(57)【要約】  本発明は、ホスト内での内在性遺伝子の発現をノックアウト又はノックダウンするための、内在性遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、及び、ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質をホスト内で発現させるための、送達媒体／発現ベクター内の遺伝子をコードするポリヌクレオチドのホストへの送達を組み合わせた使用に関する。本発明はまた、細胞、特に哺乳類の癌細胞のアポトーシス及び死滅の誘導に有用なｅＩＦ−５Ａ１の切断型にも関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の癌細胞又は腫瘍にアポトーシスを誘導するために用いられる薬剤を製造するための、切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドの使用。
【請求項２】
ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドが、図３８に示される配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含んでなる切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドが約１６ｋＤＡの切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
被験体が哺乳類である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
哺乳類がヒトである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
癌細胞又は腫瘍におけるアポトーシスの誘導が、癌細胞又は腫瘍の生育を遅くする、癌細胞又は腫瘍の生育を停止する、又は癌細胞を死滅させる若しくは腫瘍サイズを縮小させる、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
癌が多発性骨髄腫である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドが、配列番号３８に記載の（図４１に示される）配列を含んでなる、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドがプラスミド又は発現ベクター内に含まれる、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
発現ベクターがアデノウィルス発現ベクター又はｐＨＭ６である、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
発現ベクターが組織特異的プロモーターを含んでなる、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
組織特異的プロモーターがＢ細胞特異的プロモーターである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
Ｂ細胞特異的プロモーターがＢ２９である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
発現ベクターがｐＣｐＧプラスミドを含んでなる、請求項１０に記載の使用。
【請求項１５】
発現ベクターがポリエチレンイミンと複合される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１６】
発現ベクターが還元型ＣｐＧジヌクレオチドを有する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１７】
薬剤が腫瘍内、静脈内、又は皮下投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号３８に記載の（図４１に示される）配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該切断型タンパク質が配列番号３７に記載の（図３８に示される）アミノ酸配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
カスパーゼにより仲介されるｅＩＦ５Ａ１の切断によって形成される、単離された切断型ｅＩＦ５Ａ１ポリペプチド。
【請求項２１】
被験体の癌細胞又は腫瘍にアポトーシスを誘導するために用いられる薬剤を製造するための、完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドと組み合わせた、切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドが配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含んでなる切断型ｅＩＦ５Ａタンパク質をコードし、かつ完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドが配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドが約１６ｋＤＡの切断型ｅＩＦ５Ａタンパク質をコードする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
被験体が哺乳類である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
哺乳類がヒトである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
アポトーシスの誘導が、癌細胞又は腫瘍の生育を遅くする、癌細胞又は腫瘍の生育を停止する、又は癌細胞を死滅させる若しくは腫瘍サイズを縮小させる、請求項２１に記載の使用。
【請求項２７】
癌が多発性骨髄腫である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２８】
ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドが配列番号３８に記載の配列を含んでなり、かつ完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドが配列番号４３に記載の（図５３に示される）配列を含んでなる、請求項２１に記載の使用。
【請求項２９】
完全長ｅＩＦ５Ａポリヌクレオチドが変異ｅＩＦ５Ａ１をコードする、請求項２３に記載の使用であって、該変異がデオキシヒプシンシンターゼによるヒプシン化を阻止若しくは阻害し、並びに／又は、該変異がユビキチン化部位及び／若しくはアセチル化部位に存在する使用。
【請求項３０】
変異がＫ５０Ａ、Ｋ５０Ｒ、Ｋ６７Ａ、Ｋ４７Ｒ、Ｋ６７Ｒ、Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ、Ｋ５０Ａ／Ｋ４７Ｒ、Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ｒ、Ｋ５０Ｒ／Ｋ６７Ａ、Ｋ５０Ｒ／Ｋ４７Ｒ、Ｋ５０Ｒ／Ｋ６７Ｒ、及びＫ４７Ａ／Ｋ６７Ａからなる群より選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項３１】
ｅＩＦ５Ａの３’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡをさらに含んでなる、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
ｓｉＲＮＡがｅＩＦ５Ａ１の配列である５’−ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＣ  Ａ−３’を標的とする、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
ｓｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであり、ｄｓＲＮＡの一本の鎖が５’−ＧＣＵ  ＧＧＡ  ＣＵＣ  ＣＵＣ  ＣＵＡ  ＣＡＣ  Ａ−３’の配列を含んでなる、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
ｓｉＲＮＡが血清中での分解を阻止するために安定化される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチド及び／又は切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａポリヌクレオチドが発現ベクター内に存在する、請求項３１に記載の使用。
【請求項３６】
完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチド及び／又は切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａポリヌクレオチド及び／又はｓｉＲＮＡがポリエチレンイミンと複合される、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチド及び／又は切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａポリヌクレオチド及び／又はｓｉＲＮＡが独立してポリエチレンイミンと複合される、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の組成物のいずれか一つを哺乳類に提供することによる、哺乳類の癌細胞又は哺乳類の腫瘍にアポトーシスを誘導する方法。
【請求項３９】
組成物が静脈内、腹腔内、又は腫瘍内投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
癌が多発性骨髄腫である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ｅＩＦ５Ａ１の３’末端を標的とするｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ、変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターの複合体を含んでなる組成物であって、該変異ｅＩＦ５Ａ１がヒプシン化できず、並びに、該ｓｉＲＮＡ及び該発現ベクターが複合体形成のためにポリエチレンイミンと複合される、組成物。
【請求項４２】
被験体における標的遺伝子の内在性発現を抑制するための、標的遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ；及びＲＮＡＩ耐性プラスミド内の、被験体内で発現できる標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる組成物であって、該ｓｉＲＮＡ及び該プラスミドが、複合体形成のためにポリエチレンイミンと複合される、組成物。
【請求項４３】
ｓｉＲＮＡが図２５に示す配列を有し、かつ変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドがｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
組織特異的プロモーターを含んでなる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
Ｂ細胞特異的プロモーターを含んでなる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
Ｂ細胞プロモーターがＢ２９である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
発現ベクターがｐＣｐＧプラスミドを含んでなる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４８】
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ、及び変異ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターが、独立してポリエチレンイミンと複合される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４９】
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ、及び変異ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターが、一緒にポリエチレンイミンと複合される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５０】
ｅＩＦ５Ａ１の３’末端を標的とするｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ及び変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを含んでなる組成物であって、該変異ｅＩＦ５Ａ１がヒプシン化できず、並びに、該ｓｉＲＮＡ及び該発現ベクターが癌治療のため被験体に送達される、組成物。
【請求項５１】
癌が多発性骨髄腫である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
請求項５０に記載の組成物を被験体に投与することを含んでなる癌の治療法。
【請求項５３】
請求項４１に記載の組成物を被験体に投与することを含んでなる癌の治療法。
【請求項５４】
組成物が静脈内、腹腔内、又は腫瘍内投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ｅＩＦ５Ａ１の３’末端を標的とするｓｉＲＮＡ及び変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターが異なる経路を通して送達される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
組成物が約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回の注射で供給される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
組成物が約０．７５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回の注射で供給される、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００８年９月３日に提出された米国仮出願第６１／０９３，７４９号、及び２００９年３月１９日に提出された米国特許出願第１２／４００，７４２号に対する優先権を主張するものであり、これらはその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
［背景技術］
比較的最近、二重鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）がタンパク質発現の阻害に使用できることが研究者らにより観察された。遺伝子の発現を停止するこの能力にはヒトの疾病の治療に対する広範な可能性があり、現在多くの研究者及び営利団体がこの技術に基づく治療法の開発にかなりの資金を投じている。
【０００３】
二重鎖ＲＮＡにより誘導される遺伝子サイレンシングは、少なくとも異なる３段階：（ｉ）ＲＮＡにより導かれるＤＮＡ又はヒストンのメチル化を指す、転写の不活性化；（ｉｉ）ｓｉＲＮＡにより誘導されるｍＲＮＡの分解；及び（ｉｉｉ）ｍＲＮＡにより誘導される転写の減衰において起こり得る。
【０００４】
一般に、哺乳類細胞においてＲＮＡにより誘導されるサイレンシング（ＲＮＡ干渉、又はＲＮＡｉ）の主要な機構は、ｍＲＮＡの分解であると考えられている。哺乳類細胞におけるＲＮＡｉ使用の最初の試みは、長鎖のｄｓＲＮＡの使用に集中していた。しかしながらＲＮＡｉ誘導のためのこれらの試みは、標的特異的とは対照的に、一つには一般的なタンパク質合成の阻害をもたらすインターフェロン反応の誘導のためにあまり成功しなかった。従って、哺乳類系におけるＲＮＡｉに対して長鎖ｄｓＲＮＡは実行可能な選択肢ではない。
【０００５】
さらに最近、短い（１８〜３０ｂｐ）ＲＮＡ二本鎖を培養哺乳類細胞に導入した際、インターフェロン反応を誘導することなく標的ｍＲＮＡの配列特異的な阻害が実現できることが示された。阻害的低分子ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）と称されるこれらの短いｄｓＲＮＡのあるものは、細胞内で９５％を超える標的ｍＲＮＡを切断するために、モル濃度未満の濃度で触媒的に作用し得る。ｓｉＲＮＡの作用機構、同様に幾つかのその応用についての記述は、Provost  et  al.  (2002)  Ribonuclease  Activity  and  RNA  Binding  of  Recombinant  Human  Dicer,  EMBO  J.  21(21):  5864-5874;  Tabara  et  al.  (2002)  The  dsRNA  Binding  Protein  RDE-4  Interacts  with  RDE-1,  DCR-1  and  a  DexH-box  Helicase  to  Direct  RNAi  in  C.  elegans,  Cell  109(7):  861-71;  Ketting  et  al.  (2002)  Dicer  Functions  in  RNA  Interference  and  in  Synthesis  of  Small  RNA  Involved  in  Developmental  Timing  in  C.  elegans;  Martinez  et  al.,  Single-Stranded  Antisense  siRNAs  Guide  Target  RNA  Cleavage  in  RNAi,  Cell  110(5):563;  Hutvagner  &  Zamore  (2002)  A  microRNA  in  a  multiple-turnover  RNAi  enzyme  complex,  Science  297:2056に記載される。
【０００６】
機構的な視点から、長い二重鎖ＲＮＡの植物及び無脊椎動物の細胞内への導入は、ダイサーとして知られるタイプＩＩＩエンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡへ分解される。Sharp,  RNA  interference--2001,  Genes  Dev.  2001,  15:485.  Dicer,  a  ribonuclease-III-like  enzyme,  processes  the  dsRNA  into  19-23  base  pair  short  interfering  RNAs  with  characteristic  two  base  3'  overhangs.  Bernstein,  Caudy,  Hammond,  &  Hannon  (2001)  Role  for  a  bidentate  ribonuclease  in  the  initiation  step  of  RNA  interference,  Nature  409:363。ｓｉＲＮＡは次に、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（RNA-induced  silencing  complex）（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、ここで１以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、標的の認識を導くための相補的アンチセンス鎖が有効となる。Nykanen,  Haley,  &  Zamore  (2001),  ATP  requirements  and  small  interfering  RNA  structure  in  the  RNA  interference  pathway,  Cell  107:309。適切な標的ｍＲＮＡへの結合により、ＲＩＳＣ内の１以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する。Elbashir,  Lendeckel,  &  Tuschl  (2001)  RNA  interference  is  mediated  by  21-  and  22-nucleotide  RNAs,  Genes  Dev.  15:188、図１。
【０００７】
干渉効果は長く持続し得り、多数の細胞分裂後にも検出され得る。さらに、ＲＮＡｉは配列特異性を示す。Kisielow,  M.  et  al.  (2002),  Isoform-specific  knockdown  and  expression  of  adaptor  protein  ShcA  using  small  interfering  RNA,  J.  Biochem.  363:1-5。従ってＲＮＡｉ機構により、密接に関連するｍＲＮＡに影響を及ぼすことなく、一つの型の転写を特異的にノックダウンできる。これらの特性によってｓｉＲＮＡは、遺伝子発現の阻害、及び遺伝子機能の研究、及び薬物標的の検証に対して価値ある手段となる可能性がある。さらにｓｉＲＮＡは、（１）遺伝子の過剰発現又は異所性発現により引き起こされる疾病；及び（２）変異を含む遺伝子の発現によりもたらされる疾病に対する治療薬として有用な可能性がある。
【０００８】
成功したｓｉＲＮＡ依存性の遺伝子サイレンシングは幾つかの因子に依存する。ＲＮＡｉにおける最も議論のある問題の一つは、ｓｉＲＮＡ設計の必要性、すなわち使用するｓｉＲＮＡの配列を考慮することについての論点である。C.  elegans及び植物における初期の研究は、長いｄｓＲＮＡの導入によって設計の問題を回避した（例えば、Fire,  A.  et  al.  (1998)  Nature  391  :806-811を参照）。この原始的な生命体において、長いｄｓＲＮＡ分子はダイサーによりｓｉＲＮＡに切断され、こうして転写の全体を網羅する可能性のある二本鎖の多様な集団が生成される。これらの分子のうち幾つかの分画は非機能的（すなわちサイレンシングをわずかに誘導するか又は誘導しない）であるが、１以上は高度に機能的となる可能性があり、これによって興味ある遺伝子のサイレンシングが起こり、かつｓｉＲＮＡ設計の必要は少なくなる。残念なことに、哺乳類系ではインターフェロン反応のためにこの同じアプローチは使用できない。この効果はダイサーによる切断工程を介さずに、ｓｉＲＮＡを直接導入することにより回避できるが、この方策は選択したｓｉＲＮＡ配列が非機能的又は半機能的であるという危険性を持ち越す。
【０００９】
多くの研究者が、ｓｉＲＮＡの設計はＲＮＡｉの決定的な要素ではないという見解を示してきた。一方で当該分野における他の研究者達は、ｓｉＲＮＡの設計に注目することにより、ＲＮＡｉがさらに効率的となる可能性を探求し始めた。
【００１０】
様々な疾病又は疾患を治療するためには特定のタンパク質の上昇が望ましいが、それが必要な全てではない可能性もある。例えば、内在性タンパク質又は異なるタンパク質発現をノックダウン又はノックアウトするために、ｓｉＲＮＡを組み合わせた使用が必要となり得る。本発明はこの必要性を満たし、癌、特に多発性骨髄腫の治療法を提供する。
【００１１】
多発性骨髄腫を含む癌は、アポトーシス誘導能から利益を得られる疾病である。多発性骨髄腫の従来の治療法は、化学療法、幹細胞移植、幹細胞移植を併用する高用量化学療法、及びサルベージ療法を含む。化学療法は、Thalomid（登録商標）（サリドマイド）、ボルテゾミブ、Aredia（登録商標）（パミドロネート）、ステロイド、及びZometa（登録商標）（ゾレドロン酸）による治療を含む。しかしながら多くの化学療法薬は、骨髄、胃及び腸の内面、並びに、毛包のような活発に分裂する非癌細胞に有毒である。従って化学療法は、血液細胞数の減少、悪心、嘔吐、下痢、及び脱毛をもたらし得る。
【００１２】
従来の化学療法又は標準用量の化学療法は、典型的には多発性骨髄腫の患者の第一の、又は最初の治療である。患者はまた、高用量化学療法及び幹細胞移植のために用意された化学療法も受け得る。移植前に腫瘍の負荷量を減少させるため、導入療法（幹細胞移植前の従来の化学療法）が使用できる。特定の化学療法薬は骨髄細胞への毒性が少なく、かつ骨髄からの幹細胞のより高い収率をもたらすため、他のものよりも導入療法に適している。導入療法に適した化学療法薬の例は、デキサメタゾン、サリドマイド／デキサメタゾン、ＶＡＤ（ビンクリスチン、Adriamycin（登録商標）（ドキソルビシン）、及びデキサメタゾンの組み合わせ）、及びＤＶｄ（ペグ化リポソームドキソルビシン（Doxil（登録商標）、Caelyx（登録商標））、ビンクリスチン、及び投与頻度縮小型デキサメタゾンの組み合わせ）を含む。
【００１３】
多発性骨髄腫の標準的治療は、５０％の反応率を達成するメルファランとプレドニゾン（副腎皮質ステロイド薬）の組み合わせである。残念なことにメルファランはアルキル化剤であり、導入療法にはあまり適さない。副腎皮質ステロイド（特にデキサメタゾン）は時々単独で多発性骨髄腫の治療法に用いられ、特に高齢患者及び化学療法を許容できない患者に対して用いられる。デキサメタゾンはまた、単独又はその他の薬剤と組み合わせて導入療法にも使用される。ＶＡＤは最も一般に用いられる導入療法であるが、最近ＤＶｄが導入療法に有効であることが示されている。多発性骨髄腫の治療のために最近ボルテゾミブが承認されたが、これは非常に有毒である。しかしながら、現存の治療法のいずれも治癒の著しい可能性を提供していない。従って、癌及び多発性骨髄腫に適した治療を見出す必要が依然としてある。本発明はこの必要性を満たす。
【００１４】
［発明の概要］
本発明は、ｅＩＦ−５Ａ１の切断型をコードする単離されたポリヌクレオチド、同様に切断型ｅＩＦ−Ａ１ポリペプチドを提供する。切断型ｅＩＦ−５Ａ１ポリヌクレオチドは、被験体における癌細胞のアポトーシス及び死滅の誘導に有用である。切断型ポリヌクレオチドは発現ベクター内に使用され得り、これは次に被験体へ投与される。切断型ｅＩＦ−５Ａは哺乳類内に発現し、癌細胞を死滅させる。切断型ｅＩＦ−５Ａ１タンパク質は、約１７ｋＤａである完全長ｅＩＦ−５Ａ１タンパク質に対し、約１６ｋＤＡである。切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、被験体の癌細胞又は腫瘍にアポトーシスを誘導するために用いられる薬剤の製造に使用されてよい。切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるその他の実施形態と協同して（例えば、完全長ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチド、完全長変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチド、及び／又はｅＩＦ５Ａの３’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡと組み合わせて）使用されてよい。
【００１５】
本発明はまた、ホスト内での内在性遺伝子の発現をノックアウト又はノックダウンするための、内在性遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、及び、ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質をホスト内で発現させるための、送達媒体／発現ベクター内の遺伝子をコードするポリヌクレオチドのホストへの送達を組み合わせた使用にも関する。正常タンパク質がその必要な機能を実施できるように、正常（欠陥のない）タンパク質をコードするポリヌクレオチド（又はタンパク質それ自体）がホストに投与され、発現する（ポリヌクレオチドの場合）。ｓｉＲＮＡは、欠陥のあるタンパク質の内在性の発現をノックダウン又はノックアウトするが、同時に投与された正常タンパク質をコードするポリヌクレオチドの外来性の発現には影響しないような遺伝子領域を標的として好ましく設計される。
【００１６】
本発明は、ｅＩＦ５Ａ１の３’末端を標的とするｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ、変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターの複合体を含んでなる組成物を提供し、ここで該変異ｅＩＦ５Ａ１はヒプシン化できず、かつ該ｓｉＲＮＡ及び該発現ベクターは、複合体形成のためにポリエチレンイミンと複合される。
【００１７】
本発明は、被験体における標的遺伝子の内在性発現を抑制するための、標的遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、及び被験体内で発現できる標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提供する。特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドはＲＮＡｉ耐性プラスミド内（ｓｉＲＮＡにより抑制され得ない）にある。ｓｉＲＮＡ及びプラスミドは、複合体形成のためにポリエチレンイミンと好ましく複合される。
【００１８】
特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは図２５に示す配列を有し、ここで変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドはｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒである。発現ベクターは、変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチド、及び被験体内でポリヌクレオチドを発現させるために機能的に連結されたプロモーターを含んでなる。プロモーターは、好ましくは組織特異的又は全身的のいずれかである。例えば組成物が癌の治療に使用される場合、プロモーターは、好ましくは癌が属する組織に対して組織特異的である。例えば多発性骨髄腫を治療するためには、Ｂ２９のようなＢ細胞特異的プロモーターの使用が好ましい。特定の実施形態によれば、発現ベクターはｐＣｐＧプラスミドを含んでなる。
【００１９】
特定の実施形態によれば、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ、及び変異ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターは、独立してin  vivo  JetPEI（商標）のようなポリエチレンイミンと複合される。別の実施形態によれば、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ、及び変異ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターは、一緒にポリエチレンイミンと複合される。
【００２０】
本発明はさらに、ｅＩＦ５Ａ１の３’末端を標的とするｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ及び変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを含んでなる組成物を提供し、ここで該変異ｅＩＦ５Ａ１はヒプシン化できず、かつ該ｓｉＲＮＡ及び該発現ベクターは、癌治療のため被験体に送達される。癌は多発性骨髄腫を含むいずれの癌であってもよい。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の組成物を被験体（哺乳類及びヒトを含むがこれらに限定されない）に投与することを含んでなる癌の治療法を提供する。
【００２２】
組成物は、限定はされないが静脈内、腹腔内、皮下、又は腫瘍内のような許容されるいずれの経路で投与されてよい。ｓｉＲＮＡ及び発現ベクターは、異なる時間に異なる経路を通して投与されてよいか、又は同時に同じ経路を通して一緒に投与されてよい。例えば限定はされないが、これらのｓｉＲＮＡはネイキッドで、又はin  vivo  jetPEIのような担体と複合してＩＶを通して送達されてよく、かつ発現ベクターは腫瘍内に投与されてよいか、又はｓｉＲＮＡ及び発現ベクターの両方がＩＶ若しくは腫瘍内などに投与されてよい。
【００２３】
本発明は、癌細胞の生育を阻害及び／又は癌細胞を死滅させる方法を提供する。本発明はまた、癌細胞の転移能を阻害又は遅くさせる方法も提供する。癌生育の阻害は、腫瘍サイズの縮小、腫瘍生育の低下を含み、かつ腫瘍の完全な寛解もまた包含し得る。癌は、大腸癌、結腸直腸腺癌、膀胱癌、子宮頸部腺癌、及び肺癌を含むがこれらに限定されないいずれの癌又は腫瘍であってよい。好ましくは、癌は多発性骨髄腫である。
【００２４】
好ましい実施形態によれば、ｅＩＦ−５Ａはヒプシン化できない変異体である。典型的な変異体は本明細書に記載される。
【００２５】
ｅＩＦ−５Ａ、又はｅＩＦ−５Ａをコードするポリヌクレオチドの被験体への供給（ｅＩＦ−５Ａを発現させるため）に加え、ｅＩＦ−５Ａの内在性発現をノックアウト又はノックダウンするためにｓｉＲＮＡが供給される。
【００２６】
本発明はまた、多発性骨髄腫を有する被験体内の多発性骨髄腫細胞を死滅させ、癌を治療する薬剤の製造のために、ｅＩＦ５Ａ、ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチド、及びｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡの使用も提供する。好ましくは、変異ｅＩＦ−５Ａをコードするポリヌクレオチドはヒプシン化できない。
【００２７】
本発明はまた、鎌状赤血球貧血の治療法も提供する。健常ヘモグロビン遺伝子（例えばＨＢＢ）をコードするポリヌクレオチドを、鎌状赤血球貧血を患う患者へ投与する。欠陥のあるタンパク質の発現をノックダウン又はノックアウトするため、患者には欠陥のあるヘモグロビン遺伝子をコードする遺伝子（例えば変異ＨｂＳをコードする遺伝子）を標的とするｓｉＲＮＡもまた併用して投与される。治療は、その他の公知の医薬の投与、又は鎌状赤血球貧血を治療するために一般に用いられる治療をさらに含んでなってよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ヒトｅＩＦ−５Ａ１のアミノ酸配列及び様々な重要部位を示した図である。
【図２】Ｋ５０及びＫ６７におけるｅＩＦ−５Ａ１の変異が、トランスフェクトしたタンパク質の蓄積を増大させることを示した図である。実施例１を参照のこと。
【図３】Ｋ４７、Ｋ５０、及びＫ６７におけるｅＩＦ５Ａ１の変異が、トランスフェクトしたタンパク質の蓄積を増大させることを示した図である。実施例２を参照のこと。
【図４】Ｋ５０及びＫ６７におけるｅＩＦ５Ａ１の変異が、ＫＡＳ細胞にトランスフェクトした際にアポトーシスの誘導をもたらすことを示した図である。実施例３を参照のこと。
【図５】Ｋ５０及びＫ６７におけるｅＩＦ５Ａ１の変異が、ＫＡＳ細胞にトランスフェクトした際にアポトーシスの誘導をもたらすことを示した図である。実施例４を参照のこと。
【図６】Ｋ５０及びＫ６７におけるｅＩＦ５Ａ１の変異が、ＫＡＳ細胞にトランスフェクトした際にアポトーシスの誘導をもたらすことを示した図である。実施例５を参照のこと。
【図７Ａ】ｓｉＲＮＡのトランスフェクション及びｅＩＦ−５Ａ１を発現するように改変されたアデノウィルスによる処理が、ＫＡＳ細胞にアポトーシスをもたらすことを示した図である。実施例６Ａを参照のこと。
【図７Ｂ】ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（標的＃１（配列番号１）に対する）（ｓｉＲＮＡコンストラクトの配列を図２５に示す）による前処理は内在性ｅＩＦ５Ａ１の発現を減少させるが、アデノウィルスにより発現されたＲＮＡｉ耐性のｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ａは蓄積させることを示した図である。実施例６Ｂを参照のこと。
【図７Ｃ】アデノウィルス感染前の、標的＃１に対するｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡによる前処理が、ヒト多発性骨髄腫細胞におけるリン酸化ＮＦ−κＢの発現を減少させることを示した図である。実施例６Ｃを参照のこと。
【図７Ｄ】アデノウィルス感染前の、標的＃１に対するｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡによる前処理が、ヒト多発性骨髄腫細胞におけるリン酸化ＮＦ−κＢ及びＩＣＡＭ−１の発現を減少させることを示した図である。実施例６Ｄを参照のこと。
【図７Ｅ】ヒト多発性骨髄腫細胞における、ｓｉＲＮＡにより仲介されるｅＩＦ５Ａの抑制が、ＬＰＳにより仲介されるＮＦκＢのＤＮＡ結合活性の誘導を阻害することを示した図である。ＮＦ−κＢは多くの生存促進性及び抗アポトーシス経路を調節することから、ｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡによるＮＦ−κＢ活性の阻害は、ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒの過剰発現と組み合わせたときに、そのアポトーシス誘導を増大する能力を説明できる。
【図７Ｆ】ｓｉＲＮＡによるＫＡＳ細胞の前処理が、ＩＬ−６の存在下でｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ遺伝子送達によるアポトーシスを増大させることを示した図である。実施例６Ｅを参照のこと。
【図８】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させることを示した図である。示されるデータは、各群における全てのマウスの腫瘍容積である。実施例７を参照のこと。
【図９】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させることを示した図である。示されるデータは、群あたりの平均腫瘍容積＋／−標準誤差である。実施例７を参照のこと。
【図１０】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の重量を減少させることを示した図である。実施例７を参照のこと。
【図１１】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させ、かつ腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である。実施例８を参照のこと。
【図１２】ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与、及びＰＥＩ／ｅＩＦ５ＡｌＫ５０Ｒプラスミド複合体の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である。実施例９を参照のこと。
【図１３Ａ】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡによる処置が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させ、かつ腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である。
【図１３Ｂ】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与が腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である。
【図１３Ｃ】ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与、及びＰＥＩ／ｅＩＦ５ＡｌＫ５０Ｒプラスミド複合体の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である。
【図１４】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内同時投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させることを示した図である。実施例１０を参照のこと。
【図１５】ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与、及びＰＥＩ／ｅＩＦ５ＡｌＫ５０Ｒプラスミド複合体の静脈内（ｉ．ｖ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ．）投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させることを示した図である。実施例１１を参照のこと。
【図１６】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡによる処置が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させることを示した図である。
【図１７】ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させ、かつ腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である。実施例１２を参照のこと。
【図１８】ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与、及びＰＥＩ／ｅＩＦ５ＡｌＫ５０Ｒプラスミド複合体の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である。実施例１３を参照のこと。
【図１９】ＥＦ１又はＢ２９プロモーターのいずれかにより駆動されるｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミド、及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を遅延させ、かつ腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である（ＫＡＳ−ＳＱ−５）。実施例１４を参照のこと。
【図２０】ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与が、ＥＦ１又はＢ２９プロモーターのいずれかにより駆動されるｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミドの多発性骨髄腫皮下腫瘍における抗腫瘍効果を増大させ、腫瘍の負荷量を減少させることを示した図である（ＫＡＳ−ＳＱ−５）。実施例１５を参照のこと。
【図２１】ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡが、肺腺癌細胞におけるＡｄ−ｅＩＦ５Ａの感染によりもたらされたアポトーシスを相乗的に増大させることを示した図である。実施例１６を参照のこと。
【図２２】その構築について実施例１７に記載される、ｐＥｘｐ５Ａのマップを示した図である。
【図２３】ｐＥｘｐ５Ａ（３３７１ｂｐ）の予測される配列を示した図である。実施例１７を参照のこと。
【図２４】様々な細胞株におけるｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒの再発現を示した図である。実施例１８を参照のこと。
【図２５】標的配列及び好ましいｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの配列を示した図である。
【図２６】多発性骨髄腫における有効性試験の結果を示した図である。実施例２１を参照のこと。
【図２７】多発性骨髄腫における有効性試験の結果を示した図である。実施例２１を参照のこと。
【図２８】ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０ＲｃＤＮＡの配列を示した図である。
【図２９】ヒトｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒに対するヒトｅＩＦ−５Ａ１のアラインメントを示した図である。
【図３０】ＨＡ−ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒの発現におけるＤＮＡ：ｓｉＲＮＡ比の効果を示した図である。実施例２３を参照のこと。
【図３１】ナノ粒子のトランスフェクションにより誘導されるアポトーシスにおけるＤＮＡ：ｓｉＲＮＡ比の効果を示した図である。実施例２４を参照のこと。
【図３２】ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（siSTABLE又は非siSTABLE）を含むＰＥＩ複合体（Ｎ／Ｐ＝６又は８）の投与が、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育を阻害し、かつ腫瘍の縮小をもたらすことを示した図である。実施例２５を参照のこと。
【図３３】JET  PEI（商標）ナノ粒子が腫瘍組織によって効果的に取り込まれ、該ナノ粒子が同細胞にプラスミド及びｓｉＲＮＡを送達することを示した図である。実施例２６を参照のこと。
【図３４】ＫＡＳ細胞がアクチノマイシンＤに反応してアポトーシスを起こすことを示した図である。ＫＡＳ細胞は無処理か、又は０．５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤにより処理された。処理開始後２４時間目に細胞を回収、洗浄し、アポトーシス細胞をアネキシン／ＰＩ（BD  Bioscience）を用いて標識してフローサイトメトリーにより解析した。
【図３５】ｅＩＦ−５Ａ１の切断型が、アクチノマイシンＤ処理に反応して蓄積することを示した図である。ＫＡＳ細胞を、０．５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤによって０時間〜３０時間の範囲の時間枠で処理した。細胞ライセートを回収し、ｅＩＦ５Ａ１に対する抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。ｅＩＦ５Ａ１の、より小さな分子量の（切断された）形の蓄積はアクチノマイシンＤ処理後おおよそ８時間後から観察され始め、残りの処理の間を通して存在した。同じ膜でのウェスタンブロットによる等しい負荷を、アクチンに対する抗体を用いて示した。
【図３６】ｅＩＦ−５Ａ１の切断型が、完全長ｅＩＦ−５Ａ１よりも高い等電点を持つことを示した図である。ＫＡＳ細胞は無処理か、又は０．５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤにより処理された。処理開始後１７時間目に細胞ライセートを回収し、２−Ｄゲル電気泳動によって分離した後、ｅＩＦ５Ａ１に対する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。無処理サンプル中に大量の完全長ｅＩＦ５Ａ１が観察できるが、アクチノマイシンＤ処理サンプル中には高めのｐＩを有するｅＩＦ５Ａ１の切断型の蓄積が観察できる。
【図３７】切断型ｅＩＦ−５Ａ１の２−Ｄゲルの写真を示した図である。ＫＡＳ細胞は０．５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤにより処理された。処理開始後１７時間目に細胞ライセートを回収し、２−Ｄゲル電気泳動によって分離した後、クマシーブルーによる染色を行った。マススペクトロメトリー分析のために収集したｅＩＦ５Ａ１の切断型の位置を示す。
【図３８】切断型ｅＩＦ−５Ａ１のマススペクトロメトリーによる配列決定結果を示した図である。（Ａ）ｅＩＦ５Ａ１の完全長アミノ酸配列を黒で示す。ｅＩＦ５Ａ１の完全長配列と共に整列させた、マススペクトロメトリーにより同定された配列決定ペプチド（Ｂ）を下線で示す（Ａ）。配列決定ペプチドから、ｅＩＦ５Ａ１の最初の６アミノ酸が欠失していることに留意されたい。
【図３９】カスパーゼ３、８、及び９の阻害剤がｅＩＦ−５Ａ１の切断型の形成を阻害することを示した図である。ヒト多発性骨髄腫ＫＡＳ細胞を異なるカスパーゼ阻害剤と共に８時間インキュベートし、さらに１６時間、０．５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）と共に同時処理した。細胞ライセートを回収した。タンパク質を２Ｄ−ＰＡＧＥによって分離し、ｅＩＦ５Ａに対する抗体を用いるウェスタン分析に供した。使用したカスパーゼ阻害剤はＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（一般的なカスパーゼ阻害剤）、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ９阻害剤）、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ３／７阻害剤）、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ６／８阻害剤）、及びＺ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ１阻害剤）である。データにより、一般的なカスパーゼ阻害剤、並びに、カスパーゼ３、８、及び９の阻害剤は全て、ＡｃｔＤによりＫＡＳ細胞に誘導されるアポトーシスの間に蓄積されるｅＩＦ５Ａの切断型の形成を強力に阻止することが示された。カスパーゼ１の阻害剤もまた、完全な遮断ではないが、切断産物の形成を減少させる。これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１が遺伝毒性のストレス（アクチノマイシンＤにより誘導される）後にカスパーゼにより切断され；ｅＩＦ５Ａ１の切断はその活性を変化させる、すなわちアポトーシス促進活性を増大させ得ることを示した。
【図４０】脱アセチル化酵素阻害剤（ニコチンアミド）が、ｅＩＦ−５Ａ１の切断型の形成を促進することを示した図である。リジン４７がアセチル化され得るｅＩＦ５Ａは、Ｓｉｒ２関連脱アセチル化酵素であるＨｓｔ２の基質である（Shirai  et  al.,  2008）。ヒト子宮頸癌Ｈｅｌａ  Ｓ３細胞を、０．５μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）及び／又はＳｉｒ２の強力な阻害剤である２０μＭニコチンアミドにより、示される時間の長さで処理した。細胞ライセートを回収した。タンパク質を２Ｄ−ＰＡＧＥによって分離し、ｅＩＦ５Ａに対する抗体を用いるウェスタン分析に供した。ＡｃｔＤ又はニコチンアミド単独によるＨｅｌａ  Ｓ３細胞の処理は、ｅＩＦ５Ａの切断型の蓄積を誘導しない。しかしながら、アクチノマイシンＤ及びニコチンアミドの両方により処理されたＨｅＬａ細胞では、ｅＩＦ５Ａの切断型はＡｃｔＤへの暴露後少なくとも４時間目に上昇することから、アポトーシスの間にアセチル化がｅＩＦ５Ａの切断を促進し得ることが示唆される。
【図４１】切断型ヒトｅＩＦ５Ａ１のＤＮＡ配列を示した図である。
【図４２】完全長ｅＩＦ５Ａ１、切断型ｅＩＦ５Ａ、及び切断部位のタンパク質配列を示した図である。
【図４３】アデノウィルスコンストラクトによるＨｅｌａ細胞の感染が、ｅＩＦ５Ａ導入遺伝子の蓄積をもたらすことを示した図である。Ｈｅｌａ  Ｓ３細胞を、異なるアデノウィルスコンストラクトにより、細胞あたり５００感染単位にて感染させた。感染後４８及び７２時間目に細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびにｅＩＦ５Ａ及びアクチンに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析に供した。切断型ｅＩＦ５Ａの蓄積が観察され得る。
【図４４】アクチノマイシンＤ、ニトロプルシドナトリウム、又はＩＬ−６の離脱による処理を通したアポトーシスの誘導が、ヒト骨髄腫細胞にｅＩＦ５Ａ１の切断型（ｅＩＦ５Ａ１Δ１−６）の蓄積をもたらすことを示した図である。ＫＡＳ−６／１細胞を示されるように処理し、次に２Ｄ−ＰＡＧＥ、及びｅＩＦ５Ａに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析に供した。アクチノマイシンＤ、ＮＯドナー、ニトロプルシドナトリウム、又はＩＬ−６の欠乏を通したＫＡＳ−６／１細胞におけるアポトーシスの誘導は、全て切断型ｅＩＦ５Ａ１の蓄積を誘導した。Ａｄ−Ａ１Δ（２−６）又はＡｄ−Ａ１Δ（２−６）／Ｋ５０Ｒのいずれかを用いる切断型ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、アポトーシスの間に産生される切断型ｅＩＦ５Ａ１（ｅＩＦ５Ａ１Δ１−６）よりも低い等電点を有するｅＩＦ５Ａ１タンパク質の蓄積を誘導したことから、ｅＩＦ５Ａ１Δ１−６にはその他の翻訳後修飾が存在することが示される。
【図４５】ｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ及びｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒは、アポトーシスの間にアクチノマイシンＤにより誘導される切断に対して耐性であることを示した図である。ヒト多発性骨髄腫ＫＡＳ−６／１細胞を示されるように処理し、次に２Ｄ−ＰＡＧＥ、及びｅＩＦ５Ａに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析に供した。過剰発現されたｅＩＦ５Ａ１（Ａｄ−Ａ１）をアクチノマイシンＤによる処理の間に切断に供した。しかしながら、ｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ又はｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒは、アクチノマイシンＤによる処理後の切断に耐性である。これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１のアミノ酸３〜６がカスパーゼ切断部位を構成するという仮説に一致する。
【図４６】ｅＩＦ５Ａ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み替えカスパーゼにより切断されることを示した図である。ヒトｅＩＦ５Ａ１（Ａ１）及び変異ｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ（Ｄ６Ｅ）及びｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒ（Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒ）を、ＨＡ−タグ化タンパク質の発現をもたらすｐＨＭ６ベクター（Roche）にサブクローン化した。ｐＨＭ６−ＨＡ−Ａ１、ｐＨＭ６−ＨＡ−Ａ１（Ｄ６Ｅ）、及びｐＨＭ６−ＨＡ−Ａ１（Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳し（TNT  T7  Quick  Coupled  Transcription/Translation  Systems;  Promega）、次にTranscend  Non-Radioactive  Translation  Detection  Systems（Promega）を用い、製造者の指示に従って標識した。各３マイクロリットルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物を、１マイクロリットルの組み替えカスパーゼ（カスパーゼ１、２、３、６、７、８、９、又は１０；Calbiochem）と共にカスパーゼ反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０％スクロース、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で３７℃にて２時間インキュベートした。最終産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ビオチン化タンパク質をストレプトアビジン−ＨＲＰとのインキュベーション、それに続く化学発光の検出により可視化した。野生型ｅＩＦ５Ａ１は、カスパーゼ２、３、６、７、８、９、及び１０により切断されるが、カスパーゼ１によっては切断されない。ＨＡ−タグ化ｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ及びｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒは、カスパーゼ３、７、及び８によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで効果的に切断されるが、カスパーゼ９及び１０によっては効率的に切断されない。しかしながらこの切断は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系における高度に豊富なカスパーゼ活性、同様にグルタミン酸とアスパラギン酸の間の高い構造類似性による可能性があり、これによって低い効率ではあるが（特にｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ及びｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでの切断には耐性であったことから（図４５））、ｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅの切断が許容される。
【図４７】Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Δ（２−６）又はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲΔ（２−６）によるＨｅｌａ細胞の感染は、野生型Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１又はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒによる感染に比較してアポトーシスの増大をもたらすことを示した図である。ヒト子宮頸癌Ｈｅｌａ  Ｓ３細胞を、異なるアデノウィルスコンストラクトにより、細胞あたり５００感染単位にて感染させた。感染後４８又は７２時間目に細胞を回収し、アネキシンＶ／ＰＩ染色に供した。次に細胞をフローサイトメトリーにより選別した。アポトーシスの初期段階の細胞（アネキシンＶ＋／ＰＩ−）、同様にアポトーシスの後期段階（アネキシンＶ＋／ＰＩ＋）の細胞のパーセンテージを示す。アミノ酸２〜６の切断によってｅＩＦ５Ａ１又はｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒのアポトーシス活性は増大する。逆に、予測される切断部位の変異によってｅＩＦ５Ａ１又はｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒのアポトーシス活性は低下するが、無にはならない。これらの結果は、カスパーゼにより仲介されるｅＩＦ５Ａ１の切断が、ｅＩＦ５Ａ１の切断型のアポトーシス活性を増大させることを示す。
【図４８】アポトーシスにおける、カスパーゼにより仲介されるｅＩＦ５Ａ１の切断の寄与についてのモデルを示した図である。
【図４９】ＫＡＳヒト骨髄腫細胞におけるアクチノマイシンＤ処理後に、切断型ｅＩＦ５Ａが核に蓄積することを示した図である。
【図５０】ＫＡＳヒト骨髄腫細胞におけるアクチノマイシンＤ処理後に、切断型ｅＩＦ５Ａが核に蓄積することを示した図である。略語一覧：ＵＮ＝無処理；ａｃｔＤ＝アクチノマイシンＤによる処理；Ｃ＝細胞質分画；Ｎ＝核分画、α−チューブリン及びα−ＰＣＮＡはコントロールである。この図はまた、完全長ｅＩＦ５Ａは細胞質と核の間に均等に分布するが、切断型は主に核内に蓄積することも示す。
【図５１】ｅＩＦ５Ａの切断型が複数の細胞株及び細胞型において異なるアポトーシス刺激に反応して蓄積することにより、カスパーゼにより仲介されるｅＩＦ５Ａの切断はアポトーシスの間の一般的な現象であることが示されることを示した図である。この図はまた、完全長ｅＩＦ５Ａは細胞質と核の間に均等に分布するが、切断型は主に核内に蓄積することも示す。
【図５２】切断型ｅＩＦ５Ａが、異なる細胞株において異なるアポトーシス刺激［ＫＡＳヒト多発性骨髄腫細胞におけるＩＬ−６の欠乏、又はＩＬ−６及びＦＢＳの欠乏による処理後、並びにＵＡＣＣ１５９８（ヒト卵巣癌細胞株）におけるアクチノマイシンＤによる処理後］に反応して産生されるという研究結果を示した図である。
【図５３】ヒトｅＩＦ５Ａ１及びｅＩＦ５Ａ２のヌクレオチド配列を示した図である。
【００２９】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ｅＩＦ−５Ａ１の切断型をコードする単離されたポリヌクレオチド、同様に切断型ｅＩＦ−Ａ１ポリペプチドを提供する。切断型ｅＩＦ−５Ａ１ポリヌクレオチドは、癌細胞のアポトーシス及び死滅の誘導に有用である。切断型ポリヌクレオチドは発現ベクター内に使用され得り、これは次に哺乳類へ投与される。切断型ｅＩＦ−５Ａは哺乳類内に発現し、癌細胞を死滅させる。約１７ｋＤａである完全長ｅＩＦ−５Ａ１タンパク質に対し、切断型ｅＩＦ−５Ａ１タンパク質は約１６ｋＤＡである。
【００３０】
アポトーシスを起こす細胞内には、ｅＩＦ５Ａのより小さな分子量型（〜１６ｋＤａ）の形成が観察されている。このことは、サイトカインカクテルにより処理されたベータ膵島細胞、及び細胞傷害性薬物のアクチノマイシンＤにより処理されたヒト骨髄腫細胞（ＫＡＳ細胞）において観察されている。図３５を参照されたい。ｅＩＦ５Ａのより小さな分子量型はまた、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１の感染後にアポトーシスを起こしているＨｅＬａ子宮頸癌細胞に蓄積することも見出されており、このことからｅＩＦ５Ａのより小さな分子量型は、選択的スプライシングの結果というよりはプロテアーゼによる切断によるものであると示唆される。ｅＩＦ５Ａのより小さな分子量型の蓄積は完全長ヒプシン化ｅＩＦ５Ａの量の著しい減少を伴うという観察は、ｅＩＦ５Ａのより小さな分子量型が選択的スプライシングというよりは切断によるものであることをさらに支持する。図３６を参照されたい。
【００３１】
本発明は、切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提供する。この組成物は、被験体の癌細胞又は腫瘍にアポトーシスを誘導するために用いられる薬剤の製造に有用である。ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドは、好ましくは図３８に示される配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含んでなる、切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードする。特定の実施形態によれば、ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドは約１６ｋＤＡの切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードする。
【００３２】
組成物及び又は薬剤は、ヒトを含む哺乳類に投与できる。本明細書で用いられる「被験体」は哺乳類及びヒトを含む。
【００３３】
アポトーシスの誘導は、癌細胞又は腫瘍において以下の効果を持ち得る：癌細胞若しくは腫瘍の生育を遅くする、癌細胞若しくは腫瘍の生育を停止する、又は癌細胞を死滅させるか若しくは腫瘍サイズを縮小させる、及び上記のいずれの組み合わせ。いずれの癌も治療でき、特定の実施形態によれば、癌は多発性骨髄腫である。
【００３４】
特定の実施形態によれば、ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドは配列番号３８（図４１に示される）に記載の配列を含んでなる。特定の実施形態によれば、ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドはプラスミド又は発現ベクター内に構成される。プラスミド又は発現ベクターについては、以下にさらに詳しく記載される。特定の実施形態によれば、発現ベクターはアデノウィルス発現ベクター又はｐＨＭ６である。特定の実施形態によれば、組成物又は薬剤が多発性骨髄腫の治療に使用される場合、発現ベクターはＢ細胞特異的プロモーター（すなわちＢ２９）のような組織特異的プロモーターを含んでなる。発現ベクターはｐＣｐＧプラスミドを含んでなってよい。以下にさらに詳しく考察されるように、発現ベクターはポリエチレンイミンと複合されてよい。
【００３５】
組成物又は薬剤は、好ましくは腫瘍内、静脈内、又は皮下投与される。
【００３６】
本発明はまた、ポリヌクレオチドが配列番号３８（図４１に示される）に記載の配列を含んでなる、切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００３７】
本発明はまた、切断型タンパク質が配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含んでなる、切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００３８】
以下に考察されるように、ｅＩＦ５Ａ１はカスパーゼにより仲介される切断によって形成される。従って本発明はさらに、カスパーゼにより仲介されるｅＩＦ５Ａ１の切断によって形成される、単離された切断型ｅＩＦ５Ａ１ポリペプチドを提供する。
【００３９】
本発明はさらに、組成物、又は切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドを、完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドと組み合わせて含んでなる薬剤の製造のための該組成物の使用を提供する。この組成物は、被験体の癌細胞又は腫瘍にアポトーシスを誘導する薬剤の製造に有用である。切断型ｅＩＦ５Ａタンパク質をコードするｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドについては上述の通りである。完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする。完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドについては、以下にさらに詳しく記載される。特定の実施形態によれば、ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドは配列番号３８に記載の配列を含んでなり、完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドは配列番号４３（図５３に示される）に記載の配列を含んでなる。
【００４０】
本明細書に記載されるように、完全長及び切断型ポリヌクレオチドは発現ベクター内に存在してよい。加えてベクターは、本明細書に記載されるプロモーター、同様にその他のいずれの有用なプロモーターを含んでなってよい。
【００４１】
特定の実施形態によれば、完全長ｅＩＦ５Ａポリヌクレオチドは変異ｅＩＦ５Ａ１をコードし、ここで該変異はデオキシヒプシンシンターゼによるヒプシン化を阻止若しくは阻害し、並びに／又は、該変異はユビキチン化部位及び／若しくはアセチル化部位に存在する。変異については、以下にさらに詳しく記載される。特定の実施形態によれば、変異はＫ５０Ａ、Ｋ５０Ｒ、Ｋ６７Ａ、Ｋ４７Ｒ、Ｋ６７Ｒ、Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ、Ｋ５０Ａ／Ｋ４７Ｒ、Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ｒ、Ｋ５０Ｒ／Ｋ６７Ａ、Ｋ５０Ｒ／Ｋ４７Ｒ、Ｋ５０Ｒ／Ｋ６７Ｒ、及びＫ４７Ａ／Ｋ６７Ａからなる群より選択される。
【００４２】
本発明はまた、切断型ｅＩＦ５Ａをコードするポリヌクレオチド、変異ｅＩＦ５Ａをコードするヌクレオチド、及びｅＩＦ５Ａの３’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡを含んでなる組成物を提供する。変異ｅＩＦ５Ａをコードするヌクレオチド、及びｅＩＦ５Ａの３’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡの組み合わせ／二元的使用については、以下にさらに完全に記載される。該組成物は、癌細胞及び腫瘍にアポトーシスを誘導するため、被験体に投与される薬剤の製造に有用である。
【００４３】
特定の好ましい実施形態によれば、ｓｉＲＮＡはｅＩＦ５Ａ１の配列である５’−ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＣ  Ａ−３’を標的とする。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡであり、ｄｓＲＮＡの一本の鎖は５’−ＧＣＵ  ＧＧＡ  ＣＵＣ  ＣＵＣ  ＣＵＡ  ＣＡＣ  Ａ−３’の配列を含んでなる。特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは血清中での分解を阻止するために安定化される。
【００４４】
完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチド及び／又は切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａポリヌクレオチドは、発現ベクター内に存在してよい。特定の実施形態によれば、完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチド及び／又は切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａポリヌクレオチド及び／又はｓｉＲＮＡは、ポリエチレンイミンと複合される。完全長ｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチド及び／又は切断型ｅＩＦ５Ａ１タンパク質をコードするｅＩＦ５Ａポリヌクレオチド及び／又はｓｉＲＮＡは、独立してポリエチレンイミンと複合される。
【００４５】
本発明はまた、本明細書に記載される、例えば切断型ｅＩＦ５Ａ１をコードするヌクレオチドを含んでなり、任意に完全長ｅＩＦ５Ａをコードするヌクレオチド又は完全長変異ｅＩＦ５Ａをコードするヌクレオチドを含んでなり、かつ任意にｅＩＦ５Ａの３’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡを含んでなる組成物又は薬剤を哺乳類に提供することによる、哺乳類の癌細胞又は哺乳類の腫瘍にアポトーシスを誘導する方法も提供する。特定の実施形態によれば、癌は多発性骨髄腫であり、組成物／薬剤は静脈内、腹腔内、又は腫瘍内投与される。
【００４６】
本発明はまた、被験体内での内在性遺伝子の発現をノックアウト又はノックダウンするための、内在性遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、及び、ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質をホスト内で発現させるために被験体へ提供される、送達媒体／発現ベクター内の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを組み合わせた使用にも関する。
【００４７】
この組み合わせは、欠陥又は変異のあるタンパク質の存在、すなわち被験体内で産生されたタンパク質が、その欠陥のある構造のために、必要な機能を実行できないか、又は代わりに代謝経路若しくは生体分子の相互作用を不調にすることにより起こる、疾病又は状態を有する被験体の治療に有用である。ｓｉＲＮＡは欠陥のあるタンパク質をコードする遺伝子を標的として設計され、その欠陥のあるタンパク質の発現をノックダウン又はノックアウトする。正常な（欠陥のない）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが被験体に投与され、正常なタンパク質がその必要な機能を実行できるように被験体内で発現する。
【００４８】
別の実施形態によれば、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与の代わりに、被験体へタンパク質が投与される。本明細書では、タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドの語は互換的に用いられる。
【００４９】
ｓｉＲＮＡは、欠陥のあるタンパク質の内在性の発現をノックダウン又はノックアウトするが、同時に投与された正常タンパク質をコードするポリヌクレオチドの外来性の発現に影響しないような遺伝子の特定の領域を標的として好ましく設計される。例えばｓｉＲＮＡは、投与されたセンスコンストラクト（タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の外来性の発現に影響しないように、３’ＵＴＲを標的とし得る。欠陥のあるタンパク質の内在性の発現をノックダウン又はノックアウトすることにより、外来性のポリペプチドから発現する正常タンパク質と競合する欠陥のあるタンパク質は、減少するか又は無になるであろう。
【００５０】
この応用が有用となり得る疾病状態の一例は、鎌状赤血球貧血に関する。鎌状赤血球貧血は、赤血球（red  blood  cell：ＲＢＣ）に見出され、身体全体への酸素の運搬を補助するタンパク質であるヘモグロビンに影響を及ぼす血液疾患である。
【００５１】
鎌状赤血球貧血は、ヒトが変異ヘモグロビン（Ｈｂｓ）の発現をもたらす２つの異常な遺伝子（各両親から１つずつ）を受け継いだ際に発生する。変異ヘモグロビンは、ＲＢＣの形を変える原因となる。正常ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ、又はＨｂＡ）を有する赤血球は血流を通して容易に移動し、身体の全ての細胞に酸素を送達する。これらは、非常に微小な血管であっても容易に「圧搾」して通り抜けることができる。鎌状赤血球貧血は、ヘモグロビンの異常型（ＨｂＳ）が、共に凝集する傾向があり、赤血球を粘着性で、堅く、さらに脆弱にさせること、かつそれらを曲がった鎌状にさせることから起こる。
【００５２】
数百のＨＢＢ遺伝子の変異形が知られているが、鎌状赤血球貧血は、最も一般的にはヘモグロビン変異形ＨｂＳにより引き起こされる。この変異形では、疎水性アミノ酸のバリンが、ＨＢＢポリペプチド鎖の６番目のアミノ酸の位置における親水性のグルタミン酸に取って代わる。この置換によりタンパク質構造の外側に疎水性の点が作り出され、これは隣接するヘモグロビン分子のベータ鎖の疎水性領域に固着する。ＨｂＳ分子がこのように共に凝集（重合）することによって強固な線維となり、赤血球を「鎌状」にする。
【００５３】
重合は、赤血球が身体全体の様々な組織に運搬する酸素分子を放出した後のみに起こる。ヘモグロビンが酸素を結合できる場である肺に赤血球がいったん帰還すると、ＨｂＳの長い線維は脱重合するか、又は単一の分子に分裂する。重合と脱重合の間の循環により、赤血球の膜は強固になる。これらの赤血球の剛性、及び酸素を運搬しないときのそれらの歪んだ形は、微小血管の封鎖をもたらし得る。この封鎖は疼痛の発現の原因となり得り、かつ臓器を損傷し得る。
【００５４】
鎌状赤血球貧血は、常染色体劣性遺伝疾患である。疾病が発現するためには、ヒトは２コピーのＨｂＳ変異形、又は１コピーのＨｂＳ及び１コピーの別の変異形のいずれかを受け継ぐ必要がある。１コピーの正常ＨＢＢ遺伝子（ＨｂＡ）及び１コピーのＨｂＳを有する保因者は、鎌状細胞の形質を有すると説明され、疾病の症状を表さない。
【００５５】
従って本発明の一実施形態は、鎌状赤血球貧血を有する被験体を治療する方法を提供する。患者には、ＨＢＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが投与される。ｓｉＲＮＡは、ヘモグロビンのＨｂＳ変異形の発現をノックダウン、好ましくはノックアウトするように設計される。被験体が正常ヘモグロビンを発現するように、被験体へ正常ヘモグロビンをコードするポリヌクレオチドが提供される。ｓｉＲＮＡはまた、正常ヘモグロビンをコードする外来性ポリヌクレオチドの発現に干渉しないようにも設計される。従って、被験体はもはや変異ヘモグロビンを作らず（又は実質的に少なく作り）、代わりに正常健常ヘモグロビンを作ることによって、正常に機能するさらに正常な赤血球がもたらされる。
【００５６】
本発明はまた、タンパク質に、疾病状態を引き起こすか又は導く翻訳後修飾が起こる状況においても有用である。ｓｉＲＮＡは内在性タンパク質の発現をノックダウンするために用いられ、これにより翻訳後修飾されるものは無くなるか又は少なくなる。次に外来性発現のために、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが患者へ提供される。タンパク質は、翻訳後修飾できないように改変される。次にこのタンパク質はその適切な使用のために身体に利用可能であるが、翻訳後修飾できないために疾病状態を導き得ない。当業者は異なる翻訳後修飾について理解するであろう。例えば翻訳後、アミノ酸の翻訳後修飾は、タンパク質に酢酸塩、リン酸塩、様々な脂質及び炭水化物のようなその他の生化学官能基を付着させることにより、アミノ酸の化学的性質を変化させることにより（例えばシトルリン化）、又はジスルフィド架橋の形成のように構造を変化させることにより、タンパク質の機能の範囲を拡張する。また、酵素はタンパク質のアミノ末端からアミノ酸を除くか、又は中間でペプチド鎖を切断し得る。例えばペプチドホルモンのインスリンは、ジスルフィド結合の形成後に２度切断され、鎖の中間からプロペプチドが除かれ；得られたタンパク質はジスルフィド結合によって連結する２つのポリペプチド鎖から成る。また、最も新生のポリペプチドはアミノ酸のメチオニンから始まるが、これはｍＲＮＡの「開始」コドンもまた、このアミノ酸をコードするためである。このアミノ酸は通常、翻訳後修飾の間に取り除かれる。リン酸化のようなその他の修飾は、タンパク質の作用を制御するための共通機構、例えば酵素の活性化又は不活性化の一部である。別の翻訳後修飾は、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）による真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ５Ａ）のヒプシン化を含む。
【００５７】
従って本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが患者へ提供され、かつ患者に発現される、被験体内の遺伝子の発現を変化させる方法を提供する。タンパク質は正常／野生型タンパク質、又は変異したタンパク質であってよい。対応する内在性遺伝子の発現は、被験体へ投与されるｓｉＲＮＡによって抑制される。
【００５８】
該方法はさらに、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるコンストラクトを提供することを含んでなり、該ポリヌクレオチドは標的タンパク質を産生するために被験体内に発現される。内在遺伝子が欠陥のあるタンパク質を発現する特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは正常／健常タンパク質のいずれかをコードするように設計される。ｓｉＲＮＡは欠陥のある内在性タンパク質の発現を抑制するために投与される。内在遺伝子が正常健常タンパク質を発現する特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、正常／健常タンパク質又は非変異タンパク質に起こるような翻訳後修飾のできない変異タンパク質をコードするように設計される。ｓｉＲＮＡは内在性タンパク質の発現を抑制するために投与され、翻訳後修飾に利用できるこのタンパク質は減少する。
【００５９】
特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは外来性ポリヌクレオチドの発現に影響しないような遺伝子の領域を標的として選択又は設計される。例えばｓｉＲＮＡは３’ＵＴＲ又は３’末端を標的としてよい。
【００６０】
ｓｉＲＮＡは、ネイキッドｓｉＲＮＡ又は血清に対して安定化されたネイキッドｓｉＲＮＡのいずれかとして患者へ送達され得る。ｓｉＲＮＡは全身性に、すなわちＩＰ又はＩＶのいずれかにより注射され得る。あるいは、ｓｉＲＮＡは身体の望まれる領域へ局所的に注射又は送達され得る。特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、限定はされないがデンドリマー、リポソーム、又はポリマーのような送達ビヒクルにおいて投与され得る。
【００６１】
所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの発現を提供するか又は許容するいずれの送達手段を通して投与され得る。本明細書で、ポリヌクレオチド及びヌクレオチドの語は互換的に用いられる。送達は、限定はされないがプラスミド、発現ベクター、ウィルス性コンストラクト、アデノウィルスコンストラクト、デンドリマー、リポソーム、又はポリマーのような、いずれのウィルス性又は非ウィルス性機構を通してよい。
【００６２】
特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドの発現のために、還元型ＣｐＧジヌクレオチドを有する発現プラスミドが用いられる。ポリヌクレオチドの発現を促進できるいずれのプロモーターも使用されてよく、これは治療法に望まれる応用に基づいて選択され得る。例えば、多発性骨髄腫を死滅させるためには、ヒトＢ２９プロモーター／エンハンサーのようなＢ細胞に特異的なプロモーターが望ましいであろう。別の実施形態によれば、プロモーターは別の組織特異的プロモーターであってよいか、又はシステムプロモーターであってよい。標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＶ若しくは皮下注射、又はその他のいずれの生物学的に適した送達機構を通して送達され得る。あるいはポリヌクレオチドは、リポソーム、又は標的腫瘍若しくは癌細胞へのＤＮＡ（又はプラスミド若しくは発現ベクター）送達のために提供される、その他のいずれの適切な「担体」又は「ビヒクル」において送達され得る。合成ＤＮＡ送達系についての総説は、例えばLuo,  Dan,  et  al,  Nature  Biotechnology,  Vol.  18,  January  2000,  pp.  33-37を参照されたい。従って、ヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターは、リポソーム、デンドリマー、又は同様の無毒性ナノ粒子のような、ナノメートルサイズのビヒクルを通して送達されることが好ましい可能性がある。ビヒクルは、好ましくは、有効量のヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを被験体、腫瘍、又は癌細胞へ送達する間、ヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを早期クリアランスから、又は免疫反応の原因から保護する。典型的なビヒクルは、ヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターに付随する単純なナノ粒子から、特異的な細胞受容体を標的とするためにその表面に付着するリガンドを有するペグ化リポソームのような、さらに複雑なペグ化ビヒクルまでに及び得る。
【００６３】
リポソーム及びペグ化リポソームは当該技術分野において公知である。従来のリポソームでは、送達される分子（すなわち小分子薬、タンパク質、ヌクレオチド、又はプラスミド）はリポソームの中央の腔内に含まれる。当業者は、分子送達に有用な「ステルス」標的化、及び陽イオンリポソームの存在もまた認識するであろう。例えば、Hortobagyi,  Gabriel  N.,  et  al,  J.  Clinical  Oncology,  Vol.  19,  Issue  14  (July)  2001  :3422-3433  及び  Yu,  Wei,  et  al.,  Nucleic  Acids  Research.  2004,  32(5);e48を参照されたい。リポソームは静脈内に注射でき、かつそれらの表面がさらに親水性になるように修飾でき（二重層へのポリエチレングリコールの添加（「ペグ化」）により）、血流でのそれらの循環時間は増大する。これらは「ステルス」リポソームとして知られ、ドキソルビシン及びミトキサントロンのような親水性（水溶性）の抗癌剤に対する担体として特に有用である。腫瘍細胞のような標的細胞へ薬物を運搬するリポソームの特異的な結合特性を促進するために、リポソームの表面に抗体、タンパク質、ペプチドなどのような特異的分子が付着され得る。例えば、癌細胞の表面にある受容体に対する抗体が、リポソームを癌細胞に向けるために使用されてよい。多発性骨髄腫を標的にする場合、リポソームを多発性骨髄腫細胞に向けるために、例えば葉酸塩、Ｉｌ−６、又はトランスフェリンが使用されてよい。
【００６４】
デンドリマーもまた当該技術分野において公知であり、好ましい送達ビヒクルを提供する。デンドリマーについての考察は、例えば、Marjoros,  Istvan,  J.,  et  al,  "PAMAM  Dendrimer-Based  Multifunctional  Conjugate  for  Cancer  Therapy:  Synthesis,  Characterization,  and  Functionality,"  Biomacromolecules,  Vol.  7,  No.  2,  2006;  572-579,  及び  Majoros,  Istvan  J.,  et  al.,  J.  Med.  Chem,  2005.  48,  5892-5899を参照されたい。
【００６５】
好ましい実施形態によれば、送達ビヒクルはポリエチレンイミンナノ粒子を含んでなる。典型的なポリエチレンイミンナノ粒子は、現在Polyplus  Transfection,  Incにより製造されるin  vivo-jetPEI（商標）である。In  vivo-jetPEI（商標）は、ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの送達薬剤として有用な陽イオンポリマートランスフェクション剤である。Polyplus  Transfectionから市販されているIn  vivo-jetPEI（商標）は、動物において信頼性のある核酸送達を提供する直鎖ポリエチレンイミン試薬である。これは遺伝子治療（Ohana  et  al,  2004.  Gene  Ther  Mol  Bio  8:181-192;  Vernejoul  et  al,  2002.  Cancer  Research  62:6124-31）、ＲＮＡ干渉（Urbain-Klein  et  al.,  2004.  Gene  therapy  23:1-6;  Grezelinski  et  al.,  2006.  Human  Gene  Therapy  17:751-66）、及び遺伝子ワクチン接種（Garzon  et  al.,  2005.  Vaccine  23:1384-92）に用いられる。In  vivo  JET-PEIは現在、癌の遺伝子治療のための送達ベクターとしてヒトの治験に使用されている（Lemkine  et  al.,  2002.  Mol.  Cell.  Neurosci.  19:165-174）。
【００６６】
In  vivo-jetPEI（商標）は核酸をおおよそ５０ｎｍのナノ粒子に凝縮し、これは数時間安定である。この独特な保護機構の結果として、注射後の血液細胞の凝集は、組織内での制限された拡散、赤血球の凝集、及び微小塞栓を防止するその他の試薬に比較して減少する。これらのナノ粒子は、組織内へ拡散し、エンドサイトーシスによって細胞へ入るためには十分に小さい。In  vivo-jetPEI（商標）は、エンドソームからの核酸の放出及び核膜を横断しての移動を支持する。
【００６７】
好ましい実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ、及びポリヌクレオチドを含んでなるベクター／プラスミドの両方が、in  vivo-jetPEI（商標）複合体を通して被験体に投与される。ｓｉＲＮＡ、及びポリヌクレオチドを含んでなるベクター／プラスミドは、ポリエチレンイミン又はin  vivo-jetPEI（商標）複合体のようなポリマー複合体を通して共に複合されてよいか、又は別々にポリマーと複合されてよい。例えば、ｓｉＲＮＡ、及びポリヌクレオチドを含んでなるベクター／プラスミドが別々に被験体へ投与される場合（時間及び／又は送達部位が別々であるという意味で）には、異なる担体と複合されたｓｉＲＮＡ及びポリヌクレオチドを用意することが好ましい。同一部位において同時に投与され得る場合には、ｓｉＲＮＡ及びポリヌクレオチドを共に複合することが好ましい。
【００６８】
別の実施形態によれば、被験体内で発現され得るポリヌクレオチドを送達するために投与されるプラスミド又はベクターの代わりに、タンパク質それ自体が被験体へ送達される。タンパク質は単離されてよいか、又は合成されてよい。
【００６９】
本発明の一実施形態は、哺乳類及びヒトを含む被験体の癌を治療する方法を提供する。癌の治療は、癌細胞におけるアポトーシスの誘導、癌細胞の死滅、癌細胞の数の減少、及び腫瘍容積／重量の減少を含むがこれらに限定されない。該方法は、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ及び変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドを含んでなる組成物を投与することを含んでなる。組成物並びにｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ及び変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドについては以下で考察する。
【００７０】
全ての細胞は真核生物翻訳開始因子５Ａ（「ｅＩＦ−５Ａ」）（又は、本明細書では「因子５Ａ」とも称される）を産生する。哺乳類細胞は、ｅＩＦ−５Ａ１の２つのアイソフォーム（ｅＩＦ−５Ａ１及びｅＩＦ−５Ａ２）を産生する。ｅＩＦ−５Ａ１はアポトーシスを起こしている細胞内で上昇していることから、アポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａと称されている。ヒトｅＩＦ−５Ａ１は受入番号ＮＭ００１９７０を有し、図１に示される。ｅＩＦ−５Ａ１は、アポトーシスに必要なタンパク質をコードするｍＲＮＡの核サブセットの核外輸送の原因であると信じられている。ｅＩＦ−５Ａ２は、細胞増殖に必要なタンパク質をコードするｍＲＮＡの核サブセットの核外輸送の原因であると信じられていることから、増殖ｅＩＦ−５Ａと称されている。Liu  &  Tartakoff  (1997)  Supplement  to  Molecular  Biology  of  the  Cell,  8,  426a.  Abstract  No.  2476,  37th  American  Society  for  Cell  Biology  Annual  Meeting,  及び  Rosorius  et  al.  (1999)  J.  Cell  Science,  112,  2369-2380を参照されたい。
【００７１】
両方の因子５Ａは、デオキシヒプシンシンターゼ（「ＤＨＳ」）により翻訳後修飾される。ＤＨＳはｅＩＦ−５Ａをヒプシン化する。独特なアミノ酸であるヒプシンは調べられた全ての真核生物及び古細菌に見出されるが、真正細菌には見出されず、ｅＩＦ−５Ａは知られている唯一のヒプシン含有タンパク質である。Park  (1988)  J.  Biol.  Chem.,  263,  7447-7449;  Schumann  &  Klink  (1989)  System.  Appl.  Microbiol,  11,  103-107;  Bartig  et  al.  (1990)  System.  Appl.  Microbiol,  13,  112-116;  Gordon  et  al  (1987a)  J.  Biol.  Chem.,  262,  16585-16589。ヒプシン化ｅＩＦ−５Ａは２つの翻訳後工程によって形成され：第１工程は、デオキシヒプシンシンターゼにより触媒される、スペルミジンの４−アミノブチル成分の、前駆体ｅＩＦ−５Ａの特定のリジンのα−アミノ基への転移による、デオキシヒプシン残基の形成である。第２工程は、ヒプシンを形成するための、デオキシヒプシンヒドロキシラーゼによるこの４−アミノブチル成分のヒドロキシル化に関する。
【００７２】
ｅＩＦ−５Ａのアミノ酸配列は種の間でよく保存されており、ｅＩＦ−５Ａのヒプシン残基周囲のアミノ酸配列は厳密に保存されていることから、この修飾は生存のために重要であるかもしれないことが示唆される。Park  et  al.  (1993)  Biofactors,  4,  95-104。この仮定は、これまでに酵母に見出されたｅＩＦ−５Ａの両方のアイソフォームの不活性化、又はその活性化によって第１工程を触媒するＤＨＳ遺伝子の不活性化が細胞分裂を遮断するという観察により、さらに支持される。Schnier  et  al  (1991)  Mol  Cell.  Biol,  11,  3105-3114;  Sasaki  et  al  (1996)  FEBS  Lett.,  384,  151-154;  Park  et  al  (1998)  J.  Biol.  Chem.,  273,  1677-1683。しかしながら、酵母におけるｅＩＦ−５Ａタンパク質の枯渇がもたらしたものは総タンパク質合成のわずかな減少のみであったことから、ｅＩＦ−５Ａはタンパク質の全体的な合成よりも、ｍＲＮＡの特定のサブセットの翻訳のために必要とされ得ることが示唆される。Kang  et  al.  (1993),  "Effect  of  initiation  factor  eIF-5A  depletion  on  cell  proliferation  and  protein  synthesis,"  in  Tuite,  M.  (ed.),  Protein  Synthesis  and  Targeting  in  Yeast,  NATO  Series  H。ｅＩＦ−５Ａを結合するリガンドがより高く保存されたモチーフを共有するという最近の知見もまた、ｅＩＦ−５Ａの重要性を支持する。Xu  &  Chen  (2001)  J.  Biol.  Chem.,  276,  2555-2561。加えて、修飾されたｅＩＦ−５Ａのヒプシン残基が配列特異的なＲＮＡの結合に必須であることが見出され、かつ結合によってリボヌクレアーゼからは保護されなかった。
【００７３】
本発明者らは、ｅＩＦ−５Ａをコードするポリヌクレオチドを細胞に投与した際、それらの細胞でアポトーシスが増大することを示した。投与後に癌細胞内で発現するｅＩＦ−５Ａ１ポリヌクレオチドを投与することによって、癌細胞をアポトーシスへ押しやることが可能であることが示された。全てそれらの全体が参照により取り込まれる、同時係属出願の１０／２００，１４８号；１１／２８７，４６０号；１１／２９３，３９１号、及び１１／６３７，８３５号を参照されたい。
【００７４】
本発明者らは、細胞に因子５Ａのヒプシン化型が蓄積される際に細胞は生存状態に入り、通常は時間と共に起こるアポトーシスが起こらないことをさらに特定した。特に癌細胞には著しい量の因子５Ａのヒプシン化型が存在することから、細胞はアポトーシスを起こさない（死滅しない）。従って、癌細胞を死滅させること（癌細胞をアポトーシス経路へ押しやること）によって癌を治療するために、ｅＩＦ−５Ａ１をコードするポリヌクレオチドが被験体へ、又は癌細胞若しくは腫瘍へ投与され、癌細胞にアポトーシス、最終的には細胞死及び腫瘍の縮小を順に引き起こすｅＩＦ−５Ａ１の発現が増大される。しかしながらｅＩＦ−５Ａ１の遺伝子発現の上昇のためにｅＩＦ−５Ａ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドのみが供給され、ｅＩＦ−５Ａ１の内在性発現をノックダウンするためのｓｉＲＮＡが使用されない場合には綱引き：細胞をアポトーシス経路へ向けるｅＩＦ−５Ａ１の発現と、細胞を細胞生存経路へ向けるヒプシン化因子５Ａの存在が競合する状態となる。本発明はこの綱引きを排除し、ｅＩＦ−５Ａ１の発現の増大のみによる改良を示す。被験体又は細胞へ投与されたポリヌクレオチドは、得られる発現タンパク質がヒプシン化され得ないように変異導入される。加えて、因子５Ａの内在性発現はｅＩＦ−５Ａを標的とするｓｉＲＮＡによってノックアウト／ダウンされ、ヒプシン化される内在性ｅＩＦ−５Ａ１は周囲に存在しなく／少なくなる。従って、細胞内にヒプシン化ｅＩＦ−５Ａが存在しない（又は実質的に少ない）ため、細胞は生存状態に押しやられることはない。
【００７５】
変異ｅＩＦ−５Ａ１をコードするポリヌクレオチドは、ヒプシン化されず、それ故細胞を生存状態にするために利用され得ないように好ましく変異導入される。例えば一実施形態によれば、ｅＩＦ−５Ａをコードするポリヌクレオチドは、通常はＤＨＳによりヒプシン化される位置５０のリジン（Ｋ）がアラニン（Ａ）（ヒプシン化され得ない）に変わるように変異導入される。この変異体はＫ５０Ａと表示される。
【００７６】
別の実施形態によれば、位置６７のリジンがアルギニン（Ｒ）に変更される。この変異体は（Ｋ６７Ｒ）と表示される。別の実施形態によれば、位置６７のリジン（Ｋ）がアラニン（Ａ）に変更され、これは（Ｋ６７Ａ）と表示される。別の実施形態によれば、位置５０のリジン（Ｋ）がアルギニンに変更され（Ｋ５０Ｒ）、別の実施形態によれば、位置４７のリジン（Ｋ）がアルギニンに変更される（Ｋ４７Ｒ）変異体が提供される。
【００７７】
別の実施形態によれば、二重変異体が使用される。一つの二重変異体では位置５０のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に変更され、かつ位置６７のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に変更される。この二重変異体はＫ５０Ｒ／Ｋ６７Ｒと称される。この二重変異体も同様にヒプシン化不可能であるが、このアミノ酸の変更は、ｅＩＦ−５Ａ１の３−Ｄ構造を単一変異体（Ｋ５０Ａ)ほどには変化させない。従って二重変異体は野生型に非常に類似した３−Ｄの形及びフォールディングのタンパク質を提供し、それ故に単一変異体よりもさらに安定である。さらに安定になることで、これは体内により長く存在して、治療上の利点をより長く提供する。従って、身体が正常細胞機能に必要とされるがヒプシン化され得ない因子５Ａを有し得ることから、細胞は細胞生存状態にならず、かつアポトーシスを回避しない。
【００７８】
別の二重変異体では位置４７のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に変更され、かつ位置５０のリジンがアルギニン（Ｒ）に変更される。この二重変異体は（Ｋ４７Ｒ／Ｋ５０Ｒ）と表示される。本発明は、位置５０のリジン（Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更され、かつ位置６７のリジンがアラニン（Ａ）に変更される、別の二重変異体を提供する。この二重変異体は（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）と表示される。
【００７９】
身体は正常細胞の生存及び健常細胞の増殖のために因子５Ａを必要とすることから、ｓｉＲＮＡが全身性に送達される場合、ｓｉＲＮＡによって被験体内の発現を完全に遮断しないことが好ましい。ｅＩＦ−５Ａ発現の制御は、発現の遮断に良好ではない（すなわち、発現を停止又は減少させるが、発現を完全には遮断しない）ｓｉＲＮＡを使用すること、又は代わりに、健常細胞の正常な生育及び機能を許容しかつ癌性細胞をアポトーシスへ押しやるために、発現レベルのバランスを取る投薬及び／又は治療計画を利用することのいずれかによって達成できる。
【００８０】
あるいは、ｓｉＲＮＡの局所送達が利用されてよい。ｓｉＲＮＡが癌細胞又は腫瘍へ局所的に送達された場合、発現は好ましくノックアウトされる。発現をノックアウトすることにより、ヒプシン化可能な因子５Ａは周囲に存在しなくなり、従って細胞を生存状態にするヒプシン化ｅＩＦ−５Ａは存在しなくなる。ｓｉＲＮＡは癌又は腫瘍へ局所的に送達されることから、通常の細胞生育に利用可能なｅＩＦ−５Ａを有する必要はない。
【００８１】
特定の実施形態によれば、内在性遺伝子はｅＩＦ５Ａ１である。内在性ｅＩＦ−５Ａ１の発現を抑制するため、被験体へｅＩＦ５Ａ１を標的とするｓｉＲＮＡが投与される。特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは配列番号１又は配列番号２を含んでなるか、又は内在性ｅＩＦ−５Ａ１の発現を抑制し得る、ｅＩＦ５Ａ１を標的とするいずれのｓｉＲＮＡである。特定の実施形態によればｅＩＦ５Ａ１はヒトｅＩＦ−５Ａ１（図１に示す）であり、被験体はヒトである。ヒトｅＩＦ−５Ａ１を標的とするその他のｓｉＲＮＡは公知であり、同時係属出願の１１／１３４，４４５号；１１／２８７，４６０号；１１／１８４，９８２号；１１／２９３，３９１号；１１／７２５，５２０号；１１／７２５，４７０号；１１／６３７，８３５号に開示される。別の実施形態によれば被験体は哺乳類であり、ｅＩＦ５Ａ１は哺乳類に対して特異的である。例えば被験体はイヌであり、ｅＩＦ５Ａ１はイヌｅＩＦ５Ａ１である。特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは図２５に示されるｓｉＲＮＡコンストラクトから本質的になる。例えば、ｓｉＲＮＡはｅＩＦ５Ａ１を標的とする核酸を含むが、Ｕ又はＴ核酸のような突出もまた含むか、又はｈｉｓタグ（ＨＡタグとも呼ばれ、しばしばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究に用いられる）のようなタグもまた含む。ｓｉＲＮＡコンストラクトが標的遺伝子の発現を減少可能である限り、５’又は３’末端のいずれか（又は例えば図２５に示される核酸の連続鎖の内側であっても）に付着する分子又はさらなる核酸が含まれてよく、「本質的になる」の範囲内となる。好ましくはｓｉＲＮＡは、外来性ポリヌクレオチドの発現に影響しないようなｅＩＦ５Ａ１遺伝子の領域を標的とする。例えば、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは３’ＵＴＲ又は３’末端を標的とする。図２５に示すｓｉＲＮＡは、典型的なｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡである。
【００８２】
ポリヌクレオチドはｅＩＦ５Ａ１をコードし、ここで該ポリヌクレオチドはｅＩＦ５Ａ１変異形をコードするように変異導入される。変異ｅＩＦ５Ａ１は、変異形ｅＩＦ５Ａ１が翻訳後修飾され得ないように（ヒプシン化され得ないように）設計される。典型的な変異体については上に考察される。
【００８３】
固形癌に関与する癌の場合、ｓｉＲＮＡを直接腫瘍へ送達することが望ましい可能性がある。ｓｉＲＮＡは、時間、同様に送達部位に関してポリヌクレオチドとは別に投与されてよいか、又は、同時及び／若しくは同じ送達部位において共に投与されてよい。当業者はｓｉＲＮＡの投与のタイミングについて、内在性タンパク質が翻訳される時に投与され、それが既に行われた後ではないことが必要な可能性があることを理解するであろう。
【００８４】
本発明者らは以前にｅＩＦ５Ａ１が正常組織に対して無毒であることを示したが（その全体が参照により本明細書に取り込まれる、２００５年１１月２８日に提出した係属出願１１／２９３，３９１号を参照）、送達複合体が（ｅＩＦ５Ａポリヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターの直接投与に比較して）好ましい可能性がある。好ましい送達系は有効量のｅＩＦ５Ａ１を被験体、腫瘍、又は癌細胞群へ提供し、同様に腫瘍又は癌細胞群への標的送達を好ましく提供する。従って特定の実施形態によれば、ｅＩＦ５Ａ１ヌクレオチド／プラスミド／発現ベクターを、リポソーム、デンドリマー、又は類似の無毒性ナノ粒子、例えばポリエチレンイミンポリマー（例えばin  vivo  JetPEI（商標）複合体）のようなナノメートルサイズのビヒクルを通して送達することが好ましい。
【００８５】
ｅＩＦ５Ａ１タンパク質もまた、腫瘍部位へ直接送達されてよい。当業者はｅＩＦ５Ａ１タンパク質送達の用量及び治療計画期間を決定できるであろう。
【００８６】
ｅＩＦ５Ａ１によるアポトーシス誘導の分子的基盤について以下に考察する。
【００８７】
デスレセプターのシグナル伝達
Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１（野生型ｅＩＦ５Ａ１を有するアデノウィルス）又はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による癌細胞の処理により、デスレセプター−リガンド結合により開始されるカスパーゼ８、及び実行カスパーゼであるカスパーゼ３の活性化が誘導される。これらはｅＩＦ５Ａ１の間接的な効果であると考えられ、カスパーゼ８及びカスパーゼ３はヒプシン化され得ないｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）による処理後にも活性化されるという事実から、この効果はリジン５０ｅＩＦ５Ａ１に起因し得ることが示される。Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１による処理はまた、ＴＮＦＲ１の上昇によって以前に示されたように、デスレセプターの上昇ももたらすと思われる。
【００８８】
ミトコンドリア経路
アポトーシスへと向かうミトコンドリア経路におけるリジン５０ｅＩＦ５Ａ１の直接又は間接の関与は、ｅＩＦ５Ａ１又はｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）のいずれかによる癌細胞の処理によってカスパーゼ９が活性化されるという知見を含む幾つかの観察によって支持される。同様に、ミトコンドリアのアポトーシス経路の活性化に役割を果たすｐ５３もｅＩＦ５Ａ１により制御されると思われる。例えば、癌細胞のアクチノマイシンＤによる処理はｐ５３の発現を上昇させ、このｐ５３の上昇はｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡによって阻害される。これと一致して、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１による癌細胞の処理はｐ５３ｍＲＮＡを上昇させる。癌細胞のｅＩＦ５Ａ１による処理はまた、Ｂａｘのサイトゾルからミトコンドリアへの移動も誘導し、これによってミトコンドリア膜電位の減少及びミトコンドリア内腔からサイトゾルへのチトクロムＣの放出が保証される。加えて、この処理によって切断型Ｂｃｌ２、Ｂｉｍ、及びスプライス型Ｂｉｍの上昇がもたらされ、これらの全てはアポトーシス促進性である。
【００８９】
ＭＡＰＫシグナル伝達
加えて本発明者らは、アポトーシスに関係するＭＡＰＫシグナル伝達におけるｅＩＦ５Ａ１の関与についての証明を得た。例えばＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１による癌細胞の処理によって、抗アポトーシス性のＢｃｌ２を阻害するＰ−ＪＮＫが上昇した。加えて、Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１及びＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）の両方は、ＴＮＦＲ１及びＴＮＦ；ＦＡＳ及びＦＡＳＬ；カスパーゼ８；Ｂｉｄ；チトクロムＣ、ならびにカスパーゼ３を含む様々なアポトーシス促進因子に影響することによってアポトーシスを開始できる、Ｐ−ｐ３８の形成を誘導する。
【００９０】
ＮＦ−κＢシグナル伝達
ＮＦ−κＢシグナル伝達が骨髄腫の生育を支持することの証明が存在する。例えば骨髄ストローマ細胞への骨髄腫細胞の接着により、多発性骨髄腫における生育及び抗アポトーシス因子の両方であるＩＬ−６の、ＮＦ−κＢ依存性の転写上昇が誘導される［Chauhan  et  al.  (1996)  Blood  87,  1104］。加えて、骨髄腫細胞により分泌されるＴＮＦ−αは骨髄ストローマ細胞内でＮＦ−κＢを活性化し、これによってＩＬ−６の転写及び分泌が上昇する。ＴＮＦ−αはまた骨髄腫細胞内でもＮＦ−κＢを活性化し、これにより骨髄腫細胞及び骨髄ストローマ細胞の両方に細胞内接着分子−１（intracellular  adhesion  molecule-1：ＩＣＡＭ−１；ＣＤ４５）及び血管細胞接着分子（vascular  cell  adhesion  molecule：ＶＣＡＭ−１；ＣＤ１０６）の上昇がもたらされる［Hideshima  et  al.  (2001)  Oncogene  20,4519］。これは次に骨髄腫細胞と骨髄ストローマ細胞との結合を増強する［Hideshima  et  al.  (2001)  Oncogene  20,4519］。反対に、これらの効果はＴＮＦ−αにより誘導されたＮＦ−κＢの活性化を遮断することによって阻害される［Hideshima  et  al.  (2001)  Oncogene  20,4519］。実際にＮＦ−κＢは、骨髄腫細胞においてＴＮＦ−αにより誘導されたアポトーシスに対する防御を仲介するように思われる［Hideshima  et  al.  (2002)  JBC  277,  16639］。これら及びその他の観察により、ＮＦ−κＢシグナル伝達が多発性骨髄腫の治療法の魅力的な標的であり得るという見解が促進された。
【００９１】
本発明者らは、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡが、ヒト骨髄腫細胞におけるＮＦ−κＢの活性化及びＩＣＡＭ−１形成の両方を阻害することを示した。これらの観察により、ｅＩＦ５Ａ１がＮＦ−κＢの活性化における役割を果たすことが示され、かつＮＦ−κＢの活性化に続く効果が事実上生存促進性である限りにおいて、本発明者らはこの活性化がヒプシン化ｅＩＦ５Ａ１によって直接的又は間接的に仲介されると予想する。
【００９２】
ＩＬ−１
炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−１の骨髄腫細胞による過剰産生は、骨組織の劣化を導く多発性骨髄腫の特徴的な性質である。ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、マウスへのＬＰＳ投与により誘導されるＩＬ−１の過剰産生を劇的に減少させることが示されている。
【００９３】
本発明の一実施形態は、多発性骨髄腫を治療する方法を提供する。多発性骨髄腫（「ＭＭ」）は、骨髄内の悪性形質細胞の増殖及び溶骨性の病変部の存在によって特徴付けられる、進行性かつ致死性の疾病である。多発性骨髄腫は難病であるが、治療可能な形質細胞の癌である。形質細胞は免疫系の重要な一部であり、感染及び疾病との戦いを援助する免疫グロブリン（抗体）を産生する。多発性骨髄腫は、骨髄内の過剰数の異常な形質細胞、及び完全なままのモノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ；「Ｍ−タンパク質」）又はベンス・ジョーンズタンパク質（遊離のモノクローナル軽鎖）の過剰産生により特徴付けられる。低カルシウム血症、貧血、腎障害、細菌感染への感受性の増大、及び正常免疫グロブリンの産生障害は、多発性骨髄腫の一般的な臨床症状である。多発性骨髄腫はしばしば、通常は骨盤、脊椎、肋骨、及び頭蓋内の広範性骨粗鬆症によっても特徴付けられる。
【００９４】
本発明は、多発性骨髄腫において見出される刺激のフィードバックループのために、多発性骨髄腫の治療によく適していると思われる。例えば、多発性骨髄腫は骨髄内で低濃度のＩｌ−１を産生する。Ｉｌ−１は次にストローマ細胞を刺激してＩＬ−６を産生させ、これが次に多発性骨髄腫の生育を刺激する。本発明者らは以前に、ｅＩＦ−５Ａ１に向けられたｓｉＲＮＡが、Ｉｌ−１；ＴＮＦ−α、及びＩｌ−８のような炎症誘発性サイトカインの発現を阻害できることを示した（係属出願の１１／７２５，５３９号及び１１／１８４，９８２号を参照）。従って、ｓｉＲＮＡはヒプシン化のために利用可能なものが少なくなるようにｅＩＦ−５Ａの発現をノックダウンするのみではなく、Ｉｌ−１／Ｉｌ−６のフィードバックループもまた、カットオフ又は減少させ得る。
【００９５】
ヒトｅＩＦ５Ａを標的とするｓｉＲＮＡを、腫瘍内の内在性ヒプシン化ｅＩＦ５Ａのレベルを抑制するために使用し、一方でヒプシン化不可能なｅＩＦ５Ａの変異体（ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒ）を発現するＲＮＡｉ耐性プラスミドを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの非修飾ｅＩＦ５Ａのレベルを上昇させるために使用した。ｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡを含むＰＥＩナノ複合体の腫瘍内注射によって、ＭＭ腫瘍の生育がコントロールｓｉＲＮＡを含む複合体に対して８０％（＊＊＊ｐ＝０．０００３）を超えるまで阻害され、ヒプシン化ｅＩＦ５Ａのレベルの抑制が抗腫瘍効果を有することが示された。ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒ発現プラスミドを含むＰＥＩ複合体は同様の効果を有し、腫瘍の生育はコントロールプラスミドを含む複合体に対して７０％（＊＊ｐ０．００１）を超えるまで阻害された。従ってＭＭ腫瘍の生育は、生育促進性のヒプシン化ｅＩＦ５Ａの抑制によって、又はアポトーシス促進性である非ヒプシン化型ｅＩＦ５Ａのレベル上昇のいずれかによって阻害できる。ｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡ及びＲＮＡｉ耐性ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒプラスミドの両方を含む複合体の腫瘍内送達は、腫瘍の生育に対して相乗的な効果を有し、腫瘍の生育を９４％（＊＊＊ｐ＝０．０００２）まで阻害する著しい腫瘍の収縮をもたらした。ｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡ／ｅＩＦ５ＡＫ５０ＲＰＥＩ複合体の静脈内送達もまた、腫瘍の生育を９５％（＊＊ｐ＝０．００２）まで効率的に減少させ、治療薬の全身性送達が実行可能であることが示された。
【００９６】
ｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡ／ｅＩＦ５ＡＫ５０ＲｐＤＮＡ  ＰＥＩ複合体の局所及び全身性送達の両方が、多発性骨髄腫において著しい抗腫瘍反応をもたらした。
【００９７】
本発明はさらに、多発性骨髄腫を含む癌の治療に有用な組成物を提供する。好ましい実施形態によれば組成物は、ヒプシン化され得ない点変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするプラスミドＤＮＡと、内在性ヒトｅＩＦ５Ａ１を選択的に抑制するが、該プラスミドによってコードされる点変異ｅＩＦ５Ａ１には影響しないｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡとの複合体である。ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ及び変異ｅＩＦ５Ａ１をコードするポリヌクレオチドについては上で考察されている。プラスミドＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの両方は、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）ナノ粒子と好ましく複合される。これらは別々に複合されて別々若しくは共に投与されてよいか、又はこれらは共に複合されてよい。ＤＮＡ及びＲＮＡはＰＥＩ上の陽性に荷電したアミノ基に結合し、ナノ粒子が細胞内に取り込まれる際に放出される。ＰＥＩ−核酸複合体は、分裂及び非分裂細胞の両方へ効果的に取り込まれることが示されている。
【００９８】
プラスミドＤＮＡはｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ｒ）を好ましくコードし、これはｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ）のようにヒプシン化され得ないことから強力にアポトーシス原性である。ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ｒ）の発現は、Ｂ細胞特異的プロモーターによって好ましく調節される。
【００９９】
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、好ましくは内在性ヒトｅＩＦ５Ａ１の３’末端に特異的であり、トランスｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ｒ）の発現に対する効果をもたない。典型的な好ましいｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、図２５に示されるｓｉＲＮＡを含んでなるか、該ｓｉＲＮＡから本質的になるか、又は該ｓｉＲＮＡからなる。ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを含むことの理論的根拠は：（１）ほとんど全てがヒプシン化されていることから、生存促進型である内在性ｅＩＦ５Ａ１を除去するため；（２）ＮＦ−κＢの活性化を阻害して、ＩＬ−６の産生及び細胞内接着分子の形成を減少させるため；及び（３）ＩＬ−１の形成を阻害するためである。このｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡはｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ｒ）と相乗的に作用して、骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導する。上記の（２）及び（３）が生存促進性の現象である限りにおいて、これらはヒプシン化ｅＩＦ５Ａ１により仲介されると思われることから、ヒプシン化され得ないｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ｒ）によっては影響されない。このアプローチにより、多発性骨髄腫細胞を含む癌細胞にアポトーシスを導くが健常細胞にはほとんど効果を示さない、非ヒプシン化ｅＩＦ５Ａ１のより大きなプールがもたらされる。
【０１００】
本明細書での好ましい組成物はＳＮＳ０１と称される。ＳＮＳ０１は、安全性増大のためにＢ細胞起源（骨髄腫細胞を含む）の細胞に発現を限定するプロモーターにより駆動されるｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒをコードする、ＲＮＡｉ耐性プラスミドＤＮＡ、及びヌクレアーゼ耐性増大のためにｄＴｄＴ３’突出を有するヒトｅＩＦ５Ａを標的とするｓｉＲＮＡの両方を含む複合体であり、このｓｉＲＮＡ及びプラスミドはin  vivo  JetPEI（商標）と複合される。
【実施例】
【０１０１】
［実施例１］
ｅＩＦ５Ａ１の野生型及び変異形によるＨｅＬａＳ３細胞へのトランスフェクション
ＨｅＬａＳ３細胞に、野生型ｅＩＦ５Ａ１（ＷＴ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ（Ｋ５０Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ６７Ｒ（Ｋ６７Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ６７Ａ（Ｋ６７Ａ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ４７Ｒ／Ｋ５０Ｒ（Ｋ４７５０Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ／Ｋ６７Ｒ（Ｋ５０６７Ｒ）、又はｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ（Ｋ５０６７Ａ）を含むＨＡ−タグ化ｅＩＦ５Ａ１変異形を発現するプラスミドを、Lipofectamine  2000を用いてトランスフェクトした。ＬａｃＺを発現するプラスミドをコントロールとして使用した。トランスフェクション後２４及び４８時間目（Ａ）又は２８及び５２時間目（Ｂ）に、細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。トランスフェクトしたｅＩＦ５Ａ１の発現レベルを、ＨＡに対する抗体を用いて検出した。結果：ｅＩＦ５Ａ１の、推定されるユビキチン化部位のリジンにおける変異（Ｋ６７Ｒ）は、野生型（Ａ）を超えてｅＩＦ５Ａ１トランス遺伝子の蓄積を増大させた。ｅＩＦ５Ａ１の、ヒプシン化に必要とされるリジンにおける変異（Ｋ５０Ｒ）もまた、野生型ｅＩＦ５Ａ１（Ｂ）を超えてｅＩＦ５Ａ１トランス遺伝子の蓄積を増大させた。ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）の二重変異体型は、非変異の野生型ｅＩＦ５Ａ１トランス遺伝子（Ａ＋Ｂ）に比較して特に良好に発現された。図２を参照されたい。
【０１０２】
［実施例２］
ｅＩＦ５Ａ１の野生型及び変異形によるＫＡＳ細胞へのトランスフェクション
ＫＡＳ細胞に、野生型ｅＩＦ５Ａ１（５Ａ１）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ６７Ａ（Ｋ６７Ａ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ（Ｋ５０Ａ  Ｋ６７Ａ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ（Ｋ５０Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ４７Ｒ（Ｋ４７Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ６７Ｒ（Ｋ６７Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ４７Ｒ／Ｋ５０Ｒ（Ｋ４７Ｒ  Ｋ５０Ｒ）、又はｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ／Ｋ６７Ｒ（Ｋ５０Ｒ  Ｋ６７Ｒ）を含むＨＡ−タグ化ｅＩＦ５Ａ１変異形を発現するプラスミドを、ＰＡＭＡＭデンドリマー（ＦＭＤ４４）を用いてトランスフェクトした。ＬａｃＺを発現するプラスミドをコントロールとして使用した。トランスフェクション後４８時間目に細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。トランスフェクトしたｅＩＦ５Ａ１の発現レベルを、ＨＡに対する抗体を用いて検出した。アクチンに対する抗体を用いて等しい負荷を確認した。結果：ｅＩＦ５Ａ１の、推定されるユビキチン化部位のリジンにおける変異（Ｋ６７Ａ又はＫ６７Ｒ）は、野生型を超えてｅＩＦ５Ａ１トランス遺伝子の蓄積を増大させた。ｅＩＦ５Ａ１の、ヒプシン化に必要とされるリジンにおける変異（Ｋ５０Ｒ）、又はアセチル化部位における変異（Ｋ４７Ｒ)もまた、野生型ｅＩＦ５Ａを超えてｅＩＦ５Ａ１トランス遺伝子の蓄積を増大させた。ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）の二重変異体型もまた、非変異の野生型ｅＩＦ５Ａ１トランス遺伝子に比較して高いレベルで発現された。図３を参照されたい。
【０１０３】
［実施例３］
ＰＡＭＡＭデンドリマーを用いたＫＡＳ細胞へのトランスフェクション
ＫＡＳ細胞に、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ（Ｋ５０Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）、又はｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ／Ｋ６７Ｒ（Ｋ５０Ｒ  Ｋ６７Ｒ）を含むＨＡ−タグ化ｅＩＦ５Ａ１変異形を発現するプラスミドを、ＰＡＭＡＭデンドリマー（ＦＭＤ４５−２）を用いてトランスフェクトした。ＬａｃＺを発現するプラスミドをコントロールとして使用した。トランスフェクション後７２時間目に細胞をアネキシン／ＰＩで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。アネキシンＶによって陽性に染まり、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）によって陰性であった細胞はアポトーシスの初期段階（Ａｎｎ＋／ＰＩ−）にあるとみなされ、アネキシンＶ及びＰＩの両方によって陽性に染まった細胞はアポトーシスの後期段階（Ａｎｎ＋／ＰＩ＋）にあるとみなされた。結果：ｅＩＦ５Ａ１の、ヒプシン化部位のリジンにおける変異（Ｋ５０Ｒ)又は推定されるユビキチン化部位のリジンにおける変異（Ｋ６７Ｒ）、同様に二重変異体（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）は、ＬａｃＺコントロールのレベルを著しく超えてＫＡＳ細胞のアポトーシスをもたらした。図４を参照されたい。
【０１０４】
［実施例４］
ｅＩＦ−５Ａ１及びｅＩＦ−５Ａ１の変異形を発現するプラスミドによるＫＡＳ細胞へのトランスフェクション
ＫＡＳ細胞に、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａ（Ｋ５０Ａ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ（Ｋ５０Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ６７Ｒ（Ｋ６７Ｒ）、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）、又はｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ／Ｋ６７Ｒ（Ｋ５０Ｒ  Ｋ６７Ｒ）を含むＨＡ−タグ化ｅＩＦ５Ａ１変異形を発現するプラスミドを、Lipofectamine  2000を用いてトランスフェクトした。ＬａｃＺを発現するプラスミドをコントロールとして使用した。トランスフェクション後７２時間目に細胞をアネキシン／ＰＩで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。アネキシンＶによって陽性に染まり、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）によって陰性であった細胞はアポトーシスの初期段階（Ａｎｎ＋／ＰＩ−）にあるとみなされ、アネキシンＶ及びＰＩの両方によって陽性に染まった細胞はアポトーシスの後期段階（Ａｎｎ＋／ＰＩ＋）にあるとみなされた。結果：ｅＩＦ５Ａ１の、ヒプシン化部位のリジンにおける変異（Ｋ５０Ｒ)又は推定されるユビキチン化部位のリジンにおける変異（Ｋ６７Ｒ）、同様に二重変異体（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）は、ＬａｃＺコントロールのレベルを著しく超えてＫＡＳ細胞のアポトーシスをもたらした。図５を参照されたい。
【０１０５】
［実施例５］
ＫＡＳ細胞にアポトーシスをもたらす処理のための、変異ｅＩＦ−５Ａ１の使用
ＫＡＳ細胞に、ＨＡ−タグ化ｅＩＦ５Ａ１変異形であるｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ（Ｋ５０Ｒ）又はｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）を発現するプラスミドを、Lipofectamine  2000を用いてトランスフェクトした。ＬａｃＺを発現するプラスミドをコントロールとして使用した。トランスフェクション後７２時間目に細胞をアネキシン／ＰＩで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。アネキシンＶによって陽性に染まり、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）によって陰性であった細胞はアポトーシスの初期段階（Ａｎｎ＋／ＰＩ−）にあるとみなされ、アネキシンＶ及びＰＩの両方によって陽性に染まった細胞はアポトーシスの後期段階（Ａｎｎ＋／ＰＩ＋）にあるとみなされた。結果：ｅＩＦ５Ａ１のヒプシン化部位のリジンにおける変異（Ｋ５０Ｒ)、又はｅＩＦ５Ａ１のヒプシン化部位及び推定されるユビキチン化部位の両方における変異（Ｋ５０Ａ／Ｋ６７Ａ）は、ＬａｃＺコントロールのレベルを著しく超えてＫＡＳ細胞のアポトーシスをもたらした。図６を参照されたい。
【０１０６】
［実施例６Ａ］
ｓｉＲＮＡ／アデノウィルスにより仲介される多発性骨髄腫細胞の死滅
ＫＡＳ（ヒト多発性骨髄腫）細胞は、Ｓ１０培地［４ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０］中で維持した。Lipofectamine  2000（Invitrogen）を用いて、ＫＡＳ細胞に５８．７ピコモルのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。モックトランスフェクト細胞は、ｓｉＲＮＡ非存在下でLipofectamine  2000により処理した。トランスフェクションは抗生物質を含まないＳ１０培地中で行った。
ａ）ヒトｅＩＦ５Ａ１を標的とするｓｉＲＮＡ：
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ標的＃１（ｓｉＲＮＡはヒトｅＩＦ５Ａ１のこの領域を標的とする：５’−ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡ−３’（配列番号：＿））。ｓｉＲＮＡ配列は図２５に示され、これは本明細書ではしばしばｈ５Ａ１と称される。
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ標的＃２（このｓｉＲＮＡはヒトｅＩＦ５Ａ１のこの領域を標的とする：５’−ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号：＿））。（ｓｉＲＮＡ配列は、本明細書ではしばしばａｓｈ５Ａ１−ＡＬＴと称される）
ｂ）コントロールｓｉＲＮＡ：コントロールｓｉＲＮＡは次の配列を有した：センス鎖、５’−ＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧｄＴｄＴ−３’；及びアンチセンス鎖、３’−ｄＴｄＴＵＧＵＧＵＡＧＧＡＧＧＡＧＵＣＣＡＧＣ−５’。
【０１０７】
使用されたその他のコントロールには、Dharmaconから入手した標的をもたないことが確認された非標的指向化ｓｉＲＮＡが含まれるが、その理由は、これらは望まれないオフターゲット効果を制限するためにマイクロアレイによって試験されていることである。例えば、ＮＦκＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために用いられたコントロールはDharmaconの非標的指向化ｓｉＲＮＡ（配列Ｄ−００１７００−０１）であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために用いられたコントロールはDharmaconのものであった（配列Ｄ−００１８１０−０１）。
【０１０８】
トランスフェクション後４時間目に細胞をペレットにして、１ｍｌのＳ１０培地に再懸濁した。最初のｓｉＲＮＡトランスフェクション後７２時間目に、トランスフェクトされたＫＡＳ細胞を計数し、２４ウェルプレート内に３００，０００細胞／ウェルにてまき、同じｓｉＲＮＡによる２度目のトランスフェクションを行った。
【０１０９】
トランスフェクション後４時間目に細胞をペレットにして、３０００ｉｆｕのＡｄ−ＬａｃＺ（−ガラクトシダーゼを発現するアデノウィルス）又はＡｄ−５Ａ１Ｍ（ヒトｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａを発現するアデノウィルス）のいずれかを含む１ｍｌのＳ１０培地（ＩＬ−６を含まない）に再懸濁した。
【０１１０】
７２時間後に細胞を回収し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ（BD  Bioscience）を用いる染色とそれに続くＦＡＣＳ解析により、アポトーシスについて分析した。
ａ）初期のアポトーシスは、アネキシン−ＦＩＴＣによって陽性に染まり、ＰＩ染色によって陰性であった細胞（Ａｎｎ＋／ＰＩ−）として定義した。
ｂ）総アポトーシスは、初期アポトーシス（Ａｎｎ＋／ＰＩ−）又は後期アポトーシス／ネクローシス（Ａｎｎ＋／ＰＩ＋）のいずれかである細胞の総数として定義した。
【０１１１】
＃１を標的とする５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、ヒトｅＩＦ５Ａ１の３’ＵＴＲを標的とすることから、アデノウィルス由来のｅＩＦ５Ａ１の発現には影響し得ない。＃２を標的とする５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、ヒトｅＩＦ５Ａ１の翻訳領域内を標的とすることから、アデノウィルス由来のｅＩＦ５Ａ１の発現に潜在的に干渉し得る。
【０１１２】
結果：ｓｉＲＮＡによって処理し、かつｅＩＦ５Ａ１  Ｋ５０Ａ変異形を発現するアデノウィルスを感染させた細胞は、無処理の細胞及びｓｉＲＮＡのみによって処理された細胞よりも、多数がアポトーシスを起こす。図７を参照されたい。
【０１１３】
［実施例６Ｂ］
ｅＩＦ５Ａ１標的＃１（図２５に示す）に対するｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを用いる前処理により、内在性ｅＩＦ５Ａ１の発現は減少したが、アデノウィルスによって発現されるＲＮＡｉ耐性ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ａは蓄積される。
ＫＡＳ細胞に、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｃ）又はｅＩＦ５Ａ１を標的とする２つのｓｉＲＮＡ（＃１及び＃２）のうちの１つのいずれかを、Lipofectamine  2000を用いてトランスフェクトした。ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ＃１は、ｅＩＦ５Ａ１の３’ＵＴＲを標的とすることから、ｅＩＦ５Ａ１の翻訳領域のみを含むアデノウィルス由来のｅＩＦ５Ａ１の発現には干渉しない。ｓｉＲＮＡの配列を図２５に示す。ｅＩＦ５Ａ１＃２  ｓｉＲＮＡはｅＩＦ５Ａ１の翻訳領域を標的とすることから、内在性及び外来性に発現されるｅＩＦ５Ａ１の両方の発現に影響し得る。最初のトランスフェクション時間から７２時間目に、細胞へ同じｓｉＲＮＡによる２度目のトランスフェクションを行った。４時間後にトランスフェクション複合体を細胞から除き、Ａｄ−ＬａｃＺ（Ｌ）又はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａ（５Ｍ）のいずれかを含む増殖培地（−）ＩＬ６と置き換えた。７２時間後に細胞ライセートを回収し、ｅＩＦ５Ａ及びアクチンに対する抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。図７Ｂを参照されたい。ウィルスによって発現されたｅＩＦ５Ａ１の蓄積が観察でき（レーン１対レーン２）、＃１及び＃２を標的とするｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡによるｅＩＦ５Ａ発現の減少が明瞭に観察できる（レーン５及び７対レーン３）。予想されたように、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ＃１はウィルスによって発現されたｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａの蓄積に影響しないが（レーン６対レーン４）、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ＃２はウィルスによって発現されたトランス遺伝子の発現に中程度にのみ影響する（レーン８対レーン４）。
【０１１４】
［実施例６Ｃ］
標的＃１に対するｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを用いるアデノウィルス感染前の前処理により、ヒト多発性骨髄腫細胞におけるリン酸化ＮＦκＢの発現は減少する。
ＫＡＳ細胞に、コントロールｓｉＲＮＡ（ｈＣ）又はｅＩＦ５Ａ１を標的とするｓｉＲＮＡ（＃１）のいずれかを、Lipofectamine  2000を用いてトランスフェクトした。ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ＃１は、ｅＩＦ５Ａ１の３’ＵＴＲを標的とすることから、ｅＩＦ５Ａ１の翻訳領域のみを含むアデノウィルス由来のｅＩＦ５Ａ１の発現には干渉し得ない。最初のトランスフェクション時間から７２時間目に、細胞へ同じｓｉＲＮＡによる２度目のトランスフェクションを行った。４時間後にトランスフェクション複合体を細胞から除き、Ａｄ−ＬａｃＺ（Ｌ）又はＡｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａ（５Ｍ）のいずれかを含む増殖培地（＋）ＩＬ６と置き換えた。２４時間後に細胞ライセートを回収し、ホスホＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）及びｅＩＦ５Ａに対する抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。予想されたように、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ＃１はウィルスによって発現されたｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ａの蓄積に影響しない。ＮＦ−κＢ  ｐ６５のＳｅｒ５３６におけるリン酸化は、活性化、核局在化、タンパク質−タンパク質相互作用、及び転写活性を調節する。図７Ｃを参照されたい。
【０１１５】
［実施例６Ｄ］
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ＃１を用いるアデノウィルス感染前の前処理により、ヒト多発性骨髄腫細胞におけるリン酸化ＮＦ−ｋＢ及びＩＣＡＭ−１の発現は減少する。
ＫＡＳ細胞に、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｃ）又はｅＩＦ５Ａ１を標的とする２つのｓｉＲＮＡ（＃１及び＃２）のうちの１つのいずれかを、Lipofectamine  2000を用いてトランスフェクトした。最初のトランスフェクション時間から７２時間目に、細胞へ同じｓｉＲＮＡによる２度目のトランスフェクションを行った。４時間後にトランスフェクション複合体を細胞から除き、増殖培地（＋）ＩＬ６と置き換えた。２度目のトランスフェクションから２４時間後、細胞を４０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで刺激して０、４、又は２４時間目に細胞ライセートを回収し、ホスホＮＦ−ｋＢ  ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）、ＩＣＡＭ−１、及びアクチンに対する抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。両方のｅＩＦ５Ａ１特異的ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後、ＴＮＦ−αにより誘導されたＮＦ−ｋＢ  ｐ６５のリン酸化（Ｓｅｒ５３６）及びＩＣＡＭ−１の発現の減少が観察された。ＮＦ−ｋＢ  ｐ６５のＳｅｒ５３６におけるリン酸化は、活性化、核局在化、タンパク質−タンパク質相互作用、及び転写活性を調節する。ＩＣＡＭ−１は、多発性骨髄腫の病因に関与すると信じられている細胞間接着表面糖タンパク質である。図７Ｄを参照されたい。
【０１１６】
［実施例６Ｅ］
ｓｉＲＮＡを用いるＫＡＳ細胞の前処理により、ＩＬ−６存在下でのｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ遺伝子送達によるアポトーシスは増大する。
ＫＡＳ細胞に、コントロールｓｉＲＮＡ（ｈｃｏｎ）又はヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（ｈ５Ａ１）のいずれかをLipofectamine  2000を用いてトランスフェクトした。７２時間後、細胞にｓｉＲＮＡを再トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡトランスフェクション培地の除去後４時間目に、空のベクター（ｍｃｓ）又はｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ（Ｋ５０Ｒ）プラスミドのＰＥＩ複合体を細胞に加えた。この研究の間を通して使用した増殖培地にはＩＬ−６が含まれていた。７２時間後に、アネキシン／ＰＩを用いる細胞の染色及びＦＡＣＳ解析によってアポトーシスを測定した。図７Ｆを参照されたい。
【０１１７】
［実施例７］
ｅＩＦ−５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育は遅延する（図８〜１０）。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始した。３〜５週齢のＳＣＩＤ／ＣＢ１７マウス６匹の右側腹部に、２００μＬのＰＢＳ中のＫＡＳ−６／１骨髄腫細胞１０７個を注射して、腫瘍の最小サイズが４ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。
【０１１８】
コントロールマウスには、ｐＣｐＧ−ｍｃｓ（空のベクター）及びコントロールｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した（コントロール群は３マウス：Ｃ−１、Ｃ−２、及びＣ−３によって構成された）。処置マウスには、ＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した（処置群は３マウス：５Ａ−１、５Ａ−２、及び５Ａ−３によって構成された）。注射は逆流を防ぐために腫瘍内の複数個所に行い、取り込みを増大させるために緩速で注射した。図８のデータに、群内のマウス全ての腫瘍容積を示す。図９に示されるデータは、群あたりの平均腫瘍容積＋／−標準誤差である。アステリスクは統計的有意性を示す（＊＝ｐ＜０．０２５；ｎ＝３）。
【０１１９】
図１０に、ｅＩＦ−５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与によって多発性骨髄腫皮下腫瘍の重量が減少することを示す。示されるデータは、群あたりの平均腫瘍重量＋／−標準誤差である。アステリスクは統計的有意性を示す（＊＝ｐ＜０．０５；ｎ＝３）。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験には２ｘ０．１ｍｌのJET-PEI（PoIyPlus）を使用した。Ｎ／Ｐ比は８であった。ＰＥＩ／ＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ複合体を、５％グルコース中において全量０．１ｍｌで形成した。複合体形成のプロトコルは以下の通りである。
１．成分を室温に置く。無菌状態を保つ。
２．２０μｇのプラスミドＤＮＡ（２ｍｇ／ｍｌを〜１０μｌ）及び１０μｇのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌを１０μｌ）を全量２５μｌに希釈する。差分を補うために滅菌水を使用する。
３．２５μｌの１０％グルコースを加え、ＤＮＡ溶液の量を５０μｌの５％グルコースに調整する。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心する。
４．全量２５μｌの１０％グルコース中へ４．８μｌのin  vivo  JETPEIを希釈する。最終濃度が５％グルコースになるように、滅菌水で量を５０μｌに調整する。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心する。
５．５０μｌの希釈ＰＥＩを５０μｌの希釈ＤＮＡへ直ちに加える（順序を逆にしないこと）。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心沈殿する。
６．注射前に１５分間インキュベートする。複合体は６時間安定である。
【０１２１】
ＣｐＧフリーのクローニングベクター及びｐＣｐＧプラスミドはInvivoGenから得た。これらのプラスミドはｐＣｐＧと命名され、ＣｐＧジヌクレオチドを完全に欠いている。これらのプラスミドはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で高レベルのトランス遺伝子発現をもたらし、かつＣＭＶに基づくプラスミドとは対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける持続発現を可能にする。ｐＣｐＧプラスミドは、全てのＣｐＧを除くように改変された、必然的にＣｐＧジヌクレオチドを欠如するエレメント、又は選択性マーカー若しくはレポーターをコードする遺伝子のような、完全に合成されたエレメントのいずれかを含む。遺伝コードを形成する１６のジヌクレオチドのうち、ＣＧは唯一必須ではなく置換可能なジヌクレオチドであるという事実によってこれらの新しい対立遺伝子の合成が可能となった。８のコドンが、異なる５アミノ酸をコードするＣＧを含む。野生型と同一のままであることから、それらの野生型の対応物と同じように活性があるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする新しい対立遺伝子を作り出すため、８コドンの全ては、同じアミノ酸をコードする少なくとも２コドンの選択によって置換できる。これらの新しい対立遺伝子は、それらを容易に切り出すことのできるｐＭＯＤというプラスミドから個別に入手できる。
【０１２２】
ｐＣｐＧプラスミドはｉｎ  ｖｉｖｏにおける持続性の発現を可能にし、かつＴＬＲ９を発現する細胞株を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現におけるＣｐＧの効果、同様に自然及び獲得免疫系におけるそれらの効果を研究するために貴重な手段の典型である。空のベクターであるｐＣｐＧ−ｍｃｓ（Invivogen）は、発現遺伝子産物を含まないマルチクローニング部位のみのベクターであり、コントロールベクターとして用いた。処置用ベクターｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１（Ｋ５０Ｒ）を作るため、ＬａｃＺ遺伝子を除去したｐＣｐＧ−ＬａｃＺベクター（Invivogen）のＮｃｏＩ及びＮｈｅＩ部位へ、ＨＡ−タグ化ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０ＲｃＤＮＡをサブクローン化した。ＤＮＡはEndo-Free  Qiagenキットを用いて調製した。測定したエンドトキシン濃度は、水中で２ｍｇ／ｍｌであるはずのＤＮＡについて、＜０．０３ＥＵ／μｇＤＮＡであった。
【０１２３】
実験に用いたコントロールｓｉＲＮＡは、Dharmacon（D-001810-01）から入手した、マイクロアレイによって確認済みの非標的指向化コントロールｓｉＲＮＡであった。血清中での分解を防ぐため、改変されたｓｉＲＮＡ（siSTABLE）を得た。
【０１２４】
実験に用いたｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、ヒトｅＩＦ５Ａ１の３’ＵＴＲに対して設計した。該ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡとマウスｅＩＦ５Ａ１の間に類似性は無いことから、該ｓｉＲＮＡはヒト（マウスではない）ｅＩＦ５Ａ１のみを抑制するはずである。該ｓｉＲＮＡはまた、ｅＩＦ５Ａ２（ヒト又はマウスのいずれか）とも類似性は無い。該ｓｉＲＮＡは、血清中での分解を防ぐために改変された（siSTABLE）。該ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは以下の標的配列：５’ＧＣＵ  ＧＧＡ  ＣＵＣ  ＣＵＣ  ＣＵＡ  ＣＡＣ  Ａ（ＵＵ）３を有する。
【０１２５】
siSTABLE  siRNAは、１ｍｇ／ｍｌにて水に溶解した（一定分量で−２０℃において保管した）。
【０１２６】
長さ（ｌ）及び幅（ｗ）に関する腫瘍の寸法は、デジタルキャリパーを用いて週あたり２〜３回測定した。腫瘍容積は以下の方程式に従って算出した：
ｌ＝長さ；最小寸法
ｗ＝幅；最大寸法
腫瘍容積（ｍｍ３）＝ｌ２＊ｗ＊０．５
【０１２７】
統計的分析
統計的分析にはスチューデントｔ−検定を用いた。有意性は９５％（ｐ＜０．０５）を超える信頼水準であるとみなされた。
【０１２８】
［実施例８］
ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育は遅延し、かつ腫瘍の収縮がもたらされる。
別の研究において、再びＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始した。コントロールマウスには、ｐＣｐＧ−ｍｃｓ（空のベクター）及びコントロールｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した（コントロール群、Ｇ−１、Ｇ−２、及びＧ−３）。処置マウスには、ＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ（２０μｇのプラスミドＤＮＡ）及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（１０μｇのｓｉＲＮＡ）を含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した（処置群、Ｇ−４、Ｇ−５、及びＧ−６）。図１１に示されるデータは、群あたりの平均腫瘍容積＋／−標準誤差である。アステリスクは統計的有意性を示す（＊＝ｐ＜０．０２５；ｎ＝３）。２１日間にわたり、６回の注射を行った（赤の矢印）。
【０１２９】
［実施例９］
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与及びＰＥＩ／ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミド複合体の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の腫瘍収縮がもたらされる（群２Ｂ）。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始し、最初にコントロールｓｉＲＮＡ（コントロール群）又はヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（処置群）のいずれか５０μｇを尾注射した。コントロールマウスは続いて、ｐＣｐＧ−ｍｃｓ（空のベクター；コントロール群；Ｇ−１、Ｇ−２、及びＧ−３）を含むＰＥＩ複合体の、週２回の腫瘍内注射によって処置された。処置マウスは続いて、ＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ（２０μｇのプラスミドＤＮＡ）（処置群；Ｇ−４、Ｇ−５、及びＧ−６）を含むＰＥＩ複合体の、週２回の腫瘍内注射によって処置された。コントロールマウスは週１回のｉ．ｖ．注射により、コントロールｓｉＲＮＡを投与され続けた（コントロール群、Ｒ−１、Ｒ−２、及びＲ−３）。処置マウスは週１回のｉ．ｖ．注射により、ヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（２０μｇ）を投与され続けた（処置群、Ｒ−４、Ｒ−５、及びＲ−６）。図１２に示されるデータは、各群における全てのマウスの腫瘍容積である。２１日間にわたり、ＰＥＩ／ＤＮＡの壁内注射を６回（赤の矢印）、及びｓｉＲＮＡのｉ．ｖ．注射を４回（青の矢印）行った。
【０１３０】
図１３に、実施例８及び９に由来するオーバーレイを示す。ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。図１３に示されるデータは、各群におけるマウスの平均腫瘍容積＋／−標準誤差である。アステリスクは処置群とコントロール群の間の統計的有意性を示す（＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；ｎ＝３）。
【０１３１】
ＰＥＩ複合体形成のためのプロトコル：
１．成分を室温に置く。無菌状態を保つ。
２．プラスミドＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ＋ｓｉＲＮＡを全量２５μｌに希釈する。量を調整するために滅菌水を使用する。
ａ）プラスミドＤＮＡのみの複合体は：
２０μｇのプラスミドＤＮＡ（２ｍｇ／ｍｌを１０μｌ）を全量２５μｌに希釈する。差分を補うために滅菌水を使用する。
ｂ）プラスミドＤＮＡ＋ｓｉＲＮＡの複合体は：
２０μｇのプラスミドＤＮＡ（２ｍｇ／ｍｌを〜１０μｌ）及び１０μｇのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌを１０μｌ）を全量２５μｌに希釈する。差分を補うために滅菌水を使用する。
３．２５μｌの１０％グルコース（ＰＥＩキットと共に提供される）を加え、ＤＮＡ溶液の量を５０μｌの５％グルコースに調整する。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心する。
４．全量２５μｌの１０％グルコース中へin  vivo  JETPEIを希釈する。
ａ）プラスミドＤＮＡのみの複合体は：
全量２５μｌの１０％グルコース中へ３．２μｌのin  vivo  JETPEIを希釈する。最終濃度が５％グルコースになるように、滅菌水で量を５０μｌに調整する。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心する。
ｂ）プラスミドＤＮＡ＋ｓｉＲＮＡの複合体は：
全量２５μｌの１０％グルコース中へ４．８μｌのin  vivo  JETPEIを希釈する。最終濃度が５％グルコースになるように、滅菌水で量を５０μｌに調整する。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心する。
５．５０μｌの希釈ＰＥＩを５０μｌの希釈ＤＮＡへ直ちに加える（順序を逆にしないこと！）。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心沈殿する。
６．注射前に１５分間インキュベートする。複合体は６時間安定である。
【０１３２】
ｓｉＲＮＡの尾静脈注射に関して、最初のｓｉＲＮＡ注射は５０マイクログラムであった。ｓｉＲＮＡはＰＢＳ中で０．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。マウスあたり１２５μｌ（５０μｇ）を尾静脈内へ注射した。続く血清安定化ｓｉＲＮＡの注射は、マウスあたり２０μｇで週２回行った。ｓｉＲＮＡはＰＢＳ中で０．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。マウスあたり５０μｌ（２０μｇ）を尾静脈内へ注射した。
【０１３３】
図１３Ｂに、ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与により腫瘍の収縮がもたらされることを示す。ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始した。マウスには、ＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した（処置群；Ｇ−４、Ｇ−５、及びＧ−６）。２１日間にわたり、６回の注射を行った。処置開始後４２日目にマウスを屠殺し、腫瘍部位下の皮膚を開いて腫瘍生育の形跡について調べた。群２Ａの処置マウスのいずれにも腫瘍の生育は観察されなかった。
【０１３４】
図１３Ｃに、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与及びＰＥＩ／ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミド複合体の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の腫瘍収縮がもたらされることを示す。ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始し、最初に５０μｇのヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを注射した（処置群）。マウスは続いて、ＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒを含むＰＥＩ複合体の、週２回の腫瘍内注射によって処置された（処置群；Ｒ−４、Ｒ−５、及びＲ−６）。マウスは週１回のｉ．ｖ．注射により、ヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを投与され続けた。処置開始後２１日目に処置を終了した。処置開始後４２日目にマウスを屠殺し、腫瘍部位下の皮膚を開いて腫瘍生育の形跡について調べた。処置群（群２Ｂ）の１マウスに、腫瘍生育の形跡がみられなかった。
【０１３５】
［実施例１０］
ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内同時投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育は遅延する。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始し、最初にコントロールｓｉＲＮＡ（コントロール群）又はヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（処置群）のいずれか５０μｇを注射した。マウスは続いて、ｐＣｐＧ−ｍｃｓ（空のベクター；コントロール群；Ａ１、Ａ２、及びＡ３）を含むＰＥＩ複合体、又はＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ（処置群；Ａ４、Ａ５、及びＡ６）を含むＰＥＩ複合体のいずれかによる、週あたり〜２回の静脈内（赤い矢印）又は腹腔内（緑の矢印）注射によって処置された。マウスは週１回のｉ．ｖ．注射（青い矢印）により、コントロールｓｉＲＮＡ（コントロール群、Ａ１、Ａ２、及びＡ３）又はヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（処置群、Ａ４、Ａ５、及びＡ６）のいずれかを投与され続けた。示されるデータは、各群における全てのマウスの腫瘍容積である。図１４に示されるデータは、各群における全てのマウスの腫瘍容積である。
【０１３６】
［実施例１１］
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与及びＰＥＩ／ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミド複合体の静脈内（ｉ．ｖ．）投与又は腹腔内（ｉ．ｐ．）投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育は遅延する。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始し、最初に５０μｇのコントロールｓｉＲＮＡ（コントロール群）又はヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（処置群）のいずれかを注射した。コントロールマウスは続いて、ｐＣｐＧ−ｍｃｓ（空のベクター；コントロール群は３マウスであった；Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）を含むＰＥＩ複合体の、週あたり〜１回の静脈内又は腹腔内注射によって処置された。処置マウスは続いて、ＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ（処置群；Ｂ４、Ｂ５、及びＢ６）を含むＰＥＩ複合体の、週あたり〜１回の静脈内又は腹腔内注射によって処置された。マウスは週１回のｉ．ｖ．注射により、コントロールｓｉＲＮＡ（コントロール群、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）又はヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（処置群は３マウスであった；Ｂ４、Ｂ５、及びＢ６）のいずれかを投与され続けた。実験は５０μｇのｓｉＲＮＡの最初の注射によって開始された（図１５のグラフの２日目）。続く注射では、毎週１回２０マイクログラムのｓｉＲＮＡを用いた。ｓｉＲＮＡはネイキッド、すなわち送達ビヒクルなしで投与された。ＰＥＩ複合体は２０μｇのプラスミドＤＮＡを含んだ。最初のＰＥＩ注射はｉ．ｐ．で行われ、続く注射はｉ．ｖ．で行われた。図１５に示されるデータは、各群における全てのマウスの腫瘍容積である。
【０１３７】
図１６に、実施例１０及び１１のオーバーレイを示す。ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始した。１セットのマウスは、コントロールｓｉＲＮＡ（コントロール；群Ａ）又はｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（処置；群Ａ）のいずれかの週１回のｉ．ｖ．注射、及びｐＣｐＧ−ｍｃｓを含むＰＥＩ複合体（コントロール；群Ａ）若しくはＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒを含むＰＥＩ複合体（処置；群Ａ）のいずれかのｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．のいずれかを受けた。第２セットのマウスは、ｐＣｐＧ−ｍｃｓ（空のベクター）及びコントロールｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体（コントロール；群Ｂ）又はＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体（処置；群Ｂ）のいずれかによるｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．注射を、週あたり〜２回受けた。示されるデータは、各群におけるマウスの平均腫瘍容積＋／−標準誤差である。アステリスクは処置群とコントロール群の間の統計的有意性を示す（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；ｎ＝３）。
【０１３８】
ＰＥＩ複合体及びｓｉＲＮＡを調製するためのプロトコルは、以前の実施例に記載した通りである。
【０１３９】
［実施例１２］
ｅＩＦ５Ａ１プラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育は遅延し、かつ腫瘍の収縮がもたらされる。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始した。コントロールマウスには、ｐＣｐＧ−ｍｃｓ（空のベクター）及びコントロールｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した（コントロール群は３マウスを有した；コントロール１、コントロール２、及びコントロール３）。処置マウスには、ＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した（処置群には４マウスが含まれた；５Ａ−１、５Ａ−２、５Ａ−３、及び５Ａ−４）。ＰＥＩ複合体の腫瘍内拒絶には、２０μｇのプラスミドＤＮＡ及び１０μｇのｓｉＲＮＡの両方が含まれた。図１７に示されるデータは、各群における全てのマウスの腫瘍容積である。
【０１４０】
［実施例１３］
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）投与及びＰＥＩ／ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミド複合体の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の腫瘍収縮がもたらされる。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始し、最初にコントロールｓｉＲＮＡ（コントロール群は３マウスを有した；コントロール１、コントロール２、及びコントロール３）又はヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（処置群は３マウスを有した；５Ａ−１、５Ａ−２、５Ａ−３）のいずれか５０μｇを注射した。コントロールマウスは続いて、ｐＣｐＧ−ｍｃｓ（２０μｇ）を含むＰＥＩ複合体の、週２回の腫瘍内注射によって処置された（コントロール群１〜３）。処置マウスは続いて、ＲＮＡｉ耐性プラスミドｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ（２０μｇ）を含むＰＥＩ複合体の、週２回の腫瘍内注射によって処置された（５Ａ−１、５Ａ−２、５Ａ−３）。コントロールマウスは週２回の尾静脈へのｉ．ｖ．注射により、コントロールｓｉＲＮＡ（２０μｇ）を投与され続けた。処置マウスは週２回の尾静脈へのｉ．ｖ．注射により、ヒトｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（２０μｇ）を投与され続けた。注射は、腫瘍内注射前の４８時間に行われた。ｓｉＲＮＡはネイキッドｓｉＲＮＡとして、すなわち送達ビヒクルなしで投与された。図１８に示されるデータは、各群における全てのマウスの腫瘍容積である。
【０１４１】
［実施例１４］
ＥＦ１又はＢ２９プロモーターのいずれかにより駆動されるｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育は遅延し、かつ腫瘍の収縮がもたらされる。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始した。マウスには、コントロールベクター（Ｇ１及びＧ２）又はＢ２９プロモーター（Ｇ３及びＧ４）若しくはＥＦ１プロモーター（Ｇ５及びＧ６）のいずれかにより駆動されるｅＩＦ５Ａ１プラスミドのいずれか、並びに、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５）又はｈ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（Ｇ２、Ｇ４、Ｇ６）のいずれかを含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した。示されるデータは、各群の平均腫瘍容積＋／−標準誤差である。注記：Ｂ２９プロモーターはＢ細胞特異的プロモーターとして意図された。しかしながら、この研究で用いたＢ２９プロモーター／ｍＣＭＶエンハンサーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＫＡＳ細胞にＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒの高い発現を駆動することが見出されたが、Ｂ細胞特異的ではないと思われる（おそらくＣＭＶエンハンサーのため）。図１９を参照されたい。
【０１４２】
［実施例１５］
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの同時投与により、ＥＦ１又はＢ２９プロモーターのいずれかにより駆動されるｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミドの多発性骨髄腫皮下腫瘍における抗腫瘍効果は増大され、かつ腫瘍の負荷量の減少がもたらされる。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始した。マウスには、コントロールベクター（Ｇ１及びＧ２）又はＢ２９プロモーター（Ｇ３及びＧ４）若しくはＥＦ１プロモーター（Ｇ５及びＧ６）のいずれかにより駆動されるｅＩＦ５Ａ１プラスミドのいずれか、並びに、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５）又はｈ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（Ｇ２、Ｇ４、Ｇ６）のいずれかを含むＰＥＩ複合体を週２回腫瘍内注射した。処置開始後２４日目にマウスを屠殺し、皮下腫瘍を除去して秤量した。示されるデータは、全ての群の平均腫瘍重量＋／−標準誤差である。図２０を参照されたい。
【０１４３】
［実施例１６］
ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、肺腺癌細胞におけるＡｄ−ｅＩＦ５Ａの感染によりもたらされたアポトーシスの誘導を相乗的に増大させる。
Ａ５４９細胞に、Ａｄ−ＬａｃＺ又はＡｄ−ｅＩＦ５Ａのいずれかを感染させた。ウィルスの添加後直ちに細胞へトランスフェクション培地を添加することにより、細胞にコントロールｓｉＲＮＡ又はヒトｅＩＦ５Ａ１（ｈ５Ａ１）を標的とするｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション及びウィルスによる感染後４時間目に培地を新鮮な培地に置き換え、細胞を７２時間インキュベートした後に、アポトーシス性の細胞を検出するためアネキシン／ＰＩにより標識した。注記：この細胞株におけるｅＩＦ５Ａの過剰発現は、ＤＨＳ及びＤＯＨＨの量が限られていることから非ヒプシン化ｅＩＦ５Ａの蓄積をもたらし、そのためにｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒの過剰発現と同じアポトーシス促進効果をもたらす。これらのデータにより、ヒプシン化ｅＩＦ５Ａの同時抑制及び非ヒプシン化ｅＩＦ５Ａの過剰発現によって引き起こされるアポトーシスにおける相乗的効果が、骨髄腫以外の腫瘍型にも同様に観察されることが示される。図２１を参照されたい。
【０１４４】
［実施例１７］
プラスミドｐＥｘｐ５Ａの構築
ｐＥｘｐ５Ａは、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒの発現が主にヒトＢ細胞系列の細胞内で駆動されるように設計された、ＣｐＧジヌクレオチドの少ない発現プラスミドである。このベクターは、ＣｐＧジヌクレオチドを完全に欠いたプラスミドであるｐＣｐＧ−ＬａｃＺ（Invivogen）に由来する。Ｅ．Ｃｏｌｉの複製及び選択に必要な全てのエレメントはＣｐＧジヌクレオチドを含まない。ＣｐＧ−ＬａｃＺベクター由来のオリジナルのＣＭＶエンハンサー／プロモーター及びＬａｃＺ遺伝子は、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲのＢ細胞特異的な発現を駆動するため、それぞれヒト最小Ｂ細胞特異的プロモーター（Ｂ２９／ＣＤ７９ｂ；Invivogen）及びヒトｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒによって置き換えられた。Ｂ２９プロモーターの活性を増大させ、非Ｂ細胞における発現を減少させるために、プラスミドのｅＩＦ５Ａ１発現カセットの下流にＢ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーが導入された（Malone  et  al.  2006.  B29  gene  silencing  in  pituitary  cells  is  regulated  by  its  3'  enhancer.  J.  Mol.  Biol.  362:  173-183）。Ｂ２９最小プロモーター、ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ、及びＢ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーの取り込みにより、ベクター内に３２のＣｐＧジヌクレオチドが導入された。
【０１４５】
Ｅ．Ｃｏｌｉにおける発現のためのエレメント
複製開始点：Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｒ６Ｋガンマｏｒｉ
＊Ｒ６Ｋガンマ複製開始点の存在により、ｐＣｐＧプラスミドはｐｉｒ変異遺伝子を発現する変異株のみにおいて増幅できる。これらは標準のＥ．Ｃｏｌｉ株においては複製し得ない。従ってｐＣｐＧプラスミドは、Ｄｅｍメチル化も欠くｐｉｒ変異体であるＥ．Ｃｏｌｉ  ＧＴ１１５株（Invivogen）と共に供給される。
細菌性プロモーター：細菌性ＥＭ７プロモーターのＣｐＧを含まないバージョンであるＥＭ２Ｋ。
選択性マーカー：Zeocin（商標）耐性遺伝子；ＣｐＧを含まない合成対立遺伝子。
【０１４６】
哺乳類細胞における発現のためのエレメント
哺乳類プロモーター：Ｂ細胞における組織特異的発現のための、ヒト−１６７ｂｐ最小Ｂ２９（ＣＤ７９ｂ）プロモーター。５’ＵＴＲに合成イントロン（Ｉ１４０）も存在する。
ポリアデニル化シグナル：後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのＣｐＧジヌクレオチドを含まないバージョン。
３’エンハンサー：ヒトＢ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサー。
ＭＡＲ：細菌性及び哺乳類性の転写ユニットの間に、ＣｐＧを含まないマトリックス結合領域（Matrix  attached  regions：ＭＡＲ）が２つ存在する。ＭＡＲの１つはヒトＩＦＮ−β遺伝子の５’領域由来であり、１つはβ−グロビン遺伝子の５’領域由来である。
【０１４７】
ｐＥｘｐ５Ａの予測される配列（３３７１ｂｐ）を図２３に示す。
【０１４８】
ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒのアミノ酸配列
＊Ｋ５０Ｒ変異を下線で示す。
【０１４９】
【化１】
2012501650.tif 000003
【０１５０】
ｐＥｘｐ５Ａの構築−−構築の概略
工程１：Ｂ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーのクローニング及びｐＧＥＭ  T  easy（Promega）へのサブクローニング−−ｐＧＥＭ−４．４ｅｎｈ＃８の作製。
工程２：最小Ｂ２９プロモーターのｐＣｐＧ−ＬａｃＺ（Invivogen）へのサブクローニング−−Ｂ２９−５＃３の作製。
工程３：ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲのＢ２９−５＃３ベクターへのサブクローニング−−Ｂ２９−５＃３−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒの作製。
工程４：ｐＧｐＧ−ｍｃｓ（Invivogen）内の新しいマルチクローニング部位の作製−−ｐＣｐＧ−リンカー４の作製。
工程５：Ｂ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーのｐＣｐＧ−リンカー４へのサブクローニング−−ｐＣｐＧ−ＤＨＳ４．４の作製。
工程６：Ｂ２９プロモーター＋ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ＋ＳＶ４０  ｐＡ発現カセットのｐＣｐＧ−ＤＨＳ４．４へのサブクローニングによるｐＥｘｐ−５の作製。
工程７：ｐＥｘｐ−５内のＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒを非ＨＡ  ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒに置き換えることによる、最終ベクターｐＥｘｐ５Ａの作製。
【０１５１】
構築の詳細
工程１：Ｂ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーのクローニング及びｐＧＥＭ  T  easy（Promega）へのサブクローニング−−ｐＧＥＭ−４．４ｅｎｈ＃８の作製。
Ｂ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーを、以下のプライマー：順方向５’−ＣＡＧＣＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧ−３’及び逆方向５’−ＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡＴＧ−３’を用いて、ＫＡＳ細胞（ヒト多発性骨髄腫細胞株）より分離したゲノムＤＮＡからＰＣＲによってクローン化した。プライマーは、ヒトＣＤ７９Ｂ／ＧＨ−１遺伝子間領域（受入番号ＡＢ０６２６７４）の配列を用いて設計した。得られた６０８ｂｐのＰＣＲ断片を、ｐＧＥＭ（登録商標）T  easyクローニングベクター（Promega）にサブクローン化して配列決定した。Komatsu  et  al.  2002.  Novel  regulatory  regions  found  downstream  of  the  rat  B29/Ig-b  gene.  Eur.  J.  Biochem.  269  :  1227-1236。
【０１５２】
ｐＧＥＭ−４．４ｅｎｈ＃８内の、Ｂ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーＰＣＲ断片（２９７ｂｐ）の配列
【０１５３】
【化２】
2012501650.tif 000004
【０１５４】
○  ＋４．４の領域に、幾つかの転写因子結合部位が含まれる。
【０１５５】
【化３】
2012501650.tif 000005
【０１５６】
ｐＧＥＭ−４．４ｅｎｈ＃８内の、Ｂ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーＰＣＲ断片（２９７ｂｐ）及びヒトＣＤ７９Ｂ／ＧＨ−１遺伝子間領域（受入番号ＡＢ０６２６７４）の配列のアラインメント。
【０１５７】
【化４】
2012501650.tif 000006
【０１５８】
【化５】
2012501650.tif 000007
【０１５９】
工程２：最小Ｂ２９プロモーターのｐＣｐＧ−ＬａｃＺ（Invivogen）へのサブクローニング−−Ｂ２９−５＃３の作製。
最小−１６７ヒトＢ２９プロモーターを、以下のプライマー：順方向５’−ＣＣＡＡＣＴＡＧＴＧＣＧＡＣＣＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣ−３’；逆方向５’−ＣＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＣＴＴＧＧ−３’を用いて、完全長ヒトＢ２９プロモーターを有する市販のプラスミド（pDrive-hB29；Invivogen）から増幅した。得られたＰＣＲ断片をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、ｐＣｐＧ−ＬａｃＺベクター（Invivogen）のＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位へライゲートして、Ｂ２９−５＃３を作製した。
【０１６０】
Ｂ２９−５＃３内の、Ｂ２９最小プロモーターＰＣＲ断片（１８８ｂｐ）の配列
【０１６１】
【化６】
2012501650.tif 000008
【０１６２】
Ｂ２９−５＃３内のＢ２９最小プロモーターＰＣＲ断片（Ｂ２９＿ｍｉｎ）とpDrive-hB29由来の完全長ヒトＢ２９プロモーターとのアラインメント。
【０１６３】
【化７】
2012501650.tif 000009
【０１６４】
【化８】
2012501650.tif 000010
【０１６５】
【化９】
2012501650.tif 000011
【０１６６】
工程３：ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲのＢ２９−５＃３ベクターへのサブクローニング−−ｐＢ２９−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ＿７の作製。
ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒを、ＤＮＡテンプレートとしてのｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ、ならびに以下のプライマー：順方向５’−ＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＴＡＣＣＣＴＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧ−３’及び逆方向５’−ＣＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣ−３’を用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ断片をＮｃｏＩ及びＮｈｅＩを用いて消化し、Ｂ２９−５＃３のＮｃｏＩ及びＮｈｅＩ部位へサブクローン化して、ＬａｃＺを置き換えた。
【０１６７】
ｐＢ２９−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ＿７内の、ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲＰＣＲ断片（４９７ｂｐ）の配列
【０１６８】
【化１０】
2012501650.tif 000012
【０１６９】
ｐＢ２９−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ＿７内の、ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲＰＣＲ断片の翻訳
ＨＡエピトープ
ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ
Ｋ５０Ｒ
【０１７０】
【化１１】
2012501650.tif 000013
【０１７１】
ｐＢ２９−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ＿７内の、ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲＰＣＲ断片とヒトｅＩＦ５Ａ１（受入＃ＮＰ＿００１９６１）とのアラインメント
【０１７２】
【化１２】
2012501650.tif 000014
【０１７３】
工程４：ｐＧｐＧ−ｍｃｓ（Invivogen）内の新しいマルチクローニング部位の作製−−ｐＣｐＧ−リンカー４の作製。
ｐＧｐＧクローニングベクターであるｐＧｐＧ−ｍｃｓ  Ｇ２（Invivogen）をＥｃｏＲＩで消化して、ｍＣＭＶエンハンサー、ｈＥＦ１プロモーター、合成イントロン、マルチクローニング部位、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む哺乳類発現カセットを除いた。次にＥｃｏＲＩで消化したｐＧｐＧ−ｍｃｓ  Ｇ２ベクターをＥｃｏＲＩ粘着末端を有する合成リンカーへライゲートして、新しいマルチクローニング部位を有する、プロモーターの無いベクター（ｐＣｐＧ−リンカー４）を作製した。
【０１７４】
【化１３】
2012501650.tif 000015
【０１７５】
ｐＣｐＧ−リンカー４内の新しいマルチクローニング部位周囲の領域の配列
【０１７６】
【化１４】
2012501650.tif 000016
【０１７７】
上の配列の番号付けは、以下の特徴：βＧｌｏ  ＭＡＲ（ヌクレオチド１−３８０）；ＥｃｏＲＩ認識配列（ヌクレオチド３９６−４０１）；ＸｈｏＩ認識配列（ヌクレオチド４０１−４０６）；ＣｌａＩ認識配列（ヌクレオチド４０９−４１４）；ＮｏｔＩ認識配列（ヌクレオチド４１７−４２４）；ＭｌｕＩ認識配列（ヌクレオチド４２７−４３２）；ＩＦＮβ  Ｓ／ＭＡＲ（ヌクレオチド４３８−１，０３０）への参照を容易にするためである。
【０１７８】
工程５：Ｂ２９  ＤＳ４．４  ３’エンハンサーのｐＣｐＧ−リンカー４へのサブクローニング−−ｐＣｐＧ−ＤＨＳ４．４の作製。
Ｂ２９  ＤＨＳ４．４  ３’エンハンサーを、テンプレートとしてのｐＧＥＭ−４．４ｅｎｈ＃８、ならびに以下のプライマー：順方向５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧ−３’；及び逆方向５’−ＣＣＡＣＧＣＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＡＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＡＡＡＧ−３’を用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ断片をＮｏｔＩ及びＭｌｕＩを用いて消化し、ｐＣｐＧ−リンカー４の新しいマルチクローニング部位内のＮｏｔＩ及びＭｌｕＩ部位へライゲートして、ｐＣｐＧ−ＤＨＳ４．４を作製した。
【０１７９】
＞ｐＣｐＧ−ＤＨＳ４．４完全長配列（２，２８２ｂｐ）
【０１８０】
【化１５】
2012501650.tif 000017
【０１８１】
【化１６】
2012501650.tif 000018
【０１８２】
上の配列の番号付けは、以下の特徴：βＧｌｏ  ＭＡＲ（ヌクレオチド１−４００）；ＥｃｏＲＩ認識配列（ヌクレオチド４１６−４２１）；ＸｈｏＩ認識配列（ヌクレオチド４２１−４２６）；ＣｌａＩ認識配列（ヌクレオチド４２９−４３４）；ＮｏｔＩ認識配列（ヌクレオチド４３７−４４４）；ＤＨＳ４．４（ヌクレオチド４４５−７４１）；ＭｌｕＩ認識配列（ヌクレオチド７４２−７４７）；ＩＦＮβ  Ｓ／ＭＡＲ（ヌクレオチド７５３−１，５６９）への参照を容易にするためである。
【０１８３】
工程６：Ｂ２９プロモーター＋ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ＋ＳＶ４０  ｐＡ発現カセットのｐＣｐＧ−ＤＨＳ４．４へのサブクローニングによるｐＥｘｐ−５の作製。
最小Ｂ２９プロモーター、合成イントロン、ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ、及びＳＶ４０ｐＡを含むＢ２９−ｅＩＦ５Ａ１発現カセットを、ｐＢ２９−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ＿７（工程３）からＰＣＲにより、以下のプライマー：順方向５’−ＧＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣＴＡＧＴＧＣＧＡＣＣＧＣＣＡＡＡＣＣ−３’；及び逆方向５’−ＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣ−３’を用いて増幅した。得られたＰＣＲ断片をＣｌａＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、ｐＣｐＧ−ＤＨＳ４．４のマルチクローニング部位内のＣｌａＩ及びＮｏｔＩ部位へサブクローン化して、ｐＥｘｐ−５を作製した。
【０１８４】
工程７：ｐＥｘｐ−５内のＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒを非ＨＡ  ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒに置き換えることによる、最終ベクターｐＥｘｐ５Ａの作製。
ｐＥｘｐ−５プラスミドをＮｃｏＩ及びＮｈｅＩにより消化してＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒを除いた。非ＨＡ−タグ化ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲＰＣＲ断片を、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲからＰＣＲにより、以下のプライマー：順方向５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’；及び逆方向５’−ＣＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣ−３’を用いて増幅した。得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＮｈｅＩを用いて消化し、Ｂ２９−５＃３のＮｃｏＩ及びＮｈｅＩ部位へライゲートしてＢ２９−Ｋ５０Ｒを作製した。Ｂ２９−Ｋ５０ＲをＮｃｏＩ及びＮｈｅＩを用いて消化し、４７０ｂｐのｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ断片をゲル精製した後、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化したｐＥｘｐ−５へライゲートして最終発現ベクターのｐＥｘｐ５Ａを作製した。
【０１８５】
［実施例１８］
ｐＥｘｐ５Ａの試験
様々な細胞株にLipofectamine  2000を用いてプラスミドをトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間目に抗ＨＡ抗体（Roche）を用いるウェスタンブロットによってＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒの発現を判定した。試験された異なる細胞株は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（マウスＢリンパ芽球−骨髄腫）、ＫＡＳ（ヒト骨髄腫）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓肝細胞癌）、Ｔ２４（ヒト膀胱癌）；ＨＴ−２９（ヒト結腸直腸腺癌）、ＨＥＫ−２９３（ヒト胚性腎細胞）、ＰＣ３（ヒト前立腺腺癌）；ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部腺癌）、及びＡ５４９（肺癌）であった。図２４を参照されたい。
【０１８６】
ｐＥｘｐ−５プラスミドは、ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒをヒト及びマウス両方の骨髄腫細胞株に、恒常的なＥＦ１プロモーター（ＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒ）を用いるプラスミドに匹敵するレベルで発現する。しかしながら、恒常的なプロモーターによる発現と比較して、ｐＥｘｐ−５により駆動されるＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒの発現は非Ｂ細胞に限定される。一例外は、ｐＥｘｐ−５のトランスフェクション後にＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒの発現が高いレベルで観察された、ヒト胚性腎細胞のＨＥＫ−２９３であった−これは細胞株の胚性の性質による可能性があり；現時点で本発明者らには、ｐＥｘｐ−５が成体の腎細胞に発現するか否かは明らかでない。毒性試験及び治験に使用する最終プラスミドは、ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒが非ＨＡタグ化ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒによって置き換えられたｐＥｘｐ−５のバージョン（ｐＥｘｐ−５Ａ）となり得る。ｐＥｘｐ−５は、最小ヒトＢ２９プロモーター／エンハンサーの制御下にＨＡ−タグ化ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒを含み；ＨＡ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒの発現は、恒常的に発現するプラスミドにより駆動される発現に対して、同様に完全長Ｂ２９プロモーターを含むプラスミドに対して比較された。
【０１８７】
［実施例１９］
in  vivo  JETPEI（商標）ナノ粒子の形成
この実施例は、２０ｇのマウスへ１．５ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍＬ）の用量−−１．５ｍｇ／ｋｇ＝１．０ｍｇ  ｐＥｘｐ５Ａ／ｋｇ＋０．５ｍｇ  ｈ５Ａ１／ｋｇ−−ＤＮＡ：ｓｉＲＮＡ比＝２：１により注射するための、in  vivo  JETPEI（商標）ナノ粒子複合体形成のために行われる。
【０１８８】
プラスミドＤＮＡ及びｓｉＲＮＡを全量２５ｍｌに希釈する。量を調整するために滅菌水を使用する。＊２０ｍｇのプラスミドＤＮＡ（２ｍｇ／ｍｌを１０ｍｌ）及び１０ｍｇのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌを１０ｍｌ）を全量２５ｍｌに希釈する。差分を補うために滅菌水を使用する。２５ｍｌの１０％グルコース（ＰＥＩキットと共に提供される）を加え、ＤＮＡ溶液の量を５０ｍｌの５％グルコースに調整する。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心する。全量２５ｍｌの水中へin  vivo  JETPEI（商標）を希釈する。＊３．６ｍｌのin  vivo  JETPEI（商標）を水で全量２５ｍｌに希釈する。最終濃度が５％グルコースになるように、１０％グルコースで最終量を５０ｍｌに調整する。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心する。５０ｍｌの希釈ＰＥＩを５０ｍｌの希釈ＤＮＡへ直ちに加える（順序を逆にしないこと！）。穏やかにボルテックスした後、短時間遠心沈殿する。
【０１８９】
形成後、複合体は８〜１０時間安定である。複合体のＮ／Ｐ比は６でなければならない。Ｎ／Ｐ比は、ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの陰性に荷電したリン酸残基の数に対する、in  vivo-jetPEIの陽性に荷電した窒素残基の数の比である。ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡは、グラムあたり同数のリン酸基を含む。従ってＮ／Ｐ比は複合体内のイオン平衡の尺度である。複合体のＮ／Ｐ比の増大により、複合体の毒性が増大され得る。in  vivo  JET-PEIは１５０ｍＭ溶液（窒素残基で表される）として供給されるが、ＤＮＡは１ｍｇ中に３ナノモルの陰イオン性リン酸を含む。最終量中のＤＮＡの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌを超えてはならない。ＤＮＡは高い品質で、水中で調製する必要がある。in  vivo-jetPEI及び１０％グルコースは、使用前に室温に置く必要がある。
【０１９０】
［実施例２０］
マウスにおける静脈内ＳＮＳ０１及びＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵによる用量設定及び反復投与試験。
ＳＮＳ０１は本発明の一実施形態である−これは多発性骨髄腫の治療を目標とする、癌治療の生物工学製品である。ＳＮＳ０１は３つの成分：ｅＩＦ５Ａのアポトーシス促進性変異体を発現するＤＮＡベクター（図２２を参照）；癌細胞の生育／抗アポトーシスを促進する野生型のｅＩＦ５Ａを標的とするｓｉＲＮＡ（図２５の配列を参照）；及び送達ビヒクルとして作用する、ポリエチレンイミンと称される合成ポリマー（In  vivo-jetPEI；Polyplus  Transfection  Inc.）により構成される。
【０１９１】
試験の目的は、マウスへの静脈内ＳＮＳ０１の最大許容用量及び治療用量の長期投与の実行可能性を決定することである。別々の２試験を行った。最大許容用量試験（試験ＩＤ：ＭＴＤ）は、マウスに増加性の量のＳＮＳ０１（２．２ｍｇ／ｋｇ〜３．７ｍｇ／ｋｇ）の静脈内用量を２回投与し、臨床徴候、体重、臓器重量、及び肝酵素をモニターすることによって毒性を評価する８日間の試験である。９週間の反復投与試験（試験ＩＤ：ＥＸ６）は、ＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵの治療用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）及び同様にその様々な成分の、週２回の長期投与後の毒性を評価するために計画された試験である。ＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵはＳＮＳ０１の前臨床版であり、主に、ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒの発現がＳＮＳ０１複合体のようにＢ細胞特異的プロモーターではなく、恒常的なプロモーター（全ての組織にいつでも発現するもの）により駆動されることで異なっている。ＳＮＳ０１におけるＢ細胞特異的Ｂ２９プロモーターの使用は、アポトーシス促進性のｅＩＦ５Ａ変異体の発現を、骨髄腫細胞を含むＢ細胞起源の細胞に限定することによって治療上の安全性を高めるために計画された。ＥＸ６試験にはマウス特異的なｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡを投与されたマウスの群もまた含まれたが、これはマウス組織においてｅＩＦ５Ａを抑制することによるいずれの毒性効果があるか否かを判定するためである。反復投与試験における毒性は、臨床徴候、体重、血液、肝酵素、同様に組織病理をモニターすることによって評価した。
【０１９２】
【表１】
2012501650.tif 000019
【０１９３】
【表２】
2012501650.tif 000020
【０１９４】
前臨床試験により、ＳＮＳ０１は０．７５ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇの用量において治療的であることが示された（試験ＥＸ９）。８日間の用量設定試験（試験ＩＤ：ＭＴＤ）において、用量範囲の上限を決定するため、治療用範囲よりも著しく高い用量が試験された。試験品の週２回の静脈内用量は２．２ｍｇ／ｋｇ及び２．９ｍｇ／ｋｇの低めの用量レベルで十分に許容されたが、１マウスは２．９ｍｇ／ｋｇにおいて病的状態に至り、安楽死させた。３．３ｍｇ／ｋｇ以上の用量は、おおよそ２０〜２５％の生存率をもたらした。従って最大許容用量は２．２ｍｇ／ｋｇと２．９ｍｇ／ｋｇの間であり、これは０．７５ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇの治療用範囲を十分に超えている。
【０１９５】
９週間の反復投与試験（試験ＩＤ：ＥＸ６）において、マウスは治療用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）のＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵを週２回尾静脈注射によって投与され、試験期間にわたって試験品に関連した毒性効果は観察されなかった。この試験においてはＤＮＡ及びｓｉＲＮＡもまた別々に試験され、両方共マウスにより十分に許容された。ヒトｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡはマウスにおいて活性を示さないことから、マウスｅＩＦ５Ａに特異的なｓｉＲＮＡもまた試験に含めた。９週間の期間にわたり、マウスｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡの長期的な投与に関連した毒性効果は観察されなかった。これらの結果により、ＳＮＳ０１及びＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵの治療用量は長期間にわたって投与されたとしてもマウスには無毒であることが示された。
【０１９６】
【表３】
2012501650.tif 000021
【０１９７】
試験系及び試験計画
この試験の全ての態様は、カナダ動物管理協会（Canadian  Council  on  Animal  Care）及びオンタリオ州研究動物条例（Province  of  Ontario  Animals  for  Research  Act）により確立された、ウォータールー大学動物管理委員会（University  of  Waterloo  Animal  Care  Committee）（ウォータールー、オンタリオ州、カナダ）により設定された指針に従って実行された。
【０１９８】
ＣＤ−１及びＢＡＬＢ／ＣマウスはCharles  River  Laboratories（ケベック州、カナダ）から入手した。両試験のマウスは試験品を週２回、尾静脈を通した静脈内注射によって投与された。０．２ｍｌを超える量の送達には緩慢な注射（〜２−３分）を用いた。
【０１９９】
８日間の試験に用いたマウスは、試験開始時におおよそ６〜９週齢であった。９週間の反復投与試験に用いたマウスは、試験開始時におおよそ５〜６週齢であった。
【０２００】
【表４】
2012501650.tif 000022
【０２０１】
【表５】
2012501650.tif 000023
【０２０２】
８日間の最大許容用量試験（ＭＴＤ）
２用量による８日間の試験は、ＳＮＳ０１の最大許容用量を決定するために計画された用量設定試験である。用量範囲は２．２ｍｇ／ｋｇ〜３．７ｍｇ／ｋｇであり、これは０．７５ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇの治療用量範囲を十分に超えている。ＳＮＳ０１の最小用量（２．２ｍｇ／ｋｇ）において、１マウスがわずかに毛を逆立たせ、活動を低下させたが１時間以内に回復したことを除けば、毒性の臨床徴候は観察されなかった。２．２ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ０１を２回目に注射した後には毒性の臨床徴候は観察されなかった。全てのマウスは試験の間中、その体重を維持した。臓器に肉眼的な変化は観察されなかった。体重に対する臓器重量の比は、肝臓重量：体重の比における中程度の増大を除いては、コントロール群からの変化は無かった。しかしながら、この比の増大はより高い用量レベル群のいずれにも観察されなかったことから、試験品に関連したものであるとは考えにくい。
【０２０３】
５マウスのうち４が、毒性の臨床徴候を示すことなく２．９ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ０１を許容した。しかしながら、１マウスが注射後１時間以内に痙攣及び軽度の呼吸促迫症を経験したため人道的に安楽死させる必要があった。残りのマウスには、ＳＮＳ０１の２回目の注射後に毒性の臨床徴候は観察されなかった。マウスは試験の間中、その体重を維持し、臓器の肉眼的な変化、又は体重に対する臓器重量の比における変化は観察されなかった。２用量の２．９ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ０１の後に、ＡＬＴの血清濃度がわずかに上昇した。
【０２０４】
予想されたように、３．３ｍｇ／ｋｇ以上の用量のＳＮＳ０１は十分に許容されず、両群において１匹を除く全てのマウスを人道的に安楽死させる必要があった。病的状態のためマウスを人道的に安楽死させる必要があった全ての事例において臨床徴候は注射後１時間以内に現れ、これは高用量のＰＥＩを用いたその他の報告された試験と一致していた。３．３ｍｇ／ｋｇ及び３．７ｍｇ／ｋｇにおいて生存したマウスは２回目の用量は投与されなかったが、注射後４時間以内に完全に回復し、試験の間中その体重を維持した。従ってＳＮＳ０１の最大許容用量は２．２ｍｇ／ｋｇと２．９ｍｇ／ｋｇの間であると思われる。
【０２０５】
９週間の反復投与試験（ＥＸ６）
９週間の反復投与試験の目的は、ＳＮＳ０１開発の間の前臨床試験のために使用された複合体であるＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵの、治療用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）の長期的な投与の安全性を評価することである。ＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵはＳＮＳ０１と大きくは異ならないが、主要な相違は材料が研究グレードであること、及びｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒの発現が全ての細胞型において活性のある恒常的なヒトＥＦ１プロモーターにより駆動されていることである。ＳＮＳ０１はｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒの発現を駆動するためにＢ細胞特異的なプロモーターを使用しているが、この安全性試験における恒常的なプロモーターの使用により、非Ｂ細胞における変異ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒタンパク質の蓄積がもたらす毒性の評価が可能となる。９週間の反復投与試験の別の態様は、ＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵの個別成分の安全性を試験するための群を包含することであった。ＤＮＡ群（Ｅｘ６−Ｇ３）にはｅＩＦ５Ａプラスミド及び非標的指向化コントロールｓｉＲＮＡを含む複合体が投与され、一方でｓｉＲＮＡ群（Ｅｘ６−Ｇ４）にはヒトｅＩＦ５Ａ（ｈ５Ａ１）ｓｉＲＮＡ及び非発現プラスミドを含む複合体が投与された。試験品のＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵには、内在性のマウスｅＩＦ５Ａの発現に影響し得ないヒトｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡが含まれることから、この試験の別の特色は、非発現プラスミド及びマウスｅＩＦ５Ａを効率的に標的とするｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体を投与された群（Ｅｘ６−Ｇ６）を包含することであった。この群によって、活性のあるｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡの長期的な投与の安全性についての評価が可能となった。
【０２０６】
全ての動物は、予定された屠殺日まで生存した。９週間の試験過程にわたり、いずれの群にも毒性の臨床徴候は観察されず、全ての群におけるマウスの体重は試験期間の間に増加し続けた。赤血球及び白血球の数は処置開始後３及び６週間目に測定され、全ての投与群において正常であった。肝酵素の血清濃度は屠殺後に測定され、全てのマウスについて正常範囲内であった。いずれの群にも、臓器の肉眼的外観に変化は観察されなかった。独立した病理学者により、主要な臓器の組織病理学的分析が行われた（試験品に起因する毒性は示されなかった。
【０２０７】
ＳＮＳ−ＥＦ１／ＵＵの治療用量の長期的な投与はマウスにより十分に許容され、有害作用は観察されなかった。加えて、マウス特異的なｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡの長期的な投与が毒性効果を示さなかったことから、ヒトｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体の投与はヒトに対して安全なはずであることが示された。
【０２０８】
［実施例２１］
多発性骨髄腫を有するマウスにおける、静脈内ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵ及びＳＮＳ０１の治療効果試験
ＳＮＳ０１は上記の通りである。試験品ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵはＳＮＳ０１の前臨床版である。ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵのＳＮＳ０１との違いはわずかであり、主要な違いは成分がＧＬＰグレードではなく研究グレードであることである。ここに報告される試験の目的は、ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの最小有効用量の決定であり、かつＳＮＳ０１を含んでなるＧＬＰグレードの材料が、前臨床試験で用いられた研究グレードの材料と同様に作用することの確認であった。反復投与腫瘍試験（repeated  dose  tumor  study）（試験ＩＤ：ＥＸ９）は、ＳＮＳ０１の至適な治療用量を決定する目的で、マウスの皮下腫瘍の生育を阻害する、ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの次第に縮小する能力を持つ週２回の用量を評価する５週間の試験であった。処置された動物はまた、臨床徴候、体重、及び臓器重量をモニターすることによって毒性の徴候を評価された。
【０２０９】
【表６】
2012501650.tif 000024
【０２１０】
【表７】
2012501650.tif 000025
【０２１１】
ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの治療用範囲を、ヒト多発性骨髄腫皮下腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおいて決定した。０．１５ｍｇ／ｋｇと１．５ｍｇ／ｋｇの間のＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの用量について試験した。試験品の抗腫瘍効果を、週２回の腫瘍容積の測定ならびに屠殺後の腫瘍組織の切除及び秤量によって決定した。０．７５ｍｇ／ｋｇ及び１．５ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの用量により腫瘍の著しい収縮がもたらされたことから、ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの治療用範囲は０．７５ｍｇ／ｋｇと１．５ｍｇ／ｋｇの間にあることが示される。腫瘍の収縮は観察されなかったが、皮下腫瘍の生育の効果的な阻害は０．３８ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵでもまた観察された。０．１５ｍｇ／ｋｇという低用量のＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵでさえも腫瘍生育の幾らかの阻害が観察されたことから、治療用範囲は広いことが示される。図２６及び２７を参照されたい。
【０２１２】
ＧＬＰグレード成分を用いて作られたＳＮＳ０１の有効性をＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵと比較し、腫瘍生育の阻害において同程度の有効性を持つことが見出された。腫瘍を有するＳＣＩＤマウスのＳＮＳ０１及びＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵによる処置は十分に許容され、マウスの体重は試験期間の間に増加し続けた。
【０２１３】
【表８】
2012501650.tif 000026
【０２１４】
試験系及び試験計画
雌のＣ．Ｂ．１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃ（ＳＣＩＤ）マウスはHarlan（インディアナポリス、インディアナ州、米国）から入手した。皮下腫瘍は、１０ｘ１０６のＫＡＳ−６／１（ヒト多発性骨髄腫）生細胞を５〜６週齢のマウスの右側腹部に注射することにより確立した。ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵによる処置は、腫瘍がおおよそ２０〜４０ｍｍ３のサイズに達した時点（腫瘍細胞注射後おおよそ４週間目）に開始した。ＳＮＳ０１による処置は、腫瘍がおおよそ１３０ｍｍ３のサイズに達した時点（腫瘍細胞注射後おおよそ６週間目）に開始した。マウスは試験品を週２回、尾静脈の静脈内注射を通して投与された。
【０２１５】
【表９】
2012501650.tif 000027
【０２１６】
反復投与腫瘍試験（repeated  dose  tumor  study）
反復投与腫瘍試験（repeated  dose  tumor  study）は、ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの最小有効治療用量を決定し、かつＧＬＰグレードのＳＮＳ０１試験品が、研究グレードの試験品であるＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵによって示された腫瘍の阻害活性を保持していることを確認するために計画された。第２の目的は、処置されたマウスの臨床徴候、体重、及び臓器重量をモニターすることによって、処置によるいずれの毒性効果を評価することであった。試験品の治療上の抗腫瘍活性は、デジタルキャリパーを用いて腫瘍容積を週２回測定することによりモニターした。屠殺後に腫瘍を切除して秤量した。
【０２１７】
全てのマウスは予定された屠殺日まで生存した。非発現プラスミド及び非標的指向化ｓｉＲＮＡを含むＰＥＩナノ複合体によって処置されたコントロールマウスは、屠殺時に２８４ｍｍ３の平均腫瘍容積を有したが、１．５ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵによって処置されたマウスは、わずかに１３ｍｍ３の平均腫瘍容積、腫瘍生育における９５％（＊ｐ＝０．０２６）の減少を有した。しかしながら、１．５ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵによって処置されたマウスからの腫瘍の切除を試みた際、いずれのマウスにも腫瘍の形跡は見出されなかった。ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの用量を半分の０．７５ｍｇ／ｋｇまで減少させてもなお、腫瘍容積及び重量それぞれにおいて９１％（＊ｐ＝０．０３）及び８７％（＊ｐ＝０．０４）の減少がもたらされ、１マウスでは腫瘍が完全に消失していた。従って、ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの週２回の注射の至適な治療用量は、０．７５ｍｇ／ｋｇと１．５ｍｇ／ｋｇの間であると思われる。ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの週２回の用量が０．１５ｍｇ／ｋｇと低くてもなお、最終的な腫瘍容積の６０％の減少がもたらされたことから、ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵは広い用量範囲にわたって強力な抗腫瘍活性を有することが示される。
【０２１８】
腫瘍生育の阻害に加え、０．７５ｍｇ／ｋｇ及び１．５ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵ及びＳＮＳ０１による処置は腫瘍容積の著しい減少をもたらしたことから、この処置が、おそらくは腫瘍へのアポトーシスの誘発を通して腫瘍の退縮を誘導できることが示される。０．７５ｍｇ／ｋｇ及び１．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルであるＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵによって処置された、腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積のパーセント変化は、それぞれ−２４４％及び−２４５％であった。コントロールマウスの腫瘍サイズは、同期間の間に２０００％を超えて増大した。ＳＮＳ０１の週２回の注射もまた、多発性骨髄腫を著しく収縮させた。１．５ｍｇ／ｋｇのＳＮＳ０１によって処置されたマウスの腫瘍容積のパーセント変化は−３４９％であったことから、ＳＮＳ０１はＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵと同様に有効であることが示される。ＳＮＳ０１による処置は、わずかに２５日間の処置後に腫瘍容積の３４９％の減少を達成したが、ＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵは３５日間の処置後に腫瘍容積の２４５％の減少を達成したことから、ＧＬＰグレード材料の使用によって生物活性が事実上増大された可能性がある。加えて、ＳＮＳ０１によって処置された腫瘍は極めて大きかった（〜１３０ｍｍ３）ことから、ＳＮＳ０１による処置は十分に確立された腫瘍に対して有効であることが示される。
【０２１９】
処置は全てのマウスにより十分に許容され、毒性の徴候は観察されなかった。全ての群におけるマウスの体重は試験の間を通して増加し続けた。剖検では臓器の肉眼的外観に変化は観察されず、体重に対する臓器重量の比における著しい変化は起こらなかった。
【０２２０】
従ってＳＮＳ０１（及びその前臨床版であるＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵ）はＳＣＩＤマウスによって十分に許容され、週あたり２回の静脈内注射によって送達される際、皮下のヒト多発性骨髄腫の治療に非常に有効である。試験された全てのＳＮＳ−Ｂ２９／ＵＵの用量は腫瘍生育の阻害に有効であったが、最高用量である１．５ｍｇ／ｋｇにより、処置された全てのマウスの腫瘍は成功裏に除去された。
【０２２１】
［実施例２２］
プラスミドＤＮＡ及びｓｉＲＮＡポリエチレンイミン（JetPEI）複合体の生体内分布
ＰＥＩ複合体により送達されたプラスミドＤＮＡの局在を判定するため、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）ＧＦＰ発現コンストラクトを用いた。ＧＦＰ発現を駆動するため、２つのプロモーター：ＥＦ１：遍在性プロモーター（ＥＦ１：：ＧＦＰ）又はＢ２９：Ｂ細胞特異的プロモーター（Ｂ２９：：ＧＦＰ）が用いられた。２０マイクログラムのＧＦＰプラスミドＤＮＡ及び１０マイクログラムの蛍光標識（ＤＹ５４７）ｈ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを含むＰＥＩ複合体を、６のＮ／Ｐ比において調製した。ＢａｌＢ／Ｃマウスに、５％グルコース又はＰＥＩ複合体のいずれかを２日間連続して静脈内注射した。最初の注射後７２時間目にマウスを安楽死させ、それらの臓器を回収して、ＧＦＰの発現及びＤＹ５４７−ｓｉＲＮＡを共焦点顕微鏡法によって解析した。
骨髄：ほとんどの事例でＤＹ５４７−ｓｉＲＮＡの形跡が存在したが、ＧＦＰ発現は見られなかった。臓器回収の時期はＧＦＰ発現のピークと一致しない可能性があり；ＧＦＰシグナルは消失したか、又はＧＦＰは発現していない可能性がある。しかしながら幾つかの例で、ＧＦＰ及びＤＹ５４７が同じ骨髄細胞に共存することが観察された。従ってこのことにより、静脈内注射によって投与する際、ＰＥＩナノ粒子を生きた動物の骨髄細胞にトランスフェクトできることが証明された。
肺：ほとんどの事例でＤＹ５４７−ｓｉＲＮＡの形跡が存在したが、ＧＦＰ発現は見られなかった。臓器回収の時期はＧＦＰ発現のピークと一致しない可能性があるか、又はＧＦＰシグナルは消失したか若しくはＧＦＰは発現していない可能性がある。
脾臓：ＤＹ５４７−ｓｉＲＮＡの存在もまた陽性である細胞内で、ＧＦＰ発現（ＥＦ１プロモーターにより駆動される場合）が共存する形跡が見られた。Ｂ２９プロモーターにより駆動した際、脾細胞内でのＧＦＰの発現はかなり低かった。このことにより、ＰＥＩナノ粒子は脾臓の細胞にトランスフェクトされるようであることが示される。
腎臓：ＧＦＰ又はＤＹ５４７の発現は観察されなかったことから、ナノ粒子は腎臓には進入し得ないことが示される。
肝臓：ほとんどの事例でＤＹ５４７−ｓｉＲＮＡの形跡が存在したが、ＧＦＰ発現は見られなかった。このことにより、ＰＥＩナノ粒子は肝臓の細胞にトランスフェクトされることが証明される。
心臓：心臓組織におけるＥＦ１：：ＧＦＰとＤＹ５４７−ｓｉＲＮＡとの共存が観察されたことから、ＰＥＩナノ粒子はこの臓器にトランスフェクトし得ることが示される。Ｂ２９プロモーターを用いた際にはＧＦＰは観察されなかった。
【０２２２】
［実施例２３］
ＨＡ−ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒの発現における、ＤＮＡ：ｓｉＲＮＡ比の効果
ＫＡＳ細胞に、Ｂ２９−ＨＡ−ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒ（Ｂ細胞特異的プロモーターにより駆動されるプラスミド）及びｈ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを含むナノ粒子をトランスフェクトした。ｐＥｘｐ５Ａ及びｈ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを異なる比において含むJET  PEI（商標）ナノ粒子を作製し、ＫＡＳ細胞への添加前に室温で４時間インキュベートした。トランスフェクション後４時間目に、ナノ粒子を含む培地を新鮮な培地に交換した。２４時間後に細胞ライセートを回収し、ＨＡに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析に使用した。ＤＮＡ：ｓｉＲＮＡの比は、標準的な比である２：１から異なっていた。ＨＡ−ｅＩＦ５ＡＫ５０Ｒの蓄積は、１：０、３：１、及び２：１の比においてピークであった。図３０を参照されたい。
【０２２３】
［実施例２４］
ナノ粒子のトランスフェクションにより誘導されたアポトーシスにおけるＤＮＡ：ｓｉＲＮＡ比の効果
ｐＥｘｐ５Ａ及びｈ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを異なる比において含むナノ粒子を作製し、ＫＡＳ細胞への添加前に室温で４時間インキュベートした。トランスフェクション後４時間目に、ナノ粒子を含む培地を新鮮な培地に交換した。４８時間後に細胞を回収し、アネキシンＶ／ＰＩにより標識してＦＡＣＳによって解析した。アポトーシスの誘導は、標準的なＤＮＡ：ｓｉＲＮＡ比である２：１によるナノ粒子をトランスフェクトした細胞において最も高かった。図３１を参照されたい。
【０２２４】
［実施例２５］
ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒプラスミド及びｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（siSTABLE又は非siSTABLE）を含むＰＥＩ複合体（Ｎ／Ｐ＝６又は８）の投与により、多発性骨髄腫皮下腫瘍の生育は阻害され、かつ腫瘍の収縮がもたらされる。
ＫＡＳ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が観察された時点で処置を開始した。マウスに：（Ｇ１）２０ｍｇのｐＣｐＧ−ｍｃｓ（空のベクター）及び１０ｍｇのコントロールｓｉＲＮＡをＮ／Ｐ＝８において含むＰＥＩ複合体（中程度用量）；（Ｇ５）２０ｍｇのＲＮＡｉ耐性プラスミドであるｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ及び１０ｍｇのsiSTABLE  ｈ５Ａ１  ｓｉＲＮＡをＮ／Ｐ＝８において含むＰＥＩ複合体（中程度用量、siSTABLE）；（Ｇ８）２０ｍｇのＲＮＡｉ耐性プラスミドであるｐＣｐＧ−ｅＩＦ５Ａ１ｋ５０Ｒ及び１０ｍｇのｈ５Ａ１  ｓｉＲＮＡをＮ／Ｐ＝６において含むＰＥＩ複合体（中程度用量、Ｎ／Ｐ＝６）のいずれかを週あたり２回静脈内注射した。示されるデータは、各群のマウスについての個々の腫瘍容積である。最終の注射は、処置開始後４０日目に行った。図３２を参照されたい。
【０２２５】
［実施例２６］
JET  PEI（商標）ナノ粒子は腫瘍組織によって効果的に取り込まれ、このナノ粒子は同細胞へプラスミド及びｓｉＲＮＡを送達する。
ｐＥｘｐ−ＧＦＰ（Ｂ細胞特異的プロモーターによる制御下のＧＦＰ）及びＤＹ５４７−ｓｉＲＮＡ（蛍光標識されたｓｉＲＮＡ）を含むナノ粒子の注射後４８時間目の腫瘍切片。共焦点顕微鏡法に従って腫瘍切片内にＧＦＰ及びＤＹ５４７の共存した発現が観察されることから、ナノ粒子は腫瘍組織によって効果的に取り込まれ、このナノ粒子は同細胞へプラスミド及びｓｉＲＮＡを送達することが示される。図３３を参照されたい。
【０２２６】
［実施例２７］
切断試験のために作製されたアデノウィルスコンストラクト。
アデノウィルス（血清型５、Ｅ３欠失）
１）Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Δ（２−６）［Δ（２−６）］−これはアミノ酸２〜６を欠損したヒトｅＩＦ５Ａ１である。
２）Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０ＲΔ（２−６）［Δ（２−６）／Ｋ５０Ｒ］−これはアミノ酸２〜６を欠損したヒトｅＩＦ５Ａ１である。加えて、「Ｋ５０Ｒ」は位置５０のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に変異しており、このためにＤＨＳによりヒプシン化不可能であると信じられていることを示す。
３）Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ［Ｄ６Ｅ］−これは予想される切断部位が変異している（Ｄ６がＥへ）ヒトｅＩＦ５Ａ１である。
４）Ａｄ−ｅＩＦ５Ａ１Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒ［Ｄ６Ｅ／Ｋ５０Ｒ］−これは予想される切断部位が変異している（Ｄ６がＥへ）ヒトｅＩＦ５Ａ１Ｋ５０Ｒである。加えて、「Ｋ５０Ｒ」は位置５０のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に変異しており、このためにＤＨＳによりヒプシン化不可能であると信じられていることを示す。
【０２２７】
［実施例２８］
カスパーゼにより仲介されるｅＩＦ５Ａの切断
切断部位を同定するため、アクチノマイシンＤにより処理されたＫＡＳ細胞から分離したタンパク質ライセートを２−Ｄゲル電気泳動により分離し（図３７）、分子量の小さなｅＩＦ５Ａの切断産物に相当する点をゲルから切り出して質量分析法により配列決定した（図３８Ｂ）。切断産物の完全長配列は得られなかったが、切断はタンパク質のＮ−末端から６番目のアミノ酸の後に起こったことが特定された（図３８Ａ）。考えられる切断部位のすぐ前の配列は「ＤＤＬＤ」であり、これはカスパーゼ切断部位として同定された配列である（Chay  et  al.,  2002）。
【０２２８】
切断断片の産物がカスパーゼ依存性であるか否かを決定するため、ヒト骨髄腫細胞においてアクチノマイシンＤ誘導性のアポトーシスの間に産生される切断断片の産生を遮断する、カスパーゼ阻害剤の能力を試験した（図４１）。一般的なカスパーゼ阻害剤ならびにカスパーゼ３、８、及び９の特異的な阻害剤は全て、ＫＡＳ細胞においてＡｃｔＤ誘導性のアポトーシスの間に蓄積するｅＩＦ５Ａの切断型の形成を強力に阻止する。カスパーゼ１の阻害剤もまた、切断産物の形成を完全には遮断しなかったものの、減少させた。カスパーゼ阻害剤とのインキュベーションは、切断産物の蓄積を阻止しただけではなく、ｅＩＦ５Ａのヒプシン化型の減少もまた阻害したことから（図４１）、アクチノマイシンＤ誘導性のアポトーシスの間のヒプシン化ｅＩＦ５Ａの減少は切断の結果であることが示される。
【０２２９】
アポトーシスの間のカスパーゼによるタンパク質の切断（Fisher  et  al.,  2003による総説）は無数の目的：１）生存促進性又は抗アポトーシス性タンパク質の不活性化−例えば：ｍＲＮＡの５’キャップ構造に結合して、キャップ形成されたｍＲＮＡの４０Ｓリボソームサブユニットへの結合を促進する真核生物翻訳開始因子４Ｇ１が、カスパーゼによる切断によって不活性化されることで翻訳を阻害する；２）タンパク質のドミナントネガティブ型の作製（例えば、ＮＦ−カッパＢ  ｐ６５はアポトーシスの間にカスパーゼによって切断され、ＤＮＡに結合はするが転写活性化の活性を持たないためにＮＦ−ｋＢのドミナントネガティブ阻害物質として作用する、ドミナントネガティブ断片を作り出す）；３）阻害性又は調節性ドメインの除去によって新しい活性又は増大した活性を持つ断片の形成がもたらされることによる、アポトーシス促進性タンパク質の活性化をもたらす機能獲得型の切断（例えば、細胞周期の停止及びアポトーシスを仲介する乳癌抑制タンパク質であるＢＲＣＡ−１は、アポトーシス促進性切断断片の放出しうるカスパーゼによる切断によって活性化される。ｅＩＦ４ＧファミリーのメンバーであるＤＡＰ５はカスパーゼによる切断後に活性化され；切断産物はアポトーシス関連タンパク質の翻訳を刺激する）；４）抗アポトーシスタンパク質のアポトーシス促進性タンパク質への変換（例えばＢｃｌ−ｘＬ及びｃ−ＩＡＰ１のようなアポトーシス阻害物質は、カスパーゼによる切断を通してアポトーシス促進性タンパク質に変化し得る）；及び５）細胞内の再分布（例えばカスパーゼ８による切断に従い、Ｂｉｄのアポトーシス促進性ｐ１５断片では切断によって曝露されたグリシン残基がミリストイル化され、続いてこれによりＢｉｄがミトコンドリアへ移動してチトクロムｃの放出を増大させることが可能になる）を有し得る。
【０２３０】
アクチノマイシンＤ誘導性アポトーシスの間の、カスパーゼにより仲介されるｅＩＦ５Ａの切断が一般的な現象であるか又は骨髄腫細胞に特異的であるかを決定するために、切断されたｅＩＦ５Ａの存在下において、アクチノマイシンＤによって処理したＨｅＬａ細胞を調べた（図４２）。アクチノマイシンＤによって処理したＨｅＬａ細胞内に、ｅＩＦ５Ａの切断断片の蓄積は観察されなかった。ｅＩＦ５Ａの翻訳後修飾（例えばリン酸化又はアセチル化）がカスパーゼによる切断の必要条件であり得るか否かを決定する試みにおいて、脱アセチル化酵素阻害剤であるニコチンアミドの、切断断片の形成における効果について調べた。本発明者らの研究室及びその他（Kim  et  al.,  2006）によるｅＩＦ５Ａの質量分析によって、ｅＩＦ５Ａのアセチル化が観察された。さらに、酵母ｅＩＦ５ＡがＳｉｒ２関連の脱アセチル化酵素であるＨｓｔ２の基質として同定され（Shirai  et  al.,  2008）、著者らによりｅＩＦ５Ａのアセチル化がＨｓｔ２を欠損した酵母か又はｅＩＦ５Ａを過剰発現する酵母においてのみ見られることが観察されたことから、ｅＩＦ５Ａは一般には非アセチル化型で存在することが示される。アクチノマイシンＤによって処理したＨｅＬａ細胞とＳｉｒ２脱アセチル化酵素阻害剤であるニコチンアミドとのインキュベーションによりｅＩＦ５Ａ切断産物の蓄積がもたらされたことから、カスパーゼにより仲介される切断が起こるためにはｅＩＦ５Ａのアセチル化が必要とされることが示される。これらのデータにより、ｅＩＦ５Ａは通常、アポトーシスシグナルがｅＩＦ５Ａのアセチル化を引き起こしてカスパーゼにより仲介される切断が可能となるまで、カスパーゼ活性から保護され得ることが示唆される。
【０２３１】
参考文献
Chay  KO,  Park  SS,  Mushinski  JF  (2002).  Linkage  of  caspase-mediated  degradation  of  paxillin  to  apoptosis  in  Ba/F3  murine  pro-B  lymphocytes.  J  Biol  Chem.  277,  14521-14529.
Fischer  U,  Janicke  RU,  Schulze-Osthoff  K  (2003).  Many  cuts  to  ruin:  a  comprehensive  update  of  caspase  substrates.  Cell  Death  and  Differentiation  10,  76-100.
Kim,  S.  C,  Sprung,  R.,  Chen,  Y.,  Xu,  Y.,  Ball,  H.,  Pei,  J.,  Cheng,  T.,  Kho,  Y.,  Xiao,  H.,  Xiao,  L.,  Grishin,  N.  V.,  White,  M.,  Yang,  X.  J.,  and  Zhao,  Y.  (2006)  Substrate  and  Functional  Diversity  of  Lysine  Acetylation  Revealed  by  a  Proteomics  Survey.  Mol  Cell  23,  607-618.
Shirai  et  al.  (2008).  Global  analysis  of  gel  mobility  of  proteins  and  its  use  in  target  identification  J.  Biol.  Chem.  283,  10745-10752.
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2012501650.tif 000089
【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2012501650.tif 000093
2012501650.tif 000094
2012501650.tif 000095