(57)【要約】  骨形成性の胎盤接着性細胞（ＯＰＡＣ）、ＯＰＡＣおよびＯＰＡＣ集団の使用方法、ならびにＯＰＡＣの培養、増殖、拡張または分化の方法が本明細書で提供される。対象への投与に適する移植可能または注射可能な組成物を製剤化するためにＯＰＡＣを用いる方法が、さらに本明細書で提供される。ＯＰＡＣおよびＯＰＡＣを含む組成物で骨欠損を治療する方法が本明細書でさらに提供される。多発性骨髄腫を有する個体における多発性骨髄腫の治療および管理、例えば多発性骨髄腫の１つまたは複数の症状の進行の低減、進行の停止またはその改善にＯＰＡＣを用いる方法であって、個体に複数のＯＰＡＣを投与するステップを含む方法も本明細書で提供される。【選択図】図１
2012500792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、前記個体に単離された骨形成性の胎盤接着性細胞（ＯＰＡＣ）を投与するステップを含み、前記ＯＰＡＣは絨毛膜から得られ、組織培養プラスチックに接着性であり、前記ＯＰＡＣはＣＤ２００に関して陰性であるかまたはＣＤ２００ｄｉｍであり、ＣＤ１０５に関して陽性であり、前記投与するステップは、前記多発性骨髄腫の１つまたは複数の症状の進行を検出可能に低減させるか、その進行を停止させるか、またはその症状を改善する前記方法。
【請求項２】
前記ＯＰＡＣがＳＳＥＡ３＋またはＳＳＥＡ４＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＯＰＡＣがＳＳＥＡ３＋およびＳＳＥＡ４＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＰＡＣが、
前記ＯＰＡＣおよびＣＤ２００＋接着性胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の前記ＣＤ２００＋胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ３（骨形成タンパク質３）、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１（象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１）、ＤＳＰＰ（象牙質シアロリンタンパク質）、ＥＮＡＭ（エナメリン）、ＦＧＦＲ２（線維芽細胞増殖因子受容体２）、ＭＭＰ１０（マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２））、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数を含み；
前記ＯＰＡＣおよびＣＤ２００＋接着性胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ（アメロブラスチン（エナメルマトリックスタンパク質））、ＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）、ＣＡＬＣＲ（カルシトニン受容体）、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＦＧＦ３、ＧＤＦ１０（増殖分化因子１０）、ＩＧＦ１（インスリン様増殖因子１）、ＩＴＧＡ１（インテグリン、α１（ＣＤ４９））、ＩＴＧＡ２（インテグリン、アルファ２（ＣＤ４９Ｂ））、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ８（マトリックスメタロプロテアーゼ８（好中球コラゲナーゼ））、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＡ（血小板由来増殖因子Ａ）、ＳＭＡＤ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２（トランスフォーミング増殖因子ベータ、受容体２）の１つまたは複数を含み；
前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を増殖培地で培養するか、骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、栄養芽細胞または栄養膜細胞層ではない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＭＭＰ１０、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、栄養芽細胞または栄養膜細胞層ではない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ（アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質）、ＡＬＰＬ（アルカリホスファターゼ肝臓／骨／腎臓）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＦＬＴ１（ｆｍｓ関連のチロシンキナーゼ１（血管内皮増殖因子／血管透過性因子受容体））、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ（インテグリン、アルファＭ（補体成分３受容体３サブユニット））、ＳＣＡＲＢ１（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー１）、ＳＯＸ９（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス９）、ＴＮＦ、ＴＷＩＳＴ１（Ｔｗｉｓｔホモログ１、旧称瞼裂縮小、逆内眼角贅皮および下垂３、尖頭合指３）、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）および／またはＶＤＲ（ビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）受容体）の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、栄養芽細胞または栄養膜細胞層ではない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＧＮ（二グリカン）、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）、ＦＧＦ１および／またはＶＣＡＭ１の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を増殖培地で培養するか、骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、栄養芽細胞または栄養膜細胞層ではない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルでＶＣＡＭ１を発現し；
前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＣＡＬＣＲ、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＦＬＴ１、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＵＦＴ１（Ｔｕｆｔｅｌｉｎ  １）の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび前記胎盤幹細胞を増殖培地で培養するか、骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ（骨ガンマカルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）タンパク質）、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ１の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＢＧＮ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＣＤ３６、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２、ＭＭＰ８、ＰＨＥＸ（リン酸調節エンドペプチダーゼホモログ、Ｘ連鎖）、ＲＵＮＸ２（ｒｕｎｔ関連の転写因子２）、ＳＣＡＲＢ１、ＳＯＸ１、ＶＣＡＭ１および／またはＶＥＧＦＢの１つまたは複数、またはすべてを含み；あるいは
前記ＯＰＡＣおよび前記胎盤幹細胞を増殖培地で培養するか、骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＩＧＦ２、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ９の１つまたは複数、またはすべてを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＰＡＣが、
同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＳＦ２、ＣＴＳＫ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、ＦＬＴ１、ＩＴＧＡ１、ＭＩＮＰＰ１、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＴＧＦＢ３およびＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数を含み、前記ＯＰＡＣおよび前記間葉幹細胞は、同等数の継代培養を経ており、あるいは
同等数の線維芽細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＦＬＴ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＴＧＡ１、ＭＩＮＰＰ１、ＰＤＧＦＡ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＭＡＤ３、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＮＦ、ＴＵＦＴ１、ＶＣＡＭ１およびＶＥＧＦＡの１つまたは複数を含み、前記線維芽細胞は、同等数の継代培養を経ている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＯＰＡＣが、タンパク質デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５またはＴＩＭＰ−２の１つまたは複数を分泌する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＯＰＡＣが、タンパク質デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５およびＴＩＭＰ−２を分泌する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数の症状が骨痛、骨細胞病変、貧血または腎不全である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記個体に少なくとも１×１０８個／ｋｇのＯＰＡＣを投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
単離された骨形成性の胎盤接着性細胞（ＯＰＡＣ）であって、絨毛膜から得られ、組織培養プラスチックに接着性であり、ＣＤ２００に関して陰性であるかまたはＣＤ２００ｄｉｍであり、ＣＤ１０５に関して陽性である、前記細胞。
【請求項１１】
ＳＳＥＡ３＋またはＳＳＥＡ４＋である、請求項９に記載の単離細胞。
【請求項１２】
ＳＳＥＡ３＋およびＳＳＥＡ４＋である、請求項９に記載の単離細胞。
【請求項１３】
オステオプロテゲリンを生成する、請求項９に記載の単離細胞。
【請求項１４】
さらに、アルファ平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性であるか、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す、請求項９に記載の単離細胞。
【請求項１５】
さらに、アルファ平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性であり、誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す、請求項１３に記載の単離細胞。
【請求項１６】
ＣＤ２００＋接着性胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＳＦ３、ＣＴＳＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＩＮＰＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ３、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１およびＶＥＧＦＢの１つまたは複数を含み、前記ＯＰＡＣおよび前記ＣＤ２００＋接着性胎盤幹細胞は同等数の継代培養を経ており；
骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＳＦ２、ＣＴＳＫ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、ＦＬＴ１、ＩＴＧＡ１、ＭＩＮＰＰ１、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＴＧＦＢ３およびＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数を含み、前記ＯＰＡＣおよび前記間葉幹細胞は、同等数の継代培養を経ており；および／または
線維芽細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＦＬＴ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＴＧＡ１、ＭＩＮＰＰ１、ＰＤＧＦＡ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＭＡＤ３、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＮＦ、ＴＵＦＴ１、ＶＣＡＭ１およびＶＥＧＦＡの１つまたは複数を含み、前記線維芽細胞は、前記線維芽細胞が経た継代培養数と同等である継代培養数を培養で経ている、請求項９に記載の単離細胞。
【請求項１７】
タンパク質デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５またはＴＩＭＰ−２の１つまたは複数を分泌する、請求項９に記載の単離細胞。
【請求項１８】
タンパク質デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５およびＴＩＭＰ−２を分泌する、請求項１６に記載の単離細胞。
【請求項１９】
請求項９に記載の細胞を含む単離された細胞集団。
【請求項２０】
前記細胞が、
前記ＯＰＡＣおよびＣＤ２００＋接着性胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の前記ＣＤ２００＋胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ３（骨形成タンパク質３）、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１（象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１）、ＤＳＰＰ（象牙質シアロリンタンパク質）、ＥＮＡＭ（エナメリン）、ＦＧＦＲ２（線維芽細胞増殖因子受容体２）、ＭＭＰ１０（マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２））、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数を含み；
前記ＯＰＡＣおよびＣＤ２００＋接着性胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ（アメロブラスチン（エナメルマトリックスタンパク質））、ＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）、ＣＡＬＣＲ（カルシトニン受容体）、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＦＧＦ３、ＧＤＦ１０（増殖分化因子１０）、ＩＧＦ１（インスリン様増殖因子１）、ＩＴＧＡ１（インテグリン、アルファ１（ＣＤ４９））、ＩＴＧＡ２（インテグリン、アルファ２（ＣＤ４９Ｂ））、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ８（マトリックスメタロプロテアーゼ８（好中球コラゲナーゼ））、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＡ（血小板由来増殖因子Ａ）、ＳＭＡＤ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２（トランスフォーミング増殖因子ベータ、受容体２）の１つまたは複数を含み；
前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を増殖培地で培養するか、骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、栄養芽細胞または栄養膜細胞層ではない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＭＭＰ１０、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、栄養芽細胞または栄養膜細胞層ではない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ（アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質）、ＡＬＰＬ（アルカリホスファターゼ肝臓／骨／腎臓）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＦＬＴ１（ｆｍｓ関連のチロシンキナーゼ１（血管内皮増殖因子／血管透過性因子受容体））、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ（インテグリン、アルファＭ（補体成分３受容体３サブユニット））、ＳＣＡＲＢ１（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー１）、ＳＯＸ９（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス９）、ＴＮＦ、ＴＷＩＳＴ１（Ｔｗｉｓｔホモログ１、旧称瞼裂縮小、逆内眼角贅皮および下垂３、尖頭合指３）、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）および／またはＶＤＲ（ビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）受容体）の１つまたは複数、またはすべてを含み；、
前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、栄養芽細胞または栄養膜細胞層ではない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＧＮ（二グリカン）、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）、ＦＧＦ１および／またはＶＣＡＭ１の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を増殖培地で培養するか、骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、栄養芽細胞または栄養膜細胞層ではない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルでＶＣＡＭ１を発現し；
前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＣＡＬＣＲ、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＦＬＴ１、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＵＦＴ１（Ｔｕｆｔｅｌｉｎ  １）の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび前記胎盤幹細胞を増殖培地で培養するか、骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ（骨ガンマカルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）タンパク質）、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ１の１つまたは複数、またはすべてを含み；
前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＢＧＮ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＣＤ３６、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２、ＭＭＰ８、ＰＨＥＸ（リン酸調節エンドペプチダーゼホモログ、Ｘ連鎖）、ＲＵＮＸ２（ｒｕｎｔ関連の転写因子２）、ＳＣＡＲＢ１、ＳＯＸ１、ＶＣＡＭ１および／またはＶＥＧＦＢの１つまたは複数、またはすべてを含み；あるいは
前記ＯＰＡＣおよび前記胎盤幹細胞を増殖培地で培養するか、骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価して、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＩＧＦ２、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ９の１つまたは複数、またはすべてを含む、請求項９に記載の単離細胞集団。
【請求項２１】
前記細胞集団中の細胞が、タンパク質デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５またはＴＩＭＰ−２の１つまたは複数を発現する、請求項１８に記載の単離細胞集団。
【請求項２２】
前記細胞集団中の細胞が、タンパク質デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５およびＴＩＭＰ−２を発現する、請求項１８に記載の単離細胞集団。
【請求項２３】
前記集団の細胞の少なくとも５０％が請求項９に記載の細胞である、請求項１８に記載の単離細胞集団。
【請求項２４】
前記集団の細胞の少なくとも８０％が請求項９に記載の細胞である、請求項１８に記載の単離細胞集団。
【請求項２５】
前記集団の細胞の少なくとも９５％が請求項９に記載の細胞である、請求項１８に記載の単離細胞集団。
【請求項２６】
請求項９に記載の細胞から本質的になる、請求項１８に記載の単離細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年８月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／０９０，８９８号および２００８年８月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／０９０，８９７号の優先権を主張し、これらの開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
１．分野
骨形成接着性胎盤細胞（ＯＰＡＣ）の単離された集団を用いる方法、および例えば多発性骨髄腫の治療でＯＰＡＣを用いる方法、および多発性骨髄腫に関連するかまたはそれに起因する骨量減少を軽減、停止するかまたはそれから回復させる方法が本明細書で提供される。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
多発性骨髄腫（別名ＭＭ、骨髄腫、形質細胞性骨髄腫またはカーラー病）は、抗体産生免疫系細胞である形質細胞のある種の癌である。多発性骨髄腫の症状には、骨痛、感染症、腎不全、貧血および骨病変が含まれる。この疾患は不治であると考えられており、レナリドマイド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））などのわずかな治療法だけが利用可能で、見込みを示す。このように、多発性骨髄腫のための新しい治療法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
３．概要
単離された骨形成胎盤接着性細胞（ＯＰＡＣ）、ＯＰＡＣの集団、およびＯＰＡＣがそこに存在し、かつ絨毛膜から単離される、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供される。特定の実施形態では、ＯＰＡＣは絨毛膜スカート（平滑絨毛膜）から単離されない。ＯＰＡＣは幹細胞または多能細胞の１つまたは複数の特性を示し（例えば、幹細胞または多能細胞に関連するマーカーを提示し、培養において未分化状態で少なくとも１０〜２０回複製し、３つの胚葉の少なくとも１つを代表する成体細胞に分化し、など）、組織培養基質（例えば、組織培養皿または多重ウェルプレートの表面などの組織培養プラスチック）に付着することができる。骨欠損の治療、および骨関連の癌、例えば多発性骨髄腫の治療でＯＰＡＣを用いる方法、ならびに多発性骨髄腫に関連するかまたは起因する骨量減少を軽減、停止するかまたはそれから回復させるためにＯＰＡＣを用いる方法が本明細書でさらに提供される。
【０００５】
一態様では、単離されたＯＰＡＣ、すなわち、組織培養プラスチックに接着性で、骨形成性であり、絨毛膜スカート（平滑絨毛膜）を除く絨毛膜から単離される、単離された骨形成胎盤接着性細胞が本明細書で提供される。ＯＰＡＣは、栄養芽細胞、栄養膜細胞層、胚性幹細胞または胚性胚細胞ではないが、その理由は、それらの細胞が当技術分野で公知であって理解されているからである。
【０００６】
一実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ細胞、例えば、絨毛膜から単離されるが、絨毛膜スカート（平滑絨毛膜（laeve））から単離されない細胞である。具体的な実施形態において、ＯＰＡＣは骨形成性である。具体的な実施形態において、例えばフローサイトメトリーによって検出した場合、ＯＰＡＣは、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の分泌に関して陽性である。オステオプロテゲリンは、破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）に特異的に結合して破骨細胞成熟を阻害する、骨芽細胞によって分泌されるデコイ受容体である。したがって、ＯＰＡＣは骨形成を促進し、破骨細胞媒介性の骨量減少を低減させる。別の具体的な実施形態では、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出した場合、ＯＰＡＣはＲＡＮＫＬ（核因子κＢリガンドの受容体活性化剤；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ８６８１１．１を参照）を発現しない。ＲＡＮＫＬは、骨吸収に関与する破骨細胞を活性化するタンパク質である。したがって、ＯＰＡＣは骨吸収を促進しない。別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣはＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、例えば抗体染色で判定した場合、ＯＰＡＣは、α平滑筋アクチン（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１６０４を参照）の発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬに関して陰性、またはＮＧ２（神経／グリア細胞２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の発現に関して陽性である。特定の実施形態では、ＮＧ２染色が集中的であるＣＤ２００＋（非ｄｉｍ）組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞と比較して、ＯＰＡＣでの前記ＮＧ２についての染色はび漫性である。別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬに関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、およびオステオプロテゲリンの分泌に関して陽性である。別の具体的な実施形態では、例えば比色アッセイで測定した場合、ＯＰＡＣは誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬに関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性であり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性であり、誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。
【０００７】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＳＳＥＡ３＋またはＳＳＥＡ４＋である。より具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＳＳＥＡ３＋およびＳＳＥＡ４＋である。別のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬに関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋、ＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬに関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。
【０００８】
特定の実施形態では、ＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団、またはＯＰＡＣを含む細胞集団は、その集団が無機物化（mineralized）マトリックスの形成を可能にする条件下で培養される場合、胎盤細胞の集団で無機物化マトリックスの形成を促進する。
【０００９】
ＯＰＡＣを含む細胞集団であって、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍである細胞集団も本明細書で提供される。したがって、一実施形態では、ＯＰＡＣを含む単離された細胞集団であって、絨毛膜スカート（平滑絨毛膜）から単離されず、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍである細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。具体的な実施形態において、前記細胞集団は、骨形成性である。別の具体的な実施形態では、フローサイトメトリーによって検出した場合、前記細胞集団はＣＤ２００−およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、フローサイトメトリーによって検出した場合、前記細胞集団はＣＤ２００ｄｉｍおよびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、またはオステオプロテゲリンの分泌に関して陽性である。特定の実施形態では、ＮＧ２染色が集中的であるＣＤ２００＋（非ｄｉｍ）組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞と比較して、ＯＰＡＣでの前記ＮＧ２についての染色はび漫性である。別の実施形態では、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出した場合、前記細胞集団はＲＡＮＫＬの発現に関して陰性である。別の実施形態では、前記細胞集団は、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、およびオステオプロテゲリンの分泌に関して陽性である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、前記集団は、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性の１つまたは複数でもあるか、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、前記細胞集団は、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋であり；α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬに関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性であり；誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。
【００１０】
別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、ＳＳＥＡ３＋またはＳＳＥＡ４＋である。さらに別の実施形態では、前記集団細胞は、ＳＳＥＡ３＋およびＳＳＥＡ４＋である。さらに別の実施形態では、前記細胞集団は、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、前記細胞集団は、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍであり、ＣＤ１０５＋およびＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、前記細胞集団は、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍであり；ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋、ＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性であり、および／または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。
【００１１】
別の具体的な実施形態では、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値で調べた場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数のＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、接着性胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで、骨形成性の培地でマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）を発現する。
【００１２】
他の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよびＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、接着性胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記ＣＤ２００＋胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ３（骨形成タンパク質３）、ＣＤＨ１１（カドヘリン１１型）、ＣＯＬ１０Ａ１（コラーゲンＸ型、アルファ１）、ＣＯＬ１４ＡＩ（コラーゲン、ＸＩＶ型、アルファ１）、ＣＯＬ１５Ａ１（コラーゲン、ＸＶ型、アルファ１）、ＤＭＰ１（象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１）、ＤＳＰＰ（象牙質シアロリンタンパク質）、ＥＮＡＭ（エナメリン）、ＦＧＦＲ２（線維芽細胞成長因子受容体２）、ＭＭＰ１０（マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２））、ＴＧＦＢ３（トランスフォーミング増殖因子、β３）、および／またはＴＧＦＢＲ１（トランスフォーミング増殖因子β、受容体１）の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００１３】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよびＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、接着性胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ（アメロブラスチン（エナメルマトリックスタンパク質））、ＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）、ＣＡＬＣＲ（カルシトニン受容体）、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１１Ａ１（コラーゲン、ＸＩ型、アルファ１）、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１（コラーゲン、ＩＩ型、アルファ１）、ＣＳＦ２（コロニー刺激因子２（顆粒球マクロファージ））、ＣＳＦ３（コロニー刺激因子３（顆粒球））、ＤＭＰＩ、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＦＧＦ３（線維芽細胞成長因子３）、ＧＤＦ１０（成長分化因子１０）、ＩＧＦ１（インスリン様増殖因子１）、ＩＴＧＡ１（インテグリン、アルファ１（ＣＤ４９））、ＩＴＧＡ２（インテグリン、アルファ２（ＣＤ４９Ｂ））、ＭＭＰ８（マトリックスメタロプロテアーゼ８（好中球コラゲナーゼ））、ＭＭＰ９（マトリックスメタロペプチダーゼ９（ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａＩＶ型コラゲナーゼ））、ＭＭＰ１０、ＰＤＧＦＡ（血小板由来増殖因子Ａ）、ＳＭＡＤ１（ＳＭＡＤファミリーメンバー１）、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２（トランスフォーミング増殖因子ベータ、受容体２）の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００１４】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＭＭＰ１０、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００１５】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ（α−２−ＨＳ−糖タンパク質）、ＡＬＰＬ（アルカリホスファターゼ肝臓／骨／腎臓）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＦＬＴ１（ｆｍｓ関連のチロシンキナーゼ１（血管内皮成長因子／血管透過性因子受容体））、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ（インテグリン、αＭ（補体成分３受容体３サブユニット））、ＳＣＡＲＢ１（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー１）、ＳＯＸ９（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス９）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ＴＷＩＳＴ１（Ｔｗｉｓｔ同族体１；旧称瞼裂縮小、逆内眼角贅皮および下垂３、尖頭合指３）、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）および／またはＶＤＲ（ビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）受容体）の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００１６】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＧＮ（二グリカン）、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）、ＦＧＦ１および／またはＶＣＡＭ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００１７】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルでＶＣＡＭ１を発現する。
【００１８】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＣＡＬＣＲ、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＦＬＴ１、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＵＦＴ１（Ｔｕｆｔｅｌｉｎ  １）の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００１９】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００２０】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００２１】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ（骨ガンマカルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）タンパク質）、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００２２】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＢＧＮ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＣＤ３６、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２、ＭＭＰ８、ＰＨＥＸ（リン酸調節エンドペプチダーゼ同族体、Ｘ連鎖）、ＲＵＮＸ２（ｒｕｎｔ関連の転写因子２）、ＳＣＡＲＢ１、ＳＯＸ１、ＶＣＡＭ１および／またはＶＥＧＦＢの１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００２３】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、ＯＰＡＣを含む細胞集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＩＧＦ２、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ９の１つまたは複数、またはすべてを含む。上記の実施形態の各々のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣおよび前記ＣＤ２００＋胎盤幹細胞または間葉幹細胞は、同等数の継代培養または細胞数倍加を経ている。
【００２４】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団が本明細書で提供され、そこにおいて、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）をコードする遺伝子は、増殖培地でのＭＭＰ９の発現と比較して、骨形成性の培地中の前記ＯＰＡＣにおいて、前記ＭＭＰ９が、前記増殖培地でのＭＭＰ９の発現と比較して、前記骨形成性の培地中の胎盤幹細胞、例えばＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋組織培養接着性多能胎盤細胞で誘導されるよりも、少なくとも２、３、４または５桁大きく誘導される。別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団が本明細書で提供され、そこにおいて、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）をコードする遺伝子は、増殖培地でのＭＭＰ９の発現と比較して、骨形成性の培地中の前記ＯＰＡＣにおいて、前記ＭＭＰ９が、前記増殖培地でのＭＭＰ９の発現と比較して、前記骨形成性の培地中の骨髄由来の間葉幹細胞（ＭＳＣ）で誘導されるよりも、少なくとも２、３、４または５桁大きく誘導される。別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団が本明細書で提供され、そこにおいて、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）をコードする遺伝子は、増殖培地でのＭＭＰ９の発現と比較して、骨形成性の培地中の前記ＯＰＡＣにおいて、前記ＭＭＰ９が、前記増殖培地でのＭＭＰ９の発現と比較して、前記骨形成性の培地中の線維芽細胞で誘導されるよりも、少なくとも２、３、４または５桁大きく誘導される。
【００２５】
具体的な実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団内の細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％は、ＣＤ２００−および／またはＣＤ２００ｄｉｍである。他の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団内のＯＰＡＣの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％は、ＣＤ２００−および／またはＣＤ２００ｄｉｍである。
【００２６】
単離されたＯＰＡＣ集団であって、胎盤から絨毛膜組織を単離するステップと（ここで、前記絨毛膜組織が絨毛膜スカート（平滑絨毛膜）組織でない）、単離された絨毛膜組織を組織破壊酵素で消化してＯＰＡＣを含む絨毛膜細胞の集団を得るステップと、前記絨毛膜細胞から前記ＯＰＡＣを単離するステップとによって生成される前記集団が本明細書でさらに提供される。具体的な実施形態において、組織破壊酵素は、トリプシン、ディスパーゼまたはコラゲナーゼである。様々な実施形態では、絨毛膜組織を消化して得られる細胞集団に含まれるＯＰＡＣは、前記絨毛膜細胞集団の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。
【００２７】
本明細書で提供されるＯＰＡＣおよびＯＰＡＣを含む細胞集団には、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０代以上継代培養されたかまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回の集団倍加培養されたＯＰＡＣおよびＯＰＡＣ含有細胞集団が含まれる。ＯＰＡＣ集団には、例えば培養物中の２つ以上のＯＰＡＣの集団、および容器、例えばバッグ内の集団も含まれる。
【００２８】
別の態様では、マトリックスを無機物化する能力を有する骨形成性の細胞を生成する方法であって、本明細書で提供される複数のＯＰＡＣまたは本明細書で提供される単離されたＯＰＡＣの集団を、前記ＯＰＡＣが骨形成性の細胞に分化する条件下で培養するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで、前記培養は、前記骨形成性の細胞がカルシウムおよび／またはリン酸塩を含む無機物化マトリックスの検出可能な量を生成するかまたはその生成を促進するのに十分な時間行われる。特定の実施形態では、ＯＰＡＣは骨を生成するかまたはその生成を促進する。
【００２９】
別の態様では、ＯＰＡＣを含む組成物、例えば移植可能な組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態において、移植可能な組成物は、マトリックスを含む。より具体的な実施形態では、前記マトリックスは、三次元骨格である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態では、マトリックスは、羊膜または羊膜由来の生体材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、細胞外の膜タンパク質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、合成化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、生理活性化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記生理活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分子である。特定の実施形態では、マトリックスは、合成分解性ポリマー、例えばポリ乳酸またはポリグリコール酸である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム基質、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、無機物化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質またはセラミック基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、コラーゲン基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、リン酸カルシウム基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、無機物化ヒト胎盤コラーゲン基質である。
【００３０】
別の態様では、対象で骨欠損を治療する方法であって、それを必要とする対象に本明細書で提供されるＯＰＡＣの集団を含む移植可能または注射可能な組成物を投与し、それによって対象で骨欠損を治療するステップを含む前記方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、骨欠損は、例えば癒合が必要な、癌、骨折または脊柱に関連する骨溶解性の病巣である。特定の実施形態では、骨溶解性の病巣は、多発性骨髄腫、骨癌または転移癌に関連する。特定の実施形態では、骨折は、偽関節（non-union）骨折である。特定の実施形態では、移植可能な組成物は、例えば骨欠損部位に外科的に移植される。特定の実施形態では、注射可能な組成物は、骨欠損の領域に外科的に投与される。特定の実施形態では、注射可能な組成物は、全身投与される。
【００３１】
別の態様では、骨形成性の細胞を生成する方法であって、複数のＯＰＡＣまたは単離されたＯＰＡＣの集団を、前記ＯＰＡＣが骨形成性の細胞に分化する条件下で培養するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで、前記培養が、前記ＰＯＡＣは無機物化カルシウム、骨組織または骨の検出可能な量を生成するかまたはその生成を促進するのに十分な時間で行われる。
【００３２】
特定の実施形態では、注射可能な組成物を製剤化する方法であって、ＯＰＡＣの集団を注射可能なヒアルロン酸またはコラーゲンと組み合わせるステップを含む前記方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、組成物は注射可能なヒアルロン酸を含む。特定の実施形態では、組成物は注射可能なコラーゲンを含む。ＯＰＡＣの集団および注射可能なヒアルロン酸またはコラーゲンを含む組成物も、本明細書で提供される。
【００３３】
別の態様では、骨関連の癌、例えば多発性骨髄腫、骨癌、乳癌、肺癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、転移性癌、多発性骨髄腫、および骨転移を特徴とする任意の型の転移癌を有する個体を治療する方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、骨関連の癌を有する個体の治療方法であって、単離されたＯＰＡＣ、例えばＯＰＡＣを含む単離された細胞集団を前記個体に投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで、前記ＯＰＡＣは絨毛膜から得られ、組織培養プラスチックに接着性であり、前記ＯＰＡＣはＣＤ２００に関して陰性であるかまたはＣＤ２００ｄｉｍであり、およびＣＤ１０５に関して陽性であり、前記投与するステップは、前記多発性骨髄腫の１つまたは複数の症状の進行を検出可能的に低減させるか、その進行を停止させるか、または改善する。具体的な実施形態において、前記ＯＰＡＣは、ＳＳＥＡ３＋またはＳＳＥＡ４＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣは、ＳＳＥＡ３＋およびＳＳＥＡ４＋である。別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−および／またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬに関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−および／またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋、ＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬに関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。他の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、下のセクション５．１に挙げる特性のいずれか、または特性の組合せを含む。
【００３４】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよびＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、接着性胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記ＣＤ２００＋胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ３、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＦＧＦＲ２、ＭＭＰ１０、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００３５】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ、ＢＭＰ２、ＣＡＬＣＲ、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＦＧＦ３、ＧＤＦ１０、ＩＧＦ１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＡ、ＳＭＡＤ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００３６】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＭＭＰ１０、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００３７】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＰＬ、ＥＧＦ、ＦＬＴ１、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＡＲＢ１、ＳＯＸ９、ＴＮＦ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＣＡＭ１またはＶＤＲの１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００３８】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＧＮ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＭＰ、ＦＧＦ１および／またはＶＣＡＭ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００３９】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベルでＶＣＡＭ１を発現する。
【００４０】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＣＡＬＣＲ、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＦＬＴ１、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＵＦＴ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００４１】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００４２】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００４３】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ（骨ガンマカルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）タンパク質）、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００４４】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＢＧＮ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＣＤ３６、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２、ＭＭＰ８、ＰＨＥＸ、ＲＵＮＸ２、ＳＣＡＲＢ１、ＳＯＸ１、ＶＣＡＭ１および／またはＶＥＧＦＢの１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００４５】
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来の間葉幹細胞を増殖培地または骨形成性の培地で培養するに関係なく、定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記ＯＰＡＣは、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＩＧＦ２、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ９の１つまたは複数、またはすべてを含む。
【００４６】
多発性骨髄腫の治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣは、同等数の骨髄由来の間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＳＦ２、ＣＴＳＫ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、ＦＬＴ１、ＩＴＧＡ１、ＭＩＮＰＰ１、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＴＧＦＢ３およびＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数を含み、前記ＯＰＡＣおよび前記間葉幹細胞は、同等数の継代培養または細胞数倍加を経ており、または同等数の線維芽細胞よりも検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＦＬＴ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＴＧＡ１、ＭＩＮＰＰ１、ＰＤＧＦＡ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＭＡＤ３、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＮＦ、ＴＵＦＴ１、ＶＣＡＭ１およびＶＥＧＦＡの１つまたは複数を含み、前記線維芽細胞は、同等数の継代培養または細胞数倍加を経ている。
【００４７】
多発性骨髄腫を有する個体の治療方法の別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣは、タンパク質デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５またはＴＩＭＰ−２の１つまたは複数を分泌する。より具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣは、タンパク質デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５およびＴＩＭＰ−２を分泌する。
【００４８】
治療方法の別の具体的な実施形態では、多発性骨髄腫の前記１つまたは複数の症状は、骨痛、骨細胞病変（例えば、Ｘ線または磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）によって見える）、骨粗鬆症、貧血、高カルシウム血症もしくは高カルシウム血症による症状、または腎不全である。別の具体的な実施形態では、前記投与するステップは、前記個体での骨ミネラル密度または骨ミネラル含量の検出可能な増加、または減少の低下を引き起こす。別の具体的な実施形態では、前記投与するステップは、前記個体にｋｇにつき少なくとも１×１０８個のＯＰＡＣを投与することを含む。他の具体的な実施形態では、前記個体は、多発性骨髄腫のためにこれまで治療されたことがない；前記個体は、多発性骨髄腫のために治療され、非ＯＰＡＣ療法に応答する；前記個体は、多発性骨髄腫のために治療され、非ＯＰＡＣ療法に応答していないが、前記個体での多発性骨髄腫の過程は進行していない；または、前記個体は、進行性の多発性骨髄腫を有する。
【００４９】
さらに別の態様では、対象で骨欠損を治療する方法であって、それを必要とする対象にＯＰＡＣの集団を含む移植可能または注射可能な組成物を投与し、それによって対象で骨欠損を治療するステップを含む方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、骨欠損は、（ａ）癌関連の骨溶解性病変、（ｂ）骨折、（ｃ）癒合が必要な脊柱、（ｄ）偽関節（nonunion）骨折、または（ｅ）骨粗鬆症である。特定の実施形態では、骨溶解性病変は、多発性骨髄腫、骨癌または転移癌に関連する。特定の実施形態では、骨折は、偽関節骨折である。特定の実施形態では、ＯＰＡＣの集団を含む移植可能な組成物が、対象に投与される。特定の実施形態では、移植可能な組成物は、外科的に移植される。特定の実施形態では、ＯＰＡＣの集団を含む注射可能な組成物が、対象に投与される。特定の実施形態では、注射可能な組成物は、骨欠損の領域に外科的に投与される。特定の実施形態では、注射可能な組成物は、全身投与される。
【００５０】
さらに別の態様では、対象で骨欠損を治療する方法であって、それを必要とする対象にＯＰＡＣの集団を含む移植可能または注射可能な組成物を投与するステップを含む方法が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣは、対象で骨または骨組織の形成を引き起こすかまたは促進し、それによって対象で骨欠損を治療する。特定の実施形態では、骨欠損は、（ａ）癌関連の骨溶解性病変、（ｂ）骨折、（ｃ）癒合が必要な脊柱、（ｄ）偽関節骨折、または（ｅ）骨粗鬆症である。特定の実施形態では、骨溶解性病変は、多発性骨髄腫、骨癌または転移癌に関連する。特定の実施形態では、骨折は、偽関節骨折である。特定の実施形態では、ＯＰＡＣの集団を含む移植可能な組成物が、対象に投与される。特定の実施形態では、移植可能な組成物は、外科的に移植される。特定の実施形態では、ＯＰＡＣの集団を含む注射可能な組成物が、対象に投与される。特定の実施形態では、注射可能な組成物は、骨欠損の領域に外科的に投与される。特定の実施形態では、注射可能な組成物は、全身投与される。
【００５１】
３．１  定義
本明細書で用いるように、ＯＰＡＣを含む細胞集団との関連で「それから本質的になる」とは、細胞集団が、例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９５％または少なくとも９５．５％ＯＰＡＣであることを意味する。
【００５２】
本明細書で用いるように、用語「ＯＰＡＣ」および「ＯＰＡＣ（複数）」は、下のセクション５．１に記載の細胞を指す。
【００５３】
本明細書で用いるように、細胞を指す場合、「ＣＤ２００ｄｉｍ」は、フローサイトメトリーで、アイソタイプ対照を２０〜３０％以下上回るＣＤ２００の蛍光強度を細胞が示すことを意味する。本明細書で用いるように、集団中の細胞の少なくとも６０％がＣＤ２００を発現しないかまたはＣＤ２００ｄｉｍである場合、およびフローサイトメトリーアッセイで、細胞集団が全体としてアイソタイプ対照を４０〜６０％以下上回るＣＤ２００蛍光強度を示す場合、その細胞集団はＣＤ２００ｄｉｍである。ＣＤ２００ｄｉｍ集団は、ＣＤ２００＋（非ｄｉｍ）細胞を含むことができる点に注意する。
【００５４】
本明細書で用いるように、用語「ＳＨ２」は、マーカーＣＤ１０５の上のエピトープに結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ２＋と呼ばれる細胞は、ＣＤ１０５＋である。
【００５５】
本明細書で用いるように、用語「ＳＨ３」および「ＳＨ４」は、マーカーＣＤ７３の上に存在するエピトープに結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ３＋および／またはＳＨ４＋と呼ばれる細胞は、ＣＤ７３＋である。
【００５６】
本明細書で用いるように、用語「単離されたＯＰＡＣ」または「単離ＯＰＡＣ」は、ＯＰＡＣが由来する組織、例えば絨毛膜の他の非ＯＰＡＣから実質的に分離されるＯＰＡＣを意味する。ＯＰＡＣが本来関連している非ＯＰＡＣの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９９％が、例えばＯＰＡＣの採集および／または培養の間にＯＰＡＣから除去される場合、ＯＰＡＣは「単離される」。
【００５７】
本明細書で用いるように、用語「単離された細胞の集団」または「単離細胞の集団」は、その細胞集団が由来する組織、例えば胎盤の他の細胞から実質的に分離される細胞の集団を意味する。ＯＰＡＣの集団、またはＯＰＡＣの集団が由来する細胞が本来関連する細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％が、例えば採集および／または培養の間にＯＰＡＣの集団から除去される場合、ＯＰＡＣの集団は「単離される」。
【００５８】
本明細書で用いるように、用語「胎盤幹細胞」は、形態、細胞表面マーカー、または一次培養後の継代培養数に関係なく、哺乳動物の胎盤に由来する幹細胞または前駆体細胞を指す。しかし、本明細書で用いる用語「胎盤幹細胞」は、栄養芽細胞を指さない。細胞が幹細胞の少なくとも１つの属性、例えば幹細胞の１つまたは複数の型に関連するマーカーまたは遺伝子発現プロフィール；培養で少なくとも１０〜４０回複製する能力、３つの胚葉すべての細胞に分化する能力；成体の（すなわち、分化した）細胞特性の欠損などを保持する場合、細胞は「幹細胞」とみなされる。用語「胎盤幹細胞」および「胎盤由来幹細胞」は、互換的に用いることができる。
【００５９】
本明細書で用いるように、そのマーカーが検出可能である場合、細胞は特定のマーカーに関して「陽性」である。例えば、ＣＤ１０５は胎盤幹細胞の上でバックグラウンドよりも（例えばアイソタイプ対照と比較して）検出可能に多い量で検出可能であるので、ＯＰＡＣは、例えばＣＤ１０５に関して陽性である。また、細胞を少なくとも１つの他の細胞型から区別するために、あるいは存在するかまたはその細胞によって発現される場合にその細胞を選択または単離するためにそのマーカーを用いることができる場合、細胞はマーカーに関して陽性である。同様に、例えば集団中の細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％がそのマーカーを発現する場合、細胞集団はマーカーに関して陽性である。
【００６０】
本明細書で用いるように、「骨形成性細胞」は、骨の主成分ヒドロキシアパタイトを沈着させること、またはヒドロキシアパタイトを沈着させることができる細胞に分化することができる細胞である。「骨形成性細胞」は、骨芽細胞または骨細胞と通常呼ばれる細胞を包含することが、特に企図される。骨形成性の胎盤接着性細胞が、ヒドロキシアパタイトを沈着させることができる細胞に分化することができる例示的な条件については、下のセクション５．１．６を参照。
【００６１】
本明細書で用いるように、「マトリックス」は、物質全体に分散する孔を特徴とする、三次元の物質を指す。孔は、例えば、マトリックスの中での細胞、例えば幹細胞、ＯＰＡＣおよび／または骨形成性細胞の成長に適する。例示的なマトリックスには、β−リン酸三カルシウム基質、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、無機物化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質およびセラミック基質が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、マトリックスは、マトリックスの孔に存在する骨形成性細胞によって無機物化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】選択的接着によって、得られたＯＰＡＣの遺伝子発現量の図である。ｘ軸：アルカリホスファターゼ遺伝子の相対的発現量のｌｏｇ１０値。ｘ軸：実験条件。
【図２】選択的接着によって、得られたＯＰＡＣのＣＤ３４、ＣＤ１０５およびＣＤ２００に対する免疫表現型の図である。ＬＮ：ラミニン。ＶＮ：ビトロネクチン。ＦＮ：フィブロネクチン。ＣＯＬ：コラーゲン。１０：１０％のウシ胎児血清。２０：２０％のウシ胎児血清。Ｃｔｒｌ：表示の表面被覆上での６日間のＯＰＡＣ培養。
【図３】選択的接着によって、得られたＯＰＡＣの骨形成マーカーの免疫表現型の図である。ＬＮ：ラミニン。ＶＮ：ビトロネクチン。ＦＮ：フィブロネクチン。ＣＯＬ：コラーゲン。１０：１０％のウシ胎児血清。２０：２０％のウシ胎児血清。Ｃｔｒｌ：表示の表面被覆上での６日間のＯＰＡＣ培養。星印：ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤幹細胞の対照実験（水平線）と比較した有意差。
【図４】選択的接着によって、得られたＯＰＡＣの胚性幹細胞マーカーの免疫表現型の図である。ＬＮ：ラミニン。ＶＮ：ビトロネクチン。ＦＮ：フィブロネクチン。ＣＯＬ：コラーゲン。１０：１０％のウシ胎児血清。２０：２０％のウシ胎児血清。Ｃｔｒｌ：表示の表面被覆上での６日間のＯＰＡＣ培養。上方水平線：ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤幹細胞におけるＳＳＥＡ−３の発現量、下方水平線：ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤幹細胞におけるＳＳＥＡ−４の発現量。
【図５】選択的接着によって、得られたＯＰＡＣのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性の図である。
【図６】増殖培養させたＯＰＡＣの免疫表現型の図である。
【図７】増殖培養させたＯＰＡＣのアルカリホスファターゼ活性の図である。基礎：増殖培地。ＯＳ：骨形成性の培地。ｍ１：培地１−１００単位（units）／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）／α−ＭＥＭ。ｍ２：培地２−間葉幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ；Ｌｏｎｚａ）。ｍ３：培地３−１００単位／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１０％のＦＢＳ（検定済み間葉幹細胞用ＦＢＳ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）／α−ＭＥＭ。
【図８】磁気活性細胞選別後のＯＰＡＣの免疫表現型（ＣＤ２００、ＣＤ１０５）の図である。ＬＮ：ラミニン。ＶＮ：ビトロネクチン。ＦＮ：フィブロネクチン。ｍ１：培地１−１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）／α−ＭＥＭ。ｍ３：培地３−１００単位／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１０％のＦＢＳ（検定済み間葉幹細胞用ＦＢＳ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）／α−ＭＥＭ。
【図９】磁気活性細胞選別の後のＣＤ２００＋細胞集団およびフロースルー画分（ＣＤ２００−細胞を含む）のアルカリホスファターゼ活性の図である。ＬＮ：ラミニン。ＶＮ：ビトロネクチン。ＦＮ：フィブロネクチン。ｍ１：培地１−１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）／α−ＭＥＭ。ｍ３：培地３−１００単位／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１０％のＦＢＳ（検定済み間葉幹細胞用ＦＢＳ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）／α−ＭＥＭ。基礎：増殖培地におけるＡＰ発現量。誘導：骨形成性の培地におけるＡＰ発現量。
【図１０】コロニー形成単位−磁気活性細胞選別後の絨毛膜由来幹細胞集団のアルカリホスファターゼ（ＣＦＵ−ＡＰ）活性の図である。ＬＮ：ラミニン。ＶＮ：ビトロネクチン。ＦＮ：フィブロネクチン。ｍ１：培地１−１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）／α−ＭＥＭ。ｍ３：培地３−１００単位／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１０％のＦＢＳ（検定済み間葉幹細胞用ＦＢＳ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）／α−ＭＥＭ。ＣＤ２００＋状態は、実質的にＡＰ発現がゼロである。
【図１１】磁気活性細胞選別後のＯＰＡＣ画分の総コロニー形成の図である。ＦＮ：フィブロネクチン。ｍ１：培地１−１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）／α−ＭＥＭ。ｍ３：培地３−１００単位／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１０％のＦＢＳ（検定済み間葉幹細胞用ＦＢＳ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）／α−ＭＥＭ。ＰＤＡＣ：ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチックに接着性の胎盤多能性細胞。
【図１２】骨形成刺激後のＯＰＡＣによる誘導可能なオステオプロテゲリン分泌の図である。
【図１３】ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  ５０７タンパク質ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙを用いてＯＰＡＣ、ＰＤＡＣ（商標）、ＭＳＣおよび線維芽細胞において、確認された分泌タンパク質の一覧表である。タンパク質発現量を、内部陽性対照と比較して＋（低度）、＋＋（中程度）および＋＋＋（高度）に分類している。骨形成（↑）または再吸収（↓）におけるタンパク質の影響を示している。
【図１４】処理群別の骨組織形成の平均量の図である、最大値を４として０〜４として採点した。
【図１５】処理群別の頭蓋欠損部位の骨塩量の図である。
【図１６】屠殺時のＸ線走査による残存欠損の測定で定量した場合に、５０％超の欠損閉鎖（defect closure）を有する動物の分布図である。
【図１７】破骨細胞の分化に対するＯＰＡＣおよびＭＳＣの効果の図である。ＯＣ：破骨細胞。対照：ＯＰＡＣまたはＭＳＣなしの破骨細胞。
【図１８】多発性骨髄腫細胞の増殖に対するＯＰＡＣおよびＭＳＣの効果の図である。ＯＢ：骨形成条件下でＭＳＣまたはＰＤＡＣから得た骨芽細胞または骨芽細胞様細胞。ＭＴＴ  ＯＤ：ＭＴＴアッセイの光学密度。より高い値は、より高い多発性骨髄腫細胞生存率の程度を示している。ＣｏｎＭＭ：２７人のヒト多発性骨髄腫患者由来の多発性骨髄腫細胞。
【図１９】初期骨髄腫ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスの骨塩量に対するＯＰＡＣの効果の図である。対照：ＰＢＳのみ。Ｐｒｅ−Ｒｘ：ＯＰＡＣ投与前の骨塩量（ＢＭＤ）。最終：注入後８〜１６週間後の骨塩量。移植した骨の骨塩量（ＢＭＤ）の変化量を、ＰＩＸＩｍｕｓＤＥＸＡ（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＵＮＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して定量した。
【図２０】初期骨髄腫（myelomatous）マウス中のヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）濃度に対するＯＰＡＣの効果の図である。Ｉｇ：マウス血清中のヒト免疫グロブリン。
【図２１】初期骨髄腫ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスの骨質量に対するＯＰＡＣの効果の図である。ＢＭＤ：骨塩量。ＢＭＣ：骨ミネラル含量。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
５．詳細な説明
５．１  骨形成性の胎盤接着性細胞（ＯＰＡＣ）
５．１．１  特徴
５．１．１．１  物理的特徴および形態的特徴
一次培養または細胞培養で培養した場合、本明細書で提供される骨形成性の胎盤接着性細胞（ＯＰＡＣ）は、組織培養基質、例えば組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）に付着する。培養物中のＯＰＡＣは、一般に線維芽細胞様の星状の外観を呈し、いくつかの細胞質突起が中央細胞体から延びている。しかし、ＯＰＡＣは線維芽細胞よりも多くのそのような突起を一般に示すので、ＯＰＡＣは、同じ条件下で培養される線維芽細胞から形態的に識別可能である。形態的には、ＯＰＡＣは、培養物中で一般により丸いかまたは玉石の形態を呈する造血幹細胞からも識別可能である。
【００６４】
５．１．１．２  細胞表面、分子および遺伝子マーカー
一実施形態では、単離されたＯＰＡＣ（骨形成性の胎盤接着性細胞）、すなわち、接着性、骨形成性であり、絨毛膜から単離される単離された細胞が本明細書で提供される。一実施形態では、ＯＰＡＣは絨毛膜スカート（平滑絨毛膜）から単離されない。本明細書で提供されるＯＰＡＣ、およびＯＰＡＣの集団は、ＯＰＡＣまたはＯＰＡＣを含む細胞の集団を同定および／または単離するために用いることができる複数の細胞マーカーおよび遺伝子マーカーを発現する。本明細書で提供されるＯＰＡＣおよびＯＰＡＣを含む細胞集団には、絨毛膜から直接得られたＯＰＡＣおよびＯＰＡＣを含有する細胞集団、例えば一次培養物が含まれる。ＯＰＡＣ集団には、例えば２つ以上の培養物中のＯＰＡＣの集団、単細胞懸濁液のＯＰＡＣ、および容器、例えばバッグ内の集団も含まれる。具体的な実施形態において、ＯＰＡＣの集団は、細胞培養物中の複数のＯＰＡＣである。ＯＰＡＣは、栄養芽細胞、栄養膜細胞層、胚性幹細胞または胚性胚細胞ではないが、その理由は、それらの細胞が当技術分野で公知であって理解されているからである。
【００６５】
ＯＰＡＣがＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍである、単離されたＯＰＡＣが本明細書で提供される。具体的な実施形態において、ＯＰＡＣは骨形成性である。具体的な実施形態において、ＯＰＡＣは、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５３７０９を参照）の分泌に関して陽性である。オステオプロテゲリンは、破骨細胞分化因子に特異的に結合して破骨細胞成熟を阻害する、骨芽細胞によって分泌されるデコイ受容体である。したがって、ＯＰＡＣは骨形成を促進し、破骨細胞媒介性の骨量減少を低減させる。別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣはＲＡＮＫＬ（核因子κＢの受容体活性化剤）の発現に関して陰性である。ＲＡＮＫＬは、骨吸収に関与する破骨細胞を活性化するタンパク質である。したがって、ＯＰＡＣは骨吸収を促進しない。別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣはＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、例えば免疫蛍光染色によって測定した場合、ＯＰＡＣはα平滑筋アクチンの発現に関して陰性である。胎盤からの他の細胞集団、例えば米国特許出願公開第２００５／００５８６３１に記載の細胞は、α平滑筋アクチンに関して陽性である点に注意する。別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、またはＮＧ２（神経／グリア細胞２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の発現に関して陽性の１つまたは複数である。別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、およびオステオプロテゲリンの分泌に関して陽性である。別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、およびＣＤ１０５＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性の１つまたは複数であるか、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、およびＣＤ１０５＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、および誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。ＯＰＡＣによるＣＤ２００の発現の欠如または低い発現は、ＯＰＡＣを他の組織培養プラスチック接着性胎盤由来多能細胞、例えばＰＤＡＣ（商標）、例えばＥｄｉｎｇｅｒら、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号に記載の胎盤多能細胞から区別する。
【００６６】
別の具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＳＳＥＡ３＋またはＳＳＥＡ４＋である。より具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＳＳＥＡ３＋およびＳＳＥＡ４＋である。別のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、およびＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、および／または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、およびＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、ＯＰＡＣは、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋、ＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。ＯＰＡＣによるＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４の発現は、ＯＰＡＣを他の胎盤由来の細胞、例えば、Ｈａｒｉｒｉ、米国特許第７，４６８，２７６号に記載の組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞から区別する役目を果たす。
【００６７】
特定の実施形態では、ＯＰＡＣは、その集団が無機物化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養される場合、胎盤細胞の集団で無機物化マトリックスの形成を促進する。
【００６８】
ＯＰＡＣを含む細胞集団であって、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍである細胞集団も本明細書で提供される。したがって、一実施形態では、ＯＰＡＣを含む単離された細胞集団であって、絨毛膜スカート（平滑絨毛膜）から単離されず、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍである細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。具体的な実施形態において、前記細胞集団は骨形成性である。別の具体的な実施形態では、フローサイトメトリーによって検出した場合、前記細胞集団はＣＤ２００−およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、フローサイトメトリーによって検出した場合、前記細胞集団はＣＤ２００ｄｉｍおよびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、および／またはオステオプロテゲリンの分泌に関して陽性である。別の実施形態では、前記細胞集団は、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、およびオステオプロテゲリンの分泌に関して陽性である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、前記集団は、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性の１つまたは複数でもあるか、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。より具体的な実施形態では、前記細胞集団は、ＣＤ２００−、ＣＤ１０５＋またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋であり；α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性であり；誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。
【００６９】
別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、ＳＳＥＡ３＋またはＳＳＥＡ４＋である。さらに別の実施形態では、前記細胞集団は、ＳＳＥＡ３＋およびＳＳＥＡ４＋である。さらに別の実施形態では、前記細胞集団は、ＣＤ２００−および／またはＣＤ２００ｄｉｍ、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、前記細胞集団は、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍであり、ＣＤ１０５＋およびＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性でもあり、または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。別のより具体的な実施形態では、前記細胞集団は、ＣＤ２００−またはＣＤ２００ｄｉｍであり；ＣＤ１０５＋、ＳＳＥＡ３＋、ＳＳＥＡ４＋であり、α平滑筋アクチンの発現に関して陰性、ＲＡＮＫＬの発現に関して陰性、ＮＧ２の発現に関して陽性、オステオプロテゲリンの発現に関して陽性であり、および／または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示す。
【００７０】
具体的な実施形態では、集団内の細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％は、ＣＤ２００−である。
【００７１】
単離されたＯＰＡＣ集団であって、胎盤から絨毛膜組織を単離するステップであって、前記絨毛膜組織が絨毛膜スカート（平滑絨毛膜）組織でない前記ステップと；単離された絨毛膜組織を組織破壊酵素で消化してＯＰＡＣを含む絨毛膜細胞の集団を得るステップと；前記絨毛膜細胞から前記ＯＰＡＣを単離するステップとによって生成される集団が、本明細書でさらに提供される。具体的な実施形態において、組織破壊酵素は、トリプシン、ディスパーゼまたはコラゲナーゼである。様々な実施形態では、絨毛膜組織を消化して得られる細胞集団に含まれる絨毛膜幹細胞は、前記絨毛膜細胞集団の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。
【００７２】
ＯＰＡＣを含む単離された細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団は、遺伝子プロファイリングで示すように、他の細胞、例えば、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，４６８，２７６号および第７，２５５，８７９号、ならびに米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２１号に記載の、例えばＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤由来接着性細胞（本明細書でＰＤＡＣ（商標）と称す）から識別可能である。ＰＤＡＣ（商標）は、例えば、胎盤または臍帯からのＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ細胞として同定され、それらは組織培養表面、例えば組織培養プラスチックに接着性である。ＰＤＡＣ（商標）は、胎盤または臍帯からのＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋細胞であるとさらに特徴付けることができ、それらは組織培養表面、例えば組織培養プラスチックに接着性である。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００７３】
本明細書で記載されるＯＰＡＣは、その発現またはその発現の程度がＰＤＡＣ（商標）と比較してＯＰＡＣに特異的である、１つまたは複数の遺伝子の発現に基づいて、ＰＤＡＣ（商標）から区別することができる。一実施形態では、例えば、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を同等の条件下で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記細胞集団は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の前記胎盤幹細胞（ＰＤＡＣ（商標））よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ６（骨形成タンパク質６；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７１８を参照）、ＣＤＨ１１（カドヘリン１１、２型、骨芽細胞カドヘリン；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７９７を参照）、ＣＯＬ１０Ａ１（コラーゲン、Ｘ型、α１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４９３を参照）、ＣＯＬ１４Ａ１（コラーゲン、ＸＩＶ型、α１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１１１０を参照）、ＣＯＬ１５Ａ１（コラーゲン、ＸＶ型、α１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１８５５を参照）、ＣＯＬ１Ａ１（コラーゲン、Ｉ型、α１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００８８を参照）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲン、Ｉ型、α２；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００８９を参照）、ＣＯＬ３Ａ１（コラーゲン、ＩＩＩ型、α１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００９０を参照）、ＣＯＬ４Ａ３（コラーゲン、ＩＶ型、α３；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００９１を参照）、ＣＯＬ５Ａ１（コラーゲン、Ｖ型、α１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００９３を参照）、ＣＳＦ３（コロニー刺激因子３（顆粒球）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７５９を参照）、ＣＴＳＫ（カテプシンＫ；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３９６を参照）、ＩＧＦ１Ｒ（インスリン様増殖因子１受容体；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８７５を参照）、ＭＩＮＰＰ１（複数のイノシトールポリリン酸ヒスチジンホスファターゼ１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４８９７を参照）、ＭＭＰ２（マトリックスメタロプロテアーゼ２（別名ゼラチナーゼＡ、７２ｋＤａゼラチナーゼ、７２ｋＤａＩＶ型コラゲナーゼ）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５３０を参照）、ＭＭＰ９（マトリックスメタロペプチダーゼ９（別名ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａＩＶ型コラゲナーゼ）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９９４を参照）、ＭＳＸ１（ｍｓｈホメオボックス１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４４８を参照）、ＳＭＡＤ１（ＳＭＡＤファミリーメンバー１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００３６８８を参照）、ＳＭＡＤ３（ＳＭＡＤファミリーメンバー３；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９０２を参照）、ＴＧＦＢ３（トランスフォーミング増殖因子、β３；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２３９を参照）、ＴＧＦＢＲ１（トランスフォーミング増殖因子、β受容体１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４６１２を参照）およびＶＥＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００１１２８９０９を参照）の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。具体的な実施形態において、その細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００７４】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記細胞集団は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ３（骨形成タンパク質３；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０１を参照）、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１（象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００８９８８を参照）、ＤＳＰＰ（象牙質シアロリンタンパク質；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４２０８を参照）、ＥＮＡＭ（エナメリン；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３１８８９を参照）、ＦＧＦＲ２（線維芽細胞成長因子受容体２；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１４１を参照）、ＭＭＰ１０（マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４２５を参照）、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、前記増殖培地は、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含むαＭＥＭ／２０％ウシ胎児血清である。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００７５】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞の集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ（アメロブラスチン（エナメルマトリックスタンパク質）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３１８８９を参照）、ＢＭＰ２（骨形成タンパク質２；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２００を参照）、ＣＡＬＣＲ（カルシトニン受容体；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７４２を参照）、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１１Ａ１（コラーゲンＸＩ型、α１；ＮＭ＿００１８５４）、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１（コラーゲンＩＩ型、α１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１８４４を参照）、ＣＳＦ２（コロニー刺激因子２；ＮＭ＿０００７５８）、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＦＧＦ３、ＧＤＦ１０（成長分化因子１０；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９６２を参照）、ＩＧＦ１（インスリン様増殖因子１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６１８を参照）、ＩＴＧＡ１（インテグリン、α１（ＣＤ４９）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１８１５０１を参照）、ＩＴＧＡ２（インテグリン、α２（ＣＤ４９Ｂ）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２０３を参照）、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ８（マトリックスメタロプロテアーゼ８（好中球コラゲナーゼ）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４２４を参照）、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＡ（血小板由来増殖因子Ａ；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００１１２６４４１を参照）、ＳＭＡＤ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２（トランスフォーミング増殖因子β、受容体２；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２４８４７を参照）の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、前記骨形成性培地は、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸および１００ｎＭのデキサメタゾンを含む、αＭＥＭ／２０％ウシ胎児血清である。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００７６】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＭＭＰ１０、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００７７】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベル（例えば、少なくとも２倍低いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ（α−２−ＨＳ−糖タンパク質；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６２２を参照）、ＡＬＰＬ（アルカリホスファターゼ肝臓／骨／腎臓；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４７８を参照）、ＥＧＦ（上皮成長因子；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９６３を参照）、ＦＬＴ１（ｆｍｓ関連のチロシンキナーゼ１（血管内皮成長因子／血管透過性因子受容体）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１９を参照）、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ（インテグリン、αＭ（補体成分３受容体３サブユニット）；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６３２を参照）、ＳＣＡＲＢ１（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５５０５を参照）、ＳＯＸ９（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス９；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４６を参照）、ＴＮＦ、ＴＷＩＳＴ１（Ｔｗｉｓｔ同族体１；旧称瞼裂縮小、逆内眼角贅皮および下垂３、尖頭合指３；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４７４を参照）、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０７８を参照）および／またはＶＤＲの１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、前記増殖培地は骨形成性の培地は、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含むαＭＥＭ／２０％ウシ胎児血清である。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００７８】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベル（例えば、少なくとも２倍低いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＧＮ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）、ＦＧＦ１および／またはＶＣＡＭ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、前記骨形成性培地は、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸および１００ｎＭのデキサメタゾンを含む、αＭＥＭ／２０％ウシ胎児血清である。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００７９】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の前記胎盤幹細胞よりも検出可能に低いレベル（例えば、少なくとも２倍低いレベル）でＶＣＡＭ１を発現する。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８０】
遺伝子プロファイリングは、ＯＰＡＣを含む単離された細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団は、間葉幹細胞、例えば骨髄由来間葉幹細胞からの区別が可能であることも示す。一実施形態では、例えば、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来間葉幹細胞を同等の条件下で生育させた場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、同等数の前記幹細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＳＦ２、ＣＴＳＫ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、ＦＬＴ１、ＩＴＧＡ１、ＭＩＮＰＰ１、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＴＧＦＢ３およびＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８１】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＣＡＬＣＲ、ＣＤ３６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＦＬＴ１、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＵＦＴ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、前記増殖培地は骨形成性の培地は、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含むαＭＥＭ／２０％ウシ胎児血清である。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８２】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＭＢＮ、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＳＦ３、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ９、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１および／またはＴＧＦＢＲ２の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、前記骨形成性培地は、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸および１００ｎＭのデキサメタゾンを含む、αＭＥＭ／２０％ウシ胎児血清である。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８３】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来間葉幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＡＬＣＲ、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＭＳＸ１、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。別の具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８４】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来間葉幹細胞を増殖培地で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベル（例えば、少なくとも２倍低いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、前記増殖培地は骨形成性の培地は、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含むαＭＥＭ／２０％ウシ胎児血清である。別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来間葉幹細胞を骨形成性の培地で培養した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記細胞集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベル（例えば、少なくとも２倍低いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＢＧＮ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＣＤ３６、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ２、ＭＭＰ８、ＰＨＥＸ、ＲＵＮＸ２（ｒｕｎｔ関連の転写因子２；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０１５０５１を参照）、ＳＣＡＲＢ１、ＳＯＸ１、ＶＣＡＭ１および／またはＶＥＧＦＢの１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、前記骨形成性培地は、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸および１００ｎＭのデキサメタゾンを含む、αＭＥＭ／２０％ウシ胎児血清である。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８５】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび骨髄由来間葉幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、同等数の前記間葉幹細胞よりも検出可能に低いレベル（例えば、少なくとも２倍低いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ、ＢＧＬＡＰ、ＩＧＦ２、ＳＣＡＲＢ１および／またはＳＯＸ９の１つまたは複数、またはすべてを含む。別の具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８６】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣ、接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞および骨髄由来間葉幹細胞を増殖培地で培養するかまたは骨形成性の培地で培養するかに関係なく、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、細胞、例えばＯＰＡＣの前記集団は、同等数の前記胎盤幹細胞、および同等数の前記骨髄由来間葉幹細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ２、ＤＭＰ、ＤＳＰＰ、ＴＧＦＢ３および／またはＴＧＦＢＲ１の１つまたは複数、またはすべてを含む。別の具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８７】
遺伝子プロファイリングは、ＯＰＡＣを含む単離された細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団は、ヒト皮膚線維芽細胞からの区別が可能であることも示す。一実施形態では、例えば、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣおよび皮膚線維芽細胞を同等の条件下で生育した場合、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、前記細胞集団は、同等数の前記皮膚線維芽細胞よりも検出可能に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高いレベル）で１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＦＬＴ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＴＧＡ１、ＭＩＮＰＰ１、ＰＤＧＦＡ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＭＡＤ３、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＮＦ、ＴＵＦＴ１、ＶＣＡＭ１およびＶＥＧＦＡの１つまたは複数、またはすべてを含み、これらの遺伝子の発現は線維芽細胞でよりもＯＰＡＣで高い。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８８】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の１つまたは複数の遺伝子の前記細胞集団、例えばＯＰＡＣでの発現の増加は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞における、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の前記遺伝子の前記１つまたは複数の増加よりも少なくとも１０倍高く、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ２、ＣＳＦ３、ＩＴＧＡ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０および／またはＴＧＦＢ２の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００８９】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の１つまたは複数の遺伝子の前記細胞集団、例えばＯＰＡＣでの発現の増加は、栄養芽細胞または栄養膜細胞層でない同等数の接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞における、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の前記遺伝子の前記１つまたは複数の増加よりも少なくとも１０倍低く、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００９５を参照）、ＣＴＳＫ、ＦＧＦ１（線維芽細胞成長因子１；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８００を参照）および／またはＦＧＦＲ２の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００９０】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の１つまたは複数の遺伝子の前記細胞集団、例えばＯＰＡＣでの発現の増加は、同等数の骨髄由来間葉幹細胞における、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の前記遺伝子の前記１つまたは複数の増加よりも少なくとも１０倍高く、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＳＦ３、ＩＧＦ２、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０および／またはＴＧＦＢ２の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００９１】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の１つまたは複数の遺伝子の前記細胞集団、例えばＯＰＡＣでの発現の増加は、同等数の骨髄由来間葉幹細胞における、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の前記遺伝子の前記１つまたは複数の増加よりも少なくとも１０倍低く、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＬＰＬ（アルカリホスファターゼ、肝臓／骨／腎臓）、ＣＤ３６、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＭＰ、ＣＴＳＫ、ＦＧＦ１および／またはＦＧＦＲ２の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００９２】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の１つまたは複数の遺伝子の前記細胞集団、例えばＯＰＡＣでの発現の増加は、同等数の線維芽細胞における、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の前記遺伝子の前記１つまたは複数の増加よりも少なくとも１０倍高く、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ２、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＩＧＦ１、ＩＴＧＡ２、ＭＭＰ９および／またはＭＭＰ１０の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００９３】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団が本明細書で提供され、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の１つまたは複数の遺伝子の前記細胞集団、例えばＯＰＡＣでの発現の増加は、同等数の線維芽細胞における、増殖培地と比較した場合の、骨形成性培地中の前記遺伝子の前記１つまたは複数の増加よりも少なくとも１０倍低く、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＢＭＰ４、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＭＰ、ＦＧＦ１および／またはＭＭＰ８の１つまたは複数、またはすべてを含む。具体的な実施形態において、細胞集団は、本質的にＯＰＡＣからなる。
【００９４】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団が本明細書で提供され、例えば定量的リアルタイムＰＣＲからのＣｔ値によって評価した場合、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）をコードする遺伝子は、増殖培地でのＭＭＰ９の発現と比較して、骨形成性の培地中の前記ＯＰＡＣにおいて、前記ＭＭＰ９が、前記増殖培地でのＭＭＰ９の発現と比較して、前記骨形成性の培地で誘導されるよりも、少なくとも２、３、４または５桁大きく誘導される。
【００９５】
別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団が本明細書で提供され、前記集団は同等数の接着性ＣＤ２００＋、非ｄｉｍ、胎盤幹細胞よりも少なくとも１０倍高く１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＣＨＲＤ（コーディン；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３７４１を参照）、ＧＤＦ７（成長分化因子７；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１８２８２８を参照）、ＩＧＦＢＰ３（インスリン様増殖因子結合性タンパク質３；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５９８を参照）および／またはＩＮＨＡ（インヒビンα；例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１９１を参照）である。別の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団が本明細書で提供され、前記集団は、同等数の接着性ＣＤ２００＋（非ｄｉｍ）胎盤幹細胞よりも少なくとも１０倍低いレベルでＴＧＦＢ２を発現する。
【００９６】
他の実施形態では、ＯＰＡＣを含む細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団が本明細書で提供され、ＯＰＡＣは、免疫蛍光染色によって検出可能であるα平滑筋アクチンを発現し、前記細胞は、フィブロネクチン１遺伝子（ＦＮ１）および／またはＴＧＦ−β２遺伝子（ＴＧＦＢ２）を、同等数の骨髄由来間葉幹細胞とほぼ同じレベルで、またはそれと比較して高いレベルで発現する。
【００９７】
これらの遺伝子の発現レベルを用いて、少なくとも複数のＯＰＡＣを含むときの細胞集団を同定すること、ＯＰＡＣ集団の同一性を確認することなどができる。ＯＰＡＣ集団はクローン、例えば単一のＯＰＡＣから拡張されたＯＰＡＣ集団であってもよく、またはＯＰＡＣの混合集団、例えば複数のＯＰＡＣから拡張されたＯＰＡＣだけを含む細胞集団、またはＯＰＡＣおよび少なくとも１つの他の細胞型を含む細胞集団であってもよい。
【００９８】
これらの遺伝子の発現レベルは、ＯＰＡＣの集団を選択するために用いることができる。例えば、これらの遺伝子の１つまたは複数の発現が、間葉幹細胞の同等の集団でよりもその細胞集団からの試料中でかなり高い場合、細胞、例えばクローン拡張細胞の集団を選択することができる。そのような選択は、複数の胎盤幹細胞または絨毛膜幹細胞集団、その同一性は未知である複数の細胞集団などからの集団の選択であってもよい。
【００９９】
ＯＰＡＣおよびＯＰＡＣを含む細胞の集団は、間葉幹細胞対照でのその１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較した、１つまたは複数のそのような遺伝子の発現レベルに基づいて選択されてもよい。一実施形態では、同等数の間葉幹細胞を含む試料での前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、対照として用いられる。別の実施形態では、特定の条件下で試験されるＯＰＡＣのための対照は、前記条件下での間葉幹細胞での前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを表す数値である。
【０１００】
ＯＰＡＣおよびＯＰＡＣを含む細胞の集団は、対照、例えば胎盤幹細胞、間葉幹細胞または線維芽細胞での発現レベルと比較した、１つまたは複数の分泌タンパク質の発現に基づいて選択されてもよい。一実施形態では、ＯＰＡＣは、接着性ＣＤ２００＋（非ｄｉｍ）胎盤幹細胞、間葉幹細胞または線維芽細胞と比較してＯＰＡＣに特異的であるデコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−β結合性タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−βＲ１／ＡＬＫ５およびＴＩＭＰ−２の１つまたは複数の分泌に基づいて、胎盤幹細胞、間葉幹細胞または線維芽細胞から区別することができる。別の実施形態では、ＰＤＡＣ（商標）ではなくＯＰＡＣによって分泌されるタンパク質には、組織因子、ホリスタチン様１、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ｓＦＲＰ−４およびＴＳＧ−６の１つまたは複数が含まれる。
【０１０１】
上記ＯＰＡＣの単離された集団、および一般にＯＰＡＣの集団は、約、少なくとも、またはわずか（no more than）１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個またはそれ以上のＯＰＡＣを含むことができる。
【０１０２】
５．１．１．３  培養での増殖
ＯＰＡＣの増殖は、いかなる哺乳動物細胞に関しても、増殖のために選択される特定の培地に一部依存する。最適な条件下で、ＯＰＡＣは一般的に１〜３日で数が２倍になる。培養の間、本明細書で提供されるＯＰＡＣは、培養の基質、例えば組織培養容器（例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンコートプラスチックなど）の表面に付着して単層を形成する。
【０１０３】
５．１．２  ＯＰＡＣの取得方法
５．１．２．１  細胞収集組成物
ＯＰＡＣを収集、単離する方法が本明細書でさらに提供される。一般に、ＯＰＡＣは、生理的に許容される液、例えば細胞収集組成物を用いて絨毛膜から得られる。細胞収集組成物は、米国特許出願公開第２００７−０１９００４２号に詳細に記載され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
細胞収集組成物は、細胞、例えばＯＰＡＣの収集および／または培養に適する任意の生理的に許容される溶液、例えば食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水、クレブス液、改変クレブス液、イーグル溶液、０．９％ＮａＣｌなど）、培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）その他を含むことができる。
【０１０５】
細胞収集組成物は、収集時から培養時まで、ＯＰＡＣを保存する傾向、すなわち、ＯＰＡＣの死滅を予防するかまたはＯＰＡＣの死滅を遅らせる傾向、死滅する細胞集団中のＯＰＡＣの数を減少させる傾向などがある、１つまたは複数の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤またはＪＮＫ阻害剤）；血管拡張薬（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）；ネクローシス阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバメートまたはクロナゼパム）；ＴＮＦ−α阻害剤；および／または酸素運搬パーフルオロカーボン（例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデシルブロミドなど）であってもよい。
【０１０６】
細胞収集組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮアーゼまたはＤＮアーゼなどを含むことができる。そのような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、ヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）からのコラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモライシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
細胞収集組成物は、抗生物質の殺菌的または静菌的に有効な量を含むことができる。特定のそれには限定されない実施形態では、抗生物質はマクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシムもしくはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）またはキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシンもしくはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質は、グラム（＋）および／またはグラム（−）細菌、例えば、緑膿菌、黄色ブドウ球菌などに対して活性である。
【０１０８】
細胞収集組成物は、以下の化合物の１つまたは複数を含むこともできる：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）；マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；一実施形態では、内皮の完全性および細胞の生存能を維持するのに十分な量で存在する、２０，０００ダルトンを超える分子量の高分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌまたは約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する、合成のまたは天然に存在するコロイド、デキストランなどの多糖、またはポリエチレングリコール）；抗酸化剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣもしくはビタミンＥ）；還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）；細胞へのカルシウム流入を阻止する剤（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）；一実施形態では、残留性血液の凝固の阻止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血物質（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００、０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン）；またはアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライドもしくはイソブチルアミロライド）。
【０１０９】
５．１．２．２  胎盤の収集および取扱い
一般に、ヒト胎盤は、出生後その排除の直後に回収される。好ましい実施形態では、胎盤は、インフォームドコンセントの後に、患者の完全な病歴がとられ、胎盤に関連付けられた後に患者から回収される。好ましくは、病歴は分娩後続ける。そのような病歴は、絨毛膜またはそこから単離されるＯＰＡＣの以降の使用を調整するために用いることができる。例えば、病歴を踏まえて、絨毛膜が得られる胎盤に関連する乳児、または乳児の親、兄弟もしくは他の親類のための個別化された薬のために、ＯＰＡＣを用いることができる。
【０１１０】
特定の実施形態では、ＯＰＡＣの回収の前に、絨毛膜を取り出す胎盤から、臍帯血および胎盤血を除去する。特定の実施形態では、分娩の後、胎盤の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血回収工程を受けることができる。一般的に、胎盤を瀉血するために、重力の助けを借りて、針またはカニューレが用いられる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許第５，４１５，６６５号を参照）。針またはカニューレは、通常臍静脈に置かれ、胎盤からの臍帯血の排出を助けるために、胎盤を軽くマッサージしてもよい。そのような臍帯血回収は、市販品で、例えばＬｉｆｅＢａｎｋ  ＵＳＡ、Ｃｅｄａｒ  Ｋｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．、ＶｉａＣｏｒｄ、Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｙｏｃｅｌｌで実施することができる。好ましくは、臍帯血回収の間の組織破壊を最小にするために、さらなる操作なしで胎盤は重力排出される。
【０１１１】
一般的に、臍帯血の回収および細胞の収集のために、胎盤は分娩室または出産室から別の場所、例えば研究室に運ばれる。胎盤は、好ましくは無菌の、断熱された搬送装置（２０〜２８℃の間に胎盤の温度を維持する）で、例えば、留めた(clamped)近位臍帯を有する胎盤を無菌のジップロックプラスチック袋に置き、それを次に断熱容器に置くことによって運ばれる。別の実施形態では、胎盤は、実質的に２００５年９月１９日に出願の係属中の米国特許出願第１１／２３０，７６０号に記載のように、臍帯血収集キットで運ばれる。好ましくは、胎盤は分娩の４〜２４時間後に研究室に届けられる。特定の実施形態では、臍帯血回収より前に、好ましくは胎盤ディスク中への挿入の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内で、近位臍帯を留める。他の実施形態では、臍帯血回収の後であるが、胎盤のさらなる処理の前に近位臍帯を留める。
【０１１２】
胎盤は、ＯＰＡＣの収集の前に、無菌条件下の、室温または５〜２５℃（摂氏）の温度で保存することができる。胎盤は、４８時間よりも長く、好ましくはあらゆる残留性臍帯血を除去するために胎盤を潅流する前の４〜２４時間、保存することができる。胎盤は、好ましくは５〜２５℃（摂氏）の温度の抗凝血液で保存される。適する抗凝血液は、当技術分野において周知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液を用いることができる。好ましい実施形態では、抗凝血液は、ヘパリン溶液（例えば、１：１０００溶液の１重量％）を含む。瀉血した胎盤は、ＯＰＡＣを収集する前に、好ましくは最大３６時間保存される。
【０１１３】
５．１．２．３  絨毛膜組織の物理的破壊および酵素消化
一実施形態では、ＯＰＡＣは、哺乳動物の胎盤から器官の物理的破壊、例えば酵素消化によって収集される。例えば、絨毛膜またはその一部は、本明細書で提供される細胞収集組成物と接触中に、例えば、破砕、剪断、細かく切り刻むこと、さいの目に切ること、切断、細断することなどができ、生じた組織は、１つまたは複数の酵素でその後消化することができる。絨毛膜またはその一部を、１つまたは複数の酵素で物理的に破壊して消化し、生じた物質を次に細胞収集組成物に浸すかまたは混合することもできる。物理的破壊の任意の方法を用いることができるが、但し、例えばトリパンブルー排除で測定した場合、その破壊方法は、前記器官中の細胞の複数、より好ましくは大多数、より好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％を生存可能な状態のままにする。一般的に、ＯＰＡＣは、絨毛膜の小さなブロック、例えば胎盤組織の容量が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメートルのブロックの破壊によって得ることができる。
【０１１４】
好ましい細胞収集組成物は、１つまたは複数の組織破壊酵素を含む。絨毛膜の酵素消化は、好ましくは酵素の組合せ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼおよび中性プロテアーゼの組合せ、例えばコラゲナーゼおよびディスパーゼの組合せを用いる。他の実施形態では、絨毛膜組織の酵素消化は、ヒアルロン酸の消化のためにマトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼおよび粘液溶解酵素の組合せ、例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼおよびヒアルロニダーゼの組合せ、またはＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）およびヒアルロニダーゼの組合せを用いる。絨毛膜組織を破壊するために用いることができる他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシンまたはエラスターゼが含まれる。セリンプロテアーゼは血清中のα２ミクログロブリンが阻害することができ、したがって、消化のために用いられる培地は通常無血清である。ＥＤＴＡおよびＤＮアーゼは、細胞回収効率を高めるために、酵素消化法で通常用いられる。粘性消化物中のＯＰＡＣの捕獲を回避するために、消化生成物（酵素消化から生じる組織および細胞）は好ましくは希釈される。
【０１１５】
組織消化酵素の一般的な濃度には、例えば、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＶについては５０〜２００Ｕ／ｍＬ、ディスパーゼについては１〜１０Ｕ／ｍＬ、およびエラスターゼについては１０〜１００Ｕ／ｍＬが含まれる。プロテアーゼは、ＯＰＡＣを遊離させるために、組合せで、すなわち同じ消化反応で２つ以上のプロテアーゼで用いること、または逐次的に用いることができる。例えば、一実施形態では、絨毛膜組織を先ず２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩの適当量で３０分間消化し、その後３７℃で、トリプシン０．２５％で１０分間消化する。セリンプロテアーゼは、好ましくは他の酵素の使用の後に連続して用いられる。
【０１１６】
具体的な実施形態において、ＯＰＡＣは、絨毛膜組織からの羊膜の分離によって；絨毛膜組織を、例えば約１ｍｍ３片に細断することによって；組織を、例えば約１、２、３、４または５Ｕ／ｍＬ、例えば２．４Ｕ／ｍＬのディスパーゼＩＩで十分な時間、例えば１時間消化することによって；約１００、２００、３００、４００または５００Ｕ／ｍＬ、例えば約２７０Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩＩで十分な時間、例えば約１時間消化し、その後酵素中和、単一細胞の収集、および適する培地、例えば２０％ＦＢＳ／αＭＥＭでの絨毛膜細胞の培養によって得られる。
【０１１７】
別の実施形態では、組織は、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の、幹細胞を含む細胞収集組成物への添加、または幹細胞の単離の前に組織が細胞収集組成物で破壊および／または消化される溶液への添加によって、さらに破壊することができる。
【０１１８】
胎児細胞および母体細胞の両方を含む絨毛膜全体または絨毛膜の一部の場合、収集されるＯＰＡＣが胎児源および母体源の両方に由来するＯＰＡＣの混合物を含むことが理解される。母体細胞（例えば、羊膜）を含まないかまたは無視できる数を含む絨毛膜の一部の場合、収集されるＯＰＡＣは、ほとんど排他的に胎児の胎盤細胞を含む。
【０１１９】
一実施形態では、ＯＰＡＣは以下の通りに絨毛膜組織から単離される。絨毛膜組織を得、例えば約１〜２ｍｍ３片に細断する。細断した組織を、例えば約１Ｕ／ｍＬ〜約１０Ｕ／ｍＬ、例えば２．４Ｕ／ｍＬの濃度のディスパーゼＩＩで、消化が完了するまで、例えば３７℃で１時間消化する。次に、消化した組織を、例えば約１００Ｕ／ｍＬ〜約１０００Ｕ／ｍＬ、例えば２７Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩで、消化が完了するまで、例えば３７℃で約１時間消化する。細胞を遠心分離で収集し、洗浄し、ビトロネクチンコートまたはラミニンコートの組織培養容器で培養し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたは２０％ＦＢＳ／αＭＥＭで約６日間培養する。培養６日目、非接着性細胞を除去し、接着性細胞を増殖させる。細胞が約８０％〜９０％のコンフルエントに達するとき、例えばトリプシンを用いて細胞を取り出し、ビトロネクチンコートまたはラミニンコートの組織培養容器へ移す。細胞が当初ラミニンコート容器で培養される場合、ラミニンコートの培養容器への移動が好ましい。同様に、細胞が当初ビトロネクチンコート容器で培養される場合、ビトロネクチンコートの培養容器への移動が好ましい。第二のプレートへの移動の前に、細胞は任意選択で凍結保存される。例えばフローサイトメトリーによって、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００−および／またはＣＤ２００ｄｉｍ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性、α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）陽性およびオステオプロテゲリン（ＯＰ）陽性について細胞は分析され、およびそうであると判定される。
【０１２０】
したがって一態様では、骨形成性胎盤接着性細胞（ＯＰＡＣ）を単離する方法であって、ディスパーゼＩＩ、次にコラゲナーゼＩＩで絨毛膜組織を連続的に消化して細胞集団を生成するステップと；第一のビトロネクチンコート表面またはラミニンコート表面で前記細胞集団を約６日間培養するステップであって、前記細胞集団は接着性細胞および非接着性細胞を含む前記ステップと；非接着性細胞を除去するステップと；第二のビトロネクチンコート表面またはラミニンコート表面に接着性細胞を移すステップであって、前記接着性細胞はＯＰＡＣである前記ステップとを含む前記方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣは、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００ｄｉｍ、ＡＰ＋、α−ＳＭＡ＋およびＯＰ＋の１つまたは複数である。他の実施形態では、ＯＰＡＣは、本明細書の他の場所で記載されている細胞特性または遺伝特性のいずれかを有する。
【０１２１】
５．１．３  ＯＰＡＣの培養
５．１．３．１  培地
細胞培養を開始または播種するのに、単離されたＯＰＡＣ、またはＯＰＡＣの集団を用いることができる。細胞は、無菌の組織培養容器へ一般に移される。容器は、好ましくはビトロネクチン、フィブロネクチンまたは両方でコーティングされる。特定の他の実施形態では、組織培養容器はコーティングされないか、または細胞外マトリックスもしくはリガンド、例えばラミニン、コラーゲン（例えば、天然のもしくは変性された）、ゼラチン、オルニチンおよび／または細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．））でコーティングされる。
【０１２２】
好ましくは、ＯＰＡＣは以下の通りに得られる。絨毛膜組織を、例えば上に述べたディスパーゼＩＩおよびコラゲナーゼＩＩで消化することによって得られる、ＯＰＡＣを含む絨毛膜細胞は、コラーゲン、ビトロネクチンまたはラミニンでコーティングされた組織培養表面で、例えば２０％ＦＢＳ／αＭＥＭ中で約１〜６日間最初に培養され、続いて、または付随して、非接着性細胞が除去される。非接着性細胞は、数回、例えば培養の３時間、１日および６日後に、または１回、例えば培養６日後に除去することができる。選択的接着の後、ＯＰＡＣは、例えばＣＤ２００に対する抗体を用いてＣＤ２００＋（非ｄｉｍ）細胞の除去によって選択され、ＣＤ２００ｄｉｍ／ＣＤ２００−細胞の集団が残る。
【０１２３】
ＯＰＡＣは、当技術分野で幹細胞の培養に許容されると認識されている、任意の培地および任意の条件で培養することができる。好ましくは、培地は血清を含む。ＯＰＡＣは、例えば、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノール酸−ウシ血清アルブミン）、デキストロース、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＬＧ（ダルベッコの改変基本培地、低グルコース）／ＭＣＤＢ２０１（ニワトリ線維芽細胞基礎培地）；１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−ＨＧ（高グルコース）；１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ；１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清およびヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地）；１０％ＦＢＳ、ＥＧＦおよびヘパリンを含むＭ１９９；１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ（最小基本培地）；１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むＤＭＥＭなどで培養することができる。好ましい培地は、２％ＦＢＳ、ＩＴＳ、ＬＡ＋ＢＳＡ、デキストロース、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−ＬＧ／ＭＣＤＢ−２０１である。
【０１２４】
ＯＰＡＣの培養に用いることができる他の培地には、ＤＭＥＭ（高もしくは低グルコース）、イーグルの基礎培地、ハムのＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムのＦ−１２培地（Ｆ１２）、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地、間葉幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＬｉｅｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、高度ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥが含まれる。
【０１２５】
培地は、例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ（ウマ）血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ））；β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つまたは複数の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；ならびに微生物汚染を制御する１つまたは複数の抗生物質および／または抗真菌薬、例えばペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシンおよびナイスタチンを単独あるいは併用で含む、１つまたは複数の成分で補うことができる。
【０１２６】
ＯＰＡＣは、標準の組織培養条件で、例えば組織培養皿または多重ウェルプレートで培養することができる。ＯＰＡＣは、懸滴法を用いて培養されてもよい。この方法では、ＯＰＡＣは約５ｍＬの培地に１ｍＬにつき約１×１０４個の細胞濃度で懸濁され、培地の１滴または数滴が、組織培養容器、例えば１００ｍＬペトリ皿の蓋の内部に置かれる。液滴は、例えば単一の液滴、または例えばマルチチャネルピペッタからの複数の液滴であってもよい。蓋を注意深く反転し、一定量の液体、例えば、培養皿の環境中の水分含量を維持するのに十分な無菌のＰＢＳを含む培養皿の底の上に置き、細胞を培養する。
【０１２７】
５．１．３．２  ＯＰＡＣの拡張（expansion）および増殖（proliferation）
単離されたＯＰＡＣ、または単離されたＯＰＡＣ集団（例えば、ＯＰＡＣまたはＯＰＡＣの集団がｉｎ  ｖｉｖｏで通常関連する絨毛膜細胞の少なくとも約５０％から分離されているＯＰＡＣまたはＯＰＡＣの集団）が得られると、そのＯＰＡＣまたはＯＰＡＣの集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖および拡張することができる。例えば、７０〜９０％のコンフルエントまで、すなわち、細胞およびそれらの後代が組織培養容器の培養表面積の７０〜９０％を占めるまで細胞が増殖するのに十分な時間、組織培養容器、例えば、培養皿、フラスコ、多重ウェルプレートなどでＯＰＡＣの集団を培養することができる。
【０１２８】
ＯＰＡＣは、細胞増殖を可能にする密度で培養容器に播種することができる。例えば、細胞は、低密度（例えば、１ｃｍ２につき細胞数約１，０００〜約５，０００）から高密度（例えば、１ｃｍ２につき細胞数約５０，０００以上）で播種されてもよい。好ましい実施形態では、細胞は、大気中の約０〜約５容量パーセントのＣＯ２で培養される。一部の好ましい実施形態では、細胞は、大気中の約２〜約２５パーセントのＯ２、好ましくは大気中の約５〜約２０パーセントのＯ２で培養される。細胞は、好ましくは約２５℃〜約４０℃、好ましくは３７℃で培養される。細胞は、好ましくはインキュベータで培養される。培地は、静置でも、または例えばバイオリアクターを用いて撹拌されてもよい。ＯＰＡＣは、好ましくは低い酸化ストレス（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなどの添加による）の下で増殖させる。
【０１２９】
７０％〜９０％のコンフルエントが得られると、細胞を継代培養することができる。例えば、細胞を当分野で周知の技術を用いて酵素処理、例えばトリプシン処理して、それらを組織培養表面から分離することができる。細胞をピペットで取り出して細胞を計数した後に、約２０，０００〜１００，０００個の細胞、好ましくは約５０，０００個の細胞を、新しい培地を含んでいる新しい培養容器で継代培養する。一般的に、新しい培地は、細胞を取り出したのと同じ種類の培地である。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０代、またはそれ以上継代培養された、胎盤細胞の集団が本明細書で提供される。
【０１３０】
５．１．３．３  ＯＰＡＣ集団
ＯＰＡＣの集団が、本明細書でさらに提供される。ＯＰＡＣは、１つまたは複数の胎盤からの絨毛膜から直接に単離することができる。本明細書で提供される単離されたＯＰＡＣを培養、拡張して、ＯＰＡＣの集団を生成することもできる。ＯＰＡＣを含む絨毛膜細胞の集団を培養、拡張して、ＯＰＡＣの集団を生成することもできる。
【０１３１】
本明細書で提供されるＯＰＡＣ集団は、ＯＰＡＣを、例えば本明細書に記載のＯＰＡＣを含む。様々な実施形態では、単離された細胞集団内の細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％は、ＯＰＡＣである。すなわち、ＯＰＡＣの集団は、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のＯＰＡＣ以外の細胞を含むことができる。
【０１３２】
例えば、特定のマーカーおよび／または特定の培養特性もしくは形態学的特性を発現する絨毛膜から細胞を選択することによって、単離されたＯＰＡＣの集団を生成する方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、例えば、細胞集団を生成する方法であって、基質に付着し、ＣＤ１０５を発現するがＣＤ２００を発現しない絨毛膜細胞を選択するステップと；他の絨毛膜細胞から前記細胞を単離して、細胞集団、例えばＯＰＡＣの集団を形成するステップとを含む前記方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＮＧ２＋、オステオプロテゲリン＋、α平滑筋アクチン陰性でもあり、および／または誘導可能なアルカリホスファターゼ活性を示すＣＤ１０５＋、ＣＤ２００−絨毛膜細胞が、他の絨毛膜細胞から単離される。
【０１３３】
上記の実施形態では、基質は、細胞、例えばＯＰＡＣの培養および／または選択を達成することができる、任意の表面であることができる。一般的に、基質は、プラスチック、例えば組織培養皿または多重ウェルプレートのプラスチックである。組織培養プラスチックは、生体分子、例えば、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲンまたはフィブロネクチンでコーティングすることができる。
【０１３４】
ＯＰＡＣ、およびＯＰＡＣの集団は、細胞選択の分野で公知である任意の手段によって選択することができる。例えば、細胞は、例えばフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳで、１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する１つまたは複数の抗体を用いて選択することができる。選択は、抗体を磁気ビーズと併用して達成することができる。特定の幹細胞関連のマーカーに特異的である抗体は、当技術分野で公知である。例えば、ＣＤ２００（Ａｂｃａｍ）またはＣＤ１０５（Ａｂｃａｍ；ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｃｏ、ＭＥ）などを用いて、ＯＰＡＣまたはＯＰＡＣの集団を選択することができる。
【０１３５】
ＯＰＡＣの集団は、ＯＰＡＣでない絨毛膜細胞、または絨毛膜細胞もしくはＯＰＡＣでない細胞を含むことができる。
【０１３６】
単離されたＯＰＡＣ集団は、非ＯＰＡＣ細胞または非絨毛膜細胞の１つまたは複数の集団と組み合わされてもよい。例えば、単離されたＯＰＡＣの集団は、血液（例えば、胎盤血または臍帯血）、血液由来の幹細胞（例えば、胎盤血または臍帯血に由来する幹細胞）、血液由来の有核細胞の集団、骨髄由来の間葉性細胞、骨由来の幹細胞集団、未精製の骨髄、成体（体細胞性）幹細胞、組織に含まれる幹細胞の集団、培養された幹細胞、完全分化細胞（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心細胞など）の集団などと組み合わせることができる。単離されたＯＰＡＣ集団の細胞は、各集団の総有核細胞数を比較して、約１００，０００，０００：１、５０，０００，０００：１、２０，０００，０００：１、１０，０００，０００：１、５，０００，０００：１、２，０００，０００：１、１，０００，０００：１、５００，０００：１、２００，０００：１、１００，０００：１、５０，０００：１、２０，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、２，０００：１、１，０００：１、５００：１、２００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：５００、１：１，０００、１：２，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：２０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１，０００，０００、１：２，０００，０００、１：５，０００，０００、１：１０，０００，０００、１：２０，０００，０００、１：５０，０００，０００または約１：１００，０００，０００の比で別の型の複数の細胞と組み合わせることができる。単離されたＯＰＡＣ集団の細胞は、複数の細胞型の複数の細胞とも組み合わせることができる。
【０１３７】
一実施形態では、単離されたＯＰＡＣの集団は、複数の造血幹細胞と組み合わせられる。そのような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血または末梢血に；胎盤血、臍帯血または末梢血からの総有核細胞に；胎盤血、臍帯血または末梢血からのＣＤ３４＋細胞の単離された集団に；未処理の骨髄に；骨髄からの総有核細胞に；骨髄からのＣＤ３４＋細胞の単離された集団などに含まれてもよい。
【０１３８】
５．１．４  ＯＰＡＣおよび胎盤灌流液または胎盤灌流液細胞の組合せ
単離された胎盤灌流液細胞および／または本明細書で提供されるＯＰＡＣとの胎盤灌流液の組合せが、本明細書で提供される。一実施形態では、例えば、複数の胎盤灌流液細胞および／または複数のＯＰＡＣで補われるある量の胎盤灌流液が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、例えば、胎盤灌流液の各１ミリリットルは、約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６またはそれ以上の胎盤灌流液細胞またはＯＰＡＣで補われる。別の実施形態では、複数の胎盤灌流液細胞は、胎盤灌流液および／またはＯＰＡＣで補われる。別の実施形態では、複数のＯＰＡＣは、胎盤灌流液および／または複数の胎盤灌流液細胞で補われる。特定の実施形態では、灌流液が補充のために用いられる場合、灌流液の容量は、細胞（液中）と灌流液の合計容量の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％または１％、またはそれを超えるかそれ未満である。胎盤灌流液細胞が複数のＯＰＡＣの補充のために用いられる場合、胎盤灌流液細胞は、一般に胎盤灌流液細胞とＯＰＡＣとの合計数の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％または１％、またはそれを超えるかそれ未満である。同様に、ＯＰＡＣが複数の胎盤灌流液細胞の補充のために用いられる場合、ＯＰＡＣは、一般に胎盤灌流液細胞とＯＰＡＣとの合計数の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％または１％、またはそれを超えるかそれ未満である。ＯＰＡＣまたは胎盤灌流液細胞が胎盤灌流液の補充のために用いられる場合、細胞が懸濁される液（例えば、食塩水、培地など）の容量は、灌流液と細胞との合計容量の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％または１％、またはそれを超えるかそれ未満であり、ここでＯＰＡＣは、補充より前に１ミリリットルにつき約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個またはそれ以上の細胞に懸濁される。
【０１３９】
２つ以上の原材料、例えば２つ以上の胎盤から得られて合わせられる、例えばプールされる、プールされた胎盤灌流液が本明細書でさらに提供される。そのようなプールされた灌流液は、各原材料からの約同等の量の灌流液を含むこと、または各原材料からの異なる量を含むことができる。各原材料からの相対量は、ランダムに選択すること、あるいは例えば１つまたは複数の細胞因子、例えばサイトカイン、増殖因子、ホルモンなどの濃度または量；各原材料からの灌流液中の胎盤細胞数；または各原材料からの灌流液の他の特性に基づくことができる。同じ胎盤の複数の灌流からの灌流液を、同様にプールすることができる。
【０１４０】
同様に、２つ以上の原材料、例えば２つ以上の胎盤および／または絨毛膜から得られてプールされる、胎盤灌流液細胞およびＯＰＡＣが本明細書で提供される。そのようなプールされた細胞は、２つ以上の原材料からの約同等数の細胞、またはプールされた原材料の１つまたは複数からの異なる数の細胞を含むことができる。各原材料からの細胞の相対数は、例えば、プールされる細胞中の１つまたは複数の特定の細胞型の数、例えばＣＤ３４−幹細胞などの数に基づいて選択されてもよい。
【０１４１】
プールは、例えば胎盤灌流液細胞を補った胎盤灌流液；ＯＰＡＣを補った胎盤灌流液；胎盤灌流液細胞およびＯＰＡＣの両方を補った胎盤灌流液；胎盤灌流液を補った胎盤灌流液細胞；ＯＰＡＣを補った胎盤灌流液細胞；胎盤灌流液およびＯＰＡＣの両方を補った胎盤灌流液細胞；胎盤灌流液を補ったＯＰＡＣ；胎盤灌流液細胞を補ったＯＰＡＣ；または胎盤灌流液細胞および胎盤灌流液の両方を補ったＯＰＡＣを含むことができる。
【０１４２】
特定の実施形態では、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞およびＯＰＡＣは、医薬用の投与可能な単位として提供される。そのような単位は、別々の量、例えば１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬなどで提供されてもよい。そのような単位は、例えば、胎盤灌流液細胞、胎盤灌流液由来の中間ナチュラルキラー細胞、または両方の特定数、例えば１ミリリットルにつき１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個またはそれ以上の細胞、あるいは１単位につき１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個またはそれ以上の細胞を含むように提供されてもよい。そのような単位は、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞および／またはＯＰＡＣの任意の２つまたは全３つの特定数を含むように提供されてもよい。
【０１４３】
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞および／またはＯＰＡＣの上記の組合せでは、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞および／またはＯＰＡＣのいずれか１つ、いずれか２つまたは全３つは、レシピエントに自己由来であること（すなわち、レシピエントから得ること）、またはレシピエントに相同であること（すなわち、前記レシピエントと異なる少なくとも１個体から得ること）ができる。
【０１４４】
ＯＰＡＣを胎盤灌流液細胞および／または胎盤灌流液と組み合わせて含む組成物も、本明細書で提供される。したがって、別の態様では、単離されたＯＰＡＣを含む組成物が本明細書で提供され、前記胎盤幹は胎盤灌流液から単離され、前記ＯＰＡＣは組成物中の細胞の少なくとも５０％を含む。具体的な実施形態において、前記ＯＰＡＣは、組成物中の細胞の少なくとも８０％を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は単離された胎盤灌流液を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液は、前記ＯＰＡＣと同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液は、前記ＯＰＡＣと異なる個体からの胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は、前記ＯＰＡＣと同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は、前記ＯＰＡＣと異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、組成物は、単離された胎盤灌流液および単離された胎盤灌流液細胞をさらに含み、前記単離された灌流液および前記単離された胎盤灌流液細胞は異なる個体に由来する。胎盤灌流液を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液は、少なくとも２個体からの胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも２個体に由来する。
【０１４５】
５．１．５  ＯＰＡＣ細胞バンクの生成
分娩後絨毛膜からのＯＰＡＣをいくつかの異なる方法で培養し、１セットのロット、例えば１セットの個々に投与可能な用量を生成することができる。複数の絨毛膜から得られるＯＰＡＣのロットセットは、例えば長期保管のためにＯＰＡＣのバンクに配備することができる。一般に、ＯＰＡＣは種培養を形成するための絨毛膜材料の初期培養から得られ、それは制御された条件下で拡張されて、約同等の回数の倍加から細胞集団を形成する。ロットは、好ましくは単一の胎盤の絨毛膜組織に由来するが、複数の胎盤の組織に由来してもよい。
【０１４６】
一実施形態では、ＯＰＡＣロットは以下の通りに得られる。絨毛膜組織を、例えば細断することによって先ず破壊し、適する酵素、例えばディスパーゼまたはディスパーゼおよびコラゲナーゼで消化する（上のセクション５．２．３を参照）。絨毛膜組織は、好ましくは、例えば単一の胎盤からの絨毛膜全体を含むが、絨毛膜の一部だけを含むことができる。消化された組織は、例えば約１〜３週間、好ましくは約２週間の間培養される。非接着性細胞の除去の後、形成される高密度コロニーを、例えばトリプシン処理によって収集する。これらの細胞を収集し、都合のよい容量の培地に再懸濁し、０代継代の細胞と定義する。
【０１４７】
０代継代の細胞は、拡張培養を播種するために次に用いられる。拡張培養は、別々の細胞培養装置、例えば、ＮＵＮＣ（商標）によるＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙの任意の配置であることができる。０代継代の培養の細胞は、拡張培養に、例えば１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４または１０×１０４個の細胞を播種するように、任意の程度に細分化することができる。好ましくは、約２×１０４〜約３×１０４個の０代継代の細胞が、各拡張培養に播種するために用いられる。拡張培養の数は、０代継代の細胞数に依存することができ、ＯＰＡＣが得られる特定の絨毛膜によって、数がより大きくなるかまたはより小さくなってもよい。
【０１４８】
培養細胞の密度が特定の値、例えば１ｃｍ２につき約１×１０５個の細胞に到達するまで、拡張培養を生育させる。細胞を収集し、この時点で凍結保存すること、または上に述べたように新しい拡張培養に継代培養することができる。細胞は、使用時までに例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０代の継代を経ることができる。好ましくは、個体数倍加の累積回数の記録が、拡張培養の間維持される。０代の継代培養からの細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０回の倍加、または最高６０の倍加回数拡張することができる。しかし好ましくは、細胞集団を個々の用量に分割する前の個体数倍加回数は、約１５〜約３０回、好ましくは約２０回の倍加である。細胞を拡張工程全体で連続的に培養すること、または拡張中の１時点または複数時点で凍結させることができる。
【０１４９】
個々の用量のために用いられる細胞は、後の使用のために凍結させること、例えば凍結保存することができる。個々の用量は、例えば１ｍｌにつき約１，０００，０００〜約１００，０００，０００個の細胞を含むことができ、合計で約１０６〜約１０９個の細胞を含むことができる。
【０１５０】
本方法の具体的な実施形態において、０代継代の細胞は、約４回の倍加の間培養され、次に第一の細胞バンクで冷凍される。第一の細胞バンクからの細胞は冷凍され、第二の細胞バンクに播種するために用いられ、その細胞はさらなる約８回の倍加の間拡張される。この段階の細胞を収集、冷凍し、さらなる約８回の倍加の間進行させられる新しい拡張培養に播種するために用い、細胞数倍加の累積回数を約２０回にする。以降の拡張培養で使用するために、継代培養の中間点の細胞を、１ｍｌにつき約１００，０００〜約１０，０００，０００個の細胞、好ましくは１ｍｌにつき約１，０００，０００個の細胞の単位で冷凍することができる。投与またはＯＰＡＣ含有組成物の作製に使用するために、約２０回の倍加の細胞を１ｍｌにつき約１，０００，０００〜約１００，０００，０００個の細胞の個々の用量で冷凍することができる。
【０１５１】
好ましい実施形態では、胎盤が得られるドナー（例えば、母親）は、少なくとも１つの病原体について検査される。検査の結果母親が検査病原体に陽性反応を示す場合、その胎盤からのロット全体は破棄される。そのような検査は、０代継代の細胞の確立の前か後を含むＯＰＡＣ細胞ロットの生成の間、または拡張培養の間の任意の時点で実施することができる。存在が検査される病原体には、非限定的に、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどを含めることができる。
【０１５２】
５．１．６  ＯＰＡＣの分化
ＯＰＡＣは、例えば骨形成性経路を下って分化するように誘導することができる。ＯＰＡＣの骨形成性分化は、例えば骨形成性細胞への分化を誘導する細胞培養条件にＯＰＡＣを置くことによって誘導することができる。好ましい骨細胞培地は、１５％臍帯血血清を補ったＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）またはＤＭＥＭを含み、その後に、０．１μＭデキサメタゾン、０．０５ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｍＭβグリセロリン酸を含む骨形成誘導培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）が続く。別の実施形態では、ＯＰＡＣは、約１０−７〜約１０−９Ｍデキサメタゾン、約１０〜５０μＭアスコルビン酸リン酸塩（例えば、アスコルビン酸−２−リン酸）および約１０ｎＭ〜約１０ｍＭβ−グリセロリン酸を含む培地（例えば、ＤＭＥＭ−低グルコース）で培養される。骨形成性培地は、血清、１つまたは複数の抗生物質／抗カビ剤、トランスフォーミング増殖因子−β（例えば、ＴＧＦ−β１）および／または骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはそれらの組合せ）を含むこともできる。
【０１５３】
分化は、カルシウム特異染色、例えばｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色、および例えば、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、骨シアロタンパク質および／またはオステオポンチン遺伝子発現のＲＴ／ＰＣＲ検出を用いて検査することができる。
【０１５４】
５．１．７  ＯＰＡＣの保存
ＯＰＡＣは、保存すること、すなわち、長期保管を可能にする条件、または例えば、アポトーシスもしくはネクローシスによる細胞死を阻害する条件の下に置くことができる。
【０１５５】
ＯＰＡＣは、例えば、「胎盤幹細胞を収集し、器官を保存するための改良培地」と題された、２００５年１２月２５日に出願の関連米国特許仮出願第６０／７５４，９６９号に記載のアポトーシス阻害剤、ネクローシス阻害剤および／または酸素運搬パーフルオロカーボンを含む組成物を用いて保存されてもよい。一実施形態では、ＯＰＡＣの集団を保存する方法であって、前記ＯＰＡＣの集団を、アポトーシス阻害剤および酸素運搬パーフルオロカーボンを含む細胞収集組成物と接触させるステップを含み、ここで前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触していないＯＰＡＣの集団と比較して、ＯＰＡＣの集団でアポトーシスを低減または阻止するのに十分な量および時間で存在する、前記方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態において、前記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記ＪＮＫ阻害剤は、前記ＯＰＡＣの分化または増殖を調節しない。別の実施形態では、前記細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬パーフルオロカーボンを別々の相に含む。別の実施形態では、前記細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬パーフルオロカーボンを乳剤に含む。別の実施形態では、細胞収集組成物は、乳化剤、例えばレシチンをさらに含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記パーフルオロカーボンは、ＯＰＡＣと接触する時点では約０℃〜約２５℃である。別のより具体的な実施形態では、ＯＰＡＣに接触する時点では、前記アポトーシス阻害剤および前記パーフルオロカーボンは、約２℃〜１０℃、または約２℃〜約５℃である。別のより具体的な実施形態では、前記接触は、前記ＯＰＡＣ集団の移動の間に実施される。別のより具体的な実施形態では、前記接触は、前記ＯＰＡＣ集団の冷凍および解凍の間に実施される。
【０１５６】
別の実施形態では、ＯＰＡＣの集団を保存する方法であって、前記ＯＰＡＣ集団をアポトーシス阻害剤および器官保存化合物と接触させるステップを含み、ここで前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触していないＯＰＡＣの集団と比較して、ＯＰＡＣの集団でアポトーシスを低減または阻止するのに十分な量および時間で存在する、前記方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態において、器官保存化合物は、ＵＷ液（米国特許第４，７９８，８２４号に記載；別名ＶｉａＳｐａｎ；Ｓｏｕｔｈａｒｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４９巻（２号）：２５１〜２５７頁（１９９０年）も参照）またはＳｔｅｒｎら、米国特許第５，５５２，２６７号に記載される液である。別の実施形態では、前記器官保存化合物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトバイオニック酸、ラフィノースまたはそれらの組合せである。別の実施形態では、細胞収集組成物は、２相でまたは乳剤として、酸素運搬パーフルオロカーボンをさらに含む。
【０１５７】
本方法の別の実施形態では、灌流の間、アポトーシス阻害剤および酸素運搬パーフルオロカーボン、器官保存化合物またはそれらの組合せを含む細胞収集組成物とＯＰＡＣを接触させる。別の実施形態では、組織破壊、例えば酵素消化の工程の間、前記ＯＰＡＣを接触させる。別の実施形態では、灌流による収集の後、または組織破壊、例えば酵素消化による収集の後、前記細胞収集化合物とＯＰＡＣを接触させる。
【０１５８】
一般的に、細胞の収集、濃縮および単離の間、低酸素および物理的なストレスによる細胞ストレスを最小化または除去することが好ましい。したがって本方法の別の実施形態では、前記保存の間、収集、濃縮または単離中の６時間未満の間、ＯＰＡＣを低酸素状態に曝露させ、そこにおいて、低酸素状態は、正常な血液酸素濃度未満である酸素濃度である。より具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣを、前記保存の間の２時間未満、前記低酸素状態に曝露させる。別のより具体的な実施形態では、収集、濃縮または単離の間、ＯＰＡＣを前記低酸素状態に１時間未満、もしくは３０分未満曝露させるか、または低酸素状態に曝露させない。別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣを、収集、濃縮または単離の間、剪断ストレスに曝露させない。
【０１５９】
本明細書で提供されるＯＰＡＣは、例えば小容器、例えばアンプル中の凍結保存培地で凍結保存することができる。適する凍結保存培地には、例えば増殖培地または細胞冷凍培地、例えば市販の細胞冷凍培地、例えばＣ２６９５、Ｃ２６３９またはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）を含む培地が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、凍結保存培地は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を、例えば約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む。凍結保存培地は、追加の剤、例えばメチルセルロースおよび／またはグリセロールを含むことができる。ＯＰＡＣは凍結温保存の間、好ましくは約１℃／分で冷却される。好ましい凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存細胞は、使用のために解凍する前に、液体窒素へ移されてもよい。一部の実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に到達したならば、それらは液体窒素保存領域へ移される。凍結保存細胞は、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度、好ましくは約３７℃の温度で解凍される。
【０１６０】
５．１．８  ＯＰＡＣを含む組成物
ＯＰＡＣまたはそれからの生体分子を含む組成物が、本明細書で提供される。本明細書で提供されるＯＰＡＣは、例えば研究または治療で使用するための、任意の生理的に許容されるかまたは医学的に許容される化合物、組成物または用具と組み合わせることができる。
【０１６１】
５．１．８．１  凍結保存されたＯＰＡＣ
後の使用のために本明細書で提供されるＯＰＡＣの集団を保存すること、例えば凍結保存することができる。細胞、例えばＯＰＡＣの凍結保存方法は、当技術分野で周知である。ＯＰＡＣ集団は、個体に容易に投与可能である形態で調製することができる。例えば、医療用に適する容器に含まれるＯＰＡＣ集団が本明細書で提供される。そのような容器は、例えば、ＯＰＡＣ集団を容易に排出させることができる無菌のプラスチックバッグ、フラスコ、ジャーまたは他の容器であることができる。例えば、容器は、レシピエントへの液体の静脈内投与に適する血液バッグ、または他のプラスチック製の医学的に許容されるバッグであることができる。容器は、好ましくは、組み合わせた細胞集団の凍結保存を可能にするものである。
【０１６２】
凍結保存されたＯＰＡＣ集団は、単一のドナー、または複数のドナーに由来するＯＰＡＣを含むことができる。ＯＰＡＣの集団は、目的のレシピエントとＨＬＡが完全に一致するか、または部分的もしくは完全にＨＬＡが不一致であってもよい。
【０１６３】
したがって一実施形態では、容器にＯＰＡＣの集団を含む組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態において、集団は凍結保存される。別の具体的な実施形態では、容器はバッグ、フラスコまたはジャーである。より具体的な実施形態では、前記バッグは、無菌のプラスチックバッグである。より具体的な実施形態では、前記バッグは、ＯＰＡＣ集団の静脈内投与に適するか、それを可能にするかまたは促進する。バッグは、投与の前または投与中にＯＰＡＣおよび１つまたは複数の他の溶液、例えば薬剤の混合を可能にするために相互接続されている、複数の内腔または小室を含むことができる。別の具体的な実施形態では、組成物は、細胞集団の凍結保存を促進する１つまたは複数の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣ集団は、生理的に許容される水溶液中に含まれる。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容される水溶液は、０．９％ＮａＣｌ液である。別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣ集団は、前記集団のレシピエントとＨＬＡが一致する胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣ集団は、前記集団のレシピエントと少なくとも部分的にＨＬＡが不一致である細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣは、複数のドナーに由来する。
【０１６４】
５．１．８．２  医薬組成物
ＯＰＡＣの集団、またはＯＰＡＣを含む細胞集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための医薬組成物に製剤化することができる。そのような医薬組成物は、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための薬学的に許容される担体、例えば食塩水または他の認められた生理的に許容される溶液に含む。本明細書で提供される医薬組成物は、本明細書の他の場所に記載されるＯＰＡＣ集団のいずれかを含むことができる。医薬組成物は、胎児、母体、または胎児および母体の両方のＯＰＡＣを含むことができる。本明細書で提供される医薬組成物は、単一の個体もしくは絨毛膜から、または複数の個体もしくは絨毛膜から得られるＯＰＡＣをさらに含むことができる。
【０１６５】
本明細書で提供される医薬組成物は、治療的に役立つ任意の数のＯＰＡＣを含むことができる。例えば、様々な実施形態において、ＯＰＡＣの単一の単位用量は、約、少なくとも、または最大で１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個またはそれ以上のＯＰＡＣを含むことができる。
【０１６６】
本明細書で提供される医薬組成物は、５０％以上の生存細胞を含む細胞集団（すなわち、集団中の細胞の少なくとも約５０％は機能的であるかまたは生存している）を含むことができる。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも約６０％は生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％または９９％は生存可能である。
【０１６７】
本明細書で提供される医薬組成物は、例えば移植を容易にする１つまたは複数の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制薬など）；アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプンなどの安定剤を含むことができる。
【０１６８】
５．１．８．３  ＯＰＡＣ馴化培地
本明細書で提供されるＯＰＡＣは、馴化培地、すなわち、細胞によって分泌または排出される１つまたは複数の生体分子を含む培地を生成するために用いることができる。様々な実施形態では、馴化培地は、ＯＰＡＣが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日またはそれ以上の間増殖した培地を含む。他の実施形態では、馴化培地は、ＯＰＡＣが少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のコンフルエント、または最高１００％のコンフルエントまで増殖した培地を含む。そのような馴化培地は、ＯＰＡＣの別々の集団、または別の種類の幹細胞の培養をサポートするために用いることができる。別の実施形態では、馴化培地は、ＯＰＡＣが最終的に分化した細胞型、または最終的に分化した細胞の１つまたは複数の特性を有する細胞に分化した培地を含む。別の実施形態では、本明細書で提供される馴化培地は、ＯＰＡＣおよびＯＰＡＣ以外のものが培養された培地を含む。
【０１６９】
５．１．８．４  ＯＰＡＣを含むマトリックス
ＯＰＡＣまたはＯＰＡＣの集団を含むマトリックス、ヒドロゲル、足場などが、本明細書でさらに提供される。特定の実施形態では、マトリックスは、骨欠損の治療に有用であることが当分野の技術者に公知である、任意の基質であることができる。例えば、マトリックスは、β−リン酸三カルシウム基質、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、無機物化コラーゲン基質およびヒアルロン酸基質であることができる。一部の実施形態では、マトリックス中のコラーゲンは、胎盤コラーゲンであってもよい。胎盤コラーゲンを単離、調製するための方法および組成物は、例えば米国特許出願公開第２００７／００２０２２５号に広く記載され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
ＯＰＡＣは、分化段階の前または後に、骨を治療するためのマトリックスに播種することができる。例えば、ＯＰＡＣを、例えば骨形成性の培地に、例えば約１〜２０日間培養し、次にマトリックスに播種することができる。あるいは、ＯＰＡＣを単離してマトリックスの上に播種し、次に、例えば約１〜２０日間、本明細書に記載の骨形成性培地で培養することができる。別の実施形態では、ＯＰＡＣを、例えば骨形成性培地で例えば約１〜２０日間培養し、次にマトリックスに播種し、次に、本明細書に記載の骨形成性培地で、例えば約１〜２０日間培養する。
【０１７１】
ＯＰＡＣは、天然のマトリックス、例えば羊膜物質などの胎盤生体材料に播種することができる。そのような羊膜物質は、例えば、哺乳動物の胎盤から直接に切開される羊膜；固定または熱処理された羊膜、実質的に乾燥した（すなわち、＜２０％Ｈ２Ｏ）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜および絨毛膜などでよい。ＯＰＡＣを播種することができる好ましい胎盤生体材料は、Ｈａｒｉｒｉ、米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号に記載されている。
【０１７２】
本明細書で提供されるＯＰＡＣは、例えば注射に適するヒドロゲル溶液に懸濁させることができる。そのような組成物に適するヒドロゲルには、ＲＡＤ１６などの自己集合ペプチドが含まれる。一実施形態では、細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えば型の中で硬化させて、移植のためにその中に分散させた細胞を有するマトリックスを形成することができる。そのようなマトリックス中のＯＰＡＣは、移植前に細胞が有糸分裂的に拡張されるように培養することもできる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合または水素結合を通して架橋され、水分子を閉じ込めてゲルを形成する三次元の開放格子構造を生成する有機ポリマー（天然または合成の）である。ヒドロゲル形成性物質には、多糖類、例えばアルギン酸およびその塩、ペプチド、ポリホスファジン、ならびにイオン的に架橋されるポリアクリレート、またはポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体などのブロックポリマーが含まれ、それらはそれぞれ温度もしくはｐＨによって架橋される。一部の実施形態では、ヒドロゲルまたはマトリックスは生物分解性である。
【０１７３】
一部の実施形態では、製剤はｉｎ  ｓｉｔｕで重合可能なゲルを含む（例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号；Ａｎｓｅｔｈら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、７８巻（１〜３号）：１９９〜２０９頁（２００２年）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２４巻（２２号）：３９６９〜８０頁（２００３年）を参照）。
【０１７４】
一部の実施形態では、ポリマーは、荷電側鎖またはその一価のイオン性塩を有する、水、緩衝塩溶液または水性アルコール溶液などの水溶液に少なくとも部分的に溶解性である。カチオンと反応させることができる酸性側鎖を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸およびメタクリル酸の共重合体、ポリ（酢酸ビニル）、ならびにスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリルまたはメタクリル酸、およびビニルエーテルモノマーまたはポリマーの反応によって形成される酸性側鎖を有する共重合体を用いることもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ化）アルコール基、フェノールＯＨ基および酸性ＯＨ基である。
【０１７５】
ＯＰＡＣまたはその集団は、三次元のフレームワークまたは足場に播種し、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植することができる。そのようなフレームワークは、組織形成を刺激するかさもなければ組織修復を強化もしくは改善する、任意の１つまたは複数の増殖因子、細胞、薬剤または他の成分と一緒に移植することができる。
【０１７６】
用いることができる足場の例には、不織布マット、多孔性フォームまたは自己集合ペプチドが含まれる。不織布マットは、グリコール酸および乳酸の合成吸収性共重合体（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）からなる線維を用いて形成することができる。例えばポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）共重合体で構成され、凍結乾燥または真空凍結乾燥などの工程によって形成されるフォーム（例えば米国特許第６，３５５，６９９号を参照）を、足場として用いることもできる。
【０１７７】
本明細書で提供されるＯＰＡＣは、それらに限定されないが、モノ−、ジ−、トリ−、α−トリ−、β−トリ−およびテトラ−カルシウムホスフェート、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）などの生物活性ガラス、およびそれらの混合物を含む、生理的に許容されるセラミック物質に播種すること、または接触させることもできる。現在市販されている多孔性生体適合性セラミック物質には、ＳＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｎａｄａ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ、ＡＧ、Ｂｅｔｔｌａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ならびに無機物化コラーゲン骨移植製品、例えばＨＥＡＬＯＳ（商標）（Ｄｅｐｕｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｙｎｈａｍ、ＭＡ）およびＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（商標）およびＣＯＲＴＯＳＳ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐａ．）が含まれる。フレームワークは、天然および／または合成物質の混合物、ブレンドまたは複合物でもよい。
【０１７８】
別の実施形態では、ＯＰＡＣは、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬの共重合体もしくはブレンド、またはヒアルロン酸などの生体吸収性物質から作製されるマルチフィラメント糸で構成することができるフェルトに播種すること、または接触させることができる。
【０１７９】
本明細書で提供されるＯＰＡＣは、別の実施形態では、複合構造物であることができるフォーム足場に播種されてもよい。そのようなフォーム足場は、修繕、置換または増強される体内の特定の構造の一部の形状などの、有用な形に成型することができる。一部の実施形態では、細胞付着を高めるために、フレームワークを、例えば０．１Ｍの酢酸で処理し、続いてポリリジン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲンにインキュベートし、その後ＯＰＡＣを植え付ける。マトリックスの外表面は、例えばマトリックスをプラズマコーティングすることによって、または１つまたは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、硫酸ヘパリン、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ケラチンなど）、細胞マトリックスおよび／または他の材料、例えば、それらに限定されないがゼラチン、アルギン酸、寒天、アガロースおよび植物ゴムなどの添加によって、細胞の付着もしくは増殖および組織の分化を改善するために改変されてもよい。
【０１８０】
一部の実施形態では、足場は、それを非血栓形成性にする物質を含むか、またはそれで処理される。これらの処理および物質は、内皮増殖、移動および細胞外マトリックス沈着を促進および持続させることもできる。これらの物質および処理の例には、それらに限定されないが、基底膜タンパク質などの天然物質、例えばラミニンおよびＩＶ型コラーゲン、合成物質、例えばＥＰＴＦＥおよびセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えばＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。足場は、ヘパリンなどの抗血栓薬を含むこともできる。足場は、ＯＰＡＣによる播種の前に、表面電荷を変化させるために処理する（例えば、プラズマでコーティングする）こともできる。足場は、骨増殖を刺激し、および／または骨吸収を阻害する剤をさらに含むことができる。例えば、足場は、骨形態形成タンパク質、例えばＢＭＰ−２および／またはＢＭＰ−７、ＷＮＴ阻害剤などを含むことができる。
【０１８１】
５．１．９  不死化ＯＰＡＣ細胞系
増殖促進タンパク質の生成および／または活性が外部因子によって調節可能であるように、ＯＰＡＣは、増殖促進遺伝子、すなわち適当な条件下でトランスフェクトされた細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の適するベクターによるトランスフェクションで、条件つきで不死化することができる。好ましい実施形態では、増殖促進遺伝子は、オンコジーン、例えばそれらに限定されないが、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ポリオーマラージＴ抗原、Ｅ１ａアデノウイルスまたはヒト乳頭腫ウイルスのＥ７タンパク質である。
【０１８２】
増殖促進タンパク質の外部調節は、外部調節可能なプロモーター、例えばその活性を、例えばトランスフェクトされる細胞の温度または細胞と接触する培地の組成を変更することによって調節することができるプロモーターの支配下に増殖促進遺伝子を置くことによって達成することができる。一実施形態では、テトラサイクリン（ｔｅｔ）制御遺伝子発現系を用いることができる（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９巻：５５４７〜５５５１頁、１９９２年；Ｈｏｓｈｉｍａｒｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻：１５１８〜１５２３頁、１９９６年を参照）。ｔｅｔの不在下で、このベクター中のｔｅｔによって制御されるトランス活性化因子（ｔＴＡ）は、ｔｅｔオペレータ配列に融合しているヒトサイトメガロウイルスからの最小限のプロモーターである、ｐｈＣＭＶ＊−１からの転写を強力に活性化する。ｔＴＡは、大腸菌のトランスポゾン−１０由来のｔｅｔ耐性オペロンのリプレッサー（ｔｅｔＲ）および単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６の酸性ドメインの融合タンパク質である。ｔｅｔの低い、無毒性の濃度（例えば、０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）は、ｔＴＡによるトランス活性化をほとんど完全に消滅させる。
【０１８３】
一実施形態では、ベクターは、選択可能なマーカー、例えば薬剤耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。細菌のネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）は、本明細書で記載されるように使用することができるそのようなマーカーの１つである。ｎｅｏＲを保有する細胞は、増殖培地への例えば１００〜２００μｇ／ｍＬのＧ４１８の添加などの、当分野の技術者に公知である手段によって選択することができる。
【０１８４】
トランスフェクションは、それに限定されないがレトロウイルス感染を含む、当分野の技術者に公知である様々な手段のいずれかによって達成することができる。一般に、細胞培養は、ベクターの生産細胞系から収集される馴化培地、およびＮ２補助剤を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２の混合物とのインキュベーションによってトランスフェクトすることができる。例えば、上に述べたように調製された胎盤細胞培養は、例えば５日後にインビトロで、１容の馴化培地および２容のＮ２補助剤含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で約２０時間のインキュベーションによって感染させることができる。次に、選択可能なマーカーを保有するトランスフェクトされた細胞を、上に述べたように選択することができる。
【０１８５】
トランスフェクションに続いて、増殖を可能にする、例えば２４時間の間に細胞の少なくとも約３０％を倍加させる表面に培養を継代培養する。好ましくは、基質は、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）および／またはラミニン（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基質、ポリリジン／ラミニン基質またはフィブロネクチンで処理された表面である。次に、培養物に３〜４日ごとに、１つまたは複数の増殖増強因子を補っても補わなくてもよい増殖培地を供給する。増殖増強因子は、培養が５０％未満のコンフルエントである場合に、増殖培地に加えてもよい。
【０１８６】
８０〜９５％のコンフルエントである場合、条件的に不死化されたＯＰＡＣ細胞系を、標準の技術を用いて、例えばトリプシン処理によって継代培養することができる。約第２０代の継代までは、一部の実施形態では、選択（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞のＧ４１８の添加によって）を維持することが有益である。細胞は、長期保管のために液体窒素で冷凍することもできる。
【０１８７】
クローン細胞系は、上に述べたように調製された条件的に不死化されたヒトＯＰＡＣ細胞系から単離することができる。一般に、そのようなクローン細胞系は、標準の技術を用いて、例えば限定希釈によって、またはクローニング環を用いて単離し、拡張することができる。クローン細胞系は、一般に上に述べたように供給し、継代培養することができる。
【０１８８】
その必要はないがクローンであってもよい条件的に不死化されたヒトＯＰＡＣ細胞系は、分化を促進する培養条件下で増殖促進タンパク質の生成および／または活性を抑制することによって分化するように誘導することが一般にできる。例えば、増殖促進タンパク質をコードする遺伝子が外部的に調節可能なプロモーターの支配下にある場合、条件、例えば培地の温度または組成は、増殖促進遺伝子の転写を抑制するために改変することができる。上で述べたテトラサイクリンによって制御される遺伝子発現系については、増殖促進遺伝子の転写を抑制するためのテトラサイクリンの添加によって分化を達成することができる。一般に、分化を開始するのに４〜５日間の１μｇ／ｍＬテトラサイクリンで十分である。さらなる分化を促進するために、追加の剤が増殖培地に含まれてもよい。
【０１８９】
５．１．１０  アッセイ
ＯＰＡＣの増殖、拡張および／または分化に及ぼす培養条件、環境要因、分子（例えば、生体分子、小さな無機分子など）その他の影響を、そのような条件に曝露させられないＯＰＡＣと比較して判定するために、本明細書で提供されるＯＰＡＣをアッセイで用いることができる。
【０１９０】
好ましい実施形態では、本明細書で提供されるＯＰＡＣは、分子と接触した後の増殖、拡張または分化の変化について分析される。例えば、骨形成性分化は、アルカリホスファターゼ活性および／またはカルシウム無機質化を監視することによって分析することができる。
【０１９１】
例えば一実施形態では、複数のＯＰＡＣの増殖を調節する化合物を同定する方法であって、増殖を可能にする条件下で前記複数のＯＰＡＣを前記化合物と接触させるステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記化合物が、前記化合物と接触しない複数のＯＰＡＣと比較して前記複数のＯＰＡＣの増殖の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物はＯＰＡＣの増殖を調節する化合物と同定される。具体的な実施形態において、前記化合物は、増殖阻害剤として同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は、増殖エンハンサーとして同定される。
【０１９２】
別の実施形態では、複数のＯＰＡＣの拡張を調節する化合物を同定する方法であって、拡張を可能にする条件下で前記複数のＯＰＡＣを前記化合物と接触させるステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記化合物が、前記化合物と接触しない複数のＯＰＡＣと比較して前記複数のＯＰＡＣの拡張の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物はＯＰＡＣの拡張を調節する化合物と同定される。具体的な実施形態において、前記化合物は、拡張阻害剤と同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は、拡張エンハンサーと同定される。
【０１９３】
別の実施形態において、ＯＰＡＣの分化を調節する化合物を同定する方法であって、分化を可能にする条件下で前記ＯＰＡＣを前記化合物と接触させるステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記化合物が、前記化合物と接触しないＯＰＡＣと比較して前記ＯＰＡＣの分化の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物はＯＰＡＣの増殖を調節する化合物と同定される。具体的な実施形態において、前記化合物は、増殖阻害剤と同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は、増殖エンハンサーと同定される。
【０１９４】
５．２  ＯＰＡＣの使用
５．２．１  ＯＰＡＣを用いる骨関連の癌の治療
個体にＯＰＡＣの治療的有効量を投与することを含む、骨関連の癌を有する当該個体を治療する方法が本明細書で提供される。骨関連の癌には、それらに限定されないが、多発性骨髄腫、骨癌、乳癌、肺癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、転移性癌、多発性骨髄腫、および骨転移を特徴とする任意の型の転移癌が含まれる。特定の実施形態では、ＯＰＡＣの投与は、骨関連の癌に関連する１つまたは複数の症状、例えば個体の１つまたは複数の骨に対する癌の影響に起因または関係する症状を軽減、改善するかまたは後退させるのに治療的に有効である。当分野の技術者が認識するように、癌に起因する骨欠損の治療は、癌自体を必ずしも寛解しないことがある。本明細書で提供される癌関連の骨欠損の治療は、下で述べるように、追加の癌療法の前、後またはそれに並行して起こることができる。したがって、一実施形態では、骨欠損は、癌が抗癌療法で治療される前に治療される。別の実施形態では、骨欠損は、癌が抗癌療法で治療されるのと同じ時間またはその近くで治療される。別の実施形態では、骨欠損は、癌が抗癌療法で治療された後に治療される。
【０１９５】
特定の実施形態では、骨関連の癌、例えば多発性骨髄腫の治療は、骨関連の癌細胞、例えば多発性骨髄腫細胞を有する個体にＯＰＡＣの治療的有効量を投与することを含み、前記ＯＰＡＣの少なくとも一部は、少なくともいくつかの多発性骨髄腫細胞に直接接触し、例えば、前記ＯＰＡＣの少なくとも一部と前記骨関連癌細胞の一部との間に直接的な細胞間接触がある。特定の他の実施形態では、骨関連の癌、例えば多発性骨髄腫の治療は、骨関連の癌細胞、例えば多発性骨髄腫細胞を有する個体にＯＰＡＣの治療的有効量を投与することを含み、前記ＯＰＡＣのいずれも、または実質的にいずれも多発性骨髄腫細胞に直接接触せず、例えば、前記ＯＰＡＣの少なくとも一部と骨関連癌細胞との間に直接的な細胞間接触は全く、または実質的にない。
【０１９６】
特定の実施形態では、ＯＰＡＣは病巣内に、例えば癌に起因する１つまたは複数の骨病巣に直接に、またはそれに隣接して（例えば、その１〜５ｃｍ内に）投与される。特定の実施形態では、ＯＰＡＣはマトリックスと、例えば注射可能なマトリックスと一緒に投与される。
【０１９７】
特定の他の実施形態では、ＯＰＡＣは、固体マトリックス、例えば下のセクション５．２．２に記載の骨代用品、マトリックスまたは骨代用品と一緒に、骨関連の癌を有する個体に投与される。
【０１９８】
特定の他の実施形態では、ＯＰＡＣは個体に静脈内投与される。ＯＰＡＣは、任意の容器から、流体、例えば細胞を含む流体のデリバリーのために医学的に適する任意のデリバリー系によって個体に投与することができる。そのような容器は、例えば、ＯＰＡＣ集団を容易に排出させることができる無菌のプラスチックバッグ、フラスコ、ジャーまたは他の容器であることができる。例えば、容器は、レシピエントへの液体の静脈内投与に適する血液バッグ、または他のプラスチック製の医学的に許容されるバッグであることができる。
【０１９９】
病巣内または静脈内投与は、単一用量中に、例えば約、少なくとも、または最大で１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個またはそれ以上のＯＰＡＣを含むことができる。療法の過程で、ＯＰＡＣは１回または複数回投与されてもよい。好ましくは、投与されるＯＰＡＣは、５０％以上の生存細胞を含む（すなわち、集団中の細胞の少なくとも約５０％は機能的であるかまたは生存している）。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも約６０％は生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％または９９％は生存可能である。
【０２００】
５．２．１．１  多発性骨髄腫の治療
多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、前記個体に複数のＯＰＡＣを投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、前記ＯＰＡＣは上のセクション５．１に記載の特性の任意の組合せまたはすべてを有する。具体的な実施形態では、前記複数のＯＰＡＣは、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００ｄｉｍ、またはＣＤ１０５＋およびＣＤ２００−である。本明細書で提供される治療方法は、上のセクション５．１に記載されるＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団のいずれかの使用を包含する。
【０２０１】
多発性骨髄腫は、免疫系の抗体産生細胞である形質細胞の癌である。この疾患は、一般的に４つの主な特徴、すなわち高カルシウム、腎不全、貧血および骨病変を表す。これらの症状その他を、下で述べる。
【０２０２】
骨痛−骨髄腫細胞は、骨を破壊するように破骨細胞を活性化して有痛性の骨病変を起こすサイトカインである、破骨細胞活性化因子（ＯＡＦ）としても知られるＩＬ−６を分泌する。これらの骨病変は性質が溶解性であり、ラジオグラフで見ることができ、それは「穴のあいた」吸収性病巣を示すことがある。骨髄腫骨痛は、通常脊柱および肋骨を巻き込み、活動で悪化する。持続的な限局性疼痛が存在することがあり、病理学的骨折を示すことがある。脊柱の関与は、脊髄圧迫をもたらすことがある。骨の破壊は、血液へのカルシウムの放出にもつながり、高カルシウム血症およびその関連症状をもたらす。
【０２０３】
骨格の調査で観察される骨の破壊領域は、骨の１つまたは複数の溶解性病変、すなわち骨が存在しないかまたは「穴のあいた」ように見える領域として一般的に現れる。
【０２０４】
感染−免疫系が破壊されるので、多発性骨髄腫の別の一般的な症状は、感染である。感染の危険の増加は、正常抗体の生成の減少および破壊の増加によるび漫性の低ガンマグロブリン血症から生じる免疫不全に起因する。最も一般的な感染は、肺炎および腎盂腎炎である。多発性骨髄腫患者で疾患を引き起こす一般的な肺炎病原体には肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌および肺炎桿菌が含まれ、腎盂腎炎を引き起こす一般的な病原体には大腸菌が含まれる。一般的に、感染は、化学療法の開始から最初の数カ月で起こる。
【０２０５】
腎不全−多発性骨髄腫は、腎不全をもたらす傾向もあり、それは急性および慢性的に発達することがある。多発性骨髄腫での腎不全は、破骨細胞が既存の骨を解体するにしたがって発達する高カルシウム血症にほとんど起因する。腎不全は、Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓタンパク質とも呼ばれる軽鎖の排出が起こす尿細管の損傷にも起因し、それはファンコニ症候群（ＩＩ型腎尿細管性アシドーシス）として現れることがある。他の原因には、アミロイドの糸球体沈着、高尿酸血、再発性の感染（例えば、腎盂腎炎）および腫瘍細胞の局所浸潤が含まれる。腎不全は、血清クレアチニンレベルの上昇に関連することもある。
【０２０６】
貧血−骨髄腫で見られる貧血は、通常正球性および正色素性であり、浸潤性腫瘍細胞による正常な骨髄の置換およびサイトカインによる正常な赤血球生成（造血）の阻害から生じる。
【０２０７】
神経の症状−多発性骨髄腫の症状には、高カルシウム血性頭痛による虚弱、混乱および倦怠、視覚的変化および網膜症を含む広範囲の神経学的状態が含まれ、それらはパラプロテイン（下記参照）の特性に依存する血液の過粘稠の結果であることがある。他の神経学的症状には、根性痛、腸または膀胱のコントロールの喪失（例えば、脊髄圧迫をもたらす脊髄の関与による）、および手根管圧迫症候群および他の神経障害（例えば、アミロイドによる末梢神経の浸潤による）が含まれる。多発性骨髄腫は、後期発症事例では、対麻痺を引き起こすことがある。
【０２０８】
パラプロテインの存在−多発性骨髄腫の診断上の症状は血液および／または尿中のパラプロテインの存在であり、それは、モノクローナルタンパク質（Ｍタンパク質）、例えば、形質細胞のクローン増殖によって生成される免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン断片のことである。
【０２０９】
症候性の多発性骨髄腫は、一般的に以下の症状または徴候が存在する場合に診断される：骨髄生検で、または他の組織（例えば、形質細胞腫）からの生検の任意の量において、細胞の１０％超を構成するクローン形質細胞；血清または尿中のパラプロテイン；末端器官損傷（関連する器官または組織の障害）の証拠、例えば、高カルシウム血症（例えば、血液中の補正カルシウム＞２．７５ｍｍｏｌ／Ｌ）、骨髄腫に起因しうる腎機能不全、ヘモグロビン＜１０ｇ／ｄＬ血液と定義される貧血、骨病変（例えば、圧迫骨折を伴う溶解性病変または骨粗鬆症）、頻発する重度感染症（年に２回を超える）、他の臓器のアミロイド症（アミロイドタンパク質の沈着）、および過粘着性症候群（血液粘度の増加）。
【０２１０】
多発性骨髄腫を有する個体は、以下の群のうちの１つに分類される。一実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体は、その疾患のためにこれまで治療されていない。別の実施形態では、その個体は応答性の骨髄腫、すなわち療法に応答する多発性骨髄腫を有する。具体的な実施形態において、そのような個体は、治療の結果として少なくとも５０％のＭタンパク質（パラプロテイン）の減少を示す。別の具体的な実施形態では、その個体は、治療の結果として２５％〜５０％のＭタンパク質の減少を示す。別の実施形態では、その個体は安定した多発性骨髄腫を有し、それは、治療に応答していない（例えば、Ｍタンパク質の減少が５０％に到達していない）が、進行または悪化していない骨髄腫を指す。別の実施形態では、その個体は、進行性の多発性骨髄腫を有し、それは、悪化する（例えば、Ｍタンパク質の増加および器官もしくは組織障害の悪化または末端器官の損傷）活性骨髄腫を指す。別の実施形態では、その個体は再発性の多発性骨髄腫を有し、それは、当初は療法に応答したが、その後再び進行を始めた骨髄腫疾患を指す。具体的な実施形態では、その個体は最初の療法後に再発したか、または以降の療法後に再発した。別の実施形態では、その個体は、治療抵抗性の多発性骨髄腫を有する。具体的な実施形態において、治療抵抗性の多発性骨髄腫は、最初の療法に応答しなかった多発性骨髄腫である。別の具体的な実施形態では、治療抵抗性の多発性骨髄腫は、以降の治療に応答しなかった再発性の多発性骨髄腫である。別の具体的な実施形態では、治療抵抗性の多発性骨髄腫は、非応答性の進行性治療抵抗性疾患であり、それは、進行する治療抵抗性の疾患を指す。別の具体的な実施形態では、治療抵抗性の多発性骨髄腫は、非応答性の非進行性治療抵抗性疾患であり、それは、悪化しない治療抵抗性の疾患を指す。
【０２１１】
したがって、一実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、その個体にＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団を投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記投与は、多発性骨髄腫の１つまたは複数の症状の進行の検出可能な低下、悪化の検出可能な停止、および／または検出可能な改善をもたらす。具体的な実施形態では、前記１つまたは複数の症状は、正常なものと比較して上昇した血中もしくは尿中のカルシウム、骨病変の存在、貧血または腎不全を含む。より具体的な実施形態では、前記１つまたは複数の症状は、骨髄生検で、もしくは他の組織（例えば、形質細胞腫）からの生検の任意の量において、細胞の１０％超を構成するクローン形質細胞、血清または尿中のパラプロテイン、および／または末端器官損傷の証拠を含む。より具体的な実施形態では、前記１つまたは複数の症状は、２．７５ｍｍｏｌ／Ｌを超える血中カルシウム濃度、腎機能不全、１デシリットルの血液につき１０ｇ未満のヘモグロビン、骨病変の存在、または骨髄以外の１つまたは複数の器官のアミロイド症である。
【０２１２】
別の具体的な実施形態では、前記症状は、神経症状である。より具体的な実施形態では、前記神経症状は、虚弱、混乱、倦怠、頭痛、視覚的変化、網膜症、根性痛、腸もしくは膀胱のコントロールの喪失、手根管圧迫症候群および／または対麻痺である。
【０２１３】
具体的な実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、その個体にＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団を投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記投与は、個体の１つまたは複数の器官での、多発性骨髄腫細胞、例えばクローン多発性骨髄腫細胞の数の検出可能な減少をもたらす。
【０２１４】
具体的な実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、その個体にＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団を投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記投与は、個体の血中ヘモグロビンの検出可能な増加、例えば正常範囲への増加をもたらす。下の表１に示すように、正常なヘモグロビンレベルは、個体の年齢および性別によって異なる。
【０２１５】
【表１】
2012500792.tif 000003
【０２１６】
したがって、より具体的な実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、その個体にＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団を投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記投与は、前記個体において１１ｇ／ｄＬ血液〜２０ｇ／ｄＬ血液への血中ヘモグロビンレベルの増加をもたらす。より具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体において１１ｇ／ｄＬ血液〜１３ｇ／ｄＬ血液への血中ヘモグロビンレベルの増加をもたらす。別のより具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体において１２ｇ／ｄＬ血液〜１６ｇ／ｄＬ血液への血中ヘモグロビンレベルの増加をもたらす。より具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体において１４ｇ／ｄＬ血液〜１８ｇ／ｄＬ血液への血中ヘモグロビンレベルの増加をもたらす。
【０２１７】
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、その個体にＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団を投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記投与は、前記個体からの血中または尿中のパラプロテインレベルの検出可能な低下をもたらす。具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体の血中または尿中パラプロテインの、検出不能レベルへの低下をもたらす。
【０２１８】
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、その個体にＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団を投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記投与は、例えば骨スキャンまたはＸ線撮影による判定で、前記個体で多発性骨髄腫によって引き起こされる骨病変の重症度および／または数の検出可能な低減をもたらす。別の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、その個体にＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団を投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記投与は、前記個体で、骨質量もしくは骨ミネラル含量の減少の検出可能な低減、骨質量もしくは骨ミネラル含量の減少の停止、または骨質量もしくは骨ミネラル含量の増加をもたらす。
【０２１９】
治療方法の別の具体的な実施形態では、多発性骨髄腫の前記１つまたは複数の症状は、骨痛、骨細胞病変（例えば、Ｘ線または磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）によって見える）、骨粗鬆症、貧血、高カルシウム血症もしくは高カルシウム血症による症状、または腎不全である。他の具体的な実施形態では、前記個体は、多発性骨髄腫のためにこれまで治療されたことがない；前記個体は、多発性骨髄腫のために治療され、非ＯＰＡＣ療法に応答する；前記個体は、多発性骨髄腫のために治療され、非ＯＰＡＣ療法に応答していないが、前記個体での多発性骨髄腫の過程は進行していない；または、前記個体は進行性の多発性骨髄腫を有する。
【０２２０】
別の態様では、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、前記多発性骨髄腫細胞の増殖が検出可能に抑制されるように、前記多発性骨髄腫細胞を複数のＯＰＡＣと接触させるステップを含む前記方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏで多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、多発性骨髄腫細胞を含む個体にＯＰＡＣの治療的有効量を投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供され、ここで前記投与するステップは、前記多発性骨髄腫細胞の増殖を検出可能に低減する。具体的な実施形態において、前記投与するステップは、多発性骨髄腫の１つまたは複数の症状または徴候を検出可能に低減（例えば、改善）するか、または多発性骨髄腫の前記１つまたは複数の症状または徴候の悪化を低減する。
【０２２１】
本明細書で提供される方法で有用なＯＰＡＣは、少なくとも上のセクション５．１で述べる形態学的、マーカーおよび培養の特性によって同定および選択することができる、絨毛膜（絨毛膜スカート（平滑絨毛膜）以外）由来の接着性、骨形成性の細胞である。
【０２２２】
５．２．１．２  併用療法
骨関連の癌、例えば多発性骨髄腫の治療は、癌を有する個体への、別の療法と組み合わせたＯＰＡＣの投与を含むことができる。
【０２２３】
したがって別の態様では、骨関連の癌、例えば多発性骨髄腫を有する個体の治療方法であって、１つまたは複数の他の抗癌療法、例えば１つまたは複数の化学療法剤または化学療法化合物と組み合わせて、ＯＰＡＣ、ＯＰＡＣの集団またはＯＰＡＣを含む細胞の集団を、個体に投与するステップを含む前記方法が本明細書で提供される。そのような他の抗癌療法は、ＯＰＡＣの前記投与と同時に、同じ治療コースの間に、または別々に個体に投与することができる。具体的な実施形態において、前記他の抗癌療法の投与は、前記ＯＰＡＣの投与に続いて投与される。より具体的な実施形態では、前記１つまたは複数の他の抗癌療法は、前記ＯＰＡＣの投与の前に前記個体に投与される。例えば、そのような他の抗癌療法のコースは、個体へのＯＰＡＣの投与の前に個体に投与され、完了される。別のより具体的な実施形態では、前記ＯＰＡＣは、前記他の抗癌療法の投与の前に個体に投与される。例えば、ＯＰＡＣのコースは、前記他の抗癌療法の投与の前に前記個体に投与され、前記１つまたは複数の他の抗癌療法の個体への投与の前に完了される。
【０２２４】
具体的な実施形態において、抗癌剤はメルファラン（別名Ｌ−フェニルアラニンマスタードまたはＬ−ＰＡＭ；商品名Ａｌｋｅｒａｎ）である。したがって、一実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法は、メルファランを、例えばメルファランの治療的に有効な１用量または複数用量を前記個体に投与するステップを含む。投与は、一般的に経口または静脈内である。別の具体的な実施形態では、抗癌剤はサリドマイドである。別の具体的な実施形態では、抗癌剤はポマリドマイド（商品名ＡＣＴＩＭＩＤ（登録商標）で売られる）、レナリドマイド（商品名ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）で売られる）、またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドマイドである。別の具体的な実施形態では、抗癌治療薬は、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））である。別の具体的な実施形態では、抗癌剤は、メルファラン、プレドニゾンおよびサリドマイドの組合せ（別々に、または一緒に投与される）を含む。別の具体的な実施形態では、抗癌剤は、ボルテゾミブ、メルファランおよびプレドニゾン（別々に、または一緒に投与される）である。
【０２２５】
他の抗癌剤は、当技術分野において周知である。したがって他の具体的な実施形態では、以下に限定されないが、抗癌剤には、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アムボマイシン、酢酸アメタントロン、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタト、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴル、セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトルメシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ズアゾマイシン、エダトレキセート、塩酸エフロミチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモフォシン、イプロプラチン、イリノテカン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコル、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、マイトクロミン、マイトジリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスパー、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリソマイシン、テコガランナトリウム、タキソテール、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、および塩酸ゾルビシンが含まれる。
【０２２６】
他の抗癌薬には、それらに限定されないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５−エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アムバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管形成阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス、抗背側化形態発生タンパク質１、抗アンドロゲン、前立腺癌、抗エストロゲン、抗新生物薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィジコリングリシネート、アポトーシス遺伝子調節因子、アポトーシス調節因子、アプリン酸、ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータ−アレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルフォスチンＣ、カンプトセシン誘導体、カペシタビン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３、ＣＡＲＮ  ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリックス、クロリン（ｃｈｌｏｒｌｎｓ）、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クランベシジン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクフォスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデンミンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール,９−、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルフォシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エクセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フ���ルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン、ホルフェニメックス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモフォシン、イルマスタット、イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、イミキモド、免疫活性化ペプチド、インスリン様増殖因子１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール,４−、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン−Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球アルファインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾール、線状ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リゾフィリン、溶解性ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコル、マスピン、マトリライシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストーン、ミルテフォシン、ミリモスチム、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、ミトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ヒト絨毛膜ゴナドトロフィン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ）、一リン酸化脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ、モピダモール、マスタード抗癌剤、ミカペルオキシドＢ、ミコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ−アセチルジナリン、Ｎ置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素調節因子、窒素酸化物抗酸化剤、ニトルリン、オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））、Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導因子、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金トリアミン錯体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、タンパク質Ａベースの免疫調節剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤,微細藻類、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ１８６エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴール、サイントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ  １模倣薬、セムスチン、老化によって誘導される阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合性タンパク質、ソネルミン、スパルフォシン酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、スチピアミド、ストロメライシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テニポシド、テトラクロロデカオキサイド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチン模倣体、サイマルファシン、サイモポイエチン受容体アゴニスト、サイモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、錫エチルエチオプルプリン、チラパザミン、二塩化チタノセン、トプセンチン、トレミフェン、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来の増殖阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベラレゾル、ベラミン、ベルジンス（verdins）アメリカツリスガラ、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブおよびジノスタチンスチマラマーが含まれる。
【０２２７】
他の実施形態では、併用療法は、破骨細胞の阻害剤と併用されるＯＰＡＣの個体への投与を含む。具体的な実施形態において、破骨細胞阻害剤は、ＲＡＮＫＬの阻害剤、例えばデノスマブである。別の具体的な実施形態では、破骨細胞阻害剤は、インテグリンまたはカテプシンＫ阻害剤である。
【０２２８】
別の実施形態では、併用療法は、ビスホスホネートと併用されるＯＰＡＣの投与を含む。具体的な実施形態では、ビスホスホネートはクロドロネートおよび／またはパミドロネートである。
【０２２９】
５．２．２  ＯＰＡＣを用いる骨欠損の治療
骨欠損、例えば外傷、または疾患、例えば骨関連の癌以外の疾患から生じる骨欠損を治療するのに、ＯＰＡＣの集団を用いることができる。ＯＰＡＣは、骨の欠損をもたらすかまたはそれに関連する任意の疾患、障害または状態を治療するのに用いることもできる。本明細書で用いるように、「治療」は、疾患、障害もしくは状態、またはその任意のパラメータもしくは症状の治療、矯正、改善、その重症度の低減、またはその経過時間の短縮を包含する。
【０２３０】
ＯＰＡＣの単離集団は、骨折、例えば偽関節骨折を治療するのに用いることもできる。ＯＰＡＣの単離集団は、例えばそれを必要とする対象で脊椎癒合を完了するために、脊柱を融合するのに用いることもできる。ＯＰＡＣの単離集団は、上記のものを治療するのに、幹細胞または前駆体細胞集団と一緒に用いることもできる。
【０２３１】
移植可能な組成物を形成するために、ＯＰＡＣを基質と、例えばマトリックスと組み合わせることができる。例えば、ＯＰＡＣを含む組成物、例えば移植可能な組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態において、移植可能な組成物は、マトリックスを含む。より具体的な実施形態では、前記マトリックスは、三次元の足場である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。別の具体的な実施形態では、前記マトリックスは、ヒドロキシアパタイトを含む。より具体的な実施形態では、前記マトリックスは、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイトの両方を含み、例えば、マトリックスはＨＥＡＬＯＳ（登録商標）である。別のより具体的な実施形態では、マトリックスは、羊膜または羊膜由来の生体材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、細胞外の膜タンパク質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、合成化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、生理活性化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記生理活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分子である。特定の実施形態では、マトリックスは、合成分解性ポリマー、例えばポリ乳酸またはポリグリコール酸である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム基質、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、無機物化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質またはセラミック基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、コラーゲン基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、リン酸カルシウム基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、無機物化されたヒト胎盤コラーゲン基質である。
【０２３２】
ＯＰＡＣ、およびＯＰＡＣの集団は、そのような細胞、またはそのような細胞から分化した細胞を必要とする個体への投与に向けて、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで特定の細胞型に分化するように誘導することもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで器官新生および損傷の修復のために、損傷を受けた器官、例えば損傷を受けた骨にＯＰＡＣを注入することができる。そのような損傷は、それらに限定されないが、例えば脊椎癒合で治療できる、骨粗鬆症、癌、骨折および脊髄状態から生じる病変を含む骨欠損を含む状態および障害によることがある。ＯＰＡＣは、損傷を受けた骨に単独で注入することができるか、または本明細書に記載の移植可能な基質で導入することができる。
【０２３３】
ＯＰＡＣが懸濁液または注射可能な液体として投与される場合、細胞は静脈内に、または好ましくは骨欠損、例えば破損の部位に投与することができる。
【０２３４】
特定の態様では、対象で骨欠損を治療する方法であって、それを必要とする対象に本明細書で提供されるＯＰＡＣの集団を含む移植可能または注射可能な組成物を投与し、それによって対象で骨欠損を治療するステップを含む前記方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、骨欠損は、例えば癒合が必要な、癌、骨折または脊柱に関連する骨溶解性の病巣である。特定の実施形態では、骨溶解性病変は、多発性骨髄腫、骨癌または転移癌に関連する。特定の実施形態では、骨折は、偽関節骨折である。特定の実施形態では、移植可能な組成物は、例えば骨欠損部位に外科的に移植される。特定の実施形態では、注射可能な組成物は、骨欠損領域に外科的に投与される。特定の実施形態では、注射可能な組成物は、全身的に投与される。
【０２３５】
具体的な実施形態において、ＯＰＡＣを含む移植可能な組成物は、マトリックスを含む。より具体的な実施形態では、前記マトリックスは、三次元の足場である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態では、マトリックスは、羊膜または羊膜由来の生体材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、細胞外の膜タンパク質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、合成化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリックスは、生理活性化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記生理活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分子である。特定の実施形態では、マトリックスは、合成分解性ポリマー、例えばポリ乳酸またはポリグリコール酸である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム基質、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、無機物化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質およびセラミック基質からなる群から選択される。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、コラーゲン基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、リン酸カルシウム基質である。特定の実施形態では、移植可能な足場基質は、無機物化されたヒト胎盤コラーゲン基質である。
【０２３６】
別の態様では、ＯＰＡＣの集団を注射可能なヒアルロン酸またはコラーゲンと組み合わせるステップを含む、注射可能な組成物を製剤化する方法が本明細書で提供される。別の態様では、ＯＰＡＣおよびヒアルロン酸またはコラーゲンを含む注射可能な組成物が本明細書で提供される。
【０２３７】
ＯＰＡＣは、ＯＰＡＣを分化させる条件下で培養することなく、投与されてもよい。あるいは、投与の前にＯＰＡＣを、例えば骨形成性の培地に、例えば約１〜２０日間培養してもよい。あるいは、ＯＰＡＣを単離してマトリックスの上に播種し、次に、例えば約１〜２０日間、骨形成性培地で培養することができる。別の実施形態では、ＯＰＡＣを、例えば骨形成性培地で例えば約１〜２０日間培養し、次にマトリックスに播種し、次に、本明細書に記載の骨形成性培地で、例えば約１〜２０日間培養してもよい。
【０２３８】
他の実施形態では、それらに限定されないが、角膜上皮欠損の治療、軟骨修復、顔の削皮術、粘膜、鼓膜、腸の内層、神経構造物（例えば、網膜、基底板の聴覚ニューロン、嗅上皮の嗅ニューロン）、皮膚外傷のための火傷および創傷修復、または他の損傷を受けたかもしくは有病の器官もしくは組織の再建を含む、自己または異種の組織再生または置換療法またはプロトコルでＯＰＡＣの単離集団を用いることができる。
【０２３９】
特定の実施形態では、ＯＰＡＣの単離集団は、造血幹細胞の部分的または全体的な喪失を起こしている個体、例えば致死性または致死下の線量の放射線（産業、医療または軍事のいずれであれ）に曝露された個体；例えば癌療法などの一部として骨髄抑制を受けた個体での、造血再構成で用いられる。ＯＰＡＣの単離集団は、骨髄または骨髄由来の幹細胞の集団の代わりに、またはそれを補うために用いることができる。一般的に、患者体重１キログラムにつき約１×１０８〜２×１０８個の骨髄単核細胞が、骨髄移植での移植のために注入される（すなわち、７０ｋｇのドナーでは約７０ｍｌの髄）。７０ｍｌを得るためには、供与過程で集中的供与およびドナー血液のかなりの減少を必要とする。様々な実施形態で、造血再構成のためのＯＰＡＣの単離集団は、約、少なくとも、または最大で１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個またはそれ以上のＯＰＡＣを含むことができる。
【０２４０】
本明細書で提供されるＯＰＡＣは、単独で、または他の幹細胞もしくは前駆体細胞集団と一緒に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組織または器官の製造で用いることができる。本明細書で提供される方法は、ＯＰＡＣを用いてマトリックスに播種し、細胞を分化させてマトリックスに住み着かせるのに適当な条件下で培養することを包含する。本明細書で提供される方法によって得られる組織および器官は、研究および治療目的を含む様々な目的のために用いることができる。
【０２４１】
好ましい実施形態では、本明細書で提供されるＯＰＡＣ、およびＯＰＡＣの集団は、ＨＬＡ型の一致するおよび不一致の造血移植を含む、自己および同種異系移植のために用いることができる。同種異系造血移植としてＯＰＡＣを用いる一実施形態では、ドナー細胞の免疫拒絶を低減させるかまたは免疫トレランスを形成するために、宿主を治療する（例えば、米国特許第５，８００，５３９号および第５，８０６，５２９号を参照）。別の実施形態では、免疫拒絶を低減させるかまたは免疫トレランスを形成するために、宿主を治療しない。
【０２４２】
６．実施例
以下の実施例は、本実施形態を例示することを目的とするものであり、決して限定的であると解釈されるべきではない。すべての参照を、特許参照、文献参照、またはそれ以外の本明細書において引用したものにせよ、すべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
【実施例１】
【０２４３】
６．１  ＯＰＡＣの単離および特徴付け
６．１．１  材料および方法
ＯＰＡＣの単離：妊娠末期胎盤を、インフォームドコンセントを得た後に健常な提供者母から得た。絨毛膜性組織を羊膜から手作業で分離し、１２ｇの絨毛膜性組織を１ｍｍ３片に切って細かく切り刻んだ。細かく切り刻んだ組織を、次に濃度２．４単位／ｍＬの２４０ｍＬのディスパーゼＩＩ溶液へ移し、組織を、８０ＲＰＭで撹拌しながら、ディスパーゼＩＩと伴に３７℃で１時間（ｈｒ）インキュベートした。ディスパーゼと伴にインキュベートした後、消化された組織を、遠心分離できるように５０ｍＬの管に分注し、消化された組織試料を、室温（ＲＴ）で５分間、２２０ｇで遠心分離した。上清を慎重に移した後に、沈殿した組織を、暖かいコラゲナーゼＩＩ溶液（体積２４０ｍＬ中に２７０単位／ｍＬ）に再懸濁して溜めて、８０ＲＰＭで撹拌しながら３７℃で、１時間インキュベートした。遠心分離できるように消化物を５０ｍＬの管に分注し、消化した組織試料を、ＲＴで５分間、２２０ｇで遠心分離した。消化した組織中に存在する酵素を、５％のＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄して中和した。試料を再度、遠心分離した（ＲＴで５分間２２０ｇ）。次に、沈殿物（遊離した細胞および組織を含んでいる）を、１×ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１×Ｌ−グルタミンを含む２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）／α−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）また１×ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１×Ｌ−グルタミンを含む１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）／ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地に再懸濁した。
【０２４４】
ＯＰＡＣの選択的接着単離
選択的接着方策の一部として、細胞懸濁液（上記の通りに得た）を、フィブロネクチン（ＦＮ、Ｓｉｇｍａ）、コラーゲン（ＣＯＬ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ビトロネクチン（ＶＮ、Ｓｉｇｍａ）およびラミニン（ＬＮ、Ｓｉｇｍａ）を用いてあらかじめコーティングしたフラスコに加えた。各タンパク質の１０μｇ／ｍＬの溶液を用いて、フィブロネクチンおよびコラーゲンに関しては室温で１時間、ビトロネクチンに関しては３７℃で１時間およびラミニンに関しては３７℃で２時間フラスコをインキュベートすることにより、フラスコをコーティングし、このようにインキュベートした後、フラスコをＰＢＳで２回洗浄した。
【０２４５】
コーティングしたフラスコに細胞懸濁液を播種して３時間、２４時間および６日間後に、確立した培養物から非接着性細胞／組織を除去した。次いで、組織培養フラスコに残っている細胞を増殖させた。一旦培養物が、約８０〜９０％のコンフルエントに達したら、細胞を凍結保存した。
【０２４６】
絨毛膜由来接着性細胞（ＯＰＡＣ）を、抗−ヒトＣＤ２００−ＰＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５２４７５）、抗−ＰＥミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｔｙｉ、カタログ番号１３０−０４８−８０１）およびＭＡＣカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用する磁気アシスト細胞選別（ＭＡＣ）技術を用いて、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＭＡＣカラム手順に従ってＣＤ２００の細胞表面発現に基づいて分離した。
【０２４７】
ＯＰＡＣの培養
最も高いアルカリホスファターゼ（ＡＰ）誘導レベルを示した選択的接着方策の条件（ＬＮまたはＶＮコーティング、２０％のＦＢＳ／α−ＭＥＭ、６日間確立接着）を、骨形成機能性を促進する条件において、さらに発展させた。これらの条件には、市販の間葉幹細胞培地を用いてまたは検定済み間葉幹細胞用ウシ胎児血清を用いてフィブロネクチンの塗布表面上で継代培養することが含まれた。最初の選択的接着基質に由来する２つの細胞株を、下記の行列に従ってＬＮ、ＶＮまたはＦＮの塗布表面上で、表２に示した３種の培地を用いて継代培養した。
【０２４８】
【表２】
2012500792.tif 000004
表２に示す選択的接着行列を用いて得た細胞を、次いでフローサイトメトリーによって、およびアルカリホスファターゼ活性に関して分析した。以下のアッセイ法を用いて細胞を特徴付けた：フローサイトメトリー、遺伝子発現分析、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性、およびタンパク質分泌。
【０２４９】
遺伝子発現
細胞をトリプシン処理し、有核細胞の計算を行って、最低で１×１０６〜１×１０７個の細胞を定量した。次いで、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙキットの溶解プロトコルを使用して細胞を溶解し、次に、溶解物をＱＩＡシュレッダーに通して細胞の溶解を最大にした。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙキットを使用してＲＮＡの単離を行った。
【０２５０】
Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ１０００分光光度計を用いてＲＮＡ量を定量し、最低で２８ｎｇ／μＬのＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ１０００によって分析した。アジレント２１００バイオアナライザでＲＮＡの品質を測定し、２．０のｒＲＮＡ比２８Ｓ／１８Ｓを、高品質ＲＮＡの決定要素として使用した。Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ａｒｃｈｉｖｅキットの手順を使用してＲＮＡからｃＤＮＡ反応を起こした。Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックスを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼの５’活性を使用して、ＰＣＲ中にＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを切断する。そのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは、プローブの５”末端にレポーター色素および３”末端に消光色素を含んでいる。このレポーター色素の蛍光の増加を監視することによって、ＰＣＲ産物の蓄積を直接検出する。
【０２５１】
ＯＰＡＣ、胎盤幹細胞、間葉幹細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびヒト皮膚線維芽細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から骨形成スーパーアレイ用に、ならびにＯＰＡＣおよび胎盤幹細胞から（ＴＧＦ−ＢＭＰアレイ用に）ＲＮＡを単離した。細胞を、基本培地（各細胞型用のそれぞれの増殖条件）中で３日間培養し、骨形成性の培地（骨形成条件）中で１週間培養した。ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて試料を４組ずつ単離した。すべてのＲＮＡ単離は高品質であり、続けるのに十分な収量が得られた（濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで、純度をアジレントチップで測定した）。製造業者の手順に従ってアレイを行い、ＡＢＩ７９００で結果を定量した。
【０２５２】
アルカリホスファターゼ活性
骨形成を誘導するために、細胞を、５×１０３細胞／ｃｍ２で約３日間増殖培地に播種し、次いで、最長２週間アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）、デキサメタゾン（０．１μＭ）およびα−グリセロリン酸（１０ｍＭ）を含むＯＳ培地（１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ）で誘導し、もしくは増殖培地中で維持し、週２回（bi-weekly）、細胞に新しい増殖培地または骨形成性の培地を供給した。
【０２５３】
細胞可溶化物中のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を、ｐ−ニトロフェノール産物の形成を測定する、比色アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して定量し、ピコグリーン（PicoGreen）ｄｓＤＮＡ蛍光アッセイを使用して、（細胞数のいくらかの差異を明らかにするために）１μｇ当たりのＤＮＡでＡＰ活性を標準化した。細胞可溶化物により形成されるｐ−ニトロフェノールの量を、既知量のｐ−ニトロフェノール（キットで提供される）を用いて作成した検量線から線形回帰分析によって定量した。シグマのキット（番号８５）を使用して製造業者の指示により組織化学的にもアルカリホスファターゼ活性を評価した。
【０２５４】
コロニー形成単位アッセイ−アルカリホスファターゼ活性
ＣＤ２００−およびＣＤ２００＋細胞の混合物を含むあらかじめ分取したＯＰＡＣ、ＣＤ２００＋細胞集団、ならびにフロースルー画分（比較的高い濃度でＣＤ２００陰性／ｄｉｍ細胞集団を含んでいる）を、３５ｍｍグリッド付ディッシュ中の骨形成分化培地（１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ／５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸／０．１μＭデキサメタゾン）に、２２．５細胞／ｃｍ２で播種した。細胞に週２回骨形成性の培地を供給し、１０日後にシグマのキット（番号８５）を使用して製造業者の指示により、アルカリホスファターゼ活性に関して細胞を組織化学的に評価した。アルカリホスファターゼ陽性のコロニー数を、実体顕微鏡を使用して視覚的に定量した。
【０２５５】
免疫蛍光染色
細胞を、Ｌａｂｔｅｋスライド上で５，０００細胞／ｃｍ２で培養し、２〜３日間培養した。細胞を、３．７％のホルムアルデヒドで９分間固定し、次にＰＢＳで３回洗浄した。ブロッキング緩衝液（１０％のヤギ血清、２×カゼイン、０．３％のトライトン）を用いて室温で２０分間のブロッキングした後、ウサギ抗−ヒトＮＧ２抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：１５０希釈）、マウス抗ヒトα−平滑筋アクチン抗体（Ｄａｋｏ、１：３０の希釈）を使用して、ＮＧ２（コンドロイチン硫酸）およびα−平滑筋アクチンに関して細胞を染色し、細胞を、一次抗体と伴に４℃で終夜インキュベートした。それから、次に試料をＰＢＳで洗浄し、アレクサフルオロ（AlexaFluor）４８８抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：４００の希釈）またはアレクサフルオロ４８８抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：４００の希釈）いずれかの蛍光標識二次抗体と伴にインキュベートし、細胞を、二次抗体と伴に室温で３０分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで３回洗浄し、核を対比染色するためにＤＡＰＩを含む封入剤を使用して封入した。細胞を、落射蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
【０２５６】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ
細胞の条件培地試料中の分泌因子を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのヒト骨パネル１Ｂ−１１ｐｌｅｘ（カタログ番号ＨＢＮ１Ｂ−５１Ｋ−１１）を使用して製造業者の指示に従って分析した。
【０２５７】
抗体アレイ
ＯＰＡＣ、間葉幹細胞、胎盤幹細胞および線維芽細胞を、基本培地（増殖条件）中で３日間培養し、次に２４時間、無血清培地へ切り替えた。製造業者の指示に従い、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  ＲＡＹＢＩＯ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙに培地試料を供した。ＧｅｌＬｏｇｉｃ  ２２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍおよびＫｏｄａｋ  ＭＩイメージングプログラムをそれぞれ使用して、化学発光アレイを画像化し、ドットサイズを分析した。
【０２５８】
６．１．２  結果
選択的接着および遺伝子発現
６日間の接着条件のすべてで、分析に充分な数の細胞を得たが、１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ中の３時間（hr）および２４時間の接着条件では、十分に増殖せず、分析に十分な細胞を得られなかった。ｍＲＮＡの発現分析のために選択した遺伝子には、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＤＬＸ５（転写因子）、骨シアロタンパク質、ＲＵＮＸ２（転写因子）、コラゲナーゼＩＩＩ、ｏｓｔｅｒｉｘ（転写因子）およびオステオカルシンが含まれていた。これらの遺伝子のうち、ＬＮ、ＶＮおよびＣＯＬコーティングにおける６日間（day）の接着で、２０％のＦＢＳ／αＭＥＭ培地に由来する細胞は、骨髄由来の間葉幹細胞と比較してＡＰｍＲＮＡレベルの発現増加を示した（図１）。分析した他のすべての遺伝子は、新たに単離した胎盤細胞において、間葉幹細胞と比較してより低い遺伝子発現を示した。
【０２５９】
免疫表現型検査の結果、２０％のＦＢＳ／αＭＥＭ中のＬＮ、ＶＮ、ＣＯＬコーティング条件において最も高い増加が検出されたが、６日間の接着条件のＣＤ２００ｄｉｍ／ＣＤ２００−細胞集団において、胎盤幹細胞と比較して有意な増加が示された（図２）。フローサイトメトリーでもＯＰＡＣがＣＤ３４−およびＣＤ１０５＋であることが確認された（図２）。
【０２６０】
培養の置換（permutations）、すなわち２０％のＦＢＳ／αＭＥＭにおけるＬＮ、ＶＮ、ＣＯＬコーティングの条件は、ＣＤ２００ｄｉｍ／ＣＤ２００−細胞集団の増加をもたらしたが、フローサイトメトリーによってＡＰ＋およびＳｔｒｏ−１＋細胞集団の有意な増加も示し（図３）、これらの条件は、ＭＳＣ対照群と対比して高レベルのＡＰ遺伝子発現も示した。これらの同じ条件も、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４陽性細胞集団における有意な増加を示した（図４）。
【０２６１】
機能分析は、ＡＰ活性によって定量した場合、ＦＮコーティング条件はより穏やかな誘導を示したとはいえ、２０％のＦＢＳ／αＭＥＭ条件のＦＮ、ＬＮ、ＶＮ、ＣＯＬコーティング基質における骨形成分化条件（１０日間の誘導）下で誘導可能なＡＰ活性を示した、（図５）。
【０２６２】
培養細胞の特徴付け
様々な増殖条件における増殖の結果生じた細胞の免疫表現型検査から、ＣＤ２００＋細胞集団において、胎盤幹細胞（ＰＤＡＣ（商標））がほぼ１００％であるのに対し、４０〜６０％の細胞がＣＤ２００＋であることが示され、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２に記述されている。ＰＤＡＣ（商標）と比べてＡＰ陽性細胞の割合において、少しの増加もあったが、ＣＤ１０５陽性細胞の割合はＰＤＡＣ（商標）と同じままだった（図６）。
【０２６３】
絨毛膜由来細胞（ＯＰＡＣ）をより特徴付けるために、免疫蛍光法染色を行って、骨形成活性を表す細胞に関連するマーカーを染色した。周皮細胞は、脈管構造に関連しており骨形成活性を有することが知られている細胞であり、ＮＧ２およびα−平滑筋アクチンに対して陽性に染まる。したがって、これらのマーカーに対して免疫蛍光法染色試験を行った。ＯＰＡＣは、ＰＤＡＣ（商標）と比較して染色の際において、２つの違いを示した：（１）ＰＤＡＣ（商標）がα−平滑筋アクチンに陽性なのと比較して、α−平滑筋アクチンに対する染色がないこと、および（２）標準的ＰＤＡＣ（商標）ではＮＧ２が接着斑に局在して染色されるのと比較して、細胞に局在するＮＧ２が拡散していることであり、接着斑のような細胞内構造へのＮＧ２の局在は、ＮＧ２の活性との関連を有している（データは示さない）。
【０２６４】
骨形成分化条件下で１０日間誘導した後、ＬＮ−ＬＮ培地１およびＶＮ−ＶＮ培地１条件は、図７に示すように、最高のＡＰ活性誘導（黒い矢）（骨形成条件／増殖培地の比）を示したが、ＬＮ−ＬＮ培地３およびＶＮ−ＦＮ培地１は、全ＡＰ活性の最高値を示した（白抜きの矢）。
【０２６５】
骨形成活性およびＴ細胞抑制などの機能活性が、これらの選択的接着細胞標品のＣＤ２００低／陰性画分由来なのか、またはＣＤ２００＋画分にあるのか解決するために、抗−ヒトＣＤ２００抗体を用いたＭＡＣ（磁気支援細胞分別）を使用して、これらの２つの細胞集団を分離した。最高のＡＰ誘導または全ＡＰの最高活性のいずれかを有するとして、上記で確認した４細胞株を、ＣＤ２００の発現量に基づいて磁気分離処理し、フローサイトメトリー、ＡＰ活性、およびＡＰ陽性のコロニー形成単位形成によって、分析した。
【０２６６】
免疫表現型検査から、４試料のうち２つはＣＤ２００＋の純度が８５％より大きい細胞集団であり、そのフロースルー画分はまだＣＤ２００＋細胞を含んでいることが示された（図８）。
【０２６７】
分離した結果生じた細胞を、骨形成培地で１０日間誘導し、ＡＰ活性について分析した。その結果、ＣＤ２００＋画分は、ＣＤ２００ｄｉｍ／ＣＤ２００−画分と比較して、ＡＰ誘導能を低減させたことが示される（図９）。
【０２６８】
ＣＦＵ（コロニー形成単位アッセイ）アッセイは、細胞集団の中の前駆体細胞数を測定し、例えば、一般にＣＦＵ−Ｆアッセイを使用して骨髄吸引物中の前駆体の数を測定している。ＣＦＵ−ＡＰアッセイは、細胞集団の中の潜在的骨芽細胞前駆体の数を概算する。ＣＤ２００画分を、３５ｍｍのグリッド付ディッシュの骨形成性の培地に１０日間播種し、アルカリホスフェートに関して染色した。ディッシュ当たりのコロニー数およびＡＰ陽性のコロニー数を定量した。ＣＤ２００＋画分は、ＣＦＵ−ＡＰ活性を示さず全ＣＦＵ活性の最低を示したが、その事前選別（pre-sort）した画分は、ＣＤ２００ｄｉｍ／陰性細胞集団を最も多く含んでおり、最大のＡＰ陽性ＣＦＵおよびＣＦＵ活性を示した。比較的に、ＣＤ２００＋細胞集団は、より低レベルのＣＦＵ−ＡＰおよび全ＣＦＵ活性を有した（図１０および図１１）。
【０２６９】
骨関連の分泌タンパク質用の１１−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを、ＯＰＡＣ、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞（ＰＤＡＣ（商標））および間葉幹細胞（ＭＳＣ）由来の条件培地試料について行った。細胞を、それらに対応する各培地中で３日間培養し、次に無血清ＤＭＥＭで２４時間インキュベートした。骨形成条件下の細胞の挙動を確認するために、細胞を増殖条件で３日間培養し、骨形成分化培地（アスコルビン酸およびデキサメタゾンを補充した培地）中に７日間晒し、次に無血清ＤＭＥＭで終夜インキュベートした。その結果、それら３つの細胞型のうち、ＯＰＡＣが最高レベルのオステオプロテゲリンレベルを構成的に分泌したことが示されている。さらに、３つの細胞型を骨形成分化条件下で培養した場合、ＯＰＡＣだけがオステオプロテゲリン分泌の上方制御を示したが、ＭＳＣおよびＰＤＡＣ（商標）は下方制御されたオステオプロテゲリンを示した。このことは、骨微細環境において、高レベルのオステオプロテゲリンの放出を介して破骨細胞の活性を阻害するのに、ＯＰＡＣはより適している可能性があることを意味している。
【０２７０】
増殖培地および骨形成性の培地中で培養したＯＰＡＣ、ＰＤＡＣ（商標）、ＭＳＣおよび線維芽細胞における骨形成に関連する８４遺伝子の発現分析を、ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ−Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して実施した。本実験において使用した増殖培地は、１×ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１×Ｌ−グルタミンを含むαＭＥＭ／２０％のウシ胎児血清であり、本実験において使用した骨形成性の培地は、骨形成性の培地は、１×ペニシリン−ストレプトマイシン、１×Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸および１００ｎＭのデキサメタゾンを含むαＭＥＭ／２０％のウシ胎児血清骨形成培地であった。骨形成関連の遺伝子の発現量を、増殖および骨形成分化条件下で培養したＯＰＡＣ、ＰＤＡＣ（商標）、ＭＳＣおよび線維芽細胞で測定した。
【０２７１】
すべての細胞型において、測定した大部分の骨形成遺伝子に関して（統計的に有意な蛍光シグナルの増加が最初に検出されるＰＣＲサイクルである、Ｃｔ値によって測定した場合）遺伝子発現が見られた。ＯＰＡＣは、ＰＤＡＣ（商標）、ＭＳＣおよび線維芽細胞と比較したとき、固有の遺伝子発現プロファイルを示し（それぞれ表３Ａ〜３Ｃ）、細胞を増殖培地から骨形成性の培地に移した場合にＰＤＡＣ（商標）、ＭＳＣおよび線維芽細胞と比較したとき、固有の遺伝子発現誘導プロファイルを示した（それぞれ表３Ｄ〜３Ｆ）。Ｃｔ値（表３Ａ〜３Ｃ）は、ＰＣＲサイクラから直接に得られる数値であり幅として記録される、したがって、後述するように、これらの値を１、２、３または４の正符号に変換した。骨形成性の培地と比較した増殖培地における遺伝子発現量の変化倍率を計算するために、ハウスキーピング遺伝子の発現量に基づいてＣｔ値に補正係数を適用する。この補正係数は、ＰＣＲに使用したＲＮＡ量のわずかな差異を標準化する。
【０２７２】
表３Ａ〜３Ｃ：上で定義した通り、増殖または骨形成性の培地におけるＰＤＡＣ（商標）に対するＯＰＡＣ（表３Ａ）、ＭＳＣに対するＯＰＡＣ（表３Ｂ）および線維芽細胞に対するＯＰＡＣ（表３Ｃ）の骨形成遺伝子発現量（Ｃｔ値）の表である（ｎ＝２）。これら遺伝子の発現量を、＋＋＋＋（非常に高い、Ｃｔ＜２０）、＋＋＋（高い、２０＜Ｃｔ＜２５）、＋＋（中程度、２５＜Ｃｔ＜３０）、＋（低い、３０＜Ｃｔ＜３５）、−（低い、３５＜Ｃｔ＜４０）、または、空欄（検出信号なし）に分類した。
【０２７３】
【表３Ａ】
2012500792.tif 000005
2012500792.tif 000006
2012500792.tif 000007
【０２７４】
【表３Ｂ】
2012500792.tif 000008
2012500792.tif 000009
2012500792.tif 000010
【０２７５】
【表３Ｃ】
2012500792.tif 000011
2012500792.tif 000012
2012500792.tif 000013
【０２７６】
表３Ｄ〜３Ｆは増殖培地における選択された遺伝子の、ＯＰＡＣとＰＤＡＣ（商標）、ＭＳＣおよび線維芽細胞の発現量を骨形成性の培地と比較した変化倍率を示す表である。特定の遺伝子に対する１０倍の変化倍率は、例えば増殖培地と比較して骨形成性の培地において、１０倍誘導されている遺伝子を示している。ＯＰＡＣの骨形成性の培地における誘導倍率がＰＤＡＣ（商標）（表３Ｄ）、ＭＳＣ（表３Ｅ）または線維芽細胞（表３Ｆ）における誘導倍率より少なくとも１０倍高いまたは低い結果だけを示している（空欄の結果は、選択基準で０の値を割り当てられた）。
【０２７７】
【表３Ｄ】
2012500792.tif 000014
【０２７８】
【表３Ｅ】
2012500792.tif 000015
【０２７９】
【表３Ｆ】
2012500792.tif 000016
【０２８０】
増殖条件において培養したＯＰＡＣおよびＰＤＡＣ（商標）を、ＴＧＦ−β／ＢＭＰスーパーファミリーの８４遺伝子の１組を使用して比較した場合、ＯＰＡＣは概して骨形成に関連した遺伝子の高い発現を示した（表４）。ＯＰＡＣには、ＢＭＰ（特にＢＭＰ−２）およびＴＧＦ−βを含めた骨形成の栄養支持に関連する遺伝子のより強い発現があった。ＯＰＡＣには、骨形成の阻害または、インヒビンおよびＴＧＦ−β（ＴＧＦ−βは、骨形成および吸収の両方に関係する）を含めた骨吸収の栄養支持に関連する可能性のある遺伝子のより強い発現もあった。ＴＧＦβ／ＢＭＰスーパーファミリーは、複数の異なる器官系の複雑なフィードバック系の制御を代表している。このスーパーファミリーの遺伝子群が、ＯＰＡＣにおいて、ＰＤＡＣ（商標）よりも高発現するという事実は、ＯＰＡＣにはＰＤＡＣ（商標）よりも高い骨代謝制御能力があることを示している。
【０２８１】
【表４】
2012500792.tif 000017
【０２８２】
表４はＯＰＡＣ、ＰＤＡＣ（商標）、ＭＳＣおよび線維芽細胞の増殖培地におけるＴＧＦβ／ＢＭＰスーパーファミリーメンバーの遺伝子発現量（Ｃｔ値）（ｎ＝３）の表である。これら遺伝子の発現レベルを、＋＋＋＋（非常に高度、Ｃｔ＜２０）＋＋＋（高度、２０＜Ｃｔ＜２５）、＋＋（中程度、２５＜Ｃｔ＜３０）、＋（低度、３０＜Ｃｔ＜３５）、−（低度３５＜Ｃｔ＜４０）、または、空欄（検出信号なし）に分類している。変化倍率は、ＯＰＡＣをＰＤＡＣ（商標）と比較したときの発現量の差を表している。ＯＰＡＣにおける発現量がＰＤＡＣ（商標）における発現量を上回る、またはＰＤＡＣ（商標）における発現量がＯＰＡＣにおける発現量を上回る遺伝子だけを示している。
【０２８３】
遺伝子発現に加えて、増殖条件下で増殖させたＯＰＡＣ、ＰＤＡＣ（商標）、ＭＳＣおよび線維芽細胞由来のタンパク質分泌（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈのＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ）の分析も行った（図１３）。４細胞型の間で、合計４６種の分泌タンパク質を同定した。ＯＰＡＣにより分泌されＰＤＡＣ（商標）ではされないタンパク質には、凝固因子ＩＩ／組織因子、デコリン、エピレグリン、ホリスタチン様−１、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＬ−２Ｒα（インターロイキン２受容体α）、ＩＬ−１２Ｒβ２（インターロイキン１２受容体サブユニットβ２）、ＩＬ−１７ＲＣ（インターロイキン受容体Ｃ）、ＩＬ−２７（インターロイキン２７）、潜在性ＴＧＦ−β結合タンパク質１、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６（神経細胞接着分子１）、ｓＦＲＰ−４（分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質４）、ＳＭＡＤ４、スピネシン、ＴＦＰＩ（組織因子経路インヒビター）、ＴＧＦ−βＲＩ／ＡＬＫ５（トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体１）、ＴＩＭＰ−２（メタロプロテアーゼ２の組織インヒビター）およびＴＳＧ−６（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）刺激遺伝子６）が含まれた。ＯＰＡＣにより分泌されＭＳＣではされないタンパク質には、デコリン、エピレグリン、ＦＧＦ−７／ＫＧＦ、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ−２Ｒα（インターロイキン−２受容体アルファ）、ＩＬ−３Ｒα（インターロイキン３受容体アルファ）、ＩＬ−５Ｒα（インターロイキン５受容体アルファ）、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ＳＭＡＤ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−βＲ１／ＡＬＫ５、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ（トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体３）およびＴＩＭＰ２が含まれた。ＰＤＡＣ（商標）およびＭＳＣと比較してその発現がＯＰＡＣに固有であったタンパク質は、デコリン、エピレグリン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−２７、潜在性ＴＧＦ−ベータ結合タンパク質１（ＬＴＢＰ）、ＮＣＡＭ−１、Ｓｍａｄ４、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−ベータＲ１／ＡＬＫ５およびＴＩＭＰ−２であった。そのうち、デコリン、ＩＧＦＢＰ−６およびＩＬ−２７は、骨制御に関係している。そのうち、ホリスタチン様−１、ｓＦＲＰ−４およびＴＳＧ−６は、骨制御に関係している。
【０２８４】
別の実験において、定量的リアルタイムＰＣＲによって評価したとき、ＯＰＡＣがＲＡＮＫＬを発現しないことも示されたが、骨髄由来のＭＳＣは、かなりの量のＲＡＮＫＬのＲＮＡを産生した。
【実施例２】
【０２８５】
６．２  ＯＰＡＣのｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成能
ＯＰＡＣのｉｎ  ｖｉｖｏにおける骨形成能を評価するために、骨修復の頭蓋欠損モデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ試験を行った。実験的には、試験開始時に約６週齢の４８匹（４８）のオスＨｓｄ：ＲＨ−Ｆｏｘｎｌｒｎｕ胸腺欠損ラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を使用した。すべてのラットには、頭蓋冠の両側に作製された３ｍｍ×５ｍｍの欠損を有していた。各々の左側の欠損を陰性対照（ＨＥＡＬＯＳ（登録商標）移植骨片代用品だけ）で処理し、各々の右側の欠損を陽性対照（ＨＥＡＬＯＳ（登録商標）＋ＢＭＰ―２）、陰性対照（空の欠損、骨を取り除いて何とも置き換えない）、またはＨＥＡＬＯＳ（登録商標）担体マトリックスに載せた細胞（ＰＤＡＣ（商標）またはＯＰＡＣ）のいずれかを用いて処理した。８匹の動物を細胞処理群に割り当てて、４匹の動物をＢＭＰ−２および空の欠損群に割り当てた。これら欠損を次の用量を含むＨｅａｌｏｓで処理した：５μｇのＢＭＰ−２または３×１０５〜４×１０５の細胞。
【０２８６】
移植後７週目にラットを屠殺した。死体解剖で、頭蓋骨を採取し１０％のホルムアルデヒド中に置いた。それら頭蓋冠をＰＩＸＩで走査し、レントゲン撮影し、次に脱石灰してパラフィン包埋し、切片を作製した。それら頭蓋冠の冠状組織切片をトルイジンブルーおよびＨ＆Ｅ染色法（ヘマトキシリン−エオシン）を用いて染色した。欠損に対する骨内成長量を、最大値を４とする０〜４の採点法によって評価した。
【０２８７】
手術の詳細
全部で四十八（４８）匹さらに予備の四（４）匹のオス胸腺欠損ラットＨｓｄ：ＲＨ−ＦｏｘｎｌｒｎｕをＨａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ  ＵＳＡに注文した。これらの動物は、特定病原体未感染であり、ＭＤＳ−ＰＳ有効性薬学で到着時約６週齢であった。腹腔内注射によって投与したケタミン／キシラジンを使用して標準操作手順（ＳＯＰ）の通り、ラットを麻酔した。全身麻酔を約３〜５分で完了し、足指ピンチに対する無反応によって確認した。必要に応じて、手術の間中イソフルランで鎮静状態を維持した。
【０２８８】
頭蓋骨領域を電気バリカンを使用して剃り、アルコールおよびクロルヘキシジン洗浄により準備した。この動物を、前向きの安定な位置に頭部をしっかりと保持する状態にし、局所麻酔注射（約０．２ｍＬのキシロカイン）を耳の間の中心頭蓋領域の皮下に投与した。キシロカイン注射部位で横皮膚切開を行い、切開の吻側縁（皮膚弁）の中央領域に組織拡張器を設置した。拡張器で、切開部を開き頭蓋を露出させた。ゲル状になるキシロカインを削りとり、外科用メスを使用して頭頂溝／頭頂間縫合で骨膜を横切開した。切開の後に頭頂骨からこの骨膜を取り除いた。ドレメル（Ｄｒｅｍｅｌ）ドリルを中速度で使用して、骨の主要片が完全に離れるまで両方の欠損部の縁、各頭頂骨の約３ｍｍ×５ｍｍ領域、を穏やかに切り開いた。骨が過熱状態になることを防止するために、掘削の間中その領域に無菌の生理食塩滴で水をやった。その骨片を完全に分離したとき、アドソン鉗子を用いてそれを取り除いた。欠損の端を点検し、必要に応じてピンセットを使用して穏やかに滑らかにした。骨粉および骨片を取り除くために、頭蓋を約３ｍＬの無菌の生理食塩水で洗浄し、それを滅菌ガーゼを用いて吸収した。一旦、消毒し余分な液体を除去いた後、この欠損部を定めた被験物質を用いて処理した。次にその真皮を頭蓋上に引き戻し、皮膚切開部を３．０または４．０のＶｉｃｒｙｌ縫合糸を使用して閉じた。動物施設人員は、手術後の検査を行って動物の完全回復を記録した。術後４９日目に、残りの動物をＣＯ２窒息によって、安楽死させた。
【０２８９】
分析の詳細
これら頭蓋冠を、採取し１０％のホルムアルデヒド中に置いた。固定化した後、Ｌｕｎａｒ二重エネルギーＸ線吸光光度定量法（ＰＩＸＩ）を使用して、両側の頭蓋冠欠損部の骨塩量（ＢＭＤ）を定量した。欠損領域の縁より小さいＲＯＩを設定し、すべての試料の両側の欠損に同じ大きさのＲＯＩを使用した。ＰＩＸＩで、骨ミネラル領域（ＢＭＡ）および骨ミネラル含量（ＢＭＣ、ｇ）を測定した。次に、ＢＭＣをＢＭＡ（ｍｍ２）で割って、骨塩量（ＢＭＤ、ｇ／ｍｍ２）を定量した。ＰＩＸＩ密度計測を完了した後、これら頭蓋冠をレントゲン撮影し組織検査用に処理した。これら頭蓋冠をレントゲン撮影し、組織の脱石灰処理によって処理し、２片にｇｒｏｓｓした。ｇｒｏｓｓした後に、それら頭蓋冠をパラフィンに包埋した。欠損領域を通る３つの冠状切片をそれぞれ約４〜６μｍ厚に切り出し、スライド上に装着した。骨内成長を組織病理学的に評価するために、１断片をトルイジンブルーで染色し、もう１断片をＨ＆Ｅを用いて染色した。放射線不透過性領域と放射線透過性領域（暗く残る欠損部）を明確にするためにしきい値を使用して、頭蓋欠損部を囲む対象の領域を指定し、画像処理ソフトウェアを用いてこれらの領域に残っている欠損部を定量化することによって、Ｘ線走査を使用して欠損閉鎖の定量を行った。
【０２９０】
その結果、ＢＭＣおよびＢＭＤの増加、ならびにＨ＆Ｅ染色によって見た場合、本モデルにおけるＯＰＡＣの骨形成はＰＤＡＣ（商標）と比較して２０％増加していることが示された。ｉｎ  ｖｉｖｏデータの分析に基づくと、組織学的（図１４）および密度測定（ＰＩＸＩ）（図１５）分析によって、ＯＰＡＣはＰＤＡＣ（商標）よりも少なくとも２０％多い骨形成を示した。さらに、屠殺時に得たＸ線走査を使用した残存欠損領域の分析により、ＰＤＡＣ群の動物の３８％と比較した場合、ＯＰＡＣ群の動物の６３％が５０％より大きい欠損部の閉鎖を示したことが明らかになった（図１６）。
【実施例３】
【０２９１】
６．３  ＯＰＡＣを使用する多発性骨髄腫の治療
６．３．１  材料および方法
６．３．１．１  高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を用いて安定導入されたＯＰＡＣの確立
高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードしている配列を含んでいるｐＬＥＧＦＰレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いてパッケージング細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ（エコトロピック(ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）を一過性にトランスフェクトした。ＥＧＦＰは、哺乳動物細胞におけるより明るい蛍光およびより高い発現のために最適化された、野生型オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）緑色蛍光タンパク質の赤色偏移変異体である。レトロウイルス粒子を含んでいる上清を、トランスフェクションの２４〜４８時間後に採取した。８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、ＯＰＡＣにレトロウイルス粒子を１２時間感染させ、同時に培地を新しい培地と交換した。いくつかの実験においては、２００〜４００μｇ／ｍＬのＧ４１８存在下で２〜３週間細胞を培養することにより選択する前に、細胞をウイルス粒子を含んでいる上清に再度曝露した。
【０２９２】
６．３．１．２  骨髄腫ＳＣＩＤ−ＲａｂマウスにおけるＯＰＡＣの移植
初期ヒト骨髄腫のＳＣＩＤ−ｈｕモデルにおいてヒト骨組織を使用する代わりとして、ウサギの骨をＳＣＩＤマウスに移植し（ＳＣＩＤ−ｒａｂマウス）、続いて移植した骨に骨髄腫細胞を直接導入する系を代用した。骨髄腫ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスを、前述の通り構築した。Ｙａｔａ、Ｋ．およびＹａｃｃｏｂｙ、Ｓ．等、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００４年、１８巻：１８９１〜１８９７頁を参照。ＣＢ．１７／Ｉｃｒ−ＳＣＩＤマウス（６〜８週齢）を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から得て、妊娠したニュージーランドウサギをＭｙｒｔｌｅ  Ｒａｂｂｉｔｒｙ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＮ、ＵＳＡ）から得た。３〜４週齢のウサギを、高用量のペントバルビタールナトリウムを用いて深く麻酔し、頚椎脱臼によって、安楽死させた。このウサギ大腿骨および脛骨を、近位および遠位端を閉じたまま２つに切り分け、一方で椎骨を小断片（１×２ｃｍ２）に切断した。
【０２９３】
骨移植するために、ＳＣＩＤマウスの右側または左側を、アルコールを用いて洗い、滅菌ガーゼを用いて拭いた。ウサギの骨を、小さい（５ｍｍ）切開部を通して皮下に挿入した。次に、この切開部を無菌外科用ステープルを用いて閉じて、６〜８週間その骨の移植を起こさせた。何匹かの実験的マウスにおいて、同じマウスの対側に２つの骨を同時移植した。各実験において、１７±８％の形質細胞（ＰＣ）を含んでいる未分離のヒト患者由来の骨髄腫骨髄細胞１０〜５０×１０６個の、または５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３．３±１．６×１０６個のＰＣを、移植したウサギの骨に直接注入した。少なくとも２匹のマウスを、各実験に使用した。マウスを、定期的に尾静脈から出血させて、循環しているヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のＭ−タンパク質アイソタイプの濃度変化を測定した。
【０２９４】
ＥＬＩＳＡによってわかるマウス血清中のヒトモノクローナル免疫グロブリン（ｈＩｇ）の濃度増加によって、および溶解性骨病変のレントゲン写真の評価によって、骨髄腫増殖の確立を実証した。５×１０５のＥＧＦＰ発現ＯＰＡＣを、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し５０μＬのＰＢＳに再懸濁した。このＯＰＡＣを、ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスに移植した骨に直接注入した。注入後８〜１６週間、実験を継続した。移植した骨の骨塩量（ＢＭＤ）の変化を、ＰＩＸＩｍｕｓ  ＤＥＸＡ密度計（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＵＮＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して定量した。
【０２９５】
６．３．１．３  ＳＣＩＤ／Ｒａｂマウスから採取した組織の免疫組織化学
初期骨髄腫を有するＳＣＩＤ−ｒａｂマウスの脱灰骨切片を、キシレンで脱パラフィンし、エタノールを用いて再水和し、ＰＢＳですすぎ、前述の通り電子レンジを使用して抗原を回復した（上記Ｙａｔａ、Ｋ．を参照）。培養したＯＰＡＣを、トリプシン処理し、サイトスピンスライドを準備し、１０％のリン酸緩衝液ホルマリンを用いて２０分間固定した。３％の過酸化水素を用いて１０分間ペルオキシダーゼ消光した後、そのスライドをＥＧＦＰおよびヒトＣＤ１６６、オステオカルシンおよびＢＭＰ−２（５〜１０μｇ／ｍＬ）に対するモノクローナル抗体と伴に３０〜６０分間インキュベートし、Ｄａｋｏの免疫ペルオキシダーゼキットを使用して現像し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０２９６】
６．３．１．４  Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａおよびアリザリンレッド染色
カルシウム沈着を検出するために（フォンコッサ染色）、ＯＰＡＣを１０％リン酸緩衝ホルマリン中で１０分間固定した。新たに用意した５％の硝酸銀を加え、その試料を暗がりに１０分間置き、蒸留水で洗浄し、次いで水で覆いながら１５分間の紫外光に曝露した。蒸留水で完全にすすぐことによって、反応を止めた。
【０２９７】
６．３．１．５  統計分析
特に明記しない限り、すべての値は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。スチューデント対応ｔ−検定を用いて、骨髄腫細胞の数、生存率、アポトーシスおよび増殖に対する異なる培養条件の効果を試験し、ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスにおける腫瘍成長およびヒト骨塩量（ＢＭＤ）に対するＯＰＡＣの効果を試験した。
【０２９８】
６．３．１．６  レンチウイルスを仲介したＯＰＡＣのトランスダクション
すべての組換えレンチウイルスを、標準手順に従って２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって作製した。簡単に述べると、２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション沈殿物と一緒に一晩インキュベートし、その後、培地を交換し追加の２日間インキュベートし続けた。トランスフェクトした細胞の培地を採取し、３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、孔径０．２２μｍのフィルタを通して濾過した。濾液を２０％のショ糖クッションの上に重ねて置き、ベックマン超遠心分離器にＳＷ２８ローターを使用して２６，０００ｒｐｍで、４℃で１００分間遠心分離した。ペレット化したウイルス様粒子を、ＤＭＥＭ中に懸濁し−８０℃で貯蔵した。この貯蔵ウイルスの力価（力価単位「ＴＵ」／ｍＬ）を、２９３Ｔ細胞または他の適当な細胞型の単層上にウイルス懸濁液の一定分量を添加することにより定量し、次いでＧＦＰ−陽性細胞の割合を蛍光活性化細胞分取法（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって評価することにより測定した。１０９ＴＵ／ｍＬより大きい力価が、常に得られた。
【０２９９】
８μｇ／ｍＬのポリブレン存在下で、ＯＰＡＣにレトロウイルス粒子を１２時間トランスフェクトし、同時に培地を新しい培地と交換した。いくつかの実験においては、２００〜４００μｇ／ｍＬのＧ４１８存在下で２〜３週間細胞を培養することにより選択する前に、細胞をウイルス粒子を含んでいる上清に再度曝露した。
【０３００】
６．３．２  結果
６．３．２．１  ＯＰＡＣによるマトリックス（基質）石灰化
ＯＰＡＣを 骨形成性の培地（１０％のＦＢＳ、デキサメタゾン（１００ｎＭ）、アスコルビン酸（０．０５ｍＭ）およびベータＧＰ（１０ｍＭ）を補充したアルファＭＥＭ）のありなしで約２週間培養した。カルシウム沈着を検出するために、細胞を１０％リン酸緩衝ホルマリン中で１０分間固定した。固定した細胞を、アリザリンレッド色素によって染色した。蒸留水で十分に洗い流して反応を止めた。骨形成性の培地中で培養したＯＰＡＣは、細胞によって産生された細胞外基質に沈着するカルシウムへのアリザリンレッドの結合により示される通り、基質石灰化の徴候を示した。基質の石灰化は、骨形成分化の１つのマーカーである（データは示さない）。
【０３０１】
６．３．２．２  ＯＰＡＣの破骨細胞成熟阻害
共培養実験：トランスウェル器具を用いて、造骨性の培地で挿入物の裏側にＯＰＡＣまたはＭＳＣを先ず培養し、次いで破骨細胞前駆体を、上部室にてインキュベートした。骨芽細胞および破骨細胞を同時に分化させるために、次にこの挿入物を、１０％のＰＢＳ、ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍＬ）、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）、デキサメタゾン（１００ｎＭ）、アスコルビン酸（０．０５ｍＭ）およびβＧＰ（１０ｍＭ）を補充したα−ＭＥＭで約２週間インキュベートした。この手順の結果、酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を発現している多核破骨細胞およびアルカリホスフェートを発現している骨芽細胞が同時に増殖した。ＯＰＡＣまたは間葉幹細胞の非存在下で培養した破骨細胞前駆体は、平均で１２０個の破骨細胞を生じた（図１７を参照）。一方で、破骨細胞前駆体は、胎盤幹細胞存在下で培養した場合には平均４０個の破骨細胞を、ＭＳＣ存在下で培養した場合には平均６０個の破骨細胞を産生した。したがって、ＯＰＡＣは、間葉幹細胞よりもより効果的に破骨細胞の形成を抑制すると思われる。
【０３０２】
破骨細胞およびＯＰＡＣをオステオプロテゲリン抗体存在下で培養した場合、破骨細胞の分化に対するＯＰＡＣの効果は著しく低減し、著しく多くの破骨細胞が形成された（抗−ＯＰＧ、ｐ＜０．０４）。さらに、ＯＰＡＣだけを破骨細胞前駆体と伴に培養した場合、破骨細胞前駆体を抗−ＯＰＧ存在下で培養した場合よりも、有意に多い破骨細胞が形成された（ｐ＜０．００４）。したがって、何か特定の機序または原理に制約されたくはないが、ＯＰＡＣによる破骨細胞の分化の抑制は、ＯＰＡＣが分泌するオステオプロテゲリンによって仲介されると思われる。
【０３０３】
６．３．２．３  ＯＰＡＣによる多発性骨髄腫細胞増殖の抑制
多発性骨髄腫細胞を、予定された来診の間に、活動性骨髄腫を患う２７人の患者由来のヘパリン化骨髄（ＢＭ）吸引物から得た。骨髄試料を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（比重１．０７７ｇ／ｍＬ）を使用した密度遠心分離法によって分離し、低密度細胞分画中の多発性骨髄腫形質細胞の割合を、ＣＤ３８／ＣＤ４５フローサイトメトリーによって定量した。形質細胞（ＰＣ）を、ＣＤ１３８免疫磁気ビーズ選択法および自動ＭＡＣ自動分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して単離した。ＰＣ純度を、常に９４％以上になるようにＣＤ３８／ＣＤ４５フローサイトメトリーによって定量した。
【０３０４】
ＯＰＡＣおよびＭＳＣを、標準条件または骨形成性の条件で処理し、多発性骨髄腫細胞と伴に共培養した。共培養実験のために、１μｍ孔のトランスウェル挿入物を使用した。このシステムにおいて、骨芽細胞（すなわち、骨形成性の条件で増殖したＭＳＣまたはＯＰＡＣ）、ＭＳＣまたはＯＰＡＣを挿入物の裏側で増殖させ、多発性骨髄腫（ＣｏｎＭＭ）細胞を挿入物の上部室中で培養した。培養するために、６穴挿入物を上下反転させ無菌深型ディッシュ中に置いた。ＭＳＣまたはＯＰＡＣを、トリプシン−ＥＤＴＡで回収し、ＭＳＣ培地に再懸濁した（約０．５×１０６個／ｍＬ）。約６００μＬの細胞を、反転させた挿入物の中央に置いた。そのディッシュを、次にパラフィルムで覆いインキュベータ中に１時間置いて、細胞が膜に付着できるようにした。インキュベート後、これら挿入物を反転して戻して６ウェルプレート中に置いた。ＭＳＣまたはＯＰＡＣが約８０％のコンフルエントに達したときに、それらをＭＳＣ培地で、または骨芽細胞培地で２〜３週間培養した。多発性骨髄腫細胞の生存率を、ＭＴＴアッセイを用いて７２時間後に評価した。ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴをホルマザンに還元する酵素の活性を測定するための比色アッセイであり、紫色を発する。この還元反応は、ミトコンドリアの還元酵素が活性である場合にだけ起こり、したがって変換は生細胞の基準としてしばしば使用される。
【０３０５】
その結果は、未分化ＯＰＡＣはＣｏｎＭＭ細胞の生存率を約７０％まで阻害したが、ＭＳＣはＣｏｎＭＭ生存率を約４０％だけ阻害したことを示している（図１８を参照）。ＯＰＡＣは、非骨形成性の条件下よりも骨形成性の条件においてなおさら、ＣｏｎＭＭ細胞の生存を阻害し、ＯＰＡＣのそれと同じレベルではないが、ＭＳＣも骨形成性の条件下でより強い阻害を示した（図１８を参照）。
【０３０６】
細胞間接触ができる共培養環境において多発性骨髄腫細胞株の増殖を抑制する能力に関しても、ＯＰＡＣを胎児骨髄由来の間葉幹細胞（ＦＢ  ＭＳＣ）と比較して試験した。ＯＰＡＣ（１０，０００細胞／ウェル）を、多発性骨髄腫細胞株ＢＮおよびＪＢ（Ｌｉ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１３８巻（６号）：８０２〜８１１頁、２００７年を参照）、ＡＲＰ１（デキサメタゾン感受性ＩｇＡ多発性骨髄腫由来細胞株）、Ｕ２６６（ＩｇＥ産生性形質細胞株）、ＤｎおよびＨａｌｅ（１０，０００細胞／ウェル）と伴に培養し、そのすべてが１０％のウシ胎児血清および抗生物質を含むＲＰＭＩ培地中で７日間ルシフェラーゼを発現した。多発性骨髄腫細胞の増殖を、ルシフェラーゼ活性の検出によって評価した。ＯＰＡＣは、およそ以下の通り、多発性骨髄腫細胞株の増殖を抑制した：ＢＮ（０．４）、ＪＢ（０．５）、ＡＲＰ１（０．１５）、Ｕ２６６（０．２８）、Ｄｎ（０．３２）およびヘイル（hale）（０．７５）。括弧の中の数字は、ＭＭ細胞株の増殖をＦＢ−ＭＳＣと共培養したＭＭ細胞株の増殖との倍率で示している。
【０３０７】
さらなる実験において、６人の異なるヒト患者由来の多発性骨髄腫細胞を得て、４００，０００細胞／ウェルで胎児の骨髄由来の間葉幹細胞またはＯＰＡＣと伴に６日〜１０日間共培養した。胎児のＭＳＣと比較した場合、ＯＰＡＣの存在下で多発性骨髄腫細胞の生存率は著しく低減した（ｐ＜０．０３）。
【０３０８】
６．３．２．４  標識し、病巣内に投与したＯＰＡＣの動物中の生体内分布
この実施例は、マウスにトランスフェクトしたＯＰＡＣの生体分布を例示する。ＯＰＡＣに、ルシフェラーゼリポータをトランスフェクトした。パッケージング細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏに、ＥＧＦＰを含んでいるｐＬＥＧＦＰレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を利用して一過性にトランスフェクトした。レトロウイルス粒子を含む上清を、トランスフェクション後２４時間〜４８時間後に採取した。８μｇ／ｍＬのポリブレン存在下で、ＯＰＡＣにレトロウイルス粒子を１２時間トランスフェクトし、同時に培地を新しい培地と交換した。いくつかの実験においては、２００〜４００μｇ／ｍＬのＧ４１８存在下で２〜３週間細胞を培養することにより選択する前に、ウイルス粒子を含む上清に再度曝露した。
【０３０９】
ＳＣＩＤ−ｒａｂ動物に、前述したようにウサギの骨を移植した。進行性病変を示す骨を有する動物に、標識した細胞（１×１０６個の細胞）を病変部に直接注入した。そのマウス中のＯＰＡＣの生体内分布を、リアルタイム、非侵襲性手段である生物発光画像化によって、異なる時点で観察した。感染の２週間および５週間後に、ＳＣＩＤ−ｒａｂ動物に外来性の骨を移植した領域において、ＥＧＦＰを発現しているＯＰＡＣをそのマウス中に検出することができた（データは示さない）。
【０３１０】
６．３．２．５  ＯＰＡＣは、初期骨髄腫ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスにおける骨塩量を増加させる
上記の通りに、初期骨髄腫ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスを構築した。ＥＬＩＳＡによるマウス血清中のヒトモノクローナル免疫グロブリン（ｈＩｇ）の濃度増加によって、および溶解性骨病変のレントゲン写真の評価によって判定した通り、骨髄腫の増殖が確立した時点で、１×１０６個のＥＧＦＰを発現しているＯＰＡＣをトリプシン−ＥＤＴＡを用いて採取し、１００μＬのＰＢＳに再懸濁した。これらＯＰＡＣおよびＰＢＳを、骨髄腫病変を含む移植骨に直接注入した。移植した骨の骨塩量（ＢＭＤ）の変化量を、ＰＩＸＩｍｕｓＤＥＸＡ（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＵＮＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、注入後８週〜１６週間の間に５週間の間隔で定量した。病巣内に投与したＯＰＡＣは、培地だけを注入した対照と比較して、移植した骨の骨塩量（ＢＭＤ）を増加させることが判明した（ｐ＝０．０００６）（図１９を参照）。
【０３１１】
６．３．２．６  ＯＰＡＣは、多発性骨髄腫の影響を受けた骨の骨質量を増加させる
上記の通りに、骨髄腫ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスを構築し、ヒト患者由来の初期骨髄腫細胞を注入した。ＥＬＩＳＡによって評価するマウス血清中のヒトモノクローナル免疫グロブリン（ｈＩｇ）の濃度増加によって、および溶解性骨病変のレントゲン写真の評価によって実証した通り、溶骨性病変が発達した後、５〜１０×１０５個のＥＧＦＰを発現しているＯＰＡＣを、上記の実施例に記載の通り投与した。注入後８週〜１６週間、実験を継続した。ＯＰＡＣ注入後に、ＥＬＩＳＡアッセイによるマウス血清中のヒトモノクローナル免疫グロブリン（ｈＩｇ）を用いて、ヒト骨髄腫細胞の量を定量した（図２０を参照）。移植した骨の骨塩量（ＢＭＤ）の変化を、ＰＩＸＩｍｕｓＤＥＸａ（ＢＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＵＮＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して定量した。研究の過程を通じて、病巣内投与されたＯＰＡＣを受けている骨髄腫マウス中の移植骨は、緩衝液だけを受けているマウスと比較した場合、注入後３５日目に骨質量の有意な増加（０．１０ｇ／ｃｍ２）を示した（ｐ＝０．００６）。
【０３１２】
６．３．２．７  ＯＰＡＣは、悪性（aggressive）多発性骨髄腫細胞株を投与したＳＣＩＤ−Ｒａｂ動物における骨破壊を阻害する
上記の通りに、骨髄腫ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスを構築した。悪性のＢＮ骨髄腫細胞株（ヒト患者から単離した非高２倍体の細胞株）を用いて骨髄腫を確立した時点で、骨髄腫細胞の増殖に対する緩衝液またはＯＰＡＣの効果を、ＥＬＩＳＡによるマウス血清中のヒトモノクローナル免疫グロブリン（ｈＩｇ）の濃度増加によって、および溶解性骨病変のレントゲン写真の評価によって判定した。０．５×１０６個のＥＧＦＰを発現しているＯＰＡＣ（０．５×１０６個の細胞）を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて採取し、５０μＬのＰＢＳに再懸濁した。これらＯＰＡＣおよびＰＢＳを、ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスに移植した骨の中に直接注入した。実験を、注入後８〜１６週間継続した。移植した骨の骨塩量（ＢＭＤ）の変化を、ＰＩＸＩｍｕｓＤＥＸＡ（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＵＮＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて定量した。これらデータは、骨塩量（ＢＭＤ）および骨ミネラル含量（ＢＭＣ）によって測定した通り、この悪性多発性骨髄腫細胞株に起因したであろう骨量減少を、ＯＰＡＣが阻害したことを示している。図２１を参照。
【０３１３】
ＯＰＡＣによる骨質量の減少の低減／消失を、Ｘ線検査によって、確認した（データは示さない）。新しい骨のＸ線不透過性領域の有意な増加によって明らかになった通り、ＯＰＡＣで処理した動物は、対照動物と比較した場合、より高い骨質量を有した。
【実施例４】
【０３１４】
６．４  ＯＰＡＣをメルファランと併用して使用する多発性骨髄腫の治療
この実施例は、多発性骨髄腫に関連した骨溶解性病変を治療するために、ＯＰＡＣをメルファランと併用して投与する有効性を例証している。
【０３１５】
上記６．３．１．２に記載されている通り、骨髄腫ＳＣＩＤ−ｒａｂマウスに、骨を移植した。マウスを、リン酸緩衝生理食塩水中に約１，０００，０００個の用量でＯＰＡＣを受けている群と、ＯＰＡＣを受けていない対照群とに分離した。第０週に、マウスにＥＧＦＰ／ルシフェラーゼを発現している多発性骨髄腫細胞株（ＢＮ）を移植骨の中へ直接注入し、第３週目から始めて４週間（骨髄腫細胞注入後の３週目〜７週目）の間、週に２回、１ｋｇにつき１０ｍｇのメルファランを皮下に処理した。第７週に、メルファラン処理を中止し、マウスあたり約１，０００，０００個の非標識のＯＰＡＣ細胞を、移植骨の中に病巣内注入した。疾患の進行を、追加で１１週間続けた。生きている動物の画像化を、第３週、第７週および第１８週に行った。ＥＧＦＰおよびルシフェラーゼの蛍光により証明した通り、ＯＰＡＣを受けているマウスは、対照と比較して多発性骨髄腫腫瘍細胞の負荷の低減を示した。さらに、ＯＰＡＣを受けているマウスは、対照マウスよりも良く骨質量を保持しており、対照マウスにおいてメルファラン後に約４％減少したのと比較して、メルファラン後に骨質量の約２８％の増加を示した。
【実施例５】
【０３１６】
６．５  凍結保存されたＯＰＡＣ産物および細胞バンクの生産
この実施例は、凍結ＯＰＡＣに基づく産物の生産を例示する。
【０３１７】
凍結保存：実施例１に記載の通り、ＯＰＡＣを得る。凍結されるべき細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養物から採取し、ＰＢＳ中の２％ＦＢＳで反応を止め、血球計算板で数えた。遠心分離の後、細胞バンクの組み立てに使用する細胞用に約１，０００，０００細胞／ｍＬ、個々の凍結細胞用量用に１０，０００，０００細胞／ｍＬの濃度で、細胞をＦＢＳ中の１０％のＤＭＳＯに再懸濁する。細胞溶液を凍結容器に移し、それを−８０℃の冷凍庫の中のイソプロピルアルコール槽の中に置く。次の日、細胞を液体窒素へ移す。
【０３１８】
６．５．１  ＯＰＡＣバンクの設計
「ロット」を、単一の提供者の絨毛膜に由来するすべての細胞用量として定義する。増殖培養中の８代の継代培養および３０回倍加以上の間、細胞は正常な増殖、核型および細胞表面マーカー表現型を維持した。この制限を前提として、用量は５代の継代培養および約２０回倍加由来の細胞を含んでいる。同等な細胞の供給を生み出すために、単一のロットを培養で増殖させ、二層構造の細胞バンク中凍結用量で保管する。特に、初代培養から採取した細胞（０回倍加を経た０代継代の細胞として定義する）を使用して増殖培養を開始する。第１継代の後、約４回倍加が起こり、細胞をＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＭＣＢ）に凍結する。このＭＣＢからのバイアルを使用して、追加の増殖培養を播種する。ＭＣＢから解凍した細胞をさらに２代継代培養した後、細胞をＷｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＷＣＢ）に凍結すると、累積で約１２回倍加になる。ＷＣＢからのバイアルを使用して、さらに増殖培養を播種して２代継代培養すると、結果として個別用量に凍結される、約２０回倍加で５代の継代培養の細胞を得る。
【０３１９】
６．５．２  培養用の細胞の解凍
細胞の凍結容器を、密封したプラスチック袋に入れて、３７℃の水浴に浸す。小さい氷を除くすべての内容物が溶けるまで容器を穏やかにかきまわす。容器を密封したプラスチック袋から取り出し、１０倍量の培地を穏やかに混合しながら細胞にゆっくり加える。試料を、血球計算板で計数し、増殖培養物に播種する。
【０３２０】
６．５．３  注入用の細胞の解凍
細胞の凍結容器を、乾燥窒素搬送具で投与現場に移す。投与の前に、容器を密封したプラスチック袋に入れて、３７℃の水浴に浸す。小さい氷を除いてすべての内容物が溶けるまで容器を穏やかにかきまわす。容器を密封したプラスチック袋から取り出し、等容量の２．５％のＨＳＡ／５％のデキストランを加える。さらに洗浄することなく細胞を注入する。
【０３２１】
６．５．４  試験および仕様
母性血液試料は、すべての提供者の胎盤に伴う。試料は、Ｂ型肝炎コア抗体および表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗体および核酸、ならびにＨＩＶ  ＩおよびＩＩ抗体および核酸に対するスクリーニングを行う。試験結果を受け取る前に胎盤の処理および初代培養を開始するが、すべてのウイルスに関する試験で陰性である母性血液試料に関連する胎盤だけを継続する。なんらかの病原体に関する試験で陽性であるドナーの場合、ロットを廃棄する。さらに、表３に記載する試験を、ＭＣＢ、ＷＣＢおよびＷＣＢのバイアル由来の細胞用量材料の試料について行う。すべての仕様が満たされる場合にだけロットを公開する。
【０３２２】
【表５】
2012500792.tif 000018
【実施例６】
【０３２３】
６．６  ＯＰＡＣの投与による多発性骨髄腫の治療
６．６．１  溶液中のＯＰＡＣの病巣内投与
個体が、骨痛および過カルシウム血症の症状を伴う多発性骨髄腫を発症している（この場合、３〜４ｍｍｏｌ／Ｌの血中カルシウム濃度）。Ｘ線画像化により、脛骨、腓骨、橈骨および尺骨における複数の病変の存在を確認する。病変部当たり１．０〜２．０ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の約１×１０７〜約１×１０８個のＯＰＡＣを、病変部に直接注入することによって、その個体に投与する。注入の後に、Ｘ線によってその個体を２週間ごとに評価して骨病変の範囲を定量する、そして骨病変がＸ線によって目に見えて低減する、または血中カルシウム濃度が検出可能なほど低減するまで血中カルシウム濃度を毎週評価する。最初の投与からの４週間以内に、ＯＰＡＣを任意に再投与する。
【０３２４】
６．６．２  コラーゲンゲル中のＯＰＡＣの病巣内投与
個体が、骨痛および過カルシウム血症の症状を伴う多発性骨髄腫を発症している（この場合、３〜４ｍｍｏｌ／Ｌの血中カルシウム濃度）。Ｘ線画像化により、脛骨、腓骨、橈骨および尺骨における複数の病変の存在を確認する。注入可能なゲルを形成するのに十分なコラーゲンを含む１．０〜２．０ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、病変部当たり約１×１０７〜約１×１０８個のＯＰＡＣを、病変部に直接注入することによって、その個体に投与する。注入の後に、Ｘ線によってその個体を２週間ごとに評価して骨病変の範囲を定量し、骨病変がＸ線によって目に見えて低減する、または血中カルシウム濃度が３ｍｍｏｌ／Ｌあるいはそれ以下に低減するまで血中カルシウム濃度を毎週評価する。最初の投与からの４週間以内に、ＯＰＡＣを任意に再投与する。
【０３２５】
６．６．３  移植骨交換によるＯＰＡＣの病巣内投与
個体が、骨痛および過カルシウム血症の症状を伴う多発性骨髄腫を発症している（この場合、３〜４ｍｍｏｌ／Ｌの血液カルシウム濃度）。Ｘ線画像化により、脛骨、腓骨、橈骨および尺骨における複数の病変の存在を確認する。ベッドサイドで、注入可能な骨−移植代用物（例えば、ＨＥＡＬＯＳ（登録商標））を、１．０〜２．０ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で約１×１０７〜約１×１０８個のＯＰＡＣと予備混合し、次に病変部でその個体中に注入する。注入の後に、Ｘ線によってその個体を２週間ごとに評価して骨病変の範囲を定量する、そして骨病変がＸ線によって目に見えて低減する、または血中カルシウム濃度が３ｍｍｏｌ／Ｌあるいはそれ以下に低減するまで血中カルシウム濃度を毎週評価する。最初の投与からの４週間以内に、ＯＰＡＣを任意に再投与する。
【０３２６】
６．６．４  ＯＰＡＣの静脈内投与
個体が、骨痛および過カルシウム血症の症状を伴う多発性骨髄腫を発症している（この場合、３〜４ｍｍｏｌ／Ｌの血液カルシウム濃度）。Ｘ線画像化により、脛骨、腓骨、橈骨および尺骨における複数の病変の存在を確認する。約７５０ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の約１×１０９〜約１×１０１０個のＯＰＡＣを、静脈内点滴によってその個体に投与する。注入の後に、Ｘ線によってその個体を２週間ごとに評価して骨病変の範囲を定量し、骨病変がＸ線によって目に見えて低減する、または血中カルシウム濃度が３ｍｍｏｌ／Ｌあるいはそれ以下に低減するまで血中カルシウム濃度を毎週評価する。最初の投与からの４週間以内に、ＯＰＡＣを任意に再投与する。
【０３２７】
均等物：
本明細書において提供される組成物および方法は、本明細書において記載されている特定の実施例によって範囲を限定されるものではない。実際、これら記載されているものに加えて実施例の様々な変更態様は、前述の説明および添付の図から当業者にとって明らかになる。この種の変更態様は、添付の請求の範囲内に含まれるものとする。
【０３２８】
様々な刊行物、特許および特許出願が本願明細書において引用されており、それらの開示はその全体を参照により本明細書に組み込む。
【図１】
2012500792.tif 000019
【図２】
2012500792.tif 000020
【図３】
2012500792.tif 000021
【図４】
2012500792.tif 000022
【図５】
2012500792.tif 000023
【図６】
2012500792.tif 000024
【図７】
2012500792.tif 000025
【図８】
2012500792.tif 000026
【図９】
2012500792.tif 000027
【図１０】
2012500792.tif 000028
【図１１】
2012500792.tif 000029
【図１２】
2012500792.tif 000030
【図１３】
2012500792.tif 000031
【図１４】
2012500792.tif 000032
【図１５】
2012500792.tif 000033
【図１６】
2012500792.tif 000034
【図１７】
2012500792.tif 000035
【図１８】
2012500792.tif 000036
【図１９】
2012500792.tif 000037
【図２０】
2012500792.tif 000038
【図２１】
2012500792.tif 000039
【国際調査報告】
2012500792.tif 000040
2012500792.tif 000041