(57)【要約】  ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を診断又は同定する方法及びＶＥＧＦ非依存性腫瘍を治療する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得た試験試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを決定することを含む対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍を検出する方法であって、参照試料と比較した、試験試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの変化が、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍の存在を示し、少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＰＤＧＦＣおよびＨＧＦからなる群から選択される方法。
【請求項２】
発現レベルがｍＲＮＡ発現レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍＲＮＡ発現レベルを、マイクロアレイまたはｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｍＲＮＡ発現レベルの変化が増加である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子のうちの１つが、Ｓ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｍＲＮＡ発現レベルの変化が減少である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子のうちの１つが、ＰＤＧＦＣ、Ｔｉｅ−１またはＴｉｅ−２である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子のうちの１つがＴｉｅ−１またはＴｉｅ−２であり、前記方法が試験試料中の第２の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定することをさらに含み、第２の遺伝子がＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験試料中のＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２のｍＲＮＡ発現レベルが、参照試料と比較して減少している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
発現レベルがタンパク質発現レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質発現レベルを、免疫学的アッセイを使用して測定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫学的アッセイがＥＬＩＳＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質発現レベルの変化が増加である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子のうちの１つがＨＧＦである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象から得た試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現レベルを決定することを含む対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍を検出する方法であって、参照試料と比較した、試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍の存在を示し、少なくとも２つの遺伝子は、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦＣおよびＨＧＦからなる群から選択される方法。
【請求項１６】
発現レベルがｍＲＮＡ発現レベルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｍＲＮＡ発現レベルの変化が増加である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子のうちの１つが、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＰｌＧＦまたはＩＬ−１βである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｍＲＮＡ発現レベルの変化が減少である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子のうちの１つが、ＰＤＧＦＣ、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２またはＣＤ３１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
発現レベルがタンパク質発現レベルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質発現レベルの変化が増加である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子のうちの１つが、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦまたはＨＧＦである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子のうちの２つが、ＩＬ−１βおよびＰｌＧＦである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象がヒトである、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２６】
対象が癌と診断されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
癌が、非小細胞肺癌、腎臓細胞癌、神経膠芽腫、乳癌および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象を治療することをさらに含み、該治療がＩＬ−１βアンタゴニスト、ＰｌＧＦアンタゴニスト、Ｓ１００Ａ８アンタゴニスト、Ｓ１００Ａ９アンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニストまたはｃ−Ｍｅｔアンタゴニストのうちのいずれか１つの有効量を対象に投与することを含む、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２９】
有効量の化学療法剤を対象に投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを対象に投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗ＶＥＧＦ抗体がモノクローナル抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＬ−１βアンタゴニスト、ＰｌＧＦアンタゴニスト、Ｓ１００Ａ８アンタゴニスト、Ｓ１００Ａ９アンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニストまたはｃ−Ｍｅｔアンタゴニストのうちのいずれか１つの有効量を対象に投与することを含む、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍を治療する方法。
【請求項３５】
有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを対象に投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗ＶＥＧＦ抗体がモノクローナル抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＩＬ−１βアンタゴニストが抗ＩＬ−１β抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストが抗ｃ−Ｍｅｔ抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
ＨＧＦアンタゴニストが抗ＨＧＦ抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
対象がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
対象が癌と診断されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
癌が、非小細胞肺癌、腎臓細胞癌、神経膠芽腫、乳癌および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
有効量の化学療法剤を対象に投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法施行規則第１．５３条第（ｂ）項第（１）号の下に出願する非仮特許出願であり、内容が参照により本明細書に組み込まれている２００８年８月２９日出願の仮特許出願第６１／０９３，１６１号に対して、米国特許法第１１９条第（ｅ）項に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、腫瘍の成長および腫瘍型の分野に関する。本発明は、癌および腫瘍の成長の診断および治療のための阻害剤および診断薬の腫瘍マーカーならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
米国においては、悪性腫瘍（癌）が心臓疾患に次ぐ主要な死亡原因である（例えば、Ｂｏｒｉｎｇら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｌ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．４３：７（１９９３）を参照されたい）。癌は、正常組織に由来する、増殖して腫瘍塊を形成する異常細胞または新生物細胞の数の増加、これらの新生物腫瘍細胞の隣接組織への浸潤、ならびに血液またはリンパ系を介して局所リンパ節にも、転移と呼ばれるプロセスを介して遠位部位にも最終的に広がる悪性細胞の発生によって特徴付けられる。癌の状況においては、正常細胞であれば成長しない条件下でも細胞が増殖する。癌は、多種多様な形で現れ、浸潤性および侵襲性の違いによって特徴付けられる。
【０００４】
典型的には、癌型に応じて、患者が利用することができる治療の選択肢はいくつかあり、これらとして、化学療法、放射線照射および抗体に基づいた薬物が挙げられる。異なる治療計画から臨床転帰を予測するのに有用な診断方法があれば、これらの患者の臨床管理にとって大いに有益であろう。遺伝子発現と特定の癌型の同定との相関性を、例えば、突然変異特異的アッセイ、マイクロアレイ解析、ｑＰＣＲ等によって探索した研究がいくつかある。そのような方法は、患者が提示する癌の同定および分類に有用であり得る。
【０００５】
今では、血管新生が、多様な障害の病変形成に関連があることが十分確立している。これらの障害は、固形腫瘍および転移、アテローム動脈硬化、後水晶体線維増殖、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、血管新生緑内障等の眼内血管新生疾患、移植した角膜組織およびその他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、ならびに乾癬を含む。Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１０９３１〜１０９３４（１９９２）；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７〜２３９（１９９１）；およびＧａｒｎｅｒ  Ａ．、「Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｉｎ：Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．、Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  ＧＫ編、２版（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ、１９９４）、１６２５〜１７１０頁。
【０００６】
腫瘍が成長する際に、血管新生は、過形成から新生物への移行の点でも、腫瘍の成長および転移に栄養を与える点でも重大であるようである。Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：５８（１９８９）。血管新生によって、腫瘍細胞は、正常細胞と比較して、成長の利点および増殖の自律性を獲得することが可能になる。腫瘍は通常、利用可能な毛細血管床から離れているため、わずか数立方ミリメートルのサイズまでしか増殖できない単一の異常細胞として始まり、長期間にわたりさらに成長および播種することなく「休止状態」に留まることができる。次いで、いくつかの腫瘍細胞が、血管新生の表現型に転換して内皮細胞を活性化し、これらの細胞は、増殖および成熟して新しい毛細血管となる。これらの新たに形成された血管によって、原発性腫瘍の成長の継続のみならず、転移性腫瘍細胞の播種および再コロニー形成も可能になる。したがって、乳癌およびいくつかの他の腫瘍において、腫瘍切片中の微小血管の密度と、患者の生存との間に相関性が認められている。Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３２４：１〜６（１９９１）；Ｈｏｒａｋら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１１２０〜１１２４（１９９２）；Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１４５〜１４６（１９９２）。血管新生の転換を制御する正確な機構は十分には理解されていないが、腫瘍塊の血管新生は、多数の血管新生の刺激剤と阻害剤との正味のバランスの結果として生じると考えられている（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １（１）：２７〜３１）。
【０００７】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が、病理学的状態における血管新生の主要な制御因子であるという認識から、ＶＥＧＦ活性を遮断する多数の試みがなされている。ＶＥＧＦは、最も十分に特徴付けられている、最も強力な血管新生の正の制御因子のうちの１つである。例えば、Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．およびＫｅｒｂｅｌ，Ｒ．Ｓ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：９６７〜７４（２００５）を参照されたい。ＶＥＧＦは、血管新生および血管形成における血管新生因子であることに加え、多面的な増殖因子として、内皮細胞の生存、血管透過性および血管拡張、単核球走化性、ならびにカルシウムの流入等のその他の生理学的プロセスにおいて、複数の生物学的な作用を示す。ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１８：４〜２５。さらに、ＶＥＧＦが、網膜色素上皮細胞、膵管細胞およびシュワン細胞等のいくつかの非内皮細胞型に対して分裂促進作用を及ぼすことを報告した研究もある。例えば、Ｇｕｅｒｒｉｎら  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：３８５〜３９４（１９９５）；Ｏｂｅｒｇ−Ｗｅｌｓｈら  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２６：１２５〜１３２（１９９７）；およびＳｏｎｄｅｌｌら  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：５７３１〜５７４０（１９９９）を参照されたい。
【０００８】
ＶＥＧＦ活性を遮断するために、多数の試みがなされている。阻害性の抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性受容体構築物、アンチセンス戦略、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマーおよび低分子量ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤は全て、ＶＥＧＦシグナル伝達を妨害するのに使用するために提案されたものである。例えば、Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１７：２４１〜２４８（１９９８）を参照されたい。抗ＶＥＧＦ中和抗体が、ヌードマウスにおいて、多様なヒト腫瘍細胞系の成長を抑制することが示されており（Ｋｉｍら  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１〜８４４（１９９３）；Ｗａｒｒｅｎら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１７８９〜１７９７（１９９５）；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４０３２〜４０３９（１９９６）；およびＭｅｌｎｙｋら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：９２１〜９２４（１９９６））、虚血性網膜障害モデルにおける眼内血管新生も示されている（Ａｄａｍｉｓら  Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６〜７１（１９９６））。実際に、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が、最初に米国ＦＤＡから承認を得た、血管新生を阻害するように設計された治療薬である。例えば、Ｆｅｒｒａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、３：３９１〜４００（２００４）を参照されたい。ベバシズマブの適応は、転移性結腸直腸癌患者の第一選択または第二選択の治療のための、静脈内５−フルオロウラシルに基づく化学療法と組み合わせた使用；切除不能な、局所進行性、再発性または転移性の非扁平上皮性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の第一選択の治療のための、カルボプラチンおよびパクリタキセルによる化学療法と組み合わせた使用；ならびに転移性、ＨＥＲ２陰性の乳癌について化学療法を受けたことがない患者の治療のための、パクリタキセルによる化学療法と組み合わせた使用である。
【０００９】
しかし、治療用化合物の、腫瘍の成長を妨げる長期の能力が、その薬物耐性の獲得によって制限されることがある。種々の細胞傷害性化合物に対する耐性のいくつかの機構が、主として単細胞腫瘍モデルにおいて、同定され、機能的に特徴付けられている。例えば、Ｌｏｎｇｌｅｙ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０５：２７５〜９２（２００５）を参照されたい。さらに、宿主の間質細胞と腫瘍細胞の相互作用が、薬物耐性の表現型に関与する場合もある。間質細胞は、多様な血管新生促進因子を分泌し、腫瘍細胞ほどには遺伝子が不安定ではなく、突然変異速度が増加しない（Ｋｅｒｂｅｌ，Ｒ．Ｓ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １３：３１〜６（１９９１）；ＦｅｒｒａｒａおよびＫｅｒｂｅｌならびにＨａｚｌｅｈｕｒｓｔらによる総説、Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．およびＫｅｒｂｅｌ，Ｒ．Ｓ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：９６７〜７４（２００５）；ならびにＨａｚｌｅｈｕｒｓｔ，Ｌ．Ａ．、Ｌａｎｄｏｗｓｋｉ，Ｔ．Ｈ．およびＤａｌｔｏｎ，Ｗ．Ｓ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：７３９６〜４０２（２００３））。
【００１０】
前臨床モデルにおいて、ヒト化モノクローナル抗体であるベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、またはベバシズマブのマウス前駆体（Ａ４．６．１（Ａ４．６．１を産生するハイブリドーマ細胞系、１９９１年３月２９日に寄託、ＡＴＣＣ  ＨＢ−１０７０９））を用いてＶＥＧＦシグナル伝達を遮断することによって、試験した異種移植モデルの大部分において腫瘍の成長が顕著に阻害され、腫瘍の血管新生が低下した（ＧｅｒｂｅｒおよびＦｅｒｒａｒａによる総説、Ｇｅｒｂｅｒ，Ｈ．Ｐ．およびＦｅｒｒａｒａ，Ｎ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ａｓ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：６７１〜８０（２００５））。単一薬剤による抗ＶＥＧＦ治療の薬理学的作用は、治療を腫瘍の成長の早期に開始した場合に、最も目覚ましかった。治療を腫瘍が十分に確立されるまで遅延させた場合には、阻害作用は典型的には一過性であり、最終的には腫瘍に耐性が発生した。例えば、Ｋｌｅｍｅｎｔ，Ｇ．ら  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘｅｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦＲ−２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：２２１〜３２（２００２）を参照されたい。抗ＶＥＧＦ治療に対するそのような耐性の根底にある細胞事象および分子事象は複雑である。例えば、Ｃａｓａｎｏｖａｓ，Ｏ．、Ｈｉｃｋｌｉｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｂｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．およびＨａｎａｈａｎ，Ｄ．  Ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｅｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ８：２９９〜３０９（２００５）；ならびにＫｅｒｂｅｌ，Ｒ．Ｓ．ら  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｄｒｕｇｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ２０：７９〜８６（２００１）を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、抗ＶＥＧＦ治療に対する耐性を有する対象を同定し、治療するために使用することができる分子に基づいた診断方法があれば、非常に好都合であろう。本発明は、以下の開示を精査することによって明らかになるであろう、これらおよびその他の必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の方法は、例えば、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍の同定、診断および治療を含めて、多様な状況において活用することができる。特定の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を同定するためのマーカーのセットを提供する。
【００１３】
本明細書では、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍を検出する方法を提供する。例えば、この方法は、対象から得た試験試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、参照試料と比較した、試験試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの変化が、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍の存在を示し、少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＰＤＧＦＣおよびＨＧＦからなる群から選択される。
【００１４】
特定の実施形態では、発現レベルは、ｍＲＮＡ発現レベルである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルを、マイクロアレイまたはｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの変化は増加である。一実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの増加を示す遺伝子のうちの１つは、Ｓ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９である。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの変化は減少である。一実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの減少を示す遺伝子のうちの１つは、ＰＤＧＦＣ、Ｔｉｅ−１またはＴｉｅ−２である。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの減少を示す遺伝子のうちの１つは、Ｔｉｅ−１またはＴｉｅ−２であり、この方法は、試験試料中の第２の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定するステップをさらに含み、第２の遺伝子は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２である。特定の実施形態では、試験試料中のＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２のｍＲＮＡ発現レベルは、参照試料と比較して減少している。
【００１５】
特定の実施形態では、発現レベルは、タンパク質発現レベルである。特定の実施形態では、タンパク質発現レベルを、免疫学的アッセイを使用して測定する。特定の実施形態では、免疫学的アッセイはＥＬＩＳＡである。特定の実施形態では、タンパク質発現レベルの変化は増加である。一実施形態では、タンパク質発現レベルの増加を示す遺伝子のうちの１つは、ＨＧＦである。
【００１６】
特定の実施形態では、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を検出する方法は、対象から得た試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、参照試料と比較した、試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍の存在を示し、少なくとも２つの遺伝子は、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＤ３１、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦＣおよびＨＧＦからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を検出する方法は、対象から得た試験試料中の５つ以上の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、参照試料と比較した、試験試料中の５つ以上の遺伝子の発現レベルの変化が、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍の存在を示し、少なくとも５つの遺伝子は、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦＣおよびＨＧＦからなる群から選択される。
【００１７】
特定の実施形態では、発現レベルはｍＲＮＡ発現レベルである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの変化は増加である。一実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの増加を示す遺伝子のうちの１つは、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＰｌＧＦまたはＩＬ−１βである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの変化は減少である。一実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルの減少を示す遺伝子のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つは、ＰＤＧＦＣ、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２である。
【００１８】
特定の実施形態では、発現レベルはタンパク質発現レベルである。特定の実施形態では、タンパク質発現レベルの変化は増加である。一実施形態では、タンパク質発現レベルの増加を示す遺伝子のうちの１つは、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦまたはＨＧＦである。別の実施形態では、タンパク質発現レベルの増加を示す遺伝子のうちの２つは、ＩＬ−１βおよびＰｌＧＦである。
【００１９】
特定の実施形態では、上記の方法は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象を治療するステップをさらに含み、このステップは、ＩＬ−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＬＩＦアンタゴニスト、ＰｌＧＦアンタゴニスト、Ｓ１００Ａ８アンタゴニスト、Ｓ１００Ａ９アンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニストまたはｃ−Ｍｅｔアンタゴニストのうちのいずれか１つの有効量を対象に投与することを含む。一実施形態では、有効量のｃ−Ｍｅｔアンタゴニストを、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象に投与する。一実施形態では、有効量のＨＧＦアンタゴニストを、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象に投与する。特定の実施形態では、上記の方法は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象を治療するステップをさらに含み、このステップは、有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを、第２の薬剤と組み合わせて対象に投与することを含み、第２の薬剤は、ＩＬ−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＬＩＦアンタゴニスト、ＰｌＧＦアンタゴニスト、Ｓ１００Ａ８アンタゴニスト、Ｓ１００Ａ９アンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニストまたはｃ−Ｍｅｔアンタゴニストのうちのいずれか１つである。一実施形態では、第２の薬剤はｃ−Ｍｅｔアンタゴニストである。一実施形態では、第２の薬剤はＨＧＦアンタゴニストである。特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体である。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。特定の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストは抗ｃ−Ｍｅｔ抗体である。特定の実施形態では、ＨＧＦアンタゴニストは抗ＨＧＦ抗体である。特定の実施形態では、この方法は、有効量の化学療法剤を対象に投与するステップをさらに含む。
【００２０】
また、本明細書では、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍を治療する方法も提供する。特定の実施形態では、この方法は、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍を治療するステップを含み、このステップは、ＩＬ−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＬＩＦアンタゴニスト、ＰｌＧＦアンタゴニスト、Ｓ１００Ａ８アンタゴニスト、Ｓ１００Ａ９アンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニストまたはｃ−Ｍｅｔアンタゴニストのうちのいずれか１つの有効量を対象に投与することを含む。一実施形態では、有効量のｃ−Ｍｅｔアンタゴニストを、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象に投与する。一実施形態では、有効量のＨＧＦアンタゴニストを、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象に投与する。別の実施形態では、有効量のＩＬ−１βアンタゴニストを、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象に投与する。特定の実施形態では、この方法は、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍を治療するステップを含み、このステップは、有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを、第２の薬剤と組み合わせて対象に投与することを含み、第２の薬剤は、ＩＬ−１βアンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＬＩＦアンタゴニスト、ＰｌＧＦアンタゴニスト、Ｓ１００Ａ８アンタゴニスト、Ｓ１００Ａ９アンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニストまたはｃ−Ｍｅｔアンタゴニストのうちのいずれか１つである。一実施形態では、第２の薬剤はｃ−Ｍｅｔアンタゴニストである。特定の実施形態では、第２の薬剤はＨＧＦアンタゴニストである。特定の実施形態では、第２の薬剤はＩＬ−１βアンタゴニストである。一実施形態では、ＩＬ−１βアンタゴニストは抗ＩＬ−１β抗体である。別の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストは抗ｃ−Ｍｅｔ抗体である。別の実施形態では、ＨＧＦアンタゴニストは抗ＨＧＦ抗体である。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。特定の実施形態では、この方法は、有効量の化学療法剤を、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する対象に投与するステップをさらに含む。
【００２１】
特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は、癌と診断されている。特定の実施形態では、対象は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有すると診断されている。一実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、腎臓細胞癌、神経膠芽腫、乳癌および結腸直腸癌からなる群から選択される。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、対象の腫瘍が、抗血管新生療法以外のまたは抗血管新生療法に加えた抗癌療法に有効に応答するかどうかを予測する方法を提供し、この方法は、１つまたは複数の遺伝子が試験試料中で参照試料中の発現レベルよりも高いレベルで発現する細胞を、対象由来の試験試料が含むかどうかを決定するステップを含み、少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦおよびＨＧＦからなる群から選択される。特定の実施形態では、この方法は、ＩＬ−１βアンタゴニスト、ＰｌＧＦアンタゴニスト、Ｓ１００Ａ８アンタゴニスト、Ｓ１００Ａ９アンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニスト、ｃ−Ｍｅｔアンタゴニスト、ＬＩＦアンタゴニストまたはそれらの任意の組合せの有効量を対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本発明は、対象の腫瘍が、抗血管新生療法以外のまたは抗血管新生療法に加えた抗癌療法に有効に応答するかどうかを予測する方法を提供し、この方法は、１つまたは複数の遺伝子が試験試料中で参照試料中の発現レベルよりも減少したレベルで発現する細胞を、対象由来の試験試料が含むかどうかを決定するステップを含み、少なくとも１つの遺伝子は、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＰＤＧＦＣ、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２からなる群から選択される。特定の実施形態では、発現レベルはｍＲＮＡ発現レベルである。特定の実施形態では、発現レベルはタンパク質発現レベルである。特定の実施形態では、抗血管新生療法は、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む。特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体である。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明は、癌患者の抗ＶＥＧＦ療法に対する応答性を予測するための方法を提供し、この方法は、癌患者から得た試験試料中の１つまたは複数の上記の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、参照試料と比較した、試験試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの顕著な変化が、癌患者の抗ＶＥＧＦ療法に対する応答性の低下または完全な欠如を示す。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、癌患者において抗ＶＥＧＦ療法の有効性をモニターするための方法を提供し、この方法は、抗ＶＥＧＦ療法のコースの間に癌患者から得た試験試料中の１つまたは複数の上記の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、参照試料と比較した、試験試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの顕著な変化が、抗ＶＥＧＦ療法の有効性の低下または完全な欠如を示す。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ療法に対して耐性である癌患者の亜集団を同定するための方法を提供し、この方法は、各癌患者から得た試験試料中の１つまたは複数の上記の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、参照試料と比較した、試験試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの顕著な変化が、癌患者が、抗ＶＥＧＦ療法に対して耐性である亜集団に属することを示す。
【００２６】
本明細書に記載する任意の実施形態またはそれらの任意の組合せが、本明細書に記載する本発明のあらゆる方法に適用される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ−Ｂ】乳腺の発達を示す図である。（Ａ）８週齢の未交尾のＶＥＧＦ＋／＋由来の代表的な乳腺の全載、および（Ｂ）ｅｐｉＶＥＧＦ−／−乳腺である。バーは、１０００μｍを示す。
【００２８】
【図２Ａ−Ｄ】腫瘍の発達および進行を示すグラフである。（Ａ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋マウス（ｎ＝２４）およびＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウス（ｎ＝２０）における、最初の触診可能な腫瘍の時期。（Ｂ）８〜１６週齢のＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋（ｎ＝２０）マウスおよびＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウス（ｎ＝１５）に由来する累積腫瘍数／マウス。（Ｃ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋マウス（ｎ＝２０）およびＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウス（ｎ＝１５）における累積腫瘍体積の平均。（Ｄ）腫瘍重量の平均。１６週齢のマウス。＊は、群間の統計学的に有意な（Ｐ＜０．０５）差を示す。
【００２９】
【図３Ａ−Ｆ】腫瘍血管密度を示す図である。（Ａ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋マウス由来の腫瘍血管網の代表的な最大強度を投影した画像、および（Ｂ）ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウス、（Ｃ）対照ＩｇＧ（ＧＰ１２０）を用いて治療したＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋マウス、または（Ｄ）抗ＶＥＧＦ（Ｇ６．３１ｍＡｂ）を用いて治療したＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋マウス。（Ｅ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍およびＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍における血管の直径に対する血管容積。（Ｆ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍とＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍とを比較した、血管直径に対する％血管容積（当該半径の血管容積／総血管容積）。
【００３０】
【図４Ａ−Ｃ】腫瘍の微小血管の血流を示す図である。（Ａ）相対的な微小血管の血流速度。データを平均±ＳＥＭとして示す。＊は、群間の有意な（Ｐ＜０．０５）差を示す。サイズを一致させた（Ｂ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍および（Ｃ）ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍における微小血管の血流を示す造影超音波灌流解析の代表的な画像。
【００３１】
【図５Ａ−Ｈ】腫瘍中のＶＥＧＦＲ１  ｍＲＮＡおよびＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの局在化を示す図である。（Ａ）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍においては、ＶＥＧＦＲ１  ｍＲＮＡが、血管内皮と強力に結合していることを示す。（Ｂ）また、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においても、ＶＥＧＦＲ１  ｍＲＮＡが、血管内皮と結合している（矢印）が、シグナルは一般に、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍におけるシグナルよりも弱い。（Ｃ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍および（Ｄ）ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍に由来するヘマトキシリンおよびエオシンで染色したスライドの平行画像。（Ｅ）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍においては、ＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡが、血管内皮細胞と一致する個別の細胞クラスターと結合していることを示す。（Ｆ）ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、ＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡが、血管内皮に沿う点状クラスターに結合している（矢印）が、シグナルは一般に、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍におけるシグナルよりも弱い。（Ｇ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍および（Ｈ）ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍に由来するヘマトキシリンおよびエオシンで染色したスライドの平行画像。平行画像は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したスライドを、暗視野（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または明視野（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）の照明を用いて撮影した。スケールバーは１００μｍである。センス対照スライドは、顕著なシグナルを欠いた（データ未公開）。
【００３２】
【図６Ａ−Ｂ】Ｔａｑｍａｎ解析による、腫瘍中のＶＥＧＦＲ１  ｍＲＮＡおよびＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの相対的なレベルを示すグラフである。ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍およびＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍中の（Ａ）ＶＥＧＦＲ１転写物および（Ｂ）ＶＥＧＦＲ２転写物の相対的なレベル。データを、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋に対する倍率変化として示す（群間で絶対レベルの有意差（Ｐ＜０．０５）を示した、１群当たりｎ＝９個の腫瘍）。
【００３３】
【図７Ａ−Ｅ】ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍可溶化液中のＶＥＧＦレベルの減少を示す図である。（Ａ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍またはＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍に由来する可溶化液中のＶＥＧＦタンパク質レベル。（Ｂ〜Ｅ）ＶＥＧＦについてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（欠失を検出するために、エクソン３についてのリボプローブを使用する）。（Ｂ）ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍、発現（矢印）が、壊死性の領域に直ちに隣接する、生存可能であるがおそらく低酸素状態の腫瘍組織に重なっている、または（Ｃ）ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍、発現が主として、壊死性の腫瘍の周囲の低酸素状態の領域には存在しない。平行画像は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したスライドを、暗視野（Ｂ、Ｃ）または明視野（Ｄ、Ｅ）の照明を用いて撮影した。スケールバーは１００μｍである。センス対照スライドは、顕著なシグナルを欠いた（データ未公開）。
【００３４】
【図８Ａ−Ｂ】ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍またはＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍を有するマウスの、抗ＶＥＧＦ治療の効果を示すグラフである。マウスを、５ｍｇ／ｋｇ抗ＶＥＧＦ（Ｂ２０  ４．１）またはアイソタイプの対照抗体（ＩｇＧ）を用いて１週当たり２回治療し、（Ａ）マウス１匹当たりの腫瘍の累積数の平均、または（Ｂ）累積腫瘍積載の平均を決定した。データを、平均±ＳＥＭとして示す（１群当たりｎ＝１０〜１５匹の動物）。＊は、Ｂ２０または対照抗体のいずれかで治療したＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋マウス間の有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【００３５】
【図９Ａ−Ｅ】腫瘍中の血管新生性および炎症性の相対的なｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍とＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍とを比較した、マウスの（Ａ）ＰｌＧＦ  ｍＲＮＡ、（Ｂ）ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ、（Ｃ）Ｓ１００Ａ８  ｍＲＮＡ、（Ｄ）Ｓ１００Ａ９  ｍＲＮＡおよび（Ｅ）ＰＤＧＦＣ  ｍＲＮＡの発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析。データを、群間で絶対レベルの有意差（Ｐ＜０．０５）を示した、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋に対する倍率変化として示す（１群当たりｎ＝５〜９個の腫瘍）。
【００３６】
【図１０Ａ−Ｃ】腫瘍中の血管新生因子および炎症性因子のタンパク質レベルを示すグラフである。ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍とＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍とを比較した、（Ａ）ＰｌＧＦタンパク質、（Ｂ）ＩＬ−１βタンパク質、（Ｃ）ＨＧＦタンパク質のレベルのＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘによる解析。データを、平均±ＳＥＭとして示す。＊は、群間の有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【００３７】
【図１１Ａ−Ｄ】腫瘍中のＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍およびＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍における、（Ａ）ＣＤ３１転写物、（Ｂ）ＣＤ３４転写物、（Ｃ）Ｔｉｅ−１転写物および（Ｄ）Ｔｉｅ−２転写物のレベル。データを、群間で絶対レベルの有意差（Ｐ＜０．０５）を示した、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋に対する倍率変化として示す（１群当たりｎ＝５〜７個の腫瘍）。
【００３８】
【図１２】ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍由来の初代上皮細胞が、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ＋／＋腫瘍由来の初代上皮細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＧＦに対する遊走応答の増加を示すことを示すグラフである。エラーバーはＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
一般に、本明細書において記載または参照する技法および手順を、当業者であれば、十分に理解し、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３版（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００３））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；ならびにＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９））；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；ならびにＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）に記載されている広く活用されている方法等の従来の方法を使用して通常利用している。
【００４０】
別段に定義しない限り、本明細書で使用する科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４）およびＭａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９２）が、本出願に使用する用語のうちの多くに対する一般的な手引きを当業者に提供している。特許の出願および公開を含めた、本明細書に引用する参考文献は全て、それらの全体が参照により組み込まれている。
【００４１】
定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義を適宜適用し、また、単数で使用する用語は複数も含み、その逆も当てはまる。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであって、制限する意図はないことを理解されたい。以下に記載する定義のいずれかが、参照により本明細書に組み込まれている任意の文献と矛盾する場合には、以下に記載する定義が優先するものとする。
【００４２】
本明細書では、「試験試料」または「試料」は、目的の対象から得たまたは目的の対象に由来する組成物であって、例えば、物理的、生化学的、化学的および／または生理学的な特徴に基づいて特徴付けおよび／または同定を行おうとする細胞実体および／またはその他の分子実体を含有する組成物を指す。一実施形態では、この定義は、血液および生物学的起源のその他の液体試料、ならびに生検検体または生検検体に由来する組織培養物もしくは細胞等の組織試料を包含する。組織試料の供給源は、新鮮な、凍結および／もしくは保存した器官もしくは組織の試料または生検もしくは吸引物に由来する固体の組織；血液または任意の血液構成物；体液；ならびに対象の妊娠もしくは発生における任意の時期に由来する細胞、または血漿であってよい。
【００４３】
別の実施形態では、この定義は、試薬を用いた処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチド等の特定の構成成分の濃縮、または切片化の目的でのセミ半固体もしくは固体のマトリックス中への包埋等の任意の方法で、調達後に操作されている生物学的試料を含む。本明細書における目的では、組織試料の「切片化」は、組織試料の単一の部分または小片、例えば、組織試料から切り出した組織または細胞の薄片を意味する。
【００４４】
試料として、これらに限定されないが、初代のまたは培養した細胞または細胞系、細胞上清、細胞可溶化液、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳汁、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙液、汗、粘液、腫瘍可溶化液および組織培養培地、ならびにホモジナイズした組織等の組織抽出液、腫瘍組織および細胞抽出液が挙げられる。
【００４５】
一実施形態では、試験試料は臨床試料である。別の実施形態では、試験試料を、診断アッセイにおいて使用する。いくつかの実施形態では、試験試料を、原発性または転移性の腫瘍から得る。しばしば、組織生検を使用して、腫瘍組織の代表的な小片を得る。あるいは、腫瘍細胞を、目的の腫瘍細胞を含有することが分かっているか、またはそうであると考えられる組織または液体の形態として間接的に得ることもできる。例えば、肺癌病変の生物学的試料を、切除、気管支鏡検査、細針による吸引もしくは気管支の刷毛による採取によってか、または痰、胸膜液もしくは血液から得ることができる。
【００４６】
一実施形態では、対象または患者から試験試料を抗血管新生療法の前に得る。別の実施形態では、対象または患者から試験試料をＶＥＧＦアンタゴニスト療法の前に得る。さらに別の実施形態では、対象または患者から試験試料を抗ＶＥＧＦ抗体療法の前に得る。特定の実施形態では、試験試料を、抗血管新生性のＶＥＧＦアンタゴニスト療法または抗ＶＥＧＦ抗体療法の間または後に得る。特定の実施形態では、試験試料を、癌が転移した後に得る。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「参照試料」は、比較の目的で使用する任意の試料、標準またはレベルを参照することを指す。一実施形態では、参照試料を、同じ対象または患者の身体の健常な部分および／または罹患していない部分から得る。別の実施形態では、参照試料を、同じ対象または患者の身体の治療していない組織および／または細胞から得る。
【００４８】
特定の実施形態では、参照試料は、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法に対して応答性である腫瘍を含む。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ療法は抗ＶＥＧＦ抗体を含む。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。特定の実施形態では、参照試料は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍ではない腫瘍を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、参照試料は、同じ対象または患者からの単一の試料または複数の試料の組合せであって、試験試料を得る時点とは異なる１つまたは複数の時点で得る試料である。例えば、参照試料を、同じ対象または患者から、試験試料を得る時点より早い時点で得る。癌が転移性となる場合、参照試料を癌の最初の診断の間に得、試験試料をそれより後に得る場合には、そのような参照試料は有用であることがある。
【００５０】
一実施形態では、参照試料を、対象でも患者でもない個体の身体の健常な部分および／または罹患していない部分から得る。別の実施形態では、参照試料を、対象でも患者でもない個体の身体の治療していない組織部分および／または細胞部分から得る。
【００５１】
特定の実施形態では、参照試料は、用語「試料」の下に上記で定義した、対象でも患者でもない１つまたは複数の個体から得られるあらゆる種類の生物学的試料を含む。特定の実施形態では、参照試料を、対象でも患者でもない１つまたは複数の癌の個体から得る。
【００５２】
特定の実施形態では、参照試料は、対象でも患者でもない１つまたは複数の健常な個体から得た複数の試料の組合せである。特定の実施形態では、参照試料は、対象でも患者でもない１つまたは複数の癌の個体から得た複数の試料の組合せである。特定の実施形態では、参照試料は、対象でも患者でもない１つまたは複数の個体から得た正常組織に由来するプールしたＲＮＡ試料である。特定の実施形態では、参照試料は、対象でも患者でもない１つまたは複数の癌の個体から得た腫瘍組織に由来するプールしたＲＮＡ試料である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「ＶＥＧＦ非依存性腫瘍」は、癌療法が、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む場合に、この癌療法の間に、完全には応答しないかまたは応答を喪失するもしくは応答の低下を示す癌、癌細胞または腫瘍を指す。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍は、抗ＶＥＧＦ抗体療法に対して耐性である腫瘍である。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍は、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む癌療法に対して応答する可能性が低い腫瘍である。特定の実施形態では、癌療法に対する応答性は、本明細書で定義する癌療法に対する患者の応答性である。
【００５４】
遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量を、これらに限定されないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片および／または遺伝子コピー数を含めて、当技術分野で知られている任意の適切な判断基準に基づいて定性的および／または定量的に決定することができる。特定の実施形態では、第１の試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現／量が、第２の試料中の発現／量と比較して増加している。特定の実施形態では、第１の試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現／量が、第２の試料中の発現／量と比較して減少している。特定の実施形態では、第２の試料は参照試料である。
【００５５】
特定の実施形態では、用語「増加」は、本明細書に記載する方法等の標準的な、当技術分野で既知の方法によって検出する場合に、参照試料と比較して、タンパク質または核酸のレベルが、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上全体的に増加することを指す。特定の実施形態では、増加という用語は、試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量の増加を指し、この増加は、参照試料中のそれぞれの遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約１．２５×、１．５×、１．７５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２５×、５０×、７５×または１００×である。
【００５６】
特定の実施形態では、本明細書における用語「減少」は、本明細書に記載する方法等の標準的な、当技術分野で既知の方法によって検出する場合に、参照試料と比較して、タンパク質または核酸のレベルが、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上全体的に低下することを指す。特定の実施形態では、減少という用語は、試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量の減少を指し、この減少は、参照試料中のそれぞれの遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約０．９×、０．８×、０．７×、０．６×、０．５×、０．４×、０．３×、０．２×、０．１×、０．０５×または０．０１×である。
【００５７】
遺伝子の発現レベル／量を決定するための追加の開示を、本明細書において、本発明の方法の下に記載する。
【００５８】
「検出」は、直接的な検出および間接的な検出を含めて、検出の任意の手段を含む。
【００５９】
本明細書で使用する場合、単語「標識」は、核酸プローブまたは抗体等の試薬に直接的または間接的にコンジュゲートまたは融合させた化合物または組成物であって、それがコンジュゲートまたは融合している試薬の検出を促進する化合物または組成物を指す。標識はそれ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能である基質の化合物もしくは組成物の化学変化を触媒してもよい。
【００６０】
特定の実施形態では、「相関させる（ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）」または「相関（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ）」とは、任意の方法で、第１の解析またはプロトコールの性能および／または結果と、第２の解析またはプロトコールの性能および／または結果とを比較することを意味する。例えば、第２のプロトコールを実施する場合に第１の解析もしくはプロトコールの結果を使用してもよく、かつ／または第１の解析もしくはプロトコールの結果を使用して、第２の解析もしくはプロトコールを実施すべきかどうかを決定してもよい。遺伝子発現の解析またはプロトコールの実施形態に関しては、遺伝子発現の解析またはプロトコールの結果を使用して、特定の療法計画を実施すべきかどうかを決定することができる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「バイオマーカー」は一般に、遺伝子、タンパク質、炭水化物構造または糖脂質を含めた分子を指し、哺乳動物の組織または細胞の中または表面におけるその発現を、標準的な方法（または本明細書に開示する方法）によって検出することができ、バイオマーカーの発現によって、血管新生の阻害に基づく治療計画、例えば、抗血管新生剤、例として、ＶＥＧＦ特異的阻害剤に対する、哺乳動物の細胞または組織の感受性を予測し、診断し、かつ／またはその予後を示す。
【００６２】
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【００６３】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。
【００６４】
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長の、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００６５】
「単離された」核酸分子は、同定され、ポリペプチド核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある核酸を通常発現する細胞に含まれる核酸分子が含まれる。
【００６６】
「プライマー」は、一般に、標的配列とハイブリダイズすることによって、対象の試料中に存在しうる標的に結合して、その後、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、一般に遊離した３'-ＯＨ基を有する短い単鎖のポリヌクレオチドである。
【００６７】
「ハウスキーピング遺伝子」なる用語は、活性が細胞機能の維持に必須であるタンパク質をコードする一群の遺伝子を指す。これらの遺伝子は一般的に、すべての細胞型において同じように発現される。
【００６８】
本明細書で用いる「アレイ」又は「マイクロアレイ」なる用語は、基質上でのハイブリダイズ可能なアレイ成分、好ましくはポリヌクレオチドプローブ(例えばオリゴヌクレオチド)の規則正しい整列を指す。基質は、ガラススライドなどの固体基質、又はニトロセルロースメンブレンなどの半固体基質であってもよい。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は何れかのその並べ換えでありうる。
【００６９】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来の対応するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは任意の哺乳動物からの天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、ポリペプチドの天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
【００７０】
「単離された」ポリペプチド又は「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、ポリペプチドは、(1)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％のポリペプチドより多くなるほど、又は９９重量％より多くなるまで、 (2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度にまで、あるいは(3)クーマシーブルー又は銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分な程度にまで精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内にインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一の精製工程により調製される。
【００７１】
「ポリペプチド鎖」は、その各ドメインが、非共有的相互作用又はジスルフィド結合とは対照的にペプチド結合(一又は複数)によって他のドメイン(一又は複数)に連結しているポリペプチドである。
【００７２】
ポリペプチド「変異体」は対応する天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば一又は複数のアミノ酸(天然に生じるアミノ酸及び／又は天然に生じないアミノ酸)残基が、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加され、又は欠失されたポリペプチドが含まれる。通常は、変異体は天然配列ポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％のアミノ酸配列同一性を有する。また、変異体には、典型的には生物学的に活性な天然配列のポリペプチド断片(例えば、サブ配列、切断型など)が含まれる。
【００７３】
本明細書中で用いる「タンパク質変異体」なる用語は、上記の変異体及び／又は一又は複数のアミノ酸突然変異を天然のタンパク質配列に含むタンパク質を指す。場合によって、一又は複数のアミノ酸突然変異にはアミノ酸置換(一又は複数)が含まれる。本発明での使用のためのタンパク質及びその変異体は当分野で公知の様々な方法によって調製されうる。タンパク質のアミノ酸配列変異体はタンパク質ＤＮＡの突然変異によって調製されうる。このような変異体には、タンパク質のアミノ酸配列内の残基の例えば欠失、挿入又は置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の何かを組み合わせて、所望の活性を有する最終コンストラクトに達成してもよい。変異体をコードするＤＮＡ中に作製される突然変異は、リーディングフレーム外の配列におくべきでなく、好ましくは二次的ｍＲＮＡ構造を生産しうる相補的な領域を作製しないであろう。欧州特許第７５４４４号Ａ。
【００７４】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体(完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片(以下を参照)を具体的に包含する。
【００７５】
特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は３又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。多価抗体は典型的には３又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【００７６】
「抗体断片」は、一般には無傷の抗体の抗原結合を含み、よって抗原に結合する能力を保持している無傷の抗体の一部のみを含む。本定義に包含される抗体断片の例には、(i)ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；(ii)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ'断片；(iii)ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；(iv)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ'断片；(v)抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；(vi)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward等, Nature 341, 544-546 (1989))；(vii)単離されたＣＤＲ領域；(viii)ヒンジ領域がジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ'断片を含む二価断片であるＦ(ａｂ')２断片；(ix)単鎖抗体分子(例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ)(Bird等, Science 242:423-426 (1988)；及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988))；(x)同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー(diabodies)」(例えば、欧州特許公報第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；(xi)相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１)を含む「線形抗体」(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第５６４１８７０号)が含まれる。
【００７７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる天然に生じる突然変異等の可能性のある突然変異を除いて、同一である。したがって、「モノクローナル」なる修飾語は、別の抗体の混合ではない抗体の性質を示す。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一抗原に対するものである。ある実施態様では、モノクローナル抗体は、一般に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含しており、この場合の標的に結合するポリペプチドは、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、このような選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、１の抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。
【００７８】
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【００７９】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
【００８０】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。また例として、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び米国特許第 6,982,321号及び同第7,087,409号を参照。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成したヒト抗体に関するLi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【００８１】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する(Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。暴露時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
【００８２】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００８３】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。例えば、高頻度可変領域は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
【００８４】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ  カバット    ＡｂＭ      Chothia     接触
L1      L24-L34     L24-L34     L26-L32     L30-L36
L2      L50-L56     L50-L56     L50-L52     L46-L55
L3      L89-L97     L89-L97     L91-L96     L89-L96
H1      H31-H35B    H26-H35B    H26-H32     H30-H35B  (カバット番号付け)
H1      H31-H35     H26-H35     H26-H32     H30-H35   (Chothia番号付け)
H2      H50-H65     H50-H58     H53-H55     H47-H58
H3      H95-H102    H95-H102    H96-H101    H93-H101
【００８５】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、Kabat等, 上掲に従って番号を付した。
【００８６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８７】
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
【００８８】
本明細書及び特許請求の範囲すべてにわたって、一般的に、可変ドメインの残基を指す場合にはカバット番号付けシステムを用いる(およそ、軽鎖の残基１−１０７と重鎖の残基１−１１３)(例として、Kabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。一般的に、イムノグロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる(ＥＵインデックスはKabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において報告されており、出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる)。本明細書中で特に述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基の数の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する。本明細書中で特に述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基の数の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する(例として、米国特許仮出願第６０／６４０３２３号、ＥＵ番号付けについての図を参照)。
【００８９】
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(イムノグロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１(非Ａ及びＡアロタイプを含む)、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に、例えばAbbas等 Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質ないしペプチドとの共有的ないしは非共有的結合によって形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
【００９０】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【００９１】
「Ｆｃ領域」なる用語は、インタクト抗体のパパイン消化によって生成されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域又は変異形Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によってＣＨ４ドメインを含む。
【００９２】
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用される上掲のKabat等のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【００９３】
本明細書中の「Ｆｃ領域鎖」は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
【００９４】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる)は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、ＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
【００９５】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲(つまり、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸)を含む。ここでは、ＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメインか、又は変異体ＣＨ３ドメイン(例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン：出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国特許第５８２１３３３号参照)とすることができる。このような変異体ＣＨ３ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性(例えば二重特異性)抗体をつくることができる。
【００９６】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、又は変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域はは、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【００９７】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【００９８】
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
【００９９】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、典型的には、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、例えば少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、又は少なくともおよそ９０％の配列同一性を、又は少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
【０１００】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【０１０１】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【０１０２】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が一般的に好まれる。エフェクター細胞はその天然源、例えば本明細書中に記載の血液又はＰＢＭＣから単離してもよい。
【０１０３】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 例えばRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))と、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward, Immunol. Today 18: 592-8 (1997)；Ghetie等, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton等, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；国際公開第2004/92219号 (Hinton等)を参照)。
【０１０４】
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報２０００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【０１０５】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体(変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチド)は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【０１０６】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【０１０７】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。更に、ここの多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は定量的に同じである必要はない。ここの多量体抗体に対して、機能的抗原結合部位の数は超遠心分離分析法を使用して評価することができる。この分析法によれば、多量体抗体に対する標的抗原の異なった比を組み合わせ、複合体の平均分子量を、機能的結合部位の異なった数を仮定して算定する。これらの理論値を、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実権値と比較する。
【０１０８】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
本明細書中で用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、リガンドの場合には一又は複数のレセプターへの結合、又はレセプターの場合には一又は複数のリガンドへの結合を含む、本発明のタンパク質の活性を中和、遮断(ブロック)、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。アンタゴニストには、抗体及びその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。また、アンタゴニストには、本発明のタンパク質の小分子インヒビター、及び融合タンパク質、タンパク質に特異的に結合することによってその標的への結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、本発明のタンパク質に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及び本発明のタンパク質に対するリボザイムが含まれる。
【０１０９】
「遮断(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減させるものである。特定の遮断抗体ないしアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、Houck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)、及びRobinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5): 853-865 (2001)によって記載されているように、１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１-、１４５-、１８３-、１８９-、及び２０６-アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を意味する。ＶＥＧＦ-Ａは、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦ-Ｅ、ＶＥＧＦ-Ｆ及びＰｌＧＦを含む遺伝子ファミリの一部である。ＶＥＧＦ-Ａは、ＶＥＧＦＲ-１(Ｆｌｔ-１)及びＶＥＧＦＲ-２(Ｆｌｋ-１／ＫＤＲ)の２つの高親和性レセプターチロシンキナーゼに主に結合する。この後者はＶＥＧＦ-Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主な伝達物質である。また、「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物腫由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型ないしはその断片を意味する。「切断した(切断型の)」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプター結合親和性を有する。
【０１１０】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、一又は複数のＶＥＧＦレセプターへの結合を含む、ＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子(ペプチジル又は非ペプチジル)を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合性断片、ＶＥＧＦに特異的に結合することによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及び誘導体(例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質、又はそのＶＥＧＦ結合断片、又はキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質)、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビターなどの抗ＶＥＧＦレセプター抗体及びＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、及び融合タンパク質、例として、ＶＥＧＦ-Ｔｒａｐ(Regeneron)、ＶＥＧＦ１２１-ゲロニン(Peregine)が含まれる。また、ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦに対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイムが含まれる。さらに、本発明の方法に有用なＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦを特異的に結合するペプチジルないしは非ペプチジル化合物、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体ないしその抗原結合性断片、ポリペプチド、又はＶＥＧＦに特異的に結合するその断片；ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性があるアンチセンス核酸塩基のオリゴマー；ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性がある小ＲＮＡ；ＶＥＧＦを標的とするリボザイム；ＶＥＧＦに対するペプチボディ；及び、ＶＥＧＦアプタマーが含まれる。一実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベル又は生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上低減するか、又は阻害する。他の実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストによって阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ(８−１０９)、ＶＥＧＦ(１−１０９)又はＶＥＧＦ１６５である。
「抗ＶＥＧＦ抗体」又は「ＶＥＧＦに結合する抗体」なる用語は、抗体がＶＥＧＦを標的とした診断上の薬剤及び／又は治療上の薬剤として有用であるために十分な親和性と特異性を有してＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患及び症状を標的とし、干渉する際の治療上の薬剤として有用でありうる。例として米国特許第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号、国際公開第２００５／０４４８５３号；;欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、同第２００５０１８６２０８号及び同第２００５０１１２１２６号；Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)；及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照のこと。選択した抗体は通常、ＶＥＧＦに対して十分に強い結合親和性を有する。例えば、抗体は１００ｎＭ−１ｐＭの間のＫｄ値でｈＶＥＧＦを結合しうる。抗体親和性は、例えば、表面プラスモン共鳴をベースとしたアッセイ(ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のあるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど)；酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)；及び、競合アッセイ(例えばＲＩＡのもの)によって決定されうる。例えば治療としての有効性を評価するために、抗体を他の生物学的な活性アッセイに用いてもよい。このようなアッセイは当分野で公知であり、標的抗原と抗体の使用目的に依存する。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ(例えば国際公開第８９／０６６９２号に記載のもの)；抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)及び補体媒介性細胞障害(ＣＤＣ)アッセイ(米国特許第５５００３６２号)；及び、アゴニスト活性又は造血アッセイ(国際公開第９５／２７０６２号を参照)などがある。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ又はＶＥＧＦ-Ｅなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないだろう。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体には、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ １０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体；組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Presta等 (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599）であり、限定するものではないが「ベバシズマブ(ＢＶ)」とも「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)」としても知られる抗体が含まれる。ベバシズマブは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗体Ａ.４.６.１から、変異したヒトのＩｇＧ１フレームワーク領域と抗原結合性相補性決定領域を含む。フレームワーク領域のほとんどを含め、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトのＩｇＧ１に由来し、配列のおよそ７％はＡ４.６.１に由来する。ベバシズマブは、およそ１４９０００のダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日に発行の米国特許第６８８４８７９号��さらに記載されている。ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のあるように、更なる抗ＶＥＧＦ抗体には、Ｇ６又はＢ２０系列抗体(例えば、Ｇ６-２３、Ｇ６-３１、Ｂ２０-４.１)が含まれる。さらに好適な抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６０５４２９７号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、及び同第２００５０１１２１２６号；及び、Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、用語「Ｂ２０シリーズのポリペプチド」は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含めて、ポリペプチドを指す。Ｂ２０シリーズのポリペプチドとして、これらに限定されないが、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号および／または米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されているＢ２０抗体またはＢ２０由来の抗体の配列から得た抗体が挙げられ、これらの特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれている。一実施形態では、Ｂ２０シリーズのポリペプチドは、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号および／または米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されているＢ２０−４．１である。別の実施形態では、Ｂ２０シリーズのポリペプチドは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０７３１６０号に記載されているＢ２０−４．１．１であり、この開示の全体が、参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、用語「Ｇ６シリーズのポリペプチド」は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含めて、ポリペプチドを指す。Ｇ６シリーズのポリペプチドとして、これらに限定されないが、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号および／または米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されているＧ６抗体またはＧ６由来の抗体の配列から得た抗体が挙げられる。米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号および／または米国特許出願公開第２００７００２０２６７に記載されているＧ６シリーズのポリペプチドとして、これらに限定されないが、Ｇ６〜８、Ｇ６〜２３およびＧ６〜３１が挙げられる。
【０１１３】
「ＵＲＶＩＮＡ」は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍中で上方制御される核酸を指す。ＵＲＶＩＮＡとして、これらに限定されないが、Ｓ１００Ａ８（配列番号１）、Ｓ１００Ａ９（配列番号３）、ＰｌＧＦ（配列番号５）、ＩＬ−１β（配列番号７）、ＩＬ−６（配列番号９）、およびＬＩＦ（配列番号１１）が挙げられる。
「ＵＲＶＩＰ」は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍中で上方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＶＩＰとして、これらに限定されないが、Ｓ１００Ａ８（配列番号２）、Ｓ１００Ａ９（配列番号４）、ＰｌＧＦ（配列番号６）、ＩＬ−１β（配列番号８）、ＩＬ−６（配列番号１０）、ＬＩＦ（配列番号１２）、およびＨＧＦ（配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２）が挙げられる。
「ＤＲＶＩＮＡ」は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍中で下方制御される核酸を指す。ＤＲＶＩＮＡとして、これらに限定されないが、Ｔｉｅ−１（配列番号２５）、Ｔｉｅ−２（配列番号２７）、ＶＥＧＦＲ１（配列番号２９）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号３１）、ＣＤ３１（配列番号３３）、ＣＤ３４（配列番号３５）、およびＰＤＧＦＣ（配列番号３７）が挙げられる。
「ＤＲＶＩＰ」は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍中で下方制御されるタンパク質を指す。特定の実施形態では、ＤＲＶＩＰは、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍中で下方制御される核酸、例えば、ＤＲＶＩＮＡによってコードされるタンパク質である。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、用語「ＩＬ−１βアンタゴニスト」は、ＩＬ−１βに結合し、ＩＬ−１βの生物学的活性を阻害するまたは実質的に低下させる分子を指す。ＩＬ−１βアンタゴニストの非限定的な例として、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬理作用を示す物質およびそれらの代謝産物、転写および翻訳を制御する配列等が挙げられる。本発明の一実施形態では、ＩＬ−１βアンタゴニストは、抗体、とりわけ、ヒトＩＬ−１βに結合する抗ＩＬ−１β抗体である。別の実施形態では、ＩＬ−１βアンタゴニストは、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）であるＫｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ）（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）である。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１βアンタゴニストは、ＩＬ−１  Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）である。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、用語「ＩＬ−６アンタゴニスト」は、ＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害するまたは実質的に低下させる分子を指す。ＩＬ−６アンタゴニストの非限定的な例として、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬理作用を示す物質およびそれらの代謝産物、転写および翻訳を制御する配列等が挙げられる。本発明の一実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニストは、抗体、とりわけ、ヒトＩＬ−６に結合する抗ＩＬ−６抗体である。
本明細書で使用する場合、用語「ＬＩＦアンタゴニスト」は、ＬＩＦに結合し、ＬＩＦの生物学的活性を阻害するまたは実質的に低下させる分子を指す。ＬＩＦアンタゴニストの非限定的な例として、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬理作用を示す物質およびそれらの代謝産物、転写および翻訳を制御する配列等が挙げられる。本発明の一実施形態では、ＬＩＦアンタゴニストは、抗体、とりわけ、ヒトＬＩＦに結合する抗ＬＩＦ抗体である。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、用語「ＰｌＧＦアンタゴニスト」は、ＰｌＧＦに結合し、ＰｌＧＦの生物学的活性を阻害するまたは実質的に低下させる分子を指す。ＰｌＧＦは、胎盤増殖因子を指す。ＰｌＧＦは主として、２つのスプライス変異体またはアイソフォーム、すなわち、１４９個のアミノ酸のＰｌＧＦ−１、またはカルボキシ末端領域における２１個のアミノ酸の挿入を含む１７０個のアミノ酸のＰｌＧＦ−２が存在することが見出されているが、また、その他のアイソフォームも見出されている。ＰｌＧＦアンタゴニストの非限定的な例として、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬理作用を示す物質およびそれらの代謝産物、転写および翻訳を制御する配列等が挙げられる。本発明の一実施形態では、ＰｌＧＦアンタゴニストは、抗体、とりわけ、ヒトＰｌＧＦに結合する抗ＰｌＧＦ抗体である。一実施形態では、ＰｌＧＦ抗体は、抗ＰｌＧＦ  ＴＢ−４０３（ＴｈｒｏｍｂｏＧｅｎｉｃｓ  ＮＶ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）である。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃら、Ａｎｔｉ−ＰｌＧＦ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ＶＥＧＦ（Ｒ）−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｅｓｓｅｌｓ、Ｃｅｌｌ、１３１：４６３〜４７５（２００７）を参照されたい。別の実施形態では、ＰｌＧＦアンタゴニストは、ＰｌＧＦのＦｌｔ−１受容体への結合を阻害することができる抗ＰｌＧＦ抗体である。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、用語「ＨＧＦアンタゴニスト」は、ＨＧＦに結合し、ＨＧＦの生物学的活性を阻害するまたは実質的に低下させる分子を指す。ＨＧＦアンタゴニストの非限定的な例として、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬理作用を示す物質およびそれらの代謝産物、転写および翻訳を制御する配列等が挙げられる。本発明の一実施形態では、ＨＧＦアンタゴニストは、抗体、とりわけ、ヒトＨＧＦに結合する抗ＨＧＦ抗体である。別の実施形態では、ＨＧＦアンタゴニストは、ＡＭＧ１０２、すなわち、ＨＧＦ／ＳＦ（細胞分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ））に対するヒトモノクローナル抗体である。
【０１１８】
「ｃ−Ｍｅｔアンタゴニスト」（「ｃ−Ｍｅｔ阻害剤」とも互換的に呼ぶ）は、ｃ−Ｍｅｔの活性化または機能を妨げる薬剤である。ｃ−Ｍｅｔの核酸配列およびタンパク質配列を、本明細書においてそれぞれ、配列番号２３および配列番号２４の下に開示する。ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の例として、ｃ−Ｍｅｔ抗体；ＨＧＦ抗体；小型分子ｃ−Ｍｅｔアンタゴニスト；ｃ−Ｍｅｔチロシンキナーゼ阻害剤；アンチセンスおよび阻害性のＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）分子（例えば、ＷＯ２００４／８７２０７を参照されたい）が挙げられる。特定の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔに結合する抗体または小型分子である。特定の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔに対して、約１，０００ｎＭ以下の結合親和性（解離定数）を有する。別の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔに対して、約１００ｎＭ以下の結合親和性を有する。別の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔに対して、約５０ｎＭ以下の結合親和性を有する。特定の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔに共有結合する。特定の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を、１，０００ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。別の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を、５００ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。別の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を、５０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。
「ｃ−Ｍｅｔ活性化」は、ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ｃ−Ｍｅｔ活性化の結果、シグナル伝達（例えば、ｃ−Ｍｅｔ中のｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインまたは基質ポリペプチドによって引き起こされる）シグナル伝達が発生する。ｃ−Ｍｅｔ活性化は、目的のｃ−Ｍｅｔ受容体にｃ−Ｍｅｔリガンド（ＨＧＦ）が結合することによって媒介され得る。ｃ−ＭｅｔにＨＧＦが結合すると、ｃ−Ｍｅｔのキナーゼドメインが活性化され、それによって、ｃ−Ｍｅｔ中のチロシン残基のリン酸化および／または追加の（１つもしくは複数の）基質ポリペプチドのチロシン残基のリン酸化が生じ得る。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、用語「Ｓ１００Ａ８アンタゴニスト」は、Ｓ１００Ａ８に結合し、Ｓ１００Ａ８の生物学的活性を阻害するまたは実質的に低下させる分子を指す。Ｓ１００Ａ８アンタゴニストの非限定的な例として、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬理作用を示す物質およびそれらの代謝産物、転写および翻訳を制御する配列等が挙げられる。本発明の一実施形態では、Ｓ１００Ａ８アンタゴニストは、抗体、とりわけ、ヒトＳ１００Ａ８に結合する抗Ｓ１００Ａ８抗体である。
本明細書で使用する場合、用語「Ｓ１００Ａ９アンタゴニスト」は、Ｓ１００Ａ９に結合し、Ｓ１００Ａ９の生物学的活性を阻害するまたは実質的に低下させる分子を指す。Ｓ１００Ａ９アンタゴニストの非限定的な例として、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬理作用を示す物質およびそれらの代謝産物、転写および翻訳を制御する配列等が挙げられる。本発明の一実施形態では、Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、抗体、とりわけ、ヒトＳ１００Ａ９に結合する抗Ｓ１００Ａ９抗体である。
【０１２０】
ポリペプチドに関する「生物学的活性」および「生物学的に活性な」という用語は、分子が、細胞に特異的に結合し、細胞応答、例えば、増殖、遊走等を制御する能力を指す。また、細胞応答としては、これらに限定されないが、遊走および／または増殖を含めた、受容体を通して媒介されるものも挙げられる。この文脈では、用語「調節する」は、促進および阻害の両方を含む。
【０１２１】
「ＶＥＧＦの生物学的活性」は、任意のＶＥＧＦ受容体への結合、または正常な血管新生および血管形成ならびに異常な血管新生および血管形成の両方の調節等、任意のＶＥＧＦシグナル伝達活性（ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１８：４〜２５；Ｆｅｒｒａｒａ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：５２７〜５４３）；胚の血管形成および血管新生の促進（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３５〜４３９；Ｆｅｒｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９〜４４２）；さらに、雌の生殖器系における、ならびに骨の成長および軟骨の形成のための周期性の血管増殖の調節（Ｆｅｒｒａｒａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：３３６〜３４０；Ｇｅｒｂｅｒら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：６２３〜６２８）を含む。血管新生および血管形成における血管新生因子であることに加え、ＶＥＧＦは、多面的な増殖因子として、内皮細胞の生存、血管透過性および血管拡張、単核球走化性、ならびにカルシウムの流入等のその他の生理学的プロセスにおいて、複数の生物学的な作用を示す（ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）、上記、ならびにＣｅｂｅ−Ｓｕａｒｅｚら  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６３：６０１〜６１５（２００６））。さらに、最近の研究からは、網膜色素上皮細胞、膵管細胞およびシュワン細胞等のいくつかの非内皮細胞型に対するＶＥＧＦの分裂促進作用も報告されている。Ｇｕｅｒｒｉｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：３８５〜３９４；Ｏｂｅｒｇ−Ｗｅｌｓｈら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２６：１２５〜１３２；Ｓｏｎｄｅｌｌら（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：５７３１〜５７４０。
【０１２２】
「血管新生因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激する、例えば、血管新生、血管内皮細胞増殖、血管及び／又は脈管形成の安定性などを促進する増殖因子である。例えば、血管新生因子には、限定するものではないが、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリ、線維芽細胞増殖因子ファミリ(ＦＧＦ)、ＴＩＥリガンド(アンギオポイエチン)、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが含まれる。また、創傷治癒を促す因子、例として、成長ホルモン、インスリン様成長因子-Ｉ(ＩＧＦ-Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ、及びそのファミリのメンバー、及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、血管新生因子を列挙する表１)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)を参照。
【０１２３】
「抗血管新生剤」又は「血管新生インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲートないし融合タンパク質を指し、直接又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害するものである。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義するように、血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８(リンゴ酸スニチニブ)、ＡＭＧ７０６)である。また抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性メラノーマの抗血管新生療法を列挙する表３)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、抗血管新生因子を列挙する表２)；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を挙げる表１)を参照。
【０１２４】
「抗脈管形成療法」なる用語は、本明細書で定義されるように少なくとも一つの抗脈管形成剤の投与を含む脈管形成を抑制することに役立つ治療に関連する。ある実施態様において、抗脈管形成療法は、対象にＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを含む。ある実施態様において、ここで定められるように、抗脈管形成療法はＶＥＧＦ−アンタゴニストを投与することを含む。ある実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗−ＶＥＧＦ抗体である。別の実施態様において、抗−ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブである。
【０１２５】
本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書において治療される哺乳動物の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。このような薬剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；非ステロイド性抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)；ガンシクロビル、タクロリムス、糖質コルチコイド、例として、コルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例として、シクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例として、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；アルキル化剤、例として、シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(ＭＨＣ抗原をマスキングするもの、米国特許第４１２０６４９号に記載)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド、例として、副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質コルチコイド類似体、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン及びデキサメサゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート(経口又は皮下)；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインないしはサイトカインレセプター抗体、例えば抗インターフェロン-α、-β又は-γ抗体、抗腫瘍壊死因子-α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦ-αイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性の抗リンパ球グロブリン；パン-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日に発行の国際公開第１９９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohen等、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開第１９９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第１９９１／０１１３３号)；及び、Ｔ細胞レセプター抗体(欧州特許第３４０１０９号)、例えばＴ１０Ｂ９が含まれる。
【０１２６】
「非ステロイド系抗炎症薬」又は「ＮＳＡＩＤ」の例は、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、これらの塩類及び誘導体などが含まれる。
【０１２７】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むように意図されている。
【０１２８】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ及び／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【０１２９】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＩリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANETM)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び５-ＦＵ及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【０１３０】
またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(例えばLURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；セレコシブ(celecoxib)などのＣＯＸ-２阻害剤(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾル-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【０１３１】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(例えばＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦ-Ｅ)；胎盤由来の増殖因子(ＰｌＧＦ)；血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ、例えばＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ)；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-α；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ-１５、ＩＬ-１６、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-１９、ＩＬ-２０、ＩＬ-３０のインターロイキン(ＩＬ)；セクレトグロビン／ウテログロビン；オンコスタチンＭ(ＯＳＭ)；ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-βなどの腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【０１３２】
「被検体」または「患者」は、ヒト、又はウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ及びネコのような非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を意味する。ある実施態様において患者はヒトである。別の実施態様において、癌と診断された患者yである。
【０１３３】
治療のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどを含む。ある実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【０１３４】
「疾患」は治療によって利益を得る任意の症状である。これには、哺乳動物が問題とする疾患に罹らしめる病理学的症状を含む、慢性及び急性の疾患ないし疾病が含まれる。本明細書中で治療される疾患の非限定的な例には、いずれかの形態の腫瘍、良性及び悪性の腫瘍；血管化の腫瘍；肥大；白血病及びリンパ系の悪性腫瘍；神経系疾患、膠細胞性疾患、星状性、視床下部及び他の腺性疾患、マクロファージ性疾患、上皮性疾患、間質性疾患、及び胚盤胞性疾患；及び、炎症性疾患、血管形成性及び免疫性疾患、不適当な、異常な、過剰な及び／又は病理学的脈管化及び／又は血管透過から生じる血管性疾患が含まれる。
【０１３５】
ここで使用されるところの「治療」(及び「処置」又は「治療する」などの変形句)は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるため又は疾患又は疾病の進行をゆっくりにするために用いられる。
【０１３６】
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬剤の量に相当する。癌の場合は、有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の成長をある程度阻害し；VEGF非依存性腫瘍の治療を可能にする；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。ある程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。大腸腺腫の場合、治療的有効量の薬剤により、例えば、腺腫細胞数の減少；腺腫サイズの減少；腺腫数の減少；腺腫の成長のある程度の阻害；及び／又は本疾患に関係する一又は複数の症状のある程度の軽減しうる。治療の効果と題した節も参照のこと。
【０１３７】
「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【０１３８】
前癌性、良性の、早期または後期の腫瘍の場合、治療有効量の血管新生阻害剤が、癌細胞の数を低下させること；原発性腫瘍のサイズを縮小すること；癌細胞が周辺臓器中に浸潤するのを阻害する（すなわち、ある程度まで緩慢化させ、好ましくは、停止させる）こと；腫瘍の転移を阻害する（すなわち、ある程度まで緩慢化させ、好ましくは、停止させる）こと；腫瘍の成長もしくは腫瘍の進行を阻害するもしくはある程度まで遅延させること；および／または障害と関連がある症状のうちの１つもしくは複数をある程度まで和らげることができる。薬物が、現存する癌細胞の成長を阻止することおよび／または現存する癌細胞を死滅させることができる程度まで、薬物は、細胞分裂抑制性および／または細胞傷害性であり得る。癌療法について、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を、例えば、生存期間、疾患進行（ＴＴＰ）までの時間、応答率（ＲＲ）、応答期間、および／または生活の質を評価することによって測定することができる。また、治療の有効性と題したセクションも参照されたい。
【０１３９】
「低下させるまたは阻害する」とは、参照と比較して、活性、機能および／または量を、減少させるまたは低下させることである。特定の実施形態では、「低下させるまたは阻害する」によって、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。別の実施形態では、「低下させるまたは阻害する」によって、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施形態では、「低下させるまたは阻害する」によって、７５％、８５％、９０％または９５％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。低下させるまたは阻害するは、治療を受けている障害の症状、転移の存在もしくはサイズ、原発性腫瘍のサイズ、または血管新生障害における血管のサイズもしくは数を指すことができる。
【０１４０】
「癌」及び「癌性」なる用語は、、一般的に調節されない細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、腎臓又は腎性癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌、例として小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、扁平細胞癌(例えば上皮の扁平細胞癌)、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric、stomach)癌、消化管間質腫瘍(ＧＩＳＴ)、膵癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫を含む血液悪性腫瘍(ＮＨＬ)、多発性骨髄腫及び急性の血液系悪性腫瘍、子宮内膜ないし子宮カルチノーマ、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛膜癌、唾液腺カルチノーマ、外陰部癌、甲状腺癌、食道カルチノーマ、肝癌、肛門部のカルチノーマ、陰茎カルチノーマ、上咽頭癌、喉頭のカルチノーマ、カポシ肉腫、メラノーマ、皮膚カルチノーマ、シュワン腫、乏突起細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉種、平滑筋肉腫、尿路カルチノーマ、甲状腺カルチノーマ、ウィルムス腫瘍、並びにＢ細胞リンパ腫(例えば低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球性(ＳＬ)ＮＨＬ；中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレード広汎性ＮＨＬ；高グレード免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードリンパ芽球ＮＨＬ；高グレード小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変(bulky disease)ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連のリンパ腫；及び、 ワルデンシュトレームマクログロブリン血症)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；線毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び、移植後のリンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに母斑症、浮腫(脳腫瘍と関係しているものなど)及びメイグス症候群と関係している異常な血管性増殖が含まれる。
【０１４１】
本明細書中で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性のいずれであっても、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖、及びすべての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。 
【０１４２】
治療しようとする新生物障害の例として、これらに限定されないが、本明細書において、用語「癌」および「癌性の」の下に記載するものが挙げられる。本発明のアンタゴニストを用いる治療に適している非新生物の状態として、これらに限定されないが、例えば、望まれないまたは異常な肥大、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム動脈硬化、動脈硬化性プラーク、心筋梗塞由来の浮腫、未熟児網膜症、後水晶体線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫を含めた、糖尿病性およびその他の増殖性の網膜症、角膜血管新生、角膜移植血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、偶角血管新生（ルベオーシス）、眼球血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈形成異常（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺肥大（グレーブス病を含む）、角膜およびその他の組織の移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺浸出液（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ）、脳浮腫（例えば、急性脳卒中／閉鎖性の頭部損傷／外傷と関連があるもの）、滑膜の炎症、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、骨形成肥大、骨関節炎（ＯＡ）、難治性の腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第三腔体液病（３ｒｄ  ｓｐａｃｉｎｇ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮筋腫、早期分娩、ＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）等の慢性炎症、腎臓同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望まれないまたは異常な組織塊の成長（非癌性）、肥満、脂肪組織塊の成長、血友病性関節、肥厚性瘢痕、毛髪の成長阻害、オスラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫後水晶体線維増殖、強皮症、トラコーマ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、妊娠高血圧腎症、腹水、心膜液貯留（心外膜炎と関連があるもの等）、ならびに胸水貯留が挙げられる。
【０１４３】
用語「癌療法」は、癌を治療するのに有用な療法を指す。用語「抗新生物組成物」は、少なくとも１つの活性な治療剤、例えば、「抗癌剤」を含む、癌を治療するのに有用な組成物を指す。治療剤（抗癌剤）の例として、これらに限定されるが、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、放射線療法において使用する薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、毒素および癌を治療するためのその他の薬剤が挙げられ、例えば、抗ＶＥＧＦ中和抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＨＥＲ−２、抗ＣＤ２０、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、（１つもしくは複数の）ＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体、ＥｒｂＢ４受容体もしくはＶＥＧＦ受容体のうちの１つもしくは複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および／または幹細胞因子（ＳＣＦ）についての受容体チロシンキナーゼの阻害剤（例えば、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ならびにその他の生理活性物質および有機化学物質等がある。また、それらの組合せも本発明に含まれる。
【０１４４】
用語「診断」は、本明細書では、癌の同定等、分子的もしくは病理学的な状況、疾患もしくは状態を同定することを指すため、または特定の治療計画から利益を得ることができる癌患者を同定することを指すために使用する。一実施形態では、診断は、特定の型の腫瘍を同定することを指す。さらに別の実施形態では、診断は、対象のＶＥＧＦ非依存性腫瘍を同定することを指す。
【０１４５】
用語「予後」は、本明細書では、抗癌療法に由来する、臨床上の利益の可能性を予測することを指すために使用する。
【０１４６】
用語「予測」は、本明細書では、患者の特定の抗癌療法に対する応答が有利または不利のいずれかである可能性を指すために使用する。一実施形態では、予測は、それらの応答の程度に関連する。一実施形態では、予測は、治療、例えば、特定の治療剤を用いた治療の後に、疾患の再発なしで特定の期間にわたり患者が生存するもしくは改善するかどうか、および／またはそうした確率に関連する。本発明の予測方法を臨床的に使用して、任意の特定の患者について最も適切な治療のモダリティーを選ぶことによって、治療の決定を下すことができる。本発明の予測方法は、患者が、例えば、所与の治療剤もしくは組合せの投与、外科的介入、ステロイド治療等を含めた、所与の治療投与計画等の治療計画に対して有利に応答する可能性が高いかどうか、または治療投与計画後に、患者が長期に生存する可能性が高いかどうかを予測する場合の貴重なツールである。
【０１４７】
患者の応答性を、患者に対する利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価することができ、それらのエンドポイントとして、非限定的に、（１）緩慢化および完全な停止を含めた、疾患の進行のある程度までの阻害；（２）病変サイズの縮小；（３）疾患細胞が隣接する周辺の臓器および／もしくは組織中に浸潤するのを阻害する（すなわち、低下させる、緩慢化させるもしくは完全に停止させる）こと；（４）疾患が広がるのを阻害する（すなわち、低下させる、緩慢化させるもしくは完全に停止させる）こと；（５）障害と関連がある１つもしくは複数の症状をある程度まで軽減すること；（６）治療後の、疾患が提示されない長さを延長すること；ならびに／または（８）治療後の所与の時点における死亡率の減少が挙げられる。
【０１４８】
種々のエンドポイント、例えば、緩慢化および完全な停止を含めた、疾患の進行のある程度までの阻害；疾患のエピソードおよび／もしくは症状の数の低下；病変サイズの縮小；疾患細胞が隣接する周辺の臓器および／もしくは組織中に浸潤するのを阻害する（すなわち、低下させる、緩慢化させるもしくは完全に停止させる）こと；疾患が広がるのを阻害する（すなわち、低下させる、緩慢化させるもしくは完全に停止させる）こと；疾患病変の退縮もしくは消失をもたらす場合があるが、そうでなければならないことはない自己免疫応答の減少；障害と関連がある１つもしくは複数の症状をある程度まで軽減すること；治療後の、疾患が提示されない長さ、例えば、進行が見られない生存の長さを延長すること；全体的な生存の延長；より高い応答率；ならびに／または治療後の所与の時点における死亡率の減少を評価することによって、臨床上の利益を測定することができる。
【０１４９】
用語「利益」は、広い意味で使用し、任意の望ましい作用を指し、具体的には、本明細書で定義する臨床上の利益を含む。
【０１５０】
１つまたは複数のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（同じ時期）の投与および／または任意の順の連続した投与を含む。
【０１５１】
用語「同時に」は、本明細書では、投与の少なくとも一部が時間的に重なる、２つ以上の治療剤の投与を指すために使用する。したがって、同時の投与は、１つまたは複数の薬剤の投与が、１つまたは複数のその他の薬剤の投与を中断した後も続く場合の投与計画を含む。
【０１５２】
本発明の方法
本発明は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を検出するための方法および組成物を提供する。本明細書に開示する配列情報から、当技術分野で知られている核酸検出方法と相まって、種々の開示する転写物を検出および比較することが可能になる。開示する方法は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を有する癌患者を治療するための適切または有効な療法を評価するのに有用であるデータおよび情報を得るための、好都合かつ効率的であり、潜在的に費用効果がある手段もさらに提供する。
【０１５３】
特定の実施形態では、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍を検出するため、およびＶＥＧＦアンタゴニスト治療に対する腫瘍の感受性または耐性を評価するためのマーカーのセットを本明細書において提供する。例えば、マーカーのセットは、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０個以上または全セットの分子を含むことができる。特定の実施形態では、分子は、発現が変化している核酸、発現および／もしくは活性が変化しているタンパク質をコードする核酸、または発現および／もしくは活性が変化しているタンパク質である。核酸および／またはタンパク質の発現レベルが変化している遺伝子として、これらに限定されないが、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＰＤＧＦＣ、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２が挙げられる。
【０１５４】
ＵＲＶＩＰおよびＤＲＶＩＰの調節物質、またはＵＲＶＩＮＡおよびＤＲＶＩＮＡがコードするタンパク質の調節物質は、これらのタンパク質の活性を調節する分子、例えば、アゴニストおよびアンタゴニストである。用語「アゴニスト」を、本発明のタンパク質のペプチドおよび非ペプチド性類似体、ならびに本発明のそのようなタンパク質に特異的に結合する抗体を指すために使用するが、これらの抗体は、アゴニストシグナルを発生させる能力がある抗体に限るものとする。用語「アゴニスト」を、タンパク質の生物学的な役割に照らして定義する。用語「アンタゴニスト」を、本発明のタンパク質の生物学的活性を阻害する能力を有する分子を指すために使用する。アンタゴニストは、例えば、タンパク質の活性の阻害によって評価することができる。
【０１５５】
既知配列についてのデータベースエントリー、またはチップの製造元が提供する配列情報を使用すれば、配列を、当業者によく知られている技法を使用して、（発現する場合には）検出し、測定することができる。遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量を、これらに限定されないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片および／または遺伝子のコピー数を含めた、当技術分野で知られている任意の適切な判断基準に基づいて決定することができる。
【０１５６】
試料中の種々の遺伝子またはバイオマーカーの発現を、いくつかの方法によって解析することができ、それらの方法は、その多くが当技術分野では知られており、当業者によって理解されており、これらに限定されないが、免疫組織化学的解析および／またはウエスタンブロット解析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）等、（例えば、タンパク質の発現レベルを調べるための）定量的な血液に基づいたアッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡのノーザン解析および／またはＰＣＲ解析、ならびに遺伝子および／または組織のアレイ解析によって実施することができる多種多様なアッセイのうちのいずれか１つが挙げられる。遺伝子および遺伝子産物の状況を評価するための典型的なプロトコールを、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔｓ２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、１５（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）および１８（ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）に見出すことができる。また、Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ＭｅｄｉｃｉｎｅまたはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）から入手可能なもの等のマルチプレックス化したイムノアッセイも使用することができる。
【０１５７】
特定の実施形態では、試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量が、参照試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量よりも多い場合には、試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現／量が、参照試料中の発現／量と比較して増加している。同様に、試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量が、参照試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現レベル／量よりも少ない場合には、試料中の遺伝子またはバイオマーカーの発現／量が、参照試料中の発現／量と比較して減少している。
【０１５８】
特定の実施形態では、参照試料は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＵＲＶＩＮＡ分子、ＤＲＶＩＮＡ分子、ＲＶＩＰ分子および／またはＤＲＶＩＰ分子）を含み、それらの遺伝子について、比較パラメータ、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストに対して感受性である腫瘍が知られている。
【０１５９】
特定の実施形態では、試料を、アッセイしたＲＮＡまたはタンパク質の量の差および使用したＲＮＡ試料またはタンパク質試料の質の変動についても、アッセイの試行間の変動についても正規化する。そのような正規化を、ＧＡＰＤＨまたはβアクチン等のよく知られているハウスキーピング遺伝子を含めた、特定の正規化する遺伝子の発現を測定し、組み込むことによって達成することができる。あるいは、正規化は、アッセイした遺伝子の全てまたはそれらの大型のサブセットのシグナルの平均または中央値に基づくこともできる（大域的正規化のアプローチ）。各遺伝子について、患者の腫瘍のｍＲＮＡまたはタンパク質の、測定し、正規化した量を、参照セット中に見出された量と比較する。各患者の試験した腫瘍ごとのそれぞれのｍＲＮＡまたはタンパク質について正規化した発現レベルを、参照セット中で測定した発現レベルのパーセントとして表すことができる。解析しようとする、特定の患者の試料中で測定した発現レベルが、この範囲内の何らかのパーセンタイルを示すであろう。これは、当技術分野でよく知られている方法によって決定することができる。
【０１６０】
特定の実施形態では、遺伝子の相対的な発現レベルを、以下に従って決定する。
試料１中で決定したＣｔについては、遺伝子１試料１の相対的な発現＝２ｅｘｐ（Ｃｔハウスキーピング遺伝子−Ｃｔ遺伝子１）
参照ＲＮＡ中で決定したＣｔについては、遺伝子１参照ＲＮＡの相対的な発現＝２ｅｘｐ（Ｃｔハウスキーピング遺伝子−Ｃｔ遺伝子１）
遺伝子１試料１の正規化した相対的な発現＝（遺伝子１試料１の相対的な発現／遺伝子１参照ＲＮＡの相対的な発現）
【０１６１】
Ｃｔは、閾値サイクルである。Ｃｔは、反応内で発生した蛍光が閾値ラインと交差するサイクル数である。
【０１６２】
全ての実験を、種々の組織供給源に由来するＲＮＡの包括的なミックスである参照ＲＮＡ（例えば、参照ＲＮＡ＃６３６５３８、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ製）に対して正規化する。同一の参照ＲＮＡを、各ｑＲＴ−ＰＣＲの試行中に含めて、異なる実験試行間の結果の比較を可能にする。
【０１６３】
特定の実施形態では、試験試料中のＵＲＶＩＮＡ分子を、そのｍＲＮＡの発現レベルが、参照試料と比べて、参照試料中の対応するＵＲＶＩＮＡ分子のｍＲＮＡの発現レベルから約１．５倍以上増加している場合、ｍＲＮＡの発現レベルが変化しているとみなすことができる。一実施形態では、ｍＲＮＡの発現レベルの増加は約５０％である。
【０１６４】
特定の実施形態では、試験試料中のＤＲＶＩＮＡ分子を、そのｍＲＮＡの発現レベルが、参照試料と比べて、参照試料中の対応するＤＲＶＩＮＡ分子の遺伝子の発現レベルから約２０％以上減少している場合、ｍＲＮＡの発現レベルが変化しているとみなすことができる。一実施形態では、ｍＲＮＡの発現レベルの減少は約３０％である。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡの発現レベルの減少は約４０％である。
【０１６５】
特定の実施形態では、試験試料中のＵＲＶＩＰ分子を、そのタンパク質の発現レベルが、参照試料と比べて、参照試料中の対応するＵＲＶＩＰ分子のタンパク質の発現レベルから約２０％以上増加している場合、タンパク質の発現レベルが変化しているとみなすことができる。一実施形態では、タンパク質の発現レベルの増加は約３０％である。さらに別の実施形態では、タンパク質の発現レベルの増加は約４０％である。
【０１６６】
特定の実施形態では、試験試料中のＤＲＶＩＰ分子を、そのタンパク質の発現レベルが、参照試料と比べて、参照試料中の対応するＵＲＶＩＰ分子のタンパク質の発現レベルから約２５％以上減少している場合、タンパク質の発現レベルが変化しているとみなすことができる。一実施形態では、タンパク質の発現レベルの減少は約３０％である。一実施形態では、タンパク質の発現レベルの減少は約４０％である。一実施形態では、タンパク質の発現レベルの減少は約５０％である。
【０１６７】
特定の実施形態では、参照試料は、生物学的試料、例えば、腫瘍細胞に可能な限り類似する組織型から得る。いくつかの実施形態では、参照試料は、生物学的試料と同じ対象、例えば、生物学的試料の起源の領域に近接する領域、または対象がＶＥＧＦアンタゴニスト治療に対して感受性であった時点から得る。本発明の一実施形態では、参照試料は、複数の生体試料から得る。例えば、参照試料は、それについて、腫瘍がＶＥＧＦアンタゴニストを用いた治療に対して感受性であったことが知られている以前に試験した試料からの発現パターンのデータベースであり得る。
【０１６８】
標的の遺伝子またはバイオマーカーを含む試料を、当技術分野でよく知られており、目的の癌の特定の型および場所に適している方法によって得ることができる。定義のセクションを参照されたい。例えば、癌性病変の試料を、切除、気管支鏡検査、細針による吸引もしくは気管支の刷毛による採取によってか、または痰、胸膜液もしくは血液から得ることができる。遺伝子または遺伝子産物を、癌もしくは腫瘍の組織、または尿、痰、血清もしくは血漿等のその他の生体試料から検出することができる。癌性試料中の標的の遺伝子または遺伝子産物の検出について上記で論じた同じ技法を、その他の生体試料に適用することができる。癌細胞が、癌病変から剥げ落ち、そのような生体試料中に出現する場合がある。そのような生体試料をスクリーニングすることによって、これらの癌について、簡便な早期診断を達成することができる。さらに、療法の進展を、そのような生体試料を標的の遺伝子または遺伝子産物について試験することによってより容易にモニターすることもできる。
【０１６９】
組織標本を癌細胞について濃縮する手段が、当技術分野では知られている。例えば、組織を、パラフィン切片またはクリオスタット切片から単離することができる。また、癌細胞を、正常細胞から、フローサイトメトリーまたはレーザーキャプチャー法によって分離することもできる。癌細胞を正常細胞から分離するためのこれらおよびその他の技法が、当技術分野ではよく知られている。癌組織に多くの正常細胞が混入している場合、サインの遺伝子またはタンパク質の発現プロファイルの検出はより困難になる恐れがあるが、混入および／または擬陽性／擬陰性の結果を最小限に留めるための技法が知られており、それらの技法のうちのいくつかを、本明細書において以下に記載する。また、例えば、目的の癌細胞とは関連があるが、対応する正常細胞とは関連がないこと、またはその逆のことが知られているバイオマーカーの存在について、試料を評価することもできる。
【０１７０】
特定の実施態様では、試料中のタンパク質の発現を免疫組織化学法(「ＩＨＣ」)技及び染色プロトコルを用いて検査する。組織切片の免疫組織化学的染色は、試料中のタンパク質の存在を評価ないしは検出するための確実な方法であることが示されている。免疫組織学法技術は、抗体を用いて、一般的には色素生産性方法又は蛍光性方法によって、インサイツで細胞性抗原を探索して視覚化する。
【０１７１】
前記組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい(例として、“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,” 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.を参照)。当分野の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する試料の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の技術者は、組織試料の大きさ及び用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。実施例では、中性緩衝ホルマリン、ブアン固定液又はパラホルムアルデヒドを用いて試料を固定してもよい。
【０１７２】
通常、まず試料を固定し、次いで段階的に増加させたアルコールによって、脱水し、パラフィン又は他の切片溶液に浸透させて包埋し、組織試料を切断できるようにする。別法として、組織を切断して、得られた切片を固定してもよい。例として、従来の方法によって、組織試料を包埋して、パラフィンで処理してもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。使用されうるパラフィンの例として、Paraplast、Broloid及びTissuemayがあるが、これらに限定するものではない。組織試料を包埋すると、試料をミクロトーム等によって、切断してもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。この手順の例として、切片はおよそ３ミクロンからおよそ５ミクロンの範囲の厚さでよい。切断すると、いくつかの標準的な方法によって、切片をスライドに付着させてもよい。スライド接着剤の例として、シラン、ゼラチン、ポリ‐Ｌ‐リジンなどがあるが、これに限定されるものではない。例として、パラフィン包埋切片は、正に荷電したスライド及び／又はポリ‐Ｌ‐リジンでコートしたスライドに付着させてもよい。
【０１７３】
包埋材料としてパラフィンを用いた場合、組織切片は通常、脱パラフィン化して、水に再水和させる。組織切片は、いくつかの従来の標準的な方法によって、脱パラフィン化してもよい。例えば、キシレン及び段階的に減少するアルコールを用いてもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。別法として、Ｈｅｍｏ-Ｄｅ７(CMS, Houston, Texas)などの市販の脱パラフィン化非有機薬剤が用いられてもよい。
【０１７４】
特定の実施形態では、試料の調整の後に、組織切片をＩＨＣを用いて分析してもよい。ＩＨＣは、形態学的染色及び／又は蛍光発光インサイツハイブリダイゼーションなどの付加的な技術と組み合わせて行ってもよい。ＩＨＣの直接アッセイ及び間接アッセイの２つの一般的な方法が有用である。第一のアッセイでは、標的抗原(例えばＧａｌＮａｃ−Ｔ１４)に対する抗体の結合は、直接的に測定される。この直接アッセイは、更なる抗体相互作用を必要とせずに可視化されうる酵素標識一次抗体又は蛍光タグ付加一次抗体などの標識された試薬を用いる。代表的な間接アッセイでは、コンジュゲートしていない一次抗体が抗原と結合し、次いで標識された二次抗体が一次抗体と結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートする場合、抗原を視覚化させるために色素生産性基質ないしは蛍光発生基質が加えられる。二次抗体の中には一次抗体上の異なるエピトープと反応するものもあるので、シグナルの増幅が起こる。
一般的に、免疫組織化学に使用する一次及び／又は二次抗体は、検出可能な成分にて標識されるであろう。通常、以下の種類に分類できる多くの標識が利用可能である：
【０１７５】
(ａ)ラジオアイソトープ、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ。抗体は例えばImmunology, Volumes 1 and 2, Coligen 等, 編集 Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を用いて放射性同位体にて標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
(ｂ)コロイド金粒子
(ｃ)希有土類キレート(ユウロピウムキレート)、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコクリセリン(phycocrytherin)、フィコシアニン又はＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ7及びＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ7などの市販の蛍光体及び／又は上記の何れか一ないしは複数の誘導体を含むが、これらに限定されるものではない蛍光標識。蛍光標識は、例えば、上記のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
(ｄ)様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４,２７５,１４９号にはこの概説がある。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる(例えば化学発光計測器を用いて)か、又はエネルギーを蛍光アクセプターに与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４,７３７,４５６号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環のオキシダーゼ(例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivanら., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０１７６】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
(i)基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆体(例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン(ＯＰＤ)又は3,3',5,5'テトラメチルのベンジジン塩酸塩(ＴＭＢ))を酸化する；
(ii)色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ(ＡＰ)；及び
(iii)色素生産性基質(例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)又は蛍光発生基質(例えば、4-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)を有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ(β-Ｄ-Ｇａｌ)。
【０１７７】
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４,２７５,１４９号及び４，３１８，９８０を参照。標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は当分野の技術者に公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな４つの分類のうちの何れかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテンとコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体とコンジュゲートさせる。したがって、抗体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる。
【０１７８】
上記の試料調製手順以外に、ＩＨＣ前、ＩＨＣの間又はＩＨＣ後に組織切片の更なる処置が所望されてもよい。例えば、クエン酸塩バッファ中で組織サンプルを加熱するなどのエピトープ検索方法が実施されてもよい(例として、Leong 等 Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)を参照)。
【０１７９】
場合によって行うブロック処置の後に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原と結合するような好適な条件下と十分な時間、組織切片を一次抗体に曝露させる。これを達成するための好適な条件は慣例的な実験によって決定できる。試料に対する抗体の結合の範囲は、上記の検出可能な標識の何れか一つを用いて決定される。ある実施態様では、標識は、3,3'-ジアミノベンジジンクロモゲンなどの色素生産性基質の化学変化を触媒する酵素標識(例えばＨＲＰＯ)である。ある実施態様では、酵素標識は、一次抗体(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせる。
【０１８０】
したがって、調製される検査材料はマウントしてカバーグラスをかけてもよい。その後、例えば顕微鏡を使用してスライドの評価を行い、当分野で通常用いられる染色強度判定基準を用いてもよい。染色強度判定基準は以下の通りに評価してもよい：
表１
2012501188.tif 000002
【０１８１】
ある実施態様では、１＋又はそれ以上の染色パターンスコアは、兆候及び／又は前兆である。特定の実施態様では、ＩＨＣアッセイの２＋又はそれ以上の染色パターンスコアは、兆候及び／又は前兆である。他の実施態様では腫瘍又は結腸腺腫由来の細胞及び／又は組織はＩＨＣを使用して検査され、染色は、一般に（試料に存在しうる間質又は周辺組織を対照として）腫瘍細胞及び／又は組織で決定又は測定される。
【０１８２】
別法では、試料を、抗体-バイオマーカー複合体が形成するために十分な条件下で該バイオマーカーに特異的な抗体と接触させ、次いで該複合体を検出してもよい。バイオマーカーの存在は、多くの方法、血漿又は血清を含む多種多様な組織及び試料でアッセイするためのウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡ手順によって、検出してもよい。このようなアッセイ様式を用いた広範囲にわたるイムノアッセイ技術は利用可能である。米国特許第４，０１６，０４３号、同第４，４２４，２７９号及び同第４，０１８，６５３号参照。これらには、単一の部位及び２-部位の両方、あるいは非競合型の「サンドイッチ」アッセイ、並びに従来の競合的結合アッセイが含まれる。また、これらのアッセイには、標的バイオマーカーに対する標識抗体の直接結合が含まれる。
【０１８３】
サンドイッチアッセイは最も有用なものの一つで、一般的に用いられるアッセイである。サンドイッチアッセイ技術には多くのバリエーションあり、そのすべては本発明により包含されることを目的とする。簡潔には、代表的な最近のアッセイでは、非標識抗体を固体基板上に固定して、試験する試料を結合した分子に接触させる。抗体-抗原複合体が形成されるくらいの適当な期間インキュベートした後、検出可能なシグナルを産生できるレポーター分子で標識した、抗原特異的な第二抗体を添加して、更なる抗体-抗原-標識抗体の複合体が形成されるために十分な時間インキュベートする。反応しなかった材料を洗い流し、レポーター分子により産生されるシグナルを観察することによって抗原の存在を決定する。結果は、可視的なシグナルを単純に観察したものであれば質的なものであり、バイオマーカーを既知量含有するコントロール試料と比較したものであれば量的なものである。
【０１８４】
前記のアッセイへのバリエーションには、試料及び標識抗体の両方を結合した抗体に同時に添加する同時アッセイなどがある。これらの技術は当分野の技術者には公知であり、多少のバリエーションが加えられることは容易に明らかであろう。代表的な近年のサンドイッチアッセイでは、バイオマーカーに対して特異性を有する第一抗体は固形表面に共有結合するか受動的に結合する。固形表面は一般的にガラス又はポリマーであり、最も一般的に用いられるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固形支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートの皿、又はイムノアッセイを行うために適切な他の任意の表面の形態でもあってもよい。結合方法は従来技術において周知であり、一般に、架橋性共有結合又は物理的な吸着から成り、ポリマー-抗体複合体は試験試料の調整において洗浄される。次いで、試験される試料の分割量を固相複合体に添加し、抗体中に存在する任意のサブユニットが結合するために十分な時間(例えば、より便利であるならば２〜４０分又は前夜)と適切な条件(例えば室温から４０℃、例えば２５℃から３２℃の間)下でインキュベートする。インキュベーションの後、抗体サブユニット固相を洗浄して、乾燥させ、一部のバイオマーカーに特異的な二次抗体とともにインキュベートする。二次抗体は、分子マーカーへの二次抗体の結合を表すために用いられるレポーター分子に結合させる。
【０１８５】
別法では、試料中の標的バイオマーカーを固定して、その後レポーター分子にて標識しているか又は標識していない特異的抗体に固定された標的を曝すことを伴う。標的の量及びレポーター分子シグナルの強度に応じて、結合した標的は、抗体で直接標識することによって、検出可能でありうる。あるいは、一次抗体に特異的な二次標識抗体を標的-一次抗体複合体に曝して、標的-一次抗体-二次抗体の三位複合体を形成させる。複合体は、レポーター分子により発されるシグナルにより検出される。本明細書中で用いられる「レポーター分子」は、その化学的性質によって、抗原と結合した抗体を検出するための分析して同定可能となるシグナルを提供する分子を意味する。この種のアッセイにおいて、最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光体又は分子を含有する放射性核種(すなわち放射性同位体)及び化学発光分子である。
【０１８６】
酵素イムノアッセイの場合、一般にグルタールアルデヒド又は過ヨウ素酸塩によって、酵素を二次抗体にコンジュゲートさせる。しかしながら、容易に認識されるように、技術者に容易に利用可能である多種多様な異なるコンジュゲート技術が存在する。一般的に用いられる酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ−中でもガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼなどがある。特定の酵素と共に用いられる基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解の際に生じる検出可能な色の変化で選択する。適切な酵素の例として、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼなどがある。また、上記の色素生産性基質よりも蛍光性産物を産生する蛍光性基質を用いることができる。すべての例において、酵素標識抗体を一次抗体-分子マーカー複合体に加えて、結合させ、次いで過剰な試薬を洗い流す。次いで、適当な基質を含有する溶液を抗体-抗原-抗体の複合体に加える。基質は二次抗体と結合した酵素と反応して、通常は分光測定法による量的なものでもある定性的な可視化シグナルを生じ、試料中に存在するバイオマーカーの量を表す。あるいは、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光性化合物を、抗体の結合能を変化させることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光を照射することにより活性化されると、蛍光色素標識抗体はその光エネルギーを吸収し、それによリその分子において励起状態が誘発され、続いて光学顕微鏡を用いて目視で検出可能な特徴的な色で光が放射される。ＥＩＡでは、蛍光標識抗体は、一次抗体-分子マーカー複合体に結合できる。結合していない試薬を洗い落とした後に、残りの三位複合体を適当な波長の光に曝すと、対象の分子マーカーの存在を示す蛍光発光が観察される。免疫蛍光法及びＥＩＡ技術は何れも、当分野で非常に確立されたものである。しかしながら、放射性同位体、化学発光性分子又は生物発光性分子などの他のレポーター分子も用いられてもよい。
【０１８７】
また、上記の技術が、１又は複数の標的遺伝子の発現を検出するために用いられうることも包含される。
【０１８８】
本発明の方法は、組織又は細胞試料中の１又は複数の標的遺伝子のｍＲＮＡの存在及び／又は発現を調べる手順を更に含む。細胞中のｍＲＮＡの評価方法は公知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ９、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＣ、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−６及びＬＩＦを含むがこれには限定されない、標識した１又は複数の標的遺伝子のリボプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連した技術)及び様々な核酸増幅アッセイ(例えば、１又は複数の標的遺伝子に特異的な相補的プライマーを用いたＲＴ-ＰＣＲ及び、他の増幅型の検査法、例えば枝分れＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど)が含まれる。
【０１８９】
哺乳動物の組織又は細胞試料は、例えばノーザン、ドットブロット又はＰＣＲ分析を用いて、ｍＲＮＡについて都合よくアッセイすることができる。例えば、定量的ＰＣＲアッセイなどのＲＴ-ＰＣＲアッセイは公知技術である。本発明の例示的実施態様では、生体試料中の標的ｍＲＮＡの検出方法は、少なくとも一のプライマーを用いて逆転写によって、試料からｃＤＮＡを生成し、標的ｃＤＮＡを増幅するために、ｃＤＮＡを増幅して、標的ポリヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて産生し、そして、増幅された標的ｃＤＮＡの存在を検出することを含む。加えて、このような方法は、生体試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを決定し得る一ないし複数の工程(例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較のコントロールｍＲＮＡ配列と該レベルを同時に検討すること)を含んでもよい。場合によって、増幅された標的ｃＤＮＡの配列を決定してもよい。
【０１９０】
本発明の任意の方法には、マイクロアレイ技術によって、組織又は細胞試料中のｍＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡを調べるか又は検出する手順が含まれる。核酸マイクロアレイを用いて、試験及びコントロールの組織試料から得た試験及びコントロールのｍＲＮＡ試料を逆転写させて、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識する。次いで、プローブを、固形支持体に固定した核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイの配列及び各々のメンバーの位置がわかるように、アレイを設定する。例えば、その発現がＶＥＧＦ非依存性腫瘍の検出と相関する遺伝子の選別を、固形支持体上に配列してもよい。特定のアレイメンバーと標識プローブとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。疾患組織の差次的遺伝子発現分析は、貴重な情報を提供する。マイクロアレイ技術は、単一の実験で何千もの遺伝子のｍＲＮＡ発現性質を評価するために、核酸ハイブリダイゼーション技術及び演算技術を利用する。(２００１年１０月１１日公開の国際公開公報０１／７５１６６を参照、(例えば米国特許第５，７００，６３７号、同第５，４４５，９３４号及び同第５，８０７，５２２号、Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)）、アレイ製作の考察のためにはCheung, V.G.等, Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999)を参照)。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス又は他の基質上で染色されるか直接合成される遺伝子断片を含有する微小なアレイである。何千もの遺伝子は、通常単一のアレイ上に現れる。代表的なマイクロアレイ実験は以下の工程を伴う：１）試料から単離したＲＮＡからの蛍光性標識標的の調製、２）マイクロアレイへの標識した標的のハイブリダイゼーション、３）洗浄、染色及びアレイのスキャニング、４）走査画像の分析、そして５）遺伝子発現性質の生成。一般に、ＤＮＡマイクロアレイには２つの主要な種類、ｃＤＮＡから調製されたＰＣＲ産物を含有する遺伝子発現アレイ及びオリゴヌクレオチドアレイ(通常２５〜７０mer)が用いられる。アレイを形成する際に、オリゴヌクレオチドは、事前に作製して表面にスポットしても、(インサイツで)表面上で直接合成してもよい。
【０１９１】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ(登録商標)システムは、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することにより製造されるアレイを含んでなる市販のマイクロアレイシステムである。プローブ／遺伝子アレイ：オリゴヌクレオチド（通常２５マー）は、半導体ベースのフォトリソグラフィーと固相化学合成技術との組合せによって、ガラスウェーハ上へ直接合成される。各々のアレイは最高４００，０００の異なるオリゴを含有し、各々のオリゴは何百万ものコピーで存在する。オリゴヌクレオチドプローブがアレイ上の既知の位置で合成されるので、ハイブリダイゼーションのパターン及びシグナル強度は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアによる遺伝子同一性と相対的な発現レベルに置き換えて解釈できる。各々の遺伝子は、一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって、アレイ上に表される。各々のプローブ対は、完全一致のオリゴヌクレオチドと、不一致のオリゴヌクレオチドからなる。完全一致プローブは、特定の遺伝子に対して完全に相補的な配列を有するため、遺伝子の発現を測定する。不一致プローブは、中心塩基位置での単一塩基置換によって、完全一致プローブとは異なり、標的遺伝子転写物の結合を妨げる。これによって、完全一致オリゴを決定するシグナルの一因となるバックグラウンド及び非特異的ハイブリダイゼーションを決定できる。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアは、完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度から不完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度を減算して、それぞれのプローブセットの絶対値又は特異的強度の値を決定する。プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋ及び他のヌクレオチド貯蔵所の当時の情報に基づいて選択される。この配列は遺伝子の３'末端の特定の領域を認識すると思われている。ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションオーブン(「回転式(rotisserie)」オーブン)を用いて、一度に最高６４アレイのハイブリダイゼーションを行う。ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎでは、プローブアレイの洗浄と染色が行われる。これは完全に自動化しており、４つのモジュールを含有しており、その各々のモジュールが一つのプローブアレイを保持している。各々のモジュールは、事前にプログラム化されたfluidicsプロトコルを用いたＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアにより個々に制御される。スキャナは、プローブアレイ結合した標識ｃＲＮＡにより発される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光発光スキャナである。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアを有するコンピュータワークステーションがｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎとスキャナを制御する。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアは、プローブアレイについて事前にプログラム化したハイブリダイゼーション、洗浄及び染色プロトコルを用いてｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎを８つまで制御できる。また、ソフトウェアは、ハイブリダイゼーション強度データを得て、適切なアルゴリズムを使用して各々の遺伝子の存在／非存在情報に変換する。最後に、ソフトウェアは、比較分析によって、遺伝子発現における実験間の変化を検出して、テキストファイルに出力する。このファイルは更なるデータ分析のために他のソフトウェアプログラムに用いることができる。
【０１９２】
また、組織又は細胞試料中の選択された遺伝子又はバイオマーカーの発現は、機能的なアッセイ又は活性に基づくアッセイにより検査されてもよい。例えば、バイオマーカーが酵素ならば、組織又は細胞試料中の所定の酵素活性の存在を決定又は検出するために公知技術のアッセイを行ってもよい。
【０１９３】
治療上の使用
本発明に従って、調節物質、例えば、ＵＲＶＩＰのアンタゴニストおよび／またはＵＲＶＩＮＡがコードするタンパク質のアンタゴニスト（集合的に「本発明のアンタゴニスト」）を、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍の癌細胞または腫瘍の成長を阻害する場合に使用することを企図する。本発明の特定の実施形態では、調節物質、例えば、ＤＲＶＩＰのアゴニストおよび／またはＤＲＶＩＮＡがコードするタンパク質のアゴニスト（集合的に「本発明のアゴニスト」）を使用して、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍の癌細胞または腫瘍の成長を阻害する。また、本発明に従って、本発明のアンタゴニストを使用して、腫瘍の転移を阻害することができることも企図する。特定の実施形態では、１つまたは複数の調節物質を使用して、種々の新生物または非新生物の状態を治療することができる。特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストを、本発明のアンタゴニストおよび／または本発明のアゴニストと共に投与して、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍の癌細胞または腫瘍の成長を阻害することができる。また、本明細書の併用療法と題するセクションも参照されたい。別の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせた１つまたは複数の抗癌剤を、本発明のアンタゴニストおよび／または本発明のアゴニストと共に投与して、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍の癌細胞または腫瘍の成長を阻害することができる。
【０１９４】
特定の実施形態では、本発明のアンタゴニストは、ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストである。特定の実施形態では、本発明の方法において有用なｃ−Ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するポリペプチド、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ｃ−Ｍｅｔの小型分子、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する受容体分子および誘導体、ならびに融合タンパク質を含む。また、ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−Ｍｅｔポリペプチドのアンタゴニスト作用を有する変異体、ｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦに対するＲＮＡアプタマーおよびペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）も含む。また、本発明の方法において有用なｃ−Ｍｅｔアンタゴニストとして、抗ＨＧＦ抗体、抗ＨＧＦポリペプチド、ＨＧＦに特異的に結合するｃ−Ｍｅｔの受容体分子および誘導体も含む。これらのそれぞれの例を、以下に記載する。
【０１９５】
本発明の方法において有用である抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔに十分な親和性および特異性で結合し、ｃ−Ｍｅｔの活性を低下させるまたは阻害することができる任意の抗体を含む。選択された抗体は通常、ｃ−Ｍｅｔに対して十分に強力な結合親和性を有する。例えば、抗体は、ヒトｃ−Ｍｅｔに、１００ｎＭ〜１ｐＭの間のＫｄ値で結合することができる。例えば、表面プラズモン共鳴に基づいたアッセイ（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５／０１２３５９号に記載されているＢＩＡｃｏｒｅアッセイ等）；酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ）によって、抗体の親和性を決定することができる。一実施形態では、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍の治療を含めて、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ活性が関与する疾患または状態を標的とし、それを妨げる場合の治療剤として使用することができる。また、抗体に対して、その他の生物学的活性アッセイ、例えば、治療剤としてのその有効性を評価するためのアッセイを行うこともできる。そのようなアッセイが、当技術分野では知られており、それらのアッセイは、抗体の標的抗原および意図する用途によって異なる。
【０１９６】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が、当技術分野で知られている（例えば、Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｔら（２００６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２（２０  Ｐｔ  １）：６１４４；ＵＳ６，４６８，５２９；ＷＯ２００６／０１５３７１；ＷＯ２００７／０６３８１６を参照されたい）。
【０１９７】
他の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ−１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３．３．１３）またはＨＢ−１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５．１１．６）の下に寄託されているハイブリドーマ細胞系が産生するモノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ−１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３．３．１３）またはＨＢ−１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５．１１．６）の下に寄託されているハイブリドーマ細胞系が産生するモノクローナル抗体のＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数を含む。
【０１９８】
他の実施形態では、本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔ  Ｓｅｍａドメインまたはその変異体の少なくとも一部に特異的に結合する。一実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＬＤＡＱＴ（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、配列番号２４の残基２６９〜２７３）、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、配列番号２４の残基３００〜３０８）、ＫＰＤＳＡＥＰＭ（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、配列番号２４の残基３５０〜３５７）、およびＮＶＲＣＬＱＨＦ（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、配列番号２４の残基３８１〜３８８）からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つの一部または全部によって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する。一実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、配列ＬＤＡＱＴ、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ、ＫＰＤＳＡＥＰＭおよび／またはＮＶＲＣＬＱＨＦに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性または配列類似性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。
【０１９９】
抗ＨＧＦ抗体が、当技術分野ではよく知られている。例えば、Ｋｉｍ  ＫＪら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００６）１２（４）：１２９２〜８；ＷＯ２００７／１１５０４９を参照されたい。
【０２００】
Ｃ−Ｍｅｔ受容体分子またはＨＧＦに特異的に結合するその断片を、本発明の方法において使用して、例えば、ＨＧＦタンパク質に結合させ、それを捕捉し、それによって、ＨＧＦがシグナル伝達するのを阻止することができる。特定の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ受容体分子またはそのＨＧＦ結合断片は、可溶性の形態をとる。いくつかの実施形態では、受容体の可溶性の形態は、ＨＧＦに結合し、それによって、ＨＧＦが標的細胞の表面上に存在するその自然の受容体に結合するのを阻止することによって、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の生物学的活性に対して阻害作用を発揮する。また、ｃ−Ｍｅｔ受容体融合タンパク質も含まれ、それらの例を以下に記載する。
【０２０１】
本発明の可溶性のｃ−Ｍｅｔ受容体タンパク質またはキメラｃ−Ｍｅｔ受容体タンパク質は、細胞表面に膜貫通ドメインを介して固定されていないｃ−Ｍｅｔ受容体タンパク質を含む。したがって、キメラ受容体タンパク質を含めた、ｃ−Ｍｅｔ受容体の可溶性の形態は、ＨＧＦに結合し、それを不活性化することができる一方で、膜貫通ドメインを含まず、したがって、一般に、ｃ−Ｍｅｔ分子を発現する細胞の細胞膜と関わりになることがない。例えば、Ｋｏｎｇ−Ｂｅｌｔｒａｎ、Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  （２００４）６（１）：７５〜８４を参照されたい。
【０２０２】
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、ｃ−Ｍｅｔの活性化を遮断するかまたは低下させ、それによって、ｃ−Ｍｅｔがシグナル伝達するのを阻止するＨＧＦ分子またはその断片を、本発明の方法において使用することができる。
【０２０３】
アプタマーは、ＨＧＦポリペプチド等の標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する核酸分子である。アプタマーの生成および治療上の使用は、当技術分野では十分に確立されている。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。ＨＧＦアプタマーは、ペグ化された改変オリゴヌクレオチドであり、これは、このオリゴヌクレオチドが細胞外ＨＧＦに結合するのを可能にする三次元立体構造をとる。アプタマーに関する追加の情報を、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見出すことができる。
【０２０４】
ペプチボディは、免疫グロブリン分子の断片または一部をコードするアミノ酸配列に連結するペプチド配列である。これに限定されないが、ファージディスプレイ技術を含めた、特異的な結合について、任意の方法によって選択されたランダムな配列から、ポリペプチドを得ることができる。特定の実施形態では、選択されたポリペプチドを、免疫グロブリンのＦｃ部分をコードするアミノ酸配列に連結することができる。また、ＨＧＦまたはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合および拮抗するペプチボディも、本発明の方法において有用である。
【０２０５】
Ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストは、小型分子、例として、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤として記載され、（ＵＳ５，７９２，７８３；ＵＳ５，８３４，５０４；ＵＳ５，８８０，１４１；ＵＳ６，２９７，２３８；ＵＳ６，５９９，９０２；ＵＳ６，７９０，８５２；ＵＳ２００３／０１２５３７０；ＵＳ２００４／０２４２６０３；ＵＳ２００４／０１９８７５０；ＵＳ２００４／０１１０７５８；ＵＳ２００５／０００９８４５；ＵＳ２００５／０００９８４０；ＵＳ２００５／０２４５５４７；ＵＳ２００５／０１４８５７４；ＵＳ２００５／０１０１６５０；ＵＳ２００５／００７５３４０；ＵＳ２００６／０００９４５３；ＵＳ２００６／０００９４９３；ＷＯ９８／００７６９５；ＷＯ２００３／０００６６０；ＷＯ２００３／０８７０２６；ＷＯ２００３／０９７６４１；ＷＯ２００４／０７６４１２；ＷＯ２００５／００４８０８；ＷＯ２００５／１２１１２５；ＷＯ２００５／０３０１４０；ＷＯ２００５／０７０８９１；ＷＯ２００５／０８０３９３；ＷＯ２００６／０１４３２５；ＷＯ２００６／０２１８８６；ＷＯ２００６／０２１８８１、ＷＯ２００７／１０３３０８に）報告されている化合物を含む。ＰＨＡ−６６５７５２は、小型分子であり、ＡＴＰと競合する、ｃ−Ｍｅｔの触媒活性の活性部位阻害剤であり、細胞の成長、細胞の運動性、浸潤等の表現型、および多様な腫瘍細胞の形態を阻害する（Ｍａら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：２３１２〜２３１９；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７３４５〜７３５５）。
【０２０６】
併用療法
上記のように、本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストが他の療法と組み合わされて投与される併用療法を提供する。例えば、ある実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に耐性がある腫瘍のようなＶＥＧＦ非依存性腫瘍を治療するために本発明のアンタゴニスト又は異なる薬剤(及び／又は本発明のアゴニスト)と組み合わされて投与される。ある実施態様では、付加的な薬剤、例えば抗癌剤ないし療法、抗血管新生剤、又は抗血管形成剤が、様々な腫瘍性又は非腫瘍性の症状を治療するために、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び異なるアンタゴニストと組み合わされて投与されうる。一実施態様では、腫瘍性又は非腫瘍性の症状は、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に耐性がある異常ないしは望ましくない血管形成に関連する病的状態に特徴がある。本発明のアンタゴニストは、同じ組成物中で又は別々の組成物として、これらの目的のために有効である他の薬剤と組み合わせて、又は連続的に、同じないしは異なる投与経路を使用して、投与されうる。あるいは又はさらに、本発明の複数のアンタゴニスト、薬剤及び／又はアゴニストが投与されうる。
【０２０７】
ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストがまず投与され、その後本発明の異なるアンタゴニストないしは薬剤が投与されてもよい。しかしながら、同時投与又は本発明の異なるアンタゴニストないしは薬剤の第一投与も考慮される。
【０２０８】
ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与される治療薬の有効量は医師又は獣医の裁量である。治療される症状を最大限管理するために用量投与及び調整がなされる。用量は、さらに、使用される治療薬の種類及び治療される特定の患者などの因子に依存するであろう。ＶＥＧＦアンタゴニストの好適な用量は現在用いられているものであり、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び本発明の異なるアンタゴニストの組合せ作用(相乗作用)のために低くてもよい。ある実施態様では、阻害薬の組合せは単一の阻害薬の有効性を増強する。「増強」なる用語は、その一般的又は認可された用量での治療薬の有効性の改善を指す。本明細書中の「製薬的組成物」と題した項目も参照されたい。
【０２０９】
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。ある実施態様において、血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。本発明の一実施態様では、抗癌剤又は膠癌療法は抗血管新生剤である。他の実施態様では、抗癌剤は化学療法剤である。
【０２１０】
多くの抗血管新生剤が同定されており、当分野で公知であり、本明細書中に挙げるもの、例えば定義の項目に挙げるもの、例えばCarmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)；Ferrara等, Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)に挙げるものなどがある。また、米国特許公開第２００３００５５００６号を参照。ある実施態様では、本発明のアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ中和抗体(又は断片)及び／又は他のＶＥＧＦアンタゴニストないしはＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例として、限定するものではないが、例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプター(例えば、ＶＥＧＦＲ-１、ＶＥＧＦＲ-２、ＶＥＧＦＲ-３、ニューロピリン(例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２))断片、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の低分子量インヒビター、ＶＥＧＦのアンチセンス方略、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、及びこれらのいずれかの組み合わせと組み合わせて用いられる。あるいは又はさらに、２つ以上の血管新生インヒビターは、場合によってＶＥＧＦアンタゴニストと本発明の他の薬剤に加えて患者に同時に投与されてもよい。ある実施態様では、一又は複数の更なる治療薬、例えば抗癌剤は、本発明の薬剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は抗血管新生剤と組み合わせて投与されてもよい。
【０２１１】
本発明のある態様では、本発明のアンタゴニストによる併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法(例えば、外科的治療、放射線処置(例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う)、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ)が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は２以上の異なる抗原を結合する２以上の抗体が患者に同時に投与されてもよい。また、患者に一又は複数のサイトカインを投与することが有益であることもある。
【０２１２】
化学療法剤
ある態様では、本発明は、有効量のＶＥＧＦのアンタゴニスト及び本発明のアンタゴニストと一又は複数の化学療法剤を、癌に罹りやすい患者又は癌と診断された患者に投与することによって、ＶＥＧＦ非依存性腫瘍増殖又は癌細胞の増殖を遮断する又は低減する方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の「定義」の項目に示す。
【０２１３】
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個々の被検体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。
【０２１４】
再発性腫瘍増殖 
また、本発明は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を阻害するか又は予防するための方法及び組成物を提供する。再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖は、一又は複数の現在利用可能な治療法(例えば、癌治療、例として化学療法、放射線療法、外科治療、ホルモン療法及び／又は生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌のための標準的な治療投薬計画)を施されている患者ないしはこれらによって治療された患者が臨床的に治療に不十分であるか、又は患者がこのような治療からもはやいかなる有用な効果を得ておらず更なる有効な治療を求める場合の症状を表すために用いられる。本明細書中で用いるように、この表現も「非応答性／再発性の」患者の症状を指すものであり、例えば、副作用に苦しむ治療に応答する患者、耐性を生じる患者、治療に応答しない患者、治療に満足に応答しない患者などを表す。様々な実施態様では、癌は、癌細胞の数が有意に低減しなかった、又は増加した、又は腫瘍の大きさが有意に減少しなかった、又は大きくなった、又は癌細胞のサイズないしは数に何らかの減少が生じなかった、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖である。癌細胞が再発性腫瘍増殖であるか再発性癌細胞増殖であるかの決定は、文脈上で「再発」又は「難治性」又は「非応答性」の当分野で容認される意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で公知の任意の方法によってインビトロないしはインビボでなされうる。抗ＶＥＧＦ治療に耐性のあるＶＥＧＦ非依存性腫瘍は再発性腫瘍増殖の一例である。
【０２１５】
本発明は、一又は複数の本発明のアンタゴニストを投与して、被検体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減することによって、被検体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減する方法を提供する。ある実施態様では、アンタゴニストは癌治療剤に続いて投与されてもよい。ある実施態様では、本発明のアンタゴニストは癌療法、例えば化学療法と同時に投与される。あるいは又はさらに、アンタゴニスト療法は他の癌療法と交互に行い、いずれの順序でも実施可能である。また、本発明は、癌を有する傾向にある患者の癌の発症や再発を予防するために一又は複数の阻害性抗体を投与するための方法も包含する。通常、被検体は、癌療法を施されたか同時に施されている。一実施態様では、癌療法は、抗血管新生剤、例えばＶＥＧＦアンタゴニストによる治療である。抗血管新生剤は当分野で公知のものや本明細書中の定義の項目に見られるものなどがある。一実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＶＥＧＦ中和抗体ないしは断片(例えば、ヒト化Ａ４.６.１、アバスチン(登録商標)(Genentech, South San Francisco, CA)、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３など)である。例として、米国特許第６５８２９５９号、同第６８８４８７９号、同第６７０３０２０号、国際公開第９８／４５３３２号、同第９６／３００４６号、同第９４／１０２０２号、欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１、米国公開特許第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)、及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照。更なる薬剤は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減するために、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び本発明のアンタゴニスト／アゴニストと組み合わせて投与することができる。例として本明細書中の「併用療法」と題する項目を参照のこと。
【０２１６】
一実施態様では、本発明のアンタゴニスト、又はＵＲＶＩＰ又はＵＲＶＩＮＡにコードされるタンパク質の発現を減らす他の療法が投与され、ある生物学的(例えば、抗ＶＥＧＦ抗体であるアンタゴニスト)、ホルモン、放射線及び化学療法剤に対する癌細胞の耐性又は感受性の低下を逆転させ、それによって癌細胞を、癌を治療ないしは管理する、例えば転移を予防するために投与されうる一又は複数のこれら薬剤に再感作させる。
【０２１７】
抗体
特定の実施態様において、本発明の抗体には、本発明のタンパク質の抗体、及び本発明のタンパク質の抗体の抗体断片が含まれる。本発明のポリペプチド又はタンパク質には、限定するものではないが、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９及びＵＲＶＩＮＡ及びＤＲＶＩＮＡにコードされるタンパク質が含まれる。ある実施態様において、本発明のタンパク質はＶＥＧＦ非依存性腫瘍に由来し、例えばＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＨＧＦ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＩＬ−６及びＬＩＦを含む。
【０２１８】
ある態様では、本発明のポリペプチドないしタンパク質は、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＨＧＦ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＩＬ−６、ＬＩＦ又はｃ−Ｍｅｔを含む。ある実施態様において、本発明の抗体はＵＲＶＩＰ及びＤＲＶＩＰの抗体、及びＵＲＶＩＮＡ又はＤＲＶＩＮＡにコードされるタンパク質の抗体を含む。
【０２１９】
さらに、本発明の抗体には、抗血管形成剤又は血管形成インヒビターである抗体、抗癌剤である抗体又は本明細書中に記載の他の抗体が含まれる。例示的な抗体には、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、断片、多特異性、ヘテロコンジュゲート、多価性、エフェクト機能などの抗体が含まれる。
【０２２０】
ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に公知である。例えば本発明の抗体に対するポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを一又は複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
【０２２１】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、本発明の分子、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。典型的には、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０２２２】
モノクローナル抗体
本明細書中に記載の抗原に対するモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
【０２２３】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０２２４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を典型的には含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０２２５】
典型的な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０２２６】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、例えばＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦＣ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ｃ−Ｍｅｔ、ＵＲＶＩＰ又はＤＲＶＩＰ、又は血管新生分子に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。このような技術及びアッセイは当分野で公知である。
【０２２７】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
【０２２８】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。また、モノクローナル抗体は、米国特許第４８１６５６７号に記載のもののような組み換えＤＮＡ法によって作製されうる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
【０２２９】
他の実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【０２３０】
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
【０２３１】
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０２３２】
ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗体はヒト化抗体又はヒト抗体を含みうる。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０２３３】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０２３４】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、典型的な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０２３５】
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。
【０２３６】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当分野で公知の様々な技術を用いて産生することができる(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に基本的に従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。また、Cole等及びBoerner等の技術はヒトモノクローナル抗体の調製に有用である(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991))。また、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【０２３７】
抗体断片
また、抗体断片も本発明に包含される。抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【０２３８】
多重特異性抗体(例えば二重特異性)
また、本発明の抗体には、例えば、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する多重特異性抗体が含まれる。このような分子は通常２つの抗原を結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、腫瘍細胞抗原に対する一アームと細胞障害トリガー分子に対するもう一つのアームを有するもの、例えば抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞(１Ｄ１０)、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎臓細胞カルチノーマ、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ-３、抗ＣＤ３／Ｌ-Ｄ１(抗大腸カルチノーマ)、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、、抗神経細胞付着分子(ＮＣＡＭ)／抗ＣＤ３、抗葉酸剤結合タンパク質(ＦＢＰ)／抗ＣＤ３、抗パンカルチノーマ結合抗原(ＡＭＯＣ-３１)／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する一アームと毒素に結合する一アームを有するＢｓＡｂ、例として抗サポリン／抗Ｉｄ-１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン-α(ＩＦＮ-α)／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド；酵素活性化プロドラッグを転換するためのＢｓＡｂ、例として抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ(マイトマイシンアルコールへのマイトマイシンリン酸塩プロドラッグの変換を触媒する)；線維素溶解剤として用いられうるＢｓＡｂ、例として抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)、抗フィブリン／抗ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性化因子(ｕＰＡ)；細胞表面レセプターに免疫複合体をターゲティングするためのＢｓＡｂ、例として抗低密度リポプロテイン(ＬＤＬ)／抗Ｆｃレセプター(例えばＦｃγＲI、ＦｃγＲII又はＦｃγＲIII)；感染症の治療に用いるためのＢｓＡｂ、例として、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ；インビトロ又はインビボで腫瘍を検出するためのＢｓＡｂ、例えば抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン；ワクチンのアジュバントとしてのＢｓＡｂ；そして、診断用ツールとしてのＢｓＡｂ、例として抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β-ガラクトシダーゼが含まれる。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製されてもよい。
【０２３９】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０２４０】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２４１】
この手法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０２４２】
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０２４３】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０２４４】
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０２４５】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０２４６】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０２４７】
ヘテロコンジュゲート抗体
二重特異性抗体には、本発明の抗体である架橋された又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体のうちの１つは、アビジンに結合し、他方はビオチンに結合しうる。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングすること(米国特許第4676980号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開第91/00360号、国際公開第92/200373号及び欧州特許第03089号)が考えられている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋結合方法を用いて作られてもよい。好適な架橋剤は当分野で公知であり、多くの架橋技術とともに、米国特許第4676980号に開示されている。
【０２４８】
多価抗体
本発明の抗体には多価抗体が含まれる。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【０２４９】
エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌を治療する際の抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０２５０】
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)とコンジュゲートしている本明細書中に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。例には、限定するものではないがＢｉ２１２、Ｉ１３１、Ｉｎ１３１、Ｙ９０、及びＲｅ１８６が含まれる。
【０２５１】
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学療法薬は上記した。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)など(本明細書中の「化学療法薬」の定義も参照のこと)が本発明の抗体ないしその断片にコンジュゲートされうる。
【０２５２】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体ないしその断片を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、限定するものではないがＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、Ｉｎ１１１及びＬｕの放射性同位体などが含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
【０２５３】
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、例として「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０２５４】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０２５５】
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【０２５６】
別法として、抗ＶＥＧＦ及び／又は本発明の抗体の抗たんぱく質と細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
【０２５７】
ある実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０２５８】
メイタンシン及びメイタンシノイド
本発明は、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートしている本発明の抗体を提供する。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
【０２５９】
本発明の抗体は、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子にコンジュゲートすることができる。１分子の毒素／抗体は、ネイキッド抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。一実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０２６０】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０２６１】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。典型的なカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するためのＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
【０２６２】
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０２６３】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした本発明の抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０２６４】
他の抗体修飾
本明細書において抗体の他の修飾が意図される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性ポリマーの一つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーに連結されうる。また、抗体は、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合法(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタキレート)マイクロカプセル)によって調製されるマイクロカプセルに、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)に、又はマイクロエマルジョンに内包されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示される。
【０２６５】
リポソーム及びナノ粒子
本発明のポリペプチドはリポソームとして処方することができる。例えば本発明の抗体はイムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。一般的に、製剤とリポソームの使用は当業者に公知である。
【０２６６】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤(ドキソルビジンなど)はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０２６７】
他の用途
本発明の抗体は様々な有用性を有している。例えば、本発明の抗体は、癌の検出(例えば耐性腫瘍を検出する際)のために特定の細胞、組織又は血清におけるタンパク質の発現を検出するための診断用アッセイなどに用いられうる。一実施態様では、抗体は、本明細書中に記載の方法による治療のための患者集団を選別するため、例えばＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ及びＤＲＲＴＰの発現が変更している患者を検出するために用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.(1987)pp.147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunter等, Nature144:945(1962)；David等, Biochemistry,13:1014(1974)；Pain等, J.Immunol.Meth.,40:219(1981)；及びNygren,J.Histochem.andCytochem.,30:407(1982)に記載された方法が含まれる。
【０２６８】
また、本発明の抗体は、組換え細胞培地又は天然の供給源からの本発明のタンパク質ないしタンパク質の断片の親和性精製に利用できる。この方法において、たんぱく質に対する抗体を、当分野でよく知られた方法を用いてSephadex樹脂又は濾紙等の適した支持体に固定化する。次いで、固定化した抗体をタンパク質を含む試料と接触させて精製し、その後、固定化した抗体と結合したタンパク質以外の試料中の実質的には全ての物質を取り除きうる適した溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、支持体を抗体からタンパク質を引き離しうる他の適した溶媒で洗浄する。
【０２６９】
本発明のポリペプチドに対する共有的修飾
本発明のポリペプチド、例えば本発明のタンパク質、本発明のタンパク質の抗体、ポリペプチドアンタゴニスト断片、融合分子(例えば免疫融合分子)などの共有結合による修飾は本発明の範囲内に包含される。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又はポリペプチドの化学的切断によりなされうる。他の種類のポリペプチドの共有的修飾は、選択される側鎖又はＮ末端ないしはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤とポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を反応させることによって、又は、修飾アミノ酸ないしは非天然のアミノ酸を発達するポリペプチド鎖に組み込むことによって、分子内に導入される。例えばEllman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)；Noren等 Science 244:182 (1989)；及び、米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号。
【０２７０】
最も一般的には、システイニル残基は、α-ハロアセタート(及び対応するアミン)、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイン残基もまたブロモトリフルオロアセトン；α-ブロモ-β-(５-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート；Ｎ-アルキルマレイミド類；３-ニトロ-２-ピリジルジスルフィド；メチル-２-ピリジルジスルフィド；ｐ-クロロ水銀安息香酸；２-クロロ水銀-４-ニトロフェノール；又はクロロ-７-ニトロベンゾ-２-オキサ-１,３-ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【０２７１】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応によって誘導体化されるが、この薬剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的である。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、典型的にはｐＨ６．０で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【０２７２】
リジニル及びアミノ末端残基はコハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α-アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な試薬には、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサル、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ-メチルイソ尿素、２,４-ペンタンジオン、及びグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応である。
【０２７３】
アルギニル残基は一あるいは幾つかの従来の試薬との反応によって修飾され、とりわけ、フェニルグリオキサール、２,３-ブタンジオン、１,２-シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンがある。アルジニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために反応がアルカリ性条件下で行われることを必要とする。更に、これらの試薬はリジンの基並びにアルギニンε-アミノ基と反応しうる。
【０２７４】
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基内へのスペクトル標識の導入に特に興味をもって、なされる。最も一般的には、Ｎ-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを使用して、それぞれがＯ-アセチルチロシル種と３-ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基はラジオイムノアッセイでの使用のための標識化タンパク質を調製するために１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてヨウ素化される。
【０２７５】
カルボキシル側基(アスパルチル又はグルタミル)がカルボジイミド(Ｒ-Ｎ=Ｃ=Ｎ-Ｒ')(ここで、ＲとＲ'は異なったアルキル基である)、例えば、１-シクロヘキシル-３-(２-モルホリニル-４-エチル)カルボジイミド又は１-エチル-３-(４-アゾニア-４,４-ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基へ変換される。
【０２７６】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へしばしば脱アミド化される。これらの残基は中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に入る。
【０２７７】
その他の修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86頁 (1983))、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０２７８】
他のタイプの共有的修飾は本発明のポリペプチドに対してグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングさせることを含む。これらの手順は、それらがＮ-又はＯ-結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中でのポリペプチドの生産を必要としない点で有利である。用いられるカップリング態様に応じて、糖(類)は、(a)アルギニンとヒスチジンに、(b)遊離のカルボキシル基に、(c)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(d)セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、(e)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は(f)グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号並びにAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306頁 (1981)に記載されている。
【０２７９】
本発明のポリペプチドに存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的になすことができる。化学的脱グリコシル化には、ポリペプチドを化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価化合物に暴露することを必要とする。この処理により、ポリペプチドをインタクトなままにしながら、結合糖(Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン)を除く殆どの又は全ての糖の切断が生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。例えば抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成できる。
【０２８０】
本発明のポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【０２８１】
ベクター、宿主細胞及び組換え法
ポリペプチドは容易に得られる材料と技術を使用して組換え的に製造することができる。
【０２８２】
ポリペプチド、例えばタンパク質の抗体、例えば抗ＩＬ−１β又は抗ＰｌＧＦ、の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離して配列決定される。例えば、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離し、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に、限定するものではないが、シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終末配列の一又は複数が含まれる。
【０２８３】
シグナル配列成分
本発明のポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、典型的にはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても産生される。典型的に選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然ポリペプチドシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
【０２８４】
このような前駆体領域のＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【０２８５】
複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
【０２８６】
選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含みうる。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシラス菌に対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【０２８７】
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換されるこれらの細胞は、抗薬物性を付与し、選択療法を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。
【０２８８】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、典型的には、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
【０２８９】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。
【０２９０】
あるいは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
【０２９１】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85：12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における成長による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【０２９２】
また、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8：135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9：968-975 (1991)。
【０２９３】
プロモーター成分
通常、発現及びクローニングベクターは、宿主生体により認識され、本発明のポリペプチドをコードする核酸に作用可能に結合するプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモーターもまた本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
【０２９４】
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴ富化領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【０２９５】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０２９６】
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される更なる利点を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に用いられる好適なベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【０２９７】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの本発明のポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び典型的にはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによって、提供されるこのようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【０２９８】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄIIIＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変更例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０２９９】
エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297：17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、典型的にはプロモーターから５'位に位置している。
【０３００】
転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示した発現ベクターを参照されたい。
【０３０１】
宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターに本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びＢ．リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。典型的には大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０３０２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、本発明のポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能で、ここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ．ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ．ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(欧州特許第４０２２２６号)；ピチア・パストリス(欧州特許第１８３０７０号)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(欧州特許第２４４２３４号)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属(Aspergillus)宿主、例えば偽巣性コウジ菌(A. nidulans)及びクロカビ(A. niger)が使用できる。
【０３０３】
本発明のグリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、このようなウイルスは本発明においてここに記載したウイルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションに使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することもできる。
【０３０４】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36：59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77：4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23：243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍(ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mother等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383：44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
【０３０５】
宿主細胞は、本発明のポリペプチド生産のための上述した発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
【０３０６】
宿主細胞の培養
本発明のポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地、例えばハム(Ham)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ), Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)、及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ), Sigma)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58：44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102：255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０；国際公開第８７／００１９５；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０３０７】
ポリペプチド精製
本発明のポリペプチドないしタンパク質は被検体から採取されうる。組換え技術を用いる場合、本発明のポリペプチドは、細胞内に、細胞膜周辺腔に、又は培地に直接分泌されうる。本発明のポリペプチドは、培養培地又は宿主細胞溶解物から回収されてもよい。膜結合である場合、適切な清浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いるか、又は酵素の切断によって膜から放出されうる。本発明のポリペプチドの発現に用いられる細胞は、様々な物理的又は化学的な手段、例として、凍結-解凍循環、超音波処理、物理的な破壊又は細胞溶解剤によって破壊されうる。
【０３０８】
適切なタンパク質精製手順の例は以下の手順である：イオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；二酸化ケイ素によるクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭによるクロマトグラフィ、陰イオン又陽イオン交換樹脂(例えばポリアスパラギン酸カラム、ＤＥＡＥなど)によるクロマトグラフィ；等電点電気泳動；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、セファデックスＧ-７５を用いたゲル濾過；ＩｇＧなどの混入物を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；及び、本発明のポリペプチドのエピトープタグ付加形態を結合するための金属キレートカラム。タンパク質精製に様々な方法が用いられてもよく、このような方法は当分野で公知であり、例えばDeutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)の実施例に記述される。選択される精製工程(一又は複数)は、例えば、使用する生産プロセス及び生産される本発明の特定のポリペプチドの性質に依存するであろう。
【０３０９】
例えば、細胞から調製されるＶＥＧＦ組成物は、例えば、ヒドロキシラパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティクロマトグラフィ、及び典型的な親和性技術であるアフィニティクロマトグラフィを用いて精製されうる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば上記のものも回収する抗体に依存して利用可能である。また、大腸菌の周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載しているCarter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992)も参照のこと。
【０３１０】
薬剤的組成物
本発明の薬剤の製薬的製剤(例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＵＲＶＩＰアンタゴニスト等)とその組み合わせ及び本発明に関して用いられる本明細書中に記載のものは、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.[1980])、凍結乾燥又は水溶液の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０３１１】
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.[1980]に開示されている。
【０３１２】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０３１３】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明のポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に曝露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。例として、高分子電解質被覆によるカプセルを記載している米国特許第６６９９５０１号も参照のこと。
【０３１４】
さらに、本発明の薬剤(例えばＶＥＧＦアンタゴニスト、ＵＲＶＩＰアンタゴニスト、化学療法剤又は抗癌剤)が遺伝子治療によって被検体に導入されうることを考慮する。遺伝子治療は、被検体への核酸の投与によって行われる治療を指す。遺伝子治療適用において、例えば欠損した遺伝子の置換のために、遺伝子を細胞に導入して、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」には、永続的な効果が単一の治療によって達成される従来の遺伝子治療と遺伝子治療薬の投与の両方が含まれ、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回の投与又は繰り返し投与を伴う。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡはインビボのある遺伝子の発現を遮断するための治療剤として用いられる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による取り込みに制限されて細胞内濃度が低くなるが、インヒビターとして働く細胞内に移入することができることが既に報告されている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986))。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電するホスホジエステル基を非荷電基に置換することによって修飾して、それらの取り込みを上げることができる。遺伝子治療の方法の一般的な概念については、例として、Goldspiel等 Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)；Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan Science 260:926-932 (1993)；Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；及び、May TIBTECH 11:155-215 (1993)を参照。用いられうる組換えＤＮＡ技術の当分野で公知の共通の方法は、Ausubel等 eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記述される。
【０３１５】
核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。技術は、核酸がインビトロ又はインビボで意図した宿主の細胞の培養細胞にトランスファーされるかどうかによって異なる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸のトランスファーに好適な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などが含まれる。一般に好適なインビボ遺伝子導入技術には、ウイルス(一般的にレトロウイルス)ベクターによる形質移入及び、ウイルスコートタンパク質-リポソーム媒介性形質移入が含まれる(Dzau等, Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993))。例えば、インビボ核酸導入技術には、ウイルスベクター(例えばアデノウイルス、単純ヘルペスIウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス又は、アデノ関連ウイルス)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質媒介トランスファーに有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)が含まれる。遺伝子治療にウイルスベクターを使用する例は、Clowes等 J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)；Kiem等 Blood 83:1467-1473 (1994)；Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)；Grossman and Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)；Bout等 Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994)；Rosenfeld等 Science 252:431-434 (1991)；Rosenfeld等 Cell 68:143-155 (1992)；Mastrangeli等 J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)；及び、Walsh等 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993)に見られる。
【０３１６】
ある場合では、標的細胞を標的とする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなどを核酸供給源に供給することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質は、例えばある種類の細胞に向性があるキャプシドタンパク質又はその断片、細胞周期への内部移行を行うタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を亢進するタンパク質のターゲティングのため及び／又はこれらの取り込みを容易にするために用いられうる。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)；及び、Wagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)に記載される。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコール野概要については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０３１７】
用量及び投与
本発明の薬剤(ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＵＲＶＩＰアンタゴニスト、化学療法剤又は抗癌剤)は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路、及び／又は皮下投与などにより投与される。
【０３１８】
ある実施態様では、本発明の治療はＶＥＧＦアンタゴニストとＵＲＶＩＰアンタゴニストのような一又は複数の薬剤及び／又は化学療法剤との併用投与を伴う。一実施態様では、付加的な抗癌剤、例えば、一又は複数の異なる抗血管新生剤、一又は複数の化学療法剤などが存在する。また、本発明は、複数のインヒビター、例えば同じ抗原に対する複数の抗体又は本発明の異なるタンパク質に対する複数の抗体の投与を考慮する。一実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は一又は複数のＵＲＶＩＰアンタゴニストと投与される。別の実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は一又は複数のＵＲＶＩＮＡによってコードされるタンパク質の抗体と投与される。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬的製剤による同時投与、及び／又はいずれかの順序での連続投与が含まれる。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、化学療法剤の投与の前、後、交互に行われるか、又はこれらと同時になされうる。一実施態様では、両方(又はすべて)の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間がある。
【０３１９】
疾患の予防又は治療のために、本発明の薬剤の好適な用量は、上記に定義した治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及びインヒビターへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。インヒビターは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投与計画では、本発明の組成物は治療的有効量又は治療的相乗作用量で投与される。本明細書中で用いられるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与及び／又はＶＥＧＦアンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤の同時投与により標的とする疾患又は症状が減少又は阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であってもよい。一実施態様では、投与の結果は相乗効果である。治療的相乗作用量は、特定の疾患に関係する状態又は症状を相乗作用的に又は有意に減少ないし除去するために必要な、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤、例えば化学療法剤又は抗癌剤の量である。
【０３２０】
疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＶＥＧＦアンタゴニスト又は化学療法剤、又は抗癌剤が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。典型的には、臨床医は、必要とされる生物学的な効果が生じる用量(一又は複数)が達成されるまで本発明の分子(一又は複数)を投与するであろう。本発明の治療の経過は従来の技術及びアッセイにより用意にモニターされる。
【０３２１】
例えば、血管新生インヒビター、例えばアバスチン(登録商標)(Genentech)などの抗ＶＥＧＦ抗体の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。他の例では、このような化学療法剤の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。化学療法の調製及び投与計画はChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載される。
【０３２２】
治療の効果
本発明の治療の有効性は、新生物ないし非新生物疾患を治療する際に共通に用いられる様々なエンドポイントによって決定することができる。例えば、癌治療は、限定するものではないが、腫瘍再発、腫瘍重量ないしサイズの収縮、進行時間、生存期間、進行がない生存、全体の応答速度、応答の継続期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性などで評価されてもよい。本明細書に記載の抗血管新生剤は腫瘍の血管をターゲットとするのであって、新生物細胞自体をターゲットとする必要はないので、抗癌剤の特定のクラスを示し、それゆえに薬剤に対する臨床応答の特定の測定と定義を必要としうる。例えば、二次元分析において５０％より大きい腫瘍の収縮は応答を示す標準のカットオフである。しかし、本発明のインヒビターは原発性腫瘍を収縮することなく転移の拡がりを阻害するか、又は単に腫瘍抑制(tumouristatic)効果を及ぼしうる。したがって、例えば血管新生の血漿又は尿路マーカーの測定及び放射線画像法による応答の測定などの、治療の有効性を決定する手法が用いられうる。
【０３２３】
製造品
本発明の他の実施態様では、上記の病状／疾病の治療又は病状／疾病の診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。該製造品は容器、ラベル及びパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。一実施態様では、容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。ある実施態様では、組成物中の少なくとも一つの活性剤はＶＥＧＦモジュレーターである。別の実施態様では、組成物中の少なくとも一つの活性剤はＶＥＧＦモジュレーターであり、少なくとも２つ目の活性剤は本発明のアンタゴニスト及び／又は化学療法剤である。更に別の実施態様では、組成物中の少なくとも一つの活性剤はＶＥＧＦモジュレーターであり、少なくとも２つ目の活性剤は本発明のアゴニスト及び／又は化学療法剤である。容器に添付又は付属するラベルは、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。さらに製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。他の実施態様では、容器はVEGF非依存性腫瘍を検出するための診断用であるマーカーセットを収容する。特定の実施態様において、組成物内の少なくとも一薬剤は、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＰＤＧＦＣ、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２を検出するためのマーカーである。容器に添付又は付属するラベルは、組成物がＶＥＧＦ非依存性腫瘍の診断に使用されることを示す。さらに、本発明の製造品には、更なる活性剤、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。 
【０３２４】
本発明の特定の実施態様において、容器、該容器のラベル、及び該容器内に収容される組成物を含むキットが提供される。組成物は、厳密な条件下でＵＲＶＩＮＡ、ＤＲＶＩＮＡ、ＵＲＶＩＰおよび／またはＤＲＶＩＰをコードする核酸を含むが、これに限定されない、１又は複数の遺伝子のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする１又は複数のポリヌクレオチド、少なくとも１種類の哺乳類の細胞において、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＣ、ＩＬ−１β、ＰｌＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−６および／またはＬＩＦを含むがこれに限定されない１又は複数の標的遺伝子の存在及び／又は発現されるを評価するために使用できることを示している前記容器のラベルは組成物、更に少なくとも１種類の哺乳類の細胞において１又は複数の標的RNA又はDNAの存在及び／又は発現レベルを評価するために使用されるポリヌクレオチドを含む。キットの他の任意のコンポーネントは、１又は複数のバッファー（例えば、ブロックバッファー、洗浄バッファー、基質バッファーなど）、酵素的標識によって化学的に変えられる基質である基質（例えば、色素原）のような他の試薬、エピトープ回復溶液、コントロール試料（正の及び／又は負の対照）、対照スライドなどが含まれる。
【実施例】
【０３２５】
本明細書に記載する実施例および実施形態は、例示のためのものにすぎず、それらに照らして、種々の改変形態および変化形態が当業者には提案され、それらは本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものとすることを理解されたい。
【実施例１】
【０３２６】
乳腺上皮中のＶｅｇｆ−Ａ遺伝子を不活性化しても、正常な乳腺の発達は破壊されない
ＶＥＧＦの生物学的な重要性を、とりわけ乳腺の上皮コンパートメントにおいて調べるために、第３エクソンにｌｏｘＰ組換え部位が隣接するコンディショナルなＶｅｇｆ−Ａ対立遺伝子をもつマウス（ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰ＋／＋）（Ｇｅｒｂｅｒ  ＨＰら、ＶＥＧＦ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｉｃｅ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９９、１２６：１１４９〜１１５９）を、Ｃｒｅリコンビナーゼを、マウス乳房腫瘍ウイルス末端反復配列プロモーター／エンハンサーエレメントの転写制御下で発現するトランスジェニックマウス（ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ）（Ｗａｇｎｅｒ  ＫＵら、Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７、２５：４３２３〜４３３０、Ｗａｇｎｅｒ  ＫＵら、Ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｅ  ｇｅｎｅ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＭＴＶ−ＬＴＲ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ２００１、１０：５４５〜５５３）と交配して、ＶＥＧＦ座位においてヘテロ接合型（一方の対立遺伝子はＶＥＧＦ  ｌｏｘＰであり、他方の対立遺伝子はＶＥＧＦ  ＷＴである）であり、ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ導入遺伝子を担持するマウスを作出した。これらのマウスをホモ接合型のＶＥＧＦ  ｌｏｘＰマウスとさらに交配して、ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ導入遺伝子ももち、乳腺上皮中の両方のＶＥＧＦ対立遺伝子においてエクソン３が欠失しているホモ接合型のＶＥＧＦ  ｌｏｘＰマウス（本明細書ではｅｐｉＶＥＧＦ−／−と呼ぶ）を得た。生存可能かつ健常なｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウスは、同腹仔の対照動物（本明細書ではＶＥＧＦ＋／＋と呼ぶ）と身体的に区別できず、予想されたメンデル比で生まれた（データ未公開）。
【０３２７】
６０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンを含有する溶液の腹腔内注射を使用して、マウスに麻酔を施した。鼠径部（第４位）乳腺を解体し、あらかじめ浄化したｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）ｐｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅ（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）上に広げ、カルノア固定液（６部の１００％エタノール、３部のクロロホルム、１部の氷酢酸）中で一晩固定した。試料を、段階的に濃度の異なるエタノール（７０％、５０％、３０％および１０％）を通して１５分間２回濯ぎ、最後に蒸留水中で５分間濯いだ。試料をＣａｒｍｉｎｅ  Ａｌｕｍ（５００ｍｌの水中、１ｇのカーミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２．５ｇの硫酸アルミニウムカリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））中で一晩染色した。試料を、段階的濃度のエタノール（７０％、９５％、１００％）リンスを使用して脱水し、キシレン中に３０分間または腺から脂肪組織が十分に浄化されるまで浸漬した。Ｐｅｒｍｏｕｎｔを使用してスライドに試料を載せ、カバーガラスで覆った。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、全載をデジタル写真撮影した。全載の解析は、８週齢の同腹仔マウスを用いて実施した。
【０３２８】
８週齢の未交尾の雌マウスから鼠径部乳腺を取り出し、その全載の調製物から、ｅｐｉＶＥＧＦ−／−乳腺において、乳腺の発達には特徴的な管の分枝した伸長を伴い、これは、ＶＥＧＦ＋／＋対照乳腺の伸長に類似することが明らかになった（図１Ａ、１Ｂ）。同様に、８週齢ｅｐｉＶＥＧＦ−／−乳腺のヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片においても、ＶＥＧＦ＋／＋乳腺と比べて、肉眼的な組織学的変化は見出されなかった（データ未公開）。これらの結果から、上皮細胞由来ＶＥＧＦは未交尾マウスにおける正常な乳腺の発達に必須ではないことが示唆されている。
【実施例２】
【０３２９】
上皮由来ＶＥＧＦが喪失すると、ＰｙＭＴ腫瘍の発症が遅延する
乳腺上皮における腫瘍形成を促すために、ポリオーマウイルスミドルＴ抗原（ＰｙＭＴ）をＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターの転写調節下で発現するトランスジェニックマウス（Ｇｕｙ  ＣＴら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｍｉｄｄｌｅ  Ｔ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ：ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９２、１２：９５４〜９６１）をｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウスと交配して、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−動物を作出した。
【０３３０】
ＭＭＴＶ−ＬＴＲの制御下でＰｙＭＴ腫瘍性タンパク質を発現するトランスジェニックマウス系統（ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ）を使用して、乳腺上皮における腫瘍形成を推進した（Ｇｕｙ  ＣＴら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｍｉｄｄｌｅ  Ｔ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ：ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９２、１２：９５４〜９６１）。ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ導入遺伝子に加えて、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ導入遺伝子を導入するために、ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰおよびＶＥＧＦ  ＷＴについてヘテロ接合型である雌マウスを、雄のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニックマウスと交配して、ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ導入遺伝子およびＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ導入遺伝子の発現に加えて、ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰおよびＶＥＧＦ  ＷＴについてヘテロ接合型のマウスを作出した。次いで、ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ導入遺伝子およびＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ導入遺伝子と並んで、ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰ対立遺伝子およびＶＥＧＦ  ＷＴ対立遺伝子についてヘテロ接合型の雄マウスを、雌のホモ接合型ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰマウスと交配して、ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ導入遺伝子およびＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ導入遺伝子の両方を担持するホモ接合型ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰマウスを得た。ホモ接合型ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰマウスまたはＣｒｅおよびＰｙＭＴも発現するホモ接合型ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰマウスを、ＦＶＢ／Ｎバックグラウンド上で５世代戻し交配してから、交雑させて、ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ導入遺伝子およびＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ導入遺伝子を発現するホモ接合型ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰマウス（本明細書ではＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−と呼ぶ）、ならびにＰｙＭＴ導入遺伝子およびＷＴ  ＶＥＧＦを発現するホモ接合型ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰマウス（本明細書ではＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋と呼ぶ）を作出し、後者を、全ての実験についての対照動物として使用した。別段の記載がない限り、雌マウスを全ての研究において使用した。腫瘍の形成および成長を、４週齢から開始して毎週モニターし、触診可能な腫瘍の体積を、ノギスによる測定によって決定した。マウス１匹当たりの累積腫瘍数を、個々のマウスについて、１週当たりの腫瘍小結節の数を加算することによって決定した。腫瘍体積は、式：Ｌ×Ｗ×Ｗ／２＝腫瘍体積（ｍｍ３）（Ｌ＝ｍｍで示す長径（長さ）；Ｗ＝ｍｍで示す短径（幅））を使用して計算した（Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈ  ＭＡら、（２０００）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＧＦＢ−１１１，ａ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：１０６５〜１０７０）。マウス１匹当たりの累積腫瘍体積は、個々のマウスについて各腫瘍小結節の体積を加算することによって決定した。指定の時点でマウスから腫瘍を取り出し、重量測定した。
【０３３１】
腫瘍の潜時が、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−乳腺においてＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋乳腺の潜時と比べて増加した。より具体的には、５０％のマウスにおいて、少なくとも単一の触診可能なＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍を検出するのに１０週が必要であり、一方、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍について１２．３±０．５１週が必要であった（Ｐ値＝０．００３）（図２Ａ）。触診可能な腫瘍の検出に続いて、全てのマウスを週１回モニターして、副乳腺（１０個）内部の追加の触診可能な腫瘍の時期を決定した。それに続く時点でマウス１匹当たりの触診可能な腫瘍の累積数の平均は、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウスにおいて、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋対照動物と比べて有意に少なかった（図２Ｂ）。乳癌のこの遺伝子モデルにおいて、個々の腫瘍成長の変動が大きいので（Ｖａｒｔｏｃｏｖｓｋｉら、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  １；１３（７）：２１６８〜７７）、第８週から第１７週まで、各遺伝子型について、マウス１匹当たりの累積腫瘍体積の平均を計算し、グラフで示した（図２Ｃ）。第１１週において、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋についての累積腫瘍体積の平均は、約９００ｍｍ３であり、一方、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−についての累積腫瘍体積の平均は、１００ｍｍ３未満であった（図２Ｃ）。第１７週において、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋対照の動物についての累積腫瘍積載体積の平均は、約７５００ｍｍ３であり、一方、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウスについての累積腫瘍積載体積の平均は約３０００ｍｍ３であった（図２Ｃ）。第１６週と第１７週との間に収集した腫瘍からは、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−において、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋と比べて総腫瘍重量／マウスの低下が示された（図２Ｄ）。これらの観察から、上皮ＶＥＧＦの喪失によって、ＰｙＭＴ推進性の乳腺腫瘍形成が制限されることが示されている。
【実施例３】
【０３３２】
腫瘍の血管構造が、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウスにおいては減少する
Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ血管造影を利用して、正常な血管構造（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｎｚ  Ａら、Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９９８；３１［２］：４４０〜４４４；Ｒｉｔｉｍａｎ  ＥＬ、Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ．２００５；２：４７７〜４８０）、血管新生および動脈新生の種々の動物モデル（Ｋｗｏｎ  ＨＭら  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｏｒｏｒｎａｒｙ  Ｖａｓａ  Ｖａｓｏｒｕｍ  Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ、Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１［８］、１５５１〜１５５６；Ｋｗｏｎ  ＨＭら  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔｒａｎｓｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ３−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｓｔｕｄｙ、Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．１９９９；１４：５０２〜５１０；Ｄｕｖａｌｌ  ＣＬら  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｖｅｓｓｅｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４；２８７：Ｈ３０２〜３１０）を特徴付け、より最近になって、腫瘍の血管構造を研究することに成功を収めている（Ｍａｅｈａｒａ  Ｎ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３Ｄ  ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ、Ｅｕｒ  Ｒａｄｉｏｌ．２００３；１３（７）：１５５９〜１５６５；Ｓａｖａｉ  Ｒら  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌ  ｓｕｐｐｌｙ  ｉｎ  ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｆｌａｔ−ｐａｎｅｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、Ａｍｅｒ  Ｊ  ｏｆ  Ｐａｔｈ．２００５；１６７［４］：９３７〜９４６；Ｓｈｏｊａｅｉ  Ｆら（２００７）Ｂｖ８  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：８２５〜８３１）。
【０３３３】
手短に述べると、動物に５０μｌのヘパリン１５’の腹腔内注射を投与してから、動物を二酸化炭素の吸入により安楽死させた。胸腔を開き、心臓の心尖部内に切開を設け、ポリエチレン製カニューレ（ｉｄ  ０．５８ｍｍ、ｏｄ  ０．９６ｍｍ）を左心室に通し、上行大動脈内に５−０絹製縫合糸を用いて固定した。０．１ｍＭニトロプルシドナトリウム溶液を、６ｍｌ／分の速度で灌流して、最大の血管拡張状態を得た。市販のクロム酸鉛ラテックスであるＭＩＣＲＯＦＩＬ（登録商標）（Ｆｌｏｗｔｅｃｈ、Ｃａｒｖｅｒ、ＭＡ）を製造元の推奨に従って調製し、２ｍｌ／分の速度で８．５分間灌流した。注入したラテックス混合物の重合を室温で９０分間行ってから、腫瘍を解体した。解体した腫瘍を、解析まで、１０％中性緩衝ホルマリン中に浸漬した。腫瘍の画像を、μＣＴ４０（ＳＣＡＮＣＯ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）Ｘ線マイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ−ＣＴ）システムを用いて撮影した。従来の平面Ｘ線に匹敵する矢状断の探索画像を得て、一連のｍｉｃｒｏ−ＣＴ画像切片の軸方向の獲得のための出発点および終点を定義した。軸方向の画像の位置および数を、腫瘍が完全に網羅されるように選んだ。腫瘍の画像を、大豆油をバックグラウンドの媒体として用いて撮影した。Ｘ線チューブを、５０ｋＶのエネルギーレベル、１６０μＡの電流および３００ミリ秒の積分時間で動作することによって、Ｍｉｃｒｏ−ＣＴの画像を生成した。軸方向の画像を、１６μｍの等方向性分解能で得た。血管網および腫瘍を、一連の画像処理のステップによって抽出した。強度閾値および形態学的フィルター（浸食および拡張）を、容積測定用ｍｉｃｒｏ−ｃｔ画像データに適用して、血管容積を抽出した。１１９５  Ｈｏｕｎｄｓｆｉｅｌｄ  Ｕｎｉｔ（ＨＵ）の閾値を利用して、腫瘍および大豆油のバックグラウンドシグナルから、ＭＩＣＲＯＦＩＬ（登録商標）が充填されている血管を抽出した。−８ＨＵの強度閾値を適用し、続いて、形態学的フィルターをかけて（浸食および拡張）、ノイズを抑制することによって、バックグラウンドの大豆油から腫瘍体積を抽出した。サブセットの試料について、区分けの目視検査の結果によって、血管および腫瘍の強度閾値を決定した。血管のサイズの推定は、境界シード点および単一シード点を与えられた距離変換の技法を利用する骨格化アルゴリズムに基づいた（Ｚｈｏｕ  ＹおよびＴｏｇａ  ＡＷ、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｋｅｌｅｔｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｏｂｊｅｃｔｓ、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ．１９９９；５［３］：１９６〜２０９）。画像解析を、Ｃ＋＋で書かれた社内の画像区分けアルゴリズムおよびＡＶＷ画像処理ソフトウエアライブラリー（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ  Ｉｎｃ．、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を利用するＰｙｔｈｏｎによって実施した。表面の三次元（３Ｄ）化を、μＣＴデータから、画像解析ソフトウエアパッケージであるＡｎａｌｙｚｅ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ  Ｉｎｃ．、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を使用して生み出した。抗ＶＥＧＦ  Ｇ６．３１またはブタクサに対するアイソタ��プの対照抗体を、５ｍｇ／ｋｇ体重で週２回腹腔内注射したＰＹＭＴ．ＶＥＧＦ  ｌｏｘＰ＋／＋マウスにおいて、腫瘍血管構造に対するＶＥＧＦの薬理学的阻害作用の評価を実施した。
【０３３４】
サイズを一致させた腫瘍のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）血管造影から、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍（７．９４±１．０１７ｍｍ３、ｎ＝１６）においては、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍（１２．３１±７．２７ｍｍ３、ｎ＝３０、ｐ＝０．００３２）と比べて、血管容積（ＶＶ）の平均が低下することが明らかになった。同様に、血管密度（ＶＶ／ＴＶ）の平均も、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍（０．０３４±０．００２７）において、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋対照腫瘍（０．０５４±０．０１９）と比べて、（３７％）低下した（Ｐ＝０．００４）。代表的な三次元の最大強度を投影した（ＭＩＰ）ｍｉｃｒｏ−ＣＴ血管造影図を示す（図３Ａ、Ｂ）。ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍において見られたのと類似の形で、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍を有するマウスの抗ＶＥＧＦ治療（３回、１週間）により、血管密度も、対照抗体治療マウスと比べて減少した（図３Ｃ、３Ｄ）。より細い血管が、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍において選択的に喪失し得るかどうかを決定するために、血管半径の観察された範囲にわたり血管容積を評価した。ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍と比べて、全ての血管半径にわたり血管容積の分布が低かった（図３Ｅ）。ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍における血管構造の全体的な減少について補正する、すなわち、総血管容積で割ると、有意な差は見出されなかった（図３Ｆ）。したがって、上皮ＶＥＧＦの喪失によって、腫瘍の血管構造が顕著に減少し、このことは、異なるサイズの血管に広く影響を及ぼすようである。
【実施例４】
【０３３５】
ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２の遺伝子発現が、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウスにおいては減少する
ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２の発現の相対レベルを評価するために、我々は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した。
【０３３６】
全ＲＮＡを固形腫瘍から、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して製造元の指示に従って単離し、続いて、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いたデオキシリボヌクレアーゼ処理、２５：２４：１のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによる精製およびエタノール沈殿を行った。ＲＮＡを、リボヌクレアーゼを含有しない水（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に再懸濁し、−８０℃で保存した。ＲＮＡ濃度を、分光光度法による吸光度によって決定した。目的の遺伝子の相対レベルを、各遺伝子について設計したＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーのセットを使用して決定し、リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。マウスＣＤ３１についてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＡＴＴ−３’（順方向）、５’−ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  Ｔ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  Ｃ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＣＤ３４についてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡ−３’（順方向）、５’−ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＡＧ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＴＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＴｉｅ−１についてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＴＧＡ  ＡＣ−３’（順方向）、５’−ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＧ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＴＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＴｉｅ−２についてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＧ−３’（順方向）、５’−ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＧＴＡ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＴＡＧ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  Ｃ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。
【０３３７】
また、ＲＮＡ試料を、Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイにも、６０ｒｐｍに設定した回転式オーブン中、４５℃で１９時間ハイブリダイズさせた。アレイを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションおよびスキャナー中で洗浄し、染色し、走査した。遺伝子セットの解析を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに独占所有権のあるソフトウエアを使用して実施した。血管新生関連遺伝子の発現を、各腫瘍ＲＮＡ試料について、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒマウス血管新生ＰＣＲアレイを使用し、製造元（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）の指示に従って解析した。
【０３３８】
これらの結果から、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２のｍＲＮＡレベルの減少を示すことが示されている（図１１Ａ〜Ｄ）。
【０３３９】
ＲＴ−ＰＣＲによる定量化では、ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２が、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍と比べて有意に低下し、このことは、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、対照と比べて、内皮細胞が全体的に低下していることを示唆している（図１１Ａ〜Ｄ）。
【実施例５】
【０３４０】
相対的な血流は、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍における血管構造の低下によって、不利な影響を受けていない
血管の機能を評価するために、我々は、腫瘍の灌流の造影超音波画像法を使用した。
【０３４１】
灌流画像法：マウスに、１Ｌ／秒の流速で医学的空気を用いて送達する２％イソフルランを使用して麻酔を施した。麻酔したマウスを、専用の小型の動物保持システム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、カナダ）上に仰臥位で置いた。体温および心拍数を、手順の残りの間モニターした（ＴＨＭ１５０、Ｉｎｄｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国）。腫瘍領域および頚静脈の周囲の体毛を、体毛除去クリーム（Ｎａｉｒ，Ｃｈｕｒｃｈ  ＆  Ｄｗｉｇｈｔ  Ｃｏ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、米国）を使用して除去した。超音波用造影剤（Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）を、頚静脈穿刺を通して、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）を使用して、３μｌ／分の一定の注入速度で投与した。振動器（Ｓｏｎｉｃａｒｅ，Ｋｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ  Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ）を、チューブライン上で使用して、溶液中に微小気泡が定着するのを阻止した。１５Ｌ８−Ｓプローブを使用するＡｃｕｓｏｎ  Ｓｅｑｕｏｉａ  Ｃ５１２システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ、米国）を、超音波画像法のために使用した。高調波画像法を、以下のパラメータを使用して実施した：Ｐ１４ＭＨｚ、−１０ｄＢ、ＭＩ  ０．２１、３４μｍの軸方向および横方向の分解能、ならびに２０フレーム／秒のフレーム速度。超音波プローブを動物に対して垂直に整列させ、腫瘍の中心を決定した。微小気泡を３μｌ／分の一定速度で２分間送達して、定常状態を達成した。定常状態の送達を達成した後に、総数２５０フレームの超音波データを解析のために獲得した。２０フレームの定常状態のデータを得た。次いで、微小気泡を、高出力パルス（ＭＩ  １．９、および５フレームのバースト期間）を使用して破壊し、微小気泡が視野内に再度流入するのを、追加の２３０フレームのデータを獲得することによってモニターした。このプロセスを反復して、腫瘍の中心から±１ｍｍに位置するさらに２つの平面を獲得した。
画像解析：破壊に続き、微小気泡が視野内に再度流入するのを、Ｗｅｉら  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｗｉｔｈ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−ｂｕｂｂｌｅｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８；９７：４７３〜４８３が記載している指数方程式を使用してモデル化した。
（１）ｙ＝Ａ（１−ｅ−βｔ）
式中、Ａは画像強度を示し、βは速度定数である。破壊直後のフレームを使用して、バックグラウンドノイズの強度を決定し、それを、再流入のデータからピクセルごとに減じた。Ａを、各ピクセルについて、微小気泡を破壊する前の定常状態のフレームからのバックグラウンドを補正した強度の平均として推定した。βを、微小気泡を破壊した後の強度の値の自然対数をとり、再流入期間全体にわたり直線に当てはめることによって決定した。次いで、当てはめた値を使用して、各ピクセルの位置におけるβ値の地図を生成した。腫瘍を通る相対的な血流ｆを、Ｗｅｉら  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｗｉｔｈ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−ｂｕｂｂｌｅｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８；９７：４７３〜４８３が誘導した以下の式を使用して計算した。 
（２）ｆαＡβ
【０３４２】
ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍を、サイズを一致させたＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍と比較したが、相対的な血流の有意な差は示されなかった（図４Ａ〜Ｃ）。したがって、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍における血管構造の低下にもかかわらず、血液の腫瘍への相対的な送達は、不利な影響を受けていないようである。
【実施例６】
【０３４３】
ＶＥＧＦＲ１が、ＰｙＭＴ乳腺上皮の腫瘍上で発現する
内皮細胞に加えて、ヒトおよびマウスの両方の乳癌に由来する腫瘍の上皮細胞が、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）およびＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を発現することが示されている（Ｐｒｉｃｅ  ＤＪら、Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００１；１２：１２９〜３５、Ｗｕ  Ｙら、Ａｎｔｉ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６、１２：６５７３〜６５８４）。
【０３４４】
全ての組織を、４％ホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋した。５μｍ厚さの切片を、脱パラフィンし、４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中、３７℃で３０分間除タンパクし、以前の記載（例えば、Ｌｕ  Ｌ．Ｈ．およびＧｉｌｌｅｔｔ，Ｎ．Ａ．Ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ３３Ｐ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｒｉｂｏｐｒｏｂｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｖｉｓｉｏｎ．１９９４  １：１６９〜１７６、Ｈｏｌｃｏｍｂら、ＦＩＺＺ１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０００  Ａｕｇ  １；１９（１５）：４０４６〜５５を参照されたい）に従って、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためにさらに処理した。３３Ｐ−ＵＴＰで標識したセンスプローブおよびアンチセンスプローブを、切片に、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしなかったプローブを、２０μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ中、３７℃で３０分間インキュベートすることによって除去し、続いて、高い厳密度の洗浄を、０．１×ＳＳＣ中、５５℃で２時間行い、段階的に濃度の異なるエタノールを通して脱水した。スライドを、ＮＢＴ２  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｃｋ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｒｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）中に浸し、乾燥剤を含有する密閉したプラスチック製のスライドボックス中、４℃で４週間露光し、現像し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色した。以下のプローブ鋳型を、以下に記載するプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。マウスのＶＥＧＦエクソン３、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２についての上部プライマーおよび下部プライマーは、センス転写物およびアンチセンス転写物を生成するために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをそれぞれコードする、５’末端に付加させた２７ヌクレオチドの伸長部分を有した。マウスＶＥＧＦエクソン３のＰＣＲプローブ鋳型：ＮＭ＿００９５０５のｎｔ２０２〜３９４に対応する１９２ｎｔ、上部プライマー：５’−ＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣ−３’、下部プライマー：５’−ＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＣＧ−３’。マウスＶＥＧＦＲ１のＰＣＲプローブ鋳型：ＮＭ＿０１０２２８のｎｔ１５７０〜２１９１に対応する６２２ｎｔ、上部プライマー：５’−ＣＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣ−３’、下部プライマー：５’−ＣＴＴＣＣＣＣＴＧＴ  ＧＴＡＴＡＴＧＴＴＣ  Ｃ−３’。マウスＶＥＧＦＲ２のＰＣＲプローブ鋳型：ＮＭ＿０１０６１２のｎｔ３１８〜９８４に対応する６６７ｎｔ、上部プライマー：５’−ＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＧＡＣＴＧ−３’、下部プライマー：５’−ＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＴＴ−３’。
【０３４５】
ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍と、サイズを一致させたＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍との比較。ＶＥＧＦＲ１転写物およびＶＥＧＦＲ２転写物についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析を、同等のサイズのＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍およびＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍に対して実施した。対照のＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍においては、ＶＥＧＦＲ１  ｍＲＮＡについて中等度の発現が観察され（図５Ａ）、一方、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、ＶＥＧＦＲ１  ｍＲＮＡの発現は一般に、より弱く、より変動した（図５Ｂ）。比較的一様な強いＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの発現がＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍においては見出され（図５Ｅ）、これは、内皮細胞源と一致し、一方、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、ＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの発現は一般に、より弱く、より変動した（図５Ｆ）。
【実施例７】
【０３４６】
上皮のＶＥＧＦを欠く乳房腫瘍におけるＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の遺伝子プロファイリング
定量的リアルタイムＰＣＲ解析から、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍と比較して、ＶＥＧＦＲ１  ｍＲＮＡ（図６Ａ）およびＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡ（図６Ｂ）のｍＲＮＡの発現が低いことが示されている。
【０３４７】
全ＲＮＡを、固形腫瘍から、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して製造元の指示に従って単離し、続いて、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いたデオキシリボヌクレアーゼ処理、２５：２４：１のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによる精製およびエタノール沈殿を行った。ＲＮＡを、リボヌクレアーゼを含有しない水（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に再懸濁し、−８０℃で保存した。ＲＮＡ濃度を、分光光度法による吸光度によって決定した。目的の遺伝子の相対レベルを、各遺伝子について設計したＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーのセットを使用して決定し、リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。マウスＶＥＧＦＲ１についてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＧＴＣ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＴＡＡ  ＧＴ−３’（順方向）、５’−ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＣＡＴ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＣＴ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＴＡ  ＣＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＶＥＧＦＲ２についてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＴＧＴ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＡＡＧ  Ｇ−３’（順方向）、５’−ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  Ｔ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。
【０３４８】
ＲＮＡ試料を、Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイに、６０ｒｐｍに設定した回転式オーブン中、４５℃で１９時間ハイブリダイズさせた。アレイを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションおよびスキャナー中で洗浄し、染色し、走査した。遺伝子セットの解析を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに独占所有権のあるソフトウエアを使用して実施した。血管新生関連遺伝子の発現を、各腫瘍ＲＮＡ試料について、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒマウス血管新生ＰＣＲアレイを使用し、製造元（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）の指示に従って解析した。
【０３４９】
これらの結果から、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２のｍＲＮＡレベルの減少を示すことが示されている（図６ＡおよびＢ）。
【実施例８】
【０３５０】
ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍中の残余のＶＥＧＦは、腫瘍形成にとって重要な意味はもたない
ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍中のＶＥＧＦタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍と比較して約７５％低下しており（図７Ａ）、このことは、このモデルにおいては、腫瘍上皮細胞がＶＥＧＦの主要な供給源であることを実証している。ヒト癌細胞系の異種移植モデルが、浸潤性の間質細胞が腫瘍の発達および成長に顕著に寄与する場合があることが示されている（Ｇｅｒｂｅｒら、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  Ｎｏｖ  １５；６０（２２）：６２５３〜８）。
【０３５１】
切除した腫瘍を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸−ナトリウム塩、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）、または２ｍＭ  ＥＤＴＡを有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４のいずれかの中でホモジナイズした。両方の溶解用緩衝液には、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を補い、−８０℃で保存した。総タンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して、製造元（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の指示に従って決定した。マウスＶＥＧＦのＥＬＩＳＡを、以前の記載（Ｌｉａｎｇら、Ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ＶＥＧＦ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００６  Ｊａｎ  １３；２８１（２）：９５１〜６１）に従って実施した。全ての組織を、４％ホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋した。５μｍ厚さの切片を、脱パラフィンし、４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中、３７℃で３０分間除タンパクし、以前の記載（例えば、Ｌｕ  Ｌ．Ｈ．およびＧｉｌｌｅｔｔ，Ｎ．Ａ．Ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ３３Ｐ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｒｉｂｏｐｒｏｂｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｖｉｓｉｏｎ．１９９４  １：１６９〜１７６、Ｈｏｌｃｏｍｂら、ＦＩＺＺ１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０００  Ａｕｇ  １；１９（１５）：４０４６〜５５を参照されたい）に従って、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためにさらに処理した。３３Ｐ−ＵＴＰで標識したセンスプローブおよびアンチセンスプローブを、切片に、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしなかったプローブを、２０μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ中、３７℃で３０分間インキュベートすることによって除去し、続いて、高い厳密度の洗浄を、０．１×ＳＳＣ中、５５℃で２時間行い、段階的に濃度の異なるエタノールを通して脱水した。スライドを、ＮＢＴ２  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｃｋ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｒｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）中に浸し、乾燥剤を含有する密閉したプラスチック製のスライドボックス中、４℃で４週間露光し、現像し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色した。以下のプローブ鋳型を、以下に記載するプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。マウスのＶＥＧＦ���クソン３、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２についての上部プライマーおよび下部プライマーは、センス転写物およびアンチセンス転写物を生成するために、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをそれぞれコードする、５’末端に付加させた２７ヌクレオチドの伸長部分を有した。マウスＶＥＧＦエクソン３のＰＣＲプローブ鋳型：ＮＭ＿００９５０５のｎｔ２０２〜３９４に対応する１９２ｎｔ、上部プライマー：５’−ＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣ−３’、下部プライマー：５’−ＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡ  ＣＧ−３’。
【０３５２】
ＰｙＭＴ乳房腫瘍におけるＶＥＧＦの発現の局在化を調べるために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析を、同等のサイズの腫瘍に対して、ＶＥＧＦのエクソン３に特異的なリボプローブを使用して実施した。マウス１匹当たりの累積腫瘍数を、個々マウスについて、１週当たりの腫瘍小結節の数を加算することによって決定した。腫瘍体積を、式：Ｌ×Ｗ×Ｗ／２＝腫瘍体積（ｍｍ３）（Ｌ＝ｍｍで示す長径（長さ）；Ｗ＝ｍｍで示す短径（幅））を使用して計算した（Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈ  ＭＡら、（２０００）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＧＦＢ−１１１，ａ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：１０６５〜１０７０）。マウス１匹当たりの累積腫瘍体積を、個々マウスについて、各腫瘍小結節の体積を加算することによって決定した。
【０３５３】
ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍においては、ＶＥＧＦの発現は、腫瘍全体を通して広く分布し、最も高い発現が壊死性領域付近で生じた（図７Ｂ）。対照的に、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、ＶＥＧＦの発現は、壊死性帯域周辺では、著しく弱く、上方制御の証拠を欠いた（図７Ｃ）。これらの結果から、平滑筋アクチン染色（データ未公開）と併せて、ＶＥＧＦの間質における産生の増加または動員が、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍が形成され、成長する機構である可能性は低いことが示唆されている。触診可能な腫瘍の発生（図８Ａ）および累積腫瘍体積の平均（図８Ｂ）の有意な遅延が、抗ＶＥＧＦ抗体を用いて治療したＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋マウスにおいて観察された。治療の効果は、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウスにおいては見出されなかった。これらの結果から、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウスにおいては、腫瘍成長は、これらの腫瘍中に存在する残余のＶＥＧＦに依存しないことが示唆されている（図７Ａ〜Ｇ）。
【実施例９】
【０３５４】
上皮のＶＥＧＦを欠く乳房腫瘍の遺伝子プロファイリング
ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−の腫瘍形成に関与する因子の同定を目指して、サイズを一致させたＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍およびＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍の遺伝子発現プロファイリングを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイチップ解析およびＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒマウス血管新生ＰＣＲアレイを使用して実施した（データ未公開）。候補遺伝子であるＰｌＧＦ、ＩＬ−１β、ＰＤＧＦＣならびに走化性因子のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によって確認した。
【０３５５】
全ＲＮＡを固形腫瘍から、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して製造元の指示に従って単離し、続いて、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いたデオキシリボヌクレアーゼ処理、２５：２４：１のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによる精製およびエタノール沈殿を行った。ＲＮＡを、リボヌクレアーゼを含有しない水（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に再懸濁し、−８０℃で保存した。ＲＮＡ濃度を、分光光度法による吸光度によって決定した。
【０３５６】
目的の遺伝子の相対レベルを、各遺伝子について設計したＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーのセットを使用して決定し、リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。マウスＰｌＧＦについてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＴＧ−３’（順方向）、５’−ＧＧＣ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＧＴＡ  ＧＣＴ  ＧＴＡ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  Ｃ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＩＬ−１βについてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＡＣＡ  ＴＴＡ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＡＣ−３’（順方向）、５’−ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＣ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  Ｔ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＳ１００Ａ８についてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＡＡ−３’（順方向）、５’−ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＣＣ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＣＧＡ  ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＴＡＧ  ＴＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＳ１００Ａ９についてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  Ａ−３’（順方向）、５’−ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＴＧ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＡＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＰＤＧＦＣについてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  Ｇ−３’（順方向）、５’−ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＡＴＧ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＴＴＧ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  Ｃ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスＧＡＰＤＨについてのプライマーおよびプローブのセット：５’−ＧＧＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＡＡ−３’（順方向）、５’−ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＡＧ  ＣＣＧ  ＴＡＴ  ＴＣＡ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＡＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。マウスβアクチンについてのプライマーおよびプローブのセット：５’−  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＣＴＡ−３’（順方向）、５’−  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧ−３’（逆方向）、および５’−ＦＡＭ−  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（プローブ）。
【０３５７】
ＲＮＡ試料をＷｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイに、６０ｒｐｍに設定した回転式オーブン中、４５℃で１９時間ハイブリダイズさせた。アレイをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションおよびスキャナー中で洗浄し、染色し、走査した。遺伝子セットの解析を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに独占所有権のあるソフトウエアを使用して実施した。血管新生関連遺伝子の発現を各腫瘍ＲＮＡ試料について、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒマウス血管新生ＰＣＲアレイを使用し、製造元（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）の指示に従って解析した。
【０３５８】
これらの結果から、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍は、ＰｌＧＦ（図９Ａ）、ＩＬ−１β（図９Ｂ）、Ｓ１００Ａ８（図９Ｃ）およびＳ１００Ａ９（図９Ｄ）のｍＲＮＡレベルの増加を示すことが示されている。ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍においては、ＰＤＧＦＣのｍＲＮＡレベル（図９Ｅ）は低下している。
【実施例１０】
【０３５９】
上皮のＶＥＧＦを欠く乳房腫瘍のタンパク質プロファイリング
ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍中の血管新生因子および炎症性因子のタンパク質発現レベルを調べた。
【０３６０】
増殖因子およびサイトカインについてのＥＬＩＳＡアッセイ：切除した腫瘍を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸−ナトリウム塩、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）、または２ｍＭ  ＥＤＴＡを有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４のいずれかの中でホモジナイズした。両方の溶解用緩衝液には、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を補い、−８０℃で保存した。総タンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して、製造元（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の指示に従って決定した。マウスＶＥＧＦのＥＬＩＳＡを、以前の記載（Ｌｉａｎｇら、Ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ＶＥＧＦ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００６  Ｊａｎ  １３；２８１（２）：９５１〜６１）に従って実施した。ＩＬ−１βレベルを、ＢＥＡＤＬＹＴＥ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２を使用して、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）１００（商標）Ｓｙｓｔｅｍ上で、製造元（Ｕｐｓｔａｔｅ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）の指示に従って決定した。ＰｌＧＦレベルを、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＰｌＧＦ−２  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙを使用して、製造元（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の指示に従って決定した。
【０３６１】
ｍＲＮＡの変化と一致して、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍の可溶化液は、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋腫瘍と比べて、ＰｌＧＦ（図１０Ａ）およびＩＬ−１β（図１０Ｂ）のタンパク質レベルがより高かった。さらに、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のレベルも、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍可溶化液中では、対照腫瘍と比べて増加していた（図１０Ｃ）。
【０３６２】
本明細書によって、当業者であれば本発明を十分に実行することができるとみなされる。本発明の種々の改変形態が、本明細書において示し、記載するものに加えて、前述の説明から当業者には明らかになり、それらは、添付の特許請求の範囲に属する。本明細書に引用する刊行物、特許および特許出願は全て、全ての目的で、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【実施例１１】
【０３６３】
細胞遊走アッセイ
この研究は、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍の成長および遊走におけるサイトカインおよび増殖因子の役割のさらなる調査を試みる。
【０３６４】
ＫＯ．１、ＫＯ．２、ＫＯ．３およびＫＯ．４と呼ぶ初代上皮細胞を、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−腫瘍から単離した。ＷＴ．１、ＷＴ．２、ＷＴ．３、ＷＴ．４およびＷＴ．５と呼ぶ初代上皮細胞を、ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ＋／＋腫瘍から単離した。ＷＴ．ｃは、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋．ｌｏｘＰ腫瘍から生み出した細胞系に由来する上皮細胞である。ＫＯ．ｃは、ＰｙＭＴ．ＶＥＧＦ＋／＋．ｌｏｘＰ腫瘍から生み出した細胞系に由来する上皮細胞であり、ＶＥＧＦが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｃｒｅ−リコンビナーゼを発現するアデノウイルス（Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ）に感染させることによってノックアウトされていた。上皮特異的Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換えを、抗Ｃｒｅリコンビナーゼ抗体を用いた免疫細胞化学によって確認した。Ｋｏ．ｃ細胞系においては、ＶＥＧＦの発現レベルは、ＥＬＩＳＡによって検出可能ではなかった。
【０３６５】
遊走アッセイを、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（商標）ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（商標）２４−Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、８μｍポアサイズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して実施した。プレートを、５μｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、３７℃で２時間コートした。３００μｌのアッセイ用培地（０．５％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中の細胞を上部チャンバーに添加した。７５０μｌのアッセイ用培地中のＨＧＦ４０ｎｇ／ｍｌを、下部チャンバーに添加し、細胞を、３７℃で１８時間インキュベートした。下部表面上の細胞をＭｅＯＨ中に固定し、ＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて染色した。画像を獲得し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏプラットフォーム（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して解析した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈの  Ｃｏｕｎｔ  Ｎｕｃｌｅｉアプリケーションを使用して、遊走した細胞を同定し、数えた。
【０３６６】
ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ＋／＋マウス由来の原発性腫瘍については、ＨＧＦに対する遊走応答の増加の平均は１．８であった。ＰｙＭＴ．ｅｐｉＶＥＧＦ−／−マウス由来の原発性腫瘍については、ＨＧＦに対する遊走応答の増加の平均は２．５であった。誘導倍率の差は、統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）である。ＫＯ．ｃ細胞系およびＷＴ．ｃ細胞系は、上記の原発性腫瘍細胞の場合に類似する、ＨＧＦに対する遊走応答の増加を示す。すなわち、ＫＯ．ｃ由来の細胞については、ＷＴ．ｃ由来の細胞と比べてベースラインの遊走がより低く、ＨＧＦ処置による遊走の増加倍率がより高い（２．３対１．５）（図１２）。
【０３６７】
これらの結果から、ＶＥＧＦシグナル伝達が奪われた腫瘍細胞は、おそらく、これらの腫瘍細胞が生存、成長および遊走するためにその他の因子に依存しなければならないことから、ＨＧＦ等のその他の因子に対する応答性が高まることが示されている。したがって、ＶＥＧＦ非依存性である腫瘍は、例えば、ＨＧＦ−ｃＭｅｔ経路を遮断するアンタゴニストを使用する療法に対する感度が高まる。
【図１】
2012501188.tif 000003
【図２Ａ−Ｂ】
2012501188.tif 000004
【図２Ｃ−Ｄ】
2012501188.tif 000005
【図３Ａ−Ｄ】
2012501188.tif 000006
【図３Ｅ】
2012501188.tif 000007
【図３Ｆ】
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【図４Ａ−Ｃ】
2012501188.tif 000009
【図５Ａ−Ｄ】
2012501188.tif 000010
【図５Ｅ−Ｈ】
2012501188.tif 000011
【図６Ａ−７Ａ】
2012501188.tif 000012
【図７Ｂ−Ｅ】
2012501188.tif 000013
【図８Ａ】
2012501188.tif 000014
【図８Ｂ】
2012501188.tif 000015
【図９Ａ】
2012501188.tif 000016
【図９Ｂ−Ｅ】
2012501188.tif 000017
【図１０Ａ−Ｃ】
2012501188.tif 000018
【図１１Ａ−Ｄ】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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