(57)【要約】  一態様において、本発明は、宿主の組織を2種以上のウイルス株に感染させることにより、癌細胞などの宿主中の標的である増殖細胞を選択的に殺傷するための方法を提供する。これらのウイルス株を、標的である増殖細胞における同時的溶解感染を含む相乗効果および共生効果を提供するように選択することができる。選択された実施形態においては、第1のウイルスに感染した増殖細胞における第1のビルレンス因子の発現が、第2のウイルスの溶解効果を増加させ、ならびに第2のウイルスに感染した増殖細胞における第2のビルレンス因子の発現が、第1のウイルスの溶解効果を増加させるように、前記ウイルスを選択する。第1および第2のウイルスのゲノムを、宿主の細胞中でのウイルスゲノム間の組換えにとって不適合であるように選択することができる。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主中の増殖細胞を選択的に除去する方法であって、有効量の溶解ウイルスの組合せのそれぞれを宿主に投与して、該ウイルスによる増殖細胞中での同時相乗的溶解感染を誘導することを含み、前記組合せが、
第1のビルレンス因子をコードするゲノムを有する第1の組換え溶解ウイルス、および、
第2のビルレンス因子をコードするゲノムを有する第2の組換え溶解ウイルス、
を含み、
第1のウイルスに感染した増殖細胞中での第1のビルレンス因子の発現が、第2のウイルスの溶解効果を増加させ、且つ第2のウイルスに感染した増殖細胞中での第2のビルレンス因子の発現が、第1のウイルスの溶解効果を増加させ、且つ第1および第2のウイルスのゲノムが、宿主の細胞中のウイルスゲノム間の組換えにとって不適合である、
前記方法。
【請求項２】
宿主がヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増殖細胞が癌細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第1および第2のウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第1のウイルスのゲノムが第2のビルレンス因子をコードしない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第2のウイルスのゲノムが第1のビルレンス因子をコードしない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第1のウイルスのゲノムがDNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムがRNAゲノムであり、第2のウイルスがレトロウイルス科ではないか、または、
第1のウイルスのゲノムがRNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムがDNAゲノムであり、第1のウイルスがレトロウイルス科ではないか、または、
第1のウイルスのゲノムがプラスセンスRNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムがマイナスセンスRNAゲノムであるか、または、
第1のウイルスのゲノムがマイナスセンスRNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムがプラスセンスRNAゲノムであるか、または、
第1のウイルスのゲノムが二本鎖RNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムが一本鎖RNAゲノムであるか、または、
第1のウイルスのゲノムが一本鎖RNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムが二本鎖RNAゲノムである、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第1のウイルスまたは第2のウイルスがワクシニアウイルス(VV)である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第1のウイルスまたは第2のウイルスが水疱性口内炎ウイルス(VSV)である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第1のウイルスがVVである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第2のウイルスがVSVである、請求項１〜７または１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
VVが機能的チミジンキナーゼを発現しない、請求項８または１０に記載の方法。
【請求項１３】
VVがGM-CSFを発現する、請求項８、１０または１２に記載の方法。
【請求項１４】
VVが機能的ワクシニア増殖因子を発現しない、請求項８、１０、１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
VSVが抗ウイルス応答を破壊するために非機能的であるマトリックス(M)タンパク質を発現しない、請求項９、または１１に記載の方法。
【請求項１６】
第1および／または第2のビルレンス因子がウイルスビルレンス因子である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
第1および第2のビルレンス因子が、可溶性インターフェロン結合タンパク質；ワクシニア増殖因子；補体制御タンパク質；ワクシニアウイルス補体制御タンパク質；ウイルスIL-17；ヤバ様病ウイルスタンパク質Y136；B8Rタンパク質；プロテアーゼ；MMP；トリプシン；ヤバサル腫瘍ウイルス2Lタンパク質；膜融合タンパク質；またはFAST膜融合タンパク質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
第1のビルレンス因子が可溶性インターフェロン(IFN)結合タンパク質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
可溶性IFN結合タンパク質が、VV B18Rタンパク質配列に対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
VV B18Rタンパク質配列が、Genbankアクセッション番号BAA00826のアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第2のビルレンス因子が膜融合タンパク質である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
膜融合タンパク質が、レオウイルス融合関連小分子膜貫通(FAST)タンパク質配列に対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
FASTタンパク質が爬虫類レオウイルスのp14タンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
p14タンパク質がGenbankアクセッション番号AAP03134のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第1のウイルスを第2のウイルスの前に投与する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
有効量の腫瘍溶解性ウイルスの組合せのそれぞれをヒト患者に投与して、該ウイルスによる癌細胞の同時相乗的腫瘍溶解感染を誘導することを含む、ヒト患者において癌を治療する方法であって、前記組合せが、
可溶性IFN結合タンパク質を発現するVV、および、
膜融合タンパク質を発現するVSV、
を含む、前記方法。
【請求項２７】
可溶性IFN結合タンパク質が、VV B18Rタンパク質配列に対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
VV B18Rタンパク質配列が、Genbankアクセッション番号BAA00826のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
膜融合タンパク質が、レオウイルス融合関連小分子膜貫通(FAST)タンパク質配列に対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
FASTタンパク質が、爬虫類レオウイルスのp14タンパク質である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
p14タンパク質が、Genbankアクセッション番号AAP03134のアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
レオウイルス融合関連小分子膜貫通(FAST)タンパク質を発現するVSVの有効量をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者において癌を治療する方法。
【請求項３３】
FASTタンパク質が、爬虫類レオウイルスのp14タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
p14タンパク質が、Genbankアクセッション番号AAP03134のアミノ酸配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
有効量の腫瘍溶解性ウイルスの組合せのそれぞれをヒト患者に投与して、該ウイルスによる癌細胞中での同時的腫瘍溶解感染を誘導することを含む、ヒト患者において癌を治療する方法であって、前記組合せが、
機能的E3L遺伝子を欠き、且つ可溶性IFN結合タンパク質を発現するVV、および、
VSV、
を含む、前記方法。
【請求項３６】
非標的抗ウイルスインターフェロン応答を有する非標的組織、および、
標的インターフェロン応答を有する、増殖細胞を含む標的組織、
を含む宿主中の増殖細胞を選択的に除去する方法であって、該宿主に有効量の少なくとも2種の組換えウイルス株、刺激ウイルスおよび標的化ウイルスを投与することを含み、刺激ウイルスによる標的組織の感染が、標的インターフェロン応答を下方調節することにより、増殖細胞の標的化ウイルス感染を増加させ、且つ非標的抗ウイルスインターフェロン応答が、非標的組織中で有効なままであり、標的化ウイルスによる非標的組織の感染を改善し、それにより標的化ウイルスの溶解感染が、非標的組織の細胞と比較して、標的組織の増殖細胞に対して選択的である、前記方法。
【請求項３７】
増殖細胞が癌細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
標的化ウイルスが水疱性口内炎ウイルス(VSV)である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
標的化ウイルスがMタンパク質遺伝子中に欠損を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
刺激ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
刺激ウイルスによる標的組織の感染が、標的組織中でインターフェロンアンタゴニストを産生する、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
インターフェロンアンタゴニストがB18Rタンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
宿主中の増殖細胞を選択的に除去するための組換え溶解性標的化ウイルスと刺激ウイルスの組合わせた使用であって、前記宿主が、
非標的抗ウイルスインターフェロン応答を有する非標的組織、および、
標的インターフェロン応答を有する、増殖細胞を含む標的組織、
を含み、
刺激ウイルスによる標的組織の感染が、標的インターフェロン応答を下方調節することにより増殖細胞の標的化ウイルス感染を増加させ、且つ非標的抗ウイルスインターフェロン応答が非標的組織中で有効なままであり、標的化ウイルスによる非標的組織の感染を改善し、それにより標的化ウイルスの溶解感染が、非標的組織の細胞と比較して、標的組織の増殖細胞に対して選択的である、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療、特に、腫瘍溶解性(腫瘍溶解)ウイルス療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍溶解性ウイルスは、一般的には、正常細胞と比較した場合、癌細胞の内部で選択的に増殖するように選択または遺伝子操作される(Kirnら、2001)。様々な腫瘍溶解性ウイルスが、前臨床および臨床癌療法において用いられてきた(Paratoら、2005; Bellら、2003; Evertsおよびvan der Poel, 2005; RiesおよびBrandts, 2004を参照)。これらのウイルスは、直接複製依存的および／またはウイルス遺伝子発現依存的腫瘍溶解効果を介して腫瘍細胞死を引き起こすことができる(Kirnら、2001)。さらに、ウイルスは宿主内の細胞媒介性抗腫瘍免疫の誘導を増強することができる(Todoら、2001；Sinkovicsら、2000)。また、これらのウイルスを遺伝子操作して、腫瘍内で治療的トランスジーンを発現させ、抗腫瘍効果を増強することもできる(Hermiston, 2000)。
【０００３】
腫瘍細胞に生産的に感染するように選択または遺伝子操作された腫瘍溶解性ウイルスとしては、アデノウイルス(Xiaら、2004; Wakimotoら、2004); レオウイルス；1型単純ヘルペスウイルス (Shahら、2003); ニューカッスル病ウイルス(NDV; Pecoraら、2002); ワクシニアウイルス (VV; Mastrangeloら、1999; US 2006/0099224); コクサッキーウイルス; 麻疹ウイルス；水疱性口内炎ウイルス(VSV; Stojdlら、2000; Stojdlら、2003); Seneca Valleyウイルス(Reddyら、2007)、インフルエンザウイルス；粘液腫ウイルス(Myers, R.ら、2005)が挙げられる。
【０００４】
腫瘍溶解療法における腫瘍選択性を媒介するための様々な機構が提唱されてきた。腫瘍溶解性ウイルスを癌細胞に標的化する方法は、例えば、受容体の示差的発現に基づくものであってよい。ウイルス受容体ICAM-1およびDAFは悪性メラノーマ細胞上で過剰発現されるため、未改変コクサッキーウイルス(CAV21)は、癌細胞を選択的に標的化すると考えられている。WO 2005/087931は、細胞間接着分子-1(ICAM-1)の非存在下で細胞に溶解的に感染するために適合させた選択されたピコルナウイルスを開示している。受容体の特異性を変化させる遺伝子操作も、例えば、アデノウイルス(Sebestyen 2007, Carette 2007)および麻疹ウイルス(Allen 2006, Hasegawa 2006)などの腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍標的化を増強することができる。
【０００５】
癌細胞シグナル伝達経路における変化は、DNA合成において用いられるdNTPの産生にとって必要であるチミジンキナーゼ(TK)およびリボヌクレオチドリダクターゼ(RNR)などの、細胞増殖に必要な遺伝子の上方調節を誘導する。ウイルスの複製を、TKもしくはRNR、または癌細胞において上方調節される他の遺伝子のウイルス型を欠失させることにより、高いTKもしくはRNR活性を有する癌細胞に制限することができる。米国特許第7,208,313号は、TKおよびVGF欠失を有するVVを開示し、WO 2005/049845、WO 2001/053506、US 2004/120928、WO 2003/082200、EP 1252323およびUS 2004/9604は、改善された腫瘍溶解能力および／または遺伝子送達能力を有し得る、HSVなどのヘルペスウイルスを開示している。
【０００６】
Ras/PRK経路は、癌細胞においては一般的に突然変異している。この経路は、活性化されたRasを有する癌細胞においては欠損していると考えられるインターフェロン(IFN)応答経路に影響する。いくつかの腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞対癌細胞における先天性免疫応答経路の差異に基づいて腫瘍選択的である。例えば、未改変レオウイルスは、Ras/PRK経路が活性化した腫瘍細胞における先天性抗ウイルス応答の欠如に基づいて、癌細胞に対して自然選択的である。WO 2005/002607は、レオウイルスなどの、腫瘍溶解性ウイルスの2種以上の型および／または株の組合せを含む、活性化されたPP2A様またはRas活性を有する新生物を治療するための腫瘍溶解性ウイルスの使用を開示している。宿主のインターフェロン応答に対する選択性が、腫瘍溶解性ウイルスにとって望ましい特徴であると提唱されている。例えば、WO 2004/014314は、ワクシニアウイルスを含むポックスウイルスを、インターフェロン結合タンパク質をコードする遺伝子中に突然変異を導入することによる癌を治療するための使用に適合させることができると提唱している。
【０００７】
しかしながら、抗ウイルス応答に対する感受性は、腫瘍溶解性ウイルスに対して安全性および利益を与える。例えば、VSVによるマウスの鼻内感染は、CNSの致死的感染をもたらすことが示されている。この重篤な副作用を、インターフェロンとVSVを用いる組合せ治療により対処することができる(Stojdlら、2003)。全身性VSV感染の治療的使用によりもたらされる危険に対処するためのさらなる機構を発見するための努力において、宿主インターフェロン媒介性抗ウイルス応答に対する高められた感受性を有するVSV株が開発されてきた。特に、VSVdeltaM51(Lunら、Journal of the National Cancer Institute 2006 98(21):1546-1557)などの、VSVのマトリックス(M)タンパク質遺伝子のアミノ酸置換が、宿主インターフェロン応答のより強力な誘導因子であり、正常細胞の無傷のインターフェロン応答に対しては脆弱であるが、IFN応答経路に欠陥がある癌細胞の弱毒化インターフェロン応答に対しては脆弱ではない。EP 1218019、US 2004/208849、US 2004/115170、WO 2001/019380、WO 2002/050304、WO 2002/043647およびUS 2004/170607は、ウイルスが、低いPKR活性を有する腫瘍細胞に対する選択性と共に、宿主インターフェロン応答に対する示差的感受性を示し得る、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、およびVSVなどの腫瘍溶解性ウイルスを開示している。
【０００８】
VVは、宿主抗ウイルス応答を回避するための機構のレパートリーを発現する。少なくとも部分的には、これらの属性の結果として、免疫不全の宿主のVV感染は、脳炎を伴う全身性ワクシニア感染などの重篤かつ致死的な合併症をもたらすことがある(Laneら、1969; Aritaら、1985)。野生型VVの全身使用において引き起こされる危険に対処するために、VV感染経路の様々な態様において欠陥を有する株が開発されてきた。例えば、VVを、チミジンキナーゼ(TK)活性を欠くように遺伝子操作することができる。VVのTK株は、DNA合成のためにチミジン三リン酸を必要とし、分裂している細胞、および従って癌細胞における選択的複製を誘導する。代替的手法において、VV株を、ワクシニアウイルス増殖因子(VGF)を欠くように遺伝子操作することができる。この分泌されるタンパク質は、VV感染プロセスの初期に産生され、VV感染のために周囲の細胞を刺激する分裂促進因子として作用する(Bullerら、1988, Virology 164: 182-192)。TKとVGF欠陥の両方を有するVVの混合株は、チミジン三リン酸の要求により付与される代謝宿主細胞特異性と共に、分裂促進性VGF活性が存在しない結果として生じる増強された安全性および特異性から恩恵を受ける。同様に、通常は宿主IFN応答を妨げる遺伝子を欠くように遺伝子操作されたワクシニアウイルス(E3L、K3L、B18Rなど)も正常細胞中では弱毒化されるが、IFN応答を欠く腫瘍細胞中で増殖することができる。WO 2005/007824は、抗ウイルスdsRNA依存的タンパク質キナーゼ(PKR)を阻害する能力が低下し、インターフェロンに対する感受性が増加した、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌細胞の選択的破壊のためのその使用を開示している。WO 2003/008586も同様に、ウイルス抗PKR活性の変化または欠失を含む、腫瘍溶解性ウイルスを遺伝子操作するための方法を開示している。
【０００９】
いくつかのオルトポックスウイルスは、ワクシニアウイルスのWR株中のB18Rオープンリーディングフレームによりコードされる、I型インターフェロン(IFN)-結合タンパク質を発現する。B18Rタンパク質は、マウス、ヒト、およびウシのI型IFN受容体のサブユニットと有意な相同領域を有し、伝えられるところによれば、高い親和性でヒトIFN2に結合し、膜貫通シグナル伝達を阻害すると報告されている。伝えられるところによれば、B18Rタンパク質は、可溶性細胞外ならびに細胞表面タンパク質として存在し、かくして、IFNのオートクライン機能とパラクライン機能の両方を遮断し得る(Colamoniciら、1995, JBC vol 270, pp15974-16978)。米国特許第7,285,526号は、B18Rの治療的使用を記載している。
【００１０】
腫瘍生物学の範囲内にある腫瘍溶解性ウイルスを考慮したさらなる参考文献としては、以下のものが挙げられる：Bell, 2007; Paratoら、2005; Cromptonら、2007; RussellおよびPeng, 2007; Parkら、2008; Liuら、2008; Kirn, 2001; Kumarら、2008; McCartら、2001; Parrら、1997; Thorneら、2007; Symonsら、1995; AlcamiおよびSmith, 1995; Colamoniciら、1995; Alcamiら、2000; Stojdlら、2000; Stojdlら、2003; ならびにLichtyら、2004。
【００１１】
本明細書で用いられる略語としては、以下のものが挙げられる：eGFP、高感度緑色蛍光タンパク質；MOI、感染多重度；PFU、プラーク形成単位；FAST、融合関連小分子膜貫通；SEM、平均の標準誤差；DsRed、Discosoma種由来赤色蛍光タンパク質；およびIU、国際単位。
【発明の概要】
【００１２】
一態様において、本発明は、宿主における、癌細胞などの増殖細胞を選択的に除去するための方法を提供する。本発明は、増殖細胞中での同時相乗的溶解感染を誘導するために宿主に投与された、腫瘍溶解性ウイルスなどの溶解(溶解性)ウイルスの組合せを利用する。
【００１３】
第1の溶解ウイルスが第1のビルレンス因子をコードするゲノムを有し、第2の溶解ウイルスが第2のビルレンス因子をコードするゲノムを有し、第1のウイルスに感染した増殖細胞中の第1のビルレンス因子の発現が、第2のウイルスの溶解効果を増加させ、第2のウイルスに感染した増殖細胞中の第2のビルレンス因子の発現が、第1のウイルスの溶解効果を増加させるようなウイルスの組合せを選択することができる。この組合わせた相乗効果と共に、第1および第2のウイルスのゲノムが宿主の細胞中での組換えにとって不適合であり、組換えウイルスが選択されたウイルスの組合せ属性を獲得する可能性を低下させるようにウイルスを選択することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、第1のウイルスのゲノムは第2のビルレンス因子をコードしない。同様に、いくつかの実施形態においては、第2のウイルスのゲノムは第1のビルレンス因子をコードしない。
【００１５】
ウイルスゲノムを組換えにとって不適合にさせるために、
第1のウイルスのゲノムがDNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムがRNAゲノムであり、第2のウイルスがレトロウイルス科である；または
第1のウイルスのゲノムがRNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムがDNAゲノムであり、第1のウイルスがレトロウイルス科である；または
第1のウイルスのゲノムがプラスセンス鎖RNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムがマイナスセンス鎖RNAゲノムである；または
第1のウイルスのゲノムがマイナスセンス鎖RNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムがプラスセンスRNAゲノムである；または
第1のウイルスのゲノムが二本鎖RNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムが一本鎖RNAゲノムである；または
第1のウイルスのゲノムが一本鎖RNAゲノムであり、第2のウイルスのゲノムが二本鎖RNAゲノムである、
ように、ウイルスを選択することができる。
【００１６】
本発明における使用のための腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、ワクシニアウイルス(VV)、または水疱性口内炎ウイルス(VSV)であってよい。例えば、VVが機能的チミジンキナーゼを発現しない、および／またはGM-CSFを発現する、および／または機能的ワクシニア増殖因子を発現しない、および／または機能的E3L遺伝子を欠損するように、VVを遺伝子操作することができる。例えば、VSVが抗ウイルス応答を破壊するための機能的マトリックス(M)タンパク質を発現しないように、VSVを遺伝子操作することができる。
【００１７】
選択された実施形態においては、本発明は、ヒト患者などの宿主における、癌などの増殖細胞を治療する方法であって、有効量のそれぞれの腫瘍溶解性ウイルスの組合せをヒト患者に投与して、ウイルスによる癌細胞の同時相乗的腫瘍溶解感染を誘導することを含む、前記方法を提供する。ウイルスの組合せとしては、例えば、可溶性IFN結合タンパク質を発現するVV；および膜融合タンパク質を発現するVSVが挙げられる。あるいは、方法は、レオウイルスの融合関連小分子膜貫通(FAST)タンパク質を発現する有効量のVSVで患者を治療することを含んでもよい。
【００１８】
代替的な態様においては、本発明は、ヒト患者などの宿主において癌細胞などの増殖細胞を選択的に除去する方法であって、該宿主が、非標的抗ウイルスインターフェロン応答を有する非標的組織；および標的インターフェロン応答を有する、増殖細胞を含む標的組織を含む前記方法を提供する。そのような方法は、宿主に、有効量の少なくとも2種の組換えウイルス株、刺激ウイルスと標的化ウイルスを投与することを含み、刺激ウイルスによる標的組織の感染が、標的インターフェロン応答を下方調節することにより増殖細胞の標的化ウイルス感染を増加させ、非標的抗ウイルスインターフェロン応答が、非標的組織において、標的化ウイルスによる非標的組織の感染を改善するのに依然として有効であり、それにより標的化ウイルスの溶解感染が、非標的組織の細胞と比較して標的組織の増殖細胞に対して選択的であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】様々な癌細胞系に対するワクシニア(VVdd)とVSVΔ51の組合せ治療の相乗的細胞傷害効果を示す。75％集密なHT29結腸または786-0腎臓癌細胞を、未処理のまま放置するか、またはVVdd-eGFP(0.1 MOI)で2時間、もしくはVSVΔ51-DsRed(0.0001 MOI)で45分間、もしくは2種のウイルスと組合わせて、VVddで2時間、および4時間後、VSVΔ51で最後の45分間処理した。(A)0.0001 MOIのVSVΔ51で48時間のHT29細胞の感染後にウイルス力価を決定した。標準的なプラークアッセイのために上清を回収した。3回の独立した実施形態に由来する平均±SEMを提示する。(B)アイソボログラム分析：786-0細胞を、96穴プレート中、ワクシニアウイルス、次いでVSVの連続希釈液(固定比100:1 PFU)で処理した。72時間後、アラマーブルー試薬を用いて細胞傷害性を評価した。組合せ指数(CI)を、ChouおよびTalalayの方法に従ってCalcusynソフトウェアを用いて算出した。プロットは、罹患した細胞の画分(Fa)の関数におけるCIの代数見積もり値を表す。エラーバーは、見積もり値の標準偏差を表す。2回の独立した作業形態の1つ(4つ1組)を提示する。
【図２】ワクシニアウイルスB18R遺伝子産物が、HT29癌細胞系中での水疱性口内炎ウイルスの発現を増強することを示す。(A)0.0001 MOIで48時間のVSVΔ51によるHT29細胞の感染の後に、VSV力価を決定した。標準的なプラークアッセイのために上清を回収した。3回の独立した実施形態に由来する平均±SEMを提示する。(B)75％集密なHT29結腸癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFPもしくはVVDB18R-eGFP(0.1 MOI)単独で2時間、VSVΔ51-DsRed(0.0001 MOI)と組合わせて、もしくは組合わせずに45分間処理した。HT29細胞の感染後ウイルス力価を決定した。黒色および白色のバーは、それぞれ、VVおよびVSVである。3回の独立した実施形態に由来する平均±SEMを提示する。(C)アイソボログラム分析：786-0細胞を、96穴プレート中、B18R遺伝子産物、次いで、VSVの連続希釈液(固定比1μg:50000 PFU)で処理し、上記で詳述された図1Bに記載のように処理した。CI：組合せ指数。Fa：罹患した細胞の画分。エラーバーは見積もり値の標準偏差を表す。2回の独立した作業形態の1つ(4つ1組)を提示する。(D)HT29結腸癌細胞を、様々な濃度の組換えB18R(10e-1〜10e-6μg)タンパク質で2時間予備処理するか、もしくは処理せず、または細胞をVVDD-eGFPもしくはVVDB18R-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理した。次いで、VSVΔ51-DsRed(0.0001 MOI)に、様々な濃度のIFNα(5〜30IU)を添加するか、または添加しなかった。48時間後、標準的なVSVΔ51プラークアッセイのために上清を回収した。一実施形態を提示する。
【図３】ワクシニアウイルスがヒトのin vivo腫瘍中での水疱性口内炎ウイルスの発現を増強することを示す。HT29皮下異種移植腫瘍モデルを、ヌードマウスにおいて確立した。腫瘍増殖後、群にVVDDまたはVVΔB18R-eGFP(1.10e6pfu)を投与し、2日後、VSVΔ51-ルシフェラーゼ(1.10e7pfu)も静脈内注射した。(A)in vivo腫瘍を均質化し、群の各マウスについて滴定を実施した。VSVΔ51およびVVΔB18R/VSVΔ51群は5匹のマウスを含み、VVDD/VSVΔ51群は9匹のマウスを含んでいた。バーは標準誤差に対応し、T検定を用いて、VVDD/VSVΔ51群とVVΔB18R/VSVΔ51群の間の統計学的有意差を確認した。(B)HT29皮下異種移植腫瘍モデルを、本明細書に記載のようにヌードマウスにおいて確立した。1.5週間後、ウイルスを上記のように注射した。腫瘍のサイズを各群につきモニターした(N＝4)。バーは標準偏差に対応する。(C)4T1皮下移植腫瘍モデルを、免疫応答マウスにおいて確立した。1.5週間後、ウイルスを上記のように注射した。腫瘍のサイズを各群につきモニターした(N＝4)。バーは標準偏差に対応する。
【図４】ワクシニアウイルスがヒトex vivo腫瘍中での水疱性口内炎ウイルスの発現を増強することを示す。ヒトex vivo直腸癌および正常組織標本、肝臓における結腸癌転移および正常肝臓、脳および子宮内膜癌組織に、1 x 108 pfuのVVDD-eGFPを2時間、VSVΔ51-DsRedと組合わせて、または組合わせずに最後の45分間接種した。患者の腫瘍標本をPBS中で均質化し、VSVΔ51ウイルス力価を、Vero細胞上での標準的なプラークアッセイを用いて決定して、ウイルス複製を定量した。それぞれの線は1人の患者に対応する。黒色および白色のバーは、それぞれ、単一に感染した培養物と比較した、VVDD(44人の患者)およびVVΔB18R(30人の患者)で二重に感染したVSVΔ51の増強倍数に対応する。組合せVV/VSVΔ51サンプルを、VVDD(1.10e7pfu)により2時間および／またはVSVΔ51 (1.10e8pfu)で最後の45分間感染させた。サンプルを、接種の48時間後に均質化し、VSV滴定のために処理した。
【図５】his B18R遺伝子産物を含むワクシニアウイルスがVSVΔ51の拡散を保護する方法を描くモデルを示す。75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理した後、VSVFAST-DsRed(0.1 MOI)感染を45分間実施するか、または実施しなかった。(A)VVDDおよびVSVFAST力価を、感染の48時間後に決定した。3回の独立した作業形態に由来する平均±SEMを提示する。(B)アイソボログラム分析：786-0細胞を、96穴プレート中、VVDD、次いでVSVFASTの連続希釈液(固定比1:100 PFU)で処理し、本明細書に記載の図1Bのように処理した。CI：組合せ指数。Fa：罹患した細胞の画分。エラーバーは見積もり値の標準偏差を表す。2回の独立した作業形態の1つ(4つ1組)を提示する。(C)786-O細胞を、ワクシニアウイルス、次いで、VSVまたはVSVFASTで処理した。72時間後、MTS試薬を用いて細胞傷害性を評価した。細胞死の割合を評価した。2回の独立した作業形態の1つ(2つ1組)を提示する。
【図６】ワクシニアウイルスがin vitroでのセムリキ森林熱ウイルス発現を増強することを示す。75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-Cherry (0.1 MOI)で2時間およびSFV-eGFP(0.1 MOI)で処理した。次いで、感染を45分間実施するか、または実施しなかった。(A)VVDDおよびSFV力価を、感染の48時間後に決定した。3回の独立した作業形態に由来する平均±SEMを提示する。(B)アイソボログラム分析：786-0細胞を、96穴プレート中、VVDD、次いでSFVの連続希釈液(固定比100:1 PFU)で処理した。72時間後、アラマーブルー試薬を用いて細胞傷害性を評価した。組合せ指数(CI)を、ChouおよびTalalayの方法に従ってCalcusynソフトウェアを用いて算出した。プロットは、罹患した細胞の画分(Fa)の関数におけるCIの代数見積もり値を表す。エラーバーは、見積もり値の標準偏差を表す。2回の独立した作業形態の1つ(4つ1組)を提示する。
【図７】VVDDがMaraba-SDMを増強することを示す。75％集密な結腸癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-DsRed(0.1 MOI)で2時間処理した後、MRB-SDM-eGFP(0.1もしくは0.001 MOI)感染を45分間実施するか、または実施しなかった。感染の24および48時間後にMaraba-SDM力価を決定した。
【図８】VVDDがVSVΔ51FASTを増強し、VSVΔ51FASTがVVDD増殖を増強することを示す。75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理した後、VSVFAST-DsRed(0.1 MOI)感染を45分間実施するか、または実施しなかった。(A)感染の48時間後、VVDDおよびVSVFAST力価を決定した。3回の独立した作業形態に由来する平均±SEMを提示する。(B)アイソボログラム分析：786-0細胞を、96穴プレート中、VVDD、次いで、VSVFASTの連続希釈液(固定比1:100 PFU)で処理し、本明細書に記載のように処理した。(C)細胞死の割合を評価した。786-O細胞を、ワクシニアウイルス、次いで、VSVまたはVSVFASTで処理した。72時間後、MTS試薬を用いて細胞傷害性を評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ウイルスを、その遺伝物質に基づいて、
ssRNA、プラスセンスウイルス、例えば、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、およびコロナウイルス科；
ssRNA、マイナスセンスウイルス、例えば、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、およびオルトミクソウイルス科；
ssRNA、両センスウイルス、例えば、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科；
dsRNA、プラスセンスウイルス、例えば、レオウイルス科、およびビルナウイルス科；
ssRNA、複製段階でDNA、例えば、レトロウイルス科；
ss/dsRNA、例えば、ヘパドナウイルス科；
ssDNA、例えば、パルボウイルス科；ならびに
dsRNA、例えば、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、およびイリドウイルス科、
のように、分類することができる。
【００２１】
代替的な実施形態においては、腫瘍溶解性ウイルスの1種以上の株を、同時に、または連続的に、本発明の方法において用いることができる。例えば、ウイルスを、アデノウイルス(dsDNAアデノウイルス科)；レオウイルス(dsRNAレオウイルス科)；単純ヘルペスウイルス(dsDNAヘルペスウイルス科)、例えば、HSV1；ニューカッスル病ウイルス(ssRNAパラミクソウイルス科)；ワクシニアウイルス(dsDNAポックスウイルス科)；コクサッキーウイルス(ssRNAピコルナウイルス科)；麻疹ウイルス(ssRNAパラミクソウイルス科)；水疱性口内炎ウイルス(VSV、ssRNAラブドウイルス科)；インフルエンザウイルス(ssRNAオルトミクソウイルス科)；粘液腫ウイルス(dsDNAポックスウイルス科)；ラブドウイルス(ssRNAラブドウイルス科)、ピコルナウイルス(ssRNAピコルナウイルス科)からなる群より選択することができる。
【００２２】
ウイルスゲノム間の組換えは、2つの異なるゲノムに由来する遺伝物質の新しい共有結合した組合せの形成である。組換えは相同的または非相同的であってよく、複製的または非複製的であってよい。組換えのこれらの様々な機構は、ウイルスおよび／または宿主の因子を必要とし得る。本発明の一態様においては、宿主細胞中でのウイルスゲノム間の組換えが最小化されるか、または排除されることに基づいて、宿主における同時的使用のために腫瘍溶解性ウイルスを選択する。この意味で、前記ウイルスゲノムは宿主における組換えにとって「不適合」である。代替的な実施形態においては、不適合ゲノムとしては、例えば、以下のものが挙げられる。
【００２３】
ウイルスDNAゲノム、二本鎖(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、HSV)もしくは一本鎖(例えば、パルボウイルス)でも、ウイルスRNAゲノム(例えば、ラブドウイルス、インフルエンザ、レオウイルス)との組換えにとって不適合である。これの例外は、DNA複製中間型を有するRNAに基づくウイルス(例えば、レトロウイルス)である；
プラスセンスRNAウイルス(例えば、ピコルナウイルス)は、マイナスセンスRNAウイルス(例えば、ラブドウイルス、麻疹、NDV)と不適合である；
二本鎖RNAウイルス(例えば、レオウイルス)は一本鎖RNAウイルス(例えば、ラブドウイルス)と不適合である。
【００２４】
様々な態様において、本発明は、ビルレンス因子を利用する。代替的な実施形態の文脈においては、ビルレンス因子は、様々なウイルスにコードされるタンパク質を含んでもよく、その機能は、一般的には、典型的には、細胞の抗ウイルス応答(例えば、アポトーシスによる細胞死を誘発するシグナルによる干渉)の調節し、そのようなものとして、宿主免疫応答を調節するように適合させた、サイトカインもしくはその受容体と類似する活性を有することが多いウイルス-宿主相互作用を調節することである。本発明の代替的な態様における使用のために利用可能な、多数の、かつ拡大的なビルレンス因子のカタログが存在する。いくつかの実施形態においては、本発明と共に使用するためのビルレンス因子は、ウイルス感染の微小環境に局所的に適合することができる感染細胞から分泌されるウイルスにコードされるタンパク質である「ビロカイン」または「ビロセプター」などの分泌タンパク質を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態においては、ビルレンス因子を、宿主応答を調節し、その際に、典型的には、主に免疫破壊活性を有する、宿主のサイトカインと類似する効果を有する(それらをウイルスサイトカインと呼ぶことができる)ウイルスにコードされるタンパク質から選択することができる。
【００２６】
そのようなウイルスビルレンス因子の例としては、14.7 kDaのorfウイルスタンパク質、16 kDaのorfウイルスタンパク質、牛痘ウイルスの38Kの遺伝子産物、エプスタイン-バーウイルスのBCRF-1、牛痘ウイルスのCGF、サイトメガロウイルスのCMV IL10、ヘルペスウイルス糖タンパク質D、サイトメガロウイルスのHJ1、リスザルヘルペスウイルスのHVS13、単純ヘルペスウイルスのICP34.5、伝染性軟属腫ウイルスのMC148R、粘液腫ウイルスのMGF、アフリカ豚コレラウイルスのLMW23-NL、サル肉腫ウイルスのsis、orfウイルスIL10、ポックスウイルス増殖因子、呼吸器合胞体ウイルス糖タンパク質G、粘液腫およびポックスウイルスのSERP1、粘液腫ウイルスのSERP2、ショープ線維腫のSFGF、HIVのtatタンパク質、HHV-6のU83、ワクシニア19 kDaタンパク質、KSHVのウイルスIL6、マレック病ウイルスのウイルスIL8、リスザルヘルペスウイルスのウイルスIL17、KSHVのウイルスMIP-1-α、KSHVのウイルスMIP-2、KSHVのウイルスMIP-3、パラポックスウイルスOrfウイルスのVEGF-E、またはその相同体もしくは変異体、例えば、実質的に同一の配列が挙げられる。
【００２７】
代替的な実施形態においては、ビルレンス因子を、ワクシニアウイルスのB8R、ワクシニアウイルスのB15R、ワクシニアウイルスのB18R、エプスタイン-バーウイルスのBARF1、牛痘ウイルスのcrmB、牛痘ウイルスのcrmC、牛痘ウイルスのcrmD、牛痘ウイルスのcrmE、リスザルヘルペスウイルスのECRF-3、ウマヘルペスウイルス2のEHV-2 E1 ORF、バリオラウイルスのG5R、orfウイルスのGIF、マウスガンマヘルペスウイルス68のM3、粘液腫ウイルスのM11L、伝染性軟属腫ウイルスのMC54L、粘液腫ウイルスのM-T1、粘液腫ウイルスのM-T7、ヘルペスウイルスKSHVのORF74、エクトロメリアウイルスのp13、タナポックスウイルス38 kDaタンパク質、粘液腫ウイルスのT2、ヒトヘルペスウイルス6のU12、ヒトヘルペスウイルス6のU51、サイトメガロウイルスのUS28、ブリオラウイルスのvCCI、ワクシニアウイルスのvCKBP、ワクシニア、エクトロメリアおよび牛痘ウイルスのvIL18BP、またはその相同体もしくは変異体、例えば、実質的に同一の配列から選択することもできる。
【００２８】
選択された実施形態において、本発明は、細胞増殖を局所的に増加させるビロカインであるビルレンス因子、例えば、細胞増殖を刺激し、ワクシニア感染の増加を誘導するワクシニアにコードされるタンパク質VGFの使用を含んでもよい。特定の実施形態においては、VGFをコードする配列を、VSVゲノム、例えば、第2のウイルス治療剤として用いられるVGF欠失ワクシニアを補完する第1のウイルス治療剤中に挿入することができる。
【００２９】
代替的な実施形態においては、ビルレンス因子は、ウイルスにコードされる補体制御タンパク質(ワクシニアウイルス補体制御タンパク質VCPなど)であってよい。様々な補体制御タンパク質が特性評価されており、以下のGenbankアクセッション番号：CAM58194 [ワクシニアウイルスアンカラ]; AAR17868 [ワクシニアウイルス]; CAE00483 [エクトロメリアウイルス]; AAS49730 [ウサギポックスウイルス] ; ABD97379 [牛痘ウイルス]; NP_570413 [ラクダポックスウイルス] ; ABH08129 [ウマポックスウイルス]; ABF22775 [バリオラウイルス] ; またはCAE00480 [エクトロメリアウイルス]と相同であるか、または同一である配列を有するものを代替的な実施形態において用いることができる。
【００３０】
代替的な実施形態においては、ビルレンス因子は、ウイルスIL-17(例えば、Genbankアクセッション番号CAA73627[リスザルヘルペスウイルス2]と相同であるか、または同一である配列を有する)であってよい。
【００３１】
代替的な実施形態においては、ビルレンス因子は、ヤバ様病ウイルスタンパク質Y136であってよい(Leeら、Virology 281(2): 170-192 (2001); Huangら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 June 5; 104(23): 9822-9827；例えば、Genbankアクセッション番号NP_073521と相同であるか、または同一である配列を有する)。
【００３２】
代替的な実施形態においては、ビルレンス因子は、例えば、Genbankアクセッション番号：AAO89469 可溶性インターフェロン-γ受容体様タンパク質[ワクシニアウイルス WR]; AAS49883 [ウサギポックスウイルス]; CAM58364 [ワクシニアウイルスアンカラ]; ABH08298 [ウマポックスウイルス]; AAF34077 [ワクシニアウイルス (Tian Tan株)] ; CAB96933 [ワクシニアウイルス (LIVP株)]; AAA48205 [ワクシニアウイルスコペンハーゲン] ; ABP88853 [牛痘ウイルス]; AAW67920 [サルポックスウイルス] ; AAL40628 [サルポックスウイルスザイール-96-I-16]; ABD97757 [タテラポックスウイルス]; AAL73891 [ラクダポックスウイルスM-96]; ABF23752 [バリオラウイルス]; CAE00470 [エクトロメリアウイルス]; AAZ17459 [スカンクポックスウイルス]; AAZ17461 [ラクーンポックスウイルス]; AAZ17460 [ハタネズミポックスウイルス]; YP_227387 [シカポックスウイルスW-848-83] ; AAN02732 [ランピースキン病ウイルス]; NP_659582 [ヒツジポックスウイルス]と相同であるか、または同一である配列を有する、B8Rタンパク質であってよい。
【００３３】
代替的な実施形態においては、ビルレンス因子は、MMPまたはトリプシンなどの分泌プロテアーゼであってよい。
【００３４】
代替的な実施形態においては、ビルレンス因子は、ヤバサル腫瘍ウイルス2Lタンパク質(Rahmanら、J Biol Chem. 2006 Aug 11;281(32):22517-26; Brunettiら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 15;100(8):4831-6; Genbankアクセッション番号：NP_938264 [ヤバサル腫瘍ウイルス]; ABQ43473 [タナポックスウイルス]; もしくはCAC21240 [ヤバ様病ウイルス]と相同であるか、または同一である配列を有するタンパク質など)であってよい。
【００３５】
いくつかの実施形態においては、ビルレンス因子は、レオウイルスの融合関連小分子膜貫通(FAST)タンパク質配列などの膜融合タンパク質であってよい。WO 2002/044206およびWO 99/24582は、レオウイルスに由来する、様々なFAST膜融合タンパク質、そこで同定された機能的モチーフを記載している。本発明の代替的な実施形態においては、膜融合タンパク質は、その分子量に従って命名された、全て出鱈目の細胞融合物として機能する、FASTタンパク質ファミリーの4つのメンバーのGenbankアミノ酸配列：鳥レオウイルスおよびネルソン・ベイレオウイルスのp10タンパク質(Genbankアクセッション番号ABG43114 [鳥オルトレオウイルス]; ABA43652 [ノバリケンレオウイルス]; ABY78878 [オウム科オルトレオウイルスSRK/ドイツ/2007]; ABM67655 [ムラカオルトレオウイルス]; AAR13231 [パラオレオウイルス]; ACC77635 [カンパルオルトレオウイルス]; ABW16998 [レオウイルス株HK23629/07]; およびAAF45157 [ネルソン・ベイレオウイルス]); 爬虫類レオウイルスのp14タンパク質 (Genbankアクセッション番号AAP03134); ならびにヒヒレオウイルスのp15タンパク質(Genbankアクセッション番号AAL01373)などの、レオウイルス科によりコードされる膜融合タンパク質の少なくとも領域、これらのタンパク質の機能的断片(例えば、Topら、PLoS Pathog. 2009 March; 5(3)に開示されたもの: e1000331)と相同であるか、またはある程度の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。上記のFAST配列とは異なる他の融合タンパク質としては、テナガザル白血病ウイルスの融合糖タンパク質(Genbankアクセッション番号AAC96083の配列と実質的に同一である配列を含む)、麻疹ウイルスのHおよびF膜糖タンパク質(Hornら、J Virol. 2005 Feb;79(3):1911-7)ならびにパラミクソウイルスファミリーの他のメンバー、ならびに様々なヘルペスウイルス糖タンパク質融合タンパク質(SubramanianおよびGeraghty, Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Feb 20;104(8):2903-8)が挙げられる。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、ビルレンス因子を、第1のウイルスが、例えば、第2のウイルスによる感染のために腫瘍床を局所的に調製するために、宿主の先天的または適合免疫応答を阻害するビルレンス因子を発現するように選択することができる。そのような実施形態においては、第2のウイルスは、宿主の抗腫瘍免疫反応を増強する免疫刺激的ビルレンス因子を発現してもよい。例えば、そのような実施形態における2種のウイルスを、第1の腫瘍溶解性ウイルスが拡散することができる時間、連続的に使用した後、拡散した腫瘍溶解感染に免疫系を動員することができる。
【００３７】
例示された実施形態のいくつかにおいては、ワクシニアウイルスとVSVΔ51の組合せは、腫瘍感染および殺傷を増強するが、正常組織の感染を有意に増加させない。実際、組合せ治療は、様々なヒト腫瘍細胞系に拡散するラブドウイルスVSVΔ51の増加およびその後の細胞死を誘導した。2種のウイルス間の相乗作用が、多数のヒト腫瘍外植片において確認された。
【００３８】
本発明の様々な態様において、初期の可溶性抗原および表面抗原であると理解されるタンパク質であるワクシニアB18R遺伝子産物を用いて、高い親和性でIFNα／β／γ／ωに結合させ、それによって腫瘍細胞のインターフェロン応答の弱毒化を媒介することができる。選択された実施形態において、B18R遺伝子産物を、例えば、腫瘍溶解の効果を改善するために、腫瘍溶解性ウイルスを輸送するのに用いられる担体細胞中でのB18R遺伝子の発現により用いることができる。あるいは、組換えB18R遺伝子を、通常はB18Rを発現しない刺激ウイルス株に導入することができる。この文脈においては、B18R遺伝子または遺伝子産物の改変を、この活性を保持しながら行うことができる。従って、本発明は、組換え担体細胞と、B18Rと実質的に同一であるタンパク質をコードする刺激ウイルスを提供する。
【００３９】
ワクシニアウイルスB18Rタンパク質の配列は、Genbankアクセッション番号BAA00826 (Version BAA00826.1  GI:222699 (Uedaら、Virology 177 (2), 588-594 (1990); Goebelら、Virology 179 (1), 247-266 (1990); ならびにSmithおよびChan, J. Gen. Virol. 72 (PT 3), 511-518 (1991)を参照)に記載されている。関連する可溶性インターフェロン-α／β受容体配列は、例えば、以下のGenbankアクセッション番号：AAX23631 [ウサギポックスウイルス]; AAX23632 [バッファローポックスウイルス]; CAM58375 [ワクシニアウイルスアンカラ]; AAF34090 [ワクシニアウイルス (Tian Tan株)]; AAR91034 [カンタガロウイルス]; AAA48218 [ワクシニアウイルスコペンハーゲン]; ABH08308 [ウマポックスウイルス]; ABD97547 [牛痘ウイルス]; AAX23677 [サルポックスウイルス]; AAL40635 [サルポックスウイルスザイール-96-I-16]; AAF74754 [BeAn 58058ウイルス]; YP_717517 [タテラポックスウイルス]; ABF28175 [バリオラウイルス]; AAA60926 [バリオラメジャーウイルス]; AAX23674 [ラクダポックスウイルス]; AAX23673; およびCAC41986 [エクトロメリアウイルス]に開示されている。
【００４０】
以下のGenbankアクセッション番号：NP_659706 [ヒツジポックスウイルス]; AAL69871 [ブタポックスウイルス]; AAN02861 [ランピースキン病ウイルス]; ABI99302 [シカポックスウイルスW-848-83]; NP_073521 [ヤバ様病ウイルス136Rタンパク質]; ABQ43767 [タナポックスウイルス]; およびNP_051849 [粘液腫ウイルス]の対象である配列を含む、ワクシニアウイルスB18R配列からの有意なアミノ酸相違を有する、ウイルス配列を含む、当業界で公知の他のインターフェロン結合タンパク質配列が存在する。
【００４１】
遺伝子操作されたペプチドなどの代替的なインターフェロン結合タンパク質を、本発明の態様において用いることができる。例えば、2006年12月21日に公開されたUS 2006/0286641は、インターフェロンαおよび／またはインターフェロンβに結合することができるポリペプチド、ならびにそのようなペプチドに到達するための合理的タンパク質設計方法を記載している。関連する方法が、例えば、米国特許第7,083,950号; 第6,472,179号; 第6,475,983号および米国特許公開第2003/0018174号に開示されている。
【００４２】
定義
「実質的に同一の」配列は、本明細書で考察されるように、1個以上の保存的置換によってのみ、またはアミノ酸もしくは核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列の位置に位置する1個以上の非保存的置換、欠失、もしくは挿入によって、参照配列と異なるアミノ酸もしくはヌクレオチド配列である。そのような配列は、アミノ酸もしくはヌクレオチドレベルで、例えば、Align Program(MyersおよびMiller, CABIOS, 1989, 4:11-17)またはFASTAを用いる比較に用いられる配列と、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、52.5％、55％もしくは60％もしくは75％、またはより一般的には、少なくとも80％、85％、90％もしくは95％、または99％もしくは100％同一であってよい。ポリペプチドについては、比較配列の長さは、少なくとも4、5、10もしくは15個のアミノ酸、または少なくとも20、25、もしくは30個のアミノ酸であってよい。代替的な実施形態においては、比較配列の長さは、少なくとも35、40、もしくは50個のアミノ酸、または60、80、もしくは100個を超えるアミノ酸であってよい。核酸分子については、比較配列の長さは、少なくとも15、20、もしくは25個のヌクレオチド、または少なくとも30、40、もしくは50個のヌクレオチドであってよい。代替的な実施形態においては、比較配列の長さは、少なくとも60、70、80、もしくは90個のヌクレオチド、または100、200、もしくは500個を超えるヌクレオチドであってよい。配列同一性を、公共的に利用可能な配列分析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer GroupのSequence Analysis Software Package、University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、またはNational Library of Medicineから入手可能な、もしくは本明細書に記載のBLASTソフトウェア)を用いて容易に測定することができる。有用なソフトウェアの例としては、プログラムPile-upおよびPrettyBoxが挙げられる。そのようなソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、挿入、および他の改変に割り当てることにより、類似する配列を一致させる。
【００４３】
あるいは、またはさらに、2個の核酸配列が、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合、それらは「実質的に同一」であってよい。いくつかの実施形態においては、高ストリンジェンシー条件は、例えば、65℃の温度で、0.5 M NaHPO4、pH 7.2、7％SDS、1 mM EDTA、および1％BSA(画分V)を含むバッファー、または42℃の温度で、48％ホルムアミド、4.8x SSC、0.2 M Tris-Cl、pH 7.6、1x Denhardt's液、10％硫酸デキストラン、および0.1％SDSを含むバッファー中、少なくとも500ヌクレオチド長のDNAプローブを用いて起こるハイブリダイゼーションと比較可能なハイブリダイゼーションを可能にする条件である(これらは高ストリンジェンシーノーザンまたはサザンハイブリダイゼーションのための典型的な条件である)。ハイブリダイゼーションを、約20〜30分間、または2〜6時間、または約10〜15時間、または24時間以上にわたって実行することができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはまた、高ストリンジェンシーPCR、DNA配列決定、一本鎖コンフォメーション多型分析、およびin situハイブリダイゼーションなどの、分子生物学者により日常的に実施されるいくつかの技術の成功に依存する。ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーションとは対照的に、これらの技術は通常、比較的短いプローブ(例えば、PCRもしくは配列決定については通常は約16ヌクレオチド以上およびin situハイブリダイゼーションについては約40ヌクレオチド以上)を用いて実施される。これらの技術において用いられる高ストリンジェンシー条件は、分子生物学の当業者にはよく知られており、その例を、例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとするAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1998に見出すことができる。
【００４４】
用語「核酸」または「核酸分子」は、RNA(プラス鎖およびマイナス鎖)ならびにcDNA、ゲノムDNA、および合成(例えば、化学的に合成された)DNAなどのDNAの両方を包含する。核酸は、二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であってよい。核酸分子は、天然もしくは非天然ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体もしくは誘導体などの2個以上の共有結合したヌクレオチドの任意の鎖であってよい。「RNA」とは、2個以上の共有結合した天然または改変リボヌクレオチドの配列を意味する。この用語内に含まれる改変RNAの一例は、ホスホロチオエートRNAである。「DNA」とは、2個以上の共有結合した天然または改変デオキシリボヌクレオチドの配列を意味する。「cDNA」とは、RNA依存的DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)の作用によりRNA鋳型から産生される相補的またはコピーDNAを意味する。かくして、「cDNAクローン」は、クローニングベクター中に担持された、目的のRNA分子と相補的な二本鎖DNA配列を意味する。
【００４５】
「単離された核酸」は、通常はゲノム中でそれにフランキングする核酸分子を含まないか、またはそれが通常見出される生物中に含まれない核酸分子である。従って、「単離された」遺伝子または核酸分子は、いくつかの場合、通常は(天然では)遺伝子もしくは核酸分子にフランキングする核酸分子(ゲノム配列中など)によりフランキングしない遺伝子もしくは核酸分子および／または他の転写された配列から完全もしくは部分的に精製された(cDNAもしくはRNAライブラリー中の)遺伝子もしくは核酸分子を意味すると意図される。いくつかの場合、単離された核酸分子は、ウイルスなどの生物のゲノムを意味すると意図される。本発明の単離された核酸は、それが天然に存在する複雑な細胞環境に関して実質的に単離されたものであってよい。いくつかの例においては、単離された材料は、組成物の一部(例えば、他の物質を含む粗抽出物)、バッファー系または試薬混合物を形成するであろう。他の環境においては、前記材料を、例えば、PAGEまたはHPLCなどのカラムクロマトグラフィーにより決定されるように、本質的に均質になるまで精製することができる。従って、この用語は、例えば、ゲノム；自己複製するプラスミドもしくはウイルスなどのベクター；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組込まれた、または他の配列とは無関係に別の分子(例えば、PCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されるcDNAもしくはゲノムDNA断片)として存在する組換え核酸を含む。それはまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え核酸も含む。好ましくは、単離された核酸は、存在する全ての大分子種の少なくとも約50、80または90％(モルベースで)を含む。かくして、単離された遺伝子または核酸分子は、化学的に、または組換え手段により合成された遺伝子または核酸分子を含んでもよい。ベクター中に含まれる組換えDNAは、本明細書で用いられる「単離された」の定義中に含まれる。また、単離された核酸分子は、異種宿主細胞中の組換えDNA分子、ならびに溶液中の部分的または実質的に精製されたDNA分子を含む。本発明のDNA分子のin vivoおよびin vitro RNA転写物も、「単離された」核酸分子により包含される。そのような単離された核酸分子は、コードされたポリペプチドの製造において、相同配列を単離するため(例えば、他の種から)、遺伝子マッピングのため(例えば、染色体とのin situハイブリダイゼーションによる)、またはノーザンブロット分析などによる、組織(例えば、末梢血などのヒト組織)中の核酸分子の発現を検出するためのプローブとして有用である。
【００４６】
本発明の様々な遺伝子および核酸配列は、組換え配列であってよい。用語「組換え」とは、核酸構築物を参照する場合、この用語が、一緒に連結されたか、または分子生物学的技術を用いて産生された核酸配列から構成される分子を指すように、何かが組換えられたことを意味する。タンパク質またはポリペプチドを参照する場合、用語「組換え」とは、分子生物学的技術を用いて作製された組換え核酸構築物を用いて発現されるタンパク質またはポリペプチド分子を指す。遺伝子組成物を参照する場合、用語「組換え」とは、親ゲノム中には生じなかった対立遺伝子の新しい組合せを含む配偶子または子孫を指す。組換え核酸構築物は、それが天然で結合しないか、またはそれが天然で異なる位置で結合する核酸配列に結合するか、または結合されるようになるように操作されたヌクレオチド配列を含んでもよい。従って、「組換え体」として核酸構築物に言及する場合、この核酸分子が、遺伝子操作を用いて、すなわち、ヒトの介入により操作されたことを示唆する。例えば、組換え核酸構築物を、形質転換により宿主細胞中に導入することができる。そのような組換え核酸構築物は、単離され、宿主の種の細胞中に再導入された、同じ宿主細胞種または異なる宿主細胞種に由来する配列を含んでもよい。組換え核酸構築物配列は、宿主細胞の元々の形質転換の結果として、またはその後の組換えおよび／もしくは修復事象の結果として、宿主細胞ゲノム中に組込まれるようになってもよい。
【００４７】
核酸またはタンパク質を参照して本明細書で用いられる「異種性」は、それが天然に見出される場所以外の場所に位置するようにヒトの介入により操作された分子である。例えば、ある種に由来する核酸配列を、別の種のゲノム中に導入することができるか、またはある遺伝子座に由来する核酸配列を、同じ種の別の遺伝子座もしくは染色体外の座に移動させることができる。異種タンパク質は、例えば、異種コード配列から発現されたタンパク質または天然ではそのタンパク質を発現しない細胞中の組換え遺伝子から発現されたタンパク質を含む。
【００４８】
「相補的」とは、2個の核酸分子、例えば、DNAまたはRNAが、ワトソン-クリック塩基対を形成して、2個の核酸間で二本鎖の領域を産生する十分な数のヌクレオチドを含むことを意味する。かくして、DNAまたはRNAの一方の鎖中のアデニンは、反対の相補的DNA鎖中のチミンまたは反対の相補的RNA鎖中のウラシルと対形成する。核酸分子中の各ヌクレオチドが、反対の相補鎖中のヌクレオチドと、一致したワトソン-クリック塩基対を形成して、二本鎖を形成する必要がないことが理解されるであろう。
【００４９】
治療用製剤
様々な態様において、本発明は、癌、および良性の手術不可能な腫瘤などの関連する症状を治療するための組成物および方法を提供する。例えば、本発明は、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌および胆管癌、小腸癌、尿路癌(腎臓癌、膀胱癌および尿路上皮癌など)、女性生殖管癌(頸部癌、子宮癌、および卵巣癌ならびに絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患など)、男性生殖管癌(前立腺癌、精嚢癌、精巣癌、および胚細胞腫瘍)、内分泌腺癌(甲状腺癌、副腎癌、および下垂体癌)、および皮膚癌、ならびに血管腫、メラノーマ、肉腫(骨および軟組織から生じるものならびにカポジ肉腫など)ならびに脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍(星状細胞腫、神経膠腫、グリア芽腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫および髄膜腫など)などの、原発性および転移性固形腫瘍などの固形腫瘍の存在を特徴とする癌の治療を含んでもよい。いくつかの態様においては、本発明の方法および組成物は、白血病(すなわち、緑色腫、形質細胞腫ならびに菌状息肉腫のプラークおよび腫瘍ならびに皮膚T細胞リンパ腫／白血病)およびリンパ腫(ホジキンおよび非ホジキンの両方のリンパ腫)などの造血悪性腫瘍から生じる固形腫瘍を治療するのに有用でもある。さらに、本発明の態様は、単独で、または放射線療法もしくは化学療法などのさらなる治療手法と組合わせて用いる場合、上記の腫瘍からの転移の防止において有用であってよい。
【００５０】
一態様においては、本発明は、腫瘍溶解性ウイルスまたは宿主における腫瘍溶解性ウイルス感染に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるのに有効である薬剤などの治療用化合物または組成物の投与(同時投与を含む)を含む。様々な実施形態において、そのような薬剤を、製剤または医薬品中で、治療的に用いることができる。従って、本発明は、宿主における腫瘍溶解性ウイルス感染に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるのに有効である薬剤などの、活性薬剤と、薬学上許容し得る賦形剤または担体とを含む治療用組成物を提供する。
【００５１】
本発明の薬剤の有効量は、一般的には、治療上有効量であろう。「治療上有効量」は、一般的には、宿主における腫瘍溶解性ウイルス感染に対する腫瘍細胞の感受性の増加などの、所望の治療結果を達成するのに必要な用量および期間で有効な量を指す。化合物の治療上有効量は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに化合物が個体において所望の応答を引き出す能力などの因子に応じて変化してもよい。最適な治療応答を提供するために投薬計画を調整することができる。治療上有効量はまた、化合物の任意の毒性効果または有害効果を、治療上有益な効果が上回る量でもある。
【００５２】
特定の実施形態においては、治療上有効量にとって好ましい範囲は、患者の症状の性質および／または重篤度によって変化してもよい。任意の特定の被験者にとって、特定の投薬計画を、個人の要求および組成物を投与するか、または組成物の投与を管理する人の専門的判断に従って徐々に調整するべきであることがさらに理解されるべきである。
【００５３】
「製薬上許容し得る担体」または「賦形剤」は、生理的に適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。一実施形態においては、前記担体は非経口投与にとって好適である。あるいは、前記担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与にとって好適であってよい。製薬上許容し得る担体は、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射溶液もしくは分散物の即時調製のための滅菌粉末を含む。製薬上活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当業界でよく知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の医薬組成物中でのその使用が意図される。補助的活性化合物も前記組成物中に組み入れることができる。
【００５４】
典型的には、治療用組成物は、製造および保存の条件下で滅菌されており、安定でなければならない。前記組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬剤濃度にとって好適な他の規則的構造物として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびその好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合、必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、前記組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。前記組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸およびゼラチンを含有させることにより、注射用組成物の長期的吸収をもたらすことができる。さらに、本発明の活性薬剤を、時間放出製剤、例えば、遅延放出ポリマーを含む組成物中で投与することができる。活性化合物を、インプラントおよび微小カプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、迅速な放出に対して前記化合物を保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸、ポリグリコール酸コポリマー(PLG)などの、生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は特許化されているか、または当業者に一般的に知られている。
【００５５】
必要量の活性薬剤を、上記に列挙された成分の1つまたはその組合せを含む好適な溶媒中に含有させ、必要に応じて、その後濾過滅菌することにより、滅菌注射溶液を調製することができる。一般的には、活性化合物を、基本分散媒体と、上記に列挙されたものに由来する必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中に組み入れることにより、分散物を調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、予め滅菌濾過されたその溶液に由来する任意のさらなる所望の成分を得る減圧乾燥および凍結乾燥である。
【００５６】
本発明の別の態様に従えば、宿主における腫瘍溶解性ウイルス感染に対する腫瘍もしくは癌細胞の感受性を増加させるのに有効である薬剤などの、本発明の治療剤を、癌の治療における使用のための説明書などの本発明の薬剤の使用のための説明書を提供する標識を有する容器またはキット中に提供することができる。
【００５７】
さらなる疾患進行の防止などの本明細書に開示される疾患症状を治療または予防するための本発明の使用を、その症状に罹患しているか、もしくはそれを生じる危険性があると診断されたか、またはさもなければ決定された被験者において行うことができる。いくつかの実施形態においては、腫瘍溶解療法のために、十分な骨髄機能(例えば、2,000/mm3を超える末梢絶対顆粒球計数および100,000/mm3の血小板計数と定義される)、十分な肝機能(例えば、1.5 mg/dl未満のビリルビン)および十分な腎機能(例えば、1.5 mg/dl未満のクレアチニン)を有するとして患者を特性評価することができる。
【００５８】
本発明の薬剤のための投与経路は変化してもよく、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻内、皮下、局所、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、腫瘍内、吸入、かん流、洗浄、直接注入、および経口投与および製剤が挙げられる。
【００５９】
腫瘍内注入、または腫瘍血管系への注入は、別々の固形の接近しやすい腫瘍について意図される。局所(local)、局所(regional)または全身投与も好適であってよい。4 cmを超える腫瘍については、投与する容量は、例えば、約4〜10 mlであってよいが、4 cm未満の腫瘍については、約1〜3 mlの容量を用いることができる。複数の注射液を、例えば、約0.1〜約0.5 ml容量の単回用量として送達することができる。ウイルス粒子を、例えば、約1 cm間隔で配置された腫瘍に対して複数の注射液で投与することができる。
【００６０】
本発明の方法を、例えば、手術不可能な腫瘍を切除術にかけるために、術前に用いることができる。あるいは、本発明を、手術の時点で、および／または手術後に用いて、残留するか、または転移性の疾患を治療することができる。例えば、切除された腫瘍床を、腫瘍溶解性ウイルスを含む製剤と共に注入またはかん流することができる。例えば、手術部位に埋め込まれたカテーテルを放置することにより、かん流を切除後も継続することができる。定期的術後治療も有用であってよい。
【００６１】
代替的な実施形態においては、本発明は、低酸素腫瘍組織を選択的に殺傷する化学療法剤などの、二次好中球応答の間に腫瘍細胞の殺傷を増加させる化学療法剤を宿主に投与することを含んでもよい。代替的な実施形態においては、化学療法剤は、例えば、以下のもの：ジヒドロピリミド-キノキサリンおよびジヒドロピリミド-ピリドピラジン；キノキサリンもしくはピリドピラジン誘導体；1,2-ジヒドロ-8-ピペラジニル-4-フェニルイミダゾピリドピラジンオキシドおよび1,2-ジヒドロ-8-ピペラジニル-4-フェニルイミダゾキノキサリンオキシド；ニトロフェニルマスタードおよびニトロフェニルアジリジンアルコール、およびその対応するリン酸塩；アントラキノン化合物(WO 2005/061453に開示されたもの)；アルキレンアミンオキシムに基づくリガンド、特に、ブチレンアミンオキシム環構造、およびその放射性金属錯体(WO 1995/004552に開示されたもの)；1,2,4-ベンゾトリアジン-1,4-ジオキシド化合物(WO 2005/082867)；またはニトロ置換芳香族もしくはヘテロ芳香族化合物(EP 319329)の1種以上であってよい。
【００６２】
本発明の薬剤の連続的投与を、必要に応じて、例えば、腫瘍を切り出し、腫瘍床を治療して残留する顕微鏡的疾患を排除する場合に適用することができる。例えば、連続的かん流を、治療の開始後、約1〜2時間から、約2〜6時間まで、約6〜12時間まで、約12〜24時間まで、約1〜2日まで、約1〜2週間以上までの期間行うことができる。一般的には、連続的かん流を介する治療剤の用量は、かん流が起こる時間にわたって調整された、単回または複数回の注入により与えられるものと等しいものであろう。特に、メラノーマおよび肉腫の治療において、肢かん流を用いて、本発明の治療用組成物を投与することができることがさらに意図される。
【００６３】
本発明の治療は、様々な「単位用量」を含んでもよい。単位用量は、所定量の治療用組成物を含有すると定義される。単位用量を1回の注入として投与する必要はないが、設定された期間にわたる連続的注入を含んでもよい。本発明の単位用量を、ウイルス構築物についてのプラーク形成単位(pfu)に関して都合よく記載することができる。単位用量は、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013 pfu以上である。あるいは、ウイルスの種類および達成できる力価に応じて、1〜100、10〜50、100〜1000、または最大で約104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、もしくは1015以上の感染性ウイルス粒子(vp)を、患者または患者の細胞に送達することができる。
【００６４】
(実施例)
化合物
IFNα治療を、10 x 106 IU/mlの保存濃度で4℃で保存されたイントロンA(Shering)を用いて実施した。組換えB18Rタンパク質(ワクシニアウイルスにコードされる中和I型IFN受容体)を、eBioscienceから購入し、0.1 mg/mlで-80℃で保存した。
【００６５】
細胞系
ヒトHT29結腸癌、ヒトSKOV3卵巣癌、ヒト786-0腎臓癌(American Type Tissue Collection)、ヒトU2OS骨肉腫細胞およびアフリカミドリザルVero腎臓上皮細胞を、American Type Culture Collectionから購入し、10％ウシ胎仔血清(CanSera, Etobicoke, Canada)を補給したHyQ ダルベッコ改変イーグル培地(高グルコース)(HyClone)中で増殖させた。
【００６６】
ウイルス
ワクシニアウイルス：WRのB18R欠失株およびクローニングプラスミドpSC65-蛍ルシフェラーゼは、Steve Thorne博士(Department of Pediatrics and Bio-X Program, Stanford University, Stanford, California, United States of America)により親切に提供されたものである。VVDD-高感度GFP(VVDD-eGFP)、VGFおよびチミジンキナーゼ(TK)遺伝子を二重に欠失したワクシニアウイルス、ならびにpSEL-eGFPプラスミドは、Andrea McCart博士(Division of Experimental Therapeutics, Toronto General Research Institute, Toronto, Ontario, Canada)により提供されたものである。ワクシニアΔB18R-eGFP(VVΔB18R-eGFP)を、相同組換えによりeGFP-DNAをワクシニアチミジンキナーゼ(TK)遺伝子に挿入することにより作製した。eGFP発現により成功した組換え体を選択し、プラーク精製した。全てのワクシニアウイルスをU2OS細胞中で増殖させた。感染したU2OS細胞を収穫し、1 mM Tris pH 9.0中に再懸濁し、凍結-解凍細胞溶解および36％スクロースクッション上、11500 rpmでの遠心分離後にビリオンを精製した。ウイルスペレットを、全ての動物試験のために1 mM Tris pH 9中に再懸濁した。
【００６７】
VSVウイルス：マトリックスタンパク質のメチオニン51の弱毒化欠失およびRFP(VSVΔ51-DsRed)、もしくは高感度GFP-ルシフェラーゼ(VSVΔ51-Luc)をコードするトランスジーンを含むVSVの組換えAV3株を、Vero細胞中で増殖させた(Powerら、2007)。全ての動物試験について、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Hyclone, Logan, UT)中に再懸濁する前に、0.2μm Steritopフィルター(Millipore, Billerica, MA)の通過および11500 rpmでの遠心分離により細胞培養上清からビリオンを精製した。FASTタンパク質およびRFP(VSVFAST-DsRed)をコードするトランスジーンを含む組換えVSVΔ51を、Vero細胞中で増殖させた(Brownら、2009)。
【００６８】
SFVウイルス：複製能力を有するSFVベクターVA7-EGFPの構築が記載されている(Vaha-Koskelaら、2003)。
【００６９】
HT29および786-0細胞上でのアイソボログラム分析
HT29または786-0細胞を、96穴プレート中、それぞれ、100000および50000細胞／ウェルで塗布し、一晩接着させた。次の日、VVDDおよびVSVΔ51またはSFVの連続希釈液を添加し、786-0細胞について、それぞれ100〜1の一定比を維持した。アラマーブル-試薬を用いて、薬剤および／またはウイルスとの72時間のインキュベーション後の細胞代謝活性を評価した。Calcusynを用いて、CIを計算し、0.7未満のCIを相乗的と考えた(Chou, 2006)。CIエラーバーは、見積もり値の標準偏差を表す。
【００７０】
マウスおよび腫瘍モデル
用いた全てのマウスは、Charles River Laboratoriesから取得したものである。
【００７１】
画像化試験：ヒト異種移植片結腸癌HT29腫瘍を、100μlのPBS中に懸濁した3x 106個の細胞を注入することにより、6週齢のCD1メスヌードマウス(n=4)中で皮下的に確立した。明白な腫瘍が、播種後約10日以内に形成された。VVDD-eGFPを、1 x 106pfu/マウスで静脈内投与した。VSV-Luc(1 x 107 pfu)を、ワクシニアウイルス治療の2〜3日後に静脈内投与した。
【００７２】
効力試験：皮下HT29異種移植片モデルについて、マウスをXウイルス用量／組合せでX回治療し、電子カリパスを用いて腫瘍を3〜4日毎に測定した。腫瘍体積を、(L1)2*L2/2として算出した。
【００７３】
in vivoでの画像化
蛍ルシフェラーゼ画像化のために、d-ルシフェリン(Molecular Imaging Products Company, Ann Arbor, MI)(PBS中、10 mg/mlで200μlを腹腔内投与)をマウスに注射した。3％イソフルオラン(Baxter Corp., Deerfield, IL)下でマウスを麻酔し、in vivo画像化系200 Series Imagins System(Xenogen Corporation, Hopkinton, MA)を用いて画像化した。データの獲得と分析を、Living Image v2.5ソフトウェアを用いて実施した。各実施形態について、同一の露出、絞り値およびピクセルビニング設定の下で画像を捕捉し、生物発光を同一のカラースケール上でプロットした。
【００７４】
免疫組織化学(IHC)
組織を回収し、OCT封入剤(Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)中に入れ、凍結ミクロトーム(Microm HM500 OM Cryostat)を用いて5μmの切片に切断した。組織切片を4％パラホルムアルデヒド中に20分間固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色または免疫組織化学(IHC)に用いた。IHCを、製造業者の説明書に従って、ウサギ一次抗体用Vecastain ABCキット(Vector Labs, Burlingame, CA)を用いて実施した。用いた一次抗体は、VSV(Eal Brown氏の贈り物)および活性キャスパーゼ3(BD Pharmingen, Rockville, MD)に対するウサギポリクローナル抗体であった。簡単に述べると、3％H2O2と共にインキュベートした後、1.5％正常ヤギ血清を用いて非特異的エピトープをブロックすることにより、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。続いて、全切片をアビジン、次いでビオチンブロッキング剤と共に、それぞれ15分間インキュベートした。全てのブロッキングおよびインキュベーション工程の間に、PBS洗浄を行った。次いで、切片を、抗VSV抗体(1:5000、30分)、抗活性キャスパーゼ3抗体(1:200、60分間)である一次抗体と共にインキュベートした後、抗ウサギビオチン化二次抗体と共にインキュベートした。ABC Vectastainキットから得られたアビジン：ビオチン化酵素複合体を、各スライドに30分間添加した。PBSで連続的に3回洗浄した後、3,3-ジアミノベンズイジン試薬と共にインキュベートすることにより抗原を局在化させた。切片をヘマトキシリンで対抗染色した。細胞形態の評価のために、標準的なプロトコルに従って、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。全腫瘍画像をEpson Perfection 2450 Photo Scannerを用いて取得したが、拡大図をZeiss Axiocam HRM Inverted蛍光顕微鏡を用いて捕捉し、Axiovision 4.0ソフトウェアを用いて分析した。
【００７５】
外植片調製、培養、感染および滴定
原発性癌組織標本および正常(入手可能な場合)組織標本を、腫瘍切除を受けた同意する患者から取得した。全ての組織標本を外科的切除後48時間以内に処理した。15 mm外科用メスを用いて、サンプルを手動で約10 mm3の小片に分割し、滅菌技術下、10％ウシ胎仔血清を含むα培地を含む12穴プレート上に入れた。次いで、両方とも高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードするVVΔB18RおよびVVDDを標本(107PFU)に直接添加し、37℃で2時間感染させた。最後の45分に、DsRedをコードするVSVΔ51も標本に添加した後(108PFU)、血清を含有する培地で標本を被覆した。48時間で、蛍光顕微鏡を用いて標本を可視化した。示された処理条件後、サンプルを計量し、ホモジェナイザー(Kinematica AG-PCU-11)を用いて0.5 mlのPBS中で均質化した。組織調製物の連続希釈液を、無血清培地中で調製し、ウイルス力価を標準的なプラークアッセイにより定量した。
【００７６】
in vitroの癌細胞、in vivoの腫瘍およびex vivoの患者組織サンプルからのVSVおよびVVの滴定
各処理条件から得た上清を、特定の時点で回収した。次いで、DMEM中で連続希釈を実施し、200μlの各希釈液を、45分間、Vero細胞の集密単層に加えた。続いて、プレートにDMEM-10％FBS中の0.5％アガロースを重ね、プラークを24時間増殖させた。次いで、カルノア固定液(メタノール：酢酸が3:1である)を、5分間、オーバーレイの頂部に直接加えた。オーバーレイを、スパーテルを用いてゆっくりと持ち上げ、固定された単層を0.5％クリスタルバイオレットを介して5分間染色した後、プラークを数えた。DMEM-10％FBS中の1.5％カルボキシメチルセルロースを用いて、U2OS単層上で48時間、VVDDサンプルを滴定した。オーバーレイを除去し、単層を0.5％クリスタルバイオレットを介して5分間染色した後、プラークを数えた。in vivoの腫瘍を500μlのPBS中に均質化し、in vitro試験について記載されたように処理した。
【００７７】
統計分析
腫瘍のウイルス滴定に関するin vivoデータ：これらの試験のために、マウスを治療群に無作為に割り当て、PBSについては5匹のマウス、VVDD/VSVについては9匹のマウス、およびVVDB18R/VSVについては5匹のマウスにした。T検定統計分析を行って、VVDD/VSV群とVVDB18R/VSV群を比較した。P<0.005を統計学的に有意であると考えた。ヒトサンプルのウイルス滴定に関するex vivoデータ：対応T検定統計分析を行って、ヒトサンプルのVVDD/VSV倍数増強とVVDB18R/VSV倍数増強を比較した。VVDD/VSVとVVΔB18R/VSVの両方について試験したサンプルのみを、統計学的検定に含有させた。P<0.05を統計学的に有意であると考えた。
【実施例１】
【００７８】
ワクシニアウイルスはin vitroで水疱性口内炎ウイルス感染を増強する
VSVの野生型株は、感染の際に、核からのIFN mRNAの輸送を遮断することによりIFN産生の細胞内アンタゴニストとして作用するタンパク質(Mまたはマトリックスタンパク質)を発現する。初期の研究において、Mタンパク質中に遺伝子操作された突然変異を有するウイルス(VSVΔ51)の変異体が、ウイルス感染後にIFN遺伝子の発現を遮断することができず、かくして、無傷の抗ウイルス応答を有する正常細胞中での増殖が制限されることが決定された。VSVΔ51は、IFNを産生するか、またはそれに応答する能力を欠く幅広い癌細胞において野生型ウイルスと同等のレベルで増殖する。しかしながら、いくつかのヒト腫瘍細胞系HT29(結腸)、SKOV-3(卵巣)および786-0(腎臓)はIFNに対する少なくとも部分的な応答性を保持し、図1に記載のように、および以下の条件(75％集密なHT29結腸、786-0腎臓またはSKOV-3卵巣癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFP(0.1 MOI)で2時間、もしくはVSVΔ51-DsRed(0.0001 MOIのHT29およびSKOV-3もしくは0.1の786-0)で45分間、もしくは2種のウイルスと組合わせて、VVDDで2時間および4時間後にVSVΔ51で45分間処理した)下で蛍光検出により決定されるように、VSVΔ51の拡散を弱く支援するに過ぎないことが決定された。eGFP(VV)およびDsRed(VSV)蛍光を、VSVΔ51感染の48時間後に検出した。VSVΔ51感染の72時間後、ウイルスの腫瘍溶解効果を、クリスタルバイオレットにより評価し、二重処理条件中で大規模な細胞死を証明した。
【００７９】
しかしながら、これらのVSVΔ51耐性細胞系を、本明細書に記載の、およびVVDDと呼ばれる腫瘍溶解型のワクシニアにより生産的に感染させることができることが確認された。感染後、VVDDは、抗ウイルスサイトカインIFNα／βに結合し、これを局所的に隔離するB18R遺伝子産物を発現する。同時感染した培養物内に拡散するそれぞれのウイルスのモニタリングを可能にするタグ付型のVVDD(eGFP)およびVSVΔ51(RFP)を作製した。
【００８０】
HT29細胞はVVDD感染を支援したが、低い感染多重度(MOI 0.1 pfu/細胞)では、VVDDが単層を通して拡散する(GFP発現により測定)か、または培養物を完全に殺傷するためには、48時間では不十分な時間であった。VVDD感染をVSVΔ51の1000倍低い用量で行う場合、本発明者らはVSVの迅速な拡散とHT29細胞培養物の完全な殺傷の両方を観察した。これはSKOV-3および786-0腫瘍細胞系についても同様に真実であった。これらの実施形態は、癌細胞系の感染を開始させ、以前の耐性培養物をVSVの迅速な腫瘍溶解効果に対して感作する局所環境を作るVVDDの能力を証明する。予想されるように、VSVΔ51の加速された拡散は、図1Aに示されるように、単一に感染した培養物と比較して、ウイルス産生の1000倍の増加と相関していた。アイソボログラム分析により、2種のウイルスによる同時感染が、図1Bに示されるように癌細胞系の相乗的殺傷をもたらすことが示された。蛍光顕微鏡下での実験により、一般的には、RFPおよびGFP画像は重複せず、これは、腫瘍溶解の増加がVVに感染した細胞におけるVSVの取込みの増強に起因せず、むしろVSVΔ51感染への近隣の細胞の感作に起因することを示唆している。観察されたVVに駆動される増強が、VSVに限定されないことを排除するために、別のIFN感受性RNAウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス(SFV)をチャレンジとして用いた。SFVに関する結果は、VSVΔ51に関する結果と非常に類似していたが、これは、ワクシニアウイルスが、本明細書および図6に記載のように、IFN感受性ウイルスの拡散を容易にする普遍的な能力を有し得ることを示唆している。
【実施例２】
【００８１】
VV B18R遺伝子産物はin vitroでHT29癌細胞系中でのVSV複製を増強する
HT29結腸癌細胞のIFN応答性を試験した。75％集密なHT29結腸癌細胞を、IFNα(30IUのイントロンA)で17時間予備処理するか、またはしなかった。次いで、細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFP(0.1 MOI)で2時間、もしくはVSVΔ51-DsRed(0.0001 MOI)で45分間、単独で、もしくは組合わせて、VVDDで2時間およびVSVΔ51で最後の45分間処理した。eGFP(VV)およびDsRed(VSV)蛍光を、VSVΔ51感染の48時間後に検出した。写真は、VSVΔ51単独ではこれらの細胞中であまり複製しないことを示していた。対照的に、VVDDと組合わせた場合、VSVΔ51はHT29中で複製する。IFNα予備処理と比較した場合、VVDDが感染および拡散できる場合でも、VSVΔ51は増強されなかった。別の実施形態においては、75％集密なHT29結腸癌細胞を、様々な濃度の組換えB18Rタンパク質(10e-1〜10e-6μg)で予備処理するか、またはしなかった。DsRed(VSV)蛍光を、VSVΔ51感染の48時間後に検出した。HT29細胞を、VSVΔ51による感染から保護したが、用いたIFNの濃度ではワクシニア感染に対するいくらかの感受性を保持していた。
【００８２】
また、VVDD感染細胞により分泌された因子が、VSVΔ51感染に対するHT29細胞の感作の原因となるかどうかも試験した。75％集密なHT29結腸癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFPもしくはVVΔB18R-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理した。各条件の上清を0.22μmフィルター(ワクシニアウイルスを遮断する)を用いて濾過し、濾過された培地をナイーブなHT29細胞に添加した。VVDD感染培養物に由来する上清を、感染の24時間後に回収し、濾過し(VVDDを除去するため)、HT29細胞のナイーブな培養物に加えた。続いて、これらの培養物をVSVΔ51-DsRed(0.0001 MOI)に感染させ(またはさせない)、次いで、感染を45分間行うか、または行わなかった。eGFP(VVDDの効果的な遮断を検証するため)およびDsRed(VSV)蛍光を、VSVΔ51感染の48時間後に検出した。本明細書に記載の条件下で、VVDD感染培養物の上清中に存在する因子は、HT29細胞をVSVによる感染に対して感作するのに十分であった。
【００８３】
B18Rタンパク質がVSVΔ51の増強を少なくとも部分的に担うかどうかを決定するために、B18R遺伝子を欠く組換えVV株を開発した(VVΔB18R-eGFP)。75％集密なHT29結腸癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFPもしくはVVΔB18R-eGFP(0.1 MOI)で2時間、単独で、VSVΔ51-DsRed(0.0001 MOI)と組合わせて、または組合わせずに45分間処理した。それぞれ、VVおよびVSVΔ51感染に由来するeGFPおよびDsRed蛍光を、VSVΔ51感染の48時間後に検出した。まとめると、VSVΔ51によるHT29細胞の感染はVVDDにより大きく増強されたが、VVΔB18Rウイルスによってはあまり増強されなかった。この増強は、VVΔB18R同時感染よりもVVDD同時感染培養物中で産生された100倍を超えるVSVΔ51を含む同時感染培養物(図2B)から産生されたVSVΔ51の量に反映されていた。図2Bに記載のように、VSV力価を、48時間後に、0.0001 MOIのVSVΔ51によるHT29細胞の感染後に決定した。図2Aに記載のように標準的なプラークアッセイのために上清を回収した。
【００８４】
VVΔB18R感染培養物に由来する濾過された上清は、HT29細胞中でのVSVΔ51拡散およびウイルス産生の促進において、VVDD感染培養物に由来する上清よりも非常に低い効力であると決定された。本明細書に記載のようにアイソボログラム分析を実施した。簡単に述べると、786-0細胞を、96穴プレート中、B18R遺伝子産物、次いでVSVの連続希釈液(固定比1μg:50000 PFU)で処理し、図1Dに記載のように加工した。これらの実施形態に関する結果を、図2Cに示す。
【００８５】
さらなる実施形態において、75％集密なHT29結腸癌細胞をIFNα(30IU)で予備処理するか、または予備処理せず、VVDDもしくはVVΔB18R-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理するか、またはしなかった。最後の45分に、VSVΔ51-DsRed(0.0001 MOI)を、組換えB18Rタンパク質(10e-2μg)と組合わせて、または組合わせずに添加した。eGFP(VV)およびDsRed(VSV)蛍光を、VSVΔ51感染の48時間後に検出した。
【００８６】
さらなる実施形態においては、HT29結腸癌細胞を、様々な濃度の組換えB18R(10e-1〜10e-6μg)タンパク質で2時間予備処理するか、もしくは予備処理せず、または細胞をVVDD-eGFPもしくはVVΔB18R-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理した。VSVΔ51-DsRed(0.0001 MOI)に、様々な濃度のINFα(5〜30IU)を添加するか、または添加しなかった。48時間後、標準的なVSVΔ51プラークアッセイのために上清を回収した。
【００８７】
本明細書に記載のように、HT29培養物に直接添加した場合、精製された組換えB18Rタンパク質は、図2Dに示されるように、用量依存的様式で、VSVΔ51の強固な増殖および拡散を支援し、ならびにHT29細胞のVSVΔ51感染を増強する際にVVΔB18Rウイルスを補完することができた。培養物に外因性IFNα(IFNα)を補給することにより、B18Rタンパク質の活性を克服することができた。これは、VSVΔ51の拡散が、B18RおよびIFNαの相対比率により制限されることを示しており、これはin vivoで、VSVΔ51の増殖が腫瘍微小環境中のB18Rの相対濃度により限定されることを示唆している。
【実施例３】
【００８８】
ワクシニアウイルスは腫瘍床中で特異的にVSVΔ51複製を増強する
HT29皮下異種移植片腫瘍モデルを、ヌードマウスにおいて確立した。腫瘍増殖後、群にVVDD-eGFP(1.10e5pfu)を投与し、2日後、VSVΔ51-ルシフェラーゼ(1.10e7pfu)も静脈内注射した。腫瘍部位でのウイルス複製を、GFPおよびルシフェラーゼについてVSVΔ51注射後3、7および9日目にIVIS画像化系を用いて画像化した。注入の3日後、VVDD遺伝子発現はヒト腫瘍増殖の部位に限定された。組合せ治療に対応する腫瘍マウスは、5日後から9日目までVSVΔ51の強いシグナルを示した。この時点で、VSVΔ51-ルシフェラーゼを静脈内投与し、ウイルスにコードされた受容体の発現を時間と共にモニターした。VSVΔ51関連ルシフェラーゼ発現は、二重感染した動物の腫瘍においてのみ観察された。VSVΔ51-ルシフェラーゼシグナルは、感染の約7日後にピークに達したが、感染後最大で11日間は腫瘍中でのIVIS画像化により検出可能なままであった。
【００８９】
さらに、ヌードマウスに、VVDD-eGFP(1.10e6pfu/マウス)を静脈内注射した。GFP関連発現を、生きたマウスにおける静脈内注射の2日後に顕微鏡により制御した。VSVΔ51注射後11日目に、マウスを犠牲にした。腫瘍を外科手術により取り出し、プレート上に置いて、腫瘍中でのVSVΔ51の特異的発現を検証した。組合せ治療の腫瘍マウスは、より豊富なVSVΔ51の存在を示した。
【００９０】
VVDDおよびVVΔB18Rウイルスを、図3Aに示されるように腫瘍を担持するマウスにおけるVSV複製を促進するその能力について比較し、対比させた。両ウイルスは腫瘍中での特異的なVSVΔ51複製を増強することができたが、これに関するその相対効力は、上記の本発明者らのin vitro試験を反映していた。実際、VVΔB18R/VSVΔ51同時感染腫瘍を回収し、均質化し、プラークアッセイによりウイルス力価について分析した場合、本発明者らは、VVΔB18R感染腫瘍におけるよりもVVDD感染腫瘍においてVSVΔ51が1000倍多いことを見出した(図3A)。
【００９１】
ヒト腫瘍におけるVSVの存在および性質を、抗VSV抗体を用いる免疫組織化学染色により決定した。VSVにのみ感染させた腫瘍は、同時感染した腫瘍における幅広いVSV感染の証拠が存在すると予想されたように、ウイルスタンパク質をほとんど含まないか、またはそれを検出できなかった。VSVによる腫瘍の感染は、活性キャスパーゼ3の免疫組織化学的検出により示されるように、アポトーシスの幅広い誘導をもたらす。二重感染した腫瘍におけるVSV複製の増強が、ヒト異種移植片腫瘍モデルおよび免疫応答性マウス乳腺腫瘍モデルの両方の場合に観察された(図3Bおよび3C)。
【００９２】
これらの実施形態において用いた治療用量で、いずれかのウイルスを用いる療法はそのままではこれらの迅速に増殖する腫瘍に対する影響がほとんどないことが見出された。しかしながら、VVDDおよびVSVを連続的に投与した場合、腫瘍増殖は有意に遅延した。
【００９３】
モニタリング過程の間に、同時感染した動物においてさえ、ウイルス複製が腫瘍床に限定されたが、画像化または免疫組織化学染色により検出された正常組織の感染の証拠はなかった。
【実施例４】
【００９４】
ワクシニアウイルスはex vivoでヒト腫瘍組織中の水疱性口内炎ウイルス発現を増強する
上記の実施形態は、確立された腫瘍細胞系と動物モデルにおけるワクシニアとVSVの腫瘍溶解間の相乗的相互作用を証明する。これを、無傷の一次ヒト生検サンプルにおいて試験した。
【００９５】
腫瘍組織と正常組織の両方(入手可能な場合)を含む、特定の病理を有するヒト組織外植片を、外科切除を受ける患者から取得した。各サンプルから組織スライスを調製した後、単独で、または腫瘍溶解性ウイルスと組合わせて感染させた。簡単に述べると、ヒトのex vivo直腸癌および正常組織標本、肝臓中の結腸癌転移および正常肝臓、脳および子宮内膜癌組織に、1 x 108 pfuのVVDD-eGFPで2時間、最後の45分についてはVSVΔ51-DsRedと組合わせて、または組合わせずに接種した。eGFPおよびDsRed発現を、ウイルス接種後48時間、蛍光顕微鏡によりモニターした。
【００９６】
全ての実施形態において、未感染のスライスを落射蛍光顕微鏡により可視化して、組織から発散するバックグラウンド蛍光のレベルを決定した。VVDDの存在下での一次腫瘍サンプル中の増強されたVSV感染の画像を見た。例えば、直腸腫瘍組織と隣接する正常組織の両方が本明細書に記載のマウスモデルと一致したある患者においては、腫瘍溶解性ウイルス増殖は腫瘍スライスにおいてのみ観察され、隣接する正常組織では観察されなかった。同様の結果が、肝臓中の転移結腸癌を有する患者から得た正常および腫瘍サンプル対において認められた。
【００９７】
蛍光画像は、定性的出力を提供するが、この現象を定量的に確認するために、感染した培養物から産生されたウイルス量を図4に示されるように定量した。患者の腫瘍標本をPBS中で均質化し、VSVΔ51ウイルス力価をVero細胞上での標準的なプラークアッセイを用いて決定して、ウイルス複製を定量した。図4に示されるように、それぞれの線は1人の患者に対応する(腫瘍の型＃患者数)。黒色と白色のバーはそれぞれ、単一に感染した培養物と比較した、VVDD(44人の患者)およびVVΔB18R(30人の患者)で二重に感染した培養物におけるVSVΔ51の増強倍数に対応する。組合せVV/VSVΔ51サンプルをVVDD (1.10e7pfu)により2時間感染させ、および／または最後の45分についてはVSVΔ51(1.10e8pfu)で感染させた。接種の48時間後にサンプルを均質化し、VSV滴定のために処理した。VVDD/VSV組合せについて、最も高い増加から最も低いものまで、データを分類した。
【００９８】
これらの試験のために、ウイルスの吸着の直後に、別々のサンプルを取得して、残りの入力ウイルスに関する基線を提供した。感染後48時間で、スライスを均質化し、ウイルス力価を決定した。図4に提示される結果は、様々な悪性腫瘍における二重対単一に感染した培養物におけるVSVΔ51の増強倍数である。44個の腫瘍サンプルのうちの33個において、本発明者らはワクシニアウイルスとの腫瘍サンプルの同時感染後にVSV力価の10〜10000倍の増加を観察した。入手可能な隣接する正常サンプルの多くにおいて、VVDDの存在下でのVSVΔ51による有意な感染は観察されなかった。
【実施例５】
【００９９】
VVDD増殖を増強するようにVSVΔ51を遺伝子操作することができる
VVDDは、IFNなどの抗ウイルスサイトカインに対して非応答性である腫瘍微小環境を条件化することによりVSVΔ51増殖を増強することができる。これらの実施形態は、ウイルスにコードされる遺伝子産物を往復し、産生することができたVSVΔ51株が、VVDDの増殖および／または拡散を増強することを例示する。感染の間に産生された約90％のVVDDが、(MossおよびEarl、2001ならびにMoss, 2006)に考察されたようにウイルス増殖周期を通して感染細胞の内部に残存する。
【０１００】
細胞融合を局所的に誘導する融合関連小分子膜貫通(p14 FAST)タンパク質を発現するVSVΔ51組換え体を開発した。p14 FASTタンパク質は、細胞膜融合を同時的に開始する爬虫類レオウイルスから元々単離された小型内在性膜タンパク質である。75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理した後、VSVFAST-DsRed(0.1 MOI)感染を45分間実施するか、または実施しなかった。eGFP(VV)およびDsRed(VSVFAST)蛍光を、VSVFAST感染後、顕微鏡により48時間で検出した。3つの独立した実施形態の1つを提示する。VVDDおよびVSVFAST力価を、図5Aに示されるように感染の48時間後に決定した。図5Bに示されるように、アイソボログラム分析を実施した。簡単に述べると、786-0細胞を、96穴プレート中、VVDD、次いでVSVFASTの連続希釈液(固定比1:100 PFU)で処理し、図1Dに記載のように加工した。VSVFAST感染の72時間後、ウイルスの腫瘍溶解効果をクリスタルバイオレットアッセイにより評価し、二重処理条件における大量の細胞死を証明した。図5Cに示されるように、細胞死の割合(％)を評価した。786-O細胞を、ワクシニアウイルス、次いで、VSVまたはVSVFASTで処理した。72時間後、MTS試薬を用いて細胞傷害性を評価した。2つの独立した作業形態の1つを提示する。75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD(0.1 MOI)で2時間、および／もしくはタグを含まないVSVFAST(0.1 MOI)で45分間処理した。eGFP(VV)蛍光を、SFV感染後48時間検出した。患者の結腸腫瘍標本を、VVSS(eGFP)により1.10e7pfuで2時間、および／またはVSVFAST(DsRed)により1.10e8pfuで45分間感染させた。eGFPおよびDsRed発現を、ウイルス接種後48時間モニターした。
【０１０１】
in vitroおよびex vivoでの同時感染形態において、VVDDとVSVFASTが、細胞殺傷の増加、ワクシニアウイルス産生の100倍を超える増加に翻訳される両ウイルスのウイルス拡散に関して相乗的様式で相互作用する(図5Bを参照)と決定された。
【実施例６】
【０１０２】
ワクシニアウイルスはin vitroでセムリキ森林熱ウイルス発現を増強する
75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-Cherry(0.1 MOI)で2時間およびSFV-eGFP(0.1 MOI)で処理した。次いで、感染を45分間実施するか、または実施しなかった。eGFP(SFV)およびCherry(SFV)蛍光をSFV感染後48時間で検出した。
【０１０３】
図6Aに示されるように、VVDDおよびSFV力価を、感染後48時間で決定した。図6Bに示されるように、アイソボログラム分析を行った。簡単に述べると、786-O細胞を、96穴プレート中、VVDD、次いで、SFVの連続希釈液(固定比100:1 PFU)で処理した。72時間後、アラマーブルー試薬を用いて細胞傷害性を評価した。組合せ指数(CI)を、ChouおよびTalalayの方法に従ってCalcusynソフトウェアを用いて算出した。
【実施例７】
【０１０４】
VVDDはMaraba-SDMを増強する
このセットの例示的実施形態においては、75％集密なCT26結腸癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-DsRed(0.1 MOI)で2時間処理した後、MRB-SDM-eGFP(0.1もしくは0.001 MOI)感染を45分間実施するか、または実施しなかった。DsRed(VV)およびeGFP(MRB-SDM)蛍光を、Maraba感染後顕微鏡により48時間で検出した。Maraba-SDM力価を、図7に示されるように感染後24および48時間で決定した。
【実施例８】
【０１０５】
VVDDはVSVΔ51FASTを増強し、VSVΔ51FASTはVVDD増殖を増強する
75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理した後、VSVFAST-DsRed(0.1 MOI)感染を45分間実施するか、または実施しなかった。eGFP(VV)およびDsRed(VSVFAST)蛍光を、VSVFAST感染後、顕微鏡により48時間で検出した。図8Aに示されるように、VVDDおよびVSVFAST力価を、感染後48時間で決定した。図8Bに示されるように、アイソボログラム分析を行った；簡単に述べると、786-O細胞を、96穴プレート中、VVDD、次いでVSVFASTの連続希釈液(固定比1:100 PFU)で処理し、本明細書に記載のように加工した。VSVFAST感染の72時間後、ウイルスの腫瘍溶解効果を、クリスタルバイオレットアッセイにより評価し、二重処理条件において大量の細胞死を証明した。図8Cに示されるように、細胞死の割合(％)を評価した。786-O細胞を、ワクシニアウイルス、次いで、VSVまたはVSVFASTで処理した。72時間後、MTS試薬を用いて細胞傷害性を評価した。75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD(0.1 MOI)で2時間および／もしくはタグを含まないVSVFAST(0.1 MOI)で45分間処理した。eGFP(VV)蛍光を感染後48時間で検出した。さらに、患者の結腸腫瘍標本を、VVDD(eGFP)により1.10e7pfuで2時間および／またはVSVFAST(DsRed)により1.10e8pfuで45分間感染させた。ウイルス接種後、eGFPおよびDsRed発現をモニターした。
【実施例９】
【０１０６】
Jx-963およびJx-594はVSVΔ51を増強する
JX-963は、ウイルスチミジンキナーゼ[TK]およびワクシニア増殖因子[VGF]遺伝子中に欠失を有し、ヒトGM-CSFを発現するワクシニアのWestern Reserve株[WR]である(Thornら、J. Clin. Invest. 117:3350-3358 (2007))。JX-594は、GM-CSFを発現するTK欠失ワクシニアである(Liuら、Molecular Therapy (2008) 16 (9), 1637-1642; Kimら、Molecular Therapy (2006) 14, 361-370)。
【０１０７】
75％集密な786-O腎臓癌細胞を未処理のまま放置するか、またはVVDD-eGFP、JX594-eGFPもしくはJX-963-eGFP(0.1 MOI)で2時間処理した後、VSV-DsRed(0.1)感染を45分間実施するか、または実施しなかった。eGFP(VV)およびDsRed(VSV)蛍光を、VSV感染後顕微鏡により48時間で検出した。
【０１０８】
結論
本発明の様々な実施形態が本明細書に開示されているが、当業者の一般的な知識に従って、本発明の範囲内で多くの適合化および改変を行うことができる。そのような改変は、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するための本発明の任意の態様に関する公知の等価物の置換を含む。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。語句「限定されるものではないが、含む(including, but not limited to)」と実質的に等価な、制約がない用語として本明細書で用いられる用語「含む(comprising)」と、用語「含む(comprises)」は、一致する意味を有する。本明細書で用いられる単数形「a」、「an」および「the」は、本文が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。かくして、例えば、「もの(a thing)」に対する参照は、2個以上のそのようなものを含む。本明細書に記載の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることの承認ではない。限定されるものではないが、本明細書で引用される特許および特許出願を含む、任意の優先権書類、刊行物、データベースまたはインターネットリソースは、あたかもそれぞれ個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられ、本明細書に完全に記載されると示されるように、参照により本明細書に組み入れられるものとする。本発明は、実施例および図面を参照して、実質的に本明細書に記載のような全ての実施形態および変更を含む。
【０１０９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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