(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、細胞を含む細胞培養物を清澄化する方法に関し、この方法は、細胞培養物を、１．４〜３の特定の粒子密度を有する微粒子陰イオン交換物質と接触させる工程と、十分な時間培養させる工程と、得られた細胞ペレットを上清層から分離する工程と、を含むものである。本発明は、更に、細胞培養物を、１．４〜３ｇ／ｍｌの特定の粒子密度を有する陰イオン交換物質と接触させ、得られた細胞ペレットを、上清層から分離し、更に目的とする生物学的分泌物質を上清層から抽出することにより、目的とする細胞分泌物質を、目的とする細胞培養物質を含む細胞培養物から回収する方法する。選択的に、残った生物学的物質は、更に、１若しくはそれ以上の工程により、得られた細胞ペレットから抽出することが可能である。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物を清澄する方法であって、
ａ．細胞培養物を、１．４〜３ｇ／ｍｌの特定の粒子密度を有する微粒子陰イオン交換物質と接触させる工程と、
ｂ.細胞ペレットと上清層とが形成されるのに十分な時間培養させる工程と、
ｃ．得られた細胞ペレットを上清から分離する工程と
を含むものである、方法。
【請求項２】
目的とする生物学的分泌物質を産生する細胞を含む細胞培養物から、目的とする生物学的分泌物質を回収する方法であって、
ａ．細胞培養物を、１．４〜３ｇ／ｍｌの特定の粒子密度を有する微粒子陰イオン交換物質と接触させる工程と、
ｂ．細胞ペレットと上清層とが形成されるのに十分な時間培養させる工程と、
ｃ．得られた細胞ペレットを上清層から分離する工程と
ｄ．前記目的とする生物学的分泌物質を上清から抽出する工程と
を含むものである、方法。
【請求項３】
請求項２１記載の方法であって、前記得られた細胞ペレットは、更に、
ｅ．前記得られた細胞ペレットを再懸濁させる工程と、
ｆ．細胞ペレッと上清層とが形成されるのに十分な時間培養させる工程と、
ｇ．得られた細胞ペレットを上清層から分離する工程と、
ｈ．前記目的とする生物学的培養物を上清層から抽出する工程と
を含むものである、方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、前記工程ｅ〜ｈは繰り返されるものである。
【請求項５】
請求項３又は４４の方法において、前記得られた細胞ペレットは塩類水溶液に再懸濁されるものである。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記塩類水溶液はＰＢＳである。
【請求項７】
請求項３又は４記載の方法において、前記各上清層は目的の生物学的物質を抽出する前に一緒にされるものである。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれかの方法において、前記目的とする生物学的物質は、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて抽出されるものである。
【請求項９】
前述のいずれかの請求項において、前記目的とする生物学的物質は、免疫グロブリン又はその一部である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養液を清澄化する方法、並びに目的の生物学的分泌物質を産生する細胞を含む細胞培養液から生物学的物質を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば薬剤及び特にモノクローナル抗体などの生物学的物質の培養的生産により、複合細胞培養液がもたらすものであり、この培養液から生物学的物質が単離され、種々の工程を経て精製される。
【０００３】
第一段階として、細胞及び細胞片などの固体物質が細胞培養溶液から分離される。本工程は清澄と称する。多くの例において生物学的物質は細胞外に存在しており、細胞培養溶液中に存在する。
【０００４】
最新の清澄化方法の例には、遠心分離、濾過（例えば精密濾過、深層濾過、および絶対的細孔径膜濾過）、および膨張層クロマトグラフィーが含まれる。これらの清澄化方法を強化するために、軟凝集が、特に濾過と組み合わせて用いられることもできる。
【０００５】
この目的のための軟凝集剤として知られているものは単純な電解質から合成高分子電解質（例えばＤＥＡＥデキストラン、アクリル質ポリマー、およびポリエチレンアミン）または無機質（例えば珪藻土または真珠岩）までにわたる。この目的のための最近の進歩はキトサンの使用である。
【０００６】
軟凝集剤を多用することによる不都合な点には、とりわけ、それらが目的の生物学的分泌物に結合する可能性があること、目的の生物学的分泌物を不活性化させる可能性があること、軟凝集プロセスに時間がかかる可能性があること、および／または医学上必要とされる高品質にするためには軟凝集剤が得難いまたは高価で準備できない可能性があることが挙げられる。加えて、凝集剤は最終生成分子から取り除かれる必要があり、そのプロセスは除去を実証するため、しばしば高価で時間を費やす分析試験を必要とする。
【０００７】
本願発明の方法はこれらの不都合な点は一つもない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
さらに、本願発明の目的は、哺乳類細胞及び目的の生物学的分泌物質を含むバイオリアクターから採取した細胞培養物を清澄化する費用効率のよい方法を提供するものである。
【０００９】
本願発明の更なる目的は、目的の生物学的分泌物質を産生する哺乳類細を含む細胞培養物から目的の生物学的分泌物質を回収する方法を提供することである。
【００１０】
特定の実施形態において、本願発明は、哺乳細胞と培地を含む細胞培養物、並細胞培養物が全体として正電化を有する生物学的分泌物質の清澄方法に関し、当該方法は、
ａ．細胞培養物を、１．４〜３ｇ／ｍｌの粒子密度を有する微粒子アニオン交換物質と接触させる工程と、
ｂ．細胞ペレットと上清層とを形成するのに適切な時間培養する工程と、
ｃ．得られた細胞ペレットを上清層から分離する工程と
を有するものである。
【００１１】
本願発明において、「細胞培養物」とは、無傷哺乳類細胞を用いて培養した細胞培養物を意味しており、以下に定義する細胞培養物及び生物学的分泌物質を更に含むものであってもよい。本願発明の工程において、特に細胞密度が高い場合には、バイオリアクターから得られる開始物質を希釈し、目的の細胞密度に希釈することが好ましい。本願発明の目的に対して、そのように希釈した物質もまた細胞培養物の用語の中に包含されるものである。
【００１２】
特定の上限として、本願発明による工程は、１７５×１０６細胞／ｍｌ未満、好ましくは１３０×１０６細胞／ｍｌ未満の細胞密度において実行されるものである。
【００１３】
細胞密度は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ（登録商標）などの細胞計測器（トリパンブルーを使用しない方法）を用いて測定することが可能であるが、ほかの好ましい方法として、血球計算版、血中血球容積測定、又はＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｅｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｚｏｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄ）などが含まれる。
【００１４】
開始細胞密度が１３０×１０６細胞／ｍｌ以上である場合、まず細胞培養物を希釈することが好ましい。特に、初期細胞密度が１００×１０６細胞／ｍｌである場合には、まず希釈することが好ましい。細胞培養物は、例えばＰＢＳなどの等張溶液など、細胞環境を大きく変化させない溶液を用いて希釈される。
【００１５】
「生物学的分泌物」は、哺乳類細胞により産生された生物学的物質であり、培地中に多く放出（能動的又は受動的に）されるものである。
【００１６】
「目的の」とは、生物学的物質が哺乳類細胞を使用して意図的に産生されることを意味する。
【００１７】
目的の生物学的分泌物が「全体的に正電化」であるとは、培地中の溶媒条件下における生物学的物質の正及び負に帯電した無機官能基の静電的寄与により実質正電荷となっていることをを意味する。生物学的物質が全体的に正電化であるのは、酸及び塩基残基のｐＫａ及び溶液のｐＨ、すなわちこの場合は培地のｐＨに基づくものである。生物学的物質が培地中で実質的に正電化を有する場合、当該物質のｐｌ（実質的な電化がゼロであるｐＨ）が細胞培養物のｐＨより高くなければならない。
【００１８】
「培地」とは、細胞の増殖及び産生を補助する栄養及び他の成分を含む細胞の細胞外環境を意味しており、排出物又は宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）又は溶解細胞からの物質を含むものであってもよい。培地の組成は細胞の培養経過に従って変化してもよく清澄段階において元の構成物質の１若しくはそれ以上が枯渇するものであってもよい。
【００１９】
「接触」とは、陰イオン交換を細胞培養物にもたらし、（例えば、重力又は遠心分離により）細胞を定着させることを意味する。
【００２０】
「陰イオン交換物質」とは、微粒子弱又は強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体を意味する。陰イオン交換物質は、概して、有機物質又は無機物質又は有機及び無機物質の混合物の担体を含む。適切な有機物質はアガロースを基質とした媒体及びメタクリレートである。適切な無機物質はシリカ、セラミックス及び金属である。粒子は好ましくは１５〜１５０μｍの大きさを有するものである。より好ましくは、１５〜７０μｍの大きさである。粒子は、細胞が細胞培養物から比較的速く沈殿することに適した密度を有するものであるが、密度が高すぎると沈殿することができないというように高すぎるものではない。
【００２１】
本願発明の方法によれば、１．４〜３ｇ／ｍｌの特定の粒子密度を有する微粒子陰イオン交換物質が適用される。好ましくは、前記粒子は約２ｍｇ／ｍｌのである。陰イオン高官物質の特定の密度を決定するのに適した方法は、実施例の項に記載している。好ましい陰イオン交換物質はこの要件を満たすものであり、例えばシリカ、セラミック物質、又は金属核から成るあるいはそれらを含む粒子を有するものである。
【００２２】
「十分な培養時間」とは、細胞の沈殿物が上清層と区別された細胞ペレットとして生じる時間を意味する。
【００２３】
「分離」とは、例えば上澄み液をデカンテーションするか或いは吸引するか、或いは例えば底にある出口を通して容器からペレットを流し出すといったことによって、細胞ペレットを上清から除去するあらゆる方法を意味する。
【００２４】
「上清層」とは、落ち着かせることにより、容積の上にとどまった液体を意味する。上清層は（一般に）細胞を含んでいるが、初期細胞密度よりもはるかに低い細胞密度を有するものである。
【００２５】
本願発明の実施形態によれば、哺乳類細胞及び培地、並びに全体として陽性電荷を有する目的の生物学的分泌物質を含む細胞培養物から目的の生物学的物質を回収する方法に関連し、
ａ.細胞培養物を、１．４〜３ｇ／ｍｌの粒子密度を有する特定の密度微粒子陰イオン交換物質と接触させる工程と、
ｂ．細胞ペレット及び細胞上清の形成をもたらす十分な培養時間培養させる工程と、
ｃ．得られた細胞ペレットを上清層から分離させる工程と、
ｄ．目的の生物学的分泌物質を上清層から単離させる工程と
を含む。
【００２６】
本願発明は、更に、細胞培養物中、哺乳類細胞、培地、及び、全体として正電化を有する目的の生物学的分泌物を含む細胞培養物から、目的の生物学的分泌物を回収する方法に関するものであり、得られた沈殿物は更に、
ｅ．得られた沈殿物を再懸濁する工程と、
ｆ．細胞ペレット及び上清層を形成するのに十分な時間培養させる工程と、
ｇ．得られた細胞ペレットを上清層から分離する工程と
ｈ．前記上清層から目的の生物学的分泌物を単離する工程と
によって、更に処理される。
【００２７】
本願発明の更なる方法において、前記工程ｅ〜ｈは１若しくはそれ以上繰り返されるものである。
【００２８】
本願発明の更なる方法において、得られた細胞ペレットは、哺乳類細胞の溶解を引き起こさないように、例えば食塩水（好ましくは等張）、より好ましくはＰＢＳなどの細胞環境を大きく変化させない溶液中に再懸濁されるものである。
【００２９】
好ましくは、前記上清層は集めて、前記目的の生物学的分泌物は溜めた上清から抽出されるものである。
【００３０】
哺乳類細胞の例は、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞、ハイブリドーマ、ＢＨＫ（Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｄｎｅｙ）細胞、骨髄腫細胞、例えばＨＥＫ−２９３細胞などのヒト細胞、ヒトリンパ芽球様細胞、Ｅ１不死化ＨＥＲ細胞、マウス細胞、例えばＮＳ０細胞などを含む。より好ましくは、Ｅ１不死化ＨＥＲ細胞が使用され、より好ましくは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞である。
【００３１】
好ましい実施形態において、本願発明の工程における細胞は、Ｅ１不死化ＨＥＲ細胞、より好ましくはＰＥＲ．Ｃ６細胞である（米国特許第５，９９４，１２８号を参照。これはこの参照により本願明細書に組み込まれるものである）。ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、第９６０２２９４０号としてＥＣＡＣＣに寄託されている（米国特許第５，９９４，１２８号、欧州特許第０８３３９３４号を参照。これらはこの参照により本願明細書に組み込まれるものである）。
【００３２】
清澄のための細胞培養物は、哺乳類細胞が少なくとも１５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に達するのに適したあらゆる細胞培養方法によって得られるものである。これに関して適切な方法は、例えば国際特許第２００５０９５５７８号、国際特許第２００４０９９３９６号、及び国際特許第２００８００６４９４号に記載されている。これらはこの参照により本願明細書に組み込まれるものである。
【００３３】
生物学的物質は、例えば（組み換え）遺伝子コード化を発現することなどにより、細胞によって産生されるものであり、従ってそれは、例えばウイルス又は（組み換え）タンパク質、特にレセプター、酵素、融合タンパク質、例えば血液凝固カスケードからのタンパク質などの血液タンパク質、例えばエリスロポエチン、ワクチンに使用されるようなウイルス又は細菌タンパク質多機能タンパク質などであり、より好ましくは免疫グロブリン又はその部分てきなものが細胞により産生される。好ましくは、前記生物学的物質は、例えば細胞により産生されたタンパク質又はワクチンであり、薬学的調製において活性成分として使用されるものである。本願発明において、「産生」及び「生物学的物質」は変換可能である。
【００３４】
上清層から目的の生物学的分泌物質を抽出する適切な方法は、例えば濾過（例えば深層濾過、マイクロ濾過、限外濾過、血液透析濾過）、クロマトグラフィー（例えばサイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）、水溶性２層抽出、沈殿又は遠心分離などである。有利な点として、目的の生物学的物質は、陽イオン交換クロマトグラフィーによって効果的に抽出される。目的の生物学的物質が免疫グロブリンの場合、親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Ａクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーが分離方法として特に適切である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、様々な陰イオン交換物質における時間に対する上清細胞密度を示したものである。細胞密度はＶｉ−ＣＥＬＬで測定した。
【図２】図２は、様々な陰イオン交換物質における時間に対する上清容積を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
実施例
記号
Ｘｔ＝全細胞密度、細胞／ｍｌ
Ｓｉ−ＰＥＩ＝Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ  ＰＥＩ（ＰｏｌｙＥｔｈｙｌｅｎｅＩｍｉｎｅ）Ｐｒｅｐ  ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇ  グラフト化シリカビーズ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）
ＤＥＡＥ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ＝ジエチルアミノエチル  グラフト化セラミックビーズ（Ｐａｌｌ）
Ｓｕｐｅｒ  Ｑ＝メタクリレート支持体第４級アミノ機能化（Ｔｏｓｏｈ）
ＴＰ  ＤＥＡＥ＝メタクリレート支持体ジエチルアミノエチル機能化（Ｔｏｓｏｈ）
ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水
以下の実験は、国際特許公報第２００８００６４９４号に概説された方法に従って調製したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を用いて実施した。これらのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は抗体を産生した。
【００３７】
陰イオン交換物質の粒子密度の測定方法
粒子密度（ｇ（乾燥物）／ｍｌ）は比重瓶法に従って測定した１０ｍｌ容積の比重瓶（第１５１２３Ｒ−１０Ｋｍｂｅｌｅ  Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ニュージャージー州）を以下のように測定した。
１．きれいにし、乾燥した空の比重瓶のアセンブリの重量を測定する（Ｗｉ）。
２．室温下、比重瓶を完全に水で充填する。
３．温度計を挿入し、排水口にある過剰な水をふきとる。排水口を閉じる。
４．比重瓶アセンブリの重量を再度測定する（Ｗｆ）。
５．比重瓶の体積を以下によって測定する。
【００３８】
【数１】
2012505864.tif 000002
【００３９】
ｐＨ２０（Ｔ）は温度に対する水の密度を示したものである。粒子に都度は以下のように測定される、
ａ．きれいにし、乾燥し、空にした比重瓶アセンブリの重量を測定する（Ｗｉ）。
ｂ．乾燥（５０℃で３時間乾燥）した陰イオン交換物質を比重瓶で重量を測る（Ｗｒ）。
ｃ．室温下、比重瓶を完全に水で充填する
ｄ．温度計を挿入し排水口における過剰な水をふき取る。排水口を閉じる。
ｅ．比重瓶アセンブリの重量を再度測定する（Ｗｆ）。
ｆ．粒子密度（ｐｄ）を以下によって測定する。
【００４０】
【数２】
2012505864.tif 000003
【００４１】
測定は３回行った。
【００４２】
陰イオン交換物質の粒子密度
種々の陰イオン交換物質の粒子密度は上述の方法を用いて測定した。
【００４３】
結果は以下の表にまとめた。
【００４４】
【表１】
2012505864.tif 000004
【実施例１】
【００４５】
様々な密度の陰イオン交換樹脂を用いて純度を比較した
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を含む細胞培養物を用いて、Ｓｉ−ＰＥＩ（１５及び４０μｍ）、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ（３５及び６５μｍ）、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＤＥＡＥ（３５及び６５μｍ）及びＤＥＡＥ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄを評価した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、国際特許公報第ＷＯ２００８８００６４９４号に概説された方法に従って調製した。１３日後の反応容器におけるＸｔは９８．８×１０６細胞／ｍｌであった。前記物質は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ＰＢＳ（５ｍＳ／ｃｍ）を用いて７５×１０６細胞／ｍｌに希釈し、最終体積２０ｍｌとした。陰イオン交換は５０／５０スラリー（全体積２４ｍｌ）となるように加え、細胞はペレット体積が一定となるまで落ち着かせた（６０分）。
【００４６】
収穫物及び上清の一定量を分析タンパク質Ａクロマトグラフィーによって分析し、賛成物の回収を測定した。回収は以下によって測定した。
【００４７】
【数３】
2012505864.tif 000005
【００４８】
分析は必要に応じて、すなわち細胞が実験容積に大幅に寄与する細胞密度が以上に高い場合、バイオマスに対して補正した。
【００４９】
図１は、各陰イオン交換物質及び陰イオン交換物質を加えていない対照の、時間に対する上清の細胞密度を示したものである。対照と比較して、促進された細胞の安定化がそれぞれの場合に観察された。小さい粒子サイズの場合、上清細胞密度が１０×１０６細胞／ｍｌ以下というように減少する傾向が見られ、より大きな粒子サイズの場合、細胞密度は１１〜１５×１０６細胞／ｍｌであった。
【００５０】
図２は、各陰イオン交換物質における、上清体積に対する時間を示したものである。Ｓｉ−ＰＥＩ物質の添加により、最も大きな上清体積量がもたらされたが、これが最も密集したペレットに起因していた。この場合、ペレットは全体積の４０％を占めていた他のに対して、対照の場合ペレットは全体積の６３％を占めていた。Ｓｉ−ＰＥＩ物質はメタクリレート及びアガロース基質物質よりも高い密度を有しており、これは明らかにより密集したペレット及び速い安定化速度によるものである。セラミックＨｙｐｅｒＤ物質は中間安定化速度及びペレット体積の中間密度を有する。
【実施例２】
【００５１】
目的とするの生物学的物質の精製
初期細胞密度１７５×１０６細胞／ｍＬとして採取した細胞培養物をＰＢＳで〜７５×１０６細胞／ｍｌとなるまで希釈した（初期容積１．７Ｌ）。希釈後、採取物に、ＳＩ−ＰＥＩクロマトグラフィー媒体を添加した（希釈した採取物１リットルあたり０．１ＬのＳｉ−ＰＥＩ樹脂）。細胞は〜６０分間沈降させた。上清を含む生成物をデカンテーションし、固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄した。初期上清は２回の洗浄液と一緒にまとめ、生成物の回収を最大にさせた（〜９５％）。一緒にまとめた液体は、５×１０６細胞／ｍｌ未満であり、ＨＣＰ含量は５９％まで減少した。
【００５２】
Ｓｉ−ＰＥＩ沈降後に回収した生成物は、更に深層濾過により精製させた。深層濾過は、細胞密度を更に小さくするために使用される第１のフィルター（通常１０〜５μｍの細孔径）と、その後により小さな粒子を除去し、清澄された採取物を通常０．８／０．２μｍ勾配フィルタによる滅菌濾過を行うための調整をするために使用される第２のフィルター（通常２又は１マイクロ細孔径）とにより成るものである。深層濾過トレーンは、例えばＤ０ＨＣ（第１）の後にＸ０ＨＣ（第２）媒体を含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣフィルタ、或いは例えば１０Ｍ０２（第１）の後に６０ＺＡ０５Ａ（第２）を含むＣＵＮＯ  ＺｅｔａＰｌｕｓフィルタであっても良い。いずれの場合においても、清澄化した採取物は更に、０．８／０．２μｍフィルター（Ｓｕｐｏｒ，Ｐａｌｌ）によって濾過される。
【００５３】
更に、深層濾過の中、第２のフィルタを介して８５％のＨＣＰの減少が観察された。第２のフィルタを介したＨＣＰの減少は、これらのフィルタが荷電しているという特徴に寄与しており、これまでに文献にも報告されている（Ｙｉｇｚａｗ  Ｙ，Ｐｉｐｅｒ  Ｒ，Ｔｒａｎ  Ｍ，Ｓｈｕｋｌａ  ＡＡ．２００６．Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐｔｈ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２２（１）：２８８−２９６）。
【００５４】
清澄化した物質は更に、例えばＧｉｇａＣａｐＳ（Ｔｏｓｏｈ）などの陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製される。モノクローナル抗体（生成物）は>９５ｇ／Ｌのクロマトグラフィー媒体の容量で樹脂に固定化される。抗体を固定化するのに使用される条件は弱酸性（ｐＨ〜５．３）及び〜４．５ｍＳ／ｃｍの伝導性である。結合させた後、抗体は平衡緩衝液で洗浄し、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液で採取希釈する。この工程により、ＨＣＰ含量の更なる減少（７８％）が得られる。
【００５５】
希釈した抗体はさらに、クロマトグラフィーと濾過技術により、必要な純度規定に達するまで精製される。
【００５６】
ＣＥＸ工程を介して採取した細胞培養物から得られた宿主細胞タンパク質の全体的な減少を以下に示す。
【００５７】
【表２】
2012505864.tif 000006
【図１】
2012505864.tif 000007
【図２】
2012505864.tif 000008
【国際調査報告】
2012505864.tif 000009
2012505864.tif 000010
2012505864.tif 000011