(57)【要約】インターフェロン分子の部位特異的標識の方法が提供される。当該方法は、（ａ）アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分を含む標識分子を準備する工程と；（ｂ）Ｃ末端ヒドラジド部分を有するインターフェロン分子を準備する工程と；（ｃ）当該ＰＥＧ部分のアルデヒドまたはケトン部分を当該インターフェロン分子のＣ末端ヒドラジドと反応させて、標識されたインターフェロン分子を形成する工程であって、この標識されたインターフェロン分子は、ヒドラゾン結合を介して当該インターフェロン分子のＣ末端に結合されたＰＥＧ部分を含む、工程と、を含む。このような方法を使用して標識されたインターフェロン分子も記載される。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン分子の部位特異的標識の方法であって、
（ａ）標識分子を準備する工程であって、前記標識分子はアルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分を含む、工程と；
（ｂ）インターフェロン分子を準備する工程であって、前記インターフェロン分子はＣ末端ヒドラジド部分を有する、工程と；
（ｃ）前記ＰＥＧ部分の前記アルデヒドまたはケトン部分を前記インターフェロン分子の前記Ｃ末端ヒドラジドと反応させて、標識されたインターフェロン分子を形成する工程であって、前記標識されたインターフェロン分子は、ヒドラゾン結合を介して前記インターフェロン分子のＣ末端に結合されたＰＥＧ部分を含む、工程と、
を含む方法。
【請求項２】
アルデヒドまたはケトン部分を有する前記ＰＥＧ部分は、α−ジケトンまたはα−ケト−アルデヒド基を有するＰＥＧ部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルデヒドまたはケトン部分を有する前記ＰＥＧ部分は、オキソカルボキシレート残基を有するＰＥＧ部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アルデヒドまたはケトン部分は芳香族ケトンまたは芳香族アルデヒド部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オキソカルボキシレート残基は、ピルボイル基である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）のＣ末端ヒドラジド部分を有する前記インターフェロン分子は、ヒドラジンと前駆体分子との反応によって生成され、前記前駆体分子は、チオエステル部分を介して、Ｎ末端でインテインドメインに融合された前駆体インターフェロン分子を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヒドラジンと前駆体分子との反応によって生成される工程（ｂ）のＣ末端ヒドラジド部分を有する前記インターフェロン分子は、再折り畳み工程または再折り畳み剤なしに、直接、折り畳まれたタンパク質として生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記前駆体分子は、少なくとも０．１ｍＭのキレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で、ヒドラジンとの反応に供される、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記インターフェロン分子は、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮα２ｂ分子、または配列番号１と少なくとも６０％の配列相同性を有するその断片もしくは誘導体である、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インターフェロン分子はＩＦＮα２ｂである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インターフェロン分子は、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮβ１ｂ分子、または配列番号２と少なくとも６０％の配列相同性を有するその断片もしくは誘導体である、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記インターフェロン分子はＩＦＮβ１ｂである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識されたインターフェロン分子は、対応するＰＥＧ化されていないインターフェロン分子の抗ウイルス活性の４０％を超える抗ウイルス活性を有する、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子であって、前記ＰＥＧ部分は、ヒドラゾン結合、または還元されたヒドラゾン結合を介して前記インターフェロン分子のＣ末端に結合されている、Ｃ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子。
【請求項１５】
前記インターフェロン分子は、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮα２ｂ分子、または配列番号１と少なくとも６０％の配列相同性を有するその断片もしくは誘導体である、請求項１４に記載のＣ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子。
【請求項１６】
前記インターフェロン分子はＩＦＮα２ｂである、請求項１５に記載のＣ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子。
【請求項１７】
前記インターフェロン分子は、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮβ１ｂ分子、または配列番号２と少なくとも６０％の配列相同性を有するその断片もしくは誘導体である、請求項１４に記載のＣ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子。
【請求項１８】
前記インターフェロン分子はＩＦＮβ１ｂである、請求項１７に記載の分子Ｃ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子。
【請求項１９】
前記ＰＥＧ分子は、９ｋＤａ〜１２ｋＤａの範囲の質量、例えば約１０ｋＤａの質量の線状ＰＥＧ分子である、請求項１４から請求項１８のいずれか１項に記載のＣ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子。
【請求項２０】
必要とする患者において、インターフェロン処置が有用でありうる病状を処置する方法であって、請求項１４から請求項１９のいずれか１項に記載のＰＥＧ化されたインターフェロンまたは請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法に従って製造されるＰＥＧ化されたインターフェロンを投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記病状は、癌、ＩＤＤＭ、Ｃ型肝炎、多発性硬化症、自己免疫障害、およびウイルス性症状からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
医薬における使用のための、請求項１４から請求項１９のいずれか１項に記載のＰＥＧ化されたインターフェロンまたは請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法に従って製造されるＰＥＧ化されたインターフェロン。
【請求項２３】
癌、ＩＤＤＭ、Ｃ型肝炎、多発性硬化症、自己免疫障害、またはウイルス性症状の処置のための、請求項１４から請求項１９のいずれか１項に記載のＰＥＧ化されたインターフェロンまたは請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法に従って製造されるＰＥＧ化されたインターフェロン。
【請求項２４】
癌、ＩＤＤＭ、Ｃ型肝炎、多発性硬化症、自己免疫障害、またはウイルス性症状の処置のための医薬の調製における、請求項１４から請求項１９のいずれか１項に記載のＰＥＧ化されたインターフェロンまたは請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法に従って製造されるＰＥＧ化されたインターフェロンの使用。
【請求項２５】
請求項１４から請求項１９のいずれか１項に記載のＰＥＧ化されたインターフェロンまたは請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法に従って製造されるＰＥＧ化されたインターフェロンを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
実質的に、図１〜１１のうちの１以上を参照して本願明細書に記載されたとおりの標識されたインターフェロン分子を製造する方法。
【請求項２７】
実質的に、図１〜１１のうちの１以上を参照して本願明細書に記載されたとおりのＣ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ペプチド、タンパク質などの部位特異的修飾の方法に関する。特に本願は、インターフェロンなどのタンパク質をＰＥＧで標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質治療法は、癌から代謝障害および自己免疫疾患の範囲にわたる様々な症状のために有効な処置として現れたが、この組み換えタンパク質治療法は、一般に、その薬物動態および免疫原性によって限定される。その結果として、これらを克服するために、グリコシル化、アルブミンの結合、環化およびＰＥＧ化を含めたいくつかの戦略が開発されてきた。タンパク質のグリコシル化は、（１種または複数種の）炭水化物の結合であり、これは、タンパク質の安定性を支援する可能性があり、かつタンパク質分解および免疫認識からの何らかの防御を与える可能性がある（非特許文献１）。ヒトアルブミンは、血液循環において最も一般的な血清タンパク質であり、約１９日という稀な長い半減期を有する。その結果として、タンパク質のＮまたはＣ末端へのアルブミンの遺伝子融合は、十分に耐容性があり、得られた融合タンパク質は著しく増大した半減期を有する（非特許文献２）。
【０００３】
ＰＥＧ化、つまりポリエチレングリコールの共有結合による結合（非特許文献３）は、ほぼ間違いなく、タンパク質の薬物動態を改良するために最も広く使用され受け容れられている方法である。ＰＥＧは、低い多分散性をもつ広い範囲の分子量で入手できる、繰り返し単位（−Ｃ２Ｈ３−Ｏ−）ｎに基づくポリマーであり、線状および分岐状のどちらであることもできる。ＰＥＧの高い柔軟性および水和は、ＰＥＧが、大きい流体力学半径を有して、ＰＥＧが結合されるタンパク質のサイズを著しく増大させ、その結果としてＰＥＧの腎臓クリアランスを著しく減少させるということを意味する。加えて、潜在的に免疫原性のエピトープおよびプロテアーゼ切断部位は隠され、それぞれ免疫原性およびタンパク質分解を低下させる。さらには、ＰＥＧ化によって、タンパク質の溶解性および安定性を実質的に改善することができる。
【０００４】
しかしながら、ＰＥＧ化についての公知の方法は、タンパク質求核剤、例えばリジン側鎖にあるアミノ基によるアシル化またはアルキル化を受ける求電子的なＰＥＧ誘導体を使用するので、一般に部位選択的ではない（非特許文献４）。これは、１つのＰＥＧ分子がいくつかの異なる部位でタンパク質に結合されて異なる位置異性体を生成する、不均一なタンパク質調製物を生成することが多い。タンパク質内のいくつかの位置で、ＰＥＧの結合は、受容体の結合を阻止するかまたは妨げる。加えて、いくつかのＰＥＧ分子が同じタンパク質に異なる部位で結合されている、多ＰＥＧ化された種も存在する可能性がある。その結果として、ＰＥＧ化されたタンパク質調製物の全活性は、非修飾のタンパク質に比べて低下する。結果として、部位特異的タンパク質ＰＥＧ化のための方法に対するニーズがある；タンパク質配列内の明確な位置で単独のＰＥＧ部分を組み込むことによって、非選択的なＰＥＧ化（すなわち、多数のＰＥＧの位置異性体を含有する調製物）に関連する有害な効果は克服される可能性がある。
【０００５】
標識をタンパク質に部位特異的な様式で導入するために用いられる最も一般的な方法は、特有のフリーのシステインを修飾のための位置で一次配列に導入することである。次いで、このフリーのシステインのスルフヒドリル側鎖は、標識のマレイミド誘導体と反応して部位特異的修飾をもたらす。しかしながら、このためには、その一次配列内のすべての他の天然に存在するフリーのシステインが、アミノ酸変異誘発を通して取り除かれることが必要である。加えて、タンパク質が天然にジスルフィド結合を含有する場合は、その分子内に余分なシステインを付加することは、そのタンパク質の正しい折り畳みを妨げる可能性がある。
【０００６】
結果として、タンパク質の部位特異的ＰＥＧ化のために他のアプローチが検討されてきた。非特許文献５は、ＰＥＧ−チオエステルと標的タンパク質上のＮ末端システインとの間の未変性の化学的ライゲーションによって、ＰＥＧをタンパク質のＮ末端に結合することを記載する。これは、すでに存在していなければ、タンパク質の配列にＮ末端システインを付加することを必要とするが、この付加はシステイン含有タンパク質におけるタンパク質の折り畳みを妨げる可能性がある。非特許文献６は、α−アミノＮ末端アミンだけが反応性である酸性条件下での（リジン残基のε−アミノ基よりも低いｐｋａを参照）、ＰＥＧアルデヒドを用いたタンパク質の還元的アルキル化によってＰＥＧをＮ末端に結合することを記載する（非特許文献６）。しかしながら、依然として、この方法を用いるといくらかのε−アミノＰＥＧ化が生じる可能性がある。ジスルフィド架橋へのＰＥＧの組み込みは、非特許文献７で示唆されている。これは、２つのシステインチオールを遊離させるためのジスルフィドの最初の還元、次いでＰＥＧが共有結合で結合されている３炭素架橋を与えるためのビスアルキル化を含む。しかしながら、このアプローチは、溶媒曝露のジスルフィド結合を含有するタンパク質に限定される。さらなる方法は、Ｅ．ｃｏｌｉの中で発現された組み換えタンパク質が酵素によってグリコシル化され、ＰＥＧがその天然のグリコシル化部位でグリカンを介して結合される、天然のグリコシル化部位でのＰＥＧ化である（非特許文献８）。このアプローチは、天然にグリコシル化されているタンパク質に限定される。非特許文献９は、チオ酸／アジドアミド化を介したタンパク質Ｃ末端ＰＥＧ化を記載する；この方法では、タンパク質はＶＭＡインテインＣＢＤ融合タンパク質として発現され、Ｎａ２Ｓを用いて加ヒドロチオール的に切断されてチオ酸を与え、次いでこのチオ酸は、ＰＥＧ−スルホンアジドと反応することができる。しかしながら、このチオ酸タンパク質は、標識反応の間に加水分解を受けて、そのタンパク質の標識されていないＣ末端カルボン酸誘導体を副生成物として与えるやすい。
【０００７】
非特許文献１０は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのタンパク質発現の間に、反応性の化学基を有する非天然のアミノ酸を組み込むことを記載する。この反応性の化学基によって、その後のＰＥＧ官能性の結合が可能にすることができる。これは、ユニークなコドン（例えば、中途終止コドン（ａｍｂｅｒ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｃｏｄｏｎ）、ＵＡＧ）およびＥ．ｃｏｌｉの中へと操作された対応する転移ＲＮＡ：アミノアシル−ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を使用して成し遂げられる。
【０００８】
特許文献１および特許文献２は、ウイルス感染症の処置のためのＰＥＧ化されたインターフェロンの使用を記載する。同様に、特許文献３は、ＰＥＧ化されたインターフェロンを記載する。しかしながら、これらの文献によってインターフェロンのＰＥＧ化について記載された方法は、部位特異的ではない。
【０００９】
現在、アデノシンデアミナーゼ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＩＦＮα２ａおよびＩＦＮα２ｂのＰＥＧ化されたバージョンを含めて９種のＰＥＧ化されたタンパク質治療法が治療用途用に承認されている（非特許文献１１）。
【００１０】
Ｃ型肝炎ウイルスの処置において試用され、かつ特定の癌における使用については臨床評価段階にある、２種の承認されたＩＦＮα２のＰＥＧ化されたバージョンがある（非特許文献１２）。Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）  （ホフマン・ラ・ロシュ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ））は、分岐状の４０ｋＤａ  ＰＥＧ−ＮＨＳに結合された組み換えＩＦＮα２ａである。これは、９種の位置的ＰＥＧ異性体を含む。しかしながら、これは、インビトロアッセイにおいて非ＰＥＧ化ＩＦＮα２ａのわずか７％の活性しか保持しない（非特許文献１３；非特許文献１４）。ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ（登録商標）  （シェリング・プラウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ））は、１４種の位置異性体（そのうちヒスチジン３４が４７．８％を構成する）を含む９５％モノＰＥＧ化タンパク質を生じる、単鎖の１２ｋＤａ  スクシンイミジルカーボネートＰＥＧに結合された、組み換えＩＦＮα２ｂである。ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ（登録商標）は、インビトロアッセイにおいて非ＰＥＧ化ＩＦＮα２ｂと比べて２８％抗ウイルス活性を保持する（非特許文献１５）。
【００１１】
Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）  （ＥＵではＢｅｔａｆｅｒｏｎ）（バイエル・シェリング・ファーマ（Ｂａｙｅｒ  Ｓｈｅｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａ））およびさらに最近のものではＥｘｔａｖｉａ（ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））は、多発性硬化症の処置において使用される組み換えＩＦＮβ１ｂタンパク質であり、これらは肝炎および特定の癌を含めた他の疾患の処置については臨床評価段階にある（非特許文献１６；非特許文献１７）。しかしながら、ＩＦＮβ１ｂに関する特定の問題は、ＩＦＮβ１ｂは、迅速に血液から除去され、このため、頻繁な投与管理体制が必要であるが、この頻繁な投与は注入部位で壊死を生じる可能性があり、そして患者の服薬率を下げる、ということである。中和抗体も１つの問題であり、１つの２年の研究において４５％の患者がこれら中和抗体を生成させた。現在、承認されたＰＥＧ化されたＩＦＮβ１ｂバージョンはない。しかしながら、これまでのこの領域における研究としては、非修飾のＩＦＮβ１ｂの２４〜３１％活性を有する５種の位置異性体の混合物を生じる第一級アミンのランダムＰＥＧ化、および（主に）Ｎ末端アミンのＰＥＧ化（３５％活性）が挙げられる。位置７９（天然のグリコシル化部位）またはＮもしくはＣ末端のいずれかにおける操作されたフリーのＣｙｓ残基を使用する部位特異的ＰＥＧ化の試みは、不十分な部位特異的結合のため、成功しなかった（非特許文献１８）。別の戦略は、ビシン（ｂｉｃｉｎ）（ビス−Ｎ−２−ヒドロキシエチルグリシンアミド）リンカーを使用して２〜３のＰＥＧ分子を無作為に結合した。生理的条件下では、ビシンの迅速な加水分解によりＰＥＧが放出され、活性なＩＦＮβ１ｂが残る。しかしながら、これらの放出可能なＰＥＧ化された形態の活性は、非修飾のＩＦＮβ１ｂの７〜２７％の間でしかなかった（非特許文献１９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００５／１１０４５５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０７６４７４号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０５９１２９号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｏｏｒｅｓ，Ｋ．Ｊ．、Ｇａｍｂｌｉｎ，Ｄ．Ｐ．、およびＤａｖｉｓ，Ｂ．Ｇ．、「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、第１２巻、６５６−６６５頁
【非特許文献２】Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ．Ｍ．、Ｆｉｓｃｅｌｌａ，Ｍ．、Ｌａｍｏｕｓｅ−Ｓｍｉｔｈ，Ａ．、Ｚｅｕｚｅｍ，Ｓ．、およびＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．、「Ａｌｂｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ｂ：  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ」、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年、第２５巻、１４１１−１４１９頁
【非特許文献３】Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．およびＭｅｒｏ，Ａ．、「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」、ＢｉｏＤｒｕｇｓ．、２００８年、第２２巻、３１５−３２９頁
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．、およびＨａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２００２年、第５４巻、４５９−４７６頁
【非特許文献５】Ｍａｒｓａｃ，Ｙ．、Ｃｒａｍｅｒ，Ｊ．、Ｏｌｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ｄ．、Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｋ．、およびＢｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｆ．、「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｌｉｋｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００６年、第１７巻、１４９２−１４９８頁
【非特許文献６】Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．、Ｍｏｌｉｎｅｕｘ，Ｇ．、Ｔｒｅｕｈｅｉｔ，Ｍ．、Ｌａｄｄ，Ｄ．、およびＧｅｇｇ，Ｃ．、「Ｍｏｎｏ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２００２年、第５４巻、４７７−４８５頁
【非特許文献７】Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ，Ｓ．、Ｇｏｄｗｉｎ，Ａ．、Ｂａｌａｎ，Ｓ．、Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｗ．、Ｚｌｏｈ，Ｍ．、およびＳｈａｕｎａｋ，Ｓ．、「Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｂａｓｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２００８年、第６０巻、３−１２頁
【非特許文献８】ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｇ．、Ｘｉｎｇ，Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｅ．、Ｗａｎｇ，Ｊ．、Ｚｏｐｆ，Ｄ．、Ｇｏｕｔｙ，Ｄ．Ｌ．、Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｅ．Ｒ．、Ｐａｎｎｅｅｒｓｅｌｖａｍ，Ｋ．、Ｂｒｉｎｋｍａｎ−Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ  ＥＣ、Ｂａｙｅｒ，Ｒ．Ｊ．、Ｔａｒｐ，Ｍ．Ａ．、およびＣｌａｕｓｅｎ，Ｈ．、「ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６年、第１６巻、８３３−８４３頁
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｌｉ，Ｆ．、Ｌｕ，Ｘ．Ｗ．、およびＬｉｕ，Ｃ．Ｆ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｉｏａｃｉｄ／ａｚｉｄｅ  ａｍｉｄａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００９年、第２０巻、１９７−２００頁
【非特許文献１０】Ｘｉｅ，Ｊ．およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．、「Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００６年、第７巻、７７５−７８２頁
【非特許文献１１】ＶｅｒｏｎｅｓｅおよびＭｅｒｏ、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ、２００８年、第２２巻、第５号、３１５頁
【非特許文献１２】Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．、Ｃａｐｏｎｅ，Ｉ．、およびＢｅｌａｒｄｅｌｌｉ，Ｆ．、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、２００７年、第８９巻、８８４−８９３頁
【非特許文献１３】Ｄｈａｌｌｕｉｎ，Ｃ、Ｒｏｓｓ，Ａ．、Ｌｅｕｔｈｏｌｄ，Ｌ．Ａ．、Ｆｏｓｅｒ，Ｓ．、Ｇｓｅｌｌ，Ｂ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．、およびＳｅｎｎ，Ｈ．、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ２ａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００５年、第１６巻、５０４−５１７頁
【非特許文献１４】Ｆｏｓｅｒ，Ｓ．、Ｓｃｈａｃｈｅｒ，Ａ．、Ｗｅｙｅｒ，Ｋ．Ａ．、Ｂｒｕｇｇｅｒ，Ｄ．、Ｄｉｅｔｅｌ，Ｅ．、Ｍａｒｔｉ，Ｓ．、およびＳｃｈｒｅｉｔｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ａ  （ＰＥＧＡＳＹＳ）」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、２００３年、第３０巻、７８−８７頁
【非特許文献１５】Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓ．、Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ，Ｓ．、Ｇｒａｃｅ，Ｍ．、Ｂａｕｓｃｈ，Ｊ．、Ｂｏｒｄｅｎｓ，Ｒ．、およびＷｙｓｓ，Ｄ．Ｆ．、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２００２年、第５４巻、５４７−５７０頁
【非特許文献１６】Ｆｉｎｅ，Ｈ．Ａ、Ｗｅｎ，Ｐ．Ｙ．、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ａ．、Ｋｏｗａｌ，Ｊ．、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．、およびＢｌａｃｋ，Ｐ．Ｍ．、「Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  （ＢＧ９０１５）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９７年、第３巻、３８１−３８７頁
【非特許文献１７】Ｆｕｋｕｔｏｍｉ，Ｔ．、Ｎａｋａｍｕｔａ，Ｍ．、Ｆｕｋｕｔｏｍｉ，Ｍ．、Ｉｗａｏ，Ｍ．、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．、Ｈｉｒｏｓｈｉｇｅ，Ｋ．、Ｔａｎａｂｅ，Ｙ．、およびＮａｗａｔａ，Ｈ．、「Ｄｅｃｌｉｎｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｌｏａｄ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ２４  ｈ  ａｆｔｅｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．、２００１年、第３４巻、１００−１０７頁
【非特許文献１８】Ｂａｓｕ，Ａ、Ｙａｎｇ、Ｋ．、Ｗａｎｇ，Ｍ．、Ｌｉｕ，Ｓ．、Ｃｈｉｎｔａｌａ，Ｒ．、Ｐａｌｍ，Ｔ．、Ｚｈａｏ，Ｈ．、Ｐｅｎｇ，Ｐ．、Ｗｕ，Ｄ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｈｕａ，Ｊ．、Ｈｓｉｅｈ，Ｍ．Ｃ．、Ｚｈｏｕ，Ｊ．、Ｐｅｔｔｉ，Ｇ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｊａｎｊｕａ，Ａ．、Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．、Ｌｉｕ、Ｊ．、Ｌｏｎｇｌｅｙ、Ｃ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｍｅｈｌｉｇ，Ｍ．、Ｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｖ．、Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｍ．、およびＦｉｌｐｕｌａ，Ｄ．、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ−１ｂ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，ｐｏｔｅｎｃｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏ−ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００６年、第１７巻、６１８−６３０
【非特許文献１９】Ｚｈａｏ，Ｈ．、Ｙａｎｇ，Ｋ．、Ｍａｒｔｉｎｅｚ．Ａ．、Ｂａｓｕ，Ａ、Ｃｈｉｎｔａｌａ，Ｒ．、Ｌｉｕ，Ｈ．Ｃ．、Ｊａｎｊｕａ，Ａ、Ｗａｎｇ，Ｍ．、およびＦｉｌｐｕｌａ．Ｄ．、「Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｂｉｃｉｎ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｏｍ  ｍｏｎｏ−  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉ−ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００６年、第１７巻、３４１−３５１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
タンパク質治療法の有効性および安定性を改良するために、例えば腎臓クリアランスを遅延すること、免疫原性を減少させること、および／またはタンパク質分解を減少させることによって、インターフェロン治療学の有効性を長期化するための手段についての明確なニーズが存在する。しかしながら、当該技術分野で公知のいくつかの方法が存在するが、各々は、例えばさらなる化学部分の導入の必要性、修飾の部位の制限、タンパク質の折り畳みに対する効果および活性に対する効果において、短所を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、治療的に使用するために、インターフェロンを安定化する代替方法を検討してきた。本発明者らは、インターフェロンをＰＥＧ化する新規な方法を開発した。当該方法は、部位特異的であり、そして、試験されるインターフェロンについて、実施例に記載されるとおり、従来の技法を使用してＰＥＧ化された対応するインターフェロンよりもかなり大きい、ＰＥＧ化されていないインターフェロンの抗ウイルス活性に実際に迫る抗ウイルス活性を有するＰＥＧ化されたインターフェロンを生じた。これは、ＰＥＧ官能性の新規なオキソカルボン酸誘導体、例えばピルボイル誘導体を生成させることにより、促進された。Ｃ末端ヒドラジド組み換えタンパク質は、ピルボイルＰＥＧとの反応に供され、ＰＥＧ官能性がヒドラゾン結合を介してタンパク質のＣ末端に直接結合されている、部位特異的にＣ末端ＰＥＧ化されたタンパク質を良好な収率で生成した。このヒドラゾン結合は、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いる穏和な条件下での、還元によってさらに安定化することができる。
【００１６】
従って、本発明の第１の態様では、インターフェロン分子の部位特異的標識の方法であって、
（ａ）標識分子を準備する工程であって、当該標識分子はアルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分を含む、工程と；
（ｂ）インターフェロン分子を準備する工程であって、当該インターフェロン分子はＣ末端ヒドラジド部分を有する、工程と；
（ｃ）当該ＰＥＧ部分のアルデヒドまたはケトン部分を当該インターフェロン分子のＣ末端ヒドラジドと反応させて、標識されたインターフェロン分子を形成する工程であって、この標識されたインターフェロン分子は、ヒドラゾン結合を介して当該インターフェロン分子のＣ末端に結合されたＰＥＧ部分を含む、工程と、
を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、このヒドラゾン結合は式Ｉを有する：
【化１】
2012526789.tif 000003
式中、ＲはＨまたはいずれかの置換もしくは非置換の、好ましくは非置換のアルキル基である。
【００１８】
１つの実施形態では、当該方法は、
ｄ）工程（ｃ）で生成された標識されたインターフェロン分子を還元剤と反応させ、ヒドラゾン結合が対応する置換ヒドラジンに還元される工程
を含む。
【００１９】
ヒドラゾン結合をその還元形へと還元することは、下に概略的に示される：
【化２】
2012526789.tif 000004
【００２０】
いずれの適切な還元剤も工程（ｄ）で使用してよい。ヒドラゾン結合が還元される１つの実施形態では、還元剤はシアノ水素化ホウ素である。
【００２１】
本発明の方法では、いずれかの適切なアルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ分子が使用されてもよい。１つの実施形態では、このアルデヒドまたはケトン部分はα−ジケトンまたはα−ケト−アルデヒド基である。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、オキソカルボキシレート残基を有するＰＥＧ部分である。ＰＥＧのいずれの適切なオキソカルボン酸誘導体が使用されてもよい。本発明の特定の実施形態では、使用されるオキソカルボキシレート残基はピルボイル基である。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、芳香族ケトンまたは芳香族アルデヒド部分を有するＰＥＧ部分、例えばＰＥＧのベンズアルデヒド誘導体である。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、トリフルオロメチルケトン部分を有するＰＥＧ部分である。
【００２５】
いずれの適切なインターフェロン分子を、本発明で使用してよい。末端ヒドラジド部分は、いずれかの当該技術分野で公知の技法を使用して生成してもよい。実施例に記載されるとおり、本発明者らは、Ｎ末端でインテインドメインに遺伝子的に融合されたインターフェロン分子のヒドラジンに誘導される切断によって、インターフェロン分子上にこのようなＣ末端ヒドラジド部分を生成することができた。従って、本発明の第１の態様の１つの実施形態では、工程（ｂ）のＣ末端ヒドラジド部分を有するインターフェロン分子は、ヒドラジンと、Ｎ末端でインテインドメインに融合された前駆体インターフェロン分子を含む前駆体分子との反応によって生成される。
【００２６】
実施例に記載されるとおり、そして本発明者らが驚いたことには、この方法を使用してインターフェロンヒドラジドを生成する際に、この反応がキレート剤、ＥＤＴＡの存在下で行われるときには、切断されたインターフェロンの収率は著しく改善されるということが見出された。
【００２７】
従って、インテインドメインに融合された前駆体インターフェロン分子の切断によってインターフェロン分子が生成される本発明の１つの実施形態では、当該前駆体分子は、少なくとも１０μＭ、例えば少なくとも０．１ｍＭ、例えば少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．５ｍＭ、または少なくとも０．７５ｍＭのキレート剤の存在下で、ヒドラジンとの反応に供される。このような実施形態では、いずれの適切なキレート剤を使用してもよい。使用してもよいキレート剤としては、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、またはＥＧＴＡが挙げられる。１つのこのような実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。
【００２８】
さらに、実施例に記載されるとおり、本発明者らは、特に驚いたことには、対応するインテイン融合タンパク質のヒドラジン切断によって生成されるインターフェロンのＣ末端ヒドラジド誘導体は、その折り畳まれた形態で単離されるということを見出した。これは、Ｅ．ｃｏｌｉの中で発現されるときに封入体を形成するので、ＰＥＧ化のための活性タンパク質を生成するために、可溶化および再折り畳みを必要とする、インターフェロン（αおよびβ）を生成するための従来の方法とは対照的である。本願明細書において実施例に記載されるとおり、当該ＰＥＧ化方法は、タンパク質の折り畳みを促進するための再折り畳み工程、または添加剤を何ら必要とすることなく、折り畳まれたタンパク質の生成をもたらす。タンパク質の折り畳みおよびジスルフィド連結性は、当該ヒドラジン切断工程によっては影響を受けないようである。このため、前駆体融合タンパク質のヒドラジン切断の後に、折り畳まれたＣ末端ヒドラジドタンパク質の直接の単離が可能である。
【００２９】
インテイン融合物としての発現は、ある場合には、タンパク質の溶解性の助けとなるようである。タンパク質の折り畳みおよびジスルフィド連結性は、その後のヒドラジン切断工程によっては影響を受けない。
【００３０】
このように、工程（ｂ）のＣ末端ヒドラジド部分を有するインターフェロン分子が、ヒドラジンとＮ末端でインテインドメインに融合された前駆体インターフェロン分子との反応によって生成される本発明の１つの実施形態では、Ｎ末端でインテインドメインに融合された前駆体インターフェロン分子のヒドラジン切断によって得られるＣ末端ヒドラジドインターフェロンタンパク質は、再折り畳み工程または再折り畳み剤を何ら必要とすることなく、折り畳まれたタンパク質として得られる。
【００３１】
従って、本発明の１つの実施形態では、当該方法は、再折り畳み工程または再折り畳み剤の不存在下で行われる。
【００３２】
このように、１つの実施形態では、工程（ｂ）のＣ末端ヒドラジドインターフェロン分子は折り畳まれたインターフェロン分子であり、工程（ｃ）で形成される標識されたインターフェロン分子は折り畳まれたインターフェロン分子である。
【００３３】
本発明の方法を使用して生成されるところの実施例に記載されたインターフェロンについて得られるさらに別の驚くべき利点は、非選択的にＰＥＧ化されたインターフェロン分子と比べて、増大した活性であった。
【００３４】
従って、本発明の１つの実施形態では、当該標識されたインターフェロン分子は、対応するＰＥＧ化されていないインターフェロン分子の抗ウイルス活性の２０％よりも大きい抗ウイルス活性を有する。本発明の特定の実施形態では、当該ＰＥＧ化されたインターフェロンは、対応するＰＥＧ化されていないインターフェロン分子の活性の少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を有する。
【００３５】
当該インターフェロン分子の抗ウイルス活性は、当該技術分野で公知のいずれの適切なアッセイ方法を使用して評価されてもよい。１つの実施形態では、抗ウイルス活性は、癌細胞（例えばＡ５４９肺癌細胞）および適切なウイルス（例えばＥＭＣ）を使用する細胞変性効果阻害アッセイを使用して、評価される。このような試験の一例は、実施例３．４に記載されている。
【００３６】
本発明の特定の実施形態では、標識およびインターフェロンのうちの少なくとも１つは１以上のジスルフィド結合を含む。本発明の標識方法の際立った利点は、本発明の標識方法がチオールの不存在下で行われてもよいということである。このため、ジスルフィド結合を含むタンパク質／ペプチドの効率的なライゲーションおよびこのような結合を有しないタンパク質の効率的なライゲーションが可能になる。他の標識方法は、２−メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）、ベンジルメルカプタン、チオフェノール、（４−カルボキシルメチル）チオフェノール（ＭＰＰＡ）などのチオールの存在を必要とすることがしばしばである。
【００３７】
本発明者らは、ＰＥＧ部分のアルデヒドまたはケトン部分と、当該インターフェロン分子のＣ末端ヒドラジドとが反応して標識されたインターフェロン分子を形成することは、アニリンまたはパラメトキシアニリンなどのアニリン分子の存在によって増進され、反応速度および収率の両方が増大するということを見出した。
【００３８】
従って、本発明の１つの実施形態では、工程（ｃ）は、アニリンまたはパラメトキシアニリンなどのアニリン分子の存在下で行われる。このアニリンまたはパラメトキシアニリンは、１〜５００ｍＭ、例えば、５〜２００ｍＭ、例えば５〜１００ｍＭの範囲の濃度で用いてもよい。例えば、アニリンが使用される場合、この範囲は１〜５０ｍＭであってもよく、例えば、パラメトキシアニリンが使用される場合、この範囲は２０〜５００ｍＭであってもよい。
【００３９】
本発明の第１の態様の方法は、いずれかのインターフェロンを標識するために使用されてもよい。本発明の特定の実施形態では、このインターフェロン分子はＩＦＮα２ｂである。別の実施形態では、このインターフェロン分子はＩＦＮβ１ｂである。
【００４０】
本発明の第２の態様によれば、Ｃ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子であって、ＰＥＧ部分はヒドラゾン結合を介してインターフェロン分子のＣ末端に結合されている、Ｃ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子が提供される。別の実施形態では、このＰＥＧ部分は、還元されたヒドラゾン結合、すなわち置換ヒドラジン、すなわち、式
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨＲ−
（式中、ＲはＨまたはいずれかの置換もしくは非置換のアルキル基である）
を有する結合を介してインターフェロン分子のＣ末端に結合される。
【００４１】
本発明の第１または第２の態様の１つの実施形態では、インターフェロン分子はＩＦＮα２ｂ分子である。別の実施形態では、インターフェロン分子はＩＦＮβ１ｂ分子である。
【００４２】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施形態では、インターフェロン分子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮα２ｂ分子、または配列番号１と少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列相同性を有するその断片もしくは誘導体である：
配列番号１：
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＲＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＴＮＬＱＥＳＬＲＳＫＥＧ。
【００４３】
１つの実施形態では、インターフェロン分子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮα２ｂ分子からなる。
【００４４】
本発明の第１または第２の態様の別の特定の実施形態では、インターフェロン分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮβ１ｂ分子、または配列番号２と少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性を有するその断片もしくは誘導体である：
配列番号２
ＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲＳＳＮＦＱＳＱＫＬＬＷＱＬＮＧＲＬＥＹＣＬＫＤＲＭＮＦＤＩＰＥＥＩＫＱＬＱＱＦＱＫＥＤＡＡＬＴＩＹＥＭＬＱＮＩＦＡＩＦＲＱＤＳＳＳＴＧＷＮＥＴＩＶＥＮＬＬＡＮＶＹＨＱＩＮＨＬＫＴＶＬＥＥＫＬＥＫＥＤＦＴＲＧＫＬＭＳＳＬＨＬＫＲＹＹＧＲＩＬＨＹＬＫＡＫＥＹＳＨＣＡＷＴＩＶＲＶＥＩＬＲＮＦＹＦＩＮＲＬＴＧＹＬＲＮＧ。
【００４５】
１つの実施形態では、インターフェロン分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮβ１ｂ分子からなる。
【００４６】
本発明の特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は、およそ１０ｋＤａ質量の線状ＰＥＧ部分である。
【００４７】
本発明の１つの特定の実施形態では、Ｃ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子は、式
［配列番号１］−ＮＨ−Ｎ＝ＣＲ−［ＰＥＧ］、
（式中、Ｒは−ＣＨ３であり、ＰＥＧはおよそ１０ｋＤａ質量の線状ＰＥＧ分子である）を有する。
【００４８】
本発明の別の特定の実施形態では、Ｃ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子は、式
［配列番号２］−ＮＨ−Ｎ＝ＣＲ−［ＰＥＧ］、
（式中、Ｒは−ＣＨ３であり、ＰＥＧはおよそ１０ｋＤａ質量の線状ＰＥＧ分子である）を有する。
【００４９】
本発明の第３の態様によれば、医薬における使用のための、本発明の第２の態様に係るＰＥＧ化されたインターフェロン分子、または本発明の第１の態様の方法に従って生成されるＰＥＧ化されたインターフェロンが提供される。
【００５０】
本発明の第４の態様は、必要とする患者において、インターフェロン処置が有用でありうる病状を処置する方法であって、本発明の第２の態様に係るＰＥＧ化されたインターフェロンまたは本発明の第１の態様の方法に従って生成されるＰＥＧ化されたインターフェロンを投与することを含む方法を提供する。このような病状としては、癌、Ｃ型肝炎、多発性硬化症、自己免疫障害、およびウイルス感染症、例えばインフルエンザが挙げられる。
【００５１】
本発明の第５の態様は、癌、Ｃ型肝炎、多発性硬化症、自己免疫障害、またはウイルス性症状の処置における使用のための、本発明の第２の態様に係るＰＥＧ化されたインターフェロンまたは本発明の第１の態様の方法に従って生成されるＰＥＧ化されたインターフェロンを提供する。
【００５２】
本発明の第６の態様は、癌、Ｃ型肝炎、多発性硬化症、自己免疫障害、またはウイルス性症状の処置のための医薬の調製における、本発明の第２の態様に係るＰＥＧ化されたインターフェロンまたは本発明の第１の態様の方法に従って生成されるＰＥＧ化されたインターフェロンの使用を提供する。
【００５３】
本発明の第７の態様は、本発明の第２の態様に係るＰＥＧ化されたインターフェロンまたは本発明の第１の態様の方法に従って生成されるＰＥＧ化されたインターフェロンを含む医薬組成物を提供する。
【００５４】
本発明の第８の態様は、図１〜１０のいずれか１つを参照して実質的に本願明細書に記載されるとおりの標識されたインターフェロン分子を生成する方法を提供する。
【００５５】
本発明の第９の態様は、図１〜１０のいずれか１つを参照して実質的に本願明細書に記載されるとおりのＣ末端ＰＥＧ化されたインターフェロン分子を提供する。
【００５６】
本発明の各態様の好ましい特徴は、変更すべきところは変更して、他の態様の各々にも当てはまる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】Ｎ末端ピルボイル官能性を含有する１０ｋＤａ  ＰＥＧ標的化合物の調製のためのスキームを示す。
【図２】対応するインテイン融合タンパク質のヒドラジン切断によりインターフェロンの末端ヒドラジド誘導体を生成する方法を概略的に示す。
【図３】ＩＦＮα２ｂインテインＣＢＤ融合タンパク質の精製およびヒドラジン切断を示すゲルを示す。
【図４】精製されたＩＦＮα２ｂヒドラジドのＥＳ  ＭＳを示す。
【図５】ＩＦＮα２ｂヒドラジドのＰＥＧ化およびＩＦＮα２ｂＰＥＧの精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図６】部位特異的にＰＥＧ化されたＩＦＮａ２ｂを概略的に示す。
【図７】ＩＦＮβ１ｂインテインＣＢＤ融合タンパク質の精製およびヒドラジン切断の分析において使用されたゲルを示し、そして表Ａを含む。
【図８】精製されたＩＦＮβ１ｂヒドラジドのＥＳ  ＭＳを示す。
【図９】ＩＦＮβ１ｂヒドラジドＰＥＧ化反応のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１０】Ｃ末端ＰＥＧ化されたＩＦＮβ１ｂ分子を概略的に示す。
【図１１】ＩＦＮβ１ｂ誘導体の抗ウイルス活性±ＳＤを示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
特段の記載がない限り、用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」はほとんど同義で使用される。
【００５９】
公知のＰＥＧ化されたインターフェロンに勝る注目すべき利点を有する、ＰＥＧ化されたインターフェロンの生成を可能にするインターフェロンの部位特異的Ｃ末端ＰＥＧ化の方法が提供される。これは、ＰＥＧのオキソカルボン酸誘導体などのアルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分を生成すること、およびこれとＣ末端ヒドラジドインターフェロン（これは、対応するインテイン融合タンパク質のヒドラジン切断によって任意に生成されてもよい）との反応によって、促進された。これは、ＰＥＧ官能性がヒドラゾン結合を介してタンパク質のＣ末端に直接結合されている、部位特異的にＣ末端ＰＥＧ化されたタンパク質を生成する。
【００６０】
ＰＥＧ
いずれの適切なポリエチレングリコールを、本発明で使用してよい。本発明に関しては、用語「ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）」は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）と同義で使用される。本発明に関しては、用語「ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）」は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）と同義で使用され、このＰＥＧ／ＰＯＥは、いずれの適切なサイズのものであってもよい。
【００６１】
本発明の特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、１〜６０ＫＤａ、例えば２〜４０ＫＤａ、例えば２〜２０ｋＤａの範囲の、例えば５〜１８ｋＤａ、例えば８〜１５ｋＤａ、例えば１９〜１２ＫＤａの範囲の、例えばおよそ１０ｋＤａの質量を有する。特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、およそ１０ｋＤａの線状ＰＥＧ分子である。この分子量は、いずれの適切な従来の技法を使用して、例えば適切な重量マーカーを用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析などによって確かめられうる。
【００６２】
このＰＥＧは、例えば、線状、分岐状、星型または櫛型ＰＥＧであってもよい。異なる形態のＰＥＧも、当業者にとっては周知であるとおり、重合プロセスのために使用される開始剤に依存して、入手できる。
【００６３】
本発明における使用のためのＰＥＧ分子は、いずれかの適切なアルデヒドまたはケトン部分で官能化されてもよい。
【００６４】
１つの実施形態では、このアルデヒドまたはケトン部分は、α−ジケトンまたはα−ケト−アルデヒド基である。
【００６５】
１つの実施形態では、このアルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、式ＩＩを有する：
【化３】
2012526789.tif 000005
（式中、Ｘは存在してもよいし存在しなくてもよいリンカーであり、Ｒはプロトン、Ｈまたはいずれかの他の官能性である）。１つの実施形態では、Ｒは、置換もしくは非置換のアルキル基である。存在する場合、Ｘは、いずれの適切なリンカーであってもよい。１つの実施形態では、ＸはＮＨである。別の実施形態では、ＸはＯである。別の実施形態では、Ｘは（ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４またはいずれかの整数、例えば５〜１００の範囲の整数、例えば５〜５０または５〜１０の範囲の整数である）である。
【００６６】
さらなる実施形態では、アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、芳香族ケトンまたは芳香族アルデヒド部分を有するＰＥＧ部分、例えばＰＥＧのベンズアルデヒド誘導体である。このようなＰＥＧ部分は、概略的に式ＩＩＩとして示される：
【化４】
2012526789.tif 000006
（式中、Ｒはプロトン、Ｈまたは別の官能性であり；存在してもよいし存在しなくてもよいＸは式ＩＩについて定義されており、そしてＰＥＧは、いずれかの位置で環に結合されている）。この環の他の位置は、置換されていてもよいし、非置換であってもよい。１つの実施形態では、Ｒは置換または非置換のアルキル基である。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、トリフルオロメチルケトン部分を有するＰＥＧ部分である。このようなＰＥＧ部分は、概略的に式ＩＶとして示される：
【化５】
2012526789.tif 000007
（式中、Ｘは、存在してもよいし存在しなくてもよいリンカーである）。１つの実施形態では、Ｘは、式ＩＩについて定義されるとおりである。
【００６８】
１つの実施形態では、アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、オキソカルボキシレート残基を有するＰＥＧ部分である。１つのこのような実施形態では、オキソカルボキシレート残基を有するＰＥＧ部分は、式Ｖを有する：
【化６】
2012526789.tif 000008
（式中、Ｒはプロトン、Ｈまたは別の官能性である）。１つの実施形態では、Ｒは置換または非置換のアルキル基である。
【００６９】
例えばピルボイル、グルオキシロイル（ｇｌｕｏｘｙｌｏｙｌ）（グリオキシリル）、アセトアセチル、メソキサリル、メソキサロ（ｍｅｓｏｘａｌｏ）、オキサルアセチル（ｏｘａｌａｃｅｔｙｌ）、またはオキサルアセト（ｏｘａｌａｃｅｔｏ）残基など、いずれの適切なオキソカルボキシレート残基を使用してもよい。本発明の特定の実施形態では、オキソカルボキシレート残基を有するＰＥＧ部分は、ピルボイルＰＥＧである。別の実施形態では、オキソカルボキシレート残基を有するＰＥＧ部分は、グルオキシロイル（グリオキシリル）ＰＥＧである。
【００７０】
１つの実施形態では、アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、マレイミド部分を有するＰＥＧ部分を包含すると考えられる。別の実施形態では、アルデヒドまたはケトン部分を有するＰＥＧ部分は、マレイミド部分を有するＰＥＧ部分を包含しないと考えられる。
【００７１】
インターフェロン分子
本発明のおよび本発明における使用のためのインターフェロン分子は、天然の、組み換え型のまたは合成のインターフェロン分子であってもよく、そしていずれのインターフェロン型、例えばＩ型インターフェロン（ＩＦＮ  α、β、λ、ω、τ、κ、ε、およびζなど）、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮγなど）、ならびにＩＩＩ型インターフェロン（ＩＬ−２９、ＩＬ−２８ＡおよびＩＬ２８Ｂなど）であってもよい。本発明の特定の実施形態では、インターフェロン分子はＩＦＮα２ｂである。別の実施形態では、インターフェロン分子はＩＦＮβ１ｂである。インターフェロン分子は、全長インターフェロン分子の断片および誘導体を包含する。誘導体としては、天然のインターフェロンの対応する配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の配列相同性を有する類似体またはその断片が挙げられる。このような誘導体および断片は、任意に、さらなるペプチジルまたは非ペプチジル部分に連結されてもよい。このような断片および誘導体は、インターフェロンの治療活性、例えば本願明細書に記載される抗ウイルス活性を保持することが好ましい。本発明の特定の実施形態では、インターフェロン分子はＩＦＮα２である。別の実施形態では、インターフェロン分子はＩＦＮβである。
【００７２】
本発明のおよび本発明における使用のためのインターフェロン分子は、任意に、Ｃ末端に１以上のさらなるアミノ酸残基を有してもよい。１つの実施形態では、インターフェロン分子は、Ｃ末端にグリシンが付加されたインターフェロン分子である。１つの実施形態では、インターフェロン分子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮα２ｂ分子、または配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性を有するその断片もしくは誘導体である。別の特定の実施形態では、インターフェロン分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮβ１ｂ分子、または配列番号２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性を有するその断片もしくは誘導体である。
【００７３】
本発明のおよび本発明における使用のためのインターフェロン分子は、任意に、Ｎ末端に、またはＮ末端およびＣ末端の両方に１以上のさらなるアミノ酸残基を有してもよい。
【００７４】
合成オリゴペプチドのヒドラジド含有誘導体は、公知の方法、例えば、固相合成技法を使用して、容易に生成されうる。
【００７５】
カルボン酸官能性は、カルボジイミドを使用して活性化され、次いでヒドラジンとの反応に供されてもよい。
【００７６】
上記のとおり、本発明者らは、Ｎ末端でインテインドメインに融合されたインターフェロンは、ヒドラジン処理によってインテインから選択的に切断して、所望のインターフェロンの対応するヒドラジド誘導体として所望のインターフェロンを遊離させることができ、この対応するヒドラジド誘導体は、その後、ＰＥＧ分子、例えばピルボイルＰＥＧ分子、のアルデヒドまたはケトン官能基との反応のために使用して、本発明に係るＰＥＧ化されたインターフェロンを生成することができるということも見出した。
【００７７】
このような方法は、タンパク質スプライシング（Ｐａｕｌｕｓ  Ｈ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０００年、第６９巻、４４７−４９６頁）として知られる天然に存在する生物学的現象の操作に基づく。タンパク質スプライシングは、内部領域（インテインと呼ばれる）の正確な除去、および２つの隣接配列（エクステインと呼ばれる）のライゲーションを生じる一連の分子内再編成を前駆体タンパク質が受ける、翻訳後のプロセスである。エクステインのいずれにおいても一般に配列要件はないのに対して、インテインはいくつかの保存配列モチーフによって特徴付けられ、このタンパク質ドメインファミリーの優に１００を超えるメンバーが今では特定されている。
【００７８】
タンパク質スプライシングにおける第１工程は、Ｎ−エクステインユニットが、常にインテインのＮ末端の直近に位置する保存されたＣｙｓ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基の側鎖のＳＨまたはＯＨ基へと移される、Ｎ→Ｓ（またはＮ→Ｏ）アシルシフトを含む。この機構を深く考察すると、タンパク質スプライシングの第１工程だけを促進することができるいくつかの変異インテインの設計につながった（Ｃｈｏｎｇら、Ｇｅｎｅ、１９９７年、第１９２巻、２７１−２８１頁、（Ｎｏｒｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２０００年、第３９巻、４５０−４６６頁）。これらの操作されたインテインのうちの１つへのインフレームのＮ末端融合物として発現されたタンパク質は、チオールによって、分子間トランスチオエステル化反応を介して切断することができ、組み換えタンパク質Ｃ末端チオエステル誘導体を生成することができる（Ｃｈｏｎｇら、Ｇｅｎｅ、１９９７年、第１９２巻、２７１−２８１頁、（Ｎｏｒｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２０００年、第３９巻、４５０−４６６頁）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  国際公開第００／１８８８１号パンフレット、国際公開第００４７７５１号パンフレット）。次いで、Ｎ末端システイン残基を含有するペプチド配列は、発現タンパク質ライゲーション（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＥＰＬ）またはインテイン媒介タンパク質ライゲーション（ｉｎｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＩＰＬ）と呼ばれる手順で、このような組み換えＣ末端チオエステルタンパク質のＣ末端へと特異的にライゲーションすることができる（Ｍｕｉｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９９８年、第９５巻、６７０５−６７１０頁、Ｅｖａｎｓ  Ｊｒら、Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．、１９９８年、第７巻、２２５６−２２６４頁）。組み換えタンパク質を標識するための１つのアプローチは、対応するインテイン融合タンパク質のヒドラジン切断による組み換えＣ末端ヒドラジドタンパク質の生成、およびその後の、国際公開第２００５／０１４６２０（Ａ１）号パンフレットに記載されているようなヒドラゾン結合形成反応を介した標識を介するものである。簡潔に言えば、所望のタンパク質は、操作されたインテインドメインのＮ末端融合物として発現される。その後の、タンパク質−インテイン結合体におけるＮからＳへのアシルシフトは、チオエステルで連結された中間体を生じ、この中間体は、ヒドラジンによって化学的に切断して、所望のタンパク質Ｃ末端ヒドラジドを与えることができる。
【００７９】
医薬組成物
当該ＰＥＧ化されたインターフェロンは、医薬組成物として投与されてもよい。本発明に係る医薬組成物、および本発明に係る使用のための医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容できる賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者にとっては周知である他の物質（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年）を参照）を含んでもよい。このような物質としては、酢酸塩、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などのバッファー；抗酸化物質；防腐剤；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；炭水化物；キレート剤；等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）；ならびに界面活性剤を挙げてもよい。
【００８０】
また、当該医薬組成物は、処置しようとする特定の徴候のために必要であるとして選択される、好ましくは、本発明の結合メンバー、核酸または組成物の活性に悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する１以上のさらなる活性化合物を含有してもよい。例えば、癌の処置においては、当該インターフェロンに加えて、当該組成物は、化学療法剤を含んでもよい。
【００８１】
当該有効成分（例えばインターフェロン）は、いずれの適切な経路を介しておよびいずれの適切な手段を介して、例えばミクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム、他の微粒子送達システムを介して投与されてもよい。例えば、有効成分は、例えば、コアセルベーション技法によってまたは界面重合によって調製されてもよいマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）内に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルション中に封入されてもよい。さらなる詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年を参照。
【００８２】
持続放出調剤を、活性剤の送達のために使用してよい。持続放出調剤の適切な例としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスであって、このマトリクスが成形品、例えば膜、座薬またはマイクロカプセルの形態にあるものが挙げられる。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性のエチレン−酢酸ビニルコポリマー、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【００８３】
本発明のＰＥＧ化されたインターフェロンを送達するために、いずれの適切な投与経路を使用してもよい。１つの実施形態では、インターフェロンは筋肉内に送達される。
【００８４】
活性剤、生成物または組成物は、腫瘍部位もしくは他の所望の部位へと局所的に投与されてもよいし、または腫瘍もしくは他の細胞を標的にするようにして送達されてもよい。抗体または細胞特異的リガンドなどのターゲッティング系の使用により、活性剤をより特異的に特定の種類の細胞へと送達するために、ターゲッティング療法を使用してもよい。例えば、薬剤が容認し難いほど毒性である場合、またはターゲッティングを用いなければ、薬剤があまりに高い投薬量を必要とする場合、またはターゲッティングを用いなければ、薬剤が標的細胞に入ることができないであろうと考えられる場合など、ターゲッティングは、様々な理由で望ましい可能性がある。
【００８５】
本発明の活性剤または組成物は、個体に「治療上有効量」で投与されることが好ましく、これは、その個体に利益を見えるようにするのに十分な量である。実際の投薬治療方式は、処置しようとする状態、その重症度、処置しようとする患者、使用される薬剤を含めたいくつかの要因に依存することになり、医師の判断によることになる。最適の用量は、例えば、年齢、性別、体重、処置しようとする状態の重症度、投与しようとする有効成分および投与経路を含めたいくつかのパラメータに基づいて医師が決定することができる。
【００８６】
処置
「処置」は、ヒトまたは非ヒトの動物に利益を与えることができるいずれの措置も含む。処置は、すでに存在する状態に関してのものでもよいし、または予防的なもの（予防的処置）であってもよい。処置は、治癒効果、軽減効果または予防効果を含みうる。
【００８７】
本発明のＰＥＧ化されたインターフェロンは、インターフェロンに基づく処置が有用であるいずれの状態の処置で使用されてもよい。これらには、悪性腫瘍、肝炎、多発性硬化症、自己免疫障害、またはウイルス性症状が含まれうる。
【００８８】
１つの実施形態では、本発明は、癌の処置において使用されてもよい。「癌の処置」には、癌性増殖および／または血管新生によって引き起こされる状態の処置が含まれ、新生物の成長物または腫瘍の処置が含まれる。本発明を使用して処置することができる腫瘍の例は、例えば、肉腫（骨肉腫および軟部肉腫が挙げられる）、細胞腫（例えば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵癌、胃癌、肝癌、子宮癌、前立腺癌、子宮頸癌および卵巣癌、非小細胞性肺癌、肝細胞癌）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫が挙げられる）、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、および白血病（急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病が挙げられる）、星状細胞種、神経膠腫および網膜芽細胞腫である。
【００８９】
本発明は、すでに存在する癌の処置および初期の処置において、または外科手術後の癌の再発の予防において特に有用である可能性がある。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染症、例えばＣ型肝炎感染、インフルエンザなどの処置において使用されてもよい。
【００９１】
別の実施形態では、本発明は、多発性硬化症の処置において使用されてもよい。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、自己免疫障害、例えば紅斑性狼瘡の処置において使用されてもよい。
【００９３】
別の実施形態では、本発明は、依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の処置において使用されてもよい。
【００９４】
本発明は、これより、添付の図面を参照して、以下の非限定的な実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【００９５】
実施例１：ピルボイル−ＰＥＧの生成
Ｎ末端ピルボイル官能性を含有する１０ｋＤａのＰＥＧ標的化合物（４）を、図１のスキーム１に示すように調製した。これは、予め形成された塩化ピルボイル（２）を用いた市販のＰＥＧアミン（３）の一晩のアシル化によって成し遂げられた。このＰＥＧアミンは、ネクター（Ｎｅｋｔａｒ）｛ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２Ｎｅｋｔａｒ／２Ｍ２Ｕ０ｌ０１／ＰＴ０３Ｆ２４］から入手した。
【００９６】
酸塩化物（２）は、ピルビン酸（１）をα，α−ジクロロメチルメチルエーテルで処理することにより形成した。簡潔に言えば、ピルビン酸（５ｇ）を、還流冷却器、滴下漏斗を具えかつ２Ｎ  ＮａＯＨ（水溶液）を含有するｄｒｅｓｃｈｅｌ瓶に接続した５０ｍｌの３つ口丸底フラスコに窒素下で入れた。α，α−ジクロロメチルメチルエーテル（５．１６ｍｌ）を滴下し、この反応混合物を５０℃に３０分間加熱し、副生成物であるギ酸メチルを減圧下でのエバポレーションによって除去し、粗製酸塩化物を黄色油状物として８２％収率（４．９６ｇ）で得た。
【００９７】
上記粗製酸塩化物を８２％収率で得たが、これは（１Ｈ  ＮＭＲによって判定したところ）次の工程で使用するには十分純粋であった。この酸塩化物は非常に感湿性が高かった。試験的な反応の間に湿気に曝したところ、この生成物の部分的な分解が生じた。
【００９８】
標的化合物（４）は、精製した酸塩化物（２）とＰＥＧアミン（３）との間の一晩のカップリングによって、８９％収率で形成した。簡潔に言えば、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（５００ｍｇ）および無水ＤＣＭ（５ｍｌ）を、窒素下で５０ｍｌの丸底フラスコに入れた。トリエチルアミン（１１ｍｌ）を加え、この反応混合物を０℃に冷却した。温度を５℃より低く保ちながら、塩化ピルボイル（１０ｍｇ）を滴下した。この反応混合物を一晩かけて室温まで戻し、有機層を２Ｎ  ＨＣｌ（２×１０ｍｌ）、次いでＨ２Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄し、この有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で除去し、残渣をＥｔ２Ｏでスラリーにし、純粋な生成物を白色固体として８２％収率（４２５ｍｇ）で得た。
【００９９】
実施例２：部位特異的にＣ末端ＰＥＧ化されたＩＦＮα２ｂヒドラジドの生成
実施例２．１：可溶性ＩＦＮα２ｂヒドラジドのクローニング、発現および精製
ＩＦＮα２ｂ  ｃＤＮＡ（ＩＭＡＧＥ  ｃｌｏｎｅ  ３０９１５２６９）をジーン・サービス社（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌｔｄ．）から購入した。ＩＦＮα２ｂコード配列を、以下のプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した：
順方向プライマーを、５’  ＩＦＮα２ｂ配列のすぐ上流にＮｄｅＩ部位を含むように設計した：
５’−ＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣ−３’
逆方向プライマーを、ＩＦＮα２ｂコード配列の末端の終止コドンを取り除き、それを、ＳａｐＩ部位のすぐ後に続くグリシンコドンで置き換えるように設計した：
５’−ＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣ−３’
【０１００】
得られたＰＣＲ産物をｐＴＸＢ１ベクター（ＮＥＢ）のＮｄｅＩ  ＳａｐＩ部位にクローニングした。このｐＴＸＢ１  ＩＦＮα２ｂ  ＧＬＹ構築物は、ＩＦＮα２ｂがグリシンを介してＧｙｒＡインテインのＮ末端に連結されており、次にこのＧｙｒＡインテインがキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）のＮ末端に融合されている、融合タンパク質をコードする。これを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｒｎｉ  Ｂ（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ細胞（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））に形質転換し、発現を、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて１８℃で一晩誘導した。細胞を遠心分離によってペレット化し、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦを伴う溶解バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５％  グリセロール、０．１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ  ＮＬ）中で、超音波処理によって溶解した。可溶性分画を、溶解バッファー中、４℃で１．５時間予め平衡化したキチンビーズと混合した。次いで、このビーズを溶解バッファーで、次いでライゲーションバッファー（２００ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４）で十分に洗浄し、キチンビーズ上に固定された精製したＩＦＮα２ｂ  ＧｙｒＡインテインＣＢＤ融合タンパク質を得た（図３、レーン４）。
【０１０１】
ライゲーションバッファー中でこれらのビーズを１％ヒドラジンで一晩処理して、ＩＦＮα２ｂヒドラジドを生成した。この反応を図２に概略的に示す。切断の際に１ｍＭのＥＤＴＡを添加すると、切断された物質の収率が増加した（図３でレーン５および９を比較のこと）。いずれかの１つの理論に限定されるわけではないが、ＥＤＴＡが、このインテインの活性を潜在的に阻害する可能性があるごく微量の金属イオンを取り除くということが考えられる。ＩＦＮα２ｂヒドラジドは、０．１％  ＴＦＡを伴う水およびアセトニトリル  ０．１％  ＴＦＡ勾配中におけるＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ５カラム（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｉｘ））での逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって精製し、純粋なタンパク質親液物（ｌｙｏｐｈｉｌｅ）を得た。Ｎ末端ｍｅｔなしでの予想される質量ＩＦＮα２ｂ＝１９，３４０Ｄａ；実測した質量＝１９，３３６Ｄａ；典型的な収率は約０．７ｍｇ／（細胞培養液１Ｌ）である（図４）。本実施例で作製したＩＦＮα２ｂヒドラジドの配列は以下のとおりである：
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＲＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＴＮＬＱＥＳＬＲＳＫＥＧ−ＮＨＮＨ２
【０１０２】
Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）との反応を使用して、このＩＦＮα２ｂヒドラジドが正しく折り畳まれていることを確認した。ＮＥＭはフリーのシステインと反応して、１２５の質量の増加を生じる。ＩＦＮα２ｂは４つのシステインおよび２つのジスルフィド結合を有し、それゆえ折り畳まれたタンパク質はＮＥＭとのインキュベーションに際して質量が増加しないであろう。数μｇの純粋なＩＦＮα２ｂヒドラジドを２０μｌの水または４０％  アセトニトリルに溶解した。対照として１０μｌを取り除き、５μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＮＥＭを、残りに加え、室温で少なくとも３０分間インキュベーションし、次いでＥＳ  ＭＳ分析によって分析した。ＩＦＮα２ｂは、１２５Ｄａだけ質量が増加した陽性対照（ペプチド配列ＣＥＲＧＤＫＧＹＶＰＳＶＦ）とは対照的に、ＮＥＭとは反応しなかった。従って、これらの結果は、対応するインテイン融合タンパク質の発現およびヒドラジン切断の後にＩＦＮα２ｂの折り畳まれたＣ末端ヒドラジド誘導体が直接生成したということを示す。
【０１０３】
実施例２．２：ＩＦＮα２ｂヒドラジドのＰＥＧ化
２０倍モル過剰のピルボイル−ＰＥＧを１００μｌの、０．１％  ＴＦＡを伴う４０％  アセトニトリルに溶解し、上記ＩＦＮα２ｂ親液物に加えた。反応液を室温で一晩（約１６時間）放置し、還元条件下にあるＭＥＳランニングバッファー中で、ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分析した（図５Ａ）。ＩＦＮα２ｂのＣ末端チオエステルを同じ条件下でピルボイルＰＥＧとインキュベーションしたときには、ＰＥＧ化生成物はまったく観察されず、これは、Ｃ末端ヒドラジド基のみを介する部位特異的ＰＥＧ化と整合する。この反応を図６に概略的に示す。
【０１０４】
実施例２．３：ＰＥＧ化されたＩＦＮα２ｂの精製
まず、イオン交換を使用して、未反応のピルボイル−ＰＥＧを除去した。ＰＥＧは電荷を帯びておらず、それゆえ、ＰＥＧは、電荷を帯びているタンパク質とは対照的に、イオン交換カラムに結合しないであろう。上記１００μｌのＩＦＮα２ｂ  ＰＥＧ反応液を、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．３、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４）の中で１ｍｌにし、ＡＫＴＡ精製装置システム（ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を介して１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ陰イオン交換カラムに装荷した。このカラムを５〜１０ＣＶのバッファーＡで洗浄して、結合していない未反応のピルボイル−ＰＥＧを除去し、結合したタンパク質を０〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配（２０ＣＶ）にわたって溶出した。分画を、還元条件下にあるＭＥＳランニングバッファー中で、ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分析した（図５Ｂ）。このゲルを二重に流した；１つはクマシーで染色し、他方は、文献（Ｋｕｒｆｕｒｓｔ、１９９２；Ｌｅｅら、２００８）にある方法に基づいて、ＰＥＧについて染色した。簡潔に言えば、このゲルを２０ｍｌの０．１Ｍ  過塩素酸の中で１５分間撹拌し、次いで５ｍｌの５％（質量／体積）塩化バリウム溶液および２ｍｌの０．１Ｍ  ヨウ素に１０分間移し、水中で脱染した。これは、未反応のピルボイル−ＰＥＧは、予想したとおり、カラムに結合しなかったということを示す。所望のＩＦＮα２ｂＰＥＧを含有する分画を、ＶｉｖａＳｐｉｎ２  ３Ｋ  ＭＷＣＯ遠心濃縮器（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））を使用して濃縮した。これを、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に通して流し、ＰＥＧ化されたＩＦＮα２ｂを未反応のＩＦＮα２ｂヒドラジドから分離した。プールした分画を、クマシー染色を用いてＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した（図５Ｃ）。
【０１０５】
実施例２．４：ＩＦＮα２ｂＰＥＧおよびヒドラジド対照の抗ウイルス活性
精製したＩＦＮα２ｂＰＥＧ、ならびにＰＥＧ化された分子と同じ精製および取り扱い工程を経たＩＦＮα２ｂヒドラジド対照の抗ウイルス活性を、ヒトＡ５４９肺癌細胞およびＥＭＣウイルスを用いる細胞変性効果阻害アッセイ（ピービーエル・インターフェロン・ソース（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）によって実施された）を使用して測定した（表Ａ）。ＩＦＮα２ｂヒドラジドの活性は、ＩＦＮα２ｂ標品よりも高かったが、これは、おそらくは標品のＩＦＮα２ｂの場合のような封入体からの再折り畳みではなく、当該折り畳まれた物質の初期精製に起因する。あるいは、例えばエキソプロテアーゼに対するＣ末端の感受性を低下させることにより、Ｃ末端におけるヒドラジド基の存在が有利である可能性があると考えることも可能である。部位特異的にＣ末端ＰＥＧ化されたＩＦＮα２ｂの活性（１８０±６８Ｕ／ｍｇ）は、ＶｉｒａｆｅｒｏｎＰＥＧの不均一なＰＥＧ化された調製物（７７ＭＩＵ／ｍｇ実測値および７０ＭＩＵ／ｍｇ報告値）の２倍を超えている。
【０１０６】
Ｃ末端ＰＥＧ化されたＩＦＮα２ｂの活性は、不均一的にＰＥＧ化されたＶｉｒａｆｅｒｏｎＰＥＧ（７７ＭＩＵ／ｍｇ実測値および７０ＭＩＵ／ｍｇ報告値）の活性よりも著しく高い。
【０１０７】
実施例３：部位特異的にＣ末端ＰＥＧ化されたＩＦＮβ１ｂヒドラジドの生成
実施例３．１：可溶性ＩＦＮβ１ｂヒドラジドのクローニング、発現および精製
付加的なＣ末端グリシンを有するＩＦＮβ１ｂタンパク質配列
ＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲＳＳＮＦＱＳＱＫＬＬＷＱＬＮＧＲＬＥＹＣＬＫＤＲＭＮＦＤＩＰＥＥＩＫＱＬＱＱＦＱＫＥＤＡＡＬＴＩＹＥＭＬＱＮＩＦＡＩＦＲＱＤＳＳＳＴＧＷＮＥＴＩＶＥＮＬＬＡＮＶＹＨＱＩＮＨＬＫＴＶＬＥＥＫＬＥＫＥＤＦＴＲＧＫＬＭＳＳＬＨＬＫＲＹＹＧＲＩＬＨＹＬＫＡＫＥＹＳＨＣＡＷＴＩＶＲＶＥＩＬＲＮＦＹＦＩＮＲＬＴＧＹＬＲＮＧ
をコードするＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現について最適化し、５’  ＮｄｅＩ部位および３’  ＳａｐＩ部位を含有する以下の隣接ＤＮＡ配列を用いて、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成した：
５’−ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ．．．  ［ＩＦＮβ１ｂ配列］  ．．．  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ−３’
【０１０８】
ＮｄｅＩおよびＳａｐＩを用いた、供給されたＤＮＡの消化によりＩＦＮβ１ｂ断片を得た。この断片は、同様に消化したｐＴＸＢ１ベクターに直接ライゲーションすることができた。このｐＴＸＢ１  ＩＦＮβ１ｂ  ＧＬＹ構築物は、ＩＦＮβ１ｂがグリシンを介してＧｙｒＡインテインのＮ末端に連結されており、次にこのＧｙｒＡインテインがキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）のＮ末端に融合されている、融合タンパク質をコードする。これを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）細胞（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））に形質転換し、発現を、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて１８℃で一晩誘導した。細胞を遠心分離によってペレット化し、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦを伴う溶解バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５％  グリセロール、０．１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ  ＮＬ）中で、超音波処理によって溶解した。可溶性分画を、溶解バッファー中、４℃で１．５時間予め平衡化したキチンビーズと混合した。次いで、このビーズを溶解バッファーで、次いでライゲーションバッファー（２００ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４）で十分に洗浄し、キチンビーズ上に固定された精製したＩＦＮβ１ｂ  ＧｙｒＡインテインＣＢ融合タンパク質を得た（図７、レーン２）。
【０１０９】
ライゲーションバッファー中でこれらのビーズを１％  ヒドラジンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡで一晩処理して、ＩＦＮβ１ｂヒドラジドを生成した（図７、レーン３）。ＤＴＴで処理したＩＦＮβ１ｂヒドラジドは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析に関してよりゆっくりと流れるバンドを与え（図７で、レーン３および４を比較）、これは、ジスルフィド結合が回収した化学種の中で形成されかつＤＴＴ処置に際して還元されたことと整合する。Ｎ末端ｍｅｔを含まないＩＦＮβ１ｂの予想される質量＝１９，９５０Ｄａ；実測した質量＝１９，９６４Ｄａ（図８）。ＩＦＮβ１ｂヒドラジドを、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４を伴う３ｍＭ  酢酸  ｐＨ  ３．７中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で精製し、純粋なタンパク質ヒドラジドを得た。ＮＥＭ反応を実施例３．１に記載したようにして行い、タンパク質の折り畳みについて探索した。陽性対照とは対照的に、ＮＥＭとのインキュベーションに際してＩＦＮβ１ｂの質量の増加はなく、これは、ジスルフィド結合が未変化であり、このタンパク質が正しく折り畳まれているということを示す。一定分量を、１μｇのＩＦＮβ１ｂヒドラジドあたり５０μｇのマンニトールとともに凍結乾燥した。これらの一定分量を１０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．４に再溶解し、最終のバッファー組成物、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、１３．７ｍＭ  マンニトール）を得て、ＩＦＮβヒドラジド対照として使用した。
【０１１０】
実施例３．２：ＩＦＮβ１ｂのＰＥＧ化
上記のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５分画中のＩＦＮβ１ｂの濃度を２８０ｎｍでの吸光度から見積もり、２００倍モル過剰のピルボイル−ＰＥＧに加えた。この反応液を４℃で一晩置き、次いで還元条件下にあるＭＥＳランニングバッファー中で、ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分析し、クマシーで染色した（図９）。このＰＥＧ化されたＩＦＮβ１ｂを図１０に概略的に示す。
【０１１１】
実施例３．３：ＰＥＧ化されたＩＦＮβ１ｂの精製
イオン交換を第１工程として使用して、未反応のピルボイル−ＰＥＧを除去した。このＩＦＮβ１ｂ  ＰＥＧ反応液を、バッファーＡ（２５ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ７．４、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４）中で５倍に希釈し、ＡＫＴＡ精製装置システム（ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を介して１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＸＬ陽イオン交換カラムに装荷した。このカラムを５ＣＶのバッファーＡで洗浄して、結合していない未反応のピルボイル−ＰＥＧを除去し、結合したタンパク質を０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ勾配（２０ＣＶ）にわたって溶出した。ヒツジポリクローナル抗ヒトＩＦＮβ一次抗体（ピービーエル・インターフェロン・ソース（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ））およびウサギ抗ヒツジＨＲＰに接合された二次抗体（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用するウエスタンブロットによって、分画を分析した。ＩＦＮβ１ｂＰＥＧを含有する分画を、ＶｉｖａＳｐｉｎ２  ３Ｋ  ＭＷＣＯ遠心濃縮器（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））を使用して濃縮し、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４を伴うＰＢＳ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に通して流し、ＰＥＧ化されたＩＦＮβ２ｂを未反応のＩＦＮβ２ｂヒドラジドから分離した。これらの分画を上記のとおりのウエスタンブロットによって分析し、純粋な分画を濃縮し、一定分量に分け、１μｇのＩＦＮβ１ｂヒドラジドあたり５０μｇのマンニトールとともに凍結乾燥した。
【０１１２】
実施例３．４：ＩＦＮβ１ｂＰＥＧおよびＩＦＮβ１ｂヒドラジドの抗ウイルス活性
精製したＩＦＮβ１ｂヒドラジドおよびＩＦＮβ１ｂＰＥＧの抗ウイルス活性を、ヒトＡ５４９肺癌細胞およびＥＭＣウイルスを用いる細胞変性効果阻害アッセイ（ピービーエル・インターフェロン・ソース（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ））を使用して測定した（図１１）。ＩＦＮβ１ｂヒドラジドの活性は、ＩＦＮβ１ｂ標品の活性よりも低かったが、これは、おそらくは、当該タンパク質の不安定性および当該配合物中に安定化成分がないことに起因する。部位特異的にＣ末端ＰＥＧ化されたＩＦＮβ１ｂは、ヒドラジドよりも大きい活性を示したが、これは、おそらくは、ＰＥＧによってもたらされるタンパク質安定性の増加を反映しており、この活性は、非ＰＥＧ化ＩＦＮβ１ｂ標品の活性と並んでいた。（Ｃ末端ＰＥＧ化されたＩＦＮβ１ｂの活性（３７±１３ＭＩＵ／ｍｇ）は、ＰＥＧ化されていないＩＦＮβ１ｂ標品（３０ＭＩＵ／ｍｇ）に匹敵する）。現在、ＩＦＮβ１ｂの承認されたＰＥＧ化されたバージョンは存在しない。
【０１１３】
本願明細書の中で参照されたすべての文献は、参照により本願明細書に援用したものとする。本発明の記載された実施形態に対する種々の改変および変更は、本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、請求項に係る発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないということを理解されたい。実際、当業者にとっては自明である本発明の実施の記載された態様の種々の改変は、本発明によって包含されるということが意図されている。
【０１１４】
引用文献の一覧
Ｂａｓｕ，Ａ、Ｙａｎｇ、Ｋ．、Ｗａｎｇ，Ｍ．、Ｌｉｕ，Ｓ．、Ｃｈｉｎｔａｌａ，Ｒ．、Ｐａｌｍ，Ｔ．、Ｚｈａｏ，Ｈ．、Ｐｅｎｇ，Ｐ．、Ｗｕ，Ｄ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｈｕａ，Ｊ．、Ｈｓｉｅｈ，Ｍ．Ｃ．、Ｚｈｏｕ，Ｊ．、Ｐｅｔｔｉ，Ｇ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｊａｎｊｕａ，Ａ．、Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．、Ｌｉｕ、Ｊ．、Ｌｏｎｇｌｅｙ、Ｃ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｍｅｈｌｉｇ，Ｍ．、Ｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｖ．、Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｍ．、およびＦｉｌｐｕｌａ，Ｄ．、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ−１ｂ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，ｐｏｔｅｎｃｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏ−ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００６年、第１７巻、６１８−６３０。
Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ，Ｓ．、Ｇｏｄｗｉｎ，Ａ．、Ｂａｌａｎ，Ｓ．、Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｗ．、Ｚｌｏｈ，Ｍ．、およびＳｈａｕｎａｋ，Ｓ．、「Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｂａｓｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２００８年、第６０巻、３−１２頁。
ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｇ．、Ｘｉｎｇ，Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｅ．、Ｗａｎｇ，Ｊ．、Ｚｏｐｆ，Ｄ．、Ｇｏｕｔｙ，Ｄ．Ｌ．、Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｅ．Ｒ．、Ｐａｎｎｅｅｒｓｅｌｖａｍ，Ｋ．、Ｂｒｉｎｋｍａｎ−Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ  ＥＣ、Ｂａｙｅｒ，Ｒ．Ｊ．、Ｔａｒｐ，Ｍ．Ａ．、およびＣｌａｕｓｅｎ，Ｈ．、「ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６年、第１６巻、８３３−８４３頁。
Ｄｈａｌｌｕｉｎ，Ｃ、Ｒｏｓｓ，Ａ．、Ｌｅｕｔｈｏｌｄ，Ｌ．Ａ．、Ｆｏｓｅｒ，Ｓ．、Ｇｓｅｌｌ，Ｂ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．、およびＳｅｎｎ，Ｈ．、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４０  ｋＤａ  ＰＥＧ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ２ａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００５年、第１６巻、５０４−５１７頁。
Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ａ．、Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｔ．Ｍ．、ａｎｄ  Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．、「Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｘｉｍｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．、２００６年、第４５巻、７５８１−７５８４頁。
Ｄｏｏｒｅｓ，Ｋ．Ｊ．、Ｇａｍｂｌｉｎ，Ｄ．Ｐ．、およびＤａｖｉｓ，Ｂ．Ｇ．、「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、第１２巻、６５６−６６５頁。
Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．、Ｃａｐｏｎｅ，Ｉ．、およびＢｅｌａｒｄｅｌｌｉ，Ｆ．、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、２００７年、第８９巻、８８４−８９３頁。
Ｆｉｎｅ，Ｈ．Ａ、Ｗｅｎ，Ｐ．Ｙ．、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ａ．、Ｋｏｗａｌ，Ｊ．、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．、およびＢｌａｃｋ，Ｐ．Ｍ．、「Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  （ＢＧ９０１５）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９７年、第３巻、３８１−３８７頁。
Ｆｏｓｅｒ，Ｓ．、Ｓｃｈａｃｈｅｒ，Ａ．、Ｗｅｙｅｒ，Ｋ．Ａ．、Ｂｒｕｇｇｅｒ，Ｄ．、Ｄｉｅｔｅｌ，Ｅ．、Ｍａｒｔｉ，Ｓ．、およびＳｃｈｒｅｉｔｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ａ  （ＰＥＧＡＳＹＳ）」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、２００３年、第３０巻、７８−８７頁。
Ｆｕｋｕｔｏｍｉ，Ｔ．、Ｎａｋａｍｕｔａ，Ｍ．、Ｆｕｋｕｔｏｍｉ，Ｍ．、Ｉｗａｏ，Ｍ．、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．、Ｈｉｒｏｓｈｉｇｅ，Ｋ．、Ｔａｎａｂｅ，Ｙ．、およびＮａｗａｔａ，Ｈ．、「Ｄｅｃｌｉｎｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｌｏａｄ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ２４  ｈ  ａｆｔｅｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．、２００１年、第３４巻、１００−１０７頁。
Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．、Ｍｏｌｉｎｅｕｘ，Ｇ．、Ｔｒｅｕｈｅｉｔ，Ｍ．、Ｌａｄｄ，Ｄ．、およびＧｅｇｇ，Ｃ．、「Ｍｏｎｏ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２００２年、第５４巻、４７７−４８５頁。
Ｋｕｒｆｕｒｓｔ，Ｍ．Ｍ．、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｉｒｕｄｉｎ  ｂｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２年、第２００巻、２４４−２４８頁。
Ｌｅｅ，Ｄ．Ｌ、Ｓｈａｒｉｆ，Ｉ．、Ｋｏｄｉｈａｌｌｉ，Ｓ．、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｄ．Ｉ．、およびＴｓｖｅｔｎｉｔｓｋｙ，Ｖ．、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ、２００８年、第２８巻、１０１−１１２頁。
Ｍａｒｓａｃ，Ｙ．、Ｃｒａｍｅｒ，Ｊ．、Ｏｌｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ｄ．、Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｋ．、およびＢｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｆ．、「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｌｉｋｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００６年、第１７巻、１４９２−１４９８頁。
Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ｊ．、Ｒｏｉｓｍａｎ，Ｌ．Ｃ、およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．、「Ｎｅｗ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２０００年、第２７５巻、４０４２５−４０４３３頁。
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．、およびＨａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２００２年、第５４巻、４５９−４７６頁。
Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ．Ｍ．、Ｆｉｓｃｅｌｌａ，Ｍ．、Ｌａｍｏｕｓｅ−Ｓｍｉｔｈ，Ａ．、Ｚｅｕｚｅｍ，Ｓ．、およびＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．、「Ａｌｂｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ｂ：  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ」、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年、第２５巻、１４１１−１４１９頁。
Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．およびＭｅｒｏ，Ａ．、「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」、ＢｉｏＤｒｕｇｓ．、２００８年、第２２巻、３１５−３２９頁。
Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓ．、Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ，Ｓ．、Ｇｒａｃｅ，Ｍ．、Ｂａｕｓｃｈ，Ｊ．、Ｂｏｒｄｅｎｓ，Ｒ．、およびＷｙｓｓ，Ｄ．Ｆ．、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、２００２年、第５４巻、５４７−５７０頁。
Ｘｉｅ，Ｊ．およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．、「Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００６年、第７巻、７７５−７８２頁。
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｌｉ，Ｆ．、Ｌｕ，Ｘ．Ｗ．、およびＬｉｕ，Ｃ．Ｆ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｉｏａｃｉｄ／ａｚｉｄｅ  ａｍｉｄａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００９年、第２０巻、１９７−２００頁。
Ｚｈａｏ，Ｈ．、Ｙａｎｇ，Ｋ．、Ｍａｒｔｉｎｅｚ．Ａ．、Ｂａｓｕ，Ａ、Ｃｈｉｎｔａｌａ，Ｒ．、Ｌｉｕ，Ｈ．Ｃ．、Ｊａｎｊｕａ，Ａ、Ｗａｎｇ，Ｍ．、およびＦｉｌｐｕｌａ．Ｄ．、「Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｂｉｃｉｎ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｏｍ  ｍｏｎｏ−  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉ−ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ、２００６年、第１７巻、３４１−３５１頁。
【図１】
2012526789.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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