(57)【要約】  本発明は、新規の脂肪酸ｎＥＣＲをコードする、単離された核酸分子を提供する。また、本発明は、ｎＥＣＲ核酸分子を含有する組換え発現ベクター、該発現ベクターが導入された宿主細胞、ならびに長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）、例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡの大規模生産のための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１または３に示すヌクレオチド配列を有する核酸配列、
ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）ａ）またはｂ）の核酸配列と少なくとも５０％が同一である核酸配列であって、ｎＥＣＲ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸配列、
ｄ）ｎＥＣＲ活性を有し、かつａ）〜ｃ）のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、および
ｅ）ａ）〜ｄ）のいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、ｎＥＣＲ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸配列、
からなる群から選択された核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、前記核酸配列に作用可能に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、前記核酸配列に作用可能に連結されたターミネーター配列をさらに含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの製造のための方法であって、
ａ）前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、請求項５に記載の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）ステップａ）の宿主細胞からポリペプチドを得るステップと、
を含む方法。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、あるいは請求項６に記載の方法によって得られるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のベクターを含む、非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項９】
植物、植物部位、または植物種子である、請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項１０】
多価不飽和脂肪酸を製造するための方法であって、
ａ）請求項５に記載の宿主細胞を、前記宿主細胞における多価不飽和脂肪酸の産生を可能にする条件下で培養するステップと、
ｂ）前記宿主細胞から前記多価不飽和脂肪酸を得るステップと、
を含む方法。
【請求項１１】
多価不飽和脂肪酸を製造するための方法であって、
ａ）請求項８または９に記載の非ヒトトランスジェニック生物を、前記宿主細胞における多価不飽和脂肪酸の産生を可能にする条件下で培養するステップと、
ｂ）前記非ヒトトランスジェニック生物から、前記多価不飽和脂肪酸を得るステップと、
を含む方法。
【請求項１２】
前記多価不飽和脂肪酸が、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか１つに記載の方法のステップと、前記多価不飽和脂肪酸を油、脂質、または脂肪酸組成物として配合するさらなるステップを含む、油、脂質、または脂肪酸組成物を製造するための方法。
【請求項１４】
前記油、脂質、または脂肪酸組成物が、飼料、食品、化粧品、または薬剤に使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０から１２のいずれか１つに記載の方法によって得られる多価不飽和脂肪酸を含む油。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原則として、脂肪酸の組換え製造の分野に関連する。本発明は、新規の脂肪酸デヒドラターゼ／エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ｎＥＣＲ）ファミリーのメンバーをコードする核酸分子を提供する。また、本発明は、ｎＥＣＲ核酸分子を含有する組換え発現ベクター、該発現ベクターが導入された宿主細胞、ならびに長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）、例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡの大規模生産のための方法も提供する。
【０００２】
脂肪酸は、長鎖炭化水素側鎖基を有するカルボン酸であり、これは多くの生物学的プロセスにおいて重要な役目を果たす。脂肪酸は、本来は遊離していることはまれであり、脂質の主要成分として、エステル化された形態で存在する。したがって、脂質／脂肪酸はエネルギー（例えば、ｂ−酸化）の源である。さらに、脂質／脂肪酸は、細胞膜の必須部分であり、したがってこれらは生体情報または生化学的情報を処理するためには不可欠である。
【０００３】
脂肪酸は、２つの群、炭素単結合からなる飽和脂肪酸の群と、シス配置の１つ以上複数の炭素二重結合を含有する不飽和脂肪酸の群とに分けることができる。不飽和脂肪酸は、非ヘム鉄酵素群に属する末端デサチュラーゼによって産生される。これらの酵素のそれぞれは、別の２つのタンパク質、すなわちシトクロムｂ5およびＮＡＤＨ−シトクロムｂ5レダクターゼを含有する電子伝達系の一部である。具体的には、そのような酵素は、例えば、脂肪酸の酸素依存性脱水素を触媒することにより、脂肪酸分子の炭素原子間の二重結合形成を触媒する（Ｓｐｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。ヒトおよびその他の哺乳動物は、不飽和脂肪酸における特定の二重結合の形成に必要とされるデサチュラーゼを限られた範囲で有し、したがって必須脂肪酸、例えば長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）を合成する能力が限定されている。したがって、ヒトは、食事を介して一部の脂肪酸を摂取しなければならない。そのような必須脂肪酸には、例えばリノール酸（Ｃ１８：２）、リノレン酸（Ｃ１８：３）が含まれる。対照的に、昆虫、微生物、および植物は、はるかに多くの種類の不飽和脂肪酸およびそれらの誘導体を合成することができる。実際、脂肪酸の生合成は、植物および微生物の主要な活性である。
【０００４】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９））などの長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）は、哺乳動物における種々の組織の細胞膜および細胞小器官（神経、網膜、脳、および免疫細胞）の必須成分である。例えば、脳リン脂質中の３０％を超える脂肪酸は、２２：６（ｎ−３）および２０：４（ｎ−６）である（Ｃｒａｗｆｏｒｄ，  Ｍ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ６６：１０３２Ｓ−１０４１  Ｓ）。網膜において、ＤＨＡは、光受容細胞の感光部分である桿体外節の全脂肪酸の６０％を超える（Ｇｉｕｓｔｏ，  Ｎ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ３９：３１５−３９１）。臨床研究は、乳児における脳の成長および発達、ならびに成人における正常な脳機能の維持に、ＤＨＡが必須であることを示している（Ｍａｒｔｉｎｅｔｚ，  Ｍ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  １２０：Ｓ１２９−Ｓ１３８）。また、ＤＨＡは、シグナル伝達過程、ロドプシン活性化、ならびに桿体および錐体の発達に関与する光受容体機能にも著しい影響を及ぼす（Ｇｉｕｓｔｏ，  Ｎ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ３９：３１５−３９１）。さらに、ＤＨＡのいくつかの好ましい効果が、高血圧、関節炎、アテローム性動脈硬化症、うつ病、血栓症、および癌などの疾患に対しても認められた（Ｈｏｒｒｏｃｋｓ，  Ｌ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｙｅｏ，  Ｙ．  Ｋ．  （１９９９）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｓ．  ４０：２１１−２１５）。したがって、脂肪酸を食事で適切に供給することは、ヒトの健康にとって重要である。幼児、小児、および高齢者は、そのような脂肪酸を効率的に合成することができないため、このような個人にとって、これらの脂肪酸を食事から十分に摂取することは特に重要である（Ｓｐｅｃｔｏｒ，  Ａ．Ａ．  （１９９９）  Ｌｉｐｉｄｓ  ３４：Ｓ１−Ｓ３）。
【０００５】
現在、ＤＨＡの主要源は、魚および藻類由来の油である。魚油は、この脂肪酸の主要かつ伝統的な供給源であるが、これらは通常は、販売される頃には酸化されている。さらに、魚油の供給は、特に魚の数が減少していることを考えると、極めて変動しやすい。その上、藻類油源は、生産高が低く、抽出のコストが高いため高価である。
【０００６】
ＥＰＡおよびＡＲＡは、どちらも必須脂肪酸である。これらはヒトおよび動物の食物および飼料の成分の独自の群をなす。ＥＰＡは、アシル鎖内に５個の二重結合を有するｎ−３系列に属する。ＥＰＡは、海産物中に見られ、北大西洋産の脂肪の多い魚に豊富に含まれる。ＡＲＡは、４個の二重結合を有するｎ−６系列に属する。ω−３位の二重結合の欠如は、ＡＲＡに、ＥＰＡに見られるものとは異なる特性を与える。ＡＡから産生されるエイコサノイドは、強い炎症特性および血小板凝集特性を有し、一方ＥＰＡ由来のエイコサノイドは、抗炎症特性および抗血小板凝集特性を有する。ＡＲＡは、肉、魚、卵などの一部の食物から得られるが、その濃度は低い。
【０００７】
ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）は、哺乳動物に見られるまた別の必須脂肪酸である。ＧＬＡは、極めて長い鎖のｎ−６脂肪酸および種々の活性分子の代謝中間体である。哺乳動物において、長鎖多価不飽和脂肪酸の形成はΔ６不飽和化により律速される。多くの生理学的状態および病的状態、例えば老化、ストレス、糖尿病、湿疹、および一部の感染症は、Δ６不飽和化の段階を抑制することが示されている。さらに、ＧＬＡは、特定の障害、例えば癌または炎症に関連する酸化および急速な細胞分裂により、容易に異化される。したがって、ＧＬＡの食事補給は、これらの障害のリスクを低下させうる。臨床研究は、ＧＬＡの食事補給が、一部の病的状態、例えばアトピー性湿疹、月経前症候群、糖尿病、高コレステロール血症、ならびに炎症性障害および心血管障害の処置に有効であることを示している。
【０００８】
バイオ技術は特殊脂肪酸の製造のための魅力的な経路を提示しているが、現在の技法は、不飽和脂肪酸の大規模製造のための効率的な手段を提供することができない。したがって、不飽和脂肪酸、例えばＤＨＡ、ＥＰＡ、およびＡＲＡを製造するための、改良された効率的な方法が必要とされている。
【０００９】
したがって、本発明は、
ａ）  配列番号１または３に示すヌクレオチド配列を有する核酸配列、
ｂ）  配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）  ａ）またはｂ）の核酸配列と少なくとも５０％が同一である核酸配列であって、デヒドラターゼ／エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ｎＥＣＲ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、
ｄ）  ｎＥＣＲ活性を有し、かつａ）〜ｃ）のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、および
ｅ）  ａ）〜ｄ）のいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、ｎＥＣＲ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、
からなる群から選択された核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
本発明に従って使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、デヒドラターゼ／エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ｎＥＣＲ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましくは、植物における発現時にｎＥＣＲ活性を有する本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドは、例えば、種子油、または植物全体もしくはその一部におけるＰＵＦＡ、とりわけＬＣＰＵＦＡの量を増加させることができるであろう。そのような増加は、好ましくは、ＬＣＰＵＦＡ合成に必要とされる最小限のデサチュラーゼとエロンガーゼの組み合わせは発現するが、本発明のポリヌクレオチドは発現しないＬＣＰＵＦＡ産生トランスジェニック対照植物と比較して、統計的に有意である。増加が有意であるかどうかは、当該技術分野で周知の統計的検定、例えばスチューデントのｔ検定によって決定することができる。より好ましくは、この増加は、前記対照と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％のＬＣＰＵＦＡを含有するトリグリセリドの量の増加である。好ましくは、前述のＬＣＰＵＦＡは、Ｃ−２０、Ｃ−２２、またはＣ２４脂肪酸本体を有する多価不飽和脂肪酸、より好ましくはＡＲＡ、ＥＰＡ、またはＤＨＡである。前述の活性の測定に適したアッセイは、添付の実施例に記載する。
【００１１】
「ｎＥＣＲ活性」または「デヒドラターゼ／エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性」という用語は、本明細書において、エノイル−ＣｏＡレダクターゼとデヒドラターゼとの複合活性を指す。すなわち、この複合活性を有する酵素は、脂肪酸の伸長過程の一環として、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡからヒドロキシル基を除去し、形成された二重結合を還元することができるであろう。脂肪酸伸長は、ＫＣＳ（ケトアシル−ＣｏＡ−シンターゼ）、ＫＣＲ（ケトアシル−ＣｏＡ−レダクターゼ）、ＤＨ（デヒドラターゼ）、およびＥＣＲ（エノイル−ＣｏＡレダクターゼ）の４つの酵素に代表される、４つの段階で触媒される。第１段階では、脂肪酸−ＣｏＡエステルがマロニル−ＣｏＡに縮合して、２個の炭素原子で伸長されるケトアシル−ＣｏＡ中間体とＣＯ2とを産生する。次いで、この中間体のケト基をＫＣＲによってヒドロキシル基に還元する。次の段階では、ＤＨがそのヒドロキシル基を切断し（Ｈ2Ｏが生成される）、アシル−２−エン−ＣｏＡエステル（Δ−２−エノイル−ＣｏＡ）が形成する。最終段階では、２、３位の二重結合がＥＣＲにより還元されて、伸長されたアシル−ＣｏＡエステルを形成する（Ｂｕｃｈａｎａｎ，  Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，  Ｊｏｎｅｓ  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ）。本発明の基礎となる研究において、優れた触媒活性およびＬＣＰＵＦＡに対する特異性を有する、ＤＨおよびＥＣＲの自然融合がもたらされた。
【００１２】
より好ましくは、配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１または３に示す核酸配列を有するポリヌクレオチド、またはその変異体は、好ましくはｎＥＣＲ活性を示す。
【００１３】
上記のようなｎＥＣＲ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好ましくはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａまたはＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍから、本発明に従って得られたものである。しかしながら、オルソログ、パラログ、またはその他のホモログを他の種から同定することもできる。
【００１４】
好ましくは、これらは植物、例えば藻類、例えばＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍａｎｔｏｎｉｅｌｌａ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ、またはＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、藻類／珪藻、例えばＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、またはＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、蘚類、例えばＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａまたはＣｅｒａｔｏｄｏｎ、あるいは高等植物、例えばＰｒｉｍｕｌａｃｅａｅ、例えばＡｌｅｕｒｉｔｉａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｓｔｅｌｌａｔａ、Ｏｓｔｅｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｐｉｎｅｓｃｅｎｓ、またはＯｓｔｅｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｈｙｏｓｅｒｏｉｄｅｓ、微生物、例えば菌類、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、またはＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、細菌、例えばＳｈｅｗａｎｅｌｌａ、酵母、または動物から得られる。好適な動物は、線虫、例えばＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ、昆虫、または脊椎動物である。脊椎動物の中でも、核酸分子は、好ましくは、Ｅｕｔｅｌｅｏｓｔｏｍｉ、Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙｇｉｉ；Ｎｅｏｐｔｅｒｙｇｉｉ；Ｔｅｌｅｏｓｔｅｉ；Ｅｕｔｅｌｅｏｓｔｅｉ、Ｐｒｏｔａｃａｎｔｈｏｐｔｅｒｙｇｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｉｆｏｒｍｅｓ；Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ、またはＯｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓに、より好ましくはＳａｌｍｏｎｉｆｏｒｍｅｓ目、最も好ましくはＳａｌｍｏｎｉｄａｅ科、例えばＳａｌｍｏ属に、例えばＯｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ、Ｔｒｕｔｔａ  ｔｒｕｔｔａまたはＳａｌｍｏ  ｔｒｕｔｔａ  ｆａｒｉｏ（属・種）に由来していてよい。さらに、核酸分子は、珪藻、例えばＴｈａｌｌａｓｉｏｓｉｒａ属またはＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属から得ることもできる。
【００１５】
したがって、本発明に従って使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、本発明のポリヌクレオチドのオルソログ、パラログ、またはその他のホモログに相当する、前述の特定のポリヌクレオチドの変異体をさらに包含する。さらに、本発明のポリヌクレオチドの変異体は、人工的に作り出した突然変異タンパク質も含む。前記突然変異タンパク質は、例えば、突然変異誘発技法によって作り出された、改善もしくは改変された基質特異性を示す酵素、あるいはコドン最適化されたポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド変異体は、好ましくは、その配列が、配列番号１または３のいずれか１つに示す前述の特定の核酸配列から、または配列番号２または４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより、少なくとも１つのヌクレオチド置換、付加、および／または欠失によって誘導することができる配列を特徴とする核酸配列を含み、それにより変異体核酸配列は、上記のようなｎＥＣＲ活性を有するポリペプチドを依然としてコードするであろう。また、変異体は、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前述の特定の核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含する。このようなストリンジェントな条件は、当業者に周知であり、またＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好適な例は、およそ４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（＝ＳＳＣ）のあと、５０〜６５℃において０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで１回以上の洗浄ステップを実施するハイブリダイゼーション条件である。当業者は、これらのハイブリダイゼーション条件が、核酸の種類によって異なり、また例えば有機溶媒が存在する場合には、緩衝液の温度および濃度に関して異なることを承知している。例えば、「標準的なハイブリダイゼーション条件」下で、濃度０．１〜５×ＳＳＣ（ｐＨ７．２）の水性緩衝液において、温度は核酸の種類によって４２℃から５８℃の間で異なる。上述の緩衝液中に有機溶媒、例えば５０％ホルムアミドが含まれる場合、標準的な条件下での温度はおよそ４２℃である。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの場合のハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、０．１×ＳＳＣおよび２０℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜４５℃である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合のハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、０．１×ＳＳＣおよび３０℃〜５５℃、好ましくは４５０℃〜５５℃である。上述のハイブリダイゼーション温度は、例えば、ホルムアミド不在下での長さおよそ１００ｂｐ（＝塩基対）およびＧ＋Ｃ含有量５０％の核酸に対して決定される。当業者であれば、教本、例えば前述の教本、または以下の教本：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ"，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８９；  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （Ｅｄ．）  １９８５，  "Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙ��ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ"，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ；  Ｂｒｏｗｎ  （Ｅｄ．）  １９９１，  "Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ"，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄを参照することにより、必要とされるハイブリダイゼーション条件を決定する方法を理解している。あるいは、ポリヌクレオチド変異体は、ＰＣＲに基づく技法、例えば混合オリゴヌクレオチドプライマーに基づくＤＮＡの増幅によって、すなわち本発明のポリペプチドの保存されたドメインに対する変性プライマーを用いることによって得られる。本発明のポリペプチドの保存されたドメインは、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列またはポリペプチドのアミノ酸配列の配列比較によって同定することができる。ＰＣＲプライマーとして適切なオリゴヌクレオチド、ならびに適切なＰＣＲ条件は、添付の実施例に記載する。テンプレートとして、細菌、菌類、植物、または動物に由来するＤＮＡまたはｃＤＮＡを使用することができる。さらに、変異体には、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、配列番号１または３のいずれか１つに示す核酸配列と同一である核酸配列であって、好ましくは上記のようなｎＥＣＲ活性を保有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。さらに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、配列番号２または４のいずれか１つに示すアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、好ましくは上記のようなｎＥＣＲ活性を保有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含する。同一性パーセント値を、好ましくは、アミノ酸配列領域または核酸配列領域の全体にわたって計算する。異なる配列を比較するために、当業者は、種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムを利用することができる。好適な実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，  Ｒｉｃｅ．Ｐ．，  Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．，  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６（６），  ２７６−２７７，  ２０００）のｎｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  １９７０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （４８）：４４４−４５３）を用いて、遠縁のタンパク質の場合はＢＬＯＳＵＭ４５スコア行列またはＰＡＭ２５０スコア行列のい���れか、あるいはより近縁のタンパク質の場合はＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列またはＰＡＭ１６０スコア行列のいずれか、またギャップ開始ペナルティ１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびギャップ伸長ペナルティ０．５、１、２、３、４、５、または６を使用して決定される。ＥＭＢＯＳＳパッケージのローカルインストールの案内、ならびにＷＥＢ−Ｓｅｒｖｉｃｅｓへのリンクは、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔに示されている。ｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインするために使用するパラメータの好適かつ非限定的な例は、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列、ギャップ開始ペナルティ１０、およびギャップ伸長ペナルティ０．５を含むデフォルトパラメータである。さらに別の好適な実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ、Ｒｉｃｅ，  Ｐ．，  ＬｏｎｇｄｅｎＩ．，  ａｎｄ  ＢｌｅａｓｂｙＡ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６（６），  ２７６−２７７，  ２０００）のｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて、ＥＤＮＡＦＵＬＬスコア行列、ならびにギャップ開始ペナルティ１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびギャップ伸長ペナルティ０．５、１、２、３、４、５、または６を使用して決定される。ｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて２つの配列をアラインするために併せて使用するパラメータの好適かつ非限定的な例は、ＥＤＮＡＦＵＬＬスコア行列、ギャップ開始ペナルティ１０、およびギャップ伸長ペナルティ０．５を含むデフォルトパラメータである。本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、さらに「クエリ配列」として使用して、公共データベースに対する検索を実行し、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  １９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０）の一連のＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２）を用いて実行することができる。クエリ配列として本発明のｎＥＣＲ核酸配列を用いたＢＬＡＳＴは、ＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｘ、またはｔＢＬＡＳＴｘプログラムを用い、デフォルトパラメータを使用して実行し、本発明のｎＥＣＲ配列と相同なヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴｎ、ｔＢＬＡＳＴｘ）またはアミノ酸配列（ＢＬＡＳＴｘ）のいずれかを得ることができる。クエリ配列として本発明のｎＥＣＲタンパク質配列を用いたＢＬＡＳＴは、ＢＬＡＳＴｐまたはｔＢＬＡＳＴｎプログラムを用い、デフォルトパラメータを使用して実行し、本発明のｎＥＣＲ配列と相同なアミノ酸配列（ＢＬＡＳＴｐ）または核酸配列（ｔＢＬＡＳＴｎ）のいずれかを得ることができる。比較の目的でギャップアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  １９９７，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２）に記載されているように、デフォルトパラメータを用いたＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用することができる。
【００１６】
第１表：種々のＢＬＡＳＴプログラムにおける、クエリ配列およびヒット配列の配列タイプの関係
【表１】
2012529277.tif 000002
【００１７】
また、前述の核酸配列のうちのいずれかのフラグメントを含むポリヌクレオチドも、本発明のポリヌクレオチドとして包含される。このフラグメントは、上記のようなｎＥＣＲ活性を依然として有するポリペプチドをコードすることとなる。したがって、このポリペプチドは、前記生物学的活性を与える本発明のポリペプチドのドメインを含んでも、あるいは前記ドメインからなってもよい。本明細書で言うフラグメントは、好ましくは、前述の核酸配列のいずれか１つの少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２５０個、または少なくとも５００個の連続するヌクレオチドを含む、あるいは前述のアミノ酸配列のいずれか１つの少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも８０個、少なくとも１００個、または少なくとも１５０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする。
【００１８】
変異体ポリヌクレオチドまたは前記のフラグメントは、好ましくは、有意な程度、好ましくは、配列番号２または４のいずれか１つに示す任意のポリペプチドが示すｎＥＣＲ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のｎＥＣＲ活性を保有するポリペプチドをコードする。この活性は、添付の実施例に記載するようにテストすることができる。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、前述の核酸配列から本質的になる、あるいは前述の核酸配列を含む。したがって、これらはさらなる核酸配列を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームに加え、コード遺伝子領域の３′末端および５′末端に、さらなる非翻訳配列を含んでもよく、これはコード領域５′末端の上流の少なくとも５００個、好ましくは２００個、より好ましくは１００個のヌクレオチドの配列、およびコード遺伝子領域３′末端の下流の少なくとも１００個、好ましくは５０個、より好ましくは２０個のヌクレオチドの配列である。さらに、本発明のポリヌクレオチドは融合タンパク質をコードしていてもよく、このとき融合タンパク質の１つのパートナーは、上記の核酸配列によってコードされたポリペプチドである。そのような融合タンパク質は、付加部分として、脂肪酸もしくはＰＵＦＡ生合成経路の別の酵素、発現をモニターするためのポリペプチド（例えば、緑色、黄色、青色、または赤色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼなど）、あるいは検出可能なマーカーとして、または精製のための補助手段として機能しうる、いわゆる「タグ」を含んでいてもよい。さまざまな目的のタグが当該技術分野では周知であり、これにはＦＬＡＧ−タグ、６−ヒスチジン−タグ、ＭＹＣ−タグなどが含まれる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチド（すなわち、精製されているか、または少なくともその天然のコンテクスト、例えばその天然の遺伝子座から単離されている）として、あるいは遺伝子を組換えられた形態、または外部から（すなわち、人工的に）操作した形態で提供されるであろう。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中に、その核酸分子に天然に隣接するおよそ５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含んでもよい。このポリヌクレオチドは、好ましくは、二本鎖分子または一本鎖分子の形で提供される。前述の本発明のポリヌクレオチドのいずれかを参照することによって、本発明が、上述の特定の配列またはその変異体の相補鎖または逆相補鎖にも関することは理解されるであろう。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ、またはＲＮＡのポリヌクレオチドを包含する。
【００２１】
しかしながら、本発明は、本発明のポリヌクレオチドに由来し、本発明のポリヌクレオチドの転写または翻訳に干渉しうるポリヌクレオチド変異体にも関連する。そのような変異体ポリヌクレオチドには、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ分子、モルホリノ核酸（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴ）、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、阻害オリゴヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ分子が含まれ、これらすべては、相補的または実質的に相補的な配列の存在により、本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識するであろう。そのような技法は、当業者には周知である。適切な前述の種類の変異体ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの構造に基づいて、容易に設計することができる。
【００２２】
さらに、化学修飾されたポリヌクレオチドも含まれ、これには天然の修飾ポリヌクレオチド、例えばグリコシル化またはメチル化されたポリヌクレオチド、あるいは人工的な修飾ポリヌクレオチド、例えばビオチン化されたポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
本発明の基礎となる研究において、有利には、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａおよびＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｍｔｕｍに由来するデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドが同定された。具体的には、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａおよびＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍのデヒドラターゼ／エノイル−ＣｏＡレダクターゼｎＥＣＲが同定された［ｎＥＣＲ（Ｔｐ）およびｎＥＣＲ（Ｐｔ）］。これらのｎＥＣＲのそれぞれは、脂肪酸の伸長過程の一環として、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡからヒドロキシル基を除去し、形成された二重結合を還元することができる。例えば、脂肪酸を伸長することができなかったＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ突然変異体におけるｎＥＣＲ（Ｔｐ）およびｎＥＣＲ（Ｐｔ）の発現は、伸長過程を回復することが発見された。本発明のポリヌクレオチドは、特にＬＣＰＵＦＡ、とりわけＡＲＡ、ＥＰＡ、および／またはＤＨＡの組換え製造に適している。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドの好適な実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記核酸配列に作用可能に連結された発現制御配列をさらに含む。
【００２５】
本明細書で使用する「発現制御配列」という用語は、対象核酸配列（この場合には上記の核酸配列）の転写を支配することができる、すなわち開始および制御することができる核酸配列を指す。このような配列は、通常は、プロモーターまたはプロモーターとエンハンサ配列との組み合わせを含む、あるいはプロモーターまたはプロモーターとエンハンサ配列との組み合わせからなる。ポリヌクレオチドの発現は、核酸分子の転写、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。付加的な調節要素には、転写エンハンサならびに翻訳エンハンサを含みうる。以下のプロモーターおよび発現制御配列は、好ましくは、本発明による発現ベクターにおいて使用することができる。ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、Ｉｐｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ、またはλ−ＰＬプロモーターは、好ましくは、グラム陰性細菌において使用される。グラム陽性細菌の場合、プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２を使用することができる。酵母プロモーターまたは真菌プロモーターからは、ＡＤＣ１、ＡＯＸ１ｒ、ＧＡＬ１、ＭＦα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨが、好ましく使用される。動物細胞発現または生物発現の場合、プロモーターのＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサ、ＳＶ４０−エンハンサが、好ましく使用される。植物からは、プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ（Ｆｒａｎｃｋ  １９８０，  Ｃｅｌｌ  ２１  ：  ２８５−２９４）、ＰＲＰ１（Ｗａｒｄ  １９９３，  Ｐｌａｎｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチンプロモーター、もしくはファゼオリンプロモーター。また、これに関連して、誘導性プロモーター、例えば、欧州特許第０  ３８８  １８６（Ａ１）号（すなわち、ベンジルスルホンアミド誘導性プロモーター）、Ｇａｔｚ  １９９２，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２：３９７−４０４  （すなわち、テトラサイクリン−誘導性プロモーター）、欧州特許第０  ３３５  ５２８（Ａ１）号（すなわち、アブシジン酸誘導性プロモーター）、または国際出願第９３／２１３３４号（すなわち、エタノール誘導性プロモーターまたはシクロヘキセノール誘導性プロモーター）に記載されているプロモーターも好適である。さらなる好適な植物プロモーターは、ジャガイモ由来の細胞質ＦＢＰａｓｅのプロモーターまたはＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓ  １９８９，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８，  ２４４５）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ由来のホスホリボシル−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８７９９９）、または欧州特許第０  ２４９  ６７６（Ａ１）号に記載の節特異的プロモーターである。特に好適なものは、脂肪酸の生合成に関与する組織における発現を可能にするプロモーターである。さらに、特に好適なものには、慣例によると、種子特異的プロモーター、例えばＵＳＰプロモーターがあるが、ＬｅＢ４、ＤＣ３、ファゼオリン、またはナピンプロモーターなどの別のプロモー���ーもある。さらなる特に好適なプロモーターは、単子葉植物または双子葉植物に使用することができる、米国特許第５，６０８，１５２号（アブラナ由来のナピンプロモーター）、国際出願第９８／４５４６１号（アラビドプシス由来のオレオシンプロモーター、米国特許第５，５０４，２００号（Ｐｈａｓｅｏｉｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のファゼオリンプロモーター）、国際出願第９１／１３９８０号（Ｂｒａｓｓｉｃａ由来のＢｃｅ４プロモーター）、Ｂａｅｕｍｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，  ２，  ２，  １９９２：２３３−２３９（マメ科植物由来のＬｅＢ４プロモーター）に記載されている種子特異的プロモーターであり、これらのプロモーターは双子葉類に適している。以下のプロモーターは、単子葉類に適している：オオムギ由来のｌｐｔ−２もしくはｌｐｔ−１プロモーター（国際出願第９５／１５３８９号および国際出願第９５／２３２３０号）、オオムギ由来のホルデインプロモーター、および適切であり国際出願第９９／１６８９０号に記載されている他のプロモーター。原則として、全ての天然プロモーターは、それらの調節配列、例えば上記のものなどと一緒に、本新規方法に使用することが可能である。同様に、合成プロモーターは、特に、例えば国際出願第９９／１６８９０号などに記載されているように、それらが種子特異的発現を媒介する場合に、付加的にあるいは単独で使用することが可能かつ有利である。特定の実施形態において、種子特異的プロモーターを使用して、所望のＰＵＦＡまたはＬＣＰＵＦＡの産生を促進する。
【００２６】
本明細書において使用する「作用可能に連結された」という用語は、発現制御配列と対象核酸とが連結されて、それにより前記対象核酸の発現を前記発現制御配列によって支配することができることを意味する。すなわち、この発現制御配列は、発現される前記核酸配列に機能的に連結されることになる。したがって、発現制御配列と発現される核酸配列とは、例えば発現される核酸配列の５′端に発現制御配列を挿入することによって、互いに物理的に連結されてよい。あるいは、発現制御配列と発現される核酸配列とは、発現制御配列が少なくとも１つの対象核酸配列の発現を支配することができるように、単に物理的に近接しているだけであってもよい。発現制御配列と発現される核酸とは、好ましくは、５００ｂｐ、３００ｂｐ、１００ｂｐ、８０ｂｐ、６０ｂｐ、４０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、または５ｂｐ以上は離れていない。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドのさらなる好適な実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、核酸配列に作用可能に連結されたターミネーター配列をさらに含む。
【００２８】
本明細書において使用する「ターミネーター」という用語は、転写を終結させることができる核酸配列を指す。これらの配列は、転写される核酸配列からの転写機構の解離をもたらす。好ましくは、ターミネーターは、植物において、とりわけ植物種子において活性を有するであろう。適切なターミネーターは、当該技術分野で既知であり、好ましくはポリアデニル化シグナル、例えばＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位、あるいはＬｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｏｋｅ  ２００５，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３８，  ｐｐ．  １４５７−１４６８）において示される植物特異的シグナルのうちの１つを発現される核酸配列の下流に含む。
【００２９】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。
【００３０】
「ベクター」という用語は、好ましくは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ならびに人工染色体、例えば細菌人工染色体もしくは酵母人工染色体を包含する。さらに、この用語は、標的化構築物のゲノムＤＮＡへのランダム組込みまたは部位特異的組込みを可能にする、標的化構築物にも関する。そのような標的構築物は、好ましくは、下記に詳述するような相同組換えまたは異種組換えのいずれかに十分な長さを有するＤＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、好ましくは、宿主における増殖および／または選択のための選択可能なマーカーをさらに含む。ベクターは、当該技術分野で周知の種々の技法によって、宿主細胞内に組み込むことができる。宿主細胞に導入される場合、ベクターは細胞質に滞留してもよく、あるいはゲノムに組込まれてもよい。後者の場合、ベクターが、相同組換えまたは異種挿入を可能にする核酸配列をさらに含んでもよいことを理解すべきである。ベクターは、従来の形質転換技法またはトランスフェクション技法によって、原核細胞または真核細胞に導入することができる。この文脈で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」、接合および形質導入という用語は、リン酸カルシウム、塩化ルビジウム、または塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、自然応答能、炭素ベースのクラスター、化学物質媒介転移、またはエレクトロポレーション、または粒子衝撃を含む、宿主細胞中に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための多数の従来技術の方法を含むものとする。植物細胞を含む宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）、およびその他の実験マニュアル、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５，  Ｖｏｌ．  ４４，  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｅｄ．：  Ｇａｒｔｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｄａｖｅｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙなどに記載されている。あるいは、プラスミドベクターは、熱ショックまたはエレクトロポレーション技法で導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、宿主細胞への適用前に、適当なパッケージング細胞株を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングすることができる。
【００３１】
好ましくは、本明細書におけるベクターはクローニングベクターとして適しており、すなわち微生物系において複製可能である。そのようなベクターは、細菌、および好ましくは酵母または菌類における効率的なクローニングを確実にし、植物の安定な形質転換を可能にする。とりわけ挙げるべきものは、Ｔ−ＤＮＡ媒介形質転換に適した、種々のバイナリーベクター系および共組込み型ベクター系である。そのようなベクター系は、通例、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換に必要とされるｖｉｒ遺伝子と、Ｔ−ＤＮＡの範囲を定める配列（Ｔ−ＤＮＡボーダー）とを少なくとも含有することを特徴とする。また、これらのベクター系は、好ましくは、さらなるシス調節領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、および／または適切な形質転換された宿主細胞または生物を同定することができる選択マーカーも含む。共組込み型ベクター系は、同じベクター上に配置されたｖｉｒ遺伝子とＴ−ＤＮＡ配列とを有するが、バイナリー系は、少なくとも２つのベクターに基づき、そのうち一方はｖｉｒ遺伝子を担持するがＴ−ＤＮＡを有さず、２番目のベクターはＴ−ＤＮＡを担持するがｖｉｒ遺伝子は有さない。結果として、最後に挙げたベクターは、比較的小さく、容易に操作でき、大腸菌およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの双方において複製が可能である。このようなバイナリーベクターには、ｐＢＩＢ−ＨＹＧ、ｐＰＺＰ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎ系列由来のベクターが含まれる。本発明により好ましく使用されるのは、Ｂｉｎ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ、およびｐＣＡＭＢＩＡである。バイナリーベクターとそれらの使用の概要は、Ｈｅｌｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０００）  ５，  ４４６−４５１に記載されている。さらに、適当なクローニングベクターを使用することにより、ポリヌクレオチドを宿主細胞および宿主生物、例えば植物および動物に導入することができ、それにより植物、例えば公開されている、以下に引用する植物の形質転換に使用することができる：Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａ），  ｃｈａｐｔｅｒ  ６／７，  ｐｐ．  ７１−１１９  （１９９３）；  Ｆ．Ｆ．  Ｗｈｉｔｅ，  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，  ｖｏｌ．  １，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｄ．：  Ｋｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗｕ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３，  １５−３８；  Ｂ．  Ｊｅｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，  ｖｏｌ．  １，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｄ．：  Ｋｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗｕ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９３），  １２８−１４３；  Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  １９９１  ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ４２，  ２０５−２２５。
【００３２】
より好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターである。そのような発現ベクター、すなわち発現制御配列と作用可能に連結された核酸配列を有する本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（「発現カセット」とも称される）では、原核細胞または真核細胞における発現、あるいはそれらの単離した断片が可能になる。適切な発現ベクターは、当該技術分野で既知であり、例えばＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社）、またはｐＳＰＯＲＴＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）である。典型的な融合発現ベクターのさらなる例は、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ社；  Ｓｍｉｔｈ  １９８８，  Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州ビバリー）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）であり、このときグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合性タンパク質、およびプロテインＡをそれぞれ組換え標的タンパク質と融合させる。適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例は、とりわけ、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  １９８８，  Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  １９９０，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  ６０−８９）である。ｐＴｒｃベクターの標的遺伝子発現は、宿主ＲＮＡポリメラーゼによるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に基づく。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）により媒介される、Ｔ７−ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターの転写に基づく。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７  ｇｎ１遺伝子を含有する常在λプロファージから、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により提供される。当業者は、原核生物において適切なその他のベクターを熟知しており、これらのベクターには、例えば、大腸菌においては、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ系列、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系列、例えばｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９、Ｍ１１３ｍｐ系列、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１、またはｐＢｄＣｌ、ストレプトマイセスにおいては、ｐｌＪ１０１、ｐｌＪ３６４、ｐｌＪ７０２、またはｐｌＪ３６１、バチルスにおいては、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、またはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウムにおいては、ｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７がある。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐ  Ｓｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  １９８７，  Ｅｍｂｏ  Ｊ．  ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  １９８２，  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  １９８７，  Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）が含まれる。その他の菌類、例えば糸状菌における使用に適したベクターおよびベクターの構築のための方法は、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，  Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．，  ＆  Ｐｕｎｔ，  Ｐ．Ｊ．  （１９９１）  "Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｆｕｎｇｉ，  Ｊ．  Ｆ．  Ｐｅｂｅｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄ．，  ｐｐ．  １−２８，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、またはＭｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ  （Ｊ．Ｗ．  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＆  Ｌ．  Ｌ．  Ｌａｓｕｒｅ，  Ｅｄ．，  ｐｐ．  ３９６−４２８：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に詳細に記載されているものを含む。さらなる適切な酵母ベクターは、例えば、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３、またはｐＥＭＢＬＹｅ２３である。代替的に、本発明のポリヌクレオチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において発現させることもできる。昆虫培養細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ  １９８３，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ  １９８９，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を含む。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、単細胞植物細胞（例えば、藻類）（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ  １９９９，  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １  （３）：２３９−２５１とその中に引用されている参考文献を参照）、および高等植物（例えば、耕地作物などの種子植物）由来の植物細胞において、植物発現ベクターを用いて発現させることができる。植物発現ベクターの例には、Ｂｅｃｋｅｒ  １９９２，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：１１９５−１１９７；  Ｂｅｖａｎ  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：８７１１−８７２１  ；  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｄ．：  Ｋｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗｕ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３，  ｐ．  １５−３８に詳細に記載されているものを含む。植物発現カセットは、好ましくは、植物細胞における遺伝子発現を制御することができ、それぞれの配列がその機能、例えば転写終結などを果たせるように機能的に連結した調節配列、例えばポリアデニル化シグナルを含む。好適なポリアデニル化シグナルは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴ−ＤＮＡに由来するもの、例えばオクトピンシンターゼとして知られているＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５の遺伝子３（Ｇｉｅｌｅｎ  １９８４，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３，  ８３５）、またはその機能的同等物であるが、植物において機能的に活性であるすべての他のターミネーターも適している。植物遺伝子発現は、転写レベルに限定されないことが極めて多いことから、植物発現カセットは、好ましくは、別の機能的に連結した配列、例えば翻訳エンハンサ、例えば５′−非翻訳タバコモザイクウイルスリーダー配列を含むオーバードライブ配列を含み、これはタンパク質／ＲＮＡ比を増加させる（Ｇａｌｌｉｅ  １９８７，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８６９３−８７１１）。上述のように、植物遺伝子発現は、遺伝子の発現を適時に細胞特異的または組織特異的に行なう適切なプロモーターに、機能的に連結されていなければならない。使用可能なプロモーターは、構成的プロモーター（Ｂｅｎｆｅｙ  １９８９，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：２１９５−２２０２）、例えば植物ウイルスに由来するもの、例えば３５Ｓ  ＣＡＭＶ（Ｆｒａｎｃｋ  １９８０，  Ｃｅｌｌ  ２１  ：２８５−２９４）、１９Ｓ  ＣａＭＶ（米国特許第５，３５２，６０５号および国際出願第８４／０２９１３号を参照）、または植物プロモーター、例えば米国特許第４，９６２，０２８号に記載されているＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニットのプロモーターである。植物遺伝子発現カセットにおいて機能的連結として使用するためのその他の好適な配列は、その遺伝子産物をその関連する細胞コンパートメント、例えば液胞、核、全ての種類の色素体、例えばアミロプラスト、葉緑体、有色体、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、油体、ペルオキシソーム、および植物細胞のその他のコンパートメント内に導くために必要な標的化配列である（概要は、Ｋｅｒｍｏｄｅ  １９９６，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １５，  ４：  ２８５−４２３およびその中で引用される参考文献を参照）。上述のように、植物遺伝子発現は、化学的誘導性プロモーターによって促進することもできる（概要は、Ｇａｔｚ  １９９７，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：８９−１０８を参照）。化学的に誘導可能なプロモーターは、遺伝子を時間特異的に発現させたい場合に特に適している。そのようなプロモーターの例は、サリチル酸誘導性プロモーター（国際出願第９５／１９４４３号）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｇａｔｚ  １９９２，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２，  ３９７−４０４）、およびエタノール誘導性プロモーターである。また、生物的もしくは非生物的ストレス条件に応答するプロモーターも適切なプロモーターであり、これには例えば、病原体誘導性ＰＲＰ１遺伝子プロモーター（Ｗａｒｄ  １９９３，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２：３６１−３６６）、トマト由来の熱誘導性ｈｓｐ８０プロモーター（米国特許第５，１８７，２６７号）、ジャガイモ由来の低温誘導性αアミラーゼプロモーター（国際出願第９６／１２８１４号）、または創傷誘導性ｐｉｎＩＩプロモーター（欧州特許第０  ３７５  ０９１（Ａ）号）がある。特に好適なプロモーターは、脂肪酸、脂質、および油の生合成が行なわれる組織および器官において、種子細胞、例えば内胚乳の細胞および発生中の胚の細胞において、遺伝子の発現をもたらすプロモーターである。適切なプロモーターは、アブラナ由来のナピン遺伝子プロモーター（米国特許第５，６０８，１５２号）、Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＵＳＰプロモーター（Ｂａｅｕｍｌｅｉｎ  １９９１，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２５  （３）：４５９−６７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のオレオシンプロモーター（国際出願第９８／４５４６１号）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のファゼオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号）、Ｂｒａｓｓｉｃａ由来のＢｃｅ４プロモーター（国際出願第９１／１３９８０号）、またはレグミンＢ４プロモーター（ＬｅＢ４；  Ｂａｅｕｍｌｅｉｎ  １９９２，  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２  （２）：２３３−９）、および単子葉植物、例えばトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネなどにおいて、種子特異的発現をもたらすプロモーターである。考慮すべき適切なプロモーターは、オオムギ由来のｌｐｔ２またはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（国際出願第９５／１５３８９号および国際出願第９５／２３２３０号）、または国際出願第９９／１６８９０号に記載されているもの（オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、エンバクグルテリン遺伝子、モロコシカシリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝子由来のプロモーター）である。同様に、特に適しているものは、色素体特異的発現をもたらすプロモーターであるが、これは色素体が、脂質生合成の前駆体および一部の最終産物が合成されるコンパートメントであるためである。適切なプロモーター、例えばウイルスＲＮＡ−ポリメラーゼプロモーターは、国際出願第９５／１６７８３号および国際出願第９７／０６２５０号に記載されており、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のｃｌｐＰプロモーターは、国際出願第９９／４６３９４号に記載されている。
【００３４】
上述のベクターは、本発明に従って使用すべきベクターの単なる概要に過ぎずない。さらなるベクターは、当業者には既知であり、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄ．，  Ｐｏｕｗｅｌｓ，  Ｐ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８５，  ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）に記載されている。原核細胞および真核細胞のためのさらなる適切な発現系については、上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋの第１６章および第１７章を参照されたい。
【００３５】
上記のことから、好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである。より好ましくは、本発明の前記ポリヌクレオチドは、本発明のベクター中の種子特異的プロモーターの制御下にある。本明細書で言う好適な種子特異的プロモーターは、Ｃｏｎｌｉｎｉｎ  １、Ｃｏｎｌｉｎｉｎ  ２、ナピン、ＬｕＦａｄ３、ＵＳＰ、ＬｅＢ４、Ａｒｃ、Ｆａｅ、ＡＣＰ、ＬｕＰＸＲ、およびＳＢＰからなる群から選択される。詳細については、例えば、米国特許第２００３−０１５９１７４号を参照されたい。
【００３６】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３７】
好ましくは、前記宿主細胞は植物細胞、より好ましくは、油料種子作物から得られた植物細胞である。より好ましくは、前記油料種子作物は、亜麻（Ｌｉｎｕｍ  ｓｐ．）、菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、大豆（ＧｌｙｃｉｎｅおよびＳｏｊａ  ｓｐ．）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐ．）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｓｐ．）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｓｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃｏａ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｓｐ．）、麻、アマナズナ、ハマナ、アブラヤシ、ココヤシ、ラッカセイ、ゴマ種子、トウゴマ、レスケレーラ、ハゼノキ、シアナッツ、アブラギリの実、カポックの実、ケシの実、ホホバ種子、およびシソからなる群から選択される。
【００３８】
また、好ましくは、前記宿主細胞は微生物である。より好ましくは、前記微生物は、細菌、真菌、または藻類である。より好ましくは、これはＣａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、およびＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍからなる群から選択される。
【００３９】
さらに、本発明による宿主細胞は、動物細胞であってもよい。好ましくは、前記動物宿主細胞は、魚の宿主細胞、またはそれらから得られる細胞株である。より好ましくは、魚宿主細胞は、ニシン、サケ、イワシ、アカウオ、ウナギ、コイ、マス、オヒョウ、サバ、ザンダー、またはマグロに由来する。
【００４０】
一般に、ＬＣＰＵＦＡの産生、すなわち長鎖不飽和脂肪酸生合成経路生合成経路における制御段階は、膜結合脂肪酸エロンガーゼ複合体に触媒される。植物およびその他のほとんどの真核生物は、Ｃ１８原子を超える脂肪酸の伸長に特化したエロンガーゼ系を有する。これらのエロンガーゼ反応は、脂肪酸シンターゼ複合体（ＦＡＳ）と共通するいくつかの重要な特長を有する。しかしながら、エロンガーゼ複合体は、ＦＡＳ複合体とは異なる。これはエロンガーゼ複合体が、細胞質ゾルに局在し、膜結合性であり、ＡＣＰが関与せず、エロンガーゼ３−ケトアシル−ＣｏＡ−シンターゼがマロニル−ＣｏＡとアシルプライマーの縮合を触媒するためである。エロンガーゼ複合体は、異なる触媒機能を有する４つの成分、ケトアシル−ＣｏＡ−シンターゼ（ＫＣＳ、マロニル−ＣｏＡとアシル−ＣｏＡとの縮合反応、２Ｃ原子長いケトアシル−ＣｏＡ脂肪酸を作成）、ケトアシル−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＫＣＲ、３−ケト基の３−ヒドロキシ基への還元）、デヒドラターゼ（ＤＨ、脱水がデルタ−２−エノイル−アシル−ＣｏＡ脂肪酸をもたらす）、およびエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＥＣＲ、２位の二重結合の還元、複合体からの解離）からなる。ＡＲＡ、ＥＰＡ、および／またはＤＨＡを含むＬＣＰＵＦＡの産生のためには、伸長反応は必須となりうる。高等植物は、ＬＣＰＵＦＡ（４個以上の二重結合、２０個以上のＣ原子）を産生するために必要な酵素一式を有さない。したがって、これらの触媒活性を、植物または植物細胞に付与しなければならない。伸長過程における１つの不可欠な段階は、脱水・還元反応である。本発明のポリヌクレオチドは、驚くべきことに、１つの酵素によってこの脱水・還元活性を触媒する。このｎＥＣＲを送達することによって、より高いレベルのＰＵＦＡおよびＬＣＰＵＦＡが産生される。
【００４１】
しかしながら、宿主細胞によっては、さらなる酵素活性を例えば組換え技術によって宿主細胞に付与してもよいことが理解されるであろう。したがって、本発明は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドに加えて、選択する宿主細胞に応じて必要とされるデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を想定している。宿主細胞に存在するであろう好適なデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼは、Δ−４−デサチュラーゼ、Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−５−エロンガーゼ、Δ−６−デサチュラーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ、およびΔ−６−エロンガーゼからなる群から選択された少なくとも１つの酵素である。特に好適なものは、二機能性ｄ１２ｄ１５−デサチュラーゼである、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ由来のｄ１２ｄ１５Ｄｅｓ（Ａｃ）（国際出願第２００７０４２５１０号）、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ由来のｄ１２ｄ１５Ｄｅｓ（Ｃｐ）（国際出願第２００８００６２０２号）、およびＬｏｔｔｉａ  ｇｉｇａｎｔｅａ由来のｄ１２ｄ１５Ｄｅｓ（Ｌｇ）１（国際出願第２００９０１６２０２号）、ｄ１２−デサチュラーゼである、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｃｏ）（国際出願第２００１８５９６８号）、Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｌｂ）（国際出願第２００９０１６２０２号）、Ｍｏｎｏｓｉｇａ  ｂｒｅｖｉｃｏｌｌｉｓ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｍｂ）（国際出願第２００９０１６２０２号）、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｍｇ）（国際出願第２００９０１６２０２号）、Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｎｈ）（国際出願第２００９０１６２０２号）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｏｌ）（国際出願第２００８０４０７８７号）、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｐｂ）（国際出願第２００９０１６２０２号）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｐｓ）（国際出願第２００６１００２４１号）、およびＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来のｄ１２Ｄｅｓ（Ｔｐ）（国際出願第２００６０６９７１０号）、ｄ１５−デサチュラーゼである、Ｈｅｌｏｂｄｅｌｌａ  ｒｏｂｕｓｔａ由来のｄ１５Ｄｅｓ（Ｈｒ）（国際出願第２００９０１６２０２号）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ由来のｄ１５Ｄｅｓ（Ｍｃ）（国際出願第２００９０１６２０２号）、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ由来のｄ１５Ｄｅｓ（Ｍｆ）国際出願第２００９０１６２０２号）、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ由来のｄ１５Ｄｅｓ（Ｍｇ）（国際出願第２００９０１６２０２号）、およびＮｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ由来のｄ１５Ｄｅｓ（Ｎｈ）２（国際出願第２００９０１６２０２号）、ｄ４−デサチュラーゼである、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のｄ４Ｄｅｓ（Ｅｇ）（国際出願第２００４０９０１２３号）、Ｔｈ��ａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．由来のｄ４Ｄｅｓ（Ｔｃ）（国際出願第２００２０２６９４６号）、およびＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来のｄ４Ｄｅｓ（Ｔｐ）（国際出願第２００６０６９７１０号）、ｄ５−デサチュラーゼである、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ由来のｄ５Ｄｅｓ（Ｏｌ）２（国際出願第２００８０４０７８７号）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ由来のｄ５Ｄｅｓ（Ｐｐ）（国際出願第２００４０５７００１号）、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ由来のｄ５Ｄｅｓ（Ｐｔ）（国際出願第２００２０５７４６５号）、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．由来のｄ５Ｄｅｓ（Ｔｃ）（国際出願第２００２０２６９４６号）、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来のｄ５Ｄｅｓ（Ｔｐ）（国際出願第２００６０６９７１０号）、ならびにｄ６−デサチュラーゼである、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｃｐ）（国際出願第２００００７５３４１号）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｏｌ）（国際出願第２００８０４０７８７号）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｏｔ）（国際出願第２００６０６９７１０号）、Ｐｒｉｍｕｌａ  ｆａｒｉｎｏｓａ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｐｆ）（国際出願第２００３０７２７８４号）、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｐｉｒ）＿ＢＯ（国際出願第２００２０２６９４６号）、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｐｉｒ）（国際出願第２００２０２６９４６号）、Ｐｒｉｍｕｌａ  ｌｕｔｅｏｌａ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｐｌｕ）（国際出願第２００３０７２７８４号）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｐｐ）（国際出願第２００１０２５９１号）、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｐｔ）（国際出願第２００２０５７４６５号）、Ｐｒｉｍｕｌａ  ｖｉａｌｉｉ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｐｖ）（国際出願第２００３０７２７８４号）、およびＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来のｄ６Ｄｅｓ（Ｔｐ）（国際出願第２００６０６９７１０号）、ｄ８−デサチュラーゼである、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ由来のｄ８Ｄｅｓ（Ａｃ）（欧州特許第１７９０７３１号）、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のｄ８Ｄｅｓ（Ｅｇ）（国際出願第２０００３４４３９号）、およびＰｅｒｋｉｎｓｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来のｄ８Ｄｅｓ（Ｐｍ）（国際出願第２００７０９３７７６号）、ｏ３−デサチュラーゼである、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ由来のｏ３Ｄｅｓ（Ｐｉ）（国際出願第２００５０８３０５３号）、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ由来のｏ３Ｄｅｓ（Ｐｉｒ）（国際出願第２００８０２２９６３号）、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ由来のｏ３Ｄｅｓ（Ｐｉｒ）２（国際出願第２００８０２２９６３号）、およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ由来のｏ３Ｄｅｓ（Ｐｓ）（国際出願第２００６１００２４１号）、二機能性ｄ５ｄ６−エロンガーゼである、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ由来のｄ５ｄ６Ｅｌｏ（Ｏｍ）２（国際出願第２００５０１２３１６号）、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕ由来のｄ５ｄ６Ｅｌｏ（Ｔａ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、およびＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．由来のｄ５ｄ６Ｅｌｏ（Ｔｃ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、ｄ５−エロンガーゼである、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｄ５Ｅｌｏ（Ａｔ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｄ５Ｅｌｏ（Ａｔ）２（国際出願第２００５０１２３１６号）、Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ由来のｄ５Ｅｌｏ（Ｃｉ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ由来のｄ５ＥＩｏ（Ｏｌ）（国際出願第２００８０４０７８７号）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ由来のｄ５Ｅｌｏ（Ｏｔ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来のｄ５Ｅｌｏ（Ｔｐ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、およびＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ由来のｄ５Ｅｌｏ（ＸＩ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、ｄ６−エロンガーゼである、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｏｌ）（国際出願第２００８０４０７８７号）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｏｔ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｐｉ）（国際出願第２００３０６４６３８号）、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｐｉｒ）（国際出願第２００９０１６２０８号）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｐｐ）（国際出願第２００１０５９１２８号）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｐｓ）（国際出願第２００６１００２４１号）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｐｓ）２（国際出願第２００６１００２４１号）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｐｓ）３（国際出願第２００６１００２４１号）、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｍｕｔｕｍ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｐｔ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｔｃ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、およびＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来のｄ６Ｅｌｏ（Ｔｐ）（国際出願第２００５０１２３１６号）、ｄ９−エロンガーゼである、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ由来のｄ９Ｅｌｏ（Ｉｇ）（国際出願第２００２０７７２１３号）、Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来のｄ９Ｅｌｏ（Ｐｍ）（国際出願第２００７０９３７７６号）、およびＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のｄ９Ｅｌｏ（Ｒｏ）（国際出願第２００９０１６２０８号）である。特に、高等植物におけるＡＲＡの製造を想定している場合、下記の第３表に記載する酵素（すなわち、追加として、ｄ６−デサチュラーゼ、ｄ６−エロンガーゼ、ｄ５−エロンガーゼ、ｄ５−デサチュラーゼ、ｄ１２−デサチュラーゼ、およびｄ６−エロンガーゼ）、または本質的に同じ活性を有する酵素を宿主細胞に組み込んでもよい。高等植物におけるＥＰＡの製造を想定している場合、下記の第４表に記載する酵素（すなわち、追加として、ｄ６−デサチュラーゼ、ｄ６−エロンガーゼ、ｄ５−デサチュラーゼ、ｄ１２−デサチュラーゼ、ｄ６−エロンガーゼ、オメガ３−デサチュラーゼ、およびｄ１５−デサチュラーゼ）、または本質的に同じ活性を有する酵素を宿主細胞に組み込んでもよい。高等植物におけるＤＨＡの製造を想定している場合、下記の第５表に記載する酵素（すなわち、追加として、ｄ６−デサチュラーゼ、ｄ６−エロンガーゼ、ｄ５−デサチュラーゼ、ｄ１２−デサチュラーゼ、ｄ６−エロンガーゼ、オメガ３−デサチュラーゼ、ｄ１５−デサチュラーゼ、ｄ５−エロンガーゼ、およびｄ４−デサチュラーゼ）、または本質的に同じ活性を有する酵素を宿主細胞に組み込んでもよい。
【００４２】
また、本発明は、細胞、好ましくは上記の宿主細胞、または本明細書の他の部分に記載の非ヒト生物の細胞であって、本発明のポリヌクレオチドから、点突然変異、トランケーション、逆位、欠失、付加、置換、および相同組換えによって得られるポリヌクレオチドを含む細胞に関する。ポリヌクレオチドにそのような修飾を実施する方法は、当業者には周知であり、本明細書の他の部分に詳細に記載した。
【００４３】
本発明は、さらに、本発明のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの製造のための方法であって、
ａ）前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、本発明の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）ステップａ）の宿主細胞からポリペプチドを得るステップと、
を含む方法にも関連する。
【００４４】
宿主細胞に含まれる本発明のポリヌクレオチドの発現を可能にする適切な条件は、宿主細胞、ならびに前記ポリヌクレオチドの発現を支配するために使用する発現制御配列に依存する。これらの条件およびそれらの選択方法は、当業者に周知である。発現ポリペプチドは、例えば、全ての従来の精製技法によって得られるが、これには親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および抗体沈降を含む沈降技法が含まれる。本方法は、好適ではあるが、本質的に純粋なポリペプチド製剤を必ずしも生じなくてもよいことは理解されるべきである。前述の方法に使用する宿主細胞によって、それにより産生されるポリペプチドが、翻訳後に修飾されても、あるいは別の方法でプロセスされてもよいことは理解されるべきである。
【００４５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチド、あるいは前述の方法で得られるポリペプチドを包含する。
【００４６】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、本質的に精製されたポリペプチド、またはさらに別のタンパク質を含むポリペプチド製剤を包含する。さらに、この用語は、上記の本発明のポリヌクレオチドによって少なくとも部分的にコードされた、融合タンパク質またはポリペプチドフラグメントにも関する。さらに、これは化学修飾されたポリペプチドを含む。そのような修飾は、人工的修飾または天然修飾、例えばリン酸化反応、グリコシル化、ミリスチル化などであってよい（概要は、Ｍａｎｎ  ２００３，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１，  ２５５−２６１に、植物に焦点を当てた概要は、Ｈｕｂｅｒ  ２００４，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ７，  ３１８−３２２に記載されている）。現在、３００を越える翻訳後修飾が知られている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｒｆ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｃｆｍ／ｄｍ．ｈｏｍｅの完全なＡＢＦＲＣ  Ｄｅｌｔａ  ｍａｓｓリストを参照）。本発明のポリペプチドは、上記のｎＥＣＲ活性を示すであろう。
【００４７】
さらに本発明に包含されるのは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体である。
【００４８】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明による精製ポリペプチドまたはそれに由来する適切なフラグメントを抗原として使用する周知の方法によって製造することができる。抗原として適切なフラグメントは、当該技術分野で周知の抗原性決定アルゴリズムによって同定することができる。そのようなフラグメントは、本発明のポリペプチドからタンパク分解によって得てもよく、あるいは合成ペプチドであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ化抗体、またはそれらいずれかの抗体のフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ、もしくはｓｃＦｖフラグメントなどである。また、本発明により抗体として含まれるものは、二重特異性抗体、合成抗体、または前述の抗体のいずれかの化学修飾された誘導体である。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に結合することになる（すなわち、別のポリペプチドまたはペプチドと有意には交差反応しない）。特異結合は、種々の周知の技法によってテストすることができる。抗体またはそれらのフラグメントは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  "Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８８に記載されている方法を用いて得ることができる。モノクローナル抗体は、最初にＫｏｅｈｌｅｒ  １９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５、およびＧａｌｆｒｅ  １９８１  ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ７３，  ３に記載された技法によって製造することができ、この技法は、マウス骨髄腫細胞と免疫した哺乳動物由来の脾臓細胞との融合を含む。抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫沈降、免疫局在性、または精製（例えば、親和性クロマトグラフィーによる）に、また例えば組換え生物において、前記変異体ポリペプチドの存在をモニターするために、および本発明によるタンパク質と相互作用するタンパク質または化合物を同定するために使用することができる。
【００４９】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む非ヒトトランスジェニック生物を意図している。
【００５０】
好ましくは、非ヒトトランスジェニック生物は、植物、植物部位、または植物種子である。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを導入するために使用する好適な植物は、脂肪酸を合成することができる植物、例えば全ての双子葉植物または単子葉植物、藻類、または蘚類である。また、植物由来の宿主細胞を本発明による植物の産生に使用してもよいことは理解されるべきである。好適な植物は、植物の科の群、Ａｄｅｌｏｔｈｅｃｉａｃｅａｅ、Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ、Ａｐｉａｃｅａｅ、Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ、Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ、Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ、Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉａｃｅａｅ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ、Ｄｉｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｅｌａｅａｇｎａｃｅａｅ、Ｅｒｉｃａｃｅａｅ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ、Ｆａｂａｃｅａｅ、Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ、Ｌａｕｒａｃｅａｅ、Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ、Ｌｉｎａｃｅａｅ、Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ、あるいは野菜植物、または観賞植物、例えばＴａｇｅｔｅｓから選択される。挙げることができる例には、以下からなる群から選択された植物がある：Ａｄｅｌｏｔｈｅｃｉａｃｅａｅ、例えばＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、例えばＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ（属・種）、Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ、例えばＰｉｓｔａｃｉａ属、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ属、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ属、例えばＰｉｓｔａｃｉａ  ｖｅｒａ［ピスタチオ］、Ｍａｎｇｉｆｅｒ  ｉｎｄｉｃａ［マンゴー］、またはＡｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ［カシュー］（属・種）、Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ、例えばＣａｌｅｎｄｕｌａ属、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ属、Ｃｅｎｔａｕｒｅａ属、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ属、Ｃｙｎａｒａ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｌａｃｔｕｃａ属、Ｌｏｃｕｓｔａ属、Ｔａｇｅｔｅｓ属、Ｖａｌｅｒｉａｎａ属、例えばＣａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ［コモンマリーゴールド］、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ［ベニバナ］、Ｃｅｎｔａｕｒｅａ  ｃｙａｎｕｓ［ヤグルマソウ］、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ［チコリー］、Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ［チョウセンアザミ］、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ［ヒマワリ］、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ、Ｌａｃｔｕｃａ  ｃｒｉｓｐａ、Ｌａｃｔｕｃａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｃａｒｉｏｌａ  Ｌ．  ｓｓｐ．  ｓａｔｉｖａ、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｃａｒｉｏｌａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｉｎｔｅｇｒａｔａ、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｃａｒｉｏｌａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．  ｒｏｍａｎａ、Ｌｏｃｕｓｔａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｖａｌｅｒｉａｎａ  ｌｏｃｕｓｔａ［サラダ野菜］、Ｔａｇｅｔｅｓ  ｌｕｃｉｄａ、Ｔａｇｅｔｅｓ  ｅｒｅｃｔａ、またはＴａｇｅｔｅｓ  ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ［アフリカンマリーゴールドまたはフレンチマリーゴールド］（属・種）、Ａｐｉａｃｅａｅ、例えばＤａｕｃｕｓ属、例えばＤａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ［ニンジン］（属・種）、Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ、例えばＣｏｒｙｌｕｓ属、例えばＣｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａまたはＣｏｒｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｒｎａ［ヘーゼルナッツ］（属・種）、Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ、例えばＢｏｒａｇｏ属、例えばＢｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ［ルリヂサ］（属・種）、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ、例えばＢｒａｓｓｉｃａ属、Ｍｅｌａｎｏｓｉｎａｐｉｓ属、Ｓｉｎａｐｉｓ属、Ａｒａｂａｄｏｐｓｉｓ属、例えばＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．［アブラナ］、Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ  ｖａｒ．  ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ  ｖａｒ．  ｃｒｉｓｐｉｆｏｌｉａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ  ｖａｒ．  ｆｏｌｉｏｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｉｎａｐｉｏｉｄｅｓ、Ｍｅｌａｎｏｓｉｎａｐｉｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ［カラシ］、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ［飼料ビート］、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（属・種）、Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ、例えばＡｎａｎａ属、Ｂｒｏｍｅｌｉａ（パイナップル）属、例えばＡｎａｎａ  ｃｏｍｏｓｕｓ、Ａｎａｎａｓ  ａｎａｎａｓ、またはＢｒｏｍｅｌｉａ  ｃｏｍｏｓａ［パイナップル］（属・種）、Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ、例えばＣａｒｉｃａ属、例えばＣａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ［パパイヤ］（属・種）、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ、例えばＣａｎｎａｂｉｓ属、例えばＣａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ［麻］（属・種）、Ｃｏｎｖｏｉｖｕｌａｃｅａｅ、例えばＩｐｏｍｅａ属、Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ属、例えばＩｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｐａｎｄｕｒａｔａ、Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｂａｔａｔａｓ、Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｔｉｌｉａｃｅｕｓ、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｆａｓｔｉｇｉａｔａ、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｔｉｌｉａｃｅａ、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｔｒｉｌｏｂａ、またはＣｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｐａｎｄｕｒａｔｕｓ［サツマイモ（ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ、ｂａｔａｔｅ）］（属・種）、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｂｅｔａ属、例えばＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ａｌｔｉｓｓｉｍａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  Ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｂｅｔａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｐｅｒｅｎｎｉｓ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｃｏｎｄｉｔｉｖａ、またはＢｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ［テンサイ］（属・種）、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉａｃｅａｅ、例えばＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属、例えばＣｒｙｐｔｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ（属・種）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ、例えばＣｕｃｕｒｂｉｔａ属、例えばＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｉｘｔａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ、またはＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ［カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ／ｓｑｕａｓｈ）］（属・種）、Ｃｙｍｂｅｌｌａｃｅａｅ、例えばＡｍｐｈｏｒａ属、Ｃｙｍｂｅｌｌａ属、Ｏｋｅｄｅｎｉａ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、Ｒｅｉｍｅｒｉａ属、例えばＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（属・種）、Ｄｉｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、例えばＤｉｔｒｉｃｈａｃｅａｅ属、Ａｓｔｏｍｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ属、Ｃｈｒｙｓｏｂｌａｓｔｅｌｌａ属、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ属、Ｄｉｓｔｉｃｈｉｕｍ属、Ｅｃｃｒｅｍｉｄｉｕｍ属、Ｌｏｐｈｉｄｉｏｎ属、Ｐｈｉｌｉｂｅｒｔｉｅｌｌａ属、Ｐｌｅｕｒｉｄｉｕｍ属、Ｓａｅｌａｎｉａ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｏｎ属、Ｓｋｏｔｔｓｂｅｒｇｉａ属、例えばＣｅｒａｔｏｄｏｎ  ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｃｏｌｕｍｂｉａｅ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ  ｓｓｐ．  ｃｏｎｖｏｌｕｔｕｓ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ、ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ  ｓｐｐ．  ｓｔｅｎｏｃａｒｐｕｓ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ  ｖａｒ．  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉｕｓ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｒａｔｏｄｏｎ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｓｔｅｎｏｃａｒｐｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｂｌａｓｔｅｌｌａ  ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ａｍｂｉｇｕｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｂｒｅｖｉｓｅｔｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｒｉｓｐａｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｆａｌｃｉｆｏｌｉｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｌｅｘｉｃａｕｌｅ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｍａｌｌｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｌｉｎｅａｒｅ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｌｉｎｅａｒｅ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｏｎｔａｎｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｏｎｔａｎｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｐｕｎｃｔｕｌａｔｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｕｍ  ｖａｒ．  ｔｏｒｔｉｌｅ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｒｈｙｎｃｈｏｓｔｅｇｉｕｍ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ、Ｄｉｔｒｉｃｈｕｍ  ｔｏｒｔｉｌｅ、Ｄｉｓｔｉｃｈｉｕｍ  ｃａｐｉｌｌａｃｅｕｍ、Ｄｉｓｔｉｃｈｉｕｍ  ｈａｇｅｎｉｉ、Ｄｉｓｔｉｃｈｉｕｍ  ｉｎｃｌｉｎａｔｕｍ、Ｄｉｓｔｉｃｈｉｕｍ  ｍａｃｏｕｎｉｉ、Ｅｃｃｒｅｍｉｄｉｕｍ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｍ、Ｅｃｃｒｅｍｉｄｉｕｍ  ｗｈｉｔｅｌｅｇｇｅｉ、Ｌｏｐｈｉｄｉｏｎ  ｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ｐｌｅｕｒｉｄｉｕｍ  ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ、Ｐｌｅｕｒｉｄｉｕｍ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉｕｍ、Ｐｌｅｕｒｉｄｉｕｍ  ｈｏｌｄｒｉｄｇｅｉ、Ｐｌｅｕｒｉｄｉｕｍ  ｍｅｘｉｃａｎｕｍ、Ｐｌｅｕｒｉｄｉｕｍ  ｒａｖｅｎｅｌｉｉ、Ｐｌｅｕｒｉｄｉｕｍ  ｓｕｂｕｌａｔｕｍ、Ｓａｅｌａｎｉａ  ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｏｎ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｏｎ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｓ、またはＴｒｉｃｈｏｄｏｎ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｓ  ｖａｒ．  ｏｂｌｏｎｇｕｓ（属・種）、Ｅｌａｅａｇｎａｃｅａｅ、例えばＥｌａｅａｇｎｕｓ属、例えばＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ［オリーブ］（���・種）、Ｅｒｉｃａｃｅａｅ、例えばＫａｌｍｉａ属、例えばＫａｌｍｉａ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ、Ｋａｌｍｉａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｋａｌｍｉａ  ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｋａｌｍｉａ  ｐｏｌｉｆｏｌｉａ、Ｋａｌｍｉａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｃｉｓｔｕｓ  ｃｈａｍａｅｒｈｏｄｅｎｄｒｏｓ、またはＫａｌｍｉａ  ｌｕｃｉｄａ［アメリカシャクナゲ］（属・種）、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ、例えばＭａｎｉｈｏｔ属、Ｊａｎｉｐｈａ属、Ｊａｔｒｏｐｈａ属、Ｒｉｃｉｎｕｓ属、例えばＭａｎｉｈｏｔ  ｕｔｉｌｉｓｓｉｍａ、Ｊａｎｉｐｈａ  ｍａｎｉｈｏｔ、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ａｉｐｉｌ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｄｕｌｃｉｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｍｅｌａｎｏｂａｓｉｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ［キャッサバ］、
またはＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ［トウゴマ］（属・種）、Ｆａｂａｃｅａｅ、例えばＰｉｓｕｍ属、Ａｌｂｉｚｉａ属、Ｃａｔｈｏｒｍｉｏｎ属、Ｆｅｕｉｌｌｅａ属、Ｉｎｇａ属、Ｐｉｔｈｅｃｏｌｏｂｉｕｍ属、Ａｃａｃｉａ属、Ｍｉｍｏｓａ属、Ｍｅｄｉｃａｊｏ属、Ｇｌｙｃｉｎｅ属、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ属、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属、Ｓｏｊａ属、例えばＰｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｐｉｓｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ、Ｐｉｓｕｍ  ｈｕｍｉｌｅ［エンドウマメ］、Ａｌｂｉｚｉａ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ、Ａｌｂｉｚｉａ  ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ、Ａｌｂｉｚｉａ  ｌｅｂｂｅｃｋ、Ａｃａｃｉａ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ、Ａｃａｃｉａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ａｉｂｉｚｉａ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ、Ａｌｂｉｚｚｉａ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ、Ｃａｔｈｏｒｍｉｏｎ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ、Ｆｅｕｉｌｌｅａ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ、Ｉｎｇａ  ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｐｉｔｈｅｃｅｌｌｏｂｉｕｍ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎｕｍ、Ｐｉｔｈｅｃｅｌｌｏｂｉｕｍ  ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｐｉｔｈｅｃｏｌｏｂｉｕｍ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎｕｍ、Ｐｓｅｕｄａｌｂｉｚｚｉａ  ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ、Ａｃａｃｉａ  ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ、Ａｃａｃｉａ  ｎｅｍｕ、Ａｌｂｉｚｉａ  ｎｅｍｕ、Ｆｅｕｉｌｌｅｅａ  ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ、Ｍｉｍｏｓａ  ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ、Ｍｉｍｏｓａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ、Ｓｅｒｉｃａｎｒｄａ  ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ、Ａｃａｃｉａ  ｌｅｂｂｅｃｋ、Ａｃａｃｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ、Ａｌｂｉｚｉａ  ｌｅｂｂｅｋ、Ｆｅｕｉｌｌｅｅａ  ｌｅｂｂｅｃｋ、Ｍｉｍｏｓａ  ｌｅｂｂｅｃｋ、Ｍｉｍｏｓａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ［ネムノキ］、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｆａｌｃａｔａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｖａｒｉａ［ムラサキウマゴヤシ］、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｓｏｊａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｈｉｓｐｉｄａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｍａｘ、Ｓｏｊａ  ｈｉｓｐｉｄａ、またはＳｏｊａ  ｍａｘ［大豆］（属・種）、Ｆｕｎａｒｉａｃｅａｅ、例えばＡｐｈａｎｏｒｒｈｅｇｍａ属、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ属、Ｆｕｎａｒｉａ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ属、例えばＡｐｈａｎｏｒｒｈｅｇｍａ  ｓｅｒｒａｔｕｍ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｕｓ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｂｏｌａｎｄｅｒｉ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｂｏｎｐｌａｎｄｉｉ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｊａｍｅｓｏｎｉｉ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｌｅｉｂｅｒｇｉｉ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｎｅｏｓｃｏｔｉｃｕｓ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｒｕｂｒｉｓｅｔｕｓ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｓｐａｔｈｕｌｉｆｏｌｉｕｓ、Ｅｎｔｏｓｔｈｏｄｏｎ  ｔｕｃｓｏｎｉ、Ｆｕｎａｒｉａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｂｏｌａｎｄｅｒｉ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｃａｌｃａｒｅａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｃａｌｖｅｓｃｅｎｓ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｃｏｎｖｏｌｕｔａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｆｌａｖｉｃ���ｎｓ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｇｒｏｕｔｉａｎａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ  ｖａｒ．  ａｒｃｔｉｃａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ  ｖａｒ．  ｃａｌｖｅｓｃｅｎｓ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ  ｖａｒ．  ｃｏｎｖｏｌｕｔａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ  ｖａｒ．  ｍｕｒａｌｉｓ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ  ｖａｒ．  ｕｔａｈｅｎｓｉｓ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｍｉｃｒｏｓｔｏｍａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｍｉｃｒｏｓｔｏｍａ  ｖａｒ．  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｍｕｈｌｅｎｂｅｒｇｉｉ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｏｒｃｕｔｔｉｉ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｐｌａｎｏ−ｃｏｎｖｅｘａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｐｏｌａｒｉｓ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｒａｖｅｎｅｌｉｉ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｒｕｂｒｉｓｅｔａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｓｅｒｒａｔａ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｓｏｎｏｒａｅ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｓｕｂｌｉｍｂａｔｕｓ、Ｆｕｎａｒｉａ  ｔｕｃｓｏｎｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｒｅａｄｅｒｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ａｕｓｔｒａｌｅ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｃｏｌｌｅｎｃｈｙｍａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｃｏｌｏｒａｄｅｎｓｅ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｃｕｐｕｌｉｆｅｒｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｅｕｒｙｓｔｏｍｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｆｌｅｘｉｆｏｌｉｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｈｏｏｋｅｒｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｈｏｏｋｅｒｉ  ｖａｒ．  ｓｅｒｒａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｉｍｍｅｒｓｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｋｅｌｌｅｒｍａｎｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｍｅｇａｌｏｃａｒｐｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ  ｖａｒ．  ｓｅｒｒａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｒｕｆｉｐｅｓ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｓａｎｄｂｅｒｇｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｓｕｂｓｐｈａｅｒｉｃｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ  ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｉｅｎｓｅ（属・種）、Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ、例えばＰｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ属、Ｃｏｃｏｓ属、Ｏｌｅｕｍ属、例えばＣｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ  ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉｏｉｄｅｓ、またはＯｌｅｕｍ  ｃｏｃｏｉｓ［ココヤシ］（属・種）、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、例えばＳａｃｃｈａｒｕｍ属、例えばＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ（属・種）、Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ、例えばＪｕｇｌａｎｓ属、Ｗａｌｌｉａ属、例えばＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ａｉｌａｎｔｈｉｆｏｌｉａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｗａｌｌｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｂｉｘｂｙｉ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｈｉｎｄｓｉｉ、Ｊｕｇｌａ���ｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｊａｍａｉｃｅｎｓｉｓ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｍａｊｏｒ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｎｉｇｒａ、またはＷａｌｌｉａ  ｎｉｇｒａ［クルミ］（属・種）、Ｌａｕｒａｃｅａｅ、例えばＰｅｒｓｅａ属、Ｌａｕｒｕｓ属、例えばＬａｕｒｕｓ  ｎｏｂｉｌｉｓ［月桂樹］、Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｐｅｒｓｅａ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ、またはＰｅｒｓｅａ  ｐｅｒｓｅａ［アボカド］（属・種）、Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ、例えばＡｒａｃｈｉｓ属、例えばＡｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ［ピーナッツ］（属・種）、Ｌｉｎａｃｅａｅ、例えばＬｉｎｕｍ属、Ａｄｅｎｏｌｉｎｕｍ属、例えばＬｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｌｉｎｕｍ  ｈｕｍｉｌｅ、Ｌｉｎｕｍ  ａｕｓｔｒｉａｃｕｍ、Ｌｉｎｕｍ  ｂｉｅｎｎｅ、Ｌｉｎｕｍ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ、Ｌｉｎｕｍ  ｃａｔｈａｒｔｉｃｕｍ、Ｌｉｎｕｍ  ｆｌａｖｕｍ、Ｌｉｎｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、Ａｄｅｎｏｌｉｎｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、Ｌｉｎｕｍ  ｌｅｗｉｓｉｉ、Ｌｉｎｕｍ  ｎａｒｂｏｎｅｎｓｅ、Ｌｉｎｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ、Ｌｉｎｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ  ｖａｒ．  ｌｅｗｉｓｉｉ、Ｌｉｎｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ、またはＬｉｎｕｍ  ｔｒｉｇｙｎｕｍ［亜麻仁］（属・種）、Ｌｙｔｈｒａｒｉｅａｅ、例えばＰｕｎｉｃａ属、例えばＰｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ［ザクロ］（属・種）、Ｍａｌｖａｃｅａｅ、例えばＧｏｓｓｙｐｉｕｍ属、例えばＧｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｅｒｂａｃｅｕｍ、またはＧｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｔｈｕｒｂｅｒｉ［綿］（属・種）、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｃｅａｅ、例えばＭａｒｃｈａｎｔｉａ属、例えばＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｂｅｒｔｅｒｏａｎａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｆｏｌｉａｃｅａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｍａｃｒｏｐｏｒａ（属・種）、Ｍｕｓａｃｅａｅ、例えばＭｕｓａ属、例えばＭｕｓａ  ｎａｎａ、Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ、Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．［バナナ］（属・種）、Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ、例えばＣａｍｉｓｓｏｎｉａ属、Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ属、例えば  Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ  ｂｉｅｎｎｉｓ、またはＣａｍｉｓｓｏｎｉａ  ｂｒｅｖｉｐｅｓ［マツヨイグサ］（属・種）、Ｐａｌｍａｅ、例えばＥｌａｃｉｓ属、例えばＥｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ［アブラヤシ］（属・種）、Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ、例えばＰａｐａｖｅｒ属、例えばＰａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ、Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ、Ｐａｐａｖｅｒ  ｄｕｂｌｕｍ［ケシ］（属・種）、Ｐｅｄａｌｉａｃｅａｅ、例えばＳｅｓａｍｕｍ属、例えばＳｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ［ゴマ］（属・種）、Ｐｉｐｅｒａｃｅａｅ、例えばＰｉｐｅｒ属、Ａｒｔａｎｔｈｅ属、Ｐｅｐｅｒｏｍｉａ属、Ｓｔｅｆｆｅｎｓｉａ属、例えばＰｉｐｅｒ  ａｄｕｎｃｕｍ、Ｐｉｐｅｒ  ａｍａｌａｇｏ、Ｐｉｐｅｒ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ、Ｐｉｐｅｒ  ａｕｒｉｔｕｍ、Ｐｉｐｅｒ  ｂｅｔｅｌ、Ｐｉｐｅｒ  ｃｕｂｅｂａ、��ｉｐｅｒ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｐｉｐｅｒ  ｎｉｇｒｕｍ、Ｐｉｐｅｒ  ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ、Ａｒｔａｎｔｈｅ  ａｄｕｎｃａ、Ａｒｔａｎｔｈｅ  ｅｌｏｎｇａｔａ、Ｐｅｐｅｒｏｍｉａ  ｅｌｏｎｇａｔａ、Ｐｉｐｅｒ  ｅｌｏｎｇａｔｕｍ、Ｓｔｅｆｆｅｎｓｉａ  ｅｌｏｎｇａｔａ［トウガラシ］（属・種）、Ｐｏａｃｅａｅ、例えばＨｏｒｄｅｕｍ属、Ｓｅｃａｌｅ属、Ａｖｅｎａ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ属、Ｈｏｌｃｕｓ属、Ｐａｎｉｃｕｍ属、Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ（トウモロコシ）属、
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属、例えばＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｊｕｂａｔｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｍｕｒｉｎｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｓｅｃａｌｉｎｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｏｎ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ａｅｇｉｃｅｒａｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｈｅｘａｓｔｉｃｈｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｓｅｃａｌｉｎｕｍ［オオムギ］、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ［ライムギ］、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ａｖｅｎａ  ｆａｔｕａ、Ａｖｅｎａ  ｂｙｚａｎｔｉｎａ、Ａｖｅｎａ  ｆａｔｕａ  ｖａｒ．  ｓａｔｉｖａ、Ａｖｅｎａ  ｈｙｂｒｉｄａ［カラスムギ］、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓａｃｃｈａｒａｔｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ｈｏｌｃｕｓ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｈｏｌｃｕｓ  ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｃａｆｆｒｏｒｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｃｅｒｎｕｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｄｏｃｈｎａ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｄｕｒｒａ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｎｅｒｖｏｓｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓａｃｃｈａｒａｔｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓｕｂｇｌａｂｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｆｌｏｒｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｈｏｌｃｕｓ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉｔａｃｅｕｍ［キビ］、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｏｒｙｚａ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ［イネ］、Ｚｅａ  ｍａｙｓ［トウモロコシ］、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｕｒｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｈｙｂｅｒｎｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍａｃｈａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、またはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ［コムギ］（属・種）、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉａｃｅａｅ、例えばＣｈｒｏｏｔｈｅｃｅ属、Ｆｌｉｎｔｉｅｌｌａ属、Ｐｅｔｒｏｖａｎｅｌｌａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｅｌｌａ属、Ｒｈｏｄｏｓｏｒｕｓ属、Ｖａｎｈｏｅｆｆｅｎｉａ属、例えばＰｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ（属・種）、Ｐｒｏｔｅａｃｅａｅ、例えばＭａｃａｄａｍｉａ属、例えばＭａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ［マカダミア］（属・種）、Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ、例えばＮｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ属、Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ属、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属、Ｍａｎｔｏｎｉｅｌｌａ属、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ属、例えばＮｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ  ｏｌｉｖａｃｅａ、Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ  ｄｕｂｉａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ｍａｎｔｏｎｉｅｌｌａ  ｓｑｕａｍａｔａ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ��ａｕｒｉ（属・種）、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、例えばＣｏｆｅａ属、例えばＣｏｆｅａ  ｓｐｐ．、Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ、またはＣｏｆｆｅａ  ｌｉｂｅｒｉｃａ［コーヒー］（属・種）、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ、例えばＶｅｒｂａｓｃｕｍ属、例えばＶｅｒｂａｓｃｕｍ  ｂｌａｔｔａｒｉａ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｃｈａｉｘｉｉ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｍ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｌａｇｕｒｕｓ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉｕｍ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｌｙｃｈｎｉｔｉｓ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｎｉｇｒｕｍ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｏｌｙｍｐｉｃｕｍ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｐｈｌｏｍｏｉｄｅｓ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｐｈｏｅｎｉｃｕｍ、Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ  ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｍ、またはＶｅｒｂａｓｃｕｍ  ｔｈａｐｓｕｓ［モウズイカ］（属・種）、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ、例えばＣａｐｓｉｃｕｍ属、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属、Ｓｏｌａｎｕｍ属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属、例えばＣａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  ｖａｒ．  ｇｌａｂｒｉｕｓｃｕｌｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ［コショウ］、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ［パプリカ］、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｌａｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｔｔｅｎｕａｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌａｕｃａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｅｐａｎｄａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ［タバコ］、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ［ジャガイモ］、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ［ナス］、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｉｉｕｍ、またはＳｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ［トマト］（属・種）、Ｓｔｅｒｃｕｌｉａｃｅａｅ、例えばＴｈｅｏｂｒｏｍａ属、例えばＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  ［カカオ］、あるいはＴｈｅａｃｅａｅ、例えばＣａｍｅｌｌｉａ属、例えばＣａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ［チャ］（属・種）。とりわけ、本発明に従ってトランスジェニック植物として使用すべき好適な植物は、多量の脂質化合物を含む油料果実作物、例えばピーナッツ、アブラナ、カノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、ケシ、カラシ、麻、トウゴマ、オリーブ、ゴマ、キンセンカ、ザクロ、マツヨイグサ、モウズイカ、アザミ、野バラ、ヘーゼルナッツ、アーモンド、マカダミア、アボカド、月桂樹、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ／ｓｑｕａｓｈ）、亜麻仁、大豆、ピスタチオ、ルリヂサ、木（アブラヤシ、ココヤシ、クルミ）、または作物、例えばトウモロコシ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、綿、キャッサバ、コショウ、マンジュギク、ナス科植物、例えばジャガイモ、タバコ、ナス、およびトマト、Ｖｉｃｉａ属の種、エンドウマメ、ムラサ��ウマゴヤシ、または低木植物（コーヒー、カカオ、チャ）、Ｓａｌｉｘ属の種、ならびに多年生草および飼料作物である。本発明による好適な植物は、油料作物植物、例えばピーナッツ、アブラナ、カノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、ケシ、カラシ、麻、トウゴマ、オリーブ、キンセンカ、ザクロ、マツヨイグサ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ／ｓｑｕａｓｈ）、亜麻仁、大豆、ルリヂサ、木（アブラヤシ、ココヤシ）である。特に好適なものは、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、モウズイカ、ゴマ、綿、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ／ｓｑｕａｓｈ）、ケシ、マツヨイグサ、クルミ、亜麻仁、麻、アザミ、またはベニバナである。極めて好適な植物は、ベニバナ、ヒマワリ、ケシ、マツヨイグサ、クルミ、亜麻仁、または麻などの植物である。
【００５１】
好適な蘚類は、ＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａまたはＣｅｒａｔｏｄｏｎである。好適な藻類は、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍａｎｔｏｎｉｅｌｌａ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ、またはＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、藻類／珪藻、例えばＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍまたはＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍである。より好ましくは、前記の藻類または蘚類は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ａｌｅｕｒｉｔａ、Ｍｕｓｃａｒｉｏｉｄｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｃｒｙｐｈｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍからなる群から、特にＴｈａｉｌａｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎｏｎａ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎａｅｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ａｌｅｕｒｉｔａ  ｆａｒｉｎｏｓａ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｕｓｃａｒｉｏｉｄｅｓ  ｖｉａｌｌｉｉ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｍｕｔｕｍ、またはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、あるいは特に有利にはＰｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｔｈａｉｌａｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎｏｎａ、およびＣｒｙｐｔｏｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ（属・種）から選択される。
【００５２】
トランスジェニック植物は、本明細書の他の部分と同様に、形質転換技法によって得られる。好ましくは、トランスジェニック植物は、Ｔ−ＤＮＡ媒介形質転換によって得られる。そのようなベクター系は、通例、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換に必要とされるｖｉｒ遺伝子と、Ｔ−ＤＮＡの範囲を定める配列（Ｔ−ＤＮＡボーダー）とを含有することを特徴とする。適切なベクターは、明細書の他の部分に詳細に記載する。
【００５３】
また、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物も包含される。本発明に想定される好適な非ヒトトランスジェニック動物は、魚、例えばニシン、サケ、イワシ、アカウオ、ウナギ、コイ、マス、オヒョウ、サバ、ザンダー、またはマグロである。
【００５４】
しかしながら、上記の非ヒトトランスジェニック生物によっては、さらに、酵素活性を例えば組換え技術によって前記生物に付与してもよいことは理解されるであろう。したがって、本発明は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドに加えて、選択する宿主細胞に応じて必要とされるデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、上記の非ヒトトランスジェニック生物を想定している。その生物中に存在するであろう好適なデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼは、本明細書の他の部分に具体的に記載したデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ、あるいは組み合わせの群から選択された少なくとも１つの酵素である（上記、ならびに第３表、第４表、および第５表を参照）。
【００５５】
さらに、本発明は、多価不飽和脂肪酸の製造ための方法であって、
ａ）本発明の宿主細胞を、前記宿主細胞における多価不飽和脂肪酸の産生を可能にする条件下で培養するステップと、
ｂ）前記宿主細胞から前記多価不飽和脂肪酸を得るステップと、
を含む方法を包含する。
【００５６】
本発明において使用する「多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）」という用語は、少なくとも２個、好ましくは、３個、４個、５個、または６個の二重結合を含む脂肪酸を指す。さらに、そのような脂肪酸が、脂肪酸鎖中に好ましくは１８〜２４個の炭素原子を含むことは理解されるべきである。より好ましくは、この用語は、脂肪酸鎖中に２０〜２４個の炭素原子を有する長鎖ＰＵＦＡ（ＬＣＰＵＦＡ）に関する。本発明の意味における好適な不飽和脂肪酸は、ＤＧＬＡ  ２０：３（８，１１，１４）、ＡＲＡ  ２０：４（５，８，１１，１４）、ｉＡＲＡ  ２０：４（８，１１，１４，１７）、ＥＰＡ  ２０：５（５，８，１１，１４，１７）、ＤＰＡ  ２２：５（４，７，１０，１３，１６）、ＤＨＡ  ２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）、２０：４（８，１１，１４，１７）からなる群から選択され、より好ましくはアラキドン酸（ＡＲＡ）  ２０：４（５，８，１１，１４）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）  ２０：５（５，８，１１，１４，１７）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）  ２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）である。したがって、最も好ましくは、本発明によって提供される方法が、ＡＲＡ、ＥＰＡ、またはＤＨＡの製造に関連することが理解されるであろう。さらに、合成中に生じるＬＣＰＵＦＡの中間体も包含される。そのような中間体は、好ましくは、本発明のポリペプチドのｎＥＣＲ活性によって基質から形成される。好ましくは、基質は、ＬＡ  １８：２（９，１２）、ＧＬＡ  １８：３（６，９，１２）、ＤＧＬＡ  ２０：３（８，１１，１４）、ＡＲＡ  ２０：４（５，８，１１，１４）、エイコサジエン酸  ２０：２（１１，１４）、エイコサテトラエン酸  ２０：４（８，１１，１４，１７）、エイコサペンタエン酸  ２０：５（５，８，１１，１４，１７）を包含する。
【００５７】
本明細書において使用する「培養する」という用語は、宿主細胞をそれらの細胞が前記多価不飽和脂肪酸、すなわち上記のＰＵＦＡおよび／またはＬＣＰＵＦＡを産生することを可能にする培養条件下に維持し、成長させることを指す。このことは、本発明のポリヌクレオチドが、ｎＥＣＲ活性が存在するように、宿主細胞において発現されることを示唆している。宿主細胞を培養するための適切な培養条件は、下記により詳細に記載する。
【００５８】
本発明において使用する「得る」という用語は、宿主細胞と培地とを含む細胞培養物の供給、ならびに膜リン脂質として、またはトリアシルグリセリドエステルとして、多価不飽和脂肪酸、好ましくは、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡを遊離形態または−ＣｏＡ結合形態で含む、その精製または部分精製された製剤の供給を包含する。より好ましくは、ＰＵＦＡおよびＬＣＰＵＦＡは、トリグリセリドエステルとして、例えば油の形態で得られる。精製技法のさらなる詳細は、以下の他の部分に記載する。
【００５９】
本発明の方法において使用する宿主細胞は、宿主生物に応じて、当業者が精通している方法で成長または培養される。通常、宿主細胞は、通常は糖類の形態の炭素源と、通常は有機窒素源の形態、例えば酵母エキスまたは硫酸アンモニウム塩などの塩の形態の窒素源と、微量元素、例えば鉄、マンガン、およびマグネシウムの塩、および適切な場合にはビタミンを含む液体培地中で、生物の種類に応じて、酸素雰囲気または嫌気性雰囲気下、温度０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃で成長させる。液体培地のｐＨは、一定に維持（すなわち、培養期間中に調整）しても、またはしなくてもよい。培養物は、回分式、半回分式、連続式で成長させることができる。栄養素は、発酵の開始時に供給しても、あるいは半連続的にまたは連続的に与えてもよい。産生されたＰＵＦＡまたはＬＣＰＵＦＡは、当業者に既知の方法によって、例えば抽出、蒸留、結晶化、適切な場合には塩による沈殿、および／またはクロマトグラフィーによって、上述のような宿主細胞から単離することができる。精製前に、宿主細胞を破壊する必要があるかもしれない。そのために、宿主細胞を事前に破壊しておいてもよい。使用する培地は、問題の宿主細胞の要件を適切に満たさなければならない。本発明による宿主細胞として使用することができる種々の微生物のための培地の説明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（米国ワシントンＤ．Ｃ．、１９８１年）の教本「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」に記載されている。また、培地は、さまざまな市販業者から入手することもできる。全ての培地成分は、熱またはフィルタ殺菌のいずれかによって殺菌する。全ての培地成分は、培養の開始時に存在しても、あるいは必要に応じて連続式または回分式で添加してもよい。宿主細胞に導入された本発明のポリヌクレオチドまたはベクターが、発現可能な選択マーカー、例えば抗生物質抵抗性遺伝子をさらに含む場合、培養物に選択剤、例えば導入ポリヌクレオチドの安定性を維持するための抗生物質を添加することが必要かもしれない。培養は、所望の産物の形成が最大限になるまで継続する。これは普通１０〜１６０時間以内に達成される。発酵ブロスは、そのまま使用してもよく、あるいはさらに処理してもよい。バイオマスは、要件に応じて、分離法、例えば、遠心、濾過、傾瀉、またはこれらの方法の組み合わせによって、発酵ブロスから完全または部分的に除去してもよく、あるいは前記ブロス中に完全に残してもよい。トリグリセリドエステルとして所望のＰＵＦＡまたはＬＣＰＵＦＡを含む、本発明の方法によって得られる脂肪酸製剤、例えば油は、さらなる対象産物の化学合成のための出発物質としても適切である。例えば、これらを互いとの組み合わせまたは単独で使用して、医薬組成物もしくは化粧用組成物、食品、または動物飼料を製造することができる。また、所望のＰＵＦＡまたはＬＣＰＵＦＡを含む化学的に純粋なトリグリセリドを、上記に記載の方法によっても製造することができる。この目的で、抽出、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー、またはこれらの方法の組み合わせによって、脂肪酸製剤をさらに精製する��トリグリセリドから脂肪酸部分を分離するために、加水分解も必要となりうる。前記の化学的に純粋なトリグリセリドまたは遊離脂肪酸は、とりわけ、食品産業における応用、または化粧用組成物および薬理組成物用に適している。
【００６０】
さらに、本発明は、多価不飽和脂肪酸の製造のための方法であって、
ａ）本発明の非ヒトトランスジェニック生物を、前記宿主細胞における多価不飽和脂肪酸の産生を可能にする条件下で培養するステップと、
ｂ）前記非ヒトトランスジェニック生物から前記多価不飽和脂肪酸を得るステップと、
を含む方法に関する。
【００６１】
さらに、上記から、前述の方法のいずれか１つのステップと、ＰＵＦＡまたはＬＣＰＵＦＡを油、脂質、または脂肪酸組成物として配合するさらなるステップを含む、油、脂質、または脂肪酸組成物の製造のための方法も本発明に想定されることになる。好ましくは、前記油、脂質、または脂肪酸組成物は、飼料、食品、化粧品、または薬剤に使用される。したがって、ＰＵＦＡまたはＬＣＰＵＦＡの配合は、想定される個々の製品のＧＭＰ基準に従って実施することになる。例えば、油は、植物種子から搾油機によって得られる。しかしながら、製品安全性の理由から、適用されるＧＭＰ基準によって、殺菌が要求されるであろう。同様の基準は、化粧用組成物または医薬組成物において使用される脂質または脂肪酸組成物にも適用されるであろう。製品として油、脂質、または脂肪酸組成物を配合するためのこれら全ての手段は、前述の製造に含まれる。
【００６２】
また、本発明は、前述の方法によって得られる、多価不飽和脂肪酸を含む油に関する。
【００６３】
「油」という用語は、トリグリセリドにエステル化された不飽和および／または飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物を指す。好ましくは、本発明のオイル中のトリグリセリドは、上述に記載したようなＰＵＦＡまたはＬＣＰＵＦＡを含む。エステル化ＰＵＦＡおよび／またはＬＣＰＵＦＡの量は、好ましくはおよそ３０％であり、含有量５０％はより好適であり、含有量６０％、７０％、８０％、またはそれ以上はさらに好適である。この油は、遊離脂肪酸、好ましくは、上述のＰＵＦＡおよびＬＣＰＵＦＡをさらに含みうる。分析の目的で、脂肪酸含有量を、例えば、エステル交換によって脂肪酸をメチルエステルに変換したあと、ＧＣ分析によって測定することができる。油または脂肪中の種々の脂肪酸の含有量は、とりわけ供給源によって異なる。しかしながら、この油は、ＰＵＦＡおよび／またはＬＣＰＵＦＡの組成および含有量に関して、非天然組成を有するであろう。この油のトリグリセリドにおけるＰＵＦＡおよびＬＣＰＵＦＡのそのような独特な油組成、および独特なエステル化パターンが、上記の本発明の方法を使用することによってのみ得られるであろうことが理解されるであろう。さらに、本発明の油は、他の分子種も含んでいてよい。特に、これは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの少量の不純物を含んでいてもよい。しかしながら、そのような不純物は、ＰＣＲなどの感度の高い技法によってのみ検出することができる。
【００６４】
本申請を通して引用する全ての参考文献の内容は、全般的に、および上記に記載のそれらの具体的な開示内容に関して、参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来のｎＥＣＲのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示している。
【図２】図２は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ由来のｎＥＣＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列：Ａ）ｍＲＮＡのｃＤＮＡ配列（配列番号３）；Ｂ）翻訳されたアミノ酸配列（配列番号４）を示している。
【図３】図３は、Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａおよびＰ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ由来のｎＥＣＲからのアミノ酸配列と、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のデヒドラターゼ（ＹＪＬ０９７Ｗ）およびエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＹＤＬ０１５Ｃ）とのアラインメントを示している。
【図４】図４は、図３からのアラインメントの相同性の表を示している。同一性表は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアパッケージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＡｌｉｇｎプログラムを用いたＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントによって作成した。異なる生物に由来する２つのｎＥＣＲは、６５％の同一性を共有するが、これら両方のｎＥＣＲは、酵母由来の既知のデヒドラターゼ（ＹＪＬ０９７ｗ）またはエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＹＤＬ０１５Ｃ）との同一性が３０％未満である。
【図５】図５は、酵母相補性アッセイによるｎＥＣＲ（Ｔｐ）およびｎＥＣＲ（Ｐｔ）の機能性評価を示している。相補性アッセイは、機能性エノイル−ＣｏＡレダクターゼを有さない、酵母Δｙｄｌ０１５ｃ中のｎＥＣＲ（Ｔｐ）およびｎＥＣＲ（Ｐｔ）を用いて実施した。凡例：ＹＰＤ＝完全培地、ＳＤ−Ｕｒａ＝ウラシルを含まない培地、ＳＤ−Ｌｅｕ＝ロイシンを含まない培地、ＦＯＡ＝ロイシンおよび５−ＦＯＡを含有する培地；（１）ｔｓｃ１３ΔＴｒｐ  ｐＴＳＣ１３  ＵＲＡ：機能性ＹＤＬ０１５Ｃ遺伝子を含有するベクターｐＴＳＣ１３で形質転換した、エノイル−ＣｏＡレダクターゼの機能を有さない酵母突然変異体ΔｙｄｌＯ１５Ｃ；（２）ｐｈｓ１ΔＫａｎ  ｐＰＨＳ１  ＵＲＡ：機能性ＹＪＬ０９７Ｗ遺伝子を含有するベクターｐＰＨＳ１で形質転換した、デヒドラターゼの機能を有さない酵母突然変異体Δｙｊｌ０９７ｗ；（３）ｔｓｃ１３ΔＴｒｐ  ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）：ベクターｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）で形質転換した、エノイル−ＣｏＡレダクターゼの機能を有さない酵母突然変異体Δｙｄｌ０１５Ｃ；（４）ｓｃ１３ΔＴｒｐ  ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｐｔ）：ベクターｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｐｔ）で形質転換した、エノイル−ＣｏＡレダクターゼの機能を有さない酵母突然変異体Δｙｄｌ０１５Ｃ。
【図６】図６は、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）を用いた長鎖ＰＵＦＡの産生の向上を示している。ｎＥＣＲ（Ｔｐ）を用いた長鎖ＰＵＦＡの産生の向上。ｐＹＥＳ−ｄ９Ｅｌｏ（Ｉｇ）で形質転換した酵母（Ａ）、またはｐＹＥＳ−ｄ９ＥＬｏ（Ｉｇ）＋ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）で形質転換した酵母（Ｂ）を２５μＭのリノレン酸（１８：３Δ９，１２，１５）とともに、ＳＤ（−Ｕｒａ−Ｌｅｕ）培地に供給した。４８時間のインキュベーション後、酵母細胞を遠心分離し、ペレットをガスクロマトグラフ分析した。このガスクロマトグラフは、２つの異なる酵母菌株中の異なる脂肪酸であり、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）を含まないもの（Ａ）とこれを含むもの（Ｂ）を示している。変換率は、以下のように計算する：（産物／基質−産物）＊１００。
【図７】図７は、Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ細胞成分分画のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ分析を示している。Ｍ＝タンパク質サイズマーカー、１＝全抽出物、２＝可溶性分画、３＝膜分画。矢印は、２つの型のｎＥＣＲ（Ｔｐ）を示す。
【図８】図８は、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）発現酵母由来の細胞成分分画のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ分析を示している。Ｍ＝タンパク質サイズマーカー、１＝全抽出物、２＝可溶性分画、３＝膜分画。矢印は、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）融合タンパク質を示す。
【図９】図９は、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）発現酵母由来の細胞成分分画のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ分析を示している。Ｍ＝タンパク質サイズマーカー、１＝全抽出物、２＝可溶性分画、３＝膜分画。矢印は、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）融合タンパク質を示す。
【００６６】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これは制限と解釈すべきものではない。本申請を通して引用する全ての参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに図は、参考として本明細書で援用される。
【００６７】
実施例
実施例１：生物および培養条件
半数体を再生させるために、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １６：４８７−４９６）に概説されている方法を使用した。簡潔に言うと、培養物をＤＯＢ−ウラシル中で一晩成長させ、その後ＯＤ500がおよそ２５の各培養物を洗浄し、新鮮培地に再懸濁させ、３時間成長させた。次いで、細胞を胞子形成培地（１％酢酸カリウム、０．００５％酢酸亜鉛）に懸濁させ、５日間胞子形成し、２００ｍｇ／ＬのＧ４１８および６０ｍｇ／Ｌのカナバニンを含有する半数体選択ＭａｇｉｃＭｅｄｉａプレート（２％ガラクトース、アミノ酸混合物−ウラシル−ロイシン−ヒスチジン−アルギニン、アミノ酸または硫酸アンモニウムを含まない０．１７％窒素塩基、０．１％グルタミン酸ナトリウム）に塗布した。
【００６８】
実施例２：新規のデヒドラターゼ／エノイル−ＣｏＡレダクターゼ配列
ＰＵＦＡ産生藻類をスクリーニングして、非ＰＵＦＡ産生株との差を明らかにした。これらのＰＵＦＡ産生株に対して特異的な、ＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａおよびＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍに由来する配列を得た（図１および２）。酵母（ＹＪＬ０９７ＷおよびＹＤＬＯ１５Ｃ）由来の既知のデヒドラターゼ配列およびエノイル−ＣｏＡレダクターゼ配列とのアラインメントは、低い相同性を示した（図３および４）。したがって、この新しく生成されたｎＥＣＲは、新規の酵素群に相当する。相補性アッセイ（実施例３）によって、これらの配列は、デヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ活性を示し、したがってｎＥＣＲと命名した。
【００６９】
同定された全長コード配列の一覧を第１ａ表および第１ｂ表に示す。
【００７０】
第１ａ表：全長コード配列一覧
【表２】
2012529277.tif 000003
【００７１】
第１ｂ表：第１表に記載の配列からの推定アミノ酸の一覧
【表３】
2012529277.tif 000004
【００７２】
第１表に示すオープンリーディングフレームをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のｐＥＳＣ（Ｌｅｕ）ベクターに、製品の反応条件に従ってクローニングした。反応物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離した。次にこのプラスミドｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）、ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｐｔ）を酵母形質転換に使用した。突然変異酵母菌株Δｙｄｌ０１５Ｃ（Δｔｓｃ１３）およびΔｙｊｌ０９７ｗ（Δｐｈｓ１）はともに致死性であるため、これらの株をプラスミドで形質転換して、これらの突然変異体をウラシル栄養要求性マーカーＵＲＡで相補しておいた（ｐＴＳＣ１３およびｐＰＨＳ１）。ＵＲＡマーカーを含有するベクターを、５−ＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸；Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｙｅａｓｔ．  ２００８  Ａｕｇ；２５（８）：５９５−９）を用いて、酵母として除去することができる。
【００７３】
実施例３：酵母形質転換および成長条件
Ｓ．  Ｃ．  ＥａｓｙＣｏｍｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＹＳＣ１０２１−６７４０５４（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を構築物ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）、ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｐｔ）、およびｐＥＳＣで形質転換し、ロイシン欠乏培地で選択した。デヒドラターゼ／エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を評価するために、相補性試験を実施した。その目的で、ヘテロ接合体Ｍａｇｉｃ  Ｍａｒｋｅｒ株ＹＳＣ１０２１−６７４０５４（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。この株は、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を示さない。エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性は伸長脂肪酸を生じ、これらの脂肪酸は細胞の成長および分裂に必要とされるため、これらそれぞれの酵母菌株は、前記伸長脂肪酸を含有しない培地では成長しないことになる。
【００７４】
以下の形質転換体が生成された：
１．ｔｓｃ１３ΔＴｒｐ  ｐＴＳＣ１３  ＵＲＡ：機能性ＹＤＬ０１５Ｃ遺伝子を含有するベクターｐＴＳＣ１３で形質転換した、エノイル−ＣｏＡレダクターゼの機能を有さない酵母突然変異体Δｙｄｔ０１５Ｃ。
２．ｐｈｓｉΔＫａｎ  ｐＰＨＳ１  ＵＲＡ：機能性ＹＪＬ０９７Ｗ遺伝子を含有するベクターｐＰＨＳ１で形質転換した、デヒドラターゼの機能を有さない酵母突然変異体Δｙｊｌ０９７ｗ。
３．ｔｓｃ１３ΔＴｒｐ  ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）：ベクターｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）で形質転換した、エノイル−ＣｏＡレダクターゼの機能を有さない酵母突然変異体Δｙｄｌ０１５Ｃ。
４．ｓｃ１３ΔＴｒｐ  ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｐｔ）：ベクターｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｐｔ）で形質転換した、エノイル−ＣｏＡレダクターゼの機能を有さない酵母突然変異体Δｙｄｌ０１５Ｃ。
【００７５】
酵母を全てのアミノ酸およびヌクレオチドを含有する完全培地中での形質転換後に成長させる。次に、酵母を完全培地（ＳＤ）、ウラシルを含まない完全培地（ＳＤ−Ｕｒａ）、ロイシンを含まない完全培地（ＳＤ−Ｌｅｕ）、またはロイシンを含まず、５−ＦＯＡを含有する完全培地のいずれかを含有する異なる培地に蒔く（図５）。プラスミド１および２は、ＳＤおよびＳＤ−Ｕｒａでは成長することができるが、ＳＤ−Ｌｅｕでは、これらがＬＥＵマーカーを有さないため成長することができない。プラスミド３および４は、ＳＤおよびＳＤ−Ｌｅｕでは成長することができるが、ＳＤ−Ｕｒａでは、これらがＵＲＡマーカーを含まないため成長することができない。ＵＲＡマーカーを有するプラスミドを除去するＦＯＡを含有するプレートで、相補性が示された（１および２）。しかしながら、プラスミド１または２の不在下でも、プラスミド３および４を含むコロニーの成長が認められる（図５、ＦＯＡ）。
【００７６】
したがって、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）およびｎＥＣＲ（Ｐｔ）の両配列は、酵母３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子Δｙｄｌ０１５Ｃにおける致死ヌル突然変異を相補することができる。
【００７７】
要約すると、欠損酵母突然変異体の相補により、配列ｎＥＣＲ（Ｔｐ）およびｎＥＣＲ（Ｐｔ）が生物学的機能性を有し、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を示すことを明らかにすることができた。
【００７８】
実施例４：Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ由来のｄ９−エロンガーゼと組み合わせたｎＥＣＲ（Ｔｐ）の発現
植物における多価不飽和脂肪酸の産生において、例えば栄養補給食品用途でのｎＥＣＲ（Ｔｐ）の有用性を検討するために、ＰＵＦＡ−エロンガーゼ成分である、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ由来のｄ９−エロンガーゼと組み合わせて遺伝子を発現させた（国際出願第２００２／０７７２１３号）。この酵素は、リノール酸またはリノレン酸（１８：２Δ９，１２または１８：３Δ９，１２，１５）の伸長を触媒する。実験の目的は、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）の付加が、Ｉ．  ｇａｔｂａｎａ由来のｄ９−エロンガーゼの生産性を向上させるかどうかを分析することであった。その目的で、ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）で形質転換し、ＤＯＢ（−ロイシン）プレートで成長させた酵母細胞（ＩＮＶＳＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を実施例１に記載のように、プラスミドｐＹＥＳ（Ｕｒａ）−ｄ９Ｅｌｏ（Ｉｇ）でさらに形質転換し、ＤＯＢ（−ウラシル、−ロイシン）で成長させた。ベクターｐＹＥＳ（Ｕｒａ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社から取得したものであり、ウラシルの栄養要求性を媒介する。国際出願第２００２／０７７２１３に記載されるｄ９Ｅｌｏ（Ｉｇ）のオープンリーディングフレームを、製品の条件に従ってｐＹＥＳ２にクローニングした。対照実験として、ｐＹＥＳベクターのみを含有する対照酵母菌株に、ｐＹＥＳ−ｄ９Ｅｌｏ（Ｉｇ）を形質転換した。
【００７９】
驚くべきことに、対照（ｐＥＳＣ−ｄ９Ｅｌｏ（Ｉｇ）と、伸長複合体（ｐＥＳＣ−ｄ９Ｅｌｏ（Ｉｇ）＋ｐＹＥＳ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）の２つの成分を含有する酵母との間に、伸長産物２０：３の量の差が認められた。
【００８０】
図６において、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）遺伝子の付加が、長鎖ＰＵＦＡの生産性に多大な影響を与えることが示されている。生産性は、対照実験と比較して８倍向上した。この生産性は、基質１８：３（酵母培地に外部から添加）から伸長ＰＵＦＡ脂肪酸２０：３への変換率で測定する。
【００８１】
要約すると、ｎＥＣＲは、伸長脂肪酸、例えばヒトの健康に有益な長鎖ＰＵＦＡの生産を大きく改善する。
【００８２】
実施例５：酵母発現ｎＥＣＲ（Ｔｐ）とＴ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来の天然タンパク質との比較
ｎＥＣＲ（Ｔｐ）に対する抗体を製品の操作に従って産生しておいた（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、ベルギー；ペプチド抗体）。これらの抗体は、Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａおよび酵母での異種発現におけるｎＥＣＲ（Ｔｐ）に対して極めて特異的である（図７および図８）。抗体を使用することにより、天然生物と異種発現との構造的な差を観察することができた（図７および図８）。
【００８３】
標準プロトコルを用いて、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ実験を実施した：
Ｂｉｏｒａｄ社製プレキャストゲルを用いて、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。ローディングバッファーとして、０．０５Ｍ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１Ｍ  ＤＴＴ、２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、０．１％  ブロモフェノールブルー、および１０％  グリセロールを使用した。次いで、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＢＡ８５  ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをニトロセルロースにブロットした。膜への転写は、１５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）  メタノールを含有する緩衝液を用いて、２００ｍＡ、４０Ｖで２時間実施した（Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ、Ｂｉｏｒａｄ社）。免疫学的検査の目的で、５％（ｗ／ｖ）粉乳を含むＰＢＳ（０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４））中で、この膜を１時間ブロッキングした。ｎＥＣＲ（Ｔｐ）に対する抗体を含有する血清を濃度１：２０００で添加し、４℃で一晩インキュベートした。抗体を検出するために、この膜をＰＢＳで３回洗浄し、５％（ｗ／ｖ）粉乳を含むＰＢＳで、３０分間再びブロッキングした。１単位の二次抗体（Ｂｉｏｒａｄ社の抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を添加し、さらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄したあと、この膜をＥＣＬ溶液に浸漬し、１分間インキュベートした。次いで、この溶液をティッシュペーパーで拭き取り、膜をサランラップで包んだ。ＢｉｏＩｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（ＬＫＢ社）で化学発光の検出を行なった。
【００８４】
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａからタンパク質を単離するために、Ｆ２培地で培養物５００ｍＬを２０℃で１４日間インキュベートした（Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの成長条件および培地は、Ｔｏｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｏｎｏ  ２００５，  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２：３４０１−３４１２）に記載されているとおりに使用した）。藻類を遠心分離（１０分、５０００×ｇ）で回収し、ペレットを乳鉢に入れた。乳棒を用いて、微粉を作成した。この粉末を５０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡで懸濁させ、２層のＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｍｅｒｃｋ社）または他の任意の濾過膜で濾過した。次に、この濾過生成物を分取し、アリコート５０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（上記参照）と混合した。
【００８５】
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおけるＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔによって検出されたｎＥＣＲ（Ｔｐ）の分析は（図７）、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）のタンパク質が、細胞残屑、可溶性分画、および膜分画でも認められることを明らかにした。驚くべきことに、Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおいて、主な形態は、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性（ＥＣＲ）のみを含有する切断型である。ＥＣＲドメインの証拠は、ＥＣＲドメイン中の抗体の結合部位の位置から推定される。ｎＥＣＲ（Ｔｐ）のより大きい融合タンパク質は、可溶性分画において少量認められるのみである。膜分画においては、より長い曝露時間を経てもｎＥＣＲ（Ｔｐ）は認められなかった。
【００８６】
したがって、Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおいて、ｃＤＮＡ（配列番号１）から推定されるタンパク質と、ＥＣＲドメインのみを含有する、翻訳後修飾されたより短い型との２つの型のｎＥＣＲ（Ｔｐ）があるという結論を出すことができる。ＥＣＲドメインのみが膜結合性であり、したがって正確に局在化される（エロンガーゼ複合体におけるＥＣＲの機能性は、ミクロゾーム膜で生じる（Ｎａｐｉｅｒ  ２００７，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５８：２９５−３１９））。
【００８７】
酵母におけるｎＥＣＲ（Ｔｐ）の異種発現では、異なる状態を観察することができる。実施例４に記載したように、ｐＥＳＣ−ｎＥＣＲ（Ｔｐ）を含む酵母をタンパク質抽出に使用した。酵母を５０ｍｌの培養物として２８℃で３日間成長させ、遠心分離（１０分、５０００×ｇ）によってペレットを回収した。ペレットを分取し、液体窒素で凍結させ、Ｑｉａｇｅｎ／Ｔｒｅｓｃｈミルシステムと適合するスチールビーズを加えた。細胞破壊するために、ペレットを５分間Ｔｒｅｓｃｈミルにかけた。３０分間の１０００００×ｇ遠心分離ステップにより、全細胞抽出物を可溶性分画と膜分画とに分離した。ペレットは膜分画を、上澄みは可溶性分画を構成する。３つの分画全てに、上述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ分析を行ない、分析した（図８）。酵母において、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）の切断は観察することができなかった。分子量から、この酵母は、およそ８６ｋＤａに達する融合タンパク質を発現していたが、これはＴ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ中のｎＥＣＲ（Ｔｐ）に匹敵する。５９ｋＤａのＥＣＲ切断型は存在しない。したがって、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）は、酵母ＫＯ突然変異体を相補することから（実施例３）、その非切断形態で完全に機能し、それにより新しいタンパク質群に相当すると結論することができる。さらに、可溶性分画およびミクロソーム分画を詳細に分析して、ｎＥＣＲ（Ｔｐ）の可溶性分画があるかどうかを確認した（図９）。再び、上澄みとミクロソーム分画とをゲルにロードし、より長い時間曝露した。ｎＥＣＲ（Ｔｐ）は可溶性分画において認められず、ここでもＴ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来の天然型との構造的な差を示している。
【００８８】
結論として、驚くべきことに伸長複合体（ＥＣＲおよびＤＨ）の２つの酵素活性を含有する新しい融合タンパク質が発見された。配列番号１は、Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ中の天然タンパク質とは異なる構造的特性を有する機能性融合タンパク質としての異種系における発現をもたらす。
【００８９】
実施例６：植物におけるｎＥＣＲ（Ｔｐ）およびｎＥＣＲ（Ｐｔ）の発現
Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａおよびＰ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍに由来する新規のｎＥＣＲを、国際出願第２００３／０９３４８２号、国際出願第２００５／０８３０９３号、または国際出願第２００７／０９３７７６号に記載されているように、植物形質転換ベクターにクローニングする。例となる遺伝子の適切な組み合わせは、第３表、第４表、および第５表に記載する。
【００９０】
第３表：ＡＲＡ産生のための遺伝子の組み合わせ
【表４】
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【００９１】
第４表：ＥＰＡ産生のための遺伝子の組み合わせ
【表５】
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【００９２】
第５表：ＤＨＡ産生のための遺伝子の組み合わせ
【表６】
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【００９３】
トランスジェニック菜種系統をＤｅｂｌａｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  １３，  ４７７７−４７８８に記載されているように生成し、トランスジェニック菜種植物の種子をＱｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ３１５６１−３１５６６に記載されているように分析する。
【００９４】
参考文献一覧
【表７】
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【００９５】
本明細書において引用する全ての参考文献は、開示内容全体および本明細書において具体的に言及する開示内容に関して、参考として本明細書で援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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