(57)【要約】【課題】本願発明の目的は、Ｓ−エピクロロヒドリンから開始するＬ−カルニチンを合成する全工程におけるキラル材料とキラル中間体の含有量を検出しコントロールすることにより、Ｌ−カルニチンの純度が９７％以上であり、Ｄ−カルニチンの含有量が２％以下である高純度Ｌ−カルニチンの調製方法を提供することである。【課題を解決するための手段】前記方法は、（１）ＧＣおよびキラルカラムによりＳ−エピクロロヒドリンの光学異性体の含有量を検出し、Ｓ−エピクロロヒドリンの左旋性異性体の含有量を０％〜１２％ｗ／ｗの範囲内にコントロールする工程と、（２）合成工程において、中間体であるＬ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの比旋光度を旋光計で検出し、該比旋光度を−２６．０°〜−２９．４°の範囲内にコントロールする工程と、（３）中間体混合物であるＬ−３−シアン−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの光学的純度およびその右旋性異性体の含有量をキラル誘導体化試薬を使って検出し、前記右旋性異性体の含有量を０〜３．６％ｗ／ｗの範囲内にコントロールする工程と、を有し、  前記キラル誘導体化試薬は、化学式（ＩＩ）の光学的に純粋なＤ−もしくはＬ−化合物であり、前記化学式（ＩＩ）のアスタリスクで示された炭素原子は、キラル炭素原子であり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニルもしくはアルキニル基、またはＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基であり、Ｘは、ハロゲン原子を示す、高純度Ｌ−カルニチンの調製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−エピクロロヒドリンから開始するＬ−カルニチンを合成する全工程におけるキラル体およびキラル中間体の含有量を検出およびコントロールすることにより、Ｌ−カルニチンの純度を９７％以上とし、さらにＤ−カルニチンの純度を２％以下とする高純度Ｌ−カルニチンの調製方法であって
（１）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）およびキラルカラムによりＳ−エピクロロヒドリンの光学異性体の含有量を検出し、Ｓ−エピクロロヒドリンの左旋性異性体の含有量を０％〜１２％ｗ／ｗの範囲内にコントロールする工程と、
（２）合成工程において、中間体であるＬ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの比旋光度を旋光計で検出し、該比旋光度を−２６．０°〜−２９．４°の範囲内にコントロールする工程と、
（３）中間体混合物であるＬ−３−シアン−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの光学的純度およびその右旋性異性体の含有量をキラル誘導体化試薬を使って検出し、前記右旋性異性体の含有量を０〜３．６％ｗ／ｗの範囲内にコントロールする工程と、を有し、
前記キラル誘導体化試薬は、化学式（ＩＩ）の光学的に純粋なＤ−もしくはＬ−化合物であり、
【化１】
2012505258.tif 000015
前記化学式（ＩＩ）のアスタリスクで示された炭素原子は、キラル炭素原子であり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニルもしくはアルキニル基、またはＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基であり、
Ｘは、ハロゲン原子を示す、高純度Ｌ−カルニチンの調製方法。
【請求項２】
前記光学的に純粋な化学式（ＩＩ）の化合物のＲがメチル、エチル、イソプロピル、ブチル、もしくはベンジルであり、ＸがＣｌまたはＢｒである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光学的に純粋な化学式（ＩＩ）は、結晶固体である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記光学的に純粋な化学式（ＩＩ）は、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（−）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（＋）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、および（−）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記光学的に純粋な化学式（ＩＩ）は、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記誘導体化試薬を溶媒に溶解して濃度が０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌの溶液を作成し、前記溶媒は、エーテル、プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、もしくはそれらの２以上の混合物から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記溶媒はアセトニトリルであり、濃度は１〜１０ｍｇ／ｍｌである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムの光学的純度およびそのＤ−異性体の含有量を検出する工程（３）は、
（一）化学式（ＩＩ）の光学的に純粋なＤ−型もしくはＬ−型化合物を溶媒に溶解して０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌの溶液を暗下で調製して、誘導体化試薬を調製する工程と、
（二）適量のＬ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムのサンプルを塩酸により加水分解し、さらにその後ｐＨが中性になるまでアンモニア水を添加してテスト溶液を調製する工程と、
（三）適量のラセミ体カルニチンを使用してコントロール溶液を調製する工程と、
（四）適量の化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な誘導体化試薬をＬ−カルニチン（もしくはＤ−カルニチン）テスト溶液およびカルニチンコントロール溶液と混合することにより、２０℃〜９５℃の溶媒の存在下において、前記工程（一）の前記誘導体化試薬が前記工程（二）の前記テスト溶液と前記工程（三）の前記コントロール溶液とそれぞれ反応し、Ｌ−カルニチンおよびＤ−カルニチン誘導体を生成する誘導体化反応工程と、
（五）前記工程（四）の前記テスト溶液および前記コントロール溶液中のＬ−カルニチンおよびＤ−カルニチンの含有量をＨＰＬＣを使って検出することにより、Ｌ−異性体Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムおよびＤ−異性体Ｄ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムの含有量を算出する工程と、を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、高純度Ｌ−カルニチンの調製方法に関する。特に、前記方法は、キラル材料およびキラル中間体の含有量をモニタリングおよび調整することにより高純度Ｌ−カルニチンを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルニチンは、哺乳類動物の臓器に広く存在しており、また植物および微生物中にもいくらか存在している。Ｌ−カルニチンの主な薬理効果としては、長鎖脂肪酸をミトコンドリアに運搬し、それによって脂肪酸を酸化させ、エネルギーを生産することが挙げられる。Ｌ−カルニチンは、医薬品およびヘルスケア製品に広く使用されている。Ｌ−カルニチンは、１９０５年、ＧｕｌｅｗｉｔｓｃｈとＫｒｉｍｂｅｒｇにより筋肉抽出液中から発見された。
【０００３】
天然のカルニチンは、Ｌ−カルニチンだけであり、さらにＬ−カルニチンのみが生理的に活性である。現在の医薬品業界で使用されているＬ−カルニチンは、ほとんど、化学合成により得られている。利用する原料や合成作業によって左旋性のＤ−カルニチンも得られてしまうため、天然のＬ−カルニチンとは違い、完全に純粋なＬ−カルニチンを得ることは非常に難しい。Ｄ−カルニチンは、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびカルニチンパルミチルトランスフェラーゼ（ＰＴＣ）の競合阻害剤である。そのため、ＤＬ−カルニチンを投与された患者のうち１０％程が重症筋無力症になってしまう（Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  （３３ｔｈ）：  １３５６）。そのため、医薬品の安全性を考慮すると、化学合成工程におけるＤ−カルニチンの含有量を厳しくコントロールすることが必要である。
【０００４】
１９８８年の特許出願公開Ｓ６３−１８５９４７号には、キラルエピクロロヒドリンを四級アンモニウム塩に変え、その後シアン化し、加水分解し、そして脱ミネラルカ反応を介してＬ−カルニチンを得ることが記載されている。この方法では、Ｌ−カルニチンを調製するための出発原料が光学的に純粋であるため、キラル分離を行う必要がない。しかしながら、該特許は、キラル物質中の光学異性体の含有量についての示唆もなく、また最終物質におけるＬ−カルニチンおよびＤカルニチンの含有量をどのように検出するかについての記載もない。
【０００５】
特許「光学的に活性な四級アンモニウム塩の製造」（特許第３２８７５６７Ａ号）では、キラルエピクロロヒドリンからＬ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンを製造することが記載され、さらにＬ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンが光学的に活性なカルニチンの中間体であることが示唆されているだけである。該特許は、Ｌ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの光学活性については記載しているが、キラル材料中の光学異性体の含有量やそれを正確に検知する方法については記載していない。
【０００６】
文献「Ｌ−（−）−カルニチンの合成」（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ  １２，  ２００４）には、Ｌ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンをキラルエピクロロヒドリンのアミン化により調製し、その後シアン化によりＬ−（−）−塩化−３−シアン−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンを調製し、最後にＬ−カルニチンを加水分解により得ることが詳細に記載されている。この間に、エピクロロヒドリンの正確な回転、中間体および最終生成物が検出されている。しかしながら、エピクロロヒドリン中の光学異性体の含有量、中間体および最終生成物の含有量についての記載はなく、さらにそれらの正確な検出についても記載がない。上述の方法は、純粋なＬ−カルニチンを製造するのにかなりのコストがかかってしまう。
【０００７】
Ｌ−カルニチンの合成に関する他の報告（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  ２００６，  ３７（１２））では、まず、キラル体サレン−ＣｏＩＩＩ複合体（２）（［（Ｒ，Ｒ），Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（３，５−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅ）−１，２−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｏ（２−）］酢酸コバルト）の触媒作用によりラセミ体エピクロロヒドリンの加水分解を行い、Ｓ−エピクロロヒドリンを得て、アミノ化、シアン化、加水分解、およびイオン交換によりＬ−カルニチンを得ることが記載されている。これには、エピクロロヒドリン、中間体および最終生成物の比旋光度の検出のみが記載されていたが、エピクロロヒドリンの光学異性体、中間体および最終生成物の含有量もしくはそれらの正確な検出についての記載はなかった。さらには、コストを抑えつつＬ−カルニチンの純度を上げるコントロール方法についての記載はなかった。
【０００８】
Ｌ−カルニチン中のＤ−カルニチンの含有量を検出する方法は以下の通りである。
誘導体化試薬（＋）−ＦＬＥＣ（（＋）−１−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎ）−ｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）をＨＰＬＣと組み合わせることによりＤ−カルニチンのＬ−カルニチン中における含有を検出したとＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｎａｌ．３０（２００２）２０９−２１８に報告されている。しかしながら、Ｌ−カルニチン産物中におけるＤ−カルニチンの含有量の検出は報告されているが、Ｌ−カルニチンを調製する際の出発原料および中間体における鏡像異性体の含有量を検出したものを報告したものはなく、Ｌ−カルニチンの純度を上げたり、コストを下げたりするのに使用できるコントロール方法についての報告もなかった。
【０００９】
Ｓ−エピクロロヒドリンは、有機化学的合成もしくは生物学的変換により得られるため、光学異性体の含有量の正確な検出をせずに光学的回転を検出すると、Ｌ−カルニチンを調製する各段階において光学異性体の不純物をいくらか取り込んでしまう。全調製工程において、キラル分離が行われないため、最終生成物中に光学異性体の不純物が含まれてしまう可能性がある。さらに、Ｌ−カルニチンの調製には沢山の工程があるため、ラセミ体化も容易に起きてしまう。したがって、出発原料の異性体の含有量を正確に検出しコントロールすることと、各工程における中間体の光学的純度を正確に検出することは、最終生成物の光学的純度に作用するラセミ体化を保証するのに必要である。
【００１０】
Ｌ−カルニチンの右旋性異性体は、人体に有害であるため、出発原料および中間体の光学的純度、さらに各工程における光学異性体の不純物の含有量をコントロールして、光学的純度の高いＬ−カルニチンを得る効果的な方法が求められている。これは、ヒトの健康を確実にし、さらに合成Ｌ−カルニチンの純度を向上するのに重要である。そして、環境保護のことを考慮しても、各合成工程の産物を確実にし、多数ある合成工程中の次の工程の中に予期せぬ中間体が混入するのを防ぐことで、汚染工程を減らし、さらに「三種類汚染」（“ｔｈｒｅｅ  ｗａｓｔｅ”）の処理にかかる費用を減らす。エネルギー節約や排出量削減の観点からも重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願発明の目的は、Ｓ−エピクロロヒドリンから開始するＬ−カルニチンを合成する全工程におけるキラル材料とキラル中間体の含有量を検出しコントロールすることにより、Ｌ−カルニチンの純度が９７％以上であり、Ｄ−カルニチンの含有量が２％以下である高純度Ｌ−カルニチンの調製方法を提供することである。
前記方法は、
（１）ＧＣおよびキラルカラムによりＳ−エピクロロヒドリンの光学異性体の含有量を検出し、Ｓ−エピクロロヒドリンの左旋性異性体の含有量を０％〜１２％ｗ／ｗの範囲内にコントロールする工程と、
（２）合成工程において、中間体であるＬ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの比旋光度を旋光計で検出し、該比旋光度を−２６．０°〜−２９．４°の範囲内にコントロールする工程と、
（３）中間体混合物であるＬ−３−シアン−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの光学的純度およびその右旋性異性体の含有量をキラル誘導体化試薬を使って検出し、前記右旋性異性体の含有量を０〜３．６％ｗ／ｗの範囲内にコントロールする工程と、を有し、
前記キラル誘導体化試薬は、化学式（ＩＩ）の光学的に純粋なＤ−もしくはＬ−化合物であり、前記化学式（ＩＩ）のアスタリスクで示された炭素原子は、キラル炭素原子であり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニルもしくはアルキニル基、またはＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基であり、Ｘは、ハロゲン原子を示す、高純度Ｌ−カルニチンの調製方法。
【００１２】
【化１】
2012505258.tif 000002
【００１３】
好ましい実施形態において、本願発明は、化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な化合物を提供し、前記化学式（ＩＩ）のＲは、メチル、エチル、イソプロピル、ブチル、もしくはベンジルであり、Ｘは、ＣｌもしくはＢｒである。
【００１４】
さらに好ましくは、本願発明の化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な化合物は、結晶固体である。前記結晶固体は、好ましくは、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（−）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（＋）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（−）α−メチル−６−エトキシ−ナフチルアセチル塩化物から選択される。
【００１５】
さらに好ましくは、本願発明の化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な化合物は、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（＋）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物およびその結晶から選択される。
【００１６】
好ましい実施形態では、本願発明の工程（３）において、Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムの光学的純度とその右旋性異性体の含有量の検出は；
（一）誘導体化試薬の調製：化学式（ＩＩ）の光学的に純粋なＤ−型もしくはＬ−型化合物を溶媒に溶かして、暗下において０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ溶液を調製する工程と、
（二）テスト溶液の調製：適量のＬ−３−シアン−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムのサンプルを塩酸により加水分解し、ｐＨの値が中性になるまでアンモニア水を加える工程と、
（三）コントロール溶液の調製：適量のラセミ体カルニチンを使ってコントロール溶液を調製する工程と、
（四）誘導体化反応：適量の化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な誘導体化試薬をＬ−カルニチン（もしくはＤ−カルニチン）のテスト溶液とカルニチンコントロール溶液と混ぜる工程と、を含む。上述の工程（一）の誘導体化試薬を、上述の工程（二）のテスト溶液と上述の工程（三）のコントロール溶液とそれぞれ溶媒の存在下で２０℃〜９５℃において反応させ、Ｌ−カルニチンおよびＤ−カルニチン誘導体を製造する；
（五）上述の工程（四）のテスト溶液およびコントロール溶液中のＬ−カルニチンおよびＤ−カルニチンの含有量を、ＨＰＬＣにより検出し、それによりＬ−異性体Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムおよびＤ−異性体Ｄ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムの含有量を算出する。
【００１７】
Ｓ−エピクロロヒドリンから開始するＬ−カルニチンの合成技術（下記の化学反応Ｉに示すように）は、異なる調製工程において、いくつもの重要な品質管理を提供しており、そのためＬ−カルニチンの光学的純度を上げ、さらに有害なＤ−カルニチンの含有量を減少させ、コストを下げることが出来る。
【００１８】
１．ＧＣカラムおよびキラルカラムによりＳ−エピクロロヒドリンの光学異性体の含有量を検出し、Ｓ−エピクロロヒドリンの左旋性異性体の含有量を０％〜１２％ｗ／ｗの範囲にコントロールすることにより、Ｌ−カルニチンの純度を９７％以上とし、Ｄ−カルニチンの含有量を２％以下とする。
【００１９】
２．合成工程におけるＬ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの中間体の比旋光度を旋光計を使って−２６．０°〜−２９．４°の範囲内にコントロールすることにより、Ｌ−カルニチンの含有量を９７％以上とし、Ｄ−カルニチンの含有量を２％以下とする。
【００２０】
３．Ｌ−３−シアン−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミンの光学的純度と、キラル誘導体化試薬を使ってその右旋性異性体の含有量を検出し、右旋性異性体の含有量を０〜３．６％ｗ／ｗの範囲内にコントロールすることにより、Ｌ−カルニチンの含有量を９７％以上とし、Ｄ−カルニチンの含有量を２％以下とする。
【００２１】
本願発明におけるＬ−カルニチンの生成技術：
トリメチルアミン塩酸塩のアミノ化によりＬ−第四級アンモニウム塩（Ｌ−クロロ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミン）を製造するのに利用されるＳ−エピクロロヒドリンから開始し、次に第四級アンモニウム塩をＮａＣＮによりシアン化してＬ−シアン化物（Ｌ−クロロ−３−シアン−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアミン）を製造し、そして該シアン化物を濃縮塩酸により加水分解してＬ−カルニチン塩酸塩を製造し、最後に該Ｌ−カルニチン塩酸塩を脱塩電気分解、濃縮、精製してＬ−カルニチンを製造する。
【００２２】
本願発明のＬ−カルニチン合成は、Ｌ−第四級アンモニウムもしくはＬ−シアン化物から開始する上述の工程と同じ工程を含む。
【００２３】
【化２】
2012505258.tif 000003
【００２４】
本願発明は、キラル誘導体化試薬、ガスクロマトグラフィーおよびキラルカラムを使用して、Ｓ−エピクロロヒドリンの光学的純度を精密に検出する。特に好ましいキラルカラムは、ＺＫＡＴ社のＺＴキラルカラム（０．２５  ｘ  ０．５  ｘ  ２０で、製造番号０８−０１−００１）であり、注入口の温度は１２０〜１８０℃で、カラムの温度は８０〜１００℃で、検出器の温度は２００〜２４０℃で、キャリアガスはスプリット比が４：１の窒素ガスである。
【００２５】
化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な化合物は、好ましくは結晶固体である。特定の濃度を持つ化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な化合物の溶液も使用できる。溶媒は、エーテル、プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、酢酸エチル、ｎ―ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、もしくは前述の溶媒の２種以上の混合物から選択される。該溶液の濃度は、０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌである。特に好ましくは、該溶媒は、アセトニトリルで、該溶液の濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。
【００２６】
本願発明は、Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムの光学的純度と中間体混合物中のそのＤ−異性体の含有量の検出について記しており、該検出の方法は、下記の工程を含む。
【００２７】
（一）誘導体化試薬溶液の調製：化学式（ＩＩ）のＤ−型もしくはＬ−型の光学的に純粋な化合物を上述の溶媒に溶かして、暗下で０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌの溶液を調製する。好ましくは、化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な化合物は、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物であり、溶媒は、アセトニトリルであり、溶液の濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。
【００２８】
（二）テスト溶液の調製：適量のＬ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムのサンプルを塩酸により加水分解する。好ましくは、ニトリルと３０％ＨＣｌの質量／体積の比は、２７．５ｇ：４０ｍｌである。混合物を７０〜８０℃で５時間加熱し、その後室温まで冷却し、そしてｐＨの値が中性になるまでアンモニア水を添加して調整する。
【００２９】
（三）コントロール溶液の調製：適量のラセミ体カルニチンを使用してコントロール溶液を調製する。
【００３０】
（四）誘導体化反応：適量の化学式（ＩＩ）の光学的に純粋な誘導体化試薬をＬ−カルニチン（もしくはＤ−カルニチン）テスト溶液およびカルニチンコントロール溶液と混ぜる。上述の工程（一）の誘導体化試薬を、上述の工程（二）のテスト溶液と上述の工程（三）のコントロール溶液とをそれぞれ溶媒の存在下で２０℃〜９５℃において反応させ、Ｌ−カルニチンもしくはＤ−カルニチン誘導体を製造する。
【００３１】
（五）ＨＰＬＣ検出：上述の（四）工程のテスト溶液およびコントロール溶液中のＬ−カルニチンおよびＤ−カルニチンの含有量をＨＰＬＣにより検出し、それによりＬ−異性体Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムおよびＤ−異性体Ｄ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムの含有量を計算する。
【００３２】
本願発明は、最終生成物のＬ−カルニチンおよびＤ−カルニチンの含有量をキラルＨＰＬＣ法および誘導体化試薬を使って検出することを記載しており、テストサンプルは加水分解をすることなくテスト溶液を作成するために直接溶かされている。
【００３３】
異なる調製工程における重要な品質管理に使われる高純度Ｌ−カルニチンの調製方法は、高純度Ｌ−カルニチンを提供するのに使われており、これによりＬ−カルニチンの含有量は９７％以上であり、Ｄ−カルニチンの含有量は２％以下である。そのため、Ｌ−カルニチンの合成工程において作られる人体に有害なＤ−カルニチン不純物を効果的にコントロールできるだけでなく、製造コストを著しく下げることができ、また出発原料および不純物および反応物の生成物を正確にコントロールできることから生成物の品質管理も向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ラセミ体エピクロロヒドリンの光学的純度を検出しているクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、Ｓｈｅｎｚｈｅｎｇ  ＹａＷａｎｇ−ｋａｎｇｌｉ社のＳ−エピクロロヒドリンの光学的純度を検出しているガスクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、Ｈａｉ  Ｋｅｌｉ  ｂｉｏ−ｐｈａｒｍ社のＳ−エピクロロヒドリンの光学的純度を検出しているガスクロマトグラムである。
【図４】図４は、１０％のラセミ体が添加されたエピクロロヒドリンの光学的純度を検出しているガスクロマトグラムである。
【図５】図５は、２０％のラセミ体が添加されたエピクロロヒドリンの光学的純度を検出しているガスクロマトグラムである。
【図６】図６は、Ｓｈｅｎｚｈｅｎｇ社のＳ−エピクロロヒドリンから調製されたＬ−カルニチンのＤ−異性体のＨＰＬＣを示す。
【図７】図７は、Ｓｈａｎｇｈａｉ社のＳ−エピクロロヒドリンから調製されたＬ−カルニチンのＤ−異性体のＨＰＬＣを示す。
【実施例】
【００３５】
以下に記載の実施例は本願発明を説明するだけであって、本願発明はこれに限定されない。
【００３６】
実施例１：ガスクロマトグラフィーによりエピクロロヒドリンの光学的純度の検出方法を確立する。
（１）ガスクロマトグラフィーカラムを選択する。
該方法の確立に際して、異なる製造業者からのキラルカラムをテストした。表１に使用した異なるカラムを記載する。
【００３７】
【表１】
2012505258.tif 000004
【００３８】
上記のテストを比較すると、Ａｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬｔｄのＺＴキラルカラムだけが、右旋性エピクロロヒドリンから左旋性エピクロロヒドリンを分離できることがわかった。分離度は１．８７であり、これは要件をみたしている。
【００３９】
Ａｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬｔｄのＺＴキラルカラムのパラメーターを以下に記載する：
Ａｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬｔｄからＺＴキラルカラムを購入した。最高使用温度は、２００℃である；
固定液は、ＺＫＡＴ−ｃｈｉｒａｌ  Ｂ；実行標準（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ）は、Ｑ／ＺＫＡＴ０１−２００５；製造番号は０８−０１−００１；製品番号は８０２１０３−４である。
【００４０】
（２）クロマトグラフィーの条件
注入温度は、１５０℃；カラム温度は、８５℃；検出温度は、２２０℃；キャリアガスは、Ｎ２；注入口圧力は、０．０４ＭＰａ（１５．９ｍｌ／ｍｉｎ）；メイクアップガス（ｍａｋｅ−ｕｐ  ｇａｓ）は、０．１２ＭＰａ；Ｈ２は、０．１ＭＰａ；空気は、０．０８ＭＰａ；分流速度は、４７ｍｌ／ｍｉｎ（気泡流量計での測定による）；スプリット比は、４：１；サンプルの濃度としては、サンプルはエーテルにより２５０倍に薄める；サンプル量は１μｌ。
【００４１】
（３）検出限界
ラセミ体エピクロロヒドリンは除去され、０．００４μｌ／ｍｌ、０．００８μｌ／ｍｌ、０．０１６μｌ／ｍｌ、０．０２４μｌ／ｍｌ、０．０３２μｌ／ｍｌの濃度を有する５つのサンプル溶液がエーテルを使って調製され、それらを順に検出した。
【００４２】
０．０３２μｌ／ｍｌの（Ｒ）−エピクロロヒドリンのクロマトグラフィーのＳＮＲの結果は、３：１であった。すなわち、（Ｒ）−エピクロロヒドリンの検出限界は、０．０１６μｌ／ｍｌだった。サンプル量が１μｌだったため、検出限界は１．６ｘ１０−５μｌであった。
【００４３】
実施例２：中間体（Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）のＤ−異性体の含有量の検出
Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム（２７．５ｍｇ）を正確に計量し、１００ｍｌの容量測定のフラスコに入れ、３０％塩酸（４０μｌ）を加えた。７５℃で５時間加水分解を行った後、アンモニウム水をｐＨが７．０になるまで滴下し、水を加えて溶解した。１０ｍｌの溶液をピペットで正確に採取し、１００ｍｌの容量測定用のフラスコに入れ、水を加えた。このようにしてテスト溶液を作成した。
【００４４】
ＤＬ−カルニチン（２０ｍｇ）を正確に計量し、１００ｍｌの容量測定用のフラスコに入れ、水を加えた。１ｍｌの溶液をピペットで正確に採取し、１００ｍｌの容量測定用のフラスコに入れ、水を加えた。このようにして、コントロール溶液を作成した。
【００４５】
コントロール溶液（３０μｌ）とテスト溶液（５ｍｌ）をピペットで採取し、茶色の容量測定用フラスコにそれぞれいれた。そして、それぞれに０．０５ｍｏｌ／ｌのカーボネート緩衝液（ｐＨ＝１０．３）を３０μｌ、ピリジンアセトニトリル溶液を１００μｌ（１ｍｌのアセトニトリルが５μｌのピリジンを含む）、０．５％の誘導体化試薬を１００μｌを加えてから、混合した。その後、密閉し、６０℃の水槽で９０分間反応させた後、取り出してから計量のために０．０５ｍｏｌ／ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）で希釈し、濾過した。得られたテストサンプルおよびコントロールサンプル１０μｌをピペットで正確に採取し、液体クロマトグラフに注入した。クロマトグラムを記録し、Ｄ−異性体の含有量を外部標準法およびピーク面積法により算出した。
【００４６】
ＨＰＬＣ検出法は以下の通りである：
アジレント社１１００ＨＰＬＣ；蛍光検出器；カラムは、Ｃ１８−ＯＤＳカラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ）；フロー速度は、１ｍｌ／ｍｉｎ；移動相は、トリエチルアミン緩衝液（８ｍｌのリン酸と１５ｍｌのトリエチルアミンと１５００ｍｌの水とをｐＨが５．４になるように調節）−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の混合液；グラジエント時間は、下記の表２に示す：
【００４７】
【表２】
2012505258.tif 000005
【００４８】
Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムのＤ−異性体の含有量は表３に示すように検出された。
【００４９】
【表３】
2012505258.tif 000006
【００５０】
実施例３：異なる光学的純度を持つＳ−エピクロロヒドリンから開始するＬ−カルニチンの調製
工程１：Ｌ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムの調製
まず、実施例１に記載の方法にしたがってＳ−エピクロロヒドリンのＬ−異性体の含有量を検出した。
【００５１】
次に、トリメチルアミン溶液（６０ｇ）を２５０ｍｌの三つ口フラスコに入れてから混ぜて１０〜２０℃に冷却し、Ｓ−エピクロロヒドリン（３５ｇ）を滴下した後に混ぜて１０〜２０℃で２〜４時間置いた。そして、反応温度を３０〜７０℃に上げて、そのまま２〜４時間保持し、減圧下で適量になるまで蒸発させ、凍結により結晶化し、その後乾燥させて、収率８９．０％、融点２１２．０℃〜２１５．６℃のＬ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム（５５．２ｇ）を得た。旋光度は、旋光計で検出した。
【００５２】
工程二：Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムの調製
Ｌ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム（５０ｇ）を２５０ｍｌの三つ口フラスコに入れ、Ｈ２Ｏ（４０ｍｌ）に溶解させ、３０〜７０℃に加熱し、シアン化ナトリウム（４８ｇ）を滴下し、７０℃で４時間保持し、減圧下で蒸発させ、０℃以下で凍結してから乾燥させて、収率９２．１％、融点２５２．８℃〜２５３．４℃のＬ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムを得た。
【００５３】
工程三：Ｌ−カルニチンの調製
Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム（２７．５ｇ）と３０％塩酸（４０ｍｌ）を２５０ｍｌのフラスコに加え、７０℃〜８０℃に加熱し、５時間保持した。その後、余分な塩酸を７０℃の減圧下で蒸発させ、残留物を２０℃に冷却し、２０％アンモニウム（２０ｇ）を加えてから、０℃に冷却し、塩化アンモニウムを濾過により取り除いた。その後、活性炭素（３ｇ）を加え、脱色、脱塩し、減圧下で乾燥させるために蒸発させて、その後エタノール（５０ｍｌ）を添加し、５０〜８０℃で１時間還流し、２０℃に冷却し、アセトンを滴下（１２５ｍｌ）し、ろ過し乾燥させて、収率７５．４％のＬ−カルニチン産物（１８．６ｇ）を生成する。
【００５４】
結果：
異なる光学的純度を持つＳ−エピクロロヒドリンから調製されたＬ−カルニチンの実験データを表４に示す。
【００５５】
【表４】
2012505258.tif 000007
【００５６】
異なる光学的純度を持つＳ−エピクロロヒドリンのＳ−光学異性体およびＲ−光学異性体の含有量は、図１〜５に示されている。Ｌ−カルニチンの右旋性異性体のＨＰＬＣは図６〜７に示されている。
【００５７】
図１〜５に関するデータを表５〜９に示す。
【００５８】
【表５】
2012505258.tif 000008
【００５９】
【表６】
2012505258.tif 000009
【００６０】
【表７】
2012505258.tif 000010
【００６１】
【表８】
2012505258.tif 000011
【００６２】
【表９】
2012505258.tif 000012
【００６３】
実施例４：Ｌ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムからＬ−カルニチンを調製する
異なる光学的純度を持つＬ−３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムから実施例３の工程二に従ってＬ−カルニチンを調製した。実験データを表１０に示す。
【００６４】
【表１０】
2012505258.tif 000013
【００６５】
実施例５：Ｌ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムからのＬ−カルニチンを調製する
異なる光学的純度を持つＬ−３−シアノ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムから実施例３の工程三に従ってＬ−カルニチンを調製した。実験データを表１１に示す。
【００６６】
【表１１】
2012505258.tif 000014
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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