(57)【要約】新たな紫外線吸収剤、紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤を提供する。式（１）の2-置換-6-アルキル-5-オキソ-5,6-ジヒドロ(7H)ピロロ[3,4-d]ピリミジン類化合物、または式（２）の2-置換-7-アルキル-6-オキソ-5,6-ジヒドロ(7H)ピロロ[2,3-d]ピリミジン類化合物またはその薬学的に許容される塩類を有効成分とする紫外線吸収剤、紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤。2012516285.tif 0000072012516285.tif 000008 〔式（１）または式（２）において、Ｒ１からＲ８は独立に水素または低級アルキル基、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＲ９（Ｒ９＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＮＨ２）、−ＣＨ２−ＯＣＯＣ２Ｈ５を；Ｘは−Ｎ（Ｒ１０）−（Ｒ１０＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｐｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、−ＣＨ（Ｐｈ）２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＯＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３）、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｏ−、−Ｓ−を；示す。但しＰｈはフェニル基である〕
2012516285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）または式（２）の紫外線防護のためのピリミジン類化合物を含む紫外線吸収剤、紫外線防護剤および化粧品。
【化１】
2012516285.tif 000005
【化２】
2012516285.tif 000006
〔式（１）または式（２）において、Ｒ１からＲ８は独立に水素または低級アルキル基、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＲ９（Ｒ９＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＮＨ２）、−ＣＨ２−ＯＣＯＣ２Ｈ５を；Ｘは−Ｎ（Ｒ１０）−（Ｒ１０＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｐｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、−ＣＨ（Ｐｈ）２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＯＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３）、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｏ−、−Ｓ−を；示す。但しＰｈはフェニル基である〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な紫外線吸収剤、新規な皮膚科用剤、化粧品用剤、詳しくは皮膚を紫外線障害から守る、紫外線防護剤、紫外線障害防護剤あるいは、皮膚のしみ、そばかす、炎症等のもとであるメラニンの産生系の抑制剤又は調整剤、ないしメラノサイト、ケラチノサイト等皮膚細胞の機能・活動の抑制剤又は調整剤に関する。    
【背景技術】
【０００２】
皮膚におけるしみ、そばかすの生成等色素異常、日やけ、日光やけど後の色素沈着は、ひとそれぞれ、体質による程度の違いがあるが、皮膚組織に存在する色素細胞(メラノサイト)の、日光等光被曝に対する生体防御的活動によるメラニン合成の結果の表現である。しみ、そばかすや日やけ後の色素沈着は、でき易い人とでき難い人がおり、でき易い人にとっては、大きな悩みであり、紫外線曝露に対する、効果的な紫外線防護方法を取り入れることが求められている。
【０００３】
フロンガス等による上空の成層圏にあるオゾン層破壊のため、より強力な紫外線の被曝などによる遺伝的影響、発癌作用等により癌患者の増加が懸念されている。人間の皮膚は280〜320nmの波長の紫外線に敏感で、特に305〜310nmの領域の紫外線が皮膚癌を起こすという。この波長域の紫外線を吸収するオゾン層の破壊は地上に降り注ぐ紫外線を増加させ、上記のように皮膚癌の増大につながることが論議されているが、かような放射線被曝の障害を、予防・治療する薬剤を開発することも重要な課題となってきている。
【０００４】
現代は、紫外線被曝によるしわ形成などの皮膚の老化や、メラノーマ、皮膚がんの発病や白内障の発症等の予防・治療から、頭頚部や衣服非着用部・皮膚露出部における美容上の問題の改善までを目的として、より効力があり、望ましい紫外線防護剤や紫外線防護化粧料の必要性が、より高まっている。紫外線吸収剤や紫外線遮断剤や紫外線散乱剤をまとめて、紫外線防護剤というなら、二酸化チタン類、酸化亜鉛類、桂皮酸誘導体類、ベンゾフェノン誘導体類などの物質が従来、使用されてきた。また、色素異常や色素沈着等の皮膚美容上のトラブルを回避・防止し、又は改善する目的で、アスコルビン酸類、過酸化水素、ハイドロキノン類、アルブチン、フェルラ酸、コウジ酸、グルタチオン類、美白性生薬のエキス等を配合した、いわゆる美白剤と言われる皮膚外用剤が化粧品として生産され、日常的に使用されてきた。
【０００５】
本発明者は、メラノサイトの良性腫瘍であるホクロに科学的関心があり、「アレルギー疾患抵抗性・感受性とほくろの多・無とのリンク」即ち、「ほくろ(形成能)は、花粉症等アレルギー疾患抵抗性の表現形質(素因)である」という報告等々を行ってきており、メラノサイトのメラニン合成・代謝系活性化等、皮膚状態の活性化を通した、疾患の発症や進展の予防・治療方法を提案してきた(非特許文献１、２および特許文献１)。
【０００６】
本発明者はその研究の延長で、本発明者らが以前から検討してきた一群の合成ピリミジン化合物の、紫外線防護剤として、美白剤としての生物活性を検討することに想い到った。これら合成ピリミジン化合物は、特許文献２〜７および非特許文献３〜５に示すように、元来、神経細胞の再生、修復効果を有する、末梢神経の障害疾患や中枢神経の障害疾患へ適用しうる神経疾患用治療薬であり、また、学習記憶の改善・回復効果を有し、痴呆等脳疾患へ適用しうる治療薬であり、また創傷を治癒する創傷治療剤として開発が期待されている化合物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２０３８５５公報
【特許文献２】特許第２６２８７０７号(特開平１−１３９５７２、ＷＯ８７／０４９２８) 公報
【特許文献３】ＵＳＰ４９５９３６８公報
【特許文献４】特許第２８２５０９２号(特開平１−４０４８３)公報
【特許文献５】特公平７−５１５６６(特開平１−４０４６９)公報
【特許文献６】特開平９−２９５９４６公報
【特許文献７】ＵＳＰ５９７６５２３公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Akira Awaya et.al：Microbiol Immunol. 2003;47(1):101-3.
【非特許文献２】粟屋  昭：アレルギー・免疫 Vol.12, No.8, 1214〜1217,2005.
【非特許文献３】Awaya,A.et.al：Biol.Pharm.Bull.16(3),248-253,1993.
【非特許文献４】Koyama Y, Awaya A.et.al：Biol.Pharm.Bull.20(7),823-825,1997.
【非特許文献５】粟屋  昭：組織培養工学 28(3),106-111,2002.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来にない新たな化学構造式を持つ、有用な紫外線吸収剤、紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、この目的で、本発明者らが以前に見出した式（１）または式（２）のピリミジン類化合物またはその薬学的に許容される塩類について、新たに紫外線防護活性やメラニン産生抑制活性のスクリーニングを行い、期待通り本発明の化合物が優れた生物活性を有することを見出すことにより、所期の目的を達成し、本発明を完成した。即ち、本発明は、式（１）または式（２）のピリミジン類化合物またはその薬学的に許容される塩類を有効成分とする紫外線吸収剤、紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤を提供するものである。
【化１】
2012516285.tif 000003
【化２】
2012516285.tif 000004
〔式（１）または式（２）において、Ｒ１からＲ８は独立に水素または低級アルキル基、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＲ９（Ｒ９＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＮＨ２）、−ＣＨ２−ＯＣＯＣ２Ｈ５を；Ｘは−Ｎ（Ｒ１０）−（Ｒ１０＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｐｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、−ＣＨ（Ｐｈ）２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＯＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３）、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｏ−、−Ｓ−を；示す。但しＰｈはフェニル基である〕
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、上記の式（１）または式（２）のピリミジン類化合物またはその薬学的に許容される塩類を有効成分とする紫外線吸収剤、紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤を提供する。
【００１２】
本発明によりこれら剤として提供できる合成ピリミジン系化合物としては、特許文献２〜７や非特許文献３〜５などに記載のある２−置換−６−アルキル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン類化合物および２−置換−７−アルキル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン類化合物またはその塩である。より具体的には上記の式（１）あるいは式（２）に表わす化合物である。〔式（１）または式（２）において、Ｒ１からＲ８は独立に水素または低級アルキル
基、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＲ９（Ｒ９＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＮＨ２）、−ＣＨ２−ＯＣＯＣ２Ｈ５を；Ｘは−Ｎ（Ｒ１０）−（Ｒ１０＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｐｈ、−ＣＨ２Ｐｈ、−ＣＨ（Ｐｈ）２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＯＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３）、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｏ−、−Ｓ−を；示す。但しＰｈはフェニル基である〕
【００１３】
（式（１）または式（２）において、Ｒ１からＲ８は独立に水素または低級アルキル基、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２ＯＣＯＣ２Ｈ５を、Ｘは＞ＮＨ、＞Ｎ−ＣＨ３、＞Ｎ−Ｃ２Ｈ５、＞Ｎ−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ２−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ−ｐｈ２、＞Ｎ−ＣＯＣＨ３、＞Ｎ−ＣＯＯＣ２Ｈ５、＞Ｎ−ＳＯ２ＣＨ３、＞ＣＨ２、＞ＣＨＣＨ３、＞ＣＨＣ２Ｈ５、−Ｏ−、−Ｓ−を示す。ただし、ｐｈはフェニル基を示す。）なお、低級アルキル基としては炭素数が１から７の低級アルキル基が好ましい。
【００１４】
式（１）の代表的化合物を以下に例挙する。２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−（４−メチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−（４−エチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−（４−メチルピペリジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−（４−エチルピペリジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−モルホリノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−チオモルホリノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、
【００１５】
２−ピペラジノ−６−イソプロピル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−ｎ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−ｓｅｃ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−ｔ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−４，６−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６，７−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６，７，７−トリメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−４，６−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−６，７，７−トリメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−７−メチル−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−４−メチル−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン。
【００１６】
式（２）の代表的化合物を以下に例挙する。２−ピペラジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−メチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−エチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−Ｎ−アセチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−メチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−エチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−モルホリノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−チオモルホリノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−ｎ−プロピル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−イソプロピル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、
【００１７】
２−ピペリジノ−７−ｎ−ブチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−ｔ−ブチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−５−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−５−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−４，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−５，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−５，５，７−トリメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−５，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−５，５，７−トリメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−４メチル−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−５−メチル−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン。
【００１８】
本発明のピリミジン化合物類は、下記のような、様々なインビトロ、インビボ実験系で検討され、紫外線障害過程に効果的に作用し、紫外線防護及び/又はメラニン産生抑制活性を持つことが明らかにされた。即ち、280-320nmのUVBに対する防護効果は、ヒト表皮ケラチノサイトHaCaT細胞培養液に、0-500mMの本発明化合物をUVB照射前又は照射後に添加し、UVB（50, 100mJ/cm2）を曝露して、UVB曝露12, 24時間後の細胞生存率を、細胞外へのLDH漏出量の測定、DNA断片化の検出（TUNEL染色、アガロースゲル電気泳動法）により評価した。また、炎症性サイトカインであるTNF-αの産生量を、ELISA法にて測定した。本発明の化合物により、UVB曝露による細胞生存率の減少、アポトーシスの誘導が濃度依存的に抑制され、またUVB誘発性のTNF-α産生も有意に抑制される結果を得た。更にHaCaT細胞の増殖に対する本発明化合物の作用を調べたところ、本発明化合物は一般に細胞増殖を増加させることが分かった。
【００１９】
一方、メラニン産生抑制効果のスクリーニングは、マウスB16メラノーマ細胞を、100μMを中心に様々な濃度の本発明化合物の存在下で、72時間培養する実験系で行った。細胞内メラニン産生量を、アルカリ条件下でメラニンを可溶化し、その吸光度を測定することにより評価した。またメラニン産生に関与する細胞内Mitfおよびチロシナーゼ発現量への本発明化合物の影響を、Westernblot法にて検討した。本発明の化合物により、B16細胞のメラニン産生量が有意に抑制され、更に本発明化合物は細胞内Mitfおよびチロシナーゼの発現量を減少させる結果が得られた。マウスB16メラノーマ細胞に対する本発明の化合物の細胞毒性を、MTT法で調べたが、本発明化合物は一般に毒性は弱く、安全性の高い化合物であった。
【００２０】
マウスやラットやモルモット等の背中の体毛を剃り、紫外線照射を行い、本発明化合物の紅斑、浮腫(発赤、湿疹、かぶれ)等の皮膚反応に対する作用を肉眼で観察し、紫外線防護作用を調べたところ、インビボでの効果が顕著に見られた。
【００２１】
このようにして、本発明の式（１）および式（２）のピリミジン類化合物は、UVB防護作用、及び/又は、細胞内Mitfおよびチロシナーゼの発現抑制を介したメラニン産生抑制作用を有することが示され、紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤として有用であることが明らかにされた。
【００２２】
式(１）および式（２）のピリミジン類化合物またはその薬学的に許容される塩類は、通常医薬組成物や化粧品製剤の形で用いられ、皮膚透過、皮下、筋肉内、経口、静脈内、鼻内、経気管支、経肺及び直腸経路といった種々の経路により投薬される。
【００２３】
本発明の紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤を含む医薬組成物あるいはしみやそばかす用化粧品や、日やけ、日光やけど後の色素沈着止め化粧料は、式（１）または式（２）の本発明の化合物に加えて、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、医薬組成物あるいは化粧品に、一般に用いられる製薬学的に許容される充填剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、崩壊剤等々の賦形剤、添加剤、希釈剤あるいは担体と混合することができる。これら成分として、例えば、界面活性剤、酸化防止剤、増粘剤、防腐剤、保湿剤、界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、殺菌剤、香料、色素、粉末成分、油脂、ロウ類、炭化水素油、高級脂肪酸、高級アルコール、合成エステル油、シリコーン等を配合することができる。
【００２４】
本発明は製薬的に許容される担体と活性成分としての式（１）および式（２）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含有する製薬調合物を包含する。本発明の式（１）および式（２）の化合物の薬学的に許容しうる塩類としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩などの薬学的に許容しうるアニオンを有する非毒性酸付加塩を形成する酸から形成される塩類もしくはそれらの水和物、並びに第４級アンモニウム(又はアミン)塩類もしくはそれらの水和物があげられる。
【００２５】
本発明の組成物は、例えば軟膏、無菌注射液、乳濁液、乳液、懸濁液、エアロゾル、成形パップ、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、トローチ、カシエー、エリキシル、シロップ、軟質及び硬質ゼラチンカプセル、ａｌｚｅｔ(登録商標)ｐｕｍｐカプセル、ペレット、坐薬及び無菌包装粉末などの形にすることができる。
経口投与の場合、式（１）および式（２）の化合物は、担体又は希釈剤と混合され、錠剤、カプセル剤などの形に調製される。非経口投与の場合、活性成分は１０％ブドウ糖水溶液、等張食塩水、無菌水あるいは類似の液体に溶解され、静脈内に点滴または注射により、あるいは筋肉内注射により投与されるべくバイアル又はアンプルに密閉される。有利には、溶解補助剤や局所麻酔剤、保存剤及び緩衝剤も媒体中に含有させることもできる。安定性を増すために、本組成物をバイアル又はアンプルに注入した後に、凍結乾燥することも可能である。非経口投与の他の製剤としては、例えば軟膏剤、パップ剤などの経皮的に投与される製剤がある。この場合成型パップやテープ剤が有利である。また障害局所、組織、骨などの中に直接埋め込むペレット剤やａｌｚｅｔ(登録商標)ｐｕｍｐカプセル剤などもある。ペレット作製に用いる樹脂としては、ポリ(２−ハイドロキシエチルメタアクリレート)や、エチレンビニルアセテートコポリマーなどが挙げられる。本組成物は、また患者に投薬の後、活性成分が急速に、持続的に又は遅延的に放出されるように調製することができる。
【００２６】
製薬的に許容される担体(又は希釈剤)の例は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、とうもろこし澱粉、結晶セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、不活性なポリマー類、水又は鉱油などである。
【００２７】
本組成物は、単位投薬量形状にあたり一般に０．１ないし２０００ｍｇ、好ましくは０．５ないし１０００ｍｇの活性成分を含有する。式（１）および式（２）の化合物は広い投薬量範囲にわたって有効である。例えば、１日あたりの投薬量は普通０．０３ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。実際に投与される化合物の量は、投与される化合物により、また個々の患者の年令、体重、反応、症状の程度、投与経路等により、医者により決定される。従って、上記の投薬量範囲は本発明の範囲を限定するものではない。１日あたりの好適な投薬回数は通常１〜６回、好ましくは１〜４回である。また、本発明化合物は美白効果を併せ持つ新規紫外線防護剤として期待され、クリーム、ローション、軟膏、パック、パウダーあるいは化粧水、乳液などの形態の皮膚外用剤、化粧品製剤として、当該技術分野で周知の調製方法で、調製される。１日あたりの好適な塗布回数は、医薬組成物に準じると良い。
【００２８】
式（１）および（２）の化合物は、それ自体で有効な紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤であるが、必要ならば１種又はそれ以上の他の同効剤と組合せて投薬ないしは塗布することもできる。そのような付加的な薬剤には上記のような紫外線防護剤やメラニン産生抑制剤があげられる。
本発明の治療薬に用いる式（１）および式（２）の化合物の製造例は既に、本発明者らが特許出願および論文発表をしているので、それらを参考としたい(特許文献２〜７や非特許文献３および４）。
以下に、本発明を実施例および実験例をもってより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１
活性成分１０ｍｇを含有する錠剤は以下のようにして製造される。
錠剤当り 
活性成分                                   １０ｍｇ 
トウモロコシデンプン                       ５５ｍｇ 
結晶セルロース                             ３５ｍｇ 
ポリビニルピロリドン（１０％水溶液として）   ５ｍｇ 
カルボキシメチルセルロース・カルシウム     １０ｍｇ 
ステアリン酸マグネシウム                     ４ｍｇ 
タルク                                       １ｍｇ
───────────────────────────────
合計 １２０ｍｇ
活性成分、澱粉および結晶セルロースを８０メッシュふるいを通し、完全に混合する。得られた粉末にポリビニルピロリドン溶液を混合し造粒した後、１８メッシュのふるいを通す。このように製造した顆粒を５０〜６０℃で乾燥し、再度１８メッシュのふるいにより整粒する。前もって８０メッシュのふるいにかけておいたカルボキシメチルセルロースカルシウムおよびステアリン酸マグネシウムおよびタルクを顆粒に加え、混合した後、製錠機により各々１２０ｍｇの重量の錠剤を製造する。
【００３０】
実施例２
活性成分２００ｍｇを含有する錠剤は以下のようにして製造される。
錠剤当り 
活性成分                                     ２００ｍｇ 
トウモロコシデンプン                           ５０ｍｇ 
結晶セルロース                                 ４２ｍｇ 
軽質無水ケイ酸                                   ７ｍｇ 
ステアリン酸マグネシウム                         １ｍｇ
───────────────────────────────
合計 ３００ｍｇ
上記成分を８０メッシュふるいを通し、完全に混合する。得られた粉末を圧縮成形し、重量３００ｍｇの錠剤を製造する。
【００３１】
実施例３
活性成分１００ｍｇを含有するカプセル剤は以下のようにして製造される。
カプセル当り 
活性成分                                       １００ｍｇ 
トウモロコシデンプン                             ４０ｍｇ 
乳糖                                             ５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                         ５ｍｇ
───────────────────────────────
合計 １５０ｍｇ
上記成分を混ぜ合せ、８０メッシュふるいを通し、完全に混合する。得られた粉末を１５０ｍｇずつカプセルに充填する。
【００３２】
実施例４
活性成分５ｍｇを含有するバイアル入り用時溶解注射剤は以下のようにして製造される。
バイアル当り 
活性成分                                             ５ｍｇ 
マンニトール                                       ５０ｍｇ
用時、注射用蒸留水１ｍｌを用いて溶解し、使用する。
【００３３】
実施例５
活性成分５０ｍｇを含有するアンプル入り注射剤は以下のようにして製造される。
アンプル当り 
活性成分                                           ５０ｍｇ 
塩化ナトリウム                                     １８ｍｇ 
注射用蒸留水                                           適量
───────────────────────────────
合計 ２ｍｌ
【００３４】
実施例６
活性成分１７．５ｍｇを含有する粘着性貼付製剤は以下のようにして製造される。ポリアクリル酸アンモニウム１０部を水６０部に溶解する。一方グリセリンジグリシジルエーテル２部を水１０部に加熱しつつ溶解する。更にもう一方でポリエチレングリコール（グレード４００）１０部、水１０部、活性成分１部を撹拌溶解する。ついでポリアクリル酸アンモニウムの水溶液を撹拌しつつ、グリセリンジグリシジルエーテルの水溶液及びポリエチレングリコールの活性成分含有水溶液を添加混合した薬物含有含水ゲル用溶液を、柔軟性のあるプラスチックフィルムに活性成分が平方センチメートル当り０．５ｍｇとなるように塗布し、表面を剥離紙で覆い３５平方センチメートルに切断し、製剤とした。
【００３５】
実施例７
活性成分１０ｍｇを含有する粘着性貼付製剤は以下のようにして製造される。ポリアクリル酸ナトリウム１００部、グリセリン１００部、水１５０部、トリエポキシプロピルイソシアヌレート０．２部、エタノール１００部、ミリスチン酸イソプロピル２５部、プロピレングリコール２５部及び活性成分１５部の混合水溶ゾル液を調製した。次にこのゾル液をレーヨン不織物とポリエチレンフィルムとからなる複合フィルムの不織布面に１００μｍ厚に塗布して薬剤含有の粘着剤層を形成した。この層中に含まれる放出補助物質（ミリスチン酸イソプロピルとプロピレングリコール）の含量は約２０重量％であった。その後２５℃で２４時間架橋し、上記粘着剤界面に剥離フィルムを貼り合せ、更にこれを３５平方センチメートルに切断し製剤とした。          
【００３６】
実施例８                          
ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリレート）（Polysciences, Inc.）の粗い砂状結晶を、すり鉢に入れ、すりこぎを用いて、クリーンベンチ内で無菌的に粉末状に細かく砕いた。滅菌シャーレーにこの粉末１０ｍｇをとり、９９％エチルアルコールを１０μｌと活性成分０．５ｍｇを含む水溶液１０μｌとを加え、よく攪拌して糊状の塊とした後、乾燥させた。
【００３７】
実施例９
水中油クリーム作製用の基剤成分として用いるモノステアリン酸グリセリン１０%重量、流動パラフィン１０%重量、ＰＯＥ（３０）セチルエーテル２%重量、 セチルアルコール５%重量、ワセリン４%重量およびγ−トコフェロールに活性成分１%重量を加えて各成分を混合し、８０℃に加熱した。一方、精製水 ５６%重量と１，３−ブチレングリコール１０%重量を混合し、８０℃に加熱した。両方の混合物を混ぜて、撹拌して乳化させ、その後３５℃にまで冷却して、水中油クリームを製造した。
【００３８】
実施例１０
実施例９同様の各種成分を用い、親水性化合物を固体状態で油脂性基剤に溶解させ、油相へ封入するSolid in Oil技術を応用して、経皮製剤を製造した。
【００３９】
実施例１１  
紫外線曝露されたHaCaT細胞に対する本発明化合物の作用
DMEM培地で40mmディシュに培養されたHaCaT細胞にUVB照射を行った。50ないし100mJ/cm2のUVB照射前後に様々な濃度の本発明化合物を添加して、24時間培養後、上清のLDH(乳酸脱水素酵素)含有量を測定した。対照は、UVBを照射せず、本発明化合物を加えていない細胞の培養後の上清のLDH含有量とした。LDH含有量をもとに、細胞生存率%を求め、本発明化合物の効果を下記に示す。UVB照射のみ群の細胞生存率に対する有意差を(  )内に示す。無処置群の細胞生存率は、91.39±0.32%であった。UVB50mJ/cm2照射のみ群の細胞生存率は59.91±2.50%であり、UVB100mJ/cm2照射のみ群の細胞生存率は52.19±2.07%であった。
【００４０】
２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩を添加した場合、50mJ/cm2のUVB照射前添加の場合、50、250、500μMそれぞれ、66.34±1.72%(p<0.05)、76.55±2.76%(p<0.005)、83.31±0.54%(p<0.005)であった。50mJ/cm2のUVB照射後添加の場合、50、250、500μMそれぞれ、64.35±3.29%、66.61±3.44%、70.81±2.67%(p<0.01)であった。100mJ/cm2のUVB照射前添加の場合、50、250、500μMそれぞれ、57.59±1.35%(p<0.05)、61.62±4.71%(p<0.005)、71.89±1.09%(p<0.005)であった。100mJ/cm2のUVB照射後添加の場合、50、250、500μMそれぞれ、49.93±4.99%、59.43±1.97%(p<0.01)、55.07±3.08%であった。このように、本発明化合物によってUVBによる細胞死が濃度依存的に、有意に抑制されることが明らかにされた。
【００４１】
実施例１２
HaCaT細胞のUVB照射による細胞のクロマチン凝集およびDNA断片化に対する本発明化合物の効果
HaCaT細胞培養に、50ないし100mJ/cm2のUVB照射前に、500μMの２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ(７Ｈ)ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩を添加した場合、12時間後の細胞生存率は、約250個の細胞をカウントしたが、UVB照射非添加群が、無処置群に比べ70%に落ちたのに対して、ほぼ無処置群程度に回復した(p<0.005)。また、UVB照射による12時間後のクロマチン凝集が、本発明化合物添加により抑制されることが、Hoechst33342を用いて細胞核を染色し、アポトーシス細胞特異的な核の形態変化の蛍光顕微鏡観察で示された。一方、HaCaT細胞のUV照射DNA断片化が、本発明化合物の添加により抑制されることが、Tunel染色による蛍光顕微鏡観察で示された。
また、細胞溶解後の抽出DNA断片をアガロースゲル電気泳動して、Ethidium bromide染色によるDNAの蛍光を、UVトランスイルミネーターを用いて検出することによっても、UV照射DNA断片化は、本発明化合物の添加により抑制されることが明らかにされた。
【００４２】
実施例１３
HaCaT細胞へのUVB照射によるTNF-α産生に対する本発明化合物の効果
TNF-α特異的なELISA測定系で、HaCaT細胞の培養上清のTNF-α含量の測定を行ったところ、50mJ/cm2のUVB照射24時間後のTNF-α量は3.62±0.37pg/mlであり、100mJ/cm2のUVB照射24時間後のTNF-α量は4.98±0.31pg/mlであり、無処置群は、2.67±0.47pg/mlであった。２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩を50mJ/cm2照射前に添加した場合、50、250、500μMそれぞれ、TNF-α量は2.02±0.88pg/ml、1.31±0.57pg/
ml(p<0.01)0.61±0.57pg/ml(p<0.005)であった。(  )内は、50mJ/cm2のUVB照射群との有意差検定のp値である。２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩を100mJ/cm2照射前に添加した場合、50、250、500μMそれぞれ、 TNF-α量は4.21±0.27pg/ml(p<0.05)、3.00±0.80pg/ml(p<0.05)、2.67±0.47pg/ml(p<0.005)であった。(  )内は、100mJ/cm2のUVB照射群との有意差検定のp値である。本発明の化合物添加により、UVB誘発性のTNF-α産生も有意に抑制されることが明らかにされた。
【００４３】
実施例１４
HaCaT細胞培養に50μM、250μM、500μMの２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩を添加し、6時間培養後、1μCi/ディシュの3H-チミジンを加え18時間後、細胞増殖に対する本発明化合物の作用を調べたところ、濃度依存的に細胞増殖を増加させることが分かった。
【００４４】
実施例１５                          
B16メラノーマ細胞におけるメラニン産生に対する本発明化合物の作用
B16メラノーマ細胞を6ウェルプレートに1×105 cells/wellでD-MEM培地にまいて、24時間培養し、新しい培地に換え、この時、PBSに溶解した本発明化合物を加えて全量を2mlとした(培地1.8ml+本発明化合物/PBS 200μl)。ついで、72時間培養を続けた後、細胞を洗い、EDTA0.025％を600μl/well加え、細胞をはがしこみ1.5ml チューブに回収した。そしてチューブを700gで5分間遠心した。ついで、細胞を含む50μlほどを残して、上清を捨て、1N NaOH を100μl/チューブ加えた。これを80℃で1時間保温した。それから、ウェルプレートに100μl/ウェル移し、波長405nmで吸光度を測定した。100μMの２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩を添加した場合、タンパク質量補正後の、メラニン産生量は、対照に比べて、62.7%(P<0.005)となり、本発明化合物のメラニン産生抑制作用が顕著であった。
【００４５】
実施例１６
B16メラノーマ細胞におけるMitfおよびチロシナーゼの発現量に対する本発明化合物の作用
60mmディシュで80％コンフルエント程度で培養したB16細胞を溶解後、本発明の化合物の添加が、72時間後、細胞内Mitfおよびチロシナーゼの発現量にどう影響するかwestern blot法により検討したところ、10μM、50μM、100μMの２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩を添加した場合、濃度依存的に、Mitfおよびチロシナーゼの発現量を減少させる結果が得られた。
【００４６】
実施例１７
B16メラノーマ細胞に対する本発明化合物の細胞毒性をMTTアッセイで測定した。２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩を添加し、72時間インキュベート後の場合、5〜100μMの濃度範囲では、ほぼ90%の細胞生存率であり、毒性が弱い物質であることが示された。
【００４７】
実施例１８
５〜８週齢ICR雄マウスを用い、マウス背中の体毛をバリカンで剃毛した後、少なくも半日〜１日経過した皮膚に、20μlの100μM、250μMないし500μMの２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩、２−（４−メチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩、２−ピペラジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩、２−ピペリジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩、２−（４−エチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩等本発明の化合物を塗布した。塗布部はドライヤーを用いて冷風乾燥した後、50 mJ/cm2の照射強度のUVB紫外線照射を行った。本発明の化合物を塗布後２週間を通して、毎日観察したが、発赤、湿疹、かぶれ等の皮膚の異常反応は、非塗布部分に比べ検出されなかった。また、体重増加は、対照群マウスと同様の増加推移をたどり、特に異常所見は認められなかった。
【００４８】
実施例１９
UV吸収スペクトル：本発明化合物の50μMのそれぞれの水溶液を石英セル（光路長１ｃｍ）に入れ、UV吸収能を紫外線分光光度計で測定したところ、２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩は、272.6nmに最大値を持ち、２−ピペラジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンマレイン酸塩は、301.0nmに最大値を持つことが示された。
【００４９】
実施例２０
トリオクタン酸グリセリル5%、スクアラン5%、グリセリン5%、 液状ラノリン3%、ステアリルアルコール2%、トリオクタン酸トリメチロールプロパン 2%、モノオレイン酸グリセリル2%、モノステアリン酸ポリオキシエチレン(20モル)ソルビタン1%、トリエタノールアミン1%、カルビキシビニルポリマー0.2%、p-アミノ安息香酸 0.1%、ビタミンC 0.1%を用いて、有効成分1%と、それぞれ重量比で、混合した。
更に香料少量、重硫酸ナトリウム少量、防腐剤少量、蒸留水残りを加えて乳液が調製された。
【００５０】
実験例１
本発明の化合物を雄性ｄｄｙ系５週令マウスおよび雄性ウィスター系８週令ラットに経口投与し、２４時間後に毒性を判定したが、それぞれの化合物はマウスにおいて、ＬＤ５０値が、＞１０００ｍｇ／ｋｇないし５５０〜１０００ｍｇ／ｋｇであり、ラットにおいても＞１７００ｍｇ／ｋｇないし５５０〜１０００ｍｇ／ｋｇであり、一般に毒性が弱い、安全性の高い薬剤と考えられた。個々の値については既に公開ないし登録された本発明者らの特許出願した明細書に記載されている。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上のように本発明により見い出された化合物は紫外線吸収剤、紫外線防護剤及び/又はメラニン産生抑制剤としての用途に優れ、安全性の高い医薬組成物あるいは、しみやそばかす用化粧品や、日やけ、日光やけど後の色素沈着止め化粧料、美肌作用化粧料として有用である。紫外線障害とされている、メラノーマ、皮膚がん等悪性腫瘍や、皮膚炎症、皮膚のしわ形成や白内障等の発症の予防・抑制にも効果を示すと考えられる。
【国際調査報告】
2012516285.tif 000009