(57)【要約】組換えフォンビルブラント因子（ｒＶＷＦ）分子量マーカーと組み合わせて、ＭＡＬＤＩ質量分析法を使用して、少なくとも１５０ｋＤａの目的の検体の分子量を決定するための方法が開示される。より具体的には、モノマーｒＶＷＦおよびマルチマーｒＶＷＦが、１５０ｋＤａを上回る高分子量を有する検体に適用される質量スペクトルの外部較正および内部較正のために使用される。いくつかの実施形態において、上記検体は、少なくとも１０００ｋＤａもしくは少なくとも１５００ｋＤａのＭＷを有する。特定の実施形態において、上記検体は、抗体もしくは別の大きなタンパク質（例えば、フィブリノゲンもしくはコラーゲンまたはそれらの誘導体）である。
2012513602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子量の検体の分子量を決定するための、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルの外部較正および内部較正のための方法であって、該方法は、
ａ）既知の分子量の組換えフォンビルブラント因子（ｒＶＷＦ）の質量スペクトルを得る工程；
ｂ）質量分析法を介して検体を分析して、質量スペクトルを提供する工程であって、ここで該検体は、少なくとも５００ｋＤａの分子量を有する、工程；および
ｃ）該検体の該質量スペクトルを、該ｒＶＷＦの該質量スペクトルに相関させることによって、該検体の該分子量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記検体は、少なくとも１０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検体は、少なくとも１５００ｋＤａの分子量を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検体は、２００ｋＤより大きいタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検体は、免疫グロブリン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、もしくは第ＸＩＩＩ因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記質量分析法は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）もしくはマトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検体を脱塩した後に分析を行なう工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｒＶＷＦ中のＶＷＦのモノマー（配列番号１）の数を決定することによって、前記ｒＶＷＦの分子量を計算する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＶＷＦのモノマーは、ジスルフィド結合によってつながれる、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００８年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１４０，４７５号の利益を主張し、この出願の開示は、その全体が参照として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）は、約２６０ｋＤａ（ＳＤＳアガロースゲル電気泳動によって決定される１−３）のモノマーの分子質量を有する接着性複合糖タンパク質であり、ＶＷＦは、ヒト血漿中で、４５０ｋＤａ〜２００００ｋＤａ２，４，５の分子質量範囲に及ぶダイマーおよびオリゴマーとして循環している。前駆体ポリペプチドである、プレプロＶＷＦは、内皮細胞６，７および巨核球８において合成され、２２アミノ酸残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチドおよび２０５０残基のポリペプチドからなる９。上記シグナルペプチドのインビボでの除去後、２個のプロＶＷＦユニットは、ジスルフィド結合を介して連結し、成熟ＶＷＦマルチマーのための構築ブロックであるダイマーを形成する１０，１１。血漿放出の前に、上記プロペプチドは切断され、残りの部分は、いくつかの翻訳後修飾、すなわち、グリコシル化９，１２−１４および硫酸化１５を含む。最終成熟ＶＷＦは、１２個のＮ−グリカンおよび１０個のＯ−グリカンを有し、これに関して、特定のＮ−グリカンは、硫酸化によってさらに改変される１６。
【０００３】
上記炭水化物部分は、ＶＷＦのいくつかの具体的な特性（例えば、生理学的活性、レセプター結合、血漿循環からのクリアランスおよび構造安定性）に寄与する１７，１８。生合成後、成熟ＶＷＦは、血液循環系に放出されるか、もしくはバイベル・パラーデ小体中に保存される１９かのいずれかである。ヒト血漿中では、ＶＷＦは、止血において二重の目的を果たす。血管損傷の場合には、ＶＷＦは、血小板糖タンパク質の接着（例えば、コラーゲンの血管内皮下層への）を媒介する２０。さらに、ＶＷＦは、血液凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）との非共有結合複合体を構築し、血漿からのその急速なクリアランスを回避し、従って、正常なトロンビン生成が、生じ得る２１。
【０００４】
ＶＷＦに関する遺伝性欠損は、フォンビルブラント病（ＶＷＤ）を引き起こし、ヒトにおける最も一般的な出血性障害のうちの１つである２２。ＶＷＤの症状は、異常な血小板機能であり、これは、絶えず鼻血を出す、傷害後の解明されていないひどい出血もしくは長期化の出血、をもたらす。低下したレベルのＶＷＦに起因して、ＶＷＤは、ＦＶＩＩＩ凝固促進活性の低下が一般に付随する。ＶＷＦ欠損の重篤度に依存して、いくつかの程度のＶＷＤが存在する。軽度ＶＷＤを有する患者は、低下したＶＷＦ血漿レベルを有し、ＶＷＦレベルを一時的に上昇させる、デスモプレシンの投与によって処置される２３。より重度のＶＷＤ形態に罹患している患者は、ヒト血漿由来濃縮物もしくは寒冷沈降物（ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの両方を含む）で処置されなければならない２４，２５。しかし、この補充療法には、いくつかの制限が伴う２６。ヒト血漿由来ＶＷＦ濃縮物は、ドナーのプールに依存して、種々のＶＷＦレベルおよびＦＶＩＩＩレベル、ならびに比率を示す。さらに、単離および精製（製造）プロセスの間のタンパク質分解に起因して、上記血漿由来ＶＷＦ濃縮物のマルチマー組成は変動し、最高の止血活性を示す高分子質量マルチマーが見いだされ得ない。形質転換細胞の発酵によって生成される組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）の使用は、これら制限を克服し得る２７。血漿プロテアーゼの非存在は、ｒＶＷＦ分解を回避し、ウイルス伝播のリスクをほぼ排除する。インビボおよびインビトロでの評価から、ｒＶＷＦの構造および特性は血漿由来ＶＷＦに匹敵することが確認された２８（非特許文献１）。
【０００５】
質量分析法を使用する検体（ａｎａｌｙｔｅ）の分子量決定は、標準物質の利用可能性（すなわち、上記標準物質の既知の質量に対して検体の未知の質量を相関させるために使用され得る、合理的なコストでのバッチ間の既知の正確な分子量および十分に規定された組成の分子）によって制限される。検体が既知の標準物質の質量の範囲のかなり外にある質量を有する場合、相関の正確性は、低下する。今日では、１００ｋＤａより大きい分子量を有する検体の質量分析法による分析において使用するための十分に規定されたタンパク質／糖タンパク質標準物質は、限られている。免疫グロブリンタンパク質が使用されてきたが、それらの質量は、適合が約１５０ｋＤａまでの分子量を有する検体に限られる。従って、例えば、２００ｋＤａより大きい質量を有する検体の分子量を決定するために使用され得る分子量標準物質が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｕｒｅｃｅｋ  ＰＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２；  １１７：  １２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
上記検体の質量スペクトルを測定し、これを、既知の分子量の組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）の質量スペクトルに相関させることによって、質量分析法（ＭＳ）を使用した検体の分子量を測定するための方法を、本明細書で開示する。上記ｒＶＷＦの質量スペクトルは、それを直接測定することによって、または以前に調製されたスペクトルを参照することによって、得ることができる。開示される方法で分析される上記検体は、高分子質（ＭＷ；用語分子質量は、同義として使用され得る）、例えば、少なくとも２００ｋＤａを有するものである。いくつかの実施形態において、上記検体は、少なくとも１０００ｋＤａもしくは少なくとも１５００ｋＤａのＭＷを有する。特定の実施形態において、上記検体は、抗体もしくは別の大きなタンパク質（例えば、フィブリノゲンもしくはコラーゲンまたはそれらの誘導体）である。
【０００８】
いくつかの場合において、上記開示される方法は、ＶＷＦ分子量マーカー中のＶＷＦのモノマー（配列番号１）の数を決定することによって、上記ＶＷＦ分子量マーカーのＭＷを計算する工程をさらに包含する。種々の実施形態において、上記サンプルおよび上記ＶＷＦ分子量マーカーは、ＭＳによって分析する前に脱塩される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、予備精製なしの還元条件下でのｒＶＷＦサンプルＡ、ＢおよびＣのＣＧＥオンザチップ電気泳動図を示す（ＦＵ，蛍光単位、ｓ，移動時間の秒数）。
【図２】図２は、種々の脱塩手順後の還元条件下でのｒＶＷＦサンプルＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す。
【図３】図３は、ジスルフィド結合の還元およびＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭデバイスでの脱塩後のｒＶＷＦサンプルＡ、ＢおよびＣのナノＥＳ  ＧＥＭＭＡスペクトルを示す。
【図４】図４は、ｒＶＷＦサンプルＡ、ＢおよびＣの線形モードで得られた陽イオンＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。Ｍは、成熟ｒＶＷＦを示し、Ｐは、プロｒＶＷＦを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な説明）
本明細書で記載されるように、ｒＶＷＦのモノマーおよびマルチマーが、高ＭＷの分析のための質量分析法分子量マーカーとして使用される。なぜなら、上記マルチマーｒＶＷＦのＭＷは、その反復するｒＶＷＦモノマー（配列番号１）の既知のＭＷに基づいて容易に計算されるからである。従って、上記ＶＷＦマルチマーのＭＷを知ることにより、それを使用して質量分析法技術の使用を較正する（すなわち、校正物質）ことが可能となり、目的の検体の質量を決定することが可能になる。上記ｒＶＷＦのＭＷは、再現可能にグリコシル化されたＶＷＦを生成する供給源から使用される場合、グリコシル化ｒＶＷＦのタンパク質部分およびグリカン部分を含む。
【００１１】
高分子質量ｒＶＷＦマルチマー（ＶＷＦのモノマー数に基づく）を調製する能力に起因して、ｒＶＷＦが、高（例えば、２００ｋＤａより大きい）分子量を有する検体の、質量分析法による分析のための分子量マーカーとして有用であることを発見した。上記ＶＷＦのマルチマーの分子量は、ＶＷＦモノマー（配列番号１）の反復ユニット数に基づいて計算される。評価されるべき検体の性質に依存して、ｒＶＷＦマルチマーは、２００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ超までのいずれかにある、上記目的の検体に対して適切なマーカーであるように、適切な質量を有して調製される。例えば、検体が特定の範囲における質量を有すると疑われる場合、モノマーおよび１以上のｉｃ形態および／もしくはマルチマー形態のｒＶＷＦが調製され、これは、例示であって限定はしないが、上記検体の疑われる（もしくは予測される）質量約１０ｋＤａ内の質量を提供するように、反復ｒＶＷＦモノマーの十分な数を有する。次いで、上記検体のスペクトルを、上記ｒＶＷＦマーカー（複数可）のスペクトルに対して比較して、上記検体の質量を提供する。質量分析法による分析のための標準物質としてｒＶＷＦを使用する１つの利益は、使用される上記ｒＶＷＦ標準物質が、わずか１種のマルチマーを含む必要はないことである。上記ｒＶＷＦモノマーの反復質量ユニットに起因して、種々のマルチマーの混合物ですら有用である。なぜなら、それらの質量は、上記ＶＷＦモノマーもしくはダイマーの質量だけ等しく間隔が空くからである。
【００１２】
上記ｒＶＷＦのモノマー、ダイマーおよびマルチマーは、代表的には、ジスルフィド結合を使用して繋がっている。
【００１３】
ＶＷＦは、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、少なくとも３００ｋＤａ、少なくとも３５０ｋＤａ、少なくとも４００ｋＤａ、少なくとも４５０ｋＤａ、少なくとも５００ｋＤａ、少なくとも５５０ｋＤａ、少なくとも６００ｋＤａ、少なくとも６５０ｋＤａ、少なくとも７００ｋＤａ、少なくとも７５０ｋＤａ、少なくとも８００ｋＤａ、少なくとも８５０ｋＤａ、少なくとも９００ｋＤａ、少なくとも９５０ｋＤａ、少なくとも１０００ｋＤａ、少なくとも１１００ｋＤａ、少なくとも１２００ｋＤａ、少なくとも１２５０ｋＤａ、少なくとも１３００ｋＤａ、少なくとも１３５０ｋＤａ、少なくとも１４００ｋＤａ、少なくとも１４５０ｋＤａ、少なくとも１５００ｋＤａ、もしくは少なくとも２０００ｋＤａの分子量を有する検体のための、標準物質（あるいは、本明細書では、分子量マーカーといわれる）として使用することができる。
【００１４】
所望の分子量を有するｒＶＷＦの調製は、哺乳動物細胞からの発現によって達成され得、文献中で記載されてきた（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，８（３）：１９７−２０５，１９９９、Ｓｃｈｗａｒｚら，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ，２８（２）：２１５−２６，２００２、Ｔｕｒｅｃｅｋら，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１７：１２３−１２９，２００２、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３０（１−３）：１−１６，１９９９）。
【００１５】
ナノＥＳ（エレクトロスプレー）気相電気泳動易動度高分子分析器（ＧＥＭＭＡ）、特定の種類のイオン移動度分光器、真空マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法（ＭＳ）およびさらにキャピラリーゲル電気泳動オンザチップ（ＣＧＥオンザチップ）は、検体の分子量を決定するために使用され得る。一般に使用されるアプローチである、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動２９およびＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動３０とは対照的に、３種のｒＶＷＦ調製物の正確な分子サイズ、サンプル不均一性および正確な分子質量の決定を、ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ、ＭＡＬＤＩ−線形ＴＯＦ（飛行時間）ＭＳ、ならびにＣＧＥオンザチップによって行った。
【００１６】
ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ分析は、コーンジェットモードにおけるナノＥＳプロセスによって、続いて、ポロニウム−２１０を介する電荷低下によって、複数の荷電した分子イオンを生成することに基づいており、従って、中性および一重に荷電した陽イオンおよび陰イオンを生じる。これらイオンは、ナノ微分型移動度分析装置（ｎａｎｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ）（ｎＤＭＡ）を使用して、それらの電気泳動易動度径（ＥＭＤ）に従ってサイズ分離され、間接的光学検出に基づいて、凝縮式粒子計数機（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（μＣＰＣ）によって検出される３１−３３。上記ＥＭＤの、十分に規定された球状タンパク質の上記分子質量への相関（ｒ＝０．９９８）に基づいて、糖タンパク質の分子質量が、決定され得る３４。ＧＥＭＭＡ分析は、一般に、Ａｌｌｍａｉｅｒら，Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃ．，３６：１０３８−１０５２（２００１）で議論されている。
【００１７】
ｒＶＷＦを特徴付けるために使用される第２の方法は、標準検出器付きの線形ＴＯＦシステムを適用する陽イオンＭＡＬＤＩ  ＭＳであった３５。一重〜三重に荷電した分子イオンを主に生成し、高い塩および界面活性剤許容度を示し、少量のサンプルを必要とする十分に確立された「ソフト」脱離／イオン化技術  ＭＡＬＤＩは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳを、インタクトな高い質量のタンパク質の正確な分子質量測定のための望ましい技術にする３６。ＭＡＬＤＩの考察は、米国特許第７，３５１，９５９号（本明細書に参考として援用される）において見いだされ得る。
【実施例】
【００１８】
（化学物質）
酢酸アンモニウム  ｐ．ａ．，酢酸  ９６％、アセトニトリル  ｐ．ａ．  （ＡＣＮ），  メタノール  ｐ．ａ．  （ＭｅＯＨ）、ギ酸  ９８〜１００％（ＦＡ）および水  ｐ．ａ．（２５℃での導電率≦１μＳ／ｃｍ）を、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。クマシーブリリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および２，４，６  トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）を、Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得た。ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）および１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ，  最低９９．０％）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳサンプル緩衝液（４×）、ＮｕＰａｇｅ  トリス−酢酸ＳＤＳ泳動緩衝液（２０×）、ＨｉＭａｒｋ未染色高分子量タンパク質標準物質およびＩｎｖｉｔｒｏｍａｓｓ高分子量質量較正キットを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ（Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
【００１９】
（組換えフォンビルブラント因子（ｒＶＷＦ））
３種の市販されていないｒＶＷＦ調製物を、Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）が製造した。サンプルＡは、５．２５ｇ／Ｌ  Ｌ−グリセリン、５．２５ｇ／Ｌ  Ｌ−リジン−ヒドロクロリド、５．２５ｇ／Ｌ  クエン酸三ナトリウム×２Ｈ２Ｏ、０．６２ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏおよび２．２ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）からなる緩衝系中に溶解した０．６７ｍｇ／ｍＬ  ｒＶＷＦを含んでいた。サンプルＢは、０．４９ｍｇ／ｍＬ  ｒＶＷＦを、サンプルＣは、０．５４ｍｇ／ｍＬ  ｒＶＷＦを含んでいた；両方のサンプルは、以下の緩衝系（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５％  サッカロース（ｐＨ７．４）からなる）に溶解した。
【００２０】
（サンプル均質性の評価のためのキャピラリー電気泳動オンザチップ）
ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡおよびＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳを介した詳細な特徴付けの前に、上記ｒＶＷＦサンプルを、ＣＧＥオンザチップで調査し、均質性および妥当なタイムスパン（分離時間６０秒）内の適切な分子質量の観点から、３種のサンプルの第１の全体像を得た。
【００２１】
ＣＧＥオンザチップ実験を、２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐ２００  ｐｌｕｓ  ａｓｓａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、非商業的な設定で行った。上記機器を作動させ、その得られた結果を積分し、２１００  Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアｖ．Ｂ．０２．０２．ＳＩ２３８の助けを借りて評価した。
【００２２】
全てのチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造業者の指示に従って調製した。簡潔には、４μＬの上記ｒＶＷＦサンプル溶液を、２μＬの提供された変性溶液（０．００５２ｍｇ／ｍＬ  ＤＴＴを含む）と混合し、９５℃で５分間加熱し、最終的に、上記混合物を８４μＬ  水で希釈した。上記最終サンプル溶液（６μＬ）を、上記ＣＧＥ−ｃｈｉｐ上の指定されたサンプルウェルにアプライし、動電学的に注入した。分子質量測定のために、十分に規定されたタンパク質（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓキット中に提供される）からなるタンパク質ラダーを、同じように処理した。
【００２３】
（塩／界面活性剤除去最適化のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
還元条件下でのタンパク質サンプルの分析のために、６μＬ  サンプル溶液、３μＬ  ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳサンプル緩衝液（４×）および３μＬ  ０．１Ｍ  ＤＴＴを混合し、９９℃で１分間インキュベートし、室温へと冷却した。得られた混合物（１０μＬ）を、スラブゲルに直接アプライした。分子質量推定のために、ＨｉＭａｒｋタンパク質標準物質混合物を、上記ゲルにさらにアプライした。６μＬ  ＨｉＭａｒｋタンパク質標準物質、３μＬ  ＬＤＳサンプル緩衝液（４×）および３μＬ  水を含む混合物を、上記ゲルに直接アプライした。３〜８％  トリス−酢酸塩、１ｍｍ×１０ウェル  ＮｕＰａｇｅプレキャストミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対して、新たに調製したトリス−酢酸塩ＳＤＳ泳動緩衝液を使用して、電気泳動を行った。定電圧を１５０Ｖに設定し、７０分後に分離を停止した。分離の直後に、上記ゲルを、固定溶液（４５％  ＭｅＯＨ、５％  酢酸）中に３０分間入れ、その後、クマシー染色溶液（０．１％  ＣＢＢ  Ｒ２５０、４５％  ＭｅＯＨ、９％  酢酸）で４５分間染色した。最後に、上記ゲルを、脱色溶液（４５％  ＭｅＯＨ、９％  酢酸）中に４５分間入れ、このタイムフレーム内で、上記ゲルバックグラウンドは、完全に澄み、明瞭なタンパク質バンドが見えるようになった。
【００２４】
（ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ分析のためのサンプル調製法）
多量の塩、添加剤および界面活性剤を含む異なる緩衝液組成に起因して、上記３個のｒＶＷＦサンプルを、脱塩／精製し、次に上記ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡデバイスに適用した。３種の異なる脱塩アプローチ（膜遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、および透析）を評価した。これら脱塩／精製手順の間におけるｒＶＷＦ損失を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした。
【００２５】
膜遠心分離については、ＭＷカットオフ３０００Ｄａ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）付きのＮａｎｏｓｅｐＴＭ遠心分離デバイスを使用した。ｒＶＷＦサンプル溶液（３００μＬ）を、２０分間、５０００ｒｐｍで遠沈させ，その残渣を、２０ｍＭ  酢酸アンモニウム緩衝液（１００μＬ，ｐＨ６．８）で１回洗浄し、２０ｍＭ  酢酸アンモニウム緩衝液（３００μＬ，ｐＨ６．８）中に再懸濁した。
【００２６】
サイズ排除クロマトグラフィーを、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で行った。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭカラムの限界に起因して、上記サンプルを、２つのアルコートに分け、各回、新たなスピンカラムを使用して、２０００ｒｐｍで２分間にわたって２回、別個に脱塩した。次いで、上記アリコートを、ＧＥＭＭＡ分析のために再度合わせた。
【００２７】
ｒＶＷＦ調製物の透析を、ＭＷカットオフ１０ｋＤａ付きのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で行った。ｒＶＷＦ溶液（３００μＬ）を、体積１．５ｍＬに希釈し、透析溶液（２０ｍＭ  酢酸アンモニウム，ｐＨ６．８）中で約２４時間透析した。
【００２８】
次いで、２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳおよび０．１５％（ｗ／ｖ）  ＤＴＴと混合し、９９℃で１分間インキュベートすることによって、上記ｒＶＷＦサンプルを還元して、ジスルフィド結合を壊した。次いで、得られた還元ｒＶＷＦを、ＧＥＭＭＡ分析によって分析した。
【００２９】
（ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ）
上記ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡシステム（ＴＳＩ  ３９８０）は、ナノＥＳ電荷低下ユニット（ＴＳＩ  ３４８０）、ナノ微分型移動度分析装置（ｎＤＭＡ；ＴＳＩ  ３０８０）および検出器としての超微細凝縮式粒子計数機（μＣＰＣ；ＴＳＩ  ３０２５Ａ）（全てのパーツは、ＴＳＩ  Ｉｎｃ（Ｓｈｏｒｅｖｉｅｗ，ＭＮ，ＵＳＡ）製）からなる。複数荷電のイオンを、上記ナノエレクトロスプレーユニットによって生成し、電荷を、ポロニウム−２１０によって生成した双極性雰囲気（ｂｉｐｏｌａｒ  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）によって減らして、中性および一重に荷電した種を得た。これら種を、上記ｎＤＭＡにおける粒子がない空気の流れの中で、それらの電気泳動易動度直径（ＥＭＤ）に従ってサイズ分離し、上記μＣＰＣで検出した。
【００３０】
ｒＶＷＦの分子質量決定のために、いくつかの十分に規定された標準物質タンパク質のＥＭＤを決定し、それらの分子質量と相関させた。得られた、ＥＭＤと分子質量との間の関係に基づいて、この研究のｒＶＷＦとして未知の分子のサイズを、分子質量を提供するために決定した３４，３７。
【００３１】
上記ナノＥＳ源を、２ｋＶスプレー電圧、および０．３Ｌ／分  ＣＯ２（９９．９９５％，Ａｉｒ  Ｌｉｑｕｉｄｅ，Ｓｃｈｗｅｃｈａｔ，Ａｕｓｔｒｉａ）に設定した。加圧空気（１Ｌ／分で、コンプレッサータイプＨｏｂｂｙ−Ｓｔａｒ  ２００Ｗ，ＡＧＲＥ，Ｇａｒｓｔｅｎ−Ｓｔ．Ｕｌｒｉｃｈ，Ａｕｓｔｒｉａによって生成）を、上記機器に適用した。内径１５０ｎｍの溶融シリカキャピラリーを使用し、スプレーニードルの先端を、角度７５°で配置した。上記ＥＳイオン化を、陽イオンモードで作動させた。全サイズ範囲にわたって１０〜２０回のスキャン（１スキャンあたり１２０秒）を、本明細書に提示される各最終ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡスペクトルに対して平均化した。
【００３２】
（ＭＡＬＤＩ質量分析法のためのサンプル調製）
上記ｒＶＷＦダイマーおよびマルチマー中のジスルフィド結合を還元するために、ＶＷＦ溶液（１０μＬ）を、１０％  ＬＤＳ（ｗ／ｖ，０．５μＬ）および１Ｍ  ＤＴＴ（１μＬ）と混合した。得られた混合物を徹底的にボルテックスし、遠沈し、９９℃で１分間インキュベートした。その後、サンプルの脱塩／精製を、親水性ＨＰＬ樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含むＺｉｐＴｉｐＴＭ  ペプチドチップで行った。次いで、１０μＬ溶液Ａ（ＡＣＮ／０．１％  ＦＡ、９：１，ｖ／ｖ）を、上記サンプル溶液と混合した。上記ＨＰＬ定常相を湿らすために、１０μＬの溶液Ｂ（ＡＣＮ、０．１％  ＦＡ、１：１，ｖ／ｖ）を吸引し、分与して廃棄した。上記樹脂の平衡化を、溶液Ａを３回吸引し分与することによって得た。上記サンプル溶液を７回吸引し、分与することによって、上記サンプルを樹脂に結合させた。全ての干渉する塩、添加剤および界面活性剤を除去するために、上記チップを、普通の（ｐｌａｉｎ）溶液Ａで１０回洗浄した。次いで、上記ＶＷＦを、２〜４μＬ  ＭＡＬＤＩマトリクス溶液（１ｍＬ  ０．１％  ＴＦＡ／ＡＣＮ（１：１，ｖ／ｖ）溶液中に溶解した１０ｍｇ  ＴＨＡＰ）で溶出した。ＭＡＬＤＩ  ＭＳ分析のために、０．５μＬの得られたサンプル／マトリクス溶液を、ステンレス鋼ＭＡＬＤＩ標的にアプライした。上記Ｉｎｖｉｔｒｏｍａｓｓ  高分子量較正キットを使用することによって、外部較正を行った。上記較正キットを、製造業者の指示に従ってアプライした。
【００３３】
（ＭＡＬＤＩ質量分析法）
全てのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ実験を、窒素レーザー（λ＝３３７ｎｍ）を備えたＡＸＩＭＡ  ＴＯＦ2（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｋｒａｔｏｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で行った。上記機器を、パルス状抽出を使用せずに、陽イオン線形モードで作動させた。各質量スペクトルを、５０〜２００個の非選択および連続的レーザーショットを平均化することによって獲得した。データ分析の前に、上記質量スペクトルを、Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムで滑らかにした。
【００３４】
（結果）
上記ｒＶＷＦサンプルの均質性を、ＣＧＥオンザチップを使用して測定した。いかなる特定のサンプル調製なしでかつ短いタイムスパン（６０秒稼働時間）内で、ｒＶＷＦサンプルＡ、ＢおよびＣのデータ（図１）を得、各サンプルは、２個の異なるｒＶＷＦ種に対応する２個のピークを有することが明らかになった。それらは、分子質量２７７ｋＤを有する成熟ｒＶＷＦおよび分子質量３４１ｋＤａを有するプロｒＶＷＦであると決定された。上記プロｒＶＷＦの存在は、上記成熟ｒＶＷＦへの不完全な酵素切断に起因すると合理的に解釈された。サンプルＡの主要成分は、プロｒＶＷＦと、いくらかの成熟ｒＶＷＦであった（図１の上段を参照のこと）。サンプルＢおよびＣの分析は、成熟ｒＶＷＦが主要成分で、プロｒＶＷＦがわずかであることを示した。
【００３５】
３種の異なる脱塩手順を評価して、塩および界面活性剤を上記ｒＶＷＦサンプルから除去し、その後ＧＥＭＭＡ分析を行った：膜遠心分離（ＮａｎｏｓｅｐＴＭ  ３Ｋ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭ  Ｇ−２５）、および透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）  １０Ｋ）。上記脱塩手順後の糖タンパク質回収を、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでモニターした。図２は、脱塩工程なしのｒＶＷＦサンプルＡ（レーン２）およびＭｉｃｒｏｓｐｉｎＴＭ  Ｇ−２５（サイズ排除クロマトグラフィー）カラムで２回脱塩（レーン３）を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥデータを示す。未処理ｒＶＷＦサンプルＡは、約２６９ｋＤａおよび３３９ｋＤａにおいて２個のタンパク質バンドを示し、このことは、ＣＧＥオンザチップによって達成された上記データを確認する。ｒＶＷＦサンプルＡのサイズ排除クロマトグラフィー（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭ  Ｇ−２５）はまた、２個の異なるタンパク質バンドを得、これらは、上記未処理サンプルから得られたタンパク質バンドより僅かに弱かった。ｒＶＷＦサンプルの透析は、大量のサンプル損失を生じ、このことは、透析膜への非常に接着性のｒＶＷＦの吸着が原因である可能性が最も高かった。膜遠心分離（ＮａｎｏｓｅｐＴＭ  ３Ｋ）を使用して上記サンプルを脱塩した場合、検体損失はほとんどなかった。
【００３６】
図３は、種々のｒＶＷＦ濃度を有する還元型ｒＶＷＦサンプルＡ〜ＣのナノＥＳ  ＧＥＭＭＡスペクトルを示す。ｒＶＷＦサンプルＡのＧＥＭＭＡスペクトル（図３，上段）は、分子質量２９８．８ｋＤａに対応する１１．９ｎｍ（±１．６％）において強いピークを示すのに対して、ｒＶＷＦサンプルＢ（図３，中段）およびＣ（図３，下段）は、分子質量２２７ｋＤａ（±２．５％）に対応する１０．９ｎｍにおいてピークを示す。
【００３７】
上記使用したｎＤＭＡの分解能は、上記成熟ｒＶＷＦおよびプロｒＶＷＦについて両方の分子イオンを明らかに分離するには不十分であった。実際に、上記１１．８ｎｍでのピークは、１０．９ｎｍ（サンプルＢおよびＣから測定）と１２．７ｎｍ（この値についてのベースは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦデータであった）との間の平均値であった。サンプルＢおよびＣは、大部分は成熟ｒＶＷＦであり、ほとんどプロｒＶＷＦを含まず、このことは、それらのナノＥＳ  ＧＥＭＭＡスペクトルによって確認された。上記プロｒＶＷＦの濃度は無視できる程度であった。これは、上記ＣＧＥオンザチップデータに対応する。
【００３８】
上記ｒＶＷＦサンプルをまた、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。塩および界面活性剤へのその許容度に起因して、徹底的なサンプルの脱塩／精製は必要なかった。ジスルフィド結合を還元して、上記ｒＶＷＦモノマーを得た後、塩および界面活性剤を、ＺｉｐＴｉｐＴＭ  脱塩アプローチによって除去した。図４は、上記脱塩工程後のｒＶＷＦサンプルＡ〜Ｃの陽イオンＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。上記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、ｒＶＷＦのいくつかのイオン化種を示した：成熟ｒＶＷＦの［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ  ２５６１００）イオン、［Ｍ＋２Ｈ］２＋（ｍ／ｚ  １２７８００）イオンおよび［Ｍ＋３Ｈ］３＋（ｍ／ｚ  ８７６００）イオン、ならびにプロｒＶＷＦの［Ｐ＋２Ｈ］２＋（ｍ／ｚ  １７４４００）イオン、［Ｐ＋３Ｈ］３＋（ｍ／ｚ  １１８１００）イオンおよび［Ｐ＋４Ｈ］４＋（ｍ／ｚ  ８７６００）イオンを、ｒＶＷＦサンプルＡの上記陽イオン質量スペクトルで検出した（図４，上段を参照のこと）。プロｒＶＷＦの一重に荷電した分子イオンは、検出されなかった。
【００３９】
二重に荷電した成熟ｒＶＷＦ（ｍ／ｚ  １２７８００）および三重に荷電したプロｒＶＷＦ種（ｍ／ｚ  １１８１００）は、低ＭＳ分解能に起因して、容易に分解も分離もしない。このことは、２つの最大を有する幅広いシグナルを生じる。ｍ／ｚ値の区別がつかないので（ｍ／ｚ  ８７０００）、三重に荷電した成熟ｒＶＷＦ種および四重に荷電したプロｒＶＷＦ種の分離は、観察されなかった。主に成熟ｒＶＷＦ（ＣＧＥオンザチップ分析によって確認した，図１）および少量のプロｒＶＷＦを含むｒＶＷＦサンプルＢおよびＣのＭＡＬＤＩ質量スペクトル（図４，中段および下段）は、優れたＳ／Ｎ比をもつ、成熟ｒＶＷＦの一重に（ｍ／ｚ  ２４９０００）、二重に（ｍ／ｚ  １２５６００）および三重に（ｍ／ｚ  ８５６００）荷電した分子イオンを示した。プロｒＶＷＦ（ｍ／ｚ  １６９３００  サンプルＢおよびｍ／ｚ  １６７２００  サンプルＣ）の二重に荷電した分子イオンもまた検出されるこれらＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、少量で検出できた。
【００４０】
表１は、ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳおよびＣＧＥオンザチップによって得られる分子質量データをまとめる。上記ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析計の外部質量較正によって、ｒＶＷＦ種の分子質量決定は、±０．８％の精度で可能であった。実験的分子質量値およびＶＷＦのアミノ酸配列に基づく計算値３８，３は、プロｒＶＷＦについては、２７〜４３ｋＤａのΔｍ内および成熟ｒＶＷＦについては、３０〜３４ｋＤａのΔｍ内であった。これらΔｍ値は、上記ｒＶＷＦの炭水化物部分に帰するということができ、このことは、プロｒＶＷＦについては８〜１２％、および成熟ｒＶＷＦについては１２〜１４％のグリコシル化程度を示す。
【００４１】
サンプルＡにおける上記成熟ｒＶＷＦおよびプロｒＶＷＦの分離は、上記ナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ分析については観察されなかった。低い分離能に起因して、両方の種の混合物を、１１．９ｎｍ（分子質量２９８．８ｋＤａ（±１．６％）に対応する）で検出した。上記ＭＡＬＤＩ  ＭＳデータから逆解析（Ｂａｃｋ−ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）したところ、２５６．１ｋＤａ（成熟ｒＶＷＦ）および３４９．８ｋＤａ（プロｒＶＷＦ）は、それぞれ、１１．３ｎｍおよび１２．６ｎｍのＥＭＤを示した。サンプルＢおよびＣは、ごく少量のプロｒＶＷＦを有し、成熟ｒＶＷＦ種のみが、分子質量２２７．４ｋＤａ（±２．５％）に対応するそれらのナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ分析において検出された。
【００４２】
【表１】
2012513602.tif 000003
外部ＭＳ質量較正は、上記ｒＶＷＦの分子質量についての情報を提供した。これを、報告された値と比較した。報告された値は、成熟ｒＶＷＦについては約２２６ｋＤａ、およびプロｒＶＷＦについては約３０７ｋＤａであり、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ値は、成熟ｒＶＷＦについては２５６．１ｋＤａ（±０．８％）およびプロｒＶＷＦについては３４９．８ｋＤａ（±０．８％）であった。３０〜３４ｋＤａ（成熟ｒＶＷＦ）および２７〜４３ｋＤａの質量差が観察された。このことは、成熟ｒＶＷＦについては１２〜１４％およびプロｒＶＷＦについては８〜１２％のグリコシル化程度を示すｒＶＷＦの２２個のＮ−グリカンおよびＯ−グリカンに関連し得る。ｒＶＷＦサンプルＡのナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ分析は、サイズ１１．９ｎｍを示し、分子質量２９８．８ｋＤａ（±１．６％）を示した。これは、実際に、上記成熟ｒＶＷＦおよびプロｒＶＷＦの混合物であった。少量のプロｒＶＷＦを有するサンプルＢおよびＣのｒＶＷＦのナノＥＳ  ＧＥＭＭＡ分析は、分子質量２２７．４ｋＤａ（±２．５％）（サイズ１０．９ｎｍに対応する）を有する上記成熟ｒＶＷＦの検出をもたらした。
【００４３】
前述は、本発明を記載しかつ例示しているが、以下の特許請求の範囲によって規定される本発明を限定することを意図しない。本明細書で開示されかつ特許請求された方法の全ては、本開示に鑑みれば、過度の実験なくして行われ得かつ実行され得る。本発明の材料および方法は、具体的な実施形態の観点から記載してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、上記材料および／もしくは方法に、そして本明細書に記載される方法の工程もしくは工程の順序において、バリエーションが適用され得ることは、当業者に明らかである。より具体的には、化学的かつ生理学的に関連する特定の因子が、本明細書に記載される因子の代わりに使用され得る一方で、同じもしくは類似の結果が達成されることは明らかである。
【００４４】
（参考文献）
【００４５】
【化１】
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【００４６】
【化２】
2012513602.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
2012513602.tif 000008
【図４】
2012513602.tif 000009
【配列表】
2012513602000001.app
【国際調査報告】
2012513602.tif 000010
2012513602.tif 000011
2012513602.tif 000012