(57)【要約】  生殖能力の管理は、対象に対して、式Ｉの化合物の１または２以上の用量を投与し、対象の生殖能力を低下させることを含むことができる。生殖能力の管理はまた、以下も含むことができる：化合物の有効量を投与して、雄対象におけるセルトリ細胞機能を障害すること；対象における精子形成を阻害すること；対象における精巣重量を減少させること；雌対象において卵巣重量を減少させること；雌対象において血清プロゲステロンを減少させること；雌対象において、卵巣の卵胞機能を障害すること；対象において可逆的な生殖能力をもたらすこと。生殖能力を回復させるために、前記方法は、対象への化合物の投与を停止して、対象における生殖能力を回復させることを含むことができる。化合物は、対象を不可逆的に不妊化するために投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における生殖能力を低下させる方法であって、
対象に対して、式Ｉ：
【化１】
2012532198.tif 000179
式中、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
式中、ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；
式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である；
で表される化合物、およびその薬学的に許容し得る塩およびエステルの、１または２以上の用量を投与して、対象の生殖能力を低下させることを含む、前記方法。
【請求項２】
式中、Ｒ２が水素である場合は、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１つが窒素であり、残りは独立して炭素または窒素であるか；または
Ｒ１は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＮ（ＣＨ３）２、−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨではない、
のいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が、
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；
６−フルオロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；および
その薬学的に許容し得る塩およびエステル、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
化合物が、
ガメンダゾール；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２またはＨ２−ガメンダゾール）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＴＨ２−１９２）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ２−１７８）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ２−１７９）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ１−１９０）；
１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ２−２２）；
１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ１−２８２）；
および
その薬学的に許容し得る塩およびエステル、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
化合物を、対象におけるセルトリ細胞の機能を障害する有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
化合物を、対象における精子形成を阻害する有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化合物を、対象において精巣重量を減少させる有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化合物を、対象において卵巣重量を減少させる有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
化合物を、対象において血清プロゲステロンを減少させる治療有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
化合物を、対象における卵巣の卵胞機能を障害する有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対象への化合物の投与を停止して、対象の生殖能力を回復させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
化合物を、雌対象を不可逆的に不妊化するための有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物を、雌対象において単一用量で不妊性を誘発する有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
化合物を、対象において不妊性を誘発する複数用量レジメンで投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
雄対象における精子形成を可逆的に阻害するための方法であって、
雄対象に対して、式Ｉ：
【化２】
2012532198.tif 000180
式中、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
式中、ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；
式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である；
で表される化合物、およびその薬学的に許容し得る塩およびエステルの、１または２以上の用量を投与して、精子形成を阻害することを含む、前記方法。
【請求項１６】
化合物が、
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；
６−フルオロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
ガメンダゾール；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２またはＨ２−ガメンダゾール）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＴＨ２−１９２）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ２−１７８）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ２−１７９）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ１−１９０）；
１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ２−２２）；
１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ１−２８２）；および
その薬学的に許容し得る塩およびエステル、からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
化合物を有効量で、以下の項目：
対象の体重を維持すること；
インヒビンＢの産生を阻害すること；
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の循環を増加させること；
化合物関連毒性を阻害すること；
構造化された精細胞型の層化を低減すること；
精子（spermatozoa）を減少させること；
精子細胞（spermatids）を減少させること；
精原細胞を減少させること；
生殖上皮を減少させること；
生殖細胞の量を減少させること；
精巣重量を減少させること；
熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０ＡＢ１を阻害すること；
真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）を阻害すること；;
インターロイキン１タンパク質の産生を増加させること、または
ＮＦ−κＢ阻害剤α（Ｎｆｋｂｉａ）の産生を増加させること；
のうちの少なくとも１つに従って投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
対象への化合物の投与を停止して、対象の生殖能力を回復させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
雌対象における生殖能力を低下させる方法であって、
雌対象に対して、式Ｉ：
【化３】
2012532198.tif 000181
式中、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
式中、ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；
式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である；
で表される化合物、およびその薬学的に許容し得る塩およびエステルの、１または２以上の用量を投与して、生殖能力を低下させることを含む、前記方法。
【請求項２０】
化合物が、
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；
６−フルオロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
ガメンダゾール；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２またはＨ２−ガメンダゾール）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＴＨ２−１９２）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ２−１７８）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ２−１７９）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ１−１９０）；
１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ２−２２）；
１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ１−２８２）；および
その薬学的に許容し得る塩およびエステル、からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
化合物を有効量で、以下の項目：
対象の体重を維持すること；
インヒビンＢの生産を阻害すること；
エストラジオールの産生を阻害すること；
卵巣重量を減少させること；
血清プロゲステロンを減少させること；
プロゲステロンの産生を阻害すること；
退縮卵胞を誘発すること；
生存可能な卵胞の数を減少させること；
生殖細胞の量を減少させること；
排卵を阻害すること；
のうちの少なくとも１つに従って投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
化合物が、対象における可逆的な不妊化をもたらすための有効量で投与され、該方法がさらに、
対象への化合物投与を停止して、対象の生殖能力を回復させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
化合物を、対象を不可逆的に不妊化するための有効量で投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
化合物の、対象の生殖能力を低下させるための医薬の調製のための使用であって、該化合物が、式Ｉ：
【化４】
2012532198.tif 000182
式中、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
式中、ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；
式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である；
で表される構造を有し、およびその薬学的に許容し得る塩およびエステルである、前記の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００４年４月２０日に出願された米国特許出願第10/922,747号の一部継続である２００９年２月２７日に出願された米国特許出願第12/395,521号の一部継続であり、２００８年１０月１４日に出願された米国仮出願第61/105,125号および２００９年７月６日に出願された米国仮出願第61/223,330号の利益を主張し、これらの出願は特定の参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所から授与されたNO1-HD-1-3313およびP50 DK05301の政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ロニダミンの新規なアナログ、例えばガメンダゾールおよびＨ２−ガメンダゾール等に関する。特に、ガメンダゾールおよびＨ２−ガメンダゾールなどのロニダミンのいくつかの新規なアナログは、雄（男性、males）および雌（女性、females）を不妊化し、生殖能力を抑制するのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
ヒトおよびその他の哺乳動物の意図されない妊娠を予防することは、発展途上国および先進国の両方において継続的な問題である。妊娠の予防のために、様々な方法および製品が提案され開発されている。これらの製品には、外科的避妊、コンドーム、プロゲスチンまたはプロゲスチンとエストロゲンの組み合わせを含む経口避妊薬、プロゲステロンの遅延放出形態を含む皮下インプラント、子宮内避妊器具、殺精子クリームまたはゲル、およびスポンジまたはダイヤフラムなどの膣内バリアを含む。
男性の避妊法としては、バリア法、ホルモン法、リズム法（周期避妊法）、および免疫学的方法が挙げられる。さらに最近では、研究者らが、精巣のセルトリ細胞と生殖細胞の間の接合部複合体部位を破壊することにより精子形成を阻害する化合物の検討を始めている。かかる化合物の１つがロニダミン（１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸）である。ロニダミンは、精子形成の強力な阻害剤であることが見出された、インダゾール−カルボン酸化合物の群に属する。しかし高用量でのロニダミンの抗精子形成効果は、不可逆的で毒性であることが見出された。一般的に、Lonidamine: A New Pharmacological Approach to the Study and Control of Spermatogenesis and Tumors, Chemotherapy, 27 Suppl. 2, 1-120 (1981a 1981b); Lonidamine, Proceedings of the 2nd International Symposium, Vancouver (1982)を参照のこと。
【０００４】
いくつかのロニダミンのアナログが、近年、精子形成阻害剤として検討されている。Silvestrini et al., 米国特許第6,001,865号；Baiocchi et al., 米国特許第5,112,986号；Silvestrini, 米国特許第4,282,237号；Palazzo et al., 米国特許第3,895,026号；Cheng et al., Two New Male Contraceptives Exert Their Effects by Depleting Germ Cells Prematurely from the Testis, BIOLOGY OF REPRODUCTION 65, 449-461 (2001)；Grima et al., Reversible Inhibition of Spermatogenesis in Rats Using a New Male Contraceptive 1-(2,4-dichlorobenzyl)-indazole-3-carbohydrazide, BIOLOGY OF REPRODUCTION 64, 1500-1508 (2001)；Corsi et al., 1-Halobenzyl-1H-indazole-3-carboxylic acids: A New Class of Antispermatogenic Agents, J. MED. CHEM., Vol. 19, No. 6, 778-783 (1976)；Palazzo et al., Synthesis and pharmacological properties of 1-substituted 3-dimethylaminoalkoxy-1H-indazoles, J. MED. CHEM. Vol. 9, 38-41 (1966)を参照のこと。これらの発展にも関わらず、抗精子形成性であるが好ましくは毒性副作用を示さない化合物への要求が存在している。
【０００５】
ｅＥＦ−１αの体細胞形態（ｅＥＦ−１αＳ）ｍＲＮＡは、成人性腺の雄および雌生殖細胞においては実質的に検出できないが、神経胚期の後の胚細胞には非常に豊富に存在する。対照的に、ｅＥＦ−１αの別の形態（ｅＥＦ−１αＯ）ｍＲＮＡは、卵原細胞および前卵黄卵母細胞に高度に濃縮されているが、卵子および胚では検出されない。ｅＥＦ−１αＯ ｍＲＮＡはまた、成人精巣の精原細胞および精母細胞にも存在する。後者の所見は、ｅＥＦ−１αＯ ｍＲＮＡを、生殖細胞特異的遺伝子産物として同定する。生殖細胞は非常に少量のｅＥＦ−１αＳ ｍＲＮＡを含むが、いくつかのｅＥＦ−１αＳレトロ偽遺伝子がX. laevis（アフリカツメガエル）の染色体に存在する。これらの遺伝子は、生殖細胞中に、ｍＲＮＡの逆転写と続くｃＤＮＡコピーの染色体ＤＮＡへの組み込みによって生じると考えられている。ｅＥＦ−１αＳ偽遺伝子は、胚の始原生殖細胞に、それらが卵原細胞または精原細胞に分化する前に生成されることが示唆される。Abdallah et al., Germ cell-specific expression of a gene encoding eukaryotic translation elongation factor 1 alpha (eEF-1 alpha) and generation of eEF-1 alpha retropseudogenes in Xenopus laevis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 9277-9281 (1991)を参照のこと。
【０００６】
タンパク質合成は、減数分裂および有糸分裂の期間中細胞周期の制御下にあると考えられている。したがって、ｃｄｃ２キナーゼの基質とタンパク質合成装置の成分の間のいかなる関係も、非常に重要であろう。Xenopus laevisの卵母細胞の減数分裂の間、このキナーゼの基質の１つがｐ４７タンパク質であり、これは、２つの別のタンパク質Ｐ３６およびＰ３０に複合化する。Ｐ４７およびＰ３０の部分的なアミノ酸配列データから判断すると、Ｐ３０およびＰ４７タンパク質は、Artemia salinaのタンパク質伸長因子（ＥＦ）１βおよび１γに類似していることが報告された。Belle et al., A purified complex from Xenopus oocytes contains a p47 protein, an in vivo substrate of MPF, and a p30 protein respectively homologous to elongation factors EF-1 gamma and EF-1 beta. FEBS Lett. 255: 101-104 (1989)を参照のこと、この論文は、XenopusのＰ３０、Ｐ４７およびＰ３６からなる複合体が、ArteriaのＥＦ−１β、ＥＦ−１γおよびＥＦ−１δの複合体と、次の２つの基準に従って同一であることを示す。１）両者は、リボソームへの、伸長因子１α媒介性トランスファーＲＮＡ結合および、伸長因子１αのグアニンヌクレオチドの同程度までの交換を促進する。２）Xenopusからのタンパク質複合体Ｐ３０．Ｐ４７．Ｐ３６の３つのサブユニットの各々は、ArteriaからのＥＦ−１βγδの対応するサブユニットの１つと、構造的相同性を示す。おそらく、少なくともin vitroでチューブリンと関連するＥＦ−１γのリン酸化が、タンパク質合成の増加を伴う減数分裂の開始に続くプロセスにおいて重要であると考えられる。Janssen et al., A major substrate of maturation promoting factor identified as elongation factor 1 beta gamma delta in Xenopus laevis. J. Biol. Chem. 266: 14885-14888 (1991)を参照のこと。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、生殖能力を管理するための方法、例えば対象における生殖能力をある期間低下させ、次に生殖能力を回復させることなどに有用な新規な化合物に関する。かかる生殖能力の管理には、対象に対して式Ｉの化合物の１または２以上の用量（doses）を投与して、該対象における生殖能力を低下させることを含む：
【化１】
2012532198.tif 000002
【０００８】
式Ｉにおいて、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である。化合物はまた、式Ｉの薬学的に許容し得る塩類およびエステル類であることができる。一態様において、Ｒ２が水素である場合は、次のどちらかである：Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１つは窒素であり、残りは独立して炭素または窒素である；または、Ｒ１は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＮ（ＣＨ３）２、−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨではない。
【０００９】
一態様において、化合物は、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；６−フルオロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；およびその薬学的に許容される塩およびエステル、からなる群から選択される。
【００１０】
一態様において、化合物は、ガメンダゾール；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２またはＨ２−ガメンダゾール）；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＴＨ２−１９２）；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ２−１７８）；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ２−１７９）；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ１−１９０）；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ２−２２）；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ１−２８２）；およびその薬学的に許容される塩およびエステル、からなる群から選択される。
生殖能力の管理はまた、雄対象におけるセルトリ細胞機能を障害するための、化合物の有効量を投与することを含むことができる。たとえば、化合物は、対象での精子形成を阻害する有効量で投与することができる。また、化合物は、対象での精巣重量を減少させる有効量で投与することができる。
【００１１】
生殖能力の管理はまた、雌対象における卵巣重量を減少させるための、化合物の有効量を投与することを含むことができる。化合物はまた、雌対象において血清プロゲステロンを低下させる治療有効量で投与することができる。化合物は、雌対象における卵巣の卵胞機能を障害する有効量で投与することができる。
一態様において、化合物は、対象において可逆的生殖能力を生じる有効量で投与することができる。生殖能力を回復させるために、方法は、化合物の対象への投与を停止して、対象に生殖能力を回復させることを含むことができる。
一態様において、化合物は、対象を不可逆的に不妊化するための有効量で投与することができる。これには、不妊化するための１または２以上の用量を含むことができる。
一態様において、化合物は、単一用量で対象に不妊をもたらす有効量で投与することができる。代替的に、化合物は、複数用量レジメンで投与して対象に不妊をもたらすことができる。
【００１２】
一態様において、生殖能力の管理は、雄対象において精子形成を阻害することを含み得る。かかる生殖能力管理の方法は、雄対象に式Ｉの化合物を投与して精子形成を阻害することを含むことができ、ここで式Ｉは本明細書に記載されている。雄の生殖能力管理の方法は、化合物を有効量で、以下の１つに従って投与することを含むことができる：対象の体重を維持すること；インヒビンＢの産生を阻害すること；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の循環を増加させること；化合物関連毒性を阻害すること；構造化された精細胞型の層化（structured spermatogenic cell-type layering）を低減すること；精子（spermatozoa）を減少させること；精子細胞（spermatids）を減少させること；精原細胞を減少させること；生殖上皮を減少させること；生殖細胞の量を減少させること；精巣重量を減少させること；熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０ＡＢ１を阻害すること；真核生物翻訳伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）を阻害すること；インターロイキンタンパク質の産生を増加させること；または、ＮＦ−κＢ阻害剤α（Ｎｆｋｂｉａ）の産生を増加させること。雄の生殖能力は、量およびまたは投与計画に依存して可逆的または不可逆的であり得る。より高い投薬量は、雄対象のセルトリ細胞機能を永久に障害することができる。より低い用量は可逆的な不妊性をもたらすことができ、ここで対象への化合物の投与を停止すれば、対象の精子形成能力が回復できる。
【００１３】
一態様において、化合物は、女性の生殖能力管理に用いることができる。化合物はそれのみで、または他の生殖能力管理化合物と組み合わせて、投与することができる。本発明の化合物（たとえば式Ｉ）は、雌の対象に対して、生殖能力を低下させるために投与することができる。化合物は雌対象に有効量で、以下の少なくとも１つに従って投与することができる：対象の体重を維持すること；インヒビンＢの生産を阻害すること；エストラジオールの産生を阻害すること；卵巣重量を減少させること；血清プロゲステロンを減少させること；プロゲステロンの産生を阻害すること；退縮卵胞を誘発すること；生存可能な卵胞の数を減少させること；生殖細胞の量を減少させること；または排卵を阻害すること。雌の生殖能力は、量およびまたは投与計画に依存して可逆的または不可逆的であり得る。より高い投薬量は、雌対象の卵巣卵胞を永久に障害することができる。より低い用量は可逆的な不妊性をもたらすことができ、ここで対象への化合物の投与を停止すれば、雌対象の卵胞能力が回復できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＲＣ−ＭＣ−３０を２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の全体重の変化を、対照と比較して示した図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＲＣ−ＭＣ−３０を２５ｍｇ／ｋｇ投与した動物および２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の右精巣重量を、対照と比較して示した図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＲＣ−ＭＣ−３０を２５ｍｇ／ｋｇ投与した動物および２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の左精巣重量を、対照と比較して示した図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＲＣ−ＭＣ−３０を２５ｍｇ／ｋｇ投与した動物および２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の精細管上皮の上皮高さを、対照と比較して示した図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＲＣ−ＭＣ−３０を２５ｍｇ／ｋｇ投与した動物および２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の精細管のステージを、対照と比較して示した図である。
【００１５】
【図２Ａ】図２Ａは、２５ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−３０を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２００ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−３０を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＲＣ−ＭＣ−８６を２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の全体重の変化を、対照と比較して示した図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＲＣ−ＭＣ−８６を２５ｍｇ／ｋｇ投与した動物および２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の右精巣重量を、対照と比較して示した図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＲＣ−ＭＣ−８６を２５ｍｇ／ｋｇ投与した動物および２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の左精巣重量を、対照と比較して示した図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＲＣ−ＭＣ−８６を２５ｍｇ／ｋｇ投与した動物および２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の精細管上皮の上皮高さを、対照と比較して示した図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＲＣ−ＭＣ−８６を２５ｍｇ／ｋｇ投与した動物および２００ｍｇ／ｋｇ投与した動物の精細管のステージを、対照と比較して示した図である。
【００１６】
【図４Ａ】図４Ａは、２５ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−８６を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、２００ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−８６を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図５Ａ】図５Ａは、精巣重量に対するロニダミンの用量依存効果を、ＲＣ−ＭＣ−１１０と比較して示した図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、６．０、３．０、１．５、１および０．５ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０および２５ｍｇ／ｋｇのロニダミンを投与した動物の全体重を、対照と比較して示した図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、６．０、３．０、１．５、１および０．５ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０および２５ｍｇ／ｋｇのロニダミンを投与した動物の細管ステージを、対照と比較して示した図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０およびＤＤ−ＭＣ−Ｉを投与した動物の全体重を示した図である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与した動物の左精巣重量を、比較化合物であるＤＤ−ＭＣ−Ｉ（１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸）のそれと比較して示した図である。
【００１７】
【図６Ａ】図６Ａは、０．５ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、１．０ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、１．５ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、３．０ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、６．０ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与したラット精巣の組織学写真である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＲＣ−ＭＣ−１１０試験の対照としてコーン油を投与したラット精巣の組織学写真である。
【００１８】
【図７】図７は、精巣組織構造に対する、ガメンダゾールまたはロニダミン（ＬＮＤ）の単一用量の比較を提供する図である：パネルＡ−Ｂは、ビヒクルのみを投与した対照動物からの精巣を示す；パネルＣ−Ｄは、ＩＰで２５ｍｇ／ｋｇのＬＮＤに反応した動物からの精巣を示す；パネルＥ−Ｆは、ＩＰで２５ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールで処置した動物からの精巣を示す；パネルＧ−Ｈは、経口で６ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールで処置した動物からの精巣を示す；パネルＩ−Ｊは、経口で３ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールで処置した動物からの精巣を示す．パネルＡ、Ｃ、Ｅ、ＧおよびＩは全て同一倍率であり、バー＝２００μｍである。パネルＢ、Ｄ、Ｆ、ＨおよびＪは全て同一倍率であり、バー＝２００μｍである。
【図８】図８は、ガメンダゾールまたはＬＮＤの１回の経口投与の５日後の精巣重量に対する、用量依存効果を示すグラフである。ＬＮＤで処置したラットに見られる変動の大きさは、５匹のラットのうち２匹がＬＮＤに反応しなかったとの事実による。
【図９Ａ】図９Ａ−９Ｂは、ＬＮＤ、ＡＦ−２７８５、ＡＦ−２３６４、およびガメンダゾールの１回のＩＰ投与後の体重変化を示すグラフである。動物は実験開始時に６０日齢であり、化合物投与の前日、投与の日（０日、矢印）、および２日後と５日後に計量した。図９Ａは、２５ｍｇ／ｋｇで投与した化合物について示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、２００ｍｇ／ｋｇで投与した化合物について示す。対照は、５ｍｇ／ｋｇの担体（緩衝ＤＭＳＯ）を投与した。
【００１９】
【図１０】図１０は、交配試験後の、ガメンダゾールで処置した動物における精巣組織構造を示す図である：パネルＡ−Ｂは、ビヒクルのみを投与した対照動物からの精巣を示す；パネルＣ−Ｄは、３ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールにより不妊となり、次に生殖能力を回復した動物からの精巣を示す；パネルＥ−Ｆは、６ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールにより不妊となり、次に生殖能力を回復した動物からの精巣を示す；パネルＧ−Ｈは、６ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールにより不妊となり、不妊のままの動物からの精巣を示す。パネルＡ、Ｃ、ＥおよびＧは全て同一倍率であり、バー＝２００μｍである。パネルＢ、Ｄ、ＦおよびＨは全て同一倍率であり、バー＝２００μｍである。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、ビヒクルまたは６ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールで処置した、生殖能力が証明されている雄ラットにおける、循環しているインヒビンＢ、ＦＳＨ、およびテストステロンのレベルの比較を示すグラフである。ガメンダゾールで処置したラットは、生殖能力を回復した動物と、２７週間の期間不妊のままの動物とに分けた。図１０Ａは、インヒビンＢを示す：検出限界は２５ｐｇ／ｍｌである。ヒトのインヒビンＢの標準は、去勢ラット血清において再構築した；したがって、結果はヒトのインヒビンＢに相対的である。図１０Ｂは、ＦＳＨを示す：検出限界は１．５ｎｇ／ｍｌである。図１０Ｃは、テストステロンを示す：検出限界は０．０４ｎｇ／ｍｌである。
【００２０】
【図１２Ａ】図１２Ａ−１２Ｂは、in vitroでの初代セルトリ細胞におけるガメンダゾールの反応および結合を示すグラフである。セルトリ細胞は、示した濃度でのガメンダゾールの存在下または不在下でインキュベートした。培地を収集し、インヒビンＢについて処置の７２時間後にアッセイした（図１２Ａ）。
【図１２Ｂ】細胞はＡＴＰ含量について、処置の４８時間後にアッセイした（図１２Ｂ）
【図１３】図１３は、ガメンダゾール（ＧＭＺ−ＢＴ−ＵＶ）の、in vitroでのマウスセルトリ細胞への結合の画像である。パネルＡは、ホルマリン固定した界面活性剤溶解セルトリ細胞における、ＧＭＺ−ＢＴ−ＵＶの結合を示す。パネルＢは、１０倍過剰なガメンダゾールの存在下での結合を示す。パネルＣは、１０倍過剰なＬＮＤの存在下での結合を示す。パネルＤは、ＦＩＴＣ−アビジンのみを用いた対照のインキュベーションを示す。バー＝５０μｍ。
【００２１】
【図１４】図１４のパネルＡは、ビオチン化ガメンダゾール（ガメンダゾール−ＢＴ）を用いた、ＴＭ−４セルトリ細胞サイトゾルタンパク質親和性結合を示す。レーン１および２はそれぞれ、銀染色出発サイトゾルおよび、除去済みの（pre-cleared)アビジン−アガロース処置したサイトゾルを示す。レーン３および４：１０倍過剰なガメンダゾールの不在下（レーン３）および存在下（レーン４）における、ガメンダゾール−ＢＴでインキュベートしたサイトゾルから得た、ガメンダゾール溶出物。レーン５および７：ガメンダゾール−ＢＴのみでインキュベートしたサイトゾルを適用したカラムからの、２５０および６００ｍＭのＮａＣｌ溶出液。レーン６および８：ガメンダゾール−ＢＴおよび過剰なガメンダゾールでインキュベートしたサイトゾルを適用したカラムからの、２５０および６００ｍＭのＮａＣｌ溶出物。レーン３の矢印：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＦによりＨＳＰ９０ＡＢ１と同定されたバンド。レーン７の矢印：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＦによりＥＥＦ１Ａ１と同定されたバンド。  図１４のパネルＢは、ガメンダゾール−ＢＴを用いた、ラット精巣サイトゾルタンパク質親和性結合を示す。レーン１および２はそれぞれ、クマジー染色出発サイトゾルおよび、除去済みのアビジン−アガロース処置したサイトゾルを示す。カラムの溶出は、段階的に、１．５ｍＭ（レーン３−４）、次に３．０ｍＭ（レーン５−６）のガメンダゾールで、次に６００ｍＭのＮａＣｌ（レーン７−８）で行った。各ペアの初めのレーンは、ガメンダゾール−ＢＴのみでインキュベートしたサイトゾルからの溶出物を示し、２番目のレーンは、ガメンダゾール−ＢＴおよび過剰なガメンダゾールでインキュベートしたサイトゾルからの溶出物を示す。９０ｋＤＡでの矢印は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＦによりＨＳＰ９０ＡＢ１と同定されたレーン３のバンドを示す。５３ｋＤＡでの矢印は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＦによりＥＥＦ１Ａ１と同定されたレーン７のバンドを示す。パネルＢの下の２つの図は、ＨＳＰ９０ＡＢ１とＥＥＦ１Ａ１のウェスタンブロットを示し、これらはそれぞれ、ＨＳＰ９０ＡＢ１とＥＥＦ１Ａ１における矢印で示されたゲルの対応する領域を示す。  図１４のパネルＣは、ビオチン化ガメンダゾール（ガメンダゾール−ＢＴ）を用いた、ＩＤ８卵巣癌細胞サイトゾルタンパク質親和性結合を示す。レーンは、上のパネルＡと同じ処置を示す。レーン３および７の矢印は、それぞれＨＳＰ９０ＡＢ１とＥＥＦ１Ａ１の位置に対応するバンドを表す。
【００２２】
【図１５】図１５のパネルＡは、ＢＴ−ＵＶ−ガメンダゾールの、精製されたS. cerevisaeＨＳＰ８２への直接結合および、ガメンダゾールとＬＮＤによる競合を示す。  図１５のパネルＢは、１３．７μＭのＢＴ−ＵＶ−ガメンダゾールおよびＨＳＰ９０阻害剤であるゲルダナマイシンおよびＫＵ−１の、精製酵母ＨＳＰ８２への競合的結合を示す。  図１５のパネルＣは、１３．７μＭのＢＴ−ＵＶ−ガメンダゾールの、精製されたO caniculusＥＥＦ１Ａ１への、ガメンダゾールとＬＮＤによる競合的結合を示す。  図１５のパネルＤは、ＢＴ−ＵＶ−ガメンダゾールの、精製されたS. cerevisaeＴＥＦ１への直接結合および、ガメンダゾールによる競合的結合を示す。  図１５のパネルＥは、ＢＴ−ＵＶ−ガメンダゾールの、精製されたS. cerevisaeＴＥＦ１への直接結合および、対照のタンパク質ＴＥＦ３およびＨＳＢ１への結合の不在を示す。
【図１６】図１６は、ガメンダゾールで処置したＭＣＦ−７細胞における、ＥＲＢＢ２、ＡＫＴ１、ＨＳＰ９０およびアクチンのウェスタンブロット分析を示す図である。濃度は全てμＭで表し、既知のＨＳＰ９０阻害剤であるゲルダナマイシン（５００ｎＭ）を陽性対照として用いた。
【００２３】
【図１７】図１７は、ガメンダゾールにより変化させていない初代セルトリ細胞における、ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＥＦＦ１Ａ１の免疫組織化学構造を示す。ガメンダゾールの不在下（パネルＡ）または存在下（パネルＢ）で、２４時間インキュベートした初代マウスセルトリ細胞における、ＨＳＰ９０ＡＢ１の免疫組織化学構造。ガメンダゾールの不在下（パネルＣ）または存在下（パネルＤ）で、２４時間インキュベートした初代マウスセルトリ細胞における、ＥＦＦ１Ａ１の免疫組織化学構造。バー＝５０μｍ。
【図１８Ａ】図１８Ａ−１８Ｂは、ウサギ網状赤血球溶解産物および細胞増殖における、ホタルルシフェラーゼの復元に対する、ＨＳＰ９０阻害の効果を示すグラフである。図１８Ａは、ガメンダゾール（黒丸）およびノバビオシン（白丸）の、熱的変性ホタルルシフェラーゼのＨＳＰ９０媒介性リフォールディングを抑制する能力を示す。値は、３回実施した実験の代表における平均±ＳＥを表す。アッセイは３回繰り返し、ノバビオシンのＩＣ５０は、前に発表された値と良好に相関した。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＭＣＦ−７細胞を種々の濃度のガメンダゾール（黒丸）またはノバビオシン（白丸）を用いてインキュベートしたものを示す。生存細胞は、ＭＴＳ／ＭＰＳアッセイを用いて方法の節に記載したようにして定量化した。値は、３回実施した実験の代表における平均±ＳＥを表す。アッセイは３回繰り返し、ノバビオシンのＩＣ５０は、前に発表された値と良好に相関した。
【００２４】
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂは、ＴＥＦ１ヌクレオチド結合アッセイを示すグラフである。ｍａｎｔ−ＧＭＰＰＮＰ（Ａ）およびｍａｎｔ−ＧＤＰ（Ｂ）のアリコートを、結合緩衝液およびＴＥＦ１（１μＭ）と５０μＭのガメンダゾールに加えた。蛍光をＦＲＥＴにより、２８０ｎｍの励起および４４０nmの発光で、ｍａｎｔ部分について測定した。データは双曲線に適合し、Ｋｄ値を得た。
【図２０】図２０は、ガメンダゾール（１０ｎＭ）の存在または不在下で０〜２４０分処置した初代セルトリ細胞における、Ｉｌ１ａのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図２１】図２１は、経口で単回用量（１００ｍｇ／ｋｇ）のＨ２−ガメンダゾールを投与の５日後に、雌マウスは卵巣重量の減少（図２１、パネルＡ）、および血清プロゲステロンレベルの減少（図２１、パネルＢ）を有することを示すグラフである。
【図２２】図２２は、Ｈ２−ガンメンダゾール（１００ｍｇ／ｋｇ）の投与の５日後に、複数の退縮／死滅卵胞が存在することを示す、卵巣組織構造の図である。
【図２３】図２３は、用量の増加に対する生殖能力抑制の確率を示すグラフである。
【００２５】
好ましい態様の詳細な説明
本発明のいくつかの化合物は、熱ショックタンパク質または熱ショックタンパク質に関連するシャペロンタンパク質に直接的または間接的に結合することにより、その抗生殖能効果を示すと考えられる。本発明の化合物は、熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０ＡＢ１を阻害可能であることが見出された。本明細書に記載された化合物はまた、真核生物翻訳伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）を阻害可能であることが見出されている。化合物はさらにまた、インターロイキン１および／またはＮＦ−κＢ阻害剤α（Ｎｆｋｂｉａ）の増加を誘発することができる。本化合物はまた、セルトリ細胞および卵巣細胞、例えば卵胞などを選択的に標的化できる可能性がある。
【００２６】
９０ｋＤａの熱ショックタンパク質は、細胞内機能を調節するシャペロンのファミリーに属し、これらは熱ショックに続く変性タンパク質のリフォールディングおよび、細胞プロセスに関与する多数のキータンパク質の立体構造的成熟に必要とされる。したがって、ＨＳＰ９０タンパク質または関連タンパク質の阻害は、生殖能力の阻害に有用となり得る。酵母においては、やや低い分子量８３ｋＤａのＨｓｐ９０の相同体（Ｈｓｐ８３）が、同一の機能を有する。シャペロンのＨｓｐ９０ファミリーは、４つの異なるアイソフォームからなる。Ｈｓｐ９０αおよびＨｓｐ９０βは主にサイトゾルに見出され、９４ｋＤａのグルコースにより調節されるタンパク質（「ＧＲＰ９４」）は小胞体に局在し、Ｈｓｐ７５／腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質１（「ＴＲＡＰ−１」）は主に、ミトコンドリアマトリックスに存在する。これらのＨｓｐ９０は、コシャペロンであるイムノフィリンおよびパートナータンパク質の存在下でクライアントタンパク質に結合して、新しく形成された新生ペプチドの、生物学的に活性な３次元構造への立体構造的成熟に役割を果たす、多タンパク質複合体を作る。
以下にさらに十分に議論するように、Ｈｓｐ９０は、活性なホモダイマーのＮ末端領域にＡＴＰ結合部位を有するＡＴＰ依存タンパク質である。Ｈｓｐ９０のＡＴＰアーゼ活性の破壊は、多タンパク質複合体の安定化と、続くクライアントタンパク質のユビキチン化をもたらし、クライアントタンパク質はプロテアゾーム媒介性加水分解を受ける。
【００２７】
さらに具体的には、ＡＴＰ依存性の様式で、Ｈｓｐ７０は新しく合成されたタンパク質に共翻訳的に、および／または翻訳後的に結合して、凝集を防ぐことにより新生ペプチドを安定化する。Ｈｓｐ７０／ポリペプチド二元複合体の安定化は、Ｈｓｐ７０結合タンパク質（「ＨＩＰ」）の結合に依存し、これはＨｓｐ７０が新しく形成されたペプチドに結合した後に起こる。Ｈｓｐ７０−Ｈｓｐ９０形成（organizing）タンパク質（「ＨＯＰ」）は、Ｈｓｐ７０とＨｓｐ９０の両方により認識される、高度に保存されたＴＰＲ（テトラトリコプチドリピート）を含有し、Ｈｓｐ７０／ＨＩＰとＨｓｐ９０の結合を促進して、ヘテロタンパク質複合体をもたらす。テロメラーゼおよびステロイドホルモン受容体の場合、クライアントタンパク質は、Ｈｓｐ７０、ＨＩＰおよびＨＯＰの放出と共に、Ｈｓｐ７０系からＨｓｐ９０ホモダイマーに移動される。ＡＴＰとｃｉｓ／ｔｒａｎｓプロリル−イソメラーゼ活性を有するイムノフィリン（ＦＫＢＰ５１、ＦＫＢＰ−５２、またはＣｙＰＡ）が結合すると、アンサンブルはクライアントタンパク質を三次元構造に畳み込む。続くイベントにおいて、ｐ２３はＮ末端領域近くでＨｓｐ９０に結合し、ＡＴＰの加水分解および、折り畳まれたタンパク質のＨｓｐ９０パートナータンパク質およびＡＤＰの放出を促進する。
【００２８】
立体構造的成熟のためにＨｓｐ９０に依存するタンパク質の例としては、発癌性Ｓｒｃキナーゼ、Ｒａｆ、変異体ｐ５３（正常なｐ５３ではない）、テロメラーゼ、ステロイドホルモン受容体、ｐｏｌｏ様キナーゼ（「ＰＬＫ」）、タンパク質キナーゼＢ（「ＡＫＴ」）、デスドメインキナーゼ（「ＲＩＰ」）、ＭＥＴキナーゼ、焦点接着キナーゼ（「ＦＡＫ」）、アリール炭化水素受容体、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（「ＰＫＲ」）、酸化窒素合成酵素（「ＮＯＳ」）、中心体タンパク質などが挙げられる。さらに、他のタンパク質、例えばサイクリン依存性キナーゼ４「ＣＤＫ４」）、サイクリン依存性キナーゼ６「ＣＤＫ６」）、およびヒト上皮成長因子受容体２（「Ｈｅｒ−２」）は、Ｈｓｐ９０のクライアントタンパク質であると考えられている。したがって、Ｈｓｐ９０の阻害は、生殖能力を阻害する治療薬の開発の標的であり、なぜならば、複数のシグナル伝達経路を同時に、Ｈｓｐ９０のタンパク質折り畳み機構の混乱により阻害することができるためである。
したがって、本発明は、ロニダミン構造に基づく新規な化合物（たとえばロニダミンアナログ）に、および生殖能力を調節する使用の方法に関する。ロニダミン（１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸）は、インダゾールカルボン酸化合物の群に属する。生殖能力の阻害に用いることができるロニダミンアナログのいくつかの例を、以下に記載する。
【００２９】
本発明の１側面において、式Ｉの化合物が提供される：
【化２】
2012532198.tif 000003
式Ｉにおいて、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素であり；およびその薬学的に許容し得る塩およびエステルである。
【００３０】
Ｒ２が水素以外である場合、Ｒ１は、−ＣＯＯＣＨ３、−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＮＨＣＨ３、または−ＣＯＮＨＮ（ＣＨ３）２であることができる。Ｒ２が水素の場合、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１つは窒素であり、残りは独立して窒素または炭素であるか、または、Ｒ１は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＮ（ＣＨ３）２、−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨではない。さらにＲ１は、プロピオン酸、２−メチルプロピオン酸、オキシランカルボン酸、シクロプロパンカルボン酸、プロピオン酸メチルエステル、２−メチルプロピオン酸メチルエステル、オキシランカルボン酸メチルエステル、シクロプロパンカルボン酸メチルエステルから選択される、カルボン酸またはカルボン酸エステルであることができる。
【００３１】
本発明の１側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（本明細書においてＲＣ−ＭＣ−３０とも呼ばれる）を含む化合物が提供される。
【化３】
2012532198.tif 000004
本発明の別の側面において、１−［（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール］−３−カルボン酸エチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−１５６）を含む化合物が提供される。
【化４】
2012532198.tif 000005
さらに本発明の別の側面において、１−［（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール］−３−カルボン酸プロピルエステル（ＲＣ−ＭＣ−１５８）を含む化合物が提供される。
【化５】
2012532198.tif 000006
【００３２】
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸Ｎ−メチルヒドラジド（ＲＣ−ＭＣ−１２０）を含む化合物が提供される。
【化６】
2012532198.tif 000007
本発明の別の側面において、６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＤＤ−ＭＣ−Ｉ）を含む化合物が提供される。
【化７】
2012532198.tif 000008
さらに別の側面において、本発明は、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＳＷ−１−２８４）を含む化合物を含む。
【化８】
2012532198.tif 000009
【００３３】
さらに本発明の別の側面において、１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−２０）を含む化合物が提供される。
【化９】
2012532198.tif 000010
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−２８０）を含む化合物が提供される。
【化１０】
2012532198.tif 000011
さらにまた、本発明の別の側面において、１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−１８）を含む化合物が提供される。
【化１１】
2012532198.tif 000012
【００３４】
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＪＷＳ−１−１９０）を含む化合物が提供される。
【化１２】
2012532198.tif 000013
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］プロピオン酸を含む化合物が提供される。
【化１３】
2012532198.tif 000014
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＪＷＳ−１−２９８）を含む化合物が提供される。
【化１４】
2012532198.tif 000015
【００３５】
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２−クロロ，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＪＷＳ−２−３６）を含む化合物が提供される。
【化１５】
2012532198.tif 000016
本発明のさらに別の側面において、６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＤＤ−ＭＣ−ＩＩ）を含む化合物が提供される。
【化１６】
2012532198.tif 000017
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−１−２８２）を含む化合物が提供される。
【化１７】
2012532198.tif 000018
【００３６】
さらに本発明の別の側面において、１−（２−クロロ，４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−２−２２）を含む化合物が提供される。
【化１８】
2012532198.tif 000019
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−１−１６２）を含む化合物が提供される。
【化１９】
2012532198.tif 000020
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−１５８）を含む化合物が提供される。
【化２０】
2012532198.tif 000021
【００３７】
本発明のさらに別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＪＷＳ−１−１７０）を含む化合物が提供される。
【化２１】
2012532198.tif 000022
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−１−１６０）を含む化合物を提供することは、本発明のさらに別の側面である。
【化２２】
2012532198.tif 000023
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−１００）を含む化合物が提供される。
【化２３】
2012532198.tif 000024
【００３８】
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−１−２７６）を含む化合物が提供される。
【化２４】
2012532198.tif 000025
さらに、本発明の別の側面において、１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−１４）を含む化合物が提供される。
【化２５】
2012532198.tif 000026
本発明の別の側面において、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−２７０）を含む化合物が提供される。
【化２６】
2012532198.tif 000027
【００３９】
さらに本発明の別の側面において、１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−１２）を含む化合物が提供される。
【化２７】
2012532198.tif 000028
本発明のさらなる別の側面において、ｃｉｓ３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ｃｉｓＲＣ−ＭＣ−１１０）を含む化合物が提供される。
【化２８】
2012532198.tif 000029
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＪＷＳ−１−２９４）を含む化合物が提供される。
【化２９】
2012532198.tif 000030
【００４０】
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２−クロロ，４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＪＷＳ−２−４０）を含む化合物が提供される。
【化３０】
2012532198.tif 000031
また、本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチル−アクリル酸（ＲＣ−ＭＣ−２１７）を含む化合物が提供される。
【化３１】
2012532198.tif 000032
本発明のさらなる側面において、ｔｒａｎｓ３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル（ｔｒａｎｓＲＣ−ＭＣ−２００）を含む化合物が提供される。
【化３２】
2012532198.tif 000033
【００４１】
本発明のさらなる側面において、ｃｉｓ３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル（ｃｉｓＲＣ−ＭＣ−２００）を含む化合物が提供される。
【化３３】
2012532198.tif 000034
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＲＣ−ＭＣ−１０１）を含む化合物が提供される。
【化３４】
2012532198.tif 000035
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−１−２７４）を含む化合物が提供される。
【化３５】
2012532198.tif 000036
【００４２】
さらに本発明の別の側面において、１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−２−１６）を含む化合物が提供される。
【化３６】
2012532198.tif 000037
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２；Ｈ２−ガメンダゾール）を含む化合物が提供される。
【化３７】
2012532198.tif 000038
ＪＷＳ−２−７２（Ｈ２−ガメンダゾール）
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＲＣ−ＭＣ−１１０）（ガメンダゾールとしても知られている）を含む化合物が提供される。
【化３８】
2012532198.tif 000039
ガメンダゾール（ＲＣ−ＭＣ−１１０）
【００４３】
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸（ＲＣ−ＭＣ−２９４）を含む化合物が提供される。
【化３９】
2012532198.tif 000040
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル（ＪＷＳ−２−７０）を含む化合物が提供される。
【化４０】
2012532198.tif 000041
本発明のさらなる側面において、１−（４−クロロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−２１２）を含む化合物が提供される。
【化４１】
2012532198.tif 000042
【００４４】
本発明のさらなる側面において、１−（４−クロロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−２１０）を含む化合物が提供される。
【化４２】
2012532198.tif 000043
本発明のさらなる側面において、３−［１−（４−クロロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−２−２２４）を含む化合物が提供される。
【化４３】
2012532198.tif 000044
本発明のさらなる側面において、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−２２８）を含む化合物が提供される。
【化４４】
2012532198.tif 000045
【００４５】
本発明のさらなる側面において、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−２−［１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸（ＪＷＳ−３−６）を含む化合物が提供される。
【化４５】
2012532198.tif 000046
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロプ−２−エン―１−オール（ＲＣ−ＭＣ−２２３）を含む化合物が提供される。
【化４６】
2012532198.tif 000047
本発明のさらなる側面において、ｔｒａｎｓ−３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリロニトリル（ＲＣ−ＭＣ−２２２Ｔｒａｎｓ）を含む化合物が提供される。
【化４７】
2012532198.tif 000048
【００４６】
本発明のさらなる側面において、ｃｉｓ−３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリロニトリル（ＲＣ−ＭＣ−２２２ｃｉｓ）を含む化合物が提供される。
【化４８】
2012532198.tif 000049
本発明のさらなる側面において、４−［１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ブト−３−エン−２−オン（ＲＣ−ＭＣ−２１６）を含む化合物が提供される。
【化４９】
2012532198.tif 000050
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−３−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル］−ビニル］−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール（ＲＣ−ＭＣ−２２５）を含む化合物が提供される。
【化５０】
2012532198.tif 000051
【００４７】
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド（ＲＣ−ＭＣ−２０５）を含む化合物が提供される。
【化５１】
2012532198.tif 000052
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−２８８）を含む化合物が提供される。
【化５２】
2012532198.tif 000053
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−２８７）を含む化合物が提供される。
【化５３】
2012532198.tif 000054
【００４８】
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＲＣ−ＭＣ−２９２）を含む化合物が提供される。
【化５４】
2012532198.tif 000055
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−２９１）を含む化合物が提供される。
【化５５】
2012532198.tif 000056
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−２６３）を含む化合物が提供される。
【化５６】
2012532198.tif 000057
【００４９】
本発明のさらに別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−２６２）を含む化合物が提供される。
【化５７】
2012532198.tif 000058
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＲＣ−ＭＣ−２６５）を含む化合物が提供される。
【化５８】
2012532198.tif 000059
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−２６４）を含む化合物が提供される。
【化５９】
2012532198.tif 000060
【００５０】
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−１０２）を含む化合物が提供される。
【化６０】
2012532198.tif 000061
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−１００）を含む化合物が提供される。
【化６１】
2012532198.tif 000062
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−２−１１２）を含む化合物が提供される。
【化６２】
2012532198.tif 000063
【００５１】
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−１１０）を含む化合物が提供される。
【化６３】
2012532198.tif 000064
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−２−１０４）を含む化合物が提供される。
【化６４】
2012532198.tif 000065
本発明のさらなる側面において、１−（４−クロロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−２１６）を含む化合物が提供される。
【化６５】
2012532198.tif 000066
【００５２】
本発明のさらなる側面において、１−（４−クロロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−２１４）を含む化合物が提供される。
【化６６】
2012532198.tif 000067
本発明のさらなる側面において、３−［１−（４−クロロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−２−２３２）を含む化合物が提供される。
【化６７】
2012532198.tif 000068
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ−２−１７８）を含む化合物が提供される。
【化６８】
2012532198.tif 000069
【００５３】
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＴＨ−２−１９２）を含む化合物が提供される。
【化６９】
2012532198.tif 000070
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ−２−１７９）を含む化合物が提供される。
【化７０】
2012532198.tif 000071
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−１２２）を含む化合物が提供される。
【化７１】
2012532198.tif 000072
【００５４】
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−１２０）を含む化合物が提供される。
【化７２】
2012532198.tif 000073
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−２−１３２）を含む化合物が提供される。
【化７３】
2012532198.tif 000074
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−２−１２４）を含む化合物が提供される。
【化７４】
2012532198.tif 000075
【００５５】
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−２６０）を含む化合物が提供される。
【化７５】
2012532198.tif 000076
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−２５１）を含む化合物が提供される。
【化７６】
2012532198.tif 000077
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＲＣ−ＭＣ−２６１）を含む化合物が提供される。
【化７７】
2012532198.tif 000078
【００５６】
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−２５７）を含む化合物が提供される。
【化７８】
2012532198.tif 000079
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３，６−ジカルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−２４７）を含む化合物が提供される。
【化７９】
2012532198.tif 000080
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３，６−ジカルボン酸−３−メチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−２５２）を含む化合物が提供される。
【化８０】
2012532198.tif 000081
【００５７】
本発明のさらなる側面において、３−（２−カルボキシ−ビニル）−１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−２５９）を含む化合物が提供される。
【化８１】
2012532198.tif 000082
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−３−（２−メトキシカルボキシ−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−２５８）を含む化合物が提供される。
【化８２】
2012532198.tif 000083
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオルメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−１−２６０）を含む化合物が提供される。
【化８３】
2012532198.tif 000084
【００５８】
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオルメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−１）を含む化合物が提供される。
【化８４】
2012532198.tif 000085
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオルメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−２５４）を含む化合物が提供される。
【化８５】
2012532198.tif 000086
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオルメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−３００）を含む化合物が提供される。
【化８６】
2012532198.tif 000087
【００５９】
本発明のさらに別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオルメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−１−２６８）を含む化合物が提供される。
【化８７】
2012532198.tif 000088
さらに本発明の別の側面において、３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオルメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−２−１０）を含む化合物が提供される。
【化８８】
2012532198.tif 000089
さらに、本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオルメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−１−２５８）を含む化合物が提供される。
【化８９】
2012532198.tif 000090
【００６０】
さらに本発明の別の側面において、１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオルメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−１−３０２）を含む化合物が提供される。
【化９０】
2012532198.tif 000091
さらに本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−２７０）を含む化合物が提供される。
【化９１】
2012532198.tif 000092
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−２６８）を含む化合物が提供される。
【化９２】
2012532198.tif 000093
【００６１】
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−２−２７８）を含む化合物が提供される。
【化９３】
2012532198.tif 000094
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−４−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−９４）を含む化合物が提供される。
【化９４】
2012532198.tif 000095
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−４−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−９２）を含む化合物が提供される。
【化９５】
2012532198.tif 000096
【００６２】
さらに別の側面において、式ＩＩ（Ａ）の化合物が提供され、ここで置換基は式Ｉに関連して記載されたものと同一である：
【化９６】
2012532198.tif 000097
式ＩＩ（Ａ）の誘導体の例としては、以下が挙げられる：１−（２，４−（ジフルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸；１−（２，４−（ジフルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン］−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン］−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン］−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−（ジフルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−イル］アクリル酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド；および１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド。追加の例は、本明細書に提供される。
【００６３】
本発明のさらに別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸（ＪＷＳ−１−１１４）を含む化合物が提供される。
【化９７】
2012532198.tif 000098
本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−１１０）を含む化合物が提供される。
【化９８】
2012532198.tif 000099
本発明のさらなる側面において、３-［１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−イル］アクリル酸（ＪＷＳ−２−１７６）を含む化合物が提供される。
【化９９】
2012532198.tif 000100
【００６４】
本発明のさらに別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−１−１１２）を含む化合物が提供される。
【化１００】
2012532198.tif 000101
さらに、本発明は、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸（ＪＷＳ−１−２３０）を含む化合物を含む。
【化１０１】
2012532198.tif 000102
本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−２２８）を含む化合物が提供される。
【化１０２】
2012532198.tif 000103
【００６５】
さらに、本発明は、１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−１−２３２）を含む化合物を含む。
【化１０３】
2012532198.tif 000104
さらに、本発明は、１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−メトキシ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸（ＪＷＳ−１−１４４）を含む化合物を含む。
【化１０４】
2012532198.tif 000105
本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−メトキシ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−１４２）を含む化合物が提供される。
【化１０５】
2012532198.tif 000106
【００６６】
さらに、本発明は、１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−メトキシ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ−１−１４６）を含む化合物を含む。
【化１０６】
2012532198.tif 000107
さらに別の側面において、式ＩＩ（Ｂ）の化合物：
【化１０７】
2012532198.tif 000108
が提供される。
さらに別の側面において、式ＩＩ（Ｃ）の化合物が提供され、ここで置換基は式Ｉに関連して記載されたものと同一である：
【化１０８】
2012532198.tif 000109
【００６７】
式ＩＩ（Ｃ）誘導体の例としては、以下が挙げられる：３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−イル］アクリル酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−イル］アクリル酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド；および１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド。追加の例は、本明細書に提供される。
本発明のさらに別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸（ＪＷＳ−１−１３２）を含む化合物が提供される：
【化１０９】
2012532198.tif 000110
本発明の別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−１−１３０）を含む化合物が提供される：
【化１１０】
2012532198.tif 000111
【００６８】
さらに別の側面において、式ＩＩ（Ｄ）による化合物が提供され、ここで置換基は式Ｉに関連して記載されたものと同一である：
【化１１１】
2012532198.tif 000112
式ＩＩ（Ｄ）の誘導体の例としては、以下が挙げられる：１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル］−アクリル酸；および１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド。
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−８６）を含む化合物が提供される：
【化１１２】
2012532198.tif 000113
本発明のさらに別の側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル］−アクリル酸（ＲＣ−ＭＣ−６５）を含む化合物が提供される：
【化１１３】
2012532198.tif 000114
【００６９】
本発明のさらに別の側面において、１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸ヒドラジド（ＲＣ−ＭＣ−６０）を含む化合物が提供される：
【化１１４】
2012532198.tif 000115
さらに別の側面において、式ＩＩ（Ｆ）に包含される化合物が提供され、ここで置換基は式Ｉに関連して記載されたものと同一である：
【化１１５】
2012532198.tif 000116
式ＩＩ（Ｆ）の導誘体の例としては、以下が挙げられる：１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−３−イル］−アクリル酸；および１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−３−カルボン酸ヒドラジド。
【００７０】
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−２９８）を含む化合物が提供される：
【化１１６】
2012532198.tif 000117
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−２９６）を含む化合物が提供される：
【化１１７】
2012532198.tif 000118
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−３−１）を含む化合物が提供される：
【化１１８】
2012532198.tif 000119
【００７１】
さらに別の側面において、式ＩＩ（Ｅ）に包含される化合物が提供され、ここで置換基は式Ｉに関連して記載されたものと同一である：
【化１１９】
2012532198.tif 000120
式ＩＩ（Ｅ）の誘導体の例としては、以下が挙げられる：１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−３−イル］−アクリル酸；および１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−３−カルボン酸ヒドラジド。
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−３−カルボン酸（ＪＷＳ−２−２５６）を含む化合物が提供される：
【化１２０】
2012532198.tif 000121
【００７２】
本発明のさらなる側面において、１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−３−カルボン酸メチルエステル（ＪＷＳ−２−２４６）を含む化合物が提供される：
【化１２１】
2012532198.tif 000122
本発明のさらなる側面において、３−［１−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ−２−２５４）を含む化合物が提供される：
【化１２２】
2012532198.tif 000123
本発明は以下の記述によりさらに説明されるが、これは本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００７３】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、６位のＲ２がハロゲン、アルコキシ、またはカルボン酸であるものを含めることができ、例えば以下である：１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；５−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
【００７４】
１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３，６−ジカルボン酸−３−メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３，６−ジカルボン酸−３−メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３，６−ジカルボン酸−３−メチルエステル；３−（２−カルボキシ−ビニル）−１−（２，４−ジフルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸；３−（２−カルボキシ−ビニル）−１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸；３−（２−カルボキシ−ビニル）−１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロ−ベンジル）−３−（２−メトキシカルボニル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジル）−３−（２−メトキシカルボニル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸；および１−（２−フルオロ−４−クロロ−ベンジル）−３−（２−メトキシカルボニル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸。
【００７５】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ２がトリハロアルキルであるものを含めることができる：１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（４−メチル−２−クロロ−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（４−メチル−２−フルオロ−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（４−メチル−２−クロロ−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（４−メチル−２−フルオロ−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチル−アクリル酸；ｔｒａｎｓ３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；ｃｉｓ３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；
【００７６】
１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；および３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル。
【００７７】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ２が低級アルキルであるものを含めることができる：１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル；および３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル。
【００７８】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ２がジハロアルキルであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジフルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド。
【００７９】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ２がモノハロアルキルであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；および３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド。
【００８０】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ２がアルコールであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸メチルエステル；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；および３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド。
【００８１】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ２がアルコールであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（４−メチル−２−クロロ−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（４−メチル−２−フルオロ−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；３−［１−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（４−メチル−２−クロロ−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（４−メチル−２−フルオロ−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸メチルエステル；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；および３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド。
【００８２】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ２がアミノであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸メチルエステル；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸メチルエステル；１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド；および３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸ヒドラジド。
【００８３】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、式Ｉ（Ａ）によるＲ２を含むことができる：
【化１２３】
2012532198.tif 000124
式Ｉ（Ａ）の誘導体の例としては、１−（２，４−ジフルオロ−ベンジル）−３−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−３−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−ビニル］−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール；および１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−３−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−ビニル］−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾールが挙げられる。
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、式Ｉ（Ｂ）によるＲ１を含むことができる：
【化１２４】
2012532198.tif 000125
式中、Ｒ３は水素、アルキル、アラルキル、またはシクロアルキルであり；
および式中、Ｗは、炭素または酸素であり；
ＸおよびＹは、独立してハロゲンであり；および／または
Ｒ２は、トリハロアルキルである。
【００８４】
式Ｉ（Ｂ）の誘導体の例としては、以下が挙げられる：３−［１−（２，４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；２−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；２−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；２−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ハロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２，４−フルオロベンジル）−６−ハロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ハロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ハロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；２−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−ハロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；２−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ハロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；２−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ハロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；および２−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ハロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸。
【００８５】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸エステルで、Ｒ２が水素であるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；１−［（２，４−ジフルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール］−３−カルボン酸エチルエステル；１−［（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール］−３−カルボン酸エチルエステル；１−［（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール］−３−カルボン酸エチルエステル；１−［（２，４−ジフルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール］−３−カルボン酸プロピルエステル；１−［（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール］−３−カルボン酸プロピルエステル；および１−［（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール］−３−カルボン酸プロピルエステル。
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸で、Ｒ２が水素、アルコキシ、またはカルボン酸であるものを含めることができる：１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３，６−ジカルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３，６−ジカルボン酸；および１−（２−フルオロ−４−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３，６−ジカルボン酸。
【００８６】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸で、Ｒ２がトリハロアルキルであるものを含めることができる：１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（４−メチル−２−クロロ−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（４−メチル−２−フルオロ−ベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸；３−［１−（２，４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２，４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；２−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；２−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；２−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；
【００８７】
２−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；３−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸；３−［１−（２，４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロピオン酸；３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２，４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；３−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸；２−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸；２−［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸、２−［１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸、および２−［１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸。
【００８８】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸で、Ｒ２がジハロアルキルであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；および１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−ジフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸。
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸で、Ｒ２がモノハロアルキルであるものを含めることができる：１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；および１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−フルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸。
【００８９】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸で、Ｒ２がトリハロアルキルであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（４−メチル−２−クロロ−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（４−メチル−２−フルオロ−ベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；および１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸。
【００９０】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸で、Ｒ２がアミノであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−４−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−フルオロベンジル）−４−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−４−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；および１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−４−ジメチルアミノ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸。
【００９１】
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸で、Ｒ２が低級アルキルであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−フルオロベンジル）−４−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−４−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；および１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−４−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸。
上記に加えて、式Ｉによる誘導体は、Ｒ１がカルボン酸で、Ｒ２がアルコールであるものを含めることができる：１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２，４−ジフルオロベンジル）−５−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−５−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；および１−（２−フルオロ−４−クロロベンジル）−５−ヒドロキシメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸。
【００９２】
生殖能力を調節する
本明細書に記載の化合物は、雄および雌の生殖能力の管理に用いることができる。化合物は、１または２以上の用量で投与して、生殖能力を一定期間阻害するため、または雄または雌を不妊化するために用いることができる。
本明細書で用いるガメンダゾールとは、Ｈ２−ガメンダゾール（すなわち、ＪＷＳ−２−７２またはＧＭＺ）を言い、これは、新規なインダゾールカルボン酸誘導体であり、雄の精子形成の可逆的な阻害剤であることが示されている。ガメンダゾールは、２５ｍｇ／ｋｇのＩＰ用量にて、任意の器官において明らかな組織病理なしに、動物試験で良好に耐容される。ガメンダゾールを投与したラットにおいて、処置後の５日間に、行動変化または体重変化の証拠はなかった。最近の研究により、ガメンダゾールは、ラットのセルトリ細胞においてＨＳＰ９０阻害剤として作用することが見出された。ＧＭＺは、親和性クロマトグラフィおよび直接結合試験により示されるように、ＨＳＰ９０−β、ＨＳＰ９０ＡＢ１、および真核生物伸長因子ＥＥＦ１Ａ１に直接結合する。
【００９３】
７匹の生殖能力の証明された雄ラットに６ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールを１回経口投与した後の３週間に、７匹共に、１００％の不妊性が実現されたことが示された。生殖能力は、７匹のうち４匹の動物において９週間の間に回復し、典型的な数の正常に見える受胎産物を有していた。３ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールを１回経口投与して不妊となった６匹の動物のうち４匹に、１００％の生殖能力が回復した。ガメンダゾールで処置した両方の群と、対照動物（ビヒクルのみ）の間に、交尾行動の違いは観察されなかった。可逆的な不妊を示した動物において、循環ＦＳＨレベルにおける一時的な増加が、ガメンダゾール投与後のインヒビンＢの初期の低下と符号したが、その他の循環生殖ホルモンにおいて有意な変化は観察されなかった。ガメンダゾールは、in vitroで初代セルトリ細胞によるインヒビンＢの産生を６．８±３．０×１０−１０ＭのＩＣ５０で阻害し、セルトリ細胞が一次標的であることを示唆した。ビオチン化ガメンダゾールアナログにより、初代セルトリ細胞における、ガメンダゾールの細胞質および核周囲への結合が明らかにされた。ガメンダゾールは現在までのところ、最も強力で新規な、経口による抗精子形成インダゾールカルボン酸である。しかし我々の結果は、可逆性を改善するため、および治療ウィンドウを広げるためには、この強力な非ホルモン性雄性避妊薬のより詳細な薬品開発を進める前に、追加の用量決定試験が必要であることを示している。
【００９４】
本研究は、ガメンダゾールが小分子雄性避妊薬の候補として前臨床の経路にあるべきであることを示唆する、初めの投与量決定結果を示す。この目的を支持するものとして、ガメンダゾールが現在までに合成されたもっとも強力なＬＮＤのアナログであり、６ｍｇ／ｋｇのみの１回の経口投与後のラットにおいて１００％の不妊を、３ｍｇ／ｋｇの１回の経口投与後に６７％の不妊をもたらしたことを報告する。さらに、不妊となった動物における生殖能力の回復は、３ｍｇ／ｋｇでは１００％、６ｍｇ／ｋｇ用量では５７％であった。生殖能力を回復した動物における正常に見える受胎産物の数および割合は、対照動物と同じであったとの指摘もまた、重要である。比較として、以前のＬＮＤのアナログは、ラットに完全な不妊を誘発するのに２５〜５０ｍｇ／ｋｇで複数用量が必要であった。したがってメンダゾールは、他のＬＮＤアナログより改善されているようである；しかし、ここに報告の１回の経口用量の結果は有望であるが、より低い複数投与量の決定実験によって、理想的な１００％の不妊をもたらすことができ、投与計画が終了すれば１００％生殖能力の回復がもたらされる、より広い治療ウィンドウが存在するかどうかを決定することが必要であることも示唆される。ほぼ１００％の生殖能力回復は、まだ家族を持たない男性に対して市場に出すことを意図する雄性避妊薬には必要であろう。これらの目的に適切にアプローチするために、化合物の製剤化、薬物動態学、薬力薬理学などの研究と共に、追加の投与量決定実験が計画されている。一般に、経口非ホルモン性雄性避妊薬は、現在のホルモンベースの避妊薬に比べて有利であり、それは、後者が一般に、ホルモンの組み合わせや繰り返しの経口投与に加えて、追加の剤の注射を含む複数の投与経路、不妊性の発現までの長期の投与、および生殖能力回復までの長いタイムラグなどを必要とするためである。免疫的避妊アプローチはまた注射を必要とし、個人の有意な小集団における免疫反応の欠如を含む、大きなばらつきを示す。
【００９５】
ガメンダゾールの別のキーとなる側面は、前のＬＮＤアナログについて指摘されたように副作用がないことである。ここで報告する研究において、ＬＮＤおよび類似のアナログはラットへの投与後に、不活発状態、一時的な体重増加の減少、および肝臓および膵臓の組織病理構造をもたらした。しかし、これら観察された副作用のいずれもが、不妊をもたらすのに十分な用量でのガメンダゾールの投与後に、本研究においては指摘されなかった。死亡は、２００ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールにて観察された。
６ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールの１回の経口用量の後の可逆性のレベルは、５７％であったことを指摘する。ガメンダゾールの１回のより低い経口用量（３ｍｇ／ｋｇ）が、生殖能力の６７％の低下と、１００％の生殖能力回復をもたらしたという我々の所見は有望である。可逆性と組み合わされた有効性は、より低い用量だが繰り返しの使用により改善し得る。精子形成周期の期間を考えると、複数回の低用量オプションもまた魅力的であり、それは、週に１回または月に１回の雄性経口避妊薬が精子形成の精子細胞のステージを選択的にブロックでき、また化合物投与の終了後に、最終的には精巣の再増殖が可能となると考えられるためである。
【００９６】
ＨＳＰ９０ＡＢ１（以前にＨＳＰ９０β［熱ショック９０ｋＤａタンパク質１、β］として知られている）およびＥＥＦ１Ａ１（以前にｅＥＦ１Ａ［真核生物翻訳伸長因子１α１］として知られている）は、精巣、セルトリ細胞、およびＩＤ８卵巣癌細胞からのビオチン化ガメンダゾール（ＢＴ−ＧＭＺ）親和性精製の結合標的として同定され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびウェスタン分析により確認された。ＢＴ−ＧＭＺは精製酵母ＨＳＰ８２（哺乳類のＨＳＰ９０ＡＢ１のホモログ）およびＥＥＦ１Ａ１に結合するが、ＴＥＦ３やＨＢＳ１には結合せず、非標識ガメンダゾールと競合する。しかしガメンダゾールは、ＥＥＦ１Ａ１によるヌクレオチド結合は阻害しなかった。ガメンダゾールの精製Saccharomyces cerevisiaeＨＳＰ８２への結合は、ルシフェラーゼのリフォールディングを阻害し、ＨＳＰ９０薬物ゲラダナマイシンまたはノボビオシンアナログＫＵ−１によって競合されなかった。ガメンダゾールは、ＨＳＰ９０依存性のクライアントタンパク質ＡＫＴ１およびＥＲＢＢ２を分解し、ＨＳＰ９０を誘発することなく、ＭＣＦ−７細胞において抗増殖効果を有する。これらのデータは、ガメンダゾールが、選択的ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＥＦＦ１Ａ１阻害剤の新しいクラスであることを示唆した。ガメンダゾールで処置したラットの精巣遺伝子マイクロアレイ分析は、３つのインターロイキン１遺伝子およびＮｆｋｂｉａ（ＮＦ−κＢ阻害剤α）において、経口投与の４時間後に顕著で迅速な増加を示した。ＩＬ１Ａ転写におけるスパイクは、初代セルトリ細胞において、１００ｎＭのガメンダゾールへの暴露の６０分後に確認され、セルトリ細胞が標的であることを実証した。ＡＫＴ１、ＮＦＫＢおよびインターロイキン１は、セルトリ細胞−精子細胞接合部複合体の既知の調節剤である。ガメンダゾール作用の現在のモデルは、この経路が、ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＥＥＦ１Ａ１との相互作用を、精子細胞の減少とその結果の不妊に結び付けると推測する。
【００９７】
定義
用語「マイクロ」は、記号「μ」および文字「ｕ」で表すことができる。したがって、ｕＬはマイクロリットルを表す。
用語「アミノ」は、窒素原子を介して結合した一級、二級、または三級アミノ基を意味し、二級アミノ基はアルキルまたはシクロアルキル置換基を有し、三級アミノ基は２つの同一または異なるアルキルもしくはシクロアルキル置換基、または２つの窒素置換基を有して一緒に環を形成し、例えば、ＮＨ２、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ、ピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジノ、モルホリノなどである。
用語「アルコール」は、１または２以上のヒドロキシ置換基を有する、任意に置換された炭化水素基を指す。６位または５位において、一級、二級、および三級アルコールが意図され、例えばモノアルコール類およびポリヒドロキシ変異体、例えばアルカンジオール、アルカントリオール、アルカンテトロールなどである。好ましいアルカノールは、約１個から１２個までの炭素原子を含むものであり、１個から６個までの炭素原子を有するアルカノールが最も好ましい。好ましい脂肪族アルコールの例は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−プロペン−２−オール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、３−メチル−１−ブタノール、１，２−エタンジオール（エチレングリコール）、１，２，３−プロパントリオール（グリセロール）、ｉ−１，２，３，４−ブタンテトロール（ｉ−エリトリトール）、および２，２−ジヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（ペンタエリスリトール）である。
【００９８】
用語「アルキル」は、１〜２４個の炭素原子の分枝または非分枝の飽和炭化水素基を指し、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどが挙げられる。本明細書の好ましい「アルキル」基は、１〜１２個の炭素原子を含む。「低級アルキル」は１〜６個、より好ましくは１〜４個の炭素原子のアルキル基を指す。
用語「アルコキシ」は、アルキル基で置換されたオキシ含有基を表す。例としては、限定することなく、メトキシ、エトキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシを含む。最も好ましいのは、１〜６個の炭素原子を有する「低級アルコキシ」基である。このような基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、イソプロポキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシアルキルを含む。
用語「アリール」は、１、２、または３個の環を含む炭素環式芳香族基を意味し、ここでかかる環は、ペンダント状に一緒に結合しているか、または融合している。「融合」という用語は、第２の環が、２つの隣接する原子を第一の環と共有すること（共用：shared）により存在すること（すなわち結合または形成されている）を意味する。「融合」の用語は、用語「縮合」と同等である。「アリール」という用語は、例えば、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンおよびビフェニルなどの芳香族基を包含する。
【００９９】
用語「アラルキル」は、アリール置換アルキル基を包含する。好ましいアラルキル基は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基に結合したアリール基を有する「低級アラルキル」基である。かかる基の例としては、ベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチルおよびジフェニルエチルを含む。ベンジルとフェニルメチルの用語は交換可能である。
用語「炭素環式」は、１または２以上の共有結合閉環構造を含むアルキル基であって、環の主鎖を形成する原子が全て炭素原子であるものを指す。この用語はしたがって、炭素環を、環の主鎖が少なくとも１つの非炭素原子を含有する複素環から区別する。
用語「複素環式」または「複素環」は、３〜約１２個の、好ましくは約５〜約６個の炭素原子を有する、飽和または不飽和環式炭化水素基を意味し、ここで１個〜約４個の炭素原子は、窒素、酸素または硫黄によって置き換えられている。好ましい複素環は、ベンズイミダゾール、ジヒドロチオフェン、ダイオキシン、ジオキサン、ジオキソラン、ジチアン、ジチアジン、ジチアゾール、ジチオラン、フラン、エポキシド、イミダゾール、モルホリン、オキサゾール、オキサジアゾール、オキサチアゾール、オキサチアゾリジン、オキサジン、オキサジアジン、ピペラジン（piperazine）、ピペラジン（piperadine）、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラジン、チアジアジン、チアジアゾール、チアトリアゾール、チアジン、チアゾール、チオモルホリン、チオフェン、チオピラン、トリアジン、およびトリアゾールからなる群から選択される。
【０１００】
用語「カルボキシル」は、−Ｒ１Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ２を表し、式中、Ｒ１は置換または非置換のアルキル、シクロアルキル、複素環、またはアリールであり、またはＲ１はさらに共有結合であることができ、および式中、Ｒ２は水素、アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、アラルキルであり、およびＲ２は任意に、ヒドロキシル基またはアミノ基で置換されていてもよい。
用語「カルボン酸」は、Ｒ２が水素であるカルボキシル基を指す。このような酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、２−メチルプロピオン酸、オキシランカルボン酸、およびシクロプロパンカルボン酸を含む。
用語「カルボン酸エステル」または「エステル」は、Ｒ２がアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルであり、および式中、Ｒ２が任意にヒドロキシル基またはアミノ基で置換されていてもよい、カルボキシル基を指す。
用語「シクロアルカン」または「環状アルカン」または「シクロアルキル」は、環が任意に置換された環状脂肪族炭化水素である、炭素環式基であり、例えば、好ましくは３〜１２個の環炭素を有する環状のアルキル基である。「シクロアルキル」は、例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、またはシクロオクチルなどを含む。最も好ましいのはシクロプロピルである。
【０１０１】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを指し、通常は有機化合物中のハロゲン原子に対するハロ置換に関する。ハロのうち、クロロおよびブロモは一般に好ましく、フルオロが一般により好ましい。
用語「ヒドロキシル」は、−ＯＨを意味する。
用語「ハロアルキル」は、少なくとも１個のハロゲンをその上に有するアルキル基またはシクロアルキル基を指す。この用語は、モノハロアルキル基、ジハロアルキル基、およびトリハロアルキル基を含む。ハロアルキル基の例は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、フルオロエチル、ペンタフルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、および２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピルを含む。好ましくは、ハロアルキルは１〜３個のハロ基、例えばジクロロメチル基を含む炭化水素、またはモノハロ置換炭化水素を含む。
用語「ハロアルコキシ」は、少なくとも１個のハロゲンをその上に有するアルコキシまたはシクロアルコキシ基を指す。この用語は、モノハロアルコキシ基、ジハロアルコキシ基、およびトリハロアルコキシ基を含む。ハロアルコキシ基の例としては、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、およびフルオロエトキシを含む。好ましくは、ハロアルキルは、１〜３個のハロ基、例えば、ジクロロメチル基を含む炭化水素、またはモノハロ置換炭化水素を含む。
【０１０２】
用語「アクリル」は、４個の水素原子の１つにおいてエタンが異なる官能基で置き換えられたものを含む。この用語は、置換および非置換のアクリル酸およびアクリル酸エステル、およびアクリル酸ヒドラジドを含む。非限定的例としては、アルキル（メタ）アクリレート、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、アルキル（メタ）アクリルアミド、アルキルジ（メタ）アクリレート、エチレン性不飽和カルボン酸、エポキシ（メタ）アクリレート（例えば、グリシジル（メタ）アクリレート）、シクロプロピル（メタ）アクリレート、エトキシル化（メタ）アクリレート、シアノアクリレートなどが挙げられる。また、アクリル−、（メタ）アクリルアミド−、および（メタ）アクリロニトリルも挙げられる。炭素環式および複素環式（特にアリールおよびアラルキル）アクリレートおよびメタクリレート、例えば、シクロヘキシルアクリレート、イソボルニルアクリレートも含まれる。典型的なアクリル基は、メチルアクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、イソブチルアクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート、ジ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート（「ＨＥＡ」）、ヒドロキシプロピルアクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、グリシジルアクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート（「ＨＥＭＡ」）、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、アクリロニトリル、（メタ）アクリロニトリル、アクリルアミド、またはメタクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エタノールアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、オクチルアクリルアミドなどである。一態様において、アクリル基は、テトラゾール基で置換されたエテンを含む。別の側面において、アクリル基は、オキサジアゾロン、スルホンアミン、スルホナート、またはリン酸基で置換されたエテンを含む。
【０１０３】
「アクリル酸」は、−（ＣＲ１＝＝ＣＲ２）ｎ−ＣＯＯＨの基を意味し、式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、またはアラルキルであり、およびｎは、例えば、１、２、３、４などの整数の間にあり、好ましくは１０未満である。
「アクリル酸エステル」は、−（ＣＲ１＝＝ＣＲ２）ｎ−ＣＯＯＲ３の基を意味し、式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、またはアラルキルであり、Ｒ３は、アルキルまたはシクロアルキルである。アクリル酸エステルの例は、メチルアクリレート、エチルアクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、２−メチルアクリレート、および２−エチルヘキシルアクリレートなどが挙げられ、およびｎは、例えば、１、２、３、４などの整数の間にあり、好ましくは１０未満である。
「アクリル酸ヒドラジド」は、−（ＣＲ１＝＝ＣＲ２）ｎ−ＣＯＮＲ３ＮＲ４Ｒ５の基を意味し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、またはアラルキル水素またはアルキルであり、およびｎは、例えば１、２、３、４などの整数の間にあり、好ましくは１０未満である。
「カルボン酸ヒドラジド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１ＮＲ２Ｒ３の基を意味し、式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、またはアラルキルである。
【０１０４】
用語「エポキシド」は、酸素原子が３つの原子の環の一部である少なくとも１つのエーテルを含む、任意に置換された飽和または不飽和脂肪族化合物を意味するものと理解される。本発明による例示のエポキシドとしては、オキシラン（エチレンオキシド）、オキシランカルボン酸、エポキシプロパン、エポキシブタン、２−メチルエポキシプロパン、２−メチルエポキシブタン、グリシドールおよびエピクロロヒドリン、２−メチル−２，３−エポキシブタンが挙げられる。
「任意の」または「任意に」とは、続いて記載される事象または状況が生じることもあり、または生じないこともあり、また記載が、該事象または状況が生じる場合および、それが生じない場合を含むことを意味する。「任意に」とは、記載された状況が存在する態様および、記載された状況が存在しない態様を包含する。たとえば、「任意に置換されたフェニル」とは、フェニルが置換されているかまたは置換されておらず、記載は、無置換のフェニルおよび置換が存在するフェニルの両方を含むことを意味する。この用語はまた、フェニル環における１または２以上のヘテロ原子も含む。「任意に」とは、記載された状況が存在する態様および、記載された状況が存在しない態様を包含する。
【０１０５】
本発明の化合物で処置される「患者」は、任意の動物であって、好ましくは哺乳動物、例えば野生または飼いならされた動物（例えばネコまたはイヌ）、または家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ等）またはヒトである。
本明細書において「処置」とは、本発明の化合物によって、一時的または永久的に阻害された生殖能力を有するか、または阻害された繁殖能力を有するように、処置を受ける患者を言う。かかる処置は、阻害された生殖能力または阻害された繁殖能力をもたらす１回の処置、または任意の通常の処方による定型的な処置であることができる。患者、例えば哺乳動物（特にヒト）の処置としては、以下を含むことができる：（ａ）患者が、生殖に関与可能な精子または卵子を産生するのを阻害し、またはこれを予防すること、すなわち、患者の予防的処置；（ｂ）生殖に関与可能な精子または卵子を産生する能力を改良すること、すなわち、患者の精子または卵子を産生する能力または生殖能力を排除することまたはこの能力の後退を生じさせること；または（ｃ）生殖に関与可能な精子または卵子を産生する能力を抑制すること、すなわち、患者において精子または卵子の発生を阻害すること、遅延させること、または停止させること。
【０１０６】
用語「阻害する」または「阻害すること」は、活性における統計的に有意で測定可能な減少を意味し、好ましくは対照に対して少なくとも約１０％の減少、より好ましくは約５０％以上の減少、さらにより好ましくは約８０％以上の減少である。精子形成を阻害する場合、精子を産生する能力は、少なくとも約１０％、より好ましくは約５０％、およびもっとも好ましくは７５％以上、減少させることができる。同様に、卵巣卵胞を阻害することもできる。
別の態様によれば、本発明は、医薬組成物であって、有効量の１または２以上の本発明の化合物またはその薬学的に許容し得る塩、エステル、もしくはプロドラッグを、薬学的に許容し得る希釈剤または担体と共に含有する、前記組成物を提供する。有効量は、生殖能力を阻害するのに十分である。
組成物は、任意の投与経路用に製剤化することができ、特に、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、または鼻腔内投与用である。組成物は、任意の従来の形態で、例えば錠剤、カプセル、カプレット、液剤、懸濁剤、分散剤、シロップ剤、スプレー剤、ゲル剤、座薬、パッチ、および乳剤として製剤化することができる。
【０１０７】
「薬学的に許容し得る」とのフレーズは本明細書において、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、合理的な便益／リスク比に相応する化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
「薬学的に許容し得る担体」とのフレーズは本明細書において、薬学的に許容し得る材料、組成物、またはビヒクル、例えば液体または固体の充填材、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化材料であって、対象のロニダミンアナログまたは誘導体を、１つの器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へと運ぶまたは運搬することに関与するものを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者に有害ではないとの意味において、「許容し得る」ものであるべきである。薬学的に許容し得る担体として機能することができる材料のいくつかの例としては、以下が挙げられる：（１）糖類、例えば乳糖、ブドウ糖およびショ糖；（２）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；（４）トラガント末；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばカカオバターおよび坐薬ワックス；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェン非含有水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液、および（２１）医薬製剤に用いられるその他の非毒性適合性物質。
【０１０８】
本発明の化合物は、遊離形態または薬学的に許容し得る塩の形態で投与することができる。かかる塩は、従来の方法で調製することができ、遊離化合物としての活性と同等の活性を示す。本明細書において、用語「薬学的に許容し得る塩」は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等なしに、ヒトおよび低級動物の組織と接触させて使用するのに適した、合理的な便益／リスク比に相応する塩類を指す。薬学的に許容し得る塩は、当分野によく知られている。たとえばS. M. Bergeらは、薬学的に許容し得る塩についてJ. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)に詳細に記載しており、これは参照により本明細書に組み込まれる。塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にin situで調製することができ、または、遊離塩基官能基を好適な有機酸と反応させることにより、別に調製することができる。薬学的に許容し得る、無毒性の酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸などの無機酸と共に、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸などの有機酸と共に形成したアミノ基の塩、または、イオン交換などの当分野で用いられる別の方法を用いた塩である。他の薬学的に許容し得る塩としては、これらに限定されないが、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトナート、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ塩酸、ペクチナート（pectinate）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらに薬学的に許容される塩としては、適切な場合には、無毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、および形成されたアミンカチオンが含まれる。
【０１０９】
本明細書において、用語「薬学的に許容し得るエステル」は、in vivoで加水分解するエステルを指し、これには限定することなく、ヒト身体で容易に分解されて親化合物またはその塩から離れるものを含む。好適なエステル基としては、例えば、薬学的に許容し得る脂肪族カルボン酸に、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸、およびアルカン二酸に由来するものであって、ここで各アルキルまたはアルケニル部分は有利には、６個を超える炭素原子を有さない。具体的なエステルの例としては、ホルマート、アセテート、プロピオネート、ブチレート、アクリレートおよびエチルスクシナートが挙げられる。
本明細書中において、用語「薬学的に許容し得るプロドラッグ」は、本発明の化合物のプロドラッグであって、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適し、合理的なリスク／便益比に相応し、可能な場合には、本発明の化合物の意図された使用に有効であるものを指す。用語「プロドラッグ」は、in vivoで容易に変換されて、例えば血液中での加水分解により、上述の式の親化合物を産生するものを指す。詳細な議論は、T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium SeriesおよびEdward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987に提供され、これら両者は、本明細書に参照により組み込まれる。
【０１１０】
「有効量」とは、本発明の１つの化合物または２もしくは３以上のかかる化合物の組み合わせの量であって、雄または雌のどちらかの対象の生殖能力を完全または部分的に阻害する量である。有効量はまた、予防的に有効な量であることができる。有効な量とは、患者の大きさおよび性別、処置すべき状態、状態の重篤度、および求められる結果に依存する。ある患者に対して、有効量は当業者に知られた方法により決定することができる。生殖能力の低下に関して、本発明の化合物を有効量で投与して、繁殖に関与可能な活力のある精子および／または卵子の形成を阻害することができる。有効量は、男性または女性患者の生殖能力を、一時的または永久に阻害するのに十分である。
【０１１１】
本発明の文脈において、有効量は、繁殖に関与可能な活力のある精子および／または卵子の形成を阻害するのに有効な濃度である。たとえば、ＲＣ−ＭＣ−１１０、ＪＳＷ−２−７２、およびＪＳＷ−１−１９０について、現在、約２５．０ｍｇ／体重１ｋｇ〜約０．３ｍｇ／体重１ｋｇの間の量を、好ましくは６．０ｍｇ／体重１ｋｇ未満の量を含む製剤が、静脈内または経口適用についての有効量であると考えられており、必要な場合はルーチンの実験によって、これらの濃度の他の投与経路に対する調節を提供する。雄の生殖能力を阻害する有効量の具体的な例としては、約０．０５ｍｇ／体重１ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇ未満または１５０ｍｇ／ｋｇ未満または１００ｍｇ／ｋｇ未満が、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇから約７５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、またはもっとも好ましは約２ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇを、挙げることができる。雌の生殖能力を阻害する有効量の具体的な例としては、約０．５ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇ未満または１５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約１２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約２ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約４ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、またはもっとも好ましくは約６ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇを、挙げることができる。
【０１１２】
本発明の化合物の例示の合成は、一般的に以下のスキームに示されている。例示のスキームは本発明のカルボン酸およびカルボン酸エステル誘導体に対するものであるが、当業者は類似のスキームを用いて、本発明のエステル、ヒドラジド、またはカルボン酸ヒドラジド等の誘導体を生成できることを理解する。
【化１２５】
2012532198.tif 000126
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
式中、ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；および
式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である。
同様にして、本発明の化合物はアクリル誘導体を有する。
【０１１３】
【化１２６】
2012532198.tif 000127
種々の誘導体を、本発明のアクリル酸およびアクリル酸エステルから合成することができる。たとえば、ピロピオン酸およびエステル誘導体を、任意のよく知られた水素化技法を用いて調製することができる。さらに、シクロアルキル誘導体、もっとも好ましくはシクロプロピル、および複素環式誘導体、もっとも好ましくはエポキシドを調製することができる。
【０１１４】
当業者は、本発明の化合物を調製するために、出発物質および他の前駆体に対してマイナーな変更ができることを認識する。例えば、メチル、トリフルオロメチル、塩素、またはフッ素が本発明の化合物の６位に所望される場合、出発物質は、例えば、それぞれ４−クロロ−３−ニトローメチルベンゼン、１−クロロ−２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−ベンゼン、１，４−ジクロロ−２−ニトロ−ベンゼン、１−クロロ−４−フルオロ−２−ニトロベンゼンである。同様に、トリフルオロメチルが５位にあることが望まれる場合、出発物質は１−クロロ−２−ニトロ−５−トリフルオロメチル−ベンゼンである。これらの出発物質の全ては、Marshalton Research Lab（King, North Carolina）から市販されている。
さらに、ハロゲン化アルコキシ置換基の合成は、市販の１−クロロ−４−フルオロメトキシベンゼンから出発して行うことができる。ＨＮＯ３およびＨ２ＳＯ４による５０℃で約３時間の窒素化。得られた収率（２異性体）は、９８％（スキーム−１）である。２−クロロ−４−トリフルオロメトキシニトロベンゼンは、Michel Duryによる米国特許第6,121,492号の次のスキームに従って容易に合成され、これは参照により組み込まれる。
【化１２７】
2012532198.tif 000128
【０１１５】
上記の２つの異性体は、ＤＭＦ中のジメチルマロネートを用いて、Ｋ２ＣＯ３の存在下、１２０℃で約８時間縮合された。必要な産物は、メタノール中の再結晶化により得られた。収率は約５５％であった。
【化１２８】
2012532198.tif 000129
１または２以上の窒素を６員環に有することが望ましい場合、好適な出発物質としては、例えば、２−クロロ−３−ニトロピリジン、４−ヒドロキシ−３−ニトロピリジン、２−クロロ−６−メトキシ−３−ニトロ−ピリジン、５−トリフルオロメチル−２−ピリドノール、２，３−ジクロロピラジン、４−クロロ−３−ニトロアニリン、および２−クロロピリジンが挙げられる。これらの化合物の全ては、Sigma Aldrichから市販されているか、または容易に合成可能である。
４−クロロ−３−ニトロピリジンは、Reich et al., J. Med Chem. 1989, 32, 2474-2485の次のスキームに従って容易に合成されることが理解される。
【化１２９】
2012532198.tif 000130
【０１１６】
２−クロロ−３−ニトロ−５−トリフルオロメチル−ピリジンは、欧州特許出願第0272824号の次のスキームに従って合成できることが理解される。
【化１３０】
2012532198.tif 000131
好適なピラジン前駆体も容易に合成可能である。たとえば、２−アミノ−３−クロロピラジンは、A. P. Komin et al., J. Het. Chem., Vol., 13, 13-22 (1976)の次のスキームに従って容易に合成され、これは参照により組み込まれる。
【化１３１】
2012532198.tif 000132
Ｓ，Ｓ−ジメチル−Ｎ−（３−クロロピラジン−２−イル）スルフィルイミンは、米国特許第4,609,659号の次のスキームに従って容易に合成され、これは参照により組み込まれる。スルフィルイミンのＭＣＰＢＡによる酸化により、ニトロ誘導体が提供される。
【化１３２】
2012532198.tif 000133
【０１１７】
ピリミジン系はまた、市販の５−ニトロ−４−クロロピリミジン（Magical Scientific）を用いて合成することもできる。
【化１３３】
2012532198.tif 000134
４−クロロ−２−メチル−ベンジルクロリドは、T.S Osdene and et al, Journal of Medicinal Chemistry., 10, 431-434 (1967) の次のスキームに従って容易に合成される。
【化１３４】
2012532198.tif 000135
以下の合成例は、本発明を説明するために提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１１８】
例１：１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（ＲＣ−ＭＣ−３０）の合成
ＲＣ−ＭＣ−３０の合成に、メチルインダゾール−３−カルボキシレートを最初に形成した。塩化アセチル（７ｍＬ、過剰）を氷冷したメタノール（２０ｍＬ）に滴下し、溶液を同じ温度で１０分間攪拌した。市販のインダゾール−３−カルボン酸（２．３ｇ、１４ｍｍｏｌ）を次に１ロットで溶液に添加し、混合物を室温まで温めて一晩攪拌した。溶媒を真空下で除去し、その後、残留固体をＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）に溶解させ、標準ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した。水層をＣＨＣｌ３で抽出し、合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶剤の除去により、生成物を淡黄色の固体として得た。収率＝２．０５ｇ（８５％）；ｍ.p.＝１６８℃〜１７０℃；1H NMR (400MHz, CDCl3) δ8.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.10 (s, 3H)。
【化１３５】
2012532198.tif 000136
メチルインダゾール−３−カルボキシレート
【０１１９】
次に、アセトン（２２ｍＬ）中の、メチルインダゾール−３−カルボキシレート（２．０５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）、２，４−ジクロロベンジルクロリド（３．３５ｍＬ、１２．５４ｍｍｌ）、およびＫ２ＣＯ３（７．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）の混合物を、７０℃の温度で一晩還流した。反応混合物を室温に冷却し、ろ過し、残渣をアセトンで洗浄した。合わせたろ液を真空下で濃縮した（rotovapor）。こうして得た固体をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、任意の未溶解の固体を除去した。その後、溶液を濃縮し、ヘキサンで希釈し、一晩冷蔵庫に放置した。沈殿した固体を次にろ過し、ヘキサン／酢酸エチル（９：１）の混合物で洗浄して、純粋な生成物を白色固体として得た。収率＝３．５ｇ（８９％）；ｍ.p.＝１４４℃〜１４６℃；1H NMR (400MHz, CDCl3) δ8.31 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.39-7.47 (m, 4H), 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.81 (s, 2H), 4.11 (s, 3H)。
【化１３６】
2012532198.tif 000137
メチル１−（２，４−ジクロロベンジル）インダゾール−３−カルボキシレート
【０１２０】
例２：３-［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＲＣ−ＭＣ−１１０）の合成
ステップ１：２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−マロン酸ジメチルエステル
【化１３７】
2012532198.tif 000138
マロン酸ジメチル（５９．７ｇ、０．４４ｍｏｌ）を、乾燥ｔ−ブタノール（５００ｍＬ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５１ｇ、０．４４ｍｏｌ）の撹拌溶液に滴下した。得られた懸濁液に、ｔ−ブタノール（１００ｍＬ）中の２−クロロ−５−トリフルオロメチルニトロベンゼン（５０ｇ、０．２２ｍｏｌ）の温かい溶液を添加し、混合物を６時間還流した（反応をＴＬＣによりモニタリング）。反応終了後、ｔ−ブタノールの大部分を真空下で留去し、次に冷却した水を反応混合物に添加した。ｐＨを希塩酸で中性に調整し、これにより生成物を沈殿させた。混合物を３０分間攪拌し、生成物をろ別した（６８ｇ、９５％）。この材料は、さらに精製することなく次のステップで使用した。少量は、分析のために結晶化させ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン；４：６）、黄色の結晶性物質を生成した、ｍｐ６５〜６７℃。1H NMR (CDCl3) 8.30 (s, 1 H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.37 (s, 1 H), 3.80 (s, 6 H). MS (FAB) m/z: 322.1 (M+ + 1)。
【０１２１】
ステップ２：（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−酢酸メチルエステル
【化１３８】
2012532198.tif 000139
２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−マロン酸ジメチルエステル（６８ｇ、０．２１ｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（２００ｍＬ）に溶解した。塩化ナトリウム（３４ｇ、０．５８ｍｏｌ）および水（６０ｍＬ）を加え、混合物を１２０℃で１６〜２０時間攪拌した（反応をＴＬＣによりモニタリング）。次に、反応混合物を室温まで冷却し、水中で急冷し、これにより生成物を沈殿させた。３０分間撹拌した後、生成物（４５ｇ、８０％）をろ過により単離した。生成物は、さらに精製することなく次の反応で使用した。少量の試料は、分析のために結晶化させ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：８）、黄色の結晶性物質を生成した、ｍｐ１０４〜１０５℃。1H NMR (CDCl3) 8.3 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.12 (s, 2 H), 3.60 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 275.2 (M+ + 1)。
【０１２２】
ステップ３：（２−アセチルアミノ−４−トリフルオロメチルフェニル）−酢酸メチルエステル
【化１３９】
2012532198.tif 000140
（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−酢酸メチルエステル（２５ｇ、０．０９５ｍｏｌ）の水素化及びアセチル化を、トルエン（２００ｍＬ）中の５％Ｐｄ−Ｃ（２．５ｇ、５０％湿気ｋ）および無水酢酸（３８ｇ、０．３７ｍｏｌ）の存在下にて、激しく撹拌しつつ、室温および大気圧下で約４〜５時間行った（反応をＴＬＣによりモニタリング）。触媒をろ過により除去し、トルエンで２回洗浄した。合わせた有機物を真空中で蒸発させて生成物を得て（２４．８ｇ、９５％）、これを、さらに精製することなく次のステップで使用した。少量の試料はヘキサンから結晶化させて、生成物を黄色の固体として得た、ｍｐ９２〜９４℃。1H NMR (CDCl3) 8.86 (s, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 7.36 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.31 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 3.74 (s, 3 H), 3.68 (s, 2 H), 2.23 (s, 3 H)。
【０１２３】
ステップ４：６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル
【化１４０】
2012532198.tif 000141
酢酸（５０ｍＬ）中の（２−アセチルアミノ−４−トリフルオロメチルフェニル）−酢酸メチルエステル（１６ｇ、０．０５８ｍｏｌ）の溶液に、亜硝酸ｔ−ブチル（９０％）（７．３５ｇ、０．０６３ｍｏｌ）を２０分間かけて９０〜９５℃で滴下した。次に混合物を９５℃で０．５時間攪拌し、冷水に注ぎ、１時間撹拌した。沈殿物をろ過により回収し、水で洗浄した。粗物質を酢酸エチルに溶解し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を真空内で除去した。この物質（１３．４ｇ、９５％）は、さらに精製することなく次のステップで使用した。少量の試料を酢酸エチルから結晶化して、白色の固体を得た、ｍｐ２４０〜２４２℃。1H NMR (DMSO-d-6) 8.25 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 8.04 (s, 1 H), 7.58 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 3.95 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 245.1 (M+ + 1)。
【０１２４】
ステップ５：１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル
【化１４１】
2012532198.tif 000142
６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（２．７５ｇ、０．０１１２ｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（１０ｇ、０．０７ｍｏｌ）、２，４−ジクロロベンジルクロリド（２．４２ｇ、０．０１２３９ｍｏｌ）およびヨウ化テトラブチルアンモニウム（触媒）を添加した。反応混合物を還流するまで加熱し、良好に攪拌しつつ２時間還流した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。反応終了後、熱いうちに炭酸カリウムをろ過し、アセトンで洗浄した。合わせた溶媒は、減圧下で留去して、Ｎ１およびＮ２−ベンジル化生成物の粗混合物を得た。異性体は、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液はヘキサンで開始し、次に８：２のヘキサン、酢酸エチルに変更した）により分離した。
【０１２５】
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル。収率：３．６２ｇ（８０％）、白色結晶、ｍｐ１１８〜１２０℃。1 H NMR (CDCl3) 8.39 (d, J = 8.4 Hz, 1 H) 7.74 (s, 1 H), 7.57 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.45 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 7.12 (dd, J = 8.4 and 2.1 Hz, 1 H), 6.78 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.82 (s, 2 H), 4.07 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 403 (M+ + 1)。
２−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−２Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル。収率：６８０ｍｇ（８０％）、白色結晶、ｍｐ１３２〜１３４℃。1 H NMR (DMSO-d-6) 8.27 (s, 1 H), 8.20 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.76 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.57 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.30 (dd, J = 8.3 and 1.8 Hz, 1 H), 6.78 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.17 (s, 2 H), 3.96 (s, 3 H)。
【０１２６】
ステップ６：［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−メタノール
【化１４２】
2012532198.tif 000143
ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解した１−（２，４−ジクロロベンジル−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル（３．０ｇ、０．００７５ｍｏｌ）を、−７８℃に冷却した。ＤＩＢＡＬ−Ｈ（８．１８ｍＬ、０．００８１８ｍｏｌ）を、アルゴンブランケット下、シリンジを介して１５分間かけてゆっくり滴下した。ＤＩＢＡＬ−Ｈを完全に添加した後、反応混合物を−７８℃でさらに２時間攪拌した（反応をＴＬＣによりモニタリング）。反応は、−７８℃でメタノールで慎重に急冷した。次に反応混合物を注意深く水に注ぎ、層を分離した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶剤の除去により、粗アルコール（２．６ｇ、９３％）が得られ、これは精製することなく次のステップで使用した。アルコールは白色固体であった、ｍｐ１３７〜１３９℃。1H NMR (CDCl3) 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.66 (s, 1 H), 7.44 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.42 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.12 (dd, J = 8.3 and 2.0 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 5.65 (s, 2 H), 5.09 (s, 2 H). MS (FAB) m/z: 375 (M+ + 1)。
【０１２７】
ステップ７：１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルバルデヒド
【化１４３】
2012532198.tif 000144
［１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−メタノール（３．７５ｇ、０．０１ｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、酸化マンガン（ＩＶ）（８．７ｇ、０．１ｍｏｌ）を加え、室温で２〜３時間撹拌した（反応をＴＬＣによりモニタリング）。固体をろ過により除去し、真空中でのＣＨ２Ｃｌ２除去により、粗アルデヒドを得た。アルデヒドは、さらに精製することなく次のステップで使用した。アルデヒド（３．５４ｇ、９５％）は白色固体であった、ｍｐ９７〜９８℃。1H NMR (CDCl3) 10.25 (s, 1 H), 8.45 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.79 (s, 1 H), 7.60 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.20 (dd, J = 8.3 Hz and 2.0 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 5.79 (s, 2 H). MS (FAB) m/z: 373 (M+ + 1)。
【０１２８】
ステップ８：３-［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸エチルエステル
【化１４４】
2012532198.tif 000145
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルバルデヒド（２．０ｇ、０．００５３６ｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解し、ウィッティヒ試薬（カルボエトキシメチレン）トリフェニルホスホラン（１．０６ｇ、０．０５３６ｍｏｌ）を溶液に添加した。均一な反応混合物を、油浴中で１２時間、還流するまで加熱した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。反応混合物を室温まで冷却し、水に入れて急冷し、有機層を分離した。ＣＨ２Ｃｌ２の除去により粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物を白色固体として得た（２．２５ｇ、９５％）、ｍｐ１８６〜１８８℃。1H NMR (CDCl3) 8.08 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.99 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 7.74 (s, 1 H), 7.52 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.47 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.16 (dd, J = 8.3 and 2.0 Hz, 1 H), 6.84 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.82 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 5.72 (s, 2 H), 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2 H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 3 H). MS (FAB) m/z: 443 (M+ + 1)。
アクリル酸エチルエステルは、メタノール、ＤＣＭの存在下、室温および１ａｔｍ圧力にて、５％Ｐｄ−Ｃを用いて水素化できて、プロピオン酸エステル誘導体を得ることが理解される。たとえば、かかる条件下での処理により、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸エチルエステル（ＪＷＳ−２−７０）を生成する。
【０１２９】
ステップ９：１−（２，４−ジクロロベンジル）−３−［６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸
【化１４５】
2012532198.tif 000146
１−（２，４−ジクロロベンジル）−３−［６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸エチルエステル（２．０ｇ、０．００４５ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）とメタノール（２５ｍＬ）の混合物に溶解した。水酸化リチウム溶液（７．５ｍＬの水中、０．３３ｇ、０．０１３ｍｏｌの水酸化リチウム）を、よく攪拌しながら室温でゆっくりと加えた。その後、反応混合物を４０℃に加温し、この温度で２時間維持した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出して、中性不純物を除去した。層を分離し、水性層を０℃に冷却した、次に２０％硫酸でｐＨ２の酸性にした。白色固体が沈殿し、これをろ過し、一定の重量になるまで乾燥させた。粗生成物は酢酸エチルおよびヘキサン（１：１）から再結晶化させて、純粋な生成物を白色固体として得た（１．６８ｇ、９０％）、ｍｐ１８６〜１８８℃。1H NMR (DMSO-d-6) 8.39 (s, 1 H), 8.36 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.79 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 7.66 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.35 (dd, J = 8.3 and 1.6 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.76 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 5.89 (s, 2 H). Anal. calcd. for C18H11Cl2F3N2O2: C, 52.02; H, 2.65; N, 6.74. Found: C, 50.63; H, 2.63; N, 6.63. HRMS (FAB +) m/z calcd. for C18H11Cl2F3N2O2 415.01, found 415.0233. MS (FAB) m/z: 415 (M+ + 1)。
【０１３０】
例えば本発明のＲＣ−ＭＣ−１１０などのアクリル酸誘導体のプロピオン酸誘導体は、メタノール、ＤＣＭの存在下、室温および１ａｔｍ圧力にて、５％Ｐｄ−Ｃを用いた水素化により調製できて、所望の生成物を得ることが理解される。例えば、このような条件下でのＲＣ−ＭＣ−１１０の処理は、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２）を与える。
同様に、三員環シクロアルキル複素環式環系は、本発明のアクリル酸およびエステル化合物から調製することができる。例えば、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−３−［１−（２，４−ジクロロベンジル−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−オキシラン−２−カルボン酸を含有する化合物は、ＲＣ−ＭＣ−１１０またはそのｃｉｓ異性体を、３０％過酸化水素と、水酸化ナトリウム、メタノールと水の存在下で室温で６時間処理することにより調製された。同様に、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−２−［１−（２，４−ジクロロ−ベンジル−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−シクロプロパンカルボン酸を含有する化合物は、ＲＣ−ＭＣ−１１０およびそのｃｉｓアナログを、無水エチルエステル中のヨウ化メチレンおよび亜鉛−銅結合を用いて４８時間還流させることにより、調製された。
【０１３１】
例３：１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸（ＲＣ−ＭＣ−８６）の合成
ステップ１：１−（２−クロロピリジン−３−イル）エタノール
【化１４６】
2012532198.tif 000147
乾燥ＴＨＦ（４００ｍＬ）およびｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、６３ｍＬ、０．１ｍｏｌ）を、窒素下で１Ｌのフラスコ中に−７０℃で導入した。ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の乾燥ジイソプロピルアミン（１０．１ｇ、０．１ｍｏｌ）の溶液を、混合物に−７０℃で滴下した。次に混合物を０℃で１時間維持し、次いで−７０℃に冷却した。ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の２−クロロピリジン（１１．３ｇ、０．１ｍｏｌ）の溶液を、混合物に−７０℃で滴下し、混合物をこの温度で３時間撹拌した。乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のアセトアルデヒド（４．８５ｇ、０．１１ｍｏｌ）の溶液を次に滴下し、混合物を−７０℃で３時間維持した。ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の水（４ｍＬ）の溶液を数滴の濃塩酸で酸性化したものを、混合物に−４０℃で加え、次に水（２００ｍＬ）を−１０℃で導入した。ジエチルエーテルによる抽出（３×１５０ｍＬ）、無水硫酸ナトリウム上での乾燥、および蒸発により、粗生成物を得、これはカラムクロマトグラフィーによって精製して、油を得た（１０ｇ、６４％）。*1H NMR (CDCl3) 8.15 (dd, J = 5 and 2 Hz, 1 H), 7.95 (dd, J = 8 and 2 Hz, 1 H), 7.20 (dd, J = 8 and 5 Hz, 1 H), 5.15 (d, J = 7 Hz, 1 H), 3.90 (s, 1 H), 1.45 (d, J = 7 Hz, 3 H)。
＊Journal of Chemical Society Perkin Trans 1: Organic and Bio-organic Chemistry, 1990, 9, 2409-2415に報告されたＮＭＲ値。
【０１３２】
ステップ２：１−（２−クロロピリジン−３−イル）エタノン
【化１４７】
2012532198.tif 000148
乾燥アセトン（２００ｍＬ）中の１−（２−クロロピリジン−３−イル）エタノン（１０ｇ、０．０６３５ｍｏｌ）の溶液を、アルゴン下で１Ｌのフラスコに導入した。混合物を−３０℃に冷却し、純粋な粉末無水クロム酸（１９ｇ、０．１９ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間維持した。２−プロパノール（１００ｍＬ）を加え、次に含水炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨ８にした。ろ過後、固体をクロロホルムで洗浄した。次に有機層および水性層を分離し、水性層をクロロホルムで抽出した（２×１００ｍＬ）。合わせた有機物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させて、粗ピリジルケトンを油として得た。この生成物は、カラムクロマトグラフィーで精製した（８ｇ、８１％）。*1H NMR (CDCl3) 8.44 (dd, J = 5 and 2 Hz, 1 H) 7.91 (dd, J = 7.5 and 2 Hz, 1 H), 7.34 (dd, J = 7.5 and 5 Hz, 1 H), 2.68 (s, 3 H)。
＊Journal of Chemical Society Perkin Trans 1: Organic and Bio-organic Chemistry, 1990, 9, 2409-2415に報告されたＮＭＲ値。
【０１３３】
ステップ３：３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
【化１４８】
2012532198.tif 000149
エタノール（３００ｍＬ）中の１−（２−クロロピリジン−３−イル）エタノン（２２ｇ、０．１４１５ｍｏｌ）およびヒドラジン水和物９８％（１１３ｇ、２．２１ｍｏｌ）の溶液を、１２時間還流した。約８０％のエタノールは、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で留去した。残渣を室温にもどした。沈殿した固体をろ過し、水で洗浄した。生成物は９０℃で乾燥して、一定の重量（１６ｇ、８５％）とした。ｍｐ１５２〜１５４℃。1H NMR (CDCl3) 8.62 (dd, J = 4.5 and 1.4 Hz, 1 H), 8.08 (dd, J = 8.0 and 1.4 Hz, 1 H), 7.15 (dd J = 8.0 and 4.5 Hz, 1 H), 2.64 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 133 (M+ + 1)。
【０１３４】
ステップ４：１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸
【化１４９】
2012532198.tif 000150
酸化ナトリウム（３５ｇ、０．８８ｍｏｌ）を水（８００ｍＬ）に溶解し、次に、３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン（１６ｇ、０．１２ｍｏｌ）を水酸化ナトリウムの溶液に添加して、室温で１０分間撹拌した。反応混合物を８０℃に加熱した。よく攪拌しつつ、過マンガン酸カリウム溶液（３００ｍＬの水中、６８．５ｇ、０．４３３ｍｏｌのＫＭｎＯ４）を２時間かけてゆっくり滴下し、この間油浴の温度は１００℃に保った。過マンガン酸カリウムの添加が完了した後、反応混合物をさらに１時間加熱した。反応の進行はＴＬＣによりモニタリングした。反応混合物を７０〜８０℃に冷却し、副産物二酸化マンガンをろ別した。二酸化マンガンのケーキを温水で洗浄した。主要なろ液および洗浄液を合わせて、濃硫酸でｐＨ２に酸性化した。その後水を、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で留去した。得られた黄色固体は、所望の１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸、硫酸ナトリウムおよび硫酸カリウムの混合物であった（９５ｇ）。この固体混合物は、精製なしで次のステップに用いられた。少量の試料は、分析目的でカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色結晶を得た。ｍｐ１７５〜１７６℃。1H NMR (CDCl3) 8.28 (dd, J = 4.9 and 1.6 Hz, 1 H), 7.82 (dd, J = 7.5 and 1.6 Hz, 1 H), 7.39 (dd J = 7.5 and 4.9 Hz, 1 H). MS 9FAB) m/z: 147 (M+ + 1)。
【０１３５】
ステップ５：１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル
【化１５０】
2012532198.tif 000151
前述のステップ４からの固体混合物（９５ｇ）をメタノール（５００ｍＬ）に懸濁し、硫酸（５ｍＬ）を注意して加えた。次に、反応混合物を６〜８時間加熱して還流し、反応をＴＬＣを用いてモニタリングした。反応終了後、無機固体を反応混合物からろ別し、固体ケーキは熱いメタノールで洗浄した。主要なろ液および洗浄液を合わせて、メタノールをロータリーエバポレーターで減圧下で留去した。得られた固体を、５％重炭酸ナトリウム溶液（３００ｍＬ）に懸濁して、室温で５分間攪拌した。白色固形物をろ別し、オーブンで９０〜９５℃で乾燥させて、一定重量にした（８．０７ｇ、３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン基づき４２％）。ｍｐ２０１〜２０３℃。1H NMR: (CDCl3) 14.4 (brs, 1 H), 8.74 (dd, J = 4.6 and 1.5 Hz, 1 H), 8.64 (dd, J = 8.1 and 1.5 Hz, 1 H), 7.39 (dd J = 8.1 and 4.6 Hz, 1 H), 4.10 (s, 3 H)。
【０１３６】
ステップ６：１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル
【化１５１】
2012532198.tif 000152
１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸メチルエステル（８ｇ、０．０４５２ｍｏｌ）をアセトニトリル（２００ｍＬ）に懸濁し、得られた懸濁液を加熱下で１０分攪拌して、溶液を均質化した。次に炭酸カリウム（３１．２ｇ、０．２２６ｍｏｌ）を１ロットで加え、次いでヨウ化テトラブチルアンモニウム（０．０８ｇ、触媒）および２，４− ジクロロベンジルクロリド（１０．６ｇ、０．０５４３ｍｏｌ）を添加した。反応混合物は、よく攪拌しながら２時間加熱還流した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。反応終了後、混合物を室温まで冷却し、炭酸カリウムをろ別した。アセトニトリルを減圧下留去して、粗ベンジル化生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液はヘキサンで開始し、その後８：２のヘキサン／酢酸エチル）を用いて精製して、純粋な生成物を白色結晶として得た（１１ｇ、７３％）。ｍｐ１３５〜１３６℃。1H NMR (CDCl3) 8.04 (dd, J = 4. 5 and 1.6 Hz, 1 H), 8.58 (dd, J = 8.1 and 1.6 Hz, 1 H), 7.45 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.36 (dd, J = 8.1 and 4.5 Hz, 1 H), 7.10 (dd, J = 8.3 and 2.0 Hz, 1 H), 6.72 (d, J = 8.3 Hz, 1 H ), 5. 92 (s, 2 H), 4.06 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 336 (M+ + 1)。
【０１３７】
ステップ７：１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸
【化１５２】
2012532198.tif 000153
ベンジル化メチルエステル（４ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）およびメタノール（３０ｍＬ）の混合物に溶解した。水酸化リチウム溶液（１５ｍＬの水中、１ｇ、０．０４０ｍｏｌの水酸化リチウム）を、よく攪拌しつつ室温でゆっくり加えた。反応は、１時間の撹拌後に終了した（ＴＬＣによりモニタリング）。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出して中性不純物を除去した。層を分離し、水性層を０℃に冷却し、２０％硫酸でｐＨ２の酸性にした。析出した白色固体をろ過し、一定重量まで乾燥させた。粗生成物を酢酸エチルとヘキサン（６：４）から再結晶させ、純粋な生成物を得た（３．４８ｇ、９５％）、ｍｐ２３３〜２３５℃。ＨＰＬＣ純度９９．９８％。1H NMR (CDCl3) 9.12 (dd, J = 4.5 and 1.5 Hz, 1 H), 9.00 (dd, J = 8.1 and 1.5 Hz, 1 H), 8.06 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 7.90 (dd J = 8.1 and 4.5 Hz, 1 H), 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.41 (2 H, s). 13C NMR (DMSO/acetone-d-6) δ 169.9, 152.0, 150.7, 136.6, 134.7, 134.5, 134.3, 132.4, 132.2, 130.0, 128.6, 120.4, 116.1, 48.8. Anal. calcd. for C14H10ClNO2: C, 52.17; H, 2.79; N, 13.04. Found: C, 51.94; H, 2.51; N, 13.06. HRMS (FAB) m/z calcd. for C14H10ClNO2 322.0150, found 322.0159。
【０１３８】
例４：変異原性のためのエイムス試験
本発明の化合物に対してエイムス試験を実施した。手順は次のステップを含む。
１．細菌培養(ネズミチフス菌株ＴＡ１００）
Muta-Chromoplateキット・バージョン３．０（Environmental Bio-Detection Products, inc. (EBIP), 14 Abacus Road, Brampton, Ontario, Canada, L6T 5B7より入手）からの余剰のS. typhimuriumＴＡ１００の凍結乾燥ディスクを、１３×１００ｍｍの無菌培養管内の５．０ｍｌのDifco Nutrient Broth (２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４０）または OxoidブロスＮｏ．２内に置いた。材料は、３７℃で２４時間、蓋を少しゆるめた状態でインキュベートした。濁度は、次の日に評価した。
上記の初期調製に続いて、細菌をＤＭＳＯ（細菌培養物１．０ｍｌあたり０．０９ｍｌのＤＭＳＯ）と混合し、５００μｌのアリコートに分けて滅菌遠心分離管に入れ、−８０℃で保存した。このアッセイには、１つの管をアッセイ実施の前夜に解凍して５．０ｍｌのOxoidブロスに入れた。翌日、ｒｆａ突然変異の検査を行なった。
【０１３９】
２．Ｒｆａ変異試験
２つの栄養寒天プレートを、上層寒天の調製前に３０分〜１時間、３７℃のインキュベーター中に置いた。プレートは、ステップ３で培養物を加える直前に取り除いた。
一瓶の上層寒天を融解し、２ｍｌを１３×１００ｍｍの無菌培養管に入れた。管を４５℃の加熱ブロック内に配置した。約０．１ｍｌの細菌培養物が、２ｍｌの寒天中に一晩で増殖した。培養物を添加後にできるだけ早く管をボルテックスし、材料を栄養寒天プレート上に注いだ。プレートは数分間水平面上に置き、上層寒天が固まるようにした。
約１０μｌの無菌のCrystal Violet（０．１ｇ／１００ｍｌ）を、Whitman1ろ紙から作られた無菌の１／４インチ円形ディスク上に配置した。ディスクを穏やかに上層寒天に押しつけた。プレートを、加湿された３７℃のインキュベーターに入れた。プレートは、ディスク周りの阻害のゾーンについて、１２時間〜１６時間毎にチェックした。
この試験では、１２ｍｍの阻害ゾーンが最初のプレートに、および１２ｍｍが２番めに認められ、ｒｆａ突然変異が無傷であったことを示した。
【０１４０】
３．ヒスチジン必要量
この試験は、Ｈｉｓ−変異がまだ機能していることを保証する。冷凍アリコートから一晩増殖させたブロス培養物を使用して、培養物の少量の試料を、白金２０μｌのループを使用してヒスチジン／ビオチンプレート上に広げた。プレートを反転し、３７℃インキュベーターに一晩に置いた。
同時に、少量の培養ブロスを取り出して、無菌の５００μｌの遠心管に入れた。管は、Fisher Marathon 13Kの微小遠心分離機にて３０００ｒｐｍで１０分間回転させた。ブロスを除去し、細菌を無菌の１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４０に再懸濁した。細菌をビオチンプレート上に置き、一晩インキュベートした。
ヒスチジン／ビオチンプレートは画線部位に沿って増殖を見せなければならないが、ビオチンのみのプレートは増殖なしのはずである。ヒスチジン／ビオチンプレートからのコロニーを、新しい培養物作製のためのマスタープレートとして使用することができ、これには、凍結して−８０℃で保存すべきものを含む。
【０１４１】
４．変異原性アッセイ用の細菌培養物
約６００μｌの培養物を、１３×１００ｍｍ培養管内の７．０ｍｌの栄養ブロス（Oxoid Broth No. 2）に入れた。管を３７℃で約１２時間インキュベートした。約６００μｌの培養物を、別の１３×１００ｍｍ培養管内の７．０ｍｌの栄養ブロス中に入れ、３７℃で約１２時間インキュベートした。使用の直前に、両方の管を無菌の１５ｍｌ円錐体内で混合した。この試験培養物を、プレートの播種および、培養密度の決定に用いる希釈物の作製に用いた。
管は、上記の手順を用いて、Ｈｉｓ−変異についてチェックした。
５．細菌培養物の密度のチェック
培養物は、最適な結果の場合、およそ２×１０８の細菌／プレートを含んでいた。最適な試験方法は、濁度計を用いた６５０ｎｍにおける試験である。濃度は、段階希釈物を作製し、これらを変異原性アッセイの時にデュプリケートでプレートすることにより決定した。
【０１４２】
６．変異原性アッセイ
０．５ｍＭのヒスチジン／ビオチン溶液約１０ｍｌを、１００ｍｌの上層寒天に加えた。寒天を６０〜７０℃の水浴中で融解させた。最少グルコースプレートを、アッセイ開始の前に３０〜４５分、３７℃のインキュベーターに置いた。
試験化合物をＤＭＳＯ（Fisher D128-500）に溶解し、１：１０希釈および１：１００希釈を作製した。例えば：
【表１】
2012532198.tif 000154
溶液を、０．２２μＭナイロンシリンジフィルター（Fisher, 09-719C）で滅菌した。次に上記１００ｍｇ／ｍｌ溶液の約８０ｍｌを、７２０ｕｌの滅菌ＤＭＳＯにピペットでとり、１０ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。
陽性突然変異誘発物質は、以下のようにして調製した：
アジ化ナトリウム（１５μｇ／ｍｌ）。約３ｍｇ（実際の重量＝０．００３０ｇ、FisherBiotech BP922- 500）を２ｍｌの滅菌水に溶解し、次に、９ｍｌの滅菌水に上記の１５００μｇ／ｍｌ溶液１ｍｌを入れることにより希釈した。 １５０μｇ／ｍｌの溶液約１ｍｌを、９ｍｌの滅菌水中に入れて、最終的に１５μｇ／ｍｌ溶液を得た。この溶液を、１０ｍｌシリンジに入れて０．２０μｍのナイロンフィルター（Fisherbrand 09-719C）を通過させることにより滅菌した。
【０１４３】
アミノアントラセン（２５μｇ／ｍｌ）。約５ｍｇのアミノアントラセン（実際の重量＝０．００５０ｇ、２−アントラミン、Sigma A-1381）を、２ｍｌのエタノール（Fisher A-405-20）に溶解して、２５００μｇ／ｍｌの溶液を得た。 ２５００μｇ／ｍｌの溶液の約０．５ｍｌを４．５ｍｌのエタノールに入れて、２５０μｇ／ｍｌ溶液を得た。２５０μｇ／ｍｌの溶液の約０．５ｍｌを４．５ｍｌのエタノールに入れて、２５μｇ／ｍｌ溶液を得た。この溶液を、１０ｍｌシリンジに入れて０．２０μｍのナイロンフィルター（Fisherbrand 09-719C）を通過させることにより滅菌した。
Ｓ９溶液類は次のようにして調製した：
【表２】
2012532198.tif 000155
【０１４４】
Ｓ９は、Moltox（Sprague-Dawley, Phenobarbital-5,6-Benzoflavone）から入手した。溶液類は示された順序で添加し、上層寒天溶液に添加するまでは、アッセイ中であっても氷上に維持した。
６つの１３×１００ｍｍ培養管を、使用前に数分間、４５℃の加熱したブロック内に入れた。０．５ｍＭのヒスチジン／ビオチン溶液を含有する２ｍｌの溶融した上層寒天を、各管にピペットで入れた。細菌ブロス培養物を各管についてインキュベーターから取り出し、最少グルコースプレート上に置いた。次に、０．１ｍｌの薬物、緩衝液または溶媒を、上層寒天に添加した。
次いで、約０．１ｍｌの細菌培養物を添加した。次に、適切なＳ９溶液を管に加えて、直ちにボルテックスした。上層寒天を予め暖めておいた最少グルコースプレート上に載せ、均一な分散を得るために旋回させた。
各試験化合物は、（＋）Ｓ９ミックスおよび（−）Ｓ９ミックスの両方を用いて実験を行なったが、ただし次の例外を有する：（１）アジ化ナトリウム：（−）Ｓ９のみ（細菌変異の陽性対照）；および（２）アミノアントラセン：（＋）Ｓ９のみ（Ｓ９活性化の陽性対照）。
全てのプレートは、３７℃で４８時間インキュベートした。プレートを取り出し、コロニー数について検査した。
【０１４５】
次の表１は、本発明の化合物に関するエイムス試験の結果のまとめである。
【表３−１】
2012532198.tif 000156
【０１４６】
【表３−２】
2012532198.tif 000157
【０１４７】
【表３−３】
2012532198.tif 000158
表１において、「合（Pass）」とは、コロニー数について、対照よりも有意に上回っていない化合物を指す（ｐ＜０．０５）。
【０１４８】
７．比色エイムス試験手順
次の手順を、無菌的に行なった。初めに、アッセイの前日、できるだけ遅い時間に、「Ｇ」栄養ブロスとラベルしたバイアルを、S. typhimuriumＴＡ１００（凍結乾燥）とラベルしたバイアルに入れた。混合物を一晩、３７℃で約１６〜１８時間インキュベートした。
適切なバイアル中、約５０ｍｇの試験化合物を計量した。約１ｍＬのＤＭＳＯを加え、混合物を２５ｍｍのシリンジフィルターを用いて、滅菌管にろ過滅菌して入れた。ＤＭＳＯの濃度を記録した。
無菌の５０ｍＬの管に、約１５ｍＬの無菌のDavis Mingioli Salt（Davis & Mingioli, Aromatic biosynthesis, VII. Accumulation of two derivatives of shikimic acid by bacterial mutants, J. Bacteriol. 1953. Aug;66(2): 129-36を参照）をピペットで入れた。この塩溶液（Muta成分「Ａ」）は以下からなる：（１）６００ｍＬのMilli-Q；（２）リン酸二カリウム、無水物、３８．５ｇ、（３）リン酸一カリウム、無水物、１１．０ｇ、（４）硫酸アンモニウム、５．５ｇ、（５）クエン酸三ナトリウム、１．３７５ｇ、および（６）硫酸マグネシウム、０．５５ｇ。適切な量のMilli-Q水を加えて、総容量を１Ｌとした。各成分は、上記の順序で一度に１つずつ溶解した。溶液は０．２２μｍフィルターを通し、約７．３のｐＨで沈殿物を除去した。
【０１４９】
塩溶液に、ＤＭＳＯで希釈した化合物の少量を、ＤＭＳＯが５００μｌを超えないように加えた。たとえば、ＤＭＳＯ希釈化合物の約１００μｌのアリコートを、化合物が溶液中で最高濃度に到達するまで加えた。これは、化合物が溶液形態でなくなり、無菌ＤＭＳＯの添加および／または２０分間〜１時間の超音波処理によっても溶液にもどらない場合には、より低い容積のＤＭＳＯ希釈化合物を用いてくり返す必要があることが見出された。全溶液中の、ＤＭＳＯ希釈化合物の容積を記録した。化合物の最高濃度が決まった場合、適切な容積の無菌Davis Mingioli塩を加えて、溶液の全容積を１７．５ｍＬにした。化合物およびＤＭＳＯの試験溶液中の濃度を、次に記載した。
成分は次に、反応混合物とラベルされた５０ｍＬの無菌管内で、次のように混合した：２１．６２ｍＬのＡ＋４．７５ｍｌのＢ（Ｄ−グルコース、４０％ｗ／ｖ）＋２．３８ｍＬのＣ（ブロモクレゾールパープル、５ｍｇ／ｍｌ）＋１．１９ｍｌのＤ（Ｄ−ビオチン、０．１ｍｇ／ｍｌ）＋０．０６０ｍｌ（６０μｌ）のＥ（Ｌ−ヒスチジン、０．１ｍｇ／ｍｌ）。バイアルをボルテックスしたのち、取りのけておいた。
【０１５０】
Ｓ９混合物を、Ｓ９酵素を２．１ｍＬの無菌水でもどすことにより調製した。これを「Ｓ９Ｆ」とラベルした。Ｓ９混合物とラベルした５０ｍＬの管に、次のものを一緒に混合した（全てＥＢＩＰより入手）：０．４ｍＬのＳ９Ａ（ＭｇＣｌ２、０．４ＭおよびＫＣｌ、１．６５Ｍ）＋０．０９ｍＬのＳ９Ｂ（グルコース−６−リン酸、１．０Ｍ）＋０．８１ｍＬのＳ９Ｃ（ニコチンアミドジヌクレオチドフォスフェート、０．１Ｍ）＋９．９８ｍＬのＳ９Ｄ（リン酸緩衝液、、ｐＨ７．４）＋６．７２ｍＬのＳ９Ｅ（無菌蒸留水）＋２ｍＬのＳ９Ｆ（Rate肝臓抽出物）。バイアルをボルテックスしたのち、取りのけておいた。
無菌管を次のようにラベルした：ブランク、バックグランドＩ、バックグランドＩＩ、標準変異原、化合物１（−）、化合物１（Ｓ９＋）、化合物２（−）、化合物２（Ｓ９＋）、化合物３（−）、化合物３（Ｓ９＋）。次に、約２．５ｍＬの反応ミックスを各管に加えた。次に、約２ｍＬのＳ９ミックスを、バックグランドＩＩおよびＳ９＋化合物に加えた。次に、各化合物バイアルに、約８ｍＬの調製した化合物を加えた。最終溶液中の化合物の濃度を記載した。次に、約１００μｌの標準変異原を、標準変異原バイアルに加えた。（非Ｓ９活性化に対してＮａＮ３、およびＳ９活性化について２−アミノアントラセン）。適切な量の無菌水を次に加えて、最終容積を１７．５ｍＬにした。次に、約５μｌの細菌をブランクを除く各管に加えた。各バイアルをボルテックスし、無菌のマルチチャネルピペットボートに注ぎ、ウェル当たり２００μｌを、マルチチャネルピペッターを用いて９６ウェルプレートにピペットした。プレートをラベルし、被覆し、ジップロックバッグ内に入れて、３７℃で５日間インキュベートした。
【０１５１】
インキュベーション５日目に、プレートをインキュベーターから取り出し、層流フードに入れた。ブランクを最初に分析した。黄色のウェルがあれば、試験は汚染され、結果は無効であると考えられた。プレートは次に、以下の様式で視覚的に採点した：（１）全て黄色、部分的に黄色、または不透明なウェルは陽性とする、または（２）全て紫色のウェルは陰性とする（陰性対照プレートと比較）。各プレートの陽性ウェルの数を記録した。バックグランドプレートは、アッセイした有機物の自発的またはバックグランド変異を示した。各処置したプレートの結果を、バックグランド変異に対して採点した。各処置プレートについて、統計的有意差は、キットと共に提供されている表４．１を用いて決定した。Gilbert, R.I., The Anslysis of Flucutation Tests, Mutation Research, at 283-289 (1980)を参照のこと、これは参照により組み込まれる。処置プレートが全て紫色のウェルを含む場合は、試料の試験株に対する急性毒性が生じている可能性がある。
【０１５２】
前述のエイムス試験プロトコルに関するその他の参考文献であって、参照により組み込まれるものは、以下である：Ames, B., F. Lee, and W. Durston. 1973. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 782-786；McCann, J., N. Spingarn, J. Kobori, and B. Ames. 1975a. Detection of carcinogens as mutagens: Bacterial tester strains with R Factor plasmids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 979-983；McCann, J., E. Choi, E. Yamasaki, and B. Ames. 1975b. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: Assay of 300 chemicals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 5135-5139；およびMortelmans K, and E. Zeiger. 2000. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutat Res. 455: 29-60。
【０１５３】
アッセイ結果は以下の通りである：
【表４】
2012532198.tif 000159
【０１５４】
例５：Long Evansラットにおけるin vivo抗精子形成試験
雄Long Evansラットを５５日目に注文し、接種前に５日間の隔離期間を設けた。水および餌は自由に与えた。試験の前日、全動物を計量した。
ラットが６０日齢になった時、試験化合物を冷蔵庫から取り出して、４８０ｍｇの材料を計量した。材料を次に、６．００ｍｌのジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）（Fisher、認証ＡＣＳ、D128-500）に溶解して、８０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製した。この溶液を、ラットに２００ｍｇ／ｋｇの範囲で注射するために用いた。
ロニダミンの場合、１％の濃ＨＣｌを加えて約１５分超音波処理し、物質を溶解および懸濁させることが必要であった。氷を超音波処理器に入れて、この間の過熱を防いだ。
次に８０ｍｇ／ｍｌ溶液約１．００ｍｌを、７ｍｌのＤＭＳＯに加えて、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を、ラットに２５ｍｇ／ｋｇ範囲で注射するのに用いた。
【０１５５】
８０ｍｇ／ｋｇ溶液および１０ｍｇ／ｋｇ溶液の両方を、使用の直前までフォイルに包んで保管した。対照として、動物に対して、ＤＭＳＯのみ（またはロニダミンの場合はＤＭＳＯ＋１％ＨＣｌ）を注射した。次に、使用の直前にラットを計量した。体重はキログラムに変換し、処置濃度を掛け算し、その群への溶液濃度で割り算した。例として、２００ｍｇ／ｋｇの処置群における２５０ｇは、次のように計算される：
（ａ）（０．２５０ｋｇ）（２００ｍｇ／ｋｇ）／（８０ｍｇ／ｍｌ）＝０．６２５または０．６３ｍｌ
（ｂ）対照への注射は、同様の様式で、それらが処置群の１つにいる場合に受け取る量を計算することにより行った。すなわち、２５０ｇの対照ラットもまた、０．６３ｍｌを受ける。
（ｃ）各ラットについて計算した溶液量を次に、２１ゲージ針でキャップした無菌の１ｃｃツベルクリンシリンジに入れ、動物の左下腹部の上側にｉ．ｐ．注射した。注射の前にシリンジを引き戻して、針が血管または臓器に入っていないことを確認した。
【０１５６】
動物をケージに戻し、続く数時間は近くで観察し、その後少なくとも１日１回チェックした。全ての生存している動物を、注射後２日目に再計量した。注射後５日目、動物を最後に再計量し、次に二酸化炭素窒息により安楽死させた。窒息直後、動物を正中腹部切開により開腹し、左右の精巣両方を取り出した。精巣は付着組織を切り取って計量した。
計量後、手術用メスの刃Ｎｏ．１１を用いて７〜１０個の穿刺孔を白膜に入れ、次いで精巣を、６ｍｌのブアン固定液に４℃で少なくとも４８時間入れた。ブアン固定液は、１２５ｍｌの飽和ピクリン酸（Sigma）、２５ｍｌの氷酢酸（Fisher,A35-500）、３７５ｍｌの３７％ホルムアルデヒド（Fisher, F79- 500）を一緒に混合することによって調製した。代替的に、精巣を１０％ホルマリンに固定した。
【０１５７】
各群の動物のうち少なくとも２匹において、膵臓、右の腎臓および肝臓の一部、心臓、脾臓、および肺を取り出し、毒性作用を評価した。例６を参照のこと。
４８時間後精巣を取り出し、冠状中央領域（mid-coronal region）で半分に切断し、その後さらに４８時間、ブアンに入れ戻した。同様のプロセスを、１０％ホルマリン固定した精巣に対しても行った。 ２番目の４８時間の後、組織を取り出し、包埋カセットに入れ、次いで７０％エタノールで２回洗浄して、固定液の一部の除去を試みた。組織は、以下のプロトコルを使ってパラフィンに包埋した。 （ａ）７０％エタノール、１時間、（ｂ）８０％エタノール、１時間、（ｃ）９５％エタノール、４０分、（ｄ）９５％エタノール、４０分、（ｅ）９５％エタノール、４０分、 （ｆ）１００％エタノール、４０分、（ｇ）１００％エタノール、４０分、（ｈ）１００％エタノール、４０分、（ｉ）キシレン置換、１時間、（ｊ）キシレン置換、１時間、（ｋ）パラフィン、１．５時間、（ｌ）パラフィン、１．５時間。その後、５μｍの切片を切り出し、Ｈ＆Ｅ染色した。
【０１５８】
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、２Ａ、２Ｂ（ＲＣ−ＭＣ−３０）、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、４Ａ、４Ｂ（ＲＣ−ＭＣ−８６）、５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ（ＲＣ−ＭＣ−１１０）は、本発明によるいくつかの化合物について、体重、左および／または右精巣重量、ステージ、および管の発達（tubular development）における変化、および組織学的精巣への効果を示す。これらの結果は、本発明の化合物により、対象の体重に悪影響を与えることなく、精子形成が阻害されたことを示している。J.M. Whitsett et al., Effect of Transitional Photoperiods on Testicular Development and Puberty in Male Deer Mice, J. Reprod. Fertil. 72 (2):277-286 (1984)を参照のこと。
本発明の化合物の用量反応を、次の表２に示す：
【表５−１】
2012532198.tif 000160
【０１５９】
【表５−２】
2012532198.tif 000161
【０１６０】
【表５−３】
2012532198.tif 000162
用量反応については、分数は、５匹のうちの反応した動物の数と、５匹のうちの生存した動物の数を示す。死亡率については、分数は、注射した５匹のうち、死亡した動物の数を示す。
【０１６１】
例６
本発明のいくつかの化合物をＩＰおよび／または経口で投与された動物の、毒性について検査した。犠牲にした時に、肝臓、膵臓、心臓、肺、脾臓および腎臓の試料を取り出し、視覚的に検査し、最短で４８時間、ブアン溶液中に浸漬固定した。全ての臓器を次に薄片にして、壊死、炎症、出血、および腫瘍の可能性の証拠について検査した。各組織の主要な静脈もまた、特に肝臓と膵臓において、拡張について検査し、任意のその他の異常を、既知の病理組織学的状態と比較する。上記に加えて、心臓は、筋肉壁における線維化の証拠について検査し、心室壁の厚さを比較した。膵臓は、主にカルシウムの沈着を調べ、一方肺は、任意の滲出液や出血の兆候について、特に肺胞腔でチェックした。最後に、腎臓は主に、皮質の糸球体における微細な出血、尿細管壊死または変化について検査した。
【０１６２】
例６Ａ：ＲＣ−ＭＣ−３０対ロニダミンの毒性比較
この例では、ＲＣ−ＭＣ−３０の効果を、ロニダミンのそれと、性的に成熟したラットにおいて比較した。上述のように、各ラット(合計８匹）は１回の注射を受け、注射の５日後に犠牲にして検査した。次の表（表３Ａ〜３Ｂ）は所見を示す。
表３Ａ
【表６】
2012532198.tif 000163
【０１６３】
表３Ｂ
【表７−１】
2012532198.tif 000164
【０１６４】
表３Ｂ
【表７−２】
2012532198.tif 000165
【０１６５】
例６Ｂ：ＲＣ−ＭＣ−１１０の毒性結果
この例では、ＲＣ−ＭＣ−１１０の毒性の結果を、対照と比較して検討した。２匹の対照およびＲＣ−ＭＣ−１１０を投与した４匹の動物を検討した。
２匹の対照（動物２６１と２６２）において、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。壊死または出血の兆候は、いずれの組織においても明らかではなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。
２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与した動物についても検討した。肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て、２５ｍｇ／ｋｇを投与された２匹の動物（動物２６６と２６７）および２００ｍｇ／ｋｇを投与された２匹の動物（動物２７１と２７４）において、正常範囲内のように見えた。壊死または出血の兆候は、いずれの組織においても明らかではなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。
【０１６６】
別の実験で、５匹の動物に２００ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を与えた。 ＩＰ注射の約１０分後、試験した５匹の動物は全て不活発になり、動きを停止した。注射の１５〜２０分後、この群の全ての動物は両方の後肢にかすかな震えを有し、これは約３０分続いた。２匹の動物は、そのケージから５フィート以内において聞こえる、呼吸時のウェットな水泡音を有した。３匹の動物は２〜３時間後に死亡し、一方別の２匹は回復して、任意の他の症状を示さなかった。
追跡実験において、６ｍｇ／ｋｇおよび１２ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与した動物の毒性についても検討した。動物２８６（６ｍｇ／ｋｇ）について、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肝臓は、離れて散在する小さな壊死部分（necrotic patch）を有した。動物２８７（６ｍｇ／ｋｇ）については、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肝臓は、離れて散在する小さな壊死部分を有し、亜急性肝臓壊死においてよく見出されるものと似ていた。
【０１６７】
動物２９１（１２ｍｇ／ｋｇ）について、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肝臓は、離れて散在する小さな壊死部分を有し、亜急性肝臓壊死においてよく見出されるものと似ていた。動物２９２（１２ｍｇ／ｋｇ）について、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肝臓は、亜急性肝臓壊死においてよく記述されるものに似た、小さな壊死のまだら状部分を含んでいた。肺もまた、複数の小さな出血部を、呼吸細気管支および終末細気管支の周りに有した。
【０１６８】
例６Ｃ：ロニダミンと比較したＲＣ−ＭＣ−１１０の毒性結果
この例では、種々の量のＲＣ−ＭＣ−１１０および２５ｍｇ／ｋｇのロニダミンを投与した動物の毒性について検討した。対照はコーン油のみであった。
コーン油を用いた２匹の対照（動物３２６と３２７）および２５ｍｇ／ｋｇのロニダミンを投与した動物（動物３５６と３５７）において、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。
６ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇの４種類の経口用量レベルのＲＣ−ＭＣ−１１０それぞれからの２匹の動物（動物３３１と３３２）において、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。１．５ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を投与した１匹の動物において（動物３４１）、肝臓は少数のランダムに散在する小さな壊死部分を示したが、それ以外は正常であった。１．５ｍｇ／ｋｇを投与した他の動物は、正常のように見えた。
【０１６９】
例６Ｄ：ＪＷＳ−１−１１０の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＪＷＳ−１−１１０を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。動物３０６（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大のいかなる兆候も有さなかった。脾臓は、拡張した静脈および白脾髄における壊死を有し、これはしばしば、門脈圧亢進症の初期の指標となる。動物３０７（２５ｍｇ／ｋｇ）の膵臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大のいかなる兆候も有さなかった。肝臓は、拡張した門脈とそれを取り巻く肝臓壊死の小部分を有した。肺は、肺胞および終末細気管支の周りに散在する出血部を有した。また、脾臓は拡張した静脈および、壊死細胞を含む白脾髄の量の減少を有した。
【０１７０】
動物３１１（２００ｍｇ／ｋｇ）について、腎臓、心臓および膵臓は正常範囲内のように見え、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大のいかなる兆候も有さなかった。肝臓は、拡張した門脈と壊死の小部分を有した。肺は、肺胞および終末細気管支および呼吸細気管支にわたって複数の出血部を有した。これらの出血部分のいくつかは、隣接する区画の間の拡張をもたらした。最後に、脾臓は拡張した静脈および、壊死細胞を有する白脾髄の減少を示した。動物３１２（２００ｍｇ／ｋｇ）については、腎臓、心臓および肺は正常範囲内のように見え、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は分割されていたため、心室の拡張があるかどうかを決定できなかったが、心室壁の肥大があるようには見えなかった。肝臓は、拡張した静脈と、散在する壊死の小部分を全体に有した。膵臓は拡張した静脈を有したが、その他の顕著な異常は有さなかった。最後に、脾臓は、拡張した静脈および、壊死細胞と共に白脾髄の減少を示した。
【０１７１】
例６Ｅ：ＪＷＳ−１−１１４の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＪＷＳ−１−１１４を投与した動物の毒性を検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。動物３１６および３１７（２５ｍｇ／ｋｇ）の肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は、正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大のいかなる兆候も有さなかった。
動物３２１（２００ｍｇ／ｋｇ）の膵臓、心臓および腎臓は、正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大のいかなる兆候も有さなかった。肺は、細気管支の周りに大量の肺出血と、肺胞クラスターの間にうっ血した拡張領域を有した。肝臓は中程度の大きさ（直径が５〜１０細胞）の壊死部分を通常は門脈周辺に有したが、しかし静脈拡張の証拠はなかった。この動物については脾臓試料はなかった。動物３２２（２００ｍｇ／ｋｇ）の肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は、正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大のいかなる兆候も有さなかった。
【０１７２】
例６Ｆ：ＪＷＳ−１−１３０の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＪＷＳ−１−１３０を投与した動物の毒性について検討した。対照はコーン油のみであった。動物３６６（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。壊死、腫瘍または出血の兆候はなかったが、心臓には、心室から切片を切り取る際のいくつかの人工的な裂傷があった。心臓は、心室壁の肥大または拡張の証拠を示さなかった。肝臓は、全体にわたって拡張した静脈を有するようであったが、その他の異常は見当たらなかった。動物３６７（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すいかなる兆候も有さなかった。肝臓は、通常は門脈周辺に存在する小さな散在する壊死部分と共に、全体にわたって拡張した静脈を有した。
動物３７１（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すかなる兆候も有さなかった。動物３７２については、、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すいかなる兆候も有さなかった。肝臓は、通常は門脈周辺に存在する小さな散在する壊死部分と共に、全体にわたって拡張した静脈を有した。
【０１７３】
例６Ｇ：ＪＷＳ−１−１４２の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＪＷＳ−１−１４２を投与した動物の毒性について検討した。対照はコーン油のみであった。動物３７６および３７７（２５ｍｇ／ｋｇ）両方については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すいかなる兆候も有さなかった。
動物３８１（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すいかなる兆候も有さなかった。肝臓は、実質組織内にリンパ球の小さな限局されたクラスターを含んでいた。動物３８２（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すいかなる兆候も有さなかった。
【０１７４】
例６Ｈ：ＪＷＳ−１−１４６の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇのＪＷＳ−１−１４６を投与した動物の毒性について検討した。対照はコーン油のみであった。動物３９６および３９７（２５ｍｇ／ｋｇ）の肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すいかなる兆候も有さなかった。
例６Ｉ：ＪＷＳ−１−１４４の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇのＪＷＳ−１−１４４を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。動物４４１および４４２（２５ｍｇ／ｋｇ）の肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すいかなる兆候も有さなかった。
【０１７５】
例６Ｊ：ＪＷＳ−１−１７０の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＪＷＳ−１−１７０を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。動物４５６および４５７（２５ｍｇ／ｋｇ）の肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大を示すいかなる兆候も有さなかった。
動物４６２（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。動物４６３（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肝臓は、主に門脈周囲に中程度の壊死部分（直径は５〜１０個の細胞）を有した。
【０１７６】
例６Ｋ：ＪＷＳ−１−１９０の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇのＪＷＳ−１−１９０を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。動物４６６については、肝臓、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肺は、肺胞クラスターに複数の散在する出血部分を有し、肺胞の多くは、エオジンでわずかに染色されているように見える透明な浸出液で満たされていた。動物４６７については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。
【０１７７】
例６Ｌ：ＲＣ−ＭＣ−１５６の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１５６を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。動物４７６（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大のいかなる兆候も示さなかった。肺は、主に肺胞および終末細気管支領域に、散在する小さな出血部分を有した。動物４７７（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大のいかなる兆候も示さなかった。肺は、肺胞および終末細気管支全体にわたる広い出血部を、数個の小さな細気管支周辺の小さなヘモシデリン沈着と共に示した。
動物４８１（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さない。動物４８２（２００ｍｇ／ｋｇ）については、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肺は、主に肺胞および細気管支の周りに、小さな散在する出血部を有した。肝臓は、実質組織全体に散在する小さな（直径は４〜５個の細胞）壊死部分を有し、これは、亜急性壊死において通常見出されるものに似ていた。
【０１７８】
例６Ｍ：ＲＣ−ＭＣ−１５８の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１５８を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。動物４８６（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さない。動物４８７（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。肺は、主に肺胞および終末細気管支の周りに、小さな散在する出血部を有した。
動物４９１（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肺は、主に肺胞領域に複数の大きな出血部を、いくつかのヘモシデリン沈着と共に有した。動物４９２（２００ｍｇ／ｋｇ）については、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の証拠はなかった。心臓は、拡張または肥大の兆候を示さなかった。肺は、主に肺胞において、複数の大きな出血部を有した。肝臓は、一般に門脈の周りに、小さな散在する壊死部位を有した。
【０１７９】
例６Ｎ：ＪＳＷ−１−１５８の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＪＳＷ−１−１５８を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。両方の対照は、門脈周辺部位の間に中程度の壊死部を有し、細胞質は、多くの部位で浸食されているように見えた。動物４０６（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。動物４０７については、肝臓、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肺は、肺胞および細気管支壁の肥厚および、数個の隣接する肺胞を覆う中程度の大きさの出血の散在する部分を有した。
動物４１１（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さない。膵臓は、腺房細胞の間に周辺から内側へと広がるリンパ性浸潤の部位を有した。動物４１２（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。
【０１８０】
例６Ｏ：ＪＳＷ−１−１６０の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＪＳＷ−１−１６０を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。両方の対照は、門脈周辺部位の間に中程度の壊死部を有し、細胞質は、多くの部位で浸食されているように見えた。動物４１６（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肺、膵臓、脾臓、および心臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。腎臓は、周辺よりも髄質−皮質境界近くの内皮質において、散在する尿細管壊死の小さな部分を有する。肝臓は、いくつかの拡張した静脈を有したが、その他の異常は見当たらなかった。動物４１７（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。
動物４２１（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、および心臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。腎臓は、内皮質において、散在する尿細管壊死の小さな部分を有した。動物４２２については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。
【０１８１】
例６Ｐ：ＪＳＷ−１−１６２の毒性結果
この例では、２５ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇのＪＳＷ−１−１６２を投与した動物の毒性について検討した。対照はＤＭＳＯのみであった。両方の対照は、門脈周辺部位の間に中程度の壊死部を有し、細胞質は、多くの部位で浸食されているように見えた。動物４２６および４２７（２５ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、肺、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。
動物４３１（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肺は、多くの小さな細気管支を囲む散在する出血部分を、一般にそのごく近傍の肺胞壁の肥厚と共に有した。動物４３２（２００ｍｇ／ｋｇ）については、肝臓、膵臓、脾臓、心臓および腎臓は全て正常範囲内のように見えた。どの組織にも、壊死、腫瘍または出血の兆候はなかった。心臓は、拡張または心室壁の肥大の兆候を示さなかった。肺は、肺胞壁の肥厚を示す中程度の領域を、肺胞を満たしている、エオジンによりわずかに染色された透明な浸出液と共に有した。
【０１８２】
例７：化合物の経口投与後の生殖能力試験
次の表（表４Ａ）は、１回の経口用量６ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を雄ラットに経口で投与した結果を示す。化合物は、最小量の１０％エチルアルコールに溶解し、コーン油と混合した。エチルアルコールは、投与の前に１０％に蒸発させた。「正常な胚」および「異常な胚」は、妊娠した雌１匹当たりの平均の胚数を示す。
表４Ａ：６ｍｇ／日のＲＣ−ＭＣ−１１０を７日間毎日経口投与後の雄ラットの生殖能力
【表８】
2012532198.tif 000166
【０１８３】
次の表（表４Ｂ）は、１回の経口用量６ｍｇ／ｋｇ／日のＲＣ−ＭＣ−１１０を雄ラットに経口で投与した結果を示す。
表４Ｂ：６ｍｇ／ｋｇのＲＣ−ＭＣ−１１０を１回経口投与後の雄ラットの生殖能力。
【表９−１】
2012532198.tif 000167
【０１８４】
【表９−２】
2012532198.tif 000168
【０１８５】
次の表（表４Ｃ）は、４種の異なる１回経口用量でＲＣ−ＭＣ−１１０を雄ラットに経口投与した結果を示す。
表４Ｃ：１０％エチルアルコールおよびゴマ油中のＲＣ−ＭＣ−１１０の１回の経口投与後のチャレンジ交配試験。
【表１０】
2012532198.tif 000169
【０１８６】
例８：精子形成を阻害する化合物
上記したように、本発明のいくつかの化合物はＨｓｐ９０およびＥＦ１−αに結合し、精子形成を阻害するように機能することが示された。したがって、これらタンパク質の両方の１つに結合するその他の化合物も、精子形成を阻害し得ると予想される。したがって本発明は、Ｈｓｐ９０および／またはＥＦ１−αの活性を阻害する化合物の治療有効量を投与することにより、精子形成を阻害する方法に広く関連する。
いくつかの既知のＨｓｐ９０阻害剤を上に挙げている。ＨＳＰ９０について、ＲＣ−ＭＣ−１１０は、Ｈｓｐ９０のＮ末端ＡＴＰ結合部位または新規な部位の、新規な阻害剤のようである。ショジョウバエ（fruitfly）におけるＨｓｐ９０の変異体は、不妊の雄および雌を生成することに留意すべきである。Yue L, Karr TL, Nathan DF, Swift H, Srinivasan S, Lindquist S. Genetic analysis of viable Hsp90 alleles reveals a critical role in Drosophila spermatogenesis. Genetics. 1999 Mar;151(3):1065-79を参照のこと。ロニダミンおよびＲＣ−ＭＣ−１１０をショジョウバエに与えると、両者は繁殖を阻害した。しかし、ＲＣ−ＭＣ−１１０はロニダミンより強力であった。
さらに、伸長因子１−α（ＥＦ１ａ）はＧＴＰ結合タンパク質であるため、一定のヌクレオチドアナログまたは一定のＧＴＰ結合ポケットの阻害剤は、避妊薬として作用するはずであると考えられる。あるペプチダーゼの阻害剤であるユビキチン−アルデヒドもまた、ＥＦ１ａを阻害し得る。Gonen H, Smith CE, Siegel NR, Kahana C, Merrick WC, Chakraburtty K, Schwartz AL, Ciechanover A. Protein synthesis elongation factor EF-1 alpha is essential for ubiquitin-dependent degradation of certain N alpha-acetylated proteins and may be substituted for by the bacterial elongation factor EF-Tu. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Aug 2;91(16):7648-52を参照のこと。
【０１８７】
例９： 
抗精子形成活性の最初のスクリーニングおよび特徴付けのために、対照群および試験群の各々は、５匹の６５〜７０日齢のLopng-Evansラット（２５０〜２７４ｇ）を有した。最初のスクリーニングは、２５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、または等用量のビヒクル対照（２．５ｍｌ／ｋｇにて）の１回のＩＰ注射を受けた動物の３群において実施した。２５ｍｇ／ｋｇ用量でのＩＰ投与でＬＮＤよりさらに強力な化合物を、次に経口投与（１回の経口的胃管栄養）により試験して、交配実験に含めた。経口投与には、ガメンダゾールを１０％エタノール／ゴマ油中に製剤化した。交配試験については、ラットの１群（群あたり７匹）をビヒクル（５ｍｌ／ｋｇ）で処置し、残りの群をガメンダゾールで、１回の用量０．７５、１．５、３．０、または６．０ｍｇ／ｋｇで、または６．０ｍｇ／ｋｇ／日で７日間、処置した。
【０１８８】
組織は組織学検査用に処理した。ロニダミンを標準として用いた実験において、生殖上皮の破壊が、１回のＩＰ注射後４８時間に見られた。しかし、精細管の内腔は、放出された細胞で満たされ、精子形成指標の評価は不可能であった。１回の投与の５〜７日後の間に、内腔からの脱離細胞およびデブリの除去が安定化し、精子形成指標の定量化が可能となった。初期の実験では安楽死を７日目に行ったが、後にコスト削減のため５日目が選択され、得られたデータに影響はなかった。動物を安楽死させ、精巣を取り出して計量した。精巣は、組織をヘマトキシリン＆エオジンで染色した以外は前述のようにして［２０］組織検査用に処理した。交配試験後の精巣切片をＰＡＳ−ヘマトキシリンで染色した。上記した最初のスクリーニング実験において、安楽死時に各群から２匹の動物を、組織の解剖検査用にランダムに選択した（脳、肺、胃、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、および消化管を含む）。動物が死んだ場合や、５日間の処置後スケジュールの前に安楽死になった場合（ＡＦ２７８５については、２００ｍｇ／ｋｇＩＰにおいて６匹のうち２匹の動物、ガメンダゾールについては、２００ｍｇ／ｋｇＩＰにおいて５匹のうち３匹の動物が該当した）、これらのラットも解剖検査に供した。このスクリーニング実験からの組織は、獣医学病理学者により評価され、潜在的毒性についての最初の情報が提供された。ガメンダゾールの毒性をさらに評価するために、より詳細で広範な毒性研究が必要である。
【０１８９】
ＡＦ２７８５およびＡＦ２３６４（図２）を合成および試験して、既に文献に報告されているＬＮＤアナログと比較した。前に公開されている化合物のうち、ＡＦ２７８５およびＡＦ２３６４のみをＬＮＤに対する参照標準として選択したが、これは、他の全ての従来のインダゾールカルボン酸アナログが、より強力でなく、さらに毒性が強く、およびまたは可逆性が弱いためである。
【化１５３】
2012532198.tif 000170
【０１９０】
ＡＦ２７８５、ＡＦ２３６４および新しく設計された化合物を、ロニダミン（ＬＮＤ）との相対的な有効性に基づいてランク付けするために、用量反応実験を最初に実施して、試験した動物の〜５０％において反応を示すＬＮＤの用量を次のようにして同定した：動物における陽性反応は、１つの化合物の投与の５日後における、３０％を超える精巣重量の減少、および、５０%を超える精細管での精子細胞の減少（精細管あたり５以下）に基づく。反応を示した全ての化合物について、精巣重量の減少は常に精子細胞の減少と整合していた。これらの基準を用いて、２５ｍｇ／ｋｇのＬＮＤが、５匹の動物の反復群において平均５０％の反応（すなわち、１群あたり＞２匹）を与えることが見出された。同じ基準を用いると、ＡＦ２７８５、ＡＦ２３６４および抗精子形成効果を有する新しいアナログの大部分については、反応は通常、「全か無か」であった。すなわち、反応しなかった動物は、対照と比べて精巣重量はほぼ同じであり、精巣組織構造はほぼ正常に見えた。反応した動物において、精巣は通常、対照より３０〜５０％重量が少なく、組織構造では、少なくとも７５％の精細管が５以下の精子細胞であった。同様の所見が、ＬＮＤまたはガメンダゾールの２５ｍｇ／ｋｇの経口投与後７日目に評価されたラットでも観察された。精巣重量は、ＬＮＤ−およびガメンダゾールで処置したラットにおいて、それぞれ３２％（ｐ＜０．０２）および５４％（ｐ＜０．０００１）減少していた。さらに、正常な形態を示している細管のパーセンテージは、ビヒクル処置のラット（９９±１％；平均±ＳＤ、ｎ＝６、ランクについてクラスカル・ワリスのＡＮＯＶＡと続くＳＮＫ検定に基づく）と比べて、ＬＮＤ（３２±１０％）およびガメンダゾール（１±１％）の経口処置により有意に低下した（ｐ＜０．０５）。反応する動物において、破壊された生殖上皮は、前に公開されたものと同一であるように見えた（図７）。４００ｍｇ／ｋｇの用量のＬＮＤは、報告されたＬＤ５０に近く、４０％の死亡率をもたらし、一方、ＬＮＤのより低い全ての用量では、動物の死亡は起こらなかった。したがって、ルーチンのスクリーニングには、新しいアナログの試験のために２種類の用量を用いた。２５ｍｇ／ｋｇの低用量は、ＬＮＤに対する作用強度を決定するために用いた；２００ｍｇ／ｋｇの高用量は、毒性のスクリーニングおよび、ＬＮＤならびに２つの別のアナログであるＡＦ２７８５およびＡＦ２３６４と比較して、死亡率の増加がもたらされたかどうかを決定するためである。
【０１９１】
表５は、ガメンダゾール、ＬＮＤ、ＡＦ２７８５、およびＡＦ２３６４についての結果の概要である。いずれのＬＮＤアナログまたはガメンダゾールの２５ｍｇ／ｋｇ用量では、死亡は観察されなかった；しかし、ガメンダゾールはこの用量で１００％の効能を有するただ１つのアナログであった。対照的に、ＡＦ２７８５およびガメンダゾールの２００ｍｇ／ｋｇの用量では、死亡が観察された。
表５．ＬＮＤおよび選択されたアナログの群の１回のＩＰ投与後のラットにおける、抗精子形成反応および死亡率データ
【表１１】
2012532198.tif 000171
【０１９２】
＊反応については、分数は、（精巣重量の減少＞３０％により反応した動物の数）／（その群において試験した動物の総数）を表す。死亡率については、分数は、（減少した動物の数／試験した動物の数）を表す。
＊＊ＬＮＤに対しては、４００ｍｇ／ｋｇの１回の経口用量にて、５匹のうち２匹の動物が死亡した。
２５ｍｇ／ｋｇの最小用量は避妊効果をもたらし、致死用量（下記参照）よりも８倍低い値であるため、詳細なＬＤ５０の決定は、将来のより詳細な用量設定および毒性試験に任せた。第一相試験から必要となった化合物の追加の用量決定試験を、続いて実施した。経口投与による実験をこうして実施して、ガメンダゾールもまた、低用量の避妊薬として経口投与可能で有効であると決定された（図８）。
【０１９３】
ガメンダゾールは、最終ステージの精細胞の減少を引き起こすことが見出された。ガメンダゾールは、抗精子形成効果を、２５ｍｇ／ｋｇのスクリーニング用量で１００％の動物に対して示し（図７および表２）、一方でＬＮＤは、この用量で５０％の動物において精子形成を阻害した。２５ｍｇ／ｋｇ用量でのガメンダゾール（図７、パネルＣおよびパネルＤ）の抗精子形成効果は、ＬＮＤ（図７、パネルＥおよびパネルＦ）と組織構造的に類似である。対照（図７、パネルＡおよびパネルＢ）と比較して、ＬＮＤおよびガメンダゾールの両方は、構造化された精細胞型の層化の減少と、生殖上皮からの精子（spermatozoa）および精子細胞の減少をもたらす。組織学的パターンは、ガメンダゾールがＬＮＤよりも大幅に精子細胞の減少を引き起こすことを示唆する。精子形成指標データはこの観察を支持する（表６）。濃いクロマチンパターンと高い核対実質比を有するより大きな細胞（一次精母細胞）、およびより顕著でないクロマチンパターンを有する小さくより密度の低い染色細胞（二次精母細胞）の脱落（sloughing）も、この高用量でのＬＮＤおよびガメンダゾールで観察された。異なる精細胞型の空胞形成（vacuolation）および基底膜上の精原細胞層の破壊も見られた。交配試験で用いたガメンダゾールの低い経口用量（３および６ｍｇ／ｋｇ）では、精子細胞および精子（spermatozoa）の同様の減少が観察された（図７、パネルＧ〜Ｊ）。しかし、精上皮組織のより高い保持（３ｍｇ／ｋｇで９６％の正常細管、および６ｍｇ／ｋｇで８５％の正常細管）と、細胞のより少ない分離、および空砲形成の不在がみられた。大きな一次精母細胞および小さい二次母細胞の、大幅に少ない脱落が見られた。
【０１９４】
例１０：精子形成指標
Whitsettら（Whitsett JM, Noden PF, Cherry J, Lawton AD. Effect of transitional photoperiods on testicular development and puberty in male deer mice (Peromyscus maniculatus). J.Reprod.Fertil. 1984; 72: 277-286）を修正した、Cookら（Cook CE, Wani MC, Jump JM, Lee YW, Fail PA, Anderson SA, Gu YQ, Petrow V. Structure-activity studies of 2,3,4,4a,5,9b-hexahydroindeno[1,2-c]pyridines as antispermatogenic agents for male contraception. J.Med.Chem. 1995; 38: 753-763）が用いた方法を用いて、試験化合物の精子形成に及ぼす効果を点数付けした。評価には、精巣重量のみでなく、精子形成指標（ＳＩ）も含めた。精巣中心を通る１つの断面において、全ての細管を、精原細胞、精母細胞、および精子細胞の存在について検査した。細管当たりの各細胞型の数に基づき、表６に詳述した点数を割り当てた。
【０１９５】
表６．精子形成指標の評価のための精巣形態に基づく基準
【表１２】
2012532198.tif 000172
図７からのデータを、定量的精子形成指標により確認した（表７）。ＬＮＤに比べてガメンダゾールの強化された作用強度は、１回の経口投与の５日後の精巣重量における、用量依存性の減少により明らかにされた（図８）：より高い薬物濃度で処置した群で得られた最小精巣重量への、対照からの、精巣重量の５０％の減少に基づき、ＬＮＤについて約２５ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０が推定された。
【０１９６】
表７．ＬＮＤアナログの単回投与の５日後の精細管における精子形成指標（ＳＩ）。
【表１３】
2012532198.tif 000173
【０１９７】
例１１：処置後の体重および生殖器官の変化
抗精子形成活性について用いた動物は６０日齢であり、ビヒクル処置したラットは５日間の実験中に正常な体重増を示した（図９Ａ〜９Ｂ）。２５ｍｇ／ｋｇのＬＮＤ、ＡＦ−２７８５、およびＡＦ−２３６４では、２日間の体重増加の遅れと続く対照群と並行する増加、または２日間のわずかな減少と続く対照群と並行する増加があった。２００ｍｇ／ｋｇのＬＮＤでは、２日間の体重のより大きな減少と、残る３日間の同じ体重の維持があった。ＡＦ−２７８５、およびＡＦ−２３６４を投与した動物は、２５ｍｇ／ｋｇ用量で観察されたのと同様の体重増加の遅れを示した。ガメンダゾールで処置した場合は体重増加の遅れはなく、体重増加率は５日間全体で対照のそれと並行していた。２５ｍｇ／ｋｇのガメンダゾール群はわずかに高い体重から開始されたが、どの時点でも対照と有意な差はなかった。２００ｍｇ／ｋｇの用量では、生存した動物には体重増加の２日間の遅れと、続く対照動物と並行した増加があった。ＩＰ投与実験とは対照的に、上記のように、２５ｍｇ／ｋｇでの１回の経口投与実験において、ラットの体重は処置群の間で違いはなかった（ｐ＞０．０５、データ示さず）。
【０１９８】
２つの交配試験研究からのラット（表９および１０）は、実験終了時（１０週または２７週）に解剖に付し、生殖器官の重量および精巣エンドポイントのデータを得た。３ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの単回投与群およびそれぞれのビヒクル対照群のデータのみを、表８に示す。３ｍｇ／ｋｇでの処置群において、不妊になった全ての動物が生殖能力を回復し、精巣または精巣上体の重量に対照との有意な差はなかった。処置の１０週後に、精子細胞数の１０％の減少および、正常な精細管の割合に１８％の減少がみられたが、しかし全ての動物は繁殖可能であった。６ｍｇ／ｋｇのガメンダゾール群において、全動物についてのデータ、および生殖能力を回復した動物と、処置の２７週後に不妊のままである動物に分けたものについてのデータを示す。処置した全ての動物について、雄の生殖パラメータは対照動物と比較して有意に低かった。しかし、生殖能力回復と不妊によりサブグループ化した場合、これらのパラメータはそれでもビヒクル処置のラットより低かったが、対照の値に近づいていた。
【０１９９】
表８．ガメンダゾールの単回経口投与後の身体、精巣、および精巣上体のパラメータ。
【表１４】
2012532198.tif 000174
【０２００】
１回のＩＰ投与の５日後、動物を安楽死させ、肉眼解剖を実施した。ガメンダゾールまたはＬＮＤアナログ処置群から少なくとも１匹のランダムに選択した動物において、病理検査を行なった。健康または行動について異常な効果を示した全ての動物も、詳細に検査した。全ての組織を病理組織的に検査した；影響のあった組織のみを報告する。２００ｍｇ／ｋｇ用量でのＬＮＤ処置後に、肝臓のいくつかの部位は充血した動脈および静脈を含んでおり、一方他の部位はうっ血しているように見えなかった。腎臓については、いくつかの動脈の充血および膨張した細動脈が、時折の近い細管の間の大量の血液と共に観察された。怒張した動脈および静脈はまた、膵臓でも観察された。これらの副作用は通常、２００ｍｇ／ｋｇ用量のＬＮＤにおいて５匹のうち少なくとも１匹の動物で指摘された。これらは、２５ｋｇ／ｍｇ用量の動物では観察されなかった；しかし、２５ｋｇ／ｍｇにおいて、約５０％の動物のみが精子形成の阻害を示したことも留意すべきである。２５ｋｇ／ｍｇのＡＦ−２７８５での処置後に、肝臓および膵臓周辺近くの散在する部位には、拡張した、血液で満たされた空洞が含まれていた。この部位における、壊死、ピクノーゼ核および残りの細胞の膨潤が観察された。２５ｋｇ／ｍｇのＡＦ−２３６４での処置後に、小さな単離された壊死結節が、肝臓および膵臓の周辺近くに観察された。２００ｍｇ／ｋｇにおいて、肝臓および膵臓両方において、ほとんどの静脈およびいくつかの動脈のうっ血および拡張が観察された。２５ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールの後、処置した動物の全器官における病理組織的所見に目立つものはなく、炎症、壊死、出血または腫瘍の証拠はなかった。２５ｋｇ／ｍｇのガメンダゾール処置した動物の１００％が、精子形成の減少を示したことに留意すべきである。より高い２００ｍｇ／ｋｇの用量において、ガメンダゾールは５匹のうち３匹で死亡が生じた。しかし、生存した２匹の動物において、全器官に目立つものはなく、炎症、壊死、出血または腫瘍の証拠はなかった。続く、１００％の不妊をもたらす６ｍｇ／ｋｇ（経口）までの低い用量での試験において、全ての器官に目立つものはなく、炎症、壊死、出血または腫瘍の証拠はなかった。
【０２０１】
交配試験に用いた動物からの精巣の組織構造（図１０）は、３ｍｇ／ｋｇで処置した動物全てにおける生殖能力の回復が、正常な精子形成の回復と整合したことを明らかにし（図１０、パネルＣ〜Ｄ）、これは一対対照（ビヒクル）の動物と同様であった（図１０、パネルＡ〜Ｂ）。６ｍｇ／ｋｇで処置した動物では、生殖能力を回復したものはまた、正常な精細管組織構造の回復も示した（図１０、パネルＥ〜Ｆ）。生殖能力を回復できなかった動物は、生殖上皮の再生がないだけでなく、残った精細胞の大部分の損失と、多くの細管がセルトリ細胞のみのような病理組織を示した（図１０、パネルＧ〜Ｈ）。
【０２０２】
例１２：交配試験
２つの交配試験アッセイを行って、ラットにおけるガメンダゾールの、用量依存性の抗生殖能力効果を評価した。成人雄Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）非近交系ラット（≧３００ｇ、≧９週齢；Charles River Laboratories, Kingston, NY）を、これらの交配試験アッセイに用いた。生殖能力は、当分野に知られたようにして確立した。最初のアッセイにおいて、生殖能力の証明された雄ラット（１群あたり６匹）に、１回の経口用量のビヒクル（ゴマ油中５ｍｌ／ｋｇの１０%エタノール）または０．７５、１．５もしくは３．０ｍｇ／ｋｇのガメンダゾール（投与の日＝０週の０日）を投与した。交配試験は、１〜９週において、当分野で知られたようにして実施し、雄ラットを安楽死させて、肉眼解剖を１０週目に行った。
２番目の研究では、生殖能力の証明された雄ラット（１群あたり７匹）に、次のように経口で投与した：ビヒクル対照は、５ｍｌ／ｋｇ／日で７日間（０〜６日目）、ガメンダゾールは、６ｍｇ／ｋｇで０日目（１回用量）、またはガメンダゾールを６ｍｇ／ｋｇ／日で７日間（０〜６日目）。交配試験は、１〜１０週（各週）、および１２、１４、１８および２６週目に実施した。２７週目に雄のラットを安楽死させ、肉眼解剖を行った。両方の試験を通して、雄の尾静脈から血液試料を採取して、ホルモンアッセイ用の血清試料を得た。雌の解剖後に受胎数を決定し、受胎産物は肉眼で評価し、正常の外見または吸収（resorbing）に分類した。妊娠した雌１匹当たりの正常な受胎数を、２群の間で、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により統計的に比較した。解剖において、精巣、腹側前立腺および精嚢を切除して計量した。両方の副睾丸および右側精巣を切除し、計量し、ブイン溶液中に保存した。左精巣はホモジナイズし、成熟した精子頭部数の決定に用いた。
【０２０３】
ガメンダゾールによる精子形成の強力な阻害は、ガメンダゾールが抗生殖能力活性を有する可能性を示唆した。生殖能力の証明された雄ラットにおける、用量決定効能交配試験により、１．５、３．０および６．０ｍｇ／ｋｇの１回の経口用量が、ラットに不妊を引き起こすのに有効であることを実証した（表９および１０）。１．５ｍｇ／ｋｇの１回の経口用量において、ガメンダゾールは、９週間の交配試験のうち１つの週のみ（３または４週目）に、６匹のうち２匹に不妊を引き起こした（表４）。３．０ｍｇ／ｋｇの１回の経口用量において、６匹のうち４匹の雄は、４週目に不妊となり、全４匹とも５週目に生殖能力を回復した（表９）。６．０ｍｇ／ｋｇの１回の経口用量のガメンダゾールは、１回の経口投与の４週間後に、１００％の不妊をもたらした（表１０）。６ｍｇ／ｋｇ用量は、１回の経口投与後に１００％の不妊をもたらした、試験した中での最低用量であった。完全な不妊期間は２週間続き、その後６週間までに、７匹のうち４匹の動物は生殖能力を完全回復した。この群の残りの３匹の動物は、生殖能力を回復しなかった。６．０ｍｇ／ｋｇで連続７日間投与した場合、同様な不妊の発生が観察されたが、しかし７匹のうち２匹の動物のみが２６週間の交配試験間隔中に生殖能力を回復した。全ての処置群において、生殖能力を回復した動物について、受胎数および異常な受胎産物の割合は、ビヒクル対照群と有意な差は示さなかった。
【０２０４】
表９．ガメンダゾールは成人雄ラットに不妊を引き起こす：単回経口用量に対する反応
【表１５】
2012532198.tif 000175
【０２０５】
表１０．ガメンダゾールは成人雄ラットに不妊を引き起こす：単回用量と７日間の毎日用量の比較
【表１６】
2012532198.tif 000176
【０２０６】
例１３：投与後の挙動
ＬＮＤ、ＡＦ−２７８５、ＡＦ−２３６４（２５ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ用量）の注射後２〜３時間、動物は不活発となった。ＡＦ−２７８５については、６匹のうち２匹の動物は４０分以内に発作のために死亡した。ガメンダゾールの２００ｍｇ／ｋｇ用量のみについては、３匹の動物を、２０分間で終了した痙攣後に呼吸困難および半意識的状態になった後、安楽死させた。２５ｍｇ／ｋｇの全ておよび２００ｍｇ／ｋｇガメンダゾール群の残りにおいて、および試験した全経口用量において、不活発である証拠（警戒および覚醒の減少、ケージの開放への興味の欠如、対照と比べた不活性期間の延長）は、２５ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ用量のどちらにも存在しなかった。表４および５に記載のガメンダゾールが経口投与された交配試験において、試験した全ての用量におけるガメンダゾール処置動物と対照との間で、交配挙動における差は観察されなかった。
【０２０７】
例１４：血清ホルモンアッセイ
試験を通して採取した血清試料を、ＥＬＩＳＡキット（Oxford Bio-Innovation Ltd, Oxfordshire, UK）によりインヒビンＢについて分析した。ラットのテストステロンおよびＦＳＨ測定のためののＲＩＡは、当分野に知られているようにして実施した。簡単に述べると、テストステロンはDiagnostic Products Corp. （Los Angeles, CA）からのキット（Coat-A-Count）を用いて、非抽出血清試料で測定した。ラットのＦＳＨは、Dr. A. Parlow（National Hormone and Peptide Program）から供給を受けたＮＩＤＤＫ（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases）試薬を用いて、試薬と共に受け取った手順に従って測定した。標準は、ＮＩＤＤＫ−ｒＦＳＨ−ＲＰ−２であった。
単離されたセルトリ細胞を、黒色の９６ウェルディシュにプレートし、３３℃で７２時間インキュベートした。培養培地（無血清補充ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）を取り除き、種々の濃度のガメンダゾール（１０−１０Ｍ〜２×１０−４Ｍ）をエタノールまたはＤＭＳＯ（培地中の最終濃度０．１％）に溶解したものを含有する新鮮な培地に置き換えた。細胞を３３℃に戻し、４８時間インキュベートした。細胞のＡＴＰ含量を、哺乳類細胞溶解バッファー、凍結乾燥基質、および再構築緩衝液を含むPerkin Elmer ATP-Lite Mキットを用いて、キットの挿入物にしたがって測定した。発光を、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer TopCount (Boston, MA)；単位はｃｐｓ）で測定した。データをプロットし、ＩＣ５０をGraphPad PRISMを用いて推定した。
【０２０８】
単離されたセルトリ細胞をプレートし、インキュベートし、種々の濃度のガメンダゾール（１０−１１Ｍ〜１０−６Ｍ）を含むもので処置して、上記のように７２時間インキュベートした。培地を採取し、Sertotecからのキットを用いて、沸騰のステップを省略する以外は製造業者の指示に従って、インヒビンＢを測定し、標準曲線（組み換えヒトインヒビンＢ）をセルトリ細胞培養培地において準備した。検出限界（最低標準）は１５．６ｐｇ／ｍｌであった。
対照とガメンダゾール処置動物の間に、循環テストステロンレベルの有意な差がないことに注目することは重要である（図１１Ｃ）。さらに、ガメンダゾールは、２つのアンドロゲン依存性器官である精嚢および腹側前立腺の重量に、有意な差を生じさせなかった（データ示されず）。ＬＮＤアナログについての前の研究により、セルトリ細胞が薬物の主要な標的であり、精子細胞の減少を導くことが実証された［３３］。６ｍｇ／ｋｇのガメンダゾールで処置した動物における、追加の血清ホルモンレベルの解析により（図１１Ａ）、循環インヒビンＢのレベルにおける、一時的であるが有意な減少（Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ−ＲＭの後にHolm -Sidak多重比較）が、ＦＳＨレベルにおける一過性だが有意でない増加に対応することが実証された（図１Ｂ）。インヒビンＢレベルは、ガメンダゾール処置の後に不妊のままであった動物においては低いままであるが、生殖能力を回復した動物においては、最初の減少後に元に回復することも、留意すべきである。血清ＦＳＨレベルはインヒビンＢレベルと逆に関連したが、増加は有意ではなかった。
【０２０９】
ガメンダゾールの血清インヒビンＢレベルに及ぼす効果は、ガメンダゾールも精巣において、セルトリ細胞を介して作用することを示唆し［３３］、これは、種々の濃度のガメンダゾールでインキュベートしたラットのセルトリ細胞の初代培養物における、インヒビンＢの分泌を測定することにより、確認された（図１２Ａ）。実際、セルトリ細胞におけるインヒビンＢの産生は、ガメンダゾールに非常に感受性が高く、ＩＣ５０は６．８±３．０×１０−１０Ｍである。図１２Ａは、ＩＣ５０を決定するために用いた３回の反復実験のうちの１つからのデータを示す。これに対して、細胞活性のマーカーであるセルトリ細胞ＡＴＰレベルは、ガメンダゾール濃度が１０−５Ｍ以上になるまで減少しなかった（図１２Ｂ）。したがって、セルトリ細胞へのガメンダゾール作用の、生理学的に重要な生物学的マーカーと毒性効果の間には、５つのlogの差がある。ガメンダゾールは癌治療薬のロニダミンに由来するため、in vitro毒性の追加の評価として、ガメンダゾールも、ＭＴＴアッセイを用いて、種々の卵巣癌細胞株の増殖に対する効果について試験した。ＩＤ８−Ｔ１、ＩＤ８、ＳＫＯＶ３、ＣＡＯＶ３の増殖は、それぞれ２．７×１０−５Ｍ、２．９×１０−５Ｍ、１．６×１０−４Ｍ、および７．２×１０−５Ｍのガメンダゾールにより阻害された。これらのＩＣ５０値は、初代セルトリ細胞からのＡＴＰ漏出をもたらすガメンダゾール濃度と同程度であった。生物学的効果と、in vitroでの細胞への毒性効果に対するこの用量差は、ガメンダゾールのさらなる開発に対して有望である。
【０２１０】
例１５：ガメンダゾールのin vitroでの初代セルトリ細胞への結合
初代マウスセルトリ細胞を、上記のようにして単離し、前処理されたガラス製カバーガラス上にプレートした。細胞をＰＢＳで洗浄して過剰な培地を除去し、次に２％パラホルムアルデヒドで固定し、１％ＮＰ−４０で透過化処理（permeabilization）した。細胞を、緩衝液中の５％ＢＳＡで室温で１時間ブロックし、緩衝液で洗浄し、次にＵＶ架橋ビオチン化ガメンダゾール（ＢＴ−ＵＶ−ＧＭＺ）で３７℃にて１時間インキュベートした。細胞を緩衝液で洗浄して未結合の薬物を除去し、次にフルオレセイン−アビジンＤ（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いて暗室で室温にて２０分間インキュベーションした。架橋は、ＵＶミネラルランプの長い波長を用いて４℃で２０分間実施した。カバーガラスを、蛍光に適したVectaShield（登録商標）封入剤（Vector Laboratories, Burlingame, CA）で封入した。
【化１５４】
2012532198.tif 000177
ガメンダゾールの空間的結合を、ガメンダゾールのＵＶ架橋ビオチン化アナログ（ＧＭＺ−ＢＴ−ＵＶ）を用いて、培養初代マウスセルトリ細胞において実証した。染色は主に核周囲（核小体の可能性のある点状染色）と、それよりはっきりしていない細胞質染色であった（図１３、パネルＡ）。対照の、１０倍モル過剰ガメンダゾール（図１３、パネルＢ）またはＬＮＤ（図１３、パネルＣ）の存在下での、ＧＭＺ−ＢＴ−ＵＶによるインキュベーションは、局在化をブロックし、パターンが化合物特異的であることを実証した。ＦＩＴＣ−アビジンのみとの非特異的な結合もまた、非常に少なかった（図１３、パネルＤ）。これらの結果は、セルトリ細胞がガメンダゾール作用の標的であることを示唆する。
【０２１１】
例１５：ガメンダゾール結合タンパク質の親和性精製
ＴＭ−４セルトリ細胞およびＩＤ８卵巣癌細胞：
親和性精製用の十分な出発物質を確保するために、初代セルトリ細胞ではなくＴＭ−４セルトリ細胞を用いて、親和性精製に十分なタンパク質および精巣サイトソルとしてのタンパク質の同等量を提供した。ＴＭ−４細胞は、ＦＳＨ反応性を保持している、セルトリ細胞由来の非腫瘍性マウス細胞株である。ＴＭ−４細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（５０：５０）と５％ウマ血清および２．５％ＦＢＳ中で、２つの１５０ｍｍプレート上に集密（confluency）まで培養した。ＰＢＳで１回洗浄後、細胞を、プレート当たり３ｍｌの細胞溶解バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５ＭのＮａＣｌ、０．００１％のＮＰ−４０、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのベンズアミジン、０．０５ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、０．０１ｍｇ／ｍｌのＴＰＣＫ、０．３μｇ／ｍｌのアプロチニン、および０．３μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤を含む）を用いて溶解した。細胞溶解バッファー中の細胞をかき取ってDounceガラスホモジナイザーに移し、硬い乳棒で５〜１０回突いてホモジナイズした。氷中に３０分間維持した後、ホモジネートを３７，５００×ｇおよび４℃で１０分間遠心分離した。上清溶解産物を２ｍｌのアビジン−アガロース（テトラマー形態）カラム（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／０．００１％のＮＰ−４０、ｐＨ７．４で平衡化済み）に適用して、天然のビオチン化化合物を除去し、除去済みの溶解産物を得た。
【０２１２】
除去済みの細胞溶解産物（２．７ｍｌ）を、６０μＭのビオチン化ガメンダゾール（ガメンダゾール−ＢＴ）でインキュベートした。
【化１５５】
2012532198.tif 000178
【０２１３】
並行対照である除去済み細胞溶解産物の２．７ｍｌのアリコートを、６０μＭのガメンダゾール−ＢＴに１０倍モル過剰のガメンダゾールを加えたものでインキュベートした。ロッカープラットフォーム上で４℃で一晩のインキュベーションの後、試料を、緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％ＮＰ−４０＝ＴＤ緩衝液）で予め平衡化したアビジン−アガロースカラム上に負荷し、バックグランドに到達するまでＴＤで洗浄した。カラムを続いて、０．６ｍｇ／ｍｌのガメンダゾール含有ＴＤ緩衝液２．５ｍｌ、次に２５０ｍＭのＮａＣｌ、および最後に６００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。各２．５ｍｌの溶出液を採取し、Centricon Y-10（Millipore, Billerica, MA）で５０００×ｇ、４℃で２時間、１００〜２００μｌの容積まで濃縮した。アリコートをタンパク質決定用に取り除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動試料緩衝液を加えた。電気泳動は、５〜２０％の勾配ゲル上で実施した。ゲルを固定し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ適合法を用いて銀で染色した。
前に、腫瘍発生マウス卵巣表面上皮細胞（ＩＤ８）が、ガメンダゾールに反応して増殖の阻害を示すことが指摘された。ＩＤ８細胞は、in vitroでの自発的形質転換イベントに続いて発生した。ＩＤ８細胞の、胸腺欠損同系マウスの腹腔への注入は、腹水の形成および腹膜にわたる複数の腫瘍の生着をもたらした。腫瘍の病理組織学的分析は、癌性および肉腫性の成分を含有する、高度に悪性の新生物形成を明らかにした。
【０２１４】
ＩＤ８細胞を、標準の手順を用いて、完全培地［４％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、および亜セレン酸ナトリウム（５ｎｇ／ｍｌ）を補足したＤＭＥＭ］中３７℃で、５％ＣＯ２および空気の加湿環境中で培養した。細胞はＴ７５フラスコ中、集密近くまで増殖させ、冷たい生理緩衝食塩水で２回洗浄し、上述のように細胞溶解バッファーに入れ、サイトゾルを調製し、ＴＭ−４細胞について上述したように、親和性結合および電気泳動に供した。
【０２１５】
ラット精巣：
６０日齢のラットからの精巣サイトゾルを、次のようにして調製した：２匹のラットからの被膜をとった（detunicated）精巣（全２．８ｇ）を、それぞれ氷上の６ｍｌの細胞溶解バッファー中での３回の１０秒バーストにより、PowerGenホモジナイザー（Fisher, Pittsburgh, PA）でホモジナイズし（上記参照）、次にSonic Dismembranator（Fisher, Pittsburgh, PA）を用いて、氷上でセッティング５により、５秒間超音波処理した。試料を氷の上に３０分間置き、次に３７，５００×ｇおよび４℃で１０分間、遠心分離した。得られたサイトゾルを、上記のようにしてアビジン−アガロースカラムを通して予め除去処理し、次に２つの２．７ｍｌのアリコートに分け、４℃で一晩、６０μＭのガメンダゾール−ＢＴまたは、６０μＭのガメンダゾール−ＢＴに１０倍モル過剰のガメンダゾールを加えたものを用いてインキュベートし、次にアビジン−アガロースカラムを通した。上述と同様の方法にしたがって、カラムをそれぞれ、最初に緩衝液で洗浄してバックグランドを達成し、次に段階的に、２．７ｍｌの１．５ｍＭガメンダゾール、ついで３．０ｍＭのガメンダゾール、そして最後に６００ｍＭのＮａＣｌにより溶出し、ガメンダゾールによって溶出されなかった残りのタンパク質を収集した。収集した部分を濃縮し、５〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に上述のように流した。精巣ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを固定し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ適合クマジーブルー法で染色した。
【０２１６】
ガメンダゾールは、in vivoで循環インヒビンＢレベルの顕著な減少を生じさせ、またセルトリ細胞の初代培養物は、in vitroでガメンダゾールによりインヒビン産生の低下を示し、ここでＩＣ５０は６．８×１０−１０Ｍであることが示された。これは、精巣、および特にセルトリ細胞が、この化合物に対して高い親和性を有する１標的または複数標的を含むことを示唆する。この仮説を試験するため、ビオチン化ガメンダゾールアナログであるガメンダゾール−ＢＴをアビジン親和性クロマトグラフィーにおけるリガンドとして用い（図１４）、次いでＭＡＬＤＩ−−ＴＯＦ ＭＳを行って、切り取った親和性バンドに含有されるタンパク質を同定した。以下に示すように、我々は、以前に試験され、ガメンダゾール処置により影響を受けることが見出された全組織または細胞からのサイトゾルから一貫して引き出されたバンドに焦点を合わせた：セルトリ細胞（ＴＭ４細胞、図１４、パネルＡ）、ラット精巣（図１４、パネルＢ）、およびＩＤ−８卵巣癌細胞（図１４、パネルＣ）。
【０２１７】
９０ｋＤａおよび５３ｋＤａのタンパク質バンドは、それぞれ、ガメンダゾールおよび全３種のサイトゾル源からの続く高塩溶出物中に、一貫して観察された。さらに、各９０ｋＤａおよび５３ｋＤａバンドはそれぞれ、同一のガメンダゾールと塩溶出物のプロファイルおよび、全３種のサイトゾル源からの、過剰なガメンダゾール競合による同程度のシグナルの減少を示した。ＴＭ−４細胞および精巣からの９０ｋＤａバンドに対する、最高ランクのタンパク質マッチ（protein match）は、両方とも熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＭＷ８３２２９、Ｐ３４０５８）（それぞれスコア３７および７８）であった。精巣バンドに対するスコアは、５％のMascotデフォールトにより提供される有意レベルより下であったが（スコア５０）、同定の成功に対する追加の証拠としては、タンパク質が、９０ｋゲルバンドから切除されたことである。さらに、全ＨＳＰ９０ＡＢ１の配列の１４％のカバレジ（coverage）を含む７つのペプチドマッチ（peptide match）が、ＴＭ−４の９０ｋＤａバンドを用いて作成され、全配列の１８％を含む１２個のペプチドが、精巣の９０ｋＤａバンドについてマッチした。
ＴＭ−４細胞および精巣からのから５３ｋＤａバンドに対する最高ランクのタンパク質マッチは、両方とも、ＥＥＦ１Ａ１−１（ＭＷ５００８２、Ｐ６２６３０）（スコアはそれぞれ５４および３６）であった。このタンパク質の同定の信頼度は、ゲル電気泳動により決定された、およそ５０，００の予想分子量による。さらに、全配列の１４％のカバレジを含む４つのペプチドマッチが、ＴＭ−４の５３ｋＤａバンドにより作成され、全ＥＥＦ１Ａ１配列の１７％を含む７個のペプチドが、精巣５３ｋＤａバンドについてマッチした。
【０２１８】
ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＥＥＦ１Ａ１含有バンドについての親和性精製および溶出プロファイルは、これらのタンパク質に直接結合したガメンダゾール、またはこれらのタンパク質を含有するタンパク質複合体に結合したガメンダゾールと合致した。初めに、高塩「バンプ」の前の溶出物において、これらのタンパク質を含むバンドは、ガメンダゾール依存性の様式でアビジンカラムに結合した。初めに過剰なガメンダゾール有または無しでインキュベートしたサイトゾルからの、ガメンダゾール溶出タンパク質プロファイルの比較により、ガメンダゾールによってカラムから選択的に溶出された９０ｋＤａタンパク質を明らかにした（図１４、パネルＡ、レーン３）が、過剰なガメンダゾールにより予めブロックされたガメンダゾール溶出物中には、これは不在であった（図１４、パネルＡ、レーン４）。続くＮａＣｌ溶出物中には、９０ｋＤａもまた存在したが、カラムに対するガメンダゾール依存性競合結合は示さなかった（図１４、パネルＡ、レーン６および８）。このバンドのアイデンティティは知られていない。５３ｋＤａにおけるバンドはまた、ガメンダゾールが予めブロックされた溶出物においては存在しない高塩溶出物中でも観察された（図１４、パネルＡ、レーン５〜８）。このバンドもまた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび、配列と得られた３６のペプチド中７つのマッチ（最小１７％の配列カバレジ）によってＥＥＦ１Ａ１と同定された。
【０２１９】
６０日齢のラット精巣からのサイトゾルを用いた同様の親和性精製実験も、ガメンダゾール結合タンパク質におけるＨＳＰ９０ＡＢ１およびＥＥＦ１Ａ１を明らかにした（図１４、パネルＢ）。過剰なガメンダゾールの存在または不在下でインキュベートした精巣サイトゾルからの、ガメンダゾール溶出タンパク質プロファイルの比較により、ガメンダゾールによりカラムから溶出した９０ｋＤａタンパク質を明らかにしたが（図１４、パネルＢ、レーン３〜４）、過剰なガメンダゾールにより予めブロックされたガメンダゾール溶出物中には、これは不在であった（図１４、パネルＢ、レーン６〜７）。溶出試料のウェスタンブロット分析により、９０ｋＤａのクマジー染色されたバンドにマッチする、溶出パターン中のＨＳＰ９０の存在を確認した。出発物質である除去済みのサイトゾルに存在する９０ｋＤａバンドのＨＳＰ９０に対応するウェスタンシグナル（図１４、パネルＢ、レーン１〜２）は、１．５および３．０ｍＭのガメンダゾールで溶出されたが（図１４、パネルＢ、レーン３〜４）、１０倍過剰ガメンダゾールで予めインキュベートされたサイトゾルからの溶出物中には存在しなかった（図１４、パネルＢ、レーン３〜４）。塩溶出物中の９０ｋＤａのクマジー染色バンドに対応するＨＳＰ９０ウェスタンシグナルも存在するが（図１４、パネルＢ、レーン７）、これは過剰なガメンダゾールが結合した対照中には不在であった（図１４、パネルＢ、レーン８）。これらの結果により、前高塩溶出物（pre-high salt eluate）中の９０ｋＤａバンドはＨＳＰ９０を含有し、このバンドにおけるタンパク質（単数または複数）の結合およびその溶出は、ガメンダゾールの、９０ｋＤａバンドそれ自体への直接結合または、結合パートナーとの結合に依存することを実証する。９０ｋＤａバンドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析により、このバンドがＨＳＰ９０ＡＢ１を含むことが確認された。ＴＭ−４細胞で観察されたように、ガメンダゾール依存性の結合および、カラムからの高塩の除去を必要とする溶出に抵抗性の、９０ｋＤａにおけるタンパク質の成分が存在する（図１４、パネルＢ、レーン６〜７）。ウェスタンブロットデータは、ＨＳＰ９０が６００ｍＭの塩溶出物中に存在すること（図１４、パネルＢ、レーン７）および、そのカラムへの結合は、やはりガメンダゾール依存性であること（図１５、パネルＢ、レーン８）を示唆する。したがって、高塩の適用前にカラムから溶出するには、より高レベルのガメンダゾールまたは競合化合物へのより長い暴露が必要であるかもしれない。
【０２２０】
高塩溶出物中のＥＥＦ１Ａ１を含有するバンドであって、過剰なガメンダゾールによりブロックされるものが、ウェスタンブロットにより確認された。ウェスタンブロットはさらに、ガメンダゾールのより高い濃度（３．０ｍＭ）でカラムから溶出された、ガメンダゾールが予めブロックされた試料中にも、ＥＥＦ１Ａ１を明らかにした。ＥＥＦ１Ａ１シグナルの溶出パターンは、カラムへのガメンダゾール依存性の結合は、ＨＳＰ９０に対してより強固であることを示唆し、これは、ＥＥＦ１Ａ１バンドが１．５ｍＭガメンダゾールによってでなく、より高い濃度で溶出され、ガメンダゾールがすでにカラムに適用された後のカラムからの高塩溶出物中にあるためである。過剰なガメンダゾールで予めインキュベートされた対照からの６ｍＭガメンダゾール溶出物中のＥＥＦ１Ａ１のウェスタンシグナルの存在は、ＥＥＦ１Ａ１における高親和性結合部位と、サイトゾル中の大量のＥＥＦ１Ａ１の存在により説明可能である。
【０２２１】
ＨＳＰ９０およびＥＥＦ１Ａ１は、抗癌治療剤のための薬物標的として提案されている。そこで我々は、ガメンダゾールが癌細胞中の同じタンパク質標的に結合できる可能性について検討した。我々はすでに、ＩＤ８細胞が、ガメンダゾールの存在下で培養された場合に、増殖阻害を示すことを示している。図１４のパネルＣに示すように、２つの非常に顕著ではっきりしたタンパク質バンドがカラムから溶出され、それぞれＨＳＰ９０ＡＢ１およびＥＥＦ１Ａ１と同一の挙動を、溶出、相対的分子量、および過剰なガメンダゾールによる結合の競合に関して示した。
【０２２２】
ガメンダゾール−ＢＴを用いた、精巣およびセルトリ細胞サイトゾルからのＨＳＰ９０ＡＢ１およびＥＥＦ１Ａ１の親和性精製は、ガメンダゾールのＨＳＰ９０およびＥＥＦ１Ａ１への直接的または間接的結合を示唆する。ＨＳＰ９０の直接結合は、精製組み換えS. cerevisiaeＨＳＰ８２（ＨＳＰ９０ＡＢ１の相同体）およびガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶを用いて確認された（図１５、パネルＡ）。一定の量のＨＳＰ８２の存在下、ガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶの濃度が増加すると、結合化合物のシグナルが増加する（図１５、パネルＡ、上のレーン）。ガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶのシグナルは、競合するガメンダゾールの存在下で減少し、ガメンダゾール特異的結合を示唆する（図１５、パネルＡ、中のレーン）。ＬＮＤによるガメンダゾール結合に対する競合は、１０ｍＭ以上のＬＮＤまで実現しなかった（図１５、パネルＡ、下のレーン）。これは、ガメンダゾールのＨＳＰ８２への結合は、ＬＮＤに対するよりはるかに強固であることを示唆する。この結論は、ビオチン化ＵＶ架橋ＬＮＤを用いた、精巣からの標的の親和性精製の試みによって支持された。ＬＮＤ特異的結合は、同様の手順によっては実現できなかった（データ示されず）。
【０２２３】
ガメンダゾールのＨＳＰ８２への直接結合を、既知のＨＳＰ９０の阻害剤が、ガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶ結合に競合できるかどうかを試験することにより、さらに検討した（図１５、パネルＢ）。ＨＳＰ９０ファミリーのメンバーは、Ｎ末端およびＣ末端ＡＴＰ結合部位を含む。ＨＳＰ９０機能に対する２つの知られている阻害剤は、ゲルダナマイシン（Ｎ末端ＡＴＰ部位の阻害剤）およびノバビオシン（Ｃ末端ＡＴＰ部位の阻害剤）である。我々は最近、ノバビオシンのアナログであるＡ４を合成し、これはノバビオシンのＨＳＰ９０への低ｍＭ親和性に対抗して、ＨＳＰ９０への低μＭ親和性を有する。ゲルダナマイシンもＡ４もどちらも、ＨＳＰ８２によるガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶの結合については競合しない。これは、ガメンダゾールがＨＳＰ９０と、ゲルダナマイシンまたはＡ４のどちらよりもさらに高い親和性で結合すること、あるいは、ガメンダゾールが他の化合物とは異なるＨＳＰ９０の部位に結合することを示唆する。
【０２２４】
例１６：精製された細菌発現酵母ＨＳＰ８２（ＨＳＰ９０）および精製酵母および哺乳類ＥＥＦ１Ａ１への、ガメンダゾールのin vitro結合およびＵＶ架橋
精製された組み換えSacharomyces cerevisiaeＨＳＰ８２（２０μｌ中５μｇ）、S. cerevisiaeＴＥＦ１、ＴＥＦ３、ＨＳＢ１またはO. caniculus ＥＥＦ１Ａ１を、ガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶを用いて４℃で１時間インキュベートし、次に４℃で２０分間、長波長ＵＶで架橋した。競合インキュベーションを、１０倍モル過剰ガメンダゾール、ロニダミン（ＬＮＤ）、ゲルダナマイシン、およびＡ４（ノボビオシナナログ）を用いて、ＵＶ暴露の前に行った。タンパク質を次に７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ポリフッ化ビニリデン膜に移し、ＴＴＢＳ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、および５０ｍＭのＮａＦ）中の０．１％ＢＳＡでブロックした。シートを次にホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−アビジンでインキュベートし、ＴＴＢＳで洗浄し、次にＨＲＰ（Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA）についてＡＥＣ基質で２０分間インキュベートして、ガメンダゾール結合タンパク質を視覚化した。
【０２２５】
精製O. caniculusＥＥＦ１Ａ１（図１５、パネルＣ）およびその相同体S. cerevisiaeＴＥＦ１（図１５、パネルＤ）への、直接結合およびガメンダゾール競合的結合も、同様の手順に従って確認した。一定量のＴＥＦ１の存在下、ガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶのみの５４．９ｎＭ以上の濃度は、さらなるシグナル増加を示さず、これらの濃度でのタンパク質の飽和を示唆する（図１５、パネルＤ、上のレーン）。ガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶの準飽和濃度において、１０倍過剰ガメンダゾールとの競合結合が、低い結合シグナルにより示されるように結合について競合した（図１５、パネルＤ、下のレーン）。ＴＥＦ１への架橋の特異性を制御するために、ガメンダゾール−ＢＴ−ＵＶとの反応を、２つの別の精製酵母ヌクレオチド結合タンパク質、ＨＢＳ１（ＧＴＰ結合タンパク質）およびＴＥＦ３（ＡＴＰ結合タンパク質）を用いて行った。ＴＥＦ１について用いたものと同じ濃度およびＢＴ−ＵＶ−ＧＭＺに対する同じ比率において、どちらのタンパク質への架橋も観察できなかった（図１５、パネルＥ）。
【０２２６】
例１７：ガメンダゾールの、ＭＣＦ−７細胞中のＨＳＰ９０クライアントタンパク質およびＨＳＰ９０媒介性ルシフェラーゼリフォールディングへの効果
上記の親和性精製結果およびin vitroＨＳＰ９０の結合試験は、ガメンダゾールがＨＳＰ９０に直接結合することを実証する。ガメンダゾールがＨＳＰ９０に機能的変化をもたらすかどうかを決定するために、直接薬物結合から生じるＨＳＰ９０の特有の機能的変化を測定するために以前に用いられた、一連の細胞ベースのin vitro実験を行った。阻害剤の存在下で、基質に結合したＨＳＰ９０ヘテロタンパク質複合体は不安定化され、クライアントタンパク質はユビキチン−プロテアゾーム分解の標的となる。こうして、ＨＳＰ９０媒介性のタンパク質フォールディングプロセスの破壊が、ＨＳＰ９０依存性クライアントタンパク質の分解をもたらす。我々は、多数のＨＳＰ９０阻害剤が分析されているＭＣＦ−７癌細胞系を試験して、ＨＳＰ９０阻害活性の最も適切な確認を提供することとした。
【０２２７】
ガメンダゾールがＨＳＰ９０媒介性のタンパク質フォールディングプロセスに影響するかどうかを決定するため、ＭＣＦ−７乳癌細胞溶解産物のウェスタン分析を行った（図１６）。ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）およびＡＫＴ１は、立体構造的成熟のためにＨＳＰ９０を必要とする、既知のＨＳＰ９０依存性クライアントタンパク質である。ガメンダゾールは、これら２つのＨＳＰ９０基質に、用量依存性の様式で分解を引き起こす（図１６）。アクチンはＨＳＰ９０タンパク質フォールディングプロセスの基質ではなく、ガメンダゾールの存在下でアクチンのレベルは一定であり、ガメンダゾールの効果が、基質に結合したＨＳＰ９０ヘテロタンパク質複合体の不安定化に関連するとの仮説を支持する。ガメンダゾールがＡＫＴ１およびＥＲＢＢ２の減少をもたらすとしても、ＨＳＰ９０の増加は伴わないため、これはガメンダゾールが、ＨＳＰ９０−ＨＳＦ１ヘテロタンパク質複合体を分解（dismantle）せず、したがって、ＨＳＰ９０の誘導形態であるＨＳＰ９０ＡＡ１の発現を誘発しないこと示唆する。多くのＨＳＰ９０薬物はＨＳＰ９０ＡＡ１合成を誘発するため、局在の変化が起こっている可能性を試験することは重要であり、なぜならば、ウェスタンブロットは、ＭＣＦ−７細胞のタンパク質レベルにおける変化を示さなかったからである。ガメンダゾールで処置した初代セルトリ細胞の免疫蛍光分析もまた、ＨＳＰ９０ＡＢ１またはＥＦＦ１Ａ１の局在またはレベルにおける変化を示さない（図１７）。同様に、ＥＦＦ１Ａ１レベルまたは局在の変化も観察されなかった（図１７）。ＨＳＰ９０およびＥＦＦ１Ａ１について、類似する拡散した細胞質の分散パターンが前に報告されている。
【０２２８】
例１８：ガメンダゾールは、in vitroでのＨＳＰ９０依存性ルシフェラーゼリフォールディングおよびＭＣＦ−７細胞の増殖を阻害する
ウサギ網状赤血球溶解産物中の熱的に変性したホタルルシフェラーゼのリフォールディングは、ＨＳＰ９０依存性のプロセスである。我々は最近、これが、ＮまたはＣ末端のどちらかに結合するＨＳＰ９０の阻害剤を同定可能な、頑強で再現可能なアッセイであることを実証している。ガメンダゾールはこのアッセイにおいて、変性ルシフェラーゼのリフォールディングを阻害し（ＩＣ５０＝３３０±３６μＭ）、ＨＳＰ９０活性を機能的に阻害するその能力を実証した（図１８Ａ）。ノバビオシンのＩＣ５０の値（５５２±１２μＭ）は、我々の高スループットスクリーニングで以前に推定されたもの（〜４００μＭ）より高かったが、溶解産物バッチおよび実験条件におけるわずかな違いで、この効果は説明可能である。
ガメンダゾールをこれから設計したＬＮＤは、抗癌治療剤として初めに開発された。ガメンダゾールは他のＨＳＰ９０抗癌剤と同様、ＨＳＰ９０クライアントタンパク質に阻害効果を示すため、我々は、ガメンダゾールがin vitroでＭＣＦ−７細胞の増殖を阻害するかどうかを試験した（図１８Ｂ）。ガメンダゾールによるＭＣＦ−７細胞の増殖阻害のＩＣ５０の値は、１０１±４μＭであった。一方ノバビオシンについては、ＩＣ５０は２倍高く、２２４±５μＭであった。
【０２２９】
例１９：ＴＥＦ１に対するｍａｎｔ−ＧＭＰＰＮＰおよびｍａｎｔ−ＧＤＰ結合アッセイ
ガメンダゾールの存在下または不在下における、２’−（または３’）−Ｏ−Ｎ−メチルアントラニロイル（ｍａｎｔ）−ＧＤＰおよびｍａｎｔ−ＧＭＰＰＮＰのS. cerevisiaeＴＥＦ１への結合親和性を、蛍光滴定法により決定した。ガメンダゾールがＴＥＦ１のヌクレオチド結合を阻害するかどうかを試験するために、５０μＭのガメンダゾールを、蛍光標識したヌクレオチドを加える前に、ＴＥＦ１−結合バッファーミックスを用いて２５℃で３０分間インキュベートした。ｍａｎｔ−ヌクレオチドの蛍光の増加を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により、ＴＥＦ１のトリプトファンまたはチロシンを２８０ｎｍにて励起し、ヌクレオチドのｍａｎｔ部分に対して４００ｎｍの発光波長を用いて観察した。タンパク質およびヌクレオチド複合体依存性の蛍光の値を、ｍａｎｔ−ＧＭＰＰＮＰまたはｍａｎｔ−ＧＤＰ濃度に対してプロットし、双曲線を当てはめて、Ｋｄ値を得た。
【０２３０】
ＥＥＦ１Ａ１およびＴＥＦ１の２つの既知の機能は、タンパク質合成の間の伸長およびアクチン結合である。正準翻訳機能（canonical translation function）は、タンパク質のヌクレオチド結合ポケット内でＧＤＰとＧＴＰの交換を必要とし、一方アクチン集束（bundling）はヌクレオチド独立的である。これら２つの機能の後者は、タンパク質のヌクレオチド結合ポケット内でＧＤＰとＧＴＰの交換を必要とする。ガメンダゾールの、ＴＥＦ１のヌクレオチド結合親和性への効果を決定するために、ｍａｎｔ−ＧＤＰおよびｍａｎｔ−ＧＭＰＰＮＰに対するＴＥＦ１の平衡解離定数（Ｋｄ）を、５０μＭの薬物の存在下で測定した（図１９Ａ〜１９Ｂ）。薬物不在下でのｍａｎｔ−ＧＤＰに対するＴＥＦ１のＫｄ値は、０．１８μＭである。ｍａｎｔ−ＧＤＰを用いたストップフロー速度論（stopped-flow kinetics）は、ＴＥＦ１がｍａｎｔ−ＧＤＰに、ガメンダゾールの存在下で、同様の親和性（Ｋｄ＝０．１２）で結合することを示した。ガメンダゾールの存在または不在のもとで、ｍａｎｔ−ＧＭＰＰＮＰに対するＴＥＦ１のＫｄは、それぞれ０．４３μＭおよび０．５２μＭと決定された。この類似するＫｄ値は、ガメンダゾールがＥＥＦ１Ａ１のヌクレオチド結合特性に影響しないことを示す。
【０２３１】
例２０：ガメンダゾールで処置した初代セルトリ細胞における、ＨＳＰ９０ＡＢ１およびＥＥＦ１Ａ１の免疫蛍光
初代セルトリ細胞を、６−ウェルプレートの、酸洗浄したポリ−Ｌ−リシン被覆カバーガラススリップにプレートした。細胞を、２０μＭのガメンダゾールを用いて３７℃で処置した。対照は、溶媒担体（０．２％ＤＭＳＯの最終濃度）で処置した。２４時間後、培地を吸引し、細胞を２ｍｌのＴＢＳ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）で３回洗浄した。次に細胞を、ＴＢＳ中の１０％ホルムアルデヒドで室温（ＲＴ）で２０分間固定し、ＴＢＳで１０分間、３回洗浄し、次にＴＢＳ中の１％のＮＰ−４０で１５分、透過化処理した。細胞を次にＴＢＳ＋０．１％ＮＰ−４０で洗浄し、ＴＢＳ−ＮＰ−４０中の１０％ヤギ血清を用いて、ＲＴで１時間ブロックした。ＴＢＳですすいだ後、ＴＢＳ−ＮＰ−４０中の２％ヤギ血清および０．１％ウシ血清中の一次抗体：マウスモノクローナルＩｇＧ抗ＥＥＦ１Ａ１（０５−２３５、Upstate, Waltham, MA）の１：１０００希釈か、またはマウスモノクローナルＩｇＭ抗ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＳＰＡ−８４３、Stressgen Biotechnologies, San Diego, CA）の１：１０００希釈で、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−ＮＰ−４０で３回洗浄後、ＴＲＩＴＣタグ化二次抗体（一次抗体と同一の緩衝液）：ＥＥＦ１Ａ１に対しては、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１１５−０２５−００３、Jacksonn Immunologicals, West Grove, PA）の１：２００希釈、およびＨＳＰ９０ＡＢ１に対しては、ヤギ抗マウスＩｇＭ（１１５−０２５−０２０、Jacksonn Immunologicals, West Grove, PA）の１：２００希釈を用いて、細胞を暗室ＲＴで１時間インキュベートした。ＴＢＳ−ＮＰ−４０での最後の３回の洗浄後（各１０分間）、カバーガラスを蛍光用Vectashield Hardset封入剤で封入した（Vector Laboratories, Burlingame, CA）。
【０２３２】
例２１：ガメンダゾールで処置した初代セルトリ細胞における、初期応答遺伝子としてのインターロイキン１−α（Ｉｌ１ａ）の確認
Ｉｌ１ａは、セルトリ細胞−精子細胞接合部結合性（junction integrity）の既知の破壊物質（disruptor）であり、セルトリ細胞−精細胞相互作用の重要なレギュレーターとして提案されている。３つのインターロイキン１遺伝子が、ガメンダゾールに反応して、最も迅速かつ顕著に増加した。提唱された研究を進める主な仮説は、セルトリ細胞が、ガメンダゾールの抗精子形成効果に対する主要な標的細胞であることである。この仮説にさらなる支持を提供するため、我々はＩｌ１ａを、初代セルトリ細胞における、ガメンダゾールに対する初期応答遺伝子として確認した。１００ｍＭのガメンダゾールの不在または存在下で０分、３０分、６０分、１２０分および２４０分培養した初代セルトリ細胞から調製したＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図２０）。このガメンダゾールの用量は、前の研究においてin vitroでロニダミンの効果を試験するために用いられた濃度範囲内である。ガメンダゾールによる処置の６０分において、Ｉｌ１ａに対して予想されるサイズである、約５００ｂｐの増幅産物のスパイクが観察された（図２０）。ガメンダゾールの不在下において、どの時点でも増幅産物は検出されなかった。産物はまた、逆転写酵素を加えずに行った反応においても不在であり（各正の時点の隣のレーンにＣにより示す）、シグナルが増幅ｍＲＮＡ由来であることを確認した。
【０２３３】
例２２：雌生殖能力の管理
雌の生殖能力を調節する能力について検討した。Ｈ２−ガメンダゾールを、成人サイクリングＣ５７Ｂ１６雌マウスに、１回の経口用量１００ｍｇ／ｋｇで投与した。全重量、卵巣重量、およびプロゲステロンの血清レベルを測定した。６日後に、卵巣重量（図２１、パネルＡ）およびステロイド（たとえばプロゲステロン）産生（図２１、パネルＢ）が、Ｈ２−ガメンダゾールの投与後に急速に低下したことが見出された。しかし、マウスの全重量はほぼ同じであり（データ示されず）、１回の経口投与後にも変化せず、これは、この用量が毒性ではないことを示す。組織構造（図２２）は、Ｈ２−ガメンダゾールが、本明細書に記載のように、担体の対照と比較して、卵巣卵胞を障害して死亡させる（たとえば退縮）ことを示す。これらのデータは、Ｈ２−ＧＭＺの単回用量が、卵巣に迅速で顕著な効果を及ぼすことを示す。
【０２３４】
例２３：化合物の効果の確率
これまで試験したガメンダゾールの全ての用量を用いたラットに対する交配試験データは、ラットにおいて６ｍｇ／ｋｇ用量にて、精巣重量が約５０％（３．５％の標準偏差）減少することを示す。卵巣重量の変化は、雌のマウスにおいて３５％および８％（ＳＤ）であった。用量レベルを用いて成功（不妊）を予測するロジスティックモデルは、６ｍｇ／ｋｇの用量割合で５０％の成功率、および１２ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのレベルで１００％の成功を仮定したデータに適合し（図２３）、これは、研究者の予想通りである。ガメンダゾール（ＲＣ−ＭＣ−１１０）およびＨ２−ガメンダゾール（ＪＷＳ−２−７２）の生物学的効能は類似しているため、モデルは、それぞれの化合物について、１２ｍｇ／ｋｇの用量レベルで９９．９５％の成功率を推定する：不妊性＝ｅ―７．５４１５＋１．２５６９*用量
【図１１】
2012532198.tif 000183
【図１８Ａ】
2012532198.tif 000184
【図１８Ｂ】
2012532198.tif 000185
【図２１】
2012532198.tif 000186
【図２３】
2012532198.tif 000187
【図１Ａ】
2012532198.tif 000188
【図１Ｂ】
2012532198.tif 000189
【図１Ｃ】
2012532198.tif 000190
【図１Ｄ】
2012532198.tif 000191
【図１Ｅ】
2012532198.tif 000192
【図２Ａ】
2012532198.tif 000193
【図２Ｂ】
2012532198.tif 000194
【図３Ａ】
2012532198.tif 000195
【図３Ｂ】
2012532198.tif 000196
【図３Ｃ】
2012532198.tif 000197
【図３Ｄ】
2012532198.tif 000198
【図３Ｅ】
2012532198.tif 000199
【図４Ａ】
2012532198.tif 000200
【図４Ｂ】
2012532198.tif 000201
【図５Ａ】
2012532198.tif 000202
【図５Ｂ】
2012532198.tif 000203
【図５Ｃ】
2012532198.tif 000204
【図５Ｄ】
2012532198.tif 000205
【図５Ｅ】
2012532198.tif 000206
【図６Ａ】
2012532198.tif 000207
【図６Ｂ】
2012532198.tif 000208
【図６Ｃ】
2012532198.tif 000209
【図６Ｄ】
2012532198.tif 000210
【図６Ｅ】
2012532198.tif 000211
【図６Ｆ】
2012532198.tif 000212
【図７】
2012532198.tif 000213
【図８】
2012532198.tif 000214
【図９Ａ】
2012532198.tif 000215
【図９Ｂ】
2012532198.tif 000216
【図１０】
2012532198.tif 000217
【図１２Ａ】
2012532198.tif 000218
【図１２Ｂ】
2012532198.tif 000219
【図１３】
2012532198.tif 000220
【図１４】
2012532198.tif 000221
【図１５】
2012532198.tif 000222
【図１６】
2012532198.tif 000223
【図１７】
2012532198.tif 000224
【図１９】
2012532198.tif 000225
【図２０】
2012532198.tif 000226
【図２２】
2012532198.tif 000227
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月18日(2012.5.18)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
関連分野の相互参照
本特許出願は、２００４年４月２０日に出願された米国特許出願第10/922,747号の一部継続である２００９年２月２７日に出願された米国特許出願第12/395,521号の一部継続であり、２００８年１０月１４日に出願された米国仮出願第61/105,125号および２００９年７月６日に出願された米国仮出願第61/223,330号の利益を主張し、これらの出願は特定の参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所から授与されたNO1-HD-1-3313およびP50 DK05301の政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における生殖能力を低下させるための医薬組成物であって、
式Ｉ：
【化１】
2012532198.tif 000228
式中、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
式中、ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；
式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である；
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩またはエステルを含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
式中、Ｒ２が水素である場合は、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１つが窒素であり、残りは独立して炭素または窒素であるか；または
Ｒ１は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＮ（ＣＨ３）２、−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨではない、
のいずれかである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
化合物が、
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；
６−フルオロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
ガメンダゾール；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２またはＨ２−ガメンダゾール）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＴＨ２−１９２）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ２−１７８）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ２−１７９）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ１−１９０）；
１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ２−２２）；
１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ１−２８２）；および
その薬学的に許容し得る塩およびエステル、からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
化合物を、
対象におけるセルトリ細胞の機能を障害する、
対象における精子形成を阻害する、
対象において精巣重量を減少させる、
対象において卵巣重量を減少させる、
対象において血清プロゲステロンを減少させる、または、
対象における卵巣の卵胞機能を障害する
の１または２以上となるための有効量で含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
対象の生殖能力を、対象への該組成物の投与を停止することによって、回復させることができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
化合物を、対象が雌であり、雌対象を不可逆的に不妊化するための有効量で含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
雄対象における精子形成を阻害するための医薬組成物であって、
式Ｉ：
【化２】
2012532198.tif 000229
式中、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
式中、ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；
式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である；
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩またはエステルを含む、前記医薬組成物。
【請求項８】
化合物が、
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；
６−フルオロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
ガメンダゾール；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２またはＨ２−ガメンダゾール）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＴＨ２−１９２）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ２−１７８）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ２−１７９）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ１−１９０）；
１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ２−２２）；
１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ１−２８２）；および
その薬学的に許容し得る塩およびエステル、からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
化合物を、以下の項目：
対象の体重を維持すること；
インヒビンＢの産生を阻害すること；
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の循環を増加させること；
化合物関連毒性を阻害すること；
構造化された精細胞型の層化を低減すること；
精子（spermatozoa）を減少させること；
精子細胞（spermatids）を減少させること；
精原細胞を減少させること；
生殖上皮を減少させること；
生殖細胞の量を減少させること；
精巣重量を減少させること；
熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０ＡＢ１を阻害すること；
真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）を阻害すること；;
インターロイキン１タンパク質の産生を増加させること、または
ＮＦ−κＢ阻害剤α（Ｎｆｋｂｉａ）の産生を増加させること；
のうちの少なくとも１つに従う有効量で含有する、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
雄対象の精子形成能力を、雄対象への該組成物の投与を停止することによって、回復させることができる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物
【請求項１１】
雌対象における生殖能力を低下させるための医薬組成物であって、
式Ｉ：
【化３】
2012532198.tif 000230
式中、Ｒ１は、カルボキシル、アクリル、またはカルボン酸ヒドラジドであり；
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
式中、ＸおよびＹは、互いに同一または異なっており、ハロゲンまたは低級アルキルであり；
式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、独立して窒素または炭素である；
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩またはエステルを含む、前記医薬組成物。
【請求項１２】
化合物が、
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；
６−フルオロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
ガメンダゾール；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸（ＪＷＳ−２−７２またはＨ２−ガメンダゾール）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＴＨ２−１９２）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ２−１７８）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ２−１７９）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ１−１９０）；
１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ２−２２）；
１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ１−２８２）；および
その薬学的に許容し得る塩およびエステル、からなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
化合物を、以下の項目：
対象の体重を維持すること；
インヒビンＢの生産を阻害すること；
エストラジオールの産生を阻害すること；
卵巣重量を減少させること；
血清プロゲステロンを減少させること；
プロゲステロンの産生を阻害すること；
退縮卵胞を誘発すること；
生存可能な卵胞の数を減少させること；
生殖細胞の量を減少させること；
排卵を阻害すること；
のうちの少なくとも１つに従う有効量で含有する、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
化合物を、雌対象における可逆的な不妊化をもたらすための有効量で含み、雌対象の生殖能力を、雌対象への該組成物の投与を停止することによって、回復させることができる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
化合物を、対象を不可逆的に不妊化するための有効量で含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2012532198.tif 000231
2012532198.tif 000232
2012532198.tif 000233