(57)【要約】  本発明は外部塩基を含まない非塩基性の極性非プロトン性溶媒中でプロトン化ＤＴＰＡビス無水物によりヒアルロン酸を修飾し，架橋生成物を形成することに関する。反応は錯体形成を介して生じ，アシル化剤はヒアルロナン共カチオン自体，すなわちプロトン化ＤＴＰＡビス無水物である。最終架橋誘導体（リンカー）は，多様な金属を効果的に錯化することが可能な３つのカルボン酸基及び３つの第三級アミンから成る。最終ＤＴＰＡ架橋ヒアルロン酸はまた，モノ，ビス又はトリス機能性アルキル化剤により疎水性化し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸が，外部塩基を含まない非塩基性の極性非プロトン性溶媒中でプロトン化ジエチレントリアミン５酢酸ビス無水物と反応することを特徴とするヒアルロン酸誘導体の調製方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸が遊離酸又は塩の形態であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸の分子量が１．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１の範囲内であり，多分散指数が１．０２〜５．０の範囲内であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記非塩基性の極性非プロトン性溶媒が，ＤＭＳＯ，スルホラン又はジアルルキスルホンから成る群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記非塩基性の極性非プロトン性溶媒中，１５〜７０℃で１〜１５０時間，前記ヒアルロン酸が前記プロトン化ジエチレントリアミン５酢酸ビス無水物と反応することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記誘導体が水及び／又は極性非プロトン性溶媒中で金属ハロゲン化物又は金属酢酸塩と反応する，ジエチレントリアミン５酢酸が結合した前記ヒアルロン酸誘導体と金属原子との錯体を調製するための請求項１記載の方法により得られる誘導体の使用。
【請求項７】
前記金属原子がアルカリ土類金属Ｃａ，Ｍｇ又は遷移金属Ｆｅ，Ｇｄ，Ｉｎ，Ｚｎ，Ｅｕ，Ｔｂであり，前記溶媒がＤＭＳＯ，スルホラン又はジアルキルスルホンから成る群より選択される請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記誘導体が水及び／又は極性非プロトン性溶媒及び塩基中，１５℃〜７０℃の温度で１〜１５０時間，モノ，ビス又はトリス機能性アルキル化剤と反応する，ジエチレントリアミン５酢酸が結合した前記ヒアルロン酸誘導体を前記アルキル化剤により疎水性化するための請求項１記載の方法により得られる誘導体の使用。
【請求項９】
前記アルキル化剤が１〜３個の基Ｘを含む一般式Ｒ‐Ｘを有し，式中，Ｒは場合により芳香族基又はヘテロ芳香族基を含むＣ１〜Ｃ３０アルキル直鎖又は分岐鎖であり，Ｘはハロゲン又は基‐Ｏ‐ＳＯ２‐Ｒである請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記塩基が，式中のＭはアルカリ金属である一般式ＭＨＣＯ３，Ｍ２ＣＯ３，ＭＦの無機化合物，或いは式中のＲは場合により芳香族基又はヘテロ芳香族基を含むＣ１〜Ｃ３０アルキル直鎖又は分岐鎖である一般式Ｒ３Ｎの窒素有機化合物から成る群より選択され，前記溶媒がＤＭＳＯ，スルホラン又はジアルキルスルホンから成る群より選択される請求項８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸）の架橋誘導体を形成するヒアルロン酸の新規な修飾方法，及びそれに従って修飾した誘導体の反応に関する。ヒアルロン酸はプロトン化ＤＴＰＡビス無水物により，外部塩基を全く含まない非塩基性の極性非プロトン性溶媒中で修飾し，架橋生成物を形成する。前記架橋誘導体のリンカーには３つのカルボン酸基及び３つの第三級アミンが含まれ，それらは多様な金属を効果的に錯化することが可能であり，更にＤＴＰＡカルボン酸基の修飾，例えばアルキル化剤による架橋誘導体の疎水性化も可能にする。
【背景技術】
【０００２】
多糖類はグリコシド（glylcosidic）結合により架橋された簡単な単糖類（モノマー単位）から成るポリマーである。それらは反復単位数に基づいてオリゴ糖（２〜１０単位）及び多糖類（１０単位以上）に分類される。多糖類は非常に重要である。多糖類は栄養機能，保護機能，構築機能（セルロース，キチン）又は保存機能（デンプン）を有する。ポリマーの平均分子量は，典型的に１６．１０３ｇ．ｍｏｌ−１〜１６．１０３ｇ．ｍｏｌ−１の範囲内にあることを特徴とすることが一般的である。反復単位数は重合度に依存している。
【０００３】
反復単位β‐（１，３）‐Ｄ‐グルクロン酸及びβ‐（１，４）‐Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンから成るヒアルロン酸
2012507615.tif 000002
は重要な多糖類である。それは単離方法及び初期物質に依存した５．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１の高分子量を特徴とする。ヒアルロン酸又はその塩ヒアルロナンは結合組織，滑膜関節液の主要部分であり，また水和，プロテオグリカン組織化，細胞分化，増殖及び血管形成などの多くの生物学的プロセスに重要な役割を担っている。この親水性の高い多糖類は，塩の形態でｐＨの全範囲内において水溶性である。
【０００４】
ヒアルロン酸は，コンドロイチン硫酸塩，デルマタン硫酸塩，ケラタン硫酸塩及びヘパラン硫酸塩を更に含むグリコサミノグリカン群の代表である。
【０００５】
ヒアルロン酸のアシル化
ヒアルロン酸のアシル化は，主に親水性の化合物の性質を疎水性化合物へと改変するアルキル鎖を導入するために最もよく使用される方法である。反応は，触媒を添加してそれぞれの酸の無水物，酸の塩化物又は酸自体と反応させて実行することが最も多い。
【０００６】
ヒアルロン酸オリゴマーのアシル誘導体の調製はカウチマン他(Couchmann et al.)（米国特許第４，７６１，４０１号公報；１９８８年）が特許を取得しており，ここではアシル化が脱アセチル化ヒアルロナンのヒドロキシル基及びアミノ基の両方で生じる。Ｏ‐アシル化は，酸触媒（鉱酸，有機酸又はルイス酸）及び活性化剤（Ｎ，Ｎ’‐ジシクロヘキシルカルボジイミド，２‐クロロ‐１‐メチルピリジニウムヨウ化物及びＮ，Ｎ’‐カルボニルジイミダゾール）を添加する有機酸との反応を含むか，或いは塩基の存在下で酸無水物又は塩化物を使用する。脇 道典他(Michinori et al.)（特開平０７−３０９９０２号公報；１９９５年）は，触媒の存在下，水混和性有機溶媒を含む水媒体中で，カルボン酸無水物又はカルボン酸アシルハロゲン化物との反応によりアシル化ヒアルロン酸を調製した。ヒアルロン酸のアシル基を鹸化したところ，アシル基を多数有する誘導体が生じた。また，ペルベッリーニ他(Perbellini et al.)（国際公開第２００４／０５６８７７Ａ１号公報；２００４年）は，ヒアルロン酸の特定の誘導体を調製するためにレチノイン酸塩化物及び酪酸無水物を使用した。テトラブチルアンモニウム塩の形態のヒアルロン酸はＮ，Ｎ’‐ジメチルホルムアミド媒体中で合成するために使用した。
【０００７】
ヒアルロン酸の架橋
ヒアルロン酸の架橋を記載してある方法もいくつかある。最も簡単な方法はＰＯＣｌ３による架橋である（米国特許第５，７８３，６９１号公報）。バラス他(Balasz et al.)はジビニルスルホンによりヒアルロン酸を架橋した（米国特許第４，５８２，８６５号公報）。架橋に適した他の反応性求電子剤にはアルデヒドが含まれる（米国特許第４，７１３，４４８号）。更に，高頻度に使用され，２種のポリマーと反応することが可能な薬はエポキシド及びビスエポキシドであり（国際公開第８６／００９１２号公報，国際公開第２００７／１２９８２８号公報），これらの中で最もよく知られている代表的なものはエピクロロヒドリンである。
【０００８】
ＥＤＣを使用すると，その後ポリアニオン性化合物と架橋反応することが可能なヒアルロン酸のカルボン酸基の反応性が促進される（米国特許第４，９３７，２７０号公報）。ポリヒドラジドは他の求核反応物質の代表的なものである（国際公開第２００６／００１０４６号公報）。ポリ酸無水物，ポリ（塩化アルキロイル），ポリエポキシド及びポリカルボジイミドによるヒアルロン酸の架橋方法は国際公開第００／４６２５２号公報に開示された。ビスカルボジイミドとヒアルロン酸とを反応させると（国際公開第２００５／０６７９９４号公報），反応性（rective）の求電子剤による架橋が生じる。チオール誘導体とヒアルロン酸との間のジスルフィド架橋が形成される酸化還元反応を経た架橋は欧州特許公開第１６８３８１２Ａ１号公報に開示されている。別の特定の架橋方法には光化学反応がある。桂皮酸のビニレン基又はそのアリール置換類似体がシクロブタンへと光化学環化できることは周知である。この事実は，多糖のグルコサミン部分の窒素上でヒアルロン酸のＮ‐脱アシル化誘導体を桂皮酸塩化物でアシル化した欧州特許公開第１２１７００８Ａ１号公報の考案者により利用された。架橋自体は２８０nm波長の光の照射により達成された。桂皮酸の他に，ヒアルロン酸に結合した他の光反応基を利用できる可能性があり（国際公開第９７／１８２２４号公報，欧州特許公開第０７６３７５４Ａ２号公報），これは適当な波長の光で照射することにより誘導体を架橋するものである。塩基の存在下の，或いは塩基性溶媒中でのヒアルロン酸アシル化及び架橋を目的とした特許はユイ他(Yui et al.)(米国特許第６，６７３，９１９号公報）及びグエン他(Nguyen et el.)（米国特許第５，６９０，９６１号公報）により公開された。
【０００９】
上述した公知の方法の短所には，誘導体の網に捕捉される毒性を有する低分子の極性化合物の架橋ヒアルロン酸誘導体の精製が困難であること，公知の方法は複雑であることなどが挙げられる。公知の方法と比較して，本発明による方法は簡便であり，非常に毒性の高い溶媒又はアシル化触媒の存在を必要としない。
【００１０】
発明の開示
本発明の対象は，模式図１に従ってヒアルロン酸とプロトン化ＤＴＰＡビス無水物（ジエチレントリアミン５酢酸ビス無水物）との反応によりヒアルロン酸誘導体を調製する方法である。
2012507615.tif 000003
模式図１：プロトン化ＤＴＰＡビス無水物とヒアルロン酸（ＨＡ‐ＣＨ２‐ＯＨ）との反応
【００１１】
反応は外部塩基を含まない非塩基性の極性非プロトン性溶媒中で生じ，その結果，架橋生成物が形成される。溶媒はＤＭＳＯ，スルホラン(sulpholan)又はジアルキルスルホン（dialkysulphone）から成る群より選択されることが好ましい。ヒアルロン酸は遊離酸又は塩の形態であることが好ましく，分子量は１．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１の範囲内，多分散指数は１．０２〜５．０の範囲内であることが好ましい。
【００１２】
提案した方法は公知の方法と比較して簡便であり，毒性の高い溶媒又はアシル化触媒の存在を必要としない。
2012507615.tif 000004
模式図２：ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐ＨＡと金属及びアルキル化剤との反応
【００１３】
エステル結合によるＤＴＰＡビス無水物のＨＡへの結合は１５〜７０℃，好ましくは６０℃で生じ，このことはヒアルロン酸のカルボン酸基によりＤＴＰＡビス無水物をプロトン化すると錯体が形成され，アシル化剤はヒアルロナン共カチオン自体であるという事実により説明可能である。それぞれのアシル化はヒドロキシ基上の１つで直接生じるか，或いはグルクロン部分のカルボキシレート基上と，その後分子内においてヒドロキシ基上で生じる―模式図３参照。
2012507615.tif 000005
模式図３：プロトン化ＤＴＰＡ無水物とヒアルロン酸との反応の詳細な模式図
【００１４】
０．１時間〜２４時間の期間における重水素化ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸とＤＴＰＡビス無水物との混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図１参照）は，ＤＴＰＡビス無水物に属する‐Ｎ‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｎ‐の元の水素信号が消滅したこと（３．３；３．４；３．６５；３．８５ｐｐｍ），及び３．２〜３．８ｐｐｍの範囲内に新たな性質が存在する（ピーク）ことを裏付けており，これはプロトン化ＤＴＰＡビス無水物の形成を示すものである。類似体の系のｐＫａ値の表データ（Ｒ‐ＣＯＯＨ‐ｐＫａ〜４，アルキル３Ｎ‐ｐＫａ〜１１）もまた，この可能性に好適である。
【００１５】
本発明による方法は，好ましくはＤＭＳＯ又はスルホラン中でヒアルロン酸を溶解すること，ＤＴＰＡビス無水物を添加すること，及び１５〜７０℃，好ましくは６０℃で１〜１５０時間，好ましくは２４時間，空気湿度の無い状態で混合物を混合することを含む。
【００１６】
リンカー，すなわち架橋誘導体は３つのカルボン酸基及び３つの第三級アミンを含み，それらは多様な金属を効果的に錯化することが可能であり，モノ，ビス及びトリス機能性アルキル化剤によりＤＴＰＡリンカーのカルボン酸基を疎水性化する可能性をもたらすものである―模式図２参照。
【００１７】
ヒアルロン酸及びジエチレントリアミン５酢酸の架橋誘導体と金属原子との錯体は，アルカリ土類金属―Ｃａ，Ｍｇ，又は遷移金属―Ｆｅ，Ｇｄ，Ｉｎ，Ｚｎ，Ｅｕ，Ｔｂなどのそれぞれの金属の塩化物又は酢酸塩を水又は極性非プロトン性溶媒中で，１５〜７０℃，好ましくは２０℃で１分〜２４時間反応させて調製する。ＤＴＰＡの錯化特性に関し，ＤＴＰＡヒアルロナンと，例えば診断目的のガドリニウム，又は生体でのヒアルロナンの分布をモニタリングする目的のインジウム１１３Ｉｎ，又はＤＴＰＡヒアルロナンとの錯体において化粧料に応用可能な特定の活性を示し得る亜鉛とのキレート錯体が形成される可能性がある。
【００１８】
ヒアルロン酸及びＤＴＰＡの架橋誘導体は，水と，又は極性非プロトン性溶媒と又は該溶媒と，又は該溶媒及び水と，又は複数の前記極性非プロトン性溶媒の混合液中で，１５〜７０℃，好ましくは６０℃の温度で，１〜１５０時間，モノ，ビス又はトリス‐アルキル化剤と塩基と反応させて疎水性化する。一般式Ｒ‐Ｘのアルキル化剤には，式中のＲが直鎖又は分岐鎖を有し，場合により芳香族基又はヘテロ芳香族基を含むＣ１〜Ｃ３０であり，Ｘがハロゲンであるアルキル（アリール）ハロゲン化物や，或いは，式中のＲが上記と同様であり，Ｘが基‐Ｏ‐ＳＯ２‐Ｒであるアルキル（アリール）硫酸塩が含まれる。使用する塩基には，式中のＭがアルカリ金属である一般式ＭＨＣＯ３，Ｍ２ＣＯ３，ＭＦを有する無機化合物や，或いは式中のＲが直鎖又は分岐鎖を有し，場合により芳香族基又はヘテロ芳香族基を含むＣ１〜Ｃ３０である一般式Ｒ３Ｎを有する窒素有機塩基が含まれる。
【００１９】
ヒアルロン酸及びその誘導体の分子量は重量平均分子量である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸とＤＴＰＡビス無水物との混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの０．１時間〜２４時間の時間での変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
実施例１
ＤＴＰＡビス無水物によるヒアルロン酸の修飾
酸性型のヒアルロン酸ＨＡ‐ＣＯＯＨ（１０ｋＤａ，５０ｍｇ）を６０℃の無水ＤＭＳＯ（５ｍｌ）中に溶解した。ＤＴＰＡビス無水物（９５ｍｇ）を６０℃の多糖類溶液に添加し，混合液を２４時間，空気湿度の無い状態で攪拌した。氷水で混合液を冷却した後，蒸留水及び１５０ｍｇのＮａ２ＣＯ３を含んだ水溶液３０ｍＬを添加し，該混合液を３０分間攪拌し，その後，蒸留水で１００ｍＬに希釈し，蒸留水１Ｌに対して７回透析した。最終溶液を凍結乾燥させて生成物８８ｍｇを得た。
Ｍｗ＝２８００ｋＤａ，多分散指数＝２．５６３（ＳＥＣ‐ＭＡＬＬ法で測定），
ＩＲ  １７３９ｃｍ−１，置換度１１０％（多糖の二量体に対してＮＭＲから算出），１Ｈ  ＮＭＲ（０．０２ｍＬの２０％ＮａＯＤ水溶液を添加後に算出）ＤＴＰＡ（δ２．５５  ４Ｈ，２．６  ４Ｈ，３．１０  ２Ｈ，３．５  ６Ｈ），１３Ｃ  ＮＭＲ  ＤＴＰＡ（δ  １８３．０，１８２．８，６１．５，６１．１，５４．５，５４．４ｐｐｍ）。
【００２２】
実施例２
ＤＴＰＡビス無水物によるヒアルロン酸の修飾
酸性型のヒアルロン酸ＨＡ‐ＣＯＯＨ（１０ｋＤａ，５０ｍｇ）を６０℃の無水スルホラン（５ｍｌ）中に溶解した。ＤＴＰＡビス無水物（９５ｍｇ）を６０℃の多糖類溶液に添加し，混合液を２４時間，空気湿度の無い状態で攪拌した。氷水で混合液を冷却した後，蒸留水及び１５０ｍｇのＮａ２ＣＯ３を含んだ水溶液３０ｍＬを添加し，該混合液を３０分間攪拌し，その後，蒸留水で１００ｍＬに希釈し，蒸留水１Ｌに対して７回透析した。最終溶液を凍結乾燥させて生成物７８ｍｇを得た。
Ｍｗ＝２６００ｋＤａ，多分散指数＝２．９５１（ＳＥＣ‐ＭＡＬＬ法で測定），
ＩＲ  １７３９ｃｍ−１，置換度９８％（多糖の二量体に対してＮＭＲから算出），１Ｈ  ＮＭＲ（０．０２ｍＬの２０％ＮａＯＤ水溶液を添加後に算出）ＤＴＰＡ（δ２．５５  ４Ｈ，２．６  ４Ｈ，３．１０  ２Ｈ，３．５  ６Ｈ），１３Ｃ  ＮＭＲ  ＤＴＰＡ（δ  １８３．０，１８２．８，６１．５，６１．１，５４．５，５４．４ｐｐｍ）。
【００２３】
実施例３
ＤＴＰＡビス無水物によるヒアルロン酸の修飾
酸性型のヒアルロン酸ＨＡ‐ＣＯＯＨ（３５０ｋＤａ，５０ｍｇ）を６０℃の無水ＤＭＳＯ（５ｍｌ）中に溶解した。ＤＴＰＡビス無水物（９５ｍｇ）を６０℃の多糖類溶液に添加し，混合液を２４時間，空気湿度の無い状態で攪拌した。氷水で混合液を冷却した後，蒸留水及び１５０ｍｇのＮａ２ＣＯ３を含んだ水溶液３０ｍＬを添加し，該混合液を３０分間攪拌し，その後，蒸留水で１００ｍＬに希釈し，蒸留水１Ｌに対して７回透析した。最終溶液を凍結乾燥させて生成物８３ｍｇを得た。
Ｍｗ＝２６００ｋＤａ，多分散指数＝２．９５１（ＳＥＣ‐ＭＡＬＬ法で測定），
ＩＲ  １７３９ｃｍ−１，置換度９０％（多糖の二量体に対してＮＭＲから算出），１Ｈ  ＮＭＲ（０．０２ｍＬの２０％ＮａＯＤ水溶液を添加後に算出）ＤＴＰＡ（δ２．５５  ４Ｈ，２．６  ４Ｈ，３．１０  ２Ｈ，３．５  ６Ｈ），１３Ｃ  ＮＭＲ  ＤＴＰＡ（δ  １８３．０，１８２．８，６１．５，６１．１，５４．５，５４．４ｐｐｍ）。
【００２４】
実施例４
ＤＴＰＡビス無水物によるヒアルロン酸の修飾
酸性型のヒアルロン酸ＨＡ‐ＣＯＯＨ（３５０ｋＤａ，５０ｍｇ）を６０℃の無水スルホラン（５ｍｌ）中に溶解した。ＤＴＰＡビス無水物（２５ｍｇ）を６０℃の多糖類溶液に添加し，混合液を２４時間，空気湿度の無い状態で攪拌した。氷水で混合液を冷却した後，蒸留水及び１５０ｍｇのＮａ２ＣＯ３を含んだ水溶液３０ｍＬを添加し，該混合液を３０分間攪拌し，その後，蒸留水で１００ｍＬに希釈し，蒸留水１Ｌに対して７回透析した。最終溶液を凍結乾燥させて生成物６１ｍｇを得た。
Ｍｗ＝２６００ｋＤａ，多分散指数＝２．９５１（ＳＥＣ‐ＭＡＬＬ法で測定），
ＩＲ  １７３９ｃｍ−１，置換度３０％（多糖の二量体に対してＮＭＲから算出），１Ｈ  ＮＭＲ（０．０２ｍＬの２０％ＮａＯＤ水溶液を添加後に算出）ＤＴＰＡ（δ２．５５  ４Ｈ，２．６  ４Ｈ，３．１０  ２Ｈ，３．５  ６Ｈ），１３Ｃ  ＮＭＲ  ＤＴＰＡ（δ  １８３．０，１８２．８，６１．５，６１．１，５４．５，５４．４ｐｐｍ）。
【００２５】
実施例５
ＤＴＰＡビス無水物によるヒアルロン酸の修飾
酸性型のヒアルロン酸ＨＡ‐ＣＯＯＨ（３５０ｋＤａ，５０ｍｇ）を６０℃の無水ＤＭＳＯ（５ｍｌ）中に溶解した。ＤＴＰＡビス無水物（１０ｍｇ）を６０℃の多糖類溶液に添加し，混合液を２４時間，空気湿度の無い状態で攪拌した。氷水で混合液を冷却した後，蒸留水及び１５０ｍｇのＮａ２ＣＯ３を含んだ水溶液３０ｍＬを添加し，該混合液を３０分間攪拌し，その後，蒸留水で１００ｍＬに希釈し，蒸留水１Ｌに対して７回透析した。最終溶液を凍結乾燥させて生成物５３ｍｇを得た。
Ｍｗ＝２６００ｋＤａ，多分散指数＝２．９５１（ＳＥＣ‐ＭＡＬＬ法で測定），
ＩＲ  １７３９ｃｍ−１，置換度６％（多糖の二量体に対してＮＭＲから算出），１Ｈ  ＮＭＲ（０．０２ｍＬの２０％ＮａＯＤ水溶液を添加後に算出）ＤＴＰＡ（δ２．５５  ４Ｈ，２．６  ４Ｈ，３．１０  ２Ｈ，３．５  ６Ｈ），１３Ｃ  ＮＭＲ  ＤＴＰＡ（δ  １８３．０，１８２．８，６１．５，６１．１，５４．５，５４．４ｐｐｍ）。
【００２６】
実施例６
ＤＴＰＡビス無水物によるヒアルロン酸の修飾
酸性型のヒアルロン酸ＨＡ‐ＣＯＯＨ（２０００ｋＤａ，５０ｍｇ）を６０℃の無水ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）中に溶解した。ＤＴＰＡビス無水物（９５ｍｇ）を６０℃の多糖類溶液に添加し，混合液を２４時間，空気湿度の無い状態で攪拌した。氷水で混合液を冷却した後，蒸留水及び１５０ｍｇのＮａ２ＣＯ３を含んだ水溶液３０ｍＬを添加し，該混合液を３０分間攪拌し，その後，蒸留水で１００ｍＬに希釈し，蒸留水１Ｌに対して７回透析した。最終溶液を凍結乾燥させて生成物６８ｍｇを得た。
Ｍｗ＝２６００ｋＤａ，多分散指数＝２．９５１（ＳＥＣ‐ＭＡＬＬ法で測定），
ＩＲ  １７３９ｃｍ−１，置換度７６％（多糖の二量体に対してＮＭＲから算出），１Ｈ  ＮＭＲ（０．０２ｍＬの２０％ＮａＯＤ水溶液を添加後に算出）ＤＴＰＡ（δ２．５５  ４Ｈ，２．６  ４Ｈ，３．１０  ２Ｈ，３．５  ６Ｈ），１３Ｃ  ＮＭＲ  ＤＴＰＡ（δ  １８３．０，１８２．８，６１．５，６１．１，５４．５，５４．４ｐｐｍ）。
【００２７】
実施例７
ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐Ｇｄ錯体の調製
模式図４
2012507615.tif 000006
ＧｄＣｌ３．６Ｈ２Ｏ（４０ｍｇのＧｄＣｌ３．６Ｈ２Ｏ，水中０．０４当量）の１％溶液をＨＡ‐ＤＴＰＡ（実施例５の修飾ヒアルロン酸）（置換度６％ｍｏｌ，ヒアルロン酸の二量体１ｇに対して算出）の水溶液（１００ｍＬ）に添加し，混合液を室温で１時間攪拌した。次いで最終溶液を１Ｌの蒸留水に対して透析したところ，キレート染料のキシレノールオレンジを含む酢酸緩衝液を使用し，溶媒を蒸発させた後では凍結乾燥溶液中にガドリニウムは検出されなかった。この事実，並びに濃度１０−３ｍｇ／ｍｌのＧｄがこの方法で検出できるという事実から，添加したガドリニウムの９５％以上がＨＡ‐ＤＴＰＡ中で結合したことが示唆される。
【００２８】
実施例８
ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐Ｆｅ錯体の調製
模式図５
2012507615.tif 000007
ＦｅＣｌ３（２０ｍｇのＦｅＣｌ３，水中０．０４当量）の１％溶液をＨＡ‐ＤＴＰＡ（実施例５の修飾ヒアルロン酸）（置換度６％ｍｏｌ，ヒアルロン酸の二量体１ｇに対して算出）の水溶液（１００ｍＬ）に添加し，混合液を室温で１時間攪拌した。次いで最終溶液を１Ｌの蒸留水に対して透析したところ，キレート染料のキシレノールオレンジを含む酢酸緩衝液を使用し，溶媒を蒸発させた後では凍結乾燥溶液中に鉄は検出されなかった。この事実，並びに濃度１０−４ｍｇ／ｍｌのＦｅがこの方法で検出できるという事実から，添加した鉄の９７％以上がＨＡ‐ＤＴＰＡ中で結合したことが示唆される。
【００２９】
実施例９
ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐Ｉｎ錯体の調製
模式図６
2012507615.tif 000008
ＩｎＣｌ３（１７ｍｇのＩｎＣｌ３，水中０．０４当量）の１％溶液をＨＡ‐ＤＴＰＡ（実施例５の修飾ヒアルロン酸）（置換度６％ｍｏｌ，ヒアルロン酸の二量体１ｇに対して算出）の水溶液（１００ｍＬ）に添加し，混合液を室温で１時間攪拌した。次いで最終溶液を１Ｌの蒸留水に対して透析したところ，キレート染料のキシレノールオレンジを含む酢酸緩衝液を使用し，溶媒を蒸発させた後では凍結乾燥溶液中にインジウムは検出されなかった。この事実，並びに濃度１０−４ｍｇ／ｍｌのＩｎがこの方法で検出できるという事実から，添加したインジウムの９７％以上がＨＡ‐ＤＴＰＡ中で結合したことが示唆される。
【００３０】
実施例１０
ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐Ｅｕ錯体の調製
模式図７
2012507615.tif 000009
ＥｕＣｌ３（４０ｍｇのＥｕＣｌ３，水中０．０４当量）の１％溶液をＨＡ‐ＤＴＰＡ（実施例５の修飾ヒアルロン酸）（置換度６％ｍｏｌ，ヒアルロン酸の二量体１ｇに対して算出）の水溶液（１００ｍＬ）に添加し，混合液を室温で１時間攪拌した。次いで最終溶液を１Ｌの蒸留水に対して透析したところ，キレート染料のキシレノールオレンジを含む酢酸緩衝液を使用し，溶媒を蒸発させた後では凍結乾燥溶液中にユーロピウムは検出されなかった。この事実，並びに濃度１０−３ｍｇ／ｍｌのＥｕがこの方法で検出できるという事実から，添加したユーロピウムの９５％以上がＨＡ‐ＤＴＰＡ中で結合したことが示唆される。
【００３１】
実施例１１
ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐Ｔｂ錯体の調製
模式図８
2012507615.tif 000010
ＴｂＣｌ３（４０ｍｇのＴｂＣｌ３，水中０．０４当量）の１％溶液をＨＡ‐ＤＴＰＡ（実施例５の修飾ヒアルロン酸）（置換度６％ｍｏｌ，ヒアルロン酸の二量体１ｇに対して算出）の水溶液（１００ｍＬ）に添加し，混合液を室温で１時間攪拌した。次いで最終溶液を１Ｌの蒸留水に対して透析したところ，キレート染料のキシレノールオレンジを含む酢酸緩衝液を使用し，溶媒を蒸発させた後では凍結乾燥溶液中にテルビウム（therbium）は検出されなかった。この事実，並びに濃度１０−３ｍｇ／ｍｌのＴｂがこの方法で検出できるという事実から，添加したテルビウムの９５％以上がＨＡ‐ＤＴＰＡ中で結合したことが示唆される。
【００３２】
実施例１２
ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐Ｚｎ錯体の調製
模式図９
2012507615.tif 000011
ＺｎＣｌ２（０．０４当量）の水溶液をＨＡ‐ＤＴＰＡ（実施例５の修飾ヒアルロン酸）（置換度６％ｍｏｌ，ヒアルロン酸の二量体１ｇに対して算出）の水溶液（１００ｍＬ）に添加し，混合液を室温で１時間攪拌した。次いで最終溶液を１Ｌの蒸留水に対して透析したところ，キレート染料のキシレノールオレンジを含む酢酸緩衝液を使用し，溶媒を蒸発させた後では凍結乾燥溶液中に亜鉛は検出されなかった。この事実，並びに濃度１０−４ｍｇ／ｍｌのＺｎはこの方法で検出できるという事実から，添加した亜鉛の９７％以上がＨＡ‐ＤＴＰＡ中で結合したことが示唆される。
【００３３】
実施例１３
ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐Ｃａ錯体の調製
模式図１０
2012507615.tif 000012
ＣａＣｌ２（０．３当量）の水溶液（２ｍｌ）をＨＡ‐ＤＴＰＡ（０．１ｇ  置換度３０％ｍｏｌ，ヒアルロン酸の二量体に対して算出；実施例４の誘導体）の水溶液（１０ｍＬ）に添加し，混合液を室温で１時間攪拌した。次いで反応混合液を３００ｍＬに希釈し，蒸留水１Ｌに対して７回透析した。最終溶液を凍結乾燥させて生成物１１０ｍｇを得た。
ＩＲ  １７３９ｃｍ−１，１Ｈ  ＮＭＲ（０．０２ｍｌの２０％ＮａＯＤ水溶液を添加後に測定）ＤＴＰＡ（δ２．４  ４Ｈ，２．７  ４Ｈ，３．１５  ２Ｈ，３．３０  ６Ｈ）  １３Ｃ  ＮＭＲ  ＤＴＰＡ（δ６４．４，６２．６，５８．５，５７．９ｐｐｍ）。
ＩＣＰ  ３．１％Ｃａ。
【００３４】
実施例１４
ＨＡ‐ＤＴＰＡ‐Ｍｇ錯体の調製
模式図１１
2012507615.tif 000013
ＭｇＣｌ２（０．３当量）の水溶液（２ｍｌ）をＨＡ‐ＤＴＰＡ（０．１ｇ；置換度３０％ｍｏｌ，ヒアルロン酸の二量体に対して算出；実施例４の誘導体）の水溶液（１０ｍＬ）に添加し，混合液を室温で１時間攪拌した。次いで反応混合液を３００ｍＬに希釈し，蒸留水１Ｌに対して７回透析した。最終溶液を凍結乾燥させて生成物１１０ｍｇを得た。
ＩＲ  １７３９ｃｍ−１，１Ｈ  ＮＭＲ（０．０２ｍｌの２０％ＮａＯＤ水溶液を添加後に測定）ＤＴＰＡ（δ２．４  ４Ｈ，２．７  ４Ｈ，３．１５  ２Ｈ，３．３０  ６Ｈ）  １３Ｃ  ＮＭＲ  ＤＴＰＡ（δ６４．４，６２．６，５８．５，５７．９ｐｐｍ）。
ＩＣＰ  ２．３％Ｍｇ。
【００３５】
実施例１５
アルキルハロゲン化物によるＨＡ‐ＤＴＰＡ‐ＨＡのアルキル化
架橋形態のヒアルロン酸ＨＡ‐ＤＴＰＡ（１００ｍｇ，実施例１の誘導体）を水に溶解し，１％溶液を形成し，濁度が澄むまで室温でＤＭＳＯを段階的に添加した。該混合液にＮａＨＣＯ３（２当量）の飽和水溶液及び臭化ヘキシル（２当量）を添加し，溶液を４８時間，６０℃まで加熱した。氷水で溶液を冷却した後，Ｎａ２ＣＯ３の飽和水溶液（５当量）を添加し，混合液を３０分間攪拌し，その後蒸留水で１５０ｍＬまで希釈し，５Ｌの蒸留水に対して透析した（７回繰り返した）。最終溶液を凍結乾燥させて生成物９０ｍｇを得た。
ＩＲ  １７３８ｃｍ−１，１Ｈ  ＮＭＲ  ヘキシル（δ０．８５  ３Ｈ，１．３  ４Ｈ，１．３５  ２Ｈ，１．７０  ２Ｈ，４．２５  ２Ｈ）
【００３６】
実施例１６
アルキルトシラート(alkyltosylates)によるＨＡ‐ＤＴＰＡ‐ＨＡのアルキル化
架橋形態のヒアルロン酸ＨＡ‐ＤＴＰＡ（１００ｍｇ，実施例１の誘導体）をＤＭＳＯに溶解し，０．５％溶液を形成した。該混合液にＮａＨＣＯ３（２当量）の飽和水溶液及びヘキシルトシラート(hexyltosylate)（２当量）を添加し，溶液を４８時間，６０℃まで加熱した。氷水で溶液を冷却した後，Ｎａ２ＣＯ３の飽和水溶液（５当量）を添加し，混合液を３０分間攪拌し，その後，蒸留水で１５０ｍＬまで希釈し，５Ｌの蒸留水に対して透析した（７回繰り返した）。最終溶液を凍結乾燥させて生成物９０ｍｇを得た。
ＩＲ  １７３７ｃｍ−１，１Ｈ  ＮＭＲ  ヘキシル（δ０．８６  ３Ｈ，１．３  ４Ｈ，１．３５  ２Ｈ，１．７０  ２Ｈ，４．２７  ２Ｈ）
【図１】
2012507615.tif 000014
【国際調査報告】
2012507615.tif 000015
2012507615.tif 000016
2012507615.tif 000017