(57)【要約】アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体およびその塩の調製および単離、鏡像異性体を分割する方法ならびにラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および／または酵素を特定する方法。本発明の態様は、１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割する方法を含む。その実施形態は：１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと；前記１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露するステップを含む。
2012532146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（４）の化合物
【化１３】
2012532146.tif 000017
（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎは１〜３の整数であり、ＨＸは、リン酸、硫酸、β，β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸または４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸である）。
【請求項２】
Ｒがメチルまたはエチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒがメチルであり、ＨＸがリン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒがエチルであり、ＨＸがリン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式（３）の化合物を酸ＨＸと反応させるステップを含む式（４）の化合物を製造するための方法
【化１４】
2012532146.tif 000018
（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎは１〜３の整数であり、ＨＸは、リン酸、硫酸、β，β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸または４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸である）。
【請求項６】
反応させるステップを有機溶媒中で実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
反応させるステップを、ＭＴＢＥ、酢酸エチル、ジクロロメタン、酢酸イソプロピルまたはトルエンを含む溶媒中で実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
反応させるステップを、水溶性共溶媒と組み合わせてＭＴＢＥ、酢酸エチル、ジクロロメタン、酢酸イソプロピル、またはトルエンを含む溶媒中で実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記式（４）の化合物を濾過により単離する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
式（５）のイミノエステル中間体を酸ＨＸで加水分解するステップを含む式（４）の化合物を製造する方法
【化１５】
2012532146.tif 000019
（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎは１〜３の整数であり、ＨＸは、リン酸、硫酸、β，β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸または４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸である）。
【請求項１１】
前記式（５）のイミノエステル中間体を、式（７）のトランス−１，４−ジハロブタ−２−エンを用いた（Ｅ）−Ｎ−フェニルメチレングリシンアルキルエステル（６）のジアルキル化によって得る、請求項１０に記載の方法。
【化１６】
2012532146.tif 000020
【請求項１２】
ジアルキル化に続いて、前記式（５）のイミノエステル中間体を単離せずに加水分解する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＸがリン酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記式（４）の化合物を濾過により単離する、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１５】
さらなる緩衝剤を用いずに生物学的分割プロセスにおいて式（４）の化合物を使用するステップを含む、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割のための方法。
【請求項１６】
ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる酵素を特定する方法であって：
ａ）ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと；
ｂ）細胞構成要素を前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露するステップと；
ｃ）前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、鏡像異性体比の変化について試験するステップと；
ｄ）前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に対して分割活性を有する酵素を単離するステップと；
ｅ）前記酵素を特定するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物が塩の形態である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物がリン酸塩、ナトリウム塩、硝酸塩またはカルシウム塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
暴露が流体接触である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
細胞構成要素を、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Ｆｏｒｍｏｓａ  ｓｐ．、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ｓｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｃｒｏｃｅｉｂａｃｔｅｒ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓおよびＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ａｅｑｕｏｒｅａ、Ａｑｕａｍａｒｉｎａ，ｓｐ．、ＡＱＰ３１７およびＡＱＰ３８３から得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割する方法であって：
ａ）１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと；
ｂ）１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルの前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
細胞構成要素を、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Ｆｏｒｍｏｓａ  ｓｐ．、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ｓｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｃｒｏｃｅｉｂａｃｔｅｒ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ、Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ａｅｑｕｏｒｅａ、Ａｑｕａｍａｒｉｎａ  ｓｐ．、ＡＱＰ３１７およびＡＱＰ３８３から得る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞構成要素が、図２の配列を有するタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
細胞構成要素が、図３の配列を有するタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は、サイズが１０，９５２バイトであり、「ＣＰＳ３＿４−００９＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前の、ＡＳＣＩＩ文章として２０１０年７月１日に作成された、本明細書とともに電子的に提出された配列表を含む。これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
緒言
本発明の態様は、アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体およびその塩の調製および単離、鏡像異性体を分割する方法、およびラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および／または酵素を特定する方法に関する。複数の態様では、アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体の塩を、追加的な緩衝能力を必要とすることなく、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割プロセスで使用して、鏡像異性体的に富化された１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造する。
【背景技術】
【０００３】
多くの化合物の化学合成は、所望の鏡像異性体を選択的に製造するのに失敗しており、したがって、さらに加工する前に、分離または分割しなければならないラセミ混合物または鏡像異性体混合物がもたらされる。アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体は、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼの阻害剤の調製のための主要中間体であると教示されている。非特許文献１を参照されたい。
【０００４】
Ｂｅａｕｌｉｅｕらの論文は、ベンズアルデヒドとグリシン酸エチル塩酸塩を縮合し、次いで、トランス−１，４−ジブロモブタ−２−エンと反応させてラセミ型アミノビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステル（１）を形成させるステップを含む、そうした誘導体を製造するアプローチを教示している。次いでこの化合物上のアミン官能基を、窒素原子上でのＢＯＣ基（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（ＣＨ３）３基）の付加によって保護する。保護された化合物（２）を酵素的分割に供し、任意選択でトシラート塩に転換させる。Ｂｅａｕｌｉｅｕらは、アミノエステル（１）の溶液を扱う場合、溶媒を減圧下、室温で除去すべきであると教示している。
【０００５】
【化１】
2012532146.tif 000003
保護されていない化合物を用いた直接分割法は、そうした誘導体へのより簡単で効率的な経路を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐ．  Ｌ．  Ｂｅａｕｌｉｅｕら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （１Ｒ，２Ｓ）−１−Ａｍｉｎｏ−２−ｖｉｎｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｖｉｎｙｌ−ＡＣＣＡ）  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：  Ｋｅｙ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  ＮＳ３  Ｐｒｏｔｅａｓｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７０巻（１５号）、５８６９〜５８７９頁、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
要旨
鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するための代替的アプローチを見出した。具体的には、１つのアプローチは、アミノエステル（３）のヒドロラーゼ触媒による生物学的分割を含む。
【０００８】
【化２】
2012532146.tif 000004
大量のアミノエステル（３）を得るために、酵素的分割の前に、溶媒および反応混合物から前記化合物を分離するのに蒸留を考慮するかもしれない。しかし、溶媒からのアミノエステル（３）の室温での真空分離は、効率的な大規模生産には適していない。さらに、最近、１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸エステル、例えば（３）（Ｒはメチルまたはエチルである）は比較的低い熱安定性を有し、加速速度熱量計（ＡＲＣ）により、５０℃で発熱を示すことが発見されている。これらの要素は、大規模生産で使用するのに一般に望ましい加工上の選択肢を限定することになる。
【０００９】
本発明の出願人らは、効率的な大規模生産を可能にするいくつかの新規な塩を発見した。驚くべきことに、これらの塩は、エナンチオが豊富なアミノエステル（３）のための実行可能な製造プロセスを可能にする特定の利点を有することが分かった。これらの利点は、以下の１つまたは複数を含む：塩の融点（代表的に＞１００℃）を超える温度に対する高い熱安定性；高価なＢＯＣ無水物反応物の回避；取扱いおよび貯蔵をより簡単にする改善された化合物形態（遊離アミンまたはＢＯＣ保護アミンが油状形態であるのに対して、固体である）；多大な時間を必要とする低温真空分離ステップの回避；低熱安定性化合物の温度を高める蒸留ステップの回避；次の生物学的分割ステップにおける、追加の緩衝剤を必要としない塩の直接使用への適切性。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、本発明は、式（４）の化合物
【００１１】
【化３】
2012532146.tif 000005
（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎは１〜３の整数であり、ＨＸは、リン酸、硫酸、β，β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸などの酸である）
を含む。
【００１２】
一態様では、本発明は、式（３）の化合物
【００１３】
【化４】
2012532146.tif 000006
を上で規定した酸ＨＸと反応させることによって、上記化合物（４）を作製する方法を含む。
【００１４】
本発明の他の態様は、上記塩化合物（４）を、溶媒中で適切な（Ｅ）−Ｎ−フェニルメチレングリシンアルキルエステルをトランス−１，４−ジハロブタ−２−エンでジアルキル化し、式（５）の中間体イミノエステルを酸ＨＸで加水分解し、得られた塩を濾過などにより単離することによって作製する方法を含む。
【００１５】
【化５】
2012532146.tif 000007
本発明の他の態様は、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割プロセスにおいて、追加の緩衝剤を必要とすることなく上記塩化合物（４）を使用することを含む。
【００１６】
本発明の他の態様は、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる酵素を特定する方法を含む。その方法の実施形態は：ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと；細胞構成要素をラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露するステップと；ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、鏡像異性体比の変化について試験するステップと；ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に対して分割活性を有する酵素を単離するステップと；前記酵素を特定するステップとを含む。
【００１７】
本発明の態様は、１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割する方法を含む。その実施形態は：１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと；前記１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、アキラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した、様々な酵素を用いた、５０ｇ／Ｌの１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルの加水分解速度を示すグラフである。
【図２】図２は、Ｌｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓから誘導され、鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するのに有用なタンパク質の配列表である。
【図３】図３は、Ｃｒｏｃｉｂａｃｔｅｒ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓから誘導され、鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するのに有用なタンパク質の配列表である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第１の実施形態によれば、本発明は、式（４）の化合物
【００２０】
【化６】
2012532146.tif 000008
（式中、Ｒはアルキル基である）
を含む。複数の実施形態では、Ｒは１〜約２０個の炭素原子もしくは１〜約６個の炭素原子を有するか、またはＲはメチルもしくはエチルである。特定の実施形態では、Ｒが２個超の炭素原子を有する場合、Ｒはｎ−アルキル基である。ＨＸは、リン酸、硫酸、β，β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸などの酸であり、ｎは約１〜３の整数である。
【００２１】
塩は、式ＨＸの酸と式（３）の化合物
【００２２】
【化７】
2012532146.tif 000009
を含む溶液を反応させることによって作製できる。
【００２３】
遊離アミノエステル（３）の濃度は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌまたは少なくとも約７５ｇ／Ｌであってよく、一般に約２００ｇ／Ｌ未満または約１００ｇ／Ｌ未満であってよい。加える酸の量は、アミノエステルのモル当たり約０．３〜２モル当量、約０．５〜１．５モル当量または約１モル当量である。
【００２４】
塩の形成は有機溶媒中でなされる。適切な溶媒は、その中で遊離塩基（すなわち、遊離アミノエステル）が良好な溶解性をもつが、その塩は低い溶解性をもつ溶媒である。有用な溶媒には、これらに限定されないが、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などのエーテル、酢酸エチルおよび酢酸イソプロピルなどのエステル、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素およびトルエンなどの炭化水素が含まれる。塩の形成は、溶媒と水溶性共溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトンなど）との組合せを用いて実施することができる。共溶媒の量は一般に溶媒の全量に対して約５〜２０％である。
【００２５】
したがって、複数の実施形態によれば、化合物（４）は以下のスキーム１のようにして作製することができる：
【００２６】
【化８】
2012532146.tif 000010
１つのアプローチによれば、（Ｅ）−Ｎ−フェニルメチレングリシンアルキルエステルおよびトランス−１，４−ジハロブタ−２−エンから出発して、化合物（４）を、溶媒中で適切な（Ｅ）−Ｎ−フェニルメチレングリシンアルキルエステルをトランス−１，４−ジハロブタ−２−エンでジアルキル化し、酸を用いて中間体イミノエステルを加水分解し（ただし、所望のＨＸ以外の酸を使用する場合、その加水分解ステップの後、ｐＨを約８〜９に調節する）、溶媒抽出し、低級アルコールおよび酸ＨＸを添加し；遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって塩を単離することによって作製することができる。このアプローチを、具体的な特定の試薬を示す以下のスキーム２に例示する。
【００２７】
【化９】
2012532146.tif 000011
ジアルキル化ステップは塩基によって促進される。有用な塩基には、これらに限定されないが、水酸化カリウム、ナトリウムｔ−ブトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、リチウムｔ−ブトキシド、リチウムヘキサメチルシラザン、ナトリウムヘキサメチルシラザンおよびカリウムヘキサメチルシラザンなどが含まれる。トランス−１，４−ジハロブタ−２−エンはトランス−１，４−ジブロモブタ−２−エンであってよい。
【００２８】
ジアルキル化ステップは代表的に適切な溶媒中で行う。そうした溶媒の非限定的な例はトルエン、ＭＴＢＥ、ヘキサンおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である。有用な溶媒の例は、５０〜７０容量％のＭＴＢＥを含むトルエンとＭＴＢＥとの混合物である。
【００２９】
トランス−１，４−ジブロモブタ−２−エンのモル当たりのリチウムｔ−ブトキシドまたは他の塩基の有用な量は、約２．１〜２．６モル当量であり、トランス−１，４−ジブロモブタ−２−エンのモル当たりの（Ｅ）−Ｎ−フェニルメチレングリシンアルキルエステルの有用な量は、約１．０５〜１．５モル当量である。
【００３０】
次いでジアルキル化ステップから得られたイミノエステル（５）の溶液を加水分解する。１つのアプローチによれば、加水分解ステップは、これらに限定されないが、０．１Ｍ〜１２Ｍまたは２Ｍ〜６Ｍの濃度のＨＣｌ水溶液を含む塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸などの適切な酸を用いることを含む。
【００３１】
加水分解後、有機相を廃棄し、塩基を加えてｐＨを約８〜９に上げる。適切な塩基には、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムが含まれる。次いでアミノエステルを、ＭＴＢＥなどの適切な有機溶媒に抽出することができる。このアプローチ（所望のＨＸ以外の酸を用いる）では、次いで、上記した手順にしたがって酸ＨＸを加えて塩を形成させる。
【００３２】
スキーム３に例示する代替のアプローチによれば、ＨＸを用いて５の加水分解を直接行って対応する塩を形成させることができる。このアプローチにおいて、アミノエステルのモル当たりの加える酸ＨＸの量は、約０．３〜２モル当量もしくは約０．５〜１．５モル当量の範囲または約１モル当量である。
【００３３】
【化１０】
2012532146.tif 000012
次いで塩を、遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、熱的に安定であり、その後の反応で扱うのに容易である固体として単離する。スキーム４で示すように、化合物（４）を、ラセミ種の酵素的分割において用いて、所望の単一鏡像異性体を優先的に得ることができる。
【００３４】
【化１１】
2012532146.tif 000013
これらの塩は、塩を水に溶解し、塩基を加えてｐＨを６〜９の範囲に調節し、ヒドロラーゼ酵素を加えることによって、ヒドロラーゼ触媒による酵素的分割において直接使用することができる。追加の緩衝剤は必要でない。生物体であって、適切な酵素をそれから得ることができる生物体の例には、Ｆｏｒｍｏｓａ  ｓｐ．、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ｓｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｃｒｏｃｅｉｂａｃｔｅｒ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ、Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ａｅｑｕｏｒｅａおよびＡｑｕａｍａｒｉｎａ，ｓｐ．  が含まれる。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および／または酵素を特定する方法に関する。
【００３６】
複数の実施形態では、スキーム５に概略的に示すように、１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および／または酵素を特定する方法を提供する。
【００３７】
【化１２】
2012532146.tif 000014
特定の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、１つまたは複数の生物体から細胞構成要素へ暴露させることができる。他の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を試験して、その混合物の鏡像異性体比または分割に変化があるかどうかを判定することができる。
【００３８】
代替の実施形態では、分割活性を有する１つもしくは複数の酵素を単離または特定するために、分割活性を有することが示されている細胞構成要素を、分画または分離し、分割活性についてさらに試験することができる。追加の実施形態では、分割活性を有する１つもしくは複数の酵素は、酵素に加えて非限定的な例を挙げると、ペプチドまたはＲＮＡであってよい。本発明の特定の実施形態では、分割活性を有する１つもしくは複数の酵素をコード化する遺伝子を、当該分野で標準的な手法を用いて特定しクローン化することができる。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（ｅｄｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１．８４〜１．８８、２００１年を参照されたい。
【００３９】
本明細書で用いる分割は、鏡像異性体のペアの一方の他方に対するレベル（鏡像異性体比）の変化に関する。したがって、分割は、一方の鏡像異性体を改変させて、それをもはや鏡像異性体ペアの一部でないようにするか、または一方の鏡像異性体を他方の鏡像異性体に転換させることによってもたらされる。分割の１つの非限定的な例は、エステルを切断して１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸を形成させることを含む。
【００４０】
本明細書で用いる、鏡像異性体的に富化された混合物は、鏡像異性体比が１：１以外である鏡像異性体のペアを含む混合物を指す。
【００４１】
本発明の複数の実施形態では、ラセミ混合物または鏡像異性体的に富化された混合物は、鏡像異性体ペアの２つの種を含む任意の組成物または溶液を含むことができる。さらなる実施形態では、鏡像異性体ペアの１つまたは複数の基を、例えばＢＯＣ基で保護することができる。他の実施形態では、鏡像異性体ペアの分子は、塩の一部であっても一部として存在してもよい。その塩の非限定的な例はリン酸塩、ナトリウム塩、硝酸塩またはカルシウム塩である。さらなる実施形態では、鏡像異性体ペアの分子は、遊離アミンの形態であってよい。特定の実施形態では、鏡像異性体ペアを含む混合物または溶液は、任意の溶媒または溶液を含むことができる。溶媒または溶液の例には、これらに限定されないが、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水および／またはポリソルベート界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）製品）を含む溶液が含まれる。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露することは、混合物と細胞構成要素を互いに接触させ、それによって細胞構成要素が少なくとも部分的に混合物を分割できるようにする任意の方法または手法を含むことができる。暴露の方法の例は、これらに限定されないが、流体接触および物理的接触を含む。
【００４３】
細胞構成要素への暴露は、統計的に有意な鏡像異性体比の変化が認められるまたは判定されるのに必要な任意の時間行うことができる。暴露時間の例は、これらに限定されないが、約０．１時間〜約７２時間、約１時間〜約４８時間、約８時間〜約３０時間、約３０時間および約１２時間を含む。
【００４４】
暴露はまた任意の温度で行うことができる。複数の実施形態では、暴露を、おおよそ、生物体の通常の生存環境（細胞構成要素がそれから得られる）の温度で行う。暴露を行うことができる温度の例は、これらに限定されないが、約１℃〜約９９℃、約１０℃〜約５０℃および約３０℃を含む。
【００４５】
細胞構成要素への暴露は任意のｐＨ値で行うことができる。暴露を行うことができるｐＨ値の例は、これらに限定されないが、約ｐＨ１〜約ｐＨ１２、約ｐＨ３〜約ｐＨ１１、約ｐＨ６〜約ｐＨ９、約ｐＨ９および約ｐＨ７を含む。
【００４６】
本発明の特定の実施形態では、細胞構成要素は、これらに限定されないが、細胞抽出物、細胞ペースト、細胞溶解物、無細胞抽出物、凍結乾燥された無細胞抽出物、凍結乾燥された細胞抽出物、凍結乾燥された細胞ペースト、凍結乾燥された細胞溶解物、超音波処理された細胞、単離されたタンパク質および／またはその組合せおよび／または画分および／またはフラグメントを含むことができる。
【００４７】
細胞構成要素は、任意の生物体または生物体の組合せ由来のものであってよい。生物体であって、細胞構成要素がそれから得られる生物体の例は、これらに限定されないが、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Ｆｏｒｍｏｓａ  ｓｐ．、Ｐｓｙｃｈｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ｓｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｃｒｏｃｅｉｂａｃｔｅｒ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓおよびＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ａｅｑｕｏｒｅａ、Ａｑｕａｍａｒｉｎａ，ｓｐ．、ＡＱＰ３１７およびＡＱＰ３８３を含む。
【００４８】
ＡＱＰ３１７は、ブダペスト条約に基づいて、２００７年３月９日付けのＮＣＩＭＢ４１４７５として工業用、食品用および海洋細菌の国立コレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（「ＮＣＩＭＢ」））、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄで供託されたものであり、ＡＱＰ３８３は、２００７年３月９日付けのＮＣＩＭＢ４１４７６としてＮＣＩＭＢで供託されたものである。
【００４９】
Ｌｅｅｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓは、ブダペスト条約に基づいて、２０１０年にＮＣＩＭＢで供託されたものである。Ｃｒｏｃｅｉｂａｃｔｅｒ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓは、ブダペスト条約に基づいて、２０１０年にＮＣＩＭＢで供託されたものである。Ｌｅｅｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ａｑｕｏｒｅａは、ブダペスト条約に基づいて、２０１０年にＮＣＩＭＢで供託されたものである。
【００５０】
本発明の代替の実施形態では、細胞構成要素はさらに分画または分離することができる。分画または分離の方法は、これらに限定されないが、様々な形態のクロマトグラフィー法、サイズ排除法、ゲル電気泳動法、等電点および沈殿分離法を含む。細胞構成要素は、硫酸アンモニウム沈殿法で分画することができる。
【００５１】
他の実施形態では、分割活性を有する酵素を、約３０％〜４０％またはそれを超える硫酸アンモニウム濃度で優先的に沈殿させることができ、かつ／または約５０％〜６０％またはそれを超える硫酸アンモニウム濃度で優先的に沈殿させることができる。
【００５２】
以下の実施例で、特定の具体的な態様および実施形態をさらに例示する。これらの実施例は例示を目的としたのに過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでは全くない。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルの合成。
【００５４】
ＭＴＢＥ（１．５Ｌ）中のトランス−１，４−ジブロモ−２−ブテン（３４０．６ｇ、１．３３ｍｏｌ）の撹拌溶液に、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３１８ｇ、３．３２５ｍｏｌ）を加える。得られた懸濁液を１５℃未満に冷却し、反応温度を確実に１５〜２０℃に保持しながら、トルエン（８７５ｍＬ）中の（Ｅ）−Ｎ−フェニルメチレングリシンメチルエステル（３１０ｇ、１．７５ｍｏｌ）の溶液を６０分間かけて徐々に加える。２０〜２５℃でさらに２時間撹拌した後、ＮａＣｌ溶液（２０重量％、２Ｌ）を加えて反応をクエンチする。有機相を１Ｍ  ＨＣｌ溶液（１．７５Ｌ、１．７５ｍｏｌ）と混合し、２０℃で２時間激しく撹拌する。その塊から一定分量を取って中間体イミンがすべて加水分解されていることを確認する。次いで相を分離し、水相を５００ｍｌ  ＭＴＢＥで洗浄する。次いで水相を１３℃に冷却し、ｐＨをＮａＯＨ溶液（６Ｍ、２００ｍＬ）で約９に調節する。次いで混合物をＭＴＢＥ（５Ｌ）で抽出し、１８６ｇの１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルを含む溶液を得る。
【００５５】
（実施例２）
１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【００５６】
オーバーヘッドスターラーを備えた丸底フラスコに、ＭＴＢＥ（１１０ｍＬ）中の１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステル（７ｇ）の溶液を入れる。次いでメタノール（１０ｍＬ）を加え、混合物を室温で撹拌する。オルトリン酸（３．５ｍＬ）を滴下し、沈殿物を形成させる。添加が完了した後、撹拌をさらに６０分間続行する。次いでリン酸塩を濾過により回収し、真空下で乾燥する。リン酸塩を１１．７２ｇ（約９８％）のベージュ色粉末として得る。
【００５７】
１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ４−ＭｅＯＨ）：  δ  ５．８２−５．７０  （ｍ，１Ｈ），５．４２  （ｄｄ，Ｊ＝１７＆１，１Ｈ），５．２２  （ｄｄ，Ｊ＝１０＆１，１Ｈ），３．８６  （ｓ，３Ｈ），２．４９  （ｑ，Ｊ＝９，１Ｈ），１．８５−１．８０（ｍ，１Ｈ），１．８０−１．７３（ｍ，１Ｈ）。
【００５８】
（実施例３）
１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【００５９】
グラスライン製反応器中で、実施例１に記載した合成手順によって、ＭＴＢＥ（５６６Ｋｇ）中のほぼ１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステル（７０Ｋｇ）の溶液を調製する。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し濾過した後、メタノール（４０Ｋｇ）を加える。１５℃未満の温度で８０％リン酸（６０Ｋｇ）を４０分間かけて徐々に加える。この間に沈殿物が形成する。添加が完了したら、スラリーを１０℃未満で少なくともさらに１時間撹拌する。固体を濾過により収集し、ＭＴＢＥで洗浄し、フィルターから貯蔵容器へ、代表的に２３％ＭＴＢＥ含量を有する湿潤した灰白色濾過ケーキとして排出する。約１３８．５ｋｇの湿潤濾過ケーキを単離する。これは、無溶媒ベースで約１０６．５ｋｇ（約９０％収率）の１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルホスフェートに相当する。
【００６０】
（実施例４）
１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩の合成。
【００６１】
丸底フラスコに、ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）中の１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステル（８．５ｇ）の溶液を入れる。次いでメタノール（１２ｍＬ）を加え、混合物を室温で撹拌する。オルトリン酸（６ｍＬ）を滴下すると、沈殿物の形成が始まる。添加が完了した後、撹拌をさらに２時間続行する。濾過によりリン酸塩を回収し、ＭＴＢＥで洗浄し、真空下で乾燥する。約９．４ｇ（７０％収率）の灰白色固体を得る。
【００６２】
１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ４−ＭｅＯＨ）：  δ  ５．８１−５．６７（ｍ，１Ｈ），５．３８  （ｄｄ，Ｊ＝１６＆１，１Ｈ），５．１９（ｄｄ，Ｊ＝１１＆１，１Ｈ），４．２８（ｑ，Ｊ＝７，２Ｈ），２．４３（ｑ，Ｊ＝９，１Ｈ），１．８０−１．６８（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｔ，Ｊ＝７，３Ｈ）。
【００６３】
（実施例５）
Ｎ−フェニルメチレングリシンメチルエステルからの１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【００６４】
ＭＴＢＥ（５０ｍＬ）中にスラリー化したリチウムｔ−ブトキシド（３１．８ｇ）に、ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）に溶解したトランス−１，４−ジブロモ−２−ブテン（３４ｇ）を加える。次いでこの撹拌した反応混合物に、トルエン（９０ｇ）中のＮ−フェニルメチレングリシンメチルエステル（３１ｇ）の溶液を加える。添加の間、温度を１５℃未満に保持し、続いて反応物を周囲温度で２時間撹拌する。ＮａＣｌ溶液（２０重量％、２００ｍＬ）を加えて反応物をクエンチする。水相を廃棄し、有機相に約１５容量％のメタノールを加える。溶液を５℃未満に冷却し、１モル当量の８５％リン酸を徐々に加えてリン酸塩を沈澱させる。混合物を６０分間撹拌し、沈殿物を濾過により回収し、ＭＴＢＥで洗浄する。ＨＰＬＣで約９７％の純度を有する、３２．３ｇの量の１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩（トランス−１，４−ジブロモ−２−ブテンに基づいて８５％収率）を得る。
【００６５】
（実施例６）
１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩のエステラーゼ触媒による生物学的分割。
【００６６】
２０ｍＬのステムブロック管（ｓｔｅｍ  ｂｌｏｃｋ  ｔｕｂｅ）に、脱イオン水（４ｍＬ）に溶解した１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩（０．５ｇ、２ｍｍｏｌ）を入れる。１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（２ｍＬ）を滴下して溶液のｐＨを８に調節する。混合物を２５℃で連続的に撹拌し、凍結乾燥したＡＱＰ３１７（Ｆｏｒｍｏｓａ  ａｌｇａｅ）（２００ｍｇ）を加える。撹拌を２５℃で４１時間続行し、次いでＨＰＬＣ分析により転換率が約５０％に達したことを判定する。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により、残留エステルの鏡像異性体過剰率が９９％に達していることが示される。
【００６７】
（実施例７）
エステラーゼ活性のための一次スクリーニング。
【００６８】
基質、１−アミノ−２−ビニル−シクロプロパンカルボン酸メチルエステル（２００μＬ、リン酸緩衝生理食塩水中に１０ｇ／Ｌ）を、ウェル当たり１ｍｇの凍結乾燥された細胞ペーストを含むスクリーニングプレートに塗布する。３０℃で終夜インキュベーションした後、反応物をＨＰＬＣ移動相中にサンプリングし、アミノ酸の形成を分析する。疑わしいヒットのさらなる分析を、キラルＧＣによりＣｈｉｒａｓｉｌ  Ｄｅｘ  ＣＢカラム、８３０ＫＰａ（２０ｐ．ｓ．ｉ．）のヘリウムキャリアガスで、１００℃のオーブン温度（等温）で、トリフルオロアセテートとしての残留エステルの分析により実施する。２３０の海洋微生物のスクリーニングにより、残留エステル鏡像異性体過剰率９０％を超える１２のヒットが確認された微生物を特定する。
【００６９】
（実施例８）
Ａｑｕａｐｈａｒｍ（商標）生物体スクリーニング。
【００７０】
凍結乾燥された生物体調製品（Ａｑｕａｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．から入手）の１２のヒットが確認されたもののうちの８つからなる約４ｍｇのサブセットを、リン酸緩衝生理食塩水＋０．１容量％のＴｗｅｅｎ８０（ｐＨ７）中、またはリン酸緩衝液ｐＨ９中、１ｍＬの１０ｇ／Ｌの１−アミノ−２−ビニル−シクロプロパンカルボン酸メチルエステルと一緒に、ガラス製のシンチレーションバイアル瓶に量り込む。これらの混合物を３０℃、３００ｒｐｍで３０時間インキュベートする。反応後の残留エステルをＧＣによりトリフルオロ酢酸誘導体として分析する。結果を表１に示す。すべての試料は、ｐＨ９よりｐＨ７でより活性である。
【００７１】
一次培養プレートからの回収を試みて、ＡＱＰ２５０は不可能であることが判明する。類似した形態を有し同じ供給源から単離された、Ｐｓｙｈｃｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ｓｐと特定されておりＡＱＰ３８３と指定した他の生物体を代替品として使用する。アッセイすると、これも所望の活性を有することが実証される。
【００７２】
【表１】
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（実施例９）
５０ｇ／Ｌの基質濃度での活性。
【００７３】
２００ｍｇの凍結乾燥された細胞ペーストと２５０ｍｇのメチル−１−アミノ−２−ビニル−シクロプロパンカルボキシレートリン酸塩を含む反応物を合計５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に調製し、アキラルＨＰＬＣを用いて経時的にその転換をモニターする。２つの生物体、ＡＱＰ３１７およびＡＱＰ３８３は、アキラルＨＰＬＣで判断して、他の確認済みヒットと比較して著しく高い活性度を示し、これらの濃度で基質を完全に分割している。結果を図１にプロットする。
【００７４】
（実施例１０）
１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩のＡｌｃａｌａｓｅ触媒による生物学的分割
脱イオン水（４５ｍＬ）中の１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩（２ｇ、７．９ｍｍｏｌ）をジャケット付き容器に入れ、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液（５ｍＬ）を加えることでｐＨを８に調節する。混合物を３５℃で連続的に撹拌し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから販売されているＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）酵素溶液（６ｍＬ）を加える。混合物を連続的に撹拌し、ｐＨを８．１５に保持する。一定分量（１００μＬ）を定期的に取る。ＧＣ分析はｅ．ｅ．（鏡像体過剰率）＝５．７％（ｔ＝２４時間）、ｅ．ｅ．＝１４．３％（ｔ＝４８時間）およびｅ．ｅ．＝２１．４％（ｔ＝７２時間）を示す。７２時間後でも有意の転換は起こっておらず、反応は停止している。反応はスキーム５で表される。
【００７５】
（実施例１１）
Ｆｏｒｍｏｓａ  ａｌｇａｅ  ＡＱＰ３１７の無細胞抽出物の調製。
【００７６】
ＡＱＰ３１７、Ｆｏｒｍｏｓａ  ａｌｇａｅの無細胞抽出物を、５００ｍＬ培養液から（ｅｘ  ｏｆ）の５００ｍｇの凍結乾燥された細胞ペーストを５０ｍＬのＰＢＳに再懸濁させて調製する。細胞懸濁液を、１５μｍの振幅、４℃で、１０秒間オン１５秒間オフで３０分間、超音波処理する。残渣を４℃、１０，０００Ｇで１０分間遠心分離により除去する。
【００７７】
無細胞抽出物を一連の硫酸アンモニウム沈澱法に供し、沈殿物を４℃、１０，０００Ｇで２０分間遠心分離により回収する。Ｒ．  Ｍ．  Ｃ．  Ｄａｗｓｏｎら、ｅｄｓ．、Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、５３７〜５３９頁、１９８６年を参照されたい。各ペレットを５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４４１７）に再懸濁する。タンパク質含量を、ＰｉｅｒｃｅからのＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ試薬を用いてアッセイする。同様の実験をＰｓｙｃｈｒｏｓｅｒｐｅｎｓ  ＡＱＰ３８３を用いて実施する。活性は３０〜４０％で降下することが示される。
【００７８】
（実施例１２）
生体内変換アッセイ。
【００７９】
活性を、リン酸緩衝生理食塩水中に１０ｍＭの１−アミノ２−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩を含む１ｍＬシンチレーションバイアル瓶でアッセイする。２．５時間後に反応物をサンプリングし、ＨＰＬＣ移動相に１：５で希釈し次いで分析する。次いで転換率を、存在する酵素活性単位数を算出するために用いる。結果を表２に示す。
【００８０】
（実施例１３）
分割活性の単離。
【００８１】
ＡＱＰ３１７およびＡＱＰ３８３の無細胞抽出物を標準的な手法を用いて分画する。種々の画分を、１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露し、３０℃で３０時間インキュベートする。次いで異なる画分を、上記に説明したような鏡像異性体比の変化について試験する。分割活性を有する画分を、ゲル電気泳動によりさらに分画および／または分離する。さらなる画分およびゲル単離物を分割活性について試験する。分割活性を有する単一化合物をエステラーゼとして単離し特定する。単離したエステラーゼを、カルボキシルおよび／もしくはアミノペプチド配列決定またはタンパク質質量分析にかける。次いで配列情報を用いて、エステラーゼをコードする遺伝子の単離のための推定プライマー対を作り出すか、または全遺伝子の合成ができるようにする。ＡＱＰ３１７およびＡＱＰ３８３、Ｌｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｃｒｏｃｅｉｂａｃｔｅｒ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓならびにＬｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ  ａｑｕｏｒｅａのＤＮＡ抽出物を作製し、ＰＣＲを、推定プライマー対を用いて実施する。ＰＣＲ産生物を分析し、エステラーゼをコード化する配列を単離し、ベクター中にクローン化し、次いで配列決定する。
【００８２】
（実施例１４）
クローン化したポリペプチドの活性の実証
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、当業者に公知の標準的な手法を用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ発現系にクローン化する。
【００８３】
組み換えエステラーゼの培養物を２５℃で成長させ、２４時間の成長後に誘発させ、誘発後に間隔を置いて１ｍＬ試料を取り、マイクロ遠心分離にかける。ペレットを１ｍＬ、２０ｇ／Ｌの１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩ｐＨ７に再懸濁させ、２５℃でインキュベートする。１４４時間反応させた後、残留エステルをＭＴＢＥで抽出し、トリフルオロ酢酸無水物で誘導化し、ガスクロマトグラフィーで分析する。残留エステルは８７％の鏡像異性体過剰率を有する。
【００８４】
【表２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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