(57)【要約】  本開示は、クロマトグラフィー技術によるペプチドの精製のための方法を提供する。提案された方法論は、発展するバイオ産業から生じる生物学的タンパク質生成物を精製することに関連した課題に取り組むことに役立つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物からポリペプチドを精製するための調製用クロマトグラフィー法であって、以下のステップ：
(a)  ポリペプチド混合物をクロマトグラフィープロセスに供すること、ここで樹脂は、弱酸性pHのバッファ及び有機修飾剤で洗浄され、平衡化される；
(b)  0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞に及ぶ峻度係数を有する峻度の凸状又は凹状非線形勾配により溶出させること；及び
(c)  対象不純物を少なくとも50％除いて、ポリペプチドを回収すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィープロセスが、イオン交換クロマトグラフィー、又は逆相HPLC、又はそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記のステップa)における樹脂が、イオン交換樹脂又はC4〜C18シリカ樹脂である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記の用いられるバッファが、酢酸バッファである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記pHが、約2〜約5に及ぶ、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、インスリン、インスリンアナログ、又はそれらの誘導体である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記インスリン誘導体が、IN 105である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記インスリンアナログが、グラルギン、アスパート、リスプロ、グルリジン、又はインスリンメチルエステルである、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記の対象不純物が、des-Octa不純物、des thero不純物、des octaアスパート不純物、又はフランク、及びモノグリコシル化アスパート、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記樹脂に対する前記ポリペプチドの比が、重量体積比で0.1〜50 g/lである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記樹脂に対する前記ポリペプチドの比が、より好ましくは、重量体積比で1〜25 g/lである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記の回収されたポリペプチドが、少なくとも95％の純度を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも95％の純度である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の精製されたIN-105。
【請求項１４】
少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物からインスリン及びアナログを精製する方法であって、以下のステップ：
(a)  混合物を、有機修飾剤で洗浄され、平衡化されるRPHPLCカラムに供すること、；
(b)  0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞に及ぶ峻度係数を有する峻度の凸状又/凹状非線形勾配によって溶出させること；及び
(c)  対象不純物を少なくとも50％除いて、インスリン及びアナログを回収すること、
を含む、方法。
【請求項１５】
RPHPLCが、約2〜約5に及ぶpHで洗浄及び平衡化される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記の回収されたインスリンアナログが少なくとも97％の純度を有する、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも85％の純度である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の精製されたインスリンメチルエステル。
【請求項１８】
少なくとも90％の純度である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の精製されたインスリンメチルエステル。
【請求項１９】
少なくとも90％の純度である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の精製されたグラルジン。
【請求項２０】
少なくとも95％の純度である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の精製されたグラルジン。
【請求項２１】
少なくとも80％の純度である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の精製されたアスパート。
【請求項２２】
少なくとも84％の純度である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の精製されたアスパート。
【請求項２３】
少なくとも88％の純度である、請求項1〜22のいずれか一項に記載の精製されたアスパート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
イオン交換/逆相クロマトグラフィー媒体上での調製用クロマトグラフィーによる、タンパク質の精製のための方法が開示される。本発明は、一般的に、クロマトグラフィーに、及び、より好ましくは、対象化合物のより高い純度を導く分離のためのより優れた分解能を提供する、対象と副生成物物質の非線形勾配に基づく調製用クロマトグラフィー分離の方法に関する。さらに、非線形勾配溶出を用いたRPHPLCによる、インスリンアナログ又は誘導体の精製のための方法も、開示される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発達するバイオテクノロジー産業から生じる生物学的タンパク質生成物は、クロマトグラフィーを介する精製プロセスについて新たな課題を提示する。典型的には、これらの生成物は、104〜106ダルトンの分子量を有し、大きく不安定である。そのような生成物は、細胞残屑、様々な溶質、栄養成分、DNA、及び他の不純物を含む、何百もの混入する種をしばしば含む混合物から精製される。採取溶液中のタンパク質生成物の濃縮は、ときには1 mg/l程度であるが、しかし通常、100 mg/lのオーダーである。処理溶液中のプロテアーゼの存在、及びそれらの不安定な性質は、しばしば精製が一刻も早く行われることを要求する。
【０００３】
クロマトグラフィーは、二つの相：固定(又は結合)相床と移動(又は運搬)相に分離される成分の分配に依存する、動的な分離プロセスである。移動相は、固定相で充填されたカラムを通して分離される成分を運搬する。クロマトグラフィー技術は、イオン交換、疎水性相互作用などに基づく分離を含む。逆相クロマトグラフィー(RPC)では、溶液中の分子は、クロマトグラフィー樹脂の疎水性表面又は疎水性リガンドに結合する。
【０００４】
多くの様々なクロマトグラフィー手順は、純度及び収率に関して所望の最終結果を得るために、適用される。逆相クロマトグラフィーは、主要な分離原理として、疎水性相互作用を用いる、用いられる精製の最も強力な方法の一つである。逆相液体クロマトグラフィー(「RP‐LC」)及び逆相高速液体クロマトグラフィー(「RP‐HPLC」)は、一般的に、合成又は組み換え手法により製造された、ペプチド及びタンパク質などの分子を精製することに用いられる。RP‐LC及びRP‐HPLC法は、密接に関連する不純物を効率的に分離することができ、多くの様々な分子を除くために使用されている(Lee et al., "Preparative HPLC," 8th Biotechnology Symposium, Pt. 1, 593-610 (1988))。さらに、RP‐LC及びRP‐HPLCは、分子、特に；工業規模でタンパク質を除くために首尾よく用いられている(Olsen et al., 1994, J. Chromatog. A, 675, 101)。
【０００５】
イオン交換クロマトグラフィー原理は、二つの異なる手法：イオン交換樹脂上のリガンドの電荷による、陰イオン交換及び陽イオン交換、を含む。従来のIEC精製プロセスは通常、一つ又はそれを超える：平衡化部分、適用又は充填部分、洗浄部分、溶出部分、及び再生部分から成る(Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, or Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995)を参照のこと)。
【０００６】
米国特許第6,451,987号は、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するための、イオン交換クロマトグラフィープロセスを開示する。
【０００７】
US 7,276,590は、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精製するための、イオン交換クロマトグラフィープロセスを開示する。
【０００８】
調製系のコストは、著しく増大している。その上、これらの高圧で動作するそのような系は、日常的な製造環境で用いられており、それは深刻な危険となり得る。製造業は、それ故、遅く、限られた精製能力を有する低圧、低コスト系と、著しくより高価で健康被害をもたらす高圧、高コスト系の間で選択しなければならない立場にあった。加えて、生物製剤は、熱で、又はプロテアーゼの存在などにより、調製用溶液中であってもやがて分解し得るので、迅速な分離が大変望ましい。生物学的巨大分子の液体クロマトグラフィー分離プロセスで達成される製造の効率は、生成物の量/ドルの用語で記述され得る。最適な製造を達成するために、製造速度及び能力の双方は、現在のところ、兼ね備えることのできない重要な考察すべき事項である。従って、需要は、高圧、及び関連する危険、及び高コストに頼ることなく、高い性能を有する系について、クロマトグラフィーの技術分野において存在する。
【０００９】
プロセスが、クロマトグラフィープロセスの収率、純度、処理量、及び操作条件を可能な限り再現するものであって、溶出が、選択された溶媒系、pH範囲、及び他の関連する因子により行われる場合、この需要は満たされる。操作手順は商業的分離のために有利に用いられることができる。試みは、分離が高分解能により特徴付けられるイオン交換/HPLC系を作り出すために行われている。
【００１０】
従って、標準的な抽出及びクロマトグラフィー技術を単独で、又は組み合わせて用いられる場合、本発明の抽出方法は、従来の方法により要求されるよりもより少ないステップで、高収率及び高純度における本発明の分子の単離を可能にする。
【００１１】
本発明の目的は、それ故、従来の分離及び精製系の欠点を有さずに、小規模及び小コストで、効率的な分離及び精製のための、調製用クロマトグラフィー系を提供することである。
【００１２】
より具体的には、本発明は、著しく高効率なクロマトグラフィー的分離、すなわち、クロマトグラフィー技術は、高分解能及び、クロマトグラフィーマトリックスの単位容量あたりの高処理量の双方により特徴付けられる、を行うための方法に関する。より具体的には、本発明は、特に調製用クロマトグラフィーに、及びこれまで達成されていない効率でクロマトグラフィー的分離を実行するための方法に関する。目的に加えて、本発明の利点及び新たな特徴は、それに寄与するさらなる特徴、及びそれらから生じる利点と一緒に、それは参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の不可欠な部分を形成する、添付する図面に記される、本発明の下記の記述から、当業者に明らかである。本発明の目的及び利点は、添付の請求項に特に指摘された手段及び組み合わせにより、実現され、達成されることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
従って、本発明は少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物から、ポリペプチドを精製するための、調製用クロマトグラフィー法に関し、前記方法は、以下のステップ：(a)ポリペプチド混合物をクロマトグラフィープロセスに供すること、ここで樹脂は、弱酸性pHのバッファ及び有機修飾剤で洗浄され、平衡化される、(b)0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞に及ぶ峻度係数(steepness coefficient)を有する峻度の凸状又は凹状非線形勾配によって溶出させること；及び(c)対象不純物を少なくとも50％除いて、ポリペプチドを回収すること、を含む、方法；少なくとも95％の純度である上記の本方法による精製されたIN-105；インスリン及びアナログを、少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物から精製する方法、前記方法は、以下のステップ：a)混合物を、有機修飾剤で洗浄され、平衡化されたRPHPLCカラムに供すること、b)0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞の範囲に及ぶ峻度係数を有する峻度の凸状/凹状非線形勾配により溶出させること、及びc)少なくとも50％の対象不純物を除いて、インスリン及びアナログを回収すること；を含み、少なくとも85％の純度である上記の任意の本方法による精製されたインスリンメチルエステル；少なくとも90％の純度である上記の任意の本方法による精製されたインスリンメチルエステル；少なくとも90％の純度である上記の任意の本方法による精製されたグラルギン；少なくとも95％の純度である上記の任意の本方法による精製されたグラルギン；少なくとも80％の純度である上記の任意の本方法による精製されたアスパート；少なくとも84％の純度である上記の任意の本方法による精製されたアスパート；少なくとも88％の純度である上記の任意の本方法による精製されたアスパート。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物からポリペプチドを精製するための、調製用クロマトグラフィー法に関し、前記方法は、以下のステップ：
a)  ポリペプチド混合物をクロマトグラフィープロセスに供すること、ここで樹脂は弱酸性pHのバッファ及び有機修飾剤で洗浄され、平衡化される；
b)  0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、峻度係数0〜∞に及ぶ峻度係数を有する峻度の凸状又は凹状の非線形勾配により溶出させること；及び
c)  対象不純物を少なくとも50％除いて、ポリペプチドを回収すること、
を含む。
【００１５】
本発明の実施形態では、クロマトグラフィープロセスは、イオン交換クロマトグラフィー又は逆相HPLC又はそれらの組み合わせを含む群から選択される。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、ステップa)における前記樹脂は、イオン交換樹脂又はC4〜C18シリカ樹脂である。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態では、用いられる前記バッファは、酢酸バッファである。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態では、前記pHは、約2〜約5に及ぶ。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態では、前記ポリペプチドは、インスリン、インスリンアナログ、又はその誘導体である。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態では、前記インスリン誘導体は、IN 105である。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態では、前記インスリンアナログは、グラルギン、アスパート、リスプロ、グルリジン、又はインスリンメチルエステルである。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態では、前記対象不純物は、des-Octa不純物、des thero不純物、des octaアスパート不純物、又はフランク(flank)、及びモノグリコシル化アスパート、又はそれらの任意の組み合わせである。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態では、樹脂に対するポリペプチドの比は、重量体積比で0.1〜50 g/lの範囲である。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態では、樹脂に対するポリペプチドの比は、より好ましくは、重量体積比で1〜25 g/lの範囲である。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態では、回収したポリペプチドは、少なくとも95％の純度を有する。
【００２６】
本発明は、少なくとも95％の純度を有する、先述の任意の実施形態による精製されたIN-105に関する。
【００２７】
本発明は、少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物から、インスリン及びアナログを精製する方法に関し、前記方法は、以下のステップ：
a)  混合物を、有機修飾剤で洗浄され、平衡化されるRPHPLCカラムに供すること、
b)  0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞に及ぶ峻度係数を有する峻度の、凸状/凹状の非線形勾配により溶出させること；及び
c)  対象不純物を少なくとも50％除いて、インスリンを回収すること；
を含む。
【００２８】
本発明の実施形態では、RPHPLCは、約2〜約5の範囲に及ぶpHで洗浄及び平衡化される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、回収されたインスリンアナログは、少なくとも97％の純度を有する。
【００３０】
本発明は、少なくとも85〜90％の純度である、先述の任意の実施形態による精製されたインスリンメチルエステルに関する。
【００３１】
本発明は、少なくとも90〜95％の純度である、先述の任意の実施形態による、精製されたグラルジンにさらに関する。
【００３２】
本発明は、少なくとも80〜88％の純度である、先述の任意の実施形態による、精製されたアスパートにさらに関する。
【００３３】
イオン交換及び/又は逆相調製用クロマトグラフィープロセスにより、IN-105を含む純粋でない調製物の精製のためのプロセスは、提供される。例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、固定相、典型的にはセラミックに基づく樹脂で充填される。典型的なプロセスは、クロマトグラフィーカラムに未精製のIN-105溶液を供給すること、クロマトグラフィーカラムに移動相を適用すること、及びクロマトグラフィーカラムからIN-105溶出液を回収すること、を含む。対象化合物を含むそれぞれの分離された溶出液はしかしながら、十分な回収率及び純度を有する。
【００３４】
少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物から、ポリペプチドを精製するための、調製用クロマトグラフィー法であって、前記方法は、以下：
(a)  弱酸性pHのバッファで洗浄及び平行化されるイオン交換樹脂に、ポリペプチド混合物を適用すること、
(b)  0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞の範囲で峻度の凸状/凹状の非線形勾配を用いる溶出、
(c)  対象不純物を少なくとも50％除いて、ポリペプチドを回収すること、
を含む。
【００３５】
より具体的には、本発明の主要部は、60〜95％の範囲で対象不純物の減少をもたらす、0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘って0〜∞の範囲で峻度の凸状/凹状の非線形勾配を用いる溶出に関する。このプロセスは、従って、少なくとも80％〜97％の範囲で対象化合物の純度を与える。
【００３６】
RPHPLCによるインスリン及びインスリンアナログを含む純粋でない調製物の精製のためのプロセスであって、前記方法は以下：
a)  RPHPLCカラムが、有機修飾剤の適切な百分率でまず平衡化される、
b)  タンパク質サンプルが、過重装填されたカラム条件下で、カラムに注入される、
c)  いずれの未結合のタンパク質を取り除くために、所定の百分率の有機修飾剤でカラムを洗浄する、
d)  続いて、非線形条件下で行われる勾配溶出を行う、
e)  サンプルは分画され、全体的な純度を見積もるために分析される。
f)  要求される純度に達する画分は、一緒にプールされ、溶出プールを与え、カラムはその後再生され、強固に結合している可能性があるいずれのタンパク質を取り除く、
を含む。
【００３７】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記述される一方で、本発明の真の趣旨及び範囲から離れることなく、様々な変更は行われてもよく、相当物は置換されてもよいことは、当業者により理解されるべきである。
【００３８】
この明細書では、調製用クロマトグラフィーの要求される操作パラメータの性質及び理論的基盤は、初めて開示され、特定の事例に対するクロマトグラフィープロセスの最適化に有用である方程式的原理、そのようなクロマトグラフィー、及びそのような手順の特定の例の実施に有用である特定の物質の開示が続く。
【００３９】
当業者は、本明細書に記載される方法及び系を開発することにおいて、さらなる説明を必要としないはずであるが、しかし、当該関連する技術分野における標準的な参考文献を調べることにより、これらの方法及び系の調製において、何らかの有用なガイダンスを見つけることができる。例えば、当業者は、L. R. Snyder, "Gradient Elution", from High Performance Liquid Chromatography, Cs. Horvath (ed.), Academic Press, 1980, pp. 207-316、及び M. A. Stadalius, H. S. Gold 及びL. R. Snyder, J. Chromatography, 296 (1984), 31-59、Cazes, J., 2005, "Encyclopedia of Chromatography" (pp 718). Marcel Dekker, Edition 2, VoI 1を見直すことを選択してもよく、その開示は、それらの全体において、参照によりここで組み込まれる。
【００４０】
用語の定義：
用語「イオン交換」及び「イオン交換クロマトグラフィー」とは、対象の溶質が、混合物中の溶質不純物又は混入物に比べてより強く又は弱く荷電した化合物と非特異的に相互作用するような、混合物中の対象の溶質(例えばタンパク質など)が、固相イオン交換物質に結合した(例えば共有結合などにより)荷電した化合物と相互作用する、クロマトグラフィープロセスを意味する。混合物中の混入している溶質は、イオン交換物質のカラムから、対象の溶質よりも早く又は遅く溶出する、又は対象の溶質と比較して、樹脂に結合する又は樹脂から排除される。「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的には、陽イオン交換、陰イオン交換、及び混合モードクロマトグラフィーを含む。
【００４１】
用語「調製用クロマトグラフィー分離」とは、化学的混合物の成分又は成分(複数)(例えば、所望の成分)を単離又は分離するためのクロマトグラフィー分離を意味することを意図する。調製用クロマトグラフィー分離は、調製用カラムを通して、一つ又はそれ以上の成分を溶出することを含むことができる。調製用クロマトグラフィー分離は、調製用クロマトグラフィー的パラメータにより、特徴付けられ、影響を受け得る。
【００４２】
語句「クロマトグラフィーの勾配モード」は、本明細書中で、時間に応じて、典型的には、使用者定義プロファイルに応じて変化する溶媒組成物を流すことを意味する。溶媒は、例えば、移動相バッファA及び移動相バッファBとして本明細書中で呼ばれる、二つの溶液の混合物である組成物を有する。好ましい態様では、カラムは強力な陰イオン又は強力な陽イオン交換カラムであり、それは、カラム吸着のイオン交換特性が、カラムのpH使用範囲に亘り変化しないことを意味する。
【００４３】
勾配クロマトグラフィー系は、アイソクラティック系のように同様の一般的な成分を用い、その主な違いは、液体の混合物の組成が時間に応じて連続的に変化する液体の混合物を輸送させる、溶媒輸送である。勾配技術は、アイソクラティックモードでは一緒に溶出し、区別しての分離を達成するために溶出条件において小さな変化を必要とする、ピークを分離するために、しばしば用いられる。
【００４４】
勾配溶出は、クロマトグラフィー運転の間、弱い溶離液から強力な溶離液に変化させることにより行われる。勾配溶出では、溶出プロセスは、低い移動力の溶離液から開始し、その後時間をかけて高い移動力の溶離液まで増加する。これは、溶離液の濃度及び/又は組成を変化させることにより達成することができる。記述される系に用いられる流速は、イオンクロマトグラフィーに典型的である。勾配溶出は、運転の間、弱い溶離液から強い溶離液に変化させることにより行われる溶出として定義される。そのような溶出は、勾配溶出と呼ばれる。好適な勾配溶出の例は、Rocklin, R.D.ら(Journal of Chromatography 411 (1987) 107.)、及びIon Chromatography, Small, H. (Plenum Press 1989) pp. 187, 213.に説明されてる。それらは、線形、凹状、凸状、階段状、一定期間線形の形における時間の関数、及びこれらの関数の組み合わせのような溶出強度の増加を含む。
【００４５】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の荷電の違いに基づいて、タンパク質不純物からタンパク質の分離に役立つ。CIEX運転の多くでは、溶出は、始めから終りまで、同じ濃度のバッファを有する、アイソクラティック勾配モードで行われる。溶出の間に、非線形勾配を適用することは、時間に伴うバッファ濃度の段階的変化のために、密接に関連する不純物の分離に役立つ。さらに、非線形勾配の適用は、濃度の急増に続く濃度の漸増、又は濃度の漸増に続く濃度の急増をもたらす。この非線形バリエーションは、近接して溶出する不純物の分離を向上させることに役立つ。
【００４６】
外部の勾配は、開始バッファを第二のバッファと異なる濃度で連続的に混合することにより発生させられ、混合物が所望の濃度に達するまで、第二のバッファの割合を同時に増加させる。バッファ溶液を形成する濃度勾配のそれぞれは、同じバッファ成分又は異なるバッファ成分からなることができる。
【００４７】
そのため、勾配は、「線形勾配」、「凸状勾配」、「凹状勾配」、又は「不連続勾配」、又は当業者に知られている任意の他の好適な形態であることができる。
【００４８】
「凸状勾配」は、バッファ濃度が、後で急増を伴う、初期段階を通して穏やかに上昇する勾配を意味する。
【００４９】
「凹状勾配」は、バッファ濃度が初期において傾きが急増し、後で漸増が続く勾配を意味する。
【００５０】
「分解能」とは、系が達成することができる精製の程度を意味する。この可変性は、処理溶液における溶質の性質、及びクロマトグラフィー媒体の相互作用表面の化学的性質、及びまた流速、拡散、及び吸着の動力学に影響を及ぼす特性により、制御される。
【００５１】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」とは、アミノ酸の重合体を意味し、特定の長さの生成物を意味しない；それ故、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの翻訳後修飾を意味せず、又は含まず、もっとも、それらのポリペプチドの化学的又は翻訳後修飾は、特定の実施形態として含んでも含まなくてもよい。それ故、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含む、ポリペプチドへの修飾は、用語ポリペプチドにより、明示的に包含される。さらに、これらの修飾を有するポリペプチドは、本発明に含まれる又は含まれない個別の種として指定されてもよい。一つの実施形態では、分子は、ポリペプチド、又はそれらの関連するアナログ、又はそれらの誘導体である。
【００５２】
タンパク質及び一つ又はそれ以上の混入物を含む組成物からタンパク質を、「精製すること」とは、従って、タンパク質組成物から少なくとも一つの混入物の含有量を減少させることにより、組成物中のタンパク質の純度の程度を上昇させることを意味する。
【００５３】
「不純物」とは、所望のポリペプチド生成物又は対象のタンパク質と異なる物質である。非線形勾配を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて対象とされる主な不純物は、des-Octa IN-105である。酵素反応では、トリプシンは、リーダー及びリンカー配列を切断することにより、インスリン前駆体からインスリンに変換する。この反応の間、発生させられる不純物の一つは、トリプシン作用がB鎖のC末端から8アミノ酸離れて起こる、des-Octa IN-105である。生成物の保持に対するオクタデシルセラミックカラムにおけるこの不純物の保持比は、0.84である。従って記述される不純物は、「対象不純物」と呼ばれる。
【００５４】
用語「インスリンアナログ」とは、上記で定義されたように、ポリペプチド鎖内の一つ又はそれを超えるアミノ酸が、代替のアミノ酸で置換されている、及び/又は一つ又はそれを超えるアミノ酸が欠損している、又は一つ又はそれを超えるさらなるのアミノ酸がポリペプチド鎖に加えられている、「インスリン」の任意の形態を含むことを意図する。インスリンアナログは、アスパート、グラルジン、及びインスリンメチルエステルから成る群から選択される。
【００５５】
「IN-105」とは、構造式CH3O‐(C4H2O)3‐CH2‐CH2‐COOHの両親媒性オリゴマーであるインスリンB鎖の位置B29で、イプシロンアミノ酸リジンで結合されたインスリン分子である。分子は、A1、B1、及びB29での一複合体、A1、B1、及びB29に様々な組み合わせでの二複合体、又はA1、B1、及びB29に様々な組み合わせでの三複合体でもよい。
【００５６】
インスリン及びアナログのための非線形勾配を用いるRPHPLCにおいて対象とされる主な不純物は、以下を含む：
【００５７】
Des-Threoインスリン‐酵素反応では、トリプシンは、リーダー及びリンカー配列を切断することにより、インスリン前駆体をインスリンに変換する。この反応の間、発生させられる不純物の一つは、トリプシン作用がB鎖の29番目のアミノ酸で起こる、des-threoである。生成物の保持に対するオクタデシルシリカカラムにおけるこの不純物の保持比は、0.98である。
【００５８】
Des- Octaアスパート‐酵素反応では、トリプシンは、リーダー及びリンカー配列を切断することにより、インスリンアスパート前駆体をインスリンアスパートに変換する。この反応の間、発生させられる不純物の一つは、トリプシン作用がB鎖のC末端から8アミノ酸離れて起こる、des-octaである。生成物の保持に対するオクタデシルシリカカラムにおけるこの不純物の保持比は、0.9である。
【００５９】
フランク(flank)：アスパートでは、これはまた、主な不純物の一つとして見られる。酵素反応では、トリプシンは、リーダー及びリンカー配列を切断することにより、インスリンアスパート前駆体をインスリンアスパートに変換する。この反応の間、発生させられる不純物の一つは、フランクであり、それは、C‐ペプチド(リンカーペプチド)が完全に切断されない場合に生じる。生成物の保持に対するオクタデシルシリカカラムにおけるこの不純物の保持比は、0.96である。
【００６０】
グリコシル化アスパート：宿主は、前駆体へのマンノシル基の付加をもたらす翻訳後修飾を行うことが知られている。それに応じて、発生される不純物は、グリコシル化不純物として知られている、生成物のグリコシル化形態である。生成物の保持に対するオクタデシルシリカカラムにおけるこの不純物の保持比は、0.91である。
【００６１】
峻度係数とは、時間に対する濃度曲線の傾きを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、分析用及び調製用クロマトグラフィー分離のどちらか又は双方のために、非線形溶媒強度勾配を用いても良い(例えば、区分的に線形溶媒強度勾配、凹状勾配形、または凸状勾配形)。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態では、調製用クロマトグラフィー分離を用いる所望の成分の分離を最適化及び/又は改良する前に、分析的クロマトグラフィー分離の特定の態様を最初に最適化又は改良することを(例えば、分析用勾配峻度パラメータのための適切な値を選択することにより)含んでもよい。峻度勾配は、典型的には連続的な流量操作のために効率的である。
【００６３】
本発明のタンパク質の分離及び精製のための方法の典型的な例は、以下のステップ：
i.  約10 mMの酢酸バッファで平衡化されたセラミックを基礎とした樹脂でイオン交換カラムを充填すること、
ii.  少なくとも一つの関連する不純物を含むペプチド組成物を、カラム上に流速約≦100〜400 cm/時の流速で、装填すること、
iii.  0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞の範囲で峻度の凸状/凹状勾配を用いる非線形勾配を行うカラムから、精製された生成物を溶出させること、
を含む。
【００６４】
溶出バッファのpHは、約2〜約9、あるいは約3〜約8、約4〜約8、又は約5〜約8でもよく、もっとも、溶出のpH又はpH範囲は、対象の所望のタンパク質、及び実施されるクロマトグラフィーの種類によって決定することができる。装填、洗浄、又は溶出バッファに適切なpH範囲は、対象のタンパク質が活性のある形態で回収されるような標準的な方法により容易に決定される。
【００６５】
本開示の一つの実施形態では、水性バッファ系は、酢酸ナトリウムバッファ系から選択される。別の態様では、酢酸水溶液バッファ系はまた、塩/イオン交換化合物として、一つ又はそれを超える酢酸アンモニウムと対になってもよい。さらなる態様では、水酸化ナトリウムは、任意で、pH又はナトリウムイオン濃度を調整するために用いられる。好ましい態様では、移動相中のイオン交換バッファ/バッファ塩イオン交換化合物は、酢酸アンモニウム/酢酸ナトリウムバッファ系である。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、分離勾配式に関し、方程式(i)及び(ii)は、非線形勾配の計算に用いられることができる。勾配は、時間に伴う溶媒濃度における変化が直線である場合、線形であると言われる。非線形勾配は、下記の式により計算されることができる。θが任意の時間tにおける溶媒の画分である場合、Cはその時間における溶媒濃度、C1は勾配の開始時の濃度、C2は勾配の最終時の濃度、及びtgは勾配の合計の時間であり、その結果、
(i)  凹状勾配θ＝(t/tg)∧n；C＝(C2−C1)*θ + C1
(i)  凸状勾配θ＝1−(1−t/tg)∧n；C＝(C2−C1)*θ + C1
[式中、nは峻度係数(n=0〜∞)。]
となる。
【００６７】
本発明は、別の態様では、タンパク質を精製する方法である、弱酸性pHの好適なバッファで平衡化された、セラミック樹脂を基礎とするイオン交換を含むイオン交換カラムにタンパク質混合物を装填することを含む、少なくとも一つの関連する不純物を含むタンパク質混合物を供すること、続いて60〜75％の範囲で対象不純物の減少をもたらす、0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘る、0〜∞の範囲の峻度の凸状/凹状勾配を用いる溶出のステップを含む方法を特徴付ける。溶出したタンパク質は、さらなる処理のために、高速液体クロマトグラフィーにさらに供されることができる。
【００６８】
別の態様では、本発明は、RP HPLCを行うことにより、インスリン及びアナログを精製する方法を特徴付ける。本方法は、RP HPLCカラムを適切な百分率の有機修飾剤で平衡化することを含み、その後サンプルは、過重装填されたカラム条件下でカラムに注入され、その後、いずれの未結合のタンパク質を除くために、カラムは適切な百分率の有機修飾剤で洗浄され、その後、本実施例における非線形条件下で行われる、勾配溶出が続く。さらに、サンプルは、分画され、全体の純度を評価するために分析され、要求される純度のための仕様に合う画分はプールされ、溶出プールを一緒に与えた。
【００６９】
本発明の一つの態様によれば、精製されたタンパク質生成物は、対象不純物が除かれている、又は実質的に最小量を含んでいる。本発明の一つの態様に従って、精製されたタンパク質生成物の純度は、少なくとも95％であり、本発明の別の態様によれば、精製されたタンパク質生成物の純度は、少なくとも97％であり、本発明のさらに別の態様によれば、精製されたタンパク質生成物の純度は、少なくとも98％であり、本発明のさらに別の態様によれば、精製されたタンパク質生成物の純度は、少なくとも99％であり、本発明のなおさらに別の態様によれば、精製されたタンパク質生成物の純度は、100％である。
【００７０】
本発明の別の態様によれば、精製されたインスリン及びアナログは、対象不純物が除かれている、又は実質的に最小量を含んでいる。本発明の別の態様によれば、精製されたインスリン及びアナログの純度は、少なくとも80％であり、本発明の別の態様によれば、精製されたインスリン及びアナログの純度は、少なくとも85％であり、本発明の別の態様によれば、精製されたインスリン及びアナログの純度は、少なくとも90％であり、本発明のさらに別の態様によれば、精製されたインスリン及びアナログの純度は、97％である。
【００７１】
本発明の別の態様は、逆相クロマトグラフィーを、非線形勾配を用いて行われるイオン交換クロマトグラフィーと組み合わせて行うことによる、タンパク質純度の効果的な上昇(＞95％)に関する。
【００７２】
本発明のこれら及び他の非限定的実施形態は、本明細書で提供される本開示及び特許請求の範囲を読んだ場合、当業者により容易に理解される。本発明は、記述される特定の方法及びプロセスに限定されないことは理解され、所望のタンパク質/ペプチド生成物及び方法は、当然変更してもよい。本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を記述する目的のみのためであり、限定されることを意図されないことはまた、理解される。
【００７３】
分離のために使用される要素に加えて、高分解能分離を得るための実施例に記載されたような精製の例示される方法の使用は、特に単純、便利、且つ安価な方法において、所望のペプチドを得るためにそれを特に効率化することは、高く評価される。
【００７４】
本発明の特定の実施形態の先の記述は、説明及び記述の目的のために提示される。それらは、使い果たされる、又は本発明を開示される厳格な形態に限定することを意図するものではない。様々な変更及びバリエーションは、上記の技術を考慮して、起こり得る。加えて、多くの変更は、特定の状況、物質、物質の組成、プロセス、プロセスステップ、又はステップを、本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させるために行われてもよい。全てのそのような変更は、本明細書に添付の特許請求の範囲内であると意図される。
【００７５】
本願の技術はさらに、下記の実施例の助けとともにさらに詳しく述べられる。しかしながら、実施例は、本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではない。
【実施例１】
【００７６】
実施例1
未精製のIN-105は、5倍の水で希釈され、pHは3.5に調整された。これは、Ceramic Hyper-D S陽イオン交換樹脂で充填されたスチールカラム上に装填された。平衡化及び洗浄は、pH 3.5の10 mM酢酸アンモニウムバッファで行われた。装填純度は46.22％であり、5.6％のdes-Octa不純物を含んだ。10カラム容量超の酢酸アンモニウムの0.2 M〜0.64 Mのバッファ濃度に亘って、峻度0.3の凸状勾配が用いられた場合、得られた溶出プールは、わずか4.4％のdesoctaレベルを含む、59％の純度を示し、des-Octa不純物レベルの50％までおおよその減少を示した。
【００７７】
実施例2
未精製のIN-105は、5倍の水で希釈され、pHは3.5に調整された。これは、Ceramic Hyper-D S陽イオン交換樹脂で充填されたスチールカラム上に装填された。平衡化及び洗浄は、pH 3.5の10 mM酢酸アンモニウムバッファで行われた。装填純度は52.57％であり、9.1％のdes-Octa不純物を含んだ。10カラム容量超の酢酸アンモニウムの0.38 M〜0.64 Mのバッファ濃度に亘って、峻度0.15の凹状勾配が用いられた場合、得られた溶出プールは、わずか5.14％のdes-Octaレベルを含む、63.31％の純度を示し、des-Octa不純物レベルの71％までおおよその減少を示した。
【００７８】
実施例3
未精製のIN-105は、5倍の水で希釈され、pHは3.5に調整された。これは、Ceramic Hyper-D S陽イオン交換樹脂が充填されたスチールカラム上に装填された。平衡化及び洗浄は、pH 3.5の10 mM酢酸アンモニウムバッファで行われた。装填純度は55.46％であり、8.18％のdes-Octa不純物を含んだ。10カラム容量超の酢酸アンモニウムの0.2 M〜0.64 Mのバッファ濃度に亘って、峻度0.15の凹状勾配が用いられた場合、得られた溶出プールは、わずか5.35％のdesoctaレベルを含む、67.37％の純度を示し、des-Octa不純物レベルの61％までおおよその減少を示した。
【００７９】
実施例4
未精製のIN-105は、5倍の水で希釈され、pHは3.5に調整された。これは、Ceramic Hyper-D S陽イオン交換樹脂で充填されたスチールカラム上に装填された。平衡化及び洗浄は、pH 3.5の10 mM酢酸アンモニウムバッファで行われた。装填純度は55.80％であり、7.71％のdes-Octa不純物を含んだ。10カラム容量超の酢酸アンモニウムの0.38 M〜0.64 Mのバッファ濃度に亘って、峻度0.15の凸状勾配が用いられた場合、得られた溶出プールは、わずか3.85％のdesoctaレベルを含み、70％の純度を示し、des-Octa不純物レベルの75％までおおよその減少を示した。
【００８０】
実施例5
未精製のIN-105は、5倍の水で希釈され、pHは3.5に調整された。これは、Ceramic Hyper-D S陽イオン交換樹脂で充填されたスチールカラム上に装填された。平衡化及び洗浄は、pH 3.5の10 mM酢酸アンモニウムバッファで行われた。装填純度は55.99％であり、8.15％のdes-Octa不純物を含んだ。20カラム容量超の酢酸アンモニウムの0.38 M〜0.64 Mのバッファ濃度に亘って、峻度0.15の凸状勾配が用いられた場合、得られた溶出プールは、わずか3.91％のdesoctaレベルを含み、70.32％の純度を示し、des-Octa不純物レベル74％までおおよその減少を示した。
【００８１】
実施例6
未精製のIN-105は、5倍の水で希釈され、pHは3.5に調整された。これは、Ceramic Hyper-D S陽イオン交換樹脂で充填されたスチールカラム上に装填された。平衡化及び洗浄は、pH 3.5の10 mM酢酸アンモニウムバッファで行われた。装填純度は53.51％であり、9.29％のdes-Octa不純物を含んだ。20カラム容量超の酢酸アンモニウムの0.38 M〜0.64 Mのバッファ濃度に亘って、峻度0.15の凸状勾配が用いられた場合、得られた溶出プールは、わずか4.79％のdesoctaレベルを含み、68.41％の純度を示し、des-Octa不純物レベル75％までおおよその減少を示した。
【００８２】
実施例7
未精製のIN-105は、Ceramic Hyper-D S陽イオン交換樹脂で充填されたスチールカラム上に装填され、凸状勾配で運転された。陽イオン交換から得られた溶出プールは希釈され、10％溶媒を含むシリカC8樹脂上に装填された。用いられた移動相は0.25 Mクエン酸(バッファA)及びアセトニトリル(バッファB)であった。平衡化は10％Bで、洗浄は15％Bで行われた。装填純度は78.26％であった。溶出は、20カラム容量超の15％B〜23％Bの線形勾配で行われ、得られた溶出プールは、96.33％の純度を示した。
【００８３】
実施例8
未精製のIN-105は、Ceramic Hyper-D S陽イオン交換樹脂が充填されたスチールカラム上に装填され、凸状勾配で運転された。陽イオン交換から得られた溶出プールは希釈され、10％溶媒を含むシリカC8樹脂上に装填された。用いられた移動相は0.1 M Tris、及び0.02 M MgCl2(バッファA)、及びアセトニトリル(バッファB)であった。平衡化及び洗浄は10％Bで行われた。装填純度は65.06％であった。溶出は、20カラム容量超の25％B〜32％Bの線形勾配で行われ、得られた溶出プールは、92.87％の純度を示した。
【００８４】
実施例9
TP後のインスリンメチルエステル(IME)結晶は、装填の濃度が1.5 gplとなるように、0.5 N HOAc、50 mM酢酸ナトリウム、及び15% MeOHに溶解された。これはその後濾過され、20 gpl(すなわち樹脂1リットルあたり20 g IME)でRPカラムに基づくC8シリカ上に装填された。装填純度は74.51％であり、主な不純物として約9％のDesThreoヒトインスリンを含んだ。RP HPLCは酢酸ナトリウムバッファ(バッファA)及びメタノール(バッファB)を用いて行われた。峻度3で50〜65％Bの凸状勾配が用いられ、得られた生成物は0％のDesThreoヒトインスリンを含み、95.95％の全体の純度を有した。
【００８５】
実施例10 a)
酵素反応後のグラルジン結晶は、装填濃度が0.8〜0.95 gplとなるように、2 M HOAc及び10％アセトニトリルに溶解された。装填はその後濾過され、5.4 gpl(すなわち樹脂1リットルあたり5.4 gのインスリングラルジン)の装填最大容量で、C18シリカに基づくRPカラム上に装填された。装填純度は、35〜40％であり、様々な異なる不純物を含んだ。溶出は、250 mMクエン酸(バッファA)、及び有機修飾剤としてIPA(バッファB)を用いて行われた。最終EP純度は、異なる不純物の単離を伴い、96.02％であった。80.97％の全体の純度のために、段階収率は86.7％まで上昇した。峻度0.5で10〜20％Bの凸状勾配が用いられた。
【００８６】
実施例10 b)
酵素反応後のグラルジン結晶は、装填濃度が0.8〜0.95 gplとなるように、2 M HOAc及び10％アセトニトリルに溶解された。装填はその後濾過され、5.4 gpl(すなわち樹脂1リットルあたり5.4 gインスリングラルジン)の装填最大容量で、C18シリカに基づくRPカラム上に装填された。装填純度は、35〜40％であり、様々な異なる不純物を含んだ。溶出は、250 mMクエン酸(バッファA)、及び有機修飾剤としてIPA(バッファB)を用いて行われた。最終EP純度は、異なる不純物の単離を伴い、96.02％であった。80.97％の全体の純度のために、段階収率は86.7％まで上昇した。峻度0.5で10〜20％Bの凹状勾配が用いられた。
【００８７】
実施例11
インスリンアスパートの酵素消化産物は、装填濃度が0.8までとなるように、酢酸及びアセトニトリルで希釈された。装填はその後濾過され、10 gpl(すなわち樹脂1リットルあたり10 gのインスリンアスパート)の装填最大容量で、C4シリカに基づくRPカラム上に装填された。装填純度は71.03％であり、des-octaアスパート、フランク、モノグリコシル化アスパートなどの様々な異なる密接に関連する不純物を含んだ。溶出は、pH4.0の25 mM酢酸ナトリウム(バッファA)及びアセトニトリル(バッファB)を用いて行われた。峻度0.5で15〜30％Bの凹状勾配が用いられ、得られた生成物は、88.24％の全体の純度を有した。非線形勾配を用いる主な利点は、フランク(97％まで減少)及びdes-octaアスパート(70％まで減少)などの不純物の減少である。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態は、開示された。当業者は、しかしながら、特定の変更はこの発明の技術内で生じることは、理解することができる。それ故、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲及び内容を決定するために研究されるべきである。
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月9日(2011.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物からインスリン、インスリンアナログ、又はそれらの誘導体を精製するための調製用クロマトグラフィー法であって、以下のステップ：
(a)  混合物をクロマトグラフィープロセスに供すること、ここで樹脂は、弱酸性pHのバッファ及び有機修飾剤で洗浄され、平衡化される；
(b)  0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞に及ぶ峻度係数を有する峻度の凸状又は凹状非線形勾配により溶出させること；及び
(c)  対象不純物を少なくとも50％除いて、精製されたインスリン、インスリンアナログ、又はそれらの誘導体を回収すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィープロセスが、イオン交換クロマトグラフィー、又は逆相HPLC、又はそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記のステップa)における樹脂が、イオン交換樹脂又はC4〜C18シリカ樹脂である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記の用いられるバッファが、酢酸バッファである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記pHが、約2〜約5に及ぶ、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記インスリン誘導体が、IN 105である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記インスリンアナログが、グラルギン、アスパート、リスプロ、グルリジン、又はインスリンメチルエステルである、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記の対象不純物が、des-Octa不純物、des thero不純物、des octaアスパート不純物、又はフランク、及びモノグリコシル化アスパート、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記樹脂に対する前記ポリペプチドの比が、重量体積比で0.1〜50 g/lである、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記樹脂に対する前記の精製されたインスリン、インスリンアナログ、又はそれらの誘導体の比が、より好ましくは重量体積比で1〜25 g/lである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記の回収された精製されたインスリン、インスリンアナログ、又はそれらの誘導体が、少なくとも95％の純度を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも95％の純度であって、対象不純物が少なくとも50％除かれている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の精製されたIN-105。
【請求項１３】
少なくとも一つの関連する不純物を含む混合物からインスリン及びアナログを精製する方法であって、以下のステップ：
(a)  混合物を、有機修飾剤で洗浄され、平衡化されるRPHPLCカラムに供すること、；
(b)  0.01 M〜1 Mの範囲のバッファ濃度に亘り、0〜∞に及ぶ峻度係数を有する峻度の凸状又/凹状非線形勾配によって溶出させること；及び
(c)  対象不純物を少なくとも50％除いて、インスリン及びアナログを回収すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
RPHPLCが、約2〜約5に及ぶpHで洗浄及び平衡化される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記の回収されたインスリンアナログが少なくとも97％の純度を有する、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも95％の純度であって、対象不純物が少なくとも50％除かれている、請求項1〜15のいずれか一項に記載の精製されたインスリンメチルエステル。
【請求項１７】
少なくとも96％の純度であって、対象不純物が少なくとも50％除かれている、請求項1〜16のいずれか一項に記載の精製されたグラルジン。
【請求項１８】
少なくとも88％の純度であって、対象不純物が少なくとも50％除かれている、請求項1〜17のいずれか一項に記載の精製されたアスパート。
【国際調査報告】
2012532862.tif 000002
2012532862.tif 000003