(57)【要約】【課題】病原体に対する植物またはその一部の耐性を増強するための方法、病原体に対する植物またはその一部の耐性をスクリーニングするための方法、およびその用途を提供する。【解決手段】  本発明は、植物バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、本発明は、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質のオーソログを含む病原体による感染を受けやすい植物またはその一部の耐性を増強するための方法に関し、ここで前記植物は、トマト植物でもタバコ植物でもなく、本発明はまた、少なくとも１つの病原体に対する植物またはその一部の耐性をスクリーニングするための方法に関し、ここで前記病原体は、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）でなく、ここで前記植物は、トマト植物でなく、本発明はさらに、かかる方法の使用に関する。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質のオーソログを含む病原体による感染を受けやすい植物またはその一部の耐性を増強するための方法であって、前記植物またはその一部を、Ｃｆ４またはその機能的ホモログをコードする核酸で形質転換するステップを含み、ここで前記植物がトマト植物でもタバコ植物でもない、方法。
【請求項２】
前記植物またはその一部が、バナナ植物、小麦植物、テンサイ植物、トウモロコシ植物およびセロリ植物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機能的ホモログが、Ｈｃｒ９−Ａｖｒ４ペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記形質転換するステップが、発現ベクターである核酸送達媒体を導入するステップを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記発現ベクターが、ウイルスに基づく発現ベクター、またはアデノウイルスまたはレトロウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの病原体に対する植物またはその一部の耐性をスクリーニングするための方法であって、
ａ）前記少なくとも１つの病原体を、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）の前記Ａｖｒ４タンパク質またはそのオーソログの存在についてスクリーニングするステップと、
ｂ）クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）の前記Ａｖｒ４タンパク質またはそのオーソログを含む少なくとも１つの病原体を選択するステップと、
ｃ）前記少なくとも１つの病原体を前記植物またはその一部に導入するステップと、
ｄ）前記植物またはその一部を、前記少なくとも１つの病原体に対する防御応答の不在または存在についてスクリーニングするステップと、
を含み、ここで前記植物がトマト植物でもタバコ植物でもない、方法。
【請求項７】
前記植物またはその一部が、バナナ植物、小麦植物、テンサイ植物、トウモロコシ植物、およびセロリ植物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記オーソログが、キチン結合タンパク質のＣＢＭ１４スーパーファミリのメンバ中に見出されるものに類似したキチン結合ドメインを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記オーソログが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択され、または、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記病原体が真菌であり、ここで前記真菌が、クロイボタケ綱の真菌であり、またはここで前記クロイボタケ綱の真菌が、ミコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、セルコスポラ・ニコチアナエ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、サーコスポラ・ベティコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、セルコスポラ・ゼイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅｉｎａ）、およびセルコスポラ・アピイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｐｉｉ）からなる群から選択されるが、ここで前記病原体が、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）でないことを条件とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの病原体に対する植物またはその一部の耐性を増強するための請求項１から５のいずれか一項に記載の方法に使用するための試剤であって、前記植物がトマト植物でもタバコ植物でもない、試剤。
【請求項１２】
少なくとも１つの病原体に対する植物またはその一部の耐性をスクリーニングするための請求項６から８のいずれか一項に記載の方法に使用するための試剤であって、前記植物がトマト植物でもタバコ植物でもない、試剤。
【請求項１３】
前記植物またはその一部が、バナナ植物、小麦植物、テンサイ植物、トウモロコシ植物、またはセロリ植物からなる群から選択される、請求項１１または１２に記載の試剤。
【請求項１４】
前記病原体が真菌であり、ここで前記真菌が、クロイボタケ綱の真菌であり、またはここで前記クロイボタケ綱の真菌が、ミコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、セルコスポラ・ニコチアナエ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、サーコスポラ・ベティコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、セルコスポラ・ゼイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅｉｎａ）、およびセルコスポラ・アピイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｐｉｉ）からなる群から選択されるが、ここで前記病原体が、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）でないことを条件とする、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の試剤。
【請求項１５】
病原体による感染を受けやすい植物またはその一部の耐性を増強するための方法であって、前記植物またはその一部を、Ｃｆ４またはその機能的ホモログをコードする核酸で形質転換するステップを含み、ここで前記病原体がクロイボタケ綱の真菌であるが、但しクラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）でないことを条件とし、またはここで前記クロイボタケ綱の真菌が、ミコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、セルコスポラ・ニコチアナエ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、サーコスポラ・ベティコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、セルコスポラ・ゼイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅｉｎａ）、およびセルコスポラ・アピイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｐｉｉ）からなる群から選択され、またはここで前記植物がトマト植物でもタバコ植物でもなく、またはここで前記植物が、バナナ植物、小麦植物、テンサイ植物、トウモロコシ植物、およびセロリ植物からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物バイオテクノロジーの分野に関するものであり、より詳細には、本発明は、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質のオーソログを含む病原体による感染を受けやすい植物またはその一部の耐性を増強するための方法に関し、ここで前記植物は、トマト植物でない。本発明はまた、少なくとも１つの病原体に対する植物またはその一部の耐性をスクリーニングするための方法に関し、ここで前記植物は、トマト植物でない。本発明はさらに、かかる方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界で最も重要な農作植物は、依然、その成長および増殖率に重大な影響を与えうる病原体誘発性疾患の感染を非常に受けやすい。場合によっては、かかる植物のまさに生存さえも脅かされうる。例えば、主要なバナナ栽培品種「Ｇｒｏｓ  Ｍｉｃｈｅｌ」は、１８２０年代に発見され、１９２０年代まで世界中で栽培され、消費された。それは、土壌伝染性不完全糸状菌真菌のフザリウム・オキシスポルム・エフ・エスピー・キュベンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．Ｃｕｂｅｎｓｅ）によって引き起こされるパナマ病により、わずか数十年の間にほぼ完全に根絶された。その後継栽培品種である「Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ」については、同様の疾患に起因し、その後の１０〜２０年にわたる大規模栽培において、場合によって生存不能になるという仮説が立てられている。ジャガイモ、トウモロコシ、大豆および小麦などの他の農作植物についても、一様に悲観的な見通しが予想されている。
【０００３】
したがって、農作植物の生産高が世界的に増え続ける食物需要に追随するのに極めて重要であることから、それらの病原体に対する耐性を改善するという切迫した需要がある。これらの植物の中のバナナおよびテンサイ植物は、クロイボタケ綱に属する真菌病原体に対するそれらの感受性を共有している。
【０００４】
バナナ植物（ムサ・サブエスピー（Ｍｕｓａ  ｓｓｐ．）、プランテーンおよび調理用バナナの他種を含む）の生産高は、専らトウモロコシ、米および小麦のそれによって継承されている。毎年、約１億トンのバナナが、世界約１２０か国で生産されている。上記のように、バナナは、真菌感染を非常に受けやすい。これらの感染の中で、パナマ病、より最近ではシガトカ病コンプレックス（Ｓｉｇａｔｏｋａ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）は、最も破壊的なものに属する。シガトカ病コンプレックスは、Ｍ．ムシコラ（Ｍ．ｍｕｓｉｃｏｌａ）、Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）および最近になって特徴づけられたＭ．ユームサエ（Ｍ．ｅｕｍｕｓａｅ）を含む、クロイボタケ綱のコタマカビ科（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）の３つの系統発生的に近い関連種を包含する（Ｊｏｎｅｓ  ２０００年、２００３年、Ａｒｚａｎｌｏｕら、２００７年においてレビューされている）。同疾患は、バナナプランテーションに対する世界的に深刻な脅威であり、多大な経済的損失をもたらす。３つの種が、前世紀にわたってバナナに対して出現し、ここでは、（黄シガトカ病（ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｉｇａｔｏｋａ）を引き起こす）Ｍ．ムシコラ（Ｍ．ｍｕｓｉｃｏｌａ）が、１９０２年に東南アジアで最初に出現し、また１９６０年代にわたってフィジー島のシガトカバレー（Ｓｉｇａｔｏｋａ  ｖａｌｌｅｙ）において出現した（黒シガトカ病（ｂｌａｃｋ  Ｓｉｇａｔｏｋａ）またはバナナ斑葉病（ｂｌａｃｋ  ｌｅａｆ  ｓｔｒｅａｋ）を引き起こす）Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）によって徐々に置き換わっている。第３の種のＭ．ユームサエ（Ｍ．ｅｕｍｕｓａｅ）は、ユームサエ（Ｅｕｍｕｓａｅ）斑点病を引き起こし、１９９０年代にわたり、バナナに対するシガトカ病コンプレックスの新たな構成要素として同定された。現在、黒シガトカ病は、世界的にバナナに関する最も破壊的な疾患であり、それによって生産高が３８％超減少している（Ｍａｒｉｎら、１９９１年）。
【０００５】
テンサイ（ベータ・ブルガリスＬ．（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．））は、アカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）科のメンバであり、世界の糖生産の３０％を占める。小麦およびバナナのように、それもまた、クロイボタケ綱に属する真菌による感染を受けやすい。サーコスポラ・ベティコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）種は、特にテンサイに対するその感染能について周知である。Ｃ．ベティコラ（Ｃ．ｂｅｔｉｃｏｌａ）による感染を受けているテンサイは、赤い環によって囲まれることが多い明確な円形の斑点病によって容易に認識されうる。
【０００６】
非常に大規模に商業的に生育され、かつウイルスおよび真菌感染を受けやすい別種の植物が、タバコ植物（ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属）である。世界的なタバコ生産は、タバコ葉が１９９７／９９年の５．９百万トンから２０１０年の７．１百万トン超に達するように計画されている。約１００か国が、タバコを生産する。主要な生産国は、中国、インド、ブラジル、米国、トルコ、ジンバブエおよびマラウイであり、併せて世界のタバコ生産の８０％超を提供する。これらの生産国のうち、中国は、世界生産の３５％超を単独で占める。タバコ植物はまた、クロイボタケ綱による真菌感染を受けやすい。例えば、セルコスポラ・ニコチアナエ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）によるタバコ葉の感染は、バーンロット（ｂａｒｎ  ｒｏｔ）およびフロッグアイ（ｆｒｏｇｅｙｅ）斑点病などの蔓延するタバコ植物病（ｔａｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）の主因である。
【０００７】
現在、商業用プランテーションにおけるこれらの疾患を制御するための方法は、ほとんどの場合、殺菌剤の広範かつ反復的な適用に制限される。従来では、これらの適用における毎年の世界的規模のコストは、バナナ単独において２５億ドルであると既に推定され、その時点でバナナ生産コストの２７％を占めている（Ｓｔｏｖｅｒ  １９８０年、ＳｔｏｖｅｒおよびＳｉｍｍｏｎｄｓ  １９８７年）。かかる広範な適用が、高価なだけでなく、さらにヒトおよび動物の健康や環境に対して深刻な脅威をもたらすことが明らかな場合がある。さらに、殺菌剤を集約的に適用することにより、既に耐性真菌株が発生していることが示されている（Ｍａｒｉｎら、２００３年）。
【０００８】
したがって、植物のその病原体に対する耐性を増強するための他の方法が必要とされる。好ましくは、かかる方法は、殺菌剤などの化合物の適用を回避する。
【０００９】
かかる方法は、例えばバナナを遺伝的に形質転換するための方法として、当該技術分野で既知である。（Ｃｒｏｕｃｈら、１９９８年、Ｒｅｐｏｒｔ  １９９７年、Ｓａｇｉ  １９９７年）。しかし、これらの方法は、いまだ証明が十分になされていない。したがって、農作植物のその病原体に対する耐性を改善するという需要は残る。
【００１０】
クロイボタケ綱は、約５０の科、６５０の属および６３００の既知種を含む子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ  ｆｕｎｇｉ）の綱である。伝統的に、そのメンバの大部分は、分岐群小房子嚢菌類（Ｌｏｃｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）中に含まれた。同綱は、いくつかの重要な植物病原体、例えば、（穀物のスタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）葉枯病を引き起こす）スタゴノスポラ・ノドルム（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、（リンゴおよび洋ナシを含む多数の植物の葉黒星病（ｌｅａｆ  ｓｃａｂ）を引き起こす）ベンチュリア・イナクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）および（エンドウ豆、ヒヨコマメ、ビーンおよびその他多数を含むマメ科の斑点病を引き起こす）アスコチタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）種を含む。
【００１１】
クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）は、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））の腐葉土を引き起こす生体栄養性クロイボタケ綱に属するものである。Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）は、エフェクタータンパク質を感染植物のアポプラストに分泌し、疾患の発症を促進する（Ｔｈｏｍｍａら、２００５年）。これらのエフェクタータンパク質は、耐性トマト系統中に存在する同族Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）（Ｃｆ）耐性タンパク質によって認識されうる。Ｃｆタンパク質による認識の結果、植物防御応答の迅速な導出がもたらされ、プログラム化細胞死の１種である過敏応答（ＨＲ）に至る。初期感染部位周囲の細胞は速やかに死滅し、このようにして、生体栄養性真菌のさらなる成長が阻止される（Ｄｅ  Ｗｉｔら、２００８年；ＪｏｏｓｔｅｎおよびＤｅ  Ｗｉｔ、１９９９年；Ｔｈｏｍｍａら、２００５年）。
【００１２】
これまで、４つの非病原性（Ａｖｒ）遺伝子がＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）からクローン化されており、それら全部は、感染の間に分泌される小さいシステインリッチタンパク質をコードする。これらは、Ａｖｒ２、Ａｖｒ４、Ａｖｒ４Ｅ、およびＡｖｒ９エフェクタータンパク質であり、それらのトマトにおける認識は、同族Ｃｆ耐性タンパク質Ｃｆ２、Ｃｆ４、Ｃｆ４Ｅ、およびＣｆ９によってそれぞれ媒介される（Ｄｅ  Ｗｉｔら、２００８年；ＪｏｏｓｔｅｎおよびＤｅ  Ｗｉｔ、１９９９年；Ｔｈｏｍｍａら、２００５年）。４つのさらなる細胞外タンパク質（Ｅｃｐｓ）、すなわちＥｃｐｌ、Ｅｃｐ２、Ｅｃｐ４、およびＥｃｐ５が、マッチング（ｍａｔｃｈｉｎｇ）同族Ｃｆ−Ｅｃｐ遺伝子を保有するトマト系統においてＨＲを誘発するＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）から特徴づけられている（Ｄｅ  Ｋｏｃｋら、２００５年；Ｌａｕｇｅら、２０００年）。最近、Ｅｃｐ６およびＥｃｐ７エフェクターもまた、同定されているが、これまで、それらの認識を媒介するマッチング同族Ｃｆ−Ｅｃｐ遺伝子を保有するトマト系統は全く報告されていない（Ｂｏｌｔｏｎら、２００８年）。
【００１３】
すべてのＡｖｒｓおよびＥｃｐｓが、証明されたのはほんの数例であるが、毒性因子であると仮定されている（Ｂｏｌｔｏｎら、２００８年；Ｔｈｏｍｍａら、２００５年；ｖａｎ  Ｅｓｓｅら、２００７年；ｖａｎ  Ｅｓｓｅら、２００８年）。Ａｖｒ２エフェクターは、Ｒｃｒ３、Ｐｉｐ１、アリューレインおよびＴＤＩ６を含む細胞外植物システインプロテアーゼを阻害する（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００２年；Ｒｏｏｎｅｙら、２００５年；Ｓｈａｂａｂら、２００８年）。Ａｖｒ２を生成するＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）株は、Ｒｃｒ３および同族Ｃｆ−２耐性遺伝子を保有するトマト系統におけるＨＲを誘発する（Ｄｉｘｏｎら、１９９６年；Ｌｕｄｅｒｅｒら、２００２ｂ）。Ａｖｒ４エフェクターは、真菌細胞壁を植物キチナーゼの有害な効果に対して保護するキチン結合タンパク質である（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇら、２００６年；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇら、２００４年；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇら、２００３年）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第９６／３５７９０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
同族Ｃｆ−４耐性遺伝子を保有するトマト植物は、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４生成株を認識し、ＨＲを開始させる（Ｊｏｏｓｔｅｎら、１９９４年；Ｊｏｏｓｔｅｎら、１９９７年、Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら、２００４年）。トマトＣｆ−４遺伝子の核酸配列は、Ｃｆ４のコードされたアミノ酸配列とともに国際公開第９６／３５７９０号パンフレット中に開示されている。国際公開第９６／３５７９０号パンフレットはまた、植物をＣｆ−４遺伝子をコードする核酸配列で形質転換することによって植物にＡｖｒ４エフェクタータンパク質を認識するＣｆ４タンパク質を提供することにより、植物におけるＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）に対する耐性を増強するための方法を記載している。しかし、本方法が植物にＡｖｒ４を生成するＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）株に対する耐性を付与することから、その用途は、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）による感染を受けやすい植物、例えばトマト植物およびタバコに限定される。本方法は、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）以外の病原体に感染しやすい植物、すなわちバナナ、テンサイ、タバコ、トウモロコシ、およびセロリなどの植物における耐性を増強するためには適さない。したがって、依然、トマト植物以外の植物の病原体に対する耐性を増強するための方法に対して切迫した需要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、かかる方法を提供する。クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質のオーソログを含む病原体による感染を受けやすい植物またはその一部の耐性を増強するための方法であって、前記植物またはその一部を、Ｃｆ４またはその機能的ホモログをコードする核酸で形質転換するステップを含み、ここで前記植物はトマト植物でもタバコ植物でもない、方法が提供される。好ましくは、前記植物またはその一部は、バナナ植物、小麦植物、テンサイ植物、トウモロコシ植物、およびセロリ植物からなる群から選択される。好ましくは、前記機能的ホモログは、Ｈｃｒ９−Ａｖｒ４タンパク質である。
【００１７】
一実施形態では、前記形質転換するステップは、核酸送達媒体を導入するステップを含む。好ましくは、前記送達媒体は、発現ベクターである。より好ましくは、前記発現ベクターは、ウイルスに基づく発現ベクターである。好ましくは、前記ウイルスは、アデノウイルスまたはレトロウイルスである。
【００１８】
また、少なくとも１つの病原体に対する植物またはその一部の耐性をスクリーニングするための方法であって、ａ）前記少なくとも１つの病原体を、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質またはそのオーソログの存在についてスクリーニングするステップと、ｂ）クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）の前記Ａｖｒ４タンパク質またはそのオーソログを含む少なくとも１つの病原体を選択するステップと、ｃ）前記少なくとも１つの病原体を前記植物またはその一部に導入するステップと、ｄ）前記植物またはその一部を、前記少なくとも１つの病原体に対する防御応答の不在または存在についてスクリーニングするステップと、を含み、ここで前記植物は、トマト植物でもタバコ植物でもない、方法が提供される。好ましくは、前記植物またはその一部は、バナナ植物、小麦植物、テンサイ植物、トウモロコシ植物およびセロリ植物からなる群から選択される。好ましくは、前記オーソログは、キチン結合タンパク質のＣＢＭ１４スーパーファミリのメンバ中に見出されるものに類似したキチン結合ドメインを含む。より好ましくは、前記オーソログは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択され、より好ましくは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
好ましくは、本発明に従う方法における病原体は、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）でないことを条件として真菌である。より好ましくは、前記真菌は、クロイボタケ綱の真菌である。さらにより好ましくは、前記クロイボタケ綱の真菌は、ミコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、セルコスポラ・ニコチアナエ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、サーコスポラ・ベティコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、セルコスポラ・ゼイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅｉｎａ）、およびセルコスポラ・アピイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｐｉｉ）からなる群から選択される。
【００２０】
さらに、植物またはその一部の少なくとも１つの病原体に対する耐性を増強するための本発明に従う方法の使用が提供され、ここで前記植物は、トマト植物でもタバコ植物でもない。さらに、植物またはその一部の少なくとも１つの病原体に対する耐性をスクリーニングするための本発明に従う方法の使用が提供され、ここで前記植物は、トマト植物でもタバコ植物でもない。好ましくは、前記植物またはその一部は、バナナ植物、小麦植物、テンサイ植物、トウモロコシ植物およびセロリ植物からなる群から選択される。好ましくは、前記病原体は、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）でないことを条件として真菌である。より好ましくは、前記真菌は、クロイボタケ綱の真菌である。さらにより好ましくは、前記クロイボタケ綱の真菌は、ミコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、セルコスポラ・ニコチアナエ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、サーコスポラ・ベティコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、セルコスポラ・ゼイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅｉｎａ）、およびセルコスポラ・アピイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｐｉｉ）からなる群から選択される。
【００２１】
さらに、本発明が国際公開第９６／３５７９０号パンフレット中に開示されている方法または植物のいずれも含まないことが提起される。これは、詳細には、Ｃｆ４を植物に導入し、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）に対する耐性を提供するための方法、またはＣｆ４配列に対してトランスジェニックな植物、に関する。また、本発明から、Ｃｆ４およびＡｖｒ４配列の双方に対してトランスジェニックな植物が除外される。さらに、Ｃｆ４配列またはＡｖｒ４配列に対してトランスジェニックなトマトおよびタバコ植物が除外される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）に基づく、ＣＢＭ １４タンパク質中でのキチン結合ドメインの保存。システイン残基（大文字Ｃで示される）は常に保存される。
【図２】Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４のジスルフィド結合パターン（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇら、２００３年）。接続された白棒は、無脊椎動物のキチン結合ドメイン（ｉｎｖ  ＣｈＢＤ）の３つの保存されたジスルフィド結合を示す。接続された黒帯は、付加結合を示す。類似のジスルフィド結合パターンは、Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）およびサーコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）Ａｖｒ４−オーソログについても同様に予想される。
【図３】Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）由来のＡｖｒ４−タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）と、Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）由来のそのオーソログ（配列番号２）、Ｃ．ニコチアナエ（Ｃ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）由来のそのオーソログ（配列番号３）、Ｃ．ベティコラ（Ｃ．ｂｅｔｉｃｏｌａ）由来のそのオーソログ（配列番号４）、Ｃ．ゼイナ（Ｃ．ｚｅｉｎａ）由来のそのオーソログ（配列番号５）、およびＣ．アピイ（Ｃ．ａｐｉｉ）由来のそのオーソログ（配列番号６）とのアラインメント。予測されるキチン結合ドメイン（ハイライト部）は、３つすべての配列内に存在する。ジスルフィド架橋の形成に関与し、かつタンパク質の安定性にとって重要な保存されたシステイン残基（太字）についても示される。
【図４】Ｃｆ４（左側）およびＣｆ０（右側）トマト植物におけるＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）Ａｖｒ４の浸潤。この実験の目的のため、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現系を使用し、ＭｆＡｖｒ４を生成した。この図においては、ＭｆＡｖｒ４を生成するＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の培養濾過物から単離された粗ＭｆＡｖｒ４抽出物が、（マッチング同族Ｃｆ４耐性タンパク質を有する）Ｃｆ−４および（Ｃｆ４耐性タンパク質が全く存在しない）Ｃｆ−０トマト植物に浸潤した。ＭｆＡｖｒ４による浸潤の結果、Ｃｆ−４耐性遺伝子の存在下で明らかにＨＲがもたらされる。画像は、注入の７日後に撮られた。
【図５】トマト由来のＣｆ遺伝子と、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）中のＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）およびＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）由来のＡｖｒ遺伝子との、アグロインフィルトレーション（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による一過性同時発現。４つの一過性発現アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物が１：１の比で混合され、浸潤される。画像は、浸潤の６日後に撮られた。図面は、Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）Ａｖｒ４（ＭｆＡｖｒ４）とトマトＣｆ−４遺伝子との同時発現の結果、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に対してＨＲがもたらされることを示す（左パネル）。しかし、ＨＲは、ＭｆＡｖｒ４がＣｆ−９と同時発現される場合に誘発されず、これは、Ｃｆ４とＭｆＡｖｒ４との間の相互作用の特異性を示す（右パネル）。この実験における対照として、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４（Ａｖｒ４）およびＡｖｒ９が、Ｃｆ−４およびＣｆ−９とともに同時発現された。この場合、ＨＲは、予想どおり、Ａｖｒ４とＣｆ−４（左パネル）またはＡｖｒ９とＣｆ−９（右パネル）の同時発現時に限って認められる。
【図６】ＰＶＸに基づく発現系を使用し、特定のＨＲが、ＭｆＡｖｒ４の一過性発現後、ＭＭ−Ｃｆ４トマト系統における応答を誘発した。Ｃｆ−４耐性遺伝子を保有する４週齢トマト系統（ＭＭ−Ｃｆ４）由来の子葉に、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）形質転換体のＰＶＸ：：ＰＲ１ａＭｆＡｖｒ４が接種されている。これらの形質転換体は、３５Ｓプロモーターの下流でかつタバコ由来のＰＲ１ａシグナル配列に融合された、ＰＶＸに基づくバイナリーベクターｐＳｆｉｎｘ内のＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）Ａｖｒ４  ｃＤＮＡを有する。ＨＲは、ＭＭ−Ｃｆ０系統の小葉でなく、ＭＭ−Ｃｆ４トマト系統の小葉においてのみ生じることから、Ｃｆ４によるＭｆＡｖｒ４の特異的認識が示される。対照として、空のｐＳｆｉｎｘベクターを有するＰＶＸ（ＰＶＸ：：ｐＳｆｉｎｘ）およびバイナリーベクター内のＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４を有するＰＶＸ（ＰＶＸ：：ＰＲ１ａＣｆＡｖｒ４）が使用された。予想どおり、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４のＰＶＸに基づく発現の結果、ＭＭ−Ｃｆ０系統でなく、ＭＭ−Ｃｆ４系統においてのみＨＲがもたらされる。ＭＭ−Ｃｆ４およびＣｆ−Ｏ系統への空のｐＳｆｉｎｘベクターを有するＰＶＸの接種時には、モザイク症状のみが観察された。画像は、接種の１４日後に撮られた。
【図７】ＭｆＡｖｒ４のキチン（他の多糖でない）への特異的結合。ＭｆＡｖｒ４を含有するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養濾過物が、不溶性多糖カニ殻キチン、キチン−アガロース樹脂、キトサン、セルロース、およびキシランとともに、周囲温度で２時間インキュベートされた。キチン結合親和性は、結合タンパク質（Ｂ）および未結合タンパク質（Ｓ）双方のタンパク質画分を別々のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷することによって測定された。Ｈｉｓ−Ｆｌａｇタグ化ＭｆＡｖｒ４が、抗−Ｆｌａｇタグモノクローナル抗体を使用して検出された。等量の結合および未結合タンパク質が、ゲル上に負荷された。この目的のため、上清中のタンパク質画分が、１０％ＴＣＡ（ｗ／ｖ）の存在下で沈殿された。Ｓ：濃縮上清画分中に残存したタンパク質；Ｐ：不溶性多糖画分に結合したタンパク質。ＭｆＡｖｒ４は、特異的にキチンとともに沈殿され、５つの独立した反復実験において、特異的結合が確認された。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本明細書で使用される用語「植物またはその一部」は、任意の完全または部分的な植物、例えば、植物中で無傷の、植物細胞などの単一の細胞および細胞組織、植物が再生されうる元となる細胞塊および組織培養物を意味する。植物部分の例として、限定はされないが、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、および種子に由来する単一の細胞および組織、ならびに、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、若枝、根茎、種子、プロトプラスト、カルスなどが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用される用語「品種」は、ＵＰＯＶ条約において定義される通りであり、構造的もしくは遺伝的特徴および／または性能により、同じ種内の他の品種と区別可能な類似植物の群を示す。
【００２５】
本明細書で使用される用語「栽培品種」（栽培された品種に対する）は、通常、天然に見出されないが、ヒトによって栽培されている、すなわち「野生」状態以外の生物学的状態を有する品種として定義され、ここで「野生」状態は、植物または獲得物（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）の元来の非栽培または天然状態を示す。用語「栽培品種」は、限定はされないが、半自然、半野生、雑草、伝統的栽培品種、在来種、育種材料、研究材料、ブリーダーの系統、合成集団、ハイブリッド、ファウンダーストック（ｆｏｕｎｄｅｒ  ｓｔｏｃｋ）／基礎集団、近交系（ハイブリッド栽培品種の親）、分離集団、突然変異体／遺伝材料、および高級／改善された栽培品種、を含む。
【００２６】
本明細書で使用される用語「分岐群」は、単一の共通の祖先およびすべてのその子孫から構成される群として定義される単系統群を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される用語「病原体」は、その宿主に疾患または病気を引き起こす任意の生物学的因子として定義される。これは、細菌、真菌、ウイルスおよびプリオンを含む。
【００２８】
本明細書で使用される「遺伝子」は、染色体上の特定の位置を占有し、かつ植物などの生物における特定の表現型特性または形質に対する遺伝的指令を有する、（ＤＮＡの配列によって示されることが多い）遺伝構成単位を意味する。
【００２９】
用語「核酸」は、糖、リン酸塩およびプリンもしくはピリミジンのいずれかの塩基を有する単量体（ヌクレオチド）からなる、一本鎖または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを示す。特に限定されない限り、同用語は、参照核酸と同様の結合特性を有しかつ天然ヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を有する核酸を包含する。他に指定のない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換体）および相補配列ならびに明示された配列を暗に包含する。詳細には、縮重コドン置換体は、１つもしくは複数の選択された（もしくはすべての）コドンの３番目の位置が混合基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって得られうる（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１年；Ｏｈｔｓｕｋａら、１９８５年；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４年）。「核酸断片」は、所与の核酸分子の画分である。高等植物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が遺伝物質である一方、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ内部に含まれる情報のタンパク質への移入に関与する。用語「ヌクレオチド配列」は、場合により、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中への取り込み能を有する合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有する、一本鎖または二本鎖でありうる、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを示す。用語「核酸」または「核酸配列」はまた、遺伝子、遺伝子によってコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡと交換可能に使用してもよい。
【００３０】
用語「ホモロジー」は、それらの共有される祖先に起因する特徴間での１つもしくは複数の類似性（を有するもの）として定義される。遺伝学では、ホモロジーは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）内および非コードＤＮＡ内で認められうる。タンパク質をコードする遺伝子においては、異なる遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列を比較することができる。タンパク質においては、異なるタンパク質のアミノ酸配列を比較することができる。配列ホモロジーはまた、共通の機能を示しうる。
【００３１】
本明細書で使用される用語「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」および「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」は、任意の遺伝子またはタンパク質が、共通の祖先のＤＮＡ配列からの系統（ｄｅｓｃｅｎｔ）により、第２の遺伝子またはタンパク質と関連することを意味する。用語ホモログは、スペシエーションの事象によって分離された遺伝子間またはタンパク質間の関係（オーソロジー）あるいは遺伝的重複の事象によって分離された遺伝子間またはタンパク質間の関係（パラロジー）に適用可能である。
【００３２】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性との関連における用語「〜に対して相同な」は、２つの核酸分子のヌクレオチド配列間または２つのタンパク質分子のアミノ酸配列間の類似性を示す。かかるホモロジーの推定値は、（ＨａｉｎｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．中に記載のように）当業者によって十分に理解されるように、ストリンジェンシーの条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションのいずれか、あるいは２つの核酸間またはタンパク質間での配列類似性の比較により、提供される。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、それらの配列が、５０％超、好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはさらに９８％を超える配列類似性を有する場合、相同である。
【００３３】
本明細書で使用される用語「オーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」および「オーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」は、ある種における任意の遺伝子またはタンパク質が他種における１つもしくは複数の遺伝子またはタンパク質と類似することとして定義される。これは、共通の祖先に由来するオーソログを含む。１つの分岐群内に見出される遺伝子またはタンパク質は、共通の祖先に由来するオーソログである。オーソログは、常ではないが、同じ機能を有することが多い。それはまた、収束進化によって生じているホモロジーを含む。
【００３４】
本明細書で使用される用語「遺伝子工学」、「組換えＤＮＡ技術」、「遺伝子修飾／操作（ＧＭ）」および「遺伝子スプライシング」はすべて、生物の遺伝子の直接操作のための技術を示す。これらの技術は、生物の遺伝子が間接的に操作される場合の従来の品種改良とは異なる。それらでは、遺伝子の構造および特性を直接的に改変するための分子クローニングおよび形質転換の技術が用いられる。遺伝子工学技術においては、極めて多数の用途、例えば、作物技術の改善、修飾細菌の使用による合成ヒトインスリンの製造、ハムスター卵巣細胞内でのエリスロポエチンの製造、および研究用としてのオンコマウス（ｏｎｃｏｍｏｕｓｅ）（癌マウス）などの新種の実験マウスの作製において、いくつかの成功が見出されている。一般に、遺伝子工学、組換えＤＮＡ技術、遺伝子修飾／操作（ＧＭ）は、１）目的の遺伝子の単離、２）遺伝子の移入ベクターへの挿入、３）ベクターの修飾されるべき生物への移入、４）生物の細胞の形質転換、および５）遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）の十分に修飾されていないものからの選択、の５つの主なステップを含む。
【００３５】
用語「形質転換」は、核酸断片の宿主細胞のゲノムへの移入を示し、遺伝的に安定な形質をもたらす。形質転換核酸断片を有する宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と称され、またトランスジェニック細胞を含む生物は、「トランスジェニック生物」と称される。植物および植物細胞の形質転換方法の例として、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換（Ｄｅ  Ｂｌａｅｒｅら、１９８７年）、粒子ボンバードメント技術（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年；米国特許第４，９４５，０５０号明細書）、マイクロインジェクション、ＣａＰＯ４沈殿、リポフェクション（リポソーム融合）、遺伝子銃およびＤＮＡベクタートランスポーターの使用（Ｋａｏら、２００８年）が挙げられる。全植物は、当業者に周知の方法により、トランスジェニック細胞から再生されうる（例えば、Ｆｒｏｍｍら、１９９０年を参照）。
【００３６】
本明細書で使用される用語「形質転換された」、「トランスジェニック」および「組換え体」は、異種核酸分子が導入されている細菌または植物などの宿主生物を示す。異種核酸分子は、一般に当該技術分野で既知のゲノムに安定的に統合可能であり、それについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ、１９９９年を参照のこと。例えば、「形質転換された」、「形質転換体」、および「トランスジェニック」植物またはカルスは、形質転換プロセスを介しており、それらの染色体に統合された外来遺伝子を有する。用語「形質転換されていない」は、形質転換プロセスを介していない正常な植物を示す。
【００３７】
本明細書で使用される「ベクター」は、外来遺伝物質を別の細胞に移入するための媒体として使用される任意のＤＮＡ分子として定義される。これは、プラスミド、バクテリオファージおよび他のウイルス、コスミド、ならびに人工染色体を含む。ベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、および／または選択可能マーカーを含んでもよい。
【００３８】
本明細書で使用される用語「発現ベクター」は、特定の核酸を標的細胞に導入し、その核酸によってコードされるタンパク質を発現するのに使用される任意の発現コンストラクトとして定義される。一旦発現ベクターが細胞内部に存在する場合、核酸によってコードされるタンパク質は、細胞の転写および翻訳機構によって生成されうる。これは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用しかつ発現ベクター上に保有される核酸の効率的転写をもたらす調節配列を含む、発現ベクターを含む。それはまた、終止コドン、プロモーターとクローン化遺伝子の間の距離の調節、転写終結配列および／またはＰＴＩＳ（ポータブルな翻訳開始配列（ｐｏｒｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む、発現ベクターを含む。
【００３９】
本明細書で使用される「プラスミド」は、染色体ＤＮＡと独立に複製する能力がある、染色体ＤＮＡとは別の任意の染色体外ＤＮＡ分子を意味する。これは、宿主細胞内で自動的に複製する能力がある、任意の二本鎖の一般に環状のＤＮＡ配列を含む。
【００４０】
本明細書で使用される用語「ウイルス」は、宿主細胞内部でのみ繁殖可能な任意の微小な病原菌を意味する。これは、すべてのエンベロープを有さないウイルス、すなわちウイルスの遺伝子を保護するタンパク質外殻を含むウイルスを含む。それはまた、すべてのエンベロープを有するウイルス、すなわち、宿主細胞外部に存在する場合、ウイルスを囲む脂質のエンベロープをさらに含むウイルスを含む。それは、すべてのＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスおよび逆転写ウイルスを含む。
【００４１】
本明細書で使用される用語「アデノウイルス」は、ヌクレオキャプシドおよび二本鎖線状ＤＮＡゲノムからなり、かつアデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する、任意のエンベロープを有さない２０面体ウイルスとして定義される。
【００４２】
本明細書で使用される用語「レトロウイルス」は、逆転写酵素を介して宿主細胞内で複製され、そのＲＮＡゲノムからＤＮＡを生成し、かつレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する、任意のＲＮＡウイルスを意味する。
【００４３】
本明細書で使用される用語「ウイルスに基づく」は、非感染性にされている修飾ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを有する、任意の遺伝子操作されたウイルスに基づくこととして定義されるが、ウイルスプロモーターおよび翻訳されるべき核酸をさらに含み、それにより、ウイルスプロモーターを介した核酸の翻訳が可能になる。
【００４４】
「マーカー遺伝子」は、選択可能またはスクリーニング可能な形質をコードする。用語「選択可能マーカー」は、トランスジェニックおよび非トランスジェニック生物の分離を可能にする代謝形質をコードするポリヌクレオチド配列を示し、ほとんどの場合、抗生物質耐性の提供を示す。選択可能マーカーとして、例えば、ａｐｈＬ１にコードされるカナマイシン耐性マーカー、ｎｐｔＩＩ遺伝子、ハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子が挙げられる。他の選択マーカーとして、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子の産物における同定方法は、限定はされないが、酵素アッセイおよび蛍光アッセイを含む。レポーター遺伝子およびその産物を検出するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）および定期的更新において記載がなされている。
【００４５】
本明細書で使用される用語「ペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、アミド結合またはペプチド結合によって既定の順序で結合されたアミノ酸から形成される任意のポリマーとして定義される。これは、すべてのリボソームペプチド、非リボソームペプチド、ペプトン、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびペプチド断片を含む。
【００４６】
本明細書で使用される用語「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を示し、非コード配列を除外する。それは、「連続した（ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）コード配列」、すなわち例えばｃＤＮＡ内でイントロンが欠如したものでありうるか、あるいは、適切なスプライス接合によって結合された１つもしくは複数のイントロンを含みうる。「イントロン」は、一次転写産物中に含まれるが、細胞内部でのＲＮＡの切断および再ライゲーションを通じて除去され、タンパク質に翻訳されうる成熟ｍＲＮＡを生成する、ＲＮＡの配列である。
【００４７】
本明細書で使用される「調節配列」は、コード配列の上流（５'非コード配列）、内部、または下流（３'非コード配列）に位置し、かつ関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に作用するヌクレオチド配列を示す。調節配列は、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化シグナル配列を含む。それらは、天然および合成配列、ならびに合成および天然配列の組み合わせでありうる配列を含む。上記のように、用語「好適な調節配列」は、プロモーターに限定されない。
【００４８】
本明細書で使用される用語「プロモーター」は、通常はそのコード配列の上流（５'）側にあり、コード配列の発現を、ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写にとって必要とされる他の因子に対する認識を提供することによって制御する、ヌクレオチド配列を示す。「プロモーター」は、転写開始部位を特定するのに役立つＴＡＴＡボックスおよび他の配列からなる短いＤＮＡ配列である最小プロモーターを含み、それに対し、発現を制御するために調節因子が付加される。「プロモーター」はまた、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御可能な最小プロモーター＋調節因子を含むヌクレオチド配列を示す。このタイプのプロモーター配列は、隣接した上流因子およびより遠隔の上流因子から構成され、後者の因子は、エンハンサーと称されることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができ、またプロモーターに固有の因子またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を促進するために挿入される異種因子でありうる、ＤＮＡ配列である。それは、双方向（正常または反対）で作動可能であり、またプロモーターに対して上流または下流のいずれに移動する場合であっても機能可能である。両エンハンサーおよび他の上流プロモーター因子は、それらの効果を媒介する配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質に結合する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる因子からなるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントからなる場合がある。プロモーターはまた、生理的または発生条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を有しうる。
【００４９】
本明細書で使用される用語「構成的プロモーター」は、植物のすべてもしくはほぼすべての発生段階の間、すべてもしくはほぼすべての植物組織内でそれが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現可能なプロモーターを示す。
【００５０】
本明細書で使用される用語「発現」は、植物内での、内因性遺伝子、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）もしくはその一部、またはトランス遺伝子の転写および／または翻訳を示す。発現は、センス（ｍＲＮＡ）または機能ＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はまた、タンパク質の生成を示す場合がある。
【００５１】
本明細書で使用される用語「構成的発現」は、構成的プロモーターを用いる発現を示す。「一過性発現」は、一過性形質転換事象の結果としての発現である。遺伝子の一過性発現は、宿主染色体に統合されないが、例えば、自律的複製プラスミドまたは発現カセットの一部としてか、またはウイルスなどの別の生体系の一部として独立に機能する遺伝子の発現を示す。
【００５２】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、核酸鎖に対して相補的なプライマー拡張産物の合成が誘発される条件下、すなわち、好適な温度およびｐＨで、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの重合剤（ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の存在下に置かれる場合、ＤＮＡポリメラーゼの付着を可能にし、それによってＤＮＡ合成の開始点としての機能を果たす、増幅標的にアニーリング可能なオリゴヌクレオチドを示す。（増幅）プライマーは、増幅における最大効率を意図すると、好ましくは一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合剤の存在下で拡張産物の合成をプライミングするのに十分に長くなければならない。正確なプライマー長は、温度およびプライマー源を含む多数の要素に依存することになる。本明細書で使用される「１対の二方向プライマー」は、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅に関する当該技術分野で一般に用いられる、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーを示す。
【００５３】
本明細書で使用される用語「プローブ」は、標的核酸配列分析物中の相補配列またはそのｃＤＮＡ誘導体を認識し、それと水素結合二本鎖を形成することになる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を意味する。
【００５４】
用語「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリッドの安定性に作用するハイブリダイゼーション条件、例えば温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などを示す。これらの条件は、経験的に最適化することで、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列に対する特異的結合が最大化し、非特異的結合が最小化される。使用される同用語は、プローブまたはプライマーがその標的配列に、他の配列より検出可能に大きい程度に（例えばバックグラウンドより少なくとも２倍大きく）ハイブリダイズすることになる条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下で異なることになる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびｐＨでの特異的配列における熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全に一致したプローブまたはプライマーにハイブリダイズする温度（既定のイオン強度およびｐＨ下）である。
【００５５】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、かつ、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）において少なくとも約３０℃であり、また長いプローブまたはプライマー（例えば５０ヌクレオチド超）において少なくとも約６０℃である場合となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の添加とともに得られうる。典型的な低いストリンジェントな条件または「低いストリンジェンシーの条件」は、３７℃で３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および４０℃で２×ＳＳＣでの洗浄を含む。典型的な高いストリンジェンシー条件は、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および６０℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄を含む。ハイブリダイゼーション手順は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ  Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ  Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ  Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ  Ｊ．Ａ．、Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．編  （１９９８年）  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．」  Ｖ．Ｂ．Ｃｈａｎｄａ（シリーズ編集）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓにおいて記載がなされている。
【００５６】
説明
Ｅｃｐ６以外では、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）エフェクタータンパク質のホモログは、これまで他の真菌種においては全く同定されていない（Ｂｏｌｔｏｎら、２００８年）。しかし、発明者は、Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ニコチアナエ（Ｃ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、Ｃ．ベティコラ（Ｃ．ｂｅｔｉｃｏｌａ）、Ｃ．ゼイナ（Ｃ．ｚｅｉｎａ）、およびＣ．アピイ（Ｃ．ａｐｉｉ）を含む、コタマカビ科（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）内のクロイボタケ綱集団（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に属する数種の他の真菌が、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）の場合に機能的に関連するエフェクターを生成することを見出している。発明者は今日、（ｉ）ＢＬＡＳＴを用いる構造的ホモロジー探索、（ｉｉ）相同性ヌクレオチド配列およびタンパク質モチーフに対して配列決定された真菌ゲノムのマイニング、ならびに（ｉｉｉ）ＰＣＲに基づく技術および染色体ウォーキングの使用により、真菌病原体のＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ニコチアナエ（Ｃ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、Ｃ．ベティコラ（Ｃ．ｂｅｔｉｃｏｌａ）、Ｃ．ゼイナ（Ｃ．ｚｅｉｎａ）、およびＣ．アピイ（Ｃ．ａｐｉｉ）におけるＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４エフェクターのオーソログを初めて同定しており、また、図３に示されるように、それらのアミノ酸配列を推定している。これは、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）ＡｖｒおよびＥｃｐエフェクターホモログが、関連の植物病原体におけるオーソログとして生じるが、それはバナナ（単子葉）、テンサイおよびタバコ（双子葉）のような全く関連のない宿主植物種に対して感染し、疾患を引き起こすことを示す。
【００５７】
特に、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質に対して様々な程度での同一性を有するオーソログが、Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）（３４％の同一性）、Ｃ．ニコチアナエ（Ｃ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）（３２％の同一性）、Ｃ．ベティコラ（Ｃ．ｂｅｔｉｃｏｌａ）（２７％の同一性）、Ｃ．アピイ（Ｃ．ａｐｉｉ）（２７％の同一性）、およびＣ．ゼイナ（Ｃ．ｚｅｉｎａ）（３２％の同一性）において同定されたが、それらが、クロイボタケ綱の目に属する真菌種のあらゆる主な集団内で確実に生じることが予想される。
【００５８】
８つのシステイン残基が、ＣＢＭ１４スーパーファミリのキチンに結合するタンパク質（キチン結合Ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ−Ａ；図１および２を参照）中に生じるジスルフィド橋の形成に関与するＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４タンパク質中に存在する。Ａｖｒ４は、インビトロで、感染中に、真菌細胞壁のキチンを植物のキチナーゼに対して保護する。これらのシステイン残基はまた、Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ニコチアナエ（Ｃ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、Ｃ．ベティコラ（Ｃ．ｂｅｔｉｃｏｌａ）、Ｃ．ゼイナ（Ｃ．ｚｅｉｎａ）、およびＣ．アピイ（Ｃ．ａｐｉｉ）のＡｖｒ４オーソログ中で保存され、これは、それらオーソログがキチンに結合する能力もあることを示唆する。確かに、発明者は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において生成されるＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）Ａｖｒ４オーソログがまた、キチンに結合することを実証しており、これは、それがＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４の純粋なオーソログもしくは機能的ホモログであることを示す（図７）。この重要な成果の実際的意味は、実施例において示され、ここで発明者は、Ｍ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）Ａｖｒ４オーソログおよびトマトＣｆ４タンパク質の同時発現により、タバコ植物においてＨＲ応答が誘発されることを示している。したがって、Ａｖｒ４−オーソログを生成する、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）以外のクロイボタケ綱に属する真菌に対するトマト植物以外の植物の耐性は、これらの植物にＣｆ４タンパク質を提供することによって増強されうる。
【００５９】
したがって、発明者は、提供するクラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質のオーソログを含む病原体による感染を受けやすい植物またはその一部の耐性を増強するための方法を提供し、ここで前記方法は、前記植物またはその一部をＣｆ４またはその機能的ホモログをコードする核酸で形質転換するステップを含み、またここで前記植物は、トマト植物でもタバコ植物でもない。本方法が、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質のオーソログを含む病原体による感染を受けやすいトマト植物以外の任意の植物に適用可能であることは、当業者にとって明らかであろう。好ましくは、前記植物またはその一部は、バナナ植物、小麦植物、テンサイ植物、トウモロコシ植物またはセロリ植物からなる群から選択される。例えば、バナナ植物のＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）に対する耐性は、バナナ植物を、Ｃｆ４タンパク質をコードする核酸で形質転換することによって増強されうる。
【００６０】
植物は、Ｃｆ４の機能的ホモログ、すなわちＣｆ４（Ｃｆ４自体ではない）のアミノ酸配列に対して高度な類似性を示し、かつＡｖｒ４およびそのオーソログを認識可能なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする任意の核酸で形質転換されうる。当業者が理解するように、相同性タンパク質は、当該技術分野で既知の任意の好適なスクリーニング方法を適用することにより、見出されうる。例えば、構造的ホモロジー探索は、タンパク質またはＤＮＡレベルのいずれかのデータベース内で行ってもよい。また、配列決定された植物ゲノムが、相同性ヌクレオチド配列およびタンパク質モチーフについてマイニングされうる。マイニング法を適用する場合、ＰＣＲに基づく技術などの増幅技術を適用することで、見出されたＤＮＡ配列が増幅されうる。
【００６１】
相同性タンパク質は、異なる植物において見出されうる。例えば、発明者は、見出している。Ｈｃｒ９−Ａｖｒ４と称される機能的Ｃｆ４ホモログは、ソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）属：Ｓ．ヒルスタム（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ００２２３５）、Ｓ．チレンセ（Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ）（ＡＹ６３４６１０）、Ｓ．キミエリエウスキー（Ｓ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）（ＡＹ６３４６１１）、Ｓ．パルヴィフロラム（Ｓ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）（ＡＹ６３４６１２）およびＳ．ペルビアナム（Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）（ＡＹ６３４６１３）におけるリコぺルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）のレキシコン（ｌｅｘｉｃｏｎ）に属する種の中に存在する。これらのタンパク質は、表１中に認められうるように、互いに９３〜９８％同一である。したがって、前記機能的ホモログは、好ましくはＨｃｒ９−Ａｖｒ４ペプチドである。
【００６２】
【表１】
2012532605.tif 000002
【００６３】
表１は、Ｓ．ヒルスタム（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、Ｓ．ペルビアナム（Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、Ｓ．キミエリエウスキー（Ｓ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）、Ｓ．チレンセ（Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ）およびＳ．パルヴィフロラム（Ｓ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）のＨｃｒ９−Ａｖｒ４ホモログのアミノ酸アラインメントスコアである。
【００６４】
生物を外来性核酸で形質転換するための方法は、例えば、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ａｎｄ  ＲＮＡ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＦｒｉｅｄｍａｎｎおよびＲｏｓｓｉ編、２００６年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡ」において記載のように、当該技術分野で既知である。例えば、生物が、核酸を含むベクターを導入することにより、核酸で形質転換されうることは周知である。
【００６５】
仮想的には、任意の核酸送達媒体を、レシピエント植物細胞への送達のために使用してもよい。例えば、プラスミド、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）バイナリーベクターおよびウイルスに基づく発現ベクターなどのウイルスベクター、または線状ＤＮＡ断片（場合によっては植物において発現されるべきＤＮＡ要素のみを有する）など、の形態でのＤＮＡセグメントを使用してもよい。ウイルスに基づくベクターを使用する場合、かかるベクターは、好ましくは、アデノウイルスまたはレトロウイルスに基づく。本開示のおかげで、当業者は、本発明と併用可能なベクターの作成について理解するであろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年；Ｇｅｌｖｉｎら、１９９０年を参照）。限定はされないが、本発明に従う、形質転換細胞内で使用される、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）およびＤＮＡセグメントを含むベクターは、当然のことながら、ｃＤＮＡ、形質転換体における所望されるタンパク質の生成にとって必要な１つもしくは複数の遺伝子を含むことになる。
【００６６】
本発明のベクターは、任意の植物に導入してもよい。導入されるべき遺伝子および配列は、目的の任意の植物における導入および発現のための発現カセットにおいて便益的に使用してもよい。転写カセットは、転写の５'→３'方向において、植物において機能的な、転写および翻訳開始領域、目的のＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終結領域を含むことになる。
【００６７】
終結領域は、転写開始領域とともに天然であってもよいか、目的のＤＮＡ配列とともに天然であってもよいか、または別の供給源に由来してもよい。
【００６８】
便益的な終結領域、例えばオクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドから入手可能である。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９１年）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４頁；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１年）  Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４頁；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１年）  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９頁；Ｍｏｇｅｎら（１９９０年）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２頁；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０年）  Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８頁；Ｂａｌｌａｓら（１９８９年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３頁；Ｊｏｓｈｉら（１９８７年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９頁を参照のこと。
【００６９】
植物形質転換コンストラクトを作成するための方法は、当該技術分野で記載がなされている。
【００７０】
形質転換植物において十分なレベルのトランス遺伝子発現を得ることは、遺伝子操作作物の生成における重要な態様である。植物宿主における異種ＤＮＡ配列の発現は、植物宿主内部で機能的な、作動可能に連結されたプロモーターの存在に依存する。
【００７１】
植物の形質転換は、単一のＤＮＡ分子または複数のＤＮＡ分子（すなわち同時形質転換）を用いて行われ、およびこれらの技術の双方は、本発明の発現カセットでの使用に適している。極めて多数の形質転換ベクターは、植物形質転換において利用可能であり、また本発明の発現カセットは、任意のかかるベクターと併用可能である。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換用の標的種に依存することになる。
【００７２】
植物細胞を形質転換するのに好適な方法は、限定はされないが、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら、１９８６年）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら、１９８６年）、アグロバクテリウム媒介性形質転換（Ｈｉｎｃｈｅｅら、１９８８年）、直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、１９８４年）、およびＡｇｒａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．Ａｎｄ  ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能な装置を使用するバリスティック粒子加速（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号明細書；およびＭｃＣａｂｅら、１９８８年を参照）を含む。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら、１９８８年；Ｓａｎｆｏｒｄら、１９８７年（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９８８年（大豆）；ＭｃＣａｂｅら、１９８８年（大豆）；Ｄａｔｔａら、１９９０年（米）；Ｋｌｅｉｎら、１９８９年（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら、１９９０年（トウモロコシ）；およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、１９９０年（トウモロコシ）；Ｓｖａｂら、１９９０年（タバコ葉緑体）；Ｋｏｚｉｅｌら、１９９３年（トウモロコシ）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、１９８９年（米）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９９１年（米）；欧州特許出願の欧州特許第０３３２５８１号明細書（カモガヤおよび他のイチゴツナギ亜科（Ｐｏｏｉｄｅａｅ））；Ｖａｓｉｌら、１９９２年（小麦）；Ｗｅｅｋｓら、１９９３年（小麦）を参照のこと。例えば、バナナ植物のＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）に対する耐性は、バナナ植物を、Ｈｃｒ９−Ａｖｒ４タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換することによって増強される。
【００７３】
他の形質転換方法、例えば外来ＤＮＡコンストラクトの直接取り込み（欧州特許第０２９５９５９号明細書）、エレクトロポレーションの技術（Ｆｒｏｍｍら、１９８６年）または核酸コンストラクトでコーティングされた金属粒子を用いる高速バリスティックボンバードメント（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年、および米国特許第４，９４５，０５０号明細書）は、当業者が利用可能である。細胞は、一旦形質転換されると、当業者によって再生されうる。
【００７４】
当業者は、方法の選択が、植物の種類、すなわち植物がバナナなどの単子葉植物であるかまたはテンサイおよびタバコ植物などの双子葉植物であるかに依存しうることを理解するであろう。
【００７５】
新植物種が本発明のエフェクタータンパク質の提示時に過敏応答を生じうるか否かについての迅速かつ単純な試験を提供するため、当業者は２つのうちの１つの試験を実施することができる。最も信頼性が高い方が、葉内でのエリシタータンパク質の浸潤およびＨＲについてのスコアリングである。もう一方が、ＡＴＴＡ（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）一過性発現アッセイ）の名称で知られる迅速な一過性発現試験である。このアッセイ（これに関する詳しい説明が、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎ  Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ  ８７、１３０７−１３１６頁、１９９６年の中に見出されうる）では、エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下に置かれ、安定な形質転換に対するプロトコルにおいても使用されるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に導入される。細菌と、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔ−ＤＮＡ導入を促進することで知られるアセトシリンゴンまたは任意の他のフェノール化合物とのインキュベーション後、１ｍｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物が注入によって原位置植物に浸潤され、その後、植物は温室内に置かれる。２〜５日後、葉は、ＨＲ症状の発生についてスコアリング可能である。
【００７６】
また、植物またはその一部の少なくとも１つの病原体に対する耐性をスクリーニングするための方法であって、ａ）前記少なくとも１つの病原体を、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）のＡｖｒ４タンパク質またはそのオーソログの存在についてスクリーニングするステップと、ｂ）クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）の前記Ａｖｒ４タンパク質またはそのオーソログを含む少なくとも１つの病原体を選択するステップと、ｃ）前記少なくとも１つの病原体を前記植物またはその一部に導入するステップと、ｄ）前記植物またはその一部を、前記少なくとも１つの病原体に対する防御応答の不在または存在についてスクリーニングするステップと、を含み、ここで前記植物はトマト植物でない、方法が提供される。好ましくは、前記植物またはその一部は、バナナ植物、小麦植物、トウモロコシ植物、セロリ植物またはテンサイ植物からなる群から選択される。好ましくは、前記オーソログは、キチン結合タンパク質のＣＢＭ１４スーパーファミリのメンバ中に見出される場合に類似したキチン結合ドメインを含む。より好ましくは、前記オーソログは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択され、より好ましくは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。また、Ａｖｒ４のオーソログを有するタバコ植物のスクリーニングが好ましい。
【００７７】
病原体をペプチドについてスクリーニングするための方法は、当該技術分野で既知である。病原体は、当業者によって好適と見なされる任意の方法または技術を適用することにより、Ａｖｒ４またはそのオーソログの存在についてスクリーニング可能である。かかる方法は、限定はされないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどのタンパク質電気泳動、電気ブロッティング、免疫ブロットまたはウエスタンブロット、タンパク質免疫染色、タンパク質免疫沈降、タンパク質アッセイ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳＩ−ＴＯＦなどの質量分析、ならびにＨＰＬＣおよびＲＰＣなどのクロマトグラフィーを含む。例えば、いくつかの病原体が、ウエスタンブロットにより、Ａｖｒ４またはそのオーソログの存在についてスクリーニングされる。ウエスタンブロットの結果に基づき、Ａｖｒ４を含む病原体が選択され、バナナ植物に導入される。また、バイオインフォマティクスに基づくスクリーニング方法が適用可能である。また、数学的類似性探索、例えばＢＬＡＳＴなどは、病原体内のペプチドを、Ａｖｒ４に対する類似性についてスクリーニングする場合に非常に適する。
【００７８】
Ａｖｒ４タンパク質またはそのオーソログを含む病原体を、トマト植物でない植物に導入するための一方法は、病原体を、植物の一部、例えば葉または茎部に直接適用することによるものである。あるいは、病原体は、注入してもよい。機能的な同族耐性遺伝子を有しない植物においては、病原体の適用は、疾患を引き起こすことになる。しかし、機能的な耐性遺伝子を有する植物においては、Ｃｆ４タンパク質またはその機能的ホモログは、病原体によって発現されるＡｖｒ４またはオーソログエフェクタータンパク質を認識することになり、また過敏反応をもたらすカスケードが開始されることになる。先に考察したように、また図４に示されるように、これは、植物組織の局所的壊死、または、あまり強力でない反応においては注入部位のクロロシスをもたらすことになり、ここでの効果は視覚的に観察可能である。
【００７９】
病原体を植物またはその一部に直接適用する代わりに、植物をＡｖｒ４タンパク質またはそのオーソログをコードする核酸で形質転換することにより、病原体を植物に間接的に導入することも可能である。植物または植物部分におけるタンパク質の発現を可能にするための最適な方法の１つが、いわゆるＡＴＴＡ（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）一過性発現アッセイ）によるものであり、ここではアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細菌に、本発明に従うエフェクタータンパク質をコードするコンストラクトが提供される。エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列が、本明細書中に開示されるか、または本明細書中にも提供されるアミノ酸配列に由来しうることから、当業者は、コード配列をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の形質転換に適した発現ベクターにクローン化できるであろう。
【００８０】
あるいは、ウイルスベクターを使用してもよい。Ａｖｒ４エフェクタータンパク質またはそのオーソログをコードする核酸は、ウイルスベクターにクローン化可能であり、その後、ウイルス粒子を使用し、植物または植物部分が感染され、タンパク質が発現される。ウイルスが依然としてその感染特性を維持するウイルスベクターを使用することは、さらなる利点を有する。耐性遺伝子の存在を示す、局所的壊死またはクロロシスの観察に次ぎ、耐性遺伝子の不在についても、かかる植物においては、ウイルスによって引き起こされる疾患が発症することから、可視化されることになる。したがって、疾患進行の欠如は、たとえ過敏反応（ＨＲ）の明確な症状が全く検出されなくても、耐性機序の存在を示すことになる。当然のことながら、かかるシステムは、通常、ウイルスベクターとして使用されるウイルスの感染を受けやすい植物の場合にのみ実現可能になる。
【００８１】
望ましくは、Ａｖｒ４エフェクタータンパク質またはそのオーソログがアポプラスト空間に排出される（これが天然のエフェクタータンパク質が見出される位置であることが理由）ことが確認されるべきである。スクリーニング方法がタンパク質を植物中に注入することに基づく場合、タンパク質は自動的にアポプラスト空間内に存在することになる。Ａｖｒ４またはそのオーソログがＡｖｒ４またはそのオーソログをコードする核酸を有する核酸送達媒体によって植物に導入されるというスクリーニング方法が適用される場合、アポプラスト空間への発現は、ヌクレオチド配列に細胞外標的化のためのシグナル配列を提供することによって行われうる。かかるシグナル配列は、当業者にとって利用可能であり、一例がタバコＰＲ−１ａ遺伝子のシグナル配列である。代替配列は、Ａｖｒ４ペプチド、ニンジン拡張遺伝子またはＮ末端シグナル配列に関する試験から得られうる（Ｓｍａｌｌ  Ｉ．ら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４：１５８１−１５９０頁）。
【００８２】
上記の植物耐性を増強するための方法および植物耐性をスクリーニングするための方法の双方が、真菌耐性を有する植物を、Ａｖｒ４／オーソログ−Ｃｆ４／ホモログ耐性機序の存在に基づいて栽培または作成する場合に使用されることになると予想される。したがって、さらに、植物またはその一部の少なくとも１つの病原体に対する耐性を増強するための方法の使用が提供され、ここで前記植物は、トマト植物でもタバコ植物でもない。さらに、植物またはその一部の少なくとも１つの病原体に対する耐性をスクリーニングするための方法の使用が提供され、ここで前記病原体は、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）でなく、ここで前記植物は、トマト植物でない。
【００８３】
Ａｖｒ４／オーソログ−Ｃｆ４／ホモログに基づく耐性の導入のための栽培プログラムの場合、ブリーダーは通常、Ｃｆ４またはその機能的ホモログを有する植物から開始することになる。次いで、この植物系統は、親系統として使用され、別の植物と交配され、子孫を生成することになる。この子孫は、上記のスクリーニング方法を適用することにより、耐性機序の存在について試験してもよい。次いで、このプロセスは、所望される最終産物が得られるまで、繰り返されることになる。栽培する代わりに、組換え技術を用いて耐性を改変することも可能となる。その場合、耐性遺伝子をコードする遺伝子は、適切なベクターにクローン化され、また標的植物が、このベクターで形質転換されることになる。次いで、耐性遺伝子の機能的発現は、植物にＡｖｒ４エフェクタータンパク質またはそのオーソログが提供されるというスクリーニング方法を適用することによって評価されうる。
【００８４】
Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４エフェクターの機能的ホモログを生成する、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）を除くクロイボタケ綱真菌病原体によって攻撃された単子葉および双子葉宿主種において、幅広いスペクトル耐性を得るため、分子耐性繁殖プログラム（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ）において、ソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）またはニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）種からの既存の耐性形質を利用することに次ぎ、本発明がまた、上記真菌のＡｖｒ４ホモログを発現するウイルスに基づく発現ベクターにより、バナナ、テンサイ、タバコ、トウモロコシ、およびセロリにおける新しい耐性形質の同定に拡張可能であることは明らかであろう。
【００８５】
単子葉および／または双子葉植物において強力なほぼ構成的（ｎｅａｒ−ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）発現を誘導しうるいくつかのプロモーター、例えば、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９６年）、米アクチン１プロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０年）、様々な増強されたカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら、１９９６年、Ｋａｙら、１９８７年、Ｖａｉら、１９９６年）、サトウキビ・バシリフォーム・バドナウイルス（ＳｃＢＶ）（Ｓｃｈｅｎｋら、１９９９年）、合成ｐＥｍｕプロモーター（Ｌａｓｔら、１９９１年）、バナナバンチートップウイルス（ＢＢＴＶ）（Ｈｅｒｍａｎｎら、２００１年）、キャッサバベインモザイクウイルス（ＣＶＭＶ）（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９６年）、およびこれらの方法において同様に使用可能なその他のもの（Ｓｃｈｕｅｎｍａｎｎら、２００３年）が、単離されている。
【００８６】
本発明は、以下の実施例によって例示される。本実施例は、本発明を例示することが意図されており、その範囲を決して限定するものではない。
【実施例】
【００８７】
材料および方法
ＤＮＡ操作を標準プロトコルによって実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。ＰＣＲは、ＳｕｐｅｒＴａｇ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）またはＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って実施した。制限酵素Ｔ４リガーゼおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。プライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した。トマトおよびベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を、標準の温室条件下で成長させた。ＰＶＸ接種においては、４週齢Ｍｏｎｅｙ  Ｍａｋｅｒ（ＭＭ）−Ｃｆ０（既知のＣｆ耐性遺伝子を有しない）およびＭＭ−Ｃｆ４（Ｃｆ−４耐性遺伝子を保有）トマト系統を使用する一方、アグロインフィルトレーションにおいては、６〜８週齢Ｎ．ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を使用した。すべての生成されたコンストラクトの信頼性を、Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．での配列決定によって確認した。
【００８８】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＨｉｓ６−ＦＬＡＧタグ化ＭｆＡｖｒ４の異種生成
メチロトローフ酵母Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中でのＮ末端Ｈｉｓ６−ＦＬＡＧタグ化ＭｆＡｖｒ４タンパク質の発現用のプラスミドを、上記のように生成した（Ｒｏｏｎｅｙら、２００５年）。要するに、ベクターｐＰＩＣ−９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｈｉｓ６−ｔａｇをコードするＤＮＡ断片を有するカセットを挿入することによって修飾する一方、ＳｍａＩ、ＡｐａＩ、およびＳａｃＩＩ制限部位をクローニング目的で導入し、ベクターｐＰＩＣ−９Ｈｉｓを得た。Ｈｉｓ６−ＦＬＡＧタグ化ＭｆＡｖｒ４を生成するため、イントロン除去後で、シグナルペプチド配列を有しない成熟ＭｆＡｖｒ４タンパク質をコードするＭｆＡｖｒ４のＯＲＦを、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマーＡｖｒ４Ｆ ピキア ＦＬＡＧタグ化（ｇａｃｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＡＧ  ＧＴＧＣＧＡＡＣ；プライマーはその５'末端でリン酸化される）およびＡｖｒ４Ｒ ピキア＋ＥｃｏＲＩ部位（ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＣＡＴＣＣ）を使用し、真菌のｃＤＮＡから増幅した。その後、増幅産物を、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用い、ｐＰＩＣ−９Ｈｉｓにクローン化した。次いで、プラスミドを、エレクトロポレーションにより、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、形質転換体をＹＰＤプレート上で成長させた。Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の成長用に使用されるすべての培地、すなわちＭＤ、ＹＰＤ、およびＢＭＭＹを、製造業者の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って作製した。ＭｆＡｖｒ４の、ＡＯＸ１遺伝子座へのインフレームでのクローン化が奏功し、かつコード配列内にＰＣＲによってもたらされた誤りがなかったことを検証するため、自動化されたＤＮＡ配列決定（Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を、ｐＰＩＣ−９中に存在するＡＯＸＲ（ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣ）およびＡＯＸＦ（ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ）プライミング部位を使用し、得られたＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体の培養物からの再単離プラスミドに対して実施した。大規模ＭｆＡｖｒ４を生成するためのＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体の高細胞密度発酵を、Ｓｔｒａｔｔｏｎら（１９９８年）に記載の手順に従って実施した。要するに、５０ｍＬのスタータ培養物を、３０℃（ＯＤ６００＞１０）で２日間成長させ、それを使用し、９００ｍＬのＦＭ２２培地を含有する２Ｌの容器に接種した。スタータ培養物は、ＭＤまたはＹＰＤプレート上で成長させた新しいコロニーから得られた。オートクレーブ後、ｐＨを、５．０Ｍ  ＫＯＨまたは２５％（ｗ／ｖ）ＮＨ４ＯＨで４．９に調整した。撹拌を１２００ｒｐｍで保持し、また気流を１〜２ｖｖｍで維持し、溶存酸素（ＤＯ）レベルを少なくとも３０％超で維持した。必要があれば、数滴のＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９（Ｓｉｇｍａ）を加えることにより、過剰な発泡を防止した。接種の約２０時間後、ＤＯの急激な増加により、グリセロールの減少が観察された。この段階で、グリセロールの供給を、１０ｍＬ・Ｌ−１・ｈ−１の速度で開始し（グリセロールフェドバッチ相）、安定なＤＯ読み取り値（約３５％）を維持するように適度に調節した。４時間後、メタノール供給を、３．４ｍＬ・Ｌ−１・ｈ−１の速度で開始した。培養物がメタノール上での成長に完全に適合した（４〜６時間）直後、メタノール供給速度を６ｍＬ・Ｌ−１・ｈ−１まで段階的に増加させた。メタノール蓄積を防止するため、ＤＯスパイクを実施した（メタノール供給の停止後にＤＯレベルの急激な増加が生じる必要がある；Ｓｔｒａｔｔｏｎら、１９９８年）。
【００８９】
キチン結合アッセイ
ＭｆＡｖｒ４がキチンに対して特異的親和性を有し、かつキチン以外の不溶性多糖に対して有しないか否かを、親和性沈降アッセイ（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇら、２００６年）を用いて試験した。それとともに、これらの実験において、Ｃ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）由来のＡｖｒ４を陽性対照として含めた（データは示さず）。Ｈｉｓ６−ＦＬＡＧタグ化ＭｆＡｖｒ４タンパク質を、発酵後、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体の粗培養濾過物から得て、結合性を上記のように試験した（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇら、２００６年）。要するに、ＭｆＡｖｒ４（１００μＬのＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養濾過物）を、５０ｍＭトリス、ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１×プロテアーゼ阻害剤からなる１．８ｍＬの結合緩衝液中で、約１０ｍｇ／ｍＬの不溶性多糖（カニ殻キチン、キチン−アガロース樹脂、キトサン、セルロース、およびキシラン；樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）以外、全部がＳｉｇｍａ製）とともにインキュベートした。多糖画分は、結合緩衝液中で予備平衡化していた。周囲温度で２時間の穏やかなロッキング（１５ｒｐｍ）後、不溶性分画を遠心分離（３分間、１３，０００×ｇ）によってペレット化し、上清を回収した。回収した上清中のタンパク質画分を、１０％の最終濃度（ｗ／ｖ）のＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を添加して沈殿させ、氷上で１時間インキュベートした。遠心分離（１６，０００×ｇ、３０分間）後、タンパク質ペレットを、−２０℃の８０％アセトン（ｖ／ｖ）で洗浄し、沸騰させることにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（１％ドデシル硫酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭトリス、ＨＣｌ（ｐＨ６．８））中に再溶解した。不溶性多糖を、結合緩衝液で３回洗浄した。結合されたタンパク質画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で１０分間沸騰させることにより、不溶性多糖から溶出した。等量の上清タンパク質画分および結合されたタンパク質画分を負荷し、標準の２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＭｆＡｖｒ４を、抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）を使用する免疫ブロッティングによって検出した。
【００９０】
アグロインフィルトレーションアッセイ
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物の、モデル植物Ｎ．ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉組織への浸潤による、ＭｆＡｖｒ４とＣｆ−４または目的の他の遺伝子との一過性同時発現を、次のように行った。ＭｆＡｖｒ４  ｃＤＮＡのインプランタ発現においては、コードされたＭｆＡｖｒ４の細胞外標的化のためのシグナルペプチドをコードする配列を、タバコの細胞外タンパク質ＰＲ−１ａの配列によって置換した（Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋら、１９９４年；Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋら、１９９５年；Ｈｏｎｅｅら、１９９８年；Ｊｏｏｓｔｅｎら、１９９７年）。最初に、ＰＲ−１ａを、プライマーＰＲ１ａ−Ｆ（ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＡＣ）およびＰＲ１ａ−Ｒ（ＡＴＴＴＴＧＧＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧ）とともにＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して増幅した。イントロン除去後の、元のシグナルペプチド配列を有しない成熟ＭｆＡｖｒ４タンパク質をコードするＭｆＡｖｒ４のＯＲＦ（ＭｆＡｖｒ４ｍａｔｕｒｅ）を、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、真菌のｃＤＮＡから増幅した。ＭｆＡｖｒ４ｍａｔｕｒｅの増幅に使用したプライマーは、増幅産物の５’末端に、ＰＲ−１ａ配列の３’末端に相補的な１７ｂｐ（イタリック体および下線部）およびＭｆＡｖｒ４−Ｒ（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＧＴＴＧＴＣＧＣＡＴＣＣＴＧ）を導入し、増幅産物の３’末端に、ＸｈｏＩ部位（イタリック体および下線部）を導入した、ＰＲ１ａ ＭｆＡｖｒ４−Ｆ（ＣＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＧＡＴＧＣＡＧＧＴＧＣＧ）であった。融合ＰＲ−１ａ：ＭｆＡｖｒ４成熟産物を、ＳｕｐｅｒＴａｑポリメラーゼ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を使用するオーバーラップ拡張ＰＣＲによって生成し、その後、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、製造業者の使用説明書に従ってクローン化した（コンストラクトｐＨＢ１）。融合産物の信頼性を、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ内に存在する、標準のｐＵＣ／Ｍ１３  ＦｏｒｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ結合部位を使用し、カスタムＤＮＡ配列決定（Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）によって試験した。次いで、融合されたＰＲ−１ａ：ＭｆＡｖｒ４成熟産物を、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ消化によってｐＨＢ１から切断し、同様に消化されたｐＲＨ８０ベクター内の３５ＳプロモーターとＰＩ−ＩＩターミネーターの間に挿入した（Ａｎら、１９８９年、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｏｒｎら、２０００年）（コンストラクトｐＨＢ２）。最後に、３５Ｓ：：ＰＲ−１ａ：ＭｆＡｖｒ４ｍａｔｕｒｅ：：ＰＩ−ＩＩカセットを、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を使用し、ｐＨＢ２から切断し、その後、バイナリープラスミドｐＭＯＧ８００に移入した（Ｈｏｎｅｅら、１９９８年、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｏｒｎら、２０００年）（コンストラクトｐＭｆＡｖｒ４）。この最終のｐＭｆＡｖｒ４コンストラクトを、標準的手順を用いるエレクトロポレーションにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（��ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＧＶ３０１に形質転換した（Ｈｏｏｄら、１９９３年）。Ｎ．ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物のアグロインフィルトレーションを、上記のように行った（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｏｒｎら、２０００年）。トマト耐性遺伝子Ｃｆ−４（ｐＣｆ４）およびＣｆ−９（ｐＣｆ９）、ならびにバイナリー発現ベクターｐＭＯＧ８００内のＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）エフェクターＡｖｒ４（ｐＡｖｒ４）およびＡｖｒ９（ｐＡｖｒ９）のコンストラクトを、ｐＭｆＡｖｒ４について記載のように作成し、それは既に研究室内で利用可能であった（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｏｒｎら、２０００年）。
【００９１】
ＭｆＡｖｒ４のＰＶＸ媒介性インプランタ発現
ポテトウイルスＸ（ＰＶＸ）コートタンパク質プロモーターの制御下で病原体ｃＤＮＡの発現を促進するバイナリーベクターであるｐＳｆｉｎｘ（Ｔａｋｋｅｎら、２０００年）を、本試験において使用したすべてのＰＶＸ発現コンストラクトにおけるバックボーンとして使用した。左端から右端にかけて、このベクターのＴ−ＤＮＡは、レプリカーゼ遺伝子、三重遺伝子ブロック、二重化（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ）コートタンパク質プロモーター、およびコートタンパク質遺伝子を有するＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター駆動のＰＶＸ配列から構成される。病原体ｃＤＮＡ（例えばＡｖｒ遺伝子）の特異的挿入におけるｐＳｆｉｎｘの複数のクローニング部位は、二重化コートタンパク質プロモーターのすぐ下流に位置する。ｐＳｆｉｎｘは、発現コンストラクトの植物細胞へのＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による移入を促進する一方、その後のウイルス複製の結果、ＨＲを誘発しうる病原体ｃＤＮＡの発現が、ｃＤＮＡが植物内の同族Ｒ遺伝子によって認識される非病原性タンパク質をコードする場合にもたらされる。上記のプラスミドｐＭｆＡｖｒ４を使用し、融合産物ＰＲ−１ａ：ＭｆＡｖｒ４ｍａｔｕｒｅを、ＰＲ−１ａ：ＭｆＡｖｒ４ｍａｔｕｒｅ増幅産物の５’末端にＸｍａＩおよびその３’末端にＸｈｏＩ部位をそれぞれ導入した、プライマーＭｆＡｖｒ４−Ｆ（ＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＧＴＧＣＧ）およびＭｆＡｖｒ４−Ｒ（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＧＴＴＧＴＣＧＣＡＴＣＣＴＧ）を用いて増幅した。ＰＣＲを、ＳｕｐｅｒＴａｑポリメラーゼ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を使用して行い、その後、産物を、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、製造業者の使用説明書に従ってクローン化した（コンストラクトｐＨＢ４）。次いで、ＰＲ−１ａ：ＭｆＡｖｒ４ｍａｔｕｒｅカセットを、ＸｍａＩおよびＸｈｏＩを用いてｐＨＢ４から切断し、同様に消化されたｐＳｆｉｎｘベクターにライゲートした結果、最終コンストラクトＰＶＸ：：ＰＲ１ａＭｆＡ４ｖｒ４が得られた。最終コンストラクトの信頼性について、ＰＶＸバックボーン内のｃＤＮＡインサートに隣接する、プライマーＯＸ１０（５'−ＣＡＡＴＣＡＣＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＴＧＣ−３’）およびＮ３１（５’−ＧＡＣＣＣＴＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＴＧ−３’）を使用し、Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．でのカスタムＤＮＡ配列決定によって試験した。次いで、最終ＰＶＸ：：ＰＲ１ａＭｆＡｖｒ４コンストラクトを、標準的手順（Ｈｏｏｄら、１９９３年）を用いるエレクトロポレーションにより、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＧＶ３０１に形質転換した。最後に、形質転換体を、修飾ＬＢ培地（１０ｇl １ｂａｃｔｏ−ペプトン；５ｇl １酵母抽出物；２．５ｇl １ＮａＣｌ；１０ｇl １マンニトール）を有するプレート上、２８℃で４８時間培養し、その後、コロニーを選択し、４週齢トマトＭＭ−Ｃｆ０およびＭＭ−Ｃｆ４トマト植物上に、つまようじ（ｔｏｏｔｈｐｉｃｋ）接種によって接種した（Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋら、１９９５年）。全身性ＨＲ症状を、接種の１０〜１４日後に記録した（図６）。対照として、空のｐＳｆｉｎｘベクター（ＰＶＸ：：ｐＳｆｉｎｘ）およびバイナリーベクター内のＣ．フルブム（Ｃ．ｆｕｌｖｕｍ）Ａｖｒ４（ＰＶＸ：：ＰＲ１ａＡｖｒ４）を有するＰＶＸを使用した。後者のコンストラクトは、既に我々の研究室で利用可能であった（Ｊｏｏｓｔｅｎら、１９９７年）。
REFERENCES
An G, Mitra A, Choi HK, Costa M.A, An K, Thornburg RW, Ryan CM. 1989. Functional analysis of the 3c control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. Plant Cell 1:115-122.
Arzanlou M, Abeln ECA, Kema GHJ, Waalwijk C, Carlier J, de Vries I, Guzman M, Crous PW. 2007. Molecular diagnostics for the Sigatoka disease complex of banana. Phytopathology 97: 1112-1118.
Batzer MA, Carlton JE Deininger PL 1991. Enhanced evolutionary PCR using oligonucleotides with inosine at the 3'-terminus. Nucleic Acids Research 19: 5081.
De Blaere, R., Reynaerts, A., Hofte, H., Hernalsteens, J.-P., Leemans, J. and Van Montagu, M. 1987. Vectors for cloning in plant cells Methods in Enzymology 153, 277-291.
Bolton MD, Van Esse HP, Vossen JH, De Jonge R, Stergiopoulos I, Stulemeijer IJE, Van Den Berg GCM, Borras-Hidalgo O, Dekker HL, De Koster CG, De Wit PJGM, Joosten MHAJ, Thomma BPHJ. 2008. The novel Cladosporium fulvum lysin motif effector Ecp6 is a virulence factor with orthologues in other fungal species. Molecular Microbiology 69:119-36
Carlier J, Foure E, Gauhl F, Jones DR, Lepoivre P, Mourichon X, Pasberg-Gauhl C Romero RA. 2000. Black Leaf Streak. Pages 37-79 in: Diseases of Banana, Abaca and Enset. D. R. Jones.
Christensen AH, Quail PH. 1996. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research 5: 213-218.
Christou P, McCabe DE, Swain WF. 1988 Stable Transformation of Soybean Callus by DNA-Coated Gold Particles, Plant Physiol. 87: 671-674.
Christou P, Ford TL, Kofron M. 1991. Production of transgenic rice (Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Trends in Biotechnology 10: 239-246.
Crossway, A, Oakes JV, Irvine JM, Ward B, Knauf VC, Shewmaker, LK 1986. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Molec. Gen. Genet. 202: 179-185.
Crouch JH, Vuylsteke D, Ortiz R. 1998. Perspectives on the application of biotechnology to assist the genetic enhancement of plantain and banana (Musa spp.). Electronic Journal of  Biotechnology 1:1-12.
Datta, SK, Datta, K, Potrykus, I 1990. Embryogenesis and plant regeneration from microspores of both Indica and Japonica rice (Oryza sativa). Plant Sci. 67: 83-88.
De Kock MJD, Brandwagt BF, Bonnema G, De Wit PJGM, Lindhout P. 2005. The tomato Orion locus comprises a unique class of Hcr9 genes. Molecular Breeding 15:409-22.
De Kock MJD, Iskander HM, Brandwagt BF, Lauge R, De Wit PJGM, Lindhout P. 2004. Recognition of Cladosporium fulvum Ecp2 elicitor by non-host Nicotiana spp. is mediated by a single dominant gene that is not homologous to known Cf-genes. Molecular Plant Pathology 5: 397-408.
De Wit PJGM, Joosten MHAJ, Thomma BHPJ, Stergiopoulos I. 2008. Gene-for-gene models and beyond: the Cladosporium fulvum-tomato pathosystem. The MycotaV; Plant relationships, 2nd Edition, H.B. Deising (Ed). Springer-Verlag Berlin Heildelberg 2009. pp.135-156.
Dixon MS, Jones DA, Keddie JS, Thomas CM, Harrison K, Jones JDG. 1996. The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes encoding leucine-rich repeat proteins. Cell 84:451-59.
Fromm, ME, Taylor, LP, Walbot, V 1986 Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature 319, 791-793.
Fromm, ME, Morrish, F, Armstrong, C, Williams, R, Thomas, J and Klein, TM. 1990. Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants. Bio/Technology 8: 833-839.
Gelvin SB, Habeck LL.1990. Vir genes influence the conjugal transfer of the Ti-plasmid of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 172:1600-1608.
Gordon-Kamm WJ, Spencer TM, Mangano ML, Adams TR, Daines RJ, Start WG, O'Brien JV, Chambers SA, Adams Jr WR, Willetts NG, Rice TB, Mackey CJ, Krueger RW, Kausch AP,  Lemaux PG. 1990. Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. The Plant Cell 2:603-618
Haanstra JPW, Lauge R, Meijer-Dekens F, Bonnema G, de Wit PJGM, Lindhout P. 1999. The Cf-ECP2 gene is linked to, but not part of, the Cf-4/Cf-9 cluster on the short arm of chromosome 1 in tomato. Molecular and General Genetics 262: 839-845.
Hammond-Kosack KE, Harrison K, Jones JDG. 1994. Developmentally regulated cell death on expression of the fungal avirulence gene Avr9 in tomato seedlings carrying the disease-resistance gene Cf-9. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 91:10445-10449
Hammond-Kosack KE, Staskawicz BJ, Jones JDG, Baulcombe DC. 1995. Functional expression of a fungal avirulence gene from a modified potato virus X genome. Molecular Plant-Microbe Interactions. 8:181-185.
Hermann SR, Becker DK, Harding RM Dale JL. 2001 Promoters derived from banana bunchy top virus-associated components S1 and S2 drive transgene expression in both tobacco and banana. Plant Cell Reports 20:642-646.
Hinchee MAW, Conner-Ward DV, Newell CA, McDonnell RE, Sato SJ, Gasser CS, Fischhoff DA, Re DB, Fraley RT, Horsch RB. 1988, Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer. Bio/Technology 6:915-922.
Honee G, Buitink J, Jabs T, De Klo, J, Sijbolts F, Apotheker M, Weide R, Sijen T, Stuiver M, De Wit PJGM. 1998. Induction of defence-related responses in Cf9 tomato cells by the AVR9 elicitor peptide of Cladosporium fulvum is developmentally regulated. Plant Physiology 117:809-820.
Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS, Hoekema A. 1993. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Resources 2:208-218.
Innis MA, Gelfand DH 1999: PCR Applications: protocols for functional genomics. Academic Press, San Diego, CA, USA.
Jones DR. 1993. Evaluating banana and plantain for reaction to black leaf streak disease in the south-pacific. Tropical Agriculture 70: 39-44
Jones DR. 2000. Diseases of banana, abaca and enset. CABI International, Wallingford, Oxon, UK.
Joosten MHAJ, Cozijnsen TJ, De Wit PJGM. 1994. Host resistance to a fungal tomato pathogen lost by a single base-pair change in an avirulence gene. Nature 367:384-86.
Joosten
MHAJ, De Wit PJGM. 1999. The tomato-Cladosporium fulvum interaction: A versatile experimental system to study plant-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology 37:335-67.
Joosten MHAJ, Vogelsang R, Cozijnsen TJ, Verberne MC, De Wit PJGM. 1997. The biotrophic fungus Cladosporium fulvum circumvents Cf-4-mediated resistance by producing unstable AVR4 elicitors. Plant Cell 9:367-79.
Kao CY, Huang SH, Lin CM. 2008. A low-pressure gene gun for genetic transformation of maize (Zea mays L.). Plant Biotechnology Reports 2: 267-270.
Kay R, Chan A, Daly M, McPherson J. 1987. Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes. Science 236: 1299-1302.
Klein TM, Wolf WD, Wu R, Sanford JC 1987: High velocity micro-projectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327:70-73.
Kooman-Gersmann M, Vogelsang R, Vossen P, van den Hooven HW, Mahe E, Honee G, De Wit PJGM. 1998. Correlation between binding affinity and necrosis-inducing activity of mutant Avr9 peptide elicitors. Plant Physiol. 117:609-18.
Klein, TM, Kornstein, L, Sanford, JC Fromm, ME 1989. Genetic transformation of maize cells by particle bombardment. Plant Physiol. 91: 440-444.
Koziel, MG, Beland GL, Bowman C, Carozzi NB, Crenshaw R, Crossland L, Dawson J, Desai N, Hill M, Kadwell S, Launis K, Lewis K, Maddox D, McPherson K, Meghji MR, Merlin E, Rhodes R, Warren GW, Wright M, Evola SV. 1993. Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. Bio/Technology 11:194-200.
Kruger J, Thomas CM, Golstein C, Dixon MS, Smoker M, Tang S, Mulder L, Jones JDG. 2002. A tomato cysteine protease required for Cf-2-dependent disease resistance and suppression of autonecrosis. Science 296:744-47.
Kruijt M, Kip DJ, Joosten MHAJ, Brandwagt BF, De Wit PJGM. 2005. The Cf-4 and Cf-9 resistance genes against Cladosporium fulvum are conserved in wild tomato species Molecular Plant-Microbe Interactions 18: 1011-1021.
Last DI, Brettell RIS, Chamberlaine DA, Chaudhury AM, Larkin PJ, Marsh EL, Peacock WJ, Dennis ES. 1991. pEmu: An improved promoter for gene expression in cereal cells. Theoretical Applied Genenetics 81: 581-588.
Lauge R, Goodwin PH, De Wit PJGM, Joosten MHAJ. 2000. Specific HR-associated recognition of secreted proteins from Cladosporium fulvum occurs in both host and non-host plants. Plant Journal 23:735-45.
Luderer R, Rivas S, Nurnberger T, Mattei B, Van den Hooven HW, Van der Hoorn RAL, Romeis T, Wehrfritz JM, Blume B, Nennstiel D, Zuidema D, Vervoort J, De Lorenzo G, Jones JDG, De Wit PJGM, Joosten MHAJ. 2001. No evidence for binding between resistance gene product Cf-9 of tomato and avirulence gene product AVR9 of Cladosporium fulvum. Molecular Plant-Microbe Interactions 14:867-76.
Luderer R, Takken FLW, De Wit PJGM, Joosten MHAJ. 2002. Cladosporium fulvum overcomes Cf-2-mediated resistance by producing truncated Avr2 elicitor proteins. Molecular Microbiology 45:875-84.
Marin D, Ching LD, Romero RA. 1992. Efecto de la Sigatoka negra sobre la productividad del platano. Pages 85-86 in: Corporacion Bananera Nacional-Informe Anual 1991, San Jose, Costa Rica.
McCabe, DE, Swain WF, Martinell BJ, Christou P 1988,. Stable Transformation of Soybean (Glycine Max) by Particle Acceleration. Bio/Technology 6:923
McElroy D, Zhang W, Cao J, Wu R. 1990. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell 2: 163-171.
Mitsuhara I, Ugaki M, Hirochika H, Ohshima M, Murakami T, Gotoh Y, Katayose Y, Nakamura S, Honkura R, Nishimiya S, Ueno K, Mochizuki A, Tanimoto H, Tsugawa H, Otsuki Y, Ohashi Y. 1996. Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants. Plant Cell Physiology 37: 49-59.
Miya A, Albert P, Shinya T, Desaki Y, Ichimura K, Shirasu K, Narusaka Y, Kawakami N, Kaku H and Shibuya N. 2007. CERK1, a LysM receptor kinase, is essential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 104: 19613-19618.
Ohtsuka E, Matsuki S, Ikehara M, Takahashi Y, Matsubara K. 1985, An alternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions. J Biol Chem. 260: 2605-2608.
Paszkowski, J, Shillito, RD, Saul, M, Mandak, V, Hohn, T, Hohn, B Potrykus, I 1984. Direct gene transfer to plants, EMBO J. 3: 2717-2722.
Riggs, CD Bates GW, 1986. Stable transformation of tobacco by electroporation: Evidence for plasmid concatenation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606.
Rooney HCE, van't Klooster JW, van der Hoorn RAL, Joosten MHAJ, Jones JDG, De Wit PJGM. 2005. Cladosporium Avr2 inhibits tomato Rcr3 protease required for Cf-2-dependent disease resistance. Science 308:1783-86.
Rossolini GM, Cresti S, Ingianni A, Catani P, Riccio ML, Satta G. 1994, Use of deoxyinosine-containing primers versus degenerate primers for polymerase chain reaction based on ambiguous sequence information. Molecular and Cellular Probes, 8: 91-98.
Sagi L, Remy S, Swennen R 1998. Fungal disease control in banana, a tropical monocot: Transgenic plants in the third world? Phytoprotection (Suppl.) 79:117-120.
Sagi L, Remy S, Swennen R. 1997. Genetic transformation for the improvement of bananas: A critical assessment. Focus paper No. 2. Pages 33-36 in: INIBAP Annual Report 1997. INIBAP, Montpellier, France.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis TA. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 
Sanford, JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N. 1987. Delivery of substances into cells and tissues using a microprojectile bombardment process. J. Particle Sci. Technol. 5:27-37.
Schenk PM, Sagi L, Remans T, Dietzgen RG, Bernard MJ, Graham MW, Manners JM. 1999. A promoter from sugarcane bacilliform badnavirus drives transgene expression in banana and other monocot and dicot plants. Plant Molecular Biology 39: 1221-1230.
Schunmann PHD, Surin B Waterhouse PM. 2003. A suite of novel promoters and terminators for plant biotechnology II. The pPLEX series for use in monocots. Functional Plant Biology 30: 453-460. 
Shabab M, Shindo T, Gu C, Kaschani F, Pansuriya T, Chintha R, Harzen A, Colby T, Kamoun S, Van der Hoorn RA. 2008. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related cys proteases of tomato. The Plant Cell 20:1169-83.
Shimamoto, K, Terada, R, Izawa, T, Fujimoto, H 1989. Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature 338: 274-276.
Soumpourou E, Iakovidis M, Chartrain L, Lyall V, Thomas CM. 2007. The Solanum pimpinellifolium Cf-ECP1 and Cf-ECP4 genes for resistance to Cladosporium fulvum are located at the Milky Way locus on the short arm of chromosome 1. Theoretical and Applied Genetics 115:1127-36.
Stergiopoulos I, De Kock MJD, Lindhout P, De Wit PJGM. 2007. Allelic variation in the effector genes of the tomato pathogen Cladosporium fulvum reveals different modes of adaptive evolution. Molecular Plant-Microbe Interactions 20:1271-83.
Stover RH 1980. Sigatoka leaf spot of bananas and plantains. Plant Disease 64:750-756.
Stover RH and Simmonds NW. 1987. Bananas. 3rd ed. Longman Scientific & Technical, Essex, England.
Stratton J, Chiruvolu V, Meagher M. 1998. High cell-density fermentation. In: Higgins DR, Cregg JM (eds) Methods in molecular biology: Pichia protocols. Humana, Totowa, pp 107-120
Svab Z, Hajdukiewicz P, Maliga P (1990): Stable transformation of plastids in higher plants. Proc Natl Acad Sci USA 87: 8526-8530.
Takken LW, Luderer R, Gabriels SHEJ, Westerink N, Lu R. De Wit PJGM, Joosten MHAJ. 2000. A functional cloning strategy, based on a binary PVX-expression vector, to isolate HR-inducing cDNAs of plant pathogens. Plant Journal 24:275-283.
Thomas CM, Balint-Kurti PJ, Jones DA and Jones JDG. 1996. Plant pathogen resistance genes and uses thereof. International Patent Application Number: PCT/GB96/01155. 
Thomma BPHJ, Van Esse HP, Crous PW, De Wit PJGM. 2005. Cladosporium fulvum (syn. Passalora fulva), a highly specialized plant pathogen as a model for functional studies on plant pathogenic Mycosphaerellaceae. Molecular Plant Pathology 6:379-93.
Vain P, Finer KR, Engler DE, Pratt RC, Finer JJ. 1996. Intronmediated enhancement of gene expression in maize (Zea mays L.) and bluegrass (Poa pratensis L.). Plant Cell Reports 15: 489-494.
Verdaguer B, de Kochko A, Beachy RN and Fauquet C. 1996. Isolation and expression in transgenic tobacco and rice plants of the cassava vein mosaic virus (CVMV) promoter. Plant Molecular Biology 31:1129-1139.
van den Ackerveken GFJM, van Kan JA, Joosten MHAJ, Muisers JM, Verbakel HM, De Wit PJGM. 1993. Characterization of two putative pathogenicity genes of the fungal tomato pathogen Cladosporium fulvum. Molecular Plant-MicrobeIinteractions 6:210-15.
van den Burg HA, Harrison SJ, Joosten MHAJ, Vervoort J, De Wit PJGM. 2006. Cladosporium fulvum Avr4 protects fungal cell walls against hydrolysis by plant chitinases accumulating during infection. Mol. Plant-Microbe Interactions 19:1420-30.
van den Burg HA, Spronk CAEM, Boeren S, Kennedy MA, Vissers JPC, Vuister GW, De Wit PJGM, Vervoort J. 2004. Binding of the AVR4 elicitor of Cladosporium fulvum to chitotriose units is facilitated by positive allosteric protein-protein interactions: The chitin-binding site of Avr4 represents a novel binding site on the folding scaffold shared between the invertebrate and the plant chitin-binding domain. . Journal of Biological Chemistry 279:16786-96.
van den Burg HA, Westerink N, Francoijs KJ, Roth R, Woestenenk E, Boeren S, De Wit PJGM, Joosten MHAJ, Vervoort J. 2003. Natural disulfide bond-disrupted mutants of AVR4 of the tomato pathogen Cladosporium fulvum are sensitive to proteolysis, circumvent Cf-4-mediated resistance, but retain their chitin binding ability. Journal of Biological Chemistry 278:27340-46.
van Esse HP, Bolton MD, Stergiopoulos I, De Wit PJGM, Thomma BPHJ. 2007. The chitin-binding Cladosporium fulvum effector protein Avr4 is a virulence factor. Molecular Plant-Microbe Interactions 20:1092-101.
van Esse HP, van't Klooster JW, Bolton MD, Yadeta K, VanBaarlen P, Boeren S, Vervoort J, De Wit PJGM, Thomma BPHJ. 2008. The Cladosporium fulvum virulence protein Avr2 inhibits host proteases required for basal defense. Plant Cell  20: 1948-1963.
Van der Hoorn RAL, Laurent F, Roth R, De Wit PJGM. 2000. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced Necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions 13:439-446.
Van den Hooven HW, Van den Burg HA, Vossen P, Boeren S, De Wit PJGM and Vervoort J. 2001. Disulfide bond structure of the AVR9 elicitor of the fungal tomato pathogen Cladosporium fulvum: Evidence for a cystine knot. Biochemistry, 40: 3458-3466.
van Kan JAL, van den Ackerveken GFJM, De Wit PJGM. 1991. Cloning and characterization of cDNA of avirulence gene avr9 of the fungal pathogen Cladosporium fulvum, causal agent of tomato leaf mold. Molecular Plant-Microbe Interactions 4:52-59.
Vasil, V, Castillo AM, Fromm ME,  Vasil IK.,. 1992. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Bio/Technology 10:667-674.
Wan J, Xu Zhang XC, Neece D, Ramonell KM, Cloug S, Kim SY, Stacey MG, Stacey G. 2008. A LysM Receptor-Like Kinase Plays a Critical Role in Chitin Signaling and Fungal Resistance in Arabidopsis. The Plant Cell 20:471-481.
Weeks, JT, Anderson OD, Blechl AE. 1993. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Physiol. 102:1077-1084.
Weissinger, A, Tomes, D, Maddock, S, Fromm, M, Sanford, J. 1988, Maize transformation via micro-projectile bombardment, in Molecular Biology: Genetic Improvements of Agriculturally Important Crops: Progress and Issues Meeting, pp. 21-25, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Westerink N, Brandwagt BF, De Wit PJGM, Joosten MHAJ. 2004. Cladosporium fulvum circumvents the second functional resistance gene homologue at the Cf-4 locus (Hcr9-4E) by secretion of a stable avr4E isoform. Molecular Microbiology 54:533-45.
【図１】
2012532605.tif 000003
【図２】
2012532605.tif 000004
【図３】
2012532605.tif 000005
【図４】
2012532605.tif 000006
【図５】
2012532605.tif 000007
【図６】
2012532605.tif 000008
【図７】
2012532605.tif 000009
【配列表】
2012532605000001.app
【国際調査報告】
2012532605.tif 000010
2012532605.tif 000011
2012532605.tif 000012