００ｋＤａおよび１０ｋＤａ未満の画分は、最高のＣＣＫ放出刺激活性を有した。また、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ（図２を参照）、低分子量ペプチドは全ての画分中に存在した。この知見は、低分子量および高分子量の分子は疎水性相互作用または他の相互作用により相互作用をしている可能性があり、その結果として、この方法では十分に分離されないことを示唆する。しかしながら、低分子量ペプチドはＣＣＫ放出を誘発し、これらが、より高い分子量の画分で観察される活性の原因となることは明らかである。
【００７５】
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【実施例３】
【００７６】
実施例３．腸内の生体内消化を模倣するためのペプシンおよびペプシン−パンクレアチン消化の後の、強力なＣＣＫ放出加水分解物画分のＣＣＫ放出活性
図３は、実施例２に記載される加水分解タンパク質調製物であるＳＵＰＲＯ（登録商標）９５０／ＦＸＰ９５０の１０〜１００ｋＤａ画分のペプシンおよびペプシン−パンクレアチン消化調製物によるＣＣＫ放出の刺激を示しており、ヒトおよび他の動物の消化管（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｔｒａｃｋ）に存在することが知られている酵素によるこの画分の消化の後に、このペプチド加水分解物画分のＣＣＫ放出活性が保持されることが示される。生体内の胃および上部腸管の消化を模倣するためのペプシンおよびペプシン−パンクレアチンによる消化方法は、Ｓｃｈａｓｔｅｅｎ（Ｓｈａｓｔｅｅｎ，Ｃ．Ｓ．ら，（２００７年）Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｗｉｔｈ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｔｒｕｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｍｅａｌ．Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８６（２），３４３−３４８）、およびＨｉｇａｋｉ（Ｈｉｇａｋｉ，Ｎ．ら，（２００６年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０（１２），２８４４−２８５２）の既に公開された手順を修正したものである。タンパク質サンプルを２０体積の０．０１ＭのＨＣｌ中に可溶化し、ペプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ♯Ｐ７０１２）により、１：２００（ｗ／ｗ）の酵素−基質比、ｐＨ２．３および３７℃において４時間消化した。ペプシン消化の後、２．５ＭのＮａＯＨを混合物に添加して、ｐＨを８．０に調整し、パンクレアチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ♯Ｐ３２９２）を１：２００（ｗ／ｗ）の比率で添加し、消化をさらに４〜１８時間継続させた。加水分解度は、第１級アミン基とｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）との反応により、酸加水分解（１１０℃で２４時間）後のサンプル中に存在する第１級アミンの総量に対して決定した。タンパク質加水分解物を０．５〜８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞の培地に添加し、対照反応混合物（タンパク質基質の不在下で酵素を含有する）の同等の希釈において酵素対照を添加した。ペプシンおよびペプシン−パンクレアチン処理されたタンパク質加水分解物サンプルにより刺激されたＳＴＣ−１細胞の培地中に放出されるＣＣＫの絶対濃度（ｎｇ／ｍＬ）がプロットされる。正の対照の１００ｎＭのＰＭＡおよび負の対照の２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡにより刺激されたＣＣＫの濃度はそれぞれ、図３において矢印が記される「ＰＭＡ対照」および「ベースラインのＣＣＫ放出」によって示される。
【実施例４】
【００７７】
実施例４．大豆タンパク質加水分解物のＣＣＫ放出活性
種々の加水分解度を有するいくつかの異なる大豆タンパク質加水分解物のＣＣＫ放出活性も分析した。このために、単離大豆タンパク質をＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ブロメライン、セリンプロテアーゼ、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２、Ｓ２、ＭＰ１、ＴＬ１、およびＡＳＰ−１で加水分解した。添加した酵素の量および／またはインキュベーション時間の持続時間を調整して種々の加水分解度を与えた。約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に希釈した異なる加水分解物にＳＴＣ−１細胞を暴露した。ＣＣＫ放出を上記のようにアッセイした。図４は、異なる大豆タンパク質加水分解調製物についてのＣＣＫ放出の刺激を説明する。図４Ａ〜４Ｈに示されるような異なる酵素で生成され、種々のインキュベーション条件で得られた異なる％加水分解度（％ＤＨ）を有する異なる大豆タンパク質加水分解物によって刺激されたＳＴＣ−１の培地中に放出される％ＣＣＫが、ＰＭＡにより放出される％ＣＣＫ（１００％に設定）と比較してプロットされる。細胞培地中に放出される％ＣＣＫ放出は以下のように計算される。
％CCK放出＝（ng CCKサンプルウェル − ng CCKBSAコントロールウェル）／
（ng CCKPMAウェル − ng CCKBSAコントロールウェル）ｘ 100
ＰＭＡは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の直接刺激によりＣＣＫを誘発する。各大豆タンパク質加水分解物を約２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＳＴＣ−１細胞に添加した。ＳＴＣ−１細胞によるＣＣＫ放出を誘発するための大豆加水分解物の相対能力は、酵素および加水分解度に依存する。
【００７８】
実験実施例１．大豆タンパク質加水分解物を含有する食品バー
この実験実施例では、タンパク質性材料および糖シロップを含む食品バーのサンプルは、以下の表２に記載される原料を用いて製造される。
【００７９】
食品バーを得るために、Ｈｏｂａｒｔミキサー（Ｎ５０  ５−Ｑｕａｒｔ  Ｍｉｘｅｒ、Ｌｅｇａｃｙ（登録商標）Ｃｏｕｎｔｅｒｔｏｐ  Ｍｉｘｅｒ、Ｌｅｇａｃｙ（登録商標）Ｆｌｏｏｒ  Ｍｉｘｅｒ、Ｈｏｂａｒｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｒｙ，ＯＨ）において第１の混合物が製造される。糖型シロップ、結晶糖、グリセリン、液体油、液体含有物、ガム、および天然または人工フレーバーをボウル内で混合する。スラリー混合物を２の速度設定で１分間混合する。ボウルをスパチュラで擦り取り、ボウルの側面をきれいにする。
【００８０】
スラリーを１分間混合した後、大豆タンパク質単離物、大豆タンパク質加水分解物、および粒子含有物を混合ボウルに添加する。混合物を１の速度設定で１分間混合する。ボウルの側面がきれいになるまでボウルをスパチュラで擦り取る。１の速度設定でさらに３０秒間混合する。次に、得られた生地をスラブ上に広げ、バーを約２０グラム〜約７０グラムの重さのピースに切断する。
【００８１】
表２  基本的な食品バーの配合
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【００８２】
実験実施例２．大豆タンパク質加水分解物を含有する酸性飲料
本発明に従う酸性飲料を調製する。１３０．０部の大豆タンパク質原料および８５３９部の脱イオン水を容器に添加する。均一に分散されるまで、内容物を高せん断下で混合する。次に、分散液を７４℃〜７９℃（１６５°Ｆ〜１７５°Ｆ）に加熱し、さらに１０分間混合する。次に、１１８０部の異性化糖（ｈｉｇｈ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｃｏｒｎ  ｓｙｒｕｐ）、１３１部のアップルジュース濃縮物（６８ブリックス）および２０．０部の無水クエン酸を混合しながら添加する。８５％のクエン酸でｐＨを３．８〜４．０に調整する。第１段階では２５００ポンド／平方インチ、第２段階では５００ポンド／平方インチにおいて内容物を均質化し、その後１０７℃で７秒間低温殺菌する。ボトルに飲料を高温充填し、そして氷浴中に入れて飲料の温度をおよそ室温にし、冷蔵庫に入れる。
【００８３】
実験実施例３．大豆タンパク質加水分解物を含有する乾燥ブレンド
以下の実験実施例は、本発明のタンパク質を含有する乾燥ブレンドの調製を説明し、成分は以下の表３に記載される。
【００８４】
表３
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【００８５】
原料を容器に添加し、混合して乾燥ブレンドを形成する。
【００８６】
実験実施例４−実験実施例３で調製される乾燥ブレンドを含有する飲料
実験実施例３で調製される乾燥ブレンドを液体に添加することによって、そのまま飲める（ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｄｒｉｎｋ）飲料を調製する。添加の順序は重要でない。
【００８７】
そのまま飲める飲料中、液体は全組成物の約８５質量％から約９５質量％までで存在し、そのまま飲める飲料のｐＨは約６．８から約７．４までである。
【００８８】
実験実施例４は、２９．７１グラムの実験実施例３の生成物を２４０ｍｌのスキムミルクに添加することによって調製される本発明のそのまま飲める飲料である。内容物を３０秒間ブレンドする。
【００８９】
実験実施例５−実験実施例３で調製される乾燥ブレンドを含有する飲料
実験実施例３で調製される乾燥ブレンドを液体に添加することによって、そのまま飲める飲料を調製する。添加の順序は重要でない。
【００９０】
そのまま飲める飲料中、液体は全組成物の約８５質量％から約９５質量％までで存在し、そのまま飲める飲料のｐＨは約６．８から約７．４までである。
【００９１】
実験実施例５は、２９．７１グラムの実験実施例３の生成物を２４０ｍｌの水に添加することによって調製される本発明のそのまま飲める飲料である。内容物を３０秒間ブレンドする。
【００９２】
実験実施例６  大豆タンパク質加水分解物を含有する風味付けされていない低脂肪豆乳
１回分のサイズ：８．５ｇタンパク質／２５０ｇ。
【００９３】
表４  低脂肪豆乳の配合
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* 配合中で使用される大豆タンパク質加水分解物の百分率は、現状のままのタンパク質含量に応じて調整した。
【００９４】
６０℃（１４０°F）の水中にクエン酸塩を分散させる。混合速度を上昇させ、タンパク質を水中に分散させる。タンパク質を十分に分散させた後、スラリー温度を７５℃（１６７°F）まで上昇させ、混合速度を低下させて、混合を１０分間継続する。マルトデキストリン、糖およびカラギナンをプレブレンドしてタンパク質スラリーに添加し、混合を低速で５分間継続する。ヒマワリ油をスラリーに添加し、均質になるまで約３分間、低速で混合を継続する。４５％の水酸化カリウムを用いてスラリーのｐＨを７．０〜７．２の間に調整する。以下のように加工する：均質化、低温殺菌および冷却。生成物を７２℃（１６２°F）へ加熱し、5.17 MPa（７５０ｐｓｉ）（第２段階）、15.5  MPa（２２５０ｐｓｉ）（第１段階）で均質化する。スラリーを１００℃（２１２°F）に予熱し、１４１℃（２８６°F）で６秒間超高温処理（ＵＨＴ）する。生成物を３１℃（８８°F）まで冷却し、滅菌ボトルに梱包する。冷蔵保存する。
【００９５】
実験実施例７  ５０％の大豆タンパク質加水分解物および５０％のスキムミルクを含有する風味付けされていない飲料
１回分のサイズ：８ｇタンパク質／２６０ｇ
【００９６】
表５  風味付けされていない飲料の配合
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*配合中で使用される大豆タンパク質加水分解物の百分率は、現状のままのタンパク質含量に応じて調整した。
【００９７】
１５℃（５９°F）において適度の速度の混合を用いてクエン酸塩を全脱イオン水中に分散させる。ＳＵＰＲＯ（登録商標）Ｐｌｕｓを水中に分散させる。全ての塊が分散されたら、スラリーを７７℃（１７０°F）に加熱し、低速で１０分間混合を継続する。マルトデキストリン、糖、ビタミン／ミネラルプレミックス、リン酸マグネシウム、セルロースおよびカラギナンを乾燥ブレンドする。乾燥ブレンドをタンパク質スラリーに添加し、混合を５分間継続する。ヒマワリ油を添加し、混合を３分間継続する。スラリーのｐＨを測定し、必要であれば５０％のクエン酸溶液または１ＮのＮａＯＨのいずれかを用いてｐＨをｐＨ６．９〜７．１に調整する。スキムミルクをゆっくり７２℃（１６２°F）に加熱し、加熱したスキムミルクにタンパク質スラリーを添加する。風味剤を添加し、スラリー中に完全に取り込まれるまで混合する。低速混合により３分間ブレンドし、最終スラリーのｐＨを記録する。以下のように加工する：生成物を７２℃（１６２°F）まで加熱し、７５０ｐｓｉ（第２段階）、２２５０ｐｓｉ（第１段階）で均質化する。スラリーを１０４℃（２２０°F）に予熱し、１４１℃（２８６°F）で６秒間超高温処理（ＵＨＴ）する。生成物を３１℃（８８°F）まで冷却し、梱包する。冷蔵保存する。
【００９８】
実験実施例７  カゼインカルシウムおよび無脂肪乾燥乳（ＮＦＤＭ）および大豆タンパク質加水分解物をタンパク質源として含有するバニラ風味の体重管理飲料
１回分のサイズ：１０ｇタンパク質／１１ｏｚ
【００９９】
表６  バニラ風味の体重管理飲料の配合
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【０１００】
プレブレンドを以下のように調製する：カラギナンおよびセルロースを配合のスクロースのごく一部と混合する。アラビアガムおよび残りのスクロースを混合する。キャノーラ油を混合する。
【０１０１】
次にブレンドする：高せん断混合を用いてクエン酸カリウムおよびナトリウムを水に添加する。次に、プレブレンドしたカラギナンおよびセルロースを分散させる。５分間混合する。大豆タンパク質、カゼインカルシウムおよびＮＦＤＭを分散させ、６５℃（１５０°Ｆ）への加熱を開始する。１５分間水和させ、６５℃（１５０°Ｆ）に達したら混合速度を低下させる。キャノーラ油／乳化剤ブレンドを約７０℃（１５８°Ｆ）に加熱して乳化剤を溶解させ、これは、いくらかの混合を必要とし得る。次に、熱い油混合物をバッチタンクに添加し、５分間ブレンドし、泡は分散されるであろう。スクロース／アラビアガムブレンド、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウムおよびビタミンプレミックスを添加し、１０分間混合する。バニラフレーバーを添加し、４５％のＫＯＨによりｐＨを７．０〜７．２に調整する。ＵＨＴ  ２８６Ｆ／６秒間、２５００／５００ｐｓｉ。
【０１０２】
実験実施例８  大豆タンパク質加水分解物を含有する乾燥ブレンドした飲料パフォーマンス飲料
【０１０３】
表７  乾燥ブレンドしたパフォーマンス飲料の配合
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【０１０４】
ミキサーを洗浄して消毒する。大豆タンパク質およびココア粉末をふるいにかける。全ての原料を適度な速度で１５分間混合する。乾燥粉末を衛生化した容器内で保存する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【国際調査報告】
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