(57)【要約】  ＤＮＡの定量測定のためのインピーダンス分光システムと方法とを提供する。上記方法では、共有された局所環境に露出した電極表面を有するトランスデューサを準備する。上記電極表面は、所定のＤＮＡ標的と反応するオリゴヌクレオチドによって機能化されている。ヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素およびプライマーを含むＤＮＡ試料溶液を上記局所環境に導入する。このＤＮＡ試料に対して熱サイクル処理を行い、第１ＤＮＡ標的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。その後トランスデューサ電極対の間のキャパシタンスを測定し、キャパシタンスの測定に基づいて上記ＤＮＡ試料中の第１ＤＮＡアンプリコンの有無を決定する。通常、アンプリコンの成長率を求めるため、熱サイクルを複数回行いキャパシタンス測定は各サイクルの後に行われる。
2012501174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の定量のためのインピーダンス分光法であって、
共有された環境に露出した電極表面であって、所定の第１ＤＮＡ標的と相互作用するオリゴヌクレオチドによって機能化された電極表面、を有するトランスデューサを準備するステップと、
上記共有された環境へ、ヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素およびプライマーを含むＤＮＡ試料溶液を導入するステップと、
上記ＤＮＡ試料に対して熱サイクル処理を施して、第１ＤＮＡ標的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うステップと、
トランスデューサ電極対の間のキャパシタンスを測定するステップと、
上記キャパシタンスの測定に基づいて、上記ＤＮＡ試料中の第１ＤＮＡアンプリコンの存在を決定するステップと、を含むことを特徴とするインピーダンス分光法。
【請求項２】
上記オリゴヌクレオチドによって機能化された電極表面を有するトランスデューサを準備するステップは、上記電極表面に固着した３’末端と溶液側に露出した５’末端とを有する固着されたプローブ分子、および、上記電極表面に固着した５’末端と溶液側に露出した３’末端とを有する固着されたプローブ分子からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを備える電極表面を準備するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載のインピーダンス分光法。
【請求項３】
上記オリゴヌクレオチドによって機能化された電極表面を有するトランスデューサを準備するステップは、第２電極と噛み合った形状を有する第１電極を準備するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載のインピーダンス分光法。
【請求項４】
上記ＤＮＡ試料に対して熱サイクル処理を施して、第１ＤＮＡ標的ＰＣＲを行うステップは、各熱サイクルにおいて、
上記第１ＤＮＡ試料を、第１温度にて変性するステップと、
上記第１ＤＮＡ試料を、第１温度よりも低温である第２温度にてアニーリングするステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載のインピーダンス分光法。
【請求項５】
上記各熱サイクルは、更に、アニーリングの後で、第１温度と第２温度との間の第３温度にて伸長を行うステップを含むことを特徴とする請求項４に記載のインピーダンス分光法。
【請求項６】
上記ＤＮＡ試料に対して熱サイクル処理を施して、第１ＤＮＡ標的ＰＣＲを行うステップは、２０回〜５０回の熱サイクルを含むことを特徴とする請求項４に記載のインピーダンス分光法。
【請求項７】
上記ＤＮＡ試料に対して熱サイクル処理を施して、第１ＤＮＡ標的ＰＣＲを行うステップは、略９５℃にて変性を行うステップと、略４５℃〜略７５℃の温度にてアニーリングを行うステップと、を含むことを特徴とする請求項４に記載のインピーダンス分光法。
【請求項８】
上記オリゴヌクレオチドによって機能化された電極表面を有するトランスデューサを準備するステップは、上記電極表面に固着した３’末端と溶液側に露出した５’末端とを有する固着されたオリゴヌクレオチドプローブ分子を備える電極表面を準備するステップを含み、
上記ＤＮＡ試料に対して熱サイクル処理を施すステップは、アニーリングの各サイクルにて、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンを上記固着されたプローブ分子に結合させるステップを含み、
上記トランスデューサ電極対の間のキャパシタンスを測定するステップは、アニーリングの各サイクルの後でキャパシタンスを測定するステップを含む、ことを特徴とする請求項４に記載のインピーダンス分光法。
【請求項９】
上記トランスデューサ電極対の間のキャパシタンスを測定するステップは、
複数回の熱処理サイクルのキャパシタンスを測定するステップと、
測定された複数のキャパシタンスを比較するステップと、を有することを特徴とする請求項１に記載のインピーダンス分光法。
【請求項１０】
上記オリゴヌクレオチドによって機能化された電極表面を有するトランスデューサを準備するステップは、上記電極表面に固着した５’末端と溶液側に露出した３’末端とを有する固着されたオリゴヌクレオチドプローブ分子を備える電極表面を準備するステップを含み、
上記ＤＮＡ試料に対して熱サイクル処理を施すステップは、各変性サイクルの後に、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンと上記固着されたプローブ分子との間の結合を維持するステップを含み、
上記トランスデューサ電極対の間のキャパシタンスを測定するステップは、各変性サイクルの後に、キャパシタンスの測定を行うステップを含むことを特徴とする請求項４に記載のインピーダンス分光法。
【請求項１１】
上記オリゴヌクレオチドによって機能化された電極表面を有するトランスデューサを準備するステップは、上記電極表面に固着した５’末端と溶液側に露出した３’末端とを有する固着されたオリゴヌクレオチドプローブ分子を備える電極表面を準備するステップを含み、
上記ＤＮＡ試料に対して熱サイクル処理を施すステップは、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンを上記固着されたプローブ分子に結合させるステップを含み、
上記プローブは、各伸長ステップにて、固着されたプローブ分子から一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンのアンチセンスを酵素反応にて伸長させるためのプライマーとして機能するものであり、
上記トランスデューサ電極対の間のキャパシタンスを測定するステップは、各伸長ステップの後で、キャパシタンスを測定するステップを有することと特徴とする請求項５に記載のインピーダンス分光法。
【請求項１２】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の定量を行うインピーダンス分光測定のためのトランスデューサのマイクロアレイであって、
共有されたＤＮＡ試料環境溶液に露出した表面を有する電極を備える複数のトランスデューサであって、上記電極表面が、所定の第１ＤＮＡ標的と相互作用するオリゴヌクレオチドによって機能化されている複数のトランスデューサと、
各トランスデューサの電極対の間のキャパシタンスを測定するために接続されている電気インターフェイスを有する測定ポートと、を備えることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１３】
上記測定ポートは、各電極のための独立した電気インターフェイスを有することを特徴とする請求項１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
上記トランスデューサの各々は、第１電極と第２電極とを備え、
上記測定ポートは、各第１電極に共通に接続された第１電気インターフェイスと、各第２電極のための独立した電気インターフェイスと、を備えることを特徴とする請求項１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１５】
上記トランスデューサ電極の表面は、上記電極表面に固着した３’末端と溶液側に露出した５’末端とを有する固着されたプローブ分子、および、上記電極表面に固着した５’末端と溶液側に露出した３’末端とを有する固着されたプローブ分子からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドによって機能化されていることを特徴とする請求項１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１６】
上記固着されたプローブは、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンと結合可能であり、固着されたプローブ分子から一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンのアンチセンスを酵素反応によって伸長させるプローブとして機能することを特徴とする請求項１５に記載のマイクロアレイ。
【請求項１７】
上記トランスデューサの各々は、第２電極と噛み合う形状にて形成される第１電極を有することを特徴とする請求項１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１８】
上記固着されたプローブ分子は、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンと結合可能であることを特徴とする請求項１５に記載のマイクロアレイ。
【請求項１９】
トランスデューサの下側の基板と、
トランスデューサの上側のカバーと、を備え、
上記基板および上記カバーは、組み合わされて、上記共有されるＤＮＡ試料環境溶液を導入するための空洞を形成することを特徴とする請求項１２に記載のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してデオキシリボ核酸（ＤＮＡ)の検出に関し、特に、インピーダンス分光法によるＤＮＡの測定システムと測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイ技術は、一つの試料における複数の検体の分析、所謂多重分析フォーマット（multiplexed assay format）を行うことが可能な強力な研究ツールである。この様な分析を行う際には、マイクロアレイには、異なるバイオ成分によって修飾された複数のトランスデューサを備える必要がある。特定のトランスデューサに対して所望のバイオ成分を如何に選択的に付着させるかとうことは、マイクロアレイ技術における大きな課題のひとつである。現在、マイクロアレイの多重化技術において行われている主な試みとしては次のようなものがある：（ｉ）アレイ上に異なるバイオ成分をスポットする方法；（ｉｉ）ナノ流体の結合セットを介してトランスデューサを物理的に分離し、予め選択したトランスデューサに対してバイオ成分を選択的に加える方法；（ｉｉｉ）タグ付きのバイオ成分を特異的に捕捉できる物質によって修飾したアレイ表面に、タグ付きのバイオ成分を自己集合させる方法；（ｉｖ）トランスデューサの表面において、制御しながらバイオ成分の合成を行う方法。
【０００３】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)技術は、バイオマーカー遺伝子の発現の観察、遺伝子型の特定、変異の検出、および、臨床微生物学における短時間での感染の診察や定量分析を行うために広く使用されている。また、ＰＣＲは、標準的なＰＣＲでは非効率であったか、または不可能であった作業（例えば、メチル化の検出、ＤＮＡ損傷および放射線被爆の測定、高解像の遺伝子型特定など）を行うためにも使用されている。
【０００４】
ＰＣＲという呼び名は、必須の構成の１つであるＤＮＡポリメラーゼに由来する。ＤＮＡポリメラーゼは、in vitroにおける酵素的な複製によって、ＤＮＡを増幅するために使用される。ＰＣＲが進むにつれて、この様にして生成されるＤＮＡ自身が、複製のテンプレートとして使用される。これは、ＤＮＡテンプレートを指数関数的に増幅する連鎖反応として起る。ＰＣＲによって、１コピー〜数コピーのＤＮＡを桁違いに増幅させ、百万以上のＤＮＡのコピーを生成することが可能である。ＰＣＲは、様々な遺伝子操作を行うために様々に改良することができる。
【０００５】
ＰＣＲの使用例の殆どにおいて、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ菌由来の酵素であるＴａｑポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用されている。このＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートである一本鎖ＤＮＡと、ＤＮＡ合成の開始に必要な（ＤＮＡプライマーとも称する）ＤＮＡオリゴヌクレオチドとを使用して、ＤＮＡを形成する単位である塩基を酵素反応にて組み立てて、新たなＤＮＡ鎖を形成する。ＰＣＲ法の殆どにおいて、ＰＣＲ試料の加熱と冷却とを交互に所定の回数行う温度サイクル法を採用している。この温度サイクルは、（高温時において）２本鎖ＤＮＡの各鎖を物理的に分離させ、（低温時において）分離されたＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡを選択的に増幅させるものである。特定の温度サイクル条件下で、増幅の標的となるＤＮＡ領域に相補的なプライマーを使用することで、ＰＣＲの選択性を得ることができる。
【０００６】
基本的なＰＣＲのセットには、次のような必須の成分や薬剤が幾つかある。
−増幅させるＤＮＡ領域（標的）を含むＤＮＡテンプレート、
−各ＤＮＡ鎖の３’末端のＤＮＡ領域（３プライム）に相補的な２つのプライマー、
−ＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ、または、最適温度が約７０℃である別のＤＮＡポリメラーゼ、
−ＤＮＡポリメラーゼが新しいＤＮＡ鎖を形成するための単位材料であるデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ;よく間違ってデオキシヌクレオチド三リン酸とも呼ばれる）、
−ＤＮＡポリメラーゼにとって最適な活性と安定を得るために適した化学的な環境を提供する緩衝液、
−マグネシウムイオンやマンガンイオンなどの２価の陽イオン（通常Ｍｇ２＋が使用されるが、ＰＣＲを使用したＤＮＡ突然変異生成においては、Ｍｎ２＋を使用することもできる。これは、Ｍｎ２＋が高いと、ＤＮＡ合成時のエラー率が上昇するからである。）、および、
−カリウムイオンなどの一価の陽イオン。
【０００７】
図１は、ＰＣＲサイクルを示す概略図（従来技術）である。ステージ（１）において、例えば、９４℃〜９６℃で２０秒〜３０秒間の変性を行い、ＤＮＡ鎖の相補的な塩基間の水素結合を解消させて一本鎖ＤＮＡにすることによって、ＤＮＡテンプレートとプライマーとを解離する。ステージ（２）において、例えば、約６５℃で２０秒〜４０秒間のアニーリングを行い、一本鎖のＤＮＡテンプレートにプライマーをアニーリングさせる。通常、アニーリング温度は、使用されるプライマーのＴｍ値よりも３℃〜５℃ほど低い温度である。プライマーの配列とテンプレートの配列とが非常に密接にマッチした場合にのみ、ＤＮＡ間に安定的な水素結合が形成される。ポリメラーゼは、プライマーとテンプレートとのハイブリッドに結合し、ＤＮＡ合成を開始する。
【０００８】
ステージ（３）では、例えば７２℃にて、延長または伸長が生じる。ステージ（３）では、ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートと相補的なｄＮＴＰを５’から３’の方向に加えて、ｄＮＴＰの５’−リン酸基を新生（伸長）ＤＮＡ鎖の終端の３’−ハイドロキシル基と縮合反応させる。伸長時間は、使用するＤＮＡポリメラーゼと増幅するＤＮＡ断片の長さとによる。概して、最適温度ではＤＮＡポリメラーゼは１分間に１０００塩基ほどを重合させるので、最適条件下、つまり制約を有する基板や薬剤による制限がない場合において、各伸長ステップにおいてＤＮＡ標的は２倍の量になる。よって、特定のＤＮＡ断片を指数関数的（幾何学的）に増幅することになる。
【０００９】
２つのサイクルを示す。実線はプライマーがアニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼ（円）によって伸長されたＤＮＡテンプレートを示す。点線は、伸長の結果であるＤＮＡ産物であり、ＰＣＲが進行するにつれて、それ自体がテンプレートとして使用される。ＰＣＲでは、サイクルと呼ばれる温度変化を通常２０回〜４０回繰り返す。通常、ＰＣＲは、３つの温度段階を有するサイクルで行われる。多くの場合、ホールドと呼ばれる温度段階をサイクルの実行前に高温（＞９０℃）で１回行い、サイクルの終了後に再び、伸長産物に対して、または一旦保存される物に対してホールドを行う。各サイクルの温度や時間は、様々なパラメータに依存する。パラメータとしては、例えば、ＤＮＡ合成に使用される酵素、反応に供される２価イオンやｄＮＴＰの濃度、プライマーの融点（Ｔｍ)が挙げられる。
【００１０】
定量ＰＣＲ（Ｑ-ＰＣＲ)が、ＰＣＲ産物の量を（好ましくはリアルタイムで）測定するために使用されている。Ｑ-ＰＣＲは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡなどの初発の量を定量するために従来から使用されている。Ｑ-ＰＣＲは、通常、試料中のＤＮＡ配列の有無や試料中にＤＮＡ配列のコピーの数を調べるために使用されている。最も高い精度を有する従来の方法は、定量リアルタイムＰＣＲである。よくＲＴ-ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ)またはＰＱ-ＰＣＲとも誤って称されるが、ＱＲＴ-ＰＣＲまたはＲＴＱ-ＰＣＲが、定量リアルタイムＰＣＲの略語としてより適切である。
【００１１】
二本鎖ＤＮＡ分子に結合した色素の蛍光と一本鎖ＤＮＡ分子に結合した色素の蛍光との差に基づいて、検出を行う。光学的検出が可能な色素は、ラベルとして使用される。蛍光検出法を実際に使用する場合、（ｉ）蛍光測定器と一体化したＰＣＲ器を購入するための初期費用が高い、（ｉｉ）消耗品（蛍光色素や特別なキット）が高価なので、所有経費が高い、（ｉｉｉ）光学測定器のメインテナンスコストが高い、という制限がある。また、蛍光測定に基づくリアルタイムＰＣＲの小型化は、可能であるとしても、大変困難である。
【００１２】
その他の検出方法としては、フェロセン型のラベルであるオルガノ金属化合物Ｆｅ（Ｃ５Ｈ５)２を添加し、ＤＮＡ標的に基づいた信号を生成し、当該信号を電気的に測定するものがある。しかし、蛍光色素およびフェロセンは、残念ながら測定結果にバックグラウンド「ノイズ」を生じる添加物（ラベル）である。ＤＮＡ測定は、ノイズによって干渉される。リアルタイムＰＣＲにラベルされた試料を使用する場合、主に２つの欠点がある。第１の欠点は、熱サイクル処理においてラベル自身の安定性が十分でないことである。第２の欠点は、「異物（foreign）」を使用することによって増幅のエラーおよび連鎖反応の停止がおこり、その結果ＰＣＲに偏りが生じることである。ラベルされた試料をＰＣＲ工程に使用しないことが非常に望ましい。
【００１３】
ＰＣＲを使用したＤＮＡの検出をより簡単に且つ低いコストで行うことができる方法が望まれる。また、ＤＮＡ信号に干渉するラベル無しで実施可能なＤＮＡ測定が望まれる。
【００１４】
〔発明の概要〕
蛍光測定と異なり、本明細書に記載されたＤＮＡ測定は、小型化と低コスト化の点で非常に有望である。本ＤＮＡ測定の原理は、標準的な熱サイクルＰＣＲ工程と、ＤＮＡ生成物をラベル無しでリアルタイムに定量検出をすることが可能なトランスデューサと、の組み合わせに基づく。上記トランスデューサは、所定の表面を機能化（functionalization）したインピーダンス分光電極に基づく。
【００１５】
これにより、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ)の定量測定のためのインピーダンス分光法を提供する。この方法は、共有された環境（好ましくは共有された局所環境）に露出された電極表面を有するトランスデューサを提供する。当該電極表面は、所定のＤＮＡ標的と反応するオリゴヌクレオチドによって機能化されている。ＤＮＡ試料溶液を上記環境に供給する。当該溶液には、ヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素、およびプライマーが含まれている。上記ＤＮＡ試料に熱サイクル処理を施して、第１ＤＮＡ標的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を起こす。そして、トランスデューサ電極対間のキャパシタンスを測定する。キャパシタンス測定により、ＤＮＡ試料中に第１ＤＮＡアンプリコンの有無を検出する。通常、熱サイクルは多数回行われ、キャパシタンス測定を各サイクルの後に行い、アンプリコンの増加率を測定する。
【００１６】
一態様として、上記オリゴヌクレオチドによって機能化された電極表面を有するトランスデューサの提供は、上記電極表面に３’末端が結合され５’末端が溶液側に露出するように固着化されたプローブ分子を提供するステップ、または、上記電極表面に５’末端が結合され３’末端が溶液側に露出するように固着化されたプローブ分子を提供するステップを含む。
【００１７】
上記の方法のその他の詳細やトランスデューサマイクロアレイを選択的に機能化するシステムについては、以下に説明する。
【００１８】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の好ましい実施形態を、図を参照しながら例示的な実施例に基づいて説明する。
【００１９】
図１は、ＰＣＲサイクル（従来技術）を示す概略図である。
【００２０】
図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ、ＤＮＡのインピーダンス分光定量測定を行うトランスデューサのマイクロアレイを示す平面図および部分断面図である。
【００２１】
図３は、図２のマイクロアレイの変形例を示す概略ブロック図である。
【００２２】
図４Ａおよび図４Ｂは、トランスデューサ電極表面をより詳細に示す部分断面図である。
【００２３】
図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、図４Ａおよび図４Ｂに示す機能化された電極表面を有するマイクロアレイを使用して行われるＰＣＲ工程におけるサイクルを示す図である。
【００２４】
図６は、トランスデューサの反応とＰＣＲサイクルのサイクル数との関係を示すグラフである。
【００２５】
図７は、ＤＮＡの定量測定を行うインピーダンス分光法を示すフローチャートである。
【００２６】
図８は、一本鎖のＰＣＲ産物のインピーダンス分光の検出結果を示すグラフである。
【００２７】
〔発明を実施するための形態〕
（トランスデューサおよび検出素子）
トランスデューサは、トランスデューサの表面近傍の生物学的もしくは化学的な環境における変化に応じて物理信号（出力）を生成することが可能な検出器である。上記信号は、例えば、目視できるものであってもよいし、電気的なものであってもよい。上記変化は、トランスデューサの表面に固着された所定（pre-selected)の生物成分が、検体(target analyte)と特異的に反応（バイオ認識）することによって生じる。生物成分と一体化したトランスデューサは、バイオセンサーの検出素子を形成する。
【００２８】
（検出素子の生物成分：バイオ認識成分）
バイオ認識を行う生物成分は、検体、対応する検体の所定の変換体（transformation)、または、これらの両方と特異的に結合可能な分子である。検体とは、滴定などの分析工程で測定される物質や化学成分を意図する。例えば、免疫測定分析では、検体は、リガンドまたはバインダーであり得、血糖値測定では、検体はグルコースであり得る。医学では、しばしば「検体」という用語は、患者に対して行われる試験の種類を意味する。これは、通常このような試験は人体における化学物質の測定であるからである。検体自身は通常測定することができないが、そのような検体の測定可能な物性を測定することは可能である。例えば、グルコース自体は測定できないが、グルコースの濃度は測定可能である。この場合、「グルコース」が成分であり、「濃度」が物性である。実験室や素人間で使用される用語では、省略してもどの物性が測定されているかについて疑義が生じない限り、「物性」がしばしば省略されている。
【００２９】
生物成分としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ/ＲＮＡ分子やその断片、ペプチド、受容体、抗体、酵素、全細胞や細胞片などが挙げられる。ビオチンおよびストレプトアビジンが生物成分と見なされる場合もある。
【００３０】
（トランスデューサ表面）
トランスデューサ表面は、導体であっても、半導体であっても、不導体であってもよい。当該表面の材料の例としては、金属（例えば、金、プラチナ、アルミニウム、クロム、シリカなど）またはその合金；グラファイトまたはガラス状炭素などの炭素材；ガラス；セラミック；窒化ケイ素またはインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの化合物；ポリスチレンまたはナイロンなどのプラスチックが挙げられる。
【００３１】
（トランスデューサ表面の修飾）
トランスデューサ表面の初期の修飾を行って、他の生物成分と検出素子とを結合させることが可能な官能基を、トランスデューサの表面に導入する。次に挙げる方法のひとつを行って、官能基をトランスデューサの表面に導入してもよい：
−トランスデューサの表面の直接的な化学変換。例としては、酸素プラズマまたは硝酸などの酸化剤による、炭素表面の酸化が挙げられる。
−官能基を含む構造を有するポリマーを塗布して行う表面の修飾。ポリマーを塗布することによって、上記官能基をトランスデューサの表面に導入する。上記ポリマーは、バイオポリマー（多糖類、ゼラチン等）、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ヒドロゲル（ポリビニルアルコール、シリカゲル等）、ナイロン等であってもよい。
【００３２】
（機能化）
機能化とは、検体分子を特異的にバイオ認識することが可能なバイオプローブ分子をトランスデューサの表面に付着させて、トランスデューサ表面の修飾を行うことである。バイオ認識とは、バイオプローブ分子が有する、検体分子と特異的に結合する能力、または、触媒として作用して検体分子を変換する能力のことを指す。
【００３３】
図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ、ＤＮＡのインピーダンス分光の定量的な測定のためのトランスデューサのマイクロアレイを示す平面図および部分断面図である。マイクロアレイ２００は、複数のトランスデューサ２０２を含む。図には、トランスデューサ２０２ａ、２０２ｂ、および２０２ｎを示す。図示されている例では、ｎ＝３であるが、ｎの値は特に限定されない。各トランスデューサ２０２は、電極２０４と電極２０６とを有する。電極の表面２０８は、共有されるＤＮＡ試料環境溶液２１０に露出している。
【００３４】
一実施形態において、トランスデューサ２０２の下側に基板２１８が、上側にカバー２２０が設けられている。基板２１８とカバー２２０とを組み合わせ、空洞２２２を形成する。空洞２２２に共有されるＤＮＡ試料環境溶液２１０を入れる。
【００３５】
図３は、図２におけるマイクロアレイの変形例を示す概略ブロック図である。この実施形態では、各トランスデューサ２０２の第１電極２０４が接続されている。よって、測定ポート２１２には、各第１電極２０４に接続された第１電気インターフェイス３００と、各第２電極２０６ａ、２０６ｂ、および２０６ｎに専用の電気インターフェイスが設けられている。配線３００と配線２１６ａとを使用して、電極２０４と電極２０６ａと（トランスデューサ２０２ａ）間のキャパシタンス測定を行うことができる。配線３００と配線２１６ｂとを使用して、電極２０４と電極２０６ｂと（トランスデューサ２０２ｂ）間のキャパシタンス測定を行うことができる。配線３００と配線２１６ｎとを使用して、電極２０４と電極２０６ｎと（トランスデューサ２０２ｎ）間のキャパシタンス測定を行うことができる。
【００３６】
一実施形態において、図３に示すように、各トランスデューサ２０２は、第２電極２０６と噛み合った形状の第１電極２０４を備える構成である。なお、マイクロアレイは、特定の電極形状に限定されるものではない。
【００３７】
図４Ａおよび図４Ｂは、トランスデューサ電極の表面を更に詳細に示す部分断面図である。図４Ａのトランスデューサ電極の表面２０８は、オリゴヌクレオチド固着プローブ分子４００にて修飾されている。オリゴヌクレオチド固着プローブ分子４００の３’末端４０２は電極の表面２０８に結合し、５’末端４０４は、溶液側に露出している。固着プローブ分子４００は、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンと結合することができる。
【００３８】
図４Ｂでは、トランスデューサ電極の表面２０８は、オリゴヌクレオチド固着プローブ分子４００にて修飾されている。オリゴヌクレオチド固着プローブ分子４０６の５’末端４０８は電極の表面２０８に結合し、３’末端４１０は、溶液側に露出している。固着プローブ４０６は、一本鎖の第１ＤＮＡアンプリコンと結合することができるとともに、一本鎖の第一ＤＮＡアンプリコンのアンチセンス鎖を固着プローブ分子から酵素作用にて延長するためのプライマーとして機能する。
【００３９】
ＰＣＲ熱サイクル工程は、標的ＤＮＡ分子と２つの所定のプライマーによるポリメラーゼ伸長反応に基づくものである。当該ＰＣＲ熱サイクル工程は、指数関数的な増幅反応であり、プライマー間に挟まれた標的ＤＮＡ配列の複製を大量に生成することができる。
【００４０】
図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、図４Ａおよび図４Ｂに示す機能化された電極表面を有するマイクロアレイを使用したＰＣＲ工程を示す図である。図５Ａでは、トランスデューサの表面２０８は、ＤＮＡテンプレート鎖の１つと所定のハイブリダイゼーションを行うことができるプローブによって修飾されている。別の形態としては（図５Ｂ）、５’末端を介して該トランスデューサの表面と結合しているプライマー対の一方によって、トランスデューサを修飾してもよい。ＰＣＲ工程の変性段階では、２本鎖ＤＮＡ分子が変性され、２本の一本鎖を生ずる。ＰＣＲ工程のアニーリングステップでは、一本鎖が、溶液中に遊離しているプライマーおよびトランスデューサ表面のプローブと、競合して結合する。ＤＮＡ鎖の一部は、トランスデューサの表面と結合し（図５Ａ），トランスデューサの応答を増加させる。トランスデューサ表面上のブローブが所定のプライマーの場合（図５Ｂ）、標的分子が表面に結合して、酵素作用にてトランスデューサの表面上のプローブが伸長される。これにより、トランスデューサの表面に固着した分子が大きくなり、トランスデューサの応答が起る。どちらの場合でも、トランスデューサ表面への分子の追加的な結合は、反応混合液中に存在する増幅されたＤＮＡ産物の量に比例する。よって、トランスデューサの応答により、ＰＣＲサイクル中の試料のＤＮＡ濃度をリアルタイムで定量することができる。
【００４１】
図６は、トランスデューサ応答とＰＣＲサイクル回数との関係を示すグラフである。当該関係は、試料中のＤＮＡテンプレートの初期濃度に関する関数であり、従来の蛍光リアルタイムＰＣＲ（例えば、The Journal of Physiology, July 1, 2006 574, 229-243, (B) BioRad (Hercules, CA) protocols : http://www3.bio-rad.com/gexp/html/support/amp_central/ac203c.html, (C) AMRESCO (Solon, OH) protocols : http://www.amresco-inc.com/home/products/new-products/Ribozol%20Plus.cmsxを参照）と同様の方法で、ＤＮＡテンプレートの定量に使用することができる。
【００４２】
図７は、ＤＮＡの定量を行うインピーダンス分光法のフローチャートである。ここでは、分かりやすく説明するために、ステップに番号を付けて説明するが、この番号は各ステップが行われる順番を示すものではない。これらのステップの内の一部を省略してもよく、並行して行って測定を行ってもよく、また、各ステップをこの順番通りに実施しなくてもよい。
【００４３】
ステップ７０２にて、共有された局所環境に露出した電極表面を有するトランスデューサを準備する。電極の表面は、所定の第１ＤＮＡ標的と反応するオリゴヌクレオチドによって機能化されている。ステップ７０４では、ヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素、およびプライマーを含むＤＮＡ試料溶液を、局所環境へ導入する。ステップ７０６にて、ＤＮＡ試料に対して熱サイクルを行い、第１ＤＮＡ標的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を促す。ステップ７０８にて、トランスデューサ電極対の間のキャパシタンス、つまりインピーダンスを測定する。キャパシタンスの測定に基づき、ステップ７１０で、ＤＮＡ試料中の第１ＤＮＡアンプリコンの有無を検出する。通常、ステップ７０８におけるトランスデューサ電極対の間のキャパシタンス測定は、複数回の熱サイクル中でのキャパシタンス測定と、その複数のキャパシタンス測定値の比較と、を含む。
【００４４】
一実施形態において、ステップ７０２におけるオリゴヌクレオチドにて機能化された電極表面を有するトランスデューサの準備は、電極表面に固着した３’末端と溶液側に露出した５’末端を有するオリゴヌクレオチド固着プローブ分子（図４Ａ）を準備するステップ、または、電極表面に固着した５’末端と溶液側に露出した３’末端を有するオリゴヌクレオチド固着プローブ分子（図４Ｂ）を準備するステップを有する構成としても良い。他の実施形態において、ステップ７０２は、第２電極と噛み合ったパターン形状を有する第１電極を準備するステップを含んでいてもよい。
【００４５】
また、その他の形態では、第１ＤＮＡ標的ＰＣＲを行うためのステップ７０６におけるＤＮＡ試料の熱サイクル処理は、各熱サイクルにおいてサブステップを有していてもよい。ステップ７０６ａでは、第１温度にて第１ＤＮＡ試料の変性を行う。ステップ７０６ｂでは、第１温度よりも低温である第２温度にて、第一ＤＮＡ試料をアニーリングする。一つの変形例として、アニーリング後に、ステップ７０６ｃで第３温度にて伸長を行う。第３温度は、第１温度と第２温度との間の温度である。
【００４６】
例えば、ステップ７０６におけるＤＮＡ試料の熱サイクルは、２０回〜５０回の熱サイクル処理を含む構成としてもよい。その他の例では、ステップ７０６ａの変性を約９５℃にて行い、ステップ７０６ｂのアニーリングを約４５℃〜約７５℃の間の温度にて行う構成としてもよい。
【００４７】
ステップ７０２にて、３’末端が電極の表面に固着され５’末端が溶液側に露出したオリゴヌクレオチド固着プローブ分子にて処理された電極表面を準備する場合、ステップ７０６のＤＮＡ試料の熱サイクル処理は、アニーリングのサイクル毎に、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンを固着プローブ分子に結合させるステップを含んでいてもよい。この場合、ステップ７０８のトランスデューサ電極対の間のキャパシタンス測定は、アニーリングのサイクル毎に行うことになる。
【００４８】
ステップ７０２にて、５’末端が電極の表面に固着され３’末端が溶液側に露出したオリゴヌクレオチド固着プローブ分子にて処理された電極表面を準備する場合、ＤＮＡ試料の熱サイクル処理は、各変性サイクルの後、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンと固着プローブ分子との間の結合を維持する。この場合、ステップ７０８におけるトランスデューサ電極対の間のキャパシタンス測定は、変性サイクル毎に行うことになる。
【００４９】
代替の構成または追加する構成として、ステップ７０６におけるＤＮＡ試料の熱サイクル処理は、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンを固着プローブ分子に結合させるステップを含んでいてもよい。このプローブは、各伸長ステップにて、一本鎖第１ＤＮＡアンプリコンのアンチセンス鎖を固着プローブ分子から酵素反応にて伸長させるためのプライマーとして機能する。この場合、ステップ７０８は、各伸長ステップ後のキャパシタンスを測定する構成としてもよい。
【００５０】
図８は、一本鎖ＰＣＲ産物のインピーダンス分光の検出結果を示すグラフである。測定はＰＣＲ生成物として得られた長鎖ＤＮＡ断片を検出する。
【００５１】
〔実施例〕
（１．試料調整）
細菌ゲノムをＰＣＲにて増幅し、下記のような二本鎖ＤＮＡ（配列番号１）を形成した。
AATATGGTATTCCGCAAATCTCCACTGGCGATATGCTGCGTGCTGCGGTCAAATCTGGCTCCGAGCTGGGTAAACAAGCAAAAGACATTATGGATGCTGGCAAACTGGTCACCGACGAACTGGTGATCGCGCTAAAGAGCGCATTGCTCAGGAAGACTGCCGCTACGGTTTCCTGTTGGACGGCTTCCCGCGTACCATTCCGCAGGCAGACGCGATGAAAGAAGCGGGCATCAATGTTGATTACGTTCTGGAATTCGACGTACCGGACGAACTGATTGTTGACCGTATCGTAGGCCGCCGCGTTCACGCGCCGTCTGGTCGTGTTTATCACGTTAAATTCAATCCGCCGAAAGTAGAAGGCAAAGACGACGTTACCGGTGAAGAGCTGACTACCCGTAAAGACGATCAGGAAGAGACCGTACGTAAACGTCTGGTTGAATACCATCAGATGACTGCACCGCTGATCGGCTACTACTCCAAAGAAGCGGAAGCGGGTAACACCAAATACGCG
１つのプライマーbi-TTATGGATGCTGGCAAACTG（配列番号２）を使って、上記生成物に対して再度ＰＣＲを行い、一本鎖ＤＮＡ（配列番号３）を形成する。
Biotin-
TTATGGATGCTGGCAAACTGGTCACCGACGAACTGGTGATCGCGCTAAAGAGCGCATTGCTCAGGAAGACTGCCGCTACGGTTTCCTGTTGGACGGCTTCCCGCGTACCATTCCGCAGGCAGACGCGATGAAAGAAGCGGGCATCAATGTTGATTACGTTCTGGAATTCGACGTACCGGACGAACTGATTGTTGACCGTATCGTAGGCCGCCGCGTTCACGCGCCGTCTGGTCGTGTTTATCACGTTAAATTCAATCCGCCGAAAGTAGAAGGCAAAGACGACGTTACCGGTGAAGAGCTGACTACCCGTAAAGACGATCAGGAAGAGACCGTACGTAAACGTCTGGTTGAATACCATCAGATGACTGCACCGCTGATCGGCTACTACTCCAAAGAAGCGGAAGCGGGTAACACCAAATACGCG
その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％の濃度にて含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）を使って試料を希釈し（１：５０）、インピーダンス分光測定を行った。
【００５２】
（２．金の上に固定化された、チオールによって修飾されたオリゴ）
ａ）１００μＬの脱イオン水を中空のＤＴＴ管に加え、ＤＴＴの５００ｍＭ溶液を得た。
ｂ）５００ｍＭのＤＴＴ溶液を９０μＬの脱イオン水に加えることによって、５０ｍＭのＤＴＴ溶液を得た。
【００５３】
５’末端がチオールによって修飾されているオリゴヌクレオチドGATACGGTCAACAATCAGTT（配列番号４）溶液（濃度：１０μＭ、溶媒：リン酸緩衝生理食塩水）に５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液４μＬを加え、室温にて１時間インキュベートした。その後、上記溶液をＰ６マイクロスピンカラムにて処理し、余分なＤＴＴを除去した。このＤＴＴの除去処理を、新たなカラムを使って繰り返した。この様にして得たオリゴヌクレオチド溶液（６μＬ）を、噛み合った形状の電極（図３参照）の清浄な金の表面に塗布し、乾燥するまで室温にてインキュベートした。その後、脱イオン水にて電極を複数回洗浄した。
【００５４】
（３．インピーダンス分光分析）
インピーダンス分光分析を、１５０ｍＶにて行った。セル（トランスデューサ電極表面）は、当初、ＰＢＳＴのみを含む。ベースラインの変動が安定した後、ＰＢＳＴをセルから除去し、試料をセルに加えた。図８に示す結果によれば、インピーダンス（Ｚ）は時間に依存する。ＤＮＡを含む試料を添加したことにより、２０Ｈｚ走査周波数でインピーダンスが増加した。このインピーダンスの増加は、約１０００秒後に飽和する傾向を示す。この飽和は、上記噛み合った形状の電極において、プローブで機能化された表面への標的ＤＮＡの結合が終了したことを意味する。
【００５５】
ＤＮＡの定量のためのインピーダンス分光システムと方法を説明した。方法や材料の具体例は、本発明を例示するためのもので、本発明はこれらに限定されない。本発明のその他の変形例や実施の形態は、当業者には想到できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＰＣＲサイクル（従来技術）を示す概略図である。
【図２Ａ】ＤＮＡのインピーダンス分光定量測定を行うトランスデューサのマイクロアレイを示す平面図である。
【図２Ｂ】ＤＮＡのインピーダンス分光定量測定を行うトランスデューサのマイクロアレイを示す部分断面図である。
【図３】図２のマイクロアレイの変形例を示す概略ブロック図である。
【図４Ａ】トランスデューサ電極表面をより詳細に示す部分断面図である。
【図４Ｂ】トランスデューサ電極表面をより詳細に示す部分断面図である。
【図５Ａ】図４Ａに示す機能化された電極表面を有するマイクロアレイを使用して行われるＰＣＲ工程におけるサイクルを示す図である。
【図５Ｂ】図４Ｂに示す機能化された電極表面を有するマイクロアレイを使用して行われるＰＣＲ工程におけるサイクルを示す図である。
【図６】トランスデューサの反応とＰＣＲサイクルのサイクル数との関係を示すグラフである。
【図７】ＤＮＡの定量測定を行うインピーダンス分光法を示すフローチャートである。
【図８】一本鎖のＰＣＲ産物のインピーダンス分光の検出結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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