(57)【要約】  本発明は、エンテロコッカス・フェカリスSL-5由来バクテリオシンの新規な用途に関し、さらに詳しくは、エンテロコッカス・フェカリスSL-5由来バクテリオシンである配列番号1または配列番号2のポリペプチドを含むにきび予防及び治療用組成物、にきび予防及び治療剤の製造のための上記バクテリオシンの用途及び上記バクテリオシンを必要な個体に投与または塗布することを特徴とするにきび治療方法に関する。本発明は、にきびの原因菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対して優れた抗菌活性を示すエンテロコッカス・フェカリスSL-5により製造される配列番号1または配列番号2のポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドはにきびの原因菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対して優れた抗菌活性を示してこれらの生育を阻害するため、にきびの予防及び治療、改善用として用いられる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含むにきび予防及び治療用組成物。
【請求項２】
配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含むプロビオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium  acnes)に対する抗菌用組成物。
【請求項３】
請求項1の組成物を含む製品。
【請求項４】
上記製品は、化粧品または医薬品であることを特徴とする請求項3に記載の製品。
【請求項５】
配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを塗布する段階を含むプロビオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium  acnes)の生育を阻害する方法。
【請求項６】
にきび治療用製剤製造のための配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの用途。
【請求項７】
配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを必要とする個体に有効な量で投与または塗布することを含むにきび治療または予防する方法。
【請求項８】
プロビオニバクテリウム・アクネスに対する抗菌剤剤製造のための配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの用途。
【請求項９】
配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを必要とする個体に有効な量で投与または塗布することを含むプロビオニバクテリウム・アクネスを除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロコッカス・フェカリスSL-5由来バクテリオシンの新規な用途に関し、より詳しくはエンテロコッカス・フェカリスSL-5由来バクテリオシンである配列番号1または配列番号2のポリペプチドを含むにきび予防及び治療用組成物、にきび予防及び治療剤の製造のための上記バクテリオシンの用途及び上記バクテリオシンを必要な個体に投与または塗布することを特徴とするにきび治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、にきびは、嫌気性皮膚常在菌であるプロビオニバクテリウム・アクネス菌のリパーゼ(lipase)により生成された遊離脂肪酸(free  fatty  acid)と各種低分子物質の刺激による炎症反応がその原因として知られている。このようなにきびを治療するために、経口剤または外用剤形態の薬剤を用いたが、例えば、抗-男性ホルモン剤を用いた皮脂生成の抑制剤、ステロイドホルモン及びビステロイド性消炎鎮痛剤の抗炎症作用による治療剤、レソチノール、硫黄、サリチル酸、ベンゾイルパーオキシド、レチノイン酸やイソトレチノインのような抗菌剤及び角質剥離剤、テトラシクリン、エリスロマイシン,  メクロシクリンなどの抗生物質によるプロビオニバクテリウム・アクネス菌の活性抑制方法などがある。一方、最近はアザライン酸を用いた方法も多く用いられている。
【０００３】
しかし、上記で説明した方法は、にきび治療にある程度成果を上げているが、使用性の面でいくつかの問題を有している。即ち、ホルモン剤の使用は表皮の生長抑制やその他ホルモン濫用の副作用が報告されており、レチノイン酸とベンゾイルパーオキシドなどの角質剥離剤は、角質剥離による皮膚の刺激性と接触性皮膚炎のおそれがあり、テトラシクリンのような抗生物質は耐性菌の出現及び光過敏作用の可能性が知られている。特に、イソトレチノインは、胎児に催奇性作用があることが知られている。
【０００４】
従って、にきび皮膚において人体に安全でありながらも、にきび治療効果に優れた製品の開発の必要性が絶えず指摘されている状況である。
【０００５】
一方、乳酸菌(lactic  acid  bacteria)は、炭水化物を嫌気的に用いて乳酸を生産する微生物であり、自然界に広く分布する微生物である。この微生物は、中性及びアルカリ性でよく生育する腐敗性微生物の生育を抑制し、東西洋を問わず食品の保存手段として用いられてきており、特に、牛乳、乳製品、肉製品、沈菜類及び各種塩辛類の加工に用いられてきた。乳酸菌は、これらの代射産物である数種の有機酸によりpHを減少させながら食品の保存性を増進させるが、乳酸及び酢酸のような有機酸は、大部分の微生物に対して殺菌作用(bactericidal)があるためである。また、有機酸以外に過酸化水素及びこれらが生産するバクテリオシンが保存性に関与する。
【０００６】
バクテリオシンという物質は、細菌が生産するタンパク質またはタンパク質系列の抗菌物質であり、一般に、抗菌物質生産菌株の自分と系統・血統学的に類似の菌種に制限された狭い抗菌の範囲を示し、自分の遺伝子から直接生合成されるという点で一般の抗生物質と区分される天然の抗菌性タンパク質である。バクテリオシンは、各種発酵食品中によく存在し、日常食生活を通じて摂取している乳酸菌により生産され、既存の抗生剤とは異なり、タンパク質からなっているため、人体に摂取されるとすぐに消化器管のタンパク質加水分解酵素により分解されることにより、人体に無毒性であり、残留性がないという側面で食品の新たな生物保存剤または発酵食品の生物制御剤としてその効用が大きく期待されている。乳酸菌が生産する最も広く知られたバクテリオシンであるナイシン(nisin)は、抗菌範囲が広いため、かなり前から商用が許容されてきており、米国でも1988年に食品医薬安全本部(FDA)がグラス(GRAS,generally  recognized  as  safe)食品添加物として認めるようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これに対し、本発明者は、エンテロコッカス・フェカリスSL-5の抗菌活性について研究中、にきび関連細菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対して優れた抗菌活性があることを見出し、配列番号1または配列番号2のポリペプチドがプロビオニバクテリウム・アクネスに対して優れた抗菌活性を示すことを確認し、上記配列番号1または配列番号2のポリペプチドを有効成分として含むにきび予防及び治療用組成物を開発することにより本発明を完成した。
【０００８】
従って、本発明の目的は、配列番号1または配列番号2のポリペプチドの新規な用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記のような目的を達成するために、本発明は配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含むにきび予防及び治療用組成物を提供する。
【００１０】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含むプロビオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium  acnes)に対する抗菌用組成物を提供する。
【００１１】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は、配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを塗布する段階を含むプロビオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium  acnes)の生育を阻害する方法を提供する。
【００１２】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は、にきび治療剤製造のための配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの用途を提供する。
【００１３】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを必要とする個体に有効な量で投与または塗布することを含むにきび治療または予防する方法を提供する。
【００１４】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は、プロビオニバクテリウム・アクネスに対して抗菌剤の製造のための配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの用途を提供する。
【００１５】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は、配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを必要とする個体に有効な量で投与または塗布することを含むプロビオニバクテリウム・アクネスを除去する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
従って、本発明は、にきびの原因菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対して優れた抗菌活性を示すエンテロコッカス・フェカリスSL-5により製造される配列番号1または配列番号2のポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドはにきびの原因菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対して優れた抗菌活性を示してこれらの生育を阻害するため、にきびの予防及び治療、改善用として用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、エンテロコッカス・フェカリスSL-5の抗菌活性を示したものである(A:プロビオニバクテリウム・アクネスATCC  29399;B:バシラス・サブチリスKFRI  179;C:バシラス・セレウスKCTC  3624;D:スタフィロコッカス・アウレウスKCTC  1927)
【図２】図2は、本発明のバクテリオシンの部分分離結果(A)及びこれを複製したゲルのプロビオニバクテリウム・アクネスに対する抗菌活性(B)を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の内容をさらに詳しく説明する。
本発明の組成物は、配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明の一実施形態では、エンテロコッカス・フェカリスSL-5の抗菌活性スペクトルを確認し、これがにきびの原因菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対して抗菌活性を示すことを確認した。
【００２０】
また、本発明の他の実施形態では、抗菌活性を示す物質を部分精製してN-末端配列を確認し、これを用いてPCRを通じて抗菌活性を示すペプチドを分離した。その結果、配列番号1及び配列番号2の塩基配列を有するポリペプチドであることを確認した。
【００２１】
本発明のペプチドは、当業界で公知の方法(Creighton,Proteins;Structures  and  Molecular  Principles,W.H.Freeman  and  Co.,NY,1983)により化学的合成することができる。代表的な方法としては、これらに限定されるわけではないが、液体または固体相合成、断片凝縮、F-MOCまたはT-BOC化学法が含まれる(Chemical  Approaches  to  the  Synthesis  of  Peptides  and  Proteins,  Williams  et  al.,Eds.,CRC  Press,Boca  Raton  Florida,1997;A  Practical  Approach,  Athert  on  &  Sheppard,Eds.,IRL  Press,Oxford,England,1989)。
【００２２】
また、本発明のペプチドは遺伝工学的方法により製造され得る。まず、常法により上記ペプチドをコードするDNA配列を作製する。DNA配列は、適切なプライマーを用いてPCRを増幅することにより作製できる。他の方法としては、当業界に公知となった標準方法により、例えば、自動DNA合成機(BiosearchまたはApplied  Biosystems社が販売するもの)を用いてDNA配列を合成することもできる。製作されたDNA配列は、このDNA配列に作動可能に連結され(operatively  linked)、そのDNA配列の発現を調節する一つまたはそれ以上の発現調節配列(expression  control  sequence)(例:プロモータ、エンハンサー等)を含むベクターに挿入させ、これより形成された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる。生成された形質転換体を上記DNA配列が発現されるのに適切な培地及び条件下で培養し、培養物から上記DNA配列によりコードされた実質的に純粋なペプチドを回収する。上記回収は、当業界に公知となった方法(例えば、クロマトグラフィー)を用いて行うことができる。上記において‘実質的に純粋なペプチド’とは、本発明によるペプチドが宿主に由来した如何なるタンパク質も実質的に含まないことを意味する。本発明のペプチド合成のための遺伝工学的方法は、次の文献を参考とすることができる:Maniatis  et  al.,  Molecular  Cloning;A  laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  laboratory,1982;Sambrook  et  al.,Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual,Cold  Spring  Harbor  Press,N.Y.,Second(1998)  and  Third(2000)  Edition;Gene  Expression  Technology,Method  in  Enzymology,Genetics  and  Molecular  Biology,Method  in  Enzymology,Guthrie  &  Fink  (eds.),Academic  Press,  San  Diego,Calif,1991;及びHitzeman  et  al.,J.Biol.Chem.,255:12073-12080,1990.
【００２３】
一方、配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、プロビオニバクテリウム・アクネスの生育を阻害するため、本発明は配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含むプロビオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium  acnes)に対する抗菌用組成物を提供する。
【００２４】
また、配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含む本発明の組成物は製品の形態で提供され得る。上記製品は化粧品または医薬品であってもよい。
【００２５】
医薬品の場合、本発明の組成物は、一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤をさらに含有することができる。薬学的に許容される担体としては、例えば、非経口投与用担体をさらに含むことができる。非経口投与用担体は、水、適したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含むことができ、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適した安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適した保存剤としては、ベンズアルコニウムクロリド、メチル-またはプロピル-パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考とすることができる(Remington’s  Pharmaceutical  Sciences,  19th  ed.,Mack  Publishing  Company,Easton,PA,1995)。
【００２６】
本発明の組成物を含む医薬品は、ヒトをはじめとしたほ乳動物に如何なる方法でも投与することができる。望ましくは、本発明の組成物は経皮投与され得る。上記において‘経皮投与’とは、本発明の組成物を細胞または皮膚に投与して活性成分が皮膚内に伝達されることを言う。例えば、本発明の組成物を注射型剤形で製造し、これを30ゲージの細い注射針で皮膚を軽く刺す(prick)方法、または皮膚に直接的に塗布する方法で投与され得る。
【００２７】
本発明の薬学的組成物は、上述したような投与経路により剤形化できる。例えば、非経口投与用製剤の場合には、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、エアロゾル及び鼻腔吸込剤の形態で当業界で公知の方法で剤形化できる。これら剤形は、全ての製薬化学に一般に公知となった処方書である文献(Remington’s  Pharmaceutical  Science,  15th  Edition,1975.Mack  Publishing  Company,Easton,Pennsylvania  18042,Chapter  87:Blaug,Seymour)に記載されている。
【００２８】
本発明のポリペプチドの総有効量は、単一投与量(single  dose)で患者に投与され得、多重投与量(multiple  dose)で長期間投与される分割治療方法(fractionated  treatment  protocol)により投与され得る。本発明の組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にすることができる。上記容量は、組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率等、多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるため、このような点を考慮すると、当分野の通常の知識を有する者であれば、適切な有効投与量を決定できるものであり、望ましくは0.001μg/kg体重〜10mg/kg体重であり得る。本発明による組成物を含む製品は、本発明の効果を奏する限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特別に制限されない。
【００２９】
また、化粧品の場合、本発明のポリペプチドは、化粧品学及び/又は皮膚学的に許容可能な賦形剤をさらに含有することにより、当業界で公知の方法により局所適用に適した全ての形態の剤形に製造され得る。例えば、これに限定されないが、本発明による化粧料組成物は溶液、ゲル、固体、エマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球、イオン型及び/又はノニオン型小嚢分散剤、クリーム、スキンローション、ローション、パウダ、軟膏、スプレイまたはスティックの形態で製造され得る。
【００３０】
上記化粧品学及び/又は皮膚学的に許容可能な賦形剤としては、皮膚軟化剤、乳化剤、濃厚剤及び溶媒を含むことができる。
【００３１】
上記皮膚軟化剤は、皮膚の軟化、鎮静、コーティング、うるおいとなめらかさのために用いる。本発明において、皮膚軟化剤は、当業界で公知のあらゆる種類を用いることができ、例えば、石油基剤、脂肪酸エステル、アルキルエトキシレート、脂肪酸エステルエトキシレート、脂肪アルコール、ポリシロキサンまたはこの混合物であり得る。それ以外にプロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、トリエチレングリコール、鯨蝋、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコールエーテル、グリセリド、アセトグリセリド、エトキシル化グリセリド、ポリヒドロキシアルコールの他の脂肪酸エステル、ラノリン及びこの誘導体のような通常の皮膚軟化剤を含む。
【００３２】
乳化剤は、化粧料組成物の水相と油相を混合する役割を果たす。本発明において、1種以上の乳化剤を任意に含有することができ、ノニオン性、アニオン性またはカチオン性を全て含むことができる。上記乳化剤の種類は、エマルジョンの形態が油中水の分散型か水中油の分散型かにより決定できる。適した乳化剤の例としては、これに限定されないが、ソルビタントリオレート、ソルビタントリステアレート、グリセロールモノオレート、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノラウレート、ソルビタンセスキオレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンステアリルエステル、ポリオキシエチレンソルビトール蝋誘導体、PEG200ジラウレート、PEG200モノステアレート、PEG400ジオレート、ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンモノステアレート及びポリオキシエチレンソルビタンモノステアレートなどがある。
【００３３】
濃厚剤は、架橋されたカルボキシポリメチレン重合体、エチルセルロース、ポリエチレングリコール、トラガカントゴム、カラヤガム、キサンタンガム、ベントナイト、ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロースを含む。
【００３４】
溶媒としては、精製水、アルコールまたは精製水とアルコールの混合物を用いることができる。
【００３５】
その他、任意に用いられる一般的な化粧品添加剤の例としては、これに限定されないが、パラ-ヒドロキシベンゾエートエステルのような保存剤、ブチルヒドロキシトルエン、アスコルビン酸及びその誘導体及びトコフェロール及びその誘導体のような抗酸化剤、グリセロール、ソルビトール、2-ピロリドン-5-カルボキシレート、ジブチルフタレート、ゼラチン、ポリエチレングリコールのような湿潤剤、アセテート、リン酸塩、クエン酸塩、トリエタノールアミン及びカルボネートのようなpH緩衝剤、蝋、パラフィンのようなワックス類、増粘剤、活性増強剤、着色剤及び香料が用いられ得る。
【００３６】
一方、本発明のポリペプチドは、プロビオニバクテリウム・アクネスの生育を阻害するため、本発明は配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを塗布する段階を含むプロビオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium  acnes)の生育を阻害する方法を提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、にきび治療剤の製造のための配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの用途を提供する。また、本発明は、プロビオニバクテリウム・アクネスに対する抗菌剤の製造のための配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの用途を提供する。
本発明は、配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを必要とする個体に有効な量で投与または塗布することを含むにきび治療または予防方法を提供する。また、本発明は配列番号1または配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを必要とする個体に有効な量で投与または塗布することを含むプロビオニバクテリウム・アクネスを除去する方法を提供する。
【００３８】
上記において、配列番号1または配列番号2のアミノ酸を有するポリペプチド及びこれらの効果については上述した通りであり、上記において“有効量”とは、本発明のポリペプチドが投与対象である個体内でにきびに対して予防及び治療の効果またはプロビオニバクテリウム・アクネスを除去する効果を奏する量を言い、上記“個体(subject)”とは、ほ乳動物、特にヒトを含む動物を意味する。上記個体は、にきび予防及び治療またはプロビオニバクテリウム・アクネスの除去が必要なヒトであり得る。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、上述した効果のうち、所望の効果が導き出されるまで投与され得、当業界に公知となった方法により経口または非経口の多様な経路で投与され得る。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。
【００４１】
ただし、下記実施例は、本発明を例示したことに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるわけではない。
【００４２】
＜実施例1＞
細胞培養及び抗菌スペクトルの確認
<1-1>細胞培養
エンテロコッカス・フェカリスSL-5(Enterococcus  faecalis  SL-5,16s  rRNA  sequenceがGenBank  Accession  No.AY692453として登録)を、MRS液体培地に接種した後、37℃、窒素ガスで置換された嫌気条件の下に約16時間培養した。試験菌株として用いられたプロビオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium  acnes,  ATCC  29399)は、RCMブロス(reinforced  clostridial  medium  broth,Merck,Darmstadt,Germany)において、バシラス・サブチリス(Bacillus  subtilis,KFRI  179)、バシラス・セレウス(Bacillus  cereus,KCTC  3624)及びスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus  aureus,KCTC  1972)大腸菌O157、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラパラタイフィA、シゲラ・フレキシネリは、BHIブロス(brain  heart  infusion  broth)で37℃の温度で約16時間培養した。
【００４３】
<1-2>エンテロコッカス・フェカリスSL-5の抗菌活性スペクトルの確認
E.  faecalis  SL-5の培養液は、遠心分離(9,940×g、15分、4℃)を通じて細胞成分を除去し、これを通じて得られた培養液の上澄液をさらにフィルタリング(membrane  pore  size,0.45μm)することにより、残っている細胞成分を完全に除去した。このようにして得られた上澄液の成分を‘発酵ろ液’と命名した。発酵ろ液の抗菌活性測定は‘Spot-on-the-lawn’方法(Van  Reenenら,2006,Appl.Environ.  Microbiol.72:7644-7651)で測定した。発酵ろ液は、嫌気水(42.3mM  Na2HPO4,33.1mM  KH2PO4,0.05％(v/v)Tween  80,3.2mM  L-cystein・HCl,pH7.0)を用いて順次2倍ずつ希釈して用い、希釈液10ulを試験菌株を含むMRSアガープレート(agar  plate)に点滴した後、37℃で培養して点滴位置を中心に透明帯(clear  zone)の生成有無を見て活性を確認した。
【００４４】
その結果、図1及び表1で見られるように、エンテロコッカス・フェカリスSL-5は、バシラス・セレウスKCTC  3624、バシラス・サブチリスKFRI  179、リステリア・モノサイトゲネス、プロビオニバクテリウム・アクネスATCC  29399及びスタフィロコッカス・アウレウスKCTC  1927などのグラム陽性細菌に対して抗菌活性を有しているものと示され、大腸菌O157とシゲラ・フレキシネリ、サルモネラパラタイフィAに対しては抗菌活性がないことが分かった。
【００４５】
【表１】
2012500257.tif 000003
【００４６】
<実施例2>
抗菌活性物質の同定
<2-1>抗菌活性物質の部分精製
抗菌活性を示す物質を同定するために部分精製を実施した。エンテロコッカス・フェカリスSL-5を100  mlのMRS培地に接種して37℃で16時間培養した後、新たな2リットルのMRS培地に接種し、8時間培養して上記実施例1と同様に発酵ろ液を準備した。
【００４７】
発酵ろ液を分画するために、硫酸アンモニウム(ammonium  sulfate)を最終濃度が70％になるように添加してゆっくり溶かした後、遠心分離(20,000×g/30分/4℃)を行って沈殿物を得た。沈殿物は、標準緩衝溶液(50mM  Tris-HCl,pH7.0)で最終体積が70mlになるように溶かした後、溶液中に含まれた塩類を除去するために透析チューブ(dialysis  tubing,  MW  cut-off  of  500  dalton)を用いて48時間標準緩衝溶液で3回に渡って透析した。透析液を濃縮するために、ウルトラフィルトレーション(ultrafiltration,  MW  cut-off  of  3,000  dalton)を行い、濃縮液(7mg/ml)中の8mlを液体クロマトグラフィーの一種であるCM  SepharoseTM  Fast  Flow  column  (GE  Healthcare)を用いて分画した。分画は、0Mから1MまでのNaCl濃度勾配(gradient)を通じてなされ、プロビオニバクテリウム・アクネスに対する抗菌活性は0.5M  NaCl濃度の付近で検出された。抗菌活性を有する分画中の最大活性を有する分画を16％  SDS-Tricineゲル電気泳動を通じて分析した結果、図2Aで見られるように、大部分のタンパク質は5kDa付近で分布することを確認した。
【００４８】
<2-2>抗菌活性物質の同定
約5kDa大のタンパク質がプロビオニバクテリウム・アクネスに対して抗菌活性を示すかを確認するために、図2Aに用いられたゲルに対する複製ゲル(duplicate  gel)を用いて上記実施例<1-2>と同様に活性染色実験を行った。
【００４９】
その結果、図2Bで見られるように、5kDa大のタンパク質の部分でプロビオニバクテリウム・アクネスを阻害する透明帯(clear  zone)が形成されることにより、該当タンパク質がプロビオニバクテリウム・アクネスに対して抗菌活性を有することが分かった。
【００５０】
<2-3>抗菌活性物質の配列分析
上記実施例<2-2>での物質のアミノ酸配列を決定するために、上記5kDa大のタンパク質部分をPVDF膜(polyvinylidene  fluoride  membrane)に移動(transfer)した。PVDF膜上のタンパク質バンド中、バクテリオシンバンドを切り出した後、自動化タンパク質配列分析機(automatic  protein  sequence  analyzer)を用いて10個のN-末端アミノ酸配列を決定した。
【００５１】
その結果、上記タンパク質がN末端からMet-Gly-Ala-Ile-Ala-Lys-Leu-Val-Ala-Lysの配列を有していることが分かった。
【００５２】
決定されたアミノ酸配列をBLAST(Basic  Alignment  Search  Tool)を用いてNCBI(National  Center  for  Biotechnology  Information)タンパク質データベースに存在するタンパク質と比較した結果、enterocin  MR10AとB(Martin-Plateroら,2006,Appl.Environ.Microbiol.72:4245-4249),enterocin  L50A(Cintasら,1998,J.Bacteriol.180:1988-1994)などと100％の同一性を示し、enterocin  L50B  (Cintasら,1998,J.Bacteriol.180:1988-1994)とは90％の同一性を示した。Enterocin  MR10AとBがenterocin  L50の変異体(variant)と考えられているため、enterocin  L50の塩基配列に基づいて配列番号6(5’-ATGGGAGCAATCGCAAAATTAGTA-3’)及び配列番号7(5’-TTAATGTCTTTTTAGCCATTTTTCAATTTGATCTATTGT-3’)のPCRプライマーを合成した後、エンテロコッカス・フェカリスSL-5の全体DNAを鋳型としてPCRを行い、これから287bpからなるPCR産物を得た。該当PCR産物はDNA塩基配列決定を通じて全体塩基配列(配列番号5)を決定した。決定された塩基配列を用いてenterocin  MR10とenterocin  L50を対象に整列(alignment)した結果、enterocin  MR10のopen  reading  frame  (ORF)と100％同一性を示した。これを通じて明らかになったエンテロコッカス・フェカリスSL-5の遺伝子の構造は、二つのORFが連続的に(tandem)配列されており、これをそれぞれ配列番号3及び配列番号4とした。
【００５３】
総合すれば、本発明のエンテロコッカス・フェカリスSL-5のバクテリオシンは、enterocin  MR10またはL50と同一または高い同一性を示すが、にきび原因菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対する優れた抗菌活性を有していることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上、詳察した通り、本発明はにきびの原因菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対して優れた抗菌活性を示すエンテロコッカス・フェカリスSL-5及び上記微生物により製造される配列番号1または配列番号2のポリペプチドを提供する。従って、本発明のポリペプチド及びエンテロコッカス・フェカリスSL-5はにきびの原因菌であるプロビオニバクテリウム・アクネスに対して優れた抗菌活性を示してこれらの生育を阻害するため、にきびの予防及び治療、改善用として用いられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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