(57)【要約】  いくつかの態様は不均一な細胞集団の内部から選択した細胞を遺伝学的に解析する方法に関する。細胞集団は最初に分割できる。選択した細胞はイメージングによって同定され、次いでエネルギービームでの照射によって特異的に標的にされ、かつ溶解されることによって、細胞成分が培養基に特異的に放出される。培養基は次いで、所望の核酸について標本抽出及びアッセイされる。【選択図】図１
2012514477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均一な細胞集団内にある希有な細胞から核酸を分離するための方法であって：
（ａ）前記希有な細胞の濃度が前記希有な細胞を含む容器内で、少なくともＸ倍の倍数に増加するように、前記不均一な細胞集団を複数の容器に分割するステップであって、Ｘが前記不均一な細胞集団における前記希有な細胞の数によって分割した前記容器の数であるステップと；
（ｂ）どの容器が前記希有な細胞を含むかを判定するために各々の容器の領域全体を実質的にイメージングするステップと；
（ｃ）前記細胞を溶解させ、前記希有な細胞から培地に前記核酸を放出させるように、前記希有な細胞を含む容器に試薬を添加するステップと；
（ｄ）放出した核酸を含む前記培地を、溶解した前記希有な細胞を含む容器のみから採取することによって、前記希有な細胞から前記核酸を採取するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
不均一な細胞集団内にある希有な細胞から核酸を分離するための方法であって：
（ａ）前記希有な細胞の濃度が前記希有な細胞を含む容器内で、少なくともＸ倍の倍数に増加するように、前記不均一な細胞集団を複数の容器に分割するステップであって、Ｘが前記不均一な細胞集団における前記希有な細胞の数によって分割した前記容器の数であるステップと；
（ｂ）どの容器が前記希有な細胞を含むかを判定するために各々の容器の領域全体を実質的にイメージングするステップと；
（ｃ）前記希有な細胞を含む容器内で前記希有な細胞の位置を検出するステップと；
（ｄ）他の細胞を顕著に溶解させずに前記希有な細胞を特異的に溶解させ、前記希有な細胞から培地に前記核酸を放出させるように、前記希有な細胞を含む容器内の前記希有な細胞の位置にエネルギービームを誘導するステップと；
（ｅ）放出した核酸を含む前記培地を、溶解した前記希有な細胞を含む容器のみから採取することによって、前記希有な細胞から前記核酸を採取するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、該検出が前記容器のイメージを参照することによって行われることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の方法が、前記不均一な細胞集団を前記希有な細胞に選択的に結合する薬剤と接触させるステップを更に具え、前記薬剤が光の特性として検出可能な信号を生成することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項２ないし４に記載の方法が、ステップ（ａ）ないし（ｅ）のいずれかでリボヌクレアーゼ抑制物質を添加するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１ないし５に記載の方法において、Ｘが約１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、及び１００，０００の群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１ないし６に記載の方法において、前記容器がマルチウェルプレートのウェルであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項２ないし７に記載の方法において、該採取によって、前記希有な細胞から前記核酸が採取され、希有な細胞の核酸が希有ではない細胞の核酸と対比して最大でＹ倍濃縮されており、Ｙが前記容器内の溶解されない希有ではない細胞の数であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２ないし８のいずれかに記載の方法において、Ｙが約１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、及び１００，０００の群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
不均一な細胞集団内にある希有な細胞から核酸を分離するための方法であって：
（ａ）イメージングに適した表面に前記不均一な細胞集団を配置するステップと；
（ｂ）前記表面の領域全体を実質的にイメージングするステップと；
（ｃ）前記表面のイメージを参照することによって前記表面上の前記希有な細胞の位置を検出するステップと；
（ｄ）他の細胞を顕著に溶解させずに前記希有な細胞を特異的に溶解させ、前記希有な細胞から培地に前記核酸を放出させるように、集束したエネルギービームを前記希有な細胞の位置に誘導するステップと；
（ｅ）放出した核酸を含む前記培地を、溶解した前記希有な細胞から採取することによって、前記希有な細胞から前記核酸を採取するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２ないし１０のいずれかに記載の方法が、前記細胞をナノ粒子標識で標識するステップを更に具え、前記ナノ粒子標識が前記エネルギービームを介した細胞溶解の効率を改善するように用いられることを特徴とする方法。
【請求項１２】
細胞の成分を分析する方法であって：
分析用の対象の細胞を含む細胞集団を提供するステップと；
前記細胞集団内で少なくとも１の対象の細胞を検出するステップと；
エネルギービームを前記少なくとも１の対象の細胞の位置に誘導するステップであって、前記エネルギービームのエネルギーが、前記細胞から成分を放出するのに十分であり、前記少なくとも１の対象の細胞を少なくとも部分的に溶解するのに十分であるステップと；
前記対象の細胞から放出した前記成分を分析するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれかに記載の方法が、前記細胞集団を前記少なくとも１の対象の細胞に特異的な標識と接触させるステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記標識がポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、抗体のフラグメント、レクチン、リガンド、タンパク質、ペプチド、脂質、アミノ酸、核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）といった修飾核酸、又は合成小分子のうちの１以上を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４のいずれかに記載の方法において、前記標識がナノ粒子を更に含み、当該ナノ粒子が前記エネルギービームを介した細胞溶解の効率を改善することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５ないし２１のいずれかに記載の方法において、該検出ステップが前記細胞集団をイメージングするステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１８ないし２３のいずれかに記載の方法において、前記検出ステップが前記標識の存在によって前記少なくとも１の対象の細胞を検出するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１２ないし１７のいずれかに記載の方法が、リボヌクレアーゼ抑制物質を提供するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１２ないし１８のいずれかに記載の方法において、前記細胞集団が２以上の容器に分割されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１２ないし１９のいずれかに記載の方法が、Ｆｃ受容体を遮断する試薬を添加するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１２ないし２０のいずれかに記載の方法において、前記少なくとも１の対象の細胞が、１０，０００中約１未満の濃度で前記細胞集団に存在することを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１２ないし２１のいずれかに記載の方法において、前記少なくとも１の対象の細胞が１００，０００の細胞中に約１ないし１０，０００，０００の細胞中に約１の濃度で前記細胞集団に存在することを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１２ないし２２のいずれかに記載の方法が、前記核酸を最低でも採取するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［背景技術］
不均一な細胞の混合物における、特異的な細胞のｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡといった細胞核酸の分析は一般的には、インサイツで１ないし１０のわずかな分析物を分析するか、あるいはバックグラウンド集団から所望の１以上の細胞を機械的に分離し、分離した１以上の細胞の成分を採取及び分析することによって行っている。
【０００２】
精製されない混合物内にある細胞を直接的に分析するインサイツ分析のアプローチは、インサイツ式のハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を含む。ＩＳＨは一般的には細胞又は組織部分にある特異的なｍＲＮＡ又はＤＮＡ配列を検出するのに用いられ、１の実験においては測定されうる分析物の数によって限定される。一般的には、ＩＳＨは１の実験における１又は２の分析物について行われる（Ｙｏｕｎｇ  ＷＳ  ３ｒｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１６８：７０２−１０、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）。インサイツ分析のアプローチは総て、細胞の精製がなく、更なる分析用の細胞成分の採取又は保存がない細胞試料の状況においては、細胞成分の直接的な分析によって特徴づけられる。インサイツ分析のアプローチは一般的には、手動式の微視的観察を介して行われ、高スループットの量産化又は自動化に好適ではない。
【０００３】
細胞成分の採取前に細胞を精製する機械的な分離アプローチは、抗体系磁性ビーズの精製（例えば、ドイツ連邦共和国のＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＭＡＣＳ（登録商標））、フローサイトメトリ系の細胞選別、レーザの顕微解剖、又は機械的な顕微解剖を含む。１以上の細胞が分離した時点で、完全な遺伝子発現プロファイルといった、高い多重分析が行われうる。これらの多様な細胞分離方法の各々は独自の利点及び限界を有している。例えば、磁性ビーズの精製及びフロー選別は適切に作用するのに比較的多数の細胞が要求され、分離した細胞の絶対純度はほとんど得られず、選択パラメータは一般的にはわずかな表面標識に限定される。レーザの顕微解剖は単一の細胞又は多くの細胞を分離できるが、処理できる試料の数で限定され、一般的には要求が特異的な組織試料に適用される（Ｌｕｏら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．（１９９９）５（１）：１１７−２２、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）。機械的な顕微解剖は処理されうる細胞の数及び試料の数の双方で限定される。分離方法の総てを用いても、細胞、特に希有な細胞を分析することは、対象の細胞のほとんどが処理中に失われる問題があるため困難である。
【０００４】
異なる細胞型の複雑な混合物における特異的な細胞の核酸分析の１の用途は、循環性及び散在性の腫瘍細胞の遺伝学的解析である。このような細胞は原発腫瘍によって提供され、血液又はリンパの循環に存在するか様々な組織に属する。散在性の腫瘍細胞は転移の原因になると考えられている。癌疾患由来の多数の死亡は転移のためであり、原発腫瘍のためではないことを考えると、循環性及び散在性の腫瘍細胞は重大な診断対象となっている。例えば、Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ社（ニュージャージー州ウォレン）は予測ツールとして、循環する乳腺腫瘍細胞の数を列挙するＦＤＡ認可の診断試験を始めた。しかしながら、循環性の腫瘍細胞の存在を検出する診断値とは別に、これらの細胞を分子的に分類できることが非常に所望されている。このような情報は良好な予測情報を明確にでき、治療の選択を誘導できる。例えばＨｅｒ−２受容体はハーセプチン治療のための標的であり、乳癌患者の部分的な集団に過剰発現するのみであり、乳癌患者の残余の集団はハーセプチン治療に反応しない。この例は個別化された癌治療の必要を強調している。循環性及び散在性の腫瘍細胞の分子プロファイリングは、好適な標識が同定される発見段階において、及び同定した標識が実装される診断段階においての双方で、顕著な技術的な困難性を提起している。この困難性は所望の細胞の１００，０００中に１ないし１０，０００，０００中に１といった程度の希少性であり、精製のために例外的に効率的なプロセスを要求する。
【０００５】
現在までに、循環性の腫瘍細胞の遺伝学的解析又は分子プロファイリングは主には抗体を介する分離を通して濃縮した腫瘍細胞で行われてきた。その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる「Ｓｍｉｒｎｏｖら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００５）６５（１２）：４９９３−７」は、ヒト血液からの免疫磁気分離により濃縮した循環性の腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイルについて報告した。報告の研究の限界は白血球の混入によって、数が少なくなる濃縮した腫瘍細胞の純度不足である。有用な遺伝子発現データは少なくとも１００の腫瘍細胞が得られ、バックグラウンドが１，０００ないし１０，０００未満の白血球である場合にのみ生成できる。これらの制限によって、患者の選択が、循環性の腫瘍細胞の数が血液７．５ｍｌあたり１００を超える高さの患者に制限され、癌患者の大多数の循環性の腫瘍細胞が、血液７．５ｍｌあたり１０未満であるため深刻な制限となっている（Ａｌｌａｒｄら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００４）１０（２０）：６８９７−９０４、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）。更には白血球の混入によって、分析が腫瘍細胞によって高く発現された遺伝子に限定された。結局、ＥｐＣＡＭといった特定の抗原に対し配向される抗体を用いて、循環性の腫瘍細胞を能動的に選択することは本質的に脆弱である。循環性の腫瘍細胞が曝露された表面抗原の量で顕著な不均一性を呈示し、これらの細胞の捕捉に効率の変化を引き起こし（Ａｌｌａｒｄら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００４）１０（２０）：６８９７−９０４）、更にはアッセイ感受性を損なうことは既知である。
【０００６】
抗体の選択を用いて循環性の腫瘍細胞を分離するための異なるシステムはＣＴＣチップであり（Ｎａｇｒａｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ．（２００７）４５０（７１７３）：１２３５−９、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）、濃いイオンエッチングによって製造される、７８，０００のマイクロポストを有するフローチャンバからなる。マイクロポストはＥｐＣＡＭ用の抗体でコーティングされる。血液がチャンバを通って汲み上げられると、循環性の腫瘍細胞がマイクロポストに保持される。捕捉した細胞は少しの数の遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲによって分析されている。公表のデータは、分離した循環性の腫瘍細胞の精製の変化を示し、６の癌の型にわたる純度が平均５６％であることを示している（Ｎａｇｒａｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ．（２００７）４５０（７１７３）：１２３５−９、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）。更に試料の不純物が遺伝子発現プロファイルの品質を損なわせる。更に、この方法は腫瘍細胞によって呈示されるＥｐＣＡＭ量の変化によって生じる感受性の変化に影響されやすい。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書中に記載のシステム、方法、及びデバイスの各々の態様はいくつかあってもよく、そのうちの単一のものが所望の特性に単独で関与するのではない。以下の特許請求の範囲に示されるように本開示の範囲を限定することなく、更なる顕著な特徴はここに手短に述べられるであろう。この考察を考えた後、特に「詳細な説明」と題された章を読んだ後に、この技術の特徴が希有な細胞を含む、細胞集団における比較的迅速かつ正確な細胞分析を含む利点をどのように提供するかが理解されよう。
【０００８】
本明細書中に開示のいくつかの実施形態は、不均一な細胞集団内部に存在する細胞の特異的な遺伝学的解析のための方法に関する。いくつかの実施形態においては、対象の細胞は同定され、同定した細胞は、標的の１以上の細胞を溶解させるのに十分なエネルギーでの前記細胞の照射によって、その細胞成分を周囲の培養基に放出させ、放出した核酸を含む培養基は標本抽出され、標本抽出した培養基に存在する核酸が分析される。いくつかの実施形態においては、細胞の溶解は、細胞が浸透を通して水を吸収し、実質的に破裂するように培養培地の浸透圧モル濃度を低くすることによってか、タンパク質を変性させるチオシアン酸グアニジンといったカオトロピック剤の添加によってか、あるいは、細胞膜を破壊し、かつタンパク質を変性させる、ドデシル硫酸ナトリウムといった界面活性物質の添加によって実現できる。細胞成分のいずれもこれらの方法によって分析でき、タンパク質、代謝物等を含むが、本明細書の実施例の多くは核酸の分析に関することに留意されたい。
【０００９】
いくつかの実施形態は、不均一な細胞集団内部にある希有な細胞から核酸を分離するための方法に関する。例えば、本方法は：（ａ）希有な細胞の濃度が希有な細胞を含む容器内で、少なくともＸ倍の倍数に増加するように、不均一な細胞集団を複数の容器に分割するステップであって、Ｘが不均一な細胞集団における希有な細胞の数によって分割した容器の数であるステップと；（ｂ）どの容器が希有な細胞を含むかを判定するために各々の容器の領域全体を実質的に迅速にイメージングするステップと；（ｃ）細胞を溶解させ、希有な細胞から培地に核酸を放出させるように、希有な細胞を含む容器に試薬を添加するステップと；（ｄ）放出した核酸を含む培地を、溶解した希有な細胞を含む容器のみから採取することによって、前記希有な細胞から前記核酸を採取するステップと；を具えうる。
【００１０】
いくつかの態様においては、本方法は例えば：（ａ）希有な細胞の濃度が希有な細胞を含む容器内で、少なくともＸ倍の倍数に増加するように、不均一な細胞集団を複数の容器に分割するステップであって、Ｘが不均一な細胞集団における希有な細胞の数によって分割した容器の数であるステップと；（ｂ）どの容器が希有な細胞を含むかを判定するために各々の容器の領域全体を実質的に迅速にイメージングするステップと；（ｃ）容器のイメージを参照することによって、希有な細胞を含む容器内で希有な細胞の位置を検出するステップと；（ｄ）他の細胞を顕著に溶解させずに希有な細胞を特異的に溶解させ、希有な細胞から培地に核酸を放出させるように、希有な細胞を含む容器内の希有な細胞の位置に集束したエネルギービームを誘導するステップと；（ｅ）放出した核酸を含む培地を、溶解した希有な細胞を含む容器から採取することにより、希有な細胞から核酸を採取するステップであって、希有な細胞の核酸が希有ではない細胞の核酸と対比して最大でＹ倍濃縮されており、Ｙが前記容器内の溶解されない希有ではない細胞の数であるステップと；を具えうる。
【００１１】
いくつかの態様においては、Ｘは例えば約１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、及び１００，０００にできる。容器は例えば、マルチウェルプレートのウェルにできる。
【００１２】
更なるいくつかの実施形態は、例えば：（ａ）イメージングに適した表面に不均一な細胞集団を配置するステップと；（ｂ）表面の領域全体を実質的に迅速にイメージングするステップと；（ｃ）表面のイメージを参照することによって表面上の希有な細胞の位置を検出するステップと；（ｄ）他の細胞を顕著に溶解させずに希有な細胞を特異的に溶解させ、希有な細胞から培地に核酸を放出させるように、希有な細胞の位置に集束したエネルギービームを誘導するステップと；（ｅ）放出した核酸を含む培地を、溶解した希有な細胞から採取することによって、希有な細胞から核酸を採取するステップであって、希有な細胞の核酸が希有ではない細胞の核酸と対比して最大でＹ倍濃縮されており、Ｙが前記表面上の溶解されない希有ではない細胞の数であるステップと；を具える方法に関する。いくつかの態様においては、Ｙは例えば約１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、及び１００，０００にできる。
【００１３】
本方法は更に、不均一な細胞集団を希有な細胞に選択的に結合する薬剤と接触させるステップを具えることができ、薬剤は光の特性として検出可能な信号を生成する。また、本方法は更に、リボヌクレアーゼ抑制物質を添加するステップを具えうる。
【００１４】
いくつかの実施形態は、不均一な細胞集団内部にある希有な細胞から核酸を分離する方法に関する。本方法は例えば：（ａ）希有な細胞の濃度が希有な細胞を含む容器内で、少なくともＸ倍の倍数に増加するように、不均一な細胞集団を複数の容器に分割するステップであって、Ｘが不均一な細胞集団における希有な細胞の数によって分割した容器の数であるステップと；（ｂ）どの容器が希有な細胞を含むかを判定するために各々の容器の領域全体を実質的にイメージングするステップと；（ｃ）細胞を溶解させ、希有な細胞から培地に核酸を放出させるように、希有な細胞を含む容器に試薬を添加するステップと；（ｄ）放出した核酸を含む培地を、溶解した希有な細胞を含む容器のみから採取することによって、前記希有な細胞から前記核酸を採取するステップと；を具えうる。
【００１５】
更に、いくつかの実施形態は不均一な細胞集団内部にある希有な細胞から核酸を分離する方法に関し、本方法は例えば：（ａ）希有な細胞の濃度が希有な細胞を含む容器内で、少なくともＸ倍の倍数に増加するように、不均一な細胞集団を複数の容器に分割するステップであって、Ｘが不均一な細胞集団における希有な細胞の数によって分割した容器の数であるステップと；（ｂ）どの容器が希有な細胞を含むかを判定するために各々の容器の領域全体を実質的にイメージングするステップと；（ｃ）希有な細胞を含む容器内で希有な細胞の位置を検出するステップと；（ｄ）他の細胞を顕著に溶解させずに希有な細胞を特異的に溶解させ、希有な細胞から培地に核酸を放出させるように、希有な細胞を含む容器内の希有な細胞の位置にエネルギービームを誘導するステップと；（ｅ）放出した核酸を含む培地を、溶解した希有な細胞を含む容器から採取することにより、希有な細胞から核酸を採取するステップと；を具えうる。いくつかの実施形態においては、検出は例えば容器のイメージを参照することによって行われうる。いくつかの態様においては、いくつかの態様においては、この採取によって、希有な細胞から核酸が採取され、希有な細胞の核酸は希有ではない細胞の核酸と対比して最大でＹ倍濃縮される。ここで、Ｙは容器内の溶解されない希有ではない細胞の数である。いくつかの態様においては、Ｙは例えば約１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、及び１００，０００となりうる。
【００１６】
いくつかの実施形態においては、本方法は更に例えば、不均一な細胞集団を希有な細胞に選択的に結合する薬剤と接触させるステップを具え、薬剤は光の特性として検出可能な信号を生成してもよい。更にいくつかの実施形態においては例えば、ステップ（ａ）ないし（ｅ）のいずれかでリボヌクレアーゼ抑制物質を添加するステップを具えうる。いくつかの態様においては、Ｘは例えば、約１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、又は１００，０００にできる。いくつかの態様においては、容器は例えば、マルチウェルプレートのウェルであってもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態は不均一な細胞集団内部にある希有な細胞から核酸を分離する方法に関する。本方法は例えば：（ａ）イメージングに適した表面に不均一な細胞集団を配置するステップと；（ｂ）表面の領域全体を実質的にイメージングするステップと；（ｃ）表面のイメージを参照することによって表面上の希有な細胞の位置を検出するステップと；（ｄ）他の細胞を顕著に溶解させずに希有な細胞を特異的に溶解させ、希有な細胞から培地に核酸を放出させるように、集束したエネルギービームを希有な細胞の位置に誘導するステップと；（ｅ）放出した核酸を含む培地を、溶解した希有な細胞から採取することによって、希有な細胞から核酸を採取するステップと；を具えうる。
【００１８】
いくつかの実施形態においては、上述及び本明細書中の他の場所に記載の方法は更に例えば、細胞をナノ粒子標識で標識するステップを具える。更に、このナノ粒子標識はエネルギービームを介した細胞溶解の効率を改善するのに用いることができる。
【００１９】
更なるいくつかの実施形態は細胞成分を分析する方法に関する。本方法は例えば：分析用の対象の細胞を含む細胞集団を提供するステップと；細胞集団内で少なくとも１の対象の細胞を検出するステップと；エネルギービームを少なくとも１の対象の細胞の位置に誘導するステップであって、エネルギービームのエネルギーが、細胞から成分を放出するのに十分であり、少なくとも１の対象の細胞を少なくとも部分的に溶解するのに十分であるステップと；対象の細胞から放出した成分を分析するステップと；を具えてもよい。いくつかの態様においては、対象の細胞は限定しないが例えば、有核血液細胞、初代細胞、細胞株、腫瘍細胞、疾患細胞、感染細胞、組換え細胞、トランスフェクト細胞、操作細胞、又は変異細胞であってもよい。いくつかの態様においては、細胞集団は限定しないが例えば、血液、リンパ、脳脊髄液、骨髄、外科試料、生検材料、細胞培養液、細胞ライブラリ、及び操作された細胞集団等に由来する細胞集団であってもよい。いくつかの態様においては、本方法は更に例えば、細胞集団を少なくとも１の対象の細胞に特異的な標識と接触させてもよい。標識は例えば、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、抗体のフラグメント、レクチン、リガンド、タンパク質、ペプチド、脂質、アミノ酸、核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）といった修飾核酸、合成小分子、又は標識用のその他の成分のうちの１以上を含んでもよい。限定しないがいくつかの態様においては、標識は例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、Ｃｙ３若しくはＣｙ５、フルオレセインイソチオシアナート、フィコアロシアニン（ｐｈｙｃｏａｌｌｏｃｙａｎｉｎ）、フィコエリトリン、ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＬＥＸＡＦｌｕｏｒ  Ｄｙｅ、ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、クマリン及びクマリン誘導体、又はＴＡＭＲＡのうちの１以上を含んでもよい。いくつかの態様においては、標識は更にナノ粒子を含んでもよい。いくつかの態様においては、ナノ粒子はエネルギービームを介した細胞溶解の効率を改善してもよい。
【００２０】
いくつかの態様においては、検出ステップは例えば、細胞集団をイメージングするステップを含みうる。更に検出ステップは例えば、標識の存在によって少なくとも１の対象の細胞を検出するステップを具えうる。いくつかの態様においては、本方法は更に、リボヌクレアーゼ抑制物質を提供するステップを具えてもよい。いくつかの態様においては、細胞集団は例えば２以上の容器に分割してもよい。いくつかの態様においては、本方法は更に例えば、Ｆｃ受容体を遮断する試薬を添加するステップを具えてもよい。
【００２１】
いくつかの態様においては、少なくとも１の対象の細胞は例えば、１０，０００中約１未満の濃度で細胞集団に存在してもよい。いくつかの態様においては、少なくとも１の対象の細胞は例えば、１００，０００の細胞中に約１ないし１０，０００，０００の細胞中に約１の濃度で前記細胞集団に存在できる。
【００２２】
いくつかの態様においては、本方法は更に例えば、前記放出した細胞成分を最低でも採取するステップを具えてもよい。例えば、細胞成分は限定しないが、核酸、ポリペプチド、脂質、小器官等であってもよい。
【００２３】
いくつかの態様においては、この分析は例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ解析、ヌクレアーゼプロテクション解析、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ分析、Ｔａｑｍａｎ  ＳＮＰアッセイ、ＰＣＲ制限断片長多型、ＲＮＡ塩基配列決定法、ＤＮＡ塩基配列決定法、次世代塩基配列決定法、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ）ＤＮＡ次世代塩基配列決定技術、又はＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術のうちの１以上を具えてもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態は本明細書中の上述及び他の場所に記載の方法のうちの１以上、ならびに本明細書中に記載の方法の個々のステップ又は特徴のうちの１以上を実行するように構成されるデバイス、システム及び装置に関する。
【００２５】
前述は概要であり、ひいては必要に応じて詳細の簡素化、一般化、及び省略を含んでいる。結果的に、当該技術分野の当業者は本概要が単なる例示であり、任意の方法で限定することを目的とするものではないことを理解するであろう。本明細書中に記載の方法、組成物及び／若しくはデバイス、ならびに／又は他の発明の対象の他の態様、特徴、及び利点は、本明細書で説明される教示で明確となるであろう。本概要は、詳細な説明において以下に更に説明される単純化した形態で、概念の選択を誘導するように規定される。本概要は、請求項の発明の対象の主要な特徴又は必須の特徴を同定することを目的とするものではなく、請求項の発明の対象の範囲を決定する補助として用いることを目的とするものでもない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本開示の前述及び他の特徴は、添付の図面と連携して以下の説明及び添付した特許請求の範囲から更に十分に明確となるであろう。これらの図面が本開示によるいくつかの実施形態のみを示し、ゆえに範囲の限定と見なすべきではないとの理解で、本開示は添付の図面を用いることを通して更に限定してかつ詳細に記載されるであろう。
【００２７】
【図１】図１は、様々な処置後の組織培養ウェルにおけるリボヌクレアーゼ活性を示すグラフである。
【図２】図２は、溶解細胞由来のＲＮＡの収量に対する多様な培地配合物の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒトＰＢＭＣのバックグラウンドにおける免疫染色したＳＷ４８０細胞の画像である。矢印はＳＷ４８０細胞を示す。
【図４】図４は、溶解した単一のＳＷ４８０細胞由来のＫｉ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２における変異の存在を示す配列トレースである。
【図５】図５は、レーザを介した溶解の効率に対する金のナノ粒子標識の影響を示すグラフである。
【図６】図６は、１６の単一の腫瘍細胞試料における５の選択した遺伝子の検出を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載の例示的な実施形態は限定を意味するものではない。本明細書中の教示は多数の異なる方法に適用でき、例えば請求項によって規定及び網羅されるものを含みうる。本明細書における態様は広範で多様な形態で具現化でき、本明細書中に開示の特定の構造、機能、又はその双方は単なる代表例であることは明確とすべきである。本明細書中の教示に基づいて、当該技術分野の当業者は、本明細書中に開示された態様がその他の態様とは独立に実装してもよく、これらの態様のうちの２以上を様々な方法で組み合わてもよいことを理解するであろう。例えば、当該技術分野の当業者が本明細書で説明した態様の適切な数量又は組み合わせを用いることによって、システム又は装置は実装され、あるいは方法が実行されうる。更に、本明細書で説明した態様のうちの１以上の態様に加えて、あるいはそれ以外の他の構造、機能、又は構造及び機能を用いて、このようなシステム又は装置が実施され、あるいはこのような方法が実行されうる。本明細書で示した発明の対象の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態が用いられ、他の変更がなされうる。本開示の態様は、一般的に本明細書に記載するように、かつ図面に例示したように、広範で多様な形態で配置、置換、組み合わせ、及び設計することができ、その総ては明確に考慮され、本開示の一部をなすことは容易に理解されよう。その他の実施形態は開示及び特許請求の範囲に含まれるため、開示の実施形態は以下に記載の実施例に限定するものではない。
【００２９】
本明細書中に開示のいくつかの実施形態は、不均一な細胞集団の内部に存在する細胞の特異的な遺伝学的解析のための方法に関する。いくつかの実施形態においては、対象の細胞は同定され、同定した細胞は、標的の１以上の細胞を溶解させるのに十分なエネルギーでの前記細胞の照射によって、その細胞成分を周囲の培養基に放出させ、放出した核酸を含む培養基は標本抽出され、標本抽出した培養基における物質、例えば標本抽出した培養基に存在する核酸が分析される。いくつかの実施形態においては、「希有な（ｒａｒｅ）」細胞は１，０００中に１ないし１００，０００，０００中に１程度に既定の細胞集団に希有に存在する。いくつかの好適な実施形態においては、希有な細胞は１００，０００中に１ないし１，０００，０００中に１程度に既定の細胞集団に希有に存在する。他の好適な実施形態においては、希有な細胞は１，０００，０００中に１ないし１０，０００，０００中に１程度に既定の細胞集団に希有に存在する。
【００３０】
希有な細胞の分析用の方法の固有の特徴は分析すべき細胞が分析前に任意の方法で精製又は機械的処置を行う必要がないことである。更には、本方法は非常に特異的にできる。分析の特異性は溶解すべき細胞の照射の正確性にある。レーザを用いて、例えば単一の細胞を標的にでき、混合した細胞集団内で特異的に溶解でき、細胞分析における非常に高い特異性を提供できる。更に、対象の細胞の特異的な同定を検出目的のみに、例えば機械的分離のため以外に用いてもよい。この属性によって、機械的制約を考慮する必要がないため、細胞標識の強度の点で更に高い許容度を可能にする。更に、様々な標識の組合せは現行の技術に容易に用いることができる。最後に、分泌生成物の測定（Ｈａｎａｎｉａら，Ｂｉｏｔｅｃｈ，ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９１（７），２００５、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）といった機能的な標識は、いくつかの実施形態においてはを循環性の腫瘍細胞の同定に用いられうる。分泌生成物は細胞の表面又は細胞の近傍に捕捉して、例えば、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる米国特許第７，４２５，４２６号に記載の標識抗体を用いて、分析及び更なる検出をしてもよい。
【００３１】
上述したように、本方法は、例えば他の細胞の混合物に存在する対象の細胞由来の核酸といった細胞由来の物質を分析するのに用いてもよい。核酸はリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又は双方の混合物の高分子である。ＲＮＡは一般的には長さが５０ないし１０，０００ヌクレオチドのリボヌクレオチドの高分子であり、ＤＮＡは一般的には長さが５０ないし２２０，０００，０００ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドの高分子である。限定しないが、この技術を用いて溶解細胞から得られうる核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）といった挿入したコンストラクトから発現するＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、及びウイルスＤＮＡといった細胞に形質移入されたＲＮＡを含む。
【００３２】
得られた核酸は多様な方法で分析でき、限定しないが：ＰＣＲ；ＲＴ−ＰＣＲ；Ｔａｑｍａｎプローブ又はＳｙｂｒグリーンケミストリーを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲ；例えばＳｅｑｕｅｎｏｍ社（カリフォルニア州サンディエゴ）のＭａｓｓ  Ａｒｒａｙシステムを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲ；マイクロアレイ解析；ヌクレアーゼプロテクション解析；Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ分析（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）；Ｔａｑｍａｎ  ＳＮＰアッセイ；ＰＣＲ制限断片長多型；ＲＮＡ塩基配列決定法；ＤＮＡ塩基配列決定法；Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、あるいはＡＢＩ  Ｓｏｌｉｄ型式の機器、あるいはＲｏｃｈｅ４５４型式の機器、あるいはＨｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のＨｅｌｉｓｃｏｐｅ型式の機器を用いた次世代塩基配列決定法；Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ）ＤＮＡ次世代塩基配列決定技術（カリフォルニア州メンロパークのＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）；及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ形式の技術（ワシントン州シアトルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）；を含む。
【００３３】
細胞は任意の起源のものにでき、原核細胞及び真核細胞を含む。限定しない例は哺乳類細胞、齧歯類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞を含む。細胞は例えば、血液、リンパ、脳脊髄液、骨髄、外科試料、又は生検材料等から得てもよい。分析すべき細胞は更に、例えば細胞培養液、細胞ライブラリ、及び操作された細胞集団から得てもよい。本明細書中に開示の方法で用いる前に、細胞は例えば、密度勾配遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、免疫磁気式濃縮（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、固定化抗体の捕捉を介した濃縮、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、膜濾過、無関係な細胞の凝集、及び無関係な細胞の化学的溶解によって精製してもよい。細胞は例えば、有核血液細胞、初代細胞、細胞株、腫瘍細胞、疾患細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞、操作細胞、及び変異細胞等を含むことができる。
【００３４】
標的細胞からの細胞成分の放出は、細胞を部分的に溶解させるのに十分な放射線量で標的細胞を照射することによって達成できる。好適な照射源は、細胞を溶解させるのに十分な波長とエネルギーのレーザである。いくつかの実施形態においては、本開示の方法において有用なレーザは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、及び３０００ｎｍの群から選択される任意の範囲に等しい、あるいはその間にある波長の放射線を送達するレーザである。いくつかの実施形態においては、例えば、波長は約３５５ｎｍないし約２９４０ｎｍ、好適には３５５ないし１０６４ｎｍ、最も好適には３５５ないし５３２ｎｍにできる。いくつかの実施形態においては、本開示の方法において有用なレーザは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００Ｊ／ｃｍ２未満、それを超える、それに等しい、あるいはその間の任意の数の群から選択されるエネルギー密度の放射線量を送達することができる。いくつかの実施形態においては、本開示の方法において有用なレーザは、１０７、１０８、１０９、１０１０、及び１０１１Ｗ／ｃｍ２未満、それを超える、それに等しい、あるいはその間の任意の数の群から選択される照射量の放射線量を送達することができる。本明細書中で用いられるように、照射量という用語は面積あたりの動力を意味し、多くの場合１平方センチメータあたりのワット単位で示される。いくつかの実施形態においては、ＬＥＡＰ（登録商標）型式の細胞処理ワークステーション（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ：カリフォルニア州サンディエゴのＣｙｎｔｅｌｌｅｃｔ社）は細胞を同定及び照射するのに用いることができる。更に、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる米国特許第６，５１４，７２２号に開示のデバイス、システム、及び方法を利用してもよい。
【００３５】
レーザは他の細胞を顕著に溶解することなく、希有な細胞を特異的に溶解させるのに用いることができる。いくつかの実施形態においては、他の細胞を顕著に溶解することなく、細胞集団における１０％未満の希有ではない細胞がレーザによって溶解されることが示されている。いくつかの好適な実施形態においては、他の細胞を顕著に溶解することなく、細胞集団の９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、又は２％未満の希有ではない細胞がレーザによって溶解されることが示されている。更に好適な実施形態においては、他の細胞を顕著に溶解することなく、細胞集団の１％未満の希有ではない細胞がレーザによって溶解されることが示されている。更なる好適な実施形態においては、他の細胞を顕著に溶解することなく、希有な細胞と比較してわずかな希有ではない細胞がレーザによって溶解されることが示されている。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載の方法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０平方センチメートル未満に等しい、あるいはその間の任意の数の生物学的試料を最低でも１分あたりにイメージングする。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載の方法は少なくとも５万、１０万、２５万、５０万、１００万、２０００万、４００万、又は８００万の生物学的試料の細胞を含む細胞集団で１分あたりに行われる。
【００３７】
リボヌクレアーゼ抑制物質は、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＨ、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＩ、及びリボヌクレアーゼＩＩＩを含む、既知のリボヌクレアーゼのうちの任意又は総ての活性を抑制するタンパク質、タンパク質のフラグメント、ペプチド、又は小分子である。既知のリボヌクレアーゼ抑制物質の一部の例は限定しないが、ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ（ウィスコンシン州マディソンのＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｓｕｐｅｒａｓｅ−ｉｎ（テキサス州オースティンのＡｍｂｉｏｎ社）、Ｓｔｏｐ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（メリーランド州ゲイサーズバーグの５ＰＲＩＭＥ社）、ＡＮＴＩ−ＲＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（クローン化物質：Ａｍｂｉｏｎ社），ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＲＮａｓｉｎ（登録商標：ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ社）、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（インディアナ州インディアナポリスのＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（オハイオ州クリーブランドのＵＳＢ社）、及びＰｒｏｔｅｃｔＲＮＡ（商標：ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ社）を含む。いくつかの実施形態においては、リボヌクレアーゼ抑制物質は細胞の位置に、例えば分析すべき１以上の細胞を含むウェルに、ウェルにおけるリボヌクレアーゼ活性を顕著に抑制するのに十分な、１ないし１００％、好適には２０ないし１００％、最も好適には５０ないし１００％の濃度で添加してもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態においては、対象の１以上の細胞の同定は対象の１以上の細胞を特異的に結合するが、分析すべきではない混合物中の他の細胞には結合しない薬剤を用いて実現できる。標識薬剤は任意の薬剤にでき、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖといったそのフラグメントを含む。標識薬剤は例えばレクチンにできる。標識薬剤は、検出可能な信号、例えば蛍光、化学発光、蛍光寿命、蛍光偏光、及び回折等といった光の特性として検出可能な信号を精製できる任意の部分を用いて標識できる。標識薬剤は更に、例えばホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、及びβラクタマーゼ等といった酵素標識を用いて標識できる。いくつかの態様においては、フルオロフォアが好適である。好適なフルオロフォアは、例えば好適とされるＣｙ３又はＣｙ５、フルオレセインイソチオシアナート、フィコアロシアニン、フィコエリトリン、好適にはローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＬＥＸＡＦｌｕｏｒ  Ｄｙｅｓ、ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、クマリン及びクマリン誘導体、ならびにＴＡＭＲＡ等を含んでもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態においては、Ｆｃ受容体を遮断する試薬を更に用いてもよい。例えば、遮断試薬によって標的細胞又は標識細胞の細胞性の死滅を防止できる。添加した腫瘍細胞の細胞性の死滅は、腫瘍細胞上の表面抗原に対する腫瘍細胞及び一次ヒトＰＢＭＣの一次抗体との混合を染色した後に観察された。この効果はＰＢＭＣ、好適には単球又はマクロファージの腫瘍細胞との付着が明確に観察されたので明確となった。いくつかの態様においては、Ｆｃ受容体を遮断する試薬の含有は、所望されない可能性のあるこの効果を予防するのに用いられる。Ｆｃ受容体を遮断する試薬は抗体のＦｃ領域の細胞上に存在するＦｃ受容体との相互作用を遮断する。Ｆｃ受容体を遮断する試薬は例えば、受容体結合に対する細胞標識のために用いられる抗体と競合する免疫グロブリンであってもよい。更には、Ｆｃ受容体に結合し遮断する特異的な抗体を更に用いてもよい。抗体のＦｃ領域のＦｃ受容体への結合を抑制する小さな合成分子は更に、Ｆｃ受容体の遮断試薬として用いてもよい。好適な遮断試薬は例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社（カリフォルニア州オーバーン）のＦｃＲ遮断試薬を含む。
【００４０】
発現プロファイル用に用いられるマイクロアレイは、当該技術分野の当業者に既知のいくつかの異なる様式で売られている。限定しない例は、米国特許第５，４４５，９３４号、第７，３７８，２３６号、及び第６，３２６，４８９号に示され、その各々は、その方法、物質及び教示の総てについてその全体が引用によって本明細書中に組み込まれる。ほとんどのマイクロアレイはＤＮＡの空間配置の進展を用いて、ハイブリダイゼーションによる溶液中の対応するｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの量（集団的に「標的（ｔａｒｇｅｔ）」と知られる）を測定している。マイクロアレイにある点から生成される信号は試料中の特定の配列、一般的には特定の遺伝子の発現と相関される。一般的には、異なるｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの数百ないし数千の発現はマイクロアレイでアッセイされる。マイクロアレイは更に、ゲノムＤＮＡにおける遺伝子のコピー数の変動（Ｐｉｎｋｅｌら，１９９８、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）、単一のヌクレオチド多型の存在（Ｐａｓｔｉｎｅｎら，２０００、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）、及びゲノムＤＮＡのメチル化状態（Ｙａｎら，２００１、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）を評価するのに用いることができる。新規のマイクロアレイはＶｅｒａｃｏｄｅシステム（カリフォルニア州サンディエゴのＩｌｌｕｍｉｎａ社）といったビースによるアレイを含む。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ社（ワシントン州シアトル）は「逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）」確率順序マイクロアレイを市販し、ＤＮＡの標的は、平面で固定及び分析される。任意のこのようなマイクロアレイは、本明細書中に開示の方法、システム及び装置に組み込むことができる。
【００４１】
いくつかの実施形態においては、ナノ粒子は例えば細胞の溶解を補助するために本方法、物質、装置及びシステムに組み込んでもよい。ナノ粒子は細胞のレーザを介した溶解を促進するのに用いることができる。ナノ粒子は大きさが１ないし１０００ｎｍ、好適には２ないし５００ｎｍ、最も好適には３ないし１００ｎｍの範囲にある粒子である。ナノ粒子は広範で多様な物質で生成でき、金及び銀といった貴金属、ならびにリン化インジウム及び硫化カドミウムといった半導体物質を含む。ナノ粒子は、当該技術分野の当業者に既知の様々な方法を介して製造できる。例は金溶液の沈殿の制御を介して形成される金のナノ粒子を含む（Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈら，１９５１、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）。ナノ粒子はコーティングして、懸濁液における粒子を安定化させるか、あるいはナノ粒子の細胞毒性を低減できる。例えば、金のナノ粒子をウシ血清アルブミンでコーティングして、懸濁液を安定化してもよい。ナノ粒子は分子に付着して、細胞との結合を促進できる。ナノ粒子の付着用の好適な分子の限定しない例は、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチド、レクチン、脂質、アミノ酸、核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）といった修飾核酸、合成小分子を含む。前記分子をナノ粒子に付着させるためのいくつかの限定しない方法は、当該技術分野の当業者に既知である。付着は例えば共有結合性又は可逆性であってもよく、静電性又は疎水性の相互作用を含む。いくつかの実施形態においては、ナノ粒子は標的細胞のレーザ照射の前の処理における任意の時点で細胞に添加できる。例えば、ナノ粒子は最初の細胞染色ステップ中、あるいは細胞がウェルに分配された後に添加できる。
【００４２】
ナノ粒子の好適な表面修飾のためのスクリーニング方法が考案された。多様な細胞型は１μＭの最終濃度のＣａｌｃｅｉｎＡＭで装填され、マルチウェルプレートに播種された。濃度の範囲であり、表面修飾が異なるナノ粒子は異なるウェルに添加された。細胞はＬＥＡＰ型機器でレーザパルスで照射され、細胞の溶解はすなわちレーザ処理後のＣａｌｃｅｉｎＡＭ陽性細胞の低減として測定した。レーザを介した細胞の溶解を増加させるための異なるナノ粒子のコーティングの効力は溶解効率に対するナノ粒子濃度の用量反応曲線からＥＣ５０値を得ることによって測定した。
【実施例１】
【００４３】
《ヒト血液由来の腫瘍細胞の循環分析》
一実施形態においては、患者からのヒト血液は採取され、当該技術分野の当業者に既知の方法を含む任意の好適な方法、例えば緩衝液を含む塩化アンモニウムを用いて赤血球を溶解することによって、赤血球を枯渇させた。赤血球を枯渇した血液試料は循環性の腫瘍細胞を特異的に同定し、蛍光といった光の特性によって検出可能となる標識抗体と混合される。フィコエリトリン接合型の抗ＥｐＣＡＭ抗体はこのような抗体の例である。このような抗体は例えば多様な市販の原料から得ることができる。標識されない一次抗体と一次抗体に対して配向される標識した二次抗体との混合物を更に用いてもよい。実施例はマウス抗ＥｐＣＡＭの一次抗体とヤギ抗マウス型のフィコエリトリンで標識した二次抗体とを含む。洗浄後、細胞は３８４ウェルプレートといったマルチウェルプレートに、１のウェルにつき１０ないし１００，０００の細胞密度で分割できる。腫瘍細胞は例えば、プレートをイメージングして、腫瘍細胞を同定することによって同定してもよい。必要に応じて、リボヌクレアーゼ抑制物質は１以上の腫瘍細胞を含むウェルに添加でき、例えば、標的細胞を実質的に溶解するのに十分なレーザパルスで照射することによって溶解される。培地は吸引してもよい。採取したＲＮＡは例えば、遺伝子の選択数に対するＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ遺伝子発現プロファイル、次世代塩基配列決定法、又は任意の他の好適な方法を含む任意の好適な方法によって分析できる。いくつかの実施形態においては、生成したデータは、例えば癌検診、癌診断、癌の予測、治療のモニタリング、治療の選択のために、あるいは癌検診、癌診断、癌の予測、治療のモニタリング、及び治療の選択のために好適な標識を同定するための回収段階で用いることができる。
【実施例２】
【００４４】
《レンチウイルスのトランスフェクト細胞の分析》
別の実施形態においては、１００ないし１００，０００，０００のｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｍｉｒ（アラバマ州ハンツビルのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、又はｃＤＮＡといった、異なるＤＮＡコンストラクトのレンチウイルスのライブラリは細胞集団に感染させる。しばらくして、光の特性の形態での機能的な読出し情報、例えば緑色蛍光タンパク質といった蛍光性のレポータータンパク質のレベルにおける変化を用いて、所望の特性を有する感染したＤＮＡコンストラクトを含む１以上の細胞を同定できる。所望の特性は例えば、タンパク質の発現又は分泌、炭水化物又は脂質の発現、信号伝達経路の活性化又は不活性化、タンパク質の細胞内分布、タンパク質、炭水化物、又は脂質の結合特性を含みうる。必要に応じて、リボヌクレアーゼ抑制物質は分析すべき細胞を含むウェルに添加してもよい。同定した１以上の細胞は、例えば標的細胞を溶解するのに十分なレーザパルスでの照射によって溶解できる。培地は例えば吸引して、採取してもよい。溶解細胞中に存在するＤＮＡコンストラクトは例えば、ＰＣＲ、ＰＣＲ及び塩基配列決定法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及び塩基配列決定法、マイクロアレイ解析、次世代塩基配列決定、又はその他の好適な方法を通して同定してもよい。
【実施例３】
【００４５】
《タンパク質変異体を発現する細胞の分析》
別の実施形態においては、対象のタンパク質の変異体のＤＮＡライブラリを発現する細胞集団は、例えばイメージングによって分析されて、所望の特性でタンパク質変異体を発現する１以上の細胞を同定する。所望の特性は例えば：タンパク質発現のレベル；細胞内及び細胞外のタンパク質の分布；タンパク質の折畳み構造；タンパク質の熱安定性；細胞をサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、増殖因子、神経伝達物質、及び脂質といった外因性薬剤で刺激した後のタンパク質局在化の変化；を含む。ＤＮＡを分析すべきである場合は、同定した細胞は標的細胞を溶解するのに十分なレーザパルスで照射することによって溶解してもよい。培地は吸引してもよく、溶解細胞内に含まれるＤＮＡコンストラクトは例えば、ＰＣＲ又はＰＣＲ及び更なる塩基配列決定法によって同定してもよい。ＲＮＡを分析すべきである場合は、リボヌクレアーゼ抑制物質はウェルにおけるリボヌクレアーゼ活性を顕著に阻害するのに十分な濃度でウェルに添加でき、同定した細胞は例えば、標的細胞を溶解するのに十分なレーザパルスで照射することによって溶解してもよい。培地は吸引でき、溶解細胞内に含まれる核酸コンストラクトは例えば、ＲＴ−ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ及び更なる塩基配列決定法等によって同定してもよい。
【実施例４】
【００４６】
《組織培養細胞の分析》
別の実施形態においては、組織から分離した初代細胞は細胞培養液のプレートで培養される。例えば、ペプチド、タンパク質、タンパク質のフラグメント、小分子、脂質、カンナビノイド、アミノアルキルインドール、エイコサノイド、天然抽出物、及び分取した組織抽出物等にできるリガンドは細胞を含む細胞培養液のウェルに添加してもよい。リガンドの添加に反応する細胞は例えば：ＦＬＵＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）といったＣａ２＋反応性染料によって測定される細胞内Ｃａ２＋の上昇又は減少等といった光の特性における変化；細胞形状における変化；細胞によって発現したレポーター遺伝子由来の信号の変化；あるいはヨウ化プロピジウムといった検出可能な染料の細胞への流入；によって同定できる。リボヌクレアーゼ抑制物質はウェルにおけるリボヌクレアーゼ活性を顕著に抑制するのに十分な濃度で、リガンドの添加に反応する細胞を含むウェルに添加できる。同定した細胞は例えば、標的細胞を溶解するのに十分なレーザパルスで照射することによって溶解してもよい。培地は例えば吸引によって採取でき、培地に放出されるＲＮＡは例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ解析、次世代塩基配列決定法、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ形式の技術、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイ（カリフォルニア州フレモントのＰａｎｏｍｉｃｓ社）、Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）、又は任意の他の好適な方法を用いて測定してもよい。発現データの反応細胞及び反応しない細胞との比較によって、例えば、添加したリガンドに対する反応性の要因となる１以上のｍＲＮＡ及び対応する１以上のタンパク質の同定を可能にする。更に、反応細胞からの発現データは反応する細胞型を同定することができる。
【実施例５】
【００４７】
《「分割（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）」技術を用いたヒト血液由来の循環性の腫瘍細胞の分析》
別の実施形態においては、患者からのヒト血液は採取され、赤血球が枯渇され、循環性の腫瘍細胞を特異的に同定し、かつ、蛍光といった光の特性によって検出可能となる標識抗体と混合される。フィコエリトリン接合型の抗ＥｐＣＡＭ抗体はこのような抗体の例である。洗浄後、細胞は３８４ウェルプレートといったマルチウェルプレートに、１のウェルにつき１００ないし１００，０００の細胞密度で播種される。マルチウェルプレートは腫瘍細胞を同定するのにイメージングされる。いくつかの態様においては、分割が利用できる。分割とは、サンプルを部分的なサンプルに分割し、部分的なサンプルを容器、あるいはマルチウェルプレートのウェルといった別個に分割された格納領域に配置することである。いくつかの実施形態においては、本方法は各々の容器の領域全体を実質的にイメージングしてどの容器が希有な細胞を含むかを判定する。本明細書中で用いられるように、「各々の容器の領域全体を実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｔｈｅ  ｅｎｔｉｒｅ  ａｒｅａ  ｏｆ  ｅａｃｈ  ｂｉｎ）」は例えば、容器の領域の６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、及び１００％より大きい、それと等しい、あるいはその間の数又は範囲を含んでもよい。多数のウェルに血液試料を分配する分割の効果によって、希有な腫瘍細胞の濃度は、存在する希有なウェルで増加する。１ウェルあたりの血液細胞の数が５，０００である場合、単一の腫瘍細胞の濃度は腫瘍細胞が存在するウェルにおいては５，０００中に１であり、腫瘍細胞が存在しないウェルにおいては０となる。腫瘍細胞が検出されうる特定のウェルにおける腫瘍細胞の発生頻度の明確な増加は従って、遺伝子分析の感受性を増加させる。１以上の腫瘍細胞を含む１以上のウェルは例えば、ＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて溶解される。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡは例えば、ＰＣＲ、ＰＣＲ及び塩基配列決定法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及び塩基配列決定法、定量ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ解析、次世代塩基配列決定法、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ形式の技術、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイ、Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘアッセイ、又はその他の好適な方法によって抽出及び分析される。
【実施例６】
【００４８】
《溶解細胞由来のＲＮＡの回収時のリボヌクレアーゼ抑制物質及びＲＮＡ担体の効果》
本実施例は試薬配合物によって溶解したＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡの回収の最適化について述べる。単一の細胞は１０ないし１００ｐｇの全ＲＮＡを含みうる。細胞培養液のプレートのウェルにおいて生じた単一細胞の溶解には、放出される少量のＲＮＡが表面への吸収によって、あるいは培地に存在するか、溶解細胞から放出されるかのいずれかであるリボヌクレアーゼによる分解を通して失われるのではないかという懸念がある。
【００４９】
リボヌクレアーゼ活性に関する試験は以下のように行った。３８４ウェルのＣ−ｌｅｃｔ（商標）型式のプレート（カリフォルニア州サンディエゴのＣｙｎｔｅｌｌｅｃｔ社）は、細胞培養液のインキュベータにおいて、ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が１０％である１００μｌの完全培地（ＭＥＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、３７℃で一晩インキュベーションを行った。インキュベーション後、ウェルは手動式のマルチピペットを用いてＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３回洗浄した。ＲＮＡｓｅ  Ａｌｅｒｔ試薬（Ａｍｂｉｏｎ社）は製造業者の推奨どおりに混合し、組織培養ウェルに添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、試料はＧｅｎｉｏｓプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ社）で読み取られた。結果は図１に示す。試験された条件はＨＢＳＳ洗浄の有無（＋／−）及び１ユニット／μｌの最終濃度でのリボヌクレアーゼ抑制物質（ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ（登録商標）：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の添加の有無（＋／−：「ＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈ」と称する）であった。結果は：ａ）完全培地はＲＮＡｓｅ  Ａｌｅｒｔキットの正のコントロールと等量の多量のリボヌクレアーゼ活性物質を含み、それは１ウェルあたり５０×１０−６ユニットのリボヌクレアーゼＡであり；ｂ）リボヌクレアーゼ抑制物質の添加によって、リボヌクレアーゼ活性物質の量が有意に低減し；ｃ）ＨＢＳＳでウェルを３回洗浄することによって、ウェルにおけるリボヌクレアーゼ活性は低減するが除去されず；ｄ）ＨＢＳＳでウェルを洗浄し、かつリボヌクレアーゼ抑制物質を添加することによって、リボヌクレアーゼ活性物質の量が最小となる；ことを示した。この実験から、リボヌクレアーゼ抑制物質の添加によって、ウェルにおける溶解細胞由来のＲＮＡの回収が促進できると結論づけた。
【００５０】
１ウェルあたり約２００のＨｅＬａ細胞が、３８４ウェルのＣ−ｌｅｃｔ型式のプレート（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ社）に播種された。播種の翌日に、細胞はＣａｌｃｅｉｎＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色され、ウェルはＨＢＳＳで洗浄された。２０のＨｅＬａ細胞はＬＥＡＰ型機器（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ社）を用いて、エネルギーが１０．４μＪで、かつレーザスポットの直径が１７．２μｍの５３２ｎｍのレーザパルスで照射することによって溶解された。半分の培地（ＨＢＳＳ）が採取され、そこからＲＮＡがＲＮｅａｓｙマイクロカラム（カリフォルニア州バレンシアのＱｉａｇｅｎ社）を用いて抽出した。ＲＮＡ収量は全ＲＮＡの指標としてＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを定量することによって見積もられた。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡは、ＡＢＩ７５００型式の実時間ＰＣＲ機器（カリフォルニア州フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で絶対定量的なＳｙｂｒグリーンでのＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて定量した。逆転写はＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行われ、ＳｙｂｒグリーンによるＰＣＲはＭａｘｉｍａ  ＳｙｂｒグリーンとｑＰＣＲとの混合物（メリーランド州グレンバーニーのＦｅｒｍｅｎｔａｓ社）を用いて行われた。以下の培地配合物が多様な組合せ：１倍濃度のリボヌクレアーゼ抑制物質（１Ｕ／μｌ；ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ：「ＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈ」と称する）の有無（＋／−）；ＲＮＡ担体（ＰＩ：１ウェルあたり１００ｎｇのポリイノシン酸；ＳＩＧＭＡ社）の有無（＋／−）；２倍濃度のリボヌクレアーゼ抑制物質の有無（＋／−）；で試験された。正のコントロールとして、ウェルにおける総ての細胞は１００ｎｇのポリイノシン酸を含むＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙキット）の添加によって溶解され、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙマイクロカラムで精製され、上述のとおりＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量は正のコントロールに対して規格化され、予期される量に対する割合（％）として示している。結果は図２に示される。データは：ａ）ＨＢＳＳにおける２０の細胞の溶解によってＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの収量が４．０％となり；ｂ）ポリイノシン酸の添加のみによっては、ＲＮＡの収量は有意に改善されず；ｃ）リボヌクレアーゼ抑制物質の添加によって、ＲＮＡの収量が５３．３％に劇的に改善され；ｄ）リボヌクレアーゼ抑制物質の量の増加によっては、ＲＮＡの収量が改善されない；ことを示した。リボヌクレアーゼ抑制物の添加によって、溶解細胞由来のＲＮＡの収量が有意に改善されることが結論づけられた。
【実施例７】
【００５１】
《ヒト血液細胞における希有な腫瘍細胞の変異分析》
関連モデルにおける希有な細胞の遺伝子成分を分析する能力を試験するために、ヒト結腸直腸細胞株ＳＷ４８０由来の細胞がヒト末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）に添加された。ＳＷ４８０細胞はＫｉ−ｒａｓ遺伝子における変異を含むことで知られ（ＭｃＣｏｙら，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ／ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ．”Ｎａｔｕｒｅ．１９８３  ３０２（５９０３）：７９−８１、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）、結腸直腸癌、肺癌、及び膵癌で共通である（Ｂｏｓら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２７：２９３−２９７；Ｓｌｅｂｏｓら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９０）３２３：５６１−５６５；及びＡｌｍｏｇｕｅｒａら，Ｃｅｌｌ（１９８８）５３：５４９−５５４、その全体の引用によってその各々が本明細書中に組み込まれる）。変異を検出するために、変異を含むＫｉ−ｒａｓ  ｍＲＮＡのフラグメントはＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、ＰＣＲ産物が配列決定された（カリフォルニア州サンディエゴのＥｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。変異はＫｉ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるＧからＴへの変換である。ＳＷ４８０細胞を同定するために、ＥｐＣＡＭに対するフィコエリトリン接合型の抗体（カリフォルニア州サンディエゴのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた。ＥｐＣＡＭは上皮細胞接着分子のことである。それは上皮細胞で発現し、循環する癌細胞を同定及び分離するのに頻繁に用いられる。ＳＷ４８０細胞は新しいＰＢＭＣ（カリフォルニア州ヘイワードのＡｌｌＣｅｌｌｓ社）と懸濁液において混合され、１μＭの濃度のＣａｌｃｅｉｎＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と１．２５ｎｇ／μｌの濃度のＥｐＣＡＭ抗体で染色した。ＨＢＳＳで３回洗浄した後、細胞は３８４ウェルのＣ−ｌｅｃｔ型式のプレート（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ社）に１６００のＰＢＭＣと平均して１ウェルあたり２分の１のＳＷ４８０細胞が得られる密度で分配した。プレートはＬＥＡＰ型機器（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ社）でイメージングした。単一のＳＷ４８０細胞を含むウェルを同定し、リボヌクレアーゼ抑制物質（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ）及びポリイノシン酸（Ｓｉｇｍａ社）の混合物は、総容量２０μｌにおいて、それぞれ１ユニット／μｌ及び１００ｎｇ／ウェルの最終濃度に添加した。単一のＳＷ４８０細胞はエネルギーが６．９μＪで、かつスポットの直径が２４μｍの５３２ｎｍのレーザパルスで照射することによって溶解された。溶解後、ウェルから培地の半分が吸引され、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）のＲＬＴと混合した。ＲＮＡは製造業者の手順を用いてＲＮｅａｓｙマイクロカラムを用いて精製した。Ｋｉ−ｒａｓ  ｍＲＮＡにおける変異にわたるフラグメントはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及びＴｉｔａｎｉｕｍ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，  カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物は、ＰＣＲプライマーが第１のプライマー対の内部にあ���ネステッドＰＣＲを用いて更なるラウンドで増幅された。このステップはＫｉ−ｒａｓの存在量がＳＷ４８０細胞において比較的低いために用いられうる。ネステッドＰＣＲの産物はＰＣＲｑｕｉｃｋキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製され、塩基配列決定法（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって分析した。図３は約１，６００のＰＢＭＣのバックグラウンドにおける単一のＳＷ４８０細胞（矢印）を示す。画像は元来２色であり、ＳＷ４８０細胞は緑色、ＰＢＭＣは赤色である。ＳＷ４８０細胞はＲＴ−ＰＣＲ及び塩基配列決定法によって溶解及び分析された。図４は１，６００のＰＢＭＣのバックグラウンドにおけるレーザを介した溶解によって溶解した単一のＳＷ４８０細胞を分析することで得られる配列トレースにおける変異の存在を示す。塩基８５は変異遺伝子型において「Ａ」であり、標準遺伝子型において「Ｃ」である。配列トレースはＰＣＲ増幅産物のアンチセンス鎖から生成され、ひいては「Ａ」はｍＲＮＡにおける「Ｕ」に対応し、「Ｃ」はＫｉ−ｒａｓ  ｍＲＮＡにおける「Ｇ」に対応する。３８４ウェルプレートは全部で１，６００×３８４ＰＢＭＣ＝６１４，４００のＰＢＭＣに含まれるため、１，６００のＰＢＭＣのウェルで１のＳＷ４８０細胞における変異を検出する能力は６１４，４００のＰＢＭＣあたりの１のＳＷ４８０細胞を分析する能力に変換される。
【実施例８】
【００５２】
《金のナノ粒子標識を用いたレーザを介した溶解の改善》
細胞溶解がレーザ照射時に生じるためには、レーザパルスは細胞を機械的に破壊する応力又は衝撃波を生成しなければならない。この応力又は衝撃波を生成するのに要求されるレーザエネルギーは、細胞が接触する細胞、培地又は基質によるレーザ光の吸収に依存している。ナノ粒子を介した光分解は患者の試料から腫瘍細胞を除去する治療学的方法として記載されてきた（Ｌｅｔｆｕｌｌｉｎら，２００６、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）。ナノ粒子は標的細胞が優性に破壊されるように標的の腫瘍細胞と標的でない健常細胞との間の光学的な対比を生成する手段として用いられた（Ｏｒａｅｖｓｋｙら，２００８、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）。ナノ粒子接合型の抗体は本実施例においては、細胞溶解を誘発するのに要求されるレーザ出力を低減することによって、標的細胞のレーザを介した溶解を促進するのに用いられた。レーザ出力の低減によって、隣接する標的ではない細胞を不注意に溶解させる危険を低減することによって、標的細胞の分析の特異性を改善する。
【００５３】
ナノ粒子標識を用いたレーザを介した細胞の溶解における改善を試験するために、懸濁液中のＳＷ４８０細胞は１．２５ｎｇ／μｌの濃度のＥｐＣＡＭ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とｌμＭの濃度のＣａｌｃｅｉｎＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とで標識した。ＨＢＳＳでの３回の洗浄後に、１の細胞の集合は１．１５ｎｇ／μｌの濃度の金で標識した二次抗体（３０ｎｍ：カリフォルニア州レディングのＴｅｄ  Ｐｅｌｌａ社のヤギ抗マウス）で染色し、１の集合は５ｎｇ／μｌのフィコエリトリンで標識した二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色した。ＨＢＳＳでの３回の洗浄後に、染色細胞はＨＢＳＳにおいて、３８４ウェルのＣ−ｌｅｃｔ型式のプレート（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ社）に播種した。細胞の溶解の効率はＬＥＡＰでのレーザ処理前後でＣａｌｃｅｉｎＡＭ陽性細胞の数を定量することによって測定した。図５は、異なる染色及びレーザ出力の条件下で、レーザを介した細胞の溶解の効率のグラフを示す。溶解効率は死滅した標的細胞に対する割合（％）で示される。ナノ粒子標識を用いて、溶解効率は双方のレーザ出力設定で９３％であった。ナノ粒子標識がない場合（図５におけるフィコエリトリン群）、溶解効率は２．９μＪで１０％、６．９μＪで６６％であった。従って、ナノ粒子標識はレーザを介した細胞の溶解効率を改善し、有効な細胞溶解に要求されるレーザ出力を低減した。
【００５４】
ナノ粒子標識が特異的に強くかつ特異的である場合、標的の１以上の細胞の特異的な溶解が、特異的な１以上の標的細胞に集束したエネルギーを誘導することによってではなく、好適なエネルギー量で細胞集団全体を照射することによって実現してもよい。１以上の標的細胞のみが致死的な量を吸収するが、隣接する標識しない標的ではない細胞は損傷しないため、感作物質が、時に金のナノ粒子が細胞に添加される光線力学的治療の多くの例がある。例は、従来の光線力学的治療で金のナノシェルを用いて、治療効率を改善する光熱的治療の組合せ治療であり：その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる「Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｙ，Ｊａｍｅｓ  Ｃｈｅｎ  Ｙｏｎｇ  Ｋａｈら，Ｌａｓｅｒｓ  ｉｎ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ  ４０，Ｐａｇｅｓ５８４−５８９，２００８」及び「Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＰＰＴＴ）ｕｓｉｎｇ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｘｉａｏｈｕａ  Ｈｕａｎｇら，Ｌａｓｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ２３，ｐｇｓ２１７−２２８，２００７」に見ることができる。本実施形態においては、単一のデバイス及び方法は技術を実行するのに用いることができ、イメージングするステップか、１以上の標的細胞を検出するステップか、あるいは希有な標的細胞に対し特異的なエネルギービームを誘導するステップかがない。
【実施例９】
【００５５】
《ナノ粒子で促進される、レーザを介した溶解を用いた循環性の腫瘍細胞のモデルにおける単一の腫瘍細胞の遺伝子発現分析》
ナノ粒子標識及び更なるレーザを介した溶解は、ヒトＰＢＭＣに添加した単一の腫瘍細胞における限定した遺伝子の集合の発現を検出するのに用いた。ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７はヒトＰＢＭＣに添加され、ＥｐＣＡＭ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及びフィコエリトリンで標識したＥｐＣＡＭ抗体の混合物で染色し、双方の濃度は０．６２５ｎｇ／μｌであった。１００μｌのＦｃＲ遮断試薬（カリフォルニア州オーバーンのＭｉｌｔｅｎｙｉ社）を細胞懸濁液の１ｍｌあたり添加した。ＦＢＳが２％のＨＢＳＳで洗浄後に、細胞は金で標識した二次抗体（３０ｎｍ：Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ社のヤギ抗マウス）で染色し、ＦＢＳが２％のＨＢＳＳで再度洗浄した。最終的には、細胞は１００μｌ／ｍｌのＦｃＲ遮断試薬と０．２７ｎｇ／μｌのリボヌクレアーゼＡ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）とを含むＨＢＳＳに再懸濁されて、染色プロセス中に溶解した細胞から放出されるＲＮＡを抑制した。細胞の混合物は、１ウェルあたり２０００の細胞数で３８４ウェルのＣ−ｌｅｃｔ型式のプレートに播種した。プレートはＬＥＡＰでイメージングした。ＭＣＦ−７細胞を検出したウェルにおいて、リボヌクレアーゼ抑制物質であるＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が３ユニット／μｌの最終濃度まで添加され、ポリイノシン酸（Ｓｉｇｍａ社）が１ウェルあたり１００ｎｇで添加された。単一のＭＣＦ−７細胞はＬＥＡＰ型機器での２．９μＪのレーザパルスでの照射によって溶解した。ウェル容積全体の半分は吸引され、ＴａｒｇｅｔＡｍｐ１．０の反応に添加され、製造業者の推奨（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に従って処理され、ｍＲＮＡを増幅した。増幅したＲＮＡはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡに逆転写された。定量ＰＣＲがその後、ＡＢＩ７５００型式の実時間ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＭａｘｉｍａ  ＳｙｂｒグリーンとｑＰＣＲとの混合物（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を用いて５の選択した遺伝子について行われた。分析すべき遺伝子は、ＭＣＦ−７細胞における癌との関連性及びその発現に基づいて、文献から選択した。遺伝子（遺伝子記号）はＣＣＤＣ６、ＫＲＴ１９、ＭＵＣ１、ＥｐＣＡＭ、及びＴＦＦ−１であった。単一の溶解したＭＣＦ−７細胞からの１６の試料が分析され、ＭＣＦ−７細胞がウェルに存在するが溶解しない６の負のコントロールが分析された。遺伝子は３６未満の循環値で交差した場合、遺伝子は発現したと見なされた。細胞は陽性であると分類されるため、５の遺伝子のうちの少なくとも３が発現しなければならない。１６の腫瘍細胞の試料以外に、９４％の正常な分類比率に対応する１５の試料が陽性であると分類された（図６）。６の負のコントロールのうち、いずれも陽性に分類されなかった。
【００５６】
［文献］
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Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈら，“Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｇｏｌｄ”，Ｄｉｓｃｕｓｓ．Ｆａｒａｄａｙ．Ｓｏｃ．１９５１，１１，５５−７５；
Ｙａｎら，“Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００１）１；６１（２３）：８３７５−８０；
Ｙｏｕｎｇ  ＷＳ  ３ｒｄ．”Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１６８：７０２−１０；
米国特許第５，４４５，９３４号；
米国特許第７，３７８，２３６号；
米国特許第６，３２６，４８９号；
米国特許第７，４２５，４２６号；
米国特許第６，５１４，７２２号；
米国特許出願公開第２００７／０７９５８５７号明細書；
は、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる。
【００５７】
本明細書における実質的に任意の複数形及び／又は単数形の用語の使用に関しては、当該技術分野の当業者は、文脈及び／又は用途に対して好適となるように、複数から単数及び／又は単数から複数へ変換できる。多様な単数形／複数形の置換は、明確化のために本明細書中で特に説明されうる。
【００５８】
一般的に、本明細書中に、特に添付した特許請求の範囲（例えば添付した特許請求の範囲の主要部）に用いられている用語は、「開放型（ｏｐｅｎ）」用語として一般的な意味を有するもの（例えば：用語「含んでいる、具えている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「限定しないが含んでいる、限定しないが具えている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈すべきである；用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は「少なくとも有する（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」と解釈すべきである；用語「含む、具える（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「限定しないが含む、限定しないが具える（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈すべきである等）であると当該技術分野の当業者に理解されよう。採用された請求項に特定の数が指定されている場合にこのような指定が請求項に明確に記述されること、及び、このような記述がない場合にこのような指定が存在しないことは、当該技術分野の当業者に更に理解されよう。例えば、理解を助けるために、以下に添付した特許請求の範囲は、「少なくとも１の（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」と「１以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」といった序言フレーズを用いた請求項の記述の採用を含む。しかしながら、同一の請求項が、「１以上」又は「少なくとも１つの」といった序言フレーズ、及び「１つの（ａ，ａｎ）」といった不定冠詞を含む場合であっても、「１つの（ａ，ａｎ）」といった不定冠詞による請求項の記述の採用によって、このような請求項の記述の採用を含む任意の特定の請求項がこのような１つの記述だけを含む実施形態に限定することを意味すると、「１つの（ａ，ａｎ）」といった不定冠詞を解釈すべきではなく（例えば、「１つの（ａ，ａｎ）」は一般的に「少なくとの１の」又は「１以上の」を意味すると解釈すべきであり）、請求項の記載を採用するのに用いられる定冠詞の使用についても同様に当てはまる。更に、採用した請求項の記述について特定の数が明確に記述されている場合であっても、当該技術分野の当業者は、記述の数を最小で示していると解釈すべきである（例えば、「２の事実の記述（ｔｗｏ  ｒｅｃｉｔａｔｉｏｎｓ）」という、他の修飾語がないありのままの記述は、一般的に少なくとも２の事実の記述又は２以上の事実の記述を意味する）。更には、「Ａ、Ｂ、及びＣ等のうちの少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｃ，ｅｔｃ．）」に類似する表現法を用いた例においては、一般的には、このような構成は当該技術分野の当業者が表現法を理解するであろうという意味で用いられている（例えば「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有するシステム（ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｃ）」は限定しないが、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢとを同時に有するシステム、ＡとＣとを同時に有するシステム、ＢとＣとを同時に有するシステム、及び／又はＡとＢとＣとを同時に有するシステム等を含む）。「少なくともＡ、Ｂ、又はＣのうちの１つなど（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ，Ｂ，ｏｒ  Ｃ，ｅｔｃ．）」に類似する表現法���用いた例においては、一般的には、このような構成は当該技術分野の当業者が表現法を理解するであろうという意味で用いられている（例えば「少なくともＡ、Ｂ、又はＣのうちの１つを有するシステム（ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ，Ｂ，ｏｒ  Ｃ）」は限定しないが、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢとを同時に有するシステム、ＡとＣとを同時に有するシステム、ＢとＣとを同時に有するシステム、及び／又はＡとＢとＣとを同時に有するシステム等を含む）。更に、実質的に任意の離接語及び／又は２以上の代替語を表すフレーズは、明細書、特許請求の範囲、又は図面のいずれであっても、用語のうちの１つ、用語のいずれか、又は双方の用語を含む可能性を考えるべきと理解すべきである。例えば「Ａ又はＢ」のフレーズは、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されよう。
【００５９】
多様な態様及び実施形態を本明細書に開示したが、同時に他の態様及び実施形態は当該技術分野の当業者に明らかとなるであろう。本明細書に開示した多様な態様及び実施形態は、例示を目的とするものであり、限定を目的とするものではなく、本来の範囲および精神は以下の請求項によって示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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