(57)【要約】  本発明は、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／もしくはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であり、ならびに／またはＩＬ−２受容体複合体および／もしくはＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能であり、ＩＬ−２１のアミノ酸の置換として、インターロイキン−４（ＩＬ−４）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）のアミノ酸のストレッチを含む、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）変異体に関する。本発明は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３から選択される少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物にも関する。本発明はさらに、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２および／またはＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらに本発明は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２および／またはＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３、ならびに場合によってはＣＤ４０分子の刺激剤、腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド、ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、ワクチンタンパク質抗原、およびワクチン多糖抗原から選択される少なくとも１つのエレメントを含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するためのキットに関する。
2012514586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／もしくはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であり、ならびに／またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体複合体および／もしくはインターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体複合体を結合させることが可能であり、配列番号１において定義されるインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）のアミノ酸の置換としてインターロイキン−４（ＩＬ−４）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）のアミノ酸のストレッチを含む、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）変異体。
【請求項２】
配列番号２において定義されるＩＬ−４のヘリックス部分の約１０〜６０％を含み、配列番号２において定義されるＩＬ−４のヘリックス間部分も場合によって含む、請求項１に記載のＩＬ−２１変異体。
【請求項３】
配列番号３において定義されるＩＬ−２のヘリックス部分の約１０〜６５％を含み、配列番号３において定義されるＩＬ−２のヘリックス間部分も場合によって含む、請求項１に記載のＩＬ−２１変異体。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ＩＬ−４ならびにＩＬ−２を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項８】
（i）請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびに
（ii）ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−２、ならびに／または
（iii）ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）および／もしくはシンテニン−１および／もしくはガレクチン−１および／もしくはガレクチン−３、
ならびに場合によっては
（iv）ＣＤ４０分子の刺激剤、好ましくは抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＣ４ＢＰ、
（v）腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド、好ましくはＢＡＦＦまたはＬＩＧＨＴ、
（vi）ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、好ましくはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、
（vii）ワクチンタンパク質抗原、および
（viii）ワクチン多糖抗原
から選択される少なくとも１つのエレメント
を含む、原発性体液性免疫不全疾患の治療用のキット。
【請求項９】
前記医薬組成物中または前記キット中のＩＬ−２１または前記ＩＬ−２１変異体とＩＬ−４との間の比が約５：１と２５：１の間、好ましくは約２０：１である、請求項４、５または６に記載の医薬組成物、請求項７に記載の使用、または請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記医薬組成物中または前記キット中のＩＬ−２１または前記ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２との間の比が約５：１と２０：１の間、好ましくは約１５：１である、請求項４、５または６に記載の医薬組成物、請求項７に記載の使用、または請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記医薬組成物が少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、好ましくは抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＣ４ＢＰをさらに含む、請求項４、５、６、９または１０のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項７、９または１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、少なくとも１つの腫瘍壊死因子スーパーファミリーのリガンド、好ましくはＢＡＦＦもしくはＬＩＧＨＴ、および／または少なくとも１つのヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、好ましくはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）をさらに含む、請求項４、５、６および９から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項７および９から１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、少なくとも１つのワクチンタンパク質抗原および／または少なくとも１つのワクチン多糖抗原をさらに含む、請求項４、５、６および９から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項７および９から１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
（i）の化合物と（ii）の化合物の投与の間の間隔が約１分と１２時間の間である、請求項８から１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
（i）および（ii）の化合物の投与と化合物（iii）から（vii）のいずれかの投与との間の間隔が約１２時間と７２時間の間である、請求項８から１０および１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを発現し、場合によっては
（i）ＣＤ４０分子の刺激剤、好ましくは抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＣ４ＢＰ、
（ii）腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド、好ましくはＢＡＦＦまたはＬＩＧＨＴ、
（iii）ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、好ましくはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、および
（iv）ワクチンタンパク質抗原
から選択される少なくとも１つのエレメントも発現する生物担体。
【請求項１７】
原発性体液性免疫不全疾患の治療用である、請求項１６に記載の生物担体。
【請求項１８】
前記原発性体液性免疫不全疾患が分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体のレベルの低下を伴う疾患である、請求項４、５、６および９から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項７および９から１３のいずれか一項に記載の使用、請求項８から１０、１４または１５のいずれか一項に記載のキット、または請求項１７に記載の生物担体。
【請求項１９】
前記疾患がＩｇＡの選択的欠乏症（ＩｇＡＤ）、一般変異型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症（ＩｇＧｓＤ）、増大したＩｇＭ（高ＩｇＭ症候群）またはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を有する免疫不全である、請求項１８に記載の医薬組成物、使用、キットまたは生物担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／もしくはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であり、ならびに／またはＩＬ−２受容体複合体および／もしくはＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能であり、ＩＬ−２１のアミノ酸の置換として、インターロイキン−４（ＩＬ−４）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）のアミノ酸のストレッチを含む、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）変異体に関する。本発明は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３から選択される少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物にも関する。本発明はさらに、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２および／またはＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらに本発明は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２および／またはＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３、ならびに場合によってはＣＤ４０分子の刺激剤、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのリガンド、ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、ワクチンタンパク質抗原、およびワクチン多糖抗原から選択される少なくとも１つのエレメントを含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性体液性免疫不全疾患は、免疫系の遺伝的または自然発生的欠陥から生じる障害である。この概念は、体液性免疫不全、重症複合型免疫不全症を含めた多数の個別欠陥および複合障害、ならびに食作用および補体欠陥から生じる障害を含む。一般変異型免疫不全症（ＣＶＩＤ）および選択的ＩｇＡ欠乏症（ＩｇＡＤ）は、白色人種における最も一般的な原発性免疫不全疾患である。ＣＶＩＤの診断は、正常数の循環Ｂ細胞の存在下で防御的抗体応答を増大できないこと、および抗体欠乏の他の原因の排除に特に基づく。ＩｇＡＤを有する多くの個体は無症候性であるが、いくつかの個体は気道および胃腸管の感染に対する高い感受性に苦しむ。ＣＶＩＤは非常に様々な臨床症状および結果を示す。病像は上部および下部気道感染によって作用され、慢性肺疾患、気管支拡張症、および最終的に死をもたらす。さらに、肉芽腫性炎症、胃腸管症状、自己免疫および悪性腫瘍はＣＶＩＤにおける併発要因である。
【０００３】
ＣＶＩＤおよびＩｇＡＤは、それぞれ一般に低もしくは無レベルのスイッチされた免疫グロブリンアイソタイプによって、または低もしくは無レベルの血清ＩｇＡによって主に特徴付けられる。
【０００４】
原発性体液性免疫不全疾患に関する１つの考えられる説明として、免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプスイッチ中の問題を論じる。Ｉｇアイソタイプスイッチ、またはクラススイッチは、それによってＢリンパ球が、マウス中でＩｇＭの産生からＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＥ、またはＩｇＡクラスおよびサブクラスの１つの産生に、またはヒト中でＩｇＭの産生からＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＡ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、およびＩｇＡ２の産生に移行するプロセスである（Ｚｈａｎｇ、Ｊ．ら、（２００３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７３、３２３〜３３２）。このプロセスは、δ遺伝子以外、Ｉｇ重鎖（ＩｇＨ）定常領域μ遺伝子（Ｓμ）のスイッチ（Ｓ）領域と各ＩｇＨに対して５’に位置する下流Ｓ領域の１つの間の、欠失ＤＮＡ組換えによって主に仲介される（Ｚｈａｎｇ、Ｊ．ら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ、２ｎｄ  ｅｄ．（Ｔ．Ｈｏｎｊｏ、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ、ｅｄｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２３５〜２６５）。このプロセスはＩｇクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）として知られる。ＩｇＣＳＲは、原型可変／多様性／接合（ＶＤＪ）断片、およびクラススイッチＩｇアイソタイプの産生に発現されるＩｇＨ鎖を包含する、新たな転写単位を作製し、したがって、原型抗原結合特異性、およびＩｇＨ鎖と関係がある新規なエフェクター機能を有する新たな型のＩｇ分子を生成する（Ｗａｎｇ、Ａ．Ｃ．ら、（１９７０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６６、３３７〜３４１；Ｃｏｏｐｅｒ、Ｍ．Ｄ．ら、（１９７７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４１、１３９〜１４５）。このプロセスは、Ｉｇ分子の多様な体液性の免疫機能の基盤を与える。ＣＳＲは多数の細胞および分子プロセスの関与を必要とする。ＣＳＲプロセスは３つの主なステップに分けることができる。Ｉｇ生殖系列転写と呼ばれる所与の生殖細胞系ＩｇＨ遺伝子の転写は、ＣＳＲの最初のステップである。このプロセスは、所与のＩｇＨ遺伝子座の、ＣＳＲへのアクセス性を選択的に決定するプロセスであり、サイトカイン（複数可）により活性化および指示され、ＣＤ４０の同時刺激によって相乗作用を示す。Ｉｇ生殖系列転写は、効率よい生殖系列転写およびＣＳＲをもたらすその遺伝子座制御領域機能を介して、３’Ｉｇαエンハンサーによって最適化されるようである。Ｉｇ生殖系列転写の後、Ｓ領域ＤＮＡは、それが活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）依存性機構によるＳ領域のニッキングおよび切断に適した基質として働くことができるように、立体配座の変化を受ける。最後に、Ｓ領域中に導入された二本鎖の破壊部分が適切にプロセシング、修復され、一般的な非相同的末端接合経路によって破壊末端と連結して接合する。ＣＳＲのこの最終ステップは染色体中に組換えキメラＳ領域を生成し、２つのＣＳＲパートナー間の介在ＤＮＡの除去および欠失を伴う。ＣＳＲの理解は、特にＩｇ生殖細胞系プロモーターおよびＡＩＤの役割の特徴付けにおいて生じた進歩と共に、過去数年間で著しく進行している（Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ、Ｊ．（２０００）Ｃｕｒ���．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４５、１２７〜１６８；Ｈｏｎｊｏ、Ｔ．ら、（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０、１６５〜１９６）。
【０００５】
クラススイッチ組換えの「アクセス性モデル」において、サイトカインが、リポ多糖（ＬＰＳ）およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）刺激Ｂリンパ球などの適切に活性化したＢ細胞を特異的免疫グロブリンアイソタイプへのスイッチに誘導することが確立されている（Ｚｈａｎｇ、Ｊ．ら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ、２ｎｄ  ｅｄ．（Ｔ．Ｈｏｎｊｏ、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ、ｅｄｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２３５〜２６５；Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ、Ｊ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４５、１２７〜１６８；Ｈｏｎｊｏ、Ｔ．ら、（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０、１６５〜１９６；Ｌｉｔｉｎｓｋｉｙ、Ｍ．Ｂ．ら、（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３、８２２〜８２９）。例えば、マウスにおいて、ＩＬ−４はＩｇＧ１およびＩｇＥへのＢ細胞スイッチ、インターフェロン−γはＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３へのスイッチ、ならびに形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）はＩｇＡおよびＩｇＧ２ｂへのスイッチを優先的に誘導する（Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ、Ｊ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４５、１２７〜１６８；Ｓｎａｐｐｅｒ、Ｃ．Ｆ．ら、（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６、２１７〜２２３）。ヒトでは、ＩＬ−４はＩｇＥ、ＩｇＧ４（Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ、Ｊ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４５、１２７〜１６８；Ｓｎａｐｐｅｒ、Ｃ．Ｆ．ら、（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６、２１７〜２２３）、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ１（Ｆｕｊｉｅｄａ、Ｓ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５、２３１８〜２３２８）へのＢ細胞スイッチ、ＩＬ−１０はＩｇＧ３およびＩｇＧ１へのスイッチ（Ｄｅｆｒａｎｃｅ、Ｔ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５、６７１〜６８２）、ＩＬ−１３はＩｇＧ４およびＩｇＥへのスイッチ（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ、Ｊ．ら、（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０、３７３０〜３７３４１１）、およびＴＧＦ−β、血管作動性腸管ペプチド、および樹状細胞はＩｇＡへのスイッチを誘導する（Ｆａｙｅｔｔｅ、Ｊ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５、１９０９〜１９１８）。サイトカイン誘導アイソタイプスイッチは、特異的ＩｇＨ遺伝子座からの生殖系列転写を選択的に誘導する所与のサイトカインの能力と直接関係があり、誘導される生殖系列転写はＣＳＲに先行する。したがって、所与のサイトカインは、特異的ＩｇＨ遺伝子座を介した転写を誘導することによって、ＣＳＲに関する推定既存のＩｇ−ＣＳＲ機構をその遺伝子座に「アクセス可能」にすると考えられる。
【０００６】
サイトカインは、本質的に全ての生物学的プロセスに関与するメディエーターとして機能する、１００を超えるタンパク質の大きなファミリーである。それらは重要な律速シグナルであることが分かっており、いくつかのサイトカインの遮断は有効な治療をもたらす。サイトカインは、隣接細胞間の狭い範囲で通常働く低分子量タンパク質である。いくつかの名称の中で特にインターロイキン、インターフェロン、成長因子、およびＴＮＦとも以前は呼ばれていた、これらの分子は、細胞増殖から炎症、免疫、移動、線維症、修復、および血管新生まで、本質的に全ての重要な生物学的プロセスに関与する。これらの分子およびその関連受容体は重要なプロセスに関する主たるシグナルを与えるので、サイトカイン、それらの受容体、およびそれらが開始するシグナル伝達経路の異常が、広く様々な疾患に関与することは驚くべきことではない。
【０００７】
サイトカインの分野は、ＩＦＮ、初期にＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−αのクローニングを最初にもたらした分子生物学的手法の導入によって１９７０年代後半に台頭した。１９８０年代半ばまで、ｃＤＮＡプローブ、および純粋な組換えタンパク質を認識するために産生された抗体などの分子学的ツールを使用して明らかに研究可能であった、明確に定義されたサイトカインおよびサイトカイン受容体の多血症が存在した。
【０００８】
サイトカインの作用はオートクリン、パラクリン、およびエンドクリン作用であってよい。サイトカインは、先天性免疫応答と適応性免疫応答の両方の発生および機能に重要である。それらは病原体と遭遇した免疫細胞によって分泌されることが多く、それによって活性化し、さらなる免疫細胞を動員して病原体に対する系の応答を増大する。
【０００９】
サイトカインの一般に認められている機能的分類は、免疫性サイトカインを２群、１型サイトカインと呼ばれるサイトカイン応答を高める群に分ける。この群は、例えばＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βを含む。他の群は抗体応答を促進するサイトカインを包含し、これは２型群と呼ばれる。この群は、例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３を含む。
【００１０】
サイトカインの別の構造分類は、４α−ヘリックスバンドルファミリー、ＩＬ−１ファミリーおよびＩＬ−１７ファミリーを識別する。４α−ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、４つのバンドルのα−ヘリックスを有する三次元構造を有する。このファミリーは、次いで３つのサブファミリー、すなわちＩＬ−２サブファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）サブファミリーおよびＩＬ−１０サブファミリーに分けられる。これら３つのサブファミリーのうちの第一のものが最大である。それは、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）およびトロンボポイエチン（ＴＨＰＯ）を含めた、いくつかの非免疫性サイトカインを含有する。４α−ヘリックスバンドルサイトカインは、長鎖および短鎖サイトカインに分けることができる。ＩＬ−１ファミリーはＩＬ−１およびＩＬ−１８を主に含み、一方ＩＬ−１７ファミリーのメンバーは、細胞毒性効果を引き起こすＴ細胞の増殖を促進する際に特異的効果を有する。
【００１１】
インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）は、免疫系に対するその多面的効果が調査され始めたばかりである、近年発見されたサイトカインである。ＩＬ−２１は、正確なリガンドの結合に応答して増殖を誘導し得るキメラＩＬ−２１ＲでトランスフェクトしたＢａ−Ｆ３細胞を使用して、オーファン受容体、ＩＬ−２１Ｒのリガンドとして機能的にクローニングした（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ  Ｊら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ；４０８、５７〜６３）。ＩＬ−２１は、ＩＬ−１５と最も相同的でありＩＬ−２およびＩＬ−４との有意な相同性も有する、４ヘリックスバンドルサイトカインとして同定された。それは活性化ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞によってのみ発現されるγｃファミリーである。ヒトインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）は、活性化ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞によってのみ発現されるγｃファミリーの４α−ヘリックスバンドルサイトカインである。
【００１２】
ＩＬ−２１は、ＮＫ、ＴおよびＢ細胞に対して、様々な、および時々対照的効果を発揮する。Ｂ細胞に対するその効果の中で、ＩＬ−２１は、状況依存形式で増殖またはアポトーシス、および抗原特異的抗体の産生を誘導する。ヒトＩＬ−２１遺伝子は４ｑ２６−ｑ２７にマッピングされ、ＩＬ−２遺伝子からわずか１８０ｋｂ離れており、一方ＩＬ−１５遺伝子は４ｑ３１においてより遠位に存在する（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ  Ｊら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ；４０８、５７〜６３）。さらに、ＩＬ−２およびＩＬ−２１遺伝子のエクソンおよびイントロン構造は非常に類似しており、それらの互いの隣接性およびそれらの類似した遺伝的構成のため、この２つの遺伝子は遺伝子重複によって生じた可能性があることを示唆する（Ｍｅｈｔａら、（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０２、８４〜９５）。ヒトＩＬ−２１とマウスＩＬ−２１はアミノ酸レベルで５７％同一であり、構造成分のさらに高い保存性を有する。興味深いことに、ＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）欠損マウスは明らかな発生欠損は示さないが、ただし著しく低下したＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３レベルを示し、一方ＩｇＥは増大する（Ｏｚａｋｉ  Ｋら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８（５５９８）、１６３０〜４；Ｋａｓａｉａｎ  ＭＴら、（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１６（４）、５５９〜６９）。
【００１３】
したがって、特にＩｇアイソタイプスイッチの状況で、体液性免疫応答の生成中に優勢である機械的相互関係および関係の解明は進展期に達しているが、ＣＶＩＤおよびＩｇＡＤのような原発性抗体欠損の主要かつこれまで最も典型的な治療は、依然として免疫グロブリン補充療法である。この治療手法の目的は、患者の血液中のＩｇＧまたはＩｇＡの生理的レベルの回復、およびしたがって、感染重度の緩和である。しかしながら、この治療スキームは根底にある分子学的問題を改変または軽減せず、ただし随伴症状の緩和のみを目的とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、免疫系の遺伝的欠陥から生じる障害である原発性体液性免疫不全疾患、特に一般変異型免疫不全症（ＣＶＩＤ）および選択的ＩｇＡ欠乏症（ＩｇＡＤ）の新しく有効な治療展望を提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明はこの必要性に取り組み、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であり、ＩＬ−２１のアミノ酸の置換としてＩＬ−４またはＩＬ−２のアミノ酸のストレッチを含むＩＬ−２１変異体を提供する。これらの変異体および／またはＩＬ−４および／またはＩＬ−２と組合せたＩＬ−２１は、原発性体液性免疫不全疾患の治療に有効に使用することができる。ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４および／またはＩＬ−２、ならびに場合によってはＣＤ４０分子の刺激剤、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのリガンド、ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、ワクチンタンパク質抗原、およびワクチン多糖抗原から選択される少なくとも１つのエレメントを含むキットを、原発性体液性免疫不全疾患の治療用にさらに使用することができる。
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であり、および／またはＩＬ−２受容体複合体および／またはＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能である、ＩＬ−２１のアミノ酸の置換としてＩＬ−４またはＩＬ−２のアミノ酸のストレッチを含むＩＬ−２１変異体を発見した。さらに本発明者らは、驚くべきことに、このようなＩＬ−２１変異体および／またはＩＬ−２１、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３の群から選択される少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物は、医学用途、特に原発性体液性免疫不全疾患、例えば一般変異型免疫不全症（ＣＶＩＤ）または選択的ＩｇＡ欠乏症（ＩｇＡＤ）の治療に有効に使用することができることを発見した。この新たな治療手法は、抗体補充または代替治療を不必要にする相当な利点を与える。本発明の手法により治療した患者は、ｄｅ  ｎｏｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでアイソタイプ欠損抗体を産生することができるからである。したがって、補充または代替治療のために、大量に抗体を入手、精製および保存することはもはや必要ではない。さらに、治療スキームは劇的に簡素化され、より柔軟になり得る。さらに、本発明の新たな治療手法は、予防接種スキームの状況でＩｇＡおよび／またはＩｇＧ抗体産生の誘導、抗体補充または代替治療中には考えられないシナリオをさらに可能にする。したがって、本発明の新たな治療手法は、これまであまり実現可能ではなかった、有利な抗原依存的抗体誘導を可能にする。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、配列番号２において定義されるＩＬ−４のヘリックス部分の約１０〜６０％を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、配列番号２において定義されるＩＬ−４のヘリックス間部分も含む。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、配列番号３において定義されるＩＬ−２のヘリックス部分の約１０〜６５％を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、配列番号３において定義されるＩＬ−２のヘリックス間部分も含む。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物に関する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびに、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は、前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−２を含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物の使用に関する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、
（ｉ）前述のＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびに
（ｉｉ）ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−２、ならびに／または
（ｉｉｉ）ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）および／もしくはシンテニン−１および／もしくはガレクチン−１および／もしくはガレクチン−３
を含む、原発性体液性免疫不全疾患の治療用のキットに関する。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、キットは、
（ｉｖ）ＣＤ４０分子の刺激剤、
（ｖ）腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド、
（ｖｉ）ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、
（ｖｉｉ）ワクチンタンパク質抗原、および
（ｖｉｉｉ）ワクチン多糖抗原
から選択される少なくとも１つのエレメントも含む。
【００２５】
本発明の特に好ましい実施形態では、前述のキットは、抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）およびＣ４ＢＰからなる群から選択されるＣＤ４０分子の刺激剤を含む。本発明のさらなる特に好ましい実施形態では、前述のキットは、ＢＡＦＦおよびＬＩＧＨＴからなる群から選択される腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンドを含む。
【００２６】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態では、前述のキットは、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）のようなヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチドを含む。
【００２７】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、前述の医薬組成物またはキットは、前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４を約５：１と２５：１の間の比で含む。より好ましい実施形態では、医薬組成物またはキット中の前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体とＩＬ−４の間の比は約２０：１である。
【００２８】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、前述の医薬組成物またはキットは、前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２を約５：１と２０：１の間の比で含む。より好ましい実施形態では、医薬組成物またはキット中の前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体とＩＬ−２の間の比は約１５：１である。
【００２９】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、前述の医薬組成物は、少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤をさらに含む。本発明のより好ましい実施形態では、前述の医薬組成物は、抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）およびＣ４ＢＰからなる群から選択されるＣＤ４０分子の刺激剤を含む。
【００３０】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、前述の医薬組成物は、少なくとも１つの腫瘍壊死因子スーパーファミリーのリガンドおよび／または少なくとも１つのヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチドをさらに含む。本発明のより好ましい実施形態では、前述の医薬組成物は、ＢＡＦＦおよびＬＩＧＨＴからなる群から選択される腫瘍壊死因子スーパーファミリーのリガンド、および／またはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）のようなヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチドを含む。
【００３１】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、前述の医薬組成物は、少なくとも１つのワクチンタンパク質抗原および／または少なくとも１つのワクチン多糖抗原をさらに含む。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施形態では、前述のキットは、一方で前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体と他方でＩＬ−４および／またはＩＬ−２の投与間の間隔が、約１分と１２時間の間であるように投与する。
【００３３】
本発明の別の好ましい実施形態では、前述のキットは、一方で前述のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２の投与と、他方で（ａ）ＣＤ４０分子の刺激剤、（ｂ）腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド、（ｃ）ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、（ｄ）ワクチンタンパク質抗原、および（ｅ）ワクチン多糖抗原のいずれかの投与の間隔が、約１２時間と７２時間の間であるように投与する。
【００３４】
本発明のより好ましい実施形態では、前述のＣＤ４０分子の刺激剤は、抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）およびＣ４ＢＰからなる群から選択される。
【００３５】
本発明のより好ましい実施形態では、前述の腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンドは、ＢＡＦＦおよびＬＩＧＨＴからなる群から選択される。
【００３６】
本発明のより好ましい実施形態では、前述のヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチドはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）である。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義するＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを発現する生物担体に関する。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、生物担体は、
（ｉ）ＣＤ４０分子の刺激剤
（ｉｉ）腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド
（ｉｉｉ）ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチドおよび
（ｖｉｉ）ワクチンタンパク質抗原
から選択される少なくとも１つのエレメントも発現する。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態では、前述の生物担体は、抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）およびＣ４ＢＰからなる群から選択されるＣＤ４０分子の刺激剤を発現する。本発明のさらに特に好ましい実施形態では、前述の生物担体は、ＢＡＦＦおよびＬＩＧＨＴからなる群から選択される腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンドを発現する。
【００４０】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、前述の生物担体は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）のようなヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチドを発現する。
【００４１】
本発明のさらに好ましい実施形態では、前述の生物担体は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用である。
【００４２】
本発明の別の好ましい実施形態では、前述の医薬組成物、使用、キットまたは生物担体は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体のレベルの低下を伴う疾患の治療用である。本発明の別の好ましい実施形態では、前述の医薬組成物、使用、キットまたは生物担体は、ＩｇＡの選択的欠乏症（ＩｇＡＤ）、一般変異型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症（ＩｇＧｓＤ）、増大したＩｇＭ（高ＩｇＭ症候群）またはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を有する免疫不全の治療用である。
【００４３】
本発明のこれらおよび他の特性、特徴および目的は、本発明の原理を実例として実証する添付の図面および実施例と共に、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００４４】
説明は、本発明の範囲を制限せずに、単なる例のために与える。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ダークグレーのプリーツシート構造としてヘリックスおよびライトグレーの線としてヘリックス間部分を示す、インターロイキン−２、インターロイキン−４およびインターロイキン−２１の構造を示す図である。
【図２】異なるインターロイキンとそれらの同系受容体の相互作用に関する概略図である。この図は、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒαとγｃの間の相互作用、ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒとγｃの間の相互作用、およびＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒ、とγｃの間の相互作用を示す。
【図３】平均値として表した、５体のランダムに選択した健常ドナー由来のＰＢＭＣのＩｇＧ産生の誘導を示す図である。分泌ＩｇＧの単位は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析中の特定スポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい仮想単位で測定した。図３Ａ中、１×１０６個のＰＢＭＣは、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、ＩＬ−１０またはＩＬ−２１単独、または２μ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂとの組合せのいずれかで５日間刺激した。後に、１×１０５個のＰＢＭＣに、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。図３Ｂ中、１×１０６個のＰＢＭＣは、２μ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂおよび０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−１０のいずれか単独（グレー線）、または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１との組合せ（黒線）で５日間刺激した。５×１０４個のＰＢＭＣに、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。
【図４】代表的な健常個体におけるＣＤ１９＋リンパゲーティングされた細胞上でのＣＤ２７、ＣＤ１３８ならびに表面ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＡの発現を示す図である。これらのマーカーの細胞表面発現は、相関ｘ軸およびｙ軸蛍光のドットプロットとして４０ｌｏｇスケールで表す。ＦＣＭ分析は、ＩＬ−２１［１０ｎｇ／ｍｌ］、ＩＬ−４［０．５ｎｇ／ｍｌ］および抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ［２μ／ｍｌ］の存在下で培養したＰＢＭＣを用いて第０、３、５および７日において実施した。図４Ａ中、四分画マーカーを配置して、ナイーブ成熟Ｂ細胞（ＵＬ）、ナチュラルエフェクターＢ細胞（ＵＲ）、およびＩｇＤ−記憶Ｂ細胞（ＬＲ）を含めた。円はＣＤ２７ｈｉｇｈＩｇＤ−Ｂ細胞の集団を示す。図４ＢおよびＤ中、四分画マーカーを配置してＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）とｓＩｇＡ＋Ｂ細胞（ＬＲ）を分けた。図４ＣおよびＥ中、四分画マーカーを配置してＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）とｓＩｇＧｈｉｇｈＢ細胞（ＬＲ）を分けた。
【図５】ＣＶＩＤを有する３２患者（図５ＡおよびＢ）およびＩｇＡＤを有する１０個体（図５Ｃ）由来のＰＢＭＣにおける、ＩｇＧおよびＩｇＡ産生に対するサイトカインおよび抗ＣＤ４０刺激の影響を示す図である。１×１０６個のＰＢＭＣは、サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０およびＩＬ−２１、０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４）、および言及する場合２μ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂで５日間刺激した。後に、１×１０５個のＰＢＭＣに、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。分泌ＩｇＧ（図５Ａ）およびＩｇＡ（図５ＢおよびＣ）の単位は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析中の特定スポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい仮想単位で測定した。原発性体液性免疫不全疾患を有する患者と健常対照の間の、ＩｇＧおよびＩｇＡ産生に対するサイトカインおよび抗ＣＤ４０刺激の影響のより良い解釈の可能性を与えるために、図５Ｄ〜Ｆは、ＣＶＩＤを有する３２患者（図５ＤおよびＥ、黒丸）およびＩｇＡＤを有する１０個体（図５Ｆ）からの結果と２２の健常対照（白丸）からの結果を比較する。１×１０６個のＰＢＭＣは、サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０およびＩＬ−２１、０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４）、および言及する場合２μ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂで５日間刺激した。後に、５×１０４および１×１０５個のＰＢＭＣに、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。対数スケールで表した分泌ＩｇＧ（図５Ｄ）およびＩｇＡ（図５ＥおよびＦ）の単位は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析中の特定スポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい仮想単位で測定した。
【図６】ＩＬ−２１［１０ｎｇ／ｍｌ］、ＩＬ−４［０．５ｎｇ／ｍｌ］および抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ［２μ／ｍｌ］を用いて細胞培養第３日で、ＣＶＩＤを有する１５患者（図６ＡおよびＢ）およびＩｇＡＤを有する１０個体（図６Ｃ）由来のＰＢＭＣにおいて、ＡＩＤｍＲＮＡの発現、Ｉγ−ＣγまたはＩα−Ｃα生殖系列転写の割合、およびＩγ−ＣμまたはＩα−Ｃμスイッチサークル転写産物の存在を示す図である。示したドットの直径は、５×１０４個のＰＢＭＣを使用して培養第５日で２０時間のＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出した、分泌ＩｇＧ（Ａ）またはＩｇＡ（ＢおよびＣ）の単位と比例関係にある。
【図７】ＣＶＩＤ（図７Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ）またはＩｇＡＤ（図７Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ）を有する代表的な健常個体におけるＣＤ１９＋リンパゲーティングされた細胞上でのＣＤ２７、ＣＤ１３８ならびに表面ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＡの発現を示す図である。これらのマーカーの細胞表面発現は、相関ｘ軸およびｙ軸蛍光のドットプロットとして４０ｌｏｇスケールで表す。ＦＣＭ分析は、ＩＬ−２１［１０ｎｇ／ｍｌ］、ＩＬ−４［０．５ｎｇ／ｍｌ］および抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ［２μ／ｍｌ］の存在下で培養したＰＢＭＣを用いて第０、３、５日（および７日）において実施した。図７Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ中、四分画マーカーを配置して、ナイーブ成熟Ｂ細胞（ＵＬ）、ナチュラルエフェクターＢ細胞（ＵＲ）、およびＩｇＤ−記憶Ｂ細胞（ＬＲ）を含めた。円はＣＤ２７ｈｉｇｈＩｇＤ−Ｂ細胞の集団を示す。図７ＣおよびＧ中、四分画マーカーを配置してＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）とｓＩｇＡ＋Ｂ細胞（ＬＲ）を分けた。図７ＤおよびＨ中、四分画マーカーを配置してＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）とｓＩｇＡｈｉｇｈＢ細胞（ＬＲ）を分けた。
【図８】ＣＶＩＤ（図８Ａ）およびＩｇＡＤ（図８Ｂ）を有する一個体中のＩｇＧおよびＩｇＡ産生細胞集団の同定を示す図である。ＣＤ１９＋リンパゲーティングされた細胞におけるＣＤ１３８および表面ＩｇＧまたはＩｇＡの発現は、ＩＬ−２１［１０ｎｇ／ｍｌ］、ＩＬ−４［０．５ｎｇ／ｍｌ］および抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ［２μ／ｍｌ］の存在下で５日間培養したＰＢＭＣ由来のＣＤ１３８＋形質細胞の磁気分離前後に分析した。これらのマーカーの細胞表面発現は、相関ｘ軸およびｙ軸蛍光のドットプロットとして４０ｌｏｇスケールで表す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのイメージは、ＩｇＧ産生に関して５×１０４個のＰＢＭＣ（図８Ａ）またはＩｇＡ産生に関して１×１０６個のＰＢＭＣ（図８Ｂ）の２０時間のインキュベーション後に得る。ＣＶＩＤを有する８患者由来のＰＢＭＣにおける、表面ＩｇＧ＋Ｂ細胞の存在およびＩｇＧの産生に対するＡＩＤサイレンシングの影響は図８Ｃ中に示す。対照サンプル中でのＡＩＤ発現を１００％の発現レベルと考え、一方ＲＮＡを含有しないサンプルはブランク値（０％の発現レベル）として処理した。ｓＩｇＧ＋Ｂ細胞の数は、ＰＢＭＣ培養第５日でのＣＤ１９＋リンパゲーティングされた細胞におけるＩｇＧ表面発現のＦＣＭ分析を使用して検出した。ＩｇＧ産生は、４×１０４個のＰＢＭＣを使用して培養第５日で２０時間のＥＬＩＳＰＯＴ中に検出した。分泌ＩｇＧの単位は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析中の特定スポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい仮想単位で測定した。
【図９】抗ヒトＣＤ３ｍＡｂで１×１０６個の細胞を１４時間刺激した後における、ＣＶＩＤを有する３０患者および２２健常個体由来のＰＢＭＣにおいて分析した、インターロイキン−２１およびインターロイキン−２１受容体ｍＲＮＡの発現を示す図である。ボックスの両端は２５および７５パーセンタイルを画定し、メディアンおよびエラーバーにおける線は１０および９０パーセンタイルを画定する。これらの結果は、ＣＶＩＤを有する患者のＴ細胞中でのＩＬ−２１およびＩＬ−２１受容体ｍＲＮＡの産生は機能的であることを確認する。
【図１０】ＣＶＩＤを有する４患者中（黒ドット）および４健常個体中（白ドット）の、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイド特異的ＩｇＧの誘導を示す図である。ＩＬ−２１［１０ｎｇ／ｍｌ］、ＩＬ−４［０．５ｎｇ／ｍｌ］および抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ［２μ／ｍｌ］で刺激した２×１０６個のＰＢＭＣの培養上清を、ＥＬＩＳＡの培養第７日に市販のトキソイド特異的ＩｇＧを用いて分析した。それぞれのサンプルに関して３複製を分析し、アウトライヤーを無視した平均値を作製した。点線のベースラインは、アッセイ特異的検出限界を表す。
【図１１】ＣＶＩＤを有する代表的な患者中または健常個体中の、ＣＤ１９＋リンパゲーティングされた細胞におけるＣＤ１３８および表面ＩｇＧまたはＩｇＡの発現を示す図である。これらのマーカーの細胞表面発現は、相関ｘ軸およびｙ軸蛍光のドットプロットとして４０ｌｏｇスケールで表す。ＦＣＭ分析は、ＩＬ−２１［１０ｎｇ／ｍｌ］、ＩＬ−４［０．５ｎｇ／ｍｌ］および抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ［２μ／ｍｌ］単独、または破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドとの組合せの存在下で培養したＰＢＭＣを用いて第７日で実施した。四分画マーカーを配置してＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）とｓＩｇＡｈｉｇｈもしくはｓＩｇＡ＋Ｂ細胞（ＬＲ）を分けた。
【図１２】１健常対照およびＣＶＩＤを有する２患者由来のＣＤ１９＋精製Ｂ細胞のＩｇＧおよびＩｇＡ産生に対する、いくつかのＩＬ−２１変異体の影響を示す図である。Ｂ細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体および２μ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂで５日間刺激した。後に、１×１０４個のＢ細胞に、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。分泌ＩｇＧ（図１２Ａ）およびＩｇＡ（図１２ＢおよびＣ）の単位は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析中の特定スポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい仮想単位で測定した。
【図１３】５実験からの代表的な結果の点で、ＣＶＩＤ患者由来のＰＢＭＣ（Ａ）または精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞（Ｂ）のＩｇＧおよびＩｇＡ産生の誘導を示す図である。分泌ＩｇＧおよびＩｇＡの単位は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析中の特定スポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい仮想単位で測定した。（Ａ）５×１０５個のＰＢＭＣを、５０もしくは５００ｎｇ／ｍｌのガレクチン−１またはガレクチン−３単独、または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１との組合せのいずれかで５日間刺激した。後に、２．５×１０５個のＰＢＭＣに、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。（Ｂ）２×１０５個のＣＤ１９＋Ｂ細胞を、５００ｎｇ／ｍｌのガレクチン−１またはガレクチン−３単独、または１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドとの組合せのいずれかで５日間刺激した。後に、５×１０４個のＣＤ１９＋Ｂ細胞に、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。
【図１４】５実験からの代表的な結果の点で、ＣＶＩＤ患者由来の精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞のＩｇＡ産生の誘導を示す図である。写真はＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、一方それぞれのダークスポットは１個のＩｇＡ産生Ｂ細胞を表す。４×１０５個のＣＤ１９＋Ｂ細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＩＰまたはシンテニン−１単独、または１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドとの組合せのいずれかで７日間刺激した。後に、２×１０５個のＣＤ１９＋Ｂ細胞に、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。
【図１５】５実験からの代表的な結果の点で、ＣＶＩＤ患者由来のＰＢＭＣのＩｇＧおよびＩｇＡ産生の誘導を示す図である。写真はＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、一方それぞれのダークスポットは１個のＩｇＧ−またはＩｇＡ産生細胞を表す。ＰＢＭＣは、表面固定ＣＤ４０Ｌ、切断型ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドまたはＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質を発現するラクトバチルスと７日間同時培養した。ラクトバチルスとＰＢＭＣの間の比は１０：１であった。後に、２×１０５個のＰＢＭＣに、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。
【図１６】選択的ＩｇＡ欠乏症を有する２つのランダムに選択したバフィーコートドナー由来の、ＰＢＭＣのＩｇＡ産生の誘導を示す図である。写真はＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、一方それぞれのダークスポットは１個のＩｇＡ産生Ｂ細胞を表す。５×１０５個のＰＢＭＣは、２μ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と組合せた５０ｎｇ／ｍｌの切断型ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッド、またはＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドのいずれかで７日間刺激した。後に、２×１０５個のＰＢＭＣに、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。
【図１７】選択的ＩｇＡ欠乏症を有する代表的なバフィーコートドナー由来の、ＰＢＭＣのＩｇＡ産生の誘導を示す図である。写真はＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示し、一方それぞれのダークスポットは１個のＩｇＡ産生Ｂ細胞を表す。５×１０５個のＰＢＭＣは、２μ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と組合せた１００ｎｇ／ｍｌの切断型ＩＬ−２１、または５０ｎｇ／ｍｌの「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」もしくはＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドのいずれかで７日間刺激した。後に、２×１０５個のＰＢＭＣに、２０時間のインキュベーション用にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを施した。
【図１８】ＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２の比較構造分析の結果を示し、共通γ鎖を有するＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２とそれらの特異的受容体の相互作用に重要である構造詳細および機能性エピトープおよび領域を明記する図である。
【図１９】ＩＬ−２１変異体タンパク質の受容体相互作用を検出してその程度を計算するための、ビーズベースのイムノアッセイからの結果を示す図である。図１９Ａは、タンパク質コーティングビーズを、前方および側方散乱分析に基づくフローサイトメトリーによって確実に検出することができることを示す。図１９Ｂ中、カラーコードビーズのＰＥ蛍光は受容体−キメラ複合体によって保有されるＤｙＬｉｇｈｔ６４９蛍光（ＡＰＣチャネル）に対して表し、結合した受容体−キメラ複合体の程度は、フローサイトメトリーによって検出および分析することができることを実証する。図１９Ｃは、専有ＩＬ−２Ｒβサブユニットと結合する切断型ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質およびＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質の能力を比較し、このタンパク質の設計によって意図するように、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質のみがＩＬ−２Ｒβ相互作用の濃度依存性を示すことを明らかに示す。図１９Ｄ中では、専有ＩＬ−４Ｒαサブユニットと結合する切断型ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質およびＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質の能力を互いに比較する。「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」のみがわずかなＩＬ−４Ｒα結合を可能にする一方で、この型のタンパク質の設計によって意図するように、本発明のＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質はＩＬ−４Ｒα相互作用の濃度依存性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明者らは、ＩＬ−２１のアミノ酸の置換配列中にＩＬ−４またはＩＬ−２のアミノ酸のストレッチを含むＩＬ−２１変異体は、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であり、および／またはＩＬ−２受容体複合体および／またはＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能であること、およびこのような変異体および／またはＩＬ−２１、ならびに追加的にＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３を使用することによって、原発性体液性免疫不全疾患、例えば一般変異型免疫不全症（ＣＶＩＤ）または選択的ＩｇＡ欠乏症（ＩｇＡＤ）を有効に治療することができることを発見している。
【００４７】
本発明を個々の実施形態に関して記載するが、この説明は制限的な意味で解釈すべきではない。
【００４８】
本発明の例示的な実施形態を詳細に記載する前に、本発明を理解するのに重要な定義を与える。
【００４９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「ポリペプチド」に対する言及は１つまたは複数のこのようなポリペプチドを含み、「方法」に対する言及は、本明細書に記載する方法で改変または置換することが可能である、当業者に知られている同等のステップおよび方法に対する言及を含む。
【００５０】
本発明の文脈において、用語「約」および「およそ」は、問題とする特徴の技術効果を依然として確実にすると当業者が理解している精度間隔を示す。この用語は典型的には、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、およびさらにより好ましくは±５％の、示した数値からの偏差を示す。
【００５１】
用語「含む」は制限的ではないことを理解すべきである。本発明の目的で、用語「からなる」は、用語「含む」の好ましい実施形態であると考えられる。本明細書で以後、一群が少なくとも特定数の実施形態を含むと定義する場合、これは好ましくはこれらの実施形態のみからなる群をさらに包含することを意味する。
【００５２】
さらに、本明細書中および特許請求の範囲中の用語「第一」、「第二」、「第三」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」もしくは「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」、「（ｖ）」、「（ｖｉ）」、「（ｖｉｉ）」などは類似の要素を区別するために使用し、必ずしも順番または時系列を記載するために使用するのではない。そのように使用する用語は適切な状況下で交換可能であること、および本明細書に記載する本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示する以外の順序で実施することができることを理解すべきである。
【００５３】
用語「第一」、「第二」、「第三」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」もしくは「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」、「（ｖ）」、「（ｖｉ）」、「（ｖｉｉ）」などが方法または使用のステップに関する場合、ステップ間に時間または時間間隔の一貫性は存在しない、すなわち、本明細書において以前または以降で言及するように本出願または特許請求の範囲において他に示さない限り、ステップは同時に実施することができ、またはこのようなステップ間に数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月またはさらに数年の時間間隔が存在し得る。
【００５４】
本発明は、本明細書に記載する特定の方法、プロトコール、タンパク質、細菌、ベクター、試薬などに限られないことを理解すべきである。これらは変わる可能性があるからである。本明細書で使用する術語は単に特定の実施形態を記載する目的であり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図するものではないことも理解すべきである。他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５５】
本明細書で使用する用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ、Ｂ．ａｎｄ  Ｋｏｌｂｌ、Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、ＣＨ−４０１０Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に記載されたように定義することが好ましい。
【００５６】
いくつかの文書を本明細書の本文を通じて引用する。（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、説明書などを含む）本明細書に引用する文書のそれぞれは、以前または以降のものであれ、それらの全容を参照によって本明細書に組み込む。本明細書における如何なるものも、本発明が従来の発明によるそのような開示に先立つ資格がないことを認めるものとして解釈すべきではない。
【００５７】
前に述べたように、本発明は一態様において、ＩＬ−２１変異体であって、前記ＩＬ−２１変異体がＢ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であり、および／またはＩＬ−２受容体複合体および／またはＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能であり、前記ＩＬ−２１変異体が配列番号１において定義されるＩＬ−２１のアミノ酸の置換としてＩＬ−４またはＩＬ−２のアミノ酸のストレッチを含む、ＩＬ−２１変異体に関する。
【００５８】
用語「インターロイキン−２１」または「ＩＬ−２１」は、配列番号１において定義されるポリペプチド配列を有するヒトインターロイキンを指す。したがってこの用語は、配列番号１において示す、哺乳動物細胞中での発現用に最適化した成熟、プロセシング、切断または分泌型のＩＬ−２１に関する。本発明の特定の目的または使用のため、例えばタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現用などに、インターロイキン−２１は、好ましくは追加的な２９アミノ酸のシグナル配列を含むとさらに追加的に理解することができる。この型のＩＬ−２１を「前駆体ＩＬ−２１」と呼び配列番号４において定義する。「前駆体ＩＬ−２１」は、前記シグナル配列の結果として、ＥＲ、分泌胞、または細胞外空間に誘導され得るタンパク質を指すことが好ましい。ＩＬ−２１前駆体が細胞外空間に放出される場合、ＩＬ−２１前駆体は細胞外プロセシングを経て、「ＩＬ−２１」または「成熟ＩＬ−２１」または「プロセシングＩＬ−２１」、または「切断ＩＬ−２１」、または「分泌ＩＬ−２１」タンパク質を生成することができる。細胞外空間への放出は、エクソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含めた多くの機構によって起こり得る。用語「ＩＬ−２１」、「成熟ＩＬ−２１」、「プロセシングＩＬ−２１」、「切断ＩＬ−２１」および「分泌ＩＬ−２１」は本明細書では同義語として使用し、本発明の目的では機能上同等であるとして理解すべきである。本発明の具体的な実施形態では、例えば細菌系におけるタンパク質または変異体の発現の状況で、用語「インターロイキン−２１」または「ＩＬ−２１」は、本明細書において以前または以降で定義する配列番号１において示すＩＬ−２１の配列またはそれに由来する配列に関する可能性もあり、細菌の翻訳開始剤として機能する１つの追加的アミノ酸がＮ末端に付加される。アミノ酸メチオニンを、付加することができることが好ましい。対応する配列は配列番号１０において示す。
【００５９】
用語「ＩＬ−２１変異体」は、ヒトＩＬ−２１、好ましくは配列番号１または配列番号４において定義されるポリペプチド配列を有するＩＬ−２１に由来し、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であり、および／またはＩＬ−２受容体複合体および／またはＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能であるＩＬ−２１タンパク質を指す。
【００６０】
用語「Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能である」は、ＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体が、Ｂ型リンパ球によるアイソタイプＩｇＧもしくはＩｇＡ、またはアイソタイプＩｇＧおよびＩｇＡ、好ましくはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２の少なくとも１つの抗体の放出または除去を、増大または上昇させることが可能であることを意味する。より好ましくは、この用語は、ＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体が、他の同一条件下で試験したとき配列番号１において定義されるＩＬ−２１タンパク質と比較して、Ｂ型リンパ球によるアイソタイプＩｇＧもしくはＩｇＡ、またはアイソタイプＩｇＧおよびＩｇＡ、またはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２の少なくとも１つの抗体の放出または除去を、増大または上昇させることが可能であることを意味する。
【００６１】
用語「Ｂ型リンパ球」は、マーカータンパク質ＣＤ１９および／またはＣＤ３８および／またはＣＤ１３８を発現する細胞に関する。典型的には、Ｂ型リンパ球は、マーカータンパク質ＣＤ３８を発現する、未熟または移行Ｂ細胞、成熟ナイーブＢ細胞、Ｂ１−およびＢ２−Ｂ細胞、周辺帯Ｂ細胞、濾胞性中心芽細胞および中心Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、および最終分化形質Ｂ細胞を含む。Ｂ型リンパ球は、形質Ｂ細胞として理解することが好ましい。用語「形質Ｂ細胞」は、マーカータンパク質ＣＤ３８、ＣＤ１３８および／または形質細胞抗原−１を典型的に発現する最終分化Ｂ細胞に関する。Ｂ型リンパ球によるアイソタイプＩｇＧもしくはＩｇＡ、またはアイソタイプＩｇＧおよびＩｇＡ、好ましくはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２の少なくとも１つの抗体の分泌を増大するＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体の能力は、当業者に知られている任意の適切な方法によって試験および決定することができる。Ｂ型リンパ球によるアイソタイプＩｇＧもしくはＩｇＡ、またはアイソタイプＩｇＧおよびＩｇＡ、好ましくはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２の少なくとも１つの抗体の分泌を増大するＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体の能力は、Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ  ＣＣら、（１９８３）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ６５（１〜２）、１０９〜２１に基づく方法によって試験することができることが好ましい。
【００６２】
本発明の文脈において利用する典型的な方法は、最初のステップとして、好ましくはＫｒｅｈｅｒ  ＣＲら、（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２７８（１〜２）、７９〜９３に従うフィコール分離による、末梢静脈血からのヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の入手を含むことができる。これらの細胞は、１患者型、例えば健常個体、またはＣＶＩＤのような免疫障害を有する患者から、好ましくは１個体患者のみから、単に本発明の手順の目的で得ることができる。これらの細胞は、健常な患者型のみから得ることができることがより好ましい。用語「健常」は、患者が免疫障害、特にＣＶＩＤまたはＩｇＡＤに罹患していないことを意味する。健常な患者から得る細胞は、無刺激の場合ＩｇＧまたはＩｇＡを自発的に産生しない、またはごく微量のＩｇＧまたはＩｇＡを産生することがさらに好ましい。このような挙動は、例えば本明細書で以前または以降に記載するアッセイに基づく、当業者に知られている方法によって試験することができる。用語「微量」は、本明細書で記載するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、計数したスポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい全２００単位の限界を超える可能性がないことを意味する。あるいは、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧの産生に関して標準化した市販の細胞を使用することができる。
【００６３】
後に、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞およびＣＤ１３８陽性形質細胞を、任意の適切な方法によって、例えば好ましくは選択キット（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．などの市販のキット）を用いたナノ粒子ベースの免疫磁気細胞選択によって、ＰＢＭＣから単離することができる。次のステップでは、ＰＢＭＣまたは選択したＢ型リンパ球を、当業者に知られている任意の適切な培養培地中、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で培養することができる。培養用に、１×１０４〜２×１０６個の量の細胞（ＰＢＭＣまたは選択したＢ型リンパ球）を使用することができる。当業者に知られている任意の適切な手段によって、例えば細胞計数デバイスまたは機器、顕微鏡測定などによって、細胞の量を決定することができる。
【００６４】
培地は、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むことができることが好ましい。培地は、１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１０％の熱失活ウシ胎児血清を含むことができることがより好ましい。後に、本明細書で以前または以降に記載する試験対象のＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体を適量加えることができる。混合物中の最終濃度は、約０．１と２００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約０．５と１００ｎｇ／ｍｌの間であり得ることが好ましい。さらなる実施形態では、追加的に、本明細書で以前または以降に記載するＩＬ−２またはＩＬ−４を適量加えることができる。混合物中のこれらの化合物各々の最終濃度は、約０．１と２００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約０．５と１００ｎｇ／ｍｌの間であり得ることが好ましい。あるいは、ＩＬ−２とＩＬ−４の組合せを加えることもできる。この組合せを適量加えることができる。混合物中の組合せの最終濃度は、約０．１と２００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約０．５と１００ｎｇ／ｍｌの間であり得ることが好ましい。さらに、ＣＤ４０分子の刺激剤を適量加えることができる。抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣ４ＢＰを、適量加えることができることが好ましい。混合物中のこれらの化合物各々の最終濃度は、約０．５と４μｇ／ｍｌの間、より好ましくは約１と２μｇ／ｍｌの間であり得ることが好ましい。さらなるステップ中、当業者に知られている適切なインキュベーション温度、例えば３７℃で混合成分をインキュベートすることができる。インキュベーションは有利な雰囲気中で、好ましくは５％ＣＯ２の存在下で実施することができる。インキュベーションは、当業者に知られている適切な法則に従って実施することができる。インキュベーションは、３〜７日の期間実施することができることが好ましい。インキュベーションは５日の期間実施することができることがより好ましい。
【００６５】
後に、ＰＢＭＣまたは選択したＢ型リンパ球を、当業者に知られている任意の適切な洗浄培地で、例えばＩＭＤＭで、好ましくは１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１０％の熱失活ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭで洗浄することができる。洗浄は氷上で実施することが好ましく、適切に可能な限り頻繁に、例えば２回繰り返すことができる。
【００６６】
培養ＰＢＭＣまたはＢ型リンパ球のＩｇＧおよびＩｇＡアイソタイプ分泌を決定するために、当業者に知られている適切な酵素結合免疫吸着スポット形成アッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を使用することができる。ＥＬＩＳＰＯＴ手法は典型的にはサンドウィッチＥＬＩＳＡ試験と同様に実施する、すなわち、捕捉用抗体が対象のタンパク質を捕捉し、それは検出用抗体によって後に検出することができる。
【００６７】
典型的には、９６ウエルのポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ）フィルタープレートに３０％エタノールを予め湿らせ、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ｓＰＢＳ）で３回すすぎ、ヒト免疫グロブリン重鎖特異的ポリクローナル検出用抗体を用いて４℃において一晩コーティングし、５〜１５μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌでｓＰＢＳ中に希釈することができる。後に、フィルタープレートをｓＰＢＳで３回すすぎ、１％ウシ血清アルブミンを含有するｓＰＢＳを用いて数時間、好ましくは３時間ブロッキングすることができる。その後、培養ＰＢＭＣ、またはＢ型リンパ球を、１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１０％の熱失活ウシ胎児血清を含む１００μｌのＩＭＤＭ中にウエル当たり１×１０３〜１×１０５個の細胞で平板培養することができる。次いでＥＬＩＳＰＯＴフィルタープレートを、５％ＣＯ２の存在下で、適切な期間、例えば１４〜２８時間、好ましくは２０時間、適切な温度、典型的には３７℃においてインキュベートすることができる。その後、ＥＬＩＳＰＯＴフィルタープレートは、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するｓＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を使用して６回洗浄することができる。後に、ＩｇＧおよびＩｇＡアイソタイプのヒト免疫グロブリン重鎖を、当業者に知られている任意の適切な手段を用いて、例えば特異的免疫グロブリン重鎖ＩｇＧおよびＩｇＡアイソタイプ検出用抗体を用いて検出することができる。ＩｇＧおよび／またはＩｇＡの免疫グロブリン重鎖に対するポリクローナル抗体を、使用することができることが好ましい。ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎから入手可能な抗ＩｇＧ／ＩｇＡ抗体、およびＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡから入手可能な非結合ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＡ抗体を、使用することができることがより好ましい。ＩｇＧとＩｇＡを同時に検出するために、対応するリーディングシステム、例えばＡＩＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨによって提供される「ｉＳｐｏｔ」−Ｒｅａｄｅｒ  ｓｙｓｔｅｍと共に異なる蛍光標識を使用することができる。あるいは、本明細書で前に記載したＩｇＧおよび／またはＩｇＡサブクラスに特異的な抗体を使用することができる。好ましいのは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３特異的モノクローナル抗体、例えばＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から入手可能なＩｇＧ１マウス抗ヒトＩｇＧ１（γ１鎖特異的、クローン４Ｅ３）、ＩｇＧ３マウス抗ヒトＩｇＧ３（γ３鎖特異的、クローンＨＰ６０５０）である。
【００６８】
典型的には、捕捉用抗体をｓＰＢＳ中に希釈し、１〜３μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌの最終濃度で加えることができる。検出用抗体は０．５％のウシ血清アルブミンを含有するｓＰＢＳ中に希釈し、１〜３μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌの最終濃度で加えることができる。
【００６９】
検出用抗体は、ストレプトアビジンカップリング用にビオチニル化することが可能である、または発色反応に適した任意の酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）と直接コンジュケートさせることが可能であることが好ましい。
【００７０】
４℃で一晩のインキュベーション後、ＥＬＩＳＰＯＴフィルタープレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに６回洗浄することができる。結合反応は、当業者に知られている任意の適切な発色反応で試験することができる。例えば、ホスファターゼ基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸およびニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を使用することによって、酵素発色反応を実施することができる。対象の免疫グロブリン分子を分泌した単細胞に対応する着色スポットの発色は、１分と６０分の間の期間、ＰＶＤＦ膜上で直接モニタリングすることができる。ＥＬＩＳＰＯＴフィルタープレートの各ウエルの顕微鏡による分析、および後の細胞数および免疫グロブリン量の計数は、当業者に知られている任意の適切な方法によって、例えばＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  ０４  ＨＲ  Ｒｅａｄｅｒ  ｓｙｓｔｅｍのような自動高解像度プレートリーダーを使用することによって、および適切なリーダーソフトウェアを使用することによって実施することができる。分泌免疫グロブリンの量、すなわちアイソタイプＩｇＧおよび／またはＩｇＡの分泌免疫グロブリンの量は、任意の適切な方法によって、または好ましくは特定スポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい仮想単位を使用することによって、当業者に知られている任意の適切な単位に基づいて測定することができる。
【００７１】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２および／またはＩＬ−４の添加あり、または好ましくはＩＬ−２またはＩＬ−４の添加無しのいずれかで、前に記載した手順によって測定した分泌免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において配列番号１において定義されるＩＬ−２１タンパク質の使用時に、前に記載した手順によって測定した分泌免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも０．２％、好ましくは少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％またはそれより多く、より好ましくは少なくとも５％増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であると考えられる。
【００７２】
好ましくは、分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２および／またはＩＬ−４の添加あり、または好ましくはＩＬ−２またはＩＬ−４の添加無しのいずれかで、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において配列番号１において定義されるＩＬ−２１タンパク質の使用時に、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも０．２％、好ましくは少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％またはそれより多く、より好ましくは少なくとも５％増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＧ抗体の分泌を増大することが可能であると考えられる；および分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４の添加あり、または好ましくはＩＬ−２もしくはＩＬ−４の添加無しのいずれかで、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＡアイソタイプ免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において配列番号１において定義されるＩＬ−２１タンパク質の使用時に前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＡアイソタイプ免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも０．２％、好ましくは少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％またはそれより多く、より好ましくは少なくとも５％増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であると考えられる。
【００７３】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２またはＩＬ−４を加えない、前に記載した手順によって測定した分泌免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において無刺激Ｂ型リンパ球の使用時に、前に記載した手順によって測定した分泌免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０倍またはそれより多く、より好ましくは少なくとも３０倍増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であると考えることもできる。
【００７４】
あるいは、分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２またはＩＬ−４を加える、前に記載した手順によって測定した分泌免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において無刺激Ｂ型リンパ球の使用時に、前に記載した手順によって測定した分泌免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０倍またはそれより多く、より好ましくは少なくとも６０倍増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であると考えることもできる。
【００７５】
好ましくは、分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２またはＩＬ−４を加えない、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において無刺激Ｂ型リンパ球の使用時に、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０倍またはそれより多く、より好ましくは少なくとも３０倍増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＧ抗体の分泌を増大することが可能であると考えることができる；および分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２またはＩＬ−４を加えない、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＡアイソタイプ免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において無刺激Ｂ型リンパ球の使用時に、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＡアイソタイプ免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２倍またはそれより多く、より好ましくは少なくとも２４倍増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であると考えられる。
【００７６】
あるいは、分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２またはＩＬ−４を加える、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において無刺激Ｂ型リンパ球の使用時に、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも２０倍、好ましくは少なくとも２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０倍またはそれより多く、より好ましくは少なくとも６０倍増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＧ抗体の分泌を増大することが可能であると考えることができる；および分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、手順中にＩＬ−２またはＩＬ−４を加えない、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＡアイソタイプ免疫グロブリンの量が、他に同一な条件下において無刺激Ｂ型リンパ球の使用時に、前に記載した手順によって測定した分泌ＩｇＡアイソタイプ免疫グロブリンの量と比較して、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４倍またはそれより多く、より好ましくは少なくとも２４倍増大する場合、Ｂ細胞中のＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であると考えられる。
【００７７】
あるいは、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大する、タンパク質、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体の能力は、ヒトＢ細胞、好ましくはｅｘ  ｖｉｖｏにおける免疫グロブリンクラススイッチ組換えの誘導の確認および決定によって試験することができる。用語「免疫グロブリンクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）」は、１クラスから別のクラス、例えばＩｇＭアイソタイプからＩｇＧアイソタイプに、免疫グロブリン分子の重鎖を変える不可逆的ＤＮＡ編集の生物学的機構を指す。典型的には、望ましくない重鎖遺伝子座の染色体欠失、およびスイッチ結果を表す１個の残りの重鎖遺伝子座の再結合によって、成熟Ｂ細胞の適切な刺激後にＣＳＲが起こる。このプロセスは通常、酵素活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の発現と関係がある。用語「ＡＩＤの発現」は、酵素ＡＩＤがＢ細胞中で特異的に誘導されて、Ｂ細胞の適切な刺激によってＣＳＲを開始することを意味する。ＡＩＤは典型的にはＣＳＲ中に単鎖ＤＮＡ上のシチジン塩基からアミノ基を除去し、したがって一般に、ＣＳＲの主なレギュレーターおよびＣＳＲプロセスの開始に関するマーカーとして考えられる。典型的には、ＣＳＲ中の初期ステップは、生殖系列転写産物の生成および生殖系列転写の活性によって特徴付けられる。用語「生殖系列転写産物」は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座自体の一部分であり、かつ典型的には特定のスイッチ領域および対応する重鎖遺伝子座、例えばＳγ１とＣγ１またはＳαとＣαからなる転写産物を指す。したがって生殖系列転写は定量化し、ＣＳＲの方向および程度を決定するためのマーカーとして働くことが可能である。スイッチサークル転写産物が検出可能であることが好ましい。これらの転写産物はＣＳＲ事象を具体的に反映するからである。用語「サークル転写産物」は、それらの分解前に立体円からＣＳＲのＤＮＡ編集ステップ中に切除される重鎖遺伝子座を意味する。したがってサークル転写産物は、進行中ＣＳＲの検出に関して信頼可能なパラメーターを与える。
【００７８】
原則として、ヒトＢ細胞中の免疫グロブリンクラススイッチ組換えの誘導の決定は、当業者に知られている任意の適切な方法によって実施することができる。ヒトＢ細胞中の免疫グロブリンクラススイッチ組換えの誘導の決定は、Ｋｌａｐｐｅｒ  Ｗら、（２００６）．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０９（２）、２５０〜７に基づく方法を使用することによって、実施することができることが好ましい。
【００７９】
本発明の文脈において利用する典型的な方法は、最初のステップとして、好ましくはＫｒｅｈｅｒ  ＣＲら、（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２７８（１〜２）、７９〜９３に従うフィコール分離による、末梢静脈血からのヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の入手を含むことができる。これらの細胞は、１患者型、例えば健常個体、またはＣＶＩＤのような免疫障害を有する患者から、好ましくは１個体患者のみから、単に本発明の手順の目的で得ることができる。これらの細胞は、健常な患者型のみから得ることができることがより好ましい。用語「健常」は、患者が免疫障害、特にＣＶＩＤまたはＩｇＡＤに罹患していないことを意味する。健常な患者から得る細胞は、無刺激の場合ＩｇＧまたはＩｇＡを自発的に産生しない、またはごく微量のＩｇＧまたはＩｇＡを産生することがさらに好ましい。このような挙動は、例えば本明細書で以前または以降に記載するアッセイに基づく、当業者に知られている方法によって試験することができる。用語「微量」は、本明細書で記載するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、計数したスポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２中の表面に等しい全２００単位の限界を超える可能性がないことを意味する。あるいは、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧの産生に関して標準化した市販の細胞を使用することができる。
【００８０】
後に、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞およびＣＤ１３８陽性形質細胞を、任意の適切な方法によって、例えば好ましくは選択キット（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．などの市販のキット）を用いたナノ粒子ベースの免疫磁気細胞選択によって、ＰＢＭＣから単離することができる。次のステップでは、ＰＢＭＣまたは選択したＢ型リンパ球を、当業者に知られている任意の適切な培養培地中、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で培養することができる。培養用に、１×１０５〜２×１０６個の量の細胞（ＰＢＭＣまたは選択したＢ型リンパ球）を使用することができる。当業者に知られている任意の適切な手段によって、例えば細胞計数デバイスまたは機器、顕微鏡測定などによって、細胞の量を決定することができる。
【００８１】
培地は、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むことができることが好ましい。培地は、１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１０％の熱失活ウシ胎児血清を含むことができることがより好ましい。後に、本明細書で以前または以降に記載する試験対象のＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体を適量加えることができる。混合物中の最終濃度は、約０．１と２００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約０．５と１００ｎｇ／ｍｌの間であり得ることが好ましい。追加的に、本明細書で以前または以降に記載するＩＬ−２またはＩＬ−４を適量加えることができる。混合物中のこれらの化合物各々の最終濃度は、約０．１と２００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約０．５と１００ｎｇ／ｍｌの間であり得ることが好ましい。あるいは、ＩＬ−２とＩＬ−４の組合せを加えることもできる。この組合せを適量加えることができる。混合物中の組合せの最終濃度は、約０．１と２００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約０．５と１００ｎｇ／ｍｌの間であり得ることが好ましい。さらに、ＣＤ４０分子の刺激剤を適量加えることができる。抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣ４ＢＰを、適量加えることができることが好ましい。混合物中のこれらの化合物各々の最終濃度は、約０．５と４μｇ／ｍｌの間、より好ましくは約１と２μｇ／ｍｌの間であり得ることが好ましい。さらなるステップ中、当業者に知られている適切なインキュベーション温度、例えば３７℃で混合成分をインキュベートすることができる。インキュベーションは有利な雰囲気中で、好ましくは５％ＣＯ２の存在下で実施することができる。インキュベーションは、当業者に知られている適切な法則に従って実施することができる。インキュベーションは、２〜５日の期間実施することができることが好ましい。インキュベーションは４日の期間実施することができることがより好ましい。
【００８２】
後に、ＰＢＭＣまたは選択したＢ型リンパ球を、当業者に知られている任意の適切なバッファー、例えば滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ｓＰＢＳ）で洗浄する。その後、例えばＲＮＡ抽出キット、好ましくはＱＩＡＧＥＮ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅなどからの市販のキットを使用して、細胞にＲＮＡ抽出を施す。抽出は製造者の説明書に従い実施することができる。次いで抽出したＲＮＡを、例えば市販のｃＤＮＡキット、好ましくはＱＩＡＧＥＮ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅなどからのキットを使用することによって、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写することができる。後に、ｃＤＮＡにリアルタイムＰＣＲ分析、好ましくは定量リアルタイムＰＣＲを施すことができる。この分析用に、当業者に知られている任意の適切なプライマー配列を使用することができる。β−アクチンおよび／またはＡＩＤ発現ならびに生殖系列転写産物および／またはサークル転写産物の検出用に、配列特異的プライマーを利用することができることが好ましい。
【００８３】
より好ましくは、プライマー配列
β-アクチン-1          5’CCTGGGCATGGAGTCCTGTGG3’(配列番号17)
および
β-アクチン-2          5’CTGTGTTGGCGTACAGGTCTT3’(配列番号18)
をβ−アクチン発現の検出用に使用することができる。
【００８４】
プライマー配列
AID-1          5’CACAAACTCTTCCATCAGGC3’(配列番号19)
および
AID-2          5’CATCCCCACCCATAACAATC3’(配列番号20)
をＡＩＤ発現の検出用に使用することができる。
【００８５】
プライマー配列
Iγ-コンセンサス          5’CTCAGCCAGGACCAAGGACA3(配列番号21)、
Cγ-コンセンサス          5’ACCACGCTGCTGAGGGAGTA3’(配列番号22)、
Cμ-アンチセンス-1          5’AATCTGCCGGGGACTGAAAC3’(配列番号23)、
Iα-コンセンサス          5’TGAGTGGACCTGCCATGA3’(配列番号24)、
Cα-コンセンサス          5’CTGGGATTCGTGTAGTGCTT3’(配列番号25)、
および
Cμ-アンチセンス-2          5’CGTCTGTGCCTGCATGACG3’(配列番号26)
を生殖系列転写産物および／またはサークル転写産物の検出用に使用することができる。
【００８６】
さらにより好ましくは、配列Ｉγ−コンセンサス（配列番号２１）およびＣγ−コンセンサス（配列番号２２）を有するプライマー対をＩｇＧ生殖系列転写産物の発現の検出用に使用することができ、配列Ｉγ−コンセンサス（配列番号２１）およびＣμ−アンチセンス−１（配列番号２３）を有するプライマー対をＩｇＧスイッチサークル転写産物の発現の検出用に使用することができ、配列Ｉα−コンセンサス（配列番号２４）およびＣα−コンセンサス（配列番号２５）を有するプライマー対をＩｇＡ生殖系列転写産物の発現の検出用に使用することができ、かつ配列Ｉα−コンセンサス（配列番号２４）およびＣμ−アンチセンス−２（配列番号２６）を有するプライマー対はＩｇＡスイッチサークル転写産物の発現の検出用に使用することができる。
【００８７】
定量リアルタイムＰＣＲは、適切で公知の手順規則に従い、好ましくはＰＣＲ機器および／またはリアルタイムＰＣＲ装置およびキットに関する製造者の説明書、例えばＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．などからの説明書に従い実施することができる。
【００８８】
定量リアルタイムＰＣＲの結果は、当業者に知られている適切なコンピュータ装置およびソフトウェアによって入手および確認することができる。結果の質の追加的評価および異なるサンプルプローブ間の調節は、対照反応を実施することによって行うことができる。好ましくは、サンプル間標準化用のβ−アクチンの発現に関する対照反応を使用することができる。結果は任意の適切な形で、好ましくは所与のサンプル中で計算した候補ＲＮＡの量と、同じサンプル中で計算した対照β−アクチン遺伝子の量の比として表すことができる。
【００８９】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、ＡＩＤ発現、ＩｇＧまたはＩｇＡ生殖系列転写産物またはサークル転写産物を前に記載した試験に従い検出することができる場合、Ｂ細胞中のＩｇＧまたはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であると考えることができる。
【００９０】
好ましくは、分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、所与のサンプル中で計算した候補ＲＮＡの量と、同じサンプル中で計算した対照β−アクチン遺伝子の量の比として測定したＡＩＤの発現率が、少なくとも６を超える、好ましくは７を超える、およびより好ましくは８を超える場合、所与のサンプル中で計算した候補ＲＮＡの量と、同じサンプル中で計算した対照β−アクチン遺伝子の量の比として測定したＩｇＧ生殖系列転写産物の発現率が、少なくとも８を超える、好ましくは９を超える、およびより好ましくは１０を超える場合、または所与のサンプル中で計算した候補ＲＮＡの量と、同じサンプル中で計算した対照β−アクチン遺伝子の量の比として測定したＩｇＧスイッチサークル転写産物の発現率が、少なくとも３を超える、好ましくは４を超える、およびより好ましくは５を超える場合、Ｂ細胞中のＩｇＧ抗体の分泌を増大することが可能であると考えることができる。
【００９１】
好ましくは、分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、所与のサンプル中で計算した候補ＲＮＡの量と、同じサンプル中で計算した対照β−アクチン遺伝子の量の比として測定したＩｇＡ生殖系列転写産物の発現率が、少なくとも３を超える、好ましくは４を超える、およびより好ましくは５を超える場合、または所与のサンプル中で計算した候補ＲＮＡの量と、同じサンプル中で計算した対照β−アクチン遺伝子の量の比として測定したＩｇＡスイッチサークル転写産物の発現率が、少なくとも１を超える、好ましくは２を超える、およびより好ましくは３を超える場合、Ｂ細胞中のＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であると考えることができる。
【００９２】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体が、Ｂ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能であるかどうか決定するための試験は、本明細書で前に記載した試験であることが好ましく、実施例中に記載した試験であることがより好ましい。
【００９３】
用語「ＩＬ−２受容体複合体と結合可能」は、本発明によるＩＬ−２１変異体タンパク質またはＩＬ−２１変異体が、ＩＬ−２Ｒとγｃの受容体複合体と結合することができることを意味する（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−２１ＲおよびＩＬ−２Ｒβおよびγｃの間の相互作用を示す図２を参照）。ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２受容体複合体の結合は、等モル量の組換えヒトＩＬ−２アルファ受容体、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能であるＩＬ−２アルファ受容体の添加によって改変された、当業者に知られている任意の適切な方法、例えば本明細書に記載するアッセイによって試験することができる。好ましい例は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能である組換えヒトＩＬ−２Ｒα／Ｆｃキメラである。典型的には、このような手法中、本発明によるＩＬ−２１変異体の影響は、組換えＩＬ−２受容体と結合するその能力と共に直線的に低下する可能性がある。対照として、任意の適切なタンパク質、好ましくはヒト野生型ＩＬ−２１、より好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２、好ましくは配列番号３において定義されるＩＬ−２、またはＢＳＡのような無関連タンパク質を使用することができる。
【００９４】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、任意の適切な方法により測定して、より好ましくは前に記載した手順により測定して、野生型ＩＬ−２１、好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１とＩＬ−２受容体複合体の結合能力が、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％、７５０％、１０００％、２０００％、５０００％、７５００％、１０，０００％またはそれより多く増大する場合、または少なくとも５、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、５０００、１００００、１０００００、５０００００、１０６倍またはそれより多く増大する場合、ＩＬ−２受容体複合体と結合することができると考えられる。
【００９５】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、任意の適切な方法により測定して、より好ましくは前に記載した手順により測定して、前記ＩＬ−２１変異体が、少なくとも約０．２％、好ましくは少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３３％、３５％、３７％、４０％、４３％、４５％、４７％、５０％、５３％、５５％、５７％、６０％、６３％、６５％、６７％、７０％または７５％またはそれより多くの親和性の野生型ＩＬ−２、好ましくは配列番号３において定義されるＩＬ−２とＩＬ−２受容体複合体の親和性で、ＩＬ−２受容体複合体と結合することができる場合、ＩＬ−２受容体複合体と結合することができると考えることもできる。
【００９６】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、前記ＩＬ−２１変異体が、少なくとも約１．０×１０−６Ｍ、２．０×１０−６Ｍ、３．０×１０−６Ｍ、５．０×１０−６Ｍ、７．５×１０−６Ｍ、１．０×１０−７Ｍ、２．０×１０−７Ｍ、３．０×１０−７Ｍ、４．０×１０−７Ｍ、５．０×１０−７Ｍ、６．０×１０−７Ｍ、７．０×１０−７Ｍ、８．０×１０−７Ｍ、９．０×１０−７Ｍ、１．０×１０−８Ｍ、２．０×１０−８Ｍ、３．０×１０−８Ｍ、４．０×１０−８Ｍ、５．０×１０−８Ｍ、６．０×１０−８Ｍ、７．０×１０−８Ｍ、８．０×１０−８Ｍ、９．０×１０−８Ｍ、１．０×１０−９Ｍ、２．０×１０−９Ｍ、３．０×１０−９Ｍ、４．０×１０−９Ｍ、５．０×１０−９Ｍ、６．０×１０−９Ｍ、７．０×１０−９Ｍ、８．０×１０−９Ｍ、９．０×１０−９Ｍ、１．０×１０−１０Ｍ、２．０×１０−１０Ｍ、３．０×１０−１０Ｍ、４．０×１０−１０Ｍ、５．０×１０−１０Ｍ、６．０×１０−１０Ｍ、７．０×１０−１０Ｍ、８．０×１０−１０Ｍ、９．０×１０−１０Ｍ、１．０×１０−１１Ｍ、２．０×１０−１１Ｍ、３．０×１０−１１Ｍ、４．０×１０−１１Ｍ、５．０×１０−１１Ｍ、６．０×１０−１１Ｍ、７．０×１０−１１Ｍ、８．０×１０−１１Ｍ、または９．０×１０−１１Ｍの親和性、すなわち解離定数（Ｋｄ）で、ＩＬ−２受容体複合体と結合することができる場合、ＩＬ−２受容体複合体と結合することができると考えることもできる。親和性は、当業者に知られている任意の適切な方法に従い、例えばＦｒａｎｋｅｌら、（１９７９）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６：１０１〜１０６により記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ法の改変に従い、または競合ラジオイムノアッセイによって、またはＥＬＩＳＡ試験によって測定および計算することができる。
【００９７】
用語「ＩＬ−４受容体複合体と結合可能」は、本発明によるＩＬ−２１変異体タンパク質またはＩＬ−２１変異体が、ＩＬ−４Ｒとγｃの受容体複合体と結合することができることを意味する（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒおよびγｃの間の相互作用を示す図２を参照）。ＩＬ−２１変異体とＩＬ−４受容体複合体の結合は、等モル量の組換えヒトＩＬ−４アルファ受容体、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能であるＩＬ−４アルファ受容体の添加によって改変された、当業者に知られている任意の適切な方法、例えば本明細書に記載するアッセイによって試験することができる。好ましい例は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能である組換えヒトＩＬ−４Ｒα／Ｆｃキメラである。典型的には、このような手法中、本発明によるＩＬ−２１変異体の影響は、組換えＩＬ−４受容体と結合するその能力と共に直線的に低下する可能性がある。対照として、任意の適切なタンパク質、好ましくはヒト野生型ＩＬ−２１、より好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−４、好ましくは配列番号２において定義されるＩＬ−４、またはＢＳＡのような無関連タンパク質を使用することができる。
【００９８】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、任意の適切な方法により測定して、より好ましくは前に記載した手順により測定して、野生型ＩＬ−２１、好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１とＩＬ−４受容体複合体の結合能力が、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％、７５０％、１０００％、２０００％、５０００％、７５００％、１０，０００％またはそれより多く増大する場合、または少なくとも５、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、５０００、１００００、１０００００、５０００００、１０６倍またはそれより多く増大する場合、ＩＬ−４受容体複合体と結合することができると考えられる。
【００９９】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、任意の適切な方法により測定して、より好ましくは前に記載した手順により測定して、前記ＩＬ−２１変異体が、少なくとも約０．２％、好ましくは少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３３％、３５％、３７％、４０％、４３％、４５％、４７％、５０％、５３％、５５％、５７％、６０％、６３％、６５％、６７％、７０％または７５％またはそれより多くの親和性の野生型ＩＬ−４、好ましくは配列番号２において定義されるＩＬ−４とＩＬ−４受容体複合体の親和性で、ＩＬ−４受容体複合体と結合することができる場合、ＩＬ−４受容体複合体と結合することができると考えることもできる。
【０１００】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、前記ＩＬ−２１変異体が、少なくとも約１．０×１０−６Ｍ、２．０×１０−６Ｍ、３．０×１０−６Ｍ、５．０×１０−６Ｍ、７．５×１０−６Ｍ、１．０×１０−７Ｍ、２．０×１０−７Ｍ、３．０×１０−７Ｍ、４．０×１０−７Ｍ、５．０×１０−７Ｍ、６．０×１０−７Ｍ、７．０×１０−７Ｍ、８．０×１０−７Ｍ、９．０×１０−７Ｍ、１．０×１０−８Ｍ、２．０×１０−８Ｍ、３．０×１０−８Ｍ、４．０×１０−８Ｍ、５．０×１０−８Ｍ、６．０×１０−８Ｍ、７．０×１０−８Ｍ、８．０×１０−８Ｍ、９．０×１０−８Ｍ、１．０×１０−９Ｍ、２．０×１０−９Ｍ、３．０×１０−９Ｍ、４．０×１０−９Ｍ、５．０×１０−９Ｍ、６．０×１０−９Ｍ、７．０×１０−９Ｍ、８．０×１０−９Ｍ、９．０×１０−９Ｍ、１．０×１０−１０Ｍ、２．０×１０−１０Ｍ、３．０×１０−１０Ｍ、４．０×１０−１０Ｍ、５．０×１０−１０Ｍ、６．０×１０−１０Ｍ、７．０×１０−１０Ｍ、８．０×１０−１０Ｍ、９．０×１０−１０Ｍ、１．０×１０−１１Ｍ、２．０×１０−１１Ｍ、３．０×１０−１１Ｍ、４．０×１０−１１Ｍ、５．０×１０−１１Ｍ、６．０×１０−１１Ｍ、７．０×１０−１１Ｍ、８．０×１０−１１Ｍ、または９．０×１０−１１Ｍの親和性、すなわち解離定数（Ｋｄ）で、ＩＬ−４受容体複合体と結合することができる場合、ＩＬ−４受容体複合体と結合することができると考えることもできる。親和性は、当業者に知られている任意の適切な方法に従い、例えばＦｒａｎｋｅｌら、（１９７９）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６：１０１〜１０６により記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ法の改変に従い、または競合ラジオイムノアッセイによって、またはＥＬＩＳＡ試験によって測定および計算することができる。
【０１０１】
用語「ＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体と結合可能」は、本発明によるＩＬ−２１変異体タンパク質またはＩＬ−２１変異体が、ＩＬ−２Ｒとγｃの受容体複合体と、ＩＬ−４Ｒとγｃの受容体複合体の両方と結合することができることを意味する。ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体の結合は、当業者に知られている任意の適切な方法、例えば本明細書で前に記載したアッセイによって試験することができる。対照として、任意の適切なタンパク質、好ましくはヒト野生型ＩＬ−２１、より好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−４、好ましくは配列番号２において定義されるＩＬ−４、ＩＬ−２、好ましくは配列番号３において定義されるＩＬ−２、またはＢＳＡのような無関連タンパク質を使用することができる。
【０１０２】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、任意の適切な方法により測定して、より好ましくは前に記載した手順により測定して、野生型ＩＬ−２１、好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１とＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体の平均結合能力が、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％、７５０％、１０００％、２０００％、５０００％、７５００％、１０，０００％またはそれより多く増大する場合、または少なくとも５、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、５０００、１００００、１０００００、５０００００、１０６倍またはそれより多く増大する場合、ＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体と結合することができると考えられる。
【０１０３】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、任意の適切な方法により測定して、より好ましくは前に記載した手順により測定して、前記ＩＬ−２１変異体が、少なくとも約０．２％、好ましくは少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３３％、３５％、３７％、４０％、４３％、４５％、４７％、５０％、５３％、５５％、５７％、６０％、６３％、６５％、６７％、７０％または７５％またはそれより多くの親和性の野生型ＩＬ−２、好ましくは配列番号３において定義されるＩＬ−２とＩＬ−２受容体複合体、またはＩＬ−４、好ましくは配列番号２において定義されるＩＬ−４とＩＬ−４受容体複合体の平均親和性で、それぞれＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体と結合することができる場合、ＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体と結合することができると考えることもできる。
【０１０４】
分子、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、前記ＩＬ−２１変異体が、少なくとも約１．０×１０−６Ｍ、２．０×１０−６Ｍ、３．０×１０−６Ｍ、５．０×１０−６Ｍ、７．５×１０−６Ｍ、１．０×１０−７Ｍ、２．０×１０−７Ｍ、３．０×１０−７Ｍ、４．０×１０−７Ｍ、５．０×１０−７Ｍ、６．０×１０−７Ｍ、７．０×１０−７Ｍ、８．０×１０−７Ｍ、９．０×１０−７Ｍ、１．０×１０−８Ｍ、２．０×１０−８Ｍ、３．０×１０−８Ｍ、４．０×１０−８Ｍ、５．０×１０−８Ｍ、６．０×１０−８Ｍ、７．０×１０−８Ｍ、８．０×１０−８Ｍ、９．０×１０−８Ｍ、１．０×１０−９Ｍ、２．０×１０−９Ｍ、３．０×１０−９Ｍ、４．０×１０−９Ｍ、５．０×１０−９Ｍ、６．０×１０−９Ｍ、７．０×１０−９Ｍ、８．０×１０−９Ｍ、９．０×１０−９Ｍ、１．０×１０−１０Ｍ、２．０×１０−１０Ｍ、３．０×１０−１０Ｍ、４．０×１０−１０Ｍ、５．０×１０−１０Ｍ、６．０×１０−１０Ｍ、７．０×１０−１０Ｍ、８．０×１０−１０Ｍ、９．０×１０−１０Ｍ、１．０×１０−１１Ｍ、２．０×１０−１１Ｍ、３．０×１０−１１Ｍ、４．０×１０−１１Ｍ、５．０×１０−１１Ｍ、６．０×１０−１１Ｍ、７．０×１０−１１Ｍ、８．０×１０−１１Ｍ、または９．０×１０−１１Ｍの平均親和性、すなわち解離定数（Ｋｄ）で、ＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体と結合することができる場合、ＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体と結合することができると考えることもできる。
【０１０５】
さらなる好ましい実施形態では、本発明によるＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、ＩｇＧおよび／またはＩｇＡの分泌を増大することが可能であり、ＩＬ−２受容体複合体および／またはＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能である。さらなる好ましい実施形態では、本発明によるＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、ＩｇＧの分泌を増大することが可能であり、ＩＬ−２受容体複合体を結合させることが可能である。さらなる好ましい実施形態では、本発明によるＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、ＩｇＧの分泌を増大することが可能であり、ＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能である。さらなる好ましい実施形態では、本発明によるＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、ＩｇＡの分泌を増大することが可能であり、ＩＬ−２受容体複合体を結合させることが可能である。さらなる好ましい実施形態では、本発明によるＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、ＩｇＡの分泌を増大することが可能であり、ＩＬ−４受容体複合体を結合させることが可能である。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態では、ＩＬ−２受容体複合体および／またはＩＬ−４受容体複合体を結合することが可能である本発明によるＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、ＩＬ−２１受容体複合体、ＩＬ−２受容体複合体および／またはＩＬ−４受容体複合体に対してアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストおよび／または部分的アンタゴニスト効果を発揮することがさらに可能である。好ましい実施形態では、前記ＩＬ−２１変異体は、ＩＬ−２１受容体複合体およびＩＬ−２受容体複合体、またはＩＬ−２１受容体複合体およびＩＬ−４受容体複合体に対して部分的アゴニスト効果を発揮することができる。本明細書で使用する用語「部分的アゴニスト」または「部分的アンタゴニスト」は、完全アゴニスト、例えばそれぞれＩＬ−２１、ＩＬ−２またはＩＬ−４受容体複合体の同系または野生型リガンドの効果未満、または前記受容体複合体の完全アンタゴニストの効果未満である、ＩＬ−２１変異体のアゴニストまたはアンタゴニスト効果を指す。本明細書で使用する用語「未満」は、前述の完全アゴニストまたはアンタゴニスト効果の少なくとも９０％、８５％、７５％、６０％、５０％、４０％、２０％、１０％、５％、１％または０．５％の効果を指すことができることが好ましい。
【０１０７】
本発明の目的で、「ＩＬ−２１変異体」はシグナル配列を含むことができ、またはシグナル配列を含むことができない。ＩＬ−２１変異体がシグナル配列を含む場合、それはＩＬ−２１シグナル配列を典型的に含み得る。用語「ＩＬ−２１シグナル配列」は、配列番号４の位置１〜２９のアミノ酸において示す２９アミノ酸のシグナル配列に関する。あるいは、「ＩＬ−２１変異体」は、当業者に知られている任意の他の適切なシグナル配列、例えばＩＬ−２またはＩＬ−４のシグナル配列を含むこともできる。用語「ＩＬ−２のシグナル配列」は、配列番号５の位置１〜２０のアミノ酸において示す２０アミノ酸のシグナル配列に関する。用語「ＩＬ−４のシグナル配列」は、配列番号６の位置１〜２４のアミノ酸において示す２４アミノ酸のシグナル配列に関する。
【０１０８】
ＩＬ−２１変異体の文脈において使用する用語「誘導」は、ヒトＩＬ−２１が、１つまたは複数のアミノ酸および／または１つまたは複数のアミノ酸のストレッチと、他のインターロイキン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−４の１つまたは複数のアミノ酸および／または１つまたは複数のアミノ酸のストレッチの置換によって修飾されることを意味する。置換されるアミノ酸は、ＩＬ−２１分子中の任意の位置、例えばＮ末端、Ｃ末端、または中心部分に位置してよい。置換されるアミノ酸は、ヘリックス部分、ベータシート、ベータ架橋、結合ターンまたはベンドのような、任意の典型的な二次または３次元タンパク質構造中に位置するアミノ酸を含むことができる。用語「二次タンパク質構造」は、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ＤＳＳＰ；Ｋａｂｓｃｈ  Ｗら、（１９８３）．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２（１２）、２５７７〜２６３７）中で定義された３次元タンパク質構造に関することが好ましい。ＤＳＳＰ法によれば、タンパク質の二次構造は典型的には一文字コードで記載される。二次構造は、水素結合パターンに基づいて割り当てることができる。典型的には、ＤＳＳＰ法が記載する８型の二次構造が存在する。Ｇ＝３残基の最小長を有する３ターンヘリックス（３１０ヘリックス）。Ｈ＝４残基の最小長を有する４ターンヘリックス（αヘリックス）。Ｉ＝５残基の最小長を有する５ターンヘリックス（πヘリックス）。Ｔ＝水素結合ターン（３、４または５ターン）。Ｅ＝２残基の最小長を有するパラレルおよび／またはアンチパラレルβシート立体配座中の延長鎖。Ｂ＝単離β架橋中の残基（一対のβシート水素結合形成）およびＳ＝ベンド（割り当てに基づく唯一の非水素結合）。前述の立体配座のいずれでもないアミノ酸残基は、Ｃ（ｃｏｉｌ）として典型的に分類される第８型の「Ｃｏｉｌ」として割り当てる。ヘリックス（Ｇ、ＨおよびＩ）およびシート立体配座は妥当な長さを有することを通常必要とする。したがって、一次構造中の２つの隣接残基は同じ水素結合パターンを形成しなければならない。ヘリックスまたはシート水素結合パターンが短すぎる場合、それらは各々ＴまたはＢとして指定する。
【０１０９】
タンパク質、例えばＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２もしくはＩＬ−４、またはＩＬ−２もしくはＩＬ−４の任意の変異体などの二次構造は、当業者に知られている適切な方法によって予想することができる。典型的には、個々のアミノ酸のヘリックスまたはシート形成の性質に基づく、場合によっては形成二次構造要素の遊離エネルギーを推定するための法則と関係がある、二次構造予想の方法を使用することができる。さらに、多数の配列アラインメントを利用することができ、したがって、１つの位置およびその近辺に存在するアミノ酸、典型的には進化における片側の約７残基の完全な分布を使用することができる。さらなる典型的な予想手法は、特定の位置および近隣位置における平均疎水性または残基の溶媒接触性の調査である。アラインメントデータと疎水性または残基の溶媒接触性データを組合せることによって、予想の精度を高めることができる。典型的には、ニューラルネットワーク、隠れマルコフモデルおよびサポートベクターマシンを含めた数学的方法を、タンパク質の二次構造の予想に使用することができる。
【０１１０】
ＩＬ−２１中の置換されたアミノ酸は、修飾ポリペプチドがＢ細胞中のＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大することが可能である限り、任意の数のアミノ酸を含むことができる。好ましくは、置換アミノ酸の数はＩＬ−２１の全アミノ酸の約０．５％と約５０％の間、より好ましくはＩＬ−２１の全アミノ酸の約５％と４０％の間、およびさらにより好ましくはＩＬ−２１の全アミノ酸の約１０％と３０％の間である。さらなる実施形態では、置換アミノ酸の数は本明細書で前に定義した一型の二次構造の約１％と約９０％の間、好ましくはヘリックス構造の約１％と約６０％の間、より好ましくはＨ構造またはαヘリックスの約１％と約６０％の間である。
【０１１１】
ＩＬ−２１中の置換されたアミノ酸は、ＩＬ−２１のアミノ酸の１つまたは複数のストレッチ中に存在する可能性がある。置換は１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ストレッチ中で実施することが好ましい。本発明は、最大約１００個までの、より多くのＩＬ−２１のアミノ酸のストレッチの置換も包含する。用語「アミノ酸のストレッチ」は、少なくとも２つの隣接アミノ酸のいくつかを指す。アミノ酸のストレッチは、タンパク質、例えばＩＬ−２１の全数の隣接アミノ酸も包含し得る。好ましくは、置換されるアミノ酸のストレッチは、約３個と６０個の間の隣接アミノ酸、より好ましくは約５個と４０個の間の隣接アミノ酸、およびさらにより好ましくは約１０個と３０個の間の隣接アミノ酸長である。
【０１１２】
２個以上のアミノ酸のストレッチがＩＬ−２１中で置換される場合、ストレッチは接近状態、例えば１、２もしくは３個のアミノ酸のみが脱着する、またはＩＬ−２１一次構造の反対端に位置するかのいずれかであり得る。あるいは、ストレッチはＩＬ−２１一次構造中の任意の場所に位置する可能性がある。本明細書で前に示した用語「一次構造」は、その原子組成、およびこれらの原子を結びつける化学結合によるタンパク質またはポリペプチドの正確な仕様を指す。
【０１１３】
置換されるストレッチがＩＬ−２１一次構造中の任意の場所に位置する場合、ストレッチはＩＬ−２１の二次および／または三次構造と接近状態で位置する可能性がある、または可能性がない。本明細書で前に示した用語「三次構造」は、その原子座標によって定義したタンパク質またはポリペプチドの三次元構造を指す。典型的には、タンパク質、例えばＩＬ−２１の三次構造は、結晶解析またはＮＭＲ分光分析によって得ることができる。あるいは、本発明のさらなる実施形態では、置換されるいくつかのアミノ酸のストレッチは異なる３次元位置もしくは領域で分類することができる、例えば、タンパク質の１つまたは複数の３次元領域もしくは位置において置換されるアミノ酸のストレッチの１つまたは複数の集団が存在し得る。
【０１１４】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、置換されるアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ＩＬ−２１とその同系受容体、好ましくはＩＬ−２１Ｒおよびγｃの受容体複合体との結合を担うＩＬ−２１の部分中に存在する（例えば、ＩＬ−２１とＩＬ−２Ｒとγｃの間の相互作用を示す図２を参照）。用語「ＩＬ−２１とその同系受容体の結合を担うＩＬ−２１の部分」は、ＮＭＲ分光分析試験によってＩＬ−２１受容体の結合に関与することが示されたヒトＩＬ−２１の３次元部分に関する（Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  Ｋら、（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３２）、２３３２６〜３６）。ＩＬ−２１とその同系受容体の結合を担うＩＬ−２１のこのような部分の例は、ＮＭＲ分光分析試験またはアッセイにおいて突出を示すＩＬ−２１のヘリックスまたはヘリックス間部分である。置換されるアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、１つまたは複数のＩＬ−２１の空間的に共存するヘリックス領域中に存在することができることが好ましい。用語「ＩＬ−２１の空間的に共存するヘリックス領域」は、タンパク質の３次元構造中で特に共存するとして、ＩＬ−２１の構造データから誘導可能または予想可能であるＩＬ−２１の部分に関する。置換されるアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ＩＬ−２１の空間的に共存するヘリックス領域全体、または約０．５％と９５％の間のＩＬ−２１の空間的に共存するヘリックス領域、好ましくは約２０〜６０％のＩＬ−２１の空間的に共存するヘリックス領域を含むことができる。ＩＬ−２１の空間的に共存するヘリックス領域を定義するための方法は当業者には知られていると思われ、または任意の適切な構造生物学教本から導くことができる。ＩＬ−２１の空間的に共存するヘリックス領域の定義に関する具体的な詳細は、Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  Ｋら、（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３２）、２３３２６〜３６から導くことができる。
【０１１５】
本発明のさらなる実施形態では、置換されるアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  Ｋら、（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３２）、２３３２６〜３６中に定義されたようにヘリックス領域Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ中に存在し得る。代替的または追加的に、置換されるアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  Ｋら、（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３２）、２３３２６〜３６中に定義されたように領域Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ間のヘリックス間領域またはターン中に存在し得る。より好ましくは、置換されるアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ヘリックスＣ中およびヘリックスＣとＤの間のヘリックス間ループ中に存在し得る。
【０１１６】
本発明の特に好ましい実施形態では、ＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ＩＬ−２１受容体との結合に関与するヘリックスの少なくとも１つが修飾によって影響を受けない、好ましくは構造変化によって影響を受けない方法で置換することができる。より好ましくは、ＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、少なくともＩＬ−２１のヘリックスＡもしくはヘリックスＣ、またはヘリックスＡおよびヘリックスＣが修飾によって影響を受ける可能性がない、好ましくは構造変化によって影響を受ける可能性がない方法で置換することができる。さらにより好ましくは、ＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチのこのような置換は、修飾ＩＬ−２１タンパク質または変異体が本明細書で前に定義したＩＬ−２１受容体複合体と結合することができるように実施することができる。ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２１受容体複合体の結合は、当業者に知られている任意の適切な方法によって試験することができる。好ましくは、ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２１受容体複合体の結合は、等モル量の組換えヒトＩＬ−２１受容体、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能であるＩＬ−２１受容体の添加によって改変された、本明細書で前に記載したアッセイ中で試験することができる。好ましい例は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能である組換えヒトインターロイキン２１受容体／Ｆｃキメラである。典型的には、このような手法中、本発明によるＩＬ−２１変異体の影響は、組換えＩＬ−２１受容体と結合するその能力と共に直線的に低下する可能性がある。対照として、任意の適切なタンパク質、好ましくはヒト野生型ＩＬ−２１、より好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１を使用することができる。対応する修飾は、Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  Ｋら、（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３２）、２３３２６〜３６中に与えられた構造データから誘導することができる。
【０１１７】
本発明のさらなる、特に好ましい実施形態では、ＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ＩＬ−２１受容体との結合に関与する少なくとも１つ、好ましくは２つのヘリックスが修飾によって影響を受ける、好ましくは構造変化によって影響を受ける方法で置換することができる。より好ましくは、ＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、少なくともＩＬ−２１のヘリックスＡもしくはヘリックスＣ、またはヘリックスＡおよびヘリックスＣが修飾によって影響を受ける可能性がある、好ましくは構造変化によって影響を受ける可能性がある方法で置換することができる。さらにより好ましくは、ＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチのこのような置換は、修飾ＩＬ−２１タンパク質または変異体が本明細書で前に定義したＩＬ−２１受容体複合体と結合することができるように実施することができる。ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２１受容体複合体の結合は、当業者に知られている任意の適切な方法によって試験することができる。好ましくは、ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２１受容体複合体の結合は、等モル量の組換えヒトＩＬ−２１受容体、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能であるＩＬ−２１受容体の添加によって改変された、本明細書で前に記載したアッセイ中で試験することができる。好ましい例は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能である組換えヒトインターロイキン２１受容体／Ｆｃキメラである。典型的には、このような手法中、本発明によるＩＬ−２１変異体の影響は、組換えＩＬ−２１受容体と結合するその能力と共に直線的に低下する可能性がある。対照として、任意の適切なタンパク質、好ましくはヒト野生型ＩＬ−２１、より好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１を使用することができる。
【０１１８】
さらなる実施形態では、ＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチのこのような置換は、修飾ＩＬ−２１タンパク質または変異体が本明細書で以下に定義するＩＬ−２またはＩＬ−４受容体複合体とさらに結合することができる、あるいは本明細書で以下に定義するＩＬ−２およびＩＬ−４受容体複合体と結合することができるように実施することができる。ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２１、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４受容体複合体の結合は、当業者に知られている任意の適切な方法によって試験することができる。好ましくは、ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２１、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４受容体複合体の結合は、等モル量の組換えヒトＩＬ−２１受容体、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能であるＩＬ−２１受容体、組換えヒトＩＬ−２アルファ受容体、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能であるＩＬ−２アルファ受容体、または組換えヒトＩＬ−４アルファ受容体、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能であるＩＬ−４アルファ受容体の添加によって改変された、本明細書で前に記載したアッセイ中で試験することができる。好ましい例は、いずれもＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから入手可能である、組換えヒトインターロイキン２１受容体／Ｆｃキメラ、組換えヒトＩＬ−２Ｒα／Ｆｃキメラおよび組換えヒトＩＬ−４Ｒα／Ｆｃキメラである。典型的には、このような手法中、本発明によるＩＬ−２１変異体の影響は、組換えＩＬ−２１、ＩＬ−２またはＩＬ−４受容体と結合するその能力と共に直線的に低下する可能性がある。対照として、任意の適切なタンパク質、好ましくはヒト野生型ＩＬ−２１、より好ましくは配列番号１において定義されるＩＬ−２１を使用することができる。対応する修飾は、Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  Ｋら、（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３２）、２３３２６〜３６、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１、Ｚｈａｎｇ  ＪＬら、（２００２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３１５（３）、３９９〜４０７；Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３；およびＲｉｃｋｅｒｔ  Ｍら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０８（５７２７）、１４７７〜８０中に与えられた構造データから誘導することができる。
【０１１９】
本明細書で前に示した用語「置換」または「の代わり」は、ＩＬ−２１の特定数のアミノ酸が、ＩＬ−２またはＩＬ−４由来の同数のアミノ酸によって置換されることを意味する。この用語は、より多数または少数のＩＬ−２またはＩＬ−４のアミノ酸による、ＩＬ−２１の特定数のアミノ酸の置換も包含する。ＩＬ−２１タンパク質に組み込まれるアミノ酸のストレッチは、最大３５％、好ましくは２５％を超えずに、およびさらにより好ましくは２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、３％、２％または１％を超えずに、配列番号１において定義されるタンパク質の大きさを増大することができる。あるいは、ＩＬ−２１タンパク質に組み込まれるアミノ酸のストレッチは、最大３５％、好ましくは２５％を超えずに、およびさらにより好ましくは２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、３％、２％または１％を超えずに、配列番号１において定義されるタンパク質の大きさを低減することもできる。
【０１２０】
用語「ＩＬ−２１のアミノ酸の置換におけるＩＬ−４のアミノ酸のストレッチ」は、ＩＬ−４からＩＬ−２１に移行する、１つまたは複数のＩＬ−４のアミノ酸、好ましくはＩＬ−４の少なくとも２つの隣接アミノ酸のいくつかを指す。アミノ酸のストレッチは、ＩＬ−４の全数の隣接アミノ酸を包含する可能性もある。好ましくは、ＩＬ−２１のアミノ酸に置換されるＩＬ−４のアミノ酸のストレッチは、約３個と６０個の間の隣接アミノ酸、より好ましくは約５個と４０個の間の隣接アミノ酸、およびさらにより好ましくは約１０個と３０個の間の隣接アミノ酸長である。
【０１２１】
ＩＬ−２１に移行するまたはＩＬ−２１アミノ酸に置換されるＩＬ−４のアミノ酸はＩＬ−４分子中の任意の位置、例えばＮ末端、Ｃ末端、または中心部分に位置してよい。移行するＩＬ−４のアミノ酸は、ヘリックス部分、ベータシート、ベータ架橋、結合ターンまたはベンドのような、任意の典型的な二次または３次元タンパク質構造中に位置するアミノ酸を含むことができる。
【０１２２】
ＩＬ−２１に移行するＩＬ−４のアミノ酸の数は、好ましくはＩＬ−４の全アミノ酸の約０．５％と約５０％の間、より好ましくはＩＬ−４の全アミノ酸の約５％と４０％の間、およびさらにより好ましくはＩＬ−４の全アミノ酸の約１０％と３０％の間であってよい。さらなる実施形態では、置換アミノ酸の数は、本明細書で前に定義したＩＬ−４の二次構造の一型の約１％と約９０％の間、好ましくはＩＬ−４のヘリックス構造の約１％と約６０％の間、より好ましくはＩＬ−４のＨ構造またはαヘリックスの約１％と約６０％の間であってよい。
【０１２３】
ＩＬ−４からＩＬ−２１に移行するアミノ酸は、ＩＬ−４のアミノ酸の１つまたは複数のストレッチ中に存在する可能性がある。移行または置換は、ＩＬ−４のアミノ酸の１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ストレッチ中で実施することができることが好ましい。本発明は、最大約１００個までの、より多くのＩＬ−４のアミノ酸のストレッチの置換も包含する。
【０１２４】
２個以上のアミノ酸のストレッチがＩＬ−４から移行する場合、ストレッチは接近状態の位置から誘導される、例えば１、２もしくは３個のアミノ酸のみが脱着する、またはＩＬ−４一次構造の反対端に位置する場所から誘導される可能性がある。あるいは、ストレッチはＩＬ−４一次構造中の任意の場所に位置する可能性がある。
【０１２５】
ＩＬ−２１に移行するストレッチがＩＬ−４一次構造中の任意の場所に位置する場合、ストレッチはＩＬ−４の二次および／または三次構造と接近状態で位置する可能性がある、または可能性がない。典型的には、ＩＬ−４の三次構造は、結晶解析またはＮＭＲ分光分析によって得ることができる。あるいは、本発明のさらなる実施形態では、ＩＬ−４からＩＬ−２１に移行するいくつかのアミノ酸のストレッチはＩＬ−４の異なる３次元位置もしくは領域で分類することができる、例えば、タンパク質の１つまたは複数の３次元領域もしくは位置に移行するアミノ酸のストレッチの１つまたは複数の集団が存在し得る。
【０１２６】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、移行するＩＬ−４のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ＩＬ−４とその同系受容体、好ましくはＩＬ−４Ｒおよびγｃの受容体複合体との結合を担うＩＬ−４の部分中に存在する（例えば、ＩＬ−４とＩＬ−４Ｒとγｃの間の相互作用を示す図２を参照）。用語「ＩＬ−４とその同系受容体の結合を担うＩＬ−４の部分」は、結晶学的試験によってＩＬ−４受容体の結合に関与することが示されたヒトＩＬ−４の３次元部分に関する（Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１、およびＺｈａｎｇ  ＪＬら、（２００２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３１５（３）、３９９〜４０７）。ＩＬ−４とその同系受容体の結合を担うＩＬ−４のこのような部分の例は、結晶学的試験またはアッセイにおいて突出を示すＩＬ−２１のヘリックスまたはヘリックス間部分である。置換されるアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、１つまたは複数のＩＬ−４の空間的に共存するヘリックス領域中に存在することができることが好ましい。用語「ＩＬ−４の空間的に共存するヘリックス領域」は、タンパク質の３次元構造中で特に共存するとして、ＩＬ−４の構造データから誘導可能または予想可能であるＩＬ−４の部分に関する。移行するアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ＩＬ−４の空間的に共存するヘリックス領域全体、または約０．５％と９５％の間のＩＬ−４の空間的に共存するヘリックス領域、好ましくは約２０〜６０％のＩＬ−４の空間的に共存するヘリックス領域を含むことができる。ＩＬ−４の空間的に共存するヘリックス領域を定義するための方法は当業者には知られていると思われ、または任意の適切な構造生物学教本から導くことができる。ＩＬ−４の空間的に共存するヘリックス領域の定義に関する具体的な詳細は、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１、およびＺｈａｎｇ  ＪＬら、（２００２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３１５（３）、３９９〜４０７から導くことができる。
【０１２７】
好ましい実施形態では、本明細書で前に定義したＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチを、配列番号２において定義されるＩＬ−４のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチによって置換することができる。
【０１２８】
用語「ＩＬ−２１のアミノ酸の置換におけるＩＬ−２アミノ酸のストレッチ」は、ＩＬ−２からＩＬ−２１に移行する、１つまたは複数のＩＬ−２のアミノ酸、好ましくはＩＬ−２の少なくとも２つの隣接アミノ酸のいくつかを指す。アミノ酸のストレッチは、ＩＬ−２の全数の隣接アミノ酸を包含する可能性もある。好ましくは、ＩＬ−２１のアミノ酸に置換されるＩＬ−２のアミノ酸のストレッチは、約３個と６０個の間の隣接アミノ酸、より好ましくは約５個と４０個の間の隣接アミノ酸、およびさらにより好ましくは約１０個と３０個の間の隣接アミノ酸長である。
【０１２９】
ＩＬ−２１に移行するまたはＩＬ−２１アミノ酸に置換されるＩＬ−２のアミノ酸はＩＬ−２分子中の任意の位置、例えばＮ末端、Ｃ末端、または中心部分に位置してよい。移行するＩＬ−２のアミノ酸は、ヘリックス部分、ベータシート、ベータ架橋、結合ターンまたはベンドのような、任意の典型的な二次または３次元タンパク質構造中に位置するアミノ酸を含むことができる。
【０１３０】
ＩＬ−２１に移行するＩＬ−２のアミノ酸の数は、好ましくはＩＬ−２の全アミノ酸の約０．５％と約５０％の間、より好ましくはＩＬ−２の全アミノ酸の約５％と４０％の間、およびさらにより好ましくはＩＬ−２の全アミノ酸の約１０％と３０％の間であってよい。さらなる実施形態では、置換アミノ酸の数は、本明細書で前に定義したＩＬ−２の二次構造の一型の約１％と約９０％の間、好ましくはＩＬ−２のヘリックス構造の約１％と約６０％の間、より好ましくはＩＬ−２のＨ構造またはαヘリックスの約１％と約６０％の間であってよい。
【０１３１】
ＩＬ−２からＩＬ−２１に移行するアミノ酸は、ＩＬ−２のアミノ酸の１つまたは複数のストレッチ中に存在する可能性がある。移行または置換は、ＩＬ−２のアミノ酸の１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ストレッチ中で実施することができることが好ましい。本発明は、最大約１００個までの、より多くのＩＬ−２のアミノ酸のストレッチの置換も包含する。
【０１３２】
２個以上のアミノ酸のストレッチがＩＬ−２から移行する場合、ストレッチは接近状態の位置から誘導される、例えば１、２もしくは３個のアミノ酸のみが脱着する、またはＩＬ−２一次構造の反対端に位置する場所から誘導される可能性がある。あるいは、ストレッチはＩＬ−２一次構造中の任意の場所に位置する可能性がある。
【０１３３】
ＩＬ−２１に移行するストレッチがＩＬ−２一次構造中の任意の場所に位置する場合、ストレッチはＩＬ−２の二次および／または三次構造と接近状態で位置する可能性がある、または可能性がない。典型的には、ＩＬ−２の三次構造は、結晶解析またはＮＭＲ分光分析によって得ることができる。あるいは、本発明のさらなる実施形態では、ＩＬ−２からＩＬ−２１に移行するいくつかのアミノ酸のストレッチはＩＬ−２の異なる３次元位置もしくは領域で分類することができる、例えば、タンパク質の１つまたは複数の３次元領域もしくは位置に移行するアミノ酸のストレッチの１つまたは複数の集団が存在し得る。
【０１３４】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、移行するＩＬ−２のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ＩＬ−２とその同系受容体、好ましくはＩＬ−２Ｒおよびγｃの受容体複合体との結合を担うＩＬ−２の部分中に存在する（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−２Ｒβおよびγｃの間の相互作用を示す図２を参照）。用語「ＩＬ−２とその同系受容体の結合を担うＩＬ−２の部分」は、結晶学的試験によってＩＬ−２受容体の結合に関与することが示されたヒトＩＬ−２の３次元部分に関する（Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３；およびＲｉｃｋｅｒｔ  Ｍら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０８（５７２７）、１４７７〜８０）。ＩＬ−２とその同系受容体の結合を担うＩＬ−２のこのような部分の例は、結晶学的試験またはアッセイにおいて突出を示すＩＬ−２のヘリックスまたはヘリックス間部分である。置換されるアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、１つまたは複数のＩＬ−２の空間的に共存するヘリックス領域中に存在することができることが好ましい。用語「ＩＬ−２の空間的に共存するヘリックス領域」は、タンパク質の３次元構造中で特に共存するとして、ＩＬ−２の構造データから誘導可能または予想可能であるＩＬ−２の部分に関する。移行するアミノ酸またはアミノ酸のストレッチは、ＩＬ−２の空間的に共存するヘリックス領域全体、または約０．５％と９５％の間のＩＬ−２の空間的に共存するヘリックス領域、好ましくは約２０〜６０％のＩＬ−２の空間的に共存するヘリックス領域を含むことができる。ＩＬ−２の空間的に共存するヘリックス領域を定義するための方法は当業者には知られていると思われ、または任意の適切な構造生物学教本から導くことができる。ＩＬ−２の空間的に共存するヘリックス領域の定義に関する具体的な詳細は（Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３；およびＲｉｃｋｅｒｔ  Ｍら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０８（５７２７）、１４７７〜８０）から導くことができる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、本明細書で前に定義したＩＬ−２１のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチを、配列番号３において定義されるＩＬ−２のアミノ酸またはアミノ酸のストレッチによって置換することができる。
【０１３６】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明によるＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、または両方の改変を含有する可能性がある。例えば、ＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、ただしコードポリペプチドの性質または活性は変えない改変を含有する可能性がある。遺伝コードの縮重が原因でサイレント置換によって生じるヌクレオチド変異体が好ましい。
【０１３７】
用語「ポリヌクレオチド」は、当業者に知られている任意の適切な核酸を意味する。例えば、本発明によるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡまたはＡＮＡで構成されていてよい。ＤＮＡは、例えば、Ａ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡまたはＺ−ＤＮＡの形であってよい。ＲＮＡは、例えばｐ−ＲＮＡの形、またはヘアピンＲＮＡもしくはステムループＲＮＡのような構造上修飾された形であってよい。
【０１３８】
用語「ＰＮＡ」は、ペプチド核酸、すなわち生物学的研究および医学的治療において使用されるが、しかしながら天然に存在することは知られていない、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似した人工的に合成したポリマーに関する。典型的にはＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって連結した反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されている。様々なプリン塩基とピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結している。一般にＰＮＡは、第一（左側）位置にＮ末端および右側にＣ末端で、ペプチドと同様に示される。
【０１３９】
用語「ＣＮＡ」は、アミノシクロヘキシルエタン酸核酸に関する。さらにこの用語は、シクロペンタン核酸、すなわち例えば２’−デオキシカルバグアノシンを含む核酸分子に関する。
【０１４０】
用語「ＨＮＡ」は、ヘキシトール核酸、すなわち標準核酸塩基およびリン酸化１，５−アンヒドロヘキシトール骨格から構成されるＤＮＡアナログに関する。
【０１４１】
用語「ＬＮＡ」は固定化核酸に関する。典型的には、固定化核酸は修飾されており、したがって接触不能ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’炭素と４’炭素を結び付ける過剰な架橋で修飾することができる。このような架橋は、３’末端構造立体配座中にリボースを固定化する。固定化リボースの立体配座は、塩基スタッキングおよび骨格の事前構築を高める。
【０１４２】
用語「ＡＮＡ」は、アラビノ核酸またはその誘導体に関する。本発明の文脈における好ましいＡＮＡ誘導体は、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオシド（２’Ｆ−ＡＮＡ）である。
【０１４３】
本発明によるポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡおよびＡＮＡのいずれか１つの組合せを含むこともできる。好ましいポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
【０１４４】
好ましい実施形態では、ＩＬ−２１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３のポリヌクレオチドである。
【０１４５】
別の実施形態では、ＩＬ−２１変異体はＩＬ−４のヘリックス部分を含むことができる。用語「インターロイキン−４」または「ＩＬ−４」は、配列番号２において定義されるポリペプチド配列を有するヒトインターロイキンを指す。したがってこの用語は、配列番号２において示す、哺乳動物細胞中での発現用に最適化した成熟、プロセシング、切断または分泌型のＩＬ−４に関する。本発明の特定の目的または使用のため、例えばタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現用などに、インターロイキン−４は、好ましくは追加的な２４アミノ酸のシグナル配列を含むとさらに追加的に理解することができる。この型のＩＬ−４を「前駆体ＩＬ−４」と呼び配列番号６において定義する。「前駆体ＩＬ−４」は、前記シグナル配列の結果として、ＥＲ、分泌胞、または細胞外空間に誘導され得るタンパク質を指すことが好ましい。ＩＬ−４前駆体が細胞外空間に放出される場合、ＩＬ−４前駆体は細胞外プロセシングを経て、「ＩＬ−４」または「成熟ＩＬ−４」または「プロセシングＩＬ−４」、または「切断ＩＬ−４」、または「分泌ＩＬ−４」タンパク質を生成することができる。細胞外空間への放出は、エクソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含めた多くの機構によって起こり得る。用語「ＩＬ−４」、「成熟ＩＬ−４」、「プロセシングＩＬ−４」、「切断ＩＬ−４」および「分泌ＩＬ−４」は本明細書では同義語として使用し、本発明の目的では機能上同等であるとして理解すべきである。本発明の具体的な実施形態では、例えば細菌系におけるタンパク質または変異体の発現の状況で、用語「インターロイキン−４」または「ＩＬ−４」は、本明細書において以前または以降で定義する配列番号２において示すＩＬ−４の配列またはそれに由来する配列に関する可能性もあり、細菌の翻訳開始剤として機能する１つの追加的アミノ酸がＮ末端に付加される。アミノ酸メチオニンを、付加することができることが好ましい。対応する配列は配列番号１２において示す。
【０１４６】
より好ましい実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、約１０％と６０％の間の配列番号２において定義されるＩＬ−４のヘリックス部分、より好ましくは約１５％と５０％の間、さらにより好ましくは約２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％または５０％の配列番号２において定義されるＩＬ−４のヘリックス部分を含むことができる。用語「ＩＬ−４のヘリックス部分」は、本明細書で前に定義したＩＬ−４のヘリックス二次構造、好ましくはＧ、ＨまたはＩ構造、より好ましくはＨ構造またはαヘリックスを指す。本発明の好ましい実施形態では、ＩＬ−４のヘリックス部分は、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１中で定義されたヘリックス領域Ａ、Ｂ、ＣまたはＤを含むことができる。これらのヘリックス部分は単独、任意の適切な組合せ、例えばヘリックス領域ＡとＢ、ＡとＣ、ＡとＤ、またはＢとＣまたはＢとＤ、またはＣとＤ、またはＡとＢとＣ、またはＢとＣとＤ、またはＡとＣとＤ、またはＡとＢとＣとＤの組合せのいずれかで存在してよい。ＩＬ−２１タンパク質は、さらなる好ましい実施形態において、１つまたは複数のＩＬ−４のヘリックス間領域、例えばヘリックス領域ＡとＢの間のヘリックス間領域、領域ＢとＣの間のヘリックス間領域、領域ＣとＤの間のヘリックス間領域をさらに含むことができる。ヘリックス間領域は、ヘリックス領域Ａ、Ｂ、ＣまたはＤのいずれかと組合せることができる。好ましくは、ヘリックス間領域は、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１中で定義された隣接ヘリックス領域と組合せることができる。本明細書で前に使用した用語「ヘリックス間領域」は、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１中で定義されたヘリックスのヘリックス間の任意の領域を示す。ヘリックス間領域は、２ヘリックス間の領域の任意の一部分、例えばヘリックスとの結合部におけるアミノ酸のストレッチ、および／または代替的に２ヘリックス間部分の中心におけるアミノ酸のストレッチを含むこともできる。本発明によるヘリックス間領域は、ＤＳＳＰ法によって定義された非ヘリックス二次構造のいずれかを含むことができる。ヘリックス間領域は、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１中で定義されたＩＬ−４の２ヘリックス間に任意の数のアミノ酸を含むことができる。好ましくは、ヘリックス間領域は、約２個と７０個の間のアミノ酸、より好ましくは約４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８個のアミノ酸を含むことができる。
【０１４７】
典型的には、ＩＬ−４のヘリックス領域および／またはヘリックス間領域によるＩＬ−２１アミノ酸の置換または交換は、ＩＬ−２１とＩＬ−４の間の配列アラインメントに基づいて実施することができる。用語「配列アラインメント」は、当業者に知られている任意の適切なアラインメント、例えば、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６  ２３７〜２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定可能なグローバル配列アラインメントに関する。前記グローバル配列アラインメントの結果は同一率である。同一率を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、マトリクス＝一元、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティー＝１、ジョイニングペナルティー＝３０、ランダム群長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー０．０５、ウインドウサイズ＝５００、またはいずれか短いほうの対象ヌクレオチド配列の長さである。あるいは、アラインメントはアミノ酸配列で実施することができる。このようなアラインメントに基づいて、同一または相同な１つまたは複数の配列ストレッチを定義することができる。
【０１４８】
好ましくは、ＩＬ−４のヘリックス部分を、ＩＬ−４とＩＬ−２１の間の同一または相同な位置でＩＬ−２１に挿入することができる。
【０１４９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明によるＩＬ−２１変異体は、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１中で定義されたＩＬ−４のヘリックスＡおよび／またはＩＬ−４のヘリックスＣを含むことができる。別の実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１中で定義されたＩＬ−４のヘリックスＡおよび／またはＩＬ−４のヘリックスＣ、および追加的にＩＬ−４のヘリックスＢとＣの間のヘリックス間領域を含むことができる。別の実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、Ｈａｇｅ  Ｔら、（１９９９）Ｃｅｌｌ、９７（２）、２７１〜８１中で定義されたＩＬ−４のヘリックスＡおよび／またはＩＬ−４のヘリックスＣ、および追加的にＩＬ−４のヘリックスＢとＣの間のヘリックス間領域、およびＩＬ−４のヘリックスＣとＤの間のヘリックス間領域を含むことができる。
【０１５０】
別の好ましい実施形態では、ＩＬ−２１変異体は配列番号８のＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドである。
【０１５１】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書で前に定義したＩＬ−４のヘリックス部分を含むＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明によるＩＬ−４のヘリックス部分を含むＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、または両方の改変を含有する可能性がある。例えば、ＩＬ−４のヘリックス部分を含むＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、ただしコードポリペプチドの性質または活性は変えない改変を含有する可能性がある。遺伝コードの縮重が原因でサイレント置換によって生じるヌクレオチド変異体が好ましい。
【０１５２】
好ましい実施形態では、ＩＬ−４のヘリックス部分を含むＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５のポリヌクレオチドである。
【０１５３】
別の実施形態では、ＩＬ−２１変異体はＩＬ−２のヘリックス部分を含むことができる。用語「インターロイキン−２」または「ＩＬ−２」は、配列番号３において定義されるポリペプチド配列を有するヒトインターロイキンを指す。したがってこの用語は、配列番号３において示す、哺乳動物細胞中での発現用に最適化した成熟、プロセシング、切断または分泌型のＩＬ−２に関する。本発明の特定の目的または使用のため、例えばタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現用などに、インターロイキン−２は、好ましくは追加的な２０アミノ酸のシグナル配列を含むとさらに追加的に理解することができる。この型のＩＬ−２を「前駆体ＩＬ−２」と呼び配列番号５において定義する。「前駆体ＩＬ−２」は、前記シグナル配列の結果として、ＥＲ、分泌胞、または細胞外空間に誘導され得るタンパク質を指すことが好ましい。ＩＬ−２前駆体が細胞外空間に放出される場合、ＩＬ−２前駆体は細胞外プロセシングを経て、「ＩＬ−２」または「成熟ＩＬ−２」または「プロセシングＩＬ−２」、または「切断ＩＬ−２」、または「分泌ＩＬ−２」タンパク質を生成することができる。細胞外空間への放出は、エクソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含めた多くの機構によって起こり得る。用語「ＩＬ−２」、「成熟ＩＬ−２」、「プロセシングＩＬ−２」、「切断ＩＬ−２」および「分泌ＩＬ−２」は本明細書では同義語として使用し、本発明の目的では機能上同等であるとして理解すべきである。本発明の具体的な実施形態では、例えば細菌系におけるタンパク質または変異体の発現の状況で、用語「インターロイキン−２」または「ＩＬ−２」は、本明細書において以前または以降で定義する配列番号３において示すＩＬ−２の配列またはそれに由来する配列に関する可能性もあり、細菌の翻訳開始剤として機能する１つの追加的アミノ酸がＮ末端に付加される。アミノ酸メチオニンを、付加することができることが好ましい。対応する配列は配列番号１１において示す。
【０１５４】
より好ましい実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、約１０％と６５％の間の配列番号３において定義されるＩＬ−２のヘリックス部分、より好ましくは約１５％と５５％の間、さらにより好ましくは約２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２または５４％の配列番号３において定義されるＩＬ−２のヘリックス部分を含むことができる。用語「ＩＬ−２のヘリックス部分」は、本明細書で前に定義したＩＬ−２のヘリックス二次構造、好ましくはＧ、ＨまたはＩ構造、より好ましくはＨ構造またはαヘリックスを指す。本発明の好ましい実施形態では、ＩＬ−２のヘリックス部分は、Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３中で定義されたヘリックス領域Ａ、Ｂ、ＣまたはＤを含むことができる。これらのヘリックス部分は単独、任意の適切な組合せ、例えばヘリックス領域ＡとＢ、ＡとＣ、ＡとＤ、またはＢとＣまたはＢとＤ、またはＣとＤ、またはＡとＢとＣ、またはＢとＣとＤ、またはＡとＣとＤ、またはＡとＢとＣとＤの組合せのいずれかで存在してよい。ＩＬ−２１タンパク質は、さらなる好ましい実施形態において、１つまたは複数のＩＬ−２のヘリックス間領域、例えばヘリックス領域ＡとＢの間のヘリックス間領域、領域ＢとＣの間のヘリックス間領域、領域ＣとＤの間のヘリックス間領域をさらに含むことができる。ヘリックス間領域は、ヘリックス領域Ａ、Ｂ、ＣまたはＤのいずれかと組合せることができる。好ましくは、ヘリックス間領域は、Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３中で定義された隣接ヘリックス領域と組合せることができる。本明細書で前に使用した用語「ヘリックス間領域」は、Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３中で定義されたヘリックスのヘリックス間の任意の領域を示す。ヘリックス間領域は、２ヘリックス間の領域の任意の一部分、例えばヘリックスとの結合部におけるアミノ酸のストレッチ、および／または代替的に２ヘリックス間部分の中心におけるアミノ酸のストレッチを含むこともできる。本発明によるヘリックス間領域は、ＤＳＳＰ法によって定義された非ヘリックス二次構造のいずれかを含むことができる。ヘリックス間領域は、Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３中で定義されたＩＬ−２の２ヘリックス間に任意の数のアミノ酸を含むことができる。好ましくは、ヘリックス間領域は、約２個と７０個の間のアミノ酸、より好ましくは約４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６または６８個のアミノ酸を含むことができる。
【０１５５】
典型的には、ＩＬ−２のヘリックス領域および／またはヘリックス間領域によるＩＬ−２１アミノ酸の置換または交換は、ＩＬ−２１とＩＬ−２の間の配列アラインメントに基づいて実施することができる。用語「配列アラインメント」は、当業者に知られている任意の適切なアラインメント、例えば、本明細書で前に定義したＢｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定可能なグローバル配列アラインメントに関する。このようなアラインメントに基づいて、同一または相同な１つまたは複数の配列ストレッチを定義することができる。
【０１５６】
好ましくは、ＩＬ−２のヘリックス部分を、ＩＬ−２とＩＬ−２１の間の同一または相同な位置でＩＬ−２１に挿入することができる。
【０１５７】
さらなる好ましい実施形態では、本発明によるＩＬ−２１変異体は、Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３中で定義されたＩＬ−２のヘリックスＡおよび／またはＩＬ−２のヘリックスＣを含むことができる。別の実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３中で定義されたＩＬ−２のヘリックスＡおよび／またはＩＬ−２のヘリックスＣ、および追加的にＩＬ−２のヘリックスＢとＣの間のヘリックス間領域を含むことができる。別の実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、Ｓｔａｕｂｅｒ  ＤＪら、（２００６）ＰＮＡＳ１０３（８）：２７８８〜９３中で定義されたＩＬ−２のヘリックスＡおよび／またはＩＬ−２のヘリックスＣ、および追加的にＩＬ−２のヘリックスＢとＣの間のヘリックス間領域、およびＩＬ−２のヘリックスＣとＤの間のヘリックス間領域を含むことができる。
【０１５８】
別の好ましい実施形態では、ＩＬ−２１変異体は配列番号７のＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドである。
【０１５９】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書で前に定義したＩＬ−２のヘリックス部分を含むＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明によるＩＬ−２のヘリックス部分を含むＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、または両方の改変を含有する可能性がある。例えば、ＩＬ−２のヘリックス部分を含むＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、ただしコードポリペプチドの性質または活性は変えない改変を含有する可能性がある。遺伝コードの縮重が原因でサイレント置換によって生じるヌクレオチド変異体が好ましい。
【０１６０】
好ましい実施形態では、ＩＬ−２のヘリックス部分を含むＩＬ−２１変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４のポリヌクレオチドである。
【０１６１】
本発明の別の実施形態では、ＩＬ−２１変異体は、ＩＬ−２およびＩＬ−４のヘリックス部分を含むことができる。ＩＬ−２およびＩＬ−４のヘリックス部分は、ＩＬ−２およびＩＬ−４の任意の前述のヘリックス部分または切片を含むことができる。好ましくは、ＩＬ−２１変異体は、約１０％と６５％の間のＩＬ−２およびＩＬ−４のヘリックス部分を含むことができる。用語「約１０％と６５％の間のＩＬ−２およびＩＬ−４のヘリックス部分」は、ＩＬ−２とＩＬ−４の両方由来のヘリックス部分の量が約１０％と６５％の間であることを意味する。ヘリックス部分のこの量の範囲内で、ＩＬ−２由来のヘリックス部分の分画は１％と９９％の間であってよい。同様に、ＩＬ−４由来のヘリックス部分の分画は１％と９９％の間であってよい。好ましくは、ＩＬ−２由来のヘリックス部分の分画は４０％、４５％、５０％、５５％または６０％であってよく、したがってＩＬ−４由来のヘリックス部分の分画は４０％、４５％、５０％、５５％または６０％であってよい。
【０１６２】
本発明のさらなる実施形態では、本明細書で前に定義したＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２タンパク質またはＩＬ−４タンパク質は、当業者に知られている任意のマーカー配列または精製タグを含むことができる、またはそれらと融合することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ）において与えられるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Ｇｅｎｔｚら（ＰＮＡＳ８６、８２１〜８２４（１９８９））によって記載されたように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の好都合な精製をもたらす。精製に有用な別のペプチドタグ、「ＨＡ」タグはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８４）Ｃｅｌｌ３７、７６７）。さらなる好ましい実施形態では、マーカー配列は「ＦＬＡＧ」ポリペプチドであってよい。ＦＬＡＧ抗原性ポリペプチドは、アミノもしくはカルボキシ末端の片方または両方で、本発明のＩＬ−２１、ＩＬ−２もしくはＩＬ−４またはＩＬ−２１変異体ポリペプチドと融合することができる。好ましい実施形態では、ＩＬ−２１−ＦＬＡＧ、ＩＬ−４−ＦＬＡＧまたはＩＬ−２−ＦＬＡＧ融合タンパク質を、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ａまたはｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１発現ベクターから発現させることが可能である（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｓら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６４、８２２２〜２９；Ｔｈｏｍｓｅｎ、Ｄ．Ｒら、（１９８４）ＰＮＡＳ、８１、６５９〜６３；およびＫｏｚａｋ、Ｍ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３０８、２４１）。さらなる好ましい実施形態では、ＦＬＡＧ融合タンパク質は抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体によって検出可能である。
【０１６３】
本発明のインターロイキンタンパク質または変異体、特にＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４は、当業者に知られている任意の適切な方法により組換えによって生成することができる。したがって本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２１変異体またはＩＬ−２もしくはＩＬ−４を生成するための方法も包含する。
【０１６４】
したがって本発明は、本明細書で前に定義した本発明のＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、宿主細胞、および組換え技法によるＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４の生成を企図する。
【０１６５】
適切なベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであってよい。レトロウイルスベクターは複製可能または複製欠損であってよい。後者の場合、一般にウイルス増殖は相補的宿主細胞中でのみ起こる。
【０１６６】
ＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞中での増殖用の選択マーカーを含有するベクターと接合することができる。一般にプラスミドベクターを、リン酸カルシウム沈殿などの沈殿、または荷電脂質との複合体に導入する。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞系を使用してそれをｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングし、次いで宿主細胞に形質導入することができる。ポリヌクレオチド挿入体は、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、およびレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーターと作動可能に連結しなければならない。他の適切なプロモーターは当業者に知られている。発現構築物は、転写開始、終了のための部位、および転写領域中に、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することができる。構築物によって発現される転写産物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する開始および終了コドンで翻訳開始コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含むことが好ましい。
【０１６７】
示すように、発現ベクターは少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーには、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ、真核細胞培養用のＧ４１８またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌における培養用のテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子がある。適切な宿主の代表的な例には、大腸菌、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞、および植物細胞があるが、これらだけには限られない。前に記載した宿主細胞に適した培養培地および条件は当技術分野で知られている。
【０１６８】
細菌中で使用するのに好ましいベクターには、ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５、およびＮｏｖａｇｅｎから入手可能なｐＥＴベクターがあるが、これらだけには限られない。特に好ましい真核細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩおよびｐＳＧ、およびＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。酵母系中で使用するのに好ましい発現ベクターには、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤＩ、ｐＴＥＦＩ／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａＩｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−ＳＩ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃから入手可能）があるが、これらだけには限られない。他の適切なベクターは当業者に知られている。
【０１６９】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、カチオン性脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって実施することができる。このような方法は、Ｄａｖｉｓら（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））などの多くの標準的な研究室マニュアル中に記載されている。本発明のＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４は、組換えベクターを欠く宿主細胞によって実際発現され得ると具体的に企図される。
【０１７０】
本発明によるＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４タンパク質は、当業者に知られている任意の適切な方法、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた方法によって、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に利用することができる。
【０１７１】
本発明によるＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４タンパク質は、直接単離または培養したものであれ体液、組織および細胞を含めた天然供給源から精製した産物、化学合成手順の産物、および例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含めた原核または真核宿主から組換え技法によって生じた産物から回収することもできる。組換え生成手順中で利用する宿主に応じて、本発明のポリペプチドまたはタンパク質はグリコシル化状態であってよく、または非グリコシル化状態であってよい。さらに、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、いくつかの場合、宿主仲介プロセスの結果として、初期修飾メチオニン残基も含み得る。したがって、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンは一般に、全真核細胞において翻訳後、任意のタンパク質から高い有効性で除去されることは当技術分野でよく知られている。大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニンは大部分の原核生物中でも効率よく除去されるが、いくつかのタンパク質に関して、この原核生物の除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンと共有結合したアミノ酸の性質に応じて効率が悪い。好ましくは、配列番号１０において示す配列を原核生物宿主中でのＩＬ−２１の発現に使用することができ、配列番号１２において示す配列を原核生物宿主中でのＩＬ−４の発現に使用することができ、または配列番号１１において示す配列を原核生物宿主中でのＩＬ−２の発現に使用することができる。
【０１７２】
具体的な実施形態では、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを使用して、真核生物系中で本発明によるＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４タンパク質を発現させる。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、その唯一の炭素供給源としてメタノールを代謝することができるメチロトローフ酵母である。メタノール代謝経路中の主なステップは、Ｏ２を使用したホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は酵素アルコールオキシダーゼによって触媒される。その唯一の炭素供給源としてメタノールを代謝するために、部分的にはＯ２に対するアルコールオキシダーゼの比較的低い親和性が原因で、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは高レベルのアルコールオキシダーゼを生成しなければならない。したがって、増殖培地中、主な炭素供給源としてのメタノールに応じて、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）の１つのプロモーター領域は非常に活性がある。メタノールの存在下では、ＡＯＸ１遺伝子から生成するアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中の全可溶性タンパク質の最大約３０％を含む（Ｅｌｌｉｓ  ＳＢら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５、１１１１〜２１；Ｌｏｕｔｚ  ＰＪら、（１９８９）Ｙｅａｓｔ  ５、１６７〜７７；Ｔｓｃｈｏｐｐ  ＪＦら、（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５、３８５９〜７６）。したがって、異種コード配列、例えばＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４をコードするポリヌクレオチドなどは、ＡＯＸ１制御配列の全てまたは一部分の転写制御下で、メタノールの存在下で増殖したＰｉｃｈｉａ酵母において例外的に高いレベルで発現される。
【０１７３】
一例では、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋを使用して、本質的に「Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（Ｄ．Ｒ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃｒｅｇｇ、ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９８）に記載の通り、本明細書で言及するように、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをＰｉｃｈｉａ酵母系で発現させることが可能である。この発現ベクターは、マルチクローニングサイトの上流に位置するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわちリーダー）と結合した強力なＡＯＸ１プロモーターによる、本発明のタンパク質の発現および分泌を可能にする。
【０１７４】
示される発現構築物が、必要に応じてインフレームＡＵＧを含めて、転写、翻訳、分泌（望む場合）などに関して正確に位置するシグナルをもたらす限り、当業者に知られているように、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤＩ、ｐＴＥＦＩ／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺアルファ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−ＳＩ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡ０８１５だけには限られないが、これらを含めた、多くの他の酵母ベクターをｐＰＩＣ９Ｋの代わりに使用することが可能である。
【０１７５】
別の実施形態では、例えば本発明のポリヌクレオチドなどの、異種コード配列の高レベルな発現を、例えばｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺアルファなどの発現ベクターへの本発明の異種ポリヌクレオチドのクローニング、およびメタノール不在下での酵母培養物の増殖によって達成することができる。
【０１７６】
本明細書で前に論じたベクター構築物を含有する宿主細胞を包含する以外に、本発明は、内因性遺伝物質（例えばコード配列）が欠失または交換する、および／またはＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結し、内因性ポリヌクレオチドを活性化、改変、および／または増幅する、遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作した、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の初代、第二世代、および不死化宿主細胞も包含する。例えば、当技術分野で知られている技法を使用して、相同的組換えによる異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と内因性ポリヌクレオチド配列を作動可能に連結することができ、新たな転写単位の形成をもたらすことができる。
【０１７７】
さらに、本発明のＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４は、当技術分野で知られている技法を使用して化学的に合成することができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ、３１０、１０５〜１１１）。例えば、本発明の変異体またはタンパク質に相当するポリペプチドは、ペプチド合成装置の使用によって合成することができる。
【０１７８】
さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）を含む医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１を含む医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−１を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−３を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰおよびシンテニン−１を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰおよびガレクチン−１を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰおよびガレクチン−３を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１およびガレクチン−１を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１およびガレクチン−３を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−１およびガレクチン−３を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰおよびシンテニン−１およびガレクチン−１を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰおよびシンテニン−１およびガレクチン−３を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰおよびガレクチン−１およびガレクチン−３を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１およびガレクチン−１およびガレクチン−３を含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰおよびシンテニン−１およびガレクチン−１およびガレクチン−３を含む医薬組成物に関する。本発明の好ましい実施形態では、本明細書で前に記載した前記医薬組成物はいずれも、ＩＬ−２１タンパク質に加えて、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体を含む。本発明の、さらなる、特に好ましい実施形態では、本明細書で前に記載した任意の前記医薬組成物は、ＩＬ−２１タンパク質の代わりに、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体を含む。
【０１７９】
本明細書で使用する用語「ＩｇＡ誘導タンパク質（ＩＧＩＰ）」は、ヒトタンパク質または高等真核生物起源の種のホモログ、好ましくはＥｎｄｓｌｅｙら、（２００９）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８２：１８５４〜１８５９中に記載されたヒトタンパク質、より好ましくはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１００７１９０．１、ＧＩ：５５７７０８７４を有し、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００７１８９．１を有するヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、または野生型配列に機能的に匹敵する、その機能的ホモログ、例えば欠失、例えばアミノ酸交換、付加などの修飾を含むタンパク質、またはそのアイソフォームを指す。
【０１８０】
本明細書で使用する用語「シンテニン−１」は、高等真核生物起源のヒトタンパク質または種間ホモログ、好ましくはＳｉｒａら、（２００９）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２１（９）：１０１３〜１０２３中に記載されたヒトタンパク質、より好ましくはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｏ００５６０．１、ＧＩ：２０４５５２８１、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１３２５４を有するタンパク質、または野生型配列に機能的に匹敵する、その機能的ホモログ、例えば欠失、例えばアミノ酸交換、付加などの修飾を含むタンパク質、またはそのアイソフォームを指す。
【０１８１】
本明細書で使用する用語「ガレクチン−１」は、高等真核生物起源のヒトタンパク質または種間ホモログ、好ましくはＴｓａｉら、（２００８）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８１：４５７０〜４５７９中に記載されたヒトタンパク質、より好ましくはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２２９６．１、ＧＩ：４５０４９８１を有し、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３０５．３を有するヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、または野生型配列に機能的に匹敵する、その機能的ホモログ、例えば欠失、例えばアミノ酸交換、付加などの修飾を含むタンパク質、またはそのアイソフォームを指す。
【０１８２】
本明細書で使用する用語「ガレクチン−３」は、高等真核生物起源のヒトタンパク質または種間ホモログ、好ましくはＳｔｉｊｎら、（２００９）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、４６（１６）：３２９２〜３２９９中に記載されたヒトタンパク質、より好ましくはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２２９７．２、ＧＩ：１１５４３０２２３を有し、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３０６．２を有するヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、または野生型配列に機能的に匹敵する、その機能的ホモログ、例えば欠失、例えばアミノ酸交換、付加などの修飾を含むタンパク質、またはそのアイソフォームを指す。
【０１８３】
さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰを含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−１を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−３を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰを含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにシンテニン−１を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにガレクチン−１を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにガレクチン−３を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４およびＩＬ−２を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３の群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３を含む、原発性体液性免疫不全疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【０１８４】
別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２の使用に関する。さらなる態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４の使用に関する。さらなる態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４の使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰの使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１の使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−１の使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−３の使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰの使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにシンテニン−１の使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにガレクチン−１の使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにガレクチン−３の使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の使用に関する。好ましい実施形態では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２の使用に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４の使用に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２およびＩＬ−４の使用に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３の群から選択される少なくとも１つの化合物の使用に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、原発性体液性免疫不全疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の使用に関する。
【０１８５】
別の実施形態では、本発明は、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２およびＩＬ−４の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰの投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−１の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−３の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＧＩＰの投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびシンテニン−１の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびガレクチン−１の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびガレクチン−３の投与、または患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の投与を含む、原発性体液性免疫不全疾患の治療法に関する。
【０１８６】
用語「原発性体液性免疫不全疾患」は、免疫系の遺伝的または自然発生的欠陥から生じる疾患、または障害を意味する。この用語は、多数の個別欠陥および複合障害、例えば、体液性免疫不全、重症複合型免疫不全症、ならびに食作用および補体欠陥から生じる障害を指すことが好ましい。「原発性体液性免疫不全疾患」は、例えばＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ（ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ）によって与えられた定義に基づき、当技術分野で利用可能な症状定義に従い当業者によって診断することができる。成人における原発性免疫不全に関する典型的な診断基準は、（ｉ）１年以内に抗生物質を必要とする４回以上の感染（例えば、耳炎、気管支炎、副鼻腔炎、肺炎）；（ｉｉ）長期の抗生物質療法を必要とする反復感染または感染；（ｉｉｉ）２回以上の重症細菌感染（例えば、骨髄炎、髄膜炎、敗血症、蜂窩織炎；（ｉｖ）３年以内に２回以上の放射線学的に証明された肺炎；（ｖ）異常な局在または異常な病原体がある感染；および（ｖｉ）原発性免疫不全の家族歴を含むことができる。さらに、原発性体液性免疫不全疾患の診断は、「Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（２００６）；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｈａｎｓ  Ｄ．Ｏｃｈｓ、Ｃ．Ｉ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｍ．Ｐｕｃｋ中で与えられた情報および定義に基づいてよい。
【０１８７】
好ましい実施形態では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４およびＩＬ−２を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質および／もしくはＩＬ−２１変異体ＩＬ−２ならびに／またはＩＬ−４およびＩＧＩＰおよび／もしくはシンテニン−１および／もしくはガレクチン−１および／もしくはガレクチン−３を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物に関する。
【０１８８】
さらなる実施形態では、本発明は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２の使用に関する。さらなる態様では、本発明は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４の使用に関する。さらなる実施形態では、本発明は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４の使用に関する。
【０１８９】
好ましい実施形態では、本発明は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２の使用に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４の使用に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２およびＩＬ−４の使用に関する。
【０１９０】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の使用に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の使用に関する。
【０１９１】
別の実施形態では、本発明は、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２およびＩＬ−４の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰの投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−１の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−３の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＧＩＰの投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびシンテニン−１の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびガレクチン−１の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびガレクチン−３の投与、または患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の投与を含む、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の治療法に関する。
【０１９２】
用語「分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患」は、Ｂ型リンパ球によるアイソタイプＩｇＧもしくはＩｇＡ、またはアイソタイプＩｇＧおよびＩｇＡ、またはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２の少なくとも１つの抗体の放出または除去が健常個体と比較して低下する、疾患、または障害を意味する。このような疾患は、例えば、当業者に知られている任意の適切な診断手段よって、好ましくはＩＬ−２１変異体の試験の文脈において本明細書で前に記載した試験に基づいて診断することができる。例えば、このような疾患はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ（ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ）によって与えられた定義に基づき診断することができる。さらに、分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患の診断は、「Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（２００６）；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｈａｎｓ  Ｄ．Ｏｃｈｓ、Ｃ．Ｉ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｍ．Ｐｕｃｋ中で与えられた情報および定義に基づいてよい。
【０１９３】
好ましい実施形態では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４およびＩＬ−２を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質および／もしくはＩＬ−２１変異体ＩＬ−２ならびに／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰおよび／もしくはシンテニン−１および／もしくはガレクチン−１および／もしくはガレクチン−３を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物に関する。
【０１９４】
さらなる実施形態では、本発明は、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２の使用に関する。さらなる態様では、本発明は、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４の使用に関する。さらなる態様では、本発明は、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４の使用に関する。
【０１９５】
好ましい実施形態では、本発明は、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２の使用に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４の使用に関する。他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２およびＩＬ−４の使用に関する。
【０１９６】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の使用に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療用の医薬組成物を調製するための、本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質および／もしくはＩＬ−２１変異体ＩＬ−２ならびに／またはＩＬ−４およびＩＧＩＰおよび／もしくはシンテニン−１および／もしくはガレクチン−１および／もしくはガレクチン−３の使用に関する。
【０１９７】
別の実施形態では、本発明は、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２およびＩＬ−４の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰの投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−１の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−３の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＧＩＰの投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびシンテニン−１の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびガレクチン−１の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびガレクチン−３の投与、または患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の投与を含む、免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患の治療法に関する。
【０１９８】
用語「免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患」は、１つのアイソタイプクラスから次のアイソタイプクラスのスイッチの分子学的プロセスが、非機能的であるかまたは少なくとも機能的に妨害される、疾患、または障害を意味する。典型的には、ＩｇＭからＩｇＧおよび／またはＩｇＡへのアイソタイプスイッチは機能的に妨害または遮断され得る。この用語は、障害または遮断が分子再配列によるものである状況、および障害または遮断がシグナル変換プロセス中の細胞の問題によるものである状況を含む。このような疾患または障害は、当業者に知られている任意の適切な診断手段よって、好ましくはＩＬ−２１変異体の試験の文脈において本明細書で前に記載した試験に基づいて診断することができる。
【０１９９】
本発明の別のより好ましい実施形態では、本明細書で前に言及した原発性体液性免疫不全疾患または分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡのレベルの低下を伴う疾患は、ＩｇＡＤと呼ばれるＩｇＡの選択的欠乏症、ＣＶＩＤと呼ばれる一般変異型免疫不全症、ＩｇＧｓＤと呼ばれるＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症、高ＩｇＭ症候群と呼ばれる増大したＩｇＭを有する免疫不全、またはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症であってよい。用語「ＩｇＡの選択的欠乏症」、「一般変異型免疫不全症」、「ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症」、「増大したＩｇＭを有する免疫不全」および「Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症」は当業者に知られており、例えば任意の検定済み医学免疫学教本から、例えば「Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」．（２００６）２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｈａｎｓ  Ｄ．Ｏｃｈｓ、Ｃ．Ｉ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｍ．Ｐｕｃｋから、またはＶｉｒｅｌｌａ  Ｇら、（２００７）、Ｉｎｆｏｒｍａ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  ｅｄ；またはＫｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｋｉｎｄｔ  ＴＪら、（２００６）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｄ．から誘導することができる。好ましくは、これらの用語は、ＷＨＯによって与えられた、例えばＩＣＤ−１０  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００７の第ＩＩＩ章中、セクション「Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｒｇａｎｓ  ａｎｄ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」中、特にサブセクション「Ｃｅｒｔａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ（Ｄ８０−Ｄ８９）」中の疾患の定義を指す。より好ましくは、これらの用語は、サブセクションＤ８０中、例えばＩＣＤ−１０  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００７のＤ８０．０、Ｄ８０．１、Ｄ８０．２、Ｄ８０．３またはＤ８０．５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ／ａｐｐｓ／ｉｃｄ／ｉｃｄ１０ｏｎｌｉｎｅ／？ｇｄ８０．ｈｔｍ＋ｄ８４９）中に与えられた定義に関する。
【０２００】
したがって本発明は、好ましい実施形態において、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２およびＩＬ−４、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体ならびにＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、ＩｇＡの選択的欠乏症、一般変異型免疫不全症、ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症、増大したＩｇＭを有する免疫不全、またはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を治療するための医薬組成物に関する。したがって本発明は、さらなる好ましい実施形態では、ＩｇＡの選択的欠乏症、一般変異型免疫不全症、ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症、増大したＩｇＭを有する免疫不全、またはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症の治療用の医薬組成物を調製するための、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２およびＩＬ−４、ＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体ならびにＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物、ＩＬ−２１タンパク質ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物、本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つの化合物の使用にも関する。さらに、さらなる好ましい実施形態では、したがって本発明は、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−４の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＬ−２およびＩＬ−４の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２およびＩＬ−４の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびＩＧＩＰの投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびシンテニン−１の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−１の投与、患者へのＩＬ−２１タンパク質およびガレクチン−３の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびＩＧＩＰの投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびシンテニン−１の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびガレクチン−１の投与、患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１変異体およびガレクチン−３の投与、または患者への本明細書で前に言及したＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３の投与を含む、ＩｇＡの選択的欠乏症、一般変異型免疫不全症、ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症、増大したＩｇＭを有する免疫不全、またはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症の治療法にも関する。
【０２０１】
本発明による医薬組成物は、当業者に知られている様々な送達系、例えばリポソーム封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体仲介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、４４２９〜４４３２参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などの助力によって投与することができる。導入の方法は局所、腸内または非経口であってよい。導入の方法は、真皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内、吸入、硬膜、および経口経路を含むことができる。任意の好都合な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって、または吸入によって組成物を投与することができ、他の生物学的活性剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であってよい。さらに、心室内および髄腔内注射を含めた任意の適切な経路によって、中枢神経系に本発明の医薬化合物または組成物を導入することは望ましい可能性があり、心室内注射は、例えばＯｍｍａｙａ貯蔵器などの貯蔵器と結合した、心室内カテーテルによって容易にすることができる。例えば吸入器または噴霧器、およびエアロゾル剤との併用製剤の使用によって、肺または吸入投与を利用することができる。
【０２０２】
具体的な実施形態では、治療を必要とする領域に本発明の医薬化合物または組成物を局所投与することは望ましい可能性があり、これは、例えば非制限的に、例えば外科手術中、局所施用中に、例えば外科手術後に創傷包帯と併用した局所注入により、注射により、カテーテルによって、座薬によって、またはサイラスティック膜などの膜、またはファイバーを含めた、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状材料であるインプラントによって実施することができる。好ましくは、本発明のタンパク質を投与するとき、タンパク質を吸収しない材料を使用するよう注意を払わなければならない。
【０２０３】
局所投与の好ましい方法は直接注射による方法である。好ましくは、本発明の本明細書で前に定義したＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２またはＩＬ−４は、動脈領域内に直接注射または局所注射によって投与される送達媒体と複合体形成することができる。動脈領域内の局所への組成物の投与は、動脈内の数センチメートル、好ましくは数ミリメートルに組成物を注射することを指す。局所投与の別の方法は、外科手術創中または周辺に本発明の医薬組成物を接触させることである。例えば、患者は外科手術を受けることができ、医薬組成物は創傷内の組織の表面上にコーティングすることができ、または医薬組成物は創傷内の組織領域に注射することができる。
【０２０４】
全身投与用に、本発明によるＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３は、標的送達媒体と複合体形成することができる。全身投与で使用するのに適した送達媒体は、媒体に特定部位への指向性を与えるリガンドを含むリポソームを含む。全身投与の好ましい方法には、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮（局所）送達がある。静脈内注射は、当技術分野で標準的な方法を使用して実施することができる。エアロゾル送達も、当技術分野で標準的な方法を使用して実施することができる（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、（１９９２）ＰＮＡＳ、１８９、１１２７７〜１１２８１参照）。
【０２０５】
経口送達は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３と、動物の消化管中での消化酵素による分解に耐えることができる担体を複合体形成することによって実施することができる。このような担体の例には、当技術分野で知られているカプセルまたは錠剤などの、プラスチックカプセルまたは錠剤がある。局所投与は、例えば、本発明のポリヌクレオチド構築物と、皮膚を通過することができる親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）を混合することによって実施することができる。
【０２０６】
別の実施形態では、医薬組成物は、注射針を対象部位に直接向けるために使用するイメージングデバイスを使用することによって、内臓器官、体腔などに直接送達することができる。医薬組成物は、外科的介入時に疾患部位に投与することもできる。
【０２０７】
別の実施形態では、医薬組成物は、小胞中、特にリポソーム中に送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、１５２７〜１５３３；Ｔｒｅａｔら、（１９８９）  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．３５３〜３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書、ｐｐ．３１７〜３２７）。
【０２０８】
さらに別の実施形態では、組成物は徐放系に送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ（１９８７）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４、２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ８８、５０７；Ｓａｕｄｅｋら、（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１、５７４）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（１９７４）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（１９８４）Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ、Ｊ．（１９８３）Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３、６１；Ｌｅｖｙら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８、１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、（１９８９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５；３５１；Ｈｏｗａｒｄら、（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１、１０５も参照）。さらに別の実施形態では、徐放系を治療標的、例えば脳、リンパ器官などの近くに配置することができ、したがってわずかな全身用量のみが必要とされ得る（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ（１９８４）ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５〜１３８を参照）。
【０２０９】
医薬組成物は、経口、局所または全身投与に適した形であることが好ましい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、局所、経口または全身投与する。
【０２１０】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４およびＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３、および薬学的に許容される担体を含む。用語「薬学的に許容される」は、動物、およびより詳細にはヒトにおける使用に関して、規制機構または他の一般に認められている薬局方によって承認されていることを意味する。用語「担体」は、それと共に治療剤を投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または賦形薬を指す。このような担体は薬学的に許容される、すなわち、利用する用量および濃度でレシピエントに無毒である。それは、等張、低張またはわずかに高張であり、スクロース溶液によって与えられるような比較的低いイオン強度を有することが好ましい。このような医薬担体は、水、および例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源の油を含めた油などの滅菌液であってよい。食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、液状担体として利用することもできる。適切な医薬賦形剤には、スターチ、グルコース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、ナトリウムイオン、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。組成物は、望む場合、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、例えば溶液、縣濁液、乳濁液、粉末、徐放性製剤などの形をとることができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」中に記載される。医薬担体として働くことができる物質のいくつかの他の例は、グルコースおよびスクロースなどの糖、コーンスターチおよびポテトスターチなどのスターチ、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびテオブロマ油などの植物油、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール、寒天、アルギン酸、発熱性物質除去蒸留水、等張食塩水、クランベリーエキスおよびリン酸緩衝溶液、スキムミルク粉末、ならびに例えばビタミンＣ、エストロゲンおよびエキナシアなどの、医薬製剤において使用する他の非毒性適合物質である。湿潤剤およびラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、ならびに着色剤、芳香剤、湿潤剤、賦形剤、錠剤、安定剤、抗酸化剤および防腐剤が存在してもよい。封入形、例えばセルロース封入、ゼラチン、ポリアミド、ニオソーム、ワックスマトリックス、シクロデキストリンまたはリポソーム封入で活性成分を投与することも有利である。
【０２１１】
一般に、成分は別々、または一緒に混合した、単位剤形のいずれかで、例えば乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットなどの密閉保存容器中に供給する。
【０２１２】
具体的な実施形態では、医薬組成物を、人間への静脈投与に適した医薬組成物に関する一般手順に従い製剤化する。典型的には、静脈投与用の組成物は滅菌等張水性バッファー中の溶液である。必要な場合、組成物は可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含むこともできる。一般に、成分は別々、または一緒に混合した、単位剤形のいずれかで、例えば乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットなどの密閉保存容器中に供給する。組成物を注入により投与する場合、滅菌医薬品等級の水または生理食塩水を含有する注入用容器にそれを分配することができる。組成物を注射により投与する場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを、投与前に成分を混合することができるように提供することができる。
【０２１３】
本発明の医薬組成物は、中性または塩型として製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるアニオンなどのアニオンで形成される塩、および例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるカチオンなどのカチオンで形成される塩がある。
【０２１４】
医薬組成物は直接、またはアジュバントと組合せて投与することが好ましい。アジュバントは、クロロキン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、ＥｔＯＨ、１−メチルＬ−２−ピロリドンまたはその誘導体などのプロトン性極性化合物、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルまたはその誘導体などの非プロトン性極性化合物からなる群から選択することができる。これらの化合物はｐＨ制限に関する条件で加える。本発明の組成物は脊椎動物に投与することができる。本明細書で使用する「脊椎動物」は、当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有するものとする。特に、「脊椎動物」は哺乳動物、およびより詳細にはヒトを包含する。
【０２１５】
用語「投与する」は、治療有効用量の前述の組成物の投与を意味する。「治療有効量」によって、それを投与する効果をもたらす用量を意味し、この効果は、患者におけるＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌の誘導および増大であることが好ましい。正確な用量は治療の目的に依存し、知られている技法を使用して当業者により確認可能であろう。当技術分野で知られており前に記載したように、全身および局所送達、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食生活、投与の時間、薬剤相互作用および状態の重症度の調節が必要である可能性があり、当業者により通常の実験によって確認可能であろう。
【０２１６】
医薬組成物は、ヒト治療と脊椎動物治療の両方において、好ましくはヒト治療において使用することができる。望ましい治療活性を有する本明細書に記載する化合物は、本明細書に記載するように、生理的に許容される担体において患者に投与することができる。投与の形式に応じて、以下で論じる様々方法で化合物を製剤化することができる。製剤中の治療活性化合物の濃度は約０．００００１〜１００重量％で変わる可能性がある。例えば、本発明の医薬組成物において、本明細書で前に定義したＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体は１０〜１００重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ＩＬ−４は０．１〜１０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ＩＬ−２は０．１〜１０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ＩＧＩＰは０．１〜５０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、シンテニン−１は０．１〜５０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ガレクチン−１は０．１〜５０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ガレクチン−３は０．１〜５０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は１〜５０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ＣＤ４０Ｌは１〜５０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、Ｃ４ＢＰは１〜５０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ＢＡＦＦは１〜２０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ＬＩＧＨＴは１〜２０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）は０．１〜１０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、ワクチンタンパク質抗原は１〜２０重量％の濃度（ｗ／ｗ）、およびワクチン多糖抗原は１〜２０重量％の濃度（ｗ／ｗ）で使用することができる。
【０２１７】
本発明による医薬組成物の活性成分または化合物の濃度は、目的とする投与レジメン、目的とする使用期間、組成物の全成分の正確な量および比、ならびに当業者に知られているさらなる因子およびパラメーターにさらに調節することができる。
【０２１８】
本発明による活性成分または化合物は単独、または他の治療剤と組合せて投与することができる。
【０２１９】
医薬組成物の投与は様々な方法で行うことができる。投与の好ましい経路は局所経路である。より好ましいのは吸入による投与である。
【０２２０】
本発明の医薬組成物は防腐剤を含むこともできる。本発明の特定の組成物による防腐剤は、ブチルパラベン、エチルパラベン、イミダゾリジニル尿素、メチルパラベン、Ｏ−フェニルフェノール、プロピルパラベン、クアテルニウム−１４、クアテルニウム−１５、デヒドロ酢酸ナトリウム、ピリチオン亜鉛などを非制限的に含む。
【０２２１】
防腐剤は、微生物の増殖を予防または遅延するのに有効な量で使用する。一般に防腐剤は、組成物全体の約０．１重量％〜約１重量％の量で使用し、約０．１％〜約０．８％が好ましく、および約０．１％〜約０．５％が最も好ましい。
【０２２２】
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の治療が局所投与により容易にアクセス可能な領域または臓器に関するとき有用である。例えば、皮膚、粘膜への局所施用のため、医薬組成物は適切なペースト、軟膏、ローション、クリーム、ゲルまたは経皮パッチで製剤化することが好ましい。
【０２２３】
医薬調製物は、使用分野に応じて、フォーム、ゲルスプレー、ムース、縣濁液または粉末の形であってもよい。
【０２２４】
適切なペーストは担体に縣濁した活性成分を含む。このような担体には、石油、ホワイトソフトパラフィン、黄色ワセリンおよびグリセロールがあるが、これらだけには限られない。
【０２２５】
医薬組成物は、担体に縣濁または溶解した活性成分を含む適切な軟膏で製剤化することもできる。このような担体には、１つまたは複数のグリセロール、鉱油、液状油、液状石油、白色ワセリン、黄色ワセリン、プロピレングリコール、アルコール、トリグリセリド、セチルエステルなどの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、ホワイトワックスおよびイエロービーズワックスなどのワックス、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびセチルステアリルアルコールなどの脂肪酸アルコール、ステアリン酸、ステアリン酸セチル、ラノリンなどの脂肪酸、水酸化マグネシウム、カオリンおよび水があるが、これらだけには限られない。
【０２２６】
あるいは、医薬組成物は、担体に縣濁または溶解した活性成分を含む適切なローションまたはクリームで製剤化することもできる。このような担体には、１つまたは複数のパラフィンなどの鉱油、ヒマシ油、トウゴマ油および硬化ヒマシ油などの植物油、ソルビタンモノステアレート、ポリソーバット、セチルエステルなどの脂肪酸エステル、ワックス、セチルアルコール、ステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールなどの脂肪酸アルコール、アルコール、トリグリセリドおよび水があるが、これらだけには限られない。
【０２２７】
あるいは、医薬組成物は、担体に縣濁または溶解した活性成分を含む適切なゲルで製剤化することもできる。このような担体には、１つまたは複数の水、グリセロール、プロピレングリコール、液状パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、セルロース誘導体、ベントナイトおよびコロイド状二酸化ケイ素があるが、これらだけには限られない。
【０２２８】
本発明による調製物は、このような調製物において一般に使用されるさらなる助剤、例えば防腐剤、香料、消泡剤、染料、色素、増粘剤、表面活性物質、乳化剤、軟化薬、仕上げ剤、脂肪、油、ワックス、または化粧用もしくは外皮用製剤の他の一般的構成成分、アルコール、ポリオール、ポリマー、泡安定剤、溶解促進剤、電解質、有機酸、有機溶媒、またはシリコーン誘導体などを一般に含むことができる。
【０２２９】
本発明による医薬組成物は軟化薬を含むことができる。乾燥を予防または緩和するのに有効な量で、軟化薬を使用することができる。有用な軟化薬には、非制限的に、炭化水素油およびワックス、シリコーン油、トリグリセリドエステル、アセトグリセリドエステル、エトキシル化グリセリド、アルキルエステル、アルケニルエステル、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アルコールエーテル、エーテルエステル、ラノリンおよび誘導体、多価アルコール（ポリオール）およびポリエーテル誘導体、多価アルコール（ポリオール）エステル、ワックスエステル、ビーズワックス誘導体、植物油ワックス、リン脂質、ステロールおよびアミドがある。
【０２３０】
したがって、例えば、典型的な軟化薬には、鉱油、特に５０〜５００ＳＵＳの範囲の粘度を有する鉱油、ラノリン油、ミンク油、ココナッツ油、ココアバター、オリーブ油、アーモンド油、マカダミアナッツ油、アロエエキス、ホホバ油、サフラワー油、コーン油、液状ラノリン、綿実油、ピーナッツ油、パーセリン油、ペルヒドロスクアレン（スクアレン）、ヒマシ油、ポリブテン、無臭ミネラルスピリット、スイートアーモンド油、アボカド油、カロフィラム油、リシン油、ビタミンＥ酢酸エステル、オリーブ油、ミネラルスピリット、セテアリルアルコール（主にセチルアルコールとステアリルアルコールからなる脂肪アルコールの混合物）、リノレン酸アルコール、オレイルアルコール、オクチルドデカノール、小麦麦芽セテアリルオクタノエート（セテアリルアルコールと２−エチルヘキサン酸のエステル）の油などの胚芽の油、パルミチン酸セチル、アジピン酸ジイソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ブチル、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸イソセチル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸オクチルヒドロキシ、ステアリン酸プロピレングリコール、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、オレイン酸グリセリル、アセチルグリセリド、（Ｃ１２〜Ｃ１５）アルコールのオクタノン酸塩および安息香酸塩、グリコールおよびグリセロールの塩などのアルコールおよび多価アルコールのオクタノン酸塩およびデカン酸塩、およびアジピン酸イソプロピルの塩などのアルコールおよび多価アルコールのリシン−オレイン酸塩、ラウリン酸ヘキシル、ドデカノン酸オクチル、ジメチコンコポリオール、ジメチコノール、ラノリン、ラノリンアルコール、ラノリンワックス、水素化ラノリン、ヒドロキシル化ラノリン、アセチル化ラノリン、石油、ラノリン酸イソプロピル、ミリスチン酸セチル、ミリスチン酸グリセリル、ミリスチン酸ミリスチル、乳酸ミリスチル、セチルアルコール、イソステアリルアルコール、ステアリルアルコール、およびラノリン酸イソセチルなどがある。
【０２３１】
さらに、本発明による医薬組成物は乳化剤を含むこともできる。乳化剤（すなわち乳化物質）は、組成物の成分の均一な配合をもたらすのに有効な量で使用することが好ましい。有用な乳化剤には（ｉ）脂肪酸石鹸、例えばステアリン酸カリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸アンモニウム、およびステアリン酸トリエタノールアミン；脂肪酸石鹸を含有するポリオール脂肪酸モノエステル、例えばカリウム塩またはナトリウム塩のいずれかを含有するモノステアリン酸グリセロール；硫酸エステル（ナトリウム塩）、例えばラウリル硫酸ナトリウム５、およびセチル硫酸ナトリウム；および硫酸エステルを含有するポリオール脂肪酸モノエステル、例えばラウリル硫酸ナトリウムを含有するモノステアリン酸グリセリル；などのアニオン性物質、（ｉｉ）Ｎ（ステアロイルコラミノホルミルメチル）ピリジウム；Ｎ−ソヤ−Ｎ−エチルモルホリニウムエトサルフェート；アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ジイソブチルフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；および塩化セチルピリジニウム；などのカチオン性塩化物、および（ｉｉｉ）ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、例えばモノステアレート；ポリオキシエチレンラウリルアルコール；ポリオキシプロピレン脂肪アルコールエーテル、例えば、プロポキシル化オレイルアルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレンステアレート；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート；ソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタン；ポリオキシエチレングリコール脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレングリコールモノステアレート；およびポリオール脂肪酸エステル、例えばグリセリルモノステアレートおよびプロピレングリコールモノステアレート；およびエトキシル化ラノリン誘導体、例えばエトキシル化ラノリン、エトキシル化ラノリンアルコールおよびエトキシル化コレステロールなどの非イオン性物質がある。乳化剤の選択はＳｃｈｒａｄｅｒ、Ｈｕｔｈｉｇ  Ｂｕｃｈ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９、３ｒｄｐａｒｔ中に例示的に記載されている。
【０２３２】
本発明による医薬組成物は界面活性剤を含むこともできる。適切な界面活性剤は、例えば、浄化剤、乳化物質、発泡促進剤、ハイドロトロープ剤、可溶化剤、縣濁剤および（液体中固体分散を容易にする）非界面活性剤として一般に分類される界面活性剤を含むことができる。
【０２３３】
界面活性剤は、両親媒性、アニオン性、カチオン性および非イオン性界面活性剤として通常分類される。両親媒性界面活性剤には、アシルアミノ酸および誘導体およびＮ−アルキルアミノ酸がある。アニオン性界面活性剤には、アシルアミノ酸および塩、アシルグルタメート、アシルペプチド、アシルサルコシネート、およびアシルタウレートなど；カルボン酸および塩、アルカン酸、エステルカルボン酸、およびエーテルカルボン酸など；スルホン酸および塩、アシルイセチオネート、アルキルアリルスルホネート、アルキルスルホネート、およびスルホサクシネートなど；硫酸エステル、アルキルエーテル硫酸およびアルキル硫酸などがある。カチオン性界面活性剤には、アルキルアミン、アルキルイミダゾリン、エトキシル化アミン、および第四級塩（アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、アルキルベタイン、ヘテロ環アンモニウム塩、およびテトラアルキルアンモニウム塩など）がある。および非イオン性界面活性剤には、アルコール、８〜１８個の炭素原子を含有する第一級アルコールなど；アルカノールアミド、アルカノールアミン誘導アミドおよびエトキシル化アミドなど；アミンオキシド；エステル、エトキシル化カルボン酸、エトキシル化グリセリド、グリコールエステルおよび誘導体、モノグリセリド、ポリグリセリルエステル、多価アルコールエステルおよびエーテル、ソルビタン／ソルビトールエステル、およびリン酸トリエステルなど；およびエーテル、エトキシル化アルコール、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ポリシロキサン、およびプロポキシル化ポリオキシエチレンエーテルなどがある。
【０２３４】
さらに、本発明による医薬組成物は塗膜形成要素を含むこともできる。本発明により使用される適切な塗膜形成要素は組成物をスムースに保ち、さらにアクリルアミド／アクリル酸ナトリウムコポリマー；アクリル酸アンモニウムコポリマー；バルサムペルー；セルロースガム；エチレン／無水マレイン酸コポリマー；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ポリアクリルアミド；ポリエチレン；ポリビニルアルコール；ｐｖｍ／ＭＡコポリマー（ポリビニルメチルエーテル／無水マレイン酸）；ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）；Ｇｕｌｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能なＰＡ−１８などの無水マレイン酸コポリマー；ＧＡＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＧａｎｅｘ  Ｖ−２１６などのＰＶＰ／ヘキサデセンコポリマー；アクリルアクリレートコポリマーなどを非制限的に含む。
【０２３５】
一般に塗膜形成要素は、組成物全体の約０．１重量％〜約１０重量％の量で使用し、約１％〜約８％が好ましく、および約０．１ＤＥＧ／Ｏ〜約５％が最も好ましい。フルクトース、グルコース、グルタミン酸、グリセリン、ハチミツ、マルチトール、メチルグルセス−１０、メチルグルセス−２０、プロピレングリコール、乳酸ナトリウム、スクロースなどを含めた保水剤を有効量で使用することもできる。
【０２３６】
その目的とする用途に有効な量で、本発明による医薬組成物に添加または使用することができる他の成分には、アミノ酸、タンパク質、バニラ、アロエエキス、バイオフラビノイドなど；緩衝剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤；乳化安定剤；ｐＨ調節剤；不透明化剤；およびブタンカーボンクリオキシド、エタン、ハイドロクロロフルオロカーボン２２および１４２ｂ、ハイドロフルオロカーボン１５２ａ、イソブタン、イソペンタン、窒素、一酸化二窒素、ペンタン、プロパンなどなどの推進剤などの、性能または消費者に対する魅力を高めるための生物学的添加剤がある。
【０２３７】
さらに、本発明による調製物は、抗酸化、フリーラジカルスカベンジャー、抗紅斑性、抗炎症性または抗アレルギー作用を有して、それらの作用を補充または増大する化合物を含むこともできる。特に、これらの化合物は、ビタミン、植物エキス、アルファおよびベータヒドロキシ酸、セラミド、抗炎症性、抗菌性またはＵＶフィルタリング物質、ならびにそれらの誘導体およびそれらの混合物の群から選択することができる。液相は、鉱油、鉱物ワックス、分枝および／または非分枝炭化水素および炭化水素系ワックス、飽和および／または不飽和のトリグリセリド、分枝および／または非分枝Ｃ８〜Ｃ２４−アルカンカルボン酸の物質の群から選択することが有利であり、それらは合成、半合成または天然油、オリーブ油、パーム油、アーモンド油または混合物など；油、脂肪またはワックス、飽和および／または不飽和のエステル、分枝および／または非分枝Ｃ３〜Ｃ３０−アルカンカルボン酸、および芳香族カルボン酸由来の飽和および／または不飽和、分枝および／または非分枝Ｃ３〜Ｃ３０−アルコール、および飽和および／または不飽和、分枝および／または非分枝Ｃ３〜Ｃ３０−アルコール、例えばミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ヘキシルデシル、オレイン酸オレイル；およびさらにこのようなエステルの合成、半合成および天然混合物、ホホバ油、安息香酸アルキルなど、またはシリコーン油、例えばシクロメチコン、ジメチルポリシロキサン、ジエチルポリシロキサン、オクタメチルシクロ−テトラシロキサン、およびこれらの混合物またはジアルキルエーテルなどから選択することができる。
【０２３８】
本発明の好ましい実施形態では、吸入によって医薬組成物を投与することができる。医薬組成物の調製は、したがってスプレー、例えばポンプスプレーまたはエアロゾルの形であってよい。典型的には、本発明によるエアロゾルは、医薬品または医薬組成物、１つまたは複数のクロロフルオロカーボン推進剤、および界面活性剤、またはエタノールなどの溶媒のいずれかを含む。例えば、推進剤１１および／または推進剤１１４および／または推進剤１２のようなエアロゾル推進剤を使用することができる。本発明によるエアロゾルに適したさらなる推進剤は、プロパン、ブタン、ペンタンおよびその他である。使用することができ、従来のクロロフルオロカーボンと比較して最小オゾン層破壊効果を有すると考えられる他の推進剤は、フルオロカーボンおよび水素含有クロロフルオロカーボンを含む。医療用エアロゾル製剤の他のエアロゾルは、例えばＥＰ０３７２７７７、ＷＯ９１／０４０１１、ＷＯ９１／１１１７３、ＷＯ９１／１１４９５およびＷＯ９１／１４４２２中に開示される。典型的には、アルコール、アルカン、ジメチルエーテル、界面活性剤（フッ素化および非フッ素化界面活性剤、カルボン酸、ポリエトキシレートなどを含む）および少量の従来のクロロフルオロカーボン推進剤などの１つまたは複数のアジュバントを製剤に加えることができる。
【０２３９】
さらに好ましいのは、１，１，１，２−テトラフルオロエタンより高い極性を有する共溶媒（例えば、アルコールまたは低級アルカン）と、医薬組成物粉末の安定した製剤化を得るための界面活性剤の両方と組合せた１，１，１，２−テトラフルオロエタンの使用である。さらに、界面活性剤をエアロゾル製剤の重要な成分として使用して、医薬組成物の凝集を低下させ、例えば本発明のさらなる好ましい実施形態に従い利用する場合、分配装置のバルブに油を差し、それによってバルブ作動の一貫した再現性および分配用量の精度を確実にすることができる。典型的には、本発明による医薬組成物は、１，１，１，２−テトラフルオロエタンに分散させる前に界面活性剤で事前にコーティングすることができる。
【０２４０】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、医薬エアロゾル製剤は、当業者に知られている任意の適切な装置で、好ましくは定量吸入器（ＭＤＩ）、噴霧器、Ｒｏｔａｈａｌｅｒまたはａｕｔｏｈａｌｅｒ装置によって分配することができる。
【０２４１】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物の活性化合物の肺胞吸収は、エアロゾルの最適化によって、例えば適切なエアロゾル生成システムの使用によって、好ましくはＪ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４、３５４〜３５７中に記載されたＡＥＲｘエアロゾル送達システム、またはその任意の適切な改変型の使用によって増大することができる。
【０２４２】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物の活性化合物の上皮への取り込みは、成分の適切なコーティング、例えば活性化合物のリポソームコーティングによって、好ましくはＴｅｎ  ＲＭら、（２００２）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２（２〜３）、３３３〜４４によって与えられたガイダンスに従い増大することができる。
【０２４３】
本発明の別の好ましい実施形態では、本明細書で前に定義した医薬組成物の活性成分は、適切な担体タンパク質、例えばＩｇＦｃ受容体タンパク質またはポリマーＩｇ受容体と融合することができる。本明細書で前に定義したＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１変異体は、融合タンパク質として与えることができることが好ましい。融合パートナーはＮ−またはＣ−末端に与えることができる。さらにＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ＣＤ４０分子の刺激剤、好ましくは抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＣ４ＢＰ、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのリガンド、好ましくはＢＡＦＦまたはＬＩＧＨＴ、ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、好ましくはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）および／またはワクチンタンパク質抗原を、融合タンパク質として、好ましくはＩｇＦｃ受容体タンパク質またはポリマーＩｇ受容体との融合タンパク質として与えることができる。特に好ましいのは、例えばＡ．Ｊ．Ｂｉｔｏｎｔｉら、（２００４）ＰＮＡＳ１０１、９７６３〜９７６８中に記載された新生児定常領域断片（Ｆｃ）受容体（ＦｃＲｎ）との融合体である。さらに特に好ましいのは、例えばＦｅｒｋｏｌ  Ｔら、（２０００）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６１（３Ｐｔ１）、９４４〜５１中に記載されたポリマー免疫グロブリン受容体ｐＩｇＲとの融合体である。
【０２４４】
本明細書で前に定義したエアロゾル技法の最適化、本明細書で前に定義した適切なコーティングの利用、本明細書で前に定義した適切な担体タンパク質と本発明の医薬組成物の活性化合物の融合は、個別または群としてのいずれかで組合せることができることが、本発明によってさらに想定される。
【０２４５】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、医薬組成物または医薬品中の成分間の比は、当業者の知識に従い適切に調節することができる。例えば、医薬組成物中のＩＬ−２１とＩＬ−４の間の比は、約１：１と１００：１の間、好ましくは約５：１と２５：１の間、より好ましくは約２０：１で調節することができる。あるいは、医薬組成物中の本明細書で前に定義したＩＬ−２１変異体とＩＬ−４の間の比は、約１：１と１００：１の間、好ましくは約５：１と２５：１の間、より好ましくは約２０：１で調節することができる。
【０２４６】
さらなる好ましい実施形態では、医薬組成物中のＩＬ−２１とＩＬ−２の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。あるいは、医薬組成物中の本明細書で前に定義したＩＬ−２１変異体とＩＬ−２の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。
【０２４７】
アッセイ、例えば本明細書で前に記載した、または従来技術の公知で検閲済みの教本から誘導可能な試験に基づくアッセイを場合によっては利用して、本発明の医薬組成物の成分に関する最適比および／または用量範囲を確認することを助けることができる。製剤中に利用する本明細書で前に定義した医薬組成物の正確な用量および成分間の比は投与経路、および疾患もしくは障害の正確な型にも依存し、実践者の判断および各患者の状況に従って決定しなければならない。有効な用量または成分の比は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは（動物）モデル試験系から誘導した用量応答曲線から推定することができる。
【０２４８】
典型的には、主治医および臨床因子が用量レジメンを決定し得る。医学分野でよく知られているように、任意の一患者に関する用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与する個々の化合物、性別、時間および投与経路、一般的健康状態、および同時に投与する他の薬剤を含めた、多くの要因に依存する。典型的な用量は、例えば０．００１〜１０００μｇの範囲内であってよいが、しかしながら、この例示的範囲より下または上の用量が、特に前述の要因を考慮すると想定される。
【０２４９】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、本明細書で前に定義した医薬組成物は、Ｂ細胞からのＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体の分泌を増大または改善することができる他の因子をさらに含むことができる。
【０２５０】
特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤を含むことができる。本明細書で前に使用した用語「ＣＤ４０分子の刺激剤」は、細胞表面上のＣＤ４０分子を刺激することができ、したがってＣＤ４０分子発現または提示細胞中のＣＤ４０依存性シグナル変換カスケードの、刺激または活性化をもたらすことができる任意の分子を示す。ＣＤ４０が、抗原提示細胞上で特に見られ、それらの活性化に必要とされる、共刺激タンパク質であることは一般に知られている。典型的には、例えばＢ細胞上での、ＣＤ４０分子の刺激剤とＣＤ４０分子またはＣＤ４０受容体の結合によって、特にＢ細胞活性化の休止およびＩＬ−４の産生を含む反応が誘導される。これらの相互作用の結果として、Ｂ細胞は分裂、抗体のアイソタイプスイッチ、および形質細胞への分化を経る可能性がある。「ＣＤ４０分子の刺激剤」は、アゴニストＣＤ４０結合分子、より好ましくは抗ＣＤ４０抗体、Ｃ４ＢＰ機能を有するＣＤ４０リガンドまたはタンパク質に関することが好ましい。本明細書で前に使用した用語「抗ＣＤ４０抗体」は、ＣＤ４０に対するまたはＣＤ４０に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体、好ましくは天然ＣＤ４０リガンドの効果を模倣したおよび／または大部分のその生物学的下流効果を誘導するアゴニスト抗体を指す。この用語は、本明細書で前に定義した結合能力が害されない限り、または分子が依然としてＣＤ４０と結合可能である限り、このような抗体の任意の断片、誘導体または修飾、例えば、単鎖断片なども包含することができる。
【０２５１】
本明細書で前に使用した用語「ＣＤ４０リガンド」は、ＣＤ４０の天然リガンド、好ましくはＯＭＩＭ＊３００３８６によって定義されるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）を指す。この用語はＣＤ４０Ｌの機能的等価物も含む。用語「ＣＤ４０Ｌの機能的等価物」は、特にＣＤ４０との結合の点でＣＤ４０Ｌの機能を与えるタンパク質を指す。このような機能的等価物は、例えば、切断型のＣＤ４０Ｌ、修飾型のＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０Ｌ模倣分子であってよい。
【０２５２】
用語「Ｃ４ＢＰ機能を有するタンパク質」は、Ｃ４ＢＰ自体、およびＣＤ４０との結合の点で、その機能的等価物、例えば、切断型または修飾型のＣ４ＢＰまたはＣ４ＢＰ模倣分子を指す。この用語は、ＯＭＩＭ＊１２０８３０によって定義されるＣ４ＢＰに関することが好ましい。
【０２５３】
本明細書で前に使用したＣＤ４０分子の刺激剤は、任意の起源、特に哺乳動物起源であってよく、例えば、マウス、サルまたはラット由来、好ましくはヒト起源であってよい。タンパク質は天然供給源から精製することができ、または例えば細菌または下等真核生物宿主細胞において組換えによって産生することができる。
【０２５４】
本発明のより好ましい実施形態では、本明細書で前に定義した医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体、ＯＭＩＭ＊３００３８６によって定義されるＣＤ４０Ｌ、またはＯＭＩＭ＊１２０８３０によって定義されるＣ４ＢＰを含むことができる。
【０２５５】
さらなるより好ましい実施形態では、本明細書で前に定義した２つ以上の異なるＣＤ４０分子の刺激剤は組合せで使用することができ、例えばＣＤ４０に対するモノクローナル抗体、およびＯＭＩＭ＊３００３８６によって定義されるＣＤ４０Ｌ、およびＯＭＩＭ＊１２０８３０によって定義されるＣ４ＢＰを、本発明の医薬組成物の文脈において組合せで使用することができる。
【０２５６】
さらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、腫瘍壊死因子スーパーファミリーの少なくとも１つのリガンドを含むことができる。
【０２５７】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、腫瘍壊死因子スーパーファミリーの少なくとも１つのリガンドを含むことができる。
【０２５８】
本明細書で前に使用した用語「腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド」は、アポトーシスを引き起こすことができるサイトカイン群のメンバーを指し、それはＴＮＦアルファ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＬＴＢまたはリンホトキシンベータ、ＬＴＡまたはリンホトキシンアルファまたはＴＮＦベータ、ＴＮＦＳＦ８またはＣＤ３０ＬまたはＣＤ１５３、ＴＮＦＳＦ７またはＣＤ７０またはＣＤ２７Ｌ、ＴＮＦＳＦ４またはＯＸ４０Ｌまたはｇｐ３４、ＴＮＦＳＦ９または４−１ＢＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１またはＲＡＮＫＬまたはＴＲＡＮＣＥまたはＯＤＦまたはＯＰＧＬ、ＴＮＦＳＦ１５またはＴＬ１、ＴＮＦＳＦ１２またはＴＷＥＡＫまたはＡｐｏ３Ｌ、ＴＮＦＳＦ１４またはＬＩＧＨＴまたはＨＶＥＭ−Ｌ、ＴＮＦＳＦ１３またはＡＰＲＩＬまたはＴＲＤＬ−１ＴＮＦＳＦ１３ＢまたはＢＡＦＦまたはＢＬｙＳまたはＴＨＡＮＫまたはＴＡＬＬ−１、ＴＮＦＳＦ１８またはＴＬ６またはＡＩＴＲＬまたはＧＩＴＲＬ、またはＥＤ１またはＥＤＡまたはＴａｂｂｙ、Ｔａｇ７およびＥｉｇｅｒを含む群のメンバーを指すことが好ましい。この用語は任意のこれらの因子の機能的等価物も指す。用語「機能的等価物」は、原型因子に由来し、または原型因子に基づいて修飾され得るが、当業者に知られているように、特に対応する受容体分子との結合または典型的な生物学的影響の誘導に関して、原型因子の主要機能を依然として与える分子、または原型因子の主要機能を模倣する分子を意味する。腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンドは、任意の起源、特に哺乳動物起源であってよく、例えば、マウス、サルまたはラット由来、好ましくはヒト起源であってよい。タンパク質は天然供給源から精製することができ、または例えば細菌または下等真核生物宿主細胞において組換えによって産生することができる。
【０２５９】
腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド群の好ましいメンバーはＢＡＦＦおよびＬＩＧＨＴである。用語「ＢＡＦＦ」は、ＯＭＩＭ＊６０３９６９によって定義されるヒトＢＡＦＦに関することが好ましい。用語「ＬＩＧＨＴ」は、ＯＭＩＭ＊６０４５２０によって定義されるヒトＬＩＧＨＴに関することが好ましい。
【０２６０】
本発明のより好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、ＯＭＩＭ＊６０３９６９によって定義されるＢＡＦＦ、またはＯＭＩＭ＊６０４５２０によって定義されるＬＩＧＨＴを含むことができる。
【０２６１】
さらなる好ましい実施形態では、本明細書で前に定義した腫瘍壊死スーパーファミリーの２つ以上の異なるリガンドは、例えばＯＭＩＭ＊６０３９６９によって定義されるＢＡＦＦおよびＯＭＩＭ＊６０４５２０によって定義されるＬＩＧＨＴと組合せて使用することができ、ＡＰＲＩＬは本発明の医薬組成物の文脈において組合せで使用することができる。
【０２６２】
これらの因子は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体、ＯＭＩＭ＊３００３８６によって定義されるＣＤ４０Ｌ、またはＯＭＩＭ＊１２０８３０によって定義されるＣ４ＢＰを含む医薬組成物と組合せて使用することもできる。
【０２６３】
用語「組合せ」は、本明細書で前に定義した腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンドの任意の群または亜群と、ＣＤ４０分子の刺激剤の任意の群または亜群を包含する。
【０２６４】
さらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、ヒト白血球インターフェロン活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことができる。別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、および本明細書で前に定義した少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、ヒト白血球インターフェロン活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことができる。
【０２６５】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、および少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、および本明細書で前に定義した腫瘍壊死因子スーパーファミリーの少なくとも１つのリガンド、ヒト白血球インターフェロン活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことができる。
【０２６６】
用語「ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド」は、ヒト白血球によって産生される、抗ウイルスおよび抗腫瘍性を有し、マクロファージおよびナチュラルキラーリンパ球活性化、ならびに主要組織適合性複合体糖タンパク質クラスＩおよびＩＩの増大を示し、Ｔ細胞に外来、例えば微生物ペプチドを提示することができるタンパク質を指す。この用語は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、より好ましくはＯＭＩＭ＊１４７６６０によって定義されるヒトインターフェロン−αに関することが好ましい。
【０２６７】
本発明のより好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３に加えて、ＯＭＩＭ＊１４７６６０によって定義されるヒトインターフェロン−αを含むことができる。
【０２６８】
本発明の別の実施形態では、本明細書で前に定義した医薬組成物はワクチンと組合せることができる。用語「組合せ」は、本明細書で前に定義した医薬組成物の成分を、ワクチン化合物と混合することができることを意味する。あるいはこの用語は、ワクチン化合物と一緒の本明細書で前に定義した医薬組成物の投与も指す。本明細書で前に使用した用語「ワクチン化合物」は、当業者に知られている任意の適切なワクチンまたは予防接種化合物を指す。それは（ｉ）不活化ワクチン、（ｉｉ）弱毒化ワクチン、（ｉｉｉ）サブユニットワクチンおよび（ｉｖ）ＤＮＡワクチンを指すことが好ましい。
【０２６９】
用語「不活化ワクチン」は、培養中に増殖し、および後に好ましくは熱もしくはホルムアルデヒドを使用することによって、殺傷もしくは破壊されたウイルス粒子を含むワクチンまたは組成物を意味する。このようなウイルス粒子は典型的には複製できないが、ただし特定のウイルスタンパク質、例えばカプシドタンパク質は、免疫系によって認識され応答を誘発するほど十分完全である。用語「弱毒化ワクチン」は、低い病毒性を有する生きたウイルス粒子を含むワクチンまたは組成物を意味する。典型的には、生きた弱毒化ウイルス粒子は、非常にゆっくりではあるが再生することができる。これらのワクチンは、当業者に知られている任意の適切な方法によって、通常は低毒性株を選択する組織培養中でのウイルスの増殖によって、または毒性に必要とされる遺伝子の突然変異誘発もしくは標的欠失によって生成することができる。
【０２７０】
用語「サブユニットワクチン」は、ウイルス粒子、完全もしくはその他の導入無しで免疫系に与えられる、抗原を含むワクチンまたは組成物を意味する。用語「抗原」は、ウイルス構造、例えばペプチドもしくはタンパク質構造、または非タンパク質起源の表面構造、例えば糖構造もしくは樹状構造の任意の抗原決定基を指す。サブユニットワクチンは、当業者に知られている任意の適切な方法によって生成することができる。典型的には、この生成は、ウイルスからの特異的タンパク質または糖構造のタンパク質部分の単離、およびワクチンまたはワクチン組成物としてのそれらの投与を含むことができる。
【０２７１】
用語「ＤＮＡワクチン」は、典型的には細胞、例えばヒトまたは動物細胞中に挿入され、その中で発現される、感染因子のＤＮＡまたは感染因子の構造要素をコードするＤＮＡから作製したＤＮＡ組成物に関する。
【０２７２】
発現されるタンパク質を認識する免疫系の細胞は、後にこれらのタンパク質およびそれを発現する細胞に対して攻撃を加える可能性がある。
【０２７３】
好ましいのは、管轄官庁、例えばＥＭＥＡまたはＦＤＡにより承認されているワクチン、またはドイツで公開された医薬品のレッドリストから誘導することができるワクチンである。
【０２７４】
さらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、少なくとも１つのワクチンタンパク質抗原を含むことができる。
【０２７５】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、ならびに本明細書で前に定義した少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、少なくとも１つのワクチンタンパク質抗原を含むことができる。
【０２７６】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、ならびに本明細書で前に定義した腫瘍壊死因子スーパーファミリーの少なくとも１つのリガンド、少なくとも１つのワクチンタンパク質抗原を含むことができる。
【０２７７】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、ならびに本明細書で前に定義した腫瘍壊死因子スーパーファミリーの少なくとも１つのリガンド、およびヒト白血球インターフェロン活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのワクチンタンパク質抗原を含むことができる。
【０２７８】
用語「ワクチンタンパク質抗原」は、当業者に知られているヒトまたは獣用予防接種に適した任意のタンパク質抗原を指す。このような抗原は、例えば検閲済みの予防接種教本から、例えば「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ−Ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｐｉｎｋ  Ｂｏｏｋ：Ｃｏｕｒｓｅ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、１０ｔｈｅｄ、（２００８）Ａｔｋｉｎｓｏｎら、ｅｄ．，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＣＤＣから誘導することができる。
【０２７９】
この用語は、トキソイド（例えば、不活化細菌毒素）または酵素不活化毒素サブユニット、または不活化ウイルス粒子、またはサブビリオン産物、より好ましくは「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ−Ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｐｉｎｋ  Ｂｏｏｋ：Ｃｏｕｒｓｅ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、１０ｔｈｅｄ、（２００８）Ａｔｋｉｎｓｏｎら、ｅｄ．，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＣＤＣ中に言及されたワクチンを含む、ワクチンに関することが好ましい。
【０２８０】
本発明のより好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３に加えて、ワクチンタンパク質抗原、好ましくはジフテリアトキソイドワクチンおよび／または破傷風トキソイドジフテリアトキソイドを含むことができる。
【０２８１】
さらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３に加えて、少なくとも１つのワクチン多糖抗原を含むことができる。
【０２８２】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３に加えて、本明細書で前に定義した少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、少なくとも１つのワクチン多糖抗原を含むことができる。
【０２８３】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３に加えて、少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、ならびに本明細書で前に定義した腫瘍壊死因子スーパーファミリーの少なくとも１つのリガンド、少なくとも１つのワクチン多糖抗原を含むことができる。
【０２８４】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４に加えて、少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、ならびに本明細書で前に定義した腫瘍壊死因子スーパーファミリーの少なくとも１つのリガンド、およびヒト白血球インターフェロン活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのワクチン多糖抗原を含むことができる。
【０２８５】
別のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、少なくとも１つのＣＤ４０分子の刺激剤、ならびに本明細書で前に定義した腫瘍壊死因子スーパーファミリーの少なくとも１つのリガンド、およびヒト白血球インターフェロン活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、および少なくとも１つのワクチンタンパク質抗原、少なくとも１つのワクチン多糖抗原を含むことができる。
【０２８６】
用語「ワクチン多糖抗原」は、当業者に知られているヒトまたは獣用予防接種に適した任意の多糖抗原を指す。このような抗原は、例えば検閲済みの予防接種教本から、例えば「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ−Ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｐｉｎｋ  Ｂｏｏｋ：Ｃｏｕｒｓｅ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、１０ｔｈｅｄ、（２００８）Ａｔｋｉｎｓｏｎら、ｅｄ．，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＣＤＣから誘導することができる。この用語は、細菌由来の純粋な細胞壁多糖で構成されるワクチンに関することが好ましい。さらに好ましいのは、コンジュゲート多糖ワクチン、例えば多糖がタンパク質と化学結合してその効能を増大するワクチンである。対応する方法は当業者に知られており、または適切な教本から、例えば「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ−Ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｐｉｎｋ  Ｂｏｏｋ：Ｃｏｕｒｓｅ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、１０ｔｈｅｄ、（２００８）Ａｔｋｉｎｓｏｎら、ｅｄ．，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＣＤＣから誘導することができる。
【０２８７】
本発明のより好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３に加えて、ワクチンタンパク質抗原、好ましくは肺炎球菌ワクチンおよび／またはインフルエンザ菌Ｂ型ワクチンを含むことができる。
【０２８８】
医薬組成物中に存在する場合、前述の因子は当業者に知られている任意の適切な比で存在してよく、例えば因子は等モル量で存在してよく、または１つの因子は、もう１つの因子に対して約５：１〜２０：１の比で存在してよい。これらの比は、ＩＬ−２１、ＩＬ−２１変異体とＩＬ−２またはＩＬ−４の間の比、およびＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体とＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３の間の比、および本明細書で前に定義したＩＬ−２またはＩＬ−４と、ＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３の間の比と組合せることもできる。正確および／または最適比は、当業者に知られている試験、例えばＩＬ−２１変異体タンパク質の文脈において本明細書で前に記載した試験を実施することにより調節することができる。
【０２８９】
本発明の医薬組成物は、当業者に知られている任意の適切な投与レジメンに従い患者に投与することができる。投与は、週に１回、より好ましくは週に２回、３回、４回、５回または６回、および最も好ましくは１日に１回およびまたは１日に２回またはそれより多く与えることができることが好ましい。本発明は、免疫反応後、または免疫系に関する感染後に、投与を直接与えることができるとさらに想定する。しかしながら、治療の進行中、投与は一層長い時間間隔で与えることができ、および必要な際は、一層短い時間間隔で、例えば１日に数回与えることができる。好ましい例では、本明細書に記載する方法および当業者に知られているさらなる方法を使用して、免疫応答をモニタリングすることができ、例えば時間、量および／または組成において投与を最適化する。進行は定期的な評価によってモニタリングすることができる。共同療法手法において、すなわち補充療法用に他の医薬品または薬剤、例えば抗生物質、抗ウイルス薬またはＩｇＧもしくはＩｇＡ免疫グロブリンなどとの同時投与において本発明の医薬組成物を利用することも想定される。
【０２９０】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＧＩＰを含むキットに関する。さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにシンテニン−１を含むキットに関する。さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにガレクチン−１を含むキットに関する。さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにガレクチン−３を含むキットに関する。さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＩＧＩＰを含むキットに関する。さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにシンテニン−１を含むキットに関する。さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにガレクチン−１を含むキットに関する。さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにガレクチン−３を含むキットに関する。さらなる態様では、本発明は、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１、および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３を含むキットに関する。
【０２９１】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で前に定義した医薬組成物の投与の文脈において、使用することができるキットも提供する。特に、本発明によるキットは、本発明の医薬組成物の文脈において本明細書で前に定義したように、原発性体液性免疫不全疾患、より好ましくは分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体のレベルの低下を伴う疾患の治療、さらにより好ましくは免疫グロブリンアイソタイプスイッチの障害または遮断の症状と関係がある疾患、および最も好ましくはＩｇＡの選択的欠乏症、一般変異型免疫不全症、ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症、増大したＩｇＭまたはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を有する免疫不全の治療に使用することができる。
【０２９２】
好ましい一実施形態では、本発明によるキットはＩＬ−２１およびＩＬ−４を含む。別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−４を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明によるキットはＩＬ−２１およびＩＬ−２を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１変異体およびＩＬ−２を含む。別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１およびＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２またはＩＬ−４を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１およびＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２およびＩＬ−４を含む。別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２およびＩＧＩＰを含む。別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２およびシンテニン−１を含む。別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２およびガレクチン−１を含む。別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２およびシンテニン−３を含む。別の好ましい実施形態では、本発明によるキットは、本明細書で前述したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−２および／またはＩＧＩＰおよび／またはシンテニン−１および／またはガレクチン−１および／またはガレクチン−３を含む。
【０２９３】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、キット中の成分間の比は、当業者の知識に従い適切に調節することができる。例えば、キット中のＩＬ−２１とＩＬ−４の間の比は、約１：１と１００：１の間、好ましくは約５：１と２５：１の間、より好ましくは約２０：１で調節することができる。あるいは、キット中の本明細書で前に定義したＩＬ−２１変異体とＩＬ−４の間の比は、約１：１と１００：１の間、好ましくは約５：１と２５：１の間、より好ましくは約２０：１で調節することができる。
【０２９４】
さらなる好ましい実施形態では、キット中のＩＬ−２１とＩＬ−２の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。あるいは、キット中の本明細書で前に定義したＩＬ−２１変異体とＩＬ−２の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。
【０２９５】
さらなる好ましい実施形態では、キット中のＩＬ−２１とＩＧＩＰの間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。あるいは、キット中の本明細書で前に定義したＩＬ−２１変異体とＩＧＩＰの間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。
【０２９６】
さらなる好ましい実施形態では、キット中のＩＬ−２１とシンテニン−１の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。あるいは、キット中の本明細書で前に定義したＩＬ−２１変異体とシンテニン−１の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。
【０２９７】
さらなる好ましい実施形態では、キット中のＩＬ−２１とガレクチン−１の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。あるいは、キット中の本明細書で前に定義したＩＬ−２１変異体とガレクチン−１の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。
【０２９８】
さらなる好ましい実施形態では、キット中のＩＬ−２１とガレクチン−３の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。あるいは、キット中の本明細書で前に定義したＩＬ−２１変異体とガレクチン−３の間の比は、約１：１と８０：１の間、好ましくは約５：１と２０：１の間、より好ましくは約１５：１で調節することができる。
【０２９９】
キットの成分は、本発明によれば、１つまたは複数の容器または別個の物体中に含まれ得る。それらは好ましくは医薬組成物または医薬品として製剤化することができ、より好ましくは、それらは本発明の医薬組成物の文脈において本明細書で前に記載したように製剤化することができ、例えば、それらは適切な医薬担体などを含むことができる。特に好ましいのは、本発明の医薬組成物の文脈において本明細書で前に言及したように、エアロゾルまたは吸入投与用の製剤である。本発明によるキットは、キットおよびその要素の使用または利用を示す文書も、場合によっては含むことができる。好ましくは、本発明のキット中に含まれる説明書は、推奨される治療オプション、投与レジメンなどを含むことができる。
【０３００】
さらなる好ましい実施形態では、本発明によるキットは、少なくとも１つのエレメント：
（ｉ）ＣＤ４０分子の刺激剤、
（ｉｉ）腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド、
（ｉｉｉ）ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、
（ｉｖ）ワクチンタンパク質抗原、および
（ｖ）ワクチン多糖抗原をさらに含むことができる。
【０３０１】
用語「ＣＤ４０分子の刺激剤」、「腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド」、「ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド」、「ワクチンタンパク質抗原」および「ワクチン多糖抗原」は、本発明の医薬組成物の文脈において定義している。したがってこれらの定義は、本発明のキットにも適用する。本発明のキットの文脈では、本明細書で前に定義したこれらの群の全メンバー、およびその全ての考えられる組合せも好ましい。キットは、本発明の具体的な実施形態では、エレメント（ｉ）〜（ｖ）の任意の群または亜群、ならびに本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４、ＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１またはガレクチン−３を含むことができる。本発明によるキットは、少なくとも１つのエレメント（ｉ）すなわち、ＣＤ４０分子の刺激剤、ならびに本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３を含むことが好ましい。
【０３０２】
本発明のより好ましい実施形態では、本発明のキットは、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、抗体、好ましくはＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体、好ましくはＯＭＩＭ＊３００３８６またはＣ４ＢＰによって定義される抗体、好ましくはＯＭＩＭ＊１２０８３０によって定義される抗体を含むことができる。
【０３０３】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明のキットは、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、好ましくはＯＭＩＭ＊６０３９６９によって定義されるＢＡＦＦ、または好ましくはＯＭＩＭ＊６０４５２０によって定義されるＬＩＧＨＴを含むことができる。
【０３０４】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明のキットは、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、インターフェロン−α、好ましくはヒトインターフェロン−α、より好ましくはＯＭＩＭ＊１４７６６０によって定義されるヒトインターフェロン−αを含むことができる。
【０３０５】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明のキットは、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、ワクチンタンパク質抗原、好ましくはジフテリアトキソイドワクチンおよび／または破傷風トキソイドジフテリアトキソイドを含むことができる。
【０３０６】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態では、本発明のキットは、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３に加えて、ワクチンタンパク質抗原、好ましくは肺炎球菌ワクチンおよび／またはインフルエンザ菌Ｂ型ワクチンを含むことができる。
【０３０７】
さらなる実施形態では、キットは、当業者に知られている任意の他の適切なワクチン、例えば本明細書で前に定義した不活化ワクチン組成物、本明細書で前に定義した弱毒化ワクチン組成物、または本明細書で前に定義したＤＮＡワクチン組成物を含むこともできる。
【０３０８】
さらなる実施形態では、本発明は、成分ＩＬ−２もしくはＩＬ−４、またはＩＬ−２およびＩＬ−４および／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３、ならびに本明細書で前に定義したＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体、本明細書で前に定義したＩＬ−２１およびＩＬ−２１変異体の投与の間の間隔が約１分と１２時間の間である、本明細書で前に定義したキットに関する。用語「間隔」は、２群の片方ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体と、他方ＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３のいずれかの投与間の時間期間を指す。したがってこのスキームは、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体の群を最初に投与し、その後、前に示した時間期間が過ぎた後、ＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３の第二群を患者に投与する状況、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３の群を最初に投与し、その後、前に示した時間期間が過ぎた後、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体の第二群を患者に投与する状況を包含する。
【０３０９】
間隔は、好ましくは、約１分と６時間の間、または約５分と３時間の間、または約１０分と２時間の間、または約１５分と１時間の間、または約２０分と５０分、または約２５分、３０分、３５分、４０分または４５分の間であってよい。本明細書で前に定義した間隔は、具体的状況、例えば患者の生理的状況、投与計画、平行治療プロセスから誘導可能なパラメーターなどに従い調節することができる。
【０３１０】
特に好ましい実施形態では、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体の初回投与と、ＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３の後の投与の間の間隔は１２時間であってよい。
【０３１１】
さらなる実施形態では、使用する時間間隔は、本発明によるキットで与える説明書において示すことができる。
【０３１２】
本発明は、さらなる実施形態では、成分ＩＬ−２もしくはＩＬ−４、またはＩＬ−２およびＩＬ−４ならびに本明細書で前に定義したＩＬ−２１もしくはＩＬ−２１変異体および／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３、またはならびに本明細書で前に定義したＩＬ−２１およびＩＬ−２１変異体ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３の片方（群１）と、他方の少なくとも１つのエレメント（群２）：
（ｉ）ＣＤ４０分子の刺激剤（群２ａ）、
（ｉｉ）腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド（群２ｂ）、
（ｉｉｉ）ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド（群２ｃ）、
（ｉｖ）ワクチンタンパク質抗原（群２ｄ）、および
（ｖ）ワクチン多糖抗原（群２ｅ）の投与の間の間隔が約１２時間と７２時間の間である、本明細書で前に定義したキットに関する。群２ａ〜２ｅの好ましい成分は本明細書で前に示した成分である。
【０３１３】
群１と群２の亜群のいずれか、すなわち群２ａ、ｂ、ｃ、ｄまたはｅの間の間隔は、エレメントの正確な組合せに応じて、約１２時間〜７２時間の示した間隔以内で異なってよい。好ましくは、群１と群２ａの投与の間の間隔は、約０時間と２４時間の間、より好ましくは約３時間と２４時間の間であってよく、群１と群２ｂの投与の間の間隔は約２４時間と７２時間の間であってよく、群１と群２ｃの投与の間の間隔は、約０時間と２４時間の間、より好ましくは約３時間と２４時間の間であってよく、群１と群２ｄの投与の間の間隔は約１２時間と７２時間の間であってよく、群１と群２ｅの投与の間の間隔は約１２時間と７２時間の間であってよい。
【０３１４】
亜群２ａ〜２ｅの２群以上を投与することができる場合、これらの追加的亜群の投与間にさらなる間隔、好ましくは投与する第一化合物と投与する最終化合物の間に最大７２時間の合計間隔が追加的に存在してよい。
【０３１５】
群１と群２の亜群のいずれか、すなわち群２ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅの間の間隔は、好ましくは約１２時間と３６時間の間、または約２４時間と４８時間の間、または約３６時間と７２時間の間、またはまたは約１２時間と４８時間の間、または約２４時間と７２時間の間、または約２４時間と３６時間の間、または約３６時間と４８時間の間、または４８時間と７２時間の間であってよい。
【０３１６】
本明細書で前に定義した間隔は、具体的状況、例えば患者の生理的状況、投与計画、平行治療プロセスから誘導可能なパラメーターなどに従い調節することができる。
【０３１７】
特に好ましい実施形態では、群１と群２の亜群のいずれか、すなわち群２ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅの初回投与の間の間隔は７２時間であってよい。
【０３１８】
さらなる実施形態では、群１と２ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅの投与に使用する時間間隔は、本発明によるキットで与える説明書において示すことができる。
【０３１９】
本発明のキットは、当業者に知られている任意の適切な投与レジメンに従い患者に投与することができる。キットまたはキット成分は、他に示さない限り、例えば本明細書で前に定義した間隔時間の支給によって、週に１回、より好ましくは週に２回、３回、４回、５回または６回、および最も好ましくは１日に１回およびまたは１日に２回またはそれより多く与えることができることが好ましい。本発明は、免疫反応後、または免疫系に関する感染後に、投与を直接与えることができるとさらに想定する。しかしながら、治療の進行中、投与は一層長い時間間隔で与えることができ、および必要な際は、一層短い時間間隔で、例えば１日に数回与えることができる。好ましい例では、本明細書に記載する方法および当業者に知られているさらなる方法を使用して、免疫応答をモニタリングすることができ、例えば時間、量および／または組成において投与を最適化する。進行は定期的な評価によってモニタリングすることができる。共同療法手法において、すなわち補充療法用に他の医薬品または薬剤、例えば抗生物質、抗ウイルス薬またはＩｇＧもしくはＩｇＡ免疫グロブリンなどとの同時投与においてキットを利用することも想定される。
【０３２０】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物またはキットの成分、すなわち本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／もしくはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１もしくはガレクチン−３、ならびに場合によってはＣＤ４０分子の刺激剤、好ましくは抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣ４ＢＰ、腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド、好ましくはＢＡＦＦまたはＬＩＧＨＴ、ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、好ましくはインターフェロン−α、ワクチンタンパク質抗原、好ましくはジフテリアトキソイドワクチンおよび／または破傷風トキソイドワクチン、および／またはワクチン多糖抗原、好ましくは肺炎球菌ワクチンおよび／またはインフルエンザ菌Ｂ型ワクチンを、生物学的製剤の形で与えることができる。用語「生物学的製剤」は、本発明の医薬組成物またはキットの前記成分が、任意の適切な生物担体において発現されることを意味する。
【０３２１】
したがって本発明は、さらなる態様において、本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／もしくはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３からなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを発現する生物担体に関する。好ましい実施形態では、前記生物担体は、
（ｉ）ＣＤ４０分子の刺激剤、好ましくは抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＣ４ＢＰ、
（ｉｉ）腫瘍壊死スーパーファミリーのリガンド、好ましくはＢＡＦＦまたはＬＩＧＨＴ、
（ｉｉｉ）ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、好ましくはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、および
（ｉｖ）ワクチンタンパク質抗原から選択される１、２、３または４個のエレメントを任意の組合せでさらに発現することもできる。
【０３２２】
したがって本発明は、生物細胞または担体中での発現に適した、前述の本発明の医薬組成物またはキットの成分をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号１３、１４または１５のポリヌクレオチド、または配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１または１２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。したがって本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、適切な宿主細胞、および前記宿主細胞における組換え技法によるポリペプチドの産生にも関する。ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであってよい。前述の本発明の医薬組成物またはキットの成分をコードするポリヌクレオチドは、適切な宿主中での増殖用の選択マーカーを含有するベクターと接合することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド挿入体は、本明細書で前述したように適切なプロモーターと作動可能に連結しなければならない。
【０３２３】
このようなベクターは、１、２、３個またはそれより多くの前記成分をコードする遺伝子単位を含むことができる。したがって、生物学的製剤または生物担体は、同時に１、２、３個またはそれより多くのベクターを含むことができる。それらの共存は、当業者に知られている適切な手段および方法に従い制御することができる。
【０３２４】
前記成分の発現は生物学的製剤または生物担体の表面で起こり、発現タンパク質またはペプチドの確定した、持続的または長期提示をもたらす可能性があり、または代替的に細胞（複数可）からのタンパク質またはペプチドの分泌の形であり、細胞外環境中でのタンパク質またはペプチドの濃度の増大をもたらす可能性がある。両方のシナリオに関して、適切なベクター、例えば当業者に知られている分泌シグナルなどを含む遺伝子カセットを使用することができる。
【０３２５】
用語「生物担体」は、当業者に知られている任意の適切な生物宿主細胞またはウイルスに関する。適切な宿主の代表例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓなどの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、原生動物、昆虫細胞、または動物細胞があるが、これらだけには限られない。この用語は、弱毒化細菌、弱毒化真菌細胞または弱毒化原生動物に関することが好ましい。適切なウイルスの代表例には、アデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスの群のウイルス、好ましくはアデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスの群の弱毒化ウイルスがある。好ましい実施形態では、プロビオティック細菌細胞、特にプロビオティックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を使用することができる。より好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９７３の細胞、およびさらにより好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚｅａｅ  ３９３の細胞を使用することができる。このような細菌細胞、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞は、本明細書で前述したＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体、およびＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３、および免疫グロブリンの胃腸内生成、好ましくはＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびにＣＤ４０Ｌ分子の提示、または免疫グロブリンの胃腸内生成の再構築に使用することができる。細菌細胞は、当業者に知られている任意の適切な形で患者に投与する、好ましくは経口投与することができる。
【０３２６】
したがって、細胞はｅｘ  ｖｉｖｏで、例えば実験室の条件下において培養することができる。前に記載した宿主細胞に適した培養培地および条件は当技術分野で知られている。後に細胞は、本発明の医薬組成物またはキットの成分、すなわち本明細書で前に定義したＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１変異体、ならびにＩＬ−２および／またはＩＬ−４ならびに／またはＩＧＩＰ、シンテニン−１、ガレクチン−１およびガレクチン−３、ＣＤ４０分子の刺激剤、好ましくは抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣ４ＢＰ、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのリガンド、好ましくはＢＡＦＦまたはＬＩＧＨＴ、ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチド、好ましくはインターフェロン−α、ワクチンタンパク質抗原、好ましくはジフテリアトキソイドおよび／または破傷風トキソイド、および／またはワクチン多糖抗原、好ましくは肺炎球菌細胞壁多糖および／またはインフルエンザ菌Ｂ型ワクチンの１つまたは複数を発現する適切な発現ベクターで形質転換することができる。これらの成分の発現は、例えば２つ以上の異なる選択マーカー遺伝子の使用に基づいて、例えば１つのベクターから、または異なるベクターからの化合物の発現によって、単細胞または細胞型で実施することができる。あるいは、これらの成分の発現は、例えば１つの細胞または細胞型におけるわずか１〜３個の化合物の発現によって、２つ以上の単細胞または細胞型で実施することができる。異なる発現ベクターおよび／または識別可能な選択マーカーの使用によって、前述の全ての成分は前述の細胞型に移し、安定化および発現させることが可能である。
【０３２７】
発現構築物またはカセットを、より好ましくは選択マーカーまたはマーカー痕跡を除去せずに、生物のゲノムに組み込むことができることが好ましい。このような組込み手順に適した方法は当業者に知られている。
【０３２８】
細菌中で使用するのに特に好ましいベクターは、ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５、およびＮｏｖａｇｅｎから入手可能なｐＥＴベクターである。特に好ましい真核細胞ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌおよびｐＳＧ、ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ系中で使用するのに特に好ましい発現ベクターは、Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ−Ｏｎｃｏｒ、Ｉｌｌｋｉｒｓｈ、Ｆｒａｎｃｅから入手可能なｐＧｈｏｓｔ４、ｐＧｈｏｓｔ５およびｐＧｈｏｓｔ６を含むことができる。さらに、ｐＩＡｂ８、ｐＩＡＶ７、ｐＰＳＣ２２、ｐＨ２５１５、ｐＬＰ３５３７およびｐＵＣＬ２８７を使用することができる。さらに特に好ましいのは、ベクターｐＬＰ４０２およびｐＴＵＡＴである。他の適切なベクターは当業者には知られているであろう。したがって調製した細胞は、当業者に知られている任意の適切な形で、好ましくは本明細書で前に定義した生物学的製剤を含む組成物の形で、患者に後に投与することができる。より好ましくは、このような組成物は、固体形の組成物中に１ｍｇ当たり１０２〜１０１２個の細胞、好ましくは１０３〜１０８個の細胞の量で、微生物、例えば前に記載したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを含むことができる。液体形の組成物の場合、微生物の量は１ｍｌ当たり１０２〜１０１３個の細胞である。しかしながら、特定の組成物に関して、微生物の量は異なってよく、および／または当業者に知られている適切なパラメーターに従い調節することができる。
【０３２９】
特に好ましい実施形態では、本発明による生物担体は、原発性体液性免疫不全疾患の治療、より好ましくは分泌ＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体のレベルの低下を伴う疾患の治療、さらにより好ましくはＩｇＡの選択的欠乏症（ＩｇＡＤ）、一般変異型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏症（ＩｇＧｓＤ）、増大したＩｇＭ（高ＩｇＭ症候群）またはＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を有する免疫不全の治療に使用することができる。
【０３３０】
本明細書で前に定義した生物学的製剤または生物担体を含む組成物は、例えば経口投与による局所投与、および胃腸領域中での化合物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現に使用可能であることが好ましい。あるいは、本明細書で前に定義した生物学的製剤または生物担体は、浣腸剤の形で、または腸管直腸部分への直接投与によって施用することができる。あるいは、本明細書で前に定義した生物学的製剤または生物担体を含む組成物は、例えば異なる投与経路によって全身に使用することができる。例は静脈内注射、または小腸上皮粘膜のような特定器官への局所投与であってよい。細胞は後に定住Ｂ細胞を刺激し、免疫グロブリンの産生および層間空間への同時全身分泌をもたらすことができる。
（実施例）
【実施例１】
【０３３１】
ＩＬ−２１はＩＬ−２およびＩＬ−４と協力してヒトＢ細胞における免疫グロブリンの産生を誘導する
健常ドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）内の抗ＣＤ４０刺激Ｂ細胞におけるＩｇＧおよびＩｇＡの産生を誘導する効力について、ＩＬ−２１の有効性をＩＬ−４およびＩＬ−１０の有効性と比較した（例えば、図３Ａ参照）。特に、ＩＬ−２１に誘導されたＩｇ産生は、サイトカインのγｃファミリーの他のメンバーにより増強され得ることを示している可能性がある（図３Ｂ参照）。
【０３３２】
細胞分離および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、無作為に選択した健常ドナーから得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。続いて、１×１０６／ｍｌ  ＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で５日間培養した。さらに、インターロイキン−１０またはインターロイキン−２１を、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度範囲で、ならびにインターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５を、０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で追加した（全てＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社製、フリーゾイテ、ドイツ）。使用する場合、抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（クローンＳ２Ｃ６）を２μｇ／ｍｌで添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）。培養５日目、ＰＢＭＣを上記の培養液量の２倍の容量で洗浄した。
【０３３３】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび免疫グロブリン量の判定
免疫グロブリンの量を判定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。特に、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を３０％エタノールで予め湿らせ、滅菌ＰＢＳ（ｓＰＢＳ）で３回すすぎ、および１０μｇ／ｍｌでｓＰＢＳで希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＡ捕捉抗体（ＤＡＫＯ社）のどちらかで、４℃、一晩コーティングした。洗浄後、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）含有ｓＰＢＳで３時間ブロッキングした。培養ＰＢＭＣを、上記の通りの細胞培養培地に１×１０５ＰＢＭＣ／ウェルで播種し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２０時間インキュベートした。この後、プレートを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ＳＩＧＭＡ社）含有ＰＢＳを用いて６回洗浄した。検出抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社）およびヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＡＬＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を０．５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈し、最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。スポット形成はＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質システム（ＳＩＧＭＡ社）を用いて行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレート分析ならびにこれに続く細胞数および免疫グロブリン量の計数は、適切なＡＩＤリーダーソフトウェア、リリース４．０（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ社、ストラスバーグ、ドイツ）を用いてＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  ０４  ＨＲリーダーで実施した。この手順に従い測定した免疫グロブリン量は、図３Ａおよび３Ｂから得ることができる。特に、図３ＡおよびＢに示した免疫グロブリン量は、特定のスポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２における表面に等しい仮想単位で測定した。
【０３３４】
ＩＬ−２１刺激単独は、ＩＬ−４またはＩＬ−１０で刺激した培養物より高い量のＩｇＧおよびＩｇＡを生じた（図３Ａ参照、ＩｇＡ産生に関する類似のデータは不図示）。Ｂ細胞を抗ＣＤ４０刺激により活性化した場合、追加のＩＬ−２１刺激はさらにより高いレベルのＩｇＧおよびＩｇＡをもたらした。抗ＣＤ４０刺激したＰＢＭＣのＩＬ−４またはＩＬ−１０誘導Ｉｇ産生と比べて、ＩＬ−２１に誘導されたＩｇＧおよびＩｇＡの産生は、数倍高かった（図３Ａ参照、ＩｇＡ産生に関する類似のデータは不図示）。ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１０とは対照的に、ＩＬ−２およびＩＬ−４は両方とも濃度０．５ｎｇ／ｍｌで添加した場合、ＩＬ−２１誘導ＩｇＧおよびＩｇＡ産生を最も良く強力に増強した（図３Ｂ参照、ＩｇＡ産生に関する類似のデータは不図示）。
【実施例２】
【０３３５】
ＩＬ−２１はＩｇＧまたはＩｇＡ産生形質細胞へのヒトＢ細胞の分化を促進する
以下の実験では、ＩＬ−２１はＣＳＲおよびＩｇ産生に影響すること、ならびにＢ細胞増殖および形質細胞分化の強力なプロモーターであることが示され得る。特に、ＩＬ−２１、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０ｍＡｂの組み合わせは、刺激したＰＢＭＣ内でのＣＤ２７ｈｉｇｈ  ＩｇＤ−  ＣＤ３８ｌｏｗ集団の形成をもたらすことが示され得る（例えば、図４Ａ参照）。ＣＤ２７ｈｉｇｈ  ＩｇＤ−  ＣＤ３８ｌｏｗ細胞は、形質細胞系統に最も関係している可能性がある活性化Ｂ細胞を表す。さらに、ｓｌｇ＋  ＣＤ１３８−およびＣＤ１３８＋  ｓｌｇ−  Ｂ細胞から成る２つのＩｇ分泌細胞集団が、ＩＬ−２１、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０ｍＡｂとの培養中に出現した（図４Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ参照）。
【０３３６】
細胞分離および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、無作為に選択した健常ドナーから得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離した。続いて、１×１０６／ｍｌ  ＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で７日間培養した。さらに、ＰＢＭＣ刺激に最適であることが以前に確定された通り、インターロイキン−２１を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで、およびインターロイキン−４を最終濃度０．５ｎｇ／ｍｌで追加した（両方ともＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社製、フリーゾイテ、ドイツ）。抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（クローンＳ２Ｃ６）を２μｇ／ｍｌで添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）。培養０、３、５、および７日目、ＰＢＭＣをフローサイトメトリー分析に供した。
【０３３７】
フローサイトメトリー分析（ＦＣＭ）および細胞サブセットの判定
細胞サブセットを判定するため、培養ＰＢＭＣの単細胞懸濁液を３つの１２×７５ｍｍ丸底チューブに均等に分配し、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、室温、５分間、２５０×ｇで洗浄した。続いて、モノクローナル抗体の以下の３つのカクテルを、単一のチューブに各々添加してＢ細胞および形質細胞集団を判定した：（１）、抗ＣＤ１９−ＰＣ７、抗ＣＤ２７−ＦＩＴＣ（両方ともＤＡＫＯ社製、グロストルプ、デンマーク）、抗ＣＤ５−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）および抗ＩｇＤ−ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）。（２）、抗ＣＤ１９−ＰＣ７、抗ＩｇＤ−ＰＥ、抗ＣＤ３８−ＡＰＣおよび抗ＣＤ７７−ＦＩＴＣ（両方ともＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。（３）、抗ＣＤ１９−ＰＣ７、抗ＣＤ１３８−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、グラートバッハ、ドイツ）、抗ＩｇＡ−ＦＩＴＣおよび抗ＩｇＧ−ＡＰＣ（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）または抗ＣＤ３８−ＡＰＣ。続いて、単細胞懸濁液を、氷上、暗所で３０分間、ＦＡＣＳ抗体のカクテルと共にインキュベートした。３ｍｌのＰＢＳによる別の洗浄ステップの後、残留細胞ペレットを１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ２５０μｌで分解し、リンパ球の免疫表現型検査を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）で４色サイトメトリーにより実施した。
【０３３８】
図４は、代表的な健常個体におけるＣＤ１９＋リンパゲーティングされた細胞でのＣＤ２７、ＣＤ１３８ならびに表面ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＡ発現を示す。これらのマーカーの細胞表面発現は、相関したｘ軸およびｙ軸蛍光のドットプロットとして４ｄｅｃａｄｅログスケールで表されている。ＦＣＭ分析は、ＩＬ−２１［１０ｎｇ／ｍｌ］、ＩＬ−４［０．５ｎｇ／ｍｌ］および抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ［２μｇ／ｍｌ］の存在下で培養ＰＢＭＣにより０、３、５および７日目に実施した。図４Ａでは象限マーカーは、ナイーブ成熟Ｂ細胞（ＵＬ）、天然エフェクターＢ細胞（ＵＲ）、およびＩｇＤ−記憶Ｂ細胞（ＬＲ）を含むように配置した。円はＣＤ２７ｈｉｇｈ  ＩｇＤ−  Ｂ細胞集団をタグ付けする。図４ＢおよびＤでは象限マーカーは、ｓｌｇＡ＋  Ｂ細胞（ＬＲ）とＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）を区別するように配置した。図４ＣおよびＥでは象限マーカーは、ｓｌｇＧｈｉｇｈ  Ｂ細胞（ＬＲ）とＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）を区別するように配置した。
【実施例３】
【０３３９】
ＩＬ−２１はＣＶＩＤおよびＩｇＡＤ患者におけるＩｇＧおよびＩｇＡ産生を回復させる
以下の実験では、ＩＬ−２１が原発性免疫不全症、特に最も多く見られるＰＩＤ疾患−分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）および選択的ＩｇＡ欠損（ＩｇＡＤ）の両方においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫グロブリン産生の回復に有効であることが示され得る（例えば、図５ＡからＦ参照）。
【０３４０】
細胞分離および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤまたはＩｇＡＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。続いて、１×１０６／ｍｌ  ＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で５日間培養した。さらに、ＰＢＭＣ刺激に最適であることが以前に確定された通り、インターロイキン−１０およびインターロイキン−２１を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで、ならびにインターロイキン−４を最終濃度０．５ｎｇ／ｍｌで追加した（両方ともＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社製、フリーゾイテ、ドイツ）。使用する場合、抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（クローンＳ２Ｃ６）を２μｇ／ｍｌで添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）。培養５日目、ＰＢＭＣを上記の培養液量の２倍の容量で洗浄した。
【０３４１】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび免疫グロブリン量の判定
免疫グロブリンの量を判定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。特に、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を３０％エタノールで予め湿らせ、滅菌ＰＢＳ（ｓＰＢＳ）で３回すすぎ、および１０μｇ／ｍｌでｓＰＢＳで希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＡ捕捉抗体（ＤＡＫＯ社）のどちらかで、４℃、一晩コーティングした。洗浄後、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）含有ｓＰＢＳで３時間ブロッキングした。培養ＰＢＭＣを、上記の通りの細胞培養培地に１×１０５ＰＢＭＣ／ウェルで播種し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２０時間インキュベートした。この後、プレートを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ＳＩＧＭＡ社）含有ＰＢＳを用いて６回洗浄した。検出抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社）およびヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＡＬＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を０．５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈し、最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。スポット形成はＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質システム（ＳＩＧＭＡ社）を用いて行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレート分析ならびにこれに続く細胞数および免疫グロブリン量の計数は、適切なＡＩＤリーダーソフトウェア、リリース４．０（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ社、ストラスバーグ、ドイツ）を用いてＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  ０４  ＨＲリーダーで実施した。図５Ａ、ＢおよびＣの免疫グロブリン量は、特定のスポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２における表面に等しい仮想単位で測定される。
【０３４２】
ＩＬ−１０がＣＶＩＤ患者（図５Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ参照）およびＩｇＡＤ患者（図５ＣおよびＦ参照）において中程度のＩｇ産生を誘導したのに対し、ＩＬ−２１刺激は数倍高い量の分泌ＩｇＧおよびＩｇＡをもたらした（図５Ａ〜Ｆ参照）。さらなるＣＤ４０刺激なしでのＩＬ−２１プラスＩＬ−４でさえ、幾つかの個体におけるＩｇ産生誘導ではＩＬ−１０プラスｍＡｂ抗ＣＤ４０より有効であった。抗ＣＤ４０活性化ＰＢＭＣでのＩｇ分泌を、ＩＬ−２１のみ、またはＩＬ−２１プラスＩＬ−４で刺激した細胞間で比較した場合、後者は、健常ドナーで観察されるレベル近くまで平均ＩｇＧおよびＩｇＡ産生を著しく増加させた。
【実施例４】
【０３４３】
ＩＬ−２１はＣＶＩＤまたはＩｇＡＤ個体における活性ＣＳＲを誘導する
ＩＬ−２１プラスＩＬ−４およびｍＡｂ抗ＣＤ４０刺激により誘導された免疫グロブリン産生に関与する分子機構を解明するため、ＣＶＩＤ患者（図６ＡおよびＢ参照）またはＩｇＡＤ患者（図６Ｃ参照）における活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、Ｉγ−ＣγまたはＩα−Ｃα生殖系列転写（ＧＬＴ）およびＩγ−ＣμまたはＩα−Ｃμスイッチサークル転写産物（スイッチサークル転写産物）（ＣＴ）について、ｍＲＮＡレベルを分析した。
【０３４４】
細胞分離および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤまたはＩｇＡＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。続いて、１×１０６／ｍｌ  ＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で７２時間培養した。さらに、ＰＢＭＣ刺激に最適であることが以前に確定された通り、インターロイキン−２１を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで、およびインターロイキン−４を最終濃度０．５ｎｇ／ｍｌで追加した（両方ともＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社製、フリーゾイテ、ドイツ）。抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（クローンＳ２Ｃ６）を２μｇ／ｍｌで添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）。
【０３４５】
ＲＮＡ単離およびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
培養７２時間後、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＰＢＭＣから抽出した。ワンステップのｃＤＮＡ逆転写およびリアルタイムＰＣＲを、ＳＹＢＲグリーンＩ  ＲＮＡマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、マンハイム、ドイツ）を用いて行い、およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）で処理した。β−アクチン、ＡＩＤ発現、ならびにＩγ−ＣγまたはＩα−Ｃα生殖系列転写産物およびＩγ−ＣμまたはＩα−Ｃμサークル転写産物を検出するための配列特異的プライマーは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６に与えられている。配列Ｉγ−コンセンサス（配列番号２１）およびＣγ−コンセンサス（配列番号２２）を有するプライマー対は、ＩｇＧ生殖系列転写産物発現の検出に使用し、配列Ｉγ−コンセンサス（配列番号２１）およびＣμ−アンチセンス−１（配列番号２３）を有するプライマー対は、ＩｇＧスイッチサークル転写産物発現の検出に使用し、配列Ｉα−コンセンサス（配列番号２４）およびＣα−コンセンサス（配列番号２５）を有するプライマー対は、ＩｇＡ生殖系列転写産物発現の検出に使用し、ならびに配列Ｉα−コンセンサス（配列番号２４）およびＣμ−アンチセンス−２（配列番号２６）を有するプライマー対は、ＩｇＡスイッチサークル転写産物発現の検出に使用した。データはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒデータ分析ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて分析した。結果は、同じ試料中のハウスキーピング対照β−アクチン遺伝子の算出量による、任意の試料における候補ＲＮＡの算出量の比として与えられる。β−アクチンはまた、内因性対照としておよび試料間の正規化にも役立つ。
【０３４６】
ＡＩＤ発現は、全ての分析した患者試料で培養３日目に上方制御した（図６Ａ、ＢおよびＣ参照）。免疫グロブリンアイソタイプスイッチングにおける初期ステップは、Ｉγ−ＣγおよびＩα−Ｃα生殖系列転写産物の産生に特徴付けられ、これは全ての分析した患者試料で検出することができた（図６Ａ、ＢおよびＣ参照）。Ｉγ−Ｃγ生殖系列転写をＩα−Ｃα生殖系列転写と比較した場合、全てのＣＶＩＤ患者で発現比が低下する傾向があった。これは、ＩｇＡスイッチングと比較した場合、ＩｇＧスイッチングの誘導に対するＩＬ−２１プラスＩＬ−４およびｍＡｂ抗ＣＤ４０刺激の優れた効果を反映している。スイッチサークル転写産物はＣＳＲイベントを反映し、および進行中のＣＳＲを検出するための信頼性のあるパラメータを提供する。Ｉγ−Ｃμスイッチサークル転写産物は全てのＣＶＩＤ患者で検出することができ、Ｉα−Ｃμスイッチサークル転写産物は全てのＣＶＩＤ（図６ＡおよびＢ参照）およびＩｇＡＤ（図６Ｃ）患者に存在した。全体として、これらの所見は、ＣＳＲが、ＡＩＤ発現の上方制御およびこの後の生殖系列転写産物の産生により、ＣＶＩＤおよびＩｇＡＤにおいてＩＬ−２１、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０刺激の組み合わせにより誘導されるのに対し、スイッチサークル転写産物の発現は、３日目にピークレベルにはまだ達していなかったことを示す。
【実施例５】
【０３４７】
ＩＬ−２１はＣＶＩＤまたはＩｇＡＤ個体における表面ＩｇＧ＋およびＩｇＡ＋Ｂ細胞の蓄積を促進する
ＣＶＩＤおよびＩｇＡＤ患者では、ナイーブおよび記憶Ｂ細胞の両方から動員されるＣＤ２７ｈｉｇｈ  ＩｇＤ−  ＣＤ３８ｌｏｗ集団が生じることが示され得る。さらに、健常ドナーで見られるより小さいものの、ＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞集団を伴う、ｓｌｇＧｈｉｇｈおよびｓｌｇＡｈｉｇｈ  Ｂ細胞のかなりの集団が出現する（例えば、図７ＡからＨ参照）。
【０３４８】
細胞分離および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤまたはＩｇＡＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。続いて、１×１０６／ｍｌ  ＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で７日間培養した。さらに、ＰＢＭＣ刺激に最適であることが以前に確定された通り、インターロイキン−２１を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで、およびインターロイキン−４を最終濃度０．５ｎｇ／ｍｌで追加した（両方ともＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社製、フリーゾイテ、ドイツ）。抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（クローンＳ２Ｃ６）を２μｇ／ｍｌで添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）。培養０、３、５、および７日目、ＰＢＭＣをフローサイトメトリー分析に供した。
【０３４９】
フローサイトメトリー分析（ＦＣＭ）および細胞サブセットの判定
細胞サブセットを判定するためフローサイトメトリー分析（ＦＣＭ）を実施した。特に、培養ＰＢＭＣの単細胞懸濁液を３つの１２×７５ｍｍ丸底チューブに均等に分配し、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、室温、５分間、２５０×ｇで洗浄した。続いて、モノクローナル抗体の以下の３つのカクテルを、単一のチューブに各々添加してＢ細胞および形質細胞集団を判定した：（１）、抗ＣＤ１９−ＰＣ７、抗ＣＤ２７−ＦＩＴＣ（両方ともＤＡＫＯ社製、グロストルプ、デンマーク）、抗ＣＤ５−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）および抗ＩｇＤ−ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）。（２）、抗ＣＤ１９−ＰＣ７、抗ＩｇＤ−ＰＥ、抗ＣＤ３８−ＡＰＣおよび抗ＣＤ７７−ＦＩＴＣ（両方ともＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）。（３）、抗ＣＤ１９−ＰＣ７、抗ＣＤ１３８−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、グラートバッハ、ドイツ）、抗ＩｇＡ−ＦＩＴＣおよび抗ＩｇＧ−ＡＰＣ（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）または抗ＣＤ３８−ＡＰＣ。続いて、単細胞懸濁液を、氷上、暗所で３０分間、ＦＡＣＳ抗体のカクテルと共にインキュベートした。３ｍｌのＰＢＳによる別の洗浄ステップの後、残留細胞ペレットを１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ２５０μｌで分解し、リンパ球の免疫表現型検査を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）で４色サイトメトリーにより実施した。
【０３５０】
図７は、ＣＶＩＤ（図７Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ参照）またはＩｇＡＤ（図７Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ参照）を有する代表的な個体におけるＣＤ１９＋リンパゲーティングされた細胞でのＣＤ２７、ＣＤ１３８ならびに表面ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＡ発現を示す。これらのマーカーの細胞表面発現は、相関したｘ軸およびｙ軸蛍光のドットプロットとして４ｄｅｃａｄｅログスケールで表されている。図７Ａ、Ｂ、ＥおよびＦでは象限マーカーは、ナイーブ成熟Ｂ細胞（ＵＬ）、天然エフェクターＢ細胞（ＵＲ）、およびＩｇＤ−記憶Ｂ細胞（ＬＲ）を含むように配置した。円はＣＤ２７ｈｉｇｈ  ＩｇＤ−  Ｂ細胞集団をタグ付けする。図７ＣおよびＧでは象限マーカーは、ｓｌｇＧｈｉｇｈ  Ｂ細胞（ＬＲ）とＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）を区別するように配置した。図７ＤおよびＨでは象限マーカーは、ｓｌｇＡ＋  Ｂ細胞（ＬＲ）とＣＤ１３８ｈｉｇｈ形質細胞（ＵＬ）を区別するように配置した。
【実施例６】
【０３５１】
ＣＶＩＤまたはＩｇＡＤ患者におけるＩｇ産生Ｂ細胞集団の直接可視化
ＩＬ−２１誘導免疫グロブリン産生をこれら２つの潜在的Ｉｇ分泌集団の１つに関連付けるため、ＰＢＭＣを電磁ビーズにより分離し、ＣＤ１３８＋  形質細胞およびＣＤ１３８−細胞に精製し、これらをＩｇＧおよびＩｇＡ分泌のＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した（図８ＡおよびＢ参照）。さらに、ＡＩＤ発現のサイレンシングは、ＣＶＩＤ患者におけるＩＬ−２１誘導免疫グロブリン産生を部分的にのみ抑制することが示され得、ＩＬ−２１により引き起こされるこれらの患者における固有の機構を示唆している（図８Ｃ参照）。
【０３５２】
細胞分離および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤまたはＩｇＡＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。続いて、１×１０６／ｍｌ  ＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で総計５日間培養した。さらに、ＰＢＭＣ刺激に最適であることが以前に確定された通り、インターロイキン−１０およびインターロイキン−２１を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで、ならびにインターロイキン−４を最終濃度０．５ｎｇ／ｍｌで追加した（両方ともＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社製、フリーゾイテ、ドイツ）。使用する場合、抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（クローンＳ２Ｃ６）を２μｇ／ｍｌで添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）。培養５日目、ＰＢＭＣを上記の培養液量の２倍の容量で洗浄した。
【０３５３】
ＣＤ１３８＋形質細胞の精製
ＣＤ１３８（シンデカン−１）抗原を発現している形質細胞は、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ１３８陽性セレクションキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、シアトル、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造者のプロトコールに従い磁気精製した。陽性選択したＣＤ１３８＋細胞およびＣＤ１３８−画分のＦＣＭ分析を行い精製効率を検証した。
【０３５４】
フローサイトメトリー分析（ＦＣＭ）および細胞サブセットの判定
細胞サブセットを判定するためフローサイトメトリー分析（ＦＣＭ）を実施した。特に、３日間培養したＰＢＭＣの単細胞懸濁液を１２×７５ｍｍ丸底チューブに分配し、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、室温、５分間、２５０×ｇで洗浄した。続いて、モノクローナル抗体のカクテルを、単一のチューブに添加してＢ細胞および形質細胞集団を判定した：抗ＣＤ１９−ＰＣ７（ＤＡＫＯ社、グロストルプ、デンマーク）、抗ＣＤ１３８−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、グラートバッハ、ドイツ）、抗ＩｇＡ−ＦＩＴＣおよび抗ＩｇＧ−ＡＰＣ（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）。続いて、単細胞懸濁液を、氷上、暗所で３０分間、ＦＡＣＳ抗体のカクテルと共にインキュベートした。３ｍｌのＰＢＳによる別の洗浄ステップの後、残留細胞ペレットを１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ２５０μｌで分解し、リンパ球の免疫表現型検査を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）で４色サイトメトリーにより実施した。
【０３５５】
ＲＮＡ干渉によるＡＩＤ  ｍＲＮＡ発現のサイレンシング
活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）ｍＲＮＡ発現のサイレンシングのため、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（サンタクルス、ＣＡ、ＵＳＡ）製ｓｉＲＮＡ試薬を、製造者の指示に従い使用した。簡単には、２４時間、ＩＬ−２１、ＩＬ−４およびｍＡｂ抗ＣＤ４０で前もって刺激したＡＩＤ  ｓｉＲＮＡ（ｈ、ｓｃ−４２７２９）を、３×１０５  ＰＢＭＣにトランスフェクトした。任意の既知の細胞ｍＲＮＡの分解をもたらさないスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−Ａ、ｓｃ−３７００７）を対照として含めた。ＡＩＤ  ｍＲＮＡ発現のＲＮＡ干渉媒介ノックダウンは、トランスフェクションの７２時間後にＲＴ−ＰＣＲにより検証した。対照試料でのＡＩＤ発現を１００％発現レベルと見なす一方、ＲＮＡを含有しない試料はブランク値として扱った（０％発現レベル）。
【０３５６】
ＲＮＡ単離およびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
培養７２時間後、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いてＡＩＤサイレンシングＰＢＭＣから抽出した。ワンステップのｃＤＮＡ逆転写およびリアルタイムＰＣＲを、ＳＹＢＲグリーンＩ  ＲＮＡマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、マンハイム、ドイツ）を用いて行い、およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）で処理した。β−アクチンおよびＡＩＤ発現を検出するための配列特異的プライマーは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に与えられている。データはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒデータ分析ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて分析した。結果は、同じ試料中のハウスキーピング対照β−アクチン遺伝子の算出量による、任意の試料における候補ＲＮＡの算出量の比として与えられる。β−アクチンはまた、内因性対照としておよび試料間の正規化にも役立つ。
【０３５７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび免疫グロブリン量の判定
免疫グロブリンの量を判定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。特に、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を３０％エタノールで予め湿らせ、滅菌ＰＢＳ（ｓＰＢＳ）で３回すすぎ、および１０μｇ／ｍｌでｓＰＢＳで希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＡ捕捉抗体（ＤＡＫＯ社）のどちらかで、４℃、一晩コーティングした。洗浄後、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）含有ｓＰＢＳで３時間ブロッキングした。ＣＤ１３８陽性および陰性保管細胞（図８ＡおよびＢ参照）を、上記の通りの細胞培養培地にＩｇＧ検出には５×１０４細胞（図８Ａ参照）またはＩｇＡ検出には１×１０６細胞（図８Ｂ）により、等しい容量−濃度で播種し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２０時間インキュベートした。ＡＩＤサイレンシング細胞（図８Ｃ参照）は、上記の通りの細胞培養培地に４×１０４  ＰＢＭＣで播種し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２０時間インキュベートした。この後、プレートを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ＳＩＧＭＡ社）含有ＰＢＳを用いて６回洗浄した。検出抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社）およびヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＡＬＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を０．５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈し、最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。スポット形成はＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質システム（ＳＩＧＭＡ社）を用いて行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレート分析ならびにこれに続く細胞数および免疫グロブリン量の計数は、適切なＡＩＤリーダーソフトウェア、リリース４．０（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ社、ストラスバーグ、ドイツ）を用いてＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  ０４  ＨＲリーダーで実施した。図８Ａ、ＢおよびＣの免疫グロブリン量は、特定のスポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２における表面に等しい仮想単位で測定される。
【０３５８】
ＣＶＩＤおよびＩｇＡＤ両方の患者では、ＣＤ１３８＋形質細胞は、全体のＩｇＧまたはＩｇＡ産生のごく一部のみを占めた（図８ＡおよびＢ参照）。ＦＣＭデータは、ｓｌｇＧｈｉｇｈおよびｓｌｇＡｈｉｇｈ  Ｂ細胞集団が培養３日目に既に存在すること、したがってこれらのＢ細胞は既に、ＩＬ−２１、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０による刺激に反応して表面Ｉｇ発現およびＩｇ産生を示す、アイソタイプ明示（isotype-committed）細胞を意味することを示している（図８ＡおよびＢ参照）。ＣＶＩＤにおけるＩＬ−２１、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０刺激に誘導された増殖の固有の機構は、ＡＩＤ発現のサイレンシングが、ＩＬ−２１、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０刺激の組み合わせにより誘導された、アイソタイプスイッチした免疫グロブリンの産生を妨げるかどうか調べるよう本発明者を導いた。驚くべきことに、患者のＰＢＭＣにおけるＡＩＤ  ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ対照試料と比較した場合、培養３日目に＞８４％減少した（図８Ｃ参照）が、ＣＤ１９＋リンパゲート内のｓｌｇＧ＋Ｂ細胞数は、わずかに減少したのみであった。さらに、培養５日目にＩｇＧの産生は、ＡＩＤサイレンシングＰＢＭＣで〜５８％のみ減少した（図８Ｃ参照、ＩｇＡ産生に関する類似のデータは不図示）。これは、ＣＶＩＤにおける既にスイッチしたアイソタイプ明示Ｂ細胞が、ＩＬ−２１、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０刺激のトリガー機能によりＩｇＧまたはＩｇＡ表面発現および免疫グロブリン産生へと導かれることを示唆し、ＣＶＩＤ患者に固有である。
【実施例７】
【０３５９】
ＣＶＩＤ個体におけるＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒ発現
ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ系の機能調節異常がＣＶＩＤ患者に存在するかどうかを解明するため、刺激性抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂを用いてＴ細胞の活性化時のＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒ  ｍＲＮＡ発現を試験した。３０名のＣＶＩＤ患者を、献血者プールから無作為に選択した２３名の健常個体と比較した（図９参照）。
【０３６０】
ＣＶＩＤ個体におけるＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒ発現  細胞分離および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、無作為に選択した健常ドナー、および欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。続いて、１×１０６／ｍｌ  ＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で１４時間培養した。さらに、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（クローンＣＤ３−２）を２μｇ／ｍｌで添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）。
【０３６１】
ＲＮＡ単離およびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
培養１４時間後、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＰＢＭＣから抽出した。ワンステップのｃＤＮＡ逆転写およびリアルタイムＰＣＲを、ＳＹＢＲグリーンＩ  ＲＮＡマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、マンハイム、ドイツ）を用いて行い、およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）で処理した。β−アクチン、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２１Ｒ発現を検出するための配列特異的プライマーは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に与えられている。データはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒデータ分析ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて分析した。結果は、同じ試料中のハウスキーピング対照β−アクチン遺伝子の算出量による、任意の試料における候補ＲＮＡの算出量の比として与えられる。β−アクチンはまた、内因性対照としておよび試料間の正規化にも役立つ。
【０３６２】
Ｔ細胞の抗ＣＤ３刺激時のＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒ  ｍＲＮＡ発現の分析は、ＣＶＩＤ患者における不完全なＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒ発現の証拠を示さず（図９参照）、故にＣＶＩＤにおけるＩＬ−２１の治療的役割の機能的基準を提供する。
【実施例８】
【０３６３】
ＩＬ−２１はＣＶＩＤ患者における破傷風およびジフテリアトキソイド特異的ＩｇＧを誘発する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのワクチン様抗原特異的免疫グロブリン産生を誘導するＩＬ−２１の能力を調べるため、ＣＶＩＤ患者由来のＰＢＭＣを、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、抗ＣＤ４０ｍＡｂおよびそれぞれのワクチンの事実上不可欠な部分であるジフテリアまたは破傷風トキソイドのどちらかの存在下、７日間刺激した（図１０および１１参照）。
【０３６４】
細胞分離および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。続いて、２×１０６／ｍｌ  ＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で７日間培養した。さらに、ＰＢＭＣ刺激に最適であることが以前に確定された通り、インターロイキン−１０およびインターロイキン−２１を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで、ならびにインターロイキン−４を最終濃度０．５ｎｇ／ｍｌで追加した（両方ともＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社製、フリーゾイテ、ドイツ）。抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（クローンＳ２Ｃ６）を２μｇ／ｍｌで添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）。培養５日目、ＰＢＭＣを上記の培養液量の２倍の容量で洗浄した。破傷風およびジフテリアトキソイドはＳｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ社（コペンハーゲン、デンマーク）から購入し、およびＰＢＭＣに最適であることが以前に確定された濃度で添加した。培養７日目、ＰＢＭＣおよび全てのこの培養培地を室温、１０分間、２５０×ｇで遠心分離し、培地上清を分析のため除去した。続いて、ＰＢＭＣの細胞ペレットを上記の培養液量の２倍の容量で洗浄した。
【０３６５】
ＥＬＩＳＡプロトコールならびに破傷風およびジフテリアトキソイド特異的ＩｇＧの判定
破傷風およびジフテリアトキソイド特異的ＩｇＧを判定するため、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドに対するＩｇＧ抗体を、ＶａｃｃＺｙｍｅ破傷風トキソイドＩｇＧまたはＶａｃｃＺｙｍｅジフテリアトキソイドＩｇＧアッセイ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社、バーミンガム、英国）を用いて、２×１０６培養ＰＢＭＣの７日目の培地上清で定量化した。ＥＬＩＳＡプロトコールおよびキャリブレーターは、極めて少量のトキソイド特異的ＩｇＧ抗体（＞０．００４  ＩＵ／ｍｌ抗破傷風トキソイドＩｇＧ、＞０．００１  ＩＵ／ｍｌ抗ジフテリアトキソイドＩｇＧ）の検出を可能にするように修正した。全てのＥＬＩＳＡプレート試料の吸光度は４５０ｎｍで測定し、ＳＰＥＣＴＲＡ  Ｃｌａｓｓｉｃマイクロプレートリーダーおよび適切なリーダーソフトウェア（ＴＥＣＡＮ  Ｔｒａｄｉｎｇ社、ザルツブルグ、オーストリア）により分析した。
【０３６６】
フローサイトメトリー分析（ＦＣＭ）および細胞サブセットの判定
細胞サブセットを判定するためフローサイトメトリー分析（ＦＣＭ）を実施した。特に、７日間培養したＰＢＭＣの単細胞懸濁液を１２×７５ｍｍ丸底チューブに均等に分配し、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、室温、５分間、２５０×ｇで洗浄した。続いて、モノクローナル抗体のカクテルを、単一のチューブに添加してＢ細胞および形質細胞集団を判定した：抗ＣＤ１９−ＰＣ７（ＤＡＫＯ社、グロストルプ、デンマーク）、抗ＣＤ１３８−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、グラートバッハ、ドイツ）、抗ＩｇＡ−ＦＩＴＣおよび抗ＩｇＧ−ＡＰＣ（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）。続いて、単細胞懸濁液を、氷上、暗所で３０分間、ＦＡＣＳ抗体のカクテルと共にインキュベートした。３ｍｌのＰＢＳによる別の洗浄ステップの後、残留細胞ペレットを１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ２５０μｌで分解し、リンパ球の免疫表現型検査を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）で４色サイトメトリーにより実施した。
【０３６７】
ＣＶＩＤ患者において、少量の特異的抗体はＩＬ−２１、ＩＬ−４、抗ＣＤ４０ｍＡｂ、およびジフテリアまたは破傷風トキソイドで７日間刺激した試料で検出された（図１０参照）。ＣＶＩＤ患者由来の抗原曝露ＰＢＭＣのＦＣＭ分析は、ＣＤ１３８＋形質細胞のＩＬ−２１誘導生成ならびにｓｌｇＧｈｉｇｈおよびｓｌｇＡｈｉｇｈ  Ｂ細胞の形成増強を明らかにした（図１１参照）。対照的に、抗原のないＩＬ−２１刺激は、ＣＶＩＤ患者由来の細胞の培養においてＣＤ１３８＋形質細胞蓄積をもたらさなかった。
【実施例９】
【０３６８】
ＩＬ−２１変異体はＣＶＩＤ患者由来の精製ヒトＢ細胞におけるＩｇＧおよびＩｇＡ産生を誘導する
以下の実験ではＣＶＩＤ患者由来の抗ＣＤ４０刺激精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＩｇＧおよびＩｇＡ産生を誘導する効力について、さまざまなＩＬ−２１変異体の有効性を比較した（例えば、図１２参照）。
【０３６９】
ＩＬ−２１変異体由来のプラスミドＤＮＡの調製
この目的のため、ＩＬ−２１変異体の合成遺伝子を、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に与えられたＤＮＡ配列による合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から構築した。配列番号３１は、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位の修飾を有するＩＬ−２１の切断バージョンを表す。配列番号３２は、Ｋｅｎｔ  Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄによる刊行物（Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ，Ｋ．ら（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２、２３３２６〜３６）に記載されたタンパク質を指し、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」と呼ばれる。これもまた、ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位を有するＮ末端で修飾した。「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」のオリジナルのタンパク質配列は、配列リストの配列番号９として示されており、対応するＤＮＡ配列は配列リストの配列番号１６として示されている。同様に、ＩＬ−２１変異体配列番号３３および配列番号３４は両方とも、ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位を有するＮ末端で修飾した。ＩＬ−２１変異体の合成遺伝子は、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限部位（ｉｍａＧｅｎｅｓ社、ベルリン、ドイツ）を用いてｐＥＴ４５ｂ（＋）（ａｍｐＲ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ギブスタウン、ＮＪ、ＵＳＡ）にクローニングするため送付した。最終構築物は配列決定により検証し、使用した制限部位および初めに所望したＤＮＡ配列内の配列一致は１００％であった（ｉｍａＧｅｎｅｓ社、ベルリン、ドイツ）。プラスミドＤＮＡは、Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従い形質転換菌から精製し、濃度をＵＶ分光法により判定した。
【０３７０】
ＩＬ−２１変異体タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成および精製
ＩＬ−２１変異体タンパク質の大腸菌ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造者の指示に従い行った。続いて、最終反応量を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて未変性条件下、６×Ｈｉｓタグタンパク質についてＮｉ−ＮＴＡベースの精製に供した。ヘキサヒスチジンタグは、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製ＩＬ−２１変異体から切断し、および標準ＳＤＳページ電気泳動またはもう１回のＮｉ−ＮＴＡスピンカラム通過のどちらかにより反応量から除去した。切断ＩＬ−２１変異体タンパク質の濃度は、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８〜２５４）により判定し、および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度に調整した。
【０３７１】
細胞分離、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の精製および培養条件
ＣＤ１９＋Ｂ細胞を分離および精製するため、ヘパリン化末梢静脈血を、健常ボランティア、および欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離した。続いて、ＣＤ１９抗原を発現しているＢ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ１９陽性セレクションキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、シアトル、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造者のプロトコールに従い磁気精製した。陽性選択したＣＤ１９＋細胞およびＣＤ１９−画分のＦＣＭ分析を行い精製効率を検証した。続いて、１×１０５Ｂ細胞／ｍｌを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で５日間刺激した。さらに、インターロイキン−２１変異体タンパク質を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで追加し、および抗ＣＤ４０ｍＡｂ（クローンＳ２Ｃ６、Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）を最終濃度０．２μｇ／ｍｌで添加した。使用する場合、インターロイキン−４を最終濃度０．５ｎｇ／ｍｌで添加した。培養５日目、Ｂ細胞を上記の培養液量の２倍の容量で洗浄した。
【０３７２】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび免疫グロブリン量の判定
免疫グロブリンの量を判定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。特に、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を３０％エタノールで予め湿らせ、滅菌ＰＢＳ（ｓＰＢＳ）で３回すすぎ、および１０μｇ／ｍｌでｓＰＢＳで希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＡ捕捉抗体（ＤＡＫＯ社）のどちらかで、４℃、一晩コーティングした。洗浄後、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）含有ｓＰＢＳで３時間ブロッキングした。培養Ｂ細胞を、上記の通りの細胞培養培地に１×１０４細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２０時間インキュベートした。この後、プレートを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ＳＩＧＭＡ社）含有ＰＢＳを用いて６回洗浄した。検出抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社）およびヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＡＬＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を０．５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈し、最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。スポット形成はＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質システム（ＳＩＧＭＡ社）を用いて行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレート分析ならびにこれに続く細胞数および免疫グロブリン量の計数は、適切なＡＩＤリーダーソフトウェア、リリース４．０（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ社、ストラスバーグ、ドイツ）を用いてＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  ０４  ＨＲリーダーで実施した。図３Ａおよび３Ｂの免疫グロブリン量は、特定のスポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２における表面に等しい仮想単位で測定される。
【０３７３】
健常ボランティアにおいて使用する場合、配列番号３３および配列番号３４の配列を有するＩＬ−２１変異体タンパク質は、Ｂ細胞を追加のＩＬ−４なしで培養した場合、成熟した切断ＩＬ−２１（配列番号３１）と比べて類似のより多量のＩｇＧおよびＩｇＡ産生を誘導した（図１２参照）。Ｋｅｎｔ  Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄによる刊行物（Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ，Ｋ．ら（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２、２３３２６〜３６）に記載された配列「配列番号３２」を有するＩＬ−２１変異体は、一般により少量の分泌ＩｇＧまたはＩｇＡを誘導した。ＩＬ−４を添加した場合、Ｉｇ産生は概ね増加した。ＣＶＩＤ患者において、配列「配列番号３３」および「配列番号３４」を有するＩＬ−２１変異体タンパク質は、成熟した切断ＩＬ−２１または配列「配列番号３２」を有するＩＬ−２１変異体と比較した場合、およびＢ細胞を追加のＩＬ−４なしで培養した場合、ＩｇＧおよびＩｇＡ産生を誘導するさらに多くの効力を示した（図１２参照）。健常ボランティアと同様に、ＩＬ−４の追加は全体として産生量を増加させた。
【実施例１０】
【０３７４】
ＩＬ−２１およびＩＬ−２１変異体はガレクチン−１およびガレクチン−３と相乗効果的に協力してＣＶＩＤ患者におけるＩｇＧおよびＩｇＡの産生を誘導する
以下の実験ではガレクチン−１およびガレクチン−３との併用でＩｇＧおよびＩｇＡ産生を誘導する効力について、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッド変異体の有効性が、抗ＣＤ４０刺激末梢血単核球（ＰＢＭＣ）精製Ｂ細胞またはＣＶＩＤ患者由来の精製Ｂ細胞で示された（例えば、図１３ＡおよびＢ参照）。
【０３７５】
ＩＬ−２１変異体由来のプラスミドＤＮＡの調製
この目的のため、ＩＬ−２１変異体の合成遺伝子を、配列配列番号３３、および配列番号３４に与えられたＤＮＡ配列による合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から構築した。ＩＬ−２１変異体は両方とも、ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位を有するＮ末端で修飾した。ＩＬ−２１変異体の合成遺伝子は、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限部位（ｉｍａＧｅｎｅｓ社、ベルリン、ドイツ）を用いてｐＥＴ４５ｂ（＋）（ａｍｐＲ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ギブスタウン、ＮＪ、ＵＳＡ）にクローニングするため送付した。最終構築物は配列決定により検証し、使用した制限部位および初めに所望したＤＮＡ配列内の配列一致は１００％であった（ｉｍａＧｅｎｅｓ社、ベルリン、ドイツ）。プラスミドＤＮＡは、Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従い形質転換菌から精製し、濃度をＵＶ分光法により判定した。
【０３７６】
ＩＬ−２１変異体タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成および精製
ＩＬ−２１変異体タンパク質の大腸菌ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造者の指示に従い行った。続いて、最終反応量を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて未変性条件下、６×Ｈｉｓタグタンパク質についてＮｉ−ＮＴＡベースの精製に供した。ヘキサヒスチジンタグは、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製ＩＬ−２１変異体から切断し、および標準ＳＤＳページ電気泳動またはもう１回のＮｉ−ＮＴＡスピンカラム通過のどちらかにより反応量から除去した。切断ＩＬ−２１変異体タンパク質の濃度は、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８〜２５４）により判定し、および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度に調整した。
【０３７７】
細胞分離、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の精製および培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤまたはＩｇＡＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を分離および精製するため、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ１９陽性セレクションキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、シアトル、ＷＡ、ＵＳＡ）を製造者のプロトコールに従い使用した。陽性選択したＣＤ１９＋細胞およびＣＤ１９−画分のＦＣＭ分析を行い精製効率を検証した。続いて、５×１０５／ｍｌ  ＰＢＭＣまたは２×１０５Ｂ細胞／ｍｌを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で５日間刺激した。さらに、ＩＬ−２１（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社、フリーゾイテ、ドイツ）を１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのどちらかの最終濃度で追加し、ＩＬ−２１変異体タンパク質を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで追加し、および抗ＣＤ４０ｍＡｂ（クローンＳ２Ｃ６、Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）を最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。さらに、ガレクチン−１およびガレクチン−３を５０ｎｇ／ｍｌまたは５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で追加した（両方ともＢｉｏｍｏｌ社製、ハンブルグ、ドイツ）。培養５日目または７日目、ＰＢＭＣまたはＢ細胞を上記の培養液量の２倍の容量で洗浄した。
【０３７８】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび免疫グロブリン量の判定
免疫グロブリンの量を判定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。特に、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を３０％エタノールで予め湿らせ、滅菌ＰＢＳ（ｓＰＢＳ）で３回すすぎ、および１０μｇ／ｍｌでｓＰＢＳで希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＡ捕捉抗体（ＤＡＫＯ社）のどちらかで、４℃、一晩コーティングした。洗浄後、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）含有ｓＰＢＳで３時間ブロッキングした。培養ＰＢＭＣを、２．５×１０５細胞／ウェルで播種し、およびＢ細胞を、上記の通りの細胞培養培地に５×１０４細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２０時間インキュベートした。この後、プレートを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ＳＩＧＭＡ社）含有ＰＢＳを用いて６回洗浄した。検出抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社）およびヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＡＬＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を０．５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈し、最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。スポット形成はＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質システム（ＳＩＧＭＡ社）を用いて行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレート分析ならびにこれに続く細胞数および免疫グロブリン量の計数は、適切なＡＩＤリーダーソフトウェア、リリース４．０（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ社、ストラスバーグ、ドイツ）を用いてＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  ０４  ＨＲリーダーで実施した。図１３Ａの免疫グロブリン量は、特定のスポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２における表面に等しい仮想単位で測定される。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す単一ウェル写真を図１３Ｂに示した。暗いスポットは全て、単一のＩｇＧ産生Ｂ細胞を表している。
【０３７９】
ガレクチン−１およびガレクチン−３単独は、それぞれ幅広い範囲のガレクチン−１またはガレクチン−３濃度内でＣＶＩＤ患者由来のＰＢＭＣでのＩｇＧまたはＩｇＡ産生をごくわずかに誘導した。ガレクチン−１またはガレクチン−３刺激ＰＢＭＣへのＩＬ−２１の添加は、ＩＬ−２１単独と比較した場合さらに高量の分泌ＩｇＧまたはＩｇＡを生じさせた。ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッド変異体をガレクチン−１またはガレクチン−３のどちらかと併用した場合、ＣＶＩＤ患者由来の精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞からのＩｇＧの産生は著しく増強した。これらの実験は、原発性液性免疫不全症患者（primary humoral immunodeficiency diseases）における免疫グロブリン産生を回復するためのＩＬ−２１またはＩＬ−２１変異体およびガレクチン−１またはガレクチン−３の併用の可能性を概説する。
【実施例１１】
【０３８０】
ＩＧＩＰおよびシンテニン−１はＣＶＩＤ患者においてＩｇＡ産生を誘導するＩＬ−２１変異体の作用を増強する
以下の実験ではＩＧＩＰ（ＩｇＡ誘導タンパク質、）ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッド変異体の有効性が、ガレクチン−１およびガレクチン−３との併用でＩｇＧおよびＩｇＡ産生を誘導する効力について示され、抗ＣＤ４０刺激末梢血単核球（ＰＢＭＣ）精製Ｂ細胞またはＣＶＩＤ患者由来の精製Ｂ細胞で示された（例えば、図１４参照）。
【０３８１】
ＩＬ−２１変異体由来のプラスミドＤＮＡの調製
この目的のため、ＩＬ−２１変異体の合成遺伝子を、配列配列番号３３、および配列番号３４に与えられたＤＮＡ配列による合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から構築した。ＩＬ−２１変異体は両方とも、ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位を有するＮ末端で修飾した。ＩＬ−２１変異体の合成遺伝子は、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限部位（ｉｍａＧｅｎｅｓ社、ベルリン、ドイツ）を用いてｐＥＴ４５ｂ（＋）（ａｍｐＲ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ギブスタウン、ＮＪ、ＵＳＡ）にクローニングするため送付した。最終構築物は配列決定により検証し、使用した制限部位および初めに所望したＤＮＡ配列内の配列一致は１００％であった（ｉｍａＧｅｎｅｓ社、ベルリン、ドイツ）。プラスミドＤＮＡは、Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従い形質転換菌から精製し、濃度をＵＶ分光法により判定した。
【０３８２】
ＩＬ−２１変異体タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成および精製 
ＩＬ−２１変異体タンパク質の大腸菌ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造者の指示に従い行った。続いて、最終反応量を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて未変性条件下、６×Ｈｉｓタグタンパク質についてＮｉ−ＮＴＡベースの精製に供した。ヘキサヒスチジンタグは、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製ＩＬ−２１変異体から切断し、および標準ＳＤＳページ電気泳動またはもう１回のＮｉ−ＮＴＡスピンカラム通過のどちらかにより反応量から除去した。切断ＩＬ−２１変異体タンパク質の濃度は、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８〜２５４）により判定し、および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度に調整した。
【０３８３】
ＩＧＩＰおよびシンテニン−１由来のプラスミドＤＮＡの調製
この目的のため、ＩＧＩＰおよびシンテニン−１に関する合成遺伝子を、濃縮ヒトＰＢＭＣまたはリンパ節リンパ球由来の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを用いて構築した。ＩＧＩＰに関する合成遺伝子は、第５染色体オープンリーディングフレーム５３（Ｃ５ｏｒｆ５３、ＮＣＢＩ参照配列  ＮＭ＿００１００７１８９）から増幅した。シンテニン−１に関する合成遺伝子は、ヒトシンテニン−１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号  ＢＣ０１３２５４）のコード領域から増幅した。ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位を付加したヒトＩＧＩＰおよびシンテニン−１  ｃＤＮＡを、ｐＴＵＡＴベクターに挿入した。ＤＮＡ断片を含有するＩＧＩＰヘキサヒスチジンタグまたはシンテニン−１ヘキサヒスチジンタグを、次いで大腸菌／乳酸菌シャトルベクターｐＬＰ４０２にクローニングし、ｐＬＰ４０２−ＩＧＩＰおよびｐＬＰ４０２−Ｓｙｎｔｈを形成した。乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｔｌｄｈ）由来のターミネーターは、大腸菌での下流配列の発現を抑制するようにアミラーゼのＣ末端領域とＩＧＩＰヘキサヒスチジンタグまたはシンテニン−１ヘキサヒスチジンタグ構築物のＮ末端の間に存在した。Ｔｌｄｈは、プラスミドのＮｏｔＩ消化により除去し、ライゲーション後、得られたベクターをラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）ＡＴＣＣ  ３９３（Ｌ．ｚｅａｅ）に導入した。
【０３８４】
乳酸菌発現およびＩＧＩＰおよびシンテニン−１タンパク質の精製
プラスミドｐＬＰ４０２−ＩＧＩＰまたはｐＬＰ４０２−Ｓｙｎｔｈのどちらかで形質転換したＬ．ｚｅａｅは、４８時間、３７°Ｃで嫌気培養後、３μｇ／ｍｌエリスロマイシンを有するＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ社）プレートで選択した。ｐＬＰ４０２−ＩＧＩＰおよびｐＬＰ４０２−Ｓｙｎｔｈベクターはそれぞれ、調節可能なα−アミラーゼプロモーターの転写制御下で、培地へのＩＧＩＰおよびシンテニン−１タンパク質の分泌を媒介した。α−アミラーゼプロモーターは、ネガティブフィードバックにより制御される。α−アミラーゼプロモーターは、Ｌ．ｚｅａｅにおけるグルコースおよびラクトースなどのＰＴＳ糖に抑制される。マンニトールなどの非ＰＴＳ糖の存在下での増殖は、該プロモーターを抑制解除化し、および遺伝子発現を活性化する。細胞培養培地は、０．８（１０８ｃｆｕ／ｍｌ）の６００ｎｍ（ＯＤ６００）での最適密度で指数増殖期に回収した。続いて、細胞培養培地を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて未変性条件下、６×Ｈｉｓタグタンパク質についてＮｉ−ＮＴＡベースの精製に供した。ヘキサヒスチジンタグは、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製ＩＧＩＰおよびシンテニン−１タンパク質から切断し、および標準ＳＤＳページ電気泳動またはもう１回のＮｉ−ＮＴＡスピンカラム通過のどちらかにより反応量から除去した。切断ＩＧＩＰおよびシンテニン−１タンパク質の濃度は、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８〜２５４）により判定し、および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度に調整した。
【０３８５】
細胞分離、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の精製および培養条件
ＣＤ１９＋Ｂ細胞を分離および精製するため、ヘパリン化末梢静脈血を、健常ボランティア、および欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離した。続いて、ＣＤ１９抗原を発現しているＢ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ１９陽性セレクションキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、シアトル、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造者のプロトコールに従い磁気精製した。陽性選択したＣＤ１９＋細胞およびＣＤ１９−画分のＦＣＭ分析を行い精製効率を検証した。続いて、４×１０５Ｂ細胞／ｍｌを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で７日間刺激した。さらに、ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッド変異体タンパク質を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで追加し、ＩＧＩＰタンパク質またはシンテニン−１タンパク質を最終濃度２５０ｎｇ／ｍｌで添加した。培養７日目、Ｂ細胞を上記の培養液量の２倍の容量で洗浄した。
【０３８６】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび免疫グロブリン量の判定
ＩｇＡの量を判定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。特に、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を３０％エタノールで予め湿らせ、滅菌ＰＢＳ（ｓＰＢＳ）で３回すすぎ、および１０μｇ／ｍｌでｓＰＢＳで希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＡ捕捉抗体（ＤＡＫＯ社）で、４℃、一晩コーティングした。洗浄後、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）含有ｓＰＢＳで３時間ブロッキングした。培養Ｂ細胞は、上記の通りの細胞培養培地に２．５×１０５細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２０時間インキュベートした。この後、プレートを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ＳＩＧＭＡ社）含有ＰＢＳを用いて６回洗浄した。検出抗体ヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＡＬＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を０．５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈し、最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。スポット形成はＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質システム（ＳＩＧＭＡ社）を用いて行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレート分析ならびにこれに続く細胞数および免疫グロブリン量の計数は、適切なＡＩＤリーダーソフトウェア、リリース４．０（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ社、ストラスバーグ、ドイツ）を用いてＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  ０４  ＨＲリーダーで実施した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す単一ウェル写真を図１４に示した。暗いスポットは全て、単一のＩｇＡ産生Ｂ細胞を表している。
【０３８７】
ＩＧＩＰおよびシンテニン−１タンパク質単独が、７日のインキュベーション期間後にＣＶＩＤ患者由来のＢ細胞で極めてわずかなＩｇＡ産生を誘導したのに対し、ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッド変異体タンパク質による刺激は、相対的にＩｇＡ産生の著しい増加をもたらした。ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッド変異体をＩＧＩＰまたはシンテニン−１のどちらかと併用した場合、ＣＶＩＤ患者由来の精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞からのＩｇＡの産生は予想外に数倍増加した。これらの実験は、原発性液性免疫不全症患者における免疫グロブリン産生を回復するためのＩＬ−２１変異体およびＩＧＩＰまたはシンテニン−１の併用の可能性を概説する。
【実施例１２】
【０３８８】
乳酸菌は表面発現ＩＬ−２１変異体およびＣＤ４０Ｌ分子の生担体として作用してＣＶＩＤまたはＩｇＡＤ患者におけるＩｇＧおよびＩｇＡ産生を誘導する
以下の実験では、表面発現ＩＬ−２１変異体およびＣＤ４０Ｌ分子の生担体としての乳酸菌を、ＣＶＩＤまたはＩｇＡＤ患者由来のＰＢＭＣのＩｇＧおよびＩｇＡ産生を誘導する効力についてｉｎ  ｖｉｖｏに近い設定でアッセイした（例えば、図１５、１６、および１７参照）。
【０３８９】
ＩＬ−２１変異体およびＣＤ４０Ｌ由来のプラスミドＤＮＡの調製
この目的のため、成熟切断ＩＬ−２１の合成遺伝子、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」およびＩＬ−２１変異体を、配列番号３１、配列番号９、配列番号３３、および配列番号３４に与えられたＤＮＡ配列による合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から構築した。ＩＬ−２１変異体は両方とも、ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位をコードするアミノ酸から構築前に解放した。ＣＤ４０Ｌに関する合成遺伝子を、濃縮ヒトＰＢＭＣ由来の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを用いて構築した。ＣＤ４０Ｌに関する合成遺伝子は、ヒトＣＤ４０ＬＧ（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．５９２２４４）のコード領域から増幅した。成熟切断ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質、ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質およびＣＤ４０Ｌの合成遺伝子（Ｅタグコード配列を付加した）を、ベクターｐＴＵＡＴに別個に挿入した。プロテイナーゼＰコード遺伝子ＰｒｔＰのショートまたはロングアンカー配列を導入し、ｐ−ＴＵＡＴ−Ａｎｋ（アンカー）を生成した。成熟切断ＩＬ−２１−アンカー−含有、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」−アンカー−含有、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質−アンカー−含有、ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質−アンカー−含有およびＣＤ４０Ｌ−アンカー−含有ＤＮＡ断片の合成遺伝子を、次いで大腸菌／乳酸菌シャトルベクターｐＬＰ４０２に別個にクローニングした。乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｔｌｄｈ）由来のターミネーターは、大腸菌での下流配列の発現を抑制するようにアミラーゼのＣ末端領域とＩＧＩＰヘキサヒスチジンタグまたはシンテニン−１ヘキサヒスチジンタグ構築物のＮ末端の間に存在した。Ｔｌｄｈは、プラスミドのＮｏｔＩ消化により除去し、ライゲーション後、得られたベクターをラクトバチルス・ゼアエＡＴＣＣ  ３９３（Ｌ．ｚｅａｅ）に導入した。２つの異なる構築物、すなわち、（ｉ）成熟切断ＩＬ−２１−ショートアンカー、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」−ショートアンカー、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質−ショートアンカー、ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質−ショートアンカーおよびＣＤ４０Ｌ−ショートアンカーバージョンを含有するｐＬＰ４０２（Ｌ．ｚｅａｅのプロテイナーゼＰの最後の１１７アミノ酸との融合により細胞表面発現を媒介する）；成熟切断ＩＬ−２１−ロングアンカー、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」−ロングアンカー、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質−ロングアンカー、ＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質−ロングアンカーおよびＣＤ４０Ｌ−ロングアンカーバージョンを含有するｐＬＰ４０２（プロテイナーゼＰの最後の２４４アミノ酸との融合により細胞表面発現を媒介する）を作製した。
【０３９０】
成熟切断ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１変異体およびＣＤ４０Ｌの乳酸菌発現ならびに細胞培養のための乳酸菌の計数
プラスミドｐＬＰ４０２で形質転換形質転換したＬ．ｚｅａｅは、４８時間、３７°Ｃで嫌気培養後、３μｇ／ｍｌエリスロマイシンを有するＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ社）プレートで選択した。ｐＬＰ４０２ベクターは、調節可能なα−アミラーゼプロモーターの転写制御下で、成熟切断ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１変異体およびＣＤ４０Ｌの表面固定発現を媒介した。α−アミラーゼプロモーターは、ネガティブフィードバックにより制御される。α−アミラーゼプロモーターは、Ｌ．ｚｅａｅにおけるグルコースおよびラクトースなどのＰＴＳ糖に抑制される。マンニトールなどの非ＰＴＳ糖の存在下での増殖は、該プロモーターを抑制解除化し、および遺伝子発現を活性化する。細胞は、０．８（１０８ｃｆｕ／ｍｌ）の６００ｎｍ（ＯＤ６００）での最適密度で指数増殖期に回収した。続いて、ショートまたはロングアンカータンパク質バージョン用ベクターを含有する２００μｌの各乳酸菌培養物を、１００μｌのＰＢＳでの再懸濁前に遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間）によりＰＢＳで３回洗浄した。等量の１／２００希釈マウス抗Ｅタグ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加し、試料を氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄手順を繰り返し、試料を１００μｌのＰＢＳで再懸濁し、１００μｌ  ｃｙ２標識ロバ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）（最終希釈１／２００）およびＢＤ液体計数ビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と混合し、氷上で３０分間インキュベートした。洗浄後、試料を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、容量当たりの乳酸菌数の絶対定量のためＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）機械で分析した。
【０３９１】
細胞分離および共培養条件
この目的のためヘパリン化末梢静脈血を、欧州免疫不全症学会（ＥＳＩＤ）の基準（「ＰＩＤの診断基準」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｉｄ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙ．ｐｈｐ？ｐａｒｔｙ＝３＆ｓｕｂ＝２＆ｉｄ＝７３；２００８年１０月１２日にアクセス）に従い、ＣＶＩＤまたはＩｇＡＤの診断が確定した患者から得た。ＰＢＭＣは、Ｋｒｅｈｅｒ  ＣＲら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８（１〜２）７９〜９３により記載された方法に従い、フィコール分離により分離しおよび使用まで液体窒素で保管した。続いて、ＣＶＩＤ患者由来のＰＢＭＣを、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で、表面固定したＣＤ４０Ｌ、切断ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドまたはＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質を発現する乳酸菌と７日間共培養した。乳酸菌とＰＢＭＣの間の比は１０：１であった。ＩｇＡＤ患者由来のＰＢＭＣは、５０ｎｇ／ｍｌの切断ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッド、または２μｇ／ｍｌ抗ＣＤ４０ｍＡｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社、ストックホルム、スウェーデン）と併用したＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドのどちらかにより、１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）、および１０％熱失活ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社、パシング、ドイツ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で７日間刺激した。
【０３９２】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび免疫グロブリン量の判定
免疫グロブリンの量を判定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。特に、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を３０％エタノールで予め湿らせ、滅菌ＰＢＳ（ｓＰＢＳ）で３回すすぎ、および１０μｇ／ｍｌでｓＰＢＳで希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＡ捕捉抗体（ＤＡＫＯ社）のどちらかで、４℃、一晩コーティングした。洗浄後、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）含有ｓＰＢＳで３時間ブロッキングした。培養ＰＢＭＣを、上記の通りの細胞培養培地に２．５×１０５細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２０時間インキュベートした。この後、プレートを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ＳＩＧＭＡ社）含有ＰＢＳを用いて６回洗浄した。検出抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社）およびヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＡＬＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を０．５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈し、最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。スポット形成はＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質システム（ＳＩＧＭＡ社）を用いて行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレート分析ならびにこれに続く細胞数および免疫グロブリン量の計数は、適切なＡＩＤリーダーソフトウェア、リリース４．０（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ社、ストラスバーグ、ドイツ）を用いてＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  ０４  ＨＲリーダーで実施した。図１５、１６および１７の免疫グロブリン量は、特定のスポットの強度を乗じた（０．０１ｍｍ）２における表面に等しい仮想単位で測定される。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す単一ウェル写真を図１５、１６および１７に示した。暗いスポットは全て、単一のＩｇＡまたはＩｇＧ産生Ｂ細胞を表している。
【０３９３】
図１５では表面固定したＣＤ４０ＬおよびＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質またはＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質を含有する乳酸菌が、表面固定したＣＤ４０Ｌおよび成熟切断ＩＬ−２１または「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」タンパク質を含有する乳酸菌に誘導されたよりも、ＣＶＩＤ患者のＰＢＭＣ由来の大幅に多量の分泌ＩｇＡおよびＩｇＡを誘導することが示される。これは明らかに、表面ＩＬ−２１変異体を発現する乳酸菌が原発性液性免疫不全症患者における免疫グロブリン産生を回復する適合性を示している。図１６は、乳酸菌表面発現ＩＬ−２１変異体による、および可溶性抗ＣＤ４０抗体の添加によるＩｇＡＤ患者由来のＰＢＭＣのＩｇＡ産生の誘導を示す。ここでは、表面固定したＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質またはＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質を含有する乳酸菌は、表面固定した成熟切断ＩＬ−２１または「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」タンパク質を含有する乳酸菌に誘導されたよりも、大幅に多量の分泌ＩｇＡを誘導した。これは、表面ＩＬ−２１変異体を発現する乳酸菌が原発性液性免疫不全症患者における免疫グロブリン産生を回復する適合性を示している。図１７は、ＩＬ−２１／ＩＬ−４変異体タンパク質が、成熟切断ＩＬ−２１または「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」タンパク質とは対照的に、この作用形態の典型である、ＩｇＡＤ患者由来の多様な細胞を全身的に誘導してＩｇＡを産生することを示している。
【実施例１３】
【０３９４】
重複受容体相互作用の機能的能力を有するＩＬ−２１変異体の設計およびテスト
以下の実験では重複受容体結合能を有するＩＬ−２１変異体の設計の基礎を成す計算手順が示され、および合成ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現ＩＬ−２１変異体が、独自開発のＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−４Ｒαタンパク質を結合させる能力についてテストされる（例えば、図１８および１９参照）。
【０３９５】
重複受容体結合能を有するＩＬ−２１変異体タンパク質の設計
ヒトインターロイキン−２１、インターロイキン−４およびインターロイキン−２（それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３に指定されている）の構造特性は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．社）を用いて比較および分析することができる。構造および配列アライメントの際、これらのサイトカイン間には、（ｉ）４ヘリックスバンドルから成る空間パターン、（ｉｉ）同程度の残基量および分子量、ならびに（ｉｉｉ）共通γ鎖への結合に関与する残基の類似性（図１および１８参照）に例示される、著しい構造的相同性が存在する。いずれかの細胞質内シグナルを形質導入するために、ＩＬ−２１、ＩＬ−４およびＩＬ−２は、共通γ鎖および特異的受容体サブユニット（ＩＬ−２１Ｒα、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−２Ｒβ）を必要とする。ＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２とこれらの特異的受容体サブユニットと共通γ鎖の間の相互作用は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ＶｉｓｕａｌｉｚｅｒおよびＮＣＢＩデータベース（ＮＣＢＩ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂｒａｎｃｈ社）からアクセス可能な受容体分子の高分子構造を用いて、結合自由エネルギー計算により分析することができる。このことに関して、共通γ鎖は、特異的受容体活性化に不可欠であるものの、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２（図１８参照）の両方への結合に重要な幾つかのエピトープを共有する乱交雑結合タンパク質であり、共通γ鎖相互作用に極めて重要ではないＩＬ−２１変異体タンパク質内の残基の変化を可能にし、故に設計したＩＬ−２１変異体タンパク質の共通γ鎖結合能を保持する一方で、重複する独自開発の受容体の結合効果を特徴付けることが示される。ＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２とこれらの特異的受容体サブユニットの間の相互作用に重要な残基は、同じ方法で計算され、図１８に示される。重複受容体結合能を有するＩＬ−２１変異体タンパク質を設計するため、ＩＬ−２１、ＩＬ−４−、およびＩＬ−２の構造的に互換可能な領域を同定する目的で、独自開発の受容体結合に対する同定された機能的エピトープに近い領域を、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒでリガンド相互作用計算を用いて比較した。これにより、ＩＬ−２１におけるアミノ酸Ｇｌｎ１２（配列番号１による位置番号）周辺領域は、構造的に保存されていることが見出され、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２間の互換性を示唆した。一例が、配列番号８に示されたＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質（機能的に重要なグリシンエピトープは現在、Ｇｌｎ１１位に存在する）に示されている。さらに、配列番号８のＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質では、ＩＬ−４Ｒα相互作用の界面の形成に重要なＩＬ−４の領域（配列番号２のＱ７１−Ｓ９８）が、以前はＩＬ−２１Ｒα結合の界面を形成するのみの領域と交換され、ＩＬ−４ＲαおよびＩＬ−２１Ｒα相互作用の両方を可能にする構造的構築をもたらした。これとは対照的に、Ｋｅｎｔ  Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄによる刊行物に記載さ��た「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」と呼ばれるキメラＩＬ２１−ＩＬ４タンパク質（Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄら（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２、２３３２６〜３６；配列番号９に示されている）は、ＩＬ−４Ｒαの結合界面を形成することができないように思われる。幾つかの領域は構造的に保存されないことが見出され、これらの領域がＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２間で交換される場合、このことが、条件で（in term）得られたハイブリッドタンパク質の受容体結合特性に基本的に影響する。一例が、配列番号７のＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質（ＩＬ−２Ｒβ結合に重要な領域は、ＩＬ−２１Ｒα相互作用に以前は共関与する領域にうまく融合された）に示されている。
【０３９６】
ＩＬ−２１変異体由来のプラスミドＤＮＡの調製
この目的のため、ＩＬ−２１変異体の合成遺伝子を、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に記載されたＤＮＡ配列による合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から構築した。配列番号３１は、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位の修飾を有するＩＬ−２１の切断バージョンを表す。配列番号３２は、Ｋｅｎｔ  Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄによる刊行物（Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ，Ｋ．ら（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２、２３３２６〜３６）に記載されたタンパク質を指し、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」と呼ばれる。これもまた、ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位を有するＮ末端で修飾した。「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」のオリジナルのタンパク質配列は、配列リストの配列番号９として示されており、対応するＤＮＡ配列は配列リストの配列番号１６として示されている。同様に、ＩＬ−２１変異体配列番号３３および配列番号３４は両方とも、ヘキサヒスチジンタグとこれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識部位を有するＮ末端で修飾した。ＩＬ−２１変異体の合成遺伝子は、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限部位（ｉｍａＧｅｎｅｓ社、ベルリン、ドイツ）を用いてｐＥＴ４５ｂ（＋）（ａｍｐＲ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ギブスタウン、ＮＪ、ＵＳＡ）にクローニングするため送付した。最終構築物は配列決定により検証し、使用した制限部位および初めに所望したＤＮＡ配列内の配列一致は１００％であった（ｉｍａＧｅｎｅｓ社、ベルリン、ドイツ）。プラスミドＤＮＡは、Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従い形質転換菌から精製し、濃度をＵＶ分光法により判定した。
【０３９７】
ＩＬ−２１変異体タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成および精製
ＩＬ−２１変異体タンパク質の大腸菌ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造者の指示に従い行った。続いて、最終反応量を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて未変性条件下、６×Ｈｉｓタグタンパク質についてＮｉ−ＮＴＡベースの精製に供した。ヘキサヒスチジンタグは、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製ＩＬ−２１変異体から切断し、および標準ＳＤＳページ電気泳動またはもう１回のＮｉ−ＮＴＡスピンカラム通過のどちらかにより反応量から除去した。切断ＩＬ−２１変異体タンパク質の濃度は、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８〜２５４）により判定し、および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度に調整した。
【０３９８】
受容体相互作用を検出するためのビーズベースの免疫アッセイ
ヒトインターロイキン−２１受容体独自開発サブユニット（ＩＬ−２１Ｒα）、ヒトインターロイキン−４受容体アルファサブユニット（ＩＬ−４結合サブユニット）、ヒトインターロイキン−２受容体アルファ（ＣＤ２５）、またはヒトインターロイキン−２受容体ベータ（ＣＤ１２２）に結合する能力についてＩＬ−２１変異体タンパク質をテストするため、サイトメトリービーズアレイを設計した。異なるカラーコード７．５μｍポリスチレンビーズ（ＣＢＡ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂｅａｄｓ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、スルホ−ＳＭＣＣ化学（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂｅａｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、ヤギ抗ヒトＩＬ−２１ポリクローナル抗体およびウサギ抗ヒトＩＬ−２１ポリクローナル抗体（両方ともＡｂｃａｍ  ｐｌｃ社製）の両方に共有結合させた。ヤギ抗ヒトＩＬ−２１およびウサギ抗ヒトＩＬ−２１抗体は両方とも、ウェスタンブロット法を用いて最初にテストして予測サイズを有するＩＬ−２１変異体タンパク質の適切な検出を確認した。抗体とビーズのコンジュゲーションの成功は、ＰＥ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて検証した。ビーズ捕捉ＩＬ−２１変異体と、インターロイキン−２１受容体独自開発サブユニット、インターロイキン−４受容体アルファサブユニット、インターロイキン−２受容体アルファまたはインターロイキン−２受容体ベータとの受容体相互作用を検出するため、適切な受容体−Ｆｃ−キメラタンパク質を、フローサイトメトリー評価に適したタンパク質Ａ−蛍光色素複合体と結合させた。したがって、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２１  Ｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−４  Ｒα  Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  Ｒα  Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）またはＩＬ２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒベータタンパク質（Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｃｔｉｖｅ、Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ社）を、タンパク質Ａ  ＩｇＧ結合緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で再構成し、およびＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）に製造者の指示に従いそれぞれ結合させた。５０μｌの抗体被覆ビーズおよびＩＬ−２１変異体タンパク質の連続希釈（最終濃度が１００ｐｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの範囲となる）を、蛍光コンジュゲート受容体−キメラ−タンパク質Ａ複合体と一緒に、滴定プレートシェーカーで３時間、９６ウェルプレートで過剰にインキュベートした。この後、プレートは、５分間、２００×ｇでの遠心分離により２００μｌのＣＢＡ洗浄緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で２回洗浄した。試料を、３００μｌのＣＢＡ洗浄緩衝液で慎重に再懸濁し、および直ちに分析に供した。ビーズ粒子は、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアによりＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でサイズおよび蛍光に基づき識別した（図１９ＡおよびＢ参照）。ＩＬ−２１変異体タンパク質と受容体キメラタンパク質の間の相互作用の程度は、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを用いて当初のＩＬ−２１変異体タンパク質濃度と比較したＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９蛍光（ＡＰＣチャネル）で計算し、およびＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．社、図１９ＣおよびＤ参照）により作成した散布図に示した。
【０３９９】
ＩＬ−２１変異体は、図１８に示した通り、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２と共通γ鎖およびこれらの特異的受容体との相互作用に重要な機能的エピトープならびに領域の知識で設計した。リガンド相互作用の刺激および分析は、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、およびＩＬ−２内の幾つかの領域が、同種受容体と相互作用するための界面の形成に不可欠であること、ならびに重複受容体結合能を有するタンパク質を得るためにＩＬ−２１変異体タンパク質に融合することができることを示している。このようなＩＬ−２１変異体タンパク質は、図１９に示した通り、ビーズベースの免疫アッセイによりテストして受容体相互作用の程度を検出および計算することができる。図１９Ａは、タンパク質被覆ビーズを、前方および側方散乱分析に基づきフローサイトメトリーによりしっかり検出できることを示す。図１９ＢではカラーコードビーズのＰＥ蛍光が、受容体−キメラ複合体により生じたＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９蛍光（ＡＰＣチャネル）と比較して示され、結合した受容体−キメラ複合体の程度が、フローサイトメトリーにより検出および分析できることを示している。図１９Ｃは、切断ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質およびＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質がＩＬ−２Ｒβサブユニットに結合する能力を比較しており、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質のみが、このタンパク質の設計に意図されたようなＩＬ−２Ｒβ相互作用の濃度依存性を示すことを示している。図１９Ｄでは切断ＩＬ−２１、「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」、ＩＬ−２１／ＩＬ−２ハイブリッドタンパク質およびＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質がＩＬ−４Ｒαサブユニットに結合する能力が、テストタンパク質間で比較される。「Ｃｈｉｍ−ｈＩＬ−２１／４」タンパク質のみがわずかなＩＬ−４Ｒα結合を可能にする一方、本発明によるＩＬ−２１／ＩＬ−４ハイブリッドタンパク質は、このタイプのタンパク質の設計に意図されたようなＩＬ−４Ｒα相互作用の明らかな濃度依存性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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