(57)【要約】  本発明は、改良型抗血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメイン、ならびにかかる可変ドメインを含むリガンドおよび薬物接合体、組成物、核酸、ベクターおよび宿主に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、配列番号９７〜１９１および１９８〜２０３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、可変ドメイン。
【請求項２】
抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、配列番号９７〜１９１および１９８〜２０３から選択されるアミノ酸配列と比較して、４つまでのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含んでなる、可変ドメイン。
【請求項３】
抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、配列番号１〜９６および１９２〜１９７から選択される配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでなる、可変ドメイン。
【請求項４】
配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項５】
表面プラズモン共鳴法で測定される、約０．１から約１００００ｎＭ、任意に約１から約６０００ｎＭ、の解離定数（ＫＤ）でヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項６】
表面プラズモン共鳴法で測定される、約１．５×１０−４から約０．１ｓｅｃ−１、任意に約３×１０−４から約０．１ｓｅｃ−１、の解離速度定数（Ｋｄ）でヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項７】
表面プラズモン共鳴法で測定される、約２×１０６から約１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、任意に約１×１０６から約２×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、の結合速度定数（Ｋａ）でヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項８】
表面プラズモン共鳴法で測定される、約０．１から約１００００ｎＭ、任意に約１から約６０００ｎＭ、の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項９】
表面プラズモン共鳴法で測定される、約１．５×１０−４から約０．１ｓｅｃ−１、任意に約３×１０−４から約０．１ｓｅｃ−１、の解離速度定数（Ｋｄ）でカニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項１０】
表面プラズモン共鳴法で測定される、約２×１０６から約１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、任意に約１×１０６から約５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、の結合速度定数（Ｋａ）でカニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項１１】
ＤＳＣ（示差走査熱量測定法）で測定される、少なくとも５５℃、任意に５５≦Ｔｍ≦７５℃の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項１２】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱検出器を備えたサイズ排除クロマトグラフィー）で測定したときに、実質的に単量体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の可変ドメイン。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＳＡ可変ドメインと、ＳＡ以外の標的抗原に特異的に結合する結合部分とを含んでなり、任意に前記結合部分がＴＮＦＲ１アンタゴニストである、多重特異性リガンド。
【請求項１４】
前記可変ドメインが薬物（任意にＮＣＥ薬物）に接合され、任意に、選択される可変ドメインが請求項４に記載の可変ドメインである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＳＡ単一可変ドメイン。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の可変ドメインに融合したポリペプチドまたはペプチド薬を含んでなり、任意に、選択される可変ドメインが請求項４に記載の可変ドメインである、融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の可変ドメイン、融合タンパク質もしくはリガンド、および薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤もしくはビヒクルを含んでなる、組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２および１４のいずれか一項に記載の可変ドメイン、または請求項１３に記載の多重特異性リガンド、または請求項１５に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸。
【請求項１８】
配列番号１〜９６および１９２〜１９７から選択される配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、核酸。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含んでなる、単離された宿主細胞。
【請求項２１】
患者の疾患または障害を治療または予防する方法であって、請求項１〜１２および１４のいずれか一項に記載の可変ドメイン、または請求項１３に記載の多重特異性リガンド、または請求項１５に記載の融合タンパク質の少なくとも１用量を前記患者に投与することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良型抗血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメイン、ならびにかかるドメインを含むリガンドと薬物の接合体、組成物、核酸、ベクターおよび宿主に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第０４／００３０１９号パンフレットおよび国際公開第２００８／０９６１５８号パンフレットには、治療上有用な半減期を有する抗血清アルブミン（ＳＡ）結合部分、たとえば、抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）が開示されている。これらの文献には、単量体抗血清アルブミンｄＡｂ、ならびにこのようなｄＡｂを含む多重特異性リガンド（たとえば抗血清アルブミンｄＡｂ、およびＴＮＦＲ１などの標的抗原に特異的に結合するｄＡｂを含むリガンド）が開示されている。２種類以上の種に由来する血清アルブミンに特異的に結合する結合部分、たとえばヒト／マウス交差反応性抗ＳＡ ｄＡｂが開示されている。
【０００３】
国際公開第０５／１１８６４２号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５９１０６号パンフレットには、薬物の半減期を増加させるために、抗ＳＡ結合部分、たとえば抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインをその薬物に接合または結合させるという構想が開示されている。タンパク質、ペプチド、およびＮＣＥ（化学物質）薬物が開示され、例示されている。国際公開第２００６／０５９１０６号パンフレットには、インスリン分泌促進薬、たとえばグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１などのインクレチンホルモンの半減期を増加させるためにこの構想を用いることが開示されている。
【０００４】
また、Holtらの「効き目の短い薬物の半減期を延長するための抗血清アルブミンドメイン抗体」、Protein Engineering, Design & Selection, Vol. 21, No. 5, pp. 283-288, 2008を参照されたい。
【０００５】
血清アルブミン、好ましくはヒトおよび非ヒト種に由来するアルブミン、に特異的に結合する改良型重鎖可変ドメインｄＡｂを提供することが望ましい。このｄＡｂは疾患の動物モデルにおける有用性ならびにヒトの治療および／または診断のための有用性を提供する。また、比較的中程度の親和性と高親和性の抗ＳＡ結合部分（ｄＡｂ）の間の選択を提供することが望ましい。かかる部分は薬物に連結されることが可能であり、抗ＳＡ結合部分は想定される最終用途によって選択される。これにより、抗ＳＡ結合部分の選択に基づいて、薬物を慢性徴候または急性徴候の治療および／または予防の目的に、より良好に適合させることが可能になる。溶液中で単量体である、または実質的に単量体である抗ＳＡ  ｄＡｂを提供することも望ましい。これは、ＴＮＦＲ１などの細胞表面受容体に拮抗させることを目的として、その受容体に特異的に結合するｄＡｂなどの結合部分に抗血清アルブミンｄＡｂが連結されるとき、特に有利になるであろう。多量体は細胞表面で受容体（たとえばＴＮＦＲ１）に結合および架橋結合するものを形成する可能性は低く、したがって、受容体アゴニズムおよび有害な受容体シグナリングの可能性が増加するので、抗血清アルブミンｄＡｂの単量体状態は、受容体が架橋結合する機会を減少させるのに有用である。融解温度が比較的高い抗ＳＡ  ｄＡｂを提供することも望ましい。これは、安定な製剤、たとえば良好な保存有効期限を有する保存に安定した製剤および可変ドメインを提供することに役立つ。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の態様は、これらの課題を解決するものである。
【０００７】
従って、本発明の一つの態様では、配列番号９７〜１９１および１９８〜２０３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【０００８】
本発明のある態様では、配列番号９７〜１９１および１９８〜２０３から選択されるアミノ酸配列と比較して、４つまでのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【０００９】
本発明のある態様では、配列番号１〜９６および１９２〜１９７から選択される配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１０】
本発明のある態様では、本発明の抗ＳＡ可変ドメインと、ＳＡ以外の標的抗原に特異的に結合する結合部分とを含む多重特異性リガンドが提供される。
【００１１】
本発明のある態様では、その可変ドメインが薬物（任意でＮＣＥ薬）に接合される、本発明の抗ＳＡ単一可変ドメインが提供される。
【００１２】
本発明のある態様では、融合産物、例えば融合タンパク質またはペプチドもしくはＮＣＥ（新規化学物質）薬物との融合物、が提供され、該融合産物は、本発明のいずれかの抗ＳＡ可変ドメインに融合された、もしくは（ＮＣＥについては）接合されたポリペプチド、タンパク質、ペプチドまたはＮＣＥ薬物を含む。たとえば、該可変ドメインは、配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列（または配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列）を含むか、または該アミノ酸配列からなる。
【００１３】
本発明のある態様では、本発明の可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンド、および薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤もしくはビヒクルを含む組成物が提供される。
【００１４】
本発明のある態様では、本発明の可変ドメイン、または多重特異性リガンドもしくは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
【００１５】
本発明のある態様では、配列番号１〜９６および１９２〜１９７から選択される配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
【００１６】
本発明のある態様では、本発明の核酸を含むベクターが提供される。
【００１７】
本発明のある態様では、本発明のベクターを含む単離された宿主細胞が提供される。
【００１８】
本発明のある態様では、患者の疾患または障害を治療または予防する方法が提供され、該方法は、前述の患者に本発明の可変ドメイン、または多重特異性リガンドもしくは融合タンパク質の少なくとも１用量を投与することを含む。
【００１９】
本発明の任意の態様の実施態様では、抗血清アルブミン親和性が良好な抗血清アルブミン単一可変ドメインが提供される。可変ドメインの選択により、所望の治療的設定および／または予防的設定に従って半減期を調整することが可能になる。たとえば、一つの実施態様では、血清アルブミンへの可変ドメインの親和性は比較的高く、その結果、慢性的もしくは持続的な疾患、病態、毒性または他の慢性的な徴候の治療および／または予防に有用な産物に可変ドメインを包含させることが有益になりうる。一つの実施態様では、血清アルブミンへの可変ドメインの親和性は比較的低く、その結果、急性的な疾患、病態、毒性または他の急性的な徴候の治療および／または予防に有用な産物に可変ドメインを包含させることが有益になりうる。一つの実施態様では、血清アルブミンへの可変ドメインの親和性は中間程度であり、その結果、急性的もしくは慢性的な疾患、病態、毒性または他の急性的もしくは慢性的な徴候の治療および／または予防に有用な産物に可変ドメインを包含させることが有益になりうる。
【００２０】
血清アルブミンに対して適切に高い親和性および特異性を有する分子は、所望の治療効果を得るために十分に長く循環にとどまると考えられる（Tomlinson, Nature Biotechnology 22,521-522(2004)）。ここでも、高親和性の抗ＳＡ可変ドメインは、その種の血清アルブミンの親和性と同じように、血清循環にとどまるであろう（国際公開第２００８／０９６１５８号パンフレット）。一旦循環に入ると、ＡｌｂｕｄＡｂ可変ドメインに融合したいずれの治療薬（ＮＣＥ、ペプチドまたはタンパク質など）も、結果的にその標的上で長く作用し、かつ長期間持続する治療効果を示すことができる。このため、頻回投与を必要とせずに慢性的または持続的な疾患を標的とすることが可能となる。
【００２１】
中親和性（しかしＳＡへの特異性）を有する可変ドメインは、短期間（たとえば、数時間または数日間）血清循環にとどまるだけであり、融合治療薬によって、急性疾患に関与する治療標的を特異的に標的にすることが可能になる。
【００２２】
このように、適切なアルブミン結合親和性および／または血清半減期を有する抗ＳＡ可変ドメインを選択することによって、抗ＳＡを含有する産物を疾患領域に合わせて調整することが可能になる。
【発明の具体的説明】
【００２３】
本明細書では、本発明は、明瞭かつ簡潔な説明の記載となるように、実施態様を参照して記述されている。実施態様は、本発明から逸脱することなく、さまざまに組み合わせられ、または分割され得ることが意図されており、かつその点は理解されるべきである。
【００２４】
別段定義されない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、当業者（たとえば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学の分野の当業者）によって一般に理解されるのと同じ意味をもつ。分子遺伝学的方法および生化学的方法（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい。これらは参照によって本明細書に組み込まれる）ならびに化学的方法については、標準的な技法が用いられる。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）の拮抗剤」または「抗ＴＮＦＲ１拮抗剤」等は、ＴＮＦＲ１に結合して、ＴＮＦＲ１のある（すなわち１つまたは複数の）機能を抑制できる薬剤（たとえば分子、化合物）をいう。たとえば、ＴＮＦＲ１の拮抗剤は、ＴＮＦαによるＴＮＦＲ１への結合および／またはＴＮＦＲ１を介して媒介されるシグナル伝達を抑制することができる。したがって、ＴＮＦＲ１媒介プロセスおよび細胞応答（たとえば標準Ｌ９２９細胞毒性アッセイにおけるＴＮＦα誘発細胞死）は、ＴＮＦＲ１の拮抗剤によって抑制できる。
【００２６】
「患者」は、任意の動物、たとえば哺乳類、たとえば非ヒト霊長類（ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルなど）、マウス、ヒト、ウサギ、ラット、イヌ、ネコまたはブタである。一つの実施態様では、患者はヒトである。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「ペプチド」は、ペプチド結合を介して結合される、約２〜約５０個のアミノ酸をいう。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合される、少なくとも約５０個のアミノ酸をいう。ポリペプチドは、通常三次構造を含み、機能ドメインの形に折り畳まれる。
【００２９】
本明細書で用いる場合、抗体は、自然に抗体を産生する任意の種に由来するか、または組換えＤＮＡ技術によって作製されたものか、あるいは血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されたものであるかに拘らず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥまたは断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造の多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体）をいう。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「抗体の型式」とは、構造的に抗原への結合特異性を与えるため、１つまたは複数の抗体可変ドメインを組み込むことができる、任意の適切なポリペプチド構造をいう。種々の適切な抗体の型式は、当技術分野で既知であり、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体ならびにヘテロ二量体、前述のいずれかの抗原結合断片（たとえばＦｖ断片（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖなど）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（たとえば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、および前述の任意の修飾バージョン（たとえばポリエチレングリコールもしくは他の適切なポリマーの共有結合またはヒト化ＶＨＨによる修飾）がある。
【００３１】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、異なるＶ領域もしくはＶドメインとは独立して抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）をいう。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを有する型式（たとえば、ホモ多量体またはヘテロ多量体）で存在することができるが、この他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合には必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは当該追加の可変ドメインとは独立に抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」という用語は、本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」という用語は、本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一つの実施態様では、ヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（たとえば、国際公開第００／２９００４号パンフレットに開示され、その全開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる）、テンジクザメおよびラクダ科の動物（Camelid）のＶＨＨｄＡｂなどの他の種に由来する単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科の動物のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、自然には軽鎖が欠如する重鎖抗体を産生する。ＶＨＨはヒト化されてもよい。
【００３２】
「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分から独立して三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。通常、ドメインはタンパク質の異なる機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの部分の機能を失わずに付加、除去、または他のタンパク質へ移転される。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインを特徴づける配列を有する折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、これには、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン（たとえば、その１つまたは複数のループが、抗体可変ドメインを特徴づけていない配列で置き換えられている）、あるいは切断された抗体可変ドメインまたはＮ末端もしくはＣ末端の伸長部を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも完全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片が含まれる。 
【００３３】
本願では、「予防」および「予防する」という用語には、疾患または病態が誘発される前に行われる保護組成物の投与が含まれる。「治療」および「治療する」には、疾患または病態の症状が現れた後に行われる保護組成物の投与が含まれる。「抑制」または「抑制する」とは、疾患または病態の誘発現象の後のことではあるが、その疾患または病態の臨床的出現より前に行われる組成物の投与をいう。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「用量」という用語は、被験体に、一度（単位用量）に、または規定された時間間隔にわたり２回以上の投与で投与されるリガンドの量をいう。たとえば、用量は、１日（２４時間）（１日量）、２日、１週間、２週間、３週間または１ヵ月以上の期間にわたり被験体に投与（たとえば単回投与によって、または２回以上の投与によって）されるリガンド（たとえば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド）の量をいうことができる。投与間隔は任意の所望の時間量であり得る。用量について用いられる「薬学的に有効な」という用語は、所望の効果をもたらすためのリガンド、ドメインまたは薬学的に活性な薬剤の十分な量を意味する。「有効」である量は、個体の年齢および全身状態、特定の薬物または薬学的に活性な薬剤等に応じて、被験体間で異なる。したがって、すべての患者に適用できる正確な「有効」量を特定することは、必ずしも可能でない。しかし、いずれの個体の場合でも、適切な「有効」量は、通常の実験方法を用いて当業者によって決定可能である。
【００３５】
薬物動態学的分析およびリガンド（たとえば単一可変ドメイン、融合タンパク質または多重特異性リガンド）の半減期の決定方法は、当業者にはよく知られている。詳細は、Kenneth, A et.al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists およびPeters et,al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach(1996)に見出すことができる。また、“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition(1982)を参照されたい。この文献は、ｔαおよびｔβ半減期ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）などの薬物動態パラメータを説明している。任意に、本明細書で引用されるすべての薬物動態パラメータおよび値は、ヒトでの値であると判断してよい。任意に、本明細書で引用されるすべての薬物動態パラメータおよび値は、マウスまたはラットまたはカニクイザルでの値であると判断してよい。
【００３６】
半減期（ｔ１／２αとｔ１／２β）およびＡＵＣは、リガンドの血清濃度対時間の曲線から決定することができる。たとえば、WinNonlin解析パッケージ、たとえばバージョン５．１（Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USAから入手可能)を用いて、曲線をモデル化することができる。２コンパートメントモデリングを用いるとき、第１相（α相）において、リガンドは一部除去されるが、患者内で主として分布中である。第２相（β相）はリガンドが分布終了したときの相であり、リガンドが患者から除去されるにつれて、血清濃度は低下する。ｔα半減期は第１相の半減期であり、ｔβ半減期は第２相の半減期である。このように、一つの実施態様では、本発明と関連して、可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、１５分（またはおよそ１５分）以上の範囲の半減期を有する。一つの実施態様では、この範囲の下限は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間もしくは１２時間（またはそれぞれおよその時間）である。さらに、または代わりに、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、１２時間（またはおよそ１２時間）までの範囲のｔα半減期を有する。一つの実施態様では、この範囲の上限は、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６または５時間（またはそれぞれおよその時間）である。適切な範囲の例は、１〜６時間、２〜５時間、もしくは３〜４時間（またはそれぞれおよその時間範囲）である。
【００３７】
一つの実施態様では、本発明は、２．５時間（またはおよそ２．５時間）以上の範囲のｔβ半減期を有する本発明の可変ドメイン、融合タンパク質もしくはリガンドを提供する。一つの実施態様では、この範囲の下限は、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間（もしくはそれぞれおよその時間）である。さらに、または代わりに、ｔβ半減期は、２１日または２５日（もしくはおよそ２１日または２５日）までである。一つの実施態様では、この範囲の上限は、１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日、１９日、２０日、２１日または２２日（またはそれぞれおよその時間もしくは日数）である。たとえば、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、１２〜６０時間（またはおよそ１２〜６０時間）の範囲のｔβ半減期を有する。さらなる実施態様では、それは、１２〜４８時間（またはおよそ１２〜４８時間）の範囲である。さらなる実施態様では、それは、１２〜２６時間（またはおよそ１２〜２６時間）の範囲である。
【００３８】
２コンパートメントモデリングを用いる代わりに、ノンコンパートメントモデリングを用いることも当業者によく知られている。このモデリングを用いて、終末半減期を決定することができる（本明細書で用いる場合、用語「終末半減期」は、ノンコンパートメントモデリングを用いて決定される終末半減期を意味する）。たとえば、この方法で曲線をモデル化するため、WinNonlin解析パッケージ、たとえばバージョン５．１（Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USAから入手可能）を用いることができる。この場合、一つの実施態様では、単一可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、少なくとも（もしくは少なくともおよそ）８時間、１０時間、１２時間、１５時間、２８時間、２０時間、１日、２日、３日、７日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日もしくは２５日の終末半減期を有する。一つの実施態様では、この範囲の上限は、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間または１２０時間（またはそれぞれおよその時間）である。たとえば、終末半減期は、たとえばヒトにおいて８〜６０時間、または８〜４８時間、または１２〜１２０時間（またはそれぞれおよその範囲）である。
【００３９】
さらに、または上述の判断基準の代わりに、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ以上（またはおよそ１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ）の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する。一つの実施態様では、この範囲の下限は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ（またはそれぞれおよその数値）である。さらに、または代わりに、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、６００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ（またはおよその数値）までの範囲のＡＵＣを有する。一つの実施態様では、この範囲の上限は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ（またはそれぞれおよその値）である。可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、以下からなる群から選択される範囲（またはおよそその範囲）のＡＵＣを有すれば有利である：１５〜１５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜１００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜７５ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、および１５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ。
【００４０】
「表面プラズモン共鳴法」：ヒト血清アルブミンなどの特異抗原またはエピトープが、本明細書に記述する血清アルブミン結合リガンド（たとえば特異的ｄＡｂ）との結合に関して、カニクイザル血清アルブミンなどの別の抗原またはエピトープと競合するかどうかを、競合アッセイを用いて決定することができる。同様に、競合アッセイを用いて、標的抗原またはエピトープとの結合に関して、ｄＡｂなどの第１のリガンドがｄＡｂなどの第２のリガンドと競合するかどうかを決定することができる。本明細書で用いる場合、「競合する」という用語は、２つ以上の分子間の特異的結合相互作用を任意の程度まで妨げることができる分子、化合物、好ましくはタンパク質などの物質について言及される。「競合的に阻害しない」という語句は、分子、化合物、好ましくはタンパク質などの物質が、２つ以上の分子間の特異的結合相互作用を、任意の測定可能な程度まで、またはかなりの程度まで妨げないことを意味する。２つ以上の分子間の特異的結合相互作用は、単一可変ドメインとその同族パートナーまたは標的との間の特異的結合相互作用を含むことが好ましい。干渉する、または競合する分子は、別の単一可変ドメインであることができ、または同族のパートナーもしくは標的に構造的および／または機能的に類似する分子でありうる。
【００４１】
「結合部分」という用語は、異なるエピトープまたは抗原結合ドメインとは独立に、ある抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインをいう。結合部分は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）であってもよく、または非免疫グロブリンタンパク質骨格、たとえば、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アドネクチン、アフィボディ、ａｖｉｍｅｒ、ＧｒｏＥＩ、トランスフェリン、ＧｒｏＥＳおよびフィブロネクチンからなる群から選択される骨格の誘導体で、天然リガンド以外のリガンドに結合する（本発明の場合、この部分は血清アルブミンに結合する）ドメインであってもよい。国際公開第２００８／０９６１５８号パンフレットを参照されたい。この文献は、タンパク質骨格の実施例と、抗原またはエピトープ特異的結合ドメインをレパートリーから選択する方法とを開示している（実施例１７〜２５を参照されたい）。国際公開第２００８／０９６１５８号パンフレットにおけるこれらの具体的な開示は、あたかも本明細書に明示的に記載され、かつ本発明とともに使用するためであるかのように、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。かかる開示のいずれの部分も、本発明の１または複数の請求項に組み込むことができるものとする。
【００４２】
一つの実施態様では、本発明の可変ドメインは以下の速度論的特性のうちの１つまたは複数を含む：
（ａ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、０．１（またはおよそ０．１）〜１００００（またはおよそ１００００）ｎＭ、任意に１（またはおよそ１）〜６０００（またはおよそ６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、ヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｂ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、１．５×１０−４（またはおよそ１．５×１０−４）〜０．１（またはおよそ０．１）ｓｅｃ−１、任意に３×１０−４（またはおよそ３×１０−４）〜０．１（またはおよそ０．１）ｓｅｃ−１の解離速度定数（Ｋｄ）でヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｃ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、２×１０６（またはおよそ２×１０６）〜１×１０４（またはおよそ１×１０４）Ｍ−１ｓｅｃ−１、任意に１×１０６（またはおよそ１×１０６）〜２×１０４（またはおよそ２×１０４）Ｍ−１ｓｅｃ−１の結合速度定数（Ｋａ）でヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｄ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、０．１（またはおよそ０．１）〜１００００（またはおよそ１００００）ｎＭ、任意に１（またはおよそ１）〜６０００（またはおよそ６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）ＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｅ）可変ドメインが、表面プラズモン共鳴法で測定される、１．５×１０−４（またはおよそ１．５×１０−４）〜０．１（またはおよそ０．１）ｓｅｃ−１、任意に３×１０−４（またはおよそ３×１０−４）〜０．１（またはおよそ０．１）ｓｅｃ−１の解離速度定数（Ｋｄ）でカニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、前述の請求項のいずれかに記載の可変ドメイン；
（ｆ）可変ドメインが、表面プラズモン共鳴法で測定される、２×１０６（またはおよそ２×１０６）〜１×１０４（またはおよそ１×１０４）Ｍ−１ｓｅｃ−１、任意に１×１０６（またはおよそ１×１０６）〜５×１０３（またはおよそ５×１０３）Ｍ−１ｓｅｃ−１の結合速度定数（Ｋａ）でカニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、前述の請求項のいずれかに記載の可変ドメイン；
（ｇ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、０．１（またはおよそ０．１）〜１００００（またはおよそ１００００）ｎＭ、任意に１（またはおよそ１）〜６０００（またはおよそ６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、ラットＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｈ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、２×１０−３（またはおよそ２×１０−３）〜０．１５（またはおよそ０．１５）ｓｅｃ−１、任意に９×１０−３（またはおよそ９×１０−３）〜０．１４（またはおよそ０．１４）ｓｅｃ−１の解離速度定数（Ｋｄ）で、ラットＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｉ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、２×１０６（またはおよそ２×１０６）〜１×１０４（またはおよそ１×１０４）Ｍ−１ｓｅｃ−１、任意に１×１０６（またはおよそ１×１０６）〜３×１０４（またはおよそ３×１０４）Ｍ−１ｓｅｃ−１の結合速度定数（Ｋａ）で、ヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｊ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、１（またはおよそ１）〜１００００（またはおよそ１００００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、マウスＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｋ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、２×１０−３（またはおよそ２×１０−３）〜０．１５（またはおよそ０．１５）ｓｅｃ−１の解離速度定数（Ｋｄ）で、マウスＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；および／または
（ｌ）可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定される、２×１０６（またはおよそ２×１０６）〜１×１０４（またはおよそ１×１０４）Ｍ−１ｓｅｃ−１、任意に２×１０６（またはおよそ２×１０６）〜１．５×１０４（またはおよそ１．５×１０４）Ｍ−１ｓｅｃ−１の結合速度定数（Ｋａ）で、マウスＳＡに特異的に結合する結合部位を含む。
【００４３】
任意に、可変ドメインは、
Ｉ：（ａ）および（ｄ）に記載のＫＤ、（ｂ）および（ｅ）に記載のＫｄ、ならびに（ｃ）および（ｆ）に記載のＫａ；または
ＩＩ：（ａ）および（ｇ）に記載のＫＤ、（ｂ）および（ｈ）に記載のＫｄ、ならびに（ｃ）および（ｉ）に記載のＫａ；または
ＩＩＩ：（ａ）および（ｊ）に記載のＫＤ、（ｂ）および（ｋ）に記載のＫｄ、ならびに（ｃ）および（ｌ）に記載のＫａ；または
ＩＶ：ＩおよびＩＩに記載の反応速度；または
Ｖ：ＩおよびＩＩＩに記載の反応速度；または
ＶＩ：Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに記載の反応速度
を有する。
【００４４】
本発明はまた、上述の本発明の態様または実施態様のいずれかの可変ドメインを含むリガンドを提供する。たとえば、リガンドは二重特異的なリガンドであり得る（二重特異性リガンドについては国際公開第０４／００３０１９号パンフレットを参照されたい）。一つの態様では、本発明は、上述の本発明の態様または実施態様のいずれかの抗ＳＡ可変ドメインと、ＳＡ以外の標的抗原に特異的に結合する結合部位とを含む、多重特異性リガンド提供する。この結合部分は、標的に特異的に結合するいかなる結合部分であってもよく、たとえば、この結合部分は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｄＡｂ、または非免疫グロブリンタンパク質骨格を含む結合部分である。このような部分は、国際公開第２００８／０９６１５８号パンフレットに詳細に開示されている（実施例１７〜２５を参照されたい。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）。非免疫グロブリン骨格の例は、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ブドウ球菌タンパク質Ａ（ｓｐＡ）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）、Ａｖｉｍｅｒ（商標）、アデネクチン、ＧｒｏＥＬおよびフィブロネクチンである。
【００４５】
一つの実施態様では、リンカーが抗標的結合部分と抗ＳＡ可変ドメインの間に備えられ、該リンカーはアミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む。別のリンカーは、国際公開第２００７／０８５８１４号パンフレット（参照によって本明細書に組み込まれる）および国際公開第２００８／０９６１５８号パンフレット（第１３５頁第１２行〜第１４０頁第１４行を参照されたい。リンカーについての開示およびすべての配列は、あたかも本明細書に明示的に書かれ、かつ本発明とともに使用するためであるかのように、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。この開示のいずれの部分も本明細書の１または複数の請求項に組み込むことができるものとする）に記載されている。
【００４６】
多重特異性リガンドの一つの実施態様では、標的抗原は、ポリペプチド、タンパク質または核酸であってもよく、またはその一部であってもよい。これらは天然に存在するものであってもよいし、合成物であってもよい。この点において、本発明のリガンドは、標的抗原に結合し、拮抗剤または作動薬（たとえばＥＰＯ受容体作動薬）として作用することもある。当業者は、その選択肢が広範で多様であることを理解するであろう。たとえば、それらは、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体であってもよく、サイトカイン受容体には、サイトカイン、酵素、酵素の補助因子、またはＤＮＡ結合タンパク質のための受容体が含まれる。適切なサイトカインおよび増殖因子としては、好ましくは限定されないが、以下が挙げられる：ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エクソダス−２、ＥｐｏＲ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト増殖因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ミューラー管抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄系前駆細胞抑制因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ランテス、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４、ＣＤ４、ヒトケモカイン受容体ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５、Ｃ型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質３型（ＮＳ３）、ＴＮＦ−α、ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ、ＭＭＰ−１２、ＣＥＡ、ピロリ菌、ＴＢ、インフルエンザ、Ｅ型肝炎、ＭＭＰ−１２、いくつかの細胞上で過剰発現しインターナライジングする受容体（たとえば上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、腫瘍細胞上のＥｒＢｂ２受容体、インターナライジング細胞受容体、ＬＤＬ受容体、ＦＧＦ２受容体��ＥｒｂＢ２受容体、トランスフェリン受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＰｓｍＡｒ、細胞外基質タンパク質、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、α１−アンチトリプシン，組織因子プロテアーゼ阻害剤、ＰＤＫ１、ＧＳＫ１、Ｂａｄ、カスパーゼ−９、フォークヘッド、ヘリコバクターピロリの抗原、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの抗原、およびインフルエンザウイルスの抗原。このリストが決して完全でないことは明らかであろう。
【００４７】
一つの実施態様では、多重特異性リガンドは、本発明の抗ＳＡ  ｄＡｂ可変ドメインと、抗ＴＮＦＲ１結合部分、たとえば抗ＴＮＲＦ１ ｄＡｂとを含む。任意に、このリガンドは、受容体の架橋結合の機会を減少させるため、抗ＴＮＦＲ１結合部分（たとえばｄＡｂ）を一つだけ有する。一つの実施態様では、抗ＳＡ  ｄＡｂは、配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列（または配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列）を含むか、または該アミノ酸配列からなる。
【００４８】
一つの実施態様では、抗ＴＮＦＲ１結合部分は、国際公開第２００８／１４９１４８号パンフレットに開示されるＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６である（このＰＣＴ出願に開示されている、ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、あたかも本明細書に書かれ、かつ本発明とともに使用するためであるかのように、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。この開示のいかなる部分も本明細書の１または複数の請求項に組み込むことができるものとする）。一つの実施態様では、多重特異性リガンドは、ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列と、配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列（または配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列）とを含むか、またはこれらからなる。
【００４９】
一つの実施態様では、抗ＴＮＦＲ１結合部分またはｄＡｂは、同時係属の米国特許出願第６１／１５３，７４６号明細書に開示されるそのような部分またはｄＡｂであり、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。一つの実施態様では、抗ＴＮＦＲ１結合部分は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２もしくはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列または本明細書に開示される抗ＴＮＦＲ１ ｄＡｂのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一つの実施態様では、多重特異性リガンドは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６のアミノ酸配列と、配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列（または配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列）とを含むか、またはこれらからなる。
【００５０】
一つの実施態様では、本発明のリガンドは、１つまたは複数のポリペプチドに直接的もしくは間接的に融合された本発明の可変ドメインを含む、融合タンパク質である。たとえば、この融合タンパク質は、国際公開第２００５／１１８６４２号パンフレット（この開示は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるような、本発明の可変ドメインと、このＰＣＴ出願に定義されるポリペプチド薬物とを含む「薬物融合体」であり得る。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「薬物」とは、個体に投与され、該個体内で生物学的標的分子に結合し、および／またはその機能を変化させることによって薬効、治療効果または診断効果をもたらすことができる、任意の化合物（たとえば有機小分子、核酸、ポリペプチド）をいう。標的分子は、個体のゲノムによってコードされる内在性標的分子（たとえば個体のゲノムによってコードされる酵素、受容体、増殖因子、サイトカイン）または病原体のゲノムによってコードされる外因性標的分子（たとえばウイルス、細菌、真菌、線虫または他の病原体のゲノムによってコードされる酵素）であり得る。本発明のＳＡ  ｄＡｂドメインを含む融合タンパク質および接合体で用いられる適切な薬物は、国際公開第２００５／１１８６４２号パンフレットおよび第２００６／０５９１０６号パンフレットに開示されている（これらの開示全体を参照し、かつあたかも特定薬物のリストが本明細書に明示的に記載されたかのようにこのリスト全体を本明細書に組み込む。かかる組み込みにより、本明細書の請求項に包含される特定薬物が開示されるものとする）。たとえば、薬物はグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）もしくは変異体、インターフェロンα２ｂもしくは変異体、またはエキセンディン−４もしくは変異体であり得る。
【００５２】
一つの実施態様では、本発明は、国際公開第２００５／１１８６４２号パンフレットおよび第２００６／０５９１０６号パンフレットに定義され、かつ開示される薬物接合体であって、本発明の可変ドメインを含む薬物接合体を提供する。一つの例では、薬物は可変ドメインに共有結合している（たとえば可変ドメインおよび薬物は単一ポリペプチドの一部として発現される）。あるいは、一つの例では、薬物は可変ドメインと非共有結合または会合する。薬物は、（たとえば、適切なリンカーおよび／または相補結合パートナー（たとえばビオチンおよびアビジン）の非共有結合を介して）、共有結合的または非共有結合的に、可変ドメインと直接的または間接的に結合され得る。相補結合パートナーを用いるとき、結合パートナーのうちの１つは、薬物に直接的に、または適切なリンカー部分を介して共有結合させることができ、相補結合パートナーは可変ドメインに直接的に、または適切なリンカー部分を介して共有結合させることができる。薬物がポリペプチドまたはペプチドであるとき、薬物組成物は、該ポリペプチドまたはペプチド、薬物およびポリペプチド結合部分が連続したポリペプチド鎖の個々の部分である、融合タンパク質であり得る。本明細書で記述する場合、ポリペプチド結合部分およびポリペプチド薬物部分は、ペプチド結合を介して直接互いに結合させることができるか、または適切なアミノ酸、またはペプチドもしくはポリペプチドのリンカーを介して連結できる。
【００５３】
血清アルブミンに特異的に結合する本発明の１つの単一可変ドメイン（たとえば単量体）、または２つ以上の単一可変ドメイン（本明細書で定義されるような多量体、融合タンパク質、接合体、および二重特異性リガンド）を含むリガンドは、標識、タグ、追加の単一可変ドメイン、ｄＡｂ、抗体、および抗体断片、マーカーおよび薬物（好ましくはこれらに限定されない）から選択される１つまたは複数の物質をさらに含むことができる。これらの物質の１つまたは複数を、単一可変ドメイン（免疫グロブリンの単一可変ドメインまたは非免疫グロブリンの単一可変ドメイン）を含むリガンドのＣＯＯＨ末端もしくはＮ末端のいずれかに、またはＮ末端およびＣＯＯＨ末端の両方に配置することができる。これらの物質の１つまたは複数は、１つの単一可変ドメイン（単量体）または２つ以上の単一可変ドメイン（本明細書で定義されるような多量体、融合タンパク質、接合体、および二重特異性リガンド）を含むリガンドの、血清アルブミンに特異的に結合する単一可変ドメインのＣＯＯＨ末端もしくはＮ末端、またはＮ末端およびＣＯＯＨ末端の両方に配置することができる。これらの末端の１つまたは両方に配置することができるタグの非限定的な例としては、ＨＡ、ｈｉｓまたはｍｙｃタグが挙げられる。１つまたは複数のタグ、標識および薬物を含む物質は、上述のように直接的に、またはリンカーを介して、血清アルブミンに結合する１つの単一可変ドメイン（単量体）または２つ以上の単一可変ドメイン（本明細書で定義されるように多量体、融合タンパク質、接合体、および二重特異性リガンド）を含むリガンドに結合させることができる。
【００５４】
本発明のある態様では、融合産物、例えば融合タンパク質またはペプチドとの融合物またはＮＣＥ（新規化学物質）薬物との接合体、が提供され、該融合産物は、上述のいずれかの可変ドメインに融合された、もしくは（ＮＣＥについては）接合されたポリペプチド薬物を含む。任意に、該可変ドメインは、配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列（または配列番号９７〜１０３および１９８〜２０３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列）を含むか、または該アミノ酸配列からなる。
【００５５】
本発明は、本発明のいずれかの態様の可変ドメイン、融合タンパク質、接合体またはリガンド、および薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤もしくはビヒクルを含む組成物を提供する。
【００５６】
また、本明細書に記述する可変ドメイン、融合タンパク質、接合体またはリガンド、たとえば、血清アルブミンに特異的に結合する、またはヒト血清アルブミンおよび少なくとも１種の非ヒト血清アルブミンの双方に特異的に結合する、本発明の１つの単一可変ドメイン（たとえば単量体）または２つ以上の単一可変ドメイン（たとえば、本明細書に定義されるような多量体、融合タンパク質、接合体、および二重特異性リガンド）を含むリガンド、またはその機能的活性断片のいずれかをコードする単離された核酸も、本明細書に包含される。また、本明細書に包含されるのは、次のとおりである：ベクターおよび／または発現ベクター；該ベクターを含む宿主細胞（たとえば、非ヒト宿主細胞、またはヒトもしくはヒト胎児から単離されていない宿主細胞）、たとえばベクターで形質転換された植物もしくは動物細胞および／または細胞系；上述のベクターによってコードされる、血清アルブミンに特異的に結合する１つまたは複数の可変ドメイン、融合タンパク質、もしくは１つの単一可変ドメイン（単量体）または２つ以上の単一可変ドメイン（たとえば、本明細書に定義される多量体、融合タンパク質、接合体および二重特異性リガンド）を含むリガンド、またはそれらの断片を発現および／または産生する方法であって、場合により、１つまたは複数の可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドもしくはそれらの断片が発現されるように前記宿主細胞を培養する工程と、所望により、血清アルブミンに特異的に結合する１つの単一可変ドメイン（単量体）または２つ以上の単一可変ドメイン（たとえば、本明細書で定義される多量体、融合タンパク質、接合体および二重特異性リガンド）を含むリガンドを宿主細胞培養培地から回収する工程を含む方法。また、本明細書に記述するリガンドを、血清アルブミンおよび／または非ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、および／または血清アルブミン以外の１つまたは複数の標的と接触させる方法も包含される。ここで、標的としては、生物活性分子が挙げられ、動物タンパク質、先に列挙したサイトカイン類が挙げられる。この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程、ならびに本明細書に記載の任意の可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドを、個々の宿主動物または細胞にｉｎ  ｖｉｖｏおよび／もしくはｅｘ  ｖｉｖｏで投与する工程も含む。好ましくは、血清アルブミンおよび／または非ヒト血清アルブミンに向けられた単一可変ドメイン（免疫グロブリンまたは非免疫グロブリン）と、血清アルブミン以外の１つまたは複数の標的に向けられた１つまたは複数のドメインとを含む本明細書に記載のリガンドの投与は、抗標的リガンドのｔβ半減期および／または終末半減期を含む半減期を増加させることになる。該ドメイン、融合タンパク質もしくは単一ドメインを含むリガンド、またはその断片（例えばその機能的断片）をコードする核酸分子も、本明細書に包含されている。該核酸分子をコードするベクター、例えば、好ましくは限定されるものではないが、発現ベクターは、これらの発現ベクターのうちの１つまたは複数を含む細胞系または生物に由来する宿主細胞とともに、本明細書に包含されている。また、上述の核酸、ベクター���よび宿主細胞のいずれかを含むが、好ましくはこれらに限定されない、任意のドメイン、融合タンパク質またはリガンドを産生する方法も包含されている。
【００５７】
本発明のある態様によれば、本発明による可変ドメインまたは本発明の多重特異性リガンドまたは本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
【００５８】
本発明のある態様によれば、配列番号１〜９６および１９２〜１９７のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはこの選択された配列と少なくとも７０、７５、８０，８５、９０，９５、９６、９７、９８、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
【００５９】
本発明のある態様によれば、本発明の核酸を含むベクターが提供される。本発明のある態様によれば、該ベクターを含む単離された宿主細胞が提供される。
【００６０】
ライブラリーベクター系の詳細については、単一可変ドメイン、二重特異性リガンドの特徴付け、二重特異性リガンドの構造、二重特異性リガンドの構築で用いる骨格、抗血清アルブミンｄＡｂおよび多重特異性リガンドおよび半減期を向上させたリガンドの用途、ならびに抗血清アルブミンｄＡｂを含む組成物および製剤も組み合わせて、国際公開第２００８／０９６１５８号パンフレットを参照されたい。これらの開示は、本発明のドメイン、リガンド、融合タンパク質、接合体、核酸、ベクター、宿主および組成物など、本発明の使用のためのガイダンスを提供するため、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６１】
抗血清アルブミンＶＨ単一可変ドメインの配列
ＳＰＲで決定したように、すべての可変ドメインは少なくとも１種の血清アルブミンに結合する。
【００６２】
【化１】
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【実施例】
【００６３】
実施例１
生物物理学的特性
２．５Ｌの振盪フラスコ内のＯｎｅｘ培地において、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４８時間培養した後、通常の細菌発現レベルを決定した。生物物理学的特性をＳＥＣ  ＭＡＬＬＳおよびＤＳＣによって決定した。
【００６４】
ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱検出器を備えたサイズ排除クロマトグラフィー）は、溶液中の巨大分子の特徴づけのための非侵襲性手法である。手短に言えば、タンパク質（ダルベッコＰＢＳバッファ中１ｍｇ／ｍＬの濃度）を、それらの流体力学的性質によって、サイズ排除クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ３０００、Ｓ２００）を用いて分離する。分離の後に、光を散乱させるタンパク質の性質を、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を使用して測定する。タンパク質が検出器を通る間に、散乱した光の強度を、角度の関数として測定する。屈折率（ＲＩ）検出器を使用して決定されるタンパク質濃度とこの測定との組み合わせにより、適切な式（解析ソフトウェアＡｓｔｒａ  ｖ．５．３．４．１２の整数部）を用いてモル質量を算出することが可能となる。溶出ピークの中間点での最高濃度は、約８〜１０μＭであり、これは結果的に、ＭＡＬＬＳが該タンパク質の溶液中の状態を決定する濃度である。
【００６５】
ＤＳＣ（示差走査熱量測定法）：手短に言えば、タンパク質（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）を１８０℃／時間の定率で加熱し、熱変性に付随する検出可能な熱変化を測定する。遷移中間点（ａｐｐＴｍ）を決定する。これは、タンパク質の５０％がその未変性コンホメーションの状態であり、残りの５０％が変性した状態となる温度である。ここで、試験される大部分のタンパク質は再度十分に折り畳まれないので、見かけの遷移中間点（ａｐｐＴｍ）がＤＳＣによって決定される。Ｔｍが高ければ高いほど、分子はより安定である。使用したソフトウェアパッケージは、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）ｖ７．０３８３であった。
【００６６】
ＶＨ  ｄＡｂの特性を、下記の表１にまとめる。ＡｌｂｕｄＡｂｓ（商標）（すなわち抗血清アルブミンｄＡｂ）の交差反応性は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて、ヒト、カニクイザル（Cynomolgus monkey）（ｃｙｎｏ）、ラットおよびマウスの血清アルブミン（表中の「４ＡＧ」）に対して決定された。この場合、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を用いた。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメイン１、２および／または３（Ｄ１、２、３）へのエピトープマッピングは、ＳＰＲを用いて実施し、ＣＭ５チップ（アミンカップリング）と共有結合したＨＳＡ（自社）の個々のドメインを精製した。この発現は、２．５Ｌバッフル底ガラスフラスコ中、５００ｍＬの容量で、ＯｖｅｒＮｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）中、３０℃、２５０ｒｐｍで行った。
【００６７】
ＭＡＬＬＳの結果：単一ＶＨ  ＡｌｂｕｄＡｂの大きさは、１４ｋＤａである。ＭＡＬＬＳで決定された１４ｋＤａと２８ｋＤａの間のいずれの値も、様々な程度の自己会合または二量体形成を示している（すなわち、１６ｋＤａは試験した条件下で主に単量体であるが、２２ｋＤａはＭＡＬＬＳ条件下で二量体化する強い傾向を示す）。
【００６８】
ＤＳＣの結果：ＤＳＣ実験でのタンパク質の濃度は、ＭＡＬＬＳと比較すると、実際の反応セル中、１ｍｇ／ｍＬとかなり高い。この高い濃度は、表１に見られるように、幾つかのＡｌｂｕｄＡｂに対して２つのａｐｐＴｍが存在することを一部説明することができるであろう；第１のＴｍが、二量体複合体の解離を構成するのに対して、第２のＴｍは、実際のＡｂｕｄＡｂタンパク質の変性を表す。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
ＤＯＭ７ｈ−１１２は別として、上記のすべてのＡｌｂｕｄＡｂリードは、４種の血清アルブミンの間で完全に交差反応する。特定されたすべてのＡｌｂｕｄＡｂは、非最適化条件下で、振盪フラスコ中でＨＳＡのドメイン２に結合して、理論どおりに発現する。ＭＡＬＬＳで測定すると、７ＡｌｂｕｄＡｂ中の５つは単量体であるが、ＤＯＭ７ｒ−３５は、ＭＡＬＬＳ条件下で二量体化する顕著な傾向を示す。単量体状態は、二量体化と、細胞表面受容体などの標的を架橋結合しうる産物のリスクとを回避するので、有利である。
【００７１】
ＤＯＭ７ｒ−３６は、ある程度の凝集体形成を示す（ＭＡＬＬＳ上で定量したところ、１０％未満）。７ＡｌｂｕｄＡｂ中の５つに対して、２つのａｐｐＴｍが決定されうる。これは、ＤＳＣ実験での実験濃度が高いためであり、このような高濃度では、ｄＡｂの溶液中の状態は若干異なる（詳細については、上述の説明を参照されたい）。
【００７２】
実施例２
ラットにおける血清半減期の決定
ＡｌｂｕｄＡｂをｐＤＯＭ５ベクター中にクローニングした。ｐＤＯＭ５ベクターは、タンパク質発現がＬａｃＺプロモーターによって駆動されるｐＵＣ１１９ベースの発現ベクターである。ＧＡＳ１リーダー配列（国際公開第２００５／０９３０７４号パンフレットを参照されたい）は、単離された可溶性ｄＡｂが大腸菌（E. coli）の周辺質および培養上清に確実に分泌されるようにする。ｄＡｂは、ｄＡｂのＣ末端でｍｙｃタグを付加するこのベクター内でクローン化されたＳａｌＩ／ＮｏｔＩである。各ＡｌｂｕｄＡｂに対して２０〜５０ｍｇの量を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させ、タンパク質Ａ親和性樹脂を使用して細菌培養上清から精製し、次いで１００ｍＭのグリシン、ｐＨ２を用いて溶出した。これらのタンパク質をＱスピンカラム（Vivascience）を使用して、１ｍｇ／ｍＬを超えるまで濃縮し、ＰＢＳにバッファ交換し、次いでエンドトキシンを枯渇させた。ラットの薬物動態（ＰＫ）解析のために、１化合物あたり３匹のラットを用いて、ＡｌｂｕｄＡｂを２．５ｍｇ／ｋｇで単回静脈注入として投与した。血清試料を、０．１６時間、１時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間で採取した。血清レベルの分析を、抗ｍｙｃ捕捉によって、それに続いて以下に記述する方法による抗ＶＨ検出ＥＬＩＳＡによって行った。
【００７３】
結果を表２に示す。試験したすべてのＡｌｂｕｄＡｂは、血清半減期を様々な程度まで延ばす能力を示す（陰性対照ＨＥＬ４  ｄＡｂは、ラットにおいて２０分間のＴ１／２を有する）；この傾向は、最長Ｔ１／２に対する最高値である算出されたＡＵＣでも見ることができる。３４．５時間の血清最長半減期は、ラット血清アルブミンの血清半減期に近似する。
【００７４】
ＡｌｂｕｄＡｂのＲＳＡへの特異的親和性を決定する必要があるだろう。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
ＭＳＤを用いる抗ｍｙｃ  ＥＬＩＳＡ法
血清中のＡｌｂｕｄＡｂ濃度を抗ｍｙｃ  ＥＬＩＳＡによって測定した。手短に言えば、ヤギ抗ｍｙｃポリクローナル抗体（１：５００；Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ９１３２）を，Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に終夜コ−ティングし、５％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋１％ＴＷＥＥＮ（商標）でブロッキングした。血清試料を、既知の濃度の標準溶液と一緒に、所定の範囲の希釈濃度で加えた。次いで、ＭＳＤスルホタグで直接標識したウサギポリクローナル抗ＶＨを用いて、結合したｍｙｃタグ付きＡｌｂｕｄＡｂを検出した。各ｄＡｂは、１０％の対照ラット血清を含有するアッセイ緩衝液で希釈した（１：１０００；自社試薬）（方法ＤＭ２２２）。ＭＳＤ（MesoScaleDiscovery; MesoScale.com）は、電気化学的刺激の後、スルホタグの電気化学発光検出を利用している。
【００７７】
ＥＬＩＳＡの生データから、希釈係数を考慮に入れて標準曲線に対する内挿によって、未知の試料の濃度を確立した。各時点での平均濃度結果を反復値から決定し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ解析パッケージ（たとえばバ−ジョン５．１（Pharsight Corp., Mountain View、CA94040, USAから入手可能）に入力した。ノンコンパートメントモデルを使用してデータフィッティングを行い、ＰＫパラメータをソフトウェアによって推定して、終末半減期を得た。投与情報および時点を選択して、各ＰＫプロフィールの末相に反映させた。
【００７８】
実施例３
ナイーブＶＨ  ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）の親和性成熟
ナイーブ選択から単離された１２のＶＨ  ＡｌｂｕｄＡｂのリードを、親和性成熟に向けて進めた。ＤＯＭ７ｒ−３６、ＤＯＭ７ｒ−３５、ＤＯＭ７ｒ−３１、ＤＯＭ７ｈ−９８、ＤＯＭ７ｈ−１１２、ＤＯＭ７ｒ−３８およびＤＯＭ７ｒ−２９についての個々のエラープローン（ＥＰ）ライブラリーを作製し、一方で以下の親クローンをプールして、単一のＥＰライブラリーに組み合わせ、共にスクリーニングした：ＤＯＭ７ｒ−８３、ＤＯＭ７ｒ−８５、ＤＯＭ７ｒ−９２、ＤＯＭ７ｒ−９４およびＤＯＭ７ｒ−９５。すべてのライブラリーは、２×１０９ＣＦＵ／ｍＬを超えていた。
【００７９】
選択は、可溶性抗原（ビオチン−ＨＳＡ；ビオチン−ＲＳＡ；２％Ｍａｒｖｅｌによるブロッキング）について、４ラウンドで、以下のように抗原の濃度を下げて交差選択によって行った：ラウンド１−１μＭ（ＨＳＡまたはＲＳＡ）で、ラウンド２−１μＭ（ＲＳＡまたはＨＳＡ）で、続いてさらに２ラウンドの選択−ラウンド２と同じ抗原を用いてそれぞれ１００ｎＭと１０ｎＭで。ラウンド３とラウンド４の両アウトプットからのおよそ３０００の試料を、上清ＢＩＡｃｏｒｅでスクリーニングして、それらの解離速度だけに従ってクローンをランク付けした。８点希釈の反応速度親和性測定を、改良型クローンで行った（下記データ）。
【００８０】
【表３】
2012532620.tif 000026
【００８１】
【表４】
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【００８２】
【表５】
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【００８３】
【化２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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