(57)【要約】  本発明は、Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチン検出用誘導体化試薬の調製方法およびその使用を提供する。本発明の試薬は安定しており、Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチンの正確かつ高感度な検出に使用可能である。すなわち、本試薬は、合成または天然Ｌ−カルニチン量および混合Ｄ−カルニチン量の検出に適用される。この化合物の試薬を用いれば、Ｌ−カルニチンまたは／およびＤ−カルニチンを含有する、化学薬品、生物試薬、健康管理試薬、化粧品、体液およびさまざまな食品中のキラル異性体および他のキラルアミノ酸の光学異性体を同定できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチンの分離、またはサンプル中のＬ−カルニチンまたはＤ−カルニチン含有量検出への、光学的に純粋な下記化学式（Ｉ）の誘導体化試薬の使用。
【化１】
2012505419.tif 000019
式中、アスタリスクの付いた炭素原子は、キラル炭素原子であり；本発明の化合物は、純粋な光学活性を有するキラル化合物であり、Ｄ−またはＬ−化合物であり；Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖または分岐アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖または分岐アルケニル基またはアルキニル基、またはＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基を示し；Ｘは、ハロゲン原子を示す。
【請求項２】
前記化学式（Ｉ）の化合物において、前記Ｒは、メチル、エチル、イソプロピル、ブチルまたはベンジルを示し、前記ＸはＣｌまたはＢｒである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化学式（Ｉ）の化合物は結晶性固体である請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記化学式（Ｉ）の化合物は、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（−）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（＋）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物および（−）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物から選択される請求項３に記載の使用。
【請求項５】
光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物およびその結晶性固体を溶媒に溶解して、適当な濃度の溶液を作製し；
前記溶媒をエーテル、プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、酢酸エチル、またはいずれか２以上の上記溶媒の混合物から選択し；
該溶液の濃度は０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌである請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記溶媒はアセトニトリルであり；濃度は１〜１０ｍｇ／ｍｌである請求項５に記載の使用。
【請求項７】
サンプル中のＬ−カルニチンまたはＤ−カルニチン含有量の検出方法であって、
（１）適量のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）を含有するテストサンプル溶液およびＤＬ−カルニチンを含有するコントロール溶液を調製し；  
（２）適量の本発明の誘導体試薬と、Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）を含有するテストサンプル溶液とを適量ずつ混合し、反応させてＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）誘導体を提供させ；  
（３）ＨＰＬＣを行って、サンプル中のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）を検出・算出するステップを含む方法。
【請求項８】
（一）請求項１〜５のいずれかに記載のＤ型またはＬ型の光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物を請求項６の溶媒に溶解して、暗状態で０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ溶液を作製する誘導体化試薬溶液の調製ステップ：  前記化学式（Ｉ）の化合物が好ましくは（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物であり、前記溶媒が好ましくはアセトニトリルであり；前記溶液の濃度は好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌである；と  
（二）Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチンのテスト溶液およびＤＬ−カルニチンのコントロール溶液を調製するステップ；と  
（三）前記ステップ（一）の誘導試薬を、溶媒存在下、密閉容器内で、２０℃〜９５℃にてウォーターバスを用いて２０〜１８０分間、前記ステップ（二）のテスト溶液およびコントロール溶液とそれぞれ混合・反応させるステップ；  
（四）ＨＰＬＣを行って、反応後のテスト溶液およびコントロール溶液を分離・検出し、前記テスト溶液中のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量を外部標準法にて算出するステップをさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルには、Ｌ−カルニチンＡＰＩ、注射剤、経口液体、錠剤、痩身カプセル剤および飲料などの、Ｌ−カルニチンまたは／およびＤ−カルニチンを含有する、さまざまな医薬品または生物剤、健康管理用品、化粧品、体液およびさまざまな食品が含まれる請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルには、ヒトを含むいずれかのほ乳類の組織または血しょうが含まれる請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルには、ブタ、ウシ、ヒツジ、トリ、エビ、魚、卵、野菜、果物などのさまざまな食用植物および動物性食品が含まれる請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルには動物飼料が含まれる請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルには植物栄養素が含まれる請求項７または８に記載の方法。
【請求項１４】
キラルアミノ酸含有量の検出への請求項１〜４のいずれかに記載の光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１５】
光学的に純粋な下記化学式（Ｉ）の化合物であって、
【化２】
2012505419.tif 000020
式中、アスタリスクの付いた炭素原子は、キラル炭素原子であり；本発明の化合物は、純粋な光学活性を有するキラル化合物であり、Ｄ−またはＬ−化合物であり；Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖または分岐アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖または分岐アルケニル基またはアルキニル基、またはＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基を示し；Ｘは、ハロゲン原子を示す化合物。
【請求項１６】
前記Ｒがメチル、エチル、イソプロピル、ブチルまたはベンジルを示し、前記ＸがＣｌまたはＢｒを示す請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化学式（Ｉ）の化合物は結晶性固体である請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
前記化学式（Ｉ）の化合物は、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（−）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物、（＋）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物および（−）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物から選択される請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化学式（Ｉ）の化合物は、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物であり、その回折角（２θ）のＸ線データは、６．５７９（ｄ＝１３．４２３１、Ｉ／Ｉ０＝５４．４）、１０９７９（ｄ＝８．０５２２、Ｉ／Ｉ０＝３４．１）、１３．２１８（ｄ＝６．６９２５、Ｉ／Ｉ０＝７２．２）、１３．４９９（ｄ＝６．５５３９、Ｉ／Ｉ０＝４５．８）、１８．２２２（ｄ＝４．８６４６、Ｉ／Ｉ０＝２１．２）、１８．７８０（ｄ＝４．７２１１、Ｉ／Ｉ０＝１００．０）、１９．９０１（ｄ＝４．４５７７、Ｉ／Ｉ０＝２１．７）、２１．６１９（ｄ＝４．１０７２、Ｉ／Ｉ０＝２６．２）、２２．１００（ｄ＝４．０１８８、Ｉ／Ｉ０＝７５．３）、２７．１３９（ｄ＝３．２８３０、Ｉ／Ｉ０＝１９．０）、４７．６８１（ｄ＝１．９０５７、Ｉ／Ｉ０＝１５．０である請求項１８に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチン検出用の誘導体化試薬の調製およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルニチンには、さまざまな生理的機能があるが、基本的な機能の一つが、β酸化が起きるミトコンドリア膜を通して、ミトコンドリア内に長鎖脂肪酸を「輸送する」ことである。Ｌ−カルニチンは、脂肪酸代謝に不可欠であり、カルニチンの合成が体内で阻害されるか、カルニチンが分解または過度に分泌されるか、またはカルニチントランスフェラーゼの機能の低下または喪失が起きると、脂質代謝に混乱を来し、エネルギー供給に影響を与え、多くの病気を引き起こすことになる。天然のＬ−カルニチンの代表的な抽出方法は、１９５２年にケイター（Ｃａｔｅｒ）が報告したウシからの抽出である。しかしながら、肉に含有されるＬ−カルニチンの絶対量は非常に低いうえ、肉汁内に存在するコリンは構造上非常に類似しており分離が難しいため、直接抽出法は複雑であり、生成量も低く高価である。したがって、十分な天然Ｌ−カルニチンを得るのは容易なことではない。
【０００３】
現在、医薬用途のＬ−カルニチンは通常、人工的に合成されている。通常、Ｌ−カルニチン合成にはラセミ化合物の分離が利用されている。原材料が安価で、入手が容易であり、プロセスの工業化も容易である。しかしながら、従来の化学的分解の問題点として、Ｄ−異性体は完全に除去することができないため、合成Ｌ−カルニチンは完全に左旋性ではなくＤ−カルニチンも含まれている。
【０００４】
天然カルニチンはＬ−カルニチンであり、Ｌ−カルニチンのみに生理活性がある。Ｄ−カルニチンは、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびカルニチンパルミチルトランスフェラーゼ（ＰＴＣ）の拮抗阻害剤である。したがって、ＤＬ−カルニチンを摂取後、約１０％の患者が重症筋無力症を経験したとの報告がある（マーチンデール（Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ）：特別薬局方（Ｅｘｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）（３３巻）：１３５６）。したがって、薬物安全性を考慮すると、化学合成プロセスにおいてＤ−カルニチン量を厳密に制御する必要がある。
【０００５】
現在、Ｄ−カルニチン量は、比旋光度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）により検出されるが、この方法では正確性を欠く。Ｌ−カルニチン合成物中のＤ−カルニチン含有量を正確に検出し、より安全でより効果的な医薬品、健康製品および食品を提供するために、Ｌ−カルニチン合成物中のＤ−カルニチン含有量を検出する、より高精度かつ高感度な方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の目的は、Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）の含有量検出用試薬およびその調製方法の提供である。本発明で開示する調製方法は、シンプルで経済的である。この方法で調製される試薬は、保存中安定しており、使用しやすい。
【０００７】
本発明の第二の目的は、Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチンの医薬品有効成分中、およびＬ−カルニチンまたは／およびＤ−カルニチンを含む、さまざまな医薬品または生物剤、健康管理用品（大衆薬）、化粧品、体液およびさまざまな食品中のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）の含有量を検出する方法を提供することである。本発明で開示する検出方法は、高感度であり、便利で効果的である。
【０００８】
本発明には、Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量検出用の、光学的に純粋な以下の化学式（Ｉ）の誘導体化試薬が開示される：
【化１】
2012505419.tif 000002
式中、アスタリスクの付いた炭素原子は、キラル炭素原子であり；本発明の化合物は、純粋な光学活性を有するキラル化合物であり、Ｄ−またはＬ−化合物であり；Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖または分岐アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖または分岐アルケニル基またはアルキニル基、またはＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基を示し；Ｘは、ハロゲン原子を示す。
【０００９】
本発明で使用する化学式（Ｉ）の化合物において、Ｒはメチル、エチル、イソプロピル、ブチルまたはベンジルであり、ＸはＣｌまたはＢｒである。
【００１０】
好ましくは、本発明では、Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチン含有量の検出用誘導体化試薬として、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物を開示する。
【００１１】
本発明で開示するＬ−カルニチンまたはＤ−カルニチン含有量の検出用誘導体化試薬は、好ましくは、光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物の結晶性固体である。結晶性固体は、溶液と比較して、より安定しており、分解されにくく保存しやすいのが特徴である。
【００１２】
本発明の光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物の結晶性固体は、好適な溶媒による再結晶であり；前記溶媒は、エーテル、プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、またはいずれか２以上の前記溶媒の混合物から選択される。
【００１３】
光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物の再結晶化用溶媒は、好ましくはアセトニトリルである。
【００１４】
また、本発明では、光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物の誘導体化試薬としての使用についても開示している。該化合物は、光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物およびその結晶を溶媒に溶解し、特定濃度の溶液を作製し調製され、前記溶媒は、エーテル、プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、またはいずれか２以上の前記溶媒の混合物から選択される。溶液の濃度は、０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌである。特に好ましくは、溶媒はアセトニトリルであり、溶液の濃度は１〜１０ｍｇ／ｍｌである。
【００１５】
化学式（Ｉ）の有効成分原料は、以下のステップにより作製される：
【化２】
2012505419.tif 000003
【００１６】
（＋）または（−）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチル酢酸は、加水分解され、その後、フェノール性ヒドロキシル基がハロ炭化水素と結合し、アシル化により粗アシルハライドが形成される。
【００１７】
また、本発明では、光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物の結晶性固体の調製についても開示される。すなわち、粗アシルハライドは、好適な溶媒で再結晶化されて結晶性固体を形成する。前記溶媒は、エーテル、プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、またはいずれか２以上の前記溶媒の混合物から選択される。
【００１８】
光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物の再結晶化用溶媒は、好ましくは、アセトニトリルであり、得られる結晶性固体は高い光学純度を有し、安定的に保存可能である。
【００１９】
本発明では、光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物、（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物の結晶を開示している。該結晶は、白色の針状結晶であり、融点（ｍ．ｐ）が９２．３〜９３．５℃であることを特徴とし；回折角（２θ）のＸ線データは、６．５７９（ｄ＝１３．４２３１、Ｉ／Ｉ０＝５４．４）、１０９７９（ｄ＝８．０５２２、Ｉ／Ｉ０＝３４．１）、１３．２１８（ｄ＝６．６９２５、Ｉ／Ｉ０＝７２．２）、１３．４９９（ｄ＝６．５５３９、Ｉ／Ｉ０＝４５．８）、１８．２２２（ｄ＝４．８６４６、Ｉ／Ｉ０＝２１．２）、１８．７８０（ｄ＝４．７２１１、Ｉ／Ｉ０＝１００．０）、１９．９０１（ｄ＝４．４５７７、Ｉ／Ｉ０＝２１．７）、２１．６１９（ｄ＝４．１０７２、Ｉ／Ｉ０＝２６．２）、２２．１００（ｄ＝４．０１８８、Ｉ／Ｉ０＝７５．３）、２７．１３９（ｄ＝３．２８３０、Ｉ／Ｉ０＝１９．０）、４７．６８１（ｄ＝１．９０５７、Ｉ／Ｉ０＝１５．０）であり；ＩＲは、３４１４．５ｃｍ−１、２９８３．２ｃｍ−１、１７８６．２ｃｍ−１、１６０５．０ｃｍ−１、１３９０．６ｃｍ−１、１２７０．４ｃｍ−１、１１８３．１ｃｍ−１、８２３．８ｃｍ−１、７０１．６ｃｍ−１、７４２．２ｃｍ−１であり；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＣＯＣＤ３、５００ＭＨｚ）が１．６６（ｍ、３Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、４．４６（ｍ、１Ｈ）、７．１９（ｍ、１Ｈ）、７．２９（ｍ、１Ｈ）、７．４３（ｍ、１Ｈ）、７．８２（ｍ、１Ｈ）、７．８３（ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｓ、１Ｈ）であり；元素分析は、Ｃ％：６７．７６（理論値は６７．６１）、Ｈ％：５．２５（５．２７）である。
【００２０】
ＭＳより、分子量は、２４８、２５０で、塩素の同位体ピークであり、ｍ／ｚ１８５は存在量１００％の基準ピークである。このことから、断片イオンとして以下の化学式のイオンが考えられる。
【化３】
2012505419.tif 000004
【００２１】
本発明では、サンプル中のＬ−カルニチンまたはＤ−カルニチン含有量の検出方法を開示しており、該検出方法には、以下のステップが含まれる：  
（１）適量のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）を含有するテストサンプル溶液およびＤＬ−カルニチンを含有するコントロール溶液を用意する；  
（２）適量の本発明の誘導体試薬を、Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）を含有するテストサンプル溶液と混合し反応させて、Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）誘導体を提供させる；  
（３）ＨＰＬＣを行い、サンプル中のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量を検出・算出する。
【００２２】
本発明では、サンプル中のＬ−カルニチンまたはＤ−カルニチン含有量の検出方法を開示しており、該検出方法には、以下のステップが含まれる：  
（一）誘導体化試薬溶液を用意する。すなわち、請求項１〜５のいずれかに記載のＤ型またはＬ型の光学的に純粋な化学式（Ｉ）の化合物を、溶媒中に溶解し、暗状態で０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ溶液を作製する。ここで、該化学式（Ｉ）の化合物は、好ましくは（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物であり、該溶媒は、好ましくはアセトニトリルであり、溶液濃度は、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌである；  
（二）Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチンのテスト溶液と、ＤＬ−カルニチンのコントロール溶液を用意する；  
（三）ステップ（一）の誘導試薬を、溶媒存在下、密閉容器内で、２０℃〜９５℃にてウォーターバスを用いて２０〜１８０分間、ステップ（二）のテスト溶液およびコントロール溶液と混合・反応させる；  
（四）ＨＰＬＣを行い、反応したテスト溶液およびコントロール溶液を分離、検出し、テスト溶液中のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量を外部標準法にて算出する。
【００２３】
また、検出の詳細には、以下が含まれる：  
（ｉ）クロマトグラフィー条件：  オクタデシルシラン結合シリカを充填剤とし、トリエチルアミンバッファー（リン酸塩８ｍｌ、トリエチルアミン１５ｍｌ、水１５００ｍｌ）−テトラヒドロフランを勾配溶離用の移動相とする。励起波長は２３０ｎｍ〜２６０ｎｍ、発光波長は３４０ｎｍ〜３８０ｎｍである；  
（ｉｉ）テスト溶液の調製：  テストサンプルを正確に秤量し、水に溶解して０．１μｇ／ｍｌ〜３．０μｇ／ｍｌの溶液を作製し、テスト溶液とする；  
（ｉｉｉ）コントロール溶液の調製：  ＤＬ−カルニチンを正確に秤量し、水に溶解して０．２μｇ／ｍｌ〜６．０μｇ／ｍｌの溶液を作製し、コントロール溶液とする；  
（ｉｖ）誘導体化反応：  コントロール溶液とテスト溶液をそれぞれ３０μｌずつ５ｍｌの容量フラスコに入れ、それぞれに対し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌのカーボネートバッファー溶液を添加し、適量のピリジンアセトニトリル溶液（アセトニトリル１ｍｌあたり１μｌ〜５０μｌのピリジンを含有）を、本発明の誘導体化試薬溶液と混合して密封し、ウォーターバス中２０℃〜９５℃で反応させて、酢酸バッファーで等量希釈し、ウォーターバスから取り出してすぐに振とう、ろ過させる；  
（ｖ）含有量の検出：  反応後のテストサンプルとコントロール溶液とを、それぞれ同量ずつＨＰＬＣに注入してクロマトグラムを記録し、テスト溶液中のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量を外部標準法にて算出する。
【００２４】
本発明Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出において、上述のステップ（ｉ）のクロマトグラフィー条件には、トリエチルアミンバッファー（リン酸塩８ｍｌ、トリエチルアミン１５ｍｌ、水１５００ｍｌ）と、テトラヒドロフランとの混合物である移動相が含まれる。トリエチルアミンバッファー溶液のｐＨ値は２．０〜９．０である。トリエチルアミンバッファー濃度が７０％〜９０％で、ＴＨＦ濃度が３０％〜１０％のとき、２成分の勾配は、０〜１０分間であり；トリエチルアミンバッファー濃度が７０％〜３０％から９０％〜３０％で、ＴＨＦ濃度が３０％〜７０％から１０％〜７０％のときは、１０〜１１分間であり；トリエチルアミンバッファー濃度が３０％で、テトラヒドロフラン濃度が７０％のときは、１１〜１８分間であり；トリエチルアミンバッファー濃度が３０％〜７０％から３０％〜９０％で、ＴＨＦ濃度が７０％〜３０％から７０％〜１０％のときは、１８〜１９分間であり；トリエチルアミンバッファー濃度が７０％〜９０％で、ＴＨＦ濃度が３０％〜１０％のときは、１９〜２５分間である。
【００２５】
本発明のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出において、ステップ（ｉｉｉ）のコントロール溶液は、詳しくは、ＤＬ−カルニチン２ｍｇ〜６０ｍｇを正確に秤量して、１００ｍＬの容量フラスコ内で水に溶解し、このうち１０ｍｌを正確にピペットで取り１００ｍｌの容量フラスコに入れて水を加えて調製される。これをコントロール溶液とする。Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜３．０μｇ／ｍｌのとき、良好な直線関係が得られ、線形相関係数ｒは、０．９９９１であり、回収率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）は１００．６％である。
【００２６】
本発明のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出において、ステップ（ｉｖ）の誘導体化試薬の濃度は、０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは５ｍｇ／ｍｌである。
【００２７】
本発明のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出において、ステップ（ｉｖ）のカーボネートバッファー溶液は、詳しくは、重炭酸ナトリウム４．２ｇを水９００ｍｌに溶解して、ｐＨ値を５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液で７．０〜１２．０に調整し１０００ｍＬまで水を添加することにより調製される。
【００２８】
本発明のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出において、ステップ（ｉｖ）のカーボネートバッファー溶液の添加量は５μｌ〜５００μｌである。
【００２９】
本発明のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出において、ステップ（ｉｖ）の反応温度は２０℃〜９５℃であり、反応時間は２０分間〜１８０分間である。
【００３０】
本発明のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出において、ステップ（ｉｖ）の酢酸バッファー溶液は、詳しくは、氷酢酸３．０ｍＬを水９００ｍＬにて溶解し、５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ値を２．０〜７．０に調整し１０００ｍＬまで水を添加することにより調製される。
【００３１】
本発明に開示される誘導体化試薬および検出方法は、Ｌ−カルニチンまたは／およびＤ−カルニチンを含有する、さまざまな医薬品または生物剤、健康管理用品、化粧品、体液およびさまざまな食品（たとえば、Ｌ−カルニチンＡＰＩ、注射剤、経口液体、錠剤、痩身（減量）カプセル剤、飲料など）中のＬ−カルニチンおよび／またはＤ−カルニチン含有量の検出に適用できる。
【００３２】
本発明に開示される誘導体化試薬および検出方法は、ヒトを含むさまざまなほ乳類の組織および血しょう中のカルニチン含有量の検出に適用できる。
【００３３】
本発明に開示される誘導体化試薬および検出方法は、さまざまな食用植物および動物性食品中のカルニチン含有量の検出に適用できる。たとえば、ブタ、ウシ、ヒツジ、トリ、エビ、魚、卵、野菜、果物などが挙げられる。
【００３４】
本発明に開示される誘導体化試薬および検出方法は、さまざまな動物飼料中のカルニチン含有量の検出に適用できる。
【００３５】
本発明に開示される誘導体化試薬および検出方法は、さまざまな植物栄養素中のカルニチン含有量の検出に適用できる。
【００３６】
本発明に開示される誘導体化試薬および検出方法は、その他の光学純度のキラルアミノ酸の検出に適用できる。
【００３７】
本発明で使用される記号について以下にまとめる：  
Ｄ−：  Ｄ−異性体  
Ｌ−：  Ｌ−異性体  
ＩＲ：  赤外吸収分光法  
ＨＮＭＲ：  水素核磁気共鳴  
ＭＳ：  質量分析  
ＨＰＬＣ：  高速液体クロマトグラフィー
（＋）ＭＮＰＣ：  （＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物
（＋）ＥＮＰＣ：  （＋）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物
（＋）ＰＮＰＣ：  （＋）α−メチル−６−イソプロポキシ−２−ナフチルアセチル塩化物
（＋）ＢＵＮＰＣ：  （＋）α−メチル−６−ブトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物
（＋）ＢＮＰＣ：  （＋）α−メチル−６−ベンゾキシ−２−ナフチルアセチル塩化物
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出時の励起スペクトルであり；
【図２】図２は、Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量の検出時の発光スペクトルであり；
【図３】図３は、Ｌ−カルニチン［Ｌ−カルニチン（ｔＲ＝５．１３９分間）］含有量の検出時のＨＰＬＣであり；
【図４】図４は、Ｌ−カルニチン［Ｄ−カルニチン（ｔＲ＝４．３８９分間）、Ｌ−カルニチン（ｔＲ＝５．１３６分間）］含有量の検出時のＨＰＬＣである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下の実施形態を用いて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施形態に限定されない。
【００４０】
実施例１：（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物（（＋）ＭＮＰＣ）の調製
（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチル酢酸４．６ｇと、ＴＨＦ５０ｍｌを１００ｍｌのシングルネックの瓶に添加して、氷冷し、磁力でかき混ぜた。２ｍｌのＳＯＣｌ２を添加し、適量のピリジンを添加して６時間反応させ、回転式機械により乾燥させた。アセトニトリル２０ｍｌを添加して、淡黄色の固体が得られるまで冷却し、１５ｍｌのアセトニトリルで再結晶化させて白色の針状結晶を得た。真空下で乾燥させて、２．８７ｇの生成物を得た。収率は５７％で、融点は９２．３〜９３．５℃であった。
【００４１】
ＩＲ：  ３４１４．５ｃｍ−１、２９８３．２ｃｍ−１、１７８６．２ｃｍ−１、１６０５．０ｃｍ−１、１３９０．６ｃｍ−１、１２７０．４ｃｍ−１、１１８３．１ｃｍ−１、８３２．８ｃｍ−１、７０１．６ｃｍ−１、４７２．２ｃｍ−１。
【００４２】
１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３ＣＯＣＤ３、５００ＭＨｚ）：  １．６６（ｍ、３Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、４．４６（ｍ、１Ｈ）、７．１９（ｍ、１Ｈ）、７．２９（ｍ、１Ｈ）、７．４３（ｍ、１Ｈ）、７．８２（ｍ、１Ｈ）、７．８３（ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｓ、１Ｈ）。
【００４３】
Ｘ線データ：  回折角（２θ）は、６．５７９（ｄ＝１３．４２３１、Ｉ／Ｉ０＝５４．４）、１０９７９（ｄ＝８．０５２２、Ｉ／Ｉ０＝３４．１）、１３．２１８（ｄ＝６．６９２５、Ｉ／Ｉ０＝７２．２）、１３．４９９（ｄ＝６．５５３９、Ｉ／Ｉ０＝４５．８）、１８．２２２（ｄ＝４．８６４６、Ｉ／Ｉ０＝２１．２）、１８．７８０（ｄ＝４．７２１１、Ｉ／Ｉ０＝１００．０）、１９．９０１（ｄ＝４．４５７７、Ｉ／Ｉ０＝２１．７）、２１．６１９（ｄ＝４．１０７２、Ｉ／Ｉ０＝２６．２）、２２．１００（ｄ＝４．０１８８、Ｉ／Ｉ０＝７５．３）、２７．１３９（ｄ＝３．２８３０、Ｉ／Ｉ０＝１９．０）、４７．６８１（ｄ＝１．９０５７、Ｉ／Ｉ０＝１５．０）。
【００４４】
ＭＳ：  分子量（ＭＷ）は２４８、２５０で、塩素の同位体ピークであり、ｍ／ｚ１８５は存在量１００％の基準ピークである。このことから、断片イオンとして以下の化学式のイオンが考えられる。
【化４】
2012505419.tif 000005
【００４５】
元素分析：  Ｃ％：６７．７６（理論値は６７．６１）、Ｈ％：５．２５（５．２７）
【００４６】
実施例２：（＋）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物（（＋）ＥＮＰＣ）の調製
（ステップ１）
（＋）α−メチル−６−エトキシ−２−ナフチル酢酸５０ｇを、氷酢酸２０５ｍｌに溶解し、還流加熱した。３０分ごとに３６％ＨＣｌを２０ｍｌずつ添加して、６時間反応させ、氷冷水６００ｇに注ぎ入れてろ過した。エタノール−水により再結晶化して乾燥させ、無色の結晶（９．８７ｇ）を得た。収率は９０．５％、融点は１８９．４〜１９１．３℃であった。
【００４７】
ＩＲ：  ３４１１．１ｃｍ−１、１７０１．４ｃｍ−１、１６３２．５ｃｍ−１、１６０６．２ｃｍ−１、１５０９．１ｃｍ−１、１３８４．４ｃｍ−１、１１８９．０ｃｍ−１、１１４７．３ｃｍ−１、８６５．９ｃｍ−１、４７７．８ｃｍ−１。
【００４８】
１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３ＣＯＣＤ３、５００ＭＨｚ）：  σ１．５３（ｍ、３Ｈ）、３．９８（ｓ、３Ｈ）、７．１５（ｍ、１Ｈ）、７．２０（ｍ、１Ｈ）、７．４２（ｍ、１Ｈ）、７．６７（ｍ、１Ｈ）、７．７３（ｓ、１Ｈ）、７．７６（ｍ、１Ｈ）、８．５５（ｓ、１Ｈ）。
【００４９】
（ステップ２）
ステップ１の生成物（４１．０ｇ）と、ＫＯＨ（３２．０ｇ）とを、メタノール２００ｍｌに溶解し、ブロモエタン３５．５ｍｌを添加して２時間還流加熱した。冷却後、５％ＮａＯＨ２００ｍｌを添加して３〜４時間反応させた。反応後に氷冷水６００ｇを添加、撹拌し、静置してろ過し、水で洗浄した。エタノール５００ｍｌにより再結晶化して８０℃で乾燥させ、生成物（３７．２ｇ）を得た。収率は８０．３％、融点は１５１．８〜１５５．６であった。
【００５０】
ＩＲ：  ３４５３．５ｃｍ−１、１７２９．６ｃｍ−１、１６０９．５ｃｍ−１、１６０４．５ｃｍ−１、１３９３．７ｃｍ−１、１１８１．９ｃｍ−１、１１５８．４ｃｍ−１、８６２．４ｃｍ−１、４８１．８ｃｍ−１。
【００５１】
１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３ＣＯＣＤ３、５００ＭＨｚ）：  σ１．４３（ｍ、３Ｈ）、１．５３（ｍ、３Ｈ）、３．９０（ｍ、１Ｈ）、４．１６（ｍ、２Ｈ）、７．１５（ｍ、１Ｈ）、７．２５（ｍ、１Ｈ）、７．４６（ｍ、１Ｈ）、７．７５（ｓ、１Ｈ）、７．７６（ｓ、１Ｈ）、７．７９（ｓ、１Ｈ）。
【００５２】
（ステップ３）
実施例１を参照して、ステップ２の生成物から融点９１．７〜９２．９℃の塩化アシルを作製した。
【００５３】
ＩＲ：  ３４１６．７ｃｍ−１、２９８２．１ｃｍ−１、１７８５．９ｃｍ−１、１６０５．２ｃｍ−１、１３０９．５ｃｍ−１、１２６９．１ｃｍ−１、１１８２．６ｃｍ−１、８３２．８ｃｍ−１、７０１．８ｃｍ−１、４７２．６ｃｍ−１。
【００５４】
１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３ＣＯＣＤ３、５００ＭＨｚ）：  σ１．４３（ｍ、３Ｈ）、１．６６（ｍ、３Ｈ）、４．１８（ｍ、２Ｈ）、４．４６（ｍ、１Ｈ）、７．１９（ｍ、１Ｈ）、７．２９（ｍ、１Ｈ）、７．４３（ｍ、１Ｈ）、７．８２（ｍ、１Ｈ）、７．８３（ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｓ、１Ｈ）。
【００５５】
実施例３：（＋）α−メチル−６−イソプロポキシ−２−ナフチルアセチル塩化物（（＋）ＰＮＰＣ）の調製
ステップ２で２−ブロモプロパンを使用し、実施例１の方法に従って、融点７７．８〜７９．４℃の（＋）ＰＮＰＣを得た。
【００５６】
ＩＲ：  ３４１６．３ｃｍ−１、１７８４．５ｃｍ−１、１６０４．８ｃｍ−１、１３９０．２ｃｍ−１、１２７０．３ｃｍ−１、１１８２．５ｃｍ−１、８５４．６ｃｍ−１、６９９．２ｃｍ−１、４６９．５ｃｍ−１。
【００５７】
１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３ＣＯＣＤ３、５００ＭＨｚ）：  σ１．０６（ｍ、３Ｈ）、１．６５（ｍ、３Ｈ）、１．８３（ｍ、２Ｈ）、４．０７（ｍ、２Ｈ）、４．４５（ｍ、１Ｈ）、７．１９（ｍ、１Ｈ）、７．２９（ｍ、１Ｈ）、７．４２（ｍ、１Ｈ）、７．８１（ｍ、１Ｈ）、７．８２（ｓ、１Ｈ）、７．８４（ｍ、１Ｈ）。
【００５８】
実施例４：（＋）α−メチル−６−ブトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物（（＋）ＢＵＮＰＣ）の調製
ステップ２でブロモブタンを使用し、実施例１の方法に従って、融点５６．３〜５７．３℃の（＋）ＢＵＮＰＣを得た。
【００５９】
ＩＲ：  ３４１５．７ｃｍ−１、１７８５．３ｃｍ−１、１６０５．２ｃｍ−１、１４６８．３ｃｍ−１、１３９２．３ｃｍ−１、１２６８．９ｃｍ−１、１１７８．３ｃｍ−１、９２１．８ｃｍ−１、８１９．９ｃｍ−１、７２７．４５ｃｍ−１、７４７．６ｃｍ−１．
【００６０】
１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３ＣＯＣＤ３、５００ＭＨｚ）：  σ１．００（ｍ、３Ｈ）、１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．６７（ｍ、３Ｈ）、１．８２（ｍ、２Ｈ）、４．１４（ｍ、２Ｈ）、４．４８（ｍ、２Ｈ）、７．１９（ｍ、１Ｈ）、７．３１（ｍ、１Ｈ）、７．４２（ｍ、１Ｈ）、７．８２（ｍ、１Ｈ）、７．８３（ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｍ、１Ｈ）．
【００６１】
実施例５：（＋）α−メチル−６−ベンゾキシ−２−ナフチルアセチル塩化物（（＋）ＢＮＰＣ）の調製
ステップ２で臭化ベンジルを使用し、実施例１の方法に従って、融点７７．２〜７９．１℃の（＋）ＢＮＰＣを得た。
【００６２】
１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３ＣＯＣＤ３、５００ＭＨｚ）：  σ１．６（ｄ、３Ｈ）、３．８１（ｍ、１Ｈ）、４．１４（ｍ、２Ｈ）、４．４８（ｍ、Ｈ）、５．２６（ｓ、２Ｈ）、７．１９（ｍ、１Ｈ）、７．２２（ｍ、１Ｈ）、７．３８（ｍ、３Ｈ）、７．４２（ｍ、１Ｈ）、７．４７（ｍ、２Ｈ）、７．８３（ｍ、１Ｈ）、７．８７（ｍ、１Ｈ）、７．９０（ｍ、１Ｈ）。
【００６３】
実施例６：誘導体化反応およびクロマトグラフィー条件
１．  クロマトグラフィー条件および系統適応性テスト：
アジレント１１００ＨＰＬＣ；蛍光検出器；カラム：Ｃ１８−ＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）；総流速：１ｍｌ／分；移動相：トリエチルアミンバッファー（リン酸塩８ｍｌ、トリエチレンアミン１５ｍｌ、水１５００ｍｌ、ｐＨは５．４に調整）−テトラヒドロフラン混合物、時間勾配は以下の表１のとおりであった。
【００６４】
【表１】
2012505419.tif 000006
【００６５】
理論段数は、５０００より大きく、Ｌ−カルニチンおよびＤ−カルニチンのピーク分解能はいずれも１．５超であった。
【００６６】
２．  検出波長
誘導体化反応後にスペクトルスキャンを行った（図１、２）。最終的に励起波長は２３４ｎｍ、発光波長は３６０ｎｍを選択した。
【００６７】
３．  コントロール溶液の調製
ＤＬ−カルニチン２０ｍｇを正確に秤量し、１００ｍＬの容量フラスコ内で水を添加、溶解した。その後、この溶液１０ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコに正確にピペットで取り、水を加えた。これをコントロール溶液とした。
【００６８】
４．  誘導体化反応
コントロール溶液およびテスト溶液を、それぞれ３０μｌずつ５ｍｌの容量フラスコに入れ、それぞれについて、０．０５ｍｏｌ／Ｌのカーボネートバッファー溶液（重炭酸ナトリウム４．２ｇを水９００ｍｌに溶解し、ｐＨを５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨにて８．４に調整したもの）１００μｌと、ピリジンアセトニトリル溶液（アセトニトリル１ｍｌあたりピリジン２５μｌを含有）１００μｌと、誘導体化試薬の溶液（０．５％（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物）２００μｌとを混合し、密閉して４０℃のウォーターバスにて６０分間反応させた。これを、酢酸バッファー（氷酢酸３ｍｌを水９００ｍｌに溶解して、ｐＨを５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで７．０に調整し１０００ｍＬになるまで水を添加したもの）で希釈して、ウォーターバスから出した直後に振とうしてろ過した。
【００６９】
５．  検出
反応後のテストサンプル１０μｌと、コントロール溶液をそれぞれＨＰＬＣに注入し、クロマトグラムを記録して、テスト溶液中のＬ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）含有量を外部標準法にて算出した。
【００７０】
Ｌ−カルニチン（またはＤ−カルニチン）のサンプル濃度が０．３３μｇ／ｍｌ〜１．６４μｇ／ｍｌのときには良好な直線関係が得られ、線形相関係数ｒは０．９９９１であり、回収率は１００．６％であった。
【００７１】
実施例７：化学式（Ｉ）の化合物の結晶化および該化合物含有溶液の安定性
誘導体化試薬の正確な含有量は、正確な結果を保証する。しかしながら、化学式（Ｉ）の化合物は、塩化アシルであり、化学活性があり水に分解されやすく、化学式（Ｉ）の化合物の安定性を確保し、検出エラーを低減できる好適な溶媒を選択することなど、適切な保存法と使用条件を見いだすことが必要である。溶媒は、エーテル、プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、酢酸エチルなどから選択され、結晶は溶媒に溶解して溶液とし、結晶および溶液の安定性について共に検出した。
【００７２】
５ｍｇ／ｍｌの（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物（（＋）ＭＮＰＣ）溶液（それぞれアセトニトリル、アセトン、酢酸エチルに溶解したもの）および相対する固体結晶の安定性テストを行った。表２、表３、表４、表５に実験データをまとめた。
【００７３】
【表２】
2012505419.tif 000007
注意：保存条件は、茶色のガラス製容器に分注、密閉して冷凍保存（−１５℃）とした。
【００７４】
【表３】
2012505419.tif 000008
注意：保存条件は、茶色のガラス製容器に分注、密閉して冷凍保存（−１５℃）とした。
【００７５】
【表４】
2012505419.tif 000009
注意：保存条件は、茶色のガラス製容器に分注、密閉して冷凍保存（−１５℃）とした。
【００７６】
【表５】
2012505419.tif 000010
注意：保存条件は、茶色のガラス製容器に分注、密閉して冷凍保存（−１５℃）とした。
【００７７】
表２〜表５から、全サンプル中ＭＮＰＣの固体結晶がどの溶液よりも安定していることがわかった。また、全溶液中ＭＮＰＣアセトニトリル溶液が最も高い安定性を有することがわかった。ＭＮＰＣアセトニトリル溶液では、６０日目以降含有量が明らかに減少したのに対し、それ以外の溶液ではさらに悪化していた。したがって、ＭＮＰＣの固体結晶が誘導体化試薬として最も安定性に優れ、長期保存や輸送に適している。全溶液中ＭＮＰＣアセトニトリル溶液が最も安定性に優れており、アセトニトリルは誘導体化試薬の調製および誘導体反応の実施に好適な溶媒である。
【００７８】
実施例８：合成Ｌ−カルニチン中のＤ−カルニチン含有量の正確な検出
Ｌ−カルニチン１００ｍｇを正確に秤量し、１００ｍｌの容量フラスコ内で水を加えて溶解させた。この溶液１０ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を添加してサンプル溶液とした。ＤＬ−カルニチン２０ｍｇを秤量し、１００ｍｌの容量フラスコ内で水を加えて溶解させた。この溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を添加してコントロール溶液とした。
【００７９】
コントロール溶液およびテスト溶液を、それぞれ３０μｌずつ５ｍｌの容量フラスコに正確にピペットで取り、それぞれについて、０．０５ｍｏｌ／Ｌのカーボネートバッファー溶液（重炭酸ナトリウム４．２ｇを水９００ｍｌに溶解し、ｐＨを５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨにて８．４に調整したもの）１００μｌと、ピリジンアセトニトリル溶液（アセトニトリル１ｍｌあたりピリジン２５μｌを含有）１００μｌと、誘導体化試薬の溶液（０．５％（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物）２００μｌとを混合し、密閉して４０℃のウォーターバスにて６０分間反応させた。これを、酢酸バッファー（氷酢酸３ｍｌを水９００ｍｌに溶解して、ｐＨを５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで７．０に調整し１０００ｍＬになるまで水を添加したもの）で希釈して、ウォーターバスから出した直後に振とうしてろ過した。コントロール溶液と、テストサンプルを１０μｌずつピペットで取ってそれぞれＨＰＬＣに注入し、クロマトグラムを記録して、テスト溶液中のＤ−カルニチン含有量を外部標準法にて算出した。結果を表６にまとめた。
【００８０】
【表６】
2012505419.tif 000011
【００８１】
実施例９：Ｌ−カルニチン含有量の検出
Ｌ−カルニチン１０ｍｇを正確に秤量し、１００ｍｌの容量フラスコ内で水を加えて溶解させた。この溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を添加してサンプル溶液とした。ＤＬ−カルニチン２０ｍｇを秤量し、１００ｍｌの容量フラスコ内で水を加えて溶解させた。この溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を添加してコントロール溶液とした。
【００８２】
コントロール溶液およびテスト溶液を、それぞれ３０μｌずつ５ｍｌの容量フラスコに正確にピペットで取り、それぞれについて、０．０５ｍｏｌ／Ｌのカーボネートバッファー溶液（ｐＨ＝８．４）１００μｌと、ピリジンアセトニトリル溶液１００μｌと、０．５％の誘導体化試薬アセトニトリル溶液１００μｌとを混合し、密閉して４０℃のウォーターバスにて６０分間反応させた。これを、０．０５ｍｏｌ／Ｌの酢酸バッファー（ｐＨ７．０）で希釈して、ウォーターバスから出した直後に振とうしてろ過した。コントロール溶液と、テストサンプルを１０μｌずつピペットで取ってそれぞれＨＰＬＣに注入し、クロマトグラムを記録して、テスト溶液中のＬ−カルニチン含有量を外部標準法にて算出した。結果を表８にまとめた。
【００８３】
【表８】
2012505419.tif 000012
【００８４】
実施例１０：Ｌ−カルニチンＡＰＩ中のＬ−カルニチンおよびＤ−カルニチンの同期検出
Ｌ−カルニチン含有食品１００ｍｇを正確に秤量し、１００ｍｌの容量フラスコ内で水を加えて溶解させた。この溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を添加してサンプル溶液とした。ＤＬ−カルニチン２０ｍｇを秤量し、１００ｍｌの容量フラスコ内で水を加えて溶解させ、コントロール１とした。この「コントロール１」溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を添加してコントロール２とした。
【００８５】
「コントロール１」、「コントロール２」およびテスト溶液を、それぞれ３０μｌずつ５ｍｌの容量フラスコに正確にピペットで取り、それぞれについて、０．０５ｍｏｌ／Ｌのカーボネートバッファー溶液（重炭酸ナトリウム４．２ｇを水９００ｍｌに溶解し、ｐＨを５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨにて８．４に調整したもの）１００μｌと、ピリジンアセトニトリル溶液（アセトニトリル１ｍｌあたりピリジン２５μｌを含有）１００μｌと、誘導体化試薬の溶液（０．５％（＋）α−メチル−６−メトキシ−２−ナフチルアセチル塩化物）１００μｌとを混合し、密閉して４０℃のウォーターバスにて６０分間反応させた。これを、酢酸バッファー（氷酢酸３ｍｌを水９００ｍｌに溶解して、ｐＨを５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで７．０に調整し１０００ｍＬになるまで水を添加したもの）で希釈して、ウォーターバスから出した直後に振とうしてろ過した。コントロール溶液と、テストサンプルを１０μｌずつピペットで取ってそれぞれＨＰＬＣに注入し、クロマトグラムを記録して、Ｄ−カルニチンおよびＬ−カルニチン含有量を外部標準法にて算出した。結果を表９にまとめた。
【００８６】
【表９】
2012505419.tif 000013
【００８７】
実施例１１：注射剤中のＬ−カルニチン含有量の検出
Ｌ−カルニチン注射剤（５ｍｌ：１ｇ）１ｍＬを１００ｍＬの容量フラスコに正確にピペットで取り、水を添加した。この溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコに正確にピペットで取り、水を添加した。この溶液５ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコに正確にピペットで取り、水を添加した。これをサンプル溶液とした。
【００８８】
実施例９の方法を用いて検出し、結果を表１０にまとめた。
【００８９】
【表１０】
2012505419.tif 000014
【００９０】
実施例１２：経口液体中のＬ−カルニチン含有量の検出
Ｌ−カルニチン経口溶液（１０ｍｌ：１ｇ）１ｍＬを１００ｍＬの容量フラスコに正確にピペットで取り、水を添加した。この溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコに正確にピペットで取り、水を添加した。この溶液１０ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコに正確にピペットで取り、水を添加した。これをサンプル溶液とした。
【００９１】
実施例９の方法を用いて検出し、結果を表１１にまとめた。
【００９２】
【表１１】
2012505419.tif 000015
【００９３】
実施例１３：痩身カプセル剤中のＬ−カルニチン含有量の検出
Ｌ−カルニチン痩身カプセル剤２０個を正確に秤量し、カプセル剤の内容物を取り出し（カプセル殻は捨てずに小さなブラシで汚れを取って秤量した）、カプセル剤の内容物を混合して粉状化し、適切に秤量した（Ｌ−カルニチン１０ｍｇに相当）。これを１００ｍｌの容量フラスコに入れ、水を添加して超音波で３０分間処理した。完全に溶解した後、水を足してろ過した。その後、１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を添加してサンプル溶液とした。
【００９４】
実施例９の方法を用いて検出し、結果を表１２にまとめた。
【００９５】
【表１２】
2012505419.tif 000016
【００９６】
実施例１４：血しょう中の遊離カルニチンの検出
テスト用血しょうの前処理：  血しょう１００μｌ（血液銀行より入手したもの）をピペットで取り、１０％メタノールアセトニトリル４００μｌを添加して、振とうし、ボルテックスで５分間振動させて１００００ｒｐｍ（ｒ．ｍｉｎ−１）で１０分間遠心し、上清をサンプル溶液として用いた。
【００９７】
コントロール溶液：  ＤＬ−カルニチン３５ｍｇを正確に秤量して、１００ｍＬの容量フラスコ内で溶媒を加えて溶解させた。その後、この溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を加えた。
【００９８】
実施例９の方法を用いて検出し、結果を表１３にまとめた。
【００９９】
【表１３】
2012505419.tif 000017
【０１００】
実施例１５：肉中のカルニチン濃度の検出
肉サンプル調製：  まず、新鮮な肉を粉砕し、粉砕済みサンプル２ｇを秤量して、１０％メタノールアセトニトリル溶液２５ｍｌを添加した。５分間ホモジナイズして、超音波で３０分間処理をし、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を移しておき、残存物に１０％メタノールアセトニトリル溶液２５ｍｌを添加した。超音波で３０分間処理をし、１００００ｒｐｍで１０分間遠心して、上清を合わせてサンプル溶液とした。
【０１０１】
ＤＬ−カルニチン１００ｍｇを正確に秤量し、１００ｍＬの容量フラスコ内で溶媒を加えて溶解させた。その後、この溶液１ｍｌを１００ｍｌの容量フラスコにピペットで取り、水を加えた。
【０１０２】
実施例９の方法を用いて検出し、結果を表１４にまとめた。
【０１０３】
【表１４】
2012505419.tif 000018
【図１】
2012505419.tif 000021
【図２】
2012505419.tif 000022
【図３】
2012505419.tif 000023
【図４】
2012505419.tif 000024
【国際調査報告】
2012505419.tif 000025
2012505419.tif 000026
2012505419.tif 000027
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