(57)【要約】  本発明は、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２、細菌におけるその効率的発現のための方法およびその使用に関し、具体的には、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２のアクチン結合性ならびに抗腫瘍性および抗血管形成性に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する単離されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項２】
配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基３２に対応するアミノ酸配列が欠落している、請求項１に記載のヒト短縮型Ｔ２ＲＮａｓｅ。
【請求項３】
配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項４】
配列番号２または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項５】
配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基４９に対応するアミノ酸配列が欠落している、請求項１に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項６】
配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基５２に対応するアミノ酸配列が欠落している、請求項１に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項７】
配列番号３または配列番号１５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項８】
配列番号３または配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項９】
配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６９に対応するアミノ酸配列が欠落している、請求項１に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項１０】
配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基２５、アミノ酸残基３２またはアミノ酸残基５２に対応するアミノ酸座標の少なくとも１つにおけるシステイン残基が欠落している、請求項１に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項１１】
配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基２５およびアミノ酸残基３２に対応するアミノ酸座標におけるシステイン残基が欠落している、請求項１０に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項１２】
配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基２５、アミノ酸残基３２およびアミノ酸残基５２に対応するアミノ酸座標におけるシステイン残基が欠落している、請求項１０に記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項１３】
認識実体ペプチド配列をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のヒト組換え短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項１４】
前記認識実体ペプチド配列はＨｉｓタグである、請求項１３に記載のヒト組換え短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項１５】
アクチン結合活性を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の精製された調製物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれかに記載の短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号４または配列番号５に示される核酸配列を含む、請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現可能な核酸構築物。
【請求項２１】
細菌における核酸構築物の発現は、１リットルの細菌培養物あたり少なくとも５０ｍｇのヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２を産生させる、請求項２０に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載の核酸構築物により形質転換された細胞。
【請求項２３】
前記細胞はＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の細胞を複数含み、かつ、１リットルの培養物あたり少なくとも５０ｍｇの短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を発現する細菌培養物。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれかに記載の短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２の、血管形成をその必要性のある対象において阻害するための使用。
【請求項２６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２の、血管形成をその必要性のある対象において阻害するための医薬品を製造するための使用。
【請求項２７】
前記血管形成を阻害することは、腫瘍の血管形成を阻害することである、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記腫瘍は良性腫瘍または悪性腫瘍である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記腫瘍は原発性腫瘍である、請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
前記腫瘍は転移腫瘍である、請求項２７に記載の使用。
【請求項３１】
配列番号２、配列番号３、配列番号１４または配列番号１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドを認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載される発明は、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２、細菌におけるその効率的発現のための方法およびその使用に関し、具体的には、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２のアクチン結合性ならびに抗腫瘍性および抗血管形成性に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、第６染色体（６ｑ２７）に位置するＲＮＡＳＥＴ２遺伝子によってコードされる、腫瘍抑制遺伝子として知られているＴ２−ＲＮａｓｅ糖タンパク質である（Ｔｒｕｂｉａ他、１９９７、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４２：３４２〜３４４；Ａｃｑｕａｔｉ他、２００１、Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１６０：８７〜１０１）。ＲＮＡＳＥＴ２の変異および機能の喪失が、卵巣、乳房、子宮、胃、肝臓、結腸／直腸および腎臓のガン腫、ならびに、血液学的悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫および急性リンパ芽球性白血病など）を含めて、増大した腫瘍形成性およびガンに関連している（Ｓｍｉｒｎｏｆｆ他、Ｃａｎｃｅｒ、２００６、１０７：２７６０〜６９）。ＲＮＡＳＥ６ＰＬのｃＤＮＡの腫瘍細胞株における発現により、好適な宿主に注入されたガン細胞の腫瘍形成性および転移能が抑制された。
【０００３】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子が以前に酵母のピキア・パストリスにクローン化され、これにより、ヒト組換えＲＮＡＳＥＴ２が産生された。このヒト組換えＲＮＡＳＥＴ２（ｈｒＲＮＡＳＥＴ２）は、動物モデルにおける腫瘍および血管形成的血管の発達を阻害することにおいて効果的であることが判明した（Ｓｍｉｒｎｏｆｆ他、２００６、Ｃａｎｃｅｒ、１０７（１２）、２７６０〜２７６９）。
【０００４】
ヒトＲＮＡＳＥＴ２の腫瘍抑制的かつ抗血管形成的な効果はそのリボヌクレアーゼ活性によって媒介されない。Ａｃｑｕａｔｉ他（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃ．、２００５、２６：１１５９〜６８）は、ヒスチジンをフェニルアラニンで置換する二重点変異（Ｈ６５／１１８Ｆ）により、リボ核酸分解活性の著しい喪失が生じたが、腫瘍形成性および転移のＲＮＡＳＥＴ２媒介による抑制は影響を受けなかったことを明らかにした。Ｓｍｉｒｎｏｆｆ他（Ｃａｎｃｅｒ、２００６、１０７：２７６０〜２７６９）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現させたヒト組換えＲＮＡＳＥＴ２をオートクレーブ処理し、これにより、この酵素のリボ核酸分解活性を効果的に不活性化したが、アクチン結合性および抗血管形成性は損なわれなかった。
【０００５】
Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによる米国特許第６５９００７５号（Ｒｕｂｅｎ他）は、ヒトＲＮＡＳＥＴ２に対する相同性を有する遺伝子（これは「遺伝子４７」として同定される）を含めて、分泌型タンパク質の７０個のヒト遺伝子についてのヌクレオチド配列の単離およびクローニングを開示する。
【０００６】
米国特許出願公開第２００９０７４８３０号（Ｈｕｎｔｅｒ他）は、広範囲の様々な血管形成関連疾患を治療するための、ミクロスフェアにカプセル化および調製されるいくつかの抗血管形成性の微小管破壊剤（例えば、パクリタキセルなど）の使用を開示する。
【０００７】
ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００６／０３５４３９（Ｒｏｉｚ他）は、腫瘍抑制活性および抗血管形成活性をインビボおよびインビトロで有し、同様にまた、強いアクチン結合性を有するヒトＲＮＡＳＥＴ２のクローニングおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現を開示する。これらの特性はどれも、このタンパク質のリボ核酸分解性と関連しなかった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する単離されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の別の局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有するヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の精製された調製物が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態のさらに別の局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有するヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態のなおさらに別の局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号１２または配列番号１３に示される核酸配列を含む。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現可能な核酸構築物が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌における上記核酸構築物の発現は、１リットルの細菌培養物あたり少なくとも５０ｍｇのヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２を産生させる。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態のいくつかの局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現可能な核酸構築物により形質転換された細胞が提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、上記細胞はＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態のいくつかの局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現可能な核酸構築物により形質転換された複数の細胞を含み、かつ、１リットルの培養物あたり少なくとも５０ｍｇの短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を発現する細菌培養物が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態のいくつかの局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２の、血管形成をその必要性のある対象において阻害するための使用が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態のいくつかの局面によれば、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２の、血管形成をその必要性のある対象において阻害するための医薬品を製造するための使用が提供される。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、血管形成を阻害することは、腫瘍の血管形成を阻害することである。腫瘍は良性腫瘍または悪性腫瘍であり得る。腫瘍は原発性腫瘍であり得る。腫瘍は転移腫瘍であり得る。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態のさらに別の局面によれば、配列番号２、配列番号３、配列番号１４または配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドを認識する抗体が提供される。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型Ｔ２ＲＮａｓｅは、配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基３２に対応するアミノ酸配列が欠落している。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基４９に対応するアミノ酸配列が欠落している。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基５２に対応するアミノ酸配列が欠落している。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６９に対応するアミノ酸配列が欠落している。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基２５、アミノ酸残基３２またはアミノ酸残基５２に対応するアミノ酸座標の少なくとも１つにおけるシステイン残基が欠落している。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基２５およびアミノ酸残基３２に対応するアミノ酸座標におけるシステイン残基が欠落している。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基２５、アミノ酸残基３２およびアミノ酸残基５２に対応するアミノ酸座標におけるシステイン残基が欠落している。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、ヒト組換え短縮型ＲＮＡＳＥＴ２はさらに、認識実体ペプチド配列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｅｎｔｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。認識実体ペプチド配列はＨｉｓタグであり得る。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２はアクチン結合活性を有する。
【００３３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００３５】
【図１】図１は、ＲＮＡＳＥＴ２の完全なタンパク質配列（配列番号１）を示す。短縮型形態のヒト組換え短縮型ＲＮＡＳＥ（ｈｒｔｒＲＮＡＳＥ）Ｔ２−５０（配列番号２）およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号３）の開始点をそれぞれ構成するＧｌｕ５０残基およびＭｅｔ７０残基には、一重下線が付される。ＲＮａｓｅ触媒作用部位には、二重下線が付される。システイン残基（灰色）がジスルフィド結合によって連結される。
【００３６】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、大腸菌における短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２のクローニングおよび発現の概略図を示す。ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０をコードする短縮型ｃＤＮＡ配列（ｃｙｓ６  ５７３ｂｐ、配列番号４）、および、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０をコードする短縮型ｃＤＮＡ配列（ｃｙｓ５  ５１３ｂｐ、配列番号５）を、大腸菌における発現のために最適化されて調製し、ベクターｐＨｉｓ３Ｐａｒａｌｌｅｌ（図２Ｂ、配列番号６）にクローン化し、大腸菌において発現させた。
【００３７】
【図３】図３は、大腸菌において封入体として産生されるヒト組換えＲＮＡＳＥＴ２の両方の短縮型形態およびそのインサート非含有ｐＨｉｓ３ｐａｒａｌｌｅｌベクター（モック）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。各レーンが１０μｌの粗細胞溶解物を表す。レーン１−分子マーカー；レーン２−モック；レーン３−ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）；レーン４−ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）。レーン３およびレーン４における濃いバンドに留意すること。
【００３８】
【図４】図４は、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（商標）分離システムを使用する固定化金属（ＨｉｓＴｒａｐ（商標））アフィニティーカラムの後における精製されたｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。各レーンが溶出画分の１０μｌを表す。組換えタンパク質が平衡化緩衝液におけるイミダゾールグラジエントにより溶出された。レーン１−分子マーカー；レーン２−モック；レーン３−ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）；レーン４−ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）。
【００３９】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２のアクチン結合能を示す。図５Ａは、溶液でのアクチン結合の後におけるｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す写真である。アクチン（１０μｇ）を２０μｌの緩衝液Ｇにおいて１０μｇのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）と混合した。ＥＤＣにより架橋した後、それぞれの混合物（１８μｌ）をＳＤＡ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質を可視化するためにクーマシーブルーで染色し、あるいは、１μｌのサンプル混合物を負荷し、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０またはアクチンの免疫検出のためにウサギ抗ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０またはウサギ抗アクチンにそれぞれさらした。矢印は６３ｋＤａの結合している複合体形成を示す。レーン１、分子マーカー；レーン２、３、４：タンパク質についてのクーマシーブルー染色；レーン５、６、７：抗ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０を一次抗体として使用する免疫染色；レーン８、９、１０：抗アクチンを一次抗体として使用する免疫染色。レーン２、５、８：アクチン；レーン３、６、９：ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）；レーン４、７、１０：アクチン−ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２複合体。図５Ｂは、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイにおけるｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２のアクチン結合のグラフ表示である。９６マイクロタイタープレートの各ウエルを５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）におけるＧ−アクチン（５００ｎｇ／１００μｌ／ウエル）により１時間被覆し、その後、ＴＢＳにより洗浄した。被覆されたウエルを２００μｌのＴＢＳにおける３％ＢＳＡにより１時間ブロッキング処理し、その後、ＴＢＳにより洗浄した。ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−アクチン結合を、１００μｌのＴＢＳにおける１２５ｎｇ／ウエルのタンパク質から始まる１：２の連続希釈を使用して１時間行った。ウエルをＴＢＳＴにより３回洗浄し、抗体とのインキュベーションを、ポリクローナルウサギ抗ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０抗体（１００μｌ／ウエルのＴＢＳにおいて１：５００、１時間放置後、ＴＢＳＴによる３回の洗浄）、次いで、ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート（１００μｌ／ウエルのＴＢＳにおいて１：１００００、１時間放置後、ＴＢＳＴによる３回の洗浄）を用いて行った。アクチン結合を、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡを使用して検出し、６５５ｎｍにおける吸収を測定した。
【００４０】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、結腸ガンＨＴ２９細胞におけるクローン形成能に対するＲＮＡＳＥＴ２の短縮型形態（それぞれ１μＭ）の影響を示す。図６Ａは、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０、モックの存在下、または、添加タンパク質の非存在下（ＰＢＳ）の培地で培養されたＨＴ２９細胞の結果を例示するヒストグラムである。コロニーの数（コントロールのパーセント）が、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）では、コントロールおよびモックと比較して著しくより低いこと（Ｐ＜０．０１）に留意すること（それぞれの処理についてＮ＝５）。図６Ｂは、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）、コントロールおよびモックの存在下におけるＨＴ２９コロニーの成長を示す顕微鏡写真である。細胞を５日間成長させ、ホルムアルデヒドにおいて固定処理し、メチレンブルーで染色した。
【００４１】
【図７Ａ−７Ｌ】図７Ａ−７Ｌは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）アッセイにおけるインビトロＨＵＶＥＣ管形成に対するヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の影響を例示する写真である。９６ウエルマイクロタイタープレートでのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＨＵＶＥＣ（１４×１０３細胞／ウエル）の管形成を、アンギオゲニン（図７Ａ〜図７Ｄ）、ｂＦＧＦ（図７Ｅ〜図７Ｈ）またはＶＥＧＦ（図７Ｉ〜図７Ｌ）によって誘導した（それぞれ１μｇ／ｍｌ）。加えて、細胞を、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）（図７Ｄ、図７Ｈおよび図７Ｌ）、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）（図７Ｃ、図７Ｇおよび図７Ｋ）またはインサート非含有ベクター抽出物（モック、図７Ｂ、図７Ｆおよび図７Ｊ）（２００μｇ／ｍｌの各タンパク質）、あるいは、ＰＢＳ（コントロール、図７Ａ、図７Ｅおよび図７Ｉ）により処理した。ＰＢＳまたはモックによって処理されたウエルでは、ＨＵＶＥＣ管形成が明白であること、しかしながら、ｈｒｔｒＲＮＡＳＲＥ２−５０（配列番号１４）またはｈｒｔｒＲＮＡＳＲＥ２−７０（配列番号１５）にさらされたウエルでは、管形成が阻害されることに留意すること（それぞれの処理についてＮ＝５）。
【００４２】
【図８Ａ−８Ｏ】図８Ａ−８Ｏは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）アッセイにおけるインビトロＨＵＶＥＣ管形成に対する種々の用量のｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）の影響を例示する写真である。実験を、０．５μＭ（図８Ｄ〜図８Ｆ）、２．５μＭ（図８Ｇ〜図８Ｉ）、５μＭ（図８Ｊ〜図８Ｌ）および１０μＭ（図８Ｍ〜図８Ｏ）の濃度でのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０、ならびに、増殖因子のアンギオゲニン（図８Ａ、図８Ｄ、図８Ｇ、図８Ｊおよび図８Ｍ）、ｂＦＧＦ（図８Ｂ、図８Ｅ、図８Ｈ、図８Ｋおよび図８Ｎ）およびＶＥＧＦ（図８Ｃ、図８Ｆ、図８Ｉ、図８Ｌおよび図８Ｏ）（２００μｇ／ｍｌの各タンパク質）を使用して、図７に記載されるように行った。ＰＢＳをコントロールとして使用した（図８Ａ〜図８Ｃ）。すべての増殖因子において、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０はＨＵＶＥＣ管形成を用量依存的様式で阻害した。アンギオゲニンでは、インビトロ管形成が０．５μＭのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０において阻害された。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦでは、インビトロ阻害が２．５μＭのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０において観測された。
【００４３】
【図９】図９は、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）による腫瘍成長のインビボ阻害を例示するグラフである。ヌードマウスに埋め込まれたＨＴ−２９由来結腸ガン細胞の腫瘍成長に対する５ｍｇ／ｋｇのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０の全身投与の影響を、埋め込み後５週間にわたって測定される相対的腫瘍体積として表した（相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）＝Ｖｉ／Ｖ０、式中、Ｖｉはいずれかの所与時間における腫瘍体積であり、Ｖ０は最初の処置の時における腫瘍体積である）。それぞれの棒が平均の標準誤差を表す。
【００４４】
【図１０Ａ−１０Ｆ】図１０Ａ−１０Ｆは、全身的ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）投与による腫瘍成長のインビボ阻害を例示する組織学的切片の写真である。ＨＴ−２９由来の異種移植片をヌードマウスにおいて成長させ、パラフィンにおいて固定処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンによる染色の後で切片化した。（モック）処理腫瘍（図１０Ｃ、図１０Ｄ）、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）処理腫瘍（図１０Ｅ、図１０Ｆ）。コントロール処理マウス（図１０Ａ）およびインサート非含有ベクター抽出物（モック）処理マウス（図１０Ｃ）において、低倍率の観察により、広範囲の血管形成的成長が付随する、ＨＴ−２９ガン細胞の浸襲性成長の広い領域が明らかにされる。血管の高倍率では、内皮細胞の中に広がるガン細胞が示される（図１０Ｂ、図１０Ｄ）。ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）により全身処置されたマウスにおいて、低倍率の観察（図１０Ｅ）により、壊死性組織によって取り囲まれるクラスターで集まるガン細胞、および、低下した血管形成が明らかにされる。高倍率では、血管から剥離した腫瘍細胞および内皮構造の破壊が示される（図１０Ｆ）。スケールバー＝７５μｍ（図１０Ａ、図１０Ｃ、図１０Ｅ）；１５μｍ（図１０Ｂ、図１０Ｄ、図１０Ｆ）。
【００４５】
【図１１】図１１は、ヌードマウスに埋め込まれたＨＴ−２９由来結腸ガン細胞に対する全身的ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）投与のインビボ影響を示すグラフ表示である。ガン細胞の埋め込みおよび腫瘍の確立の後、マウスに、５ｍｇ／ｋｇのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（黒三角）、インサート非含有ベクター抽出物（モック、黒四角）またはタンパク質非添加（ＰＢＳ、黒丸）を投与した。それぞれの棒が平均の標準誤差を表す。相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）＝Ｖｉ／Ｖ０、式中、Ｖｉはいずれかの所与時間における腫瘍体積であり、Ｖ０は最初の処置の時における腫瘍体積である）（Ｆｕｊｉｉ  Ｔ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ（２００３）、２３：２４０５〜２４１２）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書中に記載される発明は、そのいくつかの実施形態において、抗腫瘍性および抗血管形成性を有する短縮型ヒトＴ２ＲＮａｓｅの効率的な細菌発現の方法に関し、さらに、本発明の組換え短縮型ヒトＴ２ＲＮａｓｅの治療的使用に関する。
【００４７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００４８】
組換えヒトＲＮＡＳＥＴ２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現システムで産生された場合、そのリボヌクレアーゼ活性によって媒介されない著しい腫瘍抑制効果および抗血管形成効果を有することが示されている（国際公開ＷＯ２００６／０３５４３９を参照のこと。これは本明細書によりその全体が組み込まれる）。
【００４９】
発現タンパク質の発現レベルを増大させ、かつ、そのグリコシル化を回避するために、ｈｒＲＮＡＳＥＴ２が大腸菌において発現させられた。
【００５０】
本発明者らは、大腸菌における全長ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子の発現が微量の組換えタンパク質をもたらしたか、または、組換えタンパク質を全くもたらさなかったことを見出した。このことを改善するために、この遺伝子の２つの短縮型、すなわち、Ｇｌｕ５０から始まるＲＮＡＳＥＴ２ペプチド（ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０）（配列番号２）をコードする短縮型、および、Ｍｅｔ７０から始まるＲＮＡＳＥＴ２ペプチド（ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０）（配列番号３）をコードする短縮型を構築し、大腸菌において発現させた（それぞれ、配列番号１４および配列番号１５）。これらの短縮型ヒト組換えＲＮＡＳＥＴ２タンパク質は、Ａ．ｎｉｇｅｒ  Ｂ１真菌のＴ２ＲＮａｓｅおよび全長型の酵母産生されたヒトＲＮＡＳＥＴ２の治療特性およびアクチン結合性を保持していた。
【００５１】
したがって、本発明の１つの局面によれば、単離されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２が提供される。本発明のＲＮＡＳＥＴ２は、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する。
【００５２】
本明細書中で使用される用語「ＲＮＡＳＥＴ２」は、以前には「ＲＮａｓｅ６ＰＩ」または「ヒトＴ２ＲＮａｓｅ」として知られている、ＲＮａｓｅのＴ２ファミリーのヒト型メンバーに関連する。「ＲＮＡＳＥＴ２」（配列番号１）が、ヒトゲノムの６ｑ２７領域に位置するＲＮＡＳＥＴ２遺伝子によってコードされる（Ｃａｍｐｏｍｅｎｏｓｉ他、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ、２００６、４４９：１７〜２６を参照のこと）。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「単離された」は、その通常の生理学的状況から取り出されたタンパク質またはポリペプチドを示す。
【００５４】
本明細書中で使用される用語「短縮型（の）（短縮された／される）」は、いくつかのアミノ酸を欠くＲＮＡＳＥＴ２タンパク質またはＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドを示し、通常的にはポリペプチド鎖の一部分を欠くＲＮＡＳＥＴ２タンパク質またはＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドを示す。短縮型タンパク質は、Ｎ末端領域またはＣ末端領域において、あるいは、それらの間の任意の点（１つまたは複数）において短縮され得る（ポリペプチド鎖の一部分が欠失し得る）。
【００５５】
本発明のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、リボ核酸分解活性がなく、それにもかかわらず、抗血管形成性を保持するＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドをもたらすいずれの領域においても短縮され得る。ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、ポリペプチドの機能的性質と何らかの関わりがあると考えられる４対（合計で８個）のシステイン残基（これらは、アミノ酸座標２５、３２、５２、９８、１６１、１７９、１９０および２０８に位置する）を含むことが認められる。１つの実施形態によれば、本発明のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２はＮ末端側の仮想的なリボヌクレアーゼ触媒作用ドメインにおいて短縮される。別の実施形態によれば、本発明のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１（全長ＲＮＡＳＥＴ２）のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基３２に対応するアミノ酸配列を有しておらず、したがって、アミノ酸座標２５およびアミノ酸座標３２におけるシステイン残基を有していない。なおさらに別の実施形態によれば、本発明のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１（全長ＲＮＡＳＥＴ２）のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基５２に対応するアミノ酸配列を有しておらず、したがって、アミノ酸座標２５、アミノ酸座標３２およびアミノ酸座標５２におけるシステイン残基を有していない。別の実施形態によれば、本発明のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、全長ＲＮＡＳＥＴ２のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基４９に対応するアミノ酸配列を有していない。なおさらに別の実施形態によれば、本発明のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、配列番号１のＮ末端のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６９に対応するアミノ酸配列を有していない。例示的なヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２タンパク質が配列番号２および配列番号３において示される。さらに別の実施形態によれば、本発明のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、認識実体ペプチド（例えば、Ｈｉｓタグ）をポリペプチドのＣ末端またはＮ末端においてさらに含む融合タンパク質である。必要な場合には、別の実施形態において、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２融合タンパク質はさらに、認識実体ペプチドと、ＲＮＡＳＥＴ２アミノ酸配列との間に配置されたペプチドリンカーを含み、例えば、プロテアーゼ切断部位（例えば、エキソキナーゼ切断部位およびトロンビン切断部位など）を含む。認識実体ペプチドおよびプロテアーゼ切断部位リンカーを有する例示的なヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２融合タンパク質が配列番号１４および配列番号１５において示される。
【００５６】
したがって、１つの実施形態において、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する本発明の短縮型ＲＮＡＳＥＴ２タンパク質は、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、好ましくは８８％の相同性、より好ましくは９０％の相同性、さらにより好ましくは９３％の相同性、なおさらにより好ましくは９５％の相同性、さらにより好ましくは９８％の相同性、最も好ましくは１００％の相同性を配列番号２または配列番号３に対して有する。さらにさらなる実施形態において、本発明のＲＮＡＳＥＴ２タンパク質は、配列番号２、配列番号３、配列番号１４および配列番号１５において示される通りである。
【００５７】
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、植物および動物の様々な生物種と同様に、数多くの微生物において同定されており、それらの独特の分子的特徴によって特徴づけられる（Ｔ２ＲＮａｓｅの詳細な総説については、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ他、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００２、２８：７９〜１２２、および、国際公開ＷＯ２００６／０３５４３９を参照のこと。これらは全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。抗血管形成性、抗腫瘍性および抗転移性を有するヒト以外のＴ２ＲＮａｓｅもまた、リボ核酸分解活性を除き、かつ、細菌発現システムおよび他の発現システムにおける組換え発現を高めるために、本明細書中に記載されるように短縮され得ることが理解される。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「血管形成」は、血管のデノボ形成を示し、例えば、脈管形成から生じる血管、同様にまた、既存の血管、毛細血管および細静脈の枝分かれおよび新芽形成から生じる血管などを示す。血管形成を、例えば、組織サンプルの組織学的分析によって、また、典型的な血管形成関連遺伝子（例えば、内皮特異的遺伝子）の発現をモニターすることによって、また、インビトロアッセイ（例えば、本明細書中下記において詳しく記載されるＨＵＶＥ細胞（ＨＵＶＥＣ）−Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）アッセイなど）によって評価することができる。「腫瘍血管形成」は、腫瘍成長に伴う血管の形成を示す。「抗血管形成」は、血管形成プロセスの阻害、低下、防止または制限を示す。
【００５９】
本明細書中で使用される用語「リボ核酸分解活性」は、エンドリボヌクレアーゼ活性およびエキソリボヌクレアーゼ活性の両方を示す。「リボ核酸分解活性がない」短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は、リボヌクレアーゼ活性を本質的に欠いているＲＮＡＳＥＴ２を示すが、微量の残存ＲＮａｓｅ活性がアッセイ時に検出されることがある。
【００６０】
１つの実施形態によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２はアクチン結合活性を有する。さらに別の実施形態によれば、Ｔ２ＲＮａｓｅのアクチン結合活性は熱安定性である。Ｔ２ＲＮａｓｅのいくつかの治療特性がアクチン結合と相関している（国際公開ＷＯ２００６／０３５４３９を参照のこと）。本発明は何らかの理論によって限定されないが、Ｔ２リボヌクレアーゼがアクチンに結合できることにより、そのようなＴ２リボヌクレアーゼは、抗増殖活性、抗血管形成活性および抗腫瘍活性を有することが暗示されるのではないかと考えられる。
【００６１】
アクチン結合を様々なアッセイによって評価することができ、これらには、溶液結合アッセイ（例えば、本明細書中で詳述されるＥＤＣアッセイ）、（本明細書中で詳述されような）ＰＡＧＥ分離およびウエスタンブロッティング、フィルター型アッセイおよびＥＬＩＳＡ型アッセイが含まれるが、これらに限定されない。アクチン結合アッセイキットが、例えば、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ、米国）から市販されている。
【００６２】
ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２タンパク質は、好適な発現ベクターシステムを使用して、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって組換え産生することができる。したがって、１つの実施形態によれば、本発明のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２にはリボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有するヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００６３】
リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有するヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２をコードする例示的なポリヌクレオチドには、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０をコードするポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。したがって、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、好ましくは８８％の相同性、より好ましくは９０％の相同性、さらにより好ましくは９３％の相同性、なおさらにより好ましくは９５％の相同性、さらにより好ましくは９８％の相同性、最も好ましくは１００％の相同性を配列番号４または配列番号５に対して有する。さらにさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号１２または配列番号１３において示される通りである。
【００６４】
従って、用語「ポリヌクレオチド」は、一般に短縮型ＲＮＡＳＥＴ２に関して、あるいはいずれかの特定の短縮型ＲＮＡＳＥＴ２に関して本明細書中で用いる場合、リボ核酸分解活性を欠き、かつ血管形成を予防し、阻害しおよび／または逆行させることにおいて活性なＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドをコードするいずれのポリヌクレオチド配列もいう。
【００６５】
用語「核酸」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および適する場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの模倣体などを示す。この用語はまた、均等物として、ヌクレオチドアナログから作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、ならびに、記載されている実施形態に対して適用可能として、一本鎖（センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを包含することを理解しなければならない。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合のヌクレオシド間（骨格）連結から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような修飾オリゴヌクレオチドまたは置換オリゴヌクレオチドは、多くの場合、望ましい性質（例えば、増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された親和性、および、ヌクレアーゼの存在下での増大した安定性など）のために、天然の形態よりも好ましい。
【００６６】
ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離および配列決定される。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに連結することができ、その後、発現ベクターは細菌宿主細胞にトランスフェクションされる。
【００６７】
ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２をコードするＤＮＡ配列は、どのようなベクターであってもよい、組換えＤＮＡ手順に都合よく供され得る組換えベクターに挿入される。ベクターの選定は、多くの場合、ベクターが導入されることになる宿主細胞に依存する。
【００６８】
１つの実施形態において、発現システムは細菌の異種発現システムである。好適な発現ベクターシステムは、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡにより形質転換される細菌を含む。ベクターの発現制御エレメントは、利用される宿主−ベクターシステムに依存して、その強さおよび仕様が異なる。多数の好適な転写エレメントおよび翻訳エレメントのうちのいずれか１つを使用することができる。
【００６９】
ベクター成分には一般に、下記の１つまたは複数が含まれるが、それらに限定されない：プロモーター、複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、および、転写終結配列。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体の複製に依存しない、染色体外の実体として存在するベクター（例えば、プラスミド）であってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであってもよい。
【００７０】
ベクターは好ましくは、ＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ＤＮＡの転写のために要求されるさらなるセグメントに機能的に連結される発現ベクターである。一般に、発現ベクターはプラスミドＤＮＡまたはウイルスＤＮＡに由来するか、あるいは、両者のエレメントを含有することができる。用語「機能的に連結される」は、セグメントが、それらの意図された目的のために協調して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて始まり、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を介して進行するように配置されることを示す。
【００７１】
組換えタンパク質（すなわち、ＲＮＡＳＥＴ２）を封入体（すなわち、染色可能な物質の核凝集物または細胞質凝集物）として産生することができる細菌宿主が選択される。
【００７２】
本発明の具体的な実施形態によれば、宿主細胞が、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌から選択される。本発明の教示に従って使用することができるグラム陰性細菌の例には、大腸菌、シュードモナス属、エルウィニア属およびセラチア属が含まれるが、これらに限定されない。本教示に従って使用することができるグラム陽性細菌の例には、エンテロコッカス属、メリッソコッカス属、ペプトコッカス属、サッカロコッカス属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属およびバゴコックス属の細菌が含まれるが、これらに限定されない。宿主の選定が、最大の産生物収量を妥当な費用で提供するために、操作費用を考慮して、また、細胞培養密度の最適化とともになされる。
【００７３】
ポリペプチド、プロモーター（例えば、構成的または誘導可能型）、ならびに、必要な場合にはターミネーター、認識実体ペプチドおよび／またはプロテアーゼ切断部位配列をそれぞれコードするＤＮＡ配列を連結するために、また、それらを、複製のために必要な情報を含有する好適なベクターに挿入するために使用される手順が、当業者には広く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）を参照のこと）。プロテアーゼ切断部位を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードする例示的なポリヌクレオチド配列が配列番号１２および配列番号１３において示される。
【００７４】
本発明の教示に従った使用のために好適である細菌発現ベクターの例には、ｐＥＴ（商標）システム、Ｔ７システムおよびｐＢＡＤ（商標）システムが含まれるが、これらに限定されない。これらのシステムはこの技術分野において広く知られている。１つの実施形態において、細菌発現システムがｐＨｉｓ３Ｐａｒａｌｌｅｌであり、これは、Ｈｉｓタグの認識実体ペプチド配列を有する融合タンパク質の発現のために最適化されるｐＥＴ型ベクターである（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ他、Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、１９９９、１５：３４〜３９）。別の実施形態において、プロテアーゼ切断部位配列を、タンパク質精製の後におけるＨｉｓタグ認識配列の除去を容易にするために含むことができる。Ｈｉｓタグの除去における使用のために好適である十分に明らかにされている切断部位を有するプロテアーゼの非限定例には、エンテロキナーゼ（軽鎖、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＭＡ、米国）から入手可能）、トロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ＷＩ、米国）から入手可能）、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ＷＩ、米国）から入手可能）およびタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）（Ｎａｃａｌａｉ  ＵＳＡ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能）が含まれる。必要な場合には、この技術分野では広く知られている溶解性ドメインもまた、組換えタンパク質の回収を助けるために含むことができる。
【００７５】
発現ベクターを細菌宿主細胞に導入する様々な方法がこの技術分野では広く知られており、これらは主として、使用される宿主システムによって決まる。これらには、電気穿孔法、化学的形質転換、接合および形質導入などが含まれるが、これらに限定されない。組換えＤＮＡを、本来的に受容能を有する宿主細胞に形質転換によって容易に導入することができる。
【００７６】
宿主細胞が、多量のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、組換えタンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細菌が、本発明の組換えタンパク質を産生するように培養されるあらゆる培地を示す。そのような培地には典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細菌宿主は、所望される量に応じて、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ板において培養することができる。培養を、組換え宿主のために適切である温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【００７７】
組換え短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の適切な発現レベルが得られると、ポリペプチドが封入体から回収される。組換えタンパク質を細菌の封入体から回収する様々な方法がこの技術分野では広く知られており、典型的には、細菌溶解後の変性剤による可溶化などがある［例えば、Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｅｚ−ＣｌａｒｋおよびＧｅｏｒｇｉｏｕ、「封入体および凝集状態からのタンパク質の回収」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １：１〜２０（１９９１）。同様にまた、下記の実施例の節、実施例Ｉ：「ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号２）およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号３）のクローニング、発現および精製」を参照のこと］。
【００７８】
簡単に記載すると、封入体を、効果的な精製戦略となる簡単な遠心分離法によって細胞質タンパク質の大部分から分離することができる。その後、封入体を、尿素（例えば、８Ｍ）またはグアニジニウム塩酸塩のような強い変性剤によって、また、時には極限状態のｐＨまたは温度で可溶化することができる。変性剤濃度、暴露時間および暴露温度は、それぞれのタンパク質について規格化しなければならない。完全な可溶化の前に、封入体は、混入タンパク質の一部を除くために、変性剤および界面活性剤の希釈液により洗浄することができる。
【００７９】
最後に、可溶化された封入体は、変性剤の除去前または除去後において、クロマトグラフィー技術によるさらなる精製に直接に供することができる。タンパク質の回収、分離および精製のための例示的な方法が本明細書中下記において詳述される。
【００８０】
短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の分離を、ポリペプチドを細菌および培養培地のタンパク質および他の成分から精製するために行うことができる。組換えタンパク質の精製は、例えば、治療用途のためには特に重要であり、望ましい。したがって、１つの実施形態によれば、抗血管形成性を有し、リボ核酸分解活性がないヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の精製された調製物が提供される。本発明のＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドは、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、サイズろ過および示差的可溶化（これらに限定されない）などを使用して精製することができる。１つの実施形態において、短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は認識実体ペプチド配列を含み、精製が、所望される認識実体保有ポリペプチドを、例えば、細菌溶解物のタンパク質から単離するためにアフィニティークロマトグラフィーによって行われる。認識実体ペプチドは必要な場合には、組換えタンパク質のアミノ末端領域またはカルボキシ末端領域のどちらかにおいて操作することができる。有用な認識実体配列には、ポリヒスチジン区画（ＨＨＨＨＨＨ）、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチドおよびビオチンなどが含まれるが、これらに限定されない。組換えタンパク質は、例えば、金属キレート化（例えば、Ｎｉ−アガロース）カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ−セファロースカラムクロマトグラフィーおよびグルタチオン−セファロースカラムクロマトグラフィーを使用する１工程プロセスで容易に精製することができる。Ｎ末端またはＣ末端のシグナル配列および認識実体配列は、プロテアーゼ切断部位を組み込むことによって容易に除くことができる。
【００８１】
したがって、本発明の１つの実施形態によれば、認識実体は、６個〜１０個のヒスチジン残基の連続区域（ＨＨＨＨＨＨ）である。６アミノ酸残基のポリヒスチジン配列は、免疫原性が十分でないことが示されており、また、タンパク質の機能および構造にほとんど影響を及ぼさない。ポリヒスチジン認識実体ペプチドはタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかにおいて操作することができる。したがって、他の実施形態において、認識実体ペプチド配列がＨｉｓタグであり、精製が、本明細書中の実施例Ｉで詳しく記載されるように、ニッケルアフィニティー媒体に対する可逆的なニッケル−ヒスチジン結合によって行われる。認識実体ペプチドを、タンパク質の精製および／または機能研究のために、タンパク質にＣ末端またはＮ末端で融合されるポリヒスチジン残基（いわゆる「Ｈｉｓタグ」）の形態で使用することが記載されている（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８９７２〜８９７６、１９９１；Ｈｏｆｆｍａｎｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９：６３３７〜６３３８、１９９１；欧州特許ＥＰ０２８２０４２）。
【００８２】
１つの実施形態において、精製後、短縮型ＲＮＡＳＥＴ２タンパク質は、無傷である認識実体配列（例えば、Ｈｉｓタグ）を伴ったままであり、融合タンパク質として使用される。別の実施形態において、また、必要な場合には、組換えＲＮＡＳＥＴ２は、認識実体ペプチドに隣接するプロテアーゼ切断部位を含んで発現され、精製後、組換えＲＮＡＳＥＴ２−切断部位−認識実体ペプチドが、認識実体配列を精製された組換えＲＮＡＳＥＴ２から除くために、１つのプロテアーゼまたは種々のプロテアーゼの組合せにより処理される。好適な切断部位がこの技術分野では広く知られており、これらには、エンテロキナーゼ切断部位、トロンビン切断部位、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位が含まれるが、これらに限定されない。組換えタンパク質の発現および精製におけるそのようなプロテアーゼ切断部位の構築および使用はこの技術分野では広く知られている。さらなる実施形態において、認識実体ペプチドが、１つのエキソペプチダーゼまたは種々のエキソペプチダーゼの組合せを使用して除かれ、例えば、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、グルタミンシクロトランスフェラーゼおよびピログルタミルアミノペプチダーゼ（ＴＡＧＺｙｍｅ、Ｑｉａｇｅｎｅ（ＣＡ、米国））などを使用して除かれる。プロテアーゼ切断部位リンカーおよび認識実体ペプチドを有する例示的な短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドが配列番号１４および配列番号１５において示される。
【００８３】
上記の方法論は、抗血管形成活性および抗腫瘍活性を有する高度に精製された先例のない収量の組換えヒトＲＮＡＳＥＴ２を原核生物細胞から得るために効率的である。ＲＮＡＳＥＴ２タンパク質の正確な発現を機能的および構造的に調べることができる。活性をアッセイする様々な方法が下記の実施例の節で詳しく記載される（例えば、ＰＡＧＥ分離、アクチン結合アッセイ、免疫検出、インビトロ血管形成アッセイおよびインビボ血管形成アッセイ、抗原認識）。
【００８４】
本発明の教示は、リボ核酸分解活性がなく、抗血管形成活性を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を、誘導時の細菌培養物の１リットルあたり、少なくとも５０ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも７５ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも１００ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも１２０ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも１５０ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも２００ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも３００ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも５００ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも７５０ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で、場合により少なくとも１０００ｍｇの精製されたヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２分子の収量で提供する。
【００８５】
したがって、本発明の実施形態は、細菌調製残物と、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２とを含む組成物を提供する。細菌調製残物はさらに、この技術分野では広く知られている方法を使用して臨床用途（インビボ）のために除くことができる。
【００８６】
短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、適切な医薬的に許容されるキャリアおよび／または賦形剤の添加とともに、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、閉じ込めまたは凍結乾燥の従来のプロセスによって本発明に従って医薬品を調製するために使用することができ、あるいは、代替において、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、本明細書中上記で記載されるような適切な送達ビヒクルに連結することができる。
【００８７】
本発明を実施に移しているとき、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２が、腫瘍成長、転移増殖および血管形成をインビトロおよびインビボで効果的に阻害することが示された（実施例ＩＩＩ〜実施例ＩＶを参照のこと）。したがって、本発明の短縮型ＲＮＡＳＥＴ２、および、本発明の短縮型ＲＮＡＳＥＴ２を含む組成物は、ガン（例えば、腫瘍の血管形成および転移）、免疫調節、神経変性疾患および炎症性疾患を含めて、運動性に関連づけられる細胞障害を抑制するための治療剤として使用することができる。
【００８８】
したがって、本発明の１つの実施形態によれば、血管形成をその必要性のある対象において阻害する方法が提供される。この方法は、抗血管形成活性を有し、好ましくは、配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９５％相同的であるアミノ酸配列を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２タンパク質を提供することによって達成される。
【００８９】
短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、アクチンに特異的に結合することが示された。アクチンの集合および分解の中断は、細胞の運動性、発達、成長、増殖および再生に影響を及ぼす。したがって、本発明の組成物および方法は、細胞の異常な蓄積によって特徴づけられる状態、症候群または疾患を処置するために使用することができる。細胞の異常な蓄積によって特徴づけられる疾患または状態には、炎症性疾患、神経変性疾患およびガンが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明の組成物および方法は、細胞または組織におけるアクチンフィラメントの集合および分解を阻害するために使用することができ、これは、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２タンパク質（例えば、ＲＮＡＳＥＴ２−５０またはＲＮＡＳＥＴ２−７０、あるいは、抗血管形成活性および抗腫瘍活性を有するその短縮型ホモログ）を細胞または組織に提供することによって達成される。
【００９０】
かくして、本発明は、限定されるものではないが、胆管癌、脳癌、乳癌、頸部癌；絨毛癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；表皮内新生物；リンパ腫；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；メラノーマ；神経芽細胞腫；眼癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫、乳頭腫、神経膠芽細胞腫、カポシ肉腫、扁平細胞癌腫、神経星状細胞腫、頭部癌、首部癌、膀胱癌、結直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌腫、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、関節リウマチ、糖尿病性網膜障害、脈管形成、再狭窄、イン・ステント再狭窄、血管移植片再狭窄、増殖性硝子体網膜障害、慢性炎症性増殖性病、皮膚線維腫および乾癬を含めた悪性癌または非悪性癌等の癌性細胞または他の細胞のごとき異常に増殖する細胞によって特徴付けられる疾患、症候群または疾患を治療するのに用いることができる。
【００９１】
本明細書において、用語「癌」または「腫瘍」は臨床的に記載される用語であり、これらは、異常な細胞増殖を呈する細胞によって特徴付けられる膨大な疾患を含む。用語「腫瘍」は、組織に適用される場合、一般には、過剰かつ異常な細胞増殖に特徴付けられる、いずれの異常な組織成長もいう。腫瘍は「良性」であり得、その元の病巣から拡大できず、または「悪性」または「転移性」であり得、その解剖学的部位を超えて宿主身体全体の他の領域に拡大することができる。腫瘍は、それが発生される器官に存在しかつ転移成長でない「原発性腫瘍」であることができ、またはそれは原発性腫瘍の器官以外の器官で発生する転移腫瘍であることができる。用語「癌」は、一般には、悪性腫瘍、またはそれから生起する疾患状態を記載するのに用いられるより古い用語である。別法として、該用語は新生物としての異常な成長、および悪性新生物としての悪性異常成長をいう。
【００９２】
本発明の短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、ガンを有する危険性がある対象の予防的処置において使用することができる。本明細書中で使用される「ガンを有する危険性がある対象」は、ガンを発症する確率が高い対象である。これらの対象には、例えば、遺伝子異常を有し、その存在が、ガンを発症することのより大きい可能性に対する相関関係を有することが明らかにされている対象、および、ガンの原因となる作用因（例えば、タバコ、アスベストまたは他の化学的毒素など）にさらされる対象、または、以前にガンのために処置されたことがあり、今は見かけ上の寛解状態にある対象が含まれる。ガンを発症する危険性がある対象が本発明のＲＮＡＳＥＴ２にさらされるとき、その対象は、転移性になることから生じるどのようなガンも防止できるかもしれない。
【００９３】
本発明のＲＮＡＳＥＴ２は、対象において炎症に関連する障害を治療および／または予防するのにも有用である。アクチン結合活性を有するＲＮＡＳＥＴ２に暴露された免疫または造血細胞は、移動する能力が低いであろう。かくして、アクチン結合活性を有するＲＮＡＳＥＴ２は、免疫細胞移動に関連した炎症を妨げるのに、ならびに炎症障害および虚血性病を治療し、予防するのに有用である。
【００９４】
炎症障害および虚血症病は、損傷した、あるいはそうでなければ好中球の移動および活性化を誘導してしまった局所組織領域への好中球の移動に関連する炎症によって特徴付けられる。いずれかの特定の理論に拘束されるつもりはないが、負傷の部位への好中球移動に由来する好中球の過剰な蓄積は、周囲の組織を損傷する毒性因子の放出を引き起こすと考えられる。炎症病が急性発作である場合、好中球刺激によってしばしば損傷される組織は脳である。活性な好中球は脳に蓄積するので、梗塞が発症する。
【００９５】
本明細書において、「炎症疾患または状態」は、負傷または感染の部位における局所的炎症によって特徴付けられるいずれの状態もいい、自己免疫疾患、感染性炎症性状態のある種の形態、器官移植または他のインプラントに特徴的な望ましくない好中球活性、および局所組織部位における望まない好中球蓄積において特徴付けられる実質的にいずれの他の状態も含む。これらの状態としては、限定されるものではないが、髄膜炎、大脳浮腫、関節炎、腎炎、成人呼吸逼迫症候群、膵臓炎、筋炎、神経炎、結合組織病、静脈炎、動脈炎、血管炎、アレルギー、アナフィラキシー、エールリヒア症、痛風、器官移植および／または潰瘍性結腸炎が挙げられる。
【００９６】
本明細書において「虚血性の疾患または状態」とは、心筋または脳梗塞で見られるように、組織へ血液を供給することを担う血管のブロックまたは出血による、組織への血液供給の中断に由来する局所的炎症によって特徴付けられる疾患をいう。脳虚血性発作または脳虚血症は、脳への血液供給がブロックされた虚血性疾患の形態である。脳への血液供給のこの中断は、血管それ自体の固有のブロックまたは閉塞、閉塞の遠くで由来する源、不適切な大脳血流をもたらす減少した灌流圧もしくは増加した血液粘度、またはクモ膜下空間もしくは大脳内組織における破裂した血管を含めた、種々の原因に由来し得る。
【００９７】
本発明のいくつかの態様において、本発明のＲＮＡＳＥＴ２は、バリアーを横切っての腫瘍細胞の移動を妨げるのに十分な量で供される。癌の侵入および転移は、形質転換された細胞が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を通って侵入し、移動し、そして繋留−独立性成長特性を獲得するのを可能とする細胞接着特性の変化を含む複雑なプロセスである（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  １９９１  ６４；３２７−３３６）。これらの変化のいくつかは、膜関連細胞骨格、および細胞内シグナリング分子を含有する細胞／ＥＣＭ接触点である病巣接着において起こる。転移性疾患は、腫瘍細胞の播種性病巣が、それらの成長および繁殖を支える組織に播かれた場合に起こり、腫瘍細胞のこの第２の拡大は、癌の大部分に関連する罹病率および死亡率を担う。かくして、本明細書で用いる用語「転移」とは、原発性腫瘍部位から離れた腫瘍細胞の侵入および移動をいう。
【００９８】
さらに別の実施形態では、本発明のＲＮＡＳＥＴ２またはそれをコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、バリアーを横切るそれらの能力のテストにおいて、細胞運動性の阻害に対する感受性について細胞をアッセイすることができる。好ましくは、腫瘍細胞はバリアーを横切ることが妨げられる。腫瘍細胞に対するバリアーは、イン・ビトロ人工バリアー、またはイン・ビボ天然バリアーであり得る。イン・ビトロバリアーとして、限定されるものではないが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）等の細胞外マトリックス被覆膜が挙げられる。かくして、ＲＮＡＳＥＴ２を細胞に供することができ、該細胞は、次いで、Ｍａｔｒｉｇｅｌ侵入アッセイシステムにおいて腫瘍細胞侵入を阻害するそれらの能力についてテストすることができる。転移についての他のイン・ビトロおよびイン・ビボアッセイは、先行技術に記載されている。例えば、ここに引用して援用する、米国特許第５９３５８５０号参照。イン・ビボバリアーとは、対象の身体に存在する細胞バリアーをいう。
【００９９】
本発明の一態様による短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、それ自体、あるいはそれが適当な担体または賦形剤と混合された医薬組成物において、ヒトまたはいずれかの他の哺乳動物等の生物に投与することができる。
【０１００】
本明細書中で使用される「医薬組成物」または「医薬」は、本明細書中に記載される短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２リボヌクレアーゼの１以上と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、治療される対象に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１０１】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１０２】
医薬組成物はまた、限定されない、炎症性薬剤、抗菌剤、麻酔、癌治療剤などの１以上のさらなる有効成分を、主要な有効成分に加えて含むことができる。本発明の組成物と一緒に使用するのに好適な一般的に使用される追加の薬剤の詳細な説明は、以下に示される。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、当該分野でよく知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１０４】
本発明に従って使用するための医薬組成物は有効成分を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む一つ以上の生理学的に許容される担体を使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。
【０１０５】
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼの有意な治療効果は、異常な細胞増殖および蓄積血管形成、転移増殖および腫瘍成長の多様なモデル（ここに完全に引用して援用するＷＯ２００６／０３５４３９参照）において、広く種々の投与手段を用いて明らかにされた。ＲＮａｓｅの迅速な全身摂取および分配をもたらす腹腔内投与は、ヌードマウスにおける皮下腫瘍および腹腔内腫瘍において、腫瘍成長および発生を抑制するにおいて効果的であることが判明した。Ｔ２  ＲＮａｓｅのなおより迅速な全身摂取をもたらす静脈内投与もまた、皮下異種移植片（以下の実施例ＩＶ参照）、および静脈内腫瘍の遠隔（肺）転移拡大を抑制し、治療するにおいて効果的なことが判明した。Ｔ２  ＲＮａｓｅでの細胞の直接的投与、およびプレインキュベーションは、乳房癌腫、大腸癌腫、メラノーマ、イン・ビボでの脈管形成因子誘導脈管形成および微小血管密度、およびイン・ビトロでの植物およびヒトＨＵＶＥ細胞双方における細胞管形成での腫瘍成長の防止において効果的なことが判明した。Ｔ２  ＲＮａｓｅの経口投与は、マイクロカプセルの形態では、結腸腫瘍（ＤＭＨモデル）誘導において初期に投与した場合、腫瘍成長、増殖、腫瘍サイズ、腫瘍血管形成および異常な陰窩病巣の数を低下させるのに効果的なことが判明した。既によく発生した腫瘍を保有する動物へのＴ２  ＲＮａｓｅの同様な経口投与は、消化プロセスおよび腸内送達されたと推定される低用量へのＲＮａｓｅの暴露にかかわらず、ラットにおける結腸癌腫瘍の血管形成および悪性の度合いを低下させた。組成物の効果的な腸放出をもたらすカプセル化方法は当該分野で良く知られており、それの使用は、既に確立された腫瘍の場合には短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２の経口投与の有効性を増加させると予測されることが認識されよう。
【０１０６】
かくして、投与を行うためには、本発明の医薬組成物は適当な医薬担体、および有効量の抗血管形成活性を有する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を含み、例えば、局所、眼内、非経口、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、または当該分野で良く知られた方法を介するいずれかの他の効果的な手段によって投与される。
【０１０７】
静脈内、筋肉内または皮下注射のためには、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、水性溶液、好ましくは、ハンクスの溶液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液等の生理学的に適合する緩衝液中に処方することができる。例えば、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２の有効量を含有する生理学的に適当な溶液を血液循環中に全身投与して、直接的に到達または解剖学的に摘出することができない癌または腫瘍を治療することができる。有効量の短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を含有する生理学的に適当な溶液は、標的組織の腫瘍細胞を治療するのに有効な量にて針によって標的癌または腫瘍組織に直接的に注射することができる。
【０１０８】
経粘膜投与の場合、浸透される障壁に適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤は当該分野では一般に知られている。
【０１０９】
経口投与の場合、本発明の医薬組成物は、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を、当該分野でよく知られている医薬上許容される担体と組み合わせることによって容易に配合することができる。そのような担体により、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーである。所望する場合には、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１１０】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１１１】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟密閉カプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を含有し得る。軟カプセルでは、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０１１２】
本発明の医薬組成物の経口送達は、胃腸管に存在するｐＨおよび酵素分解のため、成功しないであろう。かくして、そのような医薬組成物は、望ましくない環境を回避するように処方されなければならない。例えば、腸溶コーティングを経口固体処方に適用することができる。セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）およびアクリル樹脂等の酸性耐性特性を持つ物質は、ミクロカプセル化のための錠剤または顆粒をコーティングするのに最も一般に用いられる。好ましくは、湿式造粒を用いて腸溶被覆顆粒を調製し、有効成分およびコーティングの間の反応を回避する（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．およびＫａｗａｓｈｉｍａ，Ｙ．１９８７，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．４：７０−７４）。溶媒蒸発方法を用いることもできる。溶媒蒸発方法を用いて、糖尿病ラットに投与されるインスリンをカプセル化し、血中グルコース濃度を維持した（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、１９８６，Ｂｉｏｍａｔｅｒ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｄｅｖｉｃｅ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎ  １３：１８７−２０１およびＬｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎ  １６：８１５−８２８）。また、それを用いて、ウイルス抗原およびコンカナバリンＡ等の高分子量の生体物質をカプセル化した（Ｍａｈａｒａｊ，Ｉ．ら、１９８４，Ｊ．Ｐｈａｍａｃ．Ｓｃｉ．７３：３９−４２）。
【０１１３】
口内投与の場合、１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１１４】
吸入による投与の場合、本発明の１つの実施形態に従って使用される短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器で使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１１５】
別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物はまた、非経口投与、例えばボーラス注射または連続点滴のために配合されることができる。注射のための組成物は、単位用量形態（例えばアンプルまたは多用量コンテナ）で提供されることができ、これらには所望により保存剤が添加されている。組成物は懸濁物、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルションであることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤の如き配合剤を含むことができる。
【０１１６】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態における活性な調製物の水溶液が含まれる。さらに、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２の懸濁物を、適切なオイル状注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有し得る。場合により、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。
【０１１７】
あるいは、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にする。
【０１１８】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１１９】
加えて、目、胃腸管、生殖泌尿器系管（例えば、泌尿器系膀胱）、肺および気管支系等のような、体腔に存在する癌または腫瘍は、針での直接的注射を介して、あるいは癌または腫瘍に罹患した中空器官に入れられたカテーテルまたは他の送達チューブを介して、有効量の短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を含有する生理学的に適当な組成物（例えば、滅菌された、生理食塩水またはリン酸緩衝液、懸濁液、またはエマルジョン等の溶液）を受けることができる。Ｘ線、ソノグラム、またはファイバー光学可視化システムの等のいずれかの効果的なイメージングデバイスを用いて、標的組織を突き止め、それに近接する針またはカテーテルチューブをガイドすることができる。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は浸透圧ミクロポンプによって送達することもできる。浸透圧ミクロポンプは体腔の１つに移植し、薬物は治療すべき組織に一定に放出される。この方法は、医薬組成物に対する免疫応答が経験された場合に特に有利である。この方法は、ＯＮＣＯＮＡＳＥで用いられてきた（Ｖａｓａｎｄａｎｉ  Ｖ．Ｍ．ら、１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５；５６（１８）：４１８０−６）。
【０１２１】
別法として、かつ本発明のさらに別の好ましい実施形態によると、医薬上許容される担体は、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を対象の哺乳動物細胞に送達することができる送達ビヒクルを含む。
【０１２２】
蛋白質または核酸を腫瘍または癌細胞へ、またはその上へ標的化するための多数の送達ビヒクルおよび方法は当該分野で公知である。例えば、リポソームは、蛋白質または核酸を標的細胞へ送達するのに利用できる人工膜小胞である（Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．およびＨｕｅｓｔｉｓ，Ｗ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，２７：４６５５−４６５９；Ｔａｎｓｗｅｌｌ，Ａ．Ｋ．ら、１９９０，Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１０４４：２６９−２７４；ならびにＣｅｃｃｏｌｌ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１９８９，９３：１９０−１９４）。かくして、Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、リポソーム小胞で高い効率にてカプセル化し、哺乳動物細胞に送達することができる。加えて、Ｔ２−ＲＮａｓｅ蛋白質または核酸を、例えば、ここに引用して援用するＬｅｅに対する米国特許第５９２５６２８号に記載されたように、ミセルを介して腫瘍または癌細胞を標的化するように送達することもできる。
【０１２３】
短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をカプセル化したリポソームまたはミセルは、標的組織の異常に増殖する細胞を治療するのに有効な用量で、局所、眼内、非経口、鼻腔内、気管内、気管支内、筋肉内、皮下、またはいずれかの他の効果的な手段によって投与することができる。リポソームは、有効量のカプセル化された短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を含有するいずれかの生理学的に適当な組成物にて投与することができる。
【０１２４】
別法として、かつ本発明のさらに別の好ましい実施形態によると、送達ビヒクルは、限定されるものではないが、特異的細胞受容体またはマーカーに結合することができる抗体またはリガンドであり得る。抗体またはリガンドは適当なリンカーを介して短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２蛋白質に直接的に連結させることができ、あるいは別法として、そのような抗体またはリガンドは、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をカプセル化するリポソームの表面に供することができる。
【０１２５】
例えば、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２は、当該分野で従前に記載されたように、特異的組織または細胞に標的化するために特異的膜蛋白質抗体またはリガンドと融合させることができる。この点に関し、リボヌクレアーゼＡスーパーファミリーのＲＮａｓｅと、トランスフェリン受容体に対する、またはＴ細胞抗原ＣＤ５に対する抗体との融合は、前記トキシンの各々に対する特異的受容体を保有する腫瘍細胞における蛋白質合成の阻害をもたらすことが認識される（Ｒｙｄａｋ，Ｍ．ら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１２０２−２１２０７およびＮｅｗｔｏｎ  ＤＬ，ら、１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０（４）：４６３−７０）。
【０１２６】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果がある量は、処置されている対象の疾患の症状を防止、軽減または改善するために、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分の量を意味する。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１２８】
治療効果がある量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の範囲内である。
【０１２９】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法、例えば、対象の有効成分に対するＩＣ５０およびＬＣ５０（試験された動物の５０％における死亡を引き起こす致死量）を決定することによって、明らかにすることができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”（第１章、１頁）を参照のこと）。
【０１３０】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は徐放性組成物の単回投与が可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、治癒が達成されるまで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１３１】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。
【０１３２】
本発明のさらに別の態様によると、癌の治療的措置を増強する方法が提供される。該方法は、治療的措置と組み合わせて、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２を、それを必要とする対象に投与することによって行われる。さらなる治療方法または組成物との短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２のそのような相乗活性は、そのような治療の有効臨床用量を大幅に低下させる能力を有し、それにより、しばしば破壊的な負の副作用および治療の高いコストを低下させることが認識されよう。
【０１３３】
本発明の短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２との組み合わせに適した癌の治療のための治療的養生法として、限定されるものではないが、化学療法、放射線療法、光療法および光動的療法、外科的処置、栄養療法、切除療法、組み合わせた放射線療法および化学療法、近接照射療法、プロトンビーム療法、免疫療法、細胞療法およびフォトンビーム放射線外科的療法が挙げられる。
【０１３４】
本発明の化合物と共投与することができる抗癌薬物として、限定されるものではないが、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタニン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビスアントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴル；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸；ドロモスタノロンプロピオン酸塩；ドゥアゾマイシン；エダトレキセート；エフロルニチン塩酸塩；エルサニトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾル；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イフォスファミド；イルモフォシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアゾゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸塩；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ニチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスペール；マイトタン；マイトキサントロン塩酸塩；ニコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィメールナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌール；タリソマイシン；タキソール；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフイリン；チラパザミン；トポテカン塩酸塩；トレミフエンクエン酸；トレストロン酢酸塩；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロン酸塩；トリプトレシン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ベロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩が挙げられる。さらなる抗新生物剤として、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｈｅａｌｔｈ  Ｂｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）のＣｈａｐｔｅｒ  ５２，Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  ＣａｌａｂｒｅｓｉおよびＢｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）、およびそれに対する緒言、１２０２−１２６３に開示されたものが挙げられる。
【０１３５】
本発明のＴ２  ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる抗炎症薬物として、限定されるものではないが、アルクロフェナック；アルクロメタゾンジプロピオン酸塩；アルゲストンアセトニド；アルファアミラーゼ；アムシナファール；アムシナフィド；アムフェナックナトリウム；アミプリローズ塩酸塩；アナキンラ；アニロラック；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；ベンジダミン塩酸塩；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；クロベタゾールプロピオン酸塩；クロベタゾン酪酸塩；クロピラック；クロチカゾンプロピオン酸塩；コルメタゾン酢酸塩；コルトドキソン；デフラザコルト；デソニド；デソキシメタゾン；デキサメタゾン二プロピオン酸塩；ジクロフェナックカリウム；ジクロフェナックナトリウム；ジフロラゾン二酢酸塩；ジフルミドンナトリウム；ジフルニザール；ジフルプレドネート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリゾン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラック；エトフェナメート；フェルビナック；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナック；フェンクロラック；フェンドザール；フェンピパロン；フェンチアザック；フラザロン；フルアザコルト；フルフェナム酸；フルミゾール；フルニゾリド酢酸塩；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；フルオロメトロン酢酸塩；フルクアゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；フルチカゾンプロピオン酸塩；フラプロフェン；フルブフェン；ハルシノニド；ハロベタゾールプロピオン酸塩；ハロプレドン酢酸塩；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；ヨードプロフェン；インドキソール；イントラゾール；イソフルプレドン酢酸塩；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；ロフェミゾール塩酸塩；ロモキシカム；ロテプレドノールエタボネート；メクロフェナメートナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリゾン二酪酸塩；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニゾロンスレプタネート；モミフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；パラニリン塩酸塩；ペントザンポリサルフェートナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセレート；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカムシンナメート；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナゼート；プリフェロン；プロドリン酸；プロカゾン；プロキサゾール；プロキサゾールクエン酸塩；リメキソロン；ロマザリット；サルコレックス；サルナセジン；サルサレート；サンギナリウム塩化物；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダック；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシ���ム；テシミド；テトリダミン；チオピナック；チキソコルトールピバリン酸塩；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミデート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウムが挙げられる。
【０１３６】
本発明のさらに別の実施形態では、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２での遺伝子治療が考えられる。本発明のこの態様によると、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードするポリヌクレオチドは医薬上許容される担体と共に哺乳動物細胞に導入され、その導入の結果、この細胞は遺伝子的に修飾され、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２のそこでの発現が可能となる。
【０１３７】
最近、Ａｃｑｕａｔｉらは、ＨＥＹ４およびＳＧ１０Ｇ卵巣腫瘍細胞系へのＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ｃＤＮＡのトランスフェクションはヌードマウスにおいて腫瘍形成性を抑制し、さらに、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた、ＨＥＹ４クローン、および色素性乾皮症ＤＶ４０−不死化細胞系のクローンは、イン・ビトロでの成長の間に顕著な老化プロセスを発生することを示しており（Ａｑｕａｔｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００１  ２２；２０（８）：９８０−８）、かくして、Ｔ２  ＲＮａｓｅでのそのような遺伝的修飾の実現可能性を示す。
【０１３８】
本明細書中、および後の請求の範囲のセクションにおいて、用語「遺伝的修飾」とは、核酸を細胞に挿入するプロセスをいう。該挿入は、例えば、ウイルス感染、注入、トランスフェクション、粒子衝撃、あるいは核酸を細胞に導入するにおいて効果的ないずれかの他の手段によって行うことができ、そのうちいくつかは後にさらに詳細する。遺伝的修飾に続き、核酸は全てが、または部分的に細胞のゲノム（ＤＮＡ）に組み込まれるか、あるいは細胞のゲノムに対して外部に留まり、それにより、安定に修飾された、または一過的に修飾された細胞を供する。
【０１３９】
本明細書において、用語「遺伝子治療」または「遺伝的治療」は相互交換的に用いられ、癌細胞等の増殖性細胞の安定なまたは一過的な遺伝的修飾がこの細胞の増殖の阻害をもたらす療法の方法をいう。短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号４、５、１２および１３）はいずれも、本発明に従って、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードするポリヌクレオチドとして使用することができる。加えて、配列番号４、５、１２および１３に対して相同であるポリヌクレオチドも、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードするポリヌクレオチドとして使用することができ、但し、それによりコードされる蛋白質は短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２として特徴付けられ、所望の抗血管形成活性を呈するものとする。さらに、そのようなポリヌクレオチドの部分、突然変異体キメラまたは対立遺伝子もまた、本発明の一実施形態による短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードするポリヌクレオチドとして使用することもできることが認識され、また、但し、そのようなポリヌクレオチドのそのような部分、突然変異体キメラまたは対立遺伝子は、所望の活性を呈する短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードするものとする。
【０１４０】
別の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドは、当該分野で良く知られた方法を用い、ポリペプチドをコードするいずれかの他の蛋白質にイン・フレームで融合させて、融合された蛋白質をコードさせることができる。一つの実施形態では、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードするポリヌクレオチドは、認識実体ペプチド（例えばＨｉｓタグ）をコードするポリヌクレオチドに融合される。なおさらなる実施形態では、プロテアーゼ切断部位（例えばＴＥＶ切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、トロンビン切断部位など）をコードする任意のポリヌクレオチド配列が、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をコードするポリヌクレオチドと認識実体ペプチドをコードするポリヌクレオチドとの間に挿入され、ＲＮＡＳＥＴ２−切断部位−認識実体ペプチドの融合タンパク質をコードする。切断部位および認識実体配列は、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されることができる。
【０１４１】
短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２蛋白質は、当該分野で良く知られた方法を用い、他の蛋白質に融合（結合）させることができる。多くの方法は、蛋白質を含め、異なるタイプの分子を結合させる、または縮合（カップリング）させることが当該分野で知られている。これらの方法は本発明に従って用い、短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２をリガンドまたは抗体等の他の分子にカップリングさせ、それにより、特異的細胞型へのＴ２−ＲＮａｓｅの標的化および結合を助けることができる。蛋白質のいずれかの対を、当業者に知られたいずれかの結合方法を用い、一緒に結合または融合させることができる。蛋白質は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルとも呼ばれる）（「ＳＤＰＤ」）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ−３４１５）、グルタルアルデヒド結合手法、またはカルボジイミド結合手法を用いて結合することができる。
【０１４２】
腫瘍または癌細胞の遺伝子治療で用いられる哺乳動物宿主細胞に適合する発現ベクターとして、限定されるものではないが、例えば、米国特許第５１７４９９３号によって開示された、プラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、および非複製アビポックスウイルスが挙げられる。
【０１４３】
いくつかの方法を用いて、本発明のこの態様による発現ベクターを標的哺乳動物細胞に送達することができる。
【０１４４】
本発明のさらに別の局面によれば、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２と特異的に結合することができる抗ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２抗体が提供される。好ましくは、抗体は、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原表面のいずれかの抗原性決定基を示す。
【０１４５】
エピトープ決定基は通常、分子の化学的に活性な表面グループ化（例えば、アミノ酸または炭水化物側鎖など）からなり、通常、特異的な三次元構造特徴、ならびに、特異的な電荷特徴を有する。
【０１４６】
本発明で使用される用語「抗体」は、無傷の分子並びにその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを意味する。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（ｉ）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（ｉｉ）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（ｉｉｉ）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（ｉｖ）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；そして（ｖ）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である。
【０１４７】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに、そのフラグメントを産生する様々な方法がこの技術分野では広く知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。１つの実施形態において、抗ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２抗体は、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０全体またはｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０全体に対してウサギにおいて惹起されるポリクローナル抗体である。
【０１４８】
ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２、および、ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２を含む組成物（例えば、医薬組成物）は、診断用途および治療用途において使用することができ、また、そのようなものとして、治療キットまたは診断キットにおいて含むことができる。
【０１４９】
したがって、本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分（すなわち、ヒト短縮型ヒトＲＮＡＳＥＴ２）を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含むことができる（例えば、限定されないが、ブリスターパックまたは加圧容器（吸入用）など）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の化合物を含む組成物もまた、上で詳述されたように、示された状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１５０】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１５１】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【０１５２】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１５３】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１５４】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１５５】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１５６】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５７】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０１５８】
用語「任意選択的」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０１５９】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１６０】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１６１】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１６２】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌ���ｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１，２，３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１６３】
（実施例Ｉ）
ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号２）およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号３）のクローニング、発現および精製
構築物：ヒトＲＮＡＳＥＴ２遺伝子を、ＲＮＡＳＥＴ２の短縮型形態のためのＤＮＡテンプレートとして使用するためにＧＥＮＥＡＲＴによって合成し、大腸菌のために最適化した（配列番号１１）。ＲＮＡＳＥＴ２−５０コード配列の短縮型形態（ｃｙｓ６  ５７３ｂｐ、配列番号４）、および、ＲＮＡＳＥＴ２−７０コード配列の短縮型形態（ｃｙｓ５  ５１３ｂｐ、配列番号５）を、ｐＨｉｓ３Ｐａｒａｌｌｅｌのための好適なプライマーを用いてＰＣＲによって、そして、Ｈｉｓタグと、ＲＮＡＳＥＴ２配列との間に挿入されるエンテロキナーゼ切断部位をコードするリンカー配列を含むことによって構築した：
ＲＮＡＳＥＴ２−５０フォワード：
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＡＡＴＧＣＧＣＧＣＧＴＡＴＴＧＧＣＣＧＧＡＴＧ−３’（配列番号７）および
リバース：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧ−３’（配列番号８）
ＲＮＡＳＥＴ２−７０フォワード：
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＡＴＣＧＴＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＴＣ−３’（配列番号９）および
リバース：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧ−３’（配列番号１０）。
【０１６４】
ＰＣＲミックスは、１０ｎｇのＤＮＡテンプレート、ｄＮＴＰミックス（０．２ｍＭの各ヌクレオチド）、０．４ｐｍｏｌの各プライマー、１ユニットのＩｍａｘ  Ｔａｑポリメラーゼ、５μｌの１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、および、５０μｌの最終体積にするための２回蒸留Ｈ２Ｏを含有した。ＰＣＲを下記の条件のもとで行った：９４℃での２分間の変性、９４℃での１０秒間の変性、５８℃での５秒間のアニーリング、７２℃での２０秒間の伸長からなる３５サイクル、その後、７２℃での４分間の伸張、および、１０℃での１０分間の終結。５７３ｂｐおよび５１３ｂｐの得られた増幅フラグメントを、配列決定、ならびに、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０の翻訳によってそれぞれ確認した（図１）。
【０１６５】
形質転換：上記ＰＣＲフラグメントを、制限酵素としてＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを使用してｐＨｉｓ３Ｐａｒａｌｌｅｌベクター（図２Ｂを参照のこと、配列番号６）に連結し、増幅のために大腸菌ＤＨ５αにサブクローニングした。タンパク質発現のために、上記インサートのそれぞれを含有するベクターを、同じ手順を使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングした（図２）。インサート非含有の「モック」では、インサートを含まない同じｐＨｉｓ３Ｐａｒａｌｌｅｌベクターが使用され、これを大腸菌ＤＨ５αにおいて増幅し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【０１６６】
細菌培養：
タンパク質発現のために、形質転換された細菌を、０．６〜１のＯＤが得られるまで（２時間〜３時間）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培養液において、３７℃、２５０ＲＰＭで成長させた。組換えタンパク質の発現を１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導し、上記条件でのインキュベーションを４時間続けた。
【０１６７】
ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２の回収、抽出および精製：
細菌細胞を、１００００ｇで１０分間、遠心分離した。ペレットを使用まで−８０℃で保った。その後、ペレットを、２ｍｇ／ｍｌの完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を含有する溶解緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩緩衝液、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、４℃で２時間撹拌することによって、細胞を溶解した。細胞破片を４℃における１２０００ｇでの５０分間の遠心分離によって除き、上清を０．２μｍのフィルターでろ過した。
【０１６８】
組換え短縮型タンパク質を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ＋ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して精製した。溶解された細菌ペレットを、５ｍｌ／分の流速で、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ  Ｎｉカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷し、平衡化緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１ＭのＮａＣｌ、８Ｍの尿素および５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）における５ｍＭ〜５００ｍＭのイミダゾールグラジエントにより溶出した。Ｈｉｓタグ配列およびエンテロキナーゼ切断配列が精製タンパク質において無傷のままであった。ピーク領域からの回収された分画物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１６９】
結果：
完全なＲＮＡＳＥＴ２配列（Ｋｕｒｉｈａｒａ他、１９９２、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ、３０６（２，３）：１８９〜１９２；Ｍａｔｓｕｕｒａ他、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６（４８）：４５２６１〜９）における４つのジスルフィド結合を形成する８個のシステイン残基のうち、短縮型のｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号２）およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号３）は６個および５個のシステイン残基をそれぞれ含有した（図１）。
【０１７０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、細菌溶解物から得られるｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）が、短縮部分を欠く全長のヒトＲＮＡＳＥＴ２の移動に対応する１９ｋＤａおよび２１ｋＤａでそれぞれ移動したことが示された（図３）。インサート非含有ベクター（モック）を含有する細菌から得られる溶解物は短縮型形態のどちらも含有しなかった。全長のヒトＲＮＡＳＥＴ２により形質転換された細菌から得られる溶解物は、ヒトＲＮＡＳＥＴ２、または、ヒトＲＮＡＳＥＴ２に対応する著量のタンパク質のどちらも含有しなかった（結果は示されず）。
【０１７１】
細菌溶解物（それぞれの短縮型タンパク質またはモックに由来する１２００ｍｌの最初の培養物から得られる３００ｍｌの溶解物）をＨｉｓＴｒａｐ（商標）アフィニティーカラムに負荷し、イミダゾールグラジエント（５ｍＭ〜５００ｍＭ）により溶出した。溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）の両方の高純度精製（＞９８％）（図４）が得られたことが示された。精製されたｈｒｔｒＲＮＡＳＥの収量が、精製された組換えタンパク質の凍結乾燥の後で測定されたとき、１リットルの細菌培養物あたり１００ｍｇ〜２００ｍｇのタンパク質の範囲であり、典型的には１リットルの細菌培養物あたり１２０ｍｇであった。したがって、ヒトＲＮＡＳＥＴ２の短縮型形態をコードする構築物は細菌に正確かつ効率的に形質転換され、発現され、これにより、高収量の組換えＲＮＡＳＥＴ２タンパク質を生じさせることができる。
【０１７２】
（実施例ＩＩ）
ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２はアクチンと効率よく結合する
精製されたヒト組換え短縮型ＲＮＡＳＥＴ２−５０のアクチン結合活性を下記のように調べた。
【０１７３】
アクチン結合アッセイ：
Ａ．溶液アクチン結合アッセイ：溶液アクチン結合アッセイは以前に記載される通りであった（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００６／０３５４３９；Ｓｍｉｒｎｏｆｆ他、２００６、Ｃａｎｃｅｒ、１０７（１２）、２７６０〜２７６９）。アクチン（１０μｇ）を、１０μｇの精製されたｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０および２０μＬの緩衝液Ｇ（２ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭのＣａＣｌ、０．２ｍＭのＡＴＰ）と混合した。混合物を室温で３０分間インキュベーションし、その後、架橋剤の１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボイミドメチオジド（ＥＤＣ）を５０ｍＭの最終濃度に加え、さらに３０分間インキュベーションした。反応を等体積のサンプル緩衝液により停止させ、架橋された複合体を、上記で記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。それぞれの反応混合物から、１８μｌ（９μｇの各タンパク質）のサンプルを分離し、タンパク質を可視化するためにクーマシーブルーで染色し、また、１μｌの２つのサンプル（２５０ｎｇの各タンパク質）を、ウサギ抗ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（ポリクローナルウサギ抗ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０がＡｎｉｌａｂ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）において調製された）、あるいは、ＲＮＡＳＥＴ２またはアクチンの免疫検出のためのウサギ抗アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．；カタログＡ２０６６）にそれぞれさらした。ブロッティング後のメンブランを、０．２５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳＴ）における５％（重量／体積）のスキムミルクにより４℃で一晩ブロッキング処理し、そして、ＴＢＳＴによりそれぞれ１０分間、２回洗浄した。その後、メンブランを、ポリクローナルウサギ抗ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（ＴＢＳにおける１：１０００の希釈）またはウサギ抗アクチン−ＩｇＧ（ＴＢＳにける１２μｇ／ｍｌ）に対して１時間半それぞれプローブし、そして、ＴＢＳにおける５μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ；カタログＡＰ１３２Ａ）に対して室温で１時間反応させた。シグナルを、１．７ｍｇのＢＣＩＰ（５−ブロモ−４  クロロ−３−インドリルホスファートｐ−トルイジン塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．；カタログＢ８５０３）および４．１ｍｇのＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．；カタログＮ６８７６）を基質として含有するアルカリホスファターゼ用の１０ｍｌの発色緩衝液（ｐＨ９．５）との暗条件での５分間のインキュベーションによって検出した。
【０１７４】
Ｂ．固相アクチン結合アッセイ：固相アクチン結合アッセイはＭｅｊｅａｎ他（１９８７；１９９２）からの改変である。簡単に記載すると、９６マイクロタイタープレートの各ウエルを５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）におけるＧ−アクチン（５００ｎｇ／１００μｌ／ウエル）により１時間被覆し、その後、ＴＢＳにより洗浄した。被覆されたウエルを２００μｌのＴＢＳにおける３％ＢＳＡにより１時間ブロッキング処理し、その後、ＴＢＳにより洗浄した。ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２結合を、１２５ｎｇ／ウエルのタンパク質から出発する１：２の連続希釈物を使用して行った。結合を１００μｌのＴＢＳにおいて１時間行った。ウエルをＴＢＳＴにより３回洗浄し、ウサギ抗ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０一次抗体とインキュベーションし（１００μｌ／ウエルのＴＢＳにおいて１：５００、１時間放置後、ＴＢＳＴによる３回の洗浄）、その後、コンジュゲート化ヤギ抗ウサギＨＲＰ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）とインキュベーションした（１００μｌ／ウエルのＴＢＳにおいて１：１００００、１時間放置後、ＴＢＳＴによる３回の洗浄）。アクチン結合が、６５５ｎｍにおける吸収を、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して検出することによって明らかにされた。
【０１７５】
結果
ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２のアクチン結合。図５Ａに示されるように、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０は、溶液アッセイにおけるアクチンに対する強い特異的な結合を明らかにした。ＥＤＣによる架橋およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの分離の後、分離されたタンパク質のクーマシー染色では、アクチンに対する短縮型ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０の高結合活性が明らかにされた（図５、レーン４を参照のこと）。架橋された反応生成物の、抗アクチンおよび抗ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２による免疫検出でもまた、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０によるアクチン結合が確認された（図５Ａ、レーン７およびレーン１０）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色および免疫染色ではともに、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０−アクチン複合体を表す６３ｋＤａのバンドが明らかにされた（図５Ａ、レーン４、レーン７、レーン１０）。
【０１７６】
固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用した場合、短縮型ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２が、広い濃度範囲（２０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ）にわたって、かなり直線的な濃度依存的様式でアクチンと結合することが示された（図５Ｂ）。
【０１７７】
したがって、組換えヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２は全長のヒトＲＮＡＳＥＴ２の特異的かつ高親和性のアクチン結合能を保持する。
【０１７８】
（実施例ＩＩＩ）
ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２はガン細胞の成長および血管形成をインビトロで効果的に阻害する
真菌Ｔ２ＲＮＡＳＥの抗血管形成治療および抗ガン治療の可能性と類似する、全長ヒト組換えＲＮＡＳＥＴ２の抗血管形成治療および抗ガン治療の可能性が明らかにされている（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００６／０３５４３９を参照のこと。これは本明細書によりその全体が組み込まれる）。細菌由来の精製された短縮型形態のｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２の抗ガン活性および抗血管形成活性を下記のように調べた。
【０１７９】
コロニー形成アッセイ：
ヒト結腸（ＨＴ−２９）ガン細胞を５０ｍｌのフラスコで成長させた（１０５細胞／フラスコ）。培地は、１μＭのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）または組換えインサート非含有ベクター細菌溶解物（モック）の存在下または非存在下、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％のグルタミンおよび１％の抗生物質−抗真菌剤溶液が補充された７ｍｌのＤＭＥＭを含有した。細胞を、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気において３７℃でインキュベーションした。４８時間後、１０３細胞／ウエルを、１μＭのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）または組換えインサート非含有ベクター細菌溶解物（モック）の存在下または非存在下、２００μｌの培地において９６ウエルプレートに接種した。５日後、細胞を４％ホルアルデヒドにおいて固定処理し、メチレンブルーで染色した。コロニーの数を計数した。
【０１８０】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）血管形成アッセイ：
新しく単離されたＨＵＶＥＣを、２０％のＦＣＳ、１％のグルタミン、１％の抗生物質−抗真菌剤溶液、０．０２％のＥＣＧＦおよび５０ユニット／１００ｍｌのヘパリンが補充されたＭ１９９培地において維持した。その後、ＨＵＶＥＣを、５％のＦＣＳおよび０．００５％のＥＣＧＦを含有するＭ１９９培地において、増殖因子欠乏のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により事前に被覆された９６ウエルプレートに置床した（１４×１０３細胞／ウエル）。ウエルは、それぞれ２００μｇ／ｍｌのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）、組換えインサート非含有ベクター細菌溶解物（モック）またはＰＢＳが、それぞれの血管形成増殖因子（１μｇ／ｍｌのアンギオゲニン、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦ）とともに、１２０μｌの最終体積にまで補充された。３７℃での一晩のインキュベーションの後、プレートを写真撮影し、管形成（血管形成）の程度を評価した。
【０１８１】
結果
ＲＮＡＳＥＴ２の両方の短縮型形態（ＲＮＡＳＥＴ２−５０およびＲＮＡＳＥＴ２−７０）は、コントロール（ＰＢＳ）と比較して、結腸ガン細胞コロニー形成に対する著しい阻害効果を有し、一方、インサート非含有ベクター細菌溶解物（モック）は実際にはガン細胞コロニー形成を誘導した（図６Ａ〜図６Ｂ）。ＨＵＶＥＣのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）アッセイで評価されたとき、ＲＮＡＳＥＴ２の両方の短縮型形態は、アンギオゲニン、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦにより誘導されるＨＵＶＥＣ管形成を阻害した（図７Ａ〜図７Ｌ）。コントロールまたはモックでは影響が何ら認められなかった。
【０１８２】
血管形成に対する短縮型ＲＮＡＳＥＴ２の異なる用量の影響をさらに調べるために、さらなるＨＵＶＥＣ管形成アッセイを、０．５μＭ、２．５μＭ、５μＭおよび１０μＭの濃度でのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０を用いて、同じプロトコルを使用して行った。ＰＢＳをコントロールとして使用した（図８Ａ〜図８Ｏ）。
【０１８３】
ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０は、ＨＵＶＥＣ管形成を、調べられた増殖因子のそれぞれの存在下において用量依存的様式で阻害した（図８Ａ〜図８Ｏ）。管形成が０．５μＭのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０濃度で著しく阻害され、５μＭ以上のｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２濃度によって完全に防止されたことには留意すること。アンギオゲニンにより誘導される管形成が０．５μＭのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０において阻害され、一方、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦにより誘導される管形成が２．５μＭのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０において阻害された。
【０１８４】
したがって、これらの結果は短縮型ｈｒＲＮＡＳＥＴ２の抗ガン性および抗血管形成性を明瞭に明らかにする。
【０１８５】
（実施例ＩＶ）
ヒト短縮型ＲＮＡＳＥＴ２はガンの腫瘍成長および血管形成をインビボで効果的に阻害する
ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）およびｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）の抗ガン効果および抗血管形成効果がインビボ治療モデルで明らかにされた。本研究を、ＨＴ−２９由来異種移植片の腫瘍発達アッセイで、無胸腺（ｂａｌｂ  ｃ、ｎｕ／ｎｕマウス）の６週齢〜７週齢の雌性マウスにおいて行った。
【０１８６】
異種移植片モデル：
ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）：ＨＴ−２９ガン細胞（０．５×１０６個／マウス）を無胸腺マウスの左臀部に皮下注入した。腫瘍が触診可能となったとき（ＨＴ２９細胞注入後１０日〜１３日）、ＰＢＳにおけるそれぞれ５ｍｇ／ｋｇのｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）またはインサート非含有ベクター細菌溶解物（モック）あるいはＰＢＳだけを尾静脈に１日おきに（週に３回）注射した（合計で９回の注射）。実験期間中、腫瘍を週に２回測定した。２１日後、マウスを屠殺し、腫瘍または注入領域をサイズ測定および組織病理学的検査のために切除した。５匹のマウスをそれぞれの処置のために使用した。腫瘍体積を、（長さ×幅２）／２の式を使用して計算した。
【０１８７】
ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０：類似するＨＴ−２９由来異種移植片モデルを、ＨＴ−２９ガン細胞（マウスあたり１×１０６／細胞）の左臀部への皮下注入によって誘導される腫瘍を有するマウスにｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）（ＰＢＳにおける５ｍｇ／ｋｇ）をＩＶ投与して実施した。８匹〜１０匹のマウスをそれぞれの処置のために使用した。
【０１８８】
血管分析：
血管形成に対するｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）の影響を腫瘍断面積中央値で求めた。それぞれの断面において、血管形成をＭａｔｓｕｚａｋｉ他（２００７、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ、８０：３９１〜３９９）に従ってスコア化した。画像解析ソフトウエア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ；ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、２値画像を、バックグランド（白色）と、血管（黒色）との間における中間の閾値を使用して作製した。サイズにおいて１０画素を越える完全な黒色物体（血管）の数およびサイズを、Ｉｍａｇｅ  Ｊの粒子解析機能を使用して求めた。血管数、総血管面積および相対面積（総血管面積と、腫瘍切片面積との比率）をこれらのデータから求めた。それぞれの腫瘍切片から、２つ〜４つの異なる視野領域を決定した。平均を、分散分析を使用することによって比較した。差は、Ｐ＜０．０００５において統計学的に有意であると見なした。
【０１８９】
結果
ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）で処置されたマウスにおいて、腫瘍重量が、モック処置マウスおよびコントロールより有意に減少した（６０％〜６７％）ことが認められた（図９）。ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０（配列番号１５）で処置されたマウスにおいて、腫瘍重量が、コントロールおよびモック注入マウスより有意に減少した（５０％）ことが認められた（図１１）。
【０１９０】
腫瘍および周囲組織の組織学的分析では、腫瘍細胞および腫瘍血管形成に対するｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２の阻害効果が明らかにされた（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。コントロールおよびモック処置マウスにおいて、大量のＨＴ−２９ガン細胞を有する広い浸襲領域が認められ、これに伴い、血管形成性が高まったことを示す証拠が得られた（数多くの血管に留意すること）（それぞれ、図１０Ａおよび図１０Ｃ）。内皮細胞は無傷であり、腫瘍細胞が明白であり、血管に付着していた（それぞれ、図１０Ｂおよび図１０Ｄ）。ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号２）でＩＶ処置されたマウス（図１０Ｅ）において、腫瘍細胞が、大量の壊死性組織によって取り囲まれるクラスターに集中していた。高倍率（図１０Ｆ）により、腫瘍細胞が血管から剥がれるとき、内皮構造の実質的な喪失が認められることが示される（図１０Ｆ）。腫瘍血管パラメーターの分析では、コントロールおよびモック処置マウスと比較して、腫瘍血管数、総血管面積および相対面積に対するｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０（配列番号１４）の阻害効果が有意に大きいことが示された（Ｐ＜０．０００５、表１、下記）。血管の数がモック処置マウスおよびコントロールマウスからの腫瘍において類似していた。しかしながら、インビトロで認められるガン細胞コロニー促進効果に反映して（図６Ａを参照のこと）、血管形成（総血管面積）が、モック処置マウスでは、コントロール（ＰＢＳ）由来の腫瘍の場合よりも有意に大きかった。
【０１９１】
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【０１９２】
したがって、短縮型ｈｒＲＮＡＳＥＴ２の生物学的活性のインビトロ評価およびインビボ評価の両方の結果は、短縮型ｈｒＲＮＡＳＥＴ２の存在が、腫瘍血管形成および結腸ガン腫瘍成長を効果的に阻害するために十分であることを示す。さらに、インビボアッセイでは、静脈内投与された治療量の短縮型ｈｒＲＮＡＳＥＴ２が、ガン性腫瘍に行き渡り、その腫瘍の成長および血管形成を効果的に阻害し得ることが明らかにされた。したがって、短縮型ｈｒＲＮＡＳＥＴ２の抗ガンおよび抗血管形成の生物学的活性は、全長ＲＮＡＳＥＴ２のそのような生物学的活性と同一でないとしても、全長ＲＮＡＳＥＴ２のそのような生物学的効果と類似している。
【０１９３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１９４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０１９５】
配列番号１は、ｈｒＲＮＡＳＥＴ２（全長）の配列である。
配列番号２は、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０の配列である。
配列番号３は、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０の配列である。
配列番号４は、ヒトｔｒＴ２−５０  ＲＮＡＳＥＴ２変異体（Ｅ．ｃｏｌｉ配列について最適化されたもの）の配列である。
配列番号５は、ヒトｔｒＴ２−７０  ＲＮＡＳＥＴ２変異体（Ｅ．ｃｏｌｉ配列について最適化されたもの）の配列である。
配列番号６は、ｐＨＩＳ−Ｐａｒａｌｌｅｌ３の配列である。
配列番号７〜１０は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ配列について最適化された組み換えヒトＲＮＡＳＥＴ２の配列である。
配列番号１２は、ｐＨｉＳ−ｐａｒａｌｌｅｌ３中へクローニングされるべきＥＫ認識部位を付加されたｔｒＴ２−５０を含む組み換えＤＮＡの配列である。
配列番号１３は、ｐＨｉＳ−ｐａｒａｌｌｅｌ３中へクローニングされるべきＥＫ認識部位を付加されたｔｒＴ２−７０を含む組み換えＤＮＡの配列である。
配列番号１４は、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−５０−ＨＩＳ−ＥＫ翻訳生成物の推断されたアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ｈｒｔｒＲＮＡＳＥＴ２−７０−ＨＩＳ−ＥＫ翻訳生成物の推断されたアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｌ】
2012507278.tif 000009
【図８Ａ−８Ｏ】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｆ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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