(57)【要約】本発明は、そのｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡミメティクスとしての使用に関して改善された安定性、効力、および／または毒性を付与する化学様式を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ポリヌクレオチドを含む医薬組成物および医薬製剤ならびにｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ発現に関連する病状を有する患者を治療する方法をさらに提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’位に１つまたは複数のヌクレオチド修飾および少なくとも１つの末端キャップ構造を有するポリヌクレオチドであって、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡアンチセンスヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記末端キャップ構造が、ホスホロチオエートモノホスフェートまたは末端脱塩基残基を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記２’位の１つまたは複数のヌクレオチド修飾が、Ｏ−メチル、フルオロ、デオキシ、およびロックド核酸から独立して選択される、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
実質的に全てのヌクレオチド２’位が修飾されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
各ヌクレオチド２’修飾が、Ｏ−メチルおよびフルオロから独立して選択される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
各ヌクレオチド２’修飾が、Ｏ−メチルである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
各プリンヌクレオチドが２’Ｏ−メチルを有し、各ピリミジンヌクレオチドが２’−Ｆを有する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
３’末端および５’末端の両方で末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１つの末端脱塩基ヌクレオチドを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
【請求項１１】
３’末端および５’末端の両方で末端脱塩基ヌクレオチドを有する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
内部ホスホロチオエート結合を含まない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
１つまたは複数の内部ホスホロチオエート結合を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
【請求項１４】
５’末端の２つの末端ヌクレオチドおよび３’末端の２つの末端ヌクレオチドの間にのみ内部ホスホロチオエート結合を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ホスホロチオエート結合が、ホスホジエステル結合で代替される、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
短縮された成熟ｍｉＲＮＡ配列または短縮された成熟ｍｉＲＮＡアンチセンス配列を含む、請求項１〜１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
全長成熟ｍｉＲＮＡ配列または全長成熟ｍｉＲＮＡアンチセンス配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
【請求項１８】
５〜２５ヌクレオチドの長さである、請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
１２〜１８ヌクレオチドの長さである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
１６ヌクレオチドの長さである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ｍｉＲ：１、１３３ａ、１３３ｂ、１４３、１４５、１５ａ、１５ｂ、１６、１９５、２０６、２０８ａ、２０８ｂ、２１、２９ａ、２９ｂ、２９ｃ、４２４、および４８６から選択される成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％相補的であるｍｉＲＮＡアンチセンス配列を含む、請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ｍｉＲＮＡアンチセンス配列が、ｍｉＲ：１、１３３ａ、１３３ｂ、１４３、１４５、１５ａ、１５ｂ、１６、１９５、２０６、２０８ａ、２０８ｂ、２１、２９ａ、２９ｂ、２９ｃ、４２４、および４８６から選択される成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的である、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記アンチセンス配列が、成熟ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２１、またはｍｉＲ−２０８ａと相補的である、請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
図１または表６に示される配列および／または構造を有する、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ｍｉＲ：１、１３３ａ、１３３ｂ、１４３、１４５、１５ａ、１５ｂ、１６、１９５、２０６、２０８ａ、２０８ｂ、２１、２９ａ、２９ｂ、２９ｃ、４２４、および４８６から選択される成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％相同であるｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記ｍｉＲＮＡ配列が、ｍｉＲ：１、１３３ａ、１３３ｂ、１４３、１４５、１５ａ、１５ｂ、１６、１９５、２０６、２０８ａ、２０８ｂ、２１、２９ａ、２９ｂ、２９ｃ、４２４、および４８６から選択される成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相同である、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビード、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームとして製剤化される、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
皮内送達、皮下送達、筋内送達、腹腔内送達、または静脈内送達用に製剤化される、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
心臓カテーテル系による投与用に製剤化される、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、ｍｉＲＮＡ発現に関連する病状を有する患者を治療する方法。
【請求項３２】
前記病状が、心臓肥大、心筋梗塞、心不全、血管傷害、および病的心臓線維症のうちの１つまたは複数である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が心臓カテーテルによって投与される、請求項３１または３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連発明の相互参照）
本出願は、２００９年６月８日に出願された米国仮出願第６１／１８５，０３３号（その全体について参照により本明細書に援用する）の優先権の利益を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）阻害剤およびミメティクス（mimetics）の化学モチーフ、特に、患者に投与したときに効力（potency）、安定性、および／または毒性における利点を有する化学修飾されたｍｉＲＮＡセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ）は、心臓機能の制御および維持を含む多くの生物学的プロセスに関与している（Chien KR, Molecular Medicine: MicroRNAs and the tell-tale heart, Nature 447, 389-390 (2007)を参照）。したがって、ｍｉＲは、とりわけ、心臓肥大、心筋梗塞、心不全、血管傷害、および病的心臓線維症（phatologic cardiac fibrosis）などの病状についての比較的新しいクラスの治療標的を表す。ｍｉＲは、約１８〜約２５ヌクレオチドの長さの小さな、タンパク質をコードしない（non-ptotein coding）ＲＮＡであり、配列が完全に相補的である場合には分解を促進することにより、あるいは、配列がミスマッチを含む場合には翻訳を阻害することにより、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして働く。成熟ｍｉＲＮＡ鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に導入され、ここで塩基対の相補性によって標的ＲＮＡと会合する。
【０００４】
ｍｉＲＮＡ機能は、アンチセンスポリヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡ機能を模倣するポリヌクレオチド（「ｍｉＲＮＡミメティック（mimetic）」）によって治療的に標的化され得る。しかしながら、該ポリヌクレオチドを無傷の細胞に導入しとき、それらはヌクレアーゼによって攻撃および分解され、活性が失われる。その分解を２’置換等によって回避しようとしてポリヌクレオチド類似体が調製されている一方（B. Sproat et al, Nucleic Acids Research 17 (1989), 3373-3388）、該修飾は、意図する生物学的活性に関するポリヌクレオチドの効力に影響を与えることが多い。このような効力の低減は、各々の場合、修飾されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡと安定な二重鎖を形成することができないことおよび／または細胞機構と相互作用がないことに起因し得る。
【０００５】
治療場面においてｍｉＲＮＡ機能を効果的に標的化するため、ｍｉＲＮＡ阻害剤およびｍｉＲＮＡミメティクスの安定性、効力、および／または毒性プロフィールを改善するための化学様式またはモチーフが求められている。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、そのｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡミメティクスとしての使用に関して改善された安定性、効力、および／または毒性を有する化学様式を付与するポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ポリヌクレオチドを含む医薬組成物および医薬製剤、ならびにｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ発現に関連する病状を有する患者を治療する方法をさらに提供する
【０００７】
一態様において、本発明は、２’位に１つまたは複数のヌクレオチド修飾および少なくとも１つの末端または「キャップ（cap）」修飾を有するポリヌクレオチドを提供する。該化学修飾モチーフにより、全てホスホロチオエート結合した（fully phosphorothioate-linked）ポリヌクレオチドおよび／または全長アンチセンスまたはセンスｍｉＲＮＡ配列が不要となり得る。上記ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡミメティックであり、本明細書に示すように、非修飾ポリリボヌクレオチドおよび／または他の可能なポリヌクレオチド修飾体を上回る改善された効力を与える。
【０００８】
たとえば、本ポリヌクレオチドは、Ｏ−アルキル（たとえばＯ−メチルまたは「ＯＭｅ」）、ハロ（たとえばフルオロ）、デオキシ（Ｈ）、およびロックド核酸（locked nucleic acid）から選択される２’修飾などの本明細書に記載される２’修飾の１つまたはそれらの組み合わせを有するｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡミメティックであってもよく、いくつかの実施態様において、実質的に全てのまたは全てのヌクレオチド２’位が修飾される。末端またはキャップ修飾は、いくつかの実施態様において、５’および／または３’ホスホロチオエートモノホスフェートおよび／または脱塩基（abaisc）部分、または本明細書に記載するような他のキャップ構造であってもよい。本ポリヌクレオチドは、全てホスホロチオエート結合している必要はないが、このような結合が存在する場合、たとえば５’末端の２つの末端ヌクレオチドおよび３’末端の２つの末端ヌクレオチドの間にこのような結合が位置してもよい。ヌクレオチド配列は、成熟ｍｉＲＮＡに対して全長であってもよいし、または全長アンチセンスｍｉＲＮＡ（成熟体）であってもよいが、いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、短縮された（truncated）ｍｉＲＮＡ配列または短縮されたｍｉＲＮＡアンチセンス配列を含む。このような修飾された短縮配列は、より長い（非修飾のまたは慣用的に修飾された）対応物と比較しても、高レベルの効力を示すことができる。本ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０８ａ、または本明細書に記載される他のもの（の全部またはその一部）と相補的なアンチセンス配列を有するアンタゴｍｉｒであってもよい。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物または医薬製剤を提供する。医薬組成物は、コロイド分散系、高分子複合体（macromolecular complex）、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビード、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含む種々の薬学的に許容可能な形態に製剤化することができる。該組成物は、コレステロールおよびポリヌクレオチドを標的哺乳類細胞に送達するための標的リガンドなど他の分子のとの接合体（conjugates）を含むことができる。
【００１０】
第３の態様において、本発明は、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ発現に関連する病状を有する患者を治療する方法を提供する。たとえば、病状は、心臓肥大、心筋梗塞、心不全、血管傷害、および病的心臓線維症のうちの１つまたは複数である。このような病状は、本発明のポリヌクレオチドおよび組成物を投与することによって治療、予防、または治癒される。したがって、本発明は、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ発現に関連する病状の治療のための本発明の修飾ポリヌクレオチドおよび組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】例示的なｍｉＲＮＡ修飾様式を示す表である。示した配列は、成熟ｍｉＲ１５ｂのアンチセンス配列（全長および短縮型）である。略記を表３に提供する。各々例示したＲＮＡの「別名」には、ｍｉＲＮＡ標的（たとえば１５ｂ）；２’構造（Ｏ−メチル，「ＯＭｅ」；またはＯ−メチルおよびフルオロ，「Ｍｅ／Ｆ」；またはＯ−メチルおよびデオキシ，「Ｍｅ／Ｈ」；またはロックド核酸，「ＬＮＡ」）；ポリヌクレオチドのサイズ（全長についてはＦＬまたは１６ｍｅｒ）；および末端の構造または内部結合（ホスホジエステル結合（phosphodiester-linked）についてはＰＯ、ホスホロチオエート結合についてはＰＳ、全ての他のホスホロチオエート結合についてはＰＳ＿ＥＯ、ホスホロチオエート末端キャップについてはＰＳ＿ＥＣ、脱塩基（Abasic）、および５’および３’ホスホロチオエートモノホスフェートについてはＰＯＳ、を含む）が含まれる。
【図２】デュアル（dual）ルシフェラーゼアッセイを用いた、ＨｅＬａ細胞における１０ｎＭ（各組の左の棒）および０．１ｎＭ（各組の右の棒）の２つの濃度の図１の修飾ポリヌクレオチドについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験結果を示している。ルシフェラーゼ比の値が大きくなるほど、阻害剤の効力が良くなる。結果は、長さ（１６ｍｅｒおよび全長）によってグループ分けしている。最も性能が良い化学物質を表４に示す。
【図３】デュアルルシフェラーゼアッセイを用いた、１０ｎＭ（各組の左の棒）および０．１ｎＭ（各組の右の棒）での、ホスホジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格と直接比較したホスホロチオエートモノホスフェート修飾ポリヌクレオチドの結果を示している。ＰＯはホスホジエステル結合であり、ＰＳはホスホロチオエート結合であり、ＰＯ＿ＰＯＳは３’および５’末端に末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有するホスホジエステル結合である。
【図４】表５のポリヌクレオチド５〜１４を用いたマウスでのｍｉＲ−１５ｂのノックダウンを示している。肝臓（各組の左の棒）および心臓（各組の右の棒）の両方にｍｉＲ−１５ｂが豊富にあると判別され、生理食塩水を注射したマウスとデータを比較している。
【図５】新生児ラット心筋細胞での修飾アンチセンスポリヌクレオチドを用いたｍｉＲ−２０８ａの阻害を示している。図５の結果は、βＭＨＣ発現について定量ＰＣＲを行ったものである。左の棒は１００ｎＭの阻害剤の結果を示し、右の棒は１ｎＭの阻害剤の結果を示している。
【図６】デュアルルシフェラーゼアッセイにおける、種々の修飾を有するアンチセンスポリヌクレオチドによるｍｉＲ−２１の阻害を示している。
【図７】表示した投与量のマウス注射後の４つの異なる修飾ｍｉＲ−１５ｂアンチセンスポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ組織分布を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡミメティクスとしての使用に関して、改善された安定性、効力、および／または毒性を付与する化学様式を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ポリヌクレオチドを含む医薬組成物および医薬製剤、ならびにｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ発現に関連する病状を有する患者を治療する方法をさらに提供する。
【００１３】
修飾ポリヌクレオチド
本ポリヌクレオチドは、以下の詳細に説明するとおり、２’位に１つまたは複数のヌクレオチド修飾および少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」を有する。本ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡミメティックであり、非修飾ポリリボヌクレオチドおよび／または他の可能なポリヌクレオチド修飾体を上回る改善された効力を示す。
【００１４】
本明細書に記載する「ｍｉＲＮＡ阻害剤」は、成熟一本鎖ｍｉＲＮＡまたはその一部に対し、本明細書に記載のように相補的または部分的に相補的な、アンチセンスである配列を有するポリヌクレオチドである。「ｍｉＲＮＡミメティック」は、成熟一本鎖ｍｉＲＮＡまたはその一部に対応する（本明細書に記載のようにこれらと相同または実質的に相同である）配列を有するポリヌクレオチドである。
【００１５】
本ポリヌクレオチドは、２’位に（２’ヒドロキシルに関して）１つまたは複数のヌクレオチド修飾を有する。たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける２’修飾ヌクレオチドの導入により、該オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性および相補ＲＮＡとの熱安定性の両方が増加し得る。２’位の様々な修飾は、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を弱めることなしにヌクレアーゼ感応性を増加させるものから独立して選択することができる。このような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの効力の増加に基づいて選択することができる。ｍｉＲＮＡ阻害の増加した効力（たとえばＩＣ５０）を決定する例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００１６】
いくつかの実施態様において、２’修飾は、（置換されてもよい）Ｏ−アルキル、ハロ、デオキシ（Ｈ）、およびロックド核酸から独立して選択してもよい。ある種の実施態様において、実質的に全てのまたは全てのヌクレオチド２’位が修飾され、たとえば、Ｏ−アルキル（たとえばＯ−メチル）、ハロ（たとえばフルオロ）、デオキシ（Ｈ）、およびロックド核酸から独立して選択される。たとえば、２’修飾は各々、Ｏ−メチルおよびフルオロから独立して選択することができる。例示的な実施態様において、各プリンヌクレオチドは２’ＯＭｅおよびピリミジンを有し、各ヌクレオチドは２’−Ｆを有する。ある種の実施態様において、１〜約５の２’位または約１〜約３の２’位は、（たとえば２’ヒドロキシルとして）非修飾とする。
【００１７】
本発明による２’修飾には、小さい炭化水素置換基も含まれる。炭化水素置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキルを含み、ここで、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニル、およびアルキニルは置換されてもよいし非置換であってもよい。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、またはアルキニル（Ｃ２またはＣ３など）であってもよい。炭化水素置換基は、Ｎ、Ｏ、および／またはＳから独立して選択することができる１つ、２つ、または３つの非炭素原子を含んでもよい。２’修飾は、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルとして、アルキル、アルケニル、およびアルキニルをさらに含んでもよい。
【００１８】
本発明による例示的な２’修飾には、２’−Ｏ−アルキル（２’ＯＭｅまたは２’ＯＥｔなどのＣ１〜３アルキル）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換が含まれる。
【００１９】
２’修飾は、全てのヌクレオチド残基または全てのプリンヌクレオチド上でＯＭｅであってもよい。
【００２０】
ある種の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、（たとえば２’ヒドロキシルに代えて）少なくとも１つの２’−ハロ修飾、たとえば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードを含む。いくつかの実施態様において、２’−ハロ修飾は、フルオロである。本ポリヌクレオチドは、１〜約２０の２’−ハロ修飾（たとえばフルオロ）または１〜約１０もしくは１〜約５の２’−ハロ修飾（たとえばフルオロ）を含んでもよい。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、全て２’−フルオロヌクレオチド、または全てのピリミジンヌクレオチド上に２’−フルオロを含む。ある種の実施態様において、２’−フルオロ基は、独立して、ジメチル化またはトリメチル化されてもよいし、メチル化されてなくてもよい。
【００２１】
本ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の２’−デオキシ修飾（たとえば２’ヒドロキシルの代わりにＨ）を有してもよいが、１〜約２０の２’−デオキシ修飾、または１〜約１０もしくは１〜約５の２’−デオキシ修飾を含んでもよい。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは全て２’−デオキシヌクレオチドを含む。
【００２２】
ある種の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の「コンホメーションが束縛された（conformationally constrained）」または二環式糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）を含み、これは、ＢＳＮを含むポリヌクレオチドとその相補的なｍｉｃｒｏＲＮＡ標的鎖との間で形成された複合体に高い熱安定性を与える。たとえば、一実施態様において、本ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）残基を含む。ＬＮＡは、たとえば、米国特許第６，２６８，４９０号，米国特許第６，３１６，１９８号，米国特許第６，４０３，５６６号，米国特許第６，７７０，７４８号，米国特許第６，９９８，４８４号，米国特許第６，６７０，４６１号，および米国特許第７，０３４，１３３号に記載され、これら全てを全体について参照により本明細書に援用する。「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、「ロックされた（locked）」コンホメーションをもたらすリボース糖部分の２’および４’炭素間に過剰な架橋を含む、修飾されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。一実施態様において、本ポリヌクレオチドは、構造Ａに示される構造を有する１つまたは複数のＬＮＡを含む。他の一実施態様において、本ポリヌクレオチドは、構造Ｂに示される構造を有する１つまたは複数のＬＮＡを含む。さらに他の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、構造Ｃに示される構造を有する１つまたは複数のＬＮＡを含む。
【化１】
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【００２３】
本発明のポリヌクレオチドで用いることができる他の好適なＢＳＮ修飾には、米国特許第６，４０３，５６６号および米国特許第６，８３３，３６１号に記載されるものが含まれ、これらの両方をその全体について参照により本明細書に援用する。ある種の一実施態様において、本ポリヌクレオチドは、約１〜約１０のロックド核酸または２〜約５のロックド核酸を含む。
【００２４】
例示的な実施態様において、本ポリヌクレオチドは、２’ＯＭｅとして修飾された２’位を含む。あるいは、プリンヌクレオチドは、２’ＯＭｅとして２’位で修飾され、ピリミジンヌクレオチドは、２’−フルオロとして２’位で修飾される。
【００２５】
本ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であってもよい。「キャップ」または「末端キャップ」には、ポリヌクレオチドのいずれかの末端における化学修飾（末端リボヌクレオチドに関して）が含まれ、５’末端の最後の２つのヌクレオチドおよび３’末端の最後の２つのヌクレオチドの間の結合における修飾が含まれる。本明細書に記載するキャップ構造は、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を弱めることなく、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を増加する。このような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの増加した効力に基づいて選択することができる。ｍｉＲＮＡ阻害の増加した効力（たとえばＩＣ５０）を決定するための例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００２６】
キャップは、５’末端（５’キャップ）または３’末端（３’キャップ）に存在してもよいし、あるいは両端に存在してもよい。ある種の実施態様において、５’および／または３’キャップは、ホスホロチオエートモノホスフェート、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、逆方向（inverted）ヌクレオチドまたは逆方向脱塩基部分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエートモノホスフェート、およびメチルホスホネート部分から独立して選択される。ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合は、キャップ構造の一部である場合、５’末端の２つの末端ヌクレオチドおよび３’末端の２つの末端ヌクレオチドの間に通常位置する。
【００２７】
ある種の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、上記の１つまたは複数の２’修飾に加えて、少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。ホスホロチオエートモノホスフェートは、エキソヌクレアーゼ作用を阻害することにより、ｍｉＲＮＡ阻害剤およびｍｉＲＮＡミメティクスのより高い効力を付与することができ、いくつかの実施態様において全てホスホロチオエート結合したポリヌクレオチドおよび／または全長阻害剤が不要となる。ホスホロチオエートモノホスフェートは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端にあってもよい。ホスホロチオエートモノホスフェートは、以下の構造によって定義され、ここで、Ｂは塩基であり、Ｒは上記の２’修飾である。
【化２】
2012529295.tif 000003
【００２８】
ある種の実施態様において、５’および／または３’末端のホスホロチオエートモノホスフェートに加え、本ポリヌクレオチドは、２’ＯＭｅとして修飾された全ての２’位を含み、あるいは、プリンヌクレオチドは、２’ＯＭｅとして２’位で修飾され、ピリミジンヌクレオチドは、２’−フルオロとして２’位で修飾される。ｍｉＲ−１５ｂ阻害剤について本明細書で例示したとおり、これらの実施態様における本ポリヌクレオチドは、全てホスホロチオエート結合している必要はなく、および／または（対応する成熟ｍｉＲＮＡ配列に関して）全長である必要はない。ホスホロチオエート結合は、いくつかの実施態様において、たとえば（キャップ構造の一部などとして）５’および３’末端の最後の２つのヌクレオチド間に存在してもよいし、あるいはホスホジエステル結合で代替されてもよい。
【００２９】
これらの実施態様または他の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、５’および３’末端のいずれかまたは両端で少なくとも１つの末端脱塩基残基を含むことができる。脱塩基部分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなどの一般的に認知されるプリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基を含まない。したがって、このような脱塩基部分は、ヌクレオチド塩基を欠くか、または他の非ヌクレオチド塩基化学基を１’位に有する。たとえば、脱塩基ヌクレオチドは、逆脱塩基ヌクレオチドであってもよく、たとえば逆脱塩基ホスホロアミダイトが（３’アミダイトの代わりに）５’アミダイトを介して結合し、５’−５’リン酸結合となる。ポリヌクレオチドの５’および３’末端の逆脱塩基ヌクレオシドの構造を以下に示す。ｍｉＲ−２１について本明細書（図６）に示すように、２’ＯＭｅ修飾を有し、このような脱塩基キャップ構造を有するポリヌクレオチドは、特に有効であり得る。
【化３】
2012529295.tif 000004
【００３０】
ホスホロチオエート結合は、ヌクレアーゼ開裂に対するポリヌクレオチドの抵抗性をより高めるために使用されている。本明細書に記載された化学修飾様式は、ホスホロチオエート結合（上記のキャップ構造として含まれる）を受容することができる一方、ある種の実施態様において、内部ホスホロチオエート結合は、記載した２’修飾およびキャップ修飾によって不必要となる。それにも関わらず、ある種の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、（キャップのもの以外に）１つまたは複数の内部ホスホロチオエート結合を含む。たとえば、本ポリヌクレオチドは、部分的にホスホロチオエート結合してもよく、たとえば、ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合で代替されてもよい。
【００３１】
本ポリヌクレオチドは、全長または短縮されたｍｉＲＮＡ配列または全長または短縮されたｍｉＲＮＡアンチセンス配列を含み、これらから本質的になり、またはこれらからなってもよい。ｍｉＲＮＡ配列に関して本明細書に記載する「全長」とは、成熟ｍｉＲＮＡ配列またはそのアンチセンス対応物の長さをいう。したがって、本明細書に記載される阻害剤およびミメティクスは、短縮されたまたは全長（センスまたはアンチセンス）成熟ｍｉＲＮＡ配列であってもよいし、あるいは他のポリヌクレオチド配列と組み合わせてこれらの配列を含んでもよい。たとえば、該阻害剤およびミメティクスは、いくつかの実施態様において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列およびｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列またはその一部に対応してもよいし、あるいは他の非ｍｉＲＮＡ配列を含んでもよい。ある種の実施態様において、本明細書に記載される化学修飾モチーフによって、全長アンチセンスまたはセンスｍｉＲＮＡ（成熟）配列が不必要となる。
【００３２】
ある種の実施態様における本ポリヌクレオチドは、５〜２５ヌクレオチドの長さ、８〜１８ヌクレオチドの長さ、または１２〜１６ヌクレオチドの長さである。ある種の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、約８ヌクレオチド未満、約１０ヌクレオチド未満、約１２ヌクレオチド未満、または約１６ヌクレオチド未満の長さである。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチドの長さである。
【００３３】
本ポリヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ、たとえば、以下の表１に列記した成熟ｍｉＲＮＡを模倣するまたは標的にするように設計されたヌクレオチド配列を有してもよい。これらの実施態様または他の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、さらにまたはあるいは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ体を標的化するように設計してもよい。ある種の実施態様において、ｍｉＲＮＡを阻害するように設計されたポリヌクレオチドは、（以下の表１に示す）完全に相補的なｍｉＲＮＡ配列に対して１〜５つ（たとえば、２つ、３つ、または４つ）のミスマッチを含む配列を有してもよい。他の実施態様において、ｍｉＲＮＡを模倣するように設計されたポリヌクレオチドは、（以下の表１に示す）成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１〜５つ（たとえば、２つ、３つ、または４つ）のヌクレオチド置換を含む配列を有してもよい。そのようなアンチセンスおよびセンス配列は、ｓｈＲＮＡ、またはステムおよびループ部分などを含む他のＲＮＡ構造に導入されてもよい。そのような配列は、特に、心臓肥大、心筋梗塞、心不全（たとえば、鬱血性心不全）、血管傷害、および／または病的心臓線維症の治療または治癒のためにｍｉＲＮＡ機能を模倣または標的化するのに特に有用である。例示的なｍｉＲＮＡ治療の有用性は、以下の表１に列記した米国特許および国際公開公報の参照文献に開示され、その各々をその全体について参照により本明細書に援用する。
【表１−１】
2012529295.tif 000005
【表１−２】
2012529295.tif 000006
【表１−３】
2012529295.tif 000007
【表１−４】
2012529295.tif 000008
【００３４】
ある種の実施態様において、本ポリヌクレオチドは、（上記のような）ｐｒｉ−、ｐｒｅ−、または成熟ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２０８ａ、またはｍｉＲ−２１の全てまたは一部に完全にまたは部分的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【００３５】
ｍｉＲ−１５ｂ（その構造および処理を含む）および（とりわけ）心臓肥大、心不全、または心筋梗塞を治療するその可能性は、国際公開第２００９／０６２１６９号に記載され、これはその全体について参照により本明細書に援用する。本発明による阻害ｍｉＲＮＡの設計に用いることができるヒトｍｉＲ−１５ｂのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（５’から３’）は、
【化４】
2012529295.tif 000009
である。
【００３６】
ｍｉＲ−２０８ａ（その構造および処理を含む）および（とりわけ）心臓肥大、心不全、または心筋梗塞を治療するその可能性は、国際公開第２００９／０１８４９２号に記載され、これをその全体について参照により本明細書に援用する。本発明による阻害ｍｉＲＮＡの設計に用いることができるヒトｍｉＲ−２０８ａのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（５’から３’）は、
【化５】
2012529295.tif 000010
である。
【００３７】
ｍｉＲ−２１（その構造および処理を含む）および（とりわけ）心臓肥大、心不全、または心筋梗塞を治療するその可能性は、国際公開第２００９／０５８８１８号に記載され、これをその全体について参照により本明細書に援用する。本発明による阻害ｍｉＲＮＡの設計に用いることができるヒトｍｉＲ−２１のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（５’から３’）は、
【化６】
2012529295.tif 000011
である。
【００３８】
標的ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２０８ａ、またはｍｉＲ−２１である場合、本ポリヌクレオチドは、上記のように全て２’ＯＭｅまたは２’ＯＭｅおよび２’−Ｆを含んでもよく、５’および３’末端にホスホロチオエートモノホスフェートキャップを含んでもよく、および／または５’および／または３’末端に脱塩基残基を含んでもよく、および／またはホスホロチオエート結合で末端キャップしてもよい。本ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート末端キャップを任意選択により有することを除き、部分的にホスホロチオエート結合してもよいし、または全てホスホジエステル結合してもよい。アンチセンスポリヌクレオチドは、たとえば約８、約１０、約１２、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８ヌクレオチドの長さ（たとえば約１４〜約１８ヌクレオチドの長さ）の短縮された成熟ｍｉＲＮＡ配列と完全に相補的であってもよい。いくつかの実施態様において、本ポリヌクレオチドは、（成熟ｍｉＲＮＡに対して）全長アンチセンス配列を含むか、またはこれからなる（またはこれから本質的になる）。このコンテクストにおいて、「本質的になる」とは、標的に対するポリヌクレオチドの効力および／または特異性に影響がない限り、追加のヌクレオチドを５’末端および／または３’末端に追加してもよく、たとえば、各末端で１〜３個のヌクレオチドを追加してもよいことを意味する。
【００３９】
本ポリヌクレオチドは、図１または以下の表２から選択される配列／構造を有することができる。略記を表３に示す。
【表２】
2012529295.tif 000012
【００４０】
固相合成による修飾ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成は周知であり、New Chemical Methods for Synthesizing Pojynucjeotides. Caruthers MH. Beaucage SL. Efcavitch JW, Fisher EF. Matteucci MD, Stabinsky Y. Nucleic Acids Symp. Ser. 1980: (7):215-23に概説されている。
【００４１】
組成物、製剤、および送達
本ポリヌクレオチドは、種々の高分子集合体または組成物内に導入してもよい。このような送達のための複合体には、患者への送達のために製剤化される種々のリポソーム，ナノ粒子、およびミセルが含まれてもよい。複合体は、細胞膜浸透を行うために１つまたは複数の融合性または親油性分子を含んでもよい。このような分子は、たとえば、米国特許第７，４０４，９６９号および米国特許第７，２０２，２２７号に記載され、これらはその全体について参照により本明細書に援用する。
【００４２】
本組成物または製剤は、本明細書に記載のように、各々独立して、複数の治療用ポリヌクレオチドを用いてもよい。たとえば、組成物または製剤は、たとえば表１、表２、および図１について、上記のように各々独立して、１〜５つのｍｉＲＮＡ阻害剤および／またはｍｉＲＮＡミメティクスを用いてもよい。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、種々の医薬組成物として製剤化することができる。該医薬組成物は、意図する用途に適切な形態で調製されるであろう。一般に、これは、発熱原およびヒトまたは動物に有害となり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを包含する。例示的な送達／製剤系は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビード、脂質ベース系、たとえば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む。本発明の核酸を心臓および骨格筋組織に送達するのに好適な市販の脂肪エマルジョンには、Ｉｎｔｒａ脂質（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似の脂質エマルジョンが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの送達運搬体としての使用に好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は、当業界において周知である。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号；米国特許第６，２１７，９００号；米国特許第６，３８３，５１２号；米国特許第５，７８３，５６５号；米国特許第７，２０２，２２７号；米国特許第６，３７９，９６５号；米国特許第６，１２７，１７０号；米国特許第５，８３７，５３号３；米国特許第６，７４７，０１４号；および国際公開第０３／０９３４４９号に開示され、これらはその全体について参照により本明細書に援用する。
【００４４】
本医薬組成物および製剤は、送達運搬体を安定にし、標的細胞による取り込みを可能とするための適切な塩および緩衝剤を用いてもよい。本発明の水性組成物は、薬学的に許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散された、阻害剤としてのポリヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（たとえばリポソームまたは他の複合体）を含む送達運搬体を有効量含む。「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」とは、動物またはヒトに投与したときに副作用、アレルギー、または他の有害な反応を生じない分子部分および組成物をいう。本明細書に用いられる「薬学的に許容可能な担体」には、医薬、たとえばヒトへの投与に好適な医薬の製剤化での使用に許容される１つまたは複数の溶剤、緩衝剤、液剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれてもよい。医薬活性物質のためのこのような媒体および剤の使用は、当業界において周知である。補充活性成分も組成物に含ませることができる。
【００４５】
本発明の医薬組成物の投与または送達は、その経路によって標的組織が利用可能である限り、任意の経路とすることができる。たとえば、投与は、皮内、皮下、筋内、腹腔内または静脈内注入であってもよいし、または標的組織（たとえば心臓組織）への直接注入によるものであってもよい。ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡ配列を含む発現構築物を含む医薬組成物は、カテーテル系または治療剤を心臓へ送達するための冠循環を同定する系によって投与することもできる。心臓および冠血管系に治療剤を送達するための種々のカテーテル系は、当業界で公知である。カテーテルをベースとした送達方法または本発明での使用に好適な冠状同定（coronary isolation）法のいくつのかの非限定的な例は、米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６，９５３，４６６号、国際公開第２００５／０８２４４０号、国際公開第２００６／０８９３４０号、米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許公開第２００６／０１４８７４２号、および米国特許公開第２００７／００６０９０７号に記載され、これらはその全体について参照により本明細書に援用する。
【００４６】
本組成物または製剤は、非経口投与してもよいし、または腹腔内投与してもよい。例示のため、遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての接合体の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合される水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製してもよい。通常の貯蔵および使用状態下では、これらの調製は、微生物の成長を妨げるための防腐剤を一般に含む。
【００４７】
注入可能な使用またはカテーテル送達に好適な医薬形態には、たとえば、無菌の水溶液または分散液、および注入可能な無菌の溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が含まれる。一般に、これらの調製は、注入が容易になる程度まで無菌かつ流動的とする。製剤は、製造および貯蔵状態下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して予防される必要がある。適切な溶剤または分散媒体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含んでもよい。適切な流動性は、たとえば、レクチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には必要な粒子サイズの保持により、および界面活性剤の使用により、保持することができる。微生物の働きは、種々の抗菌剤、抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって予防される。多くの場合、糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注入可能な組成物の吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物中で使用することによって延ばすことができる。
【００４８】
注入可能な無菌溶液は、所望する場合には任意の他の成分（たとえば、上記で列挙したもの）とともに接合体を適切な量で溶媒中に入れることによって調製することができる。一般に、分散液は、種々の無菌化活性成分を、塩基性分散媒体および所望の他の成分（たとえば上記のもの）を含む無菌運搬体に入れることによって調製する。注入可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、その好ましい調製方法には真空乾燥技術および凍結乾燥技術が含まれ、これは、予め無菌ろ過した溶液由来の活性成分および所望する任意の追加成分の粉末を生成する。
【００４９】
製剤化に際し、溶液は、投与製剤に適合するように、かつ、治療に有効な量で投与することが好ましい。製剤は、種々の剤形、たとえば、注入可能な溶液、薬物放出カプセルなどで容易に投与することができる。たとえば、水溶液での経口投与のため、溶剤は一般に好適に緩衝化され、液体希釈剤は十分な生理食塩水またはグルコースなどで最初に等張化する。そのような水性溶剤は、静脈内、筋内、皮下、および腹腔内投与などに用いることができる。無菌水性媒体は、当業者に知られているようにして使用すること、特に本開示に照らして使用することが好ましい。例示として、単一用量をＮａＣＩ等張溶液１ｍｌに溶解し、皮下注入液１０００ｍｌに添加するか、または予定の注入部位で注入してもよい（たとえば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 第１５版，第１０３５〜１０３８頁および第１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。治療対象の病状に応じて用量を変えることは必然的に必要となるであろう。いずれにしても、投与責任者が個々の対象に適切な用量を決定するであろう。さらにヒト投与のためには、製剤は、ＦＤＡ部局生物学基準によって要求される無菌性、発熱原性、一般的な安全性、および純度の基準を満たす必要がある。
【００５０】
治療方法
本発明は、ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に送達する方法、および哺乳類患者の病状の進行を治療、改善、または予防する方法を提供する。本方法は、一般に、本明細書に記載のとおり、ポリヌクレオチドまたはこれを含む組成物を哺乳類患者に投与することを含む。本ポリヌクレオチドは、上述のように、（たとえば、ｍｉＲＮＡ発現または活性を阻害するように設計されたヌクレオチド配列を有する）ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡミメティックであってもよい。したがって、患者は、ｍｉＲＮＡ発現などのＲＮＡ発現に関係する病状を有してもよい。そのような病状には、たとえば、心臓肥大、心筋梗塞、心不全（たとえば鬱血性心不全）、血管傷害、再狭窄、または病的心臓線維症が含まれる。したがって、本発明は、このような病状を治療するための、および上記のこのような治療のための医薬を調製するための、本発明の修飾ポリヌクレオチドおよび組成物の使用を提供する。
【００５１】
心臓肥大、心筋梗塞、心不全（たとえば鬱血性心不全）、血管傷害、再狭窄、および／または病的心臓線維症などの病状に関与するｍｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ機能を標的化する配列は、国際公開第２００８／０１６９２４号、国際公開第２００９／０５８８１８号、国際公開第２００９／０１８４９２、国際公開第２００９／０１８４９３号、国際公開第２００９／０１２４６８号、国際公開第２００９／０６２１６９号、および国際公開第２００７／０７０４８３号に記載され、これらは各々、その全体について参照により本明細書に援用される。このようなｍｉＲＮＡおよび配列はさらに表１に列記され、これらの配列に基づく修飾ポリヌクレオチドは表２および図１に示され、本明細書に記載される。
【００５２】
ある種の実施態様において、患者は、長期の制御不能な高血圧、不修正（uncorrected）心臓弁膜症、慢性狭心症、亜急性心筋梗塞、心疾患の先天性素因、および病的肥大などを含む１つまたは複数のリスク要因を有する。あるいは、またはさらに、患者は、心臓肥大などの遺伝的素因を有すると診断されていてもよいし、または心臓肥大などの家族歴を有していてもよい。
【００５３】
この態様において、本発明は、心不全または心臓肥大を患う患者における運動耐性の向上、少ない入院、より高い生活の質、羅患率の低下、および／または死亡率の低下をもたらすことができる。
【００５４】
本発明は、以下のさらなる実施例によってさらに例示するが、これらは限定するものと解するべきではない。当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施態様について多くの変更が可能であり、また、本発明の真意および範囲から逸脱せずに、同様のまたは類似の結果が得られることを理解するであろう。
【実施例】
【００５５】
ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１５ｂを標的化するｍｉＲＮＡ阻害剤（一本鎖オリゴヌクレオチド）の一群を合成した。配列および修飾様式を、略記とともに以下の表３に示す。
【表３】
2012529295.tif 000013
【００５６】
３つの異なる長さの逆相補ＲＮＡ阻害剤を、成熟ｍｉＲ１５−ｂ、８ｎｔ、１６ｎｔ、および全長（２２ｎｔ）に対して合成した。この実施例における化学修飾は、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、ホスホロチオエート結合、およびＬＮＡが含まれ、これらを特定のモチーフにおいて組み合わせた。モチーフは、いずれかの側の２つの塩基間にホスホロチオエート結合を含むものであった（ホスホロチオエート末端キャップした）。追加修飾は、脱塩基を有する末端キャップ（本明細書に記載のように、５’末端の５’−５’リン酸結合および／または３’末端の３’−３’リン酸結合を有する逆脱塩基モチーフ）または３’および５’末端の両端のホスホロチオエートモノホスフェートを含むものであった。
【００５７】
合成したポリヌクレオチドの構造を図１に示す。
【００５８】
実施例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍｉＲ１５−ｂの阻害
ＨｅＬａ細胞において、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの２つの濃度で一群を試験した。デュアルルシフェラーゼアッセイで読み出しした。本アッセイはｍｉＲＮＡの阻害を直接に試験するものではなく、ｍｉＲＮＡの阻害効果はウミシイタケルルシフェラーゼの増加として示される。第２のルシフェラーゼ（ホタル）は、ｍｉＲＮＡの阻害によって影響はなく、内部コントロールとして用いる。ルシフェラーゼ比の値が大きくなるほど、阻害剤の効力は良くなる。Vermeulen A, et al, Double-stranded regions are essential design components of potent inhibitors of RISC function RNA 13:723-730 (2007)を参照のこと。スクリーニングの結果を図２に示す。
【００５９】
図２は、長さ（１６ｍｅｒおよび全長）によってグループ分けした結果である。１つの注目すべき化学モチーフは、ホスホロチオエートモノホスフェートを有する２’ＯＭｅであった。
【００６０】
図３は、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート骨格と直接比較したホスホロチオエートモノホスフェートについて示している。「全長」の阻害剤に関し、１０ｎｍ濃度では比較物と等しいが、０．１ｎＭ濃度では非常により効力があることが明らかである。１６ｍｅｒの長さに関し、ホスホロチオエートモノホスフェートを有しない阻害剤は活性をあまり示さない。全てホスホロチオエートの分子が効力を有しているといえないことも注目すべきである。したがって、この末端キャップ化方法は、効力に対して有意に寄与していると考えられる。
【００６１】
スクリーニングから得られる１４個の最も優れた性能の阻害剤をＩＣ５０測定に対して選択し、これらを表４に列記する。
【表４】
2012529295.tif 000014
【００６２】
該分子を１００ｎＭ〜１ｐＭの範囲の６つの濃度においてＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、全ＲＮＡを精製し、定量ＰＣＲを行ってｍｉＲ−１５ｂおよびコントロールＲＮＡのレベルを測定した。ＩＣ５０を計算し、これを以下の表に示した。末端ホスホロチオエートモノホスフェートを含む分子を表５において太線で列記した。
【表５】
2012529295.tif 000015
【００６３】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｉＲ−１５ｂの阻害
ｍｉＲ−１５ｂを標的とする１０個の阻害剤（表５のポリヌクレオチド５〜１４）を合成し、ｍｉＲ−１５ｂレベルへの影響について健常なマウスで試験した。尾静脈の低圧注射によりマウス（ｎ＝４）に８０ｍｇ／ｋｇを投与し、ｍｉＲ−１５ｂレベルについて４日後に組織を分析した。肝臓および心臓の両方を分析し、生理食塩水を注射したマウスとデータ比較した。
【００６４】
肝臓および心臓の両方において、ホスホロチオエートモノホスフェートキャップ（ＰＯＳ）を有する阻害剤は、ｍｉＲ−１５ｂの強い阻害を示した（図４を参照のこと）。内部ホスホロチオエート結合またはコレステロール接合体のいずれも有しないこれらの分子が心臓でこのような効果を示すことが可能であり、これは非常に驚くべきことであった。
【００６５】
これらの実験は、ｍｉＲＮＡ阻害剤の効力を高める特有の修飾モチーフがあることを実証している。２’ＯＭｅ修飾を有するすべてホスホジエステル結合した分子はホスホロチオエート結合を有する分子よりも効果が低いため、ヌクレアーゼ安定性は重要な指標となり得る。１つの例外は、脱塩基ヌクレオシドまたは末端ホスホロチオエートモノホスフェートで末端がキャップされた場合であると考えられる。１６ｍｅｒでさえ、この末端キャップを有する分子は８０ｐＭのＩＣ５０を有する一方、全長ポリヌクレオチドは１８０ｐＭのＩＣ５０を有する。この修飾様式：末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する２’ＯＭｅポリヌクレオチドは、特有のモチーフである。
【００６６】
実施例３：ｍｉＲ−２０８ａの阻害
全長および１６ｍｅｒのｍｉＲ−２０８阻害剤を調製し、新生児ラット心筋細胞においてトランスフェクションから４８時間後にｂＭＨＣの発現（定量ＰＣＲによって決定した）によって試験した。阻害剤を１００ｎＭおよび１ｎＭで試験した。
【００６７】
試験した阻害剤は、全て２’ＯＭｅ；２’ＯＭｅとしてＡおよびＧが修飾され、かつ、２’−ＦとしてＣおよびＵが修飾され；デオキシＡおよびＧ、かつ、２’ＯＭｅＣおよびＵのいずれかとして修飾された２’位を含むものであった。キャップ構造は、脱塩基およびホスホロチオエートモノホスフェートキャップを含むものであった。
【００６８】
ｍｉＲ−２０８は、心臓ストレスに応じたｂＭＨＣ発現のアップレギュレーションおよび心臓における速骨格筋遺伝子の抑制に必要である。国際公開第２００９／０１８４９２号および国際公開第２００８／０１６９２４号を参照のこと（これらの各々を参照により本明細書に援用する）。
【００６９】
結果を図５に示す。示されるように、末端キャップを有する２’修飾ポリヌクレオチドは、１ｎＭの濃度でもｍｉＲ−２０８ａ阻害効果を有する。
【００７０】
実施例４：ｍｉＲ−２１の阻害
【００７１】
デュアルルシフェラーゼアッセイを用いて、ｍｉＲ−２１阻害剤（末端キャップされたもの）を１００ｎＭで、ＨｅＬａ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行った。結果を図６に示す。示されるように、脱塩基部分末端キャップを有するかまたはホロチオエートモノホスフェートで末端キャップされた、全て２’ＯＭｅを有する阻害剤が、特に有効である。
【００７２】
ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ２０８、およびｍｉＲ−２１阻害剤に関する以下の表６に示すポリヌクレオチドを合成した。
【表６】
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【００７３】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｉＲ−１５ｂ阻害剤の組織分布
【００７４】
ｍｉＲ−１５ｂの４つの阻害剤（表７）を合成し、マウスに注射し、その組織生体分布を評価した。マウスをヒトアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）で処置し、背面において皮下挿入した浸透圧ポンプにより投与した。ＡｎｇＩＩ処理の７日後、マウスに１×０．３３ｍｇ／ｋｇ、１×１ｍｇ／ｋｇ、１×３．３ｍｇ／ｋｇ、１×３３ｍｇ／ｋｇ、または３×０．３３ｍｇ／ｋｇのいずれかで投与した。最後の投与量は、その後の３日間、０．３３ｍｇ／ｋｇでマウスに投与したことを示している。動物を４日目に犠牲死させ、生体分布アッセイのために組織を処理した。投与計画の間、ＡｎｇＩＩ処理を続けた。
【００７５】
表７は、本実験で用いた各オリゴの配列および特定の修飾を列記している。化合物１０１３４は、ＬＮＡ、２’デオキシヌクレオチド、および全て（full）ホスホロチオエート骨格からなるものであった。化合物１０１１５は、２’ＯＭｅ修飾および全てホスホロチオエート骨格からなるものであった。化合物１０６２３は、２’ＯＭｅ修飾、全てホスホロチオエート骨格、ならびに３’および５’ホスホロチオエートモノホスフェートからなるものであった。化合物１０６２４は、２’ＯＭｅ修飾、互換性のホスホロチオエート結合およびホスホジエステル結合、ならびに３’および５’ホスホロチオエートモノホスフェートからなるものであった。
【表７】
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【００７６】
図７は、心臓、肝臓、腎臓、および肺における阻害剤の蓄積を示している。キャップした２’ＯＭｅオリゴとキャップしない２’ＯＭｅオリゴとを比較すると、全ての器官に送達された阻害剤の量は、ＰＯＳ修飾でキャップした場合により高いことが多い。１×０．３３ｍｇ／ｋｇの最小投与量で、効果が最も高くなる。腎臓への送達は、全ての４つの修飾様式でほとんど等しい。修飾された全てホスホロチオエート骨格はまた、全ての他の修飾と比較して、心臓、肝臓、および肺でより高い送達を示している。
【００７７】
本明細書で議論され引用された全ての公開公報、特許公報、および特許出願は、その全体について参照により援用する。開示した発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、および材料（これらは変わり得るものであるゆえ）に限定されるものではないと理解する。また、本明細書で用いた用語は、単に特定の実施態様を記述する目的するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、該本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるものと理解する。
【００７８】
当業者は、ルーチンにすぎない実験を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施態様の多数の等価物を認識または確認することが可能であろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【００７９】
参照文献
以下の参照文献は、全ての目的のため、その全体について参照により本明細書に援用する。
B. Sproat et al., Nucleic Acids Research 17: 3373-3388 (1989).
E. L Ruff et al., Journal of Organic Chemistry, 61: 1547-1550 (1998).
H. Cramer et al., Helvetica Chimica Acta, 79: 21 14-2138 (1996).
Vermeulen A, et al., RNA 13:723-730 (2007),
米国特許第５，９９８，２０３号
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年2月8日(2012.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１０個以下のポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、成熟ｍｉＲ１５ｂと相補的なアンチセンス配列を含み、ｍｉＲ１５ｂの阻害に有効であり、１つまたは複数の内部ホスホロチオエート結合および１つまたは複数のロックド核酸残基を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
成熟ｍｉＲ１５ｂと少なくとも約７５％相補的である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
約８以下のポリヌクレオチドであり、成熟ｍｉＲ１５ｂと１００％相補的である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
全てホスホロチオエート結合している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
全てロックド核酸残基からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’配列からなり、全てホスホロチオエート結合し、全てロックド核酸からなる、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビード、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームとして製剤化される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
皮内送達、皮下送達、筋内送達、腹腔内送達、または静脈内送達用に製剤化される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
心臓カテーテル系による投与用に製剤化される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ｍｉＲＮＡ発現に関連する病状を有する患者の治療に使用するための請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記病状が、心臓肥大、心筋梗塞、心不全、血管傷害、および病的心臓線維症のうちの１つまたは複数である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記組成物が心臓カテーテルによって投与される、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
２’位に１つまたは複数のヌクレオチド修飾および少なくとも１つの末端キャップ構造を有するポリヌクレオチドであって、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡアンチセンスヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
５〜２５のポリヌクレオチドの長さである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
ｍｉＲＮＡ発現に関連する病状を有する患者の治療に使用され、前記病状が、心臓肥大、心筋梗塞、心不全、血管傷害、および病的心臓線維症のうちの１つまたは複数である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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