(57)【要約】  本発明は、ホスホジエステラーゼタンパク質に結合し、それを調節する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。さらに、本発明は、ホスホジエステラーゼ結合化合物を対象に投与することによって、アミロイドβペプチド沈着物の蓄積に関連する状態を治療するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｖ）
2012513464.tif 000112
（Ｖ）
の化合物であって、式中、
ＡはＯ又はＮであり、
Ｘは−（ＣＨ２）ｎ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、又はＳ（Ｏ）２であり、
Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−ＮＲ７Ｒ８、−ＳＲ７、又はヘテロシクリルであり、
Ｒ２は−ＣＨ２ＯＲ６又はＣＯ２Ｒ８であり、
Ｒ３は水素又はハロゲンであり、
Ｒ４は−ＣＮ又はハロゲンであり、
Ｒ５は水素又はＯＲ６であり、
Ｒ６は水素、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ９であり、前記Ｃ１−Ｃ６アルキル又はＣ３−Ｃ８シクロアルキルは、任意に−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＳＲ９、又はヘテロシクリルで置換され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はＣ３−Ｃ８シクロアルキルであり、ｎは１、２、又は３である、化合物、
あるいはその薬学的に許容される塩又は互変異性体。
【請求項２】
ＡはＮである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ５は水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ５はＯＣである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物は、式（Ｖ−１）
2012513464.tif 000113
（Ｖ−１）
の化合物であり、式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−ＮＲ７Ｒ８、−ＳＲ７、又はヘテロシクリルであり、
Ｒ２は−ＣＨ２ＯＲ６又はＣＯ２Ｒ８であり、
Ｒ３は水素又はハロゲンであり、
Ｒ４は−ＣＮ又はハロゲンであり、
Ｒ６は水素、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ９であり、前記Ｃ１−Ｃ６アルキル又はＣ３−Ｃ８シクロアルキルは、任意に−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＳＲ９、又はヘテロシクリルで置換され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はＣ３−Ｃ８シクロアルキルである、請求項１に記載の化合物、
あるいはその薬学的に許容される塩又は互変異性体。
【請求項６】
Ｒ６はＣである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物は、式（Ｖ−１ａ）
2012513464.tif 000114
（Ｖ−１ａ）
の化合物であり、式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−ＮＲ７Ｒ８、−ＳＲ７、又はヘテロシクリルであり、
Ｒ２は−ＣＨ２ＯＲ６又はＣＯ２Ｒ８であり、
Ｒ３は水素又はハロゲンであり、
Ｒ４は−ＣＮ又はハロゲンであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ９であり、前記Ｃ１−Ｃ６アルキル又はＣ３−Ｃ８シクロアルキルは、任意に−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＳＲ９、又はヘテロシクリルで置換され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はＣ３−Ｃ８シクロアルキルである、請求項１に記載の化合物、
あるいはその薬学的に許容される塩又は互変異性体。
【請求項８】
Ｒ２はＣＨ２−ＯＨである、請求項１、請求項５、又は請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３はＨである、請求項１、請求項５、又は請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３はハロゲンである、請求項１、請求項５、又は請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ３は塩素である、請求項１、請求項５、又は請求項７に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ４はＣＮである、請求項１、請求項５、又は請求項７に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ４はハロゲンである、請求項１、請求項５、又は請求項７に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ４はフッ素である、請求項１、請求項５、又は請求項７に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物は、式（Ｖ−１ａ１）
2012513464.tif 000115
（Ｖ−１ａ１）
の化合物であり、式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−ＮＲ７Ｒ８、−ＳＲ７、又はヘテロシクリルであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ９であり、前記Ｃ１−Ｃ６アルキル又はＣ３−Ｃ８シクロアルキルは、任意に−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＳＲ９、又はヘテロシクリルで置換され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はＣ３−Ｃ８シクロアルキルである、請求項１に記載の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩又は互変異性体。
【請求項１６】
Ｒ１は水素である、請求項１、請求項５、請求項７又は請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１はシクロアルキルである、請求項１、請求項５、請求項７又は請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１はシクロプロピルである、請求項１、請求項５、請求項７又は請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１はジメチルアミノである、請求項１、請求項５、請求項７又は請求項１５に記載の化合物。
【請求項２０】
前記化合物は、
2012513464.tif 000116
2012513464.tif 000117
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物は、
2012513464.tif 000118
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
アミロイドβペプチド沈着物の蓄積に関連する状態を治療するための式（Ｖ）の化合物をスクリーニングするための方法であって、前記方法は、
ａ）アミロイドβペプチド沈着物の蓄積の動物モデルに式（Ｖ）のＰＤＥ５阻害剤化合物を投与することと、
ｂ）アミロイドβペプチド沈着物の蓄積の動物モデルでのＰＤＥ５阻害剤化合物の投与の完了後少なくとも１ヶ月間、セクレターゼ活性を調節できる式（Ｖ）の前記ＰＤＥ５阻害剤化合物を選択することと、を含む、方法。
【請求項２３】
アミロイドβペプチド沈着物の蓄積に関連する状態を治療するための式（Ｖ）の化合物をスクリーニングするための方法であって、前記方法は、
ａ）式（Ｖ）のＰＤＥ５阻害剤化合物を選択することを含み、前記化合物は以下の特徴、
ｉ．前記化合物は、ホスホジエステラーゼタンパク質の２個以上のアミノ酸残基と相互作用し、前記アミノ酸残基は、Ｆ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせを含む、あるいは
ｉｉ．前記化合物とホスホジエステラーゼタンパク質との間の第２の架橋リガンド（ＢＬ２）は、ＯＨ−である、
のうちの１つ又は双方を含む、方法。
【請求項２４】
アミロイドβペプチド沈着物の蓄積に関連する状態を治療するための式（Ｖ）のホスホジエステラーゼ結合化合物を同定するための方法であって、前記方法は、式（Ｖ）のＰＤＥ５阻害剤化合物を選択することを含み、式（Ｖ）のＰＤＥ５阻害剤化合物は以下の特徴、
ａ）前記化合物のＩＣ５０は約１０００ｎＭを越えない、
ｂ）前記化合物の前記選択性は、ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ６、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０、又はＰＤＥ１１と比較して、ＰＤＥ５に対して、少なくとも５０倍大きな効力である、
ｃ）前記化合物のインビトロでの前記ＰＤＥ５阻害活性は、約５０ｎＭを越えないＩＣ５０を有する、
ｄ）前記化合物は血液脳関門を透過する、
ｅ）前記化合物はｃＧＭＰを約２０％〜約８０％加水分解する、
ｆ）前記化合物とホスホジエステラーゼタンパク質との間の第２の架橋リガンド（ＢＬ２）は、ＯＨ−である、あるいは
ｇ）前記化合物は、ホスホジエステラーゼタンパク質の２個以上のアミノ酸残基と相互作用し、前記アミノ酸残基は、Ｆ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせを含む、
のうちの１つ以上を有する、方法。
【請求項２５】
前記選択されたＰＤＥ５阻害剤が、アミロイドβペプチド沈着物の蓄積の動物モデルでの投与後少なくとも１ヶ月間、セクレターゼ活性を調節するかを試験することをさらに含む、請求項２３又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物は、血液脳関門を透過するために、約５００Ｄａ未満の分子量を有するか、約９０Å２未満の極性表面積を有するか、８個未満の水素結合を有するか、又はそれらの組み合わせである、請求項２２、請求項２３、又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
対象におけるαセクレターゼタンパク質活性又は発現を増加させるための方法であり、前記方法は、
ａ）式（Ｖ）のＰＤＥ５阻害剤化合物を含む有効量の組成物を前記対象に投与し、
それによって、前記対象におけるαセクレターゼタンパク質活性又は発現を増加させることを含む、方法。
【請求項２８】
対象におけるβセクレターゼタンパク質活性又は発現を低下させるための方法であり、前記方法は、
ａ）式（Ｖ）のＰＤＥ５阻害剤化合物を含む有効量の組成物を前記対象に投与し、
それによって、前記対象におけるβセクレターゼタンパク質活性又は発現を低下させることを含む、方法。
【請求項２９】
対象におけるアミロイドβ（Ａβ）タンパク質沈着物を減少するための方法であって、前記方法は、
ａ）式（Ｖ）のＰＤＥ５阻害剤化合物を含む有効量の組成物を対象に投与し、
それによって、対象におけるＡβタンパク質沈着物を低下させることを含む、方法。
【請求項３０】
前記対象は異常に上昇したアミロイドβプラークを示す、請求項２７、請求項２８、又は請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象はアルツハイマー病、レビー小体型認知症、封入体筋炎、又は脳アミロイド血管症を患っている、請求項２７、請求項２８、又は請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物はシルデナフィル、タダラフィル、もしくはバルデナフィル、又はそれらの誘導体である、請求項２７、請求項２８、又は請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記有効量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９ｍｇ／ｋｇ体重、又は少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項２７、請求項２８、又は請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物は、最大１８日間、最大１９日間、最大２０日間、最大２１日間、最大２２日間、最大２３日間、最大２４日間、又は最大２５日間、少なくとも１日１回投与される、請求項２７、請求項２８、又は請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
αセクレターゼタンパク質活性又は発現は、治療後最大３ヶ月、治療後最大４ヶ月、治療後最大５ヶ月、又は治療後最大６ヶ月増加される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
β−セクレターゼタンパク質活性又は発現は、治療後最大３ヶ月、治療後最大４ヶ月、治療後最大５ヶ月、又は治療後最大６ヶ月低下される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ａβタンパク質沈着物はＡβ４０異性体、Ａβ４２異性体、又はその組み合わせを含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの刊行物の開示は、本明細書に記載され、特許請求される本発明の日付において、当業者に知られる最先端技術をより完全に説明するために、参照によって、それらの全体が本出願に組み込まれる。
【０００２】
本特許開示は、著作権保護の対象である資料を含む。著作権保有者は、米国特許商標局の包袋又は記録に見られるように、特許文献又は特許開示が誰によって複製されることにも異議は無いが、他の点ではあらゆる著作権を保有する。
政府支援
【０００３】
本明細書で説明される研究の全体又は一部は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ａｇｉｎｇ（国立老化研究所）助成金番号Ｒ２１ＡＧ０２７４６８によって支援された。したがって、合衆国政府は本発明の特定の権利を有する。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶喪失、シナプス機能障害、及びアミロイドβペプチド（Ａβ）の蓄積によって特徴づけられる神経変性疾患である。これは、アミロイドβペプチド１−４２（Ａβ４２）のレベルの増加に一部起因する。ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）阻害剤は、勃起不全及び肺高血圧症に対して広範に使用される薬物である。これらの阻害剤は、ｃＧＭＰレベルを増加させ、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼの活性化を介して、転写因子及び記憶に影響する分子ｃＡＭＰ応答配列結合（ＣＲＥＢ）のリン酸化を増強させると考えられる。
【０００５】
環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）及び環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、ヌクレオチド生物学的二次メッセンジャーは、血流調節、心筋収縮、細胞分化、神経伝達、腺分泌物、及び遺伝子発現等の様々な生物学的プロセスを制御する。これらの分子の細胞内受容体は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、環状ヌクレオチド依存性タンパク質キナーゼ（ＰＧＫ）、及び環状ヌクレオチド感受性チャネルを含む。ＰＤＥは、３’，５’−環状ヌクレオチドの加水分解を対応する５’一リン酸に触媒するタンパク質の大きなファミリーである。関連するが生化学的に異なった、１１のヒトＰＤＥ遺伝子群が存在する。幾つかのＰＤＥはｃＡＭＰ（ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、及びＰＤＥ８等）の加水分解に特異的であり、幾つかはｃＧＭＰ特異的（ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、及びＰＤＥ９等）であるが、幾つかのＰＤＥは混合特異性（ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ１０、及びＰＤＥ１１等）を有する。
【０００６】
ＰＤＥ５阻害剤は環状グアノシン３’、５’−一リン酸タイプ５ｃＧＭＰ  ＰＤＥ阻害剤であり、シルデナフィル、タダラフィル、ザプリナスト、及びバルデナフィルを含むが、それらに限定されない。ＰＤＥ５阻害剤は、ｃＧＭＰ上でＰＤＥ５の分解作用を阻害することによって、ｃＧＭＰレベルを増加させる。ＰＤＥ阻害剤は中枢神経系の疾患の市場に到達しておらず、ＰＤＥ５阻害剤はＡＤの治療のために使用されてはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＰＤＥ５阻害効力、高い選択性、及び血液脳関門（ＢＢＢ）透過性を伴う、キノリン含有化合物のクラスを対象とする。一態様において、化合物は本明細書で説明される式Ｖである。一実施形態において、化合物は本明細書で説明される式Ｖ−１である。別の実施形態において、本明細書で説明されるように、化合物は式Ｖ−１ａである。さらなる実施形態において、本明細書で説明されるように、化合物は式Ｖ−１ａ１である。幾つかの実施形態において、本明細書で説明されるように、化合物は、化合物１〜１８中に示されるそれらの化合物である。具体的な実施形態において、化合物は化合物３（ＹＦ０１２４０３）又は化合物８（ＹＦ０１６２０３）である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
様々な態様において、本発明は、アミロイドβペプチド沈着物の蓄積に関連する状態を治療する化合物をスクリーニングするための方法を提供し、該方法は、（ａ）アミロイドβペプチド沈着物の蓄積の動物モデルへの、ＰＤＥ５阻害剤化合物の投与の完了後少なくとも１ヶ月間、セクレターゼ活性を調節できるＰＤＥ５阻害剤化合物を選択すること（又は同定すること、もしくはスクリーニングすること）、を含む。
【０００９】
一態様において、本発明は、アミロイドβペプチド沈着物の蓄積に関連する状態を治療する化合物をスクリーニングするための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＰＤＥ５阻害剤化合物を選択することを含み、該化合物は以下の特徴、（ｉ）該化合物は、ホスホジエステラーゼタンパク質の２個以上のアミノ酸残基と相互作用し、前記アミノ酸残基はＦ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせを含む、あるいは（ｉｉ）該化合物とホスホジエステラーゼタンパク質との間の第２の架橋リガンド（ＢＬ２）はＯＨ−である、のうちの１つ又は双方を含む
【００１０】
一態様において、アミロイドβペプチド沈着物の蓄積に関連する状態を治療するホスホジエステラーゼ結合化合物を同定するための方法であり、該方法は、ＰＤＥ５阻害剤化合物を選択することを含み、ＰＤＥ５阻害剤化合物は以下の特徴、（ａ）化合物のＩＣ50は約１０００ｎＭを越えない、（ｂ）化合物の選択性は、ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ６、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０、又はＰＤＥ１１と比較して、ＰＤＥ５に対して、少なくとも５０倍大きな効力である、（ｃ）該化合物のインビトロでの該ＰＤＥ５阻害活性は約５０ｎＭを越えないＩＣ50を有する、（ｄ）化合物は血液脳関門を透過する、（ｅ）化合物は、ｃＧＭＰを約２０％〜約８０％加水分解する、（ｆ）化合物及びホスホジエステラーゼタンパク質間の前記第２の架橋リガンド（ＢＬ２）はＯＨ−である、又は（ｇ）該化合物は、ホスホジエステラーゼタンパク質の２個以上のアミノ酸残基と相互作用し、前記アミノ酸残基はＦ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせを含む、の１つ以上を含む。７。特徴（ｇ）のホスホジエステラーゼは、例えば、ホスホジエステラーゼタイプＶ（ＰＤＥ５）又はさらに別のＰＤＥを含むことができる。一態様において、特徴（ｇ）は、化合物が少なくとも全ての４個のアミノ酸残基ＰＤＥ５のＦ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、及びＭ８１６と相互作用する場合である。一態様において、化合物は、ホスホジエステラーゼタイプＶ（ＰＤＥ５）タンパク質の活性又は発現を低下させることができる。
【００１１】
幾つかの態様において、上述の方法は、前記選択されたＰＤＥ５阻害剤が、アミロイドβペプチド沈着物の蓄積の動物モデルでの投与後少なくとも１ヶ月間、セクレターゼ活性を調節できるかを試験することを、さらに含む。セクレターゼはαセクレターゼ又はβセクレターゼであり得る。調節は、β−セクレターゼ活性又は発現レベルの低下、及び／又はαセクレターゼ活性又は発現レベルの増加を含むことができる。幾つかの態様において、調節されるセクレターゼ活性又はβ−セクレターゼの発現は低下したまま残存する。幾つかの態様において、調節されるセクレターゼ活性又はαセクレターゼの発現は増加したまま残存する。幾つかの態様において、調節されるセクレターゼ活性は、投与期間の完了後２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又は７ヶ月を越えて持続する。
【００１２】
上述の方法の幾つかの態様において、アミロイドβペプチド沈着物蓄積の動物モデルは、ＡＰＰ／ＰＳ１二重遺伝子組換えマウスを含む。動物モデルがこの遺伝子組換えマウスを含む場合、幾つかの態様において、選択されたＰＤＥ５阻害剤が、ＡＰＰ／ＰＳ１二重遺伝子組換えマウスに投与後少なくとも１ヶ月間、セクレターゼ活性を調節できるかを試験するステップは、（ａ）投与期間最大２１日間、ＡＰＰ／ＰＳ１二重遺伝子組換えマウスに選択されたＰＤＥ５阻害剤を投与すること、（ｂ）選択されたＰＤＥ５阻害剤が、負の対照と比較して、投与期間の完了後直ちに、ＡＰＰ／ＰＳ１二重遺伝子組換えマウスにおけるセクレターゼ活性又は発現を調節するかを試験することと、（ｃ）負の対照と比較して、ステップ（ｂ）のＡＰＰ／ＰＳ１二重遺伝子組換えマウスにおける調節されたセクレターゼ活性又は発現が、投与期間の完了後１ヶ月以上持続するかを試験することを含む。
【００１３】
上記の方法の幾つかの態様において、特徴に基づいた化合物の選択ステップは、シリコスクリーニング、分子ドッキング、インビボスクリーニング、インビトロスクリーニング、又はそれらの組み合わせを含むことができる。
【００１４】
上記の方法に関連する幾つかの態様において、動物モデル対象へのＰＤＥ５阻害剤化合物の投与期間は、最大約５日、最大約６日、最大約７日、最大約８日、最大約９日、最大約１０日、最大約１１日、最大約１２日、最大約１３日、最大約１４日、最大約１５日、最大約１６日、最大約１７日、最大約１８日、最大約１９日、又は最大約２０日である。
【００１５】
上記の方法に関連する幾つかの態様において、血液脳関門に透過するため、該化合物は約５００Ｄａ未満の分子量を有するか、約９０Å2未満の極性表面積を有するか、８個未満の水素結合を有するか、又はそれらの組み合わせを有する。
【００１６】
上記の方法に関連する幾つかの態様において、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、（ａ）試験化合物の電子ライブラリーを提供すること、（ｂ）表１に列挙される、ＰＤＥ５タンパク質の活性部位に対して少なくとも２０個のアミノ酸残基の原子座標を提供すること（その座標は、そこからＣα原子の少なくとも５０％に関し、約２Åを越えない、関係をコンピューター可読のフォーマットで有する）、（ｃ）ＰＤＥ５タンパク質の三次元モデルを生成するため、コンピュータープロセッサによって可読な電気シグナルへと原子座標を転換すること、（ｄ）データ処理方法を行うことと、（該ライブラリーからの電子試験化合物はＰＤＥ５タンパク質の三次元モデル上にドッキングされる）、（ｅ）どの試験化合物がＰＤＥ５タンパク質の三次元モデルの活性部位に適合するかを決定すること、それによって、どの化合物がＰＤＥ５に結合するかを同定することを含む方法によって、プレスクリーニングされる。一態様において、この方法は、（ｆ）ＰＤＥ５タンパク質の活性部位をドッキングするために決定された化合物を合成すること、又は得ること、（ｇ）結合に好適な条件下でＰＤＥ５タンパク質を化合物に接触させることと、（ｈ）化合物がＰＤＥ５タンパク質発現又はｍＲＮＡ発現、もしくはＰＤＥ５タンパク質活性を、診断アッセイを使用して調節するかを決定すること、をさらに含む。
【００１７】
本方法の幾つかの態様において、本明細書で説明されるように、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、式Ｉｅ、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、式ＩＩＩｃ、式ＩＩＩａ−１、式ＩＩＩｂ−１、式ＩＩＩｃ−１、式ＩＩＩｄ、式ＩＩＩｅ、式ＩＩＩｆ；式ＩＶａ、式ＩＶｂ、式Ｖ、式Ｖ−１、式Ｖ−１−ａ、又は式Ｖ−ａ−１（化合物１〜１８のうちのいずれか１つ等）。
【００１８】
幾つかの態様において、ＰＤＥ５阻害剤は、ＰＤＥ５タンパク質又はｍＲＮＡ発現、もしくはＰＤＥ５活性を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、又は１００％低下させる。
【００１９】
幾つかの態様において、ＰＤＥ５阻害剤は、ＩＣ50少なくとも約０．１ｎＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約５ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約２５ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約２００ｎＭ、少なくとも約３００ｎＭ、少なくとも約４００ｎＭ、少なくとも約５００ｎＭ、少なくとも約６００ｎＭ、少なくとも約７００ｎＭ、少なくとも約８００ｎＭ、少なくとも約９００ｎＭ、又は少なくとも約１０００ｎＭを有する。
【００２０】
幾つかの態様において、ＰＤＥ５阻害剤を選択するための方法は、阻害剤が第２のメッセンジャー濃度中で増加又は死亡に起因するかを検出することを含み得る。第２のメッセンジャーは、例えば、環状ＧＭＰ、タンパク質キナーゼＧ（ＰＫＧ）、又はそれらの組み合わせを含むことができる。該検出は、ＧＴＰ、環状ＧＭＰ、タンパク質キナーゼＧ（ＰＫＧ）、又はＣＲＥＢの細胞内濃度を測定するアッセイを含むことができる。
【００２１】
幾つかの態様において、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、ホスホジエステラーゼタイプＶ（ＰＤＥ５）の活性部位に結合する。
【００２２】
幾つかの態様において、化合物は、ＩＣ50少なくとも約０．１ｎＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約５ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約２５ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約２００ｎＭ、少なくとも約３００ｎＭ、少なくとも約４００ｎＭ、少なくとも約５００ｎＭ、少なくとも約６００ｎＭ、少なくとも約７００ｎＭ、少なくとも約８００ｎＭ、少なくとも約９００ｎＭ、又は少なくとも約１０００ｎＭを有する。
【００２３】
一態様において、本発明は、対象中のαセクレターゼタンパク質活性又は発現を増加させるための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＰＤＥ５阻害剤化合物を含む有効量の組成物を対象に投与し、それによって対象におけるαセクレターゼタンパク質活性又は発現を増加させることを含む。
【００２４】
一態様において、本発明は、対象中のβセクレターゼタンパク質活性又は発現を減少させるための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＰＤＥ５阻害剤化合物を含む有効量の組成物を対象に投与し、それによって対象におけるβセクレターゼタンパク質活性又は発現を減少させることを含む。
【００２５】
一態様において、本発明は、対象においてアミロイドβ（Ａβ）タンパク質沈着物を減少するための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＰＤＥ５阻害剤化合物を含む有効量の組成物を対象に投与し、それによって対象におけるＡβタンパク質沈着物又は発現を減少することを含む。
【００２６】
幾つかの態様において、対象は異常に上昇したアミロイドβプラークを示す。幾つかの態様において、対象はアルツハイマー病、レビー小体型認知症、封入体筋炎、又は脳アミロイド血管症を患っている。幾つかの態様において、対象はマウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、又はヒトである。
【００２７】
幾つかの態様において、対象に投与される化合物は、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、式Ｉｅ、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、式ＩＩＩｃ、式ＩＩＩａ−１、式ＩＩＩｂ−１、式ＩＩＩｃ−１、式ＩＩＩｄ、式ＩＩＩｅ、式ＩＩＩｆ；式ＩＶａ、式ＩＶｂ、式Ｖ、式Ｖ−１、式Ｖ−１−ａ、又は式Ｖ−ａ−１（化合物１〜１８のうちのいずれか１つ等）を含む。幾つかの態様において、化合物はシルデナフィル、タダラフィル、又はバルデナフィルである。幾つかの態様において、投与は、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈注射、注入、経口又は経鼻送達、もしくはそれらの組み合わせを含む。幾つかの態様において、有効量は少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９ｍｇ／ｋｇ体重、又は少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の態様において、投与される化合物の有効量は、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重である。幾つかの態様において、組成物は、少なくとも１日１回、最大１８日間、最大１９日間、最大２０日間、最大２１日間、最大２２日間、最大２３日間、最大２４日間、又は最大２５日間投与される。幾つかの態様において、αセクレターゼタンパク質活性又は発現は、治療後最大３ヶ月間、治療後最大４ヶ月間、治療後最大５ヶ月間、又は治療後最大６ヶ月間増加される。幾つかの態様において、β−セクレターゼタンパク質活性又は発現は、治療後最大３ヶ月間、治療後最大４ヶ月間、治療後最大５ヶ月間、又は治療後最大６ヶ月間減少される。幾つかの態様において、Ａβタンパク質はＡβ４０異性体、Ａβ４２異性体、又はそれらの組み合わせを含む。
【００２８】
幾つかの態様において、ＰＤＥ５阻害剤は、投与後長い間セクレターゼ活性に長期にわたる又は持続する影響を引き起こすことができるという本明細書で提供される知見のため、セクレターゼ活性又は発現を調節するために対象に投与されるＰＤＥ５阻害剤化合物が投与される頻度は低い。したがって、幾つかの態様において、治療の方法は、対象にＰＤＥ５阻害剤を定期的であるが低い頻度で、短期間投与する場合に提供される。例えば、投与は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、又はそれ以上、続いて１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年又はそれ以上を含む投与無しの期間を含む投薬計画を含むことができ、この投薬計画は繰り返すことができ、変えることができる。つまり、投薬計画は、薬物の投与無しの期間が続き、任意にさらなるサイクルが続くＰＤＥ５阻害剤投与の期間を含む。そのような環状療法の利点は、例えば、長期にわたる総薬物摂取負荷による副作用の可能性を減らす。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】異なる刺激強度（５〜３５Ｖ）のフィールドの入力出力関係のグラフであり、ＢＳＴは、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１動物及びＷＴ同腹子において同様であることを表す。３５Ｖと等しい刺激強度での入出力曲線の勾配は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＷＴ同腹子の〜９７％であった（ＡＰＰ／ＰＳ１マウス：１．２１±０．０８Ｖ／秒、ｎ＝６匹のオスからの７スライス、ＷＴマウス：１．２５±０．０６Ｖ／秒、ｎ＝６匹のオスからの７スライス）。双方向分散分析は、二重遺伝子組換えマウス及びそれらの同腹子と対照との差異の無さを表した［Ｆ(1,12)＝０．０５、Ｐ＝０．８１］。同様の結果が、ｆＥＰＳＰ勾配対求心性繊維斉射の振幅をプロットする際に観察された。
【００３０】
【図１Ｂ】シルデナフィル（５０ｎＭ）による１０分間の灌流が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＬＴＰ機能障害を逆にすることを表すグラフである（テタヌス後１２０分、媒体処置されたＷＴ同腹子の〜１００％と等しいシルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの〜６５％との対比、テタヌス後１２０分シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス：２１５．０８±１１．８５％、ｎ＝７匹のオスからの８スライス、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス：１２８．４７±１６．７９％、ｎ＝７匹のオスからの９スライス、［Ｆ(1,15)＝４．９８、Ｐ＝０．０４１］）。テタヌスの刺激が適用されない実験中のその適用の終了１２０分後又はその適用の間のどちらかで、阻害剤は基底神経伝達に何の効果もない（シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライス中の媒体処置されたＷＴスライスの〜９６％、媒体処置された遺伝子組換えスライスの〜９７％、シルデナフィル処置されたスライスのＡＰＰ／ＰＳ１：９９．９９±３．７１％、ｎ＝４匹のオスからの４スライスと媒体処置されたスライス１００．８８±１．０２％との対比、ｎ＝４匹のオスからの５スライス［Ｆ(1,7)＝１．１５、Ｐ＝０．３１］）。矢印は、これ及び以下の図における、テタヌスの時間及びパターンを示唆する。バーは、これ及び以下の図における、薬物又は媒体の適用の時間を表す。シルデナフィルは、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＡ１領域のスライスにおけるＬＴＰの機能障害を逆にする。
【００３１】
【図１Ｃ】シルデナフィル（５０ｎＭ）がＷＴマウスのＬＴＰに影響を与えないことを表しているグラフである。テタヌス後１２０分のＬＴＰのレベルは、媒体処置されたＷＴスライスの〜９９％であった（媒体処置されたＷＴマウス：２１４．２８±１７．４９％、ｎ＝８匹のオスからの１０スライス、シルデナフィル処置されたＷＴマウス：２１３．２６±１３．６６％、ｎ＝８匹のオスからの９スライス［Ｆ(1,17)＝０．２３、Ｐ＝０．６３］）。テタヌスの刺激が適用されない実験中のその適用の終了１２０分後又はその適用の間のどちらで、阻害剤は、基底シナプス反応に何の効果もない（媒体処置されたＷＴスライスの〜９７％、シルデナフィル処置されたスライスの１００．５１±２．３４％、ｎ＝４匹のオスからの５スライス、と媒体処置されたスライス１０３．７２±３．８６％との対比、ｎ＝４匹のオスからの４スライス［Ｆ(1,7)＝０．２６、Ｐ＝０．６２］）。これらの実験を、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのそれらとインタリーブした。
【００３２】
【図２Ａ】シルデナフィルが３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知障害を寛解することを表しているグラフである。シルデナフィル（腹腔内、３ｍｇ／Ｋｇ）は、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるコンテキスト恐怖条件付けを改善した。シルデナフィルで処置したＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ同腹子又は媒体は、訓練前にすくみの差異の無さを表すが（ベースライン、４つの群間の一方向分散分析：Ｆ（３，７９）＝２．３９、Ｐ＝０．０７）、訓練後２４時間行われたコンテキストＦＣは、媒体処置されたＷＴ同腹子と比較して、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ反応の減少を表す［媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ時間は媒体処置されたＷＴマウスの〜６３％であった、ＡＰＰ／ＰＳ１の２１．３６±３．９４％、ｎ＝２１（１２匹のオス及び９匹のメス）と、ＷＴ同腹子の３３．８１±４．０５％との対比、ｎ＝２０（１１匹のオス及び９匹のメス）、Ｆ(1,39)＝６．６４、Ｐ＝０．０１］。シルデナフィルを用いた処置は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ反応における欠損を寛解する（シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ時間は、媒体処置されたＷＴマウス：２８．９５±３．９４％の約８７％、ｎ＝２２（１２匹のオス及び１０匹のメス）、Ｆ(1,40)＝０．７３、Ｐ＝０．３９）。シルデナフィルは、媒体処置されたＷＴ同腹子と比較して、ＷＴマウスのすくみ反応に何の効果も無い［媒体処置されたＷＴマウスの約８９％：３０．１±３．１１％、ｎ＝２０（１１匹のオス及び９匹のメス）、Ｆ(1,38)＝０．５２、Ｐ＝０．４７）。手掛かり恐怖条件付けは４つの群間で同様であった［Ｆ(3,79)＝０．８９、Ｐ＝０．４４］。
【００３３】
【図２Ｂ】シルデナフィルが、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知障害を寛解することを示すグラフである。シルデナフィル（腹腔内、３ｍｇ／Ｋｇ）は、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間作業記憶を改善した。媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、媒体処置されたＷＴ同腹子と比較して、隠しプラットフォームの位置を学習しない［最初の取得試験（Ａ１）のＡＰＰ／ＰＳ１：５．９１±０．１９エラー、第４の連続試験（Ａ４）による４．８３±０．５２エラー、及び想起試験（Ｒ）による５．２９±０．３１エラー、ｎ＝８（４匹のオス及びメス）、ＷＴ：Ａ１＝５．３６±０．２７エラー、Ａ４＝１．６３±０．３９エラー、Ｒ＝２．００±０．３２エラー、ｎ＝１０（５匹のオス及びメス）］。双方向分散分析は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの能力及び媒体処置されたＷＴ同腹子の能力間の有意な差異を表す（Ｆ(1,16)＝３９．６６、Ｐ＜０．０００１）、計画比較は、２群が試験で有意に異なることを表すＡ２（Ｐ＝０．０５）、Ａ３（Ｐ＝０．０２）、Ａ４及びＲ（Ｐ＝＜０．０００１）。しかしながら、シルデナフィルを用いた処置は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１と比較して、二重遺伝子組換え同腹子の能力を寛解する［Ａ１＝５．８７±０．２２エラー、Ａ４＝３．３９±０．３９エラー、Ｒ＝３．５７±０．３１エラー、ｎ＝１１（６匹のオス及び５匹のメス）、Ｆ(1,17)＝５．９９、Ｐ＝０．０２］。計画比較は、２群が試験Ａ４（Ｐ＝０．０３）及びＲ（Ｐ＝０．００１）で有意に異なることを表す。シルデナフィルは、媒体処置されたＷＴマウス［シルデナフィルと比較してＷＴマウスの能力に影響を与えない：Ａ１＝５．５±０．２３エラー、Ａ４＝１．５±０．２１エラー、Ｒ＝１．９±０．３５エラー、ｎ＝１０（５匹のオス及びメス）、Ｆ(1,18)＝０．０９、Ｐ＝０．７６）。
【００３４】
【図３Ａ】シルデナフィル（腹腔内３ｍｇ／Ｋｇ、３ヶ月の年齢で３週間）が、遺伝子組換えマウスにおいてコンテキスト恐怖条件付けを寛解することを表す棒グラフである。２４時間後、ＷＴと比較して、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるすくみ挙動の減少が存在し、シルデナフィル処置によって救われる［シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける媒体処置されたＷＴマウスの〜９７％と、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの〜６６％との対比、３０．３２±１．９８％、ｎ＝シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス中の１２匹（７匹のオス及び５匹のメス）、２０．６６±２．４２％、ｎ＝媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス中の１７匹（１０匹のオス及び７匹のメス）、Ｆ(1,27)＝７．１０、Ｐ＝０．０１３］。シルデナフィルは、媒体で処置されたＷＴマウスと比較して、ＷＴ同腹子のすくみ時間を増加しなかった［媒体処置されたＷＴマウスの〜１０４％、３２．４１±１．８８％、ｎ＝１７（１０匹のオス及び７匹のメス）と、３１．１６±１．２１％、ｎ＝１４（８匹のオス及び６匹のメス）との対比、Ｆ(1,29)＝０．２８、Ｐ＝０．０６］。手掛かり条件付け試験において、４群間に有意な差異は存在しなかった［Ｆ（３，５６）＝０．０７、Ｐ＝０．０９７］。
【００３５】
【図３Ｂ】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるラジアルアーム水迷路試験中の能力の機能障害が、シルデナフィルを用いた処置によって救われることを表すグラフである（腹腔内３ｍｇ／Ｋｇ、３ヶ月の年齢で３週間）。媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ同腹子による、数々のエラー間には有意な差異が存在した［最初の取得試験Ａ１のＡＰＰ／ＰＳ１：６．０４±０．２１エラー、Ａ２の５．３８±０．３４エラー、Ａ３の５．１４±０．３６、第４の連続試験Ａ４による４．５２±０．３３、及び想起試験Ｒによる４．９５±０．２８エラー、ｎ＝７（４匹のオス及び３匹のメス）、ＷＴ：Ａ１＝５．６０±０．６２エラー、Ａ２＝３．４６±０．３４エラー、Ａ３＝２．６６±０．８２エラー、Ａ４＝１．８６±０．１６エラー、Ｒ＝２．１３±０．３４エラー、ｎ＝５（３匹のオス及び２匹のメス）］。双方向分散分析は、２群の能力間で有意な全体の差異を明らかにした［Ｆ(1,10)＝３３．９８、Ｐ＝０．０００１］、計画比較は、第２の取得試験Ａ２（Ｐ＝０．００３）及び想起試験での差異を明白としたことを（Ｐ＝０．０００１）表した。シルデナフィルはＡＰＰ／ＰＳ１マウスの能力を改善し、ＷＴマウスの能力に影響を与えない［シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１：Ａ１＝６．１６±０．３９、Ａ２＝４．１６±０．５３、Ａ３＝３．５±０．４１、Ａ４＝２．８３±０．６１、Ｒ＝３±０．７５エラー、ｎ＝４（３匹のオス及び１匹のメス）、シルデナフィル処置されたＷＴ動物：Ａ１＝６±０．２９、Ａ２＝３．２２±０．５６、Ａ３＝２．５±０．３６、Ａ４＝１．８３±０．１６、Ｒ＝２．３３±０．３６エラー、ｎ＝６（４匹のオス及び２匹のメス）、Ｆ(1,7)＝３．４２、Ｐ＝０．１及びＦ（１，８）＝４．０４、媒体処置されたＷＴ動物と比較してＰ＝０．０７  ］。統計解析は、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１  動物と比較して、シルデナフィルで処置とされたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける処置の強い効果を明らかにした（Ｆ(1,9)＝１８．５３、Ｐ＝０．００２）、計画比較は、それらの群がＡ３（Ｐ＝０．０１９）、Ａ４（Ｐ＝０．０２６）、及びＲ（Ｐ＝０．０１７）で有意に異なることを表した。
【００３６】
【図３Ｃ】シルデナフィルを用いた先の処置によって、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路におけるＡＰＰ／ＰＳ１マウスの能力が改善されたことを記すグラフである（腹腔内３ｍｇ／Ｋｇ、３ヶ月の年齢で３週間）。ＷＴ同腹子で必要とされた２８．９１±３．９４秒と比較して、媒体処置された遺伝子組換えマウスは、６セッション後に隠しプラットフォームを見出すために４４．８３±３．７７秒必要とした［媒体処置されたＷＴマウスによって必要とされる時間の〜１５５％、Ｆ(1,21)＝１３．７３、Ｐ＝０．００１、計画比較は第４、第５、及び第６セッションで有意に異なることを表した、それぞれ、Ｐ＝０．００１、Ｐ＝０．００９、Ｐ＝０．００８］。シルデナフィルを用いた先の処置は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてプラットフォームを見出すために必要とされた時間を減少させた（３２．９２±３．５０秒、媒体処置されたＷＴマウスに必要とされた時間の〜１１４％、Ｆ(1,16)＝２．９７、Ｐ＝０．１０）。シルデナフィルは、２５．６４±３．１６秒必要としたＷＴ同腹子の能力に影響を与えなかった（媒体処置されたＷＴマウスに必要とされた時間の〜８９％、Ｆ(1,23)＝０．９８１、Ｐ＝０．３７）。統計解析は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのそれと比較して、シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの全体の能力において有意な差異を明らかにした［Ｆ(1,15)＝０．８５、Ｐ＝０．０２）］、それぞれ個々のセッションで潜時の計画比較は、差異が第４、第５、及び第６セッションで有意であったことを明らかにした（それぞれ、Ｐ＝０．０００１、Ｐ＝０．０１１、Ｐ＝０．０３４）。
【００３７】
【図３Ｄ】シルデナフィルで先に処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスが、プラットフォームが訓練中に位置づけられたターゲット象限（ＴＱ）において、プローブ試験中の媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１同腹子よりも、有意により長い時間探索したことを示す棒グラフである。（Ｆ(1,16)＝８．４２、Ｐ＝０．０１）。ＴＱにおいて、次いで他の象限において、ＷＴマウスは所与の時間の３３．３７±２．１０％を費やした［Ｆ(3,44)＝３．８５、Ｐ＝０．０１６］。計画比較は、右の隣接象限（ＡＲ）、左の隣接象限（ＡＬ）、又は逆の象限（ＯＱ）においてよりも、彼らがＴＱにおいて有意により長い時間を費やしたことを確認した（ＴＱ対ＡＲ、Ｐ＝０．０３、ＴＱ対ＯＱ、Ｐ＝０．０４、ＴＱ対ＡＬ、Ｐ＝０．０２）。シルデナフィルは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの能力を改善した［他の象限においてよりも、ＴＱにおいて所与の時間の３２．２５±０．５８％を費やした、又は媒体処置されたＷＴ同腹子によって使用される時間の〜９７％、Ｆ(3,24)＝１４．７３、Ｐ＜０．０００１］。計画比較は、彼らがＡＲ、ＡＬ、ＯＱにおいてよりも、ＴＱにおいて有意により長い時間を費やしたことを確認した（Ｐ＜０．０００１）。媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、ＴＱにおいて時間の２１．３９±１．４６％［Ｆ(3,40)＝０．５２、Ｐ＝０．６６］、又は媒体処置されたＷＴ同腹子によって使用された時間の〜６４％のみを費やした。シルデナフィル処置されたＷＴマウスは、ＴＱにおいて時間の３３．３５±１．３８％［Ｆ(3,48)＝３．６３、Ｐ＝０．０１９、計画比較ＴＱ対ＡＲ、Ｐ＝０．０３、ＴＱ対ＯＱ、Ｐ＝０．０４、ＴＱ対ＡＬ、Ｐ＝０．０２］、又は媒体処置されたＷＴ同腹子によって使用された時間の〜１００％を費やした。統計は、ＴＱにおいて、シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスによって費やされた時間の割合において、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのそれと比較して、有意な差異を明らかにした（Ｆ(1,16)＝８．４２、Ｐ＝０．０１）。ＴＱにおいて、シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスによって費やされた時間の割合において、媒体処置された及びシルデナフィル処置されたＷＴマウスと比較して、統計学的に有意な差異は見出されなかった（それぞれＦ(1,17)＝０．０４、Ｐ＝０．８４、Ｆ(1,18)＝０．０３、Ｐ＝０．８５）。
【００３８】
【図４Ａ】６〜８ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１動物のＢＳＴ機能障害は、シルデナフィル−処置（腹腔内３ｍｇ／Ｋｇ、３ヶ月の年齢で３週間）によって改善されることを表すグラフである［ＡＰＰ／ＰＳ１：媒体処置されたＷＴマウスの〜５７％、０．６２±０．０９Ｖ／秒、（ｎ＝５匹のオスからの６スライス）、Ｆ(1,9)＝７．２６、Ｐ＝０．０２、媒体処置されたＷＴマウスと比較、ＡＰＰ／ＰＳ１＋シルデナフィル：媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの〜１６０％、１．０３±０．１２Ｖ／秒、（ｎ＝６匹のオスからの８スライス）、Ｆ(1,12)＝５．５１、媒体処置された遺伝子組換えマウスと比較してＰ＝０．０３］。媒体処置された及びシルデナフィル処置されたＷＴマウスと比較して、シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのｆＥＰＳＰ勾配の値において統計学的に有意な差異は見出されなかった（それぞれ、Ｆ(1,11)＝０．０７、Ｐ＝０．７９；Ｆ(1,12)＝０．０３、Ｐ＝０．８４）。シルデナフィルはＷＴマウスのＢＳＴを変化させない［シルデナフィル処置されたＷＴマウスにおける、入出力曲線の勾配：媒体処置されたＷＴマウスの〜９４％、シルデナフィル処置されたＷＴマウス：１．０１±０．１２Ｖ／秒（ｎ＝５匹のオスからの６）、媒体処置されたマウス：１．０８±０．１１Ｖ／秒（ｎ＝５匹のオスからの５スライス）、双方向分散分析Ｆ(1,9)＝０．３４、Ｐ＝０．５７］。同様の結果が、ｆＥＰＳＰ勾配対求心性繊維斉射の振幅をプロットする際に観察された。
【００３９】
【図４Ｂ】シルデナフィル（腹腔内３ｍｇ／Ｋｇ、３ヶ月の年齢で３週間）が６〜８ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＬＴＰ機能障害を救出することを示すグラフである［ＡＰＰ／ＰＳ１＋シルデナフィル：シルデナフィル処置されたＷＴマウスの〜１００％、１２０分でベースラインの２３３．８１±３０．４７％、ｎ＝６匹のオスからの７スライス、Ｆ(1,12)＝１．１８、シルデナフィル処置されたＷＴ同腹子と比較してＰ＝０．２９、ＡＰＰ／ＰＳ１＋媒体：媒体処置されたＷＴマウスの〜６５％、ベースラインの１３５．５６±２２．０２％、ｎ＝６匹のオスからの７スライス、Ｆ(1,12)＝１４．８２、媒体処置されたＷＴ同腹子と比較してＰ＝０．００２］。
【００４０】
【図４Ｃ】シルデナフィル（腹腔内３ｍｇ／Ｋｇ、３ヶ月の年齢で３週間）は６〜８ヶ月齢のＷＴマウスのＬＴＰに影響を与えないことを記すグラフである［シルデナフィル処置されたマウスにおける媒体処置されたマウスの〜１１２％、シルデナフィル処置されたマウス：ベースラインの２３４．６７±１７．１９％、ｎ＝６匹のオスからの７スライス、媒体処置されたマウス：ベースラインの２１０．０１±１６．６２％、ｎ＝６匹のオスからの７スライス、Ｆ(1,12)＝２．１６、Ｐ＝０．１６］。テタヌスの不在における、マウスの４つの群のベースライン伝達中の差異は記されなかった（ｎ＝各群に対して４匹の動物からの４スライス、Ｆ(3、12)＝０．１７、Ｐ＝０．９１）。
【００４１】
【図５Ａ】リン酸化ＣＲＥＢ抗体で染色された海馬のスライスの代表例を表す免疫蛍光写真である。３ヶ月齢のＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１動物中で、テタヌスを用いた媒体又はシルデナフィルのどちらか（５０ｎＭ）６０分後、スライスは固定される。左、全体のスライスの低倍率（４Ｘ）視野。右、ＣＡ１細胞錐体領域の高倍率（１６Ｘ）視野。シルデナフィルは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのテタヌスの刺激に続き、ＣＲＥＢリン酸化の通常の増加を回復させる。
【００４２】
【図５Ｂ】テタヌスの適用後、ＣＡ１細胞体領域における免疫蛍光（ＩＦ）の強度の増加が、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスには見られないことを表す棒グラフである（ＷＴ：対照の１６０．５１±１４．９６％、ｎ＝４；ｔ(6)＝３．４４、テタヌス刺激されていないスライス対照と比較してＰ＝０．０１４；ＡＰＰ／ＰＳ１：対照の１１１．８９±６．６２％、ｎ＝４；ｔ(6)＝２．９６、テタヌス刺激されたスライスと比較してＰ＝０．０２５）。シルデナフィル（ｓｉｌｄ）は、テタヌス後、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＣＲＥＢリン酸化の増加を回復させるが、ＷＴテタヌス刺激されたスライス中のリン酸化ＣＲＥＢレベルには影響を与えない（ＡＰＰ／ＰＳ１＋シルデナフィル：対照の１６２．５８±１７．０９％、ｎ＝４；ｔ(6)＝０．０９、Ｐ＝０．９３；ＷＴ＋シルデナフィル：対照の１６３．５４±１３．５２％、ｎ＝４；ｔ（６）＝０．１５、ＷＴマウスのテタヌス刺激されたスライスと比較してＰ＝０．８８）。
【００４３】
【図５Ｃ】シルデナフィルの連日注射（腹腔内３ｍｇ／Ｋｇ、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスで３週間）が、６〜８ヶ月の年齢の同一マウスからの海馬のスライス中のＣＲＥＢリン酸化のテタヌス誘導性増加を回復させることを示す棒グラフである（ＷＴ：対照の１５１．６０±８．２５％、ｎ＝４／４；ｔ(6)＝４．７０、テタヌス刺激されていないスライスと比較してＰ＝０．００３；ＡＰＰ／ＰＳ１：対照の１１４．９６±９．１２％、ｎ＝４、ｔ(6)＝２．９６、それらのＷＴからの同腹子テタヌス刺激されたスライスと比較してＰ＝０．０２５；ＡＰＰ／ＰＳ１＋シルデナフィル：対照の１６３．６±１５．１４％、ｎ＝４；ｔ(6)＝０．６９、媒体処置されたＷＴ動物のテタヌス刺激されたスライスと比較してＰ＝０．５３（ｔ(6)＝２．７５、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１動物のテタヌス刺激されたスライスと比較してＰ＝０．０４１）。シルデナフィルは、ＷＴマウスにおいてＣＲＥＢリン酸化の増加に影響を与えない（対照の１５１．７３±１２．２４％、ｎ＝４、ｔ(6)＝０．００９、Ｐ＝０．９９３、ＷＴマウスのテタヌス刺激されたスライスと比較）。
【００４４】
【図６Ａ】３週間にわたるシルデナフィルの連日注射が、３ヶ月齢の遺伝子組換えマウスにおけるＡβ40及びＡβ42レベルを低下させることを表す棒グラフである（Ａβ４０：媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの〜６４％、Ａβ４２：〜８０％；Ａβ40及びＡβ42値は、それぞれ１．７１±０．２２及び３．５６±０．２３ｎｇ／ｍｇ皮質であった、シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、ｎ＝７と、２．６７±０．３５及び４．４３±０．３４ｎｇ／ｍｇ皮質、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、それぞれｎ＝７との対比、ｔ（１２）＝２．２６、Ｐ＝０．０４３、及びｔ(12)＝２．０９、Ｐ＝０．０５８）。シルデナフィルは、３〜４ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１のＡβレベルを低下させた。
【００４５】
【図６Ｂ】全長ＡＰＰ、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβ、ＣＴ８３、ＣＴ９９に対して、シルデナフィル（カラム右）で処置された、又は媒体（カラム左）で染色されたＡＰＰ／ＰＳ１の３ヶ月齢の遺伝子組換えマウスの脳の免疫ブロットの写真である。対照として、チューブリンを使用した。
【００４６】
【図６Ｃ】シルデナフィル処置された３ヶ月齢の遺伝子組換えマウスが、ＡＰＰレベルにおける変化を表さないことを示す棒グラフである（媒体処置されたマウスにおける対照の１２５．７５±４．４４％対媒体処置されたマウスにおける１１９．７５±８．９９％、ｎ＝４／４、ｔ(6)＝０．５９、Ｐ＝０．５７２）。
【００４７】
【図６Ｄ】シルデナフィル処置された３ヶ月齢の遺伝子組換えマウスが、ｓＡＰＰαにおける変化を表さないことを示す棒グラフである（８６．２５±５．０２％対８７．７５±４．９０、ｎ＝４／４、ｔ(6)＝０．２１、Ｐ＝０．８３８）。
【００４８】
【図６Ｅ】シルデナフィルで処置された３ヶ月齢の遺伝子組換え動物において、ｓＡＰＰβが低下することを示す棒グラフである（４３．２５±３．９０％対６２．７５±４．５８％、ｎ＝４／４、ｔ(6)＝３．６８、Ｐ＝０．０１０）。シルデナフィルは、３〜４ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１のβ−セクレターゼ活性を修飾する。
【００４９】
【図６Ｆ】３ヶ月齢の遺伝子組換え動物のシルデナフィル処置後、ＣＴ８３及びＣＴ９９断片が増加することを表すことを示す棒グラフである（ＣＴ８３：７４．５±６．７３％対４０．００±７．７３％、ｎ＝４／４、ｔ(6)＝３．３６、Ｐ＝０．０１５；ＣＴ９９：９５．２５±５．６６％対７０．５±７．７０％、ｎ＝４／４、ｔ(6)＝２．５８、Ｐ＝０．０４１）。
【００５０】
【図７Ａ】３ヶ月の年齢において、３週間にわたるシルデナフィルの連日注射が、７〜１０ヶ月の年齢でマウスのＡβ40及びＡβ42レベルを低下させることを表す棒グラフである（Ａβ40：媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの〜６５％、Ａβ４２：〜７３％；Ａβ40及びＡβ42値は、それぞれ４９．５９±７．９３及び３２．５５±３．２７ｎｇ／ｍｇ皮質であった、シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、ｎ＝６と、７６．９８±８．８８及び４４．７７±４．０８ｎｇ／ｍｇ、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、それぞれｎ＝７との対比、ｔ(11)＝２．２６、Ｐ＝０．０４５、及びｔ(11)＝２．２４、Ｐ＝０．０４７）。
【００５１】
【図７Ｂ】３ヶ月の年齢で３週間にわたりシルデナフィル又は媒体で処置され、全長ＡＰＰ、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβ、ＣＴ８３、ＣＴ９９に対して染色された年齢７〜１０ヶ月のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳の免疫ブロットの写真である。
【００５２】
【図７Ｃ】シルデナフィル処置されたマウスが、ＡＰＰレベルにおいて変化を表さないことを表す棒グラフである（１１６．３３±３．３２％対１０７．４±３．８８％、ｎ＝３／５、ｔ(6)＝１．５１、Ｐ＝０．１８０）。３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて３週間にわたりシルデナフィルを連日注射された、年齢７〜１０ヶ月の同一マウス中でＡＰＰが変化しなかった。
【００５３】
【図７Ｄ】３ヶ月の年齢で３週間にわたるシルデナフィルの連日注射を受取した、年齢７〜１０ヶ月のＡＰＰ／ＰＳ１  マウス中でｓＡＰＰαが増加すること（９７±３．１２％対１５３．６５±１１．９５、ｎ＝３／４、ｔ(5)＝３．５２、Ｐ＝０．０１７）を表す棒グラフである。
【００５４】
【図７Ｅ】３ヶ月の年齢で３週間にわたるシルデナフィルの連日注射を受取した、年齢７〜１０ヶ月のＡＰＰ／ＰＳ１マウス中でｓＡＰＰβを低下させることを表す棒グラフである（２８．３３±２．８４％対２５．６±２．８３％、ｎ＝３／５、ｔ(6)＝２．８４、Ｐ＝０．０２９）。
【００５５】
【図７Ｆ】３ヶ月の年齢で３週間にわたるシルデナフィルの連日注射を受取した、年齢７〜１０ヶ月のＡＰＰ／ＰＳ１マウス中でＣＴＦに対して、いずれの差異も観察されなかった（ＣＴ８３：７５．６６±１．９２％対８２．７５±６．７８％、ｎ＝３／５、ｔ(6)＝１．１３、Ｐ＝０．２９９；ＣＴ９９：９６．６６±５．２９％対８７．２±７．６３％、ｎ＝３／５、ｔ(6)＝０．８５、Ｐ＝０．４２７）ことを表す棒グラフである。
【００５６】
【図８Ａ】タダラフィル（５０ｎＭ）は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＬＴＰ機能障害を逆転させることを示すグラフである（ＬＴＰのレベル：テタヌス後１２０分媒体処置されたＷＴ同腹子の〜９６％と等しいタダラフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける〜５６％との対比；タダラフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス：１２０分で２０９．４９±１３．８９％。テタヌス後、ｎ＝６匹のオスからの８スライス；媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス：１２３．１４±５．９８％、ｎ＝７匹のオスの８スライス；媒体処置されたＷＴマウス：２１９．８８±１９．３５％、ｎ＝７匹のオスからの８スライス、Ｆ(1,14)＝１５．５７、Ｐ＝０．００１］。タダラフィルは、実験中のその適用の終了後テタヌスの刺激が適用されないその適用の間、又は１２０分後、基底神経伝達を変化させない［Ｆ(1,6)＝１．００７、Ｐ＝０．９３］。ＰＤＥ５阻害は、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＡ１領域のスライスにおけるＬＴＰの機能障害を逆にする。
【００５７】
【図８Ｂ】タダラフィル（５０ｎＭ）を用いた１０分の灌流が、ＬＴＰの振幅［媒体処置されたテタヌス刺激されたＷＴスライスの〜１０６％、２３２．４５±２１．９２％対２１９．８８±１９．３５％、ｎ＝８／８、Ｆ(1,14)＝０．２４、Ｐ＝０．６２）及びＷＴマウスのベースライン（媒体処置されたＷＴスライスの〜９８％、１０３．６５±１．６３％対１０４．７１±６．１３、ｎ＝４／４、Ｆ(1,6)＝１．０５、Ｐ＝０．３４］を変化させないことを表すグラフである。これらの実験を、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのそれらとインタリーブした。
【００５８】
【図８Ｃ】ＩＣ３５４（１μＭ）はＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＬＴＰ機能障害を逆転させないことを示すグラフである［ＬＴＰのレベル：テタヌス後１２０分で媒体処置されたＷＴ同腹子の〜５８％と等しいＩＣ３５４処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける〜５７％との対比；ＩＣ３５４処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス：１２０分で１２９．３３±８．７１％。テタヌス後、ｎ＝５匹のオスからの５スライス；媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス：１２６．８１±１２．３９％、ｎ＝５匹のオスからの５スライス；媒体処置されたＷＴマウス：２２０．８２±９．４９％、ｎ＝５匹のオスからの５スライス、Ｆ(1,8)＝０．０３、Ｐ＝０．８５］。ＩＣ３５４は、実験中のその適用の終了後テタヌスの刺激が適用されないその適用の間、又は１２０分後、基底神経伝達に影響を与えない［Ｆ(1,6)＝０．００６、Ｐ＝０．９４］。
【００５９】
【図８Ｄ】ＩＣ３５４（１μＭ）を用いた１０分灌流が、ＷＴマウスのＬＴＰに影響を与えないことを記すグラフである［媒体処置されたＷＴスライスの〜１０２％、２２６．０５±１８．７６％、ｎ＝５匹のオスからの５スライス、Ｆ(1,8)＝０．８４、Ｐ＝０．３８］。阻害剤は、実験中のその適用の終了後テタヌスの刺激が適用されないその適用の間、又は１２０分後、基底シナプス反応に何の効果もない［Ｆ(1,6)＝０．０７２、Ｐ＝０．７９］。これらの実験を、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのそれらとインタリーブした。
【００６０】
【図９】タダラフィルは３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知を寛解しない棒グラフである。タダラフィル（腹腔内１ｍｇ／Ｋｇ）は、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるコンテキスト恐怖条件付けを修飾しない。タダラフィル又は媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ同腹子は、訓練前に、すくみにおいていずれの差異も表さない［Ｆ(3,39)＝０．２６、Ｐ＝０．８５３］。訓練２４時間後に行われた恐怖条件付けは、媒体処置されたＷＴ同腹子と比較して、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてすくみ反応の減少を表す［媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるすくみ時間は、媒体処置されたＷＴマウスの〜４７％である；ＡＰＰ／ＰＳ１の１５．３４±３．１５％、ｎ＝１２（オス６匹、メス６匹）と、ＷＴ同腹子の３３．０３±５．５２％、ｎ＝１０（オス５匹、メス５匹）の対比、Ｆ(1,20)＝８．１９、Ｐ＝０．０１１］。タダラフィルを用いた処置は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１動物と比較して、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ挙動を救わない［タダラフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ時間は媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの〜１２２％：１８．７６±３．８９％、ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）、Ｆ(1,18)＝０．０８、Ｐ＝０．７７８］。タダラフィルは、ＷＴマウスのすくみ反応に影響を与えない［媒体処置されたＷＴマウスの〜８５％：２８．２９±３．３０％、ｎ＝１３（オス７匹、メス６匹）、Ｆ（１，２１）＝０．５８、Ｐ＝０．４５３］。手掛かり恐怖条件付けは４つの群間で同様であった［Ｆ(3,39)＝０．２１、Ｐ＝０．８８４］。
【００６１】
【図１０Ａ】マウスの４つの群が、可視のプラットフォームを見出すために必要な時間においていずれの差異も表さないことを示すグラフである［シルデナフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、試験の第１のセッションで２６．７３±３．４３秒及び第４で２１．１４±３．２８秒；媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、第１、第４セッションでそれぞれ２９．３３±４．６２秒及び２０．４９±４．２０秒；シルデナフィルで処置されたＷＴマウス、第１、第４セッションでそれぞれ２６．６４±３．１１秒及び２０．１７±４．０１秒；媒体で処置されたＷＴマウスは、第１、第４セッションでそれぞれ２６．８８±２．５８秒及び１９．４９±２．６５秒、Ｆ(3,35)＝０．０２、Ｐ＝０．９９４］。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、３ヶ月の年齢でいずれの感覚機能障害も表さない。
【００６２】
【図１０Ｂ】また、その４群間で泳ぐ速度においていずれの差異も見出されないことを表す棒グラフである［シルデナフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、１８．２１±１．９６ｃｍ／秒、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、１８．６５±２．３１ｃｍ／秒、シルデナフィルで処置されたＷＴマウス、１７．４２±１．７２ｃｍ／秒、及び媒体で処置されたＷＴマウス、１８．４２±１．８１ｃｍ／秒、Ｆ（３，３５）＝０．０７３；Ｐ＝０．９７４］。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、３ヶ月の年齢でいずれの運動機能障害も表さない。
【００６３】
【図１１Ａ】可視のプラットフォーム試験は、４群間で、プラットフォームに達するための時間において、いずれの有意な差異も明らかにしないことを示すグラフである［シルデナフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、試験の第１セッションで２４．４０±２．０６秒及び第４で２０．３７±２．３５秒；媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、第１、第４のセッションでそれぞれ２４．４０±３．４９秒及び２１．０９±２．８３秒；シルデナフィルで処置されたＷＴマウス、第１、第４のセッションでそれぞれ２２．７９±２．５１秒及び２０．９１±２．２１秒；媒体で処置されたＷＴマウス、第１、第４のセッションでそれぞれ２１．１６±３．１１秒及び１９．９０±２．５０秒；Ｆ（３，３９）＝０．０１、Ｐ＝０．９９７］。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、７ヶ月〜１０ヶ月の年齢でいずれの感覚機能障害も表さない。これらの動物は、３ヶ月の年齢で３週間にわたり、シルデナフィルの連日注射を受取した。
【００６４】
【図１１Ｂ】マウスの４つの群は、泳ぐ速度におけるいずれの差異も表さないことを記す棒グラフである［シルデナフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、１５．８１±１．８８ｃｍ／秒、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、１７．０５±１．４５ｃｍ／秒、シルデナフィルで処置されたＷＴマウス、１６．９７±１．４９ｃｍ／秒、及び媒体で処置されたＷＴマウス、１７．３６±１．３４ｃｍ／秒、Ｆ（３，３９）＝０．０２３；Ｐ＝０．９９５］。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、７ヶ月〜１０ヶ月の年齢でいずれの／運動機能障害も表さない。これらの動物は、３ヶ月の年齢で３週間にわたり、シルデナフィルの連日注射を受取した。
【００６５】
【図１２】報告されるＰＤＥ５阻害剤中の縮合平面環系構造を表す略図である。
【００６６】
【図１３】報告されるＰＤＥ５阻害剤の構造解析及び既知の構造活性関係（ＳＡＲ）データに基づいて、構造的に関する、公式に独立した足場（Ｉ〜ＩＶ）の４つのクラスを記す化学構造である。
【００６７】
【図１４】足場Ｉａを含む化合物の合成を表す略図である。
【００６８】
【図１５】足場ＩＩａ〜ｃを含む化合物の合成を表す略図である。
【００６９】
【図１６】足場ＩＩｄを含む化合物の合成を表す略図である。
【００７０】
【図１７】足場ＩＩＩを含む化合物の合成を表す略図である。
【００７１】
【図１８】足場ＩＶａを含む化合物の合成を表す略図である。
【００７２】
【図１９】ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＣＲＥＢ経路の略図である。
【００７３】
【図２０】ＡＰＰプロセシングの略図である。ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィルの投与は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＰＰプロセシングを修飾する。ＣＴ８３及びＣＴ９９断片の増加が観察されたにもかかわらず、シルデナフィルで処置された３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、ｓＡＰＰβレベルの低下が検出された。ｓＡＰＰβレベル中の持続性低下及びｓＡＰＰαレベル中の持続性増加を、７〜１０ヶ月の年齢で、３ヶ月の時にシルデナフィルで先に処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて検出した。
【００７４】
【図２１】シナプス性、可塑性、記憶、及びアミロイドβ（Ａβ）ペプチド合成及び分解へのＰＤＥ５阻害剤の作用を記すモデルの略図である。ＰＤＥ５阻害剤は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのシナプス性可塑を増加できる；ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの記憶、恐怖条件付け、及びＲＡＷＭを増加させる；ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＲＥＢリン酸化を増加させる；及びＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＡβペプチドレベルを低下できる。
【００７５】
【図２２】ＡＰＰ及びＰＳ１導入遺伝子の細胞培養物中の活性終末ボタンへの発現の効果を表す。図２２Ａは、ＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１海馬の培養のグルタミン酸前後の活性放出部位のＦＭ１〜４３染色の例の写真である。スケールバー、１５μｍ。図２２Ｂは、ＷＴ同腹子と比較して、Ｔｇマウスからの培養物中で、単位長さ神経突起当たりの活性終末ボタンの基底数が高いことを表すグラフである。図２２Ｃは、ＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１培養物中の０Ｍｇ＋＋中のグルタミン酸の３０分後の、シナプス前活性終末ボタンにおける増加パーセントを示すグラフである。グルタミン酸は、ＷＴ中の活性終末ボタン数を増加させるが、ＡＰＰ／ＰＳ１培養物中では増加しない。
【００７６】
【図２３】実験的設置を表す。横行海馬スライスの略図が、一番上の画像に表される。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ側枝線維及びＣＡ１放線状層を標識した。刺激及び記録電極の位置が示唆される。長期増強（ＬＴＰ）は、側枝線維のシータバースト刺激によって誘発された。一番下の画像は、電気生理学的実験のために使用された界面記録チャンバーの写真を表す
【００７７】
【図２４】新規ＰＤＥ５阻害剤の合成の模式図を表す。新規ＰＤＥ５阻害剤の必要性に基づいて、キノリン誘導体のクラスを設計した。
【００７８】
【図２５】幾つかの合成の模式図の例を記す。ＳＡＲに基づいて、ＹＦ０１２４０３（シクロプロピルリード）及びＹＦ０１６２０３（ジメチルアミノリード）は、さらなる研究のために選択された。
【００７９】
【図２６】合成された化合物のＩＣ50を表す。ＹＦ０１２４０３及びＹＦ０１６２０３は赤色で強調される。
【００８０】
【図２７】ＰＤＥ５阻害剤のインビトロ選択性を記す。２つの化合物、ＹＦ０１２４０３及びＹＦ０１６２０３、は選択性プロファイリングのためのＳＡＲに基づいて設定された。ａ）ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって得られたデータ、ｂ）Ｇｒａｅｍｅ  Ｌ．Ｃａｒｄ，ｅｔ．ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２００４，１２，２２３３−２２４７；ｃ）Ｉ  Ｓａｅｎｚ  ｄｅ  Ｔｅｊａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，１３，２８２−２９０；ｄ）Ａｌａｉｎ，Ｄａｕｇａｎ，ｅｔ．Ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４６，４５３３−４５４２。
【００８１】
【図２８】薬物動態プロファイルを表す。シルデナフィルと比較して、１つの化合物、ＹＦ０１２４０３、をＰＫプロファイリングのインビトロでの活性及び選択性に基づいて同定した。
【００８２】
【図２９】薬物動態プロファイルを表す。グラフは、脳組織及び血漿中の候補ＹＦ０１２４０３及びシルデナフィル濃度／時間曲線を記す。データはオスＣ５７／ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて収集された、各ポイントに対して３匹のマウス。
【００８３】
【図３０】ジメチルアミノ誘導体（ＹＦ０１６２０３）のプロセス化学の合成経路を記す。
【００８４】
【図３１】電気生理学データを表すグラフである。ＹＦ０１２４０３は、２００ｎＭオリゴマーのＡβ４２で処置された３〜４ヶ月齢のマウスからのスライスのＣＡ１領域のＬＴＰ機能障害を逆転させる。双方向分散分析を行った：ＡβプラスＹＦ０１２４０３と比較してＡβ＝Ｆ（１，１１）＝６．０７３、ｐ＝０．０３１４。
【００８５】
【図３２】中間体Ａの合成模式図を記す。模式図中の破線は、予測される反応を示唆する。
【００８６】
【図３３】中間体Ｂの合成模式図を記す。
【００８７】
【図３４】中間体Ｃの合成模式図を記す。
【００８８】
【図３５】中間体Ｄの合成模式図を記す。
【００８９】
【図３６】式Ｅの合成模式図を記す。
【００９０】
【図３７】式Ｆの合成模式図を記す。
【００９１】
【図３８】模式図Ａの一般的合成方法を記す。
【００９２】
【図３９】化合物９ａの合成模式図Ｉを記す（ＹＦ０１２４０３、シクロプロピルリード）。
【００９３】
【図４０】化合物１１ａの合成模式図ＩＩを記す（ＹＦ０１６２０３、ジメチルアミノリード）。
【００９４】
【図４１】中間体１０ａの合成模式図ＩＩＩ〜Ａ１を記す。
【００９５】
【図４２】ヒトの心臓、全脳、海馬及び大脳中のＰＤＥ５  ｍＲＮＡの発現レベルを表すグラフである。図４２Ａにおいて、値はβアクチンｍＲＮＡに規格化された。図４２Ｂにおいて、図４２Ａ中に表される値は、それぞれの心臓ｍＲＮＡレベルに規格化された。
【００９６】
【図４３】ｃＧＭＰに基づく分子の構造を表す。
【００９７】
【図４４】βカルボリン由来分子の構造を表す。
【００９８】
【図４５】ピラゾロピリジン、フタラジン、及びキノリン誘導体の構造を表す。
【００９９】
【図４６】イソキナゾリノン（ｉｓｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｏｎｅ）及びイソキノリノン誘導体の構造を表す。
【０１００】
【図４７】ｃＧＭＰ基質の１００ｎＭが使用されたＰＤＥ５活性を記すグラフである。
【０１０１】
【図４８】マウス脳組織及び血漿中のＹＦ０１２４０３の濃度時間曲線である（ｎ＝群当たり３マウス）。
【０１０２】
【図４９】Ａβ４２誘発シナプス及び認知障害へのＹＦ０１２４０３の有益な効果を表すグラフである。図４９Ａは、ＹＦ０１２４０３がＡβ４２処置されたスライス中のＬＴＰ欠損を寛解することを表す。グラフは、テタヌス後６０分、記録の最後の５分の平均を表す。図４９Ｂは、ＹＦ０１２４０３はＡβ４２注入されたマウスのコンテキスト恐怖記憶欠損を寛解することを表す。
【０１０３】
【図５０】ＹＦ０１２４０３のＣ８での修飾を表す略図である。
【０１０４】
【図５１】ＹＦ０１２４０３のＣ３での修飾を表す略図である。
【０１０５】
【図５２】ＹＦ０１２４０３のＣ３での修飾を表す略図である。
【０１０６】
【図５３】ＹＦ０１２４０３のＣ３での修飾を表す略図である。
【０１０７】
【図５４】ＹＦ０１２４０３の他の位置での修飾を表す略図である。
【０１０８】
【図５５】コンテキスト恐怖条件付け（ＦＣ）（図５５Ａ）及びＲＡＷＭ（図５５Ｂ）試験中、５ヶ月齢のＪ２０マウスの認知障害へのシルデナフィルの急性の有益な効果を表すグラフである。
【０１０９】
【図５６】シルデナフィルを用いた海馬のスライスの短時間灌流が、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス中のＣＡ１−ＬＴＰ機能障害を逆転させることを表すグラフである。図５６Ａ中のグラフは、ＢＳＴが３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１動物及びＷＴ同腹子と同様であることを表す。ＥＰＳＰ勾配の概要グラフと５〜３５Ｖの範囲である異なる刺激強度に対する線維斉射振幅との対比［３５Ｖ：ＡＰＰ／ＰＳ１マウス中のＷＴ同腹子の〜９７％、ｎ＝６匹のオスからの７スライスと、ＷＴスライス中のｎ＝６匹のオスからの７スライスとの対比；双方向分散分析：Ｆ(1,12)＝０．０５、Ｐ＝０．８１］。ＷＴ及び遺伝子組換え動物間の線維斉射における差異は存在しない（Ｆ（１，１２）＝３．９７、Ｐ＝０．０６）。図５６Ｂは、遺伝子組換え動物からのスライス中のシナプス可塑性への異なる濃度のシルデナフィルの効果を表す用量反応曲線である。シナプス可塑性を完全に救出する最小有効量は５０ｎＭである（ｎ＝各群に対して６匹のオスからの６スライス）。図５６Ｃは、シルデナフィル（５０ｎＭ）が、１又は２連のシータバースト刺激を介して増強されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスからのスライス中のＬＴＰを寛解することを表すグラフである（１テタヌス：ｔ(1,10)＝３．３８、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライスと比較してＰ＝０．００７；２強縮：ｔ(1,10)＝３．９２、Ｐ＝０．００３；３強縮：ｔ(1,10)＝１３．４７、Ｐ＜０．００１；ｎ＝各群に対して６匹のオスからの６スライス）。１回のシータバースト刺激を受取したＷＴマウスからのスライスは、媒体処置されたＷＴスライスと比較して、５０ｎＭシルデナフィルで灌流された場合、ＬＴＰにおいて有意な増加を表した（１テタヌス：ｔ(1,10)＝２．２５、Ｐ＝０．０４８；２強縮：ｔ(1,10)＝１．３７、Ｐ＝０．２００；３強縮：ｔ(1,10)＝１．２６、Ｐ＝０．２３６；ｎ＝各群に対して６匹のオスからの６スライス）。
【０１１０】
【図５７】３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、ＡＭＰＡ及びＮＭＤＡ受容体電流中の無変化に関連する通常のＢＳＴを有することを表すグラフである。図５７Ａ〜Ｂは、成体ＷＴ（ｎ＝３細胞）及びＡＰＰ／ＰＳ１（ｎ＝３細胞）ＣＡ１錐体細胞からのＡＭＰＡ受容体（ＡＭＰＡＲ）（図５７Ａ）及びＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）（図５７Ｂ）電流の規格化された電流電位プロットを表す。ＡＭＰＡＲ媒介ＥＰＳＣは、−９０ｍＶでＥＰＳＣに規格化された。ＮＭＤＡＲ媒介ＥＰＳＣは、＋５０ｍＶでＮＭＤＡ応答に規格化された。図５７Ｃは、ＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１錐体細胞中におけるＡＭＰＡＲのＮＭＤＡＲ電流比率との比較である。比率を、＋５０ｍＶでのピーク後５０ｍｓ、測定されたＮＭＤＡＲ電流によって、−７０ｍＶで測定されたＡＭＰＡＲ電流の振幅を分割することによって、算出した。
【０１１１】
【図５８】シルデナフィルが、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知機能を寛解することを表すグラフである。図５８Ａは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのコンテキスト恐怖記憶を改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度は３ｍｇ／ｋｇであることを表す。６ｍｇ／ｋｇは３ｍｇ／ｋｇと同一効果を有するが、１．５ｍｇ／ｋｇの濃度は、すくみを改善しない［１．５ｍｇ／ｋｇシルデナフィル：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）と媒体処置された動物ｎ＝１４（オス７匹、メス７匹）との対比、Ｆ(1,20)＝０．８２、Ｐ＝０．３７５；３ｍｇ／ｋｇシルデナフィル：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）、Ｆ(1,20)＝１１．５８、Ｐ＝０．００３；６ｍｇ／ｋｇシルデナフィル：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）、Ｆ(1,20)＝８．４８、Ｐ＝０．００９。図５８Ｂは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間作業記憶を改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度は、３週間で３ｍｇ／ｋｇであることを表す。６ｍｇ／ｋｇは３ｍｇ／ｋｇと同一効果を有するが、１．５ｍｇ／ｋｇの濃度はＲＡＷＭ能力を改善しない［１．５ｍｇ／ｋｇシルデナフィル：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）と媒体処置された動物ｎ＝１４（オス７匹、メス７匹）との対比、Ｆ(1,20)＝０．８２、Ｐ＝０．３７５及びＦ(1,20)＝０．０５、Ａ４及びＲに対してそれぞれＰ＝０．８２４；３ｍｇ／ｋｇシルデナフィル：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）、Ｆ(1,20)＝１１．５８、Ｐ＝０．００３及びＦ(1,20)＝１１．３６、Ｐ＝０．００３；６ｍｇ／ｋｇシルデナフィル：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）、Ｆ(1,20)＝８．４８、Ｐ＝０．００９及びＦ(1,20)＝７．１２、Ｐ＝０．０１５］。図５８Ｃは、シルデナフィルがＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間作業記憶にプラス効果を与えるために必要とされる最短時間は、３ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間であることを表す概要グラフである［１週間：Ｆ(1,20)＝１．８１、Ｐ＝０．１９及びＦ(1,20)＝０．８２、Ａ４及びＲはそれぞれＰ＝０．３８６；２週間：Ｆ(1,20)＝９．６９、Ｐ＝０．００５及びＦ(1,20)＝１０．３５、Ｐ＝０．００４；３週間：Ｆ(1,20)＝１３．１９、Ｐ＝０．００２及びＦ(1,20)＝１１．３６、Ｐ＝０．００３；ｎ＝各条件に対して８（オス４匹、メス４匹）］。
【０１１２】
【図５９】シルデナフィルが、３ヶ月齢のマウスの手掛かり条件付けを修飾しないことを表すグラフである。媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、媒体処置されたＷＴ同腹子と同様の能力を有する（Ｆ(1,39)＝０．１６、Ｐ＝０．６９１）。シルデナフィル（３ｍｇ／ｋｇ）の注射は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス及びＷＴ同腹子の手掛かり条件付けの間、すくみに影響しない（Ｆ(1,38)＝１．２、Ｐ＝０．２７９及びＦ(1,40)＝０．０８、媒体処置されたＷＴマウスと比較して、それぞれＰ＝０．７７３）。
【０１１３】
【図６０】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのコンテキスト恐怖記憶機能障害のシルデナフィルによる救出が、すくみの高い量を誘発する高い強度のフットショックであることを表すグラフである［Ｆ(1,26)＝５２．２４；Ｐ＝０．００１］。
【０１１４】
【図６１】タダラフィルは、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知を寛解しないことを表すグラフである。図６１Ａは、ダラフィル（腹腔内１ｍｇ／Ｋｇ）が３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスのコンテキスト恐怖条件付けを修飾しないことを表す。タダラフィル又は媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ同腹子は、訓練前に、すくみにおいていずれの差異も表さない［Ｆ(3,39)＝０．２６、Ｐ＝０．８５３］。訓練２４時間後に行われた恐怖条件付けは、媒体処置されたＷＴ同腹子と比較して、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてすくみ反応の減少を表す［媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるすくみ時間は、媒体処置されたＷＴマウスの〜４７％である；ｎ＝１２（オス６匹、メス６匹）と、ｎ＝ＷＴ同腹子に対して１０（オス５匹、メス５匹）との対比、Ｆ(1,20)＝８．１９、Ｐ＝０．０１１］。タダラフィルを用いた処置は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１動物と比較して、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ挙動を救わない［タダラフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ時間は媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの〜１２２％：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）、Ｆ(1,18)＝０．０８、Ｐ＝０．７７８］。タダラフィルは、ＷＴマウスのすくみ反応に影響を与えない［媒体処置されたＷＴマウスの〜８５％：ｎ＝１３（オス７匹、メス６匹）、Ｆ(1,21)＝０．５８、Ｐ＝０．４５３］。図６１Ｂは、４つの群間で同様である手掛かり恐怖条件付けを表す［Ｆ(3,34)＝１．４２、Ｐ＝０．２５３］。図６１Ｃは、タダラフィルが、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間作業記憶を改善しないことを表す。タダラフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１と比較して、隠しプラットフォームの位置を学習しない［ＡＰＰ／ＰＳ１＋タダラフィル：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）；ＡＰＰ／ＰＳ１＋媒体：ｎ＝８（オス５匹、メス３匹）；Ｆ(1,14)＝０．７１、Ｐ＝０．７３６及びＦ（１，１４）＝２．４６、Ａ４及びＲは、それぞれＰ＝０．１３９］。タダラフィルは、媒体処置されたＷＴマウスと比較して、ＷＴマウスの能力に影響しない［ＷＴ＋タダラフィル：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）；ＷＴ＋媒体：ｎ＝８（オス４匹、メス４匹）；Ｆ(1,14)＝０．３２、Ｐ＝０．５７９及びＦ（１，１４）＝０．０９、Ａ４及びＲは、それぞれＰ＝０．７６３］。
【０１１５】
【図６２】６〜８ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの連合及び空間記憶の双方を改善するために、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて必要とされるシルデナフィルを用いた処置の最小濃度及び持続時間を示すグラフを表す。図６２Ａは、コンテキスト恐怖記憶を改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度が、３ｍｇ／ｋｇであることを表す概要グラフである［ｎ＝これおとび以下のパネルの条件に対して８（オス４匹、メス４匹）；Ｆ(1,14)＝６．５、３ｍｇ／ｋｇシルデナフィルでＰ＝０．０２３］。図６２Ｂは、シルデナフィルがコンテキスト恐怖記憶へのプラス効果を有するために必要とされる最短時間は、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、２週間であることを表す概要グラフである［Ｆ(1,14)＝１３．９、２週間でＰ＝０．００２］。図６２Ｃは、空間作業記憶を改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度が、３ｍｇ／ｋｇであることを表す概要グラフである［Ａ４：Ｆ(1,14)＝１２．７、Ｐ＝０．００１及びＲ：Ｆ(1,14)＝１３．６、３ｍｇ／ｋｇシルデナフィルでＰ＝０．００２］。図６２Ｄは、シルデナフィルが空間作業記憶へのプラス効果を有するために必要とされる最短時間が、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、２週間であることを表す概要グラフである［Ａ４：Ｆ（１，１４）＝１２．９、Ｐ＝０．００１及びＲ：Ｆ(1,14)＝９．６、２週間でＰ＝０．００８］。図６２Ｅは、ＭＷＭを用いた能力を改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度が、３ｍｇ／ｋｇであることを表す概要グラフである（隠しプラットフォームの最後の試験でプラットフォーム達するために必要とされる時間を表すグラフである）［Ｆ(1,14)＝１６．９、３ｍｇ／ｋｇシルデナフィルでＰ＝０．００１］。図６２Ｆは、プローブ試験での能力を改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度が、３ｍｇ／ｋｇであることを表す概要グラフである（グラフは、ターゲット象限−ＴＱ中で費やした時間の割合を表す）［Ｆ(1,14)＝１８．３、３ｍｇ／ｋｇシルデナフィルでＰ＝０．００１］。図６２Ｇは、シルデナフィルがＭＷＭを用いた能力を改善するために必要とされる最短時間が、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、２週間であることを表す概要グラフである［Ｆ(1,14)＝１６．８、２週間でＰ＝０．００１］。図６２Ｈは、シルデナフィルがプローブ試験での能力を改善するために必要とされる最短時間が、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、２週間であることを表す概要グラフである［Ｆ(1,14)＝１６．８、２週間でＰ＝０．００１］。
【０１１６】
【図６３】６〜８ヶ月の年齢に達するにつれて、ＢＳＴ及びＬＴＰを改善するために３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて必要とされるシルデナフィルを用いた処置の最小濃度及び持続時間を示すグラフを表す。図６３Ａは、ＢＳＴを改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度が３ｍｇ／ｋｇであることを表す概要グラフである［ｎ＝この、及び以下のパネルにおける各条件に対する８匹のオス；Ｆ(1,14)＝２３．３２、３ｍｇ／ｋｇシルデナフィルでＰ＜０．００１］。図６３Ｂは、ＬＴＰを改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度が、３ｍｇ／ｋｇであることを表す概要グラフである［Ｆ(1,14)＝７０．３、３ｍｇ／ｋｇシルデナフィルでＰ＜０．００１］。図６３Ｃは、シルデナフィルがＢＳＴへのプラス効果を有するために必要とされる最短時間が、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、２週間であることを表す概要グラフである［Ｆ(1,14)＝３９．４、２週間でＰ＝０．００１］。図６３Ｄは、シルデナフィルがＬＴＰへのプラス効果を有するために必要とされる最短時間が、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、２週間であることを表す概要グラフである［Ｆ(1,14)＝６４．５、２週間でＰ＝０．００１］。
【０１１７】
【図６４】浴溶液を通して１０分間適用される、シルデナフィルの６ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１動物からのスライス中のＢＳＴ及びＬＴＰへの異なる濃度の効果を表す用量反応曲線である。図６４Ａは、異なる濃度のシルデナフィルがｆＥＰＳＰ勾配を変化しないことを表すグラフである（Ｆ(4,30)＝０．０９、Ｐ＝０．９８５）。図６４Ｂは、ＬＴＰを完全に救出する阻害剤の最小有効量が、５００ｎＭであることを表すグラフである（媒体処置されたＷＴスライスの９３％；ｔ（１，１１）＝７．０４、Ｐ＜０．００１、ｎ＝様々な群に対して７／４）。
【０１１８】
【図６５】シルデナフィルがＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＡβレベルを低下させることを表すグラフである。図６５Ａは、シルデナフィルが最小有効量の３ｍｇ／ｋｇで、３ヶ月齢の遺伝子組換えマウスのＡβ４０及びＡβ４２レベルを低下させることを表す（ｔ(12)＝２．３２、Ｐ＝０．０３９及びｔ(12)＝２．３０、Ａβ４０及びＡβ４２に対して、それぞれＰ＝０．０４；様々な群に対してｎ＝７）。図６５Ｂは、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて３週間にわたるシルデナフィルの連日注射が、年齢７〜１０ヶ月の同一マウスにおいて、Ａβレベルを減少することを表す。Ａβ４０及びＡβ４２レベルを低下させる最小有効量は、３ｍｇ／ｋｇである（ｔ(12)＝２．２２、Ｐ＝０．０４及びｔ(12)＝２．８５、Ａβ４０及びＡβ４２に対して、それぞれＰ＝０．０１；様々な群に対してｎ＝７）。図６５Ｃは、３ｍｇ／ｋｇのシルデナフィルがＡβ４０にプラス効果を有するために必要とされる最短時間は２週間であるが（ｔ(12)＝２．４３、Ｐ＝０．０３）、この時、Ａβ４２レベルの値は有意性には達さなかったことを表す（２週間：ｔ(12)＝２．２２、Ｐ＝０．０４；３週間：ｔ(12)＝２．８５、Ｐ＝０．０１；様々な群に対してｎ＝７）。図６５Ｄは、３ヶ月の年齢で投与された３ｍｇ／ｋｇのシルデナフィルが、７〜８ヶ月の年齢の同一マウスのＡβ４０にプラス効果を有するために必要とされる最短時間は、３週間であるが（ｔ(12)＝２．３３、Ｐ＝０．０３）、２週間でＡβ４２のレベルは、わずかに優位性を上回ることを表す（２週間：ｔ(12)＝２．０２、Ｐ＝０．０６；３週間：ｔ(12)＝２．９５、Ｐ＝０．０１；様々な群に対してｎ＝７）。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
本発明は、優れたＰＤＥ５阻害効力、高い選択性、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える合理的な薬物動態及び良好な透過性を有するキノリン含有化合物のクラスを提供する。これらの化合物は、米国で第３に費用のかかる疾患である、ＡＤ患者の副作用を最小化するために使用することができる。また、本発明の化合物は、勃起不全（ＥＤ）、肺高血圧症、心血管障害、糖尿病、及び消化器疾患を治療するために使用することができる。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、本発明は、対象中のβセクレターゼ活性又は発現の、持続された又は長期の低下を引き起こすことができるＰＤＥ５阻害剤を同定するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＰＤＥ５阻害剤の投与終了後、対象中のβセクレターゼ活性又は発現の順調な低下を引き起こすことができるＰＤＥ５阻害剤を選択するための方法を提供する。例えば、ＰＤＥ５阻害剤は、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又はそれ以上のＡβ蓄積の動物モデル（ＡＰＰ／ＰＳ１マウス等）中のβセクレターゼ活性又は発現の低下を引き起こすそれらの能力に基づいてスクリーニング又は選択されることができる。
【０１２１】
Ａβ蓄積動物モデルで試験されるＰＤＥ５阻害剤化合物の候補プールを収縮するため、最初にＰＤＥ５阻害剤は、それら所有の特定の特徴、１つ又はそれ以上を有する等、に基づいてスクリーニング又は選択されることができる：約１００ｎＭを越えないＩＣ50；他のＰＤＥに対してよりも、ＰＤＥ５に対して少なくとも５０倍を超える選択性；約５０ｎＭを越えないＩＣ５０を有するインビトロでのＰＤＥ５阻害活性、ＢＢＢを透過する能力；ｃＧＭＰを、少なくとも約２０％（又は少なくとも約８０％）加水分解する能力；化合物及びヒドロキシル基である第２の架橋リガンドを有するＰＤＥ５間の相互作用；ならびに化合物及びアミノ酸残基Ｆ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせ（全ての４つの残基での接触を含む）でのＰＤＥ５との接触を含むＰＤＥ５間の相互作用。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、Ａβ蓄積動物モデルで試験されるＰＤＥ５阻害剤の候補プールは、最初に本明細書で説明される「医薬品化学」戦略（実施例を参照されたい）に基づいてスクリーニング又は選択されることができる。例えば、報告されるＰＤＥ５阻害剤及び知られているＳＡＲデータ（図１２）の構造分析に基づいて、構造的に関するが、公式に独立した足場Ｉ〜ＩＶである４つのクラス（図１３を参照されたい）の構造解析は、ＰＤＥ５阻害剤候補として見なされる。最初に、これらの足場に由来する化合物は、スクリーニングされ、計算モデル上で最適化され得る。最も高いスコアを伴う化合物は、合成され、効力に対して試験されるであろう。この段階で、合成努力は、効力／選択性の結果を試験することによって導かれる。満足な効力及び選択性（リード化合物）を伴う化合物は、ＰＫ、生物学的利用率／脳透過、及びオフターゲット活性（安全性）に対してさらに研究されるであろう。選択された化合物を、βセクレターゼ活性又は発現の持続された又は長期の低下の持続を引き起こすかを決定するために、Ａβ蓄積動物モデルで試験することができる。本明細書で使用されるように、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、化合物がまた他のＰＤＥを阻害することができる可能性を必ずしも妨げない。
【０１２３】
したがって、本開示は、ＰＤＥ５阻害剤化合物が、シナプス機能障害及び阻害剤の投与を超えて持続する記憶喪失に対して、持続及び保護効果を示すという発見を提供する。幾つかの実施形態において、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、望まれ、スクリーニングされ、αセクレターゼへの持続増強効果を有するものの、βセクレターゼに影響を与える持続阻害を有するものが選択される。幾つかの実施形態において、治療薬（ＡＤ等のアミロイドβペプチド蓄積に関連する条件）をスクリーニングするための方法は、薬剤が、βセクレターゼ活性又は発現への持続阻害影響及び／又はαセクレターゼ活性又は発現への持続刺激影響に発現するかを試験することを含む。
【０１２４】
幾つかの実施形態において、本発明は、神経機能障害へと導くＡβ標的と相互作用する薬剤を同定、かつ使用することを対象とする。また、本発明は、ＰＤＥ５タンパク質発現又は活性を調節する化合物、又はセクレターゼ（例えば、α及びβセクレターゼ）の活性又は発現を調節する化合物を提供する。例えば、化合物はＰＤＥ５阻害剤であり得る、ＡＤ等の神経変性疾患の進行を相殺する化合物のクラス（Ｐｕｚｚｏ  ｔ  ａｌ  ［１２］）。現在使用されるＡＤ治療法（アセチルコリンエステラーゼ阻害剤又はＮＭＤＡ拮抗薬等）は、制限された有効性を有する。
【０１２５】
アルツハイマー病
【０１２６】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経細胞脱落、細胞外老人性プラーク、及び細胞内神経原線維変化、記憶喪失を引き起こすことによって特徴づけられる。ＡＤは、その称するところでは、少なくとも一部、Ａβによって産生されるシナプス傷害として始まる（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ  ２９８，７８９−７９１（２００２））。長期増強（ＬＴＰ）中のＡβ誘発された減少、学習及び記憶の基礎をなすと考えられているシナプス可塑性の生理学的相関物、及び記憶転写因子ＣＲＥＢのリン酸化は、一酸化窒素（ＮＯ）ドナー及びｃＧＭＰ類似体によって寛解される（Ｐｕｚｚｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ／ｃＧＭＰ／ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，６８８７−６８９７（２００５））。逆もまた同様に、ＮＯシンターゼ２（ＮＯＳ２）の遺伝手術は、変異アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）を発現するマウスのＡＤ表現型の悪化を引き起こす（Ｃｏｌｔｏｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＮＯ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２（ＮＯＳ２）ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０３，１２８６７−１２８７２（２００６））。まとめると、これらの知見は、ＮＯ経路の上方制御がＡＤにおいて保護的であり得ることを表す。
【０１２７】
ＡＤは、神経細胞脱落、細胞外老人性プラーク（ＳＰ）及び細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）によって、神経病理的に特徴づけられる。ＳＰは、主にＡβ凝集物を含む。ＮＦＴの主要な成分は、微小管結合タンパク質タウである。臨床的に、ＡＤは認知障害によって特徴づけられ、時間とともに、脳の進行的に大きな領域を含むシナプス傷害として始まる［１］。プロセシングの新生の概論は、脳損傷のいずれの他の臨床徴候の不在の中発生する、早期の健忘の症状の機微及び可変性が、単一のシナプスの機能における分離変化のためであり得、少なくとも一部はＡβによって産生され得ることを表すシナプス機能障害［５、７、１０、１１］を含む。
【０１２８】
アルツハイマー病の原因療法を発達させる重要な標的の１つは、シナプスによって表される。老人性プラーク及び神経原線維変化等の他の重要な変数は少ない程度に含まれるが［１］、シナプス変化は、臨床認知症［１、２］の重症度と高度に相関する。ＡＤのシナプス変化の重要性は、ＡＤの遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスモデルの研究［３］、ならびに長期増強（ＬＴＰ）の研究、スライス及びインビボの双方におけるアミロイドβ（Ａβ）の適用に続いて障害される［３、５〜１２］学習及び記憶（Ｌ＆Ｍ）の広範に研究される細胞モデル［４］によって確認された。Ａβは、顕著にＬＴＰを阻害することが見出された。Ｔｇを使用する電気生理学的研究、ヒトＡβを産生するマウスは、基底シナプス伝達の有意な欠損及び／又は海馬中のＬＴＰを度々明らかにした［２３〜３０］。
【０１２９】
ＮＯは、細胞生化学的プロセシング中の中枢分子である。ガスは、シナプス可塑性ならびに学習及び記憶への発達から、脳生理学の様々なステップにおいて重要なメッセンジャー分子を樹立した。ＡＤ研究において、ＮＯは、神経系のＡβ誘発性障害への保護効果を有することが見出された［３８〜４０］。ＰＣ１２細胞、交感神経細胞、及び海馬の神経細胞に行われた研究は、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルによるＮＯ合成の阻害は、Ａβ誘発性神経毒性に対して保護しないが、ＮＯ発生装置Ｓニトロソペニシラミンを用いた処置が、ニトロシル化［３９］によって、アポトーシス促進性の因子カスパーゼ２の阻害のため神経保護効果を発現することを表した。Ａβは、ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達を低下させることによって、ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）からＮＡＤＰＨ有効性を引くことによって［４１］、又はセリンスレオニンキナーゼＡｋｔのリン酸化を阻害することによって［４２］、ＮＯ産生を障害することが見出された［３８］。なお、ｉ−ＮＯＳ欠失は、ＡＰＰマウスのＡＤ病態を増強する［４３］。したがって、ＮＯカスケードを増強する薬物は、ＡＤに対して有益な効果を有する［４４］。
【０１３０】
ＮＯの神経保護的機能は明白であり、議論の余地はないが、またガスは高濃度で産生される場合、神経病態及び細胞死の主要な薬剤として見られる。ＮＯの高量は、Ａβ誘発性細胞死中の酸化的及びニトロソ化ストレスの原因である有意な量のペルオキシナイトライトの産生へと導く［４５−５１］。実際に、ＮＯＳ（ｉ−ＮＯＳ）の誘導型による高量のガスの制御されない産生が、ペルオキシナイトライトの産生を通して酸化的及びニトロソ化ストレスを促進できるにもかかわらず、神経細胞及び内皮アイソフォーム、ｎ−ＮＯＳ及びｅ−ＮＯＳ、の双方を含むＮＯＳの構成型による低量のＮＯの放出は、シナプス可塑性及び学習を促進する［４５〜５１］。したがって、可塑性及び記憶を遮断、細胞死へと導くペルオキシナイトライトの産生の双方のＮＯカスケードのＡβ誘発性下方制御は、ＡＤにおいて役割を果たすことができる。これらの発見を活用する薬物研究の現状は、ＮＯカスケードを上方制御し、したがって神経保護を誘発する方法を見出し、かつ神経病態を制限するため、ペルオキシナイトライト毒性作用を遮断する方法を見出すことの双方に集中している［５２］。
【０１３１】
ＰＤＥ５阻害
【０１３２】
本明細書において、治療方針は、ＮＯ産生の下流レベルで、ステップに集中することによって、ＮＯ産生をバイパスすることができる。ＰＤＥ５、ＧＭＰを分解する酵素は、その必要のある対象中のＡβ沈着物を治療することを目標とした本開示の治療法の下流標的である。ＰＤＥ５は、ＰＤＥの１１型／ファミリー（ＰＤＥ１〜ＰＤＥ１１）を含む酵素のスーパーファミリーの一部であり、それらの幾つかは、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）からヒトの範囲の多種多様な生体における記憶及び行動において、重大な役割を果たす［５３］。ＰＤＥはマルチドメインタンパク質であり、Ｃ−終端に局在している約２７０個のアミノ酸は、１１ファミリー間で高度に保存される。このドメインは、ＰＤＥの触媒作用機能を含有する。非相同アミノ酸セグメントは、制御機能をゆうするか、あるいは特異的結合特性を与える。ＰＤＥ２、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、及びＰＤＥ１０は、それらの制御アミノ末端部内で、推定ＧＡＦドメインを含有し、ｃＧＭＰに結合することを表す。
【０１３３】
ＰＤＥ５、ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥは、血管及び内臓平滑筋、血小板、ならびに骨格筋等の様々な組織中の濃度を変化させることに見られる。ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥは遍在的に発現され、海馬、皮質、及び小脳を含む、認知機能に関連する数個の脳領域に見出すことができる［１７、１８］。ＰＤＥ５は、保存されたＣ終端、亜リード含有、触媒作用ドメイン、及びＮ終端制御ドメインを含む。Ｎ終端は２つのＧＡＦドメイン反復を含有すると同時に、ＰＤＥ５のＣ終端はｃＧＭＰの切断を触媒し、それぞれはｃＧＭＰ結合部位を含有する（高い親和性及び他の低い親和性のうちの１つ）。ＰＤＥ５活性の制御は、高い及び低い親和性ｃＧＭＰ結合部位へのｃＧＭＰの結合を介して発生し、その後リン酸化が発生し、それは、双方の部位が占有されている場合にのみ発生する。ＰＤＥ５の阻害はｃＧＭＰ分解を低下し、したがってｃＧＭＰレベルの維持を可能にする。例えば、シルデナフィルは、ＰＤＥ５の強力な阻害剤であり、Ｖｉａｇｒａ（商標）の活性成分である。
【０１３４】
幾つかの臨床的に有用な薬物は、ＰＤＥのファミリー選択的阻害剤として開発された。しかしながら、いずれも、βセクレターゼ発現又は活性への長期にわたる阻害効果、ならびにαセクレターゼ発現又は活性への長期にわたる興奮効果を発現しないことを表している。前臨床研究は、選択的ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィル及びバルデナフィルが海馬のｃＧＭＰレベルを上昇させ、高齢のラット（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２）及びマウス（Ｂａｒａｔｔｉ  ＆  Ｂｏｃｃｉａ，２００１）の記憶を改善することを表している。ヒト研究において、シルデナフィルは、ヒトにおける選択的保持及び言語認識記憶を増強することが見出された（Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。シルデナフィル（Ｐｆｉｚｅｒ社よりＶｉａｇｒａ、ピラゾロ−［４，３−ｄ］−ピリミジノン誘導体）は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することが報告されているため、それは中枢神経系の研究のための良好な候補を表す。バルデナフィルの証拠は間接的であり（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ４５，９１５−９２８（２００４））、及びダラフィルはそれを通過する見込みは無い。シルデナフィルは、６．０ｎＭのＰＤＥ５に対してＩＣ５０、及びげっ歯類において０．４時間のインビボ半減期を有する（ヒトにおいて〜４時間）（Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ２９，２９７−３１０（１９９９）；Ｄａｕｇａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４６，４５３３−４５４２（２００３））。加えて、脳のそばの心筋及び血管で発現されるＰＤＥ１を含む全ての他のＰＤＥイソ酵素よりも、それはＰＤＥ５に対して非常に選択的であり、血管拡張及び頻脈（選択性比率１８０）を引き起こすことができ（Ｄａｕｇａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４６，４５３３−４５４２（２００３））、網膜中でのみ発現されるＰＤＥ６は、過渡的に視覚を障害することができる（選択性比率１２）（Ｄａｕｇａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４６，４５３３−４５４２（２００３））。
【０１３５】
神経、心血管、及び免疫系の様々な生理的プロセシングは、ＮＯ／ｃＧＭＰシグナル経路によって調節される。例えば、平滑筋において、ＮＯ及びナトリウム利尿ペプチドは、ｃＧＭＰを通して緩和を刺激することにより、血管緊張を制御する。ｃＧＭＰの分解は環状ヌクレオチドＰＤＥによって調節され、ＰＤＥ５は最も発現された、これらの細胞中でｃＧＭＰを加水分解するＰＤＥである。ＮＯ経路を上方制御する１つの効果的手段は、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の阻害剤、ＰＤＥの１１型を含む酵素のスーパーファミリーのメンバーを通してｃＧＭＰレベルを増加することにより、それらの幾つかは、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）からヒトの範囲の多種多様な生体における記憶及び行動において、重大な役割を果たす（Ｄａｖｉｓ，１９９６、Ｂａｒａｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９８、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。これらの薬物は、勃起不全及び肺高血圧症を治療するために、広範に使用されている。したがって、それらの副作用は知られており、ヒトのそれらの使用を妨げてはいない。興味深いことに、ＰＤＥ５は、認知機能に関連する、海馬、皮質、及び小脳等の数個の脳領域で発現される（ｖａｎ  Ｓｔａｖｅｒｅｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｓｔｅｉｎｂｕｓｃｈ，Ｈ．Ｗ．，Ｍａｒｋｅｒｉｎｋ−ｖａｎ  Ｉｔｔｅｒｓｕｍ，Ｍ．，Ｂｅｈｒｅｎｄｓ，Ｓ．＆  ｄｅ  Ｖｅｎｔｅ，Ｊ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９，２１５５−２１６８（２００４）；Ｖａｎ  Ｓｔａｖｅｒｅｎ，Ｗ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４６７，５６６−５８０（２００３））。
【０１３６】
転写因子ＣＲＥＢをリン酸化し、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＧ）を活性化する環状ＧＭＰは、神経伝達、ＬＴＰ、及び記憶の調節に関係している［１３〜１６］。認知機能に関連する、海馬、皮質、及び小脳等の数個の脳領域で発現される酵素［１７、１８］、ｃＧＭＰ分解酵素ホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ５）の阻害を介すｃＧＭＰレベルの上昇は、高齢のラット［１４］及びマウス［１６］の記憶を改善する。また、ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ）を介したｃＧＭＰの上昇は、ヒトにおける選択的保持及び言語認識記憶を増強する［１９］。Ｌ＆Ｍ上のｃＧＭＰの効果は細胞内及び外一酸化窒素（ＮＯ）によって媒介され、分子の産生は、溶性グアニリルシクラーゼ（ｓＧＣ）によって刺激される［２０〜２２］。前臨床研究は、選択的ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィル及びバルデナフィルが海馬のｃＧＭＰレベルを上昇させ、高齢のラット（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ，Ｊ．，ｄｅ  Ｖｅｎｔｅ，Ｊ．，Ｈｏｎｉｇ，Ｗ．，Ｓｔｅｉｎｂｕｓｃｈ，Ｈ．Ｗ．＆  Ｂｌｏｋｌａｎｄ，Ａ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈアームａｃｏｌ  ４３６，８３−８７（２００２））及びマウス（Ｂａｒａｔｔｉ，Ｃ．Ｍ．＆  Ｂｏｃｃｉａ，Ｍ．Ｍ．Ｂｅｈａｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １０，７３１−７３７（１９９９））の記憶を改善することを表している。Ｔｇ  Ａβを産生しているマウスを使用するさらなる研究は、ＣＲＥＢタンパク質のリン酸化において年齢依存性の低下を明らかにし、これらの研究は、ＬＴＰ中のＡβ媒介性変化の根底にある機構への手がかりを提供した［３１〜３３］。ＣＲＥＢリン酸化は記憶形成に必要であり、ｃＡＭＰレベルによって制御され、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）によって［３４〜３６］、ならびにｃＧＭＰレベルによって活性化され、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＧ）によって活性化される［３７］。重要なことに、インビトロ研究は、ＰＫＡ及びＰＫＧをＡβ不活性化し、それによってｃＡＭＰ、リン酸化ＣＲＥＢ、及びＬＴＰを減少することが報告されている［１０、１２、３３］。これらの観察は、ＣＲＥＢシグナル経路を増強し、ＮＯ活性化カスケードを介して作用する薬剤は、ＡＤの治療に対する可能性を有することを表す。
【０１３７】
中枢神経系疾患のために最適化されたＰＤＥ５阻害剤
【０１３８】
いずれの市販のＰＤＥ５阻害剤も、ＡＤ等の中枢神経系の慢性疾患に対する投与に必要とされる特徴を有するようには開発されていなかった。したがって、幾つかの実施形態において、本発明は、中枢神経系疾患を治療するために最適化された化合物を作成する１つ以上の特徴を有することに基づいて、薬剤又は化合物を選択することを含む、ＡＤ（もしくは他のＡβ蓄積に関する状態）の治療のための薬剤又は化合物を同定するための方法を提供する。例えば、特徴は、約１００ｎＭを越えないＩＣ50；他のＰＤＥに対してよりも、ＰＤＥ５に対して少なくとも５０倍大きい選択性；約５０ｎＭを越えないＩＣ５０を有するインビトロでのＰＤＥ５阻害活性、ＢＢＢを透過する能力；少なくとも約２０％（又は少なくとも約８０％）ｃＧＭＰを加水分解する能力；化合物とヒドロキシル基である第２の架橋リガンドを有するＰＤＥ５との間の相互作用；ならびに化合物とアミノ酸残基Ｆ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせでのＰＤＥ５との接触を含むＰＤＥ５との間の相互作用を含み得る。
【０１３９】
幾つかの実施形態において、本発明は、Ａβ蓄積に関連する状態の治療のための薬剤又は化合物を同定又は設計するための方法を提供し、コンピューター支援医薬品化学方法が、上述の特徴の１つ以上を満足させる、かつ／又は本明細書で説明される様々なバイオアッセイの強度に適するために合わせて作られた薬剤又は化合物を、同定及び／又は設計するために使用される。
【０１４０】
幾つかの実施形態において、本発明は、既存のＰＤＥ５阻害剤の構造活性関係（ＳＡＲ）特徴の徹底解析を通して同定された４つの足場構造に基づいて、ＰＤＥ５阻害剤化合物を提供する。足場構造は、未来の化合物の発達のためのリードとして役立ち、かつ役立ち続けるであろう［実施例３を参照されたい］。４つの足場構造に基づいて化合物は、上記の［００９１］項で説明された特徴の１つ以上を有する、及び／又はＡβ蓄積の動物モデル（ＡＰＰ／ＰＳ１マウス等）中のβセクレターゼ活性又は発現の低下を引き起こすそれらの能力を求めてスクリーンされ得る。
【０１４１】
本発明は、異常に上昇したアミロイドβプラークを示す対象を治療するために使用することができる化合物を、同定するための方法を提供する。加えて、本発明は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、封入体筋炎、又は脳アミロイド血管症、高血圧、及び勃起不全の治療のために使用できる化合物を同定するための方法を提供する。方法は、ＰＤＥ５ポリペプチド分子に結合できる及び／又はＰＤＥ５の生物活性又はその発現への阻害効果を有する試験化合物又は薬剤（例えば、ペプチド（抗体又はその断片等の）、小さい分子、核酸（ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ等の）、もしくは他の薬剤）の同定を含むことができ、その後、これらの化合物は、セクレターゼ活性を調節及び／又はＡβ沈着物を低下することができるかを決定する。一実施形態において、化合物はＰＤＥ５阻害剤である。
【０１４２】
本明細書に見られる「調節」という用語は、タンパク質分子の活性又は発現における変化を指す。例えば、調節は、タンパク質活性、結合特徴、又はセクレターゼタンパク質分子のいずれの他の生物学的、機能的、もしくは免疫学的特性における、増加あるいは低下を引き起こすことができる。
【０１４３】
一実施形態において、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、ホスホジエステラーゼタンパク質に結合するＰＤＥ５タンパク質のペプチド断片であり得る。例えば、ＰＤＥ５分子は、配列番号１又は配列番号２の少なくとも約８連続アミノ酸のいずれの部分も包含できる。断片は、配列番号１又は配列番号２の少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約６０アミノ酸、又は少なくとも約７５アミノ酸を含むことができる。
【０１４４】
配列番号１は、ＰＤＥ５酵素（残基１〜８７５、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第ＡＡＩ２６２３４）に対応するヒト野生型アミノ酸配列である：
2012513464.tif 000002
【０１４５】
配列番号２は、ＰＤＥ５酵素（残基１〜８６５、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第ＮＰ＿７００４７１）に対応するマウス野生型アミノ酸配列である：
2012513464.tif 000003
【０１４６】
断片は、約８〜１００アミノ酸までを含む、全ての可能なアミノ酸の長さを含む、例えば、長さ約１０〜１００アミノ酸、約１５〜１００アミノ酸、約２０〜１００アミノ酸、約３５〜１００アミノ酸、約４０〜１００アミノ酸、約５０〜１００アミノ酸、約７０〜１００アミノ酸、約７５〜１００アミノ酸、又は約８０〜１００アミノ酸である。これらのペプチド断片は、商業的に得ることができるか、もしくは液相又は固相合成方法を通して合成され得る（Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。ＰＤＥ５ペプチド断片は、自然源、遺伝子改変、又は化学的調製から単離され得る。これらの方法は、当技術分野においてよく知られている。
【０１４７】
また、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、ホスホジエステラーゼ酵素、ＰＤＥ５に対する、抗体（単クローン、ポリクローナル、ヒト化等）又はその結合断片等のタンパク質であり得る。抗体断片は、全長形態の他に、抗体の形態であり得、操作された抗体断片に加えて、全長抗体範囲内で存在する部分又は成分を含む。抗体断片は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、Ｆｖ、及び（Ｆａｂ′）２、三重特異性抗体、Ｆｃ、Ｆａｂ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、変数領域、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、二機能性雑種抗体、フレームワーク領域、定常部等（Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９−７６、Ｈｕｄｓｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：３９５−４０２、を参照されたい）を含むことができるが、それらに限定されない。抗体は、商業的に得ることができ、カスタム生成され得る、もしくは当技術分野において樹立された方法に従って、目的の抗原に対して合成され得る（Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。
【０１４８】
ＰＤＥ５タンパク質をコード化するＲＮＡの阻害は、ＲＮＡが転写されるもののＰＤＥ５遺伝子の発現を効果的に調節できる。阻害剤は、ＲＮＡ又はＲＮＡｉを干渉するｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが転写されたＤＮＡ、リボザイム、及びＲＮＡ、ＤＮＡ又は人工核酸であり得るアンチセンス核酸を含む群より選択される。
【０１４９】
アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ／ＲＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡに結合することによって、タンパク質翻訳を防止することによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基の、及びＤＥ５ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列のユニーク領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のフォスフォジエステル技術によって、合成することができる（Ｄａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．１２（４）：ＲＡ６７−７４、Ｋａｌｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：１７３−９６；Ｌｕｔｚｅｌｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：２４３−５９）。
【０１５０】
ｓｉＲＮＡは、約１５〜約５０個の塩基対、例えば約２１〜約２５個の塩基対を含有し、細胞内の発現された標的遺伝子もしくはＲＮＡと同一、又はほぼ同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。アンチセンスヌクレオチド配列は、モルフォリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等、を含むが、それらに限定されない。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが転写されたＤＮＡは、Ｕ６プロモーター等のプロモーターを含有する。これらのＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡとして機能できるｓｉＲＮＡ又は直鎖ＲＮＡとして機能できる、細胞中の小さなヘアピンＲＮＡを産生するために転写できる。ＰＤＥ５阻害剤化合物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、又は標的ＲＮＡ及び／又は遺伝子が阻害されるのに好適ないずれの組み合わせを含有できる。加えて、核酸のこれらの形態は、単鎖、二本鎖、三本鎖、又は四本鎖であり得る。（例えば、Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８  ４２９、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４  ４９８、及びＰＣＴ公報番号国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／３６６４６号、国際公開第９９／３２６１９号、国際公開第００／０１８４６号、国際公開第０１／２９０５８号、国際公開第９９／０７４０９号、国際公開第００／４４９１４号）。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、ＰＤＥ５阻害剤は、ホスホジエステラーゼタンパク質（例えば、ＰＤＥ５タンパク質）に結合し、その機能を破壊する小分子であり得る。小分子は、概して、低分子量を有する合成及び天然物質の多種多様な群である。それらは、自然源（例えば、植物、真菌、微生物等）から単離され得、商業的に得ることができ、及び／又はライブラリー、又はコレクション、又は合成として利用可能である。ＰＤＥ５を阻害する候補小分子は、インシリコでのスクリーニング、又はコンビナトリアルラブラリーのハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニングを介して同定できる。アスピリン、ペニシリン、及び多くの化学療法剤等の多くの従来の医薬品は、小分子であり、商業的に得ることができ、化学的に合成することができ、又は以下で説明されるように、ランダム又はコンビナトリアルラブラリーから得ることができる（Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ５（１）：３２−６）。
【０１５２】
ＰＤＥ５ポリペプチド等の目的の分子の第１の配列の知識、及び同一ＰＤＥファミリー（ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ６、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０、又はＰＤＥ１１等）の他のタンパク質を伴う配列の類似性は、目的のタンパク質へ、阻害剤又は拮抗薬として情報を提供できる。拮抗薬の同定及びスクリーニングは、タンパク質の構造的特徴を決定することによって、例えば、Ｘ線結晶解析、中性子回折法、核磁気共鳴分析法、及び構造決定のための他の技術を使用して、さらに促進できる。これらの技術は、タンパク質刺激薬に加えて、合理的設計、又は拮抗薬の同定を提供する。
【０１５３】
本発明は、アミロイドβペプチド沈着物の蓄積、かかるＡＤ、に関連する状態を治療するために使用される化合物をスクリーニング及び同定するための方法を提供する。一実施形態において、その方法は、アミロイドβペプチド沈着物の蓄積の動物モデルへのＰＤＥ５阻害剤化合物の投与の完了後少なくとも１ヶ月間、セクレターゼ活性を調節できるＰＤＥ５阻害剤化合物を選択すること、を含む。別の実施形態において、方法は、以下の１つ、又は双方の特徴を含むＰＤＥ５阻害剤化合物を選択することを含む：（ａ）該化合物は、ホスホジエステラーゼタンパク質の２個以上のアミノ酸残基と相互作用し、前記アミノ酸残基はＦ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせを含む、あるいは（ｂ）該化合物と、ホスホジエステラーゼタンパク質との間の第２の架橋リガンド（ＢＬ２）はＯＨ−である。別の実施形態において、方法は、以下の１つ以上の特徴を有するＰＤＥ５阻害剤化合物を選択することを含む：（ａ）化合物のＩＣ50は約１０００ｎＭを越えない、（ｂ）化合物の選択性は、ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ６、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０、又はＰＤＥ１１と比較して、ＰＤＥ５に対して、少なくとも５０倍大きな効力である、（ｃ）化合物のインビトロでのＰＤＥ５阻害活性は約５０ｎＭを越えないＩＣ50を有する、（ｄ）化合物は血液脳関門を透過する、（ｅ）化合物は、ｃＧＭＰを約２０％〜約８０％加水分解する、（ｆ）化合物と、ホスホジエステラーゼタンパク質との間の第２の架橋リガンド（ＢＬ２）はＯＨ−である、又は（ｇ）該化合物は、ホスホジエステラーゼタンパク質の２個以上のアミノ酸残基と相互作用し、アミノ酸残基はＦ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態において、その化合物、例えば、ＰＤＥ５阻害剤は、少なくとも約０．１ｎＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約５ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約２５ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約２００ｎＭ、少なくとも約３００ｎＭ、少なくとも約４００ｎＭ、少なくとも約５００ｎＭ、少なくとも約６００ｎＭ、少なくとも約７００ｎＭ、少なくとも約８００ｎＭ、又は少なくとも約９００ｎＭを有する。別の実施形態において、インビトロでのＰＤＥ５阻害活性は、少なくとも約０．１ｎＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約５ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約１５ｎＭ、少なくとも約２０ｎＭ、少なくとも約２５ｎＭ、少なくとも約３０ｎＭ、少なくとも約３５ｎＭ、少なくとも約４０ｎＭ、少なくとも約４５ｎＭであるが、約５０ｎＭを越えないＩＣ50を有する。幾つかの実施形態において、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、血液脳関門を透過するために、分子量約５００Ｄａ未満を有することができる。他の実施形態において、ＰＤＥ５阻害剤化合物は、極性表面積約９０Å2未満を有することができ、血液脳関門を透過するために、８個又はそれより少ない水素結合を有するべきである。化合物のスクリーニング及び同定は、インシリコスクリーニング、分子ドッキング、インビボスクリーニング、インビトロスクリーニング、又はそれらの組み合わせ���含むことができる。
【０１５４】
ＰＤＥ５阻害剤化合物等の試験化合物は、合成又は天然化合物の大きなライブラリーからスクリーニングされ得る（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，１４（２）：１３３−５５、Ｍａｎｎｈｏｌｄ（２００６）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，６（１０）：１０３１−４７、及びＨｅｎｓｅｎ（２００６）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １３（４）：３６１−７６を参照されたい）。多数の手段は、ペプチド、及び核酸に基づく化合物のランダム及び定方向合成のために、現在使用されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ化学的Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，Ｎ．Ｈ．）、及びＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）より商業的に入手可能である。まれな化学的ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）より入手可能である。代替的に、細菌性、真菌性、植物性、及び動物性抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、例えば、Ｐａｎ研究室ｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）又はＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（Ｎ．Ｃ．）より入手可能であり、容易に産生可能である。加えて、天然及び合成的に産生されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的な、及び生化学的手段を通して、容易に修飾される（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｔｉｂ  Ｔｅｃｈ  １４：６０）。
【０１５５】
分子のライブラリーを調製するための方法は、当技術分野においてよく知られており、多くのライブラリーは商業的に入手可能である。本発明における目的のライブラリーは、ペプチドライブラリー、ランダム化オリゴヌクレオチドライブラリー、合成有機コンビナトリアルライブラリー等を含む。縮重ペプチドライブラリーは、細菌性鞭毛ペプチドディスプレイライブラリーとして、又はファージディスプレイライブラリーとして固定化形態で、溶液中で容易に調製することができる。ペプチドリガンドは、少なくとも１個のアミノ酸を含有するペプチドのコンビナトリアルラブラリーから、選択することができる。ライブラリーは、合成されたペプトイド及び非ペプチド合成部分であり得る。かかるライブラリーをさらに合成することができ、それは、それらの自然発生の対応物と比較して、酵素分解に供じにくい非ペプチド合成部分を含有する。また、ライブラリーは、例えば、プラズミド上ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｏｎ−ｐｌａｓｍｉｄ）ライブラリー、ポリソームライブラリー、アプタマーライブラリー、合成ペプチドライブラリー、合成小分子ライブラリー、神経伝達物質ライブラリー、及び化学的ライブラリーを含むが、これらに限定さないことを意図する。また、ライブラリーは、環状炭素、もしくはヘテロ環状構造、及び／又は本明細書で説明される機能的基の１つ以上で置換される芳香族又は多環芳香族構造も含むことができる。
【０１５６】
また、小分子コンビナトリアルラブラリーは、生成され得、スクリーニングされ得る。小さな有機化合物のコンビナトリアルライブラリーは、多様性の１つ以上点において互いとは異なる、密接に関する類似体のコレクションであり、多段階プロセシングを使用した有機技術によって合成される。コンビナトリアルラブラリーは、膨大な数の小さな有機化合物を含む。コンビナトリアルライブラリーの一タイプは、化合物アレイを産生するための平行合成方法の手段によって、調製される。化合物アレイは、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ座標中のそれらの空間アドレスによって同定可能な化合物のコレクションであり得、それぞれの化合物は、分子のコア及び１つ以上の可変性の構造的多様性エレメントを有するように配置され得る。そのような化合物アレイ中の化合物は、別々の反応槽中に、それらの空間アドレスによって同定、追跡されたそれぞれの化合物と共に、平行に産生される。平行合成混合物及び平行合成方法の実施例は、１９９４年１月５日に提出された米国特許出願第０８／１７７，４９７号、及び１９９５年７月１３日に公開されたその対応するＰＣＴ公開された特許出願国際公開第９５／１８９７２、及び１９９８年１月２７日に付与された米国特許第５，７１２，１７１号、及びその対応するＰＣＴ公開された特許出願国際公開第９６／２２５２９号に提供され、参照により組み込まれる。
【０１５７】
化学的に合成されたライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４、Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）：１２３３−１２５１、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６、Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４１２、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８、Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２、１９９３年１０月１４日出願のＰＣＴ公報番号国際公開第９３／２０２４２号、及びＢｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３に説明される。
【０１５８】
ファージディスプレイライブラリーの実施例は、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０、Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８、Ｌｅｎｓｔｒａ，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５、及びＰＣＴ公報番号国際公開第９４／１８３１８号に説明される。
【０１５９】
インビトロ翻訳に基づくライブラリーは、ＰＣＴ公報番号国際公開第９１／０５０５８、及びＭａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６に説明されるものを含むが、それらに限定されない。
【０１６０】
一非限定的例において、ベンゾジアゼピンライブラリー等の非ペプチドライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２を参照されたい）は、スクリーニングされ得る。また、Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１に説明されるもの等のペプトイドライブラリーも、使用され得る。ペプチド中のアミド機能性が、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成するためにペルメチレン化されている、使用され得るライブラリーの別の実施例は、Ｏｓｔｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−１１１４２に説明される。
【０１６１】
活性部位の三次元幾何構造、例えば、ＰＤＥ５ポリペプチドのそれは、完全な分子構造を決定できるＸ線結晶解析等の、当技術分野において知られている方法によって決定され得る。固相又は液相ＮＭＲは、特定の分子内距離を決定するために使用され得る。構造決定のいずれの他の実験方法も、部分的な又は完全な幾何構造を得るために、使用され得る。幾何構造は、決定された活性部位構造の正確性を増加できる、自然又は人口の複合型リガンドを用いて測定することができる。一実施形態において、ＰＤＥ５タンパク質に結合する化合物は、：（１）試験化合物の電子ライブラリーを提供すること、（２）表１に列挙される、ＰＤＥ５の活性部位に対して少なくとも２０個のアミノ酸残基の原子座標を提供すること、その座標は、そこからＣα原子の少なくとも５０％に関し、約２Åを越えない、標準偏差をコンピューター可読のフォーマットで有する（ＰＤＢ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．１ＲＫＰを参照されたい）、（３）ＰＤＥ５タンパク質の三次元モデルを生成するため、コンピュータープロセッサによって可読な電気シグナルへと原子座標を転換すること、（４）データ処理方法を行うことと、（該ライブラリーからの電子試験化合物はＰＤＥ５タンパク質の三次元モデル上にドッキングされる）、（５）いずれの試験化合物がＰＤＥ５タンパク質の三次元モデルの活性部位に適合するかを決定すること、それによって、どの化合物がＰＤＥ５に結合するかを同定すること、を通して同定され得る。別の実施形態において、その方法は、ＰＤＥ５タンパク質の活性部位をドッキングするために決定された化合物を合成すること、又は得ること、結合に好適な条件下でＰＤＥ５タンパク質を化合物に接触させることと、化合物がＰＤＥ５タンパク質発現又はｍＲＮＡ発現、もしくはＰＤＥ５タンパク質活性を、診断アッセイを使用して調節するかを決定すること、をさらに含む。
【０１６２】
表１．ホスホジエステラーゼＶ型結晶の残基の原子座標（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｅｘｐｌｏｒｅ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｄｏ？ｓｔｒｕｃｔｕｒｅＩｄ＝１ＲＫＰを参照されたい）。
【表１−１】
2012513464.tif 000004
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【０１６３】
タンパク質配列中のタンパク質立体構造の変化への効果を予測するための方法は、当技術分野において知られており、したがって当業者は、知られている方法に従って拮抗薬として機能する変異体を設計できる。そのような方法の一実施例は、タンパク質のデノボ設計を説明する、Ｄａｈｉｙａｔ  ａｎｄ  Ｍａｙｏ  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７８：８２  ８７に説明される。方法は、ポリペプチド配列の一部のみ変える、知られているタンパク質に適用され得る。同様に、Ｂｌａｋｅ（米国特許第５，５６５，３２５）は、同様の、又は修飾された機能を伴う変異体を予測し、合成するために、知られているリガンド構造の使用を教示する。
【０１６４】
標的に結合するペプチドを調製、又は同定するための他の方法は、当技術分野において知られている。分子インプリントは、例えば、分子に結合するペプチド等の巨大分子構造のデノボ構成のために、使用できる。例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｊ．Ｓｈｅａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｔｈｅ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｉｔｅｓ，ＴＲＩＰ  Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．５，Ｍａｙ  １９９４、Ｍｏｓｂａｃｈ，（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９（９）、及びＷｕｌｆｆ，Ｇ．，ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ（Ｆｏｒｄ，Ｗ．Ｔ．，Ｅｄ．）ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．３０８，ｐｐ  １８６−２３０，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８６）を参照されたい。ＰＤＥ５阻害剤の模倣物を調製するための一方法は、（ｉ）望まれる活性を示す既知の基質（鋳型）周囲の機能的モノマーの重合、（ｉｉ）鋳型分子の除去、及び次いで（ｉｉｉ）鋳型のものと同様である１つ以上の望まれる特性を示す新規分子を提供するための、鋳型によって残された空隙中のモノマーの第２のクラスの重合、のステップを含む。また、ポリサッカライド、ヌクレオチド、薬物、核タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、糖タンパク質、ステロイド、脂質、及び他の生物活性物質等の他の結合分子が、調製され得る。この方法は、機能的モノマーのフリーラジカル重合によって調製されるため、それらの自然対応物よりも安定している様々な生物学的模倣物を設計するのに有用であり、非生分解性骨格を伴う化合物をもたらす。かかる分子を設計するための他の方法は、例えば、多数の化合物及び分子モデルの合成、及び評価を必要とする構造活性関係に基づいた薬物設計を含む。
【０１６５】
また、本発明は、ＰＤＥ５タンパク質に結合する化合物を同定するためのインビボ及びインビトロ方法を提供する。一実施形態において、その方法は、（ａ）組織及び／又はＰＤＥ５タンパク質を発現する細胞を得ること、（ｂ）効果的な期間、組織及び／又は細胞をリガンド源に接触させること、（ｃ）第２のメッセンジャーの応答を測定すること、ただしその応答がＰＤＥ５タンパク質に結合するリガンドを示す、（ｄ）リガンド源からリガンドを単離することと、（ｅ）ＰＤＥ５タンパク質を結合するリガンドの構造を同定すること、それによってＰＤＥ５タンパク質に結合し得る化合物を同定すること、を含む。本明細書で使用されるように、用語「リガンド源」は、本明細書で説明されるいずれの化合物ライブラリー、又はＰＤＥ５の刺激薬もしくは拮抗薬として作用し得る化合物を求めてスクリーニングするために使用できる、神経伝達物質のライブラリーであり得る。本明細書に列挙される、インビボ動物研究との組み合わせでのスクリーニング化合物ライブラリー［また、参照によってその全体が組み込まれる米国特許出願公報第２００５／０００９１６３号も参照されたい］、ならびに機能的及びシグナルアッセイは、ＡＤ等の異常Ａβ沈着物を患っている、対象を治療するために使用できるＰＤＥ５阻害剤化合物を同定するために、使用できる。
【０１６６】
ＰＤＥ５阻害剤化合物は、ＰＤＥ５分子インビボ及び／又はインビトロの活性及び／又は発現を低下する化合物であり得る。ＰＤＥ５阻害剤化合物は、発現を介する、翻訳後の修飾を介する、又は他の手段によるＰＤＥ５の活性へのそれらの効果を発現する化合物であり得る。一実施形態において、ＰＤＥ５阻害剤は、ＰＤＥ５タンパク質又はｍＲＮＡ発現、もしくはＰＤＥ５活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、又は１００％低下させ得る。
【０１６７】
ＰＤＥ５分子に結合する、かつ／又はＰＤＥ５分子の活性又は発現への刺激又は阻害効果を有する試験化合物又は薬剤を、様々なアッセイによって、同定することができる。そのアッセイは、試験化合物又は知られているＰＤＥ５リガンドの、ＰＤＥ５タンパク質の活性部位への結合の直接又は間接測定を含む結合アッセイであり得る。また、そのアッセイは、ＰＤＥ５分子の活性の直接又は間接測定を含む活性アッセイであり得る。また、そのアッセイは、ＰＤＥ５ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の直接又は間接測定を含む発現アッセイであり得る。様々なスクリーニングアッセイは、ＡＤ等の神経変性疾患の動物モデルの認知及びシナプス機能への試験化合物の効果を測定することを含むインビボアッセイと組み合わせることができる。ＰＤＥ５阻害剤の活性は、ＮＯ経路の下流の第２のメッセンジャーにおける変化を検出する等の、様々な手段で測定できる［図１９を参照されたい］。その変化は、細胞内環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）濃度、細胞内ＧＴＰ濃度、細胞内タンパク質キナーゼＧ（ＰＫＧ）濃度、ＣＲＥＢの細胞内リン酸化、又はそれらの組み合わせ中であり得る。例えば、ＰＤＥ阻害剤の投与に続き、ｃＧＭＰレベルの増加が観察される場合、阻害剤又は透析液中にその代謝物が検出される場合、その試験化合物が活性、したがってＰＤＥ５阻害剤であると見なされるであろう。
【０１６８】
また、本発明のスクリーニング方法の診断アッセイは、ＰＤＥ５分子の発現を監視することを含み得る。例えば、ＰＤＥ５分子の発現の阻害剤は、ＰＤＥ５陽性細胞又は組織を試験化合物と接触させる、その細胞中のＰＤＥ５タンパク質又はＰＤＥ５ｍＲＮＡの発現を決定することを通して同定することができる。試験化合物の存在下でのＰＤＥ５のそのタンパク質又はｍＲＮＡ発現レベルを、試験化合物の不在下でのＰＤＥ５のそのタンパク質又はｍＲＮＡ発現レベルと比較する。その試験化合物を、次いでこの比較に基づいて、ＰＤＥ５発現の阻害剤として同定することができる。例えば、ＰＤＥ５タンパク質又はｍＲＮＡの発現は、試験化合物の不在下よりも存在下において統計学的にあるいは有意に小さい場合、その化合物は、阻害剤のＰＤＥ５タンパク質又はｍＲＮＡの発現として同定される。言い換えれば、また、その試験化合物も、ＰＤＥ５阻害剤化合物（拮抗薬等の）であると言うことができる。細胞中のＰＤＥ５タンパク質又はｍＲＮＡのその発現レベルを、本明細書で説明される方法によって決定することができる。
【０１６９】
ＰＤＥ５分子、又は本明細書で説明されるＰＤＥ５変異体等の、その変異体に結合する試験化合物の能力を決定することは、実時間の二分子の相互作用解析（ＢＩＡ）を使用して達成することができる［ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，（１９９２）、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，（１９９１）］。ＢＩＡは、相互作用のいずれも標識することなく、実時間で生体分子特異的相互作用を研究するための科学技術である（例えば、ＢＩＡ−ｃｏｒｅ（商標））。光学的現象表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）の変化は、生物学的分子間の実時間反応の示唆として使用することができる。
【０１７０】
既知のＰＤＥ５阻害剤の構造活性関係（ＳＡＲ）
【０１７１】
既存のＰＤＥ５阻害剤の化学構造の解析は、それらを以下のクラスに分けることができることを明らかにした、１）シルデナフィル及びバルデナフィルによって表されるｃＧＭＰに基づく分子、２）タダラフィルによって表されるβカルボリン由来分子、３）ピラゾロピリジン、フタラジン、及びキノリン誘導体、４）イソキナゾリノン及びイソキノリノン誘導体。
【０１７２】
シルデナフィル及びバルデナフィル（Ｂａｙｅｒ社よりＬｅｖｉｔｒａ）によって例証されるように、ｃＧＭＰに基づくＰＤＥ５阻害剤は、ｃＧＭＰの単純類似体であり、ｃＧＭＰのプリン環上で窒素等のヘテロ原子の数及び位置においてのみ異なる（図４３）。これらの早期のＰＤＥ５阻害剤は、良好な効力を表すが、ＰＤＥ１及びＰＤＥ６よりも乏しい選択性を有する。例えば、ＰＤＥ５のＩＣ50は、シルデナフィル及びバルデナフィルのそれぞれ１０ｎＭ及び５ｎＭであるが、ＰＤＥ６／ＰＤＥ５選択性比は、シルデナフィルで１２のみ、バルデナフィルで３．５のみである［Ｂｏｓｃｈｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００１．４４（５）：ｐ．８２２−３３、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２０００．１０（２１）：ｐ．２４７７−８０］。シルデナフィル及びバルデナフィルは、それらの多環式コア間の差異に基づいて、化学構造の完全に異なるクラスを表すが、これら２個の化合物は、有意な構造的類似性を共有し、それはそれらの双方が乏しい選択性と有するという事実を説明する。シルデナフィル及びバルデナフィルへの着手の成功に伴い、ピラゾロピリミジノンコア構造（例えば、Ｄｏｎｇ−Ａ  Ｐｈａｒｍ社よりＵｄｅｎａｆｉｌ）に基づいて、新規ＰＤＥ５阻害剤を開発する多数の試みが行われてきた。残念ながら、新しく設計された化合物の大抵は、たとえそれらが優れたＰＤＥ５阻害剤であったとしても、ＰＤＥ６を越える乏しい選択性をシルデナフィルから受け継いだ。選択性を改善するために、幾つかの群は、シルデナフィルのフェニル環上の修飾を調査した。フェニルのピリジンへの形質転換と組み合わせたシルデナフィルのピラゾロ部分の置換パターンを変化することによって、選択性を改善した。また、化合物のこのクラスは、ピラゾロピリミジノンの６位置で窒素上に導入された、窒素又は酸素を含有する置換基を特徴付けた、それは高いＰＤＥ５効力及び選択性対最大２４８２倍のＰＤＥ６を有する［Ｂａｒｒｉｏｓ  Ｓｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２００４．１４（９）：ｐ．２１５５−８］（図４３中のＰｆ−１  、ならびに、例えば、国際公開第２００２０７４７７４号、国際公開第２００２０７４３１２号、欧州特許第９９５７５０号、国際公開第９８４９１６６号、欧州特許第９９５７５１号、国際公開第９３０７１４９号；欧州特許第６３６６２６号；米国特許第５２９４６１２号、欧州特許第１０９２７１８号、国際公開第９９２４４３３号；米国特許第２００３１９９６９３号）。しかしながら、化合物のこのクラスの残存するＰＤＥ、ならびにＰＫ、ＢＢＢ透過、及び毒性プロファイルの選択性は知られていないことは留意されるべきである。
【０１７３】
βカルボリンを特徴付ける分子は、ＰＤＥ５阻害剤の第２のクラスの基礎を構成する。エチルβ−カルボリン−３−カルボン酸（β−ＣＣＥ）は、わずかに選択的なヒダントイン、及び最終的にタダラフィルへと導いた、弱い、非選択的ＰＤＥ５阻害剤であった（Ｌｉｌｌｙ社よりＣｉａｌｉｓ；図４４）。タダラフィルは、１０００を越えるＰＤＥ５／ＰＤＥ１〜４及びＰＤＥ５／ＰＤＥ６の選択性を伴うが、精子形成及び受精の可能性を変化できるＰＤＥ１１（〜５）の乏しい選択性を伴う、非常に強力であり（ＩＣ50＝５ｎＭ）、非常に選択的なＰＤＥ５阻害剤である［Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２００７．１７（２１）：ｐ．５８８６−９３；Ｍａｓｌｉａｈ，Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ，１９９５．１０（２）：ｐ．５０９−１９］。ＡＤ薬物のためである場合、生殖機能障害が主要な問題を表す可能性は低く、タダラフィルの別の副作用である背痛が、老年人口における慢性使用の大きな問題と成り得る［Ｓｅｌｋｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２．２９８（５５９４）：ｐ．７８９−９１；Ｓａｎｔ’Ａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，２００３．２８（７）：ｐ．１００９−１５；Ｂｌｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３．３６１（６４０７）：ｐ．３１−９；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１９９７．８（１５）：ｐ．３２１３−７］（偶発的に、この副作用が、ＰＤＥ１１又は他のオフターゲット分子の阻害のためであるかは明白ではない）。ＳＡＲ研究は、ＮＨ基が必須であることを示唆している。窒素のアルキル化又は硫黄による窒素の置換は、活性を消失し、必須Ｈ結合ドナーとしてのＮＨの役割と一致する。また、ＳＡＲも、疎水性芳香族環（３，４−メチレンジオキシフェニル）が、高い効力のために必要不可欠であることを示唆した。ＰＤＥ５は、ヒダントインのイミド窒素ならびにタダラフィルの遊離ピペラジンジオン窒素で、広域の範囲の置換基を許容する。少なくとも、１つのカルボニル基は重要である。いずれか１つの除去が、わずかにのみ有害であるにもかかわらず、双方の欠失は顕著に効力を低下する［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２０００．１０（２１）：ｐ．２４７７−８０］。それでもなお、ＰＤＥ１１、背痛、及びＢＢＢを通過する能力の無さ（ｃｌｏｇＰ＝１．４３；ほとんど酸性であるＮＨ基は、それらの活性に対して必須であるが、化合物を極性にはできず、その結果として、ＢＢＢを透過することが困難である）に関連した乏しい選択性の問題（克服されなかった）、のため、この化合物が、ＡＤ薬物を開発するための基礎としての役割を果たすことができる可能性は低い。
【０１７４】
また近年、一連のピリミジニルピロロキノロンも、強力及び選択的なＰＤＥ５阻害剤としてＪｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ（ＪＪ）によって、開発された。ＪＪ１の合成の際（図４４）、ピロロキノロンＪＪ２を微量副産物として形成した。高いＮＨの酸性度（ｐＫａ〜９）が、ＰＤＥ５との水素結合のその傾向を増加させるため、ＰＤＥ５に対するＪＪ２の効力は、βカルボリン及びＪＪ１を越えた（［Ｆｒｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ，２００１．８５（２）：ｐ．７０８−１３］，国際公開第２００１０８７８８２号）。ＪＪ２は、ＥＤのイヌモデルにおいて、非常に良好な効力、優れた選択性及びインビボ有効性を表したが、乏しい溶解性が、この化合物のさらなる使用を妨げた。タダラフィル及び類似体に対するＳＡＲと同様に、ピロール窒素上で置換基の広域範囲に対する許容度は、効力及び選択性を保持すると同時に、溶解性及び吸収等の望まれる物理的及び化学的特性を発達させることを可能とした。結果として、ＪＪ３は、オスラットにおいて３０％を越える経口生物学的利用率、ならびにＥＤのイヌモデルにおいて良好なインビボ有効性を発達させ、表した［Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９９．３８２（３）：ｐ．１６７−７５；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００１．２１（４）：ｐ．１３２７−３３］。追加の特徴（完全なＰＤＥ選択性プロファイル、ＰＫ、ＢＢＢ透過）は知られていない。
【０１７５】
さらなる別の一連の構造において、ＢＭＳ１を、強力なＰＤＥ５阻害剤として報告（ＩＣ５０＝１ｎＭ、図４５）。鋳型としてＢＭＳ１を使用し、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒ  Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）はＢＭＳ２（図３）を、シルデナフィル（ＩＣ５０＜０．８ｎＭ）と比較して改善された効力及び選択性を伴うＰＤＥ５阻害剤として同定した（（Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００１．２１（１５）：ｐ．５７０３−１４）、国際公開第２００００１５２２２号）。ＢＭＳ２のＸ線構造は、ベンジルアミン−ＮＨ−が、アミドカルボニルとの水素結合を形成したことを表した。Ｅｉｓａｉの強力なＰＤＥ５阻害剤Ｅ１の構造と関連した（図４５、ＩＣ50＝０．５６ｎＭ）、ＥＣ50＝１３ｎＭ）（Ｖｉｔｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２００２．９９（２０）：ｐ．１３２１７−２１、国際公開第９８０７４３０号）この観察は、ＢＭＳの科学者を、化合物を束縛された立体構造及びピラゾロピリドピリダジン足場を用いて設計することへと導き、シルデナフィルのそれらより優れたＰＤＥ１及びＰＤＥ６アイソザイム選択性を伴う、強力なＰＤＥ５阻害剤ＢＭＳ３（ＩＣ50＝０．３ｎＭ、ＥＣ50＝１３ｎＭ、図４５）を得た。注目すべきことに、ＢＭＳ３は、２つの動物種において、視覚障害等の、少ないＰＤＥに関する副作用を伴い望ましいＰＫプロファイルを有した（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２．４１６（６８８０）：ｐ．５３５−９）。より近年、ＢＭＳ及び日本企業は、ＢＭＳ２及びＥ１の重要な特徴の組み合わせが、ＢＭＳ４により解説されるキノリン一連の誘導体へと導くことを独立して報告した。ＢＭＳ４は、今までで、最も強力及び選択的なＰＤＥ５阻害剤であり、シルデナフィルよりも３０倍さらに強力であり、他のＰＤＥアイソザイムに対してシルデナフィルよりもより有意に選択的である（ＩＣ５０＝０．０５ｎＭ、＞７８００選択性とＰＤＥ１〜６との対比）（Ｓｅｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅａｒｎ  Ｍｅｍ，１９９６．３（１）：ｐ．４２−８、国際公開第０１１２６０８，２００１号）。しかしながら、ＢＭＳ４は、完全なＰＤＥ特異性プロファイル、ＡＤに対するＰＫプロファイル及びインビボ有効性を欠乏している。加えて、ベンジルアルコールの存在は、オフターゲット副作用への懸念をもたらす。したがって、ＹＦ０１２４０３は、本明細書で考察されるように開発された。
【０１７６】
ＰＤＥ５阻害剤に基づくｃＧＭＰへの追加の環の組み込みは、構造の新しいクラスを生成した。その平面３環系、Ｎ−３置換イミダゾキナゾリノンは、シルデナフィルと比較して、改善された効力及び選択性を表す（ＢＭＳ５、ＩＣ50＝０．５ｎＭ、ＰＤＥ１−３／ＰＤＥ５＞１０，０００、ＰＤＥ６／ＰＤＥ５  ６０、図４６）。中間環への別の窒素及びベンジル基の組み込みは、強力及び選択的ＰＤＥ５阻害剤の別のファミリーを形成し、ＢＭＳ６によって表される（ＩＣ50＝０．３１ｎＭ、＞１０，０００倍選択性とＰＤＥ１との対比及び１６０倍とＰＤＥ６との対比）（米国特許第２００２１３３００８号）。報告されるインビトロ特性に基づき、この足場は、ＰＤＥ５／ＰＤＥ６の値が６０に達するため、新規ＰＤＥ５阻害剤を開発することに関して、興味深い、しかしながら、また、ＰＤＥ６に対するＢＭＳ６のＩＣ50は約５０ｎＭであるため、この足場に由来する化合物も、幾つかのオフターゲット毒性をもたらし得、これらの誘導体が未だに良好なＰＤＥ６阻害剤であり得ることを示唆していることは、指摘される必要がある。
【０１７７】
ナフタレン類似体ＴＳ１は、日本企業によって、強力及び選択的ＰＤＥ５阻害剤として発見された（ＩＣ５０＝６．２ｎＭ、ＰＤＥ１−４／ＰＤＥ５＞１６０００；図４６）。ｃＧＭＰを用いたＴＳ１の上書きは、ＴＳ１のナフタレン環が、ｃＧＭＰのプリン核を有意に重複し、ＴＳ１の１位置でペンダントフェニル基が、ｃＧＭＰの環状リン酸基によって占有される空間を充填することを表す。この観察に基づき、強力及び選択的ＰＤＥ５阻害剤のクラスは、Ｔ１０３２によって解説されるように同定される（ＩＣ50＜１．０ｎＭ、ＰＤＥ１／ＰＤＥ５、１３００、ＰＤＥ２／ＰＤＥ５＞１００００、ＰＤＥ３／ＰＤＥ５＞１００００、ＰＤＥ４／ＰＤＥ５  ４７００、ＰＤＥ６／ＰＤＥ５  ２８；図４６）。Ｔ１０３２は、単離されたウサギ海綿体（ＥＣ50  ７．９ｎＭ）への最も強力な弛緩作用示す（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００２，４３６（１−２）：ｐ．８３−７、国際公開第９８３８１６８号、日本特許第２００００７２６７５号）。Ｔ１０３２のフェニル環への窒素原子の導入は、強力ＰＤＥ５阻害（ＩＣ50＝０．２３ｎＭ）及び他のＰＤＥｓ１〜４、６に対して優れたＰＤＥ５選択性（＞１００，０００倍選択性とＰＤＥ１〜４との対比、２４０倍選択性とＰＤＥ６との対比）を用いて解説されたＴ１０５６（図４６）、強力及び特異的ＰＤＥ５阻害剤の別の新しい構造的クラスをさらに導いた。この化合物は、シルデナフィル（ＥＣ50＝８．７ｎＭ）よりもさらに強力な、単離されたウサギ海綿体（ＥＣ５０＝５．０ｎＭ）への弛緩作用を表した［Ｕｋｉｔａ  ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２００３．１３（１４）：ｐ．２３４１−５．］。しかしながら、Ｔ１０５６はＰＤＥ６に対する５６ｎＭのＩＣ５０を有するため、ＢＭＳ６と同一の懸念が生じる。
【０１７８】
現在使用されるＡＤ治療法（アセチルコリンエステラーゼ阻害剤又はＮＭＤＡ拮抗薬）は、制限された有効性を有する。主要な試みは、濃縮体形成を阻害するため、炎症及び酸化障害と闘うため、β及びγセクレターゼを阻害又はセクレターゼを増加する薬剤の使用のいずれかによって、Ａβオリゴマー形成を阻害する薬物の使用によって、［Ｎａｋａｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００２．１３７（５）：ｐ．６７６−８２；Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００５．２５（１０）：ｐ．２４５５−６２］、又は脳からのＡの除去が増大することが見られる、Ａβ免疫化等の治療の使用によって［Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９９．４００（６７４０）：ｐ．１７３−７］脳のＡβ負荷を低下するために進行中である。しかしながら、ＡＰＰの役割、Ａβ４０、及び通常の生理的機能のセクレターゼ［Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９５．２８４（３）：ｐ．Ｒ１−３；Ｋｏｗａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９４．２０５（３）：ｐ．１８２９−３５、Ｍａｔｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，１９９９．７３（２）：ｐ．５３２−７］は、効果的及び安全なＡＤ治療へのアプローチを提供することにおける問題を、提示できる。
【０１７９】
中枢神経系障害に対して最適化された例示的ＰＤＥ５阻害剤化合物
【０１８０】
本発明は、ＰＤＥ５に結合する化合物を提供する。これらの化合物を、本明細書で説明されるスクリーニング方法及びアッセイによって同定することができ、ＰＤＥ５タンパク質の活性又は発現を阻害する。一実施形態において、本発明は、以下の式の化合物：
2012513464.tif 000042
を包含し、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０１８１】
一実施形態において、本発明は、式Ｉａ：
2012513464.tif 000043
の化合物を包含し、式中、
ＸはＣＲ又はＮであり、
それぞれＲは独立して、該環上の２、３、又は４位置で、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲン、Ｘと相対的である、
Ｒは独立して、該環上の２、３、４、５、又は６位置で、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０１８２】
一実施形態において、Ｒは−Ｈである。
【０１８３】
別の実施形態において、Ｒは−ＯＣＨ3等の−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。
【０１８４】
さらに別の実施形態において、Ｒは、ベンジル等の−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリールである。
【０１８５】
一実施形態において、ＸのＲ及び該環上のＲは異なる。
【０１８６】
別の実施形態において、Ｒ2は−Ｈである。
【０１８７】
一実施形態において、本発明は、式Ｉｂ：
2012513464.tif 000044
の化合物を包含し、式中、
ＸはＣＲ又はＮであり、
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ1は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールであり、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０１８８】
一実施形態において、Ｒは−Ｈである。
【０１８９】
一実施形態において、本発明は、式Ｉｃ：
2012513464.tif 000045
の化合物を包含し、式中、
ＸはＣＲ又はＮであり、
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ1は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールであり、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０１９０】
一実施形態において、Ｒは−Ｈである。
【０１９１】
一実施形態において、本発明は、式Ｉｄ：
2012513464.tif 000046
の化合物を包含し、式中、
ＸはＣＲ又はＮであり、
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ1は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールであり、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０１９２】
一実施形態において、Ｒは−Ｈである。
【０１９３】
一実施形態において、本発明は、式Ｉｅ：
2012513464.tif 000047
の化合物を包含し、式中、
ＸはＣＲ又はＮであり、
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ1は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールであり、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、ハロゲン、又はＣＯ2−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。
【０１９４】
一実施形態において、Ｒは−Ｈである。
【０１９５】
別の実施形態において、Ｒ2は−ＯＨである。
【０１９６】
さらなる実施形態において、Ｒ2は−Ｃｌ等のハロゲンである。
【０１９７】
一実施形態において、Ｒ3は−Ｈである。
【０１９８】
別の実施形態において、Ｒ4は、−ＣＯ2Ｍｅ等の−ＣＯ2−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。
【０１９９】
さらに別の実施形態において、Ｒ4は−Ｈである。
【０２００】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩａ：
2012513464.tif 000048
の化合物包含し、式中、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０２０１】
実施形態において、Ｒ2はフェニル等のアリールである。
【０２０２】
別の実施形態において、Ｒ1は−Ｈである。
【０２０３】
別の実施形態において、Ｒ3は−Ｈである。
【０２０４】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩｂ：
2012513464.tif 000049
の化合物を包含し、式中、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキル−Ｃ６−Ｃ１０アリール、−Ｃ６−Ｃ１０アリール、−Ｏ−Ｃ６−Ｃ１０アリール、又はハロゲンである。
【０２０５】
実施形態において、Ｃ６−Ｃ１０アリールは、-ＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルキル−Ｃ６−Ｃ１０アリール、−Ｃ６−Ｃ１０アリール、−Ｏ−Ｃ６−Ｃ１０アリール、又はハロゲンの１個以上で置換される。
【０２０６】
実施形態において、Ｒ2はフェニル等のアリールである。
【０２０７】
別の実施形態において、Ｒ2は、トルイル等の−Ｃ1−Ｃ6アルキルで置換される−Ｃ6−Ｃ10アリールである。
【０２０８】
一実施形態において、Ｒ1は−Ｈである。
【０２０９】
一実施形態において、Ｒ3は−Ｈである。
【０２１０】
別の実施形態において、Ｒ3は、イソプロピル等の−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。
【０２１１】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩｃ：
2012513464.tif 000050
の化合物を包含し、式中、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ2は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールである。
【０２１２】
一実施形態において、Ｒ1は−Ｈである。
【０２１３】
一実施形態において、Ｒ2は−Ｈである。
【０２１４】
別の実施形態において、Ｒ2は、ベンジル等の−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリールである。
【０２１５】
さらに別の実施形態において、Ｒ3は−Ｈである。
【０２１６】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩｄ：
2012513464.tif 000051
の化合物を包含し、式中、
Ｒ2は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ6アルキル、又はＣ6−Ｃ10アリールであり、
Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
【０２１７】
一実施形態において、Ｃ6−Ｃ10アリールは、−ＯＨ，−Ｃ1−Ｃ6アルキ、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンの１個以上で置換される。
【０２１８】
実施形態において、Ｒ2は、ベンジル等の−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリールである。
【０２１９】
別の実施形態において、Ｒ2は−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリールであり、該−Ｃ6−Ｃ10アリール基は、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンの１個以上で置換される。
【０２２０】
具体的実施形態において、Ｒ2は−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリールであり、該−Ｃ6−Ｃ10アリール基は、−ＯＭｅ等の−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキルで置換される。
【０２２１】
別の具体的実施形態において、Ｒ2は−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリールであり、該−Ｃ6−Ｃ10アリール基は、−Ｃｌ等のハロゲンで置換される。
【０２２２】
一実施形態において、Ｒ3は−Ｈである。
【０２２３】
具体的実施形態において、Ｒ3は−Ｃｌ等のハロゲンである。
【０２２４】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩｅ：
2012513464.tif 000052
の化合物を包含し、式中、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6  アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、Ｒ1はキノリン環の５、６、７、又は８位置上にあり得る、
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０２２５】
一実施形態において、Ｃ6−Ｃ10アリールは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンの１個以上で置換される。
【０２２６】
実施形態において、Ｒ1は、−Ｃｌ等のハロゲンである。
【０２２７】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩＩａ：
2012513464.tif 000053
の化合物を包含し、式中、
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールである。
【０２２８】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩＩａ−１：
2012513464.tif 000054
の化合物を包含し、式中、
Ｒ2は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールである。
【０２２９】
一実施形態において、化合物は、式ＩＩＩｂ：
2012513464.tif 000055
を含み、式中、
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールである。
【０２３０】
一実施形態において、Ｒは−Ｈである。
【０２３１】
一実施形態において、Ｒ1は−Ｈである。
【０２３２】
一実施形態において、Ｒ2は−Ｈである。
【０２３３】
一実施形態において、式  ＩＩＩｂの化合物はＩＩＩｂ−１：
2012513464.tif 000056
の化合物はであり、式中、
Ｒ1及びＲ2は、式ＩＩＩｂに対して定義される。
【０２３４】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩＩｃ：
2012513464.tif 000057
の化合物を包含し、式中、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ4、及びＲ2は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０２３５】
一実施形態において、Ｒは−Ｈである。
【０２３６】
実施形態において、Ｒ1は、−Ｃｌ等のハロゲンである。
【０２３７】
実施形態において、Ｒ2は、−Ｃｌ等のハロゲンである。
【０２３８】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩＩｃ−１：
2012513464.tif 000058
の化合物を包含し、式中、
Ｒ1及びＲ2は、式ＩＩＩａに対して定義される。
【０２３９】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩＩｄ：
2012513464.tif 000059
の化合物を包含し、式中、
Ｒ1は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールである。
【０２４０】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩＩｅ：
2012513464.tif 000060
の化合物を包含し、式中、
Ｒ1は、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10  アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ2は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールである。
【０２４１】
一実施形態において、本発明は、式ＩＩＩｆ：
2012513464.tif 000061
の化合物を包含し、式中、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールである。
【０２４２】
一実施形態において、本発明は、式ＩＶａ：
2012513464.tif 000062
の化合物を包含し、式中、
Ｒ1及びＲ3は、それぞれは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンであり、
Ｒ2は、−Ｈ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はＣ6−Ｃ10アリールである。
【０２４３】
一実施形態において、Ｒ1は−Ｈである。
【０２４４】
一実施形態において、Ｒ2は、メチル等の−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。
【０２４５】
一実施形態において、Ｒ3は−Ｈである。
【０２４６】
別の実施形態において、Ｒ3は、−Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリールである。
【０２４７】
一実施形態において、本発明は、式ＩＶｂ：
2012513464.tif 000063
の化合物を包含し、式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｃ6−Ｃ10アリール、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10アリール、又はハロゲンである。
【０２４８】
一実施形態において、Ｒ1は−Ｈである。
【０２４９】
一実施形態において、Ｒ2は−Ｈである。
【０２５０】
一実施形態において、Ｒ3は−Ｈである。
【０２５１】
一実施形態において、Ｒ4は−Ｈである。
【０２５２】
一実施形態において、Ｒ5は−Ｈである。別の実施形態において、Ｒ5は−Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ1−Ｃ6アルキル−Ｃ6−Ｃ10アリールである。
【０２５３】
一実施形態において、化合物は縮合平面環系を含み、この環系は、：（１）水素結合受容体（例えば、ピリミジル環上のＮ及びシルデナフィル上のＣ＝Ｏ）、又は（２）Ｈ結合ドナー（ＮＨ）もしくはＨ結合受容体（Ｃ＝Ｏ）又は双方（アミドＮＨ−Ｃ＝Ｏ）、を含有する。
【０２５４】
別の実施形態において、化合物は、３疎水性基（Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３）を伴う縮合平面環系を含有する。ＰＤＥ５への密接な結合のため、これら３個の疎水性基の最適寸法及び本質は、酵素と、Ｈ結合受容体又はドナーとの間の水素結合の強さに依存するように思われる。縮合平面環系上のＨ結合受容体（Ｃ＝Ｏ、Ｎ：）を用いた阻害剤のため、巨大な芳香族Ｒ２基は、ｃＧＭＰのリン酸によって占有される部位で、最適な適合を達成することを助ける。縮合平面環系上のＨ結合ドナー（すなわち、タダラフィルのＮＨ）を用いた阻害剤のため、巨大な芳香族Ｒ１基は、疎水性Ｑ２ポケットで最適な適合を達成することを助ける。Ｒ３は小さくあり得る、それはＲ１及びＲ２よりも有意ではないように見える。これらの観察は、ＰＤＥ５阻害剤複合体のＸ線構造からの見識に適合する。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の修飾、効力、選択性、及び経口生物学的利用率、細胞透過、ならびに血液脳関門透過等のＰＫ特性を、微調整することができる。
【０２５５】
一実施形態において、本発明は、式（Ｖ）：
2012513464.tif 000064
（Ｖ）
の化合物を包含し、式中、
ＡはＯ又はＮであり、
Ｘは−（ＣＨ2）ｎ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、又はＳ（Ｏ）2であり、
Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、−ＮＲ7Ｒ8、−ＳＲ7、又はヘテロシクリルであり、
Ｒ2は−ＣＨ2ＯＲ6又はＣＯ2Ｒ8であり、
Ｒ3は水素又はハロゲンであり、
Ｒ4は−ＣＮ又はハロゲンであり、
Ｒ5は水素又はＯＲ6であり、
Ｒ6は水素、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ9であり、
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ9であり、前記Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルは、任意に−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、−ＮＲ9Ｒ10、−ＳＲ9、又はヘテロシクリルで置換され、
Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルであり、ｎは１、２、又は３である、化合物、
あるいはその薬学的に許容される塩又は互変異性体。
【０２５６】
一実施形態において、ＡはＮである。
【０２５７】
一実施形態において、Ｘは−（ＣＨ2）nであり、ｎは１、２、又は３である。
【０２５８】
一実施形態において、Ｒ1は水素である。別の実施形態において、Ｒ１はシクロアルキルである。具体的実施形態において、Ｒ１はシクロプロピルであり、別の特定の実施形態において、Ｒ１はジメチルアミノである。
【０２５９】
一実施形態において、Ｒ2はＣＨ2−ＯＨである。
【０２６０】
一実施形態において、Ｒ3はＨである。具体的実施形態において、Ｒ３は、クロロ等のハロゲンである。
【０２６１】
一実施形態において、Ｒ4は−ＣＮである。別の実施形態において、Ｒ4はハロゲン（例えば、フッ素）である。
【０２６２】
一実施形態において、Ｒ5は水素である。別の実施形態において、Ｒ5は−ＯＲ6であり、Ｒ6は−Ｃ1−Ｃ6アルキル、又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルである。具体的実施形態において、Ｒ5は−ＯＣである。
【０２６３】
別の実施形態において、該化合物は、式（Ｖ−１）：
2012513464.tif 000065
（Ｖ−１）
の化合物であって、式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、−ＮＲ7Ｒ8、−ＳＲ7、又はヘテロシクリルであり、
Ｒ2は−ＣＨ2ＯＲ6又はＣＯ2Ｒ8であり、
Ｒ3は水素又はハロゲンであり、
Ｒ4は−ＣＮ又はハロゲンであり、
Ｒ6は水素、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ9であり、
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ9であり、前記Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルは、任意に−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、−ＮＲ9Ｒ10、−ＳＲ9、又はヘテロシクリルで置換され、
Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルである化合物、あるいはその薬学的に許容される塩又は互変異性体。
【０２６４】
一実施形態において、Ｒ1は水素である。別の実施形態において、Ｒ1はシクロアルキルである。具体的実施形態において、Ｒ1はシクロプロピルであり、別の特定の実施形態において、Ｒ1はジメチルアミノである。
【０２６５】
一実施形態において、Ｒ2はＣＨ2−ＯＨである。
【０２６６】
一実施形態において、Ｒ3はＨである。具体的実施形態において、Ｒ３は、クロロ等のハロゲンである。
【０２６７】
一実施形態において、Ｒ4は−ＣＮである。別の実施形態において、Ｒ4はハロゲン（例えば、フッ素）である。
【０２６８】
一実施形態において、Ｒ6はＣである。
【０２６９】
別の実施形態において、該化合物は、式（Ｖ−１ａ）：
2012513464.tif 000066
（Ｖ−１ａ）
の化合物であって、式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、−ＮＲ7Ｒ8、−ＳＲ7、又はヘテロシクリルであり、
Ｒ2は−ＣＨ2ＯＲ6又はＣＯ2Ｒ8であり、
Ｒ3は水素又はハロゲンであり、
Ｒ4は−ＣＮ又はハロゲンであり、
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ9であり、前記Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルは、任意に−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、−ＮＲ9Ｒ10、−ＳＲ9、又はヘテロシクリルで置換され、
Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルである化合物、あるいはその薬学的に許容される塩又は互変異性体。
【０２７０】
一実施形態において、Ｒ1は水素である。別の実施形態において、Ｒ1はシクロアルキルである。具体的実施形態において、Ｒ1はシクロプロピルであり、別の特定の実施形態において、Ｒ1はジメチルアミノである。
【０２７１】
一実施形態において、Ｒ2はＣＨ2−ＯＨである。
【０２７２】
一実施形態において、Ｒ3はＨである。具体的実施形態において、Ｒ3は、クロロ等のハロゲンである。
【０２７３】
一実施形態において、Ｒ4は−ＣＮである。別の実施形態において、Ｒ4はハロゲン（例えば、フッ素）である。
【０２７４】
別の実施形態において、該化合物は、式（Ｖ−１ａ１）：
2012513464.tif 000067
（Ｖ−１ａ１）
の化合物であって、式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、−ＮＲ7Ｒ8、−ＳＲ7、又はヘテロシクリルであり、
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、又はＣ（Ｏ）Ｒ9であり、前記Ｃ1−Ｃ6アルキル又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルは、任意に−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ3−Ｃ8シクロアルキル、−ＮＲ9Ｒ10、−ＳＲ9、又はヘテロシクリルで置換され、
Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、又はＣ3−Ｃ8シクロアルキルである化合物、あるいはその薬学的に許容される塩又は互変異性体。
【０２７５】
一実施形態において、Ｒ1は水素である。別の実施形態において、Ｒ1はシクロアルキルである。具体的実施形態において、Ｒ1はシクロプロピルであり、別の特定の実施形態において、Ｒ1はジメチルアミノである。
【０２７６】
特定の実施形態において、該化合物は、
2012513464.tif 000068
2012513464.tif 000069
である。
【０２７７】
具体的な実施形態において、該化合物は、
2012513464.tif 000070
である。
【０２７８】
一実施形態において、本発明の化合物は、式Ｘ：
2012513464.tif 000071
（Ｘ）
の化合物を含まず、式中、
Ｒ2、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8は、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクロであり、
Ｒ3は−（ＣＨ2）ｚ、Ｙであり、式中、ｚは０、１、２、又は３であり、
Ｒ4及びＲ5は、（ｉ）Ｒ4及びＲ5が双方とも水素ではないという条件付きで、独立して水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである、（ｉｉ）まとめると、ヘテロシクロ環を形成する、あるいは（ｉｉｉ）Ｒ4及びＲ5のうちの１個は、Ｙと共にヘテロシクロ環を形成する、
Ｙは、（ｉ）−ＯＲ9、−ＣＯ２Ｒ9、−ＣＨ（ＣＯ2Ｒ9）2、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11、−ＮＲ10Ｒ11、−ＮＲ10（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ11Ｒ12、−ＣＨ［（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11］2、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11、−ＮＲ10（Ｃ＝Ｏ）Ｒ12、−Ｓ（Ｏ）mＲ9、−ＳＯ2ＮＲ10Ｒ11、イミダゾール、置換イミダゾール、トリアゾール、置換トリアゾール、又はシアノ、独立して選択される、あるいは（ｉｉ）Ｒ4又はＲ5と共にヘテロシクロ環を形成し、
ｍは０、１、又は２である、
Ｒ9は、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロ、アリール、ヘテロアリール、又はペンタフルオロフェニルであり、
Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12は、（ｉ）水素、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロ、及びヘテロアリールから独立して選択される、あるいは（ｉｉ）まとめると、式中、Ｒ10は、Ｒ11又はＲ12を用いて、３〜７員ヘテロシクロ環を形成し、もしくはＲ11は、Ｒ12を用いて３〜７員ヘテロシクロ環を形成する。
【０２７９】
また、本発明は、上記の式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、式Ｉｅ、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、式ＩＩＩｃ、式ＩＩＩａ−１、式ＩＩＩｂ−１、式ＩＩＩｃ−１、式ＩＩＩｄ、式ＩＩＩｅ、式ＩＩＩｆ；式ＩＶａ、式ＩＶｂ、式Ｖ、式Ｖ−１、式Ｖ−１−ａ、又は式Ｖ−ａ−１（１〜１８のいずれか１つの化合物等））を有する化合物のいずれか１つを投与することによって、対象中のαセクレターゼタンパク質活性又は発現を増加させるための方法を提供する。また、本発明は、上記の式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、式Ｉｅ、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、式ＩＩＩｃ、式ＩＩＩａ−１、式ＩＩＩｂ−１、式ＩＩＩｃ−１、式ＩＩＩｄ、式ＩＩＩｅ、式ＩＩＩｆ；式ＩＶａ、式ＩＶｂ、式Ｖ、式Ｖ−１、式Ｖ−１−ａ、又は式Ｖ−ａ−１（１〜１８のいずれか１つの化合物等））を有する化合物のいずれか１つを投与することによって、対象中のβセクレターゼタンパク質活性又は発現を低下させるための方法を提供する。加えて、本発明は、本発明は、上記の式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、式Ｉｅ、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、式ＩＩＩｃ、式ＩＩＩａ−１、式ＩＩＩｂ−１、式ＩＩＩｃ−１、式ＩＩＩｄ、式ＩＩＩｅ、式ＩＩＩｆ；式ＩＶａ、式ＩＶｂ、式Ｖ、式Ｖ−１、式Ｖ−１−ａ、又は式Ｖ−ａ−１（１〜１８のいずれか１つの化合物等））を有する化合物のいずれか１つを投与することによって、対象中のアミロイドβ（Ａβ）タンパク質沈着物を減少するための方法を提供する。
【０２８０】
幾つかの実施形態において、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、式Ｉｅ、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、式ＩＩＩｃ、式ＩＩＩａ−１、式ＩＩＩｂ−１、式ＩＩＩｃ−１、式ＩＩＩｄ、式ＩＩＩｅ、式ＩＩＩｆ；式ＩＶａ、式ＩＶｂ、式Ｖ、式Ｖ−１、式Ｖ−１−ａ、又は式Ｖ−ａ−１（化合物１〜１８のうちのいずれか１つ等））を有する化合物は、以下の特徴のうちの１つ以上を満足させる能力を求めて、最初にスクリーニングされる：約１００ｎＭを越えないＩＣ50；他のＰＤＥに対してよりも、ＰＤＥ５に対して少なくとも５０倍を超える選択性；約５０ｎＭを越えないＩＣ50を有するインビトロＰＤＥ５阻害活性、ＢＢＢを透過する能力；少なくとも約２０％（又は少なくとも約８０％）ｃＧＭＰを加水分解する能力；化合物及びヒドロキシル基である第２の架橋リガンドを有するＰＤＥ５間の相互作用；ならびに化合物及びアミノ酸残基Ｆ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はそれらの組み合わせでのＰＤＥ５との接触を含むＰＤＥ５間の相互作用。その後、又は独立して、該化合物を、βセクレターゼ活性又は発現の阻害及び／又はαセクレターゼ活性又は発現（マウスＡＰＰ遺伝子組換えモデルにおいて等）の活性へのへの長期にわたる効果を提供する能力に対して試験することができる。
【０２８１】
一実施形態において、該方法は、対象へのＰＤＥ５阻害剤化合物を含む有効量の組成物の投与を含む。別の実施形態において、該対象は、異常に上昇したアミロイドβプラークを示す。さらなる実施形態において、対象はアルツハイマー病、レビー小体型認知症、封入体筋炎、又は脳アミロイド血管症を患っている。幾つかの実施形態において、Ａβタンパク質沈着物は、Ａβ40異性体、Ａβ42異性体、又はその組み合わせを含む。さらなる実施形態において、αセクレターゼタンパク質活性又は発現は、最大３ヶ月、治療後最大４ヶ月、治療後最大５ヶ月、又は治療後最大６ヶ月増加される。他の実施形態において、βセクレターゼタンパク質活性又は発現は、最大３ヶ月、治療後最大４ヶ月、治療後最大５ヶ月、又は治療後最大６ヶ月低下される。
【０２８２】
本発明のＰＤＥ５阻害剤化合物は、投与に好適な薬学的組成物に組み込まれることができる。かかる組成物は、ＰＤＥ５阻害剤化合物（シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、又は式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、式Ｉｅ、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、式ＩＩＩｃ、式ＩＩＩａ−１、式ＩＩＩｂ−１、式ＩＩＩｃ−１、式ＩＩＩｄ、式ＩＩＩｅ、式ＩＩＩｆ；式ＩＶａ、式ＩＶｂ、式Ｖ、式Ｖ−１、式Ｖ−１−ａ、又は式Ｖ−ａ−１（化合物１〜１８のうちのいずれか１つ等）を有する化合物等）及び薬学的に許容される担体を含むことができる。組成物は、単独で、又は化合物等の少なくとも１つの他の薬剤との組み合わせで投与され得る、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、及び水も含むが、それらに限定されない、いずれの無菌、生体適合性薬学的担体に投与することができる。組成物は、単独で、又は他の薬剤、薬物、又はホルモンとの組み合わせで、患者に投与することができる。一実施形態において、ＰＤＥ５阻害剤化合物の有効量は、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。別の実施形態において、組成物は、最大１８日間、最大１９日間、最大２０日間、最大２１日間、最大２２日間、最大２３日間、最大２４日間、又は最大２５日間、少なくとも１日１回投与される。
【０２８３】
追加のＰＤＥ５阻害剤の非限定的例は、１−［［３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−−イル）−４−エトキシフェニル］スルフォニル］−４−メチルピペラジンとしても知られている５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニルスルフォニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピ−ｌ−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（シルデナフィル）（ＥＰ−Ａ−０４６３７５６を参照されたい）；５−（２−エトキシ−５−モルフォリノアセチルフェニル）−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＥＰ−Ａ−０５２６００４を参照されたい）；３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルフォニル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（国際公開第９８／４９１６６号を参照されたい）；３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルフォニル）−２−（２−メトキシエトキシ）ピリジン−−３−イル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（国際公開第９９／５４３３３号を参照されたい）；６−ベンゾ［１，３］ジオキソｌ−５−イル−２−メチル−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［１’，２’：−１，６］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン（ｃｉａｌｉｓ）；３−エチル−５−｛５−［４−エチルピペラジン−１−イルスルフォニル］−２−（［（１Ｒ）−２−メトキシ−１−メチル−エチル］オキシ）ピリジン−３−イル｝−２−メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロｏ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−−オンとしても知られている（＋）−３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルフォニル）−２−（２−メトキシ−１（Ｒ）−メチルエトキシ）ピリジン−３−イル］−２−メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（を参照されたい国際公開第９９／５４３３３号）；１−｛６−エトキシ−５−［３−エチル−６，７−ジヒドロ−２−（２−メトキシエチル）−７−オキソ−２Ｈ−ピラゾロ−ｏ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル］−３−ピリジルスルフォニル｝−４−エチルピペラジンとしても知られている５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルフォニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−［２−−メトキシエチル］−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７オン（を参照されたい国際公開第０１／２７１１３号，実施例８）；５−［２−イソ−ブトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルフォニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（国際公開第０１／２７１１３号、実施例１５を参照されたい）；５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルフォニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−フェ−ニル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（国際公開第０１／２７１１３号、実施例６６を参照されたい）；５−（５−アセチル−２−プロポキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−イソプロピル−３−アゼチジン−イル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（国際公開第０１／２７１１２号、実施例１２４を参照されたい）；５−（５−アセチル−２−ブトキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−エチル−３−アゼチジニル）−−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（国際公開第０１／２７１１２号、実施例１３２を参照されたい）；（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン（ＩＣ−３５１）、すなわち、公開された国際出願国際公開第９５／１９９７８号の実施例７８及び９５の化合物、ならびに実施例１、３、７、及び８の化合物；１−［［３−（３，４−ジヒドロ−５−メチル−４−オキソ−７−プロピルイミダゾ［５，１−ｆ］−ａｓ−トリアジン−２−イル）−−４−エトキシフェニル］スルフォニル］−４−エチルピペラジンとしても知られている、２−［２−エトキシ−５−（４−エチル−ピペラジン−１−イル−１−スルフォニル）−フェニル］−５−メチル−７−プロ−ピル−３Ｈ−イミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−オン（バルデナフィル）、すなわち公開された国際出願国際公開第９９／２４４３３号の実施例２０、１９、３３７、及び３３６の化合物；国際公開第９３／０７１２４号（ＥＩＳＡＩ）中の実施例１１の化合物；ならびにＲｏｔｅｌｌａ  Ｄ  Ｐ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００，４３，１２５７からの化合物３及び１４を含む。
【０２８４】
本発明に従って、薬学的に許容される担体は、薬学的投与と互換性があるいずれの、及び全ての溶剤、分散媒、コーティング、抗菌性及び抗真菌性薬剤、等張性及び吸収遅延薬剤等も含むことができる。薬学的活性物質のかかる培地及び薬剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。いずれの従来の培地又は活性化合物と互換性がある薬剤も、使用することができる。また、補足活性化合物は、組成物に組み込まれることができる。
【０２８５】
本明細書で説明されるいずれの治療上の適用も、かかる治療の必要ないずれの対象にも適用することができる、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、又はヒト等の哺乳類を含む。
【０２８６】
本発明の薬学的組成物は、それらの意図される投与の経路と互換性があるように製剤化される。投与の経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与を含む。非経口、皮内、又は皮下適用に使用された溶液又は懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射のための水等の無菌の希釈液、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶剤；ベンジルアルコール又はエチルパラベン等の抗菌性薬剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート化薬剤；酢酸、クエン酸、又はリン酸、及び塩化ナトリウム又はブドウ糖等の浸透圧の調整のための薬剤等の緩衝液。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基で調整できる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はガラス又はプラスチックで作成された複数の用量バイアルに封入できる。
【０２８７】
注射可能な使用に好適な薬学的組成物は、無菌水溶液（水溶性である）、又は無菌の注射可能な溶液又は分散の即時調製物のための分散及び無菌粉末を含む。静脈内投与に対して、好適な担体は、生理的生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＭ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は無菌でなくてはならず、容易なシリンジ化の可能性が存在する程度まで流体であるべきである。それは、製造及び貯蔵の状態下で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。その担体は、例えば、水、エタノール、薬学的に許容されるポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの好適混合物等）を含有する溶剤又は分散媒であり得る。適した流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合において必要とされる粒径の維持によって、界面活性剤の使用によって、維持されることができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌性及び抗真菌性薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェタノール、アスコルビン酸、及びチメロサールによって達成することができる。多くの場合において、それは、等張薬剤、例えば、糖、多価アルコール（組成物中のマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム等）を含むために有用であり得る。注射可能な組成物の持続吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチン）を含むことによって、もたらされることができる。
【０２８８】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、本明細書に列挙される成分の１つ、又は組み合わせと共に、適切な溶剤中の必要量のＰＤＥ５阻害剤化合物を組み込み、その後濾過滅菌することによって、調製することができる。概して、分散は、塩基分散及び本明細書で列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する、無菌の媒体に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合において、有用な調製方法の例は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、活性成分の粉末に加えて、予め無菌濾過されたその溶液からのいずれの追加の望まれる成分ももたらす。
【０２８９】
概して、経口組成物は、不活性希釈液又は可食担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル剤に封入され得るか、あるいは錠剤に圧縮され得る。経口治療上の投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれることができ、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用され得る。また、経口組成物は、口腔洗浄薬としての使用のための流体担体を使用して調製されることができ、液体担体中の化合物は、経口的に適用され、含嗽され、喀痰され、又は嚥下される。
【０２９０】
薬学的に互換性の結合薬剤、及び／又はアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル剤、ローチ剤等は、以下のいずれの成分又は同様の本質の化合物も含有できる：結晶セルロース、トラガカントゴム、又はゼラチン等の結合剤；デンプン又はラクトース等の賦形剤、崩壊薬剤（アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチ等）；マグネシウムステアリン酸又はステロート（ｓｔｅｒｏｔｅ）等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；ショ糖又はサッカリン等の甘味料；もしくはペパーミント、メチルサリチル酸、又はオレンジ香料等の香味料。
【０２９１】
また、全身投与は、経粘膜又は経皮的手段によることができる。経粘膜又は経皮投与のため、バリアを透過するのに適切な浸透性が、製剤中で使用される。概して、かかる浸透性は、当技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬又は座薬の使用を通して達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は、軟膏、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、又はクリームに製剤化され、概して、当技術分野において知られている。
実施例
【０２９２】
実施例を、本発明のさらなる完全な理解を促進するために、以下に提供する。以下の実施例は、本発明の作成及び実践の例示的様式を解説する。しかしながら、代替的方法を利用し、同様の結果を得ることができるため、本発明の範囲は、これらの実施例において開示される具体的な実施形態には限定されず、それらは解説の目的のためのみである。
実施例１−シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ）は、アルツハイマーマウスモデルの海馬のシナプス可塑性、記憶及びＡβ負荷の即時的及び持続性改善へと導く
【０２９３】
この実施例は、シルデナフィルが、変異体アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ；Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）及びプレセニリン−１（ＰＳ１；Ｍ１４６Ｌ）（ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと称される）の双方を保有するマウスのシナプス機能障害及び記憶喪失に対して、有益な効果を発現することができるかを考察する。ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ）を試験し、アミロイド沈着のマウスモデルのＡＤ表現型に対して有益であったかを見極めた。阻害剤は、シナプス機能、ＣＲＥＢリン酸化、及び記憶の即時的、及び長期にわたる寛解を産生する。この効果は、Ａβレベルの減少に関連した。したがって、ＰＤＥ５阻害剤は、上昇したＡβレベルに関連するＡＤ、及び他の疾患の治療の可能性を有する。
【０２９４】
先の研究は、ａ）ＮＯがＡβ誘発性ＬＴＰ遮断から保護する、ｂ）ｓＧＣがＡβ誘発性ＬＴＰ遮断に対するＮＯ保護に含まれる、ｃ）ｃＧＭＰ及びその下流標的の活性化、ＰＫＧは、Ａβ誘発性ＬＴＰ遮断に対して有益な効果を有する、ｄ）ＮＯ及びｃＧＭＰレベルの増加は、ＬＴＰ中のリン酸化ＣＲＥＢ増加のＡβ抑制から保護し得る、ｅ）ｓＧＣは、ＬＴＰの間の、リン酸化ＣＲＥＢにおける、Ａβ誘発性遮断に対するＮＯ保護の増加に含まれる、ｆ）ＰＫＧは、Ａβ処置中のＣＲＥＢリン酸化上のｃＧＭＰ類似体の効果に含まれる、ｇ）ＬＴＰのＡβ誘発性抑制は、ｃＧＭＰレベル中の遮断の増加に関連する、を表す（Ｐｕｚｚｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００５．２５（２９）：ｐ．６８８７−９７）。様々な説明は、これらの知見、ａ）補助因子ＮＡＤＰＨが可溶性Ａβと強く複合するならば、ＮＯＳ機能のその減少した有効性をもたらし［Ｃｏｌｔｏｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２００６．１０３（３４）：ｐ．１２８６７−７２］、ＡβはＮＡＤＰＨのシンクとして機能することができ、ＮＯＳによってＮＯの産生を防止し、その結果として、ｃＧＭＰ産生を含む現象の得られたカスケードを停止し、ＣＲＥＢリン酸化で終わる、ｂ）Ａβ適用に続くＰＤＥ活性の増加［Ｗｉｒｔｚ−Ｂｒｕｇｇｅｒ，Ｆ．ａｎｄ  Ａ．Ｇｉｏｖａｎｎｉ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０００．９９（４）：ｐ．７３７−５０］、ｃ及びｄ）ｓＧＣ活性及び／又は発現の低下［Ｂａｌｔｒｏｎｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ，２００２．１０（２）：ｐ．１３９−４９］（すなわち、ＰＤＥ活性の増加を、単離された血管及び培養されたミクログリアの双方で示し、それらにおけるＰＤＥ５阻害は、通常の血管活性を回復させ、Ａβによる炎症反応を遮断する［Ｐａｒｉｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，１９９９．１５７（１）：ｐ．２１１−２１］）、ならびにｆ）ＮＯＳ発現の減少、を支持する。ＮＯカスケード及びＡβ誘発性シナプス機能障害の関連の同定は重要な研究対象を構成し得るが、新規ＰＤＥ５阻害剤薬物が開発されるであろう。
【０２９５】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬のスライス中のシナプス機能へのシルデナフィルの急性影響。シルデナフィルの短時間の適用を試験し、基底シナプス伝達（ＢＳＴ）が正常であるにもかかわらずA12、シナプス可塑性機能障害がまず開始し出す際、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに由来するスライスのＬＴＰの欠損を救出するかを見極めた。ＢＳＴを、ＡＰＰ／ＰＳ１及び野生型（ＷＴ）マウスの刺激強度における増加する、興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）の勾配を測定することによって決定した。異なる群間のＢＳＴにおいていかなる差異も観察されなかった（図１ａ）。次いで、海馬のスライスを、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ側枝経路のテタヌスの刺激を介してＬＴＰを誘発する前に、シルデナフィル（５０ｎＭ）で１０分灌流させた。シルデナフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライス中の増強は、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライスの増強をはるかに越えていた（図１ｂ）。一方で、媒体のみで処置されたＷＴスライスと比較して、シルデナフィルは、ＷＴマウスのスライス中のＬＴＰの振幅を変化しなかった（図１ｃ）。シルデナフィルは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス又はＷＴ同腹子からのいずれのスライスにもテタヌスを適用しなかった場合、その適用中の基底シナプス反応、又は実験中のその適用の終了後１２０分の基底シナプス反応に何の効果も有さなかった（図１ｂ、ｃ）。
【０２９６】
シナプス機能障害へのシルデナフィル効果のＰＤＥ５特異性の対照として、より特異的なＰＤＥ５阻害剤、タダラフィルを使用した。ｃＧＭＰに基づく阻害剤であるシルデナフィル及びバルデナフィルとは異なり、タダラフィルはβカルボリン由来薬物であり、ＰＤＥ１（選択性比率＞２０００）及びＰＤＥ６（選択性比率１０００）、５．０ｎＭA11のＰＤＥ５に対するＩＣ50への効果を伴わない。これらの実験において、スライスを、テタヌスの前に１０分間、５０ｎＭのタダラフィルに浸した。タダラフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライス中の増強は、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライスの増強をはるかに越えていた（図８Ａ−Ｂ）。タダラフィルは、ＷＴマウスのベースラインの振幅及びＬＴＰを変化させなかった（図８Ａ−Ｂ）。
【０２９７】
また、ＰＤＥ５特異性の追加の対照として、ＩＣ３５４を使用した（ＰＤＥ１阻害剤）。これはＩＣ２２４A13のＨＣｌ塩であり、非常に選択的なＰＤＥ１阻害剤である（８０ｎＭのＰＤＥ１に対してＩＣ50、次に最も感受性の高いＰＤＥのＩＣ50値とＰＤＥ１のＩＣ50値との比率は１２７に等しい）。これらの実験において、スライスを、テタヌス前に１０分間、１μＭのＩＣ３５４に浸した。シルデナフィル又はタダラフィルとは異なり、処置はＬＴＰを増大させなかった。ＩＣ３５４で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライスの増強は、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライスと同様であった（図８Ｃ−Ｄ）、ＩＣ３５４は、ＷＴマウスの海馬のスライス中のＬＴＰの振幅を変化させなかった（図８Ｃ−Ｄ）。したがって、これらの結果をシルデナフィル及びタダラフィルの実験とまとめると、ＰＤＥ５の阻害（ＰＤＥ１ではない）がシナプス機能障害からＡＤのような動物モデルを保護し、ＰＤＥ５の阻害が、ＡＤのシナプス機能障害に対して有益であることを支持していることを示す。
【０２９８】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知機能へのシルデナフィルの急性影響。シルデナフィルが３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１のＬＴＰ欠損を逆転することから考え、次いでそれを、その阻害剤がこれらの動物の認知欠損を逆転するかを試験した。上記で報告されるように、シルデナフィルは、ＢＢＢを通過する利点を提供し、それは行動実験において容易に利用することができる。３ヶ月齢のマウスを４つの群に分けた：シルデナフィルを用いたＡＰＰ／ＰＳ１、媒体を用いたＡＰＰ／ＰＳ１、シルデナフィルを用いたＷＴ、及び媒体を用いたＷＴ。シルデナフィル及び媒体対照溶液を、３ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内投与した。この濃度は、シルデナフィルのこれらの量が海馬のｃＧＭＰレベルを上昇させ、高齢のラットA6及び血管効果A6には依存しないマウスA7の記憶を改善することを表している、先の研究に基づいて選択した。最初に、シルデナフィルの急性投与の効果を、恐怖条件づけ学習、幾つかのＡＤマウスモデルA14において障害された、かつ海馬及び扁桃体に依存する学習のタイプにおいて検討した。海馬は、マウスが中性刺激を有害なものと連合させなければならない連想的学習の形態、コンテキスト恐怖条件付けA15に不可欠である。マウスを訓練し、中性刺激を有害なものと連合させた。それらを新しいコンテキスト（恐怖条件付け箱）中に配置し、軽度フットショック（ＵＳ）と対になった白色雑音キュー（ＣＳ）に暴露し、訓練後、即時にシルデナフィルを注射した。恐怖学習を、コンテキストの表示又は完全に異なるコンテキスト内の聴覚キューに応答した、すくみ行動（必然的に生じる呼吸を除外して全ての運動の不在）を測定することによって２４時間後に評価した。いずれの差異も、訓練段階の前に、マウスの４つの群間のすくみ行動において見出せなかった（図２ａ）。２４時間後、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ行動の低下が、媒体処置されたＷＴ同腹子のものと比較して、コンテキスト学習の解析において観察された（図２ａ）。シルデナフィル処置は、すくみにおいて、シルデナフィル処置されたＷＴ動物は有意な増加を表さないにもかかわらず（図２ａ）、遺伝子組換え動物のコンテキスト学習を改善した（図２ａ）、ショウジョウバエ及びマウスＡ１６、Ａ１７の双方において見出されたように、訓練セッション後、記憶の最大レベルがすでに、媒体処置されたＷＴマウスにおいて誘発されているためであろう。次に、恐怖条件付け、海馬非依存性作業Ａ１５を試験し、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスが、連想的学習Ａ１４において選択的海馬依存性機能障害を有することで知られているように、４つの群間ですくみにおいていずれの差異も見出さなかった。
【０２９９】
シルデナフィルが、末梢血管作用を通してその行動的影響を産生する可能性を除外するため、恐怖記憶の研究を、ＢＢＢを通過することが不可能であるタダラフィルを用いて繰り返した（ｃＬｏｇＰ＝１．４３及びその製造者からの情報）。タダラフィル及び媒体対照溶液を、１ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内投与した。タダラフィルは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの連想的学習を改善させなかった。したがって、シルデナフィルの効果は、血管区画中のＰＤＥ５の阻害のためではない（図９）。
【０３００】
次に、シルデナフィルを用いた処置の、空間作業記憶、ラジアルアーム水迷路試験を用いて研究することができる短期記憶のタイプへの効果を検討した。すでに、この作業は、ＡＤA12、A18の他の遺伝子組換えモデルの記憶欠損を示し、海馬の機能Ａ１９に依存することを表した。マウスは、空間キューに関して迷路のアームの１つにおいて、隠しプラットフォームの位置を学習、かつ記憶することを必要とした。媒体注射されたＷＴ同腹子と比較して、媒体を用いて注射されたＡＰＰ／ＰＳ１は、作業の取得及び保持の双方の間、プラットフォームの位置に対する空間記憶に重篤な異常を表した（図２ｂ）。しかしながら、３週間にわたるシルデナフィルの連日注射は、第４の取得試験後、即時にＡＰＰ／ＰＳ１マウスの行動能力を寛解した（図２ｂ）。シルデナフィルを用いた処置は、媒体注射されたＷＴ同腹子と比較して、ＷＴマウスの能力に影響しなかった（図２ｂ）。マウスの４つの群は、可視のプラットフォーム作業においてプラットフォームを見出すの必要とされる時間、ならびに泳ぐ速度において、いずれの差異も表さなかった（図１０）。したがって、視覚、運動協調性、又は動機づけは、マウスの４つの群において影響されず、ラジアルアーム水迷路試験結果にも影響を与えなかった。
【０３０１】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知及びシナプス機能へのシルデナフィルの持続的効果。シルデナフィルを試験し、処置の短時間過程が、長期の利点を提供することができるかを決定した。ＰＤＥ５阻害剤を検討し、シナプス機能障害及び記憶喪失に対して、その保護効果を維持するかを見極めた。これらの実験において、年齢３ヶ月のＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴマウスの双方を、３ｍｇ／ｋｇ／日のシルデナフィルを３週間にわたって腹腔内注射し、次いで、試験前に、その処置を９〜１２週間中止した。次に、マウスを、コンテキスト学習の訓練に供した。急性実験におけるように、訓練される９〜１２週間前に、動物が同一コンテキストに再導入された場合、そのすくみ時間は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１同腹子と比較して、シルデナフィルを用いて先に処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、大いに増加した（図３ａ）。シルデナフィルは、媒体を用いて処置されたＷＴマウスと比較して、ＷＴ同腹子のすくみ時間を増加させなかった（図３ａ）。手掛かり条件付け試験において、４郡間に差異は存在しなかった。これらのデータは、ＰＤＥ５の阻害が、薬物投与の持続時間を越えて拡張された時間、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの恐怖コンテキスト学習を保護することを示唆する。
【０３０２】
次に、３週間のシルデナフィルを用いた処置の一過程の空間作業記憶への効果を、ラジアルアーム水迷路作業を使用して試験した。媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴマウスによるエラーの数間に、差異は存在しなかった（図３ｂ）A12。３週間にわたるシルデナフィルの投与は、試験の９〜１２週間前、ＷＴ動物の能力に影響を与えることなく、２つの群間の差を減少させた（図３ｂ）。これらのデータは、ＰＤＥ５阻害剤を用いた長期処置の一過程が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間作業記憶を保護することを示唆する。
【０３０３】
長期記憶へのシルデナフィルの効果を調査するため、参照記憶を、海馬の機能Ａ２０が必要とされることで知られているＭｏｒｒｉｓ水迷路作業、及び年齢６ヶ月後に障害されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスA12を用いて試験した。媒体処置された遺伝子組換えマウスは、ＷＴ同腹子と比較して、６セッション後、隠しプラットフォームを見出すために、より長い時間を必要とした（図３ｃ）。シルデナフィルを用いてＡＰＰ／ＰＳ１マウスを先に処置した場合、それらは、それらの行動能力の顕著な改善を表した。シルデナフィルは、ＷＴ同腹子の能力に影響しなかった（図３ｃ）。また、参照記憶を、プローブ試験、空間参照記憶A20の別の試験を用いて評価した。この作業を、第６の隠しプラットフォームセッション後に行った。そのプラットフォームを水から除去し、動物に６０秒間探させた。プラットフォームが特定の位置にあることを知っているマウスは、繰り返しその位置を徹底的に探すであろう。したがって、そのマウスが、プラットフォームにぶつかる等の触覚キューから独立して、その位置を知っていることを示唆する。迷路の各象限で費やしたその時間は、動物の探索パターンの空間的バイアスを評価するために使用することができる。媒体処置されたＷＴマウスは、右の隣接象限（ＡＲ）、左の隣接象限（ＡＬ）、又は逆の象限（ＯＱ）よりも、プラットフォームが訓練の間に位置づけられたターゲット象限（ＴＱ）で、より長い時間を費やした（図３ｄ）。また、シルデナフィルは、他の象限よりも、プラットフォームが訓練の間に位置づけられた象限でより探索したＡＰＰ／ＰＳ１マウスの能力を改善した（図３ｄ）。対照的に、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、その情報を保持せず、媒体処置されたＷＴ同腹子と比較して、ＴＱでより少ない時間を費やした。シルデナフィル処置されたＷＴマウスは、前の日にプラットフォームがどこにあったかを記憶しており、媒体処置されたＷＴ同腹子と約同一の時間を費やした。プローブ試験後に行われた可視のプラットフォーム試験は、４つの群間のプラットフォームに達するまでの時間、及び泳ぐ速度においていずれの差異も明らかにはしなかった（図１１Ａ〜Ｂ）。
【０３０４】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの行動能力への、シルデナフィルの顕著な効果の根底にある機能的変化の解析に深さを加えるため、同一マウスからの海馬中のシナプス機能を検討した。３ヶ月齢の二重遺伝子組換えマウスとは対照的に、８〜９ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１動物は、シナプス強度A12の減少を表す。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるシルデナフィルを用いた先の処置は、８〜９ヶ月齢からのスライス、次いで、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１同腹子スライスへの３５Ｖ刺激に応答して、ｆＥＰＳＰ勾配のより大きな値を産生した（図４ａ）。一方で、シルデナフィルは、ＷＴ同腹子における応答を変化させなかった。また、ＢＳＴに対して試験されたＣＡ３−ＣＡ１結合を、増強を経験するそれらの能力に対して評価した。シルデナフィルを用いて先に処置された、ＡＰＰ／ＰＳ１から得られたスライスから記録されたＬＴＰ値は、シルデナフィル処置されたＷＴ同腹子と同様であり、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１同腹子からのものをはるかに越えた（図４ｂ、ｃ）。８〜９ヶ月齢のＷＴマウスは、シルデナフィルを用いて処置されようと、又は媒体を用いて処置されようと、同様量の増強を表した（図４ｃ）。テタヌスの不在の時、いずれの差異も、マウスの４つの群のベースライン伝達において、示さなかった（図４ｂ、ｃ）。まとめると、これらのデータは、シルデナフィルを用いた処置の一過程が、長期にわたってシナプス機能障害からＡＰＰ／ＰＳ１マウスを保護することを、示唆する。
【０３０５】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＲＥＢリン酸化へのシルデナフィルの効果。シルデナフィルの作用の持続時間が比較的短いことから、ＰＤＥ５阻害剤の直接的効果は、その長期効果の原因ではあり得ない。ＣＲＥＢは、遺伝子の制御に関係しており、その遺伝子の発現は長期記憶の形成及び安定化をもたらし、ＣＲＥＢリン酸化は、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、ＣＲＥ依存性遺伝子発現A21を刺激するためのＣＲＥＢ能力のために必要である。また、Ａβ上昇は、記憶分子ＣＲＥＢのリン酸化におけるテタヌス誘導性増加を遮断することでも知られている（Ｐｕｚｚｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ／ｃＧＭＰ／ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，６８８７−６８９７（２００５）；）A22。したがって、阻害剤がシナプス生理機能及び行動に長期的変化を産生する機構への洞察を得るために、ＣＲＥＢリン酸化のレベルを、シルデナフィル、及び媒体処置された遺伝子組換え及びＷＴマウスにおいて測定した。電気生理学的実験で説明されるように海馬のスライスを処置し、処置後６０分固定し、Ｓｅｒ−１３３で抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体を用いて染色し、共焦点顕微鏡上で見た。テタヌスの適用後、ＷＴマウスのＣＡ１細胞体領域における免疫蛍光の強度における増加を、対照のテタヌス刺激されていないスライスと比較して（図５ａ、ｂ）、観察した。ＡＰＰ／ＰＳ１動物は、テタヌス後、ＣＡ１リン酸化ＣＲＥＢ免疫蛍光の生理的増加を有さなかった（図５ａ、ｂ）、しかしながら、シルデナフィルは、二重遺伝子組換えのテタヌス刺激されたスライス中で通常のリン酸化ＣＲＥＢ増加を回復させた（図５ａ、ｂ）。シルデナフィルは、ＷＴ動物における免疫蛍光のテタヌス誘導性増加に影響しなかった（図５ａ、ｂ）。
【０３０６】
マウスを、年齢３ヶ月で、３ｍｇ／ｋｇ／日のシルデナフィル又は媒体を用いて注射し、次いで９〜１２週間にわたって処置無しで放置した。テタヌスの適用後、ＷＴマウスのＣＡ１細胞体領域の免疫蛍光強度の増加を、テタヌス刺激されていない対照のスライスと比較して、観察した（図５ｃ）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、テタヌス後、リン酸化ＣＲＥＢの生理的増加を明らかにしないが、シルデナフィルを用いた先の処置は、それを回復させた（図５ｃ）。なお、リン酸化ＣＲＥＢ免疫蛍光は、テタヌスの刺激と共に、シルデナフィル処置されたＷＴマウスからのスライスにおいては変わらなかった（図５ｃ）。したがって、理論にとらわれることなく、シナプス生理機能及び行動における長期改善の根本において、Ｓｃｈａｆｆｅｒ側枝ＣＡ１結合のテタヌスの刺激に続く、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＲＥＢリン酸化の増加の回復が存在する。
【０３０７】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＡβレベルへのシルデナフィルの効果。ＡＰＰ／ＰＳ１マウス中のＣＲＥＢリン酸化の改善を、その阻害剤が、Ａβレベル（ＡＤの特徴）にも影響を与えるかに関して検討した。大脳皮質の抽出物のＥＬＩＳＡは、年齢３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス及び７〜１０ヶ月で、第２回目の行動試験後に殺処理されたマウスへの、３週間にわたるシルデナフィルを用いた処置の一過程後即時に、ヒトＡβ４０及びＡβ４２レベルの双方における差異を明らかにした（図６ａ、７ａ）。したがって、理論にとらわれることなく、Ａβレベルの減少は、シルデナフィルによる持続性の有益な効果の根底である。
【０３０８】
Ａβは、セクレターゼによって触媒されるタンパク質分解プロセシングを介すＡＰＰから生じ、特徴的機能A24を伴う異なる断片を産生する。ＡＰＰは、最初にα及びβセクレターゼによって切断され、α及びβセクレターゼは、α−ＡＰＰ及びβ−ＡＰＰと呼ばれる可溶性細胞外断片、Ｃ末端断片（ＣＴＦ）の３つの形態（α−セクレターゼ切断によるＣ８３、β−セクレターゼ切断A25、A26によるＣ８９及びＣ９９）を生成する。ＣＴＦは、γセクレターゼの基質であり、５７〜５８残基（ＡＰＰ細胞内ドメイン、ＡＩＤ）のＣ終端ペプチド及びＣＴＦβA27からのＡβ断片を生成する。Ａβレベルの低下が、ＡＰＰプロセシングの変化に関連していたか［図２０を参照されたい］を評価するため、マウス脳皮質で全長ＡＰＰ及びそれらの断片のウエスタンブロット分析を行った。媒体処置された遺伝子組換えと比較して、シルデナフィル処置後、ｓＡＰＰβ（図６ｂ、ｅ）の低下及びＣＴＦ断片Ｃ８３及びＣ９９の増加を、ＡＰＰ／ＰＳ１中に見出した（図６ｂ、ｆ）にもかかわらず、全長ＡＰＰ及びｓＡＰＰαのレベルにおけるいずれの差異も、媒体又はシルデナフィルで処置された３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス中には観察されなかった（図６ｂ、ｃ、ｄ）。
【０３０９】
ＡＰＰレベルが、７〜１０ヶ月齢の遺伝子組換えマウスにおいて不変であることを発見した（図７ｂ、ｃ）。それらを、年齢３ヶ月で、３週間にわたりシルデナフィルの連日注射で処置する。シルデナフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、ｓＡＰＰαタンパク質レベルの増加を表した、処置が、αセクレターゼ活性を修飾することを表す（図７ｂ、ｄ）。なお、シルデナフィルで処置された遺伝子組換えマウス中のｓＡＰＰβの低下を観察した（図７ｂ、ｅ）、ＢＡＣＥ活性の下方制御を表す。ＣＴＦ断片Ｃ８３及びＣ９９のレベルの解析は、処置に起因する（図７ｂ、ｆ）、いずれの変化も明らかにはしなかった。したがって、理論にとらわれることなく、シルデナフィルによるＡβレベルの減少は、α及びβセクレターゼ活性への阻害剤の作用に起因する。
【０３１０】
考察
【０３１１】
ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィルを用いた処置が、アミロイド沈着の遺伝子組換えマウスモデル中のシナプス及び記憶欠損を救出することを表す。また、シルデナフィルは、転写因子及び記憶分子ＣＲＥＢのリン酸化の増加を回復させる。加えて、その阻害剤は、即時的にだけではなく、薬物投与を超えて長期にわたっても、シナプス機能、記憶及びＣＲＥＢリン酸化への、Ａβの高いレベルの負の効果に反作用する。最後に、シルデナフィルは、Ａβ40及びＡβ42レベルの即時的及び長期にわたる減少を引き起こす。シルデナフィルは、Ａβレベルの持続減少を引き起こし、次に、通常のシナプス機能及び記憶を回復させる。
【０３１２】
本研究の関連する知見は、アミロイド沈着のマウスモデル中のシナプス機能障害へのシルデナフィルの有益な効果である。この知見は、ＮＯドナーの使用を介するｃＧＭＰ増加を表すスライスでの研究と一致しており、又はｃＧＭＰ類似体は、Ａβの外来適用によって、ＬＴＰの減少及びＣＲＥＢリン酸化誘発性の阻害を救出する（Ｐｕｚｚｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，６８８７−６８９７（２００５））。変化したシナプス機能は、ＡＤA28の認知低下における基本面であることから、ＡＤにおけるＰＤＥ５阻害剤の使用の利点は、化合物のこのクラスが、記憶喪失に関連し得るシナプス機能障害に結びつけられる疾患の態様に、反作用するであろうことであり得る。
【０３１３】
研究で報告される別の発見は、ＰＤＥ５阻害に続くアミロイド沈着マウスモデルの記憶機能障害の回復である。これらの結果は、ＮＯ模倣分子が、スコポラミンA29、又は前脳コリン作動性枯渇A30によって、引き起こされる認知機能障害を逆転できるという観察と一致しており、ＮＯ／ｃＧＭＰシグナル伝達系を刺激することが、認知障害のための新しい、効果的な治療を提供できることを表す。記憶への有益な効果に関しては、恐怖学習の訓練、又は空間作業の取得後即座（しかし、恐怖学習の訓練又は空間作業の取得前５分ではない）に、狭い時間窓でのＰＤＥ５活性の阻害が、遺伝子組換え動物の学習を改善することは興味深い。シルデナフィルのインビボ半減期は、げっ歯類A10において０．４時間であることを考慮すると、電気ショック、又は空間作業の取得後、最初の２０〜２５分間は時間窓が存在し得、その間は、ＰＤＥ５阻害による改善の影響を受けやすい学習過程である。なお、シルデナフィルの有益な効果が、訓練後それらの注射を用いて観察されたことから、ＰＤＥ５の阻害は、疼痛又は環境の知覚等の能力の態様ではなく、記憶固定機構に作用する。
【０３１４】
本研究において、シルデナフィルの短時間過程は、薬物投与から３〜５ヶ月後もまだ有益であった。シルデナフィルが短い半減期を有することを考慮すると、この効果は、遺伝子発現への作用を介した長期にわたるシナプス修飾のためであり得る。ＣＲＥＢは、遺伝子の制御に関係しており、その遺伝子の発現は、新しいシナプス結合Ａ１６の形成を恐らく介する長期記憶の形成及び安定化をもたらす。リン酸化ＣＲＥＢがＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合する場合、それはＣＲＥ依存性遺伝子発現を刺激する。ＣＢＰは、クロマチンのヒストＨ３のアセチル化を触媒するアセチルトランスフェラーゼとして働くことによって、基底転写装置との相互作用を促進する活性化補助因子として機能し、記憶関連遺伝子の転写における染色体抑制及び増加の損失を引き起こす。ヒストンアセチル化は自己永続的であることができ、機能的に安定したクロマチン状態を作り、したがってラットの特異的遺伝子発現A31~A33に慢性変化を作る。したがって、理論にとらわれることなく、シルデナフィルの持続性の有益な効果は、ヒストンアセチル化中の永久増加に起因する。通常、ＣＢＰの逆効果を伴う酵素の群に起因するヒストン脱アセチル化の阻害は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスＡ３４の通常のＬＴＰ及び記憶を回復させる。
【０３１５】
遺伝子組換えマウス中のＰＤＥ５阻害によるＡβレベルの低下は、本研究の別の重要な知見である。ＩＣ３５４、選択的である阻害剤のＰＤＥ１、シルデナフィルによって阻害できる別のＰＤＥは、二重遺伝子組換えマウスからのスライス中の通常のＬＴＰを回復させなかったにもかかわらず、タダラフィル、非常に選択的なＰＤＥ５阻害剤は、シナプス機能障害へのシルデナフィルの効果を再現したため、理論にとらわれることなく、シルデナフィルの有益な効果は、ＰＤＥ５阻害に特異的である。なお、投与後即時に空間作業記憶を改善しないロリプラムとは異なり、シルデナフィルは、即時に空間作業記憶を増大させた。最も重要なことに、シルデナフィルの効果及びロリプラムの効果との間の著しい差異は、前者がＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中のＡβレベルを減少するににもかかわらず、後者はＡβ濃度に影響を与えないことである。
【０３１６】
治療薬として薬物の新しいクラスを提唱する場合、それらの副作用を考慮することは重要である。これは、記憶を増強するためのＰＤＥ４阻害剤の失敗を決定することができる。ＰＤＥ５阻害剤使用の利点は、多年にわたってすでに利用されていることにより、それらの副作用が知られていることである。持続勃起症が、ＰＤＥ５阻害剤の摂取により、幾つかの場合に発生することを報告されている。しかしながら、持続勃起症の要因についての現在の概論は、ＰＤＥ５機能の調節不全のためであり、ＮＯ経路A40の下方制御に続き（また、Ａβ増加により引き起こされる現象である）（Ｐｕｚｚｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ／ｃＧＭＰ／ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，６８８７−６８９７（２００５））、よって、逆説的に、ＰＤＥ５阻害剤が、持続勃起症A41、A42に対して、治療薬として提唱される。ＰＤＥ５阻害剤の追加の有害事象は、頭痛、紅潮、胃腸障害、及び経鼻鬱血又は鼻炎等の軽度血管拡張作用を含み、ＡＤ薬剤としてＰＤＥ５阻害剤を提唱することにおける注意は当然であり得る。しかしながら、Ａβは中枢神経系に第１に蓄積するが、またＡβは、ＡＤに影響される患者、及び異常なＡβ産生A43、A44によって特徴づけられる他の神経障害の血液中にも存在する。興味深いことに、全身Ａβは、脳血管系中のみだけでなく、血管系A45~A51の他の区域中でも血管収縮を増強する。なお、高血圧症は、大抵ＡＤA46、A48、A49に関連する。したがって、ＰＤＥ５阻害剤が、記憶喪失及びＡβ生成のみではなく、ＡＤ患者に大抵影響を与える血管症状にも反作用できると考えるのは、非常に魅力的である。
【０３１７】
ＮＯカスケードに作用する薬物は、認知能力に影響を与えることができる血管効果を有する。したがって、シルデナフィルの有益な効果に対する代替的説明は、神経細胞内効果に代わり、血管効果を介して阻害剤が働くことである。これは、ＰＤＥ５の阻害が、ＰＤＥ５阻害剤に直接的に暴露されたスライスの通常のＬＴＰを回復させたため、起こり得ない。なお、ｃＡＭＰ類似体は、ｃＧＭＰ類似体A55よりも頭頂葉皮質中の脳細動脈のさらなる拡大を誘発することを表すが、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（しかし、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰではない）のみしか、げっ歯類A6の記憶能力を改善させなかった、血管機構がｃＧＭＰ効果の原因ではあり得ないことを表す。最も重要なことに、ＢＢＢを通過しないタダラフィルは、シルデナフィルの行動的影響を再現しなかった。
【０３１８】
本知見は、中枢神経系A56~A58のＡβ誘発性障害への保護効果を有するＮＯカスケードの上方制御を表す、報告と一致している。例えば、ＰＣ１２細胞、交感神経細胞、及び海馬の神経細胞で行われた研究は、ＮＯ発生装置Ｓ−ニトロソペニシラミンを用いた処置が、アポトーシス促進性の因子カスパーゼ２A57を阻害するニトロシル化を介する神経保護的作用を有することを表している。Ａβは、ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達A56の低下、ＮＯＳA59からＮＡＤＰＨ有効性を引くこと、及びセリンスレオニンキナーゼＡｋｔA51のリン酸化の阻害を含む異なる機構によって、ＮＯ生成を障害することが見出された。ＡＤ患者の上側頭葉皮質は、可溶性グアニリルシクラーゼ活性Ａ６０の減少を表す。可溶性グアニリルシクラーゼは、脳アストログリア細胞A61のＡβ暴露に続き、低下した。ＰＤＥ活性の増加は、単離されたた血液細胞及び培養されたミクログリアの双方で見出され、ＰＤＥ５阻害は、通常の血管活性を回復させ、ＡβA62によってもたらされる炎症反応を遮断する。しかしながら、また、ＮＯは、高量で産生される場合、神経病態及び細胞死の主要な薬剤として見られる。ＮＯの高量は、Ａβ誘発性細胞死A63~A69中の酸化的及びニトロソ化ストレスの原因である有意な量のペルオキシナイトライトの生成へと導く。これらの逆の知見は、ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）の誘導型による高量のガスの制御されない産生が、ペルオキシナイトライトA63~A69の産生を介する酸化的及びニトロソ化ストレスを促進できるにもかかわらず、神経細胞及び内皮アイソフォーム、ｎ−ＮＯＳ及びｅ−ＮＯＳの双方を含むＮＯＳの構成型によって、低量のＮＯの放出が、シナプス可塑性及び学習を促進するという観察を伴う知見と調和できる［図１９及び図２１を参照されたい］。これらの発見を活用する薬物研究の現状は、ＮＯカスケードを上方制御し、したがって神経保護を誘発する方法を見出し、かつ神経病態A70を制限するため、ペルオキシナイトライト毒性作用を遮断する方法を見出すことの双方に集中している。ＰＤＥ５と介在する本治療方針は、ＮＯ産生の下流レベルで、ステップに集中することによって、ＮＯ生成をバイパスする利点を提供する［図１９及び図２１を参照されたい］。
【０３１９】
結論
【０３２０】
シルデナフィル処置は、ＡＤマウスモードのシナプス及び認知障害を寛解する。ｃＧＭＰレベルを増加する薬剤は、Ｌ−ＬＴＰの減少、ＣＲＥＢリン酸化のテタヌス誘導性増加、及びＡＰＰ／ＰＳ１マウスのコンテキスト学習を救出する。認知、シナプス伝達及びＣＲＥＢリン酸化への、シルデナフィルによるｃＧＭＰレベルの増加の有益な効果を、それらの投与の持続時間を越えて拡張できる。
【０３２１】
方法
【０３２２】
動物：ヒトＡＰＰ（Ｋ６７０Ｍ：Ｎ６７１Ｌ）及びＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ）（ライン６．２）変異の双方を発現する二重遺伝子組換えマウスを、ＷＴ同腹子と比較した。それらを、ＡＰＰをＰＳ１動物と交差させることによって得た。動物の遺伝子型を同定するために、ポリメラーゼ連鎖反応は、試料の尾A12で使用された。全ての実験を、オスのマウスを使用して行った。動物は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙの温度及び湿度を調節された部屋で、１２−１２時間明暗周期（０６：００時で明期開始）を維持した。食物及び水は、自由に入手可能であった。
【０３２３】
薬物調製：シルデナフィルを、報告された手順に従って、６つのステップで合成した（Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）（米国特許第５，３４６，９０１号．１９９４）。手短に述べると、市販の２エトキシ安息香酸を、塩化チオニルを用いて２エトキシベンゾイルクロリドに転換させた。４−アミノ−１−メチル−３−Ｎ−プロピルピラゾロ−５−カルボキサミドを用いた２−エトキシベンゾイルクロリドの反応は、収率９０％でアミドをもたらした。ＮａＯＨを使用するアミドの環化は、収率７７％でピラゾロピリミジノンを産出した。後にＮ−メチルピペラジンとの反応に続く、クロロスルホン酸中のピラゾロピリミジノンのクロロスルホニル化は、収率９０％でシルデナフィルを提供した。また、タダラフィルを、報告された手段に従って合成した（Ｄａｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。手短に述べると、Ｄ−トリプトファンメチルエステルはＰｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ反応条件（ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）下で、ピペロナールと反応した、得られた産生物をクロロアセチルクロリドで凝縮し、アシル化された中間体を得た。Ｎ−メチルアミンとの中間体の反応は、タダラフィルを提供した。タダラフィルを０．１％のＤＭＳＯ中で希釈した。
【０３２４】
薬物投与：３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴマウスを、４つの群に分けた：媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、ＰＤＥ阻害剤で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、媒体で処置されたＷＴマウス、ＰＤＥ阻害剤で処置されたＷＴマウス。シナプス機能障害へのＰＤＥ阻害の急性影響を評価する実験において、シルデナフィル（５０ｎＭ）又はタダラフィル（５０ｎＭ）もしくはＩＣ３５４（１μＭ）を、シータバーストの前に１０分間、灌流システムを介する海馬のスライスに直接与えた［図２３を参照されたい］。残りの実験において、腹腔内を介してシルデナフィルを注射した。その薬物を、急性的にあるいは３週間にわたる処置の一過程のいずれかで投与した。シルデナフィルの短期効果の評価のため、その薬物を濃度の３ｍｇ／ｋｇで、訓練後即時に与えた。この用量は、〜２．５μＭの濃度のｃＧＭＰを海馬A53にもたらした。長期効果の評価のため、シルデナフィルを、３ｍｇ／ｋｇの濃度で３週間にわたる腹腔内注射によって連日与え、次いで処置を行動試験の９〜１２週間前に中止した。コンテキスト及び手掛かり恐怖条件付けを、３日にわたって行った。ラジアルアーム水迷路（ＲＡＷＭ）を、３週間にわたって行った。次いで、その動物を、電気生理学的記録のために殺処理した。急性実験におけるシルデナフィルの投与の時間を決定するために、一連の研究を行った、そこで、その阻害剤を、電気ショックの５分前、又はラジアルアーム水迷路を用いた最初の取得試験の５分前に、腹腔内注射した。いずれの有益な効果も、シルデナフィル注射されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるすくみ時間及びエラーの数の双方では観察されなかった（シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのそれと〜９０％等しい、すくみ時間を示した；ｎ＝シルデナフィル処置された遺伝子組換えの７匹のオス及び媒体処置された遺伝子組換えの６匹のオス、Ｐ＞０．０５；シルデナフィル及び媒体処置された遺伝子組換えの双方に対する保持試験において〜５つのエラー、ｎ＝シルデナフィル処置された遺伝子組換えの６匹のオス及び媒体処置された遺伝子組換えの５匹のオス、Ｐ＞０．０５、シルデナフィルは、双方の作業において、ＷＴマウスの行動能力に影響を与えなかった、ｎ＝全ての条件のための５匹のオス）。したがって、結果の項で報告される、シルデナフィルの急性影響の全ての行動実験は、訓練後、注射を用いて行った。
【０３２５】
電気生理学的分析：動物を頸椎脱臼させ、断頭により殺処理した。海馬をすぐに取り出した。横断海馬のスライス（４００μｍ）をカットし、基準手段A54に従って記録した。例えば、次のカットする海馬のスライスを記録チャンバーに移動させた、それらは２９℃で維持され、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で灌流し、９５％のＯ2及び５％のＣＯ2で連続的に沸き立てた。ｍＭ中のＡＣＳＦ組成物は、１２４．０ＮａＣｌ、４．４ＫＣｌ、１．０Ｎａ2ＨＰＯ4、２５．０ＮａＨＣＯ３、２．０ＣａＣｌ２、２．０ＭｇＳＯ4、１０．０グルコースであった。ＣＡ１ｆＥＰＳＰを、ＣＡ１放線状層において刺激及び記録電極の双方を配置することによって、記録した。ＢＳＴを、ｆＥＰＳＰの勾配に対する線維斉射のピーク振幅をプロットすることによって、又はｆＥＰＳＰの勾配に対する刺激電圧をプロットすることによって、のいずれかでアッセイした。ＬＴＰ実験のために、１５分のベースラインを、毎分、最大誘発反応の〜３５％応答を誘発する強度で記録した。ＬＴＰをθバースト刺激を使用して誘発させた（１００Ｈｚで４パルス、５Ｈｚで繰り返すバーストを用いた、及び１５秒で隔てた３回の１０バースト訓練を含む各テタヌス）。一連の実験において、ＬＴＰを１回又は２回の１０バースト訓練を用いて誘発し、テタヌスの異なる強度で誘発されたＬＴＰへのシルデナフィルの効果を評価した。テタヌス刺激後、応答を２時間にわたり記録し、ベースラインの割合として発現された興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）勾配を測定した。その結果を平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表した。
【０３２６】
行動研究−恐怖条件付け：認知試験のこのタイプは、訓練及び試験Ａ１４、Ａ１７の複数の日を必要とする他の行動作業よりも、非常に速い。条件付けチャンバーは、防音箱中にあった。クリアなＰｌｅｘｉｇｌａｓ窓は、実験で、脚上に配置され、静止画ソフトウェアに接続されたカメラを用いてマウスの能力を撮影することを可能にした（ＭＥＤ  Ａｓｓ．Ｉｎｃ．）。背景白色雑音（７２ｄＢ）を得るため、単一のコンピュータファンを、防音チャンバーの１つの側面にインストールした。条件付けチャンバーは、３６本のバーで絶縁されたショックグリッドの床を有した。その床は除去可能であり、各実験対象後、床を７５％のエタノール、次いで水を用いて浄化した。一度に１匹のみの動物が、実験室に存在した。手掛かり及びコンテキスト条件付け実験のために、マウスを、分散トーン（ＣＳ）（２８００Ｈｚ及び８５ｄＢで３０秒持続した音）の開始前に、２分にわたり条件付けチャンバー中に配置した。ＣＳの最後の２秒において、マウスに床のバーを通して、２秒にわたり０．５０ｍＡのフットショック（ＵＳ）を与えた。ＣＳ／ＵＳ対呈示後、マウスを、さらに３０秒にわたって条件付けチャンバー中に放置し、次いでそれらのホームケージに戻した。必然的に生じる呼吸を除外して全ての運動の不在として定義されるすくみ挙動を、静止表示ソフトウェアをしようしてスコア化した。
【０３２７】
コンテキスト恐怖学習を評価するために、訓練後２４時間、マウスを訓練したチャンバー内において、すくみを５分にわたり（連続的に）測定した。手掛かり恐怖学習を評価するために、次のコンテキスト試験、マウスを、新しいコンテキスト（平滑な床及びバニラ臭を伴う三角形のケージ）に２分（ＣＳ試験前）にわたり配置した、その後、それらをＣＳに３分（ＣＳ試験）にわたり暴露し、すくみを測定するであろう。ショックの感覚知覚を閾値評価を通して決定した。単一のフットショックの配列を、恐怖条件付けのために使用した同一帯電体グリッド上に配置した動物に送達した。最初に、０．１ｍＶのショックを１秒にわたり送達し、その動物行動を尻込み、跳躍、及び啼鳴に対して評価した。３０秒間隔で、そのショック強度を０．１ｍＶ〜０．７ｍＶまで増加させ、次いで３０秒間隔で０．１ｍＶ増加において、０ｍＶに戻した。啼鳴、尻込み、及び次いで跳躍の闘値を、各動物がフットショックに対して行動応答を表すショック強度を平均化することによって、各動物に対して定量化した。恐怖条件付けをシルデナフィル又は媒体の存在下で試験した、実験におけるマウスの異なる群間で、いずれの差異も観察されなかった。
【０３２８】
行動研究−空間作業記憶：これは、ＲＡＷＭ試験１２で研究できる短期記憶のタイプである。手短に述べると、ＲＡＷＭは、水（２４〜２５ｏＣ）で満たされている白色水槽（直径１２０ｃｍ）から成り、非有毒性白色ペンキの追加によって不透明になった。水槽壁内を、６つのアームを産生するために位置し、中枢領域から照射した。空間キューを試験室の壁上に提示した。アームの１つの末端に、明瞭な１０ｃｍの水浸した（１．５ｃｍ）プラットフォームを位置づけ、これは１日の全ての試験で同一位置にとどめたが、日々ランダムに移動させた。各試験で、そのマウスは、異なるランダムに選択されたアームで作業を開始した。そのマウスは、前の日のプラットフォームの位置のその長期記憶を使用しなかったが、部屋に提示された空間キューに基づいて、問題になっている日のその位置の短期記憶に頼った。各試験は１分持続し、マウスが間違ったアームに入る、又はプラットフォームに達するのに２０秒以上必要とするたびに、エラーを数えた。各エラー後、そのマウスを試験の開始アームへと戻した。４つの連続取得試験後、そのマウスをそれらのホームケージに３０分間配置し、次いで迷路へと戻し、第５の保持試験を実施した。試験を、第４、第５の試験で同一の数のエラーをＷＴマウスがしたことによって、完了したと考慮した。試験の最終３日間の各マウスのスコアを平均化し、統計解析のために使用した。
【０３２９】
行動研究−参照記憶：Ｍｏｒｒｉｓ水迷路を用いて研究された作業を、先に説明した１２。手短に述べると、マウスを訓練した、２回の一日のセッション（４時間離して）、３つの試験（各１分）から成り、３日にわたる。隠しプラットフォームに達するために必要とした時間を記録した。空間記憶の保持を試験するため、移動したプラットフォームを用いた訓練後、４つのプローブ試験を行った。その迷路を４つの象限に分けた。以前にプラットフォームを含有していた象限で費やした時間の割合を、記録し、ビデオトラッキングシステム（ＨＶＳ２０２０、ＨＶＳ画像）を使用して分析した。
【０３３０】
行動研究−可視のプラットフォーム試験：視覚及び運動欠損を試験するための可視のプラットフォーム訓練は、黒色の旗で標識されたプラットフォームを伴うＭｏｒｒｉｓ水迷路と同一プールで、試験ごとにランダムに位置付けして行った。プラットフォームに達する時間及び速度を、記録し、ビデオトラッキングシステム（ＨＶＳ２０２０、ＨＶＳ画像、ＵＫ）を用いて分析した。
【０３３１】
免疫細胞化学的実験：リン酸化ＣＲＥＢの免疫細胞化学的測定を、すでに説明したように行った（Ｐｕｚｚｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ／ｃＧＭＰ／ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，６８８７−６８９７（２００５））。手短に述べると、海馬のスライスは、処置後１分で、氷冷の４％のパラホルムアルデヒドで固定した。スライスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、６０分にわたり０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処置し、再度ＰＢＳ中で３回洗浄し、５０ｍＭの塩化アンモニウムで２０分にわたり処置し、６０分にわたり１０％のヤギ血清中でインキュベートした。スライスを、第１の抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの、１０％のヤギ血清中で１：１００に希釈されたウサギポリクローナル抗リン酸化ＣＲＥＢ）を用いて、４℃で３６時間、インキュベートした。スライスを、ＰＢＳ中で洗浄し（６回、毎回２時間）、第２の抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからの、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で標識されたヤギ抗ウサギ抗体）とインキュベートし、４℃で１２時間、１０％のヤギ血清中で１：１００に希釈し、再度ＰＢＳ中で洗浄した（６回、毎回２時間）。スライスを、４Ｘ及び１６Ｘ対物レンズを使用する、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｄ−Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１）によって検討した。４つの走査のカルマン平均を、各画像に対して収集した。その解析を、実験処置に盲目である観察者によって、ＮＩＨ画像ソフトウェアを使用して行った。背景よりも上に設定された闘値を越える平均蛍光強度を、ＣＡ１細胞体領域の各スライスに対して決定した。その値を、同一動物の無処置の対照スライスからの値に規格化し、対照±ＳＥＭの平均割合として表した。免疫蛍光の特異性を第１の抗体を取り除くことによって確認し、蛍光強度の有意な減少をもたらした。
【０３３２】
Ａβレベルの決定：凍結した脳半球を秤量し、５ＭのグアニジンＨＣＬ／５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣＬ溶液でホモジナイズした。製造者のプロトコルに従って、Ａβ４０及びＡβ４２を、ヒトβアミロイドＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＣＡ）を使用して測定した。ＥＬＩＳＡシグナルを、皮質のミリグラム当たりのＡβのナノグラムで、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。例えば、海馬のスライスは、処置後１分で、氷冷の４％のパラホルムアルデヒド中で固定した。スライスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、６０分にわたり０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処置し、再度ＰＢＳ中で３回洗浄し、５０ｍＭの塩化アンモニウムで２０分にわたり処置し、６０分にわたり１０％のヤギ血清中でインキュベートした。スライスを、第１の抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの、１０％のヤギ血清中で１：１００に希釈されたウサギポリクローナル抗リン酸化ＣＲＥＢ）を用いて、４℃で３６時間、インキュベートした。スライスを、ＰＢＳ中で洗浄し（６回、毎回２時間）、第２の抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからの、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識されたヤギ抗ウサギ抗体）とインキュベートし、４℃で１２時間、１０％のヤギ血清中で１：１００に希釈し、再度ＰＢＳ中で洗浄した（６回、毎回２時間）。スライスを、４Ｘ及び１６Ｘ対物レンズを使用する、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｄ−Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１）によって検討した。４つの走査のカルマン平均を、各画像に対して収集した。その解析を、実験処置に盲目である観察者によって、ＮＩＨ画像ソフトウェアを使用して行った。背景よりも上に設定された闘値を越える平均蛍光強度を、ＣＡ１細胞体領域の各スライスに対して決定した。その値を、同一動物の無処置の対照スライスからの値に規格化し、対照±ＳＥＭの平均割合として表した。免疫蛍光の特異性を第１の抗体を取り除くことによって確認し、蛍光強度の有意な減少をもたらした。
【０３３３】
ウエスタンブロット：マウス脳を、プロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液（２０ｍＭのトリス塩剤、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２５０ｍＭのショ糖）中でホモジナイズした。ホモジネートの一部を１００，０００ｇで１時間にわたり超遠心し、その上清を使用し、ｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβ断片を分析した。各ホモジネート中のタンパク質濃度を定量化し、各試料からの等しい量のタンパク質を分析した。試料を、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲルのウェルに負荷し、製造者のプロトコルに従って、電気泳動し、移動させた。ポンソーＳ染色後、膜を洗浄し、室温で１時間にわたり、ＰＢＳ中で５％の無脂粉乳中でインキュベートした。次いで、それらを、以下の第１の抗体を用いて、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ中の５％のヤギ血清中で希釈した：ＡＰＰ全長検出のマウス２２Ｃ１１（１：４０００，Ｓｉｇｍａ）；マウスｓＡＰＰα及びＳｗｅｄｉｓｈ  ｓＡＰＰβ（１：４０００及び１：１０００，ＩＢＬ）、ＣＴＦのウサギＡｂＤ（１：２５０，Ｚｙｍｅｄ）、対照としてマウスチューブリン（１：２０．０００，Ｓｉｇｍａ）。一晩のインキュベーション後、膜を３０分にわたりＰＢＳ中で３回洗浄し、ヤギ抗マウス又はヤギ抗ウサギ抗体でインキュベートし、ＰＢＳ中の５％の無脂粉乳中で希釈した（１：４０００及び１：２０００）。３０分にわたるＰＢＳ中での洗浄後、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）への暴露後、Ｘ線検出を行った。その解析を、実験処置に盲目である観察者によって、ＮＩＨ画像ソフトウェアを使用して行った。各試料に対して決定された平均強度及び値を、チューブリンからの値に規格化し、対照の平均割合±ＳＥＭとして表した。
【０３３４】
統計解析。全ての実験に対して、マウスを、遺伝子型及び処置に関して研究者を「盲目」にするようにコード化した。データを平均値±ＳＥＭとして表した。結果を、スチューデントｔ検定（対比較）又は事後補正（複数の比較）を用いた分散分析で分析した。有意性のレベルを、Ｐ＜０．０５に設定した。
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実施例２−ＡＤのために最適化されたＰＤＥ５阻害剤の同定−ＰＤＥ５の高い親和性及び他のＰＤＥと比較して良好な選択性を伴う化合物
【０３３５】
シナプス伝達及び認知は、ヒトアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）変異（Ｋ６７０Ｍ：Ｎ６７１Ｌ）及びヒトプレセニリン−１（ＰＳ１）変異（Ｍ１４６Ｌ）（ＡＰＰ／ＰＳ１マウス［２３］と称される）の双方を発現する、二重Ｔｇ（遺伝子組換え）マウス中で変化した。いずれの既存のＰＤＥ５阻害剤も、中枢神経系の疾患に反作用するように開発されてはおらず、同時に、ＡＤ患者等の併発状態を患う高齢者人口への、慢性投与に必要とされている選択性を保有する。ＡＤ患者に使用するための目的に合わせたＰＤＥ５阻害剤を、スクリーニングし、これらの化合物が、Ｔｇ  ＡＤモデルの通常の認知を回復できるかを見極めるために試験した。
【０３３６】
ＰＤＥ５の阻害を介するＮＯ／ｓＧＣ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の増強は、Ａβ誘発性シナプス及び認知異常に反作用する。ＮＯ／ｓＧＣ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ  経路に作用し、中枢神経系のために最適化される双方の薬物が、欠乏している。新しい薬物を、ａ）高い特異性及び効力、ｂ）良好なＰＫ、生物学的利用率及び中枢神経系透過、ｃ）安全性を用いて同定する。既存の薬物のいずれも、これらの判断基準の全てに適合しないことで知られる。シルデナフィルがＢＢＢ［７２］を通過することが報告されており［７２］、６．０ｎＭのＰＤＥ５に対してＩＣ５０、げっ歯類（ヒトにおいて〜４時間）において０．４時間のインビボ半減期を有する［７０、７４］。しかしながら、脳を除く心筋及び血管中で発現され、軽度血管拡張効果をもたらすことができるそのＰＤＥ１の選択性比率は１８０であり、網膜中のみで発現され、視覚を過渡的に妨げることができるＰＤＥ６の選択性比率は、１２と等しい［６７、８６］。ＢＢＢを通過するバルデナフィル能力の証拠は、間接的であり［８７］（０．１７ｎＭのＰＤＥ５に対するＩＣ５０、ＰＤＥ１＞１０００及びＰＤＥ６＝３．５の選択性比率）［８８、８９］、タダラフィルはそれを通過しない（また、タダラフィルもＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知能力を改善しない）（５ｎＭのＰＤＥ５に対するＩＣ５０、ＰＤＥ１＞２０００及びＰＤＥ６＝１０００の選択性比率）［８６］。報告されたＰＤＥ５阻害剤の構造活性関係（ＳＡＲ）解析が行われ、次いでＣｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｓｔｒａｔｅｇｙを利用し、これら判断基準の全てに適合する化合物を開発する。
【０３３７】
医薬品化学戦略。この提唱の強みは、プロジェクトの段階での、機能的アッセイの集約的使用毎及び検証されたインビボ疾患モデルの平行使用というところにある。その医薬品化学アプローチを、バイオアッセイの強度、ならびに医薬品化学の資金が、業界に見出すことが出来るそれよりも一桁低いという現実に適合するように調整なければならない。既存のＰＤＥ５阻害剤をＥＤの処置として使用する。報告されるＰＤＥ５阻害剤の構造解析及び知られるＳＡＲデータ（図１２）に基づいて、構造的に関連するが公式に独立した足場Ｉ〜ＩＶである、４つのクラス（図１３を参照されたい）は、ＰＤＥ５阻害剤候補として見なされる。これらの足場に由来する化合物は、スクリーニングされ、計算モデル上で最適化される。最も高いスコアを伴う化合物は、合成され、効力に対して試験される。この段階で、合成努力は、効力／選択性の結果を試験することによって導かれる。満足な効力及び選択性（リード化合物）を伴う化合物は、ＰＫ、生物学的利用率／脳透過、及びオフターゲット活性（安全性）に対してさらに研究される。
【０３３８】
既知のＰＤＥ５阻害剤の構造活性関係（ＳＡＲ）：早期のＰＤＥ５阻害剤の設計はｃＧＭＰの構造の模倣に頼ったが、現在は、ＳＡＲデータの広域なアレイ及びＰＤＥ５複合型のシルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィルを用いた非常に近年の高解像度Ｘ線構造が利用可能であり、望まれる特性を伴うＰＤＥ５阻害剤を開発するための素晴らしい基礎を提供する。ＰＤＥ５阻害剤の複数の異なった足場構造の調査及び発表された報告からのＳＡＲデータの入念な解析の後、それらの足場は、非常に一般的で重要な特徴を共有する：全ての構造は、縮合平面環系を含み、この環系は、：（１）水素結合受容体（例えば、ピリミジル環上のＮ及びシルデナフィル上のＣ＝Ｏ）、又は（２）Ｈ結合ドナー（ＮＨ）もしくはＨ結合受容体（Ｃ＝Ｏ）又は双方（アミドＮＨ−Ｃ＝Ｏ）、を含有する。これらの観察は、ＰＤＥ５阻害剤複合体のＸ線構造からの見識に適合する。この平面環系に加えて、全てのＰＤＥ５阻害剤は、３疎水性基（Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3）を含有する。これら３個の疎水性基の寸法及び本質は、酵素と、Ｈ結合受容体又はドナーとの間のＨ結合の強さに依存するように思われる。Ｈ結合受容体（Ｃ＝Ｏ、Ｎ：）を用いた阻害剤のため、縮合平面環系上で、巨大な芳香族Ｒ２基は、ｃＧＭＰのリン酸によって占有される部位で、最適な適合を達成する。環系上のＨ結合ドナー（すなわち、タダラフィルのＮＨ）を用いた阻害剤のため、巨大な芳香族Ｒ１基は、疎水性Ｑ２ポケットで最適な適合を達成する。Ｒ1及びＲ2と比較して、Ｒ3は小さく、有意ではないように見える。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の修飾、効力、選択性、ならびに経口生物学的利用率及び細胞透過等のＰＫ特性を、最適化することができる。今までに報告されたＰＤＥ５阻害剤の縮合平面環系が図１２に列挙される。
【０３３９】
合成される足場：上記のＳＡＲ解析に基づいて、足場の４つのセット（図１３）を提示する：１）シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ）及びバルデナフィル（Ｌｅｖｉｔｒａ）によって表される（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｂａｙｅｒ、Ｓｈｅｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）ｃＧＭＰに基づくもの、２）タダラフィル（Ｃｉａｌｉｓ）によって表される（Ｌｉｌｌｙ、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｊ＆Ｊ））、βカルボリン由来のもの、３）キナゾリン及びイソキノリノン誘導体（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ），Ｊａｐａｎ）、４）フタラジン誘導体（ＢＭＳ，Ｊａｐａｎ）。これらの化合物クラスは、以下の判断基準に適う：１）Ｈ結合受容体又はドナーを伴う縮合環系、２）容易に入手可能な出発物質から容易に合成される、３）スクリーニングのために比較的大きい数の化合物を生成するために、修飾可能な十分な部位。
【０３４０】
足場Ｉａ〜Ｉｃの設計は、強力なＰＤＥ５阻害（ＩＣ50＝０．２３ｎＭ）を伴う既知の構造Ｔ１０５６（図１３中に表される）、及び他のＰＤＥ１〜４、６に対する優れたＰＤＥ５選択性（＞１００，０００倍の選択性とＰＤＥ１〜４との対比、２４０倍とＰＤＥ６との対比）に基づく（国際公開第９８３８１６８号、日本特許第２００００７２６７５号）。ｃＧＭＰのリン酸の部位に適合するため、足場Ｉａにおいて、Ｒ2疎水性基を、多用途の中間体５との鈴木クロスカップリング反応によって、容易に導入できる（模式図Ｉａ）。別のＲ１基がＱ２ポケットに必要とされる場合、そのアミドのＮＨが置換のための部位に成り得る。足場Ｉｂにおいて、そのエナミン部分を、アミドで置換した。足場Ｉｃにおいて、そのＳ＝Ｏは、Ｈ結合受容体として機能する。
【０３４１】
また、足場は、図１３に列挙されるキノリン構造（ＩＩａ−ＩＩｄ）に基づいた。２つの特許は、構造ＩＩｅを伴うＰＤＥ５阻害剤としてキノリン誘導体を報告する（国際公開第２００１０１２６０８号、日本特許第２００２３０８８７７号）。ＢＭＳによって報告されるキノリンに基づくＰＤＥ５阻害剤は、シルデナフィルよりも１２０倍さらに強力であり、他のＰＤＥアイソザイムに対してシルデナフィルよりもより有意に選択的である（ＩＣ50＝０．０５ｎＭ、ＰＤＥ１−４／ＰＤＥ５＞７８００、及びＰＤＥ６／ＰＤＥ５＝１６０）。この化合物より、新しい化合物が開発される。例えば、Ｏ、Ｃ又はＳ、もしくはヘテロ原子によって置換され得る窒素を、いずれの環の様々な位置でも導入でき、化合物の新しいクラスを生成できる。わずかなＳＡＲ情報がキノリンで入手可能であるが、２〜３のステップで合成でき、概して構造ＩＩｅと等比体積である一連の分子は、インシリコスクリーニングのための予測された誘導体をガイドし得る（足場ＩＩａ〜ＩＩｃの合成を参照されたい）。
【０３４２】
図１３に解説される足場ＩＩＩａ〜ｃ及びＩＩＩａ−１〜ＩＩＩｃ−１を、全ての報告されるＰＤＥ５阻害剤が、Ｈ結合受容体又はドナーを伴う平面縮合環系を保有するという観察に、主に基づき設計する。疎水性相互作用は、タダラフィル結合中の主な力であり、関連する足場をＩＶａ及びＩＶｂによって解説する（図１３）。
【０３４３】
足場Ｉａの合成：標的化合物Ｉａの合成を、模式図Ｉａ（図１４）に概略する。鍵となる中間体キノリノン３を、マロンアミド２の環化によって得ることができ、市販のＥａｔｏｎの試薬の存在下で、二塩化マロニル及び置換アニリンから容易に調製できる。次いで、キノリノン３を、単純な二段階塩素化／加水分解配列を介して、４−クロロ誘導体５に転換する。鈴木クロスカップリング反応は、化合物５をフェニルボロン酸と結合させることが可能であり、良好な収率で標的化合物Ｉａを得る。
【０３４４】
足場ＩＩａ〜ＩＩｃの合成：ＩＩｃは、置換アニリンを高温でエトキシメチレンマロン酸エステルと、その後ベンジル臭化物等のアルキル化反応物と反応させることによって合成し、ＩＩｃ−４を得る。その中間体４−ヒドロキシキノリン（ＩＩｃ−１）を、非常に多用途の中間体である、４−クロロキノリンＩＩｃ−２に転換する。異なるアミンとのＩＩｃ−２の反応は、大きな数の化合物を提供する、例えば、４−アミノキノリンＩＩｃ−３を、アンモニアとの反応によって、４−クロロキノリンから得ることができる。ＩＩｃ−３を、アミドＩＩａ−１及びスルホンアミドＩＩｂ−１に容易に転換できる（模式図ＩＩａ〜ＩＩｃ、図１５）。
【０３４５】
足場ＩＩｄの合成：ＩＩｄを、模式図ＩＩｄ（図１６）に概略されるように合成できる。アントラニル酸を、過剰のホルムアミジン酢酸を用いて、高温で処置し、化合物ＩＩｄ〜１を得る。その塩化物産生物ＩＩｄ−２を、還流で、塩化チオニルを用いたＩＩｄ−１の処置によって得る。３−クロロ−４−メトキシベンジルアミンとの結合塩化物ＩＩｄ−２は、ＩＩｄ−３を提供する。
【０３４６】
足場ＩＩＩの合成：（模式図ＩＩＩを参照されたい、図１７）２−アミノ安息香酸メチルエステルとジメチルアセチレンジカルボン酸の反応、続いてｔ−ＢｕＯＫによって誘発される環化は、産生物ＩＩＩｃ−１を提供する。ＮＨ２ＮＨ２を用いたＩＩＩｃ−１の処置は、産生物ＩＩＩｂ−１をもたらし、それをＩＩＩａ−１に転換する。アミンを用いたＩＩＩａ−１の反応は、ＩＩＩａを提供する。アミンを用いたＩＩＩｃ−１の反応は、ＩＩＩｃを提供する。ＩＩＩｂ−１のアルキル化は、ＩＩＩｂを提供する。
【０３４７】
足場Ｉｖａの合成：模式図Ｉｖａに表されるように（図１８）、その標的化合物ＩＶを、容易に入手可能であるアミノ酸メチルエステルから調製できる。芳香族アルデヒとの反応は、イミンＩＶ−１を提供する。ナフトキノンとのイミンＩＶ−１の１．３−双極子環化付加は、鍵となる中間体ＩＶ−２をもたらす。標的ペペラジンジオン（ｐｅｐｅｒａｚｉｎｅｄｉｏｎｅ）ＩＶを、化合物ＩＶ−２のクロロアセチル化によって、その後に続く第１のアミンの存在下における閉環によって得ることができる。
【０３４８】
薬物活性の評価
【０３４９】
インビトロ試験：候補化合物を、最初にＰＤＥ５阻害活性のために試験する。その活性がわずかである場合、化合物を、他のＰＤＥに対して試験し、選択性を評価する。そのＰＤＥを購入、又は刊行物に説明される方法に従って調製する。ＰＤＥアッセイを、マルチスクリーニングプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び研究室において利用可能である真空マニホールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した、報告される方法に従って行う［９０、９１］、そこで、反応ならびに基質及び産生物の後の分離の双方が達成できる。そのアッセイは、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、５ｍＭのＭｇ酢酸、１ｍＭのＥＧＴＡ、及び２５０μｇ／ｍＬのヘビ毒ヌクレオチダーゼ、５０ｎＭの［８−3Ｈ］−ｃＧＭＰ（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）又は［８−3Ｈ］−ｃＡＭＰ（２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用する。反応を、２５μＬの希釈した酵素調製物の添加によって、開始する。そのアッセイを、３０分にわたり、３０℃でインキュベートする。微小カラムを、水中で（１２ｍＬ／ｇ）、２時間にわたり先に腫大させたＱＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘのウェル当たり３００μＬを一定分量化することによって、調製する。インキュベーションの最後に、アッセイの総量を、濾過によって微小カラムプレートに負荷する。遊離放射能の溶出を、２００μＬの水によって得、５０μＬの一定分量が、シンチレーション測定によって分析される
【０３５０】
ＰＤＥ５の強力阻害剤に成ることに加えて、また、その候補化合物は、選択的でなくてはならない（知られている阻害剤の幾つかの副作用は、心臓に見出されるＰＤＥ１及び主に網膜に位置づけられるＰＤＥ６等の、他のＰＤＥの非特異的阻害のため、少なくとも部分的にはそのためであると考えられる、また［９２］を再検討のために参照されたい）。他のＰＤＥファミリーに対してアッセイされる場合、それらは、ＰＤＥ５に向けて少なくとも５０倍大きな効力を表さなければならない。これらのファミリーは、ＰＤＥ１、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性；ＰＤＥ２、ｃＧＭＰ刺激；ＰＤＥ３、ｃＧＭＰ阻害；ＰＤＥ４、ｃＡＭＰ特異的；ＰＤＥ５、ｃＧＭＰ特異的；ＰＤＥ６、光受容体ｃＧＭＰ特異的；ＰＤＥ７、ｃＡＭＰ特異的；ＰＤＥ８、ｃＡＭＰ特異的；ＰＤＥ９、ｃＧＭＰ特異的；ＰＤＥ１０及びＰＤＥ１１を含み、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの双方を加水分解する。加えて、これらの化合物は、ＰＫＧ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、及びＰＫＢ等のキナーゼに対して、選択的でなければならない。これらのＰＤＥ、ならびにＰＫＧ及びＰＫＡのためのアッセイは、研究室において確立されている。
【０３５１】
第１の培養物及び成体マウスの試験：十分なインビトロでのＰＤＥ５阻害活性（ＩＣ５０＜５０ｎＭ）を伴う化合物を、機能的アッセイでさらに試験し、その化合物が、神経細胞のｃＧＭＰを増加できるかを決定する。海馬の神経細胞を、すでに説明したように調製し［９３］、２４ウェルの培養皿において、（１−２）×１０５細胞／ウェルの密度で、播種する。実験は、細胞がコンフルエンスに達し、シナプス接触を形成する、培養物中の１０日後に行う。培地を吸引、ＰＤＥ阻害剤を含有する０．５ｍＬのＰＢＳと置換する。３７℃で３０分後、可溶性グアニリルシクラーゼを、１００μＭのＢＡＹ４１−２２７２（ＰＤＥ活性への効果を伴わないｓＧＣ刺激剤［９４］）の添加によって、３７℃で１０分にわたり刺激する。インキュベーションの最後に、その培地を除去し、細胞外環状ヌクレオチド決定のために、−２０℃で貯蔵する。細胞内環状ヌクレオチドを、４℃で、５分にわたる２回のエタノール性（６５％）洗浄によって抽出する。そのエタノール性抽出物をプールし、蒸発乾固させ、−２０℃で貯蔵する。ｃＧＭＰを、シンチレーション近接イムノアッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって、測定する。全ての実験を、三つの組で行う。
【０３５２】
また、海馬の培養物の試験を通過する化合物を、成体マウスにおいて試験する、急性毒性の評価が後に続き、動物に投与される化合物の用量を決定する（下記の「毒性試験」を参照されたい）。動物をＰＤＥ阻害剤を用いて処置し、試料を収集し、即時にホモジナイズし、４ｍＭのＥＤＴＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＩＬ）を含有する、ＢＩＯＴＲＡＫ  ｃＧＭＰ酵素イムノアッセイキット緩衝液中で超音波処理し、試料を遠心分離（１２，０００ｘｇ、５分間）し、キットを使用して上清中でｃＧＭＰを測定する（結果は、Ｌｏｗｒｙの方法を用いて、ペレットタンパク質レベルを規格化する）。次のＰＤＥ阻害剤及びそれらの阻害剤又はそれらの代謝物に続いて、ｃＧＭＰレベルの増加を透析液中に検出し、見出す場合、その候補化合物を、活発であると見なす。
【０３５３】
計算戦略
【０３５４】
一般研究。ＰＤＥ５に結合する新しい薬物候補を発見するため、医薬品化学の試みを計算モデルによって助ける。Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−５  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ，”  Ｄｅｃ  ２７  ２００７，Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｃｈｅｍ  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）に説明される構造に基づく仮想スクリーニング等の合理的設計アプローチは、アミノ酸残基、Ｆ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、Ｍ８１６、又はＰＤＥ５のそれらの組み合わせ（Ｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１２：２２３３−４７）と連合する新しい薬物を見出す機会を最大化することを助けることができる。計算プロトコルを、図１３に表された足場の４つの主要なクラスによって表された構造  を使用して、予備ドッキング研究のために使用できる。その計算結果は、幾つかの構造又はそれらの構造的変異体が、ＰＤＥ５の結合部位に適合するかを質的に表すことができる。
【０３５５】
一般的ＡＤＭＥＴの考慮
【０３５６】
ライブラリーメンバーのＡＤＭＥＴ特性に関する最適化は、合成努力を導くように薬物発見の早期の段階で考慮されるべきである［１６７、１６８］。設計目的のために、ｍｅｄ  ｃｈｅｍフィルター（ＭＣＦ）を使用し［１６９、１７０］（例えば、反応性、不安定、又はトキシコフォア群の存在）、設計された化合物のコンプライアンスを、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ「５の法則」［１７１、１７２］［それは、１）５又はそれ以下の水素結合ドナー、２）１０又はそれ以下の水素結合受容体、３）５００未満の分子量、４）産出されたｌｏｇＰは、５未満又は５と等しい、と記載する］によって調節し、極性及び親油性表面領域を、溶解性及び細胞透過性特性［１７３］、及びＡＤＭＥＴ予測装置を利用して［１４９］、潜在的阻害剤の最適な生物学的利用率スコア［１７４］に、最適のまま保持する。
【０３５７】
ＡＤＭＥＴ予測装置［１４９］、よく知られる５の法則を越えて、追加のＡＤＭＥ予知モデルを含む先端ＡＤＭＥＴ構造特性予測プログラムを、可動性ドッキングを介して潜在的リガンドを予測するために使用できる。プログラムは、経口吸収（ｐＫａ’ｓを含む）、ならびに幾つかの薬物動態特性及び毒性の多くの態様［１４９］に重大な全ての重要な特性を予測する。また、ＢＢＢ透過を、各候補化合物の極性表面積（ＰＳＡ）及び油／水分配係数（ｌｏｇＰ）を算出する、確立された定量構造活性関係（ＱＳＡＲ）及び人工神経網（ＡＮＮ）モデル［１５０、１５１］を使用することによって、理論的に推定する。これらのＱＳＡＲ及びＡＮＮモデルは、化合物のＢＢＢ透過を、化合物のＰＳＡ及びｌｏｇＰ（又はＰＳＡ及び分子量）によって決定することを示し、双方をＡＤＭＥＴ予測装置によって、便利に算出できる。通常、ＢＢＢを通過できる化合物は、４５０Ｄａ未満の分子量及び９０Å2未満のＰＳＡを有するべきである［１５０］。
【０３５８】
かかる考慮は、膜を透過する化合物の能力を保証し、したがって細胞及び動物レベルの双方で、研究を可能とするために適切である。だが、薬らしいと計算的に予測された分子は、実際のインビボ活性に影響する非常に多くの異なる機構及びパラメーターが存在するため、「自動的に薬らしく」［１７５］はないことが、留意されるべきである。ＡＤＭＥＴプロファイルを改善するために必要とされ得るさらなる修飾を可能にするため、「リード類似」［１７６、１７７］判断基準を使用することに、主要な重点を置く。得られた「リード類似」化合物の活性及びＡＤＭＥＴプロファイルを、後に、計算機モデリングの追加のラウンド及び医薬品化学の試み、ならびに細胞及び分子薬理学及びインビトロ及びインビボ毒性学のための、様々な細胞に基づくアッセイを通して改善することができる。
実施例３−ＡＤのために最適化されたＰＤＥ５阻害剤の同定−化合物が、良好なＰＫ、生物学的利用率、及び脳透過を有するかの決定
【０３５９】
中枢神経系薬物を開発する時、行う必要がある薬物動態アッセイは、ａ）生物学的利用率及びｂ）脳取り込みの測定を含むであろう。それらを、候補化合物を腹腔内注射されるマウスにおいて行う（最終薬物候補のために、また、ＰＫ試験を経口及び点滴投与の経路を使用して行う）。５〜６匹のマウス／性別を、各時点に対して使用する。生物学的利用率（投与後、時間の関数として血液中の化合物の濃度）の評価のため、血液試料を、単一急性投与に続いて試験動物から得る。薬物投与後の時間過程研究は、少なくとも６つの点（５分、１５分、１時間、２時間、５時間、及び２４時間）を含む。その動物を、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔する。血液を心腔内穿刺によって収集し、ヘパリン化管に収集し、遠心分離によって血漿を得る。試料を、候補化合物及び代謝物の量を測定するために、ＬＣ−ＭＳによって分析する。脳取り込み及び血液脳関門透過の示唆は、マウスのＰＢＳを用いた灌流が続く、脳からの候補化合物の組織抽出物を得る。手短に述べると、脳ホモジネートを、１０分にわたり１２，０００ｘｇ遠心分離する。その化合物を、固相抽出物によって単離し、次いでＨＰＬＣによって分析し、ＬＣ−ＭＳを使用して測定する。脳濃度の時間依存性変化のパターンを、血液濃度のそれと比較する。同様のパターンは、脳取り込みが血液の濃度を反映する事実を示す。ピーク脳／血液濃度比率＞１は、化合物の脳取り込みが、臨床用途において、知られる中枢神経系薬物のそれと匹敵することを表す。例えば、ミナプリン、６フェニルアミノピリダジン中枢神経系薬物の脳／血液比率は、＞２である［１７８］。
【０３６０】
一般的考慮：注目すべきことに、シルデナフィルがＢＢＢを通過することを表し［１７９］、ＡＤ動物モデルでのシルデナフィルの有効性は、ＰＤＥ５阻害剤が、中枢神経系標的のために脳透過を達成することができることをさらに示す。脳透過のための「黄金則」が存在しないにもかかわらず、経験的相関関係は、４００〜５００Ｄａより小さい分子量、又は８以下の水素結合、及びカルボン酸よりはむしろ塩基性アミンの存在の重要性を表す。また、計算的なアプローチ（上記の「計算的な設計」の「段階＃２」を参照されたい）を含む様々な方法は、薬物候補の中枢神経系透過を評価するために開発された。また、ＰＤＥ５は細胞内酵素であり；ＰＤＥ５阻害剤は、ｃＧＭＰを増加するために細胞膜を通過せねばならず、したがって、ＰＤＥ５活性のための細胞に基づくスクリーニングは、吸光度の課題にも取り組むことになる。最後に、候補薬物の構造は、ＢＢＢ透過への化学に基づくアプローチを支持することができる。例えば、水溶性上の極性機能的群、非中枢神経系透過薬物を、脂質可溶性部分を導入することによって遮蔽することができ、又は水溶性薬物を、脂質可溶性薬物担体と抱合させることができる。理想的に、その新しい薬物又はプロドラッグは、脳内で代謝され、親薬物に転換される。臨床実践において［１８０］、この化学に基づくアプローチは、ＢＢＢ薬物送達問題を解決するための使用に成功している。段階＃２で説明された計算的方法と併用して、それはＢＢＢアクセスの信頼できる予測を提供すべきである。
【０３６１】
新しく同定された化合物が安全であるかの確認
【０３６２】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて薬物有効性を決定する前であるが、十分な量の化合物の合成及び送達のための製剤の決定後に、薬物動態特性及び化合物の毒性に取り組むデータを生成する。ＡＤＭＥＴに伴う問題のため［１８１］、全ての薬物の半分以上が、標識に達することに失敗することが推定される。したがって、費用のかかる動物毒性学の過程に乗り出す前に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって行われた迅速で、安価な一連のアッセイを用いて、化合物をスクリーニングするためにインビトロＡＤＭＥＴ試験の近年の進歩が利用される。市場からの多くの薬物の撤回をもたらし、時に全体の化学系統に影響し得る、２つの領域：薬物薬物相互作用（肝臓代謝）、ｈＥＲＧチャネル妨害物（心機能不全）に焦点が置かれるであろう。肝毒性（過去２５年における薬物撤回の主な要因、及び大量の投薬治療を受けているアルツハイマーの集団に特に重要である）に関連した薬物薬物相互作用を試験するため［１８２］、チトクロムＰ４５０阻害アッセイを使用する。チトクロムＰ４５０は、肝臓代謝の重要な成分である。なお、ＰＤＥ５阻害剤、及びアゾール抗真菌、エリスロマイシン、及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤等のチトクロムＰ４５０（Ｐ３Ａ４アイソフォーム）によって代謝される他の薬物間の薬理学的相互作用が存在する。したがって、このＥＬＩＳＡアッセイから集められたＩＣ５０データは、ＣＹＰ４５０のアイソザイムを阻害する化合物の除去を可能にする。適した心臓電気生理学を障害し、トルサードポアン（Ｔｏｒｓａｄｅｓ−ｄｅ−ｐｏｉｎｔｅｓ）及び致死へと導き得るｈＥＲＧチャネル妨害物の試験のために、ルビジウムフラックス方法を、リード化合物が、これらの重要な心筋チャネルを通るイオンの流動に影響するかを評価するために使用する。
【０３６３】
次に、急性毒性を評価する。全ての臨床徴候、開始の時間、持続時間、毒性及び死亡率の可逆性を記録する。動物を、最初の４時間に与えられた連続的監視と共に最初の２４時間にわたり周期的に観察する、次いで１４日にわたり、又は死ぬまで少なくとも１日１度、食物及び液体摂取量、体重、ならびに自発運動及び探索行動を調べるため、観察する。
【０３６４】
また、最大耐性用量（ＭＴＤ）及び慢性毒性も評価する。ＭＴＤを、倦怠感又は死（時間とともに体重を監視する）に関して、いずれの毒性効果も産生しない最大投薬量として計算する。慢性毒性をＭＴＤで評価する。全ての臨床徴候、開始の時間、持続時間、毒性及び死亡率の可逆性を記録する。
【０３６５】
慢性毒性徴候の出現を、処置の終了後、少なくとも１ヶ月にわたって評価する。総剖検を、瀕死の犠牲となった、死亡が確認された、もしくは急性処置又は３０日にわたる慢性処置の終了１４日後に殺処理したものを含む、全ての動物で行う。剖検での総評価は、体重、臓器の測定を含む。臓器の色を、脂肪変化、出血、色素沈着、又は他の変化が存在するかを決定するために記す。臓器を、異常成長、線維症、壊死、又は脂肪沈着等の一貫性における、病変及び変化の検討のために、触診、直接的に可視化する。肝臓、腎臓、脳、及び筋肉の病理組織評価を行う。
【０３６６】
肝臓切片を、アポトーシス及び壊死、線維症、脂肪肝、肥大、色素沈着（胆汁、鉄分、及び銅）ならびに膨大細胞（ミトコンドリア増殖性）変化を含む、肝細胞炎症、胆管増殖、肝細胞損傷に対して評価する。スライドを、初期検討のために、ヘマトキシリン及びエオシン及びトリクローム染色を用いて染色する。
【０３６７】
腎臓切片を、ヘマトキシリン及びエオシン、トリクローム染色及び過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）を用いて検討する。糸球体、血管、尿細管、集合管及び間質を、細胞充実性、炎症、コラーゲン沈着／線維症／硬化症に対して評価する。近位尿細管上皮細胞障害又は腎臓乳頭壊死、より一般的な腎毒性作用の幾つかが存在するかを決定する。
【０３６８】
神経毒性を、新皮質、線条体、視床、海馬、小脳、脳幹及び脊髄を含む脳の全ての領域において、評価する。脳を、細胞構築、神経細胞脱落（アポトーシス及び壊死）、炎症、軸索変性、神経膠症、及びミエリン形成に対して検討する。ヘマトキシリン及びエオシン染色されたスライドが、一般的評価のために使用され、必要な場合、追加の染色にミエリン形成のためのルクソールファストブルー−ＰＡＳ、アストロサイト反応のためのＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）、及びミクログリア応答に対するＣＤ６８が含まれるだろう。
【０３６９】
筋肉を、神経原性又は筋障害性萎縮、壊死性繊維、再生繊維、脂肪沈着、又は炎症に対して検討するために、ヘマトキシリン及びエオシンを用いて評価する。トリクローム染色を、線維症を決定するために使用する。変化を初期のスクリーニング中に決定する場合、凍結した切片を、ＡＴＰ合成酵素染色を用いて繊維型分布を評価するために、作成する。フルオレセイン二酢酸方法を使用した第１の神経細胞培養物中への薬物の投与後、インビトロ細胞毒性アッセイを、細胞生存率を評価するため行う。運動、センサー、動機づけ及び認知能力を、可視の及び隠しプラットフォーム試験、ならびに総行動評価（探索行動、ＰＩＣＡ、給餌、窮迫）を使用した、急性及び慢性毒性評価の双方中、監視する。動物に過剰な疼痛又は組織障害を引き起こすことを避けるために、刺激薬又は腐食性特徴を用いた医薬品を、局所効果からのみ重篤な毒性を産生できる濃度では投与しない。
【０３７０】
一般的考慮：インビボ毒性は予測するのに非常に困難な特性であるが、幾つかの一般的戦略が続く。分子求電子（すなわち、アルキルハロゲン化物又はＭｉｃｈａｅｌ受容体）を与えることができる機能性に、即時的に取り組む。かかる機能性は、毒性をもたらすことが一般的に見出されている。例えば、的中がブロモメチル基を含有する場合、誘導体を調製し、臭化物を除去し、それを電子吸引性及び／又はトリフルオロメチル等の疎水性基（しかし、良好な離脱基ではない）と置換し、又は臭素及びメチレンに結合する他の置換基間のメチレンを除去（すなわち、ベンジル臭化物をブロモフェニルに形質転換する）し得る。
【０３７１】
また、代謝安定性を経験的に予測するのは困難である。しかしながら、代謝的に不安定（すなわち、エステル）であるとして一般的に知られている機能性は、知られている生物学的等価物と置換される［１８３］。低い代謝安定性へと導く別の一般的経路は、芳香族環酸化である。したがって、ＳＡＲ研究の間、芳香族及びヘテロ環状環に、電子吸引性基（例えば、Ｆ又はＣｌ）の戦略的な配置によって、又は置換（すなわち、ピリジン環とのフェニル環の置換）によって、電子豊富にはならない。この変化が低下した有効性をもたらさない場合において、代謝安定性の有意な増加を理解できる。加えて、生物抱合［１８４］を起こしやすい代謝物を産生することで知られている、機能性を除去するための試みが成され得る。かかる代謝物は肝毒性であり得、化合物の有用性を限定し得、その化合物は捨てられる。
【０３７２】
化合物分析。合成し、生物活性に対して試験した全ての化合物を、完全に特徴づけ、ＨＰＬＣ及び１Ｈ  ＮＭＲによって決定することにより、＞９５％まで精製する。さらに、追加の分析技術（すなわち、13Ｃ  ＮＭＲ、ＩＲ、融点、ＭＳ及び／又はエレメント分析）を使用し、構造を決定し、精製する。光学的に純粋な物質の場合において、その純度をキラル固定相ＨＰＬＣによって評価する。構造的不確実性が残存する特定のの場合において、他の技術（すなわち、２−Ｄ  ＮＭＲ、及びＸ線結晶解析）が利用される。
実施例４−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのシナプス機能障害を救出する化合物を選択することによる、新規ＰＤＥ５阻害剤のスクリーニング
【０３７３】
シナプス機能障害は、ＡＤ［１］の主要な特徴である。ＡＤの幾つかの動物モデルは、過去１２年にわたって、利用可能と成った。最速のモデルにおいても、ＡＤ病態が２ヶ月目の最終前に開始することはないため、動物に薬物を注射し、シナプス機能障害、プラーク形成、及びＡβレベルの増加に有益であるかを評価するのに、少なくともこの年齢まで待つことが必要であった。かかるインビボアプローチは、労働集約的であり得る。代替的アプローチを、Ｔｇ動物からの細胞培養物の使用によって達成し、それはＡＤ又はＡβに関連する疾患の治療及び療法のための化合物（米国特許出願番号第１０／９８０，９２２号を参照されたい）のスクリーニング及び試験の新しく、速く、効果的であり、再現できるインビトロ方法を提供する。これらの候補を検討し、それらが活性終末ボタンの基底数、及びＡＰＰ／ＰＳ１培養物中の活性終末ボタン数の、グルタミン酸誘発性の長期にわたる増加の変化を救出するかを見極める。この方法は、比較的速く、容易に行える［９３、１８５］。
【０３７４】
そのＰＤＥ５阻害剤が、通常の数の活性終末ボタン、及びＡＰＰ／ＰＳ１マウスからの培養物中の活性終末ボタンのグルタミン酸誘発性増加を回復するかを検討する。次に、これらの結果を海馬のスライスで検証し、エンハンサーが、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスからのスライスのＣＡ１領域中の通常のＬＴＰを回復するかを見極める。
【０３７５】
既存のＰＤＥ５阻害剤のｍｅｄ／ｃｈｅｍ解析に基づいて、足場の４つのクラスを同定し、新規ＰＤＥ５阻害剤候補の開発のための役割を果たす。これらの化合物をスクリーニングし、本明細書で説明される計算モデルを使用して、最適化する。したがって、新規ＰＤＥ５阻害剤を、ａ）高い特異性及び効力、ｂ）優れた中枢神経系透過、及びｃ）安全性を用いて同定する。以下の基本的な３つのエンドポイントは、ａ）ＰＤＥ５の高い親和性及び他のＰＤＥに関する良好な選択性を伴う化合物の同定、ｂ）かかる化合物が、良好なＰＫ、生物学的利用率、及び脳透過を有するかの決定、ｃ）前述の判断基準に適う化合物が安全かの確認に集中する。
【０３７６】
実験設計：ＡＰＰ／ＰＳ１培養物が機能的シナプス前放出部位の基底数の増加を表す知見に基づいて（図２２Ｂを参照されたい）、その化合物を、活性終末ボタンの通常の基底数を回復できるものを選択するため、ＭｅｄＣｈｅｍ研究によって表されるようにスクリーニングする。ＰＤＥ５阻害剤処置有り及び無しでの活性終末ボタンの数を、二重Ｔｇ−及びＷＴ−同腹子からの培養物中において検討する。ＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ同腹子からの１０日目の培養物を、４日にわたり処置し、化合物が、活性終末ボタン数の増加を救出することができるかを試験する。また、ＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ同腹子からの１０日目の培養物を、２０分にわたり処置し、短い処置が、機能的活性終末ボタンの増加を救出するかを試験する。二重Ｔｇ及びＷＴ動物からの化合物処置された培養物間で、基底活性終末ボタン数にいずれの差異も存在しないが、媒体単独で処置された二重Ｔｇマウスからの培養物は、増加した基底活性終末ボタン数を表し、化合物を、ＡＤ動物モデルからの培養物中の機能的終末ボタンの基底数の変化の発達の遮断薬と見なす。
【０３７７】
活性終末ボタンの数のグルタミン酸誘発性増加の欠乏は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスからの培養物中で発生する別の現象である（図２２Ｃを参照されたい）。新しい化合物を、この可塑性変化の機能障害を救出することができるかに関して、検討する。同一戦略を、活性終末ボタンの基底数に関して使用する。手短に述べると、ＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ同腹子からの培養物を、活性終末ボタン数のグルタミン酸誘発性増加を誘発する前に、１０日目から４日にわたり、又は１０日目に２０分にわたり処置する。活性終末ボタン数のグルタミン酸誘発性増加の回復を検討する。これを観察する場合、その化合物が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスからの培養物中のシナプス可塑性の機能障害を救出することができると見なす。
【０３７８】
方法
【０３７９】
二重Ｔｇマウスを、ＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ）（ライン６．２）動物を用いてＡＰＰ（Ｋ６７０Ｍ：Ｎ６７１Ｌ）を通過することによって得る。その遺伝子型を、尾試料でのＰＣＲによって同定する［１８６〜１８８］。第１の培養物を、すでに説明したように、１日目のマウスの子から調製する（Ｎｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  ［１８９］を参照されたい）。
【０３８０】
小胞サイクリング研究を、蒔いた後、７〜２１日目に行う（Ｎｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ［１８９］の詳述を参照されたい）。手短に述べると、ＦＭ１〜４３の負荷を、灌流培地が通常の浴溶液から、４５秒にわたって、５μＭのＦＭ１〜４３を用いた高カリウム血性溶液へと変化することによって、誘発する。ＡＤＶＡＳＥＰ−７（１ｍＭ）を、１分及び６分の洗浄で、洗浄溶液に６０秒にわたって導入する。負荷軽減を、高カリウム血性溶液（ＦＭ１〜４３無しで）の複数の１５秒間の適用を用いて行う。高カリウム血性溶液への複数回の暴露前後の画像間の差異は、ＦＭ１〜４３染色された小胞の測定を提供する［図２２Ａを参照されたい］。細胞体からの１２μＭで、ランダムに選択された神経突起（１５Ｘ６．８５μｍ視野）の均一長さ当たりの活性終末ボタンの数を、盲検法で測定する。可塑性を、グルタミン酸（３０秒にわたるＭｇ2+遊離浴溶液中に２００μＭ）を通して誘発する。染色及び脱染手段を、グルタミン酸後、３０分繰り返す。全ての画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｄ−Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１共焦点顕微鏡を使用して取得する。ランダムに選択された視野（３０．８Ｘ３０．８μｍ）からの終末ボタンの総数を、ＮＩＨ画像（ｖ．１．６１）を使用して、盲検的に評価する。
【０３８１】
電気生理学的解析を、オスで行う（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，［８３］の詳述を参照されたい）。４００μＭのスライスを、組織チョッパーを用いてカットし、記録前に、２９℃で９０分にわたり界面チャンバーで維持する。手短に述べると、ＣＡ１ｆＥＰＳＰを、刺激及び記録電極の双方をＣＡ１放線状層に配置することによって、記録する。ＢＳＴを、ｆＥＰＳＰの勾配に対する刺激電圧をプロットすること、又はｆＥＰＳＰの勾配に対する線維斉射のピーク振幅をプロットすること、のいずれかによってアッセイする。ＬＴＰ実験のために、１５分のベースラインを、毎分、最大誘発反応の〜３５％応答を誘発する強度で記録する。ＬＴＰをθバースト刺激を使用して誘発する（１００Ｈｚで４パルス、５Ｈｚで繰り返すバーストを用いた、及び１５秒で隔てた３つの１０バースト訓練を含む各テタヌス）。
【０３８２】
統計解析を、本明細書で説明されるように行う。
実施例５−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知異常を防止するかを検討するための、シナプス機能の試験を通して選択されたＰＤＥ５阻害剤のスクリーニング
【０３８３】
ＮＯ／ｓＧＣ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路のエンハンサーは、年齢３ヶ月及び６ヶ月のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、観察された認知欠損を救出することができる。Ｔｇ培養物及びスライスの新規ＰＤＥ５阻害剤スクリーニングを、空間作業記憶、参照記憶、及びコンテキスト恐怖学習の機能障害からＡＰＰ／ＰＳ１マウスを保護できるかに関して、決定する。新規ＰＤＥ５阻害剤を用いた処置を、それらがＡＰＰ／ＰＳ１マウスの異常認知への有益な効果を有するかを見極めるため、検討する。
【０３８４】
実験設計：第１連の実験において、空間作業記憶、ＡＤに影響されている患者及びＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、早期の段階で障害されている短期記憶のタイプを、ＲＡＷＭを使用して試験する。次に、ＦＣを用いて試験され、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて年齢３ヶ月で障害されている連合記憶、コンテキスト記憶のタイプを、検討する。最後に、ＭＷＭを用いて試験され、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて年齢６ヶ月で障害されている参照記憶、長期記憶のタイプを、評価する。加えて、対照を、可視のプラットフォーム作業、感覚闘値及び手掛かり条件付け試験を用いて、行う。その処置を、予備研究（すなわち、訓練後即時に）と同一適時選択を用いて、行う。試験するための条件は、ＰＤＥ５阻害剤で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴ、を含む。行動試験後、マウスを殺処理し、それらの血液及び脳を、Ａβレベルの測定のために使用する。ＰＤＥ５阻害の有効性に対する対照として、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬のｃＧＭＰレベルを、化合物の投与後に測定する。化合物が有益な効果を有する場合、ＲＡＷＭ、及び／又はＭＷＭにおいて、及び／又は化合物で処置されたＴｇｓ及びＷＴ同腹子間のＦＣ作業において、媒体処置された二重Ｔｇｓが、異常Ｌ＆Ｍを表すべきであるにもかかわらず、いずれの差異又は少しの差異も存在しないべきである。化合物で処置されたＷＴマウスは、通常の学習を表すべきである。いずれの差異も、速度及びプラットフォーム（可視のプラットフォーム試験）への潜時、ならびに様々な群のマウスに対する手掛かり条件付けにおいて期待されない。また、いずれの差異も、様々な群のマウスのショックの感覚知覚において、期待されない。これらの結果は、これらの化合物を用いた処置が、ＡＤ動物モデルの認知異常の発達を防止できることを示唆するであろう。また、化合物が、記憶の、他ではない１つのタイプを寛解できる可能性も存在する。化合物の有益な効果は、記憶のそのタイプに限定される。
【０３８５】
これらの研究において、ＲＡＷＭ及びＦＣへのシルデナフィルの有益な効果は、薬物の適用の持続時間を越えて持続することが観察される。ＲＡＷＭ及びＦＣへのこの持続効果が、新しく同定されたＰＤＥ５阻害剤を使用して観察されるかに取り組めため、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの一群を使用し、２つのサブグループに分け、それぞれ化合物及び媒体を用いて、処置する。その処置は、３週間にわたって持続する。ＷＴ同腹子は、対照として役割を果たし、同一処置を受取する。動物が生後６ヶ月になるため、それらは、ＲＡＷＭ、ＭＷＭ、及びコンテキストＦＣ、ならびに可視のプラットフォーム試験、感覚闘値試験、及び手掛かり条件付けを含む、行動試験の完全なバッテリーを行う。次いで、その動物を、海馬のｃＧＭＰレベル、ならびに血液及び脳Ａβレベルの測定のために殺処理する。その化合物が通常の認知を回復する場合、これらの化合物の有益な効果を、薬物適用を超えて持続する、成体ＡＤ動物モデルの認知機能障害に作用するとものと見る。
【０３８６】
方法
【０３８７】
これらの研究で使用される動物を、本明細書で説明する。
【０３８８】
行動研究：実験を、変動を減少するため、オスの動物のみに盲検法で行う。
【０３８９】
空間作業記憶。このタイプの短期記憶は、ＲＡＷＭ試験を用いて研究することができる。その作業は、ＡＤの他のＴｇモデル［２３、３３、７６、２１１］の解析において、情報価値があることが立証されている。手短に述べると、そのＲＡＷＭは、粉乳による不透明水で満たされている水槽から成る。壁内を、６つのアームを産生するために位置し、中枢領域から照射する。空間キューを試験室の壁上に提示する。アームの１つの末端は、明瞭な１０ｃｍ水浸したプラットフォームであり、所与の日の全ての試験で同一位置にとどめるが、日々ランダムに移動する。各試験のために、そのマウスは、異なるランダムに選択されたアームで作業を開始する。そのマウスは、前の日のプラットフォームの位置のその長期記憶を使用できないが、部屋に提示された空間キューに基づいて、問題になっている日のその位置の短期記憶に頼らなければならない。各試験は１分持続する、マウスが間違ったアームに入る、又はプラットフォームに達するのに１０秒以上必要とするたびに、エラーを数える。各エラー後、そのマウスを試験の開始アームへと戻す。４つの連続取得試験後、そのマウスをそれらのホームケージに３０分間配置し、次いで迷路へと戻し、第５の保持試験を実施する。試験は、第４、第５の試験で同一の数のエラーをＷＴマウスが出すことによって、完了したと考慮する。試験の最終３日間の各マウスのスコアを平均化し、統計解析のために使用する。視覚及び運動欠損を試験するための可視のプラットフォーム訓練を、黒色の旗で標識されたプラットフォームを伴う、同一であるがアームの無いプールで、試験ごとにランダムに位置して行う。各動物を、１分にわたり泳がせる。プラットフォームに達する時間及び速度を記録する。
【０３９０】
参照記憶。記憶のこの長期にわたるタイプを、以前に説明されているように［２３］、ＭＷＭを用いて試験する。手短に述べると、その試験を、上記と同一であるがアームの無いプールで行う。そのプールを、４つのセクションに分ける。そのマウスは１つのセクションから開始し、水の表面真下の隠しプラットフォームを見出す。プラットフォームの位置は、異なる日々を通して一定に残存する。隠しプラットフォーム（潜時）に達するために必要とした時間を記録する。その訓練の後に、プラットフォームを用いた４つのプローブ試験が続き、空間記憶の保持を試験する。プラットフォームを含有するために使用した象限で、費やした時間の割合を、ビデオトラッキングシステム（ＨＶＳ  Ｉｍａｇｅ，ＵＫ）を用いて記録し、分析する。
【０３９１】
ＦＣ。連合記憶は、訓練及び試験の複数の日を必要とする他の行動作業よりも、非常に速い［３３］。条件付けチャンバーは、防音箱中にある。条件付けチャンバーは、３６本のバーで絶縁されたショックグリッドの除去可能な床を有する。手掛かり及びコンテキスト条件付け実験のために、マウスを、分散トーン（ＣＳ）（２８００Ｈｚ及び８５ｄＢで３０秒持続した音）の開始前に、２分にわたり条件付けチャンバー中に配置する。ＣＳの最後の２秒において、マウスに床のバーを通して、２秒にわたり０．５０ｍＡのフットショック（ＵＳ）を与える。ＣＳ／ＵＳ対呈示後、マウスを、さらに３０秒にわたって条件付けチャンバー中に放置し、次いでそれらのホームケージに戻す。必然的に生じる呼吸を除外して全ての運動の不在として定義されるすくみ挙動を、静止表示ソフトウェアをしようしてスコア化する（ＭＥＤＡｓｓ．Ｉｎｃ．）。コンテキスト恐怖学習を評価するために、訓練後２４時間、マウスを訓練するチャンバー内において、すくみを５分にわたり（連続的）測定する。手掛かり恐怖学習を評価するために、次のコンテキスト試験、マウスを、新しいコンテキスト（平滑な床及びバニラ臭を伴う三角形のケージ）に２分（ＣＳ試験前）にわたり配置する、その後、それらをＣＳに３分（ＣＳ試験）にわたり暴露し、すくみを測定する。説明されたように［３３］、ショックの感覚知覚を閾値評価を通して決定する。
【０３９２】
ｃＧＭＰ及びｃＡＭＰの決定：その方法を、「薬物活性の評価」、「成体マウスにおける試験」のセクション（ｃＡＭＰに対して、ＢＩＯＴＲＡＫ  ｃＡＭＰ酵素イムノアッセイキット緩衝液を使用する）に、説明した。
【０３９３】
Ａβレベルの決定を、すでに説明したように［２３］、凍結した脳半球のホモジネートで行う。ホモジネートをギ酸と混合い、超音波処理し、４℃で、５０，０００ｒｐｍでスピンする。上清を、中和溶液中で希釈する。その中和した物質を、ＥＬＩＳＡプレートに負荷する前に、−８０℃で貯蔵する。Ａβを、Ａβ４０（ＪＲＦ／ｃＡβ４０／１０）又はＡβ４２（ＪＲＦ／ｃＡβ４２／２６）のいずれかに対する単クローン抗体でトラップする、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ＪＲＦ／Ａβｔｏｔ／１７［２１２］を用いて検出する。ＥＬＩＳＡシグナルを、合成Ａβ４０及びＡβ４２ペプチド基準値（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用した基準曲線に基づいて、ｆｍｏｌのアミロイドβ当たりｍｇのタンパク質（ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キットを用いて決定、ＰＩＥＲＣＥ）で、２つのレプリカウェルの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として報告する。
【０３９４】
血液を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する管に収集し、４℃で５分にわたり、４０００ｒｐｍで遠心分離する。ＥＬＩＳＡプレートに負荷する前に、血漿を、−８００Ｃで貯蔵する。
【０３９５】
統計解析：全ての実験のために、マウスをコード化し、研究者を遺伝子型及び処置に関して盲目にする。結果を標準誤差（ＳＥＭ）として表す。有意性のレベルを、Ｐ＜０．０５に設定する。結果を、薬物又は遺伝子型を主作用として用いた、事後補正を用いて分散分析で分析する。実験を、バランスの取れた方法で設計する、マウスを訓練し、３つ又は４つの別々の実験において、それぞれの異なる条件で試験する。プローブ試験のために、データを、象限で費やした時間の割合の反復測定に対する、分散分析を用いて分析する、象限は、他の象限に対して、訓練中にプラットフォームを位置づけており、マウスがターゲット象限から右、左、又は逆の隣接象限よりも、標的でより多くの時間を費やすかを確認するために、計画比較を後に行う。
実施例２〜５の参考文献
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【０３９６】
実施例６−キノリン化合物及び薬理学研究
【０３９７】
電気生理学的プロトコル
【０３９８】
次のカットする海馬のスライスを記録チャンバーに移動した、それらは２９℃で維持され、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で灌流し、９５％のＯ２及び５％のＣＯ２で連続的に沸き立てた。ｍＭ中のＡＣＳＦ組成物は、１２４．０ＮａＣｌ、４．４ＫＣｌ、１．０Ｎａ2ＨＰＯ4、２５．０ＮａＨＣＯ3、２．０ＣａＣｌ2、２．０ＭｇＳＯ4、１０．０グルコースであった。ＣＡ１ｆＥＰＳＰを、ＣＡ１放線状層において刺激及び記録電極の双方に配置することによって、記録した。ＢＳＴを、ｆＥＰＳＰの勾配に対する刺激電圧をプロットすること、又はｆＥＰＳＰの勾配に対する線維斉射のピーク振幅をプロットすること、のいずれかによってアッセイした。１５分のベースラインを、毎分、最大誘発反応の〜３５％応答を誘発する強度で記録した。ＬＴＰをｑ−バースト刺激を使用して誘発した（１００Ｈｚで４パルス、５Ｈｚで繰り返すバーストを用いた、及び１５秒で隔てた３つの１０バースト訓練を含む各テタヌス）。テタヌス刺激後、応答を１時間にわたり記録し、ベースラインの割合として発現された興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）勾配を測定した。
【０３９９】
これらの実験において、ＹＦ０１２４０３（シクロプロピルリード化合物）を、シータバーストの前に、１０分にわたる灌流システムを通して、海馬のスライスに直接与えた。Ａβ４２を、シータバースト前に、２０分にわたり与えた。オリゴマーのＡβ４２を、すでに説明したように調製した（Ｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。手短に述べると、凍結乾燥したペプチド（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）を、１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１ｍＭまで再懸濁した。その溶液を一定分量し、ＨＦＩＰをドラフトで蒸発させた。得られた明瞭なペプチド膜を、ＳｐｅｅｄＶａｃ中の真空で乾燥し、−２０℃で貯蔵した。使用前２４時間、一定分量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）に添加し、１０分にわたって超音波処理した。オリゴマーのＡβ−４２を、Ａβ−４２−ＤＭＳＯをＡＣＳＦ濃度まで希釈することによって得、３０秒にわたってボルテックスし、２４時間にわたって４℃でインキュベートした。使用前、この化合物をＡＣＳＦに添加し、２００ｎＭを得た。
【０４００】
急性毒性プロファイル
【０４０１】
時間記録：２４時間−７日。時間記録において、いずれの致死的効果も観察しなかった。
【０４０２】
用量：
●５００ｍｇ／ｋｇで単一用量、腹腔内(ip)。
●１，０００ｍｇ／ｋｇで単一用量、腹腔内(ip)。
●２０００ｍｇ／ｋｇで単一用量、経口(po)。
【０４０３】
種：マウス
【０４０４】
化合物
【０４０５】
キノリン含有化合物の新しいクラスを合成し、優れたＰＤＥ５阻害剤効力、高い選択性、血液脳関門（ＢＢＢ）に対する合理的な薬物動態及び良好な透過性を有する。これらの化合物は、米国で第３に費用のかかる疾患である、ＡＤ患者の副作用を最小化するために使用することができる。また、本発明の化合物は、勃起不全（ＥＤ）、肺高血圧症、心血管障害、糖尿病、及び消化器疾患を治療するために使用することができる。
【０４０６】
リード化合物は、８−シクロプロピルキノリン誘導体（ＹＦ０１２４０３）及び８−ジメチルアミノキノリン（ＹＦ０１６２０３）誘導体である。ＰＤＥ５に対するこれらの化合物のＩＣ50は、それぞれ１．２ｎＭ及び４．５ｎＭである。例えば、ＢＡＢＬ／ｃマウスにおいて、ＹＦ０１２４０３化合物半減期は、シルデナフィル（既知のＰＤＥ５阻害剤）と比較して、脳中で１．０４時間、血漿中で１．３３時間であり、シルデナフィルは、０．８４時間の脳半減期及び１．２１時間の血漿半減期を有する。脳組織中のＹＦ０１２４０３の分布と、血漿中のそれ（非タンパク質結合遊離型、Ｃ脳／Ｃ血漿）との対比は０．４１であり、ＢＢＢに対する化合物の透過が、妥当性（Ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）に関して容認可能であることを示唆する。したがって、その化合物は、ＡＤ患者の治療に対する潜在的候補である。
【０４０７】
ＹＦ０１２４０３は高い効力（ＩＣ50＝０．２７ｎＭ）、及び他のＰＤＥアイソフォームよりも、ＰＤＥ５の優れた選択性を有する（図２７）。加えて、それは、５０ｍｇ／ｋｇの投与で、Ｔ最大＝０．５時間及びＣ最大＝３８５ｎｇ／ｇを用いた経口投与後、ＢＢＢを透過する。さらに、その化合物は、急性毒性試験において、最大で２ｇ／ｋｇ（経口）まで安全である。最も重要なことに、それはエクスビボ及びインビボ有効性の双方を表す：それは、Ａβ４２を用いて処置した海馬のスライスのＬＴＰ、及びＡβ４２を用いて注入されたマウスのコンテキスト恐怖記憶を寛解する。ＹＦ０１２４０３は、Ａβ上昇の後に続くシナプス及び認知機能の試験において、生物学的に活性がある。
【０４０８】
リード候補としてＹＦ０１２４０３を使用し、我々は、Ｃ３及びＣ８位置、ならびにキノリンの他の部分で異なる部分を有するＰＤＥ５阻害剤を設計し、合成する。キノリンのＣ８位置で置換されるＮ、及びＳ基（また、図５０を参照されたい）は、以前に報告されたことがないことを留意されたい。
【０４０９】
模式図Ａの一般的合成方法
【０４１０】
式ＸＩＩＩ’及びＸＩＶ’の誘因化合物を、便利に、模式図Ａで表されるように合成配列に従って、調製することができる（図３８）。
【０４１１】
図３８で表されるように、市販の４−アミノ−３−ブロモベンゾニトリル（Ｉ’）から開始し、鍵中間体、置換４−ヒドロキシキノリンＩＩＩ’を、ジエチルエトキシメチレンマロン酸とのアニリンＩ’の反応、その後の高温での分子内環化反応によって便利に調製する。次いで、置換４−ヒドロキシキノリンＩＩＩ’を、フェニルアルキルハロゲン化物、ベンゾイルハロゲン化物又はフェニルスルホニルハロゲン化物と反応させ、８−ブロモキノリンＶ’を得た。代替的に、ＰＯＣｌ３との反応によって、４−ヒドロキシキノリンを、対応する４−クロロキノリンＶＩ’に容易に転換し、それは、フェニルアルキルアミンと反応し、鍵中間体ＶＩＩＩ’を得るか、又はアンモニアと直接反応し、４−アミノキノリンＩＸ’を得る。次いで、４−４−アミノキノリンを、フェニルアルキルハロゲン化物、ベンゾイルハロゲン化物又はフェニルスルホニルハロゲン化物と反応させ、別の鍵中間対Ｘ’を得た。式ＸＩ’によって表される鍵中間体Ｖ’、ＶＩＩＩ’、Ｘ’から開始し、その誘因式ＸＩＩＩ’を、８−ブロモキノリンＸＩ’とのシクロアルキルボロン酸又は置換アミンの結合、その後のエチルエステル、得られた中間体ＸＩＩ’の減少によって調製する。置換アミン等の求核試薬、又はアルキルハロゲン化物、アシル、もしくはスルホアイル等の求電子試薬との反応物による置換を介して、その誘因式ＸＩＩＩ’を誘因式ＸＩＶ’に便利に転換する。
【０４１２】
化合物の合成実施例
【０４１３】
以下の実施例は、誘因化合物及び中間体の例証目的のためであり、いずれの様態においても、請求項の範囲を限定することを意図しない。当業者は、それらを変化又は修飾することができ、本質的に同一である結果を得ることができる、様々な重要性の低いパラメーターを容易に認識する。
【０４１４】
実施例１。本発明の範囲内である化合物９ａの合成を、図３９に提供される個々のステップの詳細と共に、模式図Ｉに概略する。
【０４１５】
ジエチル２−（（２−ブロモ−４−シアノフェニルアミノ）メチレン）マロン酸
2012513464.tif 000090
（中間体３ａ）の調製物：
【０４１６】
３０ｍＬのトルエン中の５．００ｇ（２５．４ｍｍｏｌ）の４−アミノ−３−ブロモベンゾニトリルの溶液に、８．２３ｇ（３８．１ｍｍｏｌ）のジエチルエトキシメチレンマロン酸（２ａ）を添加した。次いで、冷却器を空気に開放して、一晩にわたってその混合物を、加熱還流した。得られた溶液を室温まで冷却し、１００ｍＬのヘキサンに注いだ。白色の沈殿物を収集し、ヘキサン（３０ｍＬｘ３）を用いて洗浄し、望まれる産生物として、１１．９ｇのオフホワイトの固体を得た。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３６７（Ｍ＋１）＋。
【０４１７】
エチル８−ブロモ−６−シアノ−４−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸（中間体４ａ）の調製物：
2012513464.tif 000091
【０４１８】
１００ｍＬのジフェニルエーテルを還流まで加熱し、その後、３０分で５．００ｇ（１３．６ｍｍｏｌ）のジエチル２−（（２−ブロモ−４−シアノフェニルアミノ）メチレン）マロン酸を部分的に添加した。得られた茶色の溶液をさらに１時間還流し、次いで室温まで冷却した。その沈殿物を収集し、ヘキサン（１５ｍＬｘ３）を用いて洗浄し、望まれる産生物として、５．６９ｇの淡褐色の固体を得た。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３２１（Ｍ＋１）＋。
【０４１９】
エチル８−ブロモ−４−クロロ−６−シアノキノリン−３−カルボン酸（中間体５ａ）の調製物：
2012513464.tif 000092
【０４２０】
３．８５ｇ（１２ｍｍｏｌ）及び５０ｍＬのＰＯＣｌ３の混合物を、４８時間にわたって還流まで加熱した。その溶剤を真空中で除去し、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）及びトルエン（５０ｍＬｘ２）を用いて共蒸留した。得られた暗褐色のシロップを５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中で溶解し、ＰＨ＞１０までＥｔ３Ｎを用いて処置した。次いで、濃い赤色の溶液にシリカゲルパッド（３ｃｍ  ｘ  ４  ｃｍ）を通過させた。そのシリカパッドを、１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を用いて洗浄した。その濾液を収集し、濃縮し、茶色の固体を得た、それを直接的にさらなる精製無しで、次のステップにおいて使用した。
【０４２１】
エチル８−ブロモ−４−クロロ−６−シアノキノリン−３−カルボン酸（中間体７ａ）調製物：
2012513464.tif 000093
【０４２２】
上記の得られたエチル８−ブロモ−４−クロロ−６−シアノキノリン−３−カルボン酸の粗産生物に、３．１２ｇ（１５ｍｍｏｌ）の（３−クロロ−４−メトキシフェニル）メタンアミン塩酸塩（６ａ）、７．７４ｇのジイソプロピルエチルアミン、及び５０ｍＬのｎ−プロパノールを添加した。得られた混合物を２．５時間にわたって還流し、次いで１００ｍＬの冷水に注いだ。沈殿物を濾過によって収集し、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ  ｘ２）及びエタノール（３０ｍＬ  ｘ  ３）によって洗浄し、表題化合物として５．０ｇの黄色固体を得た。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４７４（Ｍ＋１）＋。
【０４２３】
エチル４−（３−クロロ−４−メトキシベンジルアミノ）−６−シアノ−８−シクロプロピ−キノリン−３−カルボン酸（中間体８ａ）の調製物：
2012513464.tif 000094
【０４２４】
窒素下で、５ｍＬの乾燥トルエン内の４７５ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の８−ブロモ−４−クロロ−６−シアノ−キノリン−３−カルボン酸の溶液に、１２９ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）のシクロプロピルボロン酸、５８ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）の（テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、及び８１５ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＣｓ２ＣＯ３を添加した。混合物を一晩還流した後、溶液中のその沈殿物を濾過によって除去した。その濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（エチル酢酸：ヘキサン＝１：４）によって精製し、望まれる化合物として３６６ｍｇの黄色の固体を得た。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４３６（Ｍ＋１）＋。
【０４２５】
４−（３−クロロ−４−メトキシベンジルアミノ）−８−シクロプロピル−３−（ヒドロキシメチル）−キノリン−６−カルボニトリル（化合物９ａ）の調製物：
2012513464.tif 000095
【０４２６】
窒素下で、５ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の１８０ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）の中間体８の溶液に、２．２ｍＬ（２．２ｍｍｏｌ）のリチウムｔｒｉ（ｔｅｒｔ−ブトキシ）アルミニウム水素化物（１Ｍのヘキサン）を添加した。得られた溶液を一晩還流し、次いで１ｍＬのＭｅＯＨを用いて停止させた。３０分後、その混合物を分液漏斗に注ぎ、その後、１５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2及び５０ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨを添加した。その有機層を分離し、１Ｎ  ＮａＯＨ（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。固体を濾過した。濾液の濃度から、誘因化合物として、１５６ｍｇの黄色の固体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，３００  ＭＨｚ）：δ８．６９（ｄ、Ｊ＝１．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．４８（ｓ、１Ｈ）、７．４２（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、１Ｈ）、７．３７（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．３３（ｄ、Ｊ＝１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．２１（ｄｄ、Ｊ1＝８．４Ｈｚ、Ｊ2＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３８（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．７９（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、４．４３（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．７９（ｓ、３Ｈ）、３．０９−３．１４（ｍ、１Ｈ）、１．０２−１．０８（ｍ、２Ｈ）、０．７２−０．８７（ｍ、２Ｈ）；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３９４（Ｍ＋１）+。
【０４２７】
実施例２。本発明の範囲内である化合物１１ａの合成を、図４０に提供される個々のステップの詳細と共に、模式図ＩＩに概略する。
【０４２８】
エチル４−（３−クロロ−４−メトキシベンジルアミノ）−６−シアノ−８−（ジメチルアミノ）−キノリン−３−カルボン酸（中間体１０ａ）の調製物：
2012513464.tif 000096
【０４２９】
窒素下で、５ｍＬの乾燥トルエン内の４７５ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の８−ブロモ−４−クロロ−６−シアノ−キノリン−３−カルボン酸の溶液に、１１ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）のパラジウム（ＩＩ）酢酸、５０ｍｇの（Ｒ）−ＢＩＮＡＰ、及び８１２ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＣｓ2ＣＯ3、及びエタノール（５．６Ｍ）内の３ｍＬの溶液ジメチルアミンを添加した。混合物を一晩還流した後、溶液中のその沈殿物を濾過によって除去した。その濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（エチル酢酸：ヘキサン＝１：２）によって精製し、望まれる化合物として１４０ｍｇの黄色の固体を得た。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４３９（Ｍ＋１）+。
【０４３０】
４−（３−クロロ−４−メトキシベンジルアミノ）−８−（ジメチルアミノ）−３−（ヒドロキシメチル）−キノリン−６−カルボニトリル（化合物１１ａ）の調製物：
2012513464.tif 000097
【０４３１】
化合物１１ａを、エチル４−（３−クロロ−４−メトキシベンジルアミノ）−６−シアノ−８−（ジメチルアミノ）−キノリン−３−カルボン酸から開始する化合物９ａの調製で説明されるものと類似する方法によって、調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ８．３７（ｓ、１Ｈ）、７．９０（ｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、１Ｈ）、７．３１（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．１６（ｄｄ、Ｊ1＝８．７Ｈｚ、Ｊ2＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．０５（ｄ、Ｊ＝１Ｈｚ、１Ｈ）、６．９０（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０（ｔ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．６７（ｓ、２Ｈ）、４．６４（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．８９（ｓ、３Ｈ）、３．０４（ｓ、６Ｈ）；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３９７（Ｍ＋１）+。
【０４３２】
また、本発明の範囲内である中間体１０ａを、図４１に提供される個々のステップの詳細と共に、模式図ＩＩＩ〜Ａ１で概略される合成経路を通して合成する。
【０４３３】
３−（ジメチルアミノ）−４−ニトロベンゾニトリル（中間体１３ａ）の調製物：
2012513464.tif 000098
【０４３４】
３−フルオロ−４−ニトロベンゾニトリルの１６．７ｇ（１００ｍｍｏｌ）の混合物及びエタノール（５Ｍ）中のジメチルアミンの１００ｍＬの溶液を一晩還流した。次いで、得られた濃い赤色の溶液を、１００ｍＬの冷水に注いだ。その沈殿物を濾過によって収集し、Ｈ2Ｏ（５０ｍＬ  ｘ  ２）及びエタノール（５０ｍＬ  ｘ  ２）によって洗浄し、望まれる産生物として、１６．９ｇの橙色の針状結晶を得た。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）１９２（Ｍ＋１）+。
【０４３５】
４−アミノ−３−（ジメチルアミノ）ベンゾニトリル（中間体１４ａ）の調製物：
2012513464.tif 000099
【０４３６】
１６ｇ（８４ｍｍｏｌ）の３−（ジメチルアミノ）−４−ニトロベンゾニトリルに、１ｇのパラジウム炭素（１０％、ｗ／ｗ）及び１００ｍＬのメタノールを添加した。その混合物を水素で飽和させ、室温で一晩撹拌した。そのパラジウム炭素を、次いで濾過した。濾過の濃度から、望まれる産生物として１２．８の濃い赤色の固体を得た。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）１６２（Ｍ＋１）+。
【０４３７】
ジエチル２−（（４−シアノ−２−（ジメチルアミノ）フェニルアミノ）メチレン）マロン酸（中間体１５ａ）の調製物：
2012513464.tif 000100
【０４３８】
中間体１５ａを、４−アミノ−３−（ジメチルアミノ）ベンゾニトリルから開始する中間体３ａの調製に説明されるものと類似する方法によって、調製した。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３３２（Ｍ＋１）+。
【０４３９】
エチル６−シアノ−８−（ジメチルアミノ）−４−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸（中間体１６ａ）の調製物：
2012513464.tif 000101
【０４４０】
中間体１６ａを、ジエチル２−（（４−シアノ−２−（ジメチルアミノ）フェニルアミノ）−メチレン）マロン酸から開始する中間体４ａの調製に説明されるものと類似する方法によって、調製した。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）２８６（Ｍ＋１）+。
【０４４１】
エチル４−クロロ−６−シアノ−８−（ジメチルアミノ）キノリン−３−カルボン酸（中間体１７ａ）の調製物：
2012513464.tif 000102
【０４４２】
中間体１７ａを、エチル６−シアノ−８−（ジメチルアミノ）−４−ヒドロキシ−キノリン−３−カルボン酸から開始する化合物５ａの調製で説明されるものと類似する方法によって、調製した。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３０４（Ｍ＋１）+。
【０４４３】
エチル４−（３−クロロ−４−メトキシベンジルアミノ）−６−シアノ−８−（ジメチルアミノ）−キノリン−３−カルボン酸（中間体１０ａ）の調製物：
2012513464.tif 000103
【０４４４】
中間体１０ａを、エチル６−シアノ−８−（ジメチルアミノ）−４−ヒドロキシ−キノリン−３−カルボン酸から開始する化合物７ａの調製で説明されるものと類似する方法によって、調製した。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４３９（Ｍ＋１）+。
【０４４５】
化合物スクリーニングのためのＰＤＥアッセイのプロトコル
【０４４６】
物質：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｒ８１６０）社からのＰｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｋｉｔを用いたＩＭＡＰＴＭ  ＴＲ−ＦＲＥＴ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｒ７５０７）社からのＦＡＭ−Ｃｙｃｌｉｃ−３’，５’−ＧＭＰ、ＰＤＥ５阻害剤。
【０４４７】
方法
【０４４８】
ステップ１：３００ｐＭ〜１０μＭの１Ｘ  ＰＤＥアッセイ緩衝液の範囲である阻害剤の希釈系列を、作成した。続いて、ＦＡＭ−ｃＧＭＰを、１Ｘ  ＰＤＥアッセイ緩衝液で２００ｎＭまで希釈する。次いで、ＰＤＥ５Ａ１酵素を、１Ｘ  ＰＤＥアッセイ緩衝液で０．１２５ｎｇ／μｌまで希釈する。
【０４４９】
ステップ２：次の成分を、低結合ブラックプレートに添加する：ａ）２５μｌの２００ｎＭのＦＡＭ−ｃＧＭＰ（最終濃度は１００ｎＭであろう）、ｂ）５μｌの化合物（最終濃度＝３０ｐＭ〜１μＭ）、ｃ）２０μｌのＰＤＥ５Ａ１（０．１２５ｎｇ／μｌ）（最終量＝２．５ｎｇ／反応）。その成分を混合し、室温で１時間インキュベートした。
【０４５０】
ステップ３：次いで、１Ｘ試薬結合緩衝液（７５％の１Ｘ結合緩衝液Ａ及び２５％の１Ｘ結合緩衝液Ｂ）を、後に結合試薬を１Ｘ試薬結合緩衝液で希釈することによって（１：６００）調製する結合溶液によって、調製する。次いで、１２０μｌの結合溶液を各ウェルに添加し、そのプレートを室温で１時間にわたりインキュベートする。
【０４５１】
ステップ４：蛍光偏光を、ＢｉｏＴｅｋ  ＳｙｎｅｒｇｙＴＭ２マイクロプレートリーダーにおいて、４８５ｎｍの励起及び５２０ｎｍの発光で測定した。
【０４５２】
薬物動態試験のプロトコル
【０４５３】
薬物動態研究をオスＢＡＢＬ／ｃマウスにおいて行った。その血液及び脳試料を、時点当たり３匹のマウスから、予定された回数で収集した。６つの時点を各化合物に対して測定した：０、０．２５、０．５、１．０、２．０、及び４．０時間。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を開発し、血漿及び脳試料中のこれらの化合物を決定した。
【０４５４】
数量化を、血漿及び脳の内部基準に対し、解析のピーク領域比を使用して内部基準方法により達成した。濃度を、加重最小二乗直線回帰（Ｗ＝１／ｘ２）を使用して算出した。その主要な薬物動態パラメーターを算出し、脳血漿分布比を推定した。
【０４５５】
用量調製物及び用量投与：そのＰＤＥ５阻害剤を、試験物を０．５％メチルセルロースに溶解することによって調製し、ＰＯ投与のため、５ｍｇ／ｍＬで最終濃度を得た。シルデナフィルを、試験物を０．２Ｍの塩酸溶液（ｐＨ＝１）に溶解することによって調製し、５ｍｇ／ｍＬで最終濃度を得た。各試験動物に対する投与量を、最新の体重に基づいて決定した。
【０４５６】
試料収集
【０４５７】
血液。血液（約２５０μＬ）を、投与後、時点当たり３匹のマウスからプレ用量（０時間）及び０．２５、０．５、１．０、２．０、及び４．０時間で、ヘパリンナトリウム抗凝固薬を含有する管に眼窩穿刺を通して収集した。マウスを、血液収集後、頸椎脱臼によって殺処理した。その血漿を遠心分離（４℃、３５００ｒｐｍ、１０分）を通して分離し、分析前に−８０℃で貯蔵した。
【０４５８】
血漿試料の調製物。凍結した知られていない血漿試料を室温で解凍し、徹底的にボルテックスした。ピペットを用いて、２５μＬの血漿を、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に移動させた。各試料に、２５μＬのメタノール及び２５μＬの内部基準を添加し、続いて１００μＬのメタノールを添加した。試料混合物を約１分にわたりボルテックスした。１１０００ｇで５分にわたって遠心分離後、有機層上部をガラス管に移動させ、４０℃で、窒素の緩流下で蒸発させた。残基を１５０μＬの移動相に溶解し、ボルテックスミキサーで混合した。２０μＬの一定分量の得られた溶液を、分析のために、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注射した。
【０４５９】
脳。マウスの死後、脳を即時に収集した。脳を切除し、秤量し、冷たい生理食塩水を用いて濯ぎ、次いでＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のためのさらなるプロセシングまで、−８０℃で凍結した。
【０４６０】
脳試料の調製物。アッセイの日、凍結した組織試料を室温で補助無しで解凍した。完全に解凍した場合、２００ｍｇの各組織試料を秤量し、可塑性管に配置した。メタノール（１．０ｍＬ）を添加し、均質化を促進し、約１分にわたり、Ｆｌｕｋｏ  Ｆ６／１０超ホモジナイザーを使用して行った。次いで、ホモジナイズした試料を１分にわたりボルテックスした。２５μＬの一定分量のホモジナイズされた試料を、エッペンドルフ管に移動させた。各試料に、２５μＬのメタノール及び２５μＬの内部基準を添加した。その試料混合物を、５分にわたり、１１０００ｇで遠心分離した。２０μＬの一定分量の上清を、移動相を用いて８０μＬ又は６０μＬまで希釈し、分析のために、１０μＬの一定分量をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注射した。
実施例７−キノリン誘導体を、ＡＤの治療のために強力及び選択的ＰＤＥ阻害剤として、開発することができる。
【０４６１】
我々の知見は、ＰＤＥ５の阻害が、ＡＤの認知欠損に対して有益であり得るこを支持している。しかしながら、シルデナフィルを含む既存の市販されている阻害剤のいずれも、中枢神経系に最適化されていない。なお、市販されていない合成阻害剤でさえも、中枢神経系使用に対しては、完全に特徴づけられてはいない。良好な中枢神経系薬物は、高い特異性及び効力、ならびに良好なＰＫ、生物学的利用率及び中枢神経系透過を有するべきであり、かつ最後に安全であるべきである。例えば、シルデナフィルがＢＢＢを通過することが報告されており［Ｓ１３７］、６．０ｎＭのＰＤＥ５に対してＩＣ５０、げっ歯類（ヒトにおいて〜４時間）において０．４時間のインビボ半減期を有する［Ｓ１３５、Ｓ１３８］。しかしながら、脳を除く心筋及び血管中で発現され、軽度血管拡張効果をもたらすことができるそのＰＤＥ１の選択性比率は１８０であり、網膜中のみで発現され、視覚を過渡的に妨げることができるＰＤＥ６の選択性比率は、１２と等しい［Ｓ１０６、Ｓ１０７］。ＢＢＢを通過するバルデナフィル能力の証拠は、間接的であり［１５０］、ＰＤＥ５に対するそのＩＣ50が０．１７ｎＭであっても、ＰＤＥ６の選択性比率は３．５と等しい［Ｓ１５１、Ｓ１５２］。理論にとらわれることなく、タダラフィルはＢＢＢを通過できない。したがって、我々の研究室は、既存のＰＤＥ５阻害剤の構造の知識に基づいて、ａ）高い特異性及び効力、ｂ）優れたＰＫ特性及び中枢神経系透過、及びｃ）ＡＤにおいて使用するための安全性、を伴う新規ＰＤＥ５阻害剤を開発するプログラムに着手している。
【０４６２】
多くのＰＤＥ５阻害剤が過去数十年に開発され、多数の強力な化合物が刊行物で報告されている。故に、我々は、高い効力及び優れた選択性を伴う完全に新しい足場を開発するため、資源を消耗することを避けた。代わりに、我々は既知の阻害剤に集中し、ＡＤの治療に役立つことができる化合物のクラスの発見に導くことができる構造を選択するため、既存の足場のＳＡＲ解析を行った。シルデナフィル及びバルデナフィル等のｃＧＭＰに基づく分子、又はタダラフィル等のβカルボリン由来分子を選択するより、我々は、設計のための一番の候補として、ＢＭＳ４の高い効力及び選択性に基づいて、キノリン誘導体、及びＡＤに対する最適化のためのＰＤＥ５阻害剤の合成を同定した。この化合物は、２つの他の強力な阻害剤、ＢＭＳ２及びＥ１の重要な特徴含有する（図４５）。それは、これまでに同定された中で、最も強力及び選択的ＰＤＥ５阻害剤として報告された［Ｓ１９］。この化合物のインビトロ試験は、ＰＤＥ１〜６の効力及び選択性に対する我々の判断基準に達っしたが、残存するＰＤＥのそれらの選択性、ＡＤモデル又は他の疾患のインビボ有効性、ＢＢＢ透過、毒性、及び溶解性を含むＰＫは、依然として不明である。加えて、キノリン環の数個の置換基のみが調査され、１つの化合物だけが支配的であった。したがって、我々は、ＹＦ０１２４０３を合成し（図２４）、この足場の効力及び選択性、ならびにＡβによるシナプス及び認知欠損に対するその有効性を検証し、また、効果的にＡＤにおけるシナプス及び記憶喪失に反作用する薬物の開発するを考慮して、リード最適化の足場を修飾する可能性を調査した。
【０４６３】
２−ブロモ−４−シアノアニリンから開始し、ＹＦ０１２４０３を、エステルの減少後、６つのステップで調製した、エステルは、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４の存在下で、キノリン臭化物７とシクロプロピルボロン酸のクロスカップリングによって得られた。カップリング前駆体７を［Ｓ１９］で説明される手段を使用して合成できる。注目すべきことに、その有機金属触媒クロスカップリング反応は、この足場のさらなる修飾のための大きな自由を我々に残した。例えば、Ｂｕｃｈｗａｌｄ−Ｈａｒｔｗｉｇ反応条件を使用することによって、ＹＦ０１２４０３、ＹＦ０１６２０３の８−ジメチル類似体を合成した。インビトロアッセイは、これらの２つの化合物が、ＰＤＥ５に対して優れた阻害活性及び全ての他のＰＤＥアイソフォームに対する選択性を有するこを表した（図２７を参照されたい）。ＰＤＥ５のＹＦ０１２４０３及びＹＦ０１６２０３のＩＣ50‘は、それぞれ０．２７ｎＭ（図４７）及び０．４ｎＭである。これらの化合物は、いずれの他のＰＤＥも阻害しない（ＰＤＥ５／ＰＤＥ＞１０００）。
【０４６４】
次いで、我々は、ＹＦ０１２４０３のＰＫ及びＢＢＢ透過能力を調査した。５０ｍｇ／ｋｇでのＢＡＢＬ／ｃマウスへの経口投与後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって血漿及び脳濃度を決定した。各試料時間での、その血漿及び脳濃度を図４８に表す。図２８のそのデータは、投薬後０．５時間で発生するピーク血漿濃度によって解説されるように、ＹＦ０１２４０３が急速に吸収されることを示唆する。なお、脳及び血漿のＴ最大値は同様であり、また、脳へのＹＦ０１２４０３の分布も速いことを示唆した。最後に、脳内のＹＦ０１２４０３の量は、０．４１のＡＵＣ0-t比で、血漿中のそれよりも低く、脳及び血漿中のＹＦ０１２４０３の半減期の除去は、それぞれ１．０４及び１．３３であった。
【０４６５】
我々の次の目標は、ＹＦ０１２４０３が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのシナプス及び認知障害を減弱できるかを調べることであった。我々は、オリゴマーのＡβ42、又は媒体の存在下で［Ｓ１８］、ＬＴＰ又はコンテキスト恐怖記憶を誘発した。ＬＴＰ実験において、２００ｎＭのＡβ４２又は媒体を、θ−バーストの適用前に２０分にわたり、浴溶液を通して灌流した。行動実験において、２００ｎＭのＡβ４２又は媒体を、フットショック１５分前に、１週間前にカニューレでプレ移植された動物の背側海馬に両側注入した。Ａβは、ＬＴＰ及びコンテキスト恐怖記憶を減少させた（図４９）。しかしながら、ＹＦ０１２４０３（５０ｎＭ；ＬＴＰ実験におけるθ−バースト前の１０分間；行動実験において、訓練後即時に３又は１０ｍｇ／Ｋｇ経口）は、電気生理学的及び行動欠損を寛解した（図４９）。まとめると、これらの結果は、ＹＦ０１２４０３が、最適化に対して良好な化合物であることを示唆する。
【０４６６】
計算モデルは、ＰＤＥ阻害剤活性及び選択性の予測に信頼性が高い。ＰＤＥ１〜ＰＤＥ５、ＰＤＥ７、及びＰＤＥ９［Ｓ２７−Ｓ３５］のＸ線結晶構造が報告されているが、活性部位での微細構造は、例えば、ＯＨ-（水酸化物アニオン）、又はＨ2Ｏ（水分子）が第２の架橋リガンド（ＢＬ２）であろうと、水素原子をＸ線回折技術によって決定することができないため、不確かである。様々な最新式の計算的な技術の使用：分子力学（ＭＤ）［Ｓ２１］、第一原理量子力学（ＱＭ）［Ｓ２２］、組織内開発された第一原理ＱＭ−完全な分極連続体モデル（ＱＭ／ＦＰＣＭ）方法［Ｓ２１、Ｓ２、Ｓ３６〜Ｓ５０］及び雑種ＱＭ／分子力学（ＱＭ／ＭＭ）［Ｓ２１］、ＨＯ-（水酸化物アニオン）、Ｈ2Ｏではない［１４２〜１５４］、報告されたＰＤＥ結晶構造において、ＢＬ２であることが発見された。基質［Ｓ２１、Ｓ２２］の触媒作用加水分解を惹起する水酸化物アニオン（ＨＯ-）は、求核試薬としての役割を果たすことが期待されているため、これらの知見は、正確な３Ｄ構造モデルを構成するための塩基を提供し、Ｘ線結晶構造が知られていない各他のＰＤＥファミリーの相同性モデルを行うために重大である。ＰＤＥ５及び他のＰＤＥのこれらの新しく決定された微細３Ｄ構造は、中枢神経系に対して作用する選択的ＰＤＥ５阻害剤を見出すことを助けるための、ユニークな機会を提供する。
【０４６７】
ＡＤに対して最適化される新規ＰＤＥ５阻害剤の設計及び合成のための医薬品化学戦略。我々のデータは、ＰＤＥ５の阻害を介するＮＯ／ｓＧＣ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の増強は、Ａβ誘発性シナプス及び認知異常に反作用する。ＮＯ／ｓＧＣ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路に作用し、中枢神経系のために最適化される双方の薬物が、欠乏している。我々は、ａ）高い特異性及び効力、ｂ）良好なＰＫ、生物学的利用率及び中枢神経系透過、ｃ）安全性、を伴う新しい薬物を得るであろう。既存の薬物のいずれも、これらの判断基準の全てに当てはまらないことで知られる。したがって、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｓｔｒａｔｅｇｙを、本明細書で説明される判断基準に適合する化合物を開発するために使用する。
【０４６８】
機能的アッセイを、検証されたインビボ疾患モデルの平行使用に加えて、ＰＤＥ５阻害剤等のＰＤＥ５調節化合物の試験において使用するであろう。化合物を次の判断基準に従って選択するであろう：高い効力、優れた選択性、合理的なＰＫプロファイル、及び良好なＢＢＢ透過。ＰＤＥ５とシルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィルの複合体の高解像度Ｘ線構造の有効性に基づいて、コンピュータによる算出を使用し、設計された構造の妥当性及び透過性を決定するであろう。最も高いスコアを伴う化合物を合成するであろう。満足な効力及び選択性を伴う化合物は、ＰＫ、生物学的利用率／脳透過、及び他の安全性プロファイルに対してさらに研究されるであろう。
【０４６９】
我々の研究設計は、それらの妥当性を最適化するためのＹＦ０１２４０３の修飾に集中するであろう。ＹＦ０１２４０３は３位置（Ｃ３）で第１のベンジル型アルコールを有し、それはベンズアルデヒドを生成するミクロソームによって酸化することができ、その結果として、タンパク質共役付加のため、初回通過代謝問題及び重篤な副作用を引き起こす。また、それらの半減期は、したがって劇的に限定され得る。したがって、ベンジリックアルコールを他のさらに薬物に優しい基に転換することが必要不可欠である。第２に、ＹＦ０１２４０３は８位置（Ｃ８）でシクロプロピル基を有し、開環を起こすことによってインビボでは安定し得ず、したがって求電子傾向を表す。この問題を避けるため、我々は、シクロプロピルを他の置換基に変化するであろう。第３に、ＹＦ０１２４０３のｌｏｇＢＢは−０．３８のみであり、したがって中枢神経系疾患に対する薬物にとって理想的ではない（ピーク脳／血液濃度比率＞１は、臨床用途において知られた中枢神経系薬物と同程度である）。最後に、幾つかの３シアノキノリン誘導体は、ＮＦ−κＢ及び他のキナーゼ（例えば［Ｓ５１−Ｓ５６］を参照されたい）に対する阻害活性、３シアノ基のエステル基との置換を表し、又はアルコールはこれらの活性を完全に［Ｓ５３、Ｓ５５］除去することが見出されているため、我々は、オフターゲット活性を最小化するため、Ｃ３でその基を修飾するであろう。したがって、我々は、Ｃ３及びＣ８位置の双方で、部分の修飾に集中する構造を説明する。加えて、我々は、キノリンの他の部分を修飾し、一番の候補の薬理学的特性を改善し、他のＡＤＭＥＴ問題を避けるであろう。
【０４７０】
Ｃ８での修飾。先の研究は、Ｃ８での修飾が、新規化合物［Ｓ１９］の阻害活性のために非常に重大であることを示唆している。キノリンのＣ８位置で水素及びエチル基のみを調査するが、そのエチル基が最高の結果を提供することを考えれば、Ｃ８でのさらに巨大な基は、さらに優れた活性をもたらすであろう。これは、この位置で最高の置換基を同定するため、Ｃ８位置での位置決めシクロアルキル、ヘテロ環状基、又はアルキルアミノ基等の、この位置でのさらに大きな変異でさえも探究することを我々に可能とした。ＹＦ０１２４０３の調製物と同様に、これらの化合物を、Ｈｅｃｋカップリング、Ｎｅｇｉｓｈｉカップリング、及びＢｕｃｈｗａｌｄ−Ｈａｒｔｗｉｇカップリング反応等の、Ｐｄ、Ｃｕ、又はＦｅの存在下で有機金属触媒作用によって助けられるカップリング反応によって合成することができ、ハロゲン化物より開始し、それは報告される手段［Ｓ１９］を使用することで入手可能である（図５０）。
【０４７１】
Ｃ３での修飾。対応するアルコールへのＣ３エチルエステルの減少は、ＩＣ５０を一桁低下させ、ＰＤＥ６を超える選択性を７０倍増加させる。活性の改善が、電子吸引性基がアリール環の電子供与基により、又は得られたアルコール及び５アミン間の水素結合により、又は遊離ヒドロキシル基によって供給されるＨ受容体／ドナーの必要性により置換される事実のためなのかは、不明である。しかしながら、上述のように、Ｃ３位置でのそのベンジル型アルコール及びシアノ基は、潜在的問題を引き起こし得る。したがって、本明細書で説明される幾つかの戦略は、Ｃ３位置での構造を最適化することを助けることができる。
【０４７２】
エステル／エーテルＬ０２、チオエーテル／チオエステルＬ０３、アミン／アミドＬ０４を、それぞれ塩基の存在下で、アルコール／酸、チオール／チオール酸、又はアミン／アミドと遊離アルコールＬ０１に由来するベンジル塩化物又はベンジルメシレートの反応によって、容易に得ることができる。また、上述のベンジルクロリド／メシレートをヘテロサイクルによって置換し、Ｌ０５を得ることができる。アルコールＬ０１又はチオール（Ｌ０３、Ｒ’＝Ｈ）もしくはアミン（Ｌ０４、Ｒ’＝Ｈ）とトリホスゲン／カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）又は塩化チオニルの反応は、それぞれ環状尿素／カルバミド（Ｌ０６）、及び環状チオ尿素／スルホンアミド（Ｌ０７）へと導くであろう。これらの単純な転換は、我々がベンジル型アルコールに由来する幾つかの化合物ライブラリーを用意に構成することを可能とし、それはこの足場の妥当性を改善するであろう。加えて、これらの化合物は低級ｔＰＳＡを有し得るため、それらは極性アルコール（図５１）よりも、より優れたＢＢＢ透過性を有し得る。
【０４７３】
別の戦略において、フッ素化した化合物は通常良好なＰＫを有し、分子内Ｆ−Ｈ結合は親油性、ＢＢＢ透過、及び生物学的利用率を増加できるため、フッ素をＣ３で導入するこができる。アルコールＬ０１とＤｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）との反応は、ベンジルフルオライドＬ０８を産出する。Ｄｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）との反応が後に続く、Ｌ０１のその対応するアルデヒドへの転換は、ジフルオロ誘導体Ｌ０９を提供する。トリフルオロメチル類似体Ｌ１０を、Ｄｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）と３−カルボンキノリンとの反応によって、容易に得る（図５２）。
【０４７４】
Ｃ３位置でのアミノ基の導入を、３−カルボンキノリンに由来するアジドより、Ｃｕｒｔｉｓ転位を通して理解できる。３−アミノ−キノリンＬ１１に着手して、その３−フルオロ誘導体を調製し、ＨＢＦ４の存在下でＳａｎｄｍｅｙｅｒ反応条件を利用することができる。アルキルハロゲン化物、１，２−ジブロモエタン、トリホスゲン／カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、又は塩化チオニルを用いてＬ１１の処置は、他の誘導体Ｌ１３〜Ｌ１６をもたらす（図５３）。
【０４７５】
他の部分での修飾。我々の研究が進行するたびに、我々のＳＡＲデータベースはさらに拡張するであろう、Ｃ３及びＣ８でのその最高の置換基を同定するであろう。この足場の薬理学的特性及び妥当性をさらに改善するため、また、我々は、この足場の他の部分を修飾することができる。置換アニリンＬ１７から開始し、３−ヒドロキシキノリンＬ１９を、メチレンマロン酸を用いたＬ１７の処置、後に、上昇した温度での環化によって調製することができる。ＰＯＣｌ３を用いた還流Ｌ１９は３−クロロキノリンＬ２０をもたらすであろう、次いで、それをアンモニアを用いた処置によって、３−アミノ誘導体Ｌ２１に転換することができる。異なる求電子試薬を用いたＬ１９及びＬ２１の処置は、それぞれアミド／スルホンアミドＬ２２及びエステル／スルホン酸塩／エーテルＬ２４を提供する。次いで、セクションｂで上述のＣ３でのＳＡＲ研究に基づいて（図５４）、Ｌ２２及びＬ２４の双方を、望まれる誘導体（Ｌ２３及びＬ２５）に転換するであろう。
【０４７６】
本明細書で説明される構造は多数の変異を包含し、それらの幾つかは、改善された選択性、ＢＢＢ透過性、ＰＫ、及び／又は他の薬理学的特性を伴う良好なＰＤＥ５阻害剤ではあり得ない。したがって、実際の合成を開始する前に限定された資源の消耗を避けるため、計算的な化学を、ドッキング及びＡＭＤＥＴパラメーター（ｃｌｏｇＰ、ｔＰＳＡ、ｃｌｏｇＢＢ等の）算出に基づいて、ｔｏｐ−ｔｉｅｒ候補に優先順位をつけ、同定することを補助するために使用するであろう。それに加えて、最適化プロセシングの間、すでに得られたデータに注意しなければならない、よって、後の研究をそれに従って導くことができる。
【０４７７】
ＡＤに対して最適化される新規ＰＤＥ５阻害剤の設計及び合成のための計算戦略。
【０４７８】
ＰＤＥ５阻害剤特性を、幾つかの主要な段階から成る計算的設計を使用して最適化するであろう。段階１は、新規の設計又はコンビナトリアルライブラリードッキングを通した、初期構造に基づく実質的スクリーニング（強固な酵素構造）を含む。段階１で使用するその計算的方法は非常に速く、したがって、実質的分子又は分子断片の大きな数の自動スクリーニングに有用である。段階１のその高くランク付けされた実質的化合物を、より洗練された可動性ドッキングのために、段階２でさらに考慮するであろう。段階２を通過する限定された数の実質的化合物（上位１００又は以下）は、水中のＰＤＥ５の微細結合のより洗練されたＭＤシミュレーション、及びＭＭ−ＰＢＳＡ結合自由エネルギー計算（段階＃３）を受けるであろう。次に、予測されるＰＤＥ５阻害剤の選択性を、段階４で評価するであろう。本明細書で説明される構造の中で、これらの計算的研究によって表されるものを、酵素活性に対して合成し、試験するであろう、それにより、我々は、医薬品化学、計算的研究、及び薬物活性の解析含む完全に結合的なアプローチを利用するであろう。
【０４７９】
ｉ．段階＃１。初期構造に基づく実質的スクリーニング：２つの計算的アプローチを使用し、固定酵素構造を用いて自動化された大規模な実質的スクリーニングを行うであろう：新規設計及びコンビナトリアルライブラリードッキング。自動様式で使用される双方のアプローチはそれら固有の利点を有し、したがって相互補完的である。その新規リガンド設計は、微細酵素リガンド結合の詳細にわたる分析に基づいており、既知の酵素又は受容体の結合部位を考慮する。既存のＰＤＥ５阻害剤の構造解析及び我々の近年に決定した結合部位の３Ｄ構造は、我々が高い効力を伴うファルマコフォア／足場のクラスを決定することを可能とする。次いで、このファルマコフォア／足場を、受容体に対する、リガンドの新規設計の基礎として使用することができる。酵素の３Ｄ構造を前提とする場合、個人は、理想的にリガンドによって満たされるサブサイトの相互作用を同定することができる。次いで、コンピュータープログラムは、データベースからの断片を相互作用サブサイトと比較し、実結合を反映するスコアルールに従って的中が提唱される。この自動比較は、相互作用の異なるサブサイトにおける断片の好ましい組み合わせを予測する。数々のコンピュータープログラムは断片の組み合わせ方法を提供することができ、ＬＵＤＩ［Ｓ１８３〜Ｓ１８５］、ＣＬＩＸ［Ｓ１８６］、ＳＰＬＩＣＥ［Ｓ１８７］、ＧｒｏｕｐＢｕｉｌｄ［Ｓ１８８］、及びＳＰＲＯＵＴ［Ｓ１８９〜Ｓ１９１］を含む。我々は、このプロジェクトのためにＬＵＤＩプログラムを選択した。また、そのプログラムは、好ましい相互作用が酵素と共に形成される様式で、相互作用サブサイトに分子断片を位置することができるであろう。次いで、断片の各組み合わせは単一の実質的分子に結合し、ＰＤＥ５を結合するそれら分子の能力をスコアするであろう。
【０４８０】
コンビナトリアルライブラリードッキングアプローチにおいて、我々は、ドッキング戦略（ＤＯＣＫ６．０プログラム［Ｓ１９２］を使用）を用いて、実質的コンビナトリアルライブラリーを構成するであろう、次いで、ＰＤＥ５活性部位とのこれらの実質的化合物のそれぞれのドッキングを構成するであろう。一般的に使用されるドッキング戦略は、リガンドを足場及び強固な部分構造断片に精査するためであり、次いでコンビナトリアル様式で多くの異なる断片を探索することによって、新しい分子構造を生成するためである。リード化合物から最初の断片（置換基）の除去後、我々は、ＺＩＮＣデータベース［Ｓ１９３］中の「断片」の様な化合物を、複数の位置でのこれらの断片及び配向をＰＤＥ５活性部位のサブサイトにドッキングすることによって、スクリーニングするであろう。各サブサイトのその上位の断片（例えば、５００）をランク付けし、ＣｏｍｂｉｌｉｂＭａｋｅｒＴＭプログラム（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）によって使用し、（５００）n実質的化合物から成るコンビナトリアルライブラリーを構築するであろう。２つのサブサイトのみが計算的な設計の各ラウンドに対して考慮された場合、各リード化合物から構築されたｎ＝２及び（５００）n＝２５０，０００化合物を有するであろう。最後に、コンビナトリアルライブラリーの各実質的化合物を、ＰＤＥ５活性部位にドッキングし、それらの結合を、ドッキング６．０プログラム［Ｓ１９２］の自動可動性ドッキング機能によってスコア化するであろう。ＤＯＣＫ６．０プログラム及びドッキング幾何学の使用によっても決定されるドッキングスコアの相対的値に基づいて、その上位にスコアされた化合物を、次の段階でさらに評価するために選択するであろう。これらのアプローチは、我々がキノリン足場のさらなる修飾の可能性を調査することを可能とする。
【０４８１】
ｉｉ．段階＃２。可動性ドッキング及びＢＢＢ透過予測：強固な酵素構造を伴う上位にスコアされた化合物の段階＃１で予測されたその結合構造を、さらに精密化し、ＤＯＣＫ６．０プログラム［Ｓ１９２］で実装されたＡｍｂｅｒスコアアプローチを使用することによって、再スコア化するであろう。Ａｍｂｅｒスコア算出の間、酵素リガンド複合体のその入力座標及びパラメーターを、システム中に読み込むであろう。次いで、共役勾配法を使用するエネルギー最小化を行い、酵素リガンド接触を最適化するであろう。そのエネルギー最小化は、一定温度で（短時間）Ｌａｎｇｅｖｉｎ  ＭＤシミュレーション、最後に短期エネルギー最小化が続き、システムの最終のエネルギー結果を得るであろう。最高のドッキングスコア及び合理的なドッキング幾何学の双方を有する化合物を、次の段階におけるさらなる評価のために選択するであろう。
【０４８２】
また、我々は、ＢＢＢ透過を各候補化合物の極性表面積（ＰＳＡ）及び油／水分配係数（ｌｏｇＰ）を算出する、確立された定量構造活性関係（ＱＳＡＲ）及び人工神経網（ＡＮＮ）モデル［Ｓ１９４、Ｓ１９５］を使用することによって、理論的に推定するであろう。これらのＱＳＡＲ及びＡＮＮモデルは、化合物のＢＢＢ透過を、化合物のＰＳＡ及びｌｏｇＰ（又はＰＳＡ及び分子量）によって決定することを示し、双方を市販のソフトウェアによって、便利に算出できる。通常、ＢＢＢを通過できる化合物は、４５０Ｄａ未満の分子量及び９０．２Å2［Ｓ１９４］未満のＰＳＡを有するべきである。
【０４８３】
ｉｉｉ．段階＃３。水中のＭＤシミュレーション及びＭＭ−ＰＢＳＡ結合自由エネルギー計算：段階＃２において可動性ドッキング及びＢＢＢ透過試験の双方を通過する上位にスコアされた化合物のそれぞれに対して、我々は、ＰＤＥ５−リガンド複合体でＭＤシミュレーションをさらに行うであろう。ＭＤシミュレーションを、Ｃｏｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｓ１９７］によって開発された新しい産生力場を伴う、Ａｍｂｅｒプログラムパッケージソフト［Ｓ１９６］を使用して水浴中で行うであろう。また、ＮＡＭＤプログラム（同一のＡｍｂｅｒ力場又はＣＨＡＲＭＭ力場を使用）［Ｓ１９８］を、大規模な平行ＭＤシミュレーション［Ｓ１９９〜Ｓ２０７］のために使用するであろう。最後に、ＭＤシミュレーションのその安定軌道を使用し、より洗練された分子力学／Ｐｏｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ表面積（ＭＭ−ＰＢＳＡ）［Ｓ２０８、Ｓ２０９］結合自由エネルギー計算を行うであろう；このプロジェクトで使用されるその詳細なＭＭ−ＰＢＳＡプロトコル及びタンパク質リガンド結合の予測におけるそれらの高い正確性を、ＰＤＥ及び他のタンパク質の阻害の我々の近年に達成した計算的研究［Ｓ２０４、Ｓ２１０］で、詳細に説明し、考察している。その算出された結合自由エネルギーは、酵素（ＰＤＥ５）とのリガンド結合の結合親和性を理論的に示唆している。ＰＤＥ５の高い結合親和性を有すると予測された化合物のみを、それらの選択性に対して、段階＃４で評価するであろう。
【０４８４】
ｉｖ．段階＃４。予測されたＰＤＥ５阻害剤の選択性の計算評価：全てのＰＤＥファミリーのモデル化された３Ｄ構造に基づいて、改善された選択性を伴う新規ＰＤＥ５阻害剤を、阻害剤がＰＤＥの一般的な残基との良好な相互作用を保持するだけでなく、ＰＤＥ５の非一般的残基（例えば、Ｆ７８７、Ｌ８０４、Ｉ８１３、及びＭ８１６）との改善された相互作用も有するように設計することができる。これらの非一般的残基はＰＤＥ５にユニークではないが、いずれの他のＰＤＥファミリーもこれらの非一般的残基の全ては有していない。もし、一般的残基に加えて、これらの非一般的残基の全てとの好ましい相互作用を有する場合、ＰＤＥ５阻害剤は選択的であることが期待される。我々は、実質的ライブラリー及び他のＰＤＥとの化合物の結合をモデル化し、それらの選択性を評価するであろう。その結果は、実質的ライブラリー中の幾つかの化合物が、他のＰＤＥとの有意に低い結合親和性を有することを示唆するであろう。
【０４８５】
我々は、他のＰＤＥファミリーとの予測されたＰＤＥ５阻害剤結合のそれぞれに対して、ＰＤＥ構造の３Ｄモデルを使用し、段階＃２で可動性ドッキングを繰り返すであろう（かつ、もし必要であれば、段階＃３でＭＤ及びＭＭ−ＰＢＳＡ算出）。ＰＤＥ５の潜在的に強力及び選択的であるその予測された新しい化合物（すなわち、その予測されたＩＣ５０＜５０ｎＭ及び予測された選択性＞１００倍）を、化学的合成及び生化学的アッセイにかけるであろう。ウェット実験試験の実際の結果を使用し、後の予測に対して、計算的設計プロトコルを精密化し、合理的根拠を改善するであろう。
【０４８６】
化合物分析。合成し、生物活性に対して試験した全ての化合物を、完全に特徴づけ、ＨＰＬＣ及び１Ｈ  ＮＭＲによって決定することにより、＞９５％まで精製するであろう。さらに、追加の分析技術（すなわち、13Ｃ  ＮＭＲ、ＩＲ、融点、ＭＳ及び／又はエレメント分析）を使用し、構造を決定し、精製するであろう。光学的に純粋な物質の場合において、その純度をキラル固定相ＨＰＬＣによって評価するであろう。構造的不確実性が残存する特定のの場合において、他の技術（すなわち、２−Ｄ  ＮＭＲ、及びＸ線結晶解析）が利用されるであろう。
【０４８７】
実施例７の参考文献
2012513464.tif 000104
2012513464.tif 000105
2012513464.tif 000106
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2012513464.tif 000109
2012513464.tif 000110
2012513464.tif 000111
実施例８−心臓、全脳、ヒトの海馬及び大脳のＰＤＥ５ｍＲＮＡの発現レベル
【０４８８】
定量ＲＴ−ＰＣＲを、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ及びプライマーの３つの異なるセットを使用して行った。プライマーの特異性を融解曲線を用いて確認した。総ＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって調製した。プライマー１、２、及び３の標的は、ＰＤＥ５  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲであった。プライマー１順方向：５’−ＴＧＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号３）、逆：５’−ＡＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴ−３’（配列番号４）、プライマー２順方向：５’−ＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡ’（配列番号５）、逆：５’−ＧＧＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧ  ＣＡＣＡＡＴＴＴ−３’（配列番号６）、プライマー３順方向：５’−ＡＣＣＧＴＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＡＴＣＣＴ’−３’（配列番号７）、逆：５’−ＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号８）。
【０４８９】
我々は、ヒト海馬においてＰＤＥ５メッセンジャーの非常に高いレベル、心臓においてはさらに高いレベルが存在することを示した（図４２を参照されたい）。この観察は、ヒト脳Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ’ｓ  ＡＳＣＥＮＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍのデータベースと一致する。これらの実験を行うことは、ヒト海馬におけるメッセンジャーの存在を示すことができない他の群からの先の試みを考慮すると、２つの理由のため、我々のプロジェクトに対して重要であった：ａ）げっ歯類配列を使用し、ヒトＲＮＡを検出した；ｂ）ＰＤＥ５遺伝子が長い３’ＵＴＲ（５０００ｂｐを越える長さ）を有することが考えられる。他がコード配列を使用したにもかかわらず、我々はその３’ＵＴＲを選択した、コード配列の選択は、６０００ｂｐを越える長さのｃＤＮＡを含む。したがって、他の群によって行われたｍＲＮＡ発現の数量化は正しくはなかった。
実施例９−ＡＤの異なる動物モデルにおけるシルデナフィルの効果
【０４９０】
ＡＰＰ／ＰＳ１動物において発現されるＡβ以外のＡＰＰの断片は、記憶の変化に寄与するこができる。したがって、また我々は、Ｊ２０マウスとして知られる変異体ヒトＡＰＰ（Ｖ７１７Ｆ、Ｋ６７０Ｍ、Ｎ６７１Ｌ）マウスへのシルデナフィル（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）投与によって、異なるＡＤモデルの我々の知見を検証した。我々は、ＡＰＰ／ＰＳ１動物に関して同一実験プロトコルを繰り返した。マウスを４つの群に分けた：シルデナフィルを用いたＪ２０（ｎ＝１０）、媒体用いたＪ２０（ｎ＝７）、シルデナフィルを用いたＷＴ（ｎ＝８）、及び媒体を用いたＷＴ（ｎ＝８）。我々は、ＦＣの訓練段階中に、いずれの差異もマウスの４つの群間のすくみ行動において見出せなかった。２４時間後、我々は、コンテキスト学習の解析で（図５５Ａ）、媒体処置されたＷＴ同腹子と比較して、媒体処置されたＪ２０マウスにおいて低下したすくみを見出した。しかしながら、訓練後即時のシルデナフィル処置は、Ｔｇ動物のコンテキスト学習を改善した。我々は、マウスの４つの群間の手掛かり学習の間のすくみ挙動において、差異を見出さなかった。また、シルデナフィルは、３週間にわたる訓練後、即時に連日注射されたＪ２０マウスの空間作業記憶を改善した（図５５Ｂ）。その同一動物を可視のプラットフォーム作業を用いて試験した場合、４つの群間でいずれの感覚運動機能障害も見られなかった。
実施例１０−ＡＤマウスモデルのＰＤＥ５及びシナプス機能、記憶、ならびにＡβ負荷の阻害
【０４９１】
記憶喪失、シナプス機能障害、及びアミロイドβペプチド（Ａβ）の蓄積は、アルツハイマー病（ＡＤ）の主要な特徴である。一酸化窒素／ｃＧＭＰ／ｃＧＭＰ−依存性−タンパク質キナーゼ／ｃ−ＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）カスケードの下方制御は、シナプス欠損、後にＡβ上昇に関連している。ここで、我々は、ホスホジエステラーゼ５阻害剤（ＰＤＥ５）シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ）、ｃＧＭＰレベルの上昇を通して記憶分子ＣＲＥＢのリン酸化を増強する分子は、アミロイド沈着のマウスモデルのＡＤ表現型に対して有益であることを報告する。我々は、阻害剤は、シナプス機能、ＣＲＥＢリン酸化、及び記憶の即時的、及び長期にわたる寛解を産生することを示す。また、この効果は、Ａβレベルの長期の減少に関連する。ＰＤＥ５阻害剤の副作用が広く知られており、老年人口へのそれらの投与を妨げないことを考え、これらの薬物は、上昇したＡβレベルに関連するＡＤ及び他の疾患の治療の潜在力を有する。
【０４９２】
導入
【０４９３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経細胞脱落、細胞外老人性プラーク、及び細胞内神経原線維変化、記憶喪失を引き起こすことによって特徴づけられる。ＡＤは、少なくとも一部、Ａβによって産生されるシナプス傷害として始まる（Ｓｅｌｋｏｅ，２００２）。長期増強（ＬＴＰ）、記憶の細胞モデル、及びＣＲＥＢのリン酸化、記憶に関与する転写因子は、Ａβによって減少する（Ｖｉｔｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。興味深いことに、一酸化窒素（ＮＯ）ドナー及びｃＧＭＰ類似体の双方は、ＬＴＰ及びＣＲＥＢリン酸化におけるＡβ誘発性機能障害に反作用する（Ｐｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。逆もまた同様に、ＮＯシンターゼ２（ＮＯＳ２）の遺伝手術は、変異アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）を発現しているマウスのＡＤ表現型の悪化をもたらし（Ｃｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ＮＯ経路の上方制御がＡＤにおいて保護的であり得ることを示唆する。
【０４９４】
ＮＯ経路を上方制御するための一効果的な様式は、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）（海馬、皮質、及び小脳等の認知機能に関連する幾つかの脳領域で発現される酵素）の阻害剤を通した、ｃＧＭＰレベルの増加によるものである（Ｖａｎ  Ｓｔａｖｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、ｖａｎ  Ｓｔａｖｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）（また、ヒト脳  Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ’ｓ  ＡＳＣＥＮＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＭ．Ｓａｋｕｒａｉとの私信を参照されたい）。前臨床研究は、選択的ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィル（Ｐｆｉｚｅｒ社よりＶｉａｇｒａ）及びバルデナフィル（Ｂａｙｅｒ社よりＬｅｖｉｔｒａ）が海馬のｃＧＭＰレベルを上昇させ、高齢のラット（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２ａ）及びマウス（Ｂａｒａｔｔｉ  ＆  Ｂｏｃｃｉａ，１９９９）の記憶を改善することを表している。興味深いことに、近年、ＦＤＡは、阻害剤タダラフィル（Ｌｉｌｌｙ社よりＣｉａｌｉｓ）の日常使用を承認した（を参照されたいｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｓｐａｃｅ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ＿ｓｔｏｒｙ．ａｓｐｘ？ＮｅｗｓＥｎｔｉｔｙＩｄ＝８２１２４）。なお、ＰＤＥ５阻害剤を広範に使用し、勃起不全及び肺高血圧症を治療することにより、それらの副作用が知られる。理論にとらわれることなく、ＰＤＥ５阻害剤を、ＡＤ患者等の老年人口への投与と互換性があり得る。本研究におけるこれらのエレメント基づいて、我々は、変異体アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ；Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）及びプレセニリン−１（ＰＳ１；Ｍ１４６Ｌ）の双方を保有する、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと称されるマウスのＡＤ表現型に対して、ＰＤＥ５阻害が有益な効果を発現するかを調査した。
【０４９５】
物質及び方法
【０４９６】
動物。実施例１で説明されたように、ヒトＡＰＰ（Ｋ６７０Ｍ：Ｎ６７１Ｌ）及びＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ）（ライン６．２）変異の双方を発現する二重遺伝子組換えマウスを使用し、処理した。
【０４９７】
薬物調製。薬物調製物を、実施例１で説明したように、行った。
【０４９８】
薬物投与。３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴマウスを４つの群に分けた：媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、ＰＤＥ阻害剤で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、媒体で処置されたＷＴマウス、ＰＤＥ阻害剤で処置されたＷＴマウス。一連の実験において、我々は、海馬のスライスを、シルデナフィル（５０ｎＭ）、又はタダラフィル（５０ｎＭ）、もしくはＩＣ３５４（１μＭ）を用いてシータバースト前に１０分にわたり灌流することによって、シナプス機能障害へのＰＤＥ阻害の急性影響を評価した。別々の一連の実験において、また、我々は、シルデナフィルの異なる濃度の急性影響を検討し、それらの最小量の効果的濃度を樹立した。残存する実験において、我々は、シルデナフィルを腹腔内注射した。シルデナフィルの短期効果の評価のため、その薬物を濃度の３ｍｇ／ｋｇで、訓練後即時に与えた。この用量は、〜２．５μＭの濃度のｃＧＭＰを海馬にもたらした（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）。これらの実験において、また、我々は、シルデナフィルの最小量の効果的濃度及びシルデナフィル送達の最低限の効果的日数も樹立した。長期効果の評価のため、シルデナフィルを、３ｍｇ／ｋｇの濃度で３週間にわたる腹腔内注射によって連日与え、次いで処置を行動試験の９〜１２週間前に中止した。また、６ヶ月目で記憶の長期救出をさらに引き起こすことができる、シルデナフィル送達の最低限の効果的日数及びその最小量のシルデナフィル効果的濃度も研究した。コンテキスト及び手掛かり恐怖条件付けを、３日にわたって行った。ラジアルアーム水迷路（ＲＡＷＭ）を、３週間にわたって行った。Ｍｏｒｒｉｓ水迷路は、３日間持続した。次いで、その動物を、電気生理学的記録のために殺処理した。
【０４９９】
短期効果実験におけるシルデナフィルの投与の時間を決定するために、我々は一連の予備研究を行った、そこで、その阻害剤を、電気ショックの５分前、又はＲＡＷＭを用いた最初の取得試験の５分前に、腹腔内注射した。我々は、いずれの有益な効果も、シルデナフィル注射されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるすくみ時間及びエラーの数の双方では見出さなかったかった（シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのそれと〜９０％等しい、すくみ時間を示した；ｎ＝シルデナフィル処置された遺伝子組換えの７匹のオス及び媒体処置された遺伝子組換えの６匹のオス、Ｐ＞０．０５；シルデナフィル及び媒体処置された遺伝子組換えの双方に対する保持試験において〜５つのエラー、ｎ＝シルデナフィル処置された遺伝子組換えの６匹のオス及び媒体処置された遺伝子組換えの５匹のオス、Ｐ＞０．０５、シルデナフィルは、双方の作業において、ＷＴマウスの行動能力に影響を与えなかった、ｎ＝全ての条件のための５匹のオス）。したがって、結果の項で報告される、シルデナフィルの短期効果の全ての行動実験は、訓練後、注射を用いて行った。最後に、別の一連の実験のにおいて、我々は、記憶へのタダラフィルの腹腔内注射の効果を試験した。
【０５００】
電気生理学的分析。実施例１で説明されるように、電気生理学的分析を行った。
【０５０１】
また、ＮＭＤＡ受容体電流及びＡＭＰＡ受容体電流の両方を評価するために、パッチクランプ実験も行った。この技術は、以前説明されている（Ｐｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。  簡潔に言えば、３５０μｍの海馬のスライスをビブラトームでカットし、水浸チャンバー内で２９℃で維持し、１２５ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、１．２５Ｎａ2ＨＰＯ4、２５ＮａＨＣＯ3、２ＣａＣｌ2、１．４ＭｇＣｌ2、２５グルコース、０．１ピクロトキシン、ｐＨ７．４（９５％Ｏ2、５％ＣＯ2）を含有する（ｍＭ単位）人工脳脊髄液で灌流した。記録前に、スライスを、３７℃で３０分間再生させ、次いで室温で少なくとも６０分間再生させた。実験全体を通して、神経細胞を電圧固定した。パッチピペット（４〜６ＭΩ）は、溶液１１７．５Ｃｓ−メチル−スルホネート、１７．５ＣｓＣｌ2、４ＮａＣｌ、０．１ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ、５ＱＸ−３１４Ｃｌ、４ＭｇＡＴＰ、０．３Ｎａ２ＧＴＰ、１０クレアチンリン酸−Ｔｒｉｓ（ＣｓＯＨを用いてｐＨを７．３に調整、ショ糖を用いてモル浸透圧濃度を２９０ｍＯｓｍに調整）を含有した（ｍＭ単位）。電流を、Ｗａｒｎｅｒ増幅器（ＰＣ−５０１Ａ）を用いて記録し、１ｋＨｚ（保持電位、−７０ｍＶ）で濾過した。振幅を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓからのＣｌａｍｐｆｉｔプログラム（バージョン１０．１）を使用することによって自動的に測定した。ピーク応答で測定された−７０ｍＶのＡＭＰＡＲ電流の振幅を、ピークの３０ミリ秒後に測定された−５０ｍＶのＮＭＤＡＲ電流で割ることによって、ＡＭＰＡＲ／ＮＭＤＡＲ受容体比率を算出した。
【０５０２】
行動研究
【０５０３】
恐怖条件付け−実施例１で説明されるように研究を行った。
【０５０４】
空間作業記憶−実施例１で説明されるように研究を行った。
【０５０５】
参照記憶−実施例１で説明されるように研究を行った。
【０５０６】
可視のプラットフォーム試験−実施例１で説明されるように訓練を行った。
【０５０７】
免疫細胞化学的実験  実施例１で説明されるように、免疫細胞化学的実験及び測定を行った。
【０５０８】
Ａβレベルの決定  凍結した脳半球を秤量し、５ＭのグアニジンＨＣＬ／５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣＬ溶液でホモジナイズした。製造者のプロトコルに従って、Ａβ４０及びＡβ４２を、ヒトβアミロイドＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）を使用して測定した。ＥＬＩＳＡシグナルを、皮質のミリグラム当たりＡβのナノグラム単位で、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。すでに説明したように、代替的に、凍結した脳半球のホモジネートに基づいて、Ａβレベルを決定することができる［Ｔｒｉｎｃｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ，２００４．５５（６）：ｐ．８０１−１４］。Ａβを、Ａβ４０（ＪＲＦ／ｃＡ４０／１０）又はＡβ４２（ＪＲＦ／ｃＡ４２／２６）のいずれかに対する単クローン抗体を用いてトラップすることができ、次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼ抱合ＪＲＦ／Ａ  ｔｏｔ／１７を用いて検出することができる［Ｊａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００．４０８（６８１５）：ｐ．９７９−８２］。ＥＬＩＳＡシグナルを、合成Ａβ40及びＡβ42ペプチド基準値（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用した基準曲線に基づいて、ｍｇタンパク質当たりｆｍｏｌ  Ａβ（ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キットを用いて決定、ＰＩＥＲＣＥ）単位で、２つのレプリカウェルの平均値として報告することができる。血液を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する管に収集し、次いで４０℃で５分間にわたり、４０００ｒｐｍで遠心分離することができる。次いで、ＥＬＩＳＡプレートに負荷する前に、血漿を、−８０℃で貯蔵することができる。
【０５０９】
統計解析  実施例１で説明されるように、統計解析を行った。異なる濃度についての曲線を当てはめるために、ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いた非線形回帰解析を使用した。
【０５１０】
結果
【０５１１】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬のスライス中のシナプス機能へのシルデナフィルの急性影響。我々の第１の目的は、ＰＤＥ５阻害がシナプス機能を寛解し得るかどうかを決定することである。シルデナフィルは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することが報告されるため（ＦＤＡ，１９９８）、バルデナフィルの証拠が間接的であり（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、タダラフィルがそれを通過しないにもかかわらず、我々は、中枢神経系研究のために、この化合物をＰＤＥ５を阻害する第１の薬物として選択した。シルデナフィルは、６．０ｎＭのＰＤＥ５に対してＩＣ５０、及びげっ歯類において０．４時間のインビボ半減期を有する（ヒトにおいて約４時間）（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｄａｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。我々は第１に、シルデナフィルの短時間の適用を試験し、基底シナプス伝達（ＢＳＴ）が正常であるにもかかわらず、シナプス可塑性機能障害がまず開始しだす際、３ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに由来するスライスのＬＴＰの欠損を救うかを見極めた（Ｔｒｉｎｃｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＢＳＴを、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス及び野生型（ＷＴ）マウスの刺激強度の増加における、視野興奮性シナプス後潜在的（ｆＥＰＳＰｓ）の勾配、またさらにｆＥＰＳＰ勾配に対して、線維斉射のピーク振幅をプロッティングすることによって決定した。我々は、異なる群の間のＢＳＴにおける差異を見出さなかった（図５６Ａ、図６７）。次いで、海馬のスライスを、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ側枝経路のテタヌスの刺激を介してＬＴＰを誘発する前に、シルデナフィル（５０ｎＭ）で１０分灌流した。シルデナフィルで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライス中の増強は、媒体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライスの増強をはるかに越えていた（図１Ｂ）。一方で、媒体のみで処置されたＷＴスライスと比較して、シルデナフィルは、ＷＴマウスのスライス中のＬＴＰの振幅を変化させなかった（図１Ｃ）。シルデナフィルは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス又はＷＴ同腹子からのいずれのスライスにもテタヌスを適用しなかった場合、その適用中の、又は実験中のその適用の終了後１２０分の基底シナプス反応に何の効果も有さなかった（図１Ｂ、Ｃ）。シルデナフィルの異なる濃度の使用は、より低い濃度がより低い効果を有する一方で、５０ｎＭが、遺伝子組換え動物からのスライス中のシナプス可塑性を完全に救う薬物の最小用量であることを表した（図５６Ｂ）。阻害剤の同一濃度は、ＷＴスライスのＬＴＰへの効果を有さない。さらなる実験で、５０ｎＭのシルデナフィルは、１連又は２連のシータバースト刺激を通して増強された、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスからのスライス中のＬＴＰを寛解した（図５６Ｃ）。興味深いことに、ＮＯ経路の刺激薬と対になったより弱いテタヌスの刺激を受取したＷＴマウスからのスライスについてすでに表されているように（Ｐｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、５０ｎＭのシルデナフィルは、１回のシータバースト刺激を受取したＷＴスライス中のＬＴＰ振幅を増加させた（図５６Ｃ）。
【０５１２】
シナプス機能障害へのシルデナフィル効果のＰＤＥ５特異性に対する対照として、我々は次に、より特異的ＰＤＥ５阻害剤である、タダラフィルを使用した。ｃＧＭＰに基づく阻害剤であるシルデナフィル及びバルデナフィルとは異なり、タダラフィルはβカルボリン由来薬物であり、ＰＤＥ１（選択性比率＞２０００）及びＰＤＥ６（選択性比率１０００）、ならびに５．０ｎＭのＰＤＥ５に対するＩＣ５０への効果を伴わない（Ｄａｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。スライスをタダラフィルに浸したとき（５０ｎＭ、テタヌス前に１０分間）、ＡＰＰ／ＰＳ１スライスにおける増強は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１スライスにおける増強をはるかに超えていた（図８Ａ）。タダラフィルは、ＷＴマウスにおけるベースライン及びＬＴＰに影響しなかった（図８Ｂ）。
【０５１３】
ＰＤＥ５特異性に対する追加の対照として、我々はまた、ＩＣ２２４のＨＣｌ塩であり、ＩＣ３５４と呼ばれる非常に選択的であるＰＤＥ１阻害剤を使用した［８０ｎＭのＰＤＥ１に対してＩＣ５０；次に最も感受性の高いＰＤＥのＩＣ50値と、ＰＤＥ１のＩＣ50値との比率は、１２７に等しい（Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）］。シルデナフィル又はタダラフィルとは異なり、ＡＰＰ／ＰＳ１スライスをＩＣ３５４に浸しとき（１μＭ、テタヌス前に１０分）、ＬＴＰは影響されなかった（図８Ｃ）。ＩＣ３５４は、ＷＴマウスの海馬のスライス中のＬＴＰ振幅を変化させなかった（図８Ｄ）。したがって、シルデナフィル及びタダラフィルの実験とまとめたこれらの結果は、ＰＤＥ５の阻害（ＰＤＥ１ではない）がシナプス機能障害からＡＤのような動物モデルを保護することを示し、ＰＤＥ５の阻害が、ＡＤのシナプス機能障害に対して有益であり得ることを支持する。
【０５１４】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知機能へのシルデナフィルの急性影響  上記で報告されるように、シルデナフィルは、ＢＢＢを通過する利点を提供し、したがってそれは行動実験において容易に利用することができる。我々は、３ヶ月齢のマウスを４つの群に分けた：シルデナフィルを用いるＡＰＰ／ＰＳ１、媒体を用いるＡＰＰ／ＰＳ１、シルデナフィルを用いるＷＴ、及び媒体を用いるＷＴ。シルデナフィル溶液及び媒体対照溶液を、３ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内投与した。この濃度は、シルデナフィルのこれらの量が、海馬のｃＧＭＰレベルを上昇させ、高齢のラット（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）及び血管効果（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）に依存しないマウス（Ｂａｒａｔｔｉ  ａｎｄ  Ｂｏｃｃｉａ，１９９９）における記憶を改善することを表す先の研究に基づいて選択された。我々は第１に、恐怖条件づけ学習、幾つかのＡＤマウスモデル（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ｂ）において損なわれ、かつ海馬及び扁桃体に依存（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ａｎｄ  ＬｅＤｏｕｘ，１９９２）する学習のタイプへのシルデナフィルの急性投与の効果を検討した。コンテキスト恐怖条件付けのために、マウスを訓練して中性刺激を有害刺激と関連付けさせた。それらを新しいコンテキスト（恐怖条件付け箱）中に配置し、軽度フットショック（無条件刺激、ＵＳ）と対になったホワイトノイズキュー（条件刺激、ＣＳ）に暴露し、訓練後、即時にシルデナフィルを注射した。恐怖学習を、コンテキストの表示又は完全に異なるコンテキスト内の聴覚キューに応答した、すくみ行動（必然的に生じる呼吸を除外して全ての運動の不在）を測定することによって２４時間後に評価した。我々は、訓練段階の前に、マウスの４つの群間のすくみ行動において、いずれの差異も見出さなかった（図２Ａ）。２４時間後、我々は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすくみ行動の低下を、媒体処置されたＷＴ同腹子のものと比較して、コンテキスト学習の解析において観察した（図２Ａ）。すくみにおいて、シルデナフィル処置されたＷＴ動物は有意な増加を表さなかったにもかかわらず（図２Ａ）、シルデナフィル処置は、遺伝子組換え動物のコンテキスト学習を改善し（図２Ａ）、これは、ショウジョウバエ及びマウスの双方において見出されたように、恐らく、訓練セッション後、記憶の最大レベルがすでに、媒体処置されたＷＴマウスにおいて誘発されているためであろう（Ｔｕｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ａ）。我々は次に、海馬非依存性作業である、手掛かり恐怖条件付けを試験したが（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ａｎｄ  ＬｅＤｏｕｘ，１９９２）、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスが、連想的学習において選択的海馬依存性機能障害を有することで知られているように（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ｂ）、４つの群間ですくみにおいて差異を見出さなかった（図５９）。なお、電気生理学的実験に関しては、我々は、１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び６ｍｇ／ｋｇの阻害剤を注射することによって、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるコンテキスト恐怖記憶を改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度を決定した。３ｍｇ／ｋｇの濃度は���恐怖記憶を完全に復元した（図５８Ａ）。阻害剤の異なる濃度を注射されたＷＴ同腹子においては、記憶増強は観察されなかった。
【０５１５】
次に、我々は、シルデナフィルを用いた処置の、空間作業記憶、ＲＡＷＭ試験を用いて研究することができる短期記憶のタイプへの効果を検討した。この作業はすでに、ＡＤの他の遺伝子組換えモデル（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｔｒｉｎｃｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）の記憶欠損を示しており、海馬の機能（Ｄｉａｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に依存することが表されている。マウスは、空間キューに関して迷路のアームの１つにおいて、隠しプラットフォームの位置を学習、かつ記憶することを必要とされた。媒体注射されたＷＴ同腹子と比較して、媒体を用いて注射されたＡＰＰ／ＰＳ１は、作業の取得及び保持の双方の間、プラットフォームの位置に対する空間記憶に重篤な異常を表した（図２Ｂ）。しかしながら、３週間にわたるシルデナフィルの連日注射は、第４の取得試験後、即時にＡＰＰ／ＰＳ１マウスの行動能力を寛解した（図２Ｂ）。シルデナフィルを用いた処置は、媒体注射されたＷＴ同腹子と比較して、ＷＴマウスの能力に影響しなかった（図２Ｂ）。我々はまた、１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び６ｍｇ／ｋｇの阻害剤を注射することによって、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間作業記憶を改善するために必要とされるシルデナフィルの最小濃度を決定した。３ｍｇ／ｋｇの濃度は、記憶を完全に復元した（図５８Ｂ）。次いで、我々は、シルデナフィルが空間作業記憶へのプラス効果を有するために必要とされる最短時間を試験した。３ｍｇ／ｋｇのシルデナフィルの連日注射は、２週間後、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの能力を改善した（図５８Ｃ）。マウスの４つの群は、可視のプラットフォーム作業においてプラットフォームを見出すのに必要とされる時間、ならびに泳ぐ速度において、いずれの差異も表さなかった（図１０）。したがって、視覚、運動協調性、又は動機づけは、マウスの４つの群において影響されず、ＲＡＷＭ結果にも影響を与え得ない。
【０５１６】
ＲＡＷＭ及び恐怖条件付けによる結果の間の興味深い差異は、シルデナフィルが、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＲＡＷＭ実験で、部分的救済を産生した一方で、救済がコンテキスト恐怖条件付けで完全であったという事実に関連した。この差異が、ＷＴマウスにおける記憶の不完全な形成のためであり、遺伝子組換えとＷＴ同腹子との間の記憶を均等化するシルデナフィルの作業を促進するということを除外するために、我々は、フットショックの強度を０．５０ｍＡから０．７５ｍＡへ増加させた追加的一連の実験を行った。この手段は、すくみの度合いを増加させることで知られている。すくみの度合いに関わらず、シルデナフィルは、ＲＡＷＭ実験とは異なり、より低い強度のフットショックを用いた実験同様に、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける記憶を完全に復元する（図６０）。
【０５１７】
シルデナフィルが、末梢血管作用を通してこの行動効果を産生した可能性を除外するために、我々は、ＢＢＢを通過することができないタダラフィルを使用する記憶研究を繰り返した（ｃＬｏｇＰ＝１．４３及びその製造者からの情報）。タダラフィル（１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるコンテキスト恐怖条件付け又は空間作業記憶のいずれも改善しなかった。したがって、シルデナフィルの効果は、血管区画中のＰＤＥ５の阻害のためではあり得ない（図６１）。
【０５１８】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける認知及びシナプス機能へのシルデナフィルの持続的効果。先の研究は、ＰＤＥ４阻害剤ロリプラムが、阻害剤の投与を超えて持続する、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるシナプス異常及び認知異常への持続された有益な効果を有することを示している（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ａ）。この知見は、ＡＤにおけるＣＲＥＢリン酸化を上方制御する薬物を使用するときの、非常に興味深い治療上の観点を広げている：短時間の処置の過程は、長期にわたって有益であり得る。シルデナフィル処置に続いて、同一効果が存在するかどうかを調べるために、我々は、ＰＤＥ５阻害剤が、シナプス機能障害及び記憶喪失に対して、その保護効果を維持するかどうかを検討した。これらの実験において、年齢３ヶ月のＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴマウスの双方を、３ｍｇ／ｋｇ／日のシルデナフィルを３週間にわたって腹腔内注射し、次いで、試験前に、その処置を９〜１２週間中止した。次に、マウスを、コンテキスト学習の訓練に供した。急性実験におけるように、動物が９〜１２週間前に訓練された同一コンテキストに、動物を再導入した場合、そのすくみ時間は、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１同腹子と比較して、シルデナフィルを用いて先に処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、大いに増加した（図３Ａ）。シルデナフィルは、媒体を用いて処置されたＷＴマウスと比較して、ＷＴ同腹子のすくみ時間を増加しなかった（図３Ａ）。手掛かり条件付け試験において、４郡間に差異は存在しなかった。３ｍｇ／ｋｇは、コンテキスト恐怖記憶への持続された有益な効果を産生する阻害剤の最小用量であり（図６２Ａ）、２週間は、シルデナフィル送達の最小限の効果的日数であった（図６２Ｂ）。これらのデータは、ＰＤＥ５の阻害が、薬物投与の持続時間を越えて拡張された時間、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの恐怖コンテキスト学習を保護することを示唆する。
【０５１９】
ＲＡＷＭ作業を使用して、空間作業記憶への、シルデナフィルを用いた３週間にわたる処置の一過程の効果を、次に試験した。媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴマウスによるエラーの数の間に、差異は存在しなかった（図３Ｂ）（Ｔｒｉｎｃｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。試験の９〜１２週間前の、３週間にわたるシルデナフィルの投与は、ＷＴ動物の能力に影響を与えることなく、２つの群間の間隙を減少させた（図３Ｂ）。加えて、恐怖条件付けを用いた実験と一致するように、３ｍｇ／ｋｇは、空間作業記憶への持続された有益な効果を産生する阻害剤の最小用量であり（図６２Ｃ）、２週間は、シルデナフィル送達の最小限の効果的日数であった（図６２Ｄ）。これらのデータは、ＰＤＥ５阻害剤を用いた長期処置の一過程が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間作業記憶を保護することを示唆する。
【０５２０】
シルデナフィルの長期記憶への効果を調査するために、我々は、海馬の機能を必要とし（Ｓｃｈｅｎｋ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，１９８５）、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて６ヶ月を過ぎた年齢で障害されることで知られる（Ｔｒｉｎｃｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）Ｍｏｒｒｉｓ水迷路作業を用いて参照記憶を試験した。媒体処置された遺伝子組換えマウスは、ＷＴ同腹子と比較して、６セッション後、隠しプラットフォームを見出すために、より長い時間を必要とした（図３Ｃ）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスをシルデナフィルを用いて先に処置した場合、それらは、それらの行動能力の顕著な改善を表した。シルデナフィルは、ＷＴ同腹子の能力に影響しなかった（図３Ｃ）。我々はまた、プローブ試験、空間参照記憶の別の試験を用いた参照記憶を評価した（Ｓｃｈｅｎｋ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，１９８５）。隠しプラットフォームの第６のセッション後、プラットフォームを水から除去し、動物に６０秒間探させた。したがって、そのマウスは、プラットフォームにぶつかる等の触覚キューとは独立して、プラットフォームの位置を知っていることを示唆している。媒体処置されたＷＴマウスは、他の象限内より、ターゲット象限（ＴＱ）内でより多くの時間を費やし、そこは、訓練の間プラットフォームが位置づけられていた場所であった（図３Ｄ）。加えて、シルデナフィルは、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも、ＴＱ内で探したＡＰＰ／ＰＳ１マウスの能力を改善した（図３Ｄ）。シルデナフィル処置されたＷＴマウスは、プラットフォームが前日にどこにあったかを記憶しており、媒体処置されたＷＴ同腹子が費やした時間とおよそ同一の時間を費やした。さらに、恐怖条件付け及びＲＡＷＭを用いた実験と一致するように、３ｍｇ／ｋｇは、参照記憶への持続された有益な効果を産生する阻害剤の最小用量であり（図６２Ｅ、Ｆ）、２週間は、シルデナフィル送達の最小限の効果的日数であった（図６２Ｇ、Ｈ）。プローブ試験後に行われた可視のプラットフォーム試験は、４つの群間のプラットフォームに達するまでの時間、及び泳ぐ速度においていずれの差異も明らかにはしなかった（図１１）。
【０５２１】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの行動能力への、シルデナフィルの顕著な効果の根底にある機能的変化の解析に深さを加えるため、我々は、同一マウスからの海馬中のシナプス機能を検討した。３ヶ月齢の二重遺伝子組換えマウスとは対照的に、８〜９ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１動物は、シナプス強度の減少を表す（Ｔｒｉｎｃｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるシルデナフィルを用いた先の処置は、８〜９ヶ月齢のマウスからのスライスにおいて、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１のスライスへのよりも、ｆＥＰＳＰ勾配のより大きな値を産生した（図４Ａ）。一方で、シルデナフィルは、ＷＴ同腹子における応答を変化させなかった。また、ＢＳＴに対して試験されたＣＡ３−ＣＡ１結合を、増強を経験するそれらの能力に対しても評価した。シルデナフィルを用いて先に処置された、ＡＰＰ／ＰＳ１から得られたスライスから記録されたＬＴＰ値は、シルデナフィル処置されたＷＴ同腹子と同様であり、媒体処置されたＡＰＰ／ＰＳ１同腹子からのものをはるかに越えた（図４Ｂ、Ｃ）。８〜９ヶ月のＷＴマウスは、シルデナフィルを用いて処置されようと、又は媒体を用いて処置されようと、同様量の増強を表した（図４Ｃ）。テタヌスの不在の時、いずれの差異も、マウスの４つの群のベースライン伝達において、示されなかった（図４Ｂ、Ｃ）。３ｍｇ／ｋｇは、ＢＳＴ及びＬＴＰへの持続された有益な効果を産生する阻害剤の最小用量であり（図６２Ａ、Ｂ）、２週間は、これらの現象を救うための、シルデナフィル送達の最小限の効果的日数であった（図６３Ｃ、Ｄ）。これらのデータは、シルデナフィル処置の一過程が、長期にわたってシナプス機能障害からＡＰＰ／ＰＳ１マウスを保護することを示唆する。
【０５２２】
追加的一連の実験において、我々はまた、６ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスからの海馬のスライスのシルデナフィルを用いた処置が、シナプス機能の即時の改善を産生するかどうかを検討した。化合物によって寛解されなかったＢＳＴとは対照的に、ＬＴＰは、５００ｎＭのシルデナフィルを用いて通常のレベルに達した（図６４Ａ、Ｂ）。したがって、いったんシナプス機能の障害が樹立されると、ＰＤＥ５阻害は、シナプス可塑性の欠損にすぐに反作用し得るが、基底シナプス機能の欠損には反作用し得ない。
【０５２３】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＣＲＥＢリン酸化及びＡβレベルへのシルデナフィルの効果シルデナフィルの作用の持続時間が比較的短いことから、ＰＤＥ５阻害剤の直接的効果は、その長期効果の原因ではあり得ない。ＣＲＥＢは、その発現が長期記憶の形成及び安定化をもたらす遺伝子の制御に関係している。ＣＲＥＢリン酸化は、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、ＣＲＥ依存性遺伝子発現を刺激するＣＲＥＢの能力に必要とされる（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。また、Ａβ上昇は、記憶分子ＣＲＥＢのリン酸化におけるテタヌス誘導性増加を遮断することでも知られている（Ｐｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。したがって、我々は、シルデナフィル処置及び媒体処置された遺伝子組換えマウスならびにＷＴマウスにおける、ＣＲＥＢリン酸化のレベルを測定した。電気生理学的実験で説明されるように海馬のスライスを処置し、処置後６０分固定し、Ｓｅｒ−１３３で抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体を用いて染色し、共焦点顕微鏡上で見た。我々は、テタヌス後、対照のテタヌス刺激されていないスライス（図５Ａ、Ｂ）と比較して、ＷＴマウスのＣＡ１細胞体領域における免疫蛍光強度の増加を表す先の知見を確認した（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｐｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＡＰＰ／ＰＳ１動物は、テタヌス後、ＣＡ１リン酸化ＣＲＥＢ免疫蛍光の生理的増加を有さなかった（図５Ａ、Ｂ）。しかしながら、シルデナフィルは、二重遺伝子組換えのテタヌスされたスライスにおける通常のリン酸化ＣＲＥＢ増加を回復させた（図５Ａ、Ｂ）。シルデナフィルは、ＷＴ動物における免疫蛍光のテタヌス誘導性増加に影響しなかった（図５Ａ、Ｂ）。
【０５２４】
我々は、３ヶ月の年齢で３ｍｇ／ｋｇ／日のシルデナフィル又は媒体を注射され、次いで９〜１２週間にわたって処置なしで放置されたマウスを調査したとき、同様の結果を得た。より若い動物と同様に、我々は、テタヌス刺激されていない対照スライスと比較して、テタヌス後、ＷＴマウスのＣＡ１細胞体領域における免疫蛍光強度の増加を見出した（図５Ｃ）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、テタヌス後、リン酸化ＣＲＥＢの生理的増加を明らかにしなかったが、シルデナフィルを用いた先の処置は、それを回復させた（図５Ｃ）。なお、リン酸化ＣＲＥＢ免疫蛍光は、テタヌスの刺激と共に、シルデナフィル処置されたＷＴマウスからのスライスにおいては変わらなかった（図５Ｃ）。したがって、シナプス生理機能及び行動における長期改善の根本において、Ｓｃｈａｆｆｅｒ側枝ＣＡ１結合のテタヌスの刺激に続く、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＲＥＢリン酸化の増加の回復が存在する。
【０５２５】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＣＲＥＢリン酸化の長期にわたる改善の根底にあるものは何であろうか？この質問に取り組むために、Ａβがリン酸化ＣＲＥＢを下方制御することから、我々は、シルデナフィルがＡβレベルに影響するかどうかを検討した。大脳皮の抽出物のＥＬＩＳＡは、３ヶ月及び７〜１０ヶ月で、３ｍｇ／ｋｇならびに６ｍｇ／ｋｇのシルデナフィルを用いた３週間の処置後の、シルデナフィル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるヒトＡβ40及びＡβ42レベルの減少を明らかにした（図６５Ａ，Ｂ）。１．５ｍｇ／ｋｇを用いた処置は、次に、Ａβレベルを低下させなかった。最後に、我々が、異なる期間で３ｍｇ／ｋｇのシルデナフィルで処置された動物におけるＡβレベルを決定したとき、Ａβレベルは、処置後、即時に殺処理された動物（図６５Ｃ）及び３ヶ月の年齢で３ｍｇ／ｋｇ／日のシルデナフィルを注射され、次いで９〜１２週間にわたって処置なしで放置された動物（図６５Ｄ）の両方において、２週間後にすでに減少していた。したがって、Ａβレベルの減少は、シルデナフィルによる、リン酸化ＣＲＥＢへの持続された有益な効果の根拠である。
【０５２６】
考察
【０５２７】
本研究は、ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィルでの処置が、アミロイド沈着の遺伝子組換えマウスモデルにおけるシナプス欠損及び記憶欠損を救うことを示す。また、シルデナフィルは、転写因子のリン酸化及び記憶分子ＣＲＥＢの増加を回復させる。加えて、阻害剤は、高レベルのＡβの、シナプス機能、記憶、及びＣＲＥＢリン酸化への負の効果に、即時的のみならず、薬物投与を超える長期にわたって反作用する。最後に、シルデナフィルは、Ａβ40及びＡβ42レベルの即時的ならびに長期にわたる減少を引き起こす。これらの知見は、ＰＤＥ５阻害剤が、Ａβ合成／分解を調節する遺伝子の転写を制御することを通して、即時的のみならず、長期間にわたって、ＡβによるＣＲＥＢリン酸化における欠損に反作用するというモデルを支持する。
【０５２８】
本研究の関連する知見は、ＰＤＥ５阻害に続く、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの記憶機能障害の回復である。これらの結果は、ＮＯ模倣分子が、スコポラミン（Ｔｈａｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、又は前脳コリン作動性枯渇（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）によって引き起こされる認知機能障害を逆転できるという観察と一致しており、ＮＯ／ｃＧＭＰシグナル伝達系を刺激することが、認知障害のための新しい、効果的な処置を提供できることを示唆する。記憶への有益な効果に関しては、恐怖学習の訓練、又は空間作業の取得後即座（しかし、恐怖学習の訓練又は空間作業の取得の５分前ではない）に、わずかな時間窓の間のＰＤＥ５活性の阻害が、遺伝子組換え動物の学習を改善することは興味深い。シルデナフィルのインビボ半減期は、げっ歯類において０．４時間である（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）ことを考慮すると、電気ショック、又は空間作業の取得後、最初の２０〜２５分間は時間窓が存在し得、その間は、ＰＤＥ５阻害による改善の影響を受けやすい学習過程である。なお、シルデナフィルの有益な効果が、訓練後それらの注射を用いて観察されたことから、ＰＤＥ５の阻害は、疼痛又は環境の知覚等の能力の態様ではなく、記憶固定機構に作用する。
【０５２９】
本研究で報告された別の発見は、シルデナフィルの、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるシナプス機能障害に対する有益な効果である。この知見は、ＮＯドナー又はｃＧＭＰ類似体の使用を介するｃＧＭＰ増加が、Ａβの外来適用によって誘発される、ＬＴＰの減少及びＣＲＥＢリン酸化の阻害を救うことを表すスライスに関する研究と一致している（Ｐｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。変化したシナプス機能は、ＡＤの認知低下における基本面であることから（Ｍａｓｌｉａｈ，１９９５）、ＡＤにおけるＰＤＥ５阻害剤の使用の利点は、化合物のこのクラスが、記憶喪失に関連し得るシナプス機能障害に結びつけられる疾患の態様に、反作用するであろうことであり得る。
【０５３０】
遺伝子組換えマウスにおけるＰＤＥ５阻害によるＡβレベルの低下は、本研究の別の重要な知見である。この結果は、ＮＯ放出薬物ＮＣＸ−２２１６が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡβ負荷を減少させるという観察と一致する（Ｊａｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。なお、ＮＯＳ２の遺伝子欠失は、ＡＰＰ過剰発現マウスにおけるＡβレベルを増加させる（Ｃｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。興味深いことに、Ａβレベルの低下は、シルデナフィル投与の終了から３〜５ヶ月後に依然として存在する。シルデナフィルが短い半減期を有することを考慮すると、この効果は、Ａβ産生及び／又はＡβクリアランスを制御する遺伝子の発現への作用のためであり得る。ＣＲＥＢは、遺伝子の制御に関係しており、その遺伝子の発現は、新しいシナプス結合の形成を恐らく介する長期記憶の形成及び安定化をもたらす（Ｔｕｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。リン酸化ＣＲＥＢがＣＢＰに結合する場合、それはＣＲＥ依存性遺伝子発現を刺激する。ＣＢＰは、染色質のヒストンＨ３のアセチル化を触媒するアセチルトランスフェラーゼとして働くことによって、基底転写装置との相互作用を促進する活性化補助因子として機能し、記憶関連遺伝子の転写における染色体抑制及び増加の損失を引き起こす。ヒストンアセチル化は自己永続的であることができ、機能的に安定したクロマチン状態を作り、したがって特異的遺伝子発現に慢性変化を作る（Ｂａｔｔａｇｌｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｌｕｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｔｕｒｎｅｒ，２００２）。理論にとらわれることなく、シルデナフィルの持続性の有益な効果は、ヒストンアセチル化中の永久増加に起因する。これと一致するように、我々は近年、通常、ＣＢＰの逆効果を伴う酵素の群に起因するヒストン脱アセチル化の阻害が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの通常のＬＴＰ及び記憶を回復させることを示した（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｙ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｓｏｃ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．５４８．５４５，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，２００７）。
【０５３１】
シルデナフィルの有益な効果は、ｃＡＭＰレベルを上昇させるＰＤＥ４阻害剤であるロリプラムの効果の多くの態様に類似し、したがって、本研究のパラダイムと同一の実験パラダイムでそれを使用した実験において、ＰＫＡを介してＣＲＥＢを活性化させる（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ｂ）。なお、カフェイン、パパベリン、及びイソブチルメチルキサンチン等の幾つかの非特異的ＰＤＥ阻害剤が、恐らくアデノシン受容体に拮抗することによって、又は細胞内Ｃａ２＋貯蔵に作用することによって、実験動物における幾つかの行動能力を改善することが報告されている（Ｖｉｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｕｎｎ，１９８１、Ｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，１９９０、Ｎｅｈｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。しかし、ＩＣ３５４、選択的である阻害剤のＰＤＥ１、シルデナフィルによって阻害できる別のＰＤＥ（選択性比率１８０）（Ｄａｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）は、二重遺伝子組換えマウスからのスライス中の通常のＬＴＰを回復させなかったにもかかわらず、タダラフィル、非常に選択的であるＰＤＥ５阻害剤は、シナプス機能障害へのシルデナフィルの効果を再現したため、シルデナフィルの有益な効果は、ＰＤＥ５阻害に特異的であり得る。なお、投与後即時に空間作業記憶を改善しないロリプラムとは異なり、シルデナフィルは、即時に空間作業記憶を増大させた。最も重要なことに、シルデナフィルの効果及びロリプラムの効果との間の著しい差異は、前者がＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中のＡβレベルを減少させるにもかかわらず、後者はＡβ負荷に影響を与えないことである。
【０５３２】
治療薬として薬物の新しいクラスを提唱するとき、それらの副作用を考慮することは必須である。これは、ＰＤＥ４阻害剤が記憶を増強させることの失敗を決定し得る。ＰＤＥ５阻害剤を使用する利点は、それらがすでに長年利用されてきたため、ＦＤＡが近年、タダラフィルの日常使用を許可したように、それらの副作用が知られていることである。幾つかのケースで、ＰＤＥ５阻害剤の摂取に続き、持続勃起症が発生することが報告されている。しかしながら、持続勃起症の原因についての現在の概論は、それが、ＮＯ経路の下方制御に続く、ＰＤＥ５機能の調節不全のためであり（Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、Ａβ増加によっても引き起こされる現象である（Ｐｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）ということである−それゆえに、ＰＤＥ５阻害剤は、持続勃起症に対する治療薬として提唱されている（Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｒａｊｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＰＤＥ５阻害剤の追加の有害事象は、頭痛、紅潮、胃腸障害、及び経鼻鬱血又は鼻炎等の軽度血管拡張作用を含み、ＡＤ薬剤としてＰＤＥ５阻害剤を提唱することにおける注意は当然であり得る。しかしながら、Ａβは中枢神経系に第１に蓄積するが、Ａβはまた、異常なＡβ産生によって特徴づけられるＡＤ及び他の神経障害（Ｂａｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に影響される患者の血液中にも存在する。  興味深いことに、全身Ａβは、脳血管系中のみだけでなく、血管系の他の区域中でも血管収縮を増強する（Ｐａｓｑｕｉｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｙｓ，１９９８、Ｋｈａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｋａｌａｒｉａ，２００３、Ｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｇｅｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。なお、高血圧症は、大抵ＡＤに関連する（Ｐａｓｑｕｉｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｙｓ，１９９８、Ｇｅｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。したがって、ＰＤＥ５阻害剤が、記憶喪失及びＡβ産生のみではなく、ＡＤ患者に大抵影響を与える血管症状にも反作用できると考えるのは、非常に魅力的である。
【０５３３】
我々の知見は、ＰＤＥ５の阻害が、ＡＤにおける認知欠損に対して有益であり得るということを強力に支持する。しかしながら、シルデナフィルを含む既存の市販されている阻害剤のいずれも、中枢神経系に最適化されていない。良好な中枢神経系薬物は、高い特異性及び効力、ならびに良好な薬物動態、生物学的利用率、及び中枢神経系透過を有するべきであり、かつ最後に安全であるべきである。例えば、シルデナフィルがＢＢＢを通過することが報告されており（ＦＤＡ，１９９８）、６．０ｎＭのＰＤＥ５に対してＩＣ５０、及びげっ歯類（ヒトにおいて約４時間）において、０．４時間のインビボ半減期を有する（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｄａｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ）。しかしながら、脳を除く心筋及び血管中で発現され、軽度血管拡張効果をもたらすことができるそのＰＤＥ１の選択性比率は１８０であり、網膜中のみで発現され、視覚を過渡的に妨げることができるＰＤＥ６の選択性比率は、１２と等しい（Ｃｏｒｂｉｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，２００２、Ｄａｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ）。ＢＢＢを通過するバルデナフィル能力の証拠は、間接的であり（Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＰＤＥ５に対するそのＩＣ５０が０．１７ｎＭであっても、ＰＤＥ６の選択性比率は３．５と等しい（Ｓａｅｎｚ  ｄｅ  Ｔｅｊａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。理論にとらわれることなく、タダラフィルはＢＢＢを通過し得ない。したがって、我々の知見は、中枢神経系のために最適化され、ＡＤ患者に使用することができる新規ＰＤＥ５阻害剤を開発することを支持する。
【０５３４】
補足的考察
【０５３５】
ＡＭＰＡ受容体電流及びＮＭＤＡ受容体電流は、３ヶ月齢の二重遺伝子組換えマウスにおいて変化しなかった。これらの知見と一致するように、基底シナプス伝達は、同様の年齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて通常であった。文献で公開されたデータの入念な解析は、ＡＭＰＡ受容体が疾患の最も早期段階では影響されないことを示唆する。例えば、この年齢でＬＴＰはすでに損なわれいたにもかかわらず、Ｃｈａｎｇらは、７〜８ヶ月齢の２ｘＫＩマウスにおける、ＡＭＰＡ受容体電流及び基底シナプス伝達の機能障害を見極めることができなかった（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらの知見と一致するように、ＡＭＰＡ受容体機能を干渉したＡβ42の濃度は非常に高かった（２μＭ）（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。なお、微小ＥＰＳＣ振幅は、器官培養型海馬のスライス中でＡＰＰを過剰発現する神経細胞中で変化しなかった（Ｋａｍｅｎｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。同様の考慮をＮＭＤＡ受容体に適用することができる。Ａβの濃度は、ＡＤにおけるＮＭＤＡ受容体の関与を示すマニュスクリプト中で高かった（１μＭ）（Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。加えて、細胞外Ａβは、ＮＭＤＡ受容体への効果を見極めるために、長時間にわたって適用された（Ｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。したがって、ＡＭＰＡ受容体及びＮＭＤＡ受容体は、ＡＤ病態の最も早期段階では影響されない。むしろ、我々のデータは、ＡＭＰＡ受容体及びＮＭＤＡ受容体の疾患への関与前に、ＬＴＰ内因性機構が影響されることを示唆する。
【０５３６】
ＮＯ−カスケードに作用する薬物は、認知能力に影響し得る血管効果を有する。したがって、シルデナフィルの有益な効果についての代替的説明は、神経細胞内効果に代わり、血管効果を介して阻害剤が働くことである。これは、ＰＤＥ５の阻害が、ＰＤＥ５阻害剤に直接的に暴露されたスライスにおいて通常のＬＴＰを回復させたため、起こりそうにない。なお、ｃＡＭＰ類似体は、ｃＧＭＰ類似体よりも頭頂葉皮質中の脳細動脈のさらなる拡大を誘発することを表すが（Ｐａｔｅｒｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（しかし、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰではない）のみしか、げっ歯類の記憶能力を改善しなく、血管機構がｃＧＭＰ効果の原因ではあり得ないことを示唆する。最も重要なことに、ＢＢＢを通過しないタダラフィルは、シルデナフィルの行動的影響を再現しなかった。
【０５３７】
われわれの知見は、ＮＯカスケードの上方制御が、中枢神経系内のＡβ誘発性障害への保護効果を有することを表す報告と一致している（ＭｃＣａｒｔｙ，１９９８、Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｗｉｒｔｚ−Ｂｒｕｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｇｉｏｖａｎｎｉ，２０００）。例えば、ＰＣ１２細胞、交感神経細胞、及び海馬の神経細胞で行われた研究は、ＮＯ発生装置Ｓ−ニトロソペニシラミンを用いた処置が、アポトーシス促進性の因子カスパーゼ２を阻害するニトロシル化を介する神経保護的作用を有することを表している（Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ａβは、ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達の低下（ＭｃＣａｒｔｙ，１９９８）、ＮＯＳに対するＮＡＤＰＨ有効性の減算（Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、及びセリンスレオニンキナーゼＡｋｔのリン酸化の阻害（Ｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を含む異なる機構によって、ＮＯ産生を損なうことが見出されている。ＡＤ患者の上側頭葉皮質は、可溶性グアニリルシクラーゼ活性の減少を表す（Ｂｏｎｋａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。可溶性グアニリルシクラーゼは、脳アストログリア細胞のＡβ暴露に続き、低下した（Ｂａｌｔｒｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＰＤＥ活性の増加は、単離されたた血液細胞及び培養されたミクログリアの双方で見出され、ＰＤＥ５阻害は、通常の血管活性を回復させ、Ａβによってもたらされる炎症反応を遮断する（Ｐａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。しかしながら、また、ＮＯは、高量で産生される場合、神経病態及び細胞死の主要な薬剤として見られる。ＮＯの高量は、Ａβ誘発性細胞死における酸化ストレス及びニトロソ化ストレスの原因である有意な量のペルオキシナイトライトの産生につながる（ＭｃＣａｎｎ，１９９７、Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらの逆の知見は、ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）の誘導型による高量のガスの制御されない産生が、ペルオキシナイトライトの産生を介する酸化的及びニトロソ化ストレスを促進し得るにもかかわらず、神経細胞アイソフォーム及び内皮アイソフォーム、ｎ−ＮＯＳ及びｅ−ＮＯＳの双方を含むＮＯＳの構成型による、低量のＮＯの放出が、シナプス可塑性及び学習を促進するという観察を伴う我々の知見と調和し得る（ＭｃＣａｎｎ，１９９７、Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらの発見を活用する薬物研究の現状は、ＮＯカスケードを上方制御し、したがって神経保護を誘発する方法を見出すこと、ならびに神経病態を制限するため、ペルオキシナイトライト毒性作用を遮断する方法を見出すことの双方に集中している（Ｃｏｎｔｅｓｔａｂｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＰＤＥ５に介入する我々の本治療方針は、ＮＯ産生の下流レベルで、ステップに集中することによって、ＮＯ産生をバイパスする利点を提供する。
実施例１１についての参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２−１】
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【図６２−２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５−１】
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【図６５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2012513464.tif 000214
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