(57)【要約】本発明は、それに限定されないが癌マーカーを含む、癌の診断、研究および療法のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、癌（例えば前立腺癌）の診断マーカーおよび臨床標的としての再現性の遺伝子融合物に関する。例えば一部の実施形態では、本発明は、患者の前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップと、試料中のＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＬＫ４遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップとを含み、試料中の遺伝子融合物の存在を検出することは、患者の前立腺癌を同定することである方法を提供する。
2012514475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）前立腺起源の核酸を含有する可能性がある、前記患者からの試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中のＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＬＫ４遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップと
を含み、前記試料中の前記遺伝子融合物の存在を検出することは、前記患者の前立腺癌を同定することである、方法。
【請求項２】
前記ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の前記転写調節領域が前記ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）が、前記ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の前記転写調節領域から転写される５’ＲＮＡ部分および前記ＥＬＫ４遺伝子から転写される３’ＲＮＡ部分を有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子融合物がリードスルー転写物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物および前立腺細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アンドロゲン調節遺伝子またはハウスキーピング遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
患者の前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）前立腺起源の核酸を含有する可能性がある、前記患者からの試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中のＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップと
を含み、前記試料中の前記遺伝子融合物の存在を検出することは、前記患者の前立腺癌を同定することである、方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）がゲノムＤＮＡの染色体再配列を検出することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）がキメラｍＲＮＡの転写物を検出することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物および前立腺細胞からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
患者の前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）前立腺起源の核酸を含有する可能性がある、前記患者からの試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中のＨＥＲＰＵＤ１遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＲＧ遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップと
を含み、前記試料中の前記遺伝子融合物の存在を検出することは、前記患者の前立腺癌を同定することである、方法。
【請求項１２】
患者の前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）前立腺起源の核酸を含有する可能性がある、前記患者からの試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中のＡＸ７４７６３０遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＴＶ１遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップと
を含み、前記試料中の前記遺伝子融合物の存在を検出することは、前記患者の前立腺癌を同定することである、方法。
【請求項１３】
患者の前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）前立腺起源の核酸を含有する可能性がある、前記患者からの試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中のＴＩＡ１：ＤＩＲＣ２、ＮＵＰ２１４：ＸＫＲ３、ＤＬＥＵ２：ＰＳＰＣ１、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ：ＴＥＡＤ１、ＳＰＯＣＫ１：ＴＢＣ１Ｄ９ＢおよびＲＥＲＥ：ＰＩＫ３ＣＤからなる群より選択される遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップと
を含み、前記試料中の前記遺伝子融合物の存在を検出することは、前記患者の前立腺癌を同定することである、方法。
【請求項１４】
患者の乳癌を同定するための方法であって、
（ａ）乳房起源の核酸を含有する可能性がある、前記患者からの試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中のＡＨＣＹＬ１：ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＲＨＧＡＰ１９：ＤＲＧ１、ＢＣ０１７２５５：ＴＭＥＭ４９、ＦＣＨＯ１：ＭＹＯ９ＢおよびＰＡＰＯＬＡ：ＡＫ７からなる群より選択される遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップと
を含み、前記試料中の前記遺伝子融合物の存在を検出することは、前記患者の前立腺癌を同定することである、方法。
【請求項１５】
患者の前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）前立腺起源の核酸を含有する可能性がある、前記患者からの試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中の
【化１０】
2012514475.tif 000029
からなる群より選択される遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップと
を含み、前記試料中の前記遺伝子融合物の存在を検出することは、前記患者の前立腺癌を同定することである、方法。
【請求項１６】
（ａ）キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、前記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分はＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来し、前記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分はＥＬＫ４遺伝子に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ、
（ｂ）ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、およびＥＬＫ４遺伝子に由来する、前記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに
（ｃ）ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、およびＥＲＧ遺伝子に由来する、前記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド
の少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項１７】
（ａ）ＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物のキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｂ）ＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物に由来する、前記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｃ）ＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物の転写調節領域に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、ならびにＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物に由来する３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド
の少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項１８】
（ａ）
【化１１】
2012514475.tif 000030
からなる群より選択される遺伝子融合物のキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｂ）
【化１２】
2012514475.tif 000031
からなる群より選択される遺伝子融合物に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および
【化１３】
2012514475.tif 000032
からなる群より選択される遺伝子融合物に由来する前記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｃ）
【化１４】
2012514475.tif 000033
からなる群より選択される遺伝子融合物の転写調節領域に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、および
【化１５】
2012514475.tif 000034
からなる群より選択される遺伝子融合物に由来する３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド
の少なくとも１つを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００９年１月９日に出願された米国仮出願第６１／１４３，５９８号および２００９年６月１７日に出願された同第６１／１８７，７７６号への優先権を主張する。上記の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金ＣＡ０６９５６８、ＣＡ１１１２７５、また米国陸軍によって付与された助成金Ｗ８１ＸＷＨ−０８−１−００３１の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、それに限定されないが、癌マーカーを含む、癌の診断、研究および療法のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、癌（例えば、前立腺癌）のための診断マーカーおよび臨床標的としての再現性（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）の遺伝子融合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
癌研究の中心の目的は、発癌の因果関係に関与する変化した遺伝子を同定することである。塩基の置換、挿入、欠失、転座ならびに染色体の増加および減少を含む、数種の体細胞性変異が同定されているが、そのすべては癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の活性変化をもたらす。１９００年代前半に最初に仮定されていたが、今では、癌における染色体再配列の起因的役割についての動かぬ証拠がある（非特許文献１）。再現性の染色体異常は、主に白血病、リンパ腫および肉腫の特徴であると考えられた。ずっとより一般的であり、ヒト癌に関連する罹患率および死亡率の比較的大きな割合に寄与する上皮性腫瘍（癌腫）は、公知の、疾患特異的染色体再配列の１％未満を構成する（非特許文献２）。血液悪性疾患は、平衡した、疾患特異的染色体再配列をしばしば特徴とするが、ほとんどの固形腫瘍は過剰の非特異的染色体異常を有する。固形腫瘍の核型複雑性は、癌の進展または進行を通して得られる二次的変化によると思われる。
【０００５】
染色体再配列の２つの主要な機構が記載されている。１つの機構では、１つの遺伝子のプロモーター／エンハンサーエレメントが癌原遺伝子に隣接して再配列され、したがって、発癌性タンパク質の発現変化を引き起こす。この種の転座は、それぞれＢ細胞およびＴ細胞の悪性疾患での癌遺伝子の活性化をもたらす、ＭＹＣへの免疫グロブリン（ＩＧ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の付加によって例示される（非特許文献３）。第二の機構では、再配列は２つの遺伝子の融合をもたらし、それは、新しい機能または変化した活性を有することができる融合タンパク質を生成する。この転座の原型例は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）でのＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子融合である（非特許文献４、非特許文献５）。重要なことに、この知見は、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼを首尾よく標的にする、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ）の合理的な開発をもたらした。（非特許文献６）。したがって、一般的な上皮性腫瘍で再現性の遺伝子再配列を特定することは、癌創薬の努力ならびに患者の治療に関して奥深い意味を有することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｏｗｌｅｙ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ（２００１年）１巻：２４５頁
【非特許文献２】Ｍｉｔｅｌｍａｎ、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（２０００年）４６２巻：２４７頁
【非特許文献３】Ｒａｂｂｉｔｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９４年）３７２巻：１４３頁
【非特許文献４】Ｒｏｗｌｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７３年）２４３巻：２９０頁
【非特許文献５】ｄｅ  Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２年）３００巻：７６５頁
【非特許文献６】Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ（２００５年）１０５巻：２６４０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、それに限定されないが、癌マーカーを含む、癌の診断、研究および療法のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、癌（例えば前立腺癌）の診断マーカーおよび臨床標的としての再現性の遺伝子融合物に関する。
【０００８】
例えば一部の実施形態では、本発明は、患者の前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップと、試料中のＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＬＫ４遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップとを含み、試料中の遺伝子融合物の存在を検出することは、患者の前立腺癌を同定することである方法を提供する。一部の実施形態では、ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域は、ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子のプロモーター領域を含む。一部の実施形態では、検出ステップは、ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域から転写される５’ＲＮＡ部分およびＥＬＫ４遺伝子から転写される３’ＲＮＡ部分を有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む。一部の実施形態では、遺伝子融合物は、リードスルー転写物である。一部の実施形態では、試料は、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物または前立腺細胞である。一部の実施形態では、この方法は、アンドロゲン調節遺伝子またはハウスキーピング遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップをさらに含む。
【０００９】
他の実施形態では、本発明は、患者の前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップと、試料中のＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７またはＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢから選択される遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップとを含み、試料中の遺伝子融合物の存在を検出することは、患者の前立腺癌を同定することである方法を提供する。一部の実施形態では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡの染色体再配列を検出することを含む。一部の実施形態では、検出ステップは、キメラｍＲＮＡ転写物またはリードスルー転写物を検出することを含む。一部の実施形態では、試料は、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物または前立腺細胞である。
【００１０】
さらなる実施形態では、本発明は、患者の前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップと、試料中のＨＥＲＰＵＤ１遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＲＧ遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップとを含み、試料中の遺伝子融合物の存在を検出することは、患者の前立腺癌を同定することである方法を提供する。
【００１１】
さらに他の実施形態では、本発明は、患者の前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップと、試料中のＡＸ７４７６３０遺伝子の転写調節領域に由来する５’部分およびＥＴＶ１遺伝子に由来する３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップとを含み、試料中の遺伝子融合物の存在を検出することは、患者の前立腺癌を同定することである方法を提供する。
【００１２】
さらなる実施形態では、本発明は、患者の前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップと、試料中のＨＥＲＰＵＤ１：ＥＲＧ、ＴＩＡ１：ＤＩＲＣ２、ＮＵＰ２１４：ＸＫＲ３、ＤＬＥＵ２：ＰＳＰＣ１、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ：ＴＥＡＤ１、ＳＰＯＣＫ１：ＴＢＣ１Ｄ９ＢまたはＲＥＲＥ：ＰＩＫ３ＣＤから選択される遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップとを含み、試料中の遺伝子融合物の存在を検出することは、患者の前立腺癌を同定することである方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、患者の乳癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップと、試料中のＡＨＣＹＬ１：ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＲＨＧＡＰ１９：ＤＲＧ１、ＢＣ０１７２５５：ＴＭＥＭ４９、ＦＣＨＯ１：ＭＹＯ９ＢまたはＰＡＰＯＬＡ：ＡＫ７から選択される遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップとを含み、試料中の遺伝子融合物の存在を検出することは、患者の前立腺癌を同定することである方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、患者の前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップと、試料中の
【００１５】
【化１】
2012514475.tif 000003
からなる群より選択される遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップとを含み、試料中の遺伝子融合物の存在を検出することは、患者の前立腺癌を同定することである方法を提供する。
【００１６】
さらなる実施形態では、本発明は、
（ａ）キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分がＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来し、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分がＥＬＫ４遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｂ）ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、およびＥＬＫ４遺伝子に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブ、または
（ｃ）ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、およびＥＲＧ遺伝子に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド
の少なくとも１つを含む組成物を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態では、本発明は、
（ａ）ＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物のキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｂ）ＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７、ＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブ、または
（ｃ）ＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物の転写調節領域に由来する、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、ならびにＵＳＰ１０：ＺＤＨＨＣ７、ＥＩＦ４Ｅ２：ＨＪＵＲＰ、ＨＪＵＲＰ：ＩＮＰＰ４Ａ、ＳＴＲＮ４：ＧＰＳＮ２、ＲＣ３Ｈ２：ＲＧＳ３、ＬＭＡＮ２：ＡＰ３Ｓ１、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７およびＭＩＰＯＬ１：ＤＧＫＢからなる群より選択される遺伝子融合物に由来する３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド
の少なくとも１つを含む組成物を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、
（ａ）
【００１９】
【化２】
2012514475.tif 000004
から選択される遺伝子融合物のキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｂ）
【００２０】
【化３】
2012514475.tif 000005
から選択される遺伝子融合物に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および
【００２１】
【化４】
2012514475.tif 000006
から選択される遺伝子融合物に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｃ）
【００２２】
【化５】
2012514475.tif 000007
から選択される遺伝子融合物の転写調節領域に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、および
【００２３】
【化６】
2012514475.tif 000008
から選択される遺伝子融合物に由来する３’部分とハイブリダイズする配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド
の少なくとも１つを含む組成物を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態を、本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、慢性骨髄性白血病細胞系統Ｋ６５２におけるトランスクリプトームの大規模並行配列決定を使用するＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子融合物の「再発見」を示している。挿入図は、Ｋ５６２細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ検証を表している。
【図２】図２は、キメラ転写物を同定するためのトランスクリプトーム配列決定の使用を表す模式図を示している。参照データベースと比べた「長リード」配列は、「マッピング」、「部分的に整列された」および「ノンマッピング」リードとして分類される。
【図３】図３は、長リード技術、短リード技術、および統合的手法に基づく計算予想キメラの総数と比べた予想ＶＣａＰ検証キメラのヒストグラムを示している。
【図４】図４は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより検証できなかった長リード配列によりノミネート（ｎｏｍｉｎａｔｅ）された融合キメラを示している。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧおよびＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７は、ＶＣａＰ細胞において１８の候補のこの組において検証されたただ２つのキメラであった。
【図５】図５は、前立腺癌細胞系統ＶＣａＰにおいて特徴付けられた代表的遺伝子融合物を示している。上のパネル、第１６染色体上のＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７融合物の模式図。ＵＳＰ１０のエクソン１は、同一染色体上で反対配向に位置するＺＤＨＨＣ７のエクソン３と融合している。挿入図は、ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ検証のヒストグラムを表示している。下のパネル、第２染色体上のＨＪＵＲＰを含む２つの遺伝子融合物をもたらす複合染色体内再配列の模式図。ＨＪＵＲＰのエクソン８は、ＥＩＦ４Ｅ２のエクソン２と融合してＨＪＵＲＰ−ＥＩＦ４Ｅ２を形成する。ＩＮＰＰ４Ａのエクソン２５は、ＨＪＵＲＰのエクソン９と融合してＩＮＰＰ４Ａ−ＨＪＵＲＰを形成する。挿入図は、ＨＪＵＲＰ−ＥＩＦ４Ｅ２およびＩＮＰＰ４Ａ−ＨＪＵＲＰ転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ検証のヒストグラムを表示している。
【図６】図６は、ＩＮＰＰ４Ａ、ＥＩＦ４Ｅ２およびＨＪＵＲＰ遺伝子を含む２ｑ１１および２ｑ３７での染色体再配列のＦＩＳＨ分析を示している。ａ、ＩＮＰＰ４Ａ、ＥＩＦ４Ｅ２およびＨＪＵＲＰ遺伝子のゲノム構成を示している模式図。水平バーはＢＡＣクローンの位置を示している。ｂ、マーカー染色体上のＩＮＰＰ４ＡとＨＪＵＲＰ遺伝子の融合を示しているＢＡＣクローン２および３を使用するＦＩＳＨ分析。矢印は、正常第２染色体の２つのコピー上の、それぞれ、２ｑ１１での５’ＩＮＰＰ４Ａプローブおよび２ｑ３７での３’ＨＪＵＲＰプローブのハイブリダイゼーションを示している。ｃ、第２染色体の２つの正常コピーへのおよびマーカー染色体上でのＨＪＵＲＰプローブのハイブリダイゼーションは、第２染色体ｑの３’末端のマーカー染色体上への転座をもたらすＥＩＦ４Ｅ２とＨＪＵＲＰ遺伝子間の切断点を示している。ｄ、２つの正常第２染色体、マーカー染色体へのプローブ２および４のハイブリダイゼーションおよび誘導体第２染色体上の分離シグナル（マーカー染色体への挿入物をもたらすプローブ２および４内の切断点を確認する）。ｅ、正常第２染色体の２つのコピー上に共局在化するシグナルに加えて、マーカー染色体上のプローブ３の存在により確認されるＩＮＰＰ４Ａ遺伝子の再配列。
【図７】図７は、前立腺癌細胞系統ＬＮＣａＰにおけるＭＩＰＯＬ１−ＤＧＫＢ遺伝子融合物の模式図を示している。ＭＩＰＯＬ１−ＤＧＫＢは、第７染色体上のＥＴＶ１遺伝子座の第１４染色体上のＭＩＰＯＬ１イントロンへの潜在的挿入に伴う染色体間遺伝子融合物である。以前決定されたゲノム切断点（星印）はＤＧＫＢおよびＭＩＰＯＬ１において示されている。挿入事象により、ＤＧＫＢの３’末端およびＥＴＶ１がエクソン１０と１１間のＭＩＰＯＬ１イントロンへ反転する。挿入図は、ＭＩＰＯＬ１−ＤＧＫＢ転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ検証のヒストグラムを表示している。
【図８】図８は、ＭＩＰＯＬ１、ＤＧＫＢおよびＥＴＶ１を含む染色体再配列のＦＩＳＨ分析を示している。ａ、第７染色体ｐ２１．２上のＥＴＶ１およびＤＧＫＢ遺伝子座のゲノム構成の模式図。遺伝子配向は矢印により示されている。ＤＧＫＢにおいて以前に同定されたゲノム切断点は、星印でマークされている。ＦＩＳＨ分析は、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞上でＢＡＣクローンを使用して実施された。ＥＴＶ１とＤＧＫＢの両方を包含するプローブ位置は水平バーで示されている。ゲノム座標は、前記２つのＢＡＣクローンにまたがる領域を示している。ｂ、共局在化シグナル（正常）は矢印により示され、矢じりは分離シグナルを示している。ｃ、第１４染色体ｑ１３．３〜ｑ２１．１上のＭＩＰＯＬ１遺伝子座のゲノム構成を示している模式図。ｄ、ＦＩＳＨ分析では、ＬＮＣａＰ細胞においてもＶＣａＰ細胞においても分離シグナルは明らかにならなかった。ｅ、それぞれ第７染色体ｐ２１．２および第１４染色体ｑ１３．３〜ｑ２１．１上のＭＩＰＯＬ１、ＥＴＶ１およびＤＧＫＢ遺伝子座のゲノム構成。ｆ、ＦＩＳＨ分析はＬＮＣａＰ細胞における共局在化を示しているが、ＶＣａＰ細胞では示していない。
【図９】図９は、キメラクラスＶ、リードスルー融合物を示している。前立腺癌細胞系統ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ、転移性前立腺組織ＶＣａｐ−ｍｅｔおよびＭｅｔ２、ならびに良性前立腺細胞系統、ＲＷＰＥ、ＰＲＥＣにおける融合転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ検証を伴うリードスルー融合物の模式図、ａ、Ｃ１９ｏｒｆ２５−ＡＰＣ２（イントロン）、ｂ、ＷＤＲ５５−ＤＮＤ１、ｃ、ＭＢＴＰＳ２−ＹＹ２、およびｄ、ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７。
【図１０】図１０は、前立腺組織におけるキメラ候補を示している。ａ、ＶＣａｐ−ＭｅｔとＭｅｔ３組織の両方において配列決定された短リードが集合しているＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合物境界の模式図。ｂ、転移性前立腺癌組織Ｍｅｔ３における第１９染色体上のＳＴＲＮ４−ＧＰＳＮ２融合物の模式図。ＳＴＲＮ４の５’部分は、同一染色体上に反対配向で存在するＧＰＳＮ２のエクソン２と融合している。ｃ、転移性前立腺癌組織、ＶＣａｐ−Ｍｅｔにおける第９染色体上のＲＣ３Ｈ２−ＲＧＳ３融合物の概略。ＲＣ３Ｈ２の５’部分は、同一染色体上に反対配向で存在するＲＧＳ３のエクソン２０と融合している。ｄ、レクチンマンノース結合２（ＬＭＡＮ２）のエクソン１とアダプター関連タンパク質複合体３サブユニット１（ＡＰ３Ｓ１）のエクソン２間の複合染色体内遺伝子融合物の模式図。前立腺癌細胞系統、ＶＣａＰおよび転移性前立腺組織ＶＣａｐ−ＭｅｔにおけるＬＭＡＮ２−ＡＰ３Ｓ１融合転写物発現のｑＲＴ−ＰＣＲ検証。
【図１１】図１１は、前立腺癌における再現性ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４キメラの発見および癌におけるキメラ転写物についての一般的分類システムを示している。左上パネル、第１染色体上に位置するＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４キメラの模式図。左中パネル、細胞系統のパネルにおけるＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４転写物のｑＲＴＰＣＲ検証。挿入図、Ｒ１８８１を用いて処理されたＬＮＣａＰ細胞におけるＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ評価のヒストグラム。左下パネル、前立腺組織良性隣接前立腺、限局性前立腺癌（ＰＣＡ）および転移性前立腺癌（Ｍｅｔｓ）のパネルにおけるｑＲＴ−ＰＣＲ検証のヒストグラム。右パネル、キメラ分類模式図（下に説明）。
【図１２】図１２は、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４  ｍＲＮＡキメラを発現する前立腺癌におけるＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４遺伝子座の再配列の欠如を示している。再配列についてのＥＬＫ４遺伝子の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。模式図（上パネル）は、第１染色体ｑ３２．１上のＳＬＣ４５Ａ３およびＥＬＫ４遺伝子のゲノム構成を示している。ＢＡＣクローンは、それぞれ、ＥＬＫ４およびＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の直に隣接する３’および５’領域から導き出された。プローブは、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４キメラ陽性細胞系統ＬＮＣａＰ（ａ、分裂中期スプレッド；ｂ、間期）およびｍＲＮＡキメラを発現する５つの指標前立腺腫瘍（ａ、ｅ、ｆ、ｇ＆ｈ）上でハイブリダイズしていた。ｃ、ＤＵ１４５はＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４キメラ陰性前立腺癌細胞系統である。
【図１３−１】図１３は、Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアを使用する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ６．０を使用した１５試料のゲノムレベル分析を示している。コピー数状態は以下の分類；０−ホモ接合型欠失；１−ヘテロ接合型欠失；２−正常二倍体；３−単一コピー増加；および４−複数コピー増加に分けられる。ゲノム構成は、（ａ）ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４および（ｂ）ＰＴＥＮに関連するゲノム異常を示している。
【図１３−２】図１３は、Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアを使用する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ６．０を使用した１５試料のゲノムレベル分析を示している。コピー数状態は以下の分類；０−ホモ接合型欠失；１−ヘテロ接合型欠失；２−正常二倍体；３−単一コピー増加；および４−複数コピー増加に分けられる。ゲノム構成は、（ａ）ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４および（ｂ）ＰＴＥＮに関連するゲノム異常を示している。
【図１４】図１４は、再現性についての前立腺癌細胞系統および組織−良性、限局性前立腺癌、ならびに転移性組織のパネルのｑＲＴ−ＰＣＲに基づく調査を示している。ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７（ａ）、ＩＮＰＰ４Ａ−ＨＪＵＲＰ（ｃ）およびＨＪＵＲＰ−ＥＩＦ４Ｅ２（ｄ）はすべて、ＶＣａＰおよびＶＣａＰ−Ｍｅｔにおける発現を示しており、前記パネル由来の他のどの試料においても確認されなかった。（ｂ）ＳＴＲＮ４−ＧＰＳＮ２発現はＭｅｔ３において確認されている。
【図１５】図１５は、前立腺癌試料に限定され同一患者由来の体細胞組織には不在の融合転写物発現のｑＲＴ−ＰＣＲに基づく確認を示している。５つの融合遺伝子、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ（ａ）、ＧＰＳＮ２−ＳＴＲＮ４（ｂ）、ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７（ｃ）、ＲＣ３Ｈ２−ＲＧＳ３（ｄ）、ＨＪＵＲＰ−ＥＩＦ４Ｅ２（ｅ）、ＩＮＰＰ４Ａ−ＨＪＵＲＰ（ｆ）、ＬＭＡＮ２−ＡＰ３Ｓ１（ｇ）、ＭＢＴＰＳ２−ＹＹ２（ｈ）、およびＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７（ｉ）は２人の患者において試験された。
【図１６】図１６は、腫瘍試料ＭＥＴ３におけるＳＴＲＮ４−ＧＰＳＮ２遺伝子融合を含む染色体再配列のＦＩＳＨ分析を示している。上パネルは、第１９染色体上に位置するＧＳＰＮ２およびＳＴＲＮ４遺伝子のゲノム構成を示している。良性試料（ａ）においては正常なシグナルパターンが観察され、共局在化シグナルは腫瘍試料（ｂ）においてのみ遺伝子融合物を示している。
【図１７】図１７は、ＶＣａＰ−Ｍｅｔ由来の腫瘍およびペアの正常組織においてＥＩＦ４Ｅ２−ＨＪＵＲＰ、ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７、およびＩＮＰＰ４Ａ−ＨＪＵＲＰ遺伝子融合物を含む染色体再配列のＦＩＳＨ分析を示している。左パネルの模式図はそのそれぞれの染色体上の遺伝子のゲノム構成を示している。
【図１８−１】図１８は、ＭＲＰＳ１０およびＨＰＲを含む染色体再配列のＦＩＳＨ分析を示している。Ａ、ＭＲＰＳ１０−ＨＰＲ融合物の模式図。第６染色体上に位置するＭＲＰＳ１０のエクソン６〜７は第１６染色体上のＨＰＲのエクソン７と融合している。ｂ、ＨＰＲ遺伝子座のゲノム構成を示す模式図。水平バーは、それぞれ、前記遺伝子の５’および３’末端からのＢＡＣクローンの近似位置を示している。ｃ、ＬＮＣａＰ細胞からのＦＩＳＨ画像は、正常第１６染色体の２つのコピー、誘導体第１６染色体［ｄｅｒ（１６）］の２つのコピー、およびＨＰＲ遺伝子における再配列を確認する誘導体第６染色体［ｄｅｒ（６）］上の単一赤色シグナルを示している。ｄ、ＭＲＰＳ１０およびＨＰＲ遺伝子座のゲノム構成を示す模式図。水平バーは、それぞれ、ＭＲＰＳ１０およびＨＰＲ遺伝子の５’および３’末端からのＢＡＣクローンの近似位置を示している。ｅ、ＬＮＣａＰ細胞からのＦＩＳＨ画像は、第６染色体の２つのコピーへのＭＲＰＳ１０プローブのハイブリダイゼーションを示しており、矢印は正常第１６染色体の２つのコピーへのＨＰＲプローブのハイブリダイゼーションを示している。ｄｅｒ（６）上の単一共局在化シグナルはＭＲＰＳ１０とＨＰＲの融合を確認している。
【図１８−２】図１８は、ＭＲＰＳ１０およびＨＰＲを含む染色体再配列のＦＩＳＨ分析を示している。Ａ、ＭＲＰＳ１０−ＨＰＲ融合物の模式図。第６染色体上に位置するＭＲＰＳ１０のエクソン６〜７は第１６染色体上のＨＰＲのエクソン７と融合している。ｂ、ＨＰＲ遺伝子座のゲノム構成を示す模式図。水平バーは、それぞれ、前記遺伝子の５’および３’末端からのＢＡＣクローンの近似位置を示している。ｃ、ＬＮＣａＰ細胞からのＦＩＳＨ画像は、正常第１６染色体の２つのコピー、誘導体第１６染色体［ｄｅｒ（１６）］の２つのコピー、およびＨＰＲ遺伝子における再配列を確認する誘導体第６染色体［ｄｅｒ（６）］上の単一赤色シグナルを示している。ｄ、ＭＲＰＳ１０およびＨＰＲ遺伝子座のゲノム構成を示す模式図。水平バーは、それぞれ、ＭＲＰＳ１０およびＨＰＲ遺伝子の５’および３’末端からのＢＡＣクローンの近似位置を示している。ｅ、ＬＮＣａＰ細胞からのＦＩＳＨ画像は、第６染色体の２つのコピーへのＭＲＰＳ１０プローブのハイブリダイゼーションを示しており、矢印は正常第１６染色体の２つのコピーへのＨＰＲプローブのハイブリダイゼーションを示している。ｄｅｒ（６）上の単一共局在化シグナルはＭＲＰＳ１０とＨＰＲの融合を確認している。
【図１９】図１９は、アレイＣＧＨにより見られるような、ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７融合物近くに位置する第１６染色体上のゲノム異常のプロットを示している。前記２つの遺伝子を含む欠失は、ＶＣａＰおよびＶＣａＰ親組織（ＶＣａＰ−Ｍｅｔ）において観察されるが、正常前立腺細胞系統、ＲＷＰＥでは観察されない。
【図２０】図２０は、尿沈渣におけるＳＬＣ４５Ａ３：ＥＬＫ４  ｍＲＮＡの同定を示している。
【図２１】図２１は、シングルリード手法に対するペアエンドトランスクリプトーム分析のダイナミックレンジおよび感度を示している。（Ａ）公知の遺伝子融合物ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ、ＢＣＲ−ＡＢＬ１、ＢＣＡＳ４−ＢＣＡＳ３、およびＡＲＦＧＥＦ２−ＳＵＬＦ２を支持するペアエンドと長シングルトランスクリプトームリードの比較。（Ｂ）メイトペアと長シングルトランスクリプトームリードを比較する、ＶＣａＰにおけるＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧの模式図。（上）メイトペアの頻度は対数尺度で示され、メイトペアが融合物境界を包含するのかそれともまたいでいるかどうかに基づいて分けられる；（下）ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合物境界をまたいでいる１００ｍｅｒのシングルトランスクリプトームリード。（Ｃ）ＵＨＲおよびＨＢＲについてのペアエンドと長シングルリード戦略の両方からのキメラノミネートのベン図。
【図２２】図２２は、ペアエンドトランスクリプトーム分析の包括性を示している。ＶＣａＰ（左）およびＬＮＣａＰ（右）に適用された（Ａ）ペアエンド遺伝子融合発見と以前報告された統合手法間の重複部分を強調するためのベン図。大きいほうの円は、ペアエンド配列決定によりノミネートされたすべての実験的に検証されたキメラを包含する。内部の円は、統合手法により以前報告されている全ての以前検証されたキメラはペアエンドノミネーションのサブセットであることを実証している。（Ｂ）ＶＣａＰおよびＫ５６２における実験的に検証されたキメラのヒストグラムであり、そのそれぞれの細胞系統内の二次遺伝子融合物由来からの公知の再現性遺伝子融合物ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧおよびＢＣＲ−ＡＢＬ１の区別を強調する。（Ｃ）ペアエンドトランスクリプトーム配列決定を使用するＭＣＦ−７におけるキメラの包括的検出。
【図２３】図２３は、ＲＮＡに基づくキメラを示している。（Ａ）０から３０の範囲の試料にわたる各リードスルーキメラを支持するリードの正規化された数を示すヒートマップ。（上）ヒートマップは、ＵＨＲ、ＨＢＲ、ＶＣａＰ、およびＫ５６２における広く発現されたキメラを強調している。（下）ヒートマップは、染色体間のおよび染色体内の再配列でエンリッチされるトップランキング限定遺伝子融合物の発現を強調している。（Ｂ）ＲＮＡに基づくキメラを（ｉ）リードスルー、（ｉｉ）収束転写物、（ｉｉｉ）発散転写物、および（ｉｖ）重複転写物に分類する説明的例。（Ｃ上）ペアエンド手法は、同一転写ユニットに属する独立の遺伝子由来のリードを連結しており（右）、シングルリード手法はこれらを独立の遺伝子に割り当てる（左）。（下）シングルリード手法は、キメラが融合物接合部にまたがっていることを必要とし（左）、ペアエンド手法は、遺伝子アノテーションと独立にメイトペアを連結することができる（右）。
【図２４】図２４は、限局性前立腺癌における以前記載されていないＥＴＳ遺伝子融合物の発見を示している。（Ａ）第１６染色体上に存在するＨＥＲＰＵＤ１のエクソン１と第２１染色体上に位置するＥＧＲのエクソン４間の染色体間遺伝子融合の模式図。（Ｂ）ＨＥＲＰＵＤ１およびＥＧＲ遺伝子のゲノム構成を示す模式図。水平バーはＢＡＣクローンの位置を示している。（下）正常組織におけるＨＥＲＰＵＤ１およびＥＧＲ（左）、腫瘍におけるＥＲＧ５＿領域の欠失（中央）、ならびに腫瘍試料におけるＨＥＲＰＵＤ１−ＥＧＲ融合（右）を示すＢＡＣクローンを使用するＦＩＳＨ分析。（Ｃ）第１７染色体上に存在するＡＸ７４７６３０と第２１染色体上に位置するＥＴＶ１のエクソン４（橙色）間の染色体間遺伝子融合物の模式図。（Ｄ上）ＡＸ７４７６３０およびＥＴＶ１遺伝子のゲノム構成の模式図。（下）腫瘍試料におけるＥＴＶ１の分離（左）および腫瘍試料におけるＡＸ７４７６３０およびＥＴＶ１の共局在化（右）を示すＢＡＣクローンを使用するＦＩＳＨ分析。
【図２５】図２５は、シングルリード手法を上回るペアエンド改良を示している。（Ａ）ペアエンド手法は、曖昧なマッピングを解決する。（上）シングルリード手法（左）は、遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙへの同一のマッチを有しているシングルリードまたは「メイト１」を表示しており、したがってこのリードは複数のマッピングを有すると分類される。ペアエンド手法（右）は、遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙに整列しているシングルリード手法と同じリードを表示している。しかし、対応するメイトペアまたは「メイト２」は、遺伝子Ｘとは予想されるインサートサイズで整列しているが、遺伝子Ｙとは整列していない。（下）メイト１は、シングルリード手法に基づいて、遺伝子Ｙとベストユニークヒットを、遺伝子Ｘとは第２のベストヒットを示している（左）。しかし、ペアエンドを使用する第２のメイト（右）は遺伝子Ｘへのベストユニークヒットを明らかにしており、実際のベストヒットを明らかにしている。（Ｂ）ペアエンド配列決定は、融合物接合部をまたいでいるカバレージを増加する。シングルリード手法は融合物接合部をまたいでいることによってのみ遺伝子融合物を検出することができるが（左）、ペアエンド手法は、メイトペアが融合物接合部をまたいでいれば、またはメイトペアが融合物接合部を包含していればキメラを検出することができ（右）、したがってキメラ発見により多くの機会を提供する。（Ｃ）融合物接合部にまたがっているシングルリードの限界。
【図２６】図２６は、キメラ発見のためのペアエンドトランスクリプトーム配列決定を示している。（Ａ）キメラ転写物を同定するためにペアエンドトランスクリプトーム配列決定を使用するためのバイオインフォマティクス方法論の模式図。メイトペアは、以下の分類（ｉ）メイトペアは同一遺伝子に整列している、（ｉｉ）メイトペアは異なる遺伝子に整列している（キメラ候補）、（ｉｉｉ）ノンマッピング、（ｉｖ）ミトコンドリア、（ｖ）リボソーム、および（ｖｉ）クォリティーコントロールに分類される。ノンマッピングメイトペアは、（ｉ）メイトペアが両方とも遺伝子にマッピングすることができない、または（ｉｉ）単一のメイトリードだけが遺伝子に整列することができない、に基づいてさらに分類される。（Ｂ）レーンにより区分されるＵＨＲおよびＨＢＲペアエンドおよび長トランスクリプトームリード手法についてのカバレージ統計。
【図２７】図２７は、新規のペアエンド概略および実験的検証を示している。（Ａ）ＧＡＳ６のエクソン５とＲＡＳＡ３のエクソン４の間に遺伝子融合を生じる第１３染色体ｑ３４上のＵＨＲ偏動原体逆位の模式図。（Ｂ）新規の血液学的遺伝子融合物ＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３。第９染色体と第２２染色体間のＢＣＲ−ＡＢＬＩおよびＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３染色体間遺伝子融合物の模式図。メイトペアおよび長シングルリードの代表的分布は、ＵＨＲとＫ５６２の両方について対数尺度で示されている。（Ｃ）慢性骨髄性白血病細胞系統にわたるＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ検証のヒストグラム。（Ｄ）新規の複合染色体間再配列ＺＤＨＨＣ７−ＡＢＣＢ９。ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７の染色体内再配列および染色体間遺伝子融合物、ＺＤＨＨＣ７−ＡＢＣＢ９の模式図。（Ｅ）ＺＤＨＨＣ７−ＡＢＣＢ９転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ検証のヒストグラム。
【図２８】図２８は、新規のＶＣａＰ染色体間遺伝子融合物ＴＩＡ１−ＤＩＲＣ２の検証を示している。（Ａ）第２染色体上に存在するＴＩＡ１と第３染色体上に位置するＤＩＲＣ２間のＶＣａＰ染色体間遺伝子融合の模式図。挿入図は、ＴＩＡ１−ＤＩＲＣ２転写物のｑＲＴ−ＰＣＲ検証のヒストグラムを表示している。（Ｂ）ＴＩＡ１およびＤＩＲＣ２遺伝子のゲノム構成を示す模式図。水平バーはＢＡＣクローンの位置を示している（上）。マーカー染色体上のＴＩＡ１とＤＩＲＣ２遺伝子の融合を示すＢＡＣクローンを使用するＦＩＳＨ分析（下）。
【図２９】図２９は、新規キメラの実験的検証を示している。ＭＣＦ−７における新規ペアエンドノミネーション（Ａ）ＡＲＨＧＡＰ１９−ＤＲＧ１、（Ｂ）ＢＣ０１７２５５−ＴＭＥＭ４９、（Ｃ）ＡＨＣＹＬ１−ＲＡＤ５１Ｃ、（Ｄ）ＭＹＯ９Ｂ−ＦＣＨＯ１、および（Ｅ）ＰＡＰＯＬＡ−ＡＫ７の定量的ＲＴ−ＰＣＲ検証。前立腺腫瘍キメラの検証は、ａＴ６４における（Ｆ）ＨＥＲＰＵＤ１−ＥＲＧおよびａＴ５２における（Ｇ）ＡＸ７４７６３０−ＥＴＶ１を含む。（Ｈ）は、新規に検証されたキメラの全体的概要である。
【図３０】図３０は、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰアンドロゲン時間的経過におけるＨＥＲＰＵＤ１およびＡＸ７４７６３０のＲＮＡ−Ｓｅｑ遺伝子発現ならびにアンドロゲン調節を示している。ヒストグラムは、飢餓状態にされ、６、２４、および４８時間でＲ１８８１を用いて処理されたＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞系統における（Ａ）ＨＥＲＰＵＤ１および（Ｂ）ＡＸ７４７６３０の正規化された遺伝子発現値を表す。（Ｃ）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ結合は、前立腺細胞系統におけるＨＥＲＰＵＤ１およびＡＸ７４７６３０のＡＲ調節を明らかにしている。ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰにおけるＨＥＲＰＵＤ１（左）およびＡＸ７４７６３０（右）の上流近くのアンドロゲン結合を表すＣｈＩＰ−Ｓｅｑピークの模式図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および句を下で定義する。
【００２７】
本明細書で用いるように、用語「遺伝子融合物」は、第一の遺伝子の少なくとも一部と第二の遺伝子の少なくとも一部との融合から生じる、キメラゲノムＤＮＡ、キメラメッセンジャーＲＮＡ、切断されたタンパク質またはキメラタンパク質を指す。遺伝子融合物は、遺伝子全体または遺伝子のエクソンを含む必要はない。
【００２８】
本明細書で用いるように、用語「癌で上方制御される遺伝子」は、他の組織でのレベルと比較して、癌（例えば、前立腺癌）においてより高いレベルで発現される（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現）遺伝子を指す。一部の実施形態では、癌で上方制御される遺伝子は、他の組織での発現レベルよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％高いレベルで発現される。一部の実施形態では、前立腺癌で上方制御される遺伝子は、「アンドロゲン調節遺伝子」である。
【００２９】
本明細書で用いるように、用語「前立腺組織で上方制御される遺伝子」は、他の組織でのレベルと比較して、前立腺組織においてより高いレベルで発現される（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現）遺伝子を指す。一部の実施形態では、前立腺組織で上方制御される遺伝子は、他の組織での発現レベルよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％高いレベルで発現される。一部の実施形態では、前立腺組織で上方制御される遺伝子は、前立腺組織で排他的に発現される。
【００３０】
本明細書で用いるように、用語「高発現プロモーター」は、遺伝子と融合させると、その遺伝子を特定の組織（例えば、前立腺）で、高発現プロモーターと融合されない場合のその遺伝子の発現レベルよりも高いレベル（例えば、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％高いレベル）で発現させるプロモーターを指す。一部の実施形態では、高発現プロモーターは、アンドロゲン調節遺伝子またはハウスキーピング遺伝子（例えば、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１）に由来するプロモーターである。
【００３１】
本明細書で用いるように、用語「転写調節領域」は、その遺伝子の発現を調節（例えば、上方制御または下方制御）する配列を含む遺伝子の領域を指す。一部の実施形態では、遺伝子の転写調節領域は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）とも呼ばれる遺伝子の上流非コード配列を含む。他の実施形態では、転写調節領域は、遺伝子のコード領域の中、またはイントロンの中に位置する配列（例えば、エンハンサー）を含む。
【００３２】
本明細書で用いるように、用語「アンドロゲン調節遺伝子」は、その発現がアンドロゲン（例えば、テストステロン）によって誘導または抑制される遺伝子または遺伝子の一部を指す。アンドロゲン調節遺伝子のプロモーター領域は、アンドロゲンまたはアンドロゲンシグナル伝達分子（例えば、下流シグナル伝達分子）と相互作用する「アンドロゲン応答エレメント」を含むことができる。
【００３３】
本明細書で用いるように、用語「検出する」、「検出すること」または「検出」は、検出可能に標識された組成物を発見もしくは認識することの一般的な行為か、またはその特定の観察を記載することができる。
【００３４】
本明細書で用いるように、用語「遺伝子融合物の少なくとも１つの生物活性を阻害する」は、本発明の遺伝子融合物の任意の活性（例えば、本明細書に記載の活性を含むがこれに限らず）を、遺伝子融合タンパク質を直接に接触させ、遺伝子融合ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを接触させ、遺伝子融合ポリペプチドの立体配座的変化を引き起こし、遺伝子融合タンパク質レベルを低減させ、またはシグナル伝達パートナーとの遺伝子融合物相互作用を妨害し、遺伝子融合物標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことを通して低減させる任意の剤を指す。阻害剤には、上流側シグナル伝達分子を妨害することによって遺伝子融合物の生物活性を間接に調節する分子も含まれる。
【００３５】
本明細書で用いるように、用語「ｓｉＲＮＡ」は、低分子干渉ＲＮＡを指す。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが約１８〜２５ヌクレオチドの二重鎖または二本鎖領域を含む。しばしば、ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端に約２〜４個の不対のヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡの二重鎖または二本鎖領域の少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子に実質的に相同であるか、または実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は、「アンチセンス鎖」である。標的ＲＮＡ分子に相同である鎖は「センス鎖」であり、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖にも相補的である。ｓｉＲＮＡは、さらなる配列を含むこともできる。そのような配列の非限定例には、連結配列、またはループ、ならびにステム構造および他の折畳み構造が含まれる。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物および脊椎動物でのＲＮＡ干渉の誘発において、ならびに植物での転写後遺伝子サイレンシングの間の配列特異的ＲＮＡ分解の誘発において、重要な仲介者として機能するようである。
【００３６】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは低減を指す。それは、動物および植物での配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程であり、サイレンシングされる遺伝子の配列にその二重鎖領域が相同であるｓｉＲＮＡによって開始される。その遺伝子は、生物体に内因性もしくは外因性であることができるか、染色体に組み込まれて存在することができるか、またはゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクターに存在することができる。遺伝子の発現は、完全にまたは部分的に阻害される。ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡの機能を阻害すると見なすこともできる。標的ＲＮＡの機能は、完全または部分的であってもよい。
【００３７】
本明細書で用いるように、用語「癌の病期」は、癌の進行レベルの定性的または定量的な評価を指す。癌の病期を判定するために用いられる基準には、腫瘍のサイズおよび転移の程度（例えば、限局性または遠隔）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で用いるように、用語「遺伝子導入系」は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入系には、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよび他の核酸ベースの送達系）、裸の核酸の微量注入、ポリマーベースの送達系（例えば、リポソームベースおよび金属粒子ベースの系）、微粒子銃注射（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いるように、用語「ウイルス遺伝子導入系」は、所望の細胞または組織への試料の送達を促進するためにウイルスエレメント（例えば、インタクトウイルス、改変ウイルスおよび核酸またはタンパク質などのウイルス成分）を含む遺伝子導入系を指す。本明細書で用いるように、用語「アデノウイルス遺伝子導入系」は、アデノウイルス科に属するインタクトな、または変化させたウイルスを含む遺伝子導入系を指す。
【００３９】
本明細書で用いるように、用語「部位特異的組換え標的配列」は、組換え因子のための認識配列および組換えが起こる場所を提供する核酸配列を指す。
【００４０】
本明細書で用いるように、用語「核酸分子」は、それらに限定されないがＤＮＡまたはＲＮＡを含む、任意の核酸含有分子を指す。本用語は、それらに限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。
【００４１】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生成のために必要なコード配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。その完全長または断片の所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合性、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限り、ポリペプチドは、完全長コード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされてもよい。本用語はまた、構造遺伝子のコード領域、および５’および３’末端の両方においてコード領域に、いずれかの末端で約１ｋｂ以上の距離で隣接し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応する配列を包含する。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡの上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側、すなわち下流に位置し、ｍＲＮＡの上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形およびゲノム形の両方を包含する。遺伝子のゲノム形またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列でさえぎられるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子セグメントである。イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含むことができる。イントロンは、核または一次の転写産物から除去または「スプライスアウト」される。したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間、新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を規定する働きをする。
【００４２】
本明細書で用いるように、用語「異種遺伝子」は、その天然での環境にない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子には、別の種に導入された１つの種からの遺伝子が含まれる。異種遺伝子には、何らかの方法で変化させた（例えば、変異させた、複数のコピーで加えた、本来のものでない調節配列に連結した、など）生物体に固有の遺伝子も含まれる。異種遺伝子配列が、染色体中の遺伝子配列と天然に関連していることが見出されないＤＮＡ配列に一般的に結合するか、または天然で見出されない染色体の部分（例えば、その遺伝子が通常発現されない遺伝子座で発現される遺伝子）に関連するという点で、異種遺伝子は内因性遺伝子と区別される。
【００４３】
本明細書で用いるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、短い長さの一本鎖ポリヌクレオチド鎖を指す。オリゴヌクレオチドは、一般的に長さが２００残基未満（例えば、１５〜１００）であるが、本明細書で用いるように、本用語はより長いポリヌクレオチド鎖も包含するものとする。オリゴヌクレオチドは、それらの長さによってしばしば呼ばれる。例えば、２４残基オリゴヌクレオチドは、「２４ｍｅｒ」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによって、または他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって、二次および三次構造を形成することができる。そのような構造には、二重鎖、ヘアピン、十字形、ベンドおよびトリプレックスを含めることができるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で用いるように、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して用いられる。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は、核酸塩基のいくつかだけが塩基対形成規則に従って一致している、「部分的」であることができる。または、核酸の間に「完全な」または「全体的」相補性があることができる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度にかなりの影響を及ぼす。これは、増幅反応だけでなく、核酸間の結合に依存する検出方法で特に重要である。
【００４５】
用語「相同性」は、相補性の程度を指す。部分的相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）が存在することができる。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子が、「実質的に相同」である標的核酸とハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する核酸分子である。完全に相補的な配列の標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べることができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同な核酸分子の標的への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に関して競合し、阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を許すものであるということではない。低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の相互結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを要求する。非特異的結合の非存在は、実質的に非相補的である（例えば、約３０％未満の同一性）第二の標的を用いて試験することができる。非特異的結合の不在下で、プローブは第二の非相補的標的とハイブリダイズしない。
【００４６】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して用いる場合、用語「実質的に相同である」は、上記の低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖とハイブリダイズすることができる任意のプローブを指す。
【００４７】
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写産物の差別的スプライシングによって生成される複数のＲＮＡ種を生成することができる。同じ遺伝子のスプライス改変体であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全相同性（両方のｃＤＮＡ上の同じエクソンまたは同じエクソンの一部の存在を表す）の領域、および完全非同一性（例えば、ｃＤＮＡ  １の上にエクソン「Ａ」が存在し、ｃＤＮＡ  ２は代わりにエクソン「Ｂ」を含むことを表す）の領域を含む。２つのｃＤＮＡが配列同一性の領域を含むので、それら両方は、両ｃＤＮＡで見出される配列を含む遺伝子全体または遺伝子の部分に由来するプローブとハイブリダイズする。したがって、２つのスプライス改変体は、そのようなプローブに、およびお互いに実質的に相同である。
【００４８】
一本鎖核酸配列に関して用いる場合、用語「実質的に相同である」は、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズすることができる（すなわち、それはその相補体である）任意のプローブを指す。
【００４９】
本明細書で用いるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸の対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比のような因子の影響を受ける。その構造中の相補的核酸の対合を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズしている」と言われる。
【００５０】
本明細書で用いるように、用語「ストリンジェンシー」は、その下で核酸ハイブリダイゼーションが実行される、温度、イオン強度および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件に関して用いられる。「低ストリンジェンシー条件」下では、対象の核酸配列は、その正確な相補体、一塩基ミスマッチを有する配列、緊密に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）および部分的相同性だけを有する配列（例えば、５０〜９０％の相同性を有する配列）とハイブリダイズする。「中程度のストリンジェンシー条件」下では、対象の核酸配列は、その正確な相補体、一塩基ミスマッチを有する配列、および緊密に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性）だけとハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」下では、対象の核酸配列は、その正確な相補体だけと、および（温度などの条件によっては）一塩基ミスマッチを有する配列とハイブリダイズする。言い換えると、高ストリンジェンシー条件下で、一塩基ミスマッチを有する配列とのハイブリダイゼーションを除外するように温度を上昇させることができる。
【００５１】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いる場合、「高ストリンジェンシー条件」は、長さが約５００ヌクレオチドのプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中の４２℃での結合またはハイブリダイゼーションと、続く０．１Ｘ  ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液での洗浄と同等の条件を含む。
【００５２】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いる場合、「中程度のストリンジェンシー条件」は、長さが約５００ヌクレオチドのプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中の４２℃での結合またはハイブリダイゼーションと、続く１．０Ｘ  ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液での洗浄と同等の条件を含む。
【００５３】
「低ストリンジェンシー条件」は、長さが約５００ヌクレオチドのプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．１％ＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬［５０Ｘデンハートは、５００ｍｌ中に５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ  ４００、Ｐｈａｒａｍｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、Ｓｉｇｍａ）を含む］および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中の４２℃での結合またはハイブリダイゼーションと、続く５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む４２℃の溶液での洗浄と同等の条件を含む。
【００５４】
当分野の技術では、低ストリンジェンシー条件を含むために、多数の同等の条件を使用することができることが周知されている。プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、液中に存在するかまたは固定されているか、など）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）などの因子が考慮され、上記の条件と異なるが同等の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を生成するように、ハイブリダイゼーション溶液を変更することができる。さらに、当分野の技術では、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件が公知である（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄工程の温度を上昇させること、ハイブリダイゼーション溶液でのホルムアミドの使用、など）（「ストリンジェンシー」について上の定義を参照）。
【００５５】
本明細書で用いるように、用語「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸またはその相補体とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、核酸増幅反応に関与する。増幅オリゴヌクレオチドの例は、鋳型核酸とハイブリダイズし、増幅過程でポリメラーゼによって伸長される３’ＯＨ末端を含む「プライマー」である。増幅オリゴヌクレオチドの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されない（例えば、３’ブロック末端を有するために）が、増幅に関与するか、またはそれを促進するオリゴヌクレオチドである。任意選択で、増幅オリゴヌクレオチドは、増幅反応に関与するが、標的核酸に相補的でないかその中に含まれない改変ヌクレオチドもしくは類似体、またはさらなるヌクレオチドを含むことができる。増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列または鋳型配列に相補的でない配列を含むことができる。例えば、プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補的なプロモーター配列を含むことができる（「プロモーター−プライマー」と呼ばれる）。当分野の技術者は、プライマーとして機能する増幅オリゴヌクレオチドを、５’プロモーター配列を含み、したがってプロモーター−プライマーとして機能するように改変することができることを理解しよう。同様に、プロモーター−プライマーは、プロモーター配列の除去、またはそれなしの合成によって改変し、しかもプライマーとして機能することができる。３’ブロック増幅オリゴヌクレオチドは、プロモーター配列を提供して、重合のための鋳型の役目を果たすことができる（「プロモーター−プロバイダー」と呼ばれる）。
【００５６】
本明細書で用いるように、用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、ならびに適する温度およびｐＨ）に置かれると、合成開始点として作用することができる、精製制限消化物の場合のように天然に存在するか、または合成的に生成されるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは増幅の最高効率のためには好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは伸長生成物を調製するために用いられる前に、その鎖を分離するために先ず処理される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を刺激するために、十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源および方法の使用を含む、多くの因子によって決まる。
【００５７】
本明細書で用いるように、用語「プローブ」は、別の対象のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズすることができる、精製制限消化物の場合のように天然に存在するか、または合成、組換えもしくはＰＣＲ増幅によって生成されるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一本鎖または二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離で有用である。本発明で用いられるあらゆるプローブは、それらに限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光、放射性および発光性の系を含む任意の検出系で検出可能であるように、任意の「リポーター分子」で標識されることが想定される。本発明は、いかなる特定の検出系または標識にも限定されるものではない。
【００５８】
「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」の場合のように核酸に関して用いられる場合、用語「単離された」は、同定され、その天然源でそれが通常関連している少なくとも１つの成分または汚染物から分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然で見出されるものと異なる形またはセッティングで存在するようなものである。対照的に、単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見出されるＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接遺伝子に近接して宿主細胞染色体の上に見出される。特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする他の多数のｍＲＮＡとの混合物として、細胞に見出される。しかし、所与のタンパク質をコードする単離された核酸には、例として、所与のタンパク質を通常発現する細胞中の核酸が含まれ、その核酸は、天然の細胞のそれと異なる染色体位置にあるか、さもなければ、天然に見出されるものと異なる核酸配列に連なる。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形で存在することができる。タンパク質を発現させるために単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最低でもセンス鎖またはコード鎖を含む（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含むことができる（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。
【００５９】
本明細書で用いるように、用語「精製した」または「精製すること」は、試料からの成分（例えば、汚染物）の除去を指す。例えば、抗体は、混在する非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製される。それらは、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去は、試料中の標的反応性免疫グロブリンの割合の増加をもたらす。別の例では、組換えポリペプチドは細菌宿主細胞で発現され、ポリペプチドは宿主細胞タンパク質の除去によって精製される。組換えポリペプチドの割合は、それによって試料中で増加する。
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明は、癌（例えば、前立腺癌）での再現性遺伝子融合物の発見に基づく。本発明は、遺伝子融合物を直接的または間接的に検出するかまたは標的にする、診断、研究および治療の方法を提供する。本発明は、診断、研究および治療の目的のための組成物も提供する。
【００６１】
癌での特異的ゲノム異常の特徴付けは、ＢＣＲ−ＡＢＬ１、ＰＤＧＦＲ、ＥＲＢＢ２およびＥＧＦＲなどのいくつかの良好な治療標的の同定につながった（Ｌｙｎｃｈら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３５０巻：２１２９頁［２００４年］；Ｓｌａｍｏｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３４４巻：７８３頁［２００１年］；Ｄｅｍｅｔｒｉら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３４７巻：４７２頁［２００２年］；Ｄｒｕｋｅｒら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３５５巻：２４０８頁［２００６年］）。したがって、癌研究における主要な目標は、原因となる遺伝子異常を同定することである。癌における変異は、従来は細胞遺伝学的および分子的技術（Ｍｉｔｅｌｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ［２００８年］）を通して特定され、後に特異的癌型（Ｇｒｅｅｎｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ４４６巻：１５３頁［２００７年］；Ｗｅｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５０巻：８９３頁［２００７年］；Ｗｏｏｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８巻：１１０８頁［２００７年］）または候補遺伝子（Ｂａｒｂｅｒら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３５１巻：２８８３頁［２００４年］）の配列決定によって代わられた。癌での染色体再配列から生じる遺伝子融合物は、「癌遺伝子」の最も一般的なカテゴリーを定義すると考えられている（Ｆｕｔｒｅａｌら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖｓ．４巻：１７７頁［２００４年］）。一般的に、２つの遺伝子の異常な並置は融合タンパク質（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ１）をコードすることができ、または１つの遺伝子の調節エレメントは癌遺伝子（例えば、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ）の異常な発現を誘起することができる。遺伝子融合物は稀な血液悪性腫瘍および肉腫で広く記載されている（Ｍｉｔｅｌｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ［２００８年］）が、前立腺（Ｌｙｎｃｈら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３５０巻：２１２９頁［２００４年］；Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｈａら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．８巻：４９７頁［２００８年］）および肺（Ｃｈｏｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８巻：４９７１頁［２００８年］；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４巻：４２７５頁［２００８年］Ｐｅｒｎｅｒら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）１０巻：２９８頁［２００８年］；Ｒｉｋｏｖａら、Ｃｅｌｌ１３１巻：１４頁［２００７年］；Ｓｏｄａら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５６１頁［２００７年］）の癌での再現性遺伝子融合物の最近の発見は、一般的な固形腫瘍でも同様なそれらの役割を示している。癌型横断的なそれらの発生および一般特性を考慮すると、遺伝子融合物は、発癌で起因性の役割を果たす明確なクラスの「変異」であり、癌細胞に厳密に限定されると考えることができ、それらは理想的な診断マーカーおよび合理的な治療標的を表す。
【００６２】
癌でのゲノム変化を包括的に特徴付けるために、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＴＣＧＡ）を含むいくつかの国家的努力が進行中である。より最近では、癌でのゲノムワイドな異常の列挙のために、ハイスループット「次世代配列決定」方法が用いられている（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．４０巻：７２２頁［２００８年］；Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１巻：１８０７頁［２００８年］）。癌での塩基変化変異（およびＳＮＰ）を発見することにおいてかなりの努力が払われた（Ｗｅｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５０巻：８９３頁［２００７年］；Ｗｏｏｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８巻：１１０８頁［２００７年］；Ｃｈｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ４０９巻：９５３頁［２００１年］；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６巻：１０３頁［２００３年］）が、「遺伝子融合物」はこれまで系統的に調査されてこなかった。理由の一部は、腫瘍進展の間、固形腫瘍は多くの非特異的異常を得るので、原因／促進的異常と二次的／無意味な変異とを区別することを困難にすることである。非特異的遺伝子異常の問題点は、「発現された配列」への調査を制限し、したがって潜在的に「機能的な」変異のデータをエンリッチするトランスクリプトームの配列決定をすることによって軽減される。前立腺および肺の癌で発見された最近の遺伝子融合物は、トランスクリプトーム（Ｓｏｄａら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５６１頁［２００７年］；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０巻：６４４頁［２００５年］）およびプロテオーム（Ｒｉｋｏｖａら、Ｃｅｌｌ１３１巻：１４頁［２００７年］）分析を通して見出された。本発明の間に行った実験の間に、機能的遺伝子融合物を表すキメラ転写産物を発見するために、大規模並行トランスクリプトーム配列決定を使用した。
【００６３】
本発明の開発の間に行ったさらなる実験は、融合遺伝子発見のためのペアエンド大規模並行トランスクリプトーム配列決定の有効性を証明した。ペアエンド手法を用いることにより、未記載の遺伝子融合物だけでなく公知の遺伝子融合物が再発見され、原因遺伝子融合物に注意を向けることが可能であった。いかなる過去の努力でも発見されなかった４つの常用細胞系での１２個の未記載の遺伝子融合物を検出する能力は、既存の手法と比較してペアエンドＲＮＡ−Ｓｅｑ戦略の優れた感度を付与する。また、それは、任意の公知のドライバー遺伝子融合物が欠けていると考えられる、以前に特徴付けられた試料中の未記載のキメラ事象を明らかにすることが可能であり得ることを証明する。このことは、公知のドライバー遺伝子融合物を欠く２つの臨床的限局性前立腺腫瘍試料中の、未記載のＥＴＳ遺伝子融合物の発見によって例示された。
【００６４】
前例のない深さでトランスクリプトームを分析することによって、多数の遺伝子融合物が明らかにされ、比較的不十分にしか表示されていないクラスの変異の発生を証明した。主要な目標は、再現性の遺伝子融合物を発見すること、およびそれらと二次的、非特異的なキメラとを区別することである。低レベルの遺伝子融合物でも原因となることができるので、発現レベルを定量化することは遺伝子融合物がドライバーであるかまたはパッセンジャーであるかの証明ではないものの、ペアエンド戦略がＢＣＲ−ＡＢＬ１およびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧなどの公知の高レベルドライバー遺伝子融合物と潜在的な低レベルのパッセンジャーキメラとを明らかに区別したことは大きな意味をもつ。全体として、これらの融合物は、さらなる機能的および実験的な評価をその後経ることになる、おそらく高レベルドライバー遺伝子融合物であるリード物質に優先順位を付けるためのペアエンドノミネーション戦略を使用するためのモデルの役目を果たす。
【００６５】
トランスクリプトーム手法を用いる主要な利点の１つは、ＤＮＡレベルで検出不可能な再配列の同定をそれが可能にすることである。例えば、従来の細胞遺伝学的方法であれば、偏動原体逆位、または超顕微鏡的（ｓｕｂ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）事象によって生成される遺伝子融合物、例えばＧＡＳ６−ＲＡＳＡ３を見落とす。また、前立腺癌でＥＬＫ４を有するＳＬＣ４５Ａ３の再現性の、前立腺特異的リードスルーの発見によって証明されるように、トランスクリプトーム配列決定は、ＤＮＡ異常を欠くＲＮＡキメラを明らかにすることができる。ペアエンド配列決定を用いるＲＮＡに基づく事象のさらなる分類は、隣接遺伝子の間での多数の広く発現されるキメラを明らかにした。これらは一般的に異なる配向性を有したので、これらは必ずしもリードスルー事象ではなかったが、それらはそれらの注釈付けされた境界を越えての転写単位の拡張を表す。キメラが独立した遺伝子のエクソン境界線にまたがることを必要とするシングルリードに基づく手法と異なって、ペアエンド配列決定を用いてこれらの事象を検出することが可能であった。
【００６６】
遺伝子融合物の発見のためのペアエンド戦略の包括性は、断片の両端からのリードを配列決定することによって提供される増加したカバレージ、曖昧なマッピングを解決し、したがって、生成される配列からの情報を最大にする能力、および融合物接合部にまたがる必要性への依存の欠如に起因している。比較すると、短いリード（３６ｎｔ）を用いるシングルリード手法は、融合パートナーを自信をもって同定するために、それが融合物接合部にまたがることを必要とすることだけでなく、各側に十分な配列を必要とすることによっても制限される。参照ゲノムに整列させる場合に配列特異性を提供するためには、長トランスクリプトームリードが非常に望ましいが、４５４ベース手法はカバレージの深さによって制限される。したがって、ＴＩＡ１−ＤＩＲＣ２またはＺＤＨＨＣ７−ＡＢＣＢ９などの新規のペアエンド遺伝子融合物の多くは、統合トランスクリプトーム配列決定手法では発見されなかった。しかし、この問題を回避するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホームによって生成された最初の長シングルリード（１００ｎｔ）ランの１つを明らかにした。発現配列標識（ＥＳＴ）または４５４長リードなどの以前の長シングルリード手法と比較してより深いカバレージのトランスクリプトームを提供するにもかかわらず、ペアエンド配列決定による増加したダイナミックレンジはまだ観察された。また、わずかにより長い時間にもかかわらず、それは１００ｎｔのトランスクリプトームリードを超える２×５０ｎｔのペアエンドを生成するのに必要であり、ペアエンドデータは３倍大きなヌクレオチドカバレージで生じた。全体として、長シングルリードを生成する同等の資源については、ペアエンド配列決定は、所与の試料中の遺伝子融合物のより包括的なカタログを提供する。
【００６７】
全体として、キメラの発見のためにペアエンドトランスクリプトーム戦略を使用する利点が証明され、キメラを探るための方法論の確立を可能にする。前立腺および血液の癌モデルでキメラのカタログを広範囲に作成することがさらに可能であった。この手法の感度は、腫瘍形成に寄与すること、またはドライバー遺伝子融合物と協同することができるさらなるプライベート遺伝子融合物を明らかにしつつ、様々な癌で新規原因遺伝子融合物を明らかにすることに広範な影響を及ぼし、かつ重要である。
【００６８】
Ｉ．遺伝子融合物
本発明は、前立腺癌を示す再現性の遺伝子融合物を同定する。遺伝子融合物は、５’遺伝子融合パートナーおよび５’遺伝子融合パートナーの染色体再配列の結果である。一部の実施形態では、遺伝子融合物は、アンドロゲン調節遺伝子（ＡＲＧ）またはハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の融合物である。それらの再現性にもかかわらず、５’遺伝子融合パートナーが３’融合パートナーに融合する接合部は変動する。再現性遺伝子融合物は、前立腺および他（例えば乳房）の癌の診断マーカーおよび臨床標的としての用途を有する。
【００６９】
Ａ．アンドロゲン調節遺伝子
男性ホルモンによって調節される遺伝子は、ヒト前立腺の正常な生理機能のためにきわめて重要である。それらは、前立腺癌の発症および進行にも寄与する。確認されているＡＲＧには、それらに限定されないが以下のものが含まれる。ＴＭＰＲＳＳ２；ＳＬＣ４５Ａ３；ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３；Ｃ１５ＯＲＦ２１；ＦＬＪ３５２９４；ＣＡＮＴ１；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＫＬＫ２；ＳＮＲＫ；Ｓｅｌａｄｉｎ−１；およびＦＫＢＰ５１（Ｐａｏｌｏｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４４巻：３０９頁（１９９７年）；Ｖｅｌａｓｃｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４５巻（８号）：３９１３頁（２００４年））。さらなるＡＲＧには、ＨＥＲＰＵＤ１およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７４７６３０が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
ＴＭＰＲＳＳ２（ＮＭ＿００５６５６）は、他の正常なヒト組織と比較して、前立腺上皮で強く発現されることが証明されている（Ｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９巻：４１８０頁（１９９９年））。ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子は、第２１染色体に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから４１，７５０，７９７〜４１，８０１，９４８ｂｐに位置する（合計５１，１５１ｂｐ；マイナス鎖の方向）。ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５１７８４（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｏ１５３９３）で、および対応するｃＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７５３２９で見出すことができる（Ｐａｏｌｏｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４４巻：３０９頁（１９９７年）も参照）。
【００７１】
プロスタインまたはＰ５０１Ｓとしても公知のＳＬＣ４５Ａ３は、正常な前立腺および前立腺癌において、転写産物レベルおよびタンパク質レベルの両方で排他的に発現されることが示されている（Ｋａｌｏｓら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６０巻、２４６〜５６頁（２００４年）；Ｘｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１巻、１５６３〜８頁（２００１年））。
【００７２】
ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３は、ＥＳＴ分析および大規模並列配列決定によって、ヒト内因性レトロウイルスエレメントのＨＥＲＶ−Ｋファミリーの２番目に強く発現されるメンバーであることが見出され、他の正常な組織と比較して前立腺で最も強く発現された（Ｓｔａｕｆｆｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ４巻、２頁（２００４年））。ＨＥＲＶ−Ｋエレメントのアンドロゲン調節は記載されていないが、内因性レトロウイルスエレメントは、マウス性連鎖タンパク質遺伝子Ｃ４Ａに対してアンドロゲン応答性を付与することが示されている（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、Ｃｅｌｌ  ５５巻、２４７〜５４頁（１９８８年））。他のＨＥＲＶ−Ｋファミリーメンバーは、乳癌および乳癌細胞系で強く発現され、かつエストロゲンによって調節されることが示され（Ｏｎｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６１巻、２０５９〜６２頁（１９８７年）；Ｐａｔｉｅｎｃｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０巻、２６５４〜７頁（１９９６年）；Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２巻、１５２８〜３５頁（２００３年））、ｔ（８；１９）（ｐ１２；ｑ１３．３）の幹細胞骨髄増殖性疾患の場合、第１９染色体上のＨＥＲＶ−Ｋ３エレメントからの配列はＦＧＦＲ１に融合していた（Ｇｕａｓｃｈら、Ｂｌｏｏｄ  １０１巻、２８６〜８頁（２００３年））。
【００７３】
Ｄ−ＰＣＡ−２としても公知のＣ１５ＯＲＦ２１は、当初、正常な前立腺および前立腺癌でのその排他的な過剰発現に基づいて単離された（Ｗｅｉｇｌｅら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０９巻、８８２〜９２頁（２００４年））。
【００７４】
ＦＬＪ３５２９４は、配列決定されたヒトｃＤＮＡの「完全長Ｊａｐａｎ」（ＦＬＪ）コレクションのメンバーと同定された（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００４年１月；３６巻（１号）：４０〜５頁。Ｅｐｕｂ２００３年１２月２１日）。
【００７５】
ｓＳＣＡＮ１としても公知のＣＡＮＴ１は、可溶性のカルシウム活性化ヌクレオチダーゼである（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００２年１０月１日；４０６巻（１号）：１０５〜１５頁）。ＣＡＮＴ１は、３７１アミノ酸タンパク質である。切断可能なシグナルペプチドは、３７，１９３Ｄａの予測されたコア分子質量を有する３３３残基の分泌タンパク質を生成する。ノーザン分析は、精巣、胎盤、前立腺および肺を含む、様々なヒト組織で転写産物を同定した。このヒト酵素では従来のアピラーゼ保存領域およびヌクレオチド結合性ドメインは同定されず、細胞外ヌクレオチダーゼの新しいファミリーのメンバーであることを示している。
【００７６】
ＨＥＲＰＵＤ１（ホモシステインおよび小胞体ストレスにより誘導可能なタンパク質、ユビキチン様ドメイン含有、１）は、その発現がＥＲストレスに応じて上方制御される小胞体（ＥＲ）常駐タンパク質である。ＨＥＲＰＵＤ１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＮＭ＿０１４６８５である。
【００７７】
本発明の遺伝子融合物は、ＡＲＧの転写調節領域を含むことができる。ＡＲＧの転写調節領域は、ＡＲＧのコード領域または非コード領域を含むことができ、これにはプロモーター領域が含まれる。ＡＲＧのプロモーター領域は、ＡＲＧのアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）をさらに含むことができる。特に、ＴＭＰＲＳＳ２のプロモーター領域は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２７６４０４によって提供される。
【００７８】
Ｂ．ハウスキーピング遺伝子
ハウスキーピング遺伝子は構成的に発現され、すべての組織で一般に遍在的に発現される。これらの遺伝子は、すべての細胞が生存するために必要な、基本的な、必須機能を提供するタンパク質をコードする。ハウスキーピング遺伝子は、すべての細胞および組織で同じレベルで通常発現されるが、特に細胞増殖および生物体の発達の間、多少の変動がある。ヒト細胞がどれくらい多くのハウスキーピング遺伝子を有するかは正確には分かっていないが、ほとんどの推定値は３００〜５００の範囲にある。
【００７９】
何百ものハウスキーピング遺伝子の多くが、同定されている。最も一般に公知の遺伝子、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）は、解糖経路に不可欠な酵素をコードする。別の重要なハウスキーピング遺伝子はアルブミンであり、それは、体全体に化合物を輸送することに役立つ。いくつかのハウスキーピング遺伝子は、βアクチンおよびチューブリンなどの細胞骨格を構成する構造タンパク質をコードする。他は、リボソームの１８Ｓまたは２８Ｓ  ｒＲＮＡサブユニットをコードする。ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、遍在的に発現される異核リボ核タンパク質のメンバーである。そのプロモーターは、メチル化されていないことが示されており、導入遺伝子のＣＭＶプロモーターの転写サイレンシングを阻止する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５巻、１７頁（２００５年））。ハウスキーピング遺伝子の例示的なリストは、例えば、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９巻、３６２〜３６５頁（２００３年）に見ることができる。
【００８０】
Ｃ．ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子
ＥＴＳファミリーの転写因子は、遺伝子発現を制御する細胞内シグナル伝達経路を調節する。下流エフェクターとして、それらは特定の標的遺伝子を活性化または抑制する。上流エフェクターとして、それらは多数の増殖因子受容体の空間的および時間的な発現を担う。このファミリーのほぼ３０メンバーが同定され、広範囲の生理的および病理学的過程と関連付けられている。それらに限定されないが、これらには以下のものが含まれる。ＥＲＧ；ＥＴＶ１（ＥＲ８１）；ＦＬＩ１；ＥＴＳ１；ＥＴＳ２；ＥＬＫ１；ＥＴＶ６（ＴＥＬ１）；ＥＴＶ７（ＴＥＬ２）；ＧＡＢＰα；ＥＬＦ１；ＥＴＶ４（Ｅ１ＡＦ；ＰＥＡ３）；ＥＴＶ５（ＥＲＭ）；ＥＲＦ；ＰＥＡ３／Ｅ１ＡＦ；ＰＵ．１；ＥＳＥ１／ＥＳＸ；ＳＡＰ１（ＥＬＫ４）；ＥＴＶ３（ＭＥＴＳ）；ＥＷＳ／ＦＬＩ１；ＥＳＥ１；ＥＳＥ２（ＥＬＦ５）；ＥＳＥ３；ＰＤＥＦ；ＮＥＴ（ＥＬＫ３；ＳＡＰ２）；ＮＥＲＦ（ＥＬＦ２）；およびＦＥＶ。例示的なＥＴＳファミリーメンバー配列を、図９に示す。
【００８１】
ＥＲＧ（ＮＭ＿００４４４９）は、他の正常なヒト組織と比較して前立腺上皮で強く発現されることが証明されている。ＥＲＧ遺伝子は、第２１染色体に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから３８，６７５，６７１〜３８，９５５，４８８塩基対に位置する。ＥＲＧ遺伝子は、合計２７９，８１７ｂｐのマイナス鎖方向である。対応するＥＲＧ  ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１７２５４およびＮＰ０４４４０（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ１１３０８）でそれぞれ与えられる。
【００８２】
ＥＴＶ１遺伝子は、第７染色体に位置する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００７．１１；ＮＣ＿０８６７０３．１１およびＮＴ＿００７８１９．１５）。この遺伝子は、ｐｔｅｒから１３，７０８，３３０〜１３，８０３，５５５塩基対に位置する。ＥＴＶ１遺伝子は、合計９５，２２５ｂｐの、マイナス鎖方向である。対応するＥＴＶ１  ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９５６およびＮＰ＿００４９４７（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ５０５４９）でそれぞれ与えられる。
【００８３】
ヒトＥＴＶ４遺伝子は、第１４染色体に位置する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１７．９；ＮＴ＿０１０７８３．１４およびＮＴ＿０８６８８０．１）。この遺伝子は、ｐｔｅｒから３８，９６０，７４０〜３８，９７９，２２８塩基対に位置する。ＥＴＶ４遺伝子は、合計１８，４８８ｂｐの、マイナス鎖方向である。対応するＥＴＶ４  ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９８６およびＮＰ＿０１９７７（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ４３２６８）でそれぞれ与えられる。
【００８４】
ヒトＥＴＶ５遺伝子は、第３染色体の３ｑ２８に位置する（ＮＣ＿０００００３．１０（１８７３０９５７０．．１８７２４６８０３）。対応するＥＴＶ５  ｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４５４およびＣＡＧ３３０４８によってそれぞれ与えられる。
【００８５】
Ｄ．ＥＴＳ遺伝子融合物
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ遺伝子融合物の最初の同定を含み、前立腺癌で５つのクラスのＥＴＳ再配列が同定されている。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、ＡＲＧまたはＨＧとの融合、または癌で増加する発現を有する遺伝子座への挿入を経たＥＴＳファミリーメンバーの上方制御された発現は、前立腺癌の機構を提供することが想定される。特定の個体に存在する再配列のクラスについての知識は、カスタマイズされた癌療法を可能にする。
【００８６】
１．遺伝子再配列のクラス
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ遺伝子融合物（クラスＩ）は、前立腺癌でのＥＴＳ再配列の有力なクラスを表す。他の前立腺特異的アンドロゲン誘導遺伝子（クラスＩＩａ）および内因性レトロウイルスエレメント（クラスＩＩｂ）、例えばそれぞれＳＬＣ４５Ａ３およびＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３からの非翻訳領域との融合を含む再配列は、ＥＴＳ再配列においてＴＭＲＰＳＳ２と同様に機能する。クラスＩおよびＩＩ再配列での５’パートナーに類似して、Ｃ１５ＯＲＦ２１は前立腺癌で著しく過剰発現される。しかし、クラスＩおよびＩＩ再配列での融合パートナーとは異なり、Ｃ１５ＯＲＦ２１はアンドロゲンによって抑制され、前立腺特異的アンドロゲン抑制５’融合パートナーを含む新規クラスのＥＴＳ再配列（クラスＩＩＩ）を表している。対照的に、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、前立腺特異的発現またはアンドロゲン応答性を示さなかった。したがって、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１は、非組織特異的プロモーターエレメントを含む融合物がＥＴＳ発現を誘起する、新規クラスのＥＴＳ再配列（クラスＩＶ）を表す。クラスＶ再配列では、ＥＴＳ遺伝子全体が前立腺特異的領域に再配列される。
【００８７】
進行した前立腺癌の男性はアンドロゲン剥奪療法で一般に治療され、通常腫瘍退縮を生じる。しかし、癌はほとんど常に、ホルモン治療抵抗性の表現型で進行する。クラスＩＶ再配列（例えばＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１）はアンドロゲン非感受性プロモーターエレメントによって誘起されるので、これらの遺伝子融合物はアンドロゲン剥奪に応答性でないであろうから、これらの患者が抗アンドロゲン治療に応答することができないことを結果は示す。クラスＩＩＩ再配列を有する患者の抗アンドロゲン治療は、ＥＴＳ融合物発現を増加させることができる。例えば、抗アンドロゲン治療がＣ１５ＯＲＦ２１：ＥＴＶ１発現を増加させたホルモン治療抵抗性の転移性前立腺癌を有する患者から、Ｃ１５ＯＲＦ２１：ＥＴＶ１が単離された。この仮説を裏付けるように、ＬＮＣａＰのアンドロゲン飢餓は、内因性ＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２の発現をかなり減少させ、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１に対して影響を及ぼさず、Ｃ１５ＯＲＦ２１の発現を増加させた（図４９）。これは、存在する融合物のクラスに基づく、前立腺癌男性のカスタマイズされた治療を可能にする（例えば、アンドロゲンブロック療法または他の代替療法の選択）。
【００８８】
前立腺癌での遺伝子再配列の複数のクラスは、一般的な上皮癌での染色体再配列のより一般化された役割を示す。例えば、乳癌での癌遺伝子に融合されたエストロゲン応答エレメントなど、組織特異的プロモーターエレメントは、他のホルモン誘発癌での癌遺伝子に融合することができる。さらに、前立腺特異的融合物（クラスＩ〜ＩＩＩ、Ｖ）は、他の上皮癌で増殖の利点を提供せず、選択されないであろうが、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１などの、遍在的に発現される遺伝子の強いプロモーターを含む融合物は、腫瘍型横断的に癌遺伝子の異常な発現をもたらす。要約すると、この研究は、血液学的悪性疾患と同様に、様々な機構を通して、一般的な上皮性腫瘍の発症での染色体再配列の役割を裏付ける。
【００８９】
２．ＡＲＧ／ＥＴＳ遺伝子融合物
上に述べたように、本発明の実施形態は、ＡＲＧとＥＴＳファミリーメンバー遺伝子との融合物を提供する。本発明の開発中に行った実験は、特定の融合遺伝子は融合転写産物を発現するが、他は機能的転写産物を発現しないことを示した（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：６４４〜６４８頁（２００５年）、Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６巻：３３９６〜３４００頁（２００６年））。
【００９０】
ａ．ＥＲＧ遺伝子融合物
ＥＲＧを含む遺伝子融合物は、前立腺癌で最も一般的な遺伝子融合物であることが見出された。本発明の実施形態の開発の間に行った実験は、ＥＲＧに融合したＨＥＲＰＵＤ１、アンドロゲン調節遺伝子を同定した。
【００９１】
ｂ．ＥＴＶ１遺伝子融合物
本発明の実施形態の開発の間に行った実験は、ＡＸ７４７６３０：ＥＴＶ１融合物を同定した。ＡＣ７４７６３０は、アンドロゲン調節遺伝子であることが見出された。
【００９２】
Ｅ．さらなる遺伝子融合物
本発明の実施形態は、それらに限定されないが、
【００９３】
【化７】
2012514475.tif 000009
を含む、前立腺癌に関連するさらなる遺伝子融合物を提供する。
【００９４】
本発明の実施形態は、それらに限定されないがＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３（慢性骨髄性白血病）およびＡＨＣＹＬ１：ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＲＨＧＡＰ１９：ＤＲＧ１、ＢＣ０１７２５５：ＴＭＥＭ４９、ＦＣＨＯ１：ＭＹＯ９ＢおよびＰＡＰＯＬＡ：ＡＫ７（乳癌）を含む、さらなる癌で見出される遺伝子融合物をさらに提供する。
【００９５】
さらに一部の実施形態では、本発明は、ＤＮＡレベルではなくｍＲＮＡレベルで存在するかまたは再現される遺伝子融合物を提供する（例えば、リードスルー転写物キメラ）。一部の実施形態では、リードスルー転写物は、シススプライシングの結果である。一部の実施形態では、ＲＮＡベースのキメラは、（ｉ）リードスルー、同じ配向性の隣接遺伝子、（ｉｉ）発散遺伝子、その５’部位が近接近する反対の配向性の隣接遺伝子、（ｉｉｉ）収束遺伝子、その３’末端が近接近する反対の配向性の隣接遺伝子、および（ｉｖ）重複する遺伝子、共通するエクソンを共有する隣接遺伝子、に類別される。ｍＲＮＡ融合物の例には、それらに限定されないが、
【００９６】
【化８】
2012514475.tif 000010
が含まれる。
【００９７】
Ｆ．複数の融合物
一部の実施形態では、試料（例えば、癌試料）は１つを超える融合物を含む。例えば、本発明の開発の過程で行った実験は、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４が腫瘍で他のＥＴＳ融合物と一緒に表されることを証明した。例えば、ＬＮＣａｐ細胞は、ＥＴＶ１再配列およびＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４融合物を有する。したがって一部の実施形態では、本発明は、組み合わされた複数の融合物の検出を利用する診断および／または予後診断の方法を提供する。
【００９８】
ＩＩ．抗体
その断片、誘導体および類似体を含む本発明の遺伝子融合タンパク質は、下記の診断、研究および治療の方法で用いることができる抗体を生成するための免疫原として用いることができる。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖またはＦａｂ断片であることができる。そのような抗体および断片の生成および標識化のために、当分野の技術者に公知である様々な手順を用いることができる。例えば、Ｂｕｒｎｓ編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３版、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５年）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４巻：７２頁（１９８３年）、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５頁（１９７５年）を参照。トランケーションされたＥＴＳファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質とそれらのそれぞれの本来のタンパク質との間の差を活用する抗体または断片が、特に好ましい。
【００９９】
ＩＩＩ．診断への応用
本明細書に記載される１つまたは複数の融合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質として検出可能である。当初、遺伝子融合物は、５’融合パートナーに由来する５’部分、および３’融合パートナーに由来する３’部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再配列として検出可能である。転写されると、遺伝子融合物は５’部分および３’部分を有するキメラｍＲＮＡとして検出可能である。翻訳されると、遺伝子融合物は、アミノ末端がトランケーションされた３’融合パートナー、または５’パートナー：３’パートナー融合タンパク質として検出可能である。トランケーションされたタンパク質およびキメラタンパク質は、アミノ酸配列、翻訳後プロセシングおよびまたは二次、三次もしくは四次構造において、それらのそれぞれの本来のタンパク質と異なってもよい。存在する場合、そのような差を用いて遺伝子融合物の存在を同定することができる。具体的な検出方法を、さらに詳細に下に記載する。
【０１００】
本発明は、遺伝子融合物を直接的または間接的に検出する、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質ベースの診断方法を提供する。本発明は、診断目的のための組成物およびキットも提供する。
【０１０１】
本発明の診断方法は、定性的または定量的でもよい。定量的な診断方法は、例えばカットオフまたは閾値レベルを通して無痛性と攻撃的な癌を区別するために用いることができる。該当する場合、定性的または定量的な診断方法は、標的、シグナルまたは仲介者（例えば、汎用性プライマー）の増幅を含むこともできる。
【０１０２】
最初のアッセイは、遺伝子融合物の存在を確認することができるが、特定の融合物を同定することができない。所望により、特定の融合物の同一性を判定するために、次に二次アッセイが実施される。第二のアッセイは、最初のアッセイと異なる検出技術を用いることができる。
【０１０３】
本発明の遺伝子融合物は、多重またはパネルフォーマットにおいて他のマーカーと共に検出することができる。マーカーは、それらの予測的価値について単独で、または遺伝子融合物と組み合わせて選択される。例示的前立腺癌マーカーには、それらに限定されないが、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＡＭＡＣＲ／Ｐ５０４Ｓ（米国特許第６，２６２，２４５号）、ＰＣＡ３（米国特許第７，００８，７６５号）、ＰＣＧＥＭ１（米国特許第６，８２８，４２９号）、プロスタイン／Ｐ５０１Ｓ、Ｐ５０３Ｓ、Ｐ５０４Ｓ、Ｐ５０９Ｓ、Ｐ５１０Ｓ、プロスターゼ／Ｐ７０３Ｐ、Ｐ７１０Ｐ（米国特許出願公開第２００３０１８５８３０号）、ならびに、米国特許第５，８５４，２０６号および第６，０３４，２１８号および米国特許出願公開第２００３０１７５７３６号に開示のものが含まれる。他の癌、疾患、感染症および代謝状態のマーカーも、多重のパネルフォーマットに組入れられることが想定される。
【０１０４】
本発明の診断方法は、特定の遺伝子融合物を疾患の病期、攻撃性もしくは進行、または転移の存在もしくは危険に関連させるデータに関して改変することもできる。最終的に、本発明の方法によって提供される情報は、特定の患者のために最良の治療コースを医師が選択するのに役立つ。
【０１０５】
Ａ．試料
遺伝子融合物を含むことが疑われるいかなる患者試料も、本発明の方法によって検査することができる。非限定例として、試料は、組織（例えば、前立腺生検試料もしくは前立腺切除によって得た組織試料）、血液、尿、精液、前立腺分泌物またはそれらの分画（例えば、血漿、血清、尿上清、尿細胞ペレットもしくは前立腺細胞）であることができる。好ましくは、尿試料は、前立腺からの前立腺細胞を尿路に排出させる、注意深い直腸指診（ＤＲＥ）の直後に収集される。
【０１０６】
患者試料は、遺伝子融合物または遺伝子融合物を含む細胞のための試料を単離またはエンリッチするように設計された、予備処理を一般的に必要とする。この目的のために、それらに限定されないが、遠心分離、免疫捕捉、細胞溶解および核酸標的捕捉を含む、当分野の技術者に公知である様々な技術を用いることができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、欧州特許第１４０９７２７号を参照）。
【０１０７】
Ｂ．ＤＮＡおよびＲＮＡ検出
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、核酸配列決定、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅を含む、当分野の技術者に公知である様々な核酸技術を用いて、ゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの染色体再配列として検出することができる。
【０１０８】
１．配列決定
核酸配列決定技術の例示的な非限定例には、鎖停止剤（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定および染色停止剤配列決定が含まれるが、これらに限定されない。ＲＮＡは細胞中でより不安定であり、ヌクレアーゼ攻撃により感受性であるので、当分野の技術者は、実験的ＲＮＡが配列決定の前にＤＮＡに通常逆転写されることを認識する。
【０１０９】
鎖停止剤配列決定は、改変ヌクレオチド基質を用いるＤＮＡ合成反応の配列特異的停止を用いる。その領域で鋳型に相補的である、放射性の、または他の標識された短いオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、伸長は、鋳型ＤＮＡ上の特異的部位で開始される。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、標準の４つのデオキシヌクレオチド塩基、および低濃度の１つの鎖停止ヌクレオチド、最も一般的にはジデオキシヌクレオチドを用いて伸長される。この反応は、各塩基が順にジデオキシヌクレオチドとなっている４つの別々の管で繰り返される。ＤＮＡポリメラーゼによる鎖停止ヌクレオチドの限定的組込みは、その特定のジデオキシヌクレオチドが用いられる位置だけで停止される一連の関連ＤＮＡ断片をもたらす。各反応管について、スラブポリアクリルアミドゲルまたは粘性ポリマーを満たした毛細管での電気泳動によって、断片はサイズ別に分離される。ゲルの上端から下端までスキャンするときに、どのレーンが標識プライマーから可視化マークを生成するかを読み取ることによって、配列が決定される。
【０１１０】
染色停止剤配列決定は、代わりに停止剤を標識する。ジデオキシヌクレオチド鎖停止剤の各々を、異なる波長で蛍光を発する別々の蛍光染料で標識することによって、完全な配列決定を単一の反応で実施することができる。
【０１１１】
２．ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーション技術の例示的な非限定例には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイおよびサザンブロットまたはノーザンブロットが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織の一部または切片で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、または組織が十分に小さい場合には組織全体で（ホールマウントＩＳＨ）、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の位置を特定するためのプローブとして、標識された相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を用いる種類のハイブリダイゼーションである。ＤＮＡ  ＩＳＨは、染色体の構造を判定するために用いることができる。ＲＮＡ  ＩＳＨは、組織切片またはホールマウントの中のｍＲＮＡおよび他の転写産物を測定し、その位置を特定するために用いられる。試料細胞および組織は、通常、標的転写産物を適所に固定して、プローブのアクセスを増加させるために処理される。プローブは昇温状態で標的配列とハイブリダイズし、過剰なプローブはその後洗い流される。放射能、蛍光または抗原で標識された塩基で標識されたプローブは、それぞれオートラジオグラフィ、蛍光顕微鏡検査または免疫組織化学を用いて、組織で位置が特定され、定量化される。ＩＳＨは、２つ以上の転写産物を同時に検出するために、放射能または他の非放射性標識で標識された２つ以上のプローブを用いることもできる。
【０１１３】
ａ．ＦＩＳＨ
一部の実施形態では、融合物配列は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて検出される。本発明のための好ましいＦＩＳＨアッセイは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を利用する。これらは、ヒトゲノム配列決定プロジェクト（Ｎａｔｕｒｅ  ４０９巻：９５３〜９５８頁（２００１年）を参照）で広範に用いられ、特異的ＢＡＣを含むクローンは、多くの提供元、例えばＮＣＢＩを通して捜すことができる販売業者を通して入手可能である。ヒトゲノムからの各ＢＡＣクローンは、それを明白に特定する参照名称が与えられている。これらの名称は、対応するＧｅｎＢａｎｋ配列を捜し出し、販売業者からクローンのコピーを注文するために用いることができる。
【０１１４】
本発明は、ヒト前立腺細胞、ヒト前立腺組織、または前記ヒト前立腺細胞もしくはヒト前立腺組織を囲む流体でＦＩＳＨアッセイを実施する方法をさらに提供する。
【０１１５】
プローブは、適当な蛍光マーカーまたは他のマーカーで標識され、その後ハイブリダイゼーションで用いられる。本明細書で提供される実施例のセクションは、欠失を測定するのに有効な１つの特定のプロトコールを示すが、当業技術者は、このアッセイの多くの変形形態を等しく都合よく用いることができることを認識する。具体的なプロトコールは当技術分野で周知であって、本発明に容易に応用することができる。方法論に関する指針は、以下を含む多くの参考文献から得ることができる：Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｇ．  Ｒ．  ＣｏｕｌｔｏｎおよびＪ．  ｄｅ  Ｂｅｌｌｅｒｏｃｈｅ編）、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９２年）、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｊ．  Ｈ．  Ｅｂｅｒｗｉｎｅ、Ｋ．  Ｌ．  ＶａｌｅｎｔｉｎｏおよびＪ．  Ｄ．  Ｂａｒｃｈａｓ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４年）、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．  Ｇ．  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９２年）、Ｋｕｏら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．４９巻：１１２〜１１９頁（１９９１年）、Ｋｌｉｎｇｅｒら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．５１巻：５５〜６５頁（１９９２年）、およびＷａｒｄら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．５２巻：８５４〜８６５頁（１９９３年）。ＦＩＳＨアッセイの実施のためにプロトコールを提供する市販キットもある（例えば、Ｏｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから入手可能）。方法論に関する指針を提供する特許には、米国特許第５，２２５，３２６号、第５，５４５，５２４号、第６，１２１，４８９号および第６，５７３，０４３号が含まれる。これらの参考文献のすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、特定の研究室に便利な手順工程を確立するために、当技術分野の類似参考文献および本明細書の実施例のセクションで提供される情報と共に用いることができる。
【０１１６】
ｂ．マイクロアレイ
それらに限定されないが、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ、化合物マイクロアレイ、ならびに抗体マイクロアレイを含む、異なる種類のバイオアッセイがマイクロアレイと呼ばれる。遺伝子チップ、ＤＮＡチップまたはバイオチップとして一般に公知のＤＮＡマイクロアレイは、数千の遺伝子の同時の発現プロファイリングまたは発現レベルの監視のための、アレイを形成する、固体表面（例えば、ガラス、プラスチックまたはシリコンチップ）に結合する顕微鏡的ＤＮＡスポットの集合である。付着したＤＮＡ断片はプローブとして公知であり、それの数千を単一のＤＮＡマイクロアレイで用いることができる。マイクロアレイは、病気の細胞および正常な細胞で遺伝子発現を比較することによって疾患遺伝子を同定するために用いることができる。マイクロアレイは、それらに限定されないが、ガラススライド上への先の鋭いピンによるプリント、予め作られたマスクを用いるフォトリソグラフィー、ダイナミックマイクロミラー装置を用いるフォトリソグラフィー、インクジェット式プリント、または微小電極アレイ上の電気化学法を含む、様々な技術を用いて作製することができる。
【０１１７】
サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングは、それぞれ特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出するために用いられる。試料から抽出されるＤＮＡまたはＲＮＡを分断し、マトリックスゲルの上で電気泳動的に分離し、メンブランフィルターに移す。フィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡを、対象の配列に相補的である標識プローブとハイブリダイズさせる。フィルターに結合している、ハイブリダイズしたプローブを検出する。この手順の変形は逆ノーザンブロットであり、そこでは、膜に付着した基質核酸が単離されたＤＮＡ断片の集合であり、プローブは、組織から抽出され、標識されたＲＮＡである。
【０１１８】
３．増幅
ゲノムＤＮＡおよびキメラｍＲＮＡの染色体再配列は、検出の前かまたは同時に増幅することができる。核酸増幅技術の例示的な非限定例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。当分野の技術者は、特定の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）は、ＲＮＡが増幅の前にＤＮＡに逆転写されることを必要とする（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）が、他の増幅技術はＲＮＡを直接に増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識する。
【０１１９】
ＰＣＲと一般に呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号および第４，９６５，１８８号）は、変性、反対の鎖へのプライマー対のアニーリング、およびプライマー伸長の複数のサイクルを用いて、標的核酸配列のコピー数を指数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変形形態では、逆転写酵素（ＲＴ）はｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製するために用いられ、ｃＤＮＡはＤＮＡの複数のコピーを生成するために次にＰＣＲによって増幅される。ＰＣＲの他の様々な置換については、例えば、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５巻：３３５頁（１９８７年）ならびにＭｕｒａｋａｗａら、ＤＮＡ  ７巻：２８７頁（１９８８年）を参照。
【０１２０】
一般にＴＭＡと呼ばれる転写によって媒介される増幅（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４８０，７８４号および第５，３９９，４９１号）は、標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーがさらなるコピーを自己触媒的に生成する、実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨの条件下で、標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成する。例えば、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，８２４，５１８号を参照。米国特許出願公開第２００６００４６２６５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される変形形態では、ＴＭＡ工程感度および精度を向上させるために、ＴＭＡは任意選択でブロッキング部分、停止部分、および他の改変部分の使用を組み込む。
【０１２１】
一般にＬＣＲと呼ばれるリガーゼ連鎖反応（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｅｉｓｓ，  Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４巻：１２９２頁（１９９１年））は、標的核酸の隣接部位とハイブリダイズする２セットの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、検出可能な二本鎖のライゲーションされたオリゴヌクレオチド生成物を生成するために、熱変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルにおいて、ＤＮＡリガーゼによって共有結合される。
【０１２２】
一般にＳＤＡと呼ばれる鎖置換増幅（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：３９２〜３９６頁（１９９２年）、米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号）は、プライマー配列の対を標的配列の反対の鎖にアニールすること、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長生成物を生成するためのｄＮＴＰαＳの存在下でのプライマー伸長、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニッキング、ならびに既存の鎖を置換し、次のラウンドのプライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のための鎖を生成して、生成物の幾何学的な増幅をもたらすための、ニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長のサイクルを用いる。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、事実上同じ方法でより高い温度において、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを用いる（欧州特許第０  ６８４  ３１５号）。
【０１２３】
他の増幅方法には、例えば以下のものが含まれる。一般にＮＡＳＢＡと呼ばれる核酸配列ベースの増幅（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１３０，２３８号）、一般にＱβレプリカーゼと呼ばれる、プローブ分子自体を増幅するためのＲＮＡレプリカーゼを用いるもの（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６巻：１１９７頁（１９８８年））、転写ベースの増幅方法（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１１７３頁（１９８９年））、および自立的配列複製（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：１８７４頁（１９９０年））。公知の増幅方法に関するさらなる議論については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，  Ｄａｖｉｄ  Ｈ．、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら編）、５１〜８７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９９３年））を参照。
【０１２４】
４．検出方法
増幅されていないかまたは増幅された遺伝子融合核酸は、従来の任意の手段によって検出することができる。例えば、遺伝子融合物は、検出可能に標識されたプローブとのハイブリダイゼーションおよび生じたハイブリッドの測定によって検出することができる。検出方法の例示的な非限定例を、下に記載する。
【０１２５】
１つの例示的な検出方法、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）は、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、アクリジニウムエステル標識（ＡＥ）プローブ）を標的配列とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていないプローブの上に存在する化学発光標識を選択的に加水分解し、ルミノメーター中で残存プローブから生成される化学発光を測定することを含む。例えば、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２８３，１７４号およびＮｏｒｍａｎ  Ｃ．  Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、１７章（Ｌａｒｒｙ  Ｊ．  Ｋｒｉｃｋａ編、２版、１９９５年）を参照。
【０１２６】
別の例示的な検出方法は、増幅過程のリアルタイムでの定量評価を可能にする。「リアルタイム」での増幅過程の評価は、増幅反応の間、反応混合液中のアンプリコンの量を連続的または定期的に測定し、測定値を用いて試料中に最初に存在する標的配列の量を計算することを含む。リアルタイム増幅に基づいて試料中に存在する最初の標的配列の量を測定するための様々な方法は、当技術分野で周知である。これらには、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３０３，３０５号および第６，５４１，２０５号に開示の方法が含まれる。試料中に最初に存在する標的配列の量を測定するための、しかしリアルタイム増幅に基づかない別の方法が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７１０，０２９号に開示されている。
【０１２７】
増幅生成物は、そのほとんどはステム−ループ構造を有する様々な自己ハイブリダイゼーションプローブを用いることによって、リアルタイムで検出することができる。そのような自己ハイブリダイゼーションプローブは、プローブが自己ハイブリダイズした状態にあるかまたは標的配列とのハイブリダイゼーションを通して変化した状態にあるかによって、それらが検出可能なシグナルを異なって放射するように標識される。非限定例として、「分子トーチ」は、連結領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）によって連結され、所定ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いとハイブリダイズする、自己相補性の異なる領域（「標的結合ドメイン」および「標的クロージングドメイン」と呼ばれる）を含む、自己ハイブリダイゼーションプローブの１種である。好ましい実施形態では、分子トーチは、長さが１〜約２０塩基であって、鎖置換条件下で増幅反応に存在する標的配列とのハイブリダイゼーションにアクセス可能である一本鎖塩基領域を標的結合ドメインに含む。鎖置換条件下では、標的結合ドメインに存在する一本鎖領域に結合して、標的クロージングドメインのすべてまたは一部を置換する標的配列が存在する場合を除いて、分子トーチの、完全または部分的に相補的であってよい２つの相補的領域のハイブリダイゼーションが有利である。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的クロージングドメインは、分子トーチが標的核酸とハイブリダイズする場合と、分子トーチが自己ハイブリダイズする場合で異なるシグナルが生成され、それによって、ハイブリダイズしていない分子トーチの存在下で試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にするように置かれる検出可能な標識または対の相互作用標識（例えば、発光／失活剤）を含む。分子トーチおよび様々な種類の相互作用標識対は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２７４に開示されている。
【０１２８】
自己相補性を有する検出プローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的相補的配列を有する核酸分子、増幅反応に存在する標的配列の不在下で閉じた立体配座でプローブを保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉じた立体配座のときに相互作用する標識対を含む。標的配列と標的相補的配列のハイブリダイゼーションは親和性対のメンバーを分離し、それによってプローブを開いた立体配座へ移行させる。開いた立体配座への移行は、例えば蛍光団および失活剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であってもよい標識対の相互作用の減少のために検出可能である。分子ビーコンは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２５，５１７号および第６，１５０，０９７号に開示されている。
【０１２９】
他の自己ハイブリダイゼーションプローブは、当分野の技術者に周知である。非限定例として、米国特許第５，９２８，８６２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどの、相互作用標識を有するプローブ結合対を、本発明で使用するために応用することができるかもしれない。一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために用いられるプローブ系も、本発明で利用できるかもしれない。さらなる検出系には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００４２６３８号に開示されている「分子スイッチ」が含まれる。挿入色素および／または蛍光色素を含むものなどの他のプローブも、本発明で増幅生成物の検出のために有用である。例えば、（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）米国特許第５，８１４，４４７号を参照。
【０１３０】
Ｃ．タンパク質検出
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、タンパク質配列決定およびイムノアッセイを含む、当分野の技術者に公知である様々なタンパク質技術を用いて、トランケーションされたＥＴＳファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質として検出することができる。
【０１３１】
１．配列決定
タンパク質配列決定技術の例示的な非限定例には、質量分析およびエドマン分解が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
質量分析は、原則としていかなるサイズのタンパク質も配列決定することができるが、サイズが大きくなるにつれて計算がより困難になる。タンパク質をエンドプロテアーゼによって消化し、生じた溶液を高圧液体クロマトグラフィーカラムに通す。このカラムの末端で、高い正電位に荷電した狭いノズルから溶液を質量分析計にスプレーする。液滴上の電荷は、単一のイオンだけが残るまでそれらを断片化させる。その結果ペプチドが断片化され、断片の質量−電荷比を測定する。質量スペクトルをコンピュータで分析し、それは、断片の配列を判定するために、前に配列決定をしたタンパク質のデータベースに対してしばしば比較される。この工程を次に異なる消化酵素で繰り返し、配列中の重複部分を用いてタンパク質の配列を構築する。
【０１３３】
エドマン分解反応では、配列決定をされるペプチドは、固体表面（例えば、ポリブレンでコーティングしたガラス繊維）に吸着される。エドマン試薬、フェニルイソチオシアナート（ＰＴＣ）は、１２％トリメチルアミンの弱塩基性の緩衝液と一緒に吸着ペプチドに加えられ、Ｎ末端アミノ酸のアミン基と反応する。次に無水酸の添加によって、末端アミノ酸誘導体を選択的に分離することができる。誘導体は異性化して置換されたフェニルチオヒダントインを与え、それを洗い流してクロマトグラフィーによって同定することができ、そのサイクルを繰り返してもよい。各ステップの効率は約９８％であり、それは、約５０アミノ酸が確実に測定されることを可能にする。
【０１３４】
２．イムノアッセイ
イムノアッセイの例示的な非限定例には、それらに限定されないが、以下のものが含まれる。免疫沈降、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリーおよびイムノＰＣＲ。当分野の技術者に公知である様々な技術（例えば、比色、蛍光、化学発光または放射）を用いて検出可能に標識されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、イムノアッセイで使用するために適する。
【０１３５】
免疫沈降は、その抗原に特異的である抗体を用いて溶液から抗原を沈殿させる技術である。この方法は、複合体中にあると思われるタンパク質をターゲッティングすることによって、細胞抽出物に存在するタンパク質複合体を同定するために用いることができる。複合体は、プロテインＡおよびプロテインＧなどの、細菌から最初に単離された不溶性抗体結合性タンパク質によって、溶液から取り出される。抗体は、溶液から容易に分離することができるセファロースビーズに結合させることもできる。洗浄後、沈殿物は、質量分析、ウェスタンブロット法、または複合体中の構成成分を同定するための任意数の他の方法を用いて分析することができる。
【０１３６】
ウェスタンブロットまたはイムノブロットは、組織ホモジネートまたは抽出物の所与の試料中のタンパク質を検出する方法である。それは、質量によって変性タンパク質を分離するために、ゲル電気泳動を用いる。タンパク質は次にゲルから膜に、一般的にポリビニルジフルオリドまたはニトロセルロース上に移され、そこでそれらは対象のタンパク質に特異的である抗体を用いて調べられる。その結果、研究者は所与の試料中のタンパク質の量を検査して、いくつかの群の間でレベルを比較することができる。
【０１３７】
酵素結合免疫吸着検定法を省略したＥＬＩＳＡは、試料中の抗体または抗原の存在を検出する生化学技術である。それは最低２つの抗体を利用し、その抗体のうちの一方は抗原に特異的であり、他方は酵素に結合する。二次抗体は、発色性または蛍光発生性の基質にシグナルを生成させる。ＥＬＩＳＡの変形形態には、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴが含まれる。ＥＬＩＳＡは試料中の抗原の存在または抗体の存在を評価するために実施することができるので、それは、血清抗体濃度を測定するための、そのうえ抗原の存在を検出するための有用なツールである。
【０１３８】
免疫組織化学および免疫細胞化学は、それらのそれぞれの抗体に結合する組織または細胞中の抗原成分を通して、それぞれ組織切片または細胞でタンパク質の位置を特定する方法を指す。可視化は、抗体を発色性または蛍光性の標識で標識することによって可能になる。色標識の一般的な例には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。蛍光団標識の一般的な例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
フローサイトメトリーは、流体の流れに懸濁している顕微鏡的粒子を計数、検査および選別するための技術である。それは、光学／電子検出装置の中を流れる単一細胞の物理的および／または化学的特性の、同時多重パラメーター分析を可能にする。単一の周波数または色の光線（例えば、レーザー）を、流体力学的に集中させた流体の流れに誘導する。いくつかの検出器が、流れが光線を通過するポイントを標的にする。１つは光線と並列し（順方向散乱またはＦＳＣ）、いくつかはそれ（側方散乱（ＳＳＣ）および１つまたは複数の蛍光検出器）と垂直である。ビームを通過する各懸濁粒子は何らかの方法で光を散乱し、粒子中の蛍光化学物質は、光源よりも低い周波数で光を放射するように励起させることができる。散乱光および蛍光光の組合せが検出器によって拾われ、蛍光発光ピーク毎に各検出器で輝度の変動を分析することによって、各個々の粒子の物理化学的構造について様々な事実を推測することが可能である。ＦＳＣは細胞容量と相関し、ＳＳＣは粒子の密度または内部の複雑性（例えば、核の形、細胞質顆粒の量および種類または膜の粗さ）と相関する。
【０１４０】
イムノポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）は、抗体ベースのイムノアッセイでシグナル生成を増加させるために、核酸増幅技術を利用する。ＰＣＲのタンパク質同等物が存在しないので、すなわち、核酸がＰＣＲの間に複製されるのと同じ方法でタンパク質を複製することができないので、検出感度を増加させる唯一の方法はシグナル増幅によるものである。標的タンパク質を抗体に結合させ、それをオリゴヌクレオチドに直接または間接にコンジュゲートさせる。未結合の抗体を洗い流し、残留する結合抗体はそれらのオリゴヌクレオチドが増幅される。タンパク質検出は、リアルタイム法を含む標準の核酸検出方法を用いる、増幅オリゴヌクレオチドの検出を通して起こる。
【０１４１】
Ｄ．データ分析
一部の実施形態では、検出アッセイによって生成される生データ（例えば、所与の遺伝子融合物または他のマーカーの存在、非存在または量）を、臨床医にとって予測的価値のあるデータに翻訳するために、コンピュータベースの分析プログラムが用いられる。臨床医は、任意の適する手段を用いて予測的データにアクセスすることができる。したがって、一部の好ましい実施形態では、本発明は、遺伝学および分子生物学の訓練をおそらく受けていない臨床医が生データを理解する必要がないという、さらなる利点を提供する。データは、その最も有用な形で臨床医に直接に示される。そこで臨床医は、被験体のケアを最適化するためにその情報を直ちに利用することができる。
【０１４２】
本発明は、アッセイを実行する研究室、情報提供者、医療職および被験体に対して、およびそれらから、情報を受け取り、処理し、伝えることができる任意の方法を想定する。例えば、本発明の一部の実施形態では、試料（例えば、生検または血清もしくは尿の試料）を被験体から得、世界の任意の地域（例えば、被験体が居住する国、または情報が最終的に用いられる国とは異なる国）に位置するプロファイリングサービス（例えば、医療施設の臨床検査室、ゲノムプロファイリングビジネスなど）に提出し、生データを生成する。試料が組織または他の生体試料を含む場合、被験体は医療施設を訪問し、試料を得てプロファイリング施設に送ることができるか、または被験体は自身で試料（例えば、尿試料）を収集して、プロファイリング施設にそれを直接に送ることができる。試料がそれ以前に判定された生体情報を含む場合、その情報は被験体によってプロファイリングサービスに直接に送られてもよい（例えば、その情報を含む情報カードをコンピュータでスキャンすることができ、データは、電子伝達システムを用いてプロファイリング施設のコンピュータに送ることができる）。プロファイリングサービスによって受領されると、試料は処理され、その被験体に望まれる診断または予後診断情報に特異的であるプロファイルが生成される（すなわち、発現データ）。
【０１４３】
次いで、プロファイルデータは、治療臨床医による解釈に適するフォーマットで作成される。例えば、生の発現データを提供するのではなく、作成されたフォーマットは、特定の治療選択肢の推奨と共に、被験体のための診断またはリスクの評価（例えば、癌が存在する可能性）を表すことができる。データは、任意の適する方法によって臨床医に提示されてもよい。例えば、一部の実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医（例えば、ケアの発生するポイント）のために印刷することができるか、またはコンピュータモニターで臨床医に提示することができる報告を生成する。
【０１４４】
一部の実施形態では、情報は先ずケアの発生するポイント、または地域の施設で分析される。生データは、さらなる分析のためにおよび／または臨床医もしくは患者に有用な情報に生データを変換するために、次に中央処理施設に送られる。中央処理施設は、データ分析のプライバシー（すべてのデータは、均一なセキュリティプロトコールを有する中央施設で保存される）、速度および均一性の利点を提供する。次に、中央処理施設は、被験体の治療後にデータの消長を管理することができる。例えば、電子伝達システムを用いて、中央施設は、臨床医、被験体または研究者にデータを提供することができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、被験体は電子伝達システムを用いて、データに直接にアクセスすることができる。被験体は、結果に基づいてさらなる介入またはカウンセリングを選択することができる。一部の実施形態では、データは研究用途のために用いられる。例えば、特定の状態または疾患の病期の有用な指標として、マーカーの組入れまたは排除をさらに最適化するために、このデータを用いることができる。
【０１４６】
Ｅ．ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、以下を含むｉｎ  ｖｉｖｏ画像化技術を用いて検出することもできる。放射性核種画像化、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ体軸断層撮影、Ｘ線または磁気共鳴画像化法、蛍光検出および化学発光検出。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化技術が、動物（例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物）で癌マーカーの存在または発現を可視化するために用いられる。例えば、一部の実施形態では、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質は、癌マーカーに特異的な標識抗体を用いて標識される。特異的に結合している、標識された抗体は、それらに限定されないが、放射性核種画像化、陽電子放射断層撮影、コンピュータ体軸断層撮影、Ｘ線または磁気共鳴画像化法、蛍光検出および化学発光検出を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法を用いて個体で検出することができる。本発明の癌マーカーに対する抗体を生成する方法を、下に記載する。
【０１４７】
本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法は、本発明の癌マーカーを発現する癌（例えば、前立腺癌）の診断で有用である。ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化は、癌を示すマーカーの存在を可視化するために用いられる。そのような技術は、不快な生検を使用しない診断を可能にする。本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法は、癌患者に予後診断を提供するためにも有用である。例えば、転移しそうな癌を示すマーカーの存在を検出することができる。本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法は、体の他の部分で転移性癌を検出するためにさらに用いることができる。
【０１４８】
一部の実施形態では、本発明の癌マーカーに特異的な試薬（例えば、抗体）が、蛍光で標識される。標識抗体は、被験体に導入される（例えば、経口的または非経口的に）。蛍光標識抗体は、任意の適する方法を用いて（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９８，１０７号に記載の装置を用いて）検出される。
【０１４９】
他の実施形態では、抗体は放射標識される。ｉｎ  ｖｉｖｏ診断のための抗体の使用は、当技術分野で周知である。Ｓｕｍｅｒｄｏｎら、（Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ  １７巻：２４７〜２５４頁（１９９０年））は、標識としてインジウム１１１を用いる腫瘍のラジオイムノシンチグラフィー画像化のための、最適化された抗体−キレート剤を記載している。Ｇｒｉｆｆｉｎら、（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃ  ９巻：６３１〜６４０頁（１９９１年））は、再発性の結腸直腸癌が疑われる患者で腫瘍を検出することにおける、この剤の使用を記載している。磁気共鳴画像化のための標識としての常磁性イオンを有する類似の剤の使用は、当技術分野で公知である（Ｌａｕｆｆｅｒ、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２巻：３３９〜３４２頁（１９９１年））。用いられる標識は、選択される画像化様式によって決まる。平面スキャンまたは単光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）のために、インジウム１１１、テクネチウム９９ｍまたはヨウ素１３１などの放射性標識を用いることができる。フッ素１９などの陽電子放射標識を、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）のために用いることもできる。ＭＲＩについては、ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンを用いることができる。
【０１５０】
スカンジウム４７（３．５日）、ガリウム６７（２．８日）、ガリウム６８（６８分）、テクネチウム９９ｍ（６時間）およびインジウム１１１（３．２日）などの、１時間から３．５日の範囲の半減期を有する放射性金属が抗体へのコンジュゲーションに利用可能であるが、そのうちガリウム６７、テクネチウム９９ｍおよびインジウム１１１はガンマカメラ画像化のために好ましく、ガリウム６８は陽電子放射断層撮影のために好ましい。
【０１５１】
そのような放射性金属で抗体を標識する有用な方法は、例えばＩｎ−１１１およびＴｃ−９９ｍについてはＫｈａｗら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９巻：２９５頁（１９８０年））によって、およびＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５巻：１５１１頁（１９８２年））によって記載されるように、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）などの二官能基のキレート化剤によるものである。他のキレート化剤を用いることもできるが、１−（ｐ−カルボキシメトキシベンジル）ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡのカルボキシ炭酸無水物（ｃａｒｂｏｘｙｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）が有利であり、その理由は、それらの使用が、抗体の免疫活性に実質的影響を及ぼさないコンジュゲーションを可能にするからである。
【０１５２】
ＤＰＴＡをタンパク質に結合するための別の方法は、Ｉｎ−１１１によるアルブミンの標識についてＨｎａｔｏｗｉｃｈら（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｉｓｏｔ．３３巻：３２７頁（１９８２年））によって記載されるようにＤＴＰＡの環状無水物の使用によるものであるが、それは、抗体の標識に応用することができる。ＤＰＴＡによるキレート化を用いずにＴｃ−９９ｍで抗体を標識するのに適する方法は、Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄら、（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，３２３，５４６号）の予備はんだ法（ｐｒｅｔｉｎｎｉｎｇ）である。
【０１５３】
Ｔｃ−９９ｍで免疫グロブリンを標識する好ましい方法は、血漿タンパク質についてＷｏｎｇら（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｉｓｏｔ．２９巻：２５１頁（１９７８年））によって記載され、抗体を標識するためにＷｏｎｇら（Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．２３巻：２２９頁（１９８１年））が最近応用して成功した方法である。
【０１５４】
特異抗体にコンジュゲートされる放射性金属の場合、その免疫特異性を破壊することなく、抗体分子にできるだけ高い割合の放射標識を導入することが同様に望ましい。抗体上の抗原結合部位が保護されることを保証するために、本発明の特異的癌マーカーの存在下で放射標識を実行することによって、さらなる改善を達成することができる。抗原は、標識した後に切り離される。
【０１５５】
さらなる実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏバイオフォトニック画像化（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌｍｅｄａ、ＣＡ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のために利用される。このリアルタイムｉｎ  ｖｉｖｏ画像化は、ルシフェラーゼを利用する。ルシフェラーゼ遺伝子は、細胞、微生物および動物に組み込まれる（例えば、本発明の癌マーカーとの融合タンパク質として）。活性な場合、それは光を放射する反応をもたらす。画像を捕捉して、それを分析するために、ＣＣＤカメラおよびソフトウェアが用いられる。
【０１５６】
Ｆ．組成物とキット
本発明の診断方法に用いられる組成物は、プローブ、増幅オリゴヌクレオチドおよび抗体を含むが、これらに限定されない。特に好ましい組成物は、遺伝子融合物が存在する場合に限り、生成物を検出する。これらの組成物は、以下を含む。５’融合パートナーからの５’部分が３’融合パートナーからの３’部分と融合する接合部とハイブリダイズする（すなわち、遺伝子融合物接合部にわたる）配列を含む単一の標識プローブ、第一の増幅オリゴヌクレオチドが５’融合パートナーとハイブリダイズする配列を含み、第二の増幅オリゴヌクレオチドが３’融合パートナーとハイブリダイズする配列を含む、増幅オリゴヌクレオチドの対、アミノ末端がトランケーションされた３’融合パートナーに対する抗体、あるいは、５’融合パートナーからのアミノ末端部分および３’融合パートナーからのカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質に対する抗体。しかし、他の有用な組成物は以下を含む。第一の標識プローブが５’融合パートナーとハイブリダイズする配列を含み、第二の標識プローブが３’融合パートナーとハイブリダイズする配列を含む、標識プローブの対。
【０１５７】
これらの組成物のいずれかを、単独でまたは本発明の他の組成物と組み合わせて、キットの形で提供することができる。例えば、単一の標識プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドの対は、本発明の遺伝子融合物の増幅および検出のためのキットで提供することができる。キットは、適当な対照および／または検出試薬をさらに含むことができる。本発明のプローブおよび抗体組成物は、アレイの形で提供することもできる。
【０１５８】
ＩＶ．薬物スクリーニング適用
いくつかの実施形態では、本発明は薬物スクリーニングアッセイ（例えば、抗癌薬を求めてスクリーニングすること）を提供する。本発明のスクリーニング法は、本発明の方法を使用して同定される癌マーカーを利用する（例えば、本発明の遺伝子融合物を含むがこれに限定されない）。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子融合物の発現を変化させる（例えば、減少させる）化合物を求めてスクリーニングする方法を提供する。化合物または作用薬は、例えば、プロモーター領域と相互作用することにより転写を妨げ得る。化合物または作用薬は、融合物から産生されるｍＲＮＡを妨げ得る（例えば、ＲＮＡ干渉、アンチセンス技術、等により）。化合物または作用薬は、融合物の生物活性の上流または下流である経路を妨げ得る。いくつかの実施形態では、候補化合物は、癌マーカーに対して向けられるアンチセンスまたは干渉ＲＮＡ剤（例えば、オリゴヌクレオチド）である。他の実施形態では、候補化合物は、本発明の癌マーカー調節因子または発現産物に特異的に結合しその生物学的機能を阻害する抗体または小分子である。
【０１５９】
一スクリーニング法では、化合物を癌マーカーを発現している細胞に接触させ次に発現に対する候補化合物の効果についてアッセイすることにより、癌マーカー発現を変化させるその能力について候補化合物は評価される。いくつかの実施形態では、細胞により発現される癌マーカーｍＲＮＡのレベルを検出することにより、癌マーカー遺伝子の発現に対する候補化合物の効果についてアッセイされる。ｍＲＮＡ発現は、適切などんな方法によっても検出することが可能である。
【０１６０】
他の実施形態では、癌マーカーによりコードされるポリペプチドのレベルを測定することにより、癌マーカー遺伝子の発現に対する候補化合物の効果がアッセイされる。発現されるポリペプチドのレベルは、本明細書で開示される方法を含むがこれらに限定されない適切などんな方法でも使用して測定することが可能である。
【０１６１】
具体的には、本発明は、モジュレーター、すなわち、本発明の癌マーカーに結合し、例えば、癌マーカー発現もしくは癌マーカー活性に対する阻害（もしくは刺激）効果を有する、または、例えば、癌マーカー基質の発現もしくは活性に対する刺激もしくは阻害効果を有する候補または試験化合物または作用薬（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣剤、ペプトイド、小分子もしくは他の薬物）を同定するためのスクリーニング法を提供する。このようにして同定される化合物を使用して、治療プロトコールにおいて直接的にもしくは間接的に標的遺伝子産物（例えば、癌マーカー遺伝子）の活性を調節する、標的遺伝子産物の生物学的機能を詳細に詰める、または正常な標的遺伝子相互作用を混乱させる化合物を同定することが可能である。癌マーカーの活性または発現を阻害する化合物は、増殖性障害、例えば、癌、特に前立腺癌の治療において有用である。
【０１６２】
一実施形態では、本発明は癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物活性部分の基質である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物活性部分に結合する、あるいは癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物活性部分の活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０１６３】
生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが新規の非ペプチド骨格を有し、酵素的分解に抵抗性であるが、それにもかかわらず依然生理活性がある分子のライブラリー；例えば、Ｚｕｃｋｅｎｎａｎｎら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７巻：  ２６７８〜８５頁［１９９４年］参照）；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成的ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのうちのいずれでも使用して本発明の試験化合物を得ることが可能である。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチはペプチドライブラリーを用いて使用するために好ましく、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適応可能である（Ｌａｍ  （１９９７年）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２巻：１４５頁）。
【０１６４】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野において、例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０巻：６９０９頁［１９９３年］；  Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻  ：１１４２２頁［１９９４年］；  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７巻：２６７８頁［１９９４年］；  Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻：１３０３頁［１９９３年］；  Ｃａｒｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３巻．２０５９頁［１９９４年］；  Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３巻：２０６１頁［１９９４年］；およびＧａｌｌｏｐら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７巻：１２３３頁［１９９４年］に見出すことが可能である。
【０１６５】
化合物のライブラリーは、溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３巻：４１２〜４２１頁［１９９２年］）、またはビーズ上（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４巻：８２〜８４頁［１９９１年］）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４巻：５５５〜５５６頁［１９９３年］）、細菌もしくは胞子（米国特許第５２２３４０９号、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１８６５〜１８６９頁［１９９２年］）またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：３８６〜３９０頁［１９９０年］；  Ｄｅｖｌｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：４０４〜４０６頁［１９９０年］；  Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８７巻：６３７８〜６３８２頁［１９９０年］；  Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：３０１頁［１９９１年］）で提示され得る。
【０１６６】
一実施形態では、アッセイは、癌マーカーｍＲＮＡもしくはタンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を試験化合物に接触させ、癌マーカーの活性を調節する試験化合物の能力が判定される細胞ベースアッセイである。癌マーカー活性を調節する試験化合物の能力を判定するのは、例えば、酵素活性、破壊またはｍＲＮＡまたはそれと同類のものの変化をモニターすることにより実現することが可能である。
【０１６７】
化合物、例えば、癌マーカー基質またはモジュレーターへの癌マーカーの結合を調節する試験化合物の能力も評価することが可能である。これは、例えば、化合物、例えば、基質の癌マーカーへの結合を複合体における標識化合物、例えば、基質を検出することにより判定することができるように、化合物、例えば、基質を放射性同位体元素または酵素標識とカップリングすることにより、実現することが可能である。
【０１６８】
代わりに、癌マーカーを放射性同位体元素または酵素標識とカップリングして、複合体における癌マーカーの癌マーカー基質への結合を調節する試験化合物の能力をモニターする。例えば、化合物（例えば、基質）を１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで、直接的にまたは間接的に標識することが可能であり、放射性同位体元素は放射性放出を直接計測することによりまたはシンチレーション計測により検出することが可能である。代わりに、化合物を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することが可能であり、酵素標識は適切な基質の生成物への転換を判定することにより検出することが可能である。
【０１６９】
相互作用物のうちのどれかを標識してまたは標識せずに、癌マーカーと相互作用をする化合物（例えば、癌マーカー基質）の能力を評価することが可能である。例えば、マイクロフィジオメーターを使用して、化合物も癌マーカーも標識化せずに癌マーカーとの化合物の相互作用を検出することが可能である（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７巻：１９０６〜１９１２頁［１９９２年］）。本明細書で使用されるように、「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光アドレッサブル電位差センサ（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物と癌マーカー間の相互作用の指標として使用することが可能である。
【０１７０】
さらに別の実施形態では、癌マーカータンパク質またはその生物活性部分を試験化合物に接触させ、癌マーカータンパク質、ｍＲＮＡ、またはその生物活性部分に結合する試験化合物の能力を評価する無細胞アッセイが提供される。本発明のアッセイにおいて使用される癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡの好ましい生物活性部分には、基質または他のタンパク質との相互作用に関与する断片、例えば、表面確率スコアが高い断片が挙げられる。
【０１７１】
無細胞アッセイは、標的遺伝子タンパク質と試験化合物の反応混合物を、前記２つの成分が相互作用し、結合し、したがって取り除いておよび／または検出することが可能な複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で調製することを含む。
【０１７２】
２つの分子間の相互作用は、例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して検出することも可能である（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；  Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，９６８，１０３号参照；これらの特許文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている）。第一のドナー分子の放出される蛍光エネルギーが、第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識に吸収され、次に第二の分子は吸収したエネルギーのせいで蛍光を発することができるように、フルオロフォア標識が選択される。
【０１７３】
代わりに、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用するだけでもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」の標識と識別し得るように、異なった波長の光を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てている距離に関係するために、分子間の空間的関係を評価することが可能である。分子間で結合が生じる状況では、「アクセプター」分子標識の蛍光放出は最大になるはずである。ＦＲＥＴ結合事象は、当技術分野で周知の標準蛍光定量的検出手段により（例えば、蛍光光度計を使用して）都合よく測定することが可能である。
【０１７４】
別の実施形態では、標的分子に結合する癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡの能力を判定することは、リアルタイム生物分子間相互作用解析（ＢＩＡ）を使用して実現することが可能である（例えば、ＳｊｏｌａｎｄｅｒおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６３巻：２３３８〜２３４５頁［１９９１年］およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：６９９〜７０５頁［１９９５年］参照）。「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、相互作用物質のどれも標識せずに、生体分子特異的相互作用をリアルタイムで検出する（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。結合表面における質量の変化（結合事象を示す）により、表面近傍の光の屈折率が変化し（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる検出可能なシグナルを発生する。
【０１７５】
一実施形態では、標的遺伝子産物または試験物質は固相上に固定される。固相上に固定された標的遺伝子産物／試験化合物複合体は、反応の終了時に検出することが可能である。好ましくは、標的遺伝子産物は固体表面上に固定することが可能であり、試験化合物（固定されていない）は、本明細書で考察される検出可能標識を用いて直接的にまたは間接的に標識することが可能である。
【０１７６】
癌マーカー、抗癌マーカー抗体またはその標的分子を固定化し、前記タンパク質のうちの１つまたは両方の非複合化形からの複合化形の分離を促進すること、他にもアッセイの自動化を提供することが望ましいことがある。試験化合物の癌マーカータンパク質への結合、または候補化合物の存在下および不在下での癌マーカータンパク質と標的分子の相互作用は、反応物を含有するのに適したどんな容器内でも実現することが可能である。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心分離管が挙げられる。一実施形態では、前記タンパク質のうちの１つまたは両方がマトリックスに結合されることを可能にするドメインを追加する融合タンパク質を提供することが可能である。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−癌マーカー融合タンパク質またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることが可能であり、次に前記融合タンパク質は、試験化合物または試験化合物と非吸着標的タンパク質もしくは癌マーカータンパク質のどちらかと組み合わされ、混合物は複合体形成に資する条件下で（例えば、塩およびｐＨの生理的条件で）インキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルは洗浄されて非結合成分はどれも取り除かれ、ビーズの場合はマトリックスは固定化され、例えば、上記の通りに複合体は直接的にまたは間接的に判定される。
【０１７７】
代わりに、複合体をマトリックスから分離することが可能であり、癌マーカー結合または活性のレベルが標準技法を使用して決定される。癌マーカータンパク質または標的分子をマトリックス上に固定化するための他の技法には、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを使用することが挙げられる。ビオチン化された癌マーカータンパク質または標的分子は、当技術分野で公知の技法（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＥＬ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミド）から調製し、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）のウェルに固定化することが可能である。
【０１７８】
前記アッセイを行うために、非固定化成分が、固定化された成分を含有するコート表面に添加される。反応が完了した後、形成されたどんな複合体も固体表面上に固定化されたままであるような条件下で未反応成分は取り除かれる（例えば、洗浄することにより）。固体表面上に固定化された複合体の検出はいくつかの方法で実現することが可能である。前もって非固定化された成分が前標識されている場合、表面上に固定化された標識を検出すれば複合体が形成されたことを示す。前もって非固定化された成分が前標識されていない場合、間接的標識を使用して、例えば、固定化された成分に特異的な標識された抗体（抗体は、今度は、例えば、標識された抗ＩｇＧ抗体を用いて直接的に標識することも間接的に標識することも可能である）を使用して表面上に固定化された複合体を検出することが可能である。
【０１７９】
このアッセイは、癌マーカータンパク質または標的分子とは反応するが癌マーカータンパク質のその標的分子への結合を妨げない抗体を利用して実施される。そのような抗体は、プレートのウェルに誘導体化することが可能であり、未結合標的または癌マーカータンパク質は抗体コンジュゲーションによりウェルに捕捉される。そのような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ固定化複合体についての上記の方法に加えて、癌マーカータンパク質または標的分子と反応する抗体を使用する複合体の免疫検出の他にも、癌マーカータンパク質または標的分子に関連する酵素活性を検出することに頼る酵素連結アッセイが挙げられる。
【０１８０】
代わりに、無細胞アッセイは液相で行うことが可能である。そのようなアッセイでは、分画遠心法（例えば、ＲｉｖａｓおよびＭｉｎｔｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １８巻：２８４〜７頁［１９９３年］参照）；クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）；電気泳動法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９年、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）；および免疫沈降法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９年、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）を含むがこれらに限定されないいくつかの標準技法のどれかにより反応生成物は未反応成分から分離される。そのような樹脂およびクロマトグラフ法は当業者には公知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １１巻：１４１〜８頁［１９９８年］；  Ｈａｇｅａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ａｐｐｌ  ６９９巻：４９９〜５２５頁［１９９７年］参照）。さらに、本明細書に記載されるように、蛍光エネルギー移動を都合よく利用して、複合体を溶液からそれ以上精製することなく結合を検出してもよい。
【０１８１】
アッセイは、癌マーカータンパク質、ｍＲＮＡ、またはその生物活性部分を、癌マーカーに結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、前記アッセイ混合物を試験化合物に接触させ、癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡと相互作用する試験化合物の能力を判定することを含み、癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡと相互作用する試験化合物の能力を判定することは、公知の化合物と比べて、癌マーカーまたはその生物活性部分に優先的に結合する、または標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を判定することを含むことが可能である。
【０１８２】
癌マーカーが、タンパク質などの１つまたは複数の細胞または細胞外巨大分子とｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用することができる限り、そのような相互作用の阻害剤は有用である。阻害剤を同定するのに同種のアッセイを使用することが可能である。
【０１８３】
例えば、標的遺伝子産物と相互作用的細胞または細胞外結合パートナー産物の前もって形成された複合体が、標的遺伝子産物またはその結合パートナーのどちらかが標識されているが、その標識により生み出されるシグナルが複合体形成のせいで消光されるように、調製される（例えば、米国特許第４，１０９，４９６号参照。参照によりこの特許文献は本明細書に組み込まれており、このアプローチを免疫アッセイのために利用する）。前もって形成された複合体由来の種の１つと競合し取って代わる試験物質の添加により、バックグラウンドを超えるシグナルが生じることになる。このようにして、標的遺伝子産物−結合パートナー相互作用を乱す試験物質を同定することが可能である。代わりに、癌マーカータンパク質をツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ  ７２巻：２２３〜２３２頁［１９９３年］；  Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８巻．１２０４６〜１２０５４頁［１９９３年］；  Ｂａｒｔｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４巻：９２０〜９２４頁［１９９３年］；  Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８巻：１６９３〜１６９６頁［１９９３年］；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００参照；これらの文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている）において「ベイトタンパク質」として使用して、癌マーカーに結合するかまたは相互作用し、癌マーカー活性に関与する他のタンパク質（「癌マーカー結合タンパク質」もしくは「癌マーカーｂｐ」）を同定することが可能である。そのような癌マーカーｂｐは、癌マーカータンパク質または標的（例えば、癌マーカー媒介シグナル伝達経路の下流エレメントなど）によるシグナルの活性化剤または阻害剤となることが可能である。
【０１８４】
癌マーカー発現のモジュレーターも同定することが可能である。例えば、細胞または無細胞混合物を候補化合物に接触させ、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を、候補化合物の不在下での癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比べて評価する。癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下でのほうがその不在下でよりも大きい場合には、候補化合物は癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤として同定される。代わりに、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下でのほうがその不在下でよりも少ない（すなわち、統計的に有意に少ない）場合には、候補化合物は癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定される。癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載される方法により決定することが可能である。
【０１８５】
調節剤は、細胞ベースまたは無細胞アッセイを使用して同定することが可能であり、癌マーカータンパク質の活性を調節する作用薬の能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、疾病の動物モデルなどの動物（例えば、前立腺癌もしくは転移性前立腺癌を有する動物、または動物（例えば、ヒト）由来の前立腺癌の異種移植片を宿す動物）または前立腺癌の（例えば、リンパ節、骨、もしくは肝臓への）転移から生じる癌由来の細胞、または前立腺癌細胞系統由来の細胞において確証することが可能である。
【０１８６】
本発明は、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規の作用薬にさらに関する（例えば、癌治療の以下の説明参照）。したがって、適切な動物モデルにおいて（例えば、本明細書に記載される動物）本明細書に記載される通りに同定される作用薬（例えば、癌マーカー調節剤、アンチセンス癌マーカー核酸分子、ｓｉＲＮＡ分子、癌マーカー特異的抗体、または癌マーカー結合パートナー）をさらに使用して、そのような作用薬を用いた治療の有効性、毒性、副作用、または作用機序を決定することは本発明の範囲内である。さらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規の作用薬は、例えば、本明細書に記載される治療のために使用することが可能である。
【０１８７】
Ｖ．治療的適用
いくつかの実施形態では、本発明は、癌（例えば、前立腺癌）の治療法を提供する。いくつかの実施形態では、治療法は、直接的にまたは間接的に、本発明の遺伝子融合物を標的にする。
【０１８８】
Ａ．ＲＮＡ干渉およびアンチセンス治療
いくつかの実施形態では、本発明は遺伝子融合物の発現を標的にする。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の癌マーカーをコードする核酸分子の機能を調節し、最終的には発現される癌マーカーの量を調節するのに使用するための、オリゴマーアンチセンスまたはＲＮＡｉ化合物、特にオリゴヌクレオチド（例えば、上記の薬物スクリーニング法において同定されるオリゴヌクレオチド）を含む組成物を用いる。
【０１８９】
１．ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉを利用して融合タンパク質機能を阻害する。ＲＮＡｉは、ヒトを含む大半の真核生物において外来遺伝子の発現を制御するための進化的に保存された細胞防御を表す。ＲＮＡｉは典型的には、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により誘発され、ｄｓＲＮＡに応答して相同な一本鎖標的ＲＮＡの配列特異的ｍＲＮＡ分解を引き起こす。ｍＲＮＡ分解の媒介物は低分子干渉ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）であり、これは通常、細胞内での酵素的切断により長いｄｓＲＮＡから産生される。ｓｉＲＮＡは一般に、ほぼ２１ヌクレオチド長（例えば、２１〜２３ヌクレオチド長）であり、２つのヌクレオチド３’−オーバーハングにより特徴付けられる塩基対構造を有する。低分子ＲＮＡまたはＲＮＡｉの細胞内への導入に続いて、その配列はＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれる酵素複合体へ送達されると考えられている。ＲＩＳＣは標的を認識し、その標的をエンドヌクレアーゼを用いて切断する。比較的大きなＲＮＡ配列が細胞に送達される場合は、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素（ダイサー）が比較的長いｄｓＲＮＡを２１〜２３ｎｔ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ断片に変換することを注記する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、融合タンパク質の接合部領域を標的にするように設計される。
【０１９０】
化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、培養された体細胞における哺乳動物遺伝子機能のゲノムワイド分析のための強力な試薬になっている。遺伝子機能の確認のためのその価値以上に、ｓｉＲＮＡは遺伝子特異的治療薬としての大きな可能性もある（ＴｕｓｃｈｌおよびＢｏｒｋｈａｒｄｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．  ２００２年；  ２巻（３号）：  １５８〜６７頁、この文献は参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１９１】
動物細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、特定の遺伝子の強力で持続的な転写後サイレンシングが生じる（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２００１年；  ９８巻：  ９７４２〜７頁；  Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ．  ２００１年；  ４１１巻：４９４〜８頁；  Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００１年；１５巻：  １８８〜２００頁；およびＥｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００１年；  ２０巻：  ６８７７〜８８頁、これらの文献はすべて参照により本明細書に組み込まれている）。ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉを実施するための方法および組成物は、例えば、米国特許第６，５０６，５５９号に記載されており、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている。
【０１９２】
ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡの量を、伸長タンパク質により、高頻度で検出不能レベルにまで低下させるのに並はずれて有効である。サイレンシング効果は数カ月持続することがあり、並はずれて特異的である。なぜならば、標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡの中心領域間の１ヌクレオチドのミスマッチでサイレンシングを妨げるのに高頻度で十分であるからである（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２年；  ２９６巻：５５０〜３頁；およびＨｏｌｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００２年；  ３０巻：１７５７〜６６頁、これらの文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１９３】
ｓｉＲＮＡの設計において重要な要因は、ｓｉＲＮＡ結合のための到達可能な部位の存在である。Ｂａｈｏｉａら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００３年；  ２７８巻：  １５９９１〜１５９９７頁；  この文献は参照により本明細書に組み込まれている）は、効果的なｓｉＲＮＡを設計するためのｍＲＮＡにおける到達可能な部位を見つけるスキャニングアレイと呼ばれるＤＮＡアレイの１種の使用を記載している。これらのアレイは、モノマーから、配列中に各塩基を段階的に付加することによる物理的バリアー（マスク）を使用して合成されるある種の最大量、通常Ｃｏｍｅｒｓまでのサイズの幅があるオリゴヌクレオチドを含む。したがって、アレイは、標的遺伝子の一領域の完全なオリゴヌクレオチド相補体を表している。標的ｍＲＮＡのこれらのアレイへのハイブリダイゼーションは、標的ｍＲＮＡのこの領域の徹底的な到達性プロファイルを提供する。そのようなデータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（７ｍｅｒから２５ｍｅｒまでの範囲がある）の設計に有用であり、ここでは有効性と標的特異性を保持するためにオリゴヌクレオチド長と結合親和性の妥協を達成することが重要である（Ｓｏｈａｉｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００１年；  ２９巻（１０号）：  ２０４１〜２０４５頁）。ｓｉＲＮＡを選択するための追加の方法および関心事は、例えば、ＷＯ０５０５４２７０、ＷＯ０５０３８０５４Ａ１、ＷＯ０３０７０９６６Ａ２、Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．  ２００５年５月１３日；３４８巻（４号）：８８３〜９３頁、  Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．  ２００５年５月１３日；３４８巻（４号）：８７１〜８１頁、およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００３年８月１日；３１巻（１５号）：４４１７〜２４頁に記載されており、これらの文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。さらに、ソフトウェア（例えば、ＭＷＧ  ｏｎｌｉｎｅ  ｓｉＭＡＸ  ｓｉＲＮＡ設計ツール）が、ｓｉＲＮＡの選択において使用するために市販されておりまたは公的に入手可能である。
【０１９４】
２．アンチセンス
他の実施形態では、融合タンパク質発現は、本発明の癌マーカーをコードする１つまたは複数の核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を使用して調節される。オリゴマー化合物がその標的核酸に特異的にハイブリダイズすれば、核酸の正常機能が干渉を受ける。核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこのような調節は、一般に「アンチセンス」と呼ばれている。干渉を受けるＤＮＡの機能には、複製および転写が挙げられる。干渉を受けるＲＮＡの機能には、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳部位への転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたは複数のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与し得るかまたはＲＮＡにより促進され得る触媒活性などのきわめて重要な機能すべてが挙げられる。標的核酸機能へのそのような干渉の全体的効果は、本発明の癌マーカーの発現の調節である。本発明の文脈では、「調節」は、遺伝子の発現の増加（刺激）または減少（阻害）のどちらかを意味する。例えば、発現が阻害されれば、腫瘍増殖を潜在的に予防し得る。
【０１９５】
本発明は、下に記載される本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。
【０１９６】
Ｂ．遺伝子治療
本発明は、本発明の遺伝子融合物の発現を調節するのに使用するためのどんな遺伝子操作の使用でも企図している。遺伝子操作の例には、遺伝子ノックアウト（例えば組換えを使用して染色体から融合遺伝子を除去すること）、誘導性プロモーターを用いたまたは用いないアンチセンス構築物の発現、および同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への核酸構築物の送達は、適切などんな方法を使用しても行い得る。適切な方法は、望ましい事象（例えば、アンチセンス構築物の発現）が起きるように、核酸構築物を細胞内に導入する方法である。遺伝子治療を使用して、ｓｉＲＮＡまたは（例えば、誘導性プロモーター（例えば、アンドロゲン応答プロモーター）による刺激により）ｉｎ  ｖｉｖｏで発現される他の干渉分子を送達してもよい。
【０１９７】
遺伝情報を担う分子の細胞内への導入は、裸のＤＮＡ構築物の定方向注入、前記構築物を載せた金粒子銃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ならびに、例えば、リポソーム、生体高分子、および同類のものを使用する巨大分子媒介遺伝子移入を含むが、これらに限定されない様々な方法のうちのどれによっても実現される。好ましい方法は、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含むがこれらに限定されないウイルス由来の遺伝子送達ビヒクルを使用する。レトロウイルスと比べてより高い効率性のために、アデノウイルス由来のベクターが核酸分子をｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞内に移入するための好ましい遺伝子送達ビヒクルである。アデノウイルスベクターは、動物モデルにおける様々な固形腫瘍へのおよび免疫不全マウスにおけるヒト固形腫瘍移植片への非常に効率的なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子移入を提供することが明らかにされている。アデノウイルスベクターおよび遺伝子移入のための方法の例は、ＰＣＴ出願ＷＯ００／１２７３８およびＷＯ  ００／０９６７５および米国特許出願公開第６０３３９０８号、米国特許出願公開第６０１９９７８号、米国特許出願公開第６００１５５７号、米国特許出願公開第５９９４１３２号、米国特許出願公開第５９９４１２８号、米国特許出願公開第５９９４１０６号、米国特許出願公開第５９８１２２５号、米国特許出願公開第５８８５８０８号、米国特許出願公開第５８７２１５４号、米国特許出願公開第５８３０７３０号、および米国特許出願公開第５８２４５４４号に記載されており、これらの特許文献はそれぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【０１９８】
ベクターは様々な方法で被験体に投与し得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、ベクターは、直接注入を使用して腫瘍または腫瘍関連組織内に投与される。他の実施形態では、投与は血液またはリンパ循環を介する（例えば、ＰＣＴ出願９９／０２６８５参照。この特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。アデノウイルスベクターの例となる用量レベルは、好ましくは灌流液に添加される１０８〜１０１１ベクター粒子である。
【０１９９】
Ｃ．抗体治療
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の遺伝子融合物を発現する前立腺腫瘍を標的にする抗体を提供する。適切などんな抗体でも（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、または合成の）、本明細書において開示される治療法において利用し得る。好ましい実施形態では、癌治療のために使用される抗体はヒト化抗体である。抗体をヒト化するための方法は当技術分野では周知である（例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第６，０５４，２９７号、および米国特許第５，５６５，３３２号参照。これらの特許文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている）。
【０２００】
いくつかの実施形態では、治療抗体は、抗体が細胞毒性薬にコンジュゲートされている、本発明の遺伝子融合物に対して産生された抗体を含む。そのような実施形態では、正常細胞を標的にせず、したがって従来の化学療法の有害な副作用の多くを減少させる腫瘍特異的治療薬が産生される。ある種の適用のために、治療薬は、抗体への結合のために有用な薬物として働くことになる薬剤、特に内皮細胞を死滅させるまたは内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制する能力を有する細胞毒性または他の抗細胞薬であることが想定されている。本発明は、抗体にコンジュゲートされ、活性型で送達されることが可能などんな薬剤の使用でも企図している。例となる抗細胞薬には、化学療法薬、放射性同位元素、および細胞毒が挙げられる。本発明の治療抗体には、放射性同位元素（例えば、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２３、テクニシウム−９９ｍ、インジウム−１１１、レニウム−１８８、レニウム−１８６、ガリウム−６７、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５またはアスタチン−２１１）、ステロイドなどのホルモン、シトシンなどの代謝拮抗薬（例えば、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリン；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ）、ビンカアルカロイド（例えば、デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン）、およびクロラムブシルまたはメルファランなどの抗腫瘍アルキル化剤を含むが、これらに限定されない様々な細胞毒部分が挙げられ得る。他の実施形態は、血液凝固薬などの作用薬、サイトカイン、増殖因子、細菌内毒素または細菌内毒素のリピドＡ部分を含んでいてよい。例えば、いくつかの実施形態では、治療薬は、少数の例を挙げるだけでも、Ａ鎖毒素、リボソーム不活化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素またはシュードモナス外毒素などの植物由来、真菌由来または細菌由来毒素を含むことになる。いくつかの好ましい実施形態では、脱グリコシル化リシンＡ鎖が利用される。
【０２０１】
いずれにしても、これらの薬剤などの作用薬は、必要ならば、標的腫瘍細胞の部位でのそのターゲティング、内在化、放出または血液成分への提示を可能にする形で、必要に応じて公知のコンジュゲーション技術を使用して抗体に首尾よくコンジュゲートし得ることが提案されている（例えば、Ｇｈｏｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９３巻：２８０頁［１９８３年］参照）。
【０２０２】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の癌マーカー（例えば、ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合物）に標的化された免疫毒素を提供する。免疫毒素は、特定のターゲティング薬、典型的には腫瘍に対する抗体または断片と毒素部分などの細胞毒性薬とのコンジュゲートである。ターゲティング薬は毒素を標的抗原を有している細胞に向け、それによって前記細胞を選択的に死滅させる。いくつかの実施形態では、治療抗体は、高いｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を与える架橋剤を用いる（Ｔｈｏｒｐｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４８巻：６３９６頁［１９８８年］）。
【０２０３】
他の実施形態、特に固形腫瘍の治療に関係する実施形態では、抗体は、血管内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制することにより、腫瘍脈管構造に対して細胞毒性または他の抗細胞効果を有するように設計される。この攻撃は、腫瘍限局性血管虚脱をもたらし、腫瘍細胞、特に脈管構造から遠位にある腫瘍細胞から酸素および栄養素を奪い、最終的には細胞死および腫瘍壊死をもたらすことを目的とする。
【０２０４】
好ましい実施形態では、抗体ベース治療薬は、下に記載される医薬組成物として処方される。好ましい実施形態では、本発明の抗体組成物の投与により、癌の測定可能な減少（例えば、腫瘍の減少または消失）がもたらされる。
【０２０５】
Ｄ．医薬組成物
本発明は、（例えば、本発明の遺伝子融合物の発現または活性を調節する医薬品を含む）医薬組成物をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、局所的が望ましいのかまたは全身的治療が望ましいのかどうか、および治療される領域に応じていくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼部を含む、および膣および直腸送達を含む粘膜への）、肺（例えば、ネブライザーなどによる、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくはガス注入により；気管内、鼻腔内、表皮および経皮）、経口または非経口でよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入；または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内投与が含まれる。
【０２０６】
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤およびこれと同類のものは、必要であるかまたは望ましいこともある。
【０２０７】
経口投与のための組成物および製剤は、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水媒質の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェまたは錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散剤または結合剤が望ましいこともある。
【０２０８】
非経口、くも膜下腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤ならびに、浸透増強剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などの、しかしこれらに限定されない他の適切な添加物も含有し得る無菌水溶液を含み得る。
【０２０９】
本発明の医薬組成物は、溶液、乳液、およびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、前もって形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない様々な成分から作製してよい。
【０２１０】
本発明の医薬製剤は、都合よく単位投与量の形で提示されてもよいが、製薬工業において周知の従来の技法に従って調製してもよい。そのような技法は、活性成分を医薬担体（複数可）または賦形剤（複数可）と会合させるステップを含む。一般的には、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化された固体担体、またはその両方と均一におよび密に会合させ、次に、必要であれば、製品を成形することにより調製される。
【０２１１】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸剤などの、しかしこれらに限定されない多くの考え得る剤形のどれにでも処方し得る。本発明の組成物は、水媒質、非水媒質または混合媒質の懸濁液として処方してもよい。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤も含有してよい。
【０２１２】
本発明の一実施形態では、医薬組成物は泡沫として処方され使用され得る。医薬泡沫には、乳濁液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの、しかしこれらに限定されない製剤が含まれる。これらの製剤は性質は基本的に類似しているが、最終製品の成分および濃度は異なる。
【０２１３】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取込みを増強する作用薬を、本発明の医薬および他の組成物に添加してもよい。例えば、リポフェクチン（米国特許第５７０５１８８号）などの陽イオン性脂質、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（ＷＯ９７／３０７３１）などのポリカチオン性分子も、オリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強する。
【０２１４】
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来から含まれる他の補助成分をさらに含有し得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔もしくは抗炎症剤などの追加の適合性薬学的活性物質を含有してもよく、色素、香味料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な追加の物質を含有していてもよい。しかし、そのような物質は、添加されたときに、本発明の組成物の成分の生物活性を過度に妨げるべきではない。製剤は無菌化し、必要であれば、補助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、緩衝剤、着色剤、香味料、および／または芳香剤ならびに製剤の核酸（複数可）と有害に相互作用しない同類のものと混合することが可能である。
【０２１５】
本発明のある種の実施形態は、（ａ）１つまたは複数のアンチセンス化合物および（ｂ）非アンチセンス機序により機能する１つまたは複数の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの抗癌剤が挙げられるが、これらに限定されない。非ステロイド系抗炎症薬および副腎皮質ステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症薬、ならびにリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むがこれらに限定されない抗ウイルス薬も、本発明の組成物において組み合わせ得る。他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内である。２つまたはそれ以上の組み合わせた化合物を一緒にまたは順次に使用してよい。
【０２１６】
数日から数カ月、または治癒がもたらされるかもしくは病状の減少が実現されるまで続く治療の進行に合わせて、投薬は治療される病状の重症度および応答性に依存する。最適な投薬計画は、患者の体内の薬物の蓄積の測定値から計算することが可能である。投薬する医師は、最適投与量、投与方法および繰返しのペースを容易に決定することができる。最適投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変わることがあり、一般には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて効果的であることが分かっているＥＣ５０に基づいてまたは本明細書に記載される例に基づいて見積もることが可能である。一般に、投与量は体重ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまでであり、毎日、毎週、毎月または毎年１回または複数回与えてよい。治療している医師は、計測された滞留時間および体液または組織中の薬物の濃度に基づいて投与のための繰返しのペースを見積もることができる。治療の成功に続いて、オリゴヌクレオチドが、毎日１回または複数回から２０年毎に１回まで、体重ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまでの範囲の維持投与量で投与される、病状の再発を予防するための維持療法を被験体に受けてもらうことが望ましいことがある。
【０２１７】
ＶＩ．トランスジェニック動物
本発明は、本発明の外来性癌マーカー遺伝子（例えば、遺伝子融合物）またはその変異体および改変体（例えば、トランケーションまたは一塩基多型）を含むトランスジェニック動物の作製を企図している。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は、野生型動物と比べて変化した表現型（例えば、マーカーの存在の増加または減少）を示す。そのような表現型の存在または不在を分析するための方法は、本明細書に開示される方法を含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は腫瘍の増殖または癌の証拠の増加または減少をさらに示す。
【０２１８】
本発明のトランスジェニック動物は、薬物（例えば、癌治療）スクリーニングに利用法を見つける。いくつかの実施形態では、試験化合物（例えば、癌を治療するのに有用ではないかと疑われている薬物）および対照化合物（例えば、プラセボ）はトランスジェニック動物および対照動物に投与され、その効果が評価される。
【０２１９】
トランスジェニック動物は様々な方法を介して作製することが可能である。いくつかの実施形態では、様々な発生段階の胚細胞を使用して、トランスジェニック動物を作製するためのトランス遺伝子を導入する。胚細胞の発生段階に応じて異なる方法が使用される。接合体はマイクロインジェクションに最良の標的である。マウスでは、雄前核は、１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の再現性のある注入を可能にする直径でほぼ２０マイクロメーターの大きさに到達する。遺伝子移入のための標的としての接合体の使用は、ほとんどの場合に注入されたＤＮＡは最初の卵割前に宿主ゲノムに組み込まれることになる点で大きな利点を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：４４３８〜４４４２頁［１９８５年］）。したがって、トランスジェニック非ヒト動物の細胞はすべて組み込まれたトランス遺伝子を有することになる。生殖細胞の５０％がトランス遺伝子を宿すことになるために、これは一般には、初代（ｆｏｕｎｄｅｒ）の子孫へのトランス遺伝子の効率的な伝達にも反映されることになる。米国特許第４８７３１９１号は、接合体のマイクロインジェクションのための方法を記載しており、この特許の開示はその全体を本明細書に組み込まれている。
【０２２０】
他の実施形態では、レトロウイルス感染を使用して、非ヒト動物にトランス遺伝子を導入する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターを利用して、卵母細胞の囲卵腔にレトロウイルスベクターを注入することにより卵母細胞をトランスフェクトする（米国特許第６，０８０，９１２号、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている）。他の実施形態では、発生中の非ヒト胚を胚盤胞期までｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することが可能である。この期間中、卵割球はレトロウイルス感染のための標的になることが可能である（Ｊａｎｅｎｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７３巻：１２６０頁［１９７６年］）。卵割球の効率的感染は、透明帯を取り除く酵素的処理により得られる（Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．  ［１９８６年］）。トランス遺伝子を導入するのに使用されるウイルスベクター系は、典型的にはトランス遺伝子を有する複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：６９２７頁［１９８５年］）。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で卵割球を培養することにより、容易に効率的に得られる（Ｓｔｅｗａｒｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６巻：３８３頁［１９８７年］）。代わりに、感染はもっと後の段階で実施することが可能である。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔に注入することが可能である（Ｊａｈｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８巻：６２３頁［１９８２年］）。初代の大半は、組込みがトランスジェニック動物を形成する細胞のサブセットにおいてのみ起こるために、トランス遺伝子ではモザイク状になる。さらに、初代は、一般に子孫において分離することになるゲノム中の異なる位置にトランス遺伝子の様々なレトロウイルス挿入を含有し得る。さらに、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染により、トランス遺伝子を生殖系列に、低効率でも導入することも可能である（Ｊａｈｎｅｒら、上記参照  ［１９８２年］）。当技術分野に公知のトランスジェニック動物を作製するためにレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する追加の手段は、受精卵または初期胚の囲卵腔へのレトロウイルス粒子またはレトロウイルスを産生するマイトマイシンＣ処理細胞のマイクロインジェクションを含む（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９０／０８８３２［１９９０年］、ならびにＨａｓｋｅｌｌおよびＢｏｗｅｎ、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｄｅｖ．、４０巻：３８６頁［１９９５年］）。
【０２２１】
他の実施形態では、トランス遺伝子は胚性幹細胞に導入され、トランスフェクトされた幹細胞を利用して胚を形成する。ＥＳ細胞は、適切な条件下で着床前胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより得られる（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２巻：１５４頁［１９８１年］；  Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９巻：２５５頁［１９８４年］；  Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３巻：９０６５頁［１９８６年］；  およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２巻：４４５頁［１９８６年］）。リン酸カルシウム共沈、プロトプラストまたはスフェロプラスト融合、リポフェクションおよびＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションを含む当技術分野に公知の様々な方法によるＤＮＡトランスフェクションによりトランス遺伝子はＥＳ細胞に効率的に導入することが可能である。トランス遺伝子は、レトロウイルス媒介形質導入によりまたはマイクロインジェクションによりＥＳ細胞に導入してもよい。そのようなトランスフェクトされたＥＳ細胞は、胚盤胞期胚の胞胚腔へのその導入に続いて、その後、胚に定着し（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）、こうして得られたキメラ動物の生殖系列に寄与することが可能である（概説については、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０巻：１４６８頁［１９８８年］参照）。トランスフェクトされたＥＳ細胞の胞胚腔への導入に先立って、トランスフェクトされたＥＳ細胞はトランス遺伝子を取り込んでいるＥＳ細胞をエンリッチする様々な選択プロトコールに供され得、これは、トランス遺伝子はそのような選択のための手段を提供すると想定する。代わりに、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、トランス遺伝子を取り込んでいるＥＳ細胞を求めてスクリーニングしてもよい。この技法は、胞胚腔への移入に先立つ適切な選択条件下でのトランスフェクトされたＥＳ細胞の増殖を不必要にする。
【０２２２】
さらに他の実施形態では、相同組換えを利用して遺伝子機能をノックアウトするかまたは欠失改変体（例えば、トランケーション改変体）を作製する。相同組換えのための方法は、米国特許第５，６１４，３９６号に記載されており、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている。
【０２２３】
実験
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態および局面を実証し、さらに概説するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２２４】
（実施例１）
本実施例は実施例２のために使用される材料および方法を説明する。
【０２２５】
試料および細胞系統
良性不死化前立腺細胞系統ＲＷＰＥおよび前立腺癌細胞系統ＬＮＣａＰは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。原発性良性前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）はＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅから入手した。ＶＣａＰはホルモン抵抗性転移性前立腺癌を有する患者由来の脊椎骨転移に由来した（Ｋｏｒｅｎｃｈｕｋら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  （Ａｔｈｅｎｓ、Ｇｒｅｅｃｅ）１５巻：１６３頁［２００１年］）。
【０２２６】
アンドロゲン刺激実験は、２４および４８時間、１％エタノールまたはエタノール中に溶解した１ｎＭのメチルトリエノロン（Ｒ１８８１、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いた処理の前に、２４時間活性炭素除去血清含有培地において増殖させられたＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞を用いて実施された。全ＲＮＡは、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて単離された。
【０２２７】
前立腺組織は、ミシガン大学の前立腺癌専門優良研究プログラム（Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ）組織コアの、ミシガン大学の根治的前立腺切除術系列および迅速部検プログラム（Ｒｕｂｉｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６巻：１０３８頁［２０００年］）から入手した。
【０２２８】
４５４ＦＬＸ配列決定
ポリＡ＋ＲＮＡは、製造業者の説明書に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡ精製キット（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を使用する常磁性ビーズを含有するオリゴ−ｄＴでの２ラウンドの選択を使用して５０μｇ全ＲＮＡから精製された。２００ｎｇ  ｍＲＮＡは、２分間、断片化緩衝液（Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１００ｍＭ  酢酸カリウム、３１．５ｍＭ  酢酸マグネシウム、ｐＨ８．１）中８２℃で断片化された。第１鎖ｃＤＮＡライブラリーは、標準プロトコールに従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製され、配向性アダプターはクローン増幅およびＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸでの配列決定のためにｃＤＮＡ末端にライゲートされた。示されるように、５’末端アダプターＡは５ヌクレオチドの５’オーバーハングを有し、３’末端アダプターＢは６ランダムヌクレオチドの３’オーバーハングを有している。
【０２２９】
【化９】
2012514475.tif 000011
アダプターライゲーション反応は、１．６７μＭのアダプターＡ、６．６７μＭのアダプターＢおよび２０００ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を含有するクイックリガーゼ緩衝液（Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）中、３７℃で２時間実施された。適合化ライブラリー（ａｄａｐｔｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）は、製造業者の説明書に従って、０．０５％Ｓｅｒａ−Ｍａｇ３０ストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて回収された。最後に、ｓｓｃＤＮＡライブラリーは、ビーズの量を試料の容量の１．６倍にまで減らしたこと以外は、製造業者の指示通りにＲＮＡＣｌｅａｎ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて二度精製された。精製されたｓｓｃＤＮＡライブラリーは、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のＲＮＡ６０００Ｐｉｃｏチップ上で分析されて、４５０から７５０ヌクレオチドのサイズ分布を確認し、製造業者に指示に従って、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）器機上でＱｕａｎｔ−ｉＴ  Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ  ＲＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて定量された。ライブラリーは、プライマーＡ（５’−ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＣＧ  ＣＣＡ−３’；配列番号５）およびプライマーＢ（５’−ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＣ−３’；配列番号６）のそれぞれを２μＭ、４００μＭ  ｄＮＴＰ、１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２緩衝液ならびに１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ混合液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてＰＣＲ増幅された。増幅反応は、９６℃で４分間；９４℃で３０秒間；６４℃で３０秒間；ステップ２と３を全体で２０サイクル繰り返し、続いて６８℃で３分間で実施された。試料は、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して精製され、μｌあたり２００，０００分子の最終作業濃度まで希釈された。配列決定のためのエマルジョンビーズは、シークエンシングｅｍＰＣＲキットＩＩおよびキットＩＩＩを使用して作製され、配列決定は６００，０００ビーズを使用して実施された。
【０２３０】
差し引きによる正規化
前立腺癌細胞系統ＶＣａＰ由来のｍＲＮＡは、製造業者の説明書に従って、磁気ビーズ上に固定化された差し引き細胞系統ＬＮＣａＰ第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズされた。両方の細胞に共通の転写物は捕獲され、ビーズ結合差し引きｃＤＮＡの磁気分離により除去され、上清に残された差し引きされたＶＣａＰ  ｍＲＮＡは沈殿により回収され、配列決定ライブラリーを作製するために記載される通りに使用された。正規化の効率は、差し引き前および後の試料中の選択転写物のレベルのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにより評価された。
【０２３１】
Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザー配列決定
２００ｎｇ  ｍＲＮＡは、断片化緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中、７０℃で５分間断片化され、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡに変換され、続いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第２鎖ｃＤＮＡが合成された。二本鎖ｃＤＮＡライブラリーは、ＩｌｌｕｍｉｎａゲノムＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐキットによりさらに処理され；処理は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用する末端修復を含み、続いてＫｌｅｎｏｗ３’ｔｏ５’エキソポリメラーゼを使用して単一＜Ａ＞塩基が付加され、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してＩｌｌｕｍｉｎａのアダプターオリゴ混合物を用いてライゲートされた。アダプターライゲートライブラリーは、４％アガロースゲル上で分離し、２００ｂｐ（＋／−２５ｂｐ）でライブラリースミアを切り離すことによりサイズ選択された。前記ライブラリーは、Ｐｈｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりＰＣＲ増幅され、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製された。前記ライブラリーは、製造業者の指示に従って、ＭｏｄｕｌｕｓＴＭシングルチューブルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上でＱｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて定量された。１０ｎＭライブラリーを使用して、レーンあたり約３０，０００クラスターを有するフローセルを調製した。
【０２３２】
配列データベース
ヒトゲノムビルド１８（ｈｇ１８）は参照ゲノムとして使用された。全ＵＣＳＣおよびＲｅｆｓｅｑ転写物は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（Ｋａｒｏｌｃｈｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２巻：Ｄ４９３［２００４年］）からダウンロードされた。以前同定されたＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧａ融合転写物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＤＱ２０４７７２）およびＢＣＲ−ＡＢＬ１融合転写物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｍ３０８２９）の配列は参照のために使用された。
【０２３３】
短リードキメラ発見
ヒトゲノム、Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子、ミトコンドリア、リボソーム、または汚染物質配列に完全には整列しない短リードは、ノンマッピングとして分類される。多くのキメラでは、融合パートナーにマッピングするより大きな部分（主要アライメント）、および第２パートナーに整列するより小さな部分（小アライメント）が存在すると予想された。したがって、手法は、先ず主要アライメントを同定し次に小アライメントを同定するためのより徹底的な手法を実施することに焦点を合わせた２段階に分けられた。第１段階では、全ノンマッピングリードは、パターンマッチングプログラムであるＶｍａｔｃｈ（Ａｂｏｕｅｌｈｏｄａら、Ｊ．  Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｓｍｓ１巻：５３頁［２００４年］）を使用してＲｅｆｓｅｑ遺伝子の全エクソンに対して整列させられる。１２またはそれ以上のヌクレオチドのエクソン境界へのアライメントを有するリードのみを潜在的キメラとして保持する。第２段階では、次に、残りのリードのノンマッピング部分は、わずか６ヌクレオチドのアライメントを検出するため正規表現（ｒｅｇｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を利用するＰｅｒｌスクリプトを使用して考えられるすべてのエクソン境界にマッピングされる。２つの別々の遺伝子のエクソン境界への部分的アライメントを示す短リードのみがキメラとして分類される。遺伝子ｘに整列している２８ヌクレオチドおよび、８ｍｅｒが遺伝子ｙと遺伝子ｚを区別するだけの配列分解能を提供しないために遺伝子ｙおよびｚに整列する８ヌクレオチドを有するキメラを有することが可能である。したがって、これは２つの個々のキメラとして分類される。配列が５つを超えるキメラを形成する場合、その配列は曖昧なので破棄される。偽陽性を最小限に抑えるため、予想される遺伝子融合事象は、少なくとも２つの支持キメラを有することが必要とされた。
【０２３４】
長および短リード統合キメラ発見
４５４リードすべては、迅速ｍＲＮＡ／ＤＮＡアライメントツールであるＢＬＡＴ（Ｋｅｎｔ、Ｇｅｎ．  Ｒｅｓ．１２巻：６５６頁［２００２年］）を使用して、ヒトＲｅｆｓｅｑコレクションに対して整列される。Ｐｅｒｌスクリプトを使用して、ＢＬＡＳＴ出力ファイルは潜在的キメラリードを検出するために解析（ｐａｒｓｅ）された。リードは、それが公知のＲｅｆｓｅｑ転写物に９０％を超えるアライメントを示す場合は完全に整列しているとして分類される。次に、これらは、ほとんど完全に整列しており、したがってキメラに特徴的ではないので、破棄される。残りのリードから、推定キメラを表す２つのＲｅｆｓｅｑ転写物に部分的アライメントを有し、最小オーバーラップがあるリードについて照会するのが望ましかった。これを実現するために、考えられるＢＬＡＴアライメントすべては、推定キメラについて繰り返され、６ヌクレオチドまたは２コドン以下のオーバーラップを有する部分的アライメントのみを抽出した。このステップは、反復領域、大きな遺伝子ファミリー、および保存ドメインにより導入される偽陽性キメラを減少する。さらに、手法は部分的アライメント間のオーバーラップは許容するが、部分的アライメント間に１０を超えるヌクレオチドを有するものはフィルターにかける。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホームから生み出される短リード（３６ヌクレオチド）は、短リードのためのアライメントツールであるＥｌａｎｄを使用してＲｅｆｓｅｑデータベースおよびヒトゲノムに対して整列させることにより解析される。完全に整列するかまたはクォリティーコントロールできないリードは取り除かれ、キメラのための豊富な供給源である「ノンマッピング」リードのみが残される。これらのノンマッピング短リードは、続いて、パターンマッチングプログラムであるＶｍａｔｃｈ２０を使用して、全推定長リードキメラ（上記の通りに入手される）に対して整列される。それぞれの側で少なくとも３ヌクレオチド融合物境界をまたぐリードのみを抽出するために、Ｐｅｒｌスクリプトを使用してＶｍａｔｃｈ出力を解析する。この統合に続いて、残りの推定キメラは、部分的アライメントが、それぞれ異なった染色体または同一染色体上に位置しているかどうかに基づいて染色体間または染色体内キメラとして分類される。隣接する遺伝子への部分的アライメントを有する染色体内キメラは、リードスルーとしても公知の遺伝子間スプライシングと組み合わされる隣接する遺伝子の共転写の産物（ＣｏＴＩＳ）であると考えられる（Ｃｏｍｍｕｎｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７６巻：１６５６１頁［２００１年］）。残りの染色体内キメラおよび全染色体間キメラは候補遺伝子融合物と見なされる。
【０２３５】
偽陽性キメラの１つの追加の供給源は、Ｒｅｆｓｅｑにはない未知の転写物である可能性がある。Ｒｅｆｓｅｑデータベースにおけるその不在のせいで、対応する長リードは完全なアライメントを示すことができず、代わりに部分的ヒットを示すと考えられる。続いて、この転写物にまたがる短リードは、人工的に作製された融合物境界を自然に検証すると考えられる。したがって、これらの候補を取り除くために、キメラのすべてはＢＬＡＴを使用してヒトゲノムに対して整列させられた。長リードが１つのゲノム位置に対して９０％を超えるアライメントを有する場合、そのリードはキメラリードではなく新規の転写物と見なされた。残りのキメラは、融合物境界をまたぐ短リードカバレージに対して融合物境界をまたぐ長リードカバレージを掛けることにより計算されるスコアーを与えられた。
【０２３６】
カバレージ分析
遺伝子座ごとの転写カバレージは、ＥＬＡＮＤを介してエクソンにマッピングされた通過フィルターリードの総数から計算された。これらのリードの総数にリード長を掛け、ＵＣＳＣ  ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ表（２００６年３月、アッセンブリ）において定義されている全エクソン長の合計により決定される遺伝子の前記遺伝子の最長転写物アイソフォームで割った。ヌクレオチドカバレージは、考えうるすべてのＵＣＳＣ転写物アイソフォーム由来のエクソンの非重複セット内のすべてのヌクレオチド位置で、ＥＬＡＮＤマッピングに基づいて、全リードを列挙することにより決定された。
【０２３７】
アレイＣＧＨ分析
オリゴヌクレオチド比較ゲノムハイブリダイゼーションは、全ゲノムレベルで不均衡なコピー数変化を検出するための高分解能法である。アレイフォーマット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）にプリントされたオリゴヌクレオチドへの異なって標識された腫瘍および参照ＤＮＡの競合的ハイブリダイゼーションおよび各プローブについての蛍光強度の分析により、正常参照ゲノムに対する腫瘍試料におけるコピー数変化が検出される。ゲノム切断点は、ＣＧＨ分析アルゴリズムにおいて異常検出法（ＡＤＭ）により検出される各ゲノム間隔を表す１つを超えるプローブを含む増加および減少についての少なくとも１コピー（対数比±０．５）のコピー数レベルの変化を有する領域で同定された。
【０２３８】
リアルタイムＰＣＲ検証
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）は、記載された通りに、アプライドバイオシステムズステップワンプラスリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ）上で、パワーＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施された（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５９５頁［２００７年］）。オリゴヌクレオチドプライマーはすべて、インテグレイティッドＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成された。全アッセイは２連または３連実施され、結果はＧＡＰＤＨに対して平均倍率変化としてプロットされた。
【０２３９】
ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４についての定量的ＰＣＲは、製造業者の説明書に従って、融合特異的プライマーおよび内部オリゴヌクレオチドとしてユニバーサルプローブライブラリー（ＵＰＬ）のプローブ＃７のＨｕｍａｎ（Ｒｏｃｈｅ）を使用するタックマン（Ｔａｑｍａｎ）アッセイ法により実施された。ＰＧＫ１は、製造業者の説明書に従って、ＵＰＬベースタックマンアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）のためのハウスキーピング対照遺伝子として使用された。ＨＭＢＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔａｑｍａｎ  ａｓｓａｙ  Ｈｓ００６０９２９７＿ｍｌ）は、標準プロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってタックマンアッセイのためのハウスキーピング遺伝子対照として使用された。
【０２４０】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨハイブリダイゼーションは、ＶＣａＰ、ＬＮＣａＰ、およびＦＦＰＥ腫瘍および正常組織上で実施された。ＢＡＣクローンはＵＣＳＣゲノムブラウザから選択された。コロニー精製に続いて、ミディプレップＤＮＡは、キアゲンチップス１００（Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｐｓ−１００）（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して調製された。ＤＮＡは、ビオチン−１６−ｄＵＴＰおよびジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）を用いるニックトランスレーション標識化により標識された。プローブＤＮＡは沈殿され、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン、および１％デンハート液を含有するハイブリダイゼーション混合液に溶解された。約２００ｎｇの標識プローブは、各ＢＡＣクローンのマップ位置を確認するために正常ヒト染色体にハイブリダイズされた。ＦＩＳＨシグナルは、それぞれ緑色および赤色を表す抗ジゴキシゲニン−フルオレセインおよびアレクサフルオロ（ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ）５９４コンジュゲートを使用して得られた。蛍光画像はＩＳＩＳ画像処理ソフトウェア（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により制御される高解像度ＣＣＤカメラを使用して撮像された。
【０２４１】
アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ゲノムワイドヒトＳＮＰアレイ６．０
ゲノムＤＮＡ試料のそれぞれの１μｇは、ゲノムワイドヒトＳＮＰアレイ６．０上での１５試料のゲノムレベル分析のために、アフィメトリックスサービスセンター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｇｒａｎｄ  Ｒａｐｉｄ、ＭＩ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｒｅ、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）に送られた。コピー数分析はアフィメトリックスジェノタイピングコンソール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｌｅ）ソフトウェアを使用して実行され、視覚化はジェノタイピングコンソール（ＧＴＣ）ブラウザにより行われた。
【０２４２】
（実施例２）
本発明の過程中に行われた実験中の概念実証として、古典的遺伝子融合物ＢＣＲ−ＡＢＬ１（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３１５巻：５５０頁［１９８５年］）を有する慢性骨髄性白血病細胞系統、Ｋ５６２の全トランスクリプトーム配列決定が実施された。Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザーを使用して、３６ヌクレオチド長の６６９０万リードが作製され、２つの異なる遺伝子由来のエクソン境界への部分的アライメントを示すリードの存在についてスクリーニングされた。この手法はＢＣＲ−ＡＢＬ１を検出することができたが、ＢＣＲ−ＡＢＬ１は他の１１１のキメラ（少なくとも２リードを有する）のセットのうちの１つであった。したがって、デノボ発見モードでは、その他の推定キメラのバックグラウンド中でＢＣＲ−ＡＢＬ１融合物を特定するのは困難である。しかし、ＢＣＲ−ＡＢＬ１の公知の融合物接合部（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ３０８２９）を参照配列として使用した場合、１９のキメラリードが検出された（図１）。したがって、深い配列データを得るための短リード配列決定技術および候補融合遺伝子をマッピングするために参照配列を提供するための長リード技術（Ｒｏｃｈｅ４５４配列決定プラットホーム）を利用する統合的手法がキメラ検出のために使用された。
【０２４３】
トランスクリプトーム配列決定における一要因は、極めて大量のハウスキーピング遺伝子のバックグラウンドにおいてキメラ転写物を検出することが可能かどうか（すなわち、ｃＤＮＡ正規化が必要かどうか）であった。これに取り組むために、遺伝子融合物ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧを有する前立腺癌細胞系統ＶＣａＰの正規化および非正規化ｃＤＮＡライブラリーからの配列が比較された（表１）。全体としては、正規化されたライブラリーは、ノミネートされたキメラの総数において約３．６倍の減少を示した。さらに、正規化されたライブラリーはＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合物についてエンリッチすると予想されたが、正規化されたライブラリーはどんなＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧキメラも明らかにできず、正規化はこれらの分析に利益をもたらすことはないことを示していた。
【０２４４】
新規の遺伝子融合物を同定するための大規模並行トランスクリプトーム配列決定を使用することの実現可能性を評価するために、非正規化ｃＤＮＡライブラリーは、前立腺癌細胞系統ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ、ならびに良性不死化前立腺細胞系統ＲＷＰＥから作製された。第１ステップとして、Ｒｏｃｈｅ４５４プラットホームを使用して、総数で５５１，９１２のＶＣａＰ、２４４，９８４のＬＮＣａＰ、および８２６，６２４のＲＷＰＥトランスクリプトーム配列リードが作製され、平均して２２９．４ヌクレオチドであった。これらは、ヒト参照データベースに完全に整列している、部分的に整列している、またはノンマッピングとして分類された（図２）。２つの遺伝子に部分的アライメントを示す配列リードは、第１パス候補キメラとしてノミネートされた。これにより、４２８のＶＣａｐ、２４７のＬＮＣａＰ、および８３のＲＷＰＥ候補が得られた。
【０２４５】
確かに、これらのキメラ配列の多くは、トランススプライシング（Ｔａｋａｈａｒａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ１８巻：２４５頁［２００５年］）、もしくは遺伝子間スプライシングと組み合わされた隣接する遺伝子の共転写（Ｃｏｍｍｕｎｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６巻：１６５６１頁［２００１年］）の結果、または単に配列決定プロトコールの人為的結果である可能性がある。４２８のＶＣａＰ候補のうち、１つのリードのみが、長リード配列決定プラットホームを使用してＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合物接合部をまたいでいた（表２）。
【０２４６】
次に、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザーを使用して、ＶＣａＰ、ＬＮＣａＰおよびＲＷＰＥ  ｃＤＮＡライブラリーから５０００万を超える短トランスクリプトーム配列リードが得られた（表３）。最初はＶＣａＰ細胞に焦点を合わせて、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合物が５７の候補のうちの１つとして同定され、これらの候補の多くはおそらく偽陽性であった。偽陽性、長リードにおける深みの欠如、および部分的に整列している短リードのマッピングの困難さという問題を克服するために、長および短リード配列データの統合が検討された。この戦略に続いて、ＶＣａＰトランスクリプトーム配列からＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ接合部をまたぐシングル長リードキメラ配列が見つかり、２１の短リードにより支持され（図２）、全体としてはノミネートされたわずか８キメラのうちの１つとして存在した。したがって、統合的手法を使用して、偽候補の総数は減少し、実験的に検証される候補の割合が劇的に増加した（図３）。統合的分析をＬＮＣａＰおよびＲＷＰＥ配列にまで拡張すると、総数で１５のキメラ転写物が得られ、そのうちの１０は実験的に確認することができた（表４）。確実に統合戦略が偽陽性のみをフィルタリングして取り除き有効なキメラは除かれないように、統合により除かれた１６の長リードキメラ候補のパネルが試験された。そのうち、ｑＲＴ−ＰＣＲにより融合転写物を確認された候補はなかった（図４）。
【０２４７】
２つの配列決定プラットホームにより提供される集合的カバレージを体系的に活用し、候補の優先順位を付けるために、スコアリング機能が考案された。スコアーは、どちらかの方法から導き出されるキメラリードの数を掛けることにより得られた（表４）。さらに、これらのキメラは、それぞれ同一または異なる染色体上のその位置に基づいて、染色体内または染色体間として分類された。後者は、非隣接転写物に整列する染色体内キメラが表すのと同じように本物の遺伝子融合物を表し、隣接する遺伝子間の染色体内キメラは（リードスルー）として分類される。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧは、トップの遺伝子融合配列であり、リードスルーキメラＺＮＦ５７７−ＺＮＦ６４９に次いで第２位であった。
【０２４８】
ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧに加えて、ＶＣａＰにおいていくつかの新しい遺伝子融合物が同定された。１つのそのような融合物は、ＵＳＰ１０のエクソン１とＺＤＨＨＣ７のエクソン３の間にあり、両遺伝子とも第１６染色体上に、約２００ｋｂ離れて反対配向において位置していた（図５）。さらに、第２染色体上の遺伝子ＨＪＵＲＰを含む２つの別々の融合物が同定された。ＥＩＦ４Ｅ２のエクソン２とＨＪＵＲＰのエクソン８間の融合物は融合転写物ＥＩＦ４Ｅ２−ＨＪＵＲＰを生み出し、ＨＪＵＲＰのエクソン９とＩＮＰＰ４Ａのエクソン２５間の融合物はＨＪＵＲＰ−ＩＮＰＰ４Ａを生じた（図５、図６）。
【０２４９】
ＶＣａＰにおいてＨＪＵＲＰを含むこの予想されない複合染色体内再配列はさらに調査された。ＨＪＵＲＰのエクソン８とエクソン９の両方が異なる遺伝子に融合するという事実は、切断点がイントロン内に存在することを示している（図５）。これらの遺伝子融合物の両方は、ＶＣａＰおよびＶＣａＰ−ＭｅｔにおけるｑＲＴ−ＰＣＲにより確認され、試験された他の試料には不在であることが見出された。この複合染色体内再配列はＦＩＳＨ分析によっても確認された。ＨＪＵＲＰは、癌細胞におけるゲノム不安定性および不死性に関連していることが明らかにされた（Ｋａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７巻：８５４４頁［２００７年］）が、ＩＮＰＰ４Ａはホスファチジルイノシトールシグナル伝達経路に関与する酵素の１つをコードしており、ＥＩＦ４Ｅ２は真核生物翻訳開始因子である（Ｇｒｅｅｎｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ４４６巻：１５３頁［２００７年］）。
【０２５０】
興味深いことに、全トランスクリプトーム配列決定に基づいて、トップＬＮＣａＰ遺伝子融合物は、第１４染色体上のＭＩＰＯＬ１のエクソン１１と第７染色体上のＤＧＫＢの最後のエクソン間にあり、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＦＩＳＨにより確認された（図７、図８）。発癌性ＥＴＳ転写因子ファミリーのメンバーであるＥＴＶ１の過剰発現は、ＬＮＣａＰ細胞３における腫瘍増殖に関与していることが最近実証された。そのメカニズムの理解は本発明を実施するのに必要ではなく、本発明はどんな特定の作用メカニズムにも限定されないが、ＥＴＶ１過剰発現のメカニズムは、ＥＴＶ１遺伝子を包含する約２８０ＫｂのＭＩＰＯＬ１のイントロン領域への潜在的な挿入のせいであった。したがって、以前の研究は、ＥＴＶ１融合転写物の証拠なしにＥＴＶ１が再配列されると示唆していたが、本明細書ではＤＧＫＢに対するＭＩＰＯＬ１の代替融合の生成の証拠が示されており、この融合はＥＴＶ１染色体異常を示しているように思われる。
【０２５１】
遺伝子融合物に加えて、いくつかの転写物キメラが隣接する遺伝子間で同定され、リードスルー事象と呼ばれた。全体として、リードスルー事象は悪性試料と良性試料の両方にわたりより広く発現されているように思われるが、遺伝子融合物は癌細胞特異的であった（図９）。例えば、ＬＮＣａＰ細胞におけるＣ１９ｏｒｆ２５のエクソン２と隣接する遺伝子ＡＰＣ２のイントロン間のキメラである（図９）。実験的検証により、遺伝子融合物で観察されるよりも低いＣ１９ｏｒｆ２５−ＡＰＣ２（イントロン）の発現レベル、および複数の細胞系統における弱い発現が実証され、より広く発現されていることが示唆された。ＷＤＲ５５−ＤＮＤ１（図９）、ＭＢＴＰＳ２−ＹＹ２（図９）およびＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７（図９）では類似のパターンが観察された。
【０２５２】
多くの研究が遺伝子融合物候補を調べるためにゲノム情報を利用している（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．４０巻：７２２頁［２００８年］；Ｂａｓｈｉｒら、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．４巻：ｅ１００００５１［２００８年］）。したがって、トランスクリプトームデータがゲノムＤＮＡ分析から明らかになることはないキメラを検出するかどうかを決定することが望ましかった。そうするために、マッチさせた（ｍａｔｃｈｅｄ）試料のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションからの不均衡ゲノムコピー数変化データは統合され、ゲノム異常は遺伝子融合物候補内でモニターされた。これにより、２つの遺伝子融合物候補、ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７およびＭＩＰＯＬ１−ＤＧＫＢに関与する遺伝子の切断点が明らかになった（表４）。さらに具体的には、ホモ接合型欠失は、ＶＣａＰ細胞の他にもＶＣａＰが由来する親転移性前立腺癌組織（ＶＣａＰ−Ｍｅｔ）においてＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７間の領域にまたがることが観察されたが、正常前立腺細胞系統ＲＷＰＥでは観察されなかった（図１９）。そのメカニズムの理解は本発明を実施するのに必要ではなく、本発明はどんな特定の作用メカニズムにも限定されないが、総合すれば、これは複合再配列と組み合わされた欠失はＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７融合物を生み出していた可能性があることを示している。ｑＲＴ−ＰＣＲに基づく評価により、この融合がＶＣａＰおよびその親組織のＶＣａＰ−Ｍｅｔに特異的であり、ＬＮＣａＰ、ＲＷＰＥ、ＰＲＥＣまたは転移性前立腺癌組織（Ｍｅｔ２）においては特異的ではないことが確認された（図５）。ＬＮＣａＰ細胞において、ＭＩＰＯＬ１−ＤＧＫＢ融合物では切断点はＤＧＫＢにおいてのみ見出され、ＭＩＰＯＬ１では見出されなかった。さらに、調べられた他のすべての融合キメラにおける切断点の不在は、配列決定により同定された融合遺伝子候補の大部分が、ゲノムコピー数異常データを探し出すことにより発見されることはなかったことを示している。さらに、ゲノム再配列のサブセットのみが機能的遺伝子融合物を潜在的に表しているが、大半のキメラ転写物は、それが見出される細胞の生物学においてありそうな役割を有する生産的融合物を示す。
【０２５３】
次に、この方法論は、多くの場合、良性上皮、間質、リンパ球および血管細胞と混合した悪性細胞を表す腫瘍試料に拡張された。トランスクリプトーム配列決定は、２つのＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合物陽性転移性前立腺癌組織、ＶＣａＰ−Ｍｅｔ（ＶＣａＰ細胞系統はこれに由来する）およびＭｅｔ３、ならびに１つのＥＲＧ陰性転移性前立腺組織、Ｍｅｔ４を使用して実施された。ＶＣａＰ−ＭｅｔとＭｅｔ３組織の両方において検出されるＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合物配列に加えて、３つの新規の遺伝子融合物が同定された（図１０）。Ｍｅｔ３由来の１つのキメラ転写物は、ＳＴＲＮ４のエクソン９とＧＰＳＮ２のエクソン２を含んでいる（図１０）。ＧＰＳＮ２は、テストステロンを前立腺組織においてアンドロゲン応答を媒介する重要なホルモンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換する酵素であるステロイド５−アルファレダクターゼファミリーに属する。ＤＨＴは、前立腺癌において高度に発現されることが知られており、治療標的である。ＤＨＴは、その合成類似物のＲ１８８１と同様に、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ発現の他にもＰＳＡ２を誘導することが明らかにされている。さらに、ＲＣ３Ｈ２のエクソン１０はＶＣａＰ−Ｍｅｔ（およびＶＣａＰ細胞）においてＲＧＳ３のエクソン２０に融合されることが見出された（図１０）。別の新規の遺伝子融合物は、ＬＭＡＮ２のエクソン１とＡＰ３Ｓ１のエクソン２の間にあった（図１０）。
【０２５４】
ＳＬＣ４５Ａ３の第４エクソンとＥＴＳ転写因子ファミリーのメンバーであるＥＬＫ４のエクソン２間の１つのリードスルーキメラ、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４は、転移性前立腺癌、Ｍｅｔ４およびＬＮＣａＰ細胞系統において同定され、再現性を示している（図１１）。細胞系統のパネルにおいて実施されるこの融合物についてのタックマンｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、ＬＮＣａＰ細胞における高レベルの発現ならびに２２Ｒｖ１、ＶＣａＰおよびＭＤＡ−ＰＣＡ−２Ｂを含む他の前立腺癌細胞系統におけるはるかに低いレベルが明らかになった。良性前立腺上皮細胞、ＰＲＥＣおよびＲＷＰＥならびに乳房、メラノーマ、肺、ＣＭＬおよび膵臓癌細胞系統を含む非前立腺細胞系統は、この融合物に陰性であった（図１１）。ＳＬＣ４５Ａ３は、前立腺癌試料３においてＥＴＶ１に融合されていることが前に報告されており、とりわけ、ＳＬＣ４５Ａ３は前立腺特異的アンドロゲン応答性遺伝子である。融合転写物ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４は、合成アンドロゲンＲ１８８１により誘導されることも見出された（図１１）。さらに、前立腺組織のパネルはこの融合について調べられ、調べられた２０の転移性前立腺癌組織のうちの７つにおいて発現されていることが見出された（図１１）。その７つの陽性症例のうちの６つは、ＦＩＳＨスクリーニングに基づく以前の研究において、ＥＴＳ遺伝子ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４およびＥＴＶ５について陰性として同定された（Ｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８巻：７６２９頁［２００８年］）。１つのＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ１陽性転移性前立腺癌試料は、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４にも陽性であることが見出された（ＥＴＶ１陽性でもあるＬＮＣａＰに類似（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５９５頁［２００７年］））。同定された以前のＥＴＳ遺伝子融合物とは違って、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４は、隣接する遺伝子間のリードスルー事象であり、ＦＩＳＨ（図１２）、アレイＣＧＨ（データは示されていない）または高密度ＳＮＰアレイ（図１３）によるＤＮＡレベルで検出可能な変化を有していない。ＬＮＣａＰおよびＭｅｔ４はＥＴＶ１のゲノム異常を有しており、高レベルのＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４キメラ転写物を発現するため、これにより、ＥＴＶ１およびＥＬＫ４は共同してその腫瘍における前立腺発癌を促進する可能性があることが示唆される。そのメカニズムの理解は本発明を実施するのに必要ではなく、本発明はどんな特定の作用メカニズムにも限定されないが、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４は、検出可能なＤＮＡ異常がない癌に特異的な再現性ＲＮＡキメラ転写物の最初の記述を表す可能性がある。全体としては、前立腺癌試料のパネルにおいて試験された他の遺伝子融合物はそれが同定された試料に限定されると思われ（少なくとも、分析された試料の制限された数に）、したがって希有なまたはプライベート変異を表す可能性があるため、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４はトランスクリプトーム配列決定研究において同定された唯一の再現性キメラ転写物であると思われる（図１４）。
【０２５５】
次に、本研究において同定された新規の遺伝子融合物は、それが後天性体細胞変異なのかまたは単に生殖系列変動を表すのかどうかを決定するために試験された。患者のマッチされた生殖系列組織上での融合遺伝子の代表的セットのｑＲＴ−ＰＣＲ（図１５）およびＦＩＳＨ（図１６、図１７）評価に基づいて、キメラが癌組織に限定されていることが見出された。さらに、新規の遺伝子融合物に関与する２９の遺伝子は、ゲノミックバリアンツ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ）のデータベースにおいて調べられた。そのうちの８個だけが以前報告されたコピー数変動（ＣＮＶ）を有することが見出された（表５）が、マッチされたａＣＧＨデータは、それらの遺伝子においてどんなコピー数変動も明らかにせず（表６）、分析された試料がヒト集団に共通のＣＮＶを有していないことが示された。
【０２５６】
特徴付けられた遺伝子融合物に基づいて（表７）、キメラ分類システムが提唱された（図１１）。染色体間転座（クラスＩ）は異なる染色体上の２つの遺伝子（例えば、ＢＣＲ  ＡＢＬ１）間の融合を含む。異なる染色体由来の２つの遺伝子が互いに融合し、第３の遺伝子が後に続いて活性化される、（ＭＩＰＯＬ１−ＤＧＫＢ）染色体間複合再配列（クラスＩＩ）。ゲノム領域の欠失が隣接する遺伝子を融合すると染色体内欠失（クラスＩＩＩ）が生じる（ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ）。染色体内複合再配列（クラスＩＶ）は複数の領域と融合している１つの遺伝子に切断点を含み（ＨＪＵＲＰ−ＥＩＦ４Ｅ２およびＩＮＰＰ４−ＨＪＵＲＰ）ならびにリードスルーキメラ（クラスＶ）は隣接する遺伝子間にキメラ転写物を含む（ＺＮＦ６４９−ＺＮＦ５７７）。
【０２５７】
ＬＮＣａＰ細胞におけるトップの遺伝子融合ノミネーションは、ＭＩＰＯＬ１−ＤＧＫＢの融合物を含んでいた。この遺伝子融合物は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系統における推定ドライバー変異であるＥＴＶ１の潜在的な再配列の現れを表している可能性がある。さらに、ＶＣａＰにおける観察に類似して、ＬＮＣａＰ細胞が複数の融合物を有していることが観察された。検証された例の１つは、第６染色体由来のＭＲＰＳ１０のエクソン７と第１６染色体のＨＰＲのエクソン７間の融合物である（図１８）。ＭＲＰＳ１０−ＨＰＲは、ＬＮＣａＰにおいてＦＩＳＨにより確認され、ｑＲＴ−ＰＣＲにより検証されたが、ＶＣａＰ、ＶＣａＰ−Ｍｅｔ、ＲＷＰＥ、ＰＲＥＣまたはＭｅｔ２では観察されなかった（図１８）。
【０２５８】
【表１】
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表２．トップ長リードキメラ候補。以下の一覧表は４５４技術のみを使用して同定されたトップＶＣａＰキメラを強調している。融合物境界を確認された１つを超える配列を有するキメラのみがこの一覧表には示されている。黄色で強調されたキメラは短リード技術により確認され実験的に検証された。青色で強調されたキメラは長リード技術により発見されたが、予想される融合物境界をまたぐ短リードを欠き、実験的検証ができなかった。表は次ページに続く。
【０２５９】
【表２−１】
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【０２６０】
【表２−２】
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【０２６１】
【表３】
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【０２６２】
【表４】
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【０２６３】
【表５】
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【０２６４】
【表６】
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【０２６５】
【表７】
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【０２６６】
【表８−１】
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【０２６７】
【表８−２】
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【０２６８】
【表８−３】
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【０２６９】
【表９−１】
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【０２７０】
【表９−２】
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（実施例３）
本実施例は、尿沈渣中でのＳＬＣ４５Ａ３：ＥＬＫ４  ｍＲＮＡの同定を説明する。尿沈渣試料でキメラ特異的プライマーを使用するタックマンｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。結果は図２０に示されている。
【０２７１】
（実施例４）
ペアエンド遺伝子融合物発見パイプライン。メイトペアトランスクリプトームリードは、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザーパイプラインソフトウェア内のヌクレオチドデータベースの効率的アライメント（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ）（ＥＬＡＮＤ）ペアを使用して、ヒトゲノム（ｈｇ１８）およびＲｅｆｓｅｑ転写物にマッピングされ、最大２ミスマッチを許容した。Ｉｌｌｕｍｉｎａエクスポート出力ファイルが解析され、通過フィルターメイトペアを（ｉ）同一転写物にマッピングする、（ｉｉ）リボソーム、（ｉｉｉ）ミトコンドリア、（ｉｖ）クォリティーコントロール、（ｖ）キメラ候補、および（ｖｉ）ノンマッピングとして分類した。キメラ候補およびノンマッピング分類は遺伝子融合発見のために使用された。キメラ候補分類では、以下の基準：（ｉ）メイトペアは高度マッピングクオリティである（ゲノム全体でベストユニークマッチ）、（ｉｉ）ベストユニークマッチペアはより論理的な代替の組合せがない（例えば、ベストメイトペアは染色体間再配列を示し、メイト所在についての二番目のベストマッピングは予想されたインサートサイズを有するペアをもたらす）、（ｉｉｉ）遺伝子融合物の両パートナー上の最も５’側と３’側メイト間の距離の総計は＜５００ｎｔである、および（ｉｖ）キメラを支持するメイトペアは非重複である、が使用された。
【０２７２】
融合物境界を包含するメイトペアを調べることに加えて、ノンマッピング分類は、遺伝子への１リードマッピングを有するが、その対応するリードは、融合物境界をまたいでいるために整列することができないメイトペアについて調べられた。先ず、「マッピング」メイトペアが整列するアノテート転写物が抽出された。なぜならばこれが遺伝子融合に関与する潜在的パートナーの１つを表すからである。次に、「ノンマッピング」メイトペアは、完璧な部分的アライメントを同定するために、公知の遺伝子パートナーのエクソン境界のすべてに対して整列された。部分的アライメントにより、ノンマッピングメイトペアが予想される遺伝子パートナーにマッピングし、未知のパートナーに整列するノンマッピングメイトペアの一部、またはオーバーハングを明らかにすることが確認される。次に、オーバーハングは、融合パートナーを同定するために、すべての公知の転写物のエクソン境界に対して整列される。これは、単一の完璧なベストヒットを捜して考えうるすべての（ＵＣＳＣ）およびＲｅｆｓｅｑエクソン境界を抽出するＰｅｒｌスクリプトを使用して行われる。
【０２７３】
融合物境界をまたぐメイトペアは、融合物境界を包含するメイトペアとマージされる。キメラノミネーションを支持するには少なくとも２つの独立したメイトペアが必要であった。これは、（ｉ）融合物境界をまたぐ２つもしくはそれ以上の非重複メイトペア、（ｉｉ）融合物境界を包含する２つもしくはそれ以上の非重複メイトペア、または（ｉｉｉ）融合物境界を包含する１つもしくは複数のメイトペアおよび前記融合物境界をまたぐ１つもしくは複数のメイトペアにより実現された。キメラノミネーションはすべて、フィルターを通過する１００万のメイトペアあたりの融合物接合部を包含するかまたはまたぐメイトペアの累積数に基づいて正規化された。キメラは続いて染色体間および染色体内遺伝子融合物に分類された。染色体内遺伝子融合物は、それが互いに隣接しているかどうかに基づいてさらに分けられた。
【０２７４】
ＲＮＡキメラ分析。ＵＨＲ、ＨＢＲ、ＶＣａＰおよびＫ５６２から発見されたキメラは、それがすべての試料において「広く発現される」発現を示すか、または単一の試料において「限定された発現」を示すかどうかに基づいてグループ化された。ＵＨＲはＫ５６２を含むために、これら２つの試料のみで発見されたキメラも限定されていると見なされた。ヒートマップ視覚化は、ＴＩＧＲマルチエクスペリメントビュワー（ＴＩＧＲ’ｓ  ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒ）（ＴＭｅＶ）第４．０版を使用することにより行われた。ＲＮＡキメラは、１つまたは複数のＥＳＴが予想されるキメラ事象に関与する両遺伝子と重なることが見出された場合には、独立した確認が与えられた。
【０２７５】
試料および細胞系統。ＶＣａｐ細胞系統は、ホルモン抵抗性転移性前立腺癌を有する患者由来の脊椎骨転移に由来していた（Ｋｏｒｅｎｃｈｕｋら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ１５巻：１６３頁［２００１年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。ＬＮＣａＰまたはＶＣａＰ細胞は、示されたように、１ｎＭの合成アンドロゲン（Ｒ１８８１）の添加前の４８時間、活性炭デキストラン濾過されたＦＢＳおよび５％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充された無フェノールレッド培地で飢餓状態にされた。次に、ＲＮＡは、製造業者の説明書に従ってｍｉｃｒｏＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離された。前立腺組織は、ミシガン大学の前立腺癌専門優良研究プログラム（ＳＰＯＲＥ）組織コアのミシガン大学の根治的前立腺切除術系列および迅速剖検プログラム（Ｒｕｂｉｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６巻：１０３８頁［２０００年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）から入手した。全試料は、患者のインフォームドコンセントおよび施設内審査委員会の事前承認を得て収集された。Ｋ５６２、ＳＵＰ−Ｂ１５、ＭＥＧ−０１、ＫＵ８１２、ＧＤＭ−１およびＫａｓｕｍｉ−４細胞系統は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＵＨＲはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手した。ヒト脳ＲＮＡ（ＨＢＲ）はＡｍｂｉｏｎから入手した。
【０２７６】
配列データセット。ヒトゲノムビルド１８（ｈｇ１８）は参照ゲノムとして使用された。全Ｒｅｆｓｅｑおよびカリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）転写物は、ＵＳＣＳゲノムブラウザからダウンロードされた。以前同定されたＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧａ融合転写物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＤＱ２０４７７２）およびＢＣＲ−ＡＢＬ１融合転写物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｍ３０８２９）の配列は参照のために使用された。以前検証された前立腺遺伝子融合キメラは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ４２３７４２−ＦＪ４２３７５５を使用して抽出された。
【０２７７】
ＩｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザーＩＩを使用するペアエンドトランスクリプトーム配列決定。メッセンジャーＲＮＡ（１μｇ）は、断片化緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中７０℃で２分間断片化され、スパースクリプトＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して一本鎖ｃＤＮＡに変換され、続いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して二本鎖ｃＤＮＡが合成された。二本鎖ｃＤＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｍＲＮＡ配列決定プレップキットによりさらに処理された。手短に言えば、二本鎖ｃＤＮＡはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用することにより末端修復され、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（３’から５’エクソヌクレオチド活性）を使用してモノアデニル化され、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してアダプターオリゴ混合物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でライゲートされた。次に、アダプターライゲートｃＤＮＡライブラリーは、４％アガロースゲル上で分画され、約３００ｎｔに相当するスメアは切り取られ、精製され、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりＰＣＲ増幅された（１５サイクル）。ＰＣＲ産物は、３００塩基対でライブラリースメアを切り取ることにより４％アガロースゲル上で再びサイズ選択された。次に、ライブラリーは、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｍｉｎｅｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製され、製造業者の説明書に従ってアジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）上でアジレントＤＮＡ１０００キットを用いて定量化された。ライブラリー（１０ｎＭ）を使用して、ＩｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザーＩＩでの分析のためにレーンあたり約１００，０００〜１３０，０００クラスターでフローセルを調製した。
【０２７８】
長トランスクリプトームリード遺伝子融合物発見。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットホームから作製された１００ｎｔ通過フィルタートランスクリプトームリードはすべて、４５４リードからキメラを検出するために記載された方法と同様に処理された（Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５８巻：９７頁［２００９年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。キメラノミネーションはすべて、フィルターを通過する１００万リードあたり融合物接合部にまたがる総数リードに基づいて正規化された。
【０２７９】
ペアエンド手法を用いたシングルトランスクリプトームリードの比較。１００ｎｔシングルトランスクリプトームリードは、エクソン−エクソン境界をまたぐキメラを同定するためにＲｅｆｓｅｑ転写物のみに対して整列されたので、エクソン−エクソン融合物接合部の補強証拠を有するペアエンドキメラノミネーションのみが比較のために使用された。
【０２８０】
ＲＮＡキメラ分類。隣接する遺伝子間のキメラは、その互いの配向および重複しているかどうかに基づいて分類された。分類は、（ｉ）リードスルー、同一配向の隣接する遺伝子、（ｉｉ）発散遺伝子、その５’部位が近接近している反対配向の隣接する遺伝子、（ｉｉｉ）収束遺伝子、その３’末端が近接近している隣接する遺伝子、および（ｉｖ）重複遺伝子、共通のエクソンを共有する隣接する遺伝子である。遺伝子は、それが１ｎｔでも重複していれば重複と定義された。
【０２８１】
リアルタイムＰＣＲ検証。定量的ＰＣＲは、記載された通りに、アプライドバイオシステムズステップワンプラスリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ）上で、パワーＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施された（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５９５頁［２００７年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。オリゴヌクレオチドプライマーはすべて、インテグレイティッドＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成された。ＧＡＰＤＨ（Ｖａｎｄｅｓｃｏｍｐｅｌｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．３巻：３４頁［２００２年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）プライマーは記載の通りであった。全アッセイは２連または３連実施され、結果はＧＡＰＤＨに対して平均倍率変化としてプロットされた。
【０２８２】
ＦＩＳＨ。ＦＩＳＨハイブリダイゼーションは、ＶＣａＰおよび前立腺腫瘍試料で実施された。ＢＡＣクローンはＵＣＳＣゲノムブラウザから選択された。コロニー精製後、ミディプレップＤＮＡは、キアゲンチップス１００（Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｐｓ−１００）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製された。ＤＮＡは、ビオチン−１６−ｄＵＴＰおよびジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるニックトランスレーション標識化により標識された。プローブＤＮＡは沈殿され、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン、および１％デンハート液を含有するハイブリダイゼーション混合液に溶解された。約２００ｎｇの標識プローブは、各ＢＡＣクローンのマッピング位置を確認するために正常ヒト染色体にハイブリダイズされた。ＦＩＳＨシグナルは、それぞれ緑色および赤色について、抗ジゴキシゲニン−フルオレセインおよびａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５９４コンジュゲートを使用して得られた。蛍光画像はＩＳＩＳ画像処理ソフトウェア（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ）により制御される高解像度ＣＣＤカメラを使用して撮像された。
【０２８３】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ分析。培養細胞からのＣｈＩＰは、ＡＲ（ｎｏ．０６〜６８０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＥＲＧ（ｎｏ．ｓｃ３５４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびウサギＩｇＧ（ｎｏ．ｓｃ−２０２７；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する抗体を使用して、以前記載された（Ｙｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ１２巻：４１９頁［２００７年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）通りに実施された。ＣｈＩＰ試料は、製造業者のプロトコールに従って、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ試料プレップキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、配列決定のために調製された。生の配列決定画像データはＩｌｌｕｍｉｎａ分析パイプラインにより分析され、２５〜３２ｂｐの配列リードを作製するためにＥＬＡＮＤソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して発表された（ｕｎｍａｓｋｅｄ）ヒト参照ゲノム（ＮＣＢＩ  ｖ３６、ｈｇ１８）に整列された。これらの短リードは、続いてＨＰｅａｋを使用して分析された。統計的に有意なピークは、結合領域を表しているが、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおける視覚化のためにウィグルファイル（ｗｉｇｇｌｅ  ｆｉｌｅ）にエクスポートされた。
【０２８４】
ＲＮＡ−Ｓｅｑデータから遺伝子発現を計算する。トランスクリプトームリードは、最初の２塩基および３２ｍｅｒを生じるのに必要な十分な塩基を末端から取り除くことにより３２ｎｔまで削られた。３２ｍｅｒリードは、ヒトゲノムプラス５’および３’スプライシングパートナーの末端からの２８塩基を連結させることにより作製される５４ｍｅｒスプライス接合部に整列された。これにより確実に前記スプライス接合部にマッピングするリードは前記スプライス接合部に４塩基重なる（Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ４５６巻：４７０頁［２００８年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。前記リードはＢｏｗｔｉｅを使用して整列され、２塩基までのミスマッチを容認した。ユニークベストヒットを生じないリードは破棄された。遺伝子発現は、先ず、ＵＣＳＣ  ｍＲＮＡデータセットに含まれる遺伝子の任意のアイソフォームに含まれる位置のすべてにわたるカバレージを合計し、次に合計に含まれる位置の数で割って前記遺伝子について平均カバレージを得ることにより計算された（Ｓｕｌｔａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１巻：９５６頁［２００８年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。次に、平均カバレージは、試料中のヒトゲノムにマッピングするリードの数により正規化され、その後１００万を掛けて、キロベース１００万あたりのリード（ＲＰＫＭ）の遺伝子発現値が得られた。
【０２８５】
メイトペアフィルターステップの確立。融合物境界を包含するメイトペアをフィルタリングするための本明細書に記載される基準は、以下の理由から選択された。第一に、最初のキメラ候補は公知の転写物に対するマッピングから導き出されたので、アノテート転写物に対応しないゲノムに対する複数のアライメントを有する可能性がある。したがって、メイトペアはメイトのどちらかがゲノムに対してシングルユニークベストヒットを有していなければ破棄された。メイトペアが確かにシングルベストヒットを示す場合、予想されるインサートサイズに一致するメイトペア組合せをこれらのどれもが確実に示さないように、二次マッピングを通した繰返しが行われた（これはより論理的事象を表すため）。同一転写物上でおおよそインサートサイズ離れて存在する二次ヒットを有することに加えて、候補はゲノム上の５０，０００ｋｂ内でフィルターにかけられ、このアライメントが異なる遺伝子とオーバーラップしないと仮定している。残りの候補では、メイトペア間のインサートサイズを活用するフィルターが確立された。複数のメイトペアが同一融合事象を支持するとすれば、そのマッピングは融合物接合部に隣接する領域内に凝集することになると予想された。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏインサートサイズは、同一遺伝子に整列するメイトペアを使用して試料ごとに計算され、約２００ｎｔの平均サイズが見出された。したがって、２つのメイトペアが両方とも同一切断点を包含していれば、前記メイトペアが互いから離れて存在することができる最も離れた距離は前記インサートサイズにほぼ等しくなると予想された。次に、一部の候補はフローセル上で近接近している同一のメイトペアリードを有することが観察された。これらの重複はおそらく分析パイプラインの人為的結果であり、キメラのサブセットの過剰提示をもたらした。これを回避するために、キメラ候補ごとに、予想される融合事象を支持するメイトペアの非重複セットが作製された。最後に、キメラは、ノミネートされた事象に対する信頼を増やすために、融合物接合部をまたぐメイトペアの補強証拠が存在しなければ、最低２つの非重複メイトペアを有するという必要条件が設定された。
【０２８６】
結果。遺伝子変異の最も一般的クラスの１つは、染色体再配列から生じる遺伝子融合物である（Ｆｕｔｒｅａｌら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．４巻：１７７頁［２００４年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。全公知の遺伝子融合物の約８０％は、全ヒト癌の１０％のみを占める白血病、リンパ腫ならびに骨および軟組織肉腫の理由となる。これとは対照的に、一般的上皮癌は、癌関連死の８０％を占めるが、公知の再現性遺伝子融合物の１０％になりうるにすぎない（Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｈａら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．８巻：４９７頁［２００８年］；Ｍｉｔｅｌｍａｎら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．３６巻：３３１頁［２００４年］；Ｍｉｔｅｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃａｎｃ．４３巻：３５０頁［２００５年］；それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。しかし、大多数の前立腺癌における再現性遺伝子融合物であるＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５９５頁［２００７年］；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０巻：６４４頁［２００５年］；それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｓｏｄａら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５６１頁［２００７年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）の最近の発見により、一般的固形癌における発癌メカニズムとしての遺伝子融合物の領域が拡大された。その上、癌細胞への遺伝子融合物の限定された発現により、遺伝子融合物は望ましい治療標的になっている。１つの成功例は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）においてＢＣＲ−ＡＢＬ１を標的とするメシル酸イマチニブ、またはＧｌｅｅｖｅｃである（Ｄｒｕｋｅｒら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ  Ｍｅｄ．３５５巻：６４５頁［２００２年］；Ｄｒｕｋｅｒら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．２巻：５６１頁［１９９６年］；Ｋａｎｔａｒｊｉａｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ  Ｍｅｄ．３４６巻：６４５頁［２００２年］；それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。したがって、広範囲の癌における新規の遺伝子融合物の同定は、極めて大きな治療上の意義がある。
【０２８７】
上皮癌に公知の遺伝子融合物がないのは、そのクローン不均一性の、ならびに細胞遺伝学的分析、スペクトル核型決定、ＦＩＳＨおよびマイクロアレイベース比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）の技術的限界のせいであった。顕著な過剰発現または融合事象の特徴である異常値を有する遺伝子をノミネートする遺伝子発現データのバイオインフォマティクス分析を通じてこれらの限界を回避することによりＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧは発見された（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０巻：６４４頁［２００５年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。この成功を足場として、さらに最近の戦略は、ＢＡＣ末端配列決定を含む癌における染色体再配列のゲノムワイドでの検出（Ｖｏｌｉｋら、ＰＮＡＳ１００巻：７６９６頁［２００３年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、フォスミドペアエンド配列（Ｔｕｚｕｎら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．３７巻：７２７頁［２００５年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）様配列決定（Ｒｕａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１７巻：８２８頁［２００７年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）および次世代ＤＮＡ配列決定（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．４０巻：７２２頁［２００８年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）についての、解析能が増した不偏ハイスループット手法を採用するようになった。多くの新規ゲノム再配列が明らかにされたが、固形癌は腫瘍増殖の間ずっと複数の非特異的異常を蓄積し、したがって、原因となる異常およびドライバー異常は、それぞれ二次的変異および取るに足りない変異と区別がつかなくなる。
【０２８８】
大規模並行トランスクリプトーム配列決定により癌細胞を深く偏りなく見ることができるようになったために、遺伝子融合物の発見は大いに促進された。長および短リードトランスクリプトーム配列決定技術の統合は、「発現された」融合転写物についてエンリッチするための効果的手法である（Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５８巻：９７頁［２００９年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。しかし、この方法論の成功にもかかわらず、２つの配列決定プラットホームを活用するにはかなりの諸経費が必要であった。したがって、本研究では、癌トランスクリプトームにおける新規のキメラ事象を包括的に解明するためにシングルプラットホームペアエンド戦略が適応された。このシングルプラットホームを使用するほうが経済的であるだけでなく、キメラｍＲＮＡのより包括的なマッピングが可能になって、その定量的性質のためにドライバー融合産物を知ること、重複、発散または収束している稀なクラスの転写物を観察することもできた。
【０２８９】
ペアエンドトランスクリプトーム配列決定を介したキメラ発見。ここでは、トランスクリプトーム配列決定を用いてキメラノミネーションを「発現された配列」に限定し、したがって、潜在的に機能的変異についてエンリッチした。新規の遺伝子融合物を同定するための大規模並行ペアエンドトランスクリプトーム配列決定を評価するために、前立腺癌細胞系統ＶＣａＰ、ＣＭＬ細胞系統Ｋ５６２、ユニバーサルヒト参照全ＲＮＡ（ＵＨＲ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびヒト脳参照（ＨＢＲ）全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）からｃＤＮＡライブラリーを作製した。ＩｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザーＩＩを使用して、１６９０万のＶＣａＰ、２０７０万のＫ５６２、２５５０万のＵＨＲおよび２３６０万のＨＢＲトランスクリプトームメイトペアが作製された（２×５０ｎｔ）。メイトペアはトランスクリプトームに対してマッピングされ、（ｉ）同一遺伝子へのマッピング、（ｉｉ）異なる遺伝子へのマッピング（キメラ候補）、（ｉｉｉ）ノンマッピング、（ｉｖ）ミトコンドリア、（ｖ）クォリティーコントロール、または（ｖｉ）リボソームとして分類された（表１０）。全体として、キメラ候補は、試料ごとに約１％未満のリードを含むメイトペアのわずかな割合を表す。
【０２９０】
【表１０】
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ペアエンド戦略は、融合物接合部を横切るリードを配列決定することへの依存を軽減する、転写された断片の末端からリードを配列決定することにより与えられるカバレージの増加、および曖昧なマッピングを解明する能力などの、シングルリードに基づく手法に勝る複数の利点を提供すると考えられている（図２５）。したがって、キメラをノミネートするため、これらの側面のそれぞれがバイオインフォマティクス分析では活用された。配列リードの２つの主な分類：キメラ候補およびノンマッピングを分析することにより、融合物接合部を包含するおよび／またはまたぐ両メイトペアに焦点を合わせ続けた（図２６）。融合物境界をまたぐノンマッピング分類から得られるキメラ候補は、融合物境界を包含することが見出されたキメラとマージされ、それぞれＶＣａＰ、Ｋ５６２、ＨＢＲおよびＵＨＲにおいて１１９、１４４、２０５および２９４キメラが明らかにされた。
【０２９１】
既存のシングルリード手法に対するペアエンド戦略の比較。ペアエンドトランスクリプトーム手法を採用する長所を評価するため、結果は既存のシングルリード手法に対して比較された。既存のＲＮＡ配列決定（Ｓｅｑ）研究は３６ｎｔシングルリードを使用してきたが（Ｍａｒｉｏｎｉら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１８巻：１５０９頁［２００８年］；Ｍｏｒｔａｚａｖｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ５巻：６２１頁［２００８年］；それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、融合物接合部をまたぐ可能性は、ＩｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザーＩＩを使用して１００ｎｔ長シングルリードを作製することにより増加した。その上、この長さは、それが両５０ｎｔメイトペアの配列決定のために必要とされる時間により匹敵する配列決定時間を促進するために選ばれた。合計で、マッチされた試料由来のペアエンドトランスクリプトームリードに対する比較のために、ＶＣａｐ、ＵＨＲおよびＨＢＲではそれぞれ７００万、５９４０万および５３００万の１００ｎｔトランスクリプトームリードが作製された。
【０２９２】
ＵＨＲは癌細胞系統の混合物であるために、以前同定された遺伝子融合物が数多く見つかるという予想があった。したがって、長シングルリードに対するペアエンド手法のカバレージの深さは先ず、４つの以前同定された遺伝子融合物；ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５９５頁［２００７年］；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０巻：６４４頁［２００５年］；それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、ＢＣＲ−ＡＢＬ１（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３１５巻：５５０頁［１９８５年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、ＢＣＡＳ４−ＢＣＡＳ３（Ｂａｒｌｕｎｄら、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃａｎｃ．３５巻：３１１頁［２００２年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、およびＡＲＦＧＥＦ２−ＳＵＬＦ２（Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９巻：１６７頁［２００９年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）を支持する配列リードの正規化頻度を直接比較することにより、評価された。図２１Ａに示されるように、これらの良く特徴付けられた遺伝子融合物ごとの長シングルリードと比べてペアエンドリードの顕著なエンリッチメントが観察された。
【０２９３】
ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧは、ペアエンドとシングルリード手法間に１０倍を超えるエンリッチメントを有することが観察された。図２１Ｂにおける模式図は、ペアエンドとシングルリード配列決定の両方の単一フローセルレーン由来のＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合物を確認するリードの分布を示している。より長いリードは、公知の遺伝子融合物にまたがるリードの数を改良する。例えば、単一３６ｍｅｒが配列決定されたならば、１７のキメラのうちの１１は、長シングルリードの下の部分に示されているが、遺伝子融合物境界をまたぐことはなかったであろうが、代わりに、接合部の前で終了し、したがって、ＴＭＰＲＳＳ２に整列しただけであったと考えられる。しかし、より長いシングルリードからの結果は改良されたが、これは７００万配列から１７のキメラリードを作製したにすぎなかった。これとは対照的に、ペアエンド配列決定は、約１７００万配列からＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合物を支持する５５２のリードを生み出した。
【０２９４】
配列に基づく証拠がキメラのノミネーションに使用されたために、最大ヌクレオチドカバレージを提供する手法が融合物接合部を捕捉する可能性が高いと仮定された。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏインサートサイズは、同一遺伝子に整列するメイトペアを使用して試料ごとに計算され、平均インサートサイズは約２００ｎｔであることが見出された。次に、シングルリードからの総カバレージ（カバレージはリード長に対するパスフィルターリードの総数と等価である）はペアエンド手法（カバレージは各リードの長さを有するインサートサイズの合計と等価である）と比較された（図２６Ｂ）。全体として、シングルリード技術を使用して、ＵＨＲおよびＨＢＲにおけるペアエンドからの、それぞれ２５５３．３および２３６３ＭＢと比較して、８４８．７および７５７．３ＭＢの平均カバレージが観察された。レーンあたり、長リード手法と比較したペアエンド試料における約３倍のカバレージのこの増加は、ペアエンド戦略を使用して観察されるダイナミックレンジの増加を説明することができるであろう。
【０２９５】
次に、両戦略に共通するキメラを同定することが望まれた。長リード手法は１３７５および１２２８のキメラをノミネートし、ペアエンド戦略については、ＵＨＲおよびＨＢＲにおいてそれぞれ２２５および１４４のキメラのみがノミネートされた。ベン図に示されるように（図２１Ｃ）、ＵＨＲおよびＨＢＲでは、それぞれ両技術に共通する３２および３１の候補が存在した。共通のＵＨＲキメラ候補内では、以前同定された遺伝子融合物ＢＣＡＳ４−ＢＣＡＳ３、ＢＣＲ−ＡＢＬ１、ＡＲＦＧＥＦ２−ＳＵＬＦ２、およびＲＰＳ６ＫＢ１−ＴＭＥＭ４９（Ｒｕａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１７巻：８２８頁［２００７年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）が観察された。両手法によりノミネートされた残りのキメラは、高正確性のセットを表している。したがって、ペアエンド戦略が増加したダイナミックレンジを有するかどうかをさらに評価するために、両技術に共通している残りのキメラについて正規化メイトペアリードの比をシングルリードに対して比較した。ＵＨＲおよびＨＢＲ候補のそれぞれ９３．５％および９３．９％は、シングルリードよりも正規化されたメイトペアリードの高い比を有していることが観察され（表１１）、ペアエンド戦略により提供される増加したダイナミックレンジが確認された。長リード手法に特異的なノミネートされた候補のより大きな数は、４５４長リード技術を使用した場合に観察されるような、偽陽性のエンリッチメントを表すと仮定された（Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５８巻；９７頁［２００９年］；Ｚｈａｏら、ＰＮＡＳ１０６巻：１８８６頁［２００９年］；それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。
【０２９６】
【表１１−１】
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【０２９７】
【表１１−２】
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ペアエンド手法は新規の遺伝子融合物を明らかにする。ＶＣａＰ、ＨＢＲ、ＵＨＲおよびＫ５６２からノミネートされたトップのキメラの中で、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ、ＢＣＡＳ４−ＢＣＡＳ３、ＢＣＲ−ＡＢＬ１、ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７およびＡＲＦＧＥＦ２−ＳＵＬＦ２を含む多くが既に公知であった。その上、ＵＨＲにおけるこれら周知の遺伝子融合物中にランキングされているのは第１３染色体上のＧＡＳ６とＲＡＳＡ３間の融合物であった（図２７Ａおよび表１１）。ＧＡＳ６−ＲＡＳＡ３がＢＣＲ−ＡＢＬ１よりも上位であるという事実は、ＧＡＳ６−ＲＡＳＡ３がＲＮＡプール中の癌細胞系統の１つにおけるドライビング融合物である可能性があることを示している。
【０２９８】
もう１つの観察は、ＵＨＲとＫ５６２の両方に見出される上位１０の中に２つの候補が存在していることであった。血液系悪性腫瘍は、複数の遺伝子融合事象を有するとは見なされていない。ＢＣＲ−ＡＢＬ１に加えて、第９染色体ｑ３４．１３に位置するＮＵＰ２１４のエクソン２３と第２２染色体上に位置するＸＫＲ３のエクソン２間の以前記載されていない染色体間遺伝子融合物を検出することができた。これらの遺伝子は両方とも、それぞれ、第２２染色体および第９染色体上に存在し、ＢＣＲおよびＡＢＬ１に近接近している（図２７Ｂ）。Ｋ５６２細胞におけるＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３の存在はｑＲＴ−ＰＣＲを使用して確認されたが、試験された追加の５つのＣＭＬ細胞系統（ＳＵＰ−Ｂ１５、ＭＥＧ−０１、ＫＵ８１２、ＧＤＭ−１およびＫａｓｕｍｉ−４）にわたりＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３を検出することはできなかった（図２７Ｃ）。これは、ＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３がＢＣＲ−ＡＢＬ１を生み出す転座および両遺伝子領域の局所的増幅後の追加の複合再配列から生じた「プライベート」融合物であることを示している。
【０２９９】
ＵＨＲとＫ５６２の両方においてＢＣＲ−ＡＢＬ１およびＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３を検出することは可能であったが、ＵＨＲにおいてこれらの融合物を支持するメイトペアは著しく減少していた。ＵＨＲはプールされた試料であるために希釈されたシグナルが予想されるが、ＵＨＲはプールされた試料がトップ発現キメラをノミネートするための有用な手法として働き、潜在的に「ドライバー」キメラについてエンリッチすることが可能であるという証拠を提供する。
【０３００】
以前記載されていない前立腺遺伝子融合物。癌において遺伝子融合物を検出するために統合的トランスクリプトーム配列決定を使用する従前研究では、複数の遺伝子融合物が明らかにされ、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰの前立腺トランスクリプトームの複雑さが実証された（Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５８巻：９７頁［２００９年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。ここでは、同一細胞系統上でペアエンド戦略の包括性を利用して、新規のキメラを明らかにした。図２２Ａにおいて示される円形プロットでは、実験的に検証されたペアエンドキメラすべてが大きいほうの円に表示されている。内部の円に示されているように、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰにおいて以前発見されたキメラのすべてはペアエンド候補のサブセットを含んだ。
【０３０１】
ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧはトップのＶＣａＰ候補であった。ＵＳＰ１０−ＺＤＨＨＣ７、ＨＪＵＲＰ−ＩＮＰＰ４ＡおよびＥＩＦ４Ｅ２−ＨＪＵＲＰ遺伝子融合物を「再発見すること」に加えて、ペアエンド手法はＶＣａＰにおいて以前記載されなかったいくつかの遺伝子融合物を明らかにした。１つのそのような例は、第１６染色体上のＺＤＨＨＣ７と第１２染色体上に存在するＡＢＣＢ９間の染色体間遺伝子融合物であり、ｑＲＴ−ＰＣＲにより検証された（図２７Ｄ）。５’パートナーＺＤＨＨＣ７は、ＵＳＰ１０との複合染色体内遺伝子融合物として以前検証されていた（Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５８巻：９７頁［２００９年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。両融合物はＺＤＨＨＣ７の同一エクソンに整列するメイトペアを有しており（Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５８巻：９７頁［２００９年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、その切断点は隣接するイントロンにあることを示している（図２７Ｄ）。別の以前記載されていないＶＣａＰ染色体間遺伝子融合物は、第２染色体上に存在するＴＩＡ１のエクソン２と第３染色体上に位置するＤＩＲＣ２（または、ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ２（腎癌２中で破壊されている））のエクソン３間にあった。ＴＩＡ１−ＤＩＲＣ２はｑＲＴ−ＰＣＲおよびＦＩＳＨにより検証された（図２８）。合計で、追加の４つのＶＣａＰおよび２つのＬＮＣａＰキメラが確認された（図２９）。全体としては、これらの融合物は、ペアエンドトランスクリプトーム配列決定が、他の大規模並行トランスクリプトーム配列決定手法を含む、従前技法では発見されなかった候補をノミネートすることができることを示す。
【０３０２】
原因となる遺伝子融合物を二次的変異と区別する。次の目的は、ペアエンド配列決定により提供されるダイナミックレンジが、公知の再現性遺伝子融合物ＢＣＲ−ＡＢＬ１およびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧなどの公知の高レベル「ドライビング」遺伝子融合物を、もっと低レベル「パセンジャー」融合物と区別することができるかどうかを決定することであった。これを評価するために、正規化メイトペアカバレージは、再現性遺伝子融合物を有する配列決定された２つの細胞系統、ＶＣａＰおよびＫ５６２についての実験的に検証されたすべての遺伝子融合物について融合物境界においてプロットされた。図２２Ｂに示されるように、両ドライバー融合物、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧおよびＢＣＲ−ＡＢＬ１は、それぞれＶＣａＰおよびＫ５６２における検証されたキメラ間で最も高い発現を示すことが観察された。これは、プライベート非特異的プライベート遺伝子融合物の間で推定ドライバー遺伝子融合物を選択するためのペアエンドノミネーション戦略を実証する。なぜならば、これらの多くは実験的に試験され、試料のパネルにわたり検出可能な発現のレベルを欠くことが明らかにされたからである（Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４５８巻：９７頁［２００９年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。
【０３０３】
以前記載されなかった乳癌遺伝子融合物。ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰにおいて以前記載されなかった前立腺遺伝子融合物を検出する能力は、短および長トランスクリプトームリードを使用して、統合された手法と比べたペアエンドトランスクリプトーム配列決定の包括性を実証した。したがって、新規の乳癌遺伝子融合物を検出するためにペアエンド手法が用いられた。これを実現するために、乳癌細胞系統ＭＣＦ−７のペアエンドトランスクリプトーム配列決定が行われた。発現された配列タグ（ＥＳＴ）（Ｈａｈｎら、ＰＮＡＳ１０１巻：１３２５７頁［２００４年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、アレイＣＧＨ（Ｓｈａｄｅｏら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８巻：Ｒ９［２００６年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、一塩基多形アレイ（Ｈｕａｎｇら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｏｍ．１巻：２８７頁［２００４年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、遺伝子発現アレイ（Ｎｅｖｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ１０巻：５１５頁［２００６年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、末端配列プロファイリング（Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９巻：１６７頁［２００９年］；Ｖｏｌｉｋら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １６巻：３９４頁［２００６年］；それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、およびペアエンドｄｉＴａｇ（ＰＥＴ）（Ｒｕａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１７巻：８２８頁［２００７年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）などの数多くの手法を使用して、ＭＣＦ−７は融合物について調べられた。
【０３０４】
トップランクＭＣＦ−７候補のヒストグラム（図２２Ｃ）は、ＢＣＡＳ４−ＢＣＡＳ３およびＡＲＦＧＥＦ−ＳＵＬＦ２をトップ２にランクされる候補として強調しており、ＳＵＬＦ２−ＰＲＩＣＫＬＥ、ＤＥＰＤＣ１Ｂ−ＥＬＯＶＬ７、ＲＰＳ６ＫＢ１−ＴＭＥＭ４９、およびＣＸｏｒｆ１５−ＳＹＡＰ１などの他の以前に報告された候補は、以前記載されていない推定キメラの包括的一覧表の間に分散していた。これらの以前記載されていないノミネーションが偽陽性ではないことを確認するために、２つの染色体間および３つの染色体内候補がｑＲＴ−ＰＣＲを使用して実験的に検証された（図２９）。全体として、ペアエンド手法は数多くの既存の技術では発見されなかった遺伝子融合物を検出することができるだけでなく、この手法は乳癌において５つの以前記載されていない変異を明らかにした。
【０３０５】
ＲＮＡに基づくキメラ。ノミネートされた染色体間および染色体内再配列の多くは単一の試料内で発見されたが、多くのキメラ事象は試料にわたり共有されていることが観察された。ＵＨＲ、ＶＣａＰ、Ｋ５６２およびＨＢＲに共通して１３のキメラ事象が同定された（表１２）。各キメラ事象を支持するメイトペアの正規化頻度のヒートマップ表示（図３Ａ）を介して、これらの事象は、上位１３の限定されたキメラ事象とは対照的に、広く転写されていることが観察される。その上、広く発現されたキメラの１００％はゲノム上で互いに隣接して存在していたが、限定された候補の７．７％のみが隣接する遺伝子であった。この相違は、限定されたセットにおける染色体間および染色体内の再配列のエンリッチメントにより説明することができる。
【０３０６】
互いに隣接して、しかし同一配向で見出される、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４（Ｍａｈｅｒ  ＣＡら、（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ４５８巻：９７〜１０１頁）などの、以前特徴付けられた限定されたリードスルーとは違って、広く発現されるキメラ候補の大多数は互いに隣接して異なる配向で存在していた。したがって、これらの事象は、（ｉ）リードスルー、同一配向の隣接する遺伝子、（ｉｉ）発散遺伝子、その５’部位が近接近している反対配向の隣接する遺伝子、（ｉｉｉ）収束遺伝子、その３’末端が近接近している反対配向の隣接する遺伝子、および（ｉｖ）重複遺伝子、共通のエクソンを共有する隣接する遺伝子として分類される（図３Ｂ）。この分類に基づいて、１つのリードスルー、２つの収束遺伝子、６つの発散遺伝子、および４つの重複遺伝子が見出された。その上、これらのキメラの約８４．６％は少なくとも１つの支持ＥＳＴを有しており、前記事象の独立した確認を提供した（表１２）。ペアエンドとは対照的に、シングルリード手法は、おそらく、各メイトが現在のアノテーションに基づいてそのそれぞれの遺伝子に整列するような、これらの例を見逃している（図２３Ｃ）。その上、これらの例は、転写単位の伸長を表す可能性があり、これは、独立した遺伝子のエクソン境界をまたぐキメラリードを同定するシングルリード手法により検出可能ではない。全体として、これらの広く発現されたＲＮＡキメラの多くは、メイトペアが転写単位について以前記載されなかったアノテーションを明らかにしている例を表している。
【０３０７】
【表１２】
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臨床的限局性前立腺癌における以前記載されなかったＥＴＳ遺伝子融合物。前立腺腫瘍におけるＥＳＴ発癌性転写因子ファミリーメンバーを含む遺伝子融合物の高保有率を考慮して、以前報告されたＥＴＳ融合物を欠く前立腺腫瘍における遺伝子融合物発見のためにペアエンドトランスクリプトーム配列決定が用いられた。２つの前立腺腫瘍、ａＴ５２およびａＴ６４では、それぞれ６２０万および７４０万のトランスクリプトームメイトペアが作製された。ａＴ６４において、第１６染色体上に存在し、ＥＲＧのエクソン４の前に隣接するＨＥＲＰＵＤ１（図２４Ａ）がｑＲＴ−ＰＣＲ（図２９）およびＦＩＳＨ（図２４Ｂ）により検証された。これは、ＴＭＰＲＳＳ２（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０巻：６４４頁［２００５年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）およびＳＬＣ４５Ａ３（Ｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８巻：７６２９頁［２００８年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）に続く、ＥＲＧの第三の５’パートナーを表しており、おそらくＨＥＲＰＵＤ１も前立腺癌患者のサブセットにおけるＥＲＧの過剰発現を媒介している。その上、ＴＭＰＲＳＳ２およびＳＬＣ４５Ａ３がｑＲＴ−ＰＣＲによりアンドロゲン調節されていることが明らかにされたように（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ４４８巻：５９５頁［２００７年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）、ＨＥＲＰＵＤ１発現は、ＲＮＡＳｅｑを介して、アンドロゲン処理に応答性であることが明らかにされた（図３０）。その上、ＣＨＩＰ−Ｓｅｑ分析により、ＨＥＲＰＵＤ１の５’末端でのアンドロゲン結合が明らかにされた（図３０）。
【０３０８】
さらに、第２の前立腺腫瘍試料において（ａＴ５２）、染色体間遺伝子融合物が、第１７染色体上に存在する前立腺ｃＤＮＡクローン、ＡＸ７４７６３０の５’末端と第７染色体上に位置するＥＴＶ１のエクソン４の間で発見され（図２４Ｃ）、この融合物はｑＲＴ−ＰＣＲ（図２９）およびＦＩＳＨ（図２４Ｄ）を介して検証された。この融合物は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションスクリーニングにより見出された独立した試料において以前報告されており（Ｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８巻：７６２９頁［２００８年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）；したがって、この融合物が前立腺癌患者のサブセットにおいて再現性であることを実証している。従前報告のように、ＲＮＡ−Ｓｅｑを介した遺伝子発現により、ＡＸ７４７６３０がアンドロゲン誘導性遺伝子であることが確認された（図３０）。その上、ＣｈＩＰ−ＳｅｑはＡＸ７４７６３０の５’末端でのアンドロゲン占有を明らかにした（図３０）。
【０３０９】
ペアエンドフィルタリングステップの有効性。異なる遺伝子に整列するメイトペアを含むキメラ候補は、潜在的偽陽性を減らすために、組み込んでいるインサートサイズ、重複リード、および曖昧なマッピングについて一連のフィルターにかけられた。フィルターの有効性を確認するために、前記フィルターを通過しない１２の候補が試験され、すべてがｑＲＴ−ＰＣＲ検証ができなかった。これにより、これらのフィルターが偽陽性ノミネーションを取り除いていることが確認される。
【０３１０】
偏動原体逆位は新規のユニバーサルヒト参照（ＵＨＲ）遺伝子融合物ＧＡＳ６−ＲＡＳＡ３を生み出す。第１３染色体上に存在するＧＡＳ６とＲＡＳＡ３間の遺伝子融合物は特に興味深かった。ＧＡＳ６−ＲＡＳＡ３がＢＣＲ−ＡＢＬ１よりも高い位置を占めるという事実は、この融合物がＲＮＡプール中の癌細胞系統の１つにおいてドライビング融合物であることを示している。ＧＡＳ６は、細胞増殖を刺激すると考えられているガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）含有タンパク質である。このタンパク質は、ＲＡＳＡ３から約２００ＭＢ、反対配向に位置し、ＦＡＭ７０Ｂにより分離されていて、この融合遺伝子が小偏動原体逆位により生み出されることを示している。ＲＡＳＡ３は、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質のＧＡＰ１ファミリーのメンバーである。全体として、ＧＡＳ６−ＲＡＳＡ３は、ＵＨＲプール内の無名癌細胞系統の１つの腫瘍形成に光を当てる多くの新規遺伝子融合物の１つである。
【０３１１】
新規の染色体間ＶＣａＰ遺伝子融合物、ＴＩＡ１−ＤＩＲＣ２。ペアエンド戦略により見出された１つの新規ＶＣａＰ染色体間遺伝子融合物は、第２染色体上に存在するＴＩＡ１のエクソン２と第３染色体上に位置するＤＩＲＣ２（または腎癌２中で破壊されている）のエクソン３間にあった。ＴＩＡ１−ＤＩＲＣ２はｑＲＴＰＣＲおよびＦＩＳＨにより検証された（図２８）。スプライシング調節因子、ＴＩＡ１は、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）標的細胞に対して核酸分解活性を有するＲＮＡ結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、アポトーシスを誘導するのに関与している可能性がある。本発明は、特定のメカニズムに限定されない。実際、メカニズムの理解は本発明を実行するのに必要ではない。にもかかわらず、ＤＩＲＣ２の破壊はハプロ不全に関連しており、このことが腎細胞癌における腫瘍増殖のメカニズムを提供することができるであろう（Ｂｏｄｍｅｒら、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．１１巻：６４１頁［２００２年］；参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。
【０３１２】
上の明細書において言及される出版物、特許、特許出願および受託番号はすべて、参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。本発明は特定の実施形態に関連して記載されてきたが、請求される本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されてはいないと理解されるべきである。実際、本発明の記載された組成物および方法の様々な変更および変化は当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2012514475.tif 000036
【図８Ｃ】
2012514475.tif 000037
【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
2012514475.tif 000039
【図８Ｆ】
2012514475.tif 000040
【図１０ａ】
2012514475.tif 000041
【図１０ｂ】
2012514475.tif 000042
【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１２】
2012514475.tif 000045
【図１６】
2012514475.tif 000046
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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