(57)【要約】  本発明は、減数分裂Ｉから減数分裂ＩＩへの移行に関与するタンパク質ＯＳＤ１が不活性である植物に関するものである。これらの植物は、第二分裂を行わない（ＳＤＲ）２ｎ配偶子を産生する。本発明はさらに、ＯＳＤ１の活性化が、植物における減数分裂性の組換えに関与する遺伝子および減数分裂中の動原体の単極配向に関与する遺伝子の不活性化と組合わされている植物に関するものである。これらの植物は、アポマイオシス性配偶子を産生する。これらの植物は、植物の品種改良に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第二分裂を行わない２ｎ配偶子を産生する植物を得るための方法であり、前記方法が、以下ＯＳＤ１タンパク質と呼ぶタンパク質の前記植物における阻害を含み、前記タンパク質が、配列番号１のＡｔＯＳＤ１タンパク質または配列番号３５のＯｓＯＳＤ１タンパク質と、少なくとも２０％の配列同一性または少なくとも２９％の配列類似性を有する、第二分裂を行わない２ｎ配偶子を産生する植物を得るための方法。
【請求項２】
ＯＳＤ１タンパク質の阻害が、ＯＳＤ１遺伝子またはそのプロモーターの突然変異誘発によって得られ、ＯＳＤ１タンパク質活性を部分的または完全に喪失した変異体が選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＯＳＤ１タンパク質の阻害が、前記タンパク質をコードする遺伝子を標的化するサイレンシングＲＮＡを前記植物で発現させることによって得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アポマイオシス性配偶子を産生する植物を得るための方法であり、前記方法が、
ａ）請求項１に記載のＯＳＤ１タンパク質と、
ｂ）植物における減数分裂性組換えの開始に関与するタンパク質であって、
ｉ）以下ＳＰＯ１１−１タンパク質と呼ばれる、配列番号２のＳＰＯ１１−１タンパク質と少なくとも４０％の配列同一性または少なくとも６０％の配列類似性を有するタンパク質、
ｉｉ）以下ＳＰＯ１１−２タンパク質と呼ばれる、配列番号３のＳＰＯ１１−２タンパク質と少なくとも４０％の配列同一性または少なくとも６０％の配列類似性を有するタンパク質、
ｉｉｉ）以下ＰＲＤ１タンパク質と呼ばれる、配列番号４のＰＲＤ１タンパク質と少なくとも２５％の配列同一性または少なくとも３５％の配列類似性を有するタンパク質、
ｉｖ）以下ＰＡＩＲ１タンパク質と呼ばれる、配列番号５のＰＡＩＲ１タンパク質と少なくとも３０％の配列同一性または少なくとも４０％の配列類似性を有するタンパク質、
から選択されるタンパク質と、
ｃ）以下Ｒｅｃ８タンパク質と呼ばれる、配列番号６のＲｅｃ８タンパク質と少なくとも４０％の配列同一性または少なくとも４５％の配列類似性を有するタンパク質と、
を前記植物において阻害するステップを含むことを特徴とする、アポマイオシス性配偶子を産生する植物を得るための方法。
【請求項５】
ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１またはＲｅｃ８タンパク質の少なくとも一つの阻害が、前記タンパク質をコードする遺伝子またはそのプロモーターの突然変異誘発によって得られ、前記タンパク質の活性を部分的または完全に喪失した変異体が選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１またはＲｅｃ８タンパク質の少なくとも一つの阻害が、前記タンパク質をコードする遺伝子を標的化するサイレンシングＲＮＡを前記植物において発現させることにより得られることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
−植物細胞中で機能的するプロモーターと、
−ａ）ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲＥＣ８から選択された標的遺伝子のｃＤＮＡもしくはその相補的ＤＮＡのフラグメントを各々含む、または前記フラグメントと少なくとも９５％の同一性を各々有する、２００〜１０００ｂｐの一つ以上のＤＮＡ構築物であり、前記一つまたは複数のＤＮＡ配列が前記プロモーターの転写制御下に置かれているＤＮＡ構築物と、
ｂ）転写されると、ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲＥＣ８から選択された遺伝子を標的化するヘアピンＲＮＡを形成することのできる一つ以上のヘアピンＤＮＡ構築物と、
ｃ）転写されると、ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲＥＣ８から選択された遺伝子を標的化するａｍｉＲＮＡを形成することのできる一つ以上のＤＮＡ構築物
から選択された少なくとも一つのＤＮＡ構築物と、
を含み、前記一つまたは複数のＤＮＡ構築物が前記プロモーターの転写制御下に置かれていることを特徴とする、発現カセット。
【請求項８】
ＯＳＤ１遺伝子を標的化するＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項９】
ＯＳＤ１遺伝子を標的化するＤＮＡ構築物、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１およびＰＡＩＲ１から選択された遺伝子を標的化するＤＮＡ構築物、ならびにＲＥＣ８を標的化するＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の発現カセットを含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載の発現カセットを含む導入遺伝子を含むトランスジェニック植物であることを特徴とする、第二分裂を行わない２ｎ配偶子を産生する植物。
【請求項１２】
請求項４〜６のいずれかに記載の方法によって得ることのできる、アポマイオシス性配偶子を産生する植物。
【請求項１３】
請求項９に記載の発現カセットを含む導入遺伝子を含むトランスジェニック植物であることを特徴とする、請求項１２に記載の植物。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって得ることのできる植物を栽培するステップと、前記植物により産生された配偶子を回収するステップとを含むことを特徴とする、第二分裂を行わない２ｎ配偶子を産生するための方法。
【請求項１５】
請求項４〜６のいずれかに記載の方法により得ることのできる植物を栽培するステップと、前記植物により産生された配偶子を回収するステップとを含むことを特徴とする、アポマイオシス性配偶子を産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第二分裂を行わない（ＳＤＲ：Ｓｅｃｏｎｄ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｔｉｔｕｉｔｉｏｎ）２ｎ配偶子を産生する植物、およびアポマイオシス性配偶子を産生する植物、および植物の品種改良におけるそれらの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
２ｎ配偶子（２倍体配偶子としても公知である）は、配偶体の染色体数ではなくむしろ体細胞の染色体数を有する配偶子である。これらは、複数の作物の遺伝的改良のために有用であることが示されてきた（精査のためには、例えばＲＡＭＡＮＮＡ  ＆  ＪＡＣＯＢＳＥＮ、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １３３、３〜１８、２００３を参照）。詳細には、２倍体配偶子の産生により、異なる倍数性レベルの植物間での交雑、例えば４倍体の作物植物とその２倍体の野生相対物との間の交雑が可能となり、こうして植物品種改良計画にそれらの遺伝的多様性が利用されることになる。
【０００３】
２ｎ配偶子の形成は、減数分裂間の異常の結果である（精査のためにはＶＥＩＬＬＥＵＸ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ３、２５２−２８８、１９８５、またはＢＲＥＴＡＧＮＯＬＬＥ  ＆  ＴＨＯＭＰＳＯＮ、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ  １２９、１−２２、１９９５を参照）。
【０００４】
正常な減数分裂において、染色体はまず最初に複製し、姉妹染色分体の対がもたらされる。この複製期の後には、減数分裂Ｉと減数分裂ＩＩとして公知の２期の分裂がある。減数分裂Ｉの間に、相同染色体は組換えられ、各々が染色体の半数体の全内容を一つ含む、二つの細胞に分けられる。減数分裂ＩＩで、減数分裂Ｉによってもたらされた二つの細胞はさらに分裂し、姉妹染色分体は分離する。したがって、この分裂によってもたらされた胞子は半数体であり、組換えられた遺伝情報を有する。
【０００５】
２ｎ配偶子の形成に導く異常としては、詳細には、細胞質分裂異常、第一もしくは第二の減数分裂の飛び越し、または紡錘体幾何形状異常がある（精査のためにはＶＥＩＬＬＥＵＸ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ３、２５２−２８８、１９８５、またはＢＲＥＴＡＧＮＯＬＬＥ  ＆  ＴＨＯＭＰＳＯＮ、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ  １２９、１−２２、１９９５を参照）。これらの異常は、異なる部類の非還元配偶子を導く。例えば第一の減数分裂の障害は、第一分裂を行わない（ＦＤＲ）配偶子をもたらし、一方、第二の減数分裂の障害は、第二分裂を行わない（ＳＤＲ）配偶子をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さまざまな植物種において、２ｎ配偶子を産生することのできる数多くの変異体が報告されてきたが、今までのところ２ｎ花粉の形成に関与する一つの遺伝子だけが同定され、分子レベルで特徴づけされている。ＡｔＰＳ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｐｉｎｄｌｅｓ）と呼ばれるこの遺伝子の不活性化は、２倍体の雄性胞子を生成し、生存能力のある２倍体花粉粒と、後代における自然発生的な３倍体植物とを発生させることになる。この遺伝子および２ｎ花粉産生のためのその使用は、２００８年７月８日出願の欧州特許出願公開第０８４９０６７２号明細書およびＤ’ＥＲＦＵＲＴＨら（ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２００８  Ｎｏｖ；４（１１）：ｅ１０００２７４．Ｅｐｕｂ２００８  Ｎｏｖ２８）の刊行物に開示されている。
【０００７】
発明者らは今や、モデル植物であるシロイヌナズナタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において、植物中の２ｎ配偶子の形成に関与する別の遺伝子を同定した。発明者らは、この遺伝子の不活性化が、第二減数分裂の飛び越しをもたらすことを発見した。これは２倍体の雄性および雌性胞子を生成し、ＳＤＲ配偶子である生存可能な２倍体の雄性および雌性配偶子を発生させる。この遺伝子を以下、第二分裂の脱落（ｏｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を略してＯＳＤ１と呼ぶ。シロイヌナズナタリアナのＯＳＤ１遺伝子の配列は、Ａｔ３ｇ５７８６０というアクセッション番号でＴＡＩＲデータベースで、またはＮＭ−１１５６４８というアクセッション番号でＧｅｎＢａｎｋデータベースで入手可能である。この遺伝子は、２４３ａａのタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿１９１３４５）をコードし、その配列も配列番号１として添付の配列表に表わされている。
【０００８】
シロイヌナズナタリアナのＯＳＤ１遺伝子は、ＨＡＳＥらの刊行物（Ｐｌａｎｔ  Ｊ、４６、３１７−２６、２００６）において「ＵＶＩ４様」遺伝子（ＵＶＩ４−Ｌ）として先に記述されており、この刊行物はＵＶＩ４という名のそのパラログについて記載している。ＨＡＳＥらによると、ＵＶＩ４は、核内倍加の抑制因子として作用し、有糸分裂状態を維持するために必要であり、一方ＯＳＤ１（ＵＶＩ４−Ｌ）はこのプロセスには必要とされないように思われる。対照的に、本明細書で示されているように、ＯＳＤ１は、減数分裂Ｉから減数分裂ＩＩへの移行を可能にするために必要不可欠であると思われる。
【０００９】
発明者らは同様に、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）において、シロイヌナズナタリアナのＯＳＤ１遺伝子のオルソログも同定した。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａのＯＳＤ１遺伝子の配列は、ＯｒｙＧｅｎｅｓまたはＴＡＩＲデータベースで、Ｏｓ０２ｇ３７８５０というアクセッション番号で入手可能である。それは、２３４ａａのタンパク質をコードし、その配列は、配列番号３５として添付の配列表に表わされている。シロイヌナズナタリアナおよびイネのＯＳＤ１タンパク質は、その配列の全長にわたり２３．６％の同一性および３５％の類似性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって本発明は、第二分裂を行わない２ｎ配偶子を産生する植物を得るための方法であり、前記方法は、以下ＯＳＤ１タンパク質と呼ぶタンパク質を前記植物において阻害することを含み、前記タンパク質は、配列番号１のＡｔＯＳＤ１タンパク質または配列番号３５のＯｓＯＳＤ１タンパク質と、少なくとも２０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列同一性、または、少なくとも２９%の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列類似性を有する。
【００１１】
別段の規定の無いかぎり、本明細書で提供されているタンパク質の配列の同一性および類似性の値は、デフォルトパラメータ下のＢＬＡＳＴＰプログラム、またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（デフォルトパラメータ下のＥＭＢＯＳＳペアワイズアラインメントＮｅｅｄｌｅツール）を用いて、配列の全長にわたって計算される。類似度の計算は、重み行列ＢＬＯＳＵＭ６２を用いて行われる。
【００１２】
本発明にしたがって産生されたＳＤＲ２ｎ配偶子は、２ｎ配偶子の、全ての通常の利用分野において、例えば倍数体植物を産生するため、または異なる倍数性レベルの植物間の交雑を可能にするために有用である。これらの配偶子は同様に、遺伝地図作成の方法、例えば米国特許出願公開第２００８００５７５８３号明細書に開示された「逆後代地図作製」方法においても有用であり得る。
【００１３】
発明者らはさらに、ＯＳＤ１の不活性化を他の二つの遺伝子の不活性化と組合せることにより、後続する性的プロセスに影響を及ぼすことなく減数分裂が有系分裂によって完全に置換される遺伝子型をもたらすことを発見したが、該二つの遺伝子の一方は、植物中の効率的な減数分裂性の組換えに必要不可欠なタンパク質をコードし、かつその阻害が、組換えおよび対合を無くす、遺伝子（ＳＰＯ１１−１）であり（ＧＲＥＬＯＮら、Ｅｍｂｏ  Ｊ、２０、５８９−６００、２００１）、他方は、減数分裂中の動原体の単極配向に必要不可欠なタンパク質をコードし（ＣＨＥＬＹＳＨＥＶＡら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１８、４６２１−３２、２００５）、かつその阻害が染色分体の分離を変更する、遺伝子（ＲＥＣ８、Ａｔ２ｇ４７９８０）である。この遺伝子型は、以下「ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｎｓｔｅａｄ  ｏｆ  ｍｅｉｏｓｉｓ（減数分裂に代わる有系分裂）」を略してＭｉＭｅと呼ばれる。この有系分裂による減数分裂の置換は、親の遺伝情報を全て保持するアポマイオシス性配偶子を結果としてもたらす（ＢＩＣＫＮＥＬＬ  ＆  ＫＯＬＴＵＮＯＷ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１６  Ｓｕｐｐｌ、Ｓ２２８−４５、２００４）。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】有系分裂、正常な減数分裂、ｏｓｄ１変異体における減数分裂、ＳＰＯ１１−１活性が欠如した変異体（Ａｔｓｐｏ１１−１）における減数分裂、ＳＰＯ１１−１活性およびＲＥＣ８活性の両方が欠如した二重変異体（Ａｔｓｐｏ１１−１／Ａｔｒｅｃ８）における減数分裂、ならびにＭｉＭｅ変異体における減数分裂の機序間の概略的な比較を提供する図である。
【図２】ＯＳＤ１遺伝子のイントロン／エクソン構造および二つの異なるＤｓ挿入の場所を示す図である。
【図３】野生型植物における減数分裂を表す図である。
【図４】ｏｓｄ１変異体における減数分裂を表す図である。
【図５】ｏｓｄ１／Ａｔｒｅｃ８／Ａｔｓｐｏ１１−１変異体の雄性および雌性減数分裂中の染色体挙動の観察結果を示す図である。
【図６】有糸分裂中期ならびに対応する４週齢の植物および花を示す図である。
【図７】野生型における胞子の四分染色体、およびＡＭＢ１２における胞子の二分染色体を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
２倍体細胞における有糸分裂の間、染色体は複製し、そして姉妹染色分体は、分離して、２倍体であり、遺伝的に始原細胞と同一である娘細胞を生成する。正常な減数分裂の間、単一の複製期の後に２期の染色体分離が続く。分裂１において相同染色体が組換えられ、分離される。減数分裂ＩＩは、より有糸分裂に類似しており、姉妹染色分体の均一の分配をもたらす。したがって、得られた胞子は半数体であり、組換えられた遺伝情報を有する。ｏｓｄ１変異体（本研究）においては、減数分裂ＩＩは飛び越され、組換えられた遺伝情報を伴う２倍体胞子およびＳＤＲ配偶子を発生させる。
【００１６】
Ａｔｓｐｏ１１−１変異体は、不均衡な第一分裂を起こし、その後、不均衡胞子および不稔性を導く第二分裂が生じる。
【００１７】
Ａｔｓｐｏ１１−１／Ａｔｒｅｃ８二重変異体は、正常な第一減数分裂の代わりに有糸分裂様の分裂を起こし、その後、不均衡胞子および不稔性を導く不均衡な第二分裂が生じる。
【００１８】
ｏｓｄ１／Ａｔｓｐｏ１１−１／Ａｔｒｅｃ８三重変異体（ＭｉＭｅ）においては、Ａｔｓｐｏ１１−１およびＡｔｒｅｃ８突然変異の存在によって有糸分裂様の第一減数分裂が導かれ、ｏｓｄ１突然変異の存在によって第二減数分裂の発生が阻止される。こうして減数分裂は、有糸分裂様分裂により置換される。得られた胞子および配偶子は、遺伝的に始原細胞と同一である。
【００１９】
ＭｉＭｅ変異体により産生されたアポマイオシス性配偶子を、ＳＤＲ２ｎ配偶子と同じように、倍数体植物を生産するために、または異なる倍数性レベルの植物を交雑するために使用することができる。これらは、単為生殖植物、すなわち胚珠の母体組織から種子を形成して母親の遺伝的クローンである後代をもたらす植物の生産にも有利である。単為生殖植物は４００種超の被子植物において存在するものの、単為生殖である作物種はきわめて少なく、交雑によりこの形質を導入する試みは失敗に終わっている（ＳＡＶＩＤＡＮ、Ｔｈｅ  Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｐｏｍｉｘｉｓ：Ｆｒｏｍ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００１；ＳＰＩＬＬＡＮＥら、Ｓｅｘｕａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１４、２００１）。
【００２０】
したがって本発明のさらなる目的は、アポマイオシス性配偶子を産生する植物を得るための方法であり、該方法は、前記植物において、
ａ）上記で定義したＯＳＤ１タンパク質、
ｂ）植物における減数分裂性組換えの開始に関与するタンパク質であって、
ｉ）以下ＳＰＯ１１−１タンパク質と呼ばれるタンパク質であり、配列番号２のＳＰＯ１１−１タンパク質と少なくとも４０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列同一性、または、少なくとも６０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列類似性を有するタンパク質、
ｉｉ）以下ＳＰＯ１１−２タンパク質と呼ばれるタンパク質であり、配列番号３のＳＰＯ１１−２タンパク質と少なくとも４０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列同一性、または、少なくとも６０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列類似性を有するタンパク質、
ｉｉｉ）以下ＰＲＤ１タンパク質と呼ばれるタンパク質であり、配列番号４のＰＲＤ１タンパク質と少なくとも２５％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列同一性、または少なくとも３５％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列類似性を有するタンパク質、
ｉｖ）以下ＰＡＩＲ１タンパク質と呼ばれるタンパク質であり、配列番号５のＰＡＩＲ１タンパク質と少なくとも３０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列同一性、または少なくとも４０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列類似性を有するタンパク質、
から選択されるタンパク質、
ｃ）以下Ｒｅｃ８タンパク質と呼ばれるタンパク質であり、配列番号６のＲｅｃ８タンパク質と少なくとも４０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列同一性、または少なくとも４５％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９８％の配列類似性を有するタンパク質
を阻害することを含む。
【００２１】
配列番号２は、シロイヌナズナタリアナのＳＰＯ１１−１タンパク質の配列を表わす。この配列は同様に、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースでＱ９Ｍ４Ａ２というアクセッション番号で入手可能である。
【００２２】
配列番号３は、シロイヌナズナタリアナのＳＰＯ１１−２タンパク質の配列を表わす。この配列は同様に、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースでＱ９Ｍ４Ａ１というアクセッション番号で入手可能である。
【００２３】
配列番号４は、シロイヌナズナタリアナのＰＲＤ１タンパク質の配列を表わす。この配列は同様に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースでＡＢＱ１２６４２というアクセッション番号で入手可能である。
【００２４】
配列番号５は、シロイヌナズナタリアナのＰＡＩＲ１タンパク質の配列を表わす。この配列は同様に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースでＮＰ＿１７１６７５というアクセッション番号で入手可能である。
【００２５】
配列番号６は、シロイヌナズナタリアナのＲｅｃ８タンパク質の配列を表わす。この配列は同様に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースでＮＰ＿１９６１６８というアクセッション番号で入手可能である。
【００２６】
ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲｅｃ８タンパク質は、高等植物、単子葉植物ならびに双子葉植物において保存されている。単子葉植物におけるシロイヌナズナタリアナのＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲｅｃ８タンパク質のオルソログの非限定的な例として、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲｅｃ８タンパク質を挙げることができる。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＳＰＯ１１−１タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋでＡＡＰ６８３６３というアクセッション番号で入手可能であり、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＳＰＯ１１−２タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋで、ＮＰ＿００１０６１０２７というアクセッション番号で入手可能であり、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＰＲＤ１タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋでＥＡＺ３０３１１というアクセッション番号で入手可能であり、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＰＡＩＲ１タンパク質の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔでＱ７５ＲＹ２というアクセッション番号で入手可能であり、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｒｅｃ８タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋでＡＡＱ７５０９５というアクセッション番号で入手可能である。
【００２７】
以上で言及したＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１またはＲｅｃ８タンパク質の阻害は、その機能を廃止、遮断もしくは低減させることによってか、または有利には、対応する遺伝子の発現を防止または下方調節することによって得ることができる。
【００２８】
一例としては、前記タンパク質の阻害は、対応する遺伝子またはそのプロモーターの突然変異誘発と、前記タンパク質の活性を部分的または完全に喪失した変異体の選択によって得ることができる。例えば、コード配列内の突然変異は、その突然変異の性質に応じて、不活性タンパク質または活性障害を有するタンパク質の発現を誘発し得る。同様にして、プロモーター配列内の突然変異は、前記タンパク質の発現の欠如またはその減少を誘発し得る。
【００２９】
突然変異誘発は、前記タンパク質もしくはその一部をコードする遺伝子のコード配列もしくはプロモーターの標的欠失か、または、前記コード配列もしくは前記プロモーター内への外因性配列の標的挿入によって実施可能である。これは同様に、例えばＥＭＳ突然変異誘発またはランダム挿入突然変異誘発を介して、ランダム突然変異を誘発し、その後、所望の遺伝子内の変異体をスクリーニングすることによっても実施可能である。ハイスループットの突然変異誘発およびスクリーニングの方法が、当該技術分野において利用可能である。一例として、ＴＩＬＬＩＮＧ（ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００、により記載されたＴａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）に言及することができる。
【００３０】
ＯＳＤ１遺伝子における突然変異の中でも、ＳＤＲ２ｎ配偶子の産生を可能にする突然変異は、この突然変異に対してホモ接合性である植物の表現型特性に基づいて同定可能である。これらの植物は、減数分裂産物として、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、なお一層好ましくは少なくとも５０％、そして最高１００％の二分染色体を形成することができる。
【００３１】
ＳＰＯ１１−１遺伝子またはＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１またはＰＡＩＲ１遺伝子などの、植物における減数分裂性組換えの開始に関与するタンパク質をコードする遺伝子における突然変異の中でも、アポマイオシス性配偶子を産生する植物を得るのに有用な突然変異は、この突然変異に対してホモ接合性である植物の表現型特性、詳細には減数分裂Ｉにおける二価染色体に代る一価染色体の存在および植物の不稔性に基づいて同定可能である。
【００３２】
ＲＥＣ８遺伝子に突然変異を有する変異体の中でも、アポマイオシス性配偶子を産生する植物を得るのに有用な変異体は、この突然変異についてホモ接合性である植物の表現型特性、詳細には、減数分裂における染色体の断片化および植物の不稔性に基づいて同定可能である。
【００３３】
ＳＤＲ２ｎ配偶子を産生することが可能な植物を得るための本発明の方法の好ましい実施形態によると、前記方法は、
ａ）ＯＳＤ１遺伝子の対立遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害をもたらす、この対立遺伝子内に突然変異を有する植物を提供するステップであり、前記植物がこの突然変異についてヘテロ接合性であるステップと、
ｂ）前記突然変異に対してホモ接合性である植物を得るために、ステップａ）の前記植物を自家受精させるステップと
を含んでいる。
【００３４】
アポマイオシス性配偶子を産生することができる植物を得るための本発明による方法の好ましい実施形態によると、前記方法は、
ａ）ＯＳＤ１遺伝子の対立遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害をもたらす、この対立遺伝子内に突然変異を有する植物を提供するステップであり、前記植物がこの突然変異についてヘテロ接合性であるステップと、
ｂ）ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１またはＰＡＩＲ１遺伝子から選択された遺伝子の対立遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害をもたらす、この対立遺伝子内に突然変異を有する植物を提供するステップであり、前記植物がこの突然変異についてヘテロ接合性であるステップと、
ｃ）ＲＥＣ８遺伝子の対立遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害をもたらす、この対立遺伝子内に突然変異を有する植物を提供するステップであり、前記植物がこの突然変異についてヘテロ接合性であるステップと、
ｅ）ＯＳＤ１遺伝子の対立遺伝子内に突然変異を、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１またはＰＡＩＲ１遺伝子から選択された遺伝子の対立遺伝子内に突然変異を、そしてＲＥＣ８遺伝子の対立遺伝子内に突然変異を有する植物を得るために、ステップａ）ｂ）およびｃ）の植物を交雑するステップであり、前記植物が各突然変異についてヘテロ接合性であるステップと、
ｆ）ＯＳＤ１遺伝子内の突然変異、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１またはＰＡＩＲ１遺伝子から選択された遺伝子内の突然変異、そしてＲＥＣ８遺伝子内の突然変異についてホモ接合性である植物を得るために、ステップｅ）の植物を自家受精させるステップと
を含む。
【００３５】
代替的には、標的タンパク質の阻害は、対応する遺伝子のサイレンシングによって得られる。植物における遺伝子サイレンシング方法は、それ自体、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，１９０，０６５号明細書および５，２８３，３２３号明細書に例として記載されているように、アンチセンス阻害または同時抑制によるものに言及することができる。前記タンパク質のｍＲＮＡを標的化するリポザイムを使用することも可能である。
【００３６】
好ましい方法は、サイレンシングすべき遺伝子を標的化するサイレンシングＲＮＡを用いて、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって遺伝子サイレンシングを誘発する方法である。当該技術分野においては、サイレンシングＲＮＡの送達のためのさまざまな方法およびＤＮＡ構築物が利用可能である。
【００３７】
「サイレンシングＲＮＡ」とは、本明細書では、相補的ｍＲＮＡ分子に対する塩基対合により、配列特異的に標的遺伝子をサイレンシングすることができる、低分子ＲＮＡとして定義される。サイレンシングＲＮＡは、詳細には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。
【００３８】
当初、植物にサイレンシングＲＮＡを送達するためのＤＮＡ構築物は、前記植物において活性なプロモーターの転写制御下で、標的遺伝子のｃＤＮＡの３００ｂｐ以上（一般的には３００〜８００ｂｐ、ただしさらに短い配列が効率のよいサイレンシングを誘発することもある）のフラグメントを含んでいた。現在、より広く使用されているサイレンシングＲＮＡ構築物は、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）転写産物を産生することのできる構築物である。これらの構築物においては、標的遺伝子のフラグメントは、通常は反復間にスペーサー領域を伴って、逆反復している（精査のためには、ＷＡＴＳＯＮら、２００５を参照のこと）。同様に、サイレンシングすべき遺伝子に対する人工的マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を使用することもできる（植物中の、詳細にはａｍｉＲＮＡを含む、サイレンシングＲＮＡの設計および利用分野についての精査のためには、例えばＯＳＳＯＷＳＫＩら（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，５３、６７４〜９０、２００８）を参照のこと）。
【００３９】
本発明は、ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲＥＣ８から選択された一つ以上の標的遺伝子をサイレンシングするための手段、詳細には前記遺伝子を標的化するｈｐＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡのための発現カセットを含む手段を提供するものである。
【００４０】
本発明の発現カセットは、例えば、
−植物細胞中で機能するプロモーターと、
−ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲＥＣ８から選択された標的遺伝子のｃＤＮＡもしくはその相補体のフラグメントを各々が含むか、または、前記フラグメントと少なくとも９５％、そして順に好適度が高くなる、少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を各々が有する、２００〜１０００ｂｐ、好ましくは３００〜９００ｂｐの一つ以上のＤＮＡ構築物であり、前記プロモーターの転写制御下に置かれているＤＮＡ構築物と
を含んでいてよい。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態によると、ｈｐＲＮＡのための発現カセットは、
−植物細胞中で機能するプロモーターと、
−転写されると、ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲＥＣ８から選択された遺伝子を標的化するヘアピンＲＮＡを形成することのできる、一つ以上のヘアピンＤＮＡ構築物と
を含むものであり、前記一つまたは複数のＤＮＡ構築物は、前記プロモーターの転写制御下に置かれている。
【００４２】
一般に前記ヘアピンＤＮＡ構築物は、
ｉ）標的遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントで構成されるか、または前記フラグメントと少なくとも９５％の同一性、そして順に好適度が高くなる、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、２００〜１０００ｂｐ、好ましくは３００〜９００ｂｐの第一のＤＮＡ配列、
ｉｉ）前記第一のＤＮＡの相補体である第二のＤＮＡ配列であり、前記第一および第二の配列は相対する配向にあり、ならびに、
ｉｉｉ）前記第一および第二のＤＮＡ配列が転写されると、単一の二本鎖ＲＮＡ分子を形成できるように、これらの第一および第二の配列を分離する、スペーサー配列
を含む。
このスペーサーは、ＤＮＡのランダムなフラグメントであり得る。しかしながら好ましくは、標的植物細胞によりスプライシング可能であるイントロンを使用することができる。そのサイズは、一般的に長さが４００〜２０００ヌクレオチドである。
【００４３】
本発明の別の好ましい実施形態によると、ａｍｉＲＮＡのための発現カセットは、
−植物細胞中で機能するプロモーターと、
−転写されると、ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１およびＲＥＣ８から選択された遺伝子を標的化するａｍｉＲＮＡを形成することのできる、一つ以上のＤＮＡ構築物と
を含むものであり、前記一つまたは複数のＤＮＡ構築物は、前記プロモーターの転写制御下に置かれている。
【００４４】
有利には、本発明の発現カセットは、ＯＳＤ１遺伝子を標的化するＤＮＡ構築物を含む。特に好ましい実施形態によると、該発現カセットは、ＯＳＤ１遺伝子を標的化するＤＮＡ構築物、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１およびＰＡＩＲ１から選択された遺伝子を標的化するＤＮＡ構築物、ならびにＲＥＣ８を標的化するＤＮＡ構築物を含む。
【００４５】
植物中の異種遺伝子の発現に適したプロモーターの幅広い選択肢が当該技術分野において利用可能である。
【００４６】
これらは、植物、植物ウイルス、またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のような細菌から得ることができる。これらは、構成的プロモーター、すなわち、大部分の組織と細胞において、そして大部分の環境条件下で活性であるプロモーター、ならびに、一部の組織または一部の細胞型においてのみ、またはそれらにおいて主に活性である、組織特異的または細胞特異的プロモーター、および、線虫感染症からもたらされるような物理的または化学的刺激によって活性化される誘導性プロモーターを含む。
【００４７】
植物細胞において一般的に使用される構成的プロモーターの非限定的な例として、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｎｏｓプロモーター、ルビスコプロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターがある。
【００４８】
本発明において利用可能である器官または組織特異的プロモーターには、詳細には、減数分裂関連発現を付与できるプロモーター、例えばＤＭＣ１プロモーター（ＫＬＩＭＹＵＫ  ＆  ＪＯＮＥＳ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１１、１−１４、１９９７）が含まれる。遺伝子ＯＳＤ１、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＡＩＲ１またはＲＥＣ８の内因性プロモーターのいずれかを使用することもできる。
【００４９】
本発明のＤＮＡ構築物は一般的に、転写ターミネーターをも含んでいる（例えば３５Ｓ転写ターミネーターまたはノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）転写ターミネーター）。
【００５０】
本発明は同様に、本発明のキメラＤＮＡ構築物を含む組換えベクターも含んでいる。従来、前記組換えベクターは、形質転換された宿主の選択を可能にする一つまたは複数のマーカー遺伝子も含んでいる。
【００５１】
適切なベクターの選択およびその内部にＤＮＡ構築物を挿入するための方法は、当業者にとって周知である。ベクターの選択は、意図された宿主および前記宿主の意図された形質転換方法に左右される。双子葉植物または単子葉植物の数多くの植物種に、植物細胞または植物の遺伝形質転換のためのさまざまな方法を利用することが可能である。非限定的例として、ウイルス媒介性形質転換、マイクロインジェクションによる形質転換、エレクトロポレーションによる形質転換、微粒子銃媒介型形質転換、アグロバクテリウム媒介性形質転換などに言及することができる。
【００５２】
本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ構築物を含む宿主細胞も提供している。前記宿主細胞は、原核細胞、例えばアグロバクテリウム細胞、または真核細胞、例えば本発明のＤＮＡ構築物によって遺伝的に形質転換された植物細胞であり得る。構築物は、一時的に発現されてよい。これを安定した染色体外レプリコンに取込むかまたは染色体に組込むことも可能である。
【００５３】
ＳＤＲ２ｎ配偶子を産生することのできる植物を提供するための本発明による方法の好ましい実施形態によると、前記植物はトランスジェニック植物であり、前記方法は、
ａ）ＯＳＤ１遺伝子を標的化する本発明のＤＮＡ構築物を含むベクターで、少なくとも一つの植物細胞を形質転換するステップと、
ｂ）前記ＤＮＡ構築物を含む導入遺伝子をそのゲノムに有する植物を再生するために、前記形質転換された植物細胞を栽培するステップと
を含む。
【００５４】
アポマイオシス性配偶子を産生することのできる植物を得るための本発明による方法の好ましい実施形態によると、前記植物はトランスジェニック植物であり、前記方法は、
ａ）ＯＳＤ１遺伝子を標的化する本発明のＤＮＡ構築物を含むベクター、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１およびＰＡＩＲ１から選択された遺伝子を標的化する本発明のＤＮＡ構築物を含むベクター、ならびにＲＥＣ８遺伝子を標的化する本発明のＤＮＡ構築物を含むベクターで、少なくとも一つの植物細胞を形質転換するステップと、
ｂ）前記ＤＮＡ構築物を含む導入遺伝子をそのゲノムに有する植物を再生するために、前記形質転換された植物細胞を栽培するステップと
を含む。
【００５５】
アポマイオシス性配偶子を産生することのできる植物を得るための本発明の方法の別の好ましい実施形態によると、前記植物はトランスジェニック植物であり、前記方法は、
ａ）ＯＳＤ１遺伝子を標的化する本発明のＤＮＡ構築物を含むベクター、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１およびＰＡＩＲ１から選択された遺伝子を標的化する本発明のＤＮＡ構築物、ならびにＲＥＣ８遺伝子を標的化する本発明のＤＮＡ構築物を含むベクターで、少なくとも一つの植物細胞を形質転換するステップと、
ｂ）前記ＤＮＡ構築物を含む導入遺伝子をそのゲノムに有する植物を再生するために、前記形質転換された植物細胞を栽培するステップと
を含む。
【００５６】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる、ＳＤＲ２ｎ配偶子またはアポマイオシス性配偶子を産生することのできる植物を包含する。
【００５７】
これには、詳細には、
−この突然変異の結果ＯＳＤ１タンパク質が阻害される、ＯＳＤ１遺伝子内の突然変異、
−この突然変異の結果、遺伝子によりコードされるＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１またはＰＡＩＲ１タンパク質が阻害される、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１またはＰＡＩＲ１遺伝子から選択された遺伝子内の突然変異と、
−この突然変異の結果Ｒｅｃ８タンパク質が阻害される、ＲＥＣ８遺伝子内の突然変異と
を含む植物が含まれる。
【００５８】
これには同様に、本発明の一つ以上のＤＮＡ構築物によって遺伝的に形質転換された植物も含まれる。好ましくは、前記植物はトランスジェニック植物であり、ここで、前記構築物は植物ゲノムに組込まれた導入遺伝子に含まれ、その結果、連続する植物世代へと伝えられる。
【００５９】
ＯＳＤ１タンパク質の下方調節をもたらす、ＯＳＤ１遺伝子を標的化するキメラＤＮＡ構築物の発現は、前記トランスジェニック植物に、２ｎＳＤＲ配偶子を産生する能力を提供する。ＯＳＤ１遺伝子を標的化するキメラＤＮＡ構築物、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１およびＰＡＩＲ１から選択された遺伝子を標的化するキメラＤＮＡ構築物、ならびにＲＥＣ８遺伝子を標的化するキメラＤＮＡ構築物の共発現は、これら三つの遺伝子によりコードされるタンパク質の下方調節をもたらし、前記トランスジェニック植物に、アポマイオシス性配偶子を産生する能力を提供する。
【００６０】
本発明はまた、本発明の方法により得ることのできる植物を栽培するステップおよび前記植物により産生される配偶子を回収するステップを含む、ＳＤＲ２ｎ配偶子を産生するための方法をも包含している。好ましくは、前記配偶子は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の生存可能な２ｎ配偶子を含む。
【００６１】
本発明はまた、本発明の方法により得ることのできる植物を栽培するステップおよび前記植物により産生される配偶子を回収するステップを含む、アポマイオシス性配偶子を産生するための方法をも包含している。好ましくは、前記配偶子は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％の、そして順に好適度が高くなる、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の生存可能なアポマイオシス性配偶子を含む。
【００６２】
本発明は、広範な農学的に有利な単子葉または双子葉植物に適用される。非限定的例としては、ジャガイモ、イネ、小麦、トウモロコシ、トマト、キュウリ、アルファルファ、サトウキビ、サツマイモ、マニオック、クローバ、大豆、ホソムギ、バナナ、メロン、スイカ、綿花、または例えばバラ、ユリ、チューリップおよびスイセンのような観賞植物に言及することができる。
【００６３】
本発明の以上のおよびその他の目的および利点は、以下の詳細な説明および添付図面からさらに明らかになるものである。ただし、この以上の詳細な説明は例示的なものであり、本発明を制限する趣旨のものではない。
【実施例】
【００６４】
実験手順
【００６５】
植物材料と成長条件
【００６６】
シロイヌナズナ植物を、ＶＩＧＮＡＲＤら、（ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ、３、１８９４−９０６、２００７）に記載されている通りに栽培した。発芽検定およびサイトメトリー実験のために、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓをインビトロで、２１℃で昼間１６時間／夜間８時間の光周期で、そして７０％の湿度測定で、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ培地（ＥＳＴＥＬＬＥ  ＆  ＳＯＭＥＲＶＩＬＬＥ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２０６、２００−０６、１９８７）において栽培した。
【００６７】
遺伝分析
【００６８】
二つのプライマー対を用いて、ＰＣＲ（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で１分のサイクル３０回）によって植物の遺伝子型を決定した。各々の遺伝子型について、プライマー対を表Ｉに示し、挿入に特異的なプライマー対を表ＩＩに示す。
【００６９】
【表１】
2012514467.tif 000002
【００７０】
【表２】
2012514467.tif 000003
【００７１】
ｏｓｄ１−１（Ｎｏ−０）／ｏｓｄ１−２（Ｌｅｒ）×Ｃｏｌ−０  Ｆ１集団およびｏｓｄ１−（Ｎｏ−０）／ｓｐｏ１１−１（Ｃｏ１−０）／ｒｅｃ８（Ｃｏ１−０）三重変異体×ＬｅｓＦ１集団の遺伝子型を決定するために用いられる遺伝子マーカーが表ＩＩＩに列挙されている。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、Ｔｍで３０秒、そして７２℃で３０秒のサイクル４０回であった。
【００７２】
【表３】
2012514467.tif 000004
【００７３】
これらのマーカーを、示されたプライマーを用いて増幅させ（９４℃で３０秒、５８℃で３０秒そして７２℃で３０秒のサイクル４０回）、３％のアガロースゲル上の泳動後に観察した。
【００７４】
Ｅｃｏ４７ＩＩＩ／ＨｐａＩＩ二重消化の後にＣＡＰＳ  Ｋ４  １０３５５を観察した。ｏｓｄ１−１およびｏｓｄ１−２の挿入境界に特異的な二つのプライマー対を、染色体３上のマーカーとして使用した。
【００７５】
細胞学およびフローサイトメトリー：
【００７６】
ＡＺＵＭＩら（Ｅｍｂｏ  Ｊ、２１、３０８１−９５．、２００２）に記載されている通りに、最終的な減数分裂産物を観察し、４０倍の乾燥対物レンズの備わった従来の光学顕微鏡で検分した。染色体の拡散および観察を、ＭＥＲＣＩＥＲら、（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８３、１０２３−２８、２００１）に記載された技術を用いて実施した。オープンＬＡＢ４０．４ソフトウェアを用いて、花粉精核のＤＮＡ蛍光発光を定量化した。各々の核について、周囲のバックグラウンドを計算し、核の全体的な蛍光発光から減算した。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを対比染色したということを除いて、ＭＥＲＣＩＥＲら（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１５、１８５９−７１、２００１）に記載されているプロトコルにしたがって、減数分裂紡錘体を観察した。観察は、ＬｅｉｃａのＳＰ２共焦点顕微鏡を用いて行なわれた。ｘｙｚ方向で６３倍の水浸対物レンズを用いて画像を収集し、Ｌｅｉｃａソフトウェアを用いて３次元再構成を行った。投影が示される。各々Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８およびＤＡＰＩを用いて、４８８ｎｍと４０５ｎｍの励起で細胞を撮像した。標準としてトマト、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ｃｖ「Ｍｏｎｔｆａｖｅｔ」を用いて、ＭＡＲＩＥ  ＆  ＢＲＯＷＮ、（Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、７８、４１−５１、１９９３）に記載されている通りに、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのゲノムサイズを測定した（２Ｃ＝１．９９ｐｇ、％ＧＣ＝４０．０％）。
【００７７】
実施例１：ｏｓｄ１変異体による２倍体配偶子の産生
【００７８】
ＡｔＧｅｎＥｘｐｒｅｓｓ組織セット（ＳＣＨＭＩＤら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、３７、５０１−６、２００５）と共にＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｇｌｅｒツール（ＴＯＵＦＩＧＨＩら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、４３、１５３−６３、２００５）を用いた、減数分裂遺伝子のための発現プロファイリングスクリーニングの一部として、複数の公知の減数分裂遺伝子とのその同時調節に起因して優れた候補として、Ａｔ３ｇ５７８６０を選択した。Ａｔ３ｇ５７８６０は、そのパラログＵＶＩ４遺伝子の研究（ＨＡＳＥら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、４６、３１７−２６、２００６）に手短に記載されているＵＶＩ４様遺伝子（ＵＶＩ４−Ｌ）に対応する。減数分裂におけるその役割に起因して（以下参照）、我々は、Ａｔ３ｇ５７８６０遺伝子を、ｏｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ（第二分裂の脱落）を略してＯＳＤ１と再命名した。ＯＳＤ１およびＵＶＩ４タンパク質は、植物界全体に保存されているが、明らかな公知の保存された機能的ドメインを全く含んでいない。植物界以外では、いかなるホモログも同定されなかった。
【００７９】
我々は、二つの変異体を単離、そして特徴づけすることによって、ＯＳＤ１遺伝子の役割を調査した。ｏｓｄ１−１（ｐｓｔ１５３０７）およびｏｓｄ１−２（ＧＴ２１４８１）Ｄｓ挿入突然変異体は、各々Ｎｏｏｓｅｅｎ（Ｎｏ−０）およびＬａｎｄｓｂｅｒｇ（Ｌｅｒ）バックグラウンドにあり、両方のケースで、挿入はＯＳＤ１遺伝子の第二エクソンにある。
【００８０】
ＯＳＤ１遺伝子のイントロン／エクソン構造および二つの異なるＤｓ挿入の場所は、図２に示されている。ＯＳＤ１遺伝子は三つのエクソンと二つのイントロンを含み、２４３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。二つのＤｓ挿入の位置は、三角形によって示されている。
【００８１】
図３は、野生型植物における減数分裂を表わし、図４はｏｓｄ１変異体における減数分裂を表す。
【００８２】
図３の凡例：（Ａ）太糸期。相同染色体が完全に接合している。（Ｂ）移動期。キアズマにより連結された五対の相同染色体（二価）が観察される。（Ｃ）中期Ｉ。五つの二価染色体が中期板上に整列している。（Ｄ）後期Ｉ。相同染色体は分離している。（Ｅ）終期Ｉ。（Ｆ）中期ＩＩ。姉妹染色分体の対が中期板上で整列している。（Ｇ）後期ＩＩ。姉妹染色分体は分離している。（ＨおよびＩ）終期ＩＩ。四つの半数体胞子が形成される（四分染色体）。スケールバー＝１０μｍ。
【００８３】
図４の凡例：（ＡおよびＢ）トルイジンブルーで染色した雄性減数分裂産物。（Ａ）野生型四分染色体。（Ｂ）ｏｓｄ１−１変異体内の二分染色体。（Ｃ〜Ｄ）ｏｓｄ１内の雄性減数分裂は、終期Ｉまでは野生型と区別不能である（図３と比較されたい）が、第二分裂に特徴的な形態は一切観察されなかった。（Ｃ）太糸期。（Ｄ）移動期。（Ｅ）中期Ｉ。（Ｆ）後期Ｉ。（Ｇ）終期Ｉ。（Ｈ）ｏｓｄ１内の雌性減数分裂の中期Ｉ。
【００８４】
両方の独立したｏｓｄ１変異体において、雄性減数分裂の産物は、四分染色体ではなく二分染色体であった（ｏｓｄ１−１：７１４／７１４  ｏｓｄ１−２：３３４／３３４）（図４ＡおよびＢ）。ｏｓｄ１−１とｏｓｄ１−２の間の相補性試験は、これらの突然変異が対立遺伝子変異である（ｏｓｄ１−１／ｏｓｄ１−２：３６９ｄｙａｄｓ／３６９）ことを確認し、したがって、観察された二分染色体がＯＳＤ１遺伝子の分断に起因することを実証した。Ｏｓｄ１変異体は、体細胞発生上の欠陥、雄性および雌性配偶体の致死性または受精率低下を全く示さなかった（野生型では果実１個あたり３８±１１の種子、ｏｓｄ１では果実１個あたり３５±６）。
【００８５】
次に、我々は２倍体ｏｓｄ１変異体の子孫の間で倍数性レベルを測定した。自殖後代の中には、４倍体（８４％）および３倍体（１６％）が見られたが、２倍体植物は全く観察されなかった（ｏｓｄ１−１：ｎ＝５６、ｏｓｄ１−２：ｎ＝２４）。変異体花粉を使用して野生型植物を受精した場合、得られた後代は全て３倍体であった（ｏｓｄ１−１：ｎ＝７５）。変異体胚珠を野生型花粉粒で受精した場合、１２％の２倍体植物および８８％の３倍体植物を単離した（ｎ＝２５）。このことは、ｏｓｄ１変異体が高レベルの雄性（１００％）および雌性（約８５％）２倍体胞子を産生し、これが機能的配偶子をもたらすということを実証した。
【００８６】
ｏｓｄ１中の二分染色体の産生を導く機序を解明するために、我々は、減数分裂中の染色体の挙動を調査した。雄性および雌性減数分裂Ｉは、野生型から区別不能であった（図４と図３を比較のこと）。とりわけ、交差の細胞学的徴候であるキアズマ、および二価染色体が観察された。しかしながら、（前期から胞子形成までの５００超の雄性減数分裂細胞のうち）いかなる減数分裂ＩＩの形態も発見することはできず、このことは、二分染色体の産生が第二減数分裂の欠如に起因することを強く示唆していた。この第二分裂が起こらない場合には、動原体におけるヘテロ接合は、第一分裂中の姉妹染色分体の同時分離およびホモログの分離を理由として、２倍体配偶子でことごとく喪失される。組換えのため、動原体に連結されていないあらゆる遺伝子座が分離する。我々は、ｏｓｄ１−１変異体（Ｎｏ−０）およびｏｓｄ１−２変異体（Ｌｅｒ）の二つの異なる遺伝的バックグラウンドを利用することによって、我々の仮説を試験した。二つの突然変異を有するＦ１植物（ｏｓｄ１についての変異体および任意のＮｏ−０／Ｌｅｒ多型に対するヘテロ接合体）を、雄または雌として第３の遺伝的バックグラウンドＣｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ−０）に対し交雑させた。三形性分子マーカーについて得られた植物の核型および遺伝子型を決定することにより、花粉粒の遺伝的構成、および変異体により産生された雌性配偶体についての直接的な情報が得られた。試験した全ての２倍体配偶子は、予測された遺伝的特性を有していた。これらは、系統的に動原体においてホモ接合性であり、その他の遺伝子座では、組換えを理由として、分離性であった（雄性２倍体配偶子についてｎ＝４８、そして雌性２倍体配偶子についてはｎ＝４１）。これらの結果は、第二減数分裂の不在が実際に、ｏｓｄ１における２ｎ配偶子産生の原因であることを確認した。この機序は同様に、減数分裂Ｉにおける不均衡な染色体分離がｏｓｄ１における不均衡な二分染色体を発生させると考えられることも意味している。このことは、二重Ａｔｓｐ１１−１／ｏｓｄ１−１変異体を分析することによって確認された（データは示さず）。
【００８７】
第二減数分裂の不在に起因して、ｏｓｄ１変異体は、高頻度の生存可能な雄性および雌性配偶体を産生し、これは受精の後、生存可能な４倍体植物を生成する。ただし、この現象は、産生された配偶子が母植物と遺伝的に異なるという点で、アポマイオシスと異なっている。
【００８８】
実施例２：三重ｏｓｄ１／Ａｔｒｅｃ８／Ａｔｓｐｏ１１−１変異体によるアポマイオシス性配偶子の産生
【００８９】
二重Ａｔｓｐｏ１１−１／Ａｔｒｅｃ８変異体において、第一の減数分裂は、有糸分裂様の分裂により置換され、その後に、不均衡な胞子および不稔性を導く不均衡な第二分裂が続く（ＣＨＥＬＹＳＨＥＶＡら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１８、４６２１−３２、２００５）。
【００９０】
我々は、ｏｓｄ１／Ａｔｒｅｃ８／Ａｔｓｐｏ１１−１変異体を生成した。Ａｔｓｐｏ１１−１およびＡｔｒｅｃ８突然変異の両方についてヘテロ接合性の植物は、各突然変異についてヘテロ接合性である植物を交雑することによって得られるものであり、これらをｏｓｄ１についてヘテロ接合性である植物と交雑した。同定された三重ヘテロ接合性植物を自家受精させ、三つの突然変異についてホモ接合性である植物を分析した。
【００９１】
これらの変異体の雄性および雌性減数分裂中の染色体挙動の観察結果が、図５に示されている。
【００９２】
図５の凡例：（Ａ）雄性中期Ｉ。（Ｂ）雄性後期Ｉ。写真は、ＭｉＭｅ中の二分染色体を示す。（Ｃ）雌性中期Ｉ。（Ｄ）雌性後期Ｉ。スケールバー＝１０μｍ。
【００９３】
これらの観察結果は、有糸分裂様の分裂、すなわち中期板上に整列した１０個の一価染色体そして後期で分離した姉妹染色分体を明らかにした（図５）。
【００９４】
Ａｔｓｐｏ１１−１およびＡｔｒｅｃ８突然変異は、有糸分裂様の第一の減数分裂を導き、ｏｓｄ１突然変異は、第二の減数分裂が発生するのを妨げる。この結果、有糸分裂様の分裂による減数分裂の置換およびアポマイオシスがもたらされる。
【００９５】
我々はこの遺伝子型を「減数分裂に代る有糸分裂（ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｎｓｔｅａｄ  ｏｆ  ｍｅｉｏｓｉｓ）」を略してＭｉＭｅと呼んだ。ＭｉＭｅ植物は、二分染色体（４０８／４０８）を生成し、繁殖力に富む（果実１個あたり２５±６個の種子）。したがってｏｓｄ１突然変異はＡｔｓｐｏ１１−１／Ａｔｒｅｃ８二重変異体の不稔性表現型を抑制した。
【００９６】
ＭｉＭｅ植物の自殖後代は、系統的に４倍体（ｎ＝２４）であり、２倍体ＭｉＭｅ植物と野生型植物の間の戻し交配は、雄性（ｎ＝２４）または雌性（ｎ＝６７）ＭｉＭｅ配偶子のいずれが使用されるかに関わらず３倍体植物を生成し、この有糸分裂様の分裂が機能的２倍体配偶子を発生させることを示した。以上で記述した通りに同様の要領で試験した全ての配偶子（雄性および雌性）は、試験された全ての遺伝子マーカーについて母植物のヘテロ接合性を系統的に保持し、こうして遺伝的に母植物と同一であった。これらの結果は、ＭｉＭｅ植物が、その後の性的プロセスに影響を及ぼすことなく、正常な減数分裂の代りに有糸分裂様の分裂を起こすことを確認している。
【００９７】
減数分裂が有糸分裂により置換された場合、各世代で倍数性は２倍になると予想される。これは、図６に示されている通り、ＭｉＭｅ植物で観察された。
【００９８】
図６の凡例：左欄：有糸分裂中期、スケールバー＝１０μｍ。右欄：対応する４週齢の植物（スケールバー＝２ｃｍ）および花（スケールバー＝１ｍｍ）。
【００９９】
後続する世代において、我々は４倍体（４Ｎ、２０染色体、ｎ＝２６）および８倍体（８Ｎ、４０染色体、ｎ＝３３）を得た。
【０１００】
実施例３：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＯＳＤ１遺伝子のイネオルソログの同定
【０１０１】
Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａゲノムは、二つのＯＳＤ１／ＵＶＩ４ホモログ候補（Ｏｓ０２ｇ３７８５０およびＯｓ０４ｇ３９６７０）を含む。我々は、この推定ホモログの一つ（Ｏｓ０２ｇ３７８５０）の中で二つのＴ−ＤＮＡ挿入突然変異体を単離した。二つの系列ＡＭＢＡ１２およびＡＭＱＦ１０の遺伝子型をＰＣＲにより決定して、ホモ接合体を選択した。両方の系列において、２倍体変異体植物の子孫の中に自然発生的な４倍体植物が観察され、これは、機能的な雄性および雌性の２ｎ配偶子の産生を示唆していた（ＡＭＢＡ１２：１００％の４倍体、ｎ＝３０；ＡＭＱＦ１０  ３７％の４倍体、ｎ＝２７）。次に我々は、ＡＭＢ１２変異体内の減数分裂産物を研究し（ｎ＞４００）、図７により示されている通り、四分染色体に代って１００％の二分染色体の産生を観察した。
【０１０２】
図７の凡例：Ａ：野生型における胞子の四分染色体、Ｂ：ＡＭＢ１２における胞子の二分染色体。
【０１０３】
この表現型は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｏｓｄ１変異体と同一である。ＡＭＢＡ１２ホモ接合体変異体において二分染色体の産生を導く機序を解明するため、我々は減数分裂中の染色体の挙動を調査した。減数分裂Ｉは、野生型と区別不能であった。とりわけ、交差の細胞学的徴候であるキアズマ、および二価染色体が観察された。しかしながら、いかなる減数分裂ＩＩの形態も発見することはできず、このことは、２Ｎ胞子の産生がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｏｓｄ１の場合と同様、第二減数分裂の欠如に起因することを強く示唆している。全体として、これらの結果は、Ｏｓ０２ｇ３７８５０がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＯＳＤ１の機能的ホモログであることを示しており、したがってそれをＯｓＯＳＤ１と呼んだ。ＯＳＤ１およびＯｓＯＳＤ１タンパク質は、配列の全長を網羅するアラインメントで２３．６％の同一性と３５％の類似性を有する（ＥＭＢｏｓｓペアワイズアラインメントＮｅｅｄｌｅツール）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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