(57)【要約】  本発明は、以下の一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１は少なくとも１つの不飽和を含むＣ１２−Ｃ２４の不飽和脂肪酸の炭化水素鎖であり；Ｒ２およびＲ３は、独立してまたは同時に、水素、Ｃ１−Ｃ３アルキルまたはフェニルであり；Ｒ４は、水素原子、またはＣＯＲ１’であり、ここでＲ１’は、少なくとも１つの不飽和、有利には１〜６、好ましくは１〜４の不飽和を含むＣ１２−Ｃ２４不飽和脂肪酸の炭化水素鎖である）を有する化合物に関する。2012529462.tif 000025
2012529462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2012529462.tif 000023
（式中、
Ｒ１は、少なくとも１つの不飽和、有利には１〜６、好ましくは１〜４の不飽和を含むＣ１２−Ｃ２４不飽和脂肪酸の炭化水素鎖であり、
Ｒ２およびＲ３は、独立してまたは同時に、水素、Ｃ１−Ｃ３アルキルまたはフェニルを表し、および
Ｒ４は、水素原子またはＣＯＲ１’であり、ここでＲ１’は、少なくとも１つの不飽和、有利には１〜６、好ましくは１〜４の不飽和を含むＣ１２−Ｃ２４不飽和脂肪酸の炭化水素鎖である）。
【請求項２】
Ｒ２およびＲ３がＣ１−Ｃ３アルキルを表す、請求項１に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒ２およびＲ３がメチルを表す、請求項１または２に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が１〜３の不飽和を含むＣ１４−Ｃ１８不飽和脂肪酸の炭化水素鎖を表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
Ｒ１’が１〜３の不飽和を含むＣ１４−Ｃ１８不飽和脂肪酸の炭化水素鎖を表す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
不飽和脂肪酸が、ラウロレイン酸（Ｃ１２：１）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リシノール酸（Ｃ１８：１）；ガドレイン酸（Ｃ２０：１）、エルカ酸（Ｃ２２：１）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３）；ステアリドン酸（Ｃ１８：４）、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）、テトラコサペンタエン酸（Ｃ２４：５）、テトラコサヘキサエン酸（Ｃ２４：６）、リノール酸（Ｃ１８：２）、γ−リノレン酸（Ｃ１８：３）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２）；ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：２）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５）、アドレン酸（Ｃ２２：４）およびカレンジン酸（Ｃ１８：３）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
不飽和脂肪酸が、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３）およびγ−リノレン酸（Ｃ１８：３）からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項８】
Ｒ４がＣＯＲ１’を表す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
Ｒ１とＲ１’とが同じであってもまたは異なっていてもよい、請求項８に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４が水素原子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項１１】
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオクタデカ−９，１２−ジエノエート
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ，１５Ｚ，１５’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート
（６Ｚ，６’Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオクタデカ−６，９，１２−トリエノエート
（Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオレエート
（９Ｚ，１２Ｚ）−５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オクタデカ−９，１２−ジエノエート
（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート
（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オクタデカ−６，９，１２−トリエノエート
５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オレエート
のなかから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項１２】
薬剤としてまたは化粧有効成分としてそれらを使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項１３】
色素脱失有効成分、老化防止有効成分、水和有効成分、抗炎症性有効成分、頭部および／または身体の毛の再成長を刺激するための有効成分、または抗酸化性有効成分として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物を含んでなる、局所投与用組成物。
【請求項１５】
少なくとも０．０１重量％〜１０重量％の一般式（Ｉ）の化合物、好ましくは０．１重量％〜５重量％の一般式（Ｉ）の化合物を含んでなる、請求項１４に記載の局所投与用組成物。
【請求項１６】
皮膚および／または頭髪および／または体毛の色素脱失、皮膚老化の治療および／または予防、表皮の水和、頭部および／または身体の毛の再成長の刺激、または皮膚炎症の治療を目的とする、請求項１４または１５に記載の局所投与用組成物。
【請求項１７】
カルボキシル官能基が活性型にある不飽和脂肪酸と、以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2012529462.tif 000024
のアスコルビン酸誘導体とのカップリングによる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物の合成方法。
【請求項１８】
カルボン酸官能基が酸塩化物の形態に活性化されている不飽和脂肪酸から出発して、塩基および場合によりカップリング助剤の存在下で、カップリング反応を実施する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスコルビン酸誘導体およびそれらを含有する薬学的または化粧組成物、それらの調製方法ならびにそれらの特に薬剤としてのまたは活性化粧成分としての使用に関する。
【０００２】
アスコルビン酸は、抗酸化性を有する有機酸である。アスコルビン酸の天然資源は、新鮮果実および野菜、特に柑橘類果実である。
【０００３】
その抗酸化性の故に、アスコルビン酸は、農産食品産業において食品添加物のリスト中コード番号Ｅ３００の下、防腐剤としてしばしば使用される。アスコルビン酸は、化粧品産業においても、その知られた抗ラジカル性および角質溶解性のために使用される。
【０００４】
アスコルビン酸は、空気中または湿気の存在で容易に着色する白色粉末の形態にある。
【０００５】
不飽和脂肪酸は、１つまたは複数の不飽和を有する脂肪酸に相当する。
【０００６】
モノ不飽和脂肪酸という用語は、それらが単一の不飽和を含むときに使用される。多価不飽和脂肪酸という用語は、それらが数個の不飽和を含むときに使用される。
【０００７】
不飽和脂肪酸も植物起源のものであってもよい。
【０００８】
不飽和脂肪酸は、異なる種類に分けられる。これらの種類は、酸基に対する側位から数えて最初の不飽和の位置により定義される。
【０００９】
特に、不飽和脂肪酸の３つの主な種類：オメガ３（ω３）、オメガ６（ω６）およびオメガ９（ω９）に分類される。ω３、ω６およびω９シリーズのシス不飽和脂肪酸は、数種のいわゆる必須脂肪酸を含む。これらの脂肪酸は、それらが食品摂取によってのみ供給され得るので必須であるといわれる。
【００１０】
主要な構成要素がオレイン酸（Ｃ１８：１）であるω９モノ不飽和脂肪酸は、心臓血管疾患の予防に有益な効果があることが知られている。
【００１１】
ω３およびω６の種類に属する多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）も、心臓血管疾患および癌に対して予防効果があることが知られている。食品中のω３不飽和脂肪酸とω６不飽和脂肪酸との間の比、即ち５リノール酸当たり１αリノレン酸の比を順守することがフランス食品安全局ＡＦＳＳＡＰにより特に推奨されている。
【００１２】
それらの代謝効果に加えて、それらは細胞内タンパク質をコードする遺伝子の発現を改変し得る。ＰＵＦＡのこれらの遺伝子効果は、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）と呼ばれる核受容体により作動するように思われる。ＰＰＡＲは、ステロイドタイプのホルモンの核受容体のファミリーに属する。それらはレチノイン酸のＲＸＲ受容体（レチノイドＸ受容体）とヘテロダイマーを形成して、遺伝子発現を調節する。したがって、ω３ＰＵＦＡは、ＮＦ−ＫＢ経路の主要な阻害剤ＩＫＢαの発現を誘発することによりＮＦ−ＫＢ活性化経路を阻害する、炎症性応答の負の調節剤であるように思われる（Ren J and Chung SH.J Agric Food Chem.2007 55:5073-80）。それに加えて、ω３ＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸の合成の利益に加えてアラキドン酸の合成に対する阻害作用を有する（Calder PC.Lipids:2001:36,1007-24）。
【００１３】
不飽和脂肪酸、特に多価不飽和脂肪酸は、それらの皮膚科学的性質が知られている（Monpoint S,Guillot B,Truchetet F et al. Essential fatty acids in dermatology. Ann Dermatol Venereol,1992,119:233-239）。特にリノール酸は、細胞膜の作製に関与する多価不飽和脂肪酸である。リノール酸が欠乏すると皮膚の乾燥およびアレルギーの存在を招く。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の化合物は、５位および６位のヒドロキシルが環状アセタール、より詳細にはアセトンの環状アセタール（アセトニド）により保護されるアスコルビン酸の不飽和脂肪酸のジエステルまたはモノエステルである。この官能基は微酸性媒体で、即ち５．２〜７の酸性ｐＨを有する皮膚上で容易に加水分解可能である。それ故、環状アセタールはアスコルビン酸をその側鎖の酸化から保護するであろう。環状アセタールの使用により、脂肪相に大きい溶解性を有する許容されるサイズの構造を得ることが可能になる。
【００１５】
脂肪酸のエステルも、皮膚中に存在するエステラーゼにより容易に開裂され得て、それが不飽和脂肪酸の遊離を可能にする（Redoules,D.,Tarroux,R.,Assalit,M.F.and Perie,J.J. Characterization and assay of five enzymatic activities in the stratum corneum using tape-stripping, Skin Pharmacol.Appl.Skin Physiol.,12, 182-192(1999)）。皮膚中に存在するエステラーゼによる不飽和脂肪酸エステルの開裂は、それ故、有効成分の緩慢な拡散を可能にして、それは薬剤送達概念に相当する。
【００１６】
本発明による式（Ｉ）の化合物について、皮膚エステラーゼのエステル結合に対する作用により、不飽和脂肪酸のモノエステルが使用されるときは１つの不飽和脂肪酸および１分子のアスコルビン酸；または不飽和脂肪酸のジエステルが使用されるときは２位のモノエステル経由で２つの不飽和脂肪酸および１分子のアスコルビン酸の遊離が生ずる。
【００１７】
特に不飽和脂肪酸のジエステルについて、エステラーゼの作用は、先ず不飽和脂肪酸のモノエステルの形成およびアスコルビン酸の遊離を生じ、次にアスコルビン酸およびもう１つの不飽和脂肪酸の遊離を生ずるであろう（スキーム１）。
【００１８】
スキーム１：皮膚エステラーゼによる開裂反応の例
【化１】
2012529462.tif 000003
【００１９】
したがって、本発明の主題は以下の一般式（Ｉ）の化合物である：
【化２】
2012529462.tif 000004
（式中、
Ｒ１は、少なくとも１つの不飽和、有利には１〜６、および好ましくは１〜４の不飽和を含むＣ１２−Ｃ２４不飽和脂肪酸から誘導される炭化水素鎖であり；および
Ｒ２およびＲ３は独立してまたは同時に：水素またはＣ１−Ｃ３アルキルまたはフェニルであり；および
Ｒ４は水素原子またはＣＯＲ１’であり、ここでＲ１’は少なくとも１つの不飽和、有利には１〜６、および好ましくは１〜４の不飽和を含むＣ１２−Ｃ２４不飽和脂肪酸から誘導される炭化水素鎖である。）
【発明の具体的説明】
【００２０】
本発明の意味における「不飽和」は、二重結合Ｃ＝Ｃを意味する。
【００２１】
本発明の意味における「不飽和脂肪酸」は、１２〜２４個の炭素原子、好ましくは１４〜１８個の炭素原子、より好ましくは１８個の炭素原子（カルボン酸官能基の炭素原子を含む。）を含み、且つ少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合、好ましくは１〜４のＣ＝Ｃ二重結合（これらの二重結合は好ましくはシス配置を有する。）を含む直鎖カルボン酸（Ｒ１ＣＯ２Ｈ）または（Ｒ１’ＣＯ２Ｈ）酸を意味する。
【００２２】
本発明の意味における「不飽和脂肪酸の炭化水素鎖」は、不飽和脂肪酸（Ｒ１ＣＯ２Ｈ）または（Ｒ１’ＣＯ２Ｈ）の酸官能基に結合した炭化水素鎖（Ｒ１）またはＲ１’）を意味する。Ｒ１およびＲ１’は、したがって、１１〜２３個、好ましくは１３〜１７個、およびさらに好ましくは１７個の炭素原子を含み、且つ少なくとも１つ、好ましくは１〜４のＣ＝Ｃ二重結合（これらの二重結合は、好ましくはシス配置を有する。）を含む直鎖炭化水素鎖を表す。本発明によれば、Ｒ４がＣＯＲ１’を表す場合、Ｒ１とＲ１’とは同じであっても異なっていてもよい。
【００２３】
不飽和脂肪酸は、ラウロレイン酸（Ｃ１２：１）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リシノール酸（Ｃ１８：１）；ガドレイン酸（Ｃ２０：１）、エルカ酸（Ｃ２２：１）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３）；ステアリドン酸（Ｃ１８：４）、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）、テトラコサペンタエン酸（Ｃ２４：５）、テトラコサヘキサエン酸（Ｃ２４：６）、リノール酸（Ｃ１８：２）、γ−リノレン酸（Ｃ１８：３）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：２）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５）、アドレン酸（Ｃ２２：４）およびカレンジン酸（Ｃ１８：３）であってよい。
【００２４】
有利には、発明の化合物は、Ｒ１が、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３）およびγ−リノレン酸（Ｃ１８：３）を含む群から選択された不飽和脂肪酸である化合物である。
【００２５】
有利には、本発明の化合物は、Ｒ４がＣＯＲ１’を表すとき、Ｒ１’がオレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３）およびγ−リノレン酸（Ｃ１８：３）を含む群から選択された不飽和脂肪酸である化合物である。
【００２６】
本発明の意味における「アルキル」は、特定数の炭素原子を含む直鎖または分岐の飽和脂肪族炭化水素鎖を意味する。例えば、メチル、エチルおよびプロピルを挙げることができる。
【００２７】
有利には、本発明の化合物は、Ｒ２およびＲ３がＣ１−Ｃ３アルキルを表す化合物である。
【００２８】
有利には、本発明の化合物は、Ｒ２およびＲ３がメチルを表す化合物である。
【００２９】
有利には、本発明の化合物は、Ｒ１が１〜３の不飽和を含むＣ１４−Ｃ１８不飽和脂肪酸の炭化水素鎖を表す化合物である。
【００３０】
有利には、本発明の化合物は、Ｒ４がＣＯＲ１’を表すとき、Ｒ１’が１〜３の不飽和を含むＣ１４−Ｃ１８の不飽和脂肪酸の炭化水素鎖を表す化合物である。
【００３１】
本発明の一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ４がＣＯＲ１’を表す化合物である。
【００３２】
本発明のもう一つの実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ４が水素原子を表す化合物である。
【００３３】
特に、本発明の化合物は、以下の分子のなかから選択することができる。
【００３４】
１．Ｒ４がＣＯＲ１’を表す一般式（Ｉ）の分子
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオクタデカ−９，１２−ジエノエート
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ，１５Ｚ，１５’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート、
（６Ｚ，６’Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオクタデカ−６，９，１２−トリエノエート
（Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオレエート。
【００３５】
２．Ｒ４が水素原子を表す一般式（Ｉ）の分子
（９Ｚ，１２Ｚ）−５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オクタデカ−９，１２−ジエノエート
（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート
（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オクタデカ−６，９，１２−トリエノエート
５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オレエート。
【００３６】
本発明のさらなる主題は、薬剤として使用するための一般式（Ｉ）の化合物である。
【００３７】
本発明のさらなる主題は、化粧有効成分として使用するための一般式（Ｉ）の化合物である。
【００３８】
詳細には、本発明のさらなる主題は、色素脱失有効成分、老化防止有効成分、抗酸化有効成分、水和有効成分、抗炎症性有効成分として、または身体および／または頭部の毛の再成長を刺激するための有効成分として使用するための一般式（Ｉ）の化合物である。
【００３９】
本発明は、少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物を、薬学的にまたは化粧品として許容される賦形剤、特に経皮投与に適合した賦形剤との組合せで含んでなることを特徴とする、薬学的または化粧組成物にも拡張される。
【００４０】
本発明において、「薬学的にまたは化粧品として許容される」とは、一般的に安全な、無毒性の且つ生物学的にも他の面でも望ましくないことがなく、治療用または化粧使用、とりわけ局所適用の使用が許容される、薬学的または化粧組成物の調製に有用なことを意味する。
【００４１】
本発明の薬学的または化粧組成物は、賦形剤、特に有効成分の性質および利用しやすさを改善するために皮膚中への浸透を可能にする賦形剤を加えた、皮膚または頭皮への局所投与のために通常知られている形態、即ち詳細にはローション、フォーム、ゲル、分散液、エマルション、シャンプー、スプレー、セラム、マスク、ボディミルクまたはクリームであってもよい。本発明の薬学的または化粧組成物は、しわ改善剤として通常使用される注射用ゲルの形態（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンまたはアルギン酸塩等との組合せ）であってもよい。
【００４２】
これらの組成物は、本発明の化合物に加えて、一般的には水系または溶媒系の生理学的に許容される媒体、例えばアルコール、エーテルまたはグリコールを含有する。それらは、界面活性剤、錯化剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤、湿潤剤、皮膚軟化剤、微量元素、精油、芳香剤、着色剤、マティファイング（ｍａｔｉｆｙｉｎｇ）剤、化学的または鉱物フィルタ、水和剤または鉱泉水、その他も含有してもよい。
【００４３】
これらの組成物は、相補性または場合により相乗効果をもたらす他の有効成分も含有してもよい。
【００４４】
有利には、本発明の組成物は、０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．１重量％〜５重量％の一般式（Ｉ）の化合物を含んでなる。
【００４５】
これらの組成物は、より詳細には、皮膚および／または頭髪および／または体毛の色素脱失、皮膚老化の治療および／または予防、表皮の水和、頭髪および／または体毛の再成長刺激、または皮膚炎症の治療を目的とする。
【００４６】
本発明のさらなる主題は、皮膚老化を治療および／または予防するための化粧方法である。
【００４７】
本発明の主題は、少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物を含有する化粧組成物を適用することによりヒト皮膚および／または体毛および／または頭髪を白くするおよび薄くする方法にも拡張される。
【００４８】
本発明のさらなる主題は、式（Ｉ）の化合物を、カルボキシル官能基が活性型である不飽和脂肪酸と、式（ＩＩ）のアスコルビン酸誘導体とのカップリングにより調製する方法に関する。
【００４９】
スキーム２：式（Ｉ）の化合物を調製する方法
【化３】
2012529462.tif 000005
（式中、Ｒ４はＣＯＲ１’または水素原子を表すことができる）
【００５０】
本発明のカップリング反応は、塩基の存在、および場合によりカップリング助剤の存在下で実施する。
【００５１】
塩基は、例えばピリジンまたはトリエチルアミンであってよい。
【００５２】
カップリング助剤は、例えば４−ジメチルアミノピリジンであってよい。
【００５３】
本発明の意味における「活性型」は、求核剤に対してより活性になるように改変されたカルボン酸官能基を意味する。これらの活性型は、当業者に周知であり、特に酸塩化物であってよい。
【００５４】
本発明は、以下の限定するものではない実施例に照らして、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】
【図２】
【実施例】
【００５６】
例１：本発明の化合物の合成
Ｒ４がＣＯＲ１’を表す一般式（Ｉ）の分子：
１．１  一般的方法Ａ：不飽和脂肪酸塩化物およびピリジンから出発
１．１ａ  分子１：
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイル−のジオクタデカ−９，１２−ジエノエート
【化４】
2012529462.tif 000006
【００５７】
経路１：  １０ｍｌ無水ピリジン中および窒素下の５，６−Ｏ−イソプロピリデン−アスコルビン酸（１．０８ｇ、５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）および４−ジメチルアミノピリジン（６１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ．）の溶液に、２．９ｇ塩化リノレオイル（１０ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を加えて、次に混合物を周囲温度で１６時間攪拌し続ける。反応は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により追跡する。
【００５８】
周囲温度に戻した後、溶媒を蒸発させ、次に残渣をエーテル／水混合物で抽出する。有機相を１ＮＨＣｌ溶液で２回、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒蒸発後に油状物が得られる。
【００５９】
次に、残渣をヘプタン／酢酸エチル混合物（１００：０〜７０：３０）を用いたシリカで、または分取ＨＰＬＣにより精製する。無色油状物の形態で得られた生成物を一晩真空乾燥する。
【００６０】
１．４９ｇが４０％の収率で得られる。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ：０．８３（２ｔ、６Ｈ）；１．２７−１．３９（ｍ、３４Ｈ）；１．６８（ｍ、４Ｈ）；２．０６（ｍ、８Ｈ）；２．５３（２ｔ、４Ｈ）；２．７７（２ｔ、４Ｈ）；４．０１（ｄｄ、１Ｈ）；４．１８（ｄｄ、１Ｈ）；４．３５（ｔｄ、１Ｈ）；５．１４（ｄ、１Ｈ）；５．３５（ｍ、８Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ：１４．０１；２２．６−３３．６（脂肪族）；６５．１９；７２．９；７５．３；７６．７；７７；１１０．８；１２２．０；１２７−１３０；１５０．８；１６７．７；１６８、１６９。
【００６１】
経路２：  ５，６−Ｏ−イソプロピリデン−アスコルビン酸（１ｇ）をジクロロメタン（１９ｍｌ）中の懸濁液に入れる。ピリジン（０．７９ｍｌ）を加えると反応媒体は不均一に白色になる（Ｔ＝１５℃）。１０分攪拌後、氷浴を用いて反応媒体を０℃に冷却する。ジクロロメタン（６ｍｌ）中の塩化リノレオイルの溶液（２．９８ｍｌ）を５分かけて加え、その後氷浴を外して反応媒体を３０分攪拌し続ける。
【００６２】
反応媒体を、水（３×５０ｍｌ）、２％硫酸銅溶液（ｗ／ｖ）（２×５０ｍｌ）で洗浄し、次に再び水（５０ｍｌ）で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、次に真空で濃縮して褐色に着色した油状物を得る（３．３ｇ；収率９６％）。
【００６３】
この油状物を窒素雰囲気中、−１８℃で貯蔵する。
【００６４】
１．２  一般的方法Ｂ：不飽和脂肪酸塩化物およびトリエチルアミンから出発
１．２ａ  分子２：
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ，１５Ｚ，１５’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイル−のジオクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート
【化５】
2012529462.tif 000007
【００６５】
２０ｍｌ無水ジクロロメタン中および窒素下の５，６−Ｏ−イソプロピリデン−アスコルビン酸（４３２ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）およびトリエチルアミン（９６０μｌ、７ｍｍｏｌ、３．５ｅｑ．）の溶液に、１．９１ｍｌ塩化リノレオイル（６ｍｍｏｌ、３ｅｑ．、７０％、工業用）を加え、次に混合物を周囲温度で１６時間攪拌し続ける。反応はＴＬＣにより追跡する。
【００６６】
周囲温度に戻した後、溶媒を蒸発させて、残渣をエーテル／水混合物で抽出する。有機相を１ＮＨＣｌ溶液２回、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を蒸発させた後で油状物が得られる。次に残渣をヘプタン／酢酸エチル混合物（１００：０から７０：３０）を用いたシリカで、または分取ＨＰＬＣにより精製する。無色油状物の形態で得られた生成物を一晩真空乾燥する。
【００６７】
６０４ｍｇが収率４１％で得られる。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ：０．９１（２ｔ、６Ｈ）；１．２７−１．３９（ｍ、３０Ｈ）；１．６７（ｍ、４Ｈ）；２．０６（ｍ、４Ｈ）；２．５３（２ｔ、４Ｈ）；２．７９（２ｔ、４Ｈ）；４．０９（ｄｄ、１Ｈ）；４．１８（ｄｄ、１Ｈ）；４．３６（ｔｄ、１Ｈ）；５．１４（ｄ、１Ｈ）；５．３８（ｍ、１２Ｈ）。
【００６８】
１．２ｂ  分子３：
（６Ｚ，６’Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイル−のジオクタデカ−６，９，１２−トリエノエート
【化６】
2012529462.tif 000008
【００６９】
２．５当量のγ塩化リノレオイル（９８％）から出発。
【００７０】
収率６８％で無色油状物。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ：０．８９（２ｔ、６Ｈ）；１．２７−１．４４（ｍ、２０Ｈ）；１．４７（ｍ、４Ｈ）；１．６８（ｍ、４Ｈ）；２．０６（ｍ、８Ｈ）；２．５５（ｍ、４Ｈ）；２．８０（ｍ、８Ｈ）；４．０１（ｄｄ、１Ｈ）；４．１８（ｄｄ、１Ｈ）；４．３６（ｔｄ、１Ｈ）；５．１４（ｄ、１Ｈ）；５．３７（ｍ、１２Ｈ）。
【００７１】
１．２．ｃ  分子４
（Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオレエート
【化７】
2012529462.tif 000009
【００７２】
２．５当量のオレオイル塩化物（９８％）から出発。
【００７３】
精製後、収率５３％で無色油状物。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ：０．８８（２ｔ、６Ｈ）；１．２６−１．５５（ｍ、４６Ｈ）；１．６７（ｍ、４Ｈ）；２．００（ｍ、８Ｈ）；２．５３（ｍ、４Ｈ）；２．７７（２ｔ、４Ｈ）；４．０９（ｄｄ、１Ｈ）；４．１８（ｄｄ、１Ｈ）；４．３６（ｔｄ、１Ｈ）；５．１４（ｄ、１Ｈ）；５．３４（ｍ、４Ｈ）。
【００７４】
例２：本発明の化合物の合成
Ｒ４が水素原子を表す一般式（Ｉ）の分子
２．１  分子５
（９Ｚ，１２Ｚ）−５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オクタデカ−９,１２−ジエノエート−
【化８】
2012529462.tif 000010
【００７５】
窒素下の３口フラスコ中で、１１０ｍｌアセトン中の５，６−Ｏ−イソプロピリデン−アスコルビン酸（５．５ｇ；２５．４４ｍｍｏｌ）の懸濁液を調製し、その後３．５３ｍｌトリエチルアミンを加える。大量の白色沈殿が形成される。次に塩化リノレオイル（３．５５ｍｌ；１１．０６ｍｍｏｌ）を３分間かけて滴下し、次に混合物を周囲温度で１０分攪拌し続ける。混合物は再び透明になり、次に少量の塩化トリエチルアンモニウムの沈殿が生ずる。固体を、焼結フィルタを通して濾過し、濾液を引いて油状物を得る。この油状物を１００ｍｌ酢酸エチルに溶解して、飽和ＮａＣｌ溶液で３回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して蒸発させ、９０％の収率で４．７６ｇの褐色固体を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ：０．９０（ｔ，３Ｈ）；１．２７−１．３９（ｍ、２０Ｈ）；１．７０（ｍ、２Ｈ）；２．０６（ｍ、４Ｈ）；２．５８（ｔ、２Ｈ）；２．７８（ｔ、２Ｈ）；４．１３（ｄｄ、１Ｈ）；４．２０（ｄｄ、１Ｈ）；４．４３（ｍ、１Ｈ）；４．６５（ｄ、１Ｈ）；５．３７（ｍ、４Ｈ）。
［Ｍ＋Ｎａ］＋＝５０１．２；［２Ｍ＋Ｎａ］＋＝９７９．７
［Ｍ−Ｈ］−＝４７７．３；［２Ｍ−Ｈ］−＝９５５．７
【００７６】
２．２  分子６
５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オレエート−  オレオイル塩化物から出発して、分子５についてと同じ操作様式。
【００７７】
白色固体、収率：９６％；
【化９】
2012529462.tif 000011
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ：０．８９（ｔ、３Ｈ）；１．２８−１．４２（ｍ、２６Ｈ）；１．６９（ｍ、２Ｈ）；２．０２（ｍ、４Ｈ）；２．６２（ｍ、２Ｈ）；４．１５（ｄｄ、１Ｈ）；４．２２（ｄｄ、１Ｈ）；４．４５（ｔｄ、１Ｈ）；４．７０（ｄ、１Ｈ）；５．３６（ｍ、２Ｈ）。
［Ｍ＋Ｎａ］＋＝５０３．２
［Ｍ−Ｈ］−＝４７９．３
【００７８】
２．３  分子７
（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−５−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３−イル  オクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート−
塩化リノレオイルから出発して分子５についてと同じ操作様式。
【００７９】
褐色固体。収率：９１％。
【化１０】
2012529462.tif 000012
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ：０．９９（ｔ、３Ｈ）；１．３０−１．４２（ｍ、１４Ｈ）；１．７２（ｍ、２Ｈ）；２．０８（ｍ、４Ｈ）；２．６２（ｍ、２Ｈ）；２．８２（ｍ、４Ｈ）；４．１５（ｄｄ、１Ｈ）；４．２２（ｄｄ、ＩＨ）；４．４５（ｔｄ、１Ｈ）；４．７０（ｄ、１Ｈ）；５．３８（ｍ、６Ｈ）。
［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４９９．１
［Ｍ＋Ｈ］＋＝４７７．２
【００８０】
例３：本発明による組成物
１．クリーム剤
【００８１】
【表１】
2012529462.tif 000013
【００８２】
２．乳剤
【００８３】
【表２】
2012529462.tif 000014
【００８４】
例４：生物学的試験の結果
４．１  生物学的試験の対象
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、組織とって構造的、調節的役割を有する動的構造である。真皮のＥＣＭは、線維（コラーゲンおよびエラスチン）および基本的物質（水、鉱物塩、糖タンパク質、ヒアルロン酸およびプロテオグリカン）で形成されている。それは皮膚にその膨満状態および機械的性質、即ち、硬度、弾性および張りを与える。ＥＣＭは、その構成高分子の合成と分解との平衡に関して絶えず再配列を受ける。ＥＣＭは、４タイプの高分子、即ち、コラーゲン、エラスチン、構造糖タンパク質およびグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸など）で形成されている。
【００８５】
コラーゲンは、真皮中に非常に多く含まれる繊維状タンパク質である。それらは、大部分、タイプＩ、ＩＩＩおよびＶの線維性コラーゲンである。コラーゲンは繊維状網目構造の必須成分を形成して、皮膚に抵抗力および弾性を付与する機械的役割を果たす。
【００８６】
ＥＣＭの分解は、幾つかの生理学的過程の道筋（瘢痕治癒、胚発生、血管新生…）にわたって起こるが、病理学的過程（関節炎、関節症、動脈硬化、腫瘍発生および転移形成…）中にも起こる（Fisher et al., N.Engl.J.Med.333:1419,1997;Shapiro SD Current Opinion in Cell Biology 10:602,1998）。ＥＣＭの成分は、マトリックスメタロプロテアーゼまたはＭＭＰと呼ばれるエンドペプチダーゼタイプの酵素により主に分解される（Nagase and Woessner, J.Biol.Chem.274:21491,1999）。ＭＭＰは、瘢痕治癒過程において有効な役割を果たすが、それらは、皮膚のたるみおよびしわの発生の原因にもなる。ＭＭＰは亜鉛エンドペプチダーゼタイプの酵素である。
【００８７】
ＭＭＰ−１、または間質コラゲナーゼは、主にタイプＩの線維性コラーゲンの三重ヘリックスを分解し、コラーゲンＩＩ、ＩＩ、ＶＩＩＩおよびＸも分解する（Kahari VM and Saarialho-Kere U, Exp.Dermatol.6:199,1997）。ＭＭＰ−１は、それ故、コラーゲンの分解開始において決定的役割を果たす。このコラーゲン分解活性は瘢痕治癒とも関連する。タイプ１ストロメライシン（ＭＭＰ−３）は、フィブロネクチンおよびラミニンなどの糖タンパク質、ある種のプロテオグリカン、エラスチン、ゼラチンおよびコラーゲンＩＶおよびＶを分解する。皮膚レベルにおいて、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３は、ケラチン生成細胞および線維芽細胞の両方により発現する。皮膚老化中に、ヒアルロン酸量の減少も上皮および真皮両方のレベルで観察される。この減少はヒアルロン酸合成の低下およびヒアルロニダーゼ活性の上昇の結果である（Stern R, Maibach HI(2008) Hyaluronan in skin:aspects of aging and its pharmacologic modulation. Clin Dermatol 26:22）。
【００８８】
それに加えて、多数の研究により、老化進行中の炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８…）の増加が証明されている（Franceschi et al, Mechanisms of ageing and development, 92, 2006）。この炎症促進性状況または「炎症性老化」は、老化の徴候の発症、特に皮膚レベルにおける老化の徴候の発症に直接関与しているように思われる（Mocchegiani et al., Biomed Central, 1:5, 2004; Licastro et al., Neurobiol. Aging, 2006）。そのとき、Ｔリンパ球により産生されるサイトカインであるインターロイキン（ＩＬ−６またはＩＬ−８）が発現する。
【００８９】
一般式（Ｉ）の化合物の皮膚老化および炎症に対する活性を証明するために、これらの化合物の効果を、Ｈ２Ｏ２で処理して細胞老化過程を模倣したヒト真皮の線維芽細胞におけるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＩＬ８の遺伝子発現で測定した。これらの一般式（Ｉ）の化合物の効果は、ヒアルロン酸合成およびヒアルロニダーゼ活性でも測定した。ヒアルロン酸合成を刺激すると、皮膚水和が改善および／または回復させることもできる（Bissett DL. J. Cosmet. Dermatol. 2006 Dec. 5(4): 309-15. Glucosamine: an ingredient with skin and other benefits）。
【００９０】
同様に、本発明による一般式（Ｉ）の化合物の色素脱失活性を証明するために、これらの化合物の効果を、マウスの黒色腫の細胞系：系Ｂ１６−Ｆ１０における比色アッセイによるメラニン合成で測定した。
【００９１】
それに加えて、一般式（Ｉ）の化合物の頭部および／または身体の毛の再成長に対する効果も、真皮乳頭細胞の増殖刺激およびヒト毛包の成長刺激に対するそれらの活性を測定することにより評価した。
【００９２】
４．２．１．  ヒト線維芽細胞におけるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＩＬ８の遺伝子発現についての試験プロトコル
細胞処理
ヒト真皮の線維芽細胞（手術で廃棄された皮膚から単離された）をＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＣＳ中で培養した。細胞をビタミンＣおよび試験すべき化合物で、１６時間３７℃で前処理して、次にＨ２Ｏ２で刺激した。次に細胞をビタミンＣおよび（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオクタデカ−９，１２−ジエノエートを含むＤＭＥＭ中に移し替えた。負荷終了の７２時間後に、線維芽細胞の老化が始まった：老化を示す線維芽細胞はもはや増殖しないが代謝活性は残る（Hayflick, J.Invest.Dermatol.,73;8-14,1979）。次に細胞をＲＮｅａｓｙ（商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ）のライシスバッファーで溶解した。
【００９３】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ
抽出したＲＮＡをＱｉａｇｅｎによるＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ逆転写キットの指示にしたがって相補性ＤＮＡに変換した。リアルタイムＰＣＲ分析は、ｉＱ  Ｉｃｙｃｌｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して行った。
【００９４】
ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＩＬ８をコードするｍＲＮＡの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲ技法を使用して分析した。目的の遺伝子の発現レベルを標準化するために、Vandesompela et al., Genome Biol. 3: RESEARCH 0034(2002)により開発された分析戦略を選択した。１回目のＰＣＲ中に得られたΔＣＴ値を使用して、Ｇｅｎｏｒｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．４（Vandesompele J et al., Genome Biol. 3: RESEARCH 0034 2002）のアルゴリズムにより、細胞試験の精密な実験条件下における３種の参照遺伝子の安定性のレベルが比較され、最も安定な参照遺伝子の決定が可能になる。本発明者らのモデルにおいて、試験した３種の参照遺伝子は以下のものである：β−アクチン（ヒトβ−アクチン）、ＧＡＰＤＨ（ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）およびＹＷＨＡＺ（チロシン−３−モノオキシゲナーゼ、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｇａｎ）−５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質ゼータポリペプチド）。
【００９５】
最初のステップで、目的の遺伝子について得たＣｔ値を、参照遺伝子について得たＣｔ値との比較で、各実験条件に対して標準化する。
【００９６】
したがって、計算は以下のようにした：
ΔＣｔ＝Ｃｔ目的の遺伝子−Ｃｔ参照遺伝子
これらのΔＣｔ値は統計分析に使用される生の未変換値を表す。
【００９７】
計算の第２ステップで、目的の遺伝子の処理中のコピー数の変動を決定する。そのようにしてΔΔＣｔを計算する：
ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ未処理ＮＨＦ−ΔＣｔ処理ＮＨＦ
【００９８】
したがって、未処理対照について、このＱＲは１に等しい。次に、この対照と比較して目的の遺伝子の誘発または阻害要因を計算することが可能である。
【００９９】
４．２．２  ヒト線維芽細胞におけるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＩＬ８の発現についての試験結果
統計分析
統計分析は、「一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）」といわれる検定を使用して実施した。次にＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用する分散分析により、分析された遺伝子の各々について、両方の場合におけるＨ２Ｏ２の存在下での化合物による正常成人線維芽細胞のΔＣｔ値の比較ができる。次にこの検定により、両方の条件について得られた結果の有意性を特徴づける「ｐ値」が得られる。有意度は以下のようにして決定した：
有意  ｐ＜０．０５（＊）
非常に有意  ｐ＜０．００５（＊＊）
高度に有意  ｐ＜０．００１（＊＊＊）
有意でない  ｐ＞０．０５。
【０１００】
本発明の化合物により処理したまたは未処理の老化を示すヒト真皮線維芽細胞におけるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＩＬ−８のｍＲＮＡの発現分析
・ｍＲＮＡの相対量の分析
ヒト真皮線維芽細胞を、Ｈ２Ｏ２で刺激する前および後に、アスコルビン酸または（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイルのジオクタデカ−９，１２−ジエノエート（＝表２中の有効成分１）の存在下でインキュベートした。Ｈ２Ｏ２により変化されたｍＲＮＡの発現に対するこれらの抽出物の効果を分析するために、有効成分で処理してＨ２Ｏ２で刺激した試料を、Ｈ２Ｏ２のみで刺激した試料と比較した。各試料について、目的のｍＲＮＡの発現レベルは、最も安定な参照遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルで標準化しなければならなかった。
【０１０１】
・活性比率の分析
評価すべき有効成分による異なったｍＲＮＡの発現レベルの阻害率も、式：
【数１】
2012529462.tif 000015
を使用して計算することが可能である。
【０１０２】
【表３】
2012529462.tif 000016
【０１０３】
分子１（（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−オキソ−２，５−ジヒドロフラン−３，４−ジイル）のジオクタデカ−９，１２−ジエノエート）は、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３およびＩＬ−８の発現を、アスコルビン酸よりも実質的に強く阻害する。
【０１０４】
本発明は、皮膚老化を予防および／または治療するための一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０１０５】
本発明は、炎症性皮膚反応を治療するための式（Ｉ）の化合物の使用にも拡張される。
【０１０６】
４．３．１  分子Ｂ１６−Ｆ１０におけるメラニンのアッセイのための試験プロトコル
原理：
これは、マウス黒色腫の細胞系：系Ｂ１６−Ｆ１０における比色アッセイによりメラニン合成を測定する試験である。この試験により有効成分の色素脱失特性の評価が可能になる。
【０１０７】
Ｂ１６−Ｆ１０細胞を、９６ウェルプレート上にＦＣＳ（ウシ胎児血清）で補完したＤＭＥＭ媒体中に播種して、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次に細胞をα−ＭＳＨ（メラニンの合成を刺激するため、観察された刺激は約１５０％であった）で刺激して、試験すべき有効成分で７２時間処理した。有効成分の各濃度を少なくとも３つ試験した。次に、ライシスバッファーに溶解した細胞内メラニンにより追跡した合計メラニンを、４０５ｎｍでの吸収によりアッセイした。合計タンパク質を溶解産物中で定量して、結果はｍｇメラニン／ｍｇタンパク質で表す。活性比率（％）は以下のようにして計算した：
【数２】
2012529462.tif 000017
【０１０８】
負の値は阻害を示し、それに対して正の値はメラニンの誘導された合成を示す。
【０１０９】
４．３．２  Ｂ１６−Ｆ１０細胞におけるメラニンのアッセイ結果
【０１１０】
【表４】
2012529462.tif 000018
【０１１１】
これらの試験結果（表２）は、分子１、２、３、４、５、６による細胞内メラニンの合成阻害がビタミンＣによるものよりも大きいことを示す。
【０１１２】
本発明は、皮膚および／または体毛および／または頭髪を色素脱失するための一般式（Ｉ）の化合物の使用にも関する。
【０１１３】
４．４．１  ヒアルロン酸合成のためのアッセイプロトコル
ケラチン生成細胞ＨａＣａＴをＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＣＳ中で培養する。細胞を試験すべき有効成分（表１）により３７℃で４８時間処理する。ＥＬＩＳＡタイプキット（Ｅｃｈｅｌｏｎ（商標））を使用して、合成されたヒアルロン酸（ＨＡ）を培地中でアッセイする。
【０１１４】
活性比率は以下のようにして定量した。
対照と比較した変化率
％ｐ／Ｃ＝（［ＨＡ］有効成分／［ＨＡ］対照×１００）−１００
【０１１５】
４．４．２  ヒトケラチン生成細胞ＨａＣａＴ系におけるヒアルロン酸のアッセイ結果
【０１１６】
【表５】
2012529462.tif 000019
【０１１７】
これらの試験結果（表３）は、生物学的活性濃度（３０および３００μＭ）で使用されたビタミンＣが、ＨａＣａＴケラチン生成細胞におけるヒアルロン酸合成に対して効果を有しないことを示す。
【０１１８】
分子１は、２および２０μＭで、ヒアルロン酸合成を強く刺激する：＋１３２％  ＋７０％。
【０１１９】
本発明は、したがって、皮膚老化の予防および／または治療のための一般式Ｉの化合物の使用に関する。本発明は、皮膚水和を改善および／または回復するための一般式Ｉの化合物の使用にも拡張される（Bissett DL. J. Cosmet. Dermatol. 2006 Dec. 5(4): 309-15. Glucosamine: an ingredient with skin and other benefits）。
【０１２０】
４．５．１  ヒアルロニダーゼ活性のアッセイプロトコル
ヒアルロニダーゼ活性は、残存ヒアルロン酸（ＨＡ）のアッセイにより測定する。基質を担体に固定化して、次に酵素および試験すべき多量の化合物の存在下に入れる。残存ＨＡ、即ち加水分解されなかったＨＡをＨＡ−Ｅｌｉｓａ検出システム：Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））を使用してアッセイする。
【０１２１】
ウシ起源の０．５単位のヒアルロニダーゼ（ＢＴＨ、ウシ精巣ヒアルロニダーゼ）を、試験すべき化合物で、３７℃で予めインキュベートした。この混合物を、マイクロプレートウェルの表面に固定化されたＨＡ上に堆積した。酵素反応はｐＨ７．２、３７℃で行った。洗浄に続いてヒアルロネクチン（ＮＨ）による残存ＨＡの認識ステップを実施した。結合したＮＨの量を、アルカリホスファターゼと結合した抗ＮＨ抗体を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。ホスファターゼの基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩（ｐｎＮｐｐ）により４０５ｎｍにおける分光学的検出が可能になる（Delpech B et al., Analytical Biochemistry 149, 555(565(1985); Robert Stern et al. Analytical Biochemistry 251, 263-269(1997)）。ＯＤ強度は残存ＨＡ量と相関づけられた。残存ＨＡ量は酵素活性と直結する。阻害剤の存在において、残存ＨＡの量が多いほど、試料の阻害性が大きい。ヒアルロニダーゼの阻害率（％）が示されるだろう。
【０１２２】
したがって、酵素不在の平均総活性と、試験すべき化合物の添加または無添加における酵素の総活性とにおける差を表す正味の酵素活性を計算した。
【０１２３】
試験すべき化合物に関する酵素阻害率は以下のようにして計算した：
阻害（％）＝（最大正味酵素活性）−試験すべき化合物の存在下の正味酵素活性）／最大正味酵素活性。
式中、最大正味酵素活性は、０．５Ｕの平均正味酵素活性を表す。
【０１２４】
４．５．２  ヒアルロニダーゼ活性のアッセイ結果
【０１２５】
【表６】
2012529462.tif 000020
【０１２６】
これらの試験結果（表４）は、これらの濃度（１００および５００μＭ）で使用されたビタミンＣがヒアルロニダーゼ（ＢＴＨ）に対して効果を有しないことを示す。
【０１２７】
これらの試験結果は、６−パルミチン酸アスコルビルが、１０〜２５０μＭで、有利に、用量効果をもってヒアルロニダーゼを阻害することを示す。
【０１２８】
５μＭ〜５００μＭの分子１、４、５および６は、ヒアルロニダーゼを強く阻害する：分子１は用量効果を有し、そのＩＣ５０は２５〜３０μＭの領域にある。
【０１２９】
分子１、４、５および６は、参照分子であるとみなされるパルミチン酸アスコルビルと同等またはより活性である（A. Botzki et al, JBC Vol. 279 N° 44, pp 45990-450007）。
【０１３０】
これらの試験結果は、分子１、４、５および６によるヒアルロニダーゼ阻害が、パルミチン酸アスコルビルおよびビタミンＣと同等またはそれより大きいことを示す。したがって、記載された分子の抗ヒアルロニダーゼ活性は、アスコルビン酸および６−パルミチン酸アスコルビルよりも大きい。
【０１３１】
本発明は、したがって、皮膚老化の予防および／または治療のためならびに皮膚水和を改善および／または回復するための一般式Ｉの化合物の使用に関する。
【０１３２】
４．６．１  真皮乳頭細胞の増殖のインビトロ刺激のためのプロトコル
ヒト真皮の乳頭細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を培養液に入れて、１０％ＦＣＳで補完したＤＭＥＭ培地中で初期継代培養物に保った。それらを、次に９６ウェルプレートで、１０％ＦＣＳで補完したＤＭＥＭ培地中に播種して１２時間おいた。培地を無血清ＤＭＥＭ培地により置き換え、次に１％ＦＣＳおよび異なった試験濃度の分子１、２、３および４で補完したＤＭＥＭにより置き換えた。６０時間のインキュベーション後、細胞増殖をＢｒｄＵ組込みにより評価した。
【０１３３】
４．６．２  真皮乳頭細胞のインビトロ刺激増殖試験結果
添付図１中のダイアグラムは、異なる分子の存在下での細胞のＢｒｄＵ組込みの増加および刺激された細胞増殖を示す（対照の％として）。
【０１３４】
分子１は真皮乳頭細胞の増殖を、用量効果をもって刺激し、活性は濃度１２．５μＭで最高である（１６９％増殖）。同様に、分子４は、濃度６．２５μＭで１１３．９％の刺激で増殖を誘発する。分子２および３も細胞増殖を誘発するが、分子１および４より程度は小さい。
【０１３５】
本発明は、頭部および／または身体の毛の再成長を刺激するための一般式（Ｉ）の化合物の使用にも関する。
【０１３６】
４．７．１  ヒト毛包の成長を刺激するためのプロトコル
ヒト頭皮の後頭部域の生検材料を手術廃棄物から得た。毛包を双眼顕微鏡下で顕微解剖により単離した。それらを、Ｐｈｉｌｐｏｔｔの技法（Philpott MP et al, J Cell Sci. 97: 463-471, 1990）にしたがって培養液中に個々に入れた。成長期相にある毛包を、分子３または４の存在下で、１０μｇ／ｍＬインスリン、１０μｇ／ｍＬトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、１ｍＭグルタマックスＩ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍＬアンホテリシンＢで補完したＷｉｌｌｉａｍの培地を入れた２４ウェル培養シャーレ中で１１日間インキュベートした。インキュベーション培地は定期的に更新した。４日および８日の培養で各毛包の伸長（μｍ）を毛包の取り込み画像で測定した。
【０１３７】
４．７．２  ヒト毛包の刺激された成長についての試験結果
添付図２中のダイアグラムは、４日および８日のインキュベーション後の毛包の伸張に対する分子３および４の効果を示す。
【０１３８】
次の表（表５）は、各処理条件について得られた成長率（％）、ならびに分子３および４で得られた刺激された毛髪成長率（％）を対照と比較して示す。
【０１３９】
【表７】
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【０１４０】
分子３および４は１５μＭの濃度で毛成長を有意に刺激し、４日培養後の成長をそれぞれ２５％および１９％で刺激した。
【０１４１】
本発明は、頭部および／または身体の毛の再成長を刺激するための一般式（Ｉ）の化合物の使用にも関する。
【０１４２】
４．８．１．  毛球変性の評価のためのプロトコル
毛包変性は、カイネティクス（kinetics）が１１日培養後に終了したときに、毛球の形態学的損傷（丸まり、変形）の観察により評価する。アポトーシス率（％）は、毛包数の合計に対するアポトーシス毛包数を計数することにより計算する。
【０１４３】
４．８．２  毛球変性の評価結果
次の表（表６）は、１１日のインキュベーション期間後の毛包の生存に対する分子４の効果を示す。
【０１４４】
【表８】
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【０１４５】
分子４は毛髪変性の顕著な抑制を可能にする（アポトーシス毛髪が対照の７５％に対して５０％）。したがって、分子４は、毛髪生存が維持されることを可能にする抗アポトーシス効果を有するように思われる。
【０１４６】
本発明は、頭部および／または身体の毛の再成長を刺激するための一般式（Ｉ）の化合物の使用にも関する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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