(57)【要約】  野生型単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）に対して、増加したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アフィニティーおよびノックアウトされたかまたは減少したＧＰＣＲ活性を有する、新規ヒトＭＣＰ−１突然変異体およびその炎症性疾患の治療のための使用に関する。
2012516143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＭＣＰ−１タンパク質に対して増加したＧＡＧ結合アフィニティーおよび減少したＧＰＣＲ活性を有するＭＣＰ−１突然変異タンパク質において、ＭＣＰ−１タンパク質が、少なくとも２個のアミノ酸を塩基性および／または電子供与性アミノ酸で置換することによって構造保存的に改質化され、その際、１７位または３４位の少なくとも１個のアミノ酸および場合によっては２１位、２３位または４７位の少なくとも１個のアミノ酸（番号付けは配列番号１に従う）が改質化されていることを特徴とする、前記ＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項２】
１７位および３４位のアミノ酸が改質化されている、請求項１に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項３】
２１位のアミノ酸および１７位または３４位のアミノ酸が改質化されている、請求項１に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項４】
野生型ＭＣＰ−１タンパク質のＮ−末端領域の最初の１〜１０アミノ酸の少なくとも１個のアミノ酸が、少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換によって改質化されている、請求項１から３までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項５】
構造保存的な改質化が、野生型ＭＣＰ１構造からの３０％未満、好ましくは２０％未満の構造の偏差である（遠紫外線ＣＤ分光分析計による測定による）、請求項１から４までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項６】
塩基性アミノ酸がＲ、Ｋ、Ｈからなる群から選択されている、請求項１から５までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項７】
電子供与性アミノ酸が、ＮまたはＱからなる群から選択されている、請求項１から６までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項８】
１３位でのＹがＡによって置換されている、請求項１から７までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項９】
Ｎ−末端Ｍｅｔを含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項１０】
Ｎ−末端アミノ酸残基２〜８が欠失している、請求項１から９までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項１１】
一般式：
2012516143.tif 000005
［式中、
Ｚ１はＰおよびＡ、Ｇ、Ｌからなる群から選択され、好ましくはＡであり、
Ｚ２はＲおよびＫからなる群から選択され、
Ｚ３は、ＫおよびＲからなる群から選択され、
Ｘ１は、Ｙおよび／またはＡからなる群から選択され、好ましくはＡであり、
Ｘ２は、Ｎ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＮまたはＱからなる群から選択され、好ましくはＫであり、
Ｘ３は、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎおよび／またはＱからなる群から選択され、好ましくはＫであり、
Ｘ４は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎおよび／またはＱからなる群から選択され、好ましくはＫまたはＲであり、
Ｘ５は、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎおよび／またはＱからなる群から選択され、好ましくはＫであり、
Ｘ６は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎおよび／またはＱからなる群から選択され、好ましくはＫであり、
かつ、ｎおよび／またはｍは０または１であってよく、
かつ、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも２つは改質化されているが、但し、Ｘ２位またはＸ５位の少なくとも１つおよび場合によってはＸ１位、Ｘ３位またはＸ４位の少なくとも１つが改質化されていることを条件とする］のアミノ酸配列を含む、ＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項１２】
2012516143.tif 000006
からなる群から選択される、ＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、単離されたポリ核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離されたＤＮＡ分子を含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターでトランスフェクトされた、非ヒト組換え細胞。
【請求項１６】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載のタンパク質、または請求項１３に記載のポリ核酸分子、または請求項１４に記載のベクターおよび製薬学的に認容性のキャリアーを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
個々の野生型タンパク質の生物学的活性をin vitro阻害または抑制するための方法における、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質、または請求項１３に記載のポリ核酸分子、または請求項１４に記載のベクターの使用。
【請求項１８】
慢性または急性の炎症性疾患または自動免疫状態の治療のための医薬品を製造する方法における、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のＭＣＰ−１突然変異タンパク質、または請求項１３に記載のポリ核酸分子、または請求項１４に記載のベクターの使用。
【請求項１９】
炎症性疾患が、リウマチ様関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、心筋梗塞、鬱血性心不全又は虚血再灌流障害、多発性硬化症およびアテローム性動脈硬化症を含む群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型のＭＣＰ−１と比較して、増加したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アフィニティー及びノックアウトされた又は減少したＧＰＣＲ活性を有するヒト単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の新規突然変異体、並びに炎症性疾患の治療のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
全てのケモカインは、Ｃ及びＣＸ３Ｃケモカインサブファミリーの一部であるリンホタクチン及びフラクタリン／ニューロタクチンを除いて、それぞれ、逆位置で４つのシステインを有し、かつそれぞれＮ末端内での２つのシステイン間のアミノ酸の存在又は不在に基づいて、ＣＸＣ又はα−ケモカイン、及びＣＣ又はβ−ケモカインサブファミリーに分類することができる。ケモカインは、細胞間メッセンジャーとして機能して、血管の内腔から組織中への、特定の型の白血球の活性化及び遊走を調整する小さな分泌されたタンパク質である(Baggiolini M., J. Int. Med. 250,91-104 (2001))。このことは、ケモカインと、標的細胞の表面上の７つの膜内外Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲｓ）との相互作用によって介在される。かかる相互作用は、流動条件下で、生体内で生じる。従って、局所の濃度勾配の確立が、ケモカインと細胞表面のグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）との相互作用によって要求され、かつ保証される。ケモカインは、それらのレセプターと相互作用する２つの主要な部位を有し、１つはトリガー領域として機能するＮ末端領域にあり、かつ他方はドッキング領域として機能する第二のシステインの後のさらされたループ内にある(Gupta S.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, (17), 7799-7803 (1995))。ケモカインのＧＡＧ結合部位は、空間的に明確な塩基性アミノ酸のクラスターを含む(Alis S., et al., Biochem. J. 358, 737-745 (2001))。いくつかのケモカイン、例えばＲＡＮＴＥＳは、主要なＧＡＧ結合部位として４０ｓループにおけるＢＢＸＢモチーフを有し、ＩＬ−８は、Ｃ末端のα−ヘリックスを介するＧＡＧと、隣接するＮループにおけるＬｙｓ２０とを相互作用する。他のケモカイン、例えばＭＣＰ−１は、レセプター結合部位及びＧＡＧ結合部位を含有する残基間の著しい重複を示す(Lau E. K. et al., J. Biol. Chem., 279 (21), 22294-22305 (2004))。
【０００３】
サイトカインのケモカイン−βファミリーの内容において、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、単球に富む炎症成分、例えばアテローム硬化(Nelken NAら, J. Clin. Invest. 88, 1121-1127(1991); YIa-Herttuala, S., Proc. Natl. Acad. Sci USA88, 5252-5256(1991))、リウマチ様関節炎(Koch A. E.ら, J. Clin.Invest. 90, 772-779(1992); Hosaka S.ら, Clin. Exp. Immunol. 97(3), 451-457 (1994), Robinson E.ら, Clin. Exp. Immunol. 101 (3), 398-407 (1995))、炎症性腸疾患(MacDermott RP.ら, J. Clin. Immunol. 19, 266-272 (1999))及び鬱血性心不全(Aukrust P.ら, Circulation 97, 1136-1143 (1998), Hohensinner PJ.ら, FEBS Letters 580, 3532-3538 (2006))を特徴する種々の疾患において見出される、単球及び白血球に特異的な化学遊走物質並びに活性化剤である。決定的に、ＭＣＰ−１又はそのレセプターＣＣＲ２を欠くノックアウトマウスは、炎症性病変に単球及びＴ細胞を補充することができない(Grewal I, S.ら, J. Immunol. 159(1), 401-408 (1997), Boring L.ら, J.Biol. Chem. 271 (13), 7551-7558 (1996), Kuziel W.A.ら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(22), 12053-8 (1997), Luss.ら, J. Exp. Med. 187 (4), 601-8 (1998))；さらに、ＭＣＰ−１中和抗体又は他の生物学的アンタゴニストでの治療は、いくつかの動物モデルにおいて炎症を低減することができる(Lukacs N. W.ら, J. Immunol., 158 (9), 4398-4404(1997), Flory CM.ら, 1. Lab. Invest. 69(4), 396-404(1993), Gong J. H.ら, J. Exp. Med. 186 (1), 131-7 (1997), Zisman D.A.ら, J.Clin. Invest. 99(12), 2382-6 (1997))。最終的に、ＬＤＬ−レセプター／ＭＣＰ−１欠損マウス及びａｐｏＢ−遺伝子導入／ＭＣＰ−１欠損マウスは、ＷＴ ＭＣＰ−１株と比較してそれらの大動脈全体にわたって、著しく少ない脂質沈着及びマクロファージ蓄積を示す(Alcami A.ら, J. Immunol. 160(2), 624-33 (1998), Gosling J.ら., J. Clin. Invest. 103 (6), 773-8 (1999))。
【０００４】
Potzingerら（Biochemical Society Transactions, 34, 2006, 435-437）は、炎症状態におけるタンパク質ベースのＧＡＧアンタゴニストとして、改質化されたＩＬ−８タンパク質の生成を記載する。
【０００５】
Piccininiらは、増大したグリコサミノグリカン結合上で制限された数の部位特異的ＭＣＰ−１突然変異体の効果を示している(J Biol Chem.2010 Jan 22.［刊行に先駆けてのＥｐｕｂ］)。
【０００６】
Proudfootら（ Proc.Natl.Acad.Sci., 100, 4, 2003, 1885-1890）は、ケモカイン、特にＭＣＰ−１の他のものＧＡＧ結合部位中の突然変異の効果を試験した。
【０００７】
US2003/0162737は、肺性高血圧症の治療のための拮抗的ＭＣＰ−１突然変異タンパク質を開示している。前記ＭＣＰ−１突然変異タンパク質は、タンパク質のＮ−末端でＮ−末端アミノ酸１〜１０または２〜８の欠失までいくつかの欠失を含む。さらに突然変異タンパク質はアミノ酸２２位または２４位での変異を含んでいてもよい。
【０００８】
Steitz S ら（FEBS Letters, 430, 3, 1998, 158-164）は、レセプター結合上のＮ−末端改質化の役割を試験した。アミノ酸１３位および１８位の置換を含むＭＣＰ−１突然変異体が開示された。Ｙ１３Ａは、ＴＨＰ−１化学走化性を誘導するための機能において劇的な喪失を示した。
【０００９】
Lubkowski J.ら（Nature Structural Biology, 4, 1, 1997, 64.69）は、組換えヒトＭＣＰ−１のＸ−線結晶構造を試験した。タンパク質のＮ−末端を改質化させ、かつその活性における効果を測定した。特に１０位および１３位の改質化は、ＭＣＰ−１の活性を低下させ、かつダイマー安定化における効果を有していた。突然変異体の損なわれた化学走化性活性は、Ｔｙｒ２８、Ａｒｇ２９、Ａｒｇ３０およびＡｓｐ６８について、機能的有意性を示唆した。これは、電荷アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ）が交互のダイマーを脱安定化し、かつ非電荷残基の導入は安定性を顕著に増加させることができることを強調した。
【００１０】
第１のケモカインおよびそのレセプターが同定されたことから、通常および疾病の生理におけるその役割を正確に理解することの重要性がより高まっている。従来の薬剤のものとは異なる作用様式を有する新規抗炎剤のための一定の要求は、新規タンパク質ベースのＧＡＧ拮抗物質の開発およびその炎症状態における使用を支持する。
【００１１】
昨年、ＭＣＰ−１とＣＣＲ２との相互作用およびＧＡＧＳが分子ベースでより詳細に研究され、ＭＣＰ−１の生物学的作用の効果的なアンタゴニストとすべく、ケモカインの標的化された設計が実現可能となる。
【００１２】
この目的のために、グリコサミノグリカン結合に関するその野生型相補的部位と競合し、かつ、白血球の低減されたまたはノックアウトされた活性化を示す、いくつかの組換えＭＣＰ−１突然変異体が製造された。
【００１３】
したがって、本発明の一の課題は、特に炎症またはアレルギーの過程における、ＧＡＧ相互作用をＭＣＰ−１ベースの突然変異タンパク質で拮抗することによって、白血球、特に単球およびＴ細胞の遊走を抑制することである。
【００１４】
野生型ＧＡＧ結合領域の改質化または新規ＧＡＧ結合領域のＭＣＰ１タンパク質への導入によって、かつ同時に、そのＧＰＣＲ活性、特にケモカインのＣＣＲ２活性をノックアウトまたは減少させることによる、より高いＧＡＧ結合アフィニティーを有するＭＣＰ−１突然変異体が、W02009/015884A1中に記載されている。W02009/015884A1では、ＭＣＰ−１タンパク質の領域に塩基性および／または電子供与性アミノ酸を導入するか、あるいは天然のアミノ酸と塩基性および／または電子供与性アミノ酸を置き換えることによって、かつ場合によってはさらに前記ＭＣＰ−１タンパク質のＮ−末端領域をアミノ酸の付加、欠失および／または置換することによって、場合によってはＮ−末端メチオニン（Ｍ）を突然変異ＭＣＰ−１タンパク質に付加することによって、化学走化活性の部分的または完全な喪失を生じるＭＣＰ−１タンパク質が開示されている。前記ＭＣＰ−１突然変異体は、特に、標準的なＧＡＧｓ（ヘパリンまたはへパラン硫酸）に対して少なくとも５倍の改善されたＫｄを示しうるものであって、かつこれらは、標準化された単球細胞構造におけるカルシウム放出の誘導が欠失または減少している。
【００１５】
本発明によれば、さらに増加したＧＡＧ結合アフィニティーを有する新規ＭＣＰ−１突然変異体が、標準的なＧＡＧＳ（ヘパリンまたはへパラン硫酸）に対して、野生型と比較して少なくとも６倍の改善されたＫｄを示すように開発された。これは、野生型タンパク質の１７位および／または３４位のアミノ酸を特異的に改質化することによって達成される。本発明の特別な実施態様によれば、さらにＭＣＰ−１突然変異体は、アミノ酸２１位の改質化を含む。
【００１６】
本発明による突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質はさらに、突然変異体ＭＣＰ−１タンパク質またはＭＣＰ−１突然変異タンパク質をコードするポリ核酸分子、ＭＣＰ−１突然変異タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子を含むベクターならびに製薬学的許容性のキャリアーを含む医薬組成物として配合されていてもよい。
【００１７】
前記ＭＣＰ−１突然変異タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含有するベクターは、それぞれの野生型タンパク質の生物学的活性を阻害または抑制するために使用することができる。
【００１８】
本発明によるＭＣＰ−１突然変異タンパク質は、本発明によれば、慢性または急性の炎症性疾患またはアレルギー症状を治療するための医薬品を製造する方法において使用することができる。好ましくは、この疾患は、リウマチ様関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸炎、心筋梗塞、鬱血性心不全、糖尿病性合併症（たとえば網膜疾患、壊疽等）、多発性漿膜炎または虚血再灌流障害を含む群から選択される。
【００１９】
増加したＧＡＧ結合アフィニティーは、ＧＡＧ結合領域中の塩基性および／または電子供与性アミノ酸の相対量を増加させることによって導入することができ（さらに、本願発明において参考のためにのみ記載するWO05/054285中で記載されている）、これによって中性のＧＡＧ結合タンパク質との競合剤として作用する改質化タンパク質を導く。これは、特にインターロイキン−８に関して示された。ＧＡＧ結合領域の特異的位置および少なくとも２個の塩基性／電子供与性アミノ酸を選択的に導入することによるその改質化は、ＭＣＰ−１タンパク質に関して開示されていない。
【００２０】
さらに、ＭＣＰ−１のアミノ末端は、そのＧＣＧレセプターＣＣＲ２を介してのケモカインシグナルのための本質的な要素として見出された。ＭＣＰ−１ベースのＣＣＲ２アンタゴニストを製造するために、他に、ＧＡＧ結合を完全にノックアウトし、かつＣＣＲ２結合を無損傷のまま維持する方法で、ＭＣＰ−１を製造した（W003084993A1）。この理由から、好中球上のＣＣＲ２レセプターを遮断することによってＭＣＰ−１−介在型シグナリングを遮断し、かつＧＡＧ鎖を介して内皮上の付着を防止することが意図された。したがって、内皮上のＧＡＧ鎖を遮断することによってこのアプローチを確実にすること（より高いＧＡＧ結合アフィニティーを製造することによって）、およびＭＣＰ−１のＣＣＲ２結合をノックアウトすることについては明確にされていない。
【００２１】
本発明は、野生型ＭＣＰ−１タンパク質と比較して増加したＧＡＧ結合アフィニティーおよび減少したＧＰＣＲ活性を有する、新規ＭＣＰ１突然変異タンパク質を提供し、この場合、このタンパク質は、ＭＣＰ−１タンパク質を構造保存的に少なくとも２個のアミノ酸を塩基性および／または電子供与性アミノ酸により置換することによって改質化することを特徴とし、その際、１７位または３４位の少なくとも１個のアミノ酸を置換し、かつ場合によっては２１位、２３位または４７位の少なくとも１個のアミノ酸を置換する。好ましくは、突然変異体は、１７位および３４位の双方における改質化を含む。より好ましくは、突然変異体は、２１位でのさらなる改質化を含む。
【００２２】
代替的に、突然変異体は、１７位または３４位での改質化を、２１位での改質化との組合せで含む。
【００２３】
１７位および／または３４位でのアミノ酸の置換によって、ＧＡＧ結合アフィニティーは、公知のＭＣＰ−１突然変異タンパク質と比較して＞１．５倍、好ましくは＞２倍潜在的にさらに増加させることができる。前記位置は、驚くべきことに、ＧＡＧ結合アフィニティーの点で高く関連することが見出され、それというのも、２個の硫酸イオンが公知ＭＣＰ−１結晶構造の一つにおけるこれらの残基付近において発見されたためである。潜在的第２結合部位は、ＧＡＧｓのためのＭＣＰ−１の範囲内において良好にシミュレーションされた。したがって、提案された方法による前記位置へのさらなる塩基性アミノ酸の導入は、より高いＧＡＧ結合アフィニティーのための可能性のみならず、さらに、これら突然変異体の作用様式を治療的場面に拡大しうる。
【００２４】
特別な実施態様によれば、改質化されたＭＣＰ−１タンパク質はさらに、前記ＭＣＰ−１タンパク質のＮ−末端領域の最初の１〜１０個のアミノ酸の少なくとも１個のアミノ酸のさらなる改質化を、少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により含む。
【００２５】
塩基性または電子供与性アミノ酸によって置換される天然のアミノ酸が塩基性アミノ酸である場合には、置換されているアミノ酸は、より塩基性のアミノ酸でなければならないか、あるいは、天然のアミノ酸残基と比較して、異なる構造的フレキシビリティーを含むものでなければならない。本発明による構造的フレキシビリティーは、ＧＡＧリガンド結合の結果として導入物の適合度合いによって定められる。
【００２６】
本発明の特別な実施態様によれば、塩基性および／または電子供与性アミノ酸によって置換された天然のアミノ酸は、非塩基性アミノ酸である。
【００２７】
本出願において使用されている定義によれば、さらに、用語ＭＣＰ−１突然変異タンパク質はなおもケモキシン様のフォールドを示すが、単球またはＴ細胞化学走化性およびＣａ放出のようなケモキシン活性に影響を与えるかあるいはノックアウトするこれらの任意の部分またはフラグメントを含むものであってもよい。
【００２８】
本発明によって定義された用語「付近」は、ＧＡＧ結合部位の配座的近傍の範囲内に局在するが、ＧＡＧ結合部位には位置しないアミノ酸残基を含む。配座的近傍は、タンパク質のアミノ酸配列のＧＡＧ結合アミノ酸残基に隣接して局在するアミノ酸残基であるか、あるいはタンパク質の３次元構造またはフォールディングにより配座的に隣接するアミノ酸として定義することができる。
【００２９】
本発明による用語「隣接」は、２０ｎｍを上回ることなく、好ましくは１５ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ、好ましくは５ｎｍの改質化すべき各アミノ酸のカットオフ半径の範囲内に存在するものとして定義される。
【００３０】
その生物学的機能を実施することが可能であるために、タンパク質は、数多くの非共有相互作用、たとえば水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力及び疎水性パッキングによってもたらされる１個またはそれ以上の特異的な空間的な配座にフォールディングされる。三次元構造は、公知方法、たとえばＸ線−結晶構造解析またはＮＭＲ-分光分析によって測定することができる。
【００３１】
天然のＧＡＧ結合部位の同定は、突然変異誘発試験によって測定することができる。タンパク質のＧＡＧ結合部位は、タンパク質表面上に局在する塩基性残基によって特徴付けられる。これら領域がＧＡＧ結合部位を定めるかどうかを試験するために、これらの塩基性アミノ酸残基は突然変異誘発され、かつヘパリン結合アフィニティーの減少を測定することができる。これは、技術水準から公知の任意のアフィニティー測定技術によって実施することができる。
【００３２】
塩基性または電子供与性アミノ酸の導入または置換による合理的にデザインされた突然変異は、天然のＧＡＧ結合部位付近において、外来アミノ酸を導入するために実施することができ、かつＧＡＧ結合アフィニティーの増加を生じさせる。この大きさは、ＭＣＰ−１タンパク質に導入された少なくとも１個の付加的なアミノ酸によって、特に少なくとも２個のアミノ酸、とりわけ少なくとも３個のアミノ酸を導入することによって増加させることができる。
【００３３】
遠紫外線−ＣＤ分光分析によって測定された改質化された構造の、野生型ＭＣＰ−１構造からの３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満の偏差は、本発明による構造保存的改質化として定義される。
【００３４】
代替的な実施態様によれば、構造保存的改質は、ＭＣＰ−１タンパク質のＮ末端の範囲内に局在するものではない。
【００３５】
ｗｔＭＣＰ−１のＧＡＧ結合領域に関する重要な残基はＮ１７、Ｓ２１、Ｑ２３、Ｓ３４および／またはＶ４７である。１７位または３４位の少なくとも１個のアミノ酸および場合によっては２１位、２３位または４７位の少なくとも１個のアミノ酸は、塩基性および／または電子供与性アミノ酸の挿入によって改質化されなければならない。１７位および３４位において、場合によっては少なくとも１個の付加的な改質化との組合せにおいて改質化される場合には、ＧＡＧ結合アフィニティーはさらにこれら位置における単一の改質と比較してさらに増加する。
【００３６】
本発明によるＭＣＰ−１タンパク質は、Ｎ１７、Ｓ２１、Ｓ３４および／またはＶ４７のアミノ酸改質の任意の組みあわせを有していてもよく、これによって、ｗｔＭＣＰ−１に対して増加したＧＡＧ結合を有するＭＣＰ−１突然変異タンパク質を生じる。
【００３７】
特に、１７位、２１位、２３位、３４位および４７位におけるすべてのアミノ酸は、本発明にしたがって改質化することができる。
【００３８】
改質化は、たとえば、少なくとも２個の塩基性または電子供与性アミノ酸による置換または交換であってもよい。電子供与性アミノ酸は、電子または水素原子を供与するこれらのアミノ酸である（Droenstedt定義）。特に、これらのアミノ酸は、ＮまたはＱであってもよい。塩基性アミノ酸は、Ｒ、ＫおよびＨの群から選択することができる。
【００３９】
本発明の他の実施態様によれば、アミノ酸１８位におけるＲは、Ｋによって改質化されていてもよいか、および／または１９位でのＫは、Ｒによって改質化されていてもよいか、および／またはＰ８は、少なくとも部分的に減少した改質化されたＭＣＰ−１のレセプター結合を受け入れるために任意のアミノ酸置換基によって改質されていてもよい。
【００４０】
代替的に、本発明のＭＣＰ−１突然変異タンパク質は、１３位におけるＹがさらに任意のアミノ酸残基、好ましくはＡによって置換されていることを特徴とする。
【００４１】
Ｙ１３およびＲ１８は、さらにシグナリングのための重要な残基であると示されており、かつこれら残基の他のアミノ酸残基での置換は、化学走化性を誘導することのできないタンパク質を生じさせる。ＭＣＰ−１変異体の欠失及び置換の双方において報告された二次元の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣは、これらの突然変異体が、ミスフォールドタンパク質を生じさせないことを示す（Chad D. Paavola et al., J. Biol. Chem., 273 (50), 33157-33165(1998)）。
【００４２】
さらに、Ｎ−末端メチオニンは、ＴＨＰ−１細胞上のＣＣＲ２に関するＭＣＰ−１の結合アフィニティーを減少させ (Hemmerich S. et al, Biochemistry 38 (40), 13013-13025 (1999))、その結果、［Ｍｅｔ］−ＭＣＰ−１の潜在的化学走化性は、野生型よりもおおよそ３００倍低い（Jarnagin K. et al., Biochemistry 38, 16167-16177 (1999)）。これは、化学走化性を誘発しないがレセプターに対して高いアフィニティーで結合する潜在的レセプターアゴニスト［Ｍｅｔ］−ＲＡＮＴＥＳとは対照的である。
【００４３】
したがって、本発明の代替的実施態様によれば、ＭＣＰ−１突然変異タンパク質は、Ｎ−末端Ｍｅｔを含有していてもよい。Ｎ−末端メチオニンを有するＭＣＰ−１変異体は、ヘパリンに対して明らかに増加したアフィニティーを有することが明白となる（Lau E.K. et al., J. Biol. Chem. 279(21), 22294-22305(2004)）。
【００４４】
本発明によれば、改質がなされてもよい野生型ＭＣＰ−１領域のＮ−末端領域は、最初の１〜１０のＮ−末端アミノ酸を含有する。さらに本発明によるＭＣＰ−１突然変異タンパク質は、Ｎ−末端アミノ酸残基２〜８が欠失していてもよい。残基２〜８の切断([1 +9-76]hMCP-1)は、化学走化性を誘発することができないタンパク質を生じる。
【００４５】
ＧＰＣＲ活性をノックアウトすると同時に、ＧＡＧｓのアフィニティーを改善するために、改質化の数を可能な限り最小限にし、部位特異的ＭＣＰ−１−突然変異を、生物情報的手段及び生物構造的手段を用いてデザインした。これは、ｗｔＭＣＰ−１の構造が知られていることから、突然変異体が合理的にデザインされたことを意味する。これは、より高いＧＡＧ結合アフィニティーを獲得するために、より多くのＧＡＧ結合部位が、すでに存在するＧＡＧ結合領域中に、ＧＡＧ結合に直接含まれず、構造的にあまり重要ではなく、かつ塩基性アミノ酸、たとえばＫまたはＲの付近にさらされる溶剤であるアミノ酸を交換することによって導入されることを意味する。このように実施することにより、ＭＣＰ−１の特異的ＧＡＧ相互作用部位を保存するために特別な注意が払われ、すなわち、これらのアミノ酸は、ＧＡＧリガンドとの水素結合およびファンデルワールス接触と同時に、ＭＣＰ−１の表面中に含まれるタンパク質−タンパク質相互作用に基づくケモカインネットワークに強い影響を及ぼすケモナインの能力を保存するための、ケモカインのすべてのフォールディングに関して重要な役割を示す。
【００４６】
改質化されたＭＣＰ−１分子のアミノ酸配列は、一般式によって記載することができる：
一般式：
2012516143.tif 000003
［式中、
Ｚ１はＰおよびＡ、Ｇ、Ｌからなる群から選択され、好ましくはＡであり、
Ｚ２はＲおよびＫからなる群から選択され、
Ｚ３は、ＫおよびＲからなる群から選択され、
Ｘ１はＹおよび／またはＡからなる群から選択され、好ましくはＡであり、
Ｘ２はＮ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＮまたはＱからなる群から選択され、好ましくはＫであり、
Ｘ３はＳ、Ｋ、Ｈ、Ｎおよび／またはＱからなる群から選択され、好ましくはＫであり、
Ｘ４はＲ、Ｋ、Ｈ、Ｎおよび／またはＱからなる群から選択され、好ましくはＫまたはＲであり、
Ｘ５はＳ、Ｋ、Ｈ、Ｎおよび／またはＱからなる群から選択され、好ましくはＫであり、
Ｘ６はＶ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎおよび／またはＱからなる群から選択され、好ましくはＫであり、
かつ、ｎおよび／またはｍは０または１であってよく、
かつ、アミノ酸Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも２つは改質化されているが、但し、Ｘ２またはＸ５位の少なくとも１つおよび場合によってはＸ１位、Ｘ３位またはＸ４位の少なくとも１つが改質化されていることを条件とする］
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＭＣＰ−１突然変異タンパク質。
【００４７】
特に、本発明によるＭＣＰ−１突然変異タンパク質は、
2012516143.tif 000004
の群から選択することができる。
【００４８】
本発明の他の態様は、前記に示すような本発明によるタンパク質をコードする単離されたポリ核酸分子である。
【００４９】
ポリ核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。これに関して、本発明によるＭＣＰ−１突然変異タンパク質を導く改質化は、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルにおいて実施される。本発明により単離されたポリ核酸分子は、診断方法と同時に遺伝子治療のために適しており、かつ本発明によるＭＣＰ−１突然変異タンパク質のラージスケールでの製造に適している。
【００５０】
他の態様は、前記に示すような本発明による単離されたＤＮＡ分子を含むベクターに関する。ベクターは、効果的なトランスフェクションと同時にタンパク質の効果的な発現に必要なすべての調節要素を含有する。このようなベクターは従来知られており、かつ任意の適したベクターは、この目的のために選択することができる。
【００５１】
本発明の他の態様は、前記に示すような本発明によるベクターでトランスフェクトされた組換え細胞、特に非ヒト細胞に関する。細胞のトランスフェクションおよび組換え細胞の培養は、公知技術と同様に実施することができる。このような組換え細胞ならびにこの細胞由来の任意の子孫細胞は前記ベクターを含む。このため、連続的にまたは活性時にベクターに依存してＭＣＰ−１突然変異タンパク質を発現する細胞系を提供する。
【００５２】
本発明の他の態様は、前記に示すような本発明によるＭＣＰ−１突然変異タンパク質、ポリ核酸またはベクターおよび製薬学的認容性のキャリアーを含む、医薬組成物に関する。当然のことながら、医薬組成物はさらに、医薬組成物中に通常存在する付加的な物質、たとえば塩、緩衝液、乳化剤、着色剤等を含有していてもよい。
【００５３】
医薬組成物は、従来公知の任意の経路により投与することができ、特に経口、皮下、静脈内、筋肉内投与であるか、あるいは吸入による。
【００５４】
本発明の他の態様は、前記に示すような本発明によるＭＣＰ−１タンパク質、ポリ核酸またはベクターを、それぞれの野生型タンパク質の生物学的活性をｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで阻害または抑制するための方法における使用に関する。前記に示すように、本発明によるＭＣＰ−１突然変異タンパク質はアンタゴニストとして作用することができ、これにより、公知の組換えタンパク質において生じる副作用は、本発明によるＭＣＰ−１−突然変異タンパク質を用いた場合には生じえない。この場合において、副作用とは特に炎症性反応を招く生物学的活性であってもよい。
【００５５】
したがって、前記に示す本発明によるＭＣＰ−１タンパク質、ポリ核酸またはベクターの他の使用は、炎症状態の治療のための医薬品を製造するための方法における使用である。特に、副作用を生じることなく、あるいは減少した副作用でアンタゴニストとして作用し、かつ特に、慢性または急性の炎症性疾患または症状の治療のために特に適している。したがって、本発明の他の態様は、炎症性疾患またはアレルギー症状の治療のための方法であり、その際、本発明によるＭＣＰ−１突然変異タンパク質、本発明による単離されたポリ核酸分子またはベクターまたは本発明による医薬製剤が、患者に投与される。
【００５６】
より詳述すれば、炎症疾患又アレルギー状態は、呼吸性アレルギー疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、過敏性肺疾患、過敏性肺臓炎、間質性肺疾患、（例えば、特発性肺線維症、又は自己免疫疾患に関連する）、アナフィラキシーもしくは過敏症反応、薬物アレルギー及び虫刺されアレルギー；炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎；脊椎関節症、強皮症；乾癬及び炎症性皮膚症、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹；脈管炎；炎症性成分を含む病因論での自己免疫疾患、例えば関節炎（例えばリウマチ様関節炎、慢性プログレジエンテ（ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）関節炎、乾癬性関節炎及び変形性関節炎）、並びに骨欠如、炎症性疼痛、過敏症（気道過敏症及び皮膚過敏症の双方を含む）及びアレルギーを含む炎症状態及びリウマチ疾患を含むリウマチ疾患である。特定の自己免疫疾患は、自己免疫の血液学的疾患（例えば溶血性貧血、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血及び突発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨症、ヴェグナー肉芽腫症、真菌性皮膚疾患、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸、クローン病及び過敏性腸症候群を含む）、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎及び春に起こる角結膜炎、間質性肺線維症、並びに腎炎（例えば突発性ネフローゼ症候群又は微小病変症を含む、ネフローゼ症候群を有する及び有さない）；同種移植片拒絶もしくは異種移植片拒絶又は移植片対宿主疾患、及び臓器移植に関連する動脈硬化を含む移植片拒絶（例えば、心臓、肺、心臓−肺の混合型、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、又は角膜移植を含む移植において）；アテローム性動脈硬化；皮膚又は臓器の白血球浸潤を伴う癌；血管の介入から生じる狭窄又は再狭窄を含む、血管系、特に動脈、例えば冠動脈の狭窄又は再狭窄、及び新生内膜増殖；並びに虚血再灌流障害、造血器腫瘍、サイトカイン誘導毒性（例えば敗血症性ショック又は内毒素性ショック）、多発性筋炎、皮膚筋炎、及びサルコイドーシスを含む肉芽腫疾患を含む炎症性反応を含む疾患又は状態である。
【００５７】
好ましくは、前記の炎症性疾患は、リウマチ様関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、心筋梗塞、鬱血性心不全又は虚血再灌流障害を含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＭＣＰ−１突然変異体の配列を示す図（野生型ケモトキシンに対する突然変異には下線を付す）
【図２】天然のグリコサミドグリカンリガンドであるへパラン硫酸に対するＭＣＰ−１およびＭＣＰ−１突然変異体のアフィニティーを示すグラフ図（解離定数Ｋｄとして表す）
【図３】未分画へパラン硫酸に対するｗｔＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、Ｍｅｔ−ＭＣＰ−１（Ｙ１３ＡＳ２１Ｋ）およびＭｅｔ−ＭＣＰ−１（Ｙ１３ＡＳ２１ＫＱ２３Ｒ）の表面プラズモン共鳴分析−結合を示すグラフ図
【００５９】
以下の実施例は、本発明の内容を制限することなしに本発明を詳細に記載する。
【００６０】
実施例
突然変異体について、以下の試験をおこなう。
【００６１】
−  等温蛍光滴定法（ＩＦＴｓ）により、グリコサミノグリカンリガンド、たとえばへパラン硫酸に対する増加した結合アフィニティーを調べる。この方法が、非固定化リガンドを基礎とすることから、この結果は、以下に概略を示すＳＰＲ法に対して相補的である。
【００６２】
−  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験により、野生型タンパク質に対するその改善された結合アフィニティーならびにその改善された結合動態を、野生型タンパク質に対して調べる。この目的のために、潜在的ＧＡＧリガンド（へパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸）は、ＳＰＲチップ上に固定化され、かつ定流試験において干渉を定量化する。
【００６３】
−  蛍光標識されたｗｔＭＣＰ−１ならびにさらなるケモカインを使用する競合試験において、新規ＭＣＰ−１突然変異体のすでに存在するＭＣＰ−１突然変異体および野生型に対する競合的利点を調べる。
【００６４】
実施例1
ＷＴ  ＭＣＰ−１のための遺伝子は、Ｅ．Ｃｏｌｉ中での発現のために最適なコドン使用量を含む標準化された遺伝子合成技術により構築され、かつｐＪＥｘｐｅｓｓ４１１ベクター（１）中にクローニングした。ベクターの特徴は、高いレベルのＴ７プロモーター、Ｅ．Ｃｏｌｉ中の遺伝子のＩＰＴＧ−誘導型発現およびＥ．Ｃｏｌｉの選択のためのカナマイシン耐性マーカーを含むことである。それぞれの突然変異体は、デノボ合成により、相当する遺伝子中に導入され、かつｐＪＥｘｐｅｓｓ４１１ベクター中に再度組み込まれた。このコンストラクトは、タンパク質発現前にＤＮＡシークエンシングによってチェックされた。ＭＣＰ−１突然変異遺伝子を含有するｐＪＥｘｐｅｓｓ４１１プラスミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１−ＤＥ３中に形質転換された。出発培養物が調製され、かつタンパク質発現のために使用された。培養物は、３Ｌの三角フラスコ中で、３７℃で、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢブロス中で振とうしながら、ＯＤ６００が０．８になるまで培養した。タンパク質発現は、１．０ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加によって導いた。細胞は、さらに３〜４時間に亘って振とうしながらインキュベートし、かつ１０〜１５分に亘って６０００×ｇで遠心分離によりハーベストした。それぞれ湿った細胞ペレット１ｇを、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を含有する４ｍｌの溶液バッファーに再懸濁し、かつ、氷上で超音波により分断した。ライセートを、２０分に亘って２００００×ｇで４℃での遠心分離によって洗浄した。封入体ペレットを、湿った細胞１ｇあたり１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、６Ｍのグアニジン塩酸塩を含有する１０ｍｌの溶液バッファー中で、３時間に亘って室温で攪拌しながら溶解した。２０分に亘って２００００×ｇで４℃での遠心分離後に、上清を１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）に対して４℃で透析した。沈殿物をスピンダウンさせ、かつ溶液をＳＰ−セファロース高性能カラム（Amerscham Bioscience）上に装填した。突然変異体を１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）から１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌからなる線形勾配で７５分に亘って２ｍｌ／分の流速で溶出し、ＭＣＰ−１突然変異体を０．６〜０．８ＭのＮａＣｌで溶出した。ピーク画分をプールし、かつ逆相ＨＰＬＣによりＣ１８カラム上で精製した。突然変異体を、非線形勾配で溶出した：１０％〜４０％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）で５分、４０％〜６０％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）で２０分および６０〜９０％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡ）で５分、その際、流速は１０ｍｌ／分であった。タンパク質は４８±５％のアセトニトリルを溶出し、かつ前記に示すようにＳＰ−セファロース高性能カラム上にこれらを装填することによって再生した。ピーク画分を、ＰＢＳに対して透析し、かつ１ｍｌ／ｍｌに濃縮した。ＭＣＰ−１突然変異体の純度および同定を、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびナノ−ＨＰＬＣＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳでそれぞれ確認した。
【００６５】
蛍光分光分析法−定常状態の蛍光測定を、Jasco FP6500 spectrofluorimeter(Japan)LS50B蛍光計上で実施し、かつprogram Origin(Microcal Inc., Northampton, MA)を用いて分析した。温度を、すべての試験中で外部の水浴と連結させることによって２０℃に維持した。
【００６６】
等温蛍光滴定試験（ＩＦＴ）−ＰＢＳ中のそれぞれの突然変異体１μＭの溶液の発光スペクトルを３００〜４００ｎｍの範囲で、２８２ｎｍの励起上で記録した。励起および発光スリット幅を、それぞれ３ｎｍおよび５ｎｍに設定した。スペクトルを５００ｎｍ／分の速度で記録した。ＧＡＧアリコートを添加し、引き続いて、次のスペクトルが記録される前に１分の平衡化時間を置いた。バックグランドを減じた後にスペクトルを積算し、かつ３個の独立した試験から得られた蛍光強度中の正規化平均変化率（normalized mean changes）（−ΔＦ／Ｆ０）を相加平均し、かつ添加したリガンドの容積修正濃度に対してプロットした。得られる結合等温線を、その他の文献でも示すような二分子反応を示す反応式に対して、非線形回帰により分析した。
【００６７】
結果は図２に示す。
【００６８】
実施例２
表面プラズモン共鳴分析−未分画へパラン硫酸に対するｗｔＭＣＰ−１／ＣＣＬ２および本発明によるＭＣＰ−１突然変異体の結合を、BlAcore X100装置(BlAcore AB, Uppsala, Sweden)上で試験した。ビオチン化ヘパリンのストレプトアビジン被覆されたＳＡセンサチップ上への固定化を、近年確立されたプロトコールに従って実施した。正味の結合相互作用を２５℃で、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｍ２０サーファクタント（BlAcore AB）を含有するＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）中で記録した。異なるタンパク質濃度の１５分のインジェクションを３０μｌ／分の流速で６０ｓ〜１２０ｓの接触時間で実施し、引き続いて、緩衝液中で６０ｓ〜１２０ｓの解離時間で、かつ１Ｍの塩化ナトリウムのパルスで完全な再生に導いた。それぞれのセンサーグラムのプラトーに相当する、ＧＡＧ表面に対するタンパク質結合の最大の応答シグナルは、スカッチャードプロット分析及び平衡解離定数の算定のために使用した。試験はすべて、１ｎＭ〜１．５μＭの範囲のタンパク質濃度で実施した。ＢＩＡ評価ソフトウエアを用いて、１：１の定常状態相互作用モデルにしたがっての解離段階を別個にフィッティングすることにより解離速度定数（koffs）を算定した。
【００６９】
結果を図３に示す。
【００７０】
実施例３
チオグリコレート誘発腹膜炎モデルにおける炎症性単球浸潤上でのＭＣＰ−１突然変異体の抑制効果
マウスにおけるチオグリコレート（ＴＧ）誘発腹膜炎モデルは、急性炎症モデルであって、ＴＧ注入後約１６〜２４時間をピークとする、単球／マクロファージ浸潤により特徴付けられる。
【００７１】
したがって、in vivoでの抗単球遊走活性を評価するためにこのモデルを選択することができる。
【００７２】
滅菌済みチオグリコレート培地（４％）の１ｍＬを、１μｇまたは５０μｇ／マウスのＭＣＰ−１突然変異タンパク質の存在下また不在下で、腹腔内（i.p.）注入し、かつ洗浄液を１６時間後にハーベストし、かつフローサイトメトリーで分析した。
【００７３】
実施例４
ＭＣＰ−１突然変異体による試験的自動免疫ブドウ膜炎の改善
ブドウ膜炎は、眼内部の炎症性自動免疫疾患であり、工業国における失明の主要原因の一つである。ブドウ膜炎の動物モデルはヒトの疾患と多くの特徴を共有し、したがって、ブドウ膜炎の病理を理解するための助けとなり、かつ、新規治療方法および処方の評価および導入を可能にする。
【００７４】
ルイスラットにおける試験的自動免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）は、網膜抗原に対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞によって介在される。これらは目に入るやいなやサイトカインおよびケモカインを分泌し、眼に白血球を引き寄せる。これらの炎症性浸潤、主に単球／マクロファージが、細胞間組織の損傷の原因となる。
【００７５】
したがって、ＭＣＰ−１突然変異体の効果は、自動免疫ブドウ膜炎の試験ラットモデルにおいて試験される。急性炎症は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）中で双方の後ろ足に、胎児網膜Ｓ−抗原由来のブドウ膜炎性ペプチドＰＤＳＡｇの適用されることによって達成され、かつ、マイクバクテリウムツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis)菌株Ｈ３７ＲＡで強化される。これは引き続いて眼に遊走し、かつ浸潤するＴ細胞の最初の活性化を導く。この現象は、免疫化後８日前後に生じはじめる。５個体のルイスラット群を、ＭＣＰ−１突然変異体で、ＰＢＳ中に溶解された１００μｇ／動物の用量で、あるいはＰＢＳのみで、能動免疫後第１日から第２２日まで毎日ＩＰ注射することにより処理した。疾患の時間的経過は、オプタルモスコープ（ophthalmoscope）を用いて動物を日々試験し、かつブドウ膜炎は、両眼／動物群／日の平均臨床的スコアとして臨床的に等級付けした。
【００７６】
実施例５
ＭＣＰ突然変異体によるapoE-/-マウスの再狭窄のパラメータの改善
心筋梗塞の臨床的症状発現を伴うアテローム性動脈硬化症は、ほとんど世界的な死亡原因である。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の慢性炎症性疾患であり、そのレクリートメントおよび活性化を増強させるサイトカインおよびケモカインを放出する、単核細胞の流入によって特徴付けられる。したがって、欠陥のある単球レクリートメントは、将来的臨床的アプローチのための重要な治療ターゲットを示しうる。
【００７７】
apoE-/-マウスにおけるアテローム性動脈硬化症のすべての徴候に強い影響を与える、ＭＣＰ−１突然変異体の能力について試験する。
【００７８】
アテローム発生食におけるマウスについて、総頸動脈の針金損傷モデルにし、かつ内皮露出は、血管に沿っての３回のパスによって達成することができる。このマウスを、ＰＢＳ中に溶解された１０μｇのＭＣＰ−１突然変異体またはビヒクル（ＰＢＳ）で、腹腔内（i.p.）処理し、損傷の一日前およびその後３週間に亘って毎日処理をした。３週間後に頸動脈を、４％パラホルムアルデヒドでのｉｎｓｉｔｕ灌流固定後に切断し、かつ、パラフィン包埋を行う。
【００７９】
同時に、頸動脈を異なる動物において露出後２４時間、シリンジポンプを用いて、ＭＯＰＳ緩衝生理学的食塩溶液でex vivo灌流するために単離した。単球ＭｏｎｏＭａｃ６細胞（５００，０００／ｍＬ）を、カルセイン−ＡＭ（分子プローブ）で標識化し、かつ１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのＭＣＰ−１突然変異体タンパクで頸動脈をプレインキュベーションした後に５μＬ／分で灌流した。損傷した血管壁（拘束、圧延）に対するＭｏｎｏＭａｃ６付着性相互作用は、ストロボ式エピフルオレセンス照明を用いて記録する。
【００８０】
実施例６
ＭＣＰ−１突然変異体による心筋梗塞のパラメータの改善
心筋梗塞（ＭＩ）のマウスモデルにおけるＭＣＰ−１突然変異タンパク質活性についてのさらなる試験をおこなった。さらに心筋梗塞は、サイトカインおよびケモカイン増加によって特徴付けられる複雑な炎症反応を導き、これは、虚血部位での単球レクリートメントを招く。欠陥のある単球浸潤を有する動物モデルにおける研究は、心筋梗塞の試験的誘発後の新生内膜形成の減少および保存された心機能を示す。
【００８１】
ＭＩは、マウスの対照群およびＭＣＰ−１突然変異タンパク質処理群で、左側前大腿部下行動脈（left anterior descending artery）の近位の３０分の結紮により誘発する。１０、５および１μｇの用量での突然変異体ＭＣＰ−１を、ＩＰ１０分および術後２時間で提供し、かつ７日間に亘る毎日の処理によって実施することができる（群の大きさ：ｎ＝５）。
【００８２】
実施例７
多発性硬化症の動物モデルにおけるＭＣＰ−１突然変異体の効果
多発性硬化症（ＭＳ）は、ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）の最も一般的な炎症性脱髄疾患である。ＭＳ病理は、血液−脳関門（ＢＢＢ）の分断によって特徴付けられ、ＣＮＳへのマクロファージおよびＴリンパ球の浸潤を伴う。これら細胞のＣＮＳ柔組織への遊走は、ケモカインにより少なくとも部分的に調整されているようであり、特に、ＭＣＰ−１は主要な役割を示すものと考えられる。
【００８３】
ＭＳにおけるＭＣＰ−１およびＣＣＲ２の発現および細胞局在化は、３個のコンパートメント中で示された：脳、脳脊髄液および血液
特に重要であるのは、活性化された脱髄ならびに慢性の活性化されたＭＳ病変において、反応性の肥厚性神経膠星状細胞が、ＭＣＰ−１に関して強力に免疫活性的であるという報告された観察であり、これは、レクリートメントにおけるＭＣＰ−１の顕著な役割及びミエリン崩壊マクロファージの活性化を示唆し、かつそれによってＭＳの発生に寄与する。同様の研究において、脈管周囲のマクロファージおよび実質内泡沫状マクロファージは、ＭＣＰ−１タンパク質を発現しない。泡沫状マクロファージは、抗炎症性Ｍ２マクロファージと類似の表現型を示し、これは同様に炎症の消散に寄与し、したがってさらなる病変発生の抑制および病変修復の促進のための重要な役割を有しうる。したがって、ＭＣＰ−１を標的とする治療的アプローチは炎症性Ｍ１に特異的であっても、抗炎症性／修復Ｍ２マクロファージに悪影響を及ぼすものではない。
【００８４】
ＭＣＰ−１突然変異タンパク質は、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス中でラット−ＭＯＧ３５−５５誘発慢性ＥＡＥを試験することができる。腹腔内経路による４０、２００および４００μｇ／ｋｇでの処理（約１、５および１０μｇ／マウス）は、免疫後第７日目において開始し、病理における臨床的徴候は存在しないが、しかしながら循環する１種または複数種のケモカイン（ＪＥを含む：マウスＭＣＰ−１）の増加がすでに報告された場合には２１日間に亘って継続させる。突然変異体ＭＣＰ−１と同様の投与経路および処方で投与されたデキサメタゾン１ｍｇ／ｋｇは、参考化合物として使用することができる。
【００８５】
体重および臨床スコアは、動物が良好に生存しており、かつ疾病の経過の程度を評価するために毎日モニタリングする。脊髄および脳を捕集し、臨床スコア（ＴＢＡ）上でのポジティブな効果に基づく炎症性浸潤および脱髄における治療効果を評価するために、組織学的分析を行う。追試は、再発緩解ＥＺＥモデル中で保存的／減少した再発率および重症度におけるＭＣＰ−１突然変異体の活性を評価するために実施することができる。この目的のために、ＭＣＰ−１突然変異タンパク質は、ＰＬＰ−ＳＪＬマウス再発緩解ＥＡＥモデルにおいて毎日投与することができる。毎日の読出しおよび終点は前試験と同様であるが、しかしながら再発および緩解の数および期間をさらに算定することができる。
【図１】
2012516143.tif 000007
【図２】
2012516143.tif 000008
【図３】
2012516143.tif 000009
【配列表】
2012516143000001.app
【国際調査報告】
2012516143.tif 000010
2012516143.tif 000011
2012516143.tif 000012
2012516143.tif 000013
2012516143.tif 000014