(57)【要約】  本発明は、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子の増大した発現を有する単離又は組換えエタノール生産性細菌及び調製の方法を提供する。本発明はまた、この細菌及び対応するキットを使用してエタノールを生産する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
参照細菌と比較して少なくとも１つのトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大している、単離又は組換えエタノール生産性細菌。
【請求項２】
トランスヒドロゲナーゼ遺伝子がｐｎｔＡ及びｐｎｔＢである、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
当該細菌が、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の増大した発現を有する、単離又は組換え細菌。
【請求項４】
当該細菌が、参照細菌と比較してフルフラール耐性が増大している、請求項３に記載の細菌。
【請求項５】
参照細菌が野生型細菌である、請求項３に記載の細菌。
【請求項６】
当該細菌がエタノール生産性である、請求項３に記載の細菌。
【請求項７】
当該細菌が参照細菌と比較してエタノール生産性が増大している、請求項３に記載の細菌。
【請求項８】
当該細菌が、参照細菌と比較してフルフラール又は５−ＨＭＦの存在下で増大したエタノール生産性を示す、請求項３に記載の細菌。
【請求項９】
当該細菌が参照細菌と比較して増殖性が増大している、請求項３に記載の細菌。
【請求項１０】
当該細菌が、参照細菌と比較してフルフラール又は５−ＨＭＦの存在下に増殖性が増大している、請求項３に記載の細菌。
【請求項１１】
当該細菌が、約０．０２５％フルフラール〜約０．１５％フルフラールの濃度で５−ＨＭＦの存在下に増殖性が増大している、請求項３に記載の細菌。
【請求項１２】
当該細菌が、約０．０２５％フルフラール〜約０．１５％フルフラールの濃度でフルフラールの存在下に増殖性が増大している、請求項３に記載の細菌。
【請求項１３】
当該細菌が、参照細菌と比較して増殖性及びエタノール生産性が増大している、請求項３に記載の細菌。
【請求項１４】
当該細菌が、参照細菌と比較して加水分解物の存在下で増殖性が増大している、請求項３に記載の細菌。
【請求項１５】
加水分解物が、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス又はセルロースバイオマスを含む生成物に由来する、請求項１４に記載の細菌。
【請求項１６】
当該発現が、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現を調節するプロモータ又は調節タンパク質を修飾する又は付加することによって増大する、請求項３に記載の細菌。
【請求項１７】
当該細菌が、嫌気又は微好気条件下で主発酵生成物としてエタノールを生産することができる、請求項３に記載の細菌。
【請求項１８】
当該細菌が、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌から成る群より選択される、請求項３に記載の細菌。
【請求項１９】
グラム陰性細菌が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）及びクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）から成る群より選択される、請求項１８に記載の細菌。
【請求項２０】
グラム陽性細菌が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から成る群より選択される、請求項１８に記載の細菌。
【請求項２１】
細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項３に記載の細菌。
【請求項２２】
細菌がクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）である、請求項３に記載の細菌。
【請求項２３】
参照細菌と比較してＰｎｔＡ及びＰｎｔＢタンパク質の活性が増大している、単離又は組換え細菌。
【請求項２４】
当該細菌が、参照細菌と比較してフルフラール耐性を増大している、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２５】
当該細菌が、参照細菌と比較して５−ＨＭＦ耐性を増大している、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２６】
参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現が増大しており、且つ細菌が参照細菌と比較してフルフラール耐性を増大している、単離又は組換え細菌。
【請求項２７】
参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現又はＰｎｔＡ及びＰｎｔＢポリペプチドの活性が増大しており、参照細菌と比較してフルフラール又は５−ＨＭＦの耐性が増大しており、当該細菌がエタノールを生産することができ、並びに当該細菌が：
（ａ）細菌の候補株をフルフラール又は５−ＨＭＦの存在下で増殖させること；及び
（ｂ）フルフラール又は５−ＨＭＦの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含む工程によって調製される、単離又は組換え細菌。
【請求項２８】
バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖を、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離又は組換え細菌と接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法。
【請求項２９】
バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖を、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離された又は組換え細菌と接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、フルフラールの存在下でバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法によって生産されるエタノール。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法によって生産されるエタノール。
【請求項３２】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の単離又は組換え細菌を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００９年５月１５日出願の米国特許仮出願第６１／１７８，６７２号、２００９年８月１９日出願の米国特許仮出願第６１／２３５，３４０号、及び２０１０年１月４日出願の米国特許仮出願第６１／２９２，０９４号の優先権を主張する。
【０００２】
（政府支援研究）
本発明は、米国エネルギー省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）によって与えられた、契約番号第ＵＳ ＤＯＥ ＦＧ０２−９６ＥＲ２０２２２号、第ＤＥ−ＦＧ３６−０８ＧＯ８８１４２号、及び第ＤＥ−ＦＣ３６−ＧＯ１７０５８号の下での米国政府の支援を得て行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
リグノセルロースバイオマスからの糖類を基質として使用して多種多様な発酵産物を作ることができる（９、１３、１６、３７）。しかし、発酵の前に、炭水化物ポリマーであるセルロース及びヘミセルロースを、化学的工程と酵素的工程の組合せを用いて可溶性糖類に変換しなければならない（３８、４１）。化学的工程は、微生物触媒の代謝に負の影響を及ぼす、アルコール類、酸及びアルデヒド類などの少量の生成物の混合物を生じる副反応を伴う。アルコール類（カテコール、シリンゴール等）は、細胞膜の透過性を上げることによって作用し、毒性は分子の疎水性とよく相関することが示されている（４６）。有機酸（酢酸、ギ酸等）は、中性形態で膜を横断し、細胞質内でイオン化して、プロトン駆動力を崩壊させることによって増殖を阻害すると考えられる（３１、４５）。アルデヒド類の阻害機構はより複雑である。アルデヒド類は、直接の物理的作用及び代謝作用に加えて、多くの細胞成分と反応して生成物を形成し得る（２６、３４）。全体として、化学的前処理からのこれらの少量の生成物は、細胞増殖を遅延させ、バイオマス由来の糖類の発酵を減速させ得る（１０、３０）。
【０００４】
フルフラール（五炭糖類の脱水生成物）は特に重要である。フルフラールはリグノセルロース分解の天然生成物である。フルフラールは、酸性条件下でのセルロースバイオマスの解重合の間に五炭糖類の脱水によっても形成される（２１）。この化合物はヘミセルロースシロップの毒性に対する重要な寄与因子であり、他の化合物の毒性を増大する（４４）。ヘミセルロースの希酸加水分解物中のフルフラール含量は毒性と関連づけられてきた（２２）。石灰の添加（ｐＨ１０）によるフルフラールの除去は加水分解物を容易に発酵可能にしたが、フルフラールを再添加すると毒性が回復した（２１）。フルフラールはまた、ヘミセルロースの酸加水分解物中に存在することが公知の他の化合物の毒性を増強することも示されている（４４〜４６）。フルフラールは、ＤＮＡの構造と配列を変化させ（３、１７）、解糖酵素を阻害して（６）、糖代謝を遅延させる（１１）ことが報告されている。
【０００５】
これらの阻害剤の存在下で機能する発酵生物の能力が広く探求されてきた。アルギン酸塩へのサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の封入は保護的であり、ヘミセルロースの酸加水分解物における発酵を改善することが示された（３６）。Ｓ．セレビシエの株は、加水分解物阻害剤に対して改善された耐性を有することがこれまでに記述されている（１、１９、２８）。大腸菌（Escherichia coli）（７）、Ｓ．セレビシエ（２）及び他の微生物（４）は、フルフラールをより毒性の低い生成物、フルフリルアルコールに還元することを触媒する酵素を含むことが示された（４６）。大腸菌では、フルフラールレダクターゼ活性はＮＡＤＰＨ依存性であると思われる（７）。ＮＡＤＰＨ依存性のフルフラールレダクターゼは大腸菌から精製されたが、その他のものも存在し得る。５−ヒドロキシメチルフルフラール（六炭糖類の脱水生成物）を還元することができるＮＡＤＰＨ依存性酵素がＳ．セレビシエにおいて特徴づけられ、ＡＤＨ６遺伝子と同定された（３３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、エタノール生産性微生物によるフルフラールに対する耐性を高めることができれば、これらの微生物によるエタノール生産の増大をもたらすだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、大規模な燃料生産のための生物を提供する。特に、本発明は、増大したフルフラールの存在下で増殖し、エタノールを生産することができる細菌を提供する。
【０００８】
本発明は、参照細菌と比較して少なくとも１つのトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の増大した発現を有する、単離されたか又は組換えたエタノール生産性細菌を提供する。一実施形態では、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子はｐｎｔＡ及びｐｎｔＢである。
【０００９】
本発明はまた、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢの増大した発現を有する、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
【００１０】
一実施形態では、細菌は、参照細菌と比較して増大したフルフラール耐性を有する。
【００１１】
別の実施形態では、細菌は野生型細菌である。
【００１２】
別の実施形態では、細菌はエタノール生産性である。
【００１３】
別の実施形態では、細菌は参照細菌と比較して増大したエタノール生産を示す。
【００１４】
別の実施形態では、細菌は、参照細菌と比較してフルフラールの存在下で増大したエタノール生産を示す。
【００１５】
別の実施形態では、細菌は参照細菌と比較して増大した増殖を有する。
【００１６】
別の実施形態では、細菌は、参照細菌と比較してフルフラールの存在下で増大した増殖を有する。
【００１７】
別の実施形態では、細菌は、約０．０２５％フルフラール〜約０．１５％フルフラールの濃度のフルフラールの存在下で増大した増殖を有する。
【００１８】
別の実施形態では、細菌は、参照細菌と比較して増大した増殖及び増大したエタノール生産を有する。
【００１９】
別の実施形態では、細菌は、参照細菌と比較して加水分解物の存在下で増大した増殖を有する。
【００２０】
別の実施形態では、細菌は加水分解物の存在下で増大した増殖を有し、加水分解物は、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス又はセルロースバイオマスを含む生成物に由来する。
【００２１】
別の実施形態では、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現は、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現を調節するプロモータを修飾又は付加することによって増大又は変化する。
【００２２】
別の実施形態では、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現は、遺伝子を異なる調節タンパク質の制御下又は付加的な調節タンパク質の制御下に置くことによって増大又は変化する。
【００２３】
別の実施形態では、細菌は、嫌気又は微好気条件下で主発酵生成物としてエタノールを生産することができる。
【００２４】
別の実施形態では、細菌は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌から成る群より選択される。
【００２５】
別の実施形態では、細菌は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌から成る群より選択され、グラム陰性細菌は、エシェリキア属（Escherichia）、ザイモモナス属（Zymomonas）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、ジオバクター属（Geobacter）、シュワネラ属（Shewanella）、サルモネラ属（Salmonella）、エンテロバクター属（Enterobacter）及びクレブシエラ属（Klebsiella）から成る群より選択される。
【００２６】
別の実施形態では、細菌は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌から成る群より選択され、グラム陽性細菌は、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属（Streptococcus）及びユーバクテリウム属（Eubacterium）から成る群より選択される。
【００２７】
別の実施形態では、細菌は大腸菌（Escherichia coli）である。
【００２８】
別の実施形態では、細菌はクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）である。
【００２９】
本発明は、参照細菌と比較してＰｎｔＡ及びＰｎｔＢタンパク質の活性が増大している、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
【００３０】
本発明は、参照細菌と比較してＰｎｔＡ及びＰｎｔＢタンパク質の活性が増大しており、且つ参照細菌と比較して増大したフルフラール耐性を有する、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
【００３１】
本発明はまた、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現が増大しており、且つ参照細菌と比較して増大したフルフラール耐性を有する、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
【００３２】
本発明はまた、参照細菌と比較してＰｎｔＡ及びＰｎｔＢ遺伝子の発現又はＰｎｔＡ及びＰｎｔＢポリペプチドの活性が増大しており、参照細菌と比較してフルフラール耐性が増大した、エタノールを生産することができ、並びに
（ａ）細菌の候補株をフルフラールの存在下で増殖させること；及び
（ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること
を含む工程によって調製される、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
【００３３】
本発明はまた、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖を本発明の単離された細菌又は組換え細菌のいずれかと接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含む、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法を提供する。
【００３４】
さらに、本発明は、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖を本発明の単離された細菌又は組換え細菌と接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含む、フルフラールの存在下でバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法を提供する。
【００３５】
加えて、本発明は、本発明の方法によって生産されるエタノールを提供する。
【００３６】
本発明はまた、本発明の単離された細菌又は組換え細菌を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、フルフラールの存在下で種々のレベルのｓｔｈＡ遺伝子発現を有するプラスミドを保持する様々なＬＹ１８０株の増殖。２４時間後（図１Ａ）及び４８時間後（図１Ｂ）の細胞密度（光学密度）とフルフラール濃度の関係を表すグラフを示す。記号：（■）、挿入物を有さないｐＴｒｃ９９ａ対照；（▲）、ｐＴｒｃ９９ａ−ｓｔｈＡの順方向非誘導ｓｔｈＡ発現；（▲）、０．０１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導したｐＴｒｃ９９ａ−ｓｔｈＡの順方向ｓｔｈＡ発現；及び（◆）、０．１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導したｐＴｒｃ９９ａ−ｓｔｈＡの順方向ｓｔｈＡ発現。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、フルフラールの存在下で種々のレベルのｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子発現を有するプラスミドを保持する様々なＬＹ１８０株の増殖。２４時間後（図２Ａ）及び４８時間後（図２Ｂ）の細胞密度（光学密度）とフルフラール濃度の関係を表すグラフを示す。記号：（■）、挿入物を有さないｐＴｒｃ９９ａ対照；（▲）、ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢの順方向非誘導ｐｎｔＡＢ発現；（▲）、０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導したｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢの順方向ｐｎｔＡＢ発現；及び（◆）、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導したｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢの順方向ｐｎｔＡＢ発現。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、フルフラール耐性へのトランスヒドロゲナーゼ（ＳｔｈＡ及びＰｎｔＡＢ）の増大した発現の影響を示す。培養物を、５０ｇ／ｌのキシロース及び１．０ｇ／ｌのフルフラールを含むＡＭ１最少培地中で４８時間増殖させた。空のベクタを対照として使用した。接種の前に誘導物質を添加した。細胞密度（５５０ｎｍでの光学密度に関して）を、２４時間後の約０．０５％フルフラール濃度（図３Ａ）及び４８時間後の約０．１０％フルフラール濃度（図３Ｂ）での各々の株について示す。対照株を白い棒グラフで示している。種々のレベルのｐｎｔＡ発現を有するプラスミドを保持する株を斜線の棒グラフで示す。種々のレベルのｐｎｔＡＢ遺伝子発現を保持する株を黒い棒グラフで示す。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、ｐｎｔＡの核酸配列（図４Ａ）及びアミノ酸配列（図４Ｂ）を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ｐｎｔＢの核酸配列（図５Ａ）及びアミノ酸配列（図５Ｂ）を示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、０．５ｇ／ｌフルフラール抗原での抗原投与後のＬＹ１８０における転写及び調節の変化を示す。有意に変動した調節遺伝子をＮＣＡによって同定し、ヌル分布に比して０．０５をＰ値のカットオフとした。増大した活性を伴う調節因子を実線の枠で示し、減少した活性を伴う調節因子を破線の枠で示す。混合活性を示した調節因子は明灰色で示している（ＤｃｕＲ）。図６Ａは部分的な調節因子−遺伝子応答地図を示す。２倍より大きく変動した代表的な遺伝子を示しており、中実（点々）の枠は増大した発現（減少した発現）を有する遺伝子を示す。実線は連結した調節因子による活性化を示し、破線は抑制を示す。ＤｃｕＲについては変動の方向が不明確であり、この調節因子は明灰色で示している。図６Ｂは、フルフラールによる増殖阻害の機構を説明するモデルを示す。フルフラールの添加は、ＮＡＤＰＨについての基本的生合成反応と競合する２つのＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼ（ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡ）を誘導する。硫酸塩の同化はシステイン当たり４つのＮＡＤＰＨを必要とする。二次的な結果は、ストリンジェント因子ＳＦ並びに生合成調節因子ＡｒｇＲ、ＰｕｒＲ及びＲｕｔＲの変動によって証明されるように、含硫アミノ酸の枯渇と、停止した翻訳及び多くの非含硫ビルディングブロック中間体の蓄積から、より一般的なストレス応答への事象のカスケードとを含む。
【図７】図７は、ヒスチジン経路におけるｈｉｓＧ以外の遺伝子のフルフラール添加による発現増大を示す。変化の割合を括弧内に示す。略語：ＡＣＲ、アミノイミダゾールカルボキサミドリボヌクレオチド。
【図８】図８は、硫黄のシステイン及びメチオニンへの同化に関与する遺伝子のフルフラールによる発現増大を示す。比較のためにアスパラギン酸からのトレオニン及びイソロイシンの合成のための経路を含める。１．５倍又はそれ以上上方調節された遺伝子をプラスの記号で示す。１．５倍又はそれ以上下方調節された遺伝子をマイナスの記号で示す。その他はすべてプラス又はマイナス記号のない黒字で示している。
【図９】図９は、１ｇ／ｌフルフラールの存在下での増殖への培地添加物の影響を示す。４８時間の培養後に培養物を比較する（ＡＭ１培地、５０ｇ／ｌキシロース、３７℃）。図９Ａは個々のアミノ酸（各々０．１ｍＭ）の添加を示す。図９Ｂはアミノ酸（各々０．５ｍＭ）の添加を示す。図９Ｃはシステインの添加を示す。図９Ｄは代替硫黄源の添加を示す。
【図１０】図１０は、表１であり、細菌株、プラスミド及びプライマを示す。
【図１１】図１１は、表２であり、機能群によって分類した、０．５ｇ／ｌフルフラールでの処理に対するＬＹ１８０の応答が２倍より大きく変動した遺伝子を示す。
【図１２】図１２は、表３であり、フルフラール（０．５ｇ／ｌ）の添加に応答して５倍又はそれ以上の発現比の変化が生じた遺伝子を示す。これらの遺伝子の一部は、対照実験で水の添加に対する応答も２倍より大きく変化した（星印で示している）。
【図１３】図１３は、表４であり、ＮＣＡによって決定したとき、ヌル分布に比してＬＹ１８０のフルフラール応答が有意に（Ｐ＜０．０５）変動した調節因子を示す。
【図１４】図１４は、嫌気的増殖及び発酵への５−ＨＭＦの効果である。キシロース（１００ｇ／ｌキシロース）を添加したＡＭ１無機塩培地で細胞を増殖させた。Ａ．１．０ｇ／ ｌの５−ＨＭＦで増殖中の細胞質量；Ｂ．１．０ｇ／ｌの５−ＨＭＦで発酵中のエタノール生産；Ｃ．発酵中の５−ＨＭＦ（１．０ｇ／ｌ）の還元；Ｄ．２．５ｇ／ｌの５−ＨＭＦで増殖中の細胞質量；Ｅ．２．５ｇ／ｌの５−ＨＭＦで発酵中のエタノール生産；Ｆ．発酵中の５−ＨＭＦ（２．５ｇ／ｌ ５−ＨＭＦ）の還元。比較のために５−ＨＭＦなしでの並行発酵をＡ及びＢに含めている（破線）。すべてのデータは標準偏差と共に平均値としてプロットしている（ｎ＝３）。すべてについての記号：□、ＬＹ１８０；及び●、ＥＭＦＲ９。
【図１５】図１５は、５−ＨＭＦのインビトロでの還元及び５−ＨＭＦ耐性へのＹｑｈＤ及びＤｋｇＡの効果。Ａ．インビトロでの５−ＨＭＦ還元に対する比活性。溶解細胞抽出物（２ｍＭのＮＡＤＰＨ、２０ｍＭの５−ＨＭＦ）において活性を測定した。Ｂ．ＥＭＦＲ９（耐性変異株）の細胞収率へのプラスミドからのｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ発現の影響。実験は、５０ｇ／ｌのキシロース及び１．０ｇ／ｌの５−ＨＭＦを含むＡＭ１培地での試験管培養物において実施した（４８時間培養）。プラスミドの維持のためにカナマイシンを含めることは５−ＨＭＦ耐性を減少することに留意されたい。誘導株（Ｉｎｄ.）は０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して増殖させた。Ｃ．ＬＹ１８０（親株）の細胞収率へのｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ欠失の影響。実験は、５０ｇ／ｌのキシロース及び２．５ｇ／ｌの５−ＨＭＦを含むＡＭ１培地での試験管培養物において実施した（４８時間培養）。すべてのデータは標準偏差と共に平均値としてプロットしている（ｎ＝４）。
【図１６】図１６は、５−ＨＭＦ耐性へのプラスミドからのｐｎｔＡＢ発現の影響。実験は、指示されているように５０ｇ／ｌのキシロース及び５−ＨＭＦを含むＡＭ１培地でＢｉｏｓｃｒｅｅｎ Ｃ増殖曲線分析器を使用して実施した。すべてのデータは標準偏差とと共に平均値としてプロットしている（ｎ＝１０）。明瞭さのために連結点は省略した。Ａ．添加物なし；Ｂ．０．９ｇ／ｌの５−ＨＭＦを添加；及びＣ．１．８ｇ／ｌの５−ＨＭＦを添加。すべてについての記号：△、ＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ−対照）；○、非誘導ＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ）；●、０．０１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ）。
【図１７】図１７は、ＬＹ１８０の５−ＨＭＦ耐性へのＬ−システインの効果。実験は、５０ｇ／ｌのキシロース及び５−ＨＭＦを含むＡＭ１培地での試験管培養物において実施した（２４時間培養）。培養物に、指示されているようにろ過滅菌したＬ−システインを添加した。すべてのデータは標準偏差と共に平均値としてプロットしている（ｎ＝４）。Ａ．１．０ｇ／ｌの５−ＨＭＦ；Ｂ．２．０ｇ／ｌの５−ＨＭＦ。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（Ｉ．定義）
本明細書で使用される、「単離された」は、他の細菌による汚染がないことを意味する。単離された細菌は、その単離細菌の特性及び機能を妨げない少量の他の細菌の存在下で存在し得る。単離された細菌は、一般に少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％純粋である。好ましくは、本発明による単離された細菌は少なくとも９８％又は少なくとも９９％純粋である。
【００３９】
本明細書で使用される、「細菌」は、「非組換え細菌」、「組換え細菌」及び「突然変異細菌」を含む。
【００４０】
本明細書で使用される、「非組換え細菌」は、異種ポリヌクレオチド配列を含まず、本発明の組成物及び方法を用いたさらなる修飾に適する、例えば遺伝子操作、例えば異種ポリヌクレオチド配列を組み込むことができる、例えばトランスフェクトすることができる、細菌細胞を含む。この用語は、最初にトランスフェクトされた細胞の子孫を包含することが意図されている。特定の実施形態では、細胞はグラム陰性細菌細胞及びグラム陽性細菌細胞である。
【００４１】
細菌に関して本明細書で使用される「組換え体」は、遺伝子操作に適する若しくは遺伝子操作に供される、又は異種ポリヌクレオチド配列が組み込まれている、又は天然ポリヌクレオチド配列が変異若しくは欠失するように処理された細菌細胞を意味する。
【００４２】
細菌に関して本明細書で使用される「突然変異体」は、本明細書中以下で定義される参照細菌と同一ではない細菌細胞を意味する。
【００４３】
「突然変異」細菌は「組換え」細菌を含む。
【００４４】
本明細書で使用される、「エタノール生産性」は、炭水化物から主発酵生成物としてエタノールを生産する細菌の能力を意味する。この用語は、天然に生じるエタノール生産性生物及び天然に生じた又は誘導された突然変異を有するエタノール生産性生物を包含することが意図されている。
【００４５】
「非エタノール生産性」という用語は、細菌が炭水化物から主発酵生成物としてエタノールを生産することができないことを意味する。この用語は、総非ガス発酵生成物の４０％未満を含有している微量発酵生成物としてエタノールを生産する微生物を包含することが意図されている。
【００４６】
本明細書で使用される「エタノール生産」は、炭水化物からの主発酵生成物としてのエタノールの生産を意味する。
【００４７】
本明細書で使用される「エタノールを生産することができる」は、本明細書で定義されるように「エタノール生産」できることを意味する。
【００４８】
「発酵する」及び「発酵」という用語は、複合糖類の分解又は解重合並びにその糖残基のエタノール、酢酸エステル及びコハク酸エステルへの生物変換を意味する。これらの用語は、エタノールが炭水化物から生産される、特に発酵の主生成物として生産される酵素的過程（例えば細胞又は無細胞の、例えば溶解生成物又は精製ポリペプチド混合物の）を包含することが意図されている。
【００４９】
「主発酵生成物」及び「主要発酵生成物」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、総非ガス生成物の約５０％より多くを含有している非ガス性の発酵生成物を包含することが意図されている。主発酵生成物は最も大量の非ガス生成物である。本発明のある特定の実施形態では、主発酵生成物はエタノールである。
【００５０】
本明細書で使用される「微量発酵生成物」という用語は、総非ガス生成物の４０％未満を含有する非ガス性の発酵生成物を包含することが意図されている。本発明のある実施形態では、微量発酵生成物はエタノールである。
【００５１】
「同時糖化発酵」又は「ＳＳＦ」という用語は、複合糖の同時分解又は解重合及び発酵によるその糖残基のエタノールへの生物変換反応のための１又はそれ以上の組換え宿主（又は、精製又は非精製抽出物を含む、その抽出物）の使用を包含することが意図されている。ＳＳＦは、バイオマスを、細菌によって最終的にエタノールに変換可能な多糖類に分解するために使用できる周知の工程である。天然で起こる場合のバイオマスの分解を反映して、ＳＳＦは、リグノセルロースなどの糖源を、最終的にエタノールに変換できる単糖類に分解するためにエタノール生産性細菌（又はそれに由来する酵素）の活性と真菌（又は真菌から抽出されたセルラーゼなどの酵素）の活性を組み合わせる。ＳＳＦ反応は、典型的には、高価な真菌酵素の使用を最適化するために酸性ｐＨで実施される。
【００５２】
「糖」という用語は、糖分子(複数も)を含む何れの炭水化物源もを包含することが意図されている。そのような糖は、本発明の生成物及び方法による、解重合（所望により）並びにその後の発酵によるアセトアルデヒドへの及びその後のエタノールへの生物変換のための糖類の可能性のある供給源である。糖の供給源は、大部分の植物における燃料貯蔵の主要形態であるデンプン、植物の堅い細胞壁並びに繊維性及び木質組織の主たる細胞外構造成分であるヘミセルロース及びセルロースを含む。この用語は、単糖（simple sugars）とも呼ばれる単糖類（monosaccharides）、オリゴ糖類及び多糖類を包含することが意図されている。ある特定の実施形態では、糖は、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びラクトースを含む。他の実施形態では、糖はグルコースである。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ＰｎｔＡＢ」は、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを意味する。ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢとしても知られるｐｎｔＡＢは、ＰｎｔＡＢトランスヒドロゲナーゼに対応する遺伝子を指し、一方ＰｎｔＡＢという用語はｐｎｔＡＢ遺伝子の産物を示す。
【００５４】
ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子に対応するアミノ酸配列及び核酸配列をそれぞれ図４Ａ〜４Ｂ及び図５Ａ〜５Ｂに示す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ＳｔｈＡ」は、細胞質トランスヒドロゲナーゼを意味する。ｓｔｈＡはＳｔｈＡトランスヒドロゲナーゼに対応する遺伝子を指し、一方ＳｔｈＡという用語はｓｔｈＡ遺伝子の産物を示す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「突然変異核酸分子」又は「突然変異遺伝子」は、そのポリペプチド又は変異株によってコードされ得るポリペプチドがそのポリペプチド又は野生型核酸分子若しくは遺伝子によってコードされるポリペプチドとは異なる活性又は特性を示すように、少なくとも１つの変化（例えば置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子又は遺伝子を包含することが意図されている。
【００５７】
核酸分子又は遺伝子に関して本明細書で用いられる「突然変異」は、核酸若しくは遺伝子の変化、挿入若しくは欠失、又は核酸若しくは遺伝子の発現レベルの増大若しくは減少を意味し、発現の増大又は減少は、それぞれ、核酸分子又は遺伝子によってコードされ得るポリペプチドの発現の増大又は減少を生じさせる。突然変異はまた、そのポリペプチド又はその変異株によってコードされ得るポリペプチドがそのポリペプチド又は野生型核酸分子若しくは遺伝子によってコードされるポリペプチドとは異なる活性又は特性を示すように、少なくとも１つの変化（例えば置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子又は遺伝子を意味する。
【００５８】
本明細書で使用される、「突然変異タンパク質」又は「突然変異タンパク質又はアミノ酸配列」は、ポリペプチド又は突然変異アミノ酸配列によってコードされ得るポリペプチドがそのポリペプチド又は野生型アミノ酸配列によってコードされるポリペプチドとは異なる活性又は特性を示すように、少なくとも１つの変化（例えば置換、挿入、欠失）を含むアミノ酸配列を包含することが意図されている。
【００５９】
タンパク質又はアミノ酸配列に関して本明細書で使用される、「突然変異」は、アミノ酸配列のアミノ酸の変化、挿入若しくは欠失、又はアミノ酸配列の発現レベルの増大若しくは減少を意味し、発現の増大又は減少は、アミノ酸配列によってコードされ得るポリペプチドの発現の増大又は減少を生じさせる。突然変異はまた、そのポリペプチド又は変異株によってコードされ得るポリペプチドがそのポリペプチド又は野生型アミノ酸配列によってコードされるポリペプチドとは異なる活性又は特性を示すように、少なくとも１つの変化（例えば置換、挿入、欠失）を含むアミノ酸配列を有するタンパク質又はアミノ酸配列を意味する。
【００６０】
本明細書で使用される「断片」又は「サブ配列」は、親若しくは参照核酸配列若しくはアミノ酸配列の一部、又は親若しくは参照配列、ポリペプチド若しくは遺伝子の生物学的機能又は特性をコードするか又は保持する、ポリペプチド若しくは遺伝子の一部を包含することが意図されている。
【００６１】
「突然変異」細菌は、本明細書中上記で定義した「突然変異」を含む細菌を包含する。
【００６２】
本明細書で使用される「参照物」又は「参照細菌」は、少なくとも、野生型細菌及び親細菌を包含する。
【００６３】
本明細書で使用される「野生型」は、生物又は菌株の典型的な形態、例えば突然突然変異の不在下で天然に生じる細菌、遺伝子又は特徴を意味する。「野生型」は、天然集団における最も一般的な表現型を示す。野生型は、遺伝子型及び表現型についての参照物の標準である。
【００６４】
本明細書で使用される「親」又は「親細菌」は、目的の細菌を生じる細菌を示す。
【００６５】
本明細書で使用される「遺伝子」は、酵素又は他のポリペプチド分子の合成を誘導できる、例えばコード配列、例えばポリペプチド、そのサブ配列をコードする隣接するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る、又は生物においてそれ自体が機能性であり得る核酸である。生物中の遺伝子は、本明細書で定義されるオペロンにクラスター化することができ、オペロンは遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから切り離されている。オペロン内に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間の遺伝子間ＤＮＡなしでオーバーラップし得る。加えて、「遺伝子」という用語は、選択された目的のための特定遺伝子を包含することが意図されている。遺伝子は、宿主細胞にとって内因性であり得るか又は、例えばエピソームに保持されたプラスミド若しくはゲノムに安定に組み込まれたプラスミド（若しくはその断片）として、宿主細胞に組換え導入され得る。異種遺伝子は、細胞に導入される、その細胞にとって天然ではない遺伝子である。
【００６６】
「核酸」という用語は、ポリペプチド、そのサブ配列をコードするオープンリーディングフレームを含み、非コード調節配列及びイントロンをさらに含み得る核酸分子、例えばポリヌクレオチドを包含することが意図されている。加えて、この用語は、機能的遺伝子座に位置づけられる１つ又はそれ以上の遺伝子を包含することが意図されている。加えて、この用語は、選択された目的のための特定遺伝子を包含することが意図されている。一実施形態では、遺伝子という用語は、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢを含むがこれらに限定されない、トランスヒドロゲナーゼをコードする任意の遺伝子を包含する。一実施形態では、遺伝子又はポリヌクレオチドセグメントは、炭水化物のエタノールへの生物変換反応における少なくとも１つの工程に関与する。生物中の遺伝子は、本明細書で定義されるオペロンにクラスター化することができ、オペロンは遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから切り離されている。
【００６７】
本明細書で使用される「増加している」又は「増加する」又は「増加した」は、例えば、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現増加を有する細菌において、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも５％、例えば５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００％又はそれ以上増加していることを示す。
【００６８】
本明細書で使用される「増加している」又は「増加する」又は「増加した」はまた、例えば、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現増加を有する細菌において、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１倍、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍又はそれ以上の増加を意味する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「減少している」又は「減少する」又は「減少した」は、例えば、参照細菌と比較して、細菌におけるｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現レベルの減少と比較して、少なくとも５％、例えば５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９又は１００％減少していることを示す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「減少している」又は「減少する」又は「減少した」はまた、例えば、参照細菌と比較して、細菌におけるｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１倍、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍又はそれ以上の減少を意味する。
【００７１】
「減少した」又は「縮小した」も、活性、発現等の検出可能なレベルが存在しない、例えばｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現の検出可能なレベルが存在しない又はＰｎｔＡ及びＰｎｔＢタンパク質の検出可能な活性が存在しないように排除されていることを意味する。
【００７２】
本明細書で使用される「活性」は、遺伝子の活性、例えば遺伝子の転写のレベルを示す。「活性」はまた、ｍＲＮＡの活性、例えばｍＲＮＡの翻訳のレベルを示す。「活性」はまた、タンパク質、例えばＰｎｔＡ及びＰｎｔＢの活性を示す。
【００７３】
「活性の増大」は、活性の速度及び／又はレベルの増大を含む。
【００７４】
本明細書で使用される「ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢの発現」におけるような「発現」は、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子のタンパク質産物の発現を示す。本明細書で使用される場合、「ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢの発現」におけるような「発現」はまた、ｐｎｔＡ及び／又はｐｎｔＢ遺伝子に対応するｍＲＮＡ転写産物の検出可能なレベルの発現を示す。
【００７５】
発現レベルに関連して「変化している」は、目的とする遺伝子、ｍＲＮＡ又はタンパク質、例えばｐｎｔＡ及び／又はｐｎｔＢ遺伝子の発現が減少していることを意味する。
【００７６】
本明細書で使用される「発現されない」は、目的とする遺伝子又はｍＲＮＡ、例えばｐｎｔＡ及び／又はｐｎｔＢ遺伝子の産物の検出可能なレベルが存在しないことを意味する。
【００７７】
本明細書で使用される「排除する」は、検出不能なレベルへの減少を意味する。
【００７８】
本明細書で使用される「フルフラールの耐性」は、フルフラールの存在下で、例えば０．１ｇ／ｌ又はそれ以上（例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０ｇ／ｌ又はそれ以上）の濃度のフルフラールの存在下で増殖するか又はエタノールを生産する、エタノール生産性細菌の能力を意味する。フルフラールの耐性はまた、野生型細菌又は親細菌による増殖又はエタノール生産のレベルと比較して増大しているレベルで、フルフラールの存在下で増殖するか又はエタノールを生産するエタノール生産性細胞の能力を意味する。
【００７９】
本明細書で使用されるフルフラールの存在に適用されるときの「の存在下で」は、少なくとも０．１ｇ／ｌ又はそれ以上（例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０ｇ／ｌ又はそれ以上）のフルフラールの存在下に細菌を保持することを意味する。
【００８０】
本明細書で使用されるフルフラールの不在に適用されるときの「の不在下で」は、検出可能でないレベルを含む、０．１ｇ／ｌ又はそれ以下のフルフラールを含有する培地中に細菌を保持することを意味する。
【００８１】
本明細書で使用される「増殖」は、経時的な細胞の数又は質量の、本明細書で定義される増大を意味する。
【００８２】
本明細書で使用される「ヘミセルロース加水分解物」は、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス又はセルロースバイオマスに由来する加水分解物を含むが、これに限定されない。
【００８３】
本明細書で使用される「に由来する」は、それを起源とすることを意味する。
【００８４】
「グラム陰性細菌細胞」という用語は、当該技術分野で広く認められているこの用語の定義を包含することが意図されている。例示的なグラム陰性細菌は、アシネトバクター属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、エシェリキア属、ジオバクター属、シュワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属を含む。
【００８５】
「グラム陽性細菌」という用語は、当該技術分野で広く認められているこの用語の定義を包含することが意図されている。例示的なグラム陽性細菌は、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、乳酸杆菌属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、連鎖球菌属及びユーバクテリウム属を含む。
【００８６】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質において通常生じる２０のα−アミノ酸を包含することが意図されている。塩基性荷電アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びリシンを含む。中性荷電アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを含む。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。
【００８７】
本明細書で使用される「選択すること」は、同定された細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産することを確認する工程を示す。
【００８８】
本明細書で使用される「同定すること」は、細菌を評価し、その細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産することを確認する工程を示す。
【００８９】
本明細書で使用される「フルフラールの濃度を増大すること」は、０〜５ｇ／ｌの増加、例えば１μｇ／ｌの増加、１ｍｇ／ｌの増加又は１ｇ／ｌの増加を意味する。
【００９０】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法においてそれらに帰せられている制約のない意味を有し、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味する。
【００９１】
本明細書で使用される「トランスヒドロゲナーゼ」という用語は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補因子ＮＡＤ（Ｈ）とＮＡＤＰ（Ｈ）の間の還元性等価物の相互変換を触媒する酵素を示す。
【００９２】
本明細書で使用される「トランスヒドロゲナーゼ遺伝子」という用語は、その産物がトランスヒドロゲナーゼである遺伝子を示す。
【００９３】
本明細書で使用される「５−ヒドロキシメチルフルフラール」又は「５−ＨＭＦ」という用語は、構造：
【００９４】
【化１】
2012526552.tif 000002
【００９５】
を有する糖類の脱水に由来する有機化合物を意味することが意図されている。
【００９６】
ＩＩ．細菌
本発明は、エタノールの形成のために糖類を分解するのに適した細菌に関する。この細菌は、特にフルフラール及び／又は５−ＨＭＦを含む培地において、改善されたエタノール生産能力を有する。改善されたエタノール生産の能力は、糖消化及び発酵の間のフルフラール及び／又は５−ＨＭＦに対する細胞の耐性を増大するトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の選択された増大した発現に関連する。
【００９７】
従って、本発明は、参照細菌と比較して少なくとも１つのトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の増大した発現を有するエタノール生産性細菌を提供する。本発明の１つの態様では、細菌は単離された細菌である。本発明の別の態様では、細菌は組換え細菌である。本発明のさらに別の態様では、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子はｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子を含む。
【００９８】
本発明はまた、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の増大した発現を有する単離された細菌又は組換え細菌を提供する。本発明の１つの態様では、本発明の単離された細菌は野生型細菌を含む。
【００９９】
本発明の細菌はそれらの増大した増殖を特徴とし得る。本発明の細菌は、さらに、増大した濃度のフルフラール及び／又は５−ＨＭＦ中で増殖するそれらの能力を特徴とする。従って、本発明の他の態様では、単離された細菌又は組換え細菌は、参照細菌と比較して増大した増殖、又は参照細菌と比較して増大したフルフラール及び／若しくは５−ＨＭＦ耐性、又は参照細菌と比較してフルフラール及び／若しくは５−ＨＭＦの存在下での増大した増殖、又はフルフラール及び／若しくは５−ＨＭＦの存在下での、例えば約０．０２５％フルフラール〜約０．１５％フルフラールのフルフラール濃度、若しくは約０．０２５％５−ＨＭＦ〜約０．１５％５−ＨＭＦの５−ＨＭＦ濃度での増大した増殖を有する。
【０１００】
本発明の細菌はまた、糖源から主発酵生成物としてエタノールを生産するそれらの能力を特徴とし得る。フルフラール及び５−ＨＭＦは、通常、セルロース消化及びエタノールへの発酵の間エタノール生産性細菌の増殖を阻害するが、本発明の細菌は、高濃度のフルフラール及び／又は５−ＨＭＦ中でエタノールを生産することができる。従って、本発明の他の態様は、エタノール生産性である、又は参照細菌と比較して増大したエタノール生産を示す、又は参照細菌と比較してフルフラール及び／若しくは５−ＨＭＦの存在下で増大したエタノール生産を示す、又は嫌気若しくは微好気条件下で主発酵生成物としてエタノールを生産することができる、又は参照細菌と比較してフルフラール及び／若しくは５−ＨＭＦの存在下で増大した増殖及び増大したエタノール生産を示す細菌を含む。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、参照細菌と比較して加水分解物の存在下で増大した増殖を有する細菌を含む。本発明は、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス又はセルロースバイオマスに由来する加水分解物を含むがこれに限定されない様々な加水分解物を提供する。
【０１０２】
参照細菌と。例えば、プロモータを、異なるプロモータによるプロモータの置換、あるいは、例えば核酸を挿入する、置換する、重複させる若しくは除去することによる又はプロモータにおいて調節エレメント若しくはモチーフを挿入する、置換する、重複させる若しくは除去することによるプロモータの修飾を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で一般に認められている方法によって変化させる。従って、本発明の1つの態様では、本発明のｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子などのトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を、参照細菌と比較して遺伝子発現を調節するプロモータを修飾する又は付加することを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の方法によって増大させる。
【０１０３】
本発明は、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子を参照細菌と比較して異なる調節タンパク質の制御下に置くか又は付加的な調節タンパク質の制御下に置くことを含むがこれに限定されない、当該技術分野で公知の方法によって、ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の調節を変化させる方法を提供する。一実施形態では、調節タンパク質は抑制因子である。選択的な実施形態では、調節タンパク質は誘導因子である。
【０１０４】
本発明の細菌は、非組換え又は組換えでよい。本発明の細菌は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌から成る群より選択され、グラム陰性細菌は、アシネトバクター属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、エシェリキア属、ジオバクター属、シュワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属から成る群より選択され、そしてグラム陽性細菌は、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、乳酸杆菌属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、連鎖球菌属及びユーバクテリウム属から成る群より選択される。一態様では、本発明の細菌は大腸菌であり、別の態様では、本発明の細菌はクレブシエラ・オキシトカである。
【０１０５】
本発明の細菌のｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子などの増大したトランスヒドロゲナーゼ遺伝子に関連するタンパク質活性を増大又は変化できることは当業者に理解される。例えば、遺伝子産物中のアミノ酸を、天然に生じる遺伝子産物と比較して遺伝子産物の機能に実質的な影響を及ぼさずにある程度まで置換するか、付加するか又は欠失させることができる。従って、本発明はまた、ＰｎｔＡ及びＰｎｔＢタンパク質の活性が参照細菌と比較して増大している又は変化している、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。一実施形態では、そのような細菌は、参照細菌と比較して増大したフルフラール及び／又は５−ＨＭＦ耐性を有する。
【０１０６】
本発明は、上記で論じたように、例えばｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子などのトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の増大した又は変化した発現を有して、増大した濃度のフルフラール中で増殖し続けることができる細菌を提供する。従って、本発明はさらに、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現が増大又は変化しており、且つ参照細菌と比較して増大したフルフラール及び／又は５−ＨＭＦ耐性を有する、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。発現は、ｐｎｔＡ又はｐｎｔＢ遺伝子の修飾（例えば、遺伝子をコードする配列において核酸又はアミノ酸を挿入するか、置換するか又は除去することによる）を含むがこれに限定されない、当該技術分野で公知の方法によって増大させるか又は変化させる。
【０１０７】
本発明はまた、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現又はＰｎｔＡ及びＰｎｔＢポリペプチドの活性が増大しており、参照細菌と比較してフルフラール及び／又は５−ＨＭＦ耐性が高く、エタノールを生産することができ、並びに（ａ）細菌の候補株をフルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下で増殖させること；及び（ｂ）フルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下でエタノールを生産する細菌を選択することを含む工程によって調製される、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
【０１０８】
本発明はさらに、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下でのエタノール生産のために糖類を発酵させるのに適した微生物を提供する。従って、本発明は、微生物にとって内因性であるか又は、例えばエピソームに保持されたプラスミド若しくはゲノムに安定に組み込まれたプラスミド（若しくはそのフラグメント）として微生物に組換え導入されるトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の増大した発現を有する微生物を提供する。
【０１０９】
ＩＩＩ．製造方法
本発明はさらに、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下での、例えば増大したフルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下でのエタノール生産のために糖類を発酵させるのに適した細菌を生産する方法に関する。従って、本発明は、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現又はＰｎｔＡＢポリペプチドの活性が増大しており、参照細菌と比較してフルフラール及び／又は５−ＨＭＦ耐性が増大しており、細菌はエタノールを生産することができ、細菌はフルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下で細菌の候補株を増殖させることと、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下でエタノールを生産する細菌を選択することとを含む工程によって調製される、単離された細菌又は組換え細菌を提供する。
【０１１０】
組換えエタノール生産性微生物を製造する方法は、分子生物学の技術分野において公知である。適切な材料及び方法並びに組換え微生物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２６，１５２号明細書、同第６，８４９，４３４号明細書、同第６，３３３，１８１号明細書、同第５，８２１，０９３号明細書、同第５，４８２，８４６号明細書、同第５，４２４，２０２号明細書、同第５，０２８，５３９号明細書、同第５，０００，０００号明細書、同第５，４８７，９８９号明細書、同第５，５５４，５２０号明細書及び同第５，１６２，５１６号明細書並びに国際公開第ＷＯ２００３／０２５１１７号に記載されており、本発明を実施する際に使用できる。本明細書で述べられている本発明の細菌は、当業者によって日常的に実施され、本願で示す実施例において明らかにされる方法によって製造できる。
【０１１１】
ＩＶ．エタノールを生産するための方法
本発明の細菌は、エタノールの生産のために糖類を分解するのに適している。従って、本発明は、上述した本発明の単離された細菌又は組換え細菌と供給源を接触させ、それによって供給源からエタノールを生産することを含む、供給源からエタノールを生産する方法を提供する。本発明の特定の実施形態では、供給源は、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス若しくはオリゴ糖源、又はそれらの何れかの組合せから成る群より選択できる。
【０１１２】
本発明の細菌は、増大した濃度のフルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下で糖類からエタノールを生産するために使用しできる。従って、本発明は、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下で、供給源を上述した本発明の単離された細菌又は組換え細菌と接触させ、それによって供給源からエタノールを生産することを含む、供給源からエタノールを生産する方法を提供する。本発明の特定の実施形態では、供給源は、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス若しくはオリゴ糖源、又はそれらの何れかの組合せから成る群より選択できる。
【０１１３】
本発明の微生物は、嫌気条件下でのエタノール生産を特徴とする。野生型大腸菌は、嫌気的増殖の間にエタノールと酢酸塩を１：１の割合で生産する。増殖の定常期の間に、野生型大腸菌は主要生成物として乳酸塩を生産し、全発酵生成物中のエタノールの割合は約２０％である。これらのすべての発酵における生成物は様々な酸を含み、それ故混合酸発酵という用語を導く。
【０１１４】
一般的には、産生宿主細胞株の最良増殖速度及び培養物によって生成される酵素のための触媒条件を促進するための最適ｐＨ及び温度を提供する発酵条件が選択される（Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538）。様々な例示的発酵条件が米国特許第５，４８７，９８９号明細書及び同第５，５５４，５２０号明細書に開示されている。非限定的な例として、約２５〜約４０℃の範囲の温度及び約４．５〜８．０の範囲のｐＨを含む条件を選択できる。例えば、この参照により明確に本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４２４，２０２号明細書及び同第５，９１６，７８７号明細書を参照されたい。
【０１１５】
本発明は、トランスヒドロゲナーゼの増大した発現を有する単離された細菌若しくは組換え細菌、又は参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の増大した発現を有する単離された細菌若しくは組換え細菌を提供する。この細菌は、エタノールを生産するため、特に、例えばバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖などの供給源からエタノールを生産するために使用できる。従って、本発明は、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源を本発明の細菌と接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含む、バイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産するための方法を提供する。そのような生産は、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下又は不在下で起こり得る。
【０１１６】
本発明の方法に従って、本明細書で述べられている細菌は、本発明の細菌でセルロースバイオマス又はオリゴ糖源を単糖に分解又は解重合し、それによってオリゴ糖源などのバイオマス、ヘミセルロースバイオマス、リグノセルロースバイオマス、セルロースバイオマスからエタノールを生産する。その後、細菌は、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子の増大した発現によって又は、特にそれらが担持するｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の増大した発現によって、より単純な糖類を発酵によってエタノールへと異化する。同時に起こる、複合糖のより小さな糖残基への解重合とそれに続く発酵のこのプロセスは、同時糖化発酵（ＳＳＦ）と称される。
【０１１７】
現在、リグノセルロースなどの複合糖の変換は非常に複雑な多工程方法である。例えば、リグノセルロースを、最初に酸加水分解を用いて分解又は解重合しなければならない。この後に、固体から液体を分離し、その後これらの生成物を洗浄して、無毒化し、さらに解重合できるセルロースを生じさせて、最後に、適切なエタノール生産性宿主細胞によって発酵させる工程が続く。これに対し、トウモロコシの発酵ははるかに簡単であり、基本的に一工程方法で、エタノール生産性宿主による即時生物変換反応のためにアミラーゼを使用してトウモロコシデンプンを分解することができる。
【０１１８】
本発明の細菌及び方法が、リグノセルロースを発酵させるためのより効率的な工程の使用を提供することは当業者に認識される。例えば、本発明の方法は、酸加水分解を完全に回避する方法を包含することが意図されている。さらに、本発明の微生物は、好都合にも増大した濃度の毒素フルフラールの存在下で糖類を発酵させることができる。
【０１１９】
本発明の１つの利点は、これまで十分に活用されていなかったサッカリド源を使用できることである。その結果として、多くの複合サッカリド基質を、解重合並びに本発明の組換え細菌及び方法を使用したその後の発酵のための出発源として使用することができる。理想的には、再生可能資源をＳＳＦ工程において使用できる。オフィスから出る混合古紙は好ましい基質であり（Brooks et al.,(1995)Biotechnol.Progress.11:619-625；Ingram et al.,(1995)米国特許第５，４２４，２０２号明細書）、酸で前処理したバガス（Doran et al.,(1994)Biotech.Bioeng.44:240-247）又は高度に精製された結晶セルロース（Doran et al.,(1993)Biotechnol.Progress.9:533-538）よりもはるかに容易に消化される。エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの両方のグルカナーゼがセルロース結合ドメインを含み、これらの酵素は、遠心分離を用いて消化されなかったセルロース残基を採取することにより、その後の発酵のために容易に再生利用できる（Brooks et al.,(1995)Biotechnol.Progress.11:619-625）。より高いリグニン含量を有する基質に関しては再生利用工程の数が限られるかもしれないが、そのようなアプローチは精製セルロースに関して良好に機能する。本発明の範囲内である他の基質源は、あらゆる種類の加工又は非加工植物材料、例えば、刈り取った芝、トウモロコシの皮、トウモロコシの穂軸、葉柄、葉、繊維、パルプ、麻、おがくず、新聞紙等を含む。
【０１２０】
本発明はまた、上述した本発明の単離された細菌又は組換え細菌を含むキットを提供する。このキットは、随意に例えば本明細書で述べる方法及び工程に従ってエタノールを生産するための指示書のような、使用のための指示書を提供する。そのような指示書は、随意に増大した濃度のフルフラール中でエタノールを生産することを記述してもよい。一実施形態では、キットは糖源を含む。
【実施例】
【０１２１】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、それらは限定と解釈されるべきではない。実施例全体を通じて、特に明記されない限り以下の材料及び方法を使用する。
【０１２２】
材料及び方法
ＬＹ１６８株は、ヘミセルロース加水分解物における糖類の発酵に関してこれまでに記述されている。ＬＹ１８０（ＮＲＲＬ Ｂ−５０２３９）を生じさせる基質範囲を改善するためにいくつかの変更を加えた（ラクトース利用の回復、エンドグルカナーゼの組込み及びセロビオース利用の組込み）。これらの菌株についての関連する特徴を以下の表１に示す。表１に示す組込みのために使用した線状フラグメントはＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
【０１２３】
【表１】
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【０１２４】
ＬＹ１８０株をＬＢグルコースアンピシリンプレートで一晩増殖させ、各々を使用してＡＭ１キシロースの試験管に３〜４ＯＤまで接種した。この培養物を直ちに使用して、４ｍＬのＡＭ１ ５％キシロース、アンピシリン及び表示の濃度のフルフラールを含む１３の１００ｍｍの蓋付き試験管に、０．０５の初期ＯＤまで接種した。培養物を３７℃の水浴で増殖させ、２４及び４８時間後にＯＤ ５００ｎｍでの読み取りを行った。
【実施例１】
【０１２５】
ｓｔｈＡは、主としてＮＡＤＰＨ酸化の方向における機能を促進する動力学的特性を備えた細胞質トランスヒドロゲナーゼである（５２）。大腸菌の細胞質トランスヒドロゲナーゼＳｔｈＡ遺伝子をｐＴｒｃ９９ａにクローニングし、配列決定によって確認した。ＬＹ１８０株を、図１Ａ〜１Ｂに示すようにこれらのプラスミドで改変した。クローニングした遺伝子の機能性をインビトロアッセイによって確認した。ＡＭ１、アンピシリン及び５％キシロース中で改変したＬＹ１８０株の増殖を２４時間後及び４８時間後に比較した。光学密度を漸増フルフラール濃度に対してプロットした。空のベクタを対照として使用した。接種の前にインデューサを添加した。
【０１２６】
０．１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導すると、活性が約１．０ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質から１８ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質に増大することが認められた。プラスミドからのｓｔｈＡ遺伝子の発現は、ＩＰＴＧでの誘導の有無に関わらずフルフラール耐性を変化させなかった（図１）。図１Ａ〜１Ｂの結果は、２４時間後（図１Ａ）及び４８時間後（図２Ｂ）に、それぞれ、すべてのＬＹ１８０株がｓｔｈＡ遺伝子の発現レベルに関わりなく漸増フルフラール濃度で実質的に同様の増殖の減少を示したことを明らかにする。ｓｔｈＡ遺伝子の過剰発現はフルフラール耐性に影響を及ぼさないと見られた。
【実施例２】
【０１２７】
ＰｎｔＡＢは、発酵増殖の間機能しないと考えられているプロトン転位トランスヒドロゲナーゼであるが、潜在的にＮＡＤＰＨのプールを増大させることができる（５２）。実施例２及び３では、大腸菌の細胞質トランスヒドロゲナーゼＰｎｔＡＢをｐＴｒｃ９９ａにクローニングし、配列決定によって確認した。天然のリボソーム結合部位及びｒｈｏ依存性ターミネータを有するＰｎｔＡＢを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化可能末端を有するプライマを使用して大腸菌株ＬＹ１８０ゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。ＰＣＲ産物とｐＴｒｃ９９ａをＨｉｎｄＩＩＩ消化し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて精製して、Ｔ４ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。生じたベクタをＴＯＰ１０Ｆ’に形質転換した後、プラスミドを抽出し、ＬＹ１８０を形質転換するために使用した。方向をＰＣＲ分析によって確認した。ＬＹ１８０株を、図２〜３に示すようにこれらのプラスミドで改変した。空のベクタを対照として使用した。接種の前にインデューサを添加した。ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子の発現増大を有するプラスミドを担持するＬＹ１８０株の増殖を比較した（図２Ａ〜２Ｂ）。２４及び４８時間後の光学密度を漸増フルフラール濃度に対してプロットした。２４時間後、０．０５％のフルフラール濃度で、ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ正プラスミドを担持するＬＹ１８０株は、試験したその他の菌株のいずれについても２倍以上の光学細胞密度測定値を示した（図２Ａ）。４８時間後、ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ正プラスミドを担持するＬＹ１８０株は、０．１０％のフルフラール濃度で持続的な細胞増殖を示したが、その他のすべての菌株は実質的に増殖を停止していた（図２Ｂ）。これらの結果は、選択されたｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ過剰発現がフルフラール耐性を増大させることを指示する。
【実施例３】
【０１２８】
様々なレベルのトランスヒドロゲナーゼｓｔｈＡ及びｐｎｔＡＢ遺伝子発現増大を有するプラスミドを担持するＬＹ１８０株の増殖の結果を、それぞれ、２４時間後と４８時間後に０．０５％及び０．１０％フルフラール濃度で比較した（図３Ａ〜３Ｂ）。２４時間後、０．０５％のフルフラール濃度で、ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ正プラスミドを担持するＬＹ１８０株は、試験したその他の菌株のいずれについても約２倍の光学細胞密度を示した（図３Ａ）。４８時間後、０．１０％のフルフラール濃度で、ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ正プラスミドを担持するＬＹ１８０株は、試験したその他の菌株のいずれについても約７倍の光学細胞密度を示し、試験したその他の菌株は、そのようなフルフラール濃度で、あったとしてもごくわずかな増殖を示した。この場合も、これらの結果は、選択されたｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ過剰発現がフルフラール耐性を増大させることを明らかにしている。
【０１２９】
非誘導プラスミドからのｐｎｔＡＢの漏洩発現は、１ｇ／ｌ フルフラールの存在下で部分的に増殖を回復した（図３）。この酵素のより高いレベルを発現させるためにＩＰＴＧを添加すると、フルフラールに対する耐性を排除し、フルフラールの不在下での細胞の増殖も阻害した。これらの結果に基づき、フルフラールは、生合成のために必要なＮＡＤＰＨの供給を枯渇させることによって増殖を阻害する。硫酸塩同化のためにシステイン当たり４当量という大量のＮＡＤＰＨを必要とし、発酵の間のキシロースからのＮＡＤＰＨ生産のための経路が限られていることから、含硫アミノ酸の生産はＮＡＤＰＨに関するフルフラールレダクターゼからの競合を最も受けやすかった。
【実施例４】
【０１３０】
菌株、培地及び増殖条件
エタノール生産性菌株を、固体培地については２０ｇ／ｌキシロースを添加し、発酵実験については５０ｇ／ｌキシロース又はそれ以上を添加したＡＭ１無機塩培地に保持した（２２）。大腸菌株ＬＹ１８０（４８、６０）はＫＯ１１の誘導体であり、この試験のための出発点として使用した。大腸菌Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）は、当初大腸菌Ｂの誘導体であると報告された、ＫＯ１１株の親であることに留意されたい（２９）。
【０１３１】
発酵は、２Ｎ ＫＯＨの自動添加を用いて先に述べられているように（１００ｇ／ｌキシロース、３７℃、１５０ｒｐｍ、ｐＨ６．５）実施した（２３）。
【０１３２】
先に記述されているように、総容量４ｍＬのＡＭ１及び５０ｇ／ｌのろ過滅菌したキシロースを含むスタンディングチューブ中で増殖を測定することによってフルフラール耐性を試験した（４８）。チューブを３７℃で培養し、２４時間後と４８時間後に測定した。報告されている数値は４回の測定の平均である。
【０１３３】
菌株の構築
大腸菌トランスヒドロゲナーゼ遺伝子を、隣接するＨｉｎｄＩＩＩ部位を提供するプライマによりＢｉｏＲａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ（Hercules,CA）を用いてＬＹ１８０株ゲノムＤＮＡから増幅した（リボソーム結合部位、コード領域、及び２００ｂｐのターミネータ領域）（２５）。ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、生成物をＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＴｒｃ９９ａ（ベクタ）に連結し、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Carlsbad,CA）に形質転換した。ＱｉａＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Valencia,CA）を用いてプラスミドを精製した。制限酵素での消化及びポリメラーゼ連鎖反応によって遺伝子の配向性を確認した（図１０の表１）。
【０１３４】
マイクロアレイ分析
培養物を小さな発酵槽で６７０ｍｇ ｄｃｗ／ｌの密度に増殖させた。初期試料を取り出し、対照として使用した。５０ｇ／ｌ保存水溶液から直ちにフルフラールを添加して（最終濃度０．５ｇ／ｌ）、２回目の試料採取の前に１５分間培養を続けた。試料をエタノール−ドライアイス浴中で急速に冷却し、４℃で遠心分離によって採取し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ Ｌａｔｅｒに再懸濁して、−８０℃で保存した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ Ｉで処理して、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって精製した。大腸菌Ｋ１２のために設計されたプローブを使用したマイクロアレイ比較のために、ＲＮＡをＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Madison,WI）に送付した。各々の試料は、４つの発酵槽からのプールされた材料から成っていた。完全な実験を２回実施して、データを平均した（８つの発酵槽）。ＡｒｒａｙＳｔａｒ（DNA Star,Madison,WI）及びＳｉｍＰｈｅｎｙソフトウエア（Genomatica Inc.,San Diego,CA）を使用してデータを解析した。発現比を２つのプールされたデータセットの平均として提示する。対照として水だけを添加した実験では、５４の遺伝子（＞トランスクリプトームの２％）が水の添加後に２倍より大きく変化することが認められた。これらのうち８つだけがフルフラール添加によって影響を受け、フルフラール送達手順の転写への影響がフルフラールの作用に比べて無視し得るものであることを指示した。
【０１３５】
ネットワーク成分解析
ネットワーク成分解析（Network Component Analysis；ＮＣＡ）は、発現比及び公知の調節関係から転写因子活性比を計算するものであり、これを先に記述されているように実施した（４５、４６、５６）。関連性ファイルをＲｅｇｕｌｏｎ  ＤＢ及びＥｃｏＣｙｃ（４、１４）に従って更新した。「緊縮調節因子」のレギュロンを、ＭＯＰＳグルコース中のＢＷ２５１１３の中間対数増殖の間のセリンヒドロキサメート処理によるセリン飢餓に対する５分間応答の分析により、先に記述されているように定義した（１２）。有意に変化した調節活性を有する調節因子を、ヌル分布との比較によって及び０．０５のＰ値カットオフを使用して同定した。
【０１３６】
フルフラールのトランスクリプトーム効果
活発に増殖している細胞において０．５ｇ／ｌフルフラールの添加前と添加の１５分後にメッセージレベルを比較した。水対照も比較のために含めた。小さな群の遺伝子の発現がフルフラールに応答して５倍より大きく変化していることが認められた（図１２の表３）。よりストリンジェントでない測定基準（２倍又はそれ以上）を使用すると、約４００の遺伝子（トランスクリプトームの１０％）についての発現レベルが、水対照又はフルフラール添加前の培養物と比較して、フルフラール添加に応答して変化した。これらの変化した遺伝子の分布は機能群の間で大きく異なっており、フルフラールの作用機構に関する有用な洞察を提供した（図１１の表２）。大部分の機能群では、遺伝子成員の１０％未満の発現レベルが２倍又はそれ以上変化した。この低頻度の変化を有する群は、補因子、炭素化合物、調節、高分子合成（細胞構造、ＤＮＡ、脂質、転写及び翻訳）、及びその他（ファージ、推定上／ＩＳ、調節及び未分類／不明）を含んだ。４つの群（細胞プロセス、中枢代謝、エネルギー及び輸送）では成員遺伝子の１０％〜２０％についての発現レベルが変化した。中枢代謝、エネルギー及び輸送に関連する、影響を受けた遺伝子の大部分は、フルフラール添加時に発現が増大した。これらの変化は、利用可能であり得る付加的な化合物を捕捉し、代謝する、及びエネルギー産生のための炭素流を増大させる機会を提供する。細胞プロセスに関係する変化した遺伝子の多くは運動性及び化学走性に関与するが、ＬＹ１８０株は非運動性である（データは示していない）。
【０１３７】
以前の報告（４８）と一致して、フルフラールのＮＡＤＰＨ特異的還元を触媒することができる２つのオキシドレダクターゼ、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡは、先に報告されているように、フルフラールの添加によって親において５倍以上上方調節された（ｍＲＮＡ）。これら２つの遺伝子はフルフラール耐性変異株（ＥＭＦＲ９）では沈黙化し、フルフラール耐性の増大を生じさせた。
【０１３８】
２つの機能群における成員遺伝子の２０％以上についての発現レベルが、フルフラール、アミノ酸及びヌクレオチドの添加によって変化した。これらの群では、変化した遺伝子の２／３以上が、フルフラールの添加によって２倍又はそれ以上低減した。プリン、ピリミジン及びあらゆるファミリーのアミノ酸の生合成に影響を及ぼす個々の遺伝子についての発現レベルは、フルフラールの添加によって２倍又はそれ以上低減した。ヌクレオチド代謝における１個の遺伝子及びアミノ酸代謝に関与する８個の遺伝子だけが、少なくとも２倍のフルフラール依存性発現増大を示した。合わせて考慮すると、これらの変化は、フルフラールの添加時に観察される生合成及び増殖の全般的な減少と一致する。
【０１３９】
調節活性へのフルフラールの効果
フルフラールに対する細胞応答の全体的見解を提供するためにネットワーク成分解析（ＮＣＡ）を用いた。この解析は、トランスクリプトームデータから、摂動活性を有する調節因子を同定するために公知の調節ネットワーク構造を利用する（４６、５６）。この解析に含まれた６０の調節因子のうちで、２２がフルフラール負荷後に有意に変化した発現を有すると同定され、有意性はランダムネットワークに対して評価した（図６Ａ）。システイン及びメチオニン生合成の調節因子（ＣｙｓＢ及びＭｅｔＪ）並びにアミノ酸のリプレッサ（ＡｒｇＲ）及びヌクレオチド生合成のリプレッサ（ＰｕｒＲ）は、フルフラール添加によって有意に影響された。緊縮応答（アミノ酸及び炭素飢餓の間、資源を増殖から転用すること）の集合的なインジケータである緊縮調節因子も、停滞した生合成及び多くの中間体の過剰と一致する活性化を示す。合わせて考慮すると、これらの結果は、多くのアミノ酸及び生合成中間体のプールがフルフラール添加によって変化していたことを示す。システイン及びメチオニン生合成に関与する遺伝子の発現は増大したが、大部分の他の生合成経路の発現減少したという事実は、フルフラール負荷から生じる初期事象としてのシステイン及びメチオニンプールの枯渇と一致する。
【０１４０】
一般的なストレス応答についてのシグナルとして働くσ因子、ＲｐｏＳもフルフラールの添加によって影響され、細胞がストレス誘導物質の存在を認識することを示した。大腸菌ゲノムの１０％までが何らかの方法でＲｐｏＳによって調節されるので（５１、５９）、特異的阻害応答を決定することは困難である。発現増大を有するＲｐｏＳ調節性遺伝子の例は、ｐｏｘＢ（ピルビン酸塩の酢酸塩とＣＯ２への変換）（６４）及びｏｔｓＡ（浸透圧ストレス応答の間のトレハロース産生）（５５）を含む。
【０１４１】
中枢代謝における数多くの遺伝子（ａｃｅＢ、ａｃｅＥ、ｓｄｈＣ、ｄｃｔＡ、ｃｙｏＡ、ｆｕｍＡ）の発現増大及び嫌気条件下で活性であることが一般に知られている遺伝子、ｆｕｍＢの下方調節によって証明されたように、ＡｒｃＡはＮＣＡによって有意に下方調節された。フルフラール耐性へのグリセロール添加の影響を検討した。しかし、グリセロール（１．０〜２０ｇ／ｌ）の添加はフルフラール耐性に影響を及ぼさなかった（データは含めていない）。ｆｉｓ及びｃｒｐを含むいくつかの他の調節因子は、ＮＣＡによって有意に変化することが認められた。
【０１４２】
ヒスチジンもフルフラールの添加によって制限され得る。Ｈｉｓ調節因子（ヒスチジニル−ｔＲＮＡ）の制御下の遺伝子（ｈｉｓＡ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＦ、ｈｉｓＨ及びｈｉｓＩ）は、フルフラールの添加後、２倍未満であるが、一般に増大した（図７）。ヒスチジン生合成の２つの最終工程は、発酵に関連する高いＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比によって減速できる反応である、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元を含む。
【０１４３】
硫黄のアミノ酸への同化に関与する遺伝子の発現へのフルフラールの効果
硫黄のシステイン及びメチオニンへの同化に関与する多くの遺伝子（ｃｙｓＣ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＮ、ｃｙｓＱ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＬ、ｓｂｐ、ｔａｕＡ、ｔａｕＢ、ｔａｕＣ及びｔａｕＤ）は２倍又はそれ以上増大した。これらはいくつかの機能群内に散らばっている（図１１の表２）：アミノ酸、中枢代謝、調節及び輸送。硫黄の同化に関与する多くの付加的な遺伝子も２倍未満上方調節されて、幅広いフルフラール応答を明らかにするために含めている（図８）。硫黄はＡＭ１培地中で硫酸塩として供給され、４分子のＮＡＤＰＨを必要とするエネルギー消費型反応である、組込みのために硫化水素のレベルに還元されねばならない。これらの遺伝子の発現のフルフラール誘導性増大は、アミノ酸、プリン及びピリミジンの生合成に関与する多くの他の遺伝子について認められる減少とは著しい対照を成している（図１１の表２）。タウリン輸送遺伝子（ｔａｕＡＢＣＤ；硫黄の選択的供給源）、硫酸塩結合性輸送タンパク質（ｓｂｐ）、及び多くのシステイン生合成遺伝子の転写活性化因子（ｃｂｌ）の発現は、添加されたフルフラールに応答して５倍を超えて増大した（図１２の表３）。合わせて考慮すると、これらの結果は、フルフラールの添加が、この経路における高いＮＡＤＰＨ必要量に関連した含硫アミノ酸（システイン及びメチオニン）の細胞内欠乏を生じさせることを明らかにしている。
【０１４４】
フルフラール耐性へのアミノ酸添加物の影響
２０アミノ酸すべてを、ＡＭ１無機塩培地におけるＬＹ１８０の増殖を改善するそれらの能力に関して個別に試験した（図９Ａ）。個々のアミノ酸の細胞含量におおよそ基づいて０．１ｍＭの濃度を選択した（５０）。５つのアミノ酸だけが、この低濃度で供給した場合にフルフラール耐性を改善した：システイン＞メチオニン＞セリン、アルギニン＞ヒスチジン。２つの含硫アミノ酸は、フルフラール耐性のために明らかに最も有益であった。５倍高い濃度（０．５ｍＭ）で供給した場合は、すべてのアミノ酸がある程度まで有益であった（図９Ｂ）。しかし、システインが最も有効であることは変わらず、次いでセリン、メチオニン及びアルギニンであった。０．０５ｍＭのシステイン濃度では、ＬＹ１８０は、総細胞硫黄量にほぼ等しい、１ｇ／ｌフルフラールの存在下で０．８ｇ／ｌの密度に増殖することが可能であった（図４Ｃ）。０．０１ｍＭシステインではフルフラール耐性の測定可能な改善は認められなかった。
【０１４５】
システインの防御濃度（０．０５ｍＭ）は１ｇ／ｌフルフラール（１０ｍＭ）の濃度よりも２００倍低かった。無機塩培地中のフルフラールはその特徴的なスペクトルによって容易に定量され（Martinez et al.,2000）、ごくわずかな化学的反応性と一致して、３７℃で４８時間の培養の間不変のままであった。
【０１４６】
ヒスチジン生合成に関与する大部分の遺伝子は、２倍未満であるが、フルフラール添加に応答して増大した（図７）。発酵の間のヒスチジンの新規生合成は、嫌気的増殖においては高いＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比によって及び生合成の２つの最終工程ではＮＡＤ＋のさらなる還元のための必要量によって抑制される。同様に、セリン生合成における最初の関与工程もＮＡＤ＋の還元を含み、発酵の間妨げられる。セリンを増大させることは、Ｈ２Ｓからの還元硫黄をシステインに組み込む効率を高める。アルギニン生合成に関与する遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ｃａｒ  Ａ、ｃａｒＢ及びａｒｇＧ）は、一般にフルフラールの添加後２倍以上減少した。アルギニンデカルボキシラーゼをコードするｓｐｅＡの発現レベルはフルフラールの添加によって増大した。アルギニンの分解は、生合成のための有用な中間体及び補因子を提供する。
【０１４７】
フルフラール耐性への選択的硫黄源の影響
フルフラールの添加は増殖を阻害し、硫黄の同化に関与する遺伝子の転写を増大させた。選択的硫黄化合物、タウリンの取込み及び組込みに関与する遺伝子（ｔａｕＡＢＣ及びｔａｕＤ）は、最大の発現増大を有する１０遺伝子に含まれた（図１２の表３）。ｔａｕ遺伝子は、典型的には硫黄飢餓の間だけ発現される（５７）。システインはフルフラール阻害を取り除くのに有効であったので、これらの遺伝子の発現増大はフルフラールによる含硫アミノ酸のプールの減少から生じる。フルフラールは、硫酸塩からの還元硫黄（Ｈ２Ｓ）のアベイラビリティを制限することによって又は還元硫黄のシステインへの組込みを阻害することによって、含硫アミノ酸の生合成を阻害する。
【０１４８】
１ｇ／ｌフルフラールを含むＡＭ１培地での増殖の間に、還元の異なるレベルで代謝に入る選択的な硫黄源（Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、タウリン及びチオ硫酸ナトリウム）の作用（図９Ｄ）を比較した。システインへの同化の前に硫酸塩を完全に還元するためには４分子のＮＡＤＰＨと２つのレダクターゼ酵素（ＣｙｓＨ及びＣｙｓＩＪ）が必要であることに留意しなければならない。Ｌ−システイン、Ｄ−システイン及びチオ硫酸塩は両方のレダクターゼ酵素を回避し、すべてがフルフラール阻害を取り除くのに有効であった。Ｄ−システインは直接組み込まれることができず、最初にＨ２Ｓに異化される（４９）。チオ硫酸塩はまた、ＣｙｓＭによる組込みのための還元硫黄の供給源としても働く（４７）。タウリンは細胞質内で亜硫酸塩に異化され、システインへの同化の前に亜硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＩＪ及び３分子のＮＡＤＰＨ）によって還元されねばならない（５４）。システイン及びチオ硫酸塩と異なり、タウリンは１ｇ／ｌフルフラールによる増殖の阻害を防ぐのに有効ではなかった。
【０１４９】
選択的硫黄源に関するこれらの結果は、フルフラールが、還元硫黄のシステインへの組込みを阻害することによってではなく、硫酸塩からの還元Ｈ２Ｓの生産を制限することによって増殖を阻害するように働くことを示す。硫黄源としてのタウリンに関しては、フルフラールは、フルフラールレダクターゼＹｑｈＤ（８μＭ）よりも高いＮＡＤＰＨに対するＫｍ（８０μＭ）（５３）を有する、亜硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＩＪ）のレベルで作用しなければならない（４８）。硫黄源としての硫酸塩に関しては、硫黄同化のより早い工程でのフルフラールのさらなる作用を除外することはできない。
【実施例５】
【０１５０】
エタノール生産性細菌における５−ヒドロキシメチルフルフラール耐性の増大
ヘミセルロース加水分解物中に存在するフラン阻害剤を耐容する生物触媒の能力は、再生可能な化学物質の生産のために重要である。この実施例は、エタノール生産性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＹ１８０のフルフラール耐性変異株であるＥＭＦＲ９が、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）に対する耐性も獲得していることを明らかにする。フラン耐性は、ＮＡＤＰＨに対して低いＫｍを有する２つのフランレダクターゼ、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡのより低い発現から生じる。フラン耐性はまた、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨトランスヒドロゲナーゼ（ｐｎｔＡＢ）をコードするプラスミドを付加することによっても増大した。
【０１５１】
材料及び方法
菌株、培地及び増殖条件
この試験で使用した菌株及びプラスミドは以前に記述されている（７０及び２３）。これらは、ＬＹ１８０（大腸菌のエタノール生産性誘導体）、ＥＭＦＲ９（ＬＹ１８０のフルフラール耐性誘導体）、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＤ、ＬＹ１８０ΔｄｋｇＡ、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＤΔｄｋｇＡ、ｙｑｈＤを含有するｐＬＯＩ４３０１を含む。ｄｋｇＡを含有するプラスミドｐＬＯＩ４３０３（４８）、及びｐｎｔＡＢを含有するｐＬＯＩ４３１６（７０）も使用した。培養物を、２０ｇ／ｌキシロース（固体培地）、５０ｇ／ｌキシロース（Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ増殖アナライザ及び試験管培養物）、又は１００ｇ／ｌ（ｐＨ制御発酵）を含むＡＭ１最小培地（２３）において３７℃で増殖させた。
【０１５２】
ＨＭＦに対する耐性を、指示されているようにＡＭ１ ４ｍｌ及び５−ＨＭＦを含む１３×１００ｍｍの閉管を用いて試験した。適切な場合は、プラスミドの保持のための抗生物質を含ませた。管に、０．０５ＯＤ５５０ｎｍの初期密度で接種した。４８時間の培養（６０ｒｐｍ）後にＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ２０Ｄ＋分光光度計（Thermo,Waltham,MA）を用いて増殖を測定した。フラン耐性へのｐｎｔＡＢの作用を調べるために、各ウエルにつき４００μｌのＡＭ１（及び５−ＨＭＦ又はフルフラール）を含むマルチウォールプレートに上記のように接種した。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ Ｃ増殖アナライザ（Oy Growth Curves,Helsinki,Finland）を用いてＯＤ（４２０〜５８０ｎｍの帯域幅）を７２時間測定した。
【０１５３】
発酵実験のために、ＬＹ１８０及びＥＭＦＲ９の種培養物を、ＡＭ１培地３５０ｍｌを含む小さな発酵槽で一晩増殖させた（３７℃、２００ｒｐｍ）。２ＮのＫＯＨの自動添加によって培養液をｐＨ６．５に保持した。中間対数増殖期に達したとき、実験発酵槽に０．１ ＯＤ５５０ｎｍの初期細胞密度（３３ｍｇ乾燥細胞重量／ｌ）で接種した。細胞質量（ＯＤ５５０ｎｍ）及びフランレベルを先に述べられているように（２０）１２時間の間隔で観測した。
【０１５４】
インビボでのフランの還元を、ｐＨ制御発酵槽を用いて測定した。培養物が約１ＯＤ５５０ｎｍに達したとき、１０％ｗ／ｖ保存溶液を使用してフランを添加した。細胞質量及び５−ＨＭＦを０、１５、３０及び６０分後に測定した。
【０１５５】
インビトロでのフランの還元
ＡＭ１及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含む培養試験管（１３×１００ｍｍ）を０．０５ＯＤ５５０ｎｍに接種し、３７℃で培養した。これらを１〜２ＯＤ５５０ｎｍの密度で採取した。細胞ペレットを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄して、１０ＯＤ５５０ｎｍの密度で緩衝液に再懸濁した。試料（１ｍｌ）を、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｂを含む２ｍｌ試験管に添加し、ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４（MP Biomedicals,Solon,OH）を用いて破壊した（２０秒間）。ＮＡＤＰＨのフラン依存性酸化を、ＤＵ８００分光光度計（Beckman Coulter,Fullerton,CA）を用いて３４０ｎｍで測定した。反応物（総容量２００μｌ；３７℃）は、粗抽出物５０μＬ、０．２ｍＭのＮＡＤＰＨ及び２０ｍＭの５−ＨＭＦを含んでいた。ＢＣＡアッセイ（Thermo Scientific,Rockford,IL）を用いてタンパク質を測定した。
【０１５６】
統計分析
データを平均±ＳＤ（ｎ≧３）として提示する。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（La Jolla,CA）を使用して統計比較（両側スチューデントｔ検定）を行った。
【０１５７】
結果
ＥＭＦＲ９株は５−ＨＭＦに対する増大した耐性を示す
フルフラール耐性変異株、ＥＭＦＲ９中に存在する突然変異は、５−ＨＭＦに対する耐性も増大させた（図１４）。１．０ｇ／Ｌの５−ＨＭＦで、ＥＭＦＲ９による増殖及びエタノール生産は、５−ＨＭＦの不在下でのＬＹ１８０（親）のものに等しかった（図１４Ａ、１４Ｂ）。５−ＨＭＦは、細胞収率又はエタノール収率に有害な影響を及ぼさずに発酵の最初の２４時間にＥＭＦＲ９によって速やかに代謝された。ＬＹ１８０は１．０ｇ／ｌの５−ＨＭＦによって完全に阻害されたが、５−ＨＭＦレベルは培養の間緩やかに減少した（図１４Ａ、１４Ｂ及び１４Ｃ）。接種しない場合は減少が認められず（データは示していない）、これが代謝作用の結果であることを確認した。
【０１５８】
ＥＭＦＲ９に関しては、２．５ｇの５−ＨＭＦ／ｌを含めることによってエタノール生産及び増殖は減速したが、それでも進行して９６時間後に完了した（図１４Ｄ、１４Ｅ及び１４Ｆ）。このより高いレベルの５−ＨＭＦに関する細胞収率及びエタノール収率は、５−ＨＭＦなしでのＬＹ１８０と同等であった。５−ＨＭＦのレベルはＥＭＦＲ９によって急速且つ完全に減少した。ＬＹ１８０に関しては、５−ＨＭＦの代謝は遅く且つ不完全であった（図１４Ｆ）。
【０１５９】
５−ＨＭＦ耐性へのＹｑｈＤ及びＤｋｇＡの作用
ＥＭＦＲ９におけるフルフラール耐性は、２つのＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼ、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡのサイレンシングから生じることが以前に明らかにされた（２３）。これらの活性をコードする遺伝子をｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯにクローニングし、ＥＭＦＲ９に形質転換して、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞を採取し、破壊して、５−ＨＭＦレダクターゼ活性に関して試験した（図１５Ａ）。プラスミドからの個別のｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの発現は、ＮＡＤＰＨの５−ＨＭＦ依存性酸化の速度の５倍増大を生じさせ、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡが５−ＨＭＦを基質として利用することを確認した。
【０１６０】
プラスミドからのｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの個別発現は、５−ＨＭＦに対するＥＭＦＲ９の耐性を減少した（図１５Ｂ）。プラスミドの維持のためにカナマイシン（１２．５ｍｇ／ｌ）を添加すると、すべての株において５−ＨＭＦ耐性が減少し、この実験では５−ＨＭＦのより低い濃度（１．０ｇ／ｌ）の使用を必要とした。プラスミドｐＣＲ２．１は、ＩＰＴＧの不在下でクローニングした遺伝子の発現に関して露出性である（７１）。ｙｑｈＤの非誘導発現でさえも、５−ＨＭＦに対するＥＭＦＲ９の感受性を回復するのに十分であった。５−ＨＭＦによる増殖阻害はｙｑｈＤ誘導によってさらに増大した。ｄｋｇＡの発現はそれほど有効ではなく、ＥＭＦＲ９において５−ＨＭＦ感受性を回復するには誘導が必要であった。これら２つのオキシドレダクターゼの間の有効性の差は、ＤｋｇＡについての２３μＭと比較して、ＮＡＤＰＨに対するＹｑｈＤのより低い見かけＫｍ（８μＭ）と一致する（２３）。
【０１６１】
ＬＹ１８０からのｙｑｈＤの欠失は、耐性を２．５ｇ／ｌ ５−ＨＭＦに増大した（図１５Ｃ）。マーカが染色体内に残存する欠失はそれよりも有効でなかったが、ｙｑｈＤの不活性化はすべての場合に５−ＨＭＦ耐性のために有益であることを確認した。
【０１６２】
ＮＡＤＰＨのアベイラビリティを高めることは５−ＨＭＦ耐性を増大させた
ＮＡＤＰＨのアベイラビリティを高めるためにプロトン転位トランスヒドロゲナーゼｐｎｔＡＢ（６８）をＬＹ１８０において過剰発現させた（図１６）。阻害剤の不在下では（図１６Ａ）、ベクタを含むＬＹ１８０（対照）及びＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｔＡＢ）の両方が同じ速度で増殖した。ＩＰＴＧ（０．０１ｍＭ）でのＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡ）の誘導は、５−ＨＭＦの不在下では有害であった。しかし、非誘導ＬＹ１８０（ｐＴｒｃ０９９ａ  ｐｎｔＡＢ）は、５−ＨＭＦ（０．９ｇ／ｌ及び１．８ｇ／ｌ）の存在下でベクタ対照よりも速やかに増殖した（図１６Ｂ及び１６Ｃ）。ｐｎｔＡＢの同様の効果がフルフラールに関して以前に認められている（２３）。従って両方のフランによる増殖の阻害はフランの還元から生じると思われ、生合成のために必要なＮＡＤＰＨのプールを枯渇させる。加えて、ｐｎｔＡＢの過剰発現は、フルフラールの不在下でさえも、７２時間後に全体的な増殖の増大を導き、生合成がこれらの条件下でＮＡＤＰＨによって制限され得ることを指示した。
【０１６３】
硫黄の同化及びシステインの生合成はＮＡＤＰＨの特に高い必要量を有する。システインを添加することは大腸菌ＬＹ１８０においてフルフラール耐性を増大させることが以前に示されているが（７０）、５−ＨＭＦ耐性に関してはそれより有益でないことが認められた（図１７）。ＬＹ１８０の増殖は１ｇ／ｌの５−ＨＭＦによって部分的に阻害され、１００μＭのシステインを添加することによって完全に回復した（図１７Ａ）。２．５ｇ／ｌの５−ＨＭＦの存在下での増殖は、１００μＭ又は１０００μＭシステインによって回復しなかった（図１７Ｂ）。フルフラールと異なり、システインの添加は５−ＨＭＦについてのＭＩＣを増大しなかった。
【０１６４】
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【０１６５】
参照による組み込み
本明細書で特定された、全ての出版物、特許出願及び特許は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【０１６６】
均等物
当業者は、通常の実験を実施するだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識又は確認することができる。そのような均等物は、本明細書に包含されることが意図されている。
【図１】
2012526552.tif 000004
【図２】
2012526552.tif 000005
【図３】
2012526552.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2012526552.tif 000009
【図６Ｂ】
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【図７】
2012526552.tif 000011
【図８】
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【図９−１】
2012526552.tif 000013
【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月17日(2012.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
遺伝子発現は、参照細菌と比較して、本発明のｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ発現を制御するｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子などのトランスヒドロゲナーゼ遺伝子若しくは他の遺伝子又は他の非セグメントの核酸を挿入する、重複させる、除去する、置換する又はさもなければ変化させることによって増大することができる。遺伝子発現は、参照細菌と比較してｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ発現を調節するプロモータを挿入するか又は変化させることを含むがこれに限定されない、当該技術分野で公知の方法によって増大する。例えば、プロモータを、異なるプロモータによるプロモータの置換、あるいは、例えば核酸を挿入する、置換する、重複させる若しくは除去することによる又はプロモータにおいて調節エレメント若しくはモチーフを挿入する、置換する、重複させる若しくは除去することによるプロモータの修飾を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で一般に認められている方法によって変化させる。従って、本発明の1つの態様では、本発明のｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ遺伝子などのトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を、参照細菌と比較して遺伝子発現を調節するプロモータを修飾する又は付加することを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の方法によって増大させる。
【国際調査報告】
2012526552.tif 000025