(57)【要約】本開示により、非ポリマー枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含むコンジュゲートと、該コンジュゲートの親和性リガンドに非共有結合で結合し、それにより該コンジュゲートを架橋して架橋物質体を形成する多価架橋剤とを含む架橋物質体であって、該非ポリマー枠組構造の分子量が１０，０００Ｄａ未満であり、該多価架橋剤と該親和性リガンド間の非共有結合が過剰量の標的分子の存在下で競合的に解離される架橋物質体を提供する。また、本開示により、このような物質体の作製方法および使用方法を提供する。他の態様では、本開示により、グルコース応答性の架橋物質体における使用のためのコンジュゲートを含む例示的なコンジュゲートを提供する。
2012516340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ポリマー枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含むコンジュゲートと、
該コンジュゲートの親和性リガンドに非共有結合で結合し、それにより該コンジュゲートを架橋して架橋物質体を形成する多価架橋剤と
を含む架橋物質体であって、
該非ポリマー枠組構造の分子量が１０，０００Ｄａ未満であり、
該多価架橋剤と該親和性リガンド間の非共有結合が過剰量の標的分子の存在下で競合的に解離される、
架橋物質体。
【請求項２】
非ポリマー枠組構造の分子量が約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項３】
非ポリマー枠組構造の分子量が約３００〜約５，０００Ｄａの範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項４】
非ポリマー枠組構造の分子量が約５００〜約２，５００Ｄａの範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項５】
非ポリマー枠組構造の分子量が約１，０００〜約２，０００Ｄａの範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項６】
非ポリマー枠組構造の分子量が約２００〜約１，０００Ｄａの範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項７】
非ポリマー枠組構造の分子量が約３００〜約８００Ｄａの範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項８】
標的分子がグルコースであり、該少なくとも２種類の親和性リガンドが糖を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項９】
該少なくとも２種類の親和性リガンドが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースからなる群より選択される糖を含む、請求項８に記載の物質体。
【請求項１０】
該少なくとも２種類の親和性リガンドがビマンノースまたはトリマンノースを含む、請求項８に記載の物質体。
【請求項１１】
該少なくとも２種類の親和性リガンドが線状トリマンノースを含む、請求項１０に記載の物質体。
【請求項１２】
該少なくとも２種類の親和性リガンドが分岐型トリマンノースを含む、請求項１０に記載の物質体。
【請求項１３】
該少なくとも２種類の親和性リガンドが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含む、請求項８に記載の物質体。
【請求項１４】
該少なくとも２種類の親和性リガンドがアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含む、請求項８に記載の物質体。
【請求項１５】
該少なくとも２種類の親和性リガンドが糖とリンカーを含み、該糖が該リンカーにアノマー炭素を介して共有結合されている、請求項８に記載の物質体。
【請求項１６】
アノマー炭素がαアノマーである、請求項１５に記載の物質体。
【請求項１７】
該コンジュゲートが、一般式（Ｉ）：
【化１】
2012516340.tif 000054
（式中：［（Ａ―Ｔ）］
は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し；
（Ａ―Ｔ）は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し；
―Ａ―は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択され、場合により置換されている基であり；
Ｔは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、場合により置換されているＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、場合により独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており；
Ｒは各々、独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
Ｘは各々、独立して親和性リガンドであり；
ＬＢは各々、独立して共有結合であるか、またはＴとＸとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり；
Ｗは各々、独立して薬物または検出可能な標識であり；
ＬＤは各々、独立して共有結合であるか、またはＴとＷとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
ｋは、２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定し；
ｑは、１〜４（両端を含む）の整数であり；
ｋ＋ｑは、３〜１２（両端を含む）の整数であり；
ｐは各々、独立して１〜５（両端を含む）の整数であり；
ｎは各々、独立して０〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは各々、独立して１〜５（両端を含む）の整数であり；
ｖは各々、独立して０〜５（両端を含む）の整数であり、各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎは≧１であり、少なくとも１つのｖは≧１であるものとする）
を有する、請求項１〜１６いずれか１項に記載の物質体。
【請求項１８】
ｐ−括弧部分内に存在する―Ａ―が各々、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている、請求項１７に記載の物質体。
【請求項１９】
ｋ＝２および両方のｋ−分岐部においてｐ＝２であり、該コンジュゲートが式（Ｉａ）：
【化２】
2012516340.tif 000055
のものである、請求項１８に記載の物質体。
【請求項２０】
ｐ−括弧部分内の末端に存在する―Ａ―のみが、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている、請求項１７に記載の物質体。
【請求項２１】
ｋ＝２および両方のｋ−分岐部においてｐ＝２であり、両方のｋ−分岐部において最初のｐ−括弧部分はｎ＝０であり、該コンジュゲートが式（Ｉｂ）：
【化３】
2012516340.tif 000056
のものである、請求項２０に記載の物質体。
【請求項２２】
ｍ−括弧部分に存在する―Ａ―が各々、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている、請求項１７に記載の物質体。
【請求項２３】
ｋ＝２、各ｐ＝１、および各ｍ＝２であり、該コンジュゲートが式（Ｉｃ）：
【化４】
2012516340.tif 000057
のものである、請求項２２に記載の物質体。
【請求項２４】
ｍ−括弧部分内の末端に存在する―Ａ―のみが、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている、請求項１７に記載の物質体。
【請求項２５】
ｋ＝２、各ｐ＝１、各ｍ＝２、各ｎ−分岐部において最初のｍ−括弧部分（ｍｏｅｉｔｙ）はｖ＝０であり、該コンジュゲートが式（Ｉｄ）：
【化５】
2012516340.tif 000058
のものである、請求項２４に記載の物質体。
【請求項２６】
両方のｋ−分岐部においてｑ＝１およびｎ＝１であり、該コンジュゲートが式（Ｉｅ）：
【化６】
2012516340.tif 000059
のものである、請求項２５に記載の物質体。
【請求項２７】
両方のｋ−分岐部においてｑ＝１およびｎ＝２であり、該コンジュゲートが式（Ｉｆ）：
【化７】
2012516340.tif 000060
のものである、請求項２５に記載の物質体。
【請求項２８】
―Ａ―が各々、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される基で場合により置換されている、請求項１７に記載の物質体。
【請求項２９】
存在する各―Ａ―が同じである、請求項２８に記載の物質体。
【請求項３０】
中央の―Ａ―が、他のすべての―Ａ―と異なる、請求項２８に記載の物質体。
【請求項３１】
―Ａ―がすべて、中央の―Ａ―以外同じである、請求項３０に記載の物質体。
【請求項３２】
―Ａ―が、場合により置換されているアリールまたはヘテロアリール基である、請求項２８に記載の物質体。
【請求項３３】
―Ａ―が６員のアリールである、請求項３２に記載の物質体。
【請求項３４】
―Ａ―がフェニルである、請求項３３に記載の物質体。
【請求項３５】
―Ａ―が、Ｎ、ＯまたはＳから選択されるヘテロ原子である、請求項２８に記載の物質体。
【請求項３６】
―Ａ―が窒素原子である、請求項２８に記載の物質体。
【請求項３７】
―Ａ―が炭素原子である、請求項２８に記載の物質体。
【請求項３８】
Ｔが各々、独立して二価の直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和の、場合により置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、Ｔの１つ以上のメチレン単位が、場合により独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている、請求項１７に記載の物質体。
【請求項３９】
Ｔの１、２、３、４または５個のメチレン単位が、場合により独立して置き換えられている、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４０】
ＴがＣ１−１０炭化水素鎖で構築されており、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位が、場合により独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４１】
Ｔの１つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４２】
Ｔの１つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４３】
Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられている、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４４】
Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−で置き換えられている、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４５】
Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｏ−で置き換えられている、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４６】
Ｔが
【化８】
2012516340.tif 000061
である、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４７】
Ｔが
【化９】
2012516340.tif 000062
である、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４８】
Ｔが
【化１０】
2012516340.tif 000063
である、請求項３８に記載の物質体。
【請求項４９】
Ｔが
【化１１】
2012516340.tif 000064
である、請求項３８に記載の物質体。
【請求項５０】
Ｔが
【化１２】
2012516340.tif 000065
である、請求項３８に記載の物質体。
【請求項５１】
Ｔが
【化１３】
2012516340.tif 000066
である、請求項３８に記載の物質体。
【請求項５２】
各Ｔが同じである、請求項３８に記載の物質体。
【請求項５３】
Ｂ基とＤ基の外側に存在するＴが各々、二重結合であり、該コンジュゲートが式（ＩＶ）：
【化１４】
2012516340.tif 000067
のものである、請求項３８に記載の物質体。
【請求項５４】
―Ａ―が各々、中央の―Ａ―以外は二重結合であり、各ｖ＝１であり、該コンジュゲートが式（ＶＩ）：
【化１５】
2012516340.tif 000068
のものである、請求項５３に記載の物質体。
【請求項５５】
ｋ＝２およびｑ＝１である、請求項５４に記載の物質体。
【請求項５６】
ｋ＝３およびｑ＝１である、請求項５４に記載の物質体。
【請求項５７】
該コンジュゲートが式（ＶＩａ）：
【化１６】
2012516340.tif 000069
のものである、請求項５５に記載の物質体。
【請求項５８】
該コンジュゲートが式（ＶＩａ−Ｉ）：
【化１７】
2012516340.tif 000070
のものである、請求項５７に記載の物質体。
【請求項５９】
該コンジュゲートが式（ＶＩａ−２）：
【化１８】
2012516340.tif 000071
のものである、請求項５７に記載の物質体。
【請求項６０】
該コンジュゲートが式（ＶＩａ−３）：
【化１９】
2012516340.tif 000072
のものである、請求項５７に記載の物質体。
【請求項６１】
該コンジュゲートが式（ＶＩｂ）：
【化２０】
2012516340.tif 000073
のものである、請求項５５に記載の物質体。
【請求項６２】
該コンジュゲートが式（ＶＩｂ−Ｉ）：
【化２１】
2012516340.tif 000074
のものである、請求項６１に記載の物質体。
【請求項６３】
該コンジュゲートが式（ＶＩｂ−２）：
【化２２】
2012516340.tif 000075
のものである、請求項６１に記載の物質体。
【請求項６４】
該コンジュゲートが式（ＶＩｂ−３）：
【化２３】
2012516340.tif 000076
のものである、請求項６１に記載の物質体。
【請求項６５】
該コンジュゲートが式（ＶＩｂ−４）：
【化２４】
2012516340.tif 000077
のものである、請求項６１に記載の物質体。
【請求項６６】
該コンジュゲートが式（ＶＩｃ）：
【化２５】
2012516340.tif 000078
のものである、請求項５６に記載の物質体。
【請求項６７】
該コンジュゲートが、式（ＶＩｃ−Ｉ）：
【化２６】
2012516340.tif 000079
のものである、請求項６１に記載の物質体。
【請求項６８】
該コンジュゲートが、式（ＶＩｃ−２）：
【化２７】
2012516340.tif 000080
のものである、請求項６１に記載の物質体。
【請求項６９】
該架橋剤に対する該コンジュゲートと標的分子の相対親和性が１：１〜１００：１の範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項７０】
該架橋剤に対する該コンジュゲートと標的分子の相対親和性が１：１〜５０：１の範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項７１】
該架橋剤に対する該コンジュゲートと標的分子の相対親和性が１：１〜１０：１の範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項７２】
該架橋剤に対する該コンジュゲートと標的分子の相対親和性が１：１〜５：１の範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項７３】
該架橋剤に対する該コンジュゲートと標的分子の相対親和性が１：１〜２：１の範囲である、請求項１に記載の物質体。
【請求項７４】
該コンジュゲートが、非ポリマー枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項７５】
該コンジュゲートが、非ポリマー枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを３つ含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項７６】
該コンジュゲートが、非ポリマー枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを４つ含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項７７】
親和性リガンドが同じである、請求項７４〜７６いずれか１項に記載の物質体。
【請求項７８】
Ｗが薬物である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項７９】
薬物が抗糖尿病薬である、請求項７８に記載の物質体。
【請求項８０】
薬物がインスリン分子である、請求項７８に記載の物質体。
【請求項８１】
インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリン、およびウシインスリンからなる群より選択される、請求項８０に記載の物質体。
【請求項８２】
インスリン分子が、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリジンからなる群より選択される、請求項８０に記載の物質体。
【請求項８３】
インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項８０に記載の物質体。
【請求項８４】
インスリン分子が３つのジスルフィド結合を含む、請求項８０に記載の物質体。
【請求項８５】
薬物がインスリン感受性改善薬である、請求項７８に記載の物質体。
【請求項８６】
薬物がインスリン分泌促進薬（ｓｅｃｒｅｔａｔｏｇｕｅ）である、請求項７８に記載の物質体。
【請求項８７】
Ｗが検出可能な標識である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項８８】
ＬＢおよび／またはＬＤが二重結合である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項８９】
ＬＢおよび／またはＬＤが、Ｔの場合により置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、ＸまたはＷのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する、場合により置換されている部分である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項９０】
ＬＢおよび／またはＬＤが、ＸまたはＷの場合により置換されているカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、Ｔのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する、場合により置換されている部分である、請求項８９に記載の物質体。
【請求項９１】
ＬＢおよび／またはＬＤが
【化２８】
2012516340.tif 000081
である、請求項８９に記載の物質体。
【請求項９２】
ＬＢおよび／またはＬＤがスクシンイミド部分である、請求項８９に記載の物質体。
【請求項９３】
Ｗが、コンジュゲートの枠組構造にＡ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされたインスリン分子である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項９４】
Ｗが、コンジュゲートの枠組構造にＢ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされたインスリン分子である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項９５】
Ｗが、コンジュゲートの枠組構造にＢ２９アミノ酸残基を介してコンジュゲートされたインスリン分子である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項９６】
ｋ＋ｑが３〜６（両端を含む）の整数である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項９７】
ｋ＋ｑが３または４の整数である、請求項９６に記載の物質体。
【請求項９８】
ｐが各々、１、２または３である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項９９】
ｐが各々１である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項１００】
各ｐは同じである、請求項１７に記載の物質体。
【請求項１０１】
ｍが各々、１、２または３である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項１０２】
ｍが各々１である、請求項１７に記載の物質体。
【請求項１０３】
各ｍは同じである、請求項１７に記載の物質体。
【請求項１０４】
薬物負荷レベルが、コンジュゲートに対して薬物５〜９９％ｗ／ｗの範囲である、請求項７８に記載の物質体。
【請求項１０５】
薬物負荷レベルが、コンジュゲートに対して薬物５０〜９９％ｗ／ｗの範囲である、請求項７８に記載の物質体。
【請求項１０６】
薬物負荷レベルが、コンジュゲートに対して薬物８０〜９９％ｗ／ｗの範囲である、請求項７８に記載の物質体。
【請求項１０７】
多価架橋剤がポリペプチドを含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項１０８】
多価架橋剤がレクチンを含む、請求項１０７に記載の物質体。
【請求項１０９】
レクチンがＣｏｎ  Ａである、請求項１０８に記載の物質体。
【請求項１１０】
レクチンが化学修飾されている、請求項１０８に記載の物質体。
【請求項１１１】
レクチンがペグ化されている、請求項１１０に記載の物質体。
【請求項１１２】
レクチンが認識エレメントに共有結合されており、該認識エレメントは、標的分子および該コンジュゲートの親和性リガンドと、レクチンに対する結合に関して競合するものであり、該レクチンは、該認識エレメントに対してよりも該コンジュゲートの親和性リガンドに対して高い親和性を有するものである、請求項１１０に記載の物質体。
【請求項１１３】
標的分子がグルコースであり、該コンジュゲートの親和性リガンドと認識エレメントの両方が糖を含む、請求項１１２に記載の物質体。
【請求項１１４】
認識エレメントがグルコースを含む、請求項１１３に記載の物質体。
【請求項１１５】
認識エレメントがレクチンに、式（ＶＩＩＩａ）：
【化２９】
2012516340.tif 000082
（式中：
Ｒ３は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＮＯ２、およびハロゲンからなる群より選択され；
ＸＬは共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の場合により置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、ここで、ＸＬの１つ以上のメチレン単位は、場合により独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられており；
Ｒ’は各々、独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分である）
の光励起性リンカーを用いて共有結合されたものである、請求項１１２に記載の物質体。
【請求項１１６】
認識エレメントがレクチンに、式（ＶＩＩＩｂ）：
【化３０】
2012516340.tif 000083
（式中：
Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは−ＣＦ３であり；
ＸＬは共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の場合により置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、ここで、Ｘの１つ以上のメチレン単位は、場合により独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ０２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられており；
Ｒ’は各々、独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分である）
の光励起性リンカーを用いて共有結合されたものである、請求項１１２に記載の物質体。
【請求項１１７】
多価架橋剤がペプチドアプタマーを含む、請求項１０７に記載の物質体。
【請求項１１８】
多価架橋剤がポリヌクレオチドアプタマーを含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項１１９】
１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、標的分子を含まない３７℃でｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に入れたとき不溶性である、請求項１に記載の物質体。
【請求項１２０】
該コンジュゲートが該物質体から、標的分子の濃度に依存性の速度で、または標的分子の濃度に依存性の程度まで放出される、請求項１１９に記載の物質体。
【請求項１２１】
標的分子がグルコースである、請求項１２０に記載の物質体。
【請求項１２２】
５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７℃でｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、実質的に不溶性のままである、請求項１２１に記載の物質体。
【請求項１２３】
５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７℃でｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、１０％未満の物質体が溶解する、請求項１２１に記載の物質体。
【請求項１２４】
５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７℃でｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、少なくとも５０％の物質体が溶解する、請求項１２１に記載の物質体。
【請求項１２５】
５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７ＣでｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、１００％の物質体が溶解する、請求項１２１に記載の物質体。
【請求項１２６】
請求項１〜１２５いずれか１項に記載の物質体を患者に投与することを含む方法。
【請求項１２７】
該物質体が皮下注射によって投与される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
Ｗが薬物である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
薬物が抗糖尿病薬である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
薬物がインスリン分子である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリン、およびウシインスリンからなる群より選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
インスリン分子が、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリジンからなる群より選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３４】
インスリン分子が３つのジスルフィド結合を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３５】
薬物がインスリン感受性改善薬である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３６】
薬物がインスリン分泌促進薬である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３７】
患者が糖尿病である、請求項１２９〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
該物質体が、インスリン分子の平均日用量が１０〜２００Ｕの範囲となるように投与される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３９】
該物質体が毎日投与される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
該物質体が毎週投与される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
該物質体が毎月投与される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
患者がインスリン感受性改善薬も受けている、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４３】
患者がインスリン分泌促進薬も受けている、請求項１３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府実施許諾権
米国政府は、本発明において支払い済みの実施許諾を有し、米国国立衛生研究所によって与えられたＤＫ０７９４８２およびＤＫ０８０５６５の条件によって示される合理的な条件で他者に実施許諾を行なうことを特許権所有者に要求する権利を限定された状況において有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００９年１月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／１４７，８７８号、２００９年３月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／１５９，６４３号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，１０７号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，０５３号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，０５８号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，０９２号、２００９年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／１６３，０８４号、２００９年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／２１９，８９７号、２００９年７月７日に出願された米国特許仮出願第６１／２２３，５７２号、および２００９年１０月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／２５２，８５７号に対する優先権を主張するものであり、これらの内容は各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
先行技術（例えば、Ｓｅａｒｓに対する米国特許第４，１４５，４１０号、これには、酵素的に不安定なカプセル剤からの薬物放出が記載されている）において知られた「制御放出」薬物送達系の大部分は、薬物を、ヒト体内に存在する分子インジケータ（例えば、代謝産物）の量に正比例する間隔および濃度で放出することができない。したがって、このような先行技術の系での薬物の送達または放出は、文字通りの「制御された」ものでなく、外的または内的要因とは無関係の単なる低速放出である。
【０００４】
インスリン注射による真性糖尿病の処置は、インスリンの制御されていない低速放出が望ましくない場合の周知の充分研究された一例である。実際、ホルモンの単純な補充は、この疾患と関連する病的続発症の予防に充分でないことが明らかである。このような続発症の発生は、患者体内での血中グルコースの濃度変動に合わせて外因性インスリンを提供できていないことを反映していると考えられる。この問題を解決するため、より生理学的なインスリン送達系を開発するためのいくつかの生物学的なバイオエンジニアリングアプローチが提案されている（例えば、Ｂｒｏｗｎｌｅｅらに対する米国特許第４，３４８，３８７号；Ｔａｙｌｏｒらに対する米国特許第５，８３０，５０６号、同第５，９０２，６０３号、および同第６，４１０，０５３号、ならびにＺｉｏｎに対する米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９号を参照のこと）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｚｉｏｎの系の一部の特定の実施形態では、多価のグルコース結合分子（例えば、レクチン）を、グリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートと合わせる。このグリコシル化ポリマーは多数の糖結合基を含み、グルコース結合分子の存在下で不溶性のヒドロゲルまたは粒子を形成する。このゲルは、グルコース濃度の増大に応答してグリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートを放出する。以下に論考するように、既存のコンジュゲートに使用されているグリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートは、ある問題点を提示する。したがって、当該技術分野においては、このような問題点を解決することができ、なお、Ｚｉｏｎの系において有用な濃度のグルコース（または他の誘発性標的分子）に応答する機能を果たすコンジュゲートが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本開示により、非ポリマー枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含むコンジュゲートと、該コンジュゲートの親和性リガンドに非共有結合で結合し、それにより該コンジュゲートを架橋して架橋物質体を形成する多価架橋剤とを含む架橋物質体であって、該非ポリマー枠組構造の分子量が１０，０００Ｄａ未満であり、該多価架橋剤と該親和性リガンド間の非共有結合が過剰量の標的分子の存在下で競合的に解離される架橋物質体を提供する。また、本開示により、このような物質体の作製方法および使用方法を提供する。他の態様では、本開示により、グルコース応答性の架橋物質体における使用のためのコンジュゲートを含む例示的なコンジュゲートを提供する。
【０００７】
定義
本明細書全体を通して用いる具体的な官能基、化学用語および一般用語の定義を、より詳細に以下に記載する。本発明の解釈上、化学元素は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、第７５版の内表紙記載の元素周期表（ＣＡＳ版）に従って特定されるものであり、具体的な官能基は上記文献に概ね定義されている。さらに、有機化学の一般原則ならびに具体的な官能性部分および反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、１９９９；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１；Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８７に記載されている。
【０００８】
アシル−本明細書で用いる場合、用語「アシル」は、一般式−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＸ１）２、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＸ１）２、および−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ（ＲＸ１）、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＳＲＸ１、および−Ｃ（＝ＮＲＸ１）Ｎ（ＲＸ１）２（式中、ＲＸ１は水素；ハロゲン；置換もしくは非置換のヒドロキシル；置換もしくは非置換のチオール；置換もしくは非置換のアミノ；置換もしくは非置換のアシル；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐の脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のヘテロ脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のアルキル；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のアルケニル；置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ−もしくはジ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジヘテロ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、モノ−もしくはジヘテロアルキルアミノ、モノ−もしくはジアリールアミノ、またはモノ−もしくはジヘテロアリールアミノであるか；または２つのＲＸ１基が一緒になって５〜６員の複素環式の環を形成している）を有する基をいう。例示的なアシル基としては、アルデヒド（−ＣＨＯ）、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、ケトン、アシルハライド、エステル、アミド、イミン、カーボネート、カルバメート、および尿素が挙げられる。アシル置換基としては、限定されないが、安定な部分（例えば、脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環式、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど、これらは各々、さらに置換されていてもよく、そうでなくてもよい）の形成をもたらす本明細書に記載の任意の置換基が挙げられる。
【０００９】
脂肪族−本明細書で用いる場合、用語「脂肪族」または「脂肪族基」は、直鎖（すなわち、非分岐）、分岐または環式（「炭素環式」）であり得、完全飽和であってもよく、または１つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族ではない、任意選択で置換されている炭化水素部分を表す。特に記載のない限り、脂肪族基は１〜１２個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含むものであり、また他の実施形態では、脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含む。好適な脂肪族基としては、限定されないが、線状または分岐のアルキル、アルケニルおよびアルキニル基、ならびにそのハイブリッド（（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルなど）が挙げられる。
【００１０】
アルケニル−本明細書で用いる場合、用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される、任意選択で置換されている一価の基を表す。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜６個の炭素原子を含む。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜５個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜４個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルケニル基は２〜３個の炭素原子を含む。アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられる。
【００１１】
アルキル−本明細書で用いる場合、用語「アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含む脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される、任意選択で置換されている直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素原子団をいう。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルキル基は１〜５個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルキル基は１〜４個の炭素原子を含む。さらに他の実施形態では、アルキル基は１〜３個の炭素原子を含む。また別の実施形態では、アルキル基は１〜２個の炭素を含む。アルキル原子団の例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ドデシルなどが挙げられる。
【００１２】
アルキニル−本明細書で用いる場合、用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される任意選択で置換されている一価の基をいう。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜６個の炭素原子を含む。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜５個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜４個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルキニル基は２〜３個の炭素原子を含む。代表的なアルキニル基としては、限定されないが、エチニル、２−プロピニル（プロパギル）、１−プロピニルなどが挙げられる。
【００１３】
アリール−本明細書で用いる場合、単独または、「アラルキル」、「アラルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」などのより大きな部分の一部として使用される用語「アリール」は、合計５〜１０個の環構成員を有し、系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、系内の各環は３〜７個の環構成員を含む、任意選択で置換されている単環式および二環式の環系をいう。用語「アリール」は、用語「アリール環」と互換的に用いていることがあり得る。本発明の一部の特定の実施形態では、「アリール」は、限定されないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどが挙げられ、１つ以上の置換基を有していてもよい芳香族環系をいう。
【００１４】
アリールアルキル−本明細書で用いる場合、用語「アリールアルキル」は、アリール基（例えば、芳香族またはヘテロ芳香族基）で置換されているアルキル基をいう。
【００１５】
二価の炭化水素鎖−本明細書で用いる場合、用語「二価の炭化水素鎖」（「二価のアルキレン基」ともいう）は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）Ｚ−であり、式中、ｚは、１〜３０、１〜２０、１〜１２、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、または２〜３の正の整数である。置換されている二価の炭化水素鎖は、１つ以上のメチレン水素原子が置換基で置き換えられているポリメチレン基である。好適な置換基としては、置換されている脂肪族基について後述するものが挙げられる。
【００１６】
カルボニル−本明細書で用いる場合、用語「カルボニル」は、炭素−酸素二重結合を含む一価または二価の部分をいう。カルボニル基の非限定的な例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、アシルハライド、無水物、尿素、カルバメート、カーボネート、チオエステル、ラクトン、ラクタム、ヒドロキサメート、イソシアネート、およびクロロホルメートが挙げられる。
【００１７】
脂環式−本明細書で用いる場合、用語「脂環式」、「炭素環」、または「炭素環式」は、単独またはより大きな部分の一部として使用され、３〜１０員を有する本明細書に記載の、任意選択で置換されている飽和または部分不飽和の、環式の脂肪族の単環式または二環式の環系をいう。脂環式基としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、およびシクロオクタジエニルが挙げられる。一部の実施形態では、シクロアルキルは３〜６個の炭素を有する。
【００１８】
ハロゲン−本明細書で用いる場合、用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ，−Ｆ）、塩素（クロロ，−Ｃｌ）、臭素（ブロモ，−Ｂｒ）、およびヨウ素（ヨード，−Ｉ）から選択される原子をいう。
【００１９】
ヘテロ脂肪族−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロ脂肪族」または「ヘテロ脂肪族基」は、炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有し、直鎖（すなわち、非分岐）であっても、分岐であっても環式（「複素環式」）であってもよく、完全飽和であってもよく、１つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族ではない、任意選択で置換されている炭化水素部分を表す。特に記載のない限り、ヘテロ脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含み、１〜３個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。一部の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含み、１〜２個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。また他の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含み、１個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。好適なヘテロ脂肪族基としては、限定されないが、線状または分岐のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、およびヘテロアルキニル基が挙げられる。
【００２０】
ヘテロアラルキル−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されているアルキル基をいい、アルキル部分およびヘテロアリール部分は、独立して、任意選択で置換されている。
【００２１】
ヘテロアリール−本明細書で用いる場合、単独または、例えば、「ヘテロアラルキル」もしくは「ヘテロアラルコキシ」など、より大きな部分の一部として使用される用語「ヘテロアリール」は、５〜１０個の環内原子、好ましくは５、６または９個の環内原子を有し；環式アレイ内で共有される６、１０または１４個のπ原子を有し；炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する、任意選択で置換されている基をいう。ヘテロアリール基としては、限定されないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、およびプテリジニルが挙げられる。また、用語「ヘテロアリール」および「ヘテロアル（ｈｅｔｅｒｏａｒ−）」には、本明細書で用いる場合、ヘテロ芳香族環が１つ以上のアリール、炭素環式または複素環式の環に縮合され、その結合原子団または結合点が該ヘテロ芳香族環上にある基が包含される。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、およびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。ヘテロアリール基は単環式であっても二環式であってもよい。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、または「ヘテロ芳香族」（これらの用語はいずれも任意選択で置換されている環を包含する）と互換的に用いることがある。
【００２２】
ヘテロ原子−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロ原子」は窒素、酸素またはイオウをいい、窒素またはイオウの任意の酸化形態、および塩基性窒素の任意の第４級化形態を包含する。また、用語「窒素」は、置換されている窒素を包含する。
【００２３】
複素環式−本明細書で用いる場合、用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式の原子団」、および「複素環式の環」は互換的に用い、任意選択で置換されている、安定な５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式部分であって、飽和または部分不飽和のいずれかであり、炭素原子に加えて１つ以上の上記に定義したヘテロ原子を有するものをいう。複素環式の環は、その懸垂基に、安定な構造がもたらされる任意のヘテロ原子または炭素原子で結合され得、任意の環内原子は任意選択で置換されていてもよい。かかる飽和または部分不飽和の複素環式の原子団の例としては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、およびキヌクリジニルが挙げられる。用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、および「複素環式の原子団」は、本明細書において互換的に用い、また、ヘテロシクリル環が１つ以上のアリール、ヘテロアリールまたは炭素環式の環（インドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルなど）に縮合されており、その結合原子団または結合点が該ヘテロシクリル環上にある基を包含する。ヘテロシクリル基は単環式であっても二環式であってもよい。用語「ヘテロシクリルアルキル」はヘテロシクリルで置換されているアルキル基をいい、アルキル部分およびヘテロシクリル部分は、独立して、任意選択で置換されている。
【００２４】
不飽和−本明細書で用いる場合、用語「不飽和」は、ある部分が１つ以上の二重結合または三重結合を有することを意味する。
【００２５】
部分不飽和−本明細書で用いる場合、用語「部分不飽和」は、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む環部分をいう。用語「部分不飽和」は、多数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書で定義したアリール部分またはヘテロアリール部分を含むことは意図しない。
【００２６】
任意選択で置換されている−本明細書に記載のように、本発明の化合物は、「任意選択で置換されている」部分を含んでいてもよい。一般に、用語「置換されている」は、前に用語「任意選択で」があってもなくても、表示された部分の１つ以上の水素が適当な置換基で置き換えられていることを意味する。特に記載のない限り、「任意選択で置換されている」基は、該基の各置換可能な位置に適当な置換基を有していてもよく、任意の所与の構造内の１つより多くの位置が、指定された群から選択される１つより多くの置換基で置換され得る場合、該置換基は、１つ１つの位置において同じであるか、異なるかのいずれかであり得る。本発明で想定される置換基の組合せは、好ましくは、安定な、または化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものである。用語「安定な」は、本明細書で用いる場合、生成、検出、ならびに一部の特定の実施形態では回収、精製、および本明細書に開示した目的の１つ以上のための使用を可能にする条件に供されたときに、実質的に改変されない化合物をいう。
【００２７】
「任意選択で置換されている」基の置換可能な炭素原子上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０−４Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４ＯＲ°；−Ｏ−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＣＨ（ＯＲｏ）２；−（ＣＨ２）０−４ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｐｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−（ＣＨ２）０−４Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）０Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（Ｓ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ°３；−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）Ｒ°；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０−４ＳＲ、ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＳＣ（Ｏ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ°；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°、−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ°）Ｒ°；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（ＮＯＲ°）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４ＳＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｎ（０Ｒ°）Ｒ°；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ°２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｐ（Ｏ）Ｒ°２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ°２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ°）２；ＳｉＲ°３；−（Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ°）２；または−（Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ°）２であり、式中、各Ｒ°は、以下に定義するとおりに置換されていてもよく、独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−０（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、あるいは、上記の定義にかかわらず、独立して存在する２つのＲ°が、その介在原子（１つもしくは複数）を一緒になって、独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有し、以下に定義するとおりに置換されていてもよい、３〜１２員の飽和、部分不飽和またはアリール単環式または二環式の環を形成している。
【００２８】
Ｒ°（または２つの独立して存在するＲ°がその介在原子と一緒になって形成される環）上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０−２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０−２ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＣＨ（ＯＲ●）２；−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＨ、−（ＣＨ２）０−２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０−２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＮＲ●２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１−４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または−ＳＳＲ●であり、式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−０（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。Ｒ°の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、＝０および＝Ｓが挙げられる。
【００２９】
「任意選択で置換されている」基の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、以下のもの：＝０、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）０Ｒ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝Ｎ０Ｒ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３０−、または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｓ−が挙げられ、ここで、独立して存在するＲ＊は各々、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。「任意選択で置換されている」基の置換可能なビシナル炭素に結合された好適な二価の置換基としては：−０（ＣＲ＊２）２−３Ｏ−（式中、独立して存在するＲ＊は各々、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される）が挙げられる。
【００３０】
Ｒ＊の脂肪族基上の好適な置換基としては、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２（式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−０（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環である）が挙げられる。
【００３１】
「任意選択で置換されている」基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、−Ｒ†、ＮＲ†２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ†２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ†２、または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（０）２Ｒ†が挙げられ；式中、各Ｒ†は、独立して、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、非置換の−ＯＰｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、あるいは、上記の定義にかかわらず、独立して存在する２つのＲ†が、その介在原子（１つもしくは複数）と一緒になって、独立して窒素、酸素またはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の３〜１２員の飽和、部分不飽和またはアリールの単環式または二環式の環を形成している。
【００３２】
Ｒ†の脂肪族基上の好適な置換基は、独立して、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２（式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環である）である。
【００３３】
好適な保護基−本明細書で用いる場合、用語「適当な保護基」は、化合物内の位置に応じたアミノ保護基またはヒドロキシル保護基をいい、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９に詳細に記載されているものが挙げられる。
【００３４】
好適なアミノ保護基としては、メチルカルバメート、エチルカルバメート、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェンアシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニルｙｌ）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジルカルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンゾイソオキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、フェノチアジニル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、ｔ−アミルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニル（ｂｏｒｙｎｌ）カルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリメチルベンジル、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン（ｐｙｒｏｏｌｉｎ）−３−イル）アミン、第４級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタカルボニルクロム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミデート＜ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ＞、ジベンジルホスホルアミデート、ジフェニルホスホルアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Νｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Νｐｙｓ）、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’、８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤΝＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、ならびにフェンアシルスルホンアミドが挙げられる。
【００３５】
好適なヒドロキシル保護基としては、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−Ａ０Ｍ）、グアヤコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル，ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェンアシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾル−１−イル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシ���ル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（メシトエート）、アルキルメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカーボネート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカーボネート、アルキルビニルカーボネートアルキルアリルカーボネート、アルキルｐ−ニトロフェニルカーボネート、アルキルベンジルカーボネート、アルキルｐ−メトキシベンジルカーボネート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルｐ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルＳ−ベンジルチオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチルカーボネート、メチルジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシネート（ｓｕｃｃｉｎｏａｔｅ）、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ナイトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート、およびトシレート（Ｔｓ）が挙げられる。１，２−または１，３−ジオールを保護するには、保護基として、メチレンアセタール、エチリデンアセタール、１−ｔ−ブチルエチリデンケタール、１−フェニルエチリデンケタール、（４−メトキシフェニル）エチリデンアセタール、２，２，２−トリクロロエチリデンア��タール、アセトニド、シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、２，４−ジメトキシベンジリデンケタール、３，４−ジメトキシベンジリデンアセタール、２−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、１−メトキシエチリデンオルトエステル、１−エトキシエチリジンオルトエステル、１，２−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチリデン誘導体、α−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体、２−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−ｔ−ブチルシリレン基（ＤＴＢＳ）、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体（ＴＩＰＤＳ）、テトラ−ｔ−ブトキシジシロキサン−１，３−ジイリデン誘導体（ＴＢＤＳ）、環式のカーボネート、環式のボロネート、エチルボロネート、およびフェニルボロネートが挙げられる。
【００３６】
化学可変部（例えば、Ｒ基）が環の結合と交差している結合に結合されて表示されている場合はいずれも、これは、１つ以上のかかる可変部が、該交差している結合を有する環に任意選択で結合されていることを意味する。かかる環上の各Ｒ基は任意の適当な位置に結合され得、これは、該基が、親環上の水素原子の代わりに結合されていることを意味すると一般的に理解さる。これは、２つのＲ基が同じ環内原子に結合され得る可能性を含む。さらに、１つより多くのＲ基が環上に存在する場合、各々は、結合されている他のＲ基と同じであっても異なっていてもよく、各基は、同じ識別名で表され得る場合であっても、同じ分子の別の箇所に結合され得る他の基とは独立して定義される。
【００３７】
凝集された−２つ以上の細胞が本明細書に記載の架橋剤によって「凝集された」場合、該細胞は、各々、架橋剤と、細胞−薬剤−細胞複合体の状態で物理的に会合している。典型的には、凝集は、架橋剤の濃度が一旦閾値濃度に達したときしか起こらない。この濃度を最小凝集濃度（ＭＡＣ）と称する。所与の架橋剤のＭＡＣは、一般的には、溶液中での吸光度の変化を定量することができる分光測光プレートリーダーを用いて測定される。
【００３８】
アプタマー−本明細書で用いる場合、用語「アプタマー」は、標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一般に、アプタマーは、検出可能なレベルで標的分子と会合するが、同様の条件下で、無関連な分子存在体（例えば、標的分子と共通の構造的特徴を共有していない分子）とは検出可能に会合しない場合、標的分子に「特異的に結合する」と言われる。標的分子とアプタマー間の特異的会合は、典型的には、アプタマーによって認識されるエピトープなどの、標的分子の特定の構造的特徴の有無に依存する。一般的に、アプタマーがエピトープＡに特異的である場合、遊離の標識エピトープＡおよびこれに対するアプタマーの両方を含む反応液中におけるエピトープＡ含有分子の存在または遊離の非標識エピトープＡの存在により、アプタマーに結合する標識エピトープＡの量は低減される。一般に、特異性は絶対的である必要はないことが理解されよう。実際、アプタマーが、標的エピトープに加えて他のエピトープと交差反応することがあり得ることは当該技術分野で周知である。かかる交差反応性は、アプタマーが使用される適用用途によっては許容される場合があり得る。したがって、アプタマーの特異性の度合は、これが使用されている状況に依存する。また、特異性は、非標的分子に対するアプタマーの親和性対標的分子に対するアプタマーの親和性など、さらなる要素との関連において評価され得ることも理解されよう。
【００３９】
会合している−本明細書で用いる場合、２つの存在体は、直接的な非共有結合性相互作用によって結合している場合、互いに物理的に「会合している」。望ましい非共有結合性相互作用としては、免疫グロブリン分子と該免疫グロブリンに特異的な抗原との間で生じる型のもの、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的会合の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に換算して表示され得、ここで、Ｋｄが小さいほど大きな親和性を表す。例えば、選択された架橋剤と標的分子との会合特性は、当該技術分野で周知の方法を用いて定量され得る。
【００４０】
生物分解性の−本明細書で用いる場合、用語「生物分解性の」は、生理学的条件下またはエンドソーム条件下で分解される（すなわち、その共有結合性の構造の少なくとも一部が失われる）分子をいう。生物分解性の分子は、必ずしも加水分解的に分解可能である必要はなく、分解に酵素の作用を必要としてもよい。
【００４１】
生体分子−本明細書で用いる場合、用語「生体分子」は、天然に存在するものであっても人工的に作出されたものであっても（例えば、合成もしくは組換えによる方法）、細胞内および組織内に一般的に見られる分子（例えば、ポリペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、多糖類、糖類、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド類、代謝産物など）をいう。生体分子の具体的な類型としては、限定されないが、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞応答修飾因子（増殖因子および化学走化性因子など）、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられる。
【００４２】
薬物−本明細書で用いる場合、用語「薬物」は、生物学的事象を改変するか、阻害するか、活性化させるか、あるいは影響を及ぼす小分子または生体分子をいう。例えば、薬物としては、限定されないが、抗ＡＩＤＳ物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿物質、免疫抑制薬、抗ウイルス物質、酵素阻害薬、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン薬、潤滑薬（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、精神安定薬、鎮痙薬、筋弛緩薬ならびに抗パーキンソン物質、鎮痙薬および筋肉収縮剤（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔａｎｔ）（チャネル遮断薬、縮瞳薬および抗コリン作用薬など）、抗緑内障化合物、抗寄生虫および／または抗原虫化合物、細胞−細胞外マトリックス相互作用の調節薬（細胞増殖阻害薬および抗接着分子など）、血管拡張剤、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の合成阻害薬、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管形成因子、抗分泌因子、抗凝固薬および／または抗血栓剤、局所麻酔薬、眼科用薬、プロスタグランジン、抗鬱薬、抗精神病物質、制吐薬、ならびにイメージング剤が挙げられ得る。本発明における使用に適した例示的な薬物のより完全な列挙は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｘｅｌ  ＫｌｅｅｍａｎｎおよびＪｕｒｇｅｎ  Ｅｎｇｅｌ著）、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９９；「Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」、Ｓｕｓａｎ  Ｂｕｄａｖａｒｉ他編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６、およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ−２０、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．刊、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ、２００１に記載されている。
【００４３】
外因性の−本明細書で用いる場合、「外因性の」分子は、患者に投与されない限り有意なレベルで患者に存在しないものである。一部の特定の実施形態では、患者は哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ラットなどである。本明細書で用いる場合、分子は、当該種類の患者の正常血清に含まれる該分子が０．１ｍＭ未満である場合、有意なレベルで患者に存在しない。一部の特定の実施形態では、患者の正常血清に含まれる該分子は、０．０８ｍＭ未満、０．０６ｍＭ未満、または０．０４ｍＭ未満であり得る。
【００４４】
超分岐−本明細書で用いる場合、「超分岐」構造は、少なくとも１つの分岐した分岐を含む共有結合性の構造（例えば、デンドリマー構造）である。超分岐構造は、ポリマー基礎構造および／または非ポリマー基礎構造を含むものであり得る。
【００４５】
正常血清−本明細書で用いる場合、「正常血清」は、５名以上の非糖尿病患者由来の凝固させた全血の液体部分を、ほぼ等量プールすることにより得られる血清である。非糖尿病ヒト患者は、血液採取の時点で糖尿病の症状を呈していない、無作為に選択される１８〜３０歳の患者である。
【００４６】
レクチン−本明細書で用いる場合、「レクチン」は、糖質および多糖類に特異性を伴って結合するタンパク質である。レクチンは、任意の起源（例えば、植物、動物または他のもの）であり得る。一部の特定の実施形態では、レクチンは、天然供給源から単離されたものであり得る。他の実施形態では、レクチンは、合成または組換えにより作製されたものであり得る。レクチンは、生理学的条件下において１つ以上のサブユニットで構成されたものであり得る。好ましい実施形態では、レクチンは、生理学的条件下において２つ以上のサブユニット（例えば、４つのサブユニット）で構成されている。サブユニットは同じであっても異なっていてもよい。
【００４７】
マイトジェンレクチン−「マイトジェンレクチン」は、１名以上の健常患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたチミジン取込みアッセイによる測定時、Ｔ細胞の増殖を刺激するレクチンである。一般的に、マイトジェンレクチンは、１ｕｇ／ｍｌの濃度で検出可能なレベルのチミジン取込みをもたらす。例示的なマイトジェンレクチンとしては、限定されないが、ジャカリン（ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）凝集素（Ｊａｃａｌｉｎ）、ムラサキモクワンジュ（ｂａｕｈｉｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）凝集素（ＢＰＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）、スクシニル−コンカナバリンＡ（ｓ−Ｃｏｎ  Ａ）、サンゴシドウ（ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｏｒａｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）凝集素（ＥＣｏｒＡ）、セイヨウマユミ（ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＥＥＡ）、ダイズ（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬｃＨ）、イヌエンジュ（ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）凝集素（ＭＡＡ）、インゲンマメ（ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）凝集素（ＰＨＡ）、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）マイトジェン（ＰＷＭ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、およびソラマメ（ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）凝集素（ＶＦＡ）（これらはすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｏｆ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能である）が挙げられる。用語「マイトジェンレクチン」には、Ｔ細胞の増殖を刺激する能力を保持している天然レクチンの誘導体（例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加を含む誘導体）が包含されることは理解されよう。例示的な誘導体は、アミノ酸残基が部位特異的変異誘発によって導入（ｉｎｔｏｒｏｄｕｃｅ）されたものである（例えば、化学修飾のためのさらなる反応性基を提供するため）。一般的に、好適な誘導体は、当該技術分野で既知の標準的な方法を用いて（例えば、デフォルト設定したＢｌａｓｔを用いて）測定したとき、天然レクチンと少なくとも９０％配列相同性を有するものである。好ましくは、該誘導体は、天然レクチンと少なくとも９５％配列相同性、より好ましくは９９％配列相同性を有する。限定されないが、例示的な誘導体は、その天然対応物の少なくとも９０％のレベルのＴ細胞増殖を誘導し得るものである。より好ましくは、該レベルは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である。
【００４８】
天然レクチン−本明細書で用いる場合、「天然レクチン」は、天然に見られるレクチンの化学組成を有するタンパク質である。
【００４９】
パーセント相同性−本明細書で用いる場合、用語「パーセント相同性」は、本開示において定義する最適アラインメント後の２つの配列間の配列同一性の割合をいう。例えば、２つのヌクレオチド配列は、以下に論考するように一致が最大となるようにアラインメントしたときに該２つの配列内のヌクレオチドの配列が同じである場合、「同一」であるという。２つのヌクレオチド配列間の配列の比較は、典型的には、２つの最適にアラインメントされた配列の配列を、領域または「比較域」において比較し、配列が類似している領域を特定および比較することにより行なわれる。比較のための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、このようなアルゴリズムのコンピュータでの実行、または目視検査によって行なわれ得る。
【００５０】
配列同一性の割合−「配列同一性の割合」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較域において比較することにより判定され、この場合、ヌクレオチド配列の比較域内の部分には、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較したとき、付加または欠失（すなわち、ギャップ）が含まれ得る。この割合は、両方の配列に同一のヌクレオチド残基が存在している位置の数を求め、マッチングした位置の数を得、マッチングした位置の数を比較域内の位置の総数で除算し、結果に１００を乗算して配列同一性の割合を得ることにより計算される。上記に示すこの配列同一性の定義は、当業者によって使用されているものであり得る定義である。この定義自体に、アルゴリズムの補助はなんら必要とされない。アルゴリズムは、配列同一性を計算するものではなく、配列の最適アラインメントを容易にするのに役立つものにすぎない。この定義から、２つの比較対象配列間の配列同一性には明確な１つだけの値が存在することになり、この値は、最適アラインメントで得られる値に対応する。
【００５１】
生理学的条件−本明細書で用いる場合、「生理学的条件」は、典型的な患者の動脈血において見られる条件である。一般的に、患者は哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、マウスなどである。ヒト患者において、生理学的条件のｐＨは、典型的には約７．３５〜約７．４５（好ましくは約７．４０）である。ヒトの生理学的温度は約３６．４〜約３７．４Ｃの範囲（好ましくは約３６．９Ｃ）である。
【００５２】
ポリマー−本明細書で用いる場合、「ポリマー」または「ポリマー構造」は、共有結合された一連のモノマーを含む構造である。ポリマーは、１つの型のモノマーで構成されたものであってもよく、１種類より多くの型のモノマーで構成されたものであってもよい。したがって、用語「ポリマー」は、コポリマー（例えば、ポリマー全体において異なる型のモノマーが個々の集団で存在しているブロックコポリマー）を包含する。ポリマーは線状であっても分岐型であってもよい。
【００５３】
ポリヌクレオチド−本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドのポリマーである。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に用いていることがあり得る。該ポリマーは、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、および２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学的に修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、介在＜ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ＞塩基、修飾糖類（例えば、Ｔ−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）を含むものであり得る。
【００５４】
ポリペプチド−本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーである。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「オリゴペプチド」、および「ペプチド」は、互換的に用いていることがあり得る。ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖内に組み込まれ得る化合物）および／または当該技術分野で既知のようなアミノ酸類似体を含むものであり得る。また、ポリペプチドのアミノ酸残基の１つ以上が、例えば、糖鎖基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの化学的存在体の付加によって修飾されていてもよい。このような修飾としては、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組込みなどが挙げられ得る。
【００５５】
多糖−本明細書で用いる場合、「多糖」は、糖質のポリマーである。用語「多糖」、「糖鎖」、および「オリゴ糖」は、互換的に用いていることがあり得る。該ポリマーは、天然糖質（例えば、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクツロース（ｏｃｔｏｌｏｓｅ）、およびシアロース（ｓｉａｌｏｓｅ））および／または修飾糖質（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、およびヘキソース）を含むものであり得る。例示的な二糖としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コージビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノース、およびキシロビオースが挙げられる。
【００５６】
小分子−本明細書で用いる場合、用語「小分子」は、天然に存在するものであろうと、人工的に作出されたものであろうと（例えば、化学合成によって）、比較的低い分子量を有する分子をいう。典型的には、小分子は単量体であり、約１５００Ｄａ未満の分子量を有する。好ましい小分子は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて局所性または全身性効果をもたらすという点で生物学的に活性なものである。一部の特定の好ましい実施形態では、小分子は薬物である。好ましくは（必ずしもそうでないが）、薬物は、適切な政府機関または行政団体によって、既に使用が安全かつ有効であるとみなされているものである。例えば、ＦＤＡによって２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§  ３３０．５，３３１〜３６１、および４４０〜４６０にリストアップされたヒトに使用するための薬物；ＦＤＡによって２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§  ５００〜５８９にリストアップされた獣医学的使用のための薬物はすべて、本発明による使用に許容され得るとみなす。
【００５７】
処置する−本明細書で用いる場合、用語「処置する」（または「処置すること」、「処置された」、「処置」など）は、病状（例えば、糖尿病）、病状の症状（１つまたは複数）（例えば、高血糖症）、病状に対する素因を軽減する、緩和する、改変する、改善する、好転させる、または影響を及ぼす目的で、処置を必要とする被検体への本開示の物質体の投与をいう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、（ａ）骨格としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した例示的なコンジュゲート、および（ｂ）実施例３２に従って合成したインスリン−グリコゲンコンジュゲートで得られたＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較である。
【図２】図２は、ＰＢＳ緩衝液中のコンジュゲート１（□）、コンジュゲート２（△）、およびＲＨＩ（◆）に対する促進安定性試験（ＡＳＴ）での凝集アッセイである。コンジュゲートは、医薬等級のＲＨＩよりも大きく増強された安定性を示す。
【図３（ａ）】図３（ａ）は、促進安定性試験（ＡＳＴ）での化学安定性の結果である。（ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣによるＡＳＴコンジュゲートの安定性。
【図３（ｂ）】図３（ｂ）は、促進安定性試験（ＡＳＴ）での化学安定性の結果である。（ｂ）ＡＳＴコンジュゲートに関するＬＣ／ＭＳデータ。
【図４】図４は、新鮮コンジュゲート（▲）および７２時間ＡＳＴコンジュゲート（○）の（ｎ＝４）非糖尿病の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットにおけるインビボ生理活性である。７２時間ＡＳＴコンジュゲートの生理活性は、新鮮コンジュゲートのものと識別不能である（全時間点でｐ≧０．２１）。
【図５】図５は、約２０Ｕインスリン当量／ｋｇの用量で皮下注射された（▲）インスリン−デキストラン（７０Ｋ）の非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における血中グルコース抑制プロフィールである。
【図６】図６は、約２．５Ｕインスリン当量／ｋｇの用量で皮下注射された（■）インスリン−グリコゲン（ＩＩ型  牡蠣由来）の非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における血中グルコース抑制プロフィールである。
【図７】図７は、雄の非糖尿病ＳＤラットにおいて、３．５Ｕ当量のインスリン／ｋｇの皮下用量の（◆）ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートおよび（□）可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）で得られた血中グルコースレベルである。各データセットは、ｎ＝６ラットの平均および標準偏差を表す。
【図８】図８は、雄の非糖尿病ＳＤラットにおいて、３．５Ｕ当量のインスリン／ｋｇの皮下用量の（◆）ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートおよび（□）可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）で得られた血清インスリン濃度である。各データセットは、ｎ＝６ラットの平均および標準偏差を表す。
【図９】図９は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２（Ｂ２９−置換され）インスリンコンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンレベルおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。データは、ｎ＝３ラットの平均および標準偏差を表す。
【図１０】図１０は、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよびＡＥＴＭの化学構造である。これらの糖類を主体とする親和性リガンドのＣｏｎ  Ａに対する親和性は、図示のとおりに増大する。
【図１１】図１１は、一部の例示的な非デンドリマーコンジュゲートの化学構造である。
【図１２】図１２は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲート（◆）、可溶性組換えヒトインスリン、（○）およびインスリンリスプロ（△）（すべて３．５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における血清インスリン（左）および血中グルコース（右）レベルのプロットである。データは、ｎ＝６ラットの平均および標準偏差を表す。
【図１３】図１３は、図示のとおりの異なる親和性リガンドを有するＴＳＡＴ−Ｃ６系インスリンコンジュゲートでの、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の（各製剤に対してｎ＝３）時間点０における血中グルコースレベルのプロットである。血糖降下性応答は、親和性リガンドの親和性が増大するにつれて、減少する。
【図１４】図１４は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２コンジュゲート（３．５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の（ｎ＝３）時間点０における血清インスリン（左）および血中グルコース（右）レベルのプロットである。
【図１５】図１５は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−２コンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の（ｎ＝３）時間点０における血清インスリン（左）および血中グルコース（右）レベルのプロットである。
【図１６】図１６は、ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−１  ＡＥＴＭ−１コンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での、非糖尿病雄ＳＤラットに皮下注射後の（ｎ＝３）時間点０における血清インスリン（左）および血中グルコース（右）レベルのプロットである。
【図１７】図１７は、種々の親和性リガンドで修飾したレクチンの最小凝集濃度（ＭＡＣ）の比較である。
【図１８】図１８は、（ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−２−インスリン／ＤＥＭ−光親和性修飾Ｃｏｎ  Ａ）グルコース応答性物質体での、非糖尿病ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。＊で示した１２０分の時点で、グルコースのｉ．ｐ．注射を施与した。
【図１９】図１９は、（ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２−インスリン／ＤＥＭ−光親和性修飾Ｃｏｎ  Ａ）グルコース応答性物質体での、非糖尿病ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。＊で示した１２０分の時点で、グルコースのｉ．ｐ．注射を施与した。
【図２０】図２０は、（◆）ブタ血清、（■）ヒト血清、（▲）ラット血清、および（×）１×ＰＢＳ緩衝液の存在下、３７℃で６時間のインキュベーション後の、グルコース濃度の関数としての、不溶性のままであるグルコース応答性インスリン−グリコゲン系物質体の量である。
【図２１】図２１は、比色分析シグナル（Ａ４０５）の生成によって測定したときの、（ａ）アミラーゼ活性（４−ニトロフェニルα−Ｄ−ペンタ−（ｌ→４）−グルコピラノシドレポーター）および（ｂ）グルコシダーゼ活性（４−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシドレポーター）の、ブタ（実線）、ラット（長い点線）およびヒト（短い点線）の血清の１：８希釈物（ＰＢＳ中）の消化活性である。
【図２２】図２２は、左：グルコース濃度の関数としての、１時間沈殿させた後の撮影画像、右：該コンジュゲートと修飾レクチンを１時間混合した後、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）によって測定したときの、グルコース濃度の関数としての、各ウェルによって遮断された光の量のプロットである。
【図２３】図２３は、（◆）ブタ血清、（■）ヒト血清、（▲）ラット血清、および（×）１×ＰＢＳ緩衝液の存在下、３７℃で６時間のインキュベーション後の、グルコース濃度の関数としての、残留不溶物として不溶性のままとなるように構築された（例示的なインスリンコンジュゲートを使用）グルコース応答性物質体の量である。
【図２４】図２４は、（ａ）例示的なコンジュゲートＸとＡＣＡで構築したグルコース応答性物質体での、非糖尿病ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコースレベルのプロット（＊で示した１２０分の時点で、グルコースのｉ．ｐ．注射を施与した）、（ｂ）＊で示した１２０分の時点で投与したグルコースのｉ．ｐ．注射に応答した、時間の関数としての、例示的なコンジュゲートＸとＡＣＡで構築した（◆）グルコース応答性物質体および（○）内因性ラット膵臓インスリンの血清インスリンプロット（各データセットは、ｎ＝３ラットの平均および標準偏差を表す）である。
【図２５】図２５は、組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）での、非糖尿病ＳＤラットに皮下注射後の時間点０における（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコースレベルのプロットである。＊で示した１２０分の時点で、グルコースのｉ．ｐ．注射を施与した。
【図２６】図２６は、ｎ＝４の非糖尿病ラットにおける、例示的なグルコース応答性物質体（ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２−インスリン／ＡＣＡ）の皮下注射後の、グルコースクランプ試験による（υ）血清インスリンおよび（□）血中グルコース濃度のプロットである。注射後、グルコースのｉ．ｖ．注入を用いてグルコースレベルを１００ｍｇ／ｄｌに１２０分間維持した後、グルコースレベルを４００ｍｇ／ｄｌまで直線的に漸増させ、最後の１２０分間は４００ｍｇ／ｄｌに維持した。データは、ｎ＝４ラットの平均および標準偏差を示す。
【図２７】図２７は、ｎ＝４の非糖尿病ブタにおける、例示的なグルコース応答性物質体（ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２−インスリン／ＡＣＡ）の皮下注射後の、グルコースクランプ試験による（◆）血清インスリンおよび（○）血中グルコース濃度のプロットである。注射後、グルコースのｉ．ｖ．注入を用いてグルコースレベルを６５ｍｇ／ｄｌに１２０分間維持した後、グルコースレベルを４００ｍｇ／ｄｌまで直線的に漸増させ、最後の１２０分間は４００ｍｇ／ｄｌに維持した。データは、ｎ＝４ブタの平均および標準偏差を示す。
【図２８】図２８は、標的分子（例えば、グルコース）に応答してコンジュゲート２０を制御可能に放出し得る架橋物質体１０の模式図である。該物質体は、コンジュゲート２０を、コンジュゲート２０の親和性リガンド４０に非共有結合で結合し、それによりコンジュゲート２０と架橋して架橋物質体１０を形成する多価架橋剤３０と合わせることにより調製される。多価架橋剤３０と親和性リガンド４０間の非共有結合は、過剰量の標的分子（例えば、グルコース）の存在下で競合的に解離される。
【図２９】図２９は、野生型ヒトインスリンの構造である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
種々の実施形態の詳細説明
本出願書類では、特許文献および非特許文献を含むいくつかの文献に言及している。これらの各文献は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
インスリンの送達に使用する場合であれ、他の薬物の送達に使用する場合であれ、既存のＺｉｏｎコンジュゲートに使用されるグリコシル化ポリマーコンジュゲートは一定の問題点を提示する。実際、グリコシル化ポリマーが高分子量（ＭＷ）である結果、該コンジュゲートは、自然薬よりもさらに高いＭＷを有する。したがって、該コンジュゲートは体循環中への吸収が、より緩徐である。また、体循環中に入ったら、該コンジュゲートの固有の生理活性が低下することがあり得、排出速度が遅くなることがあり得る。Ｌａｎｃａｓｔｅｒらに対するＵＳ２００７−００９９８２０において、本発明者らは、薬物に、投与部位で酵素分解されるポリマーを結合させることを伴う、この問題の解決策の１つを報告した。このような酵素分解可能なコンジュゲートは、ひとたびＺｉｏｎの系から放出されるとより非コンジュゲート型インスリンに近い挙動を示したが、、主に２つの不都合性、すなわち：そもそも大量の医薬等級の物質体を製造ことの困難性、および標的分子の非存在下でさえ酵素活性によって望ましくない分解が生じること、という不都合性を有した。
【００６１】
例えば、Ｌａｎｃａｓｔｅｒの例示的なグリコゲン系コンジュゲートは、動物および植物の供給源に由来するものであり、ＭＷ分布は広くてばらつきがあり、インスリンとのコンジュゲーション前に除去が必要とされる残留異種タンパク質を含有するものであった。分布を中心に集め、多分散性を低減させるために、グリコゲンの個々の各ロットおよび型をＭＷ分画しなければならず、これは、実質的に製造コストの増大および相当する収率低下をもたらした。さらに、各グリコゲン鎖を種々の糖類親和性リガンドで修飾すると、鎖長のばらつきだけでなく、これら種々の鎖長の間で親和性リガンドのばらつきももたらされた。
【００６２】
本実施例に記載のように、本発明者らはまた、かなり予想外なことに、種々の動物種が、特有のコンジュゲート分解酵素活性レベルを有し得ることを見い出した。例えば、ラットの場合、アミラーゼ活性は、遊離のグリコゲンコンジュゲートを生理活性にするには充分であるが、活性が低いために架橋コンジュゲートをごくわずかに分解するのみであった。しかしながら、ブタでは、この活性は、架橋コンジュゲートの急速分解を引き起こすのに充分に高く、それにより、グルコースの非存在下であっても大量のインスリンの放出がもたらされた。この結果は、コンジュゲートの生理活性を架橋コンジュゲートの望ましくない分解と均衡させるためには、コンジュゲートの分解性を各動物種に対して特異的に設計する必要があるだろうということを意味した。医薬品開発の見地から、規制機関は、通常、ヒト臨床試験を開始する前に、同じ製剤に対して２種類の動物種での安全性データを要求する。しかしながら、種間の酵素分解性の差により、薬物動態は、おそらく該２つの種の各々で異なる可能性がある。
【００６３】
したがって、当該技術分野において、酵素分解に対して感受性となることなくＺｉｏｎの系内で機能を果たすことができるコンジュゲートの必要性が存在する。また、理想的には、かかるコンジュゲートは、ポリマー系天然産物に見られる生産性における課題を有さない、充分特性評価された単一の合成分子体であろう。本発明者らは、好適な非生物分解性のコンジュゲートは、非コンジュゲート型薬物と同様の薬物動態的（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）特性を示すために、低分子量であることが必要であろうという仮説をたてた。しかしながら、本発明者らはまた、Ｚｉｏｎの系を用いたこれまでの研究（米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９号および「Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｆ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｔｈｅｓｉｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００４）により、コンジュゲートが不溶性の架橋物質体に自己集合する能力は、コンジュゲートの分子量が減少するにつれて消去されることが示されたことを認識していた。したがって、本発明者らは、この問題を解決するために、これらの型の適用用途にこれまで使用されていたものよりも親和性が高い新たなリガンドファミリーを開発しなければならなかった。並行して、本発明者らは、このようなリガンドを、一連のリンカーアーム長および化学反応を用いて多価様式で化学結合させる低分子量の枠組構造を開発した。予想外なことに、本発明者は、コンジュゲートの生理活性が保持されるのに充分低い分子量の特定の高親和性リガンドは、適切な枠組構造にコンジュゲートさせると、適当な多価架橋剤と合わせた場合に不溶性の架橋物質体を形成することもできることを見出した。また、より詳細に以下に論考するように、本発明者らは、得られる物質体は、種々の濃度の標的分子の存在下でコンジュゲートが放出されるように設計され得ることを示した。
【００６４】
コンジュゲート
一態様において、本開示により、非ポリマー枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含むコンジュゲートを提供する。一般に、親和性リガンドは、標的分子と、多価架橋剤との結合に関して競合し得るものである。該コンジュゲートは、合成の非ポリマー枠組構造を含むため、規定の化学構造および単一のＭＷを有する（すなわち、多分散性ゼロ）。また、最終適用用途に応じて、該コンジュゲートは、治療用薬剤および／または検出可能な標識を含むものであってもよい。より詳細に以下に論考するように、親和性リガンド、薬物、および／または検出可能な標識は、コンジュゲートの枠組構造に共有結合または非共有結合により結合され得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの枠組構造（すなわち、親和性リガンド、薬物または検出可能な標識を含まない）は、１０，０００Ｄａ未満、例えば約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜約５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約５００〜約２，５００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約１，０００〜２，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約２００〜１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜８００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【００６５】
コンジュゲートの一般説明
種々の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、一般式（Ｉ）：
【化１】
2012516340.tif 000003
【００６６】
（式中：
［（Ａ―Ｔ）］は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し；
（Ａ―Ｔ）は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し；
―Ａ―は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される任意選択で置換されている基であり；
Ｔは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の任意選択で置換されているＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており；
Ｒは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
Ｘは各々、独立して、親和性リガンドであり；
ＬＢは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＸとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり；
Ｗは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
ＬＤは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＷとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
ｋは、２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定し；
ｑは、１〜４（両端を含む）の整数であり；
ｋ＋ｑは、３〜１２（両端を含む）の整数であり；
ｐは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
ｎは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
ｖは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎは≧１であり、少なくとも１つのｖは≧１であるものとする）
を有するものであり得る。
【００６７】
一般式（Ｉ）（および本明細書における他の式）には、１つ１つの水素を明示していないことは理解されよう。例えば、中央の―Ａ―がＣ６アリール基であり、ｋ＋ｑ＜６である場合、Ｃ６アリール環上の空き位置（１つまたは複数）には水素が含まれることは認識されよう。
【００６８】
一般に、―Ａ―は各々、存在し得る分岐部節を表すこと、ならびに各節の分岐の数は、中央の―Ａ―に対してはｋの値、中央でない―Ａ―に対してはｎの値によって決定されることは認識されよう。ｋ≧２であるため、該コンジュゲートは常に少なくとも２つのｋ−分岐部を含む。当業者には、各ｎの存在が０〜５の整数であり得るため、本開示において、このようなコンジュゲートでは、分岐実施形態と超分岐（例えば、デンドリマー様）実施形態の両方が想定されることが認識されよう。各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎが≧１であり、少なくとも１つのｖが≧１であることを必要とする条件により、どのコンジュゲートも、Ｂ（すなわち、親和性リガンド）の存在を伴う少なくとも２つの個別のｋ−分岐部を含むことが確実になる。
【００６９】
一部の特定の実施形態では、ｐ−括弧部分内に存在する―Ａ―は各々、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている。例えば、両方のｋ−分岐部においてｋ＝２およびｐ＝２である場合、該コンジュゲートは、
式（Ｉａ）：
【化２】
2012516340.tif 000004
【００７０】
のものであり得る。
【００７１】
他の実施形態では、ｐ−括弧部分内の末端に存在する―Ａ―のみが、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている。例えば、両方のｋ−分岐部においてｋ＝２およびｐ＝２である（ならびに両方のｋ−分岐部内の最初のｐ−括弧部分はｎ＝０である）場合、該コンジュゲートは、式（Ｉｂ）：
【化３】
2012516340.tif 000005
【００７２】
のものであり得る。
【００７３】
一部の特定の実施形態では、ｍ−括弧部分内に存在する―Ａ―は各々、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている。例えば、ｋ＝２、各ｐ＝１、および各ｍ＝２である場合、該コンジュゲートは、式（Ｉｃ）：
【化４】
2012516340.tif 000006
【００７４】
のものであり得る。
【００７５】
他の実施形態では、ｍ−括弧部分内の末端に存在する―Ａ―のみが、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている。例えば、ｋ＝２、各ｐ＝１、および各ｍ＝２である（ならびに各ｎ−分岐部内の第１のｍ−括弧部分についてｖ＝０である）場合、該コンジュゲートは、
式（Ｉｄ）：
【化５】
2012516340.tif 000007
【００７６】
のものであり得る。
【００７７】
さらなる一例として、先の式の両方のｋ−分岐部においてｑ＝１およびｎ＝１である場合、該コンジュゲートは、式（Ｉｅ）：
【化６】
2012516340.tif 000008
【００７８】
のものであり得る。
【００７９】
あるいはまた、先の式の両方のｋ−分岐部においてｑ＝１およびｎ＝２である場合、該コンジュゲートは、式（Ｉｆ）：
【化７】
2012516340.tif 000009
【００８０】
のものであり得る。
【００８１】
種々の実施形態において、本開示により、また、コンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された親和性リガンドおよび／または薬物もしくは検出可能な標識を含むコンジュゲートが提供される。
【００８２】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式中：―Ａ―、Ｔ、Ｄ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＲＰＢ−Ｘであり；
Ｘは各々、独立して、親和性リガンドであり；
ＬＲＰＢは各々、独立して、ＴとＸ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である、
前述の任意の式のコンジュゲートが提供される。
【００８３】
また他の実施形態では、本開示により、式中：―Ａ―、Ｔ、Ｂ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗであり；
Ｗは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
ＬＲＰＤは各々、独立して、ＴとＷ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である、
前述の任意の式のコンジュゲートが提供される。
【００８４】
他の実施形態では、本開示により、式中：―Ａ―、Ｔ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＲＰＢ−Ｘであり；
Ｘは各々、独立して、親和性リガンドであり；
ＬＲＰＢは各々、独立して、ＴとＸ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満であり、
−Ｄは、−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗであり；
Ｗは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
ＬＲＰＤは各々、独立して、ＴとＷ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である、
前述の任意の式のコンジュゲートが提供される。
【００８５】
種々の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、一般式（ＩＩ）：
【化８】
2012516340.tif 000010
【００８６】
（式中、―Ａ―、Ｂ、Ｔ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎおよびｐは本明細書において定義および記載のとおりであり、ｋは、１〜１１（両端を含む）の整数であり、ｊは、２〜４（両端を含む）の整数である）を有するものであり得る。式（ＩＩ）のコンジュゲートは、薬物に対するリガンドのコンジュゲーション部位を多数有するものであり得る。ｑが１である場合、式中、ｊが２、３または４である式（ＩＩ）のコンジュゲートに対して、当業者には、上記のもの（式（Ｉａ）〜（Ｉｆ））に対して示される類似した亜属が想定され得ることは認識されよう。
【００８７】
例示の目的で、および混乱の回避のため、式（ＩＩ）のコンジュゲート内の
―Ａ―Ｄ―Ａ―の存在（すなわち、ｊが２である場合）を、―Ａ―Ｔ―ＬＤ―Ｗ―ＬＤ―Ｔ―Ａ―（薬物がコンジュゲートの枠組構造に共有結合されている場合）または―Ａ―Ｔ―ＬＲＰＤ―Ｗ―ＬＲＰＤ―Ｔ―Ａ―（薬物がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合されている場合）
で表すことがあり得ることを理解されたい。
【００８８】
例示的な基の説明
―Ａ―（節）
一部の特定の実施形態では、―Ａ―は各々、独立して、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される、任意選択で置換されている基である。一部の実施形態では、各―Ａ―は同じである。一部の実施形態では、中央の―Ａ―は、他のすべての―Ａ―と異なる。一部の特定の実施形態では、―Ａ―はすべて、中央の―Ａ―以外、同じである。
【００８９】
一部の実施形態では、―Ａ―は、任意選択で置換されているアリールまたはヘテロアリール基である。一部の実施形態では、―Ａ―は６員のアリールである。一部の特定の実施形態では、―Ａ―はフェニルである。
【００９０】
一部の特定の実施形態では、―Ａ―は、Ｎ、ＯまたはＳから選択されるヘテロ原子である。一部の実施形態では、―Ａ―は窒素原子である。一部の実施形態では、―Ａ―は酸素原子である。一部の実施形態では、―Ａ―はイオウ原子である。一部の実施形態では、―Ａ―は炭素原子である。
【００９１】
Ｔ（スペーサー）
一部の特定の実施形態では、Ｔは各々、独立して、二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１、２、３、４または５個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔは、Ｃ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４、Ｃ２−１２、Ｃ４−１２、Ｃ６−１２、Ｃ８−１２、またはＣ１０−１２炭化水素鎖で構築されており、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｏ−で置き換えられている。
【００９２】
一部の実施形態では、Ｔが
【化９】
2012516340.tif 000011
【００９３】
である。
【００９４】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１０】
2012516340.tif 000012
【００９５】
である。
【００９６】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１１】
2012516340.tif 000013
【００９７】
である。
【００９８】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１２】
2012516340.tif 000014
【００９９】
である。
【０１００】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１３】
2012516340.tif 000015
【０１０１】
である。
【０１０２】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１４】
2012516340.tif 000016
【０１０３】
である。
【０１０４】
一部の特定の実施形態では、各Ｔは同じである。
【０１０５】
一部の特定の実施形態では、各Ｔ（Ｂ基とＤ基の外側）が二重結合であり、該コンジュゲートは、一般式（ＩＶ）または（Ｖ）：
【化１５】
2012516340.tif 000017
【０１０６】
（式中、―Ａ―、Ｂ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎ、ｐ、ｋおよびｊは、それぞれ、式（Ｉ）または（ＩＩ）で定義および記載のとおりである）
のものである。
【０１０７】
一般式（ＩＶ）および（Ｖ）の一部の特定の実施形態では、―Ａ―は各々、中央の
―Ａ―以外は二重結合であり、各ｖ＝１であり、該コンジュゲートは式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）：
【化１６】
2012516340.tif 000018
【０１０８】
（式中、―Ａ―、Ｂ、Ｄ、ｑ、ｋおよびｊは、それぞれ、式（Ｉ）または（ＩＩ）で定義および記載のとおりである）
のものである。
【０１０９】
式（ＶＩ）の一部の特定のかかる実施形態では、ｋ＝２およびｑ＝１である。
【０１１０】
他の実施形態では、ｋ＝３およびｑ＝１である。
【０１１１】
他の実施形態では、ｋ＝２およびｑ＝２である。
【０１１２】
式（ＶＩＩ）の一部の特定のかかる実施形態では、ｋ＝１およびｊ＝２である。
【０１１３】
他の実施形態では、ｋ＝２およびｊ＝２である。
【０１１４】
他の実施形態では、ｋ＝３およびｊ＝２である。
【０１１５】
他の実施形態では、ｋ＝１およびｊ＝３である。
【０１１６】
他の実施形態では、ｋ＝２およびｊ＝３である。
【０１１７】
他の実施形態では、ｋ＝３およびｊ＝３である。
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＶＩａ）：
【化１７】
2012516340.tif 000019
【０１１９】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のコンジュゲートが提供される。
【０１２０】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化１８】
2012516340.tif 000020
【０１２１】
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のコンジュゲートが提供される。
【０１２２】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＶＩｂ）：
【化１９】
2012516340.tif 000021
【０１２３】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のコンジュゲートが提供される。
【０１２４】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化２０】
2012516340.tif 000022
2012516340.tif 000023
【０１２５】
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のコンジュゲートが提供される。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＶＩｃ）：
【化２１】
2012516340.tif 000024
【０１２７】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のコンジュゲートが提供される。
【０１２８】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化２２】
2012516340.tif 000025
【０１２９】
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のコンジュゲートが提供される。
【０１３０】
式中、ｊが２、３または４である式（ＶＩＩ）のコンジュゲートに対して、当業者には、式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）および（ＶＩｃ）のものならびにその各種に類似した亜属が想定され得ることが認識されよう。例えば、ｊが２である場合、一部の特定の実施形態では、本開示により、式：
【化２３】
2012516340.tif 000026
【０１３１】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のコンジュゲートが提供される。
【０１３２】
一部の特定の実施形態では、本開示により、式：
【化２４】
2012516340.tif 000027
【０１３３】
（式中、Ｗ、Ｘおよびｊは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のコンジュゲートが提供される。
【０１３４】
Ｂ（親和性リガンド）
種々の実施形態において、−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり、式中、Ｘは親和性リガンドであり；ＬＢは、共有結合であるか、またはＸとＴとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。一般に、親和性リガンドは、標的分子と、多価架橋剤との結合に関して競合し得るものである。一部の特定の実施形態では、該コンジュゲートおよび標的分子の該架橋剤に対する相対親和性は、１：１〜１００：１の範囲である（この場合、１００：１の相対親和性は、コンジュゲート、標的分子および架橋剤の平衡混合物において（ｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中、３７℃で）、標的分子の濃度がコンジュゲートの濃度の１００倍である場合、架橋剤が、ほぼ等モル量のコンジュゲートと標的分子に結合することを意味する）。一部の特定の実施形態では、この相対親和性は１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜５：１または１：１〜２：１の範囲である。２つ以上の個別の親和性リガンドは、同じ化学構造を有するものであっても、異なる化学構造を有するものであってもよい。例えば、２つ以上の個別の親和性リガンドは、標的分子（例えば、グルコース）と同じ化学構造を有するものであってもよく、標的分子の化学的に関連している種であってもよい。例えば、標的分子がグルコースである場合、親和性リガンドとしては、糖が挙げられ得る。したがって、一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、グルコースと、多価のグルコース結合分子（例えば、限定されないが、Ｃｏｎ  Ａ、マンナン結合レクチンまたはＭＢＬなど）に対する結合に関して競合し得るものである。
【０１３５】
一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化２５】
2012516340.tif 000028
【０１３６】
（式中：
各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚ、または−ＣＨ２Ｒｘであり；
各Ｒｘは、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、または−Ｏ−Ｙであり；
各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２であり；
各Ｙは、独立して、単糖、二糖または三糖であり；
各Ｇは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているＣ１−９アルキレンであり、ここで、Ｇの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−、または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−で置き換えられており；
各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、または−ＯＳＯ２Ｒ２であり；
各Ｒ２は、独立して、水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、フェニル、窒素、酸素もしくはイオウから選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜７員の複素環式の環、または窒素、酸素もしくはイオウから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換されている基である）
のものである。
【０１３７】
一部の特定の実施形態では、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の親和性リガンドは単糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは二糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは三糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは四糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、４個以下の糖質部分を含むものである。
【０１３８】
上記に一般的に定義したように、各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚ、または−ＣＨ２Ｒｘである。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は水素である。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は−Ｏ−Ｙである。一部の特定の他の実施形態では、Ｒ１は−Ｇ−Ｚである。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２−Ｏ−Ｙである。また他の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨ２である。当業者には、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）における各Ｒ１置換基が（Ｒ）または（Ｓ）の立体化学構造であり得ることが認識されよう。
【０１３９】
上記に一般的に定義したように、各Ｒｘは、独立して、水素、−０Ｒｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、または−Ｏ−Ｙである。一部の実施形態では、Ｒｘは水素である。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは−ＯＨである。他の実施形態では、Ｒｘは−Ｏ−Ｙである。
【０１４０】
上記に一般的に定義したように、各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。一部の実施形態では、Ｒｙは水素である。他の実施形態では、Ｒｙは−Ｒ２である。一部の実施形態では、Ｒｙは−Ｃ（Ｏ）Ｒ２である。一部の特定の実施形態では、Ｒｙはアセチルである。他の実施形態では、Ｒｙは、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。
【０１４１】
上記に一般的に定義したように、Ｙは単糖、二糖または三糖である。一部の特定の実施形態では、Ｙは単糖である。一部の実施形態では、Ｙは二糖である。他の実施形態では、Ｙは三糖である。一部の実施形態では、Ｙは、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノース、またはキシロピラノースである。一部の実施形態では、Ｙは、スクロース、マルトース、ツラノース、トレハロース、セロビオース、またはラクトースである。一部の特定の実施形態では、Ｙはマンノースである。一部の特定の実施形態では、ＹはＤ−マンノースである。当業者には、糖Ｙが、−Ｏ−Ｙの酸素基にアノマー炭素を介して結合され、グリコシド結合を形成していることが認識されよう。グリコシド結合は、α立体配置であってもβ立体配置であってもよい。
【０１４２】
上記に一般的に定義したように、各Ｇは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているＣ１−９アルキレンであり、ここで、Ｇの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｇは二重結合である。一部の特定の実施形態では、Ｇは−Ｏ−Ｃ１−８アルキレンである。一部の特定の実施形態では、Ｇは−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
【０１４３】
上記に一般的に定義したように、各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、または−ＯＳＯ２Ｒ２である。一部の実施形態では、Ｚは、ハロゲンまたは−ＯＳＯ２Ｒ２である。他の実施形態では、Ｚは、−Ｎ３または−Ｃ≡ＣＲ２である。一部の特定の実施形態では、Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、または−ＳＲ２である。一部の特定の実施形態では、Ｚは−ＳＨである。一部の特定の実施形態では、Ｚは−ＮＨ２である。一部の特定の実施形態では、−Ｇ−Ｚは−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。
【０１４４】
一部の実施形態では、式（ＩＩＩａ）のＣ１炭素上のＲ１置換基は−Ｇ−Ｚであり、式（ＩＩＩａ−ｉ）：
【化２６】
2012516340.tif 000029
【０１４５】
（式中、Ｒ１、ＧおよびＺは、本明細書において定義および記載のとおりである）
の化合物が得られる。
【０１４６】
一部の実施形態では、リガンドは、式（ＩＩＩａ−ｉｉ）：
【化２７】
2012516340.tif 000030
【０１４７】
（式中、Ｒ１、Ｒｘ、ＧおよびＺは、本明細書において定義および記載のとおりである）
のものである。
【０１４８】
標的分子がグルコースである一部の特定の実施形態では、例えば、グルコース応答性物質体の応答を微調整するために、親和性リガンドがグルコースと異なる化学構造を有することが好都合な場合があり得る。例えば、一部の特定の実施形態では、以下：グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、これらの誘導体（例えば、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノースなど）および／またはこれらの高次の組合せ（例えば、ビマンノース、線状および／または分岐のトリマンノースなど）の１種類以上を含む親和性リガンドが使用され得る。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは単糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンド二糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは三糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは多糖を含む。一部の実施形態では、親和性リガンドは糖と１つ以上のアミン基を含む。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。他の実施形態では、親和性リガンドはＤ−グルコサミン（ＧＡ）である。一部の特定の実施形態では、糖リガンドは「Ｄ」立体配置のものである。他の実施形態では、糖リガンドは「Ｌ」立体配置のものである。以下に、本発明らは、これらの例示的なリガンドの構造を示す。他の例示的なリガンドは、当業者に認識されよう。
【化２８】
2012516340.tif 000031
【０１４９】
より詳細に以下に論考するように、親和性リガンドは、コンジュゲートの枠組構造内に天然に存在するものであってもよい（例えば、ポリマー主鎖の一部として、またはモノマーの側鎖基として）。択一的に（または付加的に）、親和性リガンドは、コンジュゲートの枠組構造内に人工的に組み込まれたものであってもよい（例えば、コンジュゲートの枠組構造に合成的に付加された化学基の形態で）。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、または１００個以上の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜２５、２〜５０または２〜１００個の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、２、３または４個程度の少ない個別の親和性リガンド、例えば、２、３または４個のＡＥＭ、ＡＥＢＭまたはＡＥＴＭリガンド（その混合物を含む）を含む枠組構造を含むものであり得る。
【０１５０】
親和性リガンドをコンジュゲート枠組構造にコンジュゲートさせるための方法は、より詳細に以下に論考する。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドが糖を含む場合、コンジュゲーション（直接であれ間接的であれ）には、糖のＣ１、Ｃ２またはＣ６位が関与する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションはＣ１位が関与するものである。Ｃ１位は、アノマー炭素とも称され、コンジュゲートの枠組構造に、αまたはβコンホメーションで連結され得る。一部の特定の実施形態では、Ｃ１位はαアノマーとして構成される。他の実施形態では、Ｃ１位はβアノマーとして構成される。
【０１５１】
Ｄ（薬物）
種々の実施形態において、−Ｄは−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり、式中、Ｗは薬物であり、ＬＤは共有結合であるか、またはＷとＴとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。
【０１５２】
例えば、薬物は、該物質体が治療目的に使用される場合、例えば、薬物を患者に制御可能に送達するために含まれ得る。コンジュゲートには任意の薬物が含まれ得ることは理解されよう。コンジュゲートは、１コピーより多くの同じ薬物を含むものであり得、および／または１種類より多くの型の薬物を含むものであり得る。コンジュゲートは、任意の特定の薬物に限定されず、小分子薬または生体分子薬を含むものであってもよい。一般に、使用される薬物（１種類または複数種）は、処置対象の疾患または障害に依存する。
【０１５３】
例えば、限定されないが、種々の実施形態において、コンジュゲートは、以下の薬物：ジクロフェナク、ニフェジピン、リバスチグミン、メチルフェニデート、フルオキセチン、ロシグリタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、コデイン、エチルモルヒネ、デキストロメトルファン、ノスカピン、ペントキシベリン（ｐｅｎｔｏｘｉｖｅｒｉｎｅ）、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、エピネフリン、イソプレナリン、オルシプレナリン、エフェドリン、フェノテロール、リミテロール、イプラトロピウム、コリンテオフィリネート、プロキシフィリン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デスラノシド、ジゴキシン、ジギトキシン、ジソピラミド、プロスシラリジン、キニジン、プロカインアミド、メキシレチン、フレカイニド、アルプレノロール、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒｏａｎｏｌｏｌ）、ナドロール、ピンドロール、オクスプレノロール、ラベタロール、チモロール（ｔｉｒｎｏｌｏｌ）、アテノロール、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、イソソルビドモノニトラート、ニフェジピン、フェニルアミン、ベラパミル、ジルチアゼム、シクランデラール（ｃｙｃｌａｎｄｅｌａｒ）、ニコチニルアルコール、ニコチン酸イノシトール、アルプロスタジル（ａｌｐｒｏｓｔａｔｄｉｌ）、エチレフリン、プレナルテロール、ドブタミン、ドパミン、ジヒドロエルゴタミン、グアネチジン、ベタニジン、メチルドパ、レセルピン、グアンファシン、トリメタファン、ヒドララジン、ジヒドララジン、プラゾシン、ジアゾキサイド、カプトプリル、ニフェジピン、エナラプリル、ニトロプルシド、ベンドロフルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、クロルタリドン、シネタゾン、クロパミド、メフルシド、メトラゾン、ブメタニド、エタクリナシド、スピロノラクトン、アミロリド、クロフィブラート、ニコチン酸、ニケリトロール（ｎｉｃｈｅｒｉｔｒｏｌ）、ブロモフェニルアミン、シンナリジン、デキシクロルフェニラミン、クレマスチン、アンタゾリン、シプロヘプタジン、プロメタジン（ｐｒｏｅｔｈａｚｉｎｅ）、シメチジン、ラニチジン、スクラルファート、パパベリン、モキサベリン、アトロピン、ブチルスコポラミン、エメプロン、グルコピロン、ヒヨスチアミン、メペンソラール、メチルスコポラミン、オキシフェンサイクリミン、プロバンテリン、テロジリン、センナグリコシド、サグラダエキストラクト、ダントロン、ビサコジル、ピコスルファートナトリウム、エチュロス、ジフェノキシレート（ｄｉｐｈｅｎｏｌｘｙｌａｔｅ）、ロペラミド、サラゾスルファピリジン、ピルヴィン、メベンダゾール、ジメチコン、フェロフマレート、フェロサクシネート、フェリテトラセミナトリウム、シアノコバラミン、葉酸ヘパリン、ヘパリン補因子、ジクルマロール、ワルファリン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ビタミンＫ、チオテパ（ｔｈｉｏｐｅｔａ）、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、シタラビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、プロカルバジン、ダカルバジン、ロムスチン、エストラムスチン、テニポシド、エトポシド、シスプラチン、アムサクリン、アミノグルテチミド、ホスフェストロール、メドロキシプログレステロン（ｍｅｄｒｏｘｉｐｒｏｇｒｅｓｔｅｒｏｎｅ）、ヒドロキシプロゲステロン、メゲステロール、ノレチステロン、タモキシフェン、シクロスポリン、スルフィソミジン、ベンシルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、ジクロキサシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、アンピシリン、アモキシリン、ピバンピシリン、バカンピシリン、ピペラシリン、メジオシリン、メシリナム、ピブメシリナム、セファロチン、セファレキシン、セフラジン、セファドロキシル、セファクロル、セフロキシム、セフォタキシム、セフタジジム、セフォキシチン、アズトレオナム、イミペネム、シラスタチン、テトラサイクリン、リメサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロルアンフェニコール、スピラマイシン、フシジン酸、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、アンフォテリシンＢ、グリセオフルビン、ニスタチン、バンコマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、トリメトプリム、ノルフロキサシン、サラゾスルファピリジン、アミノサリル、イソニアジド、エタンブトール（ｅｔａｍｂｕｔｏｌ）、ニトロフラントイン、ナリジクス酸、メテナミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、チニダゾール、ケトコナゾール、アシクロビル、インターフェロン、イドクスウリジン、レチノール、チアミン、デキスパンテノール、ピリドキシン、葉酸、アスコルビン酸、トコフェロール、フィトミナジオン、フェンフルナミン、コルチコトロピン、テトラコサクチド、チロトロピン、ソマトトロピン、ソマトレム、バソプレシン、リプレシン、デスモプレシン、オキシトシン、クロリオンゴナドトロピン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、フルオキシメステロン、メステロロン、ナンドロロン、スタノゾロール、オキシメトロン、シプロテロン、レボチロキシン、リオチロニン、プロピルチオウラシル、カルビマゾール、チアマゾール、ジヒドロタキステロール、アルファカルシドール、カルシチロール、インスリン、トルブタミド、クロルプロパミド、トラズアミド、グリピジド、グリベンクラミド、フェノバルビタール、メチプリロン、ピリチルジオン、メプロバメート、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、ニトラゼパム、バクロフェン、オキサゼパム、クロラゼプ酸二カリウム（ｄｉｋａｌｉｕｍｃｌｏｒａｚｅｐａｔ）、ロラゼパム、フルニトラゼパム、アルプラゾラム、ミダゾラム、ヒドロキシジン、ダントロレン、クロメチアゾール、プロピオンマジン、アリメマジン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、アセトフェナジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペナジン、トリフルオペラジン、ジキシラジン、チオリダジン（ｔｈｉｏｄｉｒａｚｉｎｅ）、ペリシアジン、クロプロチキセン（ｃｈｌｏｐｒｏｔｈｉｘｅｎｅ）、チザニジン、ザレプロン、ズクロペンチゾール、フルペンチゾール、チチキセン、ハロペリドール、トリミプラミン、オピプラモール、クロミプラミン、デシプラミン、ロフェプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、マプトロチリン、カフェイン、シンナリジン、サイクリジン、メンヒドリナート（ｄｉｍｅｎｈｙｄｉｎａｔｅ）、メクロジン、プロメタジン、チエチルペラジン、メトクロプラミド、スコポラミン、フェノバルビタール、フェニトイン、エトスクシミド、プリミドン、カルバマゼピン、クロナゼパム、オルフェナドリン、アトロピン、ベンサトロピン、ビペリデン、メチキセン、プロシリジン、レボドパ、ブロモクリプチン、アマンタジン、アンベノン、ピリドスチグミン、シンスチグミン、ジスルフィラム、モルヒネ、コデイン、ペンタゾシン、ブプレノルフィン、ペチジン、フェノペリジン、フェンタニル、メタドン、ピリトラミド、デキストロプロポキシフェン、ケトベミドン、アセチルサリチル酸、セレコキシブ、フェナゾン、フェニルブタゾン、アザプロパゾン、ピロキシカム、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、シプロヘプタジン、ピジチフェン、フルメドロキソン、アロプリノール、プロベネシド、金チオリンゴ酸ナトリウムアウラノフィン（ａｕｒｏｎｏｆｉｎ）、ペニシラミン、エストロジオール、吉草酸エストラジオール、エストリオール、エチニルエストラジオール、ジヒドロゲステロン、リネストレノール、メドロキシプログレステロン、ノルエチステロン、シクロフェニル、クロミフェン、レボノルゲストレル、メストラノール、オルニダゾール、チニダゾール、エコナゾール、クロトリマゾール、ナタマイシン、ミコナゾール、スルベンチン、メチルエルゴタミン、ジノプロスト、ジノプロストン、ゲメプロスト、ブロモクリプチン、フェニルプロパノールアミン、クロモグリク酸ナトリウム、アセタゾラミド、ジクロフェナミド、ベータカロテン、ナロキソン、ホリナートカルシウム、特にクロニジン、テオフィリン、ジピラダモール、ヒドロクロルチアジド、スコポルアミン、インドメタシン、フロセミド、塩化カリウム、モルヒネ、イブプロフェン、サルブタモール、テルブタリン、カルシトニンなどのいずれか１つを含むものであり得る。この列挙は例示を意図していること、および既知のものであれ、後に見い出されるものであれ、任意の薬物が本開示のコンジュゲートに使用され得ることは理解されよう。
【０１５４】
種々の実施形態において、コンジュゲートは、ホルモン薬（ペプチド系であっても非ペプチド系であってもよい）、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔｇｌａｎｄｉｎ）、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどを含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、ホルモンは、グルカゴン、インスリン、インスリン様増殖因子、レプチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、およびトリヨードサイロニンから選択され得る。この列挙は例示を意図していること、および既知のものであれ、後に見い出されるものであれ、任意のホルモン薬が本開示のコンジュゲートに使用され得ることは理解されよう。
【０１５５】
種々の実施形態において、コンジュゲートは甲状腺ホルモンを含むものであり得る。
【０１５６】
種々の実施形態において、コンジュゲートは抗糖尿病薬（すなわち、糖尿病に苦しむ患者に対して有益な効果を有する薬物）を含むものであり得る。
【０１５７】
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン分子を含むものであり得る。「インスリン分子」により、本発明者らは、生理活性である（すなわち、インビボで投与したとき、検出可能なグルコースの低減を引き起こし得る）限り、野生型インスリンおよび修飾型インスリンのどちらも包含することを意図する。野生型インスリンとしては、精製型であれ、合成型であれ、組換え型であれ、任意の種由来のインスリンが挙げられる（例えば、ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）。これらのいくつかは市販されており、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能である。さまざまな修飾型インスリンが当該技術分野で知られている（例えば、ＣｒｏｔｔｙおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｍｅｒｇ．Ｃａｒｅ．２３：９０３−９０５、２００７、ならびにＧｅｒｉｃｈ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１１３：３０８〜１６，２００２、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。修飾型インスリンは、化学修飾されたもの（例えば、ＰＥＧ基もしくは後述する脂肪族アシル鎖などの化学部分の付加によって）および／または変異されたもの（すなわち、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によって）であり得る。一般に、生理活性のある変異型形態のインスリンは、典型的には、野生型インスリンと１〜１０（例えば、１〜５または１〜２）個のアミノ酸の置換、付加または欠失により異なる。ヒトインスリンの野生型配列（Ａ鎖およびＢ鎖）を、以下および図２９に示す。
【０１５８】
Ａ鎖（配列番号：１）：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
Ｂ鎖（配列番号：２）：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
ヒトインスリンは、ウサギ、ブタ、ウシ、およびヒツジインスリンとアミノ酸Ａ８、Ａ９、Ａ１０、およびＢ３０のみが異なる（以下の表を参照のこと）。
【表１】
2012516340.tif 000032
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、Ｂペプチド配列のＢ２８位および／またはＢ２９位が変異されたものである。例えば、インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は、ＢペプチドのＣ末端の最後から２番目のリジンとプロリン残基が逆転した速効性インスリン変異型（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン）である。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。インスリンアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））は、Ｂ２８位のプロリンがアスパラギン酸で置換された別の速効性インスリン変異型（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン）である。この変異型も多量体の形成を抑制する。一部の実施形態では、Ｂ２８位および／またはＢ２９位の変異は、インスリンポリペプチド内の別の箇所に１つ以上の変異を伴う。例えば、インスリングルリジン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））は、Ｂ３位のアスパラギン酸がリジン残基で置き換えられ、Ｂ２９位のリジンがグルタミン酸残基で置き換えられた、また別の速効性インスリン変異型（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン）である。
【０１５９】
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、ヒトインスリンと比べてシフトした等電点を有する。一部の実施形態では、等電点のシフトは、インスリンＡペプチドのＮ末端および／またはインスリンＢペプチドのＣ末端に１つ以上のアルギニン残基を付加することによりなされる。かかるインスリンポリペプチドの例としては、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、およびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンが挙げられる。さらなる一例として、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、ＡｓｐＡ２１がグリシンで置き換えられ、２つのアルギニン残基がＢペプチドのＣ末端に付加された例示的な長期作用性インスリン変異型である。これらの変更の効果は、等電点がシフトしてｐＨ４で完全に可溶性の溶液が得られることである。したがって、一部の実施形態では、本開示のインスリン分子は、Ａ２１がＧｌｙであるＡペプチド配列と、Ｂ３１がＡｒｇ−ＡｒｇであるＢペプチド配列とを含むものである。本開示は、本明細書に記載したこれらの変異および任意の他の変異（例えば、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）の単独および多くの組合せをすべて包含することは理解されよう。
【０１６０】
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は切断型である。例えば、一部の特定の実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのＢペプチド配列は、Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９および／またはＢ３０がないものである。一部の特定の実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのＢペプチド配列に残基の組合せがない。例えば、Ｂペプチド配列は、残基Ｂ（１〜２）、Ｂ（１〜３）、Ｂ（２９〜３０）、Ｂ（２８〜３０）、Ｂ（２７〜３０）および／またはＢ（２６〜３０）がないものであり得る。一部の実施形態では、これらの欠失および／または切断は、前記の任意のインスリン分子に適用される（例えば、限定されないが、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンリスプロ、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンアスパルト、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングルリジン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングラルギンなどを作製するため）。
【０１６１】
一部の実施形態では、インスリン分子は、ＡまたはＢペプチド配列のＮ−またはＣ末端にさらなるアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、Ａ０、Ａ２１、Ｂ０および／またはＢ３１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ａ０位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ａ２１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ｂ０位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ｂ３１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、Ａ０、Ａ２１、Ｂ０またはＢ３１位に、さらなるアミノ酸残基を全く含まない。
【０１６２】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、１つ以上のアミド化アミノ酸が酸性形態で置き換えられるように変異されている。例えば、アスパラギンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。同様に、グルタミンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。特に、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１、またはＡｓｎＢ３、またはこれらの残基の任意の組合せが、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。ＧｌｎＡ１５またはＧｌｎＢ４または両方が、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、Ａ２１位にアスパラギン酸、またはＢ３位にアスパラギン酸、またはこれら両方を有する。
【０１６３】
当業者には、生物学的活性を保持したまま、インスリン分子内のまた別のアミノ酸を変異させることも可能であることが認識されよう。例えば、限定されないが、以下の修飾：Ｂ１０位のヒスチジン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＨｉｓＢ１０→ＡｓｐＢ１０）；Ｂｌ位のフェニルアラニン残基アスパラギン酸での置き換え（ＰｈｅＢ１→ＡｓｐＢ１）；Ｂ３０位のトレオニン残基のアラニンでの置き換え（ＴｈｒＢ３０→ＡｌａＢ３０）；Ｂ２６位のチロシン残基のアラニンでの置き換え（ＴｙｒＢ２６→ＡｌａＢ２６）；およびＢ９位のセリン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＳｅｒＢ９→ＡｓｐＢ９）も当該技術分野で広く認められている。
【０１６４】
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、持続性の作用プロフィールを有するものである。したがって、一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、脂肪酸でアシル化されたものであり得る。すなわち、インスリン分子上のアミノ基と脂肪酸のカルボン酸基との間にアミド結合が形成される。アミノ基は、インスリン分子のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基であってもよく、インスリン分子のリジン残基のε−アミノ基であってもよい。本開示のインスリン分子は、野生型インスリンに存在する３つのアミノ基の１つ以上がアシル化されたものであり得るか、または野生型配列に導入されたリジン残基がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ１位がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ２９位がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合された長期作用性インスリン変異型である。
【０１６５】
一部の実施形態では、ＡペプチドのＮ末端、ＢペプチドのＮ末端、Ｂ２９位のＬｙｓのε−アミノ基、または本開示のインスリン分子内の任意の他の利用可能なアミノ基が、一般式：
【化２９】
2012516340.tif 000033
【０１６６】
（式中、ＲＦは、水素またはＣ１−３０アルキル基である）
の脂肪酸部分に共有結合される。一部の実施形態では、ＲＦは、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−１９アルキル基、Ｃ５−１８アルキル基、Ｃ６−１７アルキル基、Ｃ８−１６アルキル基、Ｃ１０−１５アルキル基、またはＣ１２−１４アルキル基である。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ａ１位でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ｂ１位でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ｂ２９位のＬｙｓのε−アミノ基でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリン分子のＢ２８位がＬｙｓであり、ＬｙｓＢ２８のε−アミノ基が脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリン分子のＢ３位がＬｙｓであり、ＬｙｓＢ３のε−アミノ基が脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、脂肪酸鎖は８〜２０炭素長である。一部の実施形態では、脂肪酸は、オクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）、またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。一部の特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）、またはアラキジン酸（Ｃ２０）である。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合された長期作用性インスリン変異型である。
【０１６７】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリンアスパルト）、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリングルリジン）、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリングラルギン）、ＮεＢ２９−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリンデテミル）、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２７）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１−Ｂ３）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１６８】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル（ｍｙｒｉｓｏｔｙｌ）−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１６９】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７０】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７１】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリンポリペプチド：ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ａｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７２】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７３】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７４】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７５】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７６】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７７】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７８】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１７９】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８０】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８１】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８２】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１  −アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８３】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８４】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８５】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８６】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８７】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８８】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１８９】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９０】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９１】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９２】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９３】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９４】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９５】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９６】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９７】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９８】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１９９】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０２００】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０２０１】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ｄｅｓ（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０２０２】
また、本開示は、前記の変異および／または化学修飾のいずれか１つを含む非ヒトインスリン（例えば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）の修飾型も包含する。
【０２０３】
これらおよび他の修飾インスリン分子は、米国特許第６，９０６，０２８号；同第６，５５１，９９２号；同第６，４６５，４２６号；同第６，４４４，６４１号；同第６，３３５，３１６号；同第６，２６８，３３５号；同第６，０５１，５５１号；同第６，０３４，０５４号；同第５，９５２，２９７号；同第５，９２２，６７５号；同第５，７４７，６４２号；同第５，６９３，６０９号；同第５，６５０，４８６号；同第５，５４７，９２９号；同第５，５０４，１８８号；同第５，４７４，９７８号；同第５，４６１，０３１号；および同第４，４２１，６８５号；ならびに米国特許第７，３８７，９９６号；同第６，８６９，９３０号；同第６，１７４，８５６号；同第６，０１１，００７号；同第５，８６６，５３８号；および同第５，７５０，４９７号に詳細に記載されており、その全開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、３つの野生型ジスルフィド結合（すなわち、Ａ鎖の７位とＢ鎖の７位間に１つ、Ａ鎖の２０位とＢ鎖の１９位間に２つ目、およびＡ鎖の６位と１１位間に３つ目）を含む。
【０２０５】
インスリン分子を含む薬物をコンジュゲートさせるための方法を以下に記載する。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はコンジュゲートの枠組構造に、Ａ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、Ａ１アミノ酸残基はグリシンである。しかしながら、本開示はＮ末端コンジュゲーションに限定されないこと、および一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、非末端Ａ鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされてもよいことは理解されよう。特に、本開示は、Ａ鎖内の任意の位置に存在するリジン残基（野生型または部位特異的変異誘発によって導入されたもの）のε−アミン基を介したコンジュゲーションを包含する。Ａ鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることは認識されよう。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はコンジュゲートの枠組構造に、Ｂ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、Ｂ１アミノ酸残基はフェニルアラニンである。しかしながら、本開示はＮ末端コンジュゲーションに限定されないこと、および一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、非末端Ｂ鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされてもよいことは理解されよう。特に、本開示は、Ｂ鎖内の任意の位置に存在するリジン残基（野生型または部位特異的変異誘発によって導入されたもの）のε−アミン基を介したコンジュゲーションを包含する。例えば、一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ２９リジン残基を介してコンジュゲートされ得る。Ｂ鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることは認識されよう。
【０２０６】
一部の特定の実施形態では、リガンドは、インスリン分子などの薬物１つより多くのコンジュゲーション点にコンジュゲートされる。例えば、インスリン分子は、Ａ１のＮ末端とＢ２９リジンの両方にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、炭酸緩衝液中でアミドコンジュゲーションが起こり、Ｂ２９位とＡｌ位にコンジュゲートされるが、Ｂ１位にはコンジュゲートされない。他の実施形態では、インスリン分子は、Ａ１のＮ末端、Ｂ１のＮ末端、およびＢ２９リジンにコンジュゲートされ得る。また他の実施形態では、保護基が、コンジュゲーションがＢ１位とＢ２９位またはＢｌ位とＡｌ位で起こるように使用される。インスリン分子上のコンジュゲーション点の任意の組合せが使用され得ることは認識されよう。一部の実施形態では、コンジュゲーション点の少なくとも１つは変異リジン残基、例えばＬｙｓＡ３である。
【０２０７】
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン感受性改善薬（すなわち、インスリンの作用を増強する薬物）を含むものであり得る。インスリンの効果を増強する薬物としては、ビグアニド（例えば、メトホルミン）およびグリタゾンが挙げられる。最初のグリタゾン薬はトログリタゾンであったが、これは重度の副作用を有することが判明した。第２世代のグリタゾンとしてはピオグリタゾンおよびロシグリタゾンが挙げられ、これらは耐容性がより良好であるが、ロシグリタゾンは、一部の治験において有害な心血管事象と関連していた。
【０２０８】
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン分泌促進薬（すなわち、膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌を刺激する薬物）を含むものであり得る。例えば、種々の実施形態において、コンジュゲートはスルホニル尿素を含むものであり得る。スルホニル尿素は、膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌を、該細胞をグルコースの作用に対して感作することにより刺激する。さらに、スルホニル尿素はグルカゴンの分泌を抑止し、標的組織をインスリンの作用に対して感作し得る。第１世代のスルホニル尿素としては、トルブタミド、クロルプロパミドおよびカルブタミドが挙げられる。より低い用量で活性な第２世代のスルホニル尿素としては、グリピジド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリボルヌリドおよびグリメピリドが挙げられる。種々の実施形態において、コンジュゲートはメグリチニドを含むものであり得る。好適なメグリチニドとしては、ナテグリニド、ミチグリニドおよびレパグリニドが挙げられる。これらの血糖降下作用は、スルホニル尿素のものより速いが短い。他のインスリン分泌促進薬としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびＧＬＰ−１類似体（すなわち、ＧＬＰ−１様生理活性を有し、ＧＬＰ−１とは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）が挙げられる。ＧＬＰ−１は、中枢作用によって胃内容物排出を抑止して満腹感を増大させることにより、およびグルカゴンの放出を抑制することにより食物摂取量を低減させる。ＧＬＰ−１は、膵島細胞の増殖を増大させ、摂食後のインスリン生成を増大させることにより血漿グルコースレベルを低下させる。ＧＬＰ−１は、例えば、そのインビボ半減期を長くするため、リラグルチドの場合のように脂質のコンジュゲーションによって化学修飾され得る。また他のインスリン分泌促進薬としては、エキセンジン−４およびエキセンジン−４類似体（すなわち、エキセンジン−４様生理活性を有し、エキセンジン−４とは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）が挙げられる。エキセンジン−４は、アメリカドクトカゲ（Ｇｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒ）に毒中に見られ、ＧＬＰ−１様生理活性を示す。これは、ＧＬＰ−１よりもずっと長い半減期を有し、ＧＬＰ−１とは異なり、生理活性を失うことなく、Ｎ末端の８個のアミノ酸残基が切断され得る。ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４のＮ末端領域は、ほぼ同一であり、有意な差は２番目のアミノ酸残基、ＧＬＰ−１ではアラニン、エキセンジン−４ではグリシンであり、これにより、エキセンジン−４に、インビボ消化に対する抵抗性が付与される。また、エキセンジン−４はＧＬＰ−１と比較すると、Ｃ末端に、さらに９個のアミノ酸残基も有する。Ｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：７１３−７１６、２００７およびＲｕｎｇｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５８３０−５８４０、２００７には、本開示のコンジュゲートに使用され得るさまざまなＧＬＰ−１およびエキセンジン−４類似体が記載されている。ＧＬＰ−１の短い半減期は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による酵素的消化に起因する。一���の特定の実施形態では、内因性ＧＬＰ−１の効果は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬（例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチンまたはアログリプチン）の投与によって増強され得る。
【０２０９】
種々の実施形態において、コンジュゲートはアミリンまたはアミリン類似体（すなわち、アミリン様生理活性を有し、アミリンとは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）を含むものであり得る。アミリンは、グルコースの調節に重要な役割を果たしている（例えば、ＥｄｅｌｍａｎおよびＷｅｙｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１７５〜１８９、２００２を参照のこと）。アミリンは、食物摂取量に応答して膵臓のβ細胞によってインスリンとともに共分泌される神経内分泌ホルモンである。インスリンは血流からのグルコースの消失を調節する働きをするが、アミリンは、胃および肝臓から血流中へのグルコースの出現の調節を補助する働きをする。酢酸プラムリンチド（ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））は例示的なアミリン類似体である。天然ヒトアミリンはアミロイド形成性であるため、プラムリンチドを設計するためのストラテジーは、ある特定の残基を、アミロイド形成性でないラットアミリン由来の残基で置換することを伴うものであった。特に、プロリン残基は構造破壊性残基であることがわかっており、そのため、該残基は、ラット配列からヒト配列に直接グラフトされた。また、Ｇｌｕ−１０もアスパラギンで置換された。
【０２１０】
種々の実施形態において、プレコンジュゲート薬物は、１つ以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび／またはε−アミンリジン基を有するペプチド薬が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の薬物に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド薬の場合、適当なアミノ酸（例えば、リジン）が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
【０２１１】
上記に論考したように、本開示は、なんら特定の薬物／標的分子の組合せに限定されない。
【０２１２】
種々の実施形態において、本開示の物質体は、天然のフィードバック機構を操作するために利用され得る。例えば、２種類の内因性物質のレベル相互に関連している（例えば、グルコースおよびインスリン、この場合、グルコースレベルが増大するにつれてインスリンレベルが増大し、インスリンレベルが増大するにつれてグルコースレベルが減少する）多くの天然フィードバック機構が存在する（例えば、ほとんどのホルモン性制御機構）。かかる実施形態では、内因性物質の一方が標的分子（例えば、グルコース）となり得、他方が薬物（例えば、インスリン）となる。あるいはまた、種々の実施形態において、薬物は、（ａ）他方の内因性物質と同じ機能を有する（例えば、グルコースレベルを低減させる）、（ｂ）他方の内因性物質の生成を刺激する、および／または（ｃ）他方の内因性物質の効果（１つもしくは複数）を増強する分子であり得る。例えば、グルコースが標的分子である場合、薬物としてインスリンの代わりに、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬を使用してもよい。
【０２１３】
人工的なフィードバック系の他の非限定的な例としては、高レベルのインスリンに応答してグルカゴンコンジュゲートを放出する物質体、血栓症インジケータに応答して抗凝固薬コンジュゲート（例えば、クマリン（ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモンおよびフェニンジオンなど）、ヘパリン、直接トロンビン阻害剤（アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびダビガトランなど）など）を放出する物質体；乳酸レベルの増大に応答して乳酸降下性薬物コンジュゲート（例えば、ジクロロアセテート）を放出する物質体；などが挙げられる。
【０２１４】
種々の実施形態において、該物質体は、標的分子に直接関係しない機能を有する薬物を含むコンジュゲートを放出するように設計され得る。限定されないが、食後に濃度が増大する標的分子（例えば、グルコース）に応答する物質体は、食事中に長期間の薬物投薬をもたらすために使用され得る。定期的に、および／または食物とともに投与する必要がある任意の薬物が、かかる送達系の恩恵を被り得る。当該技術分野で周知のように、多くの従来の薬物は、食物とともに、または食事の際に投与される必要があるものである。例えば、脂肪の吸収を抑止する薬物（例えば、オルリスタット）は、食事中に存在するのが好都合である。同様に、脂質レベルを降下させる薬物（例えば、ロバスタチン、アトルバスタチン、もしくはシンバスタチン）、またはトリグリセリドレベルを降下させる薬物（例えば、ゲムフィブロジル）も、食事の際に放出されるのが好都合であり得る。
【０２１５】
Ｄ（検出可能な標識）
上記のように、種々の実施形態において、Ｄ内のＷは検出可能な標識である。例えば、コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内の該コンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で周知の任意の検出可能な標識を含むものであり得ることは理解されよう。コンジュゲートは、１コピーより多くの同じ標識を含むものであり得、および／または１種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識（１種類または複数種）は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。
【０２１６】
検出可能な標識は直接検出可能なものであってもよく、または、例えばシグナル生成系の１種類以上のさらなる構成員との複合作用によって間接的に検出可能なものであってもよい。直接検出可能な標識の例としては、放射性、常磁性、蛍光性、光散乱性、吸光性および比色分析用の標識が挙げられる。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンフィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどはすべて、例示的な蛍光標識である。化学発光性標識、すなわち、二次基質を発色性生成物に変換させ得る標識は、間接的に検出可能な標識の一例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどはすべて、例示的なタンパク質系化学発光性標識である。ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、例示的な非タンパク質系化学発光性標識である。間接的に検出可能な標識の別の非限定的で一般的に使用されている一例は、親和性リガンド、すなわち、それ自体が直接または間接的に検出可能であり得る二次結合パートナー（例えば、抗体またはアプタマー）に対して強い親和性を有する標識である。
【０２１７】
一般に、検出可能な標識は、さまざまな様式で可視化または検出され得、特定の検出様式は特定の検出可能な標識に基づいて選択されるが、ここで、代表的な検出手段としては、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
【０２１８】
種々の実施形態において、プレコンジュゲート標識は、１つ以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび／またはε−アミンリジン基を有するペプチド標識が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の標識に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸（例えば、リジン）が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
【０２１９】
ＬＢおよびＬＤ（共有結合性コンジュゲーション）
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、ＸとＴおよび／またはＷとＴ（包括的には、「構成要素」）の共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。該構成要素は、直接結合されていてもよく（すなわち、介在化学基なしで）、スペーサー（例えば、コンジュゲート要素とコンジュゲートの枠組構造の残部との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖）を介して間接的に結合されていてもよい。該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、任意の数の化学結合（例えば、限定されないが、アミド、アミン、エステル、エーテル、チオエーテル、イソ尿素、イミンなどの結合）によって共有結合され得ることは理解されよう。一部の特定の実施形態では、ＬＢおよび／またはＬＤ（全般的に、このセクションでの解釈上では「Ｌ」）は二重結合である。一部の実施形態では、Ｌは、Ｔの任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、ＸまたはＷのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する、任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Ｌは、ＸまたはＷの任意選択で置換されているカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、Ｔのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する、任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Ｌは、
【化３０】
2012516340.tif 000034
【０２２０】
である。一部の実施形態では、Ｌはスクシンイミド部分である。
【０２２１】
種々の実施形態において、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野で周知の「クリックケミストリー」反応を用いて共有結合され得る。該反応としては、例えば、付加環化反応、求核性開環反応、および炭素−炭素多重結合に対する付加が挙げられる（例えば、ＫｏｌｂおよびＳｈａｒｐｌｅｓｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ８：１１２８−１１３７、２００３ならびにそこに挙げられた参考文献ならびにＤｏｎｄｏｎｉ、Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２：７００−７０８、２００７、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。上記に論考したように、種々の実施形態において、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、天然の、または化学的に付加した懸垂基を介して結合され得る。一般に、１対の反応性基の第１と第２の構成員（例えば、反応してアミド結合をもたらすカルボキシル基とアミン基）は、該構成要素と枠組構造のいずれか一方に存在し得る（すなわち、２つの構成員の相対位置は、これらが反応してコンジュゲートが得られる限り重要でない）ことは認識されよう。例示的な結合は、より詳細に以下に論考する。
【０２２２】
種々の実施形態において、カルボキシル（または反応性エステル）含有構成要素が、−ＯＨ含有枠組構造（ＯＢＦ）に、ＫｉｍらによるＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４：４８４３−４８５１（２００３）に概要が示された手順を用いてコンジュゲートされ得る。簡単には、ＯＢＦをＤＭＳＯに、カルボキシル含有構成要素とともに溶解させ、触媒としてのＮ’，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）によって、乾燥雰囲気下で反応させる。カルボキシル含有構成要素は、−ＮＨ２含有枠組構造（ＮＢＦ）に、カルボジイミド（ＥＤＡＣ）カップリング手順を用いてコンジュゲートされ得る。この手順を使用し、カルボキシル含有構成要素を、ｐＨ５の緩衝液中、ＥＤＡＣとの反応によって官能化した後、ＮＢＦに付加する。このような場合（および以下の任意の場合）ではいずれも、得られた生成物は、当業者に利用可能な任意の数の手段によって、例えば限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、および選択的沈殿によって精製され得る。
【０２２３】
種々の実施形態において、アミン含有構成要素は−ＣＯＯＨ含有枠組構造（ＣＢＦ）にカップリングされ得る。ＣＢＦには、活性化型エステル部分が使用されている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。簡単には、末端活性化カルボン酸エステル（例えば、−ＮＨＳ、−ＳＳＣ、−ＮＰＣなど）を有するＣＢＦを、無水有機溶媒（ＤＭＳＯまたはＤＭＦなど）に溶解させる。次いで、所望の当量数のアミン含有構成要素を添加し、室温で数時間混合する。また、アミン含有構成要素は、Ｂａｕｄｙｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３、１９９８に記載のように、安定なアミド結合を得るためにＣＢＦにコンジュゲートされ得る。この反応は、トリブチルアミン（ＴＢＡ）とクロロギ酸イソブチルを、ＣＢＦとアミン含有構成要素のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に、無水条件下で添加することにより行なわれ得る。あるいはまた、アミン含有構成要素をＯＢＦに、限定されないが、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ｆｌｕｏｒｂｏｒａｔｅ）（ＣＤＡＰ）、およびｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）などの試薬を用いるシアノ化（ｃｙａｎａｌａｔｉｏｎ）によってカップリングさせてもよい。ＣＮＢｒ反応は、水溶液中で弱塩基性ｐＨにて行なわれ得る。ＣＤＡＰ反応は、ＤＭＳＯと水の混合物中で弱塩基性ｐＨにて、触媒としてトリエチルアミン（ＴＥＡ）を用いて行なわれる。一部の特定の実施形態では、アミン含有構成要素はＮＢＦに、例えば、ピリジンを含む水性緩衝溶液中でのグルタルアルデヒドカップリング後、グリシンでのクエンチングによってコンジュゲートされ得る。一部の特定の実施形態では、アミン含有構成要素はアルデヒド含有枠組構造に、シッフ塩基カップリング手順の使用後、還元することによりコンジュゲートされ得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＭｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６、１９９９およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。簡単には、末端活性化型アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドなど）を有する枠組構造を、中性またはそれより低いｐＨを有する（好ましくないアルデヒドの加水分解を抑制するため）水性緩衝液に溶解させる。次いで、所望の当量数のアミン含有構成要素を添加し、室温で混合した後、過剰の適当な還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ナトリウムシアノボロヒドリド、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリドピリジンボラン、トリエチルアミンボランなど）を添加する。
【０２２４】
種々の実施形態において、ヒドロキシル含有構成要素はＯＢＦに、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）手順に従ってコンジュゲートされ得る。この手順を使用し、ＯＢＦをｐＨ１１．４の重炭酸緩衝液に添加し、ＤＶＳで活性化させ、続いてヒドロキシル含有構成要素を添加した後、グリシンを添加して反応液を中和およびクエンチする。また、ヒドロキシル含有構成要素をＯＢＦに、エステル結合をもたらす上記の活性化型エステル部分を用いてカップリングさせてもよい。
【０２２５】
種々の実施形態において、スルフヒドリル含有構成要素がマレイミド含有枠組構造（ＭＢＦ）に、チオエーテル結合をもたらす比較的穏和な手順を用いてカップリングされ得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。マレイミド基は活性化型エステルよりもはるかに加水分解されにくいため、反応を水性条件下で行なってもよい。簡単には、ＭＢＦをｐＨ６．５〜７．５の緩衝水溶液に溶解させた後、所望の当量数のスルフヒドリル含有構成要素を溶解させる。室温で数時間混合した後、チオエーテルカップリングコンジュゲートは精製され得る。また、スルフヒドリル含有構成要素を、Ｔｈｏｍａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５９１９−５９２９、１９９９に記載の方法に従ってＮＢＦにコンジュゲートさせてもよい。この反応は、ＮＢＦを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁させた後、２，６−ルチジンと酸無水物を添加し、続いて反応性の中間体を精製することを伴う。次いで、スルフヒドリル含有構成要素を該中間体のＤＭＦ溶液（トリエチルアミンを含む）に添加する。
【０２２６】
種々の実施形態において、アジド含有構成要素がアルキン含有枠組構造（ＡＢＦ）に、１，４−ジ−置換１，２，３−トリアゾールが得られる銅（Ｉ）触媒型の現代版Ｈｕｉｓｇｅｎ型アジド−アルキン付加環化を用いてカップリングされ得る（例えば、Ｄｏｎｄｏｎｉ、Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２：７００−７０８、２００７およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＤｅｄｏｌａら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．５：１００６−１０１７、２００７を参照のこと）。この反応は、一般的に「クリック」反応と称され、例えば、無希釈ＴＨＦ中で、触媒系としてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとＣｕ（ＰＰｈＳ）３Ｂｒを用いて行なわれ得る（例えば、Ｗｕら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５７７５−５７７７、２００５を参照のこと）。また、この反応は、３：１（ＴＨＦ：水）混合物中、触媒系としてアスコルビン酸ナトリウムとＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを用いて行なわれ得る（例えば、Ｗｕら、上掲を参照のこと）。いずれの場合も、アジド含有構成要素をＡＢＦに所望の当量数で添加した後、室温で１２〜４８時間混合する。あるいはまた、アルキン含有構成要素をアジド含有枠組構造に、上記のものと厳密に同じ条件を用いてコンジュゲートさせてもよい。
【０２２７】
一部の特定の該構成要素は、天然で、１つより多くの同じ化学反応性部分を有するものであり得る。一部の例では、該構成要素が該部位のうちの唯一の部位で選択的に反応するように化学反応型および条件を選択することが可能である。例えば、インスリンが反応性アミンを介してコンジュゲートされている場合、一部の特定の実施形態では、Ｎ末端α−Ｐｈｅ−Ｂ１は、インスリン生理活性を保持するのに、Ｎ末端α−Ｇｌｙ−Ａ１およびε−Ｌｙｓ−Ｂ２９よりも好ましい結合部位である（例えば、Ｍｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６、１９９９およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＴｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７を参照のこと）。インスリンとヘキサデセナール（末端がアルデヒドの分子）との例示的な反応において、研究者らにより、この２つの構成要素を、ナトリウムシアノボロヒドリドの存在下、５４％イソプロパノールを含む１．５ＭのｐＨ６．８のサリチル酸ナトリウム水溶液中で、１：６（インスリン：アルデヒドｍｏｌ／ｍｏｌ）の比で一晩混合すると、単一置換Ｐｈｅ−Ｂ１第２級アミンコンジュゲート生成物への８０％を超える変換がもたらされることが見出された（Ｍｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６，１９９９）。彼らの研究により、溶媒、ｐＨ、およびインスリン：アルデヒド比の選択はすべて、反応の選択性および収率に影響を及ぼすことが示された。しかしながら、ほとんどの場合、化学反応条件の選択によって選択性を得ることは困難である。したがって、一部の特定の実施形態では、反応に所望される１つの部位以外すべての部位の該構成要素（例えば、インスリン）を選択的に保護し、続いて、物質体を反応させ、精製した後、脱保護工程を行なうことが好都合な場合があり得る。例えば、文献にて入手可能なインスリンのアミン基の選択的保護の例は数多くあり、酸性（ＢＯＣ）、弱酸性（無水シトラコン酸）、および塩基性（ＭＳＣ）条件下で脱保護され得るものが挙げられる（例えば、Ｔｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７；Ｄｉｘｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０９：３１２−３１４、１９６８；およびＳｃｈｕｅｔｔｌｅｒら、Ｄ．Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６０：１７２１、１９７９を参照のこと）。一例では、Ｇｌｙ−Ａ１とＬｙｓ−Ｂ２９のアミンがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基で選択的に保護され得、次いで、この基は、９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／１０％アニソールの溶液中、４Ｃで１時間のインキュベーションによるコンジュゲーション後に除去される。一実施形態では、インスリンの乾燥粉末を無水ＤＭＳＯに溶解させた後、過剰のトリエチルアミンを溶解させる。この溶液に、ほぼ２当量の重炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル溶液（ＴＨＦ中）をゆっくり添加し、溶液を３０〜６０分間混合する。反応後、粗製溶液を過剰のアセトンに注入した後、希ＨＣｌを滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。この沈殿物を遠心分離し、アセトンで洗浄し、真空下で完全に乾燥させる。所望のジ−ＢＯＣ保護生成物は、未反応インスリン、所望でないジ−ＢＯＣ異性体、ならびにモノ−ＢＯＣおよびトリ−ＢＯＣ副生成物から、分取用逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離され得る（例えば、Ｔｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８、１９９７を参照のこと）。逆相ＨＰＬＣの場合、粗製生成物の７０％水／３０％アセトニトリル溶液（０．１％のＴＦＡ含有）をＣ８カラムに負荷し、アセトニトリル漸増勾配により溶出させる。所望のジ−ＢＯＣピークを収集し、回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋な生成物を得る。
【０２２８】
ＬＲＰＢおよびＬＲＰＤ（非共有結合性コンジュゲーション）
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、ＸとＴおよび／またはＷとＴ（包括的には、「構成要素」）の非共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数（Ｋｄ）が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野で周知の非共有結合性のリガンド−受容体ペア（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア）によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が該構成要素に共有結合され、該ペアの他方の構成員がコンジュゲートの枠組構造に共有結合される。該構成要素とコンジュゲート枠組構造を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、該構成要素がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド／受容体ペアとしては、タンパク質／補因子および酵素／基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン／アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリン、およびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。他にも適当なリガンド／受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）、さらには、Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｐｐ．１０５−１５２、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９０；「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｐａｓｃａｌ  Ｂａｉｌｌｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０００；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎらによる「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２に記載のものなどのエピトープタグとペアになったモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
【０２２９】
ｋおよびｑ
一般式（Ｉ）のコンジュゲートでは、ｋは２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定する。一部の特定の実施形態では、ｋ＝２または３である。ｑは１〜４（両端を含む）の整数であり、中央の―Ａ―
基に結合されたＤ基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｑ＝１である。一部の実施形態では、ｑ＝２である。ｋ＋ｑは３〜６（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋ＋ｑ＝３または４である。
【０２３０】
一般式（ＩＩ）のコンジュゲートでは、ｊが２、３または４のとき、ｋは、１〜１１（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋは１、２または３である。ｑは１〜４（両端を含む）の整数であり、中央の―Ａ―基に結合されたＤ基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｑ＝１である。一部の実施形態では、ｑ＝２である。ｋ＋ｑは３〜６（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋ＋ｑ＝３または４である。
【０２３１】
ｐおよびｍ
ｐは各々、独立して１〜５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、各ｐは同じである。一部の特定の実施形態では、ｐ＝１、２または３である。一部の特定の実施形態では、ｐ＝１である。
【０２３２】
ｍは各々、独立して１〜５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、各ｍは同じである。一部の特定の実施形態では、ｍ＝１、２または３である。一部の特定の実施形態では、ｍ＝１である。
【０２３３】
ｎおよびｖ
ｎは各々、独立して０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、ｎの少なくとも１つは≧１であるものとする。所与のｋ−分岐部内の分岐を、本明細書ではｎ−分岐部と称する。
【０２３４】
一部の特定の実施形態では、ｐ−括弧部分内に存在する―Ａ―は各々、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている（例えば、上記式（Ｉａ）を参照のこと）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｎは同じである。このような実施形態の一部において、ｎ＝１または２である。
【０２３５】
他の実施形態では、ｐ−括弧部分内の末端に存在する―Ａ―のみが、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている（例えば、上記の式（Ｉｂ）を参照のこと）。一部の特定の実施形態では、各ｋ−分岐部に含まれるｎ≧１の存在は１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｎ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｎは同じである。このような実施形態の一部において、ｎ＝１または２である。
【０２３６】
ｖは各々、独立して０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在するｖの少なくとも１つは≧１であるものとする。
【０２３７】
一部の特定の実施形態では、ｍ−括弧部分内に存在する―Ａ―各々、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている（例えば、上記式（Ｉｃ）を参照のこと）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。
【０２３８】
他の実施形態では、ｍ−括弧部分内の末端に存在する―Ａ―のみが、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている（例えば、上記式（Ｉｄ）を参照のこと）。一部の特定の実施形態では、各ｋ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｖ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。一部の特定の実施形態では、各ｎ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が少なくとも１つである。一部の特定の実施形態では、各ｎ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｖ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。
【０２３９】
ｊ
式（ＩＩ）のｊは２〜４（両端を含む）の整数であり、Ｄ基へのコンジュゲーションの数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｊ＝２である。一部の実施形態では、ｊ＝３である。他の実施形態では、ｊ＝４である。
【０２４０】
負荷レベル
一般に、コンジュゲートに負荷される薬物（または検出可能な標識）の数は、該薬物の分子量に依存し、コンジュゲートの枠組構造の分子量および／または化学的活性化（すなわち、懸垂基を枠組構造に付加した場合）のレベルを調整することにより制御され得る。種々の実施形態において、薬物負荷レベルは、コンジュゲート（すなわち、該薬物を含む）に対して薬物が５〜９９％ｗ／ｗの範囲であり得る。種々の実施形態において、５０〜９９％のより狭い範囲内（例えば、８０〜９９％の範囲）の負荷レベルが使用され得る。
【０２４１】
コンジュゲートの調製のための中間体
一態様において、本発明は、本開示のコンジュゲートを調製するための試薬を提供する。したがって、種々の実施形態において、一般式（Ｉ）：（式中、―Ａ―、Ｔ、Ｄ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
Ｂは、−Ｔ−ＬＢ’であり；
ＬＢ’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である）
の化合物が提供される。
【０２４２】
他の実施形態では、一般式（Ｉ）：（式中、―Ａ―、Ｔ、Ｂ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
Ｄは、−Ｔ−ＬＤ’であり；
ＬＤ’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である）
の化合物が提供される。
【０２４３】
コンジュゲートの調製方法
本実施例に記載のように、本発明者らは、例示的な薬物としてインスリン、ならびに例示的な親和性リガンドとしてアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）、および／またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を使用し、前記コンジュゲートの調製方法の例を示した。限定されないが、２つの親和性リガンドと１つの薬物分子を有し、すべての枠組構造の構成要素間の距離が短いコンジュゲートは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、ｔｒｉｓ−スクシンイミジル−１，３，５−ベンゼントリカルボキシレート（ＴＳＢ）、およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−４−酪酸−ＮＨＳ−エステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ４）をコンジュゲート枠組構造として用いて調製され得る。枠組構造の構成要素間にさらなる間隔が所望される場合は、スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−Ｃ６）、スクシンイミジル（６−アミノ（ＰＥＯ−６））アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６）、ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−６−アミノカプロン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ６）、およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−１０−アミノデカン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ１０）が使用され得る。ＴＳＡＴ−Ｃ６スペーサーアームの化学的性質はＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６と比べ、該コンジュゲートに対して、より疎水性の性質を付与する。
【０２４４】
例えば、例示の目的で、一実施形態において、親和性リガンド（例えば、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＭＢおよびＡＥＴＭ）とインスリンの両方を、ＴＳＡＴ−Ｃ６枠組構造に対して、末端活性化型エステルを介して反応させると、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＧ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭＢ−２、およびインスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２  コンジュゲートが得られ得る。本実施例に論考しているように、種々の親和性リガンドを事前に合成する。また、インスリンのＡ１およびＢ２９アミノ基は、本実施例に記載のようにして、各インスリンがＰｈｅ−Ｂ１  α−アミノ基でのみ反応し得るようにＢＯＣ−保護する。ほぼ１当量のＢＯＣ−インスリンを、４０〜５０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液として、室温で、過剰のトリエチルアミンを含有する５０ｍｇ／ｍｌのＴＳＡＴ−Ｃ６のＤＭＳＯ溶液に添加し、ほぼ１時間反応させる。次に、過剰のＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよび／またはＡＥＴＭ（２〜１０当量）を１００ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液として添加し、さらに２時間反応させる。反応後、このＤＭＳＯ溶液をｐＨ５の生理食塩水緩衝液中で１０倍に超希釈した後、ｐＨを８．０に調整し、溶液をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通して低分子量反応体および塩類を除去する。ボイド画分中に溶出された物質を、３Ｋ限外濾過装置を用いて濃縮した後、これを、分取規模の逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ８，０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリル／水移動相）にインジェクションし、所望の生成物を未反応ＢＯＣ２−インスリンから精製する。所望の溶出ピークを収集し、プールし、回転濃縮してアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得る。最後に、この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍超希釈することにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、この物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通して、アニソール、ＢＯＣ、および他の混入塩を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４℃で保存する。
【０２４５】
この例示的な手順を使用し、ＴＳＡＴ−Ｃ６枠組構造を異なる枠組構造（後述）で置き換えることにより、親和性リガンドと薬物が異なる、コンジュゲーション化学反応が異なる、枠組構造の構成要素間の間隔が異なる、および／または結合価が異なる他のコンジュゲートが作製され得ることは認識されよう。
【０２４６】
例えば、枠組構造の構成要素間にさらなる距離が必要とされる場合、および／またはコンジュゲーション部位に保存電荷が必要とされる場合は、適切なサイズのアミン含有ジエチルアセタール（例えば、アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（ＡＰＤＡ）またはアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ））を、本明細書に記載の該枠組構造上の反応性基の１つにコンジュゲートさせた後、残りの反応性基と対象の親和性リガンド（例えば、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、またはＡＥＴＭ）との反応を完了させてもよい。次いで、酸性条件下で該ジエチルアセタールから反応性アルデヒド基を顕在化させた後、インスリンとの還元的アミノ化を行なうと、薬物コンジュゲーション工程が完了し得、次いで、ＡＢＤＡ−ＴＳＡＴ、ＡＢＤＡ−ＬＣＴＳＡＴなどが使用され得る。
【０２４７】
また別の例では、テトラキス−（Ｎ−スクシンイミジルカルボキシプロピル）ペンタエリトリトール（ＴＳＰＥ）を使用し、多価性の増大のために３つの親和性リガンドと１つ薬物分子が結合され得る。また、上記のいずれかの教示を用いて、さらに高次の結合価を有する超分岐（例えば、デンドリマー様）コンジュゲートが作製され得ることは当業者に認識されよう。例えば、ＲｏｅｃｋｅｎｄｏｒｆおよびＬｉｎｄｈｏｒｓｔにより、Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２１７：２０２−２３８，２００１に、超分岐構造を作製するための現行アプローチの包括的な概説が示されている。
【０２４８】
さらに、既に所定の多価性度合を含むリガンドを、上記の手順に従って再度反応させ、さらに高次のリガンド多重性を得てもよい。例えば、反応性末端アミンを含む二価のＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、またはＡＥＴＭ−２分子は、２つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製され得る。反応性末端アミンを含む三価のＡＥＭ−３、ＡＥＢＭ−３、またはＡＥＴＭ−３分子は、３つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製され得る。ＮＨ２−二価糖類を上記のものと同じ枠組構造と反応させると、薬物分子１つあたり４〜６個のリガンドを有する薬物コンジュゲートが得られ得る。ＮＨ２−三価糖類を上記のものと同じ枠組構造と反応させると、薬物分子１つあたり６〜９個のリガンドを有する薬物コンジュゲートが得られ得る。
【０２４９】
すべての場合において、異なるリガンドの混合物は同じ薬物に、多価枠組構造の化学的性質、結合価、およびリガンド：該枠組構造の化学量論性を調整することにより該枠組構造を介してコンジュゲートされ得ることを認識されたい。例えば、インスリン−ＡＥＭ−１−ＡＥＢＭ−１、インスリン−ＡＥＢＭ−１−ＡＥＴＭ−１、インスリンＡＥＭ−２−ＡＥＴＭ−２、およびインスリンＡＥＭ−１−ＡＥＴＭ−２はすべて、この混合型リガンド法に従って合成され得る。
【０２５０】
最後に、一部の場合では、親和性リガンドを枠組構造に、薬物とは異なる手段によってコンジュゲートさせることが望ましい場合があり得る。例えば、二価マレイミド／活性（ａｃｔｉｖａｔｅ）一価エステル官能化枠組構造（例えば、スクシンイミジル−３，５−ジマレイミドフェニルベンゾエート（ＳＤＭＢ））は、２つのスルフヒドリル官能化親和性リガンドと、１つのアミン官能化薬物を個別の工程でコンジュゲートさせるために使用され得る。例えば、インスリンまたは別のアミン含有薬物が枠組構造の活性化型エステル部分に、本明細書に記載の方法を用いてコンジュゲートされ得る。別工程で、アミノエチル糖類（ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）を、４−イミノチオランを用いた反応によって、末端スルフヒドリル含有リガンドに変換させてもよい。最後に、枠組構造−ジ−マレイミド−インスリンコンジュゲートを、過剰のスルフヒドリル官能化糖類と混合すると、二価糖類−インスリンコンジュゲートの生成がもたらされ得る。
【０２５１】
多価架橋剤
一部の特定の実施形態では、本開示のコンジュゲートを多価架橋剤と合わせ、架橋物質体が形成され得る。以下のセクションに、使用され得る例示的な架橋剤を記載する。
【０２５２】
より詳細に以下に論考し、図２８に図示するように、架橋物質体１０は、標的分子（例えば、グルコース）に応答してコンジュゲート２０を制御可能に放出し得るものである。該物質体は、コンジュゲート２０を、コンジュゲート２０の親和性リガンド４０に非共有結合で結合し、それによりコンジュゲート２０を架橋して架橋物質体１０を形成する多価架橋剤３０と合わせることにより調製される。多価架橋剤３０と親和性リガンド４０間の非共有結合は、過剰量の標的分子（例えば、グルコース）の存在下で競合的に解離される。
【０２５３】
１．ポリペプチド架橋剤
種々の実施形態において、多価架橋剤はポリペプチドを含むものであり得る。より詳細に以下に論考するように、適当な多価ポリペプチドは天然に存在するもの（例えば、種々のレクチン）であるが、多数の一価の結合性タンパク質、例えば、一価のレクチン、ペプチドアプタマー、抗体、細胞膜受容体などを連結することにより構築することもできる。さらに他の多価ポリペプチドは、このようなタンパク質の結合性断片を化学的に連結することにより構築されたものであり得る。
【０２５４】
さまざまな一価および多価リガンド結合タンパク質が市販されており（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）、いくつかのレクチン、葉酸結合タンパク質、サイロキシン結合グロブリン、ラクトフェリンなどが挙げられる。ＤｅＷｏｌｆおよびＢｅｓｔには、リガンド結合タンパク質、例えば、ビオチン結合タンパク質、脂質結合タンパク質／疎水性分子の輸送体、細菌ペリプラズム結合タンパク質、レクチン、血清アルブミン、免疫グロブリン、不活化型酵素、匂い物質結合タンパク質、免疫抑制薬結合タンパク質、ならびにリン酸−および硫酸結合タンパク質の概説が示されている（Ｄｅ  ＷｏｌｆｅおよびＢｅｓｔ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．５２：２０７−２３６、２０００ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。また、さまざまなホルモンの細胞膜受容体も当該技術分野で報告されている。一部の特定の実施形態では、一価または多価の結合タンパク質は、Ｌｏｏｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：１８５−１９０、２００３に記載のように、コンピュータによる合理的設計の後、既存のリガンド結合タンパク質の部位特異的変異誘発によって合成され得る。例示的なタンパク質断片としては、切断型ＭＢＰ（Ｅｄａら、Ｂｉｏｓｃｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２：１３２６−１３３１、１９９８）、切断型コングルチニン（Ｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：４３、１９９６）、切断型ＳＰ−Ｄ（Ｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２３：３９３、１９９７）、および大腸菌のグルコース／ガラクトース結合タンパク質（Ｓａｌｉｎｓら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９４：１９−２６、２００１）が挙げられる。
【０２５５】
ａ．レクチン
一部の特定の実施形態では、一価または多価のレクチンが多価架橋剤に含まれ得る。より詳細に以下に論考するように、一部の特定の実施形態では、レクチンを化学修飾することが好都合な場合があり得る。レクチンは、糖（例えば、グルコース）に応答するように設計された物質体における使用に特に好適である。レクチンは、さまざまな天然供給源、例えば、種子、根、樹皮、真菌、細菌、海草、海綿、軟体類、魚卵、無脊椎動物および下等脊椎動物の体液、ならびに哺乳動物細胞膜から単離されている（例えば、Ｔｈｅ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｌｉｅｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６を参照のこと）。また、いくつかのレクチンが組換え産生されている（例えば、ＳｔｒｅｉｃｈｅｒおよびＳｈａｒｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６３：４７−７７、２００３ならびに米国特許公開公報第２００６０２４７１５４号を参照のこと）。上記のように、レクチンは糖質および多糖類に、高い特異性度合で結合する。例えば、一部のレクチンはマンノース残基またはグルコース残基のみに結合するが、別の一部のものは、ガラクトース残基のみを認識する。一部のレクチンは、特定の残基が末端位置に存在することを要するが、別の一部のものは、多糖鎖内部の残基に結合する。一部のレクチンは特定のアノマー構造を必要とし、また別のものは、特定の糖鎖配列を認識する。レクチンの構造および性質は文献に広く記載されている。最近の概説については、Ｌｅｃｔｉｎｓ、ＳｈａｒｏｎおよびＬｉｓ編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２００３；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ編、Ｗｉｌｅｙ、２０００；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅら編、Ｗｉｌｅｙ、１９９８を参照のこと。例示的なレクチンとしては、カルネキシン、カルレチクリン、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ガレクチン（ガラクトース結合レクチン）、ミエリン関連糖タンパク質、Ｎ−アセチルグルコサミン受容体、セレクチン、シアロアドヘシン、アグリカン、アシアロ糖タンパク質受容体、ＣＤ９４、コレクチン（マンノース結合レクチン）、マンノース受容体、バーシカン、アブリン、リシン、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニンおよびヤマゴボウマイトジェンが挙げられる。種々の実施形態において、植物レクチンのヒト類似体が使用され得る。このようなものとしては、限定されないが、ヒトマンナン結合タンパク質（ＭＢＰ、マンナン結合レクチンとも称される、Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１：７８９−７９４（１９９４）；Ｄｕｍｅｓｔｒｅ−Ｐｅｒａｒｄら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３９：４６５−４７３（２００２））、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ、Ａｌｌｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６７：４５６３−４５６９（１９９９））、ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ、Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５：５７５５−５７６０（１９９０））、ＣＬ−４３（ヒト血清タンパク質）、ならびにコングルチニンが挙げられる。
【０２５６】
ｂ．ペプチドアプタマー
一部の特定の実施形態では、一価のペプチドアプタマーが多価架橋剤に含まれ得る。当該技術分野で周知のように、ペプチドアプタマーは、タンパク質骨格内に融合された可変リガンド結合ペプチドループからなるものである（例えば、Ｈｏｐｐｅ−ＳｅｙｌｅｒおよびＢｕｔｚ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：４２６−４３０，２０００ならびにＣｒａｗｆｏｒｄら、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２：７２−７９，２００３を参照のこと）。この可変ループは、典型的には約１０〜２０個のアミノ酸を含む。さまざまな骨格タンパク質が使用され得る。一般に、挿入部位は、該ペプチドループがなければ、一部の野生型機能を媒介するであろう骨格内の領域が、該ループによって分断されるように選択される（例えば、可変ループが還元性活性部位（野生型タンパク質内の−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループ）内に挿入された細菌タンパク質チオレドキシン−Ａ）。標的分子に対して適当な親和性を有するペプチドアプタマーは、任意の既知の方法を用いて調製および選択され得る。例えば、哺乳動物細胞における発現のための酵母ツーハイブリッドライブラリー、酵母発現ライブラリー、細菌発現ライブラリーおよび／またはレトロウイルスライブラリーが使用され得る。
【０２５７】
種々の実施形態において、ペプチドアプタマーは、アフィニティクロマトグラフィーによって選択され得る。かかる実施形態によれば、ライブラリー内のペプチドアプタマーは標的分子に曝露され、標的に結合しないものは除去される。次いで、結合したペプチドアプタマーを溶出させ、後続の選択ラウンドのためにクローニングする。次いで、このペプチドアプタマーのうちの１種類以上（例えば、第１ラウンドの選択で、標的分子に対して最も高い親和性を有するペプチドアプタマー）から新たなライブラリーを作製し、所望の結合親和性および／または特異性を有するペプチドアプタマーが同定されるように溶出条件のストリンジェンシーを増大または変更する。種々の実施形態において、該選択プロセスは、標的分子に対して高い親和性を有するペプチドアプタマーを選択するために、溶出条件のストリンジェンシーを徐々に増大させる工程を伴うものであり得る。種々の実施形態において、該選択プロセスは、標的分子に対して所望の特異性を有するペプチドアプタマーを選択するために、溶出条件を変更する工程を伴うものであり得る（例えば、異なるアフィニティカラムの使用によって）。種々の実施形態において、該選択プロセスは、各々が標的分子に対して同様の親和性および／または特異性を有するペプチドアプタマーを含む下位ライブラリー（または「プール」）の集合体を作製するものであり得る。種々の実施形態において、該選択プロセスは、単一のペプチドアプタマー配列（または「モノクローナル」）を作製するものであり得る。このようなペプチドアプタマー配列はいずれも、その後の組換え発現のためにクローニングされ得ることは認識されよう。
【０２５８】
ｃ．多価架橋剤の作製
多価架橋剤は、２つ以上の一価の結合性タンパク質を共有結合または非共有結合により連結し、単一の構築物にすることにより作製され得る。典型的には、２つ以上のタンパク質（同じ配列を有するものであっても異なる配列を有するものであってもよい）は、互いに直接連結され得るか（例えば、カップリング剤によって）、または枠組構造を介して間接的に連結され得る。種々の実施形態において、２、３、４、５、６、７もしくは８個またはそれ以上のタンパク質が単一の構築物に結合され得る。種々の実施形態において、２、３、４、５、６、７もしくは８個またはそれ以上のタンパク質は、同じ配列を有するものであり得る。このようなアプローチのいずれか１つにおいて、カップリング前に、タンパク質を化学修飾することが必要な場合があり得る（例えば、反応性懸垂基を含めるため）ことは認識されよう。また、本開示の多価架橋剤は、特定のカップリング反応または枠組構造に限定されない（例えば、該多価架橋剤は、ポリマー構造および／または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製されるものであってもよい）ことも認識されよう。さらに、枠組構造は線状、分岐、樹枝状および／またはこれらの組合せであり得ることが認識されよう。例示的な枠組構造およびカップリング化学反応を、以下に、該コンジュゲートとの関連において記載する。
【０２５９】
種々の実施形態において、一価の結合性タンパク質が互いに、または枠組構造に共有結合される。かかる実施形態において、該タンパク質は、直接連結されていてもよく（すなわち、介在化学基なしで）、またはスペーサー（例えば、該タンパク質同士、または該タンパク質と枠組構造との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖）を介して間接的に連結されていてもよい。以下に、該コンジュゲートとの関連において論考するように、該タンパク質は互いに、または枠組構造に、任意の数の化学結合、例えば限定されないが、アミド、エステル、エーテル、イソ尿素およびイミン結合によって共有結合され得ることは理解されよう。
【０２６０】
種々の実施形態において、２つ以上の一価の結合性タンパク質が互いに、または枠組構造に非共有結合され得る。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数（Ｋｄ）が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、該タンパク質は互いに、または枠組構造に、当該技術分野で周知の非共有結合性のリガンド−受容体ペア（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア）によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が一方のタンパク質に共有結合され、該ペアの他方の構成員が他方のタンパク質または枠組構造に共有結合される。該タンパク質同士（または該タンパク質と枠組構造）を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、該タンパク質が互いに（または枠組構造に）非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド／受容体ペアとしては、タンパク質／補因子および酵素／基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン／アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリン、およびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。他にも適当なリガンド／受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）、さらには、Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｐｐ．１０５−１５２、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」  「Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９０；「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｐａｓｃａｌ  Ｂａｉｌｌｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０００；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎらによる「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２に記載のものなどのエピトープタグとのペアでのモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
【０２６１】
２．ポリヌクレオチド  架橋剤
種々の実施形態において、多価架橋剤はポリヌクレオチドアプタマーを含むものであり得る。ポリヌクレオチドアプタマーは標的分子に結合し、多価である（すなわち、１つより多くの標的分子に結合し得る）。一般に、まず、一価のアプタマーを、その標的分子に対する結合特性に基づいて作製する。当該技術分野で周知のように、さまざまな標的分子に対するアプタマーが、インビトロ選択プロセスによって作製され得る。ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５；ならびに米国特許第５，５８２，９８１号を参照のこと。また、米国特許仮出願第６１／１６２，０９２号（２００９年３月２０日出願）、および対応ＰＣＴ出願（２０１０年１月２７日出願）（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載のグルコース結合ポリヌクレオチドアプタマーも参照のこと。
【０２６２】
典型的には、このプロセスは、プライマーとしての機能を果たす一定の５’末端と３’末端にフランキングされた固定長のランダムに作製したポリヌクレオチド配列からなるライブラリーの合成から始める。一部の特定の実施形態では（例えば、アプタマーを最適化する場合）、標的分子に結合することがわかっている配列から始め、出発配列からの限定的な範囲の変化を示すポリヌクレオチドの集合体（例えば、単一変異のランダムな組）を含むライブラリーを作製してもよい。次いで、ライブラリー内の配列は標的分子に曝露され、標的に結合しないものは除去される（例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって）。次いで、結合した配列を溶出させ、後続の選択ラウンドの準備のために増幅し（例えば、クローニングの後、転写によって、またはＰＣＲによって）、該選択ラウンドでは、所望の結合親和性および／または特異性を有する配列が同定されるように溶出条件のストリンジェンシーを増大または変更する。Ｊａｒｏｓｃｈら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：８６には、該プロセスを、該一定のプライマー領域なしで行なうことが可能な方法が記載されている。
【０２６３】
種々の実施形態において、該選択プロセスは、標的分子に対して高い親和性を有するアプタマーを選択するために、溶出条件のストリンジェンシーを徐々に増大させる工程を伴うものであり得る。
【０２６４】
種々の実施形態において、該選択プロセスは、標的分子に対して所望の特異性を有するアプタマーを選択するために、溶出条件を変更する工程を伴うものであり得る（例えば、異なるアフィニティカラムの使用によって）。
【０２６５】
種々の実施形態において、該選択プロセスは、各々が標的分子に対して同様の親和性および／または特異性を有するアプタマーを含む下位ライブラリー（または「プール」）の集合体を作製するものであり得る。種々の実施形態において、該選択プロセスは、単一のアプタマー配列（または「モノクローナル」）を作製するものであり得る。種々の実施形態において、アプタマーはＤＮＡ系である。種々の実施形態において、アプタマーはＲＮＡ系である。種々の実施形態において、アプタマーは、混合型ＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーである。
【０２６６】
多価のアプタマーは、２つ以上のこのような一価のアプタマーを共有結合または非共有結合により連結し、単一の構築物にすることにより作製され得る。例示的な方法を以下の実施例４に記載する。典型的には、２つ以上のアプタマー（同じ配列を有するものであっても異なる配列を有するものであってもよい）は、互いに直接結合され得るか（例えば、カップリング剤によって）、または独立した枠組構造を介して間接的に連結され得る。種々の実施形態において、２、３、４、５、６、７または８個のアプタマーが単一の構築物に結合され得る。種々の実施形態において、２、３、４、５、６、７または８個のアプタマーは、同じ配列を有するものであり得る。このようなアプローチのいずれか１つにおいて、カップリング前に、アプタマーを化学修飾することが必要な場合があり得る（例えば、反応性懸垂基を含めるため）ことは認識されよう。また、本開示のアプタマーは、特定のカップリング反応または枠組構造に限定されない（例えば、該アプタマーは、ポリマー構造および／または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製されるものであってもよい）ことも認識されよう。さらに、枠組構造は線状、分岐、樹枝状および／またはこれらの組合せであり得ることが認識されよう。例示的な枠組構造およびカップリング化学反応を、以下に、該コンジュゲートとの関連において記載する。
【０２６７】
種々の実施形態において、アプタマーが互いに、または枠組構造に共有結合される。かかる実施形態において、アプタマーは、直接結合されていてもよく（すなわち、介在化学基なしで）、スペーサー（例えば、アプタマー同士、またはアプタマーと枠組構造との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖）を介して間接的に結合されていてもよい。以下に、該コンジュゲートとの関連において論考するように、アプタマーは互いに、または枠組構造に、任意の数の化学結合、例えば限定されないが、アミド、エステル、エーテル、イソ尿素およびイミン結合によって共有結合され得ることは理解されよう。
【０２６８】
種々の実施形態において、２つ以上のアプタマーが互いに、または枠組構造に非共有結合される。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数（Ｋｄ）が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、アプタマーは互いに、または枠組構造に、当該技術分野で周知の非共有結合性のリガンド−受容体ペア（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア）によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が一方のアプタマーに共有結合され、該ペアの他方の構成員が他方のアプタマーまたは枠組構造に共有結合される。アプタマー（またはアプタマーと枠組構造）を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、アプタマーが互いに（または枠組構造に）非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド／受容体ペアとしては、タンパク質／補因子および酵素／基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン／アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリン、およびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。他にも適当なリガンド／受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）、さらには、Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｐｐ．１０５−１５２、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９０；「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｐａｓｃａｌ  Ｂａｉｌｌｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０００；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎらによる「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２に記載のものなどのエピトープタグとのペアでのモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
【０２６９】
３．架橋剤の化学修飾
一般に、前記の任意の多価架橋剤は、例えば、望ましくない性質を軽減するために化学修飾され得ることは理解されよう。
【０２７０】
ｉ．非特異的修飾
ＵＳ２００７−０１１０８１１において、本発明者らは、レクチンのインビボマイトジェン活性を低減するために、これをペグ化する有益性を記載した。したがって、一部の特定の実施形態では、多価架橋剤は、１種類以上の化合物との共有結合により修飾されたものであり得る。限定されないが、これは、活性化型ペグ化（ＰＥＧ）剤（例えば、限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化型ＰＥＧ、ＰＥＧプロピオン酸のスクシンイミジルエステル、ＰＥＧブタン酸のスクシンイミジルエステル、ＰＥＧα−メチルブタノエートのスクシンイミジルエステルなど）、別の水溶性だが非ＰＥＧ含有ポリマー（ポリ（ビニルアルコール）など）、例えばカルボジイミド試薬の使用によってリジンに容易にカップリングされ得る試薬、ペルフルオロ化合物などとの反応を伴うものであり得る。当業者には他の適当な化合物が、例えば、Ｌｕｎｄｂｌａｄによる「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００４にて知得され得る包括的な概説を参照することにより容易に認識されよう。
【０２７１】
一般に、該化合物（１種類または複数種）は多価架橋剤（例えば、マイトジェンレクチン）に、当業者に既知のいくつかの結合方法のいずれかによって（例えば、アミン、カルボキシル、ヒドロキシルまたはスルフヒドリル基によって）結合され得る。考えられ得る共有結合も同様に多様である（例えば、アミド結合、カルバメート結合、エステル結合、チオエーテル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合などが挙げられる）。一部の特定の実施形態では、適当な反応性基が多価架橋剤（例えば、マイトジェンレクチン）に、当該技術分野で周知の部位特異的変異誘発によって適切なアミノ酸を導入することによりグラフトされ得る。例えば、ＰＥＧは、アミノまたはカルボキシル基を介して簡便に結合される。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられる。遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられる。また、システイン残基に見られるスルフヒドリル基も、ＰＥＧ（または他の化合物）を結合させるための反応性基として使用され得る。好ましい実施形態では、ＰＥＧは、アミノ基、特に、リジン残基に見られる遊離アミノ基に共有結合される。
【０２７２】
ＰＥＧをタンパク質に直接結合させるための数多くの方法が、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４、１９９２；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８、１９９８；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載されている。かかる方法の一例では、ＭＰＥＧをトレシルクロリド（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）と反応させることにより作製されるトレシル化モノメトキシポリ（エチレングリコール）（ＭＰＥＧ）が使用される。トレシル化ＭＰＥＧは、レクチン上の露出アミン基と反応する。当業者には、本発明が、任意の特定のペグ化剤（または化合物）に限定されず、当該技術分野で周知の他の適当な化合物を同定することができることは認識されよう。
【０２７３】
一部の特定の実施形態では、ＰＥＧ（または他の化合物）は多価架橋剤に、介在リンカーを介して結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号には、ＰＥＧをタンパク質に連結させるためのウレタンリンカーが開示されている。ＰＥＧはタンパク質にリンカーを介して、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化させたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニル（ｐｅｎｙｌ）カーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体などの化合物との反応によって結合され得る。ＰＥＧをタンパク質に結合させるためのいくつかのさらなるＰＥＧ誘導体および反応化学が、ＷＯ９８／３２４６６および他の特許、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ；Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ；および／またはＥｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｏｆ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪに譲渡されたものに記載されている。このような市販のＰＥＧ供給元から、一連の適当なＰＥＧ化合物および化学反応が記載されたカタログを入手することができる（例えば、Ｎｅｋｔａｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ＣＡＴＡＬＯＧ  ２００４を参照のこと）。
【０２７４】
種々の実施形態において、ポリペプチド系架橋剤のＮ末端α−アミンおよび／またはε−アミノリジン基は、電荷の分布を変更するため、ならびにかかる変更に伴う任意の第３級および第４級効果のために、スクシニル化および／またはアセチル化してもよい。例えば、ポリペプチドは、飽和酢酸ナトリウム緩衝液中での過剰の無水コハク酸との反応によってスクシニル化され得る。アセチル化は、修飾剤として無水酢酸を用いる以外は同じ手順を用いて行なわれ得る。例えば、タンパク質がコンカナバリンＡである場合、アセチル化およびスクシニル化のどちらも、ポリペプチド内の負電荷の密度を増大させるだけでなく、生理学的ｐＨにおいて四量体ではなく二量体としての合成を強いる（例えば、Ａｇｒａｗａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７：４２１１−４２１８、１９６８およびＧｕｎｔｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７０：１０１２−１０１６、１９７３を参照のこと）。また、結果として、得られるこの物質体のインビボ安全性プロフィールが大きく改善される。
【０２７５】
ｉｉ．結合部位の修飾
一部の特定の実施形態では、より特異的で択一的な多価架橋剤の修飾方法を使用することが好都合な場合があり得る。特に、本発明者は、本開示の特定の低分子量コンジュゲートでは、高分子量ＰＥＧ試薬（＞５ｋＤａ）を用いて作製された高度にペグ化されたレクチンと合わせた場合、不溶性の薬物送達系が形成されないことを見出した。これは、本発明者らが以前に、低分子量ＰＥＧ（＜５ｋＤａ）は、レクチンのマイトジェン活性の低減における有効性がずっと低いことを見い出していたため、難題をもたらすものである。なんら特定の理論に限定されることを望まないが、より大きなＰＥＧ基によって、より小さな低結合価コンジュゲートとの結合および網目形成は立体的に妨げられ得るが、大きな高結合価コンジュゲートは妨げられ得ないであろう。このことに鑑み、本発明者らは、レクチン系架橋剤の安全性プロフィールを改善するための択一的な非ＰＥＧ系溶液を考案した。本発明者らは、これを、レクチンの糖類結合部位を特異的に標的化して修飾することにより達成した。例えば、マンノースリガンドを直接コンカナバリンＡの結合部位内に反応させ、未反応物を高い親和性リガンドクロマトグラフィーによって精製することにより、本発明者らは、最良にペグ化されたレクチンのものに匹敵する安全性プロフィールを有する架橋剤を合成することができた。なんら特定の理論に限定されることを望まないが、この機能概念は、細胞表面は規定の糖類親和性、結合価およびリガンド密度を有するが、該コンジュゲートは、これらの特性がすべて設計によって調整されたものであり得るということであると考えられる。したがって、レクチン結合部位内にマンノースを組み込むと、架橋剤が細胞に結合し、それにより該細胞を凝集させるか、または刺激する能力が完全に無効になるが、より高密度の高親和性リガンドの該コンジュゲートへの組込みでは、ゲルの形成が依然として可能である。一部の特定の実施形態では、ペグ化度合が小さく、低ＭＷの個々のＰＥＧ鎖の組込みが、さまざまな極端な保存条件下における溶液中で多価レクチンを安定化させ、新たに設計されたコンジュゲートを補完する製造可能で安全な機能性架橋剤を得るために使用され得る。
【０２７６】
一般に、結合部位修飾レクチンは、レクチン結合部位のうちの１つと会合し得る少なくとも１つの共有結合された親和性リガンドを含む。種々の実施形態において、修飾レクチンは、共有結合された親和性リガンドを１つしか含まないものであり得る。種々の実施形態において、該レクチンは、結合部位１つあたり１つの共有結合された親和性リガンドを含むものであり得る。典型的には、多価レクチンは２つまたは４つの結合部位を含むもの（例えば、一価のレクチンの二量体または四量体）であるが、本開示はまた、３つ、５つまたはそれ以上の結合部位を有するレクチンも包含する。また、本開示は、結合部位１つあたり１つより多くの共有結合された親和性リガンドを有するレクチンも包含する。さらに、本開示は、異なる数の共有結合された親和性リガンドを含むレクチン、および／または未修飾レクチンを含むレクチンの混合物を含む物質体を包含する。
【０２７７】
一旦レクチンに共有結合した該レクチンの結合部位と会合し得る限り、任意の親和性リガンドがこの目的に使用され得る。典型的には、親和性リガンドは認識エレメントを含み、認識エレメントは、一旦結合部位内に結合したら、レクチン結合部位および反応性リンカー（これは、親和性リガンドがレクチンに共有結合されるのを可能にする）と相互作用する。
【０２７８】
認識エレメント
レクチンのコグネートリガンド（例えば、Ｃｏｎ  Ａの場合は、グルコースまたはマンノース）との結合に関して競合し得る任意の認識エレメントが本開示の親和性リガンドに使用され得る。種々の実施形態において、認識エレメントは糖質を含むものである。一部の特定の実施形態では、糖質は天然糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース、キシロースなど）である。一部の特定の実施形態では、糖質は、修飾糖質（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ヘキソースなど）である。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは、グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、これらの誘導体（例えば、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノースなど）および／またはこれらの高次の組合せ（例えば、線状および／または分岐のビマンノース、線状および／または分岐のトリマンノースなど）である。
【０２７９】
他の例示的な糖質は当業者に認識されよう。特に、適用用途に応じて、該コンジュゲートの親和性リガンドとの関連において上記の糖質のいずれか１つ（例えば、式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂの糖質のいずれか１つ）が使用され得ることは理解されよう。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは単糖を含むものである。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは二糖を含むものである。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは三糖を含むものである。一部の実施形態では、認識エレメントは糖質と１つ以上のアミン基を含むものである。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。一部の実施形態では、認識エレメントはアミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。他の実施形態では、認識エレメントはＤ−グルコサミン（ＧＡ）である。
【０２８０】
種々の実施形態において、認識エレメントは、多糖、糖ペプチドまたは糖脂質を含むものである。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは、２〜１０個の糖質部分、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の該部分を含む。多糖、糖ペプチドまたは糖脂質の末端および／または内部残基は、対象のレクチンの糖特異性に基づいて選択され得る（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３１７：５００−５０４、１９７３およびＬｉｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：３５−６７、１９８６を参照のこと）。
【０２８１】
種々の実施形態において、特定のレクチン／グルコースの組合せに対する認識エレメントは、実験に基づいて選択され得る。かかる実施形態によれば、１つ以上の認識エレメントが、グルコースと比較したときのレクチンに対する相対結合親和性に基づいてスクリーニングされる。一部の特定の実施形態では、糖質および／または多糖類のライブラリーが、この様式でスクリーニングされる。適当な認識エレメントは、グルコースとの検出可能なレベルの競合を示すが、レクチンとグルコース間の結合を完全に妨げるほど強くは競合しないものである。一部の特定の実施形態では、異なる認識エレメントが、該当するレクチンの特性に対する種々の親和性リガンドの効果を試験することにより（例えば、凝集を抑止する能力、および／またはその物質セットポイント（以下、および各実施例においてより詳細に論考する）に基づいて）スクリーニングされ得る。一部の特定の実施形態では、認識エレメントは、修飾レクチンと合わされるコンジュゲートを考慮して（例えば、該コンジュゲートが認識エレメントを結合部位から移動させ、それにより、架橋物質体を形成することができるように）選択される。
【０２８２】
反応性リンカー
親和性リガンドは、レクチンに任意の様式で共有結合され得る。ほとんどの方法は、リガンドの認識エレメントをレクチン結合部位と会合させること、次いで、反応性リンカーをレクチンと反応させることを伴う。一部の特定の実施形態では、反応性リンカーは認識エレメントに、認識エレメントの結合特性に実質的に支障がない位置で結合され得る。例えば、認識エレメントが糖質または多糖である場合、リンカーは、末端の糖のＣ１、Ｃ２またはＣ６位に結合され得る。一部の特定の実施形態では、リンカーはＣ１位に結合され得る。Ｃ１位は、アノマー炭素とも称され、リンカーに、αまたはβコンホメーションで連結され得る。一部の特定の実施形態では、リンカーはＣ１位にαアノマーとして結合される。
【０２８３】
一部の特定の実施形態では、光励起性リンカーが使用され得る。例えば、Ｂｅｐｐｕら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８：１０１３−１０１９、１９７５では、紫外光を用いてアリールアジドリンカーを活性化させ、コンカナバリンＡと結合部位内の糖類誘導体間に二重結合を形成させる方法が報告された。スクシニル化コンカナバリンＡを用いたＦｒａｓｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７３：７９０−７９４、１９７６でも同様の結果が記録された。また、リシンおよびＨｏｕｓｔｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：７２０８−７２１２、１９８３に記載のガラクトースの光励起性誘導体を使用し、同様の手順が使用された。また、レクチンに対して糖質および二糖よりも高い親和性を有する複雑な糖ペプチドリガンドの光励起性誘導体が、Ｂａｅｎｚｉｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：４４２１−４４２５、１９８２によって報告されている。このような誘導体は、光励起性基を糖ペプチドリガンドのペプチド部分に共有結合することにより作製された。
【０２８４】
一般に、アリール、プリン、ピリミジン、またはアルキルアジド、ジアゾもしくはジアジリン基、ベンゾフェノン、またはニトロベンゼンなどの任意の光励起性リンカーが使用され得る。潜在的に有用な光励起性リンカーのより包括的な一覧は、Ｆｌｅｍｉｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５１：１２４７９−１２５２０、１９９５ならびにＢｒｕｎｎｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：４８３−５１４、１９９３およびＷｏｎｇ、Ｓ．Ｓ．「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」、（１９９３）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１６８−１９４（これらは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２８５】
種々の実施形態において、光励起性リンカーはジアジリン基を含むものであり得る。紫外（ＵＶ）光でのジアジリン基の光励起により、反応性カルベン中間体が生成されるが、この反応性カルベン中間体は、リンカーの範囲内の任意のアミノ酸側鎖またはペプチド主鎖との付加反応によって二重結合を形成し得るものである。ジアジリンの活性化には、長波長ＵＶ光（約３２０〜３７０ｎｍ、好ましくは約３４５ｎｍ）が典型的に使用される（例えば、Ｓｕｃｈａｎｅｋら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：２６１−２６８，２００５を参照のこと）。
【０２８６】
種々の実施形態において、光励起性リンカーはアリールアジド基を含むものであり得る。アリールアジド基をＵＶ光に曝露すると、ナイトレン基が形成されるが、このナイトレン基は、二重結合との付加反応、Ｃ−Ｈ部位およびＮ−Ｈ部位内への挿入、または後続の環拡大を開始させ、求核試薬として第１級アミンと反応し得るものである。後者の反応経路は、試料中に第１級アミンが存在する場合、優勢となる。限定されないが、置換型アリールアジド（例えば、ヒドロキシまたはニトロ基を有する）では、長波長ＵＶ光（約３２０〜３７０ｎｍ、好ましくは約３６６ｎｍ）が非常に効率的であると考えられるが、非置換のアリールアジドでは、短波長が非常に効率的であると考えられる。好適なＵＶ光源は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから市販されている。
【０２８７】
例えば、種々の実施形態において、親和性リガンドは、一般式：Ｒｅ−Ｌ１のものであり得、式中、Ｒｅは認識エレメントであり、−Ｌ１はリンカーである。一部の特定の実施形態では、Ｒｅは糖質部分である。一部の特定の実施形態では、Ｒｅは、リンカーにＣ１位で共有結合されたグルコースまたはマンノース部分である。
【０２８８】
一部の特定の実施形態では、−Ｌ１は、一般式（ＶＩＩＩａ）：
【化３１】
2012516340.tif 000035
【０２８９】
（式中：
Ｒ３は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＮＯ２、およびハロゲン（例えば、−Ｆまたは−Ｃｌ）からなる群より選択される；
ＸＬは共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されているＣ１−２０炭化水素鎖であり、ここで、ＸＬの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基
で置き換えられており；
Ｒ’は各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分である）
のものであり得る。
【０２９０】
化学可変部が環の結合と交差している結合に結合されて表示されている場合（例えば、上記のＲ３で示している場合）はいずれも、これは、１つ以上のかかる可変部が、該交差している結合を有する環に任意選択で結合されていることを意味する。かかる環上の各Ｒ３基は任意の適当な位置に結合され得、これは、該基が、親環上の水素原子の代わりに結合されていることを意味すると一般的に理解されたい。これは、２つのＲ３基が同じ環内原子に結合され得る可能性を含む。さらに、１つより多くのＲ３基が環上に存在する場合、各々は同じであってもよく、結合されている他のＲ３基と異なっていてもよく、各基は、同じ識別名で表され得る場合であっても、同じ分子の別の箇所に結合され得る他の基とは独立して定義される。
【０２９１】
一部の特定の実施形態では、−Ｎ３基はメタ位である。一部の特定の実施形態では、−Ｎ３基はオルト位である。一部の特定の実施形態では、−Ｎ３基はパラ位である。
【０２９２】
一部の特定の実施形態では、ＸＬの１、２、３、４または５個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている。一部の特定の実施形態では、ＸＬは、Ｃ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４、Ｃ２−１２、Ｃ４−１２、Ｃ６−１２、Ｃ８−１２、またはＣ１０−１２炭化水素鎖で構築されており、ここで、ＸＬの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ０２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている。一部の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、ＸＬの１つ以上のメチレン単位が−Ｏ−で置き換えられている。
【０２９３】
一部の実施形態では、ＸＬは
【化３２】
2012516340.tif 000036
【０２９４】
である。
【０２９５】
一部の実施形態では、ＸＬは
【化３３】
2012516340.tif 000037
【０２９６】
である。
【０２９７】
一部の実施形態では、ＸＬは
【化３４】
2012516340.tif 000038
【０２９８】
である。
【０２９９】
一部の実施形態では、ＸＬは
【化３５】
2012516340.tif 000039
【０３００】
である。
【０３０１】
一部の実施形態では、ＸＬは
【化３６】
2012516340.tif 000040
【０３０２】
である。
【０３０３】
一部の実施形態では、ＸＬは
【化３７】
2012516340.tif 000041
【０３０４】
である。
【０３０５】
一部の特定の実施形態では、−Ｌ１は、一般式（ＶＩＩＩｂ）：
【化３８】
2012516340.tif 000042
【０３０６】
（式中、ＸＬは、式ＶＩＩＩａで上記に定義したとおりであり、
Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは−ＣＦ３である）
のものであり得る。
【０３０７】
一部の特定の実施形態では、非光励起性リンカーが使用され得、例えば、米国特許第５，２３９，０６２号および同第５，３９５，９２４号には、ｐＨまたは温度の変化によって活性化され得るリンカーが記載されている。論考された例示的な反応性リンカーとしては、シアヌル酸（Ｋａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ２１６：５１４−５１５、１９６７）またはジクロロ−Ｓ−トリアジン（２−アミノ−４，６−ジクロロ−Ｓ−トリアジンなど（Ｋａｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９８：２７６−２８５、１９７０））および２，４−ジクロロ−６−メトキシ−Ｓ−トリアジン（Ｌａｎｇら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  １：２１８９−２１９４、１９７７）などの試薬を用いて親和性リガンドに導入され得るものが挙げられる。また、主に末端アミン（リジンに見られるものなど）と反応し得るＮＨＳ−エステルまたはアルデヒドを有する反応性リンカーも使用され得る。
【０３０８】
種々の実施形態において、特定のレクチン／標的分子の組合せに対する反応性リンカーは、実験に基づいて選択され得る。かかる実施形態によれば、同じ認識エレメントと異なるリンカー（例えば、長さが異なるリンカー、反応性基が異なるリンカー、疎水性が異なるリンカーなど）を有するいくつかの親和性リガンドが、該当するレクチンの特性に対する効果に基づいて（例えば、凝集および／または物質セットポイント（以下、および本実施例においてより詳細に論考する）を抑止する能力に基づいて）スクリーニングされる。
【０３０９】
ｉｉｉ．修飾の程度
一般に、各多価架橋剤に結合される化合物の数（すなわち、置換の度合）は、架橋剤の性質、化合物（１種類または複数種）の性質、利用可能な反応部位の数および反応条件によって異なる。例えば、コンカナバリンＡのサブユニットは各々、１２個のリジン残基を含む。その結果、コンカナバリンＡが、リジン残基と反応する化合物でペグ化された場合、各サブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の該化合物に共有結合され得る。逆に、コンカナバリンＡの各サブユニットは、グルコース結合部位を１つだけ含む。したがって、コンカナバリンＡを、該結合部位で反応する化合物と反応させた場合、各サブユニットは、かかる化合物１つだけと共有結合する。置換の度合を測定するための方法は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４、１９９２に論考されている。
【０３１０】
好ましい実施形態では、多価架橋剤の化学修飾は、複数の化合物および複数の反応条件（例えば、試薬濃度、ｐＨ、温度などが異なる）を用いて最適化され得る。好ましい化合物および反応条件は、望ましくない特性（例えば、マイトジェン活性）は非修飾架橋剤と比べて低減されるが、所望の特性（例えば、結合親和性）は実質的に障害されないようなものである。例えば、ロボットによる自動取り扱い装置を使用し、種々の化合物および種々の反応条件を用いて、一連の修飾組成物が調製され得る。常套的なオルトゴナル実験手法を使用すると、当業者は、該被処理組成物の特性をスクリーニングすることができよう。一部の特定の実施形態では、好ましい条件について好ましい化合物および反応条件をさらに精密化するために、さらなる回数のオルトゴナル最適化が行なわれる。
【０３１１】
一実施形態において、至適反応条件は、被処理組成物を電気泳動によって、好ましくは変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離させることにより特定される。種々の実施形態において、均一に修飾された架橋剤を含む組成物が好ましい。このような好ましい組成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、非修飾架橋剤の分子量において弱いバンドを有する。
【０３１２】
４．架橋剤の精製
種々の実施形態において、多価架橋剤は（化学修飾されていようと、そうでなかろうと）、その特性を改善するために、さらに処理を施してもよい。したがって、一部の特定の実施形態では、多価架橋剤を含む組成物は、タンパク質断片、非修飾成分などを除去するために精製され得る。一般に、このような分離は、物理的特性（例えば、電荷；分子量；および／またはサイズ）および／または化学的特性（例えば、標的分子に対する結合親和性）に基づいて行なわれ得る。一部の特定の実施形態では、最適な除去は、このような特性の違いに依存する方法を２つ以上組み合わせることにより行なわれ得る。一実施形態において、このような分離は変性条件下で行なわれる。例えば、非修飾または一部修飾架橋剤は、その正味電荷に基づいてイオン交換クロマトグラフィーによって除去され得る。ゲル濾過クロマトグラフィーを使用すると、差次的に修飾された架橋剤が、サイズに基づいて識別され得る。アフィニティクロマトグラフィーは、非修飾または一部修飾架橋剤を除去するために使用され得る別の方法である。このアプローチは、特定の標的分子に対する修飾架橋剤、一部修飾架橋剤および非修飾架橋剤の結合親和性の違いを利用したものである。
【０３１３】
５．架橋剤の特性評価
種々の実施形態において、多価架橋剤は（化学修飾されていようと、そうでなかろうと）、その特性を確認または特性評価するために、スクリーニングまたはさらなる試験を行なってもよい。代表的なアッセイとしては、親和性アッセイ、凝集アッセイ、Ｔ細胞マイトジェン活性アッセイ、Ｔ細胞バイアビリティアッセイ、抗原性アッセイなどが挙げられる。
【０３１４】
親和性アッセイは、多価架橋剤をアフィニティカラム（例えば、標的分子を伴うレジン）に通すこと、および該架橋剤をカラムから除去するのに必要とされる溶出条件を決定することを伴うものであり得る。また、平衡透析を当該技術分野で周知のとおりに使用することもできる。また、該架橋剤を本開示の１種類以上のコンジュゲートと合わせ、次いで種々の濃度の標的分子と接触させるセットポイントアッセイを使用してもよい。好ましくは、化学修飾された架橋剤の結合親和性は、非修飾架橋剤のものの少なくとも７５％である。より好ましくは該結合親和性は、非修飾架橋剤のものの少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９５％である。
【０３１５】
一部の特定の実施形態では、凝集アッセイを用いて多価架橋剤の最小凝集濃度（ＭＡＣ）が測定され得る。例えば、一部の特定の実施形態では、ＭＡＣは、ＵＳ２００７０１１０８１１に記載されているように、ウサギ赤血球を用いて測定され得る。本発明者らは、化学修飾レクチンの場合、高いＭＡＣ値ほど、低減されたマイトジェン活性と強く相関していることを見い出した。一部の特定の実施形態では、修飾架橋剤は、非修飾架橋剤よりも高いＭＡＣを有するものであり得る。好ましくは、該ＭＡＣは、非修飾架橋剤のものの２５倍である。より好ましくは、該ＭＡＣは、非修飾架橋剤のものの５０倍、さらにより好ましくは１００倍超である。一部の特定の実施形態では、修飾架橋剤は、ホルムアルデヒド安定化ウサギ赤血球の２％ｖ／ｖ懸濁液で、４ｕｇ／ｍｌより大きいＭＡＣを示す。好ましくは、ＭＡＣは６ｕｇ／ｍｌより大きく、より好ましくは１０ｕｇ／ｍｌより大きく、さらにより好ましくは２５ｕｇ／ｍｌより大きい。
【０３１６】
マイトジェン活性アッセイは、典型的には、対象の組成物をＴ細胞培養物（例えば、ＰＢＭＣ細胞）と、ある期間接触させること、次いで、Ｔ細胞増殖レベルを測定することを伴う。細胞増殖を測定するための種々の方法が知られている。一実施形態では、細胞密度が４５０ｎｍで分光測光的に測定され得る。別の実施形態では、５７０ｎｍにおけるＭＴＴの低減を検出することにより、間接測定値が得られ得る（例えば、Ｏｈｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：１９９−２０３、１９９１を参照のこと）。好ましい実施形態では、細胞増殖レベルは、トリチウム標識チミジン取込みアッセイを用いて測定される。当業者には、他の適当な方法も使用され得ること、および本発明は、なんら特定の増殖アッセイに限定されないことが認識されよう。一部の特定の実施形態では、修飾架橋剤のＴ細胞マイトジェン活性は、非修飾架橋剤のＴ細胞マイトジェン活性の５０％未満である。Ｔ細胞マイトジェン活性の低下は、一連の架橋剤濃度（例えば、０．０１、０．１、１、１０、１００および１０００ｕｇ／ｍｌ）全体について相対（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ）チミジン取込みアッセイを行なうことにより評価され得る。好ましい実施形態では、チミジン取込みアッセイは、ほぼ５００，０００個のＰＢＭＣを含む試料で行なわれる。次いで、試験組成物（例えば、修飾組成物）のマイトジェン活性を、最大非修飾マイトジェン活性に対する％で表示する。最大非修飾マイトジェン活性に対する％は、測定した全濃度での試験組成物の最大ＣＰＭ（カウント毎分）値を、測定した全濃度での非修飾組成物の最大ＣＰＭ値で除算することにより得られる。好ましくは、マイトジェン活性の低下を伴う試験組成物は、非修飾組成物よりも少なくとも５０％低いＴ細胞増殖レベルを誘導する。より好ましくは、該レベルは、少なくとも７５％低く、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％または９９％低い。
【０３１７】
Ｔ細胞バイアビリティは、同様の実験を使用し、トリパンブルーをＴ細胞培養物に添加し、該細胞の代表的な試料を計数すること（トリパンを取り込むか、または依然としてトリパンを排除するかのいずれかであるもの、すなわち、青色になったものと、そうでないものに注目すること）により測定され得る。次いで、トリパンを排除した細胞（「青色でない」生細胞）の数を、計数された細胞総数（「青色」の死細胞＋「青色でない」生細胞）で除算することにより、バイアビリティ％を計算する。当業者には、他の適当な方法も使用され得ること、および本発明は、なんら特定のバイアビリティアッセイに限定されないことが認識されよう。一部の特定の実施形態では、修飾架橋剤は、１００ｕｇ／ｍｌで、５００，０００細胞／ｍｌの濃度のＰＢＭＣを用いてアッセイしたとき、１０％より高い細胞バイアビリティパーセントを示す。好ましくは、細胞バイアビリティパーセントは２５％より高く、より好ましくは５０％より高く、さらにより好ましくは９０％より高い。
【０３１８】
架橋物質体
コンジュゲートと架橋剤を標的分子の非存在下で合わせると、非共有結合性架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は、水溶液中で、架橋剤とコンジュゲートの溶液を混合することにより自己集合によって調製され得る。種々の実施形態において、逆乳化によって該物質体の粒子が調製され得る。より詳細に米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９に記載されているように、これは、前記水溶液を、疎水性液と界面活性剤の混合物に添加し、混合物を撹拌することにより行なわれ得る。
【０３１９】
架橋物質体は、形成されたら、さまざまな適用用途に使用され得る。該物質体を遊離標的分子の存在下に入れると、該分子は、架橋剤とコンジュゲート間の相互作用に関して競合する。ある一定濃度より上の遊離標的分子では、競合レベルは、コンジュゲートが表面から放出されることにより、該物質体が分解され始めるようなものになる。種々の実施形態において、放出の程度および／または速度は、標的分子の濃度が増大するにつれて増大する。その結果、コンジュゲートは該物質体から、標的分子の局所濃度に直接関連する様式で放出される。
【０３２０】
一般に、該物質体の放出特性は、架橋剤、コンジュゲート、標的分子の性質および条件（例えば、ｐＨ、温度など）に依存する。架橋剤の親和性が、標的分子に対するよりもコンジュゲートに対する方がずっと大きい場合、該物質体は、高い標的分子濃度でコンジュゲートのみを放出する。コンジュゲートに対する架橋剤の相対親和性が減少するにつれて、該物質体からのコンジュゲートの放出は、より低い標的分子濃度で起こる。また、該物質体の放出特性は、コンジュゲートに対する架橋剤の相対量を変更することにより調整され得る。コンジュゲートに対する架橋剤の比率が高いほど、より高い標的分子濃度でコンジュゲートを放出する物質体がもたらされる。コンジュゲートに対する架橋剤の比率が低いほど、より低い標的分子濃度でコンジュゲートを放出する物質体がもたらされる。適用用途に応じて、このような変更により、多種多様な標的分子濃度に応答する物質体を作製することが可能なことは認識されよう。
【０３２１】
種々の実施形態において、架橋物質体は、３７℃でｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ）に入れたとき不溶性である。種々の実施形態において、標的分子を該緩衝液に、セットポイントと称される閾値濃度まで添加したとき、架橋物質体は実質的に不溶性のままである。セットポイントより上では、架橋物質体は、コンジュゲートの放出の程度および速度の増大を示す。この遷移は、急激に起こることもあり、セットポイント近くの一連の濃度にわたって緩徐に起こり得ることは認識されよう。一般に、所望のセットポイントおよび遷移は、標的分子の性質および該物質体の意図される適用用途に依存する。特に、該物質体を、特定の標的分子のレベルの増大に応答するように設計した場合、所望のセットポイントは、標的分子の通常の生理学的濃度範囲に基づいて決定される。患者内に存在する標的分子の量は、内的および／または外的要因に基づいて変動し得ることは理解されよう。例えば、一部の特定の実施形態では、標的分子の量は、例えば、ホルモン性サイクルまたは代謝経路の変化（耐久事象の際に増大する乳酸など）に応答して経時的に自然に変動し得る。一部の特定の実施形態では、該変動は、外的事象、例えば、食後のグルコースの増大に起因するものであり得る。種々の実施形態において、外的要因は、本開示の物質体からのコンジュゲートの放出を人工的に誘発するために使用され得る。例えば、コンジュゲートの放出がグルコースの増加に感受性である場合、コンジュゲートは、高グルコース飲料の摂取により、短期間で人工的に放出され得る。
【０３２２】
種々の実施形態において、標的分子はグルコースである。ヒトの通常のグルコースの生理学的濃度範囲は６０〜２００ｍｇ／ｄＬである。６０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース濃度を低血糖とみなす。２００ｍｇ／ｄＬより高いグルコース濃度を高血糖とみなす。種々の実施形態において、本開示の物質体は、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７℃でｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、実質的に不溶性のままであり得る。種々の実施形態において、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、溶解する物質体は１、２、４、６、８または１０％未満である。種々の実施形態において、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、本開示の物質体の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％が溶解する。
【０３２３】
以下の表に、他の例示的な標的分子の通常の生理学的範囲を示す。
【表２】
2012516340.tif 000043
【０３２４】
これらおよび他の標的分子に対する所望のセットポイントは、さまざまな異なる適用用途に対して容易に決定され得ることは認識されよう。また、セットポイントは、特定の患者（例えば、患者の性別、患者が異常に低い、もしくは高レベルの標的分子を有することなどに基づいて）または適用用途（例えば、高頻度基準で放出するように設計された薬物送達系は、低頻度で放出するように設計された系よりも低い閾値濃度を必要とし得る）に対して調整する必要があり得ることも認識されよう。
【０３２５】
所望のセットポイントを有する物質体は、本明細書に記載の材料および方法を用いて、常套的な実験手法によって作製され得ることは認識されよう。例えば、同じ架橋剤とコンジュゲートを組み合わせて、コンジュゲートに対する架橋剤の比（ｗ／ｗ）を漸増させた一連の物質体を作製することができる。このような物質体は、ある範囲のセットポイントをカバーする。適当なセットポイントを有するリード物質体が特定されたら、最適化物質体を得るために、より精密な解像を用いて該プロセスを繰り返してもよい。択一的に（または付加的に）、同じコンジュゲートを、該コンジュゲートに対して親和性を漸増させた複数の異なる架橋剤と組み合わせてもよい。これにより、ある範囲のセットポイントを有する複数の物質体が得られ、これを、さらに精密化してもよい（例えば、コンジュゲートに対する架橋剤のｗ／ｗ比を変更することにより）。あるいはまた、同じ架橋剤を複数の異なるコンジュゲートと組み合わせることにより該プロセスを開始してもよい。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、該架橋剤に対して種々の親和性を有するものであり得る（例えば、異なる親和性リガンドを含めた結果として）。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、同じ親和性リガンドを含むが、異なる分子量を有するものであり得る（例えば、コンジュゲート枠組構造が異なる結果として）。
【０３２６】
使用
別の態様では、本開示により、該物質体の使用方法を提供する。一般に、該物質体は、標的分子に応答して該コンジュゲートを制御可能に放出させるために使用され得る。以下に論考するように、該物質体は標的分子と、インビトロで接触させてもよく、インビボで接触させてもよい。
【０３２７】
種々の実施形態において、該物質体は、インビトロまたはインビボ化学センサーの構成要素として使用され得る。この態様を以下に、グルコースセンサーとの関連において説明するが、前述のことから、単に異なる標的分子を使用することで、他の化学センサーが作製され得ることは認識されよう。
【０３２８】
例えば、種々の実施形態において、本開示の物質体は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づいたグルコースセンサーに使用され得る。ＦＲＥＴは、２種類の異なるフルオロフォアが互いに近づくと、これにより、この２種類のフルオロフォア間でのエネルギー転移が可能になり、一方または両方のフルオロフォアの蛍光の減少（蛍光の消光と称される）がもたらされることに基づいている（Ｂａｌｌｅｒｓｔａｄｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３４５：２０３−２１２、１９９７）。グルコースの非存在下では、蛍光標識架橋剤と蛍光標識コンジュゲートの混合物が不溶性の架橋物質体を形成し、近隣のフルオロフォアがＦＲＥＴを受ける。グルコースの存在下では、蛍光標識架橋剤と蛍光標識コンジュゲート間の平均距離が増大して、ＦＲＥＴレベルの減少が引き起こされ、それにより、個々の蛍光シグナルの増大がもたらされる。そのため、蛍光レベルはグルコースレベルと直接相関し得る。
【０３２９】
他の例示的な実施形態では、本開示の物質体は、粘度系グルコースセンサーに使用され得る（例えば、米国特許第６，２６７，００２号；同第６，４７７，８９１号；および同第６，９３８，４６３号を参照のこと）。この場合も、該コンジュゲートと該架橋剤を合わせると架橋物質体が形成される。次に、該物質体にグルコースを添加すると、測定可能な（例えば、円錐平板型構造のマイクロビスコメータ機構を使用し、剪断速度の関数として）粘度の濃度依存的低下が引き起こされる。そのため、試料の粘度は、グルコースレベルと直接相関し得る。これらの２つの例示的なグルコースセンサーは、該コンジュゲート内になんら薬物の存在を必要としないことは認識されよう。また、該粘度系センサーは、該コンジュゲート内に検出可能な標識の存在を必要としないことも認識されよう。
【０３３０】
種々の実施形態において、該物質体は、患者に薬物を制御可能に送達するために使用され得る。本発明は、本開示の物質体を投与することによる疾患または病状の処置を包含する。該物質体は、任意の患者（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、マウスなど）の処置に使用され得るが、ヒトの処置に最も好ましく使用される。該物質体は、患者に任意の経路によって投与され得る。一般に、最も適切な投与経路は、さまざまな要素、例えば、処置対象の疾患または病状の性質、薬物の性質、標的分子の性質、患者の体調などに依存する。一般に、本開示は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、脳室内、経皮、経直腸、膣内、腹腔内、経表面（粉剤、軟膏もしくは滴剤により）、口腔内による投与、または経口もしくは経鼻スプレー剤もしくはエーロゾル剤としての投与を包含する。このような種々の経路のための医薬組成物の製剤化および製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５に記載されている。
【０３３１】
種々の実施形態において、該物質体は、例えば注射によって皮下投与され得る。該物質体を、送達を容易にするための担体に溶解させてもよい。例えば、担体は、水溶液、限定されないが、例えば滅菌水、生理食塩水または緩衝生理食塩水であり得る。一般に、コンジュゲート形態の薬物の治療有効量が投与される。薬物の「治療有効量」により、妥当な便益／リスク比（これには、薬物の有効性と毒性の均衡が関与する）で疾患または病状を処置するのに（例えば、その症状が改善される、進行が遅延される、再発が抑制される、発症が遅延されるなどに）充分な薬物の量を意図する。一般に、治療有効性と毒性は、標準的な薬理学的手順によって、細胞培養物において、または実験動物を用いて、例えば、ＥＤ５０（処置した被検体の５０％において治療上有効である用量）およびＬＤ５０（処置した被検体の５０％に対して致死性の用量）を計算することにより判定され得る。ＥＤ５０／ＬＤ５０は薬物の治療指数を表す。一般に、当該技術分野で周知のように、大きな治療指数を有する薬物が好ましいが、重篤な疾患または病状の場合、特に、択一的な治療選択肢がない場合は、小さい治療指数が許容され得る。ヒトに対する投与のための適切な最終選択用量範囲は、臨床試験の過程で決定される。
【０３３２】
種々の実施形態において、薬物はインスリンであり、インスリンの平均日用量は１０〜２００Ｕ、例えば、２５〜１００Ｕの範囲である（ここで、インスリン１単位は約０．０４ｍｇである）。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量を伴う量の該物質体が、１日単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の５〜１０倍の用量を伴う量の該物質体が、１週間単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の１０〜２０倍の用量を伴う量の該物質体が、隔週単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の２０〜４０倍の用量を伴う量の該物質体が、月単位で投与される。当業者には、この同じアプローチを、用量範囲が既知の承認された他の薬物（例えば、本明細書に記載の承認されたインスリン感受性改善薬およびインスリン分泌促進薬のいずれか）に当てはめてもよいことは認識されよう。
【０３３３】
任意の所与の患者に対する薬物の１日の総使用量は、担当医師によって妥当な医学的判断の範囲内で決定されることは理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量は、さまざまな要素、例えば、処置対象の疾患または病状；使用される具体的な薬物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；使用される具体的な薬物の投与期間、投与経路および排出速度；処置の持続時間；使用される具体的な薬物と併用して、または同時に使用されている薬物；ならびに医学分野で周知の同様の要素に依存する。種々の実施形態において、本開示の物質体は、１回より多くの場合で投与され得る。例えば、本開示は、具体的に、該物質体が患者に皮下注射によって、連続的スケジュール（例えば、１日１回、２日に１回、週１回、２週間に１回、月１回など）で投与される方法を包含する。
【０３３４】
一部の特定の実施形態では、本開示の物質体は、患者（例えば、哺乳動物患者）の高血糖症を処置するために使用され得る。一部の特定の実施形態では、患者は糖尿病である。しかしながら、本発明の方法は糖尿病患者の処置に限定されない。例えば、一部の特定の実施形態では、該物質体は、血糖コントロールの障害に関連する感染を有する患者の高血糖症を処置するために使用され得る。一部の特定の実施形態では、該物質体は糖尿病を処置するために使用され得る。
【０３３５】
種々の実施形態において、本開示の物質体は、少なくとも１種類のさらなる治療薬を受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、該少なくとも１種類のさらなる治療法は、投与される該物質体と同じ疾患または障害の処置を意図するものである。種々の実施形態において、該少なくとも１種類のさらなる治療法は、主薬の副作用の処置を意図するものである。この２種類以上の治療法は、患者が両方の治療法の恩恵を受けている間中、同じ時間枠で投与しても、重複する時間枠で投与しても、重複しない時間枠で投与してもよい。この２種類以上の治療法は、患者が両方の治療薬の恩恵を受けている間中、同じスケジュールで投与しても、異なるスケジュールで投与してもよい。この２種類以上の治療法は、患者が両方の治療薬の恩恵を受けている間中、同じ製剤にて投与しても、異なる製剤にて投与してもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の単独の物質体は、同じ疾患または障害を処置するための薬物を１種類より多く含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、同じ疾患または障害を処置するための異なる薬物を含む本開示の２種類以上の別個の物質体が投与され得る（混合物として、または別々に）。一部の特定の実施形態では、非コンジュゲート型の二次薬物を本開示の物質体に含めてもよい（すなわち、該物質体の成分と単に混合されるだけで、該架橋物質体に共有結合されない薬物）。例えば、一部の特定の実施形態では、このようなアプローチのいずれかを用いて、１種類より多くの抗糖尿病薬が被検体に投与され得る。このアプローチの一部の特定の例示的な実施形態をインスリン関連治療との関連において、より詳細に以下に記載するが、前述のことから、他の治療法のかかる併用アプローチの恩恵を受けることは認識されよう。
【０３３６】
インスリン感受性改善薬（例えば、メトホルミン、グリタゾンなどのビグアニド）は、所与の量のインスリンに対する患者の応答を増大させることにより作用する。したがって、インスリン感受性改善薬を受けている患者に必要とされる、本開示のインスリン系物質体の用量は、該改善薬を受けていない同一の患者よりも少ない。したがって、一部の特定の実施形態では、インスリンコンジュゲートを含む該物質体が、インスリン感受性改善薬での処置も受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、本開示の物質体は、インスリン感受性改善薬の非存在下で必要とされる通常の用量の７５％までで投与され得る。種々の実施形態において、該通常の用量の５０、４０、３０または２０％までが投与され得る。
【０３３７】
インスリン抵抗性は、通常のインスリン量が、正常なインスリン応答をもたらすのに不充分な障害である。例えば、インスリン抵抗性患者には、その抵抗性を克服し、充分なグルコース降下効果をもたらすために、高用量のインスリンが必要とされ得る。このような場合、抵抗性が低い患者において通常、低血糖が誘導され得るインスリン用量では、高度に抵抗性の患者において同等のグルコース降下効果は奏されない。同様に、本開示の物質体は、適当な時間枠で高レベルのインスリン−コンジュゲートが放出される場合、このサブクラスの患者に対してのみ有効である。一部の特定の実施形態では、このサブクラスの患者の処置は、該２つのアプローチを併用することにより助長され得る。したがって、一部の特定の実施形態では、従来のインスリン系治療剤を用いてインスリンのベースラインレベルを得、患者の必要時に、本発明の物質体を投与してインスリン補充の制御をもたらす。したがって、一部の特定の実施形態では、インスリンコンジュゲートを含む物質体が、インスリンでの処置も受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、インスリンは、本開示の物質体の非存在下で必要とされる通常の用量の７５％までで投与され得る。種々の実施形態において、該通常の用量の５０、４０、３０または２０％までが投与され得る。この併用アプローチは、インスリン分泌促進薬（例えば、スルホニル尿素、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４など）および／またはインスリン感受性改善薬（例えば、メトホルミン、グリタゾンなどのビグアニド）を受けているインスリン抵抗性患者でも使用され得ることは認識されよう。
【０３３８】
キット
本明細書に記載の低分子量コンジュゲートの重要な製造上の利点は、このようなコンジュゲートと親和性リガンド修飾レクチンから調製した架橋物質体を開発し、試験して初めて認識された。該コンジュゲートも親和性リガンド修飾レクチンどちらも分子量が小さいため、該物質体は、単一の大容量のゲル網目ではなく、粒子の分散体を形成することがわかった。このことは、高分子量ポリマーとペグ化レクチンを用いて調製された架橋物質体は、負荷してシリンジプランジャーで圧力を加えた場合は、狭いゲージの針の内部を容易に流動するが、狭いゲージ針を有するシリンジ内に吸引され得ないため、重要である。これは、複雑で費用のかかるため大規模生産が容易でないプロセスである、個々のシリンジ内への最終製品の事前充填を行なう必要があることを意味する。他方、該分散体は、大量に製造すること、および無菌条件下で慣用的な複数回使用薬物バイアル内に負荷することができる。また、コンジュゲートあたりの薬物負荷量の大きな増大および該コンジュゲートと親和性リガンド修飾レクチンが最適な網目を形成する比率を考慮すると、このような物質体では、有効負荷薬物量は、高分子量コンジュゲートを用いて調製された物質体と比べて、ほぼ１桁高い。例えば、インスリン負荷量が高いと、あらゆる市販のインスリン製剤で使用されている標準濃度１００Ｕ／ｍｌまでのインスリン当量を含む分散体を調製することが可能である。該分散体は、静かに旋回させることにより、他のインスリン製剤と同様に容易に再懸濁される。また、市販の製剤と同様、この新規な分散体は、任意の有意な圧力を必要とせずに水のように２８Ｇ針から適切な投与容量まで容易に吸引され、注射され得る。静菌剤としてのｍ−クレゾール（現在市販されているすべてのインスリン製剤に使用されている）の組込みにより、能力または安全性プロフィールは変化せず、なんら検出可能な微生物汚染なく１日に複数回で長期間の使用が可能である。したがって、種々の実施形態において、本開示により、架橋物質体の分散体を有するバイアルを１つ以上含むキットが提供される。
【０３３９】
別の態様では、本開示により、コンジュゲートおよび／または架橋剤のライブラリーを提供する。このようなライブラリーは、所望のセットポイントを有する物質体の作製に特に有用であり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、同じ架橋剤で異なるセットポイントをもたらす複数のコンジュゲートを含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、さらに、ライブラリー内でコンジュゲートとともに架橋物質体を形成する１種類以上の架橋剤を含むものであり得る。ライブラリーが１種類より多くのかかるコンジュゲートを含む場合、異なるコンジュゲートは、異なる分子量、コンジュゲート分子１つあたり異なる数の親和性リガンドおよび／または異なる親和性リガンドを有するものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、１種類より多くの型の親和性リガンドを含むコンジュゲートを１つ以上含むものであり得る。
【０３４０】
実施例
Ｉ．例示的コンジュゲートの作製方法
この第１の組の実施例では、例示的コンジュゲートを作製するための種々の方法を記載する。また、この実施例は、出発成分および最終生成物を精製およびアッセイするためのアッセイも含む。これらの方法は、本発明の範囲に含まれる他のコンジュゲートを作製するために変形してもよいことは理解されよう。
【０３４１】
実施例１−アジドエチルグルコース（ＡｚＥＧ）の合成
ａ．ブロモエチル（ｅｔｈｙｌｅ）グルコースの合成
ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ４レジン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を脱イオン水で洗浄して脱色した。２２５ｇのＤ−グルコース（１．２５ｍｏｌ；１当量、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）と１４０ｇのＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ４の混合物を、２．２Ｌの２−ブロモエタノール（３０．５ｍｏｌ、２５当量；１２４．９７ｇ／ｍｏｌ；１．７６２ｇ／ｍＬ；ＢＰ＝１５０℃；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）で処理し、この撹拌混合物を８０℃まで４時間加熱した。反応を、ＴＬＣ（２０％メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によってモニタリングした。約４時間後に反応が終了し、室温まで放冷した。この溶液を濾過してレジンを除去し、レジンを酢酸エチルとＤＣＭとで洗浄した。得られた濾液を回転式エバポレータ内でストリッピングすると、琥珀色の油状物となった。ストリッピング後の合計４００ｇ。
【０３４２】
この琥珀色の油状物をシリカゲル（４ｋｇのシリカ充填ＤＣＭ）で、以下のようにして精製した。粗製物をＤＣＭに溶解させ、カラムに負荷し、次いで、２×４Ｌの１０％メタノール／ＤＣＭ；２×４Ｌの１５％メタノール／ＤＣＭ；および３×４Ｌの２０％メタノール／ＤＣＭを用いて溶出させた。生成物含有画分（ＴＬＣに基づいて）をプールし、ストリッピングして乾固させ、１５２ｇの１−α−ブロモエチル−グルコース（４２％）を得た。
【０３４３】
ｂ．ブロモエチルグルコースのアジドエチルグルコース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱マントル、オーバーヘッドスターラーおよび温度計を取り付けた５Ｌ容の丸底３つ口フラスコに、１５０ｇのブロモエチルグルコース（５２５ｍｍｏｌ）を仕込んだ。この油状物を２Ｌの水に溶解させ、６８．３ｇのアジ化ナトリウム（１．０５ｍｏｌ、２当量；６５ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理した後、７．９ｇのヨウ化ナトリウム（５２．５ｍｍｏｌ、０．０８当量；１４９．８９ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理し、この溶液を５０Ｃまで昇温させ、一晩撹拌した。この溶液を室温まで冷却させ、回転式エバポレータにて濃縮乾固した。固形残渣を、３×５００ｍＬの５：１（容量比）ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨを用いて４０℃で温浸させた。合わせた有機部分を濾過し、蒸発乾固させ、アジドエチルグルコース（８６ｇ）をオフホワイト色固形物として得た。ＴＬＣ（２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；Ｈ２ＳＯ４を含む炭化物）：単一スポット、出発材料と識別不能。
【０３４４】
ｃ．アジドエチルグルコースの再精製
３２ｇのアジドエチルグルコースを１００ｍＬの水中に入れた。混濁した溶液を、ガラスマイクロファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂ）に通して濾過した。金色の濾液を回転式エバポレータにてエバポレートすると固形物になった。この固形物をメタノール（１００ｍＬ）中に入れ、混濁した溶液を、再度、ガラスマイクロファイバーフィルターに通して濾過した。得られた薄黄色の濾液を固形物になるまで真空下でストリッピングした。
【０３４５】
この固形物を最小限のメタノール（５０ｍＬ）中に入れ、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を、撹拌下でゆっくり添加した。重質スラリーを冷却させ、濾過した。この固形物を風乾させ（吸湿性）、６０℃の炉内に一晩入れた。ＴＬＣでは、起源物質はほとんどない。収量１５．４ｇ。母液を真空下でエバポレートすると、黄色のゴム状物となった。この時点で、この物質をさらに精製する試みは行なわなかった。
【０３４６】
実施例２−アジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）の合成
ａ．ブロモエチルマンノースの合成
ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ４レジン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を脱イオン水で洗浄して脱色する。２２５ｇのＤ−マンノース（１．２５ｍｏｌ；１当量、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）と１４０ｇのＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ４の混合物を、２．２Ｌの２−ブロモエタノール（３０．５ｍｏｌ，２５当量；１２４．９７ｇ／ｍｏｌ；１．７６２ｇ／ｍＬ；ＢＰ＝１５０℃；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）で処理し、この撹拌混合物を８０℃まで４時間加熱する。反応を、ＴＬＣ（２０％メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によってモニタリングする。約４時間後に反応が終了し、次いで、室温まで放冷する。この溶液を濾過してレジンを除去し、レジンを酢酸エチルとＤＣＭとで洗浄する。得られた濾液を回転式エバポレータ内でストリッピングすると、琥珀色の油状物となる。
【０３４７】
この琥珀色の油状物をシリカゲル（４ｋｇのシリカ充填ＤＣＭ）で、以下のようにして精製する。粗製物をＤＣＭに溶解させ、カラムに負荷し、次いで、２×４Ｌの１０％メタノール／ＤＣＭ；２×４Ｌの１５％メタノール／ＤＣＭ；および３×４Ｌの２０％メタノール／ＤＣＭを用いて溶出させる。生成物含有画分（ＴＬＣに基づいて）をプールし、ストリッピングして乾固させ、１５２ｇの１−α−ブロモエチル−グルコース（４２％）を得る。
【０３４８】
ｂ．ブロモエチルマンノースのアジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱マントル、オーバーヘッドスターラーおよび温度計を取り付けた５Ｌ容の丸底３つ口フラスコに、１５０ｇのブロモエチルマンノース（５２５ｍｍｏｌ）を仕込む。この油状物を２Ｌの水に溶解させ、６８．３ｇのアジ化ナトリウム（１．０５ｍｏｌ、２当量；６５ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理した後、７．９ｇのヨウ化ナトリウム（５２．５ｍｍｏｌ、０．０８当量；１４９．８９ｇ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理し、この溶液を５０Ｃまで昇温させ、一晩撹拌する。この溶液を室温まで冷却させ、回転式エバポレータにて濃縮乾固する。固形残渣を、３×５００ｍＬの５：１（容量比）ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨを用いて４０℃で温浸させる。合わせた有機部分を濾過し、蒸発乾固させ、アジドエチルマンノースをオフホワイト色として得る。
【０３４９】
ｃ．アジドエチルマンノースの再精製
３２ｇのアジドエチルグルコースを１００ｍＬの水中に入れる。混濁した溶液を、ガラスマイクロファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂ）に通して濾過する。濾液を回転式エバポレータにてエバポレートすると固形物になる。この固形物をメタノール（１００ｍＬ）中に入れ、混濁した溶液を、再度、ガラスマイクロファイバーフィルターに通して濾過する。得られた薄黄色の濾液を真空下でストリッピングすると固形物になる。
【０３５０】
この固形物を最小限のメタノール（５０ｍＬ）中に入れ、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を、撹拌下でゆっくり添加する。重質スラリーを冷却させ、濾過する。この固形物を風乾させ（吸湿性）、６０℃の炉内に一晩入れる。母液を真空下でエバポレートすると、黄色のゴム状物となる。
【０３５１】
実施例３−アジドエチルマンノビオース（ＡｚＥＢＭ）の合成
実施例２のＡｚＥＭ化合物を、ベンゼンジメチルエーテルを用いて選択的に保護し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、続いて臭化ベンジルと反応させ、１−α−（２−アジドエチル）−４，６−ベンズアルデヒドジアセタール−３−ベンジル−マンノピラノシドを得る。続いて、厳格な無水条件下でのトリフレート銀化学反応を用いて、この生成物を１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイルマンノピラノシドでグリコシル化し、保護型アジドエチルマンノビオース生成物を得る。次いで、この中間生成物を脱保護してベンゾイル基を除去し、ＡｚＥＢＭを得る。
【０３５２】
実施例４−アジドエチルマンノトリオース（ＡｚＥＴＭ）の合成
ａ．１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイル−マンノース
撹拌バーと窒素供給口を含む５００ｍＬ容３つ口フラスコに、４０ｇ（６０．９ｍｍｏｌのペンタベンゾイルマンノースと８０ｍＬの塩化メチレンを添加した。得られた溶液を氷浴中で＜５Ｃまで冷却させ、８０ｍＬの３３％ＨＢｒ−酢酸溶液を、滴下漏斗から、反応温度が＜１０℃に維持されるような速度で添加した。添加が終了したら（約３０分間）、氷浴を除き、撹拌を３時間継続した。
【０３５３】
反応液を等容量（１６０ｍＬ）のＤＣＭで希釈し、水（２×５００ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍＬ）で逐次抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒をエバポレートし、４１ｇの固形泡状物を得（理論収量４０．１ｇ）、Ｎ２下で冷凍庫内に保存した。この物質は、さらに精製せずに使用した。反応を、ＴＬＣ：シリカゲル（ヘキサン／酢酸エチル、７／３）によってモニタリングした。出発材料のＲｆ  ０．６５、生成物のＲｆ  ０．８  ＵＶ可視化。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ８．１１（ｄ，２Ｈ）、８．０１（ｍ，４Ｈ）、７．８４（ｄ，２Ｈ）、７．５８（ｍ，４Ｈ）、７．４１（ｍ，６Ｈ）７．２８（ｔ，２Ｈ）、６．５８（ｓ，１Ｈ）、６．２８（ｍ，２Ｈ）、５．８（ｍ，１Ｈ）、４．７５（ｄｄ，１Ｈ）４．６８（ｄｄ，１Ｈ）４．５（ｄｄ，１Ｈ）。
【０３５４】
ｂ．１−アジドエチル−２，４−ジベンゾイルマンノース
撹拌バー、窒素供給口および３００ｍＬの無水アセトニトリルを含む１．０Ｌ容３つ口フラスコに、２５ｇの１−アジドエチルマンノース（１００．４ｍｍｏｌ）と、５０ｍＬのオルト安息香酸トリエチル（２２０ｍｍｏｌ、２．２当量）を添加した。得られたスラリーを室温で撹拌し、０．８ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を未希釈で添加した。溶液は１０分以内に透明になり、撹拌をさらに２時間継続し、次いで、２５ｍＬの１０％ＴＦＡ水溶液を添加し、撹拌をさらに２時間継続して中間体をエステル異性体に加水分解させた。溶媒を真空下でエバポレートすると粘性油状物となり、これを、５０ｍＬのＤＣＭを用いて摩砕し、再度エバポレートすると粘性油状物となった。トルエン（７０ｍＬ）を残渣に添加し、その粘性溶液に２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースをシード添加した。１５分以内に微細な沈殿物が形成され、撹拌を室温で一晩継続した。得られた重質懸濁液を、冷凍庫内に２〜４時間置き、次いで濾過し、固形物を氷冷トルエンで洗浄した（２×１０ｍＬ）。この固形物を、重量が一定になるまで風乾させ、２１ｇ（５０％異性体純度でＴＹ  ２２．８５ｇ）の約９５％異性体純度を得た。生成物を４０ｍＬのトルエンに入れ、１時間撹拌し、次いで、さらに２時間、冷凍庫内に置いた。この固形物を濾過し、氷冷トルエンで洗浄し（２×１０ｍＬ）、重量が一定になるまで風乾させ、１８．５ｇの単独異性体生成物２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースを８３％の収率で得た。母液には所望でない異性体と少量の所望の異性体が含まれていた。反応は、ＴＬＣ：ＳＧによってモニタリングした。（ヘキサン／酢酸エチル  ７／３）出発材料のＲｆ  ０．０、オルトエステル中間体のＲｆ  ０．９。（ヘキサン／酢酸エチル：８／２）ＳＭのＲｆ  ０．８、所望の異性体のＲｆ  ０．４、所望でない異性体のＲｆ  ０．２
１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ  ８．１２（ｔ，４Ｈ）、７．６６（ｔ，２Ｈ）、７．５（ｍ，４Ｈ）、５．５６（ｔ，１Ｈ）、５．４８（ｍ，１Ｈ）、５．１４（ｍ，１Ｈ）、４．５（ｄｄ，１Ｈ）、４．０（ｍ，２Ｈ）、３．８（ｍ，３Ｈ）、３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）。
【０３５５】
ｃ．過ベンゾイル化マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
撹拌バー、窒素供給口を備えた１．０Ｌ容の３つ口フラスコに、４１ｇの粗製１−ブロモ−テトラベンゾル（ｂｅｎｚｏｙ）マンノース（６０．９ｍｍｏｌ、約２．５当量）（１８５ｍＬのＤＣＭ中）を添加した。これに、１１．２ｇの２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノース（２４．５ｍｍｏｌ）を添加した後、１１．２ｇの４Ａシーブスを添加した。スラリーを室温で１０分間撹拌し、メタノール／氷浴中で−１５℃まで冷却させた。
【０３５６】
別の暗色槽内に、暗所にて、１９０ｍＬのトルエンを添加した後、１５．１ｇのトリフルオロ（ｆｌｌｕｏｒｏ）メタンスルホン酸銀（ＡｇＯＴｆ）（５８．８ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加し、撹拌して溶液にした。この溶液を大型滴下漏斗に移し、反応を光から保護しながら撹拌懸濁液に滴下した。ＡｇＯＴｆの添加速度を調整することにより、反応温度を＜−１０℃に維持した。添加が終了したら（約３０分間）、冷浴を除き、ＴＬＣにより残留する生成物が１種類になるまで、反応液をさらに２時間撹拌した（ＳＧ，ヘキサン／酢酸エチル：７／３、ブロモのＲｆ  ０．９、アジドのＲｆ  ０．４、トリオース生成物のＲｆ  ０．５，ｕｖ可視化）。
【０３５７】
トリエチルアミン（７ｍＬ、５．０当量）を添加した後、２００ｍＬのＤＣＭを添加した。得られたスラリーをシリカゲルパッドおよびセライトに通して濾過し、２×７５ｍＬのＤＣＭで洗浄した。溶媒を真空下でエバポレートし、残渣を酢酸エチルに入れ、水（２×１００ｍＬ）、重炭酸塩溶液（ｂｉｃａｒｂ）（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×７５ｍＬ）で逐次洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下でエバポレートし、３９ｇの固形泡状物を得た（ＴＹ  ３９．５ｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ  ８．３（ｄ，２Ｈ）、８．２（ｍ，８Ｈ）、７．８５（ｄ，４Ｈ）、７．７５（ｄｄ，４Ｈ）、７．３−７．６５（ｍ，３０Ｈ）、７．２（ｔ，２Ｈ）、６．０５（ｍ，４Ｈ）、５．９（ｔ，２Ｈ）、５．６３（ｍ，２Ｈ）、５．３８（ｓ，２Ｈ）、５．１８（ｄ，１Ｈ）、４．６５（ｍ，４Ｈ）、４．５（ｍ，２Ｈ）、４．３５（ｍ，４Ｈ）、３，８（ｍ，２Ｈ）、３．５４（ｍ，２Ｈ）。
【０３５８】
ｄ．マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
３．０ｇの過ベンゾイル化−マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド（１．８６ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍＬ）撹拌懸濁液に、０．２ｍＬの４．２８Ｍナトリウムメトキシド（メタノール中）を添加した。得られた懸濁液を室温で２０時間撹拌すると、透明な溶液が得られた。反応の終了はＴＬＣによってモニタリングした（ＳＧ、ヘキサン／酢酸エチル：８／２  ＳＭのＲｆ  ０．４、生成物のＲｆ  ０．０）。
【０３５９】
メタノールを真空下でエバポレートすると、油性の半固形物が得られた。この残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）中に入れ、３時間撹拌した。この固形物を濾過し、新鮮酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、重量が一定になるまで風乾させ、１．０９ｇ（ＴＹ  １．０７ｇ）の生成物を得た。母液には、脱保護副生成物である残留メチルベンゾエートが含まれていた。
【０３６０】
実施例５−アジドエチル−糖類（ＡｚＥＧ、ＡｚＥＭ、ＡｚＥＢＭ、ＡｚＥＴＭ）からのアミノエチル−糖類（ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）の合成
実施例１〜４のアジド末端化合物は、パラジウム／炭素触媒、少量の酢酸、および溶媒としてエタノールを使用することにより、室温で容易に水素化され、対応するアミン末端化合物が得られる。図１０は、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭの化学構造を示す。プロセスは、ＡＥＴＭに関して以下に記載するものと同一であるが、試薬、溶媒などの量を、水素化対象の糖類−リガンドをモル数に応じて増減すべきであることは、当業者に理解されよう。
【０３６１】
ａ．マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アミノエチルマンノピラノシド（「アミノエチルトリマンノース」、ＡＥＴＭ）
５．３ｇ（９．２５ｍｍｏｌ）マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシドの１００ｍＬの水／５０ｍＬのエタノールの溶液に、０．８ｇの５％Ｐｄ／Ｃを添加した。激しく撹拌したこの懸濁液を、３０〜４０ｐｓｉで４８時間、またはＴＬＣで出発材料が見られなくなるまで水素化した（ＳＧ、メタノール、ＳＭのＲｆ  ０．７５，ＰｄｔのＲｆ  ０．０，ＰＭＡ  ｖｉｓ．）。この懸濁液をセライトにて濾過し、これをエタノール（２×５０ｍＬ）ですすぎ洗浄し、濾液を真空濃縮した。
【０３６２】
この物質のＨＰＬＣ（Ｃ１８，３％アセトニトリル／９７％０．１％Ｈ３ＰＯ４、２２０ｎｍ、２ｍｌ／分）では、注入カラムボイド物質のｕｖ吸着、Ｒｔ  ２．５分が得られ、ベンゾエートエステルが示された。
【０３６３】
濾液を７０ｍＬの水と１２ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨで希釈し、この溶液を室温で一晩撹拌した（ＨＰＬＣ：カラムボイドＲｔ  ２．５分におけるｕｖ物質なし、Ｒｔ  １０．５分におけるｕｖ物質は安息香酸とともに共溶出）。２ｇの脱色用活性炭を添加し、撹拌懸濁液を８０℃まで加熱し、室温まで冷却させ、セライトにて濾過した。濾液のｐＨを２Ｎ  ＨＣｌで８．０に調整し、無色の溶液を約５０％容量まで真空濃縮した。
【０３６４】
この溶液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ、５０ｇ）に負荷し、溶出画分が中性ｐＨになるまで（６×７５ｍＬ）水で洗浄し、残留する酸副生成物（あれば）を除去した。アミン生成物をカラムから、０．２５Ｎ水酸化アンモニウム（６×７５ｍＬ）で洗い出し、アミン生成物−ニンヒドリン検出を含む画分を合わせ、２５〜３０ｍＬまで真空濃縮した。この濃縮溶液を３００ｍＬの撹拌エタノールに滴下し、撹拌をさらに２時間継続した。生成物を濾過し、新鮮エタノールで洗浄し（２×５０ｍＬ）、重量が一定になるまで風乾させた。得られた白色の非晶質固形物を、真空炉内で８０Ｃにて５時間さらに乾燥させ、４．１ｇの白色の粒状固形物を得た（ＴＹ  ５．１ｇ）。ＮＭＲでは、芳香族プロトンはなかった。１Ｈ  ＮＭＲ  ３００  ＭＨｚ（Ｄ２Ｏ）δ  ５．０８（ｓ，１Ｈ）、４．８７（ｓ，１Ｈ）、４．８１（ｓ，１Ｈ）、４．８−３．６（ｍ，１８Ｈ）、２．９（ｍ，２Ｈ）。
【０３６５】
実施例６−ジプロパルギル糖類の合成およびＡＥ−リガンドの作製
ａ．マロン酸ジエチルジプロパルギルの合成
マロン酸ジエチル（１２２．５ｇ、０．７６４８ｍｏｌ）を、ナトリウムエトキシド（金属ナトリウムから調製、３８．５ｇ、１．６７ｍｏｌ）を含む無水エタノール（８００ｍｌ）に添加した。３０分後、温度を６０Ｃより下に維持しながら、臭化プロパルギル（２００ｇ、１．６８ｍｏｌ）を撹拌懸濁液にゆっくり添加した。混合物を一晩（１５時間）還流した。沈殿した塩を濾過によって除去し、エタノールで洗浄した。溶媒を真空除去し、残渣を水で希釈し、エタノール（２×２００ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、Ｅｔ２０で洗浄し、溶媒を真空除去すると、金色の油状物が得られた。この油状物を高真空下（４０Ｃ）に３時間置き、放置した。固形物は結晶化し始め、油性固形物が形成された。一晩（１６時間）放置した。シクロヘキサンをフラスコに仕込み、固形物を分解させ、濾過し、シクロヘキサンで洗浄し、白色の結晶性生成物を得た（８１ｇ、４４．８％収率）。反応はＧＣによって追跡した。
【０３６６】
ｂ．マロン酸ジプロパルギルの合成
マロン酸ジエチルジプロパルギル（８０ｇ、０．３３９ｍｏｌ）を、６００ｍｌの１０％アルコール性水酸化カリウム中で一晩（１５時間）還流した。溶媒を真空除去し、残渣を３Ｎ  ＨＣｌで酸性化した。この残渣をＥｔ２Ｏ（２×３００ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、真空濃縮すると油状物になった。高真空下（４０Ｃ）に２時間置き、放置すると、マロン酸ジプロパルギルが油状物として得られた（４６ｇ、７５．４％収率）。反応はＧＣによって追跡した。
【０３６７】
ｃ．酢酸ジプロパルギルの合成
マロン酸ジプロパルギル（２６ｇ、０．４４３ｍｏｌ）を未希釈で１３５Ｃにて、ＣＯ２が発生しなくなるまで加熱した。次いで、これを放冷すると油状物になった。この油状物を０．５ｐｓｉで蒸留した。蒸留フラスコ内の残留油性残渣と固形物を合わせ（１５．７ｇ、７９．９％収率）、そのままで次の工程で使用した。
【０３６８】
ｄ．［２−（３−プロプ−２−イニル−ヘキス−５−イノイルアミノ）−エチル］−カルバミン酸ｔ−ブチルエステルの合成
Ｎ−ｂｏｃ−エチレンジアミン（１８．３ｇ、０．１１４３ｍｏｌ）（５０ｍｌのＣＨ３ＣＮ中）を滴下漏斗から、酢酸ジプロパルギル（１５．５６ｇ、０．１１４３ｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（３６．７４ｇ、０．１１４ｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２９．６ｇ、０．２２９ｍｏｌ）を３００ｍｌのＣＨ３ＣＮ中に含む撹拌溶液に、０Ｃでゆっくり添加した。沈殿が起こった。氷浴を除き、生成物を周囲温度で一晩（１６時間）撹拌した。すると、反応液は完全に均質になった。この溶液を真空濃縮し、残渣を８００ｍｌの水で希釈した。得られた固形物を濾過し、水で充分に洗浄し、真空乾燥させ、１４．３ｇの粗製生成物を得た。ＤＣＭからの再結晶（２×）、濾過およびヘキサンでの洗浄により、生成物を得た（９．８５ｇ、３１％収率、ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）による９８％純度）。
【０３６９】
ｅ．［２−（３−プロプ−２−イニル−ヘキス−５−イノイルアミノ）−エチル］−カルバミン酸ｔ−ブチルエステルへのアジド糖のクリック反応
１，１ジプロパルギル−アセチル−（−１Ｎ，２Ｎ−ＢＯＣ−１，２−ジアミノエチル）アミド（ＤＰ、４１８ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）（ＤＣＭ（２０ｍＬ）中）に、ＴＦＡ（４ｍＬ）を０℃で５分間かけて滴下した。暗色になった溶液を室温で一晩撹拌した。揮発物質を減圧下でエバポレートした。トルエン（２０ｍＬ）を残渣に添加し、減圧下で２回ストリッピングした。得られた暗色油状物を、さらに精製せずに使用した。
【０３７０】
この残渣にＴＨＦ（２０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）を、撹拌しながら、１５分間添加した。硫酸銅（２２５ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加した後、アスコルビン酸ナトリウム（１８０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を５５〜６０Ｃまで６時間加熱し、次いで室温で１８時間撹拌した。この溶液を減圧下で、ほぼ半分の容量になるまでエバポレートし、マイクロファイバーガラスフィルターに通して濾過した。得られた透明な溶液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ−２）上に配置し、これを、中性ｐＨになるまで水で洗浄し（６×７５ｍＬ）、次いで、１０％ＮＨ４ＯＨで洗浄した（８×７５ｍＬ）。ニンヒドリンで陽性染色された画分を合わせ、減圧下でエバポレートすると、ガラス状の固形物になった。このガラス状残渣を水（２５０ｍＬ）中に入れ、０．５ｇの活性炭で処理し、還流加熱した。冷却したスラリーをセライトとマイクロファイバーフィルターにて濾過した。得られた薄黄色の溶液を減圧下でエバポレートするとガラス状の固形物になり、メタノールを添加し、エバポレートし（２×）、オフホワイト色の泡状物を得た（０．９ｇ、ＴＹ  １．０ｇ）。
【０３７１】
実施例７−トリプロパルギル糖類の合成およびＡＥ−リガンドの作製
ａ．２−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（プロパルギルオキシ）メチル］アミノメタン
Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルバミン酸ｔ−ブチル（Ｆｒｏｎｔｒｕｎ  Ｏｒｇａｎｉｘ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；１７７．２６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、ＮａＯＨ（１．１ｍｍｏｌ）を撹拌しながら室温で添加した。この溶液に、２−ブロモアセトアミド−トリス［（プロパルギルオキシ）メチル］アミノメタン（３５６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７３，５６０２、２００８参照）を添加し、撹拌を２０時間継続した（ＴＬＣ  ＳＧ  ８／２  ヘキサン／酢酸エチル、ｐｄｔのＲｆ  ０．４）。溶媒を真空下でエバポレートし、残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）中に入れ、水（２５ｍＬ）、０．５Ｎ  ＮａＯＨ（２５ｍＬ）およびブライン（２５ｍＬ）で連続して洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると油状物になった（３６０ｍｇ、ＴＹ  ４５２．３ｍｇ）。ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３、（ｐｐｍ）：７．０５（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；５．２５（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；４．８５（ｓ，６Ｈ）；３．８５（ｓ，６Ｈ）；３．３（ｍ，２Ｈ）；３．１５（ｓ，２Ｈ）；２．７（ｍ，２Ｈ）；２．４２（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｓ，９Ｈ）。
【０３７２】
ｂ．２−（２−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（トリアゾロ−１−（２−エチルマンノース）４−メトキシ）メチル］アミノメタン
２−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（プロパルギルオキシ）メチル］アミノメタン（１ｇ、２．２１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４０ｍＬ）撹拌溶液に、室温で、ＴＦＡ（４ｍＬ）を滴下した。得られた溶液を一晩撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣をトルエン（１５ｍＬ）中に入れ、蒸発乾固させた。
【０３７３】
この残渣をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）中に入れ、撹拌して溶液にした。アジドエチルマンノース（３．７５当量、２．０ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を添加した後、硫酸銅（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を５５〜６０Ｃ（油浴）で６時間撹拌し、室温まで冷却させ、一晩撹拌した。得られた混合物を２分の１の容量になるまで真空濃縮し、マイクロガラスフィルターに通して濾過した。濾液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗ  ５０ｘ４−１００）に負荷し、中性になるまで水を用いて溶出させた（６×７５ｍＬ）。次いで、カラムを１５％水酸化アンモニウムで溶出させ（１０×７５ｍＬ）、ニンヒドリン陽性画分をプールし、濃縮すると、ガラス状の泡状物になった（１．２９ｇ、ＴＹ（ＭＷ  １０９９ｇ／ｍｏｌ）、２工程で５３％）。
【０３７４】
実施例８−ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンの合成
典型的な合成において、４ｇの粉末化インスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１００ｍｌの無水ＤＭＳＯに室温で溶解させた後、４ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を室温で３０分間撹拌する。次に、１．７９ｍｌ（２．６当量）のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート／ＴＨＦ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をインスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり添加し、ほぼ１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０ｕｌのエタノールアミンを含む４ｍｌのストック溶液を添加した後、５分間混合することによって反応液をクエンチする。クエンチ後、溶液を全部、１６００ｍｌのアセトンに注入し、スパチュラで軽く混合する。次に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液の８×４００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。次いで、この沈殿物を遠心分離し、上清みを第２のビーカー内にデカンテーションし、一方、沈殿物ケークは確保する。上清み液に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液のさらなる８×４００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２の沈殿物を遠心分離し、上清みを廃棄する。２回の沈殿工程の合わせた遠心ケークをアセトンで１回洗浄した後、室温で真空乾燥させて粗製粉末を得る。これは、典型的には、６０％の所望のＢＯＣ２生成物と、４０％のＢＯＣ３物質を含む。
【０３７５】
分取用逆相ＨＰＬＣ法を使用し、純粋なＢ０Ｃ２−インスリンを粗製粉末から単離する。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。粗製粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂの混合物に溶解させ、シリンジ濾過した後、カラムに注入する。精製前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で、７０％Ａ／３０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを用いて平衡化させる。ほぼ５ｍｌの粗製粉末溶液を、１５ｍｌ／分の流速で５分間かけてカラムに注入した後、次の３．５分間では、７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂの線状勾配を使用し、この状態でさらに２．５分間保持する。この方法を使用すると、所望のＢＯＣ２ピークはほぼ１０．６分に溶出され、直後にＢＯＣ３ピークが溶出される。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、純粋なＢＯＣ２−インスリン粉末を得る。具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認し、コンジュゲーション部位は、Ｎ末端配列決定法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって調べる。
【０３７６】
実施例９−ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−ω−アミノ酸−ＮＨＳエステル）アミド枠組構造の合成
１，３，５−ベンゼントリカルボニルクロリド（１ｇ、３．８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（５ｍＬ）溶液を、ω−アミノ酸（３．１当量）の１Ｎ  ＮａＯＨ（２５ｍＬ）の激しく撹拌した溶液に、氷浴中で滴下する。氷浴を除き、撹拌を室温で４時間継続する。２Ｎ  ＨＣｌ（約１５ｍＬ）を、ほぼｐＨ２になるまで滴下し、得られたスラリーをさらに２時間撹拌する。沈殿物を濾過し、冷水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、真空下で風乾させ、次いで、６０℃の炉内で一晩乾燥させる。得られた白色固形物を、さらに精製せずに使用する。各ω−アミノ酸の収量（４−アミノ酪酸：収量１．６ｇ、９１％；６−アミノカプロン酸：収量１．９ｇ、９２％）。
【０３７７】
上記の物質を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．１ｍｍｏｌ、３．１当量）を含むＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に入れ、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ、３．６ｍｍｏｌ、３．６当量）を室温で添加する。得られた溶液を２４時間撹拌し、水（１２５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を水（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させる。溶媒をエバポレートし、半固形残渣をアセトニトリル（１０ｍＬ）を用いて摩砕する。固形物を濾過し、冷溶媒で洗浄し、真空下で風乾させ、次いで、６０℃の炉内で一晩乾燥させる。生成物は、尿素副生成物を含まない。ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−６−アミノカプロン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ６）：３０４ｍｇ、３６％、ｍｐ  １４０〜１４２Ｃ。ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−４−酪酸−ＮＨＳ−エステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ４）：２４５ｍｇ、４５％、ｍｐ  １８２〜１８４Ｃ。
【０３７８】
実施例１０−樹枝状枠組構造の合成
ａ．ニトロ基含有アルキン末端官能化デンドロンの水素化
ｎ＝２、４または８いずれかの末端アルキンとニトロプロピオン酸コアを含有するデンドロンを入手し（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆａｃｔｏｒｙ、Ｓｗｅｄｅｎ）、さらに精製せずに使用する。このデンドロンを、ＤＣＭとエタノールの１００ｍＬの５０：５０（容量比）混合物に溶解させ、０．８ｇの５％Ｐｄ／Ｃを添加する。激しく撹拌した懸濁液を３０〜４０ｐｓｉで４８時間、またはＴＬＣで出発材料が見られなくなるまで水素化する。懸濁液をセライトにて濾過し、これを、エタノールですすぎ洗浄し（２×５０ｍＬ）、濾液を真空濃縮する。
【０３７９】
濾液を、７０ｍＬの水と１２ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨで希釈し、この溶液を室温で一晩撹拌する。２ｇの脱色用活性炭を添加し、撹拌懸濁液を、８０℃まで加熱し、室温まで冷却させ、セライトにて濾過する。濾液のｐＨを２Ｎ  ＨＣｌで８．０に調整し、無色の溶液を約５０％容量まで真空濃縮する。
【０３８０】
この溶液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ、５０ｇ）に負荷し、溶出画分が中性ｐＨになるまで（６×７５ｍＬ）水で洗浄し、残留する酸副生成物（あれば）を除去する。アミン生成物をカラムから、０．２５Ｎ水酸化アンモニウム（６×７５ｍＬ）で洗い出し、アミン生成物（ニンヒドリン検出）を含む画分を合わせ、回転式エバポレータを用いて真空下でエバポレートする。
【０３８１】
ｂ．デンドロン（アミン、アルキン−４）とアジドエチルマンノースとの反応
水素化後に得られたアミノコアと４つの末端アルキン基を含有するこのデンドロン生成物（８．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）に入れ、撹拌して溶液にする。アジドエチルマンノース（４．７５当量、２．５３ｇ、１０．５１ｍｍｏｌ）を添加した後、硫酸銅（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を５５〜６０Ｃ（油浴）で６時間撹拌し、室温まで冷却させ、一晩撹拌する。得られた混合物を２分の１の容量になるまで真空濃縮し、マイクロガラスフィルターに通して濾過する。濾液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗ  ５０ｘ４−１００）に負荷し、中性になるまで水を用いて溶出させる（６×７５ｍＬ）。次いで、カラムを１５％水酸化アンモニウムで溶出させ（１０×７５ｍＬ）、ニンヒドリン陽性画分をプールし、濃縮すると、ガラス状の泡状物になる。
【０３８２】
実施例１１−有機溶媒中での多価活性化エステルとのアミン官能化薬物コンジュゲーション（最初に薬物付加）
Ｎ末端活性化エステルを含む枠組構造を６０ｍＭで、１．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、４００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。次いで、アミン含有薬物を、別途、７．９ｍｌのＤＭＳＯに７．４ｍＭの濃度で溶解させる。溶解したら、薬物溶液を全部、１０分間かけて枠組構造／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液に滴下した後、室温で２時間混合する。次いで、残留した活性化型エステルを、アミン官能化親和性リガンドと以下のようにして反応させる。親和性リガンドの３７０ｍＭ溶液を、適切な容量の乾燥ＤＭＳＯにて調製する。溶解したら、充分な溶液を添加して、初期活性化型エステル基の数Ｎ−１の３倍に等しい、いくつかの反応性当量を得る。例えば、枠組構造１つあたりＮ＝３の初期活性化型エステル基が存在するならば、（３×（３−１）×６０ｍＭ／３７０ｍＭ）＝０．９７３ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する。枠組構造１つあたりＮ＝４の初期活性化型エステル基が存在するならば、（３×（４−１）×６０ｍＭ／３７０ｍＭ）＝１．４６ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する、などである。親和性リガンド溶液を添加した後、この溶液を室温でさらに１時間撹拌し、反応の終了を確実にする。
【０３８３】
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ５．０）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液中で１０倍に超希釈した後、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０にｐＨ調整する。この水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。この溶液を、さらに精製して所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍカラム上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システム（ｓｙｔｅｍ）を用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
【０３８４】
実施例１２−多価糖類とのＢ１−インスリンコンジュゲート−均質なリガンド
実施例１１に記載の方法と、実施例８のアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用し、以下の枠組構造と親和性リガンドを有する薬物コンジュゲートを調製した。Ｔｒｉｓ−スクシンイミジル−１，３，５−ベンゼントリカルボキシレート（ＴＳＢ）、Ｔｒｉｓ−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、Ｔｒｉｓ−スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−Ｃ６）、およびテトラキス−（Ｎ−スクシンイミジルカルボキシプロピル）ペンタエリトリトールＴＳＰＥ活性化型エステル枠組構造は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入し、さらに精製せずに使用した。ＴＳＢ−Ｃ４およびＴＳＢ−Ｃ６枠組構造は、実施例９に従って合成した。ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、およびＡＥＴＭ親和性リガンドは、実施例１〜４に従って合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
【０３８５】
すべての場合において、ＢＯＣ保護基は、実施例１１に従って得られる凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより除去した。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてほぼ５８Ｕインスリン／ｍｌ（Ａ２８０測定に基づく）まで濃縮し、必要時まで４℃で保存した。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認されるように、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。
【表３】
2012516340.tif 000044
【０３８６】
実施例１３−Ｂ１−多価糖類とのインスリンコンジュゲート−混合型リガンド
実施例１１に記載の方法と、実施例８のアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用し、枠組構造に連結された糖類親和性リガンドの混合物を有するインスリンコンジュゲートを調製した。
【０３８７】
ＴＳＡＴ−Ｃ６およびＴＳＰＥ活性化型エステル枠組構造は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入し、さらに精製せずに使用した。ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、およびＡＥＴＭは、実施例１〜４に従って合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
【０３８８】
すべての場合において、ＢＯＣ保護基は、実施例１１に従って得られる凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより除去した。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去した。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４℃で保存した。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認されるように、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。
【表４】
2012516340.tif 000045
【０３８９】
実施例１４−Ｂ１−事前に作製した多価糖類を用いた多価糖類とのインスリンコンジュゲート
実施例１１に記載の方法と、実施例８のアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用し、以下のインスリンコンジュゲートが、事前に合成した多価アミン含有親和性リガンドから調製される。スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）とＴＳＡＴ−Ｃ６活性化型エステル枠組構造をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入し、さらに精製せずに使用する。反応性末端アミンを含有する二価のＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、およびＡＥＴＭ−２分子は、２つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製される。反応性末端アミンを含有する三価のＡＥＭ−３、ＡＥＢＭ−３、およびＡＥＴＭ−３分子は、３つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製される。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
【０３９０】
すべての場合において、実施例１１に従って得られる凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することによりＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４℃で保存する。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認されるように、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。
【表５】
2012516340.tif 000046
【０３９１】
実施例１５−樹枝状枠組構造を用いたＢ１−多価糖類とのインスリンコンジュゲート−均質なリガンド
実施例１０ｂで調製したアミノコアと４個の末端アルキン基を含有する０．１ｇ（０．０９８ｍｍｏｌ）のデンドロンを、１００ｍｇ／ｍｌで無水ＤＭＳＯに溶解させる。この溶液を、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、０．０９８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４００ｕＬ）を含む溶液に滴下し、室温で１時間反応させる。次いで、この混合物を、実施例８のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）（０．５８８ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍｇ／ｍｌ溶液に滴下し、２時間反応させる。
【０３９２】
得られたコンジュゲート水中で超希釈し、ｐＨを８．０に調整する。この溶液を、ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ２を用いて脱塩した後、Ａｍｉｃｏｎ  ３ｋ限外濾過デバイスを用いて濃縮する。得られた溶液を逆相クロマトグラフィーによって精製し、回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させる。この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することによりＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４℃で保存する。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位であり、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認される。
【０３９３】
実施例１６−ＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンの合成
ａ．Ｆｍｏｃ−１−（Ｂ２９）−インスリン
典型的な合成において、４ｇの粉末化インスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１００ｍｌの無水ＤＭＳＯに室温で溶解させた後、４ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を室温で３０分間撹拌する。次に、１．２当量の９−フルオレニルメチルＮ−スクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をゆっくりと、ＴＨＦ中Ｆｍｏｃ−ＮＨＳの１．０Ｍ溶液としてのインスリン−ＴＥＡ溶液に添加する。反応液を、ほぼ１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０ｕｌのエタノールアミンを含む４ｍｌのストック溶液を添加した後、５分間混合することによって、反応液をクエンチする。クエンチ後、溶液を全部、１６００ｍｌのアセトンに注入し、スパチュラで軽く混合する。次に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液の８×４００μｌのアリコートを、混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。次いで、この沈殿物を遠心分離し、上清みを第２のビーカー内にデカンテーションし、一方、沈殿物ケークは確保する。上清み液に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液のさらなる８×４００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２の沈殿物を遠心分離し、上清みを廃棄する。２回の沈殿工程の合わせた遠心ケークをアセトンで１回洗浄した後、室温で真空乾燥させて粗製粉末を得る。これは、典型的には、２０％のＦｍｏｃ１生成物、６５％のＦｍｏｃ２生成物、および１５％の未反応インスリンを含む。
【０３９４】
分取用逆相ＨＰＬＣ法を使用し、純粋な所望のＦｍｏｃ１−インスリンを粗製粉末から単離する。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。粗製粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂの混合物に溶解させ、シリンジ濾過した後、カラムに注入する。精製前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で、７０％Ａ／３０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを用いて平衡化させる。ほぼ５ｍｌの粗製粉末溶液を、１５ｍｌ／分の流速で５分間かけてカラムに注入した後、次の３．５分間では、７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂの線状勾配を使用し、この状態でさらに２．５分間保持する。この方法を使用すると、所望のＦｍｏｃ１ピークは、未反応ＲＨＩピークのほぼ３分後に溶出され、直後にＦｍｏｃ２−インスリンピークが溶出される。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、純粋なＦｍｏｃ１−インスリン粉末を得る。具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認し、コンジュゲーション部位は、Ｎ末端配列決定法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって調べる。
【０３９５】
ｂ．ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ−（Ｂ２９）−インスリン
典型的な合成において、１ｇのＦｍｏｃ１−（Ｂ２９）−インスリンを室温で２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、１ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を室温で３０分間撹拌する。次に、０．３７９ｍｌ（２．２当量）のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート／ＴＨＦ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をインスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり添加し、ほぼ１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０ｕｌのエタノールアミンを含む１ｍｌのストック溶液を添加した後、５分間混合することによって、反応液をクエンチする。クエンチ後、溶液を全部、４００ｍｌのアセトンに注入し、スパチュラで軽く混合する。次に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液の８×１００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。次いで、この沈殿物を遠心分離し、上清みを第２のビーカー内にデカンテーションし、一方、沈殿物ケークは確保する。上清み液に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液のさらなる８×１００μｌのアリコートを混合物の表面上に滴下し、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２の沈殿物を遠心分離し、上清みを廃棄する。２回の沈殿工程の合わせた遠心ケークアセトンで１回洗浄した後、室温で真空乾燥させて粗製粉末を得る。これは、典型的には、９０％より多くの所望のＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１生成物を含む。
【０３９６】
分取用逆相ＨＰＬＣ法を使用し、純粋なＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１−インスリンを粗製粉末から単離する。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。粗製粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂの混合物に溶解させ、シリンジ濾過した後、カラムに注入する。精製前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で、７０％Ａ／３０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを用いて平衡化させる。ほぼ５ｍｌの粗製粉末溶液を、１５ｍｌ／分の流速で５分間かけてカラムに注入した後、次の３．５分間では、７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂの線状勾配を使用し、この状態でさらに２．５分間保持する。この方法を使用すると、所望のＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１ピークは、Ｆｍｏｃ１−インスリン出発材料のほぼ５分後に溶出される。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、純粋なＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ（Ｂ２９）−インスリン粉末を得る。具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認し、コンジュゲーション部位は、Ｎ末端配列決定法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって調べる。
【０３９７】
ｃ．ＮＨ２−（Ｂ２９）−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリン
ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ（Ｂ２９）のＦｍｏｃ保護基は、先の工程に従って得られた凍結乾燥粉末を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％のピペリジンに４Ｃで３０分間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより除去される。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、Ｆｍｏｃ、ＤＭＦ、および他の混入塩（あれば）を除去する。ＮＨ２−（Ｂ２９）−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンは、必要であれば凍結乾燥して粉末にするか、または所望により水溶液に直接使用する。
【０３９８】
実施例１７−ＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンコンジュゲートの合成
実施例８のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いた先の実施例に記載の多価親和性リガンド−薬物コンジュゲートはすべて、代わりに、実施例１６のＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンを用いて調製され得る。得られるコンジュゲートはすべて、同じＭＷおよび置換特性度合を有するが、インスリン分子に対するコンジュゲーション部位は、εＢ２９アミノ基であり、Ｎ末端Ｐｈｅ−Ｂ１ではない。これは、Ｎ末端配列決定法によって確認され得る。
【０３９９】
実施例１８−有機溶媒中での多価活性化エステルとのアミン官能化薬物コンジュゲーション（最後に薬物付加）
この実施例では、薬物を枠組構造に、親和性リガンド（１つまたは複数）の前に付加する、実施例１１に記載の方法の代替法を記載する。この実施例では、親和性リガンド（１つまたは複数）を枠組構造に、薬物の前に付加する。
【０４００】
Ｎ末端活性化型エステルを含む枠組構造を６０ｍＭで、１ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、４００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。並行して、親和性リガンドの１２２ｍＭ溶液を、適切な容量の無水ＤＭＳＯにて調製する。溶解したら、充分な親和性リガンド溶液を１０分間かけて滴下し、枠組構造上の活性化型エステル基の正確な数Ｎ−１に等しい、いくつかの反応性当量を得る。例えば、枠組構造上にＮ＝３の活性化型エステル基が存在するならば、（１×（３−ｌ）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝０．９８ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する。枠組構造上にＮ＝４の活性化型エステル基が存在するならば、（１×（４−１）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝１．５ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する、などである。親和性リガンド溶液を添加した後、この溶液を室温で２時間撹拌する。
【０４０１】
次いで、アミン含有薬物を別途、７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに８．１ｍＭの濃度で溶解させる。溶解したら、薬物溶液を全部、１分間かけて枠組構造／ＤＭＳＯ／親和性リガンド／ＴＥＡ溶液に添加した後、室温でさらに２時間混合し、反応の終了を確実にする。
【０４０２】
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ５．０）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液中で１０倍に超希釈した後、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０にｐＨ調整する。この水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍカラム、１９×１５０ｍｍ上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
【０４０３】
実施例１９−有機溶媒中で非保護インスリンから作製される多価糖類とのＢ２９−インスリンコンジュゲート
この実施例は、非保護インスリンの場合、Ｌｙｓ−Ｂ２９のε−アミノ部分が最も反応性のアミンであり、続いてＡ１、次いでＢ１であることを利用するものである。したがって、非保護インスリンをアミン含有薬物として使用した場合、得られるコンジュゲートは、主に、Ｌｙｓ−Ｂ２９位置が置換されているはずである。実施例１８に記載の方法、およびアミン含有薬物として組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８Ｄａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用し、以下のインスリンコンジュゲートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入したＴＳＡＴ−Ｃ６活性化型エステル枠組構造を用いて調製した。ＡＥＭおよびＡＥＴＭは、先に記載のようにして合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤａであった。
【表６】
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【０４０４】
Ｎ末端配列決定法によれば、ＡＥＭ含有枠組構造のほぼ８５％がインスリンに、Ｌｙｓ−Ｂ２９を介してコンジュゲートされており、ＡＥＴＭ含有枠組構造のほぼ８７％がインスリンに、Ｌｙｓ−Ｂ２９を介してコンジュゲートされていた。
【０４０５】
実施例２０−水性溶媒中での多価活性化エステルとのアミン官能化薬物コンジュゲーション（最後に薬物付加）
この実施例では、反応を有機溶媒中でなく水性溶媒中で行なう、実施例１８に記載の方法の代替法を記載する。
【０４０６】
Ｎ末端活性化型エステルを含む枠組構造を６０ｍＭで、６．２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、２ｍｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。並行して、親和性リガンドの４４８ｍＭ溶液を、適切な容量の無水ＤＭＳＯにて調製する。溶解したら、充分な親和性リガンド溶液を１０分間かけて滴下し、枠組構造上の活性化型エステル基の数Ｎ−１の１．５倍に等しい、いくつかの反応性当量を得る。例えば、枠組構造にＮ＝３の活性化型エステル基が存在するならば、（１．５×（３−ｌ）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝２．５ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する。枠組構造にＮ＝４の活性化型エステル基が存在するならば、（１．５×（４−１）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝３．８ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する、などである。親和性リガンド溶液を添加した後、この溶液を室温で１時間撹拌する。
【０４０７】
次いで、アミン含有薬物を別途、１７．２ｍＭで２．６７ｍｌの０．１Ｍ（ｐＨ１１）の炭酸ナトリウム緩衝液に溶解させ、続いて、１．０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを１０．８に調整する。溶解したら、枠組構造／ＤＭＳＯ／親和性リガンド／ＴＥＡ溶液を全部、７５分間かけて薬物／炭酸緩衝液溶液滴下する。添加中、得られる混合物のｐＨを、５分毎に、必要であれば希ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いて１０．８に調整する。滴下後、この溶液をさらに１５分間撹拌し、反応の終了を確実にする。
【０４０８】
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ５．０）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液中で１０倍に超希釈した後、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０にｐＨ調整する。この水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ４０ｍｌに濃縮する。この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍカラム上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
【０４０９】
実施例２１−水性溶媒中で非保護インスリンから合成されたＢ２９−ＡＥＭ−２−インスリンコンジュゲート
この実施例は、非保護インスリンの場合、Ｌｙｓ−Ｂ２９のε−アミノ部分が最も反応性のアミンであり、続いてＡ１、次いでＢ１であることを利用するものである。したがって、非保護インスリンをアミン含有薬物として使用した場合、得られるコンジュゲートは、主に、Ｌｙｓ−Ｂ２９位置が置換されているはずである。実施例２０に記載の方法、およびアミン含有薬物として組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用し、ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入したＴＳＡＴ−Ｃ６活性化型エステル枠組構造を用いて調製した。インスリン類似体として使用したＡＥＭは、先に記載のようにして合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤであった。最終生成物（ＨＰＬＣにより９５％純粋）は、所望のＭＷ６７２９ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）を有することがわかった。これは、インスリン１分子あたり合計２．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲートされていることを示し、コンジュゲート分子の８５％より多くがＬｙｓ−Ｂ２９部位でコンジュゲートされている（Ｎ末端配列決定法）。
【０４１０】
実施例２２−アルデヒド含有枠組構造との一般的なアミン官能化薬物コンジュゲーション
ａ．１つより多くの親和性リガンドと１つの末端アルデヒドで官能化された枠組構造
まず、Ｎ末端活性化型エステルを含む枠組構造を６０ｍＭで、２７．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、８００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。アミン含有ジエチルアセタールのストック溶液を、５ｍｌの無水ＤＭＳＯ中５８０ｍＭで調製する。溶解したら、２．９ｍｌのジエチルアセタール溶液を、５分間かけて枠組構造／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液に滴下した後、室温でさらに１５分間混合する。次いで、残留した活性化型エステルを、アミン官能化親和性リガンドと以下のようにして反応させる。親和性リガンドの３７０ｍＭ溶液を、適切な容量の乾燥ＤＭＳＯにて調製する。溶解したら、充分な溶液を添加して、初期活性化型エステル基の数Ｎ−１の１．５倍に等しい、いくつかの反応性当量を得る。例えば、枠組構造１つあたりＮ＝３の初期活性化型エステル基が存在するならば、（１．５×（３−ｌ）×６０ｍＭｘ２７／３７０ｍＭ）＝１３ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する。枠組構造１つあたりＮ＝４の初期活性化型エステル基が存在するならば、（１．５×（４−１）×６０ｍＭｘ２７／３７０ｍＭ）＝２０ｍｌの親和性リガンド溶液を添加する、などである。親和性リガンド溶液を添加した後、この溶液を室温でさらに１時間４５分撹拌し、反応の終了を確実にする。反応後、溶液を全部、ジエチルエーテルで１０倍に希釈し、激しく混合し、遠心分離し、所望の物質を含む底部の濃密相を上清みから分離する。上清みを廃棄後、同容量のエタノールを添加すると、固形沈殿塊が生成する。遠心分離および上清みの廃棄後、物質をエタノールとエーテルで充分に洗浄し、次いで真空乾燥させると、多数の親和性リガンドとジエチルアセタール基を含む粗製枠組構造が得られる。
【０４１１】
ｂ．アミン官能化薬物と末端アルデヒドとのコンジュゲーション
乾燥させたら、収集した物質を６０ｍｌのＤＩ水に溶解させ、この溶液のｐＨを１．０に調整することにより、ジエチルアセタールからアルデヒド基を生成させる。この溶液を３０分間混合した後、１．５ＭのＮａＣｌを含む６ｍｌの２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し、希ＮａＯＨ溶液を用いて溶液のｐＨを６．５に調整する。この溶液に４８ｍｍｏｌのアミン含有薬物を添加し、必要であれば、ｐＨを６．５に再調整する。別途、還元剤のストック溶液を、１．５ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む１５ｍｌの２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）の緩衝液に溶解させることにより調製し、ｐＨを、希ＨＣｌ溶液で注意深く６．５に調整する。１３ｍｌのシアノ水素化ホウ素ストック溶液を薬物／枠組構造／アルデヒド溶液に添加し、室温で一晩反応させる。
【０４１２】
得られた水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍカラム、１９×１５０ｍｍ上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
【０４１３】
実施例２３−末端反応性アルデヒド基を含むＡＥＭ−２−枠組構造および後続のＢ１でのインスリンコンジュゲーション
ａ．２つのＡＥＭと１つのアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能化されたＴＳＡＴ
この物質は、実施例２２ａに記載の方法に従い、ＴＳＡＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を多価活性化エステル枠組構造として、および４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をアミン含有ジエチルアセタールとして用いて合成される。先に記載のようにして合成されるＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）を親和性リガンドとして使用した。
【０４１４】
ｂ．ＴＳＡＴ−ＡＥＭ−２−ＡＢＤＡとＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのコンジュゲーション
この物質は、実施例２２ｂに記載の方法を使用し、上記（ａ）で作製したＴＳＡＴ−ＡＥＭ−２−ＡＢＤＡを、実施例８に従って合成したアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）とともに用いて合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、２５ｍＭ  ０．１５０ＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４℃で保存する。
【０４１５】
最終生成物（ＨＰＬＣにより９５％純粋）は、所望のＭＷ６４６２ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）を有することがわかった。これは、インスリン１分子あたり合計２．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲートされていることを示し、その９９％がＰｈｅ−Ｂ１部位でコンジュゲートされていた（Ｎ末端配列決定法）。
【０４１６】
実施例２４−末端反応性アルデヒド基を含むＡＥＭ−３−枠組構造および後続のＢ１でのインスリンコンジュゲーション
ａ．３つのＡＥＭと１つのアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能化されたＴＳＰＥ
この物質は、実施例２２ａに記載の方法に従い、ＴＳＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を多価活性化エステル枠組構造として、および４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をアミン含有ジエチルアセタールとして用いて合成される。先に記載のようにして合成されるＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）を親和性リガンドとして使用した。
【０４１７】
ｂ．ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡとＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのコンジュゲーション
この物質は、実施例２２ｂに記載の方法を使用し、上記（ａ）で作製したＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡを、実施例８に従って合成したアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）とともに用いて合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することによりＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４℃で保存する。
【０４１８】
最終生成物（ＨＰＬＣにより９５％純粋）は、所望のＭＷ６８９７ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）を有することがわかった。これは、インスリン１分子あたり合計３．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲートされていることを示し、その９９％がＰｈｅ−Ｂ１部位でコンジュゲートされていた（Ｎ末端配列決定法）。
【０４１９】
実施例２５−末端反応性アルデヒド基を含むＡＥＭ−３−骨格および非保護インスリンを用いた後続のＢ１でのインスリンコンジュゲーション
ａ．３つのＡＥＭと１つのアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能化されたＴＳＰＥ
この物質は、実施例２２ａに記載の方法に従い、ＴＳＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を多価活性化エステル骨格として、および４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をアミン含有ジエチルアセタールとして用いて合成される。先に記載のようにして合成されるＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）を、インジケータ類似体として使用した。
【０４２０】
ｂ．ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡとＮＨｒＢ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのコンジュゲーション
この物質は、実施例２２ｂに記載の方法を使用し、上記（ａ）で作製したＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡを、アミン含有薬物の非修飾インスリン（ＭＷ＝５，８０８ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともに用いて合成した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発材料の非保護インスリンは３個の遊離アミン基を有するが、Ｐｈｅ−Ｂ１（ｐＫａ約６．８）がｐＨ６．５で最も反応性のアミンであるため、Ｐｈｅ−Ｂ１は骨格に対する主要インスリンコンジュゲーション部位である。凍結乾燥粉末を０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解させる。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、この物質を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４℃で保存する。
【０４２１】
最終生成物（ＨＰＬＣにより９５％純粋）は、所望のＭＷ６８９７ｇ／ｍｏｌ（ＬＣ−ＭＳ）を有することがわかった。これは、インスリン１分子あたり合計３．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲートされていることを示し、その＞８５％がＰｈｅ−Ｂ１部位でコンジュゲートされていた（Ｎ末端配列決定法）。
【０４２２】
実施例２６−混合型枠組構造の化学的性質、および薬物と親和性リガンドとの対応する個々のコンジュゲーション
スクシンイミジル−３，５−ジマレイミドフェニルベンゾエート（ＳＤＭＢ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入することができ、以下の実施例において、さらに精製せずに使用することができる。ＳＤＭＢを６０ｍＭで１．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、４００ｕｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。この溶液を高速で１０分間、室温にて撹拌する。次いで、アミン含有薬物を別途、７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに８．１ｍＭの濃度で溶解させる。溶解したら、ＳＤＭＢ溶液を全部、１０分間かけてＤＭＳＯ−薬物溶液に滴下した後、室温でさらに２時間混合し、反応の終了を確実にする。
【０４２３】
次いで、得られた溶液を、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ５．０）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液中で１０倍に超希釈した後、希ＨＣｌで最終ｐＨ８．０にｐＨ調整する。この水溶液を、まず、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。
【０４２４】
別途、６．０ｍｍｏｌのアミン含有親和性リガンドを、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ（ｐＨ８．２）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液に、４５０ｍＭの濃度で溶解させる。この溶液に、６．６ｍｍｏｌのイミノチオラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、ｐＨ８．２で室温にて３０分間反応させ、アミン末端基を末端スルフヒドリル基に変換させる。得られた物質を、先の工程で作製した薬物−枠組構造−ジ−マレイミドコンジュゲートの溶液１０ｍｌと混合する。マレイミド基を、インジケータ類似体のスルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基と、ｐＨ８．２で２時間反応させ、反応の終了を確実にする。次いで、得られた溶液を、サイズ排除（コンジュゲート物質と非コンジュゲート物質の所望の分離のための適切な固相を使用）によって精製する。カラムボイド容積に通したこの溶液を、次いで、適切なサイズの限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌに濃縮する。
【０４２５】
最後に、この溶液を、さらに精製して、所望の生成物を得る（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８、７ｕｍカラム、１９×１５０ｍｍ上での分取用逆相ＨＰＬＣを使用）。緩衝液Ａは、０．１％ＴＦＡを含む脱イオン水であり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。精製前に、カラムを１５ｍｌ／分で、８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを用いて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、２分間かけて１５ｍｌ／分の流速でカラムに注入した後、次の５分間では、８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線状勾配を使用し、続いて、次の２２分間では、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのゆるい線形勾配を使用する。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、枠組構造および親和性リガンドに応じて異なる。収集したら、この溶液を回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得、その具体物は、ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって確認され得る。
【０４２６】
実施例２７−混合型枠組構造の化学的性質を用いたアミノエチル糖類に対するインスリンコンジュゲーション
実施例２６に記載の方法を使用し、実施例８に従って合成したアミン含有薬物ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を用いて、以下の具体的な薬物コンジュゲートが得られる。ＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）、ＡＥＢＭ（ＭＷ＝３８５ｇ／ｍｏｌ）、およびＡＥＴＭ（ＭＷ＝５４７ｇ／ｍｏｌ）を先に記載のようにして合成し、合成において親和性リガンドとして使用した。適切なサイズのサイズ排除媒体は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であり、適切なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
【０４２７】
すべての場合において、実施例２６に従って得られた凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍に超希釈することによりＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通し、アニソール、ＢＯＣおよび脱保護の他の低ＭＷ副生成物、ならびに他の混入塩（あれば）を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてほぼ５８Ｕインスリン／ｍｌ（Ａ２８０測定に基づく）まで濃縮し、必要時まで４℃で保存する。出発材料のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンは、Ｐｈｅ−Ｂ１末端に１つしか遊離アミン基がないため、Ｐｈｅ−Ｂ１は、枠組構造に対する唯一のインスリンコンジュゲーション部位である。これは、Ｎ末端配列決定法によって各脱保護最終生成物において確認され得る。
【表７】
2012516340.tif 000048
【０４２８】
実施例２８−補足的枠組構造との薬物コンジュゲーションのための一般的なクリックケミストリー
少なくとも１つのアミノ官能基と１つ以上の末端アルキン基を含む枠組構造（８．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）に入れ、撹拌して溶液にする。アジドエチル基含有薬物（１０．５１ｍｍｏｌ）を添加した後、硫酸銅（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加する。得られた混合物を５５〜６０Ｃ（油浴）で６時間撹拌し、室温まで冷却させ、一晩撹拌し、２分の１の容量になるまで真空濃縮し、マイクロガラスフィルターに通して濾過する。濾液をレジンカラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗ  ５０ｘ４−１００）に負荷し、中性になるまで水を用いて溶出させる（６×７５ｍＬ）。次いで、カラムを、１５％水酸化アンモニウム（１０×７５ｍＬ）を用いて溶出させ、ニンヒドリン陽性画分をプールし、濃縮すると、ガラス状の泡状物になる。
【０４２９】
実施例２９−ウシおよびブタなどの他の種に由来する天然インスリンを用いて調製されるコンジュゲート
少なくとも１つの反応性アミン官能基を含む他の種に由来するインスリン（例えば、ウシおよびブタインスリン）は、組換えヒトインスリンをコンジュゲートさせるのに使用される任意の方法を用いてカップリングさせ得る。当業者には、ウシまたはブタインスリンからの作製によって得られるコンジュゲートの分子量が、組換えヒトインスリンから作製されるものと、以下の表に示す量だけ異なることは認識されよう。
【表８】
2012516340.tif 000049
【０４３０】
当業者には、インスリン間の構造のわずかな違いのため、ウシまたはブタインスリンからの作製によって得られるコンジュゲートが、ヒトインスリンからの作製によるコンジュゲートとわずかに異なるクロマトフラフィーピーク保持時間を有することがあり得ることは認識されよう。
【０４３１】
実施例３０−リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギンおよびデテミルなどのインスリン類似体を用いて調製されるコンジュゲート
少なくとも１つの反応性アミン官能基を含む既知のインスリン類似体（例えば、リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギン、およびデテミル）はすべて、組換えヒトインスリンをコンジュゲートさせるのに使用される任意の方法を用いてカップリングさせ得る。当業者には、インスリン類似体からの作製によって得られるコンジュゲートの分子量が、組換えヒトインスリンから作製されるものと、以下の表に示す量だけ異なることは認識されよう。
【表９】
2012516340.tif 000050
【０４３２】
当業者には、インスリン間の構造のわずかな違いのため、インスリン類似体からの作製によって得られるコンジュゲートが、ヒトインスリンからの作製によるコンジュゲートとわずかに異なるクロマトフラフィーピーク保持時間を有することがあり得ることは認識されよう。
【０４３３】
インスリングルリジン（Ｂ２９リジンを含まない代わりに、Ｂ３リジンを含む）の使用により、非保護インスリングルリジンを用いた場合、主に、Ｂ３コンジュゲートが得られる。しかしながら、Ｂ１−インスリングルリジンコンジュゲートが所望される場合は、実施例８に記載のＢＯＣ−（Ａ１，Ｂ２９）−ヒトインスリンと同じプロトコルを使用し、まず、ＢＯＣ−（Ａ１，Ｂ３）−インスリングルリジンを合成する。
【０４３４】
実施例３１−ペプチド系インスリン分泌促進薬コンジュゲートを用いて調製されるコンジュゲート
Ｎ末端アミン官能基を含むペプチド系インスリン分泌促進薬（例えば限定されないが、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体エクセナチド（ｅｘａｎｉｔｉｄｅ））は、インスリンをコンジュゲートさせるために使用される任意の方法を用いてカップリングさせ得る。
【０４３５】
ＩＩ．例示的コンジュゲートのインビトロアッセイ
この第２の組の実施例では、一部の例示的コンジュゲートのインビトロ特性を調べる種々の実験を記載する。
【０４３６】
実施例３２−インスリン−グリコゲンコンジュゲートの合成
この比較例では、米国特許出願公開公報第２００７００９９８２０号によるインスリン−グリコゲンコンジュゲートの合成を記載する。簡単には、１ｇの市販の未精製牡蠣グリコゲン（ＩＩ型、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、脱イオン水に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させる。得られた溶液に固体ＣＮＢｒを、グリコゲンに対するＣＮＢｒの質量比０．６８で添加し、ｐＨを、３Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液で１０．７＋／−０．２の一定に維持する。１５分間撹拌後、さらに等質量の固体ＣＮＢｒを添加し、撹拌しながら４５分間、ｐＨを１０．７  ＋／−０．２の一定に維持する。次いで、この溶液にインスリンを、グリコゲンに対するインスリンの質量比０．６０で添加し、固体重炭酸ナトリウムを用いてｐＨを９．１５に調整する。この溶液を一晩撹拌し、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホンディスク膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させる。次いで、得られた粉末を非コンジュゲートインスリンから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）  ３０  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）充填カラムでのゲル濾過ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）（１Ｍの酢酸移動相を使用）によって精製する。次いで、インスリングリコゲン画分を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な白色粉末として得る。得られた精製物質には、インスリン−グリコゲンコンジュゲート１分子あたり１．０ｗｔ％のインスリンが含まれていた（アミノ酸解析（ＵＣＬＡ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を用いて測定）。
【０４３７】
実施例３３−液体クロマトグラフィー解析
この実施例では、実施例３２に従って合成したインスリン−グリコゲンと、本発明に従って合成される例示的コンジュゲートとのＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールの違いを記載する。実施例３２に従って合成したインスリン−グリコゲンの１００ｕｌの５ｍｇ／ｍｌ溶液、および例示的コンジュゲートの１００ｕｌの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、別々に、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８  ５ｕｍカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）に注入し、８０％水／２０％アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）移動相（各々、０．１％のＴＦＡを含む）で平衡化した。この試験で使用した例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した。
【０４３８】
試料は１．０ｍｌ／分で、以下の勾配法：０〜５分−８０％水／２０％ＣＨ３ＣＮで一定、５〜３５分−５０％水／５０％ＣＨ３ＣＮまでの線形勾配を用いて溶出させた。図１の溶出プロフィールは、例示的コンジュゲートで単一の急上昇を示し、化学的に相違する種が単一であることを示すのに対し、インスリン−グリコゲンコンジュゲートでは、広くて不均一な溶出プロフィールを示し、化学的におよび／または分子量が異なる存在体の分布が広いことを示す。
【０４３９】
実施例３４−分子量分布解析
この実施例では、実施例３２に従って合成したインスリン−グリコゲンと、同じ例示的コンジュゲートとのＭＷおよびＭＷ分布の違いを記載する。インスリン−グリコゲンコンジュゲートのＭＷおよびＭＷ分布は、１ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ溶液（ｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）を、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で平衡化したＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に注入することにより測定した。カラムは、０．５ｍｌ／分で３０分間かけて溶出させ、溶出プロフィールは、２８０ｎｍにおける吸光度として測定した。同じプロトコルを用いた別個の実験において、１０００、５０００、１２０００、２５０００、５００００、８００００、１５００００、２７００００、および４１００００ｇ／ｍｏｌのデキストランＭＷ標準品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を注入し、保持時間に対するＭＷの較正曲線を作成した。較正曲線とインスリン−グリコゲンコンジュゲートの溶出プロフィールに基づき、平均ＭＷは５００，０００ｇ／ｍｏｌであると求められ、分布の６７％は、２５０，０００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌの広範囲にわたって溶出された（データ表示せず）。対照的に、例示的な本発明のコンジュゲートは、ＬＣ／ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）での測定時、厳密に６，７３０ｇ／ｍｏｌのＭＷを１つだけ有することが測定された（データ表示せず）。
【０４４０】
実施例３５−コンジュゲートの化学的および物理的安定性
この実施例では、例示的な本発明のコンジュゲートの安定性を、非コンジュゲート型インスリンのものと、Ｈｉｎｄｓら（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１１：１９５−２０１，２０００）に記載の方法による促進条件下、３７℃で、１５０ストローク／分の機械的撹拌速度で比較する。医薬等級の組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）を、促進安定性試験の対照として選択した。Ｈｏｌｃｏｍｂｅら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２７：１２４１−１２４２，２００４）には、非促進条件下では、ＲＨＩ安定性は、室温で（ＲＴ）少なくとも３０日間維持され、冷蔵した場合はかなり長くなると記載されている。図２は、ＲＨＩおよび２つの例示的コンジュゲートの、ｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、５０Ｕ／ｍｌでの凝集安定性アッセイの結果を示す。すべての場合において、溶液中の残留％は、この溶液を所与の時間点で遠心分離し（４５００×ｇ、５分）、上清みのＡ２８０を測定し、上清みのＡ２８０を最初の出発溶液のもので除算することにより求めた。コンジュゲート１は、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン用いて合成した。コンジュゲート２は、枠組構造としてＴＳＰＥ、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン用いて合成した。
【０４４１】
３７℃で４８時間の連続撹拌後、ＲＨＩの６％未満は溶液中で安定なままであったが、ＲＨＩの大部分は不溶性の凝集物として沈殿した。同じ時間量の後では、ＩＰＣのうち９６％〜９９％はＰＢＳ溶液中でインタクトで可溶性のままであったため、どちらのコンジュゲートも、実質的により安定なままであった。これらのデータは、このような条件下では、コンジュゲートはＲＨＩよりも有意に安定であることを決定的に示す。
【０４４２】
ＲＰ−ＨＰＬＣを使用し、コンジュゲートの化学安定性を評価した（図３ａ参照）。４８時間の促進安定後、Ｃ８逆相カラム（水−アセトニトリル溶出勾配を使用）を用いて、コンジュゲート溶液を解析した。安定前および安定後のコンジュゲート試料の保持時間を、得られたＬＣ図に見られた非コンジュゲート（遊離）インスリンおよびデスアミドインスリンの割合とともに示す。検出可能な量の遊離インスリンまたはデスアミド型は観察されず、（ｉ）糖類とインスリン分子間の共有結合は安定であること、および（ｉｉ）促進安定性試験（ＡＳＴ）中、コンジュゲートの有意な化学分解は起こらないことを示す。また、ＡＳＴの前およびＡＳＴと並行して、コンジュゲートを、４℃〜ＲＴでの毎日の熱サイクルを含む９０日間の非促進安定性試験に供した。パラレル試験の結論として、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、コンジュゲートは、依然として化学的および物理的に安定であることが示された（データ表示せず）。
【０４４３】
ＨＥＰＥＳ緩衝液中でのコンジュゲートの化学安定性のさらなる確認は、コンジュゲートをＡＳＴに供する前と後で得られるＬＣ−ＭＳデータからもたらされる。興味深いことに、ＰＢＳ中での４８時間ＡＳＴコンジュゲート試料では、相当な分解が起こったことが示されたが、ＨＥＰＥＳ緩衝液中での４８時間ＡＳＴコンジュゲート試料は完全にインタクトで安定であった（図３ｂ参照）。ＨＥＰＥＳ中に保存したコンジュゲートＨＳ−１−６０−１はＡＳＴの前後で６７３０ＤａのＭＷを有し、これは、マンノース残基（多量体骨格）およびインスリンはともに、すべて化学的に変化せず、かなり安定であることを示す。コンジュゲートの安定性を確実にするため、保存、インビトロ試験およびインビボ試験に使用される緩衝液には、すべて、緩衝剤としてＨＥＰＥＳを含める。
【０４４４】
ＬＣ−ＭＳ試験は、コンジュゲートの化学的確認アッセイとしての機能が容易に果たされ得るため、ＬＣ−ＭＳデータによってＦＤＡの製造上の規制の順守が大きく増強される。薬物（例えば、インスリン）、法多量体骨格、およびコンジュゲートはすべて、別々の分子量を有するため、得られる親和性リガンド比は、該コンジュゲートのＭＷから骨格のＭＷを減算することにより糖類基による残りの質量が得られ、容易に計算され得る。コンジュゲートＨＳ−１−６０−１の場合、マンノース：インスリンのモル比は厳密に２．０と計算される。
【０４４５】
実施例３６−コンジュゲートの機能的安定性
コンジュゲートが化学的および物理的に安定であることが示された後、７２時間ＡＳＴコンジュゲートを、その皮下生理活性に関して、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用し、５Ｕ／ｋｇで、インビボ対新鮮コンジュゲートで評価した（図４参照）。
【０４４６】
７２時間ＨＥＰＥＳ  ＡＳＴコンジュゲートデータの解析により、グルコース底に達する時間（Ｔ底）は６０分であり、空腹時血中グルコース値の７０％に戻るまでの時間（Ｔ７０％ＢＧ）は１２８＋１５分未満であることが示された。スチューデントのｔ−検定（各群ｎ＝４）を用いた各時間点における新鮮コンジュゲート対７２時間ＡＳＴコンジュゲートの生理活性曲線の比較では、有意差は示されなかった（すべてｐ値＞０．２１）。この結果は、その製剤の指定の目標値の範囲内であり、コンジュゲート化学安定性の保持がインビボでの機能的能力の保持に変形されることを示す。
【０４４７】
ＩＩＩ．例示的コンジュゲートのインビボアッセイ
この第３の組の実施例では、一部の例示的コンジュゲートのインビボ特性を調べる種々の実験を記載する。
【０４４８】
実施例３７−ＲＨＩとデキストランまたはグリコゲンのコンジュゲートでのコンジュゲート生理活性の対比
ａ．インスリン−デキストランの生理活性
この比較例では、皮下投与されたインスリン−デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＷ約７０Ｋ）のインビボ薬力学的プロフィールを評価する。以下に示すように、米国特許公開公報第２００４０２０２７１９号に従って合成されるインスリン−デキストランコンジュゲートは、皮下注射後、該コンジュゲートポリマーのＭＷが大きいことによって体循環への吸収速度が大きく妨げられるため、比較的ゆっくり作用する。インスリン−デキストランを、変形臭化シアン（ＣＮＢｒ）カップリング反応を用いて合成した。簡単には、５００ｍｇのデキストラン（ＭＷ＝７０Ｋ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍｌの脱イオン水に溶解させた。得られた溶液に５６ｍｇの固体ＣＮＢｒを添加し、５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨを１０．７±０．２に維持した。１５分間撹拌後、さらに５６ｍｇの固体ＣＮＢｒを添加し、撹拌しながら４５分間、ｐＨを１０．７±０．２に維持した。次いで、この溶液に３００ｍｇの組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）を添加し、固体の重炭酸ナトリウムを用いてｐＨを９．１５に調整した。この溶液を一晩撹拌し、１０Ｋ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホンディスク膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてＤＩ水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させた。次いで、得られた粉末を非コンジュゲート型インスリンから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）  ７５充填カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）での高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）（１Ｍの酢酸移動相を使用）によって精製した。次いで、インスリン−デキストラン画分を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な粉末として得た。インスリンのコンジュゲーション度合は１０％（ｗ／ｗ）であった（アミノ酸解析（ＵＣＬＡ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）で測定）。
【０４４９】
インスリン−デキストランの皮下注射を、０．２５ｍｌの滅菌１×ＰＢＳ溶液（２０当量Ｕのインスリン／ｍｌ）を用いて、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、２００〜２５０ｇ、ｎ＝４）の首の後ろ側に投与した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から−１５分および０分、ならびに１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００および３６０分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。図５に示されるように、グルコース底濃度に達するまでの時間（Ｔ底）は注射の約３時間後であり、血清グルコースレベルは、注射後少なくとも５時間低下したままであることがわかった。
【０４５０】
ｂ．インスリン−グリコゲンの生理活性
この実施例では、皮下投与されたインスリン−グリコゲンのインビボ薬力学的プロフィールを評価する。インスリン−グリコゲンコンジュゲートは実施例３２に従って合成した。インスリン−グリコゲンコンジュゲートの生理活性は、２．５当量Ｕのインスリン／ｋｇ用量を、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、２００〜２５０ｇ、ｎ＝４）の首の後ろ側に注射することにより評価した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から−１５分および０分、ならびに１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００および３６０分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。上記のインスリン−デキストランコンジュゲートと比較すると、高ＭＷインスリン−グリコゲンコンジュゲートは、グルコースレベルを、ずっと急速に大きな程度で低下させる（図６参照）。この急速な作用および排出プロフィールは、皮下注射後の高ＭＷグリコゲンポリマー鎖の急速な酵素的消化によるものである。
【０４５１】
ｃ．コンジュゲートとＲＨＩの生理活性の比較
この実施例では、皮下投与された例示的コンジュゲートおよび組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）のインビボ薬力学的プロフィールを評価および比較する。例示的コンジュゲートは、骨格としてＴＳＡＴ−Ｃ６、インジケータ類似体としてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した。各場合において、コンジュゲートまたはＲＨＩは、３．５Ｕ／ｋｇで、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を用いて測定した。図７に示されるように、ＲＨＩと例示的コンジュゲートのグルコース抑制プロフィールは、例示的コンジュゲートがインビボで酵素的に消化され得ないにもかかわらず、ほぼ同一である。コンジュゲートの急速な作用および排出プロフィールは、おそらく、コンジュゲートがＲＨＩよりも１４％しか大きくなく、ＭＷの増大の効果（あれば）は、薬力学的特性の点において、ほぼ無視できることによるものが大きい。
【０４５２】
実施例３８−ＲＨＩとのＰＫ比較
この実施例では、皮下投与された例示的コンジュゲートおよび組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）で得られた血清インスリンプロフィールを記載および比較する。例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン用いて合成した。各場合において、コンジュゲートまたはＲＨＩは、３．５Ｕ／ｋｇで、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。各時間点の血液を４Ｃで遠心分離し、血清を収集した。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。図８からわかるように、コンジュゲートの薬物動態プロフィールはＲＨＩのものと統計学的に識別不能であり、これは、皮下注射後、このコンジュゲートの血清中への吸収および血清からの排出が急速になされることを示す。
【０４５３】
実施例３９−ＡＥＭ−２−ＴＳＡＴ−Ｃ６−インスリンコンジュゲートのＢ２９置換型のＰＫおよび生理活性
この実施例では、皮下投与された例示的コンジュゲートで得られた血清インスリンおよび血中グルコース抑制プロフィールを記載する。例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、ならびに薬物として組換えヒトインスリン（実施例３７および３８の場合のようにＢ１置換コンジュゲートではなく、Ｂ２９置換コンジュゲートを作製するため）用いて合成した。この場合、コンジュゲートは、５Ｕ／ｋｇで、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝３）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。また、各時間点の血液を４Ｃで遠心分離し、血清を収集した。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。図９からわかるように、Ｂ２９置換コンジュゲートの薬物動態プロフィールは、ＲＨＩのもの、ならびに実施例３８のＢ１置換コンジュゲートのものと統計学的に識別不能であり、これは皮下注射後、このコンジュゲートの血清中への吸収および血清からの排出も、急速になされることを示す。
【０４５４】
実施例４０−リスプロとのＰＫおよび生理活性の比較
この実施例では、皮下投与された例示的コンジュゲートおよびインスリンリスプロで得られた血清インスリンおよび血中グルコースのプロフィールを比較する。インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は速効性インスリン類似体であり、Ｂ鎖のＣ末端の最後から２番目のリジンとプロリン残基が逆転している。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。また、比較のため、可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）のデータも示す（実施例３８および図８参照）。
【０４５５】
例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン用いて合成した。各場合において、コンジュゲートまたはインスリンリスプロは、３．５Ｕ／ｋｇで、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。また、各時間点の血液を４Ｃで遠心分離し、血清を収集した。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。図１２からわかるように、コンジュゲートの薬物動態プロフィールは、インスリンリスプロのものと統計学的に識別不能である。
【０４５６】
実施例４１−生理活性に対する親和性リガンドの効果
この実施例では、皮下投与された一連の例示的コンジュゲートで得られた血中グルコースのプロフィールを比較する。例示的コンジュゲートは、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成した。一連の親和性：ＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、ＡＥＴＭ−１  ＡＥＢＭ−１およびＡＥＴＭ−２（最も低い親和性から最も高い親和性まで）が包含されるように、親和性リガンドの組成をコンジュゲート間で変化させた。各場合において、コンジュゲートは、５Ｕ／ｋｇ（ＡＥＭ−２では３．５Ｕ／ｋｇ）で、空腹時の正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００〜５００ｇ、ｎ＝６）の首の後ろ側に注射した。血液試料を尾静脈から採取し、採血は、注射から０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分後の時点で行なった。血中グルコース値は、市販の試験紙（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。また、各時間点の血液を４Ｃで遠心分離し、血清を収集した。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。
【０４５７】
図１３からわかるように、血糖降下性応答は、リガンドの親和性が増大するにつれて減少した。このデータにより、親和性リガンドの性質がコンジュゲートの生理活性に影響を及ぼし得ることが初めて示された。図１４〜１６は、試験した各４つのコンジュゲートの血中グルコースレベルを、血清インスリンレベルとともに示す。この結果は、親和性が高いリガンドを有するコンジュゲートのグルコース応答が低いことは、該コンジュゲートのＰＫプロフィールの低下に起因することをかなり明白に示す（ＡＥＭ−２の場合の図１４と、ＡＥＴＭ−２の場合の図１６を比較）。２００９年１月２８日に出願された米国特許出願第６１／１４７，８７８号（その内容は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、本発明者らは、このＰＫプロフィール（それに関連する生理活性）の低下は、生理学的グルコース濃度の増大によって逆転され得る（すなわち、血液循環中のコンジュゲートレベルは、グルコース濃度の増大とともに上昇する）ことを示した。一部の特定の実施形態では、このグルコース依存性は、コンジュゲートのインビボ特性をさらに微調整するために使用され得ることは認識されよう。
【０４５８】
ＩＶ．結合部位修飾レクチン
この第４の組の実施例では、さまざまな結合部位修飾レクチンの調製および試験を記載する。
【０４５９】
実施例４２−アジドフェニル−糖類修飾Ｃｏｎ  Ａの合成
特に記載のない限り、工程はすべて、室温で行なった。まず、５．０ｇの天然Ｃｏｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ塩化マンガンおよび０．１％ｗ／ｖ  アジ化ナトリウム（Ｓ２８緩衝液）を含む２００ｍｌの１０ｍＭ（ｐＨ５．０）の酢酸緩衝液溶液に溶解させ、不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって分離した。本発明者らは、種々の天然Ｃｏｎ  Ａ市販調製物は、認識可能な濃度の阻害性糖類を含むことを見い出し、該糖類は、一部の特定の実施形態では光親和性修飾の前に除去される。この目的のため、この溶液を、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｐ６サイズ排除カラム（Ｓ２８移動相を使用）に２回通して精製した。最後に、得られた溶液をＳ２８で最終容量１Ｌまで希釈した。穏やかな撹拌条件下で、０．４ｇのヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した後、アジドフェニルグルコース（ＡＰＧ，ＰｏｌｙＯｒｇ  Ｉｎｃ．，Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ、ＭＡ）またはアジドフェニルマンノース（ＡＰＭ、ＰｏｌｙＯｒｇ  Ｉｎｃ．、Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ、ＭＡ）のいずれかを１６５ｍｇ添加した。この溶液を、暗所にて４Ｃで１時間、可能な限り低い撹拌速度で撹拌した。１時間の撹拌後、さらなる不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって除去した。２００ｍｌのこの溶液を、９インチ×１３インチのアルミニウムパンに注入し、ＣＬ−１０００  ＵＶ架橋炉（ＵＶＰ、Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ）内部で、４Ｃにて１５分間、３６０ｎｍで反応させた（また、ＵＶ反応は、３０２ｎｍの光を用いて行なってもよい）。反応後、さらなる不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって除去した。次いで、清澄化した溶液をＢｉｏｇｅｌ−Ｐ６サイズ排除カラム（Ｅｃｏｎｏｐａｋ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に１回通して精製した（Ｓ２８移動相を使用）。次いで、ＵＶ架橋反応およびＰ６精製プロセスを、溶液が全部反応するまで繰り返した。最後に、合わせたＰ６精製溶液を、Ｏｍｅｇａ  ３０Ｋ膜を備えたＰａｌｌタンジェンシャルフロー濾過カートリッジ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて約１８０ｍｌまで濃縮した。得られた溶液を遠心分離および／または濾過によって清澄化し、０．２２ｕｍフィルターに通した後、アフィニティカラム精製を行なった。
【０４６０】
実施例４３−ジアジリン光反応性リガンドの一般的な合成
０．９ｍｍｏｌのアミノエチル（ＡＥ）官能化糖類リガンド（例えば、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）を４ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた後、１．６ｍｌの無水トリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加すると、乳濁液が形成された。別個の容器において、２００ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）のＮＨＳ−ジアジリン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）粉末を、暗条件下で、４ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた。溶解したら、ＮＨＳ−ジアジリン溶液をＡＥ−糖類溶液に滴下し、次いで、室温で一晩暗所にて反応させた。一夜溶液のＴＬＣ解析（５０％エタノール：５０％酢酸エチル）により、ジアジリン部分のＵＶシグナル（２５４ｎｍ）と、糖類シグナル（硫酸−エタノール染色）の共溶出と同時に、ＴＬＣの基部からのＡＥ官能化糖類リガンドの消失（硫酸−エタノール染色）が示されたため、反応の終了を確認した。次いで、この溶液を、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む８０ｍｌの（ｐＨ５．０）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液中で希釈し、必要であればｐＨをｐＨ５に調整し、次いで、Ｃｏｎ  Ａとの光親和性反応の必要時まで凍結させた。
【０４６１】
実施例４４−糖類官能化ジアジリンＣｏｎ  Ａの合成および特性評価
特に記載のない限り、工程はすべて、室温で行なった。まず、５．０ｇの天然Ｃｏｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ塩化マンガンおよび０．１％ｗ／ｖ  アジ化ナトリウム（Ｓ２８緩衝液）を含む２００ｍｌの１０ｍＭ（ｐＨ５．０）の酢酸緩衝液溶液に溶解させ、不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって分離した。本発明者らは、種々の天然Ｃｏｎ  Ａ市販調製物は、認識可能な濃度の阻害性糖類を含むことを見い出し、該糖類は、一部の特定の実施形態では光親和性修飾の前に除去される。この目的のため、この溶液を、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｐ６サイズ排除カラム（Ｓ２８移動相を使用）に２回通して精製した。最後に、得られた溶液をＳ２８で最終容量１Ｌまで希釈した。次に、この溶液の容量を１×Ｓ２８を用いて１Ｌ〜リガンド容量の１／３にし、撹拌バーを入れた１Ｌ容量メディアボトル内に注入した。穏やかな撹拌条件下、暗所にて、０．４ｇのヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を溶解させた。次に、実施例４３で得られたジアジリン−糖類コンジュゲート３３ｍｌを、７回に分けて、穏やかな撹拌条件下、暗所にて添加した。溶解したら、溶液を全部、穏やかな撹拌下、暗所にて４Ｃでさらに１０分間インキュベートした。１０分間の撹拌後、さらなる不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって除去した。２５０ｍｌのこの溶液を、９インチ×１３インチのアルミニウムパンに注入し、ＣＬ−１０００  ＵＶ架橋炉（ＵＶＰ、Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ）内部で、４Ｃにて１５分間、３６０ｎｍで反応させた。反応後、さらなる不溶物（あれば）を遠心分離および／または濾過によって除去した。次いで、清澄化した溶液をＢｉｏｇｅｌ−Ｐ６サイズ排除カラム（Ｅｃｏｎｏｐａｋ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に１回通して精製した（Ｓ２８移動相を使用）。次いで、ＵＶ架橋反応およびＰ６精製プロセスを、溶液が全部反応するまで繰り返した。最後に、合わせたＰ６精製溶液を、Ｏｍｅｇａ  ３０Ｋ膜を備えたＰａｌｌタンジェンシャルフロー濾過カートリッジ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて約１８０ｍｌまで濃縮した。得られた溶液を遠心分離および／または濾過によって清澄化し、０．２２ｕｍフィルターに通した後、アフィニティカラム精製を行なった。
【０４６２】
実施例４５−修飾Ｃｏｎ  Ａ試料のアフィニティカラム精製
実施例４２および４４に従って合成した光親和性修飾レクチンをアフィニティカラムクロマトグラフィーによって精製し、充分に反応した物質を、未反応および／または一部反応物質から分離した。１００〜２００ｍｌの溶液を、グルコース含有Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ３０ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）を充填し、Ｓ２８緩衝液で平衡化したＸＫ５０／１００カラム（５０ｍｍ直径×１００ｃｍ長さ）に注入した。次いで、カラムを、Ｓ２８を用いて５ｍｌ／分で４時間溶出させた。充分に反応した所望の画分が、まず、カラムから溶出され、続いて、まだグルコース含有固定相に対して一部親和性を有する一部反応物質が溶出された。典型的には、７０〜１２０分の間に溶出された物質を収集し、残りは廃棄した。次いで、カラムを、８０ｍＭのα−メチル−マンノース溶液を含むＳ２８緩衝液を用いて５ｍｌ／分で６時間洗浄して未反応レクチン（あれば）を除去した後、Ｓ２８中、５ｍｌ／分でさらに６時間再生させた。収集した画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０Ｋ限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてほぼ１００ｍｌまで濃縮し、０．２２ｕｍフィルターに通した後、さらなるアフィニティカラム精製工程（実施する場合）を行なった。カラム精製プロセスは２回目、３回目および４回目を繰り返し、後続の試験のために充分純粋な物質を得た。４回目の精製工程後、該物質を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０Ｋ限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてほぼ１８ｍｇ／ｍｌまで濃縮した（この溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）によって測定）。この溶液を０．２２ｕｍフィルターに通し、後の試験で必要とされるまで４℃で保存した。
【０４６３】
実施例４６−修飾Ｃｏｎ  Ａ試料の化学的特性評価
ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、該物質に対して行ない、ＵＶ光への曝露の結果、有害なタンパク質分解性切断が起こらなかったことを確実にした。簡単には、１０〜１５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ既製ゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および１×Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＰＡＧＥ実験を行なった。また、広い範囲の分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および天然コンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖｌｉｎ）レクチン（Ｃｏｎ  Ａ、ＶＩ型、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の２ｍｇ／ｍｌ試料も、対照として泳動させた。２５ｕＬの各修飾レクチンまたは対照試料を５ｕＬの−メルカプトエタノール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む５０ｕＬの１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に溶解させ、試料を沸騰水浴中でほぼ５分間加熱した。試料を室温まで冷却させた後、２０ｕＬの各試料を既製ＰＡＧＥゲルのウェル内に負荷した。次いで、試料を２００ボルトで６０分間泳動させた。電気泳動後、ゲルを、脱イオン水：メタノール：氷酢酸（容量比６０：３０：１０）の溶液中に３０分間固定した後、脱イオン水中で２回洗浄した。最後に、ゲルを１×Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で６０分間染色した。最終のゲルをライトテーブルおよびデジタルカメラを用いて画像形成し、染色されたゲルを記録した。染色されたタンパク質バンドを、その分子量について、分子量および天然Ｃｏｎ  Ａ対照試料と比較することによりアッセイした。ＵＶ光への曝露中での修飾レクチン試料のタンパク質分解性切断により、天然Ｃｏｎ  Ａ対照に存在するものよりもＭＷが小さく、明白に異なると思われる分子量バンドがもたらされ得る。
【０４６４】
ｂ．マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析
当業者には、ＭＡＬＤＩが、タンパク質の分子量を特性評価するための周知の手法であることは認識されよう。ＭＡＬＤＩは、親和性リガンドへのコンジュゲーション、および後続のアフィニティカラム精製後の修飾レクチンサブユニットのＭＷを特性評価するために使用され、修飾レクチンが親和性リガンドに共有結合された程度が計算され得る。
【０４６５】
２ｍｇ／ｍｌの修飾レクチン試料を、脱イオン水で事前に平衡化したＢｉｏＳｐｉｎ  ３０カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に添加した。ＢｉｏＳｐｉｎカラムを１０００×ｇで４分間遠心分離した。得られた溶出液には、実質的に脱塩された修飾レクチン試料が含まれていた。試料をドライアイス上で凍結させ、シナピン酸マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ解析のために発送した。
【０４６６】
ｃ．解析用超遠心分離（ＡＵＣ）
ＡＵＣは、溶液中に存在するときのタンパク質試料の天然の分子量を調べるために使用される手法である。一部のレクチンは第４級構造を有するため（例えば、Ｃｏｎ  Ａ）、非変性条件（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩ）下での修飾レクチンの分子量を明らかにすることが推奨される。
【０４６７】
修飾レクチン試料および対照天然Ｃｏｎ  Ａ（ＶＩ型、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）試料を、１．０、０．５および０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、１２．５ｍＭのα−Ｄ−マンノースを含むＳ２８緩衝液に溶解させ、これらを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ｉ解析用超遠心分離機（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ＭＩＴ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のＡＵＣセル内に入れ、１０ｋ、２０ｋ、３０ｋまたは４０ｋｒｐｍの速度で連続的にスピンさせ、各速度において、何時間か平衡化させた。各細胞を２８０ｎｍの波長でスキャンし、Ｗｉｎｍａｔｃｈソフトウェア（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、ＡＵＣセルの平衡時間を求めた。各試料で得られたＡＵＣデータを、非線形最小二乗解析（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ｖｌ．０６（ＵＣｏｎｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＣＴ）を使用）を用いてフィットさせ、試料の分子量を得た。
【０４６８】
ｄ．等温熱量測定
滴定熱量測定を、２５℃で、Ｍｉｃｒｏ−Ｃａｌ  ＶＰ−ＩＴＣマイクロ熱量計（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ＭＩＴ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）（１．４ｍｌ（公称）滴定セルを使用）にて行なった。典型的な修飾レクチンの濃度は、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２）中、４〜６ｍｇ／ｍｌの範囲とした。試料を同じ緩衝液中１０ｍＭのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドで、最初の１回はシリンジを洗浄するために２μｌ増分を使用した後、４μｌの９回の注射を行ない、１１回目から３０回目の添加では８μｌに増加させ、２４０秒間隔で滴定した。通常、後の添加ほど、示されたバックグラウンド希釈熱はわずかであった（すなわち、全飽和）。データ（最初のデータ点、および任意の他の明らかに良くないデータは除外する）を、機器に付属のＯｒｉｇｉｎｓソフトウェアを用いて単一部位モデルにフィットさせた。
【０４６９】
ｅ．ＭＡＣアッセイ
種々の光親和性標識レクチン（実施例４２および４４で合成し、実施例４５に従って精製したものなど）を、未修飾レクチンが結合し得る親和性リガンドを有する細胞を凝集させる能力に基づいて比較した。各組成物の最小凝集濃度（ＭＡＣ）を、Ｖ字型ウェルマイクロタイタープレート内で、ホルムアルデヒド安定化ウサギ赤血球の２％ｖ／ｖ懸濁液を使用し、Ｃｒｏｗｌｅｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８３：３６８−３７３，１９８２の手順に従って測定した。ホルムアルデヒド処理ウサギ赤血球（公開された手順（Ｎｏｗａｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３９３：１１５−１２３、１９７５）によって、ミシガン大学の実験動物医療部門（Ｕｎｉｔ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から取得したウサギ血液から調製）は、先の試験から利用可能であった。ＭＡＣは、可視凝集を示す最も高い希釈度におけるレクチンタンパク質の濃度（結合された化学物質化合物を除く）と定義した。
【０４７０】
簡単には、レクチン組成物の水溶液を９６ウェルプレートのウェルに、レクチン濃度が約０．１〜１０００ｕｇ／ｍｌの範囲となるような希釈度を用いて添加した。次いで、ホルムアルデヒド処理ウサギ赤血球のアリコートを、各ウェルにピペットで移した。低レクチン濃度では、架橋細胞の網目が形成されるためには、存在するレクチンが不充分であり、細胞はＶ字型ウェルの底面に沈み、上から見ると、暗色のピンポイントの円のように見るものがプレートの底面に形成された。しかしながら、レクチン濃度が最小凝集濃度（ＭＡＣ）に達すると、レクチン分子は、赤血球表面上で糖質受容体を架橋させ始め、それにより網目がもたらされるが、これは、Ｖ字型ウェルの底面に沈降され得ず、上から見ると、大きな不透明の広がった円のように見るものが形成される。この大きな広がった円がもたらされる最も低い濃度を、具体的な製剤のＭＡＣ値とする。
【０４７１】
以下の表に、上記の実施例に従って合成されたＣｏｎ  Ａ系製剤のＭＡＣ値をまとめる（図１７も参照のこと）。
【表１０】
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【０４７２】
実施例４７−マイトジェン活性アッセイ
この実施例では、種々の修飾レクチン組成物のＴ細胞マイトジェン活性を特性評価し、それにより比較するために使用され得るアッセイを記載する。この典型的なアッセイの変形例および択一例は当業者に自明であろう。レクチンによるＴ細胞の活性化は、一般的に、集合的にアクセサリー細胞と称される非Ｔ細胞集団（例えば、単球、樹枝状細胞）の存在を必要とするため、このアッセイでは、高度に精製されたＴ細胞ではなく、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が使用される。典型的なアッセイでは、ＰＢＭＣを３例の健常ヒトドナーの全血から単離し、９６ウェルプレート内に、約１００，０００細胞／ウェルで隔離して広げる。次いで、異なるレクチン組成物（例えば、天然および被処理）の３連の連続希釈物を、開始濃度１０００（または１００）ｕｇ／ｍｌでウェルに添加する。プレートを３７℃で３日間インキュベートし、この時点で０．８ｕＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに添加し、さらに１８時間インキュベートする。次いで、マイトジェン活性の度合を、増殖ＰＢＭＣによる３Ｈ−チミジン取込みによって調べる。一部の場合において、新規レクチン組成物（例えば、被処理組成物）のマイトジェン活性を天然マイトジェン活性に対する最大％で表示する。天然マイトジェン活性に対する最大％は、測定した全濃度での修飾レクチン組成物の最大ＣＰＭ（カウント毎分）値を、測定した全組成での組成物での天然レクチン組成物の最大ＣＰＭ値で除算することにより得られる。
【０４７３】
以前の研究において、本発明者らは、ＭＡＣ値とＣｏｎ  Ａマイトジェン活性に対する最大％との間に強い相関性、すなわち、ＭＡＣ値の有意な増大によりマイトジェン効果の有意な減少がもたらされることを見い出した。したがって、本開示では、ＭＡＣ値を、所与の化学修飾でのマイトジェン活性の低下の可能性を調べるためのサロゲートとして使用する。
【０４７４】
Ｖ．コンジュゲートを制御可能に放出させるための架橋物質体
この第５の組の実施例では、コンジュゲートを制御可能に放出させるための例示的な架橋物質体の調製を記載する。また、この組の実施例では、該物質体のインビトロおよびインビボ特性の一例を記載する。
【０４７５】
実施例４８−修飾Ｃｏｎ  Ａから調製される架橋物質体
０．５０ｍｌの１８ｍｇ／ｍｌ  ＤＥＭ−Ｃｏｎ  Ａ溶液（Ｓ２８中）を遠心チューブに添加し、続いて、０．１１１ｍｌの１．１８ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛二水和物の脱イオン水溶液と混合した。次いで、ｐＨ８．２の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ１４緩衝液）中Ｃ６−アミン−ＡＥＢＭ−２−インスリンの０．５０ｍｌの２．３ｍｇ／ｍｌ溶液を添加した後、急速に混合すると不溶性粒子の分散体が形成された。この分散体を室温で２０分間放置し、次いで、上清みから遠心分離によって分離した。得られたケークを、１．０ｍｌのｐＨ７．４の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ２４緩衝液）で２回洗浄した。このプロセス中、最初の上清みならびに２回の洗浄液を１つの大きな遠心チューブ内に収集した。合わせた上清みと洗浄液に、０．３３３ｍｌの１．１８ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛二水和物の脱イオン水溶液を添加した。この溶液を２０分間放置した後、さらなる沈殿粒子（あれば）を遠心分離によって単離し、最初の２回の洗浄工程で残留した粒子と合わせた。この合わせた不溶性画分を、さらに３回、０．３３３ｍｌのＳ２４緩衝液で洗浄した。残留した不溶物を０．３３３ｍｌのＳ２４緩衝液中に分散させ、穏やかな撹拌下、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、残留粒子を再度、遠心分離によって単離し、０．３３３ｍｌのＳ２４中でさらに１回洗浄した。得られた不溶物を、総容量０．３０ｍｌ（Ｓ２４を使用）中に分散させ、後の試験のために確保した。このプロセスは、任意の量の所望の生成物を生成させるために直接的に規模拡大してもよい。Ｃ６−アミン−ＡＥＢＭ−２−インスリンは、上記の合成において、異なる刺激に応答性の能力特性を有する製剤を得るために、Ｃ６−アミン−ＡＥＴＭ−２−インスリン（または任意の他のコンジュゲート）と置き換えてもよい。
【０４７６】
実施例４９−非糖尿病ラットにおけるＩＰＧＴＴ実験
０．３００ｍｌの所与の架橋物質体を、３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｌｏｃａｔｉｏｎ）（体重４００〜５００ｇ）のそれぞれに皮下注射する。製剤の注射の前に、血中グルコース値を、尾静脈からの採血によりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、バックグラウンドインスリンレベルのアッセイのため、尾静脈からの採血により、ほぼ１００ｕｌの血清を得る。試験期間中は、飼料をラットケージから除く。血清中および血中グルコース値は、注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で得る。注射の１２０分後、３８％ｗ／ｖグルコース溶液の腹腔内注射を、４ｇ／ｋｇ用量となるように注射した後、血清中および血中グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、および３００分の時点で得る。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、純粋なインスリンコンジュゲート溶液で作成した標準曲線を用いて測定する。
【０４７７】
図１８および１９は、ＤＥＭ−Ｃｏｎ  ＡとＣ６−アミン−ＡＥＢＭ−２−インスリンまたはＣ６−アミン−ＡＥＴＭ−２−インスリンから（それぞれ、実施例４８に記載の手順に従って）構築した架橋物質体で得られた結果を示す。ＤＥＭ−Ｃｏｎ  Ａ／Ｃ６−アミン−ＡＥＢＭ−２製剤では、腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）後、ベースラインからの血清インスリン濃度の約２倍の増大が示され、インビボでのグルコース応答性送達を示す。他方、ＤＥＭ−Ｃｏｎ  Ａ／Ｃ６−アミン−ＡＥＴＭ−２製剤では、ＩＰＧＴＴ後、グルコースに応答してベースラインからの血清インスリン濃度の約３〜４倍の増大が示され、通常の生理学的グルコース濃度において、系から漏出される物質体は有意に少ない。さらに、ＤＥＭ−Ｃｏｎ  Ａ製剤を受けたすべての動物の注射部位では、レクチンの存在による炎症または壊死の徴候は全く示されず、該光親和性修飾物質体の安全性プロフィールの改善がさらに確認される。
【０４７８】
実施例５０−インスリン−グリコゲン架橋物質体のグルコース応答性溶解に対する種々の動物血清の効果およびアミラーゼ活性との相関性
この実施例では、インスリン−グリコゲン系コンジュゲートを用いて合成したグルコース応答性製剤の、グルコース濃度の関数としての種々の動物血清中のインビトロ溶解を記載する。インスリン−グリコゲンコンジュゲートは、以下の手順に従って合成した。まず、６２．５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ組換えヒトインスリン溶液（ＲＨＩ）（ｐＨ８．２の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＡ）中）をｐＨ９．０に調整し、氷上で冷却させ、ＲＨＩストック溶液を得た。別途、０．３１２ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＡ）を３ｍｌのＤＩ水に溶解させ、ＴＥＡストック溶液を得た。別途、０．３００ｇのシアノジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１．２ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、ＣＤＡＰストック溶液を得た。別途、１００ｍｇのマンノサミン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１．５ｍｌの１００ｍＭ（ｐＨ９）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液に溶解させ、ｐＨ９．０に調整し、マンノサミンストック溶液を得た。別途、２．０ｇの牡蠣ＩＸ型グリコゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を４０ｍｌの１００ｍＭ（ｐＨ９）のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液に溶解させた後、この溶液を濾過によって清澄化し、氷浴で冷却した。次に、１ｍｌのＣＤＡＰストック溶液をグリコゲン溶液に添加し、１分間混合した後、１ｍｌのＴＥＡ溶液を添加し、得られた溶液のｐＨを９．０に調整した。さらに１分間の撹拌後、６２ｍｌのＲＨＩ溶液を添加し、得られた溶液を５分間撹拌した後、１．０６５ｍｌのマンノサミン溶液を添加した。この溶液を室温で一晩撹拌し、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホンディスク膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させた。次いで、得られた粉末を非コンジュゲート型インスリンから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）充填カラムでのゲル濾過ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）（１Ｍの酢酸移動相を使用）によって３回精製した。次いで、インスリングリコゲン画分１を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な白色粉末として得た。
【０４７９】
２４種類のグルコース応答性製剤を、多価架橋剤としてアセチル化Ｃｏｎ  Ａ（ＡＣＡ）を使用し、以下のようにして調製した。２００ｕｌの２５ｍｇ／ｍｌインスリン−グリコゲンコンジュゲート溶液（ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）を、２００ｕｌの２５ｍｇ／ｍｌ化学修飾アセチル化Ｃｏｎ  Ａ（ＡＣＡ）溶液（ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）と混合し、２０分間放置した。次に、各製剤を遠心分離し、４００ｕｌのｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で、室温にて５回洗浄した。最後の洗浄および遠心分離後、上清みを廃棄し、残留不溶物を５０ｕｌの１×ＰＢＳ中に分散させた。
【０４８０】
２４×５０ｕｌの分散体を９６ウェルプレートに、指定量のグルコースを含有する特定動物種由来の血清５０ｕｌとともに、以下の形式に従って添加した。
【表１１】
2012516340.tif 000052
【０４８１】
実験開始時、各ウェルの外観は白色で不透明であった（光透過率の減少または４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０の増大によって測定）。次いで、９６ウェルプレートを３７Ｃで６時間インキュベートした後、各ウェルのＡ４５０値を再度測定した。残留製剤％を、Ａ４５０（最終）をＡ４５０（初期）で除算し、１００を乗算することにより計算した。物質体がすべて溶解した場合、Ａ４５０値はゼロに近く、ほぼ０％残留を示す。あるいはまた、物質体が溶解しなかった場合は、Ａ４５０は初期値に近く、ほぼ１００％残留を示す。
【０４８２】
図２０の結果は、インスリン−グリコゲンコンジュゲートから構築された架橋物質体は、緩衝生理食塩水中インキュベートすると、６時間の試験中、理想的なグルコース応答性様式で溶解することを示す。しかしながら、該物質体は、ブタ血清中でインキュベートした場合、グルコース濃度に関係なく完全に溶解する。ラット血清では、一部グルコース応答性が維持されるが、グルコースの非存在下であっても、６時間の間で相当溶解する。ヒト血清中でインキュベートした物質体は、２０％超が、グルコースの非存在下でなお、溶解する。
【０４８３】
このような違いを、まず、グリコゲンなどの線形α−１，４グリコシド結合を介して連結されたオリゴ糖からの比色分析シグナルの生成を利用したマイクロプレートアッセイを開発することにより、種それぞれの固有のアミラーゼおよびグルコシダーゼ消化活性と相関させた。アミラーゼ活性を調べるためには、４−ニトロフェニルα−Ｄ−ペンタ−（ｌ→４）−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用し、グルコシダーゼ活性を調べるためには、４−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用した。各アッセイでは、特定の種由来の血清を、量を漸増させて１×ＰＢＳによって希釈し、既知濃度の比色分析のレポーターをこの溶液中でスパイクさせた後、４０５ｎｍにおける吸光度シグナル（Ａ４０５）を時間の関数として測定した。図２１ａおよび２１ｂに、それぞれ、アミラーゼおよびグルコシダーゼ活性について試験した種々の種の各血清における酵素活性によるＡ４０５の生成を示す。ここで、本発明者らは、ＰＢＳ中の血清の希釈度が１：８のとき、ブタ血清がラット血清のほぼ１７倍の消化活性を示すことを認めた。さらに、この条件下で試験したヒト血清中では、活性はほぼ全くないようである。したがって、それぞれの種の血清中での物質体の溶解プロフィールの違いは、種の血清が対象のグリコゲンコンジュゲートを消化する能力と直接相関している。総合すると、この結果により、グリコゲン消化の制限は回避されるが、グルコース応答性物質体はなお形成される、皮下用生理活性コンジュゲート（この開示において記載のものなど）を設計するための起動力がもたらされた。
【０４８４】
実施例５１−ＡＣＡおよびＡＥＭ−２コンジュゲートを用いたグルコース応答性物質体
この実施例では、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成されたコンジュゲートを用いた、グルコース応答性の不溶性物質体の形成を記載する。５０ｕｌの２ｍｇ／ｍｌコンジュゲート溶液（ｐＨ８．２のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）を、５０ｕｌの２５ｍｇ／ｍｌ化学修飾アセチル化Ｃｏｎ  Ａ（ＡＣＡ）溶液（ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中）と、９６ウェルマイクロプレートの各ウェル内で混合した。各ウェルには、終濃度が０、５０、１００、２００、４００、８００および１６００ｍｇ／ｄｌとなるような漸増濃度の５．５ｕｌのグルコース濃縮液を入れた。最後のウェルには、効力の高いα−メチルマンノース糖類阻害薬５．５ｕｌを、終濃度が１００ｍＭとなるように入れた。次いで、漸増濃度のグルコースの存在下でＡＣＡ／コンジュゲート混合物が沈降する能力を評価した。この組合せが不溶性網目を形成した場合、ウェルの外観は、図２２に示されるように、白色で不透明となる（光透過率の減少または４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０の増大によって測定）。グルコース濃度が充分に高い場合、ウェル全体の内容物が可溶性で透明になる（光透過率の増大または４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０の減少によって測定）。この結果は、この具体的な製剤が、１００〜４００ｍｇ／ｄｌの濃度に対して最も応答性であり、インビボ試験の理想的な候補であることを明白に示す。さらに、後述するように、この具体的なコンジュゲートは、その生物学的効果を奏するために酵素的消化を必要とすることなく、非コンジュゲート型インスリンとほぼ同じ皮下生理活性を示す。
【０４８５】
実施例５２−全動物血清における同様の能力
この実施例では、実施例５１のグルコース応答性製剤の、グルコース濃度の関数としての種々の動物血清中のインビトロ溶解を記載する。
【０４８６】
２４×５０ｕｌの分散体を９６ウェルプレートに、指定量のグルコースを含有する特定動物種由来の血清５０ｕｌとともに、以下の形式に従って添加した。
【表１２】
2012516340.tif 000053
【０４８７】
実験開始時、各ウェルの外観は白色で不透明であった（光透過率の減少または４５０ｎｍにおける吸光度Ａ４５０の増大によって測定）。次いで、９６ウェルプレートを３７℃で６時間インキュベートした後、各ウェルのＡ４５０値を再度測定した。残留製剤％を、Ａ４５０（最終）をＡ４５０（初期）で除算し、１００を乗算することにより計算した。物質体がすべて溶解した場合、Ａ４５０値はゼロに近く、ほぼ０％残留を示す。あるいはまた、物質体が溶解しなかった場合は、Ａ４５０は初期値に近く、ほぼ１００％残留を示す。結果を図２２に示す。
【０４８８】
同じ条件下で試験したインスリン−グリコゲン製剤と比較した場合（図２０参照）、この新しい製剤は、低グルコース濃度でグルコース応答性であり、かつ溶解に対して抵抗性であっただけでなく、そのグルコース応答特性は、試験したすべての種においてほぼ同一であった（図２３参照）。
【０４８９】
実施例５３−ＡＣＡおよびＡＥＭ−２コンジュゲートを用いたグルコース応答性物質体
この実施例では、枠組構造としてＴＳＡＴ−Ｃ６、親和性リガンドとしてＡＥＭ、および薬物としてＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを用いて合成されたコンジュゲートを用いた、グルコース応答性の不溶性物質体を形成するための代替法を記載する。０．５０ｍｌの２．３ｍｇ／ｍｌコンジュゲート溶液（ｐＨ８．２の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ１４緩衝液）中）を遠心チューブに添加し、続いて、０．５００ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ  ＡＣＡ溶液（ｐＨ７．４の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ２４緩衝液）中）と速やかに混合すると、不溶性粒子の分散体が形成された。この分散体を室温で２０分間放置し、次いで、上清みから遠心分離によって分離した。得られたケークを、１．０ｍｌのｐＨ７．４の０．１５０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓ２４緩衝液）で５回洗浄した。最後の洗浄後、残留不溶物を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、残留粒子を再度、遠心分離によって単離し、１．０ｍｌのＳ２４中でさらに１回洗浄した。得られた不溶物を、総容量０．３０ｍｌ（Ｓ２４を使用）中に分散させ、後の試験のために確保した。このプロセスは、任意の量の所望の生成物を生成させるために直接的に規模拡大してもよい。
【０４９０】
実施例５４−非糖尿病ラットにおけるＩＰＧＴＴ実験
０．３００ｍｌの実施例５３で調製した物質体を、３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（体重４００〜５００ｇ）のそれぞれに皮下注射した。製剤の注射の前に、血中グルコース値を、尾静脈からの採血によりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、バックグラウンドインスリンレベルのアッセイのため、尾静脈からの採血により、ほぼ１００ｕｌの血清を得た。試験期間中は、飼料をラットケージから除いた。血清中および血中グルコース値は、注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で得た。注射の１２０分後、３８％ｗ／ｖグルコース溶液の腹腔内注射を、４ｇ／ｋｇ用量となるように注射した後、血清中および血中グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、および３００分の時点で得た。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、純粋なインスリンコンジュゲート溶液で作成した標準曲線を用いて測定した。このアッセイでは、内因性ラットインスリンは交差反応しない。したがって、得られた結果はいずれも、単に、外因的に投与されたインスリンコンジュゲートによるものであり、動物の内因性インスリンによるものではなかった（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキットの使用説明書を参照のこと（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ））。
【０４９１】
別個の実験において、０．３００ｍｌの生理食塩水を、３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（体重４００〜５００ｇ）のそれぞれに皮下注射した。生理食塩水の注射の前に、血中グルコース値を、尾静脈からの採血によりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、バックグラウンドインスリンレベルのアッセイのため、尾静脈からの採血により、ほぼ１００ｕｌの血清を得た。試験期間中は、飼料をラットケージから除いた。血清中および血中グルコース値は、注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で得た。注射の１２０分後、３８％ｗ／ｖグルコース溶液の腹腔内注射を、４ｇ／ｋｇ用量となるように注射した後、血清中および血中グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、および３００分の時点で得た。続いて、血清インスリン濃度を、ラットインスリンに特異的な市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。この実験の結果により、正常な非糖尿病ラットの膵臓によって生成されるグルコース応答性の内因性インスリン分泌が確立された。
【０４９２】
別個の実験において、５Ｕ／ｋｇの組換えヒトインスリン（ＲＨＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（体重４００〜５００ｇ）のそれぞれに皮下注射した。ＲＨＩの注射の前に、血中グルコース値を、尾静脈からの採血によりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、バックグラウンドインスリンレベルのアッセイのため、尾静脈からの採血により、ほぼ１００ｕｌの血清を得た。試験期間中は、飼料をラットケージから除いた。血清中および血中グルコース値は、注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で得た。注射の１２０分後、３８％ｗ／ｖグルコース溶液の腹腔内注射を、４ｇ／ｋｇ用量となるように注射した後、血清中および血中グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、および３００分の時点で得た。続いて、血清インスリン濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、純粋なインスリンコンジュゲート溶液で作成した標準曲線を用いて測定した。このアッセイでは、内因性ラットインスリンは交差反応しない。したがって、得られた結果はいずれも、単に、外因的に投与されたインスリンコンジュゲートによるものであり、動物の内因性インスリンによるものではなかった（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキットの使用説明書を参照のこと（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ））。
【０４９３】
図２４ａは、腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）後のベースラインからの血清インスリン濃度の約２倍の増大を示し、インビボでのグルコース応答性送達を示す。さらに、好都合には、ピーク−ベースライン放出プロフィールは、正常な非糖尿病ラットにおけるグルコース応答性の内因性インスリン生成と同等である（図２４ｂ参照）。最後に、図２５は、厳密に同じ条件下で注射および解析されたＲＨＩは、ＩＰＧＴＴ投与後、急速に吸収および排出され、最初の１２０分間に重度の低血糖が引き起こされ、測定可能なグルコース応答性プロフィールが示されないことを示す。
【０４９４】
実施例５５−非糖尿病ラットにおける正常血糖／高血糖クランプ実験
この実施例では、ラットのグルコースレベルを一定の値に維持し、グルコース濃度の関数として定常的な血清インスリン濃度状態を得るためのグルコースクランプの使用を記載する。０．３００ｍｌ（約０．６ｍｌ／ｋｇの体重）の実施例５３で調製した物質体を、４匹の正常な、頚静脈に二重カテーテル挿入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）（体重３００〜４００ｇ）のそれぞれに皮下注射した。各ラットの一方のカテーテルを、グルコース濃縮液を入れた可変速シリンジポンプに連結した。血中グルコース値を、尾静脈からの採血により５分毎に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、注射後、最初の２時間は、ラットが１００ｍｇ／ｄｌに維持されるように、シリンジポンプの静脈内注入速度を定期的に調整した。最初の２時間後、グルコース注入速度を４００ｍｇ／ｄｌに上げ、この速度でさらに２時間維持した。インスリン濃度（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）および血中グルコース値のための血清を定期的に収集した。図２６に示されるように、この物質は、１００〜４００ｍｇ／ｄｌの４倍のグルコース濃度の定常的増大状態（ｐ＜０．０５）、およびほぼ１：１で適合するグルコースレベルとインスリンレベル（ｐ＜０．０００１）を示す。
【０４９５】
実施例５６−非糖尿病のブタにおける正常血糖／高血糖クランプ実験およびラットで得られた結果との一致
実施例５３の具体的な物質体は、ラット血清とブタ血清間で溶解速度に有意差を示さなかったため、以下の実験を行ない、同様のグルコース応答性プロフィールがブタにおいて得られ得るかどうかを調べた。０．３００ｍｌ（約０．０１２ｍｌ／ｋｇの体重）の実施例５３で調製した物質体を、４匹の正常な、頚静脈にカテーテル挿入した、雄Ｙｕｃａｔａｎ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｅブタ（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ）（体重２０〜２５ｋｇ）のそれぞれに皮下注射した。各ブタのカテーテルを、グルコース濃縮液を入れた可変速シリンジポンプに連結した。血中グルコース値を、静脈内カテーテル採血により５分毎に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ血糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて測定し、注射後、最初の２時間は、ブタが６５ｍｇ／ｄｌに維持されるように、シリンジポンプの静脈内注入速度を定期的に調整した。最初の２時間後、グルコース注入速度を４００ｍｇ／ｄｌに上げ、この速度でさらに２時間維持した。インスリン濃度および血中グルコース値のための血清を定期的に収集した。インスリンコンジュゲートは内因性ブタインスリンと交差反応しないため、ブタにおいてインスリンを検出するための新しいアッセイ方法論を開発し、実施した。まず、ブタ由来および例示的なインスリンコンジュゲートの両方を、ほぼ同じ信号雑音比で検出するためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を開発した。このキットでの内因性ブタインスリンによるシグナルを、特定のブランクブタ血清試料をｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＲＩＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）およびインスリンＲＩＡキットに流すことにより測定した。得られた相関性を調べたら、血清試料のＲＩＡインスリンシグナル（あれば）は、内因性インスリンおよびコンジュゲート型インスリンの寄与に変換され得る。
【０４９６】
この方法を使用し、正味のコンジュゲート血清インスリンレベル（内因性ブタインスリンは既に差し引いてある）を示すために図２７を作成した。これは、この製剤が、６５〜４００ｍｇ／ｄｌの６倍のグルコース濃度の定常的増大状態（ｐ＜０．０５）、およびほぼ１：１で適合するグルコースレベルとインスリンレベル（ｐ＜０．０００１）を示すことを示す。したがって、この製剤は、ラットとブタの両方において、ほぼ同じグルコース応答性様式で機能を発揮する。
【０４９７】
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示した発明の実施により、当業者に自明となろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなし、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲に示されていることを意図する。
【図１】
2012516340.tif 000084
【図２】
2012516340.tif 000085
【図３（ａ）】
2012516340.tif 000086
【図３（ｂ）】
2012516340.tif 000087
【図４】
2012516340.tif 000088
【図５】
2012516340.tif 000089
【図６】
2012516340.tif 000090
【図７】
2012516340.tif 000091
【図８】
2012516340.tif 000092
【図９】
2012516340.tif 000093
【図１０】
2012516340.tif 000094
【図１１】
2012516340.tif 000095
【図１２】
2012516340.tif 000096
【図１３】
2012516340.tif 000097
【図１４】
2012516340.tif 000098
【図１５】
2012516340.tif 000099
【図１６】
2012516340.tif 000100
【図１７】
2012516340.tif 000101
【図１８】
2012516340.tif 000102
【図１９】
2012516340.tif 000103
【図２０】
2012516340.tif 000104
【図２１】
2012516340.tif 000105
【図２２】
2012516340.tif 000106
【図２３】
2012516340.tif 000107
【図２４】
2012516340.tif 000108
【図２５】
2012516340.tif 000109
【図２６】
2012516340.tif 000110
【図２７】
2012516340.tif 000111
【図２８】
2012516340.tif 000112
【図２９】
2012516340.tif 000113
【配列表】
2012516340000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月27日(2011.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ポリマー枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含むコンジュゲートと、
該コンジュゲートの親和性リガンドに非共有結合で結合し、それにより該コンジュゲートを架橋して架橋物質体を形成する多価架橋剤と
を含む架橋物質体であって、
該非ポリマー枠組構造の分子量が１０，０００Ｄａ未満であり、
該多価架橋剤と該親和性リガンド間の非共有結合が過剰量の標的分子の存在下で競合的に解離される、
架橋物質体。
【請求項２】
標的分子がグルコースであり、該少なくとも２種類の親和性リガンドが糖を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項３】
該少なくとも２種類の親和性リガンドが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースからなる群より選択される糖を含む、請求項２に記載の物質体。
【請求項４】
該少なくとも２種類の親和性リガンドが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含む、請求項２に記載の物質体。
【請求項５】
該コンジュゲートが、一般式（Ｉ）：
【化１】
2012516340.tif 000114
（式中：
各々の［（Ａ―Ｔ）］は、該コンジュゲート内に存在し得る分岐部を表し；
各々の（Ａ―Ｔ）は、該コンジュゲートの分岐内に存在し得る反復部を表し；
各々の―Ａ―は、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択され、場合により置換されている基であり；
各々のＴは、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、場合により置換されているＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、場合により独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており；
各々のＲは、独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
各々のＸは、独立して親和性リガンドであり；
各々のＬＢは、独立して共有結合であるか、またはＴとＸとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり；
各々のＷは、独立して薬物または検出可能な標識であり；
各々のＬＤは、独立して共有結合であるか、またはＴとＷとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
ｋは、２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定し；
ｑは、１〜４（両端を含む）の整数であり；
ｋ＋ｑは、３〜１２（両端を含む）の整数であり；
存在する各々のｐは、独立して１〜５（両端を含む）の整数であり；
存在する各々のｎは、独立して０〜５（両端を含む）の整数であり；
存在する各々のｍは、独立して１〜５（両端を含む）の整数であり；
存在する各々のｖは、独立して０〜５（両端を含む）の整数であり、各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎは≧１であり、存在する少なくとも１つのｖは≧１である）
を有する、請求項１〜４いずれか１項に記載の物質体。
【請求項６】
該コンジュゲートが式（ＶＩａ）：
【化５】
2012516340.tif 000115
のものである、請求項５に記載の物質体。
【請求項７】
該コンジュゲートが式（ＶＩａ−Ｉ）：
【化６】
2012516340.tif 000116
式（ＶＩａ−２）：
【化７】
2012516340.tif 000117
または、
式（ＶＩａ−３）：
【化８】
2012516340.tif 000118
のものである、請求項６に記載の物質体。
【請求項８】
該コンジュゲートが式（ＶＩｂ）：
【化９】
2012516340.tif 000119
のものである、請求項５に記載の物質体。
【請求項９】
該コンジュゲートが式（ＶＩｂ−Ｉ）：
【化１０】
2012516340.tif 000120
式（ＶＩｂ−２）：
【化１１】
2012516340.tif 000121
式（ＶＩｂ−３）：
【化１２】
2012516340.tif 000122
または、
式（ＶＩｂ−４）：
【化１３】
2012516340.tif 000123
のものである、請求項８に記載の物質体。
【請求項１０】
該コンジュゲートが式（ＶＩｃ）：
【化１４】
2012516340.tif 000124
のものである、請求項５に記載の物質体。
【請求項１１】
該コンジュゲートが、式（ＶＩｃ−Ｉ）：
【化１５】
2012516340.tif 000125
または、
式（ＶＩｃ−２）：
【化１６】
2012516340.tif 000126
のものである、請求項１０に記載の物質体。
【請求項１２】
Ｗが薬物である、請求項５に記載の物質体。
【請求項１３】
薬物が抗糖尿病薬である、請求項１２に記載の物質体。
【請求項１４】
薬物がインスリン分子である、請求項１２に記載の物質体。
【請求項１５】
Ｗが、コンジュゲートの枠組構造にＡ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされたインスリン分子である、請求項５に記載の物質体。
【請求項１６】
Ｗが、コンジュゲートの枠組構造にＢ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされたインスリン分子である、請求項５に記載の物質体。
【請求項１７】
Ｗが、コンジュゲートの枠組構造にＢ２９アミノ酸残基を介してコンジュゲートされたインスリン分子である、請求項５に記載の物質体。
【請求項１８】
多価架橋剤がレクチンを含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項１９】
レクチンが認識エレメントに共有結合されており、該認識エレメントは、標的分子および該コンジュゲートの親和性リガンドと、レクチンに対する結合に関して競合するものであり、該レクチンは、該認識エレメントに対してよりも該コンジュゲートの親和性リガンドに対して高い親和性を有するものである、請求項１８に記載の物質体。
【請求項２０】
標的分子がグルコースであり、該コンジュゲートの親和性リガンドと認識エレメントの両方が糖を含む、請求項１９に記載の物質体。
【請求項２１】
請求項１〜２０いずれか１項に記載の物質体を患者に投与することを含む方法。
【国際調査報告】
2012516340.tif 000127
2012516340.tif 000128
2012516340.tif 000129