(57)【要約】  本願は、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質をコードし且つ分泌する細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又は任意の更に好適な細胞に言及する。そのような眼疾患には、緑内障及びその他の視神経障害、網膜疾患、特に、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、及び糖尿病性網膜症等が挙げられる。本明細書で使用される細胞は、好ましくはコアと少なくとも１層の表面層を含む（球状）マイクロカプセルに封入されて、治療される患者の免疫系の応答を妨げる。本願はまた、そのような眼疾患の治療のための（（医薬）組成物の調製のための）本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療のためのこれら（球状）マイクロカプセル又はそのような因子の使用にも言及する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼疾患又は眼障害の眼内治療に使用するための、神経保護因子、抗血管新生因子、及びそれらのフラグメント又は変異体から選択される少なくともいずれかをコードし且つ分泌するように操作されている細胞であって、前記細胞が球状マイクロカプセルに封入されていることを特徴とする細胞。
【請求項２】
神経保護因子が、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド、及びそれらのフラグメント又は変異体から選択され、抗血管新生因子が、エンドスタチン及びそのフラグメント又は変異体から選択される請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
球状マイクロカプセルが、球状コアと少なくとも１層の表面コーティング層とを含み、
前記球状コアが、架橋ポリマーと、神経保護因子、抗血管新生因子、及びそれらのフラグメント又は変異体から選択される少なくともいずれかをコードし且つ分泌する細胞との混合物を含むか、又はそれから成り、
前記少なくとも１層の表面コーティング層が架橋ポリマーを含むか、又はそれからなる請求項１から２のいずれかに記載の細胞。
【請求項４】
球状マイクロカプセルが、約１２０μｍ〜約８００μｍの総径、約１２０μｍ〜約７００μｍの総径、約１５０μｍ〜約６５０μｍの総径、約１６５μｍ〜約６００μｍの総径、約１２０μｍ〜約３００μｍの総径、約１５０μｍ〜約２５０μｍの総径、約１６５μｍ〜約２２５μｍの総径、又は約１８０μｍ、１８５μｍ、１９０μｍ若しくは２００μｍの総径を含む約１８０μｍ〜約２００μｍの総径を有する請求項１から３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
細胞が、神経保護因子、抗血管新生因子、及びそれらのフラグメント又は変異体から選択される少なくともいずれかをコードし且つ分泌する、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト間葉系幹細胞に由来する分化した細胞、同種異系細胞又は自己細胞である請求項１から４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
コアの架橋ポリマー及び少なくとも１層の表面コーティング層の架橋ポリマーの少なくともいずれかが、化学的に同一のポリマーを同一の濃度又は異なる濃度で含み、前記ポリマーが更に、それぞれ異なる分子量を有していてもよいし、それぞれ異なる形態で架橋されていてもよいし、又はそれぞれ異なる分子量を有し且つそれぞれ異なる形態で架橋されていてもよい請求項３から５のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
架橋ポリマーが、生体ポリマー及びアルギネートからなる群から選択される請求項３から６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
球状マイクロカプセルが、１層、２層、３層、４層、又は５層以上の表面コーティング層を含む請求項３から７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
球状マイクロカプセルが、ポリカチオンからなる更なる外部表面コーティング層を含む請求項３から８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
神経保護因子及びそのフラグメント又は変異体の少なくともいずれかが、
（ａ）ＧＬＰ−１のａａ７−３５を含むペプチド；
（ｂ）ＧＬＰ−１のａａ７−３６又はＧＬＰ−１（７−３６）アミドを含むペプチド；
（ｃ）ＧＬＰ−１のａａ７−３７を含むペプチド；
（ｄ）式ＩＩ：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
（式中、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；Ｘａａ１６は、Ｖａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５は、Ａｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７は、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３は、Ｖａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓ又はアミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は非存在である）で表される配列を含むペプチド；
（ｅ）式ＩＩＩ：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
（式中、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は非存在である）で表される配列を含むペプチド；及び
（ｆ）前記（ａ）から（ｅ）のペプチドのいずれかと少なくとも８０％の同一性を示すペプチド、
からなる群から選択されるＧＬＰ−１ペプチドである請求項１から９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
神経保護因子及びそのフラグメント又は変異体の少なくともいずれかが、構成成分（Ｉ）及び構成成分（ＩＩ）を含むＧＬＰ−１融合ペプチド又はそのフラグメント若しくは変異体であり、Ｎ−末端側の前記構成成分（Ｉ）が、
（ａ）ＧＬＰ−１（７−３５、７−３６又は７−３７）配列；
（ｂ）配列番号１にで表される配列；
（ｃ）式ＩＩ：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
（式中、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；Ｘａａ１６は、Ｖａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５は、Ａｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７は、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３は、Ｖａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓ又はアミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は非存在である）で表される配列を含む又はそれからなるペプチド；
（ｄ）式ＩＩＩ：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
（式中、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は非存在である）で表される配列を含む又はそれからなるペプチド；及び
（ｅ）前記（ａ）から（ｄ）の配列のいずれかの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
からなる又はそれを含むペプチドの群から選択され、
Ｃ末端側の前記構成成分（ＩＩ）が、少なくとも９個のアミノ酸のペプチド配列及びその機能的なフラグメント又は変異体から選択される請求項１から９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２】
ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）が、
（ａ）配列番号２２（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩ）、配列番号２７（ＤＦＰＥＥＶＡＩ）、配列番号２８（ＲＤＦＰＥＥＶＡ）、配列番号２９（ＲＲＤＦＰＥＥＶ）、配列番号３０（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩ）、配列番号３１（ＡＤＦＰＥＥＶＡ）、配列番号３２（ＡＡＤＦＰＥＥＶ）で表される配列、及び前記配列番号２２、２７、２８、２９、３０、３１又は３２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むペプチド配列；
（ｂ）配列番号２３（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ）、配列番号２４（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ）、配列番号３３（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ）、配列番号３４（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ）で表される配列、及び前記配列番号２３、２４、３３又は３４と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むペプチド配列；及び
（ｃ）配列番号２（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号３（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号３５（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、又は配列番号３６（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）で表される配列、及び配列番号２、３、３５又は３６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むペプチド配列、
から選択される請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）と構成成分（ＩＩ）とが、直接連結される又はリンカー配列を介して連結される請求項１１から１２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１４】
ＧＬＰ−１融合ペプチドが、構成成分（Ｉ）及び構成成分（ＩＩ）に代えて又はこれらに加えて構成成分（ＩＩＩ）を含有し、前記構成成分（Ｉ）及び前記構成成分（ＩＩＩ）が前記融合タンパク質に存在する場合には、前記構成成分（ＩＩＩ）は、前記構成成分（Ｉ）のＣ末端及び前記構成成分（Ｉ）のＮ末端の少なくともいずれかに連結されていてもよく、前記構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）が前記融合タンパク質に存在する場合には、前記構成成分（ＩＩＩ）は、前記構成成分（ＩＩ）のＣ末端及び前記構成成分（Ｉ）のＮ末端の少なくともいずれかに連結されていてもよい請求項１１から１３のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５】
構成成分（ＩＩＩ）が、少なくとも４個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０個の追加のアミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含むか、又は
前記構成成分（ＩＩＩ）が、
（ａ）プログルカゴン中のようなＧＬＰ−２のＮ末端配列；
（ｂ）ＧＬＰ−１（５−３７、６−３７又は７−３７）配列；
（ｃ）式ＩＩ：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
（式中、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；Ｘａａ１６は、Ｖａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５は、Ａｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７は、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３は、Ｖａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓ又はアミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は非存在である）で表される配列を含むペプチド；
（ｄ）式ＩＩＩ：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
（式中、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は非存在である）で表される配列を含むペプチド；又は
（ｅ）前記（ａ）から（ｄ）の配列のいずれかの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
の少なくとも４個、好ましくは少なくとも１０個、更に好ましくは少なくとも２０個の追加のアミノ酸残基を含むか、又は
構成成分（ＩＩＩ）が、配列番号４若しくは５の配列、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む又はそれから構成される請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
ＧＬＰ−１融合ペプチドが、構成成分（ＩＶ）としてキャリアタンパク質、特にトランスフェリン又はアルブミンを追加的に含む又はそれから構成される請求項２から１５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１７】
ＧＬＰ−１融合ペプチドが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、又は配列番号４８の配列、及び配列番号６、７、８、１０、１１、１２、２６、３７から４８と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるペプチド配列を含む又はそれからなる請求項２から１６のいずれかに記載の細胞。
【請求項１８】
球状マイクロカプセルのコアにおける細胞が、抗アポトーシス因子、増殖因子、ＶＥＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、抗血小板薬、抗凝固薬、及び抗血栓薬からなる群から選択される因子を追加的に分泌するようにされる操作；ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＧＤＮＦ、ＮＴ３及びＭＣＰ１から選択される、治療レベルでカプセルを通じて放出されるパラクリン因子としての内因性のタンパク質又はペプチドを分泌するようされる操作；及び自殺遺伝子を追加的に含有するようにされる操作；の少なくともいずれかの操作が施されている請求項１から１７のいずれかに記載の細胞。
【請求項１９】
眼疾患及び眼障害が、網膜色素変性症（ＲＰ）、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）、網膜症、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、血管内皮及び周皮細胞の異常、網膜血管閉塞、小柱網を含む緑内障から選択される網膜疾患を含む網膜の変性が原因で起きる眼疾患及び眼障害、及び小柱網の変性を含む視神経症、及び角膜内皮の異常、眼の血管新生による眼疾患、脈絡膜の血管新生、黄斑変性による脈絡膜の血管新生、持続性及び再発性の脈絡膜の血管新生、ヒストプラスマ症及び病的近視による脈絡膜の血管新生、網膜色素線条症から生じる脈絡膜の血管新生、前部虚血性視神経症、細菌性心内膜炎、ベスト病、バードショット網膜脈絡膜症、脈絡膜血管腫、脈絡膜母斑、脈絡膜非潅流、脈絡膜骨腫、脈絡膜破裂、先天性脈絡膜欠如、慢性網膜剥離、網膜の欠損、ドルーゼン、内因性カンジダ眼内炎、網膜色素上皮の乳頭外過誤腫、黄色斑眼底、特発性斑紋穴、悪性黒色腫、膜増殖性糸球体腎炎（ＩＩ型）、金属眼内異物、朝顔症候群、多発一過性白点症候群（ＭＥＷＤＳ）、鋸状縁における血管新生、手術用顕微鏡のバム、視神経頭ピット、光凝固、点状脈絡膜内層症、風疹、サルコイドーシス、匐行性又は地図状の脈絡膜炎、網膜下の体液排出、傾斜乳頭症候群、トキソプラズマ性脈絡網膜炎、結核、又はフォークト・小柳・原田症候群、糖尿病性網膜症による血管新生、非糖尿病性網膜症、静脈分枝閉塞症、中心網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、周中心窩毛細血管拡張症、鎌状赤血球網膜症、イールズ病、網膜血管炎、フォン・ヒッペル・リンドウ病、放射線網膜症、網膜凍結傷害、網膜色素変性症、網膜脈絡膜コロボーマ、単純ヘルペス性角膜炎による角膜の血管新生、角膜潰瘍、角膜移植、翼状片、又は外傷を含む請求項１から１８のいずれかに記載の細胞。
【請求項２０】
治療される患者の眼、眼の組織又は領域、治療される患者の眼の冒された領域又は組織、網膜、虹彩、虹彩から２ｍｍ〜３ｍｍ離れた領域又は部位、結膜及び強膜をやや乱された後の虹彩から２ｍｍ〜３ｍｍ離れた領域又は部位、眼の硝子体腔、眼又は網膜の任意の表面、虹彩又はその組織又は周辺領域、前眼房、水晶体嚢、網膜下腔、脈絡膜上腔、眼の内部、及び眼の任意の腔から選択される投与部位に、球状マイクロカプセルが埋め込まれる又は注入される請求項１から１９のいずれかに記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子及び／又はその他のタンパク質又はタンパク質様の物質をコードし且つ分泌する細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又は更に好適な細胞に関する。そのような眼疾患として、緑内障及びその他の視神経障害、網膜疾患、特に網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）及び糖尿病性網膜症などが挙げられる。本明細書で使用される細胞は、好ましくはコアと少なくとも一層の表面層とを含む（球状）マイクロカプセルに封入されて、治療を受ける患者の免疫系の応答を妨げる。本願はまた、そのような眼疾患の治療のための（（医薬）組成物を調製するための）、本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療のために用いられるこれら（球状）マイクロカプセル又はそのような因子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
眼疾患又は眼障害は、これらの疾患又は障害が、一部の患者で視覚の重度の損傷及び失明さえ招く場合があるので、特に関心が持たれる。それら眼疾患又は眼障害の中で特に関心が持たれるものとしては、緑内障及びその他の視神経障害、及び網膜障害などが挙げられる。そのような網膜障害には、とりわけ、特に網膜色素変性症（ＲＰ）、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）、黄斑浮腫、特に他の理由による黄斑浮腫、網膜血管閉塞、高血圧性網膜症及び糖尿病性網膜症などが挙げられる。
【０００３】
上記の文脈で、網膜色素変性症（ＲＰ）は遺伝的な眼の状態の群として分類される。網膜色素変性症の症状の進行は、一般的に数年又は何十年もの間にわたって、夜間失明が視野狭窄に先行する。網膜色素変性症患者の多くは、４０代又は５０代まで法律上の失明には至らず、生涯にわたって幾ばくかの視力を保つ。そうでない患者は、早ければ小児期に網膜色素変性症から完全な失明に至ることもある。網膜色素変性症は、遺伝性障害の一群である遺伝性網膜ジストロフィの最も一般的な形態の１つであり、光受容細胞の進行性の喪失、網膜の光受容体（ロッドとコーン）の異常及び／又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の異常を特徴とし、進行性の視力低下を招き得る。これに冒された個体は先ず、不完全な暗所適応又は夜盲症（夜間失明）を経験し、次いで周辺視野の縮小（視野狭窄として知られる）を経験し、特定の疾患によっては、疾患の経過の後期に中心視野を喪失する。進行性の難聴を併発した網膜色素変性症はアッシャー症候群と呼ばれる。遺伝性網膜ジストロフィの一形態として、複数の遺伝子が、突然変異を起こした際、網膜色素変性症の表現型の原因となると想定されている。１９８９年、微光条件下での視力を可能にする視覚伝達カスケードであって、本質的な役割を担う色素である、ロドプシン遺伝子の突然変異が特定された。それ以来、この遺伝子について１００を超える突然変異が見つけられ、網膜変性のあらゆる種類の１５％の原因となっている。これらの突然変異のほとんどは、ミスセンス変異であり、通常は遺伝性である。更に、ロドプシン遺伝子は光受容体の外側セグメントの主要タンパク質をコードする。研究によって、この遺伝子における突然変異は、網膜色素変性症の常染色体形態のおよそ２５％に関与することが示されている。更に、タンパク質の円板内ドメインにおけるＰｒｏ２３Ｈｉｓの突然変異が１９９０年に初めて報告されて以来、網膜色素変性症に関連するオプシン遺伝子で１５０にのぼる突然変異が今日までに報告されている。これらの突然変異は、オプシン遺伝子全体にわたって見つけられ、タンパク質の３つのドメイン（円板内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメイン）に沿って分布する。遺伝性の原因とは別に、網膜色素変性症の原因となる突然変異は、例えば、タンパク質の誤った折り畳み又は分子シャペロンの関与のような生化学的事象によることもあり得る。現在のところ、網膜色素変性症を完全に治癒させる治療法は存在しない。ビタミンＡによる治療が最も一般的な治療法の代表であるとしても、例えば、１５，０００ＩＵのパルミチン酸ビタミンＡの日々の摂取によって疾患の進行を抑えるに過ぎない、というものにも疑問の余地がある。更なる治療には、網膜移植、人工網膜の埋め込み、遺伝子治療、幹細胞治療、栄養補給剤などが関与する。
【０００４】
網膜障害の更なる形態には、黄斑変性症（ＭＤ）が挙げられてもよい。黄斑変性症は、高齢者（＞５０歳）及び強度近視の者における失明の主な原因を表す病状である。黄斑変性症（ＭＤ）の症状は通常、この領域の網膜の損傷による視野の中央での視力の喪失（黄斑）を含む。黄斑変性症では、十分な周辺視力は残っており、日常生活のその他の活動は可能であるが、ものを読むこと又は顔を認識することが困難になるか、又は不可能になり得る。ＭＤの診断は、例えば、蛍光血管造影を介して行ってもよく、これにより、異常な血管突起の特定と局在とが可能になる。更に、光干渉断層撮影及びその他の新しく開発された画像化技術をＭＤの診断及びＭＤの治療への効果の評価に使用してもよい。
【０００５】
ＭＤの形態の１つは、いわゆる加齢黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）である。緑内障及び糖尿病性網膜症に加えて、これは、欧米における視覚障害と失明との最も一般的な原因の１つである。加齢黄斑変性症の発症は通常、網膜色素上皮とその下にある脈絡膜との間における、ドルーゼンと呼ばれる（詳細な中央の視力を提供する網膜の中央領域、窩と呼ばれる）斑紋における特徴的な黄色っぽい沈着を伴う。これらの早期の変化（加齢黄斑症と称される）のある人々のほとんどは通常、視覚に異常はない。しかしながら、そのような早期の変化が、進行したＡＭＤに発展することが相対的に多い。ドルーゼンが大きく、多数で、斑紋の下の色素細胞層における障害と関連する場合、リスクはかなり高くなる。視力の深刻な喪失に関与する進行したＡＭＤは通常、２つの形態：乾性ＡＭＤ及び湿性ＡＭＤで起きる。中央構造の萎縮症としても知られる進行したＡＭＤの「乾性」形態は、通常、網膜の下の網膜色素上皮層（及びおそらく、脈絡毛細管枝）の萎縮から生じ、眼の中央部分における光受容体（ロッドとコーン）の喪失を通じて視覚の喪失を起こす。更に、網膜と脈絡膜との間に堆積する細胞性の残渣（ドルーゼンと呼ばれる）が存在し得る。この状態に対する治療法はないが、高用量の抗酸化剤を伴ったビタミンの補給、ルテインとゼアキサンチンは、乾性黄斑変性症の進行を遅らせ、場合によっては、患者の視力を改善することが国立眼病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）などによって実証されている。血管新生ＡＭＤ又は滲出性ＡＭＤとしても知られる、進行したＡＭＤの「湿性」の形態は、ＡＭＤの更に重篤な形態を表す。滲出性の加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）（湿性のＡＭＤ）は通常、眼における異常な血管増殖を特徴とし、欠陥のある血管が流体及び血液を漏出する。これは、ブルック膜を通じた脈絡膜毛細血管から網膜下空間への異常な血管増殖のために視覚喪失の原因となり、最終的には斑紋の下での血液とタンパク質の漏出を招く。これらの血管からの出血、漏出及び瘢痕化は、治療をしないままでいると、最終的に光受容体への不可逆的な損傷、斑紋における瘢痕形成及び相対的に急速な視覚喪失を引き起こす。
【０００６】
今日まで、ＡＭＤ、特に湿性形態のＡＭＤにはほとんど治療法がない。滲出性の加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、現在では通常、眼内投与によって治療され、（追加的な）レーザー凝固による治療は相対的に稀なものでしかない。眼内投与には、眼の硝子体液に直接注入すると異常な血管を抑制し得る、かつ視力の回復をもたらし得る抗血管新生剤の使用が挙げられる。ＶＥＧＦに対して有効な剤（抗血管内皮増殖因子）を含むそのような抗血管新生剤を用いて、眼における異常な、新しい血管の形成を防ぎ、すでに漏出し始めていた血管を乾燥させることが可能である。残念ながら、これらの注入は、隔月単位か又は月単位で頻繁に繰り返さなければならず、注入に関連したリスク、特に眼内感染のリスクをはらむことになる。これらの剤の例としては、ルセンティス（商標）（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、アバスチン（商標）（Ａｖａｓｔｉｎ）（ルセンティス（商標）に構造的に密接に関係する）、及びマクジェン（商標）（Ｍａｃｕｇｅｎ）などが挙げられる。これら抗血管新生剤のうちで、ルセンティス（商標）及びマクジェン（商標）のみが、２００９年１月の時点でＦＤＡに認可されている。マクジェンは血管新生ＡＭＤにて相対的に低い効用を有することが分かったので、ルセンティス（商標）の使用はマクジェン（商標）の使用を断然上回っている。
【０００７】
この文脈で、特許文献１は、眼の血管新生を治療するアプローチを開示している。この目的で、特許文献１は、エンドスタチンをコードする（アデノ）ウイルスベクターの直接投与又は治療される患者へのエンドスタチン産生細胞の投与を利用する。しかしながら、細胞の投与は、治療される患者において望ましくない免疫応答をもたらす。特許文献１はまた、マイクロカプセル化された形態での細胞の送達を示唆しているが、しかし、これらのマイクロカプセル化された細胞を効率的に作出することができ、それらが望ましくない免疫応答を防ぎ、眼の血管新生又はその他の眼疾患の治療に有効であることは示していない。特許文献１はまた、そのようなマイクロカプセル化された細胞の患者への功を奏した投与を示していない。
【０００８】
その他の比較的一般的な網膜障害には、網膜血管閉塞が挙げられる。最近の集団ベースの調査によれば、４０歳以上の母集団の約１％が網膜血管閉塞、主として網膜静脈閉塞又は網膜動脈閉塞に罹っている。網膜動脈閉塞については、今のところエビデンスに基づいた利用可能な治療法はない。動脈の閉塞は通常、限定された持続時間しか続かず、その後、動脈は再開通する。従って、動脈が再開通するまで、損傷した網膜細胞が生き残るように助ける治療法が望ましい。網膜静脈閉塞の場合、網膜レーザー凝固及び／又は薬剤の眼内投与を実施して黄斑浮腫を軽減し、眼内の望ましくない血管新生のリスクを低下させてきた。網膜静脈閉塞についても、神経保護療法は、周辺状態が改善するまで細胞の生存を助けることが保証される。
【０００９】
緑内障は、網膜神経節細胞とその軸索との喪失を特徴とし、検眼鏡検査での典型的な視神経頭の様相をもたらす疾患の非均質な群である。（いわゆる高圧緑内障の場合のように）眼内圧が上昇する場合もあれば、又は（いわゆる正常圧緑内障の場合のように）統計的に正常である場合もある。比較的最近の研究によれば、経篩板の対圧としての眼窩内の脳脊髄液圧は、正常圧緑内障の患者の一部では異常に低い可能性がある。緑内障は慢性であり得ることもあり（開放隅角緑内障のほとんど）、又は顕著な痛みを伴った急性の発症でもあり得る（閉塞隅角緑内障の一部）。緑内障の非均質性は、何故様々な治療様式が存在するのかを説明している。それらの全ては共通して眼内圧を下げるものである。更に、損傷した細胞を生き残らせるように、又は再生すらさせるようにサポートするために神経保護療法又は神経再生療法までもが必要である。
【００１０】
ＡＭＤ及びその他の網膜障害及び視神経障害の治療には、一般的に、相当数の更なる剤が使用されてもよい。新しい治療戦略を更に開発するための多数の実験的研究に加えて、言及されたＡＭＤ及びその他の疾患の治療法のためのそのような新しい薬剤の臨床的有効性を検討するために多数のフェーズ１、２及び３の試験が進行中である。しかしながら、上記で記載したような長期間の治療として、視神経、小柱網及び／又は血管細胞を含む網膜組織の保護、又は更に好ましくは再生を可能にする、利用可能で有効な治療法は今のところない。網膜色素変性症（ＲＰ）ための薬物（例えば、ビタミンＡ及びパルミチン酸ビタミンＡ）による治療及びＡＭＤのための薬剤（例えば、ルセンティス（商標）及びマクジェン（商標））による治療がこれらの疾患の進行を遅らせることが示されていたとしても、これらの治療戦略は全て細胞の喪失に対して保護効果を示すことができていないので、有効な治療は今のところない。例えば、網膜移植又は人工網膜埋め込みといった外科的介入は、未だに早期の実験段階にある。同様に、遺伝子治療及び幹細胞治療、栄養補給剤などのような有効な治療法は、今日に至って未だに臨床段階まで開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０２／０６７９７１Ａ２号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、上述のような眼疾患及び眼障害、特に網膜の変性が原因で生じる眼疾患及び眼障害のための薬剤投与の頻繁な反復を必要とせずに、及び／又は望ましくない副作用のリスクを伴わずに、これらの問題を回避し、長期間の治療の提供を可能にする有効な治療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の根底にある課題は、添付の特許請求の範囲によって解決される。
【００１４】
本発明の根底にある課題は、網膜疾患、特に網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞及び視神経症などを含む、本明細書で定義されるような眼疾患又は眼障害の（眼内）治療のための（医薬組成物の調製のための）、眼疾患の（眼内）治療に好適な本明細書で記載されるような神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体の使用によって特に解決される。
【００１５】
更に好ましくは、本発明の根底にある課題は、本発明の文脈で使用されてもよい、好ましくは、網膜疾患、特に網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞及び視神経症を含む、本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療のための（医薬組成物の調製のための）、本明細書で定義されるような眼疾患又は眼障害の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又は任意のその他の細胞（種）の使用によって解決され、その際、当該細胞は、（球状）マイクロカプセルに封入されて、好ましくは、治療される患者の免疫系の応答を妨げる。本発明の文脈で、用語「・・をコードする細胞」は通常、「・・をコードする核酸を含有する又は含むように操作されている細胞」を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で記載されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれた細胞を介した、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体の投与によって、そのような因子の反復投与の問題を回避することが可能になる。したがって、そのような因子をコードし、発現する核酸を含有する細胞を患者の眼内に供給することにより、本明細書で定義されるような神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質が投与されてもよい。そのような細胞の埋め込みによって、生体内で、及び移植された細胞からのこれら因子の分泌のおかげで、これら因子の更に長い期間にわたる供給が保証される。それらは、反復投与を必要とせず、当該部位でこれらの因子を直接供給する。免疫系が通常、外来細胞を認識し、そのような外来物質から生物を防御するために免疫応答を誘発することは当該技術で既知である。従って、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体を発現することが可能であるような細胞の埋め込みは、このように、生物における免疫応答を招き得る。そのような防御反応は、治療の間に相当の且つ望ましくない副作用を引き起こす可能性があり、治療される生物の重篤な合併症又は死亡さえ招き得る。本明細書でも想定されるこの問題を回避する戦略の１つとしては、自己細胞、即ち、患者自身に由来する、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体を一時的に発現するように遺伝的に改変されている細胞の使用などが挙げられる。そのような手順は、治療される特定の患者の細胞に限定されることが好ましい。
【００１７】
本発明の文脈で、用語「眼疾患」は特に、他の網膜疾患の中でもとりわけ、網膜色素変性症（ＲＰ）、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）、網膜症、糖尿病性網膜症、他の理由による黄斑浮腫、血管内皮及び周皮細胞の異常、網膜血管閉塞、小柱網を含む緑内障から選択される網膜疾患を含む網膜の変性が原因で起きる眼疾患及び眼障害、及び小柱網の変性を含むその他の視神経症、及び角膜内皮などの異常、又はそれらに関連する疾患又は障害を含む。この文脈で、本発明の文脈における眼疾患は、眼の血管新生による眼疾患、脈絡膜の血管新生、黄斑変性による脈絡膜の血管新生、持続性及び再発性の脈絡膜の血管新生、ヒストプラスマ症及び病的近視による脈絡膜の血管新生、網膜色素線条症から生じる脈絡膜の血管新生、前部虚血性視神経症、細菌性心内膜炎、ベスト病、バードショット網膜脈絡膜症、脈絡膜血管腫、脈絡膜母斑、脈絡膜非潅流、脈絡膜骨腫、脈絡膜破裂、先天性脈絡膜欠如、慢性網膜剥離、網膜の欠損、ドルーゼン、内因性カンジダ眼内炎、網膜色素上皮の乳頭外過誤腫、黄色斑眼底、特発性黄斑円孔、悪性黒色腫、膜性増殖性糸球体腎炎（ＩＩ型）、金属眼内異物、朝顔症候群、多発一過性白点症候群（ＭＥＷＤＳ）、鋸状縁における血管新生、手術用顕微鏡のバム、視神経頭ピット、光凝固、点状脈絡膜内層症、風疹、サルコイドーシス、匐行性又は地図状の脈絡膜炎、網膜下の体液排出、傾斜乳頭症候群、トキソプラズマ性脈絡網膜炎、結核、又はフォークト・小柳・原田症候群、糖尿病性網膜症による血管新生、非糖尿病性網膜症、静脈分枝閉塞症、中心網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、周中心窩毛細血管拡張症、鎌状赤血球網膜症、イールズ病、網膜血管炎、フォン・ヒッペル・リンドウ病、放射線網膜症、網膜凍結傷害、網膜色素変性症、網膜脈絡膜コロボーマ、単純ヘルペス性角膜炎による角膜の血管新生、角膜潰瘍、角膜移植、翼状片、又は外傷であってもよい。本発明の文脈における眼疾患は、好ましくは、眼の腫瘍性疾患又は膠芽細胞腫を含まない。
【００１８】
上記発明の解決を提供するために使用され、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞は、（球状）マイクロカプセルに封入されて、治療される患者の免疫系の応答を妨げることが好ましい。本発明の文脈では、そのような（球状）マイクロカプセルは、好ましくは、（球状）コア（即ち、コアは球状であってもなくてもよい）と少なくとも１層の表面コーティング層とを含み、その際、
（球状）コアは、一般的に架橋ポリマーと、本発明の文脈で使用されてもよく且つ、本明細書で定義されるような、好ましくは眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又はその他の細胞（種）（の混合物）を含むか、又はそれから成り；並びに
少なくとも１層の表面コーティング層は、一般的に架橋ポリマーを含むか、又はそれからなる。
【００１９】
本明細書で定義されるような表面コーティング層だけが、投与の際、例えば、（宿主生物）の投与部位への注入又は埋め込みの際、これら（球状）マイクロカプセルの有効な免疫バリアを提供するのが好ましいので、（球状）マイクロカプセルは、そのような表面コーティング層なしでコアだけによって形成されることがないことが好ましい。
【００２０】
本明細書で使用されるような細胞で、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞を含む（球状）マイクロカプセルは、本明細書では通常、（球状）マイクロカプセルの総径と呼ばれる粒径を含む。一般に、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの総径は、具体的な治療及び投与方式によってかなり変化してもよい。本発明の文脈では、治療は、本明細書で定義されるような眼疾患及び眼障害に厳密に限定される。治療は通常、例えば、注入又は埋め込みによって特定の投与部位内に本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルを投与することにより局所的に行われるので、投与方式は、例えば、注入カニューレの直径によって、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの総径を制限してもよい。本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの総径は、少なくとも１層の表面コーティング層の厚みによってと同様に、（球状）マイクロカプセルのコアの直径によっても更に決定されるが、それは、双方の直径が通常、少なくとも部分的に互いに左右され、当然、（球状）マイクロカプセルの総径に影響を及ぼすからである。
【００２１】
本明細書で定義されるような眼疾患の治療について、本願の発明者らは驚くべきことに、約１２０μｍ〜約８００μｍ、好ましくは約１２０μｍ〜約７００μｍの（球状）マイクロカプセルの総径（粒径）、更に好ましくは約１５０μｍ〜約６５０μｍの総径、一層更に好ましくは約１６５μｍ〜約６００μｍの総径を使用してもよいことを見出した。特に、約１２０μｍ〜約３００μｍの（球状）マイクロカプセルの総径（粒径）、更に好ましくは約１５０μｍ〜約２５０μｍの総径、一層更に好ましくは約１６５μｍ〜約２２５μｍの総径、最も好ましくは約１８０μｍ〜約２００μｍの総径、例えば、約１８０μｍ、約１８５μｍ、約１９０μｍ又は約２００μｍが有利である。そのような総径を含む（球状）マイクロカプセルは通常、治療される眼における選択された注入部位に保持され、周辺組織に移動しない。これによって、治療の間、十分な時間、注入の部位にて、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体の継続的な発現を提供して、これらの因子により発揮される有益な効果の全ての領域を提供することが可能となる。
【００２２】
（球状）マイクロカプセル（又は本明細書で定義されるような（球状）コア）の上記文脈で、用語「球状」は最も広い意味で理解される。球状粒子は、好ましくは、球形様の形状を有すると理解され、そのため、形状としては、対称であっても非対称であってもよく、例えば、（球状）マイクロカプセル及び／又はそのコアは楕円形状を有してもよい。あまり好まれない実施形態としては、本発明に従って使用されるマイクロカプセル又はコアは、上記意味の範囲内で球状でなくてもよいが、例えば、マイクロカプセルの表面上で突き出ているか又は陥入しているセグメントを持つ任意の形態を有してもよく、又は繊維（特に中空繊維）若しくはシート（特に平坦な若しくは湾曲したシート）の形態で存在してもよい。本開示において「球状」のマイクロカプセル又はコアが言及される場合はいつでも、「非球状」のマイクロカプセル又はコアが同様に提供され、調製され、又は使用されてもよい。しかしながら、好ましい実施形態によれば、（球状）マイクロカプセルは、球状のマイクロカプセル又は楕円のマイクロカプセルである。好ましくは、（球状）マイクロカプセルは「非球状」マイクロカプセルではない。更に好ましくは、（球状）マイクロカプセルは繊維（特に中空繊維）又はシート（特に平坦な若しくは湾曲したシート）の形態で存在しない。
【００２３】
本明細書で定義されるように、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルは、好ましくは、（球状）コア（即ち、コアは球状であってもなくてもよい）を含み、その際、（球状）コアは、架橋ポリマーと、本発明の文脈で使用されてもよい細胞であって、本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又はその他の細胞（種）（との混合物）を含むか、又はそれからなる。
【００２４】
本発明の文脈では、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアの一般的に架橋ポリマーは、本発明の文脈で使用されてもよい細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又はその他の細胞（種）をその空洞に埋め込む足場構造を形成する。これらの細胞は、個々に、又は通常、例えば、約１０〜約１０，０００、例えば、約１０〜約５００、約１０〜約１，０００、又は約１０〜約１０，０００の凝集した細胞（のプール）のような凝集体として足場構造に埋め込まれてもよい。好ましくは、（球状）コアは、架橋ポリマーと本明細書で定義されるような埋め込まれた細胞との均質な分布を含む。好ましくは、本明細書で定義されるような足場構造と埋め込まれた細胞とを含むコアは、以下に開示されるような方法に従って調製される。この文脈で、本発明に係る使用のために（球状）マイクロカプセルを調製する場合、（球状）マイクロカプセルの封入細胞、例えば、本発明の文脈で使用されてもよい間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、自己細胞又はその他の細胞（種）を全体としてポリマーマトリクスに埋め込むことが決定的に重要である。
【００２５】
本発明の文脈で（球状）マイクロカプセルに使用されてもよい、本明細書で定義されるような埋め込まれる細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又はその他の細胞（種）は、架橋された足場ポリマーのｍＬ当たり約１×１０４個〜約１×１０８個、１×１０９個又は１×１０１０個の細胞濃度で、好ましくは架橋された足場ポリマーのｍＬ当たり約１×１０５個、約１×１０６個、又は１×１０７個の細胞濃度〜約５×１０８個の細胞濃度で（又は更に、架橋された足場ポリマーのｍＬ当たり約１×１０９個又は１×１０１０個の細胞濃度まで）、更に好ましくは、架橋された足場ポリマーのｍＬ当たり約１×１０５個、約１×１０６個又は１×１０７個の細胞濃度〜約１×１０８個の細胞濃度で、最も好ましくは、架橋された足場ポリマーのｍＬ当たり約１×１０５個、約１×１０６個又は２×１０７個の細胞濃度から６×１０７個の細胞濃度でコア内に存在してもよい。
【００２６】
本発明の文脈では、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルのコアは通常、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの総径の直径を超えない直径（粒径）を有する。通常、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルのコアは、約５０μｍ〜約２２０μｍの直径、好ましくは約１００μｍ〜約２００μｍの直径、同様に好ましくは約１１５μｍ〜約１８５μｍの直径、更に好ましくは約１３０μｍ〜約１７０μｍの直径、一層更に好ましくは約１４５μｍ〜約１５５μｍの直径、例えば、約１２０μｍ、約１２５μｍ、約１３０μｍ、約１３５μｍ、約１４０μｍ、約１４５μｍ、約１５０μｍ、又は約１５５μｍの直径を有する。特に好ましくは、（球状）マイクロカプセルのコアは、本発明に従って使用されるとき、好ましくは本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの総径より約１μｍ〜約８０μｍ小さい直径、更に好ましくは本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの総径より約１５μｍ〜約７０μｍ小さい直径、最も好ましくは本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの総径より約３０μｍ〜約６０μｍ小さい直径を有する。言い換えれば、（球状）マイクロカプセルのコアの直径は、本発明に従って使用されるとき、約５０μｍのサイズ、約６０μｍのサイズ、約７０μｍのサイズ、約８０μｍのサイズ、約９０μｍのサイズ、約１００μｍのサイズ、約１１０μｍのサイズ、約１２０μｍのサイズ、約１２５μｍのサイズ、約１３０μｍのサイズ、約１３５μｍのサイズ、約１４０μｍのサイズ、約１４５μｍのサイズ、約１５０μｍのサイズ、約１５５μｍのサイズ、約１６０μｍのサイズ、約１６５μｍのサイズ、約１７０μｍのサイズ、約１７５μｍのサイズ、約１８０μｍのサイズ、約１８５μｍのサイズ、約１９０μｍのサイズ、約１９５μｍのサイズ、約２００μｍのサイズ、約２０５μｍのサイズ、約２１０μｍのサイズ、約２１５μｍのサイズ、若しくは約２２０μｍものサイズを有してもよく、又は上述された具体値の任意の２つから選択される任意の範囲を含んでもよい。
【００２７】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルのコアは、本明細書で定義されるような、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞を含む。（球状）コアについての、本発明の文脈で使用されてもよく、コアの周辺に局在するそのような細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又はその他の細胞（種）、又は足場構造から突き出している細胞は、免疫上の問題を惹起し得るが、それは、免疫系がこれらのマイクロカプセルを外来成分として認識することが原因で、免疫系によってこれらのマイクロカプセルが攻撃されるからである。
【００２８】
当初の溶液における細胞濃度を下げることによってこの効果は回避され得るが、本発明は、コアの細胞部分を増やすことによってマイクロカプセルの効率を改善することができる。コア内における細胞濃度が高ければ高いほど、移植される最終的なマイクロカプセルの総容積は小さくなる、即ち、注入部位でマイクロカプセルは更に効率的に作用し得る。（球状）マイクロカプセルの（球状）コアで高い濃度の細胞を用いた場合の免疫上の問題を回避するために、本発明は、（球状）コアの上に適用される少なくとも１層の表面コーティング層を提供する。バリアとして作用する表面コーティング層のおかげでこれらの細胞が宿主の免疫系に達しないので、細胞がコアの周辺に非常に近く局在したとしても、この表面コーティング層は免疫応答を引き起こさない。この表面コーティング層は通常、どんな細胞も含有せずに、本明細書で定義されるような架橋ポリマーから構成される。特に好ましい実施形態によれば、上記で定義された（球状）コアは、少なくとも１層以上の表面コーティング層、例えば、１層、２層、３層、４層、５層、５層から１０層以上の表面コーティング層、更に好ましくは、１層、２層又は３層の表面コーティング層、最も好ましくは１層のみの表面コーティング層によって被覆される。通常、各表面コーティング層はコアの周りで均一な厚みを含む。（球状）マイクロカプセルの表面コーティング層の厚みは、本発明に従って使用されるとき、ほぼ任意に変化してもよく、通常、約１μｍ〜約８０μｍ、更に好ましくは約１５μｍ〜約７０μｍ、の範囲内であり、最も好ましくは約２０μｍ〜約４０μｍの範囲であり、例えば、約３０μｍである。
【００２９】
本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コア（及び任意で、（球状）マイクロカプセルの少なくとも１層の表面コーティング層）は、架橋ポリマー（の混合物）を含むか、又はそれからなる。この文脈で、当該技術で既知であり、カプセル化に好適である薬学的に許容可能な（架橋可能な）ポリマーが、本発明に従って定義されるような、（球状）コアの形成、及び互いに独立して、（球状）マイクロカプセルの少なくとも１層の表面コーティング層の形成に使用されてもよい。好ましくは、一方で、外部からの酸素や栄養を供給するためにその架橋状態で透過性を有し、他方でコアの細胞によってコードされ、分泌されるペプチドのマイクロカプセルから患者の組織又は体液への拡散を可能にするようなポリマーが使用される。更に、架橋ポリマーは、マトリクスを介して、生体の免疫系の成分が侵入することを妨げる。例証として、例えば、選択されたタンパク質又はタンパク質に基づいたポリマー（例えば、コラーゲン、アルブミンなど）、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸など）、多糖類及びそれらの誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、硫酸セルロース、アガロース、褐藻類（例えば、コンブ種（Ｌａｍｉｎａｒａｌｅｓ）、シオミドロ種（Ｅｃｔｏｃａｒｐａｌｅｓ）、ヒバマタ種（Ｆｕｃａｌｅｓ）の）のアルギネートを含むアルギネート）、カラギーナン、ヒアルロン酸、ヘパリン及び関連するグルコサミン硫酸塩、デキストラン及びその誘導体、キトサン及びその誘導体）といった天然のポリマーから得られる、合成の、半合成の、及び天然の水溶性（バイオ）ポリマー等のポリマーが使用されてもよい。例えば、脂肪族ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ酪酸など）、ポリアミド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、熱可塑性のポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート及びポリテトラフルオロエチレンなどのような合成ポリマーも使用されてもよい。
【００３０】
更に、合わせて本明細書では、ブロックポリマー、即ち、前述したポリマーの２以上の組み合わせによって誘導されるポリマーを使用してもよい。そのようなブロックポリマーは、所望の特性、例えば、孔サイズ、架橋状況、毒性、取り扱い、生体適合性などに応じて当業者によって選択されてもよい。上記ポリマーのいずれもが、本発明の文脈で「化学的に異なったポリマー」として定義され、即ち、これらポリマーのそれぞれは通常、上記ポリマーの他のものとは同一のモル質量及び構造を示さない。対照的に、「化学的に同一のポリマー」は、ポリマーが同一のモル質量及び構造を示すことを意味する。
【００３１】
最終的に、上記ポリマーの混合物も本明細書に包含され、その際、そのような混合物に含有されるポリマーの量は、例えば、上記で概説されたように、所望の特性に応じて当業者によって選択されてもよい。この点で、得られたポリマーの混合物の全体的なモル質量及び混合物の単一ポリマーの相当するモル比率が別のポリマー混合物と同一であれば、ポリマーの混合物は、別のポリマー混合物と化学的に同一（「化学的に同一のポリマー」）であるとみなすことができる。
【００３２】
好ましくは、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コア（及び任意で、（球状）マイクロカプセルの少なくとも１層の表面コーティング層）の架橋ポリマー（の混合物）は、アルギネートを含むか、又はそれからなる。アルギネートは、（球状）コア及び／又は少なくとも１層の表面コーティング層の形成のためのポリマーとして本発明に従って使用されるのであれば、その生体適合性及び架橋特性のために特に有利である。化学的な観点からは、アルギネートは、双方の酸のヘテロポリマー領域によって分離されるβ−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グルロン酸のホモポリマー基に由来するアニオン性多糖類である。アルギネートは水溶性であり、ナトリウム又はカリウムのような一価のカチオンの存在下で高い粘度の溶液を形成する。架橋された水不溶性のヒドロゲルは、アルギネート単鎖と二価、三価又は多価のカチオン（例えば、カルシウム、バリウム又はポリリシン）の相互作用の際に形成される。好ましくは、精製されたアルギネート（例えば、ＤＥ  １９８  ３６  ９６０に従って；その具体的な開示は参照によって本明細書に組み入れられる）、更に好ましくは、生理食塩水におけるアルギン酸カリウム又はアルギン酸ナトリウムが、カプセル化に使用される。そのようなアルギネートは通常、約２０ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａ、更に好ましくは約１００ｋＤａ〜約１，２００ｋＤａの平均モル質量を示す。本発明に従って使用されるような（球状）マイクロカプセルのコア及び／又は少なくとも１層の表面コーティング層の形成に使用されるアルギネートは、溶液として、更に好ましくは水溶液として提供されてもよく、例えば、使用されるアルギネートの０．２％（ｗ／ｖ）アルギネート水溶液の粘度は、約２ｍＰａ・ｓ〜約５０ｍＰａ・ｓの範囲、更に好ましくは、約３ｍＰａ・ｓ〜約１０ｍＰａ・ｓの範囲であってもよい。本発明に従ってアルギネートが使用されるのであれば、α−Ｌ−グルロン酸が豊富であるものが好まれる。言い換えれば、少なくとも５０％のα−Ｌ−グルロン酸（及び５０％未満のβ−Ｄ−マンヌロン酸）を含有するアルギネートが好まれる。更に好ましくは、使用されるアルギネートは、５０％から７０％のα−Ｌ−グルロン酸と３０％から５０％のβ−Ｄ−マンヌロン酸を含有する。本発明に従って使用されるような（球状）マイクロカプセルを調製するために好適なアルギネートは、褐藻類、例えば、コンブ種（Ｌａｍｉｎａｒａｌｅｓ）、シオミドロ種（Ｅｃｔｏｃａｒｐａｌｅｓ）、ヒバマタ種（Ｆｕｃａｌｅｓ）など、及びアルギネートを産生するその他の種の藻類を含むが、これらに限定されない特定の藻類の種から抽出することによって入手可能である。アルギネートは、当業者に既知のアルギネートの調製方法に従って、新鮮な藻類材料又は乾燥した材料から単離されてもよい。
【００３３】
本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアの調製で使用される、本明細書で定義されるような架橋ポリマーと、本明細書で定義され、及び／又は（球状）マイクロカプセルの少なくとも１層の表面コーティング層の調製用の架橋ポリマーは、選択されたポリマーに関して及び選択された濃度に関して同一であってもよく、又は異なっていてもよい。
【００３４】
第１の実施形態では、（球状）コアと少なくとも１層の表面コーティング層を調製するために使用される架橋ポリマーは、同一の濃度又は異なった濃度にて化学的に同一のポリマーを含んでもよい。好ましくは、（球状）コア及び少なくとも１層の表面コーティング層に存在するポリマーは、上記で定義されたようなポリマーのいずれかから選択された未架橋ポリマーの溶液を用いて調製される。このポリマー溶液では、未架橋ポリマーは通常、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約８％（ｗ／ｖ）の未架橋ポリマーの濃度、更に好ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約４％（ｗ／ｖ）の未架橋ポリマーの濃度、一層更に好ましくは、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約２．５％（ｗ／ｖ）の未架橋ポリマーの濃度、最も好ましくは、約１％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）の未架橋ポリマーの濃度で存在する。上記で開示されたようなアルギネートが、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアの調製用のポリマーとして及び本明細書で定義され、及び／又は（球状）マイクロカプセルの少なくとも１層の表面コーティングの調製用の架橋ポリマーとして使用されるのであれば、（球状）コアの調製用のポリマー溶液の濃度と（球状）マイクロカプセルの少なくとも１層の表面コーティング層の調製用のポリマー溶液の濃度は、互いに独立して、０．１％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）の未架橋ポリマーの濃度、好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の未架橋ポリマーの濃度から選択されてもよい。双方の溶液についてのアルギネートの濃度は同一でもよい。或いは、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コア及び少なくとも１層の表面コーティング層を調製するために異なったアルギネート濃度を使用してもよい。好ましくは、（球状）コア及び少なくとも１層の表面コーティング層の調製に使用される未架橋ポリマーは化学的に同一のポリマーを含み、更に好ましくは同一の濃度であり、例えば、本明細書で定義されるようなポリマーとの本明細書で定義されるような濃度である。この文脈で、用語「％（ｗ／ｖ）」は、未架橋ポリマーの濃度を指し、通常、例えば、好適な溶媒に未架橋ポリマーを可溶化した後（架橋する前に）、ポリマー溶液の総容積に対するその乾燥形態でのポリマーの特定の量を基にして決定される。しかしながら、上記濃度は、該当する場合、例えば、標準条件（室温、常圧など）にて流体の凝集状態で存在するポリマーを使用するならば、代わりに「％ｖ／ｖ」濃度にも相当することになっている。
【００３５】
第２の実施形態によれば、（球状）コア及び少なくとも１層の表面コーティング層を調製するために使用される架橋ポリマーは、同一の濃度又は異なった濃度にて化学的に異なったポリマーを含んでもよい。それによって、互いに独立して（球状）コア及び少なくとも１層の表面コーティング層のために、本明細書で定義されるように濃度及びポリマーが別々に選択されてもよい。更に、例えば、天然ポリマー、合成ポリマー及びポリマーの組み合わせ、即ち、ブロックポリマーを含む、本明細書で定義されるようなポリマーからポリマーが選択されてもよい。コア及び少なくとも１層の表面コーティング層に使用されるポリマーの性質の差異もまた、使用されるポリマーの異なった分子量及び／又は同一ポリマーの異なった架橋などに起因してもよい。
【００３６】
（球状）マイクロカプセルが１層を超える表面コーティング層を含む場合、少なくとも１層の表面コーティング層のそれぞれにおけるポリマーは同一であってもよく、又は異なっていてもよく、即ち、各表面コーティング層の架橋ポリマーは、同一の濃度又は異なった濃度で化学的に同一のポリマー又は異なったポリマーを含んでもよく、例えば、（球状）マイクロカプセルは、本発明に従って使用されるとき、本明細書で定義されるようなポリマーからなる、本明細書で定義されるような少なくとも１層の表面コーティング層と、ポリカチオン、例えば、本明細書で定義されるようなポリアミノ酸、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸などからなる追加の外部表面コーティング層を含んでもよい。同様に、異なる表面コーティング層に使用されるポリマーの性質の差異は、使用されるポリマーの異なった分子量及び／又は同一ポリマーの異なった架橋などに起因してもよい。
【００３７】
本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアは、更に細胞を含む。そのような細胞は通常、幹細胞又は間質細胞、例えば、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞から、又はその他の細胞（種）から選択され、それらは、本発明の文脈で使用されてもよく、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する。そのような細胞は通常、以下で定義されるような、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードする核酸の安定的な細胞へのトランスフェクション又はむしろ核酸を含有するベクターの安定的な細胞へのトランスフェクションによって入手することが可能である。
【００３８】
本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに好適な細胞は、分化全能性の、分化多能性の、又は多分化能の幹細胞を含む（未分化の）幹細胞から選択されてもよい。本文脈で使用される幹細胞は、好ましくは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、又は外胚葉、中胚葉若しくは内胚葉に由来する幹細胞、又は例えば、（ヒト）間葉系幹細胞若しくは間葉系間質細胞（ＭＳＣ、ｈＭＳＣ）（例えば、ヒトの骨髄又は脂肪組織に由来する）、造血幹細胞、表皮幹細胞、神経幹細胞、及び皮膚からの線維芽細胞（筋線維芽細胞）を含む未成熟の線維芽細胞といった成体幹細胞を含む。これらの（未分化）幹細胞は通常、対称な幹細胞分裂が可能であり、即ち、細胞分裂は同一のコピーをもたらす。幹細胞は、どのような細胞種にも転換する能力を維持する。更に、幹細胞は非対称性に分裂することが可能であり、幹細胞のコピーと、幹細胞のコピーとは異なる別の細胞、例えば、分化した細胞とをもたらす。本明細書で定義されるような幹細胞、特に、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに好適な間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞は更に、コードされ、分泌される、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体の効果をサポートする一連の内因性の栄養因子を産生してもよい。間葉系間質細胞のこのパラクリン細胞保護メカニズムのための生物学的活性因子は、例えば、サイトカイン  ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及び増殖因子、ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ、及び神経栄養因子−３であってもよい。特に好ましい実施形態によれば、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアにおける細胞は、こうして、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＧＤＮＦ、ＮＴ３及びＭＣＰ１などから選択される、治療レベルでカプセルを通じて放出されるパラクリン因子としての内因性のタンパク質又はペプチドを分泌する。
【００３９】
或いは、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルのコアは、例えば、上記幹細胞又は間質細胞から入手可能な（未分化）細胞から選択される細胞、例えば、結合組織ファミリーの細胞、例えば、（成熟）線維芽細胞、軟骨組織の細胞（軟骨細胞）、骨の細胞（骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞）、脂肪細胞（含脂肪細胞）、又は平滑筋細胞、又はリンパ系前駆細胞若しくはそれに由来する細胞を含む血液細胞、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞若しくは樹状細胞、又は一般的な骨髄性前駆細胞若しくはそれに由来する細胞、例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、破骨細胞、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、巨核球若しくは赤血球、若しくはマクロファージ、星状細胞、オリゴデンドロサイトなどを含む神経細胞、又は上皮細胞、又は表皮細胞などを含有してもよい。これらの分化した細胞は通常、対称な細胞分裂が可能であり、即ち細胞分裂が、分化元である親細胞と同一のコピーをもたらす。更に、場合によっては、これらの分化した細胞は、非対称性に分裂することが可能であってもよく、親細胞の同一コピーと、親細胞とは異なる別の細胞とをもたらし、即ち、細胞は親細胞に比べて更に分化する。或いは、場合によっては、本明細書で定義されるような分化した細胞は、細胞分裂を必要とすることなく、例えば、選択的な分化因子を添加することによって更に分化することが可能であってもよい。
【００４０】
更に、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれた細胞は、本発明に従って使用されるとき、治療される患者自身から採取された細胞（自己細胞）であってもよく、又は同種異系細胞から採取（例えば、試験管内で培養された樹立細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞などから採取）されてもよい。（球状）マイクロカプセルに（球状）コアを埋め込む表面コーティング層のおかげで、本発明に従って使用されるとき、当該表面コーティング層によって、治療される患者の望ましくない免疫応答を誘発することなく、同種異系細胞を使用することが可能になる。
【００４１】
本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞は、更に、本明細書で定義されるような（分化した及び／又は未分化の）細胞種の組み合わせであってもよい。（球状）マイクロカプセルの（球状）コアは、本発明に従って使用されるとき、例えば、ヒト間葉系幹細胞又はヒト間葉系間質細胞を含有してもよく、その際、これらの細胞の一部が、本明細書で定義されるような細胞種、例えば、含脂肪細胞（脂肪組織への移植に好適な）などに試験管内又は生体内で分化してもよい。従って、例えば、共通する系列を共有する種々の細胞種（例えば、特定の幹細胞種に由来する）がコアに配分されてもよい。
【００４２】
要約すれば、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアを調製するために好適な細胞は、未分化細胞又は分化細胞から選択されてもよい。一実施形態によれば、本明細書で定義されるような未分化細胞が好まれてもよい。そのような未分化細胞は、例えば、そのような未分化細胞の更に長い寿命による、有利な特性、例えば、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの長期にわたる効果、例えば、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体を発現し、分泌する長期にわたる能力を提供してもよい。代わりの実施形態では、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアを調製するために、本明細書で定義されるような分化した細胞が好まれてもよいが、それは、それらが通常はもはや急速に増殖しないので、本発明に従って使用されるとき、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアの中で望ましくない急速な増殖をもたらさないからである。選択された分化因子を前駆細胞に添加することにより、当該技術における既知の方法に従って、試験管内にて当業者によって細胞の具体的な分化が行われてもよい。好ましくは、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞の大半（又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％及び最も好ましくは少なくとも９９％）が同一の細胞種に属するように細胞を分化させる。特に、本明細書で定義されるような間葉系幹細胞は試験管内で、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞のような含脂肪細胞、脳細胞のようなニューロン様細胞などに分化させてもよく、それに応じて本明細書で使用されてもよい。（球状）マイクロカプセルの（球状）コアを調製するために未分化細胞が使用されるか、分化細胞が使用されるかに関しては、本明細書で定義されるとき、治療される疾患の具体的な要件、例えば、苦痛部位、投与方式、埋め込みのために選択される組織などに左右されてもよい。適切な細胞の選択は、これらの基準を評価する当業者により行われてもよい。
【００４３】
更に、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアを調製するために好適な細胞としては、不死化細胞であってもよく、又は非不死化細胞であってもよいが、好ましくは不死化細胞であってもよい。不死化細胞が使用されるのであれば、これらの細胞は、上記で議論したように対称性及び／又は非対称性の細胞分裂の能力を保持することが好ましい。本発明によれば、細胞は、正常細胞（即ち、非不死化細胞）の２倍の寿命を超える場合、不死と定義される。試験管内での正常２倍体細胞の最大寿命は、細胞種（例えば、成人細胞に対する胎児細胞）及び培養条件によって異なる。従って、試験管内での培養された正常細胞の最大寿命は、およそ６０回から８０回の細胞分裂回数である。例えば、角化細胞は約８０回分裂し、線維芽細胞は５０回を超えて分裂し、リンパ球は約２０回分裂する。正常な骨髄幹細胞は３０回から４０回の分裂回数の最大寿命を示し得る。好ましくは、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアの調製に使用される細胞株は、本発明に従って使用されるとき、３５０回の分裂回数を超えて連続的に増殖してもよく、幼若細胞に特徴的な正常な増殖速度を依然として維持してもよい。
【００４４】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアを調製するために細胞を不死化する方法は当該技術で広く知られており、それに応じて本明細書で適用されてもよい（例えば、ＷＯ  ０３／０１０３０５、又はＷＯ  ９８／６６８２７を参照のこと、これらは参照によって本明細書に組み入れられる）。例となる方法（ＷＯ  ０３／０１０３０５に係る）は、例えば、以下の工程を含む：
ａ）当業者に既知の標準的な従来の細胞培養法に従って、細胞、例えば、幹細胞、特にヒト骨髄由来の幹細胞（例えば、（ヒト）間葉系幹細胞（ＭＳＣ、ｈＭＳＣ）を培養する；
ｂ）以下の（ｂ１）から（ｂ５）により、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子又はその変異体の少なくとも一フラグメントを含むレトロウイルスベクターによって前記培養細胞に形質導入する；
ｂ１）パッケージング細胞株（例えば、ＰＡ３１７細胞、ＰＧ１３細胞、Ｐｈｅｎｉｘなど）（パッケージング細胞株は、レトロウイルスベクターが産生される細胞である）を培養し、
ｂ２）レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスなどに由来する）を構築し、その際、レトロウイルスベクターは、ヒトテロメア反復（ｈＴＲＴ）遺伝子又はその変異体の触媒サブユニットの少なくとも一フラグメント、更に好ましくはｈＴＥＲＴのｃＤＮＡフラグメント、例えば、ｐＧＲＮ１４５由来の３４５２塩基対ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｇｅｒｏｎ社）を含み、
ｂ３）前記レトロウイルスベクターによって前記パッケージング細胞株にトランスフェクションし、
ｂ４）好ましくはレトロウイルスベクターと共に細胞を遠心することによって、前記トランスフェクションした細胞により前記パッケージング細胞株に形質導入し、
ｂ５）上記工程ａ）に従って培養した細胞に、工程ｂ４）のパッケージング細胞であって前記レトロウイルスベクターを含む細胞によって形質導入する；
ｃ）不死化細胞株を得ることを含み、その際、前記不死化細胞株は、工程ａ）の細胞と比べて実質的に同一の特徴と特性を有する。その結果、ヒトテロメアサブユニット（ｈＴＲＴ）遺伝子に由来する挿入ポリヌクレオチド配列が転写され、翻訳されて機能的なテロメラーゼを産生してもよい。当業者は、コドンの縮重によって、多数のポリヌクレオチド配列が同一のテロメラーゼをコードすることを認識するであろう。加えて、野生型テロメラーゼ配列と実質的に同一の配列を有し、野生型テロメラーゼのポリペプチドの機能を保持する（例えば、野生型テロメラーゼのポリペプチドにおけるアミノ酸の保存的置換の結果生じる）テロメラーゼ変異体も含まれる。
【００４５】
本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞は通常、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌するように操作されているか、又はそれを天然にコードし且つ分泌する。
【００４６】
本発明の文脈で、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体は、当業者によって既知のタンパク質又はペプチドから選択されて、神経保護及び／又は抗血管新生の効果、又は眼疾患に関する更なる積極的な効果、例えば、抗アポトーシス効果を呈してもよい。
【００４７】
この文脈で、用語「神経保護効果」は、好ましくは、例えば、本明細書で定義されるような疾患の結果としてのアポトーシス又は変性からニューロンを保護する神経系内のメカニズムを指す。従って、「神経保護因子」は、好ましくは、神経系内のメカニズムを利用することによって、更に好ましくは本明細書で定義されるような眼疾患の文脈にて、アポトーシス又は変性からニューロンを保護する、好ましくは化合物であり、更に好ましくはペプチドである。
【００４８】
眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、好ましくは本明細書で定義されるような神経保護因子を用いた眼内薬物療法の神経保護態様、又は更に正確には、細胞保護態様は、視神経（網膜の延長として）、角膜内皮（進行性の角膜内皮ジストロフィ又はその他の障害の場合）、及び前房隅角における小柱網（眼房水の流出抵抗が高まって眼内圧が高くなり、その結果高圧緑内障を招く部位として）を含む、網膜を冒すほとんどどの障害にも効果を有してもよい。そのような細胞保護療法の目的は、眼の機能に必要とされる細胞の喪失を防ぐこと、又は当該細胞の喪失を少なくとも遅らせることである。療法の神経保護の態様／効果は、糖尿病性網膜細小血管症による網膜細胞の喪失が糖尿病性網膜症による眼の視機能低下の最も重要な理由なので、糖尿病性網膜症にとって特に重要であってもよい。眼内細胞保護療法には、角膜内皮及び毛細血管周皮細胞も含まれ、それらは、血液潅流のためにこれら毛細血管を開放したままにする試み、又は網膜組織への正常に機能しない血液供給を改善するためにそれらを再疎通させる試みにおいて糖尿病の経過において特に冒される。
【００４９】
更に、用語「抗血管新生効果」は、好ましくは、血管新生、即ち、新しい血管の増殖を阻害するメカニズムを指す。従って、「抗血管新生因子」は、好ましくは、本明細書で定義されるような眼疾患の文脈で、血管新生、例えば、新しい血管の増殖を阻害する、好ましくは化合物、更に好ましくはペプチドである。
【００５０】
眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体は、直接投与されてもよく、本明細書で定義されるようなベクターによってコードされてもよく、又は本明細書で記載されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれた細胞を介してコードされてもよい。
【００５１】
眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体が、本明細書で記載されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれた細胞を介して投与されるならば、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞は通常、（球状）コアを調製する前に、眼疾患の（眼内）治療に好適な、そのような神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードする核酸配列によってトランスフェクションされる。そのようなトランスフェクションによって、細胞は、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体を発現し、分泌することが可能になる。
【００５２】
特に好ましい実施形態によれば、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体は、本明細書で定義されるような抗血管新生因子又はそのフラグメント若しくは変異体から選択されてもよい。好ましくは、抗血管新生因子は、エンドスタチン又は本明細書で定義されるようなそのフラグメント若しくは変異体である。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩの天然に存在する２０ｋＤａのＣ末端分解産物である。それは、アンギオスタチン及びトロンボスポンジンに類似した抗血管新生剤として作用することが報告されている。エンドスタチンは広いスペクトルを示す血管新生阻害剤であり、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）及び血管増殖因子（ＶＥＧＦ）等の増殖因子の血管新生促進作用を妨害し得る。
【００５３】
別の好ましい実施形態によれば、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体は、本明細書で定義されるような神経保護因子又はそのフラグメント若しくは変異体から選択されてもよい。好ましくは、神経保護因子はＧＬＰ−１ペプチド又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、又は本明細書で定義されるようなそのフラグメント若しくは変異体から選択されてもよい。
【００５４】
好まれる一実施形態によれば、神経保護因子は、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなそのフラグメント若しくは変異体から選択されてもよい。
【００５５】
神経保護（及び好ましくは、抗アポトーシス）因子、ＧＬＰ−１は、よく研究されているグルカゴン遺伝子上に局在し、それはプレプログルカゴンをコードする（例えば、Ｗｈｉｔｅ，  Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １４（１２）  ４７１９−４７３０を参照のこと）。高分子量の前駆分子としてのプレプログルカゴン分子は、膵臓のα細胞にて、空腸にて及び結腸のＬ細胞にて合成される。プレプログルカゴンは、１８０アミノ酸の長さのプロホルモンであり、その配列は、グルカゴンに加えて、関連する構造：グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）とグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）との２つの配列を含有する。プレプログルカゴン分子では、ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２の間は、１７アミノ酸ペプチド配列（又はむしろ１５アミノ酸配列プラスＣ末端ＲＲ切断部位）、介在ペプチド２（ＩＰ２）である。ＩＰ２配列（前駆分子におけるＧＬＰ−１とＧＬＰ−２との間に位置する）は通常、生体内にてＧＬＰ−１のａａ３７の後ろでタンパク質分解によって切断される。従って、プレプログルカゴンモジュールは、その処理されていない形態での３７アミノ酸ペプチドであるＧＬＰ−１（１−３７）を含む、細胞及び環境に応じて種々のペプチドに切断される。一般に、この処理は膵臓及び腸管で生じる。ＧＬＰ−１（１−３７）配列は、更に３１アミノ酸の処理された形態である活性のあるＧＬＰ−１（７−３７）、又は更に変性産物ＧＬＰ−１（７−３６）アミドにタンパク分解によって処理される。従って、ＧＬＰ−１（７−３７）という表示は、当該フラグメントが、親ペプチドであるＧＬＰ−１のＮ末端から数えたとき、７番から（始まって）（含んで）３７番まで（含む）アミノ酸残基を含むことを意味する。ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド及びＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列は、式Ｉ（配列番号２５）に与えられる：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ  （Ｉ）
それは、ＸがＮＨ２である場合、ＧＬＰ−１（７−３６）を示し、又はＸがない場合、ＧＬＰ−１（７−３６）を示し、及びＸがＧｌｙ−ＯＨである場合、ＧＬＰ−１（７−３７）を示す。
【００５６】
ＧＬＰ−１は消化管ホルモンであり、β細胞におけるアデニル酸シクラーゼ及びタンパク質キナーゼの活性を刺激することを含む作用を持つ最も強力な内因性インスリン分泌促進剤である。生理学的には上部消化管からの胃抑制ポリペプチドと一緒に、それは、血糖レベルを下げるインクレチンホルモンとして機能する。従って、食物摂取に応答して分泌されるＧＬＰ−１は例えば、血糖を調節するのに共同して作用する胃、肝臓、膵臓、及び脳に対して多重効果を有する。その結果、グルカゴン様ペプチドＧＬＰ−１（７−３６）アミド及びその非アミド化類似体ＧＬＰ−１（７−３７）は、炭水化物代謝に対するその強力な作用及び２型糖尿病を含む糖尿病治療への適用性の可能性のゆえに相当な関心を集めている。更に、神経保護特性は、冠状動脈心疾患の治療でのみ示されている。
【００５７】
本発明の一実施形態によれば、従って、ＧＬＰ−１ペプチドは例えば、本明細書で定義されるような既知のＧＬＰ−１ペプチド配列から選択されてもよい。この文脈で、細胞がＧＬＰ−１ペプチドを発現し、分泌するように本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチドをコードする核酸配列によって、好ましくは（球状）コアを調製する前にトランスフェクションされてもよい、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってＧＬＰ−１ペプチドが分泌されてもよい。好ましくは、（球状）マイクロカプセルに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、本明細書で使用されるようなＧＬＰ−１ペプチドは、（ｗｔ）ＧＬＰ−１のａａ７−３５及びこのペプチドと少なくとも８０％、９０％、９５％又は更に９９％の同一性を示すペプチドからなる群から選択されてもよい。一般に、ＧＬＰ−１ペプチドは、（ｉ）（ｗｔ）ＧＬＰ−１のａａ１−３７を含むペプチド、（ｉｉ）（ｗｔ）ＧＬＰ−１のａａ７−３５、３６又は３７を含むペプチド、（ｉｉｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）アミド及び（ｉｖ）修飾されたペプチドを含むこれらペプチドと８０％、９０％、９５％又は更に９９％の同一性を示すペプチドからなる群から選択されてもよい。この文脈で、「修飾されたＧＬＰ−１ペプチド」は、組み合わせ、例えば、（ｗｔ）ＧＬＰ−１の生物学的機能を保持する変異体のフラグメントを含む、ＧＬＰ−１変異体又はＧＬＰ−１フラグメントを意味するように意図される。変異体及びフラグメントは、修飾されていないＧＬＰ−１配列の修飾、例えば、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）として分類される。本発明の意味の範囲内で、変異体又はフラグメントは、機能的でなければならず、例えば、修飾されていない（ＧＬＰ−１）ペプチドと同一の又は類似した生物活性を有さなければならない。用語「活性」は、生物活性を指す（例えば、受容体結合、受容体の活性化、ＧＬＰ−１について知られる有益な効果の提示を含む生物活性の１以上、例えば、同一の条件下で天然に存在する本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１及びそのフラグメント又は変異体と比較されてもよい、従来技術にて記載されたＧＬＰ−１の効果に関連して上記で言及されたような虚血又は酸素不足及び心臓組織の潜在的な死が原因で生じる損傷を強力に軽減するその活性）。好ましくは、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチドの変異体又はフラグメントは、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の少なくとも２５％の活性、更に好ましくは少なくとも５０％の（生物）活性、一層更に好ましくは６０％、７０％、８０％又は９０％の（生物）活性、最も好ましくは本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の９５％又は９９％の（生物）活性を発揮する。生物活性は標準的なアッセイによって決定されてもよく、好ましくはそれによって、例えば、２型糖尿病の動物モデルなどを用いて血糖レベルを下げるインクレチンホルモンとしての活性を決定することが可能になる。
【００５８】
特に好ましい実施形態によれば、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされてもよい、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドは、そのＮ末端に、本明細書で定義されるような（天然の）ＧＬＰ−１（１−３７）配列の天然に存在するアミノ酸１−６を含まない。一層更に好ましくは、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又は以下で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドは、そのＮ末端で天然ＧＬＰ−１（１−３７）配列の天然に存在するアミノ酸１、２、３、４、５及び／又は６を含まない。この但し書きは好ましくは、例えば、ＧＬＰ−１のａａ７−３５、３６又は３７、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド及び修飾ペプチドを含むこれらペプチドと８０％、９０％、９５％又は更に９９％の同一性を示すペプチドからなる群から選択される、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド、及びそのようなＧＬＰ−１ペプチドを含有する融合ＧＬＰ−１融合ペプチドを指す。しかしながら、この但し書きは、本明細書で定義されるようなそのようなＧＬＰ−１ペプチド又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドが、Ｎ末端（又はＣ末端）の配列修飾又はそれに融合される追加のアミノ酸若しくはペプチド、例えば、シグナルペプチド配列及び／又はリーダーペプチド配列などを含むことを除外しないが、ｗｔＧＬＰ−１のアミノ酸１−６の配列とは区別する。別の好ましい実施形態では、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）又はそのホモログのＮ末端に（直接的に）連結されるアミノ酸はＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の６位で天然に存在するアミノ酸に相当しない。更に好ましい実施形態によれば、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）又はそのホモログのＮ末端に連結されるアミノ酸は、天然のＧＬＰ−１における、好ましくはＧＬＰ−１の天然の順序における天然に存在するアミノ酸６、天然に存在するアミノ酸５及び６、天然に存在するアミノ酸４、５及び６、天然に存在するアミノ酸３、４、５及び６、天然に存在するアミノ酸２、３、４、５及び６、並びに天然に存在するアミノ酸１、２、３、４、５及び６に相当しない。特に好ましい実施形態によれば、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）又はそのホモログのＮ末端に連結されるアミノ酸は、プレプログルカゴンの配列に相当しない。
【００５９】
天然のＧＬＰ−１、特にＧＬＰ−１（７−３６）は生体内での短い半減期に悩まされているので、一般に、頻繁な投与が厳格に回避されるべきであるか又は長期投与が考えられる治療での使用が制限される。ＧＬＰ−１は、残基８と９の間でＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）によって数分以内に血漿で迅速に分解されて不活性のＮＨ２−末端の切捨て代謝体ＧＬＰ−１（９−３６）を生じる。更に、天然のＧＬＰ−１は通常腎排泄を受ける。これらの因子は、ペプチドＧＬＰ−１（７−３６）又はＮＨ２−末端の切捨て代謝体ＧＬＰ−１（９−３６）が生体内で活性のある部分であることについて、及び天然のＧＬＰ−１又はそのフラグメントによる治療応用で生理学的な効果が発揮されるかどうかについて問題点を生じる。生体内でのその迅速な分解の結果、及びそのせいで、天然のＧＬＰ−１又はそのフラグメントは、急性の眼疾患患者に有用な可能性がある集中治療室のような短期間の代謝制御に好適なツールとして使用されてもよい。
【００６０】
そのような迅速な分解を回避するために、（ＤＰＰ−ＩＶによる分解に対して）安定化された、天然に存在するＧＬＰ−１（例えば、ＧＬＰ−１（７−３７））の類似体を合成するための種々の試みが行われている。特に、生体内ではＡｌａである８番目の残基を、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒのような別の残基で置換した（Ｂｕｒｃｅｌｉｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ４８，  ２５２−２５８）。Ｇｌｙ８又はＧ８類似体の双方を合成分子として鋭意調べて、遺伝的に操作した細胞に作らせ変異ポリペプチドを分泌させている（Ｂｕｒｃｅｌｉｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８７５：２７７−２８５）。その他の種々の修飾体が、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）に導入されて、その生物活性に妥協することなく、生体内で安定性を高めている。
【００６１】
そのようなアプローチとしては、例えば、ＧＬＰ−１ペプチドと共にＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を追加的に投与することによって、ＤＰＰ−ＩＶによる分解に対してＧＬＰ−１を安定化することにより、短い半減期の問題を回避する。ＧＬＰ−１ペプチドと共にＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を追加的に投与することは、複雑化され、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は試験管内の系でのみ効率的に使用され得るので、通常、所望の長期治療にはつながらない。更に、ＧＬＰ−１の必要な患者は、長期間にわたって、即ち、治療される疾患に罹っている間、又は更に悪ければ生涯にわたってＧＬＰ−１又はその類似体若しくは変異体の１又は複数を服用しなければならない。それは、薬物の繰り返し投与が必要になることを示している。しかしながら、眼内への投与は、痛みを伴い得るし、注入に関連する眼内感染及び眼内構造の機械的病変のリスクを抱え得る。加えて、生体内でのＧＬＰ−１の相対的に短い半減期は、短い間隔で薬物の再投与を必要とする。それは侵襲性の処置なので、ＧＬＰ−１の投与は医師によって行われなければならない。水晶体への病変（白内障をもたらす）又は網膜への病変（網膜剥離をもたらす）のリスクが受け入れ難く高いので、それらは患者自身によって投与することができない。更に、薬物の反復した眼内投与は、投与が頻繁に繰り返される場合、水晶体や網膜に対する医原性病変の累積リスク及び感染の累積リスクに関連し得る。従って、必要な再投与の数を顕著に減らす処置及び技法を開発することが非常に望ましい。
【００６２】
したがって、代わりの実施形態によれば、眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体は、ＧＬＰ−１融合ペプチド、又は本明細書で定義されるようなそのフラグメント若しくは変異体から選択される神経保護因子であってもよい。本明細書で使用されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドは、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい。この文脈で、本明細書で定義されるような、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞は、通常、コアを調製する前に、これらの細胞がＧＬＰ−１融合ペプチドをコードし、発現し、分泌するように、ＧＬＰ−１融合ペプチドをコードする核酸配列によってトランスフェクションされる。
【００６３】
本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドは、少なくとも２つの構成成分、例えば、構成成分（Ｉ）と（ＩＩ）、構成成分（Ｉ）と（ＩＩＩ）又は構成成分（Ｉ）と（ＩＩ）と（ＩＩＩ）を有し、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１の生物活性を示し、同時に通常はＣ末端の伸長によってＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）に安定性を付与する。本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）は、好ましくは配列番号１と少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、一層更に好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する、上記で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチドの配列を含有する。配列番号１は、哺乳類の間で厳密に保たれているＧＬＰ−１（７−３７）（３１アミノ酸の長さ）の天然のアミノ酸配列を表す。特に好ましい実施形態によれば、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）は、配列番号１と同一の配列、又は配列番号１のアミノ酸３６及び／又は３７を欠く配列を含有する。
【００６４】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）（又は更に一般的には、融合ペプチドのフラグメント若しくは変異体を含むＧＬＰ−１ペプチド）は通常、少なくとも９のアミノ酸を有するペプチド配列を含有する。ＧＬＰ−１融合ペプチドは通常、その構成成分（ＩＩ）に９−３０、好ましくは９−２０、最も好ましくは９−１５のアミノ酸の配列長さを有してもよい。一般的に言えば、構成成分（ＩＩ）における更に短い配列は、更に長い配列よりもＧＬＰ受容体への優れた結合活性のために好まれてもよい。構成成分（ＩＩ）の配列は、前提条件ではないが、好ましくは中性であってもよく、又はｐＨ７にて負の電荷を有してもよい。ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）は更にその配列中に少なくともプロリン残基１つを含有してもよい。プロリン残基は、βターンを形成する四量体アミノ酸配列の中で共通するアミノ酸である。従って、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）はβターン様の構造を形成してもよい。βターン構造は、タンパク質又はペプチドの典型的な二次構造要素である。βターン構造は通常、４つのアミノ酸の伸展によって形成され、ペプチド又はタンパク質の主鎖の方向を戻す。ＧＬＰ−１融合ペプチドに存在するのであれば、プロリン残基は、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）に存在している四量体βターン配列モチーフの２位又は３位、好ましくは２位に一般に位置する。
【００６５】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）（又は更に一般的には、融合ペプチドのフラグメント若しくは変異体を含むＧＬＰ−１ペプチド）は、ＶＡＩＡ、ＩＡＥＥ、ＰＥＥＶ、ＡＥＥＶ、ＥＥＬＧ、ＡＡＡＡ、ＡＡＶＡ、ＡＡＬＧ、ＤＦＰＥ、ＡＡＤＸ、ＡＸＤＸ及びＸＡＤＸからなる群から選択される配列モチーフを含有してもよく、その際、Ｘは任意のアミノ酸（天然に存在するか又は修飾された非天然のアミノ酸）を表す。これらの四量体モチーフは構成成分（ＩＩ）の配列のどこに位置してもよい。特に好ましい実施形態は、本発明の融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）は、ＡＡ、ＸＡ、ＡＸ、ＲＲ、ＲＸ及びＸＲからなる群から選択されるそのＮ末端配列モチーフによって構成成分（Ｉ）のＣ末端に連結されるペプチド配列であり、その際、Ｘは任意のアミノ酸（天然に存在するか又は修飾された非天然のアミノ酸）を表す。
【００６６】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）として特に好まれるのは、ヒト又はマウスのＩＰ−２の部分配列に相当する配列番号４８：Ｘ１Ｘ１ＤＦＰＸ２Ｘ２Ｘ３Ｘ４で表される配列を含有するペプチド配列であり、その際、各Ｘ１は通常互いに独立して、天然に存在する任意のアミノ酸、好ましくはアルギニン（Ｒ）又はアラニン（Ａ）、更に好ましくはアラニン（Ａ）から選択され、又は非存在であってもよく；各Ｘ２は通常互いに独立して、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）から選択され；Ｘ３及びＸ４はそれぞれ、通常互いに独立して、天然に存在する任意のアミノ酸、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、スレオニン（Ｔ）又はバリン（Ｖ）から選択される。Ｘ４も非存在であってもよい。
【００６７】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）として一層更に好ましいのは、配列番号２２（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩ）、配列番号２７（ＤＦＰＥＥＶＡＩ）、配列番号２８（ＲＤＦＰＥＥＶＡ）、配列番号２９（ＲＲＤＦＰＥＥＶ）、配列番号３０（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩ）、配列番号３１（ＡＤＦＰＥＥＶＡ）又は配列番号３２（ＡＡＤＦＰＥＥＶ）（ペプチド配列は、全て１文字表記）で表される配列、又は配列番号２２、２７、２８、２９、３０、３１若しくは３２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含有するペプチド配列である。配列番号２２は、完全長ＩＰ−２（介在ペプチド２）配列の部分配列であり、１５アミノ酸の完全長ＩＰ−２配列のうち１０のＮ末端アミノ酸を含有する。ＩＰ−２は本明細書で使用されるような構成成分（ＩＩ）の好ましい例である。したがって、本明細書で定義されるＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）に含有されるその他の更に強く好まれる配列は、ＩＰ−２の更に長い部分アミノ酸配列、例えば、ヒト（配列番号２３：ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ）中の１４Ｎ末端アミノ酸配列又はマウスの対応物（配列番号２４：ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ）又は配列（配列番号３３：ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ）若しくは（配列番号３４：ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ）、又は配列番号２３、２４、３３若しくは３４と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列である。ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）に含有される要素として最も好ましいのは、天然に存在するＩＰ−２配列（配列番号２：ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ、ヒト；又は配列番号３：ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ、マウス；又は配列番号３５：ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ；又は配列番号３６：ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）の１５アミノ酸全てを有する完全長ＩＰ−２配列又は配列番号２、３、３５若しくは３６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列である。ＩＰ２の哺乳類アイソフォームの全て（哺乳類の間でのＩＰ２の天然の変異体）も本発明の範囲内である。構成成分（ＩＩ）に含まれる配列の１を超えるコピー、例えば、ＩＰ２又はＩＰ２のフラグメント若しくは変異体の２、３又はそれ以上のコピーが提供されてもよい。
【００６８】
従って、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されるＧＬＰ−１融合ペプチドは、好ましくは、配列番号８（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）にで表される配列、即ち、マウスのＩＰ２にそのＣ末端を介してリンカー配列無しで連結されるＧＬＰ−１（７−３７）、又は配列番号１２（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）にで表される配列、即ち、ヒトのＩＰ２にそのＣ末端を介してリンカー配列無しで連結されるＧＬＰ−１（７−３７）、又は配列番号３７（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）にで表される配列、即ち、ＩＰ２にそのＣ末端を介してリンカー配列無しで連結されるＧＬＰ−１（７−３７）、又は配列番号３８（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）にで表される配列、即ち、ＩＰ２にそのＣ末端を介してリンカー配列無しで連結されるＧＬＰ−１（７−３７）、又は配列番号３９（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＡＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号４０（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＡＡＡＡＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号４１（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＡＡＡＡＶＡＩＡＡＡＬＧ）、配列番号４２（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰ）、配列番号４３（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡ）、配列番号４４（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧＲＲＨＡＣ）、配列番号４５（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＡＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号４６（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＡＡＡＡＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号４７（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＡＡＡＡＶＡＩＶＡＡＬＧ）又は配列番号４８（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧＲＲＨＡＣ）、即ち、ＩＰ２配列の特定の類似体又は変異体にそのＣ末端を介してリンカー配列無しで連結されるＧＬＰ−１（７−３７）を含有する、含む、又はそれからなる。配列番号８、１２及び３７−４８と少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異体若しくはフラグメント、又はそのフラグメント若しくは変異体も同様に本明細書で使用されてもよい。この文脈で好まれるＧＬＰ１−融合ペプチドは更に配列番号１３、１４、１９及び２０にで表される配列を含んでもよい。
【００６９】
何ら理論に束縛されるものではないが、例えば、本発明に従って使用される、埋め込まれた（インプラントされた）（球状）マイクロカプセルの、（球状）コアに埋め込まれた細胞によって生体内で患者の周辺組織に分泌される場合、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の不安定性は、その保護されていない三次元構造のせいであると本発明者らは結論付けている。プロテアーゼは、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）ペプチドを切断し、生体内でその生理的活性を迅速に取り除き得る。ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）のＣ末端にペプチド配列を連結することによってその構造は酵素分解に対して安定性を獲得する。安定性におけるそのような獲得は、追加のＣ末端ペプチド配列（本発明に係る融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）に含有される）が折り畳み戻されると、例えば、その一次構造によって形成されるβターン構造要素の存在と構成成分（ＩＩ）に剛性を提供することによって、高められ得る。本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドは、好ましくはβターン構造要素を含有するそのＣ末端ペプチドの伸長によって、ＤＰＰ−ＩＶの不活化に対する改善された耐性を有することが見出される。Ｃ末端ペプチドは、標的細胞においてその受容体で作用する前にＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）配列から切断されないか、又はそれが生体内にて酵素で切断されてＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）を形成してもよい。ＧＬＰ−１受容体の部位で結合したＧＬＰ−１ペプチドの正確な形態に関係なく、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチドは活性のある神経保護化合物としてその機能を発揮する。βターン要素を形成する一次構造のために、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）に好適であるとみなされるＧＬＰ−１ペプチド配列は、適切な方法、例えば、分光法、例えば、円偏光二色性法、又は当業者に既知の他の方法によって容易に特定され得る。
【００７０】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩ）及び構成成分（Ｉ）は、直接連結されてもよいし、リンカー配列を介して連結されてもよい。好ましくは、双方の構成成分は互いに、直接連結される。それらがリンカー（又はスペーサー）を介して連結される場合、リンカーは好ましくはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは通常、１から１０のアミノ酸、好ましくは１から５、一層更に好ましくは１から３のアミノ酸の長さを有し、場合によっては、リンカー配列は１１から５０のアミノ酸を含む更に長いものであってもよい。ペプチドリンカーは種々の（天然に存在する）アミノ酸配列で構成されてもよい。好ましくは、ペプチドリンカーは、連結される構成成分間に若干の構造的自由度を導入する。構造的自由度は、例えば、リンカー配列のなかで種々のグリシン又はプロリン残基、好ましくは少なくとも３０％、更に好ましくは少なくとも４０％、一層更に好ましくは少なくとも６０％のプロリン及びグリシンの残基を含有するペプチドリンカーを有することによって達成される。特定の配列に関係なく、ペプチドリンカーは好ましくは免疫学的に不活性であり得る。
【００７１】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドは更に構成成分（ＩＩＩ）を含有してもよい。一般に、構成成分（ＩＩＩ）は、少なくとも４つのアミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０の追加のアミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも２０、又は最も好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。機能的な点では、構成成分（ＩＩＩ）は、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチドの安定性を更に高めることが意図される。構成成分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）の生物活性にほぼ匹敵する、ＧＬＰ−１融合ペプチドの生物学的機能を妨害しないことが期待される。一般的に言えば、本明細書で定義されるような構成成分（Ｉ）のＣ末端の伸長は、それが本明細書で定義されるような構成成分（ＩＩ）又は構成成分（ＩＩＩ）又は構成成分（ＩＩ）と構成成分（ＩＩＩ）との組み合わせのいずれであるにせよ、構成成分（Ｉ）、即ち、上記で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド、例えば、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）、又は本明細書で定義されるようなそのフラグメント若しくは変異体の安定性を高める。
【００７２】
好ましくは、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩＩ）は、任意の哺乳類生物のＧＬＰ−２のアイソフォーム（哺乳類におけるその他の天然に存在するＧＬＰ−２の変異体）、例えば配列番号４及び５で示されるようなマウス又はヒトアイソフォームの、Ｎ末端配列の少なくとも４、好ましくは少なくとも１０、更に好ましくは少なくとも２０の追加のアミノ酸残基を含む。ＧＬＰ−２はプログルカゴンに存在し、炭水化物代謝にも関与する。本発明の文脈で、用語「ＧＬＰ−２ペプチド」は好ましくはＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）を意味し、一方で、「修飾されたＧＬＰ−２ペプチド」はＧＬＰ−２のフラグメント若しくは変異体、又はＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）のフラグメント若しくは変異体を意味するように意図される。変異体又はフラグメントは、非修飾配列、例えば、ＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）の修飾体として分類される。構成成分（Ｉ）（ＧＬＰ−１ペプチド）に含まれる生物学的に活性のある配列と同様に、構成成分（ＩＩＩ）もまた、ＧＬＰ−２の天然に存在する形態の変異体又はフラグメントを含んでもよい。或いは、構成成分（ＩＩＩ）もまた、あらゆる哺乳類のアイソフォーム（本明細書で開示されるような）そのあらゆる機能的なフラグメント又は変異体を同様に含む、ＧＬＰ−１（７−３７）の（Ｎ末端）配列の少なくとも４、好ましくは少なくとも１０、更に好ましくは少なくとも２０の追加のアミノ酸残基を含んでもよい。一般的に言えば、構成成分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）に好適であると本明細書で開示されるＧＬＰ−１ペプチドの任意の形態又は修飾されたＧＬＰ−１ペプチドを含有してもよい。更なる代替では、構成成分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−２のキメラ形態も含有してもよい。キメラ形態は、ＧＬＰ−１（７−３７）とＧＬＰ−２（又はフラグメント若しくは変異体）を互いに結合させ、その後、このキメラ形態を構成成分（ＩＩＩ）としてＧＬＰ−１融合ペプチドに導入することによって作出されてもよい。好ましくは、キメラ形態は、ＧＬＰ−１（７−３７）の部分配列とＧＬＰ−２の部分配列とが一緒に連結されて構成される。キメラ形態としては、例えば、ＧＬＰ−１のＮ末端５−３０のアミノ酸とＧＬＰ−２のＣ末端５−３０のアミノ酸を含んでもよく、その逆でもよく、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸７又は８−２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８、及び１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４位からのアミノ酸配列を、ＧＬＰ−２のＣ末端に連結してもよい。ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−１（７−３７）の天然に存在する形態の修飾体がそれぞれ構成成分（ＩＩＩ）として含有されるのであれば、構成成分（ＩＩＩ）は好ましくはそれぞれ、配列番号１、４若しくは５の配列、又は配列番号１、４若しくは５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含有する。
【００７３】
別の実施形態では、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（ＩＩＩ）は、構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）について上述されたような複数の配列を含有してもよい。構成成分（ＩＩＩ）として、例えば、少なくとも２、好ましくは２、３若しくは４つのＧＬＰ−１（７−３７）及び／又はＧＬＰ−２のコピー、又は、配列番号１、４若しくは５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の少なくとも２つのコピーを含有してもよい。また、構成成分（ＩＩＩ）は、上記で開示されたようなＧＬＰ−１（７−３７）又はＧＬＰ−２のキメラ版の、１を超えるコピーを含有してもよく、例えば、最終的に、ＧＬＰ−１（７−３７）及び／若しくはＧＬＰ−２又は少なくとも８０％の配列同一性を持ったその修飾体と、キメラ版との組み合わせを形成してもよい。本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドは、また、例えば（１）そのＮ末端によって構成成分（Ｉ）又は（ＩＩ）のＣ末端に連結されてもよく、（２）そのＣ末端によってリンカーを介して又は直接、構成成分（Ｉ）のＮ末端に連結されてもよい、２つ以上の、好ましくは２つの構成成分（ＩＩＩ）を含んでもよい。２つの構成成分（ＩＩＩ）が提供されるのであれば、これらは同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００７４】
好ましい実施形態によれば、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドは、上記構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を含んでもよい。これらの構成成分全てを含有する具体的な実施形態は、好ましくは、配列番号６（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（マウス）−ＲＲ−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｃ、本明細書ではマウスＣＭ１とも表記される）、配列番号７（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（マウス）−ＲＲ−ＧＬＰ２−Ｃ、本明細書ではマウスＣＭ２とも表記される）、配列番号１０（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（ヒト）−ＲＲ−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｃ、本明細書ではヒトＣＭ１とも表記される）、及び配列番号１１（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（ヒト）−ＲＲ−ＧＬＰ−２−Ｃ、本明細書ではヒトＣＭ２とも表記される）、又は配列番号６、７、１０若しくは１１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、又はそれらのフラグメント若しくは変異体からなる群から選択される。前述の配列では、記号「Ｎ」及び「Ｃ」は、これら融合ペプチドのＮ末端及びＣ末端を指す。配列番号６、７、１０及び１１にで表される配列は全て、ＩＰ２（構成成分（ＩＩ））のＣ末端にてＲＲ−リンカー（２つのアルギニン残基）を含有するが、それは、代わりに排除されていてもよい。配列番号６、７、１０及び１１に係る実施形態のそれぞれにおける構成成分（Ｉ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）であり、一方で、構成成分（ＩＩＩ）（これら実施形態のそれぞれでは、構成成分（ＩＩ）のＣ末端に連結される）は、ＧＬＰ−１（７−３７）又はＧＬＰ−２のいずれかである。この文脈で好まれるＧＬＰ１−融合ペプチドは更に、配列番号１５、１６、１７、１８及び２６にで表される配列を含んでもよい。
【００７５】
本発明の別の好ましい実施形態では、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、ＧＬＰ−１融合ペプチドは、構成成分（Ｉ）に加えて、構成成分（Ｉ）のＣ末端及び／又は構成成分（Ｉ）のＮ末端のいずれかに連結される構成成分（ＩＩＩ）（本明細書で定義されるような構成成分（ＩＩ）無しで）を含有する。好ましくは、構成成分（ＩＩＩ）は構成成分（Ｉ）のＣ末端に位置する。構成成分（ＩＩＩ）が（そのＣ末端によって）構成成分（Ｉ）のＮ末端に連結されるか又は（そのＮ末端によって）構成成分（Ｉ）のＣ末端に連結されるかどうかに関わりなく、カップリングは直接であってもよいし、リンカー配列を介して間接的であってもよい。リンカー配列に関して言えば、それは、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）及び構成成分（ＩＩ）を接続するリンカーについてのＧＬＰ−１融合ペプチドの上記開示が言及される。
【００７６】
本発明の代わりの好ましい実施形態では、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよいＧＬＰ−１融合ペプチドは、構成成分（Ｉ）及び（ＩＩ）に加えて、構成成分（ＩＩ）のＣ末端及び／又は構成成分（Ｉ）のＮ末端のいずれかに連結される構成成分（ＩＩＩ）を含有する。好ましくは、構成成分（ＩＩＩ）は構成成分（ＩＩ）のＣ末端に位置する。構成成分（ＩＩＩ）が、構成成分（Ｉ）のＮ末端（そのＣ末端によって）又は構成成分（ＩＩ）のＣ末端（そのＮ末端によって）のいずれに連結するかにかかわりなく、カップリングは直接であってもよいし、リンカー配列を介して間接的であってもよい。リンカー配列に関して言えば、それは再び、ＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）と構成成分（ＩＩ）を接続するリンカーに関するＧＬＰ−１融合ペプチドの上記開示が言及される。
【００７７】
（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよいＧＬＰ−１融合ペプチドは、本発明に従って使用されるとき、更に、融合タンパク質の構成成分の上述の組み合わせのいずれか（即ち、構成成分（Ｉ）と（ＩＩ）、構成成分（Ｉ）と（ＩＩＩ）、又は、構成成分（Ｉ）と（ＩＩ）と（ＩＩＩ））に加えて、キャリアタンパク質、特にトランスフェリン又はアルブミンを構成成分（ＩＶ）として含んでもよい。そのような構成成分（ＩＶ）は、ＧＬＰ−１融合タンパク質の構成成分の上述の組み合わせのいずれか、即ち、構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）、構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）、又は構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び／又は（ＩＩＩ）のいずれかのＮ末端及び／又はＣ末端に直接、又は本明細書で定義されるようなリンカーを用いて連結されてもよい。
【００７８】
本発明の特定の実施形態では、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（融合）ペプチドは、構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）として、以下の式ＩＩのアミノ酸配列を含む修飾されたＧＬＰ−１ペプチドを含有する：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
式中、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり、Ｇｌｙが特に好ましく；Ｘａａ１６は、Ｖａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５は、Ａｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７は、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３は、Ｖａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓ又はアミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は非存在であり；本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（融合）ペプチドが、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されるならば、これらのアミノ酸は、好ましくは、本明細書で定義されるような眼疾患を治療する際、それを必要とする患者に投与されるように選択されるか、又は、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸であり、Ｇｌｙが特に好ましく；Ｘａａ１６は、Ｖａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５は、Ａｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７は、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３は、Ｖａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓ又はアミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は非存在であり；本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（融合）ペプチドが、本明細書で定義されるような眼疾患を治療する際、それを必要とする患者に直接提供されるのであれば、これらのアミノ酸が好ましくは選択される。
【００７９】
本発明の更に別の特定の実施形態では、本明細書で定義されるような、及び本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されるようなＧＬＰ−１（融合）ペプチドの構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）は、以下の式ＩＩＩのアミノ酸配列を含む修飾されたＧＬＰ−１ペプチドを含有する：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
式中、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は非存在であり；本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（融合）ペプチドが、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されるならば、これらのアミノ酸は、好ましくは、本明細書で定義されるような眼疾患を治療する際、それを必要とする患者に投与されるように選択されるか、又は、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂであり；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は非存在であり；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は非存在であり；本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（融合）ペプチドが、本明細書で定義されるような眼疾患を治療する際、それを必要とする患者に直接提供されるのであれば、これらのアミノ酸が好ましくは選択される。
【００８０】
特に好ましい実施形態では、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよいＧＬＰ−１（融合）ペプチドが使用され、その際、構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）は、（修飾された）ＧＬＰ−１ペプチドを含有し、それは、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）又はそれらの変異体、類似体若しくは誘導体から選択される。また好ましいのは、前記ＧＬＰ−１ペプチドの８位でＡｉｂ残基を、又は７位でアミノ酸残基を有する修飾されたＧＬＰ−１ペプチドをその構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）にて含むＧＬＰ−１（融合）ペプチドであり、それは、好ましくは、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（融合）ペプチドが、本明細書で定義されるような眼疾患を治療する際、それを必要とする患者に直接提供されるのであれば、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニンからなる群から選択される。
【００８１】
別の特に好ましい実施形態では、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよいＧＬＰ−１（融合）ペプチドが使用され、その際、式ＩＩ及びＩＩＩによって本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１（融合）ペプチドの構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）の双方の実施形態は、ＧＬＰ−１（融合）ペプチドについて上記で与えられた開示と組み合わせられてもよい。言い換えれば、一般式ＩＩ及びＩＩＩは、例えば、構成成分（ＩＩ）、リンカー、製造プロセスなどについて上記で示された開示と組み合わせてもよい。
【００８２】
本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチド、好ましくは、上記で定義されたようなＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）は、好ましくは、そのフラグメント及び変異体と同様に上記で概説されたタンパク質分解切断に対して、特に好ましくはＤＰＰ−ＩＶに対して保護される。従って、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドは、そのフラグメント及び変異体と同様に、特にＧＬＰ−１融合ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶに耐性のあるＧＬＰ−１、例えば、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）（構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）の一部としてのＧＬＰ−１融合ペプチドの場合）の配列を含有してもよい。この文脈で、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによる分解に対するペプチドの耐性は、例えば、以下の分解アッセイによって決定されてもよい：ｐＨ７−８の適切な緩衝液（アルブミンではない緩衝液）において３７℃にて精製したジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶのアリコートと共に４−２２時間、ペプチドのアリコートをインキュベートする。トリフルオロ酢酸の添加によって酵素反応を停止し、ペプチドの分解生成物を分離し、ＨＰＬＣ又はＬＣ−ＭＳの分析を用いて定量化する。この分析を行う方法の１つは、以下である：混合物をＺｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８（３０ｎｍの孔、５μｍの粒）、１５０ｍｍ×２．１ｍｍのカラムに取り、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの線形勾配（３０分間にわたって０％−１００％）によって０．５ｍＬ／分の流速で溶出する。２１４ｎｍ（ペプチド結合）又は２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸）での吸収によってペプチドとその分解生成物をモニターし、そのピーク面積の積分によって定量化する。分離したピークのＭＳスペクトルを決定することができるＬＣ−ＭＳを用いて分解パターンを決定することができる。所与の時間での無傷の化合物／分解された化合物のパーセンテージをペプチドＤＰＰ−ＩＶ安定性の推定に使用する。
【００８３】
上記の文脈で、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチド、好ましくは、上記で定義されたようなＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）は、そのフラグメント及び変異体と同様に、所与の時間での無傷の化合物のパーセンテージに基づいて、修飾されていないＧＬＰ−１（７−３７）のペプチド配列よりも１０倍以上の安定性がある場合、ＤＰＰ−ＩＶ（対して安定化されたとして定義される。したがって、ＤＰＰ−ＩＶに対して安定化されたＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチド、好ましくは、上記で定義されたようなＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）は、好ましくは、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）よりも少なくとも１０倍、更に好ましくは少なくとも２０倍安定している。安定性は、当業者に既知の方法、例えば、試験対象のペプチドの溶液にＤＰＰ−ＩＶを加え、例えば、ある期間にわたって、例えば、分光法、ウエスタンブロット解析、抗体スクリーニングなどによって、一定の時間にわたってペプチド（上記参照）の分解を測定することによって評価されてもよい。
【００８４】
並行して、ＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチド、好ましくは、上記で定義されたようなＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）は、そのフラグメント及び／又は変異体と同様に、例えば、その天然の受容体（ＧＬＰ−１受容体）への結合によって、ＧＬＰ−１（７−３７）の効果を発揮する化合物として定義される。好ましくは、ＧＬＰ−１（融合）ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドは、本明細書で定義されるようなそのフラグメント及び／又は変異体と同様に、天然に存在するＧＬＰ−１ペプチドの結合親和性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％に相当する、ＧＬＰ−１受容体への結合親和性を有する。結合親和性は、任意の好適な方法、例えば、表面プラズモン共鳴等によって測定されてもよい。更に、ＧＬＰ−１（融合）ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドの場合、本明細書で定義されるようなそのフラグメント及び／又は変異体と同様に、細胞へのシグナルを伝達する、細胞外受容体へのその結合によって細胞内ｃＡＭＰの形成を誘発することが好ましい。
【００８５】
別の好ましい実施形態によれば、本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適な神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体は、これらペプチド又はタンパク質の配列の修飾された形態から選択されてもよい。種々の修飾された形態、特に上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の修飾された形態は、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよく、又は眼疾患の治療に直接使用されてもよい。これらの修飾された形態は、以下で開示され、更に詳細に説明されるが、例えば、眼疾患の（眼内）治療に好適な、上記神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体のフラグメント、変異体などを含む。この文脈で、これらペプチド又はタンパク質のフラグメント及び／又は変異体は、天然の修飾されていないアミノ酸配列の長さ全体にわたって少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の、天然のペプチド又はタンパク質に対する配列同一性を有する。これは同様に、各（コーディング）核酸配列に適用されてもよい。
【００８６】
用語「配列同一性」は、本明細書で定義されるときは通常、配列が以下のように比較されることを意味する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセンテージを決定するには、配列を最適な比較目的で並べることができる（例えば、第１のアミノ酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、相当するアミノ酸位置にてアミノ酸を比較することができる。第１の配列の位置が、第２の配列における相当する位置と同じアミノ酸によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間での同一性パーセンテージは、それら配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、例えば、特定のペプチドが定義された長さの参照ポリペプチドに対する特定の同一性パーセンテージを有すると言われる場合、同一性パーセンテージは参照ペプチドに比例する。従って、１００アミノ酸の長さである参照ポリペプチドに５０％同一であるペプチドは、参照ポリペプチドの５０アミノ酸の長さ部分と完全に同一の５０アミノ酸のポリペプチドであり得る。それはまた、その全体の長さにわたって参照ポリペプチドに５０％同一である１００アミノ酸の長さのポリペプチドでもあり得る。当然、その他のポリペプチドも同一の基準を満たすであろう。２つの配列の同一性パーセンテージのそのような決定は、数学的なアルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的なアルゴリズムの好まれる非限定例は、Ｋａｒｌｉｎら（１９９３），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムをＮＢＬＡＳＴプログラムに組み入れ、それを用いて本発明のアミノ酸配列に対して所望の同一性を有する配列を特定することができる。比較目的のためのギャップのある配置を得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２に記載されたようにギャップのあるＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）を利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップのあるＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。−１２のギャップ開始ペナルティ（ギャップの最初の空値用）と−４のギャップ伸長ペナルティ（ギャップにおける各追加の連続空値当たり）を伴った初期設定（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリクス（値−４から１１）を用い、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰ（グローバル配置プログラム）のバージョン９を用いて、配列を更に並べてもよい。配置の後、請求された配列におけるアミノ酸の数のパーセンテージとして一致したものの数を表すことによって同一性パーセンテージを算出する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセンテージの決定の記載された方法は、同様に核酸配列に適用することができる。
【００８７】
本発明の文脈で、眼疾患の（眼内）治療に好適な、抗血管新生因子の、神経保護因子の、その他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の「フラグメント」、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等のフラグメント、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体のフラグメントは通常、これらのペプチド又はタンパク質のフラグメントを指す。通常、そのようなフラグメントは、特に天然のペプチド又はタンパク質、例えば、本明細書で定義されるような抗血管新生因子の、神経保護因子の、その他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の、単一の構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等の、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の、所望の生物活性を保持する更に短いペプチドを含み、それは、アミノ酸配列（又はそれがコードされる核酸配列）に関して、天然のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列（又はそれがコードされる核酸配列）に比べて、Ｎ末端で、Ｃ末端で、及び／又は配列の中で切り取られる。したがって、そのような切り取りは、アミノ酸レベル又はそれに応じて核酸レベルで生じてもよい。ペプチド分子のいずれかの末端からアミノ酸（ペプチド又はアミノ酸のレベルで）を取り除き、例えば、眼疾患の（眼内）治療に好適な、神経保護因子、抗血管新生因子及び／又はその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体についての本明細書で定義されるような生物学的特性について、得られたペプチド又はタンパク質を調べることによって、生物学的に機能性のフラグメントを容易に特定してもよい。或いは、天然のペプチド又はタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端のいずれかから一度に１以上のアミノ酸を取り除くプロテアーゼを用いて、所望の生物活性を保持するフラグメントを決定してもよい。最終的に、フラグメントは、ペプチド末端でのアミノ酸の欠失及び／又はペプチド配列内に位置するアミノ酸の欠失によってもよい。
【００８８】
更に、神経保護因子の、抗血管新生因子の「変異体」、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の変異体、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等の変異体、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の変異体は、好ましくは、タンパク質配列又はそのコーディング核酸配列（又はそのフラグメント）を含み、天然のタンパク質又はペプチド配列のアミノ酸が交換される。それによって、１以上の変異、例えば、１以上の置換された、挿入された及び／又は欠失されたアミノ酸にて天然のタンパク質又はペプチド配列と異なるアミノ酸配列を有する、神経保護因子の、抗血管新生因子の（変異体）、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の（変異体）、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等の（変異体）、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の（変異体）が生成される。好ましくは、完全長の天然の神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体と比べて、これらの変異体は、ほぼ同一の又は改善された生物活性を有する。本明細書で定義されるようなそのような変異体は、合成された変異体をコードするＤＮＡ配列における変異によって調製することができる。最終的に得られた変異体が所望の生物活性を持つという条件で、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせも、神経保護因子の変異体、抗血管新生因子の変異体、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の変異体、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等の変異体、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の変異体に含有されてもよい。明らかに、変異体ペプチドをコードするＤＮＡで為される突然変異は、リーディングフレームを変更してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を作出し得る相補的領域を作製しないであろう。
【００８９】
したがって、神経保護因子の変異体、抗血管新生因子の変異体、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の変異体、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等の変異体、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の変異体はまた、天然の神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体と比べて、アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端又は更に双方の末端に隣接する追加のアミノ酸残基を含有してもよい。一例として、そのような変異体は、ＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端又は更に双方の末端に隣接する追加のアミノ酸残基を含有する、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドを含んでもよい。得られたＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドがプロテアーゼに対する耐性又は安定性を保持し、本明細書で定義されるように作用するその能力を保持する限り、例えば、ＧＬＰ−１について既知の有益な効果によって、通常の実験により、そのような隣接残基がコアペプチドの基本特性に影響を及ぼすかどうかを決定することができる。用語「本質的に〜からなる」は、本明細書で定義されるような特定のＧＬＰ−１ペプチドを指すとき、特定のＧＬＰ−１ペプチドの基本特性に影響を及ぼさない追加の隣接残基が存在し得ることを意味する。この用語は通常、特定の配列の中での置換、欠失又は付加を含まない。
【００９０】
神経保護因子の「変異体」、抗血管新生因子の「変異体」、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の「変異体」、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等の「変異体」、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の「変異体」は更に、その天然の配列に比べて保存的なアミノ酸置換を含む分子を指してもよい。同じクラスに由来するアミノ酸が互いに交換される置換を保存的な置換と呼ぶ。特に、これらは、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸、正又は負に荷電する側鎖を有するアミノ酸、側鎖又はアミノ酸に芳香族基を有するアミノ酸、水素結合に入り得る側鎖、例えば、ヒドロキシル官能を有する側鎖を有するアミノ酸である。このことは、例えば、極性の側鎖を有するアミノ酸が同様に極性の側鎖を有する別のアミノ酸によって置き換えられる、又は疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸が同様に疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されることを意味する。三次元構造に修飾を起こさないか又は結合領域に影響を及ぼさない配列位置では、特に挿入及び置換が可能である。挿入又は欠失による三次元構造への修飾は、例えば、ＣＤスペクトル（円偏光二色性スペクトル）（Ｕｒｒｙ，  １９８５，  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  ＯＲＤ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  （Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ所収））によって容易に決定することができる。
【００９１】
したがって、神経保護因子の変異体、抗血管新生因子の変異体、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の変異体、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等の変異体、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の変異体はまた、全体としての神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体、又はそれらのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子を指してもよい。そのような変異体ペプチドは、当該技術で周知の方法を用いて好都合に調製されてもよい。当然、そのような変異体は、天然の抗血管新生因子、神経保護因子、眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体で知られる類似の有益な効果を有する。そのような有益な効果は、例えば、ＧＬＰ−１について言えば、相当する天然に存在するＧＬＰ−１ペプチドとしての、虚血及び酸素不足が原因となる損傷及び心臓組織の死の可能性を強力に低減させるその能力である。
【００９２】
神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の変異体に含有されてもよい保存的なアミノ酸置換の種類は、異なった種の相同のタンパク質／ペプチドの間でのアミノ酸変化の頻度の解析に基づいてもよい。そのような解析に基づいて、保存的な置換は、以下の５群の１つの中での交換として本明細書で定義されてもよい：
Ｉ：小型の、脂肪族、非極性又はやや極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ：極性の、負に荷電した残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ：極性の、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ：大型の、脂肪族の、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；
Ｖ：大型の芳香族の残基：Ｐｈｅ、Ｔｒｙ、Ｔｒｐ
【００９３】
前述の群の範囲内で、以下の置換は「高度に保存的である」とみなされる：Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ；Ｍｅｔ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ。半保存的な置換は、上記（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を含む上群（Ａ）、又は上記（ＩＶ）及び（Ｖ）を含む上群（Ｂ）に限定される群（Ｉ）〜（ＩＶ）の２つの群の間での交換であると定義される。置換は、遺伝的にコードされたアミノ酸又は更に天然に存在するアミノ酸に限定されない。上記の意味の範囲内での同義的なアミノ酸残基の好まれる群の好まれる保存的なアミノ酸置換には以下が挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ酸      同義的残基
Ｓｅｒ    Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ
Ａｒｇ    Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ
Ｌｅｕ    Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
Ｐｒｏ    Ｇｌｙ、Ａｌａ、（Ｔｈｒ）、Ｐｒｏ
Ｔｈｒ    Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ
Ａｌａ    Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ
Ｖａｌ    Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｇｌｙ    Ａｌａ、（Ｔｈｒ）、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ
Ｉｌｅ    Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ    Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ
Ｔｙｒ    Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ
Ｃｙｓ    Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ
Ｈｉｓ    Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
Ｇｌｎ    Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、（Ｔｈｒ）、Ａｒｇ、Ｇｌｎ
Ａｓｎ    Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ
Ｌｙｓ    Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
Ａｓｐ    Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ
Ｇｌｕ    Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ    Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
Ｔｒｐ    Ｔｒｐ
【００９４】
更に、神経保護因子の変異体、抗血管新生因子の変異体、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、ＧＬＰ−１融合ペプチドの単一構成成分、特に構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）等、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド全体の変異体は、例えば、溶解性を改善することを意図して為されたアミノ酸置換（親水性アミノ酸による疎水性アミノ酸の置き換え）も含有してもよい。
【００９５】
特に好ましい実施形態の１つでは、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドは、ＧＬＰ−１ペプチドの７、８、１１、１２、１６、２２、２３、２４、２５、２７、３０、３３、３４、３５、３６又は３７位における１以上の置換を特徴とするＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１融合ペプチド構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）で生じる）を含む。以下の命名［Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）］についての一例は、３４位における天然に存在するリジンがアルギニンで置換されているＧＬＰ−１類似体を示す。
【００９６】
具体的には、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）は、例えば、Ｔｈｒ１６−Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、及びＬｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｌｙｓ３８−Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７−３８）−ＯＨ、Ｌｙｓ３６−Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｌａ３７−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、及びＬｙｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）を含むＧＬＰ−１（７−３５、３６、３７又は３８）の変異体に相当してもよい。更に一般的に言えば、本明細書で言及される任意のＧＬＰ−１変異体は（特に式ＩＩ又はＩＩＩに係る）、３８位でのＬｙｓ残基の付加によって修飾されてもよい。
【００９７】
上述のＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドが眼疾患の治療において直接投与されるのであれば、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチドの構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）は、更に、Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、アセチル−Ｌｙｓ９−ＧＬＰ−１（７−３７）を含むＧＬＰ−１（７−３５、３６、３７又は３８）の変異体に相当してもよい。
【００９８】
本発明の特に好ましい実施形態では、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１ペプチド又はＧＬＰ−１融合ペプチド（構成成分（Ｉ）又は（ＩＩＩ）に関して）は、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）又はそれらのフラグメント若しくは変異体から選択される、（修飾された）ＧＬＰ−１である／を含有する。
【００９９】
神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチドは、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されるのであれば、又はそれらのフラグメント若しくは変異体は、例えば、従来の分離技法を用いて、それが発現される細胞から（従ってマイクロカプセルから）、試験管内での制御目的で単離されてもよい。従って、試験管内での支持体及び栄養分を含む、適切な条件下で細胞を増殖させ、分泌されたタンパク質、即ち、神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチドは、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されるのであれば、又はそれらのフラグメント若しくは変異体は、細胞外の培地から回収される。従って、細胞へのトランスフェクション用に操作された（ベクター）配列は、好ましくは、本明細書で定義されるような神経保護因子又は抗血管新生因子（以下参照）の分泌を可能にするシグナル（ペプチド）配列（以下参照）を含む。この文脈で、神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチドは、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されるのであれば、又はそれらのフラグメント若しくは変異体は、天然に内因性に、又は遺伝子操作法によって細胞に導入されたコーディング核酸配列のトランスフェクションの後、シグナル配列に融合されてもよい。代替法では、これらのペプチドをコードする操作された遺伝子配列は、そのようなシグナル配列を含まず、それにより、細胞内で発現されたペプチドは通常分泌されず、細胞溶解を含むプロセスによって細胞から回収されてもよい。そのような方法では、コーディング配列は培地からの生成物ペプチドの効率的な抽出を可能にする精製タグを含んでもよく；タグは、単離された、本明細書で定義されるような神経保護因子又は抗血管新生因子を放出するように切断されてもよい。しかしながら、この代替法は通常、患者に埋め込み、生体内で発現され、分泌される本明細書で定義されるような神経保護因子又は抗血管新生因子の周辺組織への送達を必要とする（球状）マイクロカプセルの細胞には、本発明に従って使用するとき、不適切である。好ましい実施形態によれば、神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチドは、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されるのであれば、又はそれらのフラグメント若しくは変異体は、ベクターによってコードされてもよく、そのようなベクターは通常、この目的に好適なベクターである。更に好ましくは、そのようなベクターが、例えば、分解の際、細胞から放出されるのであれば、そのようなベクターは、ウイルス配列による否定的な効果を回避するために、ウイルスベクターではなく、好ましくはアデノウイルスベクターではない。
【０１００】
上述の実施形態又は特徴のいずれかを、特に指示されなければ、互いに組み合わせてもよい。
【０１０１】
上述のように、神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド、又はそれらのフラグメント若しくは変異体は、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい。更に特に好ましい実施形態によれば、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞は、抗アポトーシス因子、増殖因子、ＶＥＧＦ及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）、抗血小板因子、抗凝固因子、抗血栓薬、抗血管新生因子、又は更なる因子、例えば、眼疾患の（眼内）治療に好適なタンパク質若しくはタンパク質様物質、例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ３、ニュールツリン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）、ＡＴＦのようなポリペプチド、トロンボスポンジンのフラグメント、これらの変異体など、例えば、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２のようなＦＧＦからなる群から選択される因子を追加的に分泌するように更に修飾されてもよいし、又は操作されてもよい。
【０１０２】
特定の実施形態の１つによれば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を追加的に分泌するように操作されてもよい。エリスロポエチン（ＥＰＯ、エポエチン又はプロクリットとしても知られる）は、アルファ、ベータ、オメガなどを含む多重形態で存在する約３４，０００ダルトンの分子量の酸性糖タンパク質ホルモンである。エリスロポエチンは、赤血球の産生を刺激する。それは腎臓で産生され、骨髄やその他の場所において、関係する赤血球系前駆細胞の分裂及び分化を刺激する。一般に、エリスロポエチンは、生体が健康状態にある場合、非常に低い濃度で血漿に存在し、組織は存在する数の赤血球から十分な酸素供給を受け取る。この正常な低濃度は、加齢で標準的に失われる赤血球の置き換えを刺激するのに十分である。循環中のエリスロポエチンの量は、循環中の血液細胞による酸素輸送が低下する場合、低酸素症といった状況下で増加する。低酸素症は、出血を介した大量の血液の喪失、放射線への過剰暴露による赤血球の破壊、高地又は長期の意識喪失による酸素摂取の低下、又は種々の形態の貧血若しくは虚血が原因となって生じ得る。低酸素ストレスを受ける組織に応答して、エリスロポエチンは、その後成熟し、ヘモグロビンを合成し、赤血球として循環中に放出される前赤芽球への、骨髄中の原始前駆細胞の変換を刺激することによって赤血球の産生を増加させるであろう。循環中の赤血球の数が正常な組織の酸素の要求に必要とされるものより多くなると、循環中のエリスロポエチンは減少する。（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってエリスロポエチンは、赤血球形成を誘導しない、又は代わりに対象におけるヘマトクリットを高める濃度で、又は持続時間で、例えば、９００μＭ未満、７００μＭ未満、５００μＭ未満、３００μＭ未満、１００μＭ未満、又は５０μＭ未満を含む約１ｐＭ〜１，０００μＭ未満の間で発現されてもよい（又は提供されてもよい）。他の実施形態では、エリスロポエチンは、対象の体重の関数として投与される。エリスロポエチンは、通常、７，５００Ｕ／ｋｇ、５，０００Ｕ／ｋｇ、２，５００Ｕ／ｋｇ、１，０００Ｕ／ｋｇ、７５０Ｕ／ｋｇ、５００Ｕ／ｋｇ、２５０Ｕ／ｋｇ、１００Ｕ／ｋｇ、５０Ｕ／ｋｇ、２５Ｕ／ｋｇ、１０Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ又は１Ｕ／ｋｇ未満を含む、対象の体重の約１Ｕ／ｋｇ〜１０，０００Ｕ／ｋｇの間の濃度で提供されてもよい。この文脈で、エリスロポエチンの血清濃度は正常で５ｍＵ／ｍＬ〜５０ｍＵ／ｍＬの範囲内である。本明細書で定義されるような眼疾患又は眼障害、好ましくは本明細書で定義されるような網膜疾患又はそれに関連した他の状態に冒されている患者について、エリスロポエチンは、好ましくは、症状、体重、性別、動物種などによって５０Ｕ／ｋｇ〜１００Ｕ／ｋｇの濃度で提供される。約１ｍＵ／ｍＬ〜１００ｍＵ／ｍＬで血中濃度を保持する治療選択肢が好まれることが一般に想定される���
【０１０３】
更なる特定の実施形態の１つによれば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセルのコアに埋め込まれる細胞は、ＶＥＧＦを追加的に分泌するように操作されてもよい。
【０１０４】
別の特定の実施形態によれば、神経保護因子、抗血管新生因子、眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセルのコアに埋め込まれる細胞は、抗アポトーシス因子を追加的に分泌するように操作されてもよい。そのような因子には、ＡＰＣ（カスパーゼ動員ドメインを伴ったアポトーシスリプレッサ）、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｃｈｅ−１／ＡＡＴＦ、クラステリン、インスリン、Ｍｃｌ−１、ＮＦ−ｋＢ−依存性抗アポトーシス因子、セロトニン、サバイビンなどが挙げられるが、これらに限定されない。更に、当該技術でアポトーシス因子に対して阻害因子として作用するので、抗アポトーシス因子とみなされてもよい任意の因子は本明細書に包含される。そのような因子は好ましくは、核酸によってコードされ、神経保護因子、抗血管新生因子、眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、及び／又は上述のようなＧＬＰ−１融合ペプチド、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞によって分泌される。この文脈で、そのような抗アポトーシス因子は、以下のアポトーシス因子、又はＡＩＦ、Ａｐａｆ、例えば、Ａｐａｆ−１、Ａｐａｆ−２、Ａｐａｆ−３、オダーＡＰＯ−２（Ｌ）、ＡＰＯ−３（Ｌ）、アポパイン、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ｂｉｋ、ＣＡＤ、カルパイン、カスパーゼ、例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−９、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｒｍＡ、チトクロームＣ、ＣｄＲ１、ＤｃＲ１、ＤＤ、ＤＥＤ、ＤＩＳＣ、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ−１、ＦＡＫ、Ｆａｓ（Ｆａｓ−リガンドＣＤ９５／ｆａｓ（受容体））、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ、ＦＬＩＰ、フォドリン、ｆｏｓ、Ｇ−アクチン、Ｇａｓ−２、ゲルゾリン、グランザイムＡ／Ｂ、ＩＣＡＤ、ＩＣＥ、ＪＮＫ、ラミンＡ／Ｂ、ＭＡＰ、ＭＣＬ−１、Ｍｄｍ−２、ＭＥＫＫ−１、ＭＯＲＴ−１、ＮＥＤＤ、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ、ＮｕＭａ、ｐ５３、ＰＡＫ−２、ＰＡＲＰ、パーフォリン、ＰＩＴＳＬＲＥ、ＰＫＣデルタ、ｐＲｂ、プレセニリン、ｐｒＩＣＥ、ＲＡＩＤＤ、Ｒａｓ、ＲＩＰ、スフィンゴミエリナーゼ、単純性ヘルペスに由来するチミジンキナーゼ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、トランスグルタミナーゼ等を含むアポトーシス関連タンパク質の少なくとも１つに向けられてもよい。
【０１０５】
神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドをコードし且つ分泌する、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞は、更に、例えば、本明細書で定義されるような抗アポトーシス剤、ＶＥＧＦなどのような追加の因子をコードし、分泌してもよい。これらの目的で、本明細書で定義されるような神経保護因子又は抗血管新生因子、又はそのフラグメント若しくは変異体、並びに更なる任意の因子は、通常、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアの調製前に細胞にトランスフェクションされる少なくとも１つの核酸配列によってコードされる。これらの核酸配列は、細胞に天然に存在してもよいし、又は（球状）マイクロカプセルの調製前に細胞トランスフェクション法によって細胞に導入されてもよい。本発明によれば、任意の好適な核酸配列を使用してもよい。
【０１０６】
一実施形態によれば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で例えば、本明細書で定義されるような抗アポトーシス剤、ＶＥＧＦ等のような追加の因子をコードする核酸配列は、任意の核酸から選択されてもよく、更に好ましくは、（少なくとも１つの）ペプチド又はタンパク質をコードするのに好適な核酸、即ち、コーディング核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡオリゴヌクレオチドから選択されるコーディングＤＮＡ、又は（短鎖）ＲＮＡオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等から選択されるコーディングＲＮＡから選択されてもよい。本発明の文脈で、ｍＲＮＡは通常、幾つかの構造的要素、例えば、任意の５’−ＵＴＲ領域、上流に位置するリボゾーム結合部位、それに続くコーディング領域、任意の３’−ＵＴＲ領域で構成され、ポリＡ尾部（及び／又はポリＣ尾部）がそれに続いてもよいＲＮＡである。ｍＲＮＡは、モノ−、ジ−又は更に複数のシストロンのＲＮＡとして、即ち、上述のような１、２以上のタンパク質又はペプチドのコーディング配列を運ぶＲＮＡとして存在してもよい。ジ−又は更に複数のシストロンのｍＲＮＡにおけるそのようなコーディング配列は少なくとも１つのＩＲＥＳ配列によって分離されてもよい。少なくとも１つの核酸配列はまた、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）又はウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）であってもよい。更に、少なくとも１つの核酸配列は、環状又は直鎖の核酸であってもよく、好ましくは直鎖の核酸である。更に、少なくとも１つの核酸配列は、一本鎖若しくは二本鎖の核酸配列（２つの一本鎖核酸の非共有結合によって上記の意味の範囲内で核酸とみなされてもよい）であってもよく、又は部分的に二本鎖の核酸若しくは部分的に一本鎖の核酸であってもよく、それらは少なくとも部分的に自己相補性である（これら部分的に二本鎖の核酸若しくは部分的に一本鎖の核酸の双方は通常、更に長い及び更に短い一本鎖の核酸、又は２つの一本鎖の核酸によって形成され、それらはほぼ同一の長さであり、一方の一本鎖核酸は他方の一本鎖核酸に対して部分的に相補的なので、双方はこの領域にて二本鎖核酸を形成し、即ち、部分的に二本鎖の核酸又は部分的に一本鎖の核酸を形成する）。
【０１０７】
遺伝子コードの縮重のために、複数の核酸配列が、そのような神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で例えば、本明細書で定義されるような抗アポトーシス剤、ＶＥＧＦ等のような追加の因子をコードしてもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、本明細書で定義されるような細胞のトランスフェクションに使用される核酸配列は、上述のような任意の核酸配列を含んでもよく、好ましくは、（ａ）神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン又はＧＬＰ−１ペプチド、特に全体的なＧＬＰ−１のａａ配列（ＧＬＰ−１（１−３７））又は機能的ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）（変異体）の配列又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含むその他のＧＬＰ−１ペプチド、（ｂ）任意で、（ａ）に係るＧＬＰ−１配列のＮ末端でのプロテアーゼ切断配列及び任意で（ｂ）より上流のシグナルペプチド配列、並びに（ｃ）任意で、上述のような更なる因子をコードしてもよい、本明細書で定義されるような細胞のトランスフェクションに好適な核酸配列を含んでもよい。好ましくは、シグナル（ペプチド）配列は以下で定義されるような配列から選択される。したがって、得られるアミノ酸配列は、シグナルペプチド配列、任意のプロテアーゼ切断配列及び生物学的に有効な因子、即ち、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド（及び任意で、本明細書で定義されるような抗アポトーシス剤、ＶＥＧＦ等のような追加の因子）（Ｎ末端からＣ末端まで）で構成されてもよい。それによって、シグナルペプチド配列及びプロテアーゼ切断配列は、好ましくは、宿主細胞において（天然に存在する配列に対して）非均質であり、上記で定義されたようなＧＬＰ−１（５−３７、６−３７、又は７−３７）及びその変異体の場合、上記但し書きの定義の範囲内で好ましくは、天然のＧＬＰ−１のアミノ酸１−６とは異なる。
【０１０８】
本明細書で定義されるような核酸配列はベクターに含有されてもよい。したがって、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞は、以前本明細書で定義されたような核酸を含むベクターを含有してもよい。このベクターを使用して、本明細書で定義されるような細胞にトランスフェクションして、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルを調製してもよい。通常、そのようなベクター、特に発現ベクターは、上述のような要素（ａ）、及び任意で（ｂ）及び／又は（ｃ）、及び必要に応じて本明細書で記載されるような追加の要素、例えば、上述のようなコードされた要素（ａ）、及び任意で（ｂ）及び／又は（ｃ）の発現を指向するのに好適な要素、並びに任意で、抗アポトーシス剤、ＶＥＧＦ等のような更なる因子をコードする配列をコードする、本明細書で定義されたような少なくとも１つの核酸配列を含有する。本明細書で使用されるようなベクターのクラスの１つは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス又はＳＶ４０等）に由来する自律的に複製する染色体外のプラスミドを提供するＤＮＡ要素を利用する。本明細書で使用されるようなベクターの第２のクラスは、所望の遺伝子配列の、宿主細胞染色体への一体化に頼る。
【０１０９】
本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアにそれを埋め込む前に細胞にトランスフェクションするのに好適なそのようなベクターは通常、上述のような、要素（ａ）、及び任意で（ｂ）及び／又は（ｃ）、例えば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子をコードする少なくとも１つの核酸配列を好適な（空の）ベクターに挿入することによって調製される。そのような好適な（空の）ベクターは、当業者に既知であり、例えば、「クローニングベクター（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）」（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．Ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）によって概説されてもよい。好適な（空の）ベクターはまた、当業者に既知の任意のベクター、例えば、プラスミド、ファージ、ＳＶ４０やＣＭＶ、バキュロウイルス、アデノウイルス、シンドビスウイルスのようなウイルス、トランスポゾン、ＩＳ−要素、ファスミド、ファージミド、コスミド、直鎖又は環状のＤＮＡを含むことも意図される。哺乳類細胞への一体化のためには、直鎖ＤＮＡが通常使用される。好ましくは、本発明で使用されるベクターの種類は特定の宿主細胞の要件に一致する。本発明の核酸配列とベクターが挿入されてもよい好適な市販の発現ベクターには、全てカリフォルニア州、サンディエゴのインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）から入手されてもよい、ｐＳＰＯＲＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ、バキュロウイルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ及び原核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡＩＩが挙げられる。
【０１１０】
本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの（球状）コアにそれを埋め込む前に細胞にトランスフェクションするのに好適な、本明細書で定義されるようなベクターは通常、上記で定義されたような核酸配列を、例えば、コードされたアミノ酸配列の発現を制御するその他の調節要素と組み合わせる。そのような調節要素として、例えば、（１）生体の組織又は領域に特異的である、（２）構成的である、（３）グルコース反応性である、及び／又は（４）誘導可能／調節可能である。本明細書では、調節要素は好ましくは、調節配列及び（ベクターが自律的に複製されるのであれば）複製開始点から選択される。本発明の範囲内での調節配列は、コードする核酸配列の発現、転写及び／又は翻訳に影響を有する、当業者に既知の任意の要素である。調節配列には、プロモータ配列から離れた、いわゆるエンハンサ配列が挙げられ、それは、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡの間の高度の相互作用のために高い発現をもたらし得る。本発明のベクターの更なる調節配列は、転写調節及び翻訳開始シグナル、いわゆる「ターミネータ配列」等又はその部分配列である。
【０１１１】
一般に、天然に存在するプロモータは、本明細書で使用されるような（球状）マイクロカプセルを調製するのに使用されてもよい細胞にトランスフェクションするのに好適な発現ベクターに含有されてもよい。そのようなプロモータは、任意の真核細胞、原核細胞、ウイルス、細菌、植物、ヒト、又は動物のプロモータ、例えば、哺乳類のプロモータから選択されてもよい。好適なプロモータには、例えば、サイトメガロウイルスのプロモータ、ｌａｃＺプロモータ、ｇａｌ１０プロモータ、及びＡｃＭＮＰＶ多面体プロモータ、例えば、グラム陰性細菌で有利に見出されるｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃｌｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＶ４０−、ＳＰ６、Ｉ−ＰＲ−又はＩ−ＰＬ−プロモータのようなプロモータが挙げられる。更にプロモータとして、例えば、ａｍｙ及びＳＰＯ２のようなグラム陽性プロモータ、例えば、ＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨのような酵母プロモータ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、哺乳類筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータを含む筋肉特異的プロモータ、哺乳類デスミンプロモータ、哺乳類トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモータ、又は哺乳類骨格アルファアクチン（ＡＳＫＡ）プロモータ、又は肝臓型ピルビン酸キナーゼプロモータ、特に（−１８３から＋１２）若しくは（−９６から＋１２）を実行するそれらのフラグメント（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９１）．  ２６６：８６７９−８２．；Ｃｕｉｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  （１９９２）．  １２：４８５２−６１）；スポット１４プロモータ（Ｓ１４、−２９０から＋１８）（Ｊｕｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９０）．  ２６５：３４７４−８）；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ｏ‘Ｃａｌｌａｇｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （２００１）．  ２７６：１６０３３−９）；脂肪酸シンターゼ（−６００から＋６５）（Ｒｕｆｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （２００１）．  ２８：２８）；及びグルコース−６−ホスファターゼ（ラット及びヒト）（Ｓｃｈｍｏｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｆｔ，  （１９９６）．  ３８３：６３−６；Ａｒｇａｕｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  （１９９６）．  ４５：１５６３−７１）、又はＣａＭ−Ｋｉｎａｓｅｌｌ、ネスチン、Ｌ７、ＢＤＮＦ、ＮＦ、ＭＢＰ、ＮＳＥ、ベータ−グロビン、ＧＦＡＰ、ＧＡＰ４３、チロシンヒドロキシラーゼ、カイナット−受容体−サブユニット１、グルタミン酸−受容体−サブユニットＢ、又はヒトユビキチンプロモータＢ（ｕｂｉＢ、ヒト）、ヒトフェリチンＨプロモータ（ＦｅｒＨ）等からのプロモータから得られてもよい。特に好まれるプロモータはヒト又は哺乳類由来のものである。最終的に、合成プロモータを有利に使用してもよい。プロモータ配列は、本発明のベクターに含有されるとき、試験管内での制御目的で誘導可能であって、発現の調節を可能にしてもよい（例えば、増殖培地における栄養物���はその他の誘導因子の存在又は非存在によって）。一例は、バクテリオファージラムダｐｌａｃ５から入手されるｌａｃオペロン（ラクトースオペロン）であり、それはＩＰＴＧによって誘導することができる。最終的に、本明細書で定義されるようなプロモータは、プロモータが、ＧＬＰ−１をコードする核酸配列の５’「上流」に位置するように、例えば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド及び任意で、本明細書で定義されるような抗アポトーシス剤、ＶＥＧＦ等のような追加の因子をコードする、上記で定義されたような核酸配列に連結されてもよい。好ましくは、ヒトプロモータ、例えば、ヒトユビキチンプロモータＢ（ｕｂｉＢ、ヒト）又はヒトフェリチンＨプロモータ（ＦｅｒＨ）が使用される。
【０１１２】
上記で定義された核酸配列によってコードされるペプチドの発現を上方調節するためのエンハンサ配列は、好ましくは、本明細書で定義されるようなベクター又は発現ベクターの別の構成要素である。そのようなエンハンサ配列は通常、ベクターの非コーディング３’領域に位置する。本明細書で定義されるようなベクターで採用されるようなエンハンサ配列は、真核細胞、原核細胞、ウイルス、細菌、植物、ヒト又は動物、例えば、哺乳類宿主から、好ましくは、本明細書で定義されるような相当するプロモータとの関連で得られてもよい。本発明で最も有用であるエンハンサ要素は、グルコース反応性、インスリン反応性及び／又は肝臓特異的であるものである。エンハンサ要素には、ＣＭＶエンハンサ（例えば、ユビキチンプロモータ（Ｃｕｂｉ）に連結された）；肝臓ピルビン酸キナーゼ（Ｌ−ＰＫ）プロモータ（−１７２から−１４２）のグルコース反応性要素（Ｇ１ＲＥ）を含む１以上のグルコース反応性要素；及び高い反応性を持った修飾版（Ｃｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；Ｌｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９９）．  ２７４：２８３８５−９４）；補助Ｌ３ボックスを持ったＬ−ＰＫのＧ１ＲＥ（−１７２から−１２６）（Ｄｉａｚ  Ｇｕｅｒｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  （１９９３）．  １３：７７２５−３３）；補助Ｌ３ボックスを持った高い反応性を持つＧ１ＲＥの修飾版；Ｓ１４（−１４４８から−１４２２）の炭水化物反応性要素（ＣｈｏＲＥ）及び低グルコース濃度で活性化される修飾体（Ｓｈｉｈ  ａｎｄ  Ｔｏｗｌｅ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９４）．  ２６９：９３８０−７；Ｓｈｉｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９５）．  ２７０：２１９９１−７；及びＫａｙｔｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９７）．  ２７２：７５２５−３１）；Ｓ１４（−１４６７から−１４２２）の隣接する付属因子部位を持つＣｈｏＲＥ［ｅｔ  ａｌ．，上記］；アルドラーゼ（＋１９１６から＋２３２９）（Ｇｒｅｇｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９８）．  ２７３：２５２３７−４３；Ｓａｂｏｕｒｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９６）．  ２７１：３４６９−７３）；及び脂肪酸シンターゼ（−７３８２から−６９７０）（Ｒｕｆｏ，  ｅｔ  ａｌ．，上記）、更に好ましくは、例えば、グルコース−６−ホスファターゼインスリン反応性要素（−７８０から−７２２）のようなインスリン反応性要素［Ａｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  （１９９９）．  ４８：１８８５−９）；及び例えば、プロトロンビン（９４０から−８６０）のような肝臓特異的なエンハンサ要素［Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９１）  ２６６：１８９２７−３３）；及びアルファ−１−ミクログロブリン（−２９４５から−２５３９）［Ｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  （１９９８）．  ３３４：５７７−８４）；例えば、哺乳類ＭＣＫエンハンサのような筋肉特異的なエンハンサ、哺乳類ＤＥＳエンハンサ、及び脊椎動物トロポニンＩ  ＩＲＥ（ＴＮＩ  ＩＲＥ、本明細書では以後ＦＩＲＥと呼ぶ���エンハンサなどが挙げられる。最終的に、ＳＶ４０エンハンサ配列も含められてもよい。
【０１１３】
エンハンサ要素は更に、本明細書で定義されるような核酸配列によってコードされるペプチドの発現を上方調節するために本明細書で定義されるようなプロモータと共に使用されてもよく、例えば、そのようなプロモータ／エンハンサの組み合わせには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータとＣＭＶのエンハンサ、ユビキチンのプロモータ（Ｃｕｂｉ）に連結されたＣＭＶのエンハンサ、それに相当するプロモータとの組み合わせで使用されるヒト血清アルブミン［ＨＳＡ］のエンハンサを含む肝臓特異的なエンハンサ要素、ヒトプロトロンビン［ＨＰｒＴ］エンハンサ、アルファ−１ミクログロブリン［Ａ１ＭＢ］エンハンサ及びイントロンのアルドラーゼのエンハンサの群、又はＣＭＶのプロモータ若しくはＨＳＡのプロモータの群から選択されるプロモータとの組み合わせで使用されるＨＳＡのエンハンサ、アルファ−１−アンチトリプシンのプロモータ等との組み合わせで使用されるヒトプロトロンビン［ＨＰｒＴ］及びアルファ−１ミクログロブリン［Ａ１ＭＢ］からなる群から選択されるＣＭＶプロモータエンハンサ要素との組み合わせで使用されるヒトプロトロンビン［ＨＰｒＴ］及びアルファ−１ミクログロブリン［Ａ１ＭＢ］からなる群から選択されるエンハンサ要素が挙げられる。
【０１１４】
更に、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルの構成要素として使用されてもよい細胞にトランスフェクションするのに好適な、本明細書で定義されるようなベクターは、転写シグナル及び／又は翻訳シグナル、好ましくは、適当な宿主によって認識される転写シグナル及び／又は翻訳シグナル、例えば、転写調節シグナル及び翻訳開始シグナルを含有してもよい。転写シグナル及び／又は翻訳シグナルは、好ましくは、本明細書で定義されるような対応するプロモータとの関連で、任意の真核細胞、原核細胞、ウイルス、細菌、植物、好ましくはヒト又は動物、例えば、哺乳類宿主から得られてもよい。したがって、宿主細胞が、上記で定義されたペプチド、例えば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子をコードする核酸配列と関連した転写調節シグナル及び翻訳開始シグナルを認識する範囲において、宿主の性質に応じて、多種多様な転写及び翻訳の調節配列が採用されてもよい。天然に存在するＧＬＰ−１をコードする核酸配列に隣接する５’領域が保持されてもよく、本発明のベクターにおける転写及び翻訳の調節に採用されてもよい。この領域は通常、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などのような転写及び翻訳の開始に関与する配列を含む。通常、この領域は、少なくとも約１５０塩基対の長さであり、更に通常では、約２００ｂｐであり、約１ｋｂ〜２ｋｂを超えることは稀である。
【０１１５】
上記で定義されたペプチド、例えば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又はＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子をコードする核酸配列の発現が調節され得るように、抑制又は活性化を制御できる、本明細書で定義されるようなベクターに好適な転写開始調節シグナルが選択されてもよい。そのような制御可能な調節法の１つは、温度を変化させることによって発現を抑制する又は開始するために、温度感受性である調節シグナルを使用するものである。別の制御可能な調節法は、特定の化学物質に感受性をもつ調節シグナルの使用である。これらの方法は好ましくは、例えば、必要な構築物を調製する場合、試験管内のプロセスで使用される。更に、細胞の外側からの更なる手段がなくても生体内での発現の抑制及び活性化を制御することが可能である転写開始調節シグナルを本明細書で使用して、例えば、カプセル化細胞にて一時的な発現を得てもよい。そのような転写及び／又は翻訳のシグナルには、例えば、停止シグナル及びポリアデニル化された領域といった転写停止調節配列が挙げられる。更に、転写停止調節配列は、上記で定義されたペプチド、例えば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子をコードする核酸配列を含有する、本明細書で定義されるようなベクターの非コーディング３’領域に位置してもよい。好適な停止配列には、例えば、ウシ成長ホルモン、ＳＶ４０、ｌａｃＺ、ＥＦ１アルファ及びＡｃＭＮＰＶ多面体のポリアデニル化シグナルを挙げることができる。
【０１１６】
本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルを調製するのに使用されてもよい細胞にトランスフェクションするのに好適な発現ベクターはまた、上記で定義されたペプチド、例えば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子をコードする核酸配列の最適な発現のために他の配列を含んでもよい。そのような配列には、シグナル（ペプチド）配列をコードするもの、即ち、分泌されたタンパク質の膜の中への又は膜を介した通過を提供する、Ｎ末端に位置するペプチド配列をコードするもの；発現生成物の安定性を提供するもの；及び制限エンドヌクレアーゼによる切断の部位を提供する制限酵素認識配列などが挙げられる。これらの物質は全て当該技術で既知であり、市販されている（例えば、Ｏｋａｙａｍａ  （１９８３），  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：２８０を参照）。
【０１１７】
本明細書で定義されるような「シグナル配列」は、発現された神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適な更なるタンパク質若しくはタンパク質様物質、本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、又は分泌される更なる因子、即ち、細胞膜を通過する更なる因子のＮ末端にて、ＧＬＰ−１のアミノ酸１−６に関する上記但し書きの定義の範囲内で、位置する約８−３０アミノ酸を通常含むシグナル（ペプチド）配列である。そのようなシグナル（ペプチド）配列には、野生型ＧＬＰ−１前駆体タンパク質と通常関連するシグナル（ペプチド）配列（即ち、完全長のプログルカゴン前駆体分子のシグナル（ペプチド）配列）、並びにそれに通常関連しない、即ち、野生型ＧＬＰ−１前駆体タンパク質に非相同であるシグナル（ペプチド）配列が挙げられる。本明細書で定義されるような「シグナル（ペプチド）配列」は、例えば、シグナルペプチド配列又はリーダー配列（例えば、分泌シグナル（及びリーダー）配列）であることができる。更に、本明細書で定義されるようなシグナル（ペプチド）配列は好ましくは、プロテアーゼ、例えば、シグナル配列プロテアーゼによる前駆体ペプチドの切断を提供する。プロテアーゼによる前駆体ペプチドからのシグナル配列の切断の際、例えば、生物学的に活性のある神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適な更なるタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子が産生される。そのようなシグナル（ペプチド）配列は通常、切断用プロテアーゼによって認識される切断部位をコードする領域を含む。或いは、切断用プロテアーゼによって認識される切断部位をコードする領域をシグナル（ペプチド）配列に導入することができる。更に、切断用プロテアーゼによって認識される切断部位をコードする追加の（１以上の）配列をシグナル（ペプチド）配列に付加することができる。
【０１１８】
本明細書で定義されるようなベクターによってコードされ得るシグナル（ペプチド）配列の例には、例えば、ＧＬＰ−１、又はＧＬＰ−１以外の、例えば、サイトカイン、凝固因子、免疫グロブリン、分泌酵素若しくはホルモン（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）／グルカゴンスーパーファミリーを含む）及び血清タンパク質といった、分泌されたタンパク質に由来するシグナル（ペプチド）配列が挙げられる。本明細書で定義されるようなシグナル（ペプチド）配列は、例えば、分泌されたマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えば、ストロメリシンのリーダー配列に由来することができ、分泌型ヒトアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、プロ−エキセンジン、例えば、プロエキセンジン−４のリーダー配列、プロ−ヘロデルミン、プロ−グルコース依存性のインスリン分泌促進性ポリペプチド（ＧＩＰ）、プロ−インスリン様成長因子（ＩＧＦ１）、プレプログルカゴン、アルファ−１アンチトリプシン、インスリン様成長因子１、ヒト第ＩＸ因子、ヒトリンホトキシンＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＡ０００６４）、又はヒトクラステリン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＰ８８９２７）に由来することができる。本明細書で定義されるようなシグナル（ペプチド）配列の特定の例は、シグナルペプチダーゼ、フリン、又はその他のプロホルモン転換酵素（例えば、ＰＣ３）による前駆体切断のためのシグナルのコーディング領域を含む配列である。例えば、フリン（ＰＡＣＥとしても知られる、米国特許第５，４６０，９５０号を参照）、その他のスブチリシン（ＰＣ２、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５／ＰＣ６、ＬＰＣ／ＰＣ７ＩＰＣ８／ＳＰＣ７及びＳＫＩ−１を含む、Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３２７：６２５−６３５  （１９９７））；エンテロキナーゼ（米国特許第５，２７０，１８１号を参照）又はキモトリプシンによって切断されるシグナルを、本明細書で定義されるようなシグナル（ペプチド）配列に導入することができる。これら文書のそれぞれの開示は参照によって本明細書に組み入れられる。フリンは、トランス−ゴルジに存在する普遍的に発現されたプロテアーゼであり、その分泌前にタンパク質前駆体を処理する。フリンは、例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇのようなそのコンセンサス認識配列、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ａｒｇ−Ｘ−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−ＡｒｇのＣＯＯＨ末端で切断する。これらのアミノ酸配列は、プロテアーゼフリンによる前駆体切断のためのシグナルである。従って、非相同のシグナル配列も、シグナル配列から作られたコンセンサス配列に合成的に由来することができる（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される分泌タンパク質から作られるコンセンサス配列）。
【０１１９】
本明細書で定義されるような調節配列に加えて、本明細書で定義されるような自律的に複製するベクターは通常、複製開始点を含む。好適な複製開始点には、例えば、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＭＰＩ（ｏｒｉ  ｐＭＰＩ）及びＭ１３の複製開始点等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
好ましくは、上記で定義されるようなペプチド、例えば、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子の発現に好適な、本明細書で定義されるようなベクターは、追加的に自殺遺伝子を含有してもよい（含有するように操作してもよい）。本発明の文脈で、「自殺遺伝子」は、好ましくは、特定の物質の投与の際、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに含有される自殺遺伝子を抱く細胞を殺傷することによって、本明細書で使用されるとき、（球状）マイクロカプセルによる治療を停止することが可能である。言い換えれば、本発明に好適な自殺遺伝子は、通常ヒト又は動物の体内に存在しない外因性活性化剤を投与することによって活性化されてもよい。この場合、通常、自殺遺伝子は、細胞にアポトーシス事象を受けさせるカスケードを開始する。或いは、本発明に好適な自殺遺伝子は、通常、ヒト又は動物の体内に存在しない投与された外因性の非毒性プロドラッグを代謝してもよい。外因性の非毒性プロドラッグの代謝は好ましくはプロドラッグを細胞毒性にする。自殺遺伝子は、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適な更なるタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドをコードする同一のベクターに含有されてもよいし、又は代わりに第２のベクターに含有されてもよい。更に、自殺遺伝子は、任意の種類の制御及び調節の要素、例えば、発現ベクターの構成要素として本明細書で言及されたプロモータ、エンハンサ等の制御及び調節の要素によって、又はそれらの天然に存在する制御及び調節の要素によって調節されてもよい。好ましくは、上記制御メカニズムのいずれかを可能にする自殺遺伝子が本発明に従って選択され、例えば、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｔｋ）、細菌Ｔｅｔリプレッサタンパク質（ＴｅｔＲ）のようなテトラサイクリンの添加によって誘導される自殺遺伝子、等から選択されてもよい。特定の例としてシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）が使用されてもよい。シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は通常、種々の生物に存在し、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に転換することができ、それは一般的な化学療法剤を代表するものである。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は生物にとって毒性が高い一方で、そのプロドラッグである５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）は細胞にとって毒性ではない。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）はその後、細胞性キナーゼによってリン酸化され、細胞のＲＮＡ合成をやめさせることが可能である。従って、プロドラッグである５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）は特定の細胞の自殺を誘導する優れたツールを代表する。更に、５−フルオロ−ｄＵＭＰは、抗葉酸剤として作用し、酵素チミジル酸合成酵素を阻害し、デオキシリボヌクレオチドの新生（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成経路にて、ｄＵＭＰの、ｄＴＭＰへのメチル化を触媒する。それによって、細胞におけるＤＮＡ合成の阻害が達成され得る。また好ましくは、ＨＳＶ−１のチミジンキナーゼ（ＡＴＰ：チミジン−５−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＳＶ１ｔｋ））及びその対応するプロドラッグであるガンシクロビル（ＧＣＶ）を使用してもよい。グアノシン類似体ＧＣＶは特異的にリン酸化されて、ＤＮＡ合成の伸長を阻害するので、細胞に自殺をもたらす。この文脈で、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼは細胞内で非毒性のガンシクロビルを毒性生成物に変換するので、不測の細胞増殖の場合、トランスフェクションされた細胞の破壊を可能にする。したがって、変性細胞を含有するＧＬＰ−１セルビーズ（ＣｅｌｌＢｅａｄｓ、登録商標）で治療された患者へのガンシクロビルの全身投与は、移植された細胞の破壊をもたらす。
【０１２１】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの調製に使用される好適な細胞への、本明細書で定義されるようなベクターのトランスフェクション、又は代わりに、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子をコードする裸の核酸のトランスフェクションは、当業者に既知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹを参照）によって達成されてもよい。本明細書で定義されるような好適な細胞にベクターがトランスフェクションされるのであれば、ベクターは好ましくは、ＧＬＰ−１ペプチドをコードする核酸を運ぶプラスミドＤＮＡの形態で存在する。プラスミドＤＮＡは好ましくは環状プラスミドＤＮＡである。好適なトランスフェクションの方法には、例えば、改変されたエレクトロポレーション法（例えば、ヌクレオフェクション）を含むエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、例えば、リン酸カルシウム同時沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、例えば、転移介在性リポフェクション法が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、トランスフェクションは、改変されたエレクトロポレーション法（例えば、ヌクレオフェクション）を用いて、本明細書で定義されるようなベクターを運ぶプラスミドＤＮＡによって行われる。
【０１２２】
本明細書で定義されるようなベクター、又は代わりに、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子をコードする核酸は更に、例えば、トランスフェクションのために、少なくとも１つの合成ポリマー又は天然のポリマー、例えば、ポリアミノ酸と複合体化されてもよく、又はそれに抱合されてもよい。少なくとも１つのポリマー構成要素が、本明細書で定義されるようなベクター、又は代わりに、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体と共有結合してもよい。本発明の意味における「抱合される」は、「化学的に結合される」を意味するように意図される。「化学的に結合される」は、共有結合又は非共有結合を介して結合されることを意味するように意図される。共有結合も利用されてもよい一方で、トランスフェクション目的には非共有結合が好まれる。それによって、ポリマー構成要素は、共有結合なしでの複合体化、例えば、水素結合又は静電気的な、疎水性の、等の相互作用を介して融合ペプチドに連結されてもよい。
【０１２３】
本明細書で定義されるようなベクター、又は代わりに、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体（トランスフェクション目的で）をコードする核酸を結合するために本明細書で使用されるポリマーは、水溶液又は水性懸濁液に可溶性であり、薬学上有効な量で融合ペプチドを投与する際、哺乳類に対する、例えば、副作用のような否定的な影響を有さないポリマーを含む、生理学的に許容可能なポリマーであってもよい。本発明に従って使用される生理学的に許容可能なポリマーに特定の限定はない。ポリマーは合成の性質のものであってもよいし、天然に存在するポリマー（例えば、タンパク質）であってもよい。
【０１２４】
更に一般的には、本明細書で定義されるようなベクター、又は代わりに、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体をコードする核酸と共に使用される合成ポリマーは好ましくは、アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ポリオレフィンアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシアルキルメタクリルアミド、メタクリル酸ポリヒドロキシアルキル、例えば、メタクリル酸ポリヒドロキシエチレン、ポリアクリレート、多糖類、ポリ（［アルファ］−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルフォリン）、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルアセタール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ乳酸、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ポリウレタン、ポリシアル酸、三酢酸セルロース、硝酸セルロース及び前述のいずれかの組み合わせから選択される。
【０１２５】
本発明はまた、本発明に従って使用される（球状）マイクロカプセルを調製する方法も提供する。これらの（球状）マイクロカプセルは好ましくは、２以上の方法工程に従って調製される。方法工程（１）に従って、上記で開示されたようにコアが調製される。方法工程（２）に従って、１以上の表面コーティング層によって、方法工程（１）に従って調製されたようなコアが被覆される。更なる任意の工程は、追加の表面コーティング層の調製のための方法工程（２）の反復を含んでもよい。好ましくは、方法工程（２）と同一の工程がそのような追加の表面コーティング層のそれぞれのために実施される。更なる任意の工程は、球状マイクロカプセルの調製に続く洗浄工程を含んでもよい。
【０１２６】
通常、上記で開示されたようなコアは、本発明に従って使用されるとき、（球状）マイクロカプセルを調製するための方法工程（１）に従って調製される。そのようなコアは、架橋ポリマーと、上記で開示されたような方法に従ってトランスフェクションされている神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、及び任意で、本明細書で定義されるような追加の因子をコードし且つ分泌する細胞から構成される。方法工程（１）に従って、可溶性形態のポリマー、例えば、可溶性形態のアルギネート（例えば、生理食塩水におけるアルギン酸カリウム又はアルギン酸ナトリウム）と、上記で定義された細胞との混合物は通常、好ましくは、（球状）コアについて本明細書で定義されるような濃度で、例えば、ポリマー溶液のｍＬ当たり１×１０５個から６×１０７個までの細胞にて調製される。
【０１２７】
典型的な技法として、共通の中心の周りで３つの同軸の環：内側導管、中間導管及び外側導管（エアリング）として同軸に配置される３つの導管からなる空気注入スプレーノズルを介して、均質な細胞／ポリマーの懸濁液（例えば、細胞／アルギネートの懸濁液）を加圧してもよい。好ましくは、５０μｍ〜２，０００μｍまでの内径を有する内側導管には中空の針を用いる。中間の導管は通常、６０μｍ〜４，０００μｍの内径を有し、外側導管（エアリング）は好ましくは１００μｍ〜５，０００μｍの内径を有する。本発明に従って使用されるとき、（球状）マイクロカプセルのコアを調製するための方法工程（１）では専ら、内側導管と外側導管（エアリング）を使用する。したがって、単に２つの導管（内側導管と外側導管）からなるスプレーノズルを同様に方法工程（１）で使用してもよい。通常、３つの導管を持つ空気注入スプレーノズルを使用するのであれば、中間導管を流れる物質はない。細胞／ポリマー溶液の懸濁液は通常、１０μＬ／分〜５ｍＬ／分の速度で内側導管を通じて加圧され、導管の出口で液滴をもたらし、外側導管（エアリング）によって提供され、通常０．５Ｌ／分〜１０Ｌ／分の速度を有する空気の流れによってそれが引き剥がされる。細胞と未架橋ポリマー溶液とを含有する液滴は、架橋剤を含有する溶液（沈殿槽）に落下し、それは通常、空気注入スプレーノズルの出口の約４ｃｍ〜約６０ｃｍ下に位置する。液滴は好ましくは落下中に丸くなり、それによって実質的に球状の構造形態を取る。架橋剤がポリマーのイオン性架橋を達成し、球状（水不溶性）のマイクロカプセルのコアが、（球状）コアについて本明細書で定義される直径を有して最初に形成される。（球状）マイクロカプセルのコアの直径は、方法工程（１）で使用される選択された導管のサイズと構造に左右される。架橋剤を含有する溶液（沈殿槽）は好ましくは、アルギネートがポリマーとして使用されるのであれば、二価カチオン、例えば、カルシウム若しくはバリウムのイオン（５ｍＭ〜１００ｍＭ）又はその他の二価若しくは多価のカチオンで構成される。更に、沈殿槽は好ましくは、緩衝液物質（例えば、１ｍＭ〜１０ｍＭのヒスチジン）及び塩化ナトリウム（例えば、２９０ｍＯｓモル±５０ｍＯｓモル）を含有する。アルギネート以外のポリマーが使用されるのであれば、当該技術で既知のその他の好適な架橋剤及び緩衝液を本明細書で使用してもよい。
【０１２８】
方法工程（１）は、本明細書で定義されるような架橋ポリマーと細胞で構成される（球状）マイクロカプセルのコアを提供する。方法工程（１）に続く任意の方法工程は洗浄工程を含んでもよい。（球状）マイクロカプセルのコアは、本発明に従って使用されるとき、生理食塩水又はその他の好適な洗浄溶液で洗浄され、適宜、コアは、硫酸ナトリウム溶液、好ましくは、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，５９２，８８６号に係る硫酸ナトリウム溶液にてインキュベートされる。本発明に従って使用されるとき、沈殿槽及び／又は洗浄槽からの（球状）マイクロカプセルのコアの分離は通常、遠心又はその他の好適な方法を用いて実施される。
【０１２９】
方法工程（２）に従って、本発明に従って使用されるような、方法工程（１）によって調製された（球状）マイクロカプセルのコアは、実質的に架橋ポリマーの表面コーティング層によって被覆される。したがって、工程（１）によって調製された（球状）マイクロカプセルのコアは、細胞を含まない、上記で開示されたような未架橋ポリマーを含有するポリマー溶液に添加される。好ましくは、ポリマーは、非架橋の形態で、本明細書で定義されるような濃度にて提供される。通常、ポリマー溶液と（球状）マイクロカプセルのコアとを含有するこの混合物は、上述の空気注入スプレーノズルの内側導管を通じて、例えば、１５μＬ／分〜２ｍＬ／分、好ましくは１０μＬ／分〜５ｍＬ／分の速度で加圧される。同時に、細胞を含まない純粋な未架橋ポリマー溶液、好ましくは、約０．１％〜約４％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む溶液、例えば、細胞を含まないアルギネート溶液が、通常１５μＬ／分〜２ｍＬ／分、好ましくは１０μＬ／分〜５ｍＬ／分の速度で中間導管を通じて加圧される。それによって、中間導管の端部でコアと非重合化ポリマーの表面とを含有する液滴が形成される。これらの液滴は、通常０．５Ｌ／分〜１０Ｌ／分の速度を有する外側導管（エアリング）を介して提供される空気の流れによって剥がれる。（球状）マイクロカプセルのコアのポリマー濃度、（球状）マイクロカプセルのコアが添加されるポリマー溶液のポリマー濃度、及び表面コーティング層のポリマー濃度は異なってもよい（上記参照）。（球状）マイクロカプセルのコアを含有する液滴（方法工程（２）に従って調製された）は、本明細書で定義されるような架橋剤を含有する溶液（沈殿槽）に落下する。落下する間、液滴は好ましくは、ほぼ球状の構造形態へと丸くなる。架橋剤は、方法工程（１）に類似するポリマーのイオン性架橋に影響を及ぼす。それによって、本明細書で定義されるような直径、更に好ましくは、約１００μｍ〜約２００μｍの（球状）マイクロカプセル総径（粒径）、更に好ましくは約１１５μｍ〜約１８５μｍの総径、一層更に好ましくは約１３０μｍ〜約１７０μｍの総径、最も好ましくは約１４５μｍ〜約１５５μｍ、例えば、約１５０μｍの総径を有する水不溶性の（球状）マイクロカプセルが形成される。方法工程（２）によって入手可能な（球状）マイクロカプセルの総径は、本明細書で使用されるような選択された導管のサイズと構造に左右される。１を超える表面コーティング層を持つ、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、即ち、本明細書で定義されるようなコアと２層、３層、４層、５層、５層から１０層以上の表面コーティング層を含有する（球状）マイクロカプセルを調製するために、必要なだけ多く方法工程（２）を繰り返してもよい。これらの更なる表面コーティング層は上記の直径の範囲内で定義される。
【０１３０】
方法工程（２）の後に、１以上の任意の洗浄工程が本明細書で定義されるように続いてもよい。
【０１３１】
更なる態様によれば、本発明はまた、動物、好ましくは哺乳類における眼疾患を治療する方法を提供する。従って、そのような治療方法は、ヒトの医療又は獣医学的医療のいずれかの分野で使用されてもよい。本発明の文脈で、用語、哺乳類は、通常任意の動物及びヒトを含み、好ましくは、ヒト及び、例えば、ブタ、ヤギ、ウシ、イノシシ／ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、又はマウス、ハムスター及びウサギを含むげっ歯類、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ライオン、ジャガー、ヒョウ、ラット、ブタ、スイギュウ、イヌ、ロリス、ハムスター、モルモット、ダマジカ、ウマ、ネコ、マウス、オセロット、サーバルなどを含む（哺乳類）（非ヒト）動物からなる群から選択されるが、これらに限定されない。そのような治療は通常、それを必要とする患者への本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの投与によって、特に、本明細書で定義されるような細胞、例えば、本発明の文脈で使用されてもよい、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞又は任意のその他の細胞（種）の投与によって生じ、その際、これらの細胞は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入されて、治療される患者の免疫系の応答を妨げる。そのような治療は更に、特に、本明細書で定義されるような細胞、例えば、本発明の文脈で使用されてもよい、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞又は任意のその他の細胞（種）の、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルを含む（医薬）組成物の投与によって生じ、その際、これらの細胞は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入されて、治療される患者の免疫系の応答を妨げる。好ましくは、（球状）マイクロカプセルは、本発明の方法で使用されるようなその構成成分全てと同様に、例えば、コア又は表面コーティング層等のポリマーマトリクスのポリマーは、本明細書で定義されたとおりである。更に、そのような治療は、全て本明細書で定義されるような神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又はＧＬＰ−１融合ペプチドの直接投与によっても生じてもよい。本発明に係る上記の治療方法は、ヒトに使用することができ、また獣医学的目的でも使用することができる。
【０１３２】
本明細書で定義される治療方法は、好ましくは、眼疾患及び眼障害、特に、その他の網膜疾患の中でもとりわけ、網膜色素変性症（ＲＰ）、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）、他の理由による黄斑浮腫、網膜血管閉塞、糖尿病性網膜症、緑内障及びその他の眼の神経症等から選択される網膜疾患を含む、網膜の変性が原因で生じる眼疾患及び眼障害の治療又は予防、並びにそれらに関連する状態の治療又は予防を含む。
【０１３３】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルを用いて、又はこれらの（球状）マイクロカプセル若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含む（医薬）組成物を用いて、眼疾患若しくは眼障害又はそれに関連する疾患を治療すること又は予防することは好ましくは、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適な更なるタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等の上述の有益な効果の結果生じる。例えば、有益な効果はＧＬＰ−１について知られ、例えば、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼに対する安定性のためにＧＬＰ−１ペプチドを繰り返して投与する必要がなく、及び／又は、埋め込まれたＧＬＰ−１発現同種細胞に対する、望ましくない免疫応答のリスクもなく、虚血又は酸素不足が原因で生じる損傷及び心臓組織の死の可能性を強力に低下させるその能力である。コラーゲンＸＶＩＩＩの分解産物であるエンドスタチンについて知られる有益な効果には、血管新生を有意に低減させるその能力が挙げられる。本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの細胞の「安全で且つ有効な量」、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体の「安全で且つ有効な量」は、更に治療される特定の眼疾患又は眼障害と関連して、また治療される患者の年齢と身体状態、状態の重症度、治療の持続時間、併用療法の性質、使用される特定の薬学的に許容可能なキャリアの性質、及び類似の因子と関連して、投与する医師の知識と経験の範囲内で変化するであろう。
【０１３４】
本明細書で定義されるように、眼疾患の治療若しくは予防の方法、又はそのような眼疾患に関連する疾患若しくは状態の治療若しくは予防の方法は、それを必要とする患者に、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルを投与すること、又はそのような（球状）マイクロカプセルを含有する（医薬）組成物を投与すること、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの投与を含む。「それを必要とする患者」は通常、動物であり、好ましくは哺乳類である。更に好ましくは、「それを必要とする患者」は、例えば、ブタ、ヤギ、ウシ、イノシシ／ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、又はマウス、ハムスター及びウサギを含むげっ歯類を含むヒト及び動物を含む群から選択されるが、これらに限定されない。
【０１３５】
上記治療方法の文脈での投与は通常、「安全で且つ有効な」量の活性剤、例えば、（球状）マイクロカプセル、即ち、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの細胞を投与すること、又は「安全で且つ有効な」量の神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを投与することによって生じる。本明細書で使用されるとき、「安全で且つ有効な量」は、本明細書で言及されるような眼疾患又は眼障害の陽性の改善を有意に誘導するのに十分である、上記で定義されるような活性剤の量を意味する。しかしながら、同時に、「安全で且つ有効な量」は、換言すると、利点とリスクとの間の理に適った関係を可能にする、深刻な副作用を十分に回避できるように少ないものである。これらの限界の決定は通常、理に適った医学判断の範囲内にある。本発明の文脈で、表現「安全で且つ有効な量」は好ましくは、本明細書で定義されるようなそのような神経保護因子及び／又は抗血管新生因子又はそれらのフラグメント若しくは変異体について知られる有益な効果を発揮するのに好適である、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの量、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセルの細胞の量を意味する。
【０１３６】
上記の文脈で、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの細胞は通常、（球状）マイクロカプセルのｍＬ当たり、１日当たり、約０．２μｇの濃度で、本明細書で定義されるように、例えば、ＧＬＰ−１ペプチド及び／又はエンドスタチンを分泌する。従って、投与量の範囲は、例えば、１日当たり約０．０１μｇ〜２０ｍｇの、生物学的に活性のある、分泌される神経保護因子、抗血管新生因子、又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、ＧＬＰ−１ペプチド及び／又はエンドスタチンの範囲であってもよく（１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲での更に高い量も熟考されるにもかかわらず）、例えば、１日当たり約０．０１μｇ〜１０ｍｇの範囲、好ましくは１日当たり約０．０１μｇ〜５ｍｇの範囲、一層更に好ましくは１日当たり約０．０１μｇ〜１ｍｇの範囲、最も好ましくは１日当たり約０．０１μｇ〜５００μｇの範囲であってもよい。神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドが、細胞なしで直接、投与されるのであれば、これもまた適用されてもよい。
【０１３７】
上記治療方法の文脈での投与は通常、治療される患者における特定の投与部位への、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入される細胞を提供することによって、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルを提供することによって、又はそのような（球状）マイクロカプセル、若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含有する（医薬）組成物を提供することによって生じる。そのような特定の投与部位は通常、眼であり、例えば、眼内投与であり、好ましくは、治療される患者の眼の冒された領域であり、更に好ましくは特定の組織又は領域、例えば、網膜、虹彩であり、更に好ましくは、虹彩から２ｍｍ〜３ｍｍ離れた、例えば、結膜及び強膜がやや乱された後の、眼の硝子体腔の中である。眼の硝子体腔が、眼内疾患の治療のための薬剤リザーバとして使用され得ることを実感するのは主として重要なことである。眼は身体容積の１０，０００分の１を表すため、薬剤は、眼内に投与されないと、必要とされる作用の部位、即ち、網膜又はその他の眼内構造にて同一濃度を理論的に達成するには、１０，０００倍高い投与量で全身に投与しなければならない。それは、全身性の副作用の途方もないリスクを招き得る。一例として、眼内投与された相対的に少量の投与量である２５ｍｇの結晶性ステロイド（トリアムシノロン）は、全身投与された１／４キログラムの投与量に相当する。そのような投与量は患者の生存に関わる問題である。加えて、薬剤の直接的な眼内投与は、網膜血管を通じて輸送され得るが、網膜組織における薬剤の利用効率を限定する血液網膜関門の問題を回避する。しかしながら、網膜血管壁の相対的に密接な接合部のために、薬剤は完全には血管を離れて網膜組織に浸透しないことが多い。この文脈で、投与があまりに多く繰り返される場合、薬剤の繰り返される眼内投与は、水晶体や網膜への医原性病変の累積リスクを伴い、及び感染の累積リスクを伴い得ることも主として重要である。したがって、本発明に従って実施されるように、必要な再投与の数を顕著に減らす手順や技法を開発することが非常に望ましい。細胞が免疫的に攻撃されるのを保護し、その「ケージ」から細胞が離れるのを防ぎ、同時に、産生された薬剤の放出のための細胞の栄養のための物質の交換を可能にする構造によって覆われた、眼の中への薬剤産生細胞の埋め込みを、眼の中への薬剤産生繊維の最小化及び転位と比較することができる。或いは、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入される細胞、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、又はそのような（球状）マイクロカプセル、若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、又はそれらのフラグメント若しくは変異体を含有する（医薬）組成物を、眼の前眼房又は後眼房の中に、例えば、房水又は硝子体液の中に投与してもよい。或いは、網膜下で、例えば、網膜の後での注入を介して注入を行うこともできる。
【０１３８】
本発明の文脈での投与部位には、更に、例えば、注入又は埋め込みによって投与されてもよい、眼内投与、眼又は網膜の表面、虹彩又はその組織又は周辺領域が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドをコードし且つ分泌する細胞はまた、前眼房、水晶体嚢（例えば、白内障の手術後）、網膜下腔、及び脈絡膜上腔に埋め込まれてもよい。注入又は外科的処置又は非外科的処置によって細胞の埋め込みを行い、強膜の内側の全容積として定義される眼の内部に細胞をもたらしてもよい。
【０１３９】
投与部位には更に、本明細書で言及されるような眼疾患の治療に好適な任意の腔が挙げられる。
【０１４０】
本明細書で定義されるような特定の投与部位への、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの投与、特に、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入され、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞の投与、又はそのような（球状）マイクロカプセルを含有する（医薬）組成物の投与、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの投与は、異なった投与方式を用いて実施されてもよい。本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入された細胞、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、又はそのような（球状）マイクロカプセル、若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含有する（医薬）組成物は、例えば、全身的に又は局所的に投与することができる。全身的投与の経路としては、例えば、経皮経路、静脈内（例えば、末梢静脈内注射）、皮下、動脈内（例えば、門脈を介した胆管への動脈内注射）、筋肉内、腹腔内、又は鼻腔内を含む非経口経路などが挙げられる。局所投与の経路としては、例えば、眼内の投与経路だけでなく、局所、経皮、筋肉内、皮下、心臓内、心筋内、及び／又は心膜注射などが挙げられる。更に好ましくは、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入された細胞、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、又はそのような（球状）マイクロカプセル、若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含有する（医薬）組成物は、皮内経路、皮下経路又は筋肉内経路によって投与されてもよい。注射目的で、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入された細胞、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、又はそのような（球状）マイクロカプセル若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含有する（医薬）組成物は、例えば、好適な医薬キャリアの添加によって、例えば、液体医薬組成物、ジェル等の形態で、好適な形態にて製剤化されてもよい。
【０１４１】
前述の眼疾患又は眼障害の治療に好適であってもよい投与の他の方式には、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入された細胞、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、又はそのような（球状）マイクロカプセルを含有する（医薬）組成物の、明細書で定義されるような投与部位の中への又はその部位への移植が挙げられる。移植の目的で、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入された細胞、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、又はそのような（球状）マイクロカプセルを含有する（医薬）組成物は、例えば、好適な医薬キャリアの添加によって、例えば、ジェル、カプセル、錠剤等の形態で、好適な形態にて製剤化されてもよい。
【０１４２】
投与は一般に、同一の日における単回投与として、複数回投与として、数週間又は数ヵ月の期間にわたる単回投与として、又は数週間又は数ヵ月の期間にわたる複数回投与として生じてもよい。
【０１４３】
本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに封入された細胞、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、又はそのような（球状）マイクロカプセル若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含有する（医薬）組成物は、介入手段によって、例えば、冒された領域に誘導し、注入によって投与部位に（球状）マイクロカプセルを埋め込むカテーテルを用いて、本明細書で定義されるような投与部位に直接送達されてもよい。埋め込みはまた、外科的な通常の方法を用いて、例えば、又は非外科的な処置を用いて実施することができる。
【０１４４】
特に好ましい実施形態によれば、（球状）マイクロカプセル、特に本明細書で定義されるような、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞、又はそのような（球状）マイクロカプセル、若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含む（医薬）組成物は、例えば、上記ですでに定義されたような注入を介して投与されてもよい。特に好まれるのは、例えば、１２Ｇ〜２６Ｇ、更に好ましくは１８Ｇ〜２２Ｇのサイズを有する注射針のような適切な注射針を適用することによる注入である。別の特に好ましい実施形態によれば、（球状）マイクロカプセル、特に本明細書で定義されるような、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１融合ペプチド等、又はそれらのフラグメント若しくは変異体をコードし且つ分泌する細胞、又はそのような（球状）マイクロカプセル、若しくは神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含む（医薬）組成物は、例えば、外科用メス、注射針のような外科用具を用いて、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質等を移植することを介して投与されてもよい。
【０１４５】
本発明は、更に動物、好ましくはヒトのような本明細書で定義されるような哺乳類における眼疾患若しくは眼障害又はそれに関連する疾患若しくは障害を治療するための製品、例えば、（医薬）組成物又はキットを製造するための、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドをコードし且つ分泌する細胞を含む本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの使用、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの使用を包含する。この文脈で、そのような本発明の医薬組成物は、ヒトの医療又は獣医学的医療のいずれかの分野で使用されてもよい。本発明は更に、動物、好ましくはヒトのような、本明細書で定義されるような哺乳類における眼疾患若しくは眼障害又はそれに関連する疾患若しくは障害を治療するための本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの製造のための、好ましくは、製品、例えば、（医薬）組成物又はキットを調製するための、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドをコードする細胞の使用、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの使用を包含する。細胞が使用されるのであれば、そのような目的で使用されるような細胞は好ましくは、本明細書で定義されるような細胞であり、例えば、本発明の文脈で使用されてもよい、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドをコードし且つ分泌する、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞、又はその他の細胞（種）であり、その際、これらの細胞は、（球状）マイクロカプセルに封入されて、治療される患者の免疫系の応答を妨げる。
【０１４６】
本発明の別の態様は、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又は本明細書で定義されるようなそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドをコードし且つ分泌する細胞を含む、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルを含有する（医薬）組成物、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含む（医薬）組成物である。そのような（医薬）組成物は、上記で定義されたような眼疾患又は眼障害に罹っている患者に、好ましくは、本明細書で定義されるような方式によって本明細書で定義されるような投与部位に投与されてもよい。
【０１４７】
神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドをコードし且つ分泌する細胞を含む本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルを含有する（医薬）組成物、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを「有効成分」として含有する、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルを含有する（医薬）組成物の調製は一般に、全て参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第４，６０８，２５１号；同第４，６０１，９０３号；同第４，５９９，２３１号；同第４，５９９，２３０号；同第４，５９６，７９２号及び同第４，５７８，７７０号によって例示されるように、当該技術では一般によく理解されている。
【０１４８】
通常、（医薬）組成物は、好ましくは水（水性製剤）を含有する液状の溶液又は懸濁液のいずれかとして注入可能として調製されるか、又は乳化されてもよい。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の水を含む製剤として定義される。同様に、用語「水溶液」は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の水を含む溶液として定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の水を含む懸濁液として定義される。
【０１４９】
筋肉内、静脈内、皮膚、又は皮下への注射、又は本明細書で定義されるような投与部位への更なる注射については、細胞、又は本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセル、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチド、又は上記で定義されるような医薬組成物は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口で許容可能な水溶液の形態であろう。液体の（医薬）組成物は一般に水のような液体ビヒクルを含む。好ましくは、液体ビヒクルとしては、生理食塩水、デキストロースエタノール、又はその他の糖類溶液；エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール若しくはその組み合わせなどのグリコール類；リンゲル溶液、乳酸化リンゲル溶液などの等張ビヒクル；などが挙げられる。
【０１５０】
本発明の（医薬）組成物が、細胞若しくは本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルの水溶液、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの水溶液と、例えば、緩衝液を含むのであれば、前記（球状）マイクロカプセル、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドは通常、０．１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で（医薬）組成物に存在し、前記（医薬）組成物は普通、約２．０〜約１０．０、好ましくは約７．０〜約８．５のｐＨを有する。
【０１５１】
その他の成分が本発明の（医薬）組成物に存在し得ることが可能である。そのような追加の成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、ｐＨ緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液又はマレイン酸緩衝液）、保存剤、界面活性剤、安定剤、張度調整剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）、及び／又は両性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンのようなアミノ酸）が挙げられてもよい。そのような成分は、本発明に従って使用されるとき、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞の特定の要件、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドの特定の要件に従って、当業者によって選択され、即ち、成分は細胞毒性ではなく、細胞の生存を保証する。更に、そのような成分は、本発明に従って使用されるとき、（球状）マイクロカプセルの（球状）コアに埋め込まれる細胞によってコードされ、分泌されてもよい、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体を安定化させてもよい。
【０１５２】
緩衝液として、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ヘペス、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はこれらの混合物からなる群から選択されるものが好ましい。これらの特定の緩衝液のそれぞれは本発明の代替の実施形態を構成する。
【０１５３】
本明細書で定義されるような（医薬）組成物における前述の添加剤全ての使用は、特にその濃度範囲に関して当業者に周知である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５が好都合に参照される。
【０１５４】
本明細書で定義されるような、神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質をコードし且つ分泌する細胞を含む（球状）マイクロカプセルを含有する、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体、例えば、エンドスタチン、ＧＬＰ−１ペプチド、又は本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドを含有する、本発明の（医薬）組成物は好ましくは、一般に治療のために本明細書で定義されるような方式で投与される。そのような投与は好ましくは、投与量処方に対応し、好ましくは、安全で且つ有効な量の有効成分、例えば、安全で且つ有効な量の本明細書で定義されるような細胞、又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質、又はそれらのフラグメント若しくは変異体を含み、即ち、そのような量は、安全であるとみなされるが、治療上有効である。本発明の（医薬）組成物と共に（又は、必要に応じて単独で）投与される、そのような細胞又は神経保護因子、抗血管新生因子、及び／又は本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質若しくはタンパク質様物質の量は、例えば、患者の疾患の重症度を含む、治療される対象及び疾患に左右される。好適な投与量範囲は、所定の時間の間に、且つ通常１−数百マイクログラムの桁の範囲で（球状）マイクロカプセル（本発明の（医薬）組成物に含有されるような）によって直接提供されるか又は分泌される生物学的に活性のある神経保護因子、抗血管新生因子、本明細書で定義されるような眼疾患の（眼内）治療に好適なその他のタンパク質（本明細書で定義されるような神経保護及び／又は抗血管新生因子及び／又は更に好適な任意の因子）の、本明細書で定義されるような１日当たりの量に左右される。
【０１５５】
本発明は更に、別途記載されなければ、またこれらの特に定義される単一の実施形態に限定されることを意図されなければ、上記の実施形態及び特徴の組み合わせを含む。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
添付の図面にて本発明を更に説明する。しかしながら、本発明の範囲を以下に示される図面の内容に限定することは意図されない。
【図１】図１は、構築物ａ−ｍ（実施例１も参照）の一例を示す図であり、それは、本発明に従って使用されるとき、（球状）マイクロカプセルの調製に使用される細胞に含有されてもよい。
【図２】図２は、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞における異なったＧＬＰ−１構築物の一時的な発現、及び一時的な発現の後の活性のあるＧＬＰ−１の結果を示す（実施例２も参照）。単量体のＧＬＰ−１構築物＃１０３と＃３１７（ＧＬＰ−１（７−３７）のたった１つのコピーを有する）では最低限の活性のあるＧＬＰ−１を見出し得るにすぎない。二量体のＧＬＰ−１構築物＃２１７（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞の双方にて構成成分（Ｉ）及び構成成分（ＩＩＩ）としてＧＬＰ−１（７−３７）を有する）にて発現の大きな増大が認められた。
【図３】図３は、ＧＬＰ−１分泌細胞からの細胞培養上清のウエスタンブロット解析を示す（実施例３も参照）。レーン１：偽トランスフェクションしたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清に溶解した１００ｎｇの合成ＧＬＰ−１（７−３７）；レーン２：構築物＃２１７から二量体ＧＬＰ−１を分泌するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清；レーン３：構築物＃２１７から二量体ＧＬＰ−１を分泌するＡｔＴ２０細胞（クローン８１−Ａ−２１７／３）の上清；レーンＭ：前染色したタンパク質マーカー［ｋＤａ］。結果は、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＣ末端付加物を含有する、本明細書で定義されるようなペプチドが、トランスフェクションされた細胞株から分泌され、ＧＬＰ−１（７−３７）の分子中央部分のエピトープに結合する抗ＧＬＰ−１抗体を用いて検出することができることを示している。
【図４】図４は、本発明に従って使用されるようなＧＬＰ−１ペプチドによって実施した血漿安定性試験（試験管内）を記載する。したがって、構築物（１）＃１０３：ＧＬＰ−１（７−３７）、（２）＃３１７：ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−１１ＡＡにて伸長、及び（３）＃２１７：ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ−１（７−３７）をＨＥＫ２９３細胞に一時的にトランスフェクションした。ＨＥＫ２９３細胞は遺伝子構築物にとって有効な宿主である（実施例４も参照）。
【図５】図５は、構築物＃２１７：ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ−１（７−３７）によって産生されるＧＬＰ−１ペプチドＣＭ１を分泌する、安定的にトランスフェクションされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞クローン７９ＴＭ２１７／１８Ｋ５の上清と、対照としての合成ＧＬＰ−１（７−３７）によって実施した血漿安定性動態（試験管内）を記載する。結果は３回の独立した実験から得ている。活性のあるＧＬＰ−１はＧＬＰ−１（アクティブ）ＥＬＩＳＡ（Ｌｉｎｃｏ）を用いて測定した。
【図６】図６は、以下に示すペプチドについてのウエスタンブロットを示す。以下の値を得た。配列番号１（ＩＤ１ｓｙｎ）はＧＬＰ−１（７−３７）、３１ａａ、３．３ｋＤに相当し；配列番号８（ＩＤ８ｓｙｎ、ＣＭ３）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２、４６ａａ、５．１ｋＤに相当し；配列番号７（ＩＤ７ｒｅｃ、ＣＭ２）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ２、８３ａａ、９．４ｋＤに相当し；配列番号６（ＩＤ６ｓｙｎ、ＣＭ１）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ１（７−３７）、７９ａａ、８．７ｋＤに相当する（実施例５も参照）。
【図７】図７は、バイオアッセイ細胞株１１１ＣＨＯ３４９／１８におけるＧＬＰ−１受容体が介在するｃＡＭＰ上昇の用量反応曲線を示す。構築物＃２１７：ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ−１（７−３７）によって産生される、ＣＭ１を分泌する７９ＴＭ２１７／１８Ｋ５細胞の連続希釈調整培地によって刺激を行った。ｈＭＳＣ−ＴＥＲＴ親細胞株では検出可能なｃＡＭＰ応答は見られなかった。グラフは５回の独立した実験から作成した。ｃＡＭＰバイオアッセイにて最大値の半分の効果（ＥＤ５０）を作出するペプチドの用量は３５３ｐＭであると決定された（実施例６も参照）。
【図８】図８は、一時的な遺伝子発現及び安定的な遺伝子発現に使用した、例となるベクターを示す。ベクターは、１つは当該遺伝子（ＧＯＩ）用であり、もう１つは自殺遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ及び耐性遺伝子ブラスチシジンの融合用である、２つの別個の転写単位からなる。第１の転写単位については、ヒトユビキチンＢプロモータを用い、第２の転写単位にはヒトフェリチンプロモータを用いた（実施例９も参照）。
【図９】図９は、予め細胞を不死化した後、本明細書で定義されるような（球状）マイクロカプセルに使用される細胞の性状分析を示す。図９Ａから分かり得るように、不死化された細胞は依然として、不死化されていない相方として含脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞に分化することができる（左、右）。不死化細胞は線維芽細胞の形態を有し、例えば、ここで使用される一次細胞に特徴的であるＣＤ４４とＣＤ１６６のエピトープマーカーを用いたフローサイトメトリーによって示されるように寿命のあるＭＳＣよりサイズと粒度に関して更に均質である。不死化した細胞は、非不死化の相方と同じＣＤマーカーを発現する（図９Ｂを参照）。
【図１０】図１０は、Ｃ末端を伸長したＧＬＰ−１類似体ＣＭ１の抗アポトーシス有効性を示す。それぞれ１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの最終濃度でタンパク質の生合成阻害剤、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）を添加することによってＲＩＮ−５Ｆ細胞でアポトーシスを誘導した。大腸菌で組換え的に産生された二量体ＧＬＰ−１融合ペプチドＣＭ１の様々な濃度での存在は、２４時間のインキュベーション後に定量化する細胞の生存能力の有意な増加（ｐ＜０．０１）を生じる。
【図１１】図１１は、眼疾患、特に黄斑変性（ＭＤ）の治療に利用されるようなＧＬＰ−１をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセルを用いた本発明の概念の模式図である。薄く、選択的に透過性のアルギネートマトリクスが形成する、ＧＬＰ−１をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセルに細胞、例えば、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞又は同種異系細胞が封入される。カプセル化細胞に供給する酸素及び栄養物、並びに細胞によってコードされ、分泌されるＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１融合ペプチドについてアルギネートマトリクスは透過性である。他方、免疫系の細胞及び構成成分は上述のようなこのバリアを通過することができない。左：ＧＬＰ−１をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセルを用いた本発明の概念の模式図。細胞を含有するコアビーズ（クリーム色）を純粋なアルギネート（灰色）の層が取り囲む。右：試験管内での、ＧＬＰ−１をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセル。
【図１２】図１２は、本発明に係るＧＬＰ−１及びエンドスタチンをコードし且つ分泌するマイクロカプセル（本明細書では、ＧＬＰ−１及びエンドスタチンセルビーズとも呼ぶ）の埋め込みを行ったウサギの体重の発達を示す。
【図１３】図１３は、３日目の右眼からの外植されたビーズを示す（ＣＢ−０８７ＧＬＰ−１セルビーズ）。
【図１４】図１４は、３日目の左眼からの外植されたビーズを示す（ＣＢ−１０２エンドスタチンセルビーズ）。
【図１５】図１５は、１４日目の右眼からの外植されたビーズを示す（ＣＢ−０８７ＧＬＰ−１セルビーズ）。
【図１６】図１６は、１４日目の左眼からの外植されたビーズを示す（ＣＢ−１０２エンドスタチンセルビーズ）。
【図１７】図１７は、５６日目の右眼からの外植されたビーズを示す（ＣＢ−０８７ＧＬＰ−１セルビーズ）（ＰＪ：ヨウ化プロピジウム）。
【図１８】図１８は、５６日目の左眼からの外植されたビーズを示す（ＣＢ−１０２エンドスタチンセルビーズ）（ＰＪ：ヨウ化プロピジウム）。
【図１９】図１９は、３日目、１４日目及び５６日目での硝子体液におけるＧＬＰ−１の濃度を示す。
【図２０】図２０は、５６日目までの房水におけるＧＬＰ−１の濃度を示す。
【図２１】図２１は、５６日目までの房水におけるエンドスタチンの濃度を示す。
【図２２】図２２は、３日目、１４日目及び５６日目での硝子体液におけるエンドスタチンの濃度を示す。
【図２３】図２３は、ＧＬＰ−１及びエンドスタチンセルビーズで処理したウサギに由来する網膜のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図２４】図２４は、ＧＬＰ−１及びエンドスタチンセルビーズで処理したウサギに由来する網膜のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図２５】図２５は、ＧＬＰ−１及びエンドスタチンセルビーズで処理したウサギに由来する網膜のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図２６】図２６は、ＧＬＰ−１及びエンドスタチンセルビーズで処理したウサギに由来する網膜のＴＵＮＥＬ染色−反復解析を示す。
【図２７】図２７は、ＧＬＰ−１及びエンドスタチンセルビーズで処理したウサギに由来する網膜の自己蛍光−反復解析を示す。
【実施例】
【０１５７】
実施例
添付の実施例にて本発明を更に説明する。しかしながら、本発明の範囲を以下に示される実施例の内容に限定することは意図されない。
【０１５８】
実施例１
遺伝子構築物の作製
図１ａに示すように、ＨｉｎｃｌｌとＥｃｏＲｌの部位を含む配列にてＧＬＰ−１（７−３７）ｃＤＮＡのコーディング配列を合成的に合成した。別に、図１ｂに示すように、ＧＬＰ−１（７−３７）のコーディング配列と、ＩＰ２とＳｆｏｌ、ＥｃｏＲｌ及びＸｂａｌの制限部位を含む、図１ｂで説明したｃＤＮＡを合成した。ＧＬＰ−１を分泌経路に向けるために、ストロメリシン３（Ｎｏ．ＮＭ＿００５９４０による）の非相同シグナル配列を用いた。従って、ストロメリシンのシグナル配列とリーダー配列をコードするｃＤＮＡをヒトＲＮＡから逆転写酵素ＰＣＲ増幅し、図１ａ又は図１ｂの構築物と共に用いて、それぞれ図１ｃ及び図１ｄに示す構築物を形成した。
【０１５９】
図１ａの構築物のＨｉｎｃｌｌ／ＥｃｏＲＩフラグメントを図１ｄの配列のＳｆｏＩ部位にクローニングして図１ｅの構築物を形成する。同様に、図１ｄのＥｃｏＲｌフラグメントを真核細胞発現プラスミドのＥｃｏＲｌ部位にクローニングして図１ｆに示す構築物を作製する。図１ｇに示す構築物を形成するには、図１ｂに示す構築物のＨｉｎｃｌｌ／ＸｂａＩフラグメントを図１ｄに示すＳｆｏＩ／ＸｂａＩ部位に繰り返しクローニングする。図１ｈは、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）とＩＰ２とＧＬＰ−２（１−３５）をコードする配列に融合された、短縮された内因性イントロン配列が割り込んだストロメリシンのリーダー配列とシグナル配列をコードする、合成されコドン最適化された配列を示す。構築物図１ｈのＤＮＡ配列は配列番号１６である一方で、配列番号１５も翻訳されたペプチドの配列を示す。
【０１６０】
またも合成されるのは図１ｉ及び図１ｊにおける配列である。次いで、これらを用いて、図１ｊのＮａｅｌ／ＢｓｓＨＩＩフラグメントを図１ｈのＮａｅｌ／ＢｓｓＨＩＩ線状化配列にクローニングすることによって図１ｋの構築物を形成する。構築物図１ｋのＤＮＡ配列は配列番号１４である一方で、配列番号１３も翻訳されたペプチドの配列を示す。図１ｌの構築物は、図１ｈの配列のＢｓｓＨｌｌ消化と再連結によって形成される。構築物図１ｌのＤＮＡ配列は配列番号１８である一方で、配列番号１７も翻訳されたペプチドの配列を示す。図１ｍの構築物は、図１ｉの配列のＡｆｅｌ／ＢｓｓＨＩＩフラグメントを図１ｈのＡｆｅｌ／ＢｓｓＨＩＩ線状化配列にクローニングすることによって形成される。構築物図１ｍのＤＮＡ配列は配列番号２０である一方で、配列番号１９も翻訳されたペプチドの配列を示す。
【０１６１】
上記の構築物は、日常的な技法を用いて当業者によって作製されてもよい。
【０１６２】
実施例２
哺乳類細胞のトランスフェクション、クローン選抜及びＧＬＰ−１の発現
細胞の供給源：ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞株、＃ＡＣＣ３０５、ＤＳＭＺセルカルチャーコレクション（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ）、ＡｔＴ２０（マウスＬＡＦ１下垂体腫瘍細胞株、＃８７０２１９０２、欧州セルカルチャーコレクション、英国）、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞は、デンマーク、オーデンセ大学病院、Ｋａｓｓｅｍ教授によって生成され、提供されている。
【０１６３】
１０６個の細胞のトランスフェクションのために、様々なＧＬＰ−１構築物を伴った０．５μｇ〜２μｇのプラスミドＤＮＡを用いた。構築物は実施例１と同様にして生成した。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４ｆｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｖｏｌ２．，  Ｕｎｉｔ  ９．１）に記載されたような標準的なリン酸カルシウム同時沈殿法によってＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ．  ａｌ．  １９９４ｆｆ，  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｖｏｌ  ２．，  Ｕｎｉｔ  ９．４）に記載されたようなＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＡｔＴ２０細胞にトランスフェクションした。電気的パラメータと細胞種に特異的な溶液の組み合わせに基づいた非ウイルス法であるヌクレオフェクター法（Ａｍａｘａ）を用いてｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクションを行った。ヌクレオフェクター装置（プログラムＣ１７）とヌクレオフェクター溶液ＶＰＥ−１００１を用いて、＞６０％のトランスフェクション効率を達成した。トランスフェクションの４８時間後、選抜剤、ブラスチシジン（２μｇ／ｍＬ）を培養培地に添加することによって、染色体へのＤＮＡの安定的な統合を伴った細胞クローンの選抜を行った。１２日から１５日後、安定的なトランスフェクション細胞クローンを単離し、性状分析のために増やすことができた。
【０１６４】
様々なＧＬＰ−１構築物の一時的な発現はｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞で測定した。ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞の双方にて、単量体ＧＬＰ−１構築物＃１０３及び＃３１７（ＧＬＰ−１（７−３７）のたった１つのコピーしか有さない）では最低限の活性しかないＧＬＰ−１レベルを見つけることができるにすぎないが、二量体ＧＬＰ−１構築物＃２１７（構成成分（Ｉ）及び構成成分（ＩＩＩ）としてＧＬＰ−１（７−３７）を有する）では発現の大きな増大を見つけることができる。結果を図２に要約する。ＧＬＰ−１構築物に対する構築物の伸長＃１５９（構成成分（ＩＩ）としてＩＰ２の４つのコピーを有する）は、更なる有意な増加を生じない（図示せず）。様々な構築物でｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞にトランスフェクションした後、安定的にＧＬＰ−１を発現するクローンを選抜した。発現レベルを表１に示す。
【０１６５】
【表１】
2012526524.tif 000002
【０１６６】
実施例３
哺乳類細胞から分泌されるＧＬＰ−１ペプチドのウエスタンブロット解析
ＧＬＰ−１分泌細胞からの細胞培養上清を１０％−２０％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し（１２０Ｖ、９０分間）、セミドライブロット（２．０ｍＡ／ｃｍ２、６０分間）によってＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜、０．４５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＩＰＶＨ０００１０）にトランスフェクションした。メタノール固定とブロッキング（ＴＢＳ中で３％（ｗ：ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ：ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２）の後、１μｇ／ｍＬの抗ＧＬＰ−１抗体（ＨＹＢ１４７−１２、Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）によって４℃ｏ／ｎで膜を免疫ブロットした。洗浄と、室温にて４時間の０．００２μｇ／ｍＬの検出抗体（抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＰＣ２８５５−１１９７）とのインキュベートの後、化学発光検出によってタンパク質の局在を明らかにする。
【０１６７】
ウエスタンブロット解析は、図３（１：偽トランスフェクションしたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清に溶解した１００ｎｇの合成ＧＬＰ−１（７−３７）、２：構築物＃２１７から二量体ＧＬＰ−１を分泌するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清、３：構築物＃２１７から二量体ＧＬＰ−１を分泌するＡｔＴ２０細胞（クローン８１−Ａ−２１７／３）の上清、Ｍ：前染色したタンパク質マーカー［ｋＤａ］）に示す。結果は、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＣ末端付加物を含有するペプチド（図３中の２及び３）が、トランスフェクションされた細胞株から分泌され、ＧＬＰ−１（７−３７）の分子中央部分のエピトープに結合する抗ＧＬＰ−１抗体を用いて検出ができることを示している。
【０１６８】
実施例４
ヒト細胞から分泌されたＧＬＰ−１ペプチドの試験管内での血漿安定性
以下のペプチド：
１：ＧＬＰ−１（７−３７）（構築物＃１０３）
２：ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−１１ＡＡにて伸長（構築物＃３１７）
３：ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ１（７−３７）（構築物＃２１７）
をコードするＧＬＰ−１変異体に連結される、非相同のストロメリシンのシグナル配列をコードする構築物でＨＥＫ２９３細胞及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞にトランスフェクションした。
【０１６９】
細胞から分泌されたＧＬＰ−１ペプチド又は合成ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｂａｃｈｅｍ）を含有する細胞培養上清を、ジペプチジルペプチダーゼ活性を含有するヒトリンパ球を濃縮した血漿と共に３７℃にて５％ＣＯ２で３時間、又は更に６及び９時間インキュベートした。偽トランスフェクションした細胞の上清における合成ＧＬＰ−１（７−３７）をＤＰＰ−ＩＶ活性の陽性対照として用い、それは、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（＃ＤＰＰ４、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）の添加によって阻害されることが示された。ＧＬＰ−１（７−３７）のＮ末端エピトープに結合し、ＤＰＰ−ＩＶで分解された不活性のＧＬＰ−１（９−３７）を識別する抗体を用いて、ＧＬＰ−１（アクティブ）ＥＬＩＳＡ（＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて活性のあるＧＬＰ−１を測定した。
【０１７０】
結果を図４（ＨＥＫ２９３細胞）及び図５（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞）に示す。ＨＥＫ２９３細胞及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞は双方とも遺伝子構築物の有効な宿主である。トランスフェクションされた細胞の結果の番号付けは、１：構築物＃１０３からＧＬＰ−１（７−３７）を分泌する細胞の上清、２：構築物＃３１７からＩＰ２と１１のアミノ酸とで伸長したＧＬＰ−１を分泌する細胞の上清、３：構築物＃２１７から二量体ＧＬＰ−１を分泌する細胞の上清である。構築物１が、合成ＧＬＰ−１と同様にＤＰＰ−ＩＶによって不活化される野生型ＧＬＰ−１を産生する一方で、Ｃ末端を伸長したＧＬＰ−１の形態（図４の２と３、図５の３）は分解に対して更なる耐性を有する。Ｃ末端を伸長したＧＬＰ−１ペプチドは試験管内にてヒト血漿において有意に安定化される。二量体のＧＬＰ−１配列（３）を持つペプチドは、試験管内にてＤＰＰ−ＩＶの分解に対してほぼ完全に安定化される。
【０１７１】
実施例５
ｃＡＭＰの放出によって測定されるＧＬＰ−１ペプチドの試験管内の生物活性
ＧＬＰ−１（７−３７）は、ＧＬＰ−１受容体に結合する７回膜貫通Ｇタンパク質を通じてその生物活性を発揮し、セカンドメッセンジャー環状ＡＭＰを通じてタンパク質キナーゼＡのシグナル伝達の活性化をもたらす。ＣＭ１のＣ末端の伸長がＧＬＰ−１の作用方式を妨害しないことを裏付けるために、様々な濃度のペプチドとインキュベートした後にＧＬＰ−１受容体を発現している細胞株にてｃＡＭＰの上昇を測定する試験管内のバイオアッセイにてＣＭ１の生物活性を定量化した。試験に使用したＧＬＰ−１受容体を発現している細胞株（クローン１１１ＣＨＯ３４９／１８）は、ヒトＧＬＰ−１受容体で安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株である。ペプチドの生物活性の概要を示す７９ＴＭ２１７／１８Ｋ５細胞で産生されたＣＭ１についての用量反応曲線を図７に示す。ｃＡＭＰバイオアッセイにて最大値の半分の効果（ＥＤ５０）を生じるペプチドの用量は３５３ｐＭであると決定された。
【０１７２】
実施例６
ＧＬＰ−１ＣＭペプチドの試験管内でのヒト血漿安定性
合成ＧＬＰ−１ペプチド（配列番号１ｓｙｎ、配列番号６ｓｙｎ、配列番号７ｒｅｃ、配列番号８ｓｙｎ）を２０ｎｇ／ｍＬの濃度にてヒト血漿と共に３７℃にて５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。血漿のジペプチジルペプチダーゼ活性は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（＃ＤＰＰ４、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）によって阻害された。ＧＬＰ−１（アクティブ）ＥＬＩＳＡ（＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて、活性のあるＧＬＰ−１を測定した。
【０１７３】
天然のＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１）とは対照的に、Ｃ末端を伸長したＧＬＰ−１ペプチドである配列番号６、配列番号７及び配列番号８は、試験管内でヒト血漿において有意に安定化される（図７）。対照として（右側）、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を添加した実験で得られた結果を示す。これらの対照実験では、ＧＬＰ−１活性は完全に維持される。
【０１７４】
実施例７
プラスミドの作製
一時的な遺伝子発現及び安定的な遺伝子発現のためのベクターは、１つは当該遺伝子（ＧＯＩ）用であり、もう１つは自殺遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ及び耐性遺伝子ブラスチシジンの融合用である、２つの別個の転写単位からなる。第１の転写単位については、ヒトユビキチンＢプロモータを用い、第２の転写単位にはヒトフェリチンプロモータを用いた。プラスミドは、図８に模式的に示すように、７，９１９塩基対を有するプラスミドｐＣＭ４に基づく。
【０１７５】
図８に示すように、転写単位１は以下の構成成分を含む：
ＣＭＶｅｎｈ：ヒトサイトメガロウイルスの即時早期エンハンサ
ヒトｕｂｉＢ：ユビキチンプロモータＢ
Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ：融合遺伝子、ストロメリシンのシグナルペプチド配列とリーダー配列及びＧＬＰ１構築物をコードする。
ｏｒｉ  ｐＭＢＩ：大腸菌の最小複製開始点
Ｈｙｇｒｏ：ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子
転写単位２
ＳＶ４０ｅｎｈ：ＳＶ４０エンハンサ
ＦｅｒＨ：マウスのＥＦＩ遺伝子の５’ＵＴＲと組み合わせたヒトフェリチンＨプロモータ
Ｔｋ−ｂｌａ：単純性ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼとブラスチシジン耐性遺伝子をコードする融合遺伝子。
【０１７６】
一時的な発現には環状プラスミドを用いた。安定的に発現する細胞クローンの選抜には、プラスミドを線状化し、細菌配列（ｐＭＢ１起源及びハイグロマイシン遺伝子）を除いた。
【０１７７】
実施例８
間葉系幹細胞株又は間葉系間質細胞株（ＭＳＣ）の作製
間葉系幹細胞株は、以下の基準に従って、デンマーク、オーデンセ大学病院、Ｋａｓｓｅｍ教授によって生成された（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０ｍ，５９２−５９６にて公開された）。
【０１７８】
起源
作製細胞株は、健常な男性ドナー（３３歳）の骨髄穿刺から単離された間葉系幹細胞株（ＭＳＣ）からなる。
【０１７９】
細胞の不死化
テロメラーゼ逆転写酵素のコーディング配列の導入によって細胞を不死化した。ＰＧ１３におけるモロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復によって導入遺伝子の発現が促されるＧＣｓａｍレトロウイルスベクターをパッケージングすることによってレトロウイルスを形質導入した。培養の９日目（ＰＤＬ１２）に形質導入を行った。細胞株は今のところ２６０の集団倍加レベル（ＰＤＬ）まで培養されている。
【０１８０】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法及びサザンブロットによって挿入遺伝子座を調べた。第５染色体上に異所性ｈＴＥＲＴの挿入遺伝子座がたった１つある（５ｑ２３−３１）。ＰＤＬ１８６で解析を行った。ギムザ分染及び比較ゲノムハイブリッド形成によって、ｈＭＳＣ−ＴＥＲＴはＰＤＬ９６にて数的な又は構造的な染色体異常を生じず、正常な二倍体男性核型を維持していることが明らかになった。免疫不全マウスにおいて６ヵ月間の皮下移植の後、腫瘍原性を調べ、ＰＤＬ８０で陰性であることが分かった。
【０１８１】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析
標準的な増殖培地にて８０％集密まで細胞を培養した。細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によってサイズと粒度について測定した。表面マーカー試験については、トリプシン処理した細胞を、蛍光染料に直接結合させた抗体（ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体、＃ＣＢＬ１５４Ｆ、Ｃｙｍｂｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；フィコエリスリン結合マウス抗ヒトＣＤ１６６モノクローナル抗体、#５５９２６３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって氷上にて３０分間染色した。試料を洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による解析まで１％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０１８２】
性状分析
不死化された細胞は依然として、不死化されていない相方として含脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞に分化することができる（図９Ａを参照）。不死化細胞は線維芽細胞の形態を有し、例えば、ここで使用される一次細胞に特徴的であるＣＤ４４とＣＤ１６６のエピトープマーカーを用いたフローサイトメトリーによって示されるように、寿命のあるＭＳＣよりサイズと粒度に関して更に均質である。不死化した細胞は、非不死化の相方と同じＣＤマーカーを発現する（図９Ｂを参照）。
【０１８３】
培養
血清含有の培地：
７％Ｅａｒｌｅｓ  ＭＥＭ
１０％ＦＣＳ
２ｍＭのＬ−グルタミン
１ｍＭのピルビン酸ナトリウム
１００Ｕ／ｍＬのペニシリン
０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン。
集団倍加は２６−３０時間の間である。
【０１８４】
トランスフェクション及びクローン選抜
１０６個の細胞のトランスフェクションのために、様々なＧＬＰ１構築物を伴った０．５−２μｇのプラスミドＤＮＡを用いた。標準的なリン酸カルシウム同時沈殿法によってＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＡｔＴ２０細胞にトランスフェクションした。
【０１８５】
電気的パラメータと細胞種に特異的な溶液の組み合わせに基づいた非ウイルス法であるヌクレオフェクター法（Ａｍａｘａ）を用いてｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクションを行った。ヌクレオフェクター装置（プログラムＣ１７）とヌクレオフェクター溶液ＶＰＥ−１００１を用いて、＞６０％のトランスフェクション効率を達成した。
【０１８６】
トランスフェクションの４８時間後、選抜剤、ブラスチシジン（２μｇ／ｍＬ）を培養培地に添加することによって、染色体へのＤＮＡの安定的な統合を伴った細胞クローンの選抜を行った。１２日から１５日後、安定的なトランスフェクション細胞クローンを単離し、性状分析のために増やすことができた。
【０１８７】
発現
様々なＧＬＰ構築物の一時的な発現はｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞で測定した。ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞の双方にて、単量体ＧＬＰ１構築物＃１０３（Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ１（７−３７））及び＃３１７（Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２−１１ａａにて伸長）では、活性のあるＧＬＰ１レベルを見つけることができるが、二量体ＧＬＰ１構築物＃２１７（Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ１（７−３７））では発現の大きな増大を見つけることができる。構築物＃３１７の四量体ＧＬＰ１構築物＃１５９（Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２（４ｘ）−１１ａａ）への伸長は、同様の活性を生じる（上記図２も参照）。様々な構築物でｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞にトランスフェクションした後、安定的にＧＬＰ１を発現するクローンを選抜した（上記図４及び５、実施例４を参照）。
【０１８８】
実施例９
封入
封入される培養細胞をＰＢＳ（ＰＡＡ、オーストリア）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＡＡ、オーストリア）を用いて分離した。培地（細胞の種類による、例えば、ＲＰＭＩ、ＰＡＡ、オーストリア）を用いて反応を迅速に止め、細胞懸濁液を遠心した（１，２００ｒｐｍにて８分間）。沈殿物をＰＢＳ中に再懸濁し、細胞数を測定した。所望の量の４×１０７個の細胞を再び遠心した（１，２００ｒｐｍにて８分間）。その後、吸引によってＰＢＳを完全に取り除き、気泡を入れずに５０μＬの沈殿物を、５ｍＭの１−ヒスチジンでｐＨ７．４に緩衝化した５０μＬの０．９％生理食塩水中に再度懸濁させた。この細胞懸濁液を９００μＬの１．５％（ｗ／ｖ）から１．７％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム溶液（室温にて０．２％（ｗ／ｖ）水溶液のおよそ５ｍＰａ・ｓの粘度を持つアルギネートを用いた）に入れた。
【０１８９】
再度懸濁された細胞をアルギネート溶液と混合するために、カニューレ付きの１ｍＬのシリンジで溶液を吸い上げ、吸い上げと押し戻しとをゆっくり繰り返すことによって細胞と均質に混合した。４×１０７個／ｍＬの細胞濃度を得た。
【０１９０】
約２００μｍの直径を持つマイクロカプセルを作製するために、内径１２０μｍのカニューレを、空気を充填したスプレーノズルで用いた。２．０ｍｍの開口部を持つエアリングを内側カニューレ上でネジ止めした。装置は、ＷＯ００／０９５６６に記載された装置の適応版である。均質な細胞／アルギネート溶液の混合物を記載されたスプレーノズルを通じて滴下した。この目的で、混合物を含有する１ｍＬのシリンジをルアーコネクタによってカニューレ上に取り付けた。５０μＬ／分の速度でカニューレを通じて細胞／アルギネート溶液の混合物を加圧した。２．５Ｌ／分の速度で外側のエアリングを通じて空気流を運んだ。スプレーノズルのおよそ１０ｃｍ下に構築されたバリウム含有の沈殿槽（２０ｍＭのＢａＣｌ、５ｍＭのＬ−ヒスチジン、１２４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０±０．１、２９０ｍＯｓモル±３）の中に、結果として得られたマイクロカプセルが沈殿した。バリウム含有の沈殿槽での５分間の滞留時間の後、各場合２０ｍＬのＰＢＳにて５回マイクロカプセルを洗浄した。
【０１９１】
５００μＬの単層マイクロカプセルを、次いで、上記コアに使用されるのと同じ５００μＬの１．５％（ｗ／ｖ）から１．７％（ｗ／ｖ）アルギネート溶液に入れ、均質に混合した。この懸濁液を１ｍＬのシリンジに入れ、ルアーコネクタによってスプレーノズルの内側導管（内径２００μｍ）に接続し、それを通じて５０μＬ／分の速度で加圧した。１．５％から１．７％アルギネート溶液を伴った５ｍＬのシリンジをルアーコネクタによって第２の内側導管（内径７００μｍ）に接続し、それを通じて２５０μＬ／分の速度で加圧した。２．９Ｌ／分の速度で外側のエアリングを通じて空気流を運んだ。スプレーノズルのおよそ１０ｃｍ下に構築されたバリウム含有の沈殿槽（２０ｍＭのＢａＣｌ、５ｍＭのＬ−ヒスチジン、１２４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０±０．１、２９０ｍＯｓモル±３）の中に、結果として得られたマイクロカプセルが沈殿した。バリウム含有の沈殿槽での５分間の滞留時間の後、各場合２０ｍＬのＰＢＳにて４回、培地で１回マイクロカプセルを洗浄した。この工程によっておよそ１８０μｍから２００μｍの総径を持つ２層のマイクロカプセル（アルギネート層を含む）が製造され、細胞を含有する内部のコアの直径は１２０μｍから１５０μｍである。
【０１９２】
コアにおける細胞濃度は、約４×１０７個の細胞／アルギネートのｍＬである。これは、ビーズ当たり約１００個の細胞を含有する０．００２μＬから０．００４μＬのビーズ容量を持つ（球状）マイクロカプセル（セルビーズ）を生じる。ＧＬＰ−１をコードし且つ分泌する（球状）マイクロカプセルは、１時間当たり平均０．２ｆｍｏｌの活性のあるＧＬＰ−１を産生する。
【０１９３】
封入されたＧＬＰ−１分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞をコアに含有するセルビーズの顕微鏡写真を図１０に示す。
【０１９４】
約６００μｍの直径を持つマイクロカプセルを製造するために、空気が充填された３導管スプレーノズル内で、内側導管に４００μｍの内径を持つカニューレを使用した。７００μｍの内径を持つ外側ノズルにカニューレを固定した。１．５ｍｍの開口部を持つエアリングを２つの内側カニューレの上でネジ止めした。装置は、ＷＯ００／０９５６６に記載された装置の適応版である。均質な細胞／アルギネート溶液の混合物を記載されたスプレーノズルを通じて滴下した。この目的で、混合物を含有する１ｍＬのシリンジをルアーコネクタによって内側導管上に取り付けた。３００μＬ／分の速度で内側導管を通じて細胞／アルギネート溶液の混合物を加圧した。２．５Ｌ／分の速度で外側のエアリングを通じて空気流を運んだ。スプレーノズルのおよそ１０ｃｍ下に構築されたバリウム含有の沈殿槽（２０ｍＭのＢａＣｌ、５ｍＭのＬ−ヒスチジン、１２４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０±０．１、２９０ｍＯｓモル±３）の中に、結果として得られたマイクロカプセルが沈殿した。バリウム含有の沈殿槽での５分間の滞留時間の後、各場合２０ｍＬのＰＢＳにて５回マイクロカプセルを洗浄した。
【０１９５】
５００μＬの単層マイクロカプセルを、次いで、上記コアに使用されるのと同じ５００μＬの０．８％（ｗ／ｖ）アルギネート溶液に入れ、均質に混合した。この懸濁液を１ｍＬのシリンジに入れ、ルアーコネクタによってスプレーノズルの内側導管（内径４００μｍ）に接続し、それを通じて５０μＬ／分の速度で加圧した。０．８％アルギネート溶液を伴った５ｍＬのシリンジをルアーコネクタによって第２の内側導管（内径７００μｍ）に接続し、それを通じて２５０μＬ／分の速度で加圧した。２．９Ｌ／分の速度で外側のエアリングを通じて空気流を運んだ。スプレーノズルのおよそ１０ｃｍ下に構築されたバリウム含有の沈殿槽（２０ｍＭのＢａＣｌ、５ｍＭのＬ−ヒスチジン、１２４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０±０．１、２９０ｍＯｓモル±３）の中に、結果として得られたマイクロカプセルが沈殿した。バリウム含有の沈殿槽での５分間の滞留時間の後、各場合２０ｍＬのＰＢＳにて４回、培地で１回マイクロカプセルを洗浄した。この工程によっておよそ６００μｍ±１００μｍの総径を持つ２層のマイクロカプセル（アルギネート層を含む）が製造され、細胞を含有する内部のコアの直径は３８０μｍ±２０μｍである。コアにおける細胞濃度は、約２から３×１０７個の細胞／アルギネートのｍＬである。これは、ビーズ当たり約１０００個の細胞を含有する０．０６５−０．１８０μＬのビーズ容量を持つ本発明の（球状）マイクロカプセル（セルビーズ）を生じる。ＧＬＰ−１を分泌する細胞を伴ったセルビーズは、１時間当たり平均５ｆｍｏｌの活性のあるＧＬＰを産生する。
【０１９６】
実施例１０
Ｃ末端を伸長したＧＬＰ−１の抗アポトーシス効果
ラットのインスリノーマ細胞株Ｒｉｎ−５Ｆを用いて試験管内にて、Ｃ末端を伸長したＧＬＰ−１類似体ＣＭ１の細胞保護効果を調べた。９６穴のウエル当たり、４０，０００個のＲｉｎ−５Ｆ細胞を播き、１％のＬ−グルタミンと１０％のウシ胎児血清を補完したＲＰＭＩにて２日間培養した。無血清条件（１％のＬ−グルタミンを補完したＲＰＭＩ）に変更した後、大腸菌において組換え的に産生された二量体ＧＬＰ−１融合ペプチドＣＭ１の様々な濃度での存在下でタンパク質の生合成阻害剤、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）を添加することによってアポトーシスを誘導する。２４時間後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを用いて細胞の生存能力を定量化する。１ｎＭのＧＬＰ−１類似体ＣＭ１の存在下で有意な抗アポトーシス効果（ｐ＜０．０１）が既に認められた。結果を図１０に示す。
【０１９７】
実施例１１
ＧＬＰ−１を産生するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞株のサイトカイン特性
ＧＬＰ−１とは無関係な細胞保護効果を検討するために、サイトカイン、ケモカイン及び増殖因子についてＧＬＰ−１分泌細胞株７９ＴＭ２１７／１８Ｋ５を調べた。
【０１９８】
細胞株はヒト間質細胞に由来するので、特徴的なサイトカイン特性を分泌する。３０の最も豊富なヒトサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子を同時に測定するために、マルチプレックスアッセイキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  サイトカイン３０−プレックス）を用いた。サイトカイン、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＥＧＦ、エオタキシン、ＦＧＦ−塩基性、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ−ｂ、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ及びＴＮＦαに関しては、発現は見つからなかった（１０５個の細胞及び２４時間当たりの２０ｐｇの各検体の検出限界）。検出可能なレベルで発現されているサイトカインを表１に要約する。
【０１９９】
【表１】
2012526524.tif 000003
【０２００】
実施例１２
眼疾患のための、細胞に基づいた新規の治療法に対するセルビーズの使用
１．  序論
最初に議論したように、網膜神経節細胞及び網膜色素上皮細胞を含む網膜組織の喪失が原因で失明を生じる可能性があり、それらは、例えば、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、炎症及び神経変性による障害における症例である。更なる悪化から網膜細胞を保護するために、ＣＮＴＦのような神経保護剤の反復注入が有益である。脳内適用にて抗アポトーシス効果及び神経保護効果を有することが示されているグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は驚くべきことに、網膜に対するそのような神経保護効果の有望な候補であることが見出されたので、本実験に使用した。
【０２０１】
滲出型の加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、眼における異常な血管増殖を特徴とする。不良血管は体液や血液を漏出し、その結果、視覚の喪失を生じる。コラーゲンＸＶＩＩＩの分解産物であるエンドスタチンは、血管新生を有意に低減させることが知られているので、ＡＭＤの潜在的な治療法であり得る。
【０２０２】
加齢黄斑変性症の萎縮型は、網膜色素上皮の変性と萎縮及び光受容体層の二次変化を特徴とする。萎縮型の加齢黄斑変性症は視覚障害までの視覚喪失をもたらす最も一般的な眼障害の１つであるので、これらの細胞の生き残りを助ける神経保護療法は非常に望ましいだろう。
【０２０３】
これらの治療用タンパク質を連続的に産生し、分泌する硝子体内の細胞の埋め込みが利用可能であれば、薬剤物質の反復注入及び関連する感染リスクを回避し得る。
【０２０４】
以下の実験では、９匹のウサギの右眼と左眼の硝子体腔にそれぞれ約１００のＧＬＰ−１セルビーズ及び約１００個のエンドスタチンセルビーズを埋め込んだ。目的は、封入された細胞の生存能力、セルビーズの一体化及び埋め込み後の房水における導入遺伝子の産生率をモニターすることであった。これらの実験は、網膜萎縮及びＡＭＤ及び更なる眼疾患に対する治療法としての硝子体内のセルビーズの埋め込みの好適性について初めての証拠を提供した。
【０２０５】
実験では以下のパラメータが計画された：
・硝子体腔への埋め込みの約３日後、１４日後及び５６日後のＧＬＰ−１セルビーズとエンドスタチンセルビーズの性状分析
・セルビーズの一体化
・封入された細胞の生存能力
・外植後のＧＬＰ−１融合ペプチドとエンドスタチンの分泌
・埋め込み前及び３、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９及び５６日目での房水における、セルビーズが分泌した因子（ＧＬＰ−１融合ペプチド、エンドスタチン）の定量化
・網膜の組織学的評価（ＨＥ染色、ＰＡＳ［任意］）
・網膜のアポトーシス染色（ＴＵＮＥＬ）
【０２０６】
２．  方法及び材料
２．１．  試験品
２．１．１．  ＧＬＰ−１セルビーズ
バッチ番号：ＣＢ−０８７
組成：上述のようなアルギン酸ナトリウムに封入されたＧＬＰ−１融合ペプチドを分泌する細胞株７９ＴＭ２１７／１８Ｋ５
安全注意事項：遺伝子操作生物の取り扱いに関する日常的衛生手順（バイオセーフティレベル１）
【０２０７】
２．１．２．  エンドスタチンセルビーズ
バッチ番号：ＣＢ−１０２
組成：ＧＬＰ−１セルビーズで上述した手順に従ったアルギン酸ナトリウムに封入されたエンドスタチン分泌細胞株５８ＴＭ１３１／３Ｋ７
安全注意事項：遺伝子操作生物の取り扱いに関する日常的衛生手順（バイオセーフティレベル１）
【０２０８】
２．１．３．  ビヒクル
無し、空のセルビーズは埋め込まなかった。それぞれ他方の眼は対照として機能した。
【０２０９】
２．２．  試験系
試験系：ニュージーランド白ウサギ
理論的根拠：動物の大きさ、特に眼が、意図される試験に好適である。
群の割り振り：各時点で３匹のメス（３日目、１４日目及び５６日目）
動物の合計数：９
個体識別：固有のケージカード及び対応するタトゥー番号
順化：健康チェックの後の実験室条件下にて。病気の視覚的兆候のない動物のみを試験に用いた。順化時の体重は結果のセクションに生データで示す。
【０２１０】
２．３．  追加の材料
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
ＧＬＰ−１アクティブＥＬＩＳＡ（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
エンドスタチンＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）
ノベシン０．４％点眼剤（ＯｍｎｉＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ）
レフォバシン点眼剤（Ｍｅｒｃｋ）
消毒用ポピドンヨード溶液
【０２１１】
２．４．  略語のリスト
【表Ａ】
2012526524.tif 000004
【０２１２】
２．５．  処理
９匹のウサギで、５０−１００のＧＬＰ−１セルビーズを右眼の硝子体内腔に、５０−１００のエンドスタチンセルビーズを左眼の硝子体内腔に埋め込んだ。埋め込み前、及び３、７、１４、２１、２８、３５、４１、４９及び５６日目に双方の眼から房水を試料採取した。３匹の動物をそれぞれ３日目、１４日目及び５６日目に屠殺して、埋め込みを行ったセルビーズ及び網膜を調べた。
【０２１３】
２．５．１．  試験品の投与
２．５．１．１．  埋め込み前の試験品の調製
双方とも眼への埋め込みのための、本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１をコードし且つ分泌する細胞及びこれらの細胞を含有する（球状）マイクロカプセル（ＧＬＰ−１セルビーズ（登録商標））、並びに抗血管新生因子エンドスタチンをコードし且つ分泌する細胞及びこれらの細胞を含有する（球状）マイクロカプセル（エンドスタチンセルビーズ（登録商標））は、前述の実施例１−１１で示したような実験に従って、製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に従って開発されつつある。アルギネート内に封入され、ＧＬＰ−１融合ペプチドを分泌する細胞は、細胞株７９ＴＭ２１７／１８Ｋ５（ＧＬＰ−１分泌細胞）に由来するか、又は細胞株５８ＴＭ１３１／３Ｋ７（エンドスタチン分泌細胞）に由来し、薬剤物質として定義される。
【０２１４】
本実験でＧＬＰ−１セルビーズ（登録商標）によって発現されるようなＧＬＰ−１融合ペプチドは二量体ＧＬＰ−１構築物であり、それは天然のプレプログルカゴン遺伝子と同様に配置される。それは、７９アミノ酸の二量体ＧＬＰ−１／介在ペプチド２（ＩＰ−２）／分子量８．７ｋＤａのＧＬＰ−１タンパク質であり、添付の配列表における配列番号１０に相当する。天然のＧＬＰ−１に比べて、このＣ末端を伸長したＧＬＰ−１融合ペプチドには、発現レベルが高く、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶによる天然に存在する分解に対する感受性が低いという利点がある。融合タンパク質の生物活性は維持される。安全性の理由で、使用したプラスミドによってＧＬＰ−１融合ペプチドと自殺遺伝子の同時発現が可能になる。自殺遺伝子は、最も広く使用される単純性ヘルペスウイルスＩ型のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ｔｋ）をコードする。この酵素は、非毒性のプロドラッグであるガンシクロビルを毒性の生成物に細胞内で変換するので、予期しない細胞増殖の場合、トランスフェクションした細胞の破壊を可能にする。従って、変性した細胞を含有するＧＬＰ−１セルビーズ（登録商標）で治療された患者へのガンシクロビルの全身投与は、移植した細胞の破壊をもたらす。以下で述べられるＩＣＨ（日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議）Ｑ５Ｂの推奨を考慮に入れて細胞株７９ＴＭ２１７／１８Ｋ５の性状分析を行った：
「組換えＤＮＡ技術を応用したタンパク質生産に用いる細胞中の遺伝子発現構成体の分析」及び
「Ｑ５Ｄ：生物薬品（バイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医薬品）製造用細胞基剤の由来、調製及び特性解析」及び
「遺伝子転移医薬品の品質、前臨床及び臨床に関する指針への注記」（ＥＭＥＡ（欧州医薬品庁）／２７３９７４／２００５）。
【０２１５】
これらの実験でエンドスタチンセルビーズ（登録商標）によって発現されるエンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩの分解産物であり、血管新生を著しく低減させることが知られているため、ＡＭＤの潜在的治療法であり得る。
【０２１６】
本実験で使用されるようなＧＬＰ−１セルビーズ（登録商標）及びエンドスタチンセルビーズ（登録商標）は、球状の形状のアルギネートマトリクス（直径１８０−２００μｍ）に埋め込まれたヒト間葉系間質細胞株に由来する細胞からなる。細胞は、本明細書で定義されるような、抗アポトーシス効果又は抗血管新生因子エンドスタチンを有すると思われるＧＬＰ−１融合ペプチドを分泌するように設計される。細胞を取り込むアルギネートマトリクスは、バリウムイオンでアルギネートを架橋することによる、本明細書で記載される製造プロセスの間に生成される。アルギネート自体は医薬効果を有さないが、細胞にとっての機械的な足場を提供し、患者の免疫系の攻撃に対してそれらの細胞を保護する（ＧＬＰ−１について例となる実施例１１を参照）。従って、アルギネートは、賦形剤とみなされる。患者の視点からすれば、アルギネートマトリクスは、細胞を投与点に制限し、細胞が自由に漂うのを妨ぐ、安全成分とみなされる。これらの機能を適切に満たすために、ＧＬＰ−１セルビーズ（登録商標）及びエンドスタチンセルビーズ（登録商標）は、ＧＬＰ−１融合ペプチドを分泌する細胞又はエンドスタチンを分泌する細胞を内包するアルギネートマトリクスであるコアビーズで構成される。このコアビーズは純粋なアルギネートからなるシェルによって再び取り囲まれ、細胞全ての完全な封入を確実なものにする。
【０２１７】
細胞は使用されるまで凍結保存された。その後、凍結保存されたセルビーズを融解し、次いで標準的な操作手順ＣＭ：Ｐ−１４２原基５に従って無菌条件下にてリンゲル溶液で洗浄した。セルビーズを室温にてリンゲル溶液中で保存した。埋め込み処置は約４時間で完了し、ビーズの生命力を確保するように設定された６時間の時間枠の範囲内だった。
【０２１８】
注入のために、１００個のＧＬＰ−１セルビーズ又は１００個のエンドスタチンセルビーズを無菌条件下で１ｍＬの滅菌シリンジに吸引した。リンゲル溶液を捨てて、シリンジの出口でビーズの沈殿物を得た。
【０２１９】
２．５．１．２．  埋め込みのための試験動物の準備
セルビーズの埋め込みの前日、抗生物質の点眼剤（レフォバシン、Ｍｅｒｃｋ）を投与した。房水の吸引とセルビーズの注入のために、フェイスマスクを通じて連続的に送達されるイソフルランの吸入によって動物を麻酔した。無菌条件を確実にするために、動物の眼の周りの領域を消毒用のポビドンヨード溶液で集中的に処理した。更に、動物を無菌の布で覆った。アイロックを取り付けて瞼を開けたままにした。必要に応じて点眼剤（ノベシン０．４％、ＯｍｎｉＶｉｓｉｏｎ）を投与して眼を局所的に麻酔した（暴露時間：３０秒）。ＰＶＰ−Ｊｏｄ−ＡＴ２．５％点眼剤を用いて消毒を行った（暴露時間：２分）。
【０２２０】
２．５．１．３．  試験品の投与
上記で調製されたセルビーズの埋め込みのために、２０Ｇの留置型静脈カテーテルを用いた。結膜と強膜をやや乱した後、虹彩から２−３ｍｍ離して針を垂直に刺した。カテーテルを約１ｃｍ挿入した後、硝子体腔に柔軟性のチューブを残して針を引き抜いた。１００個のセルビーズを含有する１ｍＬのシリンジを取り付け、硝子体液を吸引し、ビーズを再懸濁させて、その後硝子体内に注入した。結膜を固定した後、柔軟なチューブを慎重に取り除いた。穿刺部の閉鎖とセルビーズの漏出について注入部位をチェックした。注入されなかった残りのセルビーズについてシリンジ及びカテーテルをチェックした。これらのビーズを数えて、眼の中の実際のビーズ数を推定した。
【０２２１】
９匹の動物のそれぞれが、右眼の硝子体腔内にＧＬＰ−１セルビーズを、及び左眼の硝子体腔内にエンドスタチンセルビーズを与えられた。炎症の可能性に注意を払うために、処置の最後に抗生物質（レフォバシン、２−３滴）を結膜に点眼した。
【０２２２】
セルビーズの埋め込みの成功、シリンジ／カテーテルに見出されたビーズの数及びその他の所見は、以下のセクション３、「外植」のもとで提供する。
【０２２３】
実験全体を通して、ウサギに対する連続的な健康モニタリングを行った。健康状態は少なくとも２日ごとにモニターし、以下に示す。体重は、順化の週から開始して週１回、試験の後半では更に低い頻度で測定した。
【０２２４】
２．５．２．  房水の試料採取
埋め込み前、及び３、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９及び５６日目に、２μＬのＤＰＰ−４阻害剤を含有する反応管に１００−２００μＬの房水（１００μＬが必要最少量、２００μＬでアッセイの繰り返しが可能）を直接採取した。試料採取は、３．５．１．に係る無菌条件下で両眼から、３０Ｇの針を備えたシリンジを用いて、イソフルラン麻酔した動物で実施した。試料は採取後直ちに−２０℃で保存した。
【０２２５】
ＧＬＰ−１アクティブＥＬＩＳＡ（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及びエンドスタチンＥＬＩＳＡをそれぞれ用いて、活性のあるＧＬＰ−１とエンドスタチンの濃度について房水を分析した。結果は、対応する実験ノートに文書化する。
【０２２６】
２．５．３．  剖検
各３匹の動物を、埋め込み後、３日目、１４日目及び５６日目に屠殺した。ＣＯ２の吸入による安楽死の前に、イソフルランの吸入を用いて動物を麻酔することにより、標準的な操作手順ＰＬ：Ａ−２０７に従って動物を安楽死させた。外植の文書作成は以下に示すように行った。手短には、硝子体を開け、セルビーズを外植し、網膜をホルマリンに保存した。
（ａ）外植片の性状分析
外植したセルビーズを温めた培養培地で３回洗浄し、以下のパラメータによって性状分析を行った。
（ｉ）外植したセルビーズ全てから顕微鏡写真を撮り、セルビーズの一体化を評価した。顕微鏡写真は対応する実験ノートに文書化した。
（ｉｉ）外植後の導入遺伝子の分泌
標準的な操作手順ＣＭ：Ｑ−１５８／０２に従って、外植したセルビーズを培養培地と共にインキュベートした。培養培地の容積は、セルビーズの実際の数に適合させた（ＧＬＰ−１セルビーズ当たり１００μＬ及びエンドスタチンセルビーズ当たり１０μＬ）。結果を文書化した。
（ｉｉｉ）封入された細胞の生命力
封入された細胞の生命力を評価するために、標準的な操作手順ＣＭ：Ｑ−１４０／０１に従ってセルビーズをＳＹＢＲグリーン／ヨウ化プロピジウムで染色した。セルビーズ全てから蛍光顕微鏡写真を撮り、文書化した。
【０２２７】
（ｂ）網膜の評価
網膜は４％ホルマリンで保ち、ＨＥ染色及びＰＡＳ染色を用いた組織病理学的評価のためにＪｏｎａｓ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｋｌｉｎｉｋｕｍ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に送付するまで保存した。更に、網膜の一部をＴＵＮＥＬ染色に用いてアポトーシスを検出するであろう。両眼の房水におけるＧＬＰ−１とエンドスタチンのレベルを測定し、各結果のセクションで提供されるＭＳ  Ｅｘｃｅｌの統計機能によって異なった試料採取時点間での差異を評価することにより、統計的な解析を行う。試験品の投与、動物の死亡率／生存能力、臨床兆候、体重を、外植の結果と共に記録した。
【０２２８】
３．  結果
実験中、死亡例は認められなかった。注記される臨床兆候は、動物全てにおける、注入部位と結膜での腫れ及び発赤を含む炎症だった。炎症からの回復に３週間かかった１匹を除いて、症状は概して２、３日以内に消失した。症状が長引く場合の最も可能性の高い原因は、房水の試料採取の繰り返しであった。
【０２２９】
埋め込み後３日以内に約１０％体重が減った動物＃９を除いて、埋め込み処置は体重の発達に影響を及ぼさなかった。結果は図１２に示す（注：３匹ずつの３群を、３日目、１４日目及び５６日目に屠殺した）。
【０２３０】
３．１．  埋め込み
片眼当たり５０以上のビーズの最低目標を注入した場合、たった３７のエンドスタチンビーズしか投与されなかった動物＃１を除いて、硝子体へのセルビーズの埋め込みは成功した（以下の表１を参照）。一般に、埋め込み効率は、それぞれＧＬＰ−１とエンドスタチンについての７８ビーズと８３ビーズの平均埋め込みによる両方のセルビーズの種類の間で同程度であった。
【０２３１】
３．２．  外植
埋め込み後３日目、１４日目及び５６日目にそれぞれ３匹の動物を屠殺して眼からビーズを抽出した。結果は表１及び表２に要約する。ＧＬＰ−１セルビーズの回収率は、３日目と１４日目にて約５０％で同程度であった。５６日目では４．５％が硝子体から上手く切り離せた。エンドスタチンセルビーズは、それぞれ３日目、１４日目及び５６日目にて、埋め込まれたビーズの５８％、７２％及び８０％という、埋め込み持続時間と共に増加する高い回収率を示した。これらの知見は、週間隔で試料採取した房水の分析の結果を反映した。
【０２３２】
【表１】
2012526524.tif 000005
【０２３３】
【表２】
2012526524.tif 000006
【０２３４】
３．３．  セルビーズの生存能力
外植の３日目、１４日目及び５６日目にヨウ化プロピジウム及びＳＹＢＲグリーンによる染色によってセルビーズの生存能力を分析した。更に、標準的な手順（以下のセクション３．４を参照）に従って、各場合で、外植の後、房水／硝子体液における、及び培養培地に分泌されたＧＬＰ−１とエンドスタチンの量をチェックした。房水／硝子体液と培養培地に見出されたＧＬＰ−１とエンドスタチンの測定の結果を以下に示す。
【０２３５】
３．３．１．  ３日後の外植
【表Ｂ】
2012526524.tif 000007
【０２３６】
双方の型のセルビーズは、調べた３匹の動物全てで均質に生きていた。結果は、ＧＬＰ−１については図１３に、エンドスタチンについては図１４に要約する。
【０２３７】
３．３．２．  １４日後の外植
【表Ｃ】
2012526524.tif 000008
【０２３８】
動物＃７及び＃８では、双方の型のセルビーズは均質に生きていた。動物＃２のセルビーズは、エンドスタチンセルビーズの３０％までが死細胞を優勢に含有し、ＧＬＰ−１セルビーズの９０％までが死細胞を優勢に含有したので、生命力では非均質性が高かった。ＧＬＰ−１セルビーズの回収率はエンドスタチンセルビーズに比べて低かった。結果は、ＧＬＰ−１については図１５に、エンドスタチンについては図１６に要約する。
【０２３９】
３．３．３．  ５６日後の外植
【表Ｄ】
2012526524.tif 000009
【０２４０】
ＧＬＰ−１セルビーズの回収率は３日目及び１４日目より低かった。しかしながら、５６日目でもＧＬＰ−１セルビーズを見つけることができた。エンドスタチンビーズは高い頻度で回収された。生命力は３匹の動物間で非均質であり、動物＃３は全体的に中程度から良好な生命力を示した。動物＃４及び＃６からのビーズはＳＹＢＲグリーンで弱く及び／又は分散してしか染色されないということは、更に強い着色の単一ビーズの正常な生命力より弱いことを示した。結果は、ＧＬＰ−１については図１７に、エンドスタチンについては図１８に要約する。
【０２４１】
３．３．４．  結論
実験において生存能力の時間とセルビーズの種類との依存性の経過があった一方で、エンドスタチンビーズは試験の終了時に高い生命力を保持していた。ＧＬＰ−１セルビーズは１４日目まではエンドスタチンビーズと同程度であると思われ、その後、５６日目で見られるように生存能力／生命力が低下した。同程度の量が上手く埋め込まれたにもかかわらず、エンドスタチンセルビーズの回収率は一般にＧＬＰ−１セルビーズに比べて高かった。１４日目から５６日目で失われたＧＬＰ−１セルビーズについての経緯は説明されないままであるが、更なる試験で解決されるかも知れない。
【０２４２】
３．４．  房水及び硝子体液における発現レベル
３．４．１．  ＧＬＰ−１のレベル
セルビーズの回収と共に、各屠殺時に硝子体液を回収した。エンドスタチンセルビーズを埋め込んだ各他方の眼（各時点で検出レベルより下）に比べてＧＬＰ−１含量は有意に上昇した。最高レベルは埋め込み直後に得られたが、３日目から１４日目で４０％低下した。５６日目では、見出されたＧＬＰ−１の濃度は使用したＥＬＩＳＡシステムの検出レベルより下だった。後者の知見は、この時点でセルビーズが見つけられなかったか又は死んだセルビーズのみだったという事実に相当する。絶対値は更にやや高いが、分析システムの有効範囲によって限定された。結果を図１９に要約するが、それは、３日目、１４日目及び５６日目での硝子体液におけるＧＬＰ−１の濃度を示す（各屠殺時に試料を採取した。各時点当たり３匹）。
【０２４３】
房水は、３日目で１回、及び７日目に開始して全動物にて１週間隔で試料採取した。セルビーズの埋め込みに続いてＧＬＰ−１の大きな増加が認められた。濃度は７日目の２８８ピコモルでピークに達し、その後低下した。１４日目ではＧＬＰ−１のレベルは最高濃度の約半分（１１４ピコモル）であったが、２１日目では、濃度は、アッセイシステムのベースラインレベル／有効範囲のわずか上まで低下した（図２０を参照）。試料は、０日目、３日目及び７日目でｎ＝９、１４日目でｎ＝６、２１日目と５６日目でｎ＝３であった。対照試料は全て、アッセイシステムの検出限界より下のＧＬＰ−１レベルを有した。値を、上手く埋め込まれたセルビーズの当初の数に対して標準化する。
【０２４４】
３．４．２．  エンドスタチンのレベル
ウサギの眼へのエンドスタチンセルビーズの埋め込みは、３日目時点での最初の試料採取に始まって房水（前眼房）及び硝子体液（後眼房）においてエンドスタチン濃度の上昇を生じた。対照としての役割を果たす、ＧＬＰ−１セルビーズを埋め込んだ方の眼で見出される４−６ｎｇ／ｍＬのエンドスタチンの平均レベルで示されるように、ウサギの眼にはエンドスタチンが天然に存在する。処理した眼と対照の眼での房水におけるエンドスタチン濃度の経時的変化を図２１に示す。処理１４日目から２１日目にピーク濃度に達するエンドスタチン濃度の穏やかな上昇が認められる一方で、その後の一時的な低下が注目されるが、５６日目での最終的な濃度はピークレベルの範囲内であった。データは、図２１及び表３に提示する。
【０２４５】
セルビーズは眼の後眼房に埋め込まれたという事実に基づいて、硝子体液で測定されたエンドスタチンレベルは前眼房から得た試料に比べて明らかに高かった。測定されたレベルは３日目の対照試料に比べてわずかに高かった。最高の相対的及び絶対的なエンドスタチンレベルは１４日目に見出された。５６日後、絶対的なエンドスタチン濃度は１４日目よりやや低かったが、相対的なレベル（表３における［Δ］、対照値を差し引いた）は、対照資料の濃度が１４日目に比べて高かったのでかなり低かった。結果を図２２及び表４に要約する。
【０２４６】
【表３】
2012526524.tif 000010
【０２４７】
【表４】
2012526524.tif 000011
【０２４８】
３．５．  網膜のＴＵＮＥＬ染色
アポトーシス効果及び抗アポトーシス効果のそれぞれについて、ＴＵＮＥＬ染色によって、処理した動物の網膜を解析した。ＴＵＮＥＬ染色を用いて、染色された核としてアポトーシス効果が視覚化される一方で、未処理の対照動物に比べたこれらの核の減少は、ＧＬＰ−１セルビーズ及び／又はエンドスタチンセルビーズによる処理の抗アポトーシス効果を示し得る。
【０２４９】
ＭＥＴ０８０−０１に従ってＴＵＮＥＬ染色の染色手順を実施し、例えば、明るさ又はコントラストに関して更に補正することなく同一条件にて顕微鏡写真を撮った。
【０２５０】
図２３にてＴＵＮＥＬ染色の結果を示す。陽性対照（ＤＮＡ消化酵素Ｉで前処理した切片）は内網膜境界で明瞭な陽性の核を示した。この知見はＧＬＰ−１セルビーズで処理した動物には認められなかった。エンドスタチンセルビーズで処理した動物では、弱くしか染色されない構造に気付いたが、エンドスタチンはアポトーシスの誘導物質であるとは知られていないのでこれらは人為的であるとみなされ得る。外網膜境界は、明瞭な構造が標識されなかったので、強い、おそらくは非特異的な染色を示した。従って、上記知見の妥当性を確実にするため、これら網膜の更なる切片の実験を行った。
【０２５１】
第２のＴＵＮＥＬ染色の結果を図２４及び図２５に示す。陽性対照は、網膜下部でＴＵＮＥＬ染色について明瞭な陽性の構造を示した。ＧＬＰ−１処理した動物がそのような知見を示さなかったということは、ＧＬＰ−１によって誘導されるアポトーシス過程がないことを示している。エンドスタチン処理した動物に由来する網膜は、網膜の下部領域で再び若干弱く／かすかに染色された核を示したが、網膜の外側層に見られる非特異的シグナルに比べて強度は明らかに低かった。陰性対照である、酵素なしで同じ手順で染色した切片では、網膜の下部層も若干の陽性シグナルを示したが、明瞭な構造は特定されなかった。これらの差異は、分析した切片の異なった／可変の厚みから生じ得るので、陰性対照の更に厚い切片では核は特定され得なかったと結論づけられた。更に、顕微鏡の自己蛍光モード（赤色光のチャンネル）を使用した際にもこれらの知見が見られ、それによって前の推定を実証した（参照：ＫＭ０９＿０８ＤＬ）。
【０２５２】
同一実験助手により調製された新しい切片でのセルビーズによる２ヵ月間の処理網膜の反復した解析によって、ＴＵＮＥＬ染色による更に正確な検討が可能になった。代表的な結果を図２６及び図２７に示す。
【０２５３】
結果は、外側の受容体層は再び、顕微鏡の自己蛍光モードでも見られたかなり強い非特異的な染色を有することを示した。ＧＬＰ−１処理した動物又はエンドスタチン処理した動物の網膜には特異的なＴＵＮＥＬ陽性細胞は見られなかった。染色手順の妥当性は、アポトーシスの細胞／核が高い頻度で見つかる陽性対照によって裏付けられた。
【０２５４】
結論として、ＧＬＰ−１処理したウサギ及びエンドスタチン処理したウサギの網膜は双方とも処理の２ヵ月後、ＴＵＮＥＬ陰性であった。従って、網膜細胞の生命力に対する双方のタンパク質のマイナス効果は認められなかった。
【０２５５】
４．  考察及び結論
上記実験は、留置カテーテルによるウサギの眼へのセルビーズの硝子体内埋め込みにおいて肯定的な結果を確立した。成功率は、ノズルにおいてでビーズの喪失を生じる非線形注入導管を呈するルアーコネクタによる標準装備の使用のため、変化しやすかった。若干の軽度の炎症、例えば、発赤や腫れのみが投与後認められたので、セルビーズは上手く認容された。ＧＬＰ−１セルビーズ及びエンドスタチンセルビーズ双方の生存能力は１４日目まで良好であった。試験の終了時点（５６日目）では、ＧＬＰ−１セルビーズはわずかな程度しか回収されなかったが、エンドスタチンセルビーズは、満足の行く回収及び生存率を示した。
【０２５６】
セルビーズの埋め込みは、房水及び硝子体液で有意に見られるＧＬＰ−１とエンドスタチンのレベルを有意に高めたが、その効果は硝子体液（埋め込み部位）ではるかに顕著だった。ＧＬＰ−１のピーク濃度は、７日目と３日目でそれぞれ房水と硝子体液にてベースラインのおよそ１５倍と１００倍であった。エンドスタチンのピーク濃度は、房水と硝子体液にてそれぞれ２１日目と１４日目に認められ、ベースラインの上およそ３倍と５．５倍が測定された。
【０２５７】
ＧＬＰ−１及びエンドスタチンに暴露して５６日後でのウサギ網膜のＴＵＮＥＬ染色はアポトーシス細胞の増加がないことを示した。従って、セルビーズ処理が眼に有害な効果を有する、ということを排除することができる。
【０２５８】
本実験を行って、遺伝子操作した間葉系幹細胞から分泌される治療用タンパク質／ペプチドの送達に関して本明細書で定義されるようなＧＬＰ−１セルビーズとエンドスタチンセルビーズの有効性と安全性を評価した。セルビーズを眼の硝子体腔に埋め込むことにおける技術的経験を実験用ウサギで確立した。主な課題は、ビーズの移動を複雑にするルアーコネクタを装備した標準的な注入によって眼に実際に埋め込まれるビーズの数をモニターすることであったが、それは、ビーズがシリンジのノズルにたまる傾向があったからである。この知見は、セルビーズと共に多すぎる流体を注入することによって眼球に圧をかけるのを回避するために、本プロセスに利用できる流体の量が制限されるという事実に依存し得る（又は依存する可能性が最も高い）。全体としては、実験で用いた方法は満足の行く結果を示した。実験の鍵となる特長は、硝子体液中でのＧＬＰ−１セルビーズ及びエンドスタチンセルビーズの長時間にわたる生存能力を分析することであった。ＧＬＰ−１セルビーズは、少なくとも１４日目までは満足の行く生存能力を示した。エンドスタチンセルビーズの回収及び生存能力は、５６日目の実験終了時までどの時点でも良好であり、エンドスタチンセルビーズは少なくとも５６日間、理に適った数で生存した。
【０２５９】
セルビーズの生存能力は、硝子体液及び房水にて治療用ペプチドについて得られる濃度レベルに反映される。ＧＬＰ−１ペプチドの濃度は埋め込み後７日目でピークに達し、その後低下した。１４日目では最高濃度の約半分が認められたが、２１日目ではレベルはベースライン濃度よりわずかに高い程度だった。２８日目以降では、房水及び硝子体液にて有意なＧＬＰ−１濃度は検出されなかった（５６日目）。濃度は各時点で一貫して硝子体液の方が高かったが、ビーズは後眼腔に埋め込まれたので予想どおりだった。エンドスタチンセルビーズの実質的に改善された生存能力によって、５６日目まで房水及び硝子体液にて有意に高いエンドスタチンのレベルを生じた。試験期間が進むにつれて若干の変動が認められたが、１５日目から５６日目では試料／動物の数が少ないことが言及されてもよい。全体としては、エンドスタチンセルビーズの生存能力は早期の時点に比べてわずかに落ちているにもかかわらず、試験の終了時では、房水におけるエンドスタチンのレベルは１４日目及び２１日目でのピーク濃度と同じくらい高かった。
【０２６０】
網膜の生命力に関する治療用ペプチドの安全性は、細胞アポトーシスの増加を検出するＴＵＮＥＬ染色によってチェックした。当初の技術的困難さのためにアッセイを繰り返したが、ＧＬＰ−１セルビーズ及びエンドスタチンセルビーズで処理した眼からの網膜切片はどんな場合でもアポトーシス細胞については陰性だった。
【０２６１】
結論としては、埋め込み処置の結果生じた炎症が通常やがて消失し、水晶体の混濁が長期間認められなかったので、本実験で検討したセルビーズは両タイプとも、ウサギの眼に上手く認容された。更に、組織学的切片でアポトーシスの誘導が認められなかったので、網膜細胞の生命力はＧＬＰ−１及びエンドスタチンに影響されなかった。
【図１】
2012526524.tif 000012
【図２】
2012526524.tif 000013
【図３】
2012526524.tif 000014
【図４】
2012526524.tif 000015
【図５】
2012526524.tif 000016
【図６】
2012526524.tif 000017
【図７】
2012526524.tif 000018
【図８】
2012526524.tif 000019
【図９】
2012526524.tif 000020
【図１０】
2012526524.tif 000021
【図１１】
2012526524.tif 000022
【図１２】
2012526524.tif 000023
【図１３】
2012526524.tif 000024
【図１４】
2012526524.tif 000025
【図１５】
2012526524.tif 000026
【図１６】
2012526524.tif 000027
【図１７】
2012526524.tif 000028
【図１８】
2012526524.tif 000029
【図１９】
2012526524.tif 000030
【図２０】
2012526524.tif 000031
【図２１】
2012526524.tif 000032
【図２２】
2012526524.tif 000033
【図２３】
2012526524.tif 000034
【図２４】
2012526524.tif 000035
【図２５】
2012526524.tif 000036
【図２６】
2012526524.tif 000037
【図２７】
2012526524.tif 000038
【配列表】
2012526524000001.app
【国際調査報告】
2012526524.tif 000039
2012526524.tif 000040
2012526524.tif 000041
2012526524.tif 000042
2012526524.tif 000043