(57)【要約】  本発明は、少なくとも第６継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、プリオンタンパク質ＰｒＰを発現し、前記ＰｒＰの病原性形態であるＰｒＰｓｃの複製または増殖を支持することが可能なＭｏｖＳ６株に由来する細胞クローンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリオンタンパク質ＰｒＰを発現し、前記ＰｒＰの病原性形態であるＰｒＰｓｃの複製または増殖を支持すること可能なＭｏｖＳ６株に由来する細胞クローンであって、少なくとも第６継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、細胞クローン。
【請求項２】
少なくとも第６継代から第１００継代までの期間にわたって非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞クローン。
【請求項３】
少なくとも第７継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞クローン。
【請求項４】
少なくとも第８継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞クローン。
【請求項５】
少なくとも第１０継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞クローン。
【請求項６】
少なくとも第１４継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞クローン。
【請求項７】
少なくとも第２２継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞クローン。
【請求項８】
少なくとも第２３継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞クローン。
【請求項９】
少なくとも第４７継代まで非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞クローン。
【請求項１０】
前記細胞クローンの細胞溶解産物または培養上清が、感染後６週間目から、１００万細胞当たり３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０またはそれ以上、好ましくは１００万細胞当たり４  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０またはそれ以上、好ましくは１００万細胞当たり６  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０またはそれ以上、好ましくは１００万細胞当たり７  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０またはそれ以上の感染マーカー力価を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞クローン。
【請求項１１】
２００８年２月２２日に受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３９２２の下でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅｓ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託された、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞クローン。
【請求項１２】
試料中の、そのマーカーが病原性立体配座のタンパク質である非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）の感染力の検出および／または力価測定のためのインビトロ法であって、
ｉ）前記試料を請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞クローンと接触させること、
ｉｉ）前記ＮＣＴＡの複製によって前記試料中に存在するＮＣＴＡの量を増幅するために前記細胞クローンを培養すること、
ｉｉｉ）試料中の病原性タンパク質および／またはＮＣＴＡの存在および／または量を測定すること、
から成る工程を含み、工程ｉｉ）の培養を１またはそれ以上の継代にわたって実施する方法。
【請求項１３】
工程ｉｉｉ）が、以下の工程：
ａ）工程ｉｉ）から増幅されたＮＣＴＡを病原性タンパク質および／またはＮＣＴＡに対する基質のソースと接触させること、
ｂ）非病原性配座異性体の病原性配座異性体への形質転換および／またはＮＣＴＡの増幅を可能にする反応培地をインキュベートすること、
ｃ）工程ｉ）またはｉｉ）の間に場合により形成される凝集体を分解させること、
ｄ）試料中の病原性タンパク質および／またはＮＣＴＡの存在および／または量を測定すること
を含み、工程（ａ）〜（ｃ）は、工程（ｄ）の前に少なくとも２回反復される操作サイクルを構成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＣＴＡによって汚染されている可能性がある生物学的製剤または装置の入手工程または処理工程を評価する、および／または検査するためのインビトロ法であって、前記工程の前（Ａ）または後（Ｂ）に、前記生物学的製剤または装置に請求項１２または１３のいずれか一項に記載の力価測定法を適用し、得られた２つの測定値（Ａ）と（Ｂ）を比較する方法。
【請求項１５】
生物学的製剤または装置の除染の手順を評価する、および／または検査するためのインビトロ法であって、前記手順の前（Ａ）または後（Ｂ）に、前記生物学的製剤または装置に請求項１２または１３のいずれか一項に記載の力価測定法を適用し、得られた２つの測定値（Ａ）と（Ｂ）を比較する方法。
【請求項１６】
感染生物学的製剤の感染力を変化させることができる化合物を評価するためのインビトロ法であって、評価する化合物の存在下（Ａ）および不在下で（Ｂ）、前記感染生物学的製剤に請求項１２または１３のいずれか一項に記載の力価測定法を適用し、得られた２つの測定値（Ａ）と（Ｂ）を比較する方法。
【請求項１７】
ヒトまたは非ヒト動物被験者における伝染性海綿状脳症の診断のためのインビトロ法であって、前記被験者の生物学的試料中で、請求項１２または１３のいずれか一項で定義される方法によって病原性立体配座のタンパク質である非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）の存在を検出することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオンタンパク質ＰｒＰを発現し、前記ＰｒＰの病原性形態であるＰｒＰｓｃの複製または増殖を支持することが可能なＭｏｖＳ６株に由来する細胞クローン、ならびにその適用、特に生物学的製剤の入手工程もしくは処理工程の有効性をインビトロで評価する、および／もしくは検査するための方法、または「非通常型伝染性因子」（ＮＣＴＡ）に関連する感染力の調節活性を有する化合物を評価するもしくはスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の変性を特徴とする遺伝性または後天性疾患群に属する。ヒトにおける最も一般的な形態はクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）であるが、ＴＳＥは多くの哺乳動物においても存在する（特にヒツジのスクレイピーおよびウシ海綿状脳症）。これらの疾患の病原因子は、「非通常型伝染性因子」（ＮＣＴＡ）のカテゴリーに分類される。疾患の特徴は、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）と呼ばれる細胞外タンパク質の存在であり、このタンパク質は、疾患の過程で、プロテイナーゼＫのようなプロテアーゼに抵抗性であり、中枢神経系に蓄積する不溶性形態へと変換される。ＰｒＰｓｃと呼ばれるこの病原性異常形態のＰｒＰは、感染力を失わずに共精製され、その蓄積は組織学的病変の出現に先行する。ＰｒＰｓｃはプリオンタンパク質Ｐｒｐの立体配座の変化から生じる。ＰｒＰをコードする遺伝子の発現の修飾またはその翻訳の変化は証明されていない（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２；３１：１２２７７−８８）。
【０００３】
現在入手可能なデータは、ＴＳＥの原因となる伝染性因子が血液製剤中に感染性形態で存在することを立証できない（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．；３８（４  Ｓｕｐｐｌ  ９）：２−６）。
【０００４】
しかし、この不確実さが、一部にはおそらく血液中での非常に低い濃度から、また一部には臨床徴候の発現に先行する、これらの疾患の臨床的無症候性の特徴を有する非常に長期間の臨床的潜伏期間から生じる可能性がないとは言い切れない。
【０００５】
さらに、ＮＣＴＡの例外的な抵抗性は、寒冷沈降性血漿タンパク質（第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子等）のような血液製剤のウイルス負荷を低減するための有効性が立証されている、Ｔｗｅｅｎ−ＴＮＢＰ溶媒／界面活性剤処理などの古典的に使用されてきた不活性工程に頼ることを不可能にする。血漿凝固タンパク質のような生物学的製剤の入手または処理は、治療用途のためにウイルスの除去／不活性化工程を組み込まなければならないので、血液由来医薬品の製薬産業は、今日、血液由来製品によるＣＪＤの変異型の伝播の理論的危険性を評価することを目指している。
【０００６】
現在、古典的に使用されてきたＮＣＴＡに関連する感染力価の測定方法は、ＮＣＴＡを入れた試験物質の種々の希釈物を大脳内注入することによる、ゴールデンハムスターにおけるインビボでの力価測定法を使用する。実施した希釈に対応する種々の群の中で罹患した動物の数に応じて、未処置標準品に基づいて感染力価を計算し、与えられた処理工程の減少率を決定することができる。しかし、この方法は長い期間を要し（約１年間）、費用がかかり、プリオン除去に対する効果を迅速に知る必要がある工業規模での開発とは両立しがたいという難点を有する。
【０００７】
加えて、力価測定法の感受性を高めるためにしばしば感染因子の濃縮工程を導入する必要がある。ＴＳＥの原因となる感染因子の濃縮手順はすべて、現在のところＰｒＰｓｃの精製を含む。
【０００８】
ＴＳＥの感染因子をインビトロで力価測定するための他の方法も提案された。
【０００９】
ウエスタンブロット法（Ｍａｃ  Ｇｒｅｇｏｒ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｊ．Ｍｅｄｅｃｉｎｅ  ２００１；１１，３−１４）またはＥＬＩＳＡによるＰｒＰｓｃの検出技術は、一般に、病原性タンパク質（ＰｒＰｓｃ）を正常タンパク質（ＰｒＰ）から識別するためにプロテイナーゼＫによる分析試料の事前消化またはカオトロピック剤による変性を必要とする。
【００１０】
ＰｒＰを認識しないＰｒＰｓｃ特異的抗体の使用に基づくもう１つの力価測定方法が最近開発された（Ｋｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７  Ｎｏｖ  ６，３９０（６６５５）：７４−７）。
【００１１】
米国特許第６，１５０，５８３号は、プリオンタンパク質の立体配座に従って、プリオンタンパク質の表面に露出されているかまたは露出されていない異種エピトープによって標識されたＰｒＰを発現するトランスジェニック動物の作製を述べる。
【００１２】
Ｓａｂｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ；２００１，４１１，８１０−３）に記載されている、「ＰＭＣＡ」（異常折りたたみタンパク質反復増幅法、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と呼ばれる方法は、非病原性形態のＮＣＴＡタンパク質を病原性形態に変換するために、汚染動物からの組織または体液に由来する病原性形態を非病原性形態のＮＣＴＡタンパク質と接触させることを企図する。ＰＭＣＡの方法は、まだ開発中であるが、少なくともバイオアッセイと同程度の感受性があることが明らかになっている。それにもかからわず、前記方法は検出されたＰｒＰｓｃの感染力に関する証拠を提供せず、また血漿マトリックスに関して実施するのは難しいことが判明している。さらに、再現性の不確実さおよび偽陽性結果が報告されている。
【００１３】
国際公開広報第ＷＯ２００５／０２２１４８号は、ＮＣＴＡの複製を支持する安定なトランスジェニック細胞を生物学的製剤と接触させ、次にＮＣＴＡの複製によって生物学的製剤中に存在するＮＣＴＡの量を増幅するためにこれらの細胞を１またはそれ以上の継代にわたって培養することによる、「ＴＣＩＡ」（組織培養感染性試験、ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ）と称される、生物学的製剤中のＮＣＴＡのインビトロでの力価測定法を述べる。より詳細には、ＴＣＩＡは、感染ホモジネート（例えば、スクレイピー１２７−Ｓ株）の連続希釈物を、１希釈率につき５ウエルの割合で、マルチウエルプラークの培養細胞と接触させることから成る。その後、８〜１０継代後にＰｒＰｓｃ（感染力の切り離せないマーカー）の検出によって陽性ウエルの数を評価し、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法によって力価を測定する。同じ感染試料（脳のホモジネート）から得られた力価の再現性は、このようなアプローチの実現可能性を示す。しかし、このインビトロ力価測定法において使用された細胞株、ＭｏｖＳ６株は、細胞の不均質な集団で構成される。最終的に、この不均質性は株の安定性を変化させ、従ってＴＣＩＡ法の再現性を変化させる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
それゆえ、ＴＣＩＡ法の経時的な安定性を改善するためにＭｏｖＳ６株に由来する１またはそれ以上の安定なクローンを得ることが現在も強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ここで、プリオンタンパク質ＰｒＰを発現し、前記ＰｒＰの病原性形態であるＰｒＰｓｃの複製または増殖を支持することが可能なＭｏｖＳ６株に由来する新規細胞クローンであって、少なくとも第６継代まで、好ましくは少なくとも第６継代から第１００継代までの期間にわたってＰｒＰｓｃ産生の安定性を有することを特徴とする、細胞クローンを提供する。
【００１６】
発明者は、実際に、感染に強く応答し、ＰｒＰｓｃの産生の安定性を示す、すなわちＰｒＰｓｃ産生のレベルを有意に変化させないクローンを得ることが可能であることを明らかにした。
【００１７】
好ましくは、このクローンの感染培養物に由来する細胞溶解産物は、感染後６週間目から、１００万細胞当たり３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０またはそれ以上、好ましくは１００万細胞当たり４  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０またはそれ以上、好ましくは１００万細胞当たり６    ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０またはそれ以上、好ましくは１００万細胞当たり７  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０またはそれ以上の感染マーカー力価を有する。
【００１８】
本発明の１つの特定実施形態では、感染培養物の細胞溶解産物は、６週間目から３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／１００万細胞以上、好ましくは４．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０〜６  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／１００万細胞の感染マーカー力価を有する。
【００１９】
本発明の１つの特定実施形態では、感染培養物の細胞溶解産物は、６週間目から３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／１００万細胞以上、好ましくは４．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０〜５．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／１００万細胞の感染マーカー力価を有する。
もう１つの実施形態では、このクローンの感染培養物に由来する細胞溶解産物は、感染後６週間目から、２  ｌｏｇ１０ウエスタンブロット単位／１００万細胞（ｕＷＢ／１００万細胞）またはそれ以上、好ましくは３  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／１００万細胞またはそれ以上の感染マーカー力価を有する。
【００２０】
特に好ましい態様では、本発明の細胞クローンは、以下で開示する実験結果においてＭｏｖＳ６−４と称され、２００８年２月２２日に受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３９２２の下で国立微生物培養収集所（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅｓ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託された。
【００２１】
本発明はまた、試料中の、そのマーカーが病原性立体配座のタンパク質である非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）の感染力の検出および／または力価測定のためのインビトロ法であって、
ｉ）前記試料を上述した細胞クローンと接触させること、
ｉｉ）前記ＮＣＴＡの複製によって前記試料中に存在するＮＣＴＡの量を増幅するために前記細胞クローンを培養すること、
ｉｉｉ）試料中のＮＣＴＡの存在および／または量を測定すること、
から成る工程を含み、工程ｉｉ）の培養を１またはそれ以上の継代にわたって実施する方法を対象とする。
【００２２】
好都合には、工程ｉｉｉ）は、以下の工程：
ａ）工程ｉｉ）から増幅されたＮＣＴＡをＰｒＰおよび／またはＮＣＴＡに対する基質のソースと接触させること、
ｂ）非病原性配座異性体の病原性配座異性体への形質転換および／またはＮＣＴＡの増幅を可能にする反応培地をインキュベートすること、
ｃ）工程ｉ）またはｉｉ）の間に場合により形成される凝集体を分解させること、
ｄ）試料中のＮＣＴＡの存在および／または量を測定すること
を含み、工程（ａ）〜（ｃ）は、工程（ｄ）の前に少なくとも２回反復される操作サイクルを構成する。
【００２３】
本発明のもう１つの目的は、ＮＣＴＡによって汚染されている可能性がある生物学的製剤または装置の入手工程または処理工程を評価する、および／または検査するためのインビトロ法であって、前記工程の前（Ａ）または後（Ｂ）に、前記生物学的製剤または装置に上記で定義した力価測定法を適用し、得られた２つの測定値（Ａ）と（Ｂ）を比較する方法である。
【００２４】
本発明はまた、生物学的製剤または装置の除染の手順を評価する、および／または検査するためのインビトロ法であって、前記手順の前（Ａ）または後（Ｂ）に、前記生物学的製剤または装置に上記で定義した力価測定法を適用し、得られた２つの測定値（Ａ）と（Ｂ）を比較する方法を対象とする。
【００２５】
さらに本発明のもう１つの目的は、感染生物学的製剤の感染力を抑制することができる化合物を評価するためのインビトロ法であって、評価する化合物の存在下（Ａ）および不在下で（Ｂ）、前記感染生物学的製剤に上記で定義した力価測定法を適用し、得られた２つの測定値（Ａ）と（Ｂ）を比較する方法である。
【００２６】
さらに本発明のもう１つの目的は、ヒトまたは非ヒト動物被験者における伝染性海綿状脳症の診断のためのインビトロ法であって、前記被験者の生物学的試料中で、上記で定義した方法によって病原性立体配座のタンパク質である非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）の存在を検出することを含む方法である。
【００２７】
本発明の細胞クローンは、サイトゾル（溶解産物）中および感染培養物の上清中で検出されたことから即時に入手可能である、プリオン型の標準化された合成感染性物質の、経時的に安定な生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図面は、１３のクローン（１から１３の番号を付している）の細胞溶解産物中のＰｒＰｓｃの検出とＭＰ：分子量指標を示すオートラジオグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
「ＭｏｖＳ６株」とは、ヒツジＰｒＰ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスの後根神経節からの細胞の単離に由来する、プリオンタンパク質ＰｒＰを発現する細胞株を意味する。ＭｏｖＳ６細胞株が起源とするヒツジＰｒＰ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ヒツジＰｒＰ遺伝子を過剰発現するｔｇ３０１マウス（Ｖｉｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｖｏｌ．７５，ｐ５９７７−５９８４）と、ＳＶ４０のＴ抗原（Ｔａｇ）を発現するｐｒｐ０／０マウス（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｂｉｏ  Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．７３：７−１４）の交配から生じる。ＭｏｖＳ６細胞株の作製は、Ａｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｐ．４８２−４９０に記載されている。ＭｏｖＳ６細胞株は、機能特性だけでなく生物学的特性に関しても、細胞の不均質な集団である。実際に、ＭｏｖＳ６株が単離された後根神経節は、種々の細胞集団、特にグリア細胞、様々なタイプのニューロン等が集まっている。
【００３０】
本発明に関して、「ＭｏｖＳ６株に由来する細胞クローン」という表現は、ＭｏｖＳ６株に属する単一親細胞の細胞分裂に由来し、親細胞と同じ遺伝形質を有する娘細胞全体を表す。
【００３１】
クローンの単離は、当業者に公知の技術を用いて、例えば、限界希釈またはフローサイトメトリーを含むがこれらに限定されない技術によって実施できる。
【００３２】
「ＰｒＰプリオンタンパク質」は、一般に、細胞中に天然で存在し、細胞の正常機能に関与する、ホスファチジル糖脂質（ＧＰＩ）によって細胞膜に固定されたシアロ糖タンパク質である。このタンパク質の正常形態、すなわち非病原性形態は、一般にＰｒｐｃと呼ばれる。これは胚における神経系の発生に関わる。成体では、主として脳および脊髄（ニューロンおよびグリア）において発現される。細胞の分化および接着プロセスに関与する。また、抗酸化保護作用およびプログラム細胞死（アポトーシス）に対する保護作用を有すると考えられる。このタンパク質はまた、他のタンパク質の折りたたみにおいても役割を果たすと考えられる。
【００３３】
「ＰｒＰの病原性形態ＰｒＰｓｃ」は、一般に非病原性タンパク質のアイソフォームを指し、プリオン疾患のマーカーである。プリオンタンパク質の物理化学的性質に関連するこの病原性形態は、特に通常の殺菌および滅菌手段（加熱、化学製品、酵素等）に対する高い抵抗性として現れる。病原性プリオンタンパク質はこのようにして自己凝集能力を獲得し、特に脳において、ニューロンの死を引き起こす沈着物を形成し得る。病原性プリオンタンパク質の複製または増殖の原因となる因子は、このタンパク質が「指数関数的」に「増殖または繁殖する」ことができ、それによって健常プリオンタンパク質を病原性プリオンタンパク質へと変化させることから、この病原性プリオンタンパク質自体であると考えられる。ＰｒＰの「病原性」と呼ばれる形態は、それゆえ、その立体配座が感染ヒトまたは非ヒト動物におけるＴＳＥの発現と相関するタンパク質の形態である。
【００３４】
「前記ＰｒＰの病原性形態であるＰｒＰｓｃの複製または増殖を支持することが可能な」とは、ＮＣＴＡの存在下で病原性タンパク質に形質変換される、非病原性プリオンタンパク質から病原性プリオンタンパク質を産生する本発明の細胞クローンの能力を意味する。産生された病原性形態のプリオンタンパク質は、サイトゾル（溶解産物）中または培養上清中で検出される。このサイトゾル中の病原性形態の全部または一部は、細胞溶解産物中で回収することができる。
【００３５】
「ＮＣＴＡによる感染のマーカーの力価」は、接種アッセイの５０％において感染を可能にする試料中の感染力の量によって決定される。感染力の量は、感染マーカー、例えば、ＰｒＰの力価によって視覚化される。感染マーカーの力価は、国際公開広報第ＷＯ０４／０２１７９号に記載されている力価測定法によって測定できる。
【００３６】
感染マーカーの力価はまた、当業者に周知の方法によっても測定され得る。例えば、測定する物質の連続希釈物を、各動物群につき１つの物質希釈物の割合で大脳内に注入する。各動物群における疾患の潜伏期間および罹患動物の数に従って、例えば、好ましくはＫａｒｂｅｒ法またはＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法のような、当業者に公知の統計方法によって感染力価を推定することができる。
【００３７】
「感染のマーカーの力価の安定性」とは、経時的に有意に低下しない、すなわち生産性の有意の損失が測定できない、感染因子（ＰｒＰｓｃ）の生産性を意味する。有意の損失とは、１  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／ｍｌまたはそれ以上の感染因子の生産性の低下である。
【００３８】
「継代」は、一般に、培養容器中の細胞の全部または一部を、新鮮培地を含有する別の容器中で二次培養することである。各々の継代は、細胞集団の実数を確認し、その実数に適した量の基質を細胞集団に供給することを可能にする。
【００３９】
１つの特定実施形態では、本発明の細胞クローンは、少なくとも第６継代まで、好ましくは少なくとも第６継代から第１００継代までの期間にわたって非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）による感染のマーカーの力価の安定性を有することを特徴とする。好ましくは、本発明の細胞クローンは、少なくとも第７継代まで、さらに好ましくは少なくとも第８継代まで、さらに好ましくは少なくとも第９継代まで、さらに好ましくは少なくとも第１０継代まで、さらに好ましくは少なくとも第１１継代まで、さらに好ましくは少なくとも第１２継代まで、さらに好ましくは少なくとも第１３継代まで、さらに好ましくは少なくとも第１４継代まで、さらに好ましくは少なくとも第２２継代まで、さらに好ましくは少なくとも第２３継代まで、さらに好ましくは少なくとも第４５継代まで、さらに好ましくは少なくとも第４６継代まで、さらに好ましくは少なくとも第４７継代まで、さらに好ましくは少なくとも第４８継代まで、さらに好ましくは少なくとも第４９継代まで、さらに好ましくは少なくとも第５０継代まで、ＮＣＴＡによる感染のマーカーの力価の安定性を有する。
【００４０】
「ＴＣＩＤ５０」とは、試験接種物の５０％の感染を引き起こす感染量を意味する。これらの量は、好ましくはＴＣＩＡ法によって測定される。
【００４１】
「ｕＷＢ」（ウエスタンブロット単位）とは、ウエスタンブロット法によって検出できるＰｒＰｓｃの量を意味する。
【００４２】
一般に、ウエスタンブロット法とＴＣＩＡによる力価測定法の間には感受性の相違がある。この相違を考慮すると、２  ｌｏｇ１０ウエスタンブロット単位／１００万細胞（ｕＷＢ／１００万細胞）またはそれ以上、好ましくは３  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／１００万細胞またはそれ以上の感染マーカー力価は、３．５  ｌｏｇ１０またはそれ以上、好ましくは５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌまたはそれ以上の感染力価に等しい。
【００４３】
本発明に関して、「ＮＣＴＡ」という用語は、ヒトにおける家族性もしくは孤発性ＣＪＤ、クールー病または変異型ＣＪＤの原因となるもの、さらには、ヒツジのスクレイピー、ウシもしくはネコ海綿状脳症、シカの慢性消耗病またはミンクの海綿状脳症のような動物における自然発生のＴＳＥの原因となるもの、または最後に、実験動物に実験的に適合させたＴＳＥ株などの、あらゆる非通常型伝染性因子を表す。本明細書において、ＮＣＴＡはまた、「感染因子」という用語によっても表される。
【００４４】
「試料」とは、ＮＣＴＡによって汚染されている可能性がある物質のあらゆるソースを意味する。そのような物質のソースは、例えば、液体、食品、飲料、化粧品または遺伝子操作に由来する製品、ＮＣＴＡの感染力を調節することができる分子であり得るが、これらに限定されない。好ましくは生物学的試料、例えば、生体液または組織または組織抽出物である。そのような組織は、脳組織、脊柱組織または扁桃組織であり得るが、これらに限定されない。試料はまた、成長ホルモンまたは細胞抽出物、例えば下垂体抽出物などの、ヒトまたは動物ソースに由来する組成物であり得る。そのような組成物は、実際にＮＣＴＡによって汚染され得る。生体液の場合、試料は血液、リンパ、尿または乳であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、試料は血液製剤または誘導体、例えば、血漿誘導体もしくは血漿タンパク質濃縮物である。
【００４５】
本発明の細胞クローンは、試料中の、そのマーカーが病原性立体配座のタンパク質である非通常型伝染性因子（ＮＣＴＡ）の感染力の検出および／または力価測定のためのインビトロ法において好都合に使用できる。
【００４６】
試験試料と細胞クローンの接触
本発明の細胞クローンを、ＮＣＴＡに感染している可能性がある試験試料と、または標準物質としてＮＣＴＡを含有する感染性物質、例えば、ヒツジのプリオンのようなＮＣＴＡに感染している動物の脳の抽出物と接触させる。接触は、当業者に公知の方法に従って（国際公開広報第ＷＯ／２００５／０２２１４８または、例えば、Ａｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ．２００４，ｐ．４８２−４９０参照）実施される。
【００４７】
次に、ＮＣＴＡを複製または増殖させるために細胞クローンを１またはそれ以上の継代にわたって培養する。
【００４８】
好都合には、細胞クローンを、生物学的に許容される水溶液中の、ＮＣＴＡに感染している可能性がある試料の少なくとも１つの希釈物、特に複数の希釈物、中でも特に連続希釈物または逐次希釈物と接触させ得る。これらの希釈物は、試験試料中の感染力の測定を精緻化し得る。
【００４９】
結果をより精密に統計解析できるように、クローンの複数の複製物を生物学的製剤の同じ希釈物と接触させ得る。
【００５０】
細胞クローンの培養（工程ｉｉ））
当業者に公知の任意の技術による、潜在的に生物学的製剤に感染した細胞クローンの培養工程は、ＮＣＴＡの複製のため、従って、最初は検出するには不十分であるＮＣＴＡの量を増幅するために必要である。
【００５１】
１つの例示的な実施形態では、ＮＣＴＡの複製によって生物学的試料中に存在するＮＣＴＡの量を増幅するために実施される細胞クローンの培養工程ｉｉ）は、グルタミンおよびウシ胎仔血清（最終濃度５％）を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）＋Ｈａｍ−Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）（４：１）培地において実施される。細胞を５％ＣＯ２下に３７℃でインキュベートする。細胞の一継代（１：１０の再接種率（スプリット比）、すなわち１０細胞中１細胞を培養にもどす）を毎週実施する。
【００５２】
細胞クローンの培養から生じる産物はその病原性形態のＰｒＰを含有し、その量は、生物学的試料が病原性形態のＰｒＰを含有していた場合、生物学的試料中に最初に存在した量を上回る。病原性形態のＰｒＰおよびＮＣＴＡは感染細胞中に蓄積し、その後培地中に放出されるかまたは細胞の表面に露出される。
【００５３】
培養工程ｉｉ）は、１またはそれ以上の継代にわたって、例えば、２〜１０継代、好ましくは４〜１０継代実施することができる。
【００５４】
プリオンまたはＮＣＴＡの存在および／または量の測定（工程ｉｉｉ））
この方法は、プリオンもしくはＮＣＴＡの存在および／もしくは量の測定工程を直接含むか、またはＰｒＰおよび／もしくはＮＣＴＡに対する基質のソースとの接触と組み合わせることができる。
【００５５】
ＰｒＰおよび／またはＮＣＴＡに対する基質のソースとの接触（工程ａ））
本発明の方法の工程ｉｉ）に続いて、細胞培養から生じた産物を非病原性立体配座のＰｒＰおよび／または工程ｉｉ）の間に増幅されたＮＣＴＡに対する基質のソースと接触させることができる。
【００５６】
この基質のソースは、例えば、動物起源の生成物の形態、例えば、健常脳のホモジネート、またはインビトロ培養物に由来する物質の形態で提供され得る。この物質は、例えば、ＭｏｖＳ、Ｎ２Ａ（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），ＰＮＡＳ  ｖｏｌ．１００  ｎｏ．２０  ｐ．１６６６−１１６７１）、Ｒｏｖ、さらには酵母、真菌または細菌などの、しかしこれらに限定されない細胞に由来し得る。インビトロ培養物に由来するこの物質は、細胞外画分（例えば、限定されることなく、上清、エキソソーム）および／または膜画分および／またはサイトゾル画分（例えば、細胞溶解産物）などの様々な細胞画分において発現され得る。この工程の役割は、非病原性形態の自己変換が理論的に不可能であるので、非病原性形態のＰｒＰ（基質の内容物）の病原性形態への変換を伴う、工程ｉｉ）の間に収集されたＰｒＰｓｃおよび／またはＮＣＴＡのインビトロでの増幅を可能にすることである。病原性形態のＰｒＰは、このようにして非病原性形態から病原性形態への変換を開始する。
【００５７】
変換反応の終了時に、変換されなかった非病原性形態は、以下で説明するように、検出システムによって検出されない。
【００５８】
反応培地のインキュベーションおよび／またはＮＣＴＡの増幅（工程ｂ））
好ましい実施形態では、工程ａ）に続いて、工程ｉｉ）の細胞培養の産物をＰｒＰｓｃおよび／またはＮＣＴＡに対する基質のソースと共に、非病原性形態を有するタンパク質の少なくとも一部が病原性形態のタンパク質に変換され、ＮＣＴＡが増幅することを可能にするのに十分な期間インキュベートする。好ましくは、各々のインキュベーション工程は、１０秒間から４時間、好ましくは２０分間から１時間、特に好ましくは３０分間実施される。
【００５９】
増幅培地は、好都合には、非病原性ＰｒＰに対する基質（例えば、増幅する試料の容量を１０倍上回る容量の）を添加した緩衝液（１×ＰＢＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ）で構成される。
【００６０】
凝集体の分離
病原性形態（ＰｒＰｓｃ型）に変換されたタンパク質は、相互におよび病原性形態（ＰｒＰｓｃ）の他の粒子と凝集することがあり、非病原性形態の他のタンパク質の病原性形態への変換を妨げ得る。本発明の方法は反応培地中に存在する「変換病巣（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｆｏｃｉ）」の数が少ないことによって緩慢化し得るので、これは不都合である。
【００６１】
そこで、本発明の方法の工程ｃ）は、病原性形態のＰｒＰの粒子を放出してそれらの粒子が非病原性形態の他のタンパク質を変換することができるように、先の工程において場合により形成される凝集体を分解することから成る。
【００６２】
本発明の方法の工程ｃ）の間に凝集体を分解するために多くの方法が利用できる。例としては、溶媒（例えば、限定されることなく、ドデシル硫酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、グアニジン、尿素、トリフルオロエタノール、希トリフルオロ酢酸、希ギ酸）による処理、ｐＨ、温度、イオン強度もしくは誘電率などの溶液の物理化学的性質の修飾、ならびに超音波処理、レーザー照射、凍結／解凍、オートクレーブインキュベーション、高圧、穏やかなホモジナイゼーション、または他の照射源などの物理的方法が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、超音波処理を利用する。超音波処理は当業者に公知の方法であり、ＰｒＰｓｃの精製方法においてしばしば実施され、凝集体の溶解度を高めることができる。
【００６３】
分解は、工程ｉｉｉ）の接触およびインキュベーション／増幅の間に形成された凝集体の少なくとも一部を分解するのに十分な時間実施される。１回の分解工程を実施する間に必ずしもすべての凝集体が分解されないことがある。その場合は、複数の分解工程によって順次病原性タンパク質の濃度が上昇する。
【００６４】
分解工程の期間は当業者によって容易に決定され、選択される分解方法に依存し得る。好ましくは、分解工程の期間は１秒間から６０分間、より好ましくは５秒間から３０分間、特に５秒間から３０秒間である。
【００６５】
好都合には、工程ａ）〜ｃ）は少なくとも２回、好ましくは５〜１００回、好ましくは２０〜６０回反復される。
【００６６】
２〜１００回反復される工程ｉｉｉ）〜ｖ）のこのサイクルは、一連の増幅サイクルを構成する。一連のサイクルを数回反復することもできる。この場合、新たなシリーズは、最初のＮＣＴＡの試料の代わりに前のシリーズの容量から開始される。
【００６７】
タンパク質の検出
ＰｒＰの病原性タンパク質の検出工程ｄ）は、当業者に公知の任意の方法によって実施できる。ＰｒＰｓｃの特異的検出は、２つのアイソフォームＰｒＰｃとＰｒＰｓｃを分離する最初の工程によって実施できる。この分離は、ＰｒＰｓｃを非病原性タンパク質から識別することを可能にするＰｒＰｓｃの生化学的性質に基づいて、特にＰｒＰｓｃがプロテアーゼによる処理に対して抵抗性であり、界面活性剤の存在下でも溶解度が低い、さらには不溶性であるという事実に基づいて実施される。従って、増幅後の最初の工程は、好ましくは試料からのＰｒＰｃ（ＰｒＰの非病原性可溶性正常形態）の分離であり、これは、例えばプロテアーゼによる処理、例えばプロテイナーゼＫでの処理によって、または不溶性形態（ＰｒＰｓｃ）から可溶性形態（ＰｒＰｃ）を分離するための遠心分離によって実施できる。
【００６８】
１つの特定実施形態では、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）による消化はウエスタンブロット法に先立つ工程であり、というのは、ＰＫ消化は主としてＰｒＰｃの消化を導き、ＰｒＰｓｃの消化をほとんどまたは全く生じさせないからである。実際上、ＰｒＰｃと比較してＰＫに対してより抵抗性であることはＰｒＰｓｃの特性である。それゆえ、その後の検出工程は、非病原性形態のタンパク質がプロテアーゼによって消化されてしまったので、もはや非病原性形態のタンパク質を検出しない。
【００６９】
検出工程は、限定されることなく、以下の方法：免疫細胞化学（例えば、細胞標識またはＦａｃｓｃａｎによる）または免疫化学（ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ検定など）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ工程後の免疫ブロット法、放射能アッセイ、蛍光アッセイ、電子顕微鏡検査、および凝集体を検出するための濁度測定試験、ならびにＮＭＲ（核磁気共鳴）、円偏光二色性、ラマン分光法、紫外吸収、病原性形態のタンパク質を認識するモノクローナル抗体を含む構造試験を用いて実施され得る。
【００７０】
また、病原性形態を特異的に認識し、非病原性形態は認識しない抗体を使用して病原性形態のタンパク質を検出することができる。検出を容易にするために、この抗体自体を標識することができる。そのような抗体は、例えば、１５Ｂ３抗体（Ｋｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７  Ｎｏｖ６，３９０（６６５５）：７４−７）であり得る。そのような抗体の使用は、感染生細胞の表面に存在するプリオンタンパク質をフローサイトメトリーによって検出するのに適する。
【００７１】
ＮＣＴＡの力価測定
ＰｒＰの病原性形態の検出は、試料中に存在するＰｒＰｓｃの量の測定と組み合わせることができる。
【００７２】
力価測定は、当業者に公知の任意の力価測定法を用いて実施できる。特に、国際公開広報第ＷＯ２００５０２２１４８号および同第ＷＯ２００６１１７４８３号（特に参考実施例ＡおよびＢ）に記載されている方法のモデルに基づいて実施できる。
【００７３】
種々の希釈物および種々の複製物についてのウエスタンブロット法の結果全体を、例えば、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｎ．Ｊ．，Ｅｍｍｏｕｓ  Ｒ．Ｗ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖｉｒａｌ，ｒｉｃｋｅｔｓｉａｌ  ａｎｄ  ｃｈｌａｖｅｙｄｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１９８９，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）のような、感染力価を確立することができる当業者に公知の統計方法によって解析できる。
【００７４】
本発明の１つの実施形態では、力価の計算方法はＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法である。この方法は、試験試料の希釈が、等比級数、すなわち連続希釈物と少なくとも５ウエル中の各希釈物の一定容量（一般に０．１５０ｍｌ）の接種との間で一定の割合に従うと仮定する。最も一般的に使用される希釈係数は１０進係数である。
【００７５】
Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの式を適用するためには、各希釈物を接種した一定数のウエル、一定の希釈係数、およびどちらの側でも１００％のウエルが陽性反応を与える希釈物と、どちらの側でも１００％のウエルが陰性反応を与える希釈物の両方を包含する十分に大きな希釈物範囲を使用する必要がある。
【００７６】
これらの条件の１またはそれ以上を満たしていない場合、時として、一定の希釈係数に関して、実施された最終希釈の後に生じたより高いまたは低い希釈物が所望結果を与えた可能性があると仮定される。そのようなデータの「捏造」は、いかなる理論的根拠にも基づくものではないが、それを十分に慎重に適用すれば危険ではない。しかし、より適切な範囲の希釈物を用いて力価測定を反復することが好ましく、データに重大な欠落がある場合これは不可欠である。
【００７７】
Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの式によれば：
Ｌｏｇ１０平均量＝（Ｘ０）−（ｄ／２）＋ｄＳ（ｒｉ／ｎｉ）
式中、
Ｘ０＝すべての試験接種物が陽性である最も低い希釈の逆数のｌｏｇ１０
ｄ＝「希釈段階」（すなわち希釈対数の間隔の差）とも称される、希釈係数のｌｏｇ１０
ｎｉ＝各々の希釈に使用される試験接種物の数
ｒｉ＝試験陽性接種物の数（ｎｉのうちで）
Ｓ（ｒｉ／ｎｉ）＝Ｓ（Ｐ）＝１００％の陽性結果を与える最も低い希釈から始まる、試験陽性の割合の合計
である。
合計はＸ０希釈から始まる。
推定標準偏差は、以下の式：
Ｌｏｇ標準偏差＝ｄ＊√（Ｅ（ｐ＊（１−ｐ）／（ｎｉ−１）））
但し、ｐ＝ｒｉ／ｎｉ＝各希釈での試験陽性（すなわち反応を示す接種物のウエル）の割合
を用いて計算される。
【００７８】
本発明の方法は、４  ｌｏｇ、すなわちインビトロでの１０，０００感染単位の範囲にわたってＮＣＴＡに関連する感染力を測定することを可能にする。これは、例えば、ＮＣＴＡの除去に関する生物学的製剤の入手工程の有効性の検証基準を満たし得る。
【００７９】
ＮＣＴＡに関連する感染力の検出または力価測定の方法の適用
本発明はまた、本発明に従った力価測定法を、ＮＣＴＡによって汚染されている可能性がある生物学的製剤の入手工程または処理工程をインビトロで評価する、および／または検査するための方法に適用することに関する。この評価および／または検査方法は、前述したような本発明に従った力価測定法を、前記工程の前と後に生物学的製剤に適用し、得られた２つの測定値を比較することを特徴とする。２つの測定値の比較により、ＮＣＴＡの除去の程度または減少率を決定する。
【００８０】
特に、本発明に従った力価測定法は、例えば、クロマトグラフィーまたはナノろ過、特に欧州特許第ＥＰ  ０  ３  ５９  ５９３号および国際公開広報第ＷＯ０２／０９２６３２号に記載されているクロマトグラフィーを使用した、生物学的製剤、特に血漿誘導体などの血液製剤を入手するまたは精製するためのあらゆるタイプの工程に容易に適用することができる。
【００８１】
従って、本発明の方法の実施は、ＮＣＴＡによって汚染されている可能性がある生物学的製剤の入手または処理、さらには精製の工程（または工程の一部）の有効性を、このＮＣＴＡの除去に関して、被験ＮＣＴＡを含有する感染性物質または潜在的感染性物質と接触させた、ＮＣＴＡの複製を促進する特異的トランスジェニック細胞株を利用した力価測定によって評価する、および／または検査することを可能にする。ＮＣＴＡに関する有効性を評価しようとする工程（または工程の一部）の前後にＮＣＴＡの量を測定する。２つの測定値を比較することにより、病原体の除去の程度を決定する。従って、本発明の方法は、生物学的製剤を入手する工程の間に、または生物学的製剤の入手後にＮＣＴＡの除去処理の一環として実施することができる。
【００８２】
本発明はまた、本発明に従った力価測定法を、装置の除染の手順をインビトロで評価する、および／または検査する方法に適用することに関する。この場合は、ＮＣＴＡを含有する生物学的製剤のＮＣＴＡ力価を本発明に従った力価測定法によって測定する。次にこの感染生物学的製剤を除染する装置と接触させ、その後この装置に除染手順を適用する。最後に、除染手順を受けた生物学的製剤の力価を再び測定する。除染手順の有効性を評価するために除染手順の前後に実施した２つの力価測定値を比較する。装置は、例えば精製装置、特にクロマトグラフィーカラム、または水酸化ナトリウムを用いたクロマトグラフィーカラムの洗浄であり得る。
【００８３】
本発明はまた、本発明に従った力価測定法を、感染性物質の力価を低下させ得る化合物の選択手順および／または評価方法に適用することに関する。この場合は、ＮＣＴＡを含有する生物学的製剤のＮＣＴＡ力価を本発明に従った力価測定法によって測定する。次にこの感染生物学的製剤を試験化合物と接触させ、その後除染手順を受けた生物学的製剤の力価を再び測定する。試験化合物と試料の接触の前後に実施した２つの力価測定値を比較する。
【００８４】
本発明はまた、本発明に従った力価測定法を、ＮＣＴＡの感染力を変化させることができる化合物の選択手順および／または評価方法に適用することに関する。この場合は、ＮＣＴＡを含有する生物学的製剤のＮＣＴＡ力価を、評価する化合物の存在下で、次に不在下で、本発明に従った力価測定法によって測定する。化合物と接触させる方法は、化合物の作用が感染サイクルの開始を阻止するまたは既に開始された感染サイクルをブロックするかどうかによって決定される。いずれの場合も、試験化合物で処理した場合と処理していない場合の生物学的製剤の力価を測定する。ＮＣＴＡの感染力に対する化合物の調節活性を評価するために、実施した２つの力価測定値を比較する。
【００８５】
本発明はまた、本発明に従った力価測定法を、ＮＣＴＡの非病原性形態から病原性形態への形質転換、例えば、ＰｒＰからＰｒＰｓｃへの形質転換を調節することができる化合物の同定方法に適用することに関する。この場合は、ＮＣＴＡを含有する生物学的製剤のＮＣＴＡ力価を本発明に従った力価測定法によって測定する。次にこの感染生物学的製剤を試験化合物と接触させ、その後生物学的製剤の力価を再び測定するために本発明の力価測定法を適用する。試験化合物の有効性を評価するために化合物との接触の前後に実施した２つの力価測定値を比較する。
【００８６】
細胞クローンによって産生されるプリオン型の標準化された感染性物質
本発明の細胞クローンによって産生された細胞の溶解産物または培養上清を、当業者に公知の方法によって用量当たりの感染単位に標準化することができる。感染細胞溶解産物のストックを、例えば、３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌを含有するように調製し得る。標準化されたストックが利用できることにより、異なる試験の結果の厳密な比較が可能となる。
【００８７】
さらに、細胞溶解産物または培養上清は、場合により、実施される安定化方法による感染力価の損失を回避するための当業者に公知の物質の存在下で、凍結、乾燥、凍結乾燥または微粒化によって安定化することができる。
【００８８】
好都合には、この細胞溶解産物または培養上清は、ＮＣＴＡによって汚染されている可能性がある生物学的製剤の入手または処理工程、特に血漿誘導体の精製工程、中でも特にクロマトグラフィーまたはナノろ過を評価する、および／または検査する方法のための感染接種物として使用することができる。
【００８９】
好都合には、この細胞溶解産物または培養上清は、ＮＣＴＡによって汚染されている可能性がある装置の除染手順を評価する、および／または検査する方法のための感染接種物として使用することができる。
【００９０】
好都合には、この細胞溶解産物または培養上清は、ＮＣＴＡの感染力を抑制する化合物を評価する方法のための感染接種物として使用することができる。
【００９１】
好都合には、感染性物質（すなわち本発明の細胞クローンから調製された接種物）は、ヒツジスクレイピーまたはウシ海綿状脳症に感染したヒツジまたはウシの脳のコレクションの使用を回避することを可能にする。
【００９２】
感染性物質は、装置の除染手順をインビトロで評価する、および／または検査する方法において感染接種物として使用することができる。
【００９３】
装置は、精製装置、特にクロマトグラフィーカラムであり得る。
【００９４】
除染手順は、例えば、水酸化ナトリウムを用いたクロマトグラフィーカラムの洗浄であり得る。
【００９５】
本発明はまた、ＮＣＴＡの感染力を変化させる化合物を評価する方法のための感染接種物としての感染性物質の使用に関する。この場合は、ＮＣＴＡの感染力を変化させる能力を、本発明に従って、ＮＣＴＡの感染力を変化させることができる化合物の存在下または不在下で試験する。
【００９６】
本発明はまた、感染性物質の封じ込め手順、特にＰ３型の手順および装置を評価する、および／または検査する方法のための感染接種物としての感染性物質の使用に関する。
本発明の方法は、以下の補足説明によってよりよく理解されるが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９７】
実施例
試験材料および方法
１．細胞および感染性物質
ＭｏｖＳ６細胞（Ａｒｃｈｅｒ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．２００４）を、ＮＣＴＡの複製を支持する細胞として選択し、Ｔｇ３０１トランスジェニックマウスに適合させたスクレイピー１２７−Ｓ株を自然感染源として使用した（Ｖｉｌｏｔｔｅ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。グルタミン（最終濃度２ｍＭ）およびウシ胎仔血清（最終濃度５％）を添加したＤＭＥＭ／ＨａｍＦ−１２（３：１）培地で細胞を培養した。
【００９８】
初期感染源は、２００ｍｇ／ｍｌの感染マウスの脳ホモジネート（ロット：６．１７  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／ｍｌの力価のＬＮ−３３２６）から成った。
【００９９】
２．培養
１５日間のインキュベーション後に、２つの一次バンク（ＬＣ−１９およびＬＣ−２１とコードされる）を作製するためにＭｏｖＳ６細胞を培養した。ＬＣ−１９のアリコートを解凍し、ＬＣ−４６、ＬＣ−４７およびＬＣ−４８とコードされる３つの二次バンクを作製するために３継代にわたって培養した。ＬＣ−４６のアリコートを解凍し、ＬＣ−５９とコードされる三次バンクを作製するために２継代にわたって培養した。
【０１００】
３．ＭｏｖＳ６細胞の２ロットと標準試料のインビトロでの力価測定の比較
ＬＣ−４６およびＬＣ−５９ロットの細胞のアリコートを解凍し、並行して２継代維持した。これらのロットの各々の細胞を用いて、２４穴（２ｃｍ２／ウエル）の力価測定プレートに１００，０００細胞／ウエルの割合で並行して接種した。２４時間のインキュベーション後、ＬＮ−３３２６マウスの脳ホモジネートの連続希釈物を、培地を用いて１０倍の希釈段階に従って調製した（１０−１〜１０−８）。接種物の各々の希釈物について、５つのウエルの各ロットの細胞を感染させた。
【０１０１】
細胞を接種物の種々の希釈物１５０μｌと２４時間接触させ、その後新鮮培地１ｍｌを添加した。細胞を第１継代までさらに７２時間培養下に維持し、その時点ですべての細胞を１０ｃｍ２のウエル（６穴プレート）に再接種した。
【０１０２】
細胞培養の期間中は、培地を週に１回交換し、細胞を１：１０の割合で継代培養した。再接種しなかった細胞は乾燥ペレットの形態にて−８０℃で保存した。各継代時に保存したこれらの細胞ペレットにより、細胞によって産生されたＰｒＰｓｃを検討することができた。産生されたＰｒＰｓｃの検出は、ウエスタンブロット法によって直接実施した。
【０１０３】
４．細胞中のＰｒＰｓｃの検出
細胞ペレットの試料を解凍し、ＰＢＳ  ６０μｌ中に取った。超音波浴（出力：１５Ｗ）を用いて１５秒間超音波処理することによって細胞を溶解した。超音波処理した細胞溶解産物２０μｌを、プロテイナーゼＫで処理するために採取した。消化産物を変性し、その後変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ゲル中を泳動したタンパク質を電気的転移によってＰＶＤＦ膜に転写した。膜上に存在するＰｒＰｓｃを６Ｈ４抗体（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）、次にアルカリホスファターゼで標識した二次抗体（ヤギ抗マウス抗体）と共にインキュベートすることによって検出した。標識された膜を化学発光によって明らかにした。ＰｒＰｓｃの３つのグリコシル化形態の電気泳動像がオートラジオグラフで可視化された場合、試料を陽性とみなした。ウエスタンブロット法に必要な種々の試薬での試料の希釈を考慮に入れて、ゲルのレーンに実際に負荷された試料の容量は４．３５μｌであった。
【０１０４】
ウエスタンブロット法による各々の分析のために、陰性対照（非感染ＭｏｖＳ６細胞）を試料と並行して処理した。各々の細胞継代時に、培養プレートのすべてのウエルを試験した。接種物の所与の希釈物を接種した細胞培養の複製物すべてが２つの連続する継代時にＰｒＰｓｃ陽性と認められた場合、これらの培養物はその後の継代時に試験しなかった。
【０１０５】
５．インビトロでの力価測定の再現性
インビトロでの力価測定システムの再現性を評価するために、標準試料ＬＮ−３３２６の力価測定を、ＬＣ−４６細胞ロットの新しいアリコートを用いて各測定についてさらに２回再現した。力価測定は上述したように実施した。
【０１０６】
６．感染ＭｏｖＳ６細胞（ＬＣ−４６ロット）によるＰｒＰｓｃ産生の安定性
感染ＭｏｖＳ６細胞によるＰｒＰｓｃ産生の安定性を評価するために、解凍後４継代を受けた５×１０５細胞（ＬＣ−４６ロット）を、２５ｃｍ２フラスコ中の培地１０ｍｌに植え付け、２．２  ｌｏｇ１０  ｕＷＢのＰｒＰｓｃ負荷、すなわち１：３１００の感染多重度（ＭＯＩ）で接種した。１：１０のスプリット比で毎週１継代を実施し、感染培養物を２３継代にわたって維持した。各々の継代時に、再接種しなかった細胞から、試験終了時に種々の継代時に採集された細胞溶解産物中のＰｒＰｓｃのウエスタンブロット法による力価測定を実施するために３×１０６細胞のアリコートを乾燥ペレットの形態にて−８０℃で保存した。
【０１０７】
ＰｒＰｓｃを、アリコートの限界希釈および第４章で述べたウエスタンブロット法による分析によって定量した。もはやＰｒＰｓｃに特異的なシグナルを示さない試料の第１希釈物を、１ウエスタンブロット単位を含有するとみなした。次に、電気泳動ゲルに実際に負荷されたアリコートの容量を考慮に入れて、試料の力価を限界希釈の逆数として計算した。従って、ＰＢＳ  ６０μｌ中に取った３×１０６細胞は、３×１０６細胞／０．０６ｍｌ、すなわち５０×１０６細胞／ｍｌに相当した。第４章で述べたウエスタンブロット（ＷＢ）分析条件下で、希釈範囲内の「未希釈」試料に対応するレーンで認められたシグナルは、ＰＢＳ中に取った細胞ペレットの未希釈懸濁液４．３５μｌ、すなわち０．２２×１０６細胞から生じた。例として、シグナルがもはや検出されなかった第１希釈物が１／８１希釈に対応する場合、細胞ペレット中のＰｒＰｓｃの力価は、８１ｕＷＢ／４．３５μｌ、すなわち８１×１０００／４．３５＝１８６２０ｕＷＢ／ｍｌ、すなわち常用対数４．２７  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／ｍｌと表されるか、あるいは８１／０．２２ｕＷＢ／１００万細胞、すなわち３６８ｕＷＢ／１００万細胞、すなわち常用対数２．５７  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／１００万細胞と表された。
【０１０８】
試験結果
標準脳ホモジネート（ＬＮ−３３２６ロット）およびＭｏｖＳ６細胞の各々のロット（ＬＣ−４６およびＬＣ−５９）の力価測定結果を表１および２に要約する。
【０１０９】
表１．標準感染マウスの脳ホモジネート  （ＬＮ−３３２６）  およびＬＣ−５９細胞ロットの力価測定
【表１】
2012501638.tif 000002
ＮＴ：試験せず
【０１１０】
表２．標準感染マウスの脳ホモジネート  （ＬＮ−３３２６）  およびＬＣ−４６細胞ロットの力価測定
【表２】
2012501638.tif 000003
ＮＴ：試験せず
【０１１１】
標準試料ＬＮ−３３２６の反復力価測定の結果を以下の表３および４に要約する。
【０１１２】
表３．標準感染マウスの脳ホモジネート  （ＬＮ−３３２６）  およびＬＣ−４６細胞ロットの力価測定の反復
【表３】
2012501638.tif 000004
ＮＴ：試験せず
【０１１３】
表４．標準感染マウスの脳ホモジネート  （ＬＮ−３３２６）  およびＬＣ−４６細胞ロットの力価測定の反復
【表４】
2012501638.tif 000005
ＮＴ：試験せず
【０１１４】
これらの力価測定試験の各々において、非感染脳ホモジネート試料（陰性対照）を接種した細胞の５つの複製物のいずれにおいても感染の痕跡を認めなかった。これに対し、標準試料ＬＮ−３３２６を接種した細胞では、ＰｒＰｓｃの漸増産生が認められた。これらの結果は、インビトロでの力価測定システムが感染細胞による新たなＰｒＰｓｃ産生を明らかにし得ることを確認する。
【０１１５】
細胞ロットＬＣ−４６に関する力価測定を反復した場合、ＬＮ−３３２６標準ホモジネート試料は６．４  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（６．３〜６．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲）の平均感染力価を示す。
【０１１６】
細胞ロットＬＣ−５９に関する力価測定では、ＬＮ−３３２６標準ホモジネート試料は３．３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの感染力価を示す。
【０１１７】
２つの細胞ロット：ＬＣ−４６およびＬＣ−５９に関して測定された標準試料の感染力価は、３．１  ｌｏｇ１０の差を示す。この差は有意である。
【０１１８】
この力価の差は、感染力価がインビトロでの力価測定のために使用したＭｏｖＳ６細胞のロットに依存することを示す。
【０１１９】
７．ＭｏｖＳ６細胞によるＰｒＰｓｃ産生の安定性
接種した一定量のＭｏｖＳ６細胞において測定されたＰｒＰｓｃ力価の動態を表５に要約する。
【０１２０】
表５．感染細胞溶解産物中で測定したＰｒＰｓｃ力価
【表５】
2012501638.tif 000006
注：ＰＩ：接種後
【０１２１】
これらのデータは、５．５  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／ｍｌの平均力価を示す。標準偏差（σ）は±０．６  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／ｍｌである。標準偏差によって表した経時的な細胞溶解産物中のＰｒＰｓｃ力価の変動性は、±０．５  ｌｏｇ１０であったウエスタンブロットによる力価測定法の変動性を上回る。これらのデータは、それゆえ、接種後第６継代から第２３継代までの間に採集された細胞溶解産物における力価の有意の低下を示す。
【０１２２】
８．サブクローニング
ＬＣ−４６のアリコートを解凍し、８日間培養した。この培養物から、０．３細胞／ウエルの割合で５つの９６穴プレートへの接種を実施した。３７日間の培養後、１３のクローンを単離し、２４穴プレート（２ｃｍ２／ウエル）に再接種した（スプリット比：１００％）。８日間のインキュベーション後、これらの培養物の各々を２つのロットに分けた。最初のロットは、プレバンク（ＬＣ−８２−１〜ＬＣ−８２−１３）の作製まで２５ｃｍ２フラスコに維持し、他方のロットは、以下のように感染させるために２４穴プレートに負荷した：各々のクローン培養物を１００，０００細胞／ウエルに調整し、次に１．９  ｌｏｇ１０  ｕＷＢのＰｒＰｓｃの同じ負荷で接種した。これらの培養物を６継代にわたって維持した。この期間の終了時に、各培養物の細胞を採集し、１０６細胞／ｍｌの濃度に調整した。これらの細胞懸濁液を乾燥ペレットの形態にて−８０℃で保存した。
【０１２３】
８．１．クローンの選択
各々のクローンによる感染に対する応答の強さをウエスタンブロット法によって評価するために、各クローンの乾燥ペレットのアリコートを解凍し、超音波処理して、ウエスタンブロット法によって分析した。様々なクローン溶解産物中のＰｒＰｓｃの検出をオートラジオグラフに示す（図面）。
【０１２４】
これらのデータは、接種の６週間後に測定した、各々のクローンによる感染に対する応答がクローンの間で不均一であることを示す。
【０１２５】
ＭｏｖＳ６−１３および−１０クローンはＰｒＰｓｃに特異的なシグナルを示さない。
【０１２６】
ＭｏｖＳ６−２、−３、−５、−７、−８、−９、−１２クローンは中等度の強さのＰｒＰｓｃ特異的シグナルを示す。
【０１２７】
ＭｏｖＳ６−１、−６、−１１クローンは高い強度のＰｒＰｓｃ特異的シグナルを示す。
【０１２８】
ＭｏｖＳ６−４クローンは極めて高い強度のＰｒＰｓｃ特異的シグナルを示す。
【０１２９】
対応する非感染細胞のアリコート（ＬＣ−８２−４）を解凍し、１つの一次バンク（ＬＣ−９１）および２つの二次バンク（ＬＣ−９３およびＬＣ−９４）を作製するために培養下に維持した。
【０１３０】
８．２．ＭｏｖＳ６−４クローンの細胞によるＰｒＰｓｃ産生の安定性
感染ＭｏｖＳ６−４細胞によるＰｒＰｓｃ産生の安定性を評価するため、解凍後２継代を受けた５×１０５細胞を２５ｃｍ２フラスコ中の培地１０ｍｌに植え付け、３．０  ｌｏｇ１０  ｕＷＢのＰｒＰｓｃ負荷、すなわち１：５００の感染多重度（ＭＯＩ）で接種した。１：１０のスプリット比で毎週１継代を実施し、感染培養物を３７継代にわたって維持した。各々の継代時に、再接種しなかった細胞から、試験終了時に種々の継代時に採集された細胞溶解産物中のＰｒＰｓｃのウエスタンブロット法による力価測定を実施するためにアリコートを乾燥ペレットの形態にて−８０℃で保存した。この試験の終了時に、溶解産物中のＰｒＰｓｃを第６章で述べたように限界希釈とウエスタンブロット法によって力価測定した。
【０１３１】
８．３．標準試料とＭｏｖＳ６およびＭｏｖＳ６−４細胞とのインビトロでの力価測定の比較
ＭｏｖＳ６−４細胞のアリコート（ＬＣ−９４）を解凍し、５継代にわたって維持した。次に、２４穴（２ｃｍ２／ウエル）の力価測定プレートに１００，０００細胞／ウエルの割合で接種した。２４時間のインキュベーション後、マウス脳ホモジネートＬＮ−３３２６の連続希釈物を、培地を用いて１０倍の希釈段階に従って調製した（１０−１〜１０−８）。接種物の各々の希釈物について、５つのウエルの細胞を感染させた。
【０１３２】
細胞を接種物の種々の希釈物１５０μｌと２４時間接触させ、その後新鮮培地１ｍｌを添加した。細胞を第１継代までさらに７２時間培養下に維持し、その時点ですべての細胞を１０ｃｍ２のウエル（６穴プレート）に再接種した。
【０１３３】
細胞培養の期間中は、培地を週に１回交換し、細胞を１：１０の割合で継代培養した。再接種しなかった細胞は乾燥ペレットの形態にて−８０℃で保存した。各継代時に保存したこれらの細胞ペレットにより、細胞によって産生されたＰｒＰｓｃを検討することができた。産生されたＰｒＰｓｃの検出は、第４章で述べたようにウエスタンブロット法によって直接実施した。
【０１３４】
試験結果
接種した一定量のＭｏｖＳ６−４細胞において測定されたＰｒＰｓｃの力価の動態を表６に要約する。
【０１３５】
表６．感染細胞溶解産物中で測定したＰｒＰｓｃ力価（ｌｏｇ１０）
【表６】
2012501638.tif 000007
【０１３６】
続き：
【表７】
2012501638.tif 000008
【０１３７】
これらのデータは、４．６  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／ｍｌの平均力価を示す。標準偏差（σ）は±０．３  ｌｏｇ１０  ｕＷＢ／ｍｌである。標準偏差によって表した経時的な細胞溶解産物中のＰｒＰｓｃ力価の変動性は、±０．５  ｌｏｇ１０であったウエスタンブロットによる力価測定法の変動性を下回る。これらのデータは、それゆえ、接種後第６継代から第４７継代までの間に採集された細胞の溶解産物における力価の安定性を示す。これらのデータはウエスタンブロット法によって測定し、ウエスタンブロット単位（ｕＷＢ）で表した力価を示すが、感染細胞（細胞溶解産物）の感染力価も試験期間中安定であったとみなすことができる。ウエスタンブロットとＴＣＩＡによる力価測定法の間の感受性の差を考慮に入れると、第６継代から第４７継代までの感染力は約６．２  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【０１３８】
標準脳ホモジネート（ＬＮ−３３２６ロット）ならびにＭｏｖＳ６細胞の種々のロットおよびＭｏｖＳ６−４クローンの力価測定の結果を表７に要約する。
【０１３９】
表７．標準感染マウスの脳ホモジネート  （ＬＮ−３３２６）  ならびにＭｏｖＳ６細胞の種々のロット  （ＬＣ−４６、ＬＣ−５９）およびＭｏｖＳ６−４クローン  （ＬＣ−９４ロット）の力価測定
【表８】
2012501638.tif 000009
【０１４０】
ＭｏｖＳ６細胞（ＬＣ−４６ロット）に関する力価測定を反復した場合、ＬＮ−３３２６標準ホモジネート試料は６．４  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（６．３〜６．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲）の平均感染力価を示した。表３および４参照。
【０１４１】
ＭｏｖＳ６−４細胞に関する力価測定では、ＬＮ−３３２６標準ホモジネート試料は４．７  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの感染力価を示した。
【０１４２】
ＭｏｖＳ６（ＬＣ−４６ロット）とＭｏｖＳ６−４の２種類の細胞に関して測定された標準試料の感染力価は、１．７  ｌｏｇ１０の差を示す。この差は有意であり、感染力価がインビトロでの力価測定のために使用される細胞に依存することを確認する。
【０１４３】
結論
この試験において、それぞれＬＣ−４６およびＬＣ−５９と称する、ＭｏｖＳ６株の細胞の２つのロットを使用した。これら２つのロットは接種時の細胞齢が異なる。ＬＣ−４６ロットは５継代と１回の凍結／解凍サイクルを受け、一方ＬＣ−５９ロットは７継代と２回の凍結／解凍サイクルを受けた。
【０１４４】
標準脳ホモジネート（ＬＮ−３３２６）の力価測定データは、試料の感染力価が使用されるＭｏｖＳ６細胞のロットに依存することを示した。高齢細胞（ＬＣ−５９ロット）に関して実施した力価測定システム、ＴＣＩＡ（組織培養感染性試験）は、実際に、若齢細胞（ＬＣ−４６ロット）で実施した力価測定システムと比較して感受性の損失によって特徴づけられた。
【０１４５】
さらに、この試験のデータは、ＭｏｖＳ６細胞（ＬＣ−４６ロット）の接種後、第６継代から第２３継代までの間に生産性の有意の損失が認められたことから、ＰｒＰｓｃ産生が経時的に低下したことを示す。
【０１４６】
これら２つの所見は、実際に、継代数と凍結／解凍サイクルで表した細胞齢の、ＭｏｖＳ６株の生物学的性質への影響を示す。この細胞齢の影響は、感染に対する細胞の許容性の低下および感染細胞によるＰｒＰｓｃの生産性の損失から成る。
【０１４７】
ＭｏｖＳ６−１およびＭｏｖＳ６−１０クローンは接種後第６週目からＰｒＰｓｃ産生を全く示さなかったのに対し、ＭｏｖＳ６−４クローンに関しては高い産生レベルが認められた。
【０１４８】
８．４．ＭｏｖＳ６細胞とＭｏｖＳ６−４細胞の許容性の比較
非感染ＭｏｖＳ６−４細胞のアリコート（ＬＣ−８２−４）を解凍し、一次バンク（ＬＣ−９１）を作製するために培養下に維持した。
【０１４９】
感染前の試料の調製
ＭｏｖＳ６−４細胞のアリコート（ＬＣ−９１）を解凍し、４つの二次バンク（ＬＣ−１３１〜ＬＣ−１３４）を作製するために培養下に維持した。
【０１５０】
ＭｏｖＳ６−４細胞のアリコート（ＬＣ−１３１）を解凍し、６４日間および１０継代にわたって維持して、その後三次バンク（ＬＣ−１３９）を作製するために凍結した。
【０１５１】
ＭｏｖＳ６−４細胞のアリコート（ＬＣ−１３９）を解凍し、６６日間および１０継代にわたって維持して、その後四次バンク（ＬＣ−１４３）を作製するために凍結した。
【０１５２】
標準試料とＭｏｖＳ６細胞およびＭｏｖＳ６−４クローンのインビトロでの力価測定の比較
ＭｏｖＳ６−４細胞のアリコート（ＬＣ−１４３）を解凍し、２継代にわたって維持した。次に、２４穴（２ｃｍ２／ウエル）の力価測定プレートに１００，０００細胞／ウエルの割合で接種した。２４時間のインキュベーション後、ＬＮ−３３２６マウス脳ホモジネートの連続希釈物を、培地を用いて１０倍の希釈段階に従って調製した（１０−１〜１０−８）。接種物の各々の希釈物について、５つのウエルの細胞を感染させた。
【０１５３】
細胞を接種物の種々の希釈物１５０μｌと２４時間接触させ、その後新鮮培地１ｍｌを添加した。細胞を第１継代までさらに７２時間培養下に維持し、その時点ですべての細胞を１０ｃｍ２のウエル（６穴プレート）に再接種した。
【０１５４】
細胞培養の期間中は、培地を週に１回交換し、細胞を１：１０の割合で継代培養した。再接種しなかった細胞は乾燥ペレットの形態にて−８０℃で保存した。各継代時に保存したこれらの細胞ペレットにより、細胞によって産生されたＰｒＰｓｃを検討することができた。産生されたＰｒＰｓｃの検出は、上記第４章で述べたようにウエスタンブロット法によって直接実施した。
【０１５５】
標準脳ホモジネート（ＬＮ−３３２６ロット）ならびにＭｏｖＳ６細胞の種々のロットおよび接種後第６継代のＭｏｖＳ６−４クローンの力価測定の結果を以下の表８に要約する。
【０１５６】
表８．標準感染マウスの脳ホモジネート  （ＬＮ−３３２６）  ならびにＭｏｖＳ６細胞の種々のロット  （ＬＣ−４６およびＬＣ−５９）およびＭｏｖＳ６−４クローン（ＬＣ−１４３）の力価測定
【表９】
2012501638.tif 000010
【０１５７】
いわゆる「若齢」ＭｏｖＳ６細胞（ＬＣ−４６ロット）は、力価測定試験の前に、１回の凍結／解凍サイクルを受け、合計５継代に達した。これらの細胞に関して、標準ホモジネート試料ＬＮ−３３２６は６．４  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの感染力価を示した。
【０１５８】
いわゆる「高齢」ＭｏｖＳ６細胞（ＬＣ−５９ロット）は、力価測定試験の前に、２回の凍結／解凍サイクルを受け、合計７継代に達した。これらの細胞に関して、標準ホモジネート試料ＬＮ−３３２６は３．３  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの感染力価を示した。
【０１５９】
いわゆる「高齢」ＭｏｖＳ６細胞（ＬＣ−１４３ロット）は、力価測定試験の前に、２回の凍結サイクルと３回の解凍サイクルを受け、合計２２継代に達した。これらの細胞に関して、標準ホモジネート試料ＬＮ−３３２６は５．８２  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（５．７２〜５．９２の範囲）の感染力価を示した。
【０１６０】
「若齢」ＭｏｖＳ６細胞に関して測定された標準脳ホモジネート試料（ＬＮ−３３２６）の力価は、「高齢」ＭｏｖＳ６−４細胞に関して測定された感染力価と有意に異ならない（力価の間の差は、一般に有意差についての閾値とみなされる１  ｌｏｇ１０の差の閾値を下回る）。
【０１６１】
「高齢」ＭｏｖＳ６細胞に関して測定された標準脳ホモジネート試料（ＬＮ−３３２６）の力価は、「高齢」ＭｏｖＳ６−４細胞に関して測定された感染力価と有意に異なる。
【０１６２】
結論
この試験において、それぞれＬＣ−４６およびＬＣ−５９と称する、ＭｏｖＳ６株の細胞の２つのロットを使用した。これら２つのロットはそれらの「細胞齢」（接種前の凍結／解凍のサイクル数と細胞の継代数によって表される）だけが異なる。
【０１６３】
ＬＣ−４６ロットは５継代と１回の凍結／解凍サイクルを受け、一方ＬＣ−５９ロットは７継代と２回の凍結／解凍サイクルを受けた。
【０１６４】
標準脳ホモジネート試料（ＬＮ−３３２６）の力価測定データは、試料の感染力価が使用したＭｏｖＳ６細胞の細胞齢に依存することを示した。
【０１６５】
高齢細胞（ＬＣ−５９ロット）に関して実施した力価測定システム、ＴＣＩＡ（「組織培養感染性試験」）は、実際上、若齢細胞（ＬＣ−４６ロット）で実施した力価測定システムと比較して感受性の有意の損失によって特徴づけられた。
【０１６６】
これらの所見は、継代数と凍結／解凍サイクルで表した細胞齢の、ＭｏｖＳ６株の生物学的性質への影響を示す。この細胞齢の影響は、ＭｏｖＳ６における感染に対する細胞の許容性の低下から成る。
【０１６７】
さらに、これらのデータはまた、２回の凍結／解凍サイクルと１回の追加解凍および合計２２継代を受けた、ＭｏｖＳ６−４細胞（ＬＣ−１４３ロット）の接種後、試料の感染力価がこの細胞の細胞齢によって影響されないことを示す。従って、ＭｏｖＳ６−４細胞（ＬＣ−１４３）の細胞齢は、ＴＣＩＡによる力価測定システム感受性に影響を及ぼさない。
【０１６８】
「高齢」ＭｏｖＳ６−４細胞（ＬＣ−１４３ロット）に関して実施した力価測定システム、ＴＣＩＡ（「組織培養感染性試験」）は、実際上、「若齢」ＭｏｖＳ６細胞（ＬＣ−４６ロット）で実施した力価測定システムと比較して感受性の安定性によって特徴づけられた。
【０１６９】
この所見は、継代数と凍結／解凍サイクルで表した細胞齢が、ＭｏｖＳ６−４における感染に対する細胞の許容性に影響を及ぼさないことを示す。
【０１７０】
それゆえ、ＭｏｖＳ６−４クローンは、ＭｏｖＳ６と異なり、プリオン株による感染に対するその許容性に関して特に安定であると結論することができる。
【図１】
2012501638.tif 000011
【国際調査報告】
2012501638.tif 000012
2012501638.tif 000013
2012501638.tif 000014
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2012501638.tif 000016
2012501638.tif 000017
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