(57)【要約】  本発明は、次の一般式（I）Hel1-HB-Hel2の、少なくとも１つの配列モチーフを含んでなるペプチドを医薬担体中に含有する、医薬組成物に関する。本発明はまた、この医薬組成物の使用および製造にも関わる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（I）の少なくとも1つの配列モチーフを有するペプチドを医薬担体中に含有する、医薬組成物であって、
Hel1 - HB - Hel2(I)
式中、
HBは1から5個までの連続したアミノ酸残基を有し、ヘリックスブレイカーの機能をもつ部分配列モチーフを表しており、
Hel1およびHel2は、基本的に、親水性残基およびプロリン以外の疎水性残基から選択される、5から15個までの連続したアミノ酸残基をそれぞれ有する、同一の、または異なる、部分配列モチーフであって、いずれもαヘリックスアームを形成することができるが、軸方向投影図においてヘリックスアームの少なくとも1つは、疎水性、および親水性のヘリックスハーフへの不完全な分離を有する、
前記医薬組成物。
【請求項２】
以下の一般式（I）の少なくとも1つの配列モチーフを有するペプチドを医薬担体中に含有する、医薬組成物であって
Hel1 - HB - Hel2(I)
式中、
HBは1から5個までの連続したアミノ酸残基を有し、ヘリックスブレイカーの機能をもつ部分配列モチーフを表しており、
Hel1およびHel2は、基本的に、親水性残基およびプロリン以外の疎水性残基から選択される、5から15個までの連続したアミノ酸残基をそれぞれ有する、同一の、または異なる、部分配列モチーフであって、いずれもαヘリックスアームを形成することができるが、
そのペプチドは、50％（v/v）トリフルオロエタノール、pH 7.0中で約7から98％まで、または30 mM SDS、pH 7.0中で約8から60％までの、いずれの場合もCD分光法により測定されるαヘリックス性％の値を有する、
前記医薬組成物。
【請求項３】
配列番号1に記載の配列もしくは反復配列モチーフを有する少なくとも1つのペプチド、および/またはその変異体もしくは誘導体を医薬担体中に含有する、医薬組成物であって、
X1 X2K X3 X4 X5KIP X10 KFX6X7 X8 AX9KF（配列番号１）
配列中、
X10 は、ペプチド結合、または任意の1つもしくは2つの塩基性もしくは疎水性アミノ酸残基、または1つもしくは2つのプロリン残基であり、
X1 からX9 は、プロリン以外の、任意の塩基性もしくは疎水性アミノ酸残基であって；
この反復配列モチーフは同一であっても異なっていてもよい；
前記医薬組成物。
【請求項４】
配列番号2に記載の配列もしくは反復配列モチーフを有する少なくとも1つのペプチド、および/またはその変異体もしくは誘導体を含有する、請求項１〜３のいずれか1つに記載の組成物であって、
X1 X2K X3 X4 X5KIP X11 X12 KFX6X7 X8 AX9KF（配列番号２）
配列中、
X1 はリジン、アルギニンもしくはフェニルアラニン、
X2 はリジンもしくはトリプトファン、
X3 はロイシンもしくはリジン、
X4 はフェニルアラニンもしくはロイシン、
X5 はロイシンもしくはリジン、
X6 はロイシンもしくはリジン、
X7 はヒスチジンもしくはリジン、
X8 はアラニン、ロイシン、バリンもしくはセリン、
X9 はロイシンもしくはリジン、
X11 はプロリンもしくは化学結合、
X12 はプロリンもしくは化学結合であって、
反復配列モチーフは同一もしくは異なっている、
前記組成物。
【請求項５】
配列番号3に記載の配列もしくは反復配列モチーフを有するペプチド、および/またはその変異体もしくは誘導体を含有する、請求項４に記載の組成物。
KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2    （配列番号３）
【請求項６】
一般式（I）の、または配列番号1、2もしくは3に記載の多数のペプチド、またはそれらのバリアントもしくは誘導体がリンカー基を介して互いにペプチド結合している、反復配列モチーフを有するペプチドを含有する、請求項１〜５のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７】
リンカーが、好ましくはアラニン、グリシン、スレオニンおよびセリンから選択される、同一の、または異なる、1から10個の連続したアミノ酸残基を含んでいる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ペプチドのC末端カルボキシル基がアミド化されている、請求項１〜７のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項９】
標準条件下で測定された約1500から0.1μMまでの範囲のマラセチア・フルフルに関する最低阻害濃度を有する、上記の少なくとも１つのペプチドを含有する、請求項１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの医薬品添加物もしくは活性物質、および少なくとも1つの、請求項１〜９のいずれか１つに記載のペプチドの融合産物を含有する組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの他の医薬活性物質を追加して含有する、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの抗炎症活性物質を追加して含有する、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１３】
好ましくない細菌の増殖および/または活動を阻害するために抗菌活性物質を追加して含有する、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１４】
皮脂調節物質を追加して含有する、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１５】
ペプチドが、完成した組成物の総重量に対する重量比で、0.0001から50％までの割合で存在する、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項１〜９のいずれか1つに記載のペプチド、または請求項１０に記載の融合ポリペプチドであって、必要に応じて少なくとも１つの他の抗真菌もしくは抗細菌活性物質と組み合わせることができる、前記ペプチドまたは融合ポリペプチド。
【請求項１７】
真菌症を治療するための、請求項１６に記載のペプチドまたは融合ペプチド。
【請求項１８】
皮膚真菌症を治療するための、請求項１６に記載のペプチドまたは融合ペプチド。
【請求項１９】
皮膚、爪、毛髪もしくは粘膜の細菌感染を治療するための、請求項１６に記載のペプチドまたは融合ペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか１つに記載のペプチドを、少なくとも１つの従来の医薬品添加物、および必要に応じて追加の医薬活性物質とともに、望ましい投与形態に調剤する、請求項１〜１５のいずれか1つに記載の医薬組成物を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真菌性および抗細菌性組成物として特に局所的な形で用途のある、医薬組成物における特定のペプチドの使用に関する。本発明はさらに、そうした組成物の製造、それらの製造、およびそうしたペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
さまざまな抗菌性ペプチドがすでに文献に記載され、総説にまとめられている（Hancock, R.E.W. and Lehrer, R. 1998 in Trends in Biotechnology, 16: 82-88; Hancock, R.E.W. and Sahl, H.G. 2006 in Nature Biotechnology, 24: 1551-1557）。
【０００３】
融合ペプチドは、2つの活性ペプチドを1つに合わせたものであって、同様に文献に記載されている。Wadeらは、Hyalophora cecropia（北米産のヤママユガの一種）由来のセクロピンAおよびハチ毒メリチンのさまざまな融合物の抗細菌作用を報告している（Wade, D. et al., 1992, International Journal of Peptide and Protein Research, 40: 429-436）。Shinらは、Hyalophora cecropia由来セクロピンAおよびアフリカツメガエル（Xenopus laevis）由来のマゲイニン2からなる、20アミノ酸で構成される融合ペプチドの抗細菌作用を記載している。セクロピンAは37アミノ酸からなり、グラム陰性細菌に対して活性を示すが、グラム陽性細菌に対してはそれより弱い活性を示す。マゲイニン2は23アミノ酸からなり、細菌に対して活性があるが、腫瘍細胞株に対しても活性である。セクロピンAおよびメリチンからなる融合物と比べて、セクロピンおよびマゲイニンからなる融合物は、非常に弱い溶血作用、ならびに大腸菌（Eschrichia coli）および枯草菌（Bacillus subtilis）に対する抗菌活性を示す（Shin, S.Y.L Kang, J.H., Lee, M.K., Kim, S.Y., Kim, Y., Hahm, K.S., 1998, Biochemistry and Molecular Biology International, 44: 1119-1126）。
【０００４】
US 2003/0096745 A1およびUS 6,800,727 B2は、20アミノ酸からなる上記融合ペプチド、ならびに上記融合物のバリアントの権利を主張しているが、このバリアントは、アミノ酸、特に正電荷を持つアミノ酸および疎水性アミノ酸の置換の結果として、正電荷が強まり、疎水性の高まったバリアントである。
【０００５】
このセクロピンA-マゲイニン2融合ペプチドはさらに開発が行われ、Shinらによって1999年に報告された。ここで、P18構築物（HT2、配列番号3）は出発融合物より低い溶血作用を有するが、大腸菌および枯草菌に対する抗細菌活性は損なわれていないことが明らかになった（Shin et al. 1999 Journal of Peptide Research, 53: 82-90）。
【０００６】
それに加えて、Shinらは2001年に、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）およびバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）に対するP18構築物および類似構築物の活性も明らかにした（Shin et al., 2001, Journal of Peptide Research, 58: 504-514）。
【０００７】
P18の真菌に対する有効性に関する最初の研究は、2002年1月にShinらによって発表された。マゲイニン2より優れた、P18ペプチドのカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する有効性がここで見いだされた。さらに、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）に対するP18の抗菌作用が明らかになった（Shin et al., 2002, Biochemical and Biophysical Research Communications, 290: 558-562）。
【０００８】
Leeらは、2002年に、P18および2つの逆向きペプチドの、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichopsoron beigelii）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）に対する作用、ならびに化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）およびセラチア（Serratia marcescens）に対する作用も報告した（Lee et al., 2002, Protein and Peptide Letters, 9: 395-402）。
【０００９】
カンジダ・アルビカンスに加えて、子嚢菌アスペルギルス・フラブス、フザリウム・オキシスポルムおよび担子菌トリコスポロン・ベイゲリがP18およびそのバリアントによって阻害された。しかしながら、もっとも有効な阻害はP18で達成された（Lee et al., 2004, Biotechnology Letters, 26: 337-341）。脂質要求性真菌、特にマラセチア（Malassezia）属の阻害に関する教示はない。既知の市販の抗真菌物質と比較して、より有効なセクロピン-マゲイニン融合物の作用を示す実験の記述も見られない。
【００１０】
WO-A-00/032220は、ふけ治療用の抗真菌活性物質として真菌ポリペプチドを使用することを記載する。ここでも、先行技術の抗真菌活性物質との本質的な比較はなされていない。
【００１１】
US 2003/0096745は、特定の微生物に対して抗細菌および抗真菌活性を有する、配列KWKKLLKKPPPLLKKLLKKLのポリペプチドを記載する。抗真菌活性は、カンジダ・アルビカンスおよびトリコスポロン・ベイゲリに対して示された。
【００１２】
Shinらは、配列KWKKLPKKLLKLL-NH2を有するペプチドの、大腸菌、緑膿菌、ネズミチフス菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、および表皮ブドウ球菌に対する有効性を記載している。真菌に対する有効性は未検討である（Shin et al., 2004, Biotechnology Letters, 26:735-739）。
【００１３】
市販されているふけ治療用の活性物質ZPT（ジンクピリチオン）の抗細菌および抗真菌作用が知られている（WO 01/00151, US 3,236,733, Khattar, M.M. et al,. 1988, Journal of Applied Biotechnology, 64:265-272, Carol, J.C. et al., 1978, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 14:60-68）。しかしながら、その作用は比較的長時間接触した後にはじめて生じる。
【００１４】
しかしながら、使用中の抗菌物質、特に常用される抗菌物質は、ヒトにおいて過敏症を引き起こし、健康を損なうことも起こりうる。過敏症は、皮膚の発赤、刺激、または感作と考えられる。人体への全身性の取り込みは、身体機能の障害をもたらす可能性がある。なかでも、一部の抗菌物質の常用は、濃縮をもたらすことがある。よく知られた例がパラベンである（Dabre et al. ,2004, Journal of Applied Toxicology, 24: 5-13）。塗布によって人体または環境中に蓄積される可能性もある。
【００１５】
それに加えて、抗菌物質の過剰で不適切な使用は、標的生物において絶えず耐性を引き起こしている。
【００１６】
したがって、第一に高い抗真菌効果を有し、第二に低い一般細胞毒性を有する、新規抗菌性医薬組成物を提供する必要があり、その結果、こうした組成物を治療のために使用することが可能となる。
【００１７】
したがって、真菌症、特に皮膚真菌症治療のための、副作用レベルの低い新規の有効な活性物質を提供することを本発明の目的としたが、この活性物質は外部細菌感染の治療、たとえば皮膚、爪、毛髪および粘膜の治療にも適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】WO-A-00/032220
【特許文献２】US 2003/0096745
【特許文献３】WO 01/00151
【特許文献４】US 3,236,733
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Hancock, R.E.W. and Lehrer, R. 1998 in Trends in Biotechnology, 16: 82-88
【非特許文献２】Hancock, R.E.W. and Sahl, H.G. 2006 in Nature Biotechnology, 24: 1551-1557
【非特許文献３】Wade, D. et al., 1992, International Journal of Peptide and Protein Research, 40: 429-436
【非特許文献４】Shin, S.Y.L Kang, J.H., Lee, M.K., Kim, S.Y., Kim, Y., Hahm, K.S., 1998, Biochemistry and Molecular Biology International, 44: 1119-1126
【非特許文献５】Shin et al. 1999 Journal of Peptide Research, 53: 82-90
【非特許文献６】Shin et al., 2001, Journal of Peptide Research, 58: 504-514
【非特許文献７】Shin et al., 2002, Biochemical and Biophysical Research Communications, 290: 558-562
【非特許文献８】Lee et al., 2002, Protein and Peptide Letters, 9: 395-402
【非特許文献９】Lee et al., 2004, Biotechnology Letters, 26: 337-341
【非特許文献１０】Shin et al., 2004, Biotechnology Letters, 26:735-739
【非特許文献１１】Khattar, M.M. et al,. 1988, Journal of Applied Biotechnology, 64:265-272,
【非特許文献１２】Carol, J.C. et al., 1978, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 14:60-68
【非特許文献１３】Dabre et al. ,2004, Journal of Applied Toxicology, 24: 5-13
【発明の概要】
【００２０】
上記の目的は、添付の特許請求の範囲に明記された医薬組成物によって達成された。
【００２１】
発明の詳細な説明
1. 一般的定義
「ヘリックスブレイカー」は、ペプチド鎖の一部の領域においてヘリックス二次構造の形成を阻害する、発明のペプチド内部の一部分を意味する。しかしながら、ヘリックスブレイカーから比較的遠く離れたヘリックス構造の形成は抑制されない。典型的なヘリックスブレイカーは当業者に知られている。より具体的には、アミノ酸プロリンが、ヘリックスブレイカーの特性を有するペプチドユニットである。同じことがプロリン含有ペプチド断片にも当てはまる。
【００２２】
「疎水性アミノ酸」は、本発明との関連において、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンである。
【００２３】
「親水性アミノ酸」は、本発明との関連において、特に極性側鎖を有するアミノ酸、たとえばセリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン；酸性アミノ酸、たとえばアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに特に塩基性アミノ酸、たとえばリジン、アルギニンおよびヒスチジンである。
【００２４】
「αヘリックスアームを形成する能力のある」配列は、適当な条件下でヘリックス構造の形成を促進する配列である。ヘリックス構造の形成に適した人工的な条件は、たとえば、αヘリックス形成を促進する、トリフルオロエタノールおよびSDSをベースとする溶媒系である。
【００２５】
「αヘリックス性パーセンテージ」は、100μg/mlのペプチド濃度で、光路長1 mmの分析セルを用いて円偏光二色性（CD）分析で得られた測定値を意味すると理解され、ここで分析されるべきサンプルは、標準条件下、たとえば、特に10 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0中50％（v/v）トリフルオロエタノール、または10 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0中30 mM SDSで得られる。計算は次の式にしたがって実行される：
ヘリックス性％ = 100 ([Θ]  -  [Θ]0)/[Θ]100
式中
[Θ]  は、222 nmで実験上測定された楕円率である；
[Θ]0  は、222 nmおよびヘリックス性0％での楕円率である；ならびに
[Θ]100  は、222 nmおよびヘリックス性100％での楕円率である。
【００２６】
適当な分析条件はたとえば、Shin et al., 1999, Journal of Peptide Research, 53:82-90に記載されており、これは参考として本明細書に含めるものとする。
【００２７】
「反復配列モチーフ」は、好ましくは同一のペプチド配列が直線的に並んでいることを意味するものと理解され、そのペプチド配列は互いに直接、または間接的に、すなわち本明細書で定義される「リンカー基」を介して、連結されている。
【００２８】
「変異体」および「バリアント」という用語は、同義語として使用される。これらの用語は特に、後に、より詳細に説明するように「機能的な」または「機能的に同等な」変更物であって、それでもなお抗真菌剤として望ましい活性、およびそれによる有用性を示す前記変更物を意味すると理解される。
【００２９】
「融合産物」は、ペプチドとタンパク質の共有結合物もしくは非共有結合物（「融合ペプチド」）ならびにペプチドとポリマーの共有結合物もしくは非共有結合物（「融合ポリマー」）を意味すると考えられる。相互に連結された構成要素は、不可逆的または可逆的に互いに結合しており、すなわち、生物学的に、特に酵素的に、切断することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
2. 好ましい実施形態
本発明は第一に、下記の一般式の少なくとも1つの配列モチーフを有するペプチドを医薬担体中に含有する、医薬組成物に関するものであって
Hel1 - HB - Hel2(I)
式中、
"HB"は1から5個まで、特に1、2もしくは3個の連続したアミノ酸残基を有し、ヘリックスブレイカーの機能をもつ部分配列モチーフを表す、ならびに
"Hel1"および"Hel2"は、基本的に、親水性の、特に塩基性の残基、およびプロリン以外の疎水性残基から選択される、5から15個まで、たとえば6から12個まで、特に8、9もしくは10個の連続したアミノ酸残基をそれぞれ有する、同一の、または異なる、部分配列モチーフであって、いずれもαヘリックスアームを形成することができるが、軸方向投影図、すなわち「ヘリカルホィール」図に対応する平面図においてヘリックスアームの少なくとも1つは、疎水性、特に塩基性、および親水性のヘリックスハーフへの不完全な分離を有する。一方のタイプ（疎水性もしくは親水性）の半分の1、2、3もしくは4位をもう一方のタイプ（親水性もしくは疎水性）のアミノ酸残基で占めることができる。
【００３１】
これに対して、完全に分離された疎水性および親水性ヘリックスハーフは、もっぱら上記の疎水性および親水性アミノ酸残基からなる。完全な親水性/疎水性分離を有するヘリックスの一例が、配列モチーフKLKKLLKKである。
【００３２】
1つの「ヘリックスハーフ」は、必ずしも数字上の半分、すなわちヘリックス中のアミノ酸の総数の半分を意味すると理解されるべきでない。2つの半分の数字上のサイズは、たとえば1から3アミノ酸だけ違っていてもよい。
【００３３】
本発明は第二に、以下の一般式の少なくとも1つの配列モチーフを有するペプチドを医薬担体中に含有する、医薬組成物に関するものであって
Hel1 - HB - Hel2(I)
式中、
"HB"は1から5個まで、特に1、2もしくは3個の連続したアミノ酸残基を有し、ヘリックスブレイカーの機能をもつ部分配列モチーフを表す、ならびに
"Hel1"および"Hel2"は、基本的に、親水性、特に塩基性の残基、およびプロリン以外の疎水性残基から選択される、5から15個まで、たとえば6から12個まで、特に8、9もしくは10個の連続したアミノ酸残基をそれぞれ有する、同一の、または異なる、部分配列モチーフであって、いずれもαヘリックスアームを形成することができるが、そのペプチドは、50％（v/v）トリフルオロエタノール、pH 7.0中、約7から98％まで、たとえば30から80％まで、もしくは30から60％までのαヘリックス性パーセンテージ（ヘリックス性％）を有する；または30 mM SDS、pH 7.0中で約8から60％まで、もしくは12から55％まで、もしくは12から40％までのヘリックス性％の値を有するものであって、いずれの場合もCD分光法により測定される。
【００３４】
本発明は第三に、配列番号1に記載の配列もしくは反復配列モチーフを有する少なくとも1つのペプチド、および/または、その変異体もしくは誘導体を医薬担体中に含有する、医薬組成物に関するものであって、
X1 X2K X3 X4 X5KIP X10 KFX6X7 X8 AX9KF（配列番号１）
配列中、
X10 は、ペプチド結合、または任意の1つもしくは2つの塩基性もしくは疎水性アミノ酸残基、または1つもしくは2つのプロリン残基であり、
X1 からX9 は、プロリン以外の、任意の塩基性もしくは疎水性アミノ酸残基であって；
この反復配列モチーフは同一であっても異なっていてもよい。
【００３５】
より詳細には、本発明は、配列番号2
X1 X2K X3 X4 X5KIP X11 X12 KFX6X7 X8 AX9KF（配列番号２）
に記載の配列もしくは反復配列モチーフを有する少なくとも1つのペプチド、および/またはその変異体もしくは誘導体を含有する、上記の組成物に関するものであって、
この配列中、
X1 はリジン、アルギニンもしくはフェニルアラニン、
X2 はリジンもしくはトリプトファン、
X3 はロイシンもしくはリジン、
X4 はフェニルアラニンもしくはロイシン、
X5 はロイシンもしくはリジン、
X6 はロイシンもしくはリジン、
X7 はヒスチジンもしくはリジン、
X8 はアラニン、ロイシン、バリンもしくはセリン、
X9 はロイシンもしくはリジン、
X11 はプロリンもしくは化学結合、
X12 はプロリンもしくは化学結合であって、
反復配列モチーフは同一もしくは異なる。
【００３６】
配列番号3に記載の上記配列もしくは反復配列モチーフの、限定的でない例には、
P18         KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2    （配列番号３）
RP18        RWKLFKKIPKFLHLAKKF        （配列番号４）
KKFP18      FKKLFKKIPKFLHAAKKF        （配列番号５）
KKLP18      KWKLLKKIPKFKKLALKF        （配列番号６）
AP18        KWKLFKKIPKFLHAAKKF        （配列番号７）
KFLP18      KWKKFLKIPKFLHAAKKF        （配列番号８）
KLLP18      KWKKLLKIPKFLHAAKKF        （配列番号９）
および/またはその変異体もしくは誘導体がある。
【００３７】
本発明の組成物は、特に、反復配列モチーフを有するペプチドを含有することができるが、ここにおいて、一般式Iの、もしくは配列番号1から9に記載の、多数のペプチド、たとえば特に2個から10個の、もしくは3個から5個のペプチド、またはその変異体もしくは誘導体は、互いにリンカー基を介してペプチド結合している。
【００３８】
こうした「リンカー基」は、好ましくはアラニン、グリシン、スレオニンおよびセリンから選択される、1から10個までの同一の、もしくは異なる、連続したアミノ酸残基、たとえば、GGSGGT、GGSGGS、またはポリアラニンリンカーおよびポリグリシンリンカー（この「ポリ」は2から10個までを表す）とすることができるが；Asp、Pro、AsnおよびGlyから選択される前記アミノ酸残基、たとえばAsp-ProおよびAsn-Glyであってもよい。
【００３９】
他に、C末端カルボキシル基がアミド化されたペプチドを使用することも可能である。
【００４０】
本発明はまた、少なくとも1つの、好ましくはペプチド性の、医薬品添加物もしくは活性物質、および少なくとも1つの上記ペプチドからなる、適宜切断可能な融合ポリペプチドを含有する組成物を提供する。こうした活性物質の例としては、ヒドロホビン、ケラチン結合ドメイン、アルブミン、ラクトフェリン、アビジン、抗体、好ましくはケラチン結合抗体、表面結合ペプチド、好ましくはケラチン結合ペプチド、絹タンパク質、クモの糸のタンパク質、好ましくはC16、コラーゲン、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、エラスチン、他の構造タンパク質、好ましくは毛髪および皮膚の構造タンパク質、皮膚もしくは毛髪の構造タンパク質に対する結合タンパク質、エナメル質形成タンパク質、アメロゲニン、エナメル質形成タンパク質の結合タンパク質、アメロゲニンの結合タンパク質があり、これらの融合物は、いつまでもその状態を保つかもしれないが、切断可能な場合もある。
【００４１】
本発明はまた、少なくとも1つの医薬品ポリマーおよび少なくとも1つの上記ペプチドからなる融合ポリマーを提供する。こうしたポリマーの例には、ポリヒドロキシアルカン酸、ヒアルロン酸、グルカン、スクレログルカン、セルロース、キサンタン、ポリエチレングリコール、ポリグリセロール、ポリリジンおよびシリコーンがあるが、これらは共有結合もしくは非共有結合した形で存在する。
【００４２】
上記ペプチドが、パンテノール、ビサボロール、レチノール、カロテノイド、タンパク質加水分解物などの薬剤活性成分と共有結合した形で組成物に含まれることも考えられる。
【００４３】
本発明はまた、少なくとももう1つの薬剤活性物質、たとえば、少なくとも1つの抗炎症活性物質、望ましくない細菌（たとえば、特にマラセチア・フルフル（Malassezia furfur））の増殖および/または病態生理学的活性を阻害するための抗菌活性物質、ならびに/または皮脂制御活性物質を追加して含有する、上記組成物を提供する。
【００４４】
抗炎症活性物質の例としては、コルチコイド（たとえば、コルチゾン）、アザチオプリン、ビサボロール、シクロスポリンA、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、パンテノール、カモミール抽出物もしくはアロエ抽出物、消炎剤、細胞増殖抑制剤などがある。
【００４５】
抗菌活性物質の例としては、当業者に知られている典型的な防腐剤、たとえばアルコール類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル、イミダゾリジニル尿素、ホルムアルデヒド、ソルビン酸、安息香酸、サリチル酸などが挙げられる。上記の脱臭物質は、たとえば、リシノール酸亜鉛、トリクロサン、ウンデシレン酸アルキロールアミド、クエン酸トリエチル、クロルヘキシジンなどである（下記3.5項も参照されたい）。加えて、それにはアゾ-ル類（ケトコナゾール、クリンバゾール）、ジンクピリチオン、硫化セレンなどが含まれる。
【００４６】
皮脂制御活性物質の例には、アゼライン酸、アゼロイルジグリシンカリウム、セバシン酸、10-ヒドロキシデカン酸、1,10-デカンジオール、塩化アルミニウムなどのアルミニウム塩がある。
【００４７】
本発明はさらに、薬剤として、特に真菌症、具体的には皮膚真菌症治療用の薬剤として、および細菌感染症、特に外部感染症、たとえば皮膚、爪、毛髪または粘膜の感染症の治療用薬剤としても使用される上記ペプチドを提供する。
【００４８】
こうした薬剤は、抗菌活性ペプチドに加えて、たとえば抗生物質のような薬剤活性物質を追加して含んでいてもよく、これらは抗菌活性ペプチドと同時に投与することも、時間間隔をおいて投与することもできる。
【００４９】
本発明のペプチド性活性物質は、抗菌効果および抗真菌効果を有する。こうした活性物質は、抗真菌作用の非常に広範なスペクトルを有しており、特に皮膚糸状菌および酵母様真菌に対して、さらに二相性真菌に対しても抗真菌作用を有するが、例を挙げると、カンジダ属（Candida）の各種、たとえばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、Candida dubliniensis、Candida famata、Candida glabrata、Candida guilliermondii、Candida kefyr、Candida krusei、Candida lusitaniae、Candida parapsilosis、Candida tropicalisなど、表皮菌属（Epidermophyton）の各種、たとえばエピデルモフィトン・フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、アスペルギルス属（Aspergillus）の各種、たとえばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）およびアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）など、白癬菌属（Trichophyton）の各種、たとえばトリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）、Trichophyton ajelloi、トリコフィトン・エクイナム（Trichophyton equinum）、Trichophyton erinacei、トリコフィトン・インターディジターレ（Trichophyton interdigitale）、Trichophyton megninii、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、Trichophyton quinckeanum、トリコフィトン・ショーエンレニイイ（Trichophyton schoenleinii）、トリコフィトン・ソウダネンセ（Trichophyton soudanense）、Trichophyton terrestre、トリコフィトン・ヴェルコスム（Trichophyton verrucosum）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton violaceum）など、小胞子菌属（Microsporum）の各種、たとえばマイクロスポルム・フェリネウム（Microsporum felineum）、マイクロスポルム・アゥドウイニイイ（Microsporum audouinii）、マイクロスポルム・キャニス（Microsporum canis）、Microsporum cookei、Microsporum distortum、Microsporum ferrugineum、Microsporum gallinae、マイクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、Microsporum nanumおよびMicrosporum racemosumなど、ならびにTorulopsis glabrataのような種に対して、さらにマラセチア（Malassezia）属の各種、たとえばマラセチア・フルフル（Malassezia furfur）、マセラチア・グロボーサ（Malassezia globosa）、マセラチア・オブツサ（Malassezia obtusa）、マセラチア・パキデルマティス（Malassezia pachydermatis）、マセラチア・レストリカ（Malassezia restricta）、マセラチア・スルーフィアエ（Malassezia slooffiae）およびマセラチア・シンポディアリス（Malassezia sympodialis）に対しても、抗真菌作用を有する。トリコスポロン属（Trichosporon ssp.）、ピエドライア・ホルタエ（Piedraia hortae）、およびさまざまな黒色真菌にも言及すべきであろう。これらの微生物の一覧は、制御できる菌を限定するものではなく、単に実例となる特徴を示しているにすぎない。
【００５０】
したがって、本発明の医薬組成物は、列挙した真菌病原体と関連する次の疾患に対して有効であると考えられる：アスペルギルス症、気管支肺アスペルギルス症（ABPA）、カンジダ疹、カンジダ症、外因性アレルギー性肺胞炎（EAA）、性器真菌症（外陰部真菌症、膣真菌症）、ミクロスポルム症、粘膜炎/鵞口瘡、爪および爪囲カンジダ症、爪真菌症、砂毛症、癜風、毛孔性粃糠疹、頭部白癬、体部白癬、格闘家白癬、爪白癬、白癬（trichophytia）、接合菌症、手白癬、足白癬。
【００５１】
本発明のペプチド性活性物質は、ブドウ球菌、たとえば表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）など、連鎖球菌、たとえばストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）および化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）など、プロピオン酸菌、たとえばプロピオニバクテリウム・アクネス（アクネ菌）（Propionibacterium acnes）およびプロピオニバクテリウム・グラヌロスム（Propionibacterium granulosum）などに対して抗菌作用を有するが、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ならびに腸内細菌科（Enterobacteriaceae）のたとえば大腸菌（Escherichia coli）、赤痢菌（Shigella ssp.）、腸球菌（Enterococcus ssp）およびクレブシエラ属の菌に対しても抗菌作用を有する。これらの微生物の一覧は、制御可能な細菌を限定するものではなく、単に実例となる特徴を示しているにすぎない。
【００５２】
したがって、本発明の医薬組成物は、列挙した細菌病原体に関連する以下の疾患に対して有効であると考えられる：面皰、膿瘍、尋常性ざ瘡、化膿性分泌物、せつ（boils)、膿疱、皮膚および粘膜の膿の出る感染症、剥脱性皮膚炎、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、カリエス、異常生成物および皮膚炎。
【００５３】
それに加えて、脂漏性湿疹、アレルギー性接触性湿疹、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、嚢胞性線維症、開放創または慢性的な傷のある患者は、こうした疾患が、たとえばバイオフィルム内での、上記生物による感染と追加的に関連していることが多いので、本発明の医薬組成物による治療から恩恵を受けることができるとみなしうる。
【００５４】
これらの疾患の一覧は限定するものではなく、実例となる特徴を示しているにすぎない。
【００５５】
本発明のペプチド性活性物質は迅速な効果を有する。
【００５６】
ヒトの医学分野での適応症の例としては、たとえばトリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）および他の白癬菌属（Trichophyton）、小胞子菌属（Microepporum）およびエピデルモフィトン・フロッコーズム、酵母様真菌および二相性真菌によって、ならびにカビによっても引き起こされる、皮膚真菌症および全身性真菌症を挙げることができる。
【００５７】
動物医学における適応分野には、たとえば、すべての皮膚真菌症および全身性真菌症を含めることができるが、特に上記病原体によって引き起こされる真菌症が含まれる。
【００５８】
本発明には、毒性のない不活性な、製薬上好適な担体に加えて、1つもしくは複数の本発明の活性物質を含有する医薬製剤、または1つもしくは複数の本発明の活性物質からなる医薬製剤が含まれる。
【００５９】
本発明はまた投薬単位の医薬製剤を含んでいる。これは、製剤が１つ１つの部分、たとえば、錠剤、コーティング錠、カプセル、丸剤、座剤およびアンプルの形をとることを意味しており、その活性成分含量は単回用量の分数または倍数に相当する。投薬単位は、たとえば、単回用量の1、2、3もしくは4倍、または単回用量の1/2、1/3もしくは1/4を含有することができる。単回用量は、好ましくは、1回の投与で与えられ、通常、1日用量の全量、または1日用量の1/2、1/3もしくは1/4に相当する量の活性物質を含んでいる。
【００６０】
毒性のない不活性な、製薬上好適な担体は、あらゆる種類の、固体、半固体、もしくは液体の希釈剤、賦形剤もしくは製剤補助剤を意味すると考えられる。
【００６１】
好ましい医薬製剤には、錠剤、コーティング錠、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、座剤、液剤、懸濁剤および乳剤、泥膏（パスタ剤）、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、散剤またはスプレー剤がある。
【００６２】
錠剤、コーティング錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、活性物質の他に、通常の担体、たとえば、(a)賦形剤および増量剤、たとえば、デンプン、乳糖、甘蔗糖、グルコース、マンニトールおよびシリカ、(b)結合剤、たとえば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、(c)保湿剤、たとえば、グリセロール、(d)崩壊剤、たとえば、寒天、炭酸カルシウムおよび炭酸ナトリウム、(e)溶解遅延剤、たとえばパラフィン、および(f)吸着促進剤、たとえば、第4級アンモニウム化合物、(g)湿潤剤、たとえば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、(h)吸着剤、たとえば、カオリンおよびベントナイト、ならびに(i)滑沢剤、たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウムおよび固体ポリエチレングリコール、または(a)から(i)に記載された物質の混合物も含有することができる。
【００６３】
錠剤、コーティング錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、通常のコーティングおよびシェル（乳白剤を含有してもよい）を備えており、必要に応じて放出を遅らせることで、活性物質を腸管の特定部分内にだけ、またはそこに優先的に放出するような組成物を有することができるが、そのためにたとえば、ポリマー物質およびワックスを包埋組成物として使用することができる。
【００６４】
活性物質は、必要に応じて1つもしくは複数の上記担体とともに、マイクロカプセル化された形をとることもできる。
【００６５】
座剤は、活性物質に加えて、通常の水溶性もしくは水不溶性担体、たとえば、ポリエチレングリコール、脂肪（たとえばカカオ脂）、および高級エステル類（たとえばC16脂肪酸とC14アルコール）、またはこれらの物質の混合物を含有することができる。
【００６６】
軟膏剤、泥膏（パスタ剤）、クリーム剤およびゲル剤は、活性物質に加えて、通常の担体、たとえば、動物性および植物性脂肪、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの物質の混合物を含有することができる。
【００６７】
散剤およびスプレー剤は、活性物質に加えて、通常の担体、たとえば、乳糖、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有することができる；スプレー剤はさらに通常の噴射剤、たとえばヒドロクロロフルオロカーボンを含有することができる。
【００６８】
液剤および乳剤は、活性物質に加えて、通常の担体、たとえば溶剤、溶解遅延剤および乳化剤、たとえば、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ穀粒油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油、グリセロール、グリセロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタン脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物を含有することができる。
【００６９】
非経口投与用には、液剤および乳剤はまた、無菌の等張状態とすることができる。
【００７０】
懸濁液は、活性物質に加えて、通常の担体、たとえば液体希釈剤、たとえば、水、エチルアルコール、プロピルアルコール、懸濁溶媒、たとえば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物を含有することができる。
【００７１】
言及された製剤形態はまた、着色剤、防腐剤、および矯臭矯味剤、たとえばペパーミント油およびユーカリ油、ならびに甘味剤、たとえはサッカリンを含有することができる。
【００７２】
治療上活性のある化合物は、上記医薬製剤中に好ましくは、全混合物の約0.0001から99.5重量％まで、そして好ましくは0.01から95重量％までの濃度で存在すべきである。
【００７３】
上記で詳述した医薬製剤は、本発明の活性物質とは別に、他の医薬活性物質も含有することができる。
【００７４】
以下の活性物質と組み合わせることで、本発明のペプチド性活性物質のプラスの効果が予想され、さらに相乗効果も期待される：コルチゾン、ジトラノール、亜鉛、ビタミンC、葉酸、ビオチン、シクロスポリン、ボリコナゾール、クロトリマゾール、ペンタミジン、ヨウ化カリウム、精油、飽和脂肪酸、カプリン酸、ラウリン酸、プロポリス、ティーツリー油、ユーカリ油、ドラスタチン10、アウリスタチンPHE、N-クロロタウリン、プロスタグランジン阻害薬、たとえばアスピリン、インドメタシン、アムホテリシンB、キャンディン、ニッコーマイシン、アゾール、アリルアミン、ストロビルリン、エキノキャンディン、ニューモキャンディン、プラジミシン、ベナノミシン、オリゴペプチド、イミダゾール、トリアゾール、ポリエン、シクロピロックスオラミン、ソルダリン、アトバコン、5-FC、グリセオフルビン、カスポファンギン、フルシトシン、フルコナゾール、イトラコナゾール、シクロピロックス、テルビナフィン、グリセオフルビン、ナイスタチン、尿素、サリチル酸、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、フルオコルチン ブチルエステル、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、ピバル酸クロコルトロン、酪酸クロベタゾン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン スルホ安息香酸エステル、アルクロメタゾン、ジプロピオン酸、ピバル酸フルメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、酢酸フルプレドニデン、フルランドレノロン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、安息香酸ベタメタゾン、フルオコルトロン、フランカルボン酸モメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、ハロメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、ヘキサン酸フルオコルトロン、フルオシノロンアセトニド、非ステロイド系抗リウマチ薬、消炎薬、細胞増殖抑制薬、ブフェキサマク、ヒレハリソウ（コンフリー）根、ブロメライン、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、月見草種子油、パラセタモール、フェナゾン、ピロキシカム、プロピフェナゾン、サリチル酸、デビルズクロー根、カミツレ、マンサク、マリーゴールド、セイヨウオトギリソウ、タンニン、酸化亜鉛、ビスマス錯体、硫酸アルミニウム、スルホン化シェール油、アミノグリコシド、クロラムフェニコール、セファロスポリン、ジアミノベンジルピリミジン、ホスホマイシン、マクロライド、ペネム、スルホンアミド、テトラサイクリン、キノロン、エタムブトール、フシジン酸、グリコペプチド、イソニコチンアミド、リンコマイシン、モノバクタム、ニトロフラン、ニトロイミダゾール、オキサラクタム、パラアミノサリチル酸、ペニシリン、ポリペプチド、ポリミキシンB、コリスチン、リファマイシン、スルホン。
【００７５】
上記の医薬製剤は、既知の方法、たとえば活性物質と担体を混合することによって、通常どおり製造される。
【００７６】
本発明はまた、ヒトおよび動物の医学分野で、上記疾患の予防、改善および/または治療のために、本発明の活性物質を使用すること、ならびに1つもしくは複数の本発明の活性物質を含有する医薬製剤を使用することも含んでいる。
【００７７】
活性物質または医薬製剤は、局所、経口、非経口、腹腔内、静脈内および/または直腸投与で、好ましくは局所局部的に、投与することができる。
【００７８】
概して、望ましい結果を達成するために、24時間につき体重kg当たり約2.5から約200mg、好ましくは5から150mgの総量の本発明の活性物質を、適宜数回の個別投与の形で、投与することは、ヒトおよび動物のいずれの医学分野でも有利であることが明らかになった。
【００７９】
経口投与の場合、本発明の活性物質は、24時間あたり総量で約2.5から200、好ましくは5から150mg/体重kg投与され、非経口投与では、24時間につき総量で約2.5から50、好ましくは1から25mg/体重kg投与される。
【００８０】
しかしながら、具体的に、治療すべき対象の特性および体重、疾患の特性および重篤度、製剤の性質および薬剤の投与法、ならびに投与を実施する期間もしくは間隔によっても、上記の投与量からはずれることが必要となることもある。たとえば、場合によっては上記より少ない量の活性物質で十分なこともある一方で、別の場合には上記の活性物質の量を上回る必要がある。それぞれの場合に必要とされる活性物質の最適な投与量および投与法は、当業者がその専門的な知識に基づいて、容易に決定することができる。
【００８１】
医薬組成物は、配列番号1または配列番号2のペプチドを、医薬組成物の総重量に対して0.0001 - 50重量％、好ましくは0.001 - 25％、特に0.01 - 5重量％、さらにより好ましくは0.1 - 1重量％の濃度で含んでいることが好ましい。
【００８２】
本発明はさらに、少なくとも1つの上記ペプチドを含有する組成物に関するものであって、そのペプチドのマラセチア・フルフルに関する最小阻害濃度は、標準条件下での測定で、約1500から0.1μMまで、たとえば500から1μMまで、100から5μMまで、または50から10μMまでの範囲にある。標準条件は、マラセチア・フルフル培養の最小阻害濃度の測定に関するものであって、この培養物は、初発光学濃度は600 nmで0.02であるが、培地中にこの最小濃度で存在するペプチドとともに24時間インキュベートした後、培地μlあたり1コロニー形成単位（CFU）より少ない微生物を有する。
【００８３】
本発明はさらに、上記医薬組成物を製造する方法に関するが、その方法において上記ペプチドは、少なくとも1つの通常の医薬品添加物、および必要に応じて追加の化粧品もしくは医薬品活性成分と一緒に、望ましい投与形態となるよう製剤される。
【００８４】
P18（配列番号3）は、18アミノ酸の鎖長を有するペプチドであるが、これはHyalophora cecropia（北米産のヤママユガの一種）から得られたセクロピンAおよびアフリカツメガエル（Xenopus laevis）から得られたマゲイニンの断片の融合ペプチドに由来する。殺真菌活性は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）およびフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）に対する実験で発見された(Lee et al., (2004) Biotechnology Letters, 26:337-341)。とはいえ、殺真菌性物質の作用は生物ごとに非常に異なる可能性があることが当業者に知られている。特に、脂質要求性真菌マラセチア・フルフル（Malassezia furfur）、ならびにマラセチア属の脂質要求性の菌種に対する効果は、たとえばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）への効果とは明らかに異なる可能性がある（Hanson et al., (1989) Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 33:1391-1392; Nenhoff et al., (2002) Acta Derm Venereol., 82:170-173）。それゆえ、本発明にしたがって、P18、ならびに構造的および機能的に関連したここに記載されるタイプのペプチドについて観察される効果は、当業者にとって完全な驚きである。同じことが、抗細菌効果にも当てはまる。当業者は、抗細菌性物質のさまざまな生物に対する効果が、同じようにまったく異なる場合があることに気づいている。
【００８５】
さらに特定の実施形態において、本発明のペプチドの二次構造は、ヘリックスを破壊するアミノ酸によって中央部で2つのヘリックスに分割されたヘリックスである。「ヘリカルホイール」という表現において、疎水性アミノ酸、特にロイシン基、が一方の側で優勢であり（すなわちヘリックスの半分）、正電荷を有するアミノ酸、特にリジン基がもう一方の側で優勢である。
【００８６】
本発明のペプチドは、特にDおよび/またはL-アミノ酸、特にL-アミノ酸から構成される。
【００８７】
本明細書に記載のペプチドおよび/またはその誘導体は、本来の方法で、たとえば化学的固相合成、液体合成、または組換え生産菌株もしくは細胞培養によるバイオテクノロジーの手法によって、調製することができる。
【００８８】
3. 発明の他の形態
3.1 他の好適な配列モチーフの例
3.1.1 配列モチーフKX2KX3X4X5KIPX11KFLHAKKF
2012526771.tif 000002
2012526771.tif 000003
2012526771.tif 000004
2012526771.tif 000005
2012526771.tif 000006
2012526771.tif 000007
3.1.2 配列モチーフX1 X2K X3 X4 X5KIP X11 X12 KFX6X7 X8 AX9KF (配列番号2)
2012526771.tif 000008
2012526771.tif 000009
2012526771.tif 000010
2012526771.tif 000011
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2012526771.tif 000020
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2012526771.tif 000031
2012526771.tif 000032
2012526771.tif 000033
2012526771.tif 000034
2012526771.tif 000035
（表においてvariant=バリアント  seqid＝配列番号  である）。
【００８９】
3.1.3Hel1-HB-Hel2の配列モチーフ
2012526771.tif 000036
C末端がアミド化されていないこと以外は上記の通りの配列、したがって特にカルボキシル基が末端となる上記配列も同様に含まれる（塩もしくは酸の形で）。
【００９０】
3.1.4配列番号３の改変
配列番号３のペプチドは、N−および／またはC−末端で１以上の任意のアミノ酸残基で延長されている。追加の残基の非限定的な例としては、Asp, Pro, Asn, Glyが含まれる。NおよびC末端が同時に延長される場合には、追加のN末端残基は好ましくはProまたはGlyであり、C末端に割り当てられた残基は好ましくはAspまたはAsnである。
【００９１】
2012526771.tif 000037
C末端がアミド化されていないこと以外は上記の通りの配列、したがって特にカルボキシル基が末端となる上記配列も同様に含まれる（塩もしくは酸の形で）。
【００９２】
3.2 本発明のペプチドの他の改変
上記のペプチド配列に加えて、機能的同等物、機能的な誘導体、およびこうした配列の塩も好ましい。
【００９３】
「機能的同等物」は、本発明の過程で、特に、上記アミノ酸配列の少なくとも1カ所の配列位置に、明記された以外のアミノ酸を有するが、それにもかかわらずふけの予防、抑制および治療の特性を有する、変異体を意味すると考えられる。したがって、「機能的同等物」は、1つもしくは複数のアミノ酸付加、置換、欠失および/または逆位によって得られる変異体を含んでおり、ここで言及される変化は、それが本発明の特性プロフィールを有する変異体をもたらす限り、いかなる配列位置にも起こりうる。機能的同等物は、特に、反応性パターンが変異体と未変異ポリペプチドの間で定性的に合致する場合にも存在する。
【００９４】
上記の意味での「機能的同等物」はまた、記載のポリペプチドの「前駆体」、ならびにそのポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
【００９５】
「前駆体」は、望ましい生物活性を有する、または持たない、ポリペプチドの天然もしくは合成の前駆体である。
【００９６】
適当なアミノ酸置換の例は、下記の表に見いだすことができる：
元の残基              置換例
Ala                    Ser
Arg                    Lys
Asn                    Gln; His
Asp                    Glu
Cys                    Ser
Gln                    Asn
Glu                    Asp
Gly                    Pro
His                    Asn; Gln
Ile                    Leu; Val
Leu                    Ile; Val
Lys                    Arg; Gln; Glu
Met                    Leu; Ile
Phe                    Met; Leu; Tyr
Ser                    Thr
Thr                    Ser
Trp                    Tyr
Tyr                    Trp; Phe
Val                    Ile; Leu
「塩」という表現は、本発明のペプチド分子のカルボキシル基の塩、およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味すると理解される。カルボキシル基の塩は、それ自体既知の方法で調製することが可能であって、無機塩、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩、ならびに有機塩基との塩、たとえばアミン、たとえばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなどとの塩を含んでいる。酸付加塩、たとえば、塩酸および硫酸などの鉱酸との塩、ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩は、同様に、本発明の主題の一部をなしている。
【００９７】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」（または「誘導体」）は同様に、機能的なアミノ酸側鎖基上で、またはそのNもしくはC末端上で、既知の技術を用いて調製することができる。こうした誘導体には、たとえば、カルボン酸基の脂肪族エステル；アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミンとの反応により得られる、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって調製される、遊離アミノ基のN-アシル誘導体；またはアシル基との反応によって調製される、遊離ヒドロキシ基のO-アシル誘導体が含まれる。さらに、加えて、1から5個までの、たとえば2、3もしくは4個の、DまたはL-アミノ酸残基をNおよび/またはC-末端に共有結合（ペプチド結合）することができる；1から5個までの、たとえばいずれの場合にも1、2、3もしくは4個の残基がNおよび/またはC-末端に存在しないこともある。
【００９８】
追加のNおよび/またはC末端残基の限定的でない例には、Asp、Pro、Asn、Glyがある。NおよびC末端が同時に伸長する場合には、追加のN末端残基は好ましくはProもしくはGlyであり、C末端に割り当てられる残基は好ましくはAspもしくはAsnである。
【００９９】
上記の抗菌性ペプチドのアミノ酸配列の変異、または追加のタンパク質もしくはペプチド配列との融合によって、特定の表面、たとえば皮膚、爪、毛髪を特異的に認識する構造、またはこれらの表面もしくは存在する受容体によって認識されて結合する構造を作製することが可能である。
【０１００】
これによって、抗菌性ペプチドを望ましい作用部位により効率的に運ぶこと、またはその取り込みを改善することが可能となる。上記の抗菌性ペプチドに結合タンパク質を結合もしくは融合することによって、そこから生じるタンパク質-ペプチド融合産物は、より制御された様態で、適当な作用部位、たとえば微生物表面もしくは身体区分に方向付けられ、あるいはこうした部位により長くとどまり、その結果として、長期にわたる改善されたペプチドの効果がもたらされる。その上、上記の抗菌性ペプチドのアミノ酸配列の変異、または追加のタンパク質もしくはペプチド配列との融合によって、そのペプチドを制御された状態で望ましい作用部位に方向付けることができるが、それは、このようにして、たとえば、ペプチドの特異性を高め、ペプチドの消費もしくは用量を低下させ、さらにペプチドの作用を加速もしくは強化することを達成するためである。
【０１０１】
3.3 抗菌性ペプチドを調製するための核酸、発現構築物、ベクターおよび微生物
核酸：
本発明はさらに、本発明にしたがって使用されるペプチドおよび融合ペプチドをコードする核酸分子を含むものである。
【０１０２】
本明細書に記載のあらゆる核酸配列（一本鎖および二本鎖DNAおよびRNA配列、たとえばcDNAおよびmRNA）は、それ自体既知の方法で、ヌクレオチドユニットからの化学合成によって、たとえば個々のオーバーラップした二重らせんの相補的核酸単位のフラグメント縮合によって、調製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、たとえば、既知の方法で、ホスホラミダイト法によって実施することができる（Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896−897）。DNAポリメラーゼのクレノウ断片およびライゲーション反応、ならびに一般的なクローニング法も用いて、合成オリゴヌクレオチドを付加し、ギャップを埋めることが、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【０１０３】
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子、ならびに、たとえば、本発明の核酸コード配列の同定または増幅のためにハイブリダイゼーションプローブもしくはプライマーとして使用することができる核酸断片に関する。
【０１０４】
本発明の核酸分子は、遺伝子コード領域の3'および/または5'末端から非翻訳配列を追加して含んでいてもよい。
【０１０５】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然起源に含まれている他の核酸分子から分離されており、その上、それが組換え技術によって作製される場合には基本的に他の細胞性物質または培地を含んでおらず、化学合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を含んでいないと考えられる。
【０１０６】
本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術および本発明により与えられる配列情報を用いて、単離することができる。たとえば、cDNAは、具体的に明記された完全な配列の1つ、またはその一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、さらに標準的なハイブリダイゼーション技術を用いることによって、適当なcDNAライブラリーから単離することができる（たとえば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載の通り）。その上、記載の配列の1つ、もしくはその一部を含んでなる核酸配列を、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。このようにして増幅された核酸配列を適当なベクターにクローニングして、DNA配列分析によって特徴を明らかにすることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、たとえば自動DNA合成システムを用いて、標準的な合成法によっても調製することができる。
【０１０７】
本発明はさらに、明記されたヌクレオチド配列もしくはその一部分に相補的な核酸分子を含むものとする。
【０１０８】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物において相同配列を同定および/またはクローニングするために使用することができる、プローブおよびプライマーの作製を可能にする。こうしたプローブもしくはプライマーは通常、ストリンジェントな条件下で、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の、少なくとも約12、好ましくは少なくとも約25、たとえば約40、50または75個の連続したヌクレオチドとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列領域を含んでいる。
【０１０９】
本発明はまた、サイレント変異と呼ばれるものを含んでなる核酸配列、または明記された配列と比較して、個別の生物もしくは宿主生物のコドン使用頻度に応じて改変された核酸配列、ならびに同様に、明記された配列の、天然に存在するバリアント、たとえばスプライスバリアントもしくはアレルバリアントも含むものとする。同様に、保存的ヌクレオチド置換によって得られる配列も与えられる（すなわち、当該アミノ酸は同じ電荷、サイズ、極性および/または溶解性をもつアミノ酸によって置換される）。
【０１１０】
本発明はまた、配列多型によって具体的に記載された核酸に由来する分子も提供する。こうした遺伝的多型は、自然変異に基づく集団内の個体間に存在しうる。こうした自然変異は典型的には、遺伝子のヌクレオチド配列において1から5％の変異を引き起こす。
【０１１１】
それに加えて、本発明はまた、上記コード配列とハイブリダイズする、またはこれに相補的な核酸配列を含むものとする。こうしたポリヌクレオチドは、ゲノムもしくはcDNAライブラリー内を検索することで見いだすことができ、必要に応じて、適当なプライマーを用いてPCRによってライブラリーから増幅した後、たとえば適当なプローブで単離することができる。もう一つの選択肢は、適当な微生物を本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターで形質転換し、その微生物を増殖させることでポリヌクレオチドを増やした後、それを単離するというものである。それに加えて、本発明のポリヌクレオチドを化学的手段で合成することも可能である。
【０１１２】
ポリヌクレオチドに「ハイブリダイズする」ことができるという性質は、ストリンジェントな条件下でポリもしくはオリゴヌクレオチドが実質的に相補的な配列と結合する能力を意味すると理解されるが、こうした条件下で非相補的パートナー間の非特異的結合は起こらない。この目的のために、配列は70-100％相補的、好ましくは90-100％相補的でなければならない。相補的配列が互いに特異的に結合することができるという性質は、たとえば、ノーザンブロットもしくはサザンブロット法において、またはPCRもしくはRT-PCRでのプライマー結合に利用される。典型的には、オリゴヌクレオチドはこの目的のために30塩基対の長さから使用される。ストリンジェントな条件は、たとえば、ノーザンブロット法において、非特異的にハイブリダイズしたcDNAプローブもしくはオリゴヌクレオチドを溶出するために、50-70℃、好ましくは60-65℃で、洗浄溶液、たとえば0.1％SDSを含有する0.1 x SSCバッファー（20 x SSC: 3 M NaCl、0.3 M クエン酸Na、pH 7.0）を使用することを意味すると理解される。上記のように、高度に相補的な核酸だけが、相互に結合した状態を維持する。ストリンジェントな条件の設定は、当業者に知られており、たとえば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【０１１３】
発現構築物およびベクター：
本発明はまた、核酸制御配列の遺伝的制御下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいる発現構築物、ならびにすくなくとも1つのこうした発現構築物を含んでなるベクターを提供する。このような発現構築物は、好ましくは、特にそのコード配列の5'上流にプロモーターを、ならびに3'下流にターミネーターを有し、さらに他の通常の調節エレメントを含んでいてもよく、それぞれが機能しうるようにコード配列に連結されている。「機能的結合」は、プロモーター、コード配列、ターミネーター、ならびに、必要に応じて他の調節エレメントが、それらのいずれもがコード配列の発現において意図したとおりにその機能を果たすことができるように、順次配置されていることを意味すると理解される。機能的に結合できる配列の例には、ターゲッティング配列、およびエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどがある。他の調節エレメントには、選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製開始点などが含まれる。適当な制御配列はたとえば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【０１１４】
人為的な制御配列に加えて、天然の制御配列がまだ実際の構造遺伝子の前に存在する可能性がある。遺伝的変異によって、この天然の調節を適宜スイッチオフにすることができ、その遺伝子の発現は増加することもあるが減少することもある。しかしながら、遺伝子構築物はもっと単純な構造をとることが可能であって、これは、追加の制御シグナルが構造遺伝子の前に挿入されておらず、その調節を行う天然プロモーターが欠失していないことを意味する。その代わり、天然の制御配列は、もはや調節を行わないように変異しており、遺伝子発現は高まるか、または低下する。核酸配列は、遺伝子構築物中に1つもしくは複数コピーが存在してもよい。
【０１１５】
使用できるプロモーターの例は下記のとおりである：cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、ラムダ-PRもしくはラムダ-PLプロモーター、これらはグラム陰性細菌で有利に使用される；ならびにグラム陽性プロモーターamyおよびSPO2、酵母プロモーターADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、あるいは植物プロモーターCaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、not、またはユビキチンもしくはファセオリンプロモーター。特に好ましいのは、誘導プロモーター、たとえば光誘導性、および特に温度誘導性プロモーター、たとえばPrP1プロモーターなどの使用である。原則として、すべての天然プロモーターをそれらの制御配列とともに使用することができる。それに加えて、好都合なことに合成プロモーターを使用することもできる。
【０１１６】
上記制御配列は、制御された核酸の発現およびタンパク質発現を可能にすることを目的とする。宿主生物に応じて、このことは、たとえば、遺伝子が誘導後にのみ発現もしくは過剰発現されること、または遺伝子が直ちに発現および/または過剰発現されることを意味すると考えられる。
【０１１７】
制御配列もしくは因子は、好ましくは確実に発現に影響を及ぼすことができ、その結果として発現を増加または低下させることができる。たとえば、制御因子は、好都合なことに、強力な転写シグナル、たとえばプロモーターおよび/または「エンハンサー」を用いることによって、転写レベルで増強することができる。しかしながら、それに加えて、たとえばmRNAの安定性を向上させることによって、翻訳を増強することも可能である。
【０１１８】
発現カセットは、適当なプロモーターと適当な翻訳領域ヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルもしくはポリアデニル化シグナルとを融合することによって作製される。この目的のために、たとえば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、およびT.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)、およびAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) に記載の、標準的な組換えおよびクローニング技術が用いられる。
【０１１９】
適当な宿主生物での発現のために、組換え核酸構築物もしくは遺伝子構築物は、その宿主において遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクターに挿入されることが好ましい。ベクターは当業者によく知られており、たとえば、“Cloning Vectors” (Pouwels P. H. et al., eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)の中に見いだすことができる。ベクターはプラスミドだけでなく、当業者に知られているあらゆる他のベクター、たとえば、ファージ、ウイルス（SV40、CMV、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなど）、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、および直鎖状もしくは環状DNAもある。これらのベクターは、宿主生物において自律的に複製することができるが、染色体で複製されることもある。
【０１２０】
適当な発現ベクターの例には、下記を含めることができる：
従来の融合発現ベクター、たとえばpGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) および pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)、これらについては、それぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE-結合タンパク質およびプロテインAが、組換え標的タンパク質に融合している。
【０１２１】
非融合タンパク質発現ベクター、たとえばpTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) およびpET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89)など。
【０１２２】
酵母S. cerevisiaeで発現させるための酵母発現ベクター、たとえば、pYepSec1 (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234)、pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123) および pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。糸状菌などの他の真菌で使用するのに適したベクターおよびそれを構築するための方法には、van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi,  Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridgeに詳細に記載されたものが含まれる。
【０１２３】
培養昆虫細胞（たとえばSf9細胞）においてタンパク質を発現するために利用できるバキュロウイルスベクターには、pAc系 (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) およびpVL系(Lucklow and Summers, (1989) Virology 170:31-39)がある。
【０１２４】
Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) “New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; およびBevan, M.W. (1984) “Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721に詳述されるような植物発現ベクター。
【０１２５】
pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) およびpMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195)などの哺乳類発現ベクター。
【０１２６】
他に原核および真核細胞のために適当な発現系は、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第16および17章に記載されている。
【０１２７】
組換え微生物：
本発明のベクターは、たとえば、少なくとも1つの本発明のベクターで形質転換された組換え微生物を作製するために使用することが可能であって、そうすると本発明のポリペプチドを製造するために使用することができる。上記の本発明の組換え構築物を適当な宿主系に導入して発現させることは好都合である。特定の発現系において上記核酸の発現をもたらすために、当業者によく知られたクローニングおよびトランスフェクション法、たとえば、共沈殿、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを使用することが好ましい。適当な系は、たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., eds., Wiley Interscience, New York 1997、またはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【０１２８】
本発明によれば、相同組換え微生物を作製することも可能である。この目的のために、本発明の遺伝子もしくはコード配列の少なくとも一部を含んでなるベクターが作製されるが、本発明の配列を改変する、たとえばそれを機能的に破壊するために（「ノックアウト」ベクター）、それには少なくとも1つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換が、必要に応じて導入されている。導入される配列は、たとえば、関連微生物由来のホモログであってもよいが、哺乳類、酵母または昆虫起源に由来するものであってもよい。あるいはまた、内在性遺伝子が相同組換えに際して何か他の方法で変異または改変されてはいるが、依然として機能的タンパクをコードしているような、相同組換えに使用されるベクターを、構成することができる（たとえば、上流調節領域が、内在性タンパク質の発現を変化させるように改変されていてもよい）。本発明の遺伝子の改変部分は相同組換えベクターに含まれる。相同組換えに適したベクターの構築は、たとえば、Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503に記載されている。
【０１２９】
適当な宿主生物は、原則として、本発明の核酸、そのアレルバリアント、またはその機能的同等物もしくは誘導体を発現することができるすべての生物である。宿主生物は、たとえば、細菌、真菌、酵母、または植物もしくは動物細胞を意味するものと理解される。好ましい生物は、エシェリキア（Escherichia）属、たとえば大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）属、バシラス（Bacillus）属もしくはシュードモナス（Pseudomonas）属などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス（Aspergillus）などの真核微生物、動物もしくは植物由来の高等真核細胞、たとえばSf9もしくはCHO細胞である。
【０１３０】
形質転換に成功した生物は、同じくベクターもしくは発現カセット内に存在するマーカー遺伝子によって選択することができる。こうしたマーカー遺伝子の例は、抗生物質耐性遺伝子、ならびに発色反応を触媒し、それが形質転換された細胞の着色を引き起こす酵素の遺伝子である。これらは次に自動セルソーティングによって選択することができる。ベクターによる形質転換に成功し、対応する抗生物質耐性遺伝子（たとえばG418またはハイグロマイシン）を保有する微生物は、適当な抗生物質を含有する培地もしくは栄養培地を用いて選択することができる。細胞表面に提示されるマーカータンパク質を、アフィティクロマトグラフィーを用いた選択に利用することができる。
【０１３１】
本発明の配列の他の作製方法として、それ自体は既知の化学合成法、たとえば固相合成もしくは液相合成にも言及しておく。
【０１３２】
3.4 ポリペプチドの組換え生産：
本発明にしたがって使用されるペプチドは、ポリペプチドを産生する微生物を培養すること、必要に応じてポリペプチドの発現を誘導すること、および培養物からポリペプチドを単離することによって、それ自体は既知の方法で、組換え生産することができる。このようにしてポリペプチドは、必要ならば工業規模で生産することもできる。
【０１３３】
組換え微生物は、既知の方法で培養および発酵することができる。細菌は、たとえばTBもしくはLB培地中で、20℃から40℃までの温度および6から9までのpHで、増殖させることができる。適当な培養条件の詳細は、たとえば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載されている。
【０１３４】
ポリペプチドが培養液中に分泌されないならば、次に細胞を破壊し、その溶解液から、既知のタンパク質単離法によって産物が得られる。細胞を破壊する別法は、高周波数超音波；たとえばフレンチプレス内での高圧；浸透圧；界面活性剤、溶解酵素もしくは有機溶媒の作用；ホモジナイザー；または上記方法のいくつかの組み合わせによる。
【０１３５】
ポリペプチドの精製は、既知のクロマトグラフィー法、たとえばQ-Sepharoseクロマトグラフィーなどの分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーによって、ならびに他の通常の方法、たとえば、限外濾過、結晶化、塩析、透析、および未変性ゲル電気泳動によって成し遂げることができる。適当な方法は、たとえば、Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden [The Tools of Biochemistry], Walter de Gruyter publishers, Berlin, New York、またはScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【０１３６】
特定のヌクレオチド配列を用いてcDNAを伸長し、したがって、たとえば精製を簡単にするのに役立つ改変ポリペプチドもしくは融合タンパク質をコードしているような、ベクター系もしくはオリゴヌクレオチドを用いて組換えタンパク質を単離することは、特に好都合である。このような適当な改変は、たとえば、アンカーとして機能する「タグ」、たとえばヘキサヒスチジンアンカーとして知られる改変、または抗体によって抗原として認識されうるエピトープである（たとえば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載）。こうしたアンカーは、タンパク質を固体担体、たとえばポリマーマトリックスに付着させるのに役立つと考えられ、これは、たとえばクロマトグラフィーカラムに導入してもよいが、マイクロタイタープレートもしくは別の担体上で使用することもできる。
【０１３７】
同時に、これらのアンカーは、タンパク質を認識するために使用することもできる。タンパク質はまた、通常のマーカー、たとえば、蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、または放射性標識を単独で用いて、またはこれらをタンパク質の誘導体化のためにアンカーとともに用いて、認識することができる。
【０１３８】
本発明の抗菌性ペプチドを含有する組成物および薬剤は、ヒトおよび動物の治療において、特に真菌症、好ましくは皮膚真菌症の治療のために、ならびに細菌感染症、特に外部感染症、たとえば皮膚、毛髪および粘膜の感染症の治療のためにも、広範な用途分野を有する。
【０１３９】
製剤の製造に適した添加剤および添加物は当業者によく知られている。添加剤および添加物は、好ましくは化粧品および/または医薬品として許容される添加剤である。医薬品として許容される添加剤は、薬学および食品科学の分野、ならびに近接する分野で使用できることが知られている添加剤、特に関連の薬局方（たとえば、DAB、Ph、Eur.、BP、NF）に記載された添加剤、および他の、生理学的利用を妨害しない性質を持つ添加剤である。
【０１４０】
適当な添加剤は、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、防腐剤、抗酸化剤、抗刺激剤、キレート剤、乳化安定剤、フィルム形成剤、ゲル形成剤、矯臭剤、親水コロイド溶解剤、可溶化剤、中和剤、透過促進剤、色素、四級アンモニウム化合物、リファッティング（refatting）およびスーパーファッティング（superfatting）剤、軟膏、クリームもしくは油性基剤、シリコーン誘導体、安定化剤、滅菌剤、噴射剤、乾燥剤、乳白剤、増粘剤、ワックス、軟化剤、ホワイトオイルとすることができる。これに関する構成は、たとえば、Fiedler, H. P. Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete [Lexicon of Excipients for Pharmacy, Cosmetics and Adjoining Fields], 4th ed., Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996で詳述されるように、専門知識に基づいている。
【０１４１】
非イオン性界面活性剤を優先的に使用することができる。好ましく適当な例は、両性イオン性界面活性剤、たとえばコカミドプロピルベタイン、陽イオン性界面活性剤、たとえば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（CTAB）、および非イオン性界面活性剤、たとえばブロックポリマーおよびグルコシドである。
【０１４２】
適当な陰イオン性界面活性剤は、たとえば、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルコハク酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、N-アルキルサルコシン塩、アシルタウリン塩、アシルイセチオン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、特にアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、たとえばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ならびにアンモニウムおよびトリエタノールアミン塩である。アルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸塩およびアルキルエーテルカルボン酸塩は、分子中に、1から10個までのエチレンオキシドもしくはプロピレンオキシド単位、好ましくは1から3個までのエチレンオキシド単位を有することができる。
【０１４３】
適当な例は、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸アンモニウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、オレイルコハク酸ナトリウム、ラウリルスルホコハク酸アンモニウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミンである。
【０１４４】
適当な両性界面活性剤は、たとえば、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルスルホベタイン、アルキルグリシナート、アルキルカルボキシグリシナート、アルキルアンホ酢酸塩もしくはプロピオン酸塩、アルキルアンホ二酢酸塩もしくは二プロピオン酸塩である。
【０１４５】
たとえば、ココジメチルスルホプロピルベタイン、ラウリルベタイン、コカミドプロピルベタインまたはココアンホプロピオン酸ナトリウムを使用することができる。
【０１４６】
適当な非イオン性界面活性剤は、たとえば、脂肪族アルコールもしくはアルキルフェノール（アルキル鎖に6から20個の炭素原子を有するが、直鎖でも分岐鎖でもよい）と、エチレンオキシドおよび/またはプロピレンオキシドとの反応生成物である。アルキレンオキシドの量は、アルコール1モルについておよそ6から60モルである。アルキルアミンオキシド、モノもしくはジ-アルキルアルカノールアミド、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシド、またはソルビタンエーテルエステルも適している。
【０１４７】
下記の制限しない実施例に準拠して、これから本発明をさらに説明する。
【０１４８】
（実施例）
以下に記載の研究はマラセチア・フルフル（Malassezia furfur）菌株DSM 6170で実施した。
【実施例１】
【０１４９】
マラセチア・フルフルでテストしたP18の長期的安定性
長期にわたる保存が必要となる可能性があるので、1 mM P18ペプチド溶液（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2）をそれ以降12週間にわたって37℃で保存し、保存した溶液のマラセチア・フルフルに対する抗真菌活性を、新調製の1 mM P18ペプチド溶液の活性と比較した。これは増殖テストによって行ったが、増殖テストは次のように実施した：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０１５０】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を拡大するためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０１５１】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０１５２】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０１５３】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり100μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物からM.フルフル懸濁液を接種した。M.フルフル懸濁液は、実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.02に調整した。阻害剤溶液の濃縮液は1 mM水溶液である。
【０１５４】
次の増殖を比較した：
- M.フルフル懸濁液、阻害剤無添加
- M.フルフル懸濁液、および終濃度50μMの新調製P18水溶液を添加
- M.フルフル懸濁液、および終濃度25μMの新調製P18水溶液を添加
- M.フルフル懸濁液、および終濃度50μMの、37℃で12週間保存したP18溶液を添加
- M.フルフル懸濁液、および終濃度25μMの、37℃で12週間保存したP18溶液を添加
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０１５５】
24時間にわたって光学濃度を測定することにより増殖を観察した。その後、懸濁液をそれぞれ1μlおよび5μl画線し、6日間インキュベートした後、コロニー数をカウントすることにより、コロニー形成単位（CFU）を測定した。光学濃度に及ぼす、二相培地およびM.フルフルの増殖型の影響を除外するためにCFUを測定した。この実験は少なくとも三連の測定で行った。
【表１】
2012526771.tif 000038
【０１５６】
増殖テストの結果は、コロニー形成単位として測定されたM.フルフルの増殖が、12週間保存したP18ペプチド溶液および新調製P18ペプチド溶液によって効果的に阻害されたことを示す。これは、1 mM P18ペプチド溶液の保存が溶液の活性に影響を及ぼさなかったことを意味する；したがって、溶液はこの期間保存可能であった。
【実施例２】
【０１５７】
P18の製剤可能性
3つの異なるシャンプー基本製剤中でペプチドP18の製剤可能性を調べた。この目的のために、まず下記の組成の製剤を作製した：
【表２】
2012526771.tif 000039
【０１５８】
成分を混合し、溶解した。NaOHを用いてpHを6-7に調整した。その後、ペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2）の100 mM溶液を2つ調製した。一方の溶液のためにはDMSOを溶媒とした；もう一方の溶液用には水を溶媒とした。100 mM P18ペプチド溶液の適当量をそれぞれの製剤に添加して、製剤31-1および31-2中の終濃度が10 mM、製剤31-3中のペプチドP18の終濃度が5 mMとなるようにした。こうして得られた製剤は透明で均一であった。
【実施例３】
【０１５９】
成分としてP18を含むシャンプー基本製剤の効果
実験の目的は、P18ペプチド成分（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2）を有するシャンプー基本製剤の効果を検討することである。この目的のために、この実験において、P18ペプチドを製剤に直接添加した。まずはじめに、下記の組成を有する製剤を作製した：
【表３】
2012526771.tif 000040
【０１６０】
成分のTexapon NSOおよびTego Betain L7を混合して溶解した。NaOHを用いてpHを6-7に調整した。その後、ペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2）の100 mM水溶液を調製した。100 mM P18ペプチド溶液の適当量をいずれの場合も製剤に添加して、製剤31-3中のペプチドP18の終濃度が5 mMとなるようにした。すでに上で述べたように、こうして得られた製剤は透明で均一であった。ここで、真菌マラセチア・フルフルに対する製剤の効果を、P18ペプチドを含有しないシャンプー基本製剤と比較した。
【０１６１】
要するに、テストは次のように実施した。
【０１６２】
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０１６３】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を拡大するためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０１６４】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０１６５】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０１６６】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり170μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物からM.フルフル懸濁液10μlを接種した。これは、620 nmで測定される光学濃度0.02 - 0.1に相当する。この混合物に、シャンプー基本製剤を20μl、もしくは成分としてP18を含むシャンプー基本製剤31-3を20μl、添加した。
【０１６７】
したがって、要約すると、この実験において次の混合物を相互に比較した：
- M.フルフル懸濁液
- M.フルフル懸濁液、およびシャンプー基本製剤31-3を20μl添加
- M.フルフル懸濁液、および成分としてP18を含むシャンプー基本製剤31-3を20μl添加
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０１６８】
24時間インキュベートした後、各懸濁液から1μlを10μlの培地に再懸濁し、次にそれを画線することによって、コロニー形成単位（CFU）を測定した。6日間インキュベートした後、プレート上でコロニーを計数した。光学濃度に及ぼす、二相培地およびM.フルフルの増殖型の影響を除外するためにCFUを測定した。実験は、少なくとも2つの独立した実験において、それぞれ二連の測定で行った。
【表４】
2012526771.tif 000041
【０１６９】
その結果は、シャンプー基本製剤31-3がすでにマラセチア・フルフルに対して測定可能な増殖阻害効果を有することを示す。しかしながら、成分としてP18を含むシャンプー基本製剤31-3は、M.フルフルの増殖がもはやまったく検出できないほどの効果を有する。これは、P18ペプチドの抗真菌作用がこの製剤中で維持されることを示す。M.フルフルのこれ以上の増殖は見られなかったので、比較的低濃度のP18ペプチド成分もしくは同等のペプチドも、さらにまた他の同等の製剤も、マラセチア・フルフルおよび他のマラセチア種の増殖阻害に適していると見なすことができる。
【実施例４】
【０１７０】
重量パーセント（％（重量/重量））に基づくP18ペプチド、ジンクピリチオン、クリンバゾール、およびケトコナゾールの同一濃度でのマラセチア・フルフル増殖阻害
P18ペプチド（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2）のモル質量と、真菌マラセチア・フルフルの増殖阻害を目的とする現在市販されているふけ予防シャンプーの成分のモル質量はかなり異なる。P18ペプチドのモル質量は2300 g/molであるが、ジンクピリチオンは317 g/mol、ケトコナゾールは531 g/molであり、クリンバゾールは292 g/molのモル質量を有する。前の実施例においてM.フルフルの増殖阻害に関する実験は、これまでいつも同等のモル濃度で行ってきたので、この実施例ではマラセチア・フルフルの増殖阻害は、重量パーセント（％（重量/重量））に基づいて同一濃度のP18ペプチド、ジンクピリチオン、クリンバゾールおよびケトコナゾールを用いて検討した。この目的のために、手順は次の通りである：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０１７１】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を広げるためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０１７２】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０１７３】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０１７４】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり100μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物からM.フルフル懸濁液を接種した。M.フルフル懸濁液は、実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.02に調整した。阻害剤溶液の濃縮液は、P18についてはDMSO中1 mMであり、ジンクピリチオン、ケトコナゾールおよびクリンバゾールについてはDMSO中10 mMとした。DMSOの終濃度はすべての実験において同じに保った。これは、より高濃度のジンクピリチオン、ケトコナゾールおよびクリンバゾールの濃縮液の場合には、P18ペプチド含有混合物と同等になるように、混合物に適当量のDMSOを添加したことを意味する。
【０１７５】
光学濃度を測定することによって次の増殖を比較した：
- M.フルフル懸濁液、および終濃度50μM（0.0115％（w/w）に相当）のP18溶液を添加
- M.フルフル懸濁液、および終濃度362μMのジンクピリチオン（ZPT）溶液を添加（50μM P18ペプチド含有混合物と比較）
- M.フルフル懸濁液、および終濃度216μMのケトコナゾール溶液を添加（50μM P18ペプチド含有混合物と比較）
- M.フルフル懸濁液、および終濃度390μMのクリンバゾール溶液を添加（50μM P18ペプチド含有混合物と比較）
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０１７６】
24時間インキュベートした後、それぞれの懸濁液から10μlの培地を寒天プレート上に画線することによって、コロニー形成単位（CFU）を測定した。6日間インキュベートした後、プレート上のコロニーを計数した。光学濃度に及ぼす、二相培地およびM.フルフルの増殖型の影響を除外するためにCFUを測定した。実験は、少なくとも2つの独立した実験において、それぞれ二連の測定で行った。
【表５】
2012526771.tif 000042
【０１７７】
テスト期間を通してP18ペプチド溶液の添加はCFUを減少させ、したがって、比較物質であるジンクピリチオン（ZPT）、クリンバゾールおよびケトコナゾールより大幅にマラセチア・フルフルの増殖を減少させることが観察された。
【０１７８】
こうした結果は、重量パーセント（％（w/w））に基づいて等濃度のP18ペプチドが、ジンクピリチオン、クリンバゾールおよびケトコナゾールと比べて、有効な、少なくとも同等の、マラセチア・フルフルの増殖阻害をもたらすことを示す。
【実施例５】
【０１７９】
5分から1時間までのP18ペプチドとのインキュベーション時間
P18ペプチド（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2）によるM.フルフルの増殖阻害は、最初は、1時間を超えるインキュベーション時間のみ検討されたので、ここでは、M.フルフル一夜培養物に添加後1時間まで、インキュベーション時間の最初の数分間（5分、10分および20分）のP18ペプチドの効果を調べて、対照物質としてジンクピリチオン（Sigma Aldrich）と比較した。この目的のために、濃度100μM、200μMおよび500μMのP18ペプチドおよび対照物質であるジンクピリチオンを実験に使用した。実験は次のように行った：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０１８０】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を広げるためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０１８１】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０１８２】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０１８３】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり100μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物からM.フルフル懸濁液を接種した。M.フルフル懸濁液は、実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.1に調整した。
【０１８４】
次の増殖を比較した：
- M.フルフル懸濁液、および終濃度100μMのP18ペプチドを添加、5分、10分、20分および60分後にプレーティング
- M.フルフル懸濁液、および終濃度200μMのP18ペプチドを添加、5分、10分、20分および60分後にプレーティング
- M.フルフル懸濁液、および終濃度500μMのP18ペプチドを添加、5分、10分、20分および60分後にプレーティング
- M.フルフル懸濁液、および終濃度100μMのジンクピリチオンを添加、5分、10分、20分および60分後にプレーティング
- M.フルフル懸濁液、および終濃度200μMのジンクピリチオンを添加、5分、10分、20分および60分後にプレーティング
- M.フルフル懸濁液、および終濃度500μMのジンクピリチオンを添加、5分、10分、20分および60分後にプレーティング
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０１８５】
指定されたインキュベーション時間の後、それぞれの懸濁液から50μlを画線し、6日間インキュベートした後、コロニーを計数することによって、コロニー形成単位（CFU）を測定した。光学濃度に及ぼす、二相培地およびM.フルフルの増殖型の影響を除外するためにCFUを測定した。実験は、互いに独立して繰り返し行った。表の数字はコロニー形成単位であるが、すべての実験において、1000コロニーより少なく、すなわち顕著な増殖抑制効果を示す。
【表６】
2012526771.tif 000043
【０１８６】
結果は、マラセチア・フルフル生細胞数が、ジンクピリチオンとのインキュベーションと比較して、P18ペプチドとともにインキュベートした最初の10分以内にすでに顕著に減少したことを示す。60分間のインキュベーション後、短いインキュベーション時間と比べて、より低濃度のP18ペプチドでもコロニー形成単位が顕著に減少した。これは、P18ペプチドの作用機構が、ジンクピリチオンとはかなり異なっており、P18ペプチドは短時間のインキュベーション後にすでにM.フルフルに対する作用を示すことを意味する。
【実施例６】
【０１８７】
P18バリアントの効果
次のP18バリアントの、M.フルフルに対する阻害効果を検討した：
H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2          （P18；カルボキシ末端アミド化)
H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-OH           （P18-OH；カルボキシ末端未修飾）
H-PKWKLFKKIPKFLHLAKKFD-OH         （P18AC-OH；カルボキシ末端未修飾)
H-PKWKLFKKIPKFLHLAKKFN-NH2        （P18AC-NH2；カルボキシ末端アミド化）
実験は次のように行った：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０１８８】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を広げるためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０１８９】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０１９０】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０１９１】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり100μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物からM.フルフル懸濁液を接種した。M.フルフル懸濁液は、実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.1に調整した。
【０１９２】
ペプチドバリアントをジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶解して終濃度1 mMとした。DMSOなしですませて、純粋なペプチド水溶液を使用することも可能である。この溶液5μlをM.フルフル懸濁液100μlに添加した（P18ペプチドの終濃度50μM）。対照混合物では、P18ペプチドを含まない同量のDMSOを添加した。
【０１９３】
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０１９４】
24時間インキュベートした後、それぞれの懸濁液の10μlを画線し、6日間インキュベートした後、コロニーを計数することによって、コロニー形成単位（CFU）を測定した。3つの同一混合物を用いた、それぞれ独立した2つの実験を実施し、コロニー形成単位の数を平均した。
【表７】
2012526771.tif 000044
【０１９５】
実験は、DMSO溶媒がそれだけでCFUの低下を引き起こすことを示す。しかしながら、それに加えて、P18バリアントはすべて、DMSOを用いた対照と比べて、強いM.フルフルの阻害を示す。有効性はP18AC-OH; P18-OH; P18-NH2の順に強くなる。ペプチド分子において負電荷を持つカルボキシル基の数が同じ順で減少している。したがって、負電荷の少ないペプチドバリアントが最良の効果を示すと結論づけることができる。
【実施例７】
【０１９６】
シャンプー基本製剤存在下でのP18ペプチドのM.フルフルに及ぼす影響に関する速度論
さまざまな接触時間でジンクピリチオンおよびクリンバゾールと比較したP18ペプチド（H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2；カルボキシ末端アミド化）の効果を、シャンプー基本製剤の存在下でテストした。実験は次のように行った：
下記のシャンプー基本製剤を作製した：
【表８】
2012526771.tif 000045
【０１９７】
Texapon NSOおよびTego Betain L7成分を混合して溶解した。NaOHを用いてpHをpH 6-7に調整した。
【０１９８】
P18、ZPTおよびクリンバゾールのM.フルフルへの影響は次のように検討した：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０１９９】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を広げるためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０２００】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０２０１】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０２０２】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり100μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物からM.フルフル懸濁液を接種した。M.フルフル懸濁液は、実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.1に調整した。10％（v/v）のシャンプー基本製剤31-3をM.フルフル懸濁液に添加した。
【０２０３】
P18ペプチドを水に溶解して230 g/lの濃度とした。ジンクピリチオンおよびクリンバゾール活性物質はDMSOに溶解して230 g/lの濃度としたが、不溶性なので活性物質の一部は懸濁したままとした。ペプチドもしくは活性物質の溶液を、終濃度2.3 g/l; 1.15 g/l; 0.46 g/lおよび0.23 g/lのシャンプー基本製剤とともにM.フルフル懸濁液に添加した。
【０２０４】
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０２０５】
混合物を5分、10分、20分、60分および24時間インキュベートした後、それぞれの懸濁液の1μlを画線し、6日間インキュベートした後、コロニーを計数することによって、コロニー形成単位（CFU）を測定した。
【０２０６】
このテストにおいてP18がジンクピリチオンもしくはクリンバゾールより優れた特性を有することは明らかである。
【実施例８】
【０２０７】
P18ペプチドのシャンプー基本製剤中での長期安定性をM.フルフルに関して検討した
P18ペプチド（H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2；カルボキシ末端アミド化）の、シャンプー基本製剤中での長期安定性を調べた。
【０２０８】
下記のシャンプー基本製剤を作製した：
【表９】
2012526771.tif 000046
【０２０９】
Texapon NSOおよびTego Betain L7成分を混合して溶解した。NaOHを用いてpHをpH 6-7に調整した。その後、ペプチドP18の100 mM水溶液を調製した。表15に記載のペプチドP18の終濃度が与えられるように、100 mM P18ペプチド溶液の適当量を各製剤に加えた。
【０２１０】
製剤は40℃で保存した。
【０２１１】
0、12および22日後、M.フルフルに対する製剤の効果を検討した。
【０２１２】
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２１３】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を広げるためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０２１４】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０２１５】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０２１６】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり100μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物からM.フルフル懸濁液を接種した。M.フルフル懸濁液は、実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.1に調整した。
【０２１７】
10％（v/v）の保存されたシャンプー基本製剤31-1-10； 31-3-5; 31-3-2（表９）をM.フルフル懸濁液に添加した。
【０２１８】
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０２１９】
24時間後、コロニー形成単位（CFU）を測定した。この目的のために、各懸濁液の1μlおよび10μlを画線し、6日間インキュベートした後、コロニーを計数した。
【０２２０】
P18はテストした条件下で安定した特性を有することが明らかである。
【実施例９】
【０２２１】
シャンプー基本製剤の存在下でのペプチドP18の最小阻害濃度（MIC）の測定
シャンプー基本製剤31-3（表10）の存在下でのペプチドP18（H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2；カルボキシ末端アミド化）の最小阻害濃度（MIC）を、次のように調べた：
下記のシャンプー基本製剤を作製した：
【表１０】
2012526771.tif 000047
【０２２２】
シャンプー基本製剤を調製するために、Texapon NSOおよびTego Betain L7成分を混合して溶解した。NaOHを用いてpHをpH 6-7に調整した。
【０２２３】
M.フルフルに対するペプチドの効果を次のように検討した：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２２４】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を広げるためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０２２５】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０２２６】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０２２７】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり170μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物から10μlのM.フルフル懸濁液を接種した。これは620 nmで測定される光学濃度0.02 - 0.1に相当するものであった。20μlのシャンプー基本製剤31-3をこの混合物に加えた。ペプチドP18を10 mMの濃度でDNSOに溶解した。表11に記載の終濃度を与えるように、適当量のP18溶液を添加した。
【０２２８】
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０２２９】
24時間インキュベートした後、各懸濁液1μlを10μlの培地に再懸濁し、次にそれを画線することによって、コロニー形成単位（CFU）を測定した。6日間インキュベートした後、プレート上のコロニーを計数した。実験は、二連測定で行った。
【表１１】
2012526771.tif 000048
【０２３０】
結果は、M.フルフルの増殖がP18の100μMの濃度から完全に阻害されることを示す。したがって、シャンプー基本製剤31-3の存在下での最小阻害濃度は50μMから100μMの間である。これは、シャンプー基本製剤なしの混合物と比べて、シャンプー基本製剤の使用で活性がいくぶん低下しても、この製剤中のP18ペプチドの抗真菌効果が保たれることを示す（実施例１参照）。
【実施例１０】
【０２３１】
ペプチドP18と従来の抗真菌活性物質との併用
ある割合の従来型抗真菌活性物質ジンクピリチオンもしくはケトコナゾール、およびペプチドP18（H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2；カルボキシ末端アミド化）からなる、活性のある組み合わせの効果を、水溶液中で、シャンプー基本製剤31-3の存在下で下記のようにして調べた：
次のシャンプー基本製剤を作製した：
【表１２】
2012526771.tif 000049
【０２３２】
シャンプー基本製剤を作製するために、Texapon NSOおよびTego Betain L7成分を混合して溶解した。NaOHを用いてpHをpH 6-7に調整した。
【０２３３】
M.フルフルに対するペプチドP18の効果およびZPTの効果は次のように検討した：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２３４】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を広げるためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０２３５】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０２３６】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０２３７】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり170μlのM472ピチロスポルム培地を入れ、一夜培養物から10μlのM.フルフル懸濁液を接種した。これは620 nmで測定される光学濃度0.02 - 0.1に相当するものであった。この混合物に、20μlのシャンプー基本製剤31-3または水を加えた。ペプチドP18を10 mMの濃度で水に溶解した。従来の抗真菌活性物質は、10 mMの濃度でDMSO中に溶解した。表13に記載の終濃度を与えるように、適当量のP18溶液、および従来の抗真菌活性物質を添加した。
【表１３】
2012526771.tif 000050
【０２３８】
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０２３９】
24時間インキュベートした後、各懸濁液1μlを10μlの培地に再懸濁し、次にそれを画線することによって、コロニー形成単位（CFU）を測定した。6日間インキュベートした後、プレート上のコロニーを計数した。
【０２４０】
P18と従来の抗真菌活性物質との組み合わせは、従来の抗真菌活性物質単独よりすぐれた特性を有することが明らかになった。
【実施例１１】
【０２４１】
非イオン性および両性イオン性界面活性剤の存在下でのP18の効果
本実験の目的は、非イオン性および両性イオン性界面活性剤の、P18ペプチド（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2）の活性に及ぼす影響を検討することであった。この目的のために、次の界面活性剤を使用した：
Pluracare F 68（ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマー）
Plantacare 818（グルコシド）
Tego Betain L7 （コカミドプロピルベタイン）
テストは次のように行った。
【０２４２】
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g/l 麦芽エキス
20 g/l ウシ胆汁
10 g/l Tween 40
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２４３】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
培地は二相培地となったので、界面を広げるためにこの完全培地を超音波で処理した。
【０２４４】
寒天プレートのために、150 g/lの寒天を必要に応じて培地に添加した。
【０２４５】
増殖テストは、次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０２４６】
96ウェルマイクロタイタープレートに、620 nmで測定される光学濃度が0.1であるM472ピチロスポルム培地中のM.フルフル懸濁液をウェル当たり85μl入れた。この培養液に10μlの界面活性剤溶液および5μlのペプチド溶液を加えた。混合物中の個別の界面活性剤の終濃度が2％、4％または6％となるように、界面活性剤溶液の濃度を調整した。P18ペプチド溶液の濃度は、混合物中のP18ペプチドの終濃度が0μM、50μM、100μM、250μM、または500μMとなるように調整した。
【０２４７】
マイクロタイタープレートは30℃で振盪しながらインキュベートした。
【０２４８】
24時間インキュベートした後、各懸濁液1μlを10μlの培地に再懸濁し、次にそれを画線することによって、コロニー形成単位（CFU）を測定した。6日間インキュベートした後、プレート上のコロニーを計数した。光学濃度に及ぼす、二相培地およびM.フルフルの増殖型の影響を除外するためにCFUを測定した。実験は、少なくとも2つの独立した実験において、それぞれ三連の測定で行った。
【表１４】
2012526771.tif 000051
【０２４９】
結果は、P18が非イオン性または両性イオン性界面活性剤の存在下でマラセチア・フルフルに対してその効果を維持していることを示す。
【実施例１２】
【０２５０】
製剤例１２
ペプチドP18を含有する本発明の製剤を以下に記載する。ペプチドP18は、上記の他のすべてのペプチドを代表して、以後の実施例において使用される。本明細書に明記される他の本発明のペプチドもすべて下記の製剤に使用することができることは、当業者には明白である。
【０２５１】
製剤において、ペプチド18を唯一の活性物質として使用することができるが、他の抗真菌もしくは抗細菌活性物質（明細書参照）と組み合わせて使用することもできる。
【０２５２】
例：
ジェル
ヒドロキシエチルセルロース                                1.0% (w/w)
プロピレングリコール                                     10.0%(w/w)
ペプチドP18                                               1.0%(w/w)
蒸留水を加えて100.0%(w/w)とする
例：
軟膏
ペプチドP18                                              1.0% (w/w)
流動パラフィン/白色軟パラフィン（1:4の割合）の混合物を加えて100.0% (w/w)とする
例：
水中油エマルション
ペプチドP18                                              1.0%(w/w)
流動パラフィン                                            6.0%(w/w)
セトステアリルアルコール                                  7.2% (w/w)
白色軟パラフィン                                          15.0% (w/w)
グリセロール                                              5.0% (w/w)
蒸留水を加えて100.0%(w/w)とする
例：
軟膏
ペプチドP18                                              1.0% (w/w)
モノパルミチン酸ソルビタン                                2.0% (w/w)
白色軟パラフィン                                          97.0%(w/w)
【実施例１３】
【０２５３】
トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）に対するP18の効果
トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum（DSM 21146））に対するペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2、（Bachem AG、スイス））の効果。
【０２５４】
DSMZによるMEP増殖培地（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig、ドイツ）：
30 g 麦芽エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
3 g 大豆ペプトン（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
1リットルにフィルアップしてpH 5.6に合わせる。
【０２５５】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２５６】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０２５７】
増殖テストは、次のように実施した：トリコフィトン・ルブルム培養物が増殖した寒天プレートを5 mlのMEP培地ですすいだ。得られたT.ルブルム懸濁液の100μlを10 mlの培地に添加した。
【０２５８】
96ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり190μlのT.ルブルム懸濁液を入れた。その後、ウェル内の終濃度が0から1000 ppmまでとなるペプチドの段階希釈物を添加した。この目的のために、ウェルあたり0 ppmから20000 ppmまでの濃度のペプチド溶液10μlを、T.ルブルム懸濁液に添加し、0 ppmから1000 ppmまでのウェル内のペプチド終濃度が得られた。
【０２５９】
マイクロタイタープレートは30℃でインキュベートした。真菌の増殖は620 nmで光学濃度を測定することにより評価し、7日間観察した。実験は、少なくとも二連の測定で実施し、独立して少なくとも1回繰り返した。
【０２６０】
ペプチドの段階希釈において125 ppmから250 ppmまで、さらに1000 ppmまで上昇した濃度で、それ以上のT.ルブルムの増殖は見られず、したがって有意な濁度は測定されなかった。無菌対照は同様に濁りのないままであったが、ペプチド無添加の懸濁液は明確な濁度を示した。
【０２６１】
したがって、増殖テストの結果は、125 ppm - 250 ppmの最小阻害濃度で、ペプチドP18のT.ルブルムに対する抗真菌効果を示した。
【実施例１４】
【０２６２】
マラセチア・フルフルに対するP18の最小阻害濃度
マラセチア・フルフル（DSM 6170）に対するペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2、（Bachem AG、スイス））の最小阻害濃度。
【０２６３】
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g 麦芽エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
20 g ウシ胆汁（Merck, Darmstadt、ドイツ）
10 g Tween 40（Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim、ドイツ）
1リットルにフィルアップする。
【０２６４】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２６５】
その後、2 ml オリーブ油（無菌濾過）を添加した。
【０２６６】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０２６７】
M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルを接種し、30℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０２６８】
懸濁液は600 nmで測定した光学濃度が0.1となるように調整した。96ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり95μlのM.フルフル懸濁液を入れた。次に、ウェル内の終濃度が0から1000 ppmまでとなるペプチドの段階希釈物を添加した。この目的のために、ウェルあたり0 ppmから20000 ppmまでの濃度のペプチド溶液5μlを、M.フルフル懸濁液に添加し、0 ppmから1000 ppmまでのウェル内のペプチド終濃度が得られた。
【０２６９】
マイクロタイタープレートは30℃にて600 rpmでインキュベートした。真菌の増殖は620 nmで光学濃度を測定することにより評価し、72時間観察した。実験は、少なくとも二連の測定で実施し、独立して少なくとも1回繰り返した。
【０２７０】
125 ppmの濃度から、さらに希釈段階の1000 ppmまで濃度を高めると、M.フルフルのそれ以上の増殖は見られず、したがって有意な濁度は測定されなかった。無菌対照は同様に濁りのないままであったが、ペプチド無添加の懸濁液は24時間のインキュベーション後、明確な濁度を示した。
【０２７１】
したがって、増殖テストの結果、ペプチドP18のM.フルフルに対する抗真菌効果は125 ppmの最小阻害濃度で示された。
【実施例１５】
【０２７２】
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae（肺炎桿菌））に対するP18の効果
クレブシエラ・ニューモニエ（DSM 681）に対するペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2、（Bachem AG、スイス））の効果を検討する。
【０２７３】
TSBY増殖培地（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
17 g パンクレアチン分解カゼイン 
3 g パンクレアチン分解ダイズ 
2.5 g ブドウ糖
5 g 塩化ナトリウム
2.5 g リン酸二カリウム
3 g 酵母エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
1リットルにフィルアップしてpH 7に合わせた。
【０２７４】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２７５】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０２７６】
TSBY培地を含有する振盪培養にK.ニューモニエを接種し、37℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０２７７】
懸濁液は600 nmで測定した光学濃度が0.1となるように調整した。96ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり95μlのK.ニューモニエ懸濁液を入れた。次に、ウェル内の終濃度が0から1000 ppmまでとなるペプチドの段階希釈物を添加した。この目的のために、ウェルあたり0 ppmから20000 ppmまでの濃度のペプチド溶液5μlを、K.ニューモニエ懸濁液に添加し、0 ppmから1000 ppmまでのウェル内のペプチド終濃度が得られた。
【０２７８】
マイクロタイタープレートは37℃にて600 rpmでインキュベートした。細菌の増殖は620 nmで光学濃度を測定することにより評価し、それを24時間観察した。実験は、少なくとも二連の測定で実施し、独立して少なくとも1回繰り返した。
【０２７９】
125 ppmの濃度から、さらに段階希釈の1000 ppmまで濃度を高くすると、K.ニューモニエのそれ以上の増殖は見られず、したがって有意な濁度は測定されなかった。無菌対照は同様に濁りのないままであったが、ペプチド無添加のK.ニューモニエ懸濁液は24時間のインキュベーション後、明確な濁度を示した。
【０２８０】
したがって、増殖テストの結果は、125 ppmの最小阻害濃度で、ペプチドP18のK.ニューモニエに対する抗細菌効果を示した。
【実施例１６】
【０２８１】
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対するP18の短期的効果
数時間インキュベートした後のカンジダ・アルビカンスに対するP18の効果は知られている（Lee, D.G., Hahm, K.S., Shin, S.Y. Structure and fungicidal activity of a synthetic antimicrobial peptide, P18, and its truncated peptides, Biotechnology Letters, 2004, 26: 337-341）。この実験の目的は、1時間以内の短時間インキュベーションの間におけるカンジダ・アルビカンス（DSM 11948）に対するペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2、（Bachem AG、スイス））の効果を検討し、それをZPT（ジンクピリチオン）の効果と比較することである。この目的のために、手順は以下の通りとした。
【０２８２】
YM増殖培地（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
3 g 酵母エキス
3 g 麦芽エキス
5 g ペプトン
10 g ブドウ糖
1リットルにフィルアップして、pHを6.2に合わせた。
【０２８３】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２８４】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０２８５】
増殖テストは次のように実施した：YM培地5 mlにC.アルビカンスを接種し、30℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０２８６】
1.5 ml反応容器にYM培地を1 mlずつ入れ、一夜培養のC.アルビカンス懸濁液を接種した。その結果生じるC.アルビカンス懸濁液は実験開始時に600 nmで測定される光学濃度が0.1となるように調整された。ペプチド水溶液、もしくはDMSOに溶解したZPT溶液（ジンクピリチオン、＞96％、Sigma Aldrich）の濃度は、2％（w/w）とした。
【０２８７】
次の増殖を比較した：
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が50 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が100 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が200 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が500 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が1000 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が50 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が100 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が200 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が500 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- C.アルビカンス懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が1000 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
1.5 ml反応容器は室温でインキュベートした。
【０２８８】
指定されたインキュベーション時間の後、20μlのYM培地中に希釈した懸濁液からそれぞれ1μlを画線し、2日間インキュベートした後、コロニー数をカウントすることにより、コロニー形成単位（CFU）を測定した。
【表１５】
2012526771.tif 000052
【０２８９】
結果は、検討した濃度範囲においてC.アルビカンス生細胞数がP18の効果によりはじめの20分以内にすでに大幅に減少したことを示す。ZPTに関しては、検討した濃度範囲内で観察した期間中に、有意な阻害は観察されなかった。結果は、ZPTと比べてペプチドP18の作用メカニズムが異なることを示す。この原因は、2つの抗菌物質の攻撃ポイントの相違にあるのかもしれない。ZPTはおそらく膜輸送を阻害する（Chandler et al. 1978 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 14: 60-68）のに対して、P18はおそらく、抗菌ペプチドの細菌に対する効果についてすでに記載されているように、真菌の膜と相互作用してそれを溶解する。その一方で、DNAの関連領域または関連タンパク質と結合することも、考えられるP18の作用様式であり、あるいはいくつかの攻撃ポイントに対する効果の組み合わせかもしれない。それに加えて、異なる効果は、C.アルビカンスによるZPTの無毒化によって説明することができる。
【実施例１７】
【０２９０】
トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）に対するP18の短期的効果
本実験の目的は、はじめの1時間以内の短時間インキュベーションの過程における、トリコフィトン・ルブルム（DSM21146）に対するペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 (Bachem AG、スイス)）の効果を検討すること、ならびにそれをZPT（ジンクピリチオン）の効果と比較することである。この目的のために、手順は次の通りとした。
【０２９１】
DSMZによるMEP増殖培地
30 g 麦芽エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
3 g 大豆ペプトン（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
1リットルにフィルアップしてpH 5.6に合わせる。
【０２９２】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０２９３】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０２９４】
増殖テストは、次のように実施した：トリコフィトン・ルブルム培養物が増殖した寒天プレートを5 mlのMEP培地ですすいだ。
【０２９５】
1.5 ml反応容器に1 mlのMEP培地を入れ、10μlのT.ルブルム懸濁液を接種した。ペプチド水溶液、またはDMSOに溶解したZPT溶液（ジンクピリチオン、＞96％、Sigma Aldrich）の濃度は2％とした。
【０２９６】
次の増殖を比較した：
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が50 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が100 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が200 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が500 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が1000 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が50 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が100 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が200 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が500 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- T.ルブルム懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が1000 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
1.5 ml反応容器は室温でインキュベートした。
【０２９７】
指定されたインキュベーション時間の後、20μlのMEP培地中に希釈した懸濁液からそれぞれ1μlを画線し、2日間インキュベートした後、コロニー数をカウントすることにより、コロニー形成単位（CFU）を測定した。例として、二連測定で実施した実験のCFUを示す。
【表１６】
2012526771.tif 000053
【０２９８】
結果は、T.ルブルム生細胞数が、検討した濃度範囲内で、最初の60分という早期にP18の効果によって最大で20分の1に低下することを示す。細胞数が10倍多い場合、生細胞数は最大で2分の1に減少した（データは示さず）。これらの結果は、ペプチドP18がT.ルブルムの増殖阻害を引き起こすことを示す。
【０２９９】
効果は細胞数に左右されるので、ペプチドそれ自体がこの効果によって消費されると思われる。こうした結果は、ペプチドP18が、増殖阻害効果を触媒するのではなく、むしろその反応に不可逆的に関与するという作用メカニズムを示す。したがって、上記の理由は、このペプチドと、真菌の膜またはDNAとの不可逆な相互作用であると思われる。
【０３００】
それに加えて、この結果は、観察した期間にわたって、検討した濃度範囲内で、ZPTについては有意な阻害が検出されなかったので、ZPTとP18の作用メカニズムが異なることを示す。その理由は、C.アルビカンスに関する同様の実施例（実施例16）において考察されたのと同じ理由であると思われる。
【実施例１８】
【０３０１】
大腸菌（Escherichia coli）に対するP18の短期的効果
数時間にわたるインキュベーション後の、大腸菌（Escherichia coli）に対するP18の効果が知られている（Shin et al. 1999 Journal of Peptide Research, 53: 82-90）。本実験の目的は、はじめの1時間以内の短時間インキュベーションの過程における、大腸菌（Stratagene, BLR）に対するペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 (Bachem AG、スイス)）の効果を検討すること、ならびにそれをZPT（ジンクピリチオン）の効果と比較することである。この目的のために、手順は以下の通りとした。
【０３０２】
LB増殖培地（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
3 g 酵母エキス
3 g 麦芽エキス
5 g ペプトン
10 g ブドウ糖
1リットルにフィルアップして、pHを7に合わせた。
【０３０３】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３０４】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０３０５】
増殖テストは次のように実施した：LC培地10 mlに大腸菌を接種し、37℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０３０６】
1.5 ml反応容器にLB培地を1 mlずつ入れ、一夜培養の大腸菌懸濁液を接種した。大腸菌懸濁液は実験開始時に600 nmで測定される光学濃度が0.1となるように調整された。ペプチド水溶液、もしくはDMSOに溶解したZPT溶液（ジンクピリチオン、＞96％、Sigma Aldrich）の濃度は、2％（w/w）とした。
【０３０７】
次の増殖を比較した：
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が50 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が100 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が200 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が500 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が1000 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が50 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が100 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が200 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が500 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- 大腸菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が1000 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
1.5 ml反応容器は室温でインキュベートした。
【０３０８】
指定されたインキュベーション時間の後、20μlのLB培地中に希釈した懸濁液からそれぞれ1μlを画線し、2日間インキュベートした後、コロニー数をカウントすることにより、コロニー形成単位（CFU）を測定した。
【表１７】
2012526771.tif 000054
【０３０９】
結果は、大腸菌生細胞数が、検討した濃度範囲内で、はじめの60分という早期にP18の効果によって大幅に減少することを示す。
【０３１０】
ZPTに関しては、観察した期間にわたって、検討した濃度範囲内で、有意な阻害は見られなかった。
【０３１１】
P18とZPTの有効性が異なる理由は、2つの抗菌物質の攻撃ポイントの相違であるかもしでない。ZPTはおそらく膜輸送を阻害する（Chandler et al. 1978 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 14: 60-68）のに対して、P18はおそらく、抗菌性ペプチドの細菌に対する効果についてすでに記載されているように、細菌の膜と相互作用して、それを溶解する。その一方で、DNAの関連領域、または関連タンパク質と結合することも、考えられるP18の作用様式であり、あるいは複数の作用メカニズムの組み合わせであるのかもしれない。それに加えて、効果の相違は、大腸菌によるZPTの無毒化によって説明することができる。
【実施例１９】
【０３１２】
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）に対するP18の短期的効果
数時間にわたるインキュベーション後の表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）に対するP18の効果が知られている（Shin et al., 2002,Biochemical and Biophysical Research Communications, 290: 558-562）。本実験の目的は、はじめの1時間以内の短時間インキュベーションの過程における、表皮ブドウ球菌（DSM 1798）に対するペプチドP18（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 (Bachem AG、スイス)）の効果を検討すること、ならびにそれをZPT（ジンクピリチオン）の効果と比較することとした。この目的のために、手順は以下の通りとした。
【０３１３】
TSBY増殖培地：
Ready-made TSB培地（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）；
17 g パンクレアチン分解カゼイン 
3 g パンクレアチン分解ダイズ 
2.5 g ブドウ糖
5 g 塩化ナトリウム
2.5 g リン酸二カリウム
3 g 酵母エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
1リットルにフィルアップしてpH 7に合わせた。
【０３１４】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３１５】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０３１６】
増殖テストは次のように実施した：TSBY培地5 mlに表皮ブドウ球菌を接種し、37℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０３１７】
1.5 ml反応容器にTSBY培地を1 mlずつ入れ、一夜培養の表皮ブドウ球菌懸濁液を接種した。表皮ブドウ球菌懸濁液は実験開始時に600 nmで測定される光学濃度が0.1となるように調整された。ペプチド水溶液、もしくはDMSOに溶解したZPT溶液（ジンクピリチオン、＞96％、Sigma Aldrich）の濃度は、2％（w/w）とした。
【０３１８】
次の増殖を比較した：
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が50 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が100 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が200 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が500 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が1000 ppmとなるP18ペプチドを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が50 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が100 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が200 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が500 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
- 表皮ブドウ球菌懸濁液、さらに1.5 ml反応容器中の終濃度が1000 ppmとなるZPTを添加、5、10、20、および60分後
1.5 ml反応容器は室温でインキュベートした。
【０３１９】
指定されたインキュベーション時間の後、20μlのTSBY培地中に希釈した懸濁液からそれぞれ1μlを画線し、2日間インキュベートした後、コロニー数をカウントすることにより、コロニー形成単位（CFU）を測定した。
【表１８】
2012526771.tif 000055
【０３２０】
結果は、表皮ブドウ球菌生細胞数が、検討した濃度範囲内で、最初の5分という早期にP18の効果によって大幅に低下したことを示す。ZPTについては、観察した期間の間、検討した濃度範囲内では、50 ppmおよび100 ppmで弱い阻害が観察された。もっと高濃度については、ZPTについて有意な阻害は観察されなかった。
【実施例２０】
【０３２１】
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する製剤中のP18
実験の目的は、P18ペプチド成分（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 (Bachem AG、スイス)）を有する医薬基本製剤の効果を検討することとした。この目的のために、下記の基本製剤を使用した：
1％ヒドロキシセルロース
10％プロピレングリコール
残りは水で作製される。
【０３２２】
基本製剤をもとにして、P18濃度を上昇させた（500 ppmから10,000 ppmまで）製剤を、20％濃縮溶液から調製した。
【０３２３】
C.アルビカンス（DSM 11948）に対する製剤の効果を検討した。
【０３２４】
この目的のために、手順は以下の通りとした。
【０３２５】
YM増殖培地（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
3 g 酵母エキス
3 g 麦芽エキス
5 g ペプトン
10 g ブドウ糖
1リットルにフィルアップして、pHを6.2に合わせた。
【０３２６】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３２７】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０３２８】
増殖テストは次のように実施した：YM培地5 mlにC.アルビカンスを接種し、30℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０３２９】
1.5 ml反応容器にYM培地を1 mlずつ入れ、実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.1が得られるように、一夜培養のC.アルビカンス懸濁液を接種した。そうして得られたC.アルビカンス懸濁液を1:9（製剤：C.アルビカンス懸濁液）の割合で製剤と混合した。5分、10分、20分および60分後に培養物1μlを20μlのYM培地で希釈した後、プレートに蒔いた。24時間インキュベートした後、プレート上のコロニーを計数した。
【表１９】
2012526771.tif 000056
【０３３０】
結果は、製剤それ自体（0 ppm）には増殖阻害効果がないことを示す。60分間インキュベートした後、P18を100 ppm含有する製剤について有意な増殖阻害が観察された。わずか5分の処理時間後でも、P18ペプチドを5000 ppm含有する製剤について効果が得られた。
【実施例２１】
【０３３１】
大腸菌（Escherischia coli）に対する製剤中のP18
本実験は、P18ペプチド成分（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 (Bachem AG、スイス)）を有する医薬基本製剤の効果を検討することを目的とした。この目的のために、下記の基本製剤を使用した：
1％ヒドロキシセルロース
10％プロピレングリコール
水でフィルアップする。
【０３３２】
基本製剤をもとにして、P18濃度を上昇させた（500 ppmから10,000 ppmまで）製剤を、20％濃縮溶液から調製した。
【０３３３】
大腸菌（Stratagene,BLR）に対する製剤の効果を検討した。
【０３３４】
この目的のために、手順は以下の通りとした。
【０３３５】
LB増殖培地（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
3 g 酵母エキス
3 g 麦芽エキス
5 g ペプトン
10 g ブドウ糖
1リットルにフィルアップして、pHを7に合わせた。
【０３３６】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３３７】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０３３８】
増殖テストは次のように実施した：LB培地5 mlに大腸菌を接種し、37℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０３３９】
1.5 ml反応容器にLB培地を1 mlずつ入れ、実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.1が得られるように、一夜培養の大腸菌懸濁液を接種した。そうして得られた大腸菌懸濁液を1:9（製剤：C.アルビカンス懸濁液）の割合で製剤と混合した。5分、10分、20分および60分後に培養物1μlを20μlのLB培地で希釈した後、プレートに蒔いた。24時間インキュベートした後、プレート上のコロニーを計数した。
【表２０】
2012526771.tif 000057
【０３４０】
結果は、製剤それ自体（0 ppm）には増殖阻害効果がないことを示す。60分間インキュベートした後、P18を10,000 ppm含有する製剤について有意な増殖阻害が観察された。
【実施例２２】
【０３４１】
他の真菌および細菌に対する製剤中のP18
本実験は、他の真菌および細菌に対する、P18ペプチド成分（P18配列H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 (Bachem AG、スイス)）を有する医薬基本製剤の効果を検討することを目的とした。この目的のために、下記の基本製剤を使用した：
1％ヒドロキシセルロース
10％プロピレングリコール
水でフィルアップする。
【０３４２】
基本製剤をもとにして、P18を10,000 ppm含有する製剤を、20％濃縮溶液から調製した。
【０３４３】
表皮ブドウ球菌(DSM 1798)、M.フルフル（DSM 6170）およびT.ルブルム（DSM 21146）に対する製剤の効果を検討した。
【０３４４】
この目的のために、手順は以下の通りとした。
【０３４５】
表皮ブドウ球菌用TSBY増殖培地
Ready-made TSB培地（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）；
17 g パンクレアチン分解カゼイン 
3 g パンクレアチン分解ダイズ 
2.5 g ブドウ糖
5 g 塩化ナトリウム
2.5 g リン酸二カリウム
3 g 酵母エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
1リットルにフィルアップしてpH 7に合わせた。
【０３４６】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３４７】
M.フルフル用：DSMZによるM472増殖培地
40 g 麦芽エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
20 g ウシ胆汁（Merck, Darmstadt、ドイツ）
10 g Tween 40（Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim、ドイツ）
1リットルにフィルアップする。
【０３４８】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３４９】
その後、2 ml オリーブ油（無菌濾過）を添加した。
【０３５０】
T.ルブルム用：DSMZによるMEP増殖培地
30 g 麦芽エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
3 g 大豆ペプトン（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
1リットルにフィルアップしてpH 5.6に合わせる。
【０３５１】
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３５２】
寒天プレートのために、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０３５３】
増殖テストは、次のように実施した：
黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌用には、5 mlの培地にその微生物を接種し、37℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０３５４】
M.フルフル用には、5 mlの培地にその微生物を接種し、30℃にて200 rpmで一晩インキュベートした。
【０３５５】
T.ルブルム用には、それが増殖した寒天プレートを5 mlの培地ですすいだ。そうして得られた懸濁液の10μlをMEP培地1 mlに添加し、そのまま実験に使用した。
【０３５６】
1.5 ml反応容器に培地を1 mlずつ入れ、一夜培養から得られた真菌もしくは細菌懸濁液を接種して、その結果得られる懸濁液が実験開始時に、600 nmで測定される光学濃度0.1に合わせられるようにした。そうして得られた懸濁液を1:9（製剤：微生物懸濁液）の割合で製剤と混合した。5分および60分後に培養物1μlを20μlの培地で希釈した後、プレートに蒔いた。24時間インキュベートした後、プレート上のコロニーを計数した。
【表２１】
2012526771.tif 000058
【０３５７】
製剤それ自体（0 ppm）は増殖阻害効果を示さなかった（データは示さず）。
【０３５８】
結果は、P18含有製剤の増殖阻害効果を示す。テストした細菌である表皮ブドウ球菌よりも、検討した真菌に関して、より高い効果が観察された。
【０３５９】
要するに、P18を含有する製剤で処理することによって、＜300分の1までの細胞数の減少が引き起こされた。
【０３６０】
したがって、その結果はペプチドP18の広範な抗菌効果を示す。異なる微生物について相違が見られる。結果からさらに、特に、ほんの短いインキュベーション時間だけではZPTの有意な効果は検出されなかったので、P18とZPTの作用メカニズムがはっきりと異なることが示される。
【０３６１】
ペプチドP18は、真菌もしくは細菌の膜、DNA、または両方の作用部位に作用する可能性がある。ほんの短い時間のインキュベーションの後に観察することができる効果は、微生物の増殖にかかわりなく、微生物の生存に必須の中心的な作用部位を示している。
【０３６２】
その効果の間に、ペプチドそれ自体は、おそらくは膜成分またはDNA関連領域との不可逆な結合により、不活化される。
【実施例２３】
【０３６３】
マラセチア・フルフル（Malassezia furfur）に対するP18およびAFPPの有効性の比較
WO 00/32220は、マラセチア・フルフルの増殖に対する、アスペルギルス・ギガンテウス（Aspergillus giganteus）由来の抗真菌ポリペプチドAFPPの効果を記載する。
【０３６４】
P18（配列番号３；配列：KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 (Bachem AG, Switzerland)）の効果をAFPPの効果と比較するために、A.ギガンテウス菌株CBS 526.65（Organobalance, Berlin）の培養上清からAFPPが与えられた。精製は、Theisらにしたがって実施された（Theis T., Wedde M., Meyer V., Stahl U. (2003) The antifungal protein from Aspergillus giganteus causes membrane permeabilization. Antimicrob. Agents Chemother. 47:588-593; Theis T., Marx F., Salvenmoser W., Stahl U., Meyer V. (2005) New insights into the target site and mode of action of the antifungal protein (AFP) of Aspergillus giganteus. Res Microbiol. 156:47-56）。
【０３６５】
バッファーを置き換えて濃縮した後、リン酸バッファー（10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5, 100 mM NaCl）中2％（w/w）AFPP溶液が得られた。N-末端配列決定により精製を確認した；HPLC分析はAFPP溶液の純度が99％より高いことを示した。
【０３６６】
P18濃縮液もリン酸バッファー中2％（w/w）溶液とした。
【０３６７】
二つのペプチドを比較するための実験は次のように実施した：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig、ドイツ)
40 g 麦芽エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
20 g ウシ胆汁（Merck, Darmstadt、ドイツ）
10 g Tween 40（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim、ドイツ）
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３６８】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
寒天プレート用には、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０３６９】
増殖テストは次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルDSM 6170（DSMZ）を接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０３７０】
各テスト混合物について、1.5 ml反応容器にピチロスポルム培地を入れ、M.フルフル一夜培養物を接種して、600 nmで測定される初発OD 0.1が与えられるようにした。
【０３７１】
以下のテスト混合物の増殖をモニターした：
-  M.フルフル懸濁液、および30μlリン酸バッファーの添加（終濃度0.1％での、活性ペプチドの効果に及ぼすリン酸バッファーの影響を除外するため）
-  M.フルフル懸濁液、および60μlリン酸バッファーの添加（終濃度0.2％での、活性ペプチドの効果に及ぼすリン酸バッファーの影響を除外するため）
-  M.フルフル懸濁液、および90μlリン酸バッファーの添加（終濃度0.3％での、活性ペプチドの効果に及ぼすリン酸バッファーの影響を除外するため）
-  反応容積中の終濃度0.1％のP18を含有するM.フルフル懸濁液
-  反応容積中の終濃度0.2％のP18を含有するM.フルフル懸濁液
-  反応容積中の終濃度0.3％のP18を含有するM.フルフル懸濁液
-  反応容積中の終濃度0.1％のAFPPを含有するM.フルフル懸濁液
-  反応容積中の終濃度0.2％のAFPPを含有するM.フルフル懸濁液
-  反応容積中の終濃度0.3％のAFPPを含有するM.フルフル懸濁液
反応容積はいずれの場合も600μlとした。テスト混合物中のM.フルフルの増殖を24時間にわたって観察した。この目的のために、5分、20分、および24時間後に混合物をM472培地で1:10に希釈し、次いで10μlをプレートに蒔いた。30℃にて6日間インキュベートした後、計数することによって、CFU（コロニー形成単位）を測定した。
【０３７２】
実験は2連の測定で実施し、独立した実験として少なくとも1回繰り返した。
【０３７３】
増殖へのリン酸バッファーの有意な影響は観察されなかった。
【表２２】
2012526771.tif 000059
【０３７４】
結果は、観察した期間内において、P18の添加が同等濃度のAFPPよりはるかに大きくCFUを低下させたことを示す。これは、P18の添加がAFPPよりすぐれたM.フルフル増殖阻害を達成し、したがってP18の方が有効であることを示している。
【実施例２４】
【０３７５】
シャンプー製剤におけるマラセチア・フルフルの増殖に対するP18およびAFPPの有効性の比較
AFPPの有効性をP18（配列番号3；配列：KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 (Bachem AG、スイス)）と比較して検討するために、実施例24に記載の実験を、シャンプー製剤を用いて繰り返した。
【０３７６】
手順は次の通りとした：
2つのペプチドはリン酸バッファー（10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、100 mM NaCl）中2％（w/w）溶液とした。
【０３７７】
下記の製剤を使用した：
【表２３】
2012526771.tif 000060
【０３７８】
終濃度0.1％および0.2％となるペプチド溶液をシャンプー製剤に添加した。そうして得られた製剤を、均一溶液を得るために16時間撹拌した。テスト結果に及ぼすリン酸バッファーの影響を排除するために、同じ手順を同量のリン酸バッファーについても行った。
【０３７９】
その後の手順は次の通りとした：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g 麦芽エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
20 g ウシ胆汁（Merck, Darmstadt、ドイツ）
10 g Tween 40（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim、ドイツ）
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３８０】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
寒天プレート用には、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０３８１】
増殖テストは次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルDSM 6170（DSMZ）を接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０３８２】
各テスト混合物について、1.5 ml反応容器にピチロスポルム培地を入れ、M.フルフル一夜培養物を接種して、600 nmで測定される初発OD 0.1が与えられるようにした。
【０３８３】
以下のテスト混合物の増殖をモニターした：
-  M.フルフル懸濁液、およびペプチド-シャンプー溶液で添加されている容積と同量のリン酸バッファーをシャンプー製剤に添加（シャンプー製剤中の濃度0.1％もしくは0.2％での、活性ペプチドの効果に及ぼすリン酸バッファーの影響を除外するため）
-  M.フルフル懸濁液、およびP18濃度0.1％のシャンプー製剤
-  M.フルフル懸濁液、およびP18濃度0.2％のシャンプー製剤
-  M.フルフル懸濁液、およびAFPP濃度0.1％のシャンプー製剤
-  M.フルフル懸濁液、およびAFPP濃度0.2％のシャンプー製剤
シャンプー製剤のM.フルフル培養液に対する比率は、すべてのテスト混合物について1:10とした（シャンプー製剤：M.フルフル培養液）。反応容量は1 mlとした。
【０３８４】
テスト混合物中でのM.フルフルの増殖を、20分間にわたって観察した。この目的のために、10分および20分後に混合物をM472培地に1:10の割合で希釈し、次に10μlをプレートに蒔いた。6日間30℃でインキュベーションした後、計数することによって、CFU（コロニー形成単位）を測定した。
【０３８５】
実験は2連の測定で実施し、独立した実験として少なくとも1回繰り返した。
【０３８６】
M.フルフルの増殖に対するリン酸バッファーの有意な影響は観察されなかった。活性ペプチドを含有しない製剤の添加は、それだけでCFUの減少を引き起こした。
【表２４】
2012526771.tif 000061
【０３８７】
実験結果は、増加した濃度のP18を含有するシャンプー製剤の添加が、観察期間内に、増加した濃度のAFPPを有する同等の製剤よりはるかに大きくCFUを減少させたことを示す。このことは、P18の添加が、AFPPよりすぐれたM.フルフル増殖阻害を達成し、したがってより有効であることを示す。
【実施例２５】
【０３８８】
マラセチア・フルフルの増殖に対する本発明のペプチドおよびAFPPの有効性の比較
マラセチア・フルフルの増殖に対する本発明の他のペプチドの効果をアスペルギルス・ギガンテウス（Aspergillus giganteus）由来の抗真菌性ポリペプチドAFPPの効果と比較するために、手順は次の通りとした：
比較として、配列番号4726（配列：FKKALHLFKPIKKFLKWK-NH2 (Bachem AG、スイス)）および配列番号4727（配列：KFLHLAKKFPKWKLFKKI-NH2 (Bachem AG、スイス）を有するペプチドバリアントを選択した。ペプチドおよびAFPP濃縮液はリン酸バッファー（10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、100 mM NaCl）中2％（w/w）溶液とした。
【０３８９】
ペプチドの比較実験は次のように実施した：
増殖培地：DSMZによるM472ピチロスポルム（Pityrosporum）培地
40 g 麦芽エキス（Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA）
20 g ウシ胆汁（Merck, Darmstadt、ドイツ）
10 g Tween 40（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim、ドイツ）
成分は121℃、1バールのゲージで20分間滅菌した。
【０３９０】
2 g/l オリーブ油（無菌濾過して、他の成分のオートクレーブ滅菌後に添加した）
寒天プレート用には、15 g/lの寒天を培地に添加した。
【０３９１】
増殖テストは次のように実施した：M472ピチロスポルム培地を含有する振盪培養にM.フルフルDSM 6170（DSMZ）を接種し、30℃にて200 rpmで一晩振盪しながらインキュベートした。
【０３９２】
各テスト混合物について、1.5 ml反応容器にピチロスポルム培地を入れ、M.フルフル一夜培養物を接種して、600 nmで測定される初発OD 0.1が与えられるようにした。
【０３９３】
以下のテスト混合物の増殖をモニターした： 
-  M.フルフル懸濁液、および90μlのリン酸バッファーの添加（終濃度0.3％での、活性ペプチドの効果に及ぼすリン酸バッファーの影響を除外するため）
-  反応容積中の終濃度0.3％の配列番号4726の本発明のペプチドバリアントを含有するM.フルフル懸濁液
-  反応容積中の終濃度0.3％の配列番号4727の本発明のペプチドバリアントを含有するM.フルフル懸濁液
-  反応容積中の終濃度0.3％のAFPPを含有するM.フルフル懸濁液。
【０３９４】
反応容積はいずれの場合も600μlとした。テスト混合物中でのM.フルフルの増殖を、10分間にわたって観察した。この目的のために、10分間インキュベーション後に混合物をM472培地に1:10の割合で希釈し、次に10μlをプレートに蒔いた。6日間30℃でインキュベーション後、計数することによって、CFU（コロニー形成単位）を測定した。
【０３９５】
増殖に対するリン酸バッファーの有意な影響は観察されなかった。
【表２５】
2012526771.tif 000062
【０３９６】
結果は、本発明のペプチドバリアントの添加が、観察期間内に、同等の濃度のAFPPよりはるかに大きくCFUを減少させたことを示す。このことは、本発明のペプチドバリアントの添加が、AFPPよりすぐれたM.フルフル増殖阻害を達成し、したがって本発明のペプチドバリアントの方が有効であることを示す。
【配列表】
2012526771000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月15日(2011.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（I）の少なくとも1つの配列モチーフを有するペプチドであって、
Hel1 - HB - Hel2(I)
式中、
HBは1から5個までの連続したアミノ酸残基を有し、ヘリックスブレイカーの機能をもつ部分配列モチーフを表しており、
Hel1およびHel2は、基本的に、親水性残基およびプロリン以外の疎水性残基から選択される、5から15個までの連続したアミノ酸残基をそれぞれ有する、同一の、または異なる、部分配列モチーフであって、いずれもαヘリックスアームを形成することができるが、軸方向投影図においてヘリックスアームの少なくとも1つは、疎水性、および親水性のヘリックスハーフへの不完全な分離を有し、
トリコフィトン属種（Trichophyton sp.)、マラセチア属種(Malassezia sp.)、小胞子菌属種(Microsporum sp.)、エピデルモフィトン属種(Epidermophyton sp.)、カンジダ属種(Candida sp.)、ブドウ球菌属種(Staphylococcus sp.)、およびプロピオニバクテリウム属種(Propionibacterium sp.)から選択される病原性微生物に対する医薬として使用するための、該ペプチド。
【請求項２】
以下の一般式（I）の少なくとも1つの配列モチーフを有するペプチドであって、
Hel1 - HB - Hel2(I)
式中、
HBは1から5個までの連続したアミノ酸残基を有し、ヘリックスブレイカーの機能をもつ部分配列モチーフを表しており、
Hel1およびHel2は、基本的に、親水性残基およびプロリン以外の疎水性残基から選択される、5から15個までの連続したアミノ酸残基をそれぞれ有する、同一の、または異なる、部分配列モチーフであって、いずれもαヘリックスアームを形成することができるが、
そのペプチドは、50％（v/v）トリフルオロエタノール、pH 7.0中で約7から98％まで、または30 mM SDS、pH 7.0中で約8から60％までの、いずれの場合もCD分光法により測定されるαヘリックス性％の値を有し、
トリコフィトン属種（Trichophyton sp.)、マラセチア属種(Malassezia sp.)、小胞子菌属種(Microsporum sp.)、エピデルモフィトン属種(Epidermophyton sp.)、カンジダ属種(Candida sp.)、ブドウ球菌属種(Staphylococcus sp.)、およびプロピオニバクテリウム属種(Propionibacterium sp.)から選択される病原性微生物に対する医薬として使用するための、該ペプチド。
【請求項３】
配列番号1に記載の配列もしくは反復配列モチーフを有するペプチドであって、
X1 X2K X3 X4 X5KIP X10 KFX6X7 X8 AX9KF（配列番号１）
配列中、
X10 は、ペプチド結合、または任意の1つもしくは2つの塩基性もしくは疎水性アミノ酸残基、または1つもしくは2つのプロリン残基であり、
X1 からX9 は、プロリン以外の、任意の塩基性もしくは疎水性アミノ酸残基であって；
この反復配列モチーフは同一であっても異なっていてもよく；
トリコフィトン属種（Trichophyton sp.)、マラセチア属種(Malassezia sp.)、小胞子菌属種(Microsporum sp.)、エピデルモフィトン属種(Epidermophyton sp.)、カンジダ属種(Candida sp.)、ブドウ球菌属種(Staphylococcus sp.)、およびプロピオニバクテリウム属種(Propionibacterium sp.)から選択される病原性微生物に対する医薬として使用するための、該ペプチド。
【請求項４】
配列番号2に記載の配列もしくは反復配列モチーフを有するペプチドであって、
X1 X2K X3 X4 X5KIP X11 X12 KFX6X7 X8 AX9KF（配列番号２）
配列中、
X1 はリジン、アルギニンもしくはフェニルアラニン、
X2 はリジンもしくはトリプトファン、
X3 はロイシンもしくはリジン、
X4 はフェニルアラニンもしくはロイシン、
X5 はロイシンもしくはリジン、
X6 はロイシンもしくはリジン、
X7 はヒスチジンもしくはリジン、
X8 はアラニン、ロイシン、バリンもしくはセリン、
X9 はロイシンもしくはリジン、
X11 はプロリンもしくは化学結合、
X12 はプロリンもしくは化学結合であって、
反復配列モチーフは同一もしくは異なっており、
トリコフィトン属種（Trichophyton sp.)、マラセチア属種(Malassezia sp.)、小胞子菌属種(Microsporum sp.)、エピデルモフィトン属種(Epidermophyton sp.)、カンジダ属種(Candida sp.)、ブドウ球菌属種(Staphylococcus sp.)、およびプロピオニバクテリウム属種(Propionibacterium sp.)から選択される病原性微生物に対する医薬として使用するための、該ペプチド。
【請求項５】
微生物がトリコフィトン属種（Trichophyton sp.)、小胞子菌属種(Microsporum sp.)、エピデルモフィトン属種(Epidermophyton sp.)、カンジダ属種(Candida sp.)、ブドウ球菌属種(Staphylococcus sp.)、およびプロピオニバクテリウム属種(Propionibacterium sp.)から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号3に記載の配列もしくは反復配列モチーフを有する、請求項４に記載のペプチド。
KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2    （配列番号３）
【請求項７】
一般式（I）の、または配列番号1、2もしくは3に記載の多数のペプチドがリンカー基を介して互いにペプチド結合している、反復配列モチーフを有するペプチドを含有する、請求項１〜６のいずれか1つに記載のペプチド。
【請求項８】
リンカーが、好ましくはアラニン、グリシン、スレオニンおよびセリンから選択される、同一の、または異なる、1から10個の連続したアミノ酸残基を含んでいる、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドのC末端カルボキシル基がアミド化されている、請求項１〜８のいずれか1つに記載のペプチド。
【請求項１０】
標準条件下で測定された約1500から0.1μMまでの範囲のマラセチア・フルフルに関する最低阻害濃度を有する、請求項１〜９のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１１】
少なくとも１つの医薬品添加物もしくは活性物質、および少なくとも1つの、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のペプチドの融合産物、という形態での請求項１〜１０のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１２】
少なくとも１つの他の医薬活性物質を追加して含有する、請求項１〜１１のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１３】
少なくとも１つの抗炎症活性物質を追加して含有する、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１４】
好ましくない細菌の増殖および／または活動を阻害するために抗菌活性物質を追加して含有する、請求項１〜１３のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１５】
皮脂調節物質を追加して含有する、請求項１〜１４のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１６】
少なくとも１つのさらなる抗真菌剤または抗細菌活性物質と組み合わされた、請求項１〜１５のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１７】
真菌症、皮膚真菌症、または皮膚、爪、毛髪もしくは粘膜の細菌感染を治療するための、請求項１〜１６のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１８】
病原性微生物が、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton violaceaum）、トリコフィトン・ソウダネンセ（Trichophyton soudanese）、トリコフィトン・ショーエンレニイイ（Trichophyton schoenleinii）、トリコフィトン・インターディジターレ（Trichophyton interdigitale）、トリコフィトン・ヴェルコスム（Trichophyton verrucosum）、トリコフィトン・エクイナム（Trichophyton equinum）、トリコフィトン・インターディジターレ（Trichophyton interdigitale）、マラセチア・フルフル（Malassezia furfur）、マセラチア・グロボーサ（Malassezia globosa）、マセラチア・オブツサ（Malassezia obtusa）、マセラチア・パキデルマティス（Malassezia pachydermatis）、マセラチア・レストリカ（Malassezia restricta）、マセラチア・スルーフィアエ（Malassezia slooffiae）、マセラチア・シンポディアリス（Malassezia sympodialis）、マイクロスポルム・フェリネウム（Microsporum felineum）、マイクロスポルム・アゥドウイニイイ（Microsporum audouinii）、マイクロスポルム・キャニス（Microsporum canis）、マイクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、エピデルモフィトン・フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、およびプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から選択される、請求項１〜１７のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１９】
病原性微生物が、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）トリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton violaceaum）、トリコフィトン・ソウダネンセ（Trichophyton soudanese）、トリコフィトン・ショーエンレニイイ（Trichophyton schoenleinii）、トリコフィトン・インターディジターレ（Trichophyton interdigitale）、トリコフィトン・ヴェルコスム（Trichophyton verrucosum）、トリコフィトン・エクイナム（Trichophyton equinum）、トリコフィトン・インターディジターレ（Trichophyton interdigitale）、マセラチア・グロボーサ（Malassezia globosa）、マセラチア・オブツサ（Malassezia obtusa）、マセラチア・パキデルマティス（Malassezia pachydermatis）、マセラチア・レストリカ（Malassezia restricta）、マセラチア・スルーフィアエ（Malassezia slooffiae）、マセラチア・シンポディアリス（Malassezia sympodialis）、マイクロスポルム・フェリネウム（Microsporum felineum）、マイクロスポルム・アゥドウイニイイ（Microsporum audouinii）、マイクロスポルム・キャニス（Microsporum canis）、マイクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、エピデルモフィトン・フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、およびプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から選択される、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
爪真菌症、癜風、毛孔性粃糠疹、頭部白癬、体部白癬、格闘家白癬、爪白癬、白癬（Trichophytie）、手白癬、足白癬、粘膜炎／鵞口瘡、ミクロスポルム症および砂毛症からなる群より選択される疾患の治療のための、請求項１〜１９のいずれか１つに記載のペプチド。
【国際調査報告】
2012526771.tif 000063
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