(57)【要約】  ２つの個体の混合物中の対立遺伝子、ゲノムおよびトランスクリプトームを検出する方法および遺伝子型決定パネルが開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得；
該サンプルをサブサンプルに分割し；
胎児識別子の存在につき、サブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定し；次いで
少なくとも１つのサブサンプル中の胎児細胞からの少なくとも１つの該胎児識別子の存在を同定することを含むことを特徴とする胎児識別子の検出方法。
【請求項２】
さらに、少なくとも１つの該サブサンプルに対してサブサンプル増幅を行い、増幅生成物を供することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、該増幅生成物をアリコートに分割することを含み、
ここに、少なくとも１つの該胎児識別子の存在についてのサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、胎児識別子の存在につきアリコートをスクリーニングまたは遺伝子型決定することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
該サブサンプル増幅が、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、標的核酸増幅、胎児識別子以外の核酸配列の増幅、核酸配列用の代理の生成および細胞分裂よりなる群から選択される方法を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
該サブサンプル増幅が、標的核酸増幅、胎児識別子以外の核酸配列の増幅、核酸配列用の代理の生成および細胞分裂を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
さらに、該母体細胞の遺伝物質が、１組の標的遺伝子座にてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかを決定して、母体の遺伝子型を決定することを含み、ここに、胎児識別子についてのアリコートもしくはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、少なくとも１つの標的遺伝子座にて該母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき該アリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含み、該母体の遺伝子型と異なる該遺伝子型の存在は、該増幅生成物中の有益な父性対立遺伝子の存在を示し、少なくとも１つの該胎児識別子の存在の同定は、少なくとも１つのアリコートもしくはサブサンプル中の有益な父性対立遺伝子を同定することを含むことを特徴とする請求項１または４記載の方法。
【請求項７】
さらに、該母体細胞の遺伝物質がホモ接合性またはヘテロ接合性であるかを決定するのに先立ち、該標的遺伝子座を選択することを含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
さらに、該標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択することを含み、ここに、該スクリーニングまたは遺伝子型決定は、該試験遺伝子座にて該母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき、アリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
該試験遺伝子座の該選択が、標的遺伝子座にて該母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき、混合された母体および胎児核酸のサンプルをスクリーニングし、次いで、該試験遺伝子座として、混合された母体および胎児核酸の該サンプル中の非母体の遺伝子型で標的遺伝子座を選択することを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
さらに、該有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルを分析して、遺伝的変異を検出することを含むことを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項１１】
さらに、該有益な父性対立遺伝子を含むと同定された該アリコートもしくはサブサンプルの一部分を収集することを含み、
ここに、該有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルを分析して遺伝的変異を検出することは、該アリコートもしくはサブサンプルの収集部分を分析することを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該収集部分が、該アリコートもしくはサブサンプルの均質部分であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該収集部分が、該アリコートもしくはサブサンプルの非均質部分であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
さらに、少なくとも２つのサブサンプルからの該有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートを収集し、次いで、該増幅生成物を分析するに先立ち該アリコートを組み合わせることを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
該遺伝的変異が、染色体再編成、コピー数変異および多形性よりなる群から選択される胎児遺伝的変異であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
該分析が、該有益な父性対立遺伝子を含むアリコート中の母系および父系遺伝した対立遺伝子の比を決定することを含み、ここに、該比を分析して、遺伝的変異の存在を決定することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
該分析が、該有益な父性対立遺伝子を含むアリコート中の対立遺伝子のコピー数を決定することを含み、ここに、対立遺伝子の該コピー数を分析して遺伝的変異の存在を決定することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
さらに、少なくとも２つの該サブサンプルからの該有益な父性対立遺伝子を含むと同定された増幅生成物を分析して、モザイク現象または二卵性双胎の存在を検出することを含むことを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項１９】
分析されたアリコートが、該胎児識別子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたアリコートではないが、該胎児識別子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたアリコートと同一のサブサンプルからのものであることを特徴とする請求項１０〜１８のいずれか１記載の方法。
【請求項２０】
該標的遺伝子座がすべて、該母体の遺伝子型にホモ接合性であるか、または該母体の遺伝子型にヘテロ接合性であるか、または該母体の遺伝子型にホモ接合性およびヘテロ接合性遺伝子座の混合物を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項２１】
標的遺伝子座がすべて、該母体の遺伝子型にホモ接合性であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項２２】
該増幅生成物がゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡを含むことを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項２３】
母体の遺伝子型の該決定が、ＳＮＰのパネルを用いて、該母体細胞の源である同一の個体からの母体の遺伝物質のサンプルを遺伝子型決定することを含むことを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項２４】
該母体の遺伝物質の源が、血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、涙、唾液、頬側スワブおよび皮膚よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該母体の遺伝物質の源が、血液および頬側スワブよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
母体および胎児核酸の該混合物が、無細胞核酸の混合物であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項２７】
該母体および胎児の無細胞核酸サンプル源が、妊婦からの血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄またはダグラス窩穿刺であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
単一のアリコートもしくはサブサンプル中の１を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、あるいは１を超えるアリコートもしくはサブサンプル中の１を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子決定するか、あるいは１を超えるアリコートもしくはサブサンプル中の１つの試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含むことを特徴とする請求項８または９記載の方法。
【請求項２９】
第１のアリコートもしくはサブサンプル中の有益な父性対立遺伝子の同定後に、少なくとも第２のサブサンプル中の第２の標的遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含むことを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項３０】
該サンプルを分割して、細胞のポアソンまたは非ポアソン分布を持つサブサンプルを生成することを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項３１】
該サブサンプルの各々が、１個以下の細胞を含むことを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項３２】
さらに、該スクリーニングまたは遺伝子型決定に先立ち、２個以上のサブサンプルからのアリコートを貯蔵することを含むことを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項３３】
該貯蔵が、該アリコートを含むウェルの行および列のインデックスシステムの使用を含むことを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
さらに、サブサンプルへの該分割に先立ち、該胎児細胞につき該サンプルを富化することを含むことを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項３５】
該富化が、該母体細胞を超える該胎児細胞の差動増殖を含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該増幅生成物の均質部分が、該アリコートに分割されることを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項３７】
該増幅生成物の非均質部分が、該アリコートに分割されることを特徴とする請求項６または９記載の方法。
【請求項３８】
単一染色体に特異的な約２０〜約１００個のユニークなＳＮＰを含む少なくとも１つの染色体特異的パネルを含む、胎児対立遺伝子を検出するための一塩基多型（ＳＮＰ）パネルであり、ここに、該ＳＮＰの各々は、すべての主要な集団群を横切って測定された約３０％〜約５０％の範囲の頻度を有し；該ＳＮＰの各々は、ハーディ−ヴァインベルク平衡にあって；ＳＮＰパネル中のＳＮＰの合計数は、約５〜約１００個のＳＮＰであることを特徴とする該ＳＮＰパネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの個体の混合物の対立遺伝子、ゲノムおよびトランスクリプトームを検出する方法および遺伝子型決定パネルの分野にある。
【０００２】
関連出願
本願は、２００８年１２月２２日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／１４０，０６３、２００９年４月２日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／１６６，１８８、および２００９年８月４日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／２３１，２３２に対する優先権を主張し、それらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【背景技術】
【０００３】
出生前診断方法は、胎児または胚の遺伝子情報を得ることを主に目的とする。診療に用いる出生前遺伝子診断方法は、本質的に、羊水穿刺、絨毛膜絨毛の採取および胎児血液または組織生検の採取のごとき侵襲性技術を含む。それらの技術は、胎児から直接的に、または女性生殖器構造から間接的にサンプルを得ることを含む。それらの方法の高侵襲性の性質のために、それらは母親または胎児を合併症に付す傾向にある。羊水穿刺の場合に列挙できるかかる合併症の例は、感染、可能な同種免疫処置での胎児母体間出血、羊水損失および腹部痛のリスクである。異なる研究は、羊水穿刺後の流産のリスクを対照群のものより高い０．０６％〜２．１％と見積もった (Eddleman, Obstet Gynecol 2006 108(5): 1067-1072)。結果的に、羊水穿刺は、単に、臨床的にかなりの遺伝的変異を持った小児を有するリスクが、医原性流産のものを超える女性にき示唆され、多数の医師は、むしろ彼らの経験に比例したリスク（典型的には、３００例中の１〜５００例中の１例）を引用することを好む。
【０００４】
前記の合併症のリスクを有し、一般的に不快および／または母親のストレス源である侵襲性の出生前診断方法の使用を制限するために、非侵襲性方法の開発は、現代の産科学の主要な目的を構成する。
【０００５】
特に、母体血液中で循環する胎児細胞は、出生前遺伝子診断方法に潜在的に有用な遺伝物質源を構成する(Bianchi, Br J Haematol 1999 105: 574-583; Fisk, Curr Opin Obstet Gynecol 1998 10: 81-83)。妊娠中に、胎児起源の異なる細胞型は、胎座を横断し、母体血液中で循環する(Bianchi, Br J Haematol 1999 105: 574-583)。かかる細胞型はリンパおよび赤血球系細胞、骨髄性前駆体ならびに絨毛上皮細胞（栄養膜細胞層および合胞体栄養細胞）を含む。
【０００６】
出生前診断の目的で母体血液中で循環する胎児細胞のゲノムを分析する方法を記載するが、それらは診断の感度および特異性につき比較的限定されている(Di Naroら, Mol Hum Reprod 2000 6: 571-574; Watanabeら, Hum Genet 1998 102: 611-615; Takabayashiら, Prenat Diagn 1995 15: 74-77; Sekizawaら, Hum Genet 1998 102: 393-396)。非侵襲性の高度に特異的な出生前診断方法の開発における利点は、結果が結局陰性である妊婦において実行される侵襲性診断方法の割合を低減するためにそれを用いる可能性に起因する。一例として、７００人に１人の女性に関係する２１番染色体トリソミーの場合には、母親が３８歳である場合のみ、フランスで出生前診断が現在提供され、一方、５％の羊水穿刺の対価のために、６０％の２１番染色体トリソミー症例を検出できる生化学的分析試験が、より若い女性につき提案されている。しかしながら、２１番染色体トリソミー症例の４０％は、現在利用可能な試験によって検出されない。ＦＩＳＨ技術を用いる母体血漿から単離された胎児細胞における２１番染色体トリソミーの出生前検出が記載されている。このアプローチは注目されるが、胎児細胞として、血漿中ではまれであり（５００個中１〜２０００個中１個）、しばしばアポトーシス細胞を含み、信頼できる診断は、非常に多数の細胞に対してその方法を実行することを必要とし、ルーチン的に実行することを不可能にする。さらに、正倍数性胎児細胞はそのアプローチによって同定できない。
【０００７】
かかるアプローチの１つの制限は、血液中で循環する胎児細胞が非常に低濃度で存在するという事実に由来する。先の選択がない血液サンプル中のＹ染色体のＰＣＲ検出に基づく研究は、胎児細胞の平均数が１ミリリットルの血液当たり約１個の胎児リンパ球細胞であることを決定するのを可能にした(Bianchi, J Perinat Med 1998 26: 175-85)。より最近では、胎児細胞の平均数は、改善された富化技術がより多数の細胞を与えるので、上方に変更されている。１つの最近の研究では、１ミリリットルの血液当たり３７個の胎児リンパ球の平均値が判明している(Huang, Prenatal Diagnosis 2008 28: 892-899)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
かくして、胎児の対立遺伝子および胎児の遺伝的変異を検出するための改善された方法およびツールについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の具体例は、胎児対立遺伝子および胎児遺伝的変異の検出のための方法および遺伝子型決定パネルに関する。本発明の１つの具体例は、母体および胎児の細胞の混合物を含むサンプルを得；サンプルをサブサンプルに分割し；胎児識別子の存在につきサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定し；次いで、少なくとも１つのサブサンプル中の胎児細胞から少なくとも１つの胎児識別子の存在を同定することを含む、胎児識別子を検出する方法である。
【００１０】
本発明の具体例は、１以上の以下のものを含むことができ、また、含み得る：さらに、少なくとも１つのサブサンプルに対してサブサンプル増幅を行ない、増幅生成物を提供することを含む方法；さらに、増幅生成物をアリコートに分割することを含み、ここに、少なくとも１つの胎児識別子の存在についてのサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、胎児識別子の存在につきアリコートをスクリーニングすることを含むことを特徴とする方法；サブサンプル増幅が、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、標的核酸増幅、胎児識別子以外の核酸配列の増幅、核酸配列用の代理（proxy）の生成および細胞分裂よりなる群から選択される方法を含む方法；前増幅が全ゲノム増幅または全トランスクリプトーム増幅を含む方法；前増幅が標的核酸増幅、胎児識別子以外の核酸配列の増幅、核酸配列用の代理の生成および細胞分裂を含む方法；さらに、母体細胞の遺伝物質が、１組の標的遺伝子座にてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかを決定して、母体の遺伝子型を決定することを含み、ここに、胎児識別子についてのアリコートもしくはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、少なくとも１つの標的遺伝子座にて母体遺伝子型とは異なる遺伝子型につきアリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含み、母体の遺伝子型と異なる遺伝子の存在は、増幅生成物中の有益な父性対立遺伝子の存在を示し、少なくとも１つの胎児識別子の存在の同定は、少なくとも１つのアリコートもしくはサブサンプル中の有益な父性対立遺伝子を同定することを含むことを特徴とする方法；さらに、母体細胞の遺伝物質がホモ接合性またはヘテロ接合性であるかを決定するのに先立ち、標的遺伝子座を選択することを含む方法；さらに、標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択することを含み、ここに、スクリーニングは、試験遺伝子座にて母体遺伝子型と異なる遺伝子型につき、アリコートをスクリーニングすることを含むことを特徴とする方法；試験遺伝子座の選択が、標的遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき、混合された母体および胎児核酸のサンプルをスクリーニングし、次いで、試験遺伝子座として、混合された母体および胎児核酸のサンプル中の非母体遺伝子型で標的遺伝子座を選択することを含むことを特徴とする方法；さらに、有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルを分析して、遺伝的変異を検出することを含む方法；さらに、有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルの一部分を収集することを含み、ここに、有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートもしくはサブサンプルの分析して、遺伝的変異を検出することは、アリコートもしくはサブサンプルの収集部分を分析することを含む方法；収集部分が、アリコートもしくはサブサンプルの均質部分である方法；収集部分がアリコートの非均質部分である方法；さらに、少なくとも２つのサブサンプルから有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートを収集し、次いで、増幅生成物を分析するのに先立ちアリコートを組み合わせることを含む方法；遺伝的変異が、染色体再編成、コピー数変異および多���性よりなる群から選択される胎児遺伝的変異である方法；分析が、有益な父性対立遺伝子を含むアリコート中の母系および父系遺伝した対立遺伝子の比を決定することを含み、ここに、比を分析して、遺伝的変異の存在を決定することを特徴とする方法；分析が、有益な父性対立遺伝子を含むアリコート中の対立遺伝子のコピー数を決定することを含み、ここに、対立遺伝子のコピー数を分析して遺伝的変異の存在を決定することを特徴とする方法；さらに、少なくとも２つのサブサンプルから有益な父性対立遺伝子を含むと同定された増幅生成物を分析して、モザイク現象または二卵性双胎の存在を検出することを含む方法；分析されたアリコートもしくはサブサンプルが胎児識別子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたアリコートもしくはサブサンプルではないが、胎児識別子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたアリコートと同一のサブサンプルからのものである方法；標的遺伝子座がすべて母体の遺伝子型にホモ接合性であるか、またはすべて母体の遺伝子型にヘテロ接合性であるか、または母体の遺伝子型にホモ接合性およびヘテロ接合性遺伝子座の混合物を含む方法；標的遺伝子座がすべて母体の遺伝子型にホモ接合性である方法；増幅生成物がゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡを含む方法；母体の遺伝子型の決定が、ＳＮＰのパネルを用いて、母体細胞の源である同一の個体からの母体の遺伝物質のサンプルを遺伝子型決定することを含む方法；母体の遺伝物質の源が、血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、涙、唾液、頬側スワブおよび皮膚よりなる群から選択される方法；母体の遺伝物質源が、血液および頬側スワブよりなる群から選択される方法；母体および胎児核酸の混合物が、無細胞核酸の混合物である方法；母体および胎児の無細胞核酸サンプル源が、妊婦からの血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄またはダグラス窩穿刺である方法；単一のアリコートもしくはサブサンプル中の１を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、あるいは１を超えるアリコートもしくはサブサンプル中の１を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、あるいは１を超えるアリコートもしくはサブサンプル中の１つの試験遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含む方法；第１のアリコートもしくはサブサンプル中の有益な父性対立遺伝子の同定後に、少なくとも第２のサブサンプル中の第２の標的遺伝子座を選択およびスクリーニングまたは遺伝子型決定することを含む方法；サンプルを分割して、細胞のポアソンまたは非ポアソン分布を持つサブサンプルを生成する方法；サブサンプルの各々が、１個以下の細胞を含む方法；さらに、スクリーニングまたは遺伝子型決定に先立ち、２個以上のサブサンプルからのアリコートを貯蔵することを含む方法；貯蔵が、アリコートを含むウェルの行および列のインデックスシステム（indexed system）の使用を含む方法；さらに、サブサンプルへの分割に先立ち、胎児細胞につきサンプルを富化することを含む方法；富化が母体細胞を超える胎児細胞の差動増殖（differential expansion）を含む方法；増幅生成物の均質部���が、アリコートに分割される方法；および増幅生成物の非均質部分が、アリコートに分割される方法。
【００１１】
本発明のさらにもう一つの具体例は、単一の染色体に特異的な約５〜約１００個のユニークなＳＮＰを含む少なくとも１つの染色体特異的なパネルを含む、胎児対立遺伝子を検出するための一塩基多型（ＳＮＰ）パネルであり、ここに、ＳＮＰの各々は、すべての主要な集団群を横切って測定された約３０％〜約５０％の範囲の頻度を有し；かつ、ＳＮＰパネル中のＳＮＰ合計数は約５〜約１００個のＳＮＰである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の具体例は、胎児対立遺伝子（すなわち、非母体対立遺伝子／有益な父性対立遺伝子）および胎児遺伝的変異を検出する方法および遺伝子型決定パネルに関する。
【００１３】
本発明の具体例は、胎児の性別に拘らず、および参照サンプルとして機能する父系核酸配列を必要とすることなく、胎児対立遺伝子および胎児遺伝的変異の検出を可能とする。好ましくは各細胞単位で、胎児細胞と母体細胞とを区別することにより、本発明の具体例は、母体血液中の胎児細胞の低存在比により課された資源制約を克服し、現在利用可能な方法よりもより広範囲の分析のために胎児のゲノムまたはトランスクリプトームの完全性を保存する。加えて、各細胞単位で胎児細胞を区別することにより、本発明の具体例は、モザイク現象および二卵性双胎の検出を可能とする。
【００１４】
本発明の好ましい具体例において、母体サンプルはホモ接合性の標的遺伝子座を同定するために遺伝子型決定され、引き続いて、ホモ接合性遺伝子は、胎児細胞を含むサンプル中の胎児のヘテロ接合性遺伝子座の存在を検出するために遺伝子型決定できる。別法として、ヘテロ接合性の標的遺伝子座を同定するために母体サンプルを遺伝子型決定し、引き続いて、胎児細胞を含むサンプル中の胎児のホモ接合性の遺伝子座の存在を検出するために遺伝子型決定できることは、本明細書に記載された具体例のいずれにおいても当業者により理解されるであろう。いくつかの具体例において、母体および胎児細胞の混合物は、母体細胞に対し胎児細胞について濃縮サンプルを生成するために得られ富化される。次いで、濃縮されたサンプルは、各サブサンプルが好ましくは１個のみの細胞を含むように、サブサンプルに分割される。次いで、これらの各サブサンプルは、各サブサンプルに対応する増幅生成物を生成するために増幅され、細胞に対応するゲノムへのアクセスを提供する。次いで、増幅生成物はアリコートを生成するために分割される。次いで、これらのアリコートは、各々、ヘテロ接合性またはホモ接合性遺伝子型決定を用いて、母体サンプル中でホモ接合性と従前に同定された少なくとも１つの遺伝子座にて非母体対立遺伝子につき個々にスクリーニングされるか、または母体サンプル中でヘテロ接合性と従前に同定された少なくとも１つの遺伝子座にて遺伝子型決定され、これは、そのアリコート中の非母体対立遺伝子、かくして、胎児ゲノムまたはトランスクリプトームの存在を示す。ヘテロ接合性遺伝子型の検出は、選択された遺伝子座でのみ非母体対立遺伝子につきスクリーニングすることにより達成され得る。次いで、さらなる分析は、胎児遺伝的変異を検出するために、完全な胎児のゲノムまたはトランスクリプトームを含む少なくとも１つのアリコートを用いて、対応するスクリーニングされていないアリコートにつき行われる。
【００１５】
本発明のもう一つの好ましい具体例において、母体サンプルは遺伝子型決定され、母体および胎児細胞の混合物が得られ、サンプルは胎児細胞につき濃縮され、前記のサブサンプルに分割される。母体サンプルがホモ接合性である少なくとも１つの標的遺伝子座のパネルは、サブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定のために選択される。各サブサンプルは、これらの遺伝子座の少なくとも１つにて個々にスクリーニングまたは遺伝子型決定され、ヘテロ接合性遺伝子型の検出は、再びサブサンプル中の非母体対立遺伝子の存在を示す。次いで、ヘテロ接合性のサブサンプル中の対立遺伝子の比の分析は、胎児のコピー数変異を検出するために行われる。
【００１６】
本明細書に用いた核酸とは、デオキシリボ核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、リボ核酸（例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）、または当該技術分野において知られたいずれかの他の核酸の変異体を意味する。
【００１７】
本明細書に用いた標的遺伝子座とは、母体の遺伝物質を含有するサンプルが検出可能な遺伝子型を有する、ゲノムまたはトランスクリプトームの遺伝子座を意味する。１を超える標的遺伝子座でのいくつかの具体例において、標的遺伝子座は、すべてホモ接合性の遺伝子座、すべてヘテロ接合性の遺伝子座、またはホモ接合性およびヘテロ接合性の遺伝子座の混合物よりなる。また、標的遺伝子座のパネルは、すべてホモ接合性の遺伝子座、すべてヘテロ接合性の遺伝子座、またはホモ接合性およびヘテロ接合性の遺伝子座の混合物を含むことができる。
【００１８】
本明細書に用いた試験遺伝子座とは、胎児の遺伝物質を含むサンプル中のさらなる遺伝子型決定のために選択された標的遺伝子座を意味する。
【００１９】
本明細書に用いた胎児識別子とは、サンプルまたはその一部分が起源において胎児であるいずれかの指標をいう。胎児識別子は、いずれの遺伝的変異または他の情報も含むことができる。胎児識別子の１例は、胎児対立遺伝子である。本明細書に用いた胎児対立遺伝子とは、遺伝源を胎児と同定する能力を提供する父性対立遺伝子をいう。父性対立遺伝子は、父系サンプル中に存在するいずれかの対立遺伝子である。しかしながら、本明細書に用いた有益な父性対立遺伝子は、（本明細書に用いた）非母体対立遺伝子または（本明細書に用いた）胎児対立遺伝子に等価ないずれかの対立遺伝子である。
【００２０】
本明細書に用いた遺伝的変異とは、核酸配列におけるいずれの変異も意味する。遺伝的変異は、単一塩基対変異から染色体変異、または当該技術分野における公知のいずれかの他の変異までの範囲であることができる。遺伝的変異は、単一配列反復、短鎖縦列反復配列、一塩基多型、転座、反転、欠失、重複またはいずれかの他のコピー数変異であることができる。いくつかの具体例において、染色体変異は染色体異常である。例えば、染色体変異は、異数性、反転、転座、欠失または重複であることができる。また、遺伝的変異はモザイクであることができる。例えば、遺伝的変異は、遺伝子疾患または遺伝子疾患についてのリスク因子（例えば、嚢胞性線維症、テイ−サックス病、ハンチントン病、アルツハイマー病および種々の癌）に関与しかねない。また、遺伝的変異は、いずれの突然変異、染色体異常または前記に引用された優先権書類に開示された他の変異（例えば、異数性、微小欠失または微小重複）も含むことができる。遺伝的変異は、表現型に対して、陽性、陰性または中立的な効果を持つことができる。例えば、染色体の変異は、有利な変異、有害な変異、または中立的な変異を含み得る。いくつかの具体例において、遺伝的変異は、疾病または障害についてのリスク因子である。いくつかの具体例において、遺伝的変異は所望の表現型の形質をコードする。
【００２１】
サンプル獲得（例えば、母体および胎児細胞の混合物を含む）
本発明の具体例における母体サンプル、混合された母体および胎児細胞のサンプル、および混合された母体および胎児の無細胞核酸のサンプルは、血液から得ることができる。いくつかの具体例において、約２０〜４０ｍＬの血液が妊婦から得られる。血液サンプルは妊娠中のいずれの時点でも採取できる。例えば、いくつかの具体例において、母体サンプルは第１の三半期に採取される。他の具体例において、母体サンプルは第２の三半期に採取される。好ましい具体例において、血液は１０〜１８週の在胎期間で得られる。しかしながら、血液は、妊娠の早期、または１８週の在胎期間後に得ることができる。採取期間は、追求される情報または妊娠管理の基準に依存して変更し得る。また、血液サンプルは、その日のいつでも採取できる。いくつかの具体例において、血液は朝に採取される。他の具体例において、血液は午後に採取される。
【００２２】
血液は、中心静脈カテーテルを介してアクセス可能な腕、脚または血液を含めた身体のいずれかの適当な領域から得ることができる。いくつかの具体例において、血液は処置または活動後に採取される。例えば、血液は婦人科内診後に採取できる。また、採取時期は、サンプル中に存在する胎児細胞数を増加させるように調整できる。例えば、血液は血管拡張を誘導する練習または処置後に採取できる。
【００２３】
血液は、採取後に種々の成分と組み合わせて、引き続いての技術のためのサンプルを保存または調製し得る。例えば、いくつかの具体例において、血液は、採取後に、抗凝血剤、細胞固定剤またはＤＮＡまたはＲＮＡ保存剤で処理される。好ましい具体例において、血液は、ＥＤＴＡまたはヘパリンのごとき抗凝血剤を含む真空採血管を用いて、静脈穿刺によって採取される。また、血液は、ヘパリン被覆注射器および皮下注射針を用いて採取できる。また、血液は、細胞培養に有用であろう成分と組み合せることができる。例えば、いくつかの具体例において、血液は、細胞培養培地または補足細胞培養培地（例えば、サイトカイン）と組み合わせる。
【００２４】
また、母体サンプルは、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、涙、唾液、頬側スワブ、皮膚または他の組織を含めた当該技術分野において知られた他の源から得ることができる。また、混合された母体および胎児細胞のサンプルおよび混合された母体および胎児の無細胞核酸のサンプルは、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄、ダグラス窩穿刺、リンパ節または骨髄を含めた当該技術分野において知られた他の源から得ることができる。例えば、いくつかの具体例において、混合された母体および胎児の無細胞核酸のサンプル源は、子宮頚部スワブである。好ましい具体例において、胎児の無細胞核酸はＤＮＡを含む。もう一つの具体例において、胎児の無細胞核酸はＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。
【００２５】
胎児細胞の富化
母体および胎児細胞の混合サンプル中の胎児細胞の低存在比に取り組むために、これらのサンプルは胎児細胞につき富化できる。赤血球は成熟の場合に除核されるが、未成熟の場合に核形成されるため、これらの特性を用いて、サンプル中の母体および胎児の赤血球を区別できる。サンプルは、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはポジティブおよびネガティブ選択の組合せを介して胎児細胞につき富化できる。いくつかの具体例において、胎児細胞は直接的に捕捉される。他の具体例において、母体細胞が捕捉され、胎児細胞は残余サンプルから収集される。
【００２６】
サンプルは、細胞の物性の差に基づいて胎児細胞につき富化できる。例えば、サンプルは、密度、細胞膜構造または形態学に基づいて胎児細胞につき富化できる。密度に基づいたいくつかの具体例において、ＦＩＣＯＬＬＴＭ(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)、イオジキサノール(Axis Shield, Oslo, Norway)、ＮＹＣＯＤＥＮＺＲ(Axis Shield, Oslo, Norway)またはショ糖のごとき密度勾配を用いる。細胞膜構造に基づいたいくつかの具体例において、溶解試薬（例えば、塩化アンモニウム）が用いられる。形態学に基づいたいくつかの具体例において、フローサイトメトリーまたはフィルターが用いられる。また、サンプルは、当該技術分野において知られた他の物理特性に基づいて胎児細胞につき富化できる。例えば、サンプルは、誘電または磁気特性に基づいて胎児細胞につき富化できる。さらに、サンプルは骨髄を収集することにより胎児細胞につき富化できる。
【００２７】
また、サンプルは、細胞の生化学的特性の差に基づいて胎児細胞につき富化できる。例えば、サンプルは抗原、核酸、代謝、遺伝子発現またはエピジェネティックな差に基づいて胎児細胞につき富化できる。抗原の差に基づいたいくつかの具体例において、磁場勾配中の抗体コンジュゲート磁気もしくは常磁性ビーズ、またはフローサイトメトリーでの蛍光性標識抗体を用いる。核酸の差に基づいたいくつかの具体例において、フローサイトメトリーが用いられる。代謝的な差に基づいたいくつかの具体例において、フローサイトメトリーまたはもう一つの選別技術により測定される色素取込み／排除が用いられる。遺伝子発現に基づいたいくつかの具体例において、サイトカインでの細胞培養が用いられる。エピジェネティックな差に基づいたいくつかの具体例において、細胞培養が用いられる。また、サンプルは当該技術分野において知られた他の生化学的特性に基づいて胎児細胞につき富化できる。例えば、サンプルは、ｐＨまたは運動性に基づいて胎児細胞につき富化できる。さらに、いくつかの具体例において、１を超える方法を用いて、胎児細胞につき富化される。
【００２８】
本発明のいくつかの具体例において、サンプルは、塩化アンモニウムのごとき溶解試薬の使用を介して赤血球細胞を除去することにより、またはＦＩＣＯＬＬＴＭ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ (GE Healthcare Life Sciences Piscataway, NJ)またはショ糖のごとき密度勾配を用いる分離により、胎児細胞につき富化される。また、密度勾配を用いて、白血球画分を低減できる。さらに、得られた末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）は、Miltenyi Biotec (Gladbach, Germany)、Stemcell Technologies (Vancouver, BC, Canada)およびDynal Biotech/Invitrogen (Carlsbad, CA)のごとき製造からの磁気ビーズ分離技術を用いて、胎児細胞につき富化できる。ポジティブな富化またはネガティブな枯渇、または双方の組合せを用いて、ＰＢＭＣ中の胎児画分を富化できる。
【００２９】
胎児特異的表面マーカーは現在知られていないが、胎児細胞を１，０００〜１００，０００個の母体細胞中で１個の胎児細胞までポジティブに富化することが示されたいくつかのマーカーが存在する。いくつかの具体例において、ＣＤ７１、ＣＤ３４、ＣＤ４５またはＣＤ２３５ａ細胞表面マーカーを用いて、胎児細胞を富化する。いくつかの具体例において、胎児細胞集団に見出されない細胞表面マーカーを用いて、成人細胞集団の枯渇により胎児細胞をネガティブに富化する。いくつかの具体例において、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ６１の組合せを用いて、成人細胞を枯渇する。また、フローサイトメトリー選別を用いて、蛍光標識にコンジュゲートした細胞表面マーカーまたは細胞内マーカーを使用して、胎児細胞につき富化し得る。細胞内マーカーは、胎児細胞において優先的に発現した細胞内タンパク質（例えば、胎児性ヘモグロビン）に対する、核染色または抗体を含み得る。
【００３０】
ヘモグロビンの酸化は、優先的に、磁場勾配を用いて、核形成された赤血球（ＮＲＢＣ）を富化する１つの方法であると同定されている(Zborowski, Biophys J 2003 84(4): 2638-2645)。加えて、白血球からの赤血球の分離を促進するか、またはＰＢＭＣから胎児細胞を富化するマイクロ流体装置が開発されている(Huang, Prenatal Diagnosis 2008 28: 892-899)。
【００３１】
本発明のいくつかの具体例において、サンプルは、培養中の母体細胞を超えて胎児細胞を差動増殖することにより、胎児細胞につき富化される。差動増殖は、ＷＯ２００８／０４８９３１（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された無血清培地中の細胞刺激因子（ＳＣＦ）の存在下の母体および胎児起源のＣＤ３４＋細胞を含有する母体血液のサンプルからの細胞培養を含めた、当該技術分野において知られた多数の方法によって行うことができる。
【００３２】
本発明のいくつかの具体例において、母体および胎児細胞の混合物中の胎児細胞は、約１：２個、約１：５個、約１：１０個、約１：１００個、約１：１０００個、約１：１００００個、または約１：１０００００個の胎児：母体細胞まで、または前記の数値のいずれか２つにより定義される範囲まで富化される。
【００３３】
サブサンプルへの分割
（好ましくは、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）または全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）を用いる）サブサンプル増幅、ホモ接合性またはヘテロ接合性遺伝子座についてのスクリーニングまたは遺伝子型決定に先立ち、サンプルは、サブサンプル増幅（例えば、ＷＧＡまたはＷＴＡ）後でさえ、サンプルからの染色体コピー数がサブサンプル中で保存されるように、少数の十分な細胞を含むサブサンプルに分割できる。サンプルはポアソン分布または非ポアソン分布と一致するサブサンプルに分割できる。いくつかの具体例において、サンプルは連続して分割される。例えば、サンプルは連続的に分割できる。他の具体例において、サンプルは並列に分割される。
【００３４】
いくつかの具体例において、サンプルを分割して、１００μＬ、５０μＬ、１０μＬ、１０００ｎＬ、５００ｎＬ、４００ｎＬ、３００ｎＬ、２００ｎＬ、１００ｎＬ、５０ｎＬ、３０ｎＬ、１０ｎＬ、３ｎＬもしくは１ｎＬのサブサンプル体積のまま、その体積未満または約その体積未満、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲のサブサンプル体積を供する。好ましくは、各サブサンプルは１００ｎＬ以下の体積を含む。いくつかの具体例において、各サブサンプルは、約５００、４００、３００、２００もしくは１００個以下の細胞、または前記の値のいずれか２つによって規定される範囲を含む。好ましくは、各サブサンプルは、約５０、４０、３０、２０もしくは１０個以下の細胞または前記の値のいずれかの２つによって規定される範囲を含む。より好ましくは、各サブサンプルは、約５、４、３または２個以下の細胞を含む。いくつかの具体例において、各サブサンプルは１個以下の細胞を含む。
【００３５】
いくつかの具体例において、各サブサンプルは、平均５００、４００、３００、２００もしくは１００個の細胞、または約その個数、あるいは前記の値のいずれかの２つによって規定される範囲を含む。好ましくは、各サブサンプルは平均約５０、４０、３０、２０もしくは１０個の細胞、または前記の値のいずれかの２つによって規定される範囲を含む。より好ましくは、各サブサンプルは、平均５、４、３もしくは２個の細胞、または約その個数、あるいは前記の値のいずれかの２つによって規定される範囲を含む。いくつかの具体例において、各サブサンプルは、平均が約１個未満の細胞、約１個の細胞または約１〜２個の細胞、あるいは前記の値のいずれかの２つによって規定される範囲を含む。
【００３６】
サンプルの分割は、マイクロ流体装置中の個々の細胞の油分離を創製するオイルプラグ、ウェル中への析出または、平坦な基材に対する表面張力により固着させた独立滴の使用を含めた、当該技術分野において知られたいずれの方法によっても行われる。加えて、サブサンプルは、引き続いての反応に適切である緩衝液中で懸濁できる。例えば、サブサンプルは、単一工程細胞溶解に続いてサブサンプルのさらなる操作がない増幅を可能とする溶解およびＰＣＲ緩衝液を含む溶液中に懸濁できる。
【００３７】
サブサンプルの増幅
単一の細胞またはサブサンプル中の限定された量の遺伝物質を補うために、サブサンプル増幅を所望により行うことができる。例えば、核酸複製または細胞分裂を行うことができる。サンプルは、そのサンプルからの染色体コピー数がサブサンプル増幅後にサブサンプル中で保存されるように、少数の十分な細胞を含むサブサンプルに分割される。好ましい具体例において、サブサンプル増幅は、単一細胞を含有するサブサンプルに対して行われ、その結果、得られた増幅生成物は、母体または胎児の細胞のいずれかのゲノムまたはトランスクリプトームを表わす。例えば、サブサンプル増幅は、本明細書に記載されるごとく、マイクロウェルまたはオイルプラグによって分離された滴中に位置する個々の細胞に対して行うことができる。
【００３８】
核酸複製は、当該技術分野において知られた核酸（例えば、タンパク質発現）についてのさらなるコピーの核酸、核酸を示すさらなるシグナル等を生成するいずれかの方法を用いて行うことができる。いくつかの具体例において、核酸複製は、ＷＧＡ、ＷＴＡまたは標的核酸増幅技術を用いて行われる。他の具体例において、核酸複製は、ＩＮＶＡＤＥＲＲ(Hologic, Inc., Bedford, MA)のごとき核酸配列を示すシグナルを生成する方法を用いて行われる。いくつかの具体例において、一部分だけの増幅配列が核酸テンプレートに相補的である。例えば、いくつかの具体例において、連続増幅生成物は、一部分の核酸テンプレートおよび一部分のシグナル配列を含む。核酸複製についての一般的技術は、等温または熱サイクルの複製を含み得る。いくつかの具体例において、核酸複製は、ＳＮＰ遺伝子型決定に先立って行われる。しかしながら、核酸複製もＳＮＰ遺伝子型決定後に行うことができる。
【００３９】
また、細胞複製は、当該技術分野において知られたいずれの方法を用いても行うことができる。いくつかの具体例において、細胞は、本明細書に記載された方法に用いるさらなる核酸コピーを生成する培地および補足剤中で培養される。他の具体例において、細胞は培養され、１個以上の細胞が引き続いての分析における使用のためにそのままにされる。いくつかの具体例において、細胞複製はサブサンプルへの分割に先立ち行われる。好ましくは、細胞複製はサブサンプルへの分割後に行われる。
【００４０】
アリコートへの分割
サブサンプルの増幅後、増幅生成物はアリコートに分割できる。これらのアリコートは複数のアッセイに用いることができる。例えば、１つの具体例では、増幅生成物からの１以上のアリコートを用いて、胎児対立遺伝子の存在を検出し、一方、１以上の他のアリコートを用いて、胎児のゲノムまたはトランスクリプトームを含有する増幅生成物中の胎児の遺伝的変異の存在を検出する。いくつかの具体例において、胎児のゲノムまたはトランスクリプトームを含有すると同定されたアリコートは、遺伝的変異についての配列によってアッセイされる。例えば、アリコートは遺伝子疾患（例えば、ウィリアムズ症候群、ウルフ−ハーシュホーン症候群、ミラー−ディッカー症候群、スミス−マゲニス症候群、アンゲルマン症候群、ディジョージ症候群、プラーダー−ヴィリ症候群、ヤコブセン症候群、ネコ鳴き症候群、シャルコー−マリー−ツース病、マイクロ重複２２ｑ１１．２症候群、嚢胞性線維症、テイ−サックス病、ハンチントン病、アルツハイマー病および種々の癌）に関連した遺伝的変異につきアッセイできる。
【００４１】
増幅生成物の均質または非均質部分は、アリコートへの分割のために選択できる。いくつかの具体例において、増幅生成物の均質部分は順次（例えば、連続的に）分割される。他の具体例において、増幅生成物の均質部分は並列的に分割される。別法として、増幅生成物の非均質部分は、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはポジティブおよびネガティブ選択の組合せを用いて、アリコートへの分割のために選択できる。例えば、いくつかの具体例において、ビーズ結合捕捉オリゴを用いて、アリコートへの分割のための所望の部分の増幅生成物を標的とする。他の具体例において、表面結合オリゴを用いて、所望でない部分の増幅生成物を除去する。増幅生成物の非均質部分は、本明細書に記載されたものを含めた、当該技術分野において知られたいずれかの物理的または生化学的特性に基づき選択できる。例えば、特定の電荷、サイズまたは染色体の同一性を持った一部分の増幅生成物は、アリコートへの分割のため選択できる。
【００４２】
サブサンプル増幅の所望の工程が行れないいくつかの具体例において、サブサンプルの一部分またはアリコートは引き続いての分析のために除去できる。
【００４３】
いくつかの具体例において、アリコートは２個以上のアリコートの群に貯蔵される。これは、本明細書に記載されたＳＮＰに基づくまたは他の反応の数がＮの因子と同程度まで低下するのを可能とし、ここに、Ｎは、各貯蔵中のアリコート数である。次いで、ポジティブな貯蔵（すなわち、母体の遺伝子型と異なる少なくとも１つの遺伝子型を持った貯蔵）からのアリコートは、アリコート毎に再試験して、胎児対立遺伝子を含有するアリコートを同定し得る。いくつかの具体例において、各貯蔵は、試験遺伝子座にて非母体対立遺伝子につき試験される。いくつかの具体例において、各貯蔵はそれぞれ２以上の試験遺伝子座にて非母体対立遺伝子につき試験される。
【００４４】
いくつかの具体例において、アリコートは、陽性の貯蔵内の陽性アリコートの源の同定を可能とするインデックス方式を用いて貯蔵される。例えば、２以上のアリコートを各増幅生成物から得て、Ｎ×Ｍに増幅されたアリコートのインデックスを付した貯蔵を形成し得る。少なくとも１つの胎児対立遺伝子を含有するウェルは、直角の縦座標系における陽性のＮおよびＭ貯蔵の交差を位置させることにより同定できる。いくつかの具体例において、Ｎ（すなわち、Ｎ×Ｍインデックス中の行数）およびＭ（すなわち、Ｎ×Ｍインデックス中の列数）は、独立して約２〜約１０００である。好ましくは、ＮおよびＭは、独立して約８〜約１００である。いくつかの具体例において、Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３２、３６、４０、４８、５０、５６、６０、６４、７０、７２、８０、８４、８８、９０、９６、１００、１９２、２８８、３８４、４８０、５７６、６７２、７６８、８６４、９６０、１０００の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下または約その数以下、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である。いくつかの具体例において、Ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３２、３６、４０、４８、５０、５６、６０、６４、７０、７２、８０、８４、８８、９０、９６、１００、１９２、２８８、３８４、４８０、５７６、６７２、７６８、８６４、９６０、１０００の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下または約その数以下、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である。好ましい具体例において、増幅生成物の均質または非均質部分にインデックスを付して、ポジティブなアリコートの源の同定を可能とする。
【００４５】
親の遺伝子型の獲得または推測
親の遺伝子型は、非母体対立遺伝子の同定を支援するように得られるかまたは推測できる。今度は、非母体対立遺伝子に関する情報を用いて、アリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定するか、または遺伝子変異体につき胎児ゲノムを直接的に分析できる。例えば、父または母体の遺伝子型は、父または母体のサンプルを直接的に遺伝子決定することにより得ることができるか、または遺伝学的に関連する家族からのサンプルを遺伝子型決定することにより推測できる。しかしながら、好ましい具体例において、父の遺伝子型を得るかまたは推測する必要はない。例えば、好ましい具体例において、母体の遺伝子型だけが得られる。
【００４６】
いくつかの具体例において、父または母体の遺伝子型は、（本明細書に記載されたものを含めた）血液、血漿、血清、尿、頬側スワブ、唾液、涙、皮膚または父系核酸の他の源からの遺伝物質を遺伝子型決定することにより得られる。いくつかの具体例において、父または母体の遺伝子型は、無細胞核酸またはこれらの源の１つに由来した細胞から抽出された核酸を用いて得られる。また、父または母体の遺伝子型決定は、ＤＮＡに対して好ましくは行われるが、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは当該技術分野において知られたいずれかの他の核酸に対して行うことができる。いくつかの具体例において、父または母体サンプルのテンプレートは（例えば、ＰＣＲに基づく方法を用いて）増幅および検出される。しかしながら、いくつかの具体例において、父または母体サンプルのテンプレートは（例えば、本明細書に記載された方法を用いて）増幅されない。
【００４７】
また、父および母体の遺伝子型は、データベース、試験報告または本明細書に記載された方法が行われた先の妊娠からの情報のごとき先の遺伝子試験中に生成された情報へのアクセスにより得ることができる。また、父または母体の遺伝子型は、血族の遺伝子型を用いて推測できる。例えば、遺伝学的に関連する親、兄弟、祖父母、おば、おじまたは子供の遺伝子型を用いて、父または母体の遺伝子型を推測できる。
【００４８】
当該技術分野における公知のいずれかの多形性を用いて、親サンプルを遺伝子型決定できる。例えば、ＳＮＰ、ハプロタイプ、短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）または他の配列変異を遺伝子型決定できる。また、遺伝子またはエピジェネティックマーカーを用いて、親サンプルを遺伝子決定できる。例えば、コピー数変異（ＣＮＶ）またはメチル化パターンを評価できる。
【００４９】
母体および胎児核酸の混合物中の少なくとも１つの非母体対立遺伝子の所望の同定
ホモ接合性の標的遺伝子座が母体サンプル中で同定された具体例において、母体および胎児核酸の混合物を所望により用いて、同一の遺伝子座にてヘテロ接合性遺伝子型を同定でき、これは、胎児の存在（すなわち、非母体対立遺伝子／有益な父性対立遺伝子）を示す。この所望の工程は、個体のアリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定するのに先立ち、好ましく行われる。母体および胎児核酸の混合サンプル中で非母体対立遺伝子につきスクリーニングし、それにより、ヘテロ接合性遺伝子座（従って、胎児対立遺伝子）を同定すると、アリコートおよびサブサンプルは、有益であると知られているＳＮＰにつきより効率的にスクリーニングできる。好ましい具体例において、胎児の無細胞のＤＮＡを用いて、非母体対立遺伝子につきスクリーニングし、ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。もう一つの具体例において、胎児の無細胞のＲＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。
【００５０】
無細胞核酸は、妊婦からの血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄またはダグラス窩穿刺を含めた、当該技術分野における公知のいずれかの源から得ることができる。また、核酸を母体および胎児細胞の混合サンプルから抽出して、ヘテロ接合性遺伝子座を同定できる。好ましくは、ＤＮＡは母体および胎児細胞の混合サンプルから抽出される。しかしながら、ＲＮＡまたはｃＤＮＡは、母体および胎児細胞の混合サンプルから抽出できる。核酸は、血液、子宮頚部スワブ、子宮頚部洗浄、子宮洗浄、ダグラス窩穿刺、リンパ節または骨髄を含めた当該技術分野における公知のいずれかの源から得られた細胞から抽出できる。他の具体例において、全血を用いて、全血を細胞、血漿または血清画分に分割せずに（または分割に先立ち）ヘテロ接合性遺伝子型を同定する。
【００５１】
いくつかの具体例において、母体および胎児核酸の混合サンプルからのアリコートの核酸テンプレートを増幅および検出して、（例えば、ＰＣＲに基づく方法を用いて）ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。しかしながら、いくつかの具体例において、混合サンプルからのアリコートの核酸テンプレートは増幅せずに、ヘテロ接合性遺伝子座を同定する。
例えば、テンプレートと関連するシグナルのみが増幅される方法（米国特許第７，２２６，７９８号、第７，４７３，７７５号および第７，４６８，２６１号に記載されたＡＢＳＣＲＩＰＴＩＯＮＴＭ方法(Ribomed Biotechnologies, Inc., Carlsbad, CA)またはＩＮＶＡＤＥＲＲ化学に関連する方法(Hologic, Inc.)）を使用できる。また、核酸テンプレートがシグナルまたはテンプレートの増幅なくして検出される方法（例えば、ＷＯ２００５／０１１２２(Adnavance Technologies, Inc., San Diego, CA)に記載されたＤＮＡ結合の化学的検出を含む方法）を使用できる。加えて、核酸テンプレートが増幅なくして配列決定される方法（例えば、Eidら, Science 2009 323(5910): 133-38に記載された配列決定方法）を使用できる。非母体対立遺伝子の同定用のテンプレートの源が、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブまたは当該技術分野における公知の核酸のいずれかの源を含むことができることは当業者により理解されるであろう。
【００５２】
少なくとも１つの有益な父性対立遺伝子の存在についての少なくとも１つのアリコートまたはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定
次の工程は、サブサンプルまたはアリコートをスクリーニングまたは遺伝子決定して、非母体対立遺伝子を同定することである。一旦、（本明細書により詳細に記載された）ＳＮＰパネルが生成され、および母体の遺伝子サンプルがホモ接合性（別法として、ヘテロ接合性）である１組の標的遺伝子座が同定されたならば、試験遺伝子座または遺伝子座群を選択して、胎児対立遺伝子の存在につきサブサンプルまたはアリコートをスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。胎児対立遺伝子の存在を検出するために、試験遺伝子座は、非母体対立遺伝子の存在につきスクリーニングまたは遺伝子型決定される（すなわち、試験遺伝子座にてヘテロ接合性、または別法として、ホモ接合性遺伝子型を同定することによる）。いくつかの具体例において、増幅生成物のアリコートをアリコート毎にスクリーニングまたは遺伝子型決定して、ヘテロ接合性（または別法として、ホモ接合性の）遺伝子座を検出する。いくつかの具体例において、アリコートは、単一細胞から増幅された物質を含む。
【００５３】
サブサンプルまたはアリコートは母体サンプル中でホモ接合性と従前に同定された遺伝子座にて遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、母体サンプル中でホモ接合性と従前に同定された遺伝子座の遺伝子型は、非母体対立遺伝子の存在につきスクリーニングすることにより決定される。所望により、本明細書に記載されるごとく、非母体対立遺伝子につきアリコートまたはサブサンプルをスクリーニングするのに先立ち、混合された母体および胎児核酸（好ましくは、無細胞）のサンプルを用いて、混合核酸中の非母体対立遺伝子の存在を同定し、これは、胎児材料中の同一の遺伝子座にてヘテロ接合性遺伝子型の存在を示す。
【００５４】
他の具体例において、サブサンプルまたはアリコートは、母体サンプル中でヘテロ接合性と従前に同定された遺伝子座にて遺伝子型決定される。同一の遺伝子座についてのアリコートまたはサブサンプル中のホモ接合性遺伝子型の同定は、非母体、すなわち、胎児対立遺伝子の存在を示す。
【００５５】
本明細書に記載されたいずれの具体例におけるスクリーニングまたは遺伝子決定方法も、アリコートまたはサブサンプルのいずれかを用いて行い得ることは当業者により理解されるであろう。アリコートおよびサブサンプルは、本明細書に言及したものを含めて、当該技術分野における公知の多数の方法を用いて、胎児対立遺伝子につきスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。例えば、アリコートは、分子ビーコンまたは他の核酸に基づくＳＮＰ検出法を用いて、スクリーニングまたは遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、アリコート中の核酸テンプレートは（例えば、ＰＣＲに基づく方法を用いて）増幅および検出される。しかしながら、いくつかの具体例において、核酸テンプレートは（例えば、本明細書に記載された方法を用いて）増幅されない。さらに、当該技術分野における公知のいずれのマーカーを用いても、アリコートおよびサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。好ましい具体例において、ＳＮＰ、ハプロタイプ、短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）、他の配列変化、コピー数変異（ＣＮＶ）または母体サンプル中で遺伝子型決定されたエピジェネティックなマーカーが用いられる。
【００５６】
いくつかの具体例において、サブサンプルが１個以下の細胞を含むために、サブサンプルまたはアリコートのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、各細胞単位でできる。また、サブサンプルまたはアリコートは、本明細書に記載したものを含めた当該技術分野における公知の多数の方法を用いて、スクリーニングまたは遺伝子型決定できる。好ましくは、サブサンプルは、ＴＡＱＭＡＮＲシステム(Foster City, CA)で定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ヘテロ接合性対立遺伝子につきスクリーニングされる。所定の数のサブサンプルまたは細胞をスクリーニングして、ヘテロ接合性対立遺伝子を検出できる。例えば、表１に示されるごとく、１つの遺伝子座当たり約５個の胎児細胞が期待される場合に１：１０，０００個の胎児：母体細胞に富化したサンプル中の７つの遺伝子座を試験するために、所定の数のサンプルまたは細胞は、３５０，０００個である。いくつかの具体例において、１遺伝子座当たりの胎児細胞数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０または３００個の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である。
【００５７】
【表１】
2012513217.tif 000002
【００５８】
少なくとも１つのアリコートまたはサブサンプル中の少なくとも１つの有益な父性対立遺伝子の同定
本明細書に記載されるごとく、ホモ接合性（または別法としてヘテロ接合性）ＳＮＰが母体の遺伝物質中で同定された後、これらのＳＮＰをサブサンプルまたはアリコート中でスクリーニングまたは遺伝子型決定して、非母体対立遺伝子の存在を検出できる。第１の母体のホモ接合性／ヘテロ接合性ＳＮＰがアリコートまたはサブサンプル中でヘテロ接合性／ホモ接合性遺伝子型を生成しないならば、第２の母体のホモ接合性／ヘテロ接合性ＳＮＰを選択および遺伝子型決定できる。非母体対立遺伝子が検出されるか、または所定の数のＳＮＰおよび／または細胞、サブサンプルまたはアリコートをスクリーニングされるまで、このプロセスを繰り返すことができる。また、このプロセスは、複数のアリコートもしくはサブサンプル、多重化ＳＮＰまたはそのいずれかの組合せを遺伝子型決定することを含むことができる。
【００５９】
試験遺伝子座は、サンプル中に存在すれば、少なくとも１つの胎児対立遺伝子が検出されるように、スクリーニングまたは遺伝子型決定される。いくつかの具体例において、少なくとも１つの非母体対立遺伝子が検出されるまで、試験遺伝子座はスクリーニングまたは遺伝子型決定される。いくつかの具体例において、十分な細胞を遺伝子型決定して、非母体対立遺伝子を検出する指定の可能性を超えるまで、第１の試験遺伝子座は、アリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定される。非母体対立遺伝子が検出されないならば、十分な細胞を試行して非母体対立遺伝子を検出する指定の可能性を超えるまで、第２の試験遺伝子座は、アリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定される。非母体対立遺伝子が検出されないならば、試行された試験遺伝子座の数が混合サンプルからの非母体（かくして、胎児性）対立遺伝子を検出する指定の累積的可能性を超えるまで、さらなる遺伝子座はスクリーニングまたは遺伝子型決定される。
【００６０】
また、試験遺伝子座は、１を超える胎児対立遺伝子が検出されるまで、スクリーニングまたは遺伝子型決定できる。１を超える試験遺伝子座がスクリーニングまたは遺伝子型決定されるならば、胎児対立遺伝子（すなわち、母体の遺伝子型と異なる遺伝子型を持つ）にポジティブなさらなる各遺伝子座試験は、サブサンプルまたはアリコート中で胎児ゲノムを検出する確信を増加させる。加えて、所定の数の試験遺伝子座は、胎児の遺伝物質が存在しないかもしれないという事実を説明するように指定できる。いくつかの具体例において、所定の数の試験遺伝子座は、関連した組の変数につき胎児対立遺伝子を検出する累積的可能性の計算により決定される。例えば、表３に示されるごとく、約０．５の少数の対立遺伝子頻度を持つ７個のＳＮＰを用いて、ヘテロ接合性の胎児対立遺伝子の存在を検出する可能性は、１−（０．５）（０．５）（０．５）（０．５）（０．５）（０．５）（０．５）＝９９．２２％である。従って、表１に示すごとく、１：１０，０００個の胎児：母体細胞につき富化されたサンプルからの３５０，０００個のアリコートもしくはサブサンプルについて、所定の数の試験遺伝子座は、約７個の試験遺伝子座であることができる。
【００６１】
試験遺伝子座は、個々にまたは複数にて、スクリーニングまたは遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、１つの試験遺伝子座は、単一のアリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定される。また、単一の試験遺伝子座は、複数のアリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。加えて、アリコートもしくはサブサンプルは、個々にまたは複数でスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、１を超える試験遺伝子座は、単一のアリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定される。加えて、１を超える試験遺伝子座も複数のアリコートもしくはサブサンプル中でスクリーニングまたは遺伝子型決定できる。いくつかの具体例において、パネル中の試験遺伝子座数は、胎児対立遺伝子をスクリーニングまたは遺伝子型決定するための２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の数そのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下の複数の試験遺伝子座、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である。
【００６２】
いくつかの具体例において、母体および胎児核酸（好ましくは無細胞）の混合物中にヘテロ接合性（従って、非母体）遺伝子型を含むと同定された遺伝子座は、母体および胎児細胞の混合物に由来したサブサンプルを用いて、各サブサンプル単位でスクリーニングされる。次いで、保存されたアリコートおよびサブサンプルを用いて、さらなる遺伝子分析を行うことができる。しかしながら、胎児対立遺伝子の存在の検出における母体および胎児の無細胞核酸の利点にも拘らず、これらのサンプルは、胎児ゲノムもしくはトランスクリプトームの完全性の貯蔵、またはサンプルの捕捉を必要とする分析に適していない。これは、本明細書に記載された細胞に基づく方法を用いる利点の１つを強調する。
【００６３】
アリコートまたはサブサンプルの収集
胎児対立遺伝子を含むと同定されたアリコートまたはサブサンプルは、引き続いての分析のために収集できる。引き続いての分析のために収集されたアリコートは、胎児対立遺伝子につきスクリーニングするのに用いた同一のものであることができるか、または同一のサブサンプルからの異なるアリコートを用いて胎児対立遺伝子スクリーニングに用いたいずれの反応にも付されなかったアリコートを提供できる。いくつかの具体例において、アリコートまたはサブサンプルは、所望の核酸の品質、量または存在に基づいた収集のために選択される。例えば、アリコートまたはサブサンプルは、シグナルの相関性、シグナル強度、シグナル強度比、バックグラウンド測定に比較したシグナル、経時的プロットアッセイキネティックス、温度プロットアッセイキネティックス、または当該技術分野における公知の他の性能測定基準を用いて収集につき選択できる。いくつかの具体例において、父系と母体対立遺伝子とを区別するのに用いたマーカーまたは領域が収集される。しかしながら、他の具体例において、連関しないマーカーまたは領域は、さらなる分析のために収集される。
【００６４】
いくつかの具体例において、所望の部分のアリコートまたはサブサンプルだけが、引き続いての分析のために収集される。例えば、いくつかの具体例において、ハイブリダイゼーションプローブを用いて、注目する染色体または領域から核酸配列だけを収集する。他の具体例において、全アリコート、サブサンプルまたはその均質部分は収集される。
【００６５】
遺伝的変異体についての少なくとも１つの胎児ゲノムの分析
本明細書に記載されるごとく所望により収集された、非母体対立遺伝子を有すると同定されたアリコートまたはサブサンプルをさらに分析して、例えば、染色体または遺伝的変異の存在につき試験できる。分析に用いたアリコートは、胎児対立遺伝子につきスクリーニングまたは遺伝子型決定された同一のアリコートであることができる。あるいは、分析に用いたアリコートは、同一のサブサンプルからの異なるアリコートであるが、胎児対立遺伝子につきいずれかのスクリーニングまたは遺伝子型決定に付されなかったものであることができる。胎児のゲノム全体またはその一部分は、さらなる分析のために選択できる。いくつかの具体例において、多形性は当該技術分野における公知の方法を用いて遺伝子型決定される。例えば、ＳＮＰ、ハプロタイプまたはＳＴＲは、ＰＣＲ、および適当な場合には、キャピラリー電気泳動のごとき引き続いての検出方法を用いて遺伝子型決定できる。また、多形性は、配列決定方法を用いて遺伝子型決定できる。遺伝子型決定は好ましくは高処理技術を用いて行われる。例えば、いくつかの具体例において、マイクロアレイを用いて、ＳＮＰおよび／またはハプロタイプに関するデータを生成する。また、コピー数変異は、さらなる分析のために評価できる。例えば、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）を用いて、コピー数変異を検出できる。また、染色体再編成を評価できる。例えば、反転または転座は、配列決定、ＦＩＳＨまたはＰＣＲのごとき方法を用いて検出できる。
【００６６】
いくつかの具体例において、母系および父系遺伝した対立遺伝子の比を決定して、遺伝的変異の存在を分析する。所望により、同一遺伝子座を用いて、胎児対立遺伝子の存在および遺伝的変異の存在を決定する。例えば、ヘテロ接合性の試験遺伝子座での対立遺伝子の強度は測定でき、２：１または１：２の強度比は、コピー数変異を示す。しかしながら、いくつかの具体例において、遺伝子座を用いて、胎児対立遺伝子の存在が遺伝的変異を決定するために用いた同一の遺伝子座ではないことを決定する。加えて、他の強度比（例えば、３：１、１：３、３：２、２：３、４：１および１：４）を用いてコピー数変異の存在を検出できることは、本明細書に記載された具体例のいずれにおいても当業者によって理解されるであろう。
【００６７】
いくつかの具体例において、染色体配列の過剰提示または提示不足を決定して、コピー数変異の存在を分析する。例えば、特定の染色体についてのユニークな配列読み取り数を測定し、母体または他の参照染色体と比較でき、１：１未満または１：１を超える比は、コピー数変異を示す。これらのユニークな配列読み取りの検出は、小規模（例えば、特定の遺伝子座につき設計されたプライマー対での配列決定）または大規模（例えば、全ゲノムの配列決定）方法を用いて行うことができる。また、特定の染色体領域についての配列読み取り数を測定し、母体および／または他の参照染色体領域と比較でき、１：１未満または１：１を超える比は、コピー数変異の存在を示す。
【００６８】
アリコートまたはサブサンプルは、個々にまたは少なくとも２つのアリコートもしくはサブサンプルの組合せサンプル中で分析し得る。いくつかの具体例において、アリコートまたはサブサンプルを本明細書に記載されたシグナル測定基準に基づいてランク付けし、好ましい組は、分析または貯蔵後の分析のために選択される。いくつかの具体例において、単離されたアリコートもしくはサブサンプルまたは貯蔵物は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）分析または配列決定を用いて、遺伝子または染色体変化の存在につき試験される。しかしながら、本明細書に記載されたものを含めた当該技術分野における公知のいずれの技術を用いても、遺伝子または染色体の変異の存在につき試験できる。
【００６９】
各細胞単位でのアリコートもしくはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、モザイク現象（すなわち、同一個体からの細胞が異なる遺伝子プロフィールを有する状態）の検出を可能とする。例えば、サブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子決定して、モザイク染色体の変異を検出できる。いくつかの具体例において、モザイク現象につきスクリーニングまたは遺伝子型決定されたサブサンプル数は、約２〜約１００個のサブサンプルである。いくつかの具体例において、スクリーニングまたは遺伝子型決定されたサブサンプル数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０または１００の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である。好ましい具体例において、スクリーニングまたは遺伝子型決定されたサブサンプル数は、約５〜約１０個のサブサンプルである。所望により、同一遺伝子座を用いて、胎児対立遺伝子の存在およびモザイク現象の存在を決定する。例えば、ヘテロ接合性の試験遺伝子座の対立遺伝子の強度を測定でき、少なくとも１つのサブサンプル中の１：１の強度比および、少なくとも１つの他のサブサンプル中の２：１または１：２の強度比は、モザイク遺伝的変異の存在を示す。しかしながら、異なる遺伝子座を用いても、胎児対立遺伝子の存在およびモザイク現象の存在を決定できる。例えば、ホモ接合性の試験遺伝子座を用いて、胎児対立遺伝子を同定できる。次いで、ヘテロ接合性遺伝子座を検出でき、ヘテロ接合性遺伝子座での対立遺伝子の強度を測定でき、少なくとも１つのサブサンプル中の１：１の強度比および少なくとも１つの他のサブサンプル中の２：１または１：２の強度比は、再度、モザイク遺伝的変異の存在を示す。
【００７０】
いくつかの具体例において、モザイク現象は、性特異的染色体を用いて検出される。例えば、ヘテロ接合性Ｘ染色体試験遺伝子座での対立遺伝子を検出でき、少なくとも１つのサブサンプル中の１つの対立遺伝子の存在、および少なくとも１つの他のサブサンプル中の双方の対立遺伝子の存在は、モザイク異数性（例えば、モザイクターナー症候群）の存在を示す。もう一つの具体例において、ホモ接合性Ｘ染色体試験遺伝子座での対立遺伝子の存在を検出でき、少なくとも１つのサブサンプル中の１：１のＸ：Ｙの染色体強度比および少なくとも１つの他のサブサンプル中の２：１のＸ：Ｙの染色体強度比は、モザイク異数性（例えば、モザイククラインフェルター症候群）の存在を示す
【００７１】
また、各細胞単位でのアリコートもしくはサブサンプルのスクリーニングまたは遺伝子型決定は、二卵性双胎（すなわち、非同一の双子）の検出を可能とする。例えば、ＳＮＰ遺伝子型決定は、胎児対立遺伝子を含有するサブサンプルに対して行うことができ、異なるＳＮＰ遺伝子型を持つ少なくとも２つのサブサンプルの存在は、二卵性双胎の存在を示す。いくつかの具体例において、二卵性双胎を検出するためにスクリーニングおよび遺伝子決定されるＳＮＰ数は、約１〜約２０個のＳＮＰである。いくつかの具体例において、スクリーニングまたは遺伝子型決定されるＳＮＰ数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８もしくは２０の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下のＳＮＰ、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である。好ましい具体例において、スクリーニングまたは遺伝子型決定されるＳＮＰ数は、約３〜約４個のＳＮＰである。３個のＳＮＰを用いる二卵性双胎の存在を検出する可能性は、約１−（０．５）（０．５）（０．５）＝８７．５％であり、一方、４個のＳＮＰを用いる二卵性双胎の存在を検出する可能性は、約１−（０．５）（０．５）（０．５）（０．５）＝９３．７５％である。
【００７２】
いくつかの具体例において、二卵性双胎からの胎児対立遺伝子を含むアリコートを貯蔵できる。例えば、第１の双子からの細胞を含むアリコートは、第２の双子からの細胞を含むアリコートと独立して貯蔵できる。いくつかの具体例において、第１および第２の双子からの貯蔵されたアリコートは、１以上のアレイ上に独立して配置し、本明細書に記載した遺伝子または染色体変異につき評価できる。
【００７３】
技術
たとえ、胎児ＤＮＡまたはＲＮＡが母体および胎児の遺伝物質を含むサンプルの少数の画分中に存在したとしても、ＴＡＱＭＡＮＲ  ＰＣＲのごとき標準ＳＮＰ検出フォーマットを用いて、胎児のＳＮＰ対立遺伝子を検出することは依然として可能である。しかしながら、少数の対立遺伝子を検出するために、母体のシグナル重複が胎児特異的なシグナルを不明瞭にするのを防止するように蛍光検出を最適化することが必要であり得る。いくつかの具体例において、プローブ標識用の最適な蛍光色素を選択して、重複を最小化する。例えば、放射間の１０％未満の重複を持つ標準的蛍光スペクトル（４００〜７００ｎｍ）を横切って分離される色素を選択できる。このように、胎児対立遺伝子からの少数のシグナル（１０％未満のシグナル強度）でさえ、母体シグナル（９０％のシグナル強度）によって不明瞭にされない。いくつかの具体例において、最適な蛍光フィルターを選定して、放射検出中の重複を最小化し、カスタム蛍光検出ハードウェアおよびソフトウェアを選定して、シグナルのクロストークを最小化する。いくつかの具体例において、デジタルＰＣＲを用いて、シグナル−対−バックグラウンドを最適化する。
【００７４】
対立形質の強度を測定するための他の潜在的なツールはＳ字曲線適合、および当該技術分野における公知の他の統計解析を含む。いくつかの具体例において、Ｃｔシフトを測定して、遺伝子または染色体の変異を検出する。例えば、ＴＡＱＭＡＮＲ化学での胎児のＳＮＰの検出のための単一細胞の封入は、検出されたＳＮＰについての異常なコピー数、従って、対応する染色体のコピー数の同時の検出を可能とできる。ＳＮＰが染色体２１上に存在すれば、ＳＮＰ存在比は、Ｃｔ値、従って染色体２１についてのコピー数と相関するであろう。反応が単一細胞を含むならば、その細胞中の染色体のコピー数はＣｔシフトによって検出できる。この例において、正常な母体細胞の存在比Ｃｔ値の使用は、１個の細胞当たり２つの染色体の正常なコピー数についてのＣｔを確立し、早期のサイクルに対するＣｔシフトは、コピー数変異の存在を示すであろう。
【００７５】
本明細書に記載のごとく、配列決定方法を用いて、胎児対立遺伝子につきスクリーニングできるおよび／または遺伝子または染色体の変異の存在を決定できる。いくつかの具体例において、ショットガン配列決定を別法として用いて、例えば、Xie and Tammi, BMC Bioinformatics 2009, 10(80)に記載されるようなコピー数変異（例えば、遺伝的変異に起因する）を検出し得る。いくつかの具体例において、全ゲノム配列決定を行い得る。
【００７６】
また、ＳＮＰ遺伝子型決定は、ｑＰＣＲとＴＡＱＭＡＮＲ方法を含めた当該技術分野における公知のいずれの方法を用いても行うことができる。種々のＳＮＰ化学およびプラットフォームは、Life Technologies (TAQMANＲ) (Carlsbad, CA)、Illumina (GOLDENGATEＲ) (San Diego, CA)、Millipore (AMPLIFLUORＲ) (Billerica, MA)およびDxS Ltd. (SCORPIONSTM) (Manchester UK)のごとき製造者から入手可能である。また、小型化したフォーマットは、BioTrove (OPENARRAYTM) (Woburn, MA) およびFluidigm (BIOMARKTM) (South San Francisco, CA)から入手可能である。
【００７７】
ＳＮＰパネル
ＳＮＰパネルを用いて、母体の遺伝子サンプル中の標的遺伝子座を同定できる。一旦これらの標的遺伝子座が同定されれば、それらを用いて、混合サンプル中の非母体対立遺伝子の存在を同定する。母体の遺伝子サンプルを遺伝子型決定して、標的遺伝子座を同定することは、高価でかつ時間がかかるため、ＳＮＰパネルは、できるだけ少数のＳＮＰを含むように設計される。しかしながら、パネルは、混合サンプル中の胎児対立遺伝子の検出を可能とするために大きく十分な組の標的遺伝子座を同定するのに十分なＳＮＰを依然として含まなければならず、これらのＳＮＰは、胎児および母体細胞の混合物中の有限量の細胞を保存するのに十分に有益である。
【００７８】
ＳＮＰパネルのサイズは、パネル中のＳＮＰの少数の対立遺伝子頻度に反比例する。本発明のいくつかの具体例において、目標は、母体および胎児細胞の混合サンプルからの約１〜約５個の胎児細胞を同定することである。この目標を達成するために評価すべきＳＮＰ数は、評価されるＳＮＰの少数の対立遺伝子頻度、および遺伝子型決定される細胞数に依存する。今度は、評価すべき細胞数は、胎児細胞についての混合サンプルの富化の範囲に依存する。
【００７９】
従って、いくつかの具体例において、ＳＮＰパネルは、母体サンプルにおいてホモ接合性（または別法として、ヘテロ接合性）であって、母体および胎児の遺伝物質の混合サンプルにおいてヘテロ接合性（または別法として、ホモ接合性）である遺伝子座を同定するのに必要な試験数を最小化するように設計される。いくつかの具体例において、ＳＮＰパネルは、染色体特異的ＳＮＰパネル当たり約１〜約２０個のホモ接合性の母体ＳＮＰを同定するように設計される。いくつかの具体例において、ＳＮＰパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下のＳＮＰ、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である。好ましい具体例において、ＳＮＰパネルは、染色体特異的ＳＮＰパネル当たり約５〜約１０個のホモ接合性の母体ＳＮＰを同定するように設計される。より好ましくは、ＳＮＰパネルは、染色体特異的ＳＮＰパネル当たり約７個のホモ接合性の母体ＳＮＰを同定するように設計される。例えば、ｐ２＝０．２５の場合にＨＷＥ中のＳＮＰについて表２に示されるごとく、２０個のＳＮＰのパネルは、母体サンプルがホモ接合性である１０個のＳＮＰを同定することが必要とされる。
【００８０】
好ましくは少なくとも１つの対照染色体特異的ＳＮＰパネルを含むいくつかの染色体特異的ＳＮＰパネルを組み合わせて、母体の遺伝物質を遺伝子型決定するためのＳＮＰパネルを作成できる。各染色体特異的パネルは、その染色体についての標的の組の遺伝子座を生成するように設計される。好ましくは、染色体特異的ＳＮＰパネルは、約５〜約１００個のユニークなＳＮＰを含む。好ましくは、染色体特異的パネル中のＳＮＰの合計数は、約５〜約３０個のユニークなＳＮＰである。より好ましくは、染色体特異的パネル中のＳＮＰの合計数は約２０個のＳＮＰである。いくつかの具体例において、染色体特異的パネル中のＳＮＰの合計数は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下のＳＮＰ、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である。
【００８１】
ＳＮＰパネルは、１以上の染色体特異的パネルを含み得る。染色体特異的ＳＮＰパネルは、常染色体染色体に位置したＳＮＰ、好ましくは臨床的に関連する症候群における異数性に感受性である染色体に位置したＳＮＰを含むことができる。より好ましくは、染色体特異的ＳＮＰパネルは、染色体１３、１８および２１、ＸおよびＹに位置したＳＮＰを含む。また、染色体特異的パネルは、対照の染色体特異的パネルであることができる。好ましくは、対照の染色体特異的パネルは、異数性に感受性ではなく、または異数性が生存能と不適合である場合の染色体に位置したＳＮＰを含み、これは典型的には、より低い指標（例えば、染色体１、２、または３）により示されるより大きな染色体である。最も好ましくは、対照の染色体特異的パネルは、染色体１、２、または３に位置したＳＮＰを含む。加えて、また、染色体特異的ＳＮＰパネルは、性特異的染色体に位置したＳＮＰを含むことができる。いくつかの具体例において、パネルは特定の染色体に特異的ではない。いくつかの具体例において、対照は、染色体特異的ＳＮＰパネルではない。例えば、プライマーを用いて、対照として機能する染色体特異的領域を増幅できる。
【００８２】
いくつかの具体例において、ＳＮＰパネルは、染色体特異的パネルが、染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸまたはＹ上のＳＮＰについてのものである場合の１を超える染色体特異的パネルを含む。いくつかの具体例において、ＳＮＰパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の染色体特異的パネル、あるいは前記の値のいずれかの２つによって規定される範囲を含む。いくつかの具体例において、パネル中のＳＮＰの合計数は、染色体特異的パネル上のＳＮＰ数Ｎであり、ここに、Ｎは、ＳＮＰパネル中の染色体特異的パネル数である。
【００８３】
いくつかの因子は、遺伝子型決定パネルについての遺伝子座の選択において考慮できる。例えば、ハーディ−ヴァインベルク平衡（「ＨＷＥ」）は、ＳＮＰ対立遺伝子頻度の可能性を計算するとみなすことができる。いくつかの具体例において、選択されたＳＮＰ中の対立遺伝子の可能性は、以下の式：ｐ２＋２ｐｑ＋ｑ２＝１により得られる。例えば、０．５のヘテロ接合性を持つＳＮＰを選択できる。ＨＷＥにないＳＮＰは遺伝的なＳＮＰではないようであり、それらの有用性を制限し、または不完全な遺伝子型決定化学に起因し得るので、ＨＷＥが好ましい。
【００８４】
また、主要な公知のハプロタイプを横切るホモ接合性に支持される１つの対立遺伝子を持ったＳＮＰを選択できる。いくつかの具体例において、０．２５未満のホモ接合性の母体遺伝子型（ｐｐまたはｑｑ）および０．２５を超える反対のホモ接合性遺伝子型を持ったＳＮＰが選択される。
【００８５】
いくつかの具体例において、ＳＮＰは、すべての主要な集団群を横切って測定された少数の対立遺伝子につき約３０％〜約５０％の範囲の頻度を有する。好ましい具体例において、ＳＮＰは少数の対立遺伝子につき約４９％〜約５０％の範囲の頻度を有する。いくつかの具体例において、ＳＮＰは、少数の対立遺伝子につき３０％、３１％  ３２％  ３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％もしくは５０％の数のそのまま、約その数、少なくともその数、少なくとも約その数、その数以下、約その数以下、あるいは前記の値のいずれか２つにより規定される範囲である頻度を有する。
【００８６】
本発明の具体例
本発明の１つの具体例は、胎児対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得；胎児細胞につきサンプルを富化し；富化したサンプルをサブサンプルに分割し；サブサンプルに対し全ゲノム増幅を行い、増幅されたゲノム生成物を供し；増幅されたゲノム生成物をアリコートに分割し；母体細胞の遺伝物質が少数の対立遺伝子にホモ接合性である標的遺伝子座を同定し；標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し；試験遺伝子座にて、非母体対立遺伝子（ヘテロ接合性遺伝子型）につきアリコートをスクリーニングし、ここに、非母体対立遺伝子（ヘテロ接合性遺伝子型）の存在は、増幅されたゲノム生成物中の胎児対立遺伝子の存在を示し；次いで、少なくとも１つの胎児対立遺伝子を同定することを含む。
【００８７】
本発明のもう一つの具体例は、胎児遺伝的変異を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得；胎児細胞につきサンプルを富化し；富化したサンプルをサブサンプルに分割し、各サブサンプルは１個以下の細胞を含み；母体細胞の遺伝物質が少数の対立遺伝子にホモ接合性である少なくとも１つの遺伝子座のパネルを同定し；標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し；パネルから選択された試験遺伝子座にて非母体対立遺伝子（ヘテロ接合性遺伝子型）につきサブサンプルをスクリーニングし、ここに、非母体対立遺伝子（ヘテロ接合性遺伝子型）の存在は、サブサンプル中の胎児対立遺伝子の存在を示し；次いで、少なくとも１つの胎児対立遺伝子を同定し；次いで、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中の母系および父系遺伝した対立遺伝子の比を決定し、ここに、その比を分析して、遺伝的変異の存在を決定することを含む母体および胎児細胞の混合サンプル中の胎児対立遺伝子を同定する方法を含む。
【００８８】
本発明のもう一つの具体例は、胎児対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得；サンプルをサブサンプルに分割し；サブサンプルに対して前増幅を行い、増幅生成物を供し；増幅生成物をアリコートに分割し；標的遺伝子座を選択し、母体細胞の遺伝物質が１組の標的遺伝子座にてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかどうかを決定して、母体の遺伝子型を決定し；標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し；試験遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型についてのアリコートをスクリーニングし、ここに、母体の遺伝子型と異なる遺伝子型の存在は、増幅生成物中の胎児対立遺伝子の存在を示し；次いで、少なくとも１つの胎児対立遺伝子を同定することを含む。
【００８９】
本発明のもう一つの具体例は、胎児対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得；サンプルをサブサンプルに分割し；少なくとも１つの標的遺伝子座のパネルを同定し、母体細胞の遺伝物質が少なくとも１つの標的遺伝子座にホモ接合性であるかまたはヘテロ接合であるかを決定して、母体の遺伝子型を決定し；少なくとも１つの標的遺伝子座から試験遺伝子座を選択し；パネルから選択された試験遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につきサブサンプルをスクリーニングし、ここに、母体の遺伝子型と異なる遺伝子型の存在は、サブサンプル中の胎児対立遺伝子の存在を示し；次いで、少なくとも１つの胎児対立遺伝子を同定することを含む。
【００９０】
本発明の具体例は、以下の１以上を含むことができ、また、含み得る：さらに、胎児細胞につきサンプルを富化することを含む方法；富化することが母体細胞を超える胎児細胞の差動増殖を含む方法；さらに、胎児対立遺伝子を含むと同定された、増幅生成物を分析して、胎児遺伝的変異を検出することを含む方法；胎児遺伝的変異が、異数性、微小欠失、微小重複および突然変異または他の遺伝的変異よりなる群から選択される方法；さらに、胎児対立遺伝子を含むと同定された、増幅生成物を分析して、モザイク現象の存在を検出する含む方法；さらに、胎児対立遺伝子を含むと同定された、増幅生成物を分析して、二卵性双胎の存在を検出することを含む方法；前増幅が全ゲノム増幅または全トランスクリプトーム増幅を含む方法；標的遺伝子座が母体の遺伝子型にホモ接合性である方法；標的遺伝子座が母体の遺伝子型にヘテロ接合性である方法；標的遺伝子座が母体の遺伝子型にホモ接合性およびヘテロ接合性の遺伝子座の混合物を含む方法；増幅生成物がゲノムＤＮＡを含む方法；増幅生成物が相補的ＤＮＡを含む方法；母体の遺伝子型を決定することが、ＳＮＰのパネルを用いて、母体細胞の源であるのと同一個体からの母体の遺伝物質のサンプルを遺伝子型決定することを含む方法；母体の遺伝物質の源が、血液、血清、血漿、尿、子宮頚部スワブおよび頬側スワブよりなる群から選択される方法；母体の遺伝物質の源が血液および頬側スワブよりなる群から選択される方法；試験遺伝子座の選択が、標的遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき母体および胎児無細胞核酸のサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定し、次いで、無細胞核酸のサンプル中の非母体の遺伝子型を用いて、試験遺伝子座として標的遺伝子座を選択することを含む方法；非母体の遺伝子型がホモ接合性である方法；非母体の遺伝子型がヘテロ接合性である方法；母体および胎児の無細胞核酸サンプル源が、妊婦からの血液、血清、血漿、尿または子宮頚部スワブである方法；単一アリコート中の１を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングすることを含む方法；１を超えるアリコート中の１を超える試験遺伝子座を選択およびスクリーニングすることを含む方法；単一のアリコート中の１つの試験遺伝子座を選択およびスクリーニングすることを含む方法；１を超えるアリコート中の１つの試験遺伝子座を選択およびスクリーニングすることを含む方法；各サブサンプルが１個以下の細胞を含む方法；さらに、スクリーニングに先立ち２以上のアリコートの群を貯蔵することを含む方法；貯蔵がアリコートを含むウェルの行および列のインデックスシステムの使用を含む方法；行および列の数が独立して約２〜約１０００である方法；行および列の数が独立して約８〜約１００である方法；行および列の数が独立して約１６〜約２４である方法；少なくとも１つの標的遺伝子座が母体の遺伝子型にホモ接合性である方法；少なくとも１つの標的遺伝子座が母体の遺伝子型にヘテロ接合性である方法；パネルがホモ接合性およびヘテロ接合性の標的遺伝子座の混合物を含む方法；さらに、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中のシグナル強度を決定することを含み、ここに、シグナル強度を分析して、遺伝的変異の存在を決定する方法；さらに、母体対立遺伝子を含むサブサンプルと比較した、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中の染色体の配列の過剰提示または提示不足を決定することを含み、ここに、この過剰提示または提示不足を用いて、染色体の異数性、微小欠失または微小重複の存在を決定する方法；さらに、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中のシグナル強度を決定することを含み、ここに、シグナル強度を分析して、モザイク現象の存在を決定する方法；さらに、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中の対立遺伝子のコピー数を決定することを含み、ここに、対立遺伝子のコピー数を分析して、モザイク現象の存在を決定する方法；さらに、胎児対立遺伝子を含むサブサンプル中の対立遺伝子のコピー数を決定することを含み、ここに、対立遺伝子のコピー数を分析して、遺伝的変異の存在を決定する方法；母体の遺伝子型を決定することが、ＳＮＰのパネルを用いて、母体細胞の源である同一個体からの母体の遺伝物質のサンプルを遺伝子型決定することを含む方法；標的遺伝子座がホモ接合性であって、試験遺伝子座がヘテロ接合性である方法；標的遺伝子座がヘテロ接合であって、試験遺伝子座がホモ接合性である方法；パネルがホモ接合性およびヘテロ接合性の標的遺伝子座の混合物を含む方法；ＳＮＰのパネルが本明細書に記載されたＳＮＰのパネルである方法；およびパネルが少なくとも５つの遺伝子座のパネルである方法。
【００９１】
本発明のもう一つの具体例は、有益な父性対立遺伝子を検出する方法であり、母体および胎児細胞の混合物を含むサンプルを得；所望により、胎児細胞につきサンプルを富化し；サンプルまたは富化したサンプルをサブサンプルに分割し；所望により、増幅生成物をアリコートに分割し；所望により、１組の標的遺伝子座を選択し；母体細胞の遺伝物質が１組の標的遺伝子座にてホモ接合性またはヘテロ接合であるかを決定して、母体の遺伝子型を決定し；所望により、標的遺伝子座の組から試験遺伝子座の選択し、ここに、所望により、選択は、標的遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につき混合された母体および胎児核酸のサンプルをスクリーニングし、次いで、混合された母体および胎児核酸のサンプル中の非母体の遺伝子型で試験遺伝子座として、標的遺伝子座を選択することを含む；有益な父性対立遺伝子の存在につきアリコートもしくはサブサンプルをスクリーニングまたは遺伝子型決定し、ここに、所望により、スクリーニングは、少なくとも１つの標的または試験遺伝子座にて母体の遺伝子型と異なる遺伝子型につきアリコートをスクリーニングすることを含み、母体の遺伝子型と異なる遺伝子型の存在は、アリコート中の有益な父性対立遺伝子の存在を示す；および少なくとも１つのアリコート中の少なくとも１つの有益な父性対立遺伝子の存在を同定することを含む。いくつかの具体例において、方法は、所望により有益な父性対立遺伝子を含むと同定されたアリコートの一部分を収集し；次いで、有益な父性対立遺伝子を含むと同定された増幅生成物のアリコートまたは収集部分を分析して、遺伝的変異を検出することを含む。
【００９２】
本発明のいくつかの具体例は、染色体特異的パネルが染色体１３、１８および２１、ＸおよびＹよりなる群から選択される異数性に付された染色体対象に指向されるＳＮＰパネル；および、さらに染色体１、２および３よりなる群から選択される対照染色体に指向される対照染色体特異的パネルを含むＳＮＰパネルを含む。
【００９３】
前記に引用された優先権書類の少なくとも１つに用いたスクリーニングなる用語は、本明細書に記載されたスクリーニングおよび遺伝子型決定の方法を包含する。加えて、前記に引用された優先権書類の少なくとも１つに用いたホモ接合性およびヘテロ接合性の対立遺伝子なる用語とは、時々、本明細書中では、ヘテロ接合もしくはホモ接合性の遺伝子座または遺伝子座群、あるいはヘテロ接合性もしくはホモ接合性遺伝子型をいう。さらに、前記で引用された優先権書類の少なくとも１つに用いた前増幅なる用語とは、本明細書中ではサブサンプル増幅をいう。
【００９４】
本発明の精神から逸脱することなく、多数でかつ種々の変更をなすことができることは、当業者により理解されるであろう。本明細書に引用されたすべての参考文献を、記載された主題につき、その全てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。以下の実施例は、例示目的だけに含まれ、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【００９５】
実施例
実施例１  本発明の具体例の以下の実施例は、胎児サンプルのＰＣＲに基づく検出に続く、ＷＧＡを含む。所望により母体および胎児細胞の富化した混合物である細胞をＰＢＳのごとき緩衝液中に懸濁し、細胞溶解およびＰＣＲに適当な化学を持った第２の緩衝液に分配させる。次いで、ＰＣＲ適合性緩衝液中の細胞を、例えば、オイルプラグの導入により個々の反応に分配して、溶解およびＰＣＲ緩衝液に個々の細胞の油分離を創製する。本方法は、単一工程の細胞溶解を実行する化学、および封入後の試薬の添加なくして、標的核酸の増幅を好ましくは用いる。本方法は、好ましくは、ＤＮＡ増幅に先立つＤＮＡ精製を含まない。次いで、名目上の単一細胞反応を熱サイクリング中または最終サイクルの終了にてのいずれかの胎児特異的蛍光プローブ検出、および胎児細胞を含むすべての成分（すなわち、１以上）の検出で、加熱および冷却の熱サイクリングに付される。好ましい場合において、１つの反応当たり１個の細胞を得るが、１個の胎児細胞および数個〜多数の母体細胞よりなる反応は、依然として、正確に胎児細胞の存在または不存在を同定するであろう。引き続いてのゲノム分析が等価な混入（すなわち、１つの胎児細胞および２つの母体細胞は、３３％の純粋な胎児ＤＮＡを意味する）を許容する限り、１つの反応当たり１を超える細胞を許容可能である。ポジティブな各区画は、単一の共有容器に所望により貯蔵する。この貯蔵した胎児特異的な反応は、ＲＮＡおよびタンパク質の除去のごときＤＮＡ精製手順に付す。所望の精製後、核酸をいずれかの適合性化学を用いるＷＧＡに付す。ＷＧＡのための方法は、以下のいずれかを含む：縮重オリゴヌクレオチドプライムポリメラーゼ連鎖反応（「ＤＯＰ−ＰＣＲ」）、連結媒介ＰＣＲ（「ＬＭ−ＰＣＲ」）、Φ−２９ポリメラーゼでの鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）、または他の組合せプロトコール(Rubicon GenomicsまたはNuGen)。ＷＧＡに続いて、得られた増幅ゲノムＤＮＡを遺伝子分析、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションまたは全ゲノム配列決定（「ＣＧＨ」）に用いる。ＢＡＣ配列またはオリゴ配列を含めてＣＧＨに用いられる多数の方法がある。また、標準キャピラリーに基づくサンガー配列決定を含めた配列決定、およびSolexa/Illumina (San Diego, CA)、Complete Genomics (Mountain View, CA)、Roche/454 (Branford, CT)および Life Technologies (SOLiDＴＭ) (Carlsbad, CA)を含めた現在の「次世代」高処理配列決定プラットフォームについての種々の方法がある。
【００９６】
実施例２  細胞からの胎児ＤＮＡの検出についての本発明の具体例の以下の実施例は、区別される反応チャンバーへの細胞の単離に続いてのＷＧＡ、次いで、ＰＣＲ胎児対立遺伝子検出のための複数アリコートへの各反応の分離、次いで、遺伝子分析、例えば、ＣＧＨまたは配列決定のための胎児陽性反応の所望によるコンジュゲートアリコートの貯蔵を含む。所望により胎児および母体細胞の富化した混合物である細胞を細胞溶解およびＷＧＡに適当な緩衝液および試薬を含有する単離された反応チャンバーに分配する。これは、複数段階の試薬添加を可能とするアクセスを含む毛細管またはプレート形式で水相および油相を交互にすることにおいてできる。プレート形式において、細胞を最初に２００μｌ中の約１００，０００個の細胞として再懸濁し、９６ウェルプレートのウェルに入れる。次いで、ＴＥＣＡＮ(Mannedorf, Switzerland)、ＬａｂＣｙｔｅ(Sunnyvale, CA)または他のものより提供されるもののごとき標準的なマイクロピペット技術を用いて、平均１、２、３、４または５個の細胞を含有する１０ｎＬの細胞懸濁液を、例えば、１，５３６または３，４５６ウェルを含む高密度プレートに移す。標準ＷＧＡ化学を用いる。例えば、各１０ｎＬの細胞体積に、９０ｎＬのＷＧＡ用試薬を添加し、プレートを油によって密閉して、蒸発を防止し、ＷＧＡ化学を進行させる。ＷＧＡ後に、反応中にすべての細胞からの増幅された多数のコピーのゲノムを含有する２５μｌまでを第２の高密度プレートに移す。次いで、反応を含む胎児ＤＮＡを同定するためのプライマーおよびプローブを含有する、１００ｎＬまでのＰＣＲ試薬のアリコートを本明細書に開示されるごときＳＮＰパネルからの標的遺伝子座を用いてスクリーニングする。所望により、貯蔵後に、ＣＧＨハイブリダイゼーションまたは配列決定を含めて、下流ゲノム解析のために、胎児ＤＮＡに陽性である反応を用いる。その反応は、ＣＧＨハイブリダイゼーションまたは配列決定に先立ち精製手順に付す。
【００９７】
実施例３  本発明の具体例の以下の実施例において、染色体２１に位置したＳＮＰをパネルにつき選択する。ハーディ−ヴァインベルク平衡（「ＨＷＥ」）は、対立遺伝子頻度の可能性を計算するとみなされる。１つの対立遺伝子は主要な公知のハプロタイプを横切るホモ接合性において支持される。母体の遺伝子型は、０．２５未満のホモ接合性（ｐｐまたはｑｑ）であって、反対のホモ接合性遺伝子型は０．２５を超え、対立遺伝子の可能性は、以下の式：ｐ２＋２ｐｑ＋ｑ２＝１により与えられる。ＳＮＰはメンデルの法則の様式で遺伝する。
【００９８】
実施例４    本発明の具体例の以下の実施例において、提案されたパネルは、ＨＷＥにてＳＮＰを選択することを含み、ここに、ｐ２およびｑ２の比は０．２５であって、ヘテロ接合性は０．５である。これらの比を用いて、ホモ接合性の母体ＳＮＰを見出すには、母体サンプルがホモ接合性である１０個のＳＮＰ（２０×（０．２５＋０．２５））を見出すために２０個のＳＮＰだけを統計的に必要とする。所与のいずれのホモ接合性ＳＮＰについても、胎児を含む集団は、０．５のヘテロ接合性である可能性を有するであろう。第１の母体のホモ接合性ＳＮＰについては、胎児のヘテロ接合性の可能性は、合計の可能性が０．５のために０．５である。第１および第２の母体のホモ接合性ＳＮＰについて、組み合わせた可能性は、１−（０．５×０．５）＝０．７５である。７つのＳＮＰの組み合わせた可能性は、０．９９２である。
【００９９】
実施例５  以下の実施例は、本発明の具体例である。妊婦は１４週間の在胎期間を示す。胎児が２１番染色体トリソミーを有するかを検出するために、医師は、静脈穿刺および頬側スワブによって、各々、妊婦から３０ｍＬ血液サンプルおよび上皮細胞を得る。
【０１００】
ＳＮＰのパネルを設計する。染色体１および２１の各々２０個のＳＮＰ（すなわち、４０個の標的遺伝子座）をパネルにつき選択し、各ＳＮＰは、すべての主要な集団を横切って４９％の小数の対立遺伝子頻度を有する。母体ＤＮＡを頬側スワブから抽出し、ＳＮＰパネルを用いて遺伝子型決定する。そのパネルからの２０個のＳＮＰはホモ接合性遺伝子型（すなわち、標的遺伝子座）を生成し、次いで、血液サンプルからの母体および胎児細胞の混合物中でさらに遺伝子型決定するために選択する。
【０１０１】
血液サンプルは、ＦＩＣＯＬＬＴＭ（［位置］）に続いて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズ(Gladbach, Germany)に付すことにより、１：１０，０００の胎児：母体細胞まで富化する。その富化した血液サンプルを、溶解緩衝液およびＰＣＲ試薬を含有する溶液に懸濁する。次いで、サンプルをオイルプラグと組合せ、サンプルが各々１個以下の細胞を含むサブサンプルに分割されるように、マイクロ流体装置に導入する。一旦、マイクロ流体装置内部に入ると、サブサンプルは後記のごとく、単一工程細胞溶解に続いてＰＣＲ増幅を受ける。
【０１０２】
計算を行って、１：１０，０００の胎児：母体細胞の濃度では、４９％の小数の対立遺伝子頻度を持つＳＮＰにつき、約５個のヘテロ接合性遺伝子座を検出するために、５０，０００個の細胞をスクリーニングしなければならないことを決定する。
【０１０３】
第１の組の５０，０００個のサブサンプル（従って、５０，０００個の細胞）を、ＴＡＱＭＡＮＲシステムでの多重ｑＰＣＲを用いて、染色体１および２１の各々（すなわち、２つの遺伝子座の合計）に対する第１のＳＮＰにつき、各サブサンプル単位で（従って、各細胞単位で）スクリーニングする。ヘテロ接合性遺伝子型は染色体１または２１上のいずれのＳＮＰについても同定されない。次いで、第２の組の５０，０００個のサブサンプルを、染色体１および２１の各々に対する第２のＳＮＰにつき各サブサンプル単位でスクリーニングする。染色体１上のＳＮＰはヘテロ接合性であり（胎児対立遺伝子の存在を示す）、一方、染色体２１上のＳＮＰはホモ接合性である。次いで、第３の組の５０，０００個のサブサンプルを染色体１および２１の各々に対して第３のＳＮＰにつき各サブサンプル単位でスクリーニングする。今回は、染色体２１上のＳＮＰはヘテロ接合性であり、さらなる遺伝子型決定を行わない。
【０１０４】
次いで、染色体２１上の第３のＳＮＰからの対立遺伝子の比を分析して、異数性の存在を検出する。母体由来の対立遺伝子（Ｃ）の父系由来の対立遺伝子（Ｇ）と比較した対立遺伝子の強度が、２：１（すなわち、ＣＣＧ）であるために、２１番染色体トリソミーを検出する。
【０１０５】
実施例６  以下の実施例は、本発明の具体例である。胎児および成人の細胞は、胎児細胞の差動増殖に対するそれらの効果を評価するために、異なる因子の存在下で増殖させた。その因子は、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞刺激因子、５ｎｇ／ｎＬのＩＬ−３、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１．５ＬＶｍＬのＥＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ−３であった。細胞は、成人の動員ドナー末梢血から精製したＣＤ３４＋陽性細胞、およびＣａｍｂｒｅｘ(Walkersville, MD)から購入した胎児の肝臓組織から精製したＣＤ３４＋陽性細胞であった。細胞は、２４ウェル組織培養プレートに１ｍＬ当たり１０，０００個の細胞で蒔いた。細胞は、湿潤チャンバー中の３７℃、５％ＣＯ２にて６日間、５０単位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンおよび前記のサイトカインの組合せを含むＨＰＧＭ培地中で培養した。６日後に、細胞のアリコートを、血球計でマニュアルで計数し、合計細胞数を標準式を用いて計算した。さらなるアリコートを用い、ＶＩＡＬＩＧＨＴＲアッセイキット(Cambrex, Walkersville, MD)  を用いて、合計ＡＴＰレベル（合計細胞数との線形相関）をアッセイした。
【０１０６】
測定されたすべての場合に、胎児細胞は成人細胞を超えて増殖させた（例えば、表４からの第４カラムを第７カラムと比較されたし）。表４の最終カラムは、いくらかの増殖条件についての胎児細胞−対−成人細胞の比を示す。比を測定したすべての場合に、胎児細胞は増殖後に、より多数であった。
【０１０７】
実施例７  細胞からの胎児ＤＮＡの検出のための本発明の具体例の以下の実施例は、区別される反応チャンバーへの細胞の単離に続いてのＷＧＡ、および遺伝的変異の直接的検出を含む。所望により胎児および母体細胞の富化した混合物である細胞は、細胞溶解およびＷＧＡ用の適当な緩衝液および試薬を含有する単離された反応チャンバーに分配する。プレート様式において、細胞を２００μｌ中の１００，０００個の細胞として最初に再懸濁し、９６ウェルプレートのウェルに入れる。次いで、ＴＥＣＡＮ  (Mannedorf, Switzerland)、ＬａｂＣｙｔｅ(Sunnyvale, CA)または他のものにより提供されたもののごとき標準マイクロピペット技術を用いて、平均１、２、３、４または５個の細胞を含有する１０ｎＬの細胞懸濁液を、例えば、１，５３６または３，４５６ウェルを含む高密度プレートに移す。標準的ＷＧＡ化学を用いる。例えば、細胞体積の各１０ｎＬに、９０ｎＬのＷＧＡ用試薬を添加し、プレートは蒸発を防止するために油により密閉し、ＷＧＡ化学を進行させる。ＷＧＡ後に、胎児のＤＮＡ含有反応を同定するためのプライマーおよびプローブを含有するＰＣＲ試薬を添加して、本明細書に開示されたＳＮＰパネルからの標的遺伝子座を増幅する。胎児ＤＮＡに陽性である反応を反応チャンバー中で捕捉プローブを用いて、直接的に検出する。標的ハイブリダイゼーション後に、ウェルを洗浄して、非標的ＤＮＡおよび未反応試薬を除去する。次いで、特異的にハイブリダイズした生成物を分子ビーコンのごとき標準化学を用いて検出する。次いで、胎児および母体配列の比を用いて、遺伝的変異を決定できる。
【０１０８】
実施例８  以下の実施例は、本発明の具体例である。４０ｍｌの血液を妊婦から採取し、標準的な抗凝血剤（例えば、ＥＤＴＡ）と組み合せ、次いで、処理位置に輸送する。１２ｍｌの血漿を血液から取り出し、無細胞ＤＮＡを抽出する。全血またはＰＢＭＣのアリコートを母体の遺伝子型決定のために取り出す。
【０１０９】
勾配富化は赤血球細胞溶解を含めた赤血球除去のために行う。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いて、約５００，０００個未満の合計細胞の収率まで母体細胞を枯渇させる。細胞選別を用いて、約１０，０００個の細胞の合計収率のために胎児画分を富化する。細胞を適当な体積中の１反応当たりλ＝約１個の細胞まで分割する。細胞を直接的に溶解し、恐らく中和溶液の添加を用いて、ＰＣＲ適合溶液を創製する。ＷＧＡ試薬を１００ｎＬの合計の反応体積につき各反応に添加する。ＷＧＡは、ＤＮＡの約１０〜１０，０００の合計のゲノム等価物の合計につき進行させる（反応は最初に１つのゲノム等価物を含んだ）。ＷＧＡ反応を停止させ、すべての反応を少なくとも１つの位置にてインデックスを付したアリコートに分割する。ＰＣＲをすべてのアリコートに対して行ない、（例えば、全血またはＰＢＭＣのアリコートを用いて得た遺伝子型に比較することにより）非母体対立遺伝子を検出する。非母体対立遺伝子を含有するＷＧＡ物質の元来の位置を同定し、これらの位置での体積を回収する。次いで、これらの体積を最終ＷＧＡにつき貯蔵して、ａＣＧＨに適するＤＮＡ量（例えば、約０．５〜１μｇ）を生成する。次いで、ａＣＧＨを行い、ＣＮＶを検出する。
【０１１０】
【表２】
2012513217.tif 000003
【０１１１】
【表３】
2012513217.tif 000004
【０１１２】
【表４−１】
2012513217.tif 000005
【０１１３】
【表４−２】
2012513217.tif 000006
O: 幹細胞刺激因子(50 ng/mL); A: IL-3 (5 ng/mL); B:  IL-6 (5 ng/mL); C:  EPO (1.5 U/mL); D:  TPO (100 ng/mL); E:  Flt-3 (50 ng/mL)
【国際調査報告】
2012513217.tif 000007
2012513217.tif 000008
2012513217.tif 000009