(57)【要約】  細胞からの微粒子の放出を阻害する新規ペプチドが開示される。ペプチドはＮ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶモチーフを含みかつ１０〜１００アミノ酸長を有する。ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを担持する発現ベクター、および新規ペプチドを用いてエイズおよび腫瘍を治療するための方法も開示される。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において微粒子の放出を阻害することを目的としたペプチドであって、前記ペプチドが１０〜１００アミノ酸長を有し、かつ、（１）Ｎ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフ、または（２）Ｃ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフ、または（３）少なくとも２つの配列番号１モチーフを含む前記ペプチド。
【請求項２】
少なくとも２つの配列番号１モチーフを含む、請求項１に記載の前記ペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含む、請求項１に記載の前記ペプチド。
【請求項４】
Ｃ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含む、請求項１に記載の前記ペプチド。
【請求項５】
ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の前記ペプチド。
【請求項６】
ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３）の配列よりなる、請求項１に記載の前記ペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載の前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドであって、前記ペプチドが少なくとも２つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号２をさらに含むことを特徴とする前記ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号３をさらに含むことを特徴とする前記ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
制御配列と機能的に結合した請求項７に記載の前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
医薬組成物であって：
（１）配列番号１含有ペプチドまたはそのようなペプチドをコードする発現ベクター、および
（２）医薬品として許容できる担体を含み；
前記配列番号１含有ペプチドが（ａ）Ｎ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフ、または（ｂ）Ｃ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフ、または（ｃ）少なくとも２つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、前記ＶＥＦＰＶ（配列番号１）含有ペプチドが少なくとも２つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、前記配列番号１含有ペプチドがＮ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、前記配列番号１含有ペプチドがＣ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、前記配列番号１含有ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、前記配列番号１含有ペプチドが配列番号３の配列をさらに含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１８】
エイズを治療するための方法であって：
そのような治療を必要とする対象に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含みかつ１０〜１００アミノ酸長を有するペプチドの有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記ペプチドが少なくとも２つのＶＧＦＰＶ配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記ペプチドがＮ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、前記ペプチドがＣ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法であって、前記ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記ペプチド。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法であって、前記ペプチドが配列番号３の配列をさらに含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２４】
腫瘍を治療するための方法であって：
そのような治療を必要とする対象に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含みかつ１０〜１００アミノ酸長を有するペプチドの有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記ペプチドが少なくとも２つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、前記ペプチドがＮ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法であって、前記ペプチドがＣ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２８】
請求項１８に記載の方法であって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号２を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２９】
請求項２４に記載の方法であって、前記ペプチドが配列番号３の配列をさらに含むことを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、２００９年６月１２日に出願された米国仮出願番号第６１／２１３，４７１号および２０１０年５月２０日に出願された米国出願番号第１２／７８３，８２９からの優先権を主張する。前述の明細書の全文は本明細書に参照文献として援用される。
【０００２】
本発明は、全般的に医学的治療、特に微粒子の分泌を阻害することによりエイズまたは腫瘍を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
膜小胞は、一般的に直径が２００ｎｍ未満である球状の膜微粒子である。微粒子はサイトソル分画を含有する脂質二重膜より構成される。より具体的には、個々の膜小胞は細胞によって細胞内コンパートメントから細胞の細胞質膜との融合を経て生成され、これによりそれらは生体の細胞外生体液または培養細胞の上清に放出される。これらの小胞／微粒子は数多くの様式で放出されうる。古典的な分泌系路は、主として小胞体（ＥＲ）膜を介して受容体を担持する従来の膜シグナルを処理する（Ｌｅｅ他、（２００４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０，８７−１２３）。
【０００４】
分泌タンパク質は輸送小胞内に封入され、ゴルジ装置に送達され、最終的には細胞外空隙に放出される。
【０００５】
一方で、非古典的分泌系路が存在しかつサイトソル非シグナル担持分子の細胞外空隙への移動を媒介する（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ他（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６，８０１−８１３；およびＭｉｓｕｍｉ他（１９８６）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１１３９８−１１４０３）。これら２つは、分泌型リソソーム（Ｍｕｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１５，８６−８８）およびエキソソーム（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，９４１２−９４２０）などのエンドサイトーシス膜系の細胞内小胞を包含し、後者は後期エンドソームまたは多胞体（ＭＶＢ）の内部小胞である。細胞毒性Ｔリンパ球の分泌型リソソームなどの特殊化されたエンドサイトーシス構造が形質膜と融合するとき、リソソームの内容物は細胞の外部とのアクセスを得る。ＭＶＢが形質膜と融合するとき、後期エンドサイトーシス構造の管腔内容物は細胞外空隙に放出され、これにより内部多胞体エンドソームがその担持分子と共に細胞外空隙へと放出される（エキソソームと呼ばれる）。他の非古典的経路は、チャネルを伝導するタンパク質または膜小疱形成と呼ばれるプロセスを用いた、サイトソル因子の形質膜を横切る直接的移動を包含する（Ｎｉｃｋｅｌ，Ｗ．（２００５）Ｔｒａｆｆｉｃ．６，６０７−６１４）。膜小疱形成は、形質膜由来の微小胞の細胞外空隙への漏出を特徴とする。
【０００６】
多様な生理学的状況において異なる細胞種から微粒子が放出されることが証明されている。腫瘍細胞は、腫瘍抗原を担持し、かつこれらの抗原を提示するかまたはそれらを抗原提示細胞に転送することのできるエキソソーム、テキソソーム、Ｔｅｘまたは腫瘍テキソソームなどの微粒子を、制御された様式で分泌することが証明されている（Ｙｕ他（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８，６８６７−６８７５）（国際公開特許第ＷＯ９９／０３４９９号）。これらの微粒子は腫瘍細胞によって放出されかつ免疫細胞の殺傷または調節不全によって免疫抑制を引き起こし、腫瘍の増殖を可能とする。これらのＦａｓＬまたはＴＮＦ含有エキソソームの放出は、それにより腫瘍が免疫優越／免疫抑制状態を促進する１つの機構であることが確認されている。一方で、ＨＩＶ感染細胞がＮｅｆ含有小胞を放出することが示されている（Ｇｕｙ他（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６，４１３−４２５；およびＣａｍｐｂｅｌｌ他（２００８）Ｅｔｈｎ．Ｄｉｓ．１８，Ｓ２−Ｓ９）。我々は、これらの粒子がＨＩＶによって同様に用いられて免疫系を調節不全とし、ＨＩＶの生存を可能にしていると推定する。最後に、エンドソームトラフィック経路も感染細胞からのウイルス粒子放出に関与していることが示唆されている（Ｓａｎｆｒｉｄｓｏｎ他（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９４，８７３−８７８；およびＥｓｓｅｒ他（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５，６１７３−６１８２）。したがって、ＨＩＶ感染時に、いくつかの小胞放出経路に関与しているエンドソーム経路が、免疫系の調節および感染細胞のウイルス粒子放出において二重の役割を果たす。微粒子／小胞放出を減衰または阻害するために用いることが可能な有効な方法を有することは特に重要であろう。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の１つの態様は、細胞からの微粒子の放出を阻害する新規ペプチドに関する。ペプチドは１０〜１００アミノ酸長を有し、かつ（１）Ｎ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフ、または（２）Ｃ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフ、または（３）少なくとも２つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフを含む。
【０００８】
１つの実施形態においては、ペプチドはＮ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフを含む。他の実施形態においては、ペプチドはＣ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフを含む。他の実施形態においては、ペプチドは少なくとも２つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフを含む。他の実施形態においては、ペプチドはアミノ酸配列ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶ（配列番号２）を含む。さらに他の実施形態においては、ペプチドはアミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＯＨ（配列番号３）を含む。
【０００９】
本発明の他の態様は、本発明の新規ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび本発明の新規ペプチドをコードするポリヌクレオチドを担持する発現ベクターに関する。
【００１０】
本発明の他の態様は、エイズまたは腫瘍を治療することを目的とした医薬組成物に関する。医薬組成物は（１）１０〜１００アミノ酸長を有しかつ（ａ）Ｎ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフ、または（ｂ）Ｃ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフ、または（ｃ）少なくとも２つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフを有するペプチドまたはそのようなペプチドをコードする発現ベクター、および（２）医薬品として許容できる担体を含む。
【００１１】
本発明の他の態様はエイズを治療することを目的とした方法に関する。方法は、少なくとも１つの配列番号１モチーフを含みかつ１０〜１００アミノ酸長を有するペプチドの有効量を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【００１２】
本発明の他の態様は腫瘍を治療することを目的とした方法に関する。方法は、少なくとも１つの配列番号１モチーフを含みかつ１０〜１００アミノ酸長を有するペプチドの有効量を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】合成ＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｗｔペプチド（拮抗物質）およびＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｍｔペプチド（ネガティブコントロール）（パネルＡ）；ＧＦＰと融合したＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｗｔペプチドまたはＧＦＰと融合したＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｍｔペプチドを発現するベクター構造物（パネルＢ）；およびＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｗｔ（パネルＣ）またはＳＭＲｍｔペプチド（パネルＤ）をトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるエキソソームのマーカーであるアセチルコリンエステラーゼの量を示す複合図である。非トランスフェクトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をネガティブコントロールとして用いた。細胞は無血清培地で４８時間培養した。上清１ｍＬを４００，０００×ｇで遠心した。上清ペレットまたは細胞ライセートの沈殿体積をＰＡＧＥ上で泳動させ、ブロットし、抗ＡｃｈＥ  ｍＡｂ（アセチルコリンエステラーゼ−１：１０００希釈、エキソソームマーカー）でプローブした。細胞ライセートを抗チューブリンｍＡｂ（１：４０００）で再プローブした。デンシトメトリーによりバンドを測定し、細胞内チューブリンに対して正規化した。本明細書では、データは非トランスフェクト対照に対する百分率として示した。
【図１−２】同上
【図２】ＨＥＫ２９３細胞においてＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｗｔペプチドがＮｅｆＧＦＰの放出に拮抗することを示す図である。
【図３Ａ】Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｗｔペプチドがＮｅｆＧＦＰの放出に拮抗することを示す図である。
【図３Ｂ】同上
【図４Ａ】Ｊｕｒｋａｔ細胞（パネルＡ）、ＨＥＫ２９３細胞（パネルＢ）、ＴＨＰ−１単球（パネルＣ）およびＵ９３７単球（パネルＤ）におけるｐ２４濃度のＥＬＩＳＡ分析を示す複合図である。
【図４Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＳＭＲｗｔペプチドによってｐ２４の放出が遮断されるが（パネルＡ）、ＳＭＲｍｔペプチドによっては遮断されないこと（パネルＢ）を示す共焦点顕微鏡写真の組合せである。
【図４Ｃ】Ｒ７およびＳＭＲｗｔペプチド（パネルＡ−１）またはＲ７およびＳＭＲｍｔペプチド（パネルＢ−１）によるトランスフェクト後６日目のＪｕｒｋａｔ細胞におけるウイルス粒子分布を示す共焦点顕微鏡および電子顕微鏡写真の組合せである。
【図４Ｄ】Ｒ７およびＳＭＲｗｔペプチド（パネルＡ−２）またはＲ７およびＳＭＲｍｔペプチド（パネルＢ−２）によるトランスフェクト後１４日目のＪｕｒｋａｔ細胞におけるウイルス粒子分布を示す共焦点および電子顕微鏡写真の組合せである。
【図４Ｅ】Ｒ７およびＳＭＲｗｔペプチド（パネルＡ−１）またはＲ７およびＳＭＲｍｔペプチド（パネルＢ−１）によるトランスフェクト後６日目のＪｕｒｋａｔ細胞、およびＲ７およびＳＭＲｗｔペプチド（パネルＡ−２）またはＲ７およびＳＭＲｍｔペプチド（パネルＢ−２）によるトランスフェクト後１４日目のＪｕｒｋａｔ細胞におけるＪｕｒｋａｔ細胞内構造におけるウイルス粒子分布を示す共焦点および電子顕微鏡写真の組合せである。
【図５】Ｒ７／ＳＭＲｗｔ（パネルＡ）またはＲ７／ＳＭＲｍｔ（パネルＢ）をトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＮｅｆおよびｐ２４のウエスタンブロット分析を示す写真の組合せである。
【図６】Ｒ７／ＳＭＲｗｔ（パネルＡ）またはＲ７／ＳＭＲｍｔ（パネルＢ）をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＮｅｆおよびｐ２４のウエスタンブロット分析を示す写真の組合せである。
【図７】Ｒ７／ＳＭＲｗｔ（パネルＡ）またはＲ７／ＳＭＲｍｔ（パネルＢ）をトランスフェクトされたＴＨＰ−１単球におけるＮｅｆおよびｐ２４のウエスタンブロット分析を示す写真の組合せである。
【図８】Ｒ７／ＳＭＲｗｔ（パネルＡ）またはＲ７／ＳＭＲｍｔ（パネルＢ）をトランスフェクトされたＵ９３７単球におけるＮｅｆおよびｐ２４のウエスタンブロット分析を示す写真の組合せである。
【図９】Ｊｕｒｋａｔ細胞（パネルＡ）、ＨＥＫ２９３細胞（パネルＢ）、ＴＨＰ−１単球（パネルＣ）およびＵ９３７単球（パネルＤ）におけるＮｅｆおよびｐ２４のウェスタンブロット分析を示す複合図である。
【図１０】Ｒ７ウイルスＤＮＡ／ＳＭＲｗｔペプチド（パネルＡ）またはＲ７ウイルスＤＮＡ／ＳＭＲｍｔペプチド（パネルＢ）のいずれかをトランスフェクトしたＭａｇｉ／ＣＸＣＲ４細胞の写真の組合せである。
【図１１】Ｊｕｒｋａｔ細胞（パネルＡ）、ＨＥＫ２９３細胞（パネルＢ）、ＴＨＰ−１単球（パネルＣ）およびＵ９３７単球（パネルＤ）におけるＭａｇｉ分析ウイルス感染性を示す複合図である。
【図１２】ＳＭＲｗｔまたはＳＭＲｍｔペプチドをトランスフェクトされた細胞の細胞毒性分析の結果を示す写真の組合せである。パネルＡ−１およびパネルＢ−１：ＳＭＲｗｔおよびＳＭＲｍｔペプチドをそれぞれトランスフェクトされた細胞のヨウ化プロピジウム染色。パネルＡ−２およびパネルＢ−２：ＳＭＲｗｔおよびＳＭＲｍｔペプチドをそれぞれトランスフェクトされた細胞の二酢酸フルオレセイン染色。パネルＡ−３およびパネルＢ−３：ＳＭＲｗｔおよびＳＭＲｍｔペプチドをそれぞれトランスフェクトされた細胞の位相差顕微鏡像。
【図１３】ＳＭＲｗｔまたはＳＭＲｍｔペプチドによる免疫沈降（パネルＡ）およびウエスタンブロットによる７５ｋＤのＳＭＲ特異性タンパク質の特定を示す写真の組合せである。
【図１４】Ｍｏｒｔａｌｉｎ抗体のＮｅｆ分泌阻害を示す図である。
【図１５】Ｎｅｆ分泌に対するＳＭＲペプチドまたは未知化合物の効果をモニタリングするためのコトランスフェクト分析を示す図である。
【図１６】腫瘍小胞分泌に対するＳＭＲペプチドまたは未知化合物の効果をモニタリングするためのコトランスフェクト分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は多くの異なる形態で具現してもよいが、その一方で本明細書には本発明の具体的な好ましい実施形態が詳細に記載される。この記載は本発明の原則の例示であり、かつ例示された具体的な実施形態に本発明を限定することを意図していない。
【００１５】
細胞トラフィック経路はＨＩＶのライフサイクルおよび腫瘍発生に関与していることが知られている（Ｇｒｏｓｓｍａｎ他（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，３１９−３２３）。たとえば、ある種の腫瘍細胞より放出されるエキソソームは宿主の免疫系を調節不全とし、これにより腫瘍の成長および増殖を可能とする。現在、微粒子トラフィック経路を標的としかつ細胞からの微粒子放出を操作／阻害する実践的な技術はない。本発明は細胞因子と相互作用するＨＩＶ−Ｎｅｆシークエンスを利用し、かつトラフィック経路を操作して細胞の微粒子を生成する能力を遮断する。
【００１６】
（ペプチド）
本発明の１つの態様は、細胞からの微粒子の放出を阻害する新規ペプチドに関する。ペプチドは１０〜１００アミノ酸長を有し、（１）Ｎ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフ、または（２）Ｃ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフ、または（３）少なくとも２つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフを含む。以下で用いるところの用語「微粒子」は細胞トラフィック経路に関与する微小担体を指す。微粒子は、典型的にはサイトソル分画を含有する脂質二重膜より構成され、かつ一般的に直径が２００ｎｍ未満である。微粒子の例はエキソソーム、テキソソームおよびＴｅｘまたは腫瘍エキソソームを含むが、これに限定されない。
【００１７】
１つの実施形態においては、ペプチドは配列番号１のモチーフを少なくとも２つ含む。他の実施形態においては、ペプチドはアミノ酸配列ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶ（配列番号２）を含む。さらに他の実施形態においては、ペプチドはアミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＯＨ（配列番号３）を含む。
【００１８】
本発明のペプチドは化学的に合成されても、または組換えＤＮＡ技術（例：宿主細胞より発現および精製される）によって生成されてもよい。ペプチドを合成するかまたは組換えＤＮＡ技術によりペプチドを生成するための方法は、当業者に周知である。
【００１９】
（発現ベクター）
本発明の他の態様は、本発明の新規ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび本発明の新規ペプチドをコードするポリヌクレオチドを担持する発現ベクターに関する。
【００２０】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現に適した形態で本発明の新規ペプチドをコードするポリペプチドを含む非ウイルスまたはウイルスベクターを指す。非ウイルスベクターの１種は、その中に追加的ＤＮＡセグメントを結合することのできる環状二重らせんＤＮＡループを含む「プラスミド」である。プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いることができる。
【００２１】
発現ベクターは、発現に用いる宿主細胞に基づいて選択され、かつ発現させるポリヌクレオチド配列と機能的に結合する１つまたはそれ以上の制御配列を含む。発現ベクターのデザインは、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存することがあることは、当業者に理解されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、これにより本発明の新規ペプチドなどのタンパク質またはペプチドを生成することができる。
【００２２】
本明細書で用いるところの用語「調節配列」または「制御配列」は、特定の宿主生命体において機能的に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。用語「調節／制御配列」はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例：ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。調節／制御配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構造的発現を誘導するもの、および一定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例：組織特異的制御配列）を含む。
【００２３】
ある核酸配列が他の核酸配列との機能的関係に置かれる場合、前者が後者に「機能的に結合」される。たとえば、プレ配列または分泌リーダーペプチドのためのＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、それはポリペプチドのためのＤＮＡと機能的に結合され；プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響する場合、それはコード配列と機能的に結合され；あるいはリボソーム結合部位が翻訳を促進するよう配置される場合、それはコード配列と機能的に結合される。一般に、「機能的に結合された」は結合されたＤＮＡ配列が近接し、かつ分泌リーダーの場合、隣接しかつリーディングフェーズ内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接する必要がない。結合は好適な制限部位に結合することにより達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の実践にしたがって合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。
【００２４】
１つの実施形態においては、哺乳類発現ベクターは特定の細胞型において優先的にポリヌクレオチドの発現を誘導することができる（例：ポリヌクレオチドを発現させるには組織特異性調節エレメントが用いられる）。組織特異性調節エレメントは技術上既知であり、かつ上皮細胞特異性プロモーターを含むこともある。その他の適切な組織特異性プロモーターの非制限的な例は肝特異性プロモーター（例：アルブミンプロモーター）、リンパ特異性プロモーター、Ｔ細胞受容体および免疫グロブリンのプロモーター、ニューロン特異性プロモーター（例：ニューロフィラメントプロモーター）、膵特異性プロモーター（例：インスリンプロモーター）、および乳腺特異性プロモーター（例：乳ホエイプロモーター）を含む。発生制御プロモーター（例：α−フェトプロテインプロモーター）も包含される。
【００２５】
他の実施形態においては、発現ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの例はレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターを含むが、これに限定されない。ウイルスベクターはアストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、トガウイルスベクターを含むこともできる。  
【００２６】
本発明の発現ベクターは、制御発現系を用いて本発明のペプチドを発現してもよい。治療遺伝子の発現を制御する系が開発され、かつ現行のウイルスおよび非ウイルス遺伝子送達ベクターに組み入れられている。これらの系を以下に簡単に記述する：
【００２７】
Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系。Ｔｅｔ系は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｎ１０トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの調節エレメント：Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔＲが結合するＴｅｔオペレーターＤＮＡ配列（ｔｅｔＯ）に基づく。系は２つの構成成分「レギュレーター」および「レポーター」プラスミドからなる。「レギュレーター」プラスミドは、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６活性化ドメインに融合された変異型Ｔｅｔリプレッサー（ｒｔｅｔＲ）を含むハイブリッドタンパク質をコードする。「レポーター」プラスミドは、選択する「レポーター」遺伝子を制御するｔｅｔ応答性エレメント（ＴＲＥ）を含む。ｒｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質はＴＲＥとのみ結合することができるので、テトラサイクリンの存在下で「レポーター」遺伝子の転写を活性化させる。系は、レトロウイルス、アデノウイルスおよびＡＡＶを含む数多くのウイルスベクターに組み込まれている。
【００２８】
エクジソン系。エクジソン系はショウジョウバエに認められる脱皮誘導系を元にしているが、哺乳類細胞において発現の誘導を可能とするために変更されている。系はショウジョウバエステロイドホルモンエクジソンのアナログであるムリステロンＡを用い、ヘテロ二量体核受容体を介して目的の遺伝子の発現を活性化する。発現レベルは基底レベルの２００倍を上回り、哺乳類細胞の生理学に影響を示さないと報告されている。
【００２９】
プロゲステロン系。プロゲステロン受容体は、通常は刺激されて特異的ＤＮＡ配列と結合し、さらにそのホルモンリガンドとの相互作用を介して転写を活性化する。逆に言えば、プロゲステロン拮抗物質ミフェプリストン（ＲＵ４８６）はホルモン誘導性核輸送およびそれに続くＤＮＡ結合を遮断することができる。刺激を受けて、ＲＵ４８６との相互作用を介して結合することができるプロゲステロン受容体の変異型が生成されている。特異的で調節可能な転写因子を生成するために、プロゲステロン受容体のＲＵ４８６結合ドメインを酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインおよびＨＳＶタンパク質ＶＰ１６の転写促進ドメインと融合させる。キメラ因子はＲＵ４８６が存在しなければ不活性である。しかし、ホルモンの添加によりキメラたんぱく質の立体配置の変化が誘導され、かつこの変化によってＧＡＬ４結合部位への結合およびＧＡＬ４結合部位を含有するプロモーターからの転写の活性化が可能となる。
【００３０】
ラパマイシン系。ＦＫ５０６およびラパマイシンなどの免疫抑制剤は、特異的細胞タンパク質と結合しかつその二量体化を促進することにより活性化する。たとえば、ラパマイシンがＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）と結合すると、他のラパマイシン結合タンパク質ＦＲＡＰとヘテロ二量体化するが、薬剤を除去することによってこれを逆行させることができる。薬剤を添加することによって２つのタンパク質を結合させる能力により、転写を含む数多くの生物学的プロセスの調節が強化される。キメラＤＮＡ結合ドメインはＦＫＢＰと融合されており、これにより融合タンパク質の特異的ＤＮＡ結合配列への結合が可能となる。転写活性化ドメインもＦＲＡＰに融合されている。これら２つの融合タンパク質が同一の細胞において共発現しているとき、ラパマイシンの添加を介したヘテロ二量化によって、完全に機能的な転写因子を形成することができる。その後、二量体化したキメラ転写因子を、合成ＤＮＡ結合配列のコピーを含む合成プロモーター配列と結合することができる。この系はアデノウイルスおよびＡＡＶベクターに良好に組み込むことができる。マウスおよびヒヒのいずれにおいても長期的制御が可能な遺伝子発現が達成されている。
【００３１】
本発明の発現ベクターの細胞内への送達は、感染（ウイルスベクターについて）、転写（非ウイルスベクターについて）および当業者に周知の他の方法により達成することができる。他の送達方法および媒体の例は、死菌ウイルス結合あるいは非結合ポリカチオン濃縮ＤＮＡ、リガンド結合ＤＮＡ、リポソーム、真核細胞送達媒体細胞、光重合ハイドロゲル材料の沈着、ハンディ遺伝子導入パーティクルガン、電離放射線、核荷電中和または細胞膜との融合を含む。粒子を介した遺伝子導入を用いてもよい。簡単に述べると、従来の調節配列を含む従来型ベクターにＤＮＡ配列を挿入して高レベル発現とし、さらにその後ポリリジン、プロタミンおよびアルブミンなどのポリマーＤＮＡ結合カチオンなどの合成遺伝子導入分子と共にインキュベートし、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリンなどの細胞標的リガンドと結合させることができる。裸ＤＮＡも用いてよい。裸ＤＮＡの取り込み効率は生体分解性ラテックスビーズを用いて改善してもよい。疎水性を高め、かつこれによりエンドソームの崩壊および細胞質へのＤＮＡの放出を促進するビーズの処理によって方法をさらに改善してもよい。
【００３２】
ある実施形態においては、本発明の新規ペプチドは分泌を阻害する１つまたはそれ以上の他の薬剤と共に標的細胞に導入される。このような薬剤の例はＨ＋／Ｎａ＋およびＮａ＋／Ｃａ２＋チャネル阻害物質ジメチルアミロリド、およびＫ＋／Ｈ＋ＡＴＰアーゼ阻害物質オペラゾールを含むが、これに限定されない。
【００３３】
（医薬組成物）
本発明の他の態様は、エイズまたは腫瘍を治療することを目的とした医薬組成物に関する。医薬組成物は（１）Ｎ末端に少なくとも１つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフを含みかつ１０〜１００アミノ酸長を有するペプチドまたはそのようなペプチドをコードする発現ベクター、および（２）医薬品として許容できる担体を含む。
【００３４】
ある実施形態においては、医薬組成物は分泌を阻害する１つまたはそれ以上の他の薬剤をさらに含む。１つの実施形態においては、１つまたはそれ以上の他の薬剤はジメチルアミロリドまたはオメプラゾールまたはその両者を含む。
【００３５】
本明細書で用いるところの用語「医薬品として許容できる担体」は、医薬品としての投与に適合したあらゆるおよび全ての溶媒、溶解補助剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝化剤、滑沢剤、放出制御媒体、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、分散媒体、コーティング、抗菌または抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含むことを意図している。医薬品として活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は技術上周知である。何らかの従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない場合を除き、組成物におけるその使用は意図される。追加的な薬剤も組成物に組み入れることができる。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するよう製剤化される。投与経路の例は静脈内、皮内、皮下、口腔内（例：吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸内などの非経口投与を含む。非経口、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は以下の成分を含むことができる：注射用蒸留水、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝化剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調節剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調節することができる。非経口製剤はガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、またはマルチドーズバイアルに封入することができる。
【００３７】
注射用途に適した医薬組成物は無菌水性溶液または分散液および無菌注射溶液または分散液の即時調整に適した無菌粉末を含む。静脈内投与については、適切な担体は生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パッシパニー）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。いずれの場合も、注射用組成物は無菌でありかつ注射器で容易に扱えるほどの流動性がなければならない。製造および保存条件下で安定であり、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用から守られなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物などを含有する溶媒または分散媒体とすることができる。適切な流動性は、たとえばレクチンなどのコーティングの使用、分散の場合においては報いられた粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの多様な抗菌および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、たとえばマンニトール、ソルビトールなどの糖類、ポリアルコール類および塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが望ましいであろう。注射用組成物の長時間吸収は、組成物にモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることにより引き起こすことができる。
【００３８】
無菌注射溶液は、必要に応じ、必要とされる量の活性化合物（例：ＳＲＰＰフラグメントまたは抗ＳＲＰＰ抗体）を、上に列挙される成分の１つまたは複数の組合せを有する適切な溶媒に混合し、その後濾過滅菌することによって調整することができる。分散液は、一般的に、基剤分散媒体および上に列挙するもののうち必要とされる他の成分を含む無菌媒体に活性化合物を混合することによって調製される。無菌注射溶液の調製を目的とした無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ濾過滅菌した活性成分およびその他の所望の成分の溶液からそれらの粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥である。
【００３９】
経口組成物は、一般的に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するかまたは圧縮して錠剤とすることができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と混合し、かつ錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いることができる。経口組成物は、流動担体中の組成物を口腔内に適用し、さらに素早く動かした後吐き出すかまたは嚥下することを特徴とする洗口剤として用いるために、流動担体を用いて調製することもできる。医薬品として適した結合剤および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは以下の成分のいずれか、または類似した性質の化合物を含有することができる：微結晶性セルロース、トラガントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの香料。
【００４０】
吸入による投与のために、化合物は二酸化炭素などのガスなどの適切な噴霧剤を含む圧縮容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーの形態で送達される。
【００４１】
全身投与も経粘膜的または経皮的手段によるものとすることができる。経粘膜または経皮投与のためには、透過すべきバリアに適した浸透剤を製剤において用いる。このような浸透剤は一般的に技術上既知であり、かつたとえば経粘膜投与を目的として界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は点鼻薬または坐薬の使用によって達成することができる。経皮投与を目的として、一般的に技術上既知であるように生物活性化合物を軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化する。
【００４２】
化合物は、直腸送達を目的とした坐剤（例：カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用）または保持浣腸の形態に調製することもできる。
【００４３】
１つの実施形態においては、生体活性化合物を含みうる治療部分は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤など、体内からの迅速な消失に対して化合物を保護するであろう担体と共に調整される。酢酸エチレンビニル共重合体、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酪酸などの生体分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤の調製方法は当業者にとって明らかであろう。材料はＡｌｚａ社およびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社より購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞を標的としたリポソームを含む）も医薬品として許容できる担体として用いることができる。これらは当業者にとって既知の方法に従って調整することができる。
【００４４】
経口または非経口組成物を、投与しやすさおよび用量の一定化を目的としてユニット用量形態に製剤化することは特に有益である。本明細書で用いるところのユニット用量形態は、治療する対象に対してユニット用量として適合化した物理的に別個の単位を含み；各ユニットは、必要とされる医薬品担体と共に所望の治療効果を生成するために算出された規定量の活性化合物を含む。本発明のユニット用量形態についての規格は、活性化合物の独自の特性および達成すべき特定の治療効果、および個体の治療を目的とするような活性化合物を配合する技術に固有の限界によって決定されかつこれに直接依存する。
【００４５】
そのような化合物の毒性および治療効果は、たとえばＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％に対して治療的に有効な用量）を判定することなどを目的とした、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療係数であり、かつＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよい一方で、非罹患細胞に対する潜在的な障害を最小化するためにこのような化合物の標的を罹患組織部位とし、これにより副作用を軽減する送達系を設計するために注意を払うべきである。
【００４６】
細胞培養分析および動物試験から得られるデータは、ヒトに対して用いるための幅広い用量範囲の製剤化において用いることができる。このような化合物の用量は、好ましくは毒性をほとんど伴わずにＥＤ５０を含む血流濃度の範囲内にある。用量は、用いる剤型および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してもよい。本発明の方法において用いられるあらゆる化合物に対して、始めに細胞培養分析より治療的に有効な用量を推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養において決定したＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の１／２を達成する濃度の被験化合物）を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を製剤化してもよい。このような情報は、ヒトに対して有効な用量をより正確に判定するために用いることができる。血漿レベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィなどで測定することができる。
【００４７】
医薬組成物は、投与の指示書と共に容器、包装またはディスペンサーに収容することができる。
【００４８】
本発明の他の態様は、本発明のペプチドの発現または活性を調節するための医薬組成物を調製するための方法を含む。そのような方法は、医薬品として許容できる担体を、本発明のペプチドの発現または活性を調節する薬剤と共に製剤化することを含む。そのような組成物は他の活性薬剤をさらに含むことができる。したがって本発明は、医薬品として許容できる担体を、本発明のペプチドの発現または活性を調節する薬剤および１つまたはそれ以上の追加的生物活性薬剤と共に配合することにより、医薬組成物を調製するための方法もさらに含む。
【００４９】
（エイズおよび腫瘍を治療するための方法）
本発明の他の態様はエイズを治療することを目的とした方法に関する。方法は、ＶＧＦＰＶモチーフを少なくとも１つ含みかつ１０〜１００アミノ酸長を有するペプチドの有効量を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【００５０】
１つの実施形態においては、ペプチドは少なくとも２つのＶＧＦＰＶ（配列番号１）モチーフを含む。他の実施形態においては、ペプチドはアミノ酸配列ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶ（配列番号２）を含む。さらに他の実施形態においては、ペプチドはアミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＯＨ（配列番号３）を含む。
【００５１】
本発明の他の態様は腫瘍を治療することを目的とした方法に関する。方法は、Ｎ末端に少なくとも１つの配列番号１モチーフを含みかつ１０〜１００アミノ酸長を有するペプチドの有効量を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【００５２】
１つの実施形態においては、ペプチドは配列番号１モチーフを少なくとも２つ含む。他の実施形態においては、ペプチドはアミノ酸配列番号２を含む。さらに他の実施形態においては、ペプチドはアミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＯＨ（配列番号３）を含む。
【００５３】
本発明は、限定的なものと解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。全ての参照文献、特許および公開特許明細書の内容は本明細書全体にわたって引用され、さらに図および表は本明細書に参照文献として援用される。
【実施例１】
【００５４】
（腫瘍細胞における小胞分泌の阻害）
（１−１．細胞および培養）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、それぞれヒト乳腺癌およびヒト乳癌細胞に由来し、米国培養細胞系統保存機関（バージニア州マナッサス）から入手した。細胞は、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）およびＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（３０μＭ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州パロアルト）で維持した。
【００５５】
（１−２．抗体）
以下の抗体を使用した：（ｉ）マウスモノクローナル（ＭＥＭ−２８）抗ＣＤ４５抗体（Ａｂｃａｍ．Ｉｎｃ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）；（ｉｉ）マウスモノクローナル抗ＨＩＶ−１  Ｎｅｆ抗体（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ．Ｉｎｃ、マサチューセッツ州）；（ｉｉｉ）モノクローナル抗アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）抗体、クローンＡＥ−１（ＣＨＥＭＩＣＯＮ、カリフォルニア州）；（ｉｖ）モノクローナル抗チューブリン抗体、クローンＢ−５−１−２（ＳＩＧＭＡ、ミズーリ州）および（ｖ）セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ鎖＋Ｌ鎖（Ｈ＋Ｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）。
【００５６】
（１−３．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのエキソソームの分離および精製）
Ｃｈａｒｉｏｔ（商標）法（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ．Ｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（３×１０５）に、ＳＭＲｗｔ（Ｈ２Ｎ−ＶＧＦＰＶＡＡＶＧＦＰＶＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＯＨ）（配列番号３）、ＳＭＲｍｔ（Ｈ２Ｎ−ＡＧＦＰＶＡＡＡＧＦＰＶＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＯＨ）（配列番号４）、ｐＱＢＩ−ＳＭＲｗｔ−ＧＦＰ（図１パネルＢ）またはｐＱＢＩ−ＳＭＲｍｔ−ＧＦＰ（図Ｆｉｇｕｒｅ１、パネルＢ）をトランスフェクトした。２つのペプチドは商業的に製造された（図１、パネルＡ）。ＳＭＲ配列はペプチドのＮ末端で２回反復され、反復は短いジアラニンによって分けられる。ＳＭＲ配列に続いてペプチドの検索を可能とするＣ末端ＦＬＡＧ配列がある。しかし、Ｃ末端にはあらゆる配列の挿入が可能である。ｐＱＢＩ−ＳＭＲｗｔ−ＧＦＰ（配列番号５）およびｐＱＢＩ−ＳＭＲｍｔ−ＧＦＰ（配列番号６）構造は、ＳＭＲｗｔ配列またはＳＭＲｍｔ配列の単一コピーをそれぞれｐＱＢＩベクター（Ｑｂｉｏｇｅｎ社）のＴ７プロモーターとＧＦＰコード配列の間に挿入することによって生成された。
【００５７】
簡単に言うと、Ｃｈａｒｉｏｔ溶液１０μＬを含有する無血清培地２００μＬにペプチド１μｇを加えてよく混合し、室温で３０分間インキュベートした。細胞培養プレートを洗った。Ｃｈａｒｉｏｔ（商標）／ＤＮＡ／ペプチド複合体、続いて無血清培地１６００μＬををプレートに加えた。５％ＣＯ２中で細胞を３７℃で１時間培養した。完全増殖培地１ｍＬをプレートに添加し、さらに５％ＣＯ２中でプレートを３７℃で４８時間培養した。２０００×ｇで５分間遠心分離して細胞を培養上清より取り除いた。次に、上清を１０，０００ｇで３０分間遠心して細胞デブリを除去した。１０，０００ｇ上清１ｍＬを遠心管に移し、５０，０００×ｇ、１００，０００×ｇおよび４００，０００×ｇ、４℃で２時間遠心してエキソソームをペレット化した。非トランスフェクトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から同様に調整した上清をネガティブコントロールとして用いた。
【００５８】
（１−４．免疫ブロット分析）
ペレットを１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーに再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。各サンプル２０μＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって４−２０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で分離し、さらに電気泳動によりニトロセルロース膜に移行させた。膜をＴＢＳで５分間洗い、さらにその後５％脱脂粉乳ＴＴＢＳ溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）中で室温として１時間振盪することによりブロックし、さらに一次抗体（１：１００００希釈抗アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）ｍＡｂ）、続いてＨＲＰコンジュゲートＩｇＧ  Ａｂ（Ｈ＋Ｌ）を用い、４℃で一晩振盪することによりイムノブロット用に処理した。タンパク質バンドはウエスタンブロッティングルミノール試薬（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州サンタクルス）で検出した。ＡｃｈＥ検出の後、ブロットを剥離し、ＣＤ４５で再ハイブリダイゼーションした。ウエスタンブロッティングルミノール試薬でタンパク質バンドを検出した後、写真フィルム（ＢｉｏＭａｘフィルム；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）に露光させた。画像をスキャンしてＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ６．０に取り込み、Ａｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒソフトウェア（バージョン８．０；Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で調節し、さらにＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアリリースβ３ｂ（ＳｃｉｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州フレデリック）を用いてデンシトメトリーを実施した。
【００５９】
図１に示すように、拮抗ペプチド（ＨＩＶ−１ＮｅｆＳＭＲｗｔ；図１、パネルＣ）は、細胞内およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来の細胞上清においてＡＣｈＥをノックダウンした（腫瘍小胞の分泌の指標）。データは両コンパートメントにおける用量依存性も示す。ネガティブコントロール（ＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｍｕｔ、図１、パネルＤ）は細胞内または上清コンパートメントのいずれにおいてもＡＣｈＥに効果を示さなかった。
【００６０】
上記の結果は、ＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｗｔペプチドが腫瘍細胞からのエキソソーム小胞の放出に拮抗することを示す。これらの小胞は、癌患者の免疫系を調節不全にして腫瘍の生存および増殖を可能とすることが示されている。エキソソーム放出の拮抗によって免疫系がそれ自体を修復しかつ腫瘍を攻撃／殺傷することが可能となるであろう。
【実施例２】
【００６１】
（ＨＩＶ−１  Ｎｅｆトランスフェクト細胞における小胞分泌阻害）
遺伝学的研究によってＳＭＲモチーフの変異がＮＥＦ分泌を停止させることが明示された一方で、この効果がＳＭＲ結合部位の破壊によるものであるのか、それともＮｅｆタンパク質のミスフォールディングに至る単純な構造的な変化であるのかは不明である。それゆえ、一連のコトランスフェクト実験を実施した。Ｃｈａｒｉｏｔを用いて、ｐＱＢＩ−ＨＩＶ  Ｎｅｆ−ＧＦＰ（野生型Ｎｅｆタンパク質を発現）０．５μｇ、およびＨＩＶ  ＮｅｆＳＭＲｗｔまたはＳＭＲｍｕｔペプチドまたはｓＭ１ペプチド（完全な無作為化対照ペプチドＡＬＡＥＴＣＱＮＡＷＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））０．５μｇのいずれかを、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。簡単に言うと、Ｃｈａｒｉｏｔ試薬を用いて、野生型Ｎｅｆ−ＧＦＰクローンおよびＳＭＲペプチドを室温で３０分間複合体化した。無血清培地中のＨＥＫ２９３細胞にＤＮＡ／ペプチド／Ｃｈａｒｉｏｔ複合体を加え、細胞を培養皿に播種した。３７℃で２時間培養した後、培養皿に血清培地を添加し、さらに細胞を３７℃で４８時間培養した。次に培地を捕集し、分光蛍光計を用いて分泌を測定した。これらの培養に由来する調整済上清のＧＦＰ蛍光をプレートリーダーで測定した。結果はＮｅｆＧＦＰ＋ｓＭ１ペプチド（ネガティブコントロール、１００％）の蛍光に対する百分率として表示する。
【００６２】
図２に示すように、ＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｗｔペプチド（左より１つ目の棒グラフ）はＮｅｆＧＦＰの細胞外上清への放出に拮抗する。ＮｅｆＧＦＰは細胞外上清においてエキソソーム様小胞内に存在することが示されている。ネガティブコントロールＨＩＶ−１  ＮｅｆＳＭＲｍｕｔおよびｓＭ１は小胞の放出に影響を示さなかった。
【００６３】
これらの結果より、拮抗物質がＨＩＶ−１  Ｎｅｆトランスフェクト細胞の放出を遮断することが証明される。データより、これらの小胞は、腫瘍細胞が放出するものと同様に、免疫系を殺傷または調節不全とし、ＨＩＶが増殖しかつ最終的にエイズの発病に至ることを可能とする。エキソソーム放出の拮抗によって、免疫系がそれ自体を修復してエイズへの進行を阻止することを可能とするであろう。
【００６４】
もう１つの実験においては、Ｃｈａｒｉｏｔを用いて、ＨＩＶ−１ｗｔＮｅｆ−ＧＦＰ  ５００ｎｇおよびＳＭＲｗｔペプチド７．８〜５００ｎｇでＪｕｒｋａｔ細胞をコトランスフェクトした。図３Ａに示すように、ＳＭＲｗｔペプチドはＪｕｒｋａｔ細胞の小胞分泌を阻害する。図３Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＳＭＲｗｔペプチドが用量依存的に小胞分泌を阻害することを示す用量−反応曲線である。
【実施例３】
【００６５】
（ＨＩＶ感染細胞からの小胞分泌およびウイルス粒子放出の阻害）
（３．１  実験Ｉ）
Ｉ．Ｊｕｒｋａｔ細胞を以下に示すようにコトランスフェクトした：（Ｃｈａｒｉｏｔキットによるトランスフェクト効率３０〜４０％）
＃１．  ｐＮＬ４−３＋Ｎｅｆ  ＳＭＲ  ｗｔ（拮抗物質）            ４プレート
＃２．  ｐＮＬ４−３＋Ｎｅｆ  ＳＭＲ  ｍｔ（非機能的拮抗物質）    ４プレート
＃３．  ｐＮＬ４−３＋ｓＭ１（ネガティブコントロールペプチド）    ４プレート
【００６６】
ｐＮＬ４−３はウイルスゲノムを含有するクローンである。細胞にトランスフェクトすることでウイルスゲノムの発現、および最終的にはウイルス粒子形成および放出を可能とする。ｐ２４タンパク質（ウイルスタンパク質）を介して、細胞外上清におけるウイルス粒子生成量を測定する。サンプルは感染より４８時間後および９６時間後に捕集した。
【００６７】
感染の４８時間後に各群より２プレートを取り出し、以下の方法で測定した：
ａ．ｐ２４分析
ｂ．Ｎｅｆ分析
ｃ．感染性分析
感染の９６時間後に各群より他の２プレートを取り出し、以下の方法で測定した：
ａ．ｐ２４分析
ｂ．Ｎｅｆ分析
ｃ．感染性分析
【００６８】
表Ｉに示すように、ペプチド拮抗物質（ＮｅｆＳＭＲｗｔ）の存在下でウイルス生成量は９６時間目に激減し、ネガティブコントロールペプチド（ＮｅｆＳＭＲｍｕｔ）については影響が見られなかった。データより、拮抗物質が感染細胞からのウイルス粒子の生成および／または放出を遮断することが示唆される。
【００６９】
【表１】
2012529293.tif 000003
【００７０】
（３．２  実験ＩＩ）
Ｃｈａｒｉｏｔ(商標)キットを用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＴＨＰ−１単球およびＵ９３７単球に、Ｒ７またはＮｅｆＳＭＲｗｔ（拮抗物質）またはＲ７＋ＮｅｆＳＭＲｍｔ（非機能的拮抗物質）をコトランスフェクトした。トランスフェクト効率は３０〜４０％であった。
【００７１】
Ｒ７はウイルスゲノムを含有するクローンである。細胞にトランスフェクトすることによりウイルスゲノムの発現、および最終的にはウイルス粒子形成および放出を可能とする。ｐ２４タンパク質（ウイルスタンパク質）を介して細胞外上清におけるウイルス粒子生成量を測定する。
【００７２】
トランスフェクトより２時間、３日、６日、９日、１３日、１５日、１７日、２０日、２３日、２７日および３６日後に、各プレートより上清を０．５ｍＬ捕集し、新鮮な培地０．５ｍＬと混合し、ｐ２４  ＥＬＩＳＡ分析により測定した。各プレートより上清１．５ｍＬを捕集し、ＴＬＡ１００ローター中で４００，０００×ｇ、１時間遠心してペレットを作成した。ペレットはｐ２４ｍＡｂおよびＮｅｆ  ｍＡｂによるウエスタンブロットに用いた。
【００７３】
図４Ａに示すように、ネガティブコントロール（Ｒ７／ＳＭＲｍｔ）においては、トランスフェクトより３日後にＪｕｒｋａｔ細胞のｐ２４濃度が上昇したものの、ＳＭＲｗｔ（拮抗物質）培養中ではトランスフェクトより１３日後まで上昇しなかった。同様の結果はＨＥＫ２９３細胞およびＴＨＰ−１単球でも認められた。ＳＭＲｗｔトランスフェクトＵ９３７単球には少量のｐ２４が存在しており、細胞がＳＭＲｗｔ拮抗物質を除去できなかったことが示唆される。これらのデータは、ＳＭＲｗｔがウイルス増殖または感染細胞からの放出のある面と拮抗することを示唆する。しかし、ＳＭＲｗｔの影響は一時的なものと見られる。ＪｕｒｋａｔおよびＨＥＫ細胞は時間と共にペプチドを分解することができるのに対し、Ｕ９３７単球はペプチドを分解できないと見られる。ペプチドの一時的な効果は、非分解性ペプチドの使用（例：イオウ結合を有するペプチドまたはｄ−エナトマーペプチドの使用）によって克服してもよい。図４Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＲ７／ＳＭＲｗｔペプチド（パネルＡ）はｐ２４の放出を遮断するが、Ｒ７／ＳＭＲｍｔペプチド（パネルＢ）は遮断しないことを示す、トランスフェクト後３、６、１０、１４、１７日目の共焦点顕微鏡写真の組合せである。結果は、ＥＬＩＳＡ／ウエスタン／およびＭＡＧＩ分析より得られた結果と適合した。青色の染色は核染色であり、赤色の染色は細胞質染色であり、緑色ＦＩＴＣ染色はＨＩＶｐ２４タンパク質である。拮抗物質処理細胞の３、６、１０日目の画像では、ネガティブコントロール処理細胞の同画像と比較して、細胞質内にｐ２４が大量に蓄積しているのが確認されている。１４日目および１７日目においては、ｐ２４はネガティブコントロール処理の画像のそれと同様に見え始めている。我々はペプチドの細胞内レベルが枯渇することによりウイルスの放出の開始が可能となると考えるので、これはＭＡＧＩ／ウエスタン／ＥＬＩＳＡデータにおいてｐ２４が放出されたと見られるという事実と一致する。
【００７４】
図４Ｃ〜４ＥはＲ７／ＳＭＲｗｔまたはＲ７／ＳＭＲｍｔをトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞の、トランスフェクト後６日目（図４Ｃ）および１４日目（図４Ｄ）の電子顕微鏡写真である。６日目には、Ｒ７／ＳＭＲｗｔ処理細胞の内部において、ウイルス粒子またはヌクレオカプシドが細胞質内およびＭＶＰ内に蓄積しているのを認めることができる。これらの細胞の外面上にはウイルス粒子が蓄積しているのを認めることができない（図４Ｃ、パネルＡ−１および）。対照的に、Ｒ７／ＳＭＲｍｔ処理した細胞の内部に認められるＭＶＢは非常に少数であり、ウイルス粒子の大半は細胞の外面上に蓄積しかつ細胞の南極に分極しているのが認められる（図４Ｃ、パネルＢ−１）。１４日目には、ウイルス粒子が、ネガティブコントロールＲ７／ＳＭＲｍｔ処理した細胞（図Ｄ、パネルＢ−２）に認められるのと同様に、Ｒ７／ＳＭＲｗｔ処理細胞（図４Ｄ、パネルＡ−２）の細胞外面上で膜表面全体で分極せずに大量に蓄積しているのを観察することができる。電子密度の高い「ウイルス粒子」が上記のように蓄積しているのを示すために、６日目および１４日目の拮抗物質およびネガティブコントロールペプチド像の高倍率画像を示す（図４Ｅ）。エビデンスより、ＥＭで測定するところの感染細胞からのウイルスの放出がＳＭＲｗｔ拮抗物質により遅延することが示される。
【００７５】
ウエスタンブロット分析の結果を図５〜８に示す。結果を図９に要約する。図３〜９に示すように、ペプチド拮抗物質（ＮｅｆＳＭＲｗｔ）の存在下におけるウイルス生成量は０または０近くまで激減する。ネガティブコントロールペプチド（ＮｅｆＳＭＲｍｕｔ）については効果が認められなかった。細胞ライセートの分析により、ｐ２４の生成は全ての測定条件において同一であることが示され、ウイルスタンパク質発現には影響しないことが示唆される。データより、拮抗物質が感染細胞からのウイルス粒子の放出を遮断することが示唆される。これは、おそらくはウイルスコンポーネントの細胞質膜へのトラフィックに対する拮抗による。最終的に、これは（ｉ）ＨＩＶ感染を遮断しかつ（ｉｉ）エイズへの進行を阻止するであろう。
【００７６】
（３．３  実験ＩＩＩ）
Ｍａｇｉ／ＣＸＣＲ４細胞を、Ｒ７ウイルスＤＮＡ／ＳＭＲｗｔペプチドまたはＲ７ウイルスＤＮＡ／ＳＭＲｍｔペプチドのいずれかをトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＴＨＰ−１単球またはＵ９３７単球に由来する調整済上清に４８時間曝露した。次にこれらの細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌで染色した。図１０Ａは、Ｒ７／ＳＭＲｗｔをトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞に由来するｐ２４上清の１ｎｇ／ｍＬ希釈に曝露したＭａｇｉ／ＣＸＣＲ４細胞を示す。図１０Ｂは、Ｒ７／ＳＭＲｍｔをトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞に由来するｐ２４上清の１ｎｇ／ｍＬ希釈に曝露したＭａｇｉ／ＣＸＣＲ４細胞を示す。生産的にＲ７感染した細胞は、これを青色染色することにより光学顕微鏡下で容易に視覚化される。倍率は×２０。Ｒ７およびペプチド拮抗物質（ＳＭＲｗｔ）で処理した細胞はいずれも青色染色細胞数の激減を示した一方で、Ｒ７およびネガティブコントロールペプチド（ＳＭＲｍｔ）で処理した細胞は多数の青色染色細胞を示すことに留意されたい。これは、Ｒ７／ネガティブコントロールペプチド処理細胞由来の調節済上清にウイルスがあり、Ｒ７／拮抗物質処理細胞由来の調節上清にはウイルスがないことを示す。
【００７７】
これらのＭａｇｉ培養の青色染色細胞を定量した。データをトランスフェクト後の時間の関数としてプロットした。図１１に示すように、ＮｅｆＳＭＲｗｔトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞またはＮｅｆＳＭＲｗｔトランスフェクトＴＨＰ−１単球に由来する上清の存在下で、感染細胞の個数は有意に減少する。データより、拮抗物質が感染細胞からのウイルス粒子の放出を遮断することが示唆される。これは、おそらくはウイルスコンポーネントの細胞質膜へのトラフィックに対する拮抗による。最終的に、これはＨＩＶ感染を遮断しかつエイズへの進行を阻止するであろう。
【００７８】
要約すると、これらの実験より、この技術を用いて、タンパク質またはエピトープが細胞より容易に精製できるよう、細胞にあらゆるタンパク質またはエピトープを生成および細胞外分泌させることが可能であることが証明される。小胞を標的化するエピトープ（例：腫瘍マーカーに対する抗体エピトープ）および抗腫瘍タンパク質またはエピトープと共に充填する場合、これを化学療法に用いることもできる。さらに、この技術を用いて、自己小胞を用いるようベクターを特定の患者細胞にトランスフェクトすることも可能である。
【００７９】
タンパク質は小胞の外膜にも位置しているため、免疫応答を誘導するために用いることも可能である。したがって、たとえば、流感エピトープをベクターに充填して小胞の外面に発現させ、流感ウイルスに対する免疫応答を誘導してもよい。
【実施例４】
【００８０】
（ＨＩＶ−１  ＧＡＧＷＴ−ＧＦＰ誘導分泌に対する分泌拮抗物質（ＨＩＶ  Ｎｅｆ  ＳＭＲｗｔペプチド）の影響）
Ｃｈａｒｉｏｔを用いて、ｐＱＢＩ−ＨＩＶ  Ｇａｇ−ＧＦＰ０．５μｇ（野生型Ｎｅｆタンパク質を発現）、およびＨＩＶ−１  Ｎｅｆ  ＳＭＲｗｔまたはＳＭＲｍｕｔペプチド、ｓＭ１ペプチドまたは非トランスフェクト対照のいずれか０．５μｇによって細胞をコトランスフェクトした。これらの培養に由来する調整済上清のＧＦＰ蛍光をプレートリーダーで測定した。結果を表ＩＩに示す。任意に１×と設定した非トランスフェクト対照（ネガティブコントロール、１００％）に対する粒子分泌レベルを示す。
【００８１】
【表２】
2012529293.tif 000004
【００８２】
Ｇａｇトランスフェクト細胞より、Ｇａｇがいわゆる「ウイルス様粒子」に分泌されることが示されている。これらのウイルス様粒子は小胞に非常に類似している。ウイルス（Ｇａｇ型小胞として記載されるもの）が細胞からエキソソーム経路を経て放出されることが示唆されている。分泌拮抗物質ＳＭＲｗｔはＧａｇウイルス様粒子放出に対して影響を示さない。これは、Ｇａｇトラフィック経路とＮｅｆトラフィック経路が少なくとも１つの点で異なることを示唆している。この点は、拮抗物質が操作する経路内のその因子である。
【実施例５】
【００８３】
（ＷＴＮｅｆタンパク質の存在下におけるＨＩＶ−１  ＧＡＧＷＴ−ＧＦＰ誘導分泌に対する分泌拮抗物質（ＨＩＶ  Ｎｅｆ  ＳＭＲｗｔペプチド）の影響）
Ｃｈａｒｉｏｔを用いて、ｐＱＢＩ−ＨＩＶ  Ｇａｇ−ＧＦＰ構造物、ｗｔＮｅｆ−ＲＦＰ、および拮抗物質（ＳＭＲｗｔペプチド）、ネガティブコントロールＳＭＲｍｔペプチド、またはランダムペプチドｓＭ１のいずれを細胞に４８時間トランスフェクトした。これらの培養に由来する調整済上清のＧＦＰ蛍光をプレートリーダーで測定した。結果を表ＩＩＩに示す。任意に１×と設定した非トランスフェクト対照（ネガティブコントロール、１００％）に対する粒子分泌レベルを示す。
【００８４】
【表３】
2012529293.tif 000005
【００８５】
表ＩＩＩに示すように、ＳＭＲｗｔ拮抗ペプチドはｗｔＮｅｆ−ＲＦＰの存在下でＧａｇウイルス様粒子の放出を遮断する。これらの結果より、細胞内にＧａｇのみが存在するときＳＭＲｗｔはＧａｇＶＬＰ形成および放出にに拮抗しないが、しかし細胞内にＧａｇおよびＮｅｆの両者が存在するときＳＭＲｗｔはＧａｇ  ＶＬＰ形成および放出に拮抗することが示される。Ｎｅｆは、Ｇａｇの放出を、Ｇａｇが細胞内に単独で存在する場合に取る経路と異なる経路に誘導していることが示唆される。ＳＭＲｗｔペプチドがＨＩＶウイルス放出を遮断できるが、（Ｇａｇのみが存在するときに）Ｇａｇウイルス様粒子の放出は遮断できない理由も説明する。
【００８６】
表ＩＩＩに示すように、ｗｔＮｅｆ−ＲＦＰの存在下でＳＭＲｗｔ拮抗ペプチドはｗｔＮｅｆ−ＲＥＰの存在下でＧａｇウイルス様粒子の放出を遮断する。
【実施例６】
【００８７】
（ＳＭＲｗｔペプチドの細胞毒性分析）
Ｃｈａｒｉｏｔを用いて、ＳＭＲｗｔまたはＳＭＲｍｕｔ（ネガティブコントロール）ペプチドを単独でＪｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を４８時間増殖させた。細胞を二酢酸フルオレセイン（ＦＤ；生細胞によって取り込まれてＦＩＴＣに変換され細胞に緑色の蛍光を発生させる）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ；死細胞の多孔性膜を透過して拡散し、それらの細胞の内部より赤色の蛍光を発生させる）で細胞毒性分析した。
【００８８】
図１２に示すように、ＳＭＲｗｔトランスフェクト細胞から検出された死細胞は非常に少数に過ぎなかった（＜２％）（パネルＡ−１）。さらに、ＳＭＲｗｔトランスフェクト細胞における死細胞の個数はＳＭＲｍｕｔトランスフェクト細胞にみられるものと同様である（パネルＢ−１）。これらの結果は、ＳＭＲｗｔ拮抗物質にはＪｕｒｋａｔ細胞に対する細胞毒性がほとんどないことを示唆している。
【実施例７】
【００８９】
（拮抗物質と相互作用する細胞因子の同定）
（Ａ：ＳＭＲｗｔペプチドと結合しかつ分泌を調節する細胞因子の同定）
Ｊｕｒｋａｔ細胞ライセートに対し、ＳＭＲｍｔとＳＭＲｗｔペプチドをＦＬＡＧ免疫沈降と併用して互いに比較し、ＳＭＲｗｔ拮抗物質と相互作用するがＳＭＲｍｔネガティブコントロールとは相互作用しなかった細胞因子を捕捉した。拮抗物質と相互作用する細胞因子をＦＬＡＧ  ＩＰ分析法により測定した。簡単に述べると、細胞ライセートをＦＬＡＧタグＳＭＲペプチドとカップリングしたＡｍｉｎｏＬｉｎｋ  Ｐｌｕｓ樹脂と混合する。ＳＭＲ−特異性細胞タンパク質（ＲＯＹ）が樹脂上のＳＭＲペプチドと結合する。非特異的不純物（Ｇ−ＢＩＶ）を樹脂から洗い落とし、遠心分離により除去する。ＳＭＲ特異性細胞タンパク質（ＲＯＹ）を溶離させ、捕集する。一部の強力に結合した不純物（Ｖ）も溶離させ、捕集する。
【００９０】
除去した２つのペプチドをＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離した（（図１３、パネルＡ）。ＳＭＲｗｔレーンに出現したがＳＭＲｍｔレーンには出現しなかったバンドを切り取り、精製した。この方法で５本のバンドを特定、精製した（図１３、パネルＡ）。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてこれらのタンパク質生成物を同定したところ、モータリン／ＧＲＰ７５；ミオシン１０；ビメンチン；ＧＲＰ７８；ＨＳＣ７０であることが確認された。これらのタンパク質のうち、モータリン／ＧＲＰ７５はシャペロンのＨｓｐ７０ファミリーのメンバーである。ミトコンドリアおよび細胞質のいずれにもあり、ストレス応答から細胞内トラフィック、抗原プロセシング、および細胞増殖、分化および腫瘍化の調節におよぶ複数の機能において意味づけられている。モータリンはｐ５３と相互作用し、アポトーシスおよび小胞輸送（ＭＡＣ複合体）に関与していることが示されている。また、腫瘍細胞から放出される微小胞にも認められる。
【００９１】
ゲルに対してα−モータリン抗体によるウエスタンプローブも実施した。細胞ライセート、拮抗物質溶離物および拮抗物質親和性樹脂を含むレーンでは分子量約７５ｋＤａのタンパク質が検出されたが（図１３、パネルＢ、レーン１、３および５）、ネガティブコントロールまたはネガティブコントロールペプチド溶離物のレーン（図１３、パネルＢ、レーン２および４）では検出されなかった。
【００９２】
（モータリン抗体の小胞分泌阻害）
モータリン／ＧＰＲ７５抗体とｗｔＮｅｆＧＦＰ対照のＪｕｒｋａｔ細胞へのＣｈａｒｉｏｔトランスフェクトを用い、内因性モータリン／ＧＲＰ７５タンパク質をノックダウンしてＮｅｆ誘導性分泌の効果を観察した（図１４）。ネガティブコントロールとしてマッチング細胞にチューブリン抗体をＣｈａｒｉｏｔトランスフェクトした。我々は、モータリン／ＧＦＰ７５抗体がＮｅｆ誘導性分泌を遮断する一方で、ａ−チューブリン抗体がＮｅｆ誘導性分泌に影響を示さないことを確認した。これにより、モータリンはＮｅｆ誘導性エキソソーム分泌において重要であることが示された。モータリン抗体は溶離バンドにハイブリダイゼーションする。
【００９３】
モータリンはグルコース調節タンパク質７５（ＧＲＰ７５）、またはペプチド結合タンパク質７４（ＰＢＰ７４）としても知られる。モータリンは６７９アミノ酸長であり、熱ショックタンパク質７０ファミリーの非誘導性メンバーである。大腸菌ＤｎａＫを含む他のファミリーメンバーとの高度な同一性を有する。モータリンの結晶構造は推定されていないものの、Ｈｓｐ７０ファミリー内での進化的保持から、プロテアーゼ感受性部位によって結合されたＮ末端ＡＰＴアーゼヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）およびＣ末端基質結合ドメイン（ＳＢＤ）の２つの主要ドメインを有すると予測される。ＮＢＤがファミリー全体で高度に維持されている一方で、ＳＢＤは大きな多様性を示し、おそらくは基質特異性におけるＨｓｐ７０ファミリーメンバーの変異を説明すると思われる。そのシャペロン活性はＡＴＰ−加水分解機能と密接に関連している。
【００９４】
モータリンはミトコンドリア、さらには初期エンドサイトーシス小胞などの多様な細胞質小胞に局在していることが確認されている（たとえばＫａｎａｉ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，２００７，１２：７９７−８１０；Ｋａｕｌ他、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，２００２，３７：１１５７−１１６４；Ｓｉｎｇｈ他、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，１９９７，２３４：２０５−２１６およびＶａｎ  Ｂｕｓｋｉｒｋ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，１４６：５００−５０６を参照）。モータリンは数種類のタンパク質（例：ｐ５３およびＦＧＦ−１）と直接結合し、かつ非古典的経路（すなわちエキソソーム経路）を介してその細胞内トラフィックを調節する（たとえばＫａｕｌ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００５，２８０：３９３７３−３９３７９；Ｍｉｚｕｋｏｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００１，２８０：１２０３−１２０９；Ｍｉｚｕｋｏｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，１９９９，３４３：４６１−４６６；およびＰｒｕｄｏｖｓｋｙ他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００８，１０３：１３２７−１３４３を参照）。宿主の免疫系からの攻撃下にある細胞はモータリン発現を介して膜小胞を放出し、またモータリンはそれらの小胞内に確認されている（Ｐｉｌｚｅｒ他、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５，１７：１２３９−１２４８）。モータリンは多様な腫瘍細胞によって放出されるエキソソーム中にも確認されている（Ｃｈｏｉ他、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００７，６：４６４６−４６５５；Ｓｔａｕｂａｃｈ他、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００９）。
【００９５】
モータリンは細胞内で複数の主要な機能を果たすことが確認されている（Ｋａｕｌ他、Ｅｘｐ  Ｇｅｒ  ｏｎｔｏｌ，２００７，４２：２６３−２７４の総説）。タンパク質のインポートおよびエキスポートの細胞内移動系において主要なハウスキーピング機能を果たす。モータリンは、熱によっては誘導されないものの、軽度ストレス応答によって誘導され、ストレスおよびアポトーシスに対する警護の役割を果たすことを可能とする。モータリンの発現低下、または変異型モータリンの発現は老化を引き起こす一方で、モータリン発現の上昇は癌である変異型を伴う不死に至る。
【００９６】
エビデンスより、正常細胞からガン細胞への形質転換、さらにはそれらの細胞の化学療法抵抗性におけるモータリンの意味が明確化されている。多様な起源の腫瘍細胞においてモータリンが過剰発現しているのが確認されている（Ｗａｄｈｗａ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００６，１１８：２９７３−２９８０）。マウスのモータリンは、正常細胞ではミトコンドリアを細胞内位置としているが、ガン細胞ではその位置がサイトソルに変わっていることが確認されている（Ｗａｄｈｗａ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｎ  １９９８，２７３：２９５８６−２９５９１）。モータリンはｐ５３と相互作用することが確認されている。さらに、この相互作用により細胞質におけるｐ５３の隔離が促進され、これによりその核活性が阻害され（Ｋａｕｌ他、Ｓｕｐｒａ  ２００７，４２：２６３−２７４；Ｙｉ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００８，７：３１５−３２５；Ｃｚａｒｎｅｃｋａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００６，５：７１４−７２０）、一部の腫瘍において放射線療法および化学療法に対する抵抗性を誘導する。最終的に、上で論じたように、モータリンはエキソソーム放出に至る細胞内トラフィックと関連し、かつエキソソーム小胞内に存在することが示されている（Ｐｉｌｚｅｒ他ｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，２００５，２７：３７５−３８７；Ｃｈｏｉ他、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００７，６：４６４６−４６５５；Ｓｔａｕｂａｃｈ他、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００９）。腫瘍細胞（例：乳房腫瘍）は、腫瘍抗原を担持するエキソソームを調節された様式で分泌することが示されており、かつこれらの抗原を提示するかまたはそれらを抗原提示細胞に伝達することができる（Ｙｕ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７８：６８６７−６８７５）。これらの腫瘍エキソソームは、免疫細胞の殺傷または調節不全によって免疫抑制を引き起こし、これにより腫瘍の増殖を可能とする免疫優越状態を促進する。このように、腫瘍は多様な機構を介してモータリンを操作し、その健全性を高める。
【００９７】
熱ショック７０ファミリータンパク質は乳癌と関連することが示されている。それらは分化不良、リンパ節転移、細胞増殖の亢進、アポトーシスの遮断、およびより重度の乳癌病期と明確に関連している。これらの形態学は全て臨床的予後不良の指標である（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ，２００８，２４：３１−３９；Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，２００６，３１：１６４−１７２；Ｃｉｏｃｃａ他、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ，２００５，１０：８６−１０３）。さらに、多くの細胞腫においてモータリンの過剰発現が発癌に寄与していることが明示されており、特に乳癌細胞において確認されている（Ｗａｄｈｗａ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００６，１１８：２９７３−２９８０）。
【００９８】
モータリンが癌免疫療法の潜在的な標的であることは文献より明らかであり、かつ治療法を開発することを期待した数多くの研究がある（Ｗａｄｈｗａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１０，１：１７３−１７８；Ｗａｌｋｅｒ他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，２００６，１６８：１５２６−１５３０；Ｄｅｏｃａｒｉｓ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，２００７，２５２：２５９−２６９；Ｐｉｌｚｅｒ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００９；Ｐａｒｏｌｉｎｉ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００９）。たとえば、ＭＫＴ−０７７はガン細胞の選択的な死を引き起こすミトコンドリア探索非局在化カチオン色素である（Ｄｅｏｃａｒｉｓ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，２００７，２５２：２５９−２６９）。その細胞標的は発癌性Ｒａｓ、Ｆ−アクチン、テロメラーゼ、およびモータリン（ｈｍｏｔ−２）／ｍｔｈｓｐ７０を含む（Ｐａｒｏｌｉｎｉ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００９）。ＭＫＴ−０７７はモータリンのヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）と結合し、かつタンパク質の三次構造変換を引き起こし、そのシャペロン機能を不活性化し、ヒト腫瘍細胞株の老化を誘導する。臨床試験においては、この分子は腎毒性を引き起こすことが確認されているものの、現在は低用量であればより毒性が低くなる可能性を示唆するいくつかのエビデンスがある。
【実施例８】
【００９９】
（小胞／ウイルス放出を阻害するその他の薬剤）  
ＨＩＶ  Ｎｅｆ  ＳＭＲｗｔペプチドは、ＦＤＡによって他の状態において用いるために承認され、かつウイルス放出および小胞放出の遮断において有効性を有すると確認されている薬剤と共に用いてもよい。そのような薬剤の例は：ジメチルアミロリドおよびオメプラゾールである。
【０１００】
分泌を遮断する薬剤をスクリーニングするために用いることのできるコトランスフェクト分析が開発されている。手順１（図１５）においては、何らかの蛍光タグと結合したＮｅｆＧＦＰ、ＮｅｆＲＦＰまたはＮｅｆを細胞株にトランスフェクトし、４８時間の培養時間中に細胞を薬剤または化学物質で処理する。その後、トランスフェクトより４８時間後に、調節済上清の蛍光分子を（多様な方法により）測定する。手順２（図１６）においては、Ｎ−Ｒｈ−ＰＥなどの蛍光ラベルで細胞を処理し、内因的に生成されたエキソソームを標識する。細胞は、化学物質または小分子ペプチド拮抗物質の存在下または非存在下で少なくとも２４時間培養させる。次に、調節済上清のＮ−Ｒｈ−ＰＥ標識微小胞／エキソソームを（多様な方法により）分析する。調節済上清に蛍光タグがないことは、化学物質がエキソソーム分泌系路を遮断してその経路のＮｅｆ誘導を遮断したという徴候である。分泌を遮断する薬剤のスクリーニングのための抗スループット測定法を開発するために、この手順を改変すべきである。
【０１０１】
上の記述は、当業者に本発明を実践する方法を教示する目的のためのものであり、本記載を読むときに当業者に明らかになるであろうこれら全ての明確な改変および変法の詳細を述べることを意図していない。しかし、そのような明確な改変および変法が、以下の請求項によって定義される本実施形態の範囲に含まれることを意図している。文脈より特に反対のことが示されない限り、請求項は請求された構成要素、および意図された目的に合致するために有効なあらゆる手順におけるステップを網羅することを意図している。
【０１０２】
【表４】
2012529293.tif 000006
【０１０３】
【表５】
2012529293.tif 000007
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
【表７】
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【図１−１】
2012529293.tif 000010
【図１−２】
2012529293.tif 000011
【図２】
2012529293.tif 000012
【図３Ａ】
2012529293.tif 000013
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2012529293.tif 000023
【図９】
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【図１０】
2012529293.tif 000025
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2012529293.tif 000029
【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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