(57)【要約】  本発明は、酸の形態または薬学的に許容される塩のいずれか１つの形態の、式（Ｉ）（式中、Ａｃはアセチル基を表す。）の十糖類、ならびにこの調製方法に関する。式（Ｉ）のオリゴ糖は、抗血栓剤として有用である。2012526171.tif 000006
2012526171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸の形態または薬学的に許容される塩のいずれか１つの形態の、式（Ｉ）のオリゴ糖：
【化１】
2012526171.tif 000005
（式中、Ａｃはアセチル基を表し、波線はピラノース環の平面の下または上のいずれかに位置する結合を示す。）。
【請求項２】
ナトリウム塩の形態での、請求項１に記載のオリゴ糖。
【請求項３】
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、ＡＴアフィニティークロマトグラフィー、動的コーティング陰イオン交換クロマトグラフィー（ＣＴＡ−ＳＡＸ）および共有結合陰イオン交換クロマトグラフィーをこれらの方法の任意の可能な組合せにおいて実施することによって出発ＬＭＷＨ生成物から前記オリゴ糖を分離するためのステップを含む、請求項１または請求項２に記載のオリゴ糖の調製のための方法。
【請求項４】
以下のステップ：
−ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、次いで
−ＡＴアフィニティークロマトグラフィー、次いで
−動的コーティング陰イオン交換クロマトグラフィー（ＣＴＡ−ＳＡＸ）、次いで
−共有結合陰イオン交換クロマトグラフィー
を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｄｉｏｎｅｘ  ＡＳ１１  ＨＰＬＣカラム上で実施されることを特徴とする、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
出発ＬＭＷＨ生成物がエノキサパリンであることを特徴とする、請求項３から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
薬物として使用するための、請求項１または請求項２に記載の式（Ｉ）のオリゴ糖、または薬学的に許容される塩とのこの付加塩。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載の式（Ｉ）のオリゴ糖、または薬学的に許容される塩とのこの付加塩、および少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項９】
抗血栓オリゴ糖から選択される少なくとも１種の他の有効成分をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
血栓症の治療および予防で使用する薬物の調製のための、請求項１または請求項２に記載の式（Ｉ）のオリゴ糖、または薬学的に許容される塩とのこの付加塩の使用。
【請求項１１】
静脈血栓症および急性血栓イベントの治療および予防で使用する薬物の調製のための、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項１または請求項２に記載の式（Ｉ）のオリゴ糖、または薬学的に許容される塩とのこの付加塩の有効量の患者への投与を含む、血栓症の治療および予防のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なオリゴ糖、より具体的には、アシル化１，６−無水十糖類、および抗血栓剤としてのこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
凝固は、過剰な失血および微生物の侵入を防ぐ防御機構である。しかし、想定外の凝血の形成および転位は有害なことがあり、抗血栓薬は、凝血の形成および増大を防ぐ。
【０００３】
ヘパリンおよび低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、血栓塞栓性疾患の管理における現在の標準的療法である。これらの抗凝固活性は、凝固因子、主に活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）およびトロンビン（第ＩＩａ因子）の阻害を通じて発揮される。この阻害作用は、セルピンファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤であるアンチトロンビン（ＡＴ）とヘパリン種との特定の相互作用によって媒介される。
【０００４】
これらの薬剤は、動物源に由来し、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）は、ブタまたはウシ起源の肺または腸粘膜などの組織から単離される。チンザパリン、アルデパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリンまたはレビパリンなどのＬＭＷＨは、ヘパリンの酵素的または化学的脱重合によって得られる。
【０００５】
ヘパリンおよびＬＭＷＨは、分子の複合混合物であり、多数の硫酸化多糖類を含有し、それぞれが直鎖の単糖残基からなるポリマーである。したがって、ヘパリンおよびＬＭＷＨ中に存在する様々な多糖類は、この長さならびにこの化学構造の点で異なる。硫酸化の異なる程度ならびに様々な１→４結合ウロン酸およびグルコサミン二糖単位の存在は、複雑な全体構造を生じさせる（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００３、４６、２５５１−２５５４）。
【０００６】
別のクラスの抗血栓薬は、合成オリゴ糖に存在する。実際に、１９８０年代初頭に、いくつかのヘパリン鎖中の独特な五糖類ドメインが、アンチトロンビンＩＩＩを結合および活性化するのに必要な最小配列であることが結論付けられた（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、２００３、８５、８３−８９）。フォンダパリヌクスナトリウムは、６０を超えるステップの化学合成を介して得られる、この五糖類の合成類似体である。これは、整形および腹部の手術後の血栓症の予防、深部静脈血栓症および肺塞栓症の予防および治療、ならびに冠動脈疾患の治療のために商品化された、第Ｘａ因子の選択的阻害剤である。
【０００７】
構造ベースの設計は、結果として、選択的第Ｘａ因子またはＸａおよびＩＩａの二重阻害特性のいずれかを表す、イドラパリヌクスなどの作用期間のより長い類似体をもたらした。改善された薬力学的プロフィールの調査が、アンチトロンビン活性に関してはヘパリンより強力だが、この副作用がない、ヘパリン模倣体を提供することを目的とする、臨床候補ＳＲ１２３７８１（十六糖類化合物）などのより長いオリゴ糖の合成をもたらした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００３、４６、２５５１−２５５４
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、２００３、８５、８３−８９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本出願人は、新しい抗血栓化合物の同定のための新規な手法を考案した。ＬＭＷＨのオリゴ糖混合物から出発して、特定の分析および分離法が、抗凝固療法で有用な、有利な抗血栓特性を与えるオリゴ糖を単離することを可能にした。
【００１０】
本発明によるオリゴ糖は、式（Ｉ）
【００１１】
【化１】
2012526171.tif 000003
（式中、Ａｃはアセチル基（すなわち式−ＣＯＣＨ３の基）を表し、波線はピラノース環の平面の下または上のいずれかに位置する結合を示す。）
に対応する。
【００１２】
式（Ｉ）のオリゴ糖は、十糖類である。本発明は、酸の形態または薬学的に許容される塩のいずれか１つの形態の、式（Ｉ）の十糖類を包含する。酸の形態において、カルボン酸（−ＣＯＯ−）および硫酸（−ＳＯ３−）官能基は、それぞれ、−ＣＯＯＨおよび−ＳＯ３Ｈの形態をとっている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
式（Ｉ）のオリゴ糖の、用語「薬学的に許容される塩」は、１つまたは複数の−ＣＯＯ−および／または−ＳＯ３−官能基が、薬学的に許容される陽イオンにイオン結合しているオリゴ糖を意味することが理解される。本発明による好ましい塩は、陽イオンが、アルカリ金属の陽イオンから選ばれる塩であり、さらにより好ましくは、陽イオンがナトリウム（Ｎａ＋）である塩である。
【００１４】
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、ＡＴアフィニティークロマトグラフィーならびに動的コーティング陰イオン交換クロマトグラフィーおよび共有結合陰イオン交換クロマトグラフィーを含む高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から選択される直交（混合）分離法を用いることによって、ＬＭＷＨ生成物から得ることができる。本発明によれば、これらの分離法は、これらの任意の可能な組合せにおいて使用することができる。
【００１５】
ゲル浸透クロマトグラフィーは、ＮａＣｌＯ４を用いて循環させるＢｉｏ  Ｇｅｌ  Ｐ３０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）充填カラム上で実施することができる。選択された画分は、当分野で知られる技法を用いて脱塩される。
【００１６】
ＡＴアフィニティークロマトグラフィーは、ＡＴ−セファロース充填カラム上で実施することができる。固定相は、ヒトＡＴ（１ｇ；Ｂｉｏｍｅｄ）をＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（Ｓｉｇｍａ）にカップリングすることによって調製される。ＮａＣｌ勾配で溶出されるＡＴカラムを調製するために、Ｈｏｏｋら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９７６、６６（１）、９０−３）の方法論が使用される。
【００１７】
動的コーティング陰イオン交換クロマトグラフィーＨＰＬＣは、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー（セチルトリメチルアンモニウムを用いる動的陰イオン交換クロマトグラフィー）を使用することによって達成される。ＣＴＡ−ＳＡＸ半分取カラムは、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＢＤＳ  Ｃ１８（５μｍ）充填カラム上でＭｏｕｒｉｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｊ．およびＶｉｓｋｏｖ，Ｃ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００４、３３２、２９９−３１３）によって記載された通りにコーティングされる。カラムコーティングは、水／メタノール中で硫酸水素セチルトリメチルアンモニウム溶液を浸出させることによって、分析カラムのために実施される。移動相は、０から２．５Ｍの間で変化する濃度のメタンスルホン酸ナトリウム水溶液である。ｐＨは、希釈したメタンスルホン酸の添加によって２．５に調整される。収集した画分は、Ｍｅｇａ  Ｂｏｎｄｅｌｕｔ  Ｃ１８カートリッジ（Ｖａｒｉａｎ）上での予備処理後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０上で中和され、脱塩される。
【００１８】
共有結合陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＡＳ１１（Ｄｉｏｎｅｘ）半分取ＨＰＬＣカラム上で陰イオン交換を用いて達成することができる。ＤｉｏｎｅｘＡＳ１１以外のカラムを用いて、任意の他の陰イオン交換法を実施してもよい。
【００１９】
こうして得られるオリゴ糖を脱塩するための最終ステップは、所望の塩の形態で本発明のオリゴ糖を回収するために、収集した画分の中和後に行われる。オリゴ糖を脱塩する方法は、当業者によく知られており、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラム上での脱塩を挙げることができる。
【００２０】
以下のプロトコールは、ナトリウム塩の形態で、本発明による化合物（Ｉ）の調製のための実施例を詳細に記載している。これらのプロトコールは、単に例示のために本明細書に含まれ、本発明を制限することを意図しているものではない。
【実施例】
【００２１】
この実施例において、化合物（Ｉ）は、以下のステップ：ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、次いでＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィー、次いでＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー（動的コーティング陰イオン交換クロマトグラフィー）、次いで共有結合陰イオン交換クロマトグラフィーを実施することによって出発ＬＭＷＨ生成物から調製される。
【００２２】
約１４０ｇのエノキサパリン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓから市販されている）を、Ｂｉｏ  Ｇｅｌ  Ｐ３０充填カラム（２００ｃｍ×５ｃｍ）上で、ゲル浸透に約６０回で注入し、１００ｍｌ／時間でＮａＣｌＯ４  ０．２Ｍを用いて循環させる。各回は、２４時間持続する。十糖類画分を集めて、水を用いて循環させるＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０充填カラム（１００ｃｍ×７ｃｍ）上で脱塩し、約１８ｇの前記画分を得る。
【００２３】
全十糖類画分を、約３６回でＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィーに注入し、ここで約５００ｍｇを、３０ｃｍ×５ｃｍのカラム上に注入する。低親和性部分を、６ｍｌ／分で、１ｍＭのトリスを用いてｐＨ７．４で緩衝した０．２５ＭのＮａＣｌ溶液でカラムから溶出する。高親和性十糖類画分を、ＮａＣｌのステップ勾配（１ｍＭのトリス−ＨＣｌ中の０．７、１．１５、１．６、２．０５、２．６５および３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出する。ＮａＣｌ勾配を、伝導率によってモニタリングし、検出は、２３２ｎｍのＵＶ中である。
【００２４】
伝導率が３０から８５ｍＳ／ｃｍの親和性画分中で溶出した十糖類を集め、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０上で脱塩し、ＣＴＡ−ＳＡＸ半分取クロマトグラフィー（２５０ｍｍ×２２ｍｍカラム）において達成される次の精製のための出発物質として使用する。カラムコーティングを、カラム温度を４５℃に調整して、水／メタノール（１７：８、ｖ／ｖ）中で４時間、１ｍＭの硫酸水素セチルトリメチルアンモニウム溶液を浸出させることによって、実施する。移動相は、０から２．５Ｍの間で変化する濃度のメタンスルホン酸ナトリウム水溶液（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）である。ｐＨを、希釈したメタンスルホン酸の添加によって２．５に調整する。分離を、４０℃で達成する。移動相中の塩濃度を、６０分かけて０から２．５Ｍに直線的に増加させる。流速は、２０ｍｌ／分であり、２３４ｎｍのＵＶ検出を使用する。
【００２５】
約８００ｍｇを別々に８回で注入し、ここで１００ｍｇの純化された画分をカラム上に注入する。得られた画分を、中和後、ＣＴＡ−ＳＡＸ分析カラム（１５０×２．１ｍｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＢＤＳ  Ｃ１８（３μｍ））上で制御する。画分を集めて、Ｍｅｇａ  Ｂｏｎｄｅｌｕｔ  Ｃ１８カートリッジ（Ｖａｒｉａｎ）を通過させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０上で脱塩する。
【００２６】
このステップ後、式（Ｉ）の十糖類を、主に式（ＩＩ）の別の十糖類とのこの共溶出によって、不十分な純度で得る。
【００２７】
【化２】
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【００２８】
最終精製は、例えば以下の条件：
移動相：溶媒Ａ：Ｈ３ＰＯ４を添加することによってｐＨ２．９にした、ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ
溶媒Ｂ：Ｈ３ＰＯ４を添加することによってｐＨ３．０にした、１Ｎ  ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ中のＮａＣｌＯ４
を有する、ＮａＣｌＯ４濃度勾配で循環させるＡＳ１１（Ｄｉｏｎｅｘ）半分取カラム上で達成する。
【００２９】
溶出勾配は、以下の通り：Ｔ＝０分：％Ｂ＝１；Ｔ＝６０分：％Ｂ＝８０および２０ｍｌ／分に設定した流速、とすることができる。検出を、２３２ｎｍのＵＶ中で達成する。
【００３０】
画分を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＡＳ１１分析カラム（２５０×２．１ｍｍ）上で制御し、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０上で脱塩する。
【００３１】
十糖類（Ｉ）を、グルコサミンおよびマンノサミンエピマー（波線で示した通り、オリゴ糖の還元末端の糖類単位の２位の位置のエピマー）の５０／５０混合物として得る。ＢＲＵＣＫＥＲ装置（６００ＭＨｚ）上で実施されるこれらのプロトンＮＭＲ分析は、以下の通りである。
【００３２】
−グルコサミン異性体：
ＮＭＲ  １Ｈ、Ｄ２Ｏ中（δ、ｐｐｍ）：２．０５（３Ｈ，ｓ）、３．１８（１Ｈ，ｓ）、３．２３（２Ｈ，ｍ）、３．３２（１Ｈ，ｔ，６Ｈｚ）、３．４１（１Ｈ，ｄｄ，８および２Ｈｚ）、３．５５−４．５０（３８Ｈ，ｍ）、４．５５−４．６２（３Ｈ，ｍ）、４．７８（３Ｈ，ｍ）、４．９５（１Ｈ，ｓ）、５．１８（１Ｈ，ｓ）、５．３０（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．３３（３Ｈ，ｍ）、５．４５（２Ｈ，ｍ）、５．５７（１Ｈ，ｓ）、５．９４（１Ｈ，ｄ，６Ｈｚ）。
【００３３】
−マンノサミン異性体：
ＮＭＲ  １Ｈ、Ｄ２Ｏ中（δ、ｐｐｍ）：２．０５（３Ｈ，ｓ）、３．２３（２Ｈ，ｍ）、３．３２（１Ｈ，ｔ，６Ｈｚ）、３．４２（２Ｈ，ｍ）、３．５５−４．５０（３８Ｈ，ｍ）、４．５５−４．６２（３Ｈ，ｍ）、４．７８（３Ｈ，ｍ）、４．９５（１Ｈ，ｓ）、５．１８（１Ｈ，ｓ）、５．３０（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．３３（３Ｈ，ｍ）、５．４５（２Ｈ，ｍ）、５．５１（１Ｈ，ｓ）、５．９４（１Ｈ，ｄ，６Ｈｚ）。
【００３４】
本発明のオリゴ糖は、薬理学的な研究を経て、この抗血栓特性および治療上活性な物質としてのこの価値を示した。
【００３５】
血漿中の抗ＦＸａ活性：
ＡＴ媒介性ＦＸａ阻害を促進するためのオリゴ糖（Ｉ）のナトリウム塩の能力を、ほぼ生理的な条件において分析した。抗ＦＸａ活性の測定を、製造者の推奨に従って、ＳＴＡ（登録商標）−Ｒアナライザー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  Ｉｎｃ．）上で操作される競合発色アッセイＳＴＡ（登録商標）−Ｒｏｔａｃｈｒｏｍ（登録商標）ヘパリン（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  Ｉｎｃ．）を用いて実施した。ウシのＦＸａ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  Ｉｎｃ．）を使用した。ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって発売された商業的供給源から得られるフォンダパリヌクスが標準物質であった。これを、正常なプールヒト血漿（Ｈｙｐｈｅｎ）中で、濃度を増加させて（０．０２１８−０．０４６０−０．０８７２−０．１７４０−０．３４９０−０．４６５０μｍｏｌ／Ｌ）スパイクした。用量反応直線が示された。本発明のオリゴ糖およびフォンダパリヌクスを、０．０２１８から０．４６５０μＭの範囲の６つの濃度でテストした。血漿環境中でのＡＴの濃度は、２．２５μＭであった。精製したオリゴ糖の測定した絶対的な抗Ｘａ活性を、欧州薬局方６．０（０１／２００８：０８２８）に従って、ＩＵ／ｍｌで表した。相対的な抗ＦＸａ活性を、絶対的な活性とフォンダパリヌクスの活性との比から計算した。
【００３６】
このテストにおいて、本発明のオリゴ糖は、１．２１ＩＵ／ｍｌの絶対的な抗ＦＸａ活性を表す。フォンダパリヌクスと比較したこの相対的な抗Ｘａ活性は、１．４９倍である。
【００３７】
したがって、本発明による式（Ｉ）のオリゴ糖は、高い抗血栓特性を表す。このオリゴ糖は、薬剤、特に抗血栓薬の調製に有用であり得る。したがって、本発明の別の目的は、式（Ｉ）のオリゴ糖または薬学的に許容される塩とのこの付加塩を含む薬物である。
【００３８】
このような薬物は、療法、とりわけ静脈血栓症（例えば、術後の段階の手術患者、がん患者、または運動性が制限された内科患者における）および急性動脈血栓イベントを含めた血栓症の治療および予防、とりわけ心筋梗塞の場合に、有用である。
【００３９】
また、本発明の別の目的は、本発明による式（Ｉ）のオリゴ糖を有効成分として含む医薬組成物である。このような医薬組成物は、本発明による式（Ｉ）のオリゴ糖、または薬学的に許容される塩とのこの付加塩、および少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤の有効量を含む。前記添加剤は、当業者に知られる通常の添加剤の中から、所望の医薬形態および投与経路に従って選ばれる。
【００４０】
本発明による医薬組成物は、式（Ｉ）のオリゴ糖に加えて、合成化合物（適切な単糖またはオリゴ糖の基本単位から出発する化学的で段階的な合成によって得られる）であろうと、ヘパリンまたはＬＭＷＨ源から単離される化合物であろうと、抗血栓オリゴ糖から選択される少なくとも１種の他の有効成分を含むことができる。
【００４１】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、局所（ｌｏｃａｌ）、気管内、鼻腔内、経皮または直腸投与のための本発明による医薬組成物において、上記の式（Ｉ）の有効成分またはこの塩は、上述の病状の予防または治療のために、動物および人間に、通常の医薬添加剤とブレンドして、単位剤形として投与することができる。
【００４２】
適切な単位剤形は、錠剤、硬いまたは軟らかいゼラチンカプセル、粉末、顆粒、および経口溶液または懸濁液などの経口剤形、舌下、頬、気管内、眼内、吸入による鼻腔内剤形、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経皮、皮下、筋肉内または静脈内剤形、直腸剤形およびインプラントを含む。局所適用のために、本発明の化合物は、クリーム、ゲル、軟膏またはローションとして使用することができる。
【００４３】
本発明はまた、この態様の別のものによれば、本発明による式（Ｉ）のオリゴ糖、またはこの薬学的に許容される塩との塩の有効量の患者への投与を含む、上記の病状の治療および予防のための方法に関する。
【国際調査報告】
2012526171.tif 000007
2012526171.tif 000008
2012526171.tif 000009