(57)【要約】本発明は、免疫グロブリンを精製するための方法であって、単量体型、凝集型及びフラグメント化型の免疫グロブリンを含む緩衝化水溶液（ここで、その緩衝化水溶液は８．０〜８．５のｐＨ値を有する）を、単量体型の免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件で陰イオン交換クロマトグラフィー物質に適用すること、及び陰イオン交換クロマトグラフィー物質からのフロースルー中に単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む方法を報告している。一態様では、陰イオン交換クロマトグラフィー物質は、膜陰イオン交換クロマトグラフィー物質である。
2012513425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単量体型の免疫グロブリンを得るための方法であって、
以下の工程：
単量体型及び凝集型の免疫グロブリン並びに／又は免疫グロブリンフラグメントを含む緩衝化水溶液（ここで、該緩衝化水溶液は、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．５のｐＨ値を有する）を陰イオン交換クロマトグラフィー物質に適用し、それにより免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントが枯渇した免疫グロブリンが、該陰イオン交換クロマトグラフィー物質のフロースルーから回収されて、単量体型の免疫グロブリンが得られること
を含む方法。
【請求項２】
陰イオン交換クロマトグラフィー物質が膜陰イオン交換クロマトグラフィー物質であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
陰イオン交換クロマトグラフィー物質が、強陰イオン交換クロマトグラフィー物質であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）の前に追加的なプロテインＡクロマトグラフィー工程又はＨＣＩＣクロマトグラフィー工程を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドの精製の分野にある。溶液中の免疫グロブリンを不純物から、特に凝集型の免疫グロブリン及び免疫グロブリンフラグメントから分離することによって単量体型の免疫グロブリンを提供するための方法が報告されている。
【０００２】
発明の背景
タンパク質、特に免疫グロブリンは、今日の医学ポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。ヒトに適用するために、あらゆる治療用タンパク質は別個の基準を満たさなければならない。ヒトに対する生物学的製剤の安全性を確保するために、危害を及ぼすおそれのある核酸、ウイルス、及びホスト細胞タンパク質を特に除去しなければならない。取締上の規格を満たすために、一つ又は複数の精製工程が発酵工程に続かなければならない。とりわけ、純度、処理量、及び収率が、適切な精製工程を決定する際に重要な役割を果たす。
【０００３】
微生物タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（スルホプロピル又はカルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モードイオン交換）、チオフィリック（thiophilic）吸着（例えば、β−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いたもの）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いたもの）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）−アフィニティ物質を用いたもの）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動法など（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）の様々な方法が十分に確立されており、タンパク質の精製のために広く使用されている（例えばVijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102参照）。
【０００４】
Necina, R.ら（Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698）は、高電荷密度を示すイオン交換媒体による細胞培養上清からの直接的なヒトモノクローナル抗体の捕捉を報告した。国際公開公報第８９／０５１５７号では、細胞培養培地を陽イオン交換処理に直接供することによる産物免疫グロブリンの精製のための方法が報告されている。マウス腹水からのモノクローナルＩｇＧ抗体の一工程精製が、Danielsson, A., et al., J. Immunol. Meth. 115 (1988), 79-88により記載されている。
【０００５】
Mhatre, R., et al., J. Chrom. A 707 (1995) 225-231は、陽イオン交換クロマトグラフィー及びｐＨ勾配溶出による抗体Ｆａｂフラグメントの精製を調査した。国際公開公報第９４／００５６１号には、ヒト抗アカゲザルモノクローナル抗体及びそれを産生する細胞系が報告されている。一つ又は複数の混入物質から関心が持たれるポリペプチドを分割するために勾配洗浄が使用される、イオン交換クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するための方法が、国際公開公報第２００４／０２４８６６号に報告されている。Schwarz, A., et al., Laborpraxis 21 (1997) 62-66は、ＣＭ−ＨｙｐｅｒＤカラムを用いたモノクローナル抗体の精製を報告している。国際公開公報第２００４／０７６４８５号には、プロテインＡ及びイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製のための工程が報告されている。EP 0 530 447では、三つのクロマトグラフィー工程の組み合わせによりＩｇＧモノクローナル抗体を精製するための工程が報告されている。抗体調製物からのプロテインＡの除去が、米国特許第４，９８３，７２２号に報告されている。
【０００６】
組換えモノクローナル抗体工程は、多くの場合に陰イオン交換クロマトグラフィーを採用して、ＤＮＡ、ホスト細胞タンパク質、及びウイルスなどの痕跡レベルの不純物及び潜在的な混入物質を結合し、抗体を通過させる（Knudsen, H.L., et al., J. Chrom. A 907 (2001) 145-154）。
【０００７】
国際公開公報第９５／１６０３７号には、プロテインＡ及び陽イオン交換クロマトグラフィーによって行われるハブリッドハイブリドーマからの抗ＥＧＦ−Ｒ／抗ＣＤ３二重特異性モノクローナル抗体の精製が報告されている。イオン交換クロマトグラフィーの使用による抗体単量体のその多量体からの分離が、EP 1 084 136に報告されている。米国特許第５，４２９，７４６号は、疎水性相互作用クロマトグラフィー組み合わせクロマトグラフィーの抗体分子タンパク質の精製への適用に関する。荷電微粒子が混入した液体、特に非経口又は生物学的液体のろ過に使用するための陰イオン性改変ミクロ細孔膜が、米国特許第４，６０４，２０８号に報告されている。国際公開第０３／０４０１６６号には、タンパク質含有流動体中の痕跡量不純物を除去するために設計された膜及びデバイスが報告されている。
【０００８】
ポリペプチドを回収するための方法が、米国特許第６，７１６，５９８号に報告されている。US 2006/0194953では、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された抗体から、漏出したプロテインＡを選択的に除去するための方法が報告されている。イオン交換クロマトグラフィーの使用による凝集物からのタンパク質単量体の分離が、国際公開公報第９９／６２９３６号に報告されている。Lynch, P. and Londo, T., Gen. Eng. News 11 (1997) 17は、アフィニティー精製された治療等級の抗体から凝集物を除去するためのシステムを報告している。ヒトにおける治療適用が意図されたマウスモノクローナル抗体の２工程精製が、Jiskoot, W., et al., J. Immunol. Meth. 124 (1989) 143-156によって報告されている。
【０００９】
発明の概要
本発明は、免疫グロブリンの精製の分野における複数の局面を含む。単量体型の免疫グロブリンをフロースルー方式で陰イオン交換物質から得ることができる陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、例えばｐＨ７．８〜ｐＨ８．８の狭いｐＨ値範囲で行わなければならないことを見出した。驚くことに、このｐＨ値範囲から例えばｐＨ７．０又はｐＨ９．０への小さな逸脱は、この効果を打ち消す。本発明による方法を用いると、単量体型の免疫グロブリンを凝集型の免疫グロブリン及び免疫グロブリンフラグメントから一工程で分離することが可能になる。
【００１０】
一局面は、以下の工程を含む、単量体型の免疫グロブリンを得るための方法である:
単量体型及び凝集型の免疫グロブリン並びに／又は免疫グロブリンフラグメントを含む緩衝化水溶液（ここで、その緩衝化水溶液は、ｐＨ７．８〜ｐＨ８．８のｐＨ値を有する）を陰イオン交換クロマトグラフィー物質に適用し、それにより免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントが枯渇した免疫グロブリンが、陰イオン交換クロマトグラフィー物質のフロースルー又は上清から回収されて、単量体型の免疫グロブリンが得られること。一態様では、緩衝水溶液は、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．５のｐＨ値を有する。別の態様では、陰イオン交換クロマトグラフィー物質は、膜陰イオン交換クロマトグラフィー物質である。さらなる態様では、陰イオン交換クロマトグラフィー物質は、強陰イオン交換クロマトグラフィー物質である。別の態様では、強陰イオン交換クロマトグラフィー物質は、Q-セファロース（登録商標）、すなわち式Ｒ-Ο-ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２Ｎ+(ＣＨ３)３の第四級アンモニウム基が共有結合した架橋アガロースマトリックス（Ｒ）である。なお別の態様では、その方法は、第１工程として追加的なプロテインＡクロマトグラフィー工程又は追加的なＨＣＩＣクロマトグラフィー工程又は追加的なイオン交換クロマトグラフィー工程を含む。
【００１１】
発明の詳細な説明
「イオン交換物質」という用語又はその文法的相当語句は、共有結合した荷電置換基を有する不動性マトリックスを意味する。全体的な電荷中性のために、共有結合していない対イオンがイオン相互作用により荷電置換基に結合している。「イオン交換物質」は、その共有結合していない対イオンを、周囲の溶液の同様に荷電した結合パートナー又はイオンと交換する能力を有する。その交換可能な対イオンの電荷に応じて、「イオン交換物質」は「陽イオン交換物質」又は「陰イオン交換物質」といわれる。荷電基（置換基）の性質に応じて、「イオン交換物質」は、例えば陽イオン交換物質の場合、スルホン酸若しくはスルホプロピル樹脂（Ｓ）、又はカルボキシメチル樹脂（ＣＭ）といわれる。荷電基／置換基の化学的性質に応じて、「イオン交換物質」を、追加的に、共有結合した荷電置換基の強度に応じて、強又は弱イオン交換物質として分類することができる。例えば、強陽イオン交換物質は、荷電置換基としてスルホン酸基、好ましくはスルホプロピル基を有し、弱陽イオン交換物質は、荷電置換基としてカルボン酸基、好ましくはカルボキシメチル基を有する。強陰イオン交換物質は、荷電置換基として第四級アンモニウム基を有し、そして弱陰イオン交換物質は、ジエチルアミノエチル基を有する。
【００１２】
「膜」という用語は、ミクロ細孔膜又はマクロ細孔膜の両方を意味する。膜自体は、ポリマー物質、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン酢酸ビニルコポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド（ナイロン、例えば、Zetapore（商標）、N66Posidyne（商標））、ポリエステル、酢酸セルロース、再生セルロース、セルロース複合体、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、不織布及び織布（例えば、Tyvek（登録商標））、繊維性物質など、又は、無機物質、例えば、ゼオライト、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、若しくはヒドロキシアパタイトなどから構成される。
【００１３】
イオン交換物質は、様々な名称で、多数の企業から入手可能である：例えば、陽イオン交換樹脂Bio−Rex（登録商標）（例えば、タイプ70）、Chelex（登録商標）（例えば、タイプ100）、Macro−Prep（登録商標）（例えば、タイプCM、High S、25 S）、AG（登録商標）（例えば、タイプ50W、MP）（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）、WCX 2（Ciphergenから入手可能）、Dowex（登録商標）MAC−3（Dow chemical companyから入手可能）、セルロースＣＭ（例えば、タイプ23、52）、hyper−D、partisphere（Whatman plc.から入手可能）、Amberlite（登録商標）IRC（例えば、タイプ76、747、748）、Amberlite（登録商標）GT 73、Toyopearl（登録商標）（例えば、タイプSP、CM、650M）（全てTosoh Bioscience GmbHから入手可能）、CM 1500及びCM 3000（BioChrom Labsから入手可能）、SP−Sepharose（商標）、CM−Sepharose（商標）（GE Healthcareから入手可能）、Poros樹脂（PerSeptive Biosystemsから入手可能）、Asahipak ES（例えば、タイプ502C）、CXpak P、IEC CM（例えば、タイプ825、2825、5025、LG）、IEC SP（例えば、タイプ420N、825）、IEC QA（例えば、タイプLG、825）（Shoko America Inc.から入手可能）、50W陽イオン交換樹脂（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）、及び、例えば、陰イオン交換樹脂Dowex（登録商標）1（Dow chemical companyから入手可能）、AG（登録商標）（例えば、タイプ1、2、4）、Bio−Rex（登録商標）5、DEAE Bio−Gel 1、Macro−Prep（登録商標）DEAE（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）、陰イオン交換樹脂タイプ1（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）、Source Q、ANX Sepharose（登録商標）4、DEAE Sepharose（登録商標）（例えば、タイプCL−6B、FF）、Q Sepharose（登録商標）、Capto Q（登録商標）、Capto S（登録商標）（全てGE Healthcareから入手可能）、AX−300（PerkinElmerから入手可能）、Asahipak ES−502C、AXpak WA（例えば、タイプ624、G）、IEC DEAE（全てShoko America Inc.から入手可能）、Amberlite（登録商標）IRA−96、Toyopearl（登録商標）DEAE、TSKgel DEAE（全てTosoh Bioscience GmbH, Germanyから入手可能）。膜イオン交換物質は、以下のように様々な企業から入手可能である：例えば、膜陽イオン交換物質Mustang（商標）C及びMustang（商標）S（Pall Corporationから入手可能）、Sartobind（商標）CM、Sartobind（商標）S（Sartoriusから入手可能）など、及び陰イオン交換膜、例えばMustang（商標）Q（Pall Corporationから入手可能）、Sartobind（商標）Q（Sartoriusから入手可能）など。膜イオン交換物質では、結合部位はフロースルー孔壁で見出すことができ、拡散孔内に隠されていないことから、拡散よりも対流による物質移動が可能になる。一態様では、追加的なクロマトグラフィー工程は、Sartobind（商標）CM、又はSartobind（商標）S、又はMustang（商標）S、又はMustang（商標）Cより選択される膜陽イオン交換物質を採用した陽イオン交換クロマトグラフィー工程である。別の態様では、陰イオン交換物質は、Ｑタイプ膜陰イオン交換物質又はＱタイプ陰イオン交換カラムである。
【００１４】
「ポリペプチド」は、天然に産生されるにせよ合成で産生されるにせよ、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約２０個未満のアミノ酸残基のポリペプチドを「ペプチド」という。
【００１５】
「タンパク質」は、一つ若しくは複数のポリペプチド鎖又は１００個超のアミノ酸残基の少なくとも一つのポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は、糖質基などの非ペプチド性成分も含みうる。糖質及び他の非ペプチド性置換基は、タンパク質が産生される細胞によりタンパク質へ付加されることがあり、そして細胞の種類によって変動する。タンパク質を、それらのアミノ酸主鎖構造により本明細書において定義する；糖質基などの置換基は一般的に特定されないが、それにもかかわらず存在しうる。
【００１６】
「免疫グロブリン」という用語及びその文法的相当語句は、２本の軽ポリペプチド鎖及び２本の重ポリペプチド鎖から成る分子を意味する。重及び軽ポリペプチド鎖の各々は、可変領域（一般的に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含み、それは抗原との相互作用のための結合ドメインを有する。重及び軽ポリペプチド鎖の各々は、また、定常領域（一般的に、ポリペプチド鎖のカルボキシル末端部分）を含み、それは免疫系の様々な細胞、いくつかの食細胞、及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた宿主組織又は因子への抗体の結合を仲介しうる。一態様では、軽及び重ポリペプチド鎖は、各々が、可変領域、すなわちＶＬ又はＶＨ、及び定常領域、すなわち、軽ポリペプチド鎖の場合はＣＬ、又は重ポリペプチド鎖の場合はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び場合によりＣＨ４から成る鎖である。「免疫グロブリン」という用語は、また、免疫グロブリン遺伝子によりコードされるポリペプチドから成るタンパク質を表す。認められた免疫グロブリン遺伝子には、種々の定常領域遺伝子に加えて無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは、様々な形態で存在しうる。免疫グロブリンフラグメントは、例えばＦｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２に加えて１本鎖である（例えばHuston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird et al., Science 242 (1988) 423-426; Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984)；及びHunkapiller and Hood, Nature 323 (1986) 15-16)。本発明による方法の一態様では、免疫グロブリンは、モノクローナル免疫グロブリンである。
【００１７】
「単量体型の免疫グロブリン」という用語及びその文法的相当語句は、第２の免疫グロブリン分子と結合していない（すなわち、別の免疫グロブリン分子に共有結合も非共有結合もしていない）免疫グロブリン分子を意味する。「凝集型の免疫グロブリン」という用語及びその文法的相当語句は、少なくとも一つの追加的な免疫グロブリン分子又はそのフラグメントと共有又は非共有のいずれかで結合している免疫グロブリン分子であって、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いたクロマトグラフィーで単量体型の免疫グロブリンの前に溶出する免疫グロブリン分子を意味する。本出願内で使用する「単量体型の」という用語及びその文法的相当語句は、免疫グロブリン分子の１００％が単量体型で存在することを必ずしも意味しない。それは、免疫グロブリンのサイズ排除クロマトグラムのピーク面積として決定するとき、免疫グロブリンが本質的に単量体型であること、すなわち免疫グロブリンの少なくとも９０％が単量体型であること、一態様では免疫グロブリンの少なくとも９５％が単量体型であること、別の態様では免疫グロブリンの少なくとも９８％が単量体型であること、さらなる態様では免疫グロブリンの少なくとも９９％が単量体型であること、なお別の態様では免疫グロブリンの９９％超が単量体型であることを意味する。「単量体型及び凝集型／フラグメント化型の」という用語は、他の免疫グロブリン分子と結合していない免疫グロブリン分子及び他の免疫グロブリン分子と結合している免疫グロブリン分子、及び／又は他の免疫グロブリン分子の部分を少なくとも含む混合物を意味する。この混合物において、単量体型も凝集型もフラグメント化型も排他的には存在しない。
【００１８】
「１００％」という用語は、特定成分以外の成分の量が、言及された分析方法の特定条件下での検出限界未満であることを意味する。
【００１９】
「９０％」、「９５％」、「９８％」、「９９％」という用語は、厳密な値を意味するのではなく、言及された分析方法の特定条件下での精度内の値を意味する。
【００２０】
「免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントを枯渇した単量体性免疫グロブリン」という用語は、単量体性免疫グロブリンが、ある態様において少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、又は少なくとも９９重量％を占めることを意味する。そしてまた、免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントは、ある態様において調製物の１０重量％以下、５重量％以下、２重量％以下、又は１重量％以下を占める。
【００２１】
一般的なクロマトグラフィー法及びそれらの使用は、当業者に公知である。例えば、Chromatography 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C.F., and Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい。
【００２２】
組換えにより産生された免疫グロブリンの精製のために、多くの場合に異なるクロマトグラフィー工程の組み合わせが採用される。一般的に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに一つ又は二つの追加的な分離工程が続く。最終精製工程は、残留ＨＣＰ（ホスト細胞タンパク質）、ＤＮＡ（ホスト細胞核酸）、ウイルス、又は内毒素のような痕跡量不純物及び混入物質の除去のためのいわゆる「ポリッシング工程」である。このポリッシング工程のために、多くの場合に陰イオン交換物質だけがフロースルー方式で使用される。
【００２３】
「フロースルー方式」という用語及びその文法的相当語句は、精製しようとする関心が持たれる物質（例えば、単量体型の免疫グロブリン）を含有する溶液を、固定相（一態様では固相）と接触させ、それにより関心が持たれる物質はその固定相に結合しない、精製方法の操作方式を意味する。その結果、関心が持たれる物質が、フロースルー（精製方法がクロマトグラフィー法である場合）又は上清（精製方法がバッチ法である場合）のいずれかにおいて得られる。固定相と接触させる前にこれもまた溶液中に存在していた関心が持たれない物質（例えば、凝集型の免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリンフラグメント）は、固定相に結合し、そしてその方法で溶液から除去される。これは、関心が持たれない物質の１００％が溶液から除去されることを意味するわけではなく、サイズ排除クロマトグラフィーのピーク面積により決定するとき、関心が持たれない物質の本質的に１００％が除去される、特定の態様では、関心が持たれない物質の少なくとも５０％が溶液から除去される、関心が持たれない物質の少なくとも７５％が溶液から除去される、関心が持たれない物質の少なくとも９０％が溶液から除去される、又は、関心が持たれない物質の９５％超が溶液から除去されることを意味する。
【００２４】
「に適用する」という用語及びその文法的相当語句は、精製しようとする関心が持たれる物質を含有する溶液を固定相と接触させる、精製方法の部分的工程を意味する。これは、ａ）溶液を、固定相が配置されているクロマトグラフィーデバイスに添加すること、又は、ｂ）固定相を溶液に添加することを意味する。ａ）の場合、精製しようとする関心が持たれる物質を含有する溶液に固定相を通過させ、溶液中の固定相と物質との間の相互作用を可能にする。例えば、ｐＨ、伝導度、塩濃度、温度、及び／又は流速などの条件に応じて、溶液のいくつかの物質は固定相へ結合し、従って溶液から除去される。他の物質は溶液中に残存する。溶液中に残存している物質を、フロースルー中に見出すことができる。「フロースルー」は、クロマトグラフィーデバイスの通過後に得られる溶液を意味する。一態様では、クロマトグラフィーデバイスは、クロマトグラフィー物質を有するカラム、又は別の態様では膜クロマトグラフィー物質を有するカセットである。固定相に結合していない関心が持たれる物質は、例えば、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は濃縮溶液を得るための溶媒容積低下などの当業者によく知られる方法によってフロースルーから回収することができる。ｂ）の場合、固定相を、例えば粉末として、精製しようとする関心が持たれる物質を含有する溶液に添加し、溶液中の固定相と物質との間の相互作用を可能にする。相互作用後、固定相を例えばろ過により除去し、そして固定相に結合していない関心が持たれる物質を上清中に得る。
【００２５】
「に結合しない」という用語及びその文法的相当語句は、関心が持たれる物質（例えば、免疫グロブリン）が、固定相（例えば膜イオン交換物質）と接触させられたときに溶液中に残存することを意味する。これは、関心が持たれる物質の１００％が溶液中に残存することを意味するわけではなく、サイズ排除クロマトグラフィーのピーク面積により決定するとき関心が持たれる物質の本質的に１００％が溶液中に残存する、特定の態様では、関心が持たれる物質の少なくとも５０％が溶液中に残存する、関心が持たれる物質の少なくとも６５％が溶液中に残存する、関心が持たれる物質の少なくとも８０％が溶液中に残存する、関心が持たれる物質の少なくとも９０％が溶液中に残存する、又は、関心が持たれる物質の９５％超が溶液中に残存することを意味する。
【００２６】
「緩衝化」という用語は、酸性又は塩基性物質の添加又は遊離に起因するｐＨの変化が緩衝物質によって頭打ちになる溶液を意味する。そのような効果を生じる任意の緩衝物質を使用することができる。一態様では、薬学的に許容されうる緩衝物質、例えば、リン酸及びその塩、クエン酸及びその塩、モルホリン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸及びその塩、ヒスチジン及びその塩、グリシン及びその塩、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）及びその塩を使用する。別の態様では、緩衝物質は、リン酸及びその塩、クエン酸及びその塩、又はヒスチジン及びその塩より選択される。場合により、緩衝化溶液は、追加的な塩、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムなどを含みうる。
【００２７】
「結合及び溶出の方式」という用語及びその文法的相当語句は、精製しようとする関心が持たれる物質を含有する溶液を固定相、一態様では固相と接触させ、それにより関心が持たれる物質が固定相に結合する、精製方法の操作方式を意味する。その結果、関心が持たれる物質は固定相上に保持され、一方、関心が持たれない物質はフロースルー又は上清と共に除去される。関心が持たれる物質はその後、第２工程において固定相から溶出され、それにより固定相から溶出溶液と共に回収される。
【００２８】
このように本発明は、単量体型の免疫グロブリンを得るための方法であって、以下の工程：
単量体型及び凝集型の免疫グロブリン並びに／又は免疫グロブリンフラグメントを含む緩衝化水溶液（ここで、その緩衝化水溶液はｐＨ７．８〜ｐＨ８．８のｐＨ値を有する）を、免疫グロブリンが陰イオン交換クロマトグラフィー物質に結合しない条件で陰イオン交換クロマトグラフィー物質に適用し、それにより単量体型の免疫グロブリンをフロースルーから回収すること
を含む方法を報告している。
【００２９】
「単量体型の免疫グロブリンが陰イオン交換クロマトグラフィー物質に結合しない条件」という用語及びその文法的相当語句は、陰イオン交換物質と接触させたとき、単量体型の免疫グロブリンが陰イオン交換クロマトグラフィー物質によって結合されない条件を意味する。これは、単量体型の免疫グロブリンの１００％が陰イオン交換物質に結合されないことを意味するわけではなく、サイズ排除クロマトグラフィーのピーク面積により決定するとき、単量体型の免疫グロブリンの本質的に１００％が結合されない、特定の態様では、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも５０％が結合されない、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも６５％が結合されない、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも８０％が結合されない、単量体型の免疫グロブリンの少なくとも９０％が結合されない、又は、単量体型の免疫グロブリンの９５％超が結合されないことを意味する。一態様では、緩衝化水溶液はｐＨ７．８〜ｐＨ８．８のｐＨ値を有する。さらなる態様では、そのような条件は、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．５の緩衝化水溶液のｐＨ値である。
【００３０】
今回驚くことに、単量体型の免疫グロブリンを陰イオン交換物質からフロースルー方式で得ることができる陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、ｐＨ７．８〜ｐＨ８．８の、一態様ではｐＨ８．０〜ｐＨ８．５の狭いｐＨ値範囲で行うことができることを見出した。驚くことに、このｐＨ値範囲の（例えばｐＨ７．０又はｐＨ９．０への）小さな逸脱は、この効果を低減する。本発明による方法を用いると、単量体型の免疫グロブリンを凝集型の免疫グロブリン及び免疫グロブリンフラグメントから一工程で分離することが可能である。
【００３１】
本発明による方法は、一工程法として採用することができ、又は、例えば一態様ではプロテインＡクロマトグラフィー工程若しくは疎水性電荷誘導クロマトグラフィー工程などの他の工程と組合せることができる。
【００３２】
一態様では、陰イオン交換クロマトグラフィー物質は、膜陰イオン交換クロマトグラフィー物質である。例えばアフィニティークロマトグラフィーを採用する主要な精製工程で大部分のホスト細胞タンパク質及び培養副産物を除去することもまた、好都合である。アフィニティークロマトグラフィーは、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、例えばフェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いたもの）でありうる。一態様では、本発明による方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程前にプロテインＡクロマトグラフィー工程又はＨＣＩＣクロマトグラフィー工程を含む。
【００３３】
精製方法の一工程（又はそれに続く工程）への溶液の適用前に一つを超えるクロマトグラフィー工程を含む、本発明による方法の一態様では、例えばｐＨ値又は溶液の伝導度などのパラメーターを調整しなければならない。一態様では、陰イオン交換クロマトグラフィー物質に適用される緩衝化水溶液のｐＨ値は、ｐＨ７．８〜ｐＨ８．８、別の態様ではｐＨ８．０〜ｐＨ８．５である。
【００３４】
本発明の理解を助けるために以下の実施例及び図面を提供し、その真の範囲は添付の特許請求の範囲において示す。本発明の精神から逸脱することなく示した手順を改変できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１ａ】抗ＣＣＲ５抗体を含有する溶液をｐＨ７．０、７．５及び８．０に調整し（ｐＨ×．×ロードと呼ばれる画分）；５mgのタンパク質をそれぞれフロースルー方式で１５cm2の膜吸着体と接触させた（ｐＨ×．×フロースルーと呼ばれる画分）ことを示す図である。結合した物質を塩化ナトリウムで溶出させた（ｐＨ×．×溶出と呼ばれる画分）。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってクマシーブリリアントブルー染色を用いて分析した。
【図１ｂ】抗ＣＣＲ５抗体を含有する溶液をｐＨ８．５及び９．０に調整し（ｐＨ×．×ロードと呼ばれる画分）；５mgのタンパク質をそれぞれフロースルー方式で１５cm2の膜吸着体と接触させた（ｐＨ×．×フロースルーと呼ばれる画分）ことを示す図である。結合した物質を塩化ナトリウムで溶出させた（ｐＨ×．×溶出と呼ばれる画分）。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってクマシー染色を用いて分析した。
【図１ｃ−１】ｐＨ７．５の抗ＣＣＲ５抗体を含有する溶液のロード及びフロースルー画分（Ａ及びＢ）並びにｐＨ８．５のロード及びフロースルー画分（Ｃ及びＤ）の分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる比較を示す図である。凝集物及びフラグメントは、ｐＨ７．５でフロースルー中から検出できるが、ｐＨ８．５では検出できない。
【図１ｃ−２】ｐＨ７．５の抗ＣＣＲ５抗体を含有する溶液のロード及びフロースルー画分（Ａ及びＢ）並びにｐＨ８．５のロード及びフロースルー画分（Ｃ及びＤ）の分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる比較を示す図である。凝集物及びフラグメントは、ｐＨ７．５でフロースルー中から検出できるが、ｐＨ８．５では検出できない。
【図２ａ】ｐＨ７．５（Ａ）及びｐＨ８．５（Ｂ）のＣＤ１９抗体のロード及びフロースルー画分を示すオーバーレイである。凝集物は、ｐＨ７．５でフロースルー中から検出できるが、ｐＨ８．５ではフロースルー中から検出できない。
【図２ｂ】抗ＣＣＲ５抗体及び抗ＣＤ１９抗体溶液からの凝集物の除去を示す図である。フロースルー中で減少するのは、ｐＨ７．５を超えるｐＨ値、例えばｐＨ８．５の場合である。
【図３】スケールアップ実験を示す図である：抗ＣＣＲ５抗体を含有する溶液をｐＨ８．５に調整し、２５mgに７５cm2の膜吸着体を通過させてポンプ輸送した（ｐＨ×．×フロースルーと呼ばれる画分）。結合した物質を塩化ナトリウムで溶出させた（ｐＨ×．×溶出と呼ばれる画分）。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってクマシー染色を用いて分析した。
【図４】抗ＣＣＲ５抗体を含有する溶液をｐＨ８．５に調整し（ｐＨ８．５ロードと呼ばれる画分）、６mgのタンパク質は１mlのQ-Sepharose（登録商標）ファストフロー陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを通してポンプ輸送した（ｐＨ８．５フロースルーと呼ばれる画分）ことを示す図である。カラムを塩化ナトリウムで溶出させた（ｐＨ８．５溶出と呼ばれる画分）。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってクマシー染色を用いて分析した。
【００３６】
実施例
材料及び方法：
調節されたプロテインＡ溶出物：
抗ＣＣＲ５抗体（本明細書下記においてｍＡｂ ＣＣＲ５と呼ぶ、例えば国際公開公報第２００６／１０３１００号参照）及び抗ＣＤ１９抗体（本明細書下記においてｍＡｂ ＣＤ１９と呼ぶ）を一工程でプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
【００３７】
ｍＡｂ ＣＣＲ５は、酸性条件でプロテインＡカラムから溶出させた。さらなる処理の前に、免疫グロブリンを含有する画分のｐＨ値を、緩衝化溶液（例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（ＴＲＩＳ）又はリン酸緩衝液）に対する透析により７．０、７．５、８．０、８．５、及び９．０のｐＨ値に調整した。この物質を、以下でｍＡｂ ＣＣＲ５の調節されたプロテインＡ溶出物という。
【００３８】
ｍＡｂ ＣＤ１９を酸性条件でプロテインＡカラムから溶出させた。さらなる処理の前に、免疫グロブリンを含有する画分のｐＨ値を、緩衝化溶液（例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（ＴＲＩＳ）又はリン酸緩衝液）に対する透析によりｐＨ８．５のｐＨ値に調整した。この物質を、以下でｍＡｂ ＣＤ１９の調節されたプロテインＡ溶出物という。
【００３９】
分析法：
サイズ排除クロマトグラフィー：
樹脂：                    TSK 3000（Tosohaas）
カラム：                  ３００×７．８mm
流速：                    ０．５ml/min
緩衝液：                  ２５０mM塩化カリウムを含有し、ｐＨ７．０に調整した２００mMリン酸カリウム緩衝液
波長：                    ２８０nm
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
ＬＤＳ試料緩衝液、４倍濃縮液（４×）：４ｇグリセロール、０．６８２ｇ ＴＲＩＳ塩基、０．６６６ｇ ＴＲＩＳ塩酸塩、０．８ｇ ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６ｇ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．７５mlの１重量％(w/w)のServa Blue G250水溶液、０．７５mlの１重量％(w/w)のフェノールレッド溶液に水を添加して１０mlの合計容積にする。
【００４０】
免疫グロブリンを含有する溶液を遠心分離して破片を除去した。清澄化した上清の一定分量を１／４容(v/v)の４×ＬＤＳ試料緩衝液及び１／１０容(v/v)の０．５Ｍ １，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）と混合した。次に、試料を７０℃で１０分間インキュベーションし、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。NuPAGE（登録商標）プレキャストゲルシステム（Invitrogen Corp.）を製造業者の説明書にしたがって使用した。特に、１０％ NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）ビス−トリスプレキャストゲル（ｐＨ６．４）及びNuPAGE（登録商標）ＭＯＰＳ泳動用緩衝液を使用した。
【００４１】
実施例１
ｐＨ７．０、７．５、８．０、８．５及び９．０を有するｍＡｂ ＣＣＲ５の調節されたプロテインＡ溶出物を、それぞれ１mg/mlの濃度に調整した。クロマトグラフィーシステムの助けを借りて、再生及び（それぞれのｐＨに）平衡化したＱ−膜吸着体（膜陰イオン交換物質、膜面積：１５cm2）に５mlの各溶液をフロースルー方式で別々に適用した。その後、対応するｐＨの緩衝液で膜を洗浄した。結合したタンパク質は、塩勾配をかけて対応するｐＨ値で溶出させた。
【００４２】
ｍＡｂ ＣＣＲ５はｐＨ７．０及び７．５で膜吸着体に結合しなかったことを見出した。ｐＨ８．０〜８．５でわずかな結合が達成された。ｐＨ９．０で抗体の強い結合が出現した。サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによるフロースルー及び溶出画分の分析から、ｐＨ８．０及び８．５でフロースルーからの免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントの著しい除去が明らかとなった。ｐＨ７．０及び７．５で除去は認められず、ｐＨ９．０でマトリックス結合による高い産物損失が生じた。ｐＨ８．０及びｐＨ８．５での伝導度駆動溶出で免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントに富む画分が得られた。
【００４３】
実施例２
ｐＨ７．０、７．５、８．０、８．５及び９．０を有するｍＡｂ ＣＤ１９の調節されたプロテインＡ溶出物を、それぞれ１mg/mlの濃度に調整した。クロマトグラフシステムの助けを借りて、再生及び（それぞれのｐＨに）平衡化したＱ−膜吸着体（１５cm2）に５mlの各溶液をフロースルー方式で別々に適用した。その後、対応するｐＨの緩衝液で膜を洗浄した。結合したタンパク質は、塩勾配を用いて対応するｐＨ値で溶出させた。
【００４４】
ｍＡｂ ＣＤ１９はｐＨ７．０及び７．５で膜吸着体に結合しなかったことを見出した。ｐＨ８．０〜８．５でわずかな結合が達成された。ｐＨ９．０で免疫グロブリンの強い結合が出現した。サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによるフロースルー及び溶出画分の分析から、ｐＨ８．０及び８．５で産物からの免疫グロブリンの免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントの著しい除去が明らかとなった。ｐＨ７．０及びｐＨ７．５で除去は認められず、ｐＨ９．０でマトリックス結合による高い産物損失が生じた。ｐＨ８．０及びｐＨ８．５での伝導度駆動溶出で免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントに富む画分が得られた。
【００４５】
実施例３
ｍＡｂ ＣＣＲ５のプロテインＡ溶出物をｐＨ８．５に調節し、１mg/mlの濃度に調整した。
【００４６】
クロマトグラフィーシステムの助けを借りて、再生及び（ｐＨ８．５に）平衡化したＱ−膜吸着体（７５cm2の膜表面積）に２５mlの溶液をフロースルー方式で適用した。その後、ｐＨ８．５の緩衝液で膜を洗浄した。結合したタンパク質は、塩勾配をかけて対応するｐＨ値で溶出させた。
【００４７】
実施例１の結果を、５倍大きな規模で再現することができた。フロースルーは、免疫グロブリン凝集物及び及び免疫グロブリンフラグメントを枯渇していた。両方の不純物は膜吸着体から塩勾配かけて溶出させることができた。
【００４８】
実施例４
ｐＨ８．５に調節されたｍＡｂ ＣＣＲ５のプロテインＡ溶出物を１mg/mlの濃度に調整した。クロマトグラフィーシステムの助けを借りて、再生及び（ｐＨ８．５に）平衡化したQ Sepharose（登録商標）FFにフロースルー方式で６mlの溶液を適用した。その後、対応するｐＨの緩衝液でセファロースを洗浄した。結合したタンパク質は、塩勾配をかけて対応するｐＨ値で溶出させた。
【００４９】
サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによるフロースルー及び溶出画分の分析から、ｐＨ８．５で産物からの免疫グロブリンの免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントの著しい除去が明らかとなった。ｐＨ８．０及びｐＨ８．５での伝導度駆動溶出で免疫グロブリン凝集物及び免疫グロブリンフラグメントに富む画分が得られた。
【図１ａ】
2012513425.tif 000003
【図１ｂ】
2012513425.tif 000004
【図１ｃ−１】
2012513425.tif 000005
【図１ｃ−２】
2012513425.tif 000006
【図２ａ】
2012513425.tif 000007
【図２ｂ】
2012513425.tif 000008
【図３】
2012513425.tif 000009
【図４】
2012513425.tif 000010
【国際調査報告】
2012513425.tif 000011
2012513425.tif 000012
2012513425.tif 000013