(57)【要約】  本発明は、広く、有機化学、生化学、薬理学、及び医学に関する。より詳しくは、本発明はプロテインキナーゼ（「ＰＫｓ」）、特にタンパク質チロシンキナーゼの活性を調節することによって、異常なＰＫ活性に関連する疾患に対して有益な効果が期待される、３−ベンジリデン−インドリン−２−オン誘導体及びこれらの生理的に許容される塩及びプロドラッグに関する。本発明はさらに、がんなどのタンパク質キナーゼ介在性疾患及び疾病の緩和、予防及び／又は治療のための、単独で、又は他の治療薬との併用での、これらの化合物の使用を対象とする。
2012505880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式Iの化合物、又はこれの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグであって、
【化１】
2012505880.tif 000023
ここで、
Ｒ１とＲ２は、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキニル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、及びトリハロメチルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、
ｍは整数１、及びｎは整数１又は２であり、
ｍとｎがそれぞれ１の場合、Ｒ１は環Ａの６位、及びＲ２は環Ｂの２’、３’又は４’位であり、
ｍが１でｎが２の場合、Ｒ１は環Ａの６位、及びＲ２は環Ｂの３’及び４’位である、化合物。
【請求項２】
それぞれのＲ１が、ハロゲン及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群より独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
それぞれのＲ１が、ブロモ、クロロ、フルオロ及びメトキシからなる群より独立して選択される、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
それぞれのＲ２が、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシル、及びトリハロメチルからなる群より独立して選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
それぞれのＲ２が、メトキシ、エトキシ、ヒドロキシル、及びトリフルオロメチルからなる群より独立して選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物は化学式Ｉａの構造を有し、
【化２】
2012505880.tif 000024
ここで、ｍとｎが共に１の場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つであり、
ここで、ｍが１でｎが２の場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つである、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、
６−フルオロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、及び
６−メトキシ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が、６−クロロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オンである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
化学式ＩＩの化合物、又はこれの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグであって、
【化３】
2012505880.tif 000025
ここで、
Ｘは、Ｆ、Ｂｒ、又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、
それぞれのＲ３は、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキニル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、及びトリハロメチルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、
ｏは整数１又は２であり、
ｏが１の場合、Ｒ３は環Ｂの３’又は４’位であり、
ｏが２の場合、Ｒ３は環Ｂの３’及び４’位である、化合物。
【請求項１０】
それぞれのＲ３が、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、及びトリハロメチルからなる群より独立して選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
それぞれのＲ３が、メトキシ、ヒドロキシル、及びトリフルオロメチルからなる群より独立して選択される、請求項９又は１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘがメトキシ又はエトキシである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記化合物が化学式ＩＩａを有し、
【化４】
2012505880.tif 000026
ここで、ｎが１の場合、Ｒ３は、３’−Ｆ，３’−Ｃｌ，３’−Ｂｒ，３’−ＯＣＨ３；３’−ＯＨ；４’−ＯＣＨ３；３’ＣＦ３，４’−Ｆ，４’−Ｃｌ，４’−Ｂｒ，４’−ＯＣＨ３；４’−ＯＨ；３’−ＯＣＨ３，及び４’−ＣＦ３からなる群より選択される１つであり、
ここで、ｎが２の場合、Ｒ３は３’−Ｆ，３’−Ｃｌ，３’−Ｂｒ，３’−ＯＣＨ３；３’−ＯＨ；４’−ＯＣＨ３；３’ＣＦ３，４’−Ｆ，４’−Ｃｌ，４’−Ｂｒ，４’−ＯＣＨ３；４’−ＯＨ；３’−ＯＣＨ３，及び４’−ＣＦ３からなる群より選択される１つである、
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記化合物が、
５−クロロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
５−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
５−クロロ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、及び
５−クロロ−３−（３’トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
からなる群より選択される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
化学式Ｉ又はＩＩの化合物を調製する方法であって、塩基の存在下で、化学式（ＩＩＩ）のオキシインドールを、化学式（ＩＶ）のアルデヒドと反応させることを含む、方法。
【化５】
2012505880.tif 000027
【化６】
2012505880.tif 000028
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物、又は塩、又はプロドラッグと、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
追加の薬剤又は薬物をさらに含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
タンパク質キナーゼの触媒活性を調節する方法であって、前記タンパク質キナーゼを、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の前記化合物、塩又はプロドラッグと接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
前記タンパク質キナーゼは、タンパク質チロシンキナーゼを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質チロシンキナーゼは、受容体タンパク質チロシンキナーゼを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記受容体タンパク質チロシンキナーゼは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲ、ＣＳＦＩＲ、Ｃ−Ｋｉｔ、Ｃ−ｆｍｓ、Ｆｌｋ−１Ｒ、Ｆｌｋ４、ＫＤＲ／Ｆｌｋ１、Ｆｌｔ−１、ＦＧＦＲ−１Ｒ、ＦＧＦＲ−２Ｒ、ＦＧＦＲ−３Ｒ、ＦＧＦＲ−４Ｒ、ＥｐｈＡ２、及びＴｙｒｏ３からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患を治療又は予防するための方法であって、薬学的に有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
前記患者が哺乳類、好ましくはヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患は、受容体タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患が、ＩＧＦ−１Ｒ関連疾患である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＩＧＦ−１Ｒ関連疾患が癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患が、肝細胞癌、乳癌、大腸癌及び肺癌からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患は肝細胞癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
肝細胞癌に対して特異的な効果を有するタンパク質キナーゼ阻害剤を同定するための方法であって、
（ｉ）候補化合物を肝細胞癌細胞株と培養すること、
（ｉｉ）細胞生存度を測定すること、
（ｉｉｉ）正常な肝細胞株に対する前記候補化合物の効果と、測定された前記細胞生存度とを比較して、肝細胞癌細胞に対して特異的な活性を有する化合物を同定すること
を含む、方法。
【請求項３０】
前記肝細胞癌細胞株は、ＨｅｐＧ２及びＨｕＨ７からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２００８年１０月１４日に出願の米国仮出願番号第６１／１０５，２０６号と２００９年１月１９日に出願の米国仮出願番号第６１／１４５，５９５号の優先権の利益を主張し、両方の出願の内容はすべての目的のために全体が参照により本出願に包含される。
【０００２】
本発明は、広く、有機化学、生化学、薬理学、及び医学に関する。より詳しくは、本発明はプロテインキナーゼ（「ＰＫｓ」）、特にタンパク質チロシンキナーゼの活性を調節することによって、異常なＰＫ活性に関連する疾患に対して有益な効果が期待される、３−ベンジリデン−インドリン−２−オン誘導体及びこれらの生理的に許容される塩及びプロドラッグに関する。本発明はさらに、がんなどのタンパク質キナーゼ介在性疾患及び疾病の緩和、予防及び／又は治療のための、単独で、又は他の治療薬との併用での、これらの化合物の使用を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
調節されていないタンパク質キナーゼのシグナル伝達に関連する疾患を治療するためのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の使用は、過去２０年間にわたる大規模な研究の対象となっている。たとえば、ガンなどの細胞増殖的性疾患、アテローム性動脈硬化症、関節炎、再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏｎｓｉｓ）、及び糖尿病のような代謝性疾患を含む疾患の治療に有用なインドリノン化合物の使用は、米国特許第６，１４７，１０６号に記載された。
【０００４】
ＴＫＩｓは、進歩しつつあるガンを含むチロシンキナーゼ関連疾患に対する標的療法の分野における、一般的に重要な薬剤である。従来、これらの適用の基本機序は、腫瘍形成、すなわちがん遺伝子中毒を促進するための排他的なシグナルを提供する、慢性骨髄性白血病におけるＢｃｒ−ａｂｌ転位、又は乳がんにおけるＨＥＲ２増幅などの、単一の遺伝子損傷（ｍｏｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ）に依存している（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＩＢ．  Ｃａｎｃｅｒ．  Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ−ｔｈｅ  Ａｃｈｉｌｌｅｓ  ｈｅａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  Ｊｕｌ  ５；２９７（５５７８）：６３−６４）。しかし、山のような証拠は、多くの悪性腫瘍に対するキナーゼ変異が、ゲノム中の特定の「ホットスポット」上に集中するよりはむしろ、散発的であることを示唆している（Ｂｌｅｅｋｅｒ  ＦＥ，  Ｂａｒｄｅｌｌｉ  Ａ．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒｓ：  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００７  Ｄｅｃ；８（１２）：１６２９−１６３３；  Ｇｒｅｅｎｍａｎ  Ｃ，  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｐ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｒ，  ＤａｌＧｌｉｅｓｈ  ＧＬ，  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｃ，  Ｂｉｇｎｅｌｌ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７  Ｍａｒ  8；４４６（７１３２）：１５３−１５８；  Ｒｕｈｅ  ＪＥ，  Ｓｔｒｅｉｔ  Ｓ，  Ｈａｒｔ  Ｓ，  Ｗｏｎｇ  ＣＨ，  Ｓｐｅｃｈｔ  Ｋ，  Ｋｎｙａｚｅｖ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７  Ｄｅｃ  1；６７（２３）：１１３６８−１１３７６；  Ｔｈｏｍａｓ  ＲＫ，  Ｂａｋｅｒ  ＡＣ，  Ｄｅｂｉａｓｉ  ＲＭ，  Ｗｉｎｃｋｌｅｒ  Ｗ，  Ｌａｆｒａｍｂｏｉｓｅ  Ｔ，  Ｌｉｎ  ＷＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００７  Ｍａｒ；３９（３）：３４７−３５１）。これは、病気開始と進行のための潜在的な伝達機構（ｄｒｉｖｅｒ）が、おそらく、単剤療法の効果を弱体化させる複数の発癌性欠陥を含むことを意味する。さらに、最近の研究も、レセプターのクロストークが広汎的であり、かつ、腫瘍が発癌性依存を変える手段を提供することを証明した。例えば、ＭＥＴ増幅は、ＥＧＦＲ阻害に抵抗性の非小細胞肺癌で示され（Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ＪＡ，  Ｚｅｊｎｕｌｌａｈｕ  Ｋ，  Ｍｉｔｓｕｄｏｍｉ  Ｔ，  Ｓｏｎｇ  Ｙ，  Ｈｙｌａｎｄ  Ｃ，  Ｐａｒｋ  ＪＯ，  ｅｔ  ａｌ．  ＭＥＴ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＥＲＢＢ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７  Ｍａｙ  １８；３１６（５８２７）：１０３９−１０４３）、ＩＧ��−１Ｒシグナリングも上方制御されて、エルロチニブに起因する成長停止を回避した（Ｂｕｃｋ  Ｅ，  Ｅｙｚａｇｕｉｒｒｅ  Ａ，  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｍ，  Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｓ，  Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ  Ｍ，  Ｂａｒｒ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  Ｏｃｔ  １５；６８（２０）：８３２２−８３３２）。その結果、複数のキナーゼを標的とすることは、慢性治療において化学療法抵抗性につながる、他のキナーゼを使用する発生率をおそらく減らす（Ｐｅｔｒｅｌｌｉ  Ａ，  Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｓ．  Ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｔｏ  ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｗｈｅｎ  ａｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｅｃｏｍｅｓ  ａｎ  ａｄｖａｎｔａｇｅ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；  １５（５）：４２２−４３２；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＩＢ，Ｊｏｅ  Ａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  Ｍａｙ  １；６８（９）：３０７７−３０８０）。
【０００５】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、細胞シグナリングにおける明白な病気を引き起こす活性化突然変異が分かりにくいままのガンの例である。いくつかのチロシンキナーゼは、ＨＣＣの発生及び増殖に結びつくことが報告されている。たとえば、ＦＡＫ、ＰＹＫ２、ＩＧＦ−１ＲとＦＧＦＲ３の過剰発現は、別々に報告され、かつ疾患重症度の一因となり得る（Ｉｔｏｈ  Ｓ，Ｍａｅｄａ  Ｔ，Ｓｈｉｍａｄａ  Ｍ，Ａｉｓｈｉｍａ  Ｓ，Ｓｈｉｒａｂｅ  Ｋ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４  Ａｐｒ  １５；１０（８）：２８１２−２８１７；Ｑｉｕ  ＷＨ，Ｚｈｏｕ  ＢＳ，Ｃｈｕ  ＰＧ，Ｃｈｅｎ  ＷＧ，Ｃｈｕｎｇ  Ｃ，Ｓｈｉｈ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００５  Ｓｅｐ  １４；１１（３４）：５２６６−５２７２；Ｓｃｈａｒｆ  ＪＧ，Ｂｒａｕｌｋｅ  Ｔ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＧＦ  ａｘｉｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  ２００３  Ｎｏｖ；３５（１１−１２）：６８５−６９３；Ｓｕｎ  ＣＫ，Ｎｇ  ＫＴ，Ｓｕｎ  ＢＳ，Ｈｏ  ＪＷ，Ｌｅｅ  ＴＫ，  Ｎｇ  I，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ２（Ｐｙｋ２）ｏｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７  Ｊｕｌ  ２；９７（１）：５０−５７）。ごく最近、ＨＣＣ患者のおよそ３分の１で、正常から腫瘍への移行において、ＦＧＦＲ４の上昇が報告され、かつこれとＡＦＰ制御との潜在的な関連性が証明された（Ｈｏ  ＨＫ，Ｐｏｋ  Ｓ，Ｓｔｒｅｉｔ  Ｓ，Ｒｕｈｅ  ＪＥ，Ｈａｒｔ  Ｓ，Ｌｉｍ  ＫＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２００９  Ｊａｎ；５０（１）：１１８−１２７）。現在、ＨＣＣにおけるＴＫＩｓの臨床試験は、当初は他の病気のために設計された、承認された薬剤又は試験用の薬剤の経験的な使用法を採用する。当然のことながら、これらは病気に関係する特定のチロシンキナーゼを必ずしも標的としているわけではなかったので、これらの試験からは限界的な効果（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）しか得られなかった。例えば、切除不能なＨＣＣにおけるイマチニブ及びエルロ��ニブのフェーズＩＩ臨床研究は、参加した大多数の患者が病気の進行を示し、かつ患者のだれもが完全寛解又は部分寛解さえも示さず、期待外れの反応を示した（Ｌｉｎ  ＡＹ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＧＡ，Ｓｏ  Ｓ，Ｔａｎｇ  Ｃ，Ｌｅｖｉｔｔ  Ｌ．  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８  Ｆｅｂ；３１（ｌ）：８４−８８；Ｔｈｏｍａｓ  ＭＢ，Ｃｈａｄｈａ  Ｒ，Ｇｌｏｖｅｒ  Ｋ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｊ，Ｂｒｏｗｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  ２  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００７  Ｓｅｐ  １；１１０（５）：１０５９−１０６７）。
【０００６】
ＶＥＧＦＲｓ、ＰＤＧＦＲｓ、ＲＥＴ、ｃ−Ｋｉｔ並びにＲａｆキナーゼに関してマイクロモル以下の阻害効果を有するマルチ−ターゲティングＴＫＩであるソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（商品名））が、２００７年にＨＣＣ治療に関してＦＤＡに承認され（Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｄ，Ｋｅａｔｉｎｇ  ＧＭ．Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ：  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｄｒｕｇｓ  ２００８；６８（２）：２５１−２５８）、そして、もう一つのマルチ−ターゲティングＴＫＩであるスニチニブの治験が現在進行中であるが（Ｚｈｕ  ＡＸ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｒａｆｅｎｉｂ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００８  Ｊａｎ  １５；１１２（２）：２５０−２５９）、当技術分野において、ガンに対して目的とした効果を有する、強力な広いスペクトルのＴＫＩｓの必要性が残っている。
【０００７】
この必要性は、本発明の化合物と、これらの薬学的な使用によって解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、プロテインキナーゼ（「ＰＫｓ」）の活性を調節し、従ってガンなどの異常なＰＫ活性に関連した疾病に対して有益な効果が期待されている、３−ベンジリデン−インドリン−２−オン誘導体と、これらの生理的に許容される塩及びプロドラッグを対象とする。
【０００９】
第１の態様において、本発明は化学式Ｉの化合物、又はこれの薬学的に許容される塩又はそのプロドラッグを対象とする。
【化１】
2012505880.tif 000003
（ここで、
それぞれのＲ１とＲ２は、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、非置換又は置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、非置換又は置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、及びトリハロメチルからなる群より独立して選択され、
ｍは整数1、及び、ｎは整数1又は２であり、
mとnがそれぞれ1の場合、Ｒ１は環Ａの６位、及び、Ｒ２は環Bの２’、３’又は４’位であり、
mが1でnが2の場合、Ｒ１は環Ａの６位、及びＲ２は環Bの３’又は４’位である。）
【００１０】
別の態様において、本発明は化学式ＩＩの化合物、又は薬学的に許容される塩又はそのプロドラッグを対象とする。
【化２】
2012505880.tif 000004
（ここで、
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、
それぞれのＲ３は、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、非置換又は置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、非置換又は置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、及びトリハロメチルからなる群より独立して選択され、
ｏは整数1又は２であり、
ｏが1の場合、Ｒ３は環Bの３’又は４’位であり、
ｏが2の場合、Ｒ３は環Bの３’又は４’位である。）
【００１１】
さらなる態様において、本発明は化学式I又はIIの化合物を調製する方法を対象とし、該方法は、塩基の存在下で、化学式IIIのオキシインドールを、化学式ＩＶのアルデヒドと反応させることを含む。
【化３】
2012505880.tif 000005
【化４】
2012505880.tif 000006
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の化合物又は塩又はプロドラッグと、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む、医薬品組成物を対象とする。
【００１３】
別の態様において、本発明は、タンパク質キナーゼの触媒活性を調節するための方法を対象とし、該方法は、該タンパク質キナーゼと、本発明の少なくとも1つの化合物、塩又はプロドラッグとを接触させることを含む。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明はタンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病の治療又は予防のための方法に関連し、薬学的に有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与するを含む。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は肝細胞癌に対して特異的な効果を有するタンパク質キナーゼ阻害剤を同定するための方法を対象とし、
（ｉ）候補化合物を肝細胞癌細胞株と培養すること、
（ｉｉ）細胞生存度を測定すること、
（ｉｉｉ）正常な肝細胞系に対する前記候補化合物の効果と、測定された細胞生存度とを比較して、肝細胞癌細胞に対して特異的な活性を有する化合物を同定すること、を含む。
【００１６】
本発明は、以下の発明の詳細な説明で、そして、以下の図面の簡単な説明に関して、さらに開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図ＩＡとＩＢは、Ｇ１−ブロック（図ＩＡ）とＧ２−ブロック（図ＩＢ）から遊離した、ＨＣＴ１１６細胞における本発明の２つの例示的な化合物４６と４８の効果を示す、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）図を示す。Ｒ６、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれサブＧ１期、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期を指す。化合物４６と４８は、それぞれ１５μMと５μMで試験した（〜１．５×ＩＣ５０）。
【図２】図２は、本発明の例示的な化合物の生存度（化合物４７対スニチニブ（ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７及びＴＨＬＥ２））である。（Ａ）ＨｕＨ７、(Ｂ)ＨｅｐＧ２、及び、（Ｃ）ＴＨＬＥ２細胞は、９６穴フォーマット上に蒔かれ、そして、０〜１０μMの化合物４７（■）及びスニチニブ（●）で７２時間処理された。生存度は、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商品名）によって測定され、そして結果は未処置の対照における生細胞のパーセンテージとして、＋／−変動係数（ｎ＝８）と共に表わした。
【図３】図３は、別々のＨＣＣ細胞株のパネル上での、本発明の例示的な化合物４７の効果を示す。ＨＣＣ増殖に対する化合物４７の有効性は、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ分析により決定され、ＨＣＣ細胞株のより広いパネル上（Ｈｅｐ３Ｂ（●）、Ｈｓ８１７Ｔ（■）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（▲）、及びＳＫ−Ｈｅｐ１（▼））で試験された。
【図４】図４は、本発明の例示的な化合物、化合物４７のＨｅｐＧ２とＨｕＨ７におけるウェスタンブロット解析を示す。ＨｕＨ７又はＨｅｐＧ２細胞は、化合物４７の濃度を増やして（０、１、５又は、１０μＭ）、２４時間処理した。細胞可溶化物は回収され、そしてＨＳＰ６０をローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として、切断されたＰＡＲＰ、ホスホ−ＥｒＫ、ホスホ−Ａｋｔ、ＰＣＮＡ、サイクリンＤ１、Ｂａｘ、及びＢＣＬ−ｘＬに対してイムノブロットした。
【図５】図５は、本発明の例示的な化合物４７のＨｕＨ７とＨｅｐＧ２におけるカスパーゼ−３活性についての効果を示す。図４に記載されているように処理されたＨｕＨ７細胞（塗りつぶしあり）及びＨｅｐＧ２細胞（塗りつぶしなし）は、蛍光発生Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣの触媒加水分解によって実行されるカスパーゼ−３分析のために回収された。結果は、ＡＭＣ基質（n＝３）を用いたインキュベーション単位時間あたりの、１μｇ溶解物あたりの正規化されたＲＦＵとして表わした。
【図６】図６は、本発明の例示的な化合物４７が、ＨｕＨ７において、ＡＦＰ転写を強力に阻害することを示す。ＨｕＨ７細胞は、化合物４７（１、５、１０μM）又はスニチニブ（１０μM）で２４時間処理した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＦＰについて行った。結果として得られた平均ＣＴ値は、ハウスキーピング対照としての１８Ｓ  ｍＲＮＡに対して正規化され、そして、データは転写発現についての未処置対照に対する倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）として表わした。エラーバーは、倍率変化に変換した標準偏差（ｎ＝３）を表わす。
【図７】図７は、ＲＴＫアレイと、本発明の例示的な化合物４７のＲＴＫリン酸化についての効果を示す。血清飢餓状態のＨｕＨ７細胞を、化合物４７（１、５、１０μＭ）又はスニチニブ（１０μＭ）で、２４時間処理した。キナーゼリン酸化の変化は、ヒトのホスホＲＴＫアレイで決定した。
【図８】図８は、イムノブロットによる、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２及びＴｙｒｏ３リン酸化における、本発明の例示的な化合物４７の効果を示す。（Ａ）ＨｕＨ７細胞は、賦形剤、化合物４７（１、５又は１０μＭ）又はスニチニブ（１０μＭ）で２４時間処理した。サンプルは、ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｙ９８０及びＹ１１３５／１１３６）に対してイムノブロットした。ローディングコントロールをＨＳＰ６０とした。（Ｂ）同様に処理される細胞は、抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）でイムノブロッティングする前に、抗ＥＧＦＲ、抗ＥｐｈＡ２と抗Ｔｙｒｏ３で免疫沈降した。膜は、それぞれの抗体をローディングコントロールとして、その後再検出された。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、化学式Iの化合物を提供する：
【化５】
2012505880.tif 000007
化学式Iの化合物又は薬学的に許容される塩又はプロドラッグにおいて、置換基Ｒ１とＲ２はそれぞれ、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、非置換又は置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、非置換又は置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン及びトリハロメチルからなる群より、それぞれ独立して選択される。整数ｍは１であり、そして、整数ｎは１又は２である。したがって、ｍとｎのそれぞれが１の場合、Ｒ１は環Ａの６位であり、そして、Ｒ２は環Ｂの２’、３’又は４’位である。ｍが１でｎが２の場合、Ｒ１は環Ａの６位にあり、そして、Ｒ２は環Ｂの３’位及び４’位である。
【００１９】
化学式Ｉの化合物の別の態様において、それぞれのＲ１は、ハロゲン及びアルコキシＣ１〜Ｃ４からなる群より独立して選択される。したがって、特定の態様において、それぞれのＲ１は、ブロモ、クロロ、フルオロ、フルオロ及びメトキシからなる群より独立して選択される。
【００２０】
化学式Ｉの化合物の別の態様において、それぞれのＲ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、及びトリハロメチルからなる群より独立して選択される。特定の態様において、それぞれのＲ２は、メトキシ、エトキシ、ヒドロキシ、及びトリフルオロメチルからなる群より独立して選択される。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は化学式ＩＩの化合物を対象とする：
【化６】
2012505880.tif 000008
化学式（ＩＩ）の化合物又は薬学的に許容される塩又はプロドラッグにおいて、置換基Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣ１〜Ｃ４アルコキシである。それぞれのＲ３置換基は、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、非置換又は置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、非置換又は置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン及びトリハロメチルからなる群より独立して選択される。整数ｏは、１又は２である。したがって、ｏが１の場合、Ｒ３は環Ｂの３’又は、４’位にある。ｏが２の場合、Ｒ３は環Ｂの３’及び、４’位にある。
【００２２】
化学式ＩＩの化合物の一態様において、それぞれのＲ３はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、及びトリハロメチルからなる群より独立して選択される。特定の態様において、各々のＲ３は、メトキシ、ヒドロキシル、及びトリフルオロメチルからなる群より独立して選択される。
【００２３】
化学式ＩＩの化合物の別の態様において、Ｘはメトキシ又はエトキシであることができる。
【００２４】
本明細書で開示される化合物は、強力な抗増殖活性を有し、かつ、特にタンパク質チロシンキナーゼ活性の増加である、不適切又は異常タンパク質チロシンキナーゼの機能に関連し、又はタンパク質チロシンキナーゼの機能に関与する疾患や疾病の治療に特に有用である。従って、本発明の化合物によって治療及び／又は予防され得る疾患及び疾病は、例として、過剰増殖性障害、及び肝細胞癌、肺癌、大腸癌及び乳癌などのとガンが挙げられるが、これらの疾患及び疾病に限定されない。同時に、本発明者は、本発明の化合物が化学的予防の可能性（実施例５を参照）を提供することも見出した。このように、本明細書に開示される化合物は、癌のような異常なプロテインキナーゼ活性に関連する疾患に対して有益な効果を示すだけでなく、通常の細胞について潜在的な細胞保護作用を有する。
【００２５】
本明細書では、「アルキル」は、直鎖又は分枝鎖を含む飽和脂肪族炭化水素基を指す。好ましくは、アルキル基は１〜１０個の炭素原子を有する（本明細書中で数値範囲、例えば「１〜１０」が記載されている場合はいつでも、官能基（この場合アルキル基）は、1個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子、４個の炭素原子、５個の炭素原子、６個の炭素原子など、最大１０個までの炭素原子を含んでもよいことを意味する）。より詳しくは、アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する中程度のアルキル基、又は例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル基であってもよい。アルキル基は置換されているか、又は未置換であってもよい。置換される場合、置換基は、１つ以上の置換基、例えば１又は２の置換基であり、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、１〜４個の環原子が窒素、酸素又は硫黄から独立して選択される５〜１０員環のヘテロアリール、１〜３個の環原子が独立して窒素、酸素又は硫黄である５〜１０員環のヘテロ脂環、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、ニトロ、シリル、スルフィニル、スルホニル、アミノ、及び−ＮＲ１０Ｒ１１であって、Ｒ１０とＲ１１は、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、カルボニル、アセチル、スルホニル、アミノ、及びトリフルオロメタンスルホニル、又は、Ｒ１０とＲ１１とが、それらが結合している窒素原子と一緒に、５又は６員環を形成するヘテロ脂環からなる群より独立して選択される。
【００２６】
「シクロアルキル」基は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロブテニル、シクロペンテニル、及びシクロヘキセニルなどの、１つ又はそれ以上の環が完全共役π電子系を有さない、３〜８個の環原子の全炭素単環（すなわち、1対の隣接した炭素原子を共有する環）を指す。シクロアルキル基の例としては、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、アダマンタン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、及びシクロヘプタトリエンを含むが、これらに限定されない。シクロアルキル基は置換されているか、又は非置換であってもよい。置換されている場合、置換基は、１つ以上の置換基、例えば１つ又は２つの置換基であり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、１〜４個の環原子が、窒素、酸素又は硫黄から独立して選択される５〜１０員環のヘテロアリール、１〜３個の環原子が独立して窒素、酸素又は硫黄である５〜１０員環のヘテロ脂環、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、ニトロ、シリル、スルフィニル、スルホニル、アミノ、及び上記で定義されるＲ１０とＲ１１を有する−ＮＲ１０Ｒ１１から独立して選択される。
【００２７】
本明細書で定義される「アルケニル」基は、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル又はペンテニル及び、１−又は２−プロペニル、１−、２−又は３−ブテニルなどのこれらの構造異性体である、少なくとも2つの炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素二重結合からなるアルケニル基を指す。アルケニルは、２〜１０個の炭素原子、例えば、２〜８個の炭素原子、２〜６個の炭素原子又は２〜５個の炭素原子を含んでもよく、ここで、例えば「２〜１０」又は「Ｃ２〜Ｃ１０」などの数の範囲は、所定の範囲のそれぞれの整数を指し、例えば「Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル」は、２個の炭素原子、３個の炭素原子、４個の炭素原子、５個の炭素原子、６個の炭素原子など、最大１０個までの炭素原子を含むアルケニル基を意味する。本発明のアルケニル又はアルケン基は、置換されているか、又は非置換でもよい。置換される場合、置換基はアルキル基置換に関する上記と同じ群より選択してもよい。このような官能基の例は、エテニル、プロペニル、ブテニル、１，４−ブタジエニル、ペンテニル、ヘキセニル、４−メチル−１−ヘキセニル（４−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘ−１−ｅｎｙｌ）、４−エチル−２−メチル−１ヘキセニル（４−ｅｔｈｙｌ−２−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘ−１−ｅｎｙｌ）などを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で定義される「アルキニル」基は、アセチレン、エチニル、プロピニル、ブチニル又はペンチニル、及び上記のこれらの構造異性体である、少なくとも２つの炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素三重結合からなるアルキニル基を指す。アルキニル基は、２〜１０個の炭素原子、例えば、２〜８個の炭素原子、２〜６個の炭素原子又は２〜５個の炭素原子を含んでもよく、ここで、例えば「２〜１０」又は「Ｃ２〜Ｃ１０」などの数の範囲は、所定の範囲のそれぞれの整数を指し、例えば「Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル」は、２個の炭素原子、３個の炭素原子、４個の炭素原子、５個の炭素原子、６個の炭素原子など、最大１０個までの炭素原子を含むアルキニル基を意味する。本発明のアルキニル基は、置換されているか、又は非置換でもよい。置換される場合、置換基はアルキル基置換に関する上記と同じ群より選択してもよい。アルキン基の例は、エチニル、プロピニル、ブチニルなどを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
「アリール」基は、６〜１４個の環原子の、及び完全共役型π電子系を有する、全炭素単環基又は縮合環多環基（すなわち、隣接した一対の炭素原子を共有する環）を指す。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、及びアントラセニルであるが、これらに制限されない。アリール基は、置換されているか、又は非置換でもよい。置換される場合、置換基は、１つ以上の置換基、例えば１、２又は３つの置換基であって、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、１〜４個の環原子が、窒素、酸素又は硫黄から独立して選択される５〜１０員環のヘテロアリール、１〜３個の環原子が独立して窒素、酸素又は硫黄である５〜１０員環のヘテロ脂環、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、トリハロメチル、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、ニトロ、シリル、スルフィニル、スルホニル、アミノ、及び上記で定義されるＲ１０とＲ１１を有する−ＮＲ１０Ｒ１１から独立して選択される。好ましくは、置換基は、クロロ、フルオロ、ブロモ、メチル、エチル、ヒドロキシ、メトキシ、ニトロ、カルボキシ、メトキシカルボニル、スルホニル、又はアミノから独立して選択される。
【００３０】
「ヘテロアリール」基は、１個、２個、３個、又は４個の環原子が、窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択され、残りは炭素である、５〜１０個の環原子の単環又は縮合芳香環（すなわち、隣接した一対の原子を共有する環）を指す。ヘテロアリール基の例は、ピリジル、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イソベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノリジニル、キナゾリニル、フタラジニル（ｐｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、キノキサリニル、シンノリニル（ｃｉｎｎｎｏｌｉｎｙｌ）、ナフチリジニル（ｎａｐｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリル、５、６、７、８−テトラ−ヒドロイソキノリル、プリニル、プテリジニル、ピリジニル、ピリミジニル、カルバゾリル、キサンテニル又はベンゾキノリル（ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｌｙｌ）であるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基は、置換されているか、又は非置換でもよい。置換されている場合、置換基は、１つ以上の置換基、例えば１つ又は２つの置換基であり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、１〜４個の環原子が、窒素、酸素又は硫黄から独立して選択される５〜１０員環のヘテロアリール、１〜３個の環原子が独立して窒素、酸素又は硫黄である５〜１０員環のヘテロ脂環、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、トリハロメチル、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、ニトロ、シリル、スルフィニル、スルホニル、アミノ、及び上記で定義されるＲ１０とＲ１１とを有する−ＮＲ１０Ｒ１１から独立して選択される。好ましくは、置換基は、クロロ、フルオロ、ブロモ、メチル、エチル、ヒドロキシ、メトキシ、ニトロ、カルボキシ、メトキシカルボニル、スルホニル、又はアミノから独立して選択される。
【００３１】
「ヘテロ脂環」基は、窒素、酸素、ｎが０〜２である−Ｓ（Ｏ）ｎからなる群より選択される、１個、２個、又は３個のヘテロ原子を含み、残りは炭素である、５〜１０個の環原子の単環又は縮合芳香環を指す。該環は、１つ以上の二重結合を有してもよい。しかし、該環には完全共役π電子系がない。ヘテロ脂環基の例は、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、イミダゾリジン、テトラヒドロピリダジン、テトラヒドロフラン、チオモルホリン、テトラヒドロピリジンであるが、これらに限定されない。ヘテロ脂環は、置換されているか、又は非置換でもよい。置換される場合、置換基は１つ以上の置換基、例えば１、２、又は３つの置換基であり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、１〜４個の環原子が、窒素、酸素又は硫黄から独立して選択される５〜１０員環のヘテロアリール、１〜３個の環原子が独立して窒素、酸素又は硫黄である５〜１０員環のヘテロ脂環、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、トリハロメチル、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、ニトロ、シリル、スルフィニル、スルホニル、アミノ、及び上記で定義されるＲ１０とＲ１１とを有する−ＮＲ１０Ｒ１１から独立して選択される。好ましくは、置換基は、クロロ、フルオロ、ブロモ、メチル、エチル、ヒドロキシ、メトキシ、ニトロ、カルボキシ、メトキシカルボニル、スルホニル、又はアミノから独立して選択される。
【００３２】
「ヒドロキシル」基は、−ＯＨ基を指す。
【００３３】
本明細書中で定義される「アルコキシル」基は、−Ｏ非置換アルキル及び−Ｏ置換アルキル基を指す。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシなどを含むが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書中で定義する、「シクロアルコキシ」基は−Ｏ−シクロアルキル基を指す。1つの例は、シクロプロピルオキシである。
【００３５】
本明細書中で定義する、「アリールオキシ」基は、−Ｏ−アリールと−Ｏ−ヘテロアリール基を指す。例としては、フェノキシ、ナフチルオキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシなどを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
「メルカプト」基は、−ＳＨ基を指す。
【００３７】
本明細書中で定義する「アルキルチオ」基は、Ｓ−アルキルと−Ｓ−シクロアルキル基を指す。例としては、メチルチオ、エチルチオなどを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書中で定義する、「アリールチオ」基は、−Ｓ−アリールと−Ｓ−ヘテロアリール基を指す。例としては、フェニルチオ、ナフチルチオ、ピリジルチオ、フラニルチオなどを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書中で定義する「スルフィニル」基は、−Ｓ（Ｏ）−Ｒ”を指し、ここで、Ｒ”は、水素、ヒドロキシ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環の炭素を通して結合）、及び、ヘテロ脂環（環の炭素を通して結合）からなる群より選択される。
【００４０】
本明細書中で定義される「スルホニル」基は、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ”基を指し、ここでＲ”は水素、ヒドロキシ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環の炭素を通して結合）、ヘテロ脂環（環の炭素を通して結合）からなる群より選択される。
【００４１】
「トリハロメチル」基は、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、ジクロロフルオロメチルなどの、Ｘが本明細書中で定義したハロゲン基である、−ＣＸ３基を指す。
【００４２】
本明細書中で定義される「カルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”基を指し、ここでＲ”は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環の炭素を通して結合）とヘテロ脂環（環の炭素を通して結合）からなる群より選択される。代表的な例としては、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、ホルミル、シクロプロピルカルボニル、ピリジニルカルボニル、ピロリジン−１イルカルボニルなどを含むが、これらに限定されない。
【００４３】
「チオカルボニル」基は、本明細書で定義するＲ”を有する−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ”を指す。
【００４４】
本明細書中で同様の意味で用いられる「Ｃ−カルボキシ」と「カルボキシ」は、例えば、−ＣＯＯＨ、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどの、本明細書で定義するＲ”を有する−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ”基を指す。
【００４５】
「Ｏ−カルボキシ」基は、例えばメチルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、ベンジルカルボニルオキシなどの、本明細書で定義するＲ”を有する−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ”基を指す。
【００４６】
「アセチル」基は、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３基を指す。
【００４７】
「カルボン酸」基は、Ｒ”が水素であるＣ−カルボキシ基を指す。
【００４８】
「ハロ」又は「ハロゲン」基は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。
【００４９】
「シアノ」基は、−ＣＮ基を指す。
【００５０】
「ニトロ」基は、−ＮＯ２基を指す。
【００５１】
「Ｏ−カルバミル」基は、本明細書中で定義するＲ１０とＲ１１を有する、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１基を指す。
【００５２】
「Ｎ−カルバミル」基は、本明細書中で定義するＲ１０とＲ１１を有する、Ｒ１１ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１０−基を指す。
【００５３】
「Ｏ−チオカルバミル」基は、本明細書中で定義するＲ１０とＲ１１を有する、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１０Ｒ１１基を指す。
【００５４】
「Ｎ−チオカルバミル」グループは、本明細書中で定義するＲ１０とＲ１１を有する、Ｒ１１ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ１０−基を指す。
【００５５】
「アミノ」基は、例えば、−ＮＨ２、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルアミノ、メチルアミノなどの、Ｒ１０とＲ１１が独立して水素又は非置換の低級アルキルである、−ＮＲ１０Ｒ１１を指す。
【００５６】
「Ｃ−アミド」基は、本明細書中で定義するＲ１０とＲ１１とを有する、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１基を指す。例えば、Ｒ１０は水素又は非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、そして、Ｒ１１は、水素、必要に応じてヘテロ脂環、ヒドロキシ、又はアミノで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルである。例えば、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１は、アミノカルボニル、ジメチルアミノカルボニル、ジエチルアミノカルボニル、ジエチルアミノエチルアミノカルボニル、エチルアミノエチルアミノカルボニルなどであってもよい。
【００５７】
「Ｎ−アミド」基は、例えばアセトアミドなどの、本明細書中で定義するＲ１０とＲ１１を有する、Ｒ１１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１０−基を指す。
【００５８】
いくつかの態様において、化学式Ｉａの化合物が提供される。
【化７】
2012505880.tif 000009
ここでｍとｎの両方が１である場合、
Ｒ１は、６−Ｆ、６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’ＯＣＨ３、３’−ＯＨ、４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つであり、
ここでmが1でｎが２の場合、
Ｒ１は、６−Ｆ、６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’ＯＣＨ３、３’−ＯＨ、４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つである。
【００５９】
他の態様において、化学式ＩＩａの化合物が提供される。
【化８】
2012505880.tif 000010
ここでｎが１である場合、
Ｒ３は、３’−Ｆ、３’−Ｃｌ、３’−Ｂｒ、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ、４’−ＯＣＨ３、３’ＣＦ３、４’−Ｆ、４’−Ｃｌ、４’−Ｂｒ、４’−ＯＣＨ３、４’−ＯＨ、３’−ＯＣＨ３、及び４’ＣＦ３からなる群より選択される１つであり、
ここでｎが２である場合、
Ｒ３は、３’−Ｆ、３’−Ｃｌ、３’−Ｂｒ、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ、４’−ＯＣＨ３、３’ＣＦ３、４’−Ｆ、４’−Ｃｌ、４’−Ｂｒ、４’−ＯＣＨ３、４’−ＯＨ、３’−ＯＣＨ３及び４’ＣＦ３からなる群より選択される１つである。
【００６０】
特定の態様において、本明細書に記載される化合物は、
６−フルオロ−３−（３’−メトキシ-ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物３９と呼ぶ）、
６−フルオロ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物４１と呼ぶ）、
６−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物４２と呼ぶ）、
６−メトキシ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−ヒドロキシ−４’メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物４３と呼ぶ）、
６−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−４’メトキシ−ベンジリデン）-インドリン−２−オン（以下、化合物４４と呼ぶ）、
６−メトキシ−３−（３’−ヒドロキシ−４’メトキシ・ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物４５と呼ぶ）、
６−フルオロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物４６と呼ぶ）、
６−クロロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物４７と呼ぶ）、
６−メトキシ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物４８と呼ぶ）、
５−クロロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン（以下、化合物４０と呼ぶ）、
５−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
５−クロロ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、及び
５−クロロ−３−（３’トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン
からなる群より選択される。
【００６１】
他の態様において、本発明の化合物は、６−クロロ−３−（３’―トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オンである。
【００６２】
本発明の化合物又は薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、当技術分野で既に知られている技術と、容易に入手できる出発物質とを用いて合成することができる。本発明の化合物は、本明細書中に参照としてその全体が包含される、Ｔａｎｇ等に付与された、米国特許第６，４６９，０３２号に記載される合成方法のような、既知の技術によっても合成してもよい。したがって、本発明の化合物は、米国特許第６，４６９，０３２号の実施例５．１と実施例５．４に記載の方法Ａ又はＢによる、適切な２−インドリノン化合物を適切なアルデヒドと反応させることによって、調製することができる。
【００６３】
本発明又は薬学的に許容される塩又はプロドラッグの化合物は、実施例１のスキーム１に記載される合成スキームで得られることもできる。より詳細には、化学式Ｉ又はＩＩの化合物は、塩基の存在下で、化学式(ＩＩＩ)のオキシインドールと化学式(IV)のアルデヒドとを反応させることによって調製することができる。
【化９】
2012505880.tif 000011
【化１０】
2012505880.tif 000012
ここで、それぞれの化学式ＩＩＩとＩＶにおけるＲ１とＲ２置換基は、本明細書中の化学式Ｉ又はＩＩで定義されている。いくつかの態様において、塩基はアミン塩基を含むことができる。アミン塩基は、例えばアジリジン、ピペリジンとＮ−メチルピペリジンなどの環状アミンを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、塩基はピペリジンでありえる。
【００６４】
本明細書において、本明細書中に記載される化学式Ｉ又はＩＩの化合物は、Ｅ−異性体、Ｚ−異性体又はＥ及びＺ異性体の混合物として存在してよい。
【００６５】
本発明の化合物は、単独で、又は、他の薬理活性化合物と組み合わせて、製剤処方又は医薬組成物で投与することができる。
【００６６】
医薬品組成物に含まれてよい他の活性成分の例は、核酸アルキル化剤、ヌクレオシド類似体、アントラサイクリン、抗生物質、アロマターゼ阻害薬、葉酸拮抗薬、エストロゲン受容体修飾薬、無機ヒ酸塩、微小管阻害薬、ニトロソ尿素、破骨細胞阻害薬、プラチナ含有化合物、レチノイド、トポイソメラーゼ１阻害薬、トポイソメラーゼ２阻害薬、チミジル酸シンターゼ阻害薬、アロマターゼ阻害薬、シクロオキシゲナーゼ抑制薬、イソフラボン、チロシンキナーゼ阻害薬、成長因子、ビスホスホネート、及びモノクローナル抗体を包含するが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明の医薬品組成物に含まれてよいアルキル化剤は、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（商品名）、Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（商品名））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（商品名））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（商品名）、ＭＥＳＮＡの有無にかかわらない）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商品名）、Ｎｅｏｓａｒ（商品名））、グルホスフアミド、メルファラン／Ｌ−ＰＡＭ（Ａｌｋｅｒａｎ（商品名））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ―Ｄｏｍｅ（商品名））、及びテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）（Ｔｅｍｏｄａｒ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。具体例として、一般にシクロホスファミドとして知られている、２−ビス［（２−クロロエチル）アミノ］テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキシアザホスフォリン−２−オキシドは、ステージIIIとIVの悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、菌状息肉腫、神経芽細胞腫、卵巣腺癌、網膜芽腫、及び乳癌の治療に使用されるアルキル化剤である。
【００６８】
本発明の医薬品組成物に含まれてよいヌクレオシド類似体は、シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ（商品名））、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（商品名））、２フッ化デオキシシチジン類似体、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（商品名））、プリンの類似体、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉ-Nethol（商品名））と及びそのプロドラッグであるアザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明の医薬品組成物に含まれてもよいアントラサイクリンは、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（商品名）、Ｄｏｘｉｌ（商品名）、Ｒｕｂｅｘ（商品名））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（商品名））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（商品名））、バルルビシン（Ｖａｌｓｔａｒ（商品名））、及びエピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。１つの例として、より一般的にはドキソルビシンとして知られている、化合物（８Ｓ，１０Ｓ）−１０−（４−アミノ−５−ヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロテトラセン−５，１２−ジオンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ  ｖａｒ．Ｃａｅｓｉｕｓの培養物から単離される細胞障害性アントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンは、急性リンパ性白血病、急性骨髄芽球白血病、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、軟部肉腫及び骨肉腫、乳癌、卵巣癌、移行上皮性膀胱がん、甲状腺癌、ホジキン及び非ホジキン型リンパ腫、気管支原性肺癌、及び胃癌などの、播種性腫瘍性疾患において軽減をもたらすのに成功裡に用いられている。
【００７０】
本発明の医薬品組成物に含まれてよい抗生物質は、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（商品名））、ダウノルビシン／ダウノマイシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（商品名）、ＤａｎｕｏＸｏｍｅ（商品名））、ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（商品名））、エピルビシン（Ｐｈａｒｍｏｒｕｂｉｃｉｎ（商品名））、及びミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の実行に役立つアロマターゼ阻害剤は、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（商品名））及びレトロゾール（ｌｅｔｒｏａｚｏｌｅ）（Ｆｅｍａｒａ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の医薬品組成物に含んでもよいビスホスホネート阻害剤は、ゾレドロネート（Ｚｏｍｅｔａ（商品名））を包含するが、これに限定されない。
【００７１】
本発明の医薬品組成物に含まれてよいシクロオキシゲナーゼ阻害剤は、アセチルサルチル酸（Ａｓｐｉｒｉｎ（商品名））、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（商品名））、及びロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（商品名）、Ｃｅｏｘｘ（商品名）、Ｃｅｅｏｘｘ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の組成物に含まれてよいエストロゲン受容体修飾剤は、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（商品名））、及びフルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の組成物に含まれてよい葉酸拮抗剤は、メトトレキサート（Ｔｒｅｘａｌｌ（商品名）、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（商品名））、及びトリメトレキセート（Ｎｅｕｔｒｅｘｉｎ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。具体例として、一般にメトトレキサートとして知られている、化合物（Ｓ）−２−（４−（（（２，４−ジアミノプテリジン−６−イル）メチル）メチルアミノ）ベンズアミド）グルタール酸は、妊娠絨毛癌の治療において、並びに、破壊性絨毛腺腫及び胞状奇胎（ｈｙｄａｔｉｆｏｒｍ  ｍｏｌｅ）の患者の治療において使われる、葉酸拮抗剤である。葉酸拮抗剤は、悪性リンパ腫の進行段階の治療において、そして、菌状息肉腫の進行例の治療においても有用である。
【００７２】
本発明の医薬品組成物に含まれてよい無機ヒ酸塩は、三酸化ヒ素（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（商品名））を包含するが、これに限定されない。本発明の組成物に含まれてよい微小管阻害剤（本明細書中の「微小管阻害剤」は、微小管の会合又は分解を干渉する任意の製剤である）は、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（商品名））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（商品名））、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商品名）、Ｐａｘｅｎｅ（商品名））、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（商品名））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商品名））、エポチロン（ｅｐｏｔｂｉｌｏｎｅ）Ｂ又はＤ又はそのいずれかの誘導体、ディスコデルモリド又はその誘導体を包含するが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明の医薬品組成物に含まれてよいニトロソ尿素は、プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（商品名））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（商品名））、カルマスティン（ＢＣＮＵ（商品名）、ＢｉＣＮＵ（商品名）、Ｇｌｉａｄｅｌ  Ｗａｆｅｒ（商品名））、及びエストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の医薬品組成物に含まれてよいヌクレオシド類似体は、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（商品名））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（商品名））、６−チオグアニン（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ（商品名））、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（商品名））、シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（商品名）、ＤｅｐｏＣｙｔ（商品名））、フロキシウリジン（ＦＵＤＲ（商品名））、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（商品名））、ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ（商品名））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（商品名）、２−ＣｄＡ（商品名））、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（商品名））とカペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。具体例として、一般に５−フルオロウラシルとして知られている、化合物５−フルオロ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンは、外科的又は他の手段では不治であると考えられる患者の結腸癌、直腸癌、乳癌、胃癌及び膵臓癌の緩和処置に効果的な、代謝拮抗物質ヌクレオシド類似体である。ヌクレオシド類似体の別の例は、ゲムシタビンである。ゲムシタビンは、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロ−シチジンである。ゲムシタビンは、一塩酸塩として、そして、β異性体として市販されている。ゲムシタビンは、化学的には、１−（４−アミノ−２−オキソ−１−Ｈ−ピリミジン−１−イル）−２−デスオキシ−２，２−ジフルオロリボースとしても知られている。
【００７４】
本発明の医薬品組成物に含まれてよい破骨細胞阻害剤の具体例は、パミドロン酸（Ａｒｅｄｉａ（商品名））である。本発明の医薬品組成物に含まれてよい白金化合物は、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（商品名））及びカルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の医薬品組成物に含まれてよいレチノイドは、トレチノイン、ＡＴＲＡ（Ｖｅｓａｎｏｉｄ（商品名））、アリトレチノイン（Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商品名））及びベクサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の医薬品組成物に含まれてよいトポイソメラーゼ１阻害剤は、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ（商品名））及びイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ（商品名）、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ−１１（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の医薬品組成物に含まれてよいトポイソメラーゼ２阻害剤は、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（商品名）、Ｖｅｐｅｓｉｄ（商品名））、及びテニポシド（Ｖｕｍｏｎ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の医薬品組成物に含まれてよい他の適当なチロシンキナーゼ阻害剤の例は、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（商品名））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商品名））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商品名））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（商品名））、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（商品名））、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（商品名））及びバンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。本発明の医薬品組成物に含まれてよい（組み換え体）成長因子の例は、インターロイキン−１１、インターフェロン−α−２ｂ及びインターロイキン−２を包含するが、これらに限定されない。本発明の医薬品組成物に含んでもよいチミジル酸シンターゼ阻害剤の具体例は、Ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ（商品名）である。本発明の医薬品組成物に含まれてよいモノクローナル抗体の例は、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（商品名））又はセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商品名））を包含するが、これらに限定されない。
【００７６】
いくつかの態様において、医薬品組成物が提供される。医薬品組成物は、本発明の化合物又は塩又はプロドラッグ、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含むことができる。
【００７７】
「医薬品組成物」は、本明細書に記載される化合物の一つ以上、又はこれらの生理的／薬学的に許容される塩又はプロドラッグと、例えば生理的/薬学的に許容される担体及び賦形剤などの他の化学的組成物との混合物を指す。医薬品組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００７８】
化学式Ｉ又はＩＩの化合物は、プロドラッグとして作用してもよい。「プロドラッグ」は、生体内で親薬物（ｐａｒｅｎｔ  ｄｒｕｇ）に変換される薬剤を指す。プロドラッグはしばしば有用である。なぜなら、いくつかの状況で、プロドラッグは親薬物より投与するのが簡単であり得るからである。プロドラッグは、例えば、親薬物は経口投与できないが、経口投与によって生物学的に利用可能であってよい。プロドラッグは、医薬品組成物中で、親薬物以上の改善された可溶性を有していてもよい。プロドラッグの例は、水溶性が移動度に有害である細胞膜を通過することを容易にする一方で、水溶性が有益である細胞内一旦入ると、活性実体（ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｔｉｔｙ）であるカルボン酸に代謝的に加水分解される、エステル（「プロドラッグ」）として投与される、本発明の化合物であるが、これに限定されない。プロドラッグは、酵素のプロセスと代謝加水分解を含む、様々な機序で、親薬物に変換されうる。
【００７９】
プロドラッグのさらなる例は、２〜１０個のアミノ酸ポリペプチドであって、本発明の化合物のカルボキシル基と末端アミノ基を通じて結合した、短いポリペプチドであってもよいが、これに制限されず、ここで該ポリペプチドは、活性分子を放出するために生体内で加水分解又は代謝される。化学式Ｉ又はＩＩの化合物のプロドラッグは、本発明の範囲内である。
【００８０】
また、化学式Ｉ又はＩＩの化合物は、ヒトなどの生物の体内の酵素によって代謝されて、タンパク質チロシンキナーゼの活動を調節することができる代謝物質を産生すると考えられる。このような代謝物質は、本発明の範囲内である。
【００８１】
本明細書中の「生理的／薬学的に許容される担体」は、生物に重大な刺激作用を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物活性と特性を抑制しない、担体又は希釈剤を指す。
【００８２】
「薬学的に許容される賦形剤」は、さらに化合物の投与を容易にするために医薬品組成物に添加される、不活性物質を指す。賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖及び澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、及びポリエチレングリコールを包含するが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書中で、用語「薬学的に許容される塩」は、親化合物の生物学的効果と特性を保持する塩を指す。このような塩は、（１）親化合物の遊離塩基と、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸などの無機酸、もしくは酢酸、シュウ酸、（Ｄ）又は（Ｌ）リンゴ酸、マレイン酸、メタン硫酸酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸又はマロン酸などの有機酸、好ましくは塩酸又は（Ｌ）−リンゴ酸との反応により得られる酸付加塩、又は、（２）親化合物内に存在する酸性プロトンのいずれかが、例えば、ナトリウムもしくはカリウムなどのアルカリ金属イオン、マグネシウムもしくはカルシウムなどのアルカリ土類金属イオン、もしくはアルミニウムイオンで置換して、又はエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と配位して形成された塩を包含するが、これらに制限されない。
【００８４】
本明細書中の用語「タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病」は、異常なタンパク質チロシンキナーゼ活性を含む、タンパク質チロシンキナーゼ活性に関連する状態を指す。このような疾患及び疾病の例は、例えばガン、線維性及び糸球体間質性の疾患、異常な血管形成及び脈管形成、創傷治癒、乾癬、糖尿病、及び炎症などの異常な細胞増殖の疾患；神経変性障害、遅い創傷治癒率、及び組織移植を包含するがこれらに限定されない異常な分化状態；及び、異常な細胞生存状態である。異常な細胞生存状態は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性化又は抑制された状態に関する。いくつかのプロテインキナーゼは、アポトーシス経路と関連している。いずれか１つのプロテインキナーゼの機能における異常は、細胞不死又は早期細胞死につながる。いくつかの態様において、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患は、例えばＩＧＦ−１Ｒ関連疾患、ＥｐｈＡ２関連疾患又はＴｙｒｏ３関連疾患などの、ＲＴＫ関連疾患を包含し得る。これらの疾患は、肝細胞癌、乳癌、大腸癌及び肺癌であり得る。
【００８５】
本発明の化合物は、タンパク質チロシンキナーゼ、特に受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に、高い特異性と選択性で結合する。本発明の化合物と結合しうる例示的なＲＴＫｓは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲ  ＣＳＦＩＲ、Ｃ−Ｋｉｔ、Ｃ−ｆｍｓ、Ｆｌｋ−１Ｒ、Ｆｌｋ４、ＫＤＲ／Ｆｌｋ１、ＦｌＴ−１、ＦＧＦＲ−１Ｒ、ＦＧＦＲ−２Ｒ、ＦＧＦＲ−３Ｒ、ＦＧＦＲ−４Ｒ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、及びＴｙｒｏ３であるが、これらに限定されない。結合すると同時に、本発明の化合物は、タンパク質チロシンキナーゼ仲介細胞シグナリングを減少又は抑制する。いかなる特定の理論にも束縛されることなく、本発明の化合物は、チロシンキナーゼの活性を特異的に阻害することによって、固形腫瘍を最小化及び抹消する、又は腫瘍の成長及び／又は転移を少なくとも調節又は阻害する、と考えられる。本発明の化合物がタンパク質チロシンキナーゼのシグナリングを阻害する機序を正確に理解することは、本発明を実施するためには必要とされない。しかし、いかなる特定の機序又は理論にも束縛されることがない一方で、化合物は、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、及びイオン結合などの非共有結合的な相互作用を通して、タンパク質チロシンキナーゼのＡＴＰ結合領域、又は、その近傍のアミノ酸において、相互作用すると考えられる。したがって、化合物はＡＴＰの結合を遮断し、そして、他のタンパク質のリン酸化を遮断する。ここで、特定のタンパク質チロシンキナーゼに対する本発明の化合物の特異性は、本発明の化合物のオキシインドール・コア周辺の構成要素と、個々のタンパク質チロシンキナーゼに特有のアミノ酸領域との間の相互作用によってもたらされ得る。このように、異なるインドリノン置換基は、特定のタンパク質チロシンキナーゼへの選択的結合に貢献し得る。
【００８６】
いくつかの態様において、本発明は、上記のタンパク質チロシンキナーゼのような、プロテインキナーゼの触媒活性を調節するための方法に関する。本方法は、該プロテインキナーゼと、本発明の化合物、塩又はそのプロドラッグとを接触させることを含む。
【００８７】
本明細書中の用語「調節する」は、本明細書に記載されるプロテインキナーゼの活性における変化を指す。例えば、調節は、タンパク質の活性、結合特性、又はチロシンキナーゼの生物学的、機能的、又は免疫学的特性の増減を引き起こし得る。
【００８８】
本発明の化合物は、タンパク質チロシンキナーゼ仲介細胞シグナリングの阻害剤として、有用である。タンパク質チロシンキナーゼは、とりわけ、細胞の増殖、アポトーシス、分化及び遊走において重要な役割を果たすので、本発明の化合物は、増殖抑制活性を有するため、不適切な、又は異常なタンパク質チロシンキナーゼ機能に関連する、特にタンパク質チロシンキナーゼ活性の増加、又はタンパク質チロシンキナーゼの機能に関連する、疾患及び疾病の治療に利用することができる。本発明の化合物によって治療及び／又は予防し得る疾患及び疾病の例としては、過剰増殖性疾患、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ関連疾患、ＥｐｈＡ２関連疾患、又はＴｙｒｏ３関連疾患などの、ＲＴＫ関連疾患などのガンであるが、これらの疾患及び疾病に限定されない。これらの疾患は、肝細胞癌、乳癌、大腸癌及び肺癌であり得る。
【００８９】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病の治療又は予防するための方法を対象とする。該方法は、それを必要とする患者に、薬学的に有効量の本発明の化合物を投与することを含む。患者は、哺乳類であり得る。哺乳類は、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、類人猿、及びヒトなどの生物を包含し得るが、これらに限定されない。
【００９０】
「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病、及び／又はこれに付随する徴候を、軽減又は抑制する方法を指す。
【００９１】
「予防する」、「予防すること」、及び「予防」は、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病の発症を妨げる方法、すなわち予防方法（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）を指す。
【００９２】
「生物」は、少なくとも1つの細胞から構成される任意の生命体を指す。生物は、例えば、真核単細胞生物と同程度に単純でありえるか、又はヒトを含む哺乳類と同程度に複雑でありえる。
【００９３】
ここで、医薬としての本発明の化合物の有効性のために、結合親和性以外のいくつかの変化が重要な役割を果たすことに注意しなければならない。したがって、本発明の化合物は、結合特異性及び親和性に基づくだけでなく、例えば生物学的利用能、引き起こされる副作用の重症度、化合物の代謝転換、生体内での化合物の半減期などの他の要因にも基づいて、医薬として、特異的に選択することができる。
【００９４】
本発明の化合物又は薬学的に許容される塩又はプロドラッグは、それ自体がヒトの患者に投与されることができるか、又は前述の材料が適当な担体又は賦形剤と混合される医薬品組成物中に配合することができる。薬の調製と投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）の最新版に見出し得る。
【００９５】
本明細書中の「投与する」、又は「投与」は、本発明の化学式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物又は薬学的に許容される塩又はプロドラッグの、又は、本発明の化学式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含む医薬品組成物の、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病の予防又は治療の目的での、生体への送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を指す。
【００９６】
投与の適当な経路は、経口投与、直腸投与、経粘膜投与もしくは、又は経腸投与、又筋肉内注射、皮下注射、脊髄内注射、クモ膜下注射、直接心室内注射、静脈内注射、硝子体内注射、腹膜内注射、鼻腔内注射、又は眼内注射を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、投与の経路は、経口及び非経口である。
【００９７】
あるいは、例えば、血管を介した化合物の直接注入などの、全身的な様式よりはむしろ局所的な様式で、化合物を投与してもよく、ここで化合物は、必要に応じてデポー製剤又は徐放性製剤の化合物である。
【００９８】
本発明の医薬品組成物は、例えば、従来の混合、溶解、整粒、糖衣錠製造、粉末化、乳化、被包化、封入化、又は凍結乾燥工程などの、当技術分野で既知の工程によって製造してよい。
【００９９】
本発明で使用するための医薬品組成物は、薬学的に使用することができる製剤への活性化合物の加工を容易にする、賦形剤及び助剤を含む、１つ以上の薬学的に許容される担体を用いて、従来の方法で調製してよい。適切な剤形は、選択される投与経路に依存する。
【０１００】
注射のために、本発明の化合物は、好ましくはハンクス液、リンガー液又は生理的食塩水緩衝液などの生理的に適合する緩衝液である、水溶液として調製してよい。経粘膜投与のために、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、製剤において使用される。このような浸透剤は、通常、当技術分野で知られている。
【０１０１】
経口投与のために、化合物は、活性化合物を当技術分野で既知の薬学的に許容される担体と混合することによって、調製することができる。患者による経口摂取のために、このような担体は、本発明の化合物が、タブレット、錠剤、トローチ剤、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに調製されるのを可能にする。経口用医薬製剤は、固体賦形剤を用いて、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、そして顆粒の混合物を、必要に応じて他の適切な助剤を添加した後加工して、錠剤又は糖衣錠コアを得ることにより、製造することができる。有用な賦形剤は、特に、ラクトース、ショ糖、マンニトール又はソルビトールを含む糖などの賦形剤、例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉及びジャガイモ澱粉などのセルロース製剤、並びに例えばゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの他の材料である。必要に応じて、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸などの崩壊剤を添加してよい。アルギン酸ナトリウムなどの塩を使用してよい。
【０１０２】
糖衣錠コアは、適切なコーティングが設けられている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル（ｃａｒｂｏｐｏｌ  ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、適当な有機溶剤又は溶媒混合物を必要に応じて含み得る、濃縮した糖溶液を使用してよい。染料又は顔料を、識別又は活性化合物の量の異なる組合せを特徴づけるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加してよい。
【０１０３】
経口で使用することができる医薬品組成物は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルだけでなく、ゼラチンと、グリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で作られた、柔らかく、密封されたカプセルを包含する。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの賦形剤、澱粉などの結合剤、又はタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び必要に応じて、安定剤との混合物として、活性成分を含むことができる。柔らかいカプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解され、又は懸濁されてよい。また、これらの製剤において安定剤も添加してよい。
【０１０４】
化合物は、例えば、大量瞬時投与又は持続性点滴などの、非経口投与のために調製してもよい。注射のための製剤は、例えば、防腐剤が添加されたアンプル又は多量投与用容器などの、単位剤形の形状で存在してよい。組成物は、懸濁液、溶液又は油性又は水性賦形剤中のエマルジョンなどの形態を採用してよく、かつ懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤材料を含んでよい。
【０１０５】
非経口投与のための医薬品組成物は、活性化合物の、例えば、塩などの、水溶性型の水溶液を含むが、これに限定されない。
【０１０６】
また、活性化合物の懸濁は、親油性賦形剤で調製することができる。適当な親油性賦形剤は、胡麻油などの脂肪油、エチルオレイン酸塩及びトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームなどの材料を包含する。水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなどの、懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでよい。必要に応じて、懸濁液は、適切な安定剤及び／又は化合物の溶解度を増大させて、高濃縮溶液の調製を可能にする薬剤も含んでもよい。
【０１０７】
また、有効成分は、使用前に、例えば、発熱性物質除去蒸留水などの、適当な賦形剤と共に製剤化するための粉末形態であってもよい。
【０１０８】
化合物は、例えば、ココアバター、又は他のグリセリドなど、従来の坐剤の基剤を使用して、坐剤又は停留浣腸などの直腸組成物に調製することもできる。
【０１０９】
前述の製剤に加えて、化合物はデポー製剤として調製してもよい。このような長時間作用する製剤は、移植（例えば、皮下、又は筋内に）、又は筋肉注射によって投与してよい。本発明の化合物は、適当なポリマー材料又は疎水性材料（例えば、薬学的に許容される油を用いたエマルジョン中に）を用いて、イオン交換樹脂を用いて、又は難溶性塩などの、これに限定されない難溶性誘導体として、この投与の経路のために、調製されてもよい。
【０１１０】
本発明の疎水性化合物のための薬学的な担体の非限定的な例は、ＶＰＤ共溶媒系などの、ベンジルアルコール、無極性界面活性剤、水溶性有機ポリマー、及び水相を含む共溶媒系である。ＶＰＤは、無水エタノールで定容にされた、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖ無極性界面活性剤ポリソルベート８０、及び６５％のポリエチレングリコール３００の溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は、５％ブドウ糖水溶液で１：１に希釈したＶＰＤからなる。この共溶媒系は、疎水性合成物をよく溶かして、かつそれ自身は全身投与された時にほとんど毒性を起こさない。
【０１１１】
当然、このような共溶媒系の割合は、その溶解度と毒性特性とを損なうことなく、大幅に変更してもよい。さらにまた、共溶媒成分の内容を、変更してもよい：例えば、他の低毒性無極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに使用してもよく、ポリエチレングリコールの画分サイズを変更してもよく、ポリエチレングリコールを他の生物学的適合性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンで代用してもよく、及び糖又は多糖類をブドウ糖に代用してもよい。
【０１１２】
また、疎水性医薬品化合物のための他の供給系を使用してもよい。リポソームとエマルジョンは、疎水的な薬剤のための薬物送達賦形剤又は担体の、よく知られた例である。さらに、多くの場合、より大きな毒性という欠点があるが、ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶剤も使用してもよい。
【０１１３】
さらに、化合物は、治療剤を含む疎水性固体ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放系を使用して供給してもよい。
【０１１４】
様々な持続性材料は確立されており、かつ、これらは当業者によく知られている。持続性カプセルはその化学的性質に依存して、数週間から最大１００日以上、化合物を放出し得る。治療薬の化学的性質と生物学的安定性に依存して、安定化に対する更なる戦略を、使用してよい。
【０１１５】
本明細書中の医薬品組成物は、適当な固相又はゲル相の担体又は賦形剤も含んでよい。このような担体又は賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々の糖類、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーを包含するが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明の化合物の多くは、生理学的に許容される塩として提供することができ、前記化合物は、負又は正に帯電した種を形成してもよい。化合物が正に荷電する部分を形成する塩の例は、適切な塩基（例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）等）と、該化合物中のカルボキシル基又はスルホン酸基との反応によって形成される、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム塩を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
本発明の使用に適している医薬品組成物は、含有される活性成分が意図された目的、例えば、タンパク質チロシンキナーゼ機能の阻害、又はタンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病の治療又は予防などを達成するのに十分量の組成物を包含する。
【０１１８】
より詳しくは、治療に効果的な量は、病気の徴候を予防、軽減、もしくは改善するか、又は治療を受けている患者の生存期間を延長するのに効果的な化合物の量を意味する。治療に効果的な量の測定は、特に本明細書中に提供されている詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。
【０１１９】
本発明の方法で使われる任意の化合物に関して、治療に効果的な量又は投与量は、最初は細胞培養分析から推定することができる。次に、投与量は、細胞培養において測定されたＩＣ５０を含む循環濃度範囲（すなわち、タンパク質チロシンキナーゼ活性の最大半値の阻害を達成する試験化合物の濃度）の計算を達成するため、動物モデルで使用するために定式化することができる。このような情報は、その後、ヒトにおけるより正確な有用な投与量を測定するのに用いることができる。
【０１２０】
本明細書中に記述される化合物の毒性と治療有効性は、例えば、目的の化合物のＩＣ５０とＬＤ５０を測定することなどの、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手法で測定することができる。これらの細胞培養分析と動物実験から得られるデータが、ヒトで使用する際の投与量の範囲を定式化するのに使用することができる。投与量は、使用される剤形と利用される投与経路によって変更してよい。正確な製剤、投与経路と投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医者によって選択され得る。
【０１２１】
投与量と間隔は、タンパク質チロシンキナーゼ阻害効果を維持するのに十分である活性種の血漿中濃度を提供するように、個別に調整してもよい。これらの血漿中濃度は、最小有効濃度（ＭＥＣｓ）と呼ばれる。ＭＥＣはそれぞれの化合物によって異なるが、例えば、特定のタンパク質チロシンキナーゼの５０〜９０％阻害を達成するのに必要な濃度などの、試験管内試験のデータから推定することができる。
【０１２２】
ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴と投与経路に依存する。ＨＰＬＣ分析又は生物検定は、血漿中濃度を決定するのに用いることができる。
【０１２３】
投与間隔は、ＭＥＣ値を用いて決定することもできる。これに関連して、化合物は投与時間の１０〜９０％において、好ましくは３０〜９０％において、そして、最も好ましくは５０〜９０％において、ＭＥＣ以上の血漿中濃度を維持する投与計画を使用して投与されなければならない。
【０１２４】
局所投与又は選択的取り込みの場合には、薬物の効果的な局所的な濃度は、血漿中濃度と関連しない場合もあり、当技術分野で知られているその他の方法を、適切な投与量及び間隔を決定するために用いてもよい。
【０１２５】
投与される組成物の量は、当然、治療を受けている患者、苦痛の重篤度、投与方法、処方した医者の判断などに依存する。
【０１２６】
組成物は、必要に応じて、ＥＭＥＡやＦＤＡなどの規制当局によって承認されたキットなど、活性成分を含む１つ以上の単位投与形態を含んでもよい、パック又はディスペンサー装置として提供され得る。例えばパックは、例えばブリスターパックなどの金属箔又はプラスチック箔を含んでよい。パック又はディスペンサー装置は、投与のための説明書が付随していてもよい。
【０１２７】
パック又はディスペンサーには医薬の製造、使用又は販売を管理している政府機関によって規定される形態の、容器に付随する通知を添付してもよく、該通知は、組成物の形態、又は、ヒトや動物への投与形態についての政府機関による承認を反映する。混合可能な製薬担体中に調製される本発明の化合物を含む組成物は、調製され、適切な容器に入れられ、及び示された状態の治療のための標識を付されてもよい。
【０１２８】
本明細書中に記載される化合物、又はその塩又はそのプロドラッグは、上述の疾患又は疾病の治療のための、他の薬剤と混合されてよいことも、本発明の態様である。
【０１２９】
本発明は、肝細胞癌に対して特定の有効性があるプロテインキナーゼ阻害剤を特定する方法も包含する。本方法は、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）に対するプロテインキナーゼ阻害剤を特定するのに有用であり、ｉ）候補化合物を肝細胞癌細胞株と培養すること、ｉｉ）細胞生存度を測定すること、及び、ｉｉｉ）正常な肝細胞株に対する前記候補化合物の効果と、測定された前記細胞生存度とを比較して、肝細胞癌細胞に対して特異的な活性を有する化合物を同定すること、を含む。
【０１３０】
ここで、用語「肝細胞癌に対する特異的な活性」は「通常の肝細胞に対する低下された毒性」を意味し、かつスクリーニング方法によって特定された化合物が、他の癌種／タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病に対する活性の減少又は活性がないことを意味する訳ではないことが言及される。むしろ、本発明のスクリーニング方法によって特定される化合物は、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患又は疾病の影響を受ける、他の細胞（試験管内及び生体内で）に対しても、活性を有することができる。
【０１３１】
一態様において、スクリーニングのために使った肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株は、当業者に知られている任意のＨＣＣ細胞株であり得る。これらの細胞株は、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ３６８、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＬＨ８６、ＳＫ−Ｈｅｐ−１、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｓ８１７．Ｔ及びＭＨＣＣ９７細胞株を包含し得るが、これらに限定されない。
【０１３２】
他の態様において、スクリーニングに使われる正常肝細胞株は、ＴＨＬＥ２である。
【０１３３】
一態様において、方法は表現型ベースのスクリーニングアッセイである。
【０１３４】
本発明を容易に理解すること、及び実用的な効果を得るために、特定の実施形態が、以下の非限定的な実施例に記載される。
【実施例】
【０１３５】
以下の実施例は、さらに本発明を例示するために提供され、本発明の範囲を制限することを目的としない。
【０１３６】
＜化合物＞
本明細書に開示される本発明の化合物（化合物３９〜４８；下記の表１を参照）を、全ての目的のためにその内容の全体が参照により本明細書中に包含される米国仮出願第６１／１０５，２０６号「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅｓ」に記載の方法を用いて合成した。スニチニブは、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）より入手した。他の全ての試薬は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より入手した。
【０１３７】
＜細胞培養＞
ＨｕＨ７は、Ｐ．Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ博士（Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。ＨｅｐＧ２、ＳＫ−Ｈｅｐ１、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＴＨＬＥ２及びＨｓ８１７．Ｔ細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）より入手した。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ＢとＰＬＣ／ＰＲＦ／５はＭＥＭで、ＴＨＬＥ２はＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、他の全ての細胞はＤＭＥＭで維持した。すべての細胞培養に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手したＡＴＣＣ推奨の試薬を補充した。
【０１３８】
＜定量的リアルタイムＰＣＲ＞
全ＲＮＡは上記（１４）で述べたＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で回収され、そしてＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製された。２μｇのＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたｃＤＮＡ合成に用いた。操作は、メーカーの使用説明書に従って実施した。定量的リアルタイムＰＣＲは、１８Ｓ  ｍＲＮＡを対照として、ＡＦＰ（ＮＭ＿００１１３４）について、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７３００（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実施した。サンプルは、各々が４μＬの前希釈された（ｐｒｅｄｉｌｕｔｅ）ｃＤＮＡであるものを、３個１組で調製した。プライマー配列は以下の通りである：ＡＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＡＣ（ＡＦＰ順方向；配列番号１）；ＴＣＴＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＴＴＴＧＣＡＧ（ＡＦＰ逆方向；配列番号２）；ＣＧＧＣＴＴＡＡＴＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡＣＧ（１８Ｓ順方向；配列番号３）；ＴＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＴＴＣ（１８Ｓ逆方向；配列番号４）。データは平均ＣＴ値として得られ、対照に対するΔＣＴとして正規化した。正常組織対腫瘍組織の間のＡＦＰ転写物の発現変化は、２ΔΔＣＴ（対応する組のΔＣＴの差）を用いた倍率変化として表わした。
【０１３９】
＜イムノブロットアッセイ＞
タンパク質濃度は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によってアッセイした。サンプルは６〜１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離され、そしてタンク移動（ｔａｎｋ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によってニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜に転写された。免疫検出は、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０及び５％（ｗ／ｖ）の粉乳又はＢＳＡを含むＰＢＳで希釈された特異的抗体を用いた化学ルミネセンス（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ，Ｐｉｅｒｃｅ）で実施した。抗−ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ、抗−ホスホ−ＥｐｈＡ２、抗−ホスホ−Ｅｒｋ、抗−ホスホ-Ａｋｔ、抗−Ｂａｘ、及び抗−ＢＣＬ−ｘLは、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）社製、抗ＰＣＮＡ及び抗ＨＳＰ６０は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）社製、抗−サイクリン−Ｄ１は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）社製であった。二次抗体は、抗マウス、及び抗ウサギ−ＨＲＰ接合抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）であった。
【０１４０】
＜免疫沈降＞
ＨｕＨ７細胞は、イムノブロット法のために上記のように処理され、そして、溶解バッファー（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  トリスＨＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬ  アプロチニン、１０ｍｇ／μＬ  ロイペプチン）で回収された。溶解物（３００μg）を、５００μLのＨＮＴＧバッファー（２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）で希釈し、そして、３０μＬのタンパク質Ａ／Ｇ混合物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）、及び２μgの抗ＥＧＦＲ（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、抗ＥｐｈＡ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、又は抗Ｔｙｒｏ３（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）と、４℃で一晩、インキュベートされた。得られたビーズは、電気泳動用の２０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中で沸騰させる前に、ＨＮＴＧバッファーで洗浄した。以降の免疫検出を、抗ホスホチロシン（４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ））と、それぞれの一次抗体のストリッピング及び再検出により測定された検出物（ｌｏａｄｉｎｇ）とで実行した。
【０１４１】
＜細胞生存度アッセイ＞
細胞は１ウェル当たり５０００〜７０００細胞で播種され、処理の前に２４時間インキュベートした。様々な濃度（０〜１０μM）の試験化合物（化合物３９〜４８及びスニチニブ）を、８回繰り返して、７２時間、細胞に添加した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）アッセイは、メーカーの使用説明書に従って実行し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上の発光を検出した。データは、生存度対賦形剤処理対照のパーセンテージとして表わした。
【０１４２】
＜カスパーゼ−３活性アッセイ＞
細胞は、回収の２４時間前に、化合物４７の処理を受けた。カスパーゼ−３の活性は、前述のように測定された（Ｈｏ  ＨＫ，Ｐｏｋ  Ｓ，Ｓｔｒｅｉｔ  Ｓ，Ｒｕｈｅ  ＪＥ，Ｈａｒｔ  Ｓ，Ｌｉｍ  ＫＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ（Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２００９  Ｊａｎ；５０（１）：１１８−１２７）。データは、ＲＦＵ／μｇ溶解物／時間インキュベーション、及びｎ＝３のＳＤをエラーバーとして表わした。
【０１４３】
＜ホスホ−ＲＴＫプロファイリング＞
複数のＲＴＫリン酸化の同時決定は、ヒトのホスホ−ＲＴＫアレイ（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で達成した。ＨｕＨ７細胞は、無血清条件下で２４時間、賦形剤、化合物４７又はスニチニブに晒された。細胞回収、ＲＴＫアレイとのハイブリダイゼーション、及び抗−ホスホチロシンとのインキュベーションを、メーカーの使用説明書に従って実施した。スポット強度のイメージングと定量化を、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ−３０００（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で行った。それぞれのＲＴＫの２つのスポットの平均シグナルを、決定した。
【０１４４】
実施例1：化合物３９〜４８の合成、表1
スキーム１：本発明の化合物３９〜４８の合成経路
【化１１】
2012505880.tif 000013
本発明の化合物３９〜４８を、化学式ＩＶのアルデヒドと化学式ＩＩＩのオキシインドールの間のクネーフェナーゲル反応によって合成した。縮合は、塩基触媒としてのピペリジンを含むエタノール中で、還流により、又はマイクロ波反応器内で行った（スキーム１）。
【表１】
2012505880.tif 000014
【０１４５】
＜化合物３９〜４８の合成の基本手順＞
等モル量（０．５ｍｍｏｌ）のオキシインドールとアルデヒドをエタノール（１０ｍｌ）に溶解し、１滴のピペリジン（２μｌ）を添加して、そして、混合物はアルゴンを流した密封容器（１０ｍｌ）内で加熱した。容器は、マイクロ波シンセサイザー（Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（商品名））内で、１４０℃で１５分間加熱した。その後反応混合物は、室温に冷やされて、得られた沈殿物は濾過によって除去され、冷えたエタノールで慎重に洗浄し、そして所望の生成物を産生するために、エタノールから少なくとも一つを再結晶した。
【０１４６】
＜合成された化合物の構造決定＞
合成された化合物は、環外二重結合の存在により、Ｅ又はＺ異性体のいずれかとして存在することができた。このように、合成が一つの（支配的な）異性体、又は、異性体の混合物を産生したかどうかについて決定することが、必要であった。化合物の１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの解析は、これらが一つの（又は支配的な）異性体として得られることを示した。
【０１４７】
本明細書中に記載される合成された化合物がＥ又はＺ異性体であるかどうか決定するために、ベンジリデン環Ｂ（Ｈ−２’とＨ−６’）の芳香族のプロトンの化学シフトを分析した。Ｚ異性体ではなく、Ｅ異性体では、Ｈ−２’又はＨ−６’プロトンは、カルボニル基による反遮へいのため、低磁場側にシフトする。文献では、７．８５−８．５３ｐｐｍの化学シフトは、Ｚ異性体に、及び７．４５−７．８４ｐｐｍの化学シフトは、Ｅ異性体に帰属した（Ｓｕｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９８，４１，２５８８；Ａｎｄｒｅａｎｉ，Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００６，４９，６９２２）。すでにＥ異性体であることが報告されている化合物、及び化学シフトが文献から入手可能であった化合物に対して、本明細書中の実験値と報告値との比較は、必要とされる確証を提供した（Ｃｏｒｓｉｃｏ  Ｃｏｄａ，Ａ．；ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．２（１９７２−１９９９），１９８４，４，６１５；Ａｎｄｒｅａｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９０，２５，１８７；Ａｎｄｒｅａｎｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２７，１６７）。
【０１４８】
立体化学が以前に帰属しなかった化合物のために、７．４５−７．８４ｐｐｍにおけるＨ−２’及びＨ−６’プロトンの化学シフトは、合成された化合物がＥ異性体であったと結論するのに用いられた。化合物４６と４７などの本発明の化合物は、1つの支配的な異性体としてではなく、Ｅ異性体とＺ異性体の混合物として得られた。異性体（カラムクロマトグラフィーによる分離の後）の１Ｈのスペクトルを調べたとき、Ｈ−２’及びＨ−６’の化学シフトは、支配的な異性体の７．９０−８．０１ｐｐｍと、少量の異性体の８．４０−８．５０ｐｐｍで見出された。従って、支配的な異性体は、Ｅ構造に帰属された。
【０１４９】
＜実験手順及び化合物３９〜４８の分析データ＞
（Ｅ）−６−フルオロ−３−（３−メトキシベンジリデン）インドリン−２−オン（３９），収率２９％，融点（ｍｐ）１６９−１７０°Ｃ；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋２７０．３（２６９．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ３．７９（ｓ，３Ｈ），６．６８（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｍ，２Ｈ），１０．７７（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６８．９２，１６４．８０，１６１．５５，１５９．３６，１４４．９４，１４４．７８，１３５．６０，１３５．３５，１３５．３１，１３０．０１，１２６．７５，１２４．２４，１２４．１０，１２１．４０，１１７．３５，１１７．３２，１１５．６９，１１４．２５，１０７．７４，１０７．４４，９８．３９，９８．０２，５５．２４。
【０１５０】
（Ｅ）−５−クロロ−３−（３−メトキシベンジリデン）インドリン−２−オン（４０），収率７０％，ｍｐ  ２１２−２１４℃；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ２８６．２（２８５．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  3．８０（ｓ，３Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｍ，１Ｈ），７．２７（ｍ，３Ｈ），７．４６（ｍ，２Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），１０．７５（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６８．３１，１５９．３９，１４１．７７，１３７．５５，１３５．３７，１３０．０５，１２９．６４，１２７．０２，１２４．９４，１２２．５１，１２２．０２，１２１．５０，１１６．１５，１１４．１８，１１１．５４，５５．２６。
【０１５１】
（Ｅ）−６−クロロ−３−（３−メトキシベンジリデン）インドリン−２−オン（４１），収率７１％，ｍｐ  １９８−２００℃；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ２８６．２（２８５．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ  ３．７９（ｓ，３Ｈ），６．９１（ｍ，２Ｈ），７．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．３Ｈｚ，1H），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｔ，Ｊ−７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｓ，１Ｈ），１０．７６（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６８．６０，１５９．３６，１４４．３３，１３６．５５，１３５．５０，１３４．２０，１３０．０２，１２６．７１，１２３．７７，１２１．５２，１２０．９５，１１９．８０，１１５．９１，１１４．２８，１１０．１４，５５．２４。
【０１５２】
（Ｅ）−６−メトキシ−３−（３−メトキシベンジリデン）インドリン−２−オン（４２）４７：収率３１％，ｍｐ  １６１−１６３℃，ｌｉｔ．１６２−１６３℃；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ２８２．２（２８１．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ  ３．７７（ｍ，６Ｈ），６．４４（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄｄ，ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｍ，２Ｈ），７．４１（ｍ，２Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），１０．５４（ｓ，1H）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６９．２９，１６１．１５，１５９．２９，１４４．７７，１３６．０６，１３２．３２，１２９．８３，１２７．３６，１２３．８０，１２１．３７，１１５．２０，１１４．１８，１１３．６３，１０６．５２，９６．５０，５５．３０，５５．１７。
【０１５３】
（Ｅ）−６−フルオロ−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）インドリン−２−オン（４３），収率３３％，ｍｐ  ２２５−２２７℃；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ２８６．２（２８５．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ  ３．８３（ｓ，３Ｈ），６．６９（ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，２H），７．０５（ｍ，１Ｈ），７．１６（ｓ，２Ｈ），７．４７（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄｄ，Ｊ＝８．１，５．８Ｈｚ，１Ｈ），９．４１（ｓ，１Ｈ），１０．７０（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６９．３２，１６４．４８，１６１．２２，１４９．５０，１４６．５１，１４４．５２，１４４．３５，１３６．２０，１３６．１６，１２６．６９，１２４．２７，１２３．９３，１２３．８１，１２２．１６，１１７．６９，１１７．６５，１１６．１４，１１２．１３，１０７．５０，１０７．２０，９８．１８，９７．８２，５５．６６。
【０１５４】
（Ｅ）−６−クロロ−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）インドリン−２−オン（４４），収率５３％，ｍｐ  ２２０−２２３℃；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ３０２．２（３０１．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ  ３．８４（ｓ，３Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１８（ｍ，２Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），９．４１（ｓ，１Ｈ），１０．６９（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６９．０２，１４９．７２，１４６．５５，１４３．９４，１３７．４５，１３３．５５，１２６．６４，１２４．１４，１２３．５３，１２２．４３，１２０．７７，１２０．１７，１１６．３０，１１２．１２，１０９．９６，５５．６８。
【０１５５】
（Ｅ）−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジリデン）−６−メトキシインドリン−２−オン（４５），収率３８％，ｍｐ  １８４−１８６℃；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ２９８．２（２９７．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ  ３．７５（ｓ，３Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），６．４４（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．３Hz，１Ｈ），９．３５（ｓ，１Ｈ），１０．４９（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５MHz，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６９．７２，１６０．７８，１４９．１１，１４６．４５，１４４．３８，１３３．３０，１２７．２３，１２５．０４，１２３．６３，１２１．９０，１１６．０９，１１４．０７，１１２．１４，１０６．４２，９６．４３，５５．６７，５５．３４．
【０１５６】
（Ｅ）−６−フルオロ−３−（３−（トリフルオロメチル）ベンジリデン）インドリン−２−オン（４６），収率５０％，ｍｐ  １３２−１３５℃；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ３０８．１（３０７．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ６．６６（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，５．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｍ，２Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１０．８２（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６８．６２，１６５．０６，１６１．７９，１４５．３０，１４５．１３，１３５．４９，１３３．３８，１３３．３４，１３２．８７，１３０．２７，１２９．９６，１２９．８４，１２９．４２，１２９．００，１２８．１０，１２８．０８，１２５．９９，１２５．９５，１２５．８０，１２５．７６，１２３．９１，１２３．７８，１２２．１６，１１８．５５，１１７．００，１１６．９６，１０７．７７，１０７．４８，９８．５７，９８．２１．  ４６（Ｚ），１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ  ６．６６（ｄｄ，Ｊ＝９．２，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｍ，１Ｈ），７．７３（ｍ，３Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．８３（ｓ，１Ｈ），１０．８２（ｓ，１Ｈ）。
【０１５７】
（Ｅ）−６−クロロ−３−（３−（トリフルオロメチル）ベンジリデン）インドリン−２−オン（４７）４８：収率５１％，ｍｐ  ２０４−２０７℃；１H  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ６．８７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｍ，３Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１０．８１（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６８．２６，１４４．６０，１３５．３９，１３４．６６，１３２．９４，１３０．０２，１２９．８４，１２９．４２，１２８．０６，１２６．１８，１２６．１５，１２５．９４，１２５．９０，１２５．７５，１２３．４６，１２２．１４，１２１．０１，１１９．４４，１１０．３３．  ４７（Ｚ），１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ  ６．８８（ｓ，１Ｈ），７．０５（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｍ，３Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），８．８４（ｓ，１Ｈ），１０．８１（ｓ，１Ｈ）。
【０１５８】
（Ｅ）−６−メトキシ−３−（３−（トリフルオロメチル）ベンジリデン）インドリン−２−オン（４８），収率４３％，ｍｐ１５７−１６０℃；ＭＳ−ＡＰＣＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ３２０．１（３１９．１）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＤＭＳＯｄ６）δｐｐｍ  ３．７４（ｓ，３Ｈ），６．４０（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，２．６Ｈｚ，  ２Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．０，７．９，７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１０．６１（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １６９．０４，１６１．５４，１４５．１４，１３５．９９，１３２．９１，１３０．４０，１３０．１６，１２９．９０，１２９．７４，１２９．４４，１２９．３１，１２８．８９，１２８．７２，１２５．８３，１２５．６９，１２５．６５，１２５．５９，１２３．５０，１２２．２２，１１８．６１，１１３．２８，１０６．６１，９６．７５，５５．３９。
【０１５９】
実施例２：ＨＰＬＣによる化合物３９〜４８の化合物純度の測定
化合物の純度は、逆相高圧カラムクロマトグラフィーで評価した。測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１カラム（４．６ｍｍ  ｘ  １５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  ６００  液体クロマトグラフィー・システム上で実施した。２つの溶媒系を用いて、定組成モードを採用した（４：１の比率で、Ａ：メタノール−水、及びB：アセトニトニル−水）。流量は１ｍｌ／分に固定し、そして、二重波長（２７８ｎｍと３０５ｎｍ）のＵＶ検出を採用した。２０分間の分析の間、メインピーク下の面積を測定し、そして全体のピーク面積の％として表わした。すべての化合物は、それらのクロマトグラムが、主なピーク（ＰＨＰＬＣ）面積が両方の溶媒系で９６％を超えることを示すまで、精製した。２つの溶媒系におけるメインピークの保持時間（ｔＲ）は、分（ｍｉｎ）単位で決定された。
【表２】
2012505880.tif 000015
【０１６０】
＜生物学的アッセイのための材料＞
メナジオン、ジギトニン、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）、β−ナフトフラボン（ＢＮＦ）、ジクマロール（ｄｉｃｕｏｍａｒｏｌ）、サリチルアミド、ヨウ化プロピジウム、ＫＮａｓｅＡ、７−エトキシレゾルフィン、及びスルフォラファンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）は、ＡｃｃｕＳｔａｎｄａｒｄ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＵＳＡ）から購入した。その他の試薬は分析用グレードであった。
【０１６１】
実施例３；ＮＱＯ１活性の決定
Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、熱及び活性炭処理したウシ胎児血清（１００ｍｌの血清あたり１ｇの活性炭；５５℃で９０分）、０．１５％の重炭酸ナトリウム、０．０１％のペニシリンG、０．０１％のストレプトマイシン硫酸塩を含み、ヌクレオシドを含まないα−最小限必須培地（α−ＭＥＭ）、１０％（ｖ／ｖ）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。細胞を、細胞が８０〜９０％の集密度に達したときに継代培養し、そして測定のために６〜１７の範囲内の継代物を使った。アッセイのために、約１００００個の細胞を、α−ＭＥＭで２４時間、９６穴プレートの各々のウェルで生育した。ブラッドフォード分析に基づき、全体のタンパク質含有量が、１ウェルあたり０．０３６ｍｇであることが分かった。試験化合物の保存液をＤＭＳＯで調製し、そして、所定量を、所望の濃度を与えるために、各ウェルに添加した。各ウェルのＤＭＳＯの最終濃度を、０．５％ｖ／ｖ以下に保った。４８時間のインキュベーションの後、培地を容器を傾けて上清を捨て、そして、０．８％ｖ／ｖジギトニン及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液で、細胞を３７℃（１０分）でインキュベーションしながら溶解した。プレートを、２３℃で１０分間、オービタルシェーカー上で穏やかに攪拌した。溶液（「完全な反応混合物」）の所定量（２００μｌ）を、その後各ウェルに添加した。この溶液は使用の直前に新たに準備され、かつ７．５ｍｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．４）、１００ｍｇのウシ血清、１ｍｌの１．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１ｍｌの７．５ｍＭ  ＦＡＤ、１ｍｌの１５０ｍＭ  グルコース−６−リン酸塩、９０μｌの５０ｍＭ  ＮＡＤＰ、３００単位のイースト・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、４５ｍｇのＭＴＴ、及び脱イオン水で最終体積を１５０ｍｌに定容したものからなる。メナジオン（アセトニトリルに溶かした５０ｍＭメナジオンを１μｌ）を、混合物がウェルに分配される直前に、反応混合物のミリリットル毎に添加した。添加後、プレートを５分間穏やかに攪拌し、そして、反応を、０．５％ＤＭＳＯ及び５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７．４）中の０．３ｍＭジクマロール溶液（５０μｌ）を添加して停止した。ホルマザン形成による青色が各ウェルで観察され、その吸光度をプレートリーダー上で５９０ｎｍで測定した。空のウェルは細胞を含まず、及び対照ウェルは、０．５％ＤＭＳＯを含むが、試験化合物を含まない培地で処理したＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞が含んだ。所定の濃度での試験化合物のＮＱＯ１誘導活性は、次式から決定された：
誘導度＝Ａ試験化合物−Ａブランク／Ａ対照−Ａブランク
ここで、Ａは５９０ｎｍで測定されたホルマザンの吸光度である。
【０１６２】
スルフォラファン及びＢＮＦは、正の対照として、類似の条件下で測定された。結果はＯｒｉｇｉｎＰｒｏ  ７．５  ＳＲ１（Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｖ７．５７７６  Ｂ７７６，ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ）でプロット（誘導度対濃度）し、そして、基礎ＮＱＯ１活性（ＣＤ）を２倍にするのに必要とされる試験化合物の濃度を決定した。別々に３回の定量を行い、そして、ＣＤはｎ＝３の平均±ＳＤとして表わした。
【０１６３】
＜Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞におけるＮＱＯ１の誘導＞
化合物を、ネズミ肝癌（Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７）細胞において、ＮＱＯ１活性の誘導のために選別した（Ｐｒｏｃｈａｓｋａ，Ｈ．Ｊ．；Ｓａｎｔａｍａｒｉａ，Ａ．Ｂ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８，１６９，３２８）。簡潔には、アッセイはグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）がその補因子ＮＡＤＰの存在下で、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼによって還元されるときの、ＮＡＤＰＨの産生に基づく。ＮＡＤＰＨは、ＮＱＯ１が介在するメナジオン（キノン）のメナジオール（ジフェノール）への還元のための電子供与体としてふるまう。メナジオールはＭＴＴをホルマザン（着色製品）に還元し、そして、その形成はアッセイにおいてモニターされる。ＮＱＯ１を誘導する化合物は、メナジオールの形成速度を増やし、それゆえ、ホルマザンの産生を増やす。
【０１６４】
誘導アッセイにおいて使われる濃度が細胞に細胞毒性がないことを確実とするために、化合物を、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞における成長阻害ＩＣ５０値について、一次スクリーニングした。２５μＭ（試験される最高濃度）で細胞生存度に影響を及ぼさなかった化合物は、２５μＭを上回っているＩＣ５０値を持つものとされた。化合物は、未処理のＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞と比較して、処理した細胞のＮＱＯ１活性に２倍の増加をもたらすのに必要とされる濃度と定義され、ＣＤで表わされる誘導活性について、１０〜１００倍の濃度範囲にわたり試験された。結果は、表３で与えられる。このアッセイのための正の対照は、既知のＮＱＯ１誘導剤である、スルフォラファン、及びβ−ナフトフラボン（ＢＮＦ）であった。これらのＣＤ値は、０．２６（±０．０４）μＭ及び０．０２８（±０．００３）μＭであり、報告された値とほぼ一致する（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．  Ｔ．；Ｌｉｂｙ，Ｋ．Ｔ．；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｋ．Ｋ．；Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ，Ｗ．Ｄ．；Ｇａｏ，Ｘ．；Ｓｕｈ，Ｎ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ；Ｒｉｓｉｎｇｓｏｎｇ，Ｒ．；Ｈｏｎｄａ，Ｔ．；Ｇｒｉｂｂｌｅ，Ｇ．Ｗ．；Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．；Ｔａｌａｌａｙ）。
【表３】
2012505880.tif 000016
ａ未処理のＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞と比較して、処理した細胞のＮＱＯ１活性の２倍の増加をもたらすために必要な濃度。平均及びＳＤ（Ｎ＝３）。
【０１６５】
表３から分かるように、本発明の化合物は、ＣＤ値が０．３６μＭ〜４ｎＭにわたる、概して強力なＮＱＯ１誘導物であった。環Ａの置換が改善された誘導プロフィールに有益であるかどうかを決定するために、以下の比較（一元配置分散分析によって分析された）を行った。化合物３９〜４２（環Ｂの３’−ＯＣＨ３、環Ａの様々な置換基）の場合、より大きな誘導が、４１（６−Ｃｌ）と４２（６−ＯＣＨ３）について観察された。環Ｂ上に３’−ＣＦ３があり、かつ環Ａ上に置換基がない化合物と、化合物４６〜４７（環Ｂに３’−ＣＦ３があり、かつ様々な置換基が環Ａ上にある）とを比較すると、４７（６−Ｃｌ）のみが、活性を改善した。このように、環Ａ上に６−Ｃｌがある化合物は、特定の環Ｂの官能基、すなわち、３−ＯＣＨ３及び３’−ＣＦ３と組み合わされた時だけ、これらの非置換環Ａ類似物より良好であった。これは他の置換基にとっても同様に真実であり得るが、しかし、環Ａ又はＢが主要な役割を果たすかどうかは、現在のところ確定していない。
【０１６６】
実施例４；Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の７−エトキシレゾルフィンＯ−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）活性の測定
Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞は９６−ウェルプレートのウェルあたり１００００細胞の密度で蒔かれ、そして２４時間培養した。テスト化合物の保存液は、ＤＭＳＯ中で調製され、そしてウェル中で所望の濃度を与えるために、連続的に培地で希釈された。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．５％ｖ／ｖであった。細胞は４８時間試験化合物でインキュベートした後、培地は除去され、そして、ウェルは、２００μｌの１ｘリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄され、次いで、５μＭの７−エトキシレゾルフィンと２ｍＭのサリチルアミドを含む２００μｌの培地で、３７℃で４０分間インキュベートした。蛍光測定器で、５３０ｎｍのλ励起と５９０ｎｍのλ発光で測定値を読んだ。試験化合物の蛍光（ある場合）は、観測された測定値に対するその寄与を考慮するために、同じ波長で測定された。空のウェル（細胞なし、「ブランク」）、及び０．５％のＤＭＳＯを含むが試験化合物を含まない培地中のＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞のウェル（「対照」）の測定値も、読んだ。ＣＹＰ１Ａ１活性の強い誘導物質であるＴＣＤＤ、ならびにＢＮＦ及びスルフォラファンを、対照として用いた。ＣＹＰ１Ａ１誘導活性を、以下の式によって算出した：
誘導度=Ｆ細胞＋試験化合物−Ｆブランク／Ｆ対照−Ｆブランク
【０１６７】
Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の７−エトキシレゾルフィンＯ−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）活性に対する化合物の効果
ＮＱＯ１活性の誘導が上記の化合物について観察されたので、（実施例３を参照）、第1段階の酵素活性も同様に誘導されたかどうかを判断することが重要であった。ＥＲＯＤアッセイを、このために使用した（Ｂｕｒｋｅ，Ｍ．Ｄ．；Ｍａｙｅｒ，Ｒ．Ｔ．，ＤｒｕｇＭｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  １９７４，２，５８３）。ＥＲＯＤ活性は、ＣＹＰ１Ａ１による７−エトキシレゾルフィンのレゾルフィンへのＯ−脱エチル化した割合を表わす。化合物がＣＹＰ１Ａ１活性を誘導するならば、対照の未処置Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞と比べてより多くのレゾルフィンが形成され、そして、対照のＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞に対する処理したＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞のレゾルフィンの蛍光の比率は増加するだろう。この比率は、化合物について、これらのＣＤ値の約４倍の濃度で、測定された。一定濃度はここで使用しなかった。なぜなら、ＮＱＯ１誘導活性における大きな変動を考慮すると、この濃度を選択することが難しいと考えられたからである。ＮＱＯ１及びＣＹＰ１Ａ１誘導率（同じ濃度で測定される比率）の割合を、各々の化合物についても得た。値＞1は、ＣＹＰ１Ａ１と比較してＮＱＯ１のよりよい誘導を意味する。化合物３９〜４８についての結果は、表４に表した。
【０１６８】
ＴＣＤＤ、ＢＮＦ及びスルフォラファンを、この実験の対照として用いた。ＴＣＤＤはＣＹＰ１Ａ１の既知の誘導物であり（Ｎｉｓｈｉｕｍｉ，Ｓ．；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．；Ｋｏｄｏｉ，Ｒ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｌ；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．；Ａｓｈｉｄａ，Ｈ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２００８，４７０，１８７）、そして、このアッセイで使用する場合、１ｎＭでＥＲＯＤアッセイにおいて２．９９の比率を与える。ＢＮＦとスルフォラファンは、それぞれ二官能性及び一官能性のＮＱＯ１誘導物質である（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．；Ｌｉｂｙ，Ｋ．Ｔ．；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｋ．Ｋ．；Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ，Ｗ．Ｄ．；Ｇａｏ，Ｘ．；Ｓｕｈ，Ｎ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ；Ｒｉｓｉｎｇｓｏｎｇ，Ｒ．；Ｈｏｎｄａ，Ｔ．；Ｇｒｉｂｂｌｅ，Ｇ．Ｗ．；Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．；Ｔａｌａｌａｙ）。それゆえに、ＢＮＦはＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞でＣＹＰ１Ａ１とＮＱＯ１活性を誘導する筈であり、スルフォラファンはＣＹＰ１Ａ１活性より著しくＮＱＯ１活性を誘導する筈である。０．０１μＭのＢＮＦが、１．８３倍（ＮＱＯ１誘導率）のＮＱＯ１活性と１．１３倍（ＣＹＰ１Ａ１誘導率）のＣＹＰ１Ａ１活性を誘導し、従って、１．６２のＮＱＯ１／ＣＹＰ１Ａ１割合を与えることが見出された。スルフォラファンで得られた結果は、その一官能性の特徴に沿っていた。１μＭで、スルフォラファンはかろうじてＣＹＰ１Ａ１活性（比率＝０．９２４）を誘導したが、ＮＱＯ１活性を約４倍（比率＝３．８９）増加させた。
【０１６９】
概して、本発明の化合物は、ＣＹＰ１Ａ１の弱い誘導物質であった。具体例として、化合物４７はＣＹＰ１Ａ１活性を２倍以上増やす。ＣＹＰ１Ａ１誘導率より重要なのは、ＣＹＰ１Ａ１誘導率に対するＮＱＯ１誘導率の割合である。何故なら、化合物がＣＹＰ１Ａ１に優先してＮＱＯ１を誘導したかどうかを示すからである。より強いＮＱＯ１誘導によって相殺されるのであれば、強いＣＹＰ１Ａ１誘導は不利でない場合がある。最も強力なＮＱＯ１誘導物質は４７（ＮＱＯ１誘導率５．２０、表４）であり、そして、２．１７のやや低いＮＱＯ１／ＣＹＰ１Ａ１割合を有していた。類似の関係は、化合物４５についても見られた。
【表４】
2012505880.tif 000017
ａ化合物番号及びＣＹＰ１Ａ１誘導アッセイに用いられた濃度（ＮＱＯ１活性に対する〜４ｘＣＤ）は、括弧内に与えられる。
ｂ第１列に示す濃度でＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞で測定。平均±ＳＤ、ｎ＝３。ＣＹＰ１Ａ１誘導比＝（蛍光細胞＋試験化合物−Ｆブランク）／（蛍光対照細胞−Ｆブランク）
ｃＣＹＰ１Ａ１の誘導比と同じ濃度で、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞で測定。値は、各化合物の濃度に対する誘導度のプロットから読み取った。
ｄ割合＝ＮＱＯ１誘導活性／ＣＹＰ１Ａ１誘導活性
ｊこの値は、０．００５、０．０５、０．５、及び５μMの濃度のＢＮＦから構築された曲線から読み取った。したがって、この値にはＳＤはない。０．０５μMのＢＮＦでは、ＣＹＰ１Ａ１の比率は１．２７±０．１２であった。
【０１７０】
実施例５；ミクロ培養テトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイによる抗増殖性活性の測定
本発明の化合物の抗増殖性活性を、以下の細胞系でのＭＴＴアッセイによって測定した：ＭＣＦ７（ヒト乳癌細胞株）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌細胞株）、及びＣＣＬ１８６（正常ヒト二倍体胚性肺線維芽細胞）。細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入した。ＭＣＦ７及びＣＣＬ１８６細胞は、１０％のＦＢＳ及び０．０１％の抗生物質を補充した、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＥａｇｌｅ’ｓ最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。ＨＣＴ１１６細胞は、１０％のＦＢＳと０．０１％の抗生物質を補充した、２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含むＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地で培養した。細胞は、以下の密度で蒔いた：１００００細胞／ウェル（ＭＣＦ７）、４０００細胞／ウェル（ＨＣＴ１１６）、５０００細胞／ウェル（ＣＣＬ１８６）。これらを９６穴プレートで２４時間生育し、各々のウェル中の対応する培地は１００μｌであった。試験化合物をＤＭＳＯで調製し、そして培地で一連の濃度に希釈した。１％以下のＤＭＳＯ（最終濃度）が、各ウェルに存在した。試験化合物は細胞と７２時間インキュベートし、その後、１００μｌのＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌの１ｘＰＢＳ）を添加して３時間インキュベートし、そして細胞をホルマザン産物を遊離するために溶解した。ホルマザン産物をＤＭＳＯ（１５０μｌ）に溶解後、マイクロタイター・プレートリーダー上で、５９０ｎｍで３０分以内に吸光度を測定した。細胞生存度は、以下の式によって算出した：
細胞生存度（%）=［（Ａ細胞+試験化合物−Ａブランク）／（Ａ未処理細胞−Ａブランク）］Ｘ１００
ここでＡは、試験（Ａ細胞+試験化合物）、対照（Ａ未処理細胞）又はブランク（Ａブランク）ウェルにおける、５９０ｎｍで測定されたホルマザンの吸光度である。試験化合物の各々の濃度を、３回にわたり評価した。細胞成長の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）は、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ  ７．５  ＳＲ１（Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｖ７．５７７６  Ｂ７７６，ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）を用いて生存細胞％対濃度をプロットすることによって得られたＳ字形曲線から決定した。ＭＴＴアッセイは、試験化合物の細胞障害性を測定する目的で、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞でも行った。細胞による化合物のインキュベーション期間が７２時間の代わりに４８時間であったこと以外は、同じ手順を採用した。
【０１７１】
＜ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７及びＣＣＬ１８６細胞の化合物の抗増殖性活性＞
化合物は、最初に、ヒトガン細胞株ＨＣＴ１１６とＭＣＦ７細胞において、１０μＭの一定濃度でスクリーニングした。４２、４５〜４８のような化合物は、この濃度において５０％以上の細胞死を引き起し、これらの化合物は、２つのガン細胞株（表５）に対するＩＣ５０についてさらに評価した。細胞生存度に影響を及ぼすことが見出された化合物の少数であること（１１、１８％）は、大部分の化合物がＣＤ値＜１０μＭ（表３）でＮＱＯ１活性を誘導する化学防御と比較して、抗増殖性活性のためのより厳しい必要条件が存在することを意味し得る。
【表５】
2012505880.tif 000018
ａ試験化合物と７２時間のインキュベーション後に、５０％の細胞生存度を減らすために必要な濃度。平均±ＳＤ、ｎ＝３。太字又は斜体の値は、選択比を表す：ＩＣ５０  ＣＣＬ１８６／ＩＣ５０  ＭＣＦ７  又はＩＣ５０  ＣＣＬ１８６／ＩＣ５０  ＨＣＴ１１６。
【０１７２】
表５の化合物は、両方のガン細胞株において、ＩＣ５０値が１．２〜１９．６μＭの範囲の、同程度の抗増殖性活性を有していた。これらの活性を通常の細胞株（ヒト肺線維芽細胞）で得られるものと比較したとき、やや低めの選択性（平均で約２倍）を観測した。化合物４６及び４７は、ガン細胞と通常の細胞とをあまり区別せず、選択性は１に近かった。
【０１７３】
本発明の化合物は、強い抗増殖活性を示した。具体例として、表５に挙げた環Ｂ（４６、４７、４８）に３’−ＣＦ３を有する化合物は、環Ａ置換基と全く独立した、この置換基によってもたらされる重要な役割を示している。同様に、クラス２の環Ａは、６位での３つの異なる置換基、すなわち、６−ＯＣＨ３、６−Ｃｌ及び６−Ｆだけを有した。これらのうち、環Ｂの官能基にかかわりなく、６−ＯＣＨ３を有する３つ全ての化合物（４２、４５、４８）が表５に挙げられているので、６−ＯＣＨ３が好ましいように見える。それゆえに、６−ＯＣＨ３（環Ａ）と３’−ＣＦ３（環Ｂ）が抗増殖性活性のための好ましい官能基であると結論され得るが、それにもかかわらず、最も活性の高い化合物４２（６−ＯＣＨ３、３’−ＯＣＨ３）には同じ分子で両方の特徴はなかった。実施例３に記載したＮＱＯ１誘導活性とは異なり、抗増殖性活性について好ましい置換基は、比較的はっきりしている。
【０１７４】
実施例６：細胞数測定によるＨＣＴ１１６細胞の細胞周期に対する試験化合物の効果の測定
ＨＣＴ１１６細胞をコンフルエンスに生育し、そして培地の交換なしで、少なくとも５日間この状態で維持した。血清飢餓状態の細胞は、その後トリプシン処理され、そして６ウェルプレート中に５ｘ１０５細胞／ウェルの密度で二次培養した。成長培地は、１０％のウシ胎児血清を含んでいた。試験化合物を、細胞がＧ１期に同期してすぐに、又は、細胞がＧ２期に同期したときである、２４時間後のいずれかで添加した。細胞は、添加の時から２４時間、試験化合物とインキュベートした。この時間の後、細胞は回収され、トリプシン処理され、そして７０％の氷冷エタノールで最低２４時間固定した。遠心分離後、上澄みを捨て、そして沈殿物はＲＮａｓｅ  Ａ（２００μｇ／ｍｌ）で３０分間室温で処理し、その後２０μg／ｍｌの最終濃度のヨウ化プロピジウムを用いて細胞染色した。染色された細胞は、その後アルゴン固体レーザー（４８８ｎｍ）を備えたＤａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃｙａｎ  ＬＸ（Ｄａｋｏ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）上で、Ｓｕｍｍｉｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．３）ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、サブＧ１、Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍにおいて、細胞周期分布について解析した。化合物は、ＨＣＴ１１６細胞上のＭＴＴアッセイで測定したＩＣ５０である、〜１．５×ＩＣ５０の濃度で試験した。
【０１７５】
＜統計解析＞
データは、ＳＰＳＳ  １５．０（ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．）上の事後テストとしてチューキーＨＳＤが続く一方向分散アッセイにより、統計的有意性について解析した。スピアマンの相関解析を、同じソフトウェアで行った。０．０５の確率のレベルを、有意水準として使用した。
【０１７６】
＜選択した化合物のＨＣＴ１１６細胞の細胞周期における効果＞
表５に挙げられた化合物の抗腫瘍性活性の根本的な機序をより理解するため、細胞周期におけるこれらの効果を、フローサイトメトリーを用いた蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣ）アッセイ法によって調査した。実験は、Ｇ１又はＧ２／Ｍ期における同期した細胞数に対する試験化合物の効果を調べるように設計した。Ｇ１同期化した細胞は、最高５日間コンフルエントに細胞を生育させて、それから低密度の継代培養による細胞周期への再入を刺激することによって得られた。２４時間の生育後、これらの細胞は、Ｇ２／Ｍ期に調整された。
【０１７７】
Ｇ１ブロックから遊離した細胞は、異なる期の細胞の分布が決定した後、一定濃度（ＨＣＴ１１６細胞上で〜１．５×ＩＣ５０）の試験化合物に２４時間曝露した後、対照の未処置細胞と比較した。Ｇ２／Ｍ期に調製された細胞も、同様に処理した。Ｇ１ブロック及びＧ２ブロックから遊離した対照細胞の代表的なＦＡＣＳ図を、図１に示す。Ｇ１又はＧ２停止の解除後の各期の細胞の割合を、表６に示す。
【表６】
2012505880.tif 000019
ａ使用した濃度は括弧内に示す。〜１．５ｘＩＣ５０  ＨＣＴ１１６
ｂ各周期における細胞の比率は、３つの個別の測定の平均である。
【０１７８】
アッセイの結果は、化合物がＧ１停止（４６、４７）又はＧ２停止（４２、４５、４８）を引き起こすことを示した。その抗増殖性活性は、自食又は壊死のような他の機序から発生し得る。４６をＧ１停止と関連した化合物の例として、ＦＡＣＳ図は、Ｇ１ブロックから遊離した細胞が４６で処理されたとき、Ｇ１からＧ２／Ｍへの進行が中断したことを示した（図ＩＡ）。サブＧ１期の顕著な増加を、観測した（表６）。予想されたように、４６はＧ２／ＭからＧ１への細胞の移行に影響を及ぼさなかった（図ＩＢ）。Ｇ２停止を引き起こした４８の場合、４８はＧ１から遊離した細胞の進行に干渉しないが（図ＩＡ）、Ｇ２／ＭからＧ１（図ＩＢ）への細胞移行を妨げた。このように、Ｇ１期の細胞の割合は、４８への曝露後（２４時間）増加しなかった（未処理の細胞の５５．８８％と比較して、Ｇ１期で３０．５５％）（表６）。サブＧ１期（図ＩＢ、表６）における、アポトーシス細胞の顕著な増加もあった。
【０１７９】
Ｇ１又はＧ２停止を引き起こした化合物の間の構造傾向を観察した。Ｇ２停止を引き起こした化合物（４２、４５、４８）には、環Ａ又はＢ上に共通して１つ又は２つのメトキシ基が存在していた。化合物４２、４５及び４８は、環Ａ上に６−ＯＣＨ３を有していた。４２及び４５の環Ｂも、メトキシル化されていた。対照的に、Ｇ１停止を引き起こした化合物（４６、４７）は、ハロゲン化されていた（４６、４７）。
【０１８０】
実施例７：ＨＣＣ細胞株における化合物３９〜４８の抗増殖性潜在能力
ＨＣＣに対するこれらの化合物の制癌性潜在能力は、２つの代表的な肝がん細胞株、ＨｅｐＧ２とＨｕＨ７を用いて、化合物を１００倍以上の濃度範囲（０．１〜１０μＭ）でスクリーニングする表現型アッセイを用いて試験した。さらに、ＴＨＬＥ２を、制癌性潜在能力を非特異的な細胞障害と区別する、通常の肝細胞株として使用した。７２時間後の細胞生存度の５０％阻害に基づくＩＣ５０値は、細胞内ＡＴＰ量の減少によって求めた。結果から、化合物４７は、ＨｕＨ７とＨｅｐＧ２（それぞれ０．５μＭと０．６μＭ）に対して、μＭ以下のＩＣ５０を示した。化合物４６と４８は、類似した力価を示したが、ＨｕＨ７よりＨｅｐＧ２に対して、より効果があった（表２）。これらの応答は、ＨｕＨ７及びＨｅｐＧ２でのＩＣ５０はそれぞれ４．７μＭ及び４．５μＭであり、臨床的に関連したインドリノンであるスニチニブと同等か、より優れていた。
【０１８１】
図２に示される細胞生存度アッセイは、それぞれのＩＣ５０値の測定のために、Ｐｒｉｓｍ５によって解析した。
【表７】
2012505880.tif 000020
【０１８２】
その後、試験化合物の安全性指標を、正常肝臓対照細胞株で１０μＭでの生存率を正規化することによって定量化した（すなわちＴＨＬＥ２／（ＨｕＨ７又はＨｅｐＧ２）。大部分の化合物は、値＞1であり、これは化合物についての抗増殖性効果の腫瘍細胞対正常細胞における選択性を示す（表８）。
【０１８３】
細胞生存度は、上記の表７で記載したように測定した。１０μＭ処置での生存率が測定され、そして、安全率はＴＨＬＥ２に対するＨＣＣ細胞株の生存率を正規化することによって計算された。
【表８】
2012505880.tif 000021
【０１８４】
驚くことに、ＨｕＨ７（Ｓｒ＝２１．７６）及びＨｅｐＧ２（Ｓｒ＝６５．２７）によって評価されるように、化合物４７は顕著な安全性を示した。スニチニブとの比較は、化合物４７がより良い有効性及び減じられた細胞障害性を示すことを確認した（図２）。
【０１８５】
実施例８；化合物４７のＨＣＣ細胞株の別々のパネルにおける効果
そこで、化合物４７をＨＣＣ細胞株の４つのより大きなパネルに対してスクリーニングした。これ以降の実験は、試験される４つの細胞株のうちの３つで、低マイクロモル濃度又はマイクロモル濃度以下におけるＩＣ５０でその効果を確認した。ＳＫ−Ｈｅｐ１は、ＩＣ５０が１０μＭで達成できなかった唯一の低い応答を示したものであった。一方、Ｈｓ８１７Ｔは、化合物４７に最も感度が高く、５μＭで生存度が検知されなかった（図３）。
【０１８６】
実施例９：細胞周期とアポトーシスの生化学的マーカーに対する化合物４７の効果
次に、化合物４７の反増殖的な効果の機序を、調査した。化合物４７は、２４時間で、Ｅｒｋ及びＡｋｔの両方のリン酸化の用量依存的な阻害を引き起こした（図３）。細胞周期マーカー、サイクリン−Ｄ１及びＰＣＮＡ発現の対応する減少もあった。同様に、切断されたＰＡＲＰ（図４）及び、カスパーゼ−３活性（図５）などのアポトーシスマーカーは、プロアポトーシスの機序の関与を裏付けた。しかし、ミトコンドリアアポトーシスに関与するＢａｘとＢＣＬ−ｘＬに対する影響は、ほとんどなかった。
【０１８７】
実施例１０：化合物４７はＨｕＨ７におけるＡＦＰ転写を阻害する
ＨＣＣの治療に関する化合物４７の特性を評価するために、腫瘍マーカーＡＦＰを、転写的に測定した。より確立されたＥＬＩＳＡにに勝るＡＦＰ  ｍＲＮＡ定量の長所は、化合物４７によるＡＦＰの撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）が、直接的な遺伝子制御効果、又は変化した細胞増殖の間接的な結果によるものかどうかを確認することである。ＨｕＨ７（高いＡＦＰを生産する）を用いて、本発明者は、ＡＦＰコピーが化合物４７の投与（１０μＭ）後２４時間以内に３分の１まで顕著に抑制される一方で、この間スニチニブが測定可能な効果を示さないことを見出した（図６）。
【０１８８】
実施例１１：抗体アレイによるＲＴＫ標的のプロファイリング
その後、化合物４７のＲＴＫ標的を、ＨＣＣ細胞株におけるその有効性に関して考察した。化合物４７又はスニチニブのいずれかによる受容体型チロシンキナーゼ阻害のプロファイリングを、処理した細胞の溶解物を、ヒトのホスホＲＴＫアレイ(ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)でインキュベートすることによって測定した。血清飢餓状態ＨｕＨ７細胞を使用した。何故なら、これはこの研究において使用される他のＨＣＣ細胞株より、恒常的にリン酸化されたＲＴＫを有するからである（データ示さず）。それゆえに、このプラットホームは、標的キナーゼのリン酸化の阻害と同時のシグナル変化を検出するのを可能にする。ここでは、化合物４７によるインシュリン受容体、ＩＧＦ１−Ｒ、Ｔｙｒｏ３、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３、Ｍｅｔ、及びＲＯＮを含むＲＴＫの顕著な阻害が、観測された（図７）。これらの効果の大きさが、濃度測定的に測定され、そしてインシュリン受容体を重要な例外として、スニチニブより一般に高いことがわかった（表９）。
【０１８９】
化合物４７又はスニチニブ（図７）での処理後のＲＴＫリン酸化における変化は、定量化されて、未処置の対照における発現の大きさの順にランク付けされた（最高〜最低）。
【表９】
2012505880.tif 000022
【０１９０】
他のマイナーな効果がＦＧＦＲ４とＣＳＦ−ＩＲについて観測されたが、これらのスポットは正確な定量化のためには薄すぎた（図７）。
【０１９１】
実施例１２：ウェスタンブロットによるＩＧＦ−１Ｒ、ＥｐｈＡ２及びＴｙｒｏ３リン酸化の阻害の確認
主なＲＴＫリン酸化の変化を、イムノブロッティングよって個別に決定した。具体的には、本発明者はＨｕＨ７の腫瘍形成性のための新しい伝達機構であるかもしれない興味深い標的として、恒常的にリン酸化されるＩＧＦ−１Ｒ、ＥｐｈＡ２及びＴｙｒｏ３を調べた。結果から、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｐｈＡ２リン酸化の比例的な減少が、化合物４７（図８Ａ及び８Ｂ）の濃度の増加と共に観測された。この観測は化合物に特有であった。何故なら、１０μＭのスニチニブがどちらのチロシンキナーゼのリン酸化も認め得るほどに抑制しなかったからである。一方、Ｔｙｒｏ３リン酸化は、用いられた最も低い濃度（1μＭ）においてさえ阻害され、そして、より高い濃度で更なる阻害は観測されなかった。スニチニブは、Ｔｙｒｏ３に対して類似の効果を示した。これとは別に、ＥＧＦＲリン酸化の予想外の増加も、スニチニブではなく化合物４７で処置すると再生された（図８Ｂ）。
【０１９２】
要約すると、本発明の発明者は、本明細書中に記載される化合物が抗増殖性活性だけでなく、化学防御にも適していることを見出した。
いかなる特定の理論の束縛を受けることなく、環Ｂの３’−ＣＦ３置換基と環Ａの６−ＯＣＨ３置換基は抗増殖性活性のための重要な置換基であるようであったが、ＮＱＯ１誘導に好ましいものはより明確でなかった。良い抗増殖性活性と化学的予防可能性（これらのＮＱＯ１／ＣＹＰ１Ａ１割合から評価される）とを併せ持つ、少数の化合物を特定した。これらは、主に化合物（４２、４５〜４８）であった。これらの化合物は、２を超えるＮＱＯ１／ＣＹＰ１Ａ１割合を有していた。化合物４２、４５〜４８が特に有望である。何故なら、これらはナノモル範囲のＣＤ値を有するが、ＮＱＯ１誘導に対する少なくとも２倍の選択性を示すからである。これらの化合物は、正常な細胞に対して細胞保護性である一方で、癌細胞に対して細胞傷害性であるという、二重の効果を潜在的に有し得る。
【０１９３】
予想外の発見は、抗増殖性活性を有する化合物の構造特徴が、細胞周期の進行におけるこれらの影響とどのように関連するかであった。おそらく紡錘体の形成を阻害することによって、環Ａ及びＢに少なくとも２つのメトキシ基を有する化合物（４２、４５）は、Ｇ２停止を引き起こすことが見出された。対照的に、両方の環上にハロゲン基を有する化合物（４６〜４８）は、サイクリン依存的キナーゼ活性の阻害に関与し得るＧ１期停止を引き起こした。アポトーシスの兆候を、これらの化合物について観測した。
【０１９４】
結論として、本発明者は、本明細書中に記載される化合物の、これらのＮＱＯ１活性を誘導する能力から見られる化学的予防可能性を示した。評価された大部分の化合物は、１０μＭ未満のＣＤ値を有しており、化学的予防への足場を提供する可能性を強く示す。一方、このシリーズにおいて４倍以上選択的にＮＱＯ１を誘導した候補化合物が存在していたが、窒素の存在は、化合物をＣＹＰ１Ａ１及びＮＱＯ１活性へと誘導した可能性がある。抗増殖性活性の場合、本明細書中に記載される化合物（４２、４５〜４８）は、ＮＱＯ１の選択的な誘導と、良好な抗増殖性活性（２つの癌細胞株でＩＣ５０＜１０μＭ）とを成功裡に併せ持つことができた。したがって、これらは癌細胞に対する抗増殖性活性と、正常な細胞においてＮＱＯ１誘導を介したある程度の細胞保護作用とを併せ持つ、化合物の有用な先駆けである。
【０１９５】
本発明の発明者は、有効性の予備証拠として、ＨｕＨ７及びＨｅｐＧ２における細胞生存度の阻害を用いて、新規ベンジリデン−インドリノンをスクリーニングした。インドリノン環は、化合物ライブラリーを産生するための、誘導体化のための多部位を有する多目的の足場である。重要なことに、この足場は、効果的な送達のための低分子量（＜５００）、及び細胞透過性と分布のための良好な親油性（ｃＬｏｇＰ＜５）などの、薬様の特性の重要な基準を満たす。さらに、インドリノンの従前の最適化が、スニチニブのような他の強力なマルチターゲット阻害剤も引き起こしたので、インドリノンが最適に複数のキナーゼのＡＴＰ結合ポケットの化学的環境に適合し、そして、足場の微妙な機能化が、臨床的価値の他の類似物を発見するのに役立ち得ると推測された。
【０１９６】
この手法を使って、本発明者は、置換ベンジリデンインドリノン（化合物４６〜４８）のサブセットが、ＨＣＣで特に効果的であるのを見出した。これらの分子はもっぱら化合物ライブラリー由来の３−トリフルオロメチルの置換類似体であり、したがって、これを薬物設計のさらなる最適化のために有用なファーマコフォアであることを示唆する。特に、前述のように、化合物４７はマイクロモル以下のＩＣ５０を示し、ＨｅｐＧ２細胞での、スニチニブ（図３）及びソラフェニブより優れていた（Ｌｉｕ  Ｌ，Ｃａｏ  Ｙ，Ｃｈｅｎ  ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ，ＭｃＮａｂｏｌａ  Ａ，Ｗｉｌｋｉｅ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ  ｂｌｏｃｋｓ  ｔｈｅ  ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ  ｐａｔｈｗａｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｄｅｌ  ＰＬＣ／ＰＲＦ／５．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６  Ｄｅｃ  １５；６６（２４）：１１８５１−１１８５８）。この効果は、多様な病因の肝細胞癌細胞株の範囲へ外挿することができる。唯一の弱い応答者は、孤立間葉系幹細胞様細胞系である、ＳＫ−Ｈｅｐ１であり、それは非常にさまざまな病態を有する（結腸癌の遠転移由来の二次性腫瘍）。その上、化合物４７はＴＨＬＥ２における減少した細胞障害性に基づく、非常に好ましい安全性プロファイルを示した。これは、マルチターゲットのキナーゼ阻害剤の特に重要な属性である。何故なら、その標的選択性における本質的に低い厳密性が、何かの事情で、より非特異的な効果につながる可能性があるからである。
【０１９７】
上記の結果が潜在的な薬剤候補としての化合物４７を裏付けるので、阻害されたキナーゼが、遡及的に検討され、その際そのＨｕＨ７における活性の基本機序が、（血清飢餓条件下で）推測された。おそらく、このような戦略は、標的とされるすべてのキナーゼの包括的特定を防止し得る。しかし、このアプローチの利点は、恒常的にＨＣＣで活性であり、そのため腫瘍原性を維持するのに極めて重要な役割を果たしている、ＲＴＫｓのサブセットに価値ある見識を生み出すことである。したがって、ＩＧＦ−１Ｒが、主要な標的として、ＨＣＣ病因の将来の研究における新規かつ潜在的に重要な寄与する分子としての、ＥｐｈＡ２とＴｙｒｏ３と共に、発見された。面白いことに、ＥＧＦＲリン酸化の逆説的な増加も、観測された。ＥＧＦＲ活性は通常Ｅｋｒシグナリングを通して細胞増殖の増加と相関するが、そのような下流の効果は検出されなかった（図５）。任意の理論の束縛を受けることを望むことなく、１つの仮説は、ＥＧＦＲ活性は、腫瘍が発癌性依存を別の経路に切り替えようとする中での、ＩＧＦ−１Ｒ阻害への補償応答であるかもしれない。ＥＧＦＲ活性に正比例する、爾後のＥｋｒリン酸化の障害は、ＥＧＦＲでなく、ＩＧＦ−１Ｒが腫瘍増殖を打ち消す制御をすることを示唆する。ＥＧＦＲとＩＧＦ−１Ｒの間の相互依存は、肝癌細胞がＩＧＦ−１Ｒシグナリングを通してＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）に対する抵抗を得るというクロストークについての以前の報告に裏付けられる（ｓｂｏｉｓ−Ｍｏｕｔｈｏｎ  Ｃ，Ｃａｃｈｅｕｘ  Ｗ，Ｂｌｉｖｅｔ−Ｖａｎ  Ｅｇｇｅｌｐｏｅｌ  ＭＪ，Ｂａｒｂｕ  Ｖ，Ｆａｒｔｏｕｘ  Ｌ，Ｐｏｕｐｏｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＩＧＦ−１Ｒ／ＥＧＦＲ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋｓ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６  Ｄｅｃ  １．１１９（１１）：２５５７−２５６６）。ＩＧＦ−１Ｒの相互抑制も、これらの観測を反映したＢｘＰＣ３細胞中で、ＥＧＦＲリン酸化の増加を示した（Ｂｕｃｋ  Ｅ，Ｅｙｚａｇｕｉｒｒｅ  Ａ，Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｍ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  S，Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ  Ｍ，Ｂａｒｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  Ｏｃｔ  １５．６８（２０）：８３２２−８３３２）。同様に、別の研究は、ＩＧＦ−１Ｒの撹乱は、ＨｕＨ７細胞におけるＥｋｒリン酸化を直接変化させ、そして、腫瘍形成の一因となることを記載し（Ｃｈｅｎｇ  Ｗ，Ｔｓｅｎｇ  ＣＪ，Ｌｉｎ  ＴＴ，Ｃｈｅｎｇ  Ｉ，Ｐａｎ  ＨＷ，Ｈｓｕ  ＨＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００８  Ｊｕｌ；２９（７）．１３１９−１３２６）、したがって、��の癌種で見られるより確立されたＥＧＦＲシグナリングと比較して、ＩＧＦ−１ＲをＨＣＣにおけるＭＡＰＫシグナリングの最も有望なトランスデューサーとして確認した。
【０１９８】
ＩＧＦ−１Ｒは、がん研究への意義を高める遺伝子である。報告書は、肝細胞癌におけるＩＧＦ−１Rの役割と、その下流の細胞周期及びＨＣＣモデルにおける抗アポトーシス経路の制御を記載している（Ｃｈｅｎｇ  Ｗ，Ｔｓｅｎｇ  ＣＪ，Ｌｉｎ  ＴＴ，Ｃｈｅｎｇ  Ｉ，Ｐａｎ  ＨＷ，Ｈｓｕ  ＨＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００８  Ｊｕｌ．２９（７）：１３１９−１３２６．Ｈｏｐｆｎｅｒ  Ｍ，Ｈｕｅｔｈｅｒ  Ａ，Ｓｕｔｔｅｒ  ＡＰ，Ｂａｒａｄａｒｉ  Ｖ，Ｓｃｈｕｐｐａｎ  Ｄ，Ｓｃｈｅｒｕｂｌ  Ｈ．Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＩＧＦ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｈａｓ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００６  Ｍａｙ  １４；７１（１０）．１４３５−１４４８）。ＩＧＦ−１Ｒが、ＨｕＨ７において最も強くリン酸化されたＲＴＫ（生理活性インシュリン受容体の近傍）であるという観察は、それをＨＣＣ表現型の維持における重要な候補にする。個別に、ＥｐｈＡ２とＴｙｒｏ３は、ＨＣＣにおける新規の癌遺伝子である。ＥｐｈＡ２は、蓄積された証拠が、いくつかの悪性腫瘍での発現と役割を示唆しているので、新たな標的である。少なくともいくつかの黒色腫において、ＥｐｈＡ２活性は、腫瘍新血管形成の一因となることが示された（Ｗａｌｋｅｒ−Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｊ，Ｈｅｓｓ  ＡＲ，Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ，Ｋｉｎｃｈ  ＭＳ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥｐｈＡ２  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００３  Ａｐｒ．１６２（４）：１０３７−１０４２）。Ｔｙｒｏ３は、ＲＴＫのＡｘＩサブファミリーに属す。現在まで、その変化特性が実験的なモデルで実験的に示されたが、限られた報告はヒトのガンとＴｙｒｏ３とを関連付けた（Ｈａｆｉｚｉ  Ｓ，Ｄａｈｌｂａｃｋ  Ｂ．Ｇａｓ６  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ．  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＡｘＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ．ＦＥＢＳ  Ｊ  ２００６  Ｄｅｃ．２７３（２３）：５２３１−５２４４）。ＨＣＣにおけるこれらのＲＴＫの正確な機能が更なる調査を必要とする一方で、細胞サイクリングマーカー（ＰＣＮＡ及びサイクリンＤ１）の阻害と、初期のアポトーシス（カスパーゼ−３活性化及びＰＡＲＰ切断）の刺激は、キナーゼ阻害の結果がシグナリングカスケードを通して翻訳され、成長停止と細胞死の相乗効果をもたらしたという、更なる証拠を提供した。
【０１９９】
化合物４７のＲＴＫ標的の完全なスペクトルが調査されてない一方で、今までのところ提供されている証拠は、古典的なマルチ−ＲＴＫ阻害剤（スニチニブ）との際立った対照を明らかにした。インシュリン受容体は化合物４７によって阻害されたが、スニチニブよりかなり弱かった。これは、観測された化合物４７のスニチニブに対する、低減された細胞障害性の効果を説明し得る。対照的に、化合物４７による強いＩＧＦ−１ＲとＥｐｈＡ２阻害は、スニチニブで見られなかった。1つの重要な結果は、スニチニブが無視できる効果しか有しない一方で、化合物４７が劇的にＡＦＰ転写を減少させたという、ＡＦＰの調節における顕著な違いであった。この発見は、キナーゼが阻害されたパネルがＡＦＰを機構的に調節しそれによって、６０−７０％がＡＦＰ陽性であることが知られているＨＣＣに、選択的な効果を与えたかもしれないという可能性を暗に示した(Ａｂｅｌｅｖ  ＧＩ，Ｅｒａｉｓｅｒ  ＴＬ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ａｐｒ；９（２）．９５−１０７)。さらに、ＡＦＰノックダウンがＨｕＨ７細胞でアポトーシスを促進するという最近の発見は、ＡＦＰが無害な腫瘍マーカーの代わりにＨＣＣ成長を能動的に制御し得ることを示唆する（Ｙａｎｇ  Ｘ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｍａｏ  Ｊ．  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２００８  Ｎｏｖ  ２８；２７１（２）：２８１−２９３）。全体として、ＩＧＦ−１ＲとＥｐｈＡ２及びＴｙｒｏ３などの他のＲＴＫを含むキナーゼ阻害の新しい組合せは、化合物４７を、ＨＣＣ治療に適切なＲＴＫ標的の他の先端的な最適化と、探索のための、興味深く、かつ潜在的に有用な薬剤とする。
【０２００】
結論として、新しいインドリノン誘導体は、癌、特に肝細胞癌に対して、既存のＴＫＩ以上の治療上の利点を表示することが、同定された。機構的に、ＩＧＦ−１ＲシグナリングはおそらくＨＣＣの腫瘍維持手段のための重要な伝達機構であり、そして、ＥｐｈＡ２及びＴｙｒｏ３の果たし得る役割は、更なる調査を必要とする。ＩＧＦ−１Ｒ及び他の経路に集中する多元標的とされたキナーゼ阻害剤は、したがって、ＨＣＣならびに複数のシグナリング異常が関係し得る他の悪性に対して使用するＴＫＩｓの新しいクラスを示し得る。
【０２０１】
当業者は、本発明が目的を実行し、かつ本明細書中に記載されている固有のものと同様の結果と利点を得るのによく適合しているとも容易に認めるだろう。本明細書に記載される分子複合体、及び、方法、手順、処置、分子、特定の化合物は、現段階での好ましい態様を代表して、例示的であり、かつ発明の範囲に対する制限を意図しない。当業者に想到される、本発明の精神の範囲内の本明細書中の変更及び他の用途は、特許請求の範囲によって定められる。
【０２０２】
置換と修飾の変更が、発明の範囲と精神を逸脱しない範囲で、本明細書中で開示された発明になされるかもしれないことは、当業者にとって容易に明らかになるだろう。
【０２０３】
本明細書中に記載のすべての特許と文献は、本発明に関係する当業者のレベルを示す。個々の文献が明確に、そして、個別に参照として包含されることを示すように、すべての特許と文献は同程度に参照として本明細書中に包含される。
【０２０４】
適切に具体例として本明細書中に開示される発明は、特に本明細書中に明らかにされない任意の１つの要素又は複数の要素、１つの制限又は複数の制限がない場合でも実施されてよい。このように、本明細書中のいかなる場合でも、用語「含む」、「実質的に〜からなる」、及び「〜からなる」のうちのいずれも、他の２つの用語と置き換えてよい。使用された用語及び表現は、制限の用語でなく開示の用語として使用され、そして、このような用語及び表現の使用において、示された、又は開示された特徴又はその一部の任意の均等物を除外することを意図しないが、様々な修正が主張される発明の範囲内で可能であることが認識される。このように、本発明が好ましい態様及び選択的な特徴によって明らかにされたが、本明細書中に開示される概念の修正及び変更は当業者によってなされてもよく、そしてこのような修正及び変更が、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲内であると考えられることを理解すべきである。
【０２０５】
さらに、本発明の特徴又は面がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本発明が、それによってマーカッシュグループの任意の個々のメンバー又はサブグループのメンバーに関しても記載されていることを認識するであろう。例えば、Ｘが臭素、塩素とヨウ素からなる群より選択されると記載されている場合、Ｘが臭素である主張と、Ｘが臭素及び塩素である主張とが、完全に記載される。
【０２０６】
他の態様は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2012505880.tif 000029
【図２】
2012505880.tif 000030
【図３】
2012505880.tif 000031
【図４】
2012505880.tif 000032
【図５】
2012505880.tif 000033
【図６】
2012505880.tif 000034
【図７】
2012505880.tif 000035
【図８】
2012505880.tif 000036
【配列表】
2012505880000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月21日(2011.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式Iの化合物又はこれの薬学的に許容される塩
【化１】
2012505880.tif 000037
［式中、
ｍとｎが共に１である場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つであり、
ｍが１でありｎが２である場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つである］と、
薬学的に許容される担体又は賦形剤
とを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が、
６−フルオロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−ヒドロキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、及び
６−メトキシ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン
からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物が、６−クロロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オンである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
追加の薬剤又は薬物をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
化学式Iの化合物であって、
【化１】
2012505880.tif 000038
６−フルオロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−クロロ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−メトキシ−３−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、
６−フルオロ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン、及び
６−メトキシ−３−（３’−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−インドリン−２−オン
からなる群より選択される、化合物。
【請求項６】
５−クロロ−３−（３’−メトキシ−ベンジリデン）−インドリン−２−オン。
【請求項７】
請求項１に記載の化学式Ｉの化合物を調製する方法であって、塩基の存在下で、化学式（ＩＩＩ）のオキシインドールを、化学式（ＩＶ）のアルデヒドと反応させることを含む、方法。
【化５】
2012505880.tif 000039
【化６】
2012505880.tif 000040
【請求項８】
請求項６に記載の化合物又は塩と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
追加の薬剤又は薬物をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
タンパク質キナーゼの触媒活性を調節する方法であって、前記タンパク質キナーゼを、化学式Ｉの化合物
【化１】
2012505880.tif 000041
［式中、
ｍとｎが共に１である場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つであり、
ｍが１でありｎが２である場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つである］
と接触させることを含む、方法。
【請求項１１】
前記タンパク質キナーゼは、タンパク質チロシンキナーゼを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質チロシンキナーゼは、受容体タンパク質チロシンキナーゼを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記受容体タンパク質チロシンキナーゼは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲ、ＣＳＦＩＲ、Ｃ−Ｋｉｔ、Ｃ−ｆｍｓ、Ｆｌｋ−１Ｒ、Ｆｌｋ４、ＫＤＲ／Ｆｌｋ１、Ｆｌｔ−１、ＦＧＦＲ−１Ｒ、ＦＧＦＲ−２Ｒ、ＦＧＦＲ−３Ｒ、ＦＧＦＲ−４Ｒ、ＥｐｈＡ２、及びＴｙｒｏ３からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象におけるタンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患を治療又は予防するための薬剤の製造における、化学式Ｉの化合物
【化１】
2012505880.tif 000042
［式中、
ｍとｎが共に１である場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つであり、
ｍが１でありｎが２である場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つである］
の使用。
【請求項１５】
前記対象が哺乳類である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記対象がヒトである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患は、受容体タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患が、ＩＧＦ−１Ｒ関連疾患である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＩＧＦ−１Ｒ関連疾患が癌である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患が、肝細胞癌、乳癌、大腸癌及び肺癌からなる群より選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２１】
前記タンパク質チロシンキナーゼ関連疾病又は疾患は肝細胞癌である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
肝細胞癌に対して特異的な効果を有するタンパク質キナーゼ阻害剤を同定するための方法であって、
（ｉ）化学式Iの候補化合物を肝細胞癌細胞株と培養すること
【化１】
2012505880.tif 000043
［式中、
ｍとｎが共に１である場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つであり、
ｍが１でありｎが２である場合、
Ｒ１は６−Ｆ，６−Ｃｌ、及び６−ＯＣＨ３からなる群より選択される１つであり、
Ｒ２は、３’−ＯＣＨ３、３’−ＯＨ，４’−ＯＣＨ３、及び３’ＣＦ３からなる群より選択される１つである］、
（ｉｉ）細胞生存度を測定すること、および
（ｉｉｉ）正常な肝細胞株に対する前記候補化合物の効果と、測定された前記細胞生存度とを比較して、肝細胞癌細胞に対して特異的な活性を有する化合物を同定すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記肝細胞癌細胞株は、ＨｅｐＧ２及びＨｕＨ７からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
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