(57)【要約】  本発明は、ＨＣＶ感染の治療的処置および予防のための医薬としてのモノクローナル抗体ｅ２０またはその機能的フラグメントに関する。ｅ２０抗体は、既知のＨＣＶ遺伝子型の全てに結合することができ、該ウイルスに対し、特に遺伝子型Ｉａ、Ｉｂ、２ａおよび４に対し、強力な中和活性を示す。モノクローナル抗体ｅ２０またはその機能的フラグメント、および医薬上許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む、ＨＣＶ感染の治療および予防のための医薬組成物も記載される。
2012513457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ感染の治療的処置および予防のための医薬としての、複数の異なるＨＣＶ遺伝子型由来のＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質を結合することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１に対し少なくとも９０％同一の配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域、および配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２に対し少なくとも９０％同一の配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３、４、５および６由来のＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質を結合することができる、請求項１記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
フルサイズの免疫グロブリン、または少なくとも１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域を含む免疫グロブリンフラグメントである、請求項１または２記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
フラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＣＤＲ（相補性決定領域）、または重鎖および軽鎖の両方の可変領域またはＣＤＲを含む１本鎖抗体、または免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域由来のＣＤＲフラグメントの１以上のコピーを含む足場から選択される、請求項３記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
遊離形態である、請求項１〜４のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
イン・ビボでの持続性を調節し、体内分布を促進または制限し、タンパク質分解剤に対する感受性を減少させ、抗原性を減少させ、細胞毒性能を増加させ、および／または体液および組織における検出を容易にすることができる分子とコンジュゲートした、請求項１〜４のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
特定の組織、細胞または可溶性タンパク質構造に対して抗体を標的化することができる特定の全長免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントと融合した、請求項１〜６のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
医薬上有効量の請求項１〜７のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む、ＨＣＶ感染の治療的処置および予防のための医薬組成物。
【請求項９】
非経口、経口、点眼、局所、局所領域、浣腸またはエーロゾル投与に適当な医薬投与形態における、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
注射溶液または懸濁液、注入液、錠剤、カプセル、クリーム、軟膏、ローション、または座剤の形態における、請求項８または９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＨＣＶ感染の治療的処置および予防のための医薬を製造するための、請求項１〜７のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメントの使用。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項記載のモノクローナル抗体のイディオタイプに特異的に結合することができる抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療的処置および予防のための医薬としてのＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質に対するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、ペリカプシド（pericapsid）および１本鎖ＲＮＡを有するウイルスであり、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）ファミリーに属している。該ウイルス種は、種々のＨＣＶ単離株の間に観察される遺伝的相違点に基いて、６個の異なる遺伝子型（その各々は番号で表される）に類別される。次に、各遺伝子型は、多くのサブタイプ（その各々は文字で表される）を含む。種々のＨＣＶ遺伝子型の発生および分布は、世界中で異なる。ヨーロッパにおいて、優勢な遺伝子型は１ｂであるが、北アメリカでは遺伝子型１ａが優勢である。このような特徴は、現在最も用いられる処置であるアルファインターフェロンとリバビリン（ribavirin）の組合せに基づく治療に応答する可能性の決定に寄与するので、遺伝子型を決定することは臨床的観点から重要である。実際、遺伝子型１および４は、遺伝子型２、３、５および６よりもインターフェロンに基づく治療に応答しない。
【０００３】
今日までに、Ｃ型肝炎ウイルスに対して実際に有効であることが証明されたワクチンおよび免疫療法はない。ＨＣＶの抗原性構造の高い変動性は、これまでに、該ウイルスを中和することができると同時に、異なるウイルス遺伝子型に対する交差反応性が付与された抗体の開発を妨げてきた。かくして、このような特徴が与えられ、したがって、ＨＣＶ感染の治療および予防において実際に有効な抗ＨＣＶ抗体が求められる。
【０００４】
ＨＣＶに向けられた抗体は、先行文献に記載されている。例えば、Ｂｕｒｉｏｎｉら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  ２８，  ｎ．  ３，  １９９８は、異なるウイルス遺伝子型由来の糖タンパク質に結合することができる（交差反応性）ＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質（ＨＣＶ  Ｅ２）に特異的な５つの組み換えヒト抗体フラグメント（Ｆａｂ）をコードしている配列のクローニングおよび特徴付けについて記載する。該文献に記載されるＦａｂのなかには、ｅ２０と称される抗体フラグメントがある。Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９８（上掲）は、ｅ２０がＨＣＶ  Ｅ２結合を中和すること（ＮＯＢ活性）において、高い最小活性を有することを記載する。しかしながら、高いＮＯＢ活性にもかかわらず、国際特許出願ＷＯ  ０３／０６４４７３では、該ｅ２０抗体フラグメントは高濃度（８０μｇ／ｍｌ）であっても、ウイルス感染を中和できないと記載される（特に、ＷＯ  ０３／０６４４７３の第１６頁、８−１０行参照）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、今回、驚くべきことに、先行文献、特にＷＯ  ０３／０６４４７３の記載とは対照的に、ｅ２０フラグメントがイン・ビトロでの種々のＨＣＶ遺伝子型による感染を有効に中和できることを見出した。これにより、特にＨＣＶ中和およびＨＣＶ感染細胞の排除に適し、かつ、ＨＣＶ感染の免疫療法および免疫予防のための医薬として有用なｅ２０を作製する。
【０００６】
かかる結果の到達には、長く複雑な実験作業を要した（下記の実験セクションにおいて詳細に説明する）。
【０００７】
細心の合成において、本発明者らによって実施された実験作業により、ｅ２０抗体フラグメントが以下の予想外の特徴を示すことが明らかにされた。
【０００８】
−  ｅ２０抗体フラグメントは、遺伝子型１ｂに属するＨＣＶ株による自然感染の過程において生じるが、既知のＨＣＶ遺伝子型の全て（特に、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３、４、５および６）由来の糖タンパク質に結合することができ、それ自体、幅広い交差反応性である。
−  ｅ２０抗体フラグメントは、ＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶｐｐ）に基づく中和アッセイによって測定した場合、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａおよび４に対して特に高い中和能を有する。
−  ｅ２０のＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質に対する結合に欠くことのできない特定のアミノ酸残基は、また、ＨＣＶ感染においても必須であり、このことは、ｅ２０結合を回避することができる変異体が、同時に、減少した複製能を備えていることを示唆する。
【０００９】
上記の特徴は、明らかに、ＨＣＶ感染の免疫療法および免疫予防のための医薬としてｅ２０抗体フラグメントを用いるという目的に有利である。
【００１０】
かくして、本発明の第１の目的は、ＨＣＶ感染の治療的処置および予防のための医薬としての、複数の異なるＨＣＶ遺伝子型由来のＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質を結合することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１に対し少なくとも９０％同一の配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域、および配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２に対し少なくとも９０％同一の配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。
【００１１】
さらに好ましい配列同一性パーセンテージは、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり、ここに、「少なくとも」なる表現は、記されるパーセンテージの各々についていう。
【００１２】
本発明の１の具体例において、重鎖可変領域は、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされ、軽鎖可変領域は、配列番号４によってコードされる。
【００１３】
「抗体」なる語は、全長免疫グロブリンならびに軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＣＤＲ（相補性決定領域）、または重鎖および軽鎖の両方の可変領域またはＣＤＲを含む１本鎖抗体、または免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域由来のＣＤＲフラグメントの１以上のコピーを含む足場（scaffold）のいずれかのクラスを示すことを意図する。これは、ＳｃＦｖｓと称する機能的抗体フラグメント、ダイアボディ（diabodies）、ＶＨＨｓまたは単離された軽鎖もしくは重鎖を包含する。「抗体」なる表現は、さらに、改善されたアフィニティー、安定性および／または組み換え生産性を有するＶＨ／ＶＬ組合せを確立するために、軽鎖可変領域についてのシャッフリング過程においてｅ２０抗体フラグメント可変領域の配列を用いることによって生成されることができる抗体を包含する。「抗体」なる表現は、また、特定の組織、細胞または可溶性タンパク質構造に対してｅ２０抗体フラグメントまたは免疫グロブリンを標的化することができる、特定の全長免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントに融合したいずれかの型の全長免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントを包含する。本発明のモノクローナル抗体は、好ましくはヒトである。
【００１４】
本発明で使用される抗体は、遊離形態またはコンジュゲート形態（conjugated form）であってもよい。コンジュゲート形態は、イン・ビボでの持続性を調節し、体内分布を促進または制限し、タンパク質分解剤に対する感受性を減少させ、抗原性を減少させ、細胞毒性能を増加させ、および／または体液および組織における検出を容易にすることができる分子とコンジュゲートした上記の抗体である。コンジュゲーション（conjugation）に適当な分子の非限定的な例は、ヒト血清アルブミン、マルトース結合性タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ファージコートｐ３またはｐ８タンパク質、ペプチド、糖類、ＰＥＧまたはＰＥＧ様分子、動物由来、植物由来または微生物由来の毒素、サイトカイン、酵素、化学発光化合物、生物発光化合物、金属原子、放射性同位元素、蛍光化合物、タグ付加基、またはリン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化もしくは細胞内タンパク質分解切断の基質を包含する。コンジュゲーションを容易にするために、抗体Ｃ末端またはＮ末端を、例えば、付加的なアミノ酸残基、例えばジスルフィド架橋を形成することができる１以上のシステイン残基を挿入することによって、修飾することができる。本発明で使用される抗体は、また、ヒト赤血球または他の細胞キャリヤーに、特異的処方に、または徐放系（例えば、限定するものではないが、リポソーム、デンドリマー、ミクロソーム、ナノ粒子、マイクロカプセル、ウイルスベクター等）に連結させることができる。
【００１５】
本発明の別の目的は、医薬上有効量の上記のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むＨＣＶ感染の治療的処置および予防のための医薬組成物である。
【００１６】
本発明の組成物は、ＨＣＶに感染したか、または感染の危険性のある対象に投与されうる。非経口、経口、点眼、局所、局所領域、浣腸またはエーロゾル投与を包含するいずれかの適当な投与経路を用いればよい。非経口投与は、筋内注射、静脈内注射、リンパ管内注射、皮下注射または皮内注射および注入を包含する。
【００１７】
本発明の組成物は、選択された投与経路に適当ないずれかの医薬形態において、例えば、注射溶液または懸濁液、注入液、錠剤、カプセル、クリーム、軟膏、ローション、または座剤の形態で調製されうる。
【００１８】
本発明の組成物は、有効成分として上記の抗体またはそのフラグメント、ならびに当業者に既知の適当な医薬賦形剤、担体または希釈剤を含む。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、上記の抗体またはそのフラグメントのイディオタイプに特異的に結合することができる抗イディオタイプ抗体である。本発明の抗イディオタイプ抗体は、当業者に自体公知の抗イディオタイプ抗体を得るための常法によって得ることができる。
【００２０】
本発明は、さらに、説明目的のためだけに提供される下記の実験セクションにおいて、添付の図を参照して詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、異なる遺伝子型由来のＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質に対するｅ２０の結合を示す。該データは、陽性蛍光細胞のパーセンテージとして表される。
【図２】図２は、遺伝子型１ａ由来のＥ１−Ｅ２糖タンパク質：ＵＫＮ１Ａ２０．８（ａ）；Ｅ１Ｅ２遺伝子型１ｂ：ＵＫＮ１Ｂ５．２３（ｂ）；Ｅ１Ｅ２遺伝子型２ａ：ＵＫＮ２Ａ１．２（ｃ）；Ｅ１Ｅ２遺伝子型２ｂ：ＵＫＮ２Ｂ１．１（ｄ）；Ｅ１Ｅ２遺伝子型４：ＵＫＮ４．２１．１６（ｅ）を示すウイルス偽粒子を用いることによる、Ｆａｂ  ｅ２０の中和活性を示す。（ｆ）異なる遺伝子型由来のＥ１−Ｅ２（ＵＫＮ１Ａ２０．８、ＵＫＮ１Ｂ５．２３、ＵＫＮ２Ａ１．２、ＵＫＮ２Ｂ１．１；ＵＫＮ３Ａ１３．６、ＵＫＮ４．２１．１６、ＵＫＮ５．１５．１１、ＵＫＮ６．５．８）を示すウイルス偽粒子を用いることによる、１５μｇ／ｍｌでのＦａｂ  ｅ２０の中和活性。
【図３】図３は、ＨＣＶｃｃシステム（遺伝子型２ａ）を用いることによる、ｅ２０および他の抗ＨＣＶ抗体（ｅ１３７、ＡＰ３３）の中和活性を示す。ｅ２０および陰性対照Ｆａｂ（ｃ３３−３）の存在下におけるＪＦＨ−１感染性が、定量的逆転写ＰＣＲによって測定された場合のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼＲＮＡに対して標準化されたウイルス性ＲＮＡの量として表される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
実験セクション
クローニング法
糸状ファージの表面に展示されたランダムコンビナトリアルライブラリーの調製は、高アフィニティーヒトモノクローナル抗体を選択するための非常に強力なツールを示す。実際、ファージディスプレーに基づく選択手法は、極めて用途が広く、交差反応性抗体を選択できるように最適化することができる。特に、ｅ２０は、遺伝子型１ｂに属するＨＣＶ株に持続的に感染した５８歳の女性のＢリンパ球レパートリー由来のＩｇＧ１  Ｆａｂフラグメントとしてクローン化された。交差反応性クローンを選択するために、該患者由来のライブラリーを、異なる遺伝子型、すなわち１ａに属するウイルス単離株由来の組み換えＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質に対するパニング（panning）に付した。簡単に言うと、該アプローチを用いて、自然感染の過程において生じる抗体であって、にもかかわらず、該研究のための選択された患者の免疫系によって決して遭遇することのない異なる糖タンパク質に結合することができる抗体を得ることができた。
【００２３】
重鎖および軽鎖配列の研究
ｅ２０重鎖および軽鎖遺伝子の配列決定およびそれらの変異パターンの研究（表１）は、該抗原に対する該抗体自体のアフィニティーを改善するために、該抗体が体細胞変異過程、すなわち、特異的抗原との連続的接触によって抗体クローンにおいて刺激される過程から得られることを示した。
【００２４】
重鎖に関しては、ｅ２０は、生殖細胞系列遺伝子に対し、８５％より低いヌクレオチド配列相同性を示す。変異パターンは、相補性決定領域（ＣＤＲ）における特異的な偏り（polarisation）を伴う体細胞変異クローンの典型的な分布を示す。ｅ２０結合領域（すなわち、ＣＤＲ３を生じる結合領域）の試験は、これが、ＶＨ１−６９サブファミリーに属するＶ遺伝子（ヒト抗ＨＣＶ体液性応答における高度に示された遺伝子）、Ｄ２−２１サブファミリーに属するＤ遺伝子、およびＪＨ４サブファミリーに属するＪＨ遺伝子から構成されることを示す。
【００２５】
同様に、ｅ２０軽鎖（アイソタイプκ）は、ＣＤＲにおける偏りによって示されるように、体細胞変異過程と一致する変異パーセンテージを示す。結合領域の試験は、ｅ２０軽鎖ＣＤＲ３が、κＶ３−１５サブファミリーに属するκＶ遺伝子、およびκＪ５サブファミリーに属するκＪ遺伝子から生じることを示す。
【００２６】
配列データにより、ｅ２０が人工抗体ではなく、それどころか、該研究のために選択された患者の抗体レパートリーに実際に存在すると結論付けることができる。
【００２７】
表１
【表１−１】
2012513457.tif 000003
【表１−２】
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【００２８】
上記の表１は、生殖細胞系列ならびにｅ２０重鎖ａ）および軽鎖ｂ）における遺伝子Ｖの変異パターンを示す。アミノ酸およびヌクレオチド変異パーセンテージは、ＫａｂａｔおよびＷｕのアラインメント法にしたがって、軽鎖および重鎖についてのＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、重鎖についてのＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ならびに軽鎖についてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を考慮することによって算出された。置換変異（Ｒ）のサイレント変異（Ｓ）に対する比率もまた、報告される。
【００２９】
異なるＨＣＶ遺伝子型由来のＥ２に対するｅ２０結合の評価
Ｆａｂの形態におけるｅ２０フラグメントを、１ｂ（すなわち、ｅ２０の入手元となった患者に感染した株の遺伝子型）および１ａ（すなわち、Ｆａｂをクローン化するために用いられた遺伝子型）以外のＨＣＶ遺伝子型由来のＥ２糖タンパク質を認識する能力について試験した。異なるＨＣＶ遺伝子型から可溶性Ｅ２形態を得るために経験された困難は、別のＦＡＣＳに基づくアプローチの使用を要求した。
【００３０】
簡単に言うと、２９３Ｔヒト上皮腎細胞（ＨＥＫ）を、１０％胎仔ウシ血清、５％非必須アミノ酸、２００ｍＭグルタミン、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成育させた。８０％コンフルエンスに到達するとすぐに、２ｘ１０６ＨＥＫ細胞を１０ｃｍのプレートに播種し、２４時間後、リン酸カルシウムトランスフェクションプロトコールを用いることによって、３μｇのｐｈＣＭＶ−７、異なるＨＣＶ遺伝子型由来のＥ１Ｅ２糖タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後に培地を取り替え、次いで、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。培地を廃棄し、細胞単層をＰＢＳで２回洗浄した。５ｍｌの解離バッファーを加え、細胞を３７℃で５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各プレートから得られたペレットに、１．２ｍｌの固定化試薬を加えた。該細胞を室温で１５分間インキュベートした。該試料を、２％胎仔ウシ血清（ＦＰＢＳ）を補足した５ｍｌのＰＢＳ中で洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００３１】
１００μｌの浸透化試薬を、５０μｌのＦａｂ  ｅ２０（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）と共にペレットに加えた。同様のプロトコールを非トランスフェクト細胞（対照として用いられる）についても行った。室温で４０分間インキュベーション後、該試料を５ｍｌのＦＰＢＳ中で洗浄し、５０μｌのＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体を該ペレットに加えた。細胞を室温で２０分間インキュベートし、５ｍｌのＦＰＢＳで２回洗浄した。最後に、上清を除去し、ペレットを３００μｌのＦＰＢＳ中に再懸濁し、細胞をＦＡＣＳによって分析した。結合活性は、Ｆａｂ  ｅ２０を用いない細胞よりも高い蛍光レベルを有する細胞のパーセンテージから得られた陽性蛍光細胞のパーセンテージとして表された。非構造性ＨＣＶ抗原（ＮＳ３）に特異的な組み換えヒトＦａｂ（ｃ３３−３）を各実験における陰性対照としてインキュベートした。
【００３２】
該アプローチは、Ｆａｂ  ｅ２０が、対照Ｆａｂで得られたよりも高い蛍光細胞パーセンテージで、発現したＨＣＶ  Ｅ２遺伝子型の全て（１ａ；１ｂ；２ａ；２ｂ；３；４；５；６）を認識することができたことを示した。結果を図１に示す。
【００３３】
ＣＤ８１結合領域内で変異したＨＣＶ  １ａ由来のＥ２糖タンパク質に対するｅ２０結合の評価
Ｆａｂ  ｅ２０はまた、ＣＤ８１結合およびＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶｐｐ）の感染性に重要であると記載される保存領域内で変異したＨ７７（遺伝子型１ａ）由来のＥ１Ｅ２のパネルに対して試験された。該領域中の各保存位置は、アラニンにおいて変異した。これらの置換の全てが、下記のＨＣＶｐｐアッセイにおいて感染性の喪失をもたらした。Ｆａｂ  ｅ２０  ＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質の結合は、これらの重要な変異のいくつかによって排除される（表２）。
【００３４】
表２に記載のデータは、ｅ２０が、ウイルス感染に欠くことのできないＥ２領域に結合することを示唆する。これらのデータはまた、ｅ２０が、ＡＰ３３結合［異種抗体を用いる免疫療法が実行可能ではないこと、およびヒトのレパートリーにおける同様な抗体の存在が極めて稀であることを考慮すると（Ｔａｒｒら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ８８：２９９１．  ２００７）、最大の交差反応性を有するが、ワクチン医薬の設計の鋳型としてあまり適さず、また、免疫療法における使用にはあまり適さない中和性抗ＨＣＶ抗体］に重要な領域に結合することを確認する。また、より興味深いことに、該分析は、明らかに、ｅ２０によって認識されない変異体の全てが偽ウイルスモデルにおける標的細胞の感染を可能としないことを示した。
【００３５】
表２
【表２−１】
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【表２−２】
2012513457.tif 000006
【００３６】
上記の表２は、ｅ２０がＨ７７変異体（遺伝子型１ａ）由来のＥ１Ｅ２に結合することを示す。結合活性は、野生型Ｈ７７タンパク質で測定した値に対するパーセンテージとして表される。
【００３７】
異なる遺伝子型由来のＨＣＶ偽粒子に対するｅ２０中和活性の評価
次いで、ＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶｐｐ）に基づく中和アッセイにおいて、Ｆａｂ  ｅ２０中和活性を証明した。
【００３８】
簡単に言うと、２９３Ｔヒト上皮腎細胞（ＨＥＫ）およびＨｕｈ−７ヒト肝癌細胞を、１０％胎仔ウシ血清、５％非必須アミノ酸、２００ｍＭグルタミン、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）を補足したＤＭＥＭ中で成育させた。８０％コンフルエンスに到達するとすぐに、２ｘ１０６ＨＥＫ細胞を１０ｃｍのプレートに播種し、２４時間後、８μｇのマウス白血病ウイルスベクター（ＭＬＶ）Ｇａｇ−Ｐｏｌ、８μｇのルシフェラーゼをコードしているＭＬＶトランスファーベクター、および３μｇの異なるＨＣＶ遺伝子型由来のＥ１Ｅ２糖タンパク質をコードしている全長ｐｈＣＭＶ−７ａ発現ベクターで共トランスフェクトした。１日後、トランスフェクション培地を５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有する新鮮な培地に取り替えた。該細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。標的細胞（Ｈｕｈ−７）を２４ウェルプレート中、１ウェルあたり２．５ｘ１０４で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。培地交換の２４時間後、ＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶｐｐ）を収集し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５μｍ孔サイズ膜でろ過し、中和アッセイに用いた。
【００３９】
特に、６０μｌのＨＣＶｐｐ−含有培地を９０μｌの種々の濃度のＦａｂ  ｅ２０と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。かかる混合物をＨｕｈ−７標的細胞に加え、該細胞を３７℃で３時間インキュベートした。最後に、接種物を除去し、１ｍｌの新鮮な培地を各ウェルに加え、細胞を３７℃で４日間インキュベートした。該細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、製造者の指示に従って、１００μｌの溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。細胞溶解物を９６ウェルプレートに移し、１００μｌの基質／バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。相対的光単位（ＲＬＵ）において与えられるルミネセンス活性（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎプレートリーダー，  Ｈｉｄｅｘ）を測定することによって、細胞の感染を分析した。中和活性は、得られたルミネセンスを、競合が可能な抗体の不在下でＨＣＶｐｐウェルにおいて検出された値（ｎｅｇ）と比較することによって、感染パーセンテージとして決定した。非構造性ＨＣＶ抗原（ＮＳ３）に特異的な組み換えヒトＦａｂ（ｃ３３−３）を各実験における陰性対照として含めた。
【００４０】
該アプローチは、ｅ２０がＨＣＶ遺伝子型１ａおよび４を強力に中和できることを示した。Ｅ２０は、７．５μｇ／ｍｌ濃度にて遺伝子型１ａに対し５０％中和活性および１５μｇ／ｍｌにて遺伝子型４に対し７５％阻害を示す（図２ａ、２ｅおよび２ｆ）。しかしながら、該抗体は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂおよび２ａも強力に中和することができる。より詳細には、１５μｇ／ｍｌにて、ｅ２０は、遺伝子型１ｂおよび２ａに対し、各々４０％中和および７５％感染性を示す（図２ｂ、２ｃおよび２ｆ）。最終的に、ｅ２０は、遺伝子型２ｂ  Ｅ１Ｅ２糖タンパク質を有するＨＣＶｐｐをより低い程度に中和することができ、その結果、１５μｇ／ｍｌで２０％阻害を示す（図２ｄおよび２ｆ）。
【００４１】
細胞培養において成育したＨＣＶ株（遺伝子型２ａ、ＪＦＨ１株）のｅ２０中和活性
ＨＣＶ  ｅ２０の中和活性は、また、ＨＣＶｃｃモデルシステム（ＨＣＶ細胞培養）を用いることにより、ＨＣＶ遺伝子型２ａ（ＪＦＨ１）由来の染色体中に組み込まれたｃＤＮＡを含有し、感染性ウイルスを非常に生産する安定なヒト肝癌細胞系統を用いることによって試験した（図３）。かかるシステムは、感染性Ｃ型肝炎ウイルス株を用いることによって、中和活性の評価を可能にする。該実験のセットにおいて、種々の濃度のＦａｂ  ｅ２０を、ＨＣＶｃｃアッセイにおいて生成したウイルスを含有する培地と共にインキュベートした。３時間後、該混合物を標的細胞（Ｈｕｈ７．５）に加えた。ＨＣＶ陽性鎖ＲＮＡのレベルを測定することによって、感染性を評価した。Ｆａｂ  ｅ２０は、１μｇ／ｍｌという非常に低い濃度でＨＣＶ遺伝子型２ａの感染性を完全に排除することができるので、強力な中和活性を示した。Ｆａｂ  ｅ２０中和活性は、今日までに記載された最も強力な交差中和抗体の１つであるマウスＡＰ３３  ＩｇＧモノクローナル抗体に匹敵する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年7月20日(2011.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2012513457.tif 000010
2012513457.tif 000011
2012513457.tif 000012