(57)【要約】ヒトグリコシル化パターンを有するが、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及び／又は糖質基Ｇａｌα−３Ｇａｌを欠く、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子のタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトと同様のグリコシル化パターンを有するが、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及び／又は糖質基Ｇａｌα−３Ｇａｌを欠く、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質又は第ＩＸ因子タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子であり、かつ天然の第ＶＩＩＩ因子のＢドメインを部分的に又は全体的に欠いている天然の第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体である、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
部分的に又は全体的に欠失したＢドメインが、１０〜２５、好ましくは１４〜２０のアミノ酸残基を含むリンカーペプチドによって置き換えられている、請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、組換え第ＶＩＩＩ因子であり、かつ非ヒト哺乳類細胞、特にネズミ細胞において産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも高いフォン・ヴィレブランド因子に対する親和性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質が、組換え第ＶＩＩＩ因子であり、かつ非ヒト哺乳類細胞、特にネズミ細胞において産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも高いフォン・ヴィレブランド因子に対する結合能を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が、組換え第ＶＩＩＩ因子であり、かつ非ヒト哺乳類細胞、特にネズミ細胞において産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも高いフォン・ヴィレブランド因子に対する親和性を有する、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質が、組換え第ＶＩＩＩ因子であり、かつ非ヒト哺乳類細胞、特にネズミ細胞において産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも高いフォン・ヴィレブランド因子に対する結合能を有する、請求項６に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子であり、かつ天然の第ＶＩＩＩ因子のＢドメインを部分的に又は全体的に欠いている天然の第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体である、請求項６及び／又は７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項９】
部分的に又は全体的に欠失したＢドメインが、１０〜２５、好ましくは１４〜２０のアミノ酸残基を含むリンカーペプチドによって置き換えられている、請求項８に記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】
前記タンパク質が、腎臓、膀胱、肝臓、肺、心筋、平滑筋、卵巣、網膜、神経及び胃腸の細胞株からなる群から選択される、ヒト細胞株、特に不死化された細胞株において産生されたものである、前記請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１１】
前記ヒト細胞株が、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３；ＤＳＭ  ＡＣＣ  ３０５；ＥＣＡＣＣ  ｒｅｆ：８５１２０６０２）及び２９３Ｆ（インビトロジェンＲ７９００７）からなる群から特に選択される、ヒト胎児性腎臓細胞株（ＨＥＫ）である、請求項１０に記載の組換えタンパク質。
【請求項１２】
ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３；ＤＳＭ  ＡＣＣ  ３０５；ＥＣＡＣＣ  ｒｅｆ：８５１２０６０２）及び２９３Ｆ（インビトロジェンＲ７９００７）からなる群から選択されるヒト胎児性腎臓細胞株（ＨＥＫ）において前記タンパク質を産生することによって得られる、前記請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１３】
第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子に関連する疾患の治療ための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項１４】
治療有効量で、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質及び薬学上許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィレブランド因子との複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトと同様のグリコシル化パターンを有する、組換えにより産生したヒト第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子の糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は、動物界及び植物界並びに微生物において豊富である。糖タンパク質の糖質部分は、たとえば、細胞間認識、細胞情報伝達（cell signaling）、タンパク質の構造、タンパク質の保護、タンパク質の安定化、及びタンパク質とタンパク質との相互作用に重要な役割を担うような多重機能を有することが示されている。ほとんどの糖タンパク質の糖鎖は、アスパラギン残基の遊離アミノ基に結合するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）（Ｎ−結合型糖質）又はセリン若しくはトレオニン残基のヒドロキシル基に結合するＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（Ｏ−結合型糖質）のいずれかによってタンパク質に結合される。各部位での糖質部分は、複合体構造を形成する幾つかの単糖単位で構成されることが多い。ほとんどの糖タンパク質は、１つの分子に幾つかの異なった糖鎖を含有する。アスパラギン−結合型の糖質の構造には３つの型がある：高マンノース型と複合体型とハイブリッド型である。これらすべてが共通の五糖類のコア、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃを有する。高マンノース型構造では、さらにマンノース単位がこのコアに結合し、複合体型構造では、フコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びシアル酸が一般に見い出される。単糖単位の２以上のアンテナが共通のコアから伸びてもよい。糖鎖のハイブリッド型は高マンノース型及び複合体型の双方のアンテナを含有する。
【０００３】
血友病は、血液の凝固(clotting)又は凝集(coagulation)を制御する生体の能力を損傷する一群の遺伝性の遺伝病である。その最も一般的な形態である血友病Ａでは、凝固第ＶＩＩＩ因子が欠損する。血友病Ｂでは、第ＩＸ因子が欠損する。血友病Ａは男子出生の５，０００〜１０，０００人におよそ１人生じる一方で、血友病Ｂは約２０，０００〜３４，０００人におよそ１人生じる。第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、第ＩＸａ因子が第Ｘ因子を活性型に変換する血液凝固における必須の補因子である。第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子の欠損はそれぞれ、血漿由来の第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子の濃縮物又は組換えにより産生した第ＶＩＩＩ因子と第ＩＸ因子によって治療することができる。第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の濃縮物による治療によって血友病患者の正常な生活がもたらされている。しかしながら、特定の比率の血友病Ａの患者は注入された第ＶＩＩＩ因子産物に対する阻害抗体を発生させ、治療効果の阻害を生じる。近年、ハムスターの細胞株で産生された組換え産物がさらに頻繁に使用されるようになっている。しかしながら、一部の報告は、これらの産物が血漿由来のものよりも阻害物質形成の高い発生率の原因となっていることを示唆しているようである(エティングシャウセン及びクレウズ（Ettingshausen and Kreuz）, 2006;ヘイ（Hay）, 2006)。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子の初期の形態はＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２のように記載されるドメインから成る約３００ｋＤａの単鎖である(ギッシャーら（Gitschier et al.）, 1984;トーレら（Toole et al.）, 1984;ベハーら（Vehar et al.）, 1984; ウッドら（Wood et al.）, 1984)。該タンパク質は血中に分泌される前にプロッセッシングを受け、Ａ１−Ａ２ドメインから成る約２００ｋＤａの重鎖、及びＢドメインの主要部分、並びにＡ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインから成る８０ｋＤａの軽鎖を生じる（ここで完全長第ＶＩＩＩ因子と呼ぶ）。Ｂドメインは、第ＶＩＩＩ因子の凝集活性に無くてもよいことが示されている(アンデルソンら（Andersson et al.）, 1986;ブリンクハウスら（Brinkhous et al.）,1985;ピットマン（Pittman et al.）, 1993)。従って、血友病Ａの治療についての治療用途にＢドメインを欠失した第ＶＩＩＩ因子を使用することが可能である(コーター及びベドロシアン（Courter and Bedrosian）, 2001)。
【０００５】
血液循環では、完全な第ＶＩＩＩ因子は、高分子量タンパク質、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）との堅固な複合体で存在する。ｖＷＦは酵素ではないので、触媒活性を有さない。その主な機能は、ほかのタンパク質、特に第ＶＩＩＩ因子に結合することであり、創傷部位への血小板の付着で重要である。ｖＷＦは、総分子量２０，０００ｋＤａまでの、複数のモノマーから成る大型タンパク質である。血液循環における第ＶＩＩＩ因子の担体タンパク質として、ｖＷＦはタンパク質分解から第ＶＩＩＩ因子を保護し、それによって生体内での第ＶＩＩＩ因子の残存を増加させる。さらに、第ＶＩＩＩ因子へのｖＷＦの結合は免疫系による第ＶＩＩＩ因子の認識に対して保護効果を有し、それによって第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体の発生のリスクを低減することが示唆されている(ゲンサナら（Gensana et al.）, 2001;カラス及びタルプセプ（Kallas and Talpsep）, 2001)。
【０００６】
完全長の第ＶＩＩＩ因子は、Ｎ−結合型グリコシル化について可能な２５の部位で密にグリコシル化されたタンパク質であり、その大半はＢドメインに存在する。これらの部位の６つだけがＡ及びＣのドメイン内に局在する。以前公開されたデータは、第ＶＩＩＩ因子のＡ及びＣのドメインにおける可能な部位の４つがグリコシル化されることを示した。これらは、重鎖におけるＡｓｎ４１及びＡｓｎ２３９、並びに軽鎖におけるＡｓｎ１８１０及びＡｓｎ２１１８であった(レンティングら（Lenting et al.）, 1998;サンドバーグら（Sandberg et al.）, 2001)。Ｏ−結合型グリコシル化についての１３の部位は完全長の組換え第ＶＩＩＩ因子に見い出され、それらのほとんどはＢドメインに局在した(レンティングら（Lenting et al.）, 1998)。Ｂドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子、レファクト（ＲｅＦａｃｔｏ）（登録商標）は、Ｏ−結合型の糖鎖で置換される２つの部位を有することが報告された(サンドバーグら（Sandberg et al.）, 2001)。
【０００７】
ヒトの組換えタンパク質はネズミ細胞株で発現させることが最も多い。このことは、発現にはヒトの遺伝子構築物が使用されるが、タンパク質はネズミのグリコシル化パターンを有することを意味する。そのような例の１つが、これらの細胞株から産生される組換えタンパク質に存在する抗原性糖質基非分枝のＧａｌα１−３Ｇａｌである(ガリリら（Galili et al.）, 1985;ホッケら（Hokke et al.）, 1995)。しかしながら、この糖質基は天然のヒト糖タンパク質には存在しない。別の例は、存在するシアル酸型の組成である。ネズミの細胞株に由来する組換えタンパク質は、シアル酸の主要な形態、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）に加えて、ある比率の抗原性シアル酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）も含有することが報告されている(ホッケら（Hokke et al.）, 1990)。Ｎｅｕ５Ｇｃは、酵素ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の突然変異のために天然のヒトのタンパク質では普通存在しないが、ほかのすべての哺乳類の糖タンパク質には存在する(チョウら（Chou et al.）, 2002)。しかしながら、Ｎｅｕ５Ｇｃは、例えばヒトの癌細胞などの急速に増殖する細胞、及びヒトの胚細胞に存在することが報告されている(カワシマら（Kawashima et al.）, 1993;マークイナら（Marquina et al.）, 1996;タングボラナンタカルら（Tangvoranuntakul et al.）, 2003)。
【０００８】
ほとんどのヒトは、Ｇａｌα１−３Ｇａｌエピトープ及びＮｅｕ５Ｇｃの双方に対する循環抗体を有することが示されている。
【０００９】
今日、治療用途のためのヒト組換え第ＶＩＩＩ因子産物はすべてネズミの細胞株に由来し、それはそれらがネズミのグリコシル化パターンを有することを意味する。従って、抗原性糖質基、非分枝のＧａｌα１−３Ｇａｌが、これらの細胞株から産生された第ＶＩＩＩ因子産物に存在する可能性がある(ヒロナカら（Hironaka et al.）, 1993)。しかしながら、この糖質基は血漿由来のヒト第ＶＩＩＩ因子には存在しない。別の例は、ネズミ細胞株由来の第ＶＩＩＩ因子における抗原性のシアル酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸の存在である。
【００１０】
ヒトの細胞株で組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を製造する方法は先行技術で開示されている。ＵＳ−Ａ−２００６／０９９６８５は、少なくとも１つのアデノウイルスＥ１Ａタンパク質を発現するヒト胎児網膜細胞の重要性に着目して、前記細胞において組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を製造する方法に関する。この手順に従って製造される組換えタンパク質は単離されるヒトの対応物とは異なるヒトのグリコシル化のパターンを有すると言われる。
【００１１】
ＷＯ−Ａ−２００７／００３５８２は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を運ぶ特定のベクターによって安定に形質転換（トランスフェクト）された、血清及びタンパク質を含まない条件下のヒト細胞株における、ヒト組換えタンパク質、特に血液タンパク質の形質転換（トランスフェクション）及び製造のための方法を提供する。
【００１２】
ＵＳ−Ａ−２００３／００７７７５２は、ヒトの第ＶＩＩＩ因子の活性を有するグリコシル化タンパク質に関する。この産物のグリコシル化パターンは、α−（２，６）−結合シアル酸、及びコアであるβ−マンノースに結合した分岐するＮ−アセチルグルコサミンを含有する。
【００１３】
ＥＰ−Ａ−０７７４２６１は、第ＶＩＩＩ因子とｖＷＦとの複合体、及びその治療的価値を開示する。
【００１４】
モレキュラー・バイオテクノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３４巻（Ｖｏｌ．３４），２００６，１６５−１７８のビー・メイ（Ｂ．Ｍｅｉ）；ジェネティクス・アンド・モレキュラーリサーチ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）７（２）：３１４−３２５（２００８）のブイ・ピカンコ‐カストロ（Ｖ．Ｐｉｃａｎｃｏ−Ｃａｓｔｒｏ）ら；ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ），１２７，５６８−５７５のエム・エイチ・ロドリゲズ（Ｍ．Ｈ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）；グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），第１８巻（ｖｏｌ．１８）ｎｏ．７，ｐｐ．５２６−５３９のジー−シーエイチ・ギル（Ｇ．−Ｃｈ．Ｇｉｌ）並びにＷＯ−Ａ−２００８／０９２６４３は、ヒト細胞における組換えの第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子の製造を開示している。
【００１５】
治療に使用する際、組換えタンパク質の免疫原性を最小化するために、ヒトのグリコシル化パターンを有する組換えヒト第ＶＩＩＩ因子の産物及び組換えヒト第ＩＸ因子の産物が望ましい。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、ヒトと同様のグリコシル化パターンを有する組換えのヒト第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子タンパク質に関する。該タンパク質は、シアル酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及び／又は糖質基Ｇａｌα−３Ｇａｌを欠く。該タンパク質はまた、非哺乳類細胞株で産生された対応する組換えタンパク質よりもフォン・ヴィレブランド因子に対して良好な結合を示す。ヒトのグリコシル化パターンは、機能特性を改善し、及び／又は免疫原性を減らすので、治療に使用する際、タンパク質に有益な影響を与える。
【００１７】
本発明はまた、タンパク質が、非哺乳類細胞株で産生された対応する組換えタンパク質よりもフォン・ヴィレブランド因子に対して良好な結合を示す、ヒトのグリコシル化パターンを有する組換えヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質に関する。
【００１８】
さらなる実施形態は、以下の記載及びその全体が本明細書に組み入れられる添付のクレームから明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｖＷＦの表面に渡る３種のバッチ、ヒト−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩとネズミ−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩＸとネズミ−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩＹの１ＩＵのＦＶＩＩＩ：Ｃ／ｍＬの２分間注入のセンサーグラムを示す図である。注入はすべてトリプリケート(triplicates)で行った。明確にするために、各ＦＶＩＩＩ分子について１回の注入のみが示されている。応答はすべて注入の終了で最高の応答を有するＦＶＩＩＩ分子の応答に対して標準化した。
【図２】異なったｒｈＦＶＩＩＩ産物を１ＩＵ／ｍＬ注入の終了の後１０秒での標準偏差を伴った標準化された応答を示す図である。ヒト−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩのバーは３つのヒト−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩのバッチの平均の応答を表す。応答はすべて注入の終了後１０秒での最高の応答を有するＦＶＩＩＩ分子の応答に対して標準化した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明を説明する前に、本発明の範囲は添付のクレーム及びその同等物によってのみ限定されるので、本明細書で採用される用語は、特定の実施態様のみを記載する目的で使用され、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。
【００２１】
この明細書及び添付のクレームで使用される場合、単数形態「不定冠詞（ａ）」、「不定冠詞（ａｎ）」及び「定冠詞（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に記載しない限り、複数の対象を含む。
【００２２】
また、用語「約」は、適用可能な場合、与えられる値の＋／−２％の偏差、好ましくは、数値の＋／−５％、最も好ましくは＋／−１０％を示すために用いられる。
【００２３】
本発明の背景において、「欠く」という用語は、特定の特性又は特徴がないこと、並びに、たとえば、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（パルスアンペロメトリック検出による高速アニオン交換クロマトグラフィ）のような、しかしこれに限定されない標準の液体クロマトグラフィ法で検出可能ではない特定の特性又は特徴がないことを意味する。
【００２４】
本発明の背景において、「シアル酸」という用語は、９炭素のカルボキシル化糖類のファミリーの任意のメンバーに関する。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸(N-acetyl-neuraminic acid (2-keto-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulopyranos-1-onic acid)（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ又はＮＡＮＡと略されることが多い）である。ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されている、Ｎ−グリコリルノイラミン酸(N-glycolyl-neuraminic acid)（Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕＧＣ）である。
【００２５】
本発明の背景において、「親和性」という用語は、それによって特定の原子又は分子が凝集する又は結合する傾向を有する現象に関する。たとえば、リガンドとタンパク質との間の親和性、すなわち、リガンドがどれだけ強固に特定のタンパク質に結合するのかを記載するために、平衡解離定数（ＫＤ）が一般に用いられる。ＫＤはモル単位（Ｍ）を有し、それは、特定のタンパク質の結合部位が半分占有されるリガンドの濃度、すなわち、結合したリガンドを伴うタンパク質の濃度が結合したリガンドを伴わないタンパク質の濃度と等しいリガンドの濃度に相当する。ＫＤが小さければ小さいほど、リガンドは強固に結合し、又はリガンドとタンパク質との間の親和性が高い。たとえば、ナノモル（ｎＭ）のＫＤを有するリガンドは、マイクロモル（μＭ）のＫＤを有するリガンドよりも特定のタンパク質により強固に結合する。
【００２６】
本発明の背景において、「結合能」という用語は、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子がフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）に結合することができる程度に関係し、すなわち、それは、ｖＷＦに結合する能力を有する産物における第ＶＩＩＩ因子の分子の数に関係する。結合能は、当業者に周知の方法によって推定することができる。
【００２７】
本発明の背景において、「不死化ヒト細胞株」という用語は、生物体から直接採取された一次細胞ではないヒト細胞を指す。特に、それは、適切な新鮮培地及び空間を前提として無限に増殖し、ヘイフリック限界(Hayflick limit)（すなわち、テロメアが決定的な長さに達したために停止する以前に細胞が分裂する回数）から免れた永続的に確立された細胞培養物を指す。
【００２８】
本発明は、新規の組換えヒト第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子の糖タンパク質を提供する。本発明の組換えにより産生される第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子のタンパク質がヒト細胞で産生されるということは、該タンパク質がヒトと同様のグリコシル化パターンを有することを意味する。従って、当業者はヒトの第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子がヒトのグリコシル化パターンを示すことを期待するであろう。
【００２９】
しかしながら、驚くべきことに、本発明の組換えにより産生される第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子タンパク質は、抗原性のシアル酸Ｎ−グリコリルノイラミン酸及び／又は抗原性の糖質基Ｇａｌα−３Ｇａｌを欠くことが見い出されている。ヒト癌細胞又は急速に増殖するヒト胎児細胞は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現することが分かっているので、それらは、ヒト不死化胎児細胞株で産生されたから、組換えにより産生される第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子タンパク質はＮ−グリコリルノイラミン酸を有することが予想された。この特性及び／又は抗原性の糖質基Ｇａｌα−３Ｇａｌの欠如及び組換え第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子タンパク質の全体的なヒトのグリコシル化パターンは、それが免疫原性を減らし、かつタンパク質の機能的特性を改善することから、産物に有益な影響を有することが予想されるであろう。組換え第ＶＩＩＩ因子のそのような特性の１つは、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）へのさらに良好な結合である。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、ヒトのグリコシル化パターンを有し、かつ抗原性のＮ−グリコリルノイラミン酸及び／又はＧａｌα１−３Ｇａｌを欠く組換え第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に関する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、抗原性のＮ−グリコリルノイラミン酸及び／又はＧａｌα１−３Ｇａｌを欠き、たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞及び幼若ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞などのネズミ細胞、しかし、これらに限定されない非ヒト哺乳類細胞で産生される組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質よりも良好なｖＷＦへの結合を示す組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質に関する。さらに良好な結合は、非ヒト哺乳類細胞で産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも高いヒトｖＷＦへの親和性に関係する。特定の実施形態の１つでは、ｖＷＦへの親和性は、非ヒト哺乳類細胞で産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも少なくとも約１０〜６０％高く、好ましくは約２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％高い。
【００３２】
親和性は平衡解離定数（ＫＤ）によっても推定することができる。従って、本発明のさらに別の実施形態では、組換えタンパク質とｖＷＦの間の親和性は、たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞及び幼若ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞などのネズミ細胞、しかし、これらに限定されない非ヒト哺乳類細胞で産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも低いＫＤを有する。
【００３３】
さらに、ｖＷＦへのさらに良好な結合は結合能に関係する。従って、本発明は、たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞及び幼若ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞などのネズミ細胞、しかし、これらに限定されない非ヒト哺乳類細胞で産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも高いｖＷＦへの結合能を有する組換えにより産生される第ＶＩＩＩ因子糖タンパク質に関する。特定の実施形態の１つでは、ｖＷＦへの結合能は同一実験で調べたとき、非ヒト哺乳類細胞で産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも少なくとも約１０〜６０％高く、好ましくは約２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％高い。
【００３４】
抗原性のシアル酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸及び／又は抗原性の糖質基Ｇａｌα−３Ｇａｌを欠いている本発明に係る組換え第ＶＩＩＩ因子は、一実施形態では、天然の第ＶＩＩＩ因子のＢドメインを部分的に又は全体的に欠いている天然の第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体である。一実施形態では、欠失Ｂドメインは、１０〜２５、好ましくは１４〜２０のアミノ酸残基を含むリンカーペプチドによって置き換えられる。Ｂドメイン欠失誘導体及びリンカーについてのさらなる詳細については、その全体が本明細書に組み入れられるＷＯ−Ａ−０１／７０９６８及びＷＯ−Ａ−２００７／００３５８２を参照のこと。
【００３５】
従って、本発明は、ヒトと同様のグリコシル化パターンを有し、かつたとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞及び幼若ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞などのネズミ細胞、しかし、これらに限定されない非ヒト哺乳類細胞で産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも良好なｖＷＦへの結合を有する組換え第ＶＩＩＩ因子糖タンパク質に関する。ｖＷＦへのさらに良好な結合はｖＷＦへの親和性及び上記で定義されたような結合能に関係する。
【００３６】
一実施形態では、ヒトと同様のグリコシル化パターンを有し、かつ非ヒト哺乳類細胞で産生される組換え第ＶＩＩＩ因子よりも良好なヒトｖＷＦへの結合を有する組換えタンパク質は、天然の第ＶＩＩＩ因子のＢドメインを部分的に又は全体的に欠いている天然の第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体である。一実施形態では、欠失Ｂドメインは、１０〜２５、好ましくは１４〜２０のアミノ酸残基を含むリンカーペプチドによって置き換えられる。Ｂドメイン欠失誘導体及びリンカーについてのさらなる詳細については、その全体が本明細書に組み入れられるＷＯ−Ａ−０１／７０９６８及びＷＯ−Ａ−２００７／００３５８２を参照のこと。
【００３７】
上記で定義されたような組換えヒト第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子の糖タンパク質は、ヒト細胞株、好ましくは不死化されたヒト細胞株において産生される。そのような細胞株の非限定例は、腎臓、膀胱、肝臓、肺、心筋、平滑筋、卵巣、網膜、神経及び胃腸の細胞株である。
【００３８】
特定の実施形態の１つでは、本発明のタンパク質は、不死化されたヒト胎児性腎臓細胞株（ＨＥＫ）において産生される。そのような細胞株の非限定例は、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３；ＤＳＭ  ＡＣＣ  ３０５；ＥＣＡＣＣ  ｒｅｆ：８５１２０６０２）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１２６８；ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２４９４）及びＨＥＫ２９３Ｆ（インビトロジェンＲ７９００７）である。特定の実施形態の１つでは、ヒト細胞株はＨＥＫ２９３Ｆ（インビトロジェンＲ７９００７）である。
【００３９】
さらに別の実施形態では、本発明は、たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞及び幼若ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞などのネズミ細胞、しかし、これらに限定されない非ヒト哺乳類細胞で産生されるヒト組換え第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に比べて低い免疫原性を有する上記で定義されたような組換えタンパク質に関する。
【００４０】
本発明はまた、薬学上許容可能な賦形剤との混合物において上記で定義されたような本発明のタンパク質を含む医薬組成物にも関する。医薬組成物は、治療有効量で組換え第ＶＩＩＩ又はＩＸ因子タンパク質を含む。投与量及び治療期間は、第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子の欠損の重症度、出血の位置及び程度、並びに患者の臨床症状に左右される。個々の患者は第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子への応答で異なってもよく、異なったレベルでの生体内の回復を達成してもよく、異なった半減期を示してもよい。投与される用量は当該技術の当業者によって患者の臨床的な応答に対して漸増されるべきである。阻害物質の存在下では、さらに高い用量又は適切な特定の治療が求められてもよい。投与される第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の単位数は、国際単位（ＩＵ）で表され、それは、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子産物についての現在のＷＨＯ基準に関係する。血漿における第ＶＩＩＩ因子の活性は、パーセンテージ（正常なヒト血漿に対する）又は国際単位（血漿における第ＶＩＩＩ因子についての国際基準に対する）のいずれかで表される。
【００４１】
第ＶＩＩＩ因子活性の１国際単位（ＩＵ）は、正常なヒト血漿１ｍＬにおける第ＶＩＩＩ因子活性の量に概ね相当する。第ＶＩＩＩ因子の必要とされる投与量の算出は、体重ｋｇ当たり１ＩＵの第ＶＩＩＩ因子が血漿の第ＶＩＩＩ因子活性を約２ＩＵ／ｄＬ上げるという実験による知見に基づく。
【００４２】
血友病Ａの治療における投与される用量及び適用頻度は、個々の患者の臨床効果に依存する。通常の予防的用量は、２〜３日ごとに２０〜４０ＩＵ／体重ｋｇである。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子に関連する疾患、たとえば血友病Ａ及び血友病Ｂの治療のための方法であって、上記で定義したような組換えタンパク質が、治療上許容可能な量で、薬学上許容可能な賦形剤と共に投与される、方法に関する。薬学上許容可能な賦形剤は当業者に周知である。
【００４４】
本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子に関連する疾患、たとえば血友病Ａ及び血友病Ｂの治療のための、上記で定義したような組換えタンパク質の使用にも関する。本発明に係る組換えタンパク質は、たとえば、皮下又は静脈内への注射及び点滴、しかし、これらに限定されない当該治療分野における標準方法によって投与することができる。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子に関連する疾患、たとえば血友病Ａ及び血友病Ｂの治療のための薬剤を製造するための上記で定義したような組換えタンパク質の使用に関する。たとえば、皮下又は静脈内への注射及び点滴、しかし、これらに限定されない当該治療分野における標準方法によって薬物を投与することができる。
【００４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、タンパク質が組換え第ＶＩＩＩ因子である上記で定義したようなタンパク質とフォン・ヴィレブランド因子との間の複合体に関する。複合体は本発明のタンパク質とｖＷＦとの間の改善された結合親和性を有し、生体内での組換え第ＶＩＩＩ因子の延長された残存をもたらす。
【００４７】
今や、以下の非限定の実施例において本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００４８】
ＥＰ−Ａ−１７３９１７９(シュロダーら（Schroeder et al.）, 2007b;シュロダーら（Schroeder et al.）, 2007a)に記載された方法に従ってヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｆにおいて、ヒトのＢドメインを欠失した第ＶＩＩＩ因子、ヒト細胞株組換えヒト第ＶＩＩＩ因子（ヒト−ｃｌ−ｒｈＦＶＩＩＩ）を産生した。精製工程は、５つのクロマトグラフィ工程から成り、高純度の第ＶＩＩＩ因子タンパク質を生成した(ウィンゲら（Winge et al.）, 2008)。
【００４９】
０．１Ｍの塩酸を用いて、中に１０μｇのケトデオキシノヌロソン酸（ketodeoxynonulosonic acid）（ＫＤＮ；内部標準）を加えた精製した第ＶＩＩＩ因子タンパク質のシアル酸（４００〜６００μｇ）を酸加水分解した（８０℃で１時間）。ドウェックスカチオン交換クロマトグラフィ(Dowex cation exchange chromatography)を用いて生成物を精製し、得られた溶液を凍結乾燥し、水に再懸濁してＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって分析した。それぞれ５μｇのＮｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕＧｃ、及び１０μｇのＫＤＮを含有する標準混合物、並びに１０μｇのＫＤＮによる試薬ブランクを試料と並行して加水分解し、分析した。
【００５０】
表１及び表２は、ヒト−ｃｌ−ｒｈＦＶＩＩＩの２つの試料Ａ及びＢのＮｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕＧｃの分析の結果を示す。シアル酸型ＮｅｕＧｃは検出されないことが示されている。Ｎｅｕ５Ａｃのみが見出された。
【００５１】
【表１】
2012500250.tif 000002
【００５２】
【表２】
2012500250.tif 000003
【実施例２】
【００５３】
ビアコア３０００（Ｂｉｏｃｏｒｅ３０００）機器による表面プラスモン共鳴を用いてヒトのフォン・ヴィレブランド因子へのヒト−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩの結合を分析した。ネズミ細胞株に由来する組換え第ＶＩＩＩ因子産物Ｘ及びＹ（ネズミ−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩＸとＹ）を比較物として用いた。
【００５４】
ＣＭ５センサーチップのカルボキシメチル化したデキストランに１級アミンを介してフォン・ヴィレブランド因子を固定した。結合データを全体的に試料相互作用モデルにフィットさせ、動力学的パラメータ及び親和性を得た。フォン・ヴィレブランド因子への結合及び親和性における動力学を解析した。さらに、ほかの組換え第ＶＩＩＩ因子産物と比較したフォン・ヴィレブランド因子に結合するヒトｃｌ−ｒｈＦＶＩＩＩの能力の定量測定を得た。
【００５５】
表３は、ネズミ−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩ生成物Ｘ及びＹと比較したヒト−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩについて得られた動力学的パラメータ及び親和性を以下に示す。ネズミ−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩ産物よりもヒト−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩはフォン・ヴィレブランド因子に対して約５０〜６０％有意に高い親和性を有することが示されている。
【００５６】
【表３】
2012500250.tif 000004
ｎ＝結合分析の数
【００５７】
図１及び図２は、ネズミ−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩ産物Ｘ及びＹと比較したヒト−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩのフォン・ヴィレブランド因子に結合する能力の定量的測定の結果を示す。ｍＬ当たり１国際単位の第ＶＩＩＩ因子活性の濃度にて、固定されたフォン・ヴィレブランド因子の同一表面に渡って２分間、各ＦＶＩＩＩ産物を注入した。結果は、ネズミ−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩＩ産物の場合よりも有意に大きな部分（約４０％多い）のヒト−ｃｌ ｒｈＦＶＩＩがフォン・ヴィレブランド因子に結合することができることを示している。
【００５８】
本明細書では特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは説明のみを目的として例により行われたのであって、あとに続く添付のクレームの範囲に関して限定することを意図するものではない。特に、クレームで定義されるような本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明に対して種々の置換、代替及び改変を行ってもよいことが発明者によって意図されている。
【００５９】
（参考文献）
アンダーソン・エル・オー、フォースマン・エヌ、フアング・ケー、ラルセン・ケー、ランディン・エー、パブル・ビー、サンドバーグ・エイチ、セウェリン・ケー、及びスマート・ジェー（Andersson,L.O., Forsman,N., Huang,K., Larsen,K., Lundin,A., Pavlu,B., Sandberg,H., Sewerin,K., and Smart,J.） (1986). ヒト第ＶＩＩＩ因子の単離及び性状分析：市販の第ＶＩＩＩ因子濃縮物、クリオプレシピテート及び血漿における分子形態(Isolation and characterization of human factor VIII: molecular forms in commercial factor VIII concentrate, cryoprecipitate, and plasma)。米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A) 83, 2979-2983.
【００６０】
ブリンクハウス・ケー・エム、サンドバーグ・エイチ、ガリス・ジェー・ビー、マトソン・シー、パーム・エム、グリッグス・ティー、及びリード・エム・エス(Brinkhous,K.M., Sandberg,H., Garris,J.B., Mattsson,C., Palm,M., Griggs,T., and Read,M.S.) (1985). 精製されたヒト第ＶＩＩＩ因子凝血原タンパク質：血友病及びフォン・ヴィレブランド病のイヌへの点滴後の比較止血反応(Purified human factor VIII procoagulant protein: comparative hemostatic response after infusions into hemophilic and von Willebrand disease dogs.)。米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A） 82, 8752-8756.
【００６１】
チョウ・エイチ・エイチ、ハヤカワ・ティー、ディアズ・エス、クリングス・エム、インドリアティ・イー、リーキイ・エム、パアボ・エス、サッタ・ワイ、タカハタ・エヌ、及びバリキ・エー（Chou,H.H., Hayakawa,T., Diaz,S., Krings,M., Indriati,E., Leakey,M., Paabo,S., Satta,Y., Takahata,N., and Varki,A.） (2002). ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼの不活化はヒトの進化中、脳の拡大に先立って生じた(Inactivation of CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase occurred prior to brain expansion during human evolution.)。米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A) 99, 11736-11741.
【００６２】
カーター・エス・ジー及びベドロシアン・シー・エル(Courter,S.G. and Bedrosian,C.L.) (2001). あらかじめ治療されていない患者におけるＢドメイン欠失組換え第ＶＩＩＩ因子の臨床的評価（Clinical evaluation of B-domain deleted recombinant factor VIII in previously untreated patients.）。セミナー・イン・ヘマトロジー（Semin. Hematol.） 38, 52-59.
【００６３】
エティングシャウセン・シー・イー及びクレウズ・ダブリュ(Ettingshausen,C.E. and Kreuz,W.) (2006). 阻害物質発生に関する組換え生成物対血漿由来生成物、特に無処理のＶＷＦを伴うもの(Recombinant vs. plasma-derived products, especially those with intact VWF, regarding inhibitor development.)。血友病（Haemophilia.）12 付録（Suppl）6, 102-106.
【００６４】
ガリリ・ユー、マッチャー・ビー・エー、ブエラー・ジェー、及びショヘット・エス・ビー(Galili,U., Macher,B.A., Buehler,J., and Shohet,S.B.) (1985). ヒトの天然の抗−α−ガラクトシルＩｇＧ。ＩＩ．α(１----３)-結合型ガラクトース残基の特異的認識(Human natural anti-alpha-galactosyl IgG. II. The specific recognition of alpha (1----3)-linked galactose residues.)。J. Exp. Med. 162, 573-582.
【００６５】
ゲンサナ・エム、アルティセント・シー、アズナー・ジェー・エー、カサナ・ピー、ヘルナンデス・エフ、ジョークエラ・ジェー・アイ、マガロン・エム、マソット・エム、及びプイグ・エル（Gensana,M., Altisent,C., Aznar,J.A., Casana,P., Hernandez,F., Jorquera,J.I., Magallon,M., Massot,M., and Puig,L.） (2001). ヒト第ＶＩＩＩ因子阻害物質の第ＶＩＩＩ因子との反応性におけるフォン・ヴィレブランド因子の影響(Influence of von Willebrand factor on the reactivity of human factor VIII inhibitors with factor VIII.)。血友病（Haemophilia.）7, 369-374.
【００６６】
ギッチャー・ジェー、ウッド・ダブリュ・アイ、ゴラルカ・ティー・エム、ウィオン・ケー・エル、チェン・イー・ワイ、イートン・ディー・エイチ、ベハー、ジー・エー、カポン・ディー・ジェー、及びラウン・アール・エム(Gitschier,J., Wood,W.I., Goralka,T.M., Wion,K.L., Chen,E.Y., Eaton,D.H., Vehar,G.A., Capon,D.J., and Lawn,R.M.)(1984). ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子の性状分析(Characterization of the human factor VIII gene.)。ネイチャー（Nature）312, 326-330.
【００６７】
ヘイ・シー・アール(Hay,C.R.)(2006). 第ＶＩＩＩ因子阻害物質の疫学(The epidemiology of factor VIII inhibitors.)。血友病（Haemophilia.）12 付録（Suppl） 6, 23-28.
【００６８】
ヒロナカ・ティー、フルカワ・ケー、エスモン・ピー・シー、ヨコタ・ティー、ブラウン・ジェー・イー、サワダ・エス、フォーネル・エム・エー、カトー・エム、ミナガ・ティー、及びコバタ・エー(Hironaka,T., Furukawa,K., Esmon,P.C., Yokota,T., Brown,J.E., Sawada,S., Fournel,M.A., Kato,M., Minaga,T., and Kobata,A.) (1993). ブタ第ＶＩＩＩ因子の糖鎖の構造的検討：組織及び種に特異的な第ＶＩＩＩ因子のグリコシル化(Structural study of the sugar chains of porcine factor VIII--tissue- and species-specific glycosylation of factor VIII.)。アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch. Biochem. Biophys.) 307, 316-330.
【００６９】
ホッケ・シー・エイチ、バーグワーフ・エー・エー、バン・デデム・ジー・ダブリュ、カメルリング・ジェー・ピー、及びブリエジェンタルト・ジェー・エフ(Hokke,C.H., Bergwerff,A.A., Van Dedem,G.W., Kamerling,J.P., and Vliegenthart,J.F.)(1995). チャイニーズハムスター卵巣細胞で発現された組換えヒトエリスロポイエチンのシアリル化されたＮ−結合型とＯ−結合型の糖鎖の構造的分析。二量体Ｎ−アセチルラクトサミン単位のシアリル化パターンと分枝の位置(Structural analysis of the sialylated N- and O-linked carbohydrate chains of recombinant human erythropoietin expressed in Chinese hamster ovary cells. Sialylation patterns and branch location of dimeric N-acetyllactosamine units.)。ヨーロピアン・ジャーアナル・オブ・バイオケミストリー(Eur. J. Biochem.) 228, 981-1008.
【００７０】
ホッケ・シー・エイチ、バーグワーフ・エー・エー、バン・デデム・ジー・ダブリュ、カメルリング・ジェー・ピー、及びブリエジェンタルト・ジェー・エフ(Hokke,C.H., Bergwerff,A.A., Van Dedem,G.W., van,O.J., Kamerling,J.P., and Vliegenthart,J.F.) (1990). チャイニーズハムスター卵巣細胞で発現された組換えヒト糖タンパク質のシアリル化された糖鎖は微量のＮ−グリコリルノイラミン酸を含有する(Sialylated carbohydrate chains of recombinant human glycoproteins expressed in Chinese hamster ovary cells contain traces of N-glycolylneuraminic acid.)。フェブス・レター(FEBS Lett.) 275, 9-14.
【００７１】
カラス・エー及びタルプセプ・ティー(Kallas,A. and Talpsep,T.) (2001). 第ＶＩＩＩ因子濃縮物におけるフォン・ヴィレブランド因子は、血友病Ａ患者の第ＶＩＩＩ因子抗体による中和に対して保護する(von Willebrand factor in factor VIII concentrates protects against neutralization by factor VIII antibodies of haemophilia A patients.)。血友病(Haemophilia.) 7, 375-380.
【００７２】
カワシマ・アイ、オザワ・エイチ、コタニ・エム、スズキ・エム、カワノ・ティー、ゴミブチ・エム、及びタイ・ティー(Kawashima,I., Ozawa,H., Kotani,M., Suzuki,M., Kawano,T., Gomibuchi,M., and Tai,T.) (1993). ヒト黒色腫細胞におけるガングリオシド発現の性状分析：免疫学的及び生化学的な分析(Characterization of ganglioside expression in human melanoma cells: immunological and biochemical analysis.)。ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochem. 114, 186-193.
【００７３】
レンティング・ピー・ジェー、バン・モウリク・ジェー・エー、及びマーテンス・ケー(Lenting,P.J., van Mourik,J.A., and Mertens,K.)(1998). その構造と機能の見地からの凝集第ＶＩＩＩ因子の生活環(The life cycle of coagulation factor VIII in view of its structure and function.)。ブラッド（Blood） 92, 3983-3996.
【００７４】
マルクイナ・ジー、ワキ・エイチ、フェルナンデス・エル・イー、コン・ケー、カー・エー、バリエンテ・オー、ペレズ・アール、及びアンドー・エス(Marquina,G., Waki,H., Fernandez,L.E., Kon,K., Carr,A., Valiente,O., Perez,R., and Ando,S.)(1996). ヒト乳癌で発現されるガングリオシド(Gangliosides expressed in human breast cancer.)。キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 56, 5165-5171.
【００７５】
ピットマン・ディー・ディー、アルダーマン・イー・エム、トムキンソン・ケー・エヌ、ワング・ジェー・エイチ、ギルス・エー・アール、及びカウフマン・アール・ジェー(Pittman,D.D., Alderman,E.M., Tomkinson,K.N., Wang,J.H., Giles,A.R., and Kaufman,R.J.)(1993). Ｂドメインを欠失した第ＶＩＩＩ因子の生化学的、免疫学的及び生体内の機能的な性状分析(Biochemical, immunological, and in vivo functional characterization of B-domain-deleted factor VIII.)。ブラッド(Blood 81), 2925-2935.
【００７６】
サンドバーグ・エイチ、アルムステッド・エー、ブランド・ジェー、カストロ・ブイ・エム、グレイ・イー、ホルムクイスト・エル、ルーウィン・エム、オスワルドソン・ユー、ミカエルソン・エム、ジャンコウスキ・エム・エー、ボンド・エム、及びスコブル・エイチ・エー(Sandberg,H., Almstedt,A., Brandt,J., Castro,V.M., Gray,E., Holmquist,L., Lewin,M., Oswaldsson,U., Mikaelsson,M., Jankowski,M.A., Bond,M., and Scoble,H.A.)(2001)Ｂドメインを欠失した組換え第ＶＩＩＩ因子の構造的な及び機能的な性状分析(Structural and functional characterization of B-domain deleted recombinant factor VIII.)。セミナー・イン・ヘマトロジー(Semin. Hematol.) 38, 4-12.
【００７７】
シュロダー・シー、ウェグマン・シー、及びディング・エイチ(Schroeder, C., Wegmann, C., and Ding, H.)ヒト細胞株における組換えヒトタンパク質の無血清での安定な形質転換及び産生(Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human celllines.)。05105965.7[EP1739179A1]. 2007b. 2005b. 文献種類：特許(Ref Type:Patent)
【００７８】
シュロダー・シー、ウェグマン・シー、及びディング・エイチ(Schroeder, C., Wegmann, C., and Ding, H.)ヒト細胞株における組換えヒトタンパク質の無血清で安定な形質転換及び産生(Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human celllines.)。PCT/EP2006/063705. 2007a. 2005a. 文献種類：特許(Ref Type:Patent)
【００７９】
タングボラナンタカル・ピー、ガグネウクス・ピー、ディアズ・エス、バードー・エム、バルキ・エヌ、バルキ・エー、及びミュクモア・イー(Tangvoranuntakul,P., Gagneux,P., Diaz,S., Bardor,M., Varki,N., Varki,A., and Muchmore,E.)(2003). 免疫原性の非ヒト食物シアル酸のヒト摂取及び取り込み(Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.)。米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A） 100, 12045-12050.
【００８０】
トーレ・ジェー・ジェー、ノプフ・ジェー・エル、ウズネイ・ジェー・エム、サルツマン・エル・エー、ブエッカー・ジェー・エル、ピットマン・ディー・ディー、カウフマン・アール・ジェー、ブラウン・イー、シューメイカー・シー、オール・イー・シー(Toole,J.J., Knopf,J.L., Wozney,J.M., Sultzman,L.A., Buecker,J.L., Pittman,D.D., Kaufman,R.J., Brown,E., Shoemaker,C., Orr,E.C., and .) (1984). ヒト抗血友病因子をコードするｃＤＮＡの分子クローニング(Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor.)。ネイチャー（Nature）312, 342-347.
【００８１】
ベハー・ジー・エー、キイト・ビー、イートン・ディー、ロドリゲス・エイチ、オブリエン・ディー・ピー、ロトブラット・エフ、オパーマン・エイチ、ケック・アール、ウッド・ダブリュ・アイ、ハーキンス、アール・エヌ(Vehar,G.A., Keyt,B., Eaton,D., Rodriguez,H., O'Brien,D.P., Rotblat,F., Oppermann,H., Keck,R., Wood,W.I., Harkins,R.N., and .) (1984). ヒト第ＶＩＩＩ因子の構造(Structure of human factor VIII.)。ネイチャー(Nature) 312, 337-342.
【００８２】
ウィンゲ・エス、ジェルンベルグ・エム、ギルジャム・ジー、エリクソン・ユー、及びボーグバル・シー(Winge, S., Jernberg, M., Gilljam, G., Ericsson, U., and Borgvall, C.) 凝集第ＶＩＩＩ因子の精製方法(A process of purifying coagulation factor VIII.)。 08 158 893.1. 2008.文献種類：特許(Ref Type: Patent)
【００８３】
ウッド・ダブリュ・アイ、カプソン・ディー・ジェー、シモンセン・シー・シー、イートン・ディー・エル、ギシュエール・ジェー、キイト・ビー、シーバーグ・ピー・エイチ、スミス・ディー・エイチ、ホリングシェッド・ピー、ウィオン・ケー・エル(Wood,W.I., Capon,D.J., Simonsen,C.C., Eaton,D.L., Gitschier,J., Keyt,B., Seeburg,P.H., Smith,D.H., Hollingshead,P., Wion,K.L., and .) (1984). 組換えＤＮＡクローンからの活性のあるヒト第ＶＩＩＩ因子の発現(Expression of active human factor VIII from recombinant DNA clones.)。ネイチャー(Nature) 312, 330-337.
【図１】
2012500250.tif 000005
【図２】
2012500250.tif 000006
【国際調査報告】
2012500250.tif 000007
2012500250.tif 000008
2012500250.tif 000009