(57)【要約】  本発明は、成人のための栄養の分野に関する。特に、本発明は、消化管の機能障害を有する成人を対象とする栄養組成物に関する。本発明の一実施形態は、消化管の機能障害を有する成人に投与されるプロバイオティクス微生物を含む栄養組成物に関する。プロバイオティクス微生物は、非複製、例えば、生物活性のある加熱処理されたプロバイオティクス微生物でもよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に完全栄養を供給し、プロバイオティクス微生物を含む、消化管の機能障害を患っている成人に投与される組成物。
【請求項２】
０．９〜１．４ｋｃａｌ／ｍｌの範囲のカロリー密度、３８０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ水の範囲の重量オスモル濃度を有し、組成物のカロリーの約２３〜２７％を占めるタンパク質源、組成物のカロリーの約３４〜３８％を占める炭水化物源、組成物のカロリーの約３７〜４１％を占める脂質源を含み、７０：１〜８０：１の範囲のＮＰＣ：Ｎ比を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１．５：１〜２：１の範囲のｎ６：ｎ３脂肪酸比、及び／又は５５：４５〜４５：５５の範囲のＭＣＴ：ＬＣＴ比を有する脂質源を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
約７９〜８３％の遊離水を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
プロバイオティクス微生物が、非複製プロバイオティクス微生物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
約１０６〜１０１２ｃｆｕに相当する量のプロバイオティクス微生物を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
非複製プロバイオティクス微生物が、加熱処理によって、好ましくは少なくとも１秒間の少なくとも７１．５℃の高温処理によって非複製にされた、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
加熱処理が、約１〜１２０秒間の約７１．５〜１５０℃の高温処理であり、好ましくは高温／短時間（ＨＴＳＴ）処理又は超高温（ＵＨＴ）処理である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
炎症性障害の予防又は治療において使用するための、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
加熱処理が、約３分〜２時間、約７０〜１５０℃の温度範囲で、好ましくは５分〜４０分間、８０〜１４０℃の範囲で行われる、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
欠陥のある免疫防御と関連する障害の予防又は治療において使用するための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
プロバイオティクスの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的には全てが非複製である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
プロバイオティクス微生物が、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、プロピオニバクテリウム属、又はこれらの組合せ、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・ジアセチラクティス、ラクトコッカス・クレモリス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・デルブレッキー、エシェリキア・コリ、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
プロバイオティクス微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・ジョンソニーＬａ１、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９８３、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・ブルガリカスＮＣＣ１５、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７、又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
１日用量当たり約０．００５ｍｇ〜１０００ｍｇの非複製微生物を含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、成人のための栄養の分野に関する。特に、本発明は、消化管の機能障害を有する成人を対象とする栄養組成物に関する。本発明の一実施形態は、消化管の機能障害を有する成人に投与されるプロバイオティクス微生物を含む栄養組成物に関する。プロバイオティクス微生物は、非複製、例えば、生物活性のある加熱処理されたプロバイオティクス微生物でもよい。
【０００２】
成人は、例えば成人の年齢、成人の性別又は成人の身体活動性のレベルに基づいた特定の栄養必要量を有する。バランスのとれた食事は、それらの必要性を通常満たし、体に全ての必要な栄養素を供給し得る。
【０００３】
しかし、一部の成人は、消化（ＧＩ）管の機能障害を患っている。結果として、必ずしも体に十分な量の栄養素を供給することを望むとも、又は供給することができるとも限らない場合がある。
【０００４】
このような成人は典型的には、例えば、十分な食物摂取を可能とせず、又は必要な栄養素が摂取食物から適切に吸収されることを可能としない、食欲減退、容量不耐性、便秘又は下痢症を患っている。
【０００５】
好ましくない状況下でさえ、このような患者の特別な必要性にまだ応えることができるように、特殊栄養組成物が、このような場合のために開発されてきた。
【０００６】
典型的には、不十分な食物摂取の場合、食品組成物中の多量栄養素を加工し、それらをより吸収しやすくする。
【０００７】
それにも関わらず、消化器系がより効果的に作用するように、消化管機能をサポートすることも望ましいであろう。
【０００８】
ＧＩ管の機能障害による栄養不良は、免疫系を弱らせることが多い。
【０００９】
組成物が抗炎症作用を有していればそれはさらに望ましいであろう。
【００１０】
結果的に、疾病時又は疾病からの回復時に、患者に、栄養サポートだけでなく、免疫系へのサポート、炎症の程度の減少を可能とする天然組成物、及び／又は消化管がより良好に機能することを可能とする手段をまた提供することは望ましいであろう。
【００１１】
したがって、炎症を減少させ、免疫系をブーストし、及び／又は消化を改善する一方で、成人患者の特定の必要性に従って成人患者に特定の栄養を供給することを可能とすることが、栄養組成物の当技術分野において求められている。副作用を伴わずに投与が安全で、生産加工を使用して栄養サプリメント中に組み込むことが容易な、天然成分を使用することによって、このようなことが達成されれば好ましいであろう。
【００１２】
本発明者らは、この必要性に取り組んだ。したがって、現況技術を改善し、上記で表した必要性を満足させる、成人に投与される栄養組成物を提供することは、本発明の目的であった。
【００１３】
本発明者らが独立請求項の主題によって本発明の目的を達成できたことは驚きであった。従属請求項は、本発明のアイデアをさらに発展させる。
【００１４】
したがって、本発明者らは、ＧＩ管の機能障害を患っている成人に投与される、プロバイオティクスを含む、特定の経口栄養組成物を提供することを提案する。
【００１５】
成人は、本発明の目的のために、少なくとも１８歳のヒトと理解される。
【００１６】
プロバイオティクスは、液体栄養組成物の枠組みにおいてそれらの健康上の利益を実現できることが見出された。
【００１７】
特定の患者に投与される液体栄養組成物は、プロバイオティクスを含むヨーグルト飲料の保存寿命を超える保存寿命を通常有するため、プロバイオティクスは通常、このような栄養組成物に加えられなかった。これは、プロバイオティクスの生存能が長期間の保存寿命の間に確保できるかについて不確実であるためである。
【００１８】
非複製プロバイオティクスでさえ、プロバイオティクスの健康上の利益をもたらすことができ、改善された利益さえも有し得ることを、本発明者らは今や示すことができた。
【００１９】
したがって本発明の一実施形態は、患者に完全栄養を供給し、プロバイオティクス微生物を含む、成人に投与される組成物である。
【００２０】
成人は、例えば、消化管の機能障害を患っている成人であってもよい。
【００２１】
患者が全ての必要な栄養素を組成物から得て、さらなる食料源が必要ない場合、このような組成物は、完全栄養を実現する。
【００２２】
本発明の組成物は、経口的に投与される栄養組成物として、又は経管栄養法によって経腸的に投与される栄養組成物として提供し得る。
【００２３】
本発明の栄養組成物は、ＧＩ障害のある患者のための、中程度に高いカロリー、非常に高いタンパク質、１００％ホエイ、酵素的に加水分解された、完全成分医療食品を提供する。
【００２４】
本発明の栄養組成物は、酸化ストレス、炎症及び／又は摂食耐性を経験し得る患者の必要性を満たすように設計される。
【００２５】
組成物中に存在するペプチドは、胃内容物排出を促進するために、完全又は部分的にホエイをベースとしたものであり得る。完全にホエイをベースとするタンパク質源として、酵素的に加水分解されたホエイタンパク質を使用し得る。
【００２６】
本発明の一実施形態は、０．９〜１．４ｋｃａｌ／ｍｌの範囲のカロリー密度、３８０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ水の範囲の重量オスモル濃度を有し、組成物のカロリーの約２３〜２７％を占めるタンパク質源、組成物のカロリーの約３４〜３８％を占める炭水化物源、組成物のカロリーの約３７〜４１％を占める脂質源を含む組成物である。
【００２７】
非常に高いタンパク質含有量は、ストレスの間の体の要求をサポートする。
【００２８】
したがって、組成物は、７０：１〜８０：１の範囲のＮＰＣ：Ｎ比を有し得る。非タンパク質キロカロリーと窒素の比（ＮＰＣ：Ｎ）は、１日毎に供給される窒素のグラムを計算し（１ｇのＮ＝６．２５ｇのタンパク質）、総非タンパク質キロカロリーを窒素のグラムで割ることによって計算する。
【００２９】
典型的には、８０：１の範囲のＮＰＣ：Ｎ比を有する栄養サプリメントを、最も重度のストレス状態にある患者のために使用し、１００：１の範囲のＮＰＣ：Ｎ比を、重度のストレス状態にある患者のために使用し、１５０：１の範囲のＮＰＣ：Ｎ比を、ストレス状態にない患者のために使用する。
【００３０】
本発明による組成物は、１．５：１〜２：１の範囲のｎ６：ｎ３脂肪酸比、及び／又は５５：４５〜４５：５５の範囲のＭＣＴ：ＬＣＴ比を有する脂質源を含み得る。
【００３１】
大量のｎ−３脂肪酸は、炎症反応をモジュレートするのに役立つ。バランスのとれたペプチドプロファイル及びＭＣＴ油は、吸収及びＧＩ耐性を促進する。高いＭＣＴ：ＬＣＴ比が選択され、脂肪吸収不良の可能性を減少させる。
【００３２】
本発明の組成物は、繊維を含有し、健康な消化管微生物叢の促進に役立ち得る。エンドウマメ繊維、オリゴフルクトース、イヌリン、及びこれらの組合せを使用し得る。繊維は、５〜６ｇ／Ｌの量で存在し得る。一実施形態において、オリゴフルクトース及びイヌリンの組合せが使用される。
【００３３】
典型的には、本発明の組成物は、約７９〜８３％の遊離水を含む。遊離水は、最小限の液体の必要量を満たすのに必須である。典型的には、ＧＩの機能障害を有する患者は十分に飲み物を飲まない。
【００３４】
本発明の組成物は、癌患者、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）、短腸症候群、敗血症、重篤疾患、胃腸障害、胃腸管瘻、感染症、悪心、嘔吐、手術前及び手術後の状態、褥瘡、創傷管理、静脈うっ血性潰瘍、人工呼吸器への依存、火傷、クリティカルケア状態、クローン病、下痢症、脂肪吸収不良、グルテン不耐性、代謝亢進、消化及び吸収不良、乳糖不耐性、限定された消化管機能、代謝ストレス状態、呼吸器疾患、移行期摂食（ＴＰＮ後）、早期手術後の摂食、腸切除、膵臓炎、又はこれらの組合せの栄養管理のために使用し得る。
【００３５】
組成物は、部分的に又は単独で非複製プロバイオティクス微生物を含み得る。
【００３６】
例えば、免疫ブースト作用に関して、及び／又は抗炎症作用に関して、非複製プロバイオティクス微生物は、複製プロバイオティクス微生物より有効でさえあり得ることを、本発明者らは驚いたことに見出した。
【００３７】
プロバイオティクスは「適当量で投与されたときに健康上の利益を宿主に与える生きた微生物」（ＦＡＯ／ＷＨＯガイドライン）として定義されることが多いため、これは驚くべきことである。既刊文献の大部分は、生きたプロバイオティクスについて論じている。さらに、いくつかの研究は非複製細菌によって実現される健康上の利益を調査したが、例えば加熱処理によるプロバイオティクスの不活性化は、これらの健康上の利益と称されるものの損失をもたらすことをこれらの研究の大部分は示した（Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ，Ｄ．ら、２００４、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２６：５２０〜５２８；Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏら、２００５、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１９７〜２０４；Ｇｉｌｌ，Ｈ．Ｓ．及びＫ．Ｊ．Ｒｕｔｈｅｒｆｕｒｄ、２００１，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．８６：２８５〜２８９；Ｋａｉｌａ，Ｍ．ら、１９９５、Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ  ７２：５１〜５３）。いくつかの研究は、死んだプロバイオティクスがいくらかの健康への影響を保持し得ることを示した（Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ，Ｄ．ら、２００４、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２６：５２０〜５２８；Ｇｉｌｌ，Ｈ．Ｓ．及びＫ．Ｊ．Ｒｕｔｈｅｒｆｕｒｄ、２００１，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．８６：２８５〜２８９）が、明らかに生きているプロバイオティクスが今までのところ当技術分野でより能力があると見なされてきた。
【００３８】
本発明による組成物は、任意の有効量で、例えば、約１０６〜１０１２ｃｆｕ／ｇ乾重量に相当する量で、プロバイオティクス微生物を含み得る。
【００３９】
プロバイオティクス微生物は、非複製プロバイオティクス微生物でもよい。
【００４０】
「非複製」プロバイオティクス微生物には、加熱処理されたプロバイオティクス細菌が含まれる。これには、不活性化された、死んだ、生存していない、並びに／又はフラグメント（ＤＮＡ、代謝物、細胞質化合物、及び／若しくは細胞壁材料など）として存在する微生物が含まれる。
【００４１】
「非複製」とは、古典的なプレーティング法によって生存細胞及び／又はコロニー形成単位を検出することができないことを意味する。このような古典的なプレーティング法は、微生物学の書籍：Ｊａｍｅｓ  Ｍｏｎｒｏｅ  Ｊａｙ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、Ｄａｖｉｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｅｎ．２００５、Ｍｏｄｅｒｎ  ｆｏｏｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．７９０頁に要約されている。典型的には、生存細胞が存在しないことは、下記のように示すことができる。異なる濃度の細菌調製物（「非複製」試料）の播種、並びに適切な条件（少なくとも２４時間の好気性及び／又は嫌気性雰囲気）下でのインキュベーション後に、寒天プレート上で目に見えるコロニーがない、又は液体増殖培地の混濁度の増加がない。
【００４２】
プロバイオティクスは、本発明の目的のために、「宿主の健康又は満足な状態に対して有益な作用を有する微生物細胞調製物又は微生物細胞の成分」と定義される（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓ、Ｏｕｗｅｈａｎｄ  Ａ．Ｂｅｎｎｏ  Ｙ．ら、「Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｈｏｗ  ｓｈｏｕｌｄ  ｔｈｅｙ  ｂｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ」  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９：１０  １０７〜１０）。
【００４３】
非複製プロバイオティクス微生物を使用する可能性は、いくつかの利点を提供する。重度の免疫不全患者において、生きたプロバイオティクスの使用は、菌血症が発生する潜在的な危険性によって例外的な場合において限定されることがある。非複製プロバイオティクスは、何の問題もなしに使用し得る。
【００４４】
さらに、非複製プロバイオティクス微生物を提供することは、健康上の利益を保持する一方で高温の再構成を可能にする。
【００４５】
本発明の組成物は、健康上の利益を少なくとも部分的に生じさせるのに十分な量の、プロバイオティクス微生物及び／又は非複製プロバイオティクス微生物を含む。これを達成するのに適当な量は、「治療有効用量」と定義される。この目的のために有効な量は、患者の体重及び身体全体の健康状態などの当業者には公知のいくつかの要因、並びに食品マトリックスの作用によって決まる。
【００４６】
予防的用途において、本発明による組成物を、障害の影響を受けやすい又はそうでなければ障害の危険性がある消費者に、その障害が発生する危険性を少なくとも部分的に減少させるのに十分な量で投与する。このような量は、「予防有効用量」であると定義される。ここでまた、正確な量は、患者の健康状態及び体重などのいくつかの要因、並びに食品マトリックスの作用によって決まる。
【００４７】
当業者であれば、治療有効用量及び／又は予防有効用量を適切に調節することができる。
【００４８】
一般に、本発明の組成物は、プロバイオティクス微生物及び／又は非複製プロバイオティクス微生物を治療有効用量及び／又は予防有効用量で含有する。
【００４９】
典型的には、治療有効用量及び／又は予防有効用量は、１日用量当たり約０．００５ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲のプロバイオティクス微生物及び／又は非複製プロバイオティクス微生物である。
【００５０】
数値量に関して、「短時間高温」処理された非複製微生物は、組成物中に１０４〜１０１２当量ｃｆｕ／ｇ乾燥組成物に相当する量で存在し得る。明らかに、非複製微生物は、コロニーを形成しない。結果的に、治療有効用量及び／又は予防有効用量という用語は、１０４〜１０１２ｃｆｕ／ｇの複製細菌から得られる非複製微生物の量と理解される。これには、不活性化された、生存していない、又は死んだ、又はフラグメント（ＤＮＡ若しくは細胞壁若しくは細胞質化合物など）として存在する微生物が含まれる。すなわち、組成物が含有する微生物の量は、全ての微生物が、実際は不活性化された、又は死んだ、断片化された、又はこれらの状態の任意若しくは全ての混合物などの非複製であろうとなかろうとに関わりなく、生きているかのように、微生物の量のコロニー形成能（ｃｆｕ）に関して表される。
【００５１】
好ましくは、非複製微生物は、１０４〜１０９ｃｆｕ／ｇ乾燥組成物に相当する量で、よりさらに好ましくは１０５〜１０９ｃｆｕ／ｇ乾燥組成物に相当する量で存在する。
【００５２】
プロバイオティクスは、当技術分野において公知の任意の方法によって非複製にし得る。
【００５３】
プロバイオティクス菌株を非複製にするのに今日利用可能な技術は通常、加熱処理、γ−照射、紫外線、又は化学薬品（ホルマリン、パラホルムアルデヒド）の使用である。
【００５４】
食品産業の工業的状況において比較的容易に適用される、プロバイオティクスを非複製にする技術を使用することが好ましいであろう。
【００５５】
プロバイオティクスを含有する今日市場にある大部分の製品は、それらの生産の間に加熱処理される。したがって、プロバイオティクスがそれらの有益な特性を保持若しくは改善し、又は消費者のために新規で有益な特性を得る一方で、生産される製品と一緒に又は少なくとも同様の方法で、プロバイオティクスを加熱処理できることは好都合であろう。
【００５６】
しかし文献においては、加熱処理によるプロバイオティクス微生物の不活性化は、プロバイオティクス活性の少なくとも部分的な損失と一般に関連している。
【００５７】
プロバイオティクス微生物を例えば、加熱処理によって非複製にすることは、プロバイオティクスの健康上の利益の損失をもたらさず、それとは反対に、既にある健康上の利益を増強させ、健康上の新たな利益さえ生じさせ得ることを、本発明者らは驚いたことに今や見出した。
【００５８】
したがって、本発明の一実施形態は、非複製プロバイオティクス微生物が加熱処理によって非複製とされた組成物である。
【００５９】
このような加熱処理は、少なくとも７１．５℃で少なくとも１秒間行い得る。
【００６０】
長時間加熱処理又は短期間加熱処理を行い得る。
【００６１】
今日の工業規模において、通常、ＵＨＴ様加熱処理などの短期間加熱処理が好ましい。この種の加熱処理は細菌負荷を減少させ、処理時間を短縮し、それによって栄養素が損なわれることを減少させる。
【００６２】
高温で短時間加熱処理されたプロバイオティクス微生物が、それらの当初の特性に関わらず抗炎症性免疫プロファイルを示すことを本発明者らは初めて示す。特に、この加熱処理によって、新規な抗炎症性プロファイルが発生し、又は既にある抗炎症性プロファイルが増強される。
【００６３】
したがって、たとえ生きた対応物が抗炎症性菌株でなくても、典型的な産業上利用可能な加熱処理に相当する特定の加熱処理パラメーターを使用することによって、抗炎症性免疫プロファイルを有する非複製プロバイオティクス微生物を生じさせることは今や可能である。
【００６４】
したがって、例えば、加熱処理は、約１〜１２０秒間の約７１．５〜１５０℃の高温処理でもよい。高温処理は、高温／短時間（ＨＴＳＴ）処理又は超高温（ＵＨＴ）処理でもよい。
【００６５】
プロバイオティクス微生物は、約１〜１２０秒の短期間、約７１．５〜１５０℃の高温処理に曝し得る。
【００６６】
より好ましくは、微生物は、約１〜３０秒の短期間、約９０〜１４０℃、例えば９０°〜１２０℃の高温処理に曝し得る。
【００６７】
この高温処理によって、微生物は少なくとも部分的に非複製となる。
【００６８】
高温処理は通常の大気圧で行い得るが、また高圧下で行い得る。典型的な圧力範囲は、１〜５０バール、好ましくは１〜１０バール、さらにより好ましくは２〜５バールである。明らかに、熱が加えられるとき、プロバイオティクスは、液体又は固体である培地中で加熱処理されることが好ましい。したがって、加えられる理想的な圧力は、微生物がその中に供給される組成物の性質及び使用される温度によって決まる。
【００６９】
高温処理は、約７１．５〜１５０℃、好ましくは約９０〜１２０℃、さらにより好ましくは約１２０〜１４０℃の温度範囲で行い得る。
【００７０】
高温処理は、約１〜１２０秒、好ましくは、約１〜３０秒、さらにより好ましくは約５〜１５秒の短期間で行い得る。
【００７１】
この所与の時間枠は、プロバイオティクス微生物が所与の温度に曝される時間を意味する。微生物がその中に供給される組成物の性質及び量によって、及び使用する加熱装置の構造によって、熱を加える時間は変化し得ることに留意されたい。
【００７２】
しかし典型的には、本発明の組成物及び／又は微生物を、高温短時間（ＨＴＳＴ）処理、瞬間殺菌又は超高温（ＵＨＴ）処理によって処理する。
【００７３】
ＵＨＴ処理は、組成物を短時間、概ね１〜１０秒間、乳中の細菌胞子を殺すのに必要とされる温度である１３５℃（２７５°Ｆ）を超える温度で加熱することによる組成物の少なくとも部分殺菌を伴う、超高温加工又は超加熱処理（両方とも、ＵＨＴと省略）である。例えば、１３５℃を超える温度を使用してこのように乳を加工することは、必要な保持時間（２〜５秒まで）で細菌負荷の減少を可能にし、それによって連続流れ操作が可能となる。
【００７４】
２つの主要なタイプのＵＨＴシステム（直接及び間接システム）がある。直接システムにおいて、製品を蒸気噴射又は蒸気注入によって処理し、一方では間接システムにおいて、製品を、プレート熱交換器、チューブ式熱交換器又はかき取り式熱交換器を使用して加熱処理する。ＵＨＴシステムの組合せは、製品調製の工程において、任意のステップで又は複数のステップで適用し得る。
【００７５】
ＨＴＳＴ処理は、下記のように定義される（高温／短時間）：乳中の生存している微生物の数の９９．９９９９％を殺す、５対数の減少を達成するように設計される殺菌法。これはほぼ全ての酵母、カビ及び一般の腐敗細菌を破壊するのに適当であると考えられ、一般の耐熱性の病原生物の適当な破壊をまた確実なものとする。ＨＴＳＴ工程において、乳を７１．７℃（１６１°Ｆ）に１５〜２０秒間加熱する。
【００７６】
瞬間殺菌は、果汁及び野菜汁、ビール及び乳製品などの腐敗しやすい飲料の加熱殺菌の方法である。腐敗微生物を殺し、製品をより安全なものとし、それらの保存寿命を延ばすために、瞬間殺菌は容器への充填の前に行う。液体は、７１．５℃（１６０°Ｆ）〜７４℃（１６５°Ｆ）の温度に約１５〜３０秒間曝される間、制御された連続流に流入する。
【００７７】
本発明の目的のために、「短時間高温処理」という用語には、例えば、高温短時間（ＨＴＳＴ）処理、ＵＨＴ処理、及び瞬間殺菌が含まれる。
【００７８】
このような加熱処理は改善された抗炎症性プロファイルを有する非複製プロバイオティクスを実現するため、本発明の組成物は、炎症性障害の予防又は治療において用い得る。
【００７９】
本発明の組成物によって治療又は予防することができる炎症性障害は、特に限定されない。例えば、これらは、急性炎症（敗血症など）；火傷；及び慢性炎症（炎症性腸疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、嚢炎など）；壊死性腸炎；皮膚炎（ＵＶ又は化学物質が誘発する皮膚炎、湿疹、反応性皮膚など）；過敏性腸症候群；眼炎；アレルギー、喘息；並びにこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【００８０】
長時間加熱処理が使用されてプロバイオティクス微生物を非複製とする場合、このような加熱処理は、約７０〜１５０℃の温度範囲で約３分〜２時間、好ましくは８０〜１４０℃の範囲で５分〜４０分行い得る。
【００８１】
長時間加熱処理によって非複製とされた細菌が通常、それらのプロバイオティクス特性の発揮に関して生細胞より効率的でないことを従来技術は一般に教示する一方で、加熱処理されたプロバイオティクスが、生きた対応物と比較して免疫系を刺激することにおいて優れていることを本発明者らは示すことができた。
【００８２】
本発明はまた、少なくとも約７０℃での少なくとも約３分間の加熱処理によって非複製とされたプロバイオティクス微生物を含む組成物に関する。
【００８３】
非複製プロバイオティクスの免疫ブースト作用は、インビトロの免疫プロファイリングによって確認された。使用されたインビトロモデルは、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカインのプロファイリングを使用し、当技術分野で免疫調節性化合物の試験のための標準モデルとしてよく受け入れられている（Ｓｃｈｕｌｔｚら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０、１６５〜１７３；Ｔａｙｌｏｒら、２００６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ、３６、１２２７〜１２３５；Ｋｅｋｋｏｎｅｎら、２００８、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４、１１９２〜１２０３）。
【００８４】
インビトロのＰＢＭＣアッセイは、幾人かの著者／研究チームによって使用され、例えば、プロバイオティクスの免疫プロファイル、すなわち、プロバイオティクスの抗炎症性又は炎症誘発性の特徴によってプロバイオティクスが分類されてきた（Ｋｅｋｋｏｎｅｎら、２００８、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４、１１９２〜１２０３）。例えば、このアッセイによって、大腸炎のマウスモデルにおけるプロバイオティクス候補の抗炎症作用の予測を可能にすることが示されてきた（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。さらに、このアッセイは、臨床試験における読み出し情報として定期的に使用され、臨床成績と首尾一貫する結果をもたらすことが示された（Ｓｃｈｕｌｔｚら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０、１６５〜１７３；Ｔａｙｌｏｒら、２００６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ、３６、１２２７〜１２３５）。
【００８５】
アレルギー性疾患は過去数十年に亘り着実に増加してきており、ＷＨＯは、アレルギー性疾患を流行病と現在考えている。一般的に、アレルギーは、免疫系のＴｈ１及びＴｈ２応答の間のアンバランスに起因し、Ｔｈ２メディエーターの産生への強力な偏りをもたらすと考えられている。したがって、免疫系のＴｈ１及びＴｈ２アームの間の適切なバランスを回復することによって、アレルギーを軽減、ダウンレギュレート又は予防することができる。これは、Ｔｈ２応答を減少させ、又は少なくとも一時的に、Ｔｈ１応答を増強する必要性を意味する。後者は、例えばより高いレベルのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２を伴うことが多い免疫ブースト反応の特徴であろう。（Ｋｅｋｋｏｎｅｎら、２００８、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４、１１９２〜１２０３；Ｖｉｌｊａｎｅｎ  Ｍ．ら、２００５、Ａｌｌｅｒｇｙ、６０、４９４〜５００）
【００８６】
したがって、本発明の組成物は、欠陥のある免疫防御と関連する障害を治療又は予防することを可能とする。
【００８７】
結果的に、本発明の組成物によって治療又は予防することができる欠陥のある免疫防御と関連している障害は、特に限定されない。
【００８８】
例えば、これらの障害は、感染症、特に、細菌、ウイルス、真菌及び／又は寄生虫の感染症；食細胞欠損；ストレス又は免疫抑制薬、化学療法又は放射線療法によって誘発されるものなどの低いレベルから重症レベルまでの免疫抑制；新生児の免疫系などのより免疫適格性ではない免疫系の自然状態；アレルギー；並びにこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【００８９】
本発明に記載する組成物はまた、ワクチン、特に経口ワクチンへの患者の反応の増強を可能とする。
【００９０】
任意の量の非複製微生物が有効である。しかし、プロバイオティクスの少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的には全てが非複製である場合が一般に好ましい。
【００９１】
本発明の一実施形態において、全ての微生物は、非複製である。
【００９２】
結果的に、本発明の組成物において、プロバイオティクスの少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的には全ては、非複製でもよい。
【００９３】
全てのプロバイオティクス微生物を、本発明の目的のために使用し得る。
【００９４】
例えば、プロバイオティクス微生物は、ビフィドバクテリウム属（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、プロピオニバクテリウム属（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、又はこれらの組合せ、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ジアセチラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブレッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び／又はこれらの混合物からなる群から選択し得る。
【００９５】
本発明による組成物は、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・ジョンソニーＬａ１、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９８３、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・ブルガリカスＮＣＣ１５、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７、又はこれらの組合せからなる群から選択されるプロバイオティクス微生物を含み得る。
【００９６】
全てのこれらの菌株は、ブダペスト条約により寄託されていたか、及び／又は市販である。
【００９７】
菌株を、ブダペスト条約の元で下記のように寄託した。
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１：ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５：ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８
ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０  ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５
ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８：ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４６
ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１：ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６
ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７：ＣＧＭＣＣ１．３７２４
ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９：ＣＮＣＭ  Ｉ−１４２２
ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０５９：ＣＮＣＭ  Ｉ−４１５３
ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７：ＣＮＣＭ  Ｉ−４１５４
ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６：ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８
ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ１８２５：ＡＣＡ−ＤＣ６００２
ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９：ＡＴＣＣ７００３９６
ラクトバチルス・ブルガリカスＮＣＣ１５：ＣＮＣＭ  Ｉ−１１９８
ラクトバチルス・ジョンソニーＬａ１  ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９８３  ＤＳＭ１７９８３
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０  ＡＴＣＣ５５７３０
エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅ１９１７：ＤＳＭ６６０１
【００９８】
本明細書に記載されている本発明の全ての特徴を、開示されているような本発明の範囲から逸脱することなく自由に合わせることができることを、当業者であれば理解するであろう。
【００９９】
本発明のさらなる利点及び特徴は、下記の実施例及び図から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】「短時間高温」で処理されたプロバイオティクスの抗炎症性免疫プロファイルの増強を示す。
【図１Ｂ】「短時間高温」で処理されたプロバイオティクスの抗炎症性免疫プロファイルの増強を示す。
【図２】「短時間高温」で処理された後、抗炎症性となった、すなわちインビトロで明白な抗炎症性免疫プロファイルを示す非抗炎症性プロバイオティクス菌株を示す。
【図３Ａ】「短時間高温」で処理された後、インビトロで増強した又は新規な抗炎症性免疫プロファイルを示す、市販の製品中で使用されているプロバイオティクス菌株を示す。
【図３Ｂ】「短時間高温」で処理された後、インビトロで増強した又は新規な抗炎症性免疫プロファイルを示す、市販の製品中で使用されているプロバイオティクス菌株を示す。
【図４Ａ】高温での加熱処理によって、インビトロで増強した又は新規な抗炎症性免疫プロファイルを示す、乳製品スターター菌株（すなわち、Ｌｃ１スターター菌株）を示す。
【図４Ｂ】高温での加熱処理によって、インビトロで増強した又は新規な抗炎症性免疫プロファイルを示す、乳製品スターター菌株（すなわち、Ｌｃ１スターター菌株）を示す。
【図５】ＨＴＳＴ処理で処理された後に、インビトロで抗炎症性免疫プロファイルを示す、非抗炎症性プロバイオティクス菌株を示す。
【図６】生菌及び加熱処理された（１４０℃、１５秒間）形態の、プロバイオティクス及び乳製品スターター菌株によって生じた、ＰＢＭＣデータ上の主成分分析（ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０）。各点は、そのＮＣＣ番号又は名称によって同定される、生菌又は加熱処理された１つの菌株を表す。
【図７】生菌株及び加熱処理された（８５℃、２０分）菌株のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比を示す。全体的に、８５℃での２０分間の加熱処理は、本発明の「短時間高温」処理とは対照的に、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比の増加をもたらす（図１、２、３、４及び５）。
【図８】加熱処理された細菌で刺激されたヒトＰＢＭＣからの、インビトロのサイトカイン分泌の増強を示す。
【図９】食塩水で誘発したＯＶＡ感作マウス（陰性対照）、ＯＶＡで誘発したＯＶＡ感作マウス（陽性対照）、及びＯＶＡで誘発し、加熱処理された又は生菌のビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０で処理したＯＶＡ感作マウスにおいて観察した下痢の激しさの割合を示す。結果を、下痢の激しさ（４つの独立の実験から計算した平均±ＳＥＭ）の割合として示し、１００％の下痢の激しさは、陽性対照（アレルゲンによって感作及び誘発された）群において発生した症状に相当する。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
方法
細菌調製物：
生きたプロバイオティクスによってもたらされる宿主の免疫系に対する健康上の利益は一般に、菌株特異的であると考えられる。高レベルのＩＬ−１０及び／又は低レベルの炎症促進性サイトカインをインビトロで誘発するプロバイオティクス（ＰＢＭＣアッセイ）は、インビボで強力な抗炎症性菌株であることが示されてきた（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。
【０１０２】
いくつかのプロバイオティクス菌株を使用して、加熱処理されたプロバイオティクスの抗炎症性特性を調査した。これらは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）、及びエシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅであった。Ｎｅｓｔｌｅ  Ｌｃ１発酵製品を生産するために商業的に使用されるいくつかの菌株を含めたいくつかのスターター培養菌株（ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・ブルガリカスＮＣＣ１５及びラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７）もまた試験した。
【０１０３】
細菌細胞は、５〜１５Ｌのバイオリアクター中で各菌株について最適化した条件で培養した。全ての典型的な細菌増殖培地が使用可能である。このような培地は、当業者には公知である。ｐＨを５．５に調節したとき、３０％塩基溶液（ＮａＯＨ又はＣａ（ＯＨ）２）を連続的に加えた。適当であるとき、ヘッドスペースをＣＯ２でガス処理することによって嫌気性条件を維持した。エシェリキア・コリを、標準的な好気条件下で培養した。
【０１０４】
細菌細胞を、遠心分離（５，０００×ｇ、４℃）によって集め、概ね１０９〜１０１０ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度に達するように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に適当な容量で再懸濁させた。調製物の一部を、−８０℃で１５％グリセロールと共に冷凍した。別の部分の細胞を、以下によって加熱処理した。
超高温：１４０℃、１５秒間；間接蒸気噴射による。
高温短時間（ＨＴＳＴ）：７４℃、９０℃及び１２０℃、１５秒間、間接蒸気噴射による。
水浴中で長時間低温（８５℃、２０分）。
加熱処理した上で、試料を使用するまで−８０℃で冷凍して保持した。
【０１０５】
細菌調製物のインビトロ免疫プロファイリング：
生細菌調製物及び加熱処理された細菌調製物の免疫プロファイル（すなわち、インビトロでヒト血液細胞からの特定のサイトカインの分泌を誘発する能力）を評価した。ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、血液フィルターから単離した。細胞密度勾配による分離の後、単核細胞を集め、ハンクス平衡塩類溶液で２度洗浄した。次いで、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ｐａｒｉｓ、ｆｒａｎｃｅ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）で補充したＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させた。次いで、ＰＢＭＣ（７×１０５細胞／ウェル）を、生細菌及び加熱処理された細菌（７×１０６当量ｃｆｕ／ウェル）と共に４８ウェルプレート中で３６時間インキュベートした。生細菌及び加熱処理された細菌の作用を、２つの別々の実験に分割した８人の個々のドナーからのＰＢＭＣ上で試験した。３６時間のインキュベーション後、培養プレートを冷凍し、サイトカイン測定まで−２０℃で保持した。サイトカインプロファイリングは、生細菌及びそれらの加熱処理された対応物について並行（すなわち、ＰＢＭＣの同じバッチ上の同じ実験で）で行った。
【０１０６】
３６時間のインキュベーション後の細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０）のレベルは、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡによって決定した（Ｒ＆Ｄ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１０、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ１２ｐ４０、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦα、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ）。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αは、炎症促進性サイトカインであり、一方では、ＩＬ−１０は、強力な抗炎症メディエーターである。結果は、４人の個々のドナーの平均（ｐｇ／ｍｌ）＋／−ＳＥＭとして表すが、各々４人のドナーで行う２つの個々の実験の代表である。ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、各菌株についてインビボの抗炎症作用の予測値として計算する（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。
【０１０７】
各菌株についてのＥＬＩＳＡ（上記を参照されたい）によって決定したサイトカインの数値（ｐｇ／ｍｌ）を、ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ  ｖ５．１０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ、Ｓｉｎｔ−Ｍａｒｔｅｎｓ−Ｌａｔｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に移した。主成分分析（ＰＣＡ、ディメンショニング技術）を、このセットのデータで行った。数値についての平均の引き算、及び数値についての分散値による割り算を、主成分分析に含めた。
【０１０８】
結果
超高温（ＵＨＴ）／高温短時間（ＨＴＳＴ）様処理によって生じた抗炎症性プロファイル
調査中のプロバイオティクス菌株を、一連の加熱処理（超高温（ＵＨＴ）、高温短時間（ＨＴＳＴ）及び８５℃、２０分間）に曝し、それらの免疫プロファイルを、インビトロでの生細胞の免疫プロファイルと比較した。生きた微生物（プロバイオティクス及び／又は乳製品スターター培養物）は、ヒトＰＢＭＣと共にインキュベートしたとき、異なるレベルのサイトカイン産生を誘発した（図１、２、３、４及び５）。これらの微生物の加熱処理は、温度依存的態様でＰＢＭＣによって産生されたサイトカインのレベルを変更させた。「短時間高温」処理（１２０℃又は１４０℃、１５秒間）は、抗炎症性免疫プロファイルを有する非複製細菌を生じさせた（図１、２、３及び４）。実際に、ＵＨＴ様処理した菌株（１４０℃、１５秒）は、さらなるＩＬ−１０産生を維持又は誘発する一方で、より少ない炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０）を誘発した（生きた対応物と比較して）。このように得られたＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、生細胞と比較して、任意のＵＨＴ様処理した菌株についてより低かった（図１、２、３及び４）。この観察はまた、ＨＴＳＴ様処理によって処理された、すなわち１２０℃に１５秒間（図１、２、３及び４）、又は７４℃及び９０℃に１５秒間（図５）曝露された細菌について有効であった。加熱処理（ＵＨＴ様又はＨＴＳＴ様処理）は、プロバイオティクス菌株（図１、２、３及び５）及び乳製品スターター培養物（図４）のインビトロの免疫プロファイルに対して同様の作用を有した。生きたプロバイオティクス及び加熱処理された（１４０℃、１５秒）プロバイオティクス並びに乳製品スターター菌株によって産生されたＰＢＭＣデータ上の主成分分析によって、生菌株はｘ軸に沿って至る所に分布することが明らかになったが、これは菌株が非常に異なる免疫プロファイルをインビトロで示すことを例示する（低（左側）から高（右側）までの炎症促進性サイトカインの誘発物質）。加熱処理された菌株はグラフの左側上に集まり、炎症促進性サイトカインは加熱処理された菌株によってより少なく誘発されることが示される（図６）。対照的に、２０分間８５℃で加熱処理された細菌は、生細胞よりもより多く炎症促進性サイトカインを、及びより少なくＩＬ−１０を誘発し、より高いＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比がもたらされた（図７）。
【０１０９】
抗炎症性プロファイルは、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様処理によって増強又は生じる。
【０１１０】
ＵＨＴ及びＨＴＳＴ処理された菌株は、それらの各々の当初の免疫プロファイルに関わらず（生細胞）、抗炎症性プロファイルを示す。インビボで抗炎症性であることが公知であり、インビトロで抗炎症性プロファイルを示すプロバイオティクス菌株（ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８）は、「短時間高温」処理後に、増強された抗炎症性プロファイルをインビトロで示すことが示された。図１に示すように、ＵＨＴ様処理されたビフィドバクテリウム属菌株のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、生きた対応物のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比より低く、したがって、ＵＨＴ様処理された試料の改善された抗炎症性プロファイルが示された。より顕著には、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様処理によって抗炎症性プロファイルが生じたことは、非抗炎症性の生菌株についてまた確認された。生菌のラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７及びラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１の両方は、高いＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比をインビトロで示す（図２及び５）。２つの生菌株は、マウスにおいてＴＮＢＳが誘発する大腸炎に対して保護性でないことが示された。ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７及びラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１によって誘発されたＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、「短時間高温」処理（ＵＨＴ又はＨＴＳＴ）後に劇的に減少し、ビフィドバクテリウム属菌株で得られたＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比と同じぐらい低いレベルに達した。これらの低いＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、ＩＬ−１０分泌についての変化なし（ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７）又は劇的な誘発（ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１）と合わせて、低レベルのＩＬ−１２ｐ４０産生によるものである（図２）。
【０１１１】
結果として、
生きた微生物の抗炎症性プロファイルは、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様加熱処理によって増強させることができ（例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８）、
抗炎症性プロファイルは、非抗炎症性の生きた微生物（例えば、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、乳製品スターターであるストレプトコッカス・サーモフィルスＮＣＣ２０１９）からＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様加熱処理によって生じさせることができ、
抗炎症性プロファイルはまた、プロバイオティクスのエシェリキア・コリ菌株を含めた市販の製品から単離した菌株について示された（図３Ａ及びＢ）。
【０１１２】
ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理の影響は、全ての試験したプロバイオティクス及び乳製品スターター、例えば、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属及びストレプトコッカス属について同様であった。
【０１１３】
ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理を、異なるインビトロの免疫プロファイルを示すいくつかのラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属及びストレプトコッカス属に適用した。全ての菌株は、ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理後に、生きた対応物より低い炎症促進性サイトカインを誘発した（図１、２、３、４、５及び６）が、これはこのように得られた非複製細菌の免疫特性に対するＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理の作用が、全てのプロバイオティクス、特にラクトバチルス属及びビフィドバクテリウム属及び特定のエシェリキア・コリ菌株、及び全ての乳製品スターター培養物、特にストレプトコッカス属、ラクトコッカス属及びラクトバチルス属に一般化することができることを示す。
【０１１４】
実施例２
方法
細菌調製物：
５種のプロバイオティクス菌株を使用して、非複製プロバイオティクスの免疫ブースト特性を調査した。３種のビフィドバクテリウム属（ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０）及び２種のラクトバチルス属（ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７）。
【０１１５】
バッチ発酵において細菌細胞を、ｐＨ制御なしで、ＭＲＳ上で３７℃にて１６〜１８時間増殖させた。細菌細胞を遠心分離（５，０００×ｇ、４℃）し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させ、その後概ね１０Ｅ１０ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度に達するように食塩水に希釈した。ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７を、水浴中にて８５℃で２０分間加熱処理した。ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０を、水浴中にて９０℃で３０分間加熱処理した。加熱処理された細菌の懸濁液を分取し、使用するまで−８０℃で冷凍保存した。生細菌は、使用するまで−８０℃でＰＢＳ−グリセロール１５％中に保存した。
【０１１６】
細菌調製物のインビトロの免疫プロファイリング
生細菌調製物及び加熱処理された細菌調製物の免疫プロファイル（すなわち、インビトロで、ヒト血液細胞から特定のサイトカインの分泌を誘発する能力）を評価した。ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、血液フィルターから単離した。細胞密度勾配による分離後に、単核細胞を集め、ハンクス平衡塩類溶液で２度洗浄した。次いで、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ｐａｒｉｓ、ｆｒａｎｃｅ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させた。次いで、ＰＢＭＣ（７×１０５の細胞／ウェル）を、生細菌及び加熱処理された細菌（７×１０６当量ｃｆｕ／ウェル）と共に４８ウェルプレート中で３６時間インキュベートした。生細菌及び加熱処理された細菌の作用を、２つの別々の実験に分割した、８人の個々のドナーからのＰＢＭＣ上で試験した。３６時間のインキュベーション後、培養プレートを冷凍し、サイトカイン測定まで−２０℃で保持した。サイトカインプロファイリングを、生細菌及びそれらの加熱処理された対応物について並行で行った（すなわち、ＰＢＭＣの同じバッチでの同じ実験において）。
【０１１７】
３６時間のインキュベーション後の細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０）のレベルを、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１０、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ１２ｐ４０、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ）によって決定した。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αは、炎症促進性サイトカインであり、一方ＩＬ−１０は、強力な抗炎症メディエーターである。結果を、４人の個々のドナーの平均（ｐｇ／ｍｌ）＋／−ＳＥＭとして表すが、各々４人のドナーで行う２つの個々の実験の代表である。
【０１１８】
アレルギー性下痢症の予防における、生菌のビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０及び加熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０のインビボ作用
アレルギー性下痢症のマウスモデルを使用して、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０のＴｈ１促進作用を試験した（Ｂｒａｎｄｔ  Ｅ．Ｂら、ＪＣＩ２００３；１１２（１１）：１６６６〜１６６７）。感作（１４日の間隔で、オボアルブミン（ＯＶＡ）及び硫酸アルミニウムカリウムの２回の腹腔内注射；０日目及び１４日目）後に、雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、６回（２７日目、２９日目、３２日目、３４日目、３６日目、３９日目）ＯＶＡで経口的に誘発し、一過的臨床症状（下痢症）及び免疫パラメーターの変化（総ＩｇＥ、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ、マウス肥満細胞プロテアーゼ１、すなわち、ＭＭＣＰ−１の血漿濃度）がもたらされた。生菌のビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０又は９０℃で３０分間加熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０を、ＯＶＡ感作の４日前に（−３日目、−２日目、−１日目、０日目及び１１日目、１２日目、１３日目及び１４日目）、並びに誘発期間の間に（２３〜３９日目）、胃管栄養法によって投与した。概ね１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）又は当量ｃｆｕ／マウスの１日当たり細菌量を使用した。
【０１１９】
結果
加熱処理後の「炎症誘発性」サイトカインの分泌の誘発
加熱処理された菌種がヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）によるサイトカイン分泌を刺激する能力をインビトロで評価した。加熱処理された細菌によるＰＢＭＣの刺激による４つのサイトカインに基づいた免疫プロファイルを、同じインビトロアッセイにおいて生細菌細胞によって誘発される免疫プロファイルと比較した。
【０１２０】
加熱処理された調製物をプレーティングし、生菌数が存在しないことについて評価した。加熱処理された細菌調製物は、プレーティング後にコロニーを産生しなかった。
【０１２１】
生きたプロバイオティクスは、ヒトＰＢＭＣと共にインキュベートされるときに、異なるレベル及び菌株依存レベルのサイトカイン産生を誘発した（図８）。プロバイオティクスの加熱処理は、生きた対応物と比較すると、ＰＢＭＣによって産生されるサイトカインのレベルを変更した。加熱処理された細菌は、生きた対応物よりも炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０）をより誘発した。対照的に、加熱処理された細菌は、生細胞と比較して同様又はより低い量のＩＬ−１０を誘発した（図８）。加熱処理された細菌が生きた対応物よりも免疫系をより刺激することができ、したがって弱体化した免疫防御をよりブーストできることをこれらのデータは示す。すなわち、インビトロデータは、加熱処理後の菌種の増強された免疫ブースト作用を例示する。
【０１２２】
（生細胞と比較した）加熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０の、免疫系に対する増強された作用を例示するために、生菌のビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０（菌株Ａ）及び加熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０（菌株Ａ）の両方を、アレルギー性下痢症の動物モデルにおいて試験した。
【０１２３】
陽性対照群と比較して、下痢の激しさは、加熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０による処理後に有意に及び一貫して減少（４１．１％±４．８）し、一方では下痢の激しさは、生菌のビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０による処理後に２０±２８．３％のみ低下した。加熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０が、その生きた対応物よりアレルギー性下痢に対して増強された保護作用を示すことをこれらの結果は示す（図９）。
【０１２４】
結果として、プロバイオティクスが免疫防御を増強する能力は、加熱処理の後に改善することが示された。
【０１２５】
実施例３
下記の配合物を調製し得る。
【０１２６】
【表１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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