(57)【要約】  数種の細菌を、１７００フィートを超える深さの海底堆積物から得られた海洋区分から単離した。それらの細菌のうち少なくとも４種は、病院および診療所から単離された１つまたは複数の多剤耐性（ＭＤＲ）細菌に対して抗菌活性を示す化合物を産生した。１つの単離株ＳＪＣＨ−１２は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む検査した複数のＭＤＲ株に対して広範囲の活性を示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭ受入番号２１９７１を有する海洋細菌単離株によって産生され、少なくともエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｆｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して抗菌活性を有する抗菌性ポリペプチド。
【請求項２】
前記黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である、請求項１に記載の抗菌性ポリペプチド。
【請求項３】
以下の特性：
４℃から少なくとも３７℃までの熱安定性；
約５ｋＤａの分子量；
エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｆｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対する抗菌活性；
を含み、分泌性で少なくとも１つまたは複数の海洋細菌に細胞関連性（cell associated）を有する、請求項１に記載の抗菌性ポリペプチド。
【請求項４】
１つの細菌がエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種のｍＲＮＡと少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３に記載の抗菌性ポリペプチド。
【請求項５】
１つの細菌がシュードモナス菌と高度に類似している、請求項３に記載の抗菌性ポリペプチド。
【請求項６】
ＤＳＭＺ受入番号２１９７１を有する細菌細胞培養物。
【請求項７】
２種の細菌を含む、請求項６に記載の細菌細胞培養物。
【請求項８】
１種の細菌が配列番号１の１６Ｓ ＲＮＡ配列を有する、請求項６に記載の細菌細胞培養物。
【請求項９】
抗菌活性を有するタンパク質を産生する方法であって、以下の特性：
（ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける約５ｋＤaの分子量；
（ｉｉ）約４℃から少なくとも３７℃の範囲内の温度における熱安定性；
（ｉｉｉ）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｆｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対する抗菌活性；
を有する単離可能なポリペプチドの発現が可能な条件下で、ＤＳＭＺ受入番号２１９７１を有する細菌細胞を培養することを含む方法。
【請求項１０】
前記タンパク質の活性が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＳＭ受入番号２１９７１を有する前記細菌細胞培養物によって産生される抗菌性ポリペプチドを含む、薬学的に許容可能な組成物。
【請求項１２】
エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｆｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ））からなる群から選択される細菌によって引き起こされる感染状態を治療する方法であって、その必要がある対象に、薬学的に許容可能な賦形剤の中に含まれる有効量の請求項７に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＳＭ受入番号２１９７１を有する細菌培養物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年８月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／０９１，５３５号、および２００９年３月１１日に出願された第６１／１５９，１２８号の利益を主張し、これらの開示は、全ての図、表およびアミノ酸配列または核酸配列を含めて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、海洋環境から単離された細菌によって産生されるポリペプチド抗生物質に関する。特に、本発明は、広範囲の細菌感染の治療に有用な抗菌組成物を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
新しく、進歩した癌治療の探索は、新しい化合物の発見、新しい治療方針の開発および疾患に対する予測モデルの進歩に依存している。医薬産業および医学において達成された非常に大きな技術進歩のおかげで、治療薬物の処方に天然産物を使用する関心が復活している。事実、今日使用されている多くの薬物は天然産物の誘導体であり、これは、特に癌治療の分野において、新しい薬物の発見に利用可能な生物学的多様性をさらに活用するための追加的動機を与える。
【０００４】
長い時間かけて強いられた進化的圧力に応答して、新しい分子および化合物は絶えず進化し、コンビナトリアル化学のような現代科学技術が立ち向かうことのできない構造的多様性をもたらす。天然産物の生物学的および化学的多様性を利用するために、新しい薬物の探索に最も強力なアプローチは、次世代薬物のベースであるリード化合物を同定し産生するために、天然産物ベースの創薬技術によってリード薬物を明らかにすることから始まり、その後、ゲノムベースの基盤を利用することがますます明確になりつつある。
【０００５】
１９２９年のペニシリンの発見以来、大体５０，０００個の天然産物が微生物から単離された。これらの化合物のうち１０，０００個を上回る化合物は生物活性を有することが示され、これらのうちの１００個は、今日、広範囲のヒトおよび動物の疾患の治療に使用されている。多数の抗生物質および抗癌剤が同定され、感染症を治療するための薬物貯蔵庫に強力な武器を提供した。
【０００６】
不運にも、感染性微生物が新しい抗微生物剤にさらされた後すぐに多剤耐性が発現するように、微生物は変化する環境へ常に適応する。この耐性により、細菌の増殖および繁殖を効果的に制御する新しい薬物を同定する挑戦が続く。
【０００７】
ペニシリンのような大多数の抗生物質が天然源から単離されるか、または生理活性天然産物に由来する。リストは豊富であり、セファロスポリンファミリーのような複数のβ−ラクタム系抗生物質類、クロラムフェニコール、バンコマイシン、バシトラシン、ならびに臭素化ピロール、マグネシジン（ｍａｇｎｅｓｉｄｉｎ）、および置換されたビフェニルジオールのような構造的に多様な複数の化合物を含む。これらの化合物の起源は同様に多様で、土壌細菌から海洋シュードモナス菌およびバイオフローラに及ぶ。
【０００８】
世界の海は７０％を超える地球表面を覆い、「生命の起源の母」として表現されてきた。世界中の様々な地理的位置にある海の中で探し出された環境のユニークさを考慮すると、生物は、海洋環境への適応および生存に必要である構造的にユニークな天然化合物を生み出すことによって応答してきた。多くのこれらの化合物は、感染症から癌に及ぶ多くのヒトの疾患に対して薬理学的活性を示す。生命を救う複数の薬物および潜在的に新しい複数の薬物がこれまで発見され、それらは微生物類、藻類、植物類および無脊椎動物類から単離されている。生命工学、生物医学および製薬の分野における技術的進歩の出現により、新しい治療薬の水生生物からの発見が「新しい科学」になった。現在までに分類されている２５，０００の植物種のうち、わずか１０％が新しい治療的活性化合物を発見しようとする試みで研究された。
【０００９】
海洋環境は、新しい薬物源としてそれほど利用されてこなかった。世界の植物種および動物種の８０％を超える種が、海洋環境で発見される。生命を代表する３４の基本的門のうち、１７門が地上に存在し、３２門が海の中に存在する。２００４年現在、基礎研究により、約１４，０００の海洋天然産物が単離され、約１０〜１５個の異なる天然産物が、癌、感染症、疼痛および炎症性疾患の領域で臨床試験（ＦＤＡ主催の臨床試験）に入っている。
【００１０】
海洋環境が、生命の驚くべき多様性から生じる生理活性天然産物の優れた宝庫であるという認識にもかかわらず、海に由来する潜在的な新しい薬物の同定はとてもゆっくり進んでいる。生理活性化合物は、様々な海洋生物：被嚢類動物、海綿動物、軟らかいサンゴ、アメフラシ、ウミウシ（ｎｕｄｉｂｒａｎｃｈｓ）、コケムシ、ウミウシ（ｓｅａ ｓｌｕｇｓ）および微生物から抽出された。カリブ海の海綿動物に由来するスポンゴウリジン（Ｓｐｏｎｇｏｕｒｉｄｉｎｅ）およびスポンゴチミジン（ｓｐｏｎｇｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）は、５０年以上前に単離された最初の複数の生理活性化合物に属した。
【００１１】
海綿動物由来の産物の薬物調査研究は、抗癌および抗ウイルス化合物の開発をもたらした。ここ３０年以内に成功裏に発売され診療所に届いた２つの海洋生物由来の産物（またはそれらに由来する類似体）は、（合成物としてＡｒａ  Ａとして知られる）アシクロビルおよびセファロスポリンである。合成Ａｒａ  Ａは、以前に単離された海綿動物由来のスポンゴチミジンまたはスポンゴウリジンをモデルとし、後にユニセラ・カボリニ（Ｅｕｎｉｃｅｌｌａ ｃａｖｏｌｉｎｉ）から天然産物として単離された。抗生物質ミモサマイシン（ｍｉｍｏｓａｍｙｃｉｎ）は、ウミウシから単離され、また、特定の海綿動物で発見された。
【００１２】
海洋生物の２次代謝産物も過去１０年にわたって研究され、しばしばユニークな構造を示した。２０００年〜２００５年に、ジコノチド、アプリジン、ＫＲＮ７０００、ディスコデルモリド、ブリオスタチン、シンサドチン（ｓｙｎｔｈａｄｏｔｉｎ）、ドラスタチン１０、ソブリドチン、ハリコンドリン、ＨＴＩ−２８６、カハラリドＦ、スピスロシン（ｓｐｉｓｕｌｏｓｉｎｅ）、スクワラミンおよびエクチナサイジン７４３が、潜在的薬物候補として海洋源から同定された（Ｂｕｔｌｅｒ,２００５；Ｎｅｗｍａｎ ａｎｄ Ｃｒａｇｇ,２００４Ａ；Ｎｅｗｍａｎ ａｎｄ Ｃｒａｇｇ,２００４Ｂ.）。これらの化合物のいくつかは、臨床試験に入るかまたは臨床試験中である。
【００１３】
ジコノチドは、コノトキシン環状システイン既知ファミリーの２４〜２７個のアミノ酸ペプチドで、イモガイ（Ｃｏｎｕｓ ｍａｇｎｕｓ）毒から同定された。これは、Ｎ型電位依存性チャネルを遮断する新規非オピオイド鎮痛剤であり、深刻な慢性痛の管理のために開発された。
【００１４】
アプリジンは、地中海の被嚢類動物のアプリジウム・アルビカンス（Ａｐｌｉｄｉｕｍ ａｌｂｉｃａｎｓ）から単離されたジデムニン類似体であり、延髄甲状腺癌、腎癌、黒色腫および神経内分泌起源の腫瘍に対する活性を示し、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の分泌を阻害することが報告されている（Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ,２００４）。
【００１５】
アゲラスフィン（Ａｇｅｌａｓｐｈｉｎ）は、抗腫瘍薬として沖縄海綿動物のアゲラス・マウリチアヌス（Ａｇｅｌａｓ ｍａｕｒｉｔｉａｎｕｓ）から単離された新しいスフィンゴ糖脂質である。ＫＲＮ７０００は、臨床試験中の合成誘導体で、この活性は、ＶαＴ細胞抗原受容体のリガンドとして作用するナチュラルキラー細胞活性化に起因する（Ｈａｙａｋａｗａ,ｅｔ ａｌ.,２００３）。
【００１６】
ブリオスタチンは、フサコケムシ（Ｂｕｌｇｕｌａ ｎｅｒｉｔｉｎａ）から単離され、ホルボールエステル（ｐｈｏｂｏｌ ｅｓｔｅｒｓ）と同じ受容体に結合するが、任意の腫瘍促進活性を持たない点で異なる。ブリオスタチンの結合は、いくつかの腫瘍細胞におけるタンパク質キナーゼＣアイソフォームを下方制御し、増殖阻害、分化の変更および／または細胞死を引き起こす（Ｎｅｗｍａｎ,２００５）。
【００１７】
ディスコデルモリドは、海綿（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔｅ）から単離され、インド洋アメフラシのドラベラ・アウリキュラリア（Ｄｏｌａｂｅｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）から単離された直鎖ペプチドのドラスタチン（Ｐｅｔｔｉｔ,ｅｔ ａｌ.,１９８９）と同じように、インビトロの腫瘍細胞増殖を阻害する（Ｃａｐｏｎ,２００１）ことが判明した。
【００１８】
他の潜在的な薬物が海洋源から単離されており、それらのいくつかは、臨床試験研究中であるかまたはその候補である。表１は、海洋環境から回収された追加化合物および単離元の生物の例のリストである。
【００１９】
【表１】
2012500851.tif 000002
【００２０】
他のクラスの薬物の探索では、これまでのところほとんど候補が生み出されていないが、現在臨床試験中であるまたは潜在的薬物候補として認められる大部分の化合物は、抗腫瘍活性を示す。
【００２１】
海洋微生物がいくつかの潜在的抗菌剤を生み出し、過去数年にわたって単離された新しい抗生物質には、ロロラチン（ｌｏｌｏｌａｔｉｎ）、アグロケリン（ａｇｒｏｃｈｅｌｉｎ）(Ａｃｅｂａｌ,ｅｔ ａｌ.,１９９９)、およびアグロバクテリウム由来のセスバニマイド（ｓｅｓｂａｎｉｍｉｄｅｓ）、Ｐ．由来のペラジオマイシン（ｐｅｌａｇｉｏｍｉｃｉｎｓ）、ストレプトマイセス属由来のｄ−インドマイシノン（Ｂｉａｂｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）およびストレプトマイセス由来のジヒドロフェンコマイシンが含まれる（Ｐｕｓｅｃｋｅｒ,ｅｔ ａｌ.，１９９７）。シュードアルテロモナ・アルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａ Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）は、また、抗生物質および他の生理活性物質を生み出すことが報告された（Ｇａｕｔｈｉｅｒ,ｅｔ ａｌ.,１９９５）。
【００２２】
歴史的に、海洋源は新しい薬物の探索において十分に活用されず、単に創薬研究に充てられた学際的グループによって、今になってようやくより十分に開拓されつつある。新しい抗菌性化合物の同定においていくらかの進歩があるにもかかわらず、ＭＤＲ細菌に対して活性のある海洋由来の化合物は数に限りがある。２００５年に、わずか６つの新しい抗菌性医薬品が開発のパイプラインにあることが報告された（Ｕｓｄｉｎ,２００６）。
【００２３】
最近、海の堆積物から得られた細菌から単離された独特な１組の抗生物質がフェニカル（Ｆｅｎｉｃａｌ）らによって同定された（２００８）。新しい化合物はＮ，Ｃ２−結合ビスピロールである基本のピロール構造を有し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
ＭＤＲ株の急速な数の増加および現在使用されている抗菌剤の有効性の減少は、新しく有効な第１世代の抗生物質に対するニーズを強く示すものである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、海洋源から得られた新規化合物に基づく抗菌組成物を提供する。いくつかの異なる抗生物質活性が、大西洋の海底のコア海底試料から提供された複数の試料において同定された。これらの試料は、１８６５年１０月２５日のハリケーンで行方不明になったＳＳ共和国の難破船の近くで回収され、その船はジョージア湾から約１００マイル離れた所で沈み、深さ約５１８メートルの海底でほぼ１世紀後に発見された。
【００２６】
単離された海洋細菌によって産生されるこれらの活性化合物は、５ｋＤａの範囲の分子量を有する比較的小さいタンパク質である。これらは、いくつかの細菌種によって産生されるように思われる。
【００２７】
１３の細菌単離株が海洋堆積物試料から単離され、そのうち４種が抗菌活性を有していた（ＳＪＣＨ−３、１０、１１および１２）；しかしながらＳＪＣＨ−１２のみが広範囲の抗菌活性を示し、ＳＪＣＨ−１２のみがＭＲＳＡに対して高い活性を有した。
【００２８】
細菌単離株ＳＪＣＨ−１２は、２種類の細菌を含むことが判明し、そのうちの１つはシュードモナス菌であるように思われ、暫定的にシュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）種として同定される一方、他方は、また、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属または大腸菌属と同類であるグラム陰性桿菌であった。ＳＪＣＨ−１２培養物によって産生される抗菌性ポリペプチドは、両方の細菌の存在を必要とし得るが、実際に１種によって産生されたのか否かは確定されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】海洋微生物を単離するために使用される全体の工程を示す図である。
【図２】ＳＪＣＨ−１２の可溶性タンパク質のＳＤＳゲル電気泳動によって分離された海洋生物ＳＪＣＨ−１２の単離株中にある０８−１０８３タンパク質の抗菌活性を示す図である。
【図３】ＳＪＣＨ−１２の溶菌液中にある抗菌活性剤のタンパク質プロファイルを示す１６％アクリルアミドゲルでのＰＡＧＥゲル電気泳動を示す図である。
【図４】ＳＪＣＨ−１２の溶菌液の２次元ゲル電気泳動を示す図である。
【図５】桿菌形状を示すＳＪＣＨ−１２細菌の写真である。
【図６】ＳＪＣＨ−１２細菌の０８−１０８３部分精製タンパク質のＭＲＳＡおよび大腸菌に対する活性を示す図である。
【図７】アモキシシリンと比較した、０８−１０８３部分精製タンパク質のＭＲＳＡに対する活性を示す図である。
【図８】アモキシシリンと比較した、０８−１０８３部分精製タンパク質の大腸菌に対する活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、広範囲の抗菌活性を示す新規ポリペプチド組成物を提供する。この活性化合物を、目に見える虫の外皮を有する粗い茶色の堆積物（コア試料１）、灰色の堆積物と共にある岩（コア試料２）、および岩のような物質を含む灰色の堆積物（コア試料３）を含むコア試料堆積物から単離した海洋細菌から単離した。複数の細菌コロニーをこれらの試料から単離した。１３の細菌コロニーのうち、少なくとも１つの推定上新しい細菌種を単離し、２つの生理活性を同定し、そのうちの１つは０８−１０８３として同定した抗菌性の高いペプチドであり、もう一方は接着性の特性を有する未同定の化合物であった。９３のコア試料抽出物のうち、２０個の活性化合物がインビトロのトキシンＡ試験（Ｔｏｘ.Ａ Ａｓｓａｙ）において示された。
【００３１】
１１の試料が３つのコア試料から得られ、それをＬＢ寒天上に蒔くかまたはＬＢ培養液中で増殖させた。１３の細菌単離株をコロニー精製し、ＳＪＣＨ１〜１３として同定した。１３の単離株のうち、４つが抗菌活性を示した。ＳＪＣＨ−１２単離株は、試験をした１１生物中８生物に対して活性を示し、ＳＪＣＨ−１１は１１生物中３生物に対して活性を示し、ＳＪＣＨ−１０は２生物に対して、ＳＪＣＨ−３は１生物のみに対して活性を示した、表２を参照されたい。
【実施例】
【００３２】
材料および方法
海洋海底試料を、ジョージア海岸線の約１００マイル東の大西洋に位置するオデッセイダイビングスポットから得た。１７００フィートの位置における通例のダイビング操作の間、オデッセイ海洋探査（Ｔａｍｐａ、Ｆｌｏｒｉｄａ）の遠隔操作のビークルによって回収した海底物質を、試料は含んでいた。分析前に、試料を４℃または周囲温度で保存した。
【００３３】
細菌単離株ＳＪＣＨ−１２を、ブダペスト条約の条件の下、２００８年、１０月２０日に、ドイツの細胞バンク（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ,Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ,３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に預け、受入番号ＤＳＭ ２１９７１が割り当てられた。
【００３４】
以下の実施例を本発明の実例として提供するが、決して限定的なものとみなされるべきではない。
【００３５】
材料および方法
寒天上またはＬＢ培地中の標準条件下、細菌培養物を増殖させ、単離した。
【実施例１】
【００３６】
細菌コロニーの単離
合計１３の単離株を得た。これらを表２にまとめた。これらのうち、単離株ＳＪＣＨ−１０、ＳＪＣＨ−１１、ＳＪＣｈ−１２およびＳＪＣＨ−１３は、実施例２の表３に示した１つまたは複数の多剤耐性（ＭＤＲ）細菌株の肺炎桿菌（Ｋ.ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋ.Ｏｘｙｔｏｃａ）およびアシネトバクター・バウマニ（Ａ.ｂａｕｍａｎｉ）に対して様々な程度の抗菌活性を示した。
【００３７】
【表２】
2012500851.tif 000003
【実施例２】
【００３８】
１３の細菌単離株の抗菌活性
多剤耐性（ＭＤＲ）株を含む、表２にまとめた、病院の外科特別室および患者の病室から単離したいくつかの細菌株に対する抗菌活性を調べるために、実施例１の細菌コロニーから選択された単離株を検査した。ＭＤＲ株は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＫＰ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（ＫＯ）およびアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉ）（ＡＢ）であった。抗菌活性を表３に示した。
【００３９】
【表３】
2012500851.tif 000004
【実施例３】
【００４０】
抗菌活性のある０８−１０８３を単離した細菌は、寒天プレート上で培養すると、高い接着性があった。これは固定化現象であるのか化学結合の結果であるのかは確定しなかった。寒天は、Ｄ−ガラクトースおよび３，６−無水−Ｌ−ガラクトースの２糖単位でできているアガロビオースのポリマーとして形成されるポリマンヌロン酸である。寒天は、微多孔膜に捕捉されている間、捕捉された細胞が増殖できる細胞固定化培地として一般に使用される。
【００４１】
ＳＪＣＨ−１２細菌は、幅０．７〜０．８ミクロンおよび長さ１．２〜２．５ミクロンのグラム陰性桿菌のように思えた。これらは（条件的）嫌気性であり、酸産生株（ＡＳＳ）であり、色素（オレンジ）を産生する。プラスミドは検出されず、これらは溶血素に関して＋／−である。図５は、桿菌形状を示すスライドである。
【００４２】
ＳＪＣＨ−１２細菌培養物は、少なくとも３０日間は４℃、２５℃、および３７℃で安定であり、少なくとも６カ月間は４℃で安定である。２５℃および３７℃の６カ月保存においてはいくらか安定性を喪失する。
【実施例４】
【００４３】
０８−１０３３細菌の１６Ｓ ＲＲＮＡ遺伝子配列
ＳＪＣＨ−１２細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の約９５％を、ＰＣＲ増幅１６Ｓ ｒＤＮＡのダイレクトシークエンシングによって決定した（配列番号１）。
【００４４】
ＳＪＣＨ−１２細菌株のゲノムＤＮＡ抽出後、レイニー（Ｒａｉｎｅｙ）ら（１９９６）の記載のように、１６Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲによる増幅、ＰＣＲ産物の精製を行った。ＣＥＱＴＭＤＴＣＳ−クイックスタートキット（Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ）（Ｂｅｃｋｍａｎｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、メーカーの手順書の指示に従い、精製したＰＣＲ産物のシークエンシングを行った。ＣＥＱｔｍ８０００遺伝子解析システムを用いて、シークエンス反応物を電気泳動した。
【００４５】
シークエンスデータを、アラインメントエディターａｅ２に入力し、手動で整列させた。その後、これを腸内細菌科のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ綱に属する複数の代表生物の１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子配列と比較した。
【００４６】
表４はＳＪＣＨ−１２の相似行列および系統樹である。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の類似値を、アラインメント内の配列のペアワイズ比較によって計算した。系統学的樹状図作成のために、ＡＲＢパッケージの操作を使用した（Ｐｒｕｅｓｓｅ,ｅｔ ａｌ.,２００７）。ジュークス（Ｊｕｋｅｓ）およびカンター（Ｃａｎｔｏｒ）の相関（１９６９）を使用する近隣結合法により、進化距離値に基づいて系統樹を作成した。クロノバクター・サカザキイ（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｏｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を分析に含めることによって、系統樹のルーツを決定した。樹状図下のスケールバーは、１００ヌクレオチドあたりの１ヌクレオチド置換を示す。
【００４７】
ＳＪＣＨ−１２株の完全な１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列は、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）と９９．８％（２進値）の最も高い類似性を示す。この結果に基づいて、ＳＪＣＨ−１２株は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属内の少なくとも１つの新しい種に相当するように思えるが、エシュリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属はこの属と系統学的に高度に関係しており、したがって、ＳＪＣＨ−１２株は、また、エシュリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属内の新しい種に相当し得ることを排除することはできない。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
表５はＳＪＣＨ−１２の１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子配列である。
【００５０】
【表５】
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【００５１】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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