(57)【要約】本発明は、細胞の経時寿命を延ばす方法であって、細胞中のＳＡＧＡ１、ＳＬＩＫおよび／またはＳＡＬＳＡ複合体の少なくとも１つの機能を破壊することを含む方法に関する。
2012532599.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の経時寿命を延ばす方法であって、前記細胞中のＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡ複合体のうちの少なくとも１つの機能を破壊することを含む方法。
【請求項２】
ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡ複合体のうちの少なくとも１つが、直接的または間接的に破壊される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｓｐｔ３、Ｒｔｇ２、Ｇｃｎ５、Ｕｂｐ８、Ｓｐｔ７、Ｓｐｔ８およびＳｎｆ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を破壊することによって、前記複合体が破壊される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｓｐｔ７の機能が破壊される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子の機能がｉＲＮＡによって破壊される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子の機能が、転写／ＤＮＡレベルで破壊される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞の経時寿命（ＣＬＳ）の潜在的調節因子を同定する方法であって、
ｉ）既知のヒストン３リシン１８（Ｈ３Ｋ１８）アセチル化状態を有する細胞を、試験化合物と接触させるステップと、
ｉｉ）前記化合物が、前記細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態に影響を与えるか否かを判定するステップとを含み、
細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態の変化により、前記化合物がＣＬＳを調節することが示される方法。
【請求項８】
化合物が、Ａｃｓ１と表される遺伝子の産生物と相互作用する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、前記細胞のＣＬＳを延ばす請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
化合物が、前記細胞のＣＬＳを縮める請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｈ３Ｋ１８のアセチル化状態が、ミトコンドリア呼吸の測定により判定される請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法により同定された細胞のＣＬＳの調節因子。
【請求項１３】
細胞の複製状態を同定する方法であって、前記細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程を含み、Ｈ３Ｋ１８のアセチル修飾の存在により、前記細胞が積極的に複製を行っている細胞であることが示され、Ｈ３Ｋ１８のアセチル修飾の不存在は、もはや複製を行っていない細胞であることを示す方法。
【請求項１４】
前記細胞が、哺乳類の細胞である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、ヒトの細胞である請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、人工多能性幹細胞である請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、癌細胞である請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞のＣＬＳの変化を同定する方法であって、細胞内のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程と、これを対照細胞のアセチル化状態と比較する工程とを含み、対照細胞と比較した時、Ｈ３Ｋ１８Ａｃの損失はＣＬＳの延長を示し、Ｈ３Ｋ１８Ａｃの獲得はＣＬＳの短縮を示す方法。
【請求項１９】
前記細胞が、哺乳類の細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、ヒトの細胞である請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、人工多能性幹細胞である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、癌細胞である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞のＣＬＳの変化に関連する障害を診断する方法であって、対象から前もって単離した細胞のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程と、前記アセチル化状態を対照細胞のアセチル化状態と比較する工程とを含む方法。
【請求項２４】
前記障害が、加齢性障害、癌、血液障害および神経障害からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞老化、特に細胞の経時的老化に影響する化合物を同定するスクリーニング方法、および細胞の経時寿命の変化に関連する障害を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシン標的複合体であるＴＯＲＣ１は、酵母から人間まで保存され、細胞の栄養状況やストレス状況の感知および情報伝達で重要な役割を持ち、したがって、細胞成長１−５と細胞生存６−１１との間のバランスを制御する。出芽酵母では、ＴＯＲＣ１は、ブドウ糖の発酵成長を促進し、呼吸を下方制御する１２，１３。ＴＯＲＣ１は、ホスファチジルイノシトールキナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）−関連キナーゼ、Ｔｏｒ１またはＴｏｒ２を含む。Ｆｐｒ１との複合体（Ｆｋ５０６−感受性プロリンロタマーゼ）において、マクロライド系ラパマイシン１４は、おそらくＴｏｒキナーゼ１６の基質特異性の変化に起因する栄養制限１５に似た状態に細胞が入るようにするＴｏｒ１／２と結合する。この細胞の新しい状態は、遺伝子、特に呼吸およびストレス抵抗に必要とされる遺伝子６，１０，１７，１８の発現パターンの変化と関連する。多くのＴＯＲＣ１遺伝子の発現は、ＳＡＧＡ（Ｓｐｔ−Ａｄａ−Ｇｃｎ５−アセチル転移酵素）１９，２０、ＳＬＩＫ（ＳＡＧＡ−様）２１およびＳＡＬＳＡ（ＳＡＧＡ変更，Ｓｐｔ８不存在）２２−２４を始めとする転写共役因子複合体のＳＡＧＡファミリーに依存する。ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡは、リシンアセチルトランスフェラーゼ（ＫＡＴ）Ｇｃｎ５２１−２３および基質としてヒストンＨ３のリシン１４（Ｈ３Ｋ１４ａｃ）を含有するが、それらの存在量、それらが調節する遺伝子およびサブユニット組成１９，２４は異なる。
【０００３】
本発明者らは、Ｈ３Ｋ１８アセチル化が、細胞成長と寿命延長との間のバランスを制御するメカニズムの中心であることを発見した。また、本発明者らは、破壊されると経時寿命の延長をもたらすＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡ複合体に関与する数多くの遺伝子を同定した。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第一の態様によれば、細胞の経時寿命を延ばす方法であって、前記細胞中のＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡ複合体のうちの少なくとも１つの機能を破壊することを含む方法が提供される。
【０００５】
本発明の第二の態様によれば、細胞の経時寿命（ＣＬＳ）の潜在的調節因子を同定する方法であって、
ｉ）既知のヒストン３リシン１８（Ｈ３Ｋ１８）アセチル化状態を有する細胞を、試験化合物と接触させるステップと、
ｉｉ）前記化合物が、前記細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態に影響を与えるか否かを判定するステップとを含み、
細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態の変化により、化合物がＣＬＳを調節することが示される方法が提供される。
【０００６】
本発明の第三の態様によれば、第二の態様の方法により同定された細胞のＣＬＳの調節因子が提供される。
本発明の第四の態様によれば、細胞の複製状態を同定する方法であって、Ｈ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定することを含み、Ｈ３Ｋ１８のアセチル修飾の存在により、細胞が積極的に複製を行っている細胞であることが示され、Ｈ３Ｋ１８のアセチル修飾の不存在により、もはや複製を行っていない細胞であることが示される方法が提供される。
【０００７】
本発明の第五の態様によれば、細胞のＣＬＳの変化を同定する方法であって、細胞内のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程と、これを対照細胞のアセチル化状態と比較する工程とを含み、対照細胞と比較した時のＨ３Ｋ１８Ａｃの損失により、ＣＬＳの延長が示され、対照細胞と比較した時のＨ３Ｋ１８Ａｃの獲得により、ＣＬＳの短縮が示される方法が提供される。
【０００８】
本発明の第六の態様によれば、細胞のＣＬＳの変化に関連する障害を診断する方法であって、対象から前もって単離した細胞のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程と、該アセチル化状態を対照細胞のアセチル化状態と比較する工程とを含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１ａ】ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。ＢＹ４７４１バックグラウンドにおいて、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。
【図１ｂ】ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。ＢＹ４７４１バックグラウンドにおいて、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。
【図１ｃ】ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。ＢＹ４７４１バックグラウンドにおいて、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。
【図１ｄ】ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。ＢＹ４７４１バックグラウンドにおいて、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。
【図１ｅ】ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。ＦＹ１６８およびＦＹ５７１において、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。パネルｅでは、ＦＹ５７１中でｓｐｔ７−２１７対立遺伝子から発現したＳｐｔ７バージョンが、アミノ酸１１１９でトランケートされてＣ−末端の２１３残基を失っている。
【図１ｆ】ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。ＦＹ２およびＦＹ２０３０において、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。
【図１ｇ】ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。ＪＲ−５２Ａにおいて、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。
【図１ｈ】ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。ＦＹ１６８およびＦＹ５７１において、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。
【図２ａ】ＳＡＧＡおよびＫ１４ａｃは老化に影響する。ＦＹ２０３０バックグラウンドの１×１０８個の細胞から調製された総タンパクにおける、Ｋ１４ａｃのレベルを示すウェスタンブロット。ビオチン化を行い、指数的培養（ＹＰＤ）で１０または２０世代成長させ、磁気ストレプトアビジンビーズを使用して単離。幼若細胞（主に、５世代未満）は、残っている非ビオチン化細胞から用意した。
【図２ｂ】ＳＡＧＡおよびＫ１４ａｃは老化に影響する。ＦＹ２０３０バックグラウンドの１×１０８個の細胞から調製された総タンパクにおける、ＨＡ−Ｓｐｔ７のレベルを示すウェスタンブロット。ビオチン化を行い、指数的培養（ＹＰＤ）で１０または２０世代成長させ、磁気ストレプトアビジンビーズを使用して単離。幼若細胞（主に、５世代未満）は、残っている非ビオチン化細胞から用意した。
【図２ｃ】ＳＡＧＡおよびＫ１４ａｃは老化に影響する。ＦＹ１６８およびＦＹ５７１の１×１０８個の細胞から調製された総タンパクにおける、Ｋ１４ａｃのレベルを示すウェスタンブロット。ビオチン化を行い、指数的培養（ＹＰＤ）で１０または２０世代成長させ、磁気ストレプトアビジンビーズを使用して単離。幼若細胞（主に、５世代未満）は、残っている非ビオチン化細胞から用意した。＊は、ヒストンＨ３のプロセシングされたバージョンを示す。
【図３ａ】ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＫ１４ａｃの制御。示された株（表１に示す遺伝子型）において、１０μＭのラパマイシンの存在下で（＋）またはモック処理して（−）３時間成長させた後に調製した総細胞抽出物中のＨ３Ｋ１４ａｃ  Ｇｃｎ５またはＨＡ−Ｓｐｔ７のレベルを示すウェスタンブロット。ＷＴ株はＢＹ４７４１である。
【図３ｂ】ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＫ１４ａｃの制御。示された株（表１に示す遺伝子型）において、１０μＭのラパマイシンの存在下で（＋）またはモック処理して（−）３時間成長させた後に調製した総細胞抽出物中のＨ３Ｋ１４ａｃ  Ｇｃｎ５またはＨＡ−Ｓｐｔ７のレベルを示すウェスタンブロット。ＷＴ株はＢＹ４７４１である。
【図３ｃ】ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＫ１４ａｃの制御。示された株（表１に示す遺伝子型）において、１０μＭのラパマイシンの存在下で（＋）またはモック処理して（−）３時間成長させた後に調製した総細胞抽出物中のＨ３Ｋ１４ａｃ  Ｇｃｎ５またはＨＡ−Ｓｐｔ７のレベルを示すウェスタンブロット。ＷＴ株はＢＹ４７４１である。
【図３ｄ】ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＫ１４ａｃの制御。示された株（表１に示す遺伝子型）において、１０μＭのラパマイシンの存在下で（＋）またはモック処理して（−）３時間成長させた後に調製した総細胞抽出物中のＨ３Ｋ１４ａｃ  Ｇｃｎ５またはＨＡ−Ｓｐｔ７のレベルを示すウェスタンブロット。ＷＴ株はＢＹ４７４１である。
【図３ｅ】ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＫ１４ａｃの制御。示された株（表１に示す遺伝子型）において、１０μＭのラパマイシンの存在下で（＋）またはモック処理して（−）３時間成長させた後に調製した総細胞抽出物中のＨ３Ｋ１４ａｃ  Ｇｃｎ５またはＨＡ−Ｓｐｔ７のレベルを示すウェスタンブロット。ＷＴ株はＢＹ４７４１である。
【図３ｆ】ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＫ１４ａｃの制御。示された株（表１に示す遺伝子型）において、１０μＭのラパマイシンの存在下で（＋）またはモック処理して（−）３時間成長させた後に調製した総細胞抽出物中のＨ３Ｋ１４ａｃ  Ｇｃｎ５またはＨＡ−Ｓｐｔ７のレベルを示すウェスタンブロット。ＷＴ株はＢＹ４７４１である。
【図４ａ】Ｒｔｇ２およびＳＬＩＫは、経時寿命を決定する。対数期におけるＦＹ１６８（ＷＴ）、ＦＹ５７１（Ｓｐｔ７−２１７）およびｒｔｇ２Δ誘導体をＤｉＯＣ６で染色し、ミトコンドリア膜電位（ψ）を調べた。スケールバーは、１０μｍである。
【図４ｂ】Ｒｔｇ２およびＳＬＩＫは、経時寿命を決定する。示された株の細胞の連続１０倍希釈物を、３％のブドウ糖を含むＣＳＭにおいて静止期まで通気状態で成長をさせ、示された日にＹＤＰに蒔き、生存率を調べた。平均寿命（生存率が５０％低下する期間であって、単位は日）を、コロニー数から計算した。
【図４ｃ】Ｒｔｇ２およびＳＬＩＫは、経時寿命を決定する。細胞質翻訳を抑制するためにシクロヘキサミドで処理しまたは処理せず、３５Ｓメチオニンで１５分間パルスラベルした対数期における総タンパク質抽出物の蛍光画像（ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｓ）。
【図５】対数期または初期静止期における、ＢＹ４７４１から調製された総細胞抽出物中の、ヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを示すウェスタンブロットを示す。
【図６ａ】株ＦＹ５７１およびそのＫ１４ａｃでの誘導体におけるＳｐｔ７のＣ−末端トランケートされたバージョン（Ｓｐｔ７−２１７）の発現、および遺伝子発現の効果を示す。
【図６ｂ】種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【図６ｃ】種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【図６ｄ】種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【図６ｅ】種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【図６ｆ】種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【図６ｇ】種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【図６ｈ】種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【図６ｉ】種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【図７】静止期に入る細胞で、ＨＡ−Ｓｐｔ７がＣ−末端プロセッシングを受けることを示す。
【図８】細胞が老化するにしたがい、Ｋ１４ａｃが減少することを示す。
【図９】ヒストンＨ３に対して標準化されたＣｈＩＰによる、ＣＩＴ２（ＳＬＩＫ誘発された）またはＨＭＳ２（誘発されていない）での、ラパマイシンのＫ１４ａｃへの効果を示す。ＣｈＩＰは、リアルタイムＰＣＲ５３によりモニタリングし、入力の割合として表され、クロマチンの３種の調製物中のヒストンＨ３のレベルに対して標準化され、遺伝子の５’領域が示されている。
【図１０ａ】ラパマイシン処理におけるＫ１４ａｃのラパマイシン依存性低下にＳｎｆ１が必要とされることを示す。ウェスタンブロットは、ＢＹ４７４１で示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３での修飾のレベルを示す。示された全ての実験に関してｎ＝３である。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。
【図１０ｂ】ラパマイシン処理におけるＫ１４ａｃのラパマイシン依存性低下にＳｎｆ１が必要とされることを示す。ウェスタンブロットは、ＢＹ４７４１で示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３での修飾のレベルを示す。示された全ての実験に関してｎ＝３である。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。
【図１０ｃ】ラパマイシン処理におけるＫ１４ａｃのラパマイシン依存性低下にＳｎｆ１が必要とされることを示す。ウェスタンブロットは、ＦＹ３で示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３での修飾のレベルを示す。示された全ての実験に関してｎ＝３である。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。
【図１０ｄ】ラパマイシン処理におけるＫ１４ａｃのラパマイシン依存性低下にＳｎｆ１が必要とされることを示す。ウェスタンブロットは、ＬＰＹ８０５６バックグラウンドで示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３での修飾のレベルを示す。示された全ての実験に関してｎ＝３である。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。
【図１０ｅ】ラパマイシン処理におけるＫ１４ａｃのラパマイシン依存性低下にＳｎｆ１が必要とされることを示す。Ｇａｌ８３−ＨＡのＦｌＴＣ標識抗−ＨＡ抗体（右パネル）またはＤＡＰＩ（ＤＮＡ）（左パネル）による間接免疫蛍光法である。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。
【図１０ｆ】ラパマイシン処理におけるＫ１４ａｃのラパマイシン依存性低下にＳｎｆ１が必要とされることを示す。ウェスタンブロットは、ＢＹ４７４１で示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３での修飾のレベルを示す。示された全ての実験に関してｎ＝３である。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。
【図１０ｇ】ラパマイシン処理におけるＫ１４ａｃのラパマイシン依存性低下にＳｎｆ１が必要とされることを示す。ウェスタンブロットは、ＢＹ４７４１で示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３での修飾のレベルを示す。示された全ての実験に関してｎ＝３である。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。
【図１１】最適レベルのＫ１４ａｃにＲｔｇ２が必要であるが、Ｋ１４ａｃは、ｒｔｇ２Δ株でラパマイシン感受性であることを示す。ウェスタンブロットは、ＢＹ４７４１バックグラウンドで示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３（ａ）およびＧｃｎ５（ｂ）での修飾のレベルを示す。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。Ｒｔｇ２は、ＴＯＲＣ１６６のＬｓｔ８成分により負の制御を受け、この抑制は、ＴＯＲＣ１シグナル伝達の喪失またはラパマイシン処理によって軽減される。Ｒｔｇ２は、静止細胞中の逆行応答遺伝子の導入に必要なＳＬＩＫ１１の構成要素である。
【図１２ａ】静止期のＣＩＴ２、ＡＴＧ１およびＡＣＳ１の誘導能に対するＳｃｈ９の喪失の効果を示す。この図は、示された遺伝子に関するＲＮＡの逆転写リアルタイムＰＣＲ定量化を示す。
【図１２ｂ】静止期のＣＩＴ２、ＡＴＧ１およびＡＣＳ１の誘導能に対するＳｃｈ９の喪失の効果を示す。この図は、示された遺伝子に関するＲＮＡの逆転写リアルタイムＰＣＲ定量化を示す。
【図１２ｃ】静止期のＣＩＴ２、ＡＴＧ１およびＡＣＳ１の誘導能に対するＳｃｈ９の喪失の効果を示す。この図は、示された遺伝子に関するＲＮＡの逆転写リアルタイムＰＣＲ定量化を示す。
【図１３】ＳＡＧＡ複合体の破壊により、Ｈ３Ｋ１８アセチル化が増加することを示すウェスタンブロットである。
【図１４】ＳＡＧＡの破壊により、酵母細胞の経時寿命が延びることを示すグラフである。
【図１５】Ｈ３Ｋ１８アセチル化の妨害により、酵母細胞の経時寿命が有意に縮められることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一態様に関連して本明細書に記載されるいかなる好ましい実施形態も、適切な場合は、本発明の他のいかなる態様にも等しく適用することができることが理解されるであろう。
【００１１】
第一の態様によれば、細胞の経時寿命を延ばす方法であって、前記細胞中のＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよび／またはＳＡＬＳＡ複合体の少なくとも１つの機能を破壊することを含む方法が提供される。
【００１２】
本明細書で使用される用語「経時寿命」とは、静止期の培養液中の細胞が生存する時間を言う。
ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよび／またはＳＡＬＳＡ複合体の少なくとも１つの機能は、直接または間接的に破壊されうることが理解されるであろう。これらの複合体は、細胞のアセチル化状態およびＣＬＳの制御において重要な役割を担うが、それらのレベルは、細胞の状態およびその環境によって異なる。
【００１３】
本明細書で使用される「列挙された複合体との相互作用に直接および間接的に関連して」という用語は、複合体それ自体との、または複合体の一部を形成するペプチドをコードする遺伝子の遺伝子産物との、または複合体を形成させる遺伝子の遺伝子産物との相互作用を言う。
【００１４】
破壊は、Ｓｐｔ３、Ｒｔｇ２、Ｇｃｎ５、Ｕｂｐ８、Ｓｐｔ７、Ｓｐｔ８および／またはＳｎｆ１またはこれらの相同体からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子またはその少なくとも１種の遺伝子の産生物の破壊によって成し遂げられるのが好ましい。
【００１５】
本明細書で使用される用語「相同体」とは、同じ機能を実行し、一般的にある程度の配列相同性を示す、異なる生物の相似遺伝子を言う。当業者であれば、出芽酵母の上記遺伝子は、哺乳類を始めとする他の生物において、相同体を有することを理解するであろう。たとえば、Ｓｐｔ３は、ヒトＳＵＰＴ３Ｈ−２０３に対して相同性を示し、Ｇｃｎ５は、ヒトＫＡＴ２Ｂ−００１およびＫＡＴ２Ａ−００１に対して相同性を示し、Ｓｐｔ７は、ヒトＳＵＰＴ７Ｈに対して相同性を示し、およびＳＮＦ１は、ＰＲＫＡＡ１およびＰＲＫＡＡ２に対して相同性を示す。
【００１６】
これらの遺伝子は、ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよび／またはＳＡＬＳＡ複合体の一部を形成する産生物、または細胞中のヒストンのアセチル化に影響するような態様で前記複合体と相互作用する産生物をコードすることは理解されるであろう。
【００１７】
破壊は、ＳＰＴ７（配列番号１１）またはＳＰＴ７−２１７（配列番号１９）の破壊によって成し遂げられるのが好ましい。
本明細書で使用される用語「機能を破壊すること」、「機能の破壊」または「機能を破壊する」とは、遺伝子または遺伝子産物に関連して使用される場合、遺伝子の発現を妨害すること、またはコードされたポリペプチドの活性を破壊することを言う。さらに、転写開始と成熟タンパク質の産生との間のいずれの時期の遺伝子発現も妨害されうることは理解されるだろう。当業者であれば、これには、クロマチン構造を制御することにより遺伝子発現を制御するエピジェネティック手段、および遺伝子発現を制御する転写手段、翻訳手段および翻訳後手段が含まれるであろうことを理解するだろう。
【００１８】
本明細書で使用される、遺伝子の発現を妨害することとは、当該分野で公知の方法によって、機能性ポリペプチドの産生を阻止するまたは抑制することを意味し、コードされたポリペプチドの活性を破壊することとは、ポリペプチドがその機能を実行しないように、機能性ポリペプチドと１個以上のその結合パートナーとの相互作用を妨害することを言う。産生または機能は、完全にまたは部分的に阻止されてもよい。一実施形態では、遺伝子産物の産生または機能は、完全に阻止される、すなわち、活性遺伝子産物が存在しないことが好ましい。場合によっては、遺伝子産物の産生または機能は、野生型の発現レベルの約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％が残るように破壊されてもよい。
【００１９】
本明細書で使用される、機能性ポリペプチドの産生を抑制することとは、遺伝子産物の産生が、（ａ）前記遺伝子をノックアウトすることによって、（ｂ）前記遺伝子を、たとえば、ｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを使用して、転写後に発現停止させること（遺伝子サイレンシング）によって、（ｃ）前記遺伝子を、たとえば、エピジェネティック技術によって、転写的に発現停止させることによって、（ｄ）遺伝子産物の機能を、少なくとも１つの点突然変異の導入によって阻止するまたは変更することによって、（ｅ）遺伝子産物を翻訳後に不活性化することによって、阻止または抑制されてもよいことを意味する。
【００２０】
好ましい一実施形態では、遺伝子または相同体の発現がｉＲＮＡによって妨害される。
細胞は、プロモーターの制御の下に、ｉＲＮＡをコードするプラスミド／ベクターで形質転換されることが好ましい。このプロモーターは、恒常的プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターであってもよいことは明らかであろう。
【００２１】
本明細書で使用される用語「ｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を言う。これは、ｄｓＲＮＡを直接導入することによって誘発される真核生物における、転写後遺伝子サイレンシング方法（ＰＴＧＳ）である（Ｆｉｒｅ  Ａら（１９９８））。
【００２２】
さらに好ましい実施形態では、遺伝子の発現は、転写／ＤＮＡレベルで妨害される。該破壊は、少なくとも１つのヌクレオチドの遺伝子への挿入、または遺伝子からの少なくとも１つのヌクレオチドの欠失により実行されることが好ましい。
【００２３】
さらなる実施形態では、遺伝子の破壊は、少なくとも１つの点突然変異の導入により実行される。
ポリペプチドと１個以上のその結合パートナーとの相互作用が妨害される場合、この妨害は、適切な任意の手段によって、たとえば、競合阻害、非競合阻害、混合阻害、または不競合阻害によって実行可能であることは理解されるだろう。
【００２４】
本発明は、本明細書で定義するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列のアミノ酸配列に関し、ある程度の配列同一性または配列相同性を持つ配列（以下、「相同配列（複数を含む）」と言う）の使用を包含する。ここで、用語「相同的」とは、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列とある相同性を持つものを意味する。ここで、用語「相同性」とは、「同一性」と同等である可能性もある。
【００２５】
相同的アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列は、機能活性を保持するおよび／もしくは酵素の活性を増強するポリペプチドを提供すべきおよび／またはコードすべきである。
【００２６】
本発明の内容において、相同配列は、対象配列と、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５または９０％、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％一致しているアミノ酸配列を含むように選択される。典型的には、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含むであろう。しかし、相同性は、類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の点からも考慮されうる。
【００２７】
本発明の内容において、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）と、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５または９０％、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％一致しているヌクレオチド配列を含むように選択される。典型的には、相同体は、活性部位などをコードする配列について、対象配列と同じ配列を含むだろう。しかし、相同性は、類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の点からも考慮されうる。
【００２８】
相同性の比較は、目測で、より一般的には、簡単に利用できる配列比較プログラムの助けによって行うことができる。これら市販のコンピュータープログラムにより、２個以上の配列の間の％相同性を計算することができる。
【００２９】
％相同性は、１つの配列を他の配列と整列させ、１配列中の各アミノ酸を、直接他の配列中の対応するアミノ酸と一残基１回で比較する近接配列によって計算することができる。これを、「ギャップなし」アライメントと呼ぶ。典型的には、該ギャップなしアライメントは、比較的少ない数の残基のみで行われる。
【００３０】
これは、非常に簡単で首尾一貫した方法であるが、たとえば、１つの挿入または欠失があること以外は同一のペア配列であっても、その１つの挿入または欠失により後続のアミノ酸残基がアライメントからはずれることを考慮していないため、グローバルアライメントを行う場合、おそらく％相同性が大きく減少する可能性がある。
【００３１】
したがって、最大％相同性の計算には、先ず、ギャップペナルティを考慮して、最適アライメントを作成する必要がある。そのようなアライメントを行うための適切なコンピュータープログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）である。配列比較を実行することができるソフトウェアの例として、たとえば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４編−第１８章参照）、ＢＬＡＳＴ２（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７−８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）およびＡｌｉｇｎＸを挙げることがきるが、これらに限定されない。少なくとも、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２およびＦＡＳＴＡは、オフラインおよびオンライン検索で使用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９，７−５８から７−６０頁参照）。
【００３２】
ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、連続する少なくとも２０個のヌクレオチドにわたって測定されることが適切であり、連続する少なくとも３０個のヌクレオチドにわたって、連続する少なくとも４０個のヌクレオチドにわたって、連続する少なくとも５０個のヌクレオチドにわたって、連続する少なくとも６０個のヌクレオチドにわたって、連続する少なくとも１００個のヌクレオチドにわたって測定されることが好ましい。
【００３３】
ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、全配列にわたって測定されうることが適切である。
本明細書で使用される用語「フラグメント」とは、機能活性を保持するおよび／もしくは酵素の活性を増強するポリペプチドを提供するおよび／またはコードする配列のフラグメントを言う。
【００３４】
ポリペプチドフラグメントに関する場合、フラグメントの長さは、少なくとも５０アミノ酸であることが好ましい。より好ましくは、フラグメントは、対象配列（たとえば配列番号１９）の少なくとも１００、２００、３００、４００または５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の連続アミノ酸を含み、最大で完全長タンパク質よりもアミノ酸が１個少ないポリペプチドまでを含む。
【００３５】
ポリヌクレオチドフラグメントに関する場合、フラグメントは、少なくとも１００個のヌクレオチドを含むことが好ましく、少なくとも２００、５００、８００、１０００、１５００個またはそれ以上のヌクレオチドを含むことがより好ましく、最大で完全長ポリヌクレオチドよりもヌクレオチドが１個少ないポリヌクレオチドまでを含む。
【００３６】
特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子コードの縮重のため、互いに異なる可能性があることは当業者により理解されるだろう。本発明のポリペプチドをコードするこのようなポリヌクレオチドの使用も、本発明に含まれる。
【００３７】
さらに、ポリヌクレオチド配列に関連して、用語「相同配列」とは、ストリンジェント条件下でそのポリヌクレオチド配列に結合する配列を言いうることは、当業者には明らかであろう。
【００３８】
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌが教示するように（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ヌクレオチド結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいており、以下で説明するように、定義された「ストリンジェンシー」を与える。
【００３９】
最大ストリンジェンシーは、通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こり、高ストリンジェンシーは、Ｔｍより約５℃から１０℃低い温度で起こり、中間ストリンジェンシーは、Ｔｍより約１０℃から２０℃低い温度で起こり、低ストリンジェンシーは、Ｔｍより約２０℃から２５℃低い温度で起こる。当業者には理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一ヌクレオチド配列を同定または検出するために使用することができ、一方、中間（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用することができる。
【００４０】
好ましい態様では、本発明は、ストリンジェント条件（たとえば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０）下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列を包含する。本発明のヌクレオチド配列が二重鎖の場合、二重鎖の両方の鎖とも、それぞれ独立して、または組み合わせて、本発明に包含される。ヌクレオチド配列が一重鎖の場合、そのヌクレオチド配列の相補的配列も、本発明の範囲内に含まれると理解されるべきである。
【００４１】
本発明の配列に１００％相同ではないが本発明の範囲内に包含されるヌクレオチド配列は、数多くの方法により得ることができる。本明細書に記載される配列の他の変異体は、たとえば、様々な供給源から作られるＤＮＡライブラリーを探索することにより、得てもよい。さらに、他のウィルス性／細菌性または細胞相同体、特に哺乳類細胞（たとえば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類の細胞）に見られる細胞相同体を得てもよく、そのような相同体およびそのフラグメントは、一般的に、ここで列挙する配列に示された配列に、選択的にハイブリダイズすることができだろう。そのような配列は、他の動物種から作られたｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを探索し、およびそのようなライブラリーを、本明細書で設定されたヌクレオチド配列の全てまたは一部で構成されるプローブを使用して、中間から高ストリンジェンシーの条件下で探索することによって得てもよい。類似の考え方が、本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列の種相同体および対立遺伝子変異体を得る場合にも適用される。
【００４２】
本発明の別の態様によれば、細胞の経時寿命（ＣＬＳ）の潜在的調節因子を同定する方法であって、
ｉ）既知のヒストン３リシン１８（Ｈ３Ｋ１８）アセチル化状態を有する細胞を、試験化合物と接触させるステップと、
ｉｉ）前記化合物が、前記細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態に影響を与えるか否かを判定するステップとを含み、
細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態の変化により、その化合物がＣＬＳを調節することが示される方法が提供される。
【００４３】
クロマチンのヒストン成分の修飾は、遺伝子が活性かまたは抑圧されているかをしばしば反映し、これらの変化は、特異的修飾を保存するまたは取除く酵素によって、全体的に制御されることが知られている。活性遺伝子では、クロマチンは、特にヒストンＨ３のリシン（Ｋ）アセチル化（ａｃ）またはメチル化（ｍｅ）によってしばしば修飾される。発明者らは、ヒストンＨ３において、その修飾状態が、細胞寿命の決定において重要な役割を担うと考えられる新しいリシンを同定した。
【００４４】
本明細書で使用される用語「経時寿命の調節因子」とは、細胞のＣＬＳに影響を与える化合物を言う。この影響は、細胞のＣＬＳを延ばす、または細胞のＣＬＳを縮めうる。化合物が置かれる目的に応じて、どちらかの影響が望まれることは理解されるだろう。
【００４５】
本明細書で挙げられる化合物は、適切な任意の化合物でよく、たとえば、小分子化合物または同様に、ペプチドまたは核酸のような生体分子であってもよいことは理解されるだろう。
【００４６】
化合物は、Ｓｐｔ３（配列番号２２）、Ｒｔｇ２（配列番号４）、Ｇｃｎ５（配列番号６）、Ｕｂｐ８（配列番号１０）、Ｓｐｔ７（配列番号１２）、Ｓｐｔ８（配列番号１４）および／またはＳｎｆ１（配列番号１６）、またはこれらの相同体からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子または少なくとも１種の遺伝子の産生物と相互作用することが好ましい。
【００４７】
化合物が相互作用する遺伝子は、種々のノックアウト突然変異株を使用することにより同定できることは、当業者には明らかであろう。
そのような株を産生する方法は、当業者に周知であり、たとえば、１個以上のヌクレオチドの、遺伝子のコード領域への挿入が挙げられる。本明細書で使用される用語「少なくとも１種の遺伝子の産生物」とは、核酸、たとえばｍＲＮＡまたはペプチド産生物のいずれかを言うことは理解されるだろう。
【００４８】
さらに好ましい実施形態では、化合物は、Ａｃｓ１と表される遺伝子（配列番号１８）、またはＡｃｓ１と表される遺伝子の産生物と相互作用する。
さらに、Ｈ３Ｋ１８のアセチル化状態は、当該分野で公知の任意の適切な手段によって同定できることは、当業者には明らかであろう。
【００４９】
一実施形態では、アセチル化状態は、ミトコンドリア呼吸の測定によって決定する。
ミトコンドリア呼吸を測定する任意の適切な方法を使用できることは、当業者によって理解されるだろう。たとえば、ミトコンドリア呼吸は、ＤＩＯＣ６の存在下に細胞をインキュベートし、細胞を視覚化することによって、測定することができる。
【００５０】
代替の実施形態では、アセチル化状態は、生細胞または固定細胞上でＨ３Ｋ１８ａｃに対するモノクローナル抗体を使用して、間接免疫蛍光法によって決定される。
また、本発明は、細胞の複製状態を同定する、または細胞のＣＬＳの変化を同定する方法を提供する。
【００５１】
本明細書で使用される用語「複製状態を同定すること」とは、特定の細胞または細胞集団が、能動的に分裂しているか、もしくは能動的に分裂可能であるか、あるいは細胞または細胞集団がそれ以上分裂することができるか否かを同定することを言う。
【００５２】
本明細書で使用される用語「細胞のＣＬＳの変化を同定すること」とは、細胞／細胞集団が能動的に分裂しうる状態から、細胞／細胞集団がもはや分裂することができない状態までの、あるいはこの逆の場合の、段階的変化を同定することを言う。
【００５３】
この変化は、計画的に誘発することができ、または、自然にもしくは環境因子への暴露によって起こる可能性があることは、理解されるであろう。
細胞は、哺乳類の細胞であることが好ましい。細胞はヒトの細胞であることがさらに好ましい。
【００５４】
好ましい一実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞である。
人工多能性幹細胞は、典型的には、ある化学物質に暴露することにより、または、たとえば、種々のウィルスで形質移入することにより、多能性状態に退行させられた体細胞であることを、当業者は理解するだろう。
【００５５】
さらに好ましい実施形態では、該細胞は、腫瘍性および／または癌性であることが疑われる細胞である。該細胞は、癌を発症しているまたは発症する危険性があると疑われる患者から前もって単離したサンプルからの細胞であることが好ましい。
【００５６】
さらなる態様では、細胞のＣＬＳの変化に関連する障害を診断する方法であって、対象から前もって単離した細胞のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程と、該アセチル化状態を対照細胞のアセチル化状態と比較する工程とを含む方法が提供される。
【００５７】
本明細書で使用される用語「対照細胞」とは、対象から単離された組織型と同じ組織型の細胞を言い、該対照細胞は、健康な組織から単離され、公知のアセチル化状態を有する。
【００５８】
前記障害は、加齢性障害、癌、血液障害、パーキンソン病またはアルツハイマー病からなる群から選択されるのが好ましい。
図面を参照して、本発明をさらに説明する。図で表される株は、表１に開示する株を言う。図は以下を示す。
【００５９】
図１  ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは、増殖を反映する。図１は、ＢＹ４７４１バックグラウンド（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）、ＦＹ１６８およびＦＹ５７１（ｅ、ｈ）、ＦＹ２およびＦＹ２０３０（ｆ）、ならびにＪＲ−５２Ａ（ｇ）において、１８０分間モック処理されたまたは１０μＭのラパマイシンで処理された細胞から調製された総細胞抽出物中のヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを、ＨＡ−Ｓｐｔ７およびＧｃｎ５を含む種々のバックグラウンドで示すウェスタンブロットを示す。パネルｅでは、ＦＹ５７１中でｓｐｔ７−２１７対立遺伝子から発現したＳｐｔ７バージョンが、アミノ酸１１１９でトランケートされてＣ−末端の２１３残基を失っている。
【００６０】
図２  ＳＡＧＡおよびＫ１４ａｃは老化に影響する。ＦＹ２０３０バックグラウンド（ａ、ｂ）またはＦＹ１６８およびＦＹ５７１（ｃ）の１×１０８個の細胞から調製された総タンパクにおける、Ｋ１４ａｃ（ａ）およびＨＡ−Ｓｐｔ７（ｂ）のレベルを示すウェスタンブロット。ビオチン化を行い、指数的培養（ＹＰＤ）で１０または２０世代成長させ、磁気ストレプトアビジンビーズを使用して単離。幼若細胞（主に、５世代未満）は、残っている非ビオチン化細胞から用意した。＊は、ヒストンＨ３のプロセシングされたバージョンを示す。
【００６１】
図３  ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＫ１４ａｃの制御。示された株（表１に示す遺伝子型）において、１０μＭのラパマイシンの存在下で（＋）またはモック処理して（−）３時間成長させた後に調製した総細胞抽出物中のＨ３Ｋ１４ａｃ  Ｇｃｎ５またはＨＡ−Ｓｐｔ７のレベルを示すウェスタンブロット。ＷＴ株はＢＹ４７４１である。
【００６２】
図４  Ｒｔｇ２およびＳＬＩＫは、経時寿命を決定する。ａ．対数期におけるＦＹ１６８（ＷＴ）、ＦＹ５７１（Ｓｐｔ７−２１７）およびｒｔｇ２Δ誘導体をＤｉＯＣ６で染色し、ミトコンドリア膜電位（ψ）を調べた。スケールバーは、１０μｍである。ｂ．示された株の細胞の連続１０倍希釈物を、３％のブドウ糖を含むＣＳＭにおいて静止期まで通気状態で成長をさせ、示された日にＹＤＰに蒔き、生存率を調べた。平均寿命（生存率が５０％低下する期間であって、単位は日）を、コロニー数から計算した。ｃ．細胞質翻訳を抑制するためにシクロヘキサミドで処理しまたは処理せず、３５Ｓメチオニンで１５分間パルスラベルした対数期における総タンパク質抽出物の蛍光画像（ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｓ）。
【００６３】
図５は、対数期または初期静止期における、ＢＹ４７４１から調製された総細胞抽出物中の、ヒストンＨ３に対する種々の翻訳後修飾のレベルを示すウェスタンブロットを示す。
【００６４】
図６ａは、株ＦＹ５７１およびそのＫ１４ａｃでの誘導体におけるＳｐｔ７のＣ−末端トランケートされたバージョン（Ｓｐｔ７−２１７）の発現、および遺伝子発現の効果を示す。図１２ｂ〜ｉは、種々の遺伝子の導入に対する成長期およびＲＴＧ２の存在の効果を示す。
【００６５】
図７は、静止期に入る細胞で、ＨＡ−Ｓｐｔ７がＣ−末端プロセッシングを受けることを示す。
図８は、細胞が老化するにしたがい、Ｋ１４ａｃが減少することを示す。
【００６６】
図９は、ヒストンＨ３に対して標準化されたＣｈＩＰによる、ＣＩＴ２（ＳＬＩＫ誘発された）またはＨＭＳ２（誘発されていない）での、ラパマイシンのＫ１４ａｃへの効果を示す。ＣｈＩＰは、リアルタイムＰＣＲ５３によりモニタリングし、入力の割合として表され、クロマチンの３種の調製物中のヒストンＨ３のレベルに対して標準化され、遺伝子の５’領域が示されている。
【００６７】
図１０は、ラパマイシン処理におけるＫ１４ａｃのラパマイシン依存性低下にＳｎｆ１が必要とされることを示す。ａ〜ｄのウェスタンブロットは、ＬＰＹ８０５６バックグラウンド（ｄ）、ＢＹ４７４１（ａ〜ｂ、ｆ〜ｇ）またはＦＹ３（ｃ）で示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３での修飾のレベルを示す。示された全ての実験に関してｎ＝３である。ｅは、Ｇａｌ８３−ＨＡのＦｌＴＣ標識抗−ＨＡ抗体（右パネル）またはＤＡＰＩ（ＤＮＡ）（左パネル）による間接免疫蛍光法である。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。
【００６８】
図１１は、最適レベルのＫ１４ａｃにＲｔｇ２が必要であるが、Ｋ１４ａｃは、ｒｔｇ２Δ株でラパマイシン感受性であることを示す。ウェスタンブロットは、ＢＹ４７４１バックグラウンドで示される株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３（ａ）およびＧｃｎ５（ｂ）での修飾のレベルを示す。細胞は、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。Ｒｔｇ２は、ＴＯＲＣ１６６のＬｓｔ８成分により負の制御を受け、この抑制は、ＴＯＲＣ１シグナル伝達の喪失またはラパマイシン処理によって軽減される。Ｒｔｇ２は、静止細胞中の逆行応答遺伝子の導入に必要なＳＬＩＫ１１の構成要素である。
【００６９】
図１２は、静止期のＣＩＴ２、ＡＴＧ１およびＡＣＳ１の誘導能に対するＳｃｈ９の喪失の効果を示す。この図は、示された遺伝子に関するＲＮＡの逆転写リアルタイムＰＣＲ定量化を示す。結果は、静止期の培養液中のＳＡＬＳＡおよびＳＬＩＫの完全性を維持するために、Ｓｃｈ９が必要であることを示唆する。これと一致して、本発明者らは、ＡＣＳ１の導入はＳｃｈ９から独立していることを示す（図９のデータは、この遺伝子が、ＳＬＩＫではなく、Ｒｔｇ１／３のＲｔｇ２依存核取り込みに依存することを示唆する）。一方、ＣＩＴ２（ＳＬＩＫ／Ｒｔｇ２−依存性）およびＡＴＧ１（ＳＬＩＫではなくＳＡＬＳＡ依存性）の発現には、Ｓｃｈ９が必要である。
【００７０】
図１３は、ＳＡＧＡ複合体の破壊により、Ｈ３Ｋ１８アセチル化が増加することを示すウェスタンブロットである。
図１４は、ＳＡＧＡの破壊により、酵母細胞の経時寿命が延びることを示すグラフである。
【００７１】
図１５は、Ｈ３Ｋ１８アセチル化の妨害により、酵母細胞の経時寿命が有意に縮められることを示すグラフである。
材料および方法
株に関する詳細を、表１に挙げる。酵母は、富栄養培地（ＹＰＤ）、１％のバクトペプトン、１％Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物（ＢＤおよびＣｏ．）、２％のブドウ糖中、３０℃で、０．４×１０６細胞／ｍｌの密度まで成長させ、９０％エタノール／１０％のＴｗｅｅｎ２０中１０μＭのラパマイシンで３時間処理またはモック処理した。全細胞抽出物の調製、使用したウェスタンブロットおよび抗体、ＲＮＡの調製およびＲＮＡ定量化、クロマチン免疫沈澱（ＣｈＩＰ）、老化、ＥＲＣの判定および経時的老化アッセイのプロトコルの詳細は、以下の通りである。
【００７２】
【表１】
2012532599.tif 000003
2012532599.tif 000004
酵母全細胞抽出物の調製
２５ｍｌの細胞を、ＹＰＤ中でＯＤ約０．４Ａ６００まで成長させ、遠心分離により回収した。ラパマイシン処理細胞については、細胞を中期対数期まで成長させ、次いで１０μＭのラパマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｒ０３９５−１ＭＧ）を３時間まで加え、遠心分離により回収した。細胞ペレットを８Ｍの尿素３００μｌに再懸濁し、５分間ボルテックスすることにより破壊し、次いで酸で洗浄した２００μｌのガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。溶菌液を標準レムリ（ｌａｅｍｍｌｉ）ローディングバッファー中で５分間沸騰させた。
ウェスタンブロット法
タンパク質抽出物を、９０℃で３分間加熱した後、標準Ｔｒｉｓ−グリシン泳動緩衝液（４０％（ｗ／ｖ）グリシン、０．２５ＭのＴｒｉｓ−塩基、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を使用して、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に供した。タンパク質を、セミドライ転写（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してニトロセルロース膜上に移した。タンパク質の移動の成功は、Ｐｏｎｃｅｕ  Ｓ染色（０．１％のＰｏｎｃｅｕ  Ｓ、５％の酢酸）によって確かめた。次いで、膜を５％乾燥ミルクまたはＢＳＡを含むＰＢＳ中で１時間ブロッキングし、次いで、５％乾燥ミルク／ＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０中の一次抗体：１：３０００抗−Ｈ３（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７９１）、１：５０００抗−Ｈ３  Ｋ９ａｃ（Ｕｐｓｔａｔｅ（登録商標）０７−３５２）、１：３０００抗−Ｈ３  Ｋ１４ａｃ（Ｕｐｓｔａｔｅ（登録商標）０７−３５３）、１：５０００抗−Ｈ３  Ｋ１８ａｃ（Ｕｐｓｔａｔｅ（登録商標）０７−３５４）、１：１０，０００抗−Ｈ３  Ｋ２３ａｃ（Ｕｐｓｔａｔｅ（登録商標）０７−３５５）、１：３０００抗−Ｈ３  Ｋ２７ａｃ（Ｕｐｓｔａｔｅ（登録商標）０７−３６０）、１：５０００抗−Ｈ３  Ｋ４ｍｅ１（Ｕｐｓｔａｔｅ（登録商標）０７−４３６）、１：２０００抗−Ｈ３  Ｋ４ｍｅ２（Ｕｐｓｔａｔｅ（登録商標）０７−０３０）、１：５０００抗−Ｈ３  Ｋ４ｍｅ３（Ｕｐｓｔａｔｅ（登録商標）０７−４７３）、１：５００抗−Ｇｃｎ５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−９０７８），１：５０００抗−Ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ６１６０）、１：１０００抗−ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）クローン３Ｆ１０  １１８６７４２３００１）とともにインキュベートした。次いで、膜をＰＢＳで６回、各５分間洗浄し、５％の乾燥ミルク／ＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０中で、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を用い６回、各５分間洗浄した。結合した抗体を、製造者の指示書に従って、Ｐｉｃｏ  Ｗｅｓｔ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用して可視化した。各フィルムを数回曝露し、検出されるシグナルが飽和していないことを確認した。各実験は少なくとも３回繰り返した。
ＲＮＡ抽出およびノーザンブロット法
ＲＮＡの抽出を、熱フェノール抽出を使用して行った。総ＲＮＡ１５μｇを、１．１％のホルムアルデヒドゲル上で分離し、Ｍａｇｎａナイロン膜に移し、８０℃で２時間焼いた。ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ  Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ）とともに６５℃で２時間インキュベートすることによって、膜をブロッキングした。膜は、他に記載がない限り、典型的には２４時間曝露した。負荷された総ＲＮＡのレベルを、ｒＲＮＡ種（これらは、記載がない限り、各サンプルにわたり同じである）によってモニタリングした。
１０または２０世代成長の酵母の単離
０．２のＯＤ６００の培養物からの１×１０８個の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、３ｍｇのスルホ−ＮＳＨ−ＬＣ−ビオチンを用い、室温で１５分間ビオチン化し、ＰＢＳで６回洗浄し、前もって温めておいた１リットルの２．５％のブドウ糖を含むＹＰＤに加え、１０世代までインキュベートした。回収した細胞をＰＢＳで洗浄した。４００μｌのストレプトアビジンビーズを加え、ＰＢＳ中で２時間、氷上で細胞とともにインキュベートした。磁気選別機を氷上で２０分使用して、場合によっては攪拌しながら、ビオチン化細胞が付着したビーズを分類した。ＰＢＳを使用し、混合物の洗浄および再選択を５回行った。分類された細胞を、予め温めておいた第２の１リットルのＹＰＤに加え、さらに１０世代成長させ、正確に前と同じように分類し、洗浄した。タンパク質またはＤＮＡを、ウェスタンブロット分析のため尿素およびガラスビーズを使用して酵母から単離し（前記参照）、または、記載のあるとおりに５１スフェロプラストを調製し、フェノールクロロホルム抽出を用いる総ＤＮＡ抽出により単離した。総ＤＮＡ抽出物を０．８％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡは、放射標識されたプローブへのハイブリダイゼーションにより可視化した。
３５Ｓメチオニンによる酵母の標識化
ブドウ糖を含む合成完全培地中の対数培養物を、シクロヘキシミド（１０ｍｌの培養物中２５０μｇ／ｍｌ）で処理しまたは処理せずに、インキュベーションを５分間続け、その後、１００μＣｉの［３５Ｓ］メチオニン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに１５分のインキュベーションを行った。総タンパク質を１０または１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。次いで、ゲルをＥｎｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理し、乾燥させ、Ｘ線フィルムに４０〜７２時間曝露した。
顕微鏡検査
対数成長中または培養２．５日後（静止期）の細胞を、膜電位−感受性染料、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手したヨウ化３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯＣ６）（２０ｎｇ／ｍｌの濃度）とともに３０分インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、１５０Ｗキセノン−水銀ランプおよびＯｌｙｍｐｕｓ（登録商標）１５０Ｘ  Ｐｌａｎ  ＮｅｏＦｌｕｏｒ油浸対物レンズを備えるＯｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＩＸ−８１蛍光顕微鏡上で１０００ｍｓ（対数細胞）または２５０ｍｓ（静止期細胞）のＦＩＴＣチャンネルの曝露により可視化した。各フィールドで明視野像（ＤＩＣ）を捉えた。
ラパマイシンによる細胞処理条件の最適化
対数期の成長中の細胞を、９０％エタノール／１０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中１０μＭのラパマイシンで１８０分間処理し、Ｈ３Ｋ１４ａｃおよびヒストンＨ３のレベルを調べた。あるいは、細胞を、最大２０μＭのラパマイシンで３０分処理した。標準的な一組の条件を決定し、この明細書での全ての実験が、対数的に成長する細胞（０．４×１０７個の細胞／ｍｌ）を１０μＭのラパマイシンで２〜３時間処理することを含んでいた。
ヒストンＨ３への修飾に影響することが知られている要因の完全性に関し、ヒストンＨ３に対する翻訳後修飾の依存性を示すアッセイ
Ｓ１０またはＫ１４あるいはそれらの両残基がアラニン（Ａ）で置換されたヒストンＨ３を発現するＬＰＹ８０５６細胞から、または、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３に特異的に必要とされる因子をコードするＳＰＰ１５２またはＨ３Ｋ７９のメチルトランスフェラーゼをコードするＤＯＴ１５３，５４が欠失したＢＹ４７４１から、あるいはＨ３Ｋ４ｍｅ２およびＨ３Ｋ４ｍｅ３に必要とされるＨ２ＢＫ１２３５５に置換を有するＹＺＳ２７６から、総細胞抽出物を調製した。ヒストンＨ３上でのリシンの修飾を、各修飾に特異的な抗体を使用して、総細胞タンパク質抽出物のウェスタンブロット法によりモニタリングした。
ＨＡ−Ｓｐｔ７を、静止期に入った細胞においてＣ−末端プロセッシングし、またはラパマイシンで処理する。
【００７３】
ＳＰＴ７座からＳｐｔ７のＮ−末端標識されたバージョンを発現するＦＹ２０３０株、および標識されていない対照であるＦＹ３を、これらの実験に使用した（ａはｎ＝９）。ａ．細胞をＹＤＰで中期対数期、ジオーキシー後期（ｐｏｓｔ−ｄｉａｕｘｉｃ  ｐｈａｓｅ）または初期静止期まで成長させ、調製した総タンパク質抽出物を、３Ｆ１０モノクローナル抗体を使用してウェスタンブロット法に供し、ＨＡエピトープを明らかにした。分子量マーカーの位置が示されるとともに、ローディング対照として作用するように、ヒストンＨ３レベルが明らかになるまでブロットを展開した。ＨＡ−Ｓｐｔの３種の高分子量形態が存在し、ＳＡＧＡの完全長Ｓｐｔ７と一致するもの、ＳＬＩＫで発見され、約２００ａａを欠くＣ−末端トランケートされた形態、および機能が不明の形態３２７，２５である。さらに、完全長Ｓｐｔ７のレベルが低下する場合、５０ｋＤａの位置に移動する形態もこれらや他の調製物において明らかである。ｂ．３種全て成長条件で、先に示した実験を繰返し、Ｓｐｔ７のさらに広範なＣ−末端トランケートバージョンを示す。９つの実験のうち３つが上記のような結果を示し、一方６つは、ａよりも明確に分離されたバンドを示す。
間接免疫蛍光法
細胞のアセチル化／メチル化状態を、間接免疫蛍光法を使用して、以下のプロトコルに従って調べた。サンプル毎に１０〜５０ｍｌの細胞の新鮮な中期対数培養物を使用した。新鮮な３０％ホルムアルデヒド（５ｍｌのＰＥＭ中３ｇのｐ−ホルムアルデヒド、溶解するまで４ＭのＮａＯＨを加え、ＰＥＭで１０ｍｌにメスアップした）を作り、１／１０の容積の３０％ホルムアルデヒドを攪拌しながら培養物に加えた（円錐フラスコ中）。３０秒後、グルタールアルデヒド溶液を加え、最終濃度０．２％（ｗ／ｖ）を得た。インキュベート温度で９０分振盪した。細胞を２Ｋで５分間回転させ、次いでＰＢＳまたはＰＥＭ（１００ｍＭのＰｉｐｅｓ  ｐＨ６．９；１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇ２ＳＯ４）で３回洗浄した。１０ｍｌのＰＥＭＳ（１Ｍのソルビトール中のＰＥＭ）に細胞を再懸濁させ、５００μｌのＩＣＮ酵母溶解酵素（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。約８０％の細胞が消化されるまで、３７℃でインキュベートした（約１５分）。１０ｍｌのＰＥＭＳで３回洗浄した。１０ｍｌのＰＥＭ中１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００に３０秒間再懸濁した。１０ｍｌのＰＥＭで３回洗浄した。最終ペレットの体積を、大まかに調べた。２ｍｌのＰＥＭＢＡＬ（ＰＥＭ、０．１ＭのＬ−リシン、１％のＢＳＡ（グロブリンを含まず）、０．１％のアジ化ナトリウム）に再懸濁し、後続の回転で２０〜３０μｌのペレットを与える体積を、２本のエッペンドルフ管にそれぞれ移した。室温で３０分間回転ホイールに置いた。１０秒回転させた。５０μｌのＰＥＭＢＡＬ中一次抗体に再懸濁し（試験に適した希釈）、回転ホイール上で１６時間インキュベートした。１ｍｌのＰＥＭＢＡＬで３回洗浄した。１ｍｌのＰＥＭＢＡＬに再懸濁し、ホイールで３０分間回転させた。５０μｌのＰＥＭＢＡＬ中２０ｍｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ中に再懸濁した。回転ホイール上で１６時間インキュベートした。ＰＥＭＢＡＬで３回洗浄した。ペレットを１００μｌのＰＥＭＢＡＬに再懸濁し、ポリＬ−リシン被覆カバーガラス上に載せた。ヘアドライアーで乾燥させ、必要であれば、１００％のグリセロール中１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩに伏せた。あるいは、ＦＩＴＣ二次抗体を１／２００で使用し、ホイール上で、室温で１時間インキュベートした。注意：二次抗体を使用するインキュベーションの間はフォイルで管をカバーすること。次いで、細胞を可視化した。
実施例
ＳＡＧＡによるＨ３Ｋ１４ａｃは成長を反映する。
【００７４】
クロマチンのヒストン成分における翻訳後修飾の型は、しばしば、遺伝子が活性であるか抑制されているかを反映し、これらの変化は、特異的修飾を保存するまたは取除く酵素によって、全体的に制御される。活性遺伝子では、クロマチンは、しばしば、特にヒストンＨ３上でリシン（Ｋ）アセチル化（ａｃ）またはメチル化（ｍｅ）によって修飾される２７。細胞成長を反映するヒストンＨ３上での翻訳後修飾を同定するために、発明者らは、対数期または初期静止期の酵母から総タンパク質抽出物を調製した。ウェスタンブロットにおけるシグナルの大きく再現性のある相違は、アセチル化およびメチル化の変化を細胞生理学と関係付けることを可能にする。静止期の細胞は、Ｋ４のＫ１４ａｃ、Ｋ１８ａｃおよびトリメチル化（ｍｅ３）の減少を示し、これは、細胞周期停止の結果ではない（図５）。これらの変化は、成長および増殖を阻害するマクロライド系ラパマイシンで処理された対数増殖期の細胞でも同様であり１４（図１ａおよび１０〜１１）、これらの修飾の存在が、細胞の増殖能力を反映していることを示唆している。
【００７５】
Ｇｃｎ５は、Ｋ１４およびＫ１８の主なアセチルトランスフェラーゼである（図１ｂ）。さらに、ウェスタンブロット法によって検出可能なラパマイシン−感受性Ｋ１４ａｃは、ＳＡＧＡでＧｃｎ５によって媒介される（図１ｃ）。ＳＡＧＡ２２に特異的なＳｐｔ８、またはＳＡＧＡおよびＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡの完全性２３，３１，３２に必要とされるＳｐｔ２０を欠く株は、ラパマイシンで処理した時に変化が検出できないほどの低いレベルのＫ１４ａｃを有する。対照的に、Ｋ１４ａｃは、ユビキチンプロテアーゼ活性を有するとともにＳｐｔ７のＣ−末端領域のプロセッシングに必要とされる２３，２５ＳＡＧＡの構成要素であるＵｂｐ８を欠く株において、ラパマイシンに対し耐性がある（図１ｂ）。ＢＹ４７４１バックグラウンドで示された全ての株から調製した総細胞抽出物における、Ｈ３での修飾のレベルを示すウェスタンブロットを図１ｃ〜ｅに示す。細胞を、＋／−１０μＭのラパマイシンで３時間処理した。Ｓｐｔ７−２１７３３として知られる、Ｃ−末端２１３ａａを欠くＳｐｔ７を発現する株も、ラパマイシン耐性Ｋ１４ａｃを示し、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡは、ラパマイシンに対して耐性があることを示唆する（図１ｅ）。この株で、トランケートされたＳｐｔ７が、完全長Ｓｐｔ７に類似するレベル、つまり、高いＫ１４ａｃレベルで発現されている３３ことに注意することが重要である。ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡ中のトランケートされたＳｐｔ７のレベルは、普通、完全長Ｓｐｔ７より非常に低く、Ｋ１４ａｃの全体的レベルに僅かにしか貢献しない２２，２３、２５。また、このラパマイシンに対する耐性は、ブドウ糖が枯渇した場合１８，２１、成長を促進するために機能するＴＡＴＡボックス遺伝子３４の、活性化された、しかし基本的ではない発現における役割と一致している（図６）。さらに、これは、ＳＡＧＡによるＫ１４ａｃのラパマイシン感受性において、Ｓｐｔ７のＣ−末端２１３ａａを、ＳＡＧＡの特異的サブユニットであるＳｐｔ８と関連づけ、この領域を介して補充される２２，２３。したがって、ラパマイシンは、ＳＡＧＡおよびＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡに関して、示差的効果を有するかもしれない。ＳＡＧＡは、ブドウ糖成長細胞において活性であるが、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡは、ＴＯＲＣ１シグナル伝達が軽減された時、栄養が制限された細胞において活性である（図６）。
【００７６】
ＦＹ１６８  ＷＴ株は、ＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡ複合体において天然で見出されるものと類似するＣ−末端トランケーションを含むＳｐｔ７（ＦＹ５７１  Ｓｐｔ７−２１７）のみを発現するように、遺伝子操作されている。そのＳｐｔ７タンパク質は、完全長Ｓｐｔ７と類似するレベルで発現される１０。本発明者らは、この株のＫ１４ａｃのレベルとＲｔｇ２の影響、この株の活性に関する逆行性制御因子およびＳＬＩＫの成分を調べた。図６ａは、ＲＴＧ２の欠失が導入された場合、Ｋ１４ａｃは、この株において有意に減少しないことを示す。Ｒｔｇ２は、ＳＬＩＫ複合体のＨ３標的ＨＡＴ活性に必要である１１。これは、この複合体と比較して細胞中のＳＬＩＫのレベルがもともと低いことを反映しているのかもしれない。さらに、本発明者らは、対数成長期（ｌｏｇ）および初期静止期（ＳｔａｔまたはＳＰ）において、この株の転写応答（示された遺伝子座に対するプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲと組み合わせた逆転写を使用し、Ｎｏは、ＤＮＡ混入の対照とするために反応に加えられるＲＴａｓｅを使用しない反応を示す）を試験した。転写レベルは、Ｕ４ｓｎＲＮＡに対して標準化した。この転写レベルは、静止期細胞で、半分まで低下する（データは示さず）。ｂ．２５Ｓと１８Ｓとの間の領域の遺伝子間領域に設定されたプライマーを使用してモニタリングされたＲＤＮＡの転写レベルは、静止期において、７倍以上減少する。ｃ．逆行性応答性遺伝子ＣＩＴ２１２は、静止期細胞で誘発され、予想通り、ＷＴ  Ｓｐｔ７（ＦＹ１６８）およびＳｐｔ７−２１７（ＦＹ５７１）バックグラウンドでＲｔｇ２に依存する。ｄ．ミトコンドリアアセチルＣｏＡシンターゼをコードするＡＣＳ１の導入は、静止期で誘発され、Ｒｔｇ２−依存性である。ＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡ複合体のレベルが高い細胞では、その遺伝子は誘発されない。ＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡがＡＣＳ１発現を抑制するかもしれず、あるいは高レベルのＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡにより、Ｒｔｇ２が隔離され、ＲＴＧ２の産生をゼロにするかもしれない。ｅ．自己貪食（別の飢餓誘発応答）の制御因子１３、ＡＴＧ１の導入は、Ｒｔｇ２依存性を示さない。代わりに、Ｓｐｔ７−２１７を発現する株は、飢餓状態で、ＡＴＧ１  ｍＲＮＡレベルで２倍を超える増加を示し、ＳＡＬＳＡ複合体に関する役割を示唆する。これら３種の遺伝子の発現パターンにより、ＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡ複合体が、どのように遺伝子制御に寄与するかを規定できるかもしれない。本発明者らは、ＡＴＧ１は、ＳＡＬＳＡに依存し、ＳＬＩＫおよびＲｔｇ２とは無関係であると提案する。対照的に、ＣＩＴ２は、活性化にＳＬＩＫ複合体を必要とし、一方、ＡＣＳ１は、Ｒｔｇ２に依存するが、ＳＬＩＫには依存しない（Ｒｔｇ２は活性化因子としてのＲｔｇ１／３の核取り込みを調節する働きをする）。対数期における他の数多くの遺伝子座での発現もモニタリングした（ｆ〜ｉ）。ヒストンＨ３上のリシンの修飾を、示された修飾またはタンパク質に特異的な抗体を使用する総タンパク質抽出物のウェスタンブロット法によりモニタリングした。各実験において、ｎ＝２である。総タンパクおよびＲＮＡを、先に示した実験と同じ培養物から調製した。
【００７７】
本発明者らは、ラパマイシン処理された細胞（図１ｆ）または静止期細胞（図７）における、Ｓｐｔ７のレベルおよび完全性を調べるために、Ｓｐｔ７のＮ−末端をＨＡ標識したバージョンを使用した。Ｓｐｔ７のレベルの減少およびＣ−末端トランケーションが、両方の条件で起こり、ＳＡＧＡの完全性が損なわれる２３ことにより、Ｋ１４ａｃの減少が説明される。したがって、ＳＡＧＡの完全性は、細胞が静止期に入る時またはラパマイシン処理を行う時に起こる、Ｓｐｔ７のＣ−末端トランケーションにより制御される。Ｇｃｎ５の（ただしそのＲＮＡを除く１８）レベルも、ラパマイシン処理ＷＴ細胞において有意に低下する（図１ｇ）。対照的に、Ｇｃｎ５レベルは、Ｓｐｔ７−２１７を発現するラパマイシン処理細胞では、より高い（図１ｈ）。したがって、Ｇｃｎ５の減少は、Ｃ−末端トランケーションおよびＳｐｔ７レベルの減少の結果である可能性がある。
ＳＡＧＡは、成長細胞において老化に伴って減少する。
【００７８】
データは、ＳＡＧＡ活性が成長および増殖のマーカーであることを示唆する。細胞が老化するに従い、増殖能力およびミトコンドリア機能の両方が減少する。１０または２０世代成長した後の細胞と比べた幼若細胞（一般的に、＜５世代齢）のレベルを調べることにより、老化する間にＳＡＧＡが変化するか否かを調べる実験を行った。細胞が老化するに従い、Ｋ１４ａｃのレベルは低下し（図２ａ）、これは、ＨＡ−Ｓｐｔ７レベルにおける全体的な減少、特に完全長ＨＡ−Ｓｐｔ７の低下および老化中のＳＡＧＡの機能の喪失をサポートするＨＡ−Ｓｐｔ７のトランケート形態の増加と関連する（図２ｂ）。これに反し、Ｃ−末端がトランケートされたＳｐｔ７（Ｓｐｔ７−２１７）のみを発現する株では、Ｋ１４ａｃは、老化細胞では低下しない（図２ｃ）。総タンパク調製物は、幼若細胞または富栄養培地で対数期２０世代成長後のビオチン化細胞から調製し、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して単離した。総タンパク質抽出物中のＫ１４ａｃレベルのウェスタンブロットは、ＦＹ１６８（ＷＴ）およびＳｐｔ７−２１７を発現するＦＹ５７１から作成した。ローディング対照のため、ヒストンＨ３のレベルを調べた。図８から、単離されたタンパク質の量に違いがあることが分かる。Ｋ１４ａｃのレベルは、老化したＷＴ株で低下し、Ｓｐｔ７−２１７を発現する株では低下せず、これは、Ｋ１４ａｃの減少にはＳｐｔ７のＣ−末端領域が必要であり、ＳＡＧＡはこの調節の標的であることを示唆する。この調製物では、ヒストン「クリッピング」現象が、他の実験より起こりにくいことに注意すべきである（図２ａ参照）。また、これらの細胞は、クリップされた可能性のある、ヒストンＨ３のより小さな形態のレベルが増加している３６。このことは、細胞が老化するに従いＳＡＧＡおよびＫ１４ａｃが減少するメカニズムは、ラパマイシン処理細胞で起こるメカニズムに類似し、Ｓｐｔ７のＣ−末端領域のプロセッシングに関与することを示唆している。
ＴＯＲＣ１は、成長細胞においてＫ１４ａｃを維持する
本発明者らは、ラパマイシンがどのようにしてＳＡＧＡによるアセチル化に影響するのか明らかにするために調査した。酵母にはラパマイシンの標的が４つあり、Ｆｐｒ１〜４３７である。ラパマイシンの存在下、Ｆｐｒ１は、ＴＯＲＣ１複合体内で、ＰＩ３−関連キナーゼ、Ｔｏｒ１またはＴｏｒ２と関連する機能を抑制する３８。これは、増殖細胞中のＳＡＧＡ機能を維持することによって、Ｋ１４ａｃ、Ｋ１８ａｃおよびＫ４ｍｅ３の全体的レベルを制御するＴＯＲＣ１依存性シグナル伝達をサポートする。成長の初期段階の間、ラパマイシンによりＴＯＲＣ１を抑制することにより、ＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡ制御遺伝子を上方制御する結果となり、ブドウ糖の効率的な呼吸およびストレス耐性を増強する（図９）２０，３９。図９ｂから分かるように、ＴＯＲＣ−１複合体によって制御されるＣＩＴ２発現のレベルは、ラパマイシン添加時に増加する。
【００７９】
ＡＭＰＫは、一般的に、哺乳類ｍＴＯＲを負に制御し、ブドウ糖が途絶えるとＴＯＲＣ１シグナル伝達を下方制御し、ＡＭＰの細胞内レベルを増やす６３と考えられている。図１０から分かるように、酵母ＡＭＰＫ  Ｓｎｆ１は、Ｋ１４ａｃのラパマイシン依存性減少に必要とされるのと同じように機能するのかもしれない（ａ）。ｓｎｆ１Δ株中のＫ１４ａｃのレベルは、Ｇｃｎ５によるＫ１４アセチル化を促進するヒストンＨ３上のセリン１０のＳｎｆ１標的リン酸エステル化のため、ＷＴ株におけるレベルの約５０％に減少する６４。重要なことは、Ｋ１４ａｃ（ａ）、Ｇｃｎ５（ｂ）および細胞中のＨＡ−Ｓｐｔ７のいくつか（ｃ）は、ｓｎｆ１Δ株において、ラパマイシンに対して耐性があるということである。ｃでは、トラック５＊は、負荷下にあるということに注意すべきである。ｓｎｆ１Δと同様に、Ｋ１４ａｃのレベルは、バックグラウンド（ｄ）で減少しているが、Ｓｎｆ１でリン酸エステル化された、ヒストンＨ３上のＳ１０の完全性は、Ｋ１４ａｃのラパマイシン感受性に影響しないということに注意すべきである。本発明者らが求めたのは、Ｓｎｆ１が核または細胞質で機能しているかということである。Ｓｎｆ１の核への取り込みにＧａｌ８３が必要であり６５、ＨＡ標識Ｇａｌ８３は、固定細胞において間接免疫蛍光法により実証されているように（ｅ）、ラパマイシン処理細胞中で細胞質から核へ移動する。しかし、Ｇａｌ８３とＳｎｆ１との間の関係は、ｇａｌ８３Δ株が、処理されていない細胞におけるＫ１４ａｃのＷＴレベルおよびラパマイシンに対するある種の耐性（ｆ）を示すように、単純ではない。類似の結果が、ｇａｌ８３Δ株におけるＧｃｎ５タンパク質でも観察される（ｇ）。したがって、Ｋ１４ａｃおよびＧｃｎ５におけるラパマイシン依存性減少には、Ｇａｌ８３が必要であり、これは、Ｓｎｆ１に関する核機能であることを示唆している。
ＳＬＩＫはＲｔｇ２によってＣＬＳを制御する。
【００８０】
本発明者らは、トランケートされたＳｐｔ７だけを発現する、したがって、対数成長の間、高レベルのＳＬＩＫ／ＳＡＬＳＡ複合体を発現する株（Ｓｐｔ７−２１７）において、ミトコンドリア膜電位（ψ）およびＣＬＳを調べた。ψ（図４ａ）および平均ＣＬＳ（図４ｂ）は、ＷＴと比べてどちらも増加するが、その株は、次いで、培養１２日目くらいで生存率の急激かつ完全な喪失が起こるようであり、遺伝子発現のパターンの不均衡を反映しているかもしれない。Ｒｔｇ２は、ＴＯＲＣ１複合体によって抑制され２６、少なくとも２つの別々の機能、１つは逆行性応答の制御因子として、第二はＳＬＩＫの成分としての機能１３を有する。高レベルのトランケートされたＳｐｔ７は、Ｒｔｇ２のＳＬＩＫ複合体中への隔離を行い、他の機能に関してｒｔｇ２がゼロとなるかもしれない。このサポートとして、ｒｔｇ２株は、対数期においてψの増加（図４ａ）、ミトコンドリアタンパク質合成の増加（図４ｃ）およびＣＬＳの増強（図４ｂ）を示す。これは、ＴＯＲＣ１が活性である場合Ｒｔｇ２が機能し、ミトコンドリア機能が抑制され、ＳＬＩＫの形成はＴＯＲＣ１シグナル伝達の減少に関連し、これにより、Ｓｐｔ７がトランケーションされ、呼吸のＲｔｇ２−依存性抑制が軽減されることを示唆する。これにより、ＣＬＳを延ばす追加の方法が提供される。興味深いことに、Ｓｐｔ７もＲｔｇ２も、ミトコンドリア関連タンパク質であることが報告されている１３，４７。最後に、ＣＬＳの最も大きな延長は、ＲＴＧ２がＦＹ５７１（Ｓｐｔ７−２１７）からノックアウトされた時に観察された（図４ｂ）ことを示す。これはＲｔｇ２とは無関係なので、おそらく、ＳＡＬＳＡによる、寿命を延ばすことが知られている、自己貪食のための遺伝子の強い導入を反映しているのだろう。このｒｔｇΔ表現型は、ミトコンドリア呼吸の抑制剤の添加によっても産生することができることに気をつけるべきである。
【００８１】
要約すれば、本発明者らは、ＳＡＧＡファミリーの転写制御因子が、成長と経時寿命との間のバランスを制御することを示す。呼吸の上方または下方制御における代謝変化は、これらの複合体にシグナル伝達するＴＯＲＣ１およびＳｃｈ９によって、別々に制御される。ＴＯＲＣ１はＳｐｔ７およびＲｔｇ２の活性およびヒストンＨ３上のＫ１４のクロマチン修飾を介してミトコンドリア機能を遺伝子発現と調和させ、ＴＯＲＣ１シグナル伝達がＳＡＧＡおよびＳＬＩＫの高効率的なメカニズムに提供されることにより、細胞は成長と寿命延長との間のバランスを制御するために運命を転換する。
ＳＡＧＡの破壊により、Ｈ３Ｋ１８アセチル化が増加し、経時寿命が延長される。
【００８２】
図１３は、ＳＡＧＡ複合体が破壊されている株におけるＨ３Ｋ１８アセチル化の増加を示すウェスタンブロットである。両図面の上の列から分かるように、ＳＡＧＡ複合体が破壊されている株中の全細胞酵母抽出物に存在するＨ３Ｋ１８ａｃの量は、野生型と比べて増加している。これらの実験で使用した株は、ΔＳＰＴ８またはトランケートされたＳｐｔ７であった。図１４は、破壊されたＳＡＧＡ複合体を有する出芽酵母株の経時寿命が延びていることを示す。図で示されるように、株ＦＹ６３１およびＦＹ２０３０は野生型であり、株ＦＹ５７１は、ＳＡＧＡ特異的Ｓｐｔ７領域を欠く、トランケートされたＳｐｔ７タンパク質を発現し、株ＦＹ２０３７はΔＳＰＴ８である（Ｗｕ，Ｐ．Ｙ．およびＷｉｎｓｔｏｎ，Ｆ．，［２００２］Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２２（１５），ｐ５３６７−５３７９）。寿命は、Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｃ．およびＫａｅｂｅｒｌｅｉｎ，Ｍ．，（２００９）Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，２７．に記載されたように測定した。簡単に言えば、酵母の経時寿命は、経時的な老化酵母培養物の生存率のグラフを参照する。酵母培養物を、液体培地中で、ブドウ糖炭素源が使い尽くされ、細胞が分裂を止めるまで、成長させる。この時点で、生きていて、分裂可能な細胞の割合を、新しく植菌したその老化培養物の増殖特性をＢｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃマシンを使用して観察することによって測定する。種々の時点の生存率を比べ、培養物の経時寿命を決定する。
【００８３】
図１５は、この位置でのアセチル化が妨害されたＨ３Ｋ１８Ｑ変異体において、前記方法を使用して測定した経時寿命が、野生型と比較して縮まっていることを示す。Ｈ３Ｋ１８Ｑ酵母株では、Ｈ３遺伝子の両内在性コピーが失われ、リシン１８のグルタミンによる置換を含むＨ３遺伝子の単一コピーに置換されている。図に示す野生型株では、欠失Ｈ３遺伝子は、その遺伝子の単一野生型コピーに置換されている。
【００８４】
明細書で先に記載した全ての刊行物は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。本発明に記載された方法およびシステムの種々の変更および変種は、本発明の範囲および趣旨を逸脱しない限り、当業者に明らかになるだろう。本発明を特定の好ましい実施形態と関連して記載したが、本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際、生化学およびバイオテクノロジーまたはこれに関連する分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の種々の変更は、特許請求の範囲内に包含されるものである。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
【表３】
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【００８７】
【表４】
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【００８８】
【表５】
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【００８９】
【表６】
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【００９０】
【表７】
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【００９１】
【表８】
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【００９２】
【表９】
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【００９３】
【表１０】
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【００９４】
【表１１】
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【００９５】
【表１２】
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【００９６】
【表１３】
2012532599.tif 000022
【００９７】
【表１４】
2012532599.tif 000023
【００９８】
【表１５】
2012532599.tif 000024
【００９９】
【表１６】
2012532599.tif 000025
【０１００】
【表１７】
2012532599.tif 000026
【０１０１】
【表１８】
2012532599.tif 000027
【０１０２】
【表１９】
2012532599.tif 000028
【０１０３】
【表２０】
2012532599.tif 000029
【０１０４】
【表２１】
2012532599.tif 000030
【０１０５】
【表２２】
2012532599.tif 000031
【０１０６】
【表２３】
2012532599.tif 000032
【０１０７】
【表２４】
2012532599.tif 000033
【図１ｂ】
2012532599.tif 000034
【図３ａ】
2012532599.tif 000035
【図３ｄ】
2012532599.tif 000036
【図６ｆ】
2012532599.tif 000037
【図６ｇ】
2012532599.tif 000038
【図６ｈ】
2012532599.tif 000039
【図６ｉ】
2012532599.tif 000040
【図１ａ】
2012532599.tif 000041
【図１ｃ】
2012532599.tif 000042
【図１ｄ】
2012532599.tif 000043
【図１ｅ】
2012532599.tif 000044
【図１ｆ】
2012532599.tif 000045
【図１ｇ】
2012532599.tif 000046
【図１ｈ】
2012532599.tif 000047
【図２ａ】
2012532599.tif 000048
【図２ｂ】
2012532599.tif 000049
【図２ｃ】
2012532599.tif 000050
【図３ｂ】
2012532599.tif 000051
【図３ｃ】
2012532599.tif 000052
【図３ｅ】
2012532599.tif 000053
【図３ｆ】
2012532599.tif 000054
【図４ａ】
2012532599.tif 000055
【図４ｂ】
2012532599.tif 000056
【図４ｃ】
2012532599.tif 000057
【図５】
2012532599.tif 000058
【図６ａ】
2012532599.tif 000059
【図６ｂ】
2012532599.tif 000060
【図６ｃ】
2012532599.tif 000061
【図６ｄ】
2012532599.tif 000062
【図６ｅ】
2012532599.tif 000063
【図７】
2012532599.tif 000064
【図８】
2012532599.tif 000065
【図９】
2012532599.tif 000066
【図１０ａ】
2012532599.tif 000067
【図１０ｂ】
2012532599.tif 000068
【図１０ｃ】
2012532599.tif 000069
【図１０ｄ】
2012532599.tif 000070
【図１０ｅ】
2012532599.tif 000071
【図１０ｆ】
2012532599.tif 000072
【図１０ｇ】
2012532599.tif 000073
【図１１】
2012532599.tif 000074
【図１２ａ】
2012532599.tif 000075
【図１２ｂ】
2012532599.tif 000076
【図１２ｃ】
2012532599.tif 000077
【図１３】
2012532599.tif 000078
【図１４】
2012532599.tif 000079
【図１５】
2012532599.tif 000080
【配列表】
2012532599000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月20日(2012.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の経時寿命を延ばす方法であって、前記細胞中のＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡ複合体のうちの少なくとも１つの機能を破壊することを含む方法。
【請求項２】
ＳＡＧＡ、ＳＬＩＫおよびＳＡＬＳＡ複合体のうちの少なくとも１つが、直接的または間接的に破壊される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｓｐｔ３、Ｒｔｇ２、Ｇｃｎ５、Ｕｂｐ８、Ｓｐｔ７、Ｓｐｔ８およびＳｎｆ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を破壊することによって、前記複合体が破壊される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｓｐｔ７の機能が破壊される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子の機能がｉＲＮＡによって破壊される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子の機能が、転写／ＤＮＡレベルで破壊される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞の経時寿命（ＣＬＳ）の潜在的調節因子を同定する方法であって、
ｉ）既知のヒストン３リシン１８（Ｈ３Ｋ１８）アセチル化状態を有する細胞を、試験化合物と接触させるステップと、
ｉｉ）前記化合物が、前記細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態に影響を与えるか否かを判定するステップとを含み、
細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態の変化により、前記化合物がＣＬＳを調節することが示される方法。
【請求項８】
化合物が、Ａｃｓ１と表される遺伝子の産生物と相互作用する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、前記細胞のＣＬＳを延ばす請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
化合物が、前記細胞のＣＬＳを縮める請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
Ｈ３Ｋ１８のアセチル化状態が、ミトコンドリア呼吸の測定により判定される請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法により同定された細胞のＣＬＳの調節因子。
【請求項１３】
細胞の複製状態を同定する方法であって、前記細胞中のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程を含み、Ｈ３Ｋ１８のアセチル修飾の存在により、前記細胞が積極的に複製を行っている細胞であることが示され、Ｈ３Ｋ１８のアセチル修飾の不存在は、もはや複製を行っていない細胞であることを示す方法。
【請求項１４】
前記細胞が、哺乳類の細胞である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、ヒトの細胞である請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、人工多能性幹細胞である請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、癌細胞である請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞のＣＬＳの変化を同定する方法であって、細胞内のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程と、これを対照細胞のアセチル化状態と比較する工程とを含み、対照細胞と比較した時、Ｈ３Ｋ１８Ａｃの損失はＣＬＳの延長を示し、Ｈ３Ｋ１８Ａｃの獲得はＣＬＳの短縮を示す方法。
【請求項１９】
前記細胞が、哺乳類の細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、ヒトの細胞である請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、人工多能性幹細胞である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、癌細胞である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞のＣＬＳの変化に関連する障害を診断する方法であって、対象から前もって単離した細胞のＨ３Ｋ１８のアセチル化状態を同定する工程と、前記アセチル化状態を対照細胞のアセチル化状態と比較する工程とを含む方法。
【請求項２４】
前記障害が、加齢性障害、癌、血液障害および神経障害からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【国際調査報告】
2012532599.tif 000081
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2012532599.tif 000083
2012532599.tif 000084
2012532599.tif 000085
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2012532599.tif 000089