(57)【要約】  本発明は、細胞の浸透性の減少を導く経上皮電気抵抗を増加させる工程を含む、自己免疫性疾患を処置する方法を提供する。さらに、処置を必要とする個体において、セリアック病を処置する方法が提供され、その方法は、単鎖ゾヌリンに対して向けられた抗体を投与し、それによって上皮成長因子受容体を阻害し、および、ＰＡＲ２を阻害する工程を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞透過性の減少を導く経上皮電気抵抗を増加させる工程を含む自己免疫性疾患を処置する方法。
【請求項２】
前記細胞が、小腸細胞または胃十二指腸細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、ゾヌリンｍＲＮＡの減少した発現を有することを特徴とする請求項２
に記載の方法。
【請求項４】
上皮成長因子受容体を阻害する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記上皮成長因子受容体が、単鎖ゾヌリンに対して向けられた抗体を投与することによって阻害されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＡＲ２を阻害する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
単鎖ゾヌリンに対して向けられた抗体を投与する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＡＲ２が、ｓｉＲＮＡを使用して阻害されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＣＸＣＲ３受容体結合を介してグリアジンによってゾヌリン放出を避ける工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記自己免疫性疾患が、Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス、セリアック病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病および統合失調症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
処置を必要とする個体において、自己免疫性疾患を処置する方法であって、該方法は、
上皮成長因子受容体を阻害する工程、および
ＰＡＲ２を阻害する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
経上皮電気抵抗が増加し、細胞の浸透性の減少を導くことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、小腸細胞または胃十二指腸細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、ゾヌリンｍＲＮＡの減少した発現を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記上皮成長因子受容体が、単鎖ゾヌリンに対して向けられた抗体を投与することによって阻害されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＡＲ２が、ｓｉＲＮＡを使用して阻害されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
グリアジンを阻害する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己免疫性疾患が、Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス、セリアック病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病および統合失調症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
処置を必要とする個体において、セリアック病を処置する方法であって、該方法は、
単鎖ゾヌリンに対して向けられた抗体を投与し、それによって上皮成長因子受容体およびＰＡＲ２を阻害する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
経上皮電気抵抗が増加し、細胞浸透性の減少を導くことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、小腸細胞または胃十二指腸細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、ゾヌリンｍＲＮＡの減少した発現を有することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＡＲ２が、ｓｉＲＮＡを使用してさらに阻害されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
グリアジンを阻害する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
個体において腸透過性の増加に関連する疾患を診断するための方法であって、該方法は、
前記個体から生物サンプルを得る工程、
前記生物サンプル中のプレハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルを測定する工程、および
前記生物サンプル中のプレハプトグロビンまたはそのグリコフォームの前記発現レベルを、コントロールサンプルにおいて発現したプレハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルと比較する工程、
を含み、前記コントロールと比較した前記プレハプトグロビンまたはそのグリコフォームの過剰発現が、自己免疫性疾患の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記プレハプトグロビンの発現レベルが、ｍＲＮＡレベルで測定されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プレハプトグロビンが、プレハプトグロビン２であり、その発現レベルを測定する工程が、
サンプルからｍＲＮＡを単離する工程、および
サンプル中のプレハプトグロビン２ｍＲＮＡを増幅し、定量化する工程、
を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プレハプトグロビンおよびそのグリコフォームの発現レベルが、タンパク質レベルで測定されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記プレハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルを測定する工程が、
サンプルを、ハプトグロビンα鎖若しくはβ鎖またはそのグリコフォームに対して向けられた抗体と接触させる工程、
抗体結合ハプトグロビン鎖またはその抗体結合グリコフォームを、プレハプトグロビンまたはそのプレハプトグロビングリコフォームに特異的な抗体と接触させる工程、および
サンプル中のプレハプトグロビンタンパク質またはプレハプトグロビングリコフォームを検出し、定量化する工程、
を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記プレハプトグロビンまたはそのグリコフォームの発現レベルを測定する工程が、
サンプルを、ハプトグロビンα鎖若しくはβ鎖またはそのグリコフォームに対して向けられたポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させる工程、および
サンプル中のプレハプトグロビンタンパク質またはプレハプトグロビングリコフォームを検出し、定量化する工程、
を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記腸透過性の増加に関連する疾患が、アレルギー性、炎症性または自己免疫性の疾患であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記自己免疫性疾患が、Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス、セリアック病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病および統合失調症からなる群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが、血清、尿、大便、または組織生検であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記プレハプトグロビンが、プレハプトグロビン２であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
患者において自己免疫性疾患を診断する方法であって、該方法は、
患者から生物サンプルを得る工程、
前記生物サンプル中のプレハプトグロビン２ｍＲＮＡを増幅する工程、および
前記増幅した産物中のプレハプトグロビン２を定量化する工程、
を含み、コントロールと比較したプレハプトグロビン２産物の増加が、前記自己免疫性疾患の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項３６】
前記自己免疫性疾患が、Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス、セリアック病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病および統合失調症であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記自己免疫性疾患が、セリアック病であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルが、血清、尿、大便、または組織生検であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
被験体において自己免疫性疾患を診断する方法であって、該方法は、
前記被験体から生物サンプルを得る工程、
前記生物サンプル中のプレハプトグロビン２タンパク質を検出する工程、および
前記検出したプレハプトグロビン２タンパク質を定量化する工程、
を含み、コントロールと比較したプレハプトグロビン２の増加したレベルが、前記自己免疫性疾患の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記検出する工程が、
サンプルを、ハプトグロビンα鎖またはβ鎖に対して向けられた抗体と接触させる工程、および
抗体結合ハプトグロビンを、プレハプトグロビンに特異的な抗体と接触させるる工程、
を含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記検出する工程が、
生物サンプルを、ハプトグロビン２に対して向けられた抗体と接触させる工程、
を含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記自己免疫性疾患が、Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス、セリアック病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病および統合失調症であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記自己免疫性疾患が、セリアック病であることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプルが、血清、血漿、尿、大便、または組織生検であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜連邦機関の助成金の説明＞
本発明は、国立保健研究所によって与えられた助成金番号ＤＫ０４８３７３の下の政府支援で作られた。政府は本発明に特定の権利を有している。
【０００２】
＜関連出願の相互参照＞
この国際出願は、米国特許法１１９条（ｅ）項の下、２００９年６月１０日出願の米国仮特許出願第６１／１８５，６６２号（現在は、放棄された）の優先権の利益を主張するものであり、その全体は、引用によって本明細書によって組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
＜発明の分野＞
本発明は、細胞生物学と腸透過性の分野に関する。より具体的には、本発明は腸透過性のＥＧＦＲおよびＰＡＲ２調節に関する。
【０００４】
＜関連技術の記載＞
様々な微生物への接触が少なくなることに繋がる、衛生の強化は、過去３０〜４０年間の間に工業先進国で記録されたアレルギー性、炎症性、および自己免疫性の疾患の「流行」に対する原因として結び付けられてきた（１）。遺伝子構造および環境刺激への接触とは別に、第３の重要な要素、すなわち腸透過性（ＩＰ）の増加は、これらの疾患の病原論において提案された（２−４）。
【０００５】
腸透過性は、腸細胞および管腔の樹状細胞によってサンプリングする抗原と一緒に、腸管腔と粘膜下組織との間の分子輸送を調節し、耐性または非自己抗原に対する免疫のいずれかを導く（５）。しかしながら、傍細胞空間（１０〜１５Å）の次元は、１５Å（〜３．５ｋＤａ）（タンパク質を含む）を超える分子半径を有する溶質がこの取り込み経路から通常除外されることを示唆する。細胞間のタイトジャンクション（ＴＪ）はしっかりとこの傍細胞抗原取り込みを調節する。
【０００６】
タイトジャンクションは、生理学的環境と病理学的環境の両方の環境の下、腸上皮のいくつかの主要な機能において働く動的構造である（３）。しかしながら、細胞間のタイトジャンクションの組成および機能に関する理解の大きな進歩にもかかわらず、それらが調節される機構はまだ十分に解明されていない。
【０００７】
コレラ菌密着帯毒素（Ｚｏｔ）（タイトジャンクションの浸透性を増加させる毒素）の発見は、細胞間のタイトジャンクションの調節により可逆的に腸透過性を調節することが知られる唯一の生理的なメディエータとして、その真核生物の対応物であるゾヌリン同定に繋がった（６、７）。ヒトゾヌリンは、ヒト以外の霊長類の腸管上皮内での腸透過性を増加させて（７）、腸の先天免疫に関与し（８）、およびセリアック病（ＣＤ）（９、１０）および１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）（１１）を含む、タイトジャンクションの機能障害が中心的な自己免疫疾患で過剰発現される、〜４７ｋＤａのタンパク質である。
【０００８】
ハプトグロビン（Ｈｐ）は、動脈壁、子宮内膜および腹膜のみでなく、主として肝臓中で合成された急性期反応タンパク質である。ハプトグロビンのコア機能は、ほとんど肝臓の細網内皮（reticular endothelial）系における遊離ヘモグロビンの末端プロセシングおよび除去のために必要なヘモグロビン（Ｈｂ）結合タンパク質としてある。このシステムによって、Ｈｂ成分に存在する鉄を保存することが可能となる。
【０００９】
ハプトグロビンは、ジスルフィド結合によって結合された、２つのアルファ鎖と２つのベータ鎖を含む四量体の構造を有する。ベータ鎖（２４５のアミノ酸）は、約４０ｋＤａの質量を有しており（そのおよそ３０％ｗ／ｗが炭水化物である）、すべての表現型によってシェア（share）される。アルファ鎖は２つの形態：アルファ１（８３のアミノ酸、９ ｋＤａ）、およびアルファ２（１４２のアミノ酸、１７．３ｋＤａ）で存在し、従って、ハプトグロビンは、ＨＰ１−１、ＨＰ２−１およびＨＰ２−２と呼ばれる３つの表現型として生じる。ＨＰ１−１は、２つのアルファ１鎖を含み、ＨＰ２−２は２つのアルファ２鎖を含み、およびＨＰ２−１は１つのアルファ１鎖と１つのアルファ２鎖を含む。ＨＰ１−１は、１００ｋＤａの分子量を有し、Ｈｂで複合化されると１６５ｋＤａの質量を有する。ＨＰ１−１は、単一のアイソフォームとして存在し、Ｈｐ二量体と呼ばれる。ＨＰ２−１は、２２０ｋＤａの平均分子量を有し、線形ポリマーを形成する。ＨＰ２−２は、４００ｋＤａの平均分子量を有し、環式ポリマーを形成する。異なる重合体の形態はそれぞれ異なるアイソフォームである。
【００１０】
ハプトグロビンは、溶血によって引き起こされる腎障害のための見込みのある処置である。それは、遊離ヘモグロビンを除去する手段として潜在的に治療上有用であり；このように形成された複合体は、抗炎症剤、酸化防止剤または血管形成剤として潜在的なさらなる利点を有する。しかしながら、ハプトグロビンは、その生物活性を保持しながら大量に単離することが困難であると考えられる。
【００１１】
当該技術分野において、腸透過性を調節する方法のみでなく、プレパプトグロビン２の機能的な特性に関する必要性が認識されている。本発明は、当該技術分野におけるこの積年の必要性を満たすものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
健康時および疾患時におけるゾヌリンの腸浸透モジュレータとしての役割は、機能的に記述されているが、その生化学的特性は捉え難いままでだった。本発明は、ヒト血清のプロテオーム解析を経て、ゾヌリンが、現在までＨＰ２にとって不活性な前駆物質と単に見なされた分子である、プレパプトグロビン（ＨＰ）２（（ＨＰ１と共に）ヒトプレパプトグロビンの２つの遺伝子変異体のうちの１つ）と同一であることを示す。本発明は、その完全な単鎖前駆体の形態で、ＰＡＲ２活性化によってＥＧＦＲを転写促進させることによって腸透過性を調節すると思われ、一方、その切断された２重鎖の形態で、Ｈｂスカベンジャーとして働く多機能タンパク質である、プレパプトグロビン２としてのゾヌリンの機能的な特性を実証する。
【００１３】
従って、本発明の１つの実施形態において、自己免疫疾患を処置する方法が提供され、その方法は、細胞透過性の減少に繋がる経上皮電気抵抗を増加させる工程を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、処置を必要とする個体において、自己免疫疾患を処置する方法が提供され、その方法は、上皮成長因子受容体を阻害する工程、およびＰＡＲ２を阻害する工程を含む。
【００１５】
本発明のさらなる別の実施形態において、処置を必要とする個体において、セリアック病を処置する方法が提供され、その方法は、単鎖ゾヌリンに対して向けられた抗体を投与し、それによって上皮成長因子受容体およびＰＡＲ２を阻害する工程を含む。
【００１６】
他のさらなる態様において、本発明の特徴および利点は、開示の目的で与えられた本発明の現在のところ好ましい実施形態の以下の説明から明白になる。
【００１７】
本発明の特徴、利点および目的と、明確になる他の事も、詳細に得られ、詳細に理解され得るように、上に簡潔に要約された本発明のより具体的な記載および特定の実施形態が、添付された図面において説明される。これらの図面は、明細書の一部を形成する。しかしながら、添付された図面は、本発明の好ましい実施形態を説明するものであり、従って、それらの範囲を制限するものと考えられないことに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、アルブミンと免疫グロブリンを取り除いたＣＤ患者の血清に関する、ゾヌリンと交差反応する抗ＺｏｔポリクローナルＡｂ（zonulin cross-reacting anti-Ｚｏｔ polyclonal Ab）を用いた、ウェスタンブロットを示す。３つの主要なパターンが検出された：１８ｋＤａの免疫反応性バンドおよびより弱い〜４５ｋＤａバンドを示す血清（レーン１）、９ｋＤａのバンドのみを示す血清（レーン２）、および１８ｋＤａと９ｋＤａの両方のバンドを示す血清（レーン３）。
【図２Ａ】図２Ａは、単離されたヒトホモ接合体ＨＰ１−１およびＨＰ２−２（両方とも未処理で、かつ、ＰＧＮａｓｅによる脱グリコシル化後）のクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）およびウエスタンブロット（ＷＢ）を示す。図２Ａ：未処理のＨＰのクマシー染色は、ＭＷ〜５２ｋＤａで移動する、シェアされるグリコシル化したｂ鎖を示し、一方、ＨＰ１−１のａ（ａ１）およびＨＰ２−２のａ（ａ２）は、それぞれ、８および１８ｋＤａの予測されたＭＷで移動した。ＰＧＮａｓｅによる脱グリコシル化は、〜３６ｋＤａのＭＷまでｂ鎖の移動をもたらし（完全な脱グリコシル化）、またはより高くまでｂ鎖の移動をもたらした（不完全な脱グリコシル化）。予想通り、グリコシル化していないａ１鎖およびａ２鎖において、移動は観察されなかった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、単離されたヒトホモ接合体ＨＰ１−１およびＨＰ２−２（両方とも未処理で、かつ、ＰＧＮａｓｅによる脱グリコシル化後）のクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）およびウエスタンブロット（ＷＢ）を示す。図２Ｂ：単離されたヒトホモ接合体ＨＰ１−１およびＨＰ２−２のＷＢ（両方とも未処理、かつ、ＰＧＮａｓｅによる脱グリコシル化後）を単一のゲル上で３通り行い、移動させ、その後、別々にポリクローナル抗Ｚｏｔ（左パネル）、モノクローナル抗ＨＰ（中央パネル）またはポリクローナル抗ＨＰ  Ａｂ（右パネル）を用いてＷＢ分析を行った。試験された３つのＡｂは、ａ１とａ２の両方の鎖（全てのパネル、レーン１および２）を認識し、その反応性のパターンは、ＨＰ１−１とＨＰ２−２の両方のタンパク質調製物の脱グリコシル化の後に変わらなかった（レーン３及び４）。反対に、脱グリコシル化は、抗ＨＰモノクローナル（中央パネル、レーン３および４）または抗ＨＰポリクローナルＡｂ（右パネル、レーン３及び４）のいずれかによって検出された、ＨＰ１−１とＨＰ２−２の両方におけるβ鎖の予期されたゲル移動度シフトを引き起こした。抗Ｚｏｔ  Ａｂと交差反応するゾヌリンは、ＨＰ２−２での過剰な〜４５ｋＤａのバンドを認識したが、ＨＰ１−１ででは認識せず、それは、脱グリコシル化の後移動しなかった（矢印）。ＭＳ／ＭＳ分析およびＮ末端配列決定によって、この〜４７ｋＤａのバンドは、プレＨＰ２（ｐｒｅ−ＨＰ２）であることが確認された。
【図３】図３は、ゾヌリンが、Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスにおいて、用量また時間に依存して、腸透過性を増加させたことを示す。ゾヌリンは、５、１０、２５及び５０μｇ／ウェルでC５７ＢＬ／６ＷＴの腸切片の腔側に適用された。トリプシン切断プレＨＰ２は、５０μｇ／ウェルで適用された。暴露の６０分後から始まり、濃度≧１０μｇ／ウェルで適用された時、ゾヌリンは、ＴＥＥＲの著しい低下を引き起こした（０．０３〜０．０３６の範囲のＰ値）。データは、４つの独立した実験からの平均値±ＳＥＭである。
【図４】図４のＡ−Ｄは、インビボでのマウスの胃腸の浸透性に対するゾヌリンの効果を示す。ゾヌリン（黒いバー）（１７０ｍｇ／マウス）は、ＢＳＡ処置コントロール（白いバー）と比較して、マウスの小腸（図４のＡ）と胃十二指腸（図４のＢ）の両方の浸透性を増加させる。ｌａｃｍａｎ比（小さなＩＰ）およびショ糖分画排泄率（胃十二指腸の浸透性）の差は、チャレンジの日の測定値とチャレンジの３日前の測定値との間の浸透性の変化の百分率として示される。成熟２重鎖ＨＰ２（ドットのあるバー）（１７０ｍｇ／マウス）は、小腸または胃十二指腸のいずれにおいても浸透性の変化を引き起こさなかった。小腸（図４のＣ）と胃十二指腸（図４のＤ）の両方の浸透性が、４８時間以内にチャレンジ前の値に戻ったので、ゾヌリンの効果は完全に可逆的であった。ｌａｃｍａｎまたはショ糖分画排泄率の差は、チャレンジの２日後の値とチャレンジの日の値との間の浸透性変化の百分率として示される。＊Ｌａｃｍａｎ  Ｐ＜０．００２４、ＢＳＡコントロールおよび２重鎖ＨＰ２の両方と比較した；＊ショ糖Ｐ＜０．００４９、ＢＳＡコントロールおよび２重鎖ＨＰ２（処置の各グループのｎ＝１０）の両方と比較した。
【図５Ａ】図５Ａは、ＥＧＦＲリン酸化に対するゾヌリンの効果を示す。図５Ａ：次第に増加する濃度でゾヌリンを、血清不足のＣａｃo−２細胞上でインキュベートした。細胞を溶解し、抗ＥＧＦＲ  Ａｂを使用して、免疫沈降し、抗ホスホＥＧＦＲ（ＰＹ  Ｐｌｕｓ）Ａｂを使用して、ＷＢのために処理した。等しい充填を保証するために、ブロットを取り除き、ＥＧＦＲに関して再検出した。ゾヌリンは、ＥＧＦＲリン酸化の用量に依存した増加を引き起こし、３ｍｌ／ｍｌで平坦に達した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＥＧＦＲリン酸化に対するゾヌリンの効果を示す。図５Ｂ：１０ｍｌ／ウェルのゾヌリンを、血清不足のＣａｃｏ−２細胞上で、単独で（レーン２）、または、５μＭのＥＧＦＲ選択的ＰＴＫインヒビターＡＧ１４７８  存在下において（レーン３）、インキュベートした。培地（レーン１）またはＡＧ１４７８単独（レーン４）に曝した細胞を、さらなるコントロールとして使用した。ゾヌリンは、ＰＴＫインヒビターＡＧ１４７８によって完全に無効にされたＥＧＦＲリン酸化の増加を引き起こした（ｎ＝３実験）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＥＧＦＲリン酸化に対するゾヌリンの効果を示す。図５Ｃ：ゾヌリン  １０ｍｇ／ｍｌを、単独または５μＭのＡＧ１４７８の存在下で、Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴの腸切片の腔側に１０μｇ／ウェルの濃度で適用し、ＴＥＥＲを基線（白いバー）およびインキュベーション９０分後（黒いバー）で測定した。ゾヌリンは、ＡＧ１４７８の存在によって妨げられたＴＥＥＲの著しい低下を引き起こした（各グループのｎ＝４マウス）。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＥＧＦＲリン酸化に対するゾヌリンの効果を示す。図５Ｄ：ゾヌリン誘発ＥＧＦＲリン酸化は、単鎖ゾヌリン（レーン２）と比較して、２重鎖成熟ＨＰ２（１０ｍｌ／ｍｌ）（レーン３）での処置の後に、顕著に減少した。レーン１は、培地だけで処理された細胞におけるリン酸化を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＥＧＦＲリン酸化およびＩＰに対するゾヌリンの効果を示す。図６Ａ：ＰＡＲ２が発現抑制されると、ゾヌリン誘発ＥＧＦＲリン酸化は減少した。ＰＡＲ２発現は、２つの異なるＰＡＲ２  ｓｉＲＮＡを使用して、Ｃａｃｏ−２において抑制された。その後、細胞はゾヌリン（１０ｍｇ／ｍｌ）または培地コントロールで処理され、溶解され、抗ＥＧＦＲ  Ａｂを使用して免疫沈降され、抗−ホスホ−ＥＧＦＲ  ＰＹ−ｐｌｕｓ  ＡｂでＷＢのために処理した。ゾヌリン媒介ＥＧＦＲリン酸化は、ＰＡＲ２サイレンシングによって妨げられた。等価なタンパク質充填および移動は、ＥＧＦＲのためのブロットを取り除き、再検出することによって確認された。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＥＧＦＲリン酸化およびＩＰに対するゾヌリンの効果を示す。図６Ｂ：ゾヌリンは、ＰＡＲ２−／−マウスにおいて、腸透過性を増加させなかった。Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴとＰＡＲ２−／−の両方のマウスからの小腸の切片を、マイクロスナップウェル（microsnapwell）システム上に固定し、３０分間、培地単独で、または精製された組み換え型ゾヌリン１０ｍｇに曝し、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、時間０（白いバー）およびインキュベーションの９０分後（黒いバー）にモニターした。野生型のマウスにおいて観察されたゾヌリンに誘発されたＴＥＥＲの低下は、ＰＡＲ２−／−マウスにおいて除去された（ablate）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の略語は、本明細書において使用され得る。Ａｂ：抗体；ＥＧＦＲ：上皮成長因子受容体；ＨＰ：ハプトグロビン；ＩＰ：腸透過性；ＰＡＲ：プロテイナーゼ活性化受容体；ＴＪ：タイトジャンクション；ＷＢ：ウェスタンブロット；ＣＤ：セリアック病。
【００２０】
本明細書において使用されるように、用語「１つの（”a”又は”an”）」は、請求項及び／又は明細書において用語「含む（”comprising”）」と共に使用される時、「１」を指すことがあるが、それは、「１以上」、「少なくとも１」および「１または１以上」の意味とも一致している。本発明の幾つか実施形態は、本発明の１つ以上の要素、方法の工程、及び／又は方法からなる、または本質的になり得る。本明細書に記載の任意のデバイス、化合物、組成物、または方法は、本明細書に記載の任意の他のデバイス、化合物、組成物または方法に関して実行し得ることが予期される。
【００２１】
本明細書において使用されるように、本開示は代替物および「及び／又は」のみを指す定義をサポートするが、代替物のみを指すと意図されていなければ、または代替物が相互に排他的でなければ、請求項における用語「または（”or”）」は、「及び／又は」を指す。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「接触させる（”contacting”）」は、１以上の他の治療薬を含む、または治療薬を含まない、本明細書に記載の１以上の化合物を、１以上の細胞と接触させる任意の適切な方法を指す。インビボでの適用については、本明細書に記載されているように、投与の任意の既知の方法が適切である。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「有効な量”effective amount”」、「薬理学的に有効な量”pharmacologically effective amount”」または「治療上有効な量”therapuetically effective amount”」は、交換可能であり、インビトロにおいて細胞に対して効果または改善を引き起こす量を指す。当業者は、有効な量は、患者または被験体の状態を改善し得るが、完全な治療ではないことがあることを理解する。
【００２４】
本明細書に使用されるように、用語「被験体」は、処置の任意の対象を指す。
【００２５】
従って、本発明は、減少した細胞透過性に繋がる経上皮電気抵抗を増加させる工程を含む、自己免疫疾患を処置する方法に向けられる。この方法は、減少した細胞透過性が望まれる任意の自己免疫疾患に適用可能である。代表的な細胞としては、限定されないが、小腸細胞または胃十二指腸細胞が挙げられる。１つの態様において、そのような細胞は、ゾヌリン  ｍＲＮＡの減少した表現型を有する。関連する態様において、この方法は、上皮成長因子受容体を阻害する工程をさらに含む。当業者は、この方法において使用するための上皮成長因子受容体を阻害する既知の技術を容易に認識する。好ましい実施形態において、上皮成長因子受容体は、単鎖ゾヌリンに対して向けられた抗体を投与することによって阻害される。別の関連する態様において、この方法は、ＰＡＲ２を阻害する工程をさらに含む。当業者は、ＰＡＲ２を阻害するための既知の技術を容易に認識する。
【００２６】
本発明のこの方法の好ましい実施形態において、ＰＡＲ２は、単鎖ゾヌリンに対する抗体を用いて、またはｓｉＲＮＡを用いて阻害される。別の関連する態様において、この方法は、ＣＸＣＲ３受容体結合を介してグリアジンによってゾヌリン放出を避ける工程をさらに含む。本発明のこの方法を使用して処置して得る代表的な自己免疫疾患は、限定されないが、T１D、全身性エリテマトーデス、セリアック病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病および統合失調症を含む。
【００２７】
本発明は、さらに、治療を必要とする個体において自己免疫疾患を処置する方法に向けられ、その方法は、上皮成長因子受容体を阻害する工程；およびＰＡＲ２を阻害する工程を含む。この方法を使用して、経上皮電気抵抗が増加され、細胞透過性の減少に繋がる。細胞透過性は、限定されないが、小腸細胞または胃十二指腸細胞を含む、任意の細胞において減少され得る。典型的には、このような細胞は、ゾヌリンｍＲＮＡの減少した発現を示す。上皮成長因子受容体およびＰＡＲ２は、上に記述されるように阻害され得る。さらなる態様において、この方法は、抗グリアジン抗体を含む、当業者に既知の任意の技術を使用して、グリアジンを阻害する工程をさらに含む。本発明のこの方法を使用して処置され得る代表的な疾患は、限定されないが、T１D、全身性エリテマトーデス、セリアック病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病および統合失調症のような自己免疫疾患を含む。
【００２８】
本発明は、処置を必要とする個体においてセリアック病を処置する方法に向けられ、単鎖ゾヌリンに対する抗体を投与し、それによって、上皮成長因子受容体を阻害、またはＰＡＲ２を阻害する工程を含む。本発明のこの方法を使用して、経上皮電気抵抗は増加し、細胞透過性の減少に繋がる。代表的な細胞としては、小腸細胞または胃十二指腸細胞が挙げられるが、この方法は多くの細胞タイプに役立ち得る。この方法の関連する態様において、ＰＡＲ２は、ｓｉＲＮＡを使用してさらに阻害される。加えて、この方法は、グリアジンを阻害する工程をさらに含み得る。
【００２９】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で挙げられ、いかなる様式においても本発明を制限することを意図しない。
【００３０】
増加した腸透過性（ＩＰ）は、炎症性、アレルギー性、および自己免疫性疾患の病原論における共通の発症機序として現れる。可逆的に腸透過性を調節すると知られている唯一の生理学的メディエータであるゾヌリンの特徴付けは、捉え難いままであった。ヒト血清のプロテオーム解析を介して、本発明はヒトゾヌリンをハプトグロビン−２に対する前駆体（ｐｒｅ−ＨＰ２）として同定した。成熟ＨＰがその酸化活性を抑制するように遊離ヘモグロビンを除去することが知られているが、機能はその切断されない（uncleaved）前駆体型にいまだ帰着されていない。本発明は、単鎖ゾヌリンが、プロテイナーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）２活性化を介するＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）のトランスアクチベーションに繋がる、ＥＧＦ様モチーフを包含することを示す。これらの２つの受容体の活性化は、腸透過性の増加に結びついた。ＰＡＲ２のｓｉＲＮＡ誘発サイレンシング、またはＰＡＲ２−／−マウスの使用は、バリアの完全性（barrier integrity）の喪失を防いだ。そのａ２とｂのサブユニットのへのゾヌリンのタンパク質切断は、ＥＧＦＲを活性化するその能力と、腸透過性を増加させるその能力の両方を弱めた。量的な遺伝子発現は、セリアック病の被験体の腸管粘膜においてゾヌリンが過剰発現していることを明らかにした。これは、その前駆体型において、その成熟形態の機能とは異なる生物活性を発揮する分子の最初の例である。従って、これらの結果は、ゾヌリンを、治療的介入のために標的とされ得るヒトの免疫媒介性疾患の病原論に関連する主要なシグナロソームに関与する、新しいリガンドであると特徴付ける。
【実施例】
【００３１】
＜実施例１＞
＜ヒト血清サンプル＞
健康なボランティアとＣＤボランティアの両方からのヒト血清を、Ｃｅｄｉａｃ  Ｒｅｓｅａｃｈ血清バンクのためのセンターから得た。サンプルは全て、市販のキット（ぞれぞれ、Ｅｎｃｈａｎｔ（商標）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｋｉｔ；  Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ, Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ, ＭＩ, ＵＳＡ）およびＩｇＧ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｐｌｕｓ （ＰＩＥＲＣＥ, Ｒｏｃｋｆｏｒｄ, ＩＬ, ＵＳＡ）を使用してアルブミンとＩｇＧをそれぞれ取り除いた。アルブミンとＩｇＧを取り除いた血清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、２−Ｄ電気泳動およびＷＢ分析によって分析した。
【００３２】
＜実施例２＞
＜ヒトハプトグロビン＞
ヒト血漿から抽出されたＨＰ１−１およびＨＰ２−２を、Ｓｉｇｍａ （Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ, ＵＳＡ）から購入した。ＨＰ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、一次元と二次元の両方のゲル電気泳動ＷＢ、および質量分析を行った。ＨＰ脱グリコシル化は、メーカーの取扱説明書（Ｓｉｇｍａ, Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ, ＵＳＡ）に従って、Ｎ−グリコシダーゼF（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）の添加によって行った。
【００３３】
＜実施例3＞
＜ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびＷＢ分析＞
アルブミンとＩｇＧを取り除いた血清（ウェルにつき５０ｍｇ）、ヒトＨＰ１−１（ウェルにつき１ｍｇ）およびヒトＨＰ２−２（ウェルにつき１ｍｇ）を、それぞれ１８％又は１２％のＳＤＳ／ＰＡＧＥ  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に関して変性条件下と非変性条件下の両方でＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析した。変性条件は、サンプルへの３０ｍＬのＬａｅｍｍｌｉバッファーの添加を必要とし、その後ＳＤＳ／ＰＡＧＥの前に５分間の沸騰工程を行った。タンパク質を、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、またはＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移動し、５ｍｇ／ｍＬのアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗Ｚｏｔ  ＩｇＧ  Ａｂ（これは、以前にＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＩｇＧ（プロテインＡ）精製キット（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて精製されたヒトゾヌリンと交差反応することを示した（1））で、若しくは２ｍｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗ヒトＨＰ（Ｓｉｇｍａ）または１ｍｇ／ｍＬのラビットポリクローナル抗ヒトＨＰ（Ｓｉｇｍａ）で、主要なＡｂとして調べた。ＨＲＰ標識化ポリクローナル抗ウサギＩｇＧ（１：５，０００；Ａｍｅｒｓｈａｍ）または抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００；Ｓｉｇｍａ）を、第２のＡｂとして使用した。バンドをＥＣＬ  Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。
【００３４】
＜実施例４＞
＜２−ＤＥ分析および２−ＤＥ  ＷＢ＞
２−ＤＥをＺＯＯＭ  ＩＰＧＲｕｎｎｅｒシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。簡潔に言うと、アルブミンとＩｇＧを取り除いた血清を、尿素、洗浄剤、還元剤、両性電解質溶液および色素を含む市販のサンプル再水和バッファー（ＲｅａｄｙＰｒｅｐ Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ／Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ； Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に、１：２の比率で加え、ＺＯＯＭ ＳＴＲＩＰ ｐＨ ５．３−６．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温（ＲＴ）で１時間再水和した。その後、ストリップを、ＺＯＯＭ ＩＰＧＲｕｎｎｅｒ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填し、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行なった。サンプルを分留するために、２０分間２００Ｖ、１５分間４５０Ｖ、１５分間７５０Ｖ、および１０５分間２，０００ＶのＩＥＦステップ電圧プロトコルを使用した。ＩＥＦの後、２−ＤＥ ＳＤＳ／ＰＡＧＥの前に、ストリップを、ＮｕＰＡＧＥサンプル還元剤を含む、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１５分平衡化し、新鮮なさらなるヨードアセトアミド（１２５ ｍＭ; ＢｉｏＲａｄ）を含むＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバファー中で１５分間アルキル化した。２−ＤＥ ＳＤＳ／ＰＡＧＥを、固定したｐＨ勾配ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてＮｕＮｏｖｅｘ  ４−２０％のＴｒｉｓ−ＧｌｙｃｉｎｅＺＯＯＭＧｅｌ（１．０ｍｍ）使用して行った。タンパク質バンドをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって視覚化した。タンパク質バンドを、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移し、アフィニティー精製した［Ｉｍｍｕｎｏ−Ｐｕｒｅ ＩｇＧ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ； ＰＩＥＲＣＥ］ラビットのポリクローナルゾヌリンに交差結合する抗Ｚｏｔ  ＩｇＧ（５ｍ ｇ／ｍＬ）を主要なＡｂとして、および抗ラビットＩｇＧ（ＥＣＬ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ, ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を第２のＡｂとして調べた。ＰＶＤＦ膜をＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で曝した後に、フィルムを展開した。
【００３５】
＜実施例５＞
＜ＭＳ分析＞
タンパク質バンドのためのゲル・トリプシン消化において、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ又は２−ＤＥから取ったＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅで前染色したゲルバンド上で同定を行い、ＭＳ／ＭＳによって分析し、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｅｎｔｅｒ, Ｓｔａｎｆｏｒｄ, ＣＡ）で、タンパク質配列／質量マッピング設備を使用して、タンパク質を同定した。
【００３６】
＜実施例６＞
＜昆虫細胞におけるゾヌリン／プレＨＰ２の発現＞
ＨＰ２をエンコードするヒト完全長ｃＤＮＡクローンを、ＯｒｉＧｅｎｅ（ＴＣ１１６９５４；受入番号ＮＭ＿００５１４３；ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から購入した。C末端に６ｘＨｉｓタグを有する、ＷＴヒトゾヌリンｃＤＮＡを含む組み換え型バキュロウィルスを、メーカーのプロトコルによってｐＤＥＳＴ８およびＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウィルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して構築した。その後、ゾヌリンを、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、組み換えを介してｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターをｐＤＥＳＴ８の中へ移入した。バクミドＤＮＡを載せたＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ１０Ｂａｃ細胞を、ｐＤＥＳＴ８−ゾヌリンで形質転換した。組み換え型バクミドをＤＨ１０Ｂａｃ細胞から単離し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇＩＰｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞へトランスフェクトし、組み換え型バキュロウィルスを作製した。Ｓｆ９細胞をゾヌリンタンパク質の発現のために使用した。ゾヌリンのタンパク質発現のために、Ｓｆ９細胞（３×１０７）を、ＳＦＭ−９００ＩＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で懸濁フラスコにおいて２７℃で育てた。細胞を、感染多重度３で組み換え型バキュロウィルスによって感染した。感染の７２時間後、Ｓｆ９細胞を、２，０００ｘｇで１０分間遠心分離して集めた。ゾヌリンの精製のために、リン酸バッファー（ｐＨ７．５）およびＮａＣｌを、それぞれ、終末濃度２０ｍＭおよび０．５Ｍまで調整培地に加えた（２）。その溶液を、Ｎｉ２＋で充填されたキレートセファロース（Ｈｉｓ−バンド樹脂；Ｎｏｖａｇｅｎ）カラムに適用し、その後、２００ｍＭのイミダゾールで溶出し、ＰＢＳへ透析し分離した。精製したヒトゾヌリンを等分し、使用まで−８０℃で貯蔵した。
【００３７】
＜実施例７＞
＜マイクロスナップウェルシステムによるエキソビボＩＰ研究＞
エキソビボの腸透過性に対するゾヌリン／プレＨＰ２の効果を、（３）に記述されたように、マイクロスナップウェル（Microsnapwell）システムでモニターした。簡潔に言うと、C５７ＢＬ／６ＷＴマウスからの小腸の切片をマイクロスナップウェルシステム上に固定し、それらの腔側を、培地単独に、または精製した組み換え型ゾヌリンを次第に増加する濃度で含む培地に３０分曝した。ＴＥＥＲを、平面電極（Ｅｎｄｏｈｍ ＳＮＡＰ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ａｎ Ｅｖｏｍ−Ｇ ＷＰＩ ａｎａｌｙｚｅｒ； Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用し、２時間の間、時間０から３０分の間隔で測定し、正規化の後、Ω／ｃｍ２で表わした。ＴＥＥＲマイクロスナップウェル実験は全て、マウス小腸上で、基線ＴＥＥＲ値７７．９±３．５Ω／ｃｍ２で行った（ｎ＝２３）。選択された実験において、ＴＥＥＲに対するゾヌリンの効果を、基本条件下と、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８で前処理した後の両方でモニターした。別のセットの実験において、ゾヌリンをＣ５７ＢＬ／６  ＷＴとＰＡＲ２−／−マウスの両方においてテストした。
【００３８】
＜実施例８＞
＜インビボＩＰ＞
１２９／ＳｖＥｖ  ＷＴマウスを、３０匹のマウスの３つの群へ無作為化した。それらは、３時間断食させ、砂糖プローブで強制栄養し、１週間に２回代謝ケージに入れることによって、３週間の間実験技術に順応させた。タンパク質チャレンジの日に、動物に、６０ｍLの溶液中の精製した単鎖ゾヌリン１７０ｍｇ、または同量の精製した二重鎖切断ＨＰ２のいずれかを、（４）に記載されるように、砂糖の強制栄養と共に与えた。マウスを代謝ケージに入れ、その後の２２時間の間、自由に飲料水を与え；この時間の間、それらの尿を集め、その後、マウスを従来のケージに戻した。薬のチャレンジの日の２日後に、マウスを代謝ケージに入れ、処理からのそれらの回復を測定した。
【００３９】
＜実施例９＞
＜ＲＮＡ干渉によるＰＡＲ２のノックダウン＞
Ｃａｃｏ−２細胞におけるＰＡＲ２発現を、２つの異なるＰＡＲ２  ｓｉＲＮＡ［ＨＳＳ１０３４７１およびＨＳＳ１０３４７３（各５０ｎＭ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を用いて抑制した。細胞を、製造者の取扱説明書に従って、５％ＦＣＳの存在下で２４時間、１０ｃｍのプレートにおいて、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて、ＰＡＲ２  ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトした。ＰＡＲ２ノックダウン効率を、ＷＢとリアルタイムＰＣＲ分析の両方によって確認した。
【００４０】
＜実施例１０＞
＜腸の生検からの総ＲＮＡ抽出＞
総ＲＮＡを、ＴＲｉｚｏｌ  ＲＮＡ精製プロトコルを使用して抽出した。簡潔に言うと、腸組織標本をそれぞれ、ＰｏｌｙｔｒｏｎパワーホモジナイザーＰＴ  ３１００（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ  ＡＧ）を使用して、ＴＲｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬ中で均質化した。ＲＮＡを、クロロホルム０．２ｍＬを加えることにより抽出した。１５秒間、手でチューブを激しく振った後に、サンプルをＲＴで５分間インキュベートし、4℃で１５分間、１５，０００ｘｇで遠心分離機にかけた（Ｍａｒａｔｈｏｎ ２１０００Ｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ； Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＲＮＡに富んだ水相を別のチューブに移した後に、ＲＮＡを、最初の均質化に使用したＴＲｉｚｏｌ試薬１ｍＬ当たり０．５ｍＬのイソプロピルアルコールを加えることにより沈殿させた。サンプルをＲＴで１０分間インキュベートし、４℃で１０分間１５，０００ｘｇで遠心分離にかけた。上清を取り除いた後、ＲＮＡペレットを、最初の均質化に使用したＴＲｉｚｏｌ試薬１ｍＬ当たり少なくとも１ｍＬの７５％エタノールを加えて、７５％の氷冷エタノールで一度洗浄した。ペレットを２分未満で空気乾燥し、２０ｍＬのＲｎａｓｅの入っていない水に溶かし、−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡ濃度を、分光光度計（ＤＵ５３０、ＵＶ/ｖｉｓ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって２６０ｎｍで読んだ。各サンプルに関して、２６０：２８０の比率を決定した。
【００４１】
＜実施例１１＞
＜ｃＤＮＡ合成＞
総ＲＮＡの２マイクログラムを、製造者の取扱説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔで逆転写した。
【００４２】
＜実施例１２＞
＜ヒト腸生検におけるＨＰのＰＣＲ増幅＞
ｃＤＮＡのアリコートを、以下のプライマー対を使用して、ＨＰ２に特異的なフラグメントのＰＣＲのために使用した。それは、異なるエキソンをカバーすることを特に設計した：順方向プライマー（エキソン５）５’−ＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＡＣＴＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および逆方向プライマー（エキソン７）５’−ＴＡＣＡＧＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＴＧＴＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。０．１ｍｇのｃＤＮＡ、２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘ、０．５ｍＭの各プライマー、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および１：１０容量の１０ｍｌのＰＣＲ標準バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、ＰＣＲを行った。ＰＣＲをサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において実行した。９４℃での変性の最初の１分後に、９４℃で３０秒（変性）、５８℃で３０秒（アニーリング）、および７２℃で３０秒（伸長）を含む３０サイクルを完了し、その後、７２℃で１０分最終伸長を行った。その後、ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色し、ゲルから取り除き、ゲルバンド精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製し、３７３０ｘｌＤＮＡアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって配列した。
【００４３】
＜実施例１３＞
＜ＴａｑＭａｎ手順によるリアルタイムＰＣＲ＞
リアルタイムＰＣＲを、ＨＰ２−２またはＨＰ２−１のみの表現型の被験体からのｃＤＮＡ上で行い、およびＨＰ２特異的遺伝子プライマーおよびプローブ（ｐｒｏｄｕｃｔ ＩＤ： Ｈｓ００９７８３７７＿ｍ１）およびハウスキーピング  １８Ｓ（ｐｒｏｄｕｃｔ ＩＤ： Ｈｓ９９９９９９０１＿Ｓ１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。反応を、ＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｒｏｃｈｅによって製造）で行い、７５００Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行した。反応はすべて繰り返して行った。相対的な形質発現を、ハウスキーピング遺伝子として１８Ｓを用いる相対的なＣｔ方法を使用して計算した。１８Ｓ  ｍＲＮＡへの正規化の後に非ＣＤコントロールにおけるゾヌリンｍＲＮＡ発現と比較して、活性なＣＤ患者およびＧＦＤ食事療法をしているＣＤ患者において、ゾヌリンｍＲＮＡ発現の倍の変化が記録された。
【００４４】
＜実施例１４＞
＜バキュロウィルス発現系におけるヒトゾヌリン−プレＨＰ２クローニングおよび発現、並びにプロテアーゼによるその切断＞
バキュロウィルス系を使用する組み換え型ゾヌリン／プレＨＰ２タンパク質産生とその精製は、上に記載される。精製した単鎖ゾヌリンを、示されたセリンプロテアーゼを使用してタンパク質切断し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶解し、その後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で染色した。２重鎖ＨＰ２の生成のために、単鎖ゾヌリンを、２５℃で２０分間、トリプシンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−１７６３）に曝した。ビーズを遠心分離によって除去し、トリプシンの除去の有効性を、基質Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対するトリプシンペプチダーゼ活性のアッセイによって確認した。
【００４５】
＜実施例１５＞
＜エキソビボおよびインビボのＩＰ研究＞
エキソビボおよびインビボの腸透過性に対するゾヌリンの効果を、（８、１４）に記載のように、および上に報告したように、行った。ゾヌリンがＥＧＦＲを活性化することができるかどうかを測定するために、次第に濃度を増加させたゾヌリンまたは２重鎖の成熟ＨＰ２のいずれかを、血清不足の、高ＥＧＦＲ発現のＣａｃｏ−２細胞に、次第に増加した暴露時間の間加えた。（４０）に報告されたように、細胞を溶解し、抗ホスホＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）Ａｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｉｎｃ．）によってＷＢのために処理した。５μＭの選択的ＰＴＫインヒビターＡＧ１４７８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）の存在下で実験を繰り返した。
【００４６】
＜実施例１６＞
＜セリアック病（ＣＤ）患者および非ＣＤ患者からの腸組織からのゾヌリン遺伝子配列解明および定量化＞
診断的上部胃腸（ＧＩ）内視鏡検査を受ける被験体からの十二指腸の第２部／第３部から小腸粘膜のサンプルを得た。含まれる被験体は、１０人の健常なコントロール、診断で活性ＣＤを有する７人の患者、少なくとも６カ月の間グルテンを含まない食事療法で処置したＣＤを有する３人の患者である。患者は全て、その手順に対する臨床上の適応を有しており、この研究の目的のためにさらなる生検を受けるための説明と同意を与えた。この研究プロトコルは、メリーランド大学の倫理委員会によって承認された。小腸生検を、ＲＮＡｌａｔｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）に直ちに集め、処理するまで−２０℃で貯蔵した。総ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲは上に記述される。
【００４７】
値はすべて平均±ＳＥ（標準誤差）として表わされる。対になった変異体または対がない変異体に関して２つの群間の違いをテストするために、違いの分析を両側スチューデントｔ検定によって行った。適切なところで、多変量解析を行った。Ｐ値≦／０．０５を有意と捉えた。
【００４８】
＜実施例１７＞
＜ＣＤヒト血清からのゾヌリンの特徴付け＞
ゾヌリンが、ゾヌリンと交差反応する抗Ｚｏｔ  Ａｂ（Ａｂ）−ＥＬＩＳＡ（７−１０）によってヒト血清に検出され、正常なコントロールと比較してＣＤを有する患者において増加する（１０）ので、ウエスタン分析が、ＣＤ被験体からのアルブミンとＩｇＧを取り除いた血清中のタンパク質のゾヌリン免疫反応性を検出するために当初使用された。これらの血清は、１８および９ｋＤａの明白な分子量を有する２本の主要タンパク質バンドを示した（図１）。反応性の３つの特徴的パターンがＣＤ血清において確認された：１８ｋＤａのタンパク質バンド（図1、レーン1）、９ｋＤａのタンパク質バンド（図１、レーン２）および９および１８ｋＤａのタンパク質バンド（図1、レーン３）。注目すべきは、〜４５ｋＤａのバンドは、１つの１８ｋＤａバンドを表示した血清にのみ検出されたが（図１、レーン１）、９ｋＤａのバンドまたは両方のバンドのいずれかで血清中に検出されなかった（図１、レーン２および３）。１８ｋＤａのバンドを発現したＣＤ患者からの血清の２次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）は、ＭＳ／ＭＳ質量分析を受けやすい２つのゾヌリン免疫反応性スポットを明らかにした。１８ｋＤａスポットをＨＰ２のａ２鎖として同定し（受入番号  ＧＩ：２２３９７６）、および９ｋＤａスポットをＨＰ1のａ１鎖として同定した（受入番号  ＧＩ：３３３７３９０）。ＣＤ患者から１４の血清の不作為のスクリーニングによって、７％がＨＰ1ホモ接合体で、５７％がＨＰ1／ＨＰ２ヘテロ接合で、および３６％がＨＰ２ホモ接合体であることが明らかになった。
【００４９】
＜実施例１８＞
＜ヒトＨＰ調製物からのゾヌリンの特徴付け＞
ヒトＣＤ血清中のポリクローナルゾヌリンと交差反応する抗Ｚｏｔ ＩｇＧ Ａｂによって認識された免疫反応性バンドの同一性を確認するために、ＨＰ1（ＨＰ１−１）かＨＰ２（ＨＰ２−２）のいずれかのための被験体のホモ接合体からのヒトＨＰの市販の精製した調製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単一のゲル上で同時に溶解し、クマシー染色によって分析した（図２Ａ）。予想通りに、ＨＰ１−１のａ１鎖は、〜９ｋＤａのＭＷを示し（図２Ａ、レーン１）、一方、ＨＰ２−２のａ２鎖は、〜１８ｋＤａであった（図２Ａ、レーン２）。そのグリコシル化により、ｂ鎖は、ＨＰ１−１とＨＰ２−２の調製物の両方において、〜５２ｋＤａのＭＷを示した（図２Ａ、レーン１及び２）。Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＧＮａｓｅ  Ｆ）での３時間の脱グリコシル化反応の後、ＨＰ１−１とＨＰ２−２の両方のｂ鎖は、おそらく脱グリコシル化のさまざまな程度に起因して、５２ｋＤａより下の複数のバンドとして流れた（図２Ａ、レーン３および４）。予想されたように、グリコシダーゼ処理の後、ＨＰ１−１のａ１鎖（図２Ａ、レーン１および３を比較）か、ＨＰ２−２のａ２鎖（図２Ａ、レーン２および４を比較）のいずれかに関するゲル移動に何の変化もないことは明白だった。
【００５０】
図２Ｂは、脱グリコシル化の前と後の両方の、市販の精製されたホモ接合体のＨＰ１−１およびＨＰ２−２タンパク質の免疫ブロットを示す。タンパク質を、単一のゲル上で同時に流し、ポリクローナルゾヌリンと交差反応する抗Ｚｏｔ  Ａｂ（図２Ｂ、左パネル）、モノクローナル抗グリコシル化ｂ鎖ＨＰ（図２Ｂ、中央パネル）またはポリクローナル抗ＨＰ  Ａｂ（図２Ｂ、右パネル）で免疫ブロットした。抗Ｚｏｔ  Ａｂは、ＨＰ１−１  ａ１鎖およびＨＰ２−２  ａ２鎖の両方と強く反応し、ＨＰ２−２調製物に存在する〜４５ｋＤａでさらなるバンドを明らかにしたが、ＨＰ１−１調製物においては明らかにしなかった（図２Ｂ、左パネル、ぞれぞれ、レーン２および１）。予想通りに、〜５２ｋＤａのＨＰ  ｂグリコシル化サブユニットに対して産生された、モノクローナル抗ＨＰ抗体は、ＨＰ１−１かＨＰ２−２のいずれかのｂ鎖のみを認識し（図２Ｂ、中央パネル、それぞれレーン１及び２）、一方、ポリクローナル抗ＨＰＡｂは、ＨＰ１−１とＨＰ２−２の両方のa１鎖、ａ２鎖およびｂ鎖のエピトープを認識した（図２Ｂ、右パネル、それぞれレーン１及び２）。図２Ｂはまた、同じ３つのＡｂを使用する脱グリコシル化の後、免疫ブロットされたＨＰ１−１およびＨＰ２−２調製物を示す。グリコシル化しない９ｋＤａのａ１、および１８ｋＤａのａ２のサブユニットに関してテストした３つのＡｂの反応パターンは、脱グリコシル化の後に変化しなかった（図２Ｂ、全ての３枚のパネル、それぞれレーン３および４）。しかしながら、脱グリコシル化は、ＨＰ１−１とＨＰ２−２の両方においてβ鎖の予期されたゲル移動度シフトを引き起こした。モノクローナル抗ＨＰＡｂ（図２Ｂ、中央パネル、レーン３及び４）は、２つの不完全な脱グリコシル化β鎖バンドのみを認識し、一方、ポリクローナル抗ＨＰ  Ａｂは、完全に脱グリコシル化された〜３６ｋＤａのβ鎖も認識した（図２Ｂ、右パネル、レーン３及び４）。ＨＰ２−２調製物の中にのみ存在し、抗Ｚｏｔ  Ａｂによって認識された４５ｋＤａのバンドは、脱グリコシル時のゲル移動度に何の変化も示さなかったが、それはより弱く見えた（図２Ｂ、左パネル、レーン４）。異なる時に分析された２つの別個のサンプル上で行なわれた、この４５ｋＤａのタンパク質バンドのＭＳ／ＭＳの分析およびＮＨ２末端配列決定は、このタンパク質をヒトＨＰ２前駆体（プレＨＰ２、受入番号  Ｐ００７３８）として同定した。組み合わせたＭＳ／ＭＳ分析は、合計４９．８％の重複しないタンパク質、およびタンパク質配列全体に及ぶ１３の独特なペプチドにわたった。従って、ａ１鎖およびａ２鎖に加えて、抗Ｚｏｔ  Ａｂは、切断されていない単鎖プレＨＰ２を認識するが、ｂ鎖を認識しない。
【００５１】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡによって血清ゾヌリンを測定するために使用される抗Ｚｏｔ  Ａｂは、おそらく、プレＨＰ２と同様に、非常に豊富なＨＰ1およびＨＰ２タンパク質を検出することを示唆する。しかしながら、ＥＬＩＳＡによって検出された血清ゾヌリンの量はｎｇ／ｍｌの範囲である（１１）一方、血清中の総ＨＰプールは、ｍｇ／ｍｌの範囲である（１２）。この明白な不一致に取り組むために、ヒト血清と精製されたＨＰの両方のＷＢ分析を、抗Ｚｏｔ  Ａｂを使用して非変性条件下で繰り返した。ＷＢは、ＨＰ２−２表現型において、および商業的に精製されたＨＰ２−２において、一連のバンドを示し、ＨＰ１−１表現型血清においても、商業的に精製されたＨＰ２−２においても、バンドは検出されなかった。反対に、抗ＨＰポリクローナルＡｂ（それは切断されていないプレＨＰ２を認識しなかった）は、商業上精製されたＨＰ１−１およびＨＰ２−２調製物の両方においてバンドを検出した。組み合わせると、これらのデータは、非変性条件のもと、抗Ｚｏｔ  Ａｂは、単鎖プレＨＰ２のみを検出するが、２重鎖の成熟ＨＰは検出しないことを示唆し、さらに、単鎖プレＨＰ２が、ゾヌリン分子に相当するが、その切断された２重鎖の成熟形態は相当しない、ということを支持する。
【００５２】
＜実施例１９＞
＜組み換え型ゾヌリンの機能分析＞
哺乳動物のＨＰ２  ｍＲＮＡ転写の主要な翻訳産物は、同時翻訳で二量化し、小胞体にある間、セリンプロテアーゼ、Ｃｒ１ＬＰによってタンパク質分解で切断されるポリペプチドである（１３）。反対に、ゾヌリンは、ヒト血清において、切断されていないプレＨＰ２として検出可能である（上記参照）。切断された成熟２重鎖ＨＰ２ではなく、単鎖プレＨＰ２としてゾヌリンの同一性を確認するために、組み換え型プレＨＰ２を、昆虫細胞ベクターにプレＨＰ２ｃＤＮＡを挿入することにより発現させ、バキュロウィルス発現系を使用して、それを発現させた。図２Ｂと同様に抗ＺｏｔポリクローナルＡｂによって認識され、およびC末端で加えられた６ｘＨｉｓタグによって〜５３ｋＤａの明白なＭＷで移動する、高度に精製された組み換えプレＨＰ２を得た。その後、単鎖プレＨＰ２を一連のセリンプロテアーゼを用いてタンパク質分解の切断を受けさせた。マトリプターゼ、ウロキナーゼ、トロンビンおよび血漿カリクレインは、プレＨＰ２を切断しなかったが、一方、プラスミンは、タンパク質の完全な分解を引き起こした。対照的に、腸のセリンプロテアーゼトリプシンによる処理は、ゾヌリンのａ２とｂのサブユニットに一致する分子量で移動する２つの主要なバンドの外観に繋がった。これらの２本のバンドのＮＨ２末端配列決定は、２つのタンパク質が、予測されたＡｒｇ１６１切断部位で切断されたプレＨ２  ａ２鎖およびｂ鎖と同一であることを示した。トリプシン消化の後に得られた、完全な単鎖プレＨＰ２および切断された２重鎖の成熟ＨＰ２を両方とも、以下の研究において生物活性に関してテストした。
【００５３】
＜実施例２０＞
＜マイクロスナップウェルシステムに固定されたマウス小腸におけるＴＥＥＲに対する組み換え型ゾヌリンのエキソビボの効果＞
組み換え型プレＨＰ２（以下、ゾヌリンとして定義される）を、マイクロスナップウェルに固定したＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（murine）の小腸の切片に適用した。濃度≧４０μｇ／ｍｌで適用した時、マウス腸切片の粘膜（管腔）側に加えられた組み換え型単鎖ゾヌリンは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を減少させた、すなわち、浸透性を増加させた（図３）。対照的に、トリプシン切断された２重鎖ＨＰ２をテストすると、一致したＴＥＥＲの変化は検出されなかった（図３）。
【００５４】
＜実施例２１＞
＜マウスの胃腸の浸透性に対する組み換え型ゾヌリンのインビボの影響＞
ゾヌリンがインビボで腸透過性を変更することがあるかどうかを確証するために、マウスを、単鎖組み換え型プレＨＰ２タンパク質（１７０ｍｇ／マウス）で強制栄養し、胃十二指腸と小腸の透過性を、（１４）に記述されたように、特定の砂糖プローブ（それぞれ、ショ糖およびラクツロース／マンニトール）を使用してテストした。ゾヌリン／プレＨＰ２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）処理コントロールと比較して、小腸の透過性（図４Ａ）と胃十二指腸の透過性（図４Ｂ）との両方を増加させた。胃十二指腸の透過性と小腸の透過性の各々は、ゾヌリン／プレＨＰ２への接触に続いて、４８時間以内に基線に戻った（図４Ｃ及び４Ｄ）。
【００５５】
２重鎖の成熟ＨＰ２がＩＰに影響を与えるか否かを測定するために、上記のインビボの実験を、２重鎖のタンパク質分解で切断されたタンパク質を投与することによって繰り返した。単鎖ゾヌリンとは対照的に、２重鎖のＨＰ２（１７０ｍｇ／マウス）は、ＢＳＡ処理コントロールと比較して、胃十二指腸の浸透性も小腸の透過性もいずれも変更しなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。組み合わると、これらのデータは、単鎖ゾヌリンが、ゾヌリンに関して報告された、可逆的な浸透活性を保持するが、タンパク質分解による切断で生成されたその２重鎖の成熟ＨＰ２形態では保持しないことを示す。
【００５６】
＜実施例２２＞
＜ヒト腸粘膜におけるゾヌリンｍＲＮＡ発現および定量化＞
特定のプライマーおよびゾヌリン陽性の被験体からのヒトの腸生検のｃＤＮＡを用いて、６８６ｂｐのフラグメントを増幅し、その１４４ｂｐは、５４２ｂｐをＨＰ１とＨＰ２の両方の遺伝子のａ鎖に属し、５４２ｂｐは、ＨＰ１とＨＰ２の両方の遺伝子のｂ鎖に属する。このフラグメントを配列決定することによって、ＨＰとしてのその同一性を確認したが、増幅した領域の共通配列のため、ＨＰ１をＨＰ２から区別することはできなかった。これを克服し、ヒトの腸におけるゾヌリン遺伝子の発現を特に定量するために、健常人（ｎ＝１０）、ＣＤ患者（急性期の疾患（ｎ＝７））、およびグルテンを含まない食事療法（ＧＦＤ）に続く寛解期の疾患のＣＤ患者（ｎ＝３）の腸粘膜から得たｃＤＮAを、プライマーおよびａ２鎖に特異的なプローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって分析した。健常人と比較して、ゾヌリンｍＲＮＡ発現は、活性な疾患を有するＣＤ被験体の腸粘膜において増加した（３倍の増加、Ｐ＜０．０５）。グルテンを含まない食事療法を続ける（adhere to a gluten-free diet）、３人のセリアック病の被験体の腸粘膜は、コントロールと比較して、１．５倍だけゾヌリン発現を増加した。
【００５７】
＜実施例２３＞
＜組み換え型ゾヌリンは、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化を増加させる＞
グリアジン（小麦および他のいくつかの穀物に存在する糖タンパク質であり、およびＣＤに典型的な小腸の自己免疫傷害の原因である環境刺激である（１５））は、アクチン細胞骨格に対するＥＧＦの効果を完全に再生し（１６）、その効果は、ゾヌリンと非常に類似する（７、１０、１６）。更に、構造分析は、プレＨＰ２  ｂ鎖が、ＥＧＦ様活性に必要な３つの分子内ジスルフィド結合を形成する、６つの空間的に保存されたシステイン残基を包含するＥＧＦモチーフを含むことを明らかにした。
【００５８】
ゾヌリンがＥＧＦＲを活性化することができるかどうかを測定するために、次第に濃度を増加させたバキュロウィルス由来の、組み換え型ゾヌリンを、Ｃａｃｏ−２腸上皮細胞に加えた。細胞を溶解し、抗ＥＧＦＲ Ａｂで免疫沈降し、フォスフォチロシン免疫ブロット（ＰＹ−Ｐｌｕｓ）のために処理した。濃度≧３ｍｇ／ｍｌで、ゾヌリンは、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化を増加した（図５Ａ）。ＴＥＥＲでゾヌリンが誘発する変化におけるＥＧＦＲの役割をさらに確立するために、上記のインビトロとエキソビボの両方の実験を、ＥＧＦＲ選択的ＰＴＫインヒビター、ＡＧ１４７８の存在下で行った。ＥＧＦＲ選択的タンパク質チロシンキナーゼインヒビター（ＡＧ１４７８）（５ｍＭ）でのＣａｃｏ−２細胞の２時間のプレインキュベートは、Ｙ１０６８上のゾヌリン／プレＨＰ２誘導ＥＧＦＲリン酸化を妨げた（図５Ｂ）。同様に、ＡＧ１４７８での前処理は、ゾヌリンの反応においてＴＥＥＲの減少を止めた（abolish）（図５Ｃ）。最後に、ゾヌリンのトリプシン消化は、ＥＧＦＲを活性化するその能力を劇的に低下させた（図５Ｄ）。組み合わせると、これらのデータは、単鎖ゾヌリンは、ＥＧＦＲを活性化しＴＥＥＲにおけるＥＧＦＲで駆動される減少を誘導する一方、切断された２重鎖のＨＰ２は、ＥＧＦＲを活性化もせず、ＩＰも増加させないことを示唆する。
【００５９】
＜実施例２４＞
＜組み換え型ゾヌリン誘発ＥＧＦＲ活性化およびＴＥＥＲ変化はＰＡＲ２に依存する＞
Ｚｏｔ活性ペプチドＦＣＩＧＲＬ（ＡＴ１００２）は、ＰＡＲ２活性化ペプチド（ＡＰ）、ＳＬＩＧＲＬと構造的類似性を有し、ＴＥＥＲにおいてＰＡＲ２依存的変化を引き起し（１７）、これは、ＷＴにおいて実証されたが、ＰＡＲ２−／−マウスにおいては実証されていない発見である。さらに、ＰＡＲ２を含むいくつかのＧタンパク質結合受容体（GＰＣＲ）は、ＥＧＦＲを転写促進させる（１８）。Ｚｏｔとゾヌリンは、類似する作用機構を有し（６）、ゾヌリンタンパク質配列は、そのｂ鎖（ＦＣＡＧＭＳ）に、Ｚｏｔ様およびＰＡＲ２ＡＰ様モチーフを包含しているので、ゾヌリン誘発ＥＧＦＲ活性化がＰＡＲ２依存であるか否かを測定した。
【００６０】
Ｃａｃｏ−２細胞におけるＰＡＲ２のｓｉＲＮＡ誘発サイレンシングは、組み換え型ゾヌリン（１０ｍｇ／ｍｌ）に応じてＥＧＦＲ  Ｙ１０６８リン酸化を減少させ（図６Ａ）、ＥＧＦＲのＰＡＲ２依存性トランスアクチベーションと一致した。
【００６１】
ゾヌリンに応じてＥＧＦＲ活性化におけるＰＡＲ２に関する役割をさらに確立するために、小腸のバリア機能を、Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴマウス、またはＰＡＲ２−／−マウスのいずれかから単離した切片を用いてマイクロスナップウェルシステムで研究した。予想したように、組み換え型ゾヌリンは、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスからの腸切片においてＴＥＥＲを減少させたが、ＰＡＲ２−／−マウスからの腸切片においてＴＥＥＲを減少させなかった（図６Ｂ）。よって、ＥＧＦＲのゾヌリン誘発ＰＡＲ２依存性トランスアクチベーションは、バリア機能調節とリンクする。
【００６２】
本発明は、ゾヌリンをＨＰ２の前駆体であると確認した。成熟ヒトＨＰは、ジスルフィド結合によって共有結合で結合し、そして、その中でｂ鎖のみがグリコシル化するａおよびｂのポリペプチド鎖からなる異種ダイマー性の血漿糖タンパク質である（１９）。ｂ鎖（３６ｋＤａ）と異なり、ａ鎖は、２つの形態（すなわち、α１（〜９ｋＤａ）およびα２（〜１８ｋＤａ））で存在する。その２つの鎖の１つまたは両方の存在は、３つの表現型、ＨＰ１−１、ＨＰ２−１およびＨＰ２−２を結果として生じる。これらのＨＰ変異体は、ａ鎖が補体制御タンパク質を含み、ｂ鎖が触媒的に不活性なキモトリプシン様セリンプロテアーゼ領域を有して、マンノース結合レクチン関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）（１２、２０）から展開した（２１−２４）。ＭＡＳＰファミリーの他のメンバーは、細胞間結合（intracellular junction）の細胞成長、増殖、分化、移動および崩壊に関与する一連のプラスミノゲン関連の成長因子（ＥＧＦ、ＨＧＦ等）を含む。この多重領域構造にもかかわらず、ＨＰに割り当てられた唯一つの機能は、現在までのところ、Ｈｂを結合し、安定したＨＰＨｂ複合体を形成し、それによって、Ｈｂ誘発酸化組織傷害を防ぐことである（２５）。それらの前駆体形態に関して、何の機能もこれまで記載されていなかった。
【００６３】
ＨＰは、それらの前駆体タンパク質が、トランスゴルジ複合体において切断される代わりに、小胞体において補体Ｃ１ｒ様プロテアーゼ（Ｃｒ１ＬＰ）によってタンパク質分解で処理されるという点で珍しい分泌タンパク質である（１３）。興味深いことに、小胞体分画は、最も高いゾヌリン濃度が検出された細胞分画であった（９）。
【００６４】
ゾヌリンの主要な生物学的作用は、細胞間のＴＪ機能を調節することである（７、９−１１）ので、組み換え型プレＨＰ２は腸透過性アッセイにおいてエグサヌーブ（exanubed）された。プレＨＰ２用量と時間に依存して減少したＴＥＥＲは、エキソビボとインビボの両方でネズミ（murine）の小腸粘膜にわたる（across）。ゾヌリンが、その２つのａ２とｂのサブユニットへ切断された後、その浸透活性を失うという観察は、ゾヌリン／プレＨＰ２および成熟２重鎖ＨＰ２が異なる生物学的機能を発揮するという概念をさらに支持する。ＨＰタンパク質機能を決定づける際のタンパク質構造の重要性は、ゾヌリンと交差反応性するＺｏｔ  Ａｂが、変性条件下でＨＰ１を認識するが（図１Ａおよび２Ｂ）、非変性ＨＰ１を認識しないという発見にさらに支持される。組み合わせると、これらのデータは、プレＨＰ２としてのゾヌリンの同一性を確認する。
【００６５】
ゾヌリンのＮＨ２末端アミノ酸配列は、ヒトｇグロブリンの軽鎖と著しい類似点を有しており（７）、類似点はまた、ＨＰについても記述された（２６）。ＨＰＨｂ複合体のクリアランスは、単球／マクロファージ・スカベンジャー受容体、ＣＤ１６３によって媒介され得る（２５）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗデンドログラム（dendogram）分析は、以下のγグロブリン様コンセンサスモチーフ：ＱＬＶＥ―――Ｖ―――Ｐを有する、ＣＤ１６３結合部位のちょうど上流の、ゾヌリンｂ鎖における領域を示した。以前報告されたゾヌリン配列とこのプレＨＰ２コンセンサスモチーフとの間の相違は、種内の違いによることがある。
【００６６】
ゾヌリンは、成長因子のような繰り返しを包含する。ゾヌリンのように、成長因子は細胞間のタイトジャンクションの完全性に影響する（２７、２８）。本発明は、単鎖ゾヌリンは、ＰＡＲ２を介してＥＧＦＲを転写促進させるが、その切断された成熟形態はさせないこと、およびＴＥＥＲに対するその効果は、ＥＧＦＲまたはｓｉＲＮＡ誘発ＰＡＲ２サイレンシングを薬理学的に阻害することによって妨げられることを示す。これは、成熟した２重鎖のＨＰ２ではなく単鎖ゾヌリンにおける成長因子モチーフが、ＰＡＲ２を介する間接的なトランスアクチベーションによるタイトジャンクション分解を誘導するのに必要な分子構造を有していることを示唆する。
【００６７】
報告によれば、グリアジン（ＣＤの環境刺激）は、アクチン細胞骨格に対するＥＧＦの効果を再生する（１６）。これらの効果は、ゾヌリンに関して報告された結果に非常に似ている（７）。グリアジンはＣＸＣＲ３ケモカイン受容体に結合し（２９）、この相互作用は、腸細胞（９）と全体の腸組織（１０）の両方からのゾヌリン−プレＨＰ２放出に繋がっている。従って、グリアジンに関連するＥＧＦの効果は、ゾヌリン放出を通じて媒介されるようである。腸の細菌定着はまた、ゾヌリン放出のための刺激である（８）。グリアジンと微生物は両方とも、ゾヌリンの極性化された管腔の分泌を引き起こす（８）。従って、研究は、初期のゾヌリン作用、すなわち腸の腔側でのその活性、に集中した。このアプローチは、ＥＧＦＲとＰＡＲ２の両方が基底外側に発現されるという観察を考慮すると（３、３０）、直観に反したように見えることがある。しかしながら、それらが先端で（applically）発現したという証拠が存在する（３１）。ゾヌリンが、腸管粘膜の管腔側に適用された時、エキソビボとインビボの両方で、浸透効果を発揮したという事実は、タンパク質が基底外側で同様に作用する可能性を議論するわけではない。環境刺激（すなわち、バクテリア、グルテン）が腸管腔に存在する場合、ゾヌリンは、腸細胞から放出され、それは、少なくともグリアジンに対してＣＸＣＲ３によって媒介される工程である（２９）。ゾヌリン放出とその後に続く腸透過性の増加に続いて、これらの刺激は、ゾヌリンを発現する免疫細胞が基底外側にゾヌリンを提示することができる、粘膜下組織に達し得る。同様の両側性（bilateral）の作用は、粘膜のマスト細胞プロテアーゼＩＩ（管腔側と漿膜側の両方から作用して腸透過性をコントロールする別のセリンプロテアーゼ）に関して報告された（３２）。
【００６８】
上皮透過性を調節する際のＥＧＦＲとＰＡＲ２の両方の役割は以前に報告されている（３３、３４）。しかしながら、本発明は、小腸透過性を調節するための２つの受容体が協力的に働くという最初の証拠を提供する。
【００６９】
ゾヌリンがＣＤの急性期にアップレギュレートされることが報告されている（９、１０）。ＨＰに特異的なプライマーを使用して、本発明は、初めて、ヒトの腸におけるゾヌリン  ｍＲＮＡの発現を報告する。更に、リアルタイムＰＣＲ実験は、ゾヌリン発現が、正常なコントロールと比較して、ＣＤ患者において増加したことを示した。グルテンを含まない食事療法をしているＣＤ患者は、活性なＣＤ患者と正常なコントロールとの中間である、ゾヌリン発現に関する平均値を示したので、ゾヌリンの発現の増強は、疾患の活性と相互関連する。興味深いことに、Ｐａｐｐと同僚は、ＨＰ遺伝子における多形性がＣＤ進行およびその臨床症状に関する、新しい遺伝的危険因子を表わすと最近報告した（３５）。
【００７０】
プレＨＰのヒト血漿レベルは、１００ｍｇ／１００ｍｌと３００ｍｇ／１００ｍｌの間であり、ＨＰ２−２は、１００ｍｇ／１００ｍｌと２６０ｍｇ／１００ｍｌの間の範囲である（３６）。ＨＰのほぼ８％は、その代用形（pro-form）で分泌され（３７）、生理的な状況の下、８０−２０８ｍｇ／ｍｌのプレＨＰ２が、ヒト血漿の中に存在することを示唆する。従って、本明細書に使用されるゾヌリンの濃度は、生理的な範囲内にあり、ゾヌリンが病理学的プロセスの間にアップレギュレートされる時活性化されたシグナル経路を最も示すようである。ＣＤに加えて、ゾヌリンの高いレベルは、Ｔ１Ｄ（１１）、全身性エリテマトーデス（３８）および強直性脊椎炎（３９）を含む他の自己免疫疾患で報告されており、自己免疫疾患の病原論におけるゾヌリン経路の重要性をさらに記述する。これらの発見は、ゾヌリンがいくつかの免疫媒介性疾患の急性期に過剰発現し、その妨害が、自己免疫反応の発病を防ぐという観察と共に、ゾヌリンがこれらの疾病の病原論に寄与し、免疫媒介性疾患の病理生物学と処置の選択における新しい凡例を開いたことを示唆する。
【００７１】
以下の引用文が本明細書に引用された：
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【図１】
2012529508.tif 000002
【図２Ａ】
2012529508.tif 000003
【図２Ｂ】
2012529508.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2012529508.tif 000007
【図５Ｂ】
2012529508.tif 000008
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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