(57)【要約】  対象において病理学的状態を評価するための方法には、１以上のマーカーの発現プロフィールを測定する工程が含まれ、ここで、相違は、多発性骨髄腫（ＭＭ）またはＭＭに対する素因の指標となる。本発明は、ＭＭの診断、予後および治療のための新規方法および組成物を提供する。本発明はまた、抗ＭＭ癌剤を同定する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が多発性骨髄腫（ＭＭ）および／または意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかどうかを診断する方法であって：
対象由来の試験試料において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する
工程を含む、
ここで、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較して、試験試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける改変が、対象がＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかいずれかである指標となる
前記方法。
【請求項２】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項１の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である、請求項１の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、対象がＭＧＵＳから区別されるようなＭＭを有する指標となる、請求項３または４の方法。
【請求項６】
腫瘍増殖を抑制する必要がある対象において、腫瘍増殖を抑制するための方法であって：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である少なくとも１つの遺伝子産物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項７】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂの１以上である、請求項６の方法。
【請求項８】
ｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−１９１ａおよびｍｉＲ−１９１ｂの１以上である、請求項６の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物がｐ５３タンパク質制御に関連する、請求項１または６の方法。
【請求項１０】
対象が多発性骨髄腫（ＭＭ）を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかどうかを診断する方法であって：
（１）対象から得た試験試料由来のＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し；
（２）該ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロフィールを提供し；そして
（３）該試験試料ハイブリダイゼーションプロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロフィールに比較する
工程を含む、
ここで、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける改変が、対象がＭＭ疾患を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかいずれかである指標となる
前記方法。
【請求項１１】
対象が、対象における１以上の不都合な予後マーカーと関連する多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかどうかを診断する方法であって：
（１）対象から得た試験試料由来のＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し；
（２）該ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロフィールを提供し；そして
（３）該試験試料ハイブリダイゼーションプロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロフィールに比較する
工程を含む、
ここで、シグナルにおける改変が、対象がＭＭ関連疾患を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかいずれかである指標となる
前記方法。
【請求項１２】
多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を患う対象であって、対照細胞に比較して、対象のＭＭ細胞において少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が下方制御されているかまたは上方制御されている対象において、該疾患を治療する方法であって：
（１）ＭＭ細胞において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が下方制御されている場合、対象におけるＭＭ細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも１つの単離ｍｉＲ遺伝子産物の有効量を対象に投与するか；または
（２）ＭＭ細胞において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が上方制御されている場合、対象におけるＭＭ細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を対象に投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
対象において、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を治療する方法であって：
（１）対照細胞に比較して、ＭＭ細胞において少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の量を決定し；そして
（２）対象におけるＭＭ細胞の増殖が阻害されるように：
（ｉ）ＭＭ細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞において発現される該ｍｉＲ遺伝子産物の量より少ない場合、少なくとも１つの該単離ｍｉＲ遺伝子産物の有効量を対象に投与するか；または
（ｉｉ）ＭＭ細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞において発現される該ｍｉＲ遺伝子産物の量より多い場合、少なくとも１つの該ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を対象に投与する
ことによって、ＭＭ細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を改変する
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項１０、１１、１２または１３の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項１０、１１、１２または１３の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である、請求項１０、１１、１２または１３の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、対象がＭＧＵＳから区別されるようなＭＭを有する指標となる、請求項１０、１１、１２または１３の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの単離ｍｉＲ遺伝子産物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を治療するための薬学的組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項１８の薬学的組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項１８の薬学的組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である、請求項１８の薬学的組成物。
【請求項２２】
ｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ発現阻害剤およびアンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）の少なくとも１以上を含む、請求項１８の薬学的組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害剤化合物が、適切な対照細胞に比較してＭＭ細胞において上方制御されているｍｉＲ遺伝子産物に特異的である、請求項１８の薬学的組成物。
【請求項２４】
抗多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患剤を同定する方法であって：
試験剤を細胞に提供し、そして
ＭＭ細胞において改変される発現レベルと関連する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する
工程を含む、
ここで、適切な対照細胞に比較した、細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける改変が、試験剤が抗癌剤である指標となる
前記方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項２４の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である、請求項２４の方法。
【請求項２８】
多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患の開始、進行、重症度、病理学、攻撃性、病期、活性、能力障害、死亡率、罹患率、疾患細分類、あるいは他の根底にある病原性または病理学的特徴の少なくとも１つに寄与する１以上の代謝経路を評価するためのマーカーであって、
ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の少なくとも１つの単離ｍｉＲ遺伝子産物をコードする１以上の遺伝子産物を含む、
前記マーカー。
【請求項２９】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項２８のマーカー。
【請求項３０】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である、請求項２８のマーカー。
【請求項３１】
請求項２８、２９または３０のマーカーの少なくとも１つから選択される多発性骨髄腫関連疾患のマーカーに結合する少なくとも１つの捕捉試薬を含む、製品。
【請求項３２】
請求項２８の少なくとも１つのマーカーによってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患に関して試験するための試薬。
【請求項３３】
療法が、多発性骨髄腫（ＭＭ）を防止し、診断し、そして／または治療する有効性を評価する方法であって：
（１）有効性を評価しようとする療法に対象を供し、そして
（２）請求項２８の少なくとも１つのマーカーを評価することによって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するかまたは防止する際の、試験中の治療の有効性レベルを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項３４】
候補療法剤が：薬学的組成物、栄養補助組成物、およびホメオパシー組成物の１以上を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
評価される療法がヒト対象で使用するためのものである、請求項３３の方法。
【請求項３６】
多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を治療する療法剤に関して候補化合物をスクリーニングするためのキットであって：請求項２８、２９または３０の少なくとも１つのマーカーの１以上の試薬、および少なくとも１つのマーカーを発現している細胞を含む、前記キット。
【請求項３７】
少なくとも１つのマーカーに特異的に結合する抗体または抗体断片を含む試薬を用いて、マーカーの存在が検出される、請求項３６のキット。
【請求項３８】
多発性骨髄腫（ＭＭ）に関するスクリーニング試験であって：請求項２８、２９または３０の１以上のマーカーと、こうしたマーカーの基質および試験剤を接触させ；そして試験剤がマーカー活性を調節するかどうかを決定する工程を含む、前記試験。
【請求項３９】
すべての方法工程がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項３８のスクリーニング試験。
【請求項４０】
多発性骨髄腫（ＭＭ）合併症を治療するか、防止するか、逆転させるかまたはその重症度を制限する必要がある個体において、これを行うための方法であって：
個体に、多発性骨髄腫（ＭＭ）反応シグナル伝達経路に干渉する剤を、こうしたシグナル伝達に干渉するのに十分な量で投与する
工程を含む、
ここで、剤は、ＳＯＣＳ−１発現に干渉する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物を含む、
前記方法。
【請求項４１】
個体において、多発性骨髄腫（ＭＭ）合併症を治療するか、防止するか、逆転させるかまたはその重症度を制限するための薬剤製造のための、多発性骨髄腫（ＭＭ）反応シグナル伝達経路に干渉する剤の使用であって、
剤が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、およびｍｉＲ−３２の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物、ならびにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子産物を含む、
前記使用。
【請求項４２】
少なくとも１つのｐ３００−ＣＢＰ関連因子発現阻害化合物、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、多発性骨髄腫（ＭＭ）癌を治療するための薬学的組成物。
【請求項４３】
ｐ５３活性を制御する必要がある細胞において、ｐ５３活性を制御するための方法であって、該細胞を、こうした活性を制御するのに十分な量の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物と接触させる工程を含み、該ｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂの１以上である、前記方法。
【請求項４４】
ｍｉＲ遺伝子産物がｐ３００−ＣＢＰ関連因子（ＰＣＡＦ）遺伝子をターゲティングする、請求項４３の方法。
【請求項４５】
細胞が多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞である、請求項４３の方法。
【請求項４６】
正常からＭＧＵＳを介して臨床的に明白なＭＭに向かうＭＭ多段階形質転換プロセスと関連するｍｉＲＮＡシグネチャーであって：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、およびｍｉＲ−３２の少なくとも１以上を含む、前記シグネチャー。
【請求項４７】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である、請求項４６のｍｉＲＮＡシグネチャー。
【請求項４８】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である、請求項４６のｍｉＲＮＡシグネチャー。
【請求項４９】
アポトーシスをブロッキングし、そして／または細胞生存を促進する必要がある対象において、アポトーシスをブロッキングし、そして／または細胞生存を促進するための方法であって、１以上のｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与する工程を含み、該遺伝子産物が：ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−２１の１以上である、前記方法。
【請求項５０】
ｐ５３の正の制御因子であるＰＣＡＦをターゲティングする必要がある対象において、ＰＣＡＦをターゲティングするための方法であって、１以上のｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与する工程を含み、該ｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ１０６ｂ〜２５、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３２の１以上である、前記方法。
【請求項５１】
細胞におけるＭＭ病因形成中のより後期の段階において、ＳＯＣＳ−１を下方制御し、そして／またはＩＬ−６を活性化するための方法であって、細胞において、ｍｉＲ−１９を上方制御する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
[0001]本出願は、その全開示が本明細書に明確に援用される、２００８年８月１２日出願の米国仮出願第６１／０８８，０３６号の優先権を請求する。
【０００２】
連邦が支援する研究に関する言及
[0002]本発明は、米国癌研究所助成金番号−−−−−−−−の元で政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
本発明の技術分野および産業適用性
[0003]本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、多発性骨髄腫に関するバイオマーカーに関与する方法および組成物に関する。本発明の特定の側面には、多発性骨髄腫関連疾患の診断、療法、および予後における適用が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
[0004]本セクションに開示される背景技術が法的に先行技術を構成することは承認されない。
【０００５】
[0005]多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄におけるクローン性悪性形質細胞の集積によって特徴付けられるＢ細胞新生物である（１）。この癌は、年間およそ１％の率で、新規に生じるか、または意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）と称される良性状態から発展しうる（２〜３）。ＭＭ細胞は、多数の抗アポトーシスシグナル伝達機構を与えられ、これが現行の化学療法措置に対する耐性の主な原因となっている（４）。ＭＭにおいて有効な療法様式は、タンパク質のアポトーシス促進性および抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー、ならびに主にｐ５３（ＭＭにおいて低頻度で突然変異している）によって制御されるアポトーシス阻害剤のレベルを調節する（４）。骨髄（ＢＭ）微小環境がＭＭの生物学において、顕著な役割を果たすことが周知であり；ＭＭ細胞がＢＭ間質に付着すると、サイトカイン産生が誘発され、核因子系統の活性化によって細胞増殖および化学療法に対する耐性が増進され（７）、そしてより重要なことに、これがＭＭおよびＭＧＵＳ間の主要な遺伝子相違であるようである（３〜７）。
【０００６】
[0006]癌ゲノミクスおよびＭＭ細胞−間質相互作用における最近の進歩にもかかわらず、このなお不治である疾患の転帰を改善するため、薬理学的介入によってターゲティング可能な、ＭＭ病因形成における主要な要因を同定する緊急の必要性がある。ノンコーディングＲＮＡを含むマイクロアレイ遺伝子発現などの新規技術の出現は、慢性リンパ球性および急性骨髄性白血病に関して本発明者らが示すような、遺伝子発現変化と、ＭＭ分子および臨床的特徴との間の関連を確立することによって、ＭＭ生物学の理解の改善を導きうる（８〜９）。
【０００７】
[0007]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さ１９〜２５ヌクレオチドのノンコーディングＲＮＡであり、部分的にまたは完全に相補的な部位への塩基対形成を通じて、そのターゲットｍＲＮＡの翻訳阻害および分解を誘導することによって、遺伝子発現を制御する（１０）。ｍｉＲＮＡは、発生、細胞分化、ストレス応答、アポトーシス、および増殖を含む、決定的な生物学的プロセスに関与する（１０）。最近、特異的ｍｉＲＮＡ発現パターンが、造血および癌に結びつけられてきている（１１〜１３）。
【０００８】
[0008]しかし、ＭＭにおけるｍｉＲＮＡ発現に関してはほとんど知られていない。最近の研究によって、ＩＬ−６依存性ＭＭ細胞株において、ｍｉＲ−２１転写が、ＳＴＡＴ−３機構を通じてＩＬ−６によって制御されていることが示されてきている。さらに、異所性ｍｉＲ−２１発現は、ＩＬ−６の非存在下で、ＩＬ−６依存性細胞株の増殖を維持するのに十分である（１４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[0009]こうしたことを考慮して、多発性骨髄腫（ＭＭ）に対する素因に関して、個体を信頼性を持ってそして正確に診断しそして／またはスクリーニングするための方法に関する必要性がある。
【００１０】
[00010]それに関連する多発性骨髄腫（ＭＭ）関連癌を治療する方法もまた非常に望ましい。
【００１１】
[00011]多発性骨髄腫（ＭＭ）のための療法に関して、かなりの研究がなされているにも関わらず、ＭＭは有効に診断および治療するのが困難なままであり、そして患者において観察される死亡率は、該疾患の診断、治療および予防において改善が必要であることを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[00012]第一の広い側面において、本明細書において、対象において病理学的状態を評価するための方法を提供し、該方法には、１以上のマーカーの発現プロフィールを測定する工程が含まれ、ここで、相違は、多発性骨髄腫（ＭＭ）またはＭＭに対する素因の指標となる。
【００１３】
[00013]別の広い側面において、本明細書において、ＭＭの診断、予後および治療のための新規方法および組成物を提供する。本発明はまた、抗ＭＭ癌剤を同定する方法も提供する。
【００１４】
[00014]本発明の多様な目的および利点は、付随する図を踏まえて読むと、好ましい態様の以下の詳細な説明から、当業者には明らかとなるであろう。
【００１５】
[00015]特許または出願ファイルは、カラーおよび／または１以上の写真で作成される１以上の図を含有する。カラーの図（単数または複数）および／または写真（単数または複数）を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、要望があり、そして必要な料金の支払いがあれば、特許局によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】[00016]図１Ａ〜１Ｄ。ＭＭおよびＭＧＵＳは、正常ＣＤ１３８＋ＰＣと比較して、ｍｉＲＮＡの別個のスペクトルを発現する：[00017]図１Ａ：  ＰＣ形質転換の多段階分子プロセスを示す模式図。[00018]図１Ｂ：  分析した正常ＰＣに対してＭＧＵＳで有意に制御解除されているｍｉＲＮＡの代表的リスト。アステリスクは、特異的に関連するクラスターを指す。[00019]図１Ｃ：  分析した比較クラス、ＭＭ患者対正常ＰＣおよびＰＣ  ＭＭ対正常ＰＣにおける、共通の制御解除されているｍｉＲＮＡの代表的リスト。アステリスクは、特異的に関連するクラスターを示す。[00020]図１Ｄ：  ｍｉＲ−１７マイクロＲＮＡクラスター。マイクロＲＮＡ前駆体の３つのパラログファミリーが同定可能である：  ｍｉＲ−１７／１８／１８Ｘ１２０／９３／１０６ａ／１０６ｂ／９３（黄）、ｍｉＲ−１９ａ／１９ｂ−１／１９ｂ−２（青）およびｍｉＲ−９２−１／９２−２／２５（緑）。
【図２−１】[00021]図２Ａ〜２Ｄ：  ｍｉＲ−１８１、１０６ｂ−２５クラスター、３２はＰＣＡＦをターゲティングする。[00022]図２Ａ：  「インシリコ」ターゲットスキャン予測ソフトウェアにしたがって、３’−ＵＴＲで、いくつかのコンセンサス結合部位において、ＰＣＡＦ遺伝子と相互作用すると予測されるｍｉＲＮＡ。[00023]図２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：  ｐＧＬ３−ＰＣＡＦ−３で同時トランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性減少を示すルシフェラーゼアッセイ、＊活性±ＳＤ。各レポータープラスミドを少なくとも２回（異なる日に）トランスフェクションし、そして各試料を３つ組でアッセイした。[00024]図２Ｄ：  スクランブル化オリゴヌクレオチド、あるいはｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、または両方のＡＳＯでトランスフェクションした４８時間後、Ｕ２６６およびＪＪＮ３細胞由来の全細胞溶解物におけるＳＯＣＳ−１タンパク質を示すウェスタンブロット。ＧＡＤＰＨを装填対照として用いた。ＧＡＤＰＨレベルに基づく濃度測定によって、Ｕ２６６およびＪＪＮ３細胞にｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂまたはアンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）が一緒に存在していると、ＳＯＣＳ−１レベルが増加することが示される。
【図２−２】[00025]図２Ｅ：  ｍｉＲ−１９がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＵ２６６細胞における活性化ＳＴＡＴ−３の発現を調節することを示すウェスタンブロット。細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ｍｉＲ−１９または陰性対照（Ｓｃｒ）ｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクションし、そして７２時間後に細胞溶解物を得た。ＳＴＡＴ−３レベルに基づく濃度測定によって、ｍｉＲ−１９が存在すると、Ｐ−ＳＴＡＴ−３レベルが減少することが示される。[00026]図２Ｆ：  Ｕ２６６細胞トランスフェクション７２時間後、内因性ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの発現を検証するためのステムループｑＲＴ−ＰＣＲ（図２Ｇ〜３Ｈ）。[00027]図２Ｉ：  トランスフェクション４８時間後およびＵＶ処理４時間後、ｍｉＲ−１８１ａ／ｂで、またはｍｉＲ−１８１ａ／ｂおよびｍｉＲ−１０６ｂ／２５の一緒のＡＳＯ（プール）で、またはスクランブル化オリゴヌクレオチドで、トランスフェクションしたＭＭ．１ｓ細胞におけるｐ５３およびＰＣＡＦ発現に関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。両遺伝子に関するＰＣＲ産物をＧＡＤＰＨおよびアクチン発現に対して標準化した。棒グラフは、４つの別個の研究で観察された平均値±ＳＥを示す。[00028]図２Ｌ：  １０μＭニュートリン（ｎｕｔｌｉｎ）−３ａと９時間および一晩インキュベーションした後、ＭＭ１細胞において、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−９２およびスクランブル化ＡＳＯでトランスフェクションした４８時間後のｐ５３タンパク質発現を示すイムノブロット分析；  ＧＡＤＰＨは内部装填対照である。ＧＡＤＰＨレベルに基づく濃度測定によって、ＭＭ．１ｓ細胞にｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂ  ＡＳＯが存在していると、ｐ５３レベルが増加することが示される。
【図３−１】[00029]図３Ａ〜３Ｆ：  ｍｉＲ−１９は、ＭＭ細胞株において、ＳＯＣＳ−１をターゲティングする：[00030]図３Ａ：  １５のＭＭ細胞株および健康なドナー由来の２つのＣＤ１３８＋ＰＣ（対照）における、ＳＯＣＳ−１およびＧＡＤＰＨに対する抗血清でのイムノブロットアッセイ。[00031]図３Ｂ：  ＳＯＣＳ−１の３’ＵＴＲ上の、ｍｉＲ−１９に関するヒト、マウス、ラットおよびイヌにおける予測される非常に保存されたコンセンサス結合部位。[00032]図３Ｃ：  ＳＯＣＳ−１の３’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼレポーターベクターおよびｍｉＲ−１９またはスクランブル化オリゴヌクレオチドで一過性に同時トランスフェクションされたＭＥＧ０１細胞における相対ルシフェラーゼ活性。ｍｉＲＮＡシード領域に相補的な推定上のｍｉＲ−１９結合部位の６塩基が欠失すると、この効果が無効になった（ＭＵＴ）。バーは、ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性に対して標準化したホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ活性±ＳＤを示す。各レポータープラスミドを少なくとも２回（異なる日に）トランスフェクションし、そして各試料を３つ組でアッセイした。[00033]図３Ｄ：  スクランブル化オリゴヌクレオチドまたはｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、または両方のＡＳＯでトランスフェクションした４８時間後、Ｕ２６６およびＪＪＮ３細胞由来の全細胞溶解物におけるＳＯＣＳ−１タンパク質を示すウェスタンブロット。ＧＡＤＰＨを装填対照として用いた。ＧＡＤＰＨレベルに基づく濃度測定によって、Ｕ２６６およびＪＪＮ３細胞にｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂまたはＡＳＯが一緒に存在していると、ＳＯＣＳ−１レベルが増加することが示される。
【図３−２】[00029]図３Ａ〜３Ｆ：  ｍｉＲ−１９は、ＭＭ細胞株において、ＳＯＣＳ−１をターゲティングする：[00034]図３Ｅ：  ｍｉＲ−１９がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＵ２６６細胞における活性化ＳＴＡＴ−３の発現を調節することを示すウェスタンブロット。細胞を、抗ｍｉＲ−１９または陰性対照（Ｓｃｒ）ｍｉＲＮＡ阻害剤で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションし、そして７２時間後に細胞溶解物を得た。ＳＴＡＴ−３レベルに基づく濃度測定によって、ｍｉＲ−１９が存在すると、Ｐ−ＳＴＡＴ−３レベルが減少することが示される。[00035]図３Ｆ：  拮抗オリゴヌクレオチドでのＵ２６６細胞トランスフェクション７２時間後、内因性ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの発現を検証するためのステムループｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＵ６Ｂでの標準化後。
【図４】[00036]図４Ａ〜４Ｂ：  ＭＭ細胞株において拮抗ｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−１８１を発現させると、ヌードマウスにおいて、有意な腫瘍抑制が生じた。ｍｉＲ−１８１  ＡＳＯまたはスクランブル化オリゴで処理したＵ２６６およびＪＪＮ３細胞（３０ｘ１０６細胞）を皮下注射した。マウスを第３５日に屠殺し、そして腫瘍体積を計算した。[00037]図４Ａ：  Ｕ２６６細胞株の腫瘍増殖の時間経過。[00038]図４Ｂ：  ＪＪＮ３細胞株の腫瘍増殖の時間経過；  ｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−１８１  ＡＳＯで処理した腫瘍は、両方の細胞株に関するスクランブル化群の腫瘍より有意に小さかった（スケールバー；  １０ｍｍ）。
【図５】[00039]図５Ａ〜５Ｃ：  共通のｍｉＲＮＡ発現。比較の２クラス、ＭＭ  ＰＣ対健康ＰＣ（図５Ａ）およびＭＭ患者由来ＰＣ対健康ＰＣ（図５Ｂ）間で共通のｍｉＲＮＡを示すベン図（図５Ｃ）。
【図６−１】[00040]図６Ａ〜６Ｆ。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＭＭ患者、ＭＧＵＳおよびＭＭ細胞株対ＣＤ１３８＋ＰＣ健康におけるマイクロアレイデータの検証。ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、健康なドナー由来のＣＤ１３８＋ＰＣ（ｎ＝３）、ＭＧＵＳ（ｎ＝３）、ＭＭ患者（ｎ＝６）およびＭＭ細胞株（ｎ＝１５）におけるｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５およびｍｉＲ−１０６ｂ（図６Ａ）、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂ（図６Ｂ）、ｍｉＲ−３２（図６Ｃ）、ｍｉＲ−１７−５およびｍｉＲ−２０ａ（図６Ｄ）、ｍｉＲ−９２およびｍｉＲ−１０６ａ（図６Ｅ）ならびにｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂ（図６Ｆ）平均発現。バーはＭＭ  ＰＣ、ＭＧＵＳおよび健康ＰＣ間の相対倍変化±ＳＥを示す。ＲＮＵ６Ｂで標準化した後、異なる群間のｍｉＲＮＡ発現を比較した。
【図６−２】[00040]図６Ａ〜６Ｆ。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＭＭ患者、ＭＧＵＳおよびＭＭ細胞株対ＣＤ１３８＋ＰＣ健康におけるマイクロアレイデータの検証。ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、健康なドナー由来のＣＤ１３８＋ＰＣ（ｎ＝３）、ＭＧＵＳ（ｎ＝３）、ＭＭ患者（ｎ＝６）およびＭＭ細胞株（ｎ＝１５）におけるｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５およびｍｉＲ−１０６ｂ（図６Ａ）、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂ（図６Ｂ）、ｍｉＲ−３２（図６Ｃ）、ｍｉＲ−１７−５およびｍｉＲ−２０ａ（図６Ｄ）、ｍｉＲ−９２およびｍｉＲ−１０６ａ（図６Ｅ）ならびにｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂ（図６Ｆ）平均発現。バーはＭＭ  ＰＣ、ＭＧＵＳおよび健康ＰＣ間の相対倍変化±ＳＥを示す。ＲＮＵ６Ｂで標準化した後、異なる群間のｍｉＲＮＡ発現を比較した。
【図７】[00041]図７Ａ〜７Ｂ：  ＭＭ細胞株におけるＰＣＡＦ発現：[00042]図７Ａ：  １５のＭＭ細胞株および１つの健康なＣＤ１３８＋ＰＣ試料におけるＰＣＡＦ発現に関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＤＰＨおよびアクチン発現に対してＰＣＲ産物を標準化し、そして各点４つ組で反復し；相違は有意であった（ｐ＜０．００１）。[00043]図７Ｂ：  アクチン発現に対して標準化したＰＣＡＦの発現を示す１５のＭＭ細胞株のイムノブロット分析。
【図８】[00044]ＡＳＯトランスフェクションの検証：[00045]図８Ａ：  ＭＭ１細胞においてｍｉＲ−１８１ａ／ｂ、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉＲ−３２（プール）またはｍｉＲ−１８１ａ／ｂまたはスクランブル化ＡＳＯでトランスフェクションした４８時間後、ＭＭ．１ｓ細胞におけるＰＣＡＦタンパク質発現を示すイムノブロット分析；  ＧＡＤＰＨは内部装填対照であった。[00046]図８Ｂ：  拮抗オリゴヌクレオチドでのＭＭ．１ｓ細胞トランスフェクション４８時間後、内因性ｍｉＲ−１８１ａ／ｂ、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉＲ−３２の発現を検証するためのステムループｑ−ＲＴ−ＰＣＲ、Ｕ６での標準化後。
【図９】[00047]ｍｉＲ−１７−９２クラスターはＢｉｍをターゲティングする。Ｕ２６６細胞において、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂまたはＡＳＯで一緒にトランスフェクションした４８時間後、ＢＩＭ−ＥＬ、ＢＩＭ−ＬおよびＧＡＤＰＨ発現を示すイムノブロット分析。ＧＡＤＰＨレベルに基づく濃度測定によって、Ｕ２６６細胞にｍｉＲ−１９ｂ、ならびにｍｉＲ−１９ａおよびｂのＡＳＯが一緒に存在していると、ＢＩＭ−ＥＬおよびＢＩＭ−Ｌレベルが増加することが示される。
【図１０】[00048]表１−患者試料臨床データ。
【図１１】[00049]表２−ＭＧＵＳ対健康ＰＣ間で示差的に発現されるｍｉＲＮＡ。
【図１２】[00050]表３−マイクロアレイ分析およびステムループのためのＭＭ細胞株使用。
【図１３−１】[00051]表４−ＭＭ患者および細胞株（ＭＭ  ＰＣ）対健康ＰＣ間で示差的に発現されるｍｉＲＮＡ。
【図１３−２】[00051]表４−ＭＭ患者および細胞株（ＭＭ  ＰＣ）対健康ＰＣ間で示差的に発現されるｍｉＲＮＡ。
【図１４−１】[00052]表５−ＭＭ患者由来ＰＣ対健康ＰＣ間で示差的に発現されるｍｉＲＮＡ。
【図１４−２】[00052]表５−ＭＭ患者由来ＰＣ対健康ＰＣ間で示差的に発現されるｍｉＲＮＡ。
【図１５】[00053]表６−ＭＭ  ＰＣおよびＭＭ患者間で共通に発現されるｍｉＲＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[00054]本開示全体で、同定する引用によって、多様な刊行物、特許および公開特許明細書に言及する。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の到達水準をより詳細に記載するため、本開示内に援用される。
【００１８】
[00055]広い側面において、本明細書において、対象が多発性骨髄腫（ＭＭ）および／または意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかどうかを診断する方法であって：対象由来の試験試料において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する工程を含む、ここで、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較して、試験試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける改変が、対象がＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかいずれかである指標となる、前記方法を提供する。
【００１９】
[00056]特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である。
【００２０】
[00057]特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は、対象がＭＧＵＳから区別されるようなＭＭを有する指標となる。
【００２１】
[00058]別の広い側面において、本明細書において、腫瘍増殖を抑制する必要がある対象において、腫瘍増殖を抑制するための方法であって：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である少なくとも１つの遺伝子産物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂの１以上である。ｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ−１９１ａおよびｍｉＲ−１９１ｂの１以上である。
【００２２】
[00059]特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物はｐ５３タンパク質制御に関連する。
【００２３】
[00060]別の広い側面において、本明細書において、対象が多発性骨髄腫（ＭＭ）を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかどうかを診断する方法であって：１）対象から得た試験試料由来のＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し；２）該ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロフィールを提供し；そして３）該試験試料ハイブリダイゼーションプロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロフィールに比較する工程を含む、ここで、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける改変が、対象がＭＭ疾患を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかいずれかである指標となる、前記方法を提供する。
【００２４】
[00061]別の広い側面において、本明細書において、対象が、対象における１以上の不都合な予後マーカーと関連する多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかどうかを診断する方法であって：１）対象から得た試験試料由来のＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し；２）該ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロフィールを提供し；そして３）該試験試料ハイブリダイゼーションプロフィールを、対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロフィールに比較する工程を含む、ここで、シグナルにおける改変が、対象がＭＭ関連疾患を有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかいずれかである指標となる、前記方法を提供する。
【００２５】
[00062]別の広い側面において、本明細書において、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を患う対象であって、対照細胞に比較して、対象のＭＭ細胞において少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が下方制御されているかまたは上方制御されている対象において、該疾患を治療する方法であって：１）ＭＭ細胞において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が下方制御されている場合、対象におけるＭＭ細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも１つの単離ｍｉＲ遺伝子産物の有効量を対象に投与するか；または２）ＭＭ細胞において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が上方制御されている場合、対象におけるＭＭ細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を対象に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２６】
[00063]別の広い側面において、本明細書において、対象において、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を治療する方法であって：１）対照細胞に比較して、ＭＭ細胞において少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の量を決定し；そして２）対象におけるＭＭ細胞の増殖が阻害されるように：ｉ）ＭＭ細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞において発現される該ｍｉＲ遺伝子産物の量より少ない場合、少なくとも１つの該単離ｍｉＲ遺伝子産物の有効量を対象に投与するか；またはｉｉ）ＭＭ細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞において発現される該ｍｉＲ遺伝子産物の量より多い場合、少なくとも１つの該ｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を対象に投与することによって、ＭＭ細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を改変する工程を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は、対象がＭＧＵＳから区別されるようなＭＭを有する指標となる。
【００２７】
[00064]別の広い側面において、本明細書において、少なくとも１つの単離ｍｉＲ遺伝子産物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を治療するための薬学的組成物を提供する。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ発現阻害剤およびアンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）の少なくとも１以上を含む。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害剤化合物は、適切な対照細胞に比較してＭＭ細胞において上方制御されているｍｉＲ遺伝子産物に特異的である。
【００２８】
[00065]別の広い側面において、本明細書において、抗多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患剤を同定する方法であって：試験剤を細胞に提供し、そしてＭＭ細胞において改変される発現レベルと関連する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する工程を含む、ここで、適切な対照細胞に比較した、細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける改変が、試験剤が抗癌剤である指標となる、前記方法を提供する。
【００２９】
[00066]別の広い側面において、本明細書において、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患の開始、進行、重症度、病理学、攻撃性、病期、活性、能力障害、死亡率、罹患率、疾患細分類、あるいは他の根底にある病原性または病理学的特徴の少なくとも１つに寄与する１以上の代謝経路を評価するためのマーカーであって、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−３２の少なくとも１つの単離ｍｉＲ遺伝子産物をコードする１以上の遺伝子産物を含む、前記マーカーを提供する。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である。
【００３０】
[00067]別の広い側面において、本明細書において、本明細書に記載するようなマーカーの少なくとも１つから選択される多発性骨髄腫関連疾患のマーカーに結合する少なくとも１つの捕捉試薬を含む、製品を提供する。
【００３１】
[00068]別の広い側面において、本明細書において、本明細書に記載するような少なくとも１つのマーカーによってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患に関して試験するための試薬を提供する。
【００３２】
[00069]別の広い側面において、本明細書において、療法が、多発性骨髄腫（ＭＭ）を防止し、診断し、そして／または治療する有効性を評価する方法であって：１）有効性を評価しようとする療法に対象を供し、そして２）本明細書に記載するような少なくとも１つのマーカーを評価することによって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するかまたは防止する際の、試験中の治療の有効性レベルを決定する工程を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、候補療法剤は：薬学的組成物、栄養補助組成物、およびホメオパシー組成物の１以上を含む。特定の態様において、評価される療法はヒト対象で使用するためのものである。
【００３３】
[00070]別の広い側面において、本明細書において、多発性骨髄腫（ＭＭ）関連疾患を治療する療法剤に関して候補化合物をスクリーニングするためのキットであって：本明細書に記載するような少なくとも１つのマーカーの１以上の試薬、および少なくとも１つのマーカーを発現している細胞を含む、前記キットを提供する。特定の態様において、少なくとも１つのマーカーに特異的に結合する抗体または抗体断片を含む試薬を用いて、マーカーの存在を検出する。
【００３４】
[00071]別の広い側面において、本明細書において、多発性骨髄腫（ＭＭ）に関するスクリーニング試験であって：本明細書に記載する１以上のマーカーと、こうしたマーカーの基質および試験剤を接触させ；そして試験剤がマーカー活性を調節するかどうかを決定する工程を含む、前記試験を提供する。特定の態様において、すべての方法工程はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００３５】
[00072]別の広い側面において、本明細書において、多発性骨髄腫（ＭＭ）合併症を治療するか、防止するか、逆転させるかまたはその重症度を制限する必要がある個体において、これを行うための方法であって：個体に、多発性骨髄腫（ＭＭ）反応シグナル伝達経路に干渉する剤を、こうしたシグナル伝達に干渉するのに十分な量で投与する工程を含む、ここで、剤は、ＳＯＣＳ−１発現に干渉する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物を含む、前記方法を提供する。
【００３６】
[00073]別の広い側面において、本明細書において、個体において、多発性骨髄腫（ＭＭ）合併症を治療するか、防止するか、逆転させるかまたはその重症度を制限するための薬剤製造のための、多発性骨髄腫（ＭＭ）反応シグナル伝達経路に干渉する剤の使用であって、剤が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、およびｍｉＲ−３２の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物、ならびにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子産物を含む、前記使用を提供する。
【００３７】
[00074]別の広い側面において、本明細書において、少なくとも１つのｐ３００−ＣＢＰ関連因子発現阻害化合物、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、多発性骨髄腫（ＭＭ）癌を治療するための薬学的組成物を提供する。
【００３８】
[00075]別の広い側面において、本明細書において、ｐ５３活性を制御する必要がある細胞において、ｐ５３活性を制御するための方法であって、該細胞を、こうした活性を制御するのに十分な量の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物と接触させる工程を含み、該ｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂの１以上である、前記方法を提供する。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物はｐ３００−ＣＢＰ関連因子（ＰＣＡＦ）遺伝子をターゲティングする。特定の態様において、細胞は多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞である。
【００３９】
[00076]別の広い側面において、本明細書において、正常からＭＧＵＳを介して臨床的に明白なＭＭに向かうＭＭ多段階形質転換プロセスと関連するｍｉＲＮＡシグネチャーであって：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１７〜９２クラスター、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、およびｍｉＲ−３２の少なくとも１以上を含む、前記シグネチャーを提供する。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物は：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３２の１以上である。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの１以上である。
【００４０】
[00077]別の広い側面において、本明細書において、アポトーシスをブロッキングし、そして／または細胞生存を促進する必要がある対象において、アポトーシスをブロッキングし、そして／または細胞生存を促進するための方法であって、１以上のｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与する工程を含み、該遺伝子産物が：ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−２１の１以上である、前記方法を提供する。
【００４１】
[00078]別の広い側面において、本明細書において、ｐ５３の正の制御因子であるＰＣＡＦをターゲティングする必要がある対象において、ＰＣＡＦをターゲティングするための方法であって、１以上のｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与する工程を含み、該ｍｉＲ遺伝子産物が：ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３２の１以上である、前記方法を提供する。
【００４２】
[00079]別の広い側面において、本明細書において、細胞におけるＭＭ病因形成中のより後期の段階において、ＳＯＣＳ−１を下方制御し、そして／またはＩＬ−６を活性化するための方法であって、細胞において、ｍｉＲ−１９を上方制御する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４３】
[00080]別の広い側面において、本明細書において、ＭＭ由来細胞株、ならびにＭＭ患者、ＭＧＵＳおよび正常ドナー由来のＣＤ１３８＋骨髄形質細胞（ＰＣ）におけるｍｉＲＮＡ発現を評価するための、ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲ両方の使用を提供する。
【００４４】
[00081]本明細書において、ＰＣの悪性形質転換と関連するタンパク質の発現および制御に関連するｍｉＲＮＡシグネチャーもまた提供する。
【００４５】
[00082]本発明は、以下の実施例においてさらに定義され、ここで、別に言及しない限り、すべての部分および割合は重量であり、そして度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的のためのみに提供されることを理解しなければならない。上記議論およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認可能であり、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多様な変化および修飾を作製して、多様な使用および条件に適応させることが可能である。本明細書において言及される特許および非特許文献を含むすべての刊行物は、本明細書に完全に援用される。
【実施例】
【００４６】
[00083]
[00084]特徴的なｍｉＲＮＡシグネチャーが、健康ＰＣからＭＧＵＳを区別する
[00085]現在のモデルは、ＭＭが多段階形質転換プロセスを通じて発展すると仮定する（図１Ａ）（１５）。ＭＭの初期病原性事象に関連する特定の改変を同定するため、本発明者らは、本明細書に記載するｍｉＲＮＡマイクロアレイ・プラットフォームを用いることによって、ＭＧＵＳ対象由来の５つのＣＤ１３８＋  ＰＣおよび４つの健康ＰＣをプロファイリングした［患者特性に関しては、図１０−表１を参照されたい］。
【００４７】
[00086]本発明者らは、まず、ＢＲＢツール内の単変量ｔ検定を用いることによって、ＭＧＵＳを健康な対応ＰＣに比較した（クラス比較）（図１１−表２、図１Ｂ）。本発明者らは、４８のｍｉＲＮＡが有意に制御解除され（ｐ値≦０．０５）；正常ＣＤ１３８＋  ＰＣに比較して、ＭＧＵＳにおいて、４１のｍｉＲＮＡが上方制御され、そして７つが下方制御されることを見出した（図１１−表２、代表的なリストを図１Ｂに示す）。
【００４８】
[00087]ＭＧＵＳにおいて最も上方制御されているｍｉＲＮＡは、ＭＭにおいてもまた上方制御されていると記載されるｍｉＲ−２１（１４）、ＢおよびＴ細胞分化において役割を果たすことが知られるｍｉＲ−１８１ａ（１６）、ならびに発癌性クラスターｍｉＲ−１０６ｂ〜２５、特にｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−２５であった（図１１−表２、図１Ｂ）。
【００４９】
[00088]ＭＭ患者および細胞株におけるｍｉＲＮＡシグネチャー
[00089]ｍｉＲＮＡがＭＭにおいて制御解除されているかどうかを決定するため、本発明者らは、本発明者らのｍｉＲＮＡマイクロアレイ（１７）を用いて、４１のＭＭ由来細胞株（図１２−表３）、１０のＭＭ由来のＣＤ１３８＋未処置骨髄ＰＣ、および４つの正常ＣＤ１３８＋  ＰＣにおける網羅的なｍｉＲＮＡ発現を分析した。ＡｕｔｏＭＡＣｓ自動化分離系（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）後のＣＤ１３８＋  ＰＣ純度の度合い、ならびにＭＭ症例および正常ＰＣの臨床的特徴を図１０−表１に列挙する。
【００５０】
[00090]第一に、本発明者らは、ＢＲＢ内の単変量ｔ検定を用いて、ＣＤ１３８＋健康対照に比較して、原発性腫瘍および細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現を比較した（図１３−表４）。本発明者らの分析によって、ＣＤ１３８＋健康対照に比較して、ＭＭ患者および細胞株において、６０のｍｉＲＮＡの上方制御および３６のｍｉＲＮＡの下方制御が明らかになった（図１３−表４、図１Ｃ）。
【００５１】
[00091]すべてのｍｉＲＮＡは、２を超える倍変化および０．０１以下のｐ値を有する。細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現はまた、長期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のために制御解除される可能性もあるため、本発明者らは、健康ＰＣに対するＭＭ患者におけるｍｉＲＮＡ発現のみを分析した（図１４−表５）。
【００５２】
[00092]本発明者らは、２を超える倍変化および０．０１以下のｐ値を伴う、正常ＰＣに比較したＭＭ患者における３７のｍｉＲＮＡの上方制御および３７のｍｉＲＮＡの下方制御を見出した（図１４−表５）。上方制御されたｍｉＲＮＡの約９０％（３７のうち３４）および下方制御されたｍｉＲＮＡの約３０％（３７のうち１０）がＭＭ患者および細胞株を合わせた群に共通であり、それによって、細胞株およびＭＭ患者試料を合わせた本発明者らのアプローチは、少なくとも上方制御されたｍｉＲＮＡの分析に関しては検証された（図１Ｃ）（図１５−表６）。
【００５３】
[00093]図５のベン図は、これらの２つの比較群間に共通のｍｉＲＮＡを示す。ＭＧＵＳで観察されるシグネチャー同様、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１０６ａ〜９２クラスターは、ＭＭ患者および細胞株において、上方制御されることが見出された（図１Ｃ、図１２−表３）。しかし、本発明者らは、ｍｉＲ−３２およびクラスターｍｉＲ−１７〜９２、特にｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂは、ＭＭ試料においてのみ有意に上方制御され、ＭＧＵＳまたは健康ＰＣでは有意には上方制御されないことを同定し（図１Ｃ）、ＭＧＵＳからＭＭへの悪性形質転換における役割を果たす可能性があることが示された。
【００５４】
[00094]ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲＮＡシグネチャーの検証
[00095]マイクロアレイ結果を検証するため、本発明者らは、すべて異なるドナー由来である健康な対象（ｎ＝３）、ＭＭ患者試料（ｎ＝６）およびＭＧＵＳ（ｎ＝３）由来のランダムに選択したＣＤ１３８＋ＰＣの独立のセット（図１０−表１）に加えて、ＭＭ細胞株のセット（ｎ＝１５）（図１０−表１）を用いて、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１７−５、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０６ａ（ｍｉＲ−１７〜９２クラスター）、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−２５（ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター）、ｍｉＲ−３２８およびｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂに関して、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５５】
[00096]本発明者らは、ＣＤ１３８＋健康ＰＣに比較して、ＭＧＵＳおよびＭＭ試料において、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターの過剰発現を確認した（図６Ａ）。ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターは、ｍｉＲ−１７〜９２クラスターと高い度合いの相同性を共有し（図１Ｄ）、そして両方に関して発癌における役割が報告されたが（１８〜２０）、本発明者らは非常に類似のｍｉＲＮＡの分析に関するステムループｑ−ＲＴ−ＰＣＲの特異性に確信を持っており；本発明者らの実験室の先の報告は、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−２５プライマーの優れた特異性を示した（２０）。成熟ｍｉＲ−１８１ａは、２／３のＭＧＵＳ、６／６のＭＭ、および９／１５の細胞株で過剰発現され、示差発現の平均を図６Ｂに示す。
【００５６】
[00097]さらに、ｍｉＲ−１８１ａよりも低い度合いではあるが、ｍｉＲ−１８１ｂもまた、ＭＭおよびＭＧＵＳにおいて過剰発現された（図６Ｂ）。本発明者らは、ＭＭ患者および細胞株におけるｍｉＲ−３２およびｍｉＲ−１７〜９２クラスターの過剰発現をさらに検証した（図６Ｃ〜Ｆ）。アレイデータと一致して、２つのｍｉＲ−１７〜９２クラスターメンバー、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂ、ならびにｍｉＲ−３２は、６／６のＭＭ  ＰＣ試料および１５／１５の細胞株において非常に過剰発現された（図６Ｃ、６Ｆ）。主に、本発明者らは、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂが１００倍を超える倍変化を有する（図６Ｆ）が、これらが、１／３のＭＧＵＳで非常に低い発現を示し、そして２／３のＭＧＵＳおよび３／３の健康ＰＣ試料においてほぼ発現がないことを見出し、本発明者らの最初のアレイ結果が検証され、そしてこれらのｍｉＲＮＡがＭＭ特異的であることが示唆された。
【００５７】
[00098]ＭＭにおいて上方制御されるいくつかのｍｉＲＮＡは、ｐ５３の正の制御因子であるＰＣＡＦをターゲティングする
[00099]ＭＧＵＳおよびＭＭ患者および細胞株において最も上方制御されているｍｉＲＮＡの１つは、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂ、ならびにｍｉＲ−１０６ｂ〜２５であり、一方、ｍｉＲ−３２は、ＭＭにおいて優先的に上方制御されていた。「インシリコ」ターゲット予測ソフトウェア［Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｃａｎ（２１）、Ｐｉｃｔａｒ（２２）］を用いて、本発明者らは、これらのｍｉＲＮＡがｐ３００−ＣＢＰ関連因子（ＰＣＡＦ）をターゲティングすると予測されることを見出した（図２Ａ）。ＰＣＡＦは、腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３を含む多様な転写制御因子の可逆的アセチル化に関与する、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）である（２３）。最近、Ｌｉｎａｒｅｓらは、ＰＣＡＦが内因性ユビキチン化活性を所持することを示してきており、該活性は、Ｈｄｍ２発現レベル、およびしたがってＭＭにおいては診断時にまれにしか突然変異していない（症例の５〜１０％）し、また欠失されていない（２５〜２６）、ｐ５３（２４）を制御するのに非常に重要である。
【００５８】
[000100]これらのｍｉＲＮＡがＰＣＡＦを制御可能であるかどうかを調べるため、まず、本発明者らは、１５のＭＭ細胞株において、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ（図７Ａ）およびウェスタンブロッティング（図７Ｂ）によってＰＣＡＦ発現を分析した。対照として、本発明者らは、健康なドナーから単離された２つのＣＤ１３８＋  ＰＣを用いた。本発明者らは、ＰＣＡＦ発現が１０／１５の細胞株においてほとんど欠けており（対照より１０倍少ない）、一方、残りの５つの細胞株は非常に低い発現を示すことを見出した。この遺伝子がゲノムレベルで欠失しているかどうかを調べるため、本発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ  ６．０アレイを用いて、１５のＭＭ細胞株すべての全ゲノムＣＧＨ分析を行った。しかし、本発明者らは、ＰＣＡＦ遺伝子の欠失を観察しなかった（データ未提示）。
【００５９】
[000101]第二に、本発明者らは、ＰＣＡＦ  ３’ＵＴＲ５をルシフェラーゼレポーターベクター内にクローニングし、そして候補ｍｉＲＮＡ模倣体またはスクランブル化オリゴヌクレオチドと同時トランスフェクションし、そして方法に記載するようにルシフェラーゼアッセイを行った。本発明者らは、ｍｉＲ−１８１ａ／ｂ（図２Ｂ）、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターおよびｍｉＲ−３２（図２Ｄ、２Ｂ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＣＡＦ  ３’ＵＴＲと相互作用することを見出した。しかし、この相互作用は、ｍｉＲ−９２ではより有意ではなく（図２Ｃ）、そしてｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂでは相互作用はまったく観察されなかった（データ未提示）。レポーターベクター中の予測されるｍｉＲＮＡ結合部位を突然変異させると、この効果は無効になり、これらのｍｉＲＮＡが、ＰＣＡＦ  ３’ＵＴＲと直接相互作用することが示された。
【００６０】
[000102]ＭＭ細胞中のＰＣＡＦ制御におけるこれらのｍｉＲＮＡの生物学的役割を確認するため、本発明者らは、Ｕ２６６およびＪＪＮ３  ＭＭ細胞株において、アンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）を用いて、内因性ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−９２と拮抗させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を検証した。両細胞株において、拮抗ｍｉＲは、トランスフェクション７２時間後、ＰＣＡＦタンパク質発現の集積を誘導した（図２Ｅ、２Ｆ）。対照的に、Ｋ５６２細胞株において、オリゴヌクレオチドトランスフェクションによって、同じｍｉＲＮＡを過剰発現させると、ＰＣＡＦ発現が減少した（図２Ｇ、２Ｈ）。ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂはＰＣＡＦ発現に影響を及ぼさず（図２Ｈ）、そしてｍｉＲ−９２はその発現にほとんど影響せず（図２Ｆ）、ルシフェラーゼ発現データ（図２Ｃ）が確認された。
【００６１】
[000103]ＰＣＡＦのｍｉＲＮＡ制御因子が、ｐ５３発現に間接的に影響を及ぼすことが可能であるかどうかを決定するため、本発明者らは、ＭＭ１細胞を、抗ｍｉＲ−１８１ａ／ｂでまたはすべての拮抗ｍｉＲで同時に（抗ｍｉＲ−１８１、抗ｍｉＲ−９３、抗ｍｉＲ−１０６ｂ、抗ｍｉＲ−２５、抗ｍｉＲ−３２）トランスフェクションし、細胞を紫外（ＵＶ）照射に曝露し（図２Ｉ）、そしてｑＲＴ−ＰＣＲによってｐ５３およびＰＣＡＦの発現を測定した（図２Ｉ）。
【００６２】
[000104]図８Ａは、拮抗ｍｉＲ処理４８時間後のＰＣＡＦタンパク質の再発現を示す。トランスフェクタントオリゴの拮抗活性を図８Ｂに示す。ＵＶ処理後、ｐ５３  ｍＲＮＡ発現は、アンチセンスｍｉＲ−１８１ａ／ｂでトランスフェクションした細胞でほぼ２倍となり、一方、すべての拮抗ｍｉＲを同時にヌクレオポレーション（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ）した後、６倍増加した（図２Ｉ）。さらに、アンチセンスｍｉＲ−１８１ａ／ｂオリゴをＭＭ．１ｓにトランスフェクションした後、本発明者らは、小分子ＭＤＭ２アンタゴニスト、ニュートリン−３ａ（１０μＭ）で細胞を処理し、そしてウェスタンブロッティングによってｐ５３を測定した。本発明者らは、ｍｉＲ−１８１アンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）でトランスフェクションした細胞が、９時間および１２時間の時点で、スクランブル化およびｍｉＲ−２９  ＡＯＳと比較して、より高いレベルのｐ３タンパク質を示すことを見出した（図２Ｌ）。これらのデータを総合すると、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂがＰＣＡＦをターゲティングし、そしてこの遺伝子を通じて、骨髄腫において、ｐ５３活性を間接的に制御することが示される。
【００６３】
[000105]ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂは、ＩＬ−６Ｒ／ＳＴＡＴ３経路の負の制御因子であるＳＯＣＳ−１をターゲティングする
[000106]本発明者らの発見によって、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂは、患者試料において＞１００倍、細胞株において＞２０００倍上方制御され（図６Ｆ）、そしてどちらも正常ＰＣおよびＭＧＵＳにおいてほぼ欠けていることが示される。どちらのｍｉＲＮＡもＭＭの発展に寄与する。したがって、本発明者らは、入手可能なターゲット予測ソフトウェア［Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｃａｎ（２１）、Ｐｉｃｔａｒ（２２）］を用いて、骨髄腫病因形成に関与する、ｍｉＲ−１９ａおよびｂ  ｍＲＮＡターゲットに関して検索した。１００を超える予測されるターゲットの中で、ＳＯＣＳ−１は、ＩＬ−６を含むいくつかのサイトカイン経路、特にＪａｋ／ＳＴＡＴ経路の負の制御に関連づけられてきており（２７）、そしてＭＭにおいて、メチル化によって頻繁にサイレンシングされる（２８）。本発明者らは現在、ＭＭ試料において、高レベルのｍｉＲ−１９レベルは、負の制御因子ＳＯＣＳ−１の下方制御を通じて、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ−３シグナル伝達の恒常的な活性化に重要な役割を果たしうると考えている。本発明者らはまず、１５のＭＭ細胞株および２つの健康なＣＤ１３８＋  ＰＣにおいてその発現を評価し、そして対照に比較して、１３／１５の細胞株でほぼまったくタンパク質が発現されないことを見出した（図３Ａ）。
【００６４】
[000107]ＳＯＣＳ−１の発現レベル減少が、ＭＭ細胞において、ｍｉＲ−１９ａ／ｂの上方制御の結果でありうるかどうかを調べるため、本発明者らは、ＳＯＣＳ−１発現減少を示すＵ２６６（活性ＩＬ−６自己分泌ループを有する）（２９）およびＪＪＮ３  ＭＭ細胞株において、候補拮抗ｍｉＲＮＡまたはスクランブル化オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした後、ＳＯＣＳ−１抗体を用いたウェスタンブロット分析を行った（図３Ｄ）。
【００６５】
[000108]さらに、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂ模倣体は、ＳＯＣＳ−１  ３’ＵＴＲを含有するレポーターベクターの発現を阻害し、一方、予測されるｍｉＲＮＡ結合部位を突然変異させると、抗ｍｉＲ−１９でトランスフェクションした後のこの効果（図３Ｂ、３Ｃ）が無効になったが、スクランブル化オリゴによるトランスフェクションではそうはならなかった（図３Ｅ）。
【００６６】
[000109]７２時間の時点でのＡＳＯ活性をｑ−ＲＴ−ＰＣＲによって検出した（図３Ｆ）。これらの研究によって、ＭＭの病因形成および悪性増殖中のＩＬ−６抗アポトーシスシグナルにおけるｍｉＲ−１９の役割が示される。
【００６７】
[000110]ｍｉＲ−１７〜９２クラスターは、ＭＭ細胞において、Ｂｉｍをターゲティングする
[000111]ｍｉＲ−１７〜９２クラスターは、アポトーシス促進性遺伝子、Ｂｉｍをターゲティングすることが示されてきている（１９〜２０）ため、本発明者らは、ＭＭ細胞において、ｍｉＲ−１７−９２によってＢｉｍ発現が調節されるかどうかを調べた。Ｕ２６６細胞をｍｉＲ−１９  ＡＳＯでトランスフェクションし、そしてイムノブロットを用いてＢｉｍ発現を評価した。本発明者らは、スクランブル化オリゴヌクレオチドに比較して、抗ｍｉＲ−１９で４８時間処理した後のＢｉｍタンパク質レベルの有意な増加を見出した（図９）。総合すると、これらの結果は、ＢｉｍがｍｉＲ−１７〜９２の直接のターゲットであることを示す、先の公表されたデータ（１９〜２０）を支持し、そしてｍｉＲ−１７〜９２の過剰発現がＭＭにおいて抗アポトーシスシグナルに寄与するありうる機構を示唆する。
【００６８】
[000112]ＭＭ細胞株におけるｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−１８１ａ／ｂの異所抑制は、ヌードマウスにおいて、腫瘍増殖の有意な抑制につながる
[000113]本発明者らの観察のｉｎ  ｖｉｖｏ関連を探求するため、本発明者らは、内因性ｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−１８１ａ／ｂをサイレンシングした後、無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＵ２６６およびＪＪＮ３細胞の腫瘍形成能を調べた。各細胞株に関して、各々１６匹のマウスを用いる、２つの独立の実験を行った。Ｕ２６６またはＪＪＮ３細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＡＳＯまたはスクランブル化オリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。本発明者らは、ＢＬＯＣＫ−ＩＴ蛍光オリゴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクション効率（Ｕ２６６およびＪＪＮ３に関して８０％）を確認した。２４時間後、１００μｌのＢＤマトリゲルマトリックス中に再懸濁された、各群に関して３ｘ１０７生存細胞は、オリゴヌクレオチドが発展させる測定可能な腫瘍であった。対照的に、拮抗ｍｉＲを発現している細胞を移植されたマウスは、対照に比較して、腫瘍増殖の有意な阻害を示した（Ｐ＜０．０１）（図４Ａ、４Ｂ）。
【００６９】
[000114]抗ｍｉＲ−１９で処理したどちらの細胞株も、１０倍を超えて減少した腫瘍体積を示し、そして拮抗ｍｉＲ−１８１で処理した腫瘍は、ＪＪＮ３細胞において３倍小さく、そしてＵ２６６細胞において１０倍小さかった、それぞれ、Ｐ＝０．０２およびＰ＝０．０１。
【００７０】
[000115]重要なことに、抗ｍｉＲ−１９で処理したＵ２６６細胞を注射した２匹のマウスにおいて、完全腫瘍抑制が観察された。Ｕ２６６細胞に関する、４週間後の平均腫瘍体積は、３０８．５ｍｍ３であり、そしてＪＪＮ３細胞に関しては２２５ｍｍ３であった。拮抗ｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−１８１でトランスフェクションしたＭＭ細胞を注射したマウスの５０％のみが、４週間の時点で測定可能な腫瘍を発展させた。Ｕ２６６／抗ｍｉＲ−１９に関する平均腫瘍体積は１９．５ｍｍ３であり、そしてＵ２６６／抗ｍｉＲ−１８１に関しては１４ｍｍ３であった。ＪＪＮ３  ＭＭ細胞で類似の結果が観察され、抗ｍｉＲ−１９および抗ｍｉＲ−１８１に関しては、平均腫瘍体積は、それぞれ、２５ｍｍ３および８０ｍｍ３であった（図４Ａ、４Ｂ）。総合すると、これらの結果は、ＭＭにおけるこれらのマイクロＲＮＡの発癌における役割を示し、そして本発明者らは、本明細書において、現在、抗ｍｉＲ−１９の効果がより強いのは、Ｕ２６６がＩＬ−６に依存していることに関連すると考えている。
【００７１】
[000116]考察
[000117]過去数年間に渡って、いくつかの研究によって、正常な造血細胞の分化に関するｍｉＲＮＡの生物学的関連性、および悪性対応物における制御解除ｍｉＲＮＡ発現の寄与が例示されてきている（１１、３０、３１）。
【００７２】
[000118]本発明者らは、本明細書において、ここで、ＭＭ、ＭＧＵＳの最初の包括的な網羅的マイクロＲＮＡ発現プロファイリングを示し、そしてこれらの発現パターンを正常ＰＣのものと対比させた。ＭＭ細胞株および初代の新規に診断されたＭＭで観察されるｍｉＲＮＡ発現パターンが類似であることは、本明細書に記載するような研究設計を支持する。さらに、以前のＭＭマイクロアレイ研究は、ＭＭ細胞株と初代患者試料を組み合わせており、本発明者らの戦略を認証する（３２）。
【００７３】
[000119]さらに、本発明者らは、現在、正常ＰＣからＭＧＵＳを介して臨床的に明白な骨髄腫に向かうＭＭ多段階形質転換プロセスと関連しうるｍｉＲＮＡシグネチャーを同定する一方、ＭＧＵＳおよび初代腫瘍試料が少数であるための限界もなお認識している。
【００７４】
[000120]ＭＧＵＳ患者において、本発明者らは、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターなどの、発癌機能を持つ上方制御されたｍｉＲＮＡを同定した。ｍｉＲ−２１は、多くの固形および血液学的腫瘍において上方制御されている（１１、２５）。神経膠芽腫細胞において、ｍｉＲ−２１を異所発現させるとアポトーシスがブロックされる（３３）一方、いくつかの癌細胞においてその発現をサイレンシングすると、そのターゲット；ホスファターゼおよびテンシン相同体（ＰＴＥＮ）およびタンパク質プログラム細胞死４（ＰＤＣＤ４）のような腫瘍抑制因子遺伝子（３４）の発現がブロック解除されることによって、細胞増殖が阻害され、そしてアポトーシス細胞死の増加が導かれる。Ｐｅｔｒｏｃｃａら（２０）は、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターが、アポトーシス促進性Ｂｉｍおよびｐ２１をターゲティングすることによって、胃癌腫瘍形成において役割を果たすことを示してきている。したがって、これらの２つのｍｉＲＮＡは、アポトーシスをブロッキングし、ＰＣ生存を促進し、そして最終的に本格的な悪性腫瘍を生じる二次的遺伝子異常に対する素因を与えることによって、形質細胞形質転換におけるより初期の段階に寄与しうる。
【００７５】
[000121]ＭＭ（正常ＰＣに対してＭＭ細胞株および初代腫瘍を含む）において、本発明者らは、とりわけ；ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１０６〜２５、ならびにｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１８１ｂを含む、複数の上方制御されたｍｉＲＮＡで構成されるシグネチャーを同定した。
【００７６】
[000122]ｍｉＲ−１０６〜２５、ｍｉＲ−１８１ａおよびｂ、ならびにｍｉＲ−２１もまた、正常ＰＣに比較して、ＭＧＵＳ患者で上方制御されている一方、ｍｉＲ−３２およびｍｉＲ−１７〜９２クラスターは、ＭＭ患者においてのみ高発現されており、これらのｍｉＲＮＡがＭＭ特異的であることが示唆される。
【００７７】
[000123]ＲＡＳ突然変異以外には、ＭＭからＭＧＵＳを区別する他の遺伝子異常は見出されていない（３）。したがって、ｍｉＲ−３２およびｍｉＲ−１７〜９２クラスターは、ＭＭ特異的遺伝子変化を代表しうる。
【００７８】
[000124]ｍｉＲ−１０６〜２５クラスター同様、Ｂ細胞リンパ腫におけるｍｉＲ−１７〜９２クラスターの発癌における役割が周知であり、そしてＰＴＥＮ、Ｅ２Ｆ１、およびＢｃｌ２ｌ１１／Ｂｉｍを含むいくつかの既知のアポトーシス促進性遺伝子が、ｍｉＲ−１７〜９２のターゲットとして確認されている（３５〜３６）。最近、Ｖｅｎｔｕｒａら（１９）は、ｍｉＲ−１７〜９２クラスターがまた、Ｂ細胞発生にも必須であり、そしてｍｉＲ−１７〜９２が欠けていると、アポトーシス促進性タンパク質Ｂｉｍのレベル増加につながり、そしてプロＢからプレＢ遷移の時点で、Ｂ細胞発生が阻害されることを示した。しかし、ほぼ同一の配列であることを考慮すると、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５およびｍｉＲ−１７〜９２クラスターは、Ｂｉｍターゲティングにおけるものと同一でないとしても類似の機能を発揮する際に協調する可能性が非常に高い（１９〜２０）。
【００７９】
[000125]本明細書において、ここで、ＭＭで制御解除されているｍｉＲＮＡに関する重要な機能的洞察を示す。本発明者らは、アポトーシス促進性Ｂｉｍが、ＭＭ細胞においてｍｉＲ−１７〜９２クラスターのターゲットであることを確認している。したがって、ｍｉＲ−２１とともにｍｉＲ−１７〜９２は、アポトーシスをブロックし、そして細胞生存を促進する。一方、ｍｉＲ１０６ｂ〜２５、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３２は、ｐ５３の正の制御因子であるＰＣＡＦをターゲティングする［が、ｍｉＲ１７〜９２クラスター（特にｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−９２）はＰＣＡＦをターゲティングしない］。
【００８０】
[000126]理論によって束縛されることは望ましくないが、本発明者らは、本明細書において、現在、ＭＭにおけるｐ５３突然変異が低頻度であることと一致して、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスター、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ−３２によるＰＣＡＦの下方制御は、Ｈｄｍ２（２４）を通じてｐ５３の安定性を制御し、そしてヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）（２３）として働くことによって、ｐ５３を低レベルに維持するか、または部分的に不活性化すると考えている。
【００８１】
[000127]やはり、本明細書で初めて記載するのは、ＳＴＡＴ３／ＩＬ６Ｒの負の制御因子であるＳＯＣＳ−１に対するｍｉＲ−１９の特異的役割である。実際、ＭＭにおけるＩＬ−６経路は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーなどのアポトーシス制御因子に影響を及ぼす、ＳＴＡＴ３を通じたＰＣ形質転換および発癌に関与する最もよく性質決定された生存経路の１つである（１、１６）。これらの発見によって、ＭＭにおけるｍｉＲ−１９上方制御が、ＭＭ病因形成において、ＳＯＣＳ−１下方制御およびより遅い段階でのＩＬ−６活性化に寄与しうることが立証される。
【００８２】
[000128]ｉｎ  ｖｉｖｏ研究によって、発癌ｍｉＲＮＡとしてのＭＭ細胞におけるｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−１８１の役割が確認された。データは、ｍｉＲ−１９および１８１拮抗ｍｉＲでの処理後、移植される腫瘍の有意な腫瘍退縮を立証する。これらのデータはここで、ｍｉＲＮＡが、形質転換ＰＣの増殖に拮抗する際、療法的潜在能力を有しうることを示す。
【００８３】
[000129]結論として、既知の発癌活性を持つｍｉＲＮＡの過剰発現によって性質決定されるＭＭおよびＭＧＵＳにおいて、別個のｍｉＲＮＡシグネチャーを本明細書に記載する。データは、アポトーシス、生存および増殖を含めて、ｍｉＲＮＡによるＭＭにおける非常に重要な経路の制御との関連を確立することによって、ＭＭにおけるｍｉＲＮＡ機能への洞察を提供する。これらの結果は、ＰＣの悪性形質転換と関連する多段階プロセスにおける、この制御分子クラスによるさらなるレベルの制御を示す。
【００８４】
[000130]材料および方法
[000131]ＲＮＡ抽出およびｍｉＲＮＡマイクロアレイ実験  別の箇所に詳細に記載されるように（３７）、ＲＮＡ抽出およびｍｉＲＮＡマイクロチップ実験を行った。ｍｉＲＮＡマイクロアレイは、１チャネル系に基づく（３５）。二つ組でスポッティングされる、３４５のヒトおよび２４９のマウスｍｉＲＮＡ遺伝子を含む、１，１００のｍｉＲＮＡプローブを含有する、ＯＳＵカスタムｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ（ＯＳＵ＿ＣＣＣバージョン３．０）上のハイブリダイゼーションのため、５マイクログラムの総ＲＮＡを用いた。
【００８５】
[000132]ＲＴ−ＰＣＲ  一試験管ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡアッセイを用いて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、先に記載されるように（１０）、成熟ｍｉＲＮＡを検出し、そして定量化した。ＲＮＵ６Ｂで標準化を行った。テンプレート不含対照を含めて、３つ組で、比較リアルタイムＰＣＲを行った。比較Ｃｔ法を用いて、相対発現を計算した。
【００８６】
[000133]ＡＳＯおよび模倣体トランスフェクション実験  ヌクレオポレーション（Ａｍａｘａ）キットＶ（ＪＪＮ３およびＭＭ１ｓ細胞株に関して）およびキットＣ（Ｕ２６６細胞株に関して）を用い、１００ｎＭ  ｍｉＲＮＡ前駆体（Ａｍｂｉｏｎ）、または１００ｎＭ  ＬＮＡ  ｍｉＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｍｂｉｏｎ）を用いることによって、細胞をトランスフェクションした。タンパク質溶解物および総ＲＮＡを、示す時点で収集した。ノーザンブロットおよびステムループｑＲＴ−ＰＣＲによって、ｍｉＲＮＡプロセシングおよび発現を検証した。本発明者らは、すべての細胞株に関して、ＢＬＯＣＫ−ＩＴ蛍光オリゴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクション効率（Ｕ２６６およびＪＪＮ３に関して≒８０％、そしてＭＭ１ｓに関して５０％）を確認した。陰性対照オリゴヌクレオチドでトランスフェクションした未処理細胞を、標準物質として用いた。
【００８７】
[000134]細胞収集および総ＲＮＡ精製  試料には、ＭＭと新規に診断された症例１６例、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）患者６人、および６人の健康なドナー（正常ＰＣ）由来のＰＣが含まれた。施設の方針との調和を保ちながら、書面のインフォームドコンセントを得た。ＡｕｔｏＭＡＣｓ自動化分離系（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を用いて、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１３８抗体を用いた免疫磁気ビーズ選択によって、単核細胞分画からのＰＣ単離を行った。ＰＣ純度を図１１−表２に示し、細胞質軽鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）に関する免疫細胞化学、およびＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色による形態も示す。６つの健康ＰＣのうち３つを、ＡＬＬＣＥＬＬＳ、ＬＬＣから得て、そしてＦＡＣＳｃａｎ分析によってＰＣの純度を評価し、そしてこれは８０％より高かった。ＭＭ細胞株（図１２−表３）［Ｍ．  Ｋｕｅｈｌ博士（米国癌研究所、メリーランド州）、Ｊｏｓｈｕａ  Ｅｐｓｔｅｉｎ博士（アーカンソー州リトルロック）、Ｓ．  Ｒｏｓｅｎ博士（イリノイ州シカゴ）、Ｍ．  Ｇｒａｍａｔｚｋｉ博士（ドイツ・キール）の厚意］、およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂリンパ芽球細胞株（ＡＲＨ−７７、ＡＲＫ、ＵＣＬＡ−１）は、推奨されるように増殖させた（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州チャンティリー）。Ｔｒｉｚｏｌ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、総ＲＮＡを単離した。
【００８８】
[000135]ルシフェラーゼレポーターベクター  予測されるマイクロＲＮＡ結合部位を含有するＰＣＡＦおよびＳＯＣＳ１  ３’ＵＴＲを、ゲノムＤＮＡ（２９３Ｔ／１７細胞）からのＰＣＲによって増幅し、そしてホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼの停止コドンのすぐ下流のＸｂａ１部位を用いることによって、ｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に挿入した。製造者のプロトコルにしたがって、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、突然変異体構築物中に、各相補的シード領域相補的部位の最初の６ヌクレオチドの欠失を挿入した。
【００８９】
[000136]ルシフェラーゼアッセイ  ６ウェルプレート中、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１μｇのｐＧＬ３ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（ルシフェラーゼレポーターベクター法を参照されたい）、０．１μｇのｐｈＲＬ−ＳＶ４０対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および１００ｎＭ  ｍｉＲＮＡ前駆体（Ａｍｂｉｏｎ）で、ＱＢＩ２９３およびＭｅｇ０１細胞を同時トランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることによって、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を継続的に測定した。各レポータープラスミドを少なくとも２回（異なる日に）トランスフェクションし、そして各試料を３つ組でアッセイした。
【００９０】
[000137]異種移植片モデル  施設動物飼育および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）が認可したプロトコルのもとで、研究を行った。８週齢の雄無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）をＩＡＣＵＣ処置および指針にしたがって維持した。３０ｘ１０６  Ｕ２６６細胞またはＪＪＮ３トランスフェクション細胞を０．１０ｍｌの細胞外マトリックスゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁し、そして混合物を右および左脇腹内に皮下注射した。異種移植片増殖の連続測定を行い、そして式４／３π（Ｌ＊Ｗ＊Ｈ／８）を用いて、腫瘍体積を概算した。
【００９１】
[000138]ウェスタンブロッティング  ウサギ・ポリクローナル抗ＳＯＣＳ−１（Ａｂｃａｍ）；  Ｇａｄｐｈ、Ｂｉｍ、Ｓｔａｔ−３、Ｐ−Ｓｔａｔ−３（Ｔｙｒ７０５）に対するウサギ・ポリクローナル抗血清（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ウサギ・ポリクローナルＰＣＡＦおよびモノクローナルｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて、記載されるように（１０）、イムノブロット分析を行った。適切な抗血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出されるタンパク質レベルを、βアクチンまたは／およびＧａｐｄｈレベルに比較して標準化した。
【００９２】
[000139]ＵＶおよびニュートリン３ａ処理  ＭＭ．１ｓおよびＵ２６６  ＭＭ細胞株を本明細書に記載するように、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５、ｍｉＲ−３２およびｍｉＲ−１９  ＡＳＯでトランスフェクションし、そしてトランスフェクション２４時間後、Ｕ２６６細胞を１０μＭ  ニュートリン３ａ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で処理し、そしてＭＭ．１Ｓを６Ｊ／ｍ２  ＵＶ（Ｕｌｔｒａ  ＬＵＭ．  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州パラマウント）で処理し、そして本明細書に記載する時点で採取した。
【００９３】
[000140]データ分析  ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０を用いることによって、マイクロアレイ画像を分析した。各ｍｉＲＮＡの複製点の平均値からバックグラウンドを減じ、そしてさらなる分析に供した。ｍｉＲＮＡが試料の少なくとも５０％に存在し、そして該ｍｉＲＮＡの少なくとも５０％が遺伝子中央値より１．５より大きい倍変化を有する場合、ｍｉＲＮＡを保持した。非存在（ａｂｓｅｎｔ）コールは、標準化および統計分析前、ｌｏｇ２スケールでは４．５までが閾値であった（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｅｄ）。このレベルは、ｍｉＲＮＡチップ実験において、バックグラウンドを越えて検出される平均最小強度レベルである。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ／関数を用いて、変位値標準化を実行した。ＢＲＢツール、バージョン３．５．０内の単変量ｔ検定を用いることによって、示差的に発現されるマイクロＲＮＡを同定した。０．０１に等しいアルファレベルで一変量的に有意であると設定した。このツールは、パラメトリック検定ｔ／Ｆ検定、および確率差異（ｒａｎｄｏｍ  ｖａｒｉａｎｃｅ）ｔ／Ｆ検定を用いて、データを分析するように設計される。遺伝子リスト中の遺伝子の包含基準は、明記する閾値よりも小さいｐ値、または偽発見の数および偽発見の比率に対する明記する限界のいずれかである。後者は、多変量並べ替え検定の使用によって調節される。
【００９４】
[000141]使用例
[000142]１つの側面において、本発明は、癌対象の生存を予測するための方法を提供する。予測法は、癌細胞における複数のバイオマーカーの示差発現に基づく。短期癌生存者において、いくつかのバイオマーカーが過剰発現される傾向がある一方、他のバイオマーカーは、長期癌生存者において過剰発現される傾向があることが発見された。癌対象由来の細胞試料におけるこれらのバイオマーカーの発現のユニークなパターンを用いて、その対象に関する相対生存時間、そして最終的には予後を予測してもよい。
【００９５】
[000143]癌対象の生存を予測するための方法
[000144]本発明の１つの側面は、癌生存を予測するための方法を提供する。該方法は、癌対象由来の細胞試料における複数のバイオマーカー（すなわちｍｉＲ）の示差発現を決定する工程を含む。癌のバイオマーカー発現シグネチャーを用いて、その癌からの生存を予測するリスクスコアを得てもよい。スコアは、対象が長期間（すなわち５年より長く）生存可能であるというように低リスクを示してもよいし、またはスコアは、対象が長期間は生存しない（すなわち２年未満）というように高リスクを示してもよい。
【００９６】
[000145]生存関連バイオマーカー
[000146]いくつかのバイオマーカーは、長期生存者において過剰発現され、そしていくつかのバイオマーカーは、短期生存者において過剰発現される。バイオマーカーは、細胞接着、細胞運動性、または炎症および免疫応答に影響を及ぼすことによって、癌転移に役割を果たしうる。バイオマーカーはまた、アポトーシスに関与しうる。バイオマーカーは輸送機構に役割を果たしうる。バイオマーカーはまた、他のタイプの癌における生存とも関連しうる。
【００９７】
[000147]複数のバイオマーカーの発現の測定
[000148]１つの方法は、癌対象由来の細胞試料における複数の生存関連バイオマーカーの示差発現を測定する工程を含む。次いで、各癌または遺伝子発現シグネチャーにおける示差発現パターンを用いて、癌生存の予測となるリスクスコアを生成してもよい。バイオマーカーの発現レベルは、癌の他の対象に比較して、対象において、増加してもまたは減少してもよい。バイオマーカーの発現は、短期生存者におけるより長期生存者においてより高い可能性もある。あるいは、バイオマーカーの発現は、長期生存者におけるより短期生存者においてより高い可能性もある。
【００９８】
[000149]当該技術分野に周知の多様な技術によって、複数のバイオマーカーの示差発現を測定してもよい。バイオマーカーのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルの定量化を用いて、バイオマーカーの発現を測定してもよい。あるいは、バイオマーカーのタンパク質産物レベルの定量化を用いて、バイオマーカーの発現を測定してもよい。以下に論じる方法に関するさらなる情報は、Ａｕｓｕｂｅｌら，  （２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク、またはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに見られうる。当業者は、どのパラメーターを操作して、関心対象のｍＲＮＡまたはタンパク質の検出を最適にしうるかを知っているであろう。
【００９９】
[000150]核酸マイクロアレイを用いて、複数のバイオマーカーの示差発現を定量化してもよい。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）技術（カリフォルニア州サンタクララ）またはＩｎｃｙｔｅ（カリフォルニア州フレモント）のマイクロアレイ系を用いることによるなど、製造者のプロトコルにしたがって、商業的に入手可能な装置を用いて、マイクロアレイ分析を行ってもよい。典型的には、マイクロチップ支持体上に、一本鎖核酸（例えばｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）をプレーティングするかまたはアレイ化する。次いで、アレイ化配列を、関心対象の細胞由来の特異的核酸プローブとハイブリダイズさせる。関心対象の細胞から抽出したＲＮＡを逆転写することによって、蛍光標識デオキシヌクレオチドの取り込みを通じて、蛍光標識ｃＤＮＡプローブを生成してもよい。あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを増幅し、そしてビオチンなどのマーカーで標識してもよい。次いで、標識プローブを、非常にストリンジェントな条件下で、マイクロチップ上の固定核酸にハイブリダイズさせる。ストリンジェントに洗浄して、非特異的に結合したプローブを取り除いた後、共焦点レーザー顕微鏡によって、またはＣＣＤカメラなどの別の検出法によって、チップをスキャンする。ハイブリダイゼーションファイルにおける生の蛍光強度データを、一般的に、ロバストマルチチップ平均（ＲＭＡ）アルゴリズムでプレプロセシングして、発現値を生じる。
【０１００】
[000151]また、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、複数のバイオマーカーの示差発現を測定してもよい。ＱＲＴ−ＰＣＲにおいて、一般的に、ＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写し、これを次いで、ＰＣＲ反応を介して増幅する。ＰＣＲ産物の量をリアルタイムで周期ごとに追跡し、これによって、ｍＲＮＡの最初の濃度を決定することが可能になる。ＰＣＲ産物量を測定するため、二本鎖ＤＮＡに結合するＳＹＢＲグリーンなどの蛍光色素の存在下で、反応を行ってもよい。また、増幅しようとするＤＮＡに特異的な蛍光レポータープローブを用いて、反応を行ってもよい。蛍光レポータープローブの限定されない例は、ＴａｇＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）である。蛍光レポータープローブは、ＰＣＲ伸長サイクル中に消光剤が取り除かれると蛍光を発する。各々、異なるフルオロフォアを含有する多数の遺伝子特異的レポータープローブを用いることによって、多重ＱＲＴ−ＰＣＲを行ってもよい。各サイクル中の蛍光値を記録し、そしてこの値は、増幅反応において、その時点までに増幅した産物の量に相当する。エラーを最小限にし、そしていかなる試料間変動も減少させるため、ＱＲＴ−ＰＣＲは、典型的には、参照標準を用いて実行される。理想的な参照標準は、異なる組織間で一定レベルで発現され、そして実験処理によって影響を受けない。適切な参照標準には、限定されるわけではないが、ハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびベータ−アクチンに関するｍＲＮＡが含まれる。当該技術分野に周知の計算を用いて、元来の試料中のｍＲＮＡレベルまたは各バイオマーカーの発現の倍変化を決定してもよい。
【０１０１】
[000152]また、免疫組織化学染色を用いて、複数のバイオマーカーの示差発現を測定してもよい。この方法は、特異的抗体とタンパク質の相互作用によって、組織切片の細胞において、タンパク質の位置決定を可能にする。このため、ホルムアルデヒドまたは別の適切な固定液中で、組織を固定し、ワックスまたはプラスチック中に包埋し、そしてマイクロトームを用いて、薄い切片（約０．１ｍｍから数ｍｍ厚）を切り取る。あるいは、組織を凍結して、そしてクリオスタットを用いて、薄い切片を切り取ってもよい。組織切片を固体支持体上でアレイ化し、そして固定してもよい（すなわち組織マイクロアレイ）。組織切片を、関心対象の抗原に対する一次抗体とインキュベーションし、その後、洗浄して未結合抗体を取り除く。一次抗体を検出系にカップリングさせてもよいし、または一次抗体を、検出系にカップリングしている二次抗体で検出してもよい。検出系はフルオロフォアであってもよいし、あるいは基質を比色、蛍光、または化学発光産物に変換させうる、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素であってもよい。一般的に、染色組織切片を、顕微鏡下でスキャンする。癌対象由来の組織試料は異種性でありうるため、すなわちいくつかの細胞は正常であり、そして他の細胞が癌性でありうるため、組織中の陽性染色細胞の割合を決定してもよい。この測定を、染色強度の定量化とともに用いて、バイオマーカーの発現値を生じてもよい。
【０１０２】
[000153]酵素連結免疫吸着アッセイ、またはＥＬＩＳＡを用いて、複数のバイオマーカーの示差発現を測定してもよい。ＥＬＩＳＡアッセイには多くの変形がある。すべては、固体表面、一般的にはマイクロタイタープレート上に、抗原または抗体を固定することに基づく。元来のＥＬＩＳＡ法は、関心対象のバイオマーカータンパク質を含有する試料を調製し、マイクロタイタープレートのウェルを試料でコーティングし、各ウェルを、特定の抗原を認識する一次抗体とインキュベーションし、未結合抗体を洗い流し、そして次いで、抗体−抗原複合体を検出する工程を含む。抗体−抗体複合体を直接検出してもよい。このためには、一次抗体を検出系、例えば検出可能産物を生じる酵素にコンジュゲート化させる。抗体−抗体複合体を間接的に検出してもよい。このためには、上記のように、検出系にコンジュゲート化された二次抗体によって、一次抗体を検出する。次いで、マイクロタイタープレートをスキャンして、そして当該技術分野に知られる手段を用いて、生強度データを発現値に変換してもよい。
【０１０３】
[000154]また、抗体マイクロアレイを用いて、複数のバイオマーカーの示差発現を測定してもよい。このためには、複数の抗体をアレイ化し、そしてマイクロアレイまたはバイオチップの表面に共有結合させる。一般的に、関心対象のバイオマーカータンパク質を含有するタンパク質抽出物を蛍光色素で標識する。標識バイオマーカータンパク質を抗体マイクロアレイとインキュベーションする。洗浄して未結合タンパク質を取り除いた後、マイクロアレイをスキャンする。当該技術分野に知られる手段を用いて、生蛍光強度データを発現値に変換してもよい。
【０１０４】
[000155]また、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重化微小球体を用いて、複数のバイオマーカーの示差発現を測定してもよい。これらの顕微鏡ポリスチレンビーズは、蛍光色素で内部色コード化され、各ビーズはユニークなスペクトルのシグネチャーを有する（１００まである）。同じシグネチャーを持つビーズは、関心対象のターゲットに結合する特異的オリゴヌクレオチドまたは特異的抗体でタグ化されている（すなわち、それぞれバイオマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質）。ターゲットもまた、次に、蛍光レポーターでタグ化される。したがって、色の２つの供給源があり、一方はビーズ由来であり、そしてもう一方はターゲット上のレポーター分子由来である。次いで、１００までが１つのウェル中で検出可能なターゲットを含有する試料と、ビーズをインキュベーションする。ビーズの大きさ／表面積が小さく、そしてビーズがターゲットに三次元曝露されるため、結合反応中、ほぼ溶液相動力学が可能になる。レーザーが、各ビーズを同定する内部色素を励起するフローサイトメトリーに基づいて、先端技術流体工学によって、捕捉されたターゲットを検出し、そしてまた、アッセイ中に任意のレポーター色素を捕捉する。当該技術分野に知られる手段を用いて、獲得ファイル由来のデータを発現値に変換してもよい。
【０１０５】
[000156]また、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、複数のバイオマーカーの示差的発現を測定してもよい。この方法は、組織切片の細胞における関心対象のｍＲＮＡの位置決定を可能にする。この方法のため、組織を凍結するか、または固定してそして包埋し、そして次いで薄い切片を切り取って、これをアレイ化し、そして固体表面上に固定してもよい。組織切片を、関心対象のｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう標識アンチセンスプローブとインキュベーションする。ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程は、一般的に、非常にストリンジェントな条件下で行われる。プローブをフルオロフォアまたは小さいタグ（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）で標識して、標識ハイブリッドを検出しそして顕微鏡下で視覚化することが可能であるように、該ハイブリッドを別のタンパク質または抗体によって検出してもよい。各アンチセンスプローブが識別可能な標識を有するならば、多数のｍＲＮＡを同時に検出することも可能である。一般的に、ハイブリダイズした組織アレイを、顕微鏡下でスキャンする。癌対象由来の組織試料は異種性でありうるため、すなわちいくつかの細胞は正常であり、そして他の細胞が癌性でありうるため、組織中の陽性染色細胞の割合を決定してもよい。この測定を、染色強度の定量化とともに用いて、バイオマーカーの発現値を生じてもよい。
【０１０６】
[000157]癌対象由来の細胞試料において発現を測定するバイオマーカーの数は多様であってもよい。生存の予測されるスコアは、バイオマーカーの示差発現に基づくため、より多くのバイオマーカー発現を測定すると、より高い度合いの正確さが達成されるはずである。
【０１０７】
[000158]癌対象由来の細胞試料の獲得
[000159]複数のバイオマーカーの発現を癌対象由来の細胞試料において測定する。癌のタイプおよび分類は多様でありうるし、そして多様であろう。癌は、早期癌、すなわち第Ｉ期または第ＩＩ期であってもよいし、あるいは後期癌、すなわち第ＩＩＩ期または第ＩＶ期であってもよい。
【０１０８】
[000160]一般的に、生検または外科的切除によって、癌対象から細胞試料または組織試料が得られるであろう。生検のタイプは、癌の位置および性質に応じて多様でありうるし、そして多様であろう。針吸引生検によって、細胞試料、組織、または体液を取り出してもよい。これに関して、シリンジに取り付けた細い針を、皮膚を通じて、そして関心対象の臓器または組織内に挿入する。針は、典型的には、超音波またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像を用いて、関心対象の領域に導かれる。針が組織内に挿入されたならば、細胞または体液が針を通じて吸い込まれ、そしてシリンジ中に収集されるように、シリンジで真空を生成する。また、切開性またはコア生検によって、細胞または組織の試料を取り出してもよい。これに関して、関心対象の領域から、円錐形、筒型、またはごく少量の組織を取り出す。一般的に、ＣＴ画像、超音波、または内視鏡を用いて、このタイプの生検を導く。最後に、切除性生検または外科的切除によって、全癌病変を取り除いてもよい。
【０１０９】
[000161]細胞試料または組織試料を癌対象から取り出したら、当業者に周知であり、そして標準的な分子生物学参考書、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，  （２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨークに開示される技術を用いて、ＲＮＡまたはタンパク質の単離のため、プロセシングしてもよい。また、組織試料を保存するかまたは迅速凍結して、そして後に使用するため、−８０℃で保存してもよい。また、生検組織試料を、固定液、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、または酢酸／エタノールで固定してもよい。固定組織試料をワックス（パラフィン）またはプラスチック樹脂中に包埋してもよい。包埋組織試料（または凍結組織試料）を薄い切片に切り出してもよい。また、固定されたかまたはワックスに包埋された組織試料から、ＲＮＡまたはタンパク質を抽出してもよい。
【０１１０】
[000162]癌対象は、一般的に哺乳動物対象であろう。哺乳動物には、霊長類、家畜動物、およびコンパニオン動物が含まれる。限定されない例には以下が含まれる：霊長類にはヒト、類人猿（ａｐｅｓ）、サル（ｍｏｎｋｅｙｓ）、およびテナガザル（ｇｉｂｂｏｎｓ）が含まれてもよく；家畜動物には、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカおよびブタが含まれてもよく；コンパニオン動物には、イヌ、ネコ、ウサギ、およびげっ歯類（マウス、ラット、およびモルモットを含む）が含まれてもよい。例示的な態様において、対象はヒトである。
【０１１１】
[000163]リスクスコアの生成
[000164]本発明のバイオマーカーは、癌生存に関連する。複数のこれらのバイオマーカーの発現の示差パターンを用いて、癌対象の生存転帰を予測してもよい。特定のバイオマーカーは、長期生存者において過剰発現される傾向があり、一方、他のバイオマーカーは、短期生存者において過剰発現される傾向がある。対象における複数のバイオマーカーの発現のユニークなパターン（すなわち発現シグネチャー）を用いて、生存リスクスコアを生成してもよい。高いリスクスコアを持つ対象は、外科的切除後、短い生存時間（＜２年間）を有しうる。低いリスクスコアの対象は、切除後、より長い生存時間（＞５年間）を有しうる。
【０１１２】
[000165]複数のバイオマーカーの示差発現を測定するのに用いる技術に関わらず、各バイオマーカーの発現は、典型的には、発現値に変換されるであろう。次いで、これらの発現値を用いて、当該技術分野に周知の統計法を用い、癌対象に関して生存のリスクスコアを計算するであろう。主成分分析を用いて、リスクスコアを計算してもよい。また、単変量Ｃｏｘ回帰分析を用いて、リスクスコアを計算してもよい。１つの好ましい態様において、部分的Ｃｏｘ回帰分析を用いて、リスクスコアを計算してもよい。
【０１１３】
[000166]部分的Ｃｏｘ回帰分析によって生じるスコアは２つの群に属する：１）正の値を有するもの；および２）負の値を有するもの。正の値を有するリスクスコアは、短期生存時間と関連し、そして負の値を有するリスクスコアは、長期生存時間と関連する。
【０１１４】
[000167]本発明の方法の１つの態様において、早期癌対象から、外科的切除によって、組織試料を取り出してもよい。組織試料をＲＮＡｌａｔｅｒ中に保存してもよいし、またはＲＮＡを後日単離可能であるように、瞬間凍結してもよい。ＲＮＡをＱＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとして用いてもよく、この中で、複数のバイオマーカーの発現を分析し、そして発現データを用い、部分的Ｃｏｘ回帰分類法を用いてリスクスコアを得る。リスクスコアを用いて、対象が短期または長期癌生存者であるかどうかを予測してもよい。
【０１１５】
[000168]この方法の特に好ましい態様において、早期癌対象から組織試料を収集してもよい。組織からＲＮＡを単離して、そしてこれを用いて、核酸マイクロアレイ分析用の標識プローブを生成してもよい。マイクロアレイ分析から生成した発現値を用い、部分的Ｃｏｘ回帰分類法を用いて、リスクスコアを得てもよい。リスクスコアを用いて、対象が短期または長期癌生存者であるかどうかを予測してもよい。
【０１１６】
[000169]癌対象の予後を決定するための方法
[000170]本発明の別の側面は、癌対象の予後を決定するための方法を提供する。該方法は、対象からの細胞試料における１以上のバイオマーカーの示差発現を測定する工程を含む。各バイオマーカーの示差発現を発現値に変換し、そして発現値を用いて、上記に詳述するような統計法を用い、その対象に関するスコアを得る。正の値を有するスコアは、劣った予後または劣った転帰の指標となり、一方、負の値を有するスコアは、優れた予後または優れた転帰の指標となる。
【０１１７】
[000171]本発明の方法の１つの態様において、核酸マイクロアレイ分析によって、早期癌対象のための発現シグネチャーを生成し、そして発現値を用いて、スコアを計算する。計算されたスコアを用いて、対象が、癌転帰の優れた予後または劣った予後を有するかどうかを予測してもよい。
【０１１８】
[000172]癌対象のための治療を選択するための方法
[000173]本発明のさらなる側面は、癌対象のための有効な治療を選択するための方法を提供する。対象に関するリスクスコアが計算されたら、この情報を用いて、対象のための治療の適切なコースに関して決定してもよい。正のリスクスコア（すなわち短期生存時間または劣った予後）を有する対象は、積極的療法措置から利益を得ることも可能である。積極的療法措置は、単数または複数の適切な化学療法剤を含んでもよい。積極的療法措置はまた、放射線療法を含んでもよい。治療措置は、癌のタイプおよび病期に応じて、多様でありうるし、そして多様であろう。負のリスクスコア（すなわち長期生存時間または優れた予後）を有する対象は、再発性癌にかかる可能性が低いため、さらなる治療は必要でない可能性もある。
【０１１９】
[000174]１以上の剤がマイクロＲＮＡの発現または活性を阻害するか、マイクロＲＮＡの１以上のターゲット遺伝子の発現を阻害するか、またはその組み合わせを阻害し、それによって細胞の増殖を阻害する条件下で、細胞を維持する。
【０１２０】
[000175]癌細胞の増殖を阻害するのに使用可能な剤を同定する方法もまた提供する。該方法は、１以上のマイクロＲＮＡを、評価しようとする剤と接触させるか；１以上のターゲット遺伝子を、評価しようとする剤と接触させるか；またはその組み合わせを接触させる工程を含む。マイクロＲＮＡの発現が剤の存在下で阻害されるか；またはターゲット遺伝子の発現が剤の存在下で増進されるか、または剤の存在下でその組み合わせが起こる場合、該剤を用いて、濾胞性甲状腺癌細胞の増殖を阻害することも可能である。
【０１２１】
[000176]療法剤を同定する方法
[000177]ＣＲＣを治療するのに使用可能な剤を同定する方法もまた本明細書に提供する。該方法は、１以上のマイクロＲＮＡを、評価しようとする剤と接触させるか；１以上のマイクロＲＮＡの１以上のターゲット遺伝子を接触させるか；またはその組み合わせを接触させる工程を含む。マイクロＲＮＡの発現が剤の存在下で阻害されるか；またはターゲット遺伝子の発現が剤の存在下で増進されるか、または剤の存在下でその組み合わせが起こる場合、該剤を用いて、濾胞性甲状腺癌細胞の増殖を阻害することも可能である。
【０１２２】
[000178]本明細書に提供する方法で評価可能な剤には、ｍｉＲＮＡ阻害剤が含まれる。こうした剤の他の例には、薬学的剤、薬剤、化学的化合物、イオン性化合物、有機化合物、補因子を含む有機リガンド、糖類、組換えおよび合成ペプチド、タンパク質、ペプトイド、遺伝子を含む核酸配列、核酸産物、ならびに抗体およびその抗原結合性断片が含まれる。本明細書の方法にしたがって、こうした剤を個々にスクリーニングしてもよいし、または１以上の化合物（単数または複数）を同時に試験してもよい。コンビナトリアル化学合成または他の方法によって産生された化合物（例えば有機化合物、組換えまたは合成ペプチド、ペプトイド、核酸）の巨大コンビナトリアルライブラリーを試験してもよい。コンビナトリアルライブラリーから選択される化合物がユニークなタグを所持する場合、クロマトグラフィー法による個々の化合物の同定が可能である。本明細書の方法にしたがって、化学的ライブラリー、微生物ブロスおよびファージディスプレイライブラリーもまた試験して（スクリーニングして）もよい。
【０１２３】
[000179]癌対象の生存または予後を予測するためのキット
[000180]本発明のさらなる側面は、癌対象の生存または予後を予測するためのキットを提供する。キットは、１以上のバイオマーカーの示差発現を測定するための複数の剤、発現データを発現値に変換するための手段、および発現値を分析して生存または予後を予測するスコアを生成するための手段を含む。バイオマーカー発現を測定するためのキットにおける剤は、バイオマーカーのｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドアレイを含んでもよい。別の態様において、バイオマーカー発現を測定するためのキット中の剤は、複数のＰＣＲプローブおよび／またはＱＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーを含んでもよい。
【０１２４】
[000181]本発明はまた、１）１以上のマイクロＲＮＡ；２）１以上のマイクロＲＮＡの１以上のターゲット遺伝子；３）ターゲット遺伝子によって発現される１以上のポリペプチドまたは４）その組み合わせを検出するための１以上の試薬を含む、個体のＣＲＣを検出するためのキットにも関する。例えば、キットは、ハイブリダイゼーションプローブ、制限酵素（例えばＲＦＬＰ分析用）、アレル特異的オリゴヌクレオチド、およびターゲット遺伝子によって発現されるポリペプチドに結合する抗体を含んでもよい。
【０１２５】
[000182]特定の態様において、１以上のマイクロＲＮＡの領域に実質的にまたは完全に相補的である隣接ヌクレオチド配列を少なくとも含む。１つの態様において、キット中の１以上の試薬は標識され、そしてしたがって、キットは、標識を検出可能な剤をさらに含んでもよい。キットは、キットの構成要素を用いてＣＲＣを検出するための説明書をさらに含んでもよい。
【０１２６】
[000183]核酸アレイ
[000184]本発明の別の側面は、本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む核酸アレイを提供する。一般的に、核酸アレイは、少なくとも１つのアドレスを有する支持体で構成される。核酸アレイは、当該技術分野に一般的に知られ、そしてさらに、核酸アレイを含む支持体もまた、当該技術分野に周知である。支持体材料の限定されない例には、ガラスおよびプラスチックが含まれる。支持体は、スライドまたはチップ（すなわち四辺形型）のような形状であってもよいし、あるいは支持体はウェルのような形状であってもよい。
【０１２７】
[000185]本発明のアレイは、その上に、本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸を配置する、少なくとも１つのアドレスで構成される。１つの態様において、アレイは、各アドレスが、その上に、肺癌対象の生存を予測するためのバイオマーカーのｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸を配置する、多数のアドレスで構成される。アレイはまた、その上に、対照核酸を配置する１以上のアドレスも含んでもよい。対照は、内部対照（すなわちアレイ自体に関する対照）、および／または外部対照（すなわちアレイに適用される試料に関する対照）であってもよい。アレイは、典型的には、約１〜約１０，０００アドレスの間で構成される。１つの態様において、アレイは、約１０〜約８，０００アドレスで構成される。別の態様において、アレイは、５００を超えないアドレスで構成される。別の態様において、アレイは５００より少なくないアドレスで構成される。核酸アレイを用いる方法が当該技術分野で周知である。
【０１２８】
[000186]使用法
[000187]１つの側面において、本明細書において、対象がＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかどうかを診断する方法であって、対象由来の試験試料において、少なくとも１つの遺伝子産物のレベルを測定し、そして対照試料中の対応する遺伝子産物のレベルに、試験試料中の遺伝子産物のレベルを比較する工程を含む、前記方法を提供する。本明細書において、「対象」は、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有するかまたは有すると推測されるいかなる哺乳動物であってもよい。特定の態様において、対象は、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有するかまたは有すると推測されるヒトである。
【０１２９】
[000188]対象から得た生物学的試料の細胞において、少なくとも１つの遺伝子産物のレベルを測定してもよい。例えば、慣用的な試料採取技術によって、関連するＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有すると推測される対象から、組織試料を取り出してもよい。別の例において、血液試料を対象から取り出してもよく、そして標準技術によって、ＤＮＡ抽出のため白血球を単離してもよい。好ましくは、放射療法、化学療法または他の療法的治療の開始前に、血液または組織試料を対象から得る。影響を受けていない対象組織から、正常ヒト個体または正常個体集団から、あるいは対象試料中の大部分の細胞に対応する培養細胞から、対応する対照組織または血液試料を得てもよい。次いで、対象試料由来の細胞において所定の遺伝子から産生される遺伝子産物のレベルを、対照試料の細胞由来の対応する遺伝子産物レベルに比較可能であるように、対照組織または血液試料を、対象由来の試料とともにプロセシングしてもよい。
【０１３０】
[000189]対照試料中の対応する遺伝子産物レベルに比較した、対象から得た試料中の遺伝子産物レベルにおける改変（すなわち増加または減少）は、対象におけるＭＭおよび／またはＭＧＵＳの存在の指標となる。１つの態様において、試験試料中の少なくとも１つの遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応する遺伝子産物のレベルより大きい（すなわち遺伝子産物の発現が「上方制御されている」）。本明細書において、対象由来の細胞または組織試料中の遺伝子産物量が、対照細胞または組織試料中の同じ遺伝子産物の量よりも多い場合、遺伝子産物の発現は「上方制御されている」。別の態様において、試験試料中の少なくとも１つの遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応する遺伝子産物のレベルより小さい（すなわち遺伝子産物の発現が「下方制御されている」）。本明細書において、対象由来の細胞または組織試料中の遺伝子から産生される遺伝子産物量が、対照細胞または組織試料中の同じ遺伝子から産生される量よりも少ない場合、遺伝子発現は「下方制御されている」。１以上のＲＮＡ発現標準に関して、対照および正常試料中の相対遺伝子発現を決定してもよい。標準は、例えば、０遺伝子発現レベル、標準細胞株における遺伝子発現レベル、または正常ヒト対照集団に関して先に得られた遺伝子発現の平均レベルを含んでもよい。
【０１３１】
[000190]生物学的試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適した任意の技術を用いて、試料中の遺伝子産物レベルを測定してもよい。生物学的試料由来の細胞中のＲＮＡ発現レベルを決定するのに適した技術（例えばノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）が当業者に周知である。特定の態様において、ノーザンブロット分析を用いて、少なくとも１つの遺伝子産物レベルを検出する。例えば、核酸抽出緩衝液の存在下でのホモジナイズ後、遠心分離によって、細胞から総細胞ＲＮＡを精製してもよい。核酸を沈殿させ、そしてＤＮアーゼでの処理および沈殿によって、ＤＮＡを取り除く。次いで、標準技術にしたがって、アガロースゲル上のゲル電気泳動によって、ＲＮＡ分子を分離し、そしてニトロセルロースフィルターにトランスファーする。次いで、加熱によってフィルター上にＲＮＡを固定する。問題のＲＮＡに相補的な、適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて、特定のＲＮＡの検出および定量化を達成する。例えば、その全開示が本明細書に援用される、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９，  第７章を参照されたい。
【０１３２】
[000191]所定の遺伝子産物の核酸配列から、所定の遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションに適したプローブを産生してもよい。標識ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製のための方法、ならびにターゲットヌクレオチド配列に対するそのハイブリダイゼーションのための条件は、その開示が本明細書に援用される、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９，  第１０章および第１１章に記載される。
【０１３３】
[000192]例えば、核酸プローブを、例えば放射性核種、例えば３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３５Ｓ；重金属；あるいは標識リガンドの特異的結合対メンバーとして機能可能なリガンド（例えばビオチン、アビジンまたは抗体）、蛍光分子、化学発光分子、酵素等で標識してもよい。
【０１３４】
[000193]その全開示が本明細書に援用される、Ｒｉｇｂｙら（１９７７），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１３：２３７−２５１のニックトランスレーション法によるか、またはＦｉｅｎｂｅｒｇら（１９８３），  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３２：６−１３のランダムプライミング法によるか、いずれかで、プローブを高い比活性に標識することも可能である。後者の方法は、一本鎖ＤＮＡからまたはＲＮＡテンプレートから、高い比活性の３２Ｐ標識プローブを合成するために選択される方法である。例えば、ニックトランスレーション法にしたがって、あらかじめ存在するヌクレオチドを非常に放射性であるヌクレオチドで置換することによって、１０８ｃｐｍ／マイクログラムをはるかに超える比活性を持つ３２Ｐ標識核酸プローブを調製することも可能である。次いで、写真フィルムに、ハイブリダイズしたフィルターを曝露することによって、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出を行ってもよい。ハイブリダイズしたフィルターに曝露された写真フィルムの濃度測定スキャンは、遺伝子転写物レベルの正確な測定を提供する。別のアプローチを用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒなどのコンピュータ画像化系によって、遺伝子転写物レベルを定量化してもよい。
【０１３５】
[000194]ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの放射性核種標識が現実的ではない場合、ランダムプライマー法を用いて、類似体、例えばｄＴＴＰ類似体、５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子内に取り込んでもよい。蛍光色素または色反応を生じる酵素にカップリングされた、ビオチン結合タンパク質、例えばアビジン、ストレプトアビジン、ならびに抗体（例えば抗ビオチン抗体）と反応させることによって、ビオチニル化プローブオリゴヌクレオチドを検出してもよい。
【０１３６】
[000195]ノーザンおよび他のＲＮＡハイブリダイゼーション技術に加えて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術を用いて、ＲＮＡ転写物レベルの決定を達成してもよい。この技術は、ノーザンブロッティング技術よりも少ない細胞しか必要とせず、そして全細胞を顕微鏡カバースリップ上に沈着させ、そして放射能または別の方式で標識した核酸（例えばｃＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブを含有する溶液で、細胞の核酸内容物を探査する工程を含む。この技術は、対象由来の組織生検試料を分析するのに特によく適している。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術の実施は、その全開示が本明細書に援用される米国特許第５，４２７，９１６号により詳細に記載される。所定の遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適したプローブを核酸配列から産生してもよい。
【０１３７】
[000196]また、遺伝子転写物を逆転写し、その後、ポリメラーゼ連鎖反応によって逆転写された転写物を増幅することによって（ＲＴ−ＰＣＲ）、細胞中の遺伝子転写物の相対数を決定してもよい。内部標準、例えば同じ試料中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子由来のｍＲＮＡレベルと比較して、遺伝子転写物レベルを定量化してもよい。内部標準として使用するのに適した「ハウスキーピング」遺伝子には、例えば、ミオシンまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的ＲＴ−ＰＣＲのための方法およびその変形が、当該技術分野の技術範囲内である。
【０１３８】
[000197]いくつかの例において、試料中の複数の異なる遺伝子産物の発現レベルを同時に決定することが望ましい可能性もある。他の例において、癌と相関するすべての既知の遺伝子の転写物発現レベルを決定することが望ましい可能性もある。数百の遺伝子の癌特異的発現レベルの評価は、時間が掛かり、そして多量の総ＲＮＡ（各ノーザンブロットのため、少なくとも２０μｇ）および放射性同位体を必要とするオートラジオグラフィー技術を必要とする。
【０１３９】
[000198]これらの制限を克服するため、遺伝子または遺伝子産物セットに特異的なプローブオリゴデオキシヌクレオチドセットを含有する、マイクロチップ形式のオリゴライブラリー（すなわちマイクロアレイ）を構築してもよい。こうしたマイクロアレイを用いると、ＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを生成して、そしてこれらをマイクロアレイ上のプローブオリゴデオキシヌクレオチドにハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーションプロフィールまたは発現プロフィールを生成することによって、生物学的試料中の多数のマイクロＲＮＡの発現レベルを決定可能である。次いで、試験試料のハイブリダイゼーションプロフィールを、対照試料のものに比較して、どのマイクロＲＮＡが改変された発現レベルを有するかを決定してもよい。本明細書において、「プローブオリゴヌクレオチド」または「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」は、ターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを指す。「ターゲットオリゴヌクレオチド」または「ターゲットオリゴデオキシヌクレオチド」は、（例えばハイブリダイゼーションを介して）検出されるはずの分子を指す。「特異的プローブオリゴヌクレオチド」または「遺伝子産物に特異的なプローブオリゴヌクレオチド」によって、特定の遺伝子産物に、または特定の遺伝子産物の逆転写物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１４０】
[000199]特定の試料の「発現プロフィール」または「ハイブリダイゼーションプロフィール」は、本質的に、試料の状態のフィンガープリントであり；２つの状態が、同様に発現される何らかの特定の遺伝子を有する可能性もある一方、いくつかの遺伝子を同時に評価すると、細胞状態にユニークな遺伝子発現プロフィールの生成が可能になる。すなわち、正常細胞をＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞から区別することも可能であり、そしてＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞内で、異なる予後状態（例えば、優れたまたは劣った長期生存見込み）を決定してもよい。異なる状態のＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞の発現プロフィールを比較することによって、これらの状態各々において、どの遺伝子が重要かに関する情報（遺伝子の上方制御および下方制御両方を含む）を得る。ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞または正常細胞において示差的に発現される配列、ならびに異なる予後転帰を生じる示差発現の同定によって、いくつかの方法でのこの情報の使用が可能になる。例えば、特定の治療措置を評価してもよい（例えば化学療法薬剤が作用して、特定の患者において長期予後が改善するかどうかを決定するため）。同様に、患者試料と既知の発現プロフィールを比較することによって、診断を行うかまたは確認してもよい。さらに、これらの遺伝子発現プロフィール（または個々の遺伝子）は、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ発現プロフィールを抑制するか、または劣った予後プロフィールをよりよい予後プロフィールに変換する薬剤候補のスクリーニングを可能にする。
【０１４１】
[000200]したがって、本発明は、対象がＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかどうかを診断する方法であって、対象から得た試験試料由来のＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し、該ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロフィールを提供し、そして対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロフィールに、試験試料のハイブリダイゼーションプロフィールを比較する工程を含む、ここで、少なくとも１つのｍｉＲＮＡシグナルにおける改変は、対象がＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかいずれかである指標となる、前記方法を提供する。
【０１４２】
[000201]本発明はまた、１以上の予後マーカーと関連するＭＭおよび／またはＭＧＵＳを診断する方法であって、対象由来のＭＭおよび／またはＭＧＵＳ試験試料において、少なくとも１つの遺伝子産物レベルを測定し、そしてＭＭおよび／またはＭＧＵＳ試験試料における少なくとも１つの遺伝子産物のレベルを、対照試料中の対応する遺伝子産物のレベルに比較する工程を含む、前記方法も提供する。対照試料に比較した試験試料中の少なくとも１つの遺伝子産物のシグナルにおける改変（例えば増加、減少）は、対象が１以上の予後マーカーと関連するＭＭおよび／またはＭＧＵＳを有するかまたは該疾患にかかるリスクを有するかいずれかである指標となる。
【０１４３】
[000202]ＭＭおよび／またはＭＧＵＳは、不都合な（すなわち負の）予後に関連するマーカーまたは優れた（すなわち正の）予後に関連するマーカーを含む、１以上の予後マーカーまたは特徴と関連しうる。特定の態様において、本明細書記載の方法を用いて診断されるＭＭおよび／またはＭＧＵＳは、１以上の不都合な予後特徴と関連する。
【０１４４】
[000203]その発現が、これらの予後マーカー各々と関連するＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞において改変されている、特定のマイクロＲＮＡを本明細書に記載する。１つの態様において、対象から得た試験試料由来のＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し、該ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロフィールを提供し、そして対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロフィールに、試験試料のハイブリダイゼーションプロフィールを比較することによって、少なくとも１つの遺伝子産物レベルを測定する。
【０１４５】
[000204]いかなる１つの理論によって束縛されることも望ましくないが、細胞における１以上の遺伝子産物レベルにおける改変は、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳの形成につながりうる、これらの遺伝子産物に対する１以上の意図されるターゲットの制御解除を生じうると考えられる。したがって、（例えばＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞において上方制御される遺伝子産物レベルを減少させることによって、癌細胞において下方制御される遺伝子産物レベルを増加させることによって）遺伝子産物レベルを改変すると、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ治療に成功する可能性もある。ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞において制御解除される遺伝子産物に関する推定上の遺伝子ターゲットの例を本明細書に記載する。
【０１４６】
[000205]したがって、本発明は、対象においてＭＭおよび／またはＭＧＵＳを治療する方法であって、少なくとも１つの遺伝子産物を、対象の癌細胞中で制御解除する（例えば下方制御する、上方制御する）、前記方法を含む。ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞において、少なくとも１つの単離遺伝子産物が下方制御されている場合、方法は、対象において癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも１つの単離遺伝子産物の有効量を投与する工程を含む。癌細胞において、少なくとも１つの単離遺伝子産物が上方制御されている場合、方法は、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞の増殖が阻害されるように、本明細書において、遺伝子発現阻害化合物と称される、少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を投与する工程を含む。
【０１４７】
[000206]用語「治療する」、「治療すること」および「治療」は、本明細書において、疾患症状の開始を防止するかまたは遅延し、そして／または疾患または状態の症状の重症度または頻度を減少させることを含めて、疾患または状態、例えばＭＭおよび／またはＭＧＵＳと関連する症状を軽減させることを指す。用語「対象」および「個体」は、本明細書において、動物、例えば哺乳動物を含むと定義され、限定されるわけではないが、霊長類、ウシ（ｃｏｗｓ）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、ヤギ（ｇｏａｔｓ）、ウマ（ｈｏｒｓｅｓ）、イヌ（ｄｏｇｓ）、ネコ（ｃａｔｓ）、ウサギ（ｒａｂｂｉｔｓ）、モルモット（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ）、ラット（ｒａｔｓ）、マウス（ｍｉｃｅ）、あるいは他のウシ亜科（ｂｏｖｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ウマ科（ｅｑｕｉｎｅ）、イヌ科（ｃａｎｉｎｅ）、ネコ科（ｆｅｌｉｎｅ）、げっ歯類（ｒｏｄｅｎｔ）、またはネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ）種を含む動物が含まれる。好ましい態様において、動物はヒトである。
【０１４８】
[000207]本明細書において、単離遺伝子産物の「有効量」は、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ  Ｌを患う対象において、癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。当業者は、対象の大きさおよび体重；疾患浸透の度合い；対象の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに投与が局所的であるかまたは全身性であるかなどの要因を考慮することによって、所定の対象に投与すべき遺伝子産物の有効量を容易に決定可能である。
【０１４９】
[000208]例えば、単離遺伝子産物の有効量は、治療しようとする対象のおよそのまたは概算される体重に基づいてもよい。好ましくは、本明細書に記載するように、こうした有効量を非経口的にまたは経腸的に投与する。例えば、対象に投与される単離遺伝子産物の有効量は、約５〜３０００マイクログラム／ｋｇ体重、約７００〜１０００マイクログラム／ｋｇ体重の範囲であってもよいし、または約１０００マイクログラム／ｋｇ体重を超えてもよい。
【０１５０】
[000209]当業者はまた、所定の対象に単離遺伝子産物を投与するための適切な投薬措置を容易に決定可能である。例えば、遺伝子産物を対象に１回投与してもよい（例えば単回注射または沈着として）。あるいは、約３〜約２８日間、より詳細には約７〜約１０日間の期間、遺伝子産物を対象に毎日１回または２回投与してもよい。特定の投薬措置において、遺伝子産物を１日１回、７日間投与する。投薬措置が多数の投与を含む場合、対象に投与される遺伝子産物の有効量は、全投薬措置に渡って投与される遺伝子産物総量を含みうると理解される。
【０１５１】
[000210]本明細書において、「単離」遺伝子産物は、合成されたか、あるいは人間の介入を通じて、天然状態から改変されたかまたは取り除かれたものである。例えば、合成遺伝子産物、あるいは天然状態で同時に存在する物質から部分的にまたは完全に分離された遺伝子産物は、「単離された」と見なされる。単離された遺伝子産物は、実質的に精製された形で存在してもよいし、あるいは遺伝子産物が送達された細胞中に存在してもよい。したがって、細胞に意図的に送達されたか、または細胞中で意図的に発現されている遺伝子産物は、「単離」遺伝子産物と見なされる。前駆体分子から細胞内で産生される遺伝子産物もまた、「単離」分子と見なされる。
【０１５２】
[000211]いくつかの標準技術を用いて、単離遺伝子産物を得てもよい。例えば、当該技術分野で知られる方法を用いて、遺伝子産物を化学的に合成するか、または組換え的に産生してもよい。１つの態様において、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび慣用的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて、遺伝子産物を化学的に合成する。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業的供給者には、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツ・ハンブルグ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州ラファイエット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、米国イリノイ州ロックフォード）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州アッシュランド）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（英国グラスゴー）が含まれる。
【０１５３】
[000212]あるいは、任意の適切なプロモーターを用いて、組換え環状または直鎖ＤＮＡプラスミドから、遺伝子産物を発現してもよい。プラスミドからＲＮＡを発現するのに適したプロモーターには、例えばＵ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当該技術分野の技術範囲内である。本発明の組換えプラスミドはまた、癌細胞において、遺伝子産物の発現のための誘導性または制御可能プロモーターも含んでもよい。
【０１５４】
[000213]標準技術によって、培養細胞発現系より、組換えプラスミドから発現される遺伝子産物を単離してもよい。また、組換えプラスミドから発現される遺伝子産物を癌細胞に送達してもよく、そして癌細胞で直接発現させてもよい。遺伝子産物を癌細胞に送達するための組換えプラスミドの使用を以下により詳細に論じる。
【０１５５】
[000214]遺伝子産物は、別個の組換えプラスミドから発現されてもよいし、または同じ組換えプラスミドから発現されてもよい。１つの態様において、遺伝子産物は、単一プラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、そして前駆体分子は、限定されるわけではないが、癌細胞内に現存するプロセシング系を含む、適切なプロセシング系によって、機能する遺伝子産物にプロセシングされる。他の適切なプロセシング系には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞溶解物系（例えば、その全開示が本明細書に援用される、Ｔｕｓｃｈｌらに対する米国公開特許出願第２００２／００８６３５６号に記載されるようなもの）および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＩＩＩ系（例えば、その全開示が本明細書に援用される、Ｙａｎｇらに対する米国公開特許出願第２００４／００１４１１３号に記載されるようなもの）が含まれる。
【０１５６】
[000215]遺伝子産物を発現するのに適したプラスミドの選択、プラスミド内に核酸配列を挿入して遺伝子産物を発現させるための方法、および関心対象の細胞に組換えプラスミドを送達する方法が、当該技術分野の技術範囲内である。例えば、その全開示が本明細書に援用される、Ｚｅｎｇら（２００２），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３；  Ｔｕｓｃｈｌ（２００２），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０：４４６−４４８；  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２００２），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３；  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら（２００２），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：４９７−５００；  Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２），  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６：９４８−９５８；  Ｌｅｅら（２００２），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：５００−５０５；およびＰａｕｌら（２００２），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：５０５−５０８を参照されたい。
【０１５７】
[000216]１つの態様において、遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ極初期プロモーターの調節下で、前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書において、プロモーターの「調節下にある」は、プロモーターが、遺伝子産物コード配列の転写を開始可能であるように、遺伝子産物をコードする核酸配列が、プロモーターの３’に位置することを意味する。
【０１５８】
[000217]遺伝子産物はまた、組換えウイルスベクターから発現されてもよい。遺伝子産物を２つの別個の組換えウイルスベクターから、または同じウイルスベクターから発現させてもよい。組換えウイルスベクターから発現されるＲＮＡを、標準技術によって、培養細胞発現系から単離しても、または癌細胞において直接発現させても、いずれでもよい。癌細胞に遺伝子産物を送達するための組換えウイルスベクターの使用を以下により詳細に論じる。
【０１５９】
[000218]本発明の組換えウイルスベクターは、遺伝子産物をコードする配列およびＲＮＡ配列を発現するのに適した任意のプロモーターを含む。適切なプロモーターには、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当該技術分野の技術範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターはまた、癌細胞において、遺伝子産物の発現のための誘導性または制御可能プロモーターも含んでもよい。
【０１６０】
[000219]遺伝子産物のコード配列を受入可能な任意のウイルスベクターを用いてもよく；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えばレンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、ネズミ白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等由来のベクターがある。他のウイルス由来のエンベロープタンパク質または他の表面抗原で、ベクターを偽型化することによって、あるいは適切なように、異なるウイルスカプシドタンパク質を置換することによって、ウイルスベクターの指向性を修飾してもよい。
【０１６１】
[000220]例えば、本発明のレンチウイルスベクターを、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）等由来の表面タンパク質で偽型化してもよい。ベクターが、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するように操作することによって、本発明のＡＡＶベクターを作製して、異なる細胞をターゲティングしてもよい。例えば、血清型２ゲノム上に血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ２／２と称される。ＡＡＶ  ２／２ベクター中のこの血清型２カプシド遺伝子を血清型５カプシド遺伝子で置換して、ＡＡＶ  ２／５ベクターを産生してもよい。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当該技術分野の技術内である；例えば、その全開示が本明細書に援用される、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｅ．ら（２００２），  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：７９１−８０１を参照されたい。
【０１６２】
[000221]本発明で使用するのに適した組換えウイルスベクターの選択、ＲＮＡを発現するための核酸配列をベクター内に挿入する方法、ウイルスベクターを関心対象の細胞に送達する方法、および発現されたＲＮＡ産物の回収は、当該技術分野の技術内である。例えば、その全開示が本明細書に援用される、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ（１９９５），  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．  ２：３０１−３１０；  Ｅｇｌｉｔｉｓ（１９８８），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４；  Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０），  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．  １：５−１４；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８），  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０を参照されたい。
【０１６３】
[000222]特定の態様において、適切なウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するものである。遺伝子産物を発現するのに適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターをターゲット細胞内に送達するための方法は、その全開示が本明細書に援用される、Ｘｉａら（２００２），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０：１００６−１０１０に記載される。遺伝子産物を発現するのに適したＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築するための方法、およびターゲット細胞内にベクターを送達するための方法は、その全開示が本明細書に援用される、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８７），  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３０９６−３１０１；  Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６），  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７０：５２０−５３２；  Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９），  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ  ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ  ９３／２４６４１号に記載される。
【０１６４】
[000223]特定の態様において、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの調節下、ポリＴ終結配列と機能可能であるように連結された前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本明細書において、「ポリＴ終結配列と機能可能であるように連結された」は、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、ポリＴ終結シグナルの５’方向にすぐ隣接することを意味する。ベクターからの配列の転写中、ポリＴ終結シグナルは、転写を終結させるよう働く。
【０１６５】
[000224]また、本発明の治療法の他の態様において、発現を阻害する少なくとも１つの化合物の有効量を対象に投与してもよい。本明細書において、「遺伝子発現を阻害する」は、治療後の遺伝子産物の活性成熟型の産生が、治療前に産生される量より少ないことを意味する。当業者は、例えば、診断法に関して上に論じる、転写レベルを決定するための技術を用いて、発現が癌細胞において阻害されているかどうかを容易に決定可能である。阻害は遺伝子発現のレベルで（すなわち遺伝子産物をコードする遺伝子の転写を阻害することによって）またはプロセシングのレベルで（例えば、前駆体の成熟活性遺伝子産物へのプロセシングを阻害することによって）起こりうる。
【０１６６】
[000225]本明細書において、発現を阻害する化合物の「有効量」は、癌関連染色体特徴と関連する癌を患う対象において、癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。当業者は、対象の大きさおよび体重；疾患浸透の度合い；対象の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに投与が局所的であるかまたは全身性であるかなどの要因を考慮することによって、所定の対象に投与すべき発現阻害化合物の有効量を容易に決定可能である。
【０１６７】
[000226]例えば、発現阻害化合物の有効量は、治療しようとする対象のおよそのまたは概算される体重に基づいてもよい。本明細書に記載するように、こうした有効量を、とりわけ、非経口的にまたは経腸的に投与する。例えば、対象に投与される発現阻害化合物の有効量は、約５〜３０００マイクログラム／ｋｇ体重、約７００〜１０００マイクログラム／ｋｇ体重の範囲であってもよいし、または約１０００マイクログラム／ｋｇ体重を超えてもよい。
【０１６８】
[000227]当業者はまた、所定の対象に発現を阻害する化合物を投与するための適切な投薬措置を容易に決定可能である。例えば、発現阻害化合物を対象に１回投与してもよい（例えば単回注射または沈着として）。あるいは、約３〜約２８日間、より好ましくは約７〜約１０日間の期間、発現阻害化合物を対象に毎日１回または２回投与してもよい。特定の投薬措置において、発現阻害化合物を１日１回、７日間投与する。投薬措置が多数の投与を含む場合、対象に投与される発現阻害化合物の有効量は、全投薬措置に渡って投与される化合物総量を含みうると理解される。
【０１６９】
[000228]発現を阻害するのに適した化合物には、二本鎖ＲＮＡ（短分子または小分子干渉ＲＮＡまたは「ｓｉＲＮＡ」）、アンチセンス核酸、および酵素的ＲＮＡ分子、例えばリボザイムが含まれる。これらの化合物は各々、所定の遺伝子産物をターゲティングし、そしてターゲット遺伝子産物を破壊するかまたはその破壊を誘導する。
【０１７０】
[000229]例えば、遺伝子産物の少なくとも部分と、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列相同性を有する単離二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子を用いて遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することによって、所定の遺伝子の発現を阻害してもよい。特定の態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、「短分子または小分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」である。
【０１７１】
[000230]本発明の方法で有用なｓｉＲＮＡは、長さ約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド、好ましくは長さ約１９〜約２５ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、標準的ワトソンクリック塩基対形成相互作用（本明細書において、以後「塩基対形成」）によってともにアニーリングされる、センスＲＮＡ鎖および相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、ターゲット遺伝子産物内に含有される核酸配列と実質的に同一な核酸配列を含む。
【０１７２】
[000231]本明細書において、ターゲットｍＲＮＡ内に含有されるターゲット配列に「実質的に同一である」ｓｉＲＮＡ中の核酸配列は、ターゲット配列に同一であるか、または１つまたは２つのヌクレオチドがターゲット配列とは異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補的一本鎖ＲＮＡ分子を含んでもよく、または２つの相補的部分が塩基対形成されており、そして一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合されている、単一分子を含んでもよい。
【０１７３】
[000232]ｓｉＲＮＡはまた、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって、天然存在ＲＮＡと異なる、改変ＲＮＡであってもよい。こうした改変には、非ヌクレオチド物質の、例えばｓｉＲＮＡ末端（単数または複数）への、またはｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドへの付加、あるいはｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾、あるいはｓｉＲＮＡ中の１以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドでの置換が含まれうる。
【０１７４】
[000233]ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖はまた、３’オーバーハングも含んでもよい。本明細書において、「３’オーバーハング」は、二重鎖ＲＮＡ鎖の３’端から伸長する少なくとも１つの非対ヌクレオチドを指す。したがって、特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、長さ１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）、長さ１〜約５ヌクレオチド、長さ１〜約４ヌクレオチド、または長さ約２〜約４ヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。特定の態様において、３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖上に存在し、そして長さ２ヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含んでもよい。
【０１７５】
[000234]ｓｉＲＮＡを化学的または生物学的に産生してもよいし、あるいは単離に関して記載するような、組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現してもよい。
【０１７６】
[000235]ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を産生しそして試験するための例示的な方法は、その全開示が本明細書に援用される、Ｇｅｗｉｒｔｚに対する米国公開特許出願第２００２／０１７３４７８号、およびＲｅｉｃｈらに対する米国公開特許出願第２００４／００１８１７６号に記載される。
【０１７７】
[000236]所定の遺伝子の発現はまた、アンチセンス核酸によって阻害されうる。本明細書において、「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用によって、ターゲットＲＮＡに結合して、ターゲットＲＮＡの活性を改変する核酸分子を指す。本発明の方法で使用するのに適したアンチセンス核酸は、一般的に、遺伝子産物中の隣接核酸配列に相補的な核酸配列を含む、一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ）である。アンチセンス核酸は、遺伝子産物中の隣接核酸配列に５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的である核酸配列を含んでもよい。遺伝子産物のための核酸配列を本明細書に提供する。いかなる理論に束縛されることも望ましくないが、アンチセンス核酸は、ＲＮアーゼＨまたは遺伝子産物／アンチセンス核酸二重鎖を消化する別の細胞ヌクレアーゼを活性化すると考えられる。
【０１７８】
[000237]アンチセンス核酸はまた、核酸主鎖への、または糖および塩基部分（またはその同等物）への修飾を含有して、ターゲット特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達または分子の有効性に関連する他の特性も含有してもよい。こうした修飾には、コレステロール部分、二重鎖挿入剤、例えばアクリジン、または１以上のヌクレアーゼ耐性基が含まれる。
【０１７９】
[000238]アンチセンス核酸を化学的または生物学的に産生してもよいし、あるいは単離遺伝子産物に関して上述するような、組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現してもよい。産生し、そして試験するための例示的な方法は、当該技術分野の技術内であり；例えば、その全開示が本明細書に援用される、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ（１９９３），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１００４、ならびにＷｏｏｌｆらに対する米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい。
【０１８０】
[000239]所定の遺伝子の発現を酵素的核酸によって阻害することもまた可能である。本明細書において、「酵素的核酸」は、遺伝子産物の隣接核酸配列に相補性を有し、そして遺伝子産物を特異的に切断可能な、基質結合領域を含む、核酸を指す。酵素的核酸基質結合領域は、遺伝子産物中の隣接核酸配列に、例えば５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的であってもよい。酵素的核酸はまた、塩基、糖、および／またはリン酸基に修飾を含んでもよい。本発明の方法で使用するための例示的な酵素的核酸は、リボザイムである。
【０１８１】
[000240]酵素的核酸を化学的または生物学的に産生してもよいし、あるいは単離遺伝子産物に関して上述するような、組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現してもよい。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を産生し、そして試験するための例示的な方法は、その全開示が本明細書に援用される、ＷｅｒｎｅｒおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９９５），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：２０９２−９６；  Ｈａｍｍａｎｎら（１９９９），  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ９：２５−３１；ならびにＣｅｃｈらに対する米国特許第４，９８７，０７１号に記載される。
【０１８２】
[000241]少なくとも１つの遺伝子産物または発現を阻害するための少なくとも１つの化合物を投与すると、癌関連染色体特徴と関連する癌を有する対象において、癌細胞の増殖が阻害されるであろう。本明細書において、「癌細胞の増殖を阻害する」は、細胞を殺すか、あるいは細胞の増殖を永続的にまたは一時的に抑止するかまたは遅延させることを意味する。癌細胞増殖の阻害は、対象におけるこうした細胞数が、遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物の投与後に一定のままであるかまたは減少する場合に推測されうる。癌細胞増殖の阻害はまた、こうした細胞の絶対数が増加するが、腫瘍増殖率が減少する場合にも推測されうる。
【０１８３】
[000242]直接測定によって、あるいは原発性または転移性腫瘍塊の大きさからの概算によって、対象の体内の癌細胞数を決定することも可能である。例えば、対象における癌細胞数を、免疫組織学法、フローサイトメトリー、または癌細胞の特徴的な表面マーカーを検出するよう設計された他の技術によって、測定してもよい。
【０１８４】
[000243]遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物を対象の癌細胞に送達するのに適した任意の手段によって、これらの化合物を対象に投与してもよい。例えば、遺伝子産物または発現阻害化合物を、これらの化合物で、またはこれらの化合物をコードする配列を含む核酸で対象細胞をトランスフェクションするのに適した方法によって、投与してもよい。１つの態様において、少なくとも１つの遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含むプラスミドまたはウイルスベクターで細胞をトランスフェクションする。
【０１８５】
[000244]真核細胞のためのトランスフェクション法が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、例えば、細胞の核または前核内への核酸の直接注射；エレクトロポレーション；リポソームトランスファーまたは親油性物質によって仲介されるトランスファー；受容体仲介性核酸送達、生体弾（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）または粒子加速；リン酸カルシウム沈殿、およびウイルスベクターによって仲介されるトランスフェクションが含まれる。
【０１８６】
[000245]例えば、細胞をリポソームトランスファー化合物、例えばＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルフェート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）またはその同等物、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮでトランスフェクションしてもよい。用いる核酸の量は、本発明の実施には重要ではなく；０．１〜１００マイクログラムの核酸／１０５細胞で、許容されうる結果が達成可能である。例えば、１０５細胞あたり、３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中、約０．５マイクログラムのプラスミドベクターの比が使用可能である。
【０１８７】
[000246]また、遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物を、適切な経腸性または非経口投与経路によって、対象に投与してもよい。本発明の方法に適した経腸投与経路には、例えば、経口、直腸、または鼻内送達が含まれる。適切な非経口投与経路には、例えば血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系内へのカテーテル滴下）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注入（例えば浸透圧ポンプによる）を含む皮下注射または沈着；カテーテルまたは他の留置デバイス（例えば網膜ペレットまたは座薬あるいは多孔、無孔、またはゼラチン性物質を含む移植物）による関心対象の組織への直接適用；および吸入が含まれる。特に適した投与経路は、患者への注射、注入および静脈内投与である。
【０１８８】
[000247]本発明の方法において、遺伝子産物または遺伝子産物発現阻害化合物を、裸のＲＮＡとして、送達試薬と組み合わせて、あるいは遺伝子産物または発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例えば組換えプラスミドまたはウイルスベクター）としてのいずれかで、対象に投与してもよい。適切な送達試薬には、例えば、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えばポリリジン）、およびリポソームが含まれる。
【０１８９】
[000248]遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を含む組換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびにこうしたプラスミドおよびベクターを癌細胞に送達するための技術を本明細書に論じる。
【０１９０】
[000249]特定の態様において、リポソームを用いて、遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物（またはこれらをコードする配列を含む核酸）を対象に送達する。リポソームはまた、遺伝子産物または核酸の血液半減期を増加させうる。本発明で使用するのに適したリポソームは、一般的に中性または負に荷電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含む、標準的小胞形成脂質から形成されうる。脂質の選択は、一般的に、所望のリポソームの大きさおよび血流におけるリポソームの半減期などの要因を考慮することによって導かれる。例えば、その全開示が本明細書に援用される、Ｓｚｏｋａら（１９８０），  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９：４６７；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、および第５，０１９，３６９号に記載されるように、リポソームを調製するための多様な方法が知られる。
【０１９１】
[000250]本発明の方法で使用するためのリポソームは、癌細胞にリポソームをターゲティングするリガンド分子を含んでもよい。癌細胞で蔓延している受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１９２】
[000251]また、本発明の方法で使用するためのリポソームを修飾して、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを回避してもよい。こうした修飾リポソームは、表面上に、またはリポソーム構造内に取り込まれた、オプソニン化阻害部分を有する。特に好ましい態様において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含んでもよい。
【０１９３】
[000252]本発明のリポソームを調製する際に使用するためのオプソニン化阻害部分は、典型的には、リポソーム膜に結合する巨大親水性ポリマーである。本明細書において、オプソニン化阻害部分は、例えば脂溶性アンカーの膜自体への挿入によって、または膜脂質の活性基に直接結合することによって、化学的または物理的に膜に付着する場合、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその全開示が本明細書に援用される米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、ＭＭＳおよびＲＥＳによってリポソームの取り込みを有意に減少させる防御性表面層を形成する。
【０１９４】
[000253]リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは、約５００〜約４０，０００ダルトン、そしてより好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの数平均分子量を持つ水溶性ポリマーである。こうしたポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分枝鎖、またはデンドリマー性ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えばカルボキシル基またはアミノ基が化学的に連結されているポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、またはメトキシＰＰＧ、あるいはその誘導体のコポリマーもまた適切である。さらに、オプソニン化阻害性ポリマーは、ＰＥＧおよびポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドいずれかのブロックコポリマーであってもよい。オプソニン化阻害性ポリマーはまた、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミン化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分枝鎖）；あるいはカルボキシル化多糖またはオリゴ糖、例えば生じたカルボキシル基の連結を伴う、炭酸誘導体と反応したものであってもよい。好ましくは、オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾したリポソームは、時に、「ＰＥＧ化リポソーム」と称される。
【０１９５】
[000254]多くの周知の技術のいずれか１つによって、オプソニン化阻害部分をリポソーム膜に結合させてもよい。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、ホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合させて、そして次いで膜に結合させてもよい。同様に、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３、ならびに溶媒混合物、例えば３０：１２比のテトラヒドロフランおよび水を用いて、６０℃で、還元性アミン化を介して、デキストランポリマーをステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化してもよい。
【０１９６】
[000255]オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、非修飾リポソームよりもはるかに長く循環中に留まる。このため、こうしたリポソームは時に、「ステルス」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、多孔または「漏出性」微小血管系によって供給される組織中に集積することが知られる。したがって、こうした微小血管系欠損によって特徴付けられる組織、例えば固形腫瘍は、これらのリポソームを効率的に集積させるであろう；  Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８８），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １８：６９４９−５３を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みが減少することで、肝臓および脾臓におけるリポソームの有意な集積が防止されることによって、ステルスリポソームの毒性が低下する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物（またはこれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
【０１９７】
[000256]当該技術分野に知られる技術にしたがって、対象に遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物を投与する前に、時に「薬剤」と呼ばれる薬学的組成物として、これらを配合してもよい。したがって、本発明は、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳを治療するための薬学的組成物を含む。１つの態様において、薬学的組成物は、少なくとも１つの単離遺伝子産物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む。特定の態様において、少なくとも１つの遺伝子産物が、適切な対照細胞に比較して、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞における発現レベルが減少した遺伝子産物に対応する。
【０１９８】
[000257]他の態様において、本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つの発現阻害化合物を含む。特定の態様において、少なくとも１つの遺伝子発現阻害化合物は、その発現が対照細胞よりＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞において高い遺伝子に特異的である。
【０１９９】
[000258]本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありそして発熱物質不含であると特徴付けられる。本明細書において、「薬学的配合物」には、ヒトおよび獣医学的使用のための配合物が含まれる。本発明の薬学的組成物を調製するための方法は、当該技術分野の技術範囲内であり、例えば、その全開示が本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  第１７版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ペンシルバニア州イーストン（１９８５）に記載される。
【０２００】
[000259]本発明の薬学的配合物は、薬学的に許容されうるキャリアーと混合された、少なくとも１つの遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物（またはこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）（例えば０．１〜９０重量％）、またはその生理学的に許容されうる塩を含む。本発明の薬学的配合物はまた、リポソームおよび薬学的に許容されうるキャリアーによって被包された、少なくとも１つの遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物（またはこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）も含みうる。
【０２０１】
[000260]特に適切な薬学的に許容されうるキャリアーは、水、緩衝水、正常生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０２０２】
[000261]特定の態様において、本発明の薬学的組成物は、ヌクレアーゼによる分解に耐性である、少なくとも１つの遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物（またはこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含む。当業者は、例えば、遺伝子産物の２’位で修飾された１以上のリボヌクレオチドを取り込むことによって、ヌクレアーゼ耐性である核酸を容易に合成可能である。適切な２’修飾リボヌクレオチドには、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ、およびＯ−アリルで、２’位で修飾されたものが含まれる。
【０２０３】
[000262]本発明の薬学的組成物はまた、慣用的な薬学的賦形剤および／または添加剤も含んでもよい。適切な薬学的賦形剤には、安定化剤、酸化防止剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、およびｐＨ調節剤が含まれる。適切な添加剤には、例えば生理学的に生物適合性である緩衝剤（例えばトロメタミン塩酸）、キレート剤（ｃｈｅｌａｎｔｓ）（例えばＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）またはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）添加、あるいは場合によってカルシウムまたはナトリウム塩（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）添加が含まれる。本発明の薬学的組成物を液体型で使用するためにパッケージングしてもよいし、または凍結乾燥してもよい。
【０２０４】
[000263]本発明の固形薬学的組成物のため、慣用的な非毒性で固形の薬学的に許容されうるキャリアー；例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を用いてもよい。
【０２０５】
[000264]例えば、経口投与のため固形薬学的組成物は、任意のキャリアーおよび上に列挙する賦形剤、ならびに１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の少なくとも１つの遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物（またはこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含んでもよい。エアロゾル（吸入性）投与のための薬学的組成物は、上述のようなリポソーム中に被包された重量０．０１〜２０％、好ましくは重量１％〜１０％の少なくとも１つの遺伝子産物または遺伝子発現阻害化合物（またはこれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）、および噴霧剤を含んでもよい。また、望ましいようにキャリアーも含んでもよく、例えば鼻内送達のためにレシチンを含んでもよい。
【０２０６】
[000265]本発明はまた、抗ＡＬＬ剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を提供し、そして細胞において少なくとも１つの遺伝子産物のレベルを測定する工程を含む、前記方法も含む。１つの態様において、該方法は、試験剤を細胞に提供し、そしてＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞における発現レベル減少と関連する少なくとも１つの遺伝子産物レベルを測定する工程を含む。適切な対照細胞に比較した細胞中の遺伝子産物レベルにおける増加は、試験剤が抗ＡＬＬ剤である指標となる。特定の態様において、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞における発現レベル減少と関連する少なくとも１つの遺伝子産物は、本明細書に記載する群およびその組み合わせより選択される。
【０２０７】
[000266]他の態様において、該方法は、細胞に試験剤を提供し、そしてＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞における発現レベル増加と関連する少なくとも１つの遺伝子産物レベルを測定する工程を含む。適切な対照細胞に比較した細胞中の遺伝子産物レベルの減少は、試験剤が抗ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ剤である指標となる。特定の態様において、ＭＭおよび／またはＭＧＵＳ細胞における発現レベル増加と関連する少なくとも１つの遺伝子産物は、本明細書に記載する群およびその組み合わせより選択される。
【０２０８】
適切な剤には、限定されるわけではないが、薬剤（例えば小分子、ペプチド）、および生物学的巨大分子（例えばタンパク質、核酸）が含まれる。組換え的、合成的に剤を産生してもよいし、あるいは天然供給源から単離（すなわち精製）してもよい。こうした剤を細胞に提供するための多様な方法（例えばトランスフェクション）が当該技術分野で周知であり、そしてこうした方法のいくつかを上記に記載する。少なくとも１つの遺伝子産物の発現を検出するための方法（例えばノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、発現プロファイリング）もまた当該技術分野に知られる。
【０２０９】
[000267]定義
[000268]用語「アレイ」は、本明細書において、用語「マイクロアレイ」と交換可能に用いられる。
【０２１０】
[000269]用語「癌」は、本明細書において、典型的には、制御されていない細胞増殖、およびこれらの細胞が他の組織に侵入する能力によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。
【０２１１】
[000270]用語「発現」は、本明細書において、ＤＮＡ配列情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはタンパク質への変換を指す。全長ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ断片、全長タンパク質、またはタンパク質断片のレベルを測定することによって、発現を監視してもよい。
【０２１２】
[000271]句「遺伝子発現シグネチャー」は、本明細書において、細胞、そして特に癌細胞における遺伝子発現のユニークなパターンを指す。
【０２１３】
[000272]用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書において、２つの一本鎖核酸間の結合、アニーリング、または塩基対形成のプロセスを指す。「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、温度およびイオン強度の状態によって決定される。核酸ハイブリッド安定性は、融点またはＴｍとして表され、これは、定義される条件下でハイブリッドが５０％変性する温度である。所定のハイブリッドのＴｍを概算するための等式が得られており；等式は核酸のＧ＋Ｃ含量、ハイブリダイゼーションプローブの長さ等を考慮する（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。ターゲットとプローブのアニーリング率を最大限にするため、ハイブリダイゼーションは、一般的に、高イオン強度（６ｘＳＳＣまたは６ｘＳＳＰＥ）の溶液中、Ｔｍより約２０２５℃低い温度で行われる。ハイブリダイズさせようとする配列が同一でない場合、ハイブリダイゼーション温度は、ミスマッチ１％ごとに１〜１．５℃減少する。一般的に、洗浄条件は、出来る限りストリンジェントでなければならない（すなわち計算されるＴｍより約１２〜２０℃低い温度での低イオン強度）。例として、非常にストリンジェントな条件は、典型的には、６ｘＳＳＣ／５ｘデンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃でのハイブリダイズ、および０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄を伴う。最適なハイブリダイゼーション条件は、一般的に、溶液中で行われるハイブリダイゼーションおよび固定された核酸を用いたハイブリダイゼーション間では異なる。当業者は、ハイブリダイゼーションを最適化するために、どのパラメーターを操作すべきかを認識するであろう。
【０２１４】
[000273]用語「核酸」は、本明細書において、連結ヌクレオチドの配列を指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであってもよく、標準的または非標準的ヌクレオチドであってもよく；修飾または誘導体化ヌクレオチドであってもよく；合成類似体であってもよい。ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合または加水分解不能結合によって連結されていてもよい。核酸は、いくつかのヌクレオチドを含んでもよく（すなわちオリゴヌクレオチド）、または多くのヌクレオチドを含んでもよい（すなわちポリヌクレオチド）。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよい。
【０２１５】
[000274]用語「予後」は、本明細書において、癌のありうる経過および転帰、そして特に、回復の可能性を指す。
【０２１６】
[000275]本発明は、多様なそして好ましい態様に言及して記載されてきているが、本発明の本質的な範囲を逸脱することなく、多様な変化を行ってもよく、そしてその要素を同等物で置換してもよいことが、当業者には理解されなければならない。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の解説に対して、特定の状況または物質を適応させるよう、多くの修飾を行ってもよい。
【０２１７】
[000276]したがって、本発明は、本発明を実施するために意図される、本明細書に開示する特定の態様に限定されず、本発明には、請求項の範囲内に属するすべての態様が含まれると意図される。
【０２１８】
[000277]参考文献
[000278]本発明を明らかにするかまたは本発明の実施に関するさらなる詳細を提供する、本明細書で用いる刊行物および他の資料は、本明細書に援用され、そして便宜上、以下の文献目録中に提供される。
【０２１９】
[000279]本明細書に列挙するいかなる文書の引用も、前述のいずれもが適切な先行技術であることの承認であるとは意図されない。日付に関するすべての言及、またはこれらの文書の内容に関する表明は、出願者が入手可能な情報に基づき、そしてこれらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
【０２２０】
【化１−１】
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【０２２１】
【化１−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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