(57)【要約】  式（Ｉ）の化合物は肺炎症の吸入治療に有用な、ヒト好中球エラスターゼの阻害剤である。【化１】2012516316.tif 000033【選択図】なし
2012516316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2012516316.tif 000031
の化合物またはそれの薬学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、式（ＩＡ）
【化２】
2012516316.tif 000032
に示されるＲ−Ｒ立体構造が、Ｒ−Ｓおよび／またはＳ−Ｓ構造よりも優位である化合物。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の化合物および１以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、吸入による肺への送達に適した薬学的組成物。
【請求項４】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、肺線維症、肺炎、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺気腫、喫煙によって誘発される気腫、または嚢胞性線維症を、吸入によって治療するための、またはそれらを治療するために吸入可能な組成物を製造するための、請求項１または請求項２に記載の化合物の使用。
【請求項５】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、肺線維症、肺炎、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺気腫、喫煙によって誘発される気腫、および嚢胞性線維症から選択されるような疾患で苦しむ対象者を治療する方法であって、該方法は対象者に請求項１または請求項２に記載の化合物の効果的な量を肺吸入によって投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト好中球エラスターゼの阻害剤である、特異的に置換された３，４，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン−２，５−ジオン化合物に関し、かつ吸入投与による呼吸器疾患の治療におけるそれの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）は、好中球のアズール顆粒において発見された３２ｋＤａのセリンプロテイナーゼである。それは、エラスチンに加えてフィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンを含む、幅広い細胞外マトリックスタンパク質の分解において役割を有している（Ｂｉｅｔｈ，Ｇ．Ｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｍｅｃｈａｍ，Ｒ．Ｐ．（Ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡ  １９８６，２１７−３０６）。ＨＮＥは、組織構成タンパク質の分解による損傷組織の修復または除去を通して、恒常性において重要な役割を担っていると長年にわたり考えられてきた。また、細菌体を分解することによる、細菌侵入に対する防御と関連している。マトリックス組織へのその効果に加えて、ＨＮＥはＩＬ−８遺伝子発現の上方調節に関与し、かつ肺の上皮細胞からＩＬ−８の放出を誘発する。喫煙暴露によって誘発される慢性閉塞性肺疾患の動物モデルでは、ＨＮＥの小分子阻害剤およびタンパク質阻害剤の両方が、炎症反応および気腫の進行を阻害する（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｌ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００２，１６６，９５４−９６０；Ｃｈｕｒｇ，Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００３，１６８，１９９−２０７）。したがって、ＨＮＥは、好中球の流入が特有の特徴である、慢性呼吸器疾患におけるマトリックス破壊および炎症反応の増幅の両方において役割を担う可能性がある。実際に、ＨＮＥは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺気腫、肺炎および肺線維症を含む、様々な肺疾患に関与していると考えられている。また、それは、組織再構築が関連する様々な心血管疾患、例えば急性心筋梗塞に続く心不全および虚血性組織損傷の発生にも関与している。
【０００３】
ＣＯＰＤは、３つの異なる病態、すなわち、慢性気管支炎、気腫、および末梢気道疾患を包含する包括的用語であり、それらは全て気流制限の一因となっている。一般的に、３つ全てはＣＯＰＤ患者において様々な程度で存在し、ＣＯＰＤ患者における気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中で観察される好中球数の増加によって支持されるように、３つ全ては好中球媒介性の炎症によるものであろう（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｂ．；Ｄａｕｇｈｔｏｎ，Ｄ．ら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１９８９，１４０，１５２７−１５３７）。ＣＯＰＤの主な病原性決定基は、プロテアーゼ−抗−プロテアーゼバランス（「エラスターゼ：抗−エラスターゼ仮説」としても知られている）であり、ＨＮＥと、α１−抗トリプシン（α１−ＡＴ）、分泌型白血球プロテアーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、およびプレ−エラフィン（ｐｒｅ−ｅｌａｆｉｎ）などの内在性抗プロテアーゼとの不均衡が、ＣＯＰＤの様々な炎症性疾患を引き起こすと長年にわたり考えられてきた。プロテアーゼ阻害剤であるα１−抗トリプシンの遺伝子欠損を有する個体は、時間と共に重症化する気腫を発症する（Ｌａｕｒｒｅｌｌ，Ｃ．Ｂ．；Ｅｒｉｋｋｓｏｎ，Ｓ  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９６３  １５，１３２−１４０）。したがって、過剰のＨＮＥは破壊的であり、弾性の損失および肺中の気道における肺胞壁（ａｌｖｅｏｌａｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｓ）の破壊を伴う肺形態の崩壊（気腫）を引き起こし、同時に微小血管透過性および粘液過分泌を増大させる（慢性気管支炎）。
【０００４】
国際特許公開第２００７／１２９０６０号は、とりわけ式Ｍ−Ｌ−Ｍ１のホモ二量体またはヘテロ二量体の化合物に関し、Ｌは二価のリンカー基であり、ＭおよびＭ１はそれぞれ独立に、式（Ａ’）または（Ｂ’）の基である。
【０００５】
【化１】
2012516316.tif 000003
【０００６】
【化２】
2012516316.tif 000004
【０００７】
式中、
Ａは、アリールまたはヘテロアリール、
Ｄは、酸素または硫黄、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、ヒドロキシ、またはＣ１−Ｃ６−アルコキシ、もしくはＣ２−Ｃ６−アルケニルオキシであり、ここで、Ｃ１−Ｃ６−アルキルおよびＣ１−Ｃ６−アルコキシは水素、ヒドロキシおよびＣ１−Ｃ４−アルコキシから成る群より選択される１から３個の同一または異なる基とさらに置換可能であり、
ＲおよびＲ４は、それぞれ独立に、式−［Ｘ］ｍ−［Ａｌｋ１］ｐ−［Ｑ］ｎ−［Ａｌｋ２］ｑ−［Ｘ１］ｋ−Ｚの基を表し、
ここで、
ｋ、ｍ、ｎ、ｐおよびｑは、独立に０または１であり、
Ａｌｋ１およびＡｌｋ２は、それぞれ独立に、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）またはアミノ（−ＮＲＡ−）結合（ここで、ＲＡは水素またはＣ１−Ｃ３−アルキルである）を選択的に含み得る、選択的に置換されたＣ１−Ｃ６−アルキレンまたはＣ２−Ｃ６−アルケニレン基を表し、
Ｑは、
（ｉ）−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｓ＋（ＲＡ）−、−Ｎ（ＲＡ）−、−Ｎ＋（ＲＡ）（ＲＢ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＡ−、−ＮＲＡＣ（＝Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ２）ＮＲＡ−、−ＮＲＡＳ（Ｏ２）−、−ＮＲＡＣ（＝Ｏ）ＮＲＢ−、−ＮＲＡＣ（＝ＮＲＡ）ＮＲＢ−、−Ｃ（＝ＮＲＤ）ＮＲＥ−、−ＮＲＥＣ（＝ＮＲＤ）−、
ここで、ＲＡ、ＲＢ、ＲＤおよびＲＥは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルもしくはＣ３−Ｃ６シクロアルキル、またはＲＡおよびＲＢもしくはＲＤおよびＲＥは、それらが結合する窒素と共に、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるさらなるヘテロ原子を含み得る５から７の環原子からなる単環式複素環を形成し、または、
（ｉｉ）３−６員環を有する選択的に置換された二価の単環式もしくは二環式の炭素環または複素環基を表し、
Ｘは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲＡ−、または−Ｓ（Ｏ２）ＮＲＡ−を表し、ここで、ＲＡは、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキルまたはＣ３−Ｃ６シクロアルキルであり、
Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨを表し、かつ
Ｚは、水素、または３−６員環を有する選択的に置換された単環式もしくは二環式の炭素環または複素環基である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／１２９０６０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｅｔｈ，Ｇ．Ｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｍｅｃｈａｍ，Ｒ．Ｐ．（Ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡ  １９８６，２１７−３０６
【非特許文献２】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｌ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００２，１６６，９５４−９６０
【非特許文献３】Ｃｈｕｒｇ，Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００３，１６８，１９９−２０７
【非特許文献４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｂ．；Ｄａｕｇｈｔｏｎ，Ｄ．ら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１９８９，１４０，１５２７−１５３７
【非特許文献５】Ｌａｕｒｒｅｌｌ，Ｃ．Ｂ．；Ｅｒｉｋｋｓｏｎ，Ｓ  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９６３  １５，１３２−１４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、国際公開第２００７／１２９０６０号の特許請求の範囲内の化合物に関連するが、そこには具体的に開示されていない。国際公開第２００７／１２９０６０号における化合物のように、本化合物は、肺および気道における炎症性疾患の治療のために、吸入による肺への応用に特に有用である。しかしながら、本化合物は、国際公開第２００７／１２９０６０号に開示されるそれの最も密接な構造類似体と比較して、それの半減期（Ｔ１／２）として表される肺中でのより短い滞留時間の利点を有し、それは治療中止時のより早い排除において望ましい特性をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、式（Ｉ）の化合物およびそれの薬学的に許容される塩を提供する。
【００１２】
【化３】
2012516316.tif 000005
【００１３】
塩の検討には、ＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔｈの、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ワインハイム、独国、２００２）を参照のこと。本発明の化合物における薬学的に許容される塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、二酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩またはｐ−トルエンスルホン酸塩などの酸付加塩を含む。
【００１４】
本発明の化合物は、１以上の水和物または溶媒和物として単離し得、かつ単一または複数の多結晶形（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｆｏｒｍｓ）であることが予測される。「本発明が関連する化合物」または「本発明の化合物」または「本化合物」または「式（Ｉ）の化合物」等に対する、本発明の特許請求の範囲を含めた本明細書におけるあらゆる言及には、このような化合物の塩、水和物、および溶媒和物、ならびにそれらの結晶形に対する言及が含まれる。
【００１５】
用語「溶媒和物」は、本発明の化合物、および化学量論量の１以上の薬学的に許容される溶媒分子、例えばエタノールなどを含む、分子複合体を表すために本明細書において使用される。用語「水和物」は、前記溶媒が水であるときに使用される。
【００１６】
本発明の化合物は、以下のようにアスタリスクによって示される２つの不斉中心を有する。
【００１７】
【化４】
2012516316.tif 000006
【００１８】
好ましくは、本発明の化合物は、Ｒ−Ｓおよび／またはＳ−Ｓ構造よりも、それらの中心において主にＲ−Ｒ構造（式（ＩＡ）に示す）を有する。
【００１９】
【化５】
2012516316.tif 000007
【００２０】
したがって、本発明の化合物における好ましい試料は、Ｒ−Ｒジアステレオマーを主に含む。例えば、本発明の化合物の試料は、式（ＩＡ）において表されるＲ−Ｒジアステレオマーの少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９５重量％、より好ましくは９８重量％かそれ以上、かつそれぞれその他のジアステレオマーの１０重量％、５重量％または２重量％未満から成り得る。
【００２１】
本発明の化合物は、ＨＮＥが関与する疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、肺線維症、肺炎、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺気腫、喫煙によって誘発される気腫、または嚢胞性線維症、喘息および鼻炎などの気道疾患を、治療または予防するための肺内投与を目的としたものである。したがって、本発明の化合物は、上述した気道状態または疾患で苦しむ患者を処置するための治療方法において使用可能である。
【００２２】
したがって、本発明の他の側面は、本発明の化合物および１以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、吸入による肺内投与に適した薬学的組成物である。上記で説明したように、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物が（Ｓ−ＳおよびＲ−Ｓジアステレオマーと比較して）Ｒ−Ｒジアステレオマーとして主に存在するものを含む。好ましくは、本発明の組成物は、式（Ｉ）の化合物において、Ｒ−Ｒジアステレオマーを少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％かそれ以上、かつそれぞれその他のジアステレオマーを１０重量％、５重量％または２重量％未満含む。
【００２３】
肺吸入による投与に適した組成物は公知であり、このような化合物の使用のために知られている担体および／または希釈剤を含んでいてもよい。組成物は０．０１−９９重量％の活性化合物を含み得る。好ましくは、単位投与量は、活性化合物を１μｇから１０ｍｇの量で含む。
【００２４】
最も適した投与量レベルは、当業者に周知のあらゆる適した方法によって決定され得る。しかしながら、特定の患者に対する具体的な量は、使用される具体的な化合物の活性度、患者の年齢、体重、食事、一般的健康状態および性別、投与時間、投与経路、排出率、その他の薬剤の使用、および治療中の病気の重症度を含む、様々な要因によって決まることが理解されよう。一般的に、１日用量の範囲は、単回または分割投与において、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約１００ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり０．０１ｍｇから約５０ｍｇ、および最も好ましくは１ｋｇ当たり０．１ｍｇから１０ｍｇの範囲内であり得る。一方で、場合によってはこれらの制限の範囲外の投与量を使用しなければならない。
【００２５】
吸入による送達のために、活性化合物は好ましくは微粒子の形状である。それらは噴霧乾燥、凍結乾燥、および微粒子化を含む様々な技術によって調製可能である。
【００２６】
例として、本発明の組成物は、ネブライザーからの送達のために懸濁液として、または例えば加圧式定量噴霧式吸入器（ＰＭＤＩ）中で使用するための液体噴射剤中のエアロゾルとして調製可能である。ＰＭＤＩ中で使用するのに適した噴射剤は当業者に周知であり、ＣＦＣ−１２、ＨＦＡ−１３４ａ、ＨＦＡ−２２７、ＨＣＦＣ−２２（ＣＣｌ２Ｆ２）およびＨＦＡ−１５２（ＣＨ４Ｆ２およびイソブタン）を含む。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物は乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）を使用して送達するために乾燥粉末の形態である。多種類のＤＰＩが知られている。
【００２８】
吸入によって送達される微粒子は、送達および放出を補助する賦形剤を用いて製剤可能である。例えば、乾燥粉末製剤では、微粒子のＤＰＩから肺への流入を補助する大きな担体粒子を用いて製剤され得る。適した担体粒子は公知であり、９０μｍを超える空気動力学的粒径（ｍａｓｓ  ｍｅｄｉａｎ  ａｅｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）を有するラクトース粒子を含む。
【００２９】
エアロゾルの発生は、例えば、圧力駆動のジェットアトマイザーまたは超音波アトマイザーを使用して、好ましくは噴射剤駆動式定量エアロゾル、または例えば吸入カプセルもしくはその他の「乾燥粉末」送達システムからの微粒子した化活性化合物の噴射剤を含まない投与を使用して実施可能である。
【００３０】
活性化合物は、使用される吸入器システムに応じて記載のごとく投与され得る。活性化合物に加えて、投与形態は、例えば噴射剤（例えば定量エアロゾルの場合のＦｒｉｇｅｎ）、界面活性物質、乳化剤、安定化剤、保存剤、風味剤、充填剤（例えば、粉末吸入器の場合のラクトース）などのような賦形剤、または適切であれば、さらなる活性化合物を追加的に含む。
【００３１】
吸入の目的では、患者に適切な吸入技術を使用して、最適粒子径のエアロゾルを発生し投与できる多数のシステムが利用可能である。特に粉末吸入器の場合には、アダプター（スペーサー、エクスパンダー）および梨型容器（例えばＮｅｂｕｌａｔｏｒ（登録商標）、Ｖｏｌｕｍａｔｉｃ（登録商標））、および定量エアロゾル用のパフ噴霧（ｐｕｆｆｅｒ  ｓｐｒａｙ）を噴出する自動デバイス（Ａｕｔｏｈａｌｅｒ（登録商標））の使用に加え、多数の技術的解決法を利用可能である（例えば、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（登録商標）、Ｒｏｔａｄｉｓｋ（登録商標）、Ｔｕｒｂｏｈａｌｅｒ（登録商標）または例えば欧州特許公開第０５０５３２１号に記載されているような吸入器）。
【００３２】
エアロゾルをベースにした製剤の場合、好ましい組成物は、
本発明の化合物  ２４ｍｇ／キャニスター
レシチン、ＮＦ  Ｌｉｑ．Ｃｏｎｃ．  １．２ｍｇ／キャニスター
トリクロロフルオロメタン、ＮＦ  ４．０２５ｇ／キャニスター
ジクロロジフルオロメタン、ＮＦ  １２．１５ｇ／キャニスター、である。
【００３３】
本発明の化合物は、本化合物が有用である疾患または状態の治療／予防／抑制または改善に使用される他の薬剤と組み合わせて使用可能である。このような他の薬剤は、本発明の化合物と同時にまたは連続して、１つの経路でかつそのために通常使用される量で投与し得る。本発明の化合物を１以上のその他の薬剤と同時に使用する場合には、本発明の化合物に加えてこのようなその他の薬剤を含有する薬学的組成物が好ましい。したがって、本発明の薬学的組成物には、本発明の化合物に加えて１以上のその他の活性成分をも含有する組成物が含まれる。
【００３４】
本発明の化合物を用いた併用療法のための適した治療薬は、（１）コルチコステロイド、例えば、フルチカゾンまたはブデソニド、（２）β２−アドレナリン受容体作動薬、例えばサルメテロールまたはフォルメテロール、（３）ロイコトリエン調節薬、例えば、モンテルカストまたはプランルカスト、（４）抗コリン薬、例えば、チオトロピウム臭化物などの選択的ムスカリン−３（Ｍ３）受容体拮抗薬、（５）二重ムスカリン−３（Ｍ３）受容体拮抗薬／β２−アドレナリン受容体作動薬、例えばＧＳＫ９６１０８１、（６）ホスホジエステラーゼ−ＩＶ（ＰＤＥ−ＩＶ）阻害剤、例えばロフルミラストまたはシロミラスト、（７）鎮咳薬、例えば、コデインまたはデキストラモルファン、（８）非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、イブプロフェンまたはケトプロフェン、（９）粘液溶解薬、例えば、Ｎ−アセチルシステインまたはフドステイン、（１０）去痰薬／粘液調節薬、例えば、アンブロキソール、高張液（例えば生理食塩水またはマンニトール）または界面活性剤、（１１）ペプチド粘液溶解薬、例えば、組み換えヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ（ドルナーゼ−アルファおよびｒｈＤＮａｓｅ）またはヘリジシン（ｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）、ならびに（１２）抗生物質、例えば、アジスロマイシン、トブラマイシンおよびアズトレオナムを含む。
【００３５】
本発明を以下の実施例においてさらに説明する。
【００３６】
Ａ．本発明の化合物の合成
スキーム１から３で示す経路は、化合物（ＩＡ）を合成するための代替経路を表している。化合物（１）を形成する、２−ブロモピリジン−５−カルボキサルデヒドと、（３−トリフルオロメチルフェニル）尿素と、アセト酢酸メチルなどのアセト酢酸アルキルまたはアリールとの間のビギネリ反応は、ポリリン酸などの触媒存在下において実行可能である。臭素原子のシアノ基への置換は、例えば銅触媒を用いたアセトンシアノヒドリンなどの、様々な標準シアノ化反応条件を用いて成し得る。（２）のエナンチオマーにおけるキラル分離は、キラルＨＰＬＣを用いて成し得る。その後、臭素またはその他の標準臭素化試薬を用いて（Ｒ）−エナンチオマー（３ａ）の臭素化を提供し得る（４）（スキーム１）。
【００３７】
【化６】
2012516316.tif 000008
【００３８】
スキーム１
【００３９】
あるいは、ポリリン酸などの触媒存在下において、５−ホルミルピリジン−２−カルボン酸のエステルと、アセト酢酸アルキルまたはアリールと、（３−トリフルオロメチルフェニル）尿素との間のビギネリ反応を使用可能である（スキーム２）。具体的には、メタノールの存在下における２−ブロモピリジン−５−カルボキサルデヒドのカルボニル化によって調製可能なメチル５−ホルミルピリジン−２−カルボキシレート（５）を、アセト酢酸メチルおよび（３−トリフルオロメチルフェニル）尿素と反応させて、化合物（６）を得た。カルボン酸（７）への変換は、例えば、水酸化ナトリウム水溶液などの標準加水分解条件を用いることで成し得る。（＋）−シンコニンを用いた（７）の処理による塩のジアステレオマー混合物の形成、およびエタノールからの（Ｒ）−エナンチオマーの優先的結晶化によって、酸で処理した後に（８）を単離することが可能である。アミド（９）を形成するために、反応は標準条件を用いて、例えば酸（８）をカルボニルジイミダゾールで処理した後にアンモニアと反応させることで成し得る。（１０）を得るための（８）の臭素化は、例えば、臭素またはＮ−ブロモスクシンイミドを用いて成し得る。あるいは、中間体（９）は中間体（３）に変換可能で、それは脱水することで代替経路（スキーム１）において有用である。
【００４０】
【化７】
2012516316.tif 000009
【００４１】
スキーム２
【００４２】
スキーム３は両方の化合物（４）および（１０）を化合物（ＩＡ）に変換し得ることを示している。ビス−（３−アミノプロピル）アミンとの二量化反応は、例えば、トリエチルアミン、ＮａＨＣＯ３、ＤＩＰＥＡなどの適した塩基を使用することによる利益を得て、かつビス−（３−アミノプロピル）アミンは保護された形態で使用され得る。すなわち、第２級アミンはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどによって保護され、保護基は後半に除去される。（１０）のビス−（３−アミノプロピル）アミンとの反応からの生成物である化合物（１１）は、脱水されて（ＩＡ）をもたらし、その一方で、（４）はビス−（３−アミノプロピル）アミンと直接反応して（ＩＡ）と成る。化合物（ＩＡ）はクロマトグフラフィーによって遊離塩基として得られ、その後、適した酸性化合物と処理することによって塩に変換可能である。あるいは、（ＩＡ）は、例えば、（４）の粗二量化反応から、４−トルエンスルホン酸塩などの適した塩として結晶化することで得ることが可能である。全ての反応は使用される試薬と適合する様々な溶媒中で行うことが可能であり、かつ様々な適した温度、通常０−８０℃において実行可能である。
【００４３】
【化８】
2012516316.tif 000010
【００４４】
スキーム３
【００４５】
一般的方法
反応は、特記しない限り、不活性雰囲気下では実行されなかった。生成物をシリカによるカラムクロマトグラフィーで生成する場合、「シリカ」は、０．０３５から０．０７０ｍｍ（２３０から４００メッシュ）のクロマトグラフィー用シリカゲルを指し、カラム溶離を加速するために最大で１０ｐ．ｓ．ｉの窒素圧を加えた。分離をＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｓｉカートリッジを用いて行う場合、平均粒子サイズが３５−７０μｍ（２３０−４００メッシュ）であるシリカを含むプレパックポリプロピレン（ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標））カラムを備えた自動化クロマトグラフィー装置を使用した（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）。全ての溶媒および市販の試薬は、受け入れたものをそのまま使用した。
【００４６】
分析的ＬＣ−ＭＳ法
ＬＣ−ＭＳ法１
Ｃ１８−逆相カラム（粒子径が３μｍの３０×４．６ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ）を備えたＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＭＤ、Ａ：水＋０．１％ギ酸、Ｂ：メタノール＋０．１％ギ酸）とで溶離。勾配：
2012516316.tif 000011
【００４７】
検出−ＭＳ、ＥＬＳ、ＵＶ（インラインＷａｔｅｒｓ  ９９６  ＤＡＤ検出器を備えたＥＳＩ源に対して２００μｌのスプリット）
ＭＳイオン化法−エレクトロスプレー（陽および陰イオン）
【００４８】
ＬＣ−ＭＳ法２
Ｃ１８−逆相カラム（粒子径が３μｍの３０×４．６ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ）を備えたＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＭＤ、Ａ：水＋０．１％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸とで溶離。勾配：
2012516316.tif 000012
【００４９】
検出−ＭＳ、ＥＬＳ、ＵＶ
ＭＳイオン化法−エレクトロスプレー（陽および陰イオン）
【００５０】
ＬＣ−ＭＳ法３
Ｃ１８−逆相カラム（粒子径が５μｍの１００×３．０ｍｍ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｃｌｉｐｅｕｓ）を備えたＷａｔｅｒｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏ、Ａ：水＋０．１％ギ酸、Ｂ：メタノール＋０．１％ギ酸とで溶離。勾配：
2012516316.tif 000013
【００５１】
検出−ＭＳ、ＥＬＳ、ＵＶ（インラインＵＶ検出器を備えたＭＳに対して１００μｌのスプリット）
ＭＳイオン化法−エレクトロスプレー（陽および陰イオン）
【００５２】
ＬＣ−ＭＳ法４
Ｃ１８−逆相カラム（粒子径が１．７μｍの１００×２．１ｍｍ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ）を備えて４０℃に維持したＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ２０００、Ａ：水＋０．１％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸とで溶離。勾配：
2012516316.tif 000014
【００５３】
検出−ＭＳ、ＵＶ、ＰＤＡ
ＭＳイオン化法−エレクトロスプレー（陽／陰イオン）
【００５４】
キラルＬＣ法
キラルＬＣ法１（分析用）
ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＣ  ５μｍ−２５０×４．６ｍｍ、１０％ｎ−ヘプタン、９０％ＥｔＯＨ、０．１％ジエチルアミンで溶離。流速＝０．７ｍｌ／分。ＵＶ検出２５０ｎｍ。
【００５５】
キラルＬＣ法２（調製用）
ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＣ  ２０μｍ−２５０×７６ｍｍ、３０％ｎ−ヘプタン、７０％ＥｔＯＡｃ、０．１％ジエチルアミンで溶離。流速＝２７０ｍｌ／分。ＵＶ検出３３０ｎｍ。
【００５６】
キラルＬＣ法３（分析用）
ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＡ  ５μｍ−２５０×４．６ｍｍ、２０％ＩＰＡ、８０％ｎ−ヘプタン、０．１％ＴＦＡで溶離。流速＝１ｍｌ／分。ＵＶ検出２５４ｎｍ。
【００５７】
融点の決定
融点はＢｕｃｈｉ  Ｂ−５４０装置を使用して決定した。
【００５８】
旋光度
［α］２５Ｄ値は、２５ｍｍセルおよび光源としてのナトリウムランプを使用して、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｌｔｄ  ＡＡ−１０Ｒ自動旋光計から得た。試料を約１％ｗ／ｖのメタノール中で走査した。測定は２つ組で行った。
【００５９】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＤＳＣ測定を、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＴＳ０８０１ＲＯ試料ロボットおよび自動試料カルーセルを備えたＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣ８２３ｅにおいて行った。試料を４０μｌアルミニウムパン中で調製し、試料の蓋にロボットで自動的に穴を開け、分析を１０℃／分で３０から２５０℃の間で行った。通常、分析のために１−３ｍｇを使用し、実験は５０ｍｌ／分の乾燥窒素でパージしながら行った。機器は認定インジウムを用いて、エネルギーおよび温度を校正した。
【００６０】
粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）
システム１
データは、Ｃｕ  Ｋα放射（４０ｋＶ、４０ｍＡ）、θ−θゴニオメータ、発散Ｖ２０および受光スリット、グラファイト二次モノクロメータならびにシンチレーションカウンターを用いて、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００回折計を使用して収集した。機器は認定コランダム標準（ＮＩＳＴ  １９７６）を使用して確認を行った。データ収集のために用いたソフトウェアは、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ２．３．１であり、データをＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ１１．０．０．３を用いて分析および表示した。試料を得られた粉末を使用して、平板検体として周囲条件下で走査させた。試料を、研磨された、ゼロバックグラウンド（５１０）シリコンウェハー中に切り込まれたくぼみに、丁寧に充填した。試料は、分析の間、それ自体を平面で回転させた。データは、０．０５°２θのステップサイズおよび４秒／ステップの収集時間を用いて、２から４２°２θの間で収集した。
【００６１】
システム２
データは、Ｃｕ  Ｋα放射（４０ｋＶ、４０ｍＡ）、θ−２θゴニオメータおよびＧｅモノクロメータを備えたＬｙｎｘｅｙｅ検出器を用いて、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８回折計を使用して収集した。機器は認定コランダム標準（ＮＩＳＴ  １９７６）を使用して確認を行った。データ収集のために用いたソフトウェアは、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ２．５．０であり、データをＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ１１．０．０．２またはｖ１３．０．０．２を用いて分析および表示した。試料を得られた粉末を使用して、平板検体として周囲条件下で走査させた。データは、０．０５°２θのステップサイズおよび０．５秒／ステップの収集時間を用いて、２から４２°２θの間で収集した。
【００６２】
動的蒸気収着（ＤＶＳ）
ＤＶＳ分析は、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ＳＭＳ）のＤＶＳ−Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｒで行った。機器は、ＳＭＳ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＶＳ−Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖ１．０．０．３０）によって制御した。データの分析は、ＤＶＳ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ（ｖ６．０．０．７）と共にＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２００７を用いて行った。試料温度を２５℃に維持し、試料湿度は２００ｍｌ／分の全流速で湿潤および乾燥窒素の混合流によって得た。相対湿度は、試料の近くに配置した校正ロトロニックプローブ（ダイナミックレンジ１−１００％相対湿度（ＲＨ））を使用して測定した。％ＲＨに応じた試料の重量変化は、微量てんびん（精度±０．００５ｍｇ）によって常時測定した。その後、２０ｍｇの試料を、周囲条件下で風袋を計られたステンレス製メッシュバスケットに入れた。試料を４０％ＲＨかつ２５℃（一般的な室内条件）で出し入れし、表１に示すパラメータを使用して試料を２サイクルにわたって段階的ＤＶＳ形態にさらした。ＤＶＳ等温線を本データから計算した。
【００６３】
【表１】
2012516316.tif 000015
【００６４】
ＤＶＳ実験の方法パラメータ
【００６５】
単結晶Ｘ線
単結晶Ｘ線分析は、グラファイトモノクロメータを用いたＭｏＫからの０．７１０７３オングストロームのＸ線を用いて、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｎｏｎｉｕｓ  Ｒｏｐｅｒ  ＣＣＤカメラを備えたＢｒｕｋｅｒ−Ｎｏｎｉｕｓ  ＦＲ５９１回転アノード装置で行った。データは、１２０Ｋの温度で収集した。データ収集にはＣＯＬＬＥＣＴ（Ｈｏｏｆｔ，Ｒ．Ｗ．Ｗ．，１９９８）を用い、格子の精密化はＤＥＮＺＯ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ＆Ｍｉｎｏｒ，１９９７）およびＣＯＬＬＥＣＴ（Ｈｏｏｆｔ，Ｒ．Ｗ．Ｗ．，１９９８）で行った。構造解析および精密化はＳＨＥＬＸ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、２００８）で行った。
【００６６】
ＮＭＲ分光計
ＮＭＲは、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  Ｉｎｏｖａ  ４００ＭＨｚ分光計、またはＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＲＸ  ４００ＭＨｚ分光計のどちらかで走査した。
【００６７】
本実験項で使用する略語：
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ＝ジ−イソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＲＴ＝室温
Ｒｔ＝保持時間
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
【００６８】
中間体１
【００６９】
【化９】
2012516316.tif 000016
【００７０】
２−ブロモピリジン−５−カルボキサルデヒド（１７０．０ｇ、９１３ｍｍｏｌ）、（３−トリフルオロメチルフェニル）−尿素（１８５ｇ、９０６ｍｍｏｌ）および、アセト酢酸メチル（１０６ｇ、９１３ｍｍｏｌ）を、ポリリン酸（５００ｇ）／乾燥ＴＨＦ（１５００ｍｌ）の撹拌懸濁液に加え、反応は５時間還流しながら撹拌して行った。溶液を室温まで冷却し、水（２．５ｌ）に注いだ。生成物を酢酸エチル中に抽出し、水層を酢酸エチルで再抽出した。合わせた有機層を水、その後食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させて橙色ガムを得た。これを最小量のジエチルエーテルに溶解して放置することで結晶化させた。生成物は白色固体であった。
収量：２８３.３ｇ（６６％）
ＬＣ−ＭＳ（方法１）：Ｒｔ＝３．８３分、ｍ／ｚ＝４７０／４７２［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７１】
中間体２
【００７２】
【化１０】
2012516316.tif 000017
【００７３】
三つ口フラスコに、中間体１（１２８．０ｇ、２７１ｍｍｏｌ）、ヨウ化第一銅（５８．２ｇ、３１０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１２５０ｍｌ）を充填した。反応混合物を内部反応温度が５０℃に到達するまで撹拌しながら加熱した。その後、アセトンシアノヒドリン（４５ｍｌ、１７８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（８３．７ｍｌ、１７８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１５０℃まで加熱させて６時間撹拌した。溶液を室温まで冷却し、ＤＣＭ（２．５ｌ）で希釈した。溶液を水（×３）および食塩水（×１）で洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過および高真空下で溶媒を除去した後、粗物質をジエチルエーテルで溶離するシリカゲル（２３０−４００メッシュ）のフラッシュクロマトグラフィーで精製し、白色固体の標題化合物を得た。
収量：７４．２ｇ（６５％）
ＬＣ−ＭＳ（方法１）：Ｒｔ＝４．０６分、ｍ／ｚ＝４１７［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７４】
中間体３ａ（Ｒ）−エナンチオマー
【００７５】
【化１１】
2012516316.tif 000018
【００７６】
方法１
中間体２（５３．１ｇ）を、キラルＬＣ法２を用いて２つのエナンチオマーに分離した。
【００７７】
中間体３ａ（Ｒ）−エナンチオマー［立体化学は臭素化生成物（中間体４）のＸ線結晶学によって決定した］
回収＝２６．０ｇ（４９％）
ＨＰＬＣ（キラルＬＣ法１）：５．８分（＞９８．６％  ｅｅ）
旋光度［α］２５Ｄ−１２．８°
中間体３ｂ（Ｓ）−エナンチオマーも回収
回収＝２３．８ｇ（４５％）
ＨＰＬＣ（キラルＬＣ法１）：１０．０分（＞９９．５％  ｅｅ）
旋光度［α］２５Ｄ＋１０．６°
【００７８】
方法２
中間体９（１４０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．５ｍｌ）に溶解し、ＤＭＦ（０．０５ｍｌ、触媒）、続いてオキシ塩化リン（０．３ｍｌ、３．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３日間室温で放置し、その後、水で急冷し、生成物を酢酸エチル中に抽出した。有機層を水、その後食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過して取り除き、溶液を蒸発乾燥させて褐色フォームを得た。これを５０−１００％酢酸エチル／ペンタンを溶離剤として用いて、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｓｉカートリッジで精製した。適切な画分を合わせて淡色のフォームの要求生成物を得た。
収量：１９ｍｇ（１４％）
ＬＣ−ＭＳ（方法１）：Ｒｔ＝４．０４分、ｍ／ｚ＝４１７．２９［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７９】
旋光度［α］２５Ｄ−１０．０°。立体化学は方法１によって調製された中間体３ａとの比較によって（Ｒ）であることを確認した。
【００８０】
中間体４
【００８１】
【化１２】
2012516316.tif 000019
【００８２】
臭素（４１．６ｇ、２６０ｍｍｏｌ）／クロロホルム（２００ｍｌ）の溶液を、固体炭酸カリウム（７４．０ｇ、５３０ｍｍｏｌ）を含む中間体３ａ（１０４ｇ、２５０ｍｍｏｌ）／クロロホルム（１ｌ）の撹拌溶液に３０分かけて滴下して加えた。１時間撹拌した後、懸濁液をろ過し、溶媒を減圧下で除去し、淡黄色フォームを得た。これを最小量の酢酸エチルに溶解してジエチルエーテルで希釈した。生成物は白色固体として結晶化し、ろ過して１０％酢酸エチル／ジエチルエーテルで洗浄して、真空乾燥させた。
収量＝５４ｇ（４４％）。２回目の収量分において、最大で８５％の収率をもたらした。
ＬＣ−ＭＳ（方法２）：Ｒｔ＝４．１９分、ｍ／ｚ＝４９５／４９７［Ｍ＋Ｈ］＋
【００８３】
立体化学は、空間群Ｐ１三斜晶系、Ｒファクター０．０５１８、ＧＯＦ  １．０３８、フラックパラメータ（Ｆｌａｃｋ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）０．０４２（ｓｄ±０．００７）およびホフトパラメータ（Ｈｏｏｆｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）０．０８３（ｓｄ±０．００７）を用いた単結晶Ｘ線結晶学によって、（Ｒ）であることを確認した。
【００８４】
中間体５
【００８５】
【化１３】
2012516316.tif 000020
【００８６】
２−ブロモピリジン−５−カルボキサルデヒド（１．８６ｇ、１００ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍｌ）とＤＭＦ（１０ｍｌ）との混合物中で溶解し、トリエチルアミン（２．７５ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液に酢酸パラジウム（ＩＩ）（５６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）および１，１−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン（０．２８ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一酸化炭素ガスの通気によるバブリングで脱気した後、バルーンを用いて大気圧にて一酸化炭素雰囲気下で維持した。混合物を４８時間５５℃で加熱し、その後、水に注ぎ酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を水（×２）および食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過して取り除き、溶液を蒸発乾燥させて黒色固体を得た。これを０−４０％酢酸エチル／ＤＣＭを溶離剤として用いて、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｓｉカートリッジによるクロマトグラフィーで精製した。適切な画分を合わせて淡桃色固体の要求生成物を得た。
収量＝７５０ｍｇ（４５％）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ＝４．０６（ｓ、３Ｈ）、８．３２（ｍ、２Ｈ）、９．２０（ｍ、１Ｈ）、１０．２２（ｓ、１Ｈ）
【００８７】
中間体６
【００８８】
【化１４】
2012516316.tif 000021
【００８９】
ポリリン酸（２．９ｇ）／ＴＨＦ（２０ｍｌ）の溶液に、中間体５（０．８５ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）、（３−トリフルオロメチルフェニル）尿素（１．０５ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）およびアセト酢酸メチル（０．６０ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６時間還流下で加熱し、その後、室温まで冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残留物を酢酸エチルと水との間で分離させた。有機層を分離して水、その後食塩水で洗浄し、最後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過して取り除き、ろ液を蒸発乾燥させて淡黄色フォームを得た。精製は酢酸エチルを溶離剤として用いて、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｓｉカートリッジによるクロマトグラフィーで成し得た。適切な画分を合わせて無色フォームの要求生成物を得た。
収量＝１．２ｇ（５３％）
ＬＣ−ＭＳ（方法１）：Ｒｔ＝４．０２分、ｍ／ｚ＝４５０．３５［Ｍ＋Ｈ］＋
【００９０】
中間体７
【００９１】
【化１５】
2012516316.tif 000022
【００９２】
中間体６（１．２ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）／ＴＨＦ（３０ｍｌ）の溶液に、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（３．０ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で４時間撹拌した。溶媒を半量まで減少させ、１Ｍの塩酸溶液（１２ｍｌ）を加えた。溶液をＤＣＭ（３×５０ｍｌ）で抽出し、合わせた抽出物を水、その後食塩水で洗浄し、最後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過して、ろ液を蒸発乾燥させて無色フォームを得た。
収量＝１．１１ｇ（９５％）
ＬＣ−ＭＳ（方法１）：Ｒｔ＝３．９０分、ｍ／ｚ＝４３６．３３［Ｍ＋Ｈ］＋
【００９３】
中間体８
【００９４】
【化１６】
2012516316.tif 000023
【００９５】
中間体７（１．１ｇ、２．５２ｍｍｏｌ）および（＋）−シンコニン（７４０ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を温エタノール（６．５ｍｌ）に溶解した。溶液を一晩かけて室温まで冷却させて、結晶性固体をろ過した（０．７８ｇ、理論上８４％）。この塩を１ＮのＨＣｌ（２０ｍｌ）中で懸濁させて、酢酸エチル（３×２０ｍｌ）中に抽出した。合わせた抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過および蒸発させて白色フォームを得た。
収量＝３７０ｍｇ（６７％）
ＨＰＬＣ（キラルＬＣ法３）：Ｒｔ＝２４．５分。これはラセミ混合物（Ｒｔ＝１５分および２４．５分）と比較して、２番目の溶離エナンチオマーに相当した。
【００９６】
立体化学は中間体９を介した中間体３ａへの転換によって確認した。
【００９７】
中間体９
【００９８】
【化１７】
2012516316.tif 000024
【００９９】
中間体８（０．９２ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解し、１，１−カルボニルジイミダゾール（０．６９ｇ、４．２２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌させながら放置し、その後、３３％水性アンモニア溶液（１０ｍｌ）を加えて、混合物をさらに３０分間撹拌した。この後、水（２５ｍｌ）を加えて、生成物を酢酸エチル中に抽出した。有機相を水（×２）、その後食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過して取り除き、溶液を蒸発乾燥させて無色フォームを得た。
収量＝０．８４ｇ（９３％）
ＬＣ−ＭＳ（方法２）：Ｒｔ＝３．９０分、ｍ／ｚ＝４３５［Ｍ＋Ｈ］＋
立体化学は中間体３ａに変換することによって確認した。
【０１００】
中間体１０
【０１０１】
【化１８】
2012516316.tif 000025
【０１０２】
中間体９（０．８４ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）をクロロホルムに溶解した。臭素（０．４８ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）／クロロホルム（２ｍｌ）の溶液を、１０分かけて撹拌懸濁液に加え、その後混合物を室温で３０分間撹拌させながら放置した。溶媒を減圧下で蒸発させて除去し、残留物を酢酸エチルと１０％水性炭酸カリウム溶液との間に分配させた。有機相を水、その後食塩水で洗浄し、最後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過して取り除き、ろ液を蒸発乾燥させた。
収量＝０．９３ｇ（９４％）
ＬＣ−ＭＳ（方法２）：Ｒｔ＝３．６１分、ｍ／ｚ＝５１３／５１５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１０３】
中間体１１
【０１０４】
【化１９】
2012516316.tif 000026
【０１０５】
中間体１０（０．９３ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍｌ）中に溶解し、トリエチルアミン（１．０ｍｌ、７．２４ｍｍｏｌ）、続いてビス−（３−アミノプロピル）アミン（０．２５ｍｌ、１．８１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間放置し、その後、溶媒を除去し、残留物を、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｓｉカートリッジおよび０−１５％の２Ｍアンモニア／メタノール／ＤＣＭを溶離剤として用いて、クロマトグラフィーで精製した。適切な画分を合わせて淡色のフォームの要求生成物を得た。
収量：４２０ｍｇ、（５０％）
ＬＣ−ＭＳ（方法２）：Ｒｔ＝２．３０分、ｍ／ｚ＝９３２．３４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１０６】
化合物（ＩＡ）および塩１−５
【０１０７】
【化２０】
2012516316.tif 000027
【０１０８】
方法１
中間体４（５４．０ｇ、１０９ｍｍｏｌ）／ＴＨＦ（６５０ｍｌ）の溶液に、トリエチルアミン（４３．７ｍｌ、４３６ｍｍｏｌ）を加えて、溶液を窒素下で２５℃にて撹拌した。ビス−（３−アミノプロピル）アミン（１４．３ｇ、２．２８ｍｌ、１０９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し、溶液の一部に加えた。その後、混合物を２５℃で２２時間撹拌した。反応溶液を約１５０ｍｌの量まで減少させ、酢酸エチル（１ｌ）と水（５００ｍｌ）との間に分配させた。層を分離して、水層を酢酸エチル（２００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機層を水（５００ｍｌ）および食塩水（５００ｍｌ）で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶液をろ過して、ろ液を蒸発乾燥させて５３．０ｇの淡色のフォームを得た。フォームを１０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）に溶解し、４−トルエンスルホン酸一水和物（１１．０ｇ、５８ｍｍｏｌ）／１０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）の溶液を加えた。透明な溶液を２時間撹拌し、その間にトシラート塩（塩１）が無色結晶性固体として沈殿した。その後、これをろ過して取り除き、１０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃでよく洗浄し、３ｍｂａｒで４５℃にて乾燥させた。
収量＝３７．３５ｇ（６４％）
【０１０９】
塩（１５ｇ）をＭｅＯＨから再結晶化させて白色結晶性生成物をろ過し、少し冷却したＭｅＯＨで洗浄して真空で４５℃にて乾燥させた。
回収＝１０ｇ
ｍ．ｐ．＝１８８−１９０℃
ＬＣ−ＭＳ（方法３）：Ｒｔ＝７．４６分、ｍ／ｚ＝８９６．３９［Ｍ＋Ｈ］＋およびＲｔ＝３．２６、ｍ／ｚ＝１７１．１０［ＴｓＯ］−
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ＝１．５９（ｍ、４Ｈ）、２．９６（ｓ、３Ｈ）、２．６５（ｍ、４Ｈ）、３．０９−３．２７（ｍ、４Ｈ）、３．７８（ｍ、４Ｈ）、５．５５（ｄ、２Ｈ）、７．０６（ｍ、２Ｈ）、７．４２（ｍ、２Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、６Ｈ）、７．９２（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、７．９６−８.０９（ｍ、４Ｈ）、８．１３（ｄｄ、２Ｈ）、８．２０（ｄ、２Ｈ）、８．８４（ｄ、２Ｈ）
旋光度［α］２５Ｄ−５８．３°
【０１１０】
立体化学は中間体４のＸ線結晶構造によって（Ｒ、Ｒ）であることを確認した。
吸湿性
脱着（質量変化（％）−参照：２５℃および８０％ＲＨにて）＝３．６
ＤＳＣ分析−単一融解吸熱は約１８５℃で開始。
ＸＲＰＤ（システム１）。化合物ＩＡの結晶性４−メチルベンゼンスルホン酸塩を特徴付けるＸＲＰＤ回折パターンの（最も高い相対強度を有するものと定義される）８つの主要なピークは、角度２θにおいて、６．１５と６．２５との間、１８．５９と１８．６９との間、１７．５９と１７．６９との間、１２．３０と１２．４０との間、１６．７０と１６．８０との間、２４．９０と２５．００との間、２１．６７と２１．７７との間、および１３．５５と１３．６５との間にある。本評価において、ピークは（角度２θ）において、６．２０、１８．６４、１７．６４、１２．３５、１６．７５、２４．９５、２１．７２および１３．６０にあった。
【０１１１】
方法２
【０１１２】
【化２１】
2012516316.tif 000028
【０１１３】
中間体１１（４２０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解し、溶液を氷浴で０−５℃まで冷却した。オキシ塩化リン（０．２ｍｌ、２．１４ｍｍｏｌ）を滴下して加えて、溶液を１５分間０−５℃で撹拌させた。その後、溶液を氷と水との混合物中に注ぎ、室温まで温めた。ｐＨを希釈炭酸カリウム溶液で８−９に調節し、固体生成物をろ過で取り除き、水でよく洗浄して真空乾燥させた。
収量＝１８５ｍｇ（４６％）
ＬＣ−ＭＳ（方法２）：Ｒｔ＝２．５１分、ｍ／ｚ＝８９６．５３［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１１４】
本反応の生成物（１８５ｍｇ）を１０％メタノール／酢酸エチル（２ｍｌ）に溶解し、４−トルエンスルホン酸（４０ｍｇ、１．０２等量）を加えた。溶液を一晩室温で撹拌し、沈殿した塩をろ過して取り除き、少量の１０％メタノール／酢酸エチルで洗浄して５０℃で真空乾燥させた。
収量＝９５ｍｇ（４４％）
ＬＣ−ＭＳ（方法４）：Ｒｔ＝３．５６分、ｍ／ｚ＝８９６．３５
旋光度［α］２５Ｄ−５５．３°
立体化学は方法１で調製した化合物ＩＡとの比較によって（Ｒ、Ｒ）であることを確認した。
【０１１５】
塩２−５
酸（１．１等量）／溶媒（０．５ｍｌ）の溶液／懸濁液に、化合物ＩＡ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）／同じ溶媒（１ｍｌ）の溶液を撹拌しながら加えた。混合物を一晩室温で撹拌した。塩をろ過し、少量の冷却溶媒で洗浄して真空乾燥させた。
2012516316.tif 000029
【０１１６】
＊脱着（質量変化（％）−参照：８０％ＲＨにて）
【０１１７】
塩２
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ＝１．５９（ｍ、４Ｈ）、２．６５（ｍ、４Ｈ）、３．０９−３．２７（ｍ、４Ｈ）、３．７８（ｍ、４Ｈ）、５．５５（ｄ、２Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、６Ｈ）、７．９２（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、７．９６−８.０９（ｍ、４Ｈ）、８．１３（ｄｄ、２Ｈ）、８．２０（ｄ、２Ｈ）、８．８４（ｄ、２Ｈ）
ＤＳＣ−約２４０℃で分解する前に融解しなかった。
【０１１８】
ＸＲＰＤ（システム２）−化合物ＩＡの結晶性硫化水素塩を特徴付けるＸＲＰＤ回折パターンの（最も高い相対強度を有するものと定義される）８つの主要なピークは、角度２θにおいて、６．３８と６．４８との間、１７．７８と１７．８８との間、１３．９５と１４．０５との間、１９．３６と１９．４６との間、１７．２９と１７．３９との間、１２．８１と１２．９１との間、２０．１８と２０．２８との間、および２２．０３と２２．１３との間にある。本評価において、ピークは（角度２θ）において、６．４３、１７．８３、１４．００、１９．４１、１７．３４、１２．８６、２０．２３および２２．０８にあった。
【０１１９】
塩３
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ＝１．５９（ｍ、４Ｈ）、２．６５（ｍ、４Ｈ）、３．０９−３．２７（ｍ、４Ｈ）、３．７８（ｍ、４Ｈ）、５．５５（ｄ、２Ｈ）、７．２３−７．３０（ｍ、３Ｈ）、７．５２−７．５７（ｍ、２Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、６Ｈ）、７．９２（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、７．９６−８．０９（ｍ、４Ｈ）、８．１３（ｄｄ、２Ｈ）、８．２０（ｄ、２Ｈ）、８．８４（ｄ、２Ｈ）
ＤＳＣ−単一融解吸熱は約１６０℃で開始。
【０１２０】
ＸＲＰＤ（システム２）−化合物ＩＡの結晶性ベンゼンスルホン酸塩を特徴付けるＸＲＰＤ回折パターンの（最も高い相対強度を有するものと定義される）８つの主要なピークは、角度２θにおいて、６．２３と６．３３との間、１７．６３と１７．７３との間、２１．６５と２１．７５との間、１７．０１と１７．１１との間、１８．９４と１９．０４との間、２２．１０と２２．２０との間、１９．５９と１９．６９との間、および２５．２０と２５．３０との間にある。本評価において、ピークは（角度２θ）において、６．２８、１７．６８、２１．７０、１７．０６、１８．９９、２２．１５、１９．６４および２５．２５にあった。
【０１２１】
塩４
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ＝１．５９（ｍ、４Ｈ）、２．６５（ｍ、４Ｈ）、３．０９−３．２７（ｍ、４Ｈ）、３．７８（ｍ、４Ｈ）、５．５５（ｄ、２Ｈ）、６．４３（ｄ、１Ｈ）、６．５９（ｄｄ、１Ｈ）、７．０９（ｄ、１Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、６Ｈ）、７．９２（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、７．９６−８．０９（ｍ、４Ｈ）、８．１３（ｄｄ、２Ｈ）、８．２０（ｄ、２Ｈ）、８．８４（ｄ、２Ｈ）
ＤＳＣ−単一融解吸熱は約１７８℃で開始。
【０１２２】
ＸＲＰＤ（システム２）−化合物ＩＡの結晶性２，５−ジヒドロキシ安息香酸塩を特徴付けるＸＲＰＤ回折パターンの（最も高い相対強度を有するものと定義される）８つの主要なピークは、角度２θにおいて、２２．７０と２２．８０との間、１１．２６と１１．３６との間、１６．４６と１６．５６との間、２１．７４と２１．８４との間、２３．１６と２３．２６との間、１８．６３と１８．７３との間、１６．９６と１７．０６との間、および２０．６４と２０．７４との間にある。本評価において、ピークは（角度２θ）において、２２．７５、１１．３１、１６．５１、２１．７９、２３．２１、１８．６８、１７．０１および２０．６９にあった。
【０１２３】
塩５
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ＝１．５９（ｍ、４Ｈ）、２．６５（ｍ、４Ｈ）、３．０９−３．２７（ｍ、４Ｈ）、３．７８（ｍ、４Ｈ）、５．５５（ｄ、２Ｈ）、６．４２（ｓ、２Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、６Ｈ）、７．９２（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、７．９６−８．０９（ｍ、４Ｈ）、８．１３（ｄｄ、２Ｈ）、８．２０（ｄ、２Ｈ）、８．８４（ｄ、２Ｈ）
ＤＳＣ−単一／二重融解吸熱は約１７６℃で開始。
【０１２４】
ＸＲＰＤ（システム２）−化合物ＩＡの結晶性フマル酸塩を特徴付けるＸＲＰＤ回折パターンの（最も高い相対強度を有するものと定義される）８つの主要なピークは、角度２θにおいて、２３．６８と２３．７８との間、２２．５１と２２．６１との間、５．７６と５．８６との間、１１．７５と１１．８５との間、１０．１０と１０．２０との間、２０．３２と２０．４２との間、２１．１７と２１，２７との間、および２４．６４と２４．７４との間にある。本評価において、ピークは（角度２θ）において、２３．７３、２２．５６、５．８１、１１．８０、１０．１５、２０．３７、２１．２２および２４．６９にあった。
【０１２５】
Ｂ．生物学的アッセイ
国際公開第２００７／１２９０６０号の実施例１８における化合物は構造式（ＩＩ）を有する。
【０１２６】
【化２２】
2012516316.tif 000030
【０１２７】
（ＩＩ）にはシアノ置換フェニル環が存在する一方、（Ｉ）にはシアノ置換ピリジン環が存在する点において、化合物（ＩＩ）は本発明の化合物（Ｉ）と構造が異なる。
【０１２８】
化合物（ＩＩ）は国際公開第２００７／１２９０６０号の実施例１８にあるように調製し、以下のアッセイにおいて本発明の化合物（ＩＡ）と共に試験した。両化合物を遊離塩基として試験した。
【０１２９】
酵素阻害アッセイ
蛍光性ペプチド基質を使用
アッセイは、９６ウェルプレート中で１００μｌの全アッセイ容量で実施した。酵素（ヒト白血球エラスターゼ、Ｓｉｇｍａ  Ｅ８１４０）の最終濃度は０．０００３６単位／ウェルであった。ペプチド基質（ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌＡＭＣ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＃３２４７４５）を１００μＭの最終濃度で使用した。ＤＭＳＯの最終濃度は、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．０００５％ｂｒｉｊ−３５）中で１％であった。
【０１３０】
酵素反応は酵素を加えることで開始した。酵素反応は室温で実施し、３０分後に５０μｌの大豆トリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−９００３）を５０μｇ／ウェルの最終濃度で加えて停止させた。蛍光は、３８０ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光フィルターを使用するＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。化合物の効力は、１０００ｎＭから０．０５１ｎＭの範囲の１０濃度の濃度系列から決定した。結果は２つの独立な実験の平均値であり、それぞれ２つ組で実施した。
【０１３１】
結果は２つの独立な実験の平均値であり、それぞれ２つ組で実施した。
【０１３２】
上記のアッセイにおける化合物（ＩＡ）および（ＩＩ）のＩＣ５０は、それぞれ８．４ｎＭおよび２．１ｎＭであった。
【０１３３】
ＨＮＥはラットにおいて肺出血を誘発した
ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）のラットの肺への点滴注入は、急性肺障害を引き起こす。この損傷の程度は肺出血を測定することによって評価可能である。
【０１３４】
完全に隔離されて飼育され、かつ受入れ時に特定の微生物との非接触が保証された雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１７５−２２０ｇ）を、Ｈａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ．から入手した。動物の体重を測定し、処理群に無作為に割り当てた（１群当たり動物７−１２匹）。
【０１３５】
使用するビヒクルは１％ＤＭＳＯ／生理食塩水とした。阻害薬を１％ＤＭＳＯに溶解した後、０．９％生理食塩水を添加した。
【０１３６】
それぞれの研究において動物を使用して、様々な経路で肺に局所的に送達されるエラスターゼ阻害薬の効力を測定した。ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を投与する３０分から６時間前に投与量を与える場合には、吸入麻酔薬イソフルラン（４％）でラットを麻酔し、またはＨＮＥの投与前３０分未満に予備投与量を与える場合には、ｈｙｐｎｏｒｍ：ｈｙｐｎｏｖｅｌ：水（１．５：１：２、２．７ｍｌ／ｋｇで）でラットを最終的に麻酔し、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙミクロ噴霧器を使用した経口投による気管内（ｉ．ｔ．）、または鼻孔へ液体を滴下することによる鼻腔内（ｉ．ｎ．）のどちらかに投与した。動物はビヒクルまたは化合物を０．５ｍｌ／ｋｇの投与量で受けた。
【０１３７】
投与後に回復された動物は、最終的にｈｙｐｎｏｒｍ：ｈｙｐｎｏｖｅｌ：水（１．５：１：２、２．７ｍｌ／ｋｇ）で麻酔した。十分に麻酔されたら、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙミクロ噴霧器を使用して、ＨＮＥ（６００単位／ｍｌ）または無菌生理食塩水を１００μｌの量で経口気管点滴注入により投与した。動物を温度調節された箱内に温かく保持し、終末までの継続麻酔を確実にするのに要求されるような麻酔薬の投与量まで補充した。
【０１３８】
ＨＮＥ投与の１時間後に動物を犠牲にした（０．５ｍｌから１ｍｌのペントバルビタールナトリウム）。気管を曝露し、２つの気管輪の間に、カニューレ（１０ゲージ、外径２−１０ｍｍ、Ｐｏｒｔｅｘ  Ｌｔｄ．）が肺に向かって気管内に約２ｃｍ挿入することができる小さな切れ目を作成した。これを綿結紮糸を用いて所定の場所に固定した。その後、肺を、新鮮なヘパリン化（１０単位／ｍｌ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の４ｍｌアリコートで３回洗浄した（ＢＡＬ）。得られたＢＡＬＦは、それを遠心分離するまで氷上に保持した。
【０１３９】
ＢＡＬＦを、４から１０℃に冷却された遠心機中で１０分間１０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離した。上清液を廃棄し、細胞ペレットを１ｍｌの０．１％ＣＥＴＡＢ／ＰＢＳ中に再懸濁させて細胞を溶解した。細胞溶解液を、血液含有量に対する分光分析を成し得るまで凍結した。標準は、ラット全血の０．１％ＣＥＴＡＢ／ＰＢＳ溶液を作製することによって調製した。
【０１４０】
解凍された１００μｌのそれぞれの溶解細胞懸濁液を、９６ウェル平底プレートの分離ウェルに入れた。すべての試料を２つ組で試験し、１００μｌの０．１％ＣＥＴＡＢ／ＰＢＳをブランクとしてプレートに含めた。それぞれのウェルの内容物のＯＤを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４１５ｎｍで測定した。
【０１４１】
標準曲線は、０．１％ＣＥＴＡＢ／ＰＢＳ中の異なる濃度（３０、１０、７、３、１、０．３、０．１μｌ／ｍｌ）の血液のＯＤ（４１５ｎｍ）を測定することによって作図した。
【０１４２】
それぞれの実験試料中の血液量を、標準曲線と比較して計算した。その後、データを以下の通り分析した。
１）２つ組に対する平均ＯＤを計算した。
２）ブランクに対する値をその他のすべての試料に対する値から引き算した。
３）データを査定して分布の正規性を評価した。
【０１４３】
化合物（ＩＡ）および（ＩＩ）は、ＨＮＥの６時間前に１００μｇ／ｋｇで脊髄くも膜下腔内（ｉ．ｔ）投与すると、コントロールと比較してそれぞれ９５％および８８％の統計的に有意な出血の低下を示した。
【０１４４】
本発明における化合物と国際公開第２００７／１２９０６０号の実施例１８における化合物との肺中における半減期の比較
ＰＫアッセイ
試験材料は０．２％Ｔｗｅｅｎ８０／生理食塩水中において２０μｇ／ｍＬで作成した。溶液を、投与前に４０℃の温浴で超音波処理をして温めた。雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、１０μｇ／Ｋｇのわずかな投与量レベルをＰｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ投与針によって、試験材料の単独気管内投与を受けた。投与の後、それぞれの群の５匹のラットは、化合物（ＩＡ）（遊離塩基）の投与から１、２、４、８、２４、７２および９６時間後、および化合物（ＩＩ）（遊離塩基）の投与から１、４、８、２４、７２、９６、１６８、２６４および３３６時間後に、ペントバルビタールナトリウムを用いて最終的に麻酔した。血液は尾静脈からサンプリングし、胸部を開け、動物は灌流によって瀉血され、肺を除去して瞬間凍結した。収集した後、血液試料を遠心分離した（１００００×ｇ、４℃で２分）。血漿を取り除き、両方を−２０℃で冷凍保存した。ラットの肺を水中（氷上）で均質化し、肺：水＝１：２の割合（ｗ／ｖ）を得た。それぞれのホモジネートの１００μＬアリコートを、分析内部標準を含む２００μＬのアセトニトリルを加えることで抽出した。渦混合（ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｉｎｇ）および遠心分離（１００００×ｇ、４℃で５分）の後、上清の１００μＬアリコートを、低容量のＬＣバイアル中で５０μＬの水と合わせた。試料を完全に混合し、上述の試料のために説明した方法を使用して、コントロールラット肺ホモジネートをスパイクして１０００μＬアリコートを抽出して調製した検量線と一致する一連のマトリックスに対して、ＬＣＭＳＭＳによって試験化合物の測定を行った。
【０１４５】
試験材料を、ＬＣポンプおよびオートサンプラー（Ｒｅｌｉａｎｃｅ）を備えた三連四重極質量分析計（ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ３０００）で分析した。試験材料を正イオンモードのＴｕｒｂｏ  Ｉｏｎ  Ｓｐｒａｙにおいて検出した。試験材料の分析分離を、流速１ｍＬ／分の０．５％ギ酸、水およびアセトニトリルの移動相を用いて、逆相Ｃ１８  ５μｍ分析カラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｃｌｉｐｅｕｓ、５０×３ｍｍ）で進めた。初期条件は、０．５％ギ酸／９０％水、１０％アセトニトリルから成り、直線勾配を開始する前に１分間保持した。移動相の水分含有量は２分かけて１０％減少し、同時にアセトニトリルが上昇した。最終条件は、初期条件に戻る前にさらに１分間保持した。
【０１４６】
本発明の化合物（ＩＡ）における観察された終末肺ｔ１／２は、３１−４６時間の８０％信頼区間で３７時間であった。これは、８５−１０４時間の８０％信頼区間で９４時間の終末肺ｔ１／２を有する、国際公開第２００７／１２９０６０号の実施例１８の化合物と比較して著しく短かった。
【国際調査報告】
2012516316.tif 000034
2012516316.tif 000035