(57)【要約】  本発明は、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を活性成分として含む医薬組成物を用いる血小板減少症の治療に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板減少症の治療または予防において使用するための組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物であって、該抗体生成物が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１０−５００μｇの用量で投与され、該組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物が個々の抗体の規定のサブセットを含み、ＲｈＤ抗原上の少なくとも１つのエピトープに対する結合を示すところの、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物。
【請求項２】
少なくとも１つのエピトープがｅｐＤ１、ｅｐＤ２、ｅｐＤ３、ｅｐＤ４、ｅｐＤ５、ｅｐＤ６／７、ｅｐＤ８および／またはｅｐＤ９からなる群から選択される、請求項１記載の抗体生成物。
【請求項３】
個々のメンバーの少なくとも１つがｅｐＤ３、ｅｐＤ４およびｅｐＤ９（ＲｈＤカレゴリーＶＩ抗原）に特異的に結合し、さらに、メンバーが単独で、または組み合わせて、残りのＲｈＤ抗原エピトープｅｐＤ１、ｅｐＤ２、ｅｐＤ５、ｅｐＤ６／７およびｅｐＤ８に結合する、請求項１記載の抗体生成物。
【請求項４】
個々の抗体がＲｈ  Ｃ、ｃ、Ｅ、およびｅ抗原に結合しないか、またはわずかに結合する、請求項１記載の抗体生成物。
【請求項５】
該抗体が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１０−５００μｇの用量、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１０−２５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体２５−５０μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体５０−７５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体７５−１００μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１００−１２５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１２５−１５０μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１５０−１７５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１７５−２００μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体２００−２２５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体２２５−２５０μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体２５０−２７５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体２７５−３００μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体３００−３２５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体３２５−３５０μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体３５０−３７５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体３７５−４００μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体４００−４２５μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体４２５−４５０μｇ、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体４５０−４７５μｇ、または患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体４７５−５００μｇの用量で投与される、請求項１記載の抗体生成物。
【請求項６】
血小板減少症が貧血を有する対象において治療される、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項７】
対象が、対象が属する性別および年齢について平均より、標準偏差の２倍以上低いヘモグロビンレベルを有する、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項８】
対象が、性別および年齢について実験正常範囲の下限より２．０ｇ／ｄＬ低いヘモグロビンレベルを有する、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項９】
対象が１０ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルを有する、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項１０】
対象が１２−１６ｇ／ｄＬ未満、例えば、１２ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルを有する成人女性である、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項１１】
対象が１３−１８ｇ／ｄＬ未満、例えば、１４ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルを有する成人男性である、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項１２】
対象が１１−１２ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルを有する妊婦である、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項１３】
対象が１７−１９ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルを有する新生児である、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項１４】
対象が１４−１７ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルを有する子供である、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項１５】
対象が、対象の年齢および性別についての正常値より２Ｄ低いヘモグロビンレベルを有し、組み換えポリクローナル抗−ＲＤ抗体生成物の用量が対象のヘモグロビンレベルによって影響を受けないところの、請求項６記載の抗体生成物。
【請求項１６】
抗体の投与が、治療した対象の９０％において、ヘモグロビンレベルの３０％以下、例えば２５％以下、例えば２０％以下、例えば１５％以下、例えば１０％以下、例えば５％以下、例えば１％以下の減少に導く、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項１７】
該用量が実質的に血管外溶血を導かない、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項１８】
抗体の投与が輸血を必要とする貧血を導かない、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項１９】
対象がＲｈＤ陽性である、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項２０】
対象がＲｈＤ陰性である、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項２１】
対象が脾臓摘出していない、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項２２】
対象が脾臓摘出している、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項２３】
血小板減少症が免疫成分を含む、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項２４】
血小板減少症が免疫成分を含まない、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項２５】
血小板減少症が、ＩＴＰ、抗リン脂質抗体症候群、獲得性選択的無巨核球性形成不全、感染性因子、排他的ではないが、特に、ヘリコバクター・ピロリ、ＨＩＶおよび／またはＣ型肝炎によって引き起こされる免疫性血小板減少症、新生児の自己免疫性または同種免疫性血小板減少症（母体経胎盤性移入抗体による）および薬物依存性抗体を伴う薬物誘導性血小板減少症からなる群から選択される、請求項２３記載の抗体生成物。
【請求項２６】
血小板減少症が、先天性血小板減少症、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群によって引き起こされる血小板減少症、化学療法によって引き起こされる血小板減少症、放射線によって引き起こされる血小板減少症、栄養不足によって引き起こされる血小板減少症、および骨髄異形成症候群によって引き起こされる血小板減少症からなる群から選択される、請求項２４記載の抗体生成物。
【請求項２７】
ポリクローナル抗体生成物が、少なくとも３つの異なる抗体、例えば、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個または少なくとも２５個の異なる抗体を含む、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項２８】
ポリクローナル抗体生成物が、少なくとも３つの別個のエピトープ、例えば、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個または少なくとも２５個の別個のエピトープに結合することができる抗体を含む、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項２９】
抗体がイソ型ＩｇＧ１である、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項３０】
抗体が多価である、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項３１】
組み換え抗−ＲｈＤ抗体がヒト定常領域を含む、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項３２】
抗体がヒト可変領域を含む、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項３３】
ＶＨ：ＶＬ対由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が、図３および４に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から選択される、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項３４】
２５個の個々のモノクローナル抗−ＲｈＤ抗体産生細胞系統（ＲｈＤ１５７、１５９、１６０、１６２、１８９、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０７、２４０、２４１、２４５、２９３、３０１、３０５、３０６、３１７、３１９、３２１、３２４）を用いる、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを含有するｐＷＣＰの発生を含む方法によって生産される、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項３５】
クローンＲｈＤ１５７、１５９、１６０、１６２、１８９、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０７、２４０、２４１、２４５、２９３、３０１、３０５、３０６、３１７、３１９、３２１、３２４によってコードされる２５個の抗体のＣＤＲ配列を有する抗体を含む、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項３６】
クローンＲｈＤ１５７、１５９、１６０、１６２、１８９、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０７、２４０、２４１、２４５、２９３、３０１、３０５、３０６、３１７、３１９、３２１、３２４によってコードされる２５個の抗体のＶＨＶＬ配列を有する抗体を含む、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物。
【請求項３７】
抗体が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体を１０−５００μｇの用量で投与するために抗体を調製する、血小板減少症の治療または予防のための医薬の製造における、前記請求項のいずれか１項記載の抗体生成物の使用。
【請求項３８】
血小板減少症に罹患している対象に、治療上有効量の組み換え抗−ＲｈＤ抗体生成物を投与することを含み、該抗体が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１０−５００μｇの用量で投与される、対象における血小板減少症の治療方法。
【請求項３９】
血小板減少症に罹患している対象が貧血も患っている、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
抗−ＲｈＤ抗体が静脈内投与される、請求項３８または３９記載の方法。
【請求項４１】
抗−ＲｈＤ抗体が皮下投与される、請求項３８または３９記載の方法。
【請求項４２】
血小板減少症に罹患している対象における抗−ＲｈＤに基づく治療の間に血管外溶血を回避する方法であって、血小板減少症に罹患している対象に、治療上有効量の組み換え抗−ＲｈＤ抗体を投与することを含み、該抗体が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体１０−５００μｇの用量で投与されるところの、方法。
【請求項４３】
血小板減少症に罹患している対象が貧血も患っている、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜３３のいずれか１項記載の抗体生成物および生理学上許容される担体を含む、血小板減少症の治療のための組成物。
【請求項４５】
請求項１〜３３のいずれか１項記載の抗体生成物および医薬上許容される担体を含む、血小板減少症の治療のための組成物。
【請求項４６】
請求項１〜３３のいずれか１項記載の抗体生成物および少なくとも１つの付加的な成分を含む、血小板減少症の同時、別々の、または連続的な治療のためのパーツキット。
【請求項４７】
付加的な成分がコルチコステロイドである、請求項４６記載のパーツキット。
【請求項４８】
付加的な成分がプレドニゾロンである、請求項４６記載のパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願において引用される全ての特許および非特許文献は、出典明示により、全体として本願明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本願発明は、抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体生成物を含む薬理学的および診断的組成物ならびに血小板減少症の治療におけるその使用に関する。血小板減少症の治療は、徴候的、改善的、予防的および／または治癒的であることができる。抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体生成物およびその生産は、ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００５０１に開示される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｒｈ式血液型抗原は、所謂Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅおよびＤ抗原を包含する膜貫通型赤血球タンパク質上に位置する。白色人種の約１６％は、遺伝的多型のため、Ｒｈ  Ｄ陰性（ＲｈＤ（−））である。さらに、ＲｈＤの複数の遺伝的血清学的変種が存在し（カテゴリーＩＩ〜ＶＩＩに分類される）、そのうちＲｈＤＶＩが最も臨床的に関連がある。カテゴリーＶＩ陽性赤血球（ＲＢＣ）は、他のカテゴリーのＲＢＣよりもＤタンパク質の種々のエピトープが少ないので、ＲｈＤＶＩ（＋）個体は、他のＲｈＤ陽性（ＲｈＤ（＋））個体由来のＲＢＣに対する同種抗体を形成しうる（Ｉｓｓｉｔｔ，Ｐ．Ｄ．およびＡｎｓｔｅｅ，Ｄ．Ｊ．，１９９８．  Ｔｈｅ  Ｒｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｄｕｒｈａｍ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，  ｐｐ．  ３１５−４２３）。
【０００４】
ＩＴＰは、自己抗体が脾臓よび肝臓において血小板クリアランス促進をもたらす血液学的障害である。ＩＴＰの発病率は、１００万件のうち新症例が５０〜１００件と概算される。抗−Ｄ免疫グロブリンは、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の治療に有用であると証明された（Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｊ．Ｎ．，  ２００２．  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．  １６，  ３７−３８）。コルチコステロイドおよび静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）は、通常、一次治療を構成するが、血液ドナー由来の抗Ｒｈ  Ｄ免疫グロブリンが安全かつ効果的であることが証明され、ＩＴＰにおける一次治療として益々使用されている。重篤な症例では、脾臓が除去される。しかしながら、これは、厳しい副作用のために小児おいては不可能であり、かくして、抗−Ｄ免疫グロブリンのような別の治療法が必要とされる。
【０００５】
ＩＴＰは、血小板数＜１５０ｘ１０９／Ｌ［１５０，０００／ｍｍ３］によって定義され、挫傷が増加する傾向によって特徴付けられる。しかしながら、ＩＴＰは、しばしば、血小板数２０ｘ１０９／Ｌ［２０，０００／ｍｍ３］未満の個体における自然出血として現れる。血小板数＜１０ｘ１０９／Ｌ［１０，０００／ｍｍ３］の患者は、重篤な皮膚出血、歯肉出血、鼻血、血尿または月経過多を呈する場合がある。自然頭蓋内出血および他の内出血は、血小板数５ｘ１０９／Ｌ［５，０００／ｍｍ３］未満の重篤な血小板減少症において見ることができる（Ｓｔａｓｉ  ２００４）。血小板数が３０ｘ１０９／Ｌ［３０，０００／ｍｍ３］より多い個体におけるＩＴＰは、ほとんどの場合、ルーチンな全血球計算後に付随的に診断される。ＩＴＰはまた、未熟な末梢血小板の割合増加によって特徴付けられ、且つ、ある程度まで、骨髄における巨核球の割合増加によって特徴付けられる。成人におけるＩＴＰの臨床的特徴は、自然寛解が患者の約８０％において起こる子供に見られる特徴とは異なる。子供のＩＴＰが通常、ウイルス感染の２〜３週間後に起こる急性疾患であるのに対し、成人のＩＴＰは、典型的に、潜行性発症し、慢性的経過をたどる。さらに、該疾患の二次形態も存在する。
【０００６】
ＩＴＰにおける作用機序
ＩＴＰは、血小板表面抗原に対して向けられた自己抗体によって媒介される。自己抗体−オプソニン化血小板は、血小板減少症を引き起こすＲＥＳの食細胞によって迅速に除去される。ＲＥＳによる血小板除去のための、唯一ではないが、主要な部位は脾臓を含み、脾臓は、抗−血小板自己免疫抗体応答のさらなる進行および増幅のための主要な部位でもあると考えられる（Ｃｉｎｅｓ  ２００２）。
【０００７】
現在、ＩＴＰにおける抗−Ｄ免疫グロブリンの最も受け入れられている作用機序は、ＲＥＳにおけるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、おそらく、ＩｇＧ−オプソニン化粒子およびＩｇＧ免疫複合体に対する高いアビディティを有する食細胞マクロファージ上のＦｃγＲＩＩおよびＩＩＩの拮抗的遮断であるようである。抗−Ｄの該作用機序は、最初、ＩＴＰの治療におけるＩＶＩｇの有効性の結果として提案された。該仮定は、さらに、ＲｈＤ＋  ＩＴＰ患者における抗−Ｄ免疫グロブリンの効力およびＲｈＤ−である患者における効力欠如によって支持された。脾臓摘出患者が抗−Ｄ治療に応答しないという事実は、抗−ＤがＲＥＳ／脾臓環境においてその効果を発揮する証拠となる（Ｌａｚａｒｕｓ  ２００３；  Ｓａｌａｍａ  １９８３；  Ｓａｌａｍａ  １９８４）。
【０００８】
しかしながら、ＦｃγＲ−媒介性血小板食作用の遮断は、抗−Ｄ治療によって提供される治療上の利益の全てを説明する唯一の機序ではないかもしれない。抗−Ｄ免疫グロブリンでのＲｈＤ−患者の成功した治療の一症例を記載する。抗−Ｄ特異的抗体が現在入手可能な血漿由来抗−Ｄ生成物における免疫グロブリンの全量の約１％しか構成しないという事実を考慮すると、ＩＶＩｇの効力について提案したように、別の免疫調節メカニズムを完全に排除することはできない（Ｌａｚａｒｕｓ  ２００３）。
【０００９】
現行のＩＴＰ治療
コルチコステロイドおよびＩＶＩｇは、１９９６年にアメリカン・ソサエティ・オブ・ヘマトロジー（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）によって公式化されたＩＴＰ治療ガイドラインにおいて推奨されるように（Ｇｅｏｒｇｅ  １９９６）、主にＩＴＰの治療のために使用される（Ｓｔａｓｉ  ２００４）。抗−Ｄは、安全かつ効果的であると証明され（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ  １９９４；  Ｂｕｓｓｅｌ  １９９１；  Ｃｏｏｐｅｒ  ２００２；  Ｎｅｗｍａｎ  ２００１；  Ｓａｎｄｌｅｒ  ２００１；  Ｓｃａｒａｄａｖｏｕ  １９９７）、ＩＴＰにおける一次治療選択として益々使用されている（Ｃｉｎｅｓ  ２００５）。一般に、血小板数が３０ｘ１０９／Ｌ［３０，０００／ｍｍ３］より多い患者は、おそらく血液損失を誘導するであろう処置を受けていないかぎり、治療を必要としない（Ｇｅｏｒｇｅ  １９９６）。患者の約３分の２は、プレドニソロン（１ｍｇ／ｋｇ／日、２−４週間）に応答するであろう。ＩＶＩｇはまた、７５％の症例において、血小板数を効果的に上昇させることが実証され、その半分が正常な血小板数に達する。しかしながら、応答は一過性のものであり、効果が続く証拠はほとんどない。ＩＶＩｇは、４００ｍｇ／ｋｇという高い用量で５日間または１ｇ／ｋｇで２日間与えられる（１；４）。一次治療に応答しない症例または許容されない高用量のコルチコステロイドを必要とする症例は、難治性ＩＴＰとして定義される。高用量コルチコステロイドは、しばしばコルチコステロイドと組み合わせた高用量ＩＶＩｇ（例えば、１ｇ／ｋｇ／日）と同様に、難治性ＩＴＰ患者の二次治療として用いられた（Ｓｔａｓｉ  ２００４）。
【００１０】
脾臓摘出は、血小板の抗体媒介性クリアランスを減少させるが、脾臓外ＲＥＳ組織（例えば、肝臓）は、該疾患を蔓延させうる（Ｃｉｎｅｓ  ２００５）。脾臓摘出を受けているＩＴＰ患者の３分の２は、正常な血小板数に達し、それは、しばしば、さらなる治療を用いずに維持される。
【００１１】
抗−Ｄでの治療は、他の治療法が試験され、失敗が認められた後に行われる脾臓摘出の必要性を排除しうるか、または有意に延期させうる。静脈内抗−Ｄは、成功基準にもよるが、成人の６０−９０％において血小板数を上昇させることが分かった（Ｂｕｓｓｅｌ  １９９１；  Ｎｅｗｍａｎ  ２００１  ；Ｓｃａｒａｄａｖｏｕ  １９９７；  Ｂｕｓｓｅｌ  ２００１）。
【００１２】
組み換えポリクローナル抗−Ｄ抗体の原理
現在市販されている抗−Ｄ免疫グロブリン生成物は、ほんの少量の抗−Ｄ特異的フラクションを含むヒト抗−Ｄ高度免疫血液ドナーから得られた免疫グロブリンを含む。これらの調製物は、ヒト集団における全ての主要なＲｈＤカテゴリーに対して向けられた抗体を含有する。
【００１３】
さらに、ヒト血漿由来のＲｈＤ免疫グロブリンは、抗−Ｄ  ＩｇＧは別として、低力価の他の血液型抗体を含有し、近年、ＩＴＰ治療のための抗−Ｄ免疫グロブリン摂取後、ヘモグロビン血症またはヘモグロビン尿症の稀であるが深刻な急性副作用のいくつかが、ＲｈＤと反応する以外の受動的に獲得した血液型抗体によって引き起こされることが示唆された（Ｇａｉｎｅｓ  ２００５およびＳｃｈｗａｒｔｚ  ２００６）。
【００１４】
ＲｈｏｐｈｙｌａｃＲ（登録商標）およびＷｉｎＲｈｏＲ（登録商標）
ＲｈｏｐｈｙｌａｃＲおよびＷｉｎＲｈｏＲは、どちらも、血漿由来の抗−Ｄ生成物であり、混合した無関係のヒト血液由来ＩｇＧ免疫グロブリンおよび少量のＲｈ  Ｄ−特異的抗体からなる。これらの製品の強度は、ＷＨＯ国際標準製品（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（抗−Ｄ血液型分類試薬の最低限強度の国際標準２００５）に対して決定される。
【００１５】
ＷｉｎＲｈｏＲは、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の治療において有用であることが証明された。しかしながら、ＷｉｎＲｈｏＲは、ＲｈＯ（Ｄ）陰性患者または脾臓摘出患者に投与すべきではない。ＷｉｎＲｈｏＲのラベルには、「患者が正常値より低いヘモグロビンレベル（１０ｇ／ｄＬ未満）を有するならば、患者における貧血の重篤度を増す危険性を最小限にするために、１２５〜２００ＩＵ／ｋｇ（２５〜４０μｇ／ｋｇ）体重の減少させた用量を服用すべきである。」と記述されている。ＷｉｎＲｈｏＲの薬物警告（ＦＤＡ薬物警鐘（ｄｒｕｇ  ｗａｒｎｉｎｇ）１２−５−２００５）は、血管内溶血および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関して発せられている。
【００１６】
特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）はまた、ＲｈｏｐｈｙｌａｃＲでも治療できる。しかしながら、ＲｈｏｐｈｙｌａｃＲの欠点は、以前から貧血を患っている患者が貧血の重篤度を増加する潜在的な危険性と引き換えに、ＲｈｏｐｈｙｌａｃＲの利益に重点を置かなければならないことである。
【００１７】
さらに、文献において、血清由来の抗−ＤがＩＴＰ患者において溶血をもたらし、これは、主な副作用事象であるという報告がある（Ｓｃａｒａｄａｖｏｕら、１９９７，  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ａｎｔｉ−Ｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ：  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｉｎ  ２７２  ｐａｔｉｅｎｔｓ，  Ｂｌｏｏｄ  ８９：２６８９−２７００）。最後に、健康なボランティアにおける研究は、抗−Ｄの増加用量と溶血との間に統計学的に有意な直線傾向があると結論づける（Ｚｕｎｉｃｈら、Ａ  ｄｏｓｅ  ｒａｎｇｉｎｇ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＨ（Ｄ）  ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃２６４１，  Ｂｌｏｏｄ  １９９４；  ８４  （Ｓｕｐｐｌ）：６６４ａ）。
【００１８】
血漿由来の抗−Ｄと比較すると、個々の抗−ＲｈＤモノクローナル抗体は、ＲｈＤ−対象に対するＲｈＤ＋赤血球の実験的投与後に、循環由来の赤血球のより不均一でよりゆっくりとしたクリアランス率を誘導することが示された。かくして、モノクローナル抗−Ｄ抗体の投与は、ポリクローナル抗−Ｄ生成物と比べて、延長した赤血球半減期をもたらす（Ｋｕｍｐｅｌ  １９９５；  Ｋｕｍｐｅｌ  ２００３；  Ｍｉｅｓｃｈｅｒ  ２００４）。
【００１９】
報告は、モノクローナル抗−Ｄ抗体がＩＴＰ患者において効力を示さないことを示し（Ｓｃａｒａｄａｖｏｕら、１９９７における概要）、少なくとも１つの報告（Ｇｏｄｅａｕら、１９９７，  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ  ｗｉｔｈ  モノクローナル  ａｎｔｉ−Ｄ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，  ３６：３２８−３０）は、モノクローナル抗−Ｄ抗体が溶血を導き、貧血さえも導くので、該モノクローナル抗−Ｄ抗体は自己免疫ＩＴＰの治療に用いることができないと結論づけている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
結論として、ＷｉｎＲｈｏＲおよびＲｈｏｐｈｙｌａｃＲの不利益を伴わないＩＴＰの安全かつ効力のある抗−Ｄ治療の開発に対する要望がある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の概要
本発明は、ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００５０１に開示される生成物（Ｓｙｍ００１）のような組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を用いる、血小板減少症の治療に関する。
【００２２】
文献における証拠は、既存の抗−Ｄ生成物の天然ポリクローナル性が信頼できる効力に必要であることを示唆し、したがって、Ｓｙｍ００１組成物がドナー集団において観察される抗−Ｄ抗体の天然の多様性を反映するために選択された。同時に、Ｓｙｍ００１のような組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物は、生産中および生産後によく定義された生物学的産物に関する要件にしたがって特徴付けることができる限られた数の抗体、ＩｇＧ１サブクラスの全てを代表する。したがって、Ｓｙｍ００１のような組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物は、既存の血漿由来の抗−Ｄよりも実質的に高度に特徴付けることができる。組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物、例えば、Ｓｙｍ００１は、また、血漿由来の生成物において見られうるロット間変動（ここに、抗体レパートリーは、個々の血漿ドナーに存在するレパートリーに依存して変動する）と比べて、より再現性のある組成を有するであろう。Ｓｙｍ００１のような組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物の場合、組み換えＤＮＡ技術を用いる生産法により、いずれの無関係な免疫グロブリン分子の存在を伴うことなく、確実に毎回同じ抗体が産生される。
【００２３】
本発明に開示される組み換えポリクローナル抗−Ｄ抗体生成物を導入することの患者に対する利益は、血液ベースの生成物およびより好ましい供給状況と比べて、組み換え生成物を用いた場合、ヒト病原体を伝達するリスクの減少に関連する。より特異的な抗−ＲｈＤ活性は、血液由来生成物よりも好ましいリスク／利益プロフィールをもたらしうる。
【００２４】
別の利益は、Ｓｙｍ００１のような組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物が余分な血管溶血および／または有意なヘモグロビン減少レベルをもたらさないことである。したがって、Ｓｙｍ００１のような組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物は、治療前後の患者のヘモグロビンレベルを考慮することなく、ＩＴＰの治療に用いることができる。このことは、ＩＴＰの安全かつ効力のある治療をもたらす。
【００２５】
本発明は、血小板減少症の治療または予防に用いるための組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物であって、該抗体生成物が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０−５００μｇの用量で投与するために調製され、該組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物が個々の抗体の規定されるサブセットを含み、それにより、ＲｈＤ抗原にて少なくとも１つのエピトープに対する結合を示すところの、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物に関する。
【００２６】
本発明は、さらに、血小板減少症の治療または予防のための医薬の製造における組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物の使用であって、該抗体が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０−５００μｇの用量で投与するために調製されるところの、使用に関する。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、対象における血小板減少症の治療方法であって、血小板減少症に罹患した対象に対し、治療上有効量の組み換え抗−ＲｈＤ抗体生成物を投与することを特徴とし、ここに、該抗体が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０−５００μｇの用量で投与されるところの、方法に関する。本発明は、また、貧血も有する血小板減少症に罹患した対象の治療に関する。
【００２８】
抗−ＲｈＤ抗体生成物は、一の具体例において、静脈内または皮下投与することができる。
【００２９】
本発明は、さらに、血小板減少症に罹患した対象における抗−ＲｈＤベースの治療の間の血管外溶血を回避する方法であって、血小板減少症に罹患した対象に対し、治療上有効量の組み換え抗−ＲｈＤ抗体を投与することを特徴とし、ここに、該抗体が患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０−５００μｇの用量で投与されるところの、方法に関する。
【００３０】
本発明の別の態様は、抗−ＲｈＤ抗体生成物および生理学上許容される担体および／または医薬上許容される担体を含む、血小板減少症の治療のための組成物に関する。
【００３１】
本発明は、また、抗−ＲｈＤ抗体生成物および少なくとも１つの付加的な成分を含むパーツキットに関する。
【００３２】
定義および略語
「抗体」なる語は、血清の機能的成分を表し、しばしば、分子（抗体または免疫グロブリン）の集合物または１分子（抗体分子または免疫グロブリン分子）として示される。抗体分子は、特異的抗原決定基（抗原または抗原エピトープ）と結合または反応することができ、次いで、免疫学的エフェクターメカニズムの誘導に至る場合がある。個々の抗体分子は、通常、単一特異的とみなされ、抗体分子の組成物は、モノクローナル（すなわち、同一の抗体分子からなる）またはポリクローナル（すなわち、同一の抗原または別個の異なる抗原上の同一または異なるエピトープと反応する異なる抗体分子からなる）でありうる。各抗体分子は、対応する抗原に対する特異的結合を可能にする独特の構造を有し、全ての天然抗体分子は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖からなる全体的に同じ基本構造を有する。抗体は、また、集合的に免疫グロブリンとしても知られる。抗体なる語は、本明細書中で使用される場合、キメラおよび単鎖抗体、ならびに抗体の結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２分子、ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントまたはいずれか他の安定なフラグメント、ならびに全長抗体分子および多量体、例えば、二量体ＩｇＡ分子または５量体ＩｇＭを包含することも意図される。
【００３３】
「抗−ＲｈＤ抗体をコードする核酸セグメント」なる語は、ＶＨおよびＶＬ遺伝子エレメント対を含む核酸セグメントを表す。該セグメントは、さらに、軽鎖および／または重鎖定常領域遺伝子エレメント、例えば、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域および／またはイソ型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの１つから選択される１以上の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４を含みうる。好ましいイソ型は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３である。核酸セグメントは、また、ＶＨおよびＶＬコード配列の二方向性または一方向性転写を容易にする１以上のプロモーターカセットを含んでいてもよい。付加的な転写または翻訳エレメント、例えば、遺伝子産物を分泌経路に向けさせる機能的リーダー配列、ポリＡシグナル配列、ＵＣＯＥおよび／またはＩＲＥＳもまた、セグメントに存在していてもよい。
【００３４】
「抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体」または「抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ」なる語は、組み換え生産された多様な抗体分子の組成物を表し、ここに、個々のメンバーは、ＲｈＤ抗原上の少なくとも１つのエピトープに結合することができる。好ましくは、該組成物は、単一産生細胞系統から生産される。ポリクローナル抗体の多様性は、可変領域（ＶＨおよびＶＬ領域）、特に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域に位置する。
【００３５】
「抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの別個のメンバー」なる語は、可変領域内に１以上の範囲（stretch）を含み、該ポリクローナルタンパク質の他の個々のメンバーと比べてアミノ酸配列における相違によって特徴付けられる、組み換えポリクローナル抗体組成物の個々の抗体分子を示す。これらの範囲は、特に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域に位置する。
【００３６】
「免疫グロブリン」なる語は、一般に、血液または血清中に見出される抗体の混合物の総称として用いられるが、他の供給源から得られた抗体の混合物を示すために用いてもよく、または「免疫グロブリン分子」なる語において使用される。
【００３７】
「ポリクローナル抗体」なる語は、同一または異なる抗原上のいくつかの異なる特異的抗原決定基と結合または反応することができる種々の（多様な）抗体分子の組成物を表す。通常、ポリクローナル抗体の変化性は、ポリクローナル抗体の所謂可変領域、特に、ＣＤＲ領域に位置する。ポリクローナル抗体のメンバーが抗原に結合すると記述する場合、本明細書では、１ｍＭより小さい、好ましくは１００ｎＭより小さい、より好ましくは１０ｎＭより小さい結合定数を有する結合を意味する。
【００３８】
「組み換え抗体」なる語は、天然では細胞と結合しないタンパク質のコード配列を含む発現ベクターでトランスフェクトした細胞または細胞系統から発現される抗体分子を表すために用いられる。抗体分子が多様であるかまたは異なる場合、「組み換えポリクローナル抗体」なる語は、ポリクローナル抗体の定義にしたがって応用する。
【００３９】
「ＶＨ：ＬＣ」および「ＶＨ：ＶＬ」という書き方は、軽鎖または可変軽鎖配列と可変重鎖配列との特定の対を示す。かかる特定のＶＨおよびＶＬ配列対は、核酸配列またはポリペプチドのいずれかであることができる。本発明において、特定のＶＨおよびＶＬ対は、ＲｈＤ抗原に対する結合特異性を付与する。
【００４０】
「ＲｈＤ」なる語は、また、ＲｈＤ変種も示す。
【００４１】
略語：抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ＝抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体。ＣＡＳＹ＝細胞カウンター＋分析機システム。ＥＬＩＳＡ＝酵素免疫測定吸着法。ＩＴＰ＝特発性血小板減少性紫斑病。ｐＷＣＰ＝ポリクローナルワーキング細胞プール。ＲＢＣ＝赤血球。ＲｈＤ＝レーソスＤ。ＲｈＤ（−）＝レーソスＤ陰性。ＲｈＤ（＋）＝レーソスＤ陽性。ＲｈＤＶＩ＝レーソスＤカテゴリーＶＩ抗原。抗−Ｄ＝高度免疫ドナー由来のＲｈＤに対するポリクローナル免疫グロブリン調製物。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１Ａ−Ｃ：  ５６個の選択されたＲｈＤクローンの可変重鎖（ＶＨ）をコードする核酸配列のアラインメント。個々のクローン名は、アラインメントの右に示され、ＣＤＲ領域の位置はアラインメントの上に示される。
【図２】図２Ａ−Ｅ：  ５６個の選択されたＲｈＤクローンの全軽鎖をコードする核酸配列のアラインメント。個々のクローン名は、カッパ鎖かラムダ鎖かを示すと共に、アラインメントの右に示され、ＣＤＲ領域の位置はアラインメントの上に示される。
【図３】図３：  ５６個の選択されたＲｈＤクローンのＶＨに対応するアミノ酸配列のアラインメント。個々のクローン名は、アラインメントの右に示され、ＣＤＲ領域の位置はアラインメントの上に示される。
【図４】図４Ａ−Ｂ：  ５６個の選択されたＲｈＤクローンのＶＬに対応するアミノ酸配列のアラインメントであって、ここに、（Ａ）はカッパ鎖に対応し、（Ｂ）はラムダ鎖に対応する。個々のクローン名は、アラインメントの右に示され、ＣＤＲ領域の位置はアラインメントの上に示される。
【図５】図５：  ９週間培養後のアリコート３９４８および３９４９由来の抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物のカチオン交換クロマトグラム。下方のダイアグラムは、アリコート３９４９に対応し、上方のダイアグラムはアリコート３９４８に対応する。上方のダイアグラムのＹ軸は、下方のダイアグラムと分離するために移された。ピークＡ−Ｊは、正味荷電が異なる抗体を含み、個々の抗体は荷電が不均一なようである。
【図６】図６：  １１週間培養後に抗ＲｈＤ  ｒｐＡｂを産生するポリクローナル細胞系統アリコート３９４８＋および３９４９＋（ＦＣＷ０６５）から由来するＲＴ−ＰＣＲ産物上のＨｉｎｆＩ  ＲＦＬＰ分析を示すゲル写真。特定のクローンに割り当てることができるバンドが同定される。
【図７】図７：  （Ａ）は、５Ｌスケールの流加培養法によって生産された、２５の個々のメンバーを用いる抗−ＲｈＤ  ｐＡｂの３つのバッチ、Ｓｙｍ０４：２１、Ｓｙｍ０４：２３およびＳｙｍ０４：２４の強度の比較を示す。ｐＡｂのＲｈＤ−陽性赤血球に対する結合は、ＦＡＣＳによって測定され、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ｐＡｂ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数として示される。さらに、２５の個々のメンバーを用いる抗−ＲｈＤ  ｐＡｂの機能的活性は、組み合わせたＡＤＣＣ／食作用アッセイにおいてＳｙｍ０４：２１およびＳｙｍ０４：２４上で測定された。（Ｂ）は、ＡＤＣＣ結果をｐＡｂ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数として、ＲｈＤ−陽性およびＲｈＤ−陰性赤血球の特異的溶解のパーセンテージとして示す。（ｃ）は、ｐＡｂ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数として、ＲｈＤ−陽性およびＲｈＤ−陰性赤血球の食作用のパーセンテージを示す。
【図８】図８：  機能的イン・ビトロアッセイを用いる、Ｓｙｍ００１および血漿由来抗−Ｄ生成物Ｗｉｎｒｈｏの比較可能性。Ａのパーセンテージ：  ＲｈＤ陽性または陰性ＲＢＣｓのＰＢＭＣに媒介されるＡＤＣＣ。Ｂ：  ＲｈＤ陽性または陰性ＲＢＣｓのＰＢＭＣに媒介される食作用。Ｃ：  Ｓｙｍ００１またはＷｉｎＲｈｏ中の抗−Ｄ抗体の濃度の関数としての、オプソニン化血小板のＴＨＰ−１細胞系統に媒介される食作用。個々の測定は、三連に基づく。標準偏差をバーで示す。
【図９】図９は、ベースラインと、Ｓｙｍ００１を種々の用量で投与された、またはプラセボを投与されたＲｈＤ陽性対象における投与後の種々の時点との、平均ヘモグロビンレベルの変化を示す。どの投与レベルにおいても、投与後のいずれの時点でも、ベースラインに相対的な変化は、統計学的に有意ではなく、または臨床上重要ではなかった。最大平均ヘモグロビンレベルは、２１日目の２５μｇ／ｋｇ群で観察され、０．４２ｇ／ｄＬであった。７５μｇ／ｋｇ群にある最大平均は、１４日目および２１日目に観察され、０．３ｇ／ｄＬであった。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な記載
血小板減少症
本発明は、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を用いる血小板減少症の治療に関する。血小板減少症は、血中における比較的少ない血小板の存在をいう。組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を用いる血小板減少症の治療は、一の具体例において、徴候的および／または改善的および／または予防的および／または治癒的であることができる。
【００４４】
ヒトにおいて、正常な血小板数は１５０，０００〜４５０，０００／ｍｍ３（マイクロリットル）の範囲である。しかしながら、これらの下限および上限は、各々２．５パーセンタイルによって決定され、逸脱は、必ずしもいずれかの形態の疾患を示すわけではない。一の具体例において、本発明は、血小板数１５０，０００／ｍｍ３（マイクロリットル）未満、例えば１４０，０００／ｍｍ３未満、例えば１３０，０００／ｍｍ３未満、例えば１２０，０００／ｍｍ３未満、例えば１１０，０００／ｍｍ３未満、例えば１００，０００／ｍｍ３未満、例えば８０，０００／ｍｍ３未満、例えば６０，０００／ｍｍ３未満、例えば４０，０００／ｍｍ３未満、または例えば２０，０００／ｍｍ３未満の個体、例えばヒトの、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を用いる血小板減少症の治療に関する。
【００４５】
血小板減少症の診断
血小板減少症は、種々の研究室試験によって診断でき、該試験には、下記の測定：全血球計算、肝臓酵素の測定、腎臓酵素の測定、ビタミンＢ１２レベル、葉酸レベル、赤血球沈降速度の測定、および／または末梢血塗沫標本が包含される。低血小板数の原因が不明である場合、低血小板数が産生減少に起因するのか、または末梢的破壊に起因するのかを区別するために、しばしば骨髄生検が始められる。
本発明は、本明細書中に上記されるものを包含するいずれかの方法によって診断された血小板減少症の、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を用いる治療に関する。
【００４６】
血小板減少症の原因
血小板数の減少は、下記のものを包含するいくつかの疾患プロセスに起因することができる。本発明は、いずれかの型の血小板減少症の、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物での治療に関する。血小板減少症の原因は、限定するものではないが、下記の原因の１以上であることができる。
【００４７】
Ａ）下記の１以上の因子によって引き起こされる血小板産生減少：
−  ビタミンＢ１２または葉酸欠乏
−  白血病または骨髄異形成症候群
−  肝不全における肝臓によるトロンボポイエチン産生減少
−  肺血症、全身性ウイルスまたは細菌感染
−  デング熱は、骨髄の直接感染により血小板減少症を引き起こすことができる。
−  巨核球ならびに免疫学的な血小板生存期間の短縮
−  遺伝性症候群
−  先天性無巨核球性血小板減少症（ＣＡＭＴ）
−  血小板減少性橈骨症候群
−  ファンコニ貧血
−  大型血小板に関連する、ベルナール・スーリエ症候群
−  Ｍａｙ−Ｈｅｇｇｌｉｎ異常、すなわち、血小板減少症、薄青（pale-blue）白血球封入体、および巨大血小板の組み合わせ
−  灰色血小板症候群
−  アルポート症候群
【００４８】
Ｂ）  下記の１以上の因子によって引き起こされる血小板破壊増加：
−  溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）
−  播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）
−  発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）
−  抗リン脂質症候群
−  全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
−  輸血後の紫斑病
−  新生児の同種免疫性血小板減少症（ＮＡＩＴＰ）
−  脾臓機能亢進に起因する血小板の脾臓封鎖
−  デング熱は、血小板生存期間の短縮および免疫学的な血小板破壊を引き起こすことが示された。
−  ＨＩＶ
【００４９】
Ｃ）  薬物療法によって誘導される血小板減少症
−  ヘパリン
−  バルプロ酸
−  キニジン
−  アブシキシマブ（Abciximab）
−  スルホンアミド抗生物質
−  インターフェロン
−  はしか−おたふく風邪−風疹ワクチン
−  糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤
−  クロピドグレル（Clopidogrel）
−  バンコマイシン（Vancomycin）
−  リネゾリド（Linezolid）
−  ファモチジン（Famotidine）
−  メベベリン（Mebeverine）
−  チニダゾール（Tinidazole）／メトロニダゾール（Metronidazole）
−  直接的な骨髄抑制のための薬物、例えば、バルプロ酸、メトトレキサート（Methotrexate）、カルボプラチン（Carboplatin）、インターフェロン、および他の化学療法薬
−  免疫学的血小板破壊のための薬物、例えば、抗体のＦａｂ部分に結合する薬物（例えば、キニジン群の薬物）、Ｆｃに結合する薬物、および血小板に結合し、活性化する薬物−抗体複合体。
【００５０】
血小板減少症の治療
治療は、病因および疾患の重篤度によって導かれる。血小板減少症の治療における主要な概念は、血小板減少症を引き起こす疑いのある薬物を中止することか、または潜在的な敗血症を治療することを意味する根本的な問題を排除することである。
【００５１】
本発明は、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を用いるいずれかの型の血小板減少症の治療に関する。組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物での血小板減少症の治療は、一の具体例において、下記の１以上の治療を包含する血小板減少症の１以上の他の治療と組み合わせることができる。
【００５２】
−  血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
ＴＴＰの治療は、１９８０年代に、プラズマフェレーシスの適用で革命を起こされた。Ｆｕｒｌａｎ−Ｔｓａｉ仮説によれば、該治療は理論的に、プロテアーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−１３を切断するフォン・ヴィレブランド（von Willebrand）因子に向けられた抗体を除去することによって働く。プラズマフェレーシス法は、また、活性なＡＤＡＭＴＳ−１３プロテアーゼタンパク質を患者に与え、それにより、フォン・ヴィレブランド因子多量体のより生理学的な状態を復元する。
【００５３】
−  特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
ＩＴＰの治療は、プレドニゾンおよび他のコルチコステロイド、静脈内ガンマグロブリン、脾臓摘出、ダナゾール（Danazol）、リツキシマブ（Rituximab）、トロンボポイエチンアナログおよびＡＭＧ５３１（Ｒｏｍｉｐｌｏｓｔｉｍ、商品名Ｎｐｌａｔｅ）を包含する。
【００５４】
治療組成物
本発明の具体例において、抗−ＲｈＤ抗体生成物を含む医薬組成物は、血小板減少症の治療を目的とする。
一の具体例において、医薬組成物は、さらに医薬上許容される賦形剤を含む。
【００５５】
抗−ＲｈＤ抗体生成物は、医薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤と共に、単位投与形態で投与されうる。患者へ投与するのに適当な処方または組成物を提供するために、従来の製薬習慣を用いてもよい。好ましい具体例において、投与は予防的である。
いずれの適当な投与経路を用いてもよく、例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋内、腹腔内、鼻腔内、エーロゾル、座剤、または経口投与であってもよい。
【００５６】
例えば、治療処方は、液体溶液または懸濁液の形態であってもよく、経口投与の場合、処方は、錠剤またはカプセル、チューイングガムまたはペーストの形態であってもよく、鼻腔内投与の場合、粉末、滴鼻剤、またはエーロゾルの形態であってもよい。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、それ自体既知の方法で調製され、例えば、通常の溶解、凍結乾燥、混合、造粒または調合プロセスの手段によって調製される。医薬組成物は、従来の製薬習慣にしたがって処方すればよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （第２０版），Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編，  ２０００，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ  ａｎｄ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ｊ．  Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｏｙｌａｎ，  １９８８−１９９９，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ参照）。
【００５８】
例えば、活性成分を単独で、または担体、例えば、マンニトールと共に含む、使用前に製造されるような溶液または懸濁液のための凍結乾燥組成物の場合、可能であれば、活性成分の溶液、また、懸濁液、特に水性溶液または懸濁液が好ましく用いられる。医薬組成物は、滅菌されていてもよく、および／または賦形剤、例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤を含んでいてもよく、それ自体既知の方法で、例えば、通常の溶解または凍結乾燥プロセスの手段によって調製される。該溶液または懸濁液は、粘性増加物質、例えば、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、またはゼラチンを含んでいてもよい。
【００５９】
注射組成物は、滅菌条件下で慣例の方法で調製され、同様に、組成物をアンプルまたはバイアル中に導入し、容器を密封する。
【００６０】
経口投与用医薬組成物は、活性成分を固体担体と合わせ、所望により、得られた混合物を造粒し、次いで、必要に応じて適当な賦形剤の添加後に、該混合物を錠剤、ピルまたはカプセルに加工することによって得ることができ、それをセラック、糖またはその両方でコーティングしてもよい。また、それらを、活性成分を分散または測定量で放出させるプラスチック担体中に組み込むことも可能である。経口投与の場合、医薬組成物は、胃の胃酸中での該組成物の消化を妨げるように保護することができる。
【００６１】
医薬組成物は、約１％〜約９５％、好ましくは約２０％〜約９０％の活性成分を含む。医薬組成物は、本発明によれば、例えば、単位投与形態、例えば、アンプル、バイアル、坐剤、錠剤、ピルまたはカプセルの形態であってもよい。該処方は、疾患または状態の治療を提供するために、ヒト個人に、治療上または予防上有効量（例えば、病理学的状態を防ぐ、排除する、または減少させる量）で投与することができる。投与されるべき治療剤の好ましい投与量は、障害の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、化合物賦形剤の処方、および投与経路のような変数に依存しやすい。
【００６２】
組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を用いる血小板減少症の治療は、一の好ましい具体例において、１用量あたり、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０−５００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０−２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２５−５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が５０−７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が７５−１００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１００−１２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１２５−１５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１５０−１７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１７５−２００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２００−２２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２２５−２５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２５０−２７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２７５−３００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が３００−３２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が３２５−３５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が３５０−３７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が３７５−４００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が４００−４２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が４２５−４５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が４５０−４７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が４７５−５００μｇの用量で投与するために調製される。
【００６３】
一の具体例において、脾臓摘出患者またはＲｈＤ陰性患者における、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物を用いる血小板減少症の治療は、１用量あたり、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０−２０００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０−２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２５−５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が５０−７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が７５−１００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１００−１２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１２５−１５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１５０−１７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１７５−２００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２００−２２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２２５−２５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２５０−２７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が２７５−３００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が３００−３２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が３２５−３５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が３５０−３７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が３７５−４００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が４００−４２５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が４２５−４５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が４５０−４７５μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が４７５−５００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が５００−５５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が５５０−６００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が６００−６５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が６５０−７００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が７００−７５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が７５０−８００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が８００−８５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が８５０−９００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が９００−９５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が９５０−１０００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０００−１０５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１０５０−１１００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１１００−１１５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１１５０−１２００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１２００−１２５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１２５０−１３００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１３００−１３５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１３５０−１４００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１４００−１４５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１４５０−１５００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１５��０−１５５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１５５０−１６００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１６００−１６５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１６５０−１７００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１７００−１７５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１７５０−１８００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１８００−１８５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１８５０−１９００μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１９００−１９５０μｇ、例えば、患者の体重１ｋｇあたり特異的抗体が１９５０−２０００μｇの用量での組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物の投与を含む。
【００６４】
本発明の組成物の治療的使用
本発明によれば、医薬組成物は、ヒトなどの哺乳動物における、血小板減少症の治療、改善または予防に使用されうる。
本発明の一の態様は、動物またはヒトにおける疾患の治療、改善または予防の方法であり、ここに、組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物の有効量が投与される。
【００６５】
本発明によれば、医薬組成物は、一の具体例において、一度に投与することができ、１日１回投与することができ、１日以上、例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日間隔を置いて繰り返し投与することができ、または週１回または２回、あるいは月１回または２回、あるいは年１回または２回繰り返し投与することができる。
【００６６】
ヘモグロビンレベル
本発明は、さらに、貧血のヒトなどの個体における血小板減少症の治療に関する。貧血は、ヘモグロビン、赤血球内に見出される分子の質的または量的不足として定義される。ヘモグロビンレベルは、個体の年齢および性別に依存する。
【００６７】
本発明の一の具体例において、対象のヘモグロビンレベルは、１５ｇ／ｄＬ未満、例えば１４ｇ／ｄＬ未満、例えば１３ｇ／ｄＬ未満、例えば１２ｇ／ｄＬ未満、例えば１１ｇ／ｄＬ未満、例えば１０ｇ／ｄＬ未満、例えば９ｇ／ｄＬ未満、例えば８ｇ／ｄＬ未満である。
【００６８】
貧血は、性別および年齢についての実験正常範囲の下限より２．０ｇ／ｄＬ低い投与前ヘモグロビン値として定義することができる。性別は、雄および雌の群に分けることができる。年齢は、新生、子ども、および成体の群に分けることができる。成体のサブグループは妊娠した雌成体を含む。
【００６９】
貧血の別の定義は、年齢および性別についての正常実験範囲より２標準偏差（ＳＤ）低いヘモグロビンレベルである。２ＳＤは、ほぼ２ｇ／ｄＬに相当する。
【００７０】
成体における貧血の標準的な診断は、女性において＜１２ｇ／ｄＬおよび男性において＜１４ｇ／ｄＬのヘモグロビン値に相当し、ＷＨＯの基準（世界保健機関：  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ａｎｅｍｉａ：  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｇｅｎｅｖａ：  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  １９６８）に基づく。
【００７１】
正常なヘモグロビン値は、個々の実験標準に依存するが、ほぼ下記の通りである（情報源：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃａｌ−ｌｉｂｒａｒｙ．ｎｅｔ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｖｉｅｗ／２９７／４１／）。
成人男性：１３−１８ｇ／ｄＬヘモグロビン
成人女性：１２−１６ｇ／ｄＬヘモグロビン
妊婦：１１−１２ｇ／ｄＬヘモグロビン
新生児：１７−１９ｇ／ｄＬヘモグロビン（該値の７７％は、胎児性ヘモグロビンであり、生後４ヶ月で全体の約２３％に落ちる）
小児：１４−１７ｇ／ｄＬヘモグロビン
【００７２】
組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物
本発明で使用するための組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物は、ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００５０１に開示され、また、本明細書中にも下記される。
【００７３】
本発明のさらなる具体例において、抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体組成物は、ＲｈＤ抗原上の少なくとも１つのエピトープ、例えば、ｅｐＤ１、ｅｐＤ２、ｅｐＤ３、ｅｐＤ４、ｅｐＤ５、ｅｐＤ６／７、ｅｐＤ８および／またはｅｐＤ９に対する結合を示すが、ＲｈＣ、ｃ、Ｅ、ｅ抗原には結合しないか、または非常に弱く結合するという共通の特徴に基づいて、個々の個体の規定サブセットを含む。好ましくは、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物は、ｅｐＤ３、ｅｐＤ４およびｅｐＤ９に結合する少なくとも１つの抗体（ＲｈＤカテゴリーＶＩ抗原結合性抗体）および少なくとも一緒に残りのエピトープｅｐＤ１、ｅｐＤ２、ｅｐＤ５、ｅｐＤ６／７およびｅｐＤ８に結合するさらなる抗体、例えば、ＲｈＤカテゴリーＩＩまたはＩＩＩ抗原に対する抗体、またはカテゴリーＶＩＩ抗原に対する抗体と組み合わされたＲｈＤカテゴリーＩＶもしくはＶ抗原結合性抗体から成る。典型的には、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物は、少なくとも５、１０、２０、５０、１００または５００個の別個の変種メンバーを有する。変種メンバーの好ましい数は、５〜１００、より好ましくは５〜５０、最も好ましくは１０〜３０、例えば、１０〜２５の範囲である。
【００７４】
ＶＨおよびＶＬ領域、特にＣＤＲ領域の変動性のほかに、定常領域もまた、イソ型に関して変化しうる。これは、１の特定のＶＨおよびＶＬ対が定常重鎖イソ型、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを変化させて生じうることを意味する。かくして、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂは、可変領域（Ｖ領域）ならびに定常領域における個々の抗体分子間の配列相違によって特徴付けられる抗体分子を含みうる。抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物は、上記のいずれかの重鎖イソ型またはその組み合わせを有する抗体から成ることができる。好ましい抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物は、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ１およびＩｇＧ３定常領域を含有する。本発明の好ましい具体例において、ＶＨおよびＶＬ対の各々またはいくつかは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１および／またはＩｇＡ２定常重鎖と共に発現される。
【００７５】
抗−ＲｈＤ抗体をコードする核酸セグメントのライブラリーを提供するために、当該分野で既知のいくつかの方法を利用してもよい。ＶＨおよびＶＬをコードするセグメントを含む第一のライブラリーは、コンビナトリアル技術（例えば、ＥＰ０  ３６８  ６８４）または同族（cognate）対合を維持する技術（同じ細胞由来の可変領域をコードする配列の対合、ＷＯ  ０５／０４２７７４に記載）によって生じうる。さらに、ＶＨおよびＶＬをコードするセグメントライブラリーは、単離ＣＤＲ遺伝子フラグメントを適当なフレームワーク内に組み込むことによって（例えば、Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ，  Ｅ．ら、２０００．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ８５２−８５６）、または１以上の抗−ＲｈＤ  ＶＨおよびＶＬをコードする配列の変異によって生じうる。該第一のライブラリーは、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸セグメント産生抗体またはフラグメントについて、ＲｈＤに対する結合特異性を用いてスクリーンし、それにより、抗−ＲｈＤ  Ａｂをコードする核酸セグメントのライブラリーを生じる。特に、コンビナトリアルライブラリーを用いると、スクリーニングの前に、富化工程、所謂バイオパニング（biopanning）工程を行う。既知のバイオパニング技術はファージディスプレー（Ｋａｎｇ，  Ａ．Ｓ．ら、１９９１．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８，  ４３６３−４３６６）、リボソームディスプレー（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ，  Ｃ．ら、１９９９．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１，  １１９−１３５）、ＤＮＡディスプレー（Ｃｕｌｌ，  Ｍ．Ｇ．ら、１９９２．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９，  １８６５−１８６９）、ＲＮＡ−ペプチドディスプレー（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．，  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，  １９９７．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４，  １２２９７−１２３０２）、共有結合ディスプレー（ＷＯ  ９８／３７１８６）、細菌性表面ディスプレー（Ｆｕｃｈｓ，  Ｐ．ら、１９９１．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，  １３６９−１３７２）、酵母表面ディスプレー（Ｂｏｄｅｒ，  Ｅ．Ｔ．，  Ｗｉｔｔｒｕｐ，  Ｋ．Ｄ．，  １９９７．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，  ５５３−５５７）および真核生物ウイルスディスプレー（Ｇｒａｂｈｅｒｒ，Ｒ．，  Ｅｒｎｓｔ，Ｗ．，  ２００１．  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．  Ｓｃｒｅｅｎ．  ４，  １８５−１９２）である。ＦＡＣＳおよび磁性ビーズソーティングもまた、標識抗原を用いる富化（パニング）目的に応用される。ＲｈＤ結合物質についてのスクリーニングは、一般に、免疫検出アッセイ、例えば、凝集、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡおよび／またはイムノドットアッセイで実施される。
【００７６】
スクリーニング後、生じたＶＨおよびＶＬコード化核酸セグメントのサブライブラリーは、一般に、スクリーニングベクターから、部位特異的組込および所望の宿主細胞における発現に適当な発現ベクター中へ移入させる必要がある。移入の間、個々のＶＨ：ＶＬ対をコードしている配列を維持することが重要である。このことは、サブライブラリーの個々のメンバーを分離させ、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を１つずつ移動させることによって達成できる。別法では、サブライブラリーを構成するベクターをプールし、ＶＨ：ＶＬ対をコードしている配列をセグメントとして移動させ、移動の間、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を一緒に維持する。該過程は、物質移動（mass transfer）とも呼ばれ、選択されたＶＨ：ＶＬ対の全てを１つのベクターから別のベクターへ容易に移動させることが可能である。
【００７７】
抗−ＲｈＤ抗体生成物は、好ましくは、Ｄ＋および試験された全変種（ＤＩＩＩ、ＤＩＶ、ＤＶ、ＤＶＩ型Ｉ−ＩＩＩ、ＤＶＩＩ、ＤＦＲ、ＲｏＨＡＲ、ＤＯＬ、ＤＡＲ、ＤＨＭｉ、ＤＢＴ、弱Ｄ型１、２、３、４および１２）に対する反応性を有する抗体を含む。
【００７８】
本発明は、クローンＲｈＤ１５７、１５９、１６０、１６２、１８９、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０７、２４０、２４１、２４５、２９３、３０１、３０５、３０６、３１７、３１９、３２１および３２４によってコードされる２５個の抗体のＣＤＲ配列を有する抗体を含む抗−ＲｈＤ抗体生成物に関する。
【００７９】
本発明は、また、クローンＲｈＤ１５７、１５９、１６０、１６２、１８９、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０７、２４０、２４１、２４５、２９３、３０１、３０５、３０６、３１７、３１９、３２１および３２４によってコードされる２５個の抗体のＶＨＶＬ配列を有する抗体を含む抗−ＲｈＤ抗体生成物に関する。
【００８０】
一の好ましい具体例において、本発明は、クローンＲｈＤ１５７、１５９、１６０、１６２、１８９、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０７、２４０、２４１、２４５、２９３、３０１、３０５、３０６、３１７、３１９、３２１および３２４によってコードされる抗体を含む抗−ＲｈＤ抗体生成物に関する。
【００８１】
一の好ましい具体例において、抗−ＲｈＤ抗体生成物は、哺乳動物細胞において製造され、より好ましくは、ＣＨＯ細胞における発現によって得られうるグリコシル化を用いて製造される。
【００８２】
抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの構造的特徴付け
ポリクローナル抗体の構造的特徴付けには、混合物の複雑性（クローンの多様性、異質性およびグリコシル化）のため、高度な分析が必要である。ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたは電気泳動などの伝統的なアプローチは、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂにおける個々の抗体のなかで区別化するのに十分な分析をもたらさない。２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）が複合タンパク質混合物のプロファイリングに用いられ、次いで、質量分析（ＭＳ）または液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−ＭＳ（例えば、プロテオミクス）が用いられた。タンパク質の電荷および質量に基づく分離を組み合わせた２Ｄ−ＰＡＧＥは、血清試料中におけるポリクローナル、オリゴクローナルおよびモノクローナル免疫グロブリン間の区別に有用であることが証明された。しかしながら、該方法には、いくつかの制限がある。クロマトグラフィー技術、特に、キャピラリーおよびエレクトロスプレーイオン化ＭＳ結合型ＬＣは、複合ペプチド混合物の分析に益々応用されている。ＬＣ−ＭＳは、モノクローナル抗体の特徴付けに使用され、近年では、ポリクローナル抗体軽鎖のプロファイリングにも使用されている。非常に複雑な試料の分析には、より分解能の高いクロマトグラフ系が必要であり、それは、２次元（またはそれ以上）における分離によって得ることができる。かかるアプローチは、一次元でのイオン交換、およびＭＳに結合していてもよい、二次元での逆相クロマトグラフィー（または疎水性相互作用）に基づく。
【００８３】
抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの機能的特徴付け
抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ抗体は、例えば、抗−Ｄ免疫グロブリン生成物または抗−ＲｈＤ  ｍＡｂｓとの比較可能性研究によって機能的に特徴付けることができる。かかる研究は、イン・ビトロならびにイン・ビボで行うことができる。
イン・ビトロで抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを機能的に特徴付ける方法は、例えば、食作用アッセイ（５１ＣｒベースまたはＦＡＣＳベース）、抗体依存性細胞毒（ＡＤＣＣ）およびロゼット（rosetting）アッセイであることができる。簡単に言えば、アッセイは、下記のように実施される。
【００８４】
ＡＤＣＣアッセイ（５１Ｃｒベース）：
ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ＲｈＤ陰性および陽性ＲＢＣ（ＡＢ０系では０）を標的として用いる。まず、ＲＢＣ（ＲｈＤ（＋）およびＲｈＤ（−））を５１Ｃｒ標識し、洗浄し、次いで、種々の希釈度において、抗−ＲｈＤ抗体（例えば、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ、抗−Ｄまたは抗−ＲｈＤ  ｍＡｂ）で感作する。エフェクター細胞（ＰＭＢＣ）を感作したＲＢＣに加え（２０：１比）、一晩インキュベーションする。細胞をスピンダウンし、ウェル由来の上清をＬｕｍａｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移す。自然放出についての対照（５１Ｃｒ標識ＲＢＣのみ）、全放出についての対照（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００の５１Ｃｒ標識ＲＢＣへの添加）が含まれる。Ｌｕｍａｐｌａｔｅを乾燥させ、Ｔｏｐｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でカウントする。
【００８５】
食作用アッセイ（５１Ｃｒベース）：
食作用は、ＡＤＣＣアッセイと組み合わせて測定することができる。ＡＤＣＣアッセイにおける上清を収集後、残りの上清を除去し、低張緩衝液の添加により、赤血球を溶解する。該細胞を洗浄し、上清を除去する。ＰＢＳ＋１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を全てのウェルに加え、固定量をＬｕｍａｐｌａｔｅに移し、乾燥させ、上記のようにカウントする。
【００８６】
食作用アッセイ（ＦＡＣＳベース）：
該アッセイは、食細胞の接着に基づく。ヒト白血病性単芽球細胞系統Ｕ９３７を該アッセイに用いることができる。Ｕ９３７細胞は、１０ｎＭ  ＰＭＡを用いて分化する。２日後、培地の６０％を除去し、ＰＭＡを含有しない培地に置き換える。赤血球（ＲｈＤ（＋）およびＲｈＤ（−））の細胞膜をＰＫＨ２６（ＰＥ）を用いて、製造者のプロトコール（Ｓｉｇｍａ）にしたがい染色する。ＲＢＣを、種々の希釈度の抗−ＲｈＤ抗体で感作し、過剰な抗体を洗浄により除去する。３日目に、非接着細胞Ｕ９３７細胞を洗浄により除去し、感作したＲＢＣ（ＲｈＤ（＋）およびＲｈＤ（−））をウェルに加える。プレートをインキュベーター中で一晩インキュベートする。食菌されていないＲＢＣを数回の工程で洗い去る。食菌されていないが、接着したＲＢＣを低張緩衝液の添加によって溶解し、次いで、さらに洗浄する。トリプシンとのインキュベーションにより、Ｕ９３７細胞をウェルから外す。細胞をＦＡＣＳで分析する。
【００８７】
血小板食作用の阻害の決定のためのアッセイ：
該機能的アッセイは、血小板食作用の用量依存性阻害を決定する。
簡単に言えば、血小板をＣＭグリーンで標識し、抗体を用いてオプソニン化し、エフェクター細胞：ＴＨＰ−１単球細胞系統と共にインキュベートする。血小板、赤血球およびＴＨＰ−１細胞を実施例４の記載のように調製した。血小板の食作用は、下記のように決定された。血小板（１：２０  Ｅ：Ｔ比で、２ｘ１０８／ｍｌ  ５０μｌ／ウェル）、ＲＢＣ（１：４０  Ｅ：Ｔ比で、４ｘ１０８／ｍｌ  ５０μｌ／ウェル）およびＴＨＰ−細胞（１ｘ１０７／ｍｌ  ５０μｌ／ウェル）を混合し、加湿インキュベーター（５％  ＣＯ２−３７℃）中で２時間インキュベートした。ＰＢＳ中で予め１：１希釈した１００μｌ  Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ，Ｆｌｕｋａを加えて、ＴＨＰ細胞の外部の非特異的結合を遮断した。２００μｌ／ウェル  ＰＢＳ（２１０ｇ  ＋４℃，３分）で１回洗浄し、２００μｌ／ウェル  溶解溶液，ＢＤを加え、４℃で１５分インキュベートした。２００μｌ／ウェル  ＰＢＳ中で１回洗浄し、２００μｌ／ウェル  ＰＢＳ中に再懸濁した。ライブ・ゲート（live gate）を通過したＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ上のＨＴＳ上のＳＳＣおよびＦＳＣにより、細胞を獲得し、Ｆｌ−１のメジアン蛍光強度を分析した。
【００８８】
ロゼットアッセイ
ロゼットアッセイは、単に、Ｆｃ受容体結合アッセイである。感作した赤血球を上記のようにして分化したＵ９３７細胞と共にインキュベートする。ＲＢＣ（ＲｈＤ（−）およびＲｈＤ（＋））を種々の希釈度の抗−ＲｈＤ抗体で感作し、過剰の抗体を洗浄により除去した後、Ｕ９３７細胞と混合する。１時間インキュベーションし、結合していないＲＢＣを洗い去る。表面に結合した２以上のＲＢＣで細胞のパーセンテージをカウントする。
抗−ＲｈＤ抗体のイン・ビボ機能的特徴付けは、Ｍｉｅｓｃｈｅｒ（Ｍｉｅｓｃｈｅｒ，  Ｓ．ら、２００４，  Ｂｌｏｏｄ  １０３，  ４０２８−４０３５）によって記載されており、ＲｈＤ（＋）細胞のＲｈＤ（−）個体中への注入、次いで抗−ＲｈＤ抗体の投与を含む。ドナーのＲＢＣクリアランスおよび抗−ＲｈＤ抗体感作を分析した。
【００８９】
組み換えポリクローナル抗−ＲｈＤ抗体生成物ｗ品の生産
組み換えポリクローナルタンパク質発現系
本発明は、１または２、３個の細胞系統由来の抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体（抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ）の一貫した製造のための組み換えポリクローナル抗体発現系を提供する。抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体（抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ）は、ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００５０１に記載されるように製造および／または精製および／または特徴付けされうる。
【００９０】
ＶＨおよびＶＬ領域、特にＣＤＲ領域の変動性に加え、定常領域もまた、イソ型に関して変化しうる。このことは、１の特定のＶＨおよびＶＬ対が定常重鎖イソ型、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを変化させて生産されうることを意味する。かくして、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂは、可変領域（Ｖ領域）ならびに定常領域における個々の抗体分子間の配列相違によって特徴付けられる抗体分子を含みうる。抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物は、上記のいずれかの重鎖イソ型またはその組み合わせを有する抗体からなることができる。好ましい抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物は、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ１およびＩｇＧ３定常領域を含有する。本発明の好ましい具体例において、ＶＨおよびＶＬ対の各々またはいくつかは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１および／またはＩｇＡ２定常重鎖と共に発現される。
【００９１】
抗−ＲｈＤ抗体をコードする核酸セグメントを提供するために、当該分野で既知のいくつかの方法が利用されうる。ＶＨおよびＶＬをコードするセグメントを含む第一のライブラリーは、コンビナトリアル技術（例えば、ＥＰ  ０  ３６８  ６８４）または同族対合（同じ細胞由来の可変領域コード化配列の対合、ＷＯ  ０５／０４２７７４に記載）を維持する技術によって生成されうる。さらに、ＶＨおよびＶＬをコードするセグメントライグラリーは、単離ＣＤＲ遺伝子フラグメントを適当なフレームワーク中に組み込むことによって（例えば、Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ，  Ｅ．ら、２０００．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ８５２−８５６）、または１以上の抗−ＲｈＤ  ＶＨおよびＶＬをコードする配列の変異によって生成されうる。該第一のライブラリーは、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸セグメント産生抗体またはフラグメントについて、ＲｈＤに対する結合特異性を用いてスクリーンされ、それにより、抗−ＲｈＤ  Ａｂをコードする核酸セグメントを生成する。特に、コンビナトリアルライブラリーを用いる場合、スクリーニングの前に、富化工程、例えば、所謂バイオパニング工程を行う。既知のバイオパニング技術は、ファージディスプレー（Ｋａｎｇ，  Ａ．Ｓ．ら、１９９１．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８，  ４３６３−４３６６）、リボソームディスプレー（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ，  Ｃ．ら、１９９９．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１，  １１９−１３５）、ＤＮＡディスプレー（Ｃｕｌｌ，  Ｍ．Ｇ．ら、１９９２．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９，  １８６５−１８６９）、ＲＮＡ−ペプチドディスプレー（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．，  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，  １９９７．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４，  １２２９７−１２３０２）、共有結合ディスプレー（ＷＯ  ９８／３７１８６）、細菌表面ディスプレー（Ｆｕｃｈｓ，  Ｐ．ら、１９９１．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，  １３６９−１３７２）、酵母表面ディスプレー（Ｂｏｄｅｒ，  Ｅ．Ｔ．，  Ｗｉｔｔｒｕｐ，  Ｋ．Ｄ．，  １９９７．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，  ５５３−５５７）および真核生物ウイルスディスプレー（Ｇｒａｂｈｅｒｒ，Ｒ．，  Ｅｒｎｓｔ，Ｗ．，  ２００１．  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．  Ｓｃｒｅｅｎ．  ４，  １８５−１９２）である。ＦＡＣＳおよび磁性ビーズソーティングもまた、標識抗原を用いる富化（パニング）目的に応用できる。ＲｈＤ結合物質についてのスクリーニングは、一般に、免疫検出アッセイ、例えば、凝集、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡおよび／またはイムノドットアッセイを用いて行う。
【００９２】
スクリーニング後、生成したＶＨおよびＶＬをコードする核酸セグメントのサブライブラリーは、一般に、スクリーニングベクターから、所望の宿主細胞における部位特異的組み込みおよび発現に適当な発現ベクター中へ移入されなければならない。移入の間、個々のＶＨ：ＶＬ対をコードする配列が維持されることが重要である。これは、サブライブラリーの個々のメンバーを分離させ、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を一つずつ移動させることによって達成することができる。別法では、サブライブラリーを構成するベクターをプールし、ＶＨ：ＶＬ対をコードしている配列をセグメントとして移動させ、それにより、移入の間、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を離ればなれにならないようにする。該過程は、物質移動とも呼ばれ、選択されたＶＨ：ＶＬ対の全ての１のベクターから別のベクターへの容易な移動を可能にする。
【００９３】
本発明のさらなる具体例において、抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体組成物は、ＲｈＤ抗原上の少なくとも１つのエピトープ、例えば、ｅｐＤ１、ｅｐＤ２、ｅｐＤ３、ｅｐＤ４、ｅｐＤ５、ｅｐＤ６／７、ｅｐＤ８および／またはｅｐＤ９に対する結合を示すが、ＲｈＣ、ｃ、Ｅ、ｅ抗原には非常に弱くしか結合しないという共通の特性に基づいて、個々の抗体の規定のサブセットを含む。好ましくは、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物は、ｅｐＤ３、ｅｐＤ４およびｅｐＤ９に結合する少なくとも１つの抗体（ＲｈＤカテゴリーＶＩ抗原結合性抗体）、および少なくとも一緒に、残りのエピトープｅｐＤ１、ｅｐＤ２、ｅｐＤ５、ｅｐＤ６／７およびｅｐＤ８に結合するさらなる抗体、例えば、ＲｈＤカテゴリーＩＩまたはＩＩＩ抗原に対する抗体、またはカテゴリーＶＩＩ抗原に対する抗体と組み合わされたＲｈＤカテゴリーＩＶまたはＶ抗原結合性抗体からなる。典型的には、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物は、少なくとも５、１０、２０、５０、１００または５００の別個の変種メンバーを有する。変種メンバーの好ましい数は、５〜１００個、より好ましくは５〜５０個、最も好ましくは１＋〜３０個、例えば、１０〜２５個の範囲である。
【００９４】
本発明のさらなる具体例は、組み換えポリクローナルを製造する細胞系統であって、抗−ＲｈＤポリクローナル抗体をコードする核酸セグメントのライブラリーでトランスフェクトされた細胞のコレクションを含み、ここに、該コレクション中の各細胞は、ライブラリーの１メンバーを発現することができ、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂまたはフラグメントの別個のメンバーをコードし、該コレクション中の個々の細胞のゲノム中の同じ部位に位置し、ここに、該核酸セグメントは天然には該コレクション中の該細胞と結合しない、細胞系統である。
【００９５】
さらなる具体例において、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂをコードする変種核酸セグメントは全て、天然配列から由来するものであり、例えば、コンビナトリアルＶＨ：ＶＬ対または同族対としてドナーから単離されるものであり、変異によって誘導されるものではない。
【００９６】
各細胞内のゲノム中の単一の特異的部位に位置する変種核酸を含有する細胞の組成物は、ＷＯ  ０２／４４３６１に記載されている。該公報は、所望の特性を有する分子を同定するための細胞の使用を開示するが、生産系の提供または抗原に対する特異的結合によって特徴付けられるポリクローナル抗体の提供を取り扱わない。
【００９７】
クローン多様性／ポリクローナル性
ポリクローナル抗体の特徴の１つは、いくつかの個々の抗体分子から構成され、ここに、各抗体分子がポリクローナル抗体の他の分子と同種であるが、ポリクローナル抗体の個々のメンバー間のアミノ酸配列相違によって特徴付けられる変動性を有することである。これらの相違点は通常、可変領域、特にＣＤＲ領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に制限される。ポリクローナル抗体の該変動性は、また、機能性レベルにおける多様性、例えば、１以上の標的に位置する同一または異なる抗原上の異なる抗原決定基に関して異なる特異性およびアフィニティーとして記載することもできる。組み換えポリクローナル抗体において、多様性は、ドナー由来の免疫グロブリン生成物において観察される多様性のサブセットを構成する。かかるサブセットは、所望の標的抗原、特定の場合、ＲｈＤ抗原に対する結合能に関して、注意深く選択され、特徴付けられる。
【００９８】
組み換えポリクローナル抗体の産生に関して、関心の１つは、クローン多様性が最終産物において維持されるか否かである。クローン多様性は、ＲＦＬＰまたは抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを発現する細胞由来の（ＲＴ）−ＰＣＲ産物の配列決定によって分析されうる。該多様性は、また、細胞系統によって産生される抗ＲｈＤ  ｒｐＡｂ上での機能試験（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって、個々のメンバーに対する抗−イディオタイプ抗体によって、またはクロマトグラフィー法によって、タンパク質レベルで分析することができる。
【００９９】
クローンバイアスは、存在するならば、トランスフェクションに用いられる最初のライブラリーのクローン多様性を、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを発現する細胞（ポリクローナル細胞系統）のプール中で見出される多様性と比較することによって評価することができる。
【０１００】
抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂのクローン多様性は、ポリクローナル組成物の個々のメンバーの分布として評価することができる。該分布は、トランスフェクションの間、細胞系統中にもともと導入される異なるコード化配列の数と比較した、最終ポリクローナル抗体組成物中の異なる個々のメンバーの数として評価することができる。この場合、、トランスフェクションにおいてもともと用いられたコード化配列の少なくとも５０％が最終−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの異なる個々のメンバーとして同定できる場合、十分な多様性が獲得されたとみなされる。好ましくは、トランスフェクションに使用された抗−ＲｈＤ抗体コード化配列の少なくとも７５％が最終組成物中で抗体として同定することができる。より好ましくは、トランスフェクションに使用された抗−ＲｈＤ抗体コード化配列の少なくとも８５％〜９５％、最も好ましくは１００％が最終組成物の抗体として同定することができる。
【０１０１】
抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物の個々のメンバーの分布は、また、個々のメンバー間での相互分布に関して評価することができる。この場合、最終抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物中の個々のメンバーの全数の７５％より多くを構成する組成物中の単一のメンバーが無い場合、十分なクローン多様性が獲得されたとみなされる。好ましくは、各メンバーは、最終ポリクローナル組成物中の個々のメンバーの全数の５０％、より好ましくは２５％、最も好ましくは１０％を超えない。ポリクローナル組成物中の個々のメンバーの分布に基づくクローン多様性の評価は、ＲＦＬＰ分析、配列分析またはタンパク質分析、例えば、ポリクローナル組成物の特徴付けのための下記のアプローチによって実施することができる。
【０１０２】
クローン多様性は、ａ）クローニング過程の間、ｂ）細胞増殖における変動の結果として、またはｃ）複数の要素のスクランブルによって生じることのできるクローンバイアスの結果として、減少されうる。かかるバイアス生じる場合、クローン多様性の喪失のこれらの原因の各々は、本明細書中に記載される方法に若干の修正を加えた方法によって、容易に補修される。
【０１０３】
適当なベクター中への可変ドメインのクローニングによって導入されるバイアスを制限するために、１のベクターから別のベクターへの目的遺伝子の移入を、クローニングバイアスが制限されるように設計してもよい。物質移動技術および増幅に用いられるイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の注意深い選択により、クローニングバイアスを減少させることができる。別の可能性は、スクリーニングベクターと部位特異的組み込みのためのベクターとの間における、ポリクローナル抗体の個々のメンバーをコードしている各ポリヌクレオチドの個々の移動を実施することである。細胞系統における個々の細胞の細胞増殖速度における変化は、長期にわたり、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ発現中にバイアスを導入することができ、その結果、細胞系統によって発現される抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂのいくつかのメンバーの存在を増加または減少させることが可能である。増殖速度におけるかかる変化の１の理由は、最初のトランスフェクションに用いられる開始細胞系統を構成する細胞の集団が不均一であることである。細胞系統における個々の細胞が長期にわたり異なって発達することが知られている。より均一な出発物質を確保するために、目的のライブラリーでトランスフェクションする前に、細胞系統を単一細胞レベルまで減らし、各単一細胞を新規の細胞集団まで増殖させた限界希釈を用いて、細胞系統のサブクローニングを行ってもよい（所謂、限界希釈による細胞サブクローニング）。次いで、これらの細胞集団の１以上を、それらの増殖および発現特性に基づいて、出発物質として選択する。さらに、部位特異的組み込み体（integrant）を受容した細胞のみが生存することを確実にするために用いられる選択圧は、ポリクローナル細胞系統内の個々の細胞の増殖速度に影響を及ぼすかもしれない。これは、該選択圧に適合させるために、ある種の遺伝的変化を受ける好ましい細胞に起因するかもしれない。かくして、選択マーカーの選択もまた、増殖速度によって誘導されるバイアスに影響しうる。このような場合、種々の選択マーカーを試験すべきである。選択が細胞毒性物質に基づく場合、最適濃度を注意深く試験すべきであり、また、選択が生産期間の全期間を通して必要なのか、または最初の段階でのみ必要なのかを試験すべきである。
【０１０４】
よく定義された細胞集団を確実にするための付加的なアプローチは、トランスフェクションおよび選択手法後に蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いることである。ＩｇＧ構築物でトランスフェクトされた細胞のプールから由来する生産性の高い細胞を富化するために、蛍光標識抗体を用いることができる（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙら、Ｊ．  ２００３．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７７，  １４１−１５５）。該方法は、また、類似レベルの免疫グロブリンを発現する細胞を分類するために用いることもでき、それにより、生産性について均一な細胞集団を作成することができる。同様に、蛍光染料５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識することによって、類似の増殖速度を示す細胞をＦＡＣＳ法によって選択することができる。さらに、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの個々のメンバーの発現レベルにおける相違は、また、長期にわたって最終産物中にバイアスを導入しうる。
ポリクローナル細胞系統が選択後に別々にトランスフェクトされたクローンを混合することによって生成される場合、下記の選択基準は、混合前の細胞培養レベルで個々のクローンについて設定されうる：増殖速度は２４〜３２時間でなければならず、生産性は１日あたり、１細胞につき、抗体１．５ｐｇを超えなければならず、培養物は、細胞内染色方法によって評価される均一細胞集団を示さなければならない。所望により、各クローンのより均一な細胞集団は、ＦＡＣＳ分析に関して集団の特定領域上でゲーティングすることによって個々のクローンを混合する前に、Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙによって記載された表面染色方法を用いて得ることができる。
【０１０５】
たとえ、増殖速度により誘導される、または生産性により誘導されるバイアスが生じたとしても、個々のメンバーの喪失または過剰提示は、最終抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ生成物の多様性要求に依存して、必ずしも重大ではないかもしれない。
部位特異的単一組み込み体を有する細胞において、該細胞は、発現されるべき抗体の可変領域の配列においてのみ相違するであろう。したがって、組み込み部位および遺伝性調節エレメントにおける変化によって課せられた異なる細胞の影響は、排除され、組み込まれたセグメントは、細胞増殖速度に対して最小限影響する。スクランブリング組み込みまたは多重組み込みは、稀な事象なので、どちらも、生産細胞系統の増殖率における問題を引き起こさないようである。ランダム組み込みは、一般に、約１０−５の効率で起こるが、一方、部位特異的組み込みは、約１０−３の効率で起こる。多重組み込みが予想外にも問題を提示する場合、代替手段は、上記のように該事象が再び起こる見込みは非常に小さいので、抗−ＲｈＤ抗体発現ベクターのライブラリーでのトランスフェクションを繰り返すことである。統計値を考慮すれば、多数の細胞のバルクトランスフェクションもまた、望ましくないクローンのバイアスを回避する方法を構成する。該アプローチにおいて、宿主細胞系統は、抗−ＲｈＤ抗体発現ベクターのライブラリーで大量にトランスフェクトされる。かかるライブラリーは、ライブラリーの各々別個のメンバーの多くのコピーを構成する。これらのコピーは、好ましくは、多数の宿主細胞中に組み込まれるべきである。好ましくは、少なくとも１００個、１０００個、１００００個または１０００００個の個々の細胞を変種核酸セグメントのライブラリーの別個のメンバーのコピーでトランスフェクトする。かくして、別個の変種核酸セグメントのライブラリーが、各々１０００個の個々の細胞中に組み込まれる１０００個の別個のメンバーから成る場合、部位特異的に組み込まれた抗−ＲｈＤ  抗体をコードするセグメントを含有する１０６個のクローンがトランスフェクションから生じるべきである。該方法において、個々の細胞の倍増速度のガウス曲線は、非常にわずかにだけ、一般集団に影響を及ぼすべきである。このことは、低い割合の生産細胞が異常増殖および／または発現特性を示すとしても、クローン組成物を一定に維持する確率を増加させるであろう。
別法では、以前に記載されたセミ−バルクトランスフェクションまたは個々のトランスフェクション方法を用いてもよい。
【実施例】
【０１０６】
実施例１
抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体の産生
ドナー
ドナーは、Ａａｌｂｏｒｇ  Ｓｙｇｅｈｕｓ  Ｎｏｒｄで登録された。全部で８人のＲｈＤ（−）女性をＲｈＤ（＋）個体から誘導されたＲｈＤ（＋）赤血球で免疫した。ドナーは、追加免疫回数および免疫化のためのＲｈＤ（＋）赤血球の起源に関して異なる免疫歴を有した。種々のドナーの免疫歴を表１に示す。
【０１０７】
【表１】
2012500813.tif 000002
【０１０８】
単核球は、最後の追加免疫の５〜７日後、白血球フェレーシスによって採取された。細胞をペレット化し、すぐに市販のＲＮＡ調製キット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｌ，  Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，  ｃａｔ．  ｎｏ．  ７４０  ９６２．２０）由来の細胞溶解溶液に移した。細胞溶解後、懸濁を凍結させた後、さらなるプロセスに付した。
【０１０９】
抗−ＲｈＤ  Ｆａｂディスプレーライブラリーの生成
各ドナーから得られた材料をライブラリー生成およびパニング手法の間、別々に維持した。細胞溶解物を解凍し、キットの説明書（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｌ）にしたがってＲＮＡを調製した。ＲＮＡの無欠性をアガロースゲル電気泳動によって分析し、次いで、１８Ｓ／２８ＳリボソームＲＮＡが分解されなかったことを証明した。
ＲＮＡを、製造者の指示書にしたがって、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる反応において約１０μｇの全ＲＮＡを用いるオリゴ（ｄＴ）プライム反応におけるｃＤＮＡ合成に付した。該ｃＤＮＡを、下記のプライマーを用いるＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【０１１０】
【表２】
2012500813.tif 000003
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
【表６】
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【０１１５】
【表７】
2012500813.tif 000008
【０１１６】
３６回のＶＨ反応、６回のカッパ反応および２２回のラムダ反応に達するまで、個々のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。全てのＶＨ、カッパおよびラムダＰＣＲ産物を別々にプールし、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラム（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，  ｃａｔ．  ｎｏ．  ７４０  ５９０．２５０）を用いて精製後、生産物を消化後、クローニングし（ＶＨ：  ＡｓｃＩ／ＸｈｏＩ、カッパおよびラムダ：  ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ）、次いで、目的のバンドをゲル精製工程に付した（ＰｅｒｆｅｃｔＰｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎｕｐ  ｋｉｔ，  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  ｃａｔ．  ｎｏ．  ００３２  ００７．７５９）。軽鎖（カッパおよびラムダを別々に）をＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ処理したＥｍ３５１ファージディスプレーベクター中にライゲーションによって挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で増幅した。軽鎖ライブラリーを構成するプラスミドＤＮＡを、カルベニシリン寒天プレート上で一晩選択したＥ．ｃｏｌｉ細胞から単離した（各々、カッパおよびラムダの各ドナーについて２つのライブラリー）。該ライブラリーＤＮＡをＡｓｃＩ／ＸｈｏＩでの消化に付し、ゲル精製後、ＶＨＰＣＲ産物（同じ酵素での消化に付し、ゲル精製した）を各ドナー由来の２つの軽鎖ライブラリー中にライゲートし、寒天プレート上のカルベニシリン選択を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において増幅した。一晩増殖後、細菌をプレートから剥がし、グリセロールストックを適当なライブラリー保管のために調製した。また、コンビナトリアル可変重鎖−軽鎖（ＶＨ：ＬＣ）ライブラリーを含有するプラスミドＤＮＡ調製を行って、将来のためにライブラリーを確保した。ＴＧ１細胞中に含有されるコンビナトリアルライブラリー（各ドナーから２つ）をここに、ファージディスプレーおよびパニングのために用意した。コンビナトリアルライブラリー（全部で１６）のサイズは、１０６以上であった。
【０１１７】
ＲｈＤ抗原結合性Ｆａｂフラグメントを提示するファージの富化
表面にＦａｂを提示するファージを次のように生成した。５０ｍＬの２ｘＹＴ／１％グルコース／１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを、コンビナトリアルＶＨ：ＶＬライブラリーを含有するＴＧ１細胞に接種して、ＯＤ６００  約０．０８を得た。培養物を１時間半振盪し、ヘルパーファージを加えた（ＶＳＣＭ１３）。培養物を３７℃で振盪なしで３０分間、振盪して３０分間インキュベートした。細菌をペレット化し（３２００ｘｇ，１０分，４℃）、５０ｍＬの２ｘＹＴ／１００μｇ／ｍＬカルベニシリン／７０μｇ／ｍＬカナマイシン中に再懸濁し、培養物を３０℃で一晩振盪した。１／５容量の２０％ＰＥＧ／１．５Ｍ  ＮａＣｌを加え、氷上で３０分間インキュベートし、８０００  ｘ  ｇにて４℃で３０分間遠心分離することによって、ファージを培養上清から沈澱させた。沈澱したファージをＰＢＳ中に再懸濁し、直接パニングに用いた。
ＲｈＤ抗原結合性Ｆａｂフラグメントのためのパニングを２段階法で行った。１０８ＲｈＤ（−）赤血球（ＲＢＣ）をＰＢＳ中で３回洗浄し（２０００  ｘ  ｇにて４５秒遠心分離）、１５０μｌのパニングバッファー（０．８５ｘＰＢＳ中２％スキムミルク）中に再懸濁した。５０μｌの新たに調製したファージをＲｈＤ（−）細胞（パニングバッファー中に再懸濁された）に加えて、陰性選択工程を行い、回転ローター上４℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベーション後、遠心分離（２０００  ｘ  ｇ，４５秒）によって細胞をペレット化し、ファージを含有する上清を２ｘ１０７ＲｈＤ（＋）ＲＢＣでインキュベートした（ＰＢＳ中で３回洗浄）。ファージ：ＲｈＤ（＋）ＲＢＣ混合物を回転ローター上４℃で１時間インキュベートした。１ｍＬのパニングバッファーで５回およびＰＢＳで５回洗浄することにより、結合していないファージを除去した。２００μｌのＨ２Ｏ（細胞を溶解する）の添加により、結合したファージを溶出した。１００μｌの溶出物を対数増殖期ＴＧ１細胞に加え、残りを−８０℃で保管した。溶出したファージで感染させたＴＧ１細胞をＣａｒｂ／ｇｌｕ寒天皿上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、コロニーをプレートから剥がし、第２ラウンドのパニングのためのファージ調製のために、１０ｍＬの培養培地を接種した。第２ラウンドのパニングを上記の第１ラウンドのとおりに行った。
【０１１８】
ＲｈＤカテゴリーＶＩ抗原結合性Ｆａｂフラグメントを提示するファージの富化
パニングの別のセットにおいて、ＲｈＤカテゴリーＶＩ抗原に対する反応性を有するクローンを回収するための選択を行った。記載されるようにＲｈＤ（−）血液で陰性選択を行い、ＲｈＤＶＩ陽性赤血球で陽性選択を行った。その他、手順は上記の通りであった。
【０１１９】
抗−ＲｈＤ結合性Ｆａｂのスクリーニング
パニングの各ラウンド後、凝集アッセイにおける赤血球に対する結合性の分析のために、単一のコロニーを採取した。簡単に言えば、単一コロニーを２ｘＹＴ／１００μｇ／ｍＬカルベニシリン／１％グルコース中に接種し、３７℃で一晩振盪した。次の日に、９００μｌの２ｘＹＴ／１００μｇ／ｍＬカルベニシリン／０．１％グルコースおよび１０μｌの一晩培養物を用いて、Ｄｅｅｐｗｅｌｌプレートに播種した。プレートを３７℃で２時間振盪した後、３００μｌの２ｘＹＴ／１００μｇ／ｍＬカルベニシリン／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧ／ウェルの添加によって、Ｆａｂ誘導を行った。プレートを３０℃で一晩振盪した。次の日に、細菌を遠心分離（３２００ｘｇ，４℃，１０分）によってペレット化し、１００μｌの０．８Ｍ  ＮａＣｌ、０．２ｘＰＢＳ、８ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートして、Ｆａｂフラグメントのペリプラスム抽出を行った。プレートを−２０℃に移し、最後に懸濁を解凍し、４℃および３２００  ｘ  ｇで１０分間遠心分離を行った。ペリプラスム抽出物を、Ｆａｂ含量分析のためのＥＬＩＳＡアッセイ、および個々のＦａｂフラグメントの結合可能性を評価するための凝集アッセイにおいて用いた。凝集アッセイは、次のように行った。ＲｈＤ（−）およびＲｈＤ（＋）ＲＢＣを１：１比で混合し、ＰＢＳ中で３回洗浄した。最終洗浄後、細胞混合物をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に１％細胞密度で再懸濁し、５０μｌを９６−プレートの各ウェルに加えた。ペリプラスム抽出物を該ウェルに加えた。陽性対照として、Ｒｈｅｓｏｇａｍｍａ  Ｐ  免疫グロブリン（Ａｖｅｎｔｉｓ）を製造者の指示書にしたがって用いた。プレートを穏やかに振盪しながら、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄後、二次抗体を１：１００希釈で加えた（ヤギ抗−ヒトＦａｂ／ＦＩＴＣコンジュゲート，Ｓｉｇｍａ  Ｆ５５１２）。プレートを、振盪なしで室温で１時間、凝集のために放置した。該凝集アッセイにおいて陽性のＦａｂフラグメントを目視検査によって決定し、写真を撮って記録した。Ｆａｂフラグメントの結合活性の定量化は、凝集試料のＦＡＣＳ分析によって行った。
ＲｈＤＶＩ＋赤血球に対する反応性を有するクローンのスクリーニングを行うとき、かかる細胞をＲｈＤ（−）細胞と共に用いた以外は、上記と同一の手法を用いた。
【０１２０】
多様な抗−ＲｈＤ  Ｆａｂをコードする配列の選択
全部で１７００個のＲｈＤ抗原結合性クローンを同定した。全ての陽性クローンをＤＮＡ配列決定に付した。これらから５６個のクローンを、重鎖ＣＤＲ配列の独特なセットに基づいて選択した。同じ重鎖を異なる軽鎖と共に用いた複数のクローンについて、ＦＡＣＳアッセイにおいて最も高い結合活性を示したクローンを選択した。それにより、高いＲｈＤ抗原特異性を有する幅広い多様性を示す可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＬＣ）をコードする配列の対からなるサブライブラリーを全陽性クローンから選択した。
これらの５６個のクローンの結合活性を凝集アッセイで再確認して、確実に間違った陽性クローンを選択しないようにした。
選択したクローンをさらに、変異、例えばファミリー間クロスプライミングに起因する変異に関して、かかる変異は、おそらく新規なエピトープを作成する発現した抗体の全体的構造変化を導き、それにより、最終産物の免疫原性の増加をもたらしうるので、これらの変異に関して分析した。かかる変異を有するクローンを、ファージミドベクターから哺乳動物発現ベクターへのＶＨ：ＬＣ移動に関する下記のセクションに記載のように修復した。
【０１２１】
ＶＨおよび軽鎖（ＬＣ）についての正しい核酸配列のアラインメントを各々、図１〜４に示す。ＶＨおよびＶＬポリペプチド鎖のさらなるアラインメントを各々、図３および４に示す。ポリペプチドアラインメントを行い、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７，  ７７６−７９８；  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４，  ４６２８−４６３８およびＷｉｌｌｉａｍｓら、１９９６  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６４，  ２２０−２３２）によって定義された構造的基準にしたがって番号を付した。図はさらに、可変領域内の３つのＣＤＲ領域の位置を示す。アミノ酸配列内のＣＤＲ領域位置を表２にまとめる。ポリペプチドアラインメント（図３および４）中のＣＤＲ３領域の番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従わない（図中、アステリスクでマークした推移）。アミノ酸位置に関してＣＤＲ３領域の同定を可能にするために、アステリスクの後で連続する番号を割り当てた。各クローンについてのＣＤＲ３領域配列は、該番号付けに基づいた図から誘導することができる。
【０１２２】
【表８】
2012500813.tif 000009
【０１２３】
Ｆａｂとしてスクリーンし、ＲｈＤ抗原に対する結合能について選択された可変重鎖および完全軽鎖の対は、その同一クローン番号によって同定することができる。５６ＶＨ：ＬＣ対の全てが、クローン番号、核酸（ｎｕｃ．）ＳＥＱ ＩＤおよびアミノ酸（ａ．ａ．）ＳＥＱ  ＩＤによって表３に挙げられる。
【０１２４】
【表９】
2012500813.tif 000010
【０１２５】
選択されたＶＨおよび軽鎖をコードする配列の哺乳動物発現ベクター中への移動
例えば、ファミリー間クロスプライミングに由来する変異のため、大量の選択された配列を修復する必要があった。これは、ファージディスプレーから哺乳動物発現への発現系の交換に関連して行われた。この理由のために、各個々のクローンの移動は別々に行われた。
移動および修復は、次のように行われた。まず、Ｅｍ３５１ベクター中にあるＶＨをコードする配列を、高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびコレクティング（correcting）プライマーの適当なセットを用いるＰＣＲによって再増幅した。ＶＨ  ＰＣＲフラグメントをＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ゲル精製に付した。Ｎｅｏ発現ベクターを対応する酵素で消化し、ゲル精製することにより、リーダー配列と重鎖定常領域との間にある核酸配列を除去した。補正したＶＨフラグメントおよびＮｅｏ発現ベクターをライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細胞中で増幅した。ＶＨ含有Ｎｅｏ発現ベクターのプラスミドＤＮＡをカルベニシリン上で一晩選択したＥ．ｃｏｌｉ細胞から単離した。
ＶＨ−コード化配列の移動後、対応するＬＣ配列を高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびコレクティングプライマーの適当なセットを用いるＰＣＲによって再増幅した。ＬＣ  ＰＣＲフラグメントをＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製に付した。ＶＨ含有Ｎｅｏ発現ベクターを対応する酵素で消化し、ゲル精製することにより、カッパリーダー配列とＢＧＨｐｏｌｙＡシグナル配列との間にある核酸配列を除去した。補正したＬＣフラグメントおよびＶＨ含有Ｎｅｏ発現ベクターをライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細胞中で増幅した。グリセロールストックを各クローンのために調製し、哺乳動物細胞のトランスフェクションに適当な高品質プラスミド調製物を細菌調製物から同様に調製した。各クローンについて別々に移動を行うことにより、ファージディスプレーによって始めに選択されたＶＨ：ＬＣ対を哺乳動物発現ベクター中で再生成した。修復が必要ない場合、適当な制限酵素で消化する前にＰＣＲを行うことなく、核酸セグメントを移動させた。記載の移動により生成された哺乳動物発現ベクターは、全長抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体を発現するのに適当である。該ベクターはこの時点で別々に維持されるが、まだ、抗−ＲｈＤ抗体発現ベクターのライブラリーとみなされる。
【０１２６】
哺乳動物細胞系統のトランスフェクションおよび選択
Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞系統（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、組み換えポリクローナル産生細胞系統の確立のための出発細胞系統として用いた。しかしながら、より均一な細胞系統を得るために、親のＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞系統をサブクローン化した。簡単に言えば、限界希釈によって親の細胞系統をサブクローン化し、いくつかのクローンを選択し、拡大した。増殖挙動に基づいて、１のクローン、ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）を産生細胞系統として選択した。
全５６個のプラスミド調製物を個々に、ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞系統中に、次のようにトランスフェクトした。ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）を含有するＦ１２−ＨＡＭ中、接着細胞として培養した。２．５ｘ１０６細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、１つのクローンを提示するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をトリプシン処理し、３  ｘ  Ｔ１７５フラスコ中に移した。トランスフェクションの４８時間後に、選択圧（この場合、４５０μｇ／ｍｌネオマイシン）を加えた。約２週間後にクローンが出現した。クローンをカウントし、細胞をトリプシン処理し、その後、５６個の特異的抗−ＲｈＤ抗体の１つを発現しているクローンのプールとして培養した。
【０１２７】
血清不含懸濁培養物への適応
個々の接着性抗−ＲｈＤ抗体  ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞培養物をトリプシン処理、遠心分離し、適当な血清不含培地（Ｅｘｃｅｌｌ３０２，  ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、８ｘ１０５細胞／ｍｌで別々の振盪フラスコに移した。
増殖および細胞形態を数週間にわたって追跡した。細胞が良好かつ安定な増殖挙動を示し、３２時間以内に２倍になったとき、１０ｘ１０６細胞／管を有する各培養物の５０個のアリコートを凍結させた（５６ｘ５０アリコート）。
【０１２８】
細胞系統の特徴付け
個々の細胞系統の全てを、抗体産生および増殖に関して特徴付けした。これは、下記のアッセイで行った。
産生：
個々の培養物中における組み換え抗体の産生をカッパおよびラムダ特異的ＥＬＩＳＡによって経時的に追跡した。ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩バッファーｐＨ９．６中におけるヤギ−抗−ヒトカッパ（Ｃａｌｔａｇ）またはヤギ−抗−ヒトラムダ（Ｃａｌｔａｇ）抗体で一晩被覆した。プレートを洗浄バッファー（１ｘＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で６回洗浄し、２％ミルクを含有する洗浄バッファーで１時間ブロックした。試料をウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、二次抗体（ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰＯ，Ｃａｌｔａｇ）を１時間加え、次いで６回洗浄した。ＥＬＩＳＡをＴＭＢ基質を用いて展開し、Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
さらに、蛍光タグ付加した抗体を用いる細胞内ＦＡＣＳ染色を用いて、細胞培養系における組み換え抗体の産生を測定した。５ｘ１０５細胞を冷ＦＡＣＳ  ＰＢＳ（１ｘ  ＰＢＳおよび２％ＦＣＳ）中で洗浄し、遠心分離した。細胞をＣｅｌｌＦｉｘ（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２０分間固定し、その後、サポニンバッファー（１ｘ  ＰＢＳおよび０．２％サポニン）中で洗浄した。懸濁を遠心分離し、蛍光タグ付加した抗体（ヤギＦ（ａｂ’）２フラグメント，抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を氷上で２０分間加えた。サポニンバッファー中で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＦＡＣＳによって分析した。該細胞内染色を用いて、一般的な発現レベルを決定し、ならびに組み換え抗体の発現に関して細胞集団の均一性を決定した。
【０１２９】
増殖：
細胞懸濁のアリコートを週に３回採取し、細胞数、細胞サイズ、凝集の度合いおよび死んだ細胞の割合をＣＡＳＹＲ（登録商標）（細胞カウンター＋分析器システム、Ｓｃｈａｅｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ製）によって決定した。細胞培養物の倍増時間は、ＣＡＳＹＲ測定器から得られる細胞数によって算出された。
【０１３０】
抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体産生のための産生細胞系統の確立
各々、別個の組み換え抗−Ｒｈ−Ｄ抗体を発現する１０個の細胞系統（ＲｈＤ１５７．１１９Ｄ１１、ＲｈＤ１５８．１１９Ｂ０６、ＲｈＤ１５９．１１９Ｂ０９、ＲｈＤ１６１．１１９Ｅ０９、ＲｈＤ１６３．１１９Ａ０２、ＲｈＤ１９０．１１９Ｆ０５、ＲｈＤ１９１．１１９Ｅ０８、ＲｈＤ１９２．１１９Ｇ０６、ＲｈＤ１９７．１２７Ａ０８およびＲｈＤ２０４．１２８Ａ０３）を、組み換えポリクローナル産生細胞系統を構成するように選択した。Ｒｈｄ１９７およびＲｈＤ２０４はラムダクローンであったが、他は全て、カッパクローンであった。
個々の抗−Ｒｈ抗体を発現する細胞培養物を振盪フラスコ中、血清不含懸濁培養に完全に適応させた後、それらを等細胞数で混合し、それにより、ポリクローナルＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞系統を生成した。該混合細胞培養物を遠心分離し、１０ｘ１０６細胞／管のアリコートで凍結させた。
２つの管（３９４８ＦＣＷ０６５および３９４９ＦＣＷ０６５）を解凍し、各々、ネオマイシンを含有する１００ｍｌのＥｘｃｅｌｌ３０２培地を含有する１０００ｍｌの振盪フラスコ中で１１週間培養した。上清を採取し、ろ過後、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを精製した。
【０１３１】
クローン多様性
タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルの両方で、クローン多様性をアッセイした。抗体組成物を分析するのに用いられる上清試料を９週間の培養後に採取し、一方、ｍＲＮＡ組成物を分析するのに用いられる細胞試料を１１週間の培養後に採取した。
【０１３２】
抗体組成物：
ポリクローナルＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞系統から発現される抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂは、ＩｇＧ１イソ型抗体である。固定化したタンパク質Ａを有するカラムを用いて、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを両アリコート（３９４８および３９４９）から精製した。個々の抗体は、固定化タンパク質ＡとｐＨ７．４で相互作用したが、混入タンパク質をカラムから洗浄した。結合した抗体を次いで、低ｐＨ値（ｐＨ２．７）にてカラムから溶出した。抗体を含有するフラクション（２８０ｎｍでの吸光度から決定する）をプールし、５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５に対して透析した。
【０１３３】
培養９週間後にアリコート３９４８および３９４９（ＦＣＷ０６５）から得られた抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物をカチオン交換クロマトグラフィーを用いて分析した。タンパク質Ａ精製抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０中、６０ｍｌ／時間の流速にて室温でＰｏｌｙＣａｔＡカラム（４．６ｘ１００ｍｍ）上にアプライした。抗体成分を次いで、２５ｍＭ酢酸ナトリウム中における１５０〜３５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．０、流速６０ｍｌ／時間）の直線勾配を用いて溶出した。抗体成分を２８０ｎｍにて、分光光度測定法で検出した。次いで、クロマトグラム（図５）を積分し、次いで、個々のピークＡ−Ｊの面積を用いて抗体成分を定量した（表４）。ピークの総面積を１００％とした。２つのアリコート由来のクロマトグラムは、同一のピーク分布ならびに各ピークにおける類似の成分濃度を示した。これらの結果から、同一の条件下で増殖する同じポリクローナル細胞系統のアリコートは、類似のクローン多様性で抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを産生すると結論づけることができる。
抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの個々のメンバーは、１以上の特定のピークに割り当てられた（表４にまとめる）。割り当ては、各個々のクローン由来の抗体生成物について得られたクロマトグラムに基づく。ＲｈＤ１５８．１１９Ｂ０６から産生した抗体について、各個々のクロマトグラムは得られず、かくして、該クローンはいずれのピークにも割り当てられなかった。しかしながら、ピークＤは、おそらくＲｈＤ１５８．１１９Ｂ０６を構成すると考えられ、該クローンは、不均一性のために他のピークのいくつかにおいても提示されうると考えられる。特に、クローンｈＤ１９７．１２７Ａ０８由来の抗体生成物は、高い不均一性を有する。クローンＲｈＤ１９０．１１９Ｆ０５は、１５．３分で可視であるべきである。しかしながら、検出可能ではなかったので、該クローンが組み換えポリクローナル産生細胞系統から喪失したことが示された。クローンＲｈＤ１９０．１１９Ｆ０５の喪失は、多様性の１０％減少に相当し、これは、最終抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ組成物の多様性に関して許容できると考えられる。
【０１３４】
【表１０】
2012500813.tif 000011
【０１３５】
ｍＲＮＡ組成物：
１１週間の培養後のポリクローナルＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞系統内のクローン多様性は、ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析によって評価された。簡単に言えば、２００細胞に相当する細胞懸濁を冷凍−解凍手法に付し、これらの溶解物を、Ｏｎｅ−ＳＴＥＰ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、軽鎖を増幅するプライマーと共に、ＲＴ−ＰＣＲにおける鋳型として用いた。プライマー配列は：
順方向プライマー  ５’−ＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧ    （配列番号２５９）
逆方向プライマー  ５’−ＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡ  （配列番号２６０）
である。
ＲＴ−ＰＣＲ産物をＨｉｎｆＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分析し、制限産物をエチジウムブロマイド染色で可視化した（図６）。
【０１３６】
ＲＴ−ＰＣＲ増幅した軽鎖のＨｉｎｆＩ消化によって得られた制限フラグメントの予想サイズを各クローンについて表５に示す。特異的ＲｈＤ抗体産生クローンに割り当てることが出来たゲル上の６個の独特のフラグメントサイズを太字で示す。独特のフラグメントの全てがゲル上で同定できたわけではなく、これらを斜体で示す。しかしながら、これは必ずしも、これらのクローンが培養物中に現れないことを意味するのではなく、該フラグメントは、同定できる程十分に他のフラグメントから分離されなかったり、またはそれらの濃度がより強いバンドと比べて弱い場合もある。短いフラグメントは、より少数しかエチジウムブロマイド分子に結合せず、したがって見えにくいので、このことは、より短いフラグメントについて、より強調されうる。
【０１３７】
【表１１】
2012500813.tif 000012
【０１３８】
同じポリクローナル細胞系統の２つのアリコート（３９４８および３９４９）は、ゲルにおいて類似の発現パターンを示すが、バンドの強度は完全に一致しない。このことは、また、同一の条件下で増殖した同じポリクローナル細胞系統のアリコートが類似のクローン多様性で抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを産生することを示す。
【０１３９】
まとめ
本実験は、５６個の変種抗ＲｈＤをコードする核酸セグメント（表３）を含む抗−ＲｈＤ抗体発現ベクターのライブラリーを生成することに成功した。
該ライブラリーの個々のメンバーを含有するプラスミドを用いて、ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞系統をトランスフェクトし、それにより、特異的抗−ＲｈＤ抗体を発現することができる５６個の個々の細胞系統を生成した。
これらの細胞系統のうち１０個を混合して、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ産生細胞系統を生成し、９週間の培養後に、まだ最初の多様性の９０％を維持した。培養１１週間後、６個の異なるクローン由来のｍＲＮＡを明白に同定することができた。いくつかの他のクローンはおそらく、約５００ｂｐをバンドにおいて示される。
ポリクローナルＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞系統の２つのアリコートがクローン多様性に関して類似の結果を示したという事実は、再現可能な結果を得ることができることを説明した。
【０１４０】
実施例２
より大規模な産生のためのポリクローナル細胞プールの生成
２７個の細胞培養物を、ポリクローナル細胞系統を構成するために選択した（ＲｈＤ１５７．１１９Ｄ１１、ＲｈＤ１５９．１１９Ｂ０９、ＲｈＤ１６０．１１９Ｃ０７、ＲｈＤ１６１．１１９Ｅ０９、ＲｈＤ１６２．１１９Ｇ１２、ＲｈＤ１６３．１１９Ａ０２、ＲｈＤ１８９．１８１Ｅ０７、ＲｈＤ１９１．１１９Ｅ０８、ＲｈＤ１９２．１１９Ｇ０６、ＲｈＤ１９６．１２６Ｈ１１、ＲｈＤ１９７．１２７Ａ０８、ＲｈＤ１９９．１６４Ｅ０３、ＲｈＤ２０１．１６４Ｈ１２、ＲｈＤ２０２．１５８Ｅ０７、ＲｈＤ２０３．１７９Ｆ０７、ＲｈＤ２０７．１２７Ａ１１、ＲｈＤ２４０．１２５Ａ０９、ＲｈＤ２４１．１１９Ｂ０５、ＲｈＤ２４４．１５８Ｂ１０、ＲｈＤ２４５．１６４Ｅ０６、ＲｈＤ２９３．１０９Ａ０９、ＲｈＤ３０１．１６０Ａ０４、ＲｈＤ３０５．１８１Ｅ０６、ＲｈＤ３０６．２２３Ｅ１１、ＲｈＤ３０７．２３０Ｅ１１、ＲｈＤ３１９．１８７Ａ１１およびＲｈＤ３２４．２３１Ｆ０７）。
【０１４１】
個々のクローンのなかでの高い多様性のほかに、クローン選択は、個々の細胞培養物の増殖および産生の特徴にも基づく。
【０１４２】
細胞培養レベルでの選択基準には、次のものが包含される。
Ｉ：  倍増時間；２４〜３２時間でなければならない。
ＩＩ：  細胞内染色；均一な細胞集団を示さなければならない。
ＩＩＩ：  生産性；１日あたり、１細胞につき１．５ｐｇを超えなければならない。
【０１４３】
該２７個の異なる細胞培養物は、細胞数に関して等しく混合し、該混合物は、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂのパイロット・プラント産生のために、ポリクローナル細胞プールを構成する。
【０１４４】
実施例３
本実施例は、２５の個々のメンバーを有する抗−ＲｈＤ組み換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）および血漿由来抗−Ｄ生成物  ＷｉｎＲｈｏＲ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ製）が食作用について比較可能な生物学的活性を示し、一方、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂは抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）をあまり示さないことを明らかにする。
【０１４５】
赤血球の調製−凍結
血液銀行（Ａａｌｂｏｒｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  ＤＫ）でのインフォームド・コンセント後に健康なドナーから得られた全血由来の赤血球（ＲＢＣ）を高グリセロール技術（３８％）によって凍結し、−８０℃で保存した。赤血球を１２％ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）中で解凍し、クエン酸−マンニトール（ＬＡＢ２０９１０．０５００，  Ｂｉｅ  ＆  Ｂｅｒｎｔｓｅｎ）を３分後に加えた。細胞をＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＣＡ，  ＵＳ）中で３回洗浄し、ＩＤ−Ｃｅｌｌｓｔａｂ（ＤｉａＭｅｄ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中における３％溶液として４℃で保存した。
【０１４６】
ＰＢＭＣの調製
健康なドナー由来の血液を含有する軟膜をデンマーク国コペンハーゲンの国立病院の血液銀行から得、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ，  Ｎｏｒｗａｙ）で精製した。プールしたＰＢＭＣを１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０１４７】
組み合わせたＡＤＣＣおよび食作用アッセイ
該アッセイは、Ｂｅｒｋｍａｎら、２００２．  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５，  ４１５−４１９から適応させた。簡単に言えば、ＲｈＤ陽性（ＲｈＤ＋）またはＲｈＤ陰性（ＲｈＤ−）赤血球（ＲＢＣ）を放射活性クロミウムで標識した。Ｃｒ５１標識のために、１ｘ１０８  ＲｈＤ＋およびＲｈＤ−  ＲＢＣを各々、遠心分離し（７００ｘｇで２分間）、１００μｌのＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＣＡ，  ＵＳ）および２００μｌのクロム酸ナトリウム（０．２μＣｉ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＫ）を各管に加えた後、３７℃で１．５時間インキュベートした。懸濁を遠心分離し（２分で７００ｘｇ）、上清を除去した。次いで、ＲＢＣを１５ｍｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で再懸濁した。細胞を２ｘ１０６細胞／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルを９６−ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ）に加えた。次いで、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中における、Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍで製造された抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ（ＷＯ  ２００６／００７８５０  Ａ１  Ｅｘａｍｐｌｅ  ５にさらに記載されるＳｙｍ００１  ｒＷＳ（研究標準））および血漿由来抗Ｄ生成物ＷｉｎＲｈｏＲ（Ｂａｘｔｅｒ製）の２倍希釈液の５０μｌを各ウェルに加えた（但し、対照ウェルを除く）。プレートを加熱棚中３７℃で４０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μｌ／ウェル  ＰＢＳ中で３回（２分７００ｘｇ）注意深く洗浄し、１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩ中に再懸濁する。
【０１４８】
ＰＢＭＣを２ｘ１０７細胞／ｍｌに調整し、１００μｌを各ウェルに加えた。対照に完全ＲＰＭＩを補足し、自然溶解／保持または最大溶解のいずれかに用いた。プレートを加湿インキュベーター中、３７℃で一晩インキュベートした。１００μｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｍｅｒｃｋ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を最大溶解対照ウェルに加えた。プレートを遠心分離し（７００ｘｇで２分）、上清５０μｌをＡＤＣＣ  Ｌｕｍａｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）に移した。
【０１４９】
上清を移した後、細胞培養プレートを遠心分離し（７００ｘｇで２分）、最大溶解ウェル由来の上清５０μｌを別のＬｕｍａＰｌａｔｅ（食作用ＬｕｍａＰｌａｔｅ）に移した。細胞培養プレート中、上清を残りのウェルから除去し、溶解バッファー（１４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ，１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を加え、次いで、３７℃で１０分インキュベートした。ＮＨ４ＣｌはＲＢＣを溶解するが、ＰＢＭＣフラクションおよびそれにより食菌されたＲＢＣを無傷状態のままにする。ＲＢＣ溶解後、プレートを遠心分離し（７００ｘｇで２分）、ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。１００μｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００をウェルに加えて、食細胞ＰＢＭＣを溶解し、溶解物５０μｌを食作用ＬｕｍａＰｌａｔｅｓに移した。該ＬｕｍａＰｌａｔｅｓを３７℃で一晩乾燥させ、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐａｃｋａｒｄ，  ＣＴ，  ＵＳＡ）中でカウントした。全データをＥｘｃｅｌ中にインポートし、Ｂｅｒｋｍａｎら、２００２．  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５，  ４１５−４１９に記載のように分析した。簡単に言えば、コンピューター処理は、次のように実施された。
ＡＤＣＣ：  免疫溶解（％）＝（放出された平均試験Ｃｒ５１  −  放出された平均自発Ｃｒ５１）／（標的赤血球中の全Ｃｒ５１  −  機械背景）ｘ１００
食作用：  免疫食作用（％）＝（平均試験Ｃｒ５１保持  −  平均自発Ｃｒ５１保持）／（標的赤血球中の全Ｃｒ５１  −  機械背景）ｘ１００
全データは、合わせた最大安定水準値に標準化した。
【０１５０】
Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍで製造された抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂおよびＷｉｎＲｈｏＲ（Ｂａｘｔｅｒ製）の機能的活性は、食作用に関してほぼ同一の機能的活性を示したが、抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂは、ＡＤＣＣに関してあまり活性を示さなかった。
【０１５１】
実施例４
ＩＴＰにおける抗−Ｄの作用機序をよく示す機能的アッセイが開発された。該ＩＴＰモデルにおいて、Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍで製造された抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂおよびＷｉｎＲｈｏＲ（Ｂａｘｔｅｒ製）は、血小板食作用の用量依存的阻害に関して、ほぼ同一の機能的活性を示した。
簡単に言えば、該研究において、血小板をＣＭグリーンで標識し、抗体でオプソニン化し、エフェクター細胞：ＴＨＰ−１  単核細胞系統と共にインキュベートした。
【０１５２】
血小板の調製
健康なドナー由来の血液を含有する軟膜をデンマーク国コペンハーゲンの国立病院の血液銀行から得、血小板を遠心分離（２１０ｇで１５分、室温、ブレーキ無し）によって精製した。血小板に富む血漿を収集し、ＣＰＤＡ（アデニンを含有するクエン酸−リン酸−デキストラン溶液，Ｓｉｇｍａ）を加え、血小板をスピンした（５８０ｇで１５分、室温、ブレーキ無し）。
【０１５３】
血小板を、０．０２ｍｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ１（Ｓｉｇｍａ）および２０μＭ  ＣＭグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＰＢＳ中における１０％ＣＰＤＡ中に再懸濁した。血小板を３７℃で２０分インキュベートし、１回洗浄し（５８０ｇ、１５分、室温、ブレーキ無し）、室温でオンのままにし、１回洗浄し、ＰＢＳ中における１０％ＣＰＤＡ中、５ｘ１０８血小板／ｍｌに再懸濁した。１００μｌ  ｗ６／３２（ｍＩｇＧ抗ＨＬＡ１）（Ｓｉｇｍａ）（０．２ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ血小板溶液毎に加えた。血小板を室温で３０分インキュベートし、１回洗浄し、ＰＢＳ中における１０％ＣＰＤＡ中、２ｘ１０８血小板／ｍｌに再懸濁した。
【０１５４】
赤血球の調製−凍結
血液銀行（Ａａｌｂｏｒｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  ＤＫ）でのインフォームド・コンセント後に健康なドナーから得られた全血由来の赤血球（ＲＢＣ）を高グリセロール技術（３８％）によって凍結し、−８０℃で保存した。赤血球を１２％ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）中で解凍し、クエン酸−マンニトール（ＬＡＢ２０９１０．０５００，  Ｂｉｅ  ＆  Ｂｅｒｎｔｓｅｎ）を３分後に加えた。細胞をＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＣＡ，  ＵＳ）中で３回洗浄し、ＩＤ−Ｃｅｌｌｓｔａｂ（ＤｉａＭｅｄ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中における３％溶液として４℃で保存した。
【０１５５】
ＲＢＣをＰＢＳ（７００ｇ、５分）中で１回洗浄し、ＰＢＳ中、４ｘ１０８ＲＢＣ／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルを９６−ウェルＦＡＣＳプレート（ＢＤ）に加えた。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中における、Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍで製造された抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ（ＷＯ  ２００６／００７８５０  Ａ１  Ｅｘａｍｐｌｅ  ５にさらに記載されるＳｙｍ００１  ｒＷＳ（研究標準））および血漿由来抗Ｄ生成物ＷｉｎＲｈｏＲ（Ｂａｘｔｅｒ製）の２倍希釈液の５０μｌを各ウェルに加えた（但し、対照ウェルを除く）。プレートをプレート振盪機上、室温で４５分間インキュベートした。その後、細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中で２回（２分７００ｘｇ）注意深く洗浄し、ＰＢＳ中における１６％ＩｓｃｏｖｅのＤＭＥＭ中に再懸濁した。
【０１５６】
ＴＨＰ−１細胞の調製
ＴＨＰ−１細胞を加湿インキュベーター（５％ＣＯ２−３７℃）中、完全ＲＰＭＩ（＋ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％胎仔ウシ血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＣＡ，  ＵＳ）中で培養した。ＴＨＰ−１細胞をスピンし、ＰＢＳで１回洗浄し（２２℃、３００ｘｇ、７分）、ＰＢＳ中、１ｘ１０７細胞／ｍｌに再懸濁した。細胞を０．１μｇ  ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）／１０７細胞（１ｍｇ／ｍｌの１００ｘＰＢＳ希釈ストック１０μｌ）を用いて、室温で１５分刺激した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、ＰＢＳ中における１６％ＩｓｃｏｖｅのＤＭＥＭ中で１ｘ１０７細胞／ｍｌに調整した。
【０１５７】
血小板の食作用
血小板（２ｘ１０８／ｍｌ、５０μｌ／ウェル、１：２０  Ｅ：Ｔ比）、ＲＢＣ（４ｘ１０８／ｍｌ、５０μｌ／ウェル、１：４０  Ｅ：Ｔ比）およびＴＨＰ−細胞（１ｘ１０７／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）を混合し、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２−３７℃）中で２時間インキュベートした。予めＰＢＳ中で１：１に希釈した１００μｌのトリパンブルー（Ｆｌｕｋａ）を加えて、ＴＨＰ−細胞の外側における非特異的結合を遮断した。２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中で１回洗浄し（２１０ｇ、＋４℃、３分）、２００μｌ／ウェルの溶解溶液（ＢＤ）を加え、４℃で１５分インキュベートした。２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中で１回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中に再懸濁した。ライブ・ゲート（live gate）を通過したＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ上のＨＴＳ上のＳＳＣおよびＦＳＣにより、細胞を獲得し、Ｆｌ−１のメジアン蛍光強度を分析した（図８Ａ−Ｃ）。
【０１５８】
実施例５
本実施例は、２５個の個々のメンバーを有する抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを含有するｐＷＣＰの生成を明らかにし、ｐＷＣＰの異なるバイアルから精製したｒｐＡｂ生成物の最小限のバッチ間変動を確認する。
【０１５９】
ｐＷＣＰの生成
２５個の個々のメンバーを有する抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂを含有するｐＷＣＰを生成するために、２５個の銀行に預けられたモノクローナル抗−ＲｈＤ抗体産生細胞系統（ＲｈＤ１５７、１５９、１６０、１６２、１８９、１９１、１９２、１９６、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０７、２４０、２４１、２４５、２９３、３０１、３０５、３０６、３１７、３１９、３２１、３２４）の各バイアルを、４ｍＭグルタミンを含有するＥｘＣｅｌｌ  ３０２培地中で解凍し、５００  ｇ／ｍｌのＧ４１８および１：２５０希釈した抗凝集剤を添加した同じ培地中で３週間拡大させた。次いで、各培養物由来の等数の細胞（２ｘ１０６）を注意深く一緒に混合し、標準的な冷凍手法を用いて、液体窒素中で凍結させた（５ｘ１０７細胞／バイアル）。
【０１６０】
バイオリアクター中での培養
ｐＷＣＰ由来のバイアルをＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，  Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）中で解凍し、スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）中で拡大させた。５Ｌのバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，  Ｓｃｈｉｅｄａｍ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に、１．５Ｌ中０．６ｘ１０６細胞／ｍｌを接種した。リアクター実行の間、毎日、濃縮フィード溶液、グルタミンおよびグルコースを添加したＥｘＣｅｌｌ  ３０２培地を補給して、最終容量４．５Ｌにした。バイオリアクター実行は、１６−１７日後に停止した。３つのバッチをＳｙｍ０４：２１、Ｓｙｍ０４：２３およびＳｙｍ０４：２４と呼ぶ。バッチを異なる時点で培養した。
【０１６１】
バッチ間変動の分析
組み換えポリクローナル抗体試料をＨｉＴｒａｐＴＭ（登録商標）ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＫ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
精製した組み換えポリクローナル抗体試料を２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０中、流速６０ｍｌ／時間（室温）にて、ＰｏｌｙＣＡＴ  Ａカラム（４，６ｘ１００ｍｍ、ＰｏｌｙＬＣ  Ｉｎｃ．，  ＭＡ，  ＵＳから入手）を用いるカチオン交換クロマトグラフィーを用いて分析した。次いで、抗体ピークを、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中における１５０ｍＭ〜３５０または５００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配を用いて、流速６０ｍｌ／時間にて溶出した。抗体ピークを２８０ｎｍにて分光光度法で検出した。クロマトグラムを積分し、個々のピークの面積を定量に用いた。すでに記載したように、個々の抗体のいくつかは不均一性を提示し、２つの抗体は、ＩＥＸクロマトグラムにおける同じピークに寄与しうる。
表６は、全抗体成分（ＡＣ）の相対含量パーセントを示す。本実施例において、相対面積は、３５ＡＣについで計算されたが、実施例４は、２５ＡＣについての相対面積しか計算しなかった。この相違点は、クロマトグラムにおける異なるピークの割り当てに厳しく起因し、プロファイル自体の実際の相違に起因するものではない。
【０１６２】
【表１２】
2012500813.tif 000013
表６は、３つのバッチから得られた抗体生成物間の再現性が高かったことを示す。個々の抗体ピークのサイズにおける変動は、ほとんどの抗体成分について２０％以内であったが、最小ピークのいくつかについての変動はわずかに大きかった。
【０１６３】
実施例６
本実施例は、２５個の個々のメンバー（実施例４と同じ組成）を用いる抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの異なるバッチが類似の効力でＲｈＤ陽性赤血球に結合することを明らかにし、関連するエフェクターメカニズム：抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および食作用に関して、比較可能な生物学的活性を示す。
【０１６４】
赤血球の調製
血液銀行（Ａａｌｂｏｒｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  ＤＫ）でのインフォームド・コンセント後に健康なドナーから得られた全血から、１％仔ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）中で該血液を３回洗浄することによって、赤血球（ＲＢＣ）を調製した。該赤血球を再懸濁し、ＩＤ−Ｃｅｌｌｓｔａｂ（ＤｉａＭｅｄ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中における１０％溶液として４℃で保存した。
【０１６５】
ＰＢＭＣの調製
健康なドナー由来の血液を含有する軟膜をデンマーク国コペンハーゲンの国立病院の血液銀行から得、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ，  Ｎｏｒｗａｙ）で精製した。
【０１６６】
効力アッセイ
効力アッセイは、欧州薬局方（セクション２．７．１３、方法Ｃ）から採用した。２５個の個々のメンバーを有する抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの結合能力を、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中５ｘ１０４細胞／μｌにてＲｈＤ陽性赤血球を用いて測定した。抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂバッチ、Ｓｙｍ０４：２１、Ｓｙｍ０４：２３およびＳｙｍ０４：２４を個々の５Ｌ供給バッチバイオリアクター実行から得た。抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂバッチの希釈（１．５倍）を９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）において、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中、３連で作成した。抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂ希釈の５０μｌを５０μｌの赤血球と混合し、３７℃で４０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で２回洗浄した（３００ｘｇ、２分）。ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で１：２０希釈したフィコエリトリン結合型ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）８０μｌを各試料に加え、４℃で３０分間放置した。試料をＰＢＳ、１％ＢＳＡ中、ＦａｃｓＦｌｏｗ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）中において洗浄し（３００ｘｇ、２分）、２００μｌのＦＡＣＳＦｌｏｗ中で再懸濁した。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）に付し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ＰｒｏおよびＥｘｃｅｌを用いてデータ分析を行った。３つの個々の抗−ＲｈＤ ｒｐＡｂバッチは、ＲｈＤ陽性赤血球に対して本質的に同一の結合力を提示した（図７Ａ）。
【０１６７】
組み合わせたＡＤＣＣおよび食作用アッセイ
該アッセイは、Ｂｅｒｋｍａｎら、２００２．  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５，  ４１５−４１９から適応させた。簡単に言えば、ＲｈＤ陽性（ＲｈＤ＋）またはＲｈＤ陰性（ＲｈＤ−）赤血球（ＲＢＣ）を放射活性クロミウムで標識した。Ｃｒ５１標識のために、１ｘ１０８  ＲｈＤ＋およびＲｈＤ−  ＲＢＣを各々、遠心分離し（６００ｘｇで１０分間）、１００μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および２００μｌのクロム酸ナトリウム（０．２μＣｉ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＫ）を各管に加えた後、３７℃で１．５時間インキュベートした。懸濁を５０ｍｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、１ｍｌの完全ＤＭＥＭ（２ｍＭグルタミン、１％ペニリシン−ストレプトマイシンおよび１０％胎仔ウシ血清を含有する）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳ）中で再懸濁した。細胞を４ｘ１０６細胞／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルを９６−ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ）に加えた。次いで、バッチＳｙｍ０４：２１またはＳｙｍ０４：２４由来の抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの２倍希釈液５０μｌを各ウェルに加えた（但し、対照ウェルを除く）。対照に完全ＤＭＥＭを補足し、自然溶解／保持または最大溶解に用いた。
【０１６８】
ＰＢＭＣを２ｘ１０７細胞／ｍｌに調整し、１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で一晩インキュベートした。１００μｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｍｅｒｃｋ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を最大溶解対照ウェルに加えた。プレートを遠心分離し（６００ｘｇで２分）、上清５０μｌをＡＤＣＣ  Ｌｕｍａｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）に移した。
【０１６９】
上清を移した後、細胞培養プレートを遠心分離し（３００ｘｇで２分）、最大溶解ウェル由来の上清５０μｌを別のＬｕｍａＰｌａｔｅ（食作用ＬｕｍａＰｌａｔｅ）に移した。細胞培養プレート中、上清を残りのウェルから除去し、溶解バッファー（１４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ，１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を加え、次いで、３７℃で５分インキュベートした。ＮＨ４ＣｌはＲＢＣを溶解するが、ＰＢＭＣフラクションおよびそれにより食菌されたＲＢＣを無傷状態のままにする。ＲＢＣ溶解後、プレートを遠心分離し（４℃、２分、３００ｇ）、ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。１００μｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００をウェルに加えて、食細胞ＰＢＭＣを溶解し、溶解物５０μｌを食作用ＬｕｍａＰｌａｔｅｓに移した。該ＬｕｍａＰｌａｔｅｓを４０℃で一晩乾燥させ、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐａｃｋａｒｄ，  ＣＴ，  ＵＳＡ）中でカウントした。全データをＥｘｃｅｌ中にインポートし、Ｂｅｒｋｍａｎら、２００２．  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５，  ４１５−４１９に記載のように分析した。簡単に言えば、コンピューター処理は、次のように実施された。
ＡＤＣＣ：  免疫溶解（％）＝（放出された平均試験Ｃｒ５１  −  放出された平均自発Ｃｒ５１）／（標的赤血球中の全Ｃｒ５１  −  機械背景）ｘ１００
食作用：  免疫食作用（％）＝（平均試験Ｃｒ５１保持  −  平均自発Ｃｒ５１保持）／（標的赤血球中の全Ｃｒ５１  −  機械背景）ｘ１００
全データは、合わせた最大安定水準値に標準化した。
【０１７０】
２つの連続的リアクター実行由来の抗−ＲｈＤ  ｒｐＡｂの機能的活性は、バッチ間の高い一貫性を反映するイン・ビトロアッセイ（図７Ｂおよび７Ｃ）の両方において、ほぼ同一の機能的活性を示した。
【０１７１】
実施例７
研究の標題：  ＲｈＤ陽性およびＲｈＤ陰性健康ボランティアにおける、単一の静脈内Ｓｙｍ００１投与のプラセボ対照、二重盲式、無作為化、逐次的用量増加安全性、薬物動力学的および薬力学的研究
第一目的：  ＲｈＤ−およびＲｈＤ＋健康ボランティアにおける単一静脈内（ＩＶ）注入後のＳｙｍ００１の安全性を評価すること。
方法：  ７７人の健康な対象をＰＫ、ＰＤおよびＩＶ投与したＳｙｍ００１の単一用量の安全性の該二重盲式の逐次的用量増加研究に登録した。スクリーニングは、各群について、−２８日目〜−２日目で行った。研究開始前に準備した無作為化計画にしたがって、１日目に、対象に、０．２５、１．０、４．０、１２．５、２５、５０、および７５μｇ／ｋｇのＳｙｍ００１単一用量またはプラセボを３０分間かけてＩＶ投与した。
Ｓｙｍ００１の増加レベルは、表７に記載のように、７投与群において研究された。
【０１７２】
【表１３】
2012500813.tif 000014
【０１７３】
安全性モニタリング委員会（ＳＭＣ）は、各群投与７日後、全ての入手可能な安全性およびＰＤデータを検討し、計画通りに逐次的に次の群に投与される用量を増加するか否かを決定した。下記の場合は、用量増加を続行可能であった。
１群につき、いずれか１対象において、＞２．０ｇ／ｄＬのＨｇｂにおける減少が見られない場合。
１群につき、３以上の対象において、＞１．０ｇ／ｄＬのＨｇｂにおける減少が見られない場合。
治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）のパターンは、重篤度において中程度と評価されず、おそらく治療に関連して、症状の罹患率または性質が潜在的な安全性に対する懸念を生じるとは見なされなかった。
【０１７４】
結果
安全性の結果：
死亡例、深刻なＡＥ例、重篤な強度のＡＥ例、およびＲｈＤ＋またはＲｈＤ−集団における研究の中断をもたらしたＡＥ例はなかった。
【０１７５】
投与７日後のヘモグロビンにおける変化
該試験の間、いずれかのＲｈＤ集団において臨床上有意と考えられるベースラインレベルからのヘモグロビン変化はなかった。個々の対象において、＞２ｇ／ｄＬのヘモグロビン減少はなかった。＞１ｇ／ｄＬのヘモグロビン減少が１０対象（９ＲｈＤ＋および１ＲｈＤ−）において起こり、Ｓｙｍ００１の投与、または他の溶血バイオマーカーの臨床上有意な変化とは関連がないようであった。＞１ｇ／ｄＬの個々のヘモグロビン減少のいずれも、健康な成人男性において、ヘモグロビンの正常範囲外の値をもたらさなかった。
【０１７６】
考察：  該試験において、ＲｈＤ＋対象において、７５μｇ／ｋｇまでの用量にて、Ｈｂの実質的低下は観察されなかった。これは、血漿由来抗−Ｄ生成物で観察されたＨｂ低下データと一致しなかった。ＷｉｎＲｈｏＲの単回投与を受けたＲｈＤ陽性ボランティアにおける試験において、Ｈｂ低下（２８日目にて）は、各々、５０および７５μｇ／ｋｇの投与量で、１．１および２．１ｇ／ｄＬであった。ＩＴＰ患者における臨床試験は、血漿由来抗−Ｄ生成物での治療後に、有意なＨｂ低下を示した。ＷｉｎＲｈｏの推奨される最初の静脈内投与量５０μｇ／ｋｇで治療された患者の４臨床試験において、ヘモグロビンの平均最大減少は、１．７０ｇ／ｄＬ（範囲  ＋０．４０〜−６．１ｇ／ｄＬ）であった。ＲｈｏｐｈｙｌａｃＲの単回投与で治療された９８人のＩＴＰ患者での試験において、Ｈｂの最大減少は投与後６および８日目に起こり、ＲｈｏｐｈｙｌａｃＲの投与後６日目および８日目の（０．８ｇ／ｄＬ）に相当した。
【０１７７】
イン・ビトロでのＲＢＣ結合および食作用に関して、Ｓｙｍ００１および血漿由来抗−Ｄ生成物の類似の効力を鑑みて、イン・ビボでのヘモグロビンに対するＳｙｍ００１および血漿由来抗−Ｄ生成物の類似の効果を予測することができた。最初のヒト試験の結果（Ｓｙｍ００１−０１）は、ＲｈＤ陽性対象におけるヘモグロビン低下が７５μｇ／ｋｇまでの投与後、血漿由来抗−Ｄ生成物の治療的投与量で観察されたものより重要ではないかもしれないことを示す。ＩＴＰ患者における治療的投与量にて、Ｓｙｍ００１は、血漿由来抗−Ｄ生成物よりも、ヘモグロビン低下をあまり引き起こさず、その結果、Ｓｙｍ００１のより良好なリスク−便益プロフィールをもたらすことが示唆される。
【０１７８】
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【図１Ａ】
2012500813.tif 000015
【図１Ｂ】
2012500813.tif 000016
【図１Ｃ】
2012500813.tif 000017
【図２Ａ】
2012500813.tif 000018
【図２Ｂ】
2012500813.tif 000019
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2012500813.tif 000024
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月24日(2011.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012500813000001.app
【国際調査報告】
2012500813.tif 000177
2012500813.tif 000178
2012500813.tif 000179