(57)【要約】  タンパク質標的Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−４（ＤＫＫ４）または両方と結合する結合分子およびその断片を使用する方法（本明細書においてＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方に対する特異性を「ＤＫＫ１／４」として表す）が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４の存在に関連する障害または状態を治療する方法であって、薬剤として使用する有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、前記組成物が、ＤＫＫ１ポリペプチド（配列番号１）および／またはＤＫＫ４ポリペプチド（配列番号１３１）中のエピトープと特異的に結合する抗原結合領域を含み、抗体またはその機能的断片がＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方の中の少なくとも１つのエピトープと結合し、薬剤が、ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４の存在に関連する障害または状態を治療する際に使用する薬剤である方法。
【請求項２】
ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４の存在に関連する障害または状態を治療する方法であって、障害または状態が、
ｉ．悪性線維性組織球増殖症（ＭＦＨ）；
ｉｉ．ベータサラセミア；
ｉｉｉ．神経芽細胞腫；
ｉｖ．炎症性腸疾患および過敏性腸症候群；
ｖ．２型真性糖尿病；
ｖｉ．グルココルチコイドまたは他の薬物関連の糖尿病；
ｖｉｉ．非インスリン依存性真性糖尿病；
ｖｉｉｉ．低インスリン血症；
ｉｘ．色素沈着に関連する障害；
ｘ．心血管障害；
ｘｉ．コレステロール関連の障害；
ｘｉｉ．ＭＧＵＳ；
ｘｉｉｉ．プラトー型骨髄腫；ならびに
ｘｉｖ．くすぶり型骨髄腫
から選択され、表５、６、７および８から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む薬学的有効量のＤＫＫ１／４抗体を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３】
第２の治療作用物質を投与するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第２の治療作用物質が、抗癌剤；抗骨粗鬆症剤；抗生物質；代謝拮抗剤；抗糖尿病剤；抗炎症剤；抗血管新生剤；成長因子；骨同化、体重減少療法、脂質低下剤（hypylipidemic agent）、および抗肥満剤、降圧剤、ならびに／またはペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニストおよびサイトカインから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第２の治療作用物質が、中和性抗ＤＫＫ１／４組成物またはその誘導体以外の薬学的活性作用物質であり、前記作用物質が、
ｉ．アロマターゼ阻害因子；
ｉｉ．抗エストロゲン、抗アンドロゲンまたはゴナドレリンアゴニスト；
ｉｉｉ．トポイソメラーゼＩ阻害因子またはトポイソメラーゼＩＩ阻害因子；
ｉｖ．微小管活性作用物質、アルキル化剤、抗新生物抗代謝産物またはプラチン化合物；
ｖ．タンパク質キナーゼ活性もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質ホスファターゼ活性もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／低下させる化合物、さらなる抗血管新生化合物あるいは細胞分化の過程を誘導する化合物；
ｖｉ．モノクローナル抗体；
ｖｉｉ．シクロオキシゲナーゼ阻害因子、ビスホスホネート、ヘパラナーゼ阻害因子、生物学的応答修飾因子；
ｖｉｉｉ．Ｒａｓ発癌性アイソフォームの阻害因子；
ｉｘ．テロメアーゼ阻害因子；
ｘ．プロテアーゼ阻害因子、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害因子、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害因子、またはプロテアソーム阻害因子；
ｘｉ．血液悪性腫瘍の治療で使用される作用物質、またはＦｌｔ−３の活性を標的とし、低下させもしくは阻害する化合物；
ｘｉｉ．ＨＳＰ９０阻害因子；
ｘｉｉｉ．抗増殖性抗体；
ｘｉｖ．ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害因子；
ｘｖ．セリン／スレオニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的とし、低下させまたは阻害する化合物；
ｘｖｉ．ソマトスタチン受容体アンタゴニスト；
ｘｖｉｉ．抗白血病化合物；
ｘｖｉｉｉ．腫瘍細胞を損傷させる手法；
ｘｉｘ．ＥＤＧ結合剤；
ｘｘ．リボヌクレオチドレダクターゼ阻害因子；
ｘｘｉ．Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害因子；
ｘｘｉｉ．ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体；
ｘｘｉｉｉ．光力学的療法；
ｘｘｉｖ．血管新生抑制ステロイド；
ｘｘｖ．コルチコステロイドを含有するインプラント；
ｘｘｖｉ．ＡＴ１受容体アンタゴニスト；
ｘｘｖｉｉ．ＡＣＥ阻害因子；
ｘｘｖｉｉｉ．抗糖尿病剤；
ｘｘｉｘ．脂質低下剤；
ｘｘｘ．抗肥満剤；
ｘｘｘｉ．降圧剤；および
ｘｘｘｉｉ．ペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト、
ならびに任意選択で薬学的に許容される担体
から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
悪性線維性組織球増殖症（ＭＦＨ）を治療する方法であって、表５、６、７および８から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む薬学的有効量のＤＫＫ１／４抗体を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項７】
骨障害が、骨折治癒、溶骨性病変および転移、骨減少症、骨粗鬆症、骨密度異常、骨肉腫、ならびに骨溶解からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
癌が、骨髄腫、多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ、くすぶり型もしくはプラトー型骨髄腫；骨、乳房、結腸、メラニン形成細胞、肝細胞、肝細胞癌（ＨＣＣ）、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌；またはその転移からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
筋肉疾患が、筋肉損傷、萎縮、衰弱、変性、修復、再生からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
代謝疾患が、インスリン耐性、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、低インスリン血症、糖尿病（特に２型真性糖尿病、またはグルココルチコイドもしくは他の薬物関連の糖尿病）、肥満、体重減少、体重減少の維持、神経性食欲不振症、過食症、悪液質、Ｘ症候群、代謝症候群、食後高血糖症、食後高脂血症および／または高トリグリセリド血症、低血糖症、高血糖症、高尿酸血症、高インスリン血症、高コレステロール血症、高脂血症、異脂肪血症、混合型異脂肪血症、高トリグリセリド血症、膵炎、ならびに非アルコール性脂肪肝疾患からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
心血管疾患が、冠動脈疾患、血管石灰化、跛行、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、急性心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋症、心筋梗塞、狭心症、高血圧、低血圧、卒中、虚血、虚血性再灌流障害、動脈瘤、再狭窄、および血管狭窄からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
コレステロール関連の障害が、コレステロール上昇、コレステロール上昇に関連する状態、脂質障害、高脂血症、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶ型高脂血症、二次性高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、黄色腫症、ならびにコレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠乏からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＨＦを治療する方法であって、表５、６、７および８から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む薬学的有効量のＤＫＫ１／４抗体を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
表５、６、７および８から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が、ＶＨＣＤＲ１については配列番号４９〜５２、ＶＨＣＤＲ２については配列番号５３〜６３、ＶＨＣＤＲ３については配列番号６４〜６９、およびＶＬＣＤＲ１については配列番号７０〜７４、ＶＬＣＤＲ２については配列番号７５〜７９、ＶＬＣＤＲ３については配列番号８０〜９８から選択される、請求項２から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
表５、６、７および８から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が、ＶＨＣＤＲ１については配列番号４０〜４３、ＶＨＣＤＲ２については配列番号４４〜４７、ＶＨＣＤＲ３については配列番号４８、ならびにＶＬＣＤＲ１については配列番号１１３および１１６、ＶＬＣＤＲ２については配列番号１１４および１１７、ＶＬＣＤＲ３については配列番号１１５および１１８から選択される、請求項２から１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、胚の発生の調節および新生物の過程に関与する。細胞外Ｗｎｔタンパク質は、胚発生の間の多くの細胞型の増殖および分化に関与し、多くの癌の発生に寄与する。
【０００２】
Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するタンパク質の少なくとも２つのファミリー、すなわち分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ファミリーおよびＤｉｃｋｋｏｐｆ（ＤＫＫ）ファミリーがある。ＤＫＫファミリーは現在４つのファミリーメンバー、すなわちＤＫＫ１（ヒトＤＮＡ受託番号ＮＭ＿０１２２４２；ＰＲＴ受託番号Ｏ９４９０７）、ＤＫＫ２（ヒト受託番号ＮＭ＿０１４４２１；ＰＲＴ受託番号ＮＰ＿０５５２３６）、ＤＫＫ３（ヒト受託番号ＮＭ＿０１５８８１；ＰＲＴ受託番号ＡＡＱ８８７４４）、およびＤＫＫ４（ヒト受託番号ＮＭ＿０１４４２０；ＰＲＴ受託番号ＮＰ＿０５５２３５）を含有する。
【０００３】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の分泌型阻害因子である。例えば、ＮｉｅｈｒｓのＰＣＴ公開ＷＯ９９２２０００；ＭｃＣａｒｔｈｙのＷＯ９８４６７５５、ＳｈｕｌｏｋらのＷＯ２００７／０８４３４４を参照されたい。ＤＫＫ１は、Ｗｎｔによって誘導される軸複製（axis duplication）を阻害する能力を有し、遺伝学的分析は、ＤＫＫ１が上流で作用してＷｎｔシグナル伝達を阻害することを示す。ＤＫＫ１はＬＲＰ６と拮抗的に相互作用し、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル活性化を遮断する。例えば、Ｍａｏら、２００１  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３２１を参照されたい。ＤＫＫ１は、脂肪生成、軟骨形成、胃腸上皮増殖の増殖、リウマチに関連する骨喪失、および毛包プラコード形成の開始にも役割を果たす。オンライン版ヒトのメンデル遺伝（Online Mendelian Inheritance in Man）（「ＯＭＩＭ」）受託番号６０５１８９を参照されたい。
【０００４】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−４（ＤＫＫ４）はあまり特徴付けられていないが、同様にＷｎｔ経路の分泌型阻害因子である。ＤＫＫ４は、アルツハイマー病の患者のプラークに沈着することが示されており、筋肉、小脳、Ｔ細胞、食道および肺で発現する。ＯＭＩＭ受託番号６０５４１７を参照されたい。
【０００５】
ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４によって媒介されるＷｎｔシグナル伝達の拮抗作用に干渉し、またはそれを中和するような作用物質を含めて、癌、骨密度異常、および代謝障害を治療する組成物および方法が必要である。
【０００６】
Ｗｎｔタンパク質は、細胞の発生に主要な役割を果たし、脂肪生成を制御することが知られている。Ｗｎｔ１０ｂを過剰発現するｏｂ／ｏｂおよびアグーチマウスは、脂肪組織が著しく少なく、グルコース耐性およびインスリン感受性が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、骨、骨密度、代謝、糖尿病、癌などのＤＫＫ１／４関連の異常を治療するための、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（「ＤＫＫ１」）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−４（「ＤＫＫ４」）、または両方に特異的な結合分子の組成物および使用方法（本明細書においてＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方に対する特異性を「ＤＫＫ１／４」として表す）に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において、本発明の実施形態は、ＤＫＫ１および／もしくはＤＫＫ４ポリペプチドまたはその断片と選択的に結合しそれを中和する結合分子またはその抗原結合部分、ならびに疾患を治療する際のその使用を提供する。
【０００９】
特定の実施形態では、本発明は、ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４（ＤＫＫ１／４）発現に関連する障害または状態を治療する方法を提供する。ＤＫＫ１またはＤＫＫ４関連疾患には、それだけに限らないが、骨髄腫（多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）または良性単クローン性ガンマグロブリン血症、プラトーおよびくすぶり型骨髄腫を含む）、悪性線維性組織球増殖症（ＭＦＨ）（高悪性度未分化多形性肉腫としても知られる）、神経芽細胞腫、ベータサラセミア、炎症性腸疾患、および骨障害が含まれる。さらなる疾患または障害には、それだけに限らないが、例えば、それだけに限らないが骨折治癒、溶骨性病変−特に骨髄腫（特に多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ、プラトーおよびくすぶり型骨髄腫）に、あるいは骨、乳房、結腸、メラニン形成細胞、肝細胞、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移に関連する溶骨性病変および転移；移植に関連する骨喪失；骨減少症、骨粗鬆症、骨密度異常、骨肉腫、および骨溶解を含めた骨障害が含まれる。さらなる疾患または障害には、それだけに限らないが、例えば、癌、様々な筋肉および代謝疾患、アルツハイマー病、リウマチ、結腸炎ならびに／または望まれない脱毛が含まれる。脂肪生成、軟骨形成、および色素沈着の障害も含まれる。追加の障害には、それだけに限らないが、心血管疾患、例えば冠動脈疾患、血管石灰化、跛行、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、急性心不全、うっ血性心不全、心筋症、心筋梗塞、狭心症、高血圧、低血圧、卒中、虚血、虚血性再灌流障害、動脈瘤、再狭窄、および血管狭窄が含まれる。ＤＫＫ１およびＷｎｔ経路の遺伝子は、ＭＦＨ（高悪性度未分化多形性肉腫としても知られる）（Ｍａｔｕｓｈａｎａｓｋｙら、２００７  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：３２４８〜３２５７）；炎症性腸疾患（Ｙｏｕら、２００８  Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．５３：１０１３〜１０１９）；骨肉腫（Ｌｅｅら、２００７  Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７：１５５２〜１５５９；Ｇｒｅｇｏｒｙら、２００３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２８０６７〜２８０７８）；骨髄（骨格）転移（Ｇｒａｎｃｈｉら、２００８  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２３：１５２６〜１５３５）；ならびに肺癌および食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）（Ｙａｍａｂｕｋｉら、２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：２５１７〜２５２５）を含めて、これらの疾患の多くで発現が変化していることが知られている。ＤＫＫ１またはＤＫＫ４に関連する具体的な筋肉および代謝疾患には、インスリン耐性、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、低インスリン血症、糖尿病（特に２型真性糖尿病、またはグルココルチコイドもしくは他の薬物関連の糖尿病）、肥満、体重減少、体重減少の維持、神経性食欲不振症、過食症、悪液質、Ｘ症候群、代謝症候群、食後高血糖症、食後高脂血症および／または高トリグリセリド血症、低血糖症、高血糖症、高尿酸血症、高インスリン血症、高コレステロール血症、高脂血症、異脂肪血症、混合型異脂肪血症、高トリグリセリド血症、膵炎、非アルコール性脂肪肝疾患、ならびに筋肉の損傷、萎縮、衰弱、変性、修復、再生が含まれる。関連する実施形態では、治療される癌は、ＭＧＵＳ、多発性骨髄腫またはくすぶり型もしくはプラトー型骨髄腫などの骨髄腫、骨、乳房、結腸、メラニン形成細胞、肝細胞（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ））、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移である。
【００１０】
その方法では、本発明の結合分子を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する。
【００１１】
本発明の中和性ＤＫＫ１／４結合分子は、それだけに限らないが、コレステロール上昇またはコレステロール上昇に関連する状態、例えば脂質障害（例えば、高脂血症、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型高脂血症、二次性高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、黄色腫症、コレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠乏）を含めたコレステロール関連の障害を有する、またはそのリスクがあるヒト患者を治療するのに適している。ＤＫＫ１／４結合分子は、心血管疾患を有するヒト患者、および例えば１つまたは複数のリスクファクター（例えば、高血圧、喫煙、糖尿病、肥満、または高ホモシステイン血症）の存在によりこの疾患のリスクがある患者を治療するのにも適している。
【００１２】
特定の実施形態では、上記の方法のいずれかでさらに化学療法剤または他の薬学的活性作用物質を投与する。関連する実施形態では、化学療法剤は抗癌剤である。別の関連する実施形態では、化学療法剤は抗骨粗鬆症剤である。一実施形態では、１つまたは複数の骨同化、体重減少療法および／または糖尿病療法と組み合わせて結合分子を投与する。
【００１３】
一実施形態では、結合分子はＤＫＫ１／４中和性結合分子である（すなわち、それはＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方を特異的に中和する）。様々な実施形態では、ＤＫＫ１／４中和性結合分子の抗原結合部分はＤＫＫ２またはＤＫＫ３と結合しない。
【００１４】
一実施形態では、結合分子またはその抗原結合部分は、例えばヒト、ヒト化、ヒューマニア化、サメまたはラクダ科骨格から選択されるフレームワークなどの免疫グロブリン様骨格内に配置され、かつ／またはさらに組換え、キメラ、またはＣＤＲ移植抗体でもよい。例えば、ヒト抗マウス抗体応答を最小限にするように設計された技術（Ｋａｌｏｂｉｏｓのヒューマニア化技術またはＰＤＬのヒト化技術）は、本発明内で企図される。さらに、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４に特異的な抗原結合部分は、例えば、アドネクチン、フィブリノーゲン、アンキリンに由来する反復などの内部で整列した型のフレームワークを含めた非免疫グロブリン様骨格内にあってもよい。
【００１５】
一実施形態では、ＤＫＫ１結合分子は、標的タンパク質ＤＫＫ１に特異的な抗原結合領域を有するものとして特徴付けられ、結合分子または機能的断片は、ＤＫＫ１またはその断片と結合する。関連する実施形態では、ＤＫＫ４結合分子は、標的タンパク質ＤＫＫ４に特異的な抗原結合領域を有するものとして特徴付けられ、結合分子または機能的断片は、ＤＫＫ４またはその断片と結合する。一実施形態では、結合分子またはその抗原結合部分は、ＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４ポリペプチドまたは両方と結合するが、ＤＫＫ２またはＤＫＫ３ポリペプチドとは結合しない。
【００１６】
別の実施形態では、結合分子またはその抗原結合部分は単クローン性である。別の実施形態では、抗原結合部分は多クローン性である。様々な実施形態では、ＤＫＫ１結合分子またはその抗原結合部分は、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４ポリペプチドの３０個の連続したアミノ酸からなるペプチドと結合する。一実施形態では、本発明の結合分子は、不連続なアミノ酸を含むＤＫＫ１またはＤＫＫ４エピトープと結合する。
【００１７】
関連する実施形態では、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４との結合は、少なくとも以下のアッセイの１つによって決定される：Ｗｎｔによってシグナル伝達される転写のＤＫＫ１またはＤＫＫ４拮抗作用の阻害；表面プラズモン共鳴親和性決定、酵素結合免疫吸着アッセイ結合；電気化学発光に基づく結合分析；オステオカルシン（ＯＣＮ）、１型プロコラーゲン窒素性プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）やオステオプロテグリン（ＯＰＧ）などのバイオマーカーのＦＭＡＴ、ＳＥＴ、ＳＰＲ、ＡＬＰ、ＴｏｐＦｌａｓｈ、血清濃度、ならびにＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）、ＬＲＰ（ＬＲＰ５／６）やＫｒｅｍｅｎ（Ｋｒｍ）などの細胞表面受容体（複数可）との結合。特定の実施形態では、Ｄｋｋ１結合分子または抗原結合部分は、以下の特性の少なくとも１つを有する：ヒトＤＫＫ２またはＤＫＫ３より少なくとも１０３倍、１０４倍または１０５倍大きいＤＫＫ１の選択性；１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１．０ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫｏｎでＤＫＫ１またはＤＫＫ４と結合すること；１秒当たり１０−２、１秒当たり１０−３、１秒当たり１０−４、または１秒当たり１０−５未満のＤＫＫ１の解離速度を有すること。
【００１８】
関連する実施形態では、本発明の結合分子は、ＬＲＰ５／６との結合についてＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４と競合する。関連する実施形態では、本発明の結合分子は、Ｋｒｍとの結合についてＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４と競合する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、上記結合分子またはその機能的断片のいずれかの単離抗原結合領域、およびこれらのアミノ酸配列を提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、配列番号２〜２０および配列番号４０〜７２の群から選択される単離アミノ酸配列、ならびにこれらの配列の保存的またはヒューマニア化変異体を提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、特にＤＫＫ１／４抗体、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３領域、ならびに様々なフレームワーク領域および骨格のものを含めて、本発明の結合分子のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を提供する。
【００２１】
一実施形態では、生産および臨床使用について、配列を発現について最適化する。臨床使用について最適化される特徴には、それだけに限らないが、例えば、半減期、薬物動態（ＰＫ）、抗原性、エフェクター機能、ＦｃＲｎクリアランス、および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を含めた患者の応答が含まれる。
【００２２】
他の実施形態では、本発明は、表１８に表された影付きのＣＤＲ領域（配列番号４９〜９８）のいずれか１つまたは複数と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を提供し、表１８は、本発明の抗体の重可変領域（配列番号２〜２０）および軽鎖可変領域（配列番号２１〜３９）を示す。一実施形態では、本発明は、配列番号４０〜４８のいずれか１つもしくは複数で示されるＶＨ鎖の亜群のＣＤＲコンセンサス配列、および／または配列番号１１３〜１１８のいずれか１つもしくは複数で示されるＶＬ鎖の亜群のＣＤＲコンセンサス配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を提供する。表１８からのクローニング骨格配列は、配列番号１２５〜１３０で示される通りである。
【００２３】
表１８は、配列番号２〜３９の重鎖および軽鎖可変領域を示す。本発明の抗体の最適化ＬＣおよびＨＣ変異体の配列は、ＤＮＡについては配列番号９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９および１１１、コードされたポリペプチドについては配列番号１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０および１１２としてそれぞれ示されている。一実施形態では、本発明は、配列番号２〜３９、ならびに１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０および１１２に表された配列のいずれか１つまたは複数と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９および１１１に表された配列のいずれか１つまたは複数と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。
【００２４】
最適化ＶＬ鎖、より具体的にはそのＤＮＡセンス鎖、その対応するアンチセンス鎖およびそのコードされたポリペプチドの配列は、配列番号１１９〜１２１としてそれぞれ示されている。最適化ＶＨ鎖、より具体的にはそのＤＮＡセンス鎖、その対応するアンチセンス鎖およびそのコードされたポリペプチドの配列は、配列番号１２２〜１２４としてそれぞれ示されている。一実施形態では、本発明は、配列番号１２１または１２４に表された配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を提供する。関連する一実施形態では、本発明は、配列番号１１９〜１２０および１２２〜１２３に表された配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。
【００２５】
特定の実施形態では、上記の単離抗体のいずれかはＩｇＧである。関連する実施形態では、上記の単離抗体のいずれかはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。別の実施形態では、抗体は、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＡである。関連する実施形態では、本発明は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体組成物から選択される。さらなる実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化、ヒューマニア化、組換えなどの抗体である。
【００２６】
機能的断片には、ＦｖおよびＦａｂ断片（ｓｃＦｖなどの単鎖型を含む）、また非免疫グロブリン骨格と連結したもの、ラクダ科およびサメ抗体などの重鎖抗体ならびにナノボディを含めた本発明の抗体の他の抗原結合領域が含まれる。関連する実施形態では、上記に記載の単離抗体はＩｇＧである。別の関連する実施形態では、上記に記載の単離抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。別の実施形態では、抗体は、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＡである。関連する実施形態では、本発明はポリクローナル抗体組成物である。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、ＤＫＫ１のエピトープに特異的な抗原結合領域を有する単離ヒトもしくはヒト化結合分子またはその機能的断片を提供し、その結合分子または機能的断片はＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４と結合し、またはその他の形でＤＫＫ１またはＤＫＫ４と細胞表面受容体（例えば、ＬＲＰ５／６、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄなどの受容体）の結合を遮断する。特定の実施形態では、結合分子またはその断片は、溶骨性病変の発症を予防、治療、または改善する。他の実施形態では、本発明の抗ＤＫＫ組成物は、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４関連の癌または疾患を予防、治療、または改善する。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、標的ＤＫＫ１またはＤＫＫ４のエピトープに特異的な抗原結合領域を有する単離ヒトもしくはヒト化結合分子またはその機能的断片を提供し、そのエピトープは、ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４のＣＹＳ１−リンカー−ＣＹＳ２ドメインを含むポリペプチド断片由来の６個以上のアミノ酸残基を含有する。関連する実施形態では、エピトープは立体構造エピトープである。一実施形態では、エピトープはＣＹＳ２ドメイン内にある。特定の実施形態では、エピトープは修飾アミノ酸残基を含む。関連する実施形態では、エピトープは少なくとも１つのグリコシル化アミノ酸残基を含有する。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、上記結合分子または機能的断片または保存的変異体のいずれかまたは複数の少なくとも１つ、およびその薬学的に許容される担体または賦形剤を有する医薬組成物を提供する。
【００３０】
別の実施形態では、上記のヒトもしくはヒト化結合分子またはその断片は合成物である。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、上記結合分子またはその機能的断片のいずれかおよび追加の治療作用物質の医薬組成物を提供する。追加の治療作用物質は、抗癌剤；抗骨粗鬆症剤；抗生物質；代謝拮抗剤；抗糖尿病剤；抗炎症剤；抗血管新生剤；成長因子；骨同化、体重減少療法、抗糖尿病剤、脂質低下剤（hypylipidemic agent）、および抗肥満剤、降圧剤、ならびに／またはペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニストおよびサイトカインからなる群から選択することができる。
【００３２】
本発明はさらに、
（ａ）本発明のＤＫＫ１／４結合分子と、
（ｂ）１つまたは複数の薬学的活性作用物質と、任意選択で
（ｃ）薬学的に許容される担体と
を含む薬学的作用物質の組合せで、哺乳動物、特にヒトにおけるＤＫＫ１、ＤＫＫ４またはＤＫＫ１／４関連疾患または障害を予防または治療する方法に関し、少なくとも１つの薬学的活性作用物質は抗癌治療薬である。
【００３３】
本発明はさらに、
（ａ）ＤＫＫ１／４中和剤と、
（ｂ）薬学的活性作用物質と、任意選択で
（ｃ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物に関し、少なくとも１つの薬学的活性作用物質は、骨同化、体重減少治療薬または糖尿病治療薬である。
【００３４】
本発明はさらに、
（ａ）ＤＫＫ１／４中和性結合分子の医薬製剤と、
（ｂ）同時に、併用して、個別にまたは順次使用する薬学的活性作用物質の医薬製剤と
を含む市販パッケージまたは製品に関し、少なくとも１つの薬学的活性作用物質は、抗癌治療薬、骨同化、体重減少治療薬または糖尿病治療薬である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】抗ＤＫＫ１／４抗体が、ヒトＤＫＫ１に対する高い親和性（２ｐＭ）を有し、この親和性の抗体に典型的な結合動態を有することを示す図である。
【図２】（図２Ａ）完全長および切断型ＤＫＫ１の概略図である。（図２Ｂ）中和性抗ＤＫＫ１／４抗体およびＤＫＫ１タンパク質の結合を表す図である。
【図３】抗ＤＫＫ１／４抗体が、ＤＫＫ１とＬＲＰ６の結合を競合的に阻害することを示す図である。
【図４】抗ＤＫＫ１／４抗体が、０．１６ｎＭの見かけのＥＣ５０で、ＤＫＫ１によって抑制されるＷｎｔシグナル伝達を再活性化することを示す図である。
【図５】多能性マウス細胞系統Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（１０Ｔ１／２）のＷｎｔ媒介性骨芽細胞分化を測定するために確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを示す図である。
【図６】腫瘍成長に対する抗ＤＫＫ１／４抗体の３種の投与の効果を示す図である。
【図７】ＰＢＳ、ＩｇＧ、および抗ＤＫＫ１／４で処置した動物における石灰化した骨の百分率を示す図である。
【図８】抗ＤＫＫ１／４抗体がＺｏｍｅｔａと同等の抗溶骨活性を示す図である。
【図９】抗ＤＫＫ１／４抗体の同化骨効果が、最小有効用量２０〜６０μｇ／マウス、３回／週で用量依存的であることを示す図である。
【図１０】（図１０Ａおよび図１０Ｂ）分化マーカーのＲＮＡ発現に対するＷｎｔ１およびＤＫＫ１の効果を示す図であり、ＧＬＵＴ４タンパク質発現がＷｎｔ３ａおよびＤＫＫ１とともに増大する。
【図１１】Ｗｎｔ３ａ、ＤＫＫ１およびＭＯＲ４９１０（「ＢＨＱ８８０」）で処置した細胞の分化マーカーＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰ２およびＡＰ２の発現レベルのグラフ表示である。
【図１２】ウェスタンブロット法で分析したＧＬＵＴ４レベルを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４と特異的に結合し、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４の機能特性を阻害する単離ＤＫＫ１／４結合分子、特にヒト抗体の使用に関する。一実施形態では、ＤＫＫ１／４結合分子（ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４と結合する分子）は、ＤＫＫ２またはＤＫＫ３と特異的に結合しない。
【００３７】
本明細書において「ＤＫＫ１関連疾患または障害」または「ＤＫＫ４関連疾患または障害」あるいは「ＤＫＫ１／４関連疾患または障害」（ＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４に関連する疾患または障害）には、それだけに限らないが、骨髄腫（多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ、プラトーおよびくすぶり型骨髄腫を含む）、悪性線維性組織球増殖症または組織球腫（ＭＦＨ）、神経芽細胞腫、ベータサラセミア、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、および骨障害が含まれる。本明細書において、ＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方への言及は、「ＤＫＫ１／４」として表す。さらなるそのような疾患または障害には、それだけに限らないが、例えば、それだけに限らないが骨折治癒、溶骨性病変および転移；移植に関連する骨喪失；骨減少症、骨粗鬆症、骨密度異常、骨肉腫、および骨溶解を含めた骨障害が含まれる。さらなるそのような疾患または障害には、それだけに限らないが、例えば、癌、様々な筋肉および代謝疾患、アルツハイマー病、リウマチ、結腸炎ならびに／または望まれない脱毛が含まれる。脂肪生成、軟骨形成、および皮膚色素沈着の障害も含まれる。追加の疾患または障害には、それだけに限らないが、心血管疾患が含まれる。関連する実施形態では、治療される癌は、骨髄腫（多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ、プラトー型およびくすぶり型骨髄腫など）、または骨、乳房、結腸、メラニン形成細胞、肝細胞、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移である。対象は、コレステロール上昇もしくはコレステロール上昇に関連する状態、例えば脂質障害（例えば、高脂血症、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型高脂血症、二次性高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、黄色腫症、コレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠乏）を有する、もしくはそのリスクがある場合、または心血管疾患を有する、もしくは例えば１つまたは複数のリスクファクター（例えば、高血圧、喫煙、糖尿病、肥満、または高ホモシステイン血症）の存在によりこの疾患のリスクがある場合、ＤＫＫ１／４関連疾患または障害を同様に有する可能性がある。本出願で提示したデータは、３Ｔ３Ｌ１線維芽細胞をＤＫＫ１抗体ＭＯＲ４９１０で処置すると、脂肪細胞への分化が阻害されることを示す。脂肪細胞の阻害は、肥満、体重減少の維持や高脂血症などの脂肪細胞の活性および体脂肪に関連する代謝疾患および状態、ならびに癌患者における体脂肪の低下に適用することができる。
【００３８】
その方法では、本発明の結合分子を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の結合分子は特定の重鎖および軽鎖配列に由来する抗体であり、かつ／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特質を含む。本発明は、単離抗体、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む免疫コンジュゲートおよび二重特異性分子、ならびに本発明の抗体、免疫コンジュゲートまたは二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。本発明は、本明細書で提供するように、抗体を使用してＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方に関連する障害または状態を阻害する方法にも関する。
【００４０】
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明全体を通じて記載する。
【００４１】
「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓によって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用を指し、その結果、侵入している病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織が選択的に傷害され、破壊され、または人体から排除される。
【００４２】
「シグナル伝達経路」とは、細胞の一方の部分から細胞の他方の部分へのシグナルの伝達に役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。本明細書において、「細胞表面受容体」という語句は、例えば、シグナルを受け、細胞の形質膜を越えてそのようなシグナルを伝達することができる分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例は、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４タンパク質分子が結合する受容体である。そのような細胞表面受容体には、それだけに限らないが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）、ＬＲＰ（ＬＲＰ５およびＬＲＰ６）、およびＫｒｅｍｅｎ（Ｋｒｍ）が含まれる。
【００４３】
本明細書において、「結合分子」という用語は、標的分子のエピトープを特異的に認識しそれと結合する免疫グロブリンおよび非免疫グロブリン部分を指す。
【００４４】
本明細書において、「ＤＫＫ１／４結合分子」とは、ＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方と特異的に結合するポリペプチドである。一実施形態では、ＤＫＫ１／４結合分子は、約１０倍〜約１０００倍の親和性の差でＤＫＫ４よりＤＫＫ１と優先的に結合する。一実施形態では、親和性の差は１００倍である。一実施形態では、ＤＫＫ１／４結合分子は、ＤＫＫ２またはＤＫＫ３ポリペプチドを認識しない。ＤＫＫ１／４結合分子の例には、それだけに限らないが、少なくとも１つのＣＤＲ断片が含まれる。本発明の特定のＣＤＲ断片は、それだけに限らないが、例えば、標的分子（複数可）のエピトープを特異的に認識しそれと結合する抗体もしくは抗体断片、または免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリン部分を含めて、当技術分野で知られている様々な骨格の中にあってもよい。
【００４５】
本明細書において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および親抗体の抗原結合機能を保持する他の断片などのその断片などの免疫グロブリンを指す。したがって、抗体は、免疫グロブリンもしくは糖タンパク質、またはその断片もしくは部分、あるいは改変免疫グロブリン様フレームワーク内に含まれる抗原結合部分を含む構築物、あるいは非免疫グロブリン様フレームワークまたは骨格を含む構築物内に含まれる抗原結合部分を指し得る。
【００４６】
本明細書において、「モノクローナル抗体」という用語は、同種の抗体の集団を有する抗体組成物を指す。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されず、それが作製された様式によっても限定されるものではない。この用語は、免疫グロブリン全体ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および抗体の抗原結合機能を保持する他のものなどの断片を包含する。任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体を本発明で使用することができる。しかし実際には、抗体は、モノクローナル抗体を産生するのに必要なハイブリッド細胞系統またはハイブリドーマを作製する際の使用にラットまたはマウス細胞系統が利用可能であるため、典型的にはラットまたはマウス由来のものとなる。
【００４７】
本明細書において、「ポリクローナル抗体」という用語は、異種の抗体の集団を有する抗体組成物を指す。ポリクローナル抗体はしばしば、免疫感作した動物または選択したヒトのプール血清に由来する。
【００４８】
本明細書において、「単鎖抗体」という語句は、結合する抗体の結合ドメイン（重鎖と軽鎖の両方）を決定し、その結合機能の保存を可能にする連結部分を供給することによって調製された抗体を指す。これは、本質的に、徹底的に省略された抗体を形成し、抗原との結合に必要な可変ドメインの部分しか有さない。単鎖抗体の決定および構築は、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００４９】
「天然に存在する抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互に連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性のある領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらは以下の順にアミノ末端からカルボキシ末端へと配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと宿主の組織または免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の最初の構成成分（Ｃ１ｑ）を含めたファクターの結合を媒介することができる。
【００５０】
本明細書において、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」）という用語は、標的、例えば１つまたは複数のＣＤＲと結合するタンパク質の配列を指す。それは、例えば、完全長抗体、抗体の１つもしくは複数の断片、および／または抗原（例えば、ＤＫＫ１）と特異的に結合する能力を保持する非免疫グロブリン関連骨格上のＣＤＲを含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たすことができる。抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含される結合断片の例には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；および単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００５１】
本明細書において、「抗原」または「エピトープ」とは、互換的に、抗体の抗原結合部分、抗体断片、結合分子またはそれらの同等物によって特異的に認識される標的タンパク質上のポリペプチド配列を指す。抗原またはエピトープは、少なくとも６アミノ酸を含み、それは標的配列内で連続していてもよく、または不連続でもよい。立体構造エピトープは、不連続な残基を含んでもよく、任意選択で天然にまたは合成により修飾されたアミノ酸残基を含有してもよい。残基の修飾には、それだけに限らないが、リン酸化、グリコシル化、ＰＥＧ化、ユビキチン化、フラニル化などが含まれる。
【００５２】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え方法を使用して、それらをＶＬおよびＶＨ領域が対となって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９〜５８８３を参照）として作製することを可能にする合成リンカーにより連結することができる。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来技術を使用して得られ、断片は完全な抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００５３】
本明細書に記載のように、保存的変異体は、同定されているアミノ酸配列のいずれかにあるアミノ酸残基、特にタンパク質工学の分野の技術者に周知である保存的変化を含む。
【００５４】
本明細書において、「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＤＫＫ１と特異的に結合する単離抗体は、ＤＫＫ１以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＤＫＫ１と特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＤＫＫ１分子、またはＤＫＫ４もしくは関連のパラログなどの他のファミリーメンバーなどの他の抗原との交差反応性を有する可能性がある。さらに、単離抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【００５５】
本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域もＣＤＲ領域もヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もそのようなヒト配列、例えばヒト生殖系列配列、または突然変異型のヒト生殖系列配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでよい。しかし、本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含まないものとする。
【００５６】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示す抗体を指し、フレームワーク領域もＣＤＲ領域もヒト配列に由来する可変領域を有する。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００５７】
本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部分がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。ヒトフレームワーク配列上に移植されている別の種、特に哺乳動物種、例えばマウスの生殖系列に由来するＣＤＲ配列を有する抗体などの「ヒト化」抗体。例となる技術には、ＰＤＬのヒト化技術がある。
【００５８】
本明細書において、「ヒューマニア化抗体」という用語は、同じエピトープと結合するが配列が異なる抗体を意味する。例となる技術には、Ｋａｌｏｂｉｏｓのヒューマニア化技術によって産生されるヒューマニア化抗体が含まれ、抗原結合領域の配列は、保存的なアミノ酸の置き換えではなく、例えば突然変異によって誘導される。
【００５９】
本明細書において、「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子導入もしくは染色体導入した動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体や、他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部分のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された全てのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列について遺伝子導入した動物を使用するときはｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【００６０】
本明細書において、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってもたらされる抗体のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３やＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。
【００６１】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において「抗原と特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。本明細書において、「ヒトＤＫＫ１と特異的に結合する」抗体は、５×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下、または１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＤＫＫ１と結合する抗体を指すものとする。「ヒトＤＫＫ１以外の抗原と交差反応する」抗体は、０．５×１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、または２×１０−９Ｍ以下のＫＤでその抗原と結合する抗体を指すものとする。「特定の抗原と交差反応しない」抗体は、１．５×１０−８Ｍ以上のＫＤ、または５〜１０×１０−８Ｍもしくは１×１０−７Ｍ以上のＫＤでその抗原と結合する抗体を指すものとする。特定の実施形態では、抗原と交差反応しないそのような抗体は、標準的な結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出不能な結合を示す。
【００６２】
本明細書において、ＬＲＰ、ＦｚやＫｒｍなどの「細胞表面受容体とＤＫＫ１の結合を阻害する」結合分子とは、１ｎＭ以下、０．７５ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．２５ｎＭ以下のＫで受容体とＤＫＫ１の結合を阻害する結合分子を指す。
【００６３】
本明細書において、「骨溶解」とは、例えば骨芽細胞活性の低下、破骨細胞活性の増大を含めた様々な作用機構に起因し得る骨密度の低下を指す。したがって、骨溶解は、一般に骨塩密度に影響を及ぼす機構を包含する。本明細書において、「溶骨活性を阻害する」結合分子とは、骨形成を増大し、または骨吸収を遮断することによって骨密度の減少を阻害する結合分子を指すものとする。
【００６４】
本明細書において、「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を指すものとするが、本明細書において、「Ｋｄｉｓ」または「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すものとする。本明細書において、「ＫＤ」という用語は解離定数を指すものとし、これはＫｄとＫａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立されている方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定する方法は、表面プラズモン共鳴の使用、ＦＭＡＴ、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）系などのバイオセンサー系の使用によるものである。
【００６５】
本明細書において、「親和性」という用語は、単一の抗原性部位における抗体などの結合分子と抗原との相互作用の強度を指す。各抗原性部位内で、抗体の「腕」の可変領域は、弱い非共有結合の力を介して多数の部位で相互作用する；相互作用が多いと、親和性は強くなる。
【００６６】
本明細書において、「結合力」という用語は、結合分子−抗原複合体の全体的な安定性または強度の尺度を指す。それは３つの主要なファクター：結合分子のエピトープ親和性；抗原と結合分子両方の価数；および相互作用する部分の構造的配置によって調節される。最終的にこれらのファクターは結合分子の特異性、すなわち、特定の結合分子が正確な抗原エピトープと結合している可能性を規定する。
【００６７】
結合力がより高いプローブを得るために、二量体コンジュゲート（ＦＡＣＳマーカーと連結したＪＷＪ−１の２つの分子）を構築し、それによって、ＦＡＣＳにより容易に検出される（生殖系列抗体などとの）低親和性の相互作用を作り出すことができる。さらに、抗原結合の結合力を増大させる別の手段では、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４結合分子の本明細書に記載されているフィブロネクチン構築物のいずれかの二量体または多量体を生成する。そのような多量体は、個々のモジュール間の共有結合を介して、例えば、天然のＣからＮ末端の結合を模倣し、またはその定常領域を介して互いに保持される抗体二量体を模倣することによって生成することができる。Ｆｃ／Ｆｃインターフェース中に工学的に作製される結合は、共有結合でもよく、または非共有結合でもよい。さらに、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４ハイブリッドにおいてＦｃ以外の二量体化または多量体化パートナーを使用して、そのような高次の構造を作り出すことができる。
【００６８】
本明細書において、「交差反応性」という用語は、結合分子または結合分子の集団が他の抗原上のエピトープと結合することを指す。これは、結合分子の低い結合力もしくは特異性、または同一のもしくは酷似するエピトープを有する複数の異なる抗原によって引き起こされる可能性がある。交差反応性は、関連する群の抗原との幅広い結合を望むとき、または抗原エピトープ配列が進化において高度に保存されていないときに交差種標識を試みるときに望ましいことがある。
【００６９】
本明細書において、ＩｇＧ抗体について「高親和性」または「高特異性」という用語は、標的抗原について１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし、「高親和性」の結合は、他の抗体アイソタイプについて様々であり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプについて「高親和性」の結合は、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【００７０】
本明細書において、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００７１】
「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物を含む。「非ヒト細胞」という用語は、とりわけ、脊椎動物、無脊椎動物、微生物、真菌または他の由来の
細胞を含めて、ヒト由来のものでない任意の真核または原核細胞を指す。
【００７２】
本明細書において、「最適化された」という用語は、産生細胞もしくは生物において好ましいコドンを使用したアミノ酸配列をコードするようにヌクレオチド配列が変化していること、および／または潜伏性スプライスドナーもしくはスプライスアクセプター部位を除去するようにヌクレオチド配列が変化していることを意味する。最適化されたコドン表は、多種多様な種について当技術分野で周知である。スプライスドナーおよびアクセプター部位の配列も当技術分野で知られ、例えば、転写物または発現データの分析によって潜伏性スプライス部位を同定することができる。産生細胞には、それだけに限らないが、例えば、細菌（大腸菌（E. coli））などの原核細胞などの原核細胞、または真核細胞、例えば酵母（例えば、ピキア（Pichia））、真菌細胞、バキュロウイルス感染細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、骨髄腫細胞もしくはヒト細胞が含まれる。最適化されたヌクレオチド配列は、「親配列」としても知られている、開始ヌクレオチド配列によって元々コードされているアミノ酸配列および残基数を完全にまたはできるだけ多く保持するように工学的に作製される。本明細書において、最適化された配列は、産生細胞において好ましいコドンを有するように工学的に作製されているが、他の真核および原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も本明細書において想定されている。任意選択で、最適化されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列も最適化されたとみなされる。
【００７３】
関連する実施形態では、本発明の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物のポリペプチド配列、およびそれをコードするヌクレオチドを生産および臨床使用について最適化する。臨床使用について最適化され得る特徴には、それだけに限らないが、例えば、半減期、薬物動態（ＰＫ）、抗原性、エフェクター機能、ＦｃＲｎクリアランス、および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を含めた患者の応答が含まれる。
【００７４】
本明細書において、「ＤＫＫ１関連疾患」および／または「ＤＫＫ４関連疾患」（「ＤＫＫ１／４関連疾患」）には、それだけに限らないが、溶骨性病変−特に骨髄腫（特に多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ、プラトーおよびくすぶり型骨髄腫）に、あるいは骨、乳房、結腸、メラニン形成細胞、肝細胞、上皮、食道、脳、肺、前立腺もしくは膵臓の癌またはその転移に関連する溶骨性病変；移植に関連する骨喪失が含まれる。さらなる疾患または障害には、それだけに限らないが、例えば、骨肉腫、前立腺癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、骨髄腫（多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ、プラトーおよびくすぶり型骨髄腫を含む）、糖尿病、肥満、筋肉衰弱、アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨減少症、リウマチ、結腸炎および／または望まれない脱毛が含まれる。
【００７５】
本明細書において、「治療」とは、障害の発症を予防し、またはその病状を変化させる意図で行う介入である。「治療」は、治療的処置と予防または防止的方策の両方を指す。治療を必要とする者は、すでに障害を有する者ならびに障害を予防すべき者を含む。腫瘍（例えば、癌）の治療において、治療作用物質は腫瘍細胞の病状を直接軽減することもでき、または腫瘍細胞を他の作用物質、例えば放射線および／もしくは化学療法による治療により感受性にすることもできる。癌の「病状」は、患者の健康に支障を来す全ての現象を含む。これには、それだけに限らないが、異常なまたは調節不能な細胞増殖、転移、近傍細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルでのサイトカインまたは分泌産物の放出、炎症または免疫学的応答の抑制または悪化などが含まれる。
【００７６】
骨溶解などの疾患の臨床的、生化学的、放射線医学的または自覚的症状を患う患者の治療は、そのような症状の一部もしくは全部の緩和、または疾患素因の低減を含むことがある。
【００７７】
一般に、本発明の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物は、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３にまたはＷｎｔ経路の他のモジュレーターに関連する疾患ではなく、ＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方に関連するＷｎｔ関連疾患を予防、治療、または改善する。
【００７８】
本発明の様々な態様は、以下の小節にさらに詳細に記載されている。
【００７９】
Ｗｎｔ経路は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨芽細胞への分化の主要な制御因子である。それは、活性な骨芽細胞にとって重要な生存因子でもある。Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）は、成体の骨において優勢に発現するＷｎｔ経路のアンタゴニストであり、溶骨性病変を有する骨髄腫患者で上方制御されている。中和性抗ＤＫＫ１／４結合分子は真正の同化剤であり、破骨細胞の活性を同時に低下させつつ骨芽細胞の活性を増大させることにより作用する。その一方、同化剤として販売されているＰＴＨなどの現在の薬物は実際、骨芽細胞にも骨芽細胞にも関連するマーカーを増大させる。
【００８０】
ＤＫＫ１との結合について選択されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体が本発明で提供される。一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＤＫＫ１に対して１０ｐＭ未満の親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗ＤＫＫ１抗体はＤＫＫ４と交差反応するが（Ｋｄ約３００ｐＭ）、ＤＫＫ２とは交差反応しない（現在の方法では検出不能）。
【００８１】
一実施形態では、抗ＤＫＫ１または抗ＤＫＫ４結合分子のエピトープは、ＬＲＰ６結合とＫｒｅｍｅｎ結合の両方に関与することが知られているＣｙｓ−２ドメインにマッピングされる（ＡＡ１８９〜２６３）。一実施形態では、エピトープは、ＤＫＫ１またはＤＫＫ４ポリペプチドのＣｙｓ−２ドメインの少なくとも６個、多くて３０個のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、エピトープは、一続きの少なくとも６個の連続したアミノ酸を含む。別の実施形態では、結合部位は非線形であり、すなわち不連続なアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、結合はＮ−グリコシル化に依存する。Ｃｙｓ−２ドメインの残基２５６にＮ−グリコシル化部位が１つだけ予測される。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、マウスにおいて用量直線的な薬物動態（ＡＵＣ）を示し、２０〜２００μｇ／マウスの用量にわたるマウスの用量依存的な終末相半減期は３５〜９６時間である。
【００８３】
したがって、当技術分野で知られている方法に従って決定され、本明細書に記載されているこれらのＤＫＫ１の機能特性（例えば、生化学的、免疫化学的、細胞、生理学的または他の生物学的活性など）の１つまたは複数を「阻害する」結合分子は、結合分子の不在下で（例えば、または無関係な特異性のある対照結合分子が存在するときに）認められるものと比べた、特定の活性の統計的に有意な低下に関連することが理解されるであろう。ＤＫＫ１の活性を阻害する結合分子は、そのように統計的に有意に、測定されるパラメーターを少なくとも１０％、少なくとも５０％、８０％または９０％低下させ、特定の実施形態では、本発明の結合分子は９５％、９８％または９９％を超えてＤＫＫ１の機能活性を阻害できる。
【００８４】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆファミリーメンバー
本発明のＤＫＫポリペプチドには、ＤＫＫ１（配列番号１）およびＤＫＫ４（配列番号１３３）、ならびにＤＫＫ２（配列番号１３１）およびＤＫＫ３（配列番号１３２）が含まれる。表Ａ−ＤＫＫ１ファミリーメンバーの重層配列に示すように、ＤＫＫファミリーメンバーは２つのＣＹＳドメイン（ＣＹＳ１およびＣＹＳ２）を有する。ＤＫＫタンパク質は、酸性Ｎ末端シグナルペプチド、分岐したリンカー領域によって分離されたシステイン残基のクラスターを含有する２つのＣＹＳドメイン、および潜在的なＣ末端Ｎ−グリコシル化部位を含有する。ＤＫＫ４中のＣＹＳ２ドメインは、形質膜でＷＮＴ／ＤＫＫ相互作用を促進することができる脂質結合機能を有する。ＯＭＩＭ受託番号６０５４１７。
【００８５】
【表１】
2012526139.tif 000002
【００８６】
ＤＫＫ１およびＤＫＫ４に対する結合分子
一実施形態では、本発明の結合分子はヒトＤＫＫタンパク質に特異的である。一実施形態では、本発明の結合分子はヒトＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４タンパク質、または両方に特異的である。
【００８７】
ＤＫＫ１またはＤＫＫ４中和性結合分子は、腫瘍促進につながっているＷｎｔ経路改変物と異なる。Ｗｎｔ経路は、細胞外リガンド、受容体およびアンタゴニストの複雑なネットワークによって制御され、ＤＫＫ１はそのうちの１つに過ぎない。成体ではＤＫＫ１の発現が制限され、他のＷｎｔアンタゴニストとその機能が重複するため、中和性ＤＫＫ１結合分子がＷｎｔシグナル伝達の広範な活性化、またはその結果腫瘍発生を引き起こす可能性は低い。これは、２つの観察結果によってさらに支持される：第一に、（ＤＫＫ結合を阻害する）活性化ＬＲＰ５突然変異は高骨量の表現型を誘導するが、癌のリスクの明らかな増大を有さず［Ｍｏｏｎ  ２００４］、一方ＤＫＫ１ヘテロ接合性ヌルまたはダブルリッジ（Doubleridge）マウスはＤＫＫ１レベルの低下、高骨量の表現型を有するが、腫瘍形成の速度の増大は報告されていない［ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ２００４］。
【００８８】
抗ＤＫＫ１結合分子は、ｄｅ  ｎｏｖｏの腫瘍発生のリスクを増大させずに、骨髄腫によって誘導される溶骨性疾患に正の影響を及ぼすはずである。そのような結合分子が抗腫瘍化学療法、およびおそらくは破骨細胞機能を阻害する抗骨吸収薬と組み合わせて使用されることが予想される。他の治療の組合せが本明細書において提供される。
【００８９】
ＤＫＫ１、ＤＫＫ４または両方を中和する結合分子は抗体であり得る。
【００９０】
ポリクローナル抗体
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、特にヒトポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体は、免疫感作した動物または選択したヒトのプール血清に由来する。
【００９１】
モノクローナル抗体
一実施形態では、本発明の抗体は、例えば実施例１〜８で単離され構造的に特徴付けられているようなヒトモノクローナル抗体である。抗体の特定のＶＨアミノ酸配列は、例えば配列番号２〜２０に示されている。抗体の特定のＶＬアミノ酸配列は、例えば配列番号２１〜３９に示されている。
【００９２】
例えば、配列番号１２４に示される配列など、哺乳動物細胞における発現について抗体のＶＨアミノ酸配列を最適化することができる。例えば、配列番号１２１に示される配列など、哺乳動物細胞における発現について抗体のＶＬアミノ酸配列を最適化することができる。同様に、どの発現系が最適化する特徴にとって好ましいかに応じて、例えば酵母、細菌、ハムスターおよび他の細胞における発現について配列を最適化することができる。本発明の他の抗体は、突然変異しているが、ＣＤＲ領域において上記に記載の配列に表されたＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。
【００９３】
一実施形態では、完全長最適化軽鎖親ヌクレオチド配列は、配列番号９９、１０１、１０３および１０５に示される通りである。完全長最適化重鎖親ヌクレオチド配列は、配列番号１０７、１０９および１１１に示される通りである。そのような完全長ＬＣおよびＨＣヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞における発現についてさらに最適化することができる。これらの最適化軽鎖親ヌクレオチド配列によってコードされる完全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１００、１０２、１０４および１０６に示される通りである。これらの最適化重鎖親ヌクレオチド配列によってコードされる完全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号１０８、１１０および１１２に示される通りである。本発明の他の抗体は、突然変異しているが、本明細書および上記に記載の本発明の配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９パーセントの同一性を有するアミノ酸または核酸を含む。
【００９４】
これらの抗体はそれぞれＤＫＫ１と結合することができるため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖および完全長重鎖配列（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）を「ミックスアンドマッチ」して、本発明の他の抗ＤＫＫ１結合分子を作製することができる。上記および実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して、そのような「ミックスアンドマッチ」抗体のＤＫＫ１結合を試験することができる。これらの鎖をミックスアンドマッチするとき、特定のＶＨ／ＶＬの対由来のＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖の対由来の完全長重鎖配列を、構造的に類似する完全長重鎖配列と置き換えるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬの対由来のＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖の対由来の完全長軽鎖配列を、構造的に類似する完全長軽鎖配列と置き換えるべきである。本発明の抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖および完全長重鎖配列は、これらの抗体が同じ生殖系列配列に由来するＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖および完全長重鎖配列を使用し、それによって構造的類似性を示すため、特にミックスアンドマッチしやすい。
【００９５】
したがって、一態様では、本発明は、配列番号２〜２０および１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域；ならびに配列番号２１〜３９および１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を有する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合する。
【００９６】
重鎖および軽鎖の組合せの例には、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；または配列番号３を含むＶＨ領域および配列番号２２を含むＶＬ領域；または配列番号４を含むＶＨ領域および配列番号２３を含むＶＬ領域；または配列番号５を含むＶＨ領域および配列番号２４を含むＶＬ領域；または配列番号６を含むＶＨ領域および配列番号２５を含むＶＬ領域；または配列番号７を含むＶＨ領域および配列番号２８を含むＶＬ領域；または配列番号８を含むＶＨ領域および配列番号２９を含むＶＬ領域；または配列番号９を含むＶＨ領域および配列番号３０を含むＶＬ領域；または配列番号１０を含むＶＨ領域および配列番号３１を含むＶＬ領域；または配列番号１１を含むＶＨ領域および配列番号３２を含むＶＬ領域；または配列番号１２を含むＶＨ領域および配列番号３３を含むＶＬ領域；または配列番号１２４を含むＶＨ領域および配列番号１２１を含むＶＬ領域が含まれる。
【００９７】
別の態様では、本発明は、配列番号１０８、１１０および１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む完全長重鎖；ならびに配列番号１００、１０２、１０４および１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む完全長軽鎖を有する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００９８】
したがって、完全長重鎖および完全長軽鎖のそれぞれの組合せの例には、配列番号１０８と配列番号１００；または配列番号１１０と配列番号１０２；または配列番号１１２と配列番号１０４；または配列番号１１２と配列番号１０６が含まれる。
【００９９】
別の態様では、本発明は、配列番号１０７、１０９および１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる完全長重鎖；ならびに配列番号９９、１０１、１０３および１０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる完全長最適化軽鎖を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１００】
したがって、組み合わせることができる完全長重鎖および軽鎖をそれぞれコードするヌクレオチドの例には、配列番号１０７および９９；または配列番号１０９および１０１；または配列番号１１１および１０３；または配列番号１１１および１０５が含まれる。
【０１０１】
さらに別の態様では、本発明は、抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはその組合せを含む抗体を提供する。本発明の抗体のＶＨ鎖のアミノ酸配列は配列番号２〜２０に示されている。これらのそれぞれのＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号４９〜５２として提供されている。これらのそれぞれのＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号５３〜６３として提供されている。これらのそれぞれのＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列は配列番号６４〜６９として提供されている。本発明の抗体のＶＬカッパおよびラムダ軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２１〜３９に示されている。これらのそれぞれのＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号７０〜７４として提供されている。これらのそれぞれのＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号７５〜７９として提供されている。これらのそれぞれのＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列は配列番号８０〜９８として提供されている。ＣＤＲ領域はＫａｂａｔの系を使用して表される（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。
【０１０２】
これらの抗体がそれぞれＤＫＫ１と結合することができ、抗原結合特異性が主としてＣＤＲ１、２および３領域によってもたらされることを考慮すると、ＶＨＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬＣＤＲ１、２および３配列を「ミックスアンドマッチ」することができる（すなわち異なる抗体のＣＤＲをミックスアンドマッチすることができるが、各抗体は、本発明の他の抗ＤＫＫ１結合分子を作製するためにＶＨＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬＣＤＲ１、２および３を含有していなければならない。上記および実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して、そのような「ミックスアンドマッチ」抗体のＤＫＫ１結合を試験することができる。ＶＨＣＤＲ配列をミックスアンドマッチするとき、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきである。同様に、ＶＬＣＤＲ配列をミックスアンドマッチするとき、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきである。さらに、特定のＶＨまたはＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列に特異的にまたはランダムに突然変異を起こさせて、親和性または結合の特徴について試験できる抗体を作製することができる。１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ領域の配列を、本発明のモノクローナル抗体について本明細書で示されているＣＤＲ配列由来の構造的に類似する配列と置換することによって、新規のＶＨおよびＶＬ配列を作製できることが、当業者には容易に明らかであろう。
【０１０３】
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、配列番号４９〜５２として提供されている、配列番号２〜５、８〜１１、２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域ＣＤＲ１；配列番号５３〜６３として提供されている、配列番号２〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域ＣＤＲ２；配列番号６４〜６９として提供されている、配列番号２〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域ＣＤＲ３；配列番号７０〜７４として提供されている、配列番号２１〜３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域ＣＤＲ１；配列番号７５〜７９として提供されている、配列番号２１〜３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域ＣＤＲ２；および配列番号８０〜９８として提供されている、配列番号２１〜３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域ＣＤＲ３を有し、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合する。
【０１０４】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６９を含むＶＨ領域ＣＤＲ３および配列番号８０を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１０５】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６４を含むＶＨ領域ＣＤＲ３および配列番号８１を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６５を含むＶＨ領域ＣＤＲ３および配列番号８２を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６６を含むＶＨ領域ＣＤＲ３および配列番号８７を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１０８】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６７を含むＶＨ領域ＣＤＲ３および配列番号９２を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１０９】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６８を含むＶＨ領域ＣＤＲ３および配列番号９８を含むＶＬ領域ＣＤＲ３からなる。
【０１１０】
本明細書において、ヒト抗体は、その抗体の可変領域または完全長の鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、特定の生殖系列配列「の産物」でありまたはそれに「由来する」重もしくはＶＬ領域または完全長重鎖もしくは軽鎖を含む。そのような系では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを対象の抗原で免疫感作し、またはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを対象の抗原でスクリーニングする。したがって、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近い（すなわち％同一性が最も大きい）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」でありまたはそれに「由来する」ヒト抗体を同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」でありまたはそれに「由来する」ヒト抗体は、例えば天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入に起因する、生殖系列配列と比較したアミノ酸の相違を含有する可能性がある。しかし、選択されるヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較したときにヒト抗体がヒトのものであると分かるアミノ酸残基を含有する。特定の場合では、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸の相違を示す。特定の場合では、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と５個以下、またはさらに４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸の相違を示し得る。
【０１１１】
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載の抗体のアミノ酸およびヌクレオチド配列と相同である完全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列；完全長重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、可変領域重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、または可変領域重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有し、抗体は本発明の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物の所望の機能特性を保持する。
【０１１２】
例えば、本発明は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ＶＨ領域は、配列番号２〜２０および１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２１〜３９および１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、抗体はＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４と特異的に結合し、抗体は以下の機能特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１タンパク質とＬＲＰ６、Ｆｚおよび／もしくはＫｒｍの結合を中和し、または抗体はＤＫＫ４タンパク質とＬＲＰ、Ｐｚおよび／もしくはＫｒｍの結合を中和する。
【０１１３】
さらなる例では、本発明は、完全長重鎖および完全長軽鎖を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、完全長重鎖は、配列番号１０８、１１０および１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、完全長軽鎖は、配列番号１００、１０２、１０４および１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、抗体は以下の機能特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して溶骨性病変を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善する。
【０１１４】
別の例では、本発明は、完全長重鎖および完全長軽鎖を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、完全長重鎖は、配列番号１０７、１０９および１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を含み、完全長軽鎖は、配列番号９９、１０１、１０３および１０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を含み、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、以下の機能特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して溶骨性病変を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善する。
【０１１５】
別の例では、本発明は、完全長重鎖および完全長軽鎖を含む、細胞における発現について最適化されている単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、完全長重鎖は、配列番号１０８〜１１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を含み、完全長軽鎖は、配列番号１０４〜１０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を含み、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、抗体は以下の機能特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して溶骨性病変を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善する。
【０１１６】
別の例では、本発明は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む、細胞における発現について最適化されている単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、完全長重鎖は、配列番号１２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を含み、完全長軽鎖は、配列番号１２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を含み、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、抗体は以下の特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１とＤＫＫ１受容体の結合を阻害し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して溶骨性病変を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善する。
【０１１７】
本明細書において、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間のパーセント相同性は、２つの配列間のパーセント同一性に等しい。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入することが必要なギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、％相同性は同一の位置の数／位置の合計数×１００に等しい）。非限定的な以下の例に記載のように、数学的アルゴリズムを使用して、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定を行うことができる。
【０１１８】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１〜１７、１９８８）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３、１９７０）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さの重み１、２、３、４、５、または６を使用して決定することができる。
【０１１９】
それに加えてまたはその代わりに、本発明のタンパク質配列をさらに「質問配列」として使用して公的データベースに対する検索を行って、例えば関連する配列を同定することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行って、本発明の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップ入りアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載のようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【０１２０】
保存的改変を有する抗体
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなるＶＨ領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなるＶＬ領域を有し、これらのＣＤＲ配列の１つまたは複数は、本明細書に記載の抗体またはその保存的改変物に基づく特定のアミノ酸配列を有し、抗体は本発明の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物の所望の機能特性を保持する。したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなるＶＨ領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなるＶＬ領域からなる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ＶＨ可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号４９〜５２、およびその保存的改変物からなる群から選択され、ＶＨ可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号５３〜６３、およびその保存的改変物からなる群から選択され、ＶＨ可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号６４〜６９、およびその保存的改変物からなる群から選択され、ＶＬ可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号７０〜７４、およびその保存的改変物からなる群から選択され、ＶＬ可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号７５〜７９、およびその保存的改変物からなる群から選択され、ＶＬ可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号８０〜９８、およびその保存的改変物からなる群から選択され、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、抗体は以下の機能特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して溶骨性病変を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善する。
【０１２１】
他の実施形態では、本発明の抗体は、完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列を有し、これらの配列の１つまたは複数は、本明細書に記載の抗体またはその保存的改変物に基づく特定のアミノ酸配列を有し、抗体は本発明の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物の所望の機能特性を保持する。したがって、本発明は、完全長重鎖および完全長軽鎖からなる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、完全長重鎖は、配列番号１０８、１１０および１１２、ならびにその保存的改変物の群から選択されるアミノ酸配列を有し、完全長軽鎖は、配列番号１００、１０２、１０４および１０６、ならびにその保存的改変物の群から選択されるアミノ酸配列を有し、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、抗体は以下の機能特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して溶骨性病変を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善する。
【０１２２】
他の実施形態では、細胞における発現について最適化されている本発明の抗体は、ＶＨ領域配列およびＶＬ領域配列を有し、これらの配列の１つまたは複数は、本明細書に記載の抗体またはその保存的改変物に基づく特定のアミノ酸配列を有し、抗体は本発明の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物の所望の機能特性を保持する。したがって、本発明は、ＶＨ領域およびＶＬ領域からなる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ＶＨ領域は、配列番号１２４、およびその保存的改変物の群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＶＬ領域は、配列番号１２１、およびその保存的改変物の群から選択されるアミノ酸配列を有し、抗体はＤＫＫ１と特異的に結合し、抗体は以下の機能特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して溶骨性病変を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善する。
【０１２３】
様々な実施形態では、抗体は、本明細書において列挙し論じた機能特性の１つもしくは複数、２つ以上、または３つ以上を示し得る。そのような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１２４】
本明細書において、「保存的配列改変」という用語は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合の特徴に著しく影響または変化を及ぼさないアミノ酸改変を指すものとする。そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。部位特異的突然変異誘発やＰＣＲによって媒介される突然変異誘発など、当技術分野で知られている標準的な技術によって、本発明の抗体に改変を導入することができる。
【０１２５】
保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内にある１つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置き換えることができ、本明細書に記載の機能アッセイを使用して、変化した抗体を機能の保持について試験することができる。
【０１２６】
本発明の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物と同じエピトープと結合する抗体
別の実施形態では、本発明は、本明細書において提供される本発明の様々な中和性抗ＤＫＫ１／４組成物と同じエピトープと結合する抗体を提供する。標準的なＤＫＫ１結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意な様式でその結合を競合的に阻害する）能力に基づいて、そのような追加の抗体を同定することができる。試験抗体が本発明の抗体とヒトＤＫＫ１の結合を阻害できることは、試験抗体がヒトＤＫＫ１との結合についてその抗体と競合できることを示す；非限定的な仮説によれば、そのような抗体は、それが競合する抗体と同じまたは関連する（例えば、構造的に類似するまたは空間的に近接する）、ヒトＤＫＫ１上のエピトープと結合することができる。特定の実施形態では、ヒトＤＫＫ１上の本発明の抗体と同じエピトープと結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。実施例に記載のように、そのようなヒトモノクローナル抗体を調製および単離することができる。
【０１２７】
ラクダ科および他の重鎖抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界のメンバーを含めたラクダおよびヒトコブラクダ（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Camelus dromaderius））科のメンバーから得られる抗体タンパク質が、サイズ、構造的な複雑さおよびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。この科の哺乳動物由来の特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠く。したがって、それらは、他の動物由来の抗体で認められる（２つの重鎖および２つの軽鎖を有する）典型的な４本鎖の四次構造と構造的に異なる。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公開されたＷＯ９４／０４６７８）を参照されたい。
【０１２８】
ＶＨＨとして同定された小さな単一の可変ドメインであるラクダ科抗体の領域を遺伝子工学により取得して、標的に対する高い親和性を有する小さなタンパク質をもたらすことができ、その結果、「ラクダ科ナノボディ」として知られている低分子量の抗体由来タンパク質が生じる。１９９８年６月２日に発行された米国特許第５，７５９，８０８号を参照されたい；Ｓｔｉｊｌｅｍａｎｓ，Ｂ．ら、２００４  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１２５６〜１２６１；Ｄｕｍｏｕｌｉｎ，Ｍ．ら、２００３  Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：７８３〜７８８；Ｐｌｅｓｃｈｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．ら、２００３  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １４：４４０〜４４８；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ，Ｖ．ら、２００２  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８９：４５６〜６２；およびＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．ら、１９９８  ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：３５１２〜３５２０も参照されたい。ラクダ科抗体および抗体断片の工学的に作製されたライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科抗体のアミノ酸配列を組換えにより変化させて、ヒト配列により酷似する配列を得ることができ、すなわちナノボディを「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科抗体の天然の低い抗原性をさらに低減することができる。
【０１２９】
ラクダ科ナノボディは、ヒトＩｇＧ分子のおよそ１０分の１の分子量を有し、そのタンパク質はわずか数ナノメートルの物理的直径を有する。サイズが小さいことの１つの帰結は、ラクダ科ナノボディが、大きな抗体タンパク質にとって機能的に見分けのつかない抗原性部位と結合できることであり、すなわち、ラクダ科ナノボディは古典的な免疫学的技術を使用しても普通なら隠れている抗原を検出する試薬として、また可能性のある治療作用物質として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラクダ科ナノボディが、標的タンパク質の溝または狭い裂け目にある特定の部位と結合する結果阻害でき、したがって、古典的な抗体よりも古典的な低分子量薬物の機能に酷似する役割を果たすことができることである。
【０１３０】
さらに、低分子量およびコンパクトサイズである結果、ラクダ科ナノボディは極度に熱安定性であり、極度のｐＨおよびタンパク質分解性消化に安定であり、抗原性が低い。別の帰結は、ラクダ科ナノボディが循環系から組織へと容易に移動し、血液脳関門も越え、神経組織に影響を及ぼす障害を治療できることである。ナノボディは、血液脳関門を越える薬物輸送をさらに促進することができる。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願第２００４０１６１７３８号を参照されたい。ヒトに対する低い抗原性と組み合わせたこれらの特質は大きな治療潜在性を示す。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞中で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現し、機能的である。
【０１３１】
したがって、本発明の特質は、ＤＫＫ１に対する高い親和性を有するラクダ科抗体またはナノボディである。本明細書における特定の実施形態では、ラクダ科抗体またはナノボディは、ラクダ科動物中で天然に産生され、すなわち、他の抗体について本明細書に記載されている技術を使用して、ＤＫＫ１またはそのペプチド断片での免疫感作後にラクダ科動物によって産生される。あるいは、中和性抗ＤＫＫ１／４ラクダ科ナノボディは工学的に作製され、すなわち、例えば、本明細書における実施例に記載のように標的としてＤＫＫ１および／またはＤＫＫ４を用いたパニング法を使用した、適当に突然変異を起こさせたラクダ科ナノボディタンパク質を提示するファージのライブラリーからの選択によって産生される。レシピエント対象における半減期が４５分〜２週間となるように、工学的に作製されたナノボディを遺伝子工学によりさらにカスタマイズすることができる。
【０１３２】
ラクダ科抗体に加えて、それだけに限らないが、例えば、特定の種のサメおよびフグを含めた他の動物中に重鎖抗体が天然に存在する（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０１４１６１を参照）。そのような重鎖抗体に由来する可変ドメインを本発明で使用することができるが、ラクダ科由来の重鎖抗体および／またはその可変ドメイン配列の使用は好ましい最適化、ヒト化、ヒューマニア化など、および／またはヒトにおける臨床使用のためである。
【０１３３】
工学的作製および改変抗体
本明細書で示されたＶＨおよび／またはＶＬ配列の１つまたは複数を有する抗体を開始物質として使用して本発明の抗体をさらに調製して、開始抗体から変化した特性を有し得る改変抗体を工学的に作製することができる。一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つもしくは複数のＣＤＲ領域内および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を改変することによって、抗体を工学的に作製することができる。それに加えてまたはその代わりに、定常領域（複数可）内の残基を改変することにより抗体を工学的に作製して、例えば抗体のエフェクター機能（複数可）を変化させることができる。
【０１３４】
行うことができる可変領域の工学的作製の１つの型はＣＤＲ移植である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基により標的抗原と優勢に相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間でＣＤＲの外側の配列より多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら、１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら、１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９〜１００３３；ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５５３０１０１号；第５５８５０８９号；第５６９３７６２号および第６１８０３７０号を参照）。
【０１３５】
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号４９〜５２および４０〜４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域；配列番号５３〜６３および４４〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域；配列番号６４〜６９および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域をそれぞれ含むＶＨ領域；ならびに配列番号７０〜７４、１１３および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域；配列番号７５〜７９、１１４および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域；配列番号８０〜９８、１１５および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域をそれぞれ含むＶＬ領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、そのような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体と異なるフレームワーク配列を含有してもよい。
【０１３６】
そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公開されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重およびＶＬ領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−  ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいてインターネット上で利用可能）、ならびにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．ら、１９９２  Ｊ．ｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；およびＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ら、１９９４  Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７〜８３６で見つけることができる；これらの内容はそれぞれ参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【０１３７】
本発明の抗体で使用するフレームワーク配列の例は、選択された本発明の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するもの、例えば本発明のモノクローナル抗体によって使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列である。ＶＨＣＤＲ１、２および３配列、ならびにＶＬＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列の由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中で認められるものと同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植することができ、またはその生殖系列配列と比較して１つもしくは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域上にＣＤＲ配列を移植することができる。例えば、場合によっては、フレームワーク領域内の残基に突然変異を起こさせて、抗体の抗原結合能を維持または亢進すると有益であることが認められている（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。
【０１３８】
別の型の可変領域の改変は、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基に突然変異を起こさせることによって、対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を向上させることであり、これは「親和性成熟」として知られている。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによって媒介される突然変異誘発を行って、突然変異（複数可）を導入することができ、抗体の結合、または対象の他の機能特性に対する効果を、本明細書に記載され実施例で提供されているｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで評価することができる。（上記で論じた）保存的改変を導入することができる。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失でよい。さらに、典型的にはＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個以下の残基が変化する。
【０１３９】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号４９〜５２の群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号４９〜５２と比較して１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨＣＤＲ１領域；配列番号５３〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号５３〜６３と比較して１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ２領域；配列番号６４〜６９からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６４〜６９と比較して１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ３領域；配列番号７０〜７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７０〜７４と比較して１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ１領域；配列番号７５〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７５〜７９と比較して１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ２領域；および配列番号８０〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号８０〜９８と比較して１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域からなる単離中和性抗ＤＫＫ１／４組成物またはその抗原結合部分を提供する。
【０１４０】
本発明の工学的作製抗体は、例えば抗体の特性を向上させるように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に改変がなされているものを含む。典型的には、抗体の免疫原性を低下させるようにそのようなフレームワーク改変がなされる。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基に、対応する生殖系列配列への「復帰突然変異を起こさせる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を起こしている抗体は、その抗体の由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含有する可能性がある。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、その抗体の由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。フレームワーク領域配列をその生殖系列の構成に戻すために、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによって媒介される突然変異誘発により、体細胞突然変異に生殖系列配列への「復帰突然変異を起こさせる」ことができる。そのような「復帰突然変異」抗体も、本発明に包含されるものとする。
【０１４１】
別の型のフレームワーク改変では、フレームワーク領域内で、または１つもしくは複数のＣＤＲ領域内でも１つまたは複数の残基に突然変異を起こさせて、Ｔ細胞エピトープを除去することにより抗体の潜在的な免疫原性を低減する。この手法は、「脱免疫感作」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【０１４２】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内でなされる改変に加えてまたはその代わりに、Ｆｃ領域内に改変を含めて、典型的には血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害などの抗体の１つまたは複数の機能特性を変化させるように本発明の抗体を工学的に作製することができる。さらに、抗体の１つまたは複数の機能特性をさらに変化させるために、本発明の抗体を化学修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体と結合することもでき）、またはそのグリコシル化を変化させるように改変することもできる。これらの実施形態はそれぞれ下記にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１４３】
一実施形態では、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化する、例えば増大または低下するようにＣＨ１のヒンジ領域を改変する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変化させて、例えば、軽鎖および重鎖の構築を促進し、または抗体の安定性を増大もしくは低下させる。
【０１４４】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域に突然変異を起こさせて、抗体の生物学的半減期を低下させる。より具体的には、抗体のブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が天然のＦｃ−ヒンジドメインのＳｐＡ結合と比べて障害されているように、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェース領域に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【０１４５】
別の実施形態では、抗体を改変してその生物学的半減期を増大させる。様々な手法が考えられる。例えば、Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの１つまたは複数を導入することができる。あるいは、生物学的半減期を増大させるために、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で抗体を変化させることができる。
【０１４６】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置き換えることによりＦｃ領域を変化させて、抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対する親和性は変化するが、親抗体の抗原結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。親和性を変化させるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１構成成分であり得る。この手法は、Ｗｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【０１４７】
別の実施形態では、抗体のＣ１ｑ結合が変化し、かつ／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が低減もしくは消失するように、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【０１４８】
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を変化させることにより抗体が補体と結合する能力を変化させる。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【０１４９】
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を改変することによりＦｃ領域を改変して、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大させる。この手法は、ＰｒｅｓｔａらによるＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎの、ヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が向上した変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２７６：６５９１〜６６０４を参照）。
【０１５０】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を改変する。例えば、無グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、その抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を変化させて、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増大させることができる。そのような炭水化物の改変は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化の部位を変化させることによって行うことができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位が除去されることによりその部位でのグリコシル化が除去される１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。そのような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【０１５１】
それに加えてまたはその代わりに、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体やバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増大した抗体など、変化した型のグリコシル化を有する抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンが抗体のＡＤＣＣの能力を増大させることが実証されている。そのような炭水化物の改変は、例えば、グリコシル化機構が変化している宿主細胞中で抗体を発現させることによって行うことができる。グリコシル化機構が変化している細胞は当技術分野で記載されており、それを宿主細胞として使用して、本発明の組換え抗体を発現させることにより、グリコシル化が変化している抗体を産生することができる。例えば、ＨａｎｇらによるＥＰ１，１７６，１９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系統について記載し、したがってそのような細胞系統中で発現した抗体は低フコシル化を示す。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は変異型ＣＨＯ細胞系統であるＬｅｃｌ３細胞について記載し、その細胞はフコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物と結合する能力が低下しており、やはりその結果その宿主細胞中で発現した抗体の低フコシル化が生じる（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３〜２６７４０も参照）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように工学的に作製された細胞系統について記載し、したがってその工学的作製細胞系統中で発現した抗体はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増大を示し、その結果抗体のＡＤＣＣ活性が増大する（Ｕｍａｎａら、１９９９  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６〜１８０も参照）。
【０１５２】
本発明によって企図される、本明細書における抗体の別の改変はペグ化である。抗体をペグ化して、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期を増大させることができる。抗体をペグ化するには、典型的には、抗体またはその断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルやアルデヒド誘導体などと、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片と結合するようになる条件下で反応させる。反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によってペグ化を実施することができる。本明細書において、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシまたはアリールオキシポリエチレングリコールやポリエチレングリコールマレイミドなど、他のタンパク質の誘導体化に使用されている任意の形態のＰＥＧを包含するものとする。特定の実施形態では、ペグ化される抗体は無グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当技術分野で知られ、それを本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ  ０  ４０１  ３８４を参照されたい。
【０１５３】
抗体を工学的に作製する方法
上記で論じたように、本明細書で示されているＶＨおよびＶＬ配列または完全長重鎖および軽鎖配列を有する抗ＤＫＫ１抗体を使用して、完全長重鎖および／もしくは軽鎖配列、ＶＨおよび／もしくはＶＬ配列、またはそれと結合した定常領域（複数可）を改変することにより新たな抗ＤＫＫ１／４抗体を作製することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明の抗ＤＫＫ１抗体の構造的特質を使用して、ヒトＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方と結合することや、ＤＫＫ１もしくはＤＫＫ４または両方の１つまたは複数の機能特性も阻害することなど、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性を保持する、構造的に関連する抗ＤＫＫ１／４抗体を作製する。
【０１５４】
標準的な分子生物学技術を使用して、変化した抗体配列を調製し発現させることができる。変化した抗体配列（複数可）によってコードされる抗体は、本明細書に記載の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物の機能特性の１つ、一部または全部を保持するものであり、その機能特性には、それだけに限らないが、ヒトＤＫＫ１と特異的に結合することが含まれ、抗体は以下の機能特性の少なくとも１つを示す：抗体はＤＫＫ１タンパク質とＤＫＫ１受容体の結合を阻害し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して骨溶解を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害しそれによって溶骨性病変を予防もしくは改善し、または抗体はＤＫＫ１受容体の結合を阻害して癌を予防もしくは改善する。
【０１５５】
実施例に記載のものなど、当技術分野で利用可能でありかつ／または本明細書に記載されている標準的なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して、変化した抗体の機能特性を評価することができる。
【０１５６】
本発明の抗体を工学的に作製する方法の特定の実施形態では、抗ＤＫＫ１抗体コード配列の全部または一部に沿ってランダムにまたは選択的に突然変異を導入することができ、得られた改変抗ＤＫＫ１抗体を、結合活性および／または本明細書に記載の他の機能特性についてスクリーニングすることができる。突然変異の方法は当技術分野で記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー（synthetic ligation assembly）、またはその組合せを使用して抗体の突然変異を生成しスクリーニングする方法について記載している。あるいは、ＬａｚａｒらによるＷＯ０３／０７４６７９は、抗体の生理化学的特性を最適化するコンピュータスクリーニング方法を使用する方法について記載している。
【０１５７】
抗体のＦｃ定常領域は、血清半減期の決定およびエフェクター機能、すなわち抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性にとって重要である。Ｆｃ断片の特定の突然変異体を工学的に作製して、そのエフェクター機能および／または血清半減期を変化させることができる（例えばＸｅｎｃｏｒ技術を、例えばＷＯ２００４０２９２０７も参照されたい）。
【０１５８】
抗体のエフェクター機能および血清半減期を変化させる１つの方法は、抗体断片の可変領域に適当なエフェクター機能を有するＦｃ断片を移植することである。殺細胞活性についてはＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを選択することができるが、（殺細胞活性を有さない）サイレントまたは中和抗体についてはＩｇＧ２アイソタイプを選択することができる。
【０１５９】
抗体の可変領域とＨＳＡなどの血清タンパク質またはＨＳＡ結合タンパク質などのそのような血清タンパク質と結合するタンパク質のキメラ融合を行うことによって、血清半減期が長いサイレント抗体を得ることができる。
【０１６０】
抗体のグリコシル化パターンを調整することによって、エフェクター機能を変化させることもできる。Ｇｌｙｃａｒｔ（例えば、ＵＳ６，６０２，６８４）、Ｂｉｏｗａ（例えば、ＵＳ６，９４６，２９２）およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（例えば、ＷＯ０３／０３５８３５）は、エフェクター機能が増大または低下した抗体を産生する哺乳動物細胞系統を工学的に作製している。特に、非フコシル化抗体はＡＤＣＣ活性が亢進する。Ｇｌｙｃｏｆｉはまた、特定のグリコフォームの抗体を産生することができる酵母細胞系統を開発している。
【０１６１】
より完全な開示は、ＳｈｕｌｏｋらのＷＯ２００７／０８４３４４中に見つけることができる。
【０１６２】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。完全長軽鎖親ヌクレオチド配列の例は、ＳｈｕｌｏｋらのＷＯ２００７／０８４３４４中に見つけることができる。
【０１６３】
本発明のモノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含めた様々な技術によって産生することができる。モノクローナル抗体を産生する多数の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を使用することができる。
【０１６４】
ＳｈｕｌｏｋらのＷＯ２００７／０８４３４４に示されるように、本発明のハイブリドーマ、キメラまたはヒト化抗体を調製することができる。
【０１６５】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤された、本発明の中和性抗ＤＫＫ１／４組成物または抗原結合部分（複数可）の１つまたは組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。そのような組成物は、１つまたは組合せの（例えば２つ以上の異なる）本発明の抗体、または免疫コンジュゲートもしくは二重特異性分子を含んでよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合し、または相補的な活性を有する抗体（または免疫コンジュゲートもしくは二重特異性分子）の組合せを含み得る。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、併用療法において、すなわち他の作用物質と組み合わせて投与することもできる。
【０１６７】
一実施形態では、ゾレドロン酸と組み合わせて本発明のＤＫＫ１／４結合分子を投与する。
【０１６８】
一実施形態では、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症もしくは抗骨粗鬆症剤または骨同化、体重減少療法および／もしくは糖尿病療法と組み合わせた本発明の抗ＤＫＫ１抗体を含み得る。併用療法で使用できる治療作用物質の例は、本発明の抗体の使用の節において以下により詳細に記載されている。
【０１６９】
本明細書において、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。担体は、静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄もしくは表皮投与（例えば、注射または注入による）、または例えば骨における溶解性病変への直接注射に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、免疫コンジュゲート、または二重特異性分子を、酸の作用および化合物を不活性化する可能性がある他の天然の状態から化合物を保護する物質で被覆することができる。
【０１７０】
本発明の薬学的化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容される塩を含んでよい。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、所望されない毒性効果を付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、１９７７  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９を参照）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸に由来するもの、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、クロリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが含まれる。
【０１７１】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される酸化防止剤を含んでもよい。薬学的に許容される酸化防止剤の例には、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性酸化防止剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が含まれる。
【０１７２】
本発明の医薬組成物で使用することができる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。例えば、レシチンなどの被覆物質の使用、分散物の場合における必要な粒子サイズの維持、および表面活性物質の使用により、適当な流動性を維持することができる。
【０１７３】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤や分散剤などの補助剤を含有してもよい。当技術分野で知られている滅菌手順、例えば放射線、濾過、または抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸の包含をどちらも行うことにより、微生物の存在の防止を確実に行うことができる。組成物中に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めると望ましいこともある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなど吸収を遅延させる作用物質の包含により、注射可能な医薬形態の吸収の延長をもたらすことができる。
【０１７４】
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射溶液または分散物の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質用のそのような媒体および作用物質の使用は当技術分野で知られている。従来の媒体および作用物質が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を組成物に入れることもできる。
【０１７５】
典型的には、治療用組成物は無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適した規則的な構造として製剤することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどの被覆の使用、分散物の場合における必要な粒子サイズの維持、および表面活性物質の使用により、適当な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含めることができる。組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることにより、注射可能な組成物の吸収の延長をもたらすことができる。
【０１７６】
適当な溶媒中の必要量の活性化合物を上記に列挙した成分の１つまたは組合せと混合し、必要に応じてその後滅菌精密濾過を行うことにより、滅菌注射溶液を調製することができる。一般に、分散物は、基本の分散媒および上記に列挙したものから必要な他の成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を入れることにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の方法は、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥（freeze-drying (lyophilization)）である。
【０１７７】
担体物質と組み合わせて単一の剤形を作製できる活性成分の量は、治療する対象、および特定の投与形態に応じて様々となる。担体物質と組み合わせて単一の剤形を作製できる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる組成物の量となる。一般に、１００パーセントのうち、この量は薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分の約０．０１パーセント〜約９９パーセント、約０．１パーセント〜約７０パーセント、または活性成分の約１パーセント〜約３０パーセントとなる。
【０１７８】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整する。例えば、単回ボーラス投与を行うこともでき、いくつかの分割投与を経時的に行うこともでき、または投与を比例的に低減または増大させることもでき、これは治療の場面での緊急の事情によって示される。投与の容易性および投与の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を製剤すると特に有利である。本明細書において単位剤形とは、治療する対象の単位投与量として適した物理的に別々の単位を指す；各単位は、必要な薬学的担体を伴う、所望の治療効果が生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の独特の特徴および実現される特定の治療効果、ならびにそのような治療用活性化合物を配合する分野に固有の、個体における感受性の制限によって決まり、それに直接依存する。
【０１７９】
抗体の投与では、投与量は、宿主体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜２００ｍｇ、より一般には約０．０１〜約５０ｍｇである。例えば、投与量は、少なくとも約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内にある１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重もしくは４０ｍｇ／ｋｇ体重、および／または約０．３、１、３、５、１０、２０、４０、５０もしくは６０ｍｇ／ｋｇ体重未満であり得る。例示的な治療レジメでは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回投与する。本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体の投与レジメンは、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重または４０ｍｇ／ｋｇを含み、下記の投与スケジュールの１つを使用して抗体を投与する：４週間毎で６回投与、次いで３ヶ月毎；３週間毎；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後１ｍｇ／ｋｇ体重を３週間毎；または４０ｍｇ／ｋｇ体重を２８日毎。最終用量および投与レジメンは、転帰、例えば骨の強さおよび／または抗腫瘍効果に応じて最適化され、過度な実験を行わずとも当業者の知識の範囲内にある。
【０１８０】
方法によっては、結合特異性が異なる２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、その場合投与する各抗体の量は示された範囲内に入る。抗体は通常複数回投与する。１回の投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎または毎年であり得る。間隔は不規則でもあり得、これは標的抗原に対する抗体のまたはＯＣＮ、ＯＰＧやＰ１ＮＰなどのいくつかのバイオマーカーの患者血液レベルを測定することによって示される。方法によっては、血漿抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍｌ、方法によっては約２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように投与を調節する。
【０１８１】
あるいは、持続放出製剤として抗体を投与することもでき、その場合少ない頻度の投与しか必要としない。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて様々である。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与の量および頻度は、処置が予防的であるか、または治療的であるかに応じて様々となり得る。予防的な適用では、比較的低い量を比較的頻繁でない間隔で長期にわたって投与する。一部の患者は一生処置を受け続ける。治療的な適用では、疾患の進行が抑えられもしくは終結するまで、または患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量が必要となることがある。その後、患者に予防的レジメを施すことができる。
【０１８２】
特定の患者、組成物、および投与形態について所望の治療応答を実現するのに有効であり、患者にとって毒性でない活性成分の量を得るために、本発明の医薬組成物中の活性成分の現実の投与レベルを変化させることができる。選択される投与レベルは、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時期、使用する特定の化合物の排出率、治療の持続時間、使用する特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴、ならびに医療分野で周知のファクターなどを含めた様々な薬物動態ファクターに依存する。
【０１８３】
本発明の抗ＤＫＫ１抗体の「治療有効投与量」の結果、疾患の症状の重症度を低下させ、疾患の症状がない時期の頻度および持続期間を増大させ、または疾患の苦痛による機能障害もしくは能力障害を防止することができる。
【０１８４】
当技術分野で知られている様々な方法の１つまたは複数を使用して、１つまたは複数の投与経路により本発明の組成物を投与することができる。当業者には理解されるであろうが、投与経路および／または形態は所望の結果に応じて様々となる。本発明の抗体の投与経路には、例えば注射または注入による、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書において「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与形態を意味し、それには、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および基質内注入および注射が含まれるがそれだけに限られない。
【０１８５】
あるいは、本発明の抗体は、局所、表皮または粘膜投与経路などの非経口でない経路により、例えば鼻内、経口、経膣、直腸、舌下または局所投与することができる。
【０１８６】
インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達系を含めた制御放出製剤など、活性化合物を、急速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルやポリ乳酸など、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製する多数の方法が特許を受け、当業者に一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１８７】
米国特許第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号；第４，５９６，５５６号；第４，４８７，６０３号；第４，４８６，１９４号；第４，４４７，２３３号；第４，４４７，２２４号；第４，４３９，１９６号；および第４，４７５，１９６号で示されているデバイスなど、当技術分野で知られている医療デバイスを用いて、治療用組成物を投与することができる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれている。多数の他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に知られている。
【０１８８】
特定の実施形態では、確実にｉｎ  ｖｉｖｏで適切に分布するように本発明のヒトモノクローナル抗体を製剤することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を排出する。（所望の場合）確実に本発明の治療用化合物がＢＢＢを越えるようにするために、例えばリポソームに入れてそれを製剤することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；および第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、それによって標的薬物送達を亢進する１つまたは複数の部分を含んでよい（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ、１９８９  Ｊ．Ｃｌｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。例示的な標的化部分には、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号を参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、１９８８  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら、１９９５  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら、１９９５  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｒｎｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら、１９９５  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が含まれ、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ、１９９４  ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ、１９９４  Ｉｍｒｎｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照されたい。
【０１８９】
組合せ
追加の治療作用物質は、抗癌剤；抗骨粗鬆症剤；抗生物質；代謝拮抗剤；抗炎症剤；抗血管新生剤；成長因子；骨同化、体重減少療法、抗糖尿病剤、脂質低下剤（hypylipidemic agent）、および抗肥満剤、降圧剤、ならびに／またはペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニストおよびサイトカインからなる群から選択することができる。
【０１９０】
本発明はさらに、
（ａ）本発明のＤＫＫ１／４結合分子と、
（ｂ）１つまたは複数の薬学的活性作用物質と、任意選択で
（ｃ）薬学的に許容される担体と
を含む薬学的作用物質の組合せで、哺乳動物、特にヒトにおけるＤＫＫ１、ＤＫＫ４またはＤＫＫ１／４関連疾患または障害を予防または治療する方法に関し、少なくとも１つの薬学的活性作用物質は抗癌治療薬である。
【０１９１】
本発明はさらに、
（ａ）ＤＫＫ１／４中和剤と、
（ｂ）薬学的活性作用物質と、任意選択で
（ｃ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物に関し、少なくとも１つの薬学的活性作用物質は、骨同化、体重減少治療薬または糖尿病治療薬である。
【０１９２】
本発明はさらに、
（ａ）ＤＫＫ１／４中和性結合分子の医薬製剤と、
（ｂ）同時に、併用して、個別にまたは順次使用する薬学的活性作用物質の医薬製剤と
を含む市販パッケージまたは製品に関し、少なくとも１つの薬学的活性作用物質は、抗癌治療薬、骨同化、体重減少治療薬または糖尿病治療薬である。
【０１９３】
追加の治療作用物質は、抗癌剤；抗骨粗鬆症剤；抗生物質；代謝拮抗剤；抗糖尿病剤；抗炎症剤；抗血管新生剤；成長因子；骨同化、体重減少療法、抗糖尿病剤、脂質低下剤（hypylipidemic agent）、および抗肥満剤、降圧剤、ならびに／またはペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニストおよびサイトカイン、または本明細書で提供されている薬学的活性作用物質のいずれか１つもしくは複数からなる群から選択することができる。
【０１９４】
薬学的活性作用物質
「薬学的活性作用物質」という用語は、異なる作用機構を有する多くの薬学的活性作用物質をカバーする幅広い用語である。これらのいくつかとＤＫＫ１／４中和性抗体／組成物を組み合わせた結果、癌治療を改善することができる。一般に、薬学的活性作用物質はその作用機構に従って分類される。利用可能な作用物質の多くは、様々な腫瘍の発生経路の抗代謝産物であり、または腫瘍細胞のＤＮＡと反応する。トポイソメラーゼＩやトポイソメラーゼＩＩなどの酵素を阻害し、または有糸分裂阻害剤である作用物質もある。ＤＫＫ１、ＤＫＫ４または両方に関連する非新生物疾患の治療についてさらなる作用物質が提供される。
【０１９５】
「薬学的活性作用物質」という用語は、特に中和性抗ＤＫＫ１／４組成物またはその誘導体以外の任意の薬学的活性作用物質を意味する。それには、
１．アロマターゼ阻害因子；
２．抗エストロゲン、抗アンドロゲンまたはゴナドレリンアゴニスト；
３．トポイソメラーゼＩ阻害因子またはトポイソメラーゼＩＩ阻害因子；
４．微小管活性作用物質、アルキル化剤、抗新生物抗代謝産物またはプラチン化合物；
５．タンパク質キナーゼ活性もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質ホスファターゼ活性もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／低下させる化合物、さらなる抗血管新生化合物あるいは細胞分化の過程を誘導する化合物；
６．モノクローナル抗体；
７．シクロオキシゲナーゼ阻害因子、ビスホスホネート、ヘパラナーゼ阻害因子、生物学的応答修飾因子；
８．Ｒａｓ発癌性アイソフォームの阻害因子；
９．テロメアーゼ阻害因子；
１０．プロテアーゼ阻害因子、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害因子、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害因子、またはプロテアソーム阻害因子；
１１．血液悪性腫瘍の治療で使用される作用物質、またはＦｌｔ−３の活性を標的とし、低下させもしくは阻害する化合物；
１２．ＨＳＰ９０阻害因子；
１３．抗増殖性抗体；
１４．ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害因子；
１５．セリン／スレオニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的とし、低下させまたは阻害する化合物；
１６．ソマトスタチン受容体アンタゴニスト；
１７．抗白血病化合物；
１８．腫瘍細胞を損傷させる手法；
１９．ＥＤＧ結合剤；
２０．リボヌクレオチドレダクターゼ阻害因子；
２１．Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害因子；
２２．ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体；
２３．光力学的療法；
２４．血管新生抑制ステロイド；
２５．コルチコステロイドを含有するインプラント；
２６．ＡＴ１受容体アンタゴニスト；
２７．ＡＣＥ阻害因子；
２８．抗糖尿病剤；
２９．脂質低下剤；
３０．抗肥満剤；
３１．降圧剤；および
３２．ペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト
が含まれるが、それだけに限られない。
【０１９６】
これらの用語のより詳細な定義は、ＳｈｕｌｏｋらのＷＯ２００７／０８４３４４中に見出される。
【０１９７】
本発明の抗体と以下の治療薬との特定の組合せが企図される。癌の治療について企図される組合せのパートナーは、それだけに限らないが、タモキシフェン、フルベストラント、ラロキシフェンおよび塩酸ラロキシフェンを含めた抗エストロゲンである。癌の治療について企図される組合せのパートナーは、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ）；チロホスチンまたはピリミジルアミノベンズアミドおよびその誘導体（ＡＭＮ１０７）などのタンパク質チロシンキナーゼである。癌または増殖性疾患の治療について企図される組合せのパートナーは、それだけに限らないが、ベバシズマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、デノスマブ、抗ＣＤ４０、抗ＧＭ−ＣＳＦ、およびトシツモマブを含めた１つまたは複数のモノクローナル抗体である。癌または骨関連疾患の治療について企図される組合せのパートナーは、それだけに限らないが、エトリドン酸、クロドロン酸、チルドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸およびゾレドロン酸を含めたビスホスホネートである。糖尿病の治療について企図される組合せのパートナーは、それだけに限らないが、インスリン、インスリン誘導体および模倣物；スルホニル尿素などのインスリン分泌促進物質、例えばグリピジド、グリブリドおよびアマリール；メグリチニドなどのインスリン向性スルホニル尿素受容体リガンド、例えばナテグリニドおよびレパグリニド；ＰＴＰ−１１２などのタンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害因子；ＳＢ−５１７９５５、ＳＢ−４１９５０５２、ＳＢ−２１６７６３、ＮＮ−５７−０５４４１やＮＮ−５７−０５４４５などのＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３）阻害因子；ＧＷ−０７９１やＡＧＮ−１９４２０４などのＲＸＲリガンド；Ｔ−１０９５などのナトリウム依存性グルコース共輸送体阻害因子；ＢＡＹ  Ｒ３４０１などのグリコーゲンホスホリラーゼＡ阻害因子；メトホルミンなどのビグアニド；アカルボースなどのアルファ−グルコシダーゼ阻害因子；ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）、エキセンジン−４などのＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１模倣物；ならびにビルダグリプチンなどのＤＰＰＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害因子；チアゾラジンジオンを含めた１つまたは複数の抗糖尿病剤である。肥満の治療について企図される組合せのパートナーは、それだけに限らないが、オルリスタットもしくはリモナバント、シブトラミン、またはフェンテルミンを含めた１つまたは複数の抗肥満剤である。
【０１９８】
他の薬学的活性作用物質には、それだけに限らないが、植物アルカノイド、ホルモン作用物質およびアンタゴニスト、生物学的応答修飾因子（例えば、リンホカインまたはインターフェロン）、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含めたオリゴヌクレオチド誘導体；あるいは種々の作用物質または他のもしくは未知の作用機構を有する作用物質が含まれる。
【０１９９】
特許出願または科学刊行物を引用する各場合において、特にその中のそれぞれの化合物クレームおよび実施例の最終産物に関して、その最終産物の材料、医薬調製物およびクレームは、本明細書でこれらの刊行物を参照することにより本出願に組み込まれる。同様に、その中で開示されている対応する立体異性体、ならびに対応する結晶変態、例えば溶媒和物および多形体が含まれる。本明細書で開示されている組合せの中で活性成分として使用される化合物は、引用した文献に記載のようにそれぞれ調製および投与することができる。
【０２００】
コード番号、一般名または商品名によって特定される活性作用物質の構造は、現行版の標準的な抄録集「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ」またはデータベース、例えばＰａｔｅｎｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、例えばＩＭＳ  Ｗｏｒｌｄ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓもしくは上記および下記で挙げる刊行物から得ることができる。対応するその内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０１】
構成成分（ａ）および（ｂ）への言及は、その活性物質のいずれかの薬学的に許容される塩も含むことを意味することが理解されるであろう。構成成分（ａ）および／または（ｂ）によって含まれる活性物質が、例えば少なくとも１つの塩基性の中心を有する場合、それは酸付加塩を形成することができる。所望の場合、さらに存在する塩基性の中心を有する、対応する酸付加塩を形成することもできる。酸性基、例えばＣＯＯＨを有する活性物質は、塩基と塩を形成することができる。構成成分（ａ）および／もしくは（ｂ）中に含まれる活性物質または薬学的に許容されるその塩は、水和物の形態で使用してもよく、または結晶化に使用される他の溶媒を含んでもよい。
【０２０２】
したがって、最初の態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒト患者におけるＤＤＫ１および／またはＤＫＫ４（ＤＫＫ１／４）関連疾患、障害または状態を予防または治療する方法に関し、その方法は、薬学的有効量の
（ａ）中和性抗ＤＫＫ１／４組成物と、
（ｂ）薬学的活性作用物質と
の組合せで、併用してまたは順次患者を治療するステップを含む。
【０２０３】
一実施形態では、本発明は、
（ａ）中和性抗ＤＫＫ１／４組成物と、
（ｂ）アロマターゼ阻害因子；抗エストロゲン；抗アンドロゲン；ゴナドレリンアゴニスト；トポイソメラーゼＩ阻害因子；トポイソメラーゼＩＩ阻害因子；微小管活性作用物質；アルキル化剤；抗新生物抗代謝産物；プラチン化合物；タンパク質キナーゼ活性もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質ホスファターゼ活性もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／低下させる化合物、抗血管新生化合物；細胞分化の過程を誘導する化合物；モノクローナル抗体；シクロオキシゲナーゼ阻害因子；ビスホスホネート；ヘパラナーゼ阻害因子；生物学的応答修飾因子；Ｒａｓ発癌性アイソフォームの阻害因子；テロメアーゼ阻害因子；プロテアーゼ阻害因子、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害因子、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害因子；プロテアソーム阻害因子；Ｆｌｔ−３の活性を標的とし、低下させまたは阻害する作用物質；ＨＳＰ９０阻害因子；抗増殖性抗体；ＨＤＡＣ阻害因子；セリン／スレオニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的とし、低下させまたは阻害する化合物；ソマトスタチン受容体アンタゴニスト；抗白血病化合物；腫瘍細胞を損傷させる手法；ＥＤＧ結合剤；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害因子；Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害因子；ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体；光力学的療法；血管新生抑制ステロイド；コルチコステロイドを含有するインプラント；ＡＴ１受容体アンタゴニスト；ならびにＡＣＥ阻害因子、骨同化、体重減少療法、抗糖尿病剤、脂質低下剤（hypylipidemic agent）、および抗肥満剤、降圧剤、ならびに／またはペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト、または本明細書で提供されている他の薬学的活性作用物質からなる群から選択される１つまたは複数の薬学的活性作用物質と
を含む調製物を提供する。
【０２０４】
構成成分（ａ）および（ｂ）の組合せのいずれか、これら２つの構成成分を投与するステップを含む温血動物を治療する方法、同時に、個別にまたは順次使用するこれら２つの構成成分を含む医薬組成物、増殖性疾患の進行を遅延させもしくはそれを治療するため、またはこれらの目的で医薬調製物を製造するためのその組合せの使用、あるいは構成成分（ａ）および（ｂ）のそのような組合せを含む市販製品は、上記に挙げまたは定義したもの全てが以降で本発明の組合せとも称される（その結果、この用語はこれらの各実施形態を指し、したがって各実施形態は適当な場合にこの用語と置き換えることができる）。
【０２０５】
同時投与は、２つ以上の活性成分を有する１つの固定された組合せの形で、または独立に製剤された２つ以上の活性成分を同時に投与することによって行うことができる。一実施形態では、順次使用（投与）は、組合せの１つ（または複数）の構成成分をある時点で、他の構成成分を異なる時点で投与することを意味する。一実施形態では、その組合せは、独立に投与された単一の化合物より高い効率を示す（特に相乗作用を示す）。一実施形態では、個別使用（投与）は、互いに独立して、異なる時点でその組合せの構成成分を投与することを意味する。一実施形態では、個別使用は、重複する形で（同時に）両方の化合物の測定可能な血液レベルの重複が存在しないように構成成分（ａ）および（ｂ）を投与することを意味する。
【０２０６】
一実施形態では、２つ以上の順次、個別および同時投与の組合せが可能である。一実施形態では、組合せの構成成分薬物は、その治療効率に対する相互の効果を認めることができないほど大きい時間間隔で組合せの構成成分薬物が独立に使用されるときに認められる効果を上回る複合的治療効果を示す。一実施形態では、相乗効果が起こる。
【０２０７】
本明細書において、「進行の遅延」という用語は、患者において例えば早期形態の対応する疾患が診断され、または患者が、対応する疾患が発症する可能性が高い例えば医療処置中の状態もしくは偶発事象から生じる状態にある、治療する疾患の最初の症状発現または再発の前段階または初期にある患者に対する組合せの投与を意味する。
【０２０８】
「複合的治療活性のある」または「複合的治療効果」とは、治療する対象が依然として相互作用（複合的治療効果）を示すほどの時間間隔で個別に（長期にわたってずらした形で、例えば順序特異的な形で）化合物を投与できることを意味する。一実施形態では、治療の対象は温血動物、特にヒトである。一実施形態では、観察される相互作用は相乗的である。これが事実であることは、とりわけ、血液レベルを追跡し、治療するヒトの血中に少なくとも特定の時間間隔の間はどちらの化合物も存在することを示すことによって決定することができる。
【０２０９】
一実施形態では、「薬学的に有効な」は、増殖性疾患の進行に対して治療的に、または予防的にも有効である量に関する。
【０２１０】
本明細書において、「市販パッケージ」または「製品」という用語は、上記で定義した構成成分（ａ）および（ｂ）を、独立にまたは区別された量の構成成分（ａ）および（ｂ）を有する異なる固定された組合せの使用によって、すなわち同時にまたは異なる時点で投与できるという意味で特に「キットオブパーツ」を定義するものである。さらに、これらの用語は、増殖性疾患の進行の遅延またはその治療においてそれを同時にまたは順次（長期にわたってずらして、時間特異的な順序で、または個別に）使用するための説明書と一緒に、活性成分として構成成分（ａ）および（ｂ）を含む（特に組み合わせた）市販パッケージを含む。次いでキットオブパーツのパーツを、例えば同時にまたは順番にずらして、すなわち異なる時点で、任意のパーツについて等しいまたは異なる時間間隔をおいて投与することができる。一実施形態では、（標準的な方法に従って決定することができる）パーツを組み合わせた使用における治療する疾患に対する効果が、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）のいずれか１つだけの使用によって得られる効果より大きいように時間間隔が選択される。例えば、治療する患者の部分集団の要求または１人の患者の要求に対処するために、組合せ調製物において投与する組合せパートナー（ａ）と組合せパートナー（ｂ）の総量の比を変化させることができ、その異なる要求は、患者の特定の疾患、年齢、性別、体重などに起因し得る。一実施形態では、少なくとも１つの有益な効果、例えば、特に相加効果を超える組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の効果の相互亢進があり、したがってそれは、組み合わせた各薬物を、組み合わせずに個々の薬物だけで治療する場合に許容できる用量よりそれぞれ低い用量で用いて実現することができ、追加の有利な効果、例えば少ない副作用、または組合せパートナー（構成成分）（ａ）および（ｂ）の一方もしくは両方の普通なら有効でない投与量での組合せ治療効果が生じる。一実施形態では、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の強い相乗作用がある。
【０２１１】
構成成分（ａ）および（ｂ）の組合せを使用する場合でも市販パッケージを使用する場合でも、同時、順次および個別使用の任意の組合せがやはり可能であり、これは、構成成分（ａ）および（ｂ）をある時点で同時に投与し、その後宿主毒性が低いどちらか一方の構成成分だけを後の時点で長期にわたって投与し、例えば３〜４週間を超えて毎日投与し、その後（最適な抗腫瘍効果のためのその後の薬物組合せ治療過程において）他方の構成成分または両方の構成成分の組合せをさらに後の時点で投与できることなどを意味する。
【０２１２】
本発明の組合せは、他の治療、例えば、外科的介入、温熱療法および／または放射線照射療法と組み合わせて適用することもできる。
【０２１３】
本発明による医薬組成物は、従来の手段によって調製することができ、ヒトを含めた哺乳動物への経口または直腸などの経腸投与および非経口投与に適したものであり、単独のまたは１つもしくは複数の薬学的に許容される担体、特に経腸もしくは非経口適用に適したものと組み合わせた治療有効量のＶＥＧＦ阻害因子および少なくとも１つの薬学的活性作用物質を含む。
【０２１４】
医薬組成物は、約０．００００２〜約１００％、特に、例えば使用準備ができている注入希釈物の場合０．０００１〜０．０２％、あるいは例えば注射もしくは注入濃縮物または特に非経口製剤の場合約０．１％〜約９５％、または約１％〜約９０％、または約２０％〜約６０％；少なくとも約０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、もしくは９５％のいずれか、および／または約０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、もしくは９５％のいずれかを超えない活性成分を含む（各場合において重量比）。本発明による医薬組成物は、例えば、アンプル、バイアル、ドラジェ、錠剤、注入バッグまたはカプセルの形態などの単位剤形のものでもよい。
【０２１５】
本発明の製剤中の各組合せパートナーの有効投与量は、使用する特定の化合物または医薬組成物、投与形態、治療する状態および治療する状態の重症度に応じて様々となり得る。通常の技術のある医師、臨床家または獣医は、状態の進行を予防、治療または阻止するのに必要な各活性成分の有効量を容易に決定することができる。
【０２１６】
一実施形態では、チロホスチン、特にアダホスチンを、約１〜６０００ｍｇ／日、さらにまたは２５〜５０００ｍｇ／日、または５０〜４０００ｍｇ／日の投与量で温血動物、特にヒトに投与する。一実施形態では、本明細書において別段に述べていない限り、１日当たり１〜５回、特に１〜４回化合物を投与する。
【０２１７】
経腸または非経口投与での併用療法のための医薬調製物は、例えば、糖衣錠、カプセル、座剤やアンプルなどの単位剤形のものである。別段に示さない場合、これらの製剤は、従来の手段、例えば従来の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥工程によって調製される。各剤形の個々の用量に含有される組合せパートナーの単位含量は、複数の投与単位の投与によって必要な有効量に達することができるため、それ自体で有効量を構成する必要はない。当業者は、組合せ構成成分の適当な薬学的有効量を決定する能力を有する。
【０２１８】
一実施形態では、化合物または薬学的に許容されるその塩は、錠剤、カプセルもしくはシロップの形態の経口医薬製剤として、または適切な場合は非経口注射として投与する。
【０２１９】
経口投与用の組成物を調製する際に、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤など任意の薬学的に許容される媒体を使用することができる。薬学的に許容される担体には、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤が含まれる。
【０２２０】
活性成分の溶液、また懸濁液も、特に等張水溶液または懸濁液は、活性成分の非経口投与に有用であり、それは、例えば、使用前に作製するそのような溶液または懸濁液のための、単独のまたは薬学的に許容される担体、例えばマンニトールと一緒に活性成分を含む凍結乾燥組成物の場合にあり得る。医薬組成物は、滅菌してもよく、かつ／あるいは賦形剤、例えば保存剤、安定化剤、湿潤および／もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を制御する塩ならびに／または緩衝剤を含んでもよく、それ自体知られている形で、例えば従来の溶解または凍結乾燥工程によって調製される。溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなど、粘性を増大させる物質を含んでよい。油中の懸濁液は、油構成成分として、注射の目的で習慣的な植物油、合成油または半合成油を含む。
【０２２１】
等張剤は、当技術分野で知られている任意のもの、例えばマンニトール、デキストロース、グルコースおよび塩化ナトリウムから選択することができる。注入製剤を水性媒体で希釈することができる。希釈剤として使用する水性媒体の量は、注入溶液中の活性成分の所望の濃度に従って選択される。注入溶液は、酸化防止剤など、静脈内投与する製剤で通常使用される他の賦形剤を含有してもよい。
【０２２２】
本発明はさらに「組合せ調製物」に関し、これは、本明細書において、上記で定義した組合せパートナー（ａ）および（ｂ）を、独立にまたは区別された量の組合せパートナー（ａ）および（ｂ）を有する異なる固定された組合せの使用によって、すなわち同時にまたは異なる時点で投与できるという意味で特に「キットオブパーツ」を定義するものである。次いでキットオブパーツのパーツを、例えば同時にまたは順番にずらして、すなわち異なる時点で、キットオブパーツの任意のパーツについて等しいまたは異なる時間間隔をおいて投与することができる。例えば、患者が受ける任意の副作用の重篤度に基づいて治療する患者の部分集団の要求または１人の患者の要求に対処するために、組合せ調製物において投与する組合せパートナー（ａ）と組合せパートナー（ｂ）の総量の比を変化させることができる。
【０２２３】
本発明について十分に記載してきたが、例示的であるがさらに限定することを意味しない以下の実施例および特許請求の範囲によってそれをさらに例示する。当業者なら、日常的な実験だけを使用して、本明細書に記載の特定の手順に対する多数の均等物を認識しまたは確認できるであろう。そのような均等物は、本発明および特許請求の範囲内にある。発行された特許および公開された特許出願を含めて、本出願全体にわたって引用されたすべての参照文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
［実施例］
【実施例１】
【０２２４】
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーからヒトＤＫＫ１特異的抗体の作製
市販のファージディスプレイライブラリーであるＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを抗体変種タンパク質のソースとして用いて高い結合親和性を有するクローンを選抜することにより、ヒトＤＫＫ１タンパク質に対する治療抗体を作製する。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）は、全６種のＣＤＲが適切な突然変異により多様化したＦａｂライブラリーであり（Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６；Ｋｒｅｂｓら、２００１  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４：６７〜８４；Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００３  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８（４０）：３８１９４〜３８２０５）、これはＦａｂフラグメントをファージ表面に結合するためのＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を利用している（国際公開第０１／０５９５０号パンフレット、Ｌｏｈｎｉｎｇ  ２００１）。
【０２２５】
基本手順：ファージミドレスキュー、ファージ増幅および精製
３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む標準的な細菌用富栄養培地（２×ＹＴ）（２×ＹＴ−ＣＧ）中で、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを増幅させる。ＯＤ６００ｎｍが０．５の細胞をＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させた（細胞とファージの混合物を振盪せず３７℃で３０分間インキュベートし、続いて３７℃で３０分間、２５０ｒｐｍで振盪した）後、細胞を遠心分離し（４１２０ｇ；５分間；４℃）、２×ＹＴ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌ  カナマイシン／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧに再懸濁し、２２℃で一晩培養する。この培養期間の終わりに細胞を遠心分離により除去し、上清からファージを２回ＰＥＧ沈殿し、ＰＢＳ／２０％グリセロールに再懸濁し、−８０℃で保存する。
【０２２６】
２ラウンドのパニング間のファージ増幅は次の通り行われる。ＤＫＫ１タンパク質を用いた選抜の後、ファージに感染した対数期中期の大腸菌（E. coli）株ＴＧ１細胞を溶出させ、１％グルコースおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天（ＬＢ−ＣＧプレート）上に蒔く。プレートを３０℃で一晩インキュベーションした後、細菌コロニーを寒天表面から掻き取って２×ＹＴ−ＣＧブロスへの播種に用いてＯＤ６００ｎｍを０．５とし、続いてＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを加えて上述の通り増殖性感染を達成する。
【０２２７】
Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ磁気ビーズを用いた溶液相パニングの予備実験
（ＶｏｓｓおよびＳｋｅｒｒａ、１９９７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：９７５〜９８２）によると、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩはＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマトリックスに対する親和性が低い（ＫＤ約１μＭ）ことが報告されており、したがって予備実験を行ってＳｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎでコートされたＭａｇＳｔｒｅｐビーズを抗体選抜における抗原捕集に用いることの適性を評価し、またパニングにおける抗原損失を避ける。
【０２２８】
このため、８ｍｇのＭａｇＳｔｒｅｐビーズを４６μｇのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１と１時間室温でインキュベートし、プレブロッキングした４本のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへと試料を分注する。１本のチューブを陽性対照（洗浄なし）とし、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）マニュアルのパニングセクションに従って残り３本の試料を異なるストリンジェンシーで洗浄する。Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１とＭａｇＳｔｒｅｐビーズ（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎでコートされた磁気ビーズ、ＩＢＡ（ゲッティンゲン、ドイツ）製）との結合の検出は、ＢｉｏＶｅｒｉｓにおいてヤギ抗ＤＫＫ１抗体およびルビジウム標識抗ヤギ検出抗体を用いて行う。
【０２２９】
洗浄なしビーズを異なるＨｕＣＡＬ（登録商標）ストリンジェンシーで洗浄したビーズと比較しても、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎでコートされたビーズからＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１の有意な損失は検出できない。したがって、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎでコートした磁気ビーズ（ＭａｇＳｔｒｅｐビーズ）を用いた溶液相パニングにおける使用に適していると考えられる。
【０２３０】
ライブラリーからＤＫＫ１特異的抗体のパニングによる選抜
ヒトＤＫＫ１を認識する抗体の選抜のため、２通りのパニング戦略を適用する。
【０２３１】
要約すると、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージ−抗体を、ＶＨマスター遺伝子の異なる組み合わせを含む４個のプール（プール１はＶＨ１／５λκを含み；プール２はＶＨ３λκを含み；プール３はＶＨ２／４／６λκを含み；プール４はＶＨ１〜６λκを含む）に分ける。これらのプールをそれぞれ、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁気ビーズ（Ｍｅｇａ  Ｓｔｒｅｐビーズ；ＩＢＡ）上に捕集したＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１による２ラウンドの溶液相パニングに付し、３回目の選抜ラウンドのみ、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁気ビーズ上に捕集したＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１か、あるいはビオチン化抗ＡＰＰ抗体を用いてストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン；Ｄｙｎａｌ）により捕集されたＡＰＰ−タグ付きヒトＤＫＫ１タンパク質のいずれかにより行う。
【０２３２】
詳しくは、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁気ビーズと結合したＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１を用いた溶液相パニングのため、次のプロトコールが適用される。ＰＢＳで１：１希釈した２×ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（１．５ｍｌ）で一晩４℃にて処理することにより、プレブロッキングしたチューブ（１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）を調製する。次の通り処理することにより、プレブロッキングしたビーズを調製する。５８０μｌ（２８ｍｇビーズ）のＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁気ビーズを５８０μｌのＰＢＳで１回洗浄し、５８０μｌの１×ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（１容量の１×ＰＢＳで希釈）に再懸濁する。ビーズのブロッキングは、プレブロッキングしたチューブにおいて一晩４℃で行う。
【０２３３】
パニング条件毎に、最終容量５００μｌとなるようＰＢＳに希釈したファージ粒子を５００μｌの２×ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ／０．１％Ｔｗｅｅｎと混合し、回転ホイール上で１時間室温にて維持する。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎまたはビーズと結合するファージを除去するためにファージ粒子の前吸着を２回行う。１６０μｌのブロッキング済みＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁気ビーズ（４ｍｇ）をブロッキング済みファージ粒子に添加し、回転ホイール上で３０分間室温にてインキュベートする。磁気装置（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｅ）によりビーズを分離した後、ファージ上清（約１．１ｍｌ）を新しいブロッキング済み反応チューブへと移し、１６０μｌのブロッキング済みビーズを用いて３０分間の前吸着を繰り返す。その後、４００ｎＭか１００ｎＭいずれかのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１を、新しいブロッキング済み１．５ｍｌ反応チューブ中のブロッキング済みファージ粒子に添加し、混合物を回転ホイール上で６０分間室温にてインキュベートする。
【０２３４】
４００ｎＭか１００ｎＭのファージパニングプールそれぞれに添加した３２０μｌか１６０μｌいずれかのブロッキング済みＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁気ビーズを用いてファージ−抗原複合体を捕集し、次にこれを回転ホイール上で２０分間室温にてインキュベートする。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁気ビーズと結合したファージ粒子を磁気粒子分離装置により再度収集する。
【０２３５】
次にビーズをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で７回洗浄し、続いてＰＢＳのみでさらに３回洗浄する。２００μｌの２０ｍＭ  ＤＴＴ含有１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を各チューブへと１０分間添加することにより、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁気ビーズからファージ粒子の溶出を行う。溶出液を収集し、ビーズを２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ溶出液をＤＴＴ溶出液に加える。この溶出液試料を用いて、ＯＤ６００ｎｍが０．６〜０．８となるまで培養した１４ｍｌの大腸菌（E. coli）ＴＧ−１培養物を感染させる。
【０２３６】
感染させ、続いて１０分間５０００ｒｐｍで遠心分離した後、各細菌ペレットを５００μｌの２×ＹＴ培地に再懸濁し、２×ＹＴ−ＣＧ寒天プレート上に蒔き、一晩３０℃でインキュベートする。翌朝、得られたコロニーをプレートから掻き取り、上述の通りレスキューおよび増幅によりファージを調製する。
【０２３７】
使用する抗原量を減らし（５０ｎＭおよび１０ｎＭ）、洗浄手順のストリンジェンシーを適切に変更した以外は第一ラウンドのプロトコールに従って、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１による第二ラウンドの溶液相パニングを行う。
【０２３８】
第三の選抜ラウンドのため、２通りの異なるパニング戦略を適用する。第二のパニングラウンドの増幅ファージアウトプットを分割し、２種の異なるパニング条件に付す。ファージアウトプットの第一の半量は、上述の通りＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎビーズ上に捕集したヒトＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１による標準的なパニング戦略に用いる（抗原量はそれぞれ１０ｎＭまたは１ｎＭである）。
【０２３９】
第三の選抜ラウンドのための第二のパニング変法は、ヒトＡＰＰタグ付きＤＫＫ１により行う。最終濃度５０ｎＭまたは１０ｎＭのＡＰＰタグ付きＤＫＫ１タンパク質を、プレクリアした第二ラウンドのファージ粒子１ｍｌと混合し、混合液を回転ホイール上で室温にて１時間インキュベートする。並行して、８ｍｇのプレブロッキングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ）を４０μｇのビオチン化マウス抗ＡＰＰ抗体と回転ホイール上で３０分間室温にてインキュベートし、続いてＰＢＳＴによる２回の洗浄ステップを行った。ＡＰＰタグ付きＤＫＫ１と結合したファージ−抗体からなる前形成複合体を抗ＡＰＰでコートしたＭ−２８０ストレプトアビジン磁気ビーズにより３０分間室温で捕集する。上述の通りファージの溶出および増幅を行う。
【０２４０】
可溶性Ｆａｂフラグメントのサブクローニングおよび発現
可溶性Ｆａｂの迅速かつ効率的な発現を容易にするため、選抜されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドにおけるＦａｂをコードするインサートを発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨへとサブクローニングする。このため、選抜されたクローンのプラスミドＤＮＡを制限酵素エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、これによりＦａｂをコードするインサート（ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ）を切り取る。次に、このインサートをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨへとクローニングする。
【０２４１】
このベクターからＦａｂタンパク質が発現すると、その結果、Ｆａｂタンパク質は検出と精製両方のための２個のＣ末端タグ（それぞれＦＬＡＧ（商標）および６×Ｈｉｓ）を備える。
【０２４２】
大腸菌（E. coli）におけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体の微量発現
上述の通り得られた各クローンにコードされたタンパク質を十分量得るため、選抜されたＦａｂをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ発現ベクターへとサブクローニングした後、クロラムフェニコール耐性細菌のシングルコロニーを選抜する。次に、これらコロニーのそれぞれを用いて、各ウェルが１ウェル当たり１００μｌの２×ＹＴ−ＣＧ培地を含む滅菌９６ウェル・マイクロタイタープレートのウェルに播種し、細菌を一晩３７℃で培養する。各大腸菌（E. coli）ＴＧ−１培養物の試料（５μｌ）を、１ウェル当たり３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび０．１％グルコースを添加した１００μｌの２×ＹＴ培地を予め充填した新しい滅菌９６ウェル・マイクロタイタープレートへと移す。ＯＤ６００ｎｍが約０．５となり培養液がやや濁るまで（約２〜４時間）、マイクロタイタープレートをマイクロプレートシェイカー上で４００ｒｐｍにて振盪しつつ３０℃でインキュベートする。
【０２４３】
これらプレート様式における発現のため、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび３ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加した２０μｌの２×ＹＴ培地を各ウェルに加え（ＩＰＴＧ最終濃度０．５ｍＭ）、ガス透過性テープでマイクロタイタープレートに封をし、４００ｒｐｍで振盪しつつ一晩３０℃でインキュベートする。
【０２４４】
ホールセルライセート（ＢＥＬ抽出液）の作製
発現プレートの各ウェルに対し、２．５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む４０μｌのＢＥＬバッファー（２×ＢＢＳ／ＥＤＴＡ：２４．７ｇ／ｌホウ酸、１８．７ｇ  ＮａＣｌ／ｌ、１．４９ｇ  ＥＤＴＡ／ｌ、ｐＨ８．０）を加え、プレートをマイクロタイタープレートシェイカー（４００ｒｐｍ）上で２２℃にて１時間インキュベートする。ＢＥＬ抽出液をＦＭＡＴによる結合解析に用いる（実施例２を参照）。
【０２４５】
大腸菌（E. coli）におけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体のマイクログラム量の発現および精製
ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにコードされたＦａｂフラグメントの大腸菌（E. coli）ＴＧ１Ｆ細胞における発現を５０ｍｌプラスチックチューブ内で行う。このため、シングルクローンを播種した前培養物を２×ＹＴ−ＣＧ培地において一晩３０℃で培養する。翌朝、各前培養物の５０μｌを用いて滅菌５０ｍｌプラスチックチューブ内の３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．１％グルコースを添加した２５ｍｌの２×ＹＴ培地に播種し、一晩３０℃でインキュベートする。大腸菌（E. coli）細胞を回収し、細胞ペレットを凍結し、最後にＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて破砕する。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いてＦａｂフラグメントを単離する。
【０２４６】
大腸菌（E. coli）におけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体のミリグラム量の発現および精製
３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した７５０ｍｌの２×ＹＴ培地を用いたシェイカーフラスコ培養物中で、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにコードされたＦａｂフラグメントのＴＧ１Ｆ細胞における発現を行う。ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで培養物を３０℃で振盪する。０．７５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、続いて３０℃で２０時間インキュベーションすることにより発現を誘導する。リゾチームを用いつつ細胞を破砕し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）によりＦａｂフラグメントを単離する。ＵＶ分光光度法によりタンパク質濃度を決定する（Ｋｒｅｂｓら、２００１）。
【実施例２】
【０２４７】
ＤＫＫ１特異的ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体の同定
上述のパニング戦略により選抜した個々の大腸菌（E. coli）クローンのＢＥＬ抽出液を、蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ（商標）、８２００細胞検出システム分析機器、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）によって解析し、ＤＫＫ１特異的Ｆａｂをコードするクローンを同定する。ＦＭＡＴ（商標）８１００ＨＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍは、生細胞またはビーズを用いたミックスアンドリード非放射性アッセイの検出を自動化する蛍光マクロ共焦点ハイスループットスクリーニング装置である（Ｍｉｒａｇｌｉａ、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（１９９９）、４（４）１９３〜２０４）。
【０２４８】
ＤＫＫ１と結合するＦａｂを細菌ライセートから検出するための蛍光微量アッセイ技術に基づく結合解析（ＦＭＡＴ）
ＤＫＫ１と結合するＦａｂ抗体を大腸菌（E. coli）ライセート（ＢＥＬ抽出液）から検出するため、ＦＭＡＴ８２００細胞検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて結合を解析する。Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１をＭ−４５０Ｅｘｐｏｘｙビーズ（Ｄｙｎａｌ）上に結合させるため、３００μｌのＭ−４５０Ｅｐｏｘｙビーズ（１．２×１０８ビーズ）試料を反応チューブ内に移し、磁気粒子分離装置を用いて捕集する。上清を除去し、ビーズを１ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４で４回洗浄する。抗原コーティングのため、６０μｇのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１を、１５０μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４中のビーズ懸濁液に添加する。抗原−ビーズ懸濁液を回転ホイール上で１６時間室温にてインキュベートする。次に、コートされたビーズをＰＢＳで３回洗浄し、最終容量２５０μｌのＰＢＳに再懸濁する。
【０２４９】
３８４ウェルプレートのそれぞれに対し、３％ＢＳＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＤＫＫ１でコートしたビーズ（１．９×１０６ビーズ）（４μｌ）およびＣｙ５（商標）検出抗体（４μｌ）を含む２０ｍｌのＰＢＳ混合液を調製する。この溶液４５μｌの試料を、３８４ウェルＦＭＡＴ黒／透明底プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルに分注する。Ｆａｂ含有ＢＥＬ抽出液（５μｌ）を各ウェルに添加する。ＦＭＡＴプレートを室温で一晩インキュベートする。翌朝、８２００細胞検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてプレートを解析する。
【０２５０】
陽性クローンを得て、ＦＭＡＴにおいて陽性の特異的シグナルを生じるクローンの重鎖および軽鎖配列を解析する。ヒトＤＫＫ１に対し十分に強い結合を示す５７個の独自（非重複）抗ＤＫＫ１クローンが同定されたことが観察された。これらのクローンを発現させ、精製し、親和性および機能アッセイにおいて試験する。
【０２５１】
表面プラズモン共鳴法を用いたナノモル濃度の親和性の決定
これらのクローンを用いて、１０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５中の約４００ＲＵ密度の組換えヒトＤＫＫ１、マウスＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）またはカニクイザルＤＫＫ１のいずれかでコートされたＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、スウェーデン）において、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミン結合化学を用いた動態ＳＰＲ解析を行う。同程度の量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を参照フローセル上に固定化する。ＰＢＳ（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）をランニングバッファーとして用いる。濃度シリーズ１６〜５００ｎＭ、流速２０μｌ／分でＦａｂ標本をアプライする。会合相は６０ｓに、解離相は１２０ｓに設定する。この方法によって決定されたヒト、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１それぞれに対するｎＭ表記の親和性の概要を本明細書の表１に示す。
【０２５２】
【表２】
2012526139.tif 000003
【実施例３】
【０２５３】
ＤＫＫ１のＷｎｔアンタゴニスト活性を阻害する抗ヒトＤＫＫ１  Ｆａｂ候補の同定
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーから選抜し、その結果得られた５７個の異なるＤＫＫ１特異的抗体を用いて精製抗体を得て、次にヒトＤＫＫ１のＷｎｔアンタゴニスト活性の阻害に対するその効力を試験する。これら抗体の内、１７個の抗体候補が機能的に活性である。
【０２５４】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いて、それぞれのＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂの機能活性を確認する。ルシフェラーゼレポーター遺伝子上流に１２個のＴＣＦ／Ｌｅｆ結合部位をクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子にＴＣＦ／Ｌｅｆ応答性を付与する。標準Ｗｎｔタンパク質はベータ−カテニンの安定化をもたらし、これによりＴＣＦ／Ｌｅｆの転写を活性化してルシフェラーゼタンパク質を産生する。ＤＫＫ１タンパク質の添加はＷｎｔ活性、ひいてはルシフェラーゼ遺伝子の転写を遮断する。その結果、各細胞により産生されたルシフェラーゼのレベルは、選抜されたＦａｂがＤＫＫ１の作用を遮断する効力と相関することが予想される。
【０２５５】
安定的ＴＣＦ／Ｌｅｆ応答性レポーター細胞系ＨＥＫ２９３Ｔ／１７−１２ｘＳＴＦ
安定的なヒト胚性腎細胞レポーター細胞系ＨＥＫ２９３Ｔ／１７−１２ｘＳＴＦを用いてバイオアッセイを行う。１０％ＦＣＳ（ＰＡＮまたはＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）および１μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、９０％集密度に達するまで細胞を培養する。次に細胞をトリプシン処理し、計数し、ピューロマイシンを含まない培養液で１ｍｌ当たり４×１０５細胞の濃度となるよう希釈する。その後、白色平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；１ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液）に細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。翌日、Ｗｎｔ３ａ馴化培地（ＣＭ）に５００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１−ＡＰＰを加えてアッセイ培地を調製する。陽性対照（最終濃度１．５μｇ／ｍｌ）として用いた抗ＤＫＫ１  ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）およびヤギ抗ヒトＤＫＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＣＭに希釈する。
【０２５６】
接着細胞を乱さないようアッセイプレートの各ウェルから６０μｌ容量の培地を除去し、ＣＭに希釈した６０μｌの試験抗体または対照に置き換える。細胞をさらに２４時間インキュベートし、１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を各ウェルに加える。５分間のインキュベーション時間の後、ルミノメーター（ＧｅｎｉｏＰｒｏ、Ｔｅｃａｎ）で発光を読み取る。ルシフェラーゼ発現の程度は、抗体存在の程度の尺度である。
【実施例４】
【０２５７】
結合親和性の定量的解析：ＤＫＫ１のＷｎｔアンタゴニスト活性を阻害する抗ヒトＤＫＫ１  Ｆａｂ候補の決定
親和性決定
抗ＤＫＫ１抗体をさらに特徴付けるため、ヒト、カニクイザルおよびマウスＤＫＫ１に対する親和性を決定する。組換えＤＫＫ１タンパク質をＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定化し、Ｆａｂを異なる濃度の移動相にアプライする。一価親和性を確実に決定するため、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて≧９０％モノマー画分を示したＦａｂバッチのみをＢｉａｃｏｒｅ測定に用いる。
【０２５８】
ヒト、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１の親和性データの概要を表２に示す。試験した全１７個のＦａｂは、ヒトＤＫＫ１に対して１００ｎＭより低い親和性を有することが判明した。さらに、これらクローンの内９クローンは、１０ｎＭ未満の親和性を有する抗体を産生した。試験した全事例において、カニクイザルおよびマウスＤＫＫ１に対する親和性は、ヒトＤＫＫ１に対する親和性とほぼ同じである。
【０２５９】
【表３】
2012526139.tif 000004
【０２６０】
ＥＣ５０決定
ＤＫＫ１に対して最大の親和性を有する抗体クローンに対する５０％阻害の有効濃度を示すデータを、本明細書の表３に示す。このデータは３９〜９５ｎＭの範囲の有効濃度ＥＣ５０を示し、中央値は５８〜８３ｎＭの間である。
【０２６１】
【表４】
2012526139.tif 000005
【実施例５】
【０２６２】
ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ２カセットの並列交換による、選抜された抗ＤＫＫ１  Ｆａｂの親和性成熟
本明細書に記載されている抗体のＤＫＫ１に対する親和性を親Ｆａｂフラグメントのプールに対して最適化するため、ＢｐｉＩおよびＳｐｈＩを用いて各親ＦａｂのＬＣＤＲ３、フレームワーク４および軽鎖（４０５ｂｐ）定常部を除去し、多様化されたＬＣＤＲ３のレパートリーならびにフレームワーク４および定常部ドメインに置き換える。０．５μｇのバインダー（binder）プールベクターの試料を、多様化されたＬＣＤＲ３を有する３倍モル濃度過剰のインサート断片とライゲーションする。
【０２６３】
同様のアプローチにおいて、ＸｈｏＩおよびＢｓｓＨＩＩ部位を用いてＨＣＤＲ２を多様化し、連結フレームワーク領域は一定に保つ。クローニング効率を上げるため、多様化されたＨＣＤＲ２カセットの挿入前に親ＨＣＤＲ２を５９０ｂｐの詰め物（stuffer）配列に置き換える。
【０２６４】
１１種の異なるライブラリーのライゲーション混合物を、４ｍｌの大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）へとエレクトロポレーションし、２×１０７から２×１０８個の独立したコロニーを得る。以前に記述された通りにライブラリーの増幅を行う（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００３  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８（４０）：３８１９４〜３８２０５）。品質管理のため、ライブラリー当たり数個のクローンをランダムに採取し、プライマーＣＦＲ８４（ＶＬ）およびＯＣＡＬ＿Ｓｅｑ＿Ｈｐ（ＶＨ）を用いて配列解析する（ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ、ファターシュテッテン、ドイツ）。
【０２６５】
親和性成熟のための候補の選択
次の特性を有すると特徴付けられたことにより、６個の選抜された成熟候補（「親Ｆａｂ」）が選択される。ヒトＤＫＫ１に対する１０ｎＭ未満の親和性と、カニクイザルおよびマウスＤＫＫ１に対する有意な交差反応性、１００ｎＭ未満のＥＣ５０、大腸菌（E. coli）における良から並のＦａｂ発現レベルおよびＦａｂ精製後の凝集の欠如。
【０２６６】
親和性測定の過程において、ＭＯＲ０４４８０は高い希釈率では非常に不安定となることが明らかとなった。このため、試験した全Ｆａｂ内で最高の親和性（１ｎＭ）および最良のＥＣ５０（７ｎＭ）を有するにも関わらず、ＭＯＲ０４４８０は成熟候補のリストから除かれる。ＭＯＲ０４４８３は、ヒトＤＫＫ１に対して５．５ｎＭの高親和性を有するが、マウスＤＫＫ１に対して反応交差性を示し、ＭＯＲ０４４５３は精製後に凝集するＦａｂを高比率で含んでいた。したがって、これら２個の抗体もまた成熟から除外される。
【０２６７】
利用できる全データを注意深く評価した後、６個の成熟候補（ＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６、ＭＯＲ０４４６１、ＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ０４５１６）を選択する。これら候補の特性を本明細書の表４に列挙する。
【０２６８】
【表５】
2012526139.tif 000006
【０２６９】
親和性成熟のための選抜Ｆａｂライブラリーの作製
より高い親和性および阻害活性を有する抗ＤＫＫ１抗体のクローンを得るため、前述の実施例に示されている選抜されたＦａｂクローンＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６、ＭＯＲ０４４６１、ＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ４５１６を、親和性成熟として知られるさらに別の多様化および選抜ラウンドに付す。
【０２７０】
このため、トリヌクレオチド突然変異誘発によって予め構築された、対応するＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ２成熟カセットを用いてＣＤＲ領域を多様化させる（Ｖｉｒｎｅｋａｓら、１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５６００〜５６０７；Ｎａｇｙら、２００２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：８０１〜８０７）。本明細書の表５は、親クローンＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６、ＭＯＲ０６１、ＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ４５１６のＬＣＤＲ３配列を示す。
【０２７１】
【表６】
2012526139.tif 000007
【０２７２】
本明細書の表６は、親クローンＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６、ＭＯＲ０６１、ＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ４５１６のＨＣＤＲ３配列を示す。
【０２７３】
【表７】
2012526139.tif 000008
【０２７４】
発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨから得られたＦａｂフラグメントをファージミドベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５（米国特許第６，７５３，１３６号明細書を参照）へとサブクローニングする。このベクターは、Ｎ末端がシステイン残基と、またＣ末端のシステインがＦｄ抗体鎖と融合したファージタンパク質ｐＩＩＩを提供し、これによりファージ表面上に各Ｆａｂフラグメントをジスルフィド結合して提示することができる。２通りの異なる戦略を並行して適用し、親Ｆａｂの親和性と有効性の両方を最適化する。
【０２７５】
６個の親クローンの内５クローンのＬＣＤＲ３が個々の軽鎖ＣＤＲ３配列のレパートリーに置き換えられた、５種のファージ抗体Ｆａｂライブラリーを作製する。ＭＯＲ０４４５４クローンはそのＣＤＲ領域の１個に追加のＢｐｉＩ制限部位を有し、ＢｐｉＩ制限酵素はライブラリークローニング手順に用いられるため、ＭＯＲ０４４５４のＬＣＤＲ３成熟は行わない。
【０２７６】
並行して、各親クローンのＨＣＤＲ２領域を個々の重鎖ＣＤＲ２配列のレパートリーに置き換える。各親Ｆａｂを切り取り、５９０ｂｐの詰め物配列に置き換える。このＤＮＡ詰め物配列は、２回消化したベクターバンドから１回消化したベクターバンドの分離を容易にし、成熟パニングにおける高親和性の親Ｆａｂのバックグラウンドを抑制する。次のステップにおいて、各親クローンのＦａｂをコードするプラスミドから詰め物配列を切り取り、高度に多様化されたＨＣＤＲ２成熟カセットに置き換える。
【０２７７】
２×１０７メンバーを超える大規模な親和性成熟ライブラリーを標準的なクローニング手順により作製し、多様化されたクローンを電気的形質転換受容性の大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。上述の実施例１に記載されている通りＦａｂ提示ファージを調製する。
【０２７８】
次の選抜プロセスを容易にするため４種の成熟プールを構築する。プール１ａはＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ０４５１６のＬＣＤＲ３ライブラリーからなり、プール１ｂはＭＯＲ０４４７０およびＭＯＲ０４５１６のＨＣＤＲ２ライブラリーからなり、プール２ａはＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６およびＭＯＲ０４４６１のＬＣＤＲ３ライブラリーからなり、プール２ｂはＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５５、ＭＯＲ０４４５６およびＭＯＲ０４４６１のＨＣＤＲ２ライブラリーからなる。
【０２７９】
各プールに、より少量のＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１を用いて溶液中でパニングを行い、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズによってファージ−抗原を捕集する。並行して、ニュートラアビジンでコートされたプレート上に捕集されたより少量のビオチン化ＤＫＫ１を用いて、パニングに各プールをアプライする。パニングのストリンジェンシーを高めるため、またオフレートを改善して選抜するため、精製された親Ｆａｂおよび非標識抗原との競合は、インキュベーション時間を延長して行う。
【０２８０】
パニング直後に、濃縮ファージミドプールをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ発現ベクターにサブクローニングする。約２３００個のシングルクローンを採取し、ＦａｂをＩＰＴＧで誘導する。
【０２８１】
成熟パニング戦略
それぞれ２または３ラウンド用の溶液中のＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１およびビオチン化Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１により、４種の抗体プールを用いたパニング手順を行う。各パニング戦略のため、精製された親Ｆａｂタンパク質または非標識ＡＰＰタグ付きＤＫＫ１との競合ならびに低い抗原濃度および十分な洗浄によりストリンジェンシーを高める。
【０２８２】
主として実施例１に記載されている標準的なプロトコールに従い、非標識Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きＤＫＫ１による溶液相パニングを選抜２ラウンドにわたり行う。これら手順と異なるのは、抗原投与量の減少（５ｎＭから１ｎＭに減少）、競合物質ありまたはなしのいずれかの高ストリンジェンシーの洗浄手順、および抗体−ファージと抗原とのインキュベーション時間の延長である。
【０２８３】
ビオチン化ＤＫＫ１を用いた第一の選抜ラウンドのため、ニュートラアビジンプレートのウェルを３００μｌのＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで１：１希釈した２×ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）（ブロッキングバッファー）でウェルをブロッキングする。選抜前に、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージもまた０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１容量のブロッキングバッファーにより３０分間室温でブロッキングする。ブロッキング済みファージ標本の１００μｌアリコートをニュートラアビジンでコートしたプレートのウェルへと３０分間室温で移す。この前吸着ステップを１回繰り返す。ブロッキングし、プレクリアしたファージ標本を回転ホイール上で５ｎＭビオチン化ＤＫＫ１と２時間２２℃でインキュベートする。親ＦａｂまたはＡＰＰ−ＤＫＫ１を加えて、あるいは競合物質なしで、試料を回転ホイール上で一晩４℃にてインキュベートする。
【０２８４】
ニュートラアビジンプレートのウェルにおいて２０分間室温で抗原−ファージ複合体を捕集する。十分な洗浄ステップの後、１０分間室温で１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中の２０ｍＭ  ＤＴＴを１ウェル当たり２００μｌ添加することによって、結合したファージ粒子を溶出する。溶出液を取り分け、ＯＤ６００ｎｍが０．６〜０．８になるまで培養した１４ｍｌの大腸菌（E. coli）ＴＧ１細胞へと加える。ウェルを２００μｌのＰＢＳで１回リンスし、この溶液も大腸菌（E. coli）ＴＧ１細胞に加える。振盪せず４５分間３７℃で大腸菌（E. coli）をファージに感染させる。１０分間５０００ｒｐｍで遠心分離した後、細菌ペレットをそれぞれ５００μｌの２×ＹＴ培地に再懸濁し、２×ＹＴ−ＣＧ寒天プレート上に播種し、一晩３０℃でインキュベートする。コロニーをプレート表面から掻き取って回収し、ファージ粒子をレスキューし、上述の通り増幅する。
【０２８５】
洗浄条件がよりストリンジェントで抗原濃度がそれぞれ１および０．１ｎＭである以外は上述の選抜第一ラウンドと同様に、選抜の第二および第三ラウンドを行う。
【０２８６】
電気化学発光（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）に基づくＤＫＫ１と結合するＦａｂの結合解析
大腸菌（E. coli）ライセート（ＢＥＬ抽出液）における改善された親和性のＤＫＫ１特異的抗体断片の検出のため、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍ−３８４ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、ウィットニー、オックスフォードシャー、英国）を用いる。９６ウェル・ポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいて、０．５％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳをアッセイバッファーとしてアッセイを行う。供給元の取扱説明書に従って、Ｍ−２８０ストレプトアビジン常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ）上にビオチン化ヒトＤＫＫ１を固定化する。ウェル毎にビーズ原液の１：２５希釈を加える。１００μｌの希釈ＢＥＬ抽出液試料およびビーズをシェイカー上で一晩室温にてインキュベートする。検出のため、供給元（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、ウィットニー、オックスフォードシャー、英国）の取扱説明書に従ってＢＶ−ｔａｇ（商標）で標識した抗ヒト（Ｆａｂ）’２（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いる。
【０２８７】
約２３００個のランダムに採取したクローンのセットを上述の方法により解析する。最高値が得られた１６０クローンのサブセットを溶液平衡滴定におけるさらなる解析用に選択する。
【０２８８】
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）を用いたピコモル濃度の親和性決定
ＫＤ決定のため、Ｆａｂモノマー画分（少なくとも９０％のモノマー含有量、分析的ＳＥＣにより解析；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる。溶液相における電気化学発光（ＥＣＬ）に基づく親和性決定およびデータ評価は、基本的にＨａｅｎｅｌら、２００５による記載の通りに行われる。溶液中の異なる濃度（段階的３ｎ希釈）のヒトＤＫＫ１（４ｎＭの出発濃度）を用いて、一定量のＦａｂを平衡化する。常磁性ビーズ（Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｌ）と結合したビオチン化ヒトＤＫＫ１およびＢＶ−ｔａｇ（商標）（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、ウィットニー、オックスフォードシャー、英国）標識抗ヒト（Ｆａｂ）’２（Ｄｉａｎｏｖａ）を添加し、混合物を３０分間インキュベートする。その後、Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）３８４分析機器（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）を用いたＥＣＬ検出により非結合Ｆａｂの濃度を定量化する。
【０２８９】
このため、１６０個のシングルクローンを選抜し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースによりμｇスケールで精製する。ＢｉｏＶｅｒｉｓにおける４点溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により予備的に親和性を決定する。これらのデータから、親和性を示す２０クローンを選抜する。これらのＦａｂをｍｇスケールで精製する。Ｆａｂの部分的な凝集がサイズ排除クロマトグラフィーにより検出されたため、ＭＯＲ０４９５０は親和性決定およびさらなる評価から除外される。最終的な親和性は、８点ＳＥＴ測定値ならびにヒト、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１を用いて、各Ｆａｂクローンの２個の独立バッチから決定される。
【０２９０】
基本的に上述の通り、ヒトＤＫＫ１の代わりにマウスＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびカニクイザルＤＫＫ１を溶液中の分析物として用いて、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対する親和性決定を行う。遊離Ｆａｂの検出のため、常磁性ビーズと結合したビオチン化ヒトＤＫＫ１を用いる。Ｈａｅｎｅｌら、２００５  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３３９．１：１８２〜１８４に従って親和性を算出する。
【０２９１】
上述のアッセイ条件を用いて、親和性が最適化された抗ＤＫＫ１  Ｆａｂに対する親和性を溶液中で決定する。ヒトＤＫＫ１ならびにマウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対する親和性を決定する。
【実施例６】
【０２９２】
親和性が最適化された抗ヒトＤＫＫ１  Ｆａｂの特性評価
酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）技術
５０％ヒト血清（ＨＳ）存在下における成熟Ｆａｂの結合特異性を決定する。ビオチン化組換えヒトＤＫＫ１をＴＢＳで段階希釈した液を用いて、１ウェル当たり８ｎｇのＤＫＫ１から１ウェル当たり１２５ｎｇのＤＫＫ１濃度でニュートラアビジンマイクロタイタープレートを２時間室温でコートする。抗原コーティングの後、１％ＢＳＡを添加したＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ）でウェルを１時間室温でブロッキングする。上述の通り精製したＦａｂを、ＴＢＳ／４％ＢＳＡまたはＴＢＳ／５０％ＨＳのいずれかにより最終濃度１μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、コーティングおよびブロッキングしたウェルに加え、プレートを１時間室温でインキュベートする。検出のため、抗ＦＬＡＧアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗体（ＴＢＳＴで１：５０００希釈）および蛍光発生基質ＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ）を用いる。ウェルを３回洗浄したときの標識二次抗体による最後のインキュベーションステップの後を除き、各インキュベーション後にマイクロタイタープレートのウェルをＴＢＳＴで５回洗浄する。
【０２９３】
ＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーにおいて蛍光を測定する。最適化された抗ＤＫＫ１  Ｆａｂの結合活性は、４％ＢＳＡにおける結合活性と比較して５０％ヒト血清存在下で決定する。中央値は９３％であることが判明し、したがって抗ＤＫＫ１  Ｆａｂはヒト血清存在下で標的と十分に結合することが判明した。
【０２９４】
Ｕ２ＯＳ細胞系を用いたヒト血清存在下におけるルシフェラーゼレポーター細胞アッセイ
最適化された抗ＤＫＫ１  Ｆａｂの結合特異性をさらに決定するため、骨肉種細胞系Ｕ２ＯＳを用いて１５％ヒト血清存在下でルシフェラーゼレポーター細胞アッセイを繰り返す。Ｕ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−９６）を提供元のプロトコール（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）に従って培養する。細胞をトリプシン処理し、計数し、培養液（ＭｃＣｏｙ５ａ／１０％ＦＣＳ）で２×１０５細胞／ｍｌ濃度となるよう希釈する。各２×１０４細胞に対し、０．０７５μｇのｐＴＡ−ＬＵＣ−１２ｘＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈおよび０．００４μｇのｐｈＲＬ−ＳＶ４０の混合物である溶液を調製する。これらを最終容量９．８μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭと混合する。次に、０．２μｌのＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を添加する。このトランスフェクション混合液を短時間インキュベートし、次に予め調製した細胞と混合する。その後、白色平底９６ウェル細胞培養皿の１ウェル当たり１００μｌに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。翌日、アッセイプレートの各ウェルから７５μｌの培地を除去し、１０μｌのＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ抗体希釈液（無血清培養液で１０〜０．０１μｇ／ｍｌ希釈）、１５μｌの７０％ＦＣＳまたはヒト血清のいずれか、および５０μｌのＷｎｔ３ａ馴化培地、６００ｎｇ／ｍｌ  ＤＫＫ１−ＡＰＰ含有、を各ウェルに加えて置換する。
【０２９５】
陰性対照のため、抗体希釈液の代わりに無血清培地を添加する。最大のルシフェラーゼシグナルを得るために、抗体希釈液の代わりに１０μｌの無血清培地および５０μｌのＷｎｔ３ａ  ＣＭを含むがＤＫＫ１−ＡＰＰを含まない対照を加える。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を用いてメーカーの取扱説明書に従って発光を測定する。
【０２９６】
これらのデータは、ヒト血清存在下で機能する抗ＤＫＫ１  Ｆａｂのクローンが得られたことを示す。
【０２９７】
ルシフェラーゼレポーター細胞アッセイによる親和性を最適化した抗ＤＫＫ１  ＦａｂのＥＣ５０決定
標準的なＷｎｔ３ａ依存性ＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃレポーターアッセイにおける親和性を改善したＦａｂの試験において、ルシフェラーゼの発現阻害を達成するために１０ｎＭ  ＤＫＫ１が用いられた。アッセイの感受性が非常に低いため、この方法ではＥＣ５０値を得られないことが判明した。このことは、非常に急勾配の阻害曲線および試験した全Ｆａｂで同様のＥＣ５０値によって示される。
【０２９８】
ＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃレポーターアッセイの改良版を開発する。ＤＫＫ１はＫｒｅｍｅｎ−１および−２膜貫通タンパク質と結合し、この相互作用はＷｎｔシグナル伝達の強力で相乗的な阻害をもたらす（Ｍａｏら、２００２  Ｎａｔｕｒｅ：４１７：６６４〜６７）。したがって、ＫｒｅｍｅｎのｃＤＮＡをＴＣＦ／ＬＥＦ  ｌｕｃレポーターアッセイと同時トランスフェクトする。その結果作製されたＷｎｔ３ａ依存性レポーターアッセイは、Ｋｒｅｍｅｎ共働受容体タンパク質の同時発現により媒介され、顕著に改善されたＤＫＫ１感受性を示した。このアッセイにおいて、０．３３ｎＭのＤＫＫ１は、Ｗｎｔシグナル伝達の完全な阻害の誘導に十分である。０．３３ｎＭのＤＫＫ１を用いてＦａｂ滴定（１０濃度）を繰り返してＳ字形阻害曲線を作成し、これからＥＣ５０値を算出することができる。
【０２９９】
その結果、上述の通りＥＣ５０に関して親和性を最適化した抗ＤＫＫ１  Ｆａｂを解析する。この方法によって得られたＥＣ５０値は、０．２ｎＭから５．６ｎＭの範囲である。
【０３００】
親和性を最適化したＦａｂの配列解析
全２０個のＦａｂの重鎖およびＶＬ領域（ＶＨおよびＶＬ）のヌクレオチド配列を決定する。相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を本明細書の表７および表８に列挙する。
【０３０１】
【表８】
2012526139.tif 000009
【０３０２】
コンセンサスＨ−ＣＤＲ配列である配列番号４０〜４８は表１８Ａに由来し、表７に記載されている。本発明の重鎖または軽鎖いずれかの追加的コンセンサスＣＤＲ配列は、当業者であれば標準的な方法および本明細書に記載されている方法を用いて表１８Ａ〜１８Ｃにおけるアライメントから決定することができる。
【０３０３】
【表９】
2012526139.tif 000010
【０３０４】
配列解析は、６個の親（Ｐ）Ｆａｂの内５個が親和性の改善された後継を生じたことを示した。ＭＯＲ０４４６１およびＭＯＲ０４４７０は、ＬＣＤＲ３と共にＨＣＤＲ２において最適化することができる。ＭＯＲ０４４５４の最適化された後継は得られなかった。さらに、表８における様々なＣＤＲのコンセンサス１およびコンセンサス２配列に示されている通り、異なる親抗体の間に高い相同性が生じる。同様のコンセンサス配列は、当業者によく知られた方法を用いて表１０Ａに示される親配列に提供できる。
【０３０５】
さらに、ＭＯＲ０４９２０がＨＣＤＲ２領域に突然変異を有することが決定され（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００１  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９．３：６５７〜６７０によって発表されたナンバリング構想に従い、７３位におけるＳｅｒ残基がＧｌｙへと変異）、したがってＨｕＣＡＬ（登録商標）設計から逸脱する。
【０３０６】
ＭＯＲ０４９１３は、カッパ軽鎖のフレームワーク４に点突然変異を有することを示す（１４８位におけるＬｙｓからＡｓｎへの置換）。この位置は、抗体の結合特性に効果があるとは予想されないため、突然変異はＩｇＧ変換の間に生殖系列／ＨｕＣＡＬ（登録商標）組成へと復帰されて、抗体ＭＯＲ０５１４５を生じる。
【０３０７】
ＭＯＲ０４９４７は、ＬＣＤＲ２にグリコシル化部位候補を有する。ＭＯＲ０４９４７はバックアップ候補の１つとしてのみ選択されるため、この部位は除去されない。
【実施例７】
【０３０８】
ＨｕＣＡＬ（登録商標）免疫グロブリンの産生
ＩｇＧ型への変換
全長免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現させるため、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ  Ｆａｂ発現ベクターからヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４のためのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇまたはｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇベクターシリーズのいずれかへとサブクローニングする。ヒトＩｇＧ２のための代替的なベクターを用いてもよい。ＶＨドメイン断片のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ１およびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ４へのサブクローニングには、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いる。ＶＨドメイン断片のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ４へのサブクローニングには、制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いる。ＶＬドメイン断片のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇκおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇκへのサブクローニングは、ＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩ部位を用いて行うが、一方ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇλおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇλ２へのサブクローニングは、ＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを用いて行う。
【０３０９】
ヒトＩｇＧの一過性発現および精製
ＨＥＫ２９３細胞に等モル濃度の量のＩｇＧ  重鎖および軽鎖発現ベクターをトランスフェクトする。トランスフェクション後４または５日目に、細胞培養上清を回収する。上清のｐＨを８．０に調整して滅菌濾過した後、溶液を標準的プロテインＡカラムクロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ２０Ａ、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に付す。
【０３１０】
親ＦａｂのＩｇＧ型への変換
親和性成熟の開始と並行して、ＭＯＲ０４４５４、ＭＯＲ０４４５６およびＭＯＲ０４４７０をｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ１およびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ４発現ベクターにクローニングする。代替的な構築物をＩｇＧ２発現ベクターの作製に用いてもよい。ＨＥＫ２９３細胞に対する一過性トランスフェクションによりスモールスケール発現を行い、細胞培養上清から全長免疫グロブリンを精製する。
【０３１１】
データは、サイズ排除クロマトグラフィーにより抗体がモノマー型であることを示す。Ｗｎｔ３ａ依存性レポーターアッセイにおける試験により、タンパク質が機能的であることが証明された。
【実施例８】
【０３１２】
発現に最適化された遺伝子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
哺乳動物における発現を増加させるため、細胞における発現に対するコドン使用を最適化するため、本明細書におけるＦａｂの重鎖および軽鎖に変化を導入する。数種類の負のシス作用性モチーフは、哺乳動物における発現を減少させることが知られている。本明細書における最適化プロセスは、発現に負の影響を与える負のシス作用性部位（スプライス部位またはポリ（Ａ）シグナル等）を取り除く。本明細書における最適化プロセスは、ＧＣ含有をさらに濃縮し、ｍＲＮＡ半減期を延長する。
【０３１３】
本明細書においてファージディスプレイを用いた選抜により単離したＦａｂクローンＭＯＲ０４９４５（全長軽鎖親ヌクレオチド配列は配列番号９８であり、全長重鎖親ヌクレオチド配列は配列番号１０２である）を用いて、可変軽鎖および重鎖領域を最適化する。次に、このクローンおよび他のクローンの軽鎖および重鎖全体のそれぞれをコードするヌクレオチド配列を各自、これらの手順を用いて最適化する。
【０３１４】
ＭＯＲ０４９４５のＶＨおよびＶＬ鎖のための最適化プロセス
ＶＬおよびＶＨ鎖それぞれのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を哺乳動物細胞における発現に最適化するため、コドン使用を哺乳動物遺伝子のコドンの偏りに適応させる。さらに、可能であれば、非常に高い（＞８０％）あるいは非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有の領域を減少または除去する。あるいは、細菌、酵母またはバキュロウイルスにおける発現への最適化は、コドン使用の偏りをそれぞれの遺伝子に適応させることを伴うであろう。
【０３１５】
哺乳動物発現への最適化プロセスにおいては、次のシス作用性配列モチーフを避ける。内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボソーム侵入部位、ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列鎖、ＲＮＡ不安定性モチーフ（ＡＲＥ）配列エレメント、阻害ＲＮＡ配列エレメント（ＩＮＳ）、ｃＡＭＰ応答性（ＣＲＳ）配列エレメント、反復配列およびＲＮＡ二次構造、潜在性部位等のスプライスドナーおよびアクセプター部位ならびに枝分かれ部位。指示されている場合を除き、ＶＬ鎖のヌクレオチド配列最適化のプロセスにおいて、ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の導入を避ける。指示されている場合を除き、ＶＨ鎖のヌクレオチド配列最適化のプロセスにおいてＭｌｙＩおよびＢｓｔＥＩＩ部位の導入を避ける。
【０３１６】
発現に最適化されたＭＯＲ０４９４５のＶＨおよびＶＬ鎖のアミノ酸配列
コドン使用を哺乳動物のコドン使用に適応させて、その結果生じる上述のクローンＭＯＲ０４９４５のＶＨおよびＶＬ鎖の最適化されたアミノ酸配列の、哺乳動物細胞におけるより高くより安定的な発現率を可能にする。実施例５を参照。
【０３１７】
下の表９は、発現に最適化された可変軽鎖のセンス（「センス」とする、配列番号１１９）およびアンチセンス（「ＡＳ」とする、配列番号１２０）ヌクレオチド配列ならびにその結果生じる可変軽鎖アミノ酸（「ＡＡ」とする、配列番号１２１）配列を示す。
【０３１８】
【表１０】
2012526139.tif 000011
【０３１９】
下の表１０は、発現に最適化されたセンスおよびアンチセンス可変重鎖ヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１２２および１２３）ならびにその結果生じる可変重鎖アミノ酸（ＡＡとする）配列（配列番号１２４）を示す。
【０３２０】
【表１１】
2012526139.tif 000012
【０３２１】
最適化前および最適化後のチャートは、親配列および最適化された遺伝子のそれぞれの各配列コドンのパーセンテージを提供することができ、ＶＨおよびＶＬ鎖をコードする各ヌクレオチド配列の品質クラスを解析する。本明細書における品質値とは、所望の発現系における所定のアミノ酸に対する最も高頻度のコドン使用を１００に設定し、使用頻度に従ってその他のコドンを見積もることを意味する（Ｓｈａｒｐ、Ｐ．Ｍ．、Ｌｉ、Ｗ．Ｈ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（３）、１９８７）。
【０３２２】
さらに、コドン適応指標（ＣＡＩ）は、どの程度良好にヌクレオチド配列のコドンが標的生物のコドン使用優先度に一致するかを説明する数値である。ＣＡＩの最大値を１．０に設定し、したがって＞０．９のＣＡＩは高発現を可能にすると考えられる。最適化前のＶＬ鎖のＣＡＩは０．７３であることが判明し、最適化後に、ＣＡＩは０．９５であると決定された。同様に、最適化前のＶＨ鎖のＣＡＩは０．７４であることが判明し、最適化後では最適化された構築物において０．９８であると決定され、ＶＬ鎖におけるＧＣ含有は、ＭＯＲ０４９４５親配列の５１％からＭＯＲ０４９４５に由来する最適化された配列の６２％へと増加する。ＶＨ鎖におけるＧＣ含有は、ＭＯＲ０４９４５親配列の５４％からＭＯＲ０４９４５の最適化された派生物の６４％へと増加する。
【０３２３】
ＭＯＲ０４９１０、ＭＯＲ０４９４５、ＭＯＲ０４９４６およびＭＯＲ０５１４５の全長軽鎖および重鎖の発現の最適化
最適化プロセスは、ＭＯＲ０４９１０（配列番号９７）、ＭＯＲ０４９４５（配列番号９８）、ＭＯＲ０４９４６（配列番号９９）およびＭＯＲ０５１４５（配列番号１００）の軽鎖全長親ヌクレオチド配列ならびにＭＯＲ０４９１０（配列番号１０１）、ＭＯＲ０４９４５（配列番号１０２）、ＭＯＲ０４９４６（配列番号１０３）およびＭＯＲ０５１４５（配列番号１０３）の重鎖全長親ヌクレオチド配列のそれぞれに適用される。
【０３２４】
最適化プロセスは、親クローン番号に関連する次の軽鎖ヌクレオチド配列のそれぞれの構築に用いられる。クローンＭＯＲ０４９１０に対する最適化ヌクレオチド配列は配列番号１０４であり、クローンＭＯＲ０４９４５に対する最適化ヌクレオチド配列は配列番号１０５であり、クローンＭＯＲ０４９４６に対する最適化ヌクレオチド配列は配列番号１０６であり、クローンＭＯＲ０５１４５に対する最適化ヌクレオチド配列は配列番号１０７である。さらに、最適化プロセスは、親クローン番号に関連する次の重鎖ヌクレオチド配列のそれぞれの構築に用いられる。クローンＭＯＲ０４９１０に対する最適化ヌクレオチド配列は配列番号１０８であり、クローンＭＯＲ０４９４５に対する最適化ヌクレオチド配列は配列番号１０９であり、クローンＭＯＲ０４９４６に対する最適化ヌクレオチド配列は配列番号１１０であり、クローンＭＯＲ０５１４５に対する最適化ヌクレオチド配列は配列番号１１０である。
【０３２５】
最適化された軽鎖ヌクレオチド配列は、次の最適化された軽鎖アミノ酸配列に関連する。クローンＭＯＲ０４９１０に対する最適化アミノ酸配列は配列番号１１１であり、クローンＭＯＲ０４９４５に対する最適化アミノ酸配列は配列番号１１２であり、クローンＭＯＲ０４９４６に対する最適化アミノ酸配列は配列番号１１３であり、クローンＭＯＲ０５１４５に対する最適化アミノ酸配列は配列番号１１４である。最適化された重鎖ヌクレオチド配列は、次の最適化された重鎖アミノ酸配列に関連する。クローンＭＯＲ０４９１０に対する最適化アミノ酸配列は配列番号１１５であり、クローンＭＯＲ０４９４５に対する最適化アミノ酸配列は配列番号１１６であり、クローンＭＯＲ０４９４６に対する最適化アミノ酸配列は配列番号１１７であり、クローンＭＯＲ０５１４５に対する最適化アミノ酸配列は配列番号１１７である。
【０３２６】
企図されている全長軽鎖および重鎖配列のヌクレオチドおよびポリペプチド配列を表１１に列挙する。表１１は、最適化されたヌクレオチド配列およびそれらによってコードされたポリペプチドを提供する。これらのヌクレオチド配列は、哺乳動物発現系において認識される潜在的スプライス部位を取り除くよう最適化する。
【０３２７】
【表１２−１】
2012526139.tif 000013
【表１２−２】
2012526139.tif 000014
【表１２−３】
2012526139.tif 000015
【実施例９】
【０３２８】
生物活性アッセイ
ＳｕｐｅｒＴｏｐｆｌａｓｈ  Ｋｒｍ１７と称する遺伝子組換え細胞系ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ＳＴＦ＿７０ＩＲＥＳ＿Ｋｒｍ＿（１７）を用いて、レポーター遺伝子アッセイにおいて抗ＤＫＫ１／４中和抗体の生物活性を測定する。この細胞系は、ヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３に由来し、ｉ）プロモーターＴＣＦがホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に融合したレポーター構築物およびｉｉ）この細胞表面上におけるＫｒｍの過剰発現をもたらす構築物によって安定的にトランスフェクトされる。この細胞系において、Ｗｎｔタンパク質への曝露は用量依存的様式でのルシフェラーゼ発現を刺激する。段階的な量の抗ＤＫＫ１／４抗体を、固定された準最大用量のＤＫＫ１へとＷｎｔ存在下で添加すると、１６時間のインキュベーション時間の間にルシフェラーゼの発現増加をもたらす。この時間の終わりに、ルシフェラーゼ量を細胞ライセート中のその酵素活性に基づき定量化する。ルシフェラーゼは、基質であるルシフェリンの、化学発光産物であるオキシルシフェリンへの変換を触媒する。続いて、適切なルミノメーターを用いてその結果生じるグロータイプの化学発光を決定する。
【０３２９】
ルシフェラーゼ発現を増加させるその能力を標準試料と比較することにより、抗ＤＫＫ１／４中和抗体実験試料の生物学的効力を決定する。タンパク質含有量に基づき試料および標準物質を正規化する。次に、ヨーロッパ薬局方１に従い、平行ラインアッセイを用いて相対効力を計算する。最終結果は、参照標準に対する試料の相対効力（パーセント表記）として表す。
【実施例１０】
【０３３０】
関連する生物学的標的におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
細胞アッセイにおいて低ナノモル濃度範囲での親和性および強力な活性を有するリードＦＡｂを選択する。ＤＫＫ１の生理的結合パートナーは、ＬＲＰ５／６（Ｋｄ約３４０ｐＭ）ならびにＫｒｅｍｅｎ１および２（Ｋｄ約２８０ｐＭ）である［Ｍａｏ  ２００１］［Ｍａｏ  ２００２］。これらの高親和性の相互作用を前提とし、生理的ＤＫＫ１相互作用とより良く競合するために親和性をさらに改善することが望ましい。選択されたＦＡｂの親和性および生物活性を高めるため、トリヌクレオチド指向型突然変異誘発を用いたカセット突然変異誘発によりＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ２領域を並行して最適化する［Ｖｉｒｎｅｋａｓ  １９９４］［Ｋｎａｐｐｉｋ  ２０００］［Ｎａｇｙ  ２００２］。
【０３３１】
親和性成熟に続き、低ピコモル濃度の親和性を有し、ＤＫＫ１が阻害したｗｎｔシグナル伝達を１ｎＭより小さいＥＣ５０で再活性化し、カニクイザル、マウスおよびラットＤＫＫ１と交差反応するＦＡｂを選択する。次に、このＦＡｂの可変領域を２種の異なるヒトＩｇＧ１フレームワークへと操作する。
【０３３２】
抗ＤＫＫ１／４抗体は、この親和性の抗体に一般的な結合動態でヒトＤＫＫ１（２ｐＭ）に対して高い親和性を有する。図１を参照。
【０３３３】
図１．方法：ＣＭ５（Ｓ）センサーチップ（Ｃａｔ＃ＢＲ−１００６−６８）を備えるＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）装置による表面プラズモン共鳴法を用いて、リード候補およびｒｈＤＫＫ１（組換えヒトＤＫＫ１）（バッチＢＴＰ７７５７）の結合親和性および動態を測定する。抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９−００６−０９８）を各フローセル上に固定化し、続いて約１００ＲＵの予測捕集でリード候補を捕集する。最後に、６濃度のＤＫＫ１（０．１９５〜６．２５ｎＭの範囲）を１種類の反復濃度でチップにおいて試験する。ＤＫＫ１結合のために２４０秒間フローセルを活性化し、続いて３０分間解離する。正規化データ（バックグラウンドを差し引く）は、ＢＩＡ評価１．０ソフトウエアにおける動態解析を用いた大量輸送モデルによる１：１結合と適合する。この実験を３回繰り返し行い、示されているデータはこれら３実験の標準偏差付き平均値である。
【実施例１１】
【０３３４】
エピトープマッピング
成熟ＤＫＫ１は、２個のシステインリッチ領域（Ｃｙｓ−１およびＣｙｓ−２）を備える２６６アミノ酸のタンパク質である。Ｃｙｓ−２ドメインは、ＬＲＰおよびＫｒｅｍｅｎタンパク質の両方との結合に関与し、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害に必要かつ十分である［Ｌｉ  ２００２］［Ｂｒｏｔｔ  ２００２］。免疫沈降実験（図２Ａ、図２Ｂ）は、抗ＤＫＫ１／４抗体がＣｙｓ−２ドメインと特異的に結合するが、Ｃｙｓ−１ドメインと結合しないことを証明する。抗ＤＫＫ１／４抗体は、変性ＤＫＫ１を用いたウエスタンブロッティングでは活性が弱く、ペプチドマッピング実験においてタンパク質（ＪＴＰ）の長さにわたって重複する１５アミノ酸ペプチドの内いずれかとの特異的結合は見られず、これは抗ＤＫＫ１／４抗体がＣｙｓ−２内の非線形エピトープを認識し得ることを示唆する。
【０３３５】
図２Ａは、全長ＤＫＫ１および切断ＤＫＫ１の略図を示す。全長（ＦＬ、残基１〜２６６を含む）、カルボキシル末端切断（ΔＣ、残基１〜１８５を含む）およびアミノ末端切断（ΔＮ、残基１〜６０と残基１５７〜２６６を含む）は、各自のＣ末端でＨＡエピトープと融合し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター制御下の哺乳動物発現ベクターにクローニングする。図２Ｂは、抗ＤＫＫ１／４中和抗体とＤＫＫ１タンパク質との結合を表す。全長、アミノ切断およびカルボキシル末端切断ＤＫＫ１タンパク質を含んで発現する、一過性トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞から得られた馴化培地を抗リゾチームＩｇＧ１対照または抗ＤＫＫ１／４抗体と２時間室温でインキュベートし、免疫複合体をプロテインＧビーズ上に収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、転写し、抗ＨＡ抗体でブロッティングする。対照として全インプットの１／１０をロードする。
［実施例１１Ａ］
【０３３６】
エピトープマッピング  −  Ｎ−グリコシル化
Ｗｎｔシグナル伝達経路内の数多くのタンパク質は、その細胞活性を調節する翻訳後酵素により共有結合的に修飾される。ＤＫＫ１等、ＤＫＫファミリーメンバーはＮ−グリコシル化により修飾される［Ｋｒｕｐｎｉｋ  １９９９  Ｇｅｎｅ  ２３８：３０１〜３１３］。ＤＫＫ１は、Ｃｙｓ−２ドメイン内のアミノ酸２５６に理論上のＮ結合型グリコシル化部位を１個有する。Ｃｙｓ−２ドメインの高度に保存された性質ならびにＬＲＰ６に対するＤＫＫ１の結合部位候補およびＤＫＫ１に対する抗ＤＫＫ１／４抗体の結合部位候補の両方を仮定し、本出願人らは、抗ＤＫＫ１／４抗体がＮ−グリコシル化型のＤＫＫ１を認識するか決定するよう努めた。ＥＬＩＳＡにより、抗ＤＫＫ１／４抗体が、特異的なＮ結合型脱グリコシル化型ｒｈＤＫＫ１よりもＮ−グリコシル化型のｒｈＤＫＫ１をより良く認識することを証明する（表１２Ａ）。同タンパク質は、組換えタンパク質の融合エピトープタグ領域に対する第二の抗体（抗ＨＩＳ）により等しく良好に認識される。表面プラズモン共鳴法を用いて親和性におけるこの差異を定量化し、抗ＤＫＫ１／４抗体が、グリコシル化ｒｈＤＫＫ１に対して脱グリコシル化タンパク質よりも１００倍高いＫＤを有することを見出す。表１２Ｂを参照。
【０３３７】
【表１３】
2012526139.tif 000016
【０３３８】
【表１４】
2012526139.tif 000017
【０３３９】
抗ＤＫＫ１／４抗体と、野生型（ＷＴ）ｒｈＤＫＫ１（ＨＥＫ  ＨＩＳ  ｅｉｐｔｏｐｅタグ付き、バッチ＃ＢＴＰ７７５７）との、またＮ結合型脱グリコシル化（Ｎ−ＤＥＧＬＹ、酵素ＰＮＧａｓｅ  ＦによるＮ結合型脱グリコシル化（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｅ−ＤＥＧＬＹ））ｒｈＤＫＫ１との結合をＥＬＩＳＡにより測定する。簡単に述べると、高結合ＥＬＩＳＡ（Ｎｕｎｃ＃４４２４０４）プレートを１μｇ／ｍｌのＷＴまたはＮ−ＤＥＧＬＹ  ＤＫＫ１でコートする。抗ＤＫＫ１／４抗体および抗ＨＩＳ抗体両者のＷＴ  ＤＫＫ１との結合を、それらそれぞれのＮ−ＤＥＧＬＹとの結合と比較した比率を示す。３種類の異なる濃度（代表的な一濃度のデータを示す）を用いてこの実験を行ったところ、全濃度で同様の結果が示された。Ｂ．ＷＴおよびＮ−ＤＥＧＬＹ  ＤＫＫ１（ＨＥＫ２９３、バッチ＃ＢＴＰ７７５７）の両方に対する抗ＤＫＫ１／４抗体の結合親和性および動態をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて測定する。抗ＤＫＫ１／４抗体は、Ｎ−ＤＥＧＬＹ  ＤＫＫ１に対してＷＴ  ＤＫＫ１より１００倍低い親和性を一貫して有する。
【実施例１２】
【０３４０】
ＤＫＫファミリーメンバーのパーセント同一性
ヒトＤｉｃｋｋｏｐｆファミリーは４種類のパラログからなり（表１３を参照）、その内３種類（ＤＫＫ１、２＆４）はＬＲＰ６およびＫｒｅｍｅｎタンパク質と結合し、ＬＲＰ５／６の内部移行を誘導し、標準Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する［Ｍａｏ  ２００１］［Ｍａｏ  ２００３］。ＤＫＫ２はＬＲＰ６の過剰発現と協同したＷｎｔシグナル伝達の増強も誘導するが、ＬＲＰ６とＫｒｅｍｅｎ２の同時発現はＤＫＫ２による経路阻害を回復する［Ｍａｏ  ２００３］。したがって、ＤＫＫ２は、細胞構成に応じてアゴニストとアンタゴニストの両方として作用することができる。ＤＫＫ３はファミリーメンバーの中で最も保存されておらず（これはＬＲＰ５／６およびＫｒｅｍｅｎとの相互作用に関わるＣｙｓ−２ドメイン内領域を含む）、ＬＲＰまたはＫｒｅｍｅｎと結合せずＷｎｔシグナル伝達を遮断しないため、他のＤＫＫファミリーメンバーとは異なる［Ｍａｏ  ２００１］［Ｍａｏ  ２００３］。
【０３４１】
【表１５】
2012526139.tif 000018
【０３４２】
アミノ酸同一性の比率を比較するペアワイズ配列アライメントのためのＡｌｉｇｎＸアルゴリズムを用いて、ＤＫＫファミリーメンバー間の相同性を評価する（ベクターＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅｄ９．１．０）。それぞれ１０および０．１のギャップオープニングおよびギャップエクステンションペナルティーが適用される。この評価は、タンパク質全体の比較と共にＣｙｓ−２ドメインのみの比較を含んでいた。上の表に示されている通り、ＤＫＫ１、２および４は、タンパク質全体にわたり３０〜４０％のアミノ酸配列相同性を共有する。Ｃｙｓ−２ドメイン単独の比較は、ＤＫＫ１と２はこの領域内で６９％の相同性を共有し、一方ＤＫＫ４はＤＫＫ１および２の同一ドメインとおよそ５７％を共有することを示す。ＤＫＫ３は、他のファミリーメンバーに対し最も低レベルの相同性を示す。全メンバー間では、Ｃｙｓ−２ドメイン内の相同性は最大である。
【実施例１３】
【０３４３】
抗ＤＫＫ１／４抗体のヒトＤＫＫファミリーメンバーに対する親和性
ＤＫＫ１との結合に加えて、抗ＤＫＫ１／４抗体はＤＫＫ４とも結合する。表１４を参照。ＤＫＫ４に対する親和性は、ＤＫＫ１より約１００倍低いが、依然としてナノモル濃度未満（subnanomolar）であり、したがって生物学的かつ臨床的に関連する可能性がある。留意すべきことに、ＤＫＫ２とＤＫＫ４のいずれも、ＤＫＫ１のＣｙｓ−２ドメインにおけるグリコシル化標的と予測されるアスパラギン残基を保存しない。予備的な免疫沈降実験は、抗ＤＫＫ１／４抗体がＤＫＫ２と特異的に結合しないことを示唆する。ＤＫＫ２と結合する抗ＤＫＫ１／４抗体の結合親和性は、ＤＫＫ２の精製が成功した後に決定されるであろう。ＤＫＫ３の異なる機能および結合特性と一致することに、抗ＤＫＫ１／４抗体はＤＫＫ３と結合しない。
【０３４４】
【表１６】
2012526139.tif 000019
【０３４５】
ヒトＤＫＫファミリータンパク質の他のメンバーに対する抗ＤＫＫ１／４抗体の結合親和性および動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて測定する。前述の通り、抗ＤＫＫ１／４抗体と有意に結合するタンパク質に対し３回繰り返して実験を行い、３実験の標準偏差付き平均値として報告する。相同性が最も低いファミリーメンバーであるＤＫＫ３はバックグラウンドを超えるレベルが検出できる程の結合性を持たず、したがってＮＳＢ（有意な結合なし；No Significant binding）であると考えられる。同様に、最新のデータは、本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体がＤＫＫ２とも有意な結合性を持たないことを示唆する。
【実施例１４】
【０３４６】
抗ＤＫＫ１／４抗体はＤＫＫ１とＬＲＰ６との結合を遮断する
ＤＫＫ１は、ＬＲＰ５／６およびＫｒｅｍｅｎと相互作用することによりそのＷｎｔアンタゴニスト活性を媒介し、内部移行を誘導し、Ｗｎｔが誘導するＬＲＰ５／６とＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体との相互作用を遮断する。図３の競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗ＤＫＫ１／４抗体は、ＤＫＫ１がＬＲＰ６と結合するのを競合的に阻害する。
【０３４７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＤＫＫ１の結合を可視化するのに十分なレベルの内在性ＬＲＰ５または６を発現しない。しかし、表面輸送シャペロンタンパク質であるＭＥＳＤとＬＲＰ６の同時トランスフェクションにより、ＧＦＰタグ付きＤＫＫ１を細胞表面上に検出し、ＤＫＫ１／ＬＲＰ６相互作用の特異的な性質を示すことができる。抗ＤＫＫ１／４抗体と同じ可変領域を共有するＭＯＲ０４９１０は、この相互作用を特異的に遮断する。
【０３４８】
ＤＫＫ１がＬＲＰ６と直接的に結合するのを阻害する抗ＤＫＫ１／４抗体の能力をＥＬＩＳＡにより測定する。すなわち、無処理プレート（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ＃１２５６５５０１）を１μｇ／ｍｌの組換えＬＲＰ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃１５０５−ＬＲ）でコートし、次に５００ｎｇ／ｍｌのｒｈＤＫＫ１と、抗ＤＫＫ１／４抗体かｈＩｇＧ１（抗リゾチームＭＯＲ３２０７、ＡＣＥ１０９１５）いずれかの濃度曲線とを３０分間氷上でプレインキュベートし、その後これをＬＲＰ６でコートされたプレート上に２時間置く。プレートを洗浄し、ＤＫＫ１結合レベルを抗ＤＫＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ１０９６）で検出する。未加工のＯＤ値（バックグラウンドを差し引く）を示す。抗ＤＫＫ１／４抗体の濃度を高めるとＤＫＫ１とＬＲＰ６との直接的な結合が用量依存的様式で阻害されるが、ｈＩｇＧ１の濃度を高めてもＬＲＰ６とＤＫＫ１との結合は遮断されない。
【０３４９】
細胞表面上のＤＫＫ１／ＬＲＰ６結合を阻害するＭＯＲ０４９１０の能力を蛍光顕微鏡により測定する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に偽（mock）トランスフェクトする、あるいはＬＲＰ６およびＭＥＳＤをコードするプラスミドを一過性トランスフェクトする。抗リゾチームＦＡｂまたは抗ＤＫＫ１  ＦＡｂ  ＭＯＲ０４９１０と共に細胞をＤＫＫ１−ＧＦＰ馴化培地で１時間３７℃でインキュベートし、蛍光顕微鏡により検査する。ＧＦＰ蛍光は、ＤＫＫ１−ＧＦＰと過剰発現したＬＲＰ６との細胞膜上における結合を反映する。抗ＤＫＫ１／４抗体は、細胞表面上でＤＫＫ１がＬＲＰ６と相互作用するのを遮断する。
［実施例１４］
【０３５０】
レポーターアッセイ  −  ＤＫＫ１が阻害したＴＣＦ／ＬＥＦ遺伝子転写の再活性化
標準Ｗｎｔシグナル伝達は、その結果としてベータ−カテニンの核への転位をもたらし、そこでベータ−カテニンはＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子と関連し、Ｗｎｔ応答性遺伝子の転写増強をもたらす。ルシフェラーゼ遺伝子の転写を駆動するＴＣＦ／ＬＥＦ応答性プロモーターを用いてレポーターアッセイを確立し、Ｗｎｔ経路調節の検出を容易にする。ＤＫＫ１は、このアッセイにおいてＷｎｔ３Ａ馴化培地（ＣＭ）により誘導されたルシフェラーゼ活性を効果的に遮断する。抗ＤＫＫ１／４抗体は、見かけ上のＥＣ５０が０．１６ｎＭでＤＫＫ１の抑制したＷｎｔシグナル伝達を再活性化する（図４）。アッセイは完全な抑制に約１ｎＭのＤＫＫ１を必要とし、抗体の親和性が２ｐＭであるため、このＥＣ５０は、抗ＤＫＫ１／４抗体競合の絶対限界ではなくむしろアッセイの感受性および各タンパク質の相対量を反映する可能性がある。
【０３５１】
ＳｕｐｅｒＴｏｐｆｌａｓｈレポーターを安定的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞およびＫｒｅｍｅｎを、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＤＫＫ１、５０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地および様々な量の抗ＤＫＫ１／４抗体で処理する。１８時間後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりルシフェラーゼ活性を測定する。
【実施例１５】
【０３５２】
レポーターアッセイ  −  前骨芽様細胞におけるＤＫＫ１阻害性アルカリホスファターゼ分泌の回復
より生理的に関連した環境で抗ＤＫＫ１／４抗体がＤＫＫ１機能を遮断するか決定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを確立して多能性マウス細胞系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（１０Ｔ１／２）のＷｎｔ介在性骨芽細胞分化を測定する。図５を参照。骨芽細胞分化において、１０Ｔ１／２細胞はアルカリホスファターゼ（ＡＰまたはＡＬＰ）を分泌するが、この現象はＤＫＫ１により阻害することができる。抗ＤＫＫ１／４抗体は、Ｗｎｔ３Ａ馴化培地存在下でＤＫＫ１による１０Ｔ１／２分化の抑制を遮断するが、ＩｇＧ対照は遮断しなかった。
【０３５３】
Ｗｎｔは、多くの細胞構成において増殖を誘導しアポトーシスを阻害することが報告されており、ベータ−カテニン安定化または核局在によって示されている通り、Ｗｎｔ経路の活性化は多くの場合、腫瘍進行に関連する。さらに、一部の癌（例えば、結腸癌やメラノーマ）においてＤＫＫ１が下方制御［Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓａｎｃｈｏ  ２００５］［Ｋｕｐｈａｌ  ２００６］されることから、一部の研究者は、ＤＫＫ１が一部の癌に対する腫瘍抑制因子となり得ることを示唆している。ＤＫＫ１が腫瘍増殖または生存に効果を有するか試験するため、腫瘍細胞系を抗ＤＫＫ１／４抗体で処理し、成長の変化を解析する。試験した腫瘍細胞系で、抗ＤＫＫ１／４抗体の添加によって有意に影響を受けることが判明したものはない。
【０３５４】
数種類の癌細胞系の生存および増殖における抗ＤＫＫ１／４抗体の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価する。このアッセイにおいて、抗ＤＫＫ１／４抗体（１００μｇ／ｍｌ）を腫瘍細胞系とインキュベートし、その３日後、細胞数と直線的に関係する代謝活性細胞の尺度として、ＡＴＰの定量化（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ（登録商標））により細胞数を評価する。３種類の異なる血清濃度で（無血清、最小限の成長用および完全な成長用）このアッセイを行う。無処理およびｈＩｇＧ１処理細胞と比べて有意な変化は見出されない。細胞系の上清をＥＬＩＳＡによりＤＫＫ１発現に関して分析する。
【実施例１６】
【０３５５】
ＤＫＫ１の種間交差反応性および中和
抗ＤＫＫ１／４抗体の中和は、そのヒトＤＫＫ１に対する高親和性および中和能力のためではなく、有効性および安全性試験に用いることのできるその他の種との交差反応性に基づいて選択される。抗ＤＫＫ１／４抗体は、ヒトＤＫＫ１よりも低い親和性でマウス、ラットおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ、マカク・ファスキクラリス（Macaca fascicularis））ＤＫＫ１と交差反応する。表１５を参照。さらに、抗ＤＫＫ１／４抗体は、全４種のＤＫＫ１介在性Ｗｎｔ抑制活性を中和し（表１５）、これらの種が安全性および有効性モデルの両方に関与することを示唆する。
【０３５６】
【表１７】
2012526139.tif 000020
【０３５７】
ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＤＫＫ１に対する親和性決定を、Ｍ−３８４  ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）分析機器（ＢｉｏＶｅｒｉｓ、Ｅｕｒｏｐｅ）を用いて溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により分析する。溶液平衡滴定（ＳＥＴ）によるＫＤ決定のため、ＩｇＧタンパク質のモノマー画分（少なくとも９０％のモノマー含有量、分析的ＳＥＣにより分析；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる。溶液中における電気化学発光（ＥＣＬ）に基づく親和性決定およびデータ評価は、基本的に［Ｈａｅｎｅｌら、２００５］によって記載されている通りに行い、［Ｐｉｅｈｌｅｒら、１９９７］）によるところを修正した結合適合モデルを適用する。溶液中の異なる濃度（段階的３ｎ希釈）のヒトＤＫＫ１（４ｎＭの出発濃度）で一定量のＭＯＲ４９１０  ＩｇＧを平衡化する。常磁性ビーズ（Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｌ）と結合したビオチン化ヒトＤＫＫ１およびＢＶ−ｔａｇ（商標）（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、ウィットニー、オックスフォードシャー、英国）標識ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）’２ポリクローナル抗体を添加し、３０分間インキュベートする。その後、Ｍ−３８４  ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）分析機器（ＢｉｏＶｅｒｉｓ、Ｅｕｒｏｐｅ）を用いて、ＥＣＬ検出により非結合ＩｇＧの濃度を定量化する。ヒトＤＫＫ１の代わりにマウス、ラットおよびカニクイザルＤＫＫ１を溶液中の分析物として用いて、基本的に上述の通りラット、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対する親和性決定を行う。遊離ＩｇＧ分子の検出のため、常磁性ビーズと結合したビオチン化ヒトＤＫＫ１を用いる。ＭＯＲ４９１０および抗ＤＫＫ１／４抗体は、等しいＥＣ５０でヒトＤＫＫ１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を中和し、抗ＤＫＫ１／４抗体はサル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、マウス（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １７６５−ＤＫ−０１０）およびラット（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）ＤＫＫ１も中和する。ヒトＤＫＫ１の代わりに各生物種の組換えＤＫＫ１をＷｎｔ馴化培地の阻害剤として用いて、基本的に上述（図４）の通りヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルＤＫＫ１に対するＴＯＰＦＬＡＳＨレポーターアッセイを行う。ラット組換えＤＫＫ１は、より高濃度のタンパク質をＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイの有意な阻害達成に必要とした。
【実施例１７】
【０３５８】
ＰＣ３Ｍ２ＡＣ６異種移植片の脛骨内成長における抗ＤＫＫ１／４抗体の効果
前立腺腫瘍転移は、溶骨性よりむしろ圧倒的に造骨性であるという点において、骨転移の間で独特のものである［Ｋｅｌｌｅｒ  ２００１］。しかし、特にアンドロゲン除去療法が行われている患者の場合、優勢な造骨性骨転移であっても骨溶解の根幹をなす領域を有し、多くの場合低い骨量密度（ＢＭＤ）を有する［Ｓａａｄ  ２００６］。近年、ＤＫＫ１がスイッチとして作用し、これによりＤＫＫ１の発現が混合型造骨性／溶骨性前立腺腫瘍細胞系（Ｃ４−２Ｂ）の溶骨特性を促進できることが証明された。さらに、ＤＫＫ１のｓｈＲＮＡ抑制は、優勢な溶骨性前立腺腫瘍細胞系（ＰＣ３）の溶骨活性を阻害した［Ｈａｌｌ  ２００５］［Ｈａｌｌ  ２００６］。ＤＫＫ１ノックダウンもまた、腫瘍異種移植片の脛骨内成長を阻害し、これは著者らに溶骨活性が転移性ニッチの確立に重要となり得ることを推測させるが、続く前立腺の転移におけるＤＫＫ１減少は、腫瘍を造骨性表現型に変換する。
【０３５９】
［Ｋｉｍ  ２００３］による方法から溶骨性前立腺腫瘍モデルを適用する。ルシフェラーゼを安定的に発現する溶骨性前立腺腫瘍細胞系（ＰＣ３Ｍ）の変種（ＰＣ３Ｍ２ＡＣ６）をマウスの脛骨中に注射する。ルシフェラーゼにより腫瘍成長をモニターし、一方、マイクロコンピュータ化断層撮影（ｍｉｃｒｏ−ＣＴ）および組織学により骨における変化をモニターする。抗ＤＫＫ１／４抗体は、腫瘍成長を促進するよりむしろ腫瘍成長の阻害傾向を示す。阻害はいずれの研究においても有意ではないが、現在までに行われた５／５研究において一貫して生じ、腫瘍成長における３用量の抗ＤＫＫ１／４抗体の効果を示す代表的な研究を図６に示す。同様の非有意な阻害傾向は、皮下にＰＣ３Ｍ２ＡＣ６異種移植片を有する抗ＤＫＫ１／４抗体処置マウスにより生じた。
【０３６０】
移植後５日目に処置を開始する（２０万細胞／動物）。抗ＤＫＫ１／４抗体は、２０、６０および２００μｇ／マウス／日の用量でｑ．ｄ．、１週間に３回を２週間ｉ．ｖ．投与する。対照ＩｇＧは、２００μｇ／マウス／日、ｑ．ｄ．、１週間に３回を２週間ｉ．ｖ．投与する。溶媒対照（ＰＢＳ）は、ｑ．ｄ．、１週間に３回を２週間ｉ．ｖ．投与する。処置後、最終的な有効性データおよび体重変化を計算する。
【０３６１】
このモデルを用いて、本出願人らは抗ＤＫＫ１／４抗体が腫瘍誘導性皮質骨の損傷を阻害することを見出した。腫瘍移植と偽移植の両方が骨への機械的な損傷をもたらし、その結果、繊維性骨の初期増加を生じ、これは後に再構築されて見かけ上の骨容量減少をもたらすという観察により、このモデルにおける海綿骨への効果は混乱する。したがって、新生繊維性骨および海綿骨の骨容量全体／海綿骨容量（ＢＶ／ＴＶ）比における相対的な効果は不明である。しかし、抗ＤＫＫ１／４抗体が、腫瘍移植および偽移植した脛骨の両方において骨生成を増加させ、再構築に伴う骨容量の減少を阻害するあるいは遅延させることは明らかである。同一の腫瘍誘導性溶骨性モデルを用いることにより、抗ＤＫＫ１／４抗体はＺｏｍｅｔａと等しい抗溶骨性活性を示す。図８を参照。抗ＤＫＫ１／４抗体の骨代謝効果は、２０〜２００μｇ／マウスの範囲において用量応答性であり、最小有効用量は２０〜６０μｇ／マウスの間である。図９を参照。これらのデータを合わせると、抗ＤＫＫ１／４抗体は腫瘍誘導性溶骨性疾患に影響を及ぼすはずであるが、骨粗鬆症等、非腫瘍骨疾患に効果的であってもよいし、骨折の修復を促進してもよいことが示唆される。
【実施例１８】
【０３６２】
抗ＤＫＫ１／４抗体は、腫瘍移植および偽移植脛骨の両方において骨密度上昇を維持する
マウスにおける有効性の薬力学的マーカーを評価する取り組みにおいて、骨代謝の３種類の血清マーカー、すなわちオステオカルシン（ＯＣ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）および分泌型核因子κＢ活性化受容体リガンド（ｓＲＡＮＫＬ）を解析する。抗体作用の予想される機序のため、より典型的な破骨細胞マーカーではなくこれらの骨芽細胞マーカーを用いる。しかし、腫瘍を有する動物対無処置の動物において一貫した変化は検出されない。これらマーカーの内いずれかを用いてｍｉｃｒｏ−ＣＴまたはＩＨＣによって測定しても、骨減少の相関関係は一貫して観察されない。
【０３６３】
処置マウス脛骨のＭｉｃｒｏＣＴ再構築の代表例を行う。皮質損傷は、０＝損傷なしから３＝重度の損傷まで点数化する。腫瘍を移植した脛骨における皮質損傷を実験群に関して盲検化し、ｍｉｃｒｏＣＴ解析により手作業で点数化する。皮質損傷は偽移植した脚のいずれにおいても観察されなかった。
【０３６４】
方法：２×１０５個のＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６細胞を左脛骨に、偽注射を右脛骨に行い、１２週齢の雌のヌードマウスの脛骨内に移植する。移植後５日目に処置を開始する。ＮＶＰ−抗ＤＫＫ１／４抗体−ＮＸ（抗ＤＫＫ１／４抗体）およびＩｇＧ対照を２００μｇ／マウス／日、の用量でｑ．ｄ．、１週間に３回を２週間ｉ．ｖ．投与する。溶媒（ＰＢＳ）対照もまた、ｑ．ｄ．、１週間に３回を２週間ｉ．ｖ．投与する。μ−ＣＴ  ＶｉｖａＣＴ４０  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＳＣＡＮＣＯ、スイス）を用いて、腫瘍移植後７、１４および１８日目に動物を走査する。方法に記載されている通り、海綿骨密度（ＢＶ／ＴＶ）を分析する。星印（＊）は、同一時点における溶媒とＩｇＧ対照（ｎ＝１２）両方との統計的有意差ｐ＜０．０５を示す。
【０３６５】
図７において、骨量を決定するため、ギムザ染色に基づいてＺｅｉｓｓ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ．１およびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウエアにより脛骨の二次海綿質を撮像する。読み取りは、視野全体におけるパーセント石灰化骨に基づく。全カラムは、規定数の動物の平均および標準偏差を表す。ＰＢＳ、ＩｇＧおよび抗ＤＫＫ１／４抗体処置群において、腫瘍を有する動物のみを分析する。右脚は偽注射されず、左脚は腫瘍を有する。統計：ダネット多重比較検定一元配置分散分析。左脚または右脚をＰＢＳ群の各脚と比較する、ｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．０１＊＊、ｐ＞０．０５ｎ．ｓ．。
【０３６６】
図９は、抗ＤＫＫ１／４抗体の同化骨有効性が２０〜６０μｇ／マウスの間を３×／週の最小有効用量において用量依存的であることを示す。２×１０５個のＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６細胞を左脛骨に、偽注射を右脛骨に行い、１２週齢の雌ヌードマウスの脛骨内に移植する。移植後６日目に処置を開始する。ＮＶＰ−抗ＤＫＫ１／４抗体−ＮＸ（抗ＤＫＫ１／４抗体）は、２０、６０および２００μｇ／マウス／日の用量でｑ．ｄ．、１週間に３回を２週間、ｉ．ｖ．投与する。対照ＩｇＧは、２００μｇ／マウス／日、ｑ．ｄ．、１週間に３回を２週間ｉ．ｖ．投与する。溶媒対照（ＰＢＳ）をｑ．ｄ．、１週間に３回を２週間ｉ．ｖ．投与する。μ−ＣＴ  ＶｉｖａＣＴ４０  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＳＣＡＮＣＯ、スイス）を用いて腫瘍移植後７および２０日目に動物を走査する。方法に記載されている通りに海綿骨密度（ＢＶ／ＴＶ）を分析する。＊は、同一時点における溶媒、ＩｇＧ、穿孔のみおよび無処置動物を含む全対照との統計的有意差ｐ＜０．０５を示す。
【実施例１９】
【０３６７】
バイオマーカーの状態
ＤＫＫ１バイオマーカー
ＤＫＫ１のＲＮＡ発現パターンは、これまでに説明されてきた。Ｋｒｕｐｎｉｋ（１９９９）は、胎盤における発現をノーザンブロット解析により示したが、発現は、心臓、脳、肺、肝臓、骨格筋または膵臓では検出されなかった。Ｗｉｒｔｈｓ（２００３）は、肝臓、腎臓および乳房ではＲＮＡ発現を欠くが、ＲＮＡ発現は肝芽腫およびウィルムス腫瘍のサブセットにおいて観察されることを示した。消化管におけるＤＫＫ１発現をＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試験する研究者は、正常であれ悪性であれ、胃および結腸において発現がないことを示した（Ｂｙｕｎ  ２００６）。
【０３６８】
マウスにおけるＲＮＡ発現解析は、骨における高いＤＫＫ１発現レベル、胎仔および胎盤における中程度の発現、そして褐色脂肪組織、胸腺および十二指腸における弱い発現を明らかにした［Ｌｉ  ２００６］。
【０３６９】
本研究で用いたものと同じヤギ抗体を用いて、骨髄腫検体におけるＤＫＫ１のタンパク質発現が評価された（Ｔｉａｎ、２００３）。この論文において、低悪性度の形態を有する患者の骨髄腫細胞において発現が観察された。５名の対照被験者の骨髄生検標本において、ＤＫＫ１タンパク質発現は検出されない。
【０３７０】
一連の正常ヒトおよびサル組織に対してスクリーニングすることにより、治療抗体である抗ＤＫＫ１／４抗体の組織分布および種間交差反応性を研究する。組織全体の切片および組織マイクロアレイの両方を評価する。陽性対照として、同一組織セットにおいて評価された市販のＤＫＫ１抗体が挙げられる。
ＤＫＫ１＿１５（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＤＫＫ１／４抗体）およびＤＫＫ１＿８（ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ＤＫＫ１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ１０９６、ロットＧＢＬ０１３１０１およびＧＢＬ１４１１１）。
【０３７１】
他のバイオマーカー
ＤＫＫ１の病態生理学的役割はほとんど分かっていないため、バイオマーカー研究により抗ＤＫＫ１／４抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果に関する知識ベースの構築と、開発をさらに進めるためにこれをどのように利用できるかに相当量の労力を集中的に費やしてきており、また引き続きそうしている。焦点となる重要な分野として、
１）骨破壊性および造骨性活性の循環マーカーの測定による、正常および転移性骨代謝における抗ＤＫＫ１／４抗体の効果の理解
２）標的徴候を確認および拡大するための多発性骨髄腫および他の腫瘍におけるＤＫＫ１の比較発現レベル
３）ベータ−カテニン活性化を評価するための、結腸、骨髄、肺、皮膚および乳房等、主要組織における遺伝子発現レベルへの効果
が挙げられた。
【０３７２】
予備的分子疫学研究により、多発性骨髄腫の患者におけるＤＫＫ１血清レベル上昇を確認し、この徴候におけるＰＯＣを支持する。
【０３７３】
既存の知識に基づき、表１６は、抗ＤＫＫ１／４抗体に対して提案されたバイオマーカー候補を提供する。
【０３７４】
【表１８】
2012526139.tif 000021
［実施例１９］
【０３７５】
抗ＤＫＫ１抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列
そのＣＤＲ領域が表５および６に示されている抗ＤＫＫ１抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列全体を表１７に提供する。
【０３７６】
【表１９−１】
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【表１９−２】
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【０３７７】
表１７における可変領域のＣＤＲおよびＦＲ部分は、表１８Ａにおいて重鎖が（配列番号２〜２０；ＶＨ３は配列番号１２５、ＶＨ５は配列番号１２６）、表１８Ｂにおいてカッパ軽鎖が（配列番号２１、２２、２３、２７、２８および２９；ＶＫ１は配列番号１２７、ＶＫ３は配列番号１２８）、表１８Ｃにおいてラムダ軽鎖が（配列番号２４、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６および３７；ＶＬ２は配列番号１２９、ＶＬ１は配列番号１３０）整列される。
【０３７８】
【表２０】
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【０３７９】
【表２１】
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【０３８０】
【表２２】
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【実施例２０】
【０３８１】
様々な疾患の治療における抗ＤＫＫ１／４抗体
Ａ．ＤＫＫ１／４中和抗体の有効性の評価
Ｍａｔｕｓｈａｎａｓｋｙら．２００７  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７（１１）：３２４８〜３２５７に記載されているように、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、ＭＦＨ（悪性線維性ヒスチオサイトーシスまたは組織球腫）の前駆細胞である。ｈＭＳＣ増殖のメディエーターであるＤＫＫ１は、ＭＦＨにおいて過剰発現する。ＤＫＫ１は、Ｗｎｔ２／β−カテニン標準シグナル伝達経由のｈＭＳＣの分化コミットメントを阻害する。ＭＦＨにおいて変化した発現を行うこれら遺伝子および遺伝子産物の活性レベルに本発明の抗体が与える効果を測定することによって、抗ＤＫＫ１／４中和抗体がＭＦＨを治療するおよび／またはｈＭＳＣから肉腫への誘導を阻害する能力を評価する。これらのマーカーとして、ＭＦＨにおいて蓄積しない核β−カテニン、ＭＦＨにおいて高度に過剰発現するＷｎｔ２および他の肉腫サブタイプと比べて存在しないＷｎｔ５ａが挙げられる。本技術分野で公知の技法により、これらマーカーのレベルおよび活性の変化の測定を行う。
【０３８２】
Ｍａｔｕｓｈａｎａｓｋｙらによって記載されている通り、ｈＭＳＣおよびＳＶ４０ラージＴ抗原により不死化したｈＭＳＣは、ＤＫＫ１を含む培地で培養されると腫瘍原性コロニー形成を示し、ヌードマウスに注射すると腫瘍を形成する。一実施形態において、抗ＤＫＫ１／４抗体が成長培地に添加され、ｈＭＳＣからＭＦＨの誘導を阻害するその能力が評価される。
【０３８３】
一実施形態において、例えば、Ｙｏｕら、２００８  Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．５３：１０１３〜１０１９によって記載されている通り、試料ＲＮＡを得てそれをＷｎｔ経路特異的マイクロアレイで試験することにより、ＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルまたは活性が評価される。
【０３８４】
Ｂ．ＤＫＫ１／４抗体によるＭＦＨの治療
ＭＦＨと診断された、あるいはそのリスクのある対象に本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体を有効量投与し、治療効果をモニターする。転移性疾患の存在を生検およびＣＴまたはＭＲＩ走査により決定する。抗体の投与方法は、本明細書に提供されている、あるいは当業者に知られた方法によるものとなることができる。これらの方法は、生理食塩水中または約５％デキストロースもしくはグルコースを含む水溶液（「Ｄ５Ｗ」）中におけるｉ．ｖ．注射を含むが、これらに限定されるものではない。必要に応じて患者に例えばアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンを前投薬する。用量範囲（用量制限毒性等）、安全性および薬物動態（代謝産物の検出や排出半減期の決定を含む）を決定する。ＤＫＫ１および核β−カテニン、Ｗｎｔ２および／またはＷｎｔ５ａのレベルを測定することにより、抗体の活性を決定する。
【０３８５】
疾患の治療は、必要に応じて化学療法（イホスファミドやドキソルビシン等）、放射線照射および外科的切除を含む、他の治療法も含む。このような併用療法または治療は、ＤＫＫ１／４抗体の投与に対して同時、同時発生的、別々または連続的となることができる。治療の間は病状に関して、治療が成功した後は疾患の再発に関して患者をモニターする。
【０３８６】
Ｃ．ＤＫＫ１／４抗体によるＩＢＤの治療
ＩＢＤと診断された、あるいはそのリスクのある対象に、本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体を有効量投与し、治療効果をモニターする。ＩＢＤ（例えば、クローン病や潰瘍性大腸炎）の存在を胃腸炎および腸外徴候（例えば、肝臓疾患、関節炎ならびに皮膚および眼の疾患）により決定する。抗体の投与方法は、本明細書に提供されている、あるいは当業者に知られた方法によるものとなることができる。これらの方法は、Ｄ５Ｗ中または生理食塩水中におけるｉ．ｖ．注射を含むが、これらに限定されるものではない。必要に応じて患者に例えばアセトアミノフェンやジフェンヒドラミンを前投薬する。用量範囲（用量制限毒性を含む）、安全性および薬物動態（代謝産物の検出や排出半減期の決定を含む）を決定する。潰瘍性大腸炎で過剰発現するＷｎｔ遺伝子（Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ９およびＷｎｔ１１）のレベルを測定することにより、抗体の活性を決定する。
【０３８７】
疾患の治療は、必要に応じて外科手術や、プレドニゾン、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、メトトレキサート、６−メルカプトプリンおよびメサラミンを含む免疫抑制剤や抗炎症剤を含む医薬品を含めた他の治療法も含む。このような併用療法または治療は、ＤＫＫ１／４抗体の投与に対して同時、同時発生的、別々または連続的となることができる。治療の間、症状（腹痛、嘔吐、下痢、血便、体重減少、関節炎、壊疽性膿皮症および原発性硬化性胆管炎）のモニタリングを含む、病状に関して患者をモニターする。
【０３８８】
Ｄ．ＤＫＫ１／４抗体による肺癌の治療
肺癌（例えば、非小細胞肺癌）と診断された、あるいはそのリスクのある対象に本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体を有効量投与し、治療効果をモニターする。胸部Ｘ線、気管支鏡検査、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）スキャンおよび／または喀痰細胞診試験により肺癌の存在を決定する。抗体の投与方法は、本明細書に提供されている、あるいは当業者に知られた方法によるものとなることができる。これらの方法は、Ｄ５Ｗ中または生理食塩水中におけるｉ．ｖ．注射を含むが、これらに限定されるものではない。必要に応じて例えばアセトアミノフェンやジフェンヒドラミンを患者に前投薬する。用量範囲（用量制限毒性を含む）、安全性および薬物動態（代謝産物の検出や排出半減期の決定を含む）を決定する。この疾患において過剰発現するＤＫＫ１のレベルを測定することによって、抗体の活性を決定する。
【０３８９】
疾患の治療は、必要に応じて外科手術、放射線療法および化学療法（例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン等、白金を用いた治療）を含めた他の治療法も含む。このような併用療法または治療は、ＤＫＫ１／４抗体の投与に対して同時、同時発生的、別々または連続的となることができる。治療の間、症状（息切れ、咳嗽、喀血、胸または腹痛、疲労、食欲不振、骨痛、嗄声、発熱および体重減少）のモニタリングを含めて、病状に関して患者をモニターする。
【０３９０】
Ｅ．ＤＫＫ１／４抗体による食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）の治療
ＥＳＣＣと診断された、あるいはそのリスクのある対象に本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体を有効量投与し、治療効果をモニターする。バリウム嚥下、バリウムミール、食道胃十二指腸内視鏡検査、ＣＴスキャン、ポジトロン放出断層撮影および／または食道超音波内視鏡検査によりＥＳＣＣの存在を決定する。抗体の投与方法は、本明細書に提供されている、あるいは当業者に知られた方法によるものとなることができる。これらの方法は、Ｄ５Ｗ中または生理食塩水中におけるｉ．ｖ．注射を含むが、これらに限定されるものではない。必要に応じて例えばアセトアミノフェンやジフェンヒドラミンを患者に前投薬する。用量範囲（用量制限毒性を含む）、安全性および薬物動態（代謝産物の検出や排出半減期の決定を含む）を決定する。この疾患において過剰発現するＤＫＫ１のレベルを測定することにより、抗体の活性を決定する。
【０３９１】
疾患の治療は、必要に応じて外科手術、レーザー療法、放射線療法および化学療法（フルオロウラシルおよびエピルビシンならびにカルボプラチンおよびオキサリプラチン等のシスプラチンベースの化合物を含む）を含めた他の治療法も含む。このような併用療法または治療は、ＤＫＫ１／４抗体の投与に対して同時、同時発生的、別々または連続的となることができる。治療の間、症状（嚥下障害や嚥下痛、体重減少、嘔吐、咳嗽、肺炎、吐血、疼痛および栄養不足を含む）のモニタリングを含めて、病状に関して患者をモニターする。
【０３９２】
Ｆ．ＤＫＫ１／４抗体による骨髄（骨格）転移の治療
骨髄（骨格）転移と診断された、あるいはそのリスクのある対象に本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体を有効量投与し、治療効果をモニターする。生検、Ｘ線解析、ポジトロン放出断層撮影、骨スキャン、ＭＲＩおよび／またはシンチグラフィー画像診断により、骨髄（骨格）転移の存在を決定する。抗体の投与方法は、本明細書に提供されている、あるいは当業者に知られた方法によるものとなることができる。これらの方法は、Ｄ５Ｗ中または生理食塩水中におけるｉ．ｖ．注射を含むが、これらに限定されるものではない。必要に応じて例えばアセトアミノフェンやジフェンヒドラミンを患者に前投薬する。用量範囲（用量制限毒性を含む）、安全性および薬物動態（代謝産物の検出や排出半減期の決定を含む）を決定する。この疾患において過剰発現するＤＫＫ１のレベルを測定することにより、抗体の活性を決定する。
【０３９３】
疾患の治療は、必要に応じて外科手術、放射線療法および化学療法［オステオプロテゲリン；ＲＡＮＫＬ（核内因子κＢ活性化受容体）ブロッカー；核内因子κＢ（ＮＦκＢ）アンタゴニスト；抗ＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホルモン関連ペプチド）抗体；ＳＴ１５７１やメシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）等、ＰＤＧＦＲアンタゴニスト；アトラセンタンを含む、ＥＴＡ（エンドセリン受容体サブタイプＡ）阻害剤；ＥＭＤ１２１９７４（シレンギチド（cilengitide））；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬；サマリウム；ストロンチウムおよびｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓを含む］を含めた他の治療法も含む。このような併用療法または治療は、ＤＫＫ１／４抗体の投与に対して同時、同時発生的、別々または連続的となることができる。治療の間、症状、特に疼痛のモニタリングを含む、病状に関して患者をモニターする。
【０３９４】
Ｇ．ＤＫＫ１／４抗体による骨肉種の治療
骨肉種と診断された、あるいはそのリスクのある対象に本発明の抗ＤＫＫ１／４抗体を有効量投与し、治療効果をモニターする。生検、Ｘ線解析、ポジトロン放出断層撮影、骨スキャン、ＭＲＩおよび／またはシンチグラフィー画像診断により、骨肉種の存在を決定する。抗体の投与方法は、本明細書に提供されている、あるいは当業者に知られた方法によるものとなることができる。これらの方法は、Ｄ５Ｗ中または生理食塩水中におけるｉ．ｖ．注射を含むがこれらに限定されるものではない。必要に応じて例えばアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンを患者に前投薬する。用量範囲（用量制限毒性を含む）、安全性および薬物動態（代謝産物の検出や排出半減期の決定を含む）を決定する。この疾患において過剰発現するＤＫＫ１のレベルを測定することにより、抗体の活性を決定する。
【０３９５】
疾患の治療は、必要に応じて外科化学療法（ロイコボリンレスキューによるメトトレキサート、シスプラチン、アドリアマイシン、メスナによるイホスファミド、ＢＣＤ、エトポシド、ムラミルトリペプチド（ＭＴＰ）を含む）を含めた他の治療法も含む。このような併用療法または治療は、ＤＫＫ１／４抗体の投与に対して同時、同時発生的、別々または連続的となることができる。治療の間、症状（疼痛や組織の壊死を含む）のモニタリングを含む、病状に関して患者をモニターする。
【実施例２１】
【０３９６】
３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞をＡＴＣＣ（カタログ＃ＣＬ１７３）から購入する。細胞を集密度になるよう培養し、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１９９５０６５）ＤＭＥＭ中にさらに５日間維持する。分化させる日において、培地を、１１μｇ／ｍｌインスリン、１１５μｇ／ｍｌ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）および０．０９７５μｇ／ｍｌデキサメタゾンを添加した分化培地に３日間交換する。
【０３９７】
Ｗｎｔ３ａをコードする発現プラスミドをトランスフェクトした細胞からＷｎｔ３ａ馴化培地を作製する。対照馴化培地は、空ベクターをトランスフェクトした細胞から作製する。分化させる日において、１１μｇ／ｍｌインスリン、１１５μｇ／ｍｌ  ＩＢＭＸおよび０．０９７５μｇ／ｍｌデキサメタゾンを含むＷｎｔ３ａ馴化培地を細胞に添加する。分化３および５日目に、培地を馴化培地へと交換する。分化７日目に細胞を解析に用いる。
【０３９８】
分化させる日において、様々な濃度のＷｎｔ３ａ単独、Ｗｎｔ３ａとＤＫＫ１またはＷｎｔ３ａとＤＫＫ１と共にＭＯＲ４９１０を分化培地に添加する。細胞に添加する前に、Ｗｎｔ３ａとＤＫＫ１と共にＤＫＫ１とＭＯＲ４９１０を小容量で組み合わせて、１０分間氷上でインキュベートする。分化後３および５日目に、培地をＷｎｔ３ａ、ＤＫＫ１およびＭＯＲ４９１０を含む培地に交換する。分化後７日目に細胞を解析に用いる。Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＧＦ１４５からＷｎｔ３ａ組換えタンパク質を購入する。
【０３９９】
タンパク質ライセートを調製し、ウエスタンブロッティングを行う。使用した一次抗体は、ヤギ抗ＧＬＵＴ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ−１６０８）、マウス抗ベータ−アクチン（Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ６２７６−１００）、ウサギ抗リン酸化ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃９２７１）、ウサギ抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃９２７２）および抗β−カテニン（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂ  ＃６１０１５４）である。
【実施例２２】
【０４００】
細胞から全ＲＮＡを抽出し、１マイクログラムの全ＲＮＡを用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｐｅｒ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１８０８０−４００）によりメーカーのマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成する。新規に合成したｃＤＮＡをヌクレアーゼを含まない水で１：５希釈し、最終容量１００マイクロリットルとし、使用するまで−２０Ｃで保存する。
【０４０１】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システムにおいて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＳＤＳ２．０ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析する。反応毎に１マイクロリットルのｃＤＮＡを用いる。内在性対照１８Ｓ  ｒＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃４３１０８９３Ｅ）により各標的遺伝子の発現を正規化する。特異的プライマーおよび標的遺伝子のプローブを含むＡｓｓａｙ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ  ２０×ミックスは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手する。
【０４０２】
【表２３】
2012526139.tif 000027
【実施例２３】
【０４０３】
ＤＫＫ１およびＷｎｔ３ａの分化における効果をＲＮＡおよびタンパク質レベルで確認するため、次を解析する。ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ）、Ｃ／ＥＢＰ２（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質２）およびＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質２）のｍＲＮＡならびにＧＬＵＴ４（グルコーストランスポーター）のタンパク質発現。図１０Ａに示されている通り、Ｗｎｔ３ａおよびＤＫＫ１による処理はＷｎｔ３ａの効果を逆行させ、したがってこれらの試料において分化マーカーのｍＲＮＡ発現レベルは増加する。図１０Ｂは、Ｗｎｔ３ａ単独による処理と比べてＷｎｔ３ａおよびＤＫＫ１がＧＬＵＴ４タンパク質発現を上昇させることを示す。
【実施例２４】
【０４０４】
ＤＫＫ１が脂肪細胞分化におけるＷｎｔ３ａの阻害効果を逆行できるという、実施例２３との一致を確認した後、続いてＤＫＫ１阻害抗体ＭＯＲ４９１０がＷｎｔ３ａの効果を回復できるか試験する。細胞に対し１０ｎｇ／ｍｌの組換えＷｎｔ３ａ、１μｇ／ｍｌのＤＫＫ１タンパク質ならびに１マイクログラム／ｍｌおよび２．５マイクログラム／ｍｌのＭＯＲ４９１０を含む分化培地で細胞を処理する。これらの細胞が分化するにつれての形態学的変化をモニターし、分化マーカーのｍＲＮＡ発現レベルおよびＧＬＵＴ４タンパク質発現を解析する。
【０４０５】
実施例２１に記載されている通りに細胞を培養する。４、５、６および７日目に撮像して細胞分化における形態学的差異を示す。以前に観察された通り、Ｗｎｔ３ａによる分化の阻害は、１μｇ／ｍｌ  ＤＫＫ１で同時処理することにより完全に逆行する。ＤＫＫ１がＷｎｔ３ａ機能を阻害する能力は、２．５μｇ／ｍｌ  ＭＯＲ４９１０を添加することにより崩壊する。その結果、Ｗｎｔ３ａ単独で処理した細胞と同様に、ＭＯＲ４９１０およびＤＫＫ１で処理した細胞は分化しない。対照は、ＤＫＫ１と組み合わせた、あるいはＷｎｔ３ａおよびＤＫＫ１と組み合わせた対照抗体は効果がないことを示す。
【実施例２５】
【０４０６】
ＭＯＲ４９１０（図１１および図１２における標識「ＢＨＱ８８０」）の分化におけるＲＮＡおよびタンパク質レベルへの効果を、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰ２およびＦＡＢＰ４のｍＲＮＡならびにＧＬＵＴ４のタンパク質発現により確認する。図１１に示されている通り、Ｗｎｔ３ａおよびＤＫＫ１タンパク質と併せたＭＯＲ４９１０は、分化マーカーの発現レベルを抑制する。図１２は、Ｗｎｔ３ａおよびＤＫＫ１と併せたＭＯＲ４９１０はＧＬＵＴ４タンパク質発現を低減させることを示す。
【０４０７】
図１１に示されている通り、Ｗｎｔ３ａ、ＤＫＫ１およびＭＯＲ４９１０（「ＢＨＱ８８０」）で処理した細胞から全ＲＮＡを回収する。分化マーカーＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰ２およびＡＰ２の発現レベルをＱ−ＰＣＲにより決定する。
【０４０８】
図１２に示されている通り、細胞からライセートを調製し、ウエスタンブロッティングによりＧＬＵＴ４レベルを解析する。カラム１  −  添加全くなしにおけるＧｌｕｔ４の発現。カラム２  −  ３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞においてＷｎｔ３ａはＧｌｕｔ４の発現を遮断する。カラム３  −  Ｗｎｔ３ａに加えたＤＫＫ−１の添加はＷｎｔ３ａの効果を遮断し、Ｇｌｕｔ４の発現をもたらす。カラム４  −  ＤＫＫ−１およびＷｎｔ３ａの組み合わせにＩｇＧを加えてもＧｌｕｔ４の発現に影響しない。カラム５  −  細胞へのＤＫＫ−１およびＩｇＧの添加は、対照を超えるＧｌｕｔ４レベルを誘導する。カラム６および７  −  １ｕｇ／ｍｌおよび２．５ｕｇ／ｍｌのＢＨＱ８８０の添加は、Ｗｎｔ３ａ＋ＤＫＫ−１に応じたＧｌｕｔ４発現の用量依存的遮断をもたらす（レーン３、６および７を比べる）  −  Ｇｌｕｔ４のバンドは強度が徐々に減少する。全カラムにおいて、アクチンは発現変動が僅かであることを示し、これはタンパク質ロード量がカラム（レーン）間で相対的に一定であることを暗示する。
【０４０９】
【表２４−１】
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【表２４−２】
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【表２４−３】
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【０４１０】
均等物
本発明の具体的な実施形態の上記の詳細な説明から、新規の抗体およびその免疫学的断片が記載されていることが明らかであるはずである。本明細書において特定の実施形態が詳細に開示されているが、これは、ほんの一例として例示の目的でなされている。特に、本発明の趣旨および範囲を逸脱せずに、本発明に対して様々な置換、変更および改変を行うことができることが、本発明者によって企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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