(57)【要約】本発明は一般に、候補免疫原を試験するのに適した動物モデル、特に膜近接外部領域（ＭＰＥＲ）ＨＩＶ−Ｉの広域中和抗体の重鎖および軽鎖を発現するノックインマウス、ならびにそれを用いて候補免疫原をスクリーニングする方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化トランスジェニックマウスであって、前記マウスのゲノムはヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖または軽鎖の可変部をコードする核酸配列を含み、その際、前記核酸配列は、前記核酸配列が発現して前記ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の前記重鎖または軽鎖の可変部が産生されるように作動可能な状態でプロモーターに結合して前記ゲノム内に存在するマウス。
【請求項２】
前記ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体が２Ｆ５である、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体が４Ｅ１０である、請求項１に記載のマウス。
【請求項４】
前記核酸配列が、ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖可変部をコードする、請求項１に記載のマウス。
【請求項５】
前記核酸配列が、ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の軽鎖可変部をコードする、請求項１に記載のマウス。
【請求項６】
前記ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖可変部をコードする前記核酸配列が、作動可能な状態でＪ５５８  Ｈ１０ファミリーのＶＨプロモーターに結合している、請求項４に記載のマウス。
【請求項７】
前記ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の軽鎖可変部をコードする前記核酸配列が、作動可能な状態でＶκＯχ−１ファミリーのＶκプロモーターに結合している、請求項５に記載のマウス。
【請求項８】
前記核酸配列が、作動可能な状態で内在性エンハンサーエレメントに結合して前記ゲノム内に存在する、請求項１に記載のマウス。
【請求項９】
前記マウスのゲノムが、前記ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖可変部をコードする核酸配列、および前記ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の軽鎖可変部をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項１０】
請求項１に記載のマウスから単離できる、キメラ型のＨＩＶ−１広域中和抗体。
【請求項１１】
請求項９に記載のマウスから単離できる、キメラ型のＨＩＶ−１広域中和抗体。
【請求項１２】
前記キメラ抗体が２Ｆ５の重鎖および軽鎖の可変部を含む、請求項１１に記載のキメラ抗体。
【請求項１３】
前記キメラ抗体が４Ｅ１０の重鎖および軽鎖の可変部を含む、請求項１１に記載のキメラ抗体。
【請求項１４】
請求項１に記載の前記マウスの抗体産生Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより誘導されたハイブリドーマ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ＨＩＶ−１広域中和抗体の産生を誘導できる候補作用物質を同定する方法であって、
ｉ）請求項１に記載の前記マウスに、抗体を産生できる条件下または抗体を発現するようにＢ細胞を誘導できる条件下で被験化合物を投与し、
ｉｉ）抗体を含有する試料または抗体を発現するＢ細胞を含有する試料をマウスから入手し、そして
ｉｉｉ）ＨＩＶ−１の膜近接外部領域（ＭＰＥＲ）に特異的な抗体またはＭＰＥＲ特異的Ｂ細胞の存在または不存在について前記試料をアッセイし、その際、前記試料中に対照試料と比較して前記ＭＰＥＲ特異的な抗体またはＢ細胞が存在することは前記化合物が前記候補作用物質であることの指標となる
ことを含む方法。
【請求項１７】
前記抗体を含有する試料または前記抗体を発現するＢ細胞を含有する試料が、血清試料または粘膜抽出物の試料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記粘膜抽出物の試料が唾液、便または膣洗浄液の試料である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞を含有する試料がマウスの全身または粘膜の免疫組織から入手した試料である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が骨髄、脾臓または末梢血リンパ球試料である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が腸リンパ節もしくはパイエル板の試料または雌性生殖管試料または肺試料である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｉｉｉ）がＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、表面プラズモン共鳴、Luminexまたはサイトメトリーベースのアッセイ法を用いて行なわれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、前記候補作用物質をＨＩＶ−１中和活性についてアッセイすることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＺＭ−ｂｌアッセイ法を用いて中和活性について前記作用物質をアッセイすることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験化合物がタンパク質またはペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
ＨＩＶ−１広域中和抗体の産生を誘導できる作用物質を同定する方法であって、
ｉ）請求項１に記載の前記マウスに、抗体を産生できる条件下または抗体を発現するようにＢ細胞を誘導できる条件下で被験化合物を投与し、
ｉｉ）抗体を含有する試料または抗体を発現するＢ細胞を含有する試料を前記マウスから入手し、そして
ｉｉｉ）前記試料を対照試料と比較してＨＩＶ−１中和活性についてアッセイする
ことを含む方法。
【請求項２７】
段階（ｉｉｉ）がＴＺＭ−ｂｌアッセイ法を用いて行なわれる、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願Ｎｏ．  ６１／２０２，７７８，  ２００９年４月３日出願に基づく優先権を主張し、その内容全体を本明細書に援用する。
技術分野
本発明は一般に、候補免疫原を試験するのに適した動物モデル、特に膜近接外部領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｘｔ
ｅｒｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  （ＭＰＥＲ））ＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖および軽鎖を発現するノックインマウス、ならびにそれを用いて候補免疫原をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
急性ＨＩＶ−１感染症において形成される最初の抗体は、ＣＤ４結合部位(Moore et al, J. Virol, 68(8) 5142 (1994))、ＣＣＲ５共受容体結合部位(Choe et al, Cell 114(2): 161-170 (2003))、およびＶ３ループ(Moore et al, J. Acquir, Immun. Def. Syn. 7(4): 332 (1994))に対するものである。しかし、これらの抗体はＨＩＶ−１を抑制せず、容易に回避される(Burton et al, Nature Immun. 5: 233-236 (2004), Wei et al, Nature 422 (6929): 307-312 (2003))。オートロガスウイルスに対する中和抗体は感染後５０〜６０日目に発現するが、ヘテロロガスＨＩＶ−１株を中和できる抗体は感染の１年後まで形成されない(Richman et al, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 100(7): 4144-4149 (2003), Wei et al, Nature 422 (6929): 307-312 (2003))。
【０００３】
希有広域（ｂｒｏａｄｌｙ）反応性中和抗体が結合するＨＩＶ−１エンベロープ上の４つのエピトープは、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ＢＳ）（ｍａｂ（モノクローナル抗体）ＩｇＧ１ｂ１２）(Zwick et al, J. Virol. 77(10): 5863-5876 (2003))、ヒトｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０により規定される膜近接外部領域（ＭＰＥＲ）エピトープ類(Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54: 915-920 (2004), Stiegler and Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 51: 757-759 (2003), Zwick et al, Journal of Virology 79: 1252-1261 (2005), Purtscher et al, AIDS 10: 587 (1996))（図１）、ならびにヒトｍａｂ  ２Ｇ１２により規定されるマンナングリカンエピトープ(Scanlan et al, Adv. Exper. Med. Biol. 535: 205-218 (2003))である。これら４つの希有ヒトｍａｂはすべて特異である：２つはＩｇＧ３であり（２Ｆ５および４Ｅ１０）、１つはユニークＩｇ二量体構造をもち（２Ｇ１２）、１つは著しく疎水性のＣＤＲ３をもち（２Ｆ５）(Ofek et al, J. Virol. 198: 10724 (2004))、かつ４つすべてにおいてＣＤＲ３が異例に長い(Burton et al, Nature Immunol. 5(3): 233-236 (2004), Kunert et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20(7): 755-762 (2004), Zwick et al, J. Virol. 78(6): 3155-3161 (2004), Cardoso et al, Immunity 22: 163-172 (2005))。これらのうち、２Ｆ５様および４Ｅ１０様のヒトｍａｂはかなり稀である。急性ＨＩＶ−１患者はＭＰＥＲまたは２Ｇ１２エピトープに対する抗体を形成しない；ＭＰＥＲはＨＩＶエンベロープのアミノ酸６５２−６８３として定義できる(Cardoso et al, Immunity 22: 163-173 (2005)  （たとえばＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＫ）。ＣＤ４結合部位（ＢＳ）抗体は普通はＨＩＶ−１感染の初期に形成されるが、これらの抗体はｍａｂ  ＩｇＧ１ｂ１２が示す広域中和スペクトルを一般にもたない(Burton et al, Nat. Immunol. 5(3): 233-236 (2004))。
【０００４】
ＨＩＶ−１エンベロープの多数のエピトープが宿主組織と交差反応することが示され(Pinto et al, AIDS Res. Hum. Retrov, 10: 823-828 (1994), Douvas et al, AIDS Res. Hum. Retrov. 10: 253-262 (1994), Douvas et al, AIDS Res. Hum. Retrov, 12: 1509-1517 (1996))、自己免疫患者はＨＩＶ−１タンパク質と交差反応する抗体を形成することが示された(Pinto et al, AIDS Res. Hum. Retrov. 10: 823-828 (1994), Douvas et al, AIDS Res. Hum. Retrov. 10: 253-262 (1994), Douvas et al, AIDS Res. Hum. Retrov, 12: 1509-1517 (1996), Barthel et al, Semin. Arthr. Rheum. 23: 1-7 (1993))。同様に、自己エピトープに対する免疫応答の誘発がエイズにおける自己免疫異常およびＴ細胞枯渇の原因であると示唆された(Douvas et al, AIDS Res. Hum. Retrov. 12: 1509-1517 (1996), Ziegler et al, Clin. Immunol. Immunopath. 41: 305-313 (1986))。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Moore et al, J. Virol, 68(8) 5142 (1994)
【非特許文献２】Choe et al, Cell 114(2): 161-170 (2003)
【非特許文献３】Moore et al, J. Acquir, Immun. Def. Syn. 7(4): 332 (1994)
【非特許文献４】Burton et al, Nature Immun. 5: 233-236 (2004)
【非特許文献５】Wei et al, Nature 422 (6929): 307-312 (2003)
【非特許文献６】Richman et al, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 100(7): 4144-4149 (2003)
【非特許文献７】Zwick et al, J. Virol. 77(10): 5863-5876 (2003)
【非特許文献８】Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54: 915-920 (2004)
【非特許文献９】Stiegler and Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 51: 757-759 (2003)
【非特許文献１０】Zwick et al, Journal of Virology 79: 1252-1261 (2005)
【非特許文献１１】Purtscher et al, AIDS 10: 587 (1996)
【非特許文献１２】Scanlan et al, Adv. Exper. Med. Biol. 535: 205-218 (2003)
【非特許文献１３】Ofek et al, J. Virol. 198: 10724 (2004)
【非特許文献１４】Kunert et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20(7): 755-762 (2004)
【非特許文献１５】Zwick et al, J. Virol. 78(6): 3155-3161 (2004)
【非特許文献１６】Cardoso et al, Immunity 22: 163-172 (2005)
【非特許文献１７】Pinto et al, AIDS Res. Hum. Retrov, 10: 823-828 (1994)
【非特許文献１８】Douvas et al, AIDS Res. Hum. Retrov. 10: 253-262 (1994)
【非特許文献１９】Douvas et al, AIDS Res. Hum. Retrov, 12: 1509-1517 (1996)
【非特許文献２０】Barthel et al, Semin. Arthr. Rheum. 23: 1-7 (1993)
【非特許文献２１】Ziegler et al, Clin. Immunol. Immunopath. 41: 305-313 (1986)
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＭＰＥＲ特異的Ｂ細胞の調節におけるＢ細胞寛容の役割を直接調べ、関与する機序／作用を受けるＢ細胞亜集団を決定するために設計した研究から得られた。本明細書に記載するノックインマウスモデルを用いて、自己反応性および／または中和活性を付与することができるＭＰＥＲ特異的Ｂ細胞レパートリー内の重鎖および軽鎖のスペクトルに関する遺伝情報を得ることができる。開示したマウスモデルは、寛容が関与するか否かに関係なく、ＭＰＥＲ  ｂｎＡｂを誘発する際のリード候補免疫原の試験を促進するためにも使用できる。
【０００７】
発明の概要
一般に本発明は、候補免疫原を試験するのに適した動物モデルに関する。より詳細には、本発明はＭＰＥＲ  ＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖および軽鎖を発現するノックインマウスに関する。本発明はさらに、それらのマウスを用いて候補免疫原をスクリーニングする方法に関する。
【０００８】
本発明の目的および利点は以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、広域中和抗体（ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ｂｎＡｂ）ノックイン（ｋｉ）マウスを作成するための全般的方法を示す。
【図２】図２は、２Ｆ５  ＶＨをマウスのＩｇＭおよびＩｇＧの定常ドメインと会合した状態で発現させることができることの証明を示す。
【図３】図３は、２Ｆ５  ＶＨ＋／−マウスの骨髄Ｂ細胞の約８０％は２Ｆ５重鎖が最初にＢ細胞表面の軽鎖と対合／発現するＢ細胞発生初期（すなわち、プレＢ細胞から未熟Ｂ細胞への移行期）に欠失することを証明する代表的な染色プロフィールを示す。
【図４】図４は、２Ｆ５  ＶＨ＋／−マウスにおいて未熟なアネルギー(機能的に不活性な非Ａｂ分泌性)様表現型をもつＢ細胞が末梢に蓄積することを示す代表的な染色である。
【図５】図５は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスの２Ｆ５重鎖発現レパートリー内にある自己反応性＋ＭＰＥＲエピトープ反応性Ｂ細胞の亜集団の証明を示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、２Ｆ５ノックインマウスにおいて負の選択圧の不存在下でＭＰＥＲリード候補免疫原を試験することを目的とした２つの戦略を示す。
【図７Ａ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｂ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｃ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｄ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｅ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｆ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｇ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｈ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｉ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｊ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｋ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｌ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｍ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｎ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｏ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｐ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｑ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｒ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｓ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｔ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｕ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｖ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｗ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｘ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図７Ｙ】図７は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける中枢および末梢機序による、２Ｆ５重鎖発現Ｂ細胞のストリンジェント対抗選択を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｄ。キメラ組換え２Ｆ５抗体（ｍ２Ｆ５）は元のヒト２Ｆ５  ｍＡｂ（ｈ２Ｆ５）とインビトロで機能的に同等である。（図８Ａおよび８Ｂ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるｍ２Ｆ５とｈ２Ｆ５の機能の比較であり、抗原結合特異性および脂質反応性が組換えｍ２Ｆ５抗体において保存されていることを証明する。（図８Ａ）ｍ２Ｆ５は、２Ｆ５結合エピトープ（ＥＬＤＫＷＡＳ）を含むＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチドｇｐ４１６５２−６７１（上）およびｇｐ４１６５６−６８３（下）に結合した。ＭＰＥＲペプチドへのｍ２Ｆ５の結合（実線）は、ｈ２Ｆ５のもの（破線）に匹敵していた。ＣＤ４ｉ  ｇｐ１２０  ｍＡｂ  １７ｂ（点線）を陰性対照として用いた。（図８Ｂ）ｍ２Ｆ５抗体において脂質反応性が保持され、ホスファチジルセリン（破線）またはカルジオリピン（実線）のいずれかを含むリポソームへの結合が、ｈ２Ｆ５およびｍ２Ｆ５両方のｍＡｂについてみられた。（図８Ｃ）ｍ２Ｆ５およびｈ２Ｆ５抗体は比較可能な結合力および特異性でマウス核抗原と反応する。（図８Ｄ）ｍ２Ｆ５およびｈ２Ｆ５抗体はヒト核抗原に対する比較可能な反応性をもつ。さらに、ｍ２Ｆ５およびｈ２Ｆ５をＴＺＭ−ｂｌ  ＨＩＶ  Ｅｎｖ擬ウイルス中和アッセイにおいて試験し、両抗体ともＨｌＶ−１株Ｂ．ＢＧ１１６８、Ｂ．ＳＦ１６２、Ｂ．ＱＨ０６９２、ＢＪＲＦＬおよびＣ．９２ＵＧ０２３７を中和したが、Ｃ．ＴＶ−１を中和しなかった。ｍ２Ｆ５およびｈ２Ｆ５のＩＣ５０中和力価は、それぞれ０．３５から１１．９μｇ／ｍｌまで、および０．０６から１．８μｇ／ｍｌまでの範囲であった（表１）。
【図９】図９は、２Ｆ５  ＶＨ遺伝子の標的化置換を示す。２Ｆ５  ＶＨ標的化構築体、内在性Ｉｇ  ＨＣ遺伝子座、相同組換え後の標的化対立遺伝子、およびＣｒｅ−仲介ｎｅｏカセット欠失後の標的化対立遺伝子のゲノム構造。２Ｆ５  ＶＨ発現カセットは、Ｊ５５８  Ｈ１０ファミリーＶＨプロモーター（ｐ）、Ｈ１０スプリットリーダー配列（Ｌ）、および前転位２Ｆ５  Ｖ（Ｄ）Ｊ  ＶＨセグメント（２Ｆ５  ＶＨ）からなる。エキソンを閉じたボックスとして示し、Ｉｇｈイントロンエンハンサー（Ｅ）を円により示し、２Ｆ５  ＶＨ、ｎｅｏおよびＣＡＧ−ＤＴＡカセットを影付きボックスにより示し、ｌｏｘＰ部位を三角形として表わす。図示した制限フラグメントサイズは野生型および標的化した遺伝子座について示される。ＪＨ−Ｅμ領域の５’および３’側領域それぞれにおける相同組換え事象を証明するために用いた５’および３’プローブを黒い棒として示す。下記のものを同定するためのＰＣＲプライマーも示す：ｉ）相同組換えクローン（黒い矢印）、ｉｉ）ｎｅｏマーカーの除去（灰色の矢印）、およびｉｉｉ）生殖細胞系列伝達されたヘテロ接合（２Ｆ５  ＶＨ＋／−）およびホモ接合（２Ｆ５  ＶＨ＋／＋）マウス（彩色した矢印）。Ｂ＝ＢａｍＨＩ、ＲＶ＝ＥｃｏＲＶ、Ｎ＝ＮｄｅＩ。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂ。Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）、２Ｆ５  ＶＨ＋／−、および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスの骨髄におけるＢ細胞発生のフローサイトメトリー分析。図１０Ａ：代表的なドットプロットヒストグラム；数字は全骨髄Ｂ細胞集団（ｓｉｎｇｌｅｔ，ｌｉｖｅ，ｌｉｎ−細胞としてゲート;ｌｉｎ＝Ｔｅｒ−１１９、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８）内の細胞のパーセントを示す。骨髄細胞は９〜１２週令の雌マウスから単離された。図１０Ｂ：骨髄Ｂ細胞亜集団頻度の統計分析；各々の黒、中空および灰色の円は、それぞれ個々のＷＴ、２Ｆ５  ＶＨ＋／−、および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスを表わす；水平の線は各グループの平均を表わす。有意の数値は両側（two-tailed）スチューデント検定により決定された：＊，ｐ≦０．０５；＊＊，ｐ≦０．００１；＊＊＊，ｐ≦０．０００１；ＮＳ，有意でない。集団を下記のように定義した：プロ／大型プレＢ（画分Ａ〜Ｃ；Ｂ２２０ｌｏＣＤ４３＋）、小型プレＢ（画分Ｄ；Ｂ２２０ｌｏＣＤ４３−）、未熟Ｂ（Ｂ２２０ｉｎｔ／ｌｏＩｇＭｌｏＩｇＤ−）、移行期、Ｔ１＋Ｔ２（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭｉｎｔ／ｈｉＩｇＤｌｏ）、および骨髄成熟（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉ）。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂ。２Ｆ５  ＶＨ＋／−  Ｂ細胞の表面に発現したＷＴおよび２Ｆ５  ＶＨトランスジェニックＨＣのフローサイトメトリー分析。（図１１Ａ）ＷＴ  ＩｇＨｂ／ＷＴ  ＩｇＨａおよび２Ｆ５  ＶＨ  ＩｇＨｂ／ＷＴ  ＩｇＨａ  Ｆｌマウスからの脾臓Ｂ細胞集団の代表的な輪郭コンターヒストグラム（ｃｏｎｔｏｕｒ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）；数字はｓｉｎｇｌｅｔ，ｌｉｖｅ，全Ｂ（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）細胞ゲート内のＩｇＭａ＋およびＩｇＭｂ＋細胞（それぞれ、内在性および２Ｆ５  ＶＨ導入遺伝子保有ＨＣをもつ）のパーセントを示す。（図１１Ｂ）それぞれ５および６匹のマウス／Ｆｌグループについて示したＩｇＭ＋骨髄および脾臓画分内のＩｇＭａ陽性細胞の頻度。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃ。Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）、２Ｆ５  ＶＨ＋／−、および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスの脾臓Ｂ細胞発生のフローサイトメトリー分析。Ａｌｌｍａｎ分類スキーム(Allman et al, J. Immunol. 167: 6834-6840 (2001))を用いた代表的なドットプロットヒストグラム；上パネルの数字はＣＤ９３（ＡＡ４．１）＋移行期またはＣＤ９３−（成熟＋境界帯域，ＭＺ）Ｂ細胞であったＢ細胞（Ｂ２２０＋）の総数を示し（図１２Ａ）、Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋画分内の移行期Ｔ１−Ｔ３集団を計数できるように（図１２Ｂ）、またはさらにＢ２２０＋ＣＤ１９−画分内のＭＺおよび成熟Ｂ細胞亜集団を計数できるように（図１２Ｃ）ゲートした。ＰＥ標識抗ＩｇＭによるＷＴ、２Ｆ５  ＶＨ＋／−、および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋成熟Ｂ細胞亜集団の染色についての平均蛍光強度は、それぞれ７５６、５０６、および３４２であった。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂ。ＷＴ、２Ｆ５  ＶＨ＋／−、および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスにおける、全または自己抗原特異的な血清Ｉｇレベル、およびｇｐ４１  ＭＰＥＲ特異的血清ＩｇまたはＢ細胞反応性。（図１３Ａ）全ＩｇＭおよびＩｇＧ血清抗体レベル。各ドットは個々のマウスを表わす；水平の線は平均血清抗体レベルを表わす。有意数値は両側スチューデント検定により決定された：＊，ｐ≦０．０５；＊＊，ｐ≦０．００１；＊＊＊，ｐ≦０．０００１；ＮＳ，有意でない。（図１３Ｂ）プレートに結合したｇｐ４１  ＭＰＥＲ  ２Ｆ５公称エピトープペプチド、抗核抗原、およびカルジオリピンに対する全血清Ｉｇ反応性。ｇｐ４１  ＭＰＥＲ、ＡＮＡ、およびカルジオリピン反応性アッセイには、ＭＲＬ／ｐｒ血清を陽性対照として用いた。各ドットは個々のマウスを表わす；水平の線は平均血清抗体レベルを表わす。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃ。キメラ２Ｆ５重鎖と任意の内在性マウスＬＣとの対合によって、２Ｆ５  ＬＣと対合したものと同等に良好に自己抗原に結合する機能性抗体を作成できる。（図１４Ａおよび１４Ｂ）組換え抗体ＭＫ−１、ＭＫ−４、ＭＫ−５、およびＭＫ−６（キメラ２Ｆ５重鎖と内在性マウスＬＣの対合により作成）はＭＰＥＲに対する反応性を欠如するが、３／４はｍ２Ｆ５（ｍ２Ｆ５ＨＣ＋ｍ２Ｆ５ＬＣ組換え抗体）に匹敵するカルジオリピンとの反応性を保持する。（図１４Ａ）組換え抗体を上清から精製し、標準ＥＬＩＳＡにより１００μｇ／ｍｌで、カルジオリピンまたは先に記載された２Ｆ５の公称エピトープペプチドであるｇｐ４１６５２−６７１ＭＰＥＲ(Haynes et al, Science 308: 1906-1908 (2005), Alam et al, J. Immunool 178: 4424-4435 (2007))の結合についてアッセイした。カルジオリピンおよびｇｐ４１  ＭＰＥＲ両方の結合について、ｍ２Ｆ５を陽性対照として用いた。（図１４Ｂ）ＭＫ−１、ＭＫ−４、ＭＫ−５、およびＭＫ−６のカルジオリピン反応性のＥＬＩＳＡ分析（図１４Ａの場合と同様に実施）を、全濃度範囲にわたってグラフで示したもの。Ｐ３＝Ｐ３Ｘ６３／Ａｇ８陰性対照パラプロテイン。（図１４Ｃ）ＭＫ−１、ＭＫ−４、ＭＫ−５、およびＭＫ−６におけるカルジオリピン（ＣＬ）反応性のＳＰＲ結合分析。ＳＰＲ分析、ならびにＣＬ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびＰＣ：ＣＬ（３：１）リポソームの調製は、先の記載に従って実施された(Alam et al, J. Immunol. 178: 4424-4435 (2007))。これらの結果は、組換え抗体ＭＫ−１、ＭＫ−４、ＭＫ−５、およびＭＫ−６の脂質結合反応性が対照ｍ２Ｆ５ＨＣ＋ｍ２Ｆ５ＬＣ抗体のものに匹敵することを示す。ｍ２Ｆ５陽性対照およびＭＫ１〜６  ｍＡｂは共にカルジオリピンに結合したが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）リポソームには結合しなかった。すべての抗体を５０μｇ／ｍＬ、３０μＬ／分で注入した。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃ。Ｉｇｈ遺伝子座へのマウス２Ｆ５  ＶＨの標的化挿入の確認。（図１５Ａ）親（列１）および標的化２Ｆ５  ＶＨを含む４つの組換えＥＳ細胞クローン（列２〜５）からのゲノムＤＮＡの代表的なサザンブロット分析。変異体（ｍｔ）および野生型（ｗｔ）バンドを３種類の方法で解明した：ＮｄｅＩ消化したＤＮＡをＪＨ−Ｅμ領域の５’側ＰＣＲ生成物で探査（５’プローブ；上パネル）、およびＢａｍ  ＨＩ消化したＤＮＡを３’側ＰＣＲ生成物で探査（３’プローブ；中パネル）、またはｎｅｏ特異的プローブで探査（下パネル）。（図１５Ｂ）ｎｅｏ欠失２Ｆ５  ＶＨ＋／−ＥＳ細胞に由来する、生殖細胞系列伝達された２Ｆ５  ＶＨ挿入配列を宿した子孫の代表的なＰＣＲ分析。生殖細胞系列伝達されたＦｌヘテロ接合交配子孫の尾のＤＮＡから増幅したゲル分画ＰＣＲ生成物を示し、ＷＴ、ヘテロ接合（２Ｆ５  ＶＨ＋／−）およびホモ接合（２Ｆ５  ＶＨ＋／＋）マウスを表わす；予想したＷＴ対立遺伝子特異的および標的化遺伝子特異的アンプリコンは、それぞれ約０．４ｋｂおよび０．５ｋｂである。（図１５Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）および２Ｆ５  ＶＨ  Ｂ細胞におけるＩｇＭおよびＩｇＧ転写体のＰＣＲ増幅。共通プライマー（ＶＨ  Ｊ５５８）を用いるとＩｇＭ（列３、４）およびＩｇＧ１（列９、１０）再編成配列を表わすＰＣＲ生成物はＣ５７ＢＬ／６および２Ｆ５  ＶＨ＋／−両方のｃＤＮＡに検出され、一方、２Ｆ５  ＶＨ特異的プライマーを用いるとＩｇＭ（列５、６）およびＩｇＧ１（列１１、１２）再編成配列は２Ｆ５  ＶＨ＋／−  ｃＤＮＡのみに検出可能であった。
【図１６】図１６は、２Ｆ５  ＶＨおよび３Ｈ９ホモ接合ノックインマウスの骨髄におけるＢ細胞発生の比較を示す。全ＢＭ  Ｂ細胞集団（ｓｉｎｇｌｅｔ，ｌｉｖｅ，ｌｉｎ−細胞としてゲート;ｌｉｎ＝Ｔｅｒ−１１９、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８）内のＢ細胞画分におけるＣＤ９３、ＣＤ２３およびＣＤ２１の細胞表面発現の代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＢＭ細胞は９〜１２週令の雌マウスから単離され、図１０について記載したように染色および分析された。
【図１７】図１７は、Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）、２Ｆ５  ＶＨ＋／−、および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスの全（Ｂ２２０＋）Ｂ細胞画分内の脾臓Ｂ細胞亜集団頻度の統計分析を示す。Ｂ細胞亜集団を図１２に示したＡｌｌｍａｎ分類スキーム（Allman et al, J. Immunol. 167: 6834-6840 (2001)）を用いて分画し、データを図１０の場合と同じ方法でグラフ表示する。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂ。４Ｅ１０  ＶＨ＋／＋マウスの骨髄における大画分の４Ｅ１０  ＶＨ発現Ｂ細胞が（２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスの２Ｆ５  ＶＨ発現骨髄Ｂ細胞と同様に）Ｂ細胞発生の初期に（すなわち、プレＢ細胞から未熟Ｂ細胞への移行期；その時期に４Ｅ１０重鎖がＢ細胞表面で最初に軽鎖と対合／発現する）削除される（ｄｅｌｅｔｅｄ）ことを証明する代表的な染色プロフィール。図３について記載したようにＢＭ細胞を単離し、フローサイトメトリー処理し、判定した。頻度が著しく低下したＢ細胞集団を赤色で強調する。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂ。２Ｆ５  ＶＬ＋／＋ノックインマウスの骨髄において２Ｆ５  ＶＬ発現Ｂ細胞が正常な発生を行なうことを証明する代表的な染色プロフィール。図３について記載したようにＢＭ細胞を単離し、フローサイトメトリー処理し、判定した。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃ。抗アポトーシス生存因子ｂｃｌ２のＢ細胞特異的発現は、インビボで２Ｆ５  ＶＨ発現Ｂ細胞および血清ＩｇをＢ細胞寛容からレスキューし、より高頻度のＭＰＥＲ＋Ｂ細胞を生じる。２Ｆ５  ＶＨ  Ｅμ−ｂｃｌ２  ｔｇマウスは、Ｅμ−ｂｃｌ２トランスジェニックマウスを２Ｆ５  ＶＨマウスと交配することにより作成された。（図２０Ａ）Ｅμ−ｂｃｌ２導入遺伝子が２Ｆ５  ＶＨの脾臓および骨髄においてＢ細胞の生存および発生を助けることを証明する代表的な染色プロフィール。骨髄細胞（上パネル）および脾細胞（下パネル）を８〜１２週令の雌マウスから単離し、全生存Ｂ細胞をＢ細胞特異的マーカーＩｇＭ、ＩｇＤ、Ｂ２２０およびＣＤ１９の組合わせで染色した。（図２０Ｂ）血清ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂレベルの比較は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおいて普通は抑制される血清ＩｇＭおよびＩｇＧ３が、２Ｆ５  ＶＨ  Ｅμ−ｂｃｌ２  ｔｇマウスにおいては選択的にレスキューされることを証明する（ｂｃｌ２導入遺伝子が特定のＩｇＭおよびＩｇＧ３を産生するＢ細胞集団をアネルギー、すなわち機能不活性化からレスキューすることをも示唆する）。８−１２週令のＢ６（ＷＴ）、２Ｆ５  ＶＨ＋／−、または２Ｆ５  ＶＨ＋／＋  Ｅμ−ｂｃｌ２  ｔｇ雌マウスからの全血清免疫グロブリンレベルの分析は、標準的なLuminexアッセイを用いて測定された。（図２０Ｃ）ｂｃｌ２導入遺伝子発現によりＭＰＥＲ反応性をもつＩｇＭ＋脾臓Ｂ細胞の頻度増大が生じることを証明するハイブリドーマ分析。ＬＰＳ活性化した２Ｆ５  ＶＨ＋／−または２Ｆ５  ＶＨ＋／＋×ｂｃｌ２  ｔｇ脾臓培養からハイブリドーマを作成し、ハイブリドーマ上清を限定希釈度で２回サブクローニングし、次いでＥＬＩＳＡによりカルジオリピン（ＣＬ）またはＭＰＥＲ反応性についてスクリーニングした。示したデータはＣＬおよび／またはＭＰＥＲ（Ｓｐ６２）特異的ウェル／全ＩｇＭ＋ウェルの頻度を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＭＰＥＲ  ＨＩＶ−１広域中和抗体を発現するノックイン動物（たとえばマウス）モデル、およびそれを用いてリード候補免疫原をスクリーニングする方法に関する。本発明は、内在性免疫グロブリン遺伝子座において２種類の広域中和ＨＩＶ−１  ｇｐ４１膜近接外部領域（ＭＰＥＲ）抗体（２Ｆ５および４Ｅ１０）の重鎖および軽鎖を発現する一連のノックインマウス系列の構築から得られる（図１および後記の実施例を参照）。これらの系列のひとつである２Ｆ５  ＶＨノックインマウス（２Ｆ５重鎖の部位特異的発現を伴う）の特性付けにより、２Ｆ５重鎖をＢ細胞によって適宜発現させることができる（図２）が、これらの２Ｆ５発現Ｂ細胞はＢ細胞発生の初期に重鎖が軽鎖と対合する段階で排除されるという決定的な所見が得られた（図３）。重要なことに、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスは、末梢にこの初期対抗選択段階を逃れるアネルギー様２Ｆ５発現Ｂ細胞の実質的亜集団をもち（図４）、また自己反応性かつＭＰＥＲ反応性である２Ｆ５発現抗体を分泌しうる小亜集団のＢ細胞をもつ（図５）。これに関して、これらのマウスは、残存する２Ｆ５発現Ｂ細胞をどのような方法でリード候補免疫原により誘発、調節または拡張して広域中和抗体（ｂｎＡｂ）を分泌させることができるかを直接に試験するための魅力的なモデルとなる。
【００１１】
したがって、１態様において本発明は、そのゲノムがヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部をコードする核酸配列を含む標的化トランスジェニックマウスに関する。本発明によれば、この核酸配列を、核酸配列が発現してヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体（たとえば、２Ｆ５および４Ｅ１０）の重鎖および／または軽鎖の可変部を産生するように、作動可能な状態でプロモーターに結合してゲノム内に存在させることができる。有利には、この核酸配列は作動可能な状態で内在性エンハンサーエレメントに結合してゲノム内に存在する。
【００１２】
好ましい態様において、ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖可変部をコードする核酸配列は、作動可能な状態でＪ５５８  Ｈ１０ファミリーのＶＨプロモーター(Love et al, Mol. Immunol. 37: 29-39 (2000))に結合している。他の好ましい態様において、ヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の軽鎖可変部をコードする核酸配列は、作動可能な状態でＶκＯχ−１ファミリーのＶκプロモーター(Sharpe et al, EMBO 10(8): 2139-2145 (1991))に結合している。
【００１３】
本発明はさらに、前記の標的化トランスジェニックマウス、特にそれのゲノム中にヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の重鎖可変部をコードする核酸配列およびヒトＨＩＶ−１の広域中和抗体の軽鎖可変部をコードする核酸配列の両方を含むマウスから単離できる、キメラ型のＨＩＶ−１広域中和抗体に関する。本発明は、前記マウスの抗体産生Ｂ細胞を、たとえば常法により骨髄腫細胞と融合させることによって得られたハイブリドーマにも関する。本発明は、そのようなハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を含む。
【００１４】
さらに他の態様において本発明は、ＨＩＶ−１広域中和抗体の産生を誘導できる候補作用物質を同定する方法に関する。この方法は下記を含むことができる：ｉ）前記マウスに、抗体を産生できる条件下または抗体を発現するようにＢ細胞を誘導できる条件下で被験化合物（たとえば、タンパク質またはペプチドを含む化合物）を投与し、ｉｉ）抗体を含有する試料または抗体を発現するＢ細胞を含有する試料をマウスから入手し、そしてｉｉｉ）ＨＩＶ−１膜近接外部領域（ＭＰＥＲ）に特異的な抗体またはＭＰＥＲ特異的Ｂ細胞の存在または不存在について試料をアッセイする（たとえば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、表面プラズモン共鳴、Luminexまたはサイトメトリーベースのアッセイ法）。その際、対照試料（たとえば、非処理マウス）と比較して試料中にＭＰＥＲ特異的な抗体またはＢ細胞が存在することは、その被験化合物が候補作用物質であることの指標となる。抗体を含有する試料または抗体を発現するＢ細胞を含有する試料は、血清試料または粘膜抽出物の試料（たとえば、唾液、便または膣洗浄液の試料）であってもよい。Ｂ細胞を含有する試料は、マウスの全身または粘膜の免疫組織から入手できる。たとえば、試料は骨髄、脾臓または末梢血リンパ球試料であってもよい。試料は腸リンパ節もしくはパイエル板の試料または雌性生殖管試料または肺試料であってもよい。本発明方法を用いて同定した候補作用物質をＨＩＶ−１中和活性について、たとえばＴＺＭ−ｂｌアッセイ(たとえば、Polonis et al, virol. 375(2) 315 (2008)を参照)を用いてアッセイすることができる。
【００１５】
本発明はさらに、ＨＩＶ−１広域中和抗体の産生を誘導できる作用物質を同定する方法であって、下記を含む方法に関する：ｉ）前記マウスに、抗体を産生できる条件下または抗体を発現するようにＢ細胞を誘導できる条件下で被験化合物（たとえば、タンパク性化合物）を投与し、ｉｉ）抗体を含有する試料または抗体を発現するＢ細胞を含有する試料をマウスから入手し、そしてｉｉｉ）対照試料（たとえば、非処理マウスからのもの）と比較してＨＩＶ−１中和活性について試料をアッセイする。上記の段階（ｉｉｉ）は、たとえばＴＺＭ−ｂｌアッセイ法を用いて行なうことができる。
【００１６】
後記の実施例に提示するデータは、ヘテロ接合型およびホモ接合型両方の２Ｆ５  ＶＨノックインマウスが特性付けされたことを証明する。両方とも骨髄Ｂ細胞の発生においてプレＢ細胞から未熟Ｂ細胞への移行期に著しい遮断を示し、これはこの発生ブロックが導入遺伝子の発現の欠陥によるものではあり得ず、むしろ２Ｆ５  ＨＣと自己抗原の遭遇を伴う能動プロセスを伴うにちがいないということを指摘する。２Ｆ５    ＶＨを含む重鎖がインビボで多数の内在性マウス軽鎖パートナーと対合できることは実施例２で証明され（表６のハイブリドーマ分析を参照）、これは発生ブロックがマウス軽鎖との不適正会合によるものであるということに強く反論する。より低い表面密度をもつ成熟した脾臓Ｂ細胞の総数が減少するにもかかわらず、これらのマウスには正常比率の成熟Ｂ細胞があり、これは小割合の細胞が骨髄における初期削除（initial deletion）を逃れることを指摘する。重要なことに、これは、発生ブロックが著しいけれども完全ではなく、残存細胞は多様な方策でレスキューされる可能性をもつことを示す。ヘテロ接合２Ｆ５  ＶＨノックインマウスには実質的なレベルの総血清Ｉｇがあるが、これらはＭＰＥＲエピトープまたはヒト／ネズミ自己抗原に対する反応性を欠如する。これらのマウスが正常レベルのＩｇを発現できることは、この反応性の欠如は導入遺伝子の不適正な発現によるものではなく、むしろこの反応性が多様な寛容機序により排除されたことによるものにちがいないということを示す。インビトロで、２Ｆ５  ＶＨ挿入配列はキメラ型ヒト／マウス抗体を産生することができ、これはＭＰＥＲエピトープ＋ヒト／ネズミ自己抗原に対する反応性およびＨＩＶ−１を中和する能力が比較可能なことを含めて、元のヒト２Ｆ５抗体に機能的に類似する。これは、これらのマウスにおける血清Ｉｇ反応性の欠如も２Ｆ５  ＨＣのキメラ性によるものではないことを証明する。
【００１７】
さらに、他のノックインモデルを遺伝子操作して前記の対抗選択圧を除くことが容易にでき（図６）、それらは、どのリード免疫原候補／免疫化戦略がＢ細胞寛容作用に関係なく体細胞過変異または他のＢ細胞多様化プロセスによって最も良く前駆ｂｎＡｂ  Ｂ細胞レパートリーを形成できるかを解明するための有力なインビボモデルともなる。さらに、ＨＩＶ−１  ｂｎＡｂ特異性を生じさせるために記載したノックイン法は、いかなるｂｎＡｂ特異性の発現のためにも同様に使用でき、したがって候補ワクチン免疫原をそれらが広域中和抗体を誘導する能力についていかなるウイルス感染作用物質に対しても試験することが可能になる。最後に、このノックイン法を用いて、他のウイルス感染作用物質モデルにおけるＢ細胞免疫調節の潜在的影響を調べることができる；ＨＩＶ−１との類似性をもつウイルス感染に特に関連するもの、たとえば、分子擬態またはＶＨ  Ｂ細胞レパートリーを偏らせる強い選択圧、たとえばインフルエンザおよびＣ型肝炎に対するｂｎＡｂについてみられるＶＨ１−６９バイアスの潜在的シグネチャーを示すもの。
【００１８】
限定ではない以下の実施例によって、本発明の特定の観点をより詳細に記載することができる。（米国仮特許出願Ｎｏ．  ６１／１６６，６２５，  ２００９年４月３日出願、および米国仮特許出願Ｎｏ．  ６１／１６６，６４８，  ２００９年４月３日出願も参照）。
【実施例】
【００１９】
実施例１
図１は、広域中和抗体（ｂｎＡｂ）ノックイン（ｋｉ）マウスを作成するための全般的方法を示す。ｂｎＡｂ  ２Ｆ５／４Ｅ１０  ＶＨおよびＶＬ  ｋｉマウスは、内在性マウスＪＨおよびＪκクラスター（赤色）を元の変異型２Ｆ５／４Ｅ１０  ＶＨＤＪＨまたは２Ｆ５／４Ｅ１０  ＶκＪκ遺伝子再編成配列（青色）で部位特異的に置換することにより作成された。２Ｆ５／４Ｅ１０  ＶＨカセットは、Ｊ５５８  Ｈ１０ファミリーＶＨプロモーター（ｐ）、Ｈ１０スプリットリーダー配列（Ｌ）、および前再編成した２Ｆ５／４Ｅ１０  Ｖ（Ｄ）Ｊ  ＶＨセグメントからなる。２Ｆ５／４Ｅ１０  ＶＬカセットは、ＶκＯχ１プロモーター（ｐ）、ＶκＯχ１スプリットリーダー配列（Ｌ）、および再編成した２Ｆ５／４Ｅ１０  ＶκＪκコーディングセグメントからなる。
【００２０】
図２は、２Ｆ５  ＶＨをマウスＩｇＭおよびＩｇＧ定常ドメインと会合した状態で発現させることができることを示す。共通ＶＨ１  ＩｇＭ（列３、４）およびＩｇＧ１再編成配列（列９、１０）を表わすＰＣＲ生成物が、ＶＨ  Ｊ５５８プライマーを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６および２Ｆ５  ＶＨｋｉ両方のｃＤＮＡに検出された。これに対し、ＩｇＭ（列５、６）またはＩｇＧｌ（列１１、１２）のいずれかについて予想した２Ｆ５  ＰＣＲ生成物は、２Ｆ５  ＶＨｋｉ＋／−  ｃＤＮＡにのみ検出された。これらのデータは、２Ｆ５  ＶＨがキメラ動物においてＩｇＭおよびＩｇＧ１として転写可能であることを示し、これはマウスにおけるヒト２Ｆ５  ＶＨＤＪＨ再編成配列の発現およびクラス切換えが適切であること、またマウス軽鎖との対合が可能であることの指標となる。
【００２１】
図３は、２Ｆ５  ＶＨ＋／−マウスの骨髄Ｂ細胞の約８０％が、２Ｆ５重鎖がＢ細胞表面の軽鎖と対合／発現するＢ細胞発生初期（すなわち、プレＢ細胞から未熟Ｂ細胞への移行期）に削除されることを証明する代表的な染色プロフィールを示す。ＢＭ細胞を８週の野生型または２Ｆ５  ＶＨ＋／−から単離し、フローサイトメトリー処理した。全Ｂ細胞集団（ｓｉｎｇｌｅｔ，ｌｉｖｅ，ｌｉｎｅａｇｅ−、ＣＤ１９＋およびＢ２２０＋ゲートした細胞）からのＢ細胞亜集団を、Ｋａｌｌｅｄサブフラクショネーションスキーム（左パネル；より成熟したＢ細胞ＢＭ画分を識別するため）またはＨａｒｄｙフラクショネーションスキーム（右パネル；初期Ｂ細胞亜集団を識別するため）により決定した。
【００２２】
図４は、２Ｆ５  ＶＨ＋／−マウスにおいてアネルギー（機能的に不活性な非Ａｂ分泌性）様表現型をもつ未熟なＢ細胞が末梢に蓄積することを示す。全脾臓Ｂ細胞集団（ｓｉｎｇｌｅｔ，ｌｉｖｅ，ｌｉｎｅａｇｅ−、ＣＤ１９＋ゲートした細胞）からのＢ細胞亜集団を、ＷＴマウス（左パネル）と比較して２Ｆ５  ＶＨ＋／−マウスにおいてより低いレベルの全Ｂ２２０発現をもつことに基づいて“未熟様”と定義した。“アネルギー様”表現型は、２Ｆ５  ＶＨ＋／−マウスにおいて一般的なＢ細胞集団（青色）のいずれとも異なるＩｇＭｌｏ集団（赤色）のＢ細胞が蓄積することに基づく；これらはＫａｌｌｅｄサブフラクショネーションスキームを用いて決定された。この表現型は、これらのマウスにおいてＭＰＥＲエピトープまたはＡＮＡに対する血清抗体反応性が最小レベルであることと一致する（データを示していない）。
【００２３】
図５は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける２Ｆ５重鎖発現レパートリー内の自己反応性＋ＭＰＥＲエピトープ反応性Ｂ細胞の亜集団の証明を示す。２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおけるナイーブレパートリーのＢ細胞をＢ細胞ハイブリドーマの分析により決定した；これは、ＮＳＯネズミ骨髄腫細胞および免疫化した２Ｆ５  ＶＨ＋／ａ（すなわち、２Ｆ５  ＶＨ  ＩｇＨｂ  ×  ＷＴ  ＩｇＨａ）または２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスから採取した脾細胞を用いて実施した融合により作成された。２Ｆ５  ＶＨ＋／ａマウスにおける２Ｆ５重鎖発現クローンの数はＩｇＭｂ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いるハイブリドーマのスクリーニングにより推定され、一方、２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスにおけるものは総ＩｇＭ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて推定された。２Ｆ５  ＶＨ＋／−レパートリーと比較して２Ｆ５  ＶＨ＋／＋レパートリー内ではより大きな画分のクローンがカルジオリピンおよびＭＰＥＲ反応性であることに注目されたい；これは、２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスからの末梢Ｂ細胞が内在性重鎖対立遺伝子の利用により自己反応性を排除する選択肢をもたないという事実によるものと思われる。
【００２４】
２Ｆ５ノックインマウスにおいて負の選択圧の無い状態でＭＰＥＲリード候補免疫原を試験することを目的とした２つの戦略を図６に示す。
実施例２
実験の詳細
ｍ２Ｆ５の発現／特性付けおよび２Ｆ５  ＶＨマウスの作成。ｍ２Ｆ５の作成に用いた方法および試薬、ならびにそれの機能特性を解明するために用いた結合、免疫蛍光および中和アッセイは、２Ｆ５  ＶＨをマウスＩｇｈ遺伝子座に部位特異的に標的化するために用いた試薬および方法と共に実施例３に記載される。
【００２５】
マウスおよびフローサイトメトリー。雌Ｃ５７ＢＬ／６およびＣ５７ＢＬ／６  Ｉｇｈａ同系交配マウス系統（８〜１２週令）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。Ｄｒ．  Ｍａｒｔｉｎ  Ｗｅｉｇｅｒｔの研究室において最初に作成されたＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドの３Ｈ９マウスを、Ｄｒ．  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの研究室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）で１４世代以上、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに戻し交配した。
【００２６】
フローサイトメトリー分析のために、ＢＭ細胞および脾細胞を９〜１２週令の雌マウスから単離した。全ＢＭ  Ｂ細胞（ｓｉｎｇｌｅｔ，ｌｉｖｅ，ＣＤ１９＋，ｌｉｎ−リンパ球としてゲート；ｌｉｎ＝Ｔｅｒ−ｌ１９、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８）を、ＡＰＣ抗Ｂ２２０およびＰＥ抗ＣＤ４３抗体またはＦＩＴＣ抗ＩｇＤおよびＰＥ抗ＩｇＭ抗体で染色した；ｓｉｎｇｌｅｔ，ｌｉｖｅ，リンパ球ゲートした脾細胞は、ＦＩＴＣ抗Ｂ２２０、ＰＥ抗ＩｇＭ、ＡＰＣ抗ＣＤ９３、およびＰＥ−Ｃｙ７抗ＣＤ２３抗体の組合わせを用いて染色された。データはＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを備えたＢＤ  ＬＳＲｌＩフローサイトメーターを用いるフローサイトメトリーにより取得され、ＦｌｏＪｏソフトウェアを用いて分析された。
【００２７】
アロタイプスクリーニング。２Ｆ５  ＶＨ  ＩｇＨｂ／ＷＴ  ＩｇＨａおよびＷＴ  ＩｇＨｂ／ＷＴ  ＩｇＨａ  Ｆｌマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｉｇｈａコンジェニックマウスをそれぞれ２Ｆ５  ＶＨ＋／−マウスおよびＷＴ同腹仔対照と交配することにより作成された。各グループからの８〜１６週令の雌Ｆｌマウスに由来するＢＭ細胞および脾細胞をＰＥ−ＩｇＭａ抗体およびＦＩＴＣ−ＩｇＭｂ抗体で表面染色して、標的化ＩｇＨ対立遺伝子のアロタイプ（ＩｇＭｂ）を保有する標的化２Ｆ５  ＶＨ  μＨＣを、ＩｇＭｂアロタイプを保有する内在性μＨＣから識別した。
【００２８】
ＥＬＩＳＡ分析。血清試料を、ナイーブ雌ＷＴ、２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋、ならびに利用できる場合にはＭＲＬ／ｌｐｒマウスから採集した。総ＩｇＧおよびＩｇＭの血清濃度を、それぞれ定量マウスＩｇＧおよびＩｇＭ  ＥＬＩＳＡキット(Bethyl)により測定した。総（ＩｇＭ＋ＩｇＧ特異的）Ｉｇのカルジオリピンおよびｇｐ４１  ＭＰＥＲ  ２Ｆ５反応性のＥＬＩＳＡ測定値を、先の記載(Haynes et al, Science 308: 19064908 (2005), Alam et al, J. Immunol. 178: 4424-4435 (2007))に従って光学濃度読取りにより測定し、核自己抗原に対する総Ｉｇの血清反応性をマウス抗ＡＮＡ定量ＥＬＩＳＡキット(Alpha Diagnostics)により測定した。カルジオリピンおよびＡＮＡのアッセイは１２〜３２週からの血清を用いて行なわれた；他のすべてのアッセイは８〜１６週令のマウスからの血清を用いて行なわれた。
【００２９】
結果
ヒト２Ｆ５  ＶＤＪ再編成配列はマウスＣＨとの機能的キメラ抗体を形成する。マウス定常部が元のヒトＩｇＧｌ  ２Ｆ５  ｍＡｂ（本明細書中でｈ２Ｆ５と呼ぶ）の会合および結合特性に作用を及ぼすかどうかを判定するために、まずインビトロ試験法を作成した。これを実施するために、２Ｆ５  ＶＨ／マウスＣγｌおよび２Ｆ５  ＶＬ／マウスＣκ発現構築体を作成し、２９３Ｔ細胞内へ同時形質導入した。２Ｆ５キメラ型マウス／ヒト組換え抗体（ｍ２Ｆ５）を、それが脂質ならびにマウスおよびヒト細胞抗原を結合する能力について評価した。実際に、ｍ２Ｆ５は両方のｇｐ４１および脂質をヒトＩｇＧｌ  ２Ｆ５  ｍＡｂ（ｈ２Ｆ５；図８Ａおよび８Ｂ）と同等に結合した。さらに、ｍ２Ｆ５はｈ２Ｆ５と同様にヒト上皮およびマウス線維芽細胞の核抗原と反応し（図８Ｃおよび８Ｄ）、ＨＩＶ−１を中和した（図８記号一覧および表１）。
【００３０】
表１．キメラ組換え２Ｆ５抗体（ｍ２Ｆ５）およびヒト２Ｆ５  ｍＡｂ（ｈ２Ｆ５）のＨＩＶ−１中和活性プロフィール
【００３１】
【表１】
2012522520.tif 000002
【００３２】
＊  ＴＺＭ−ｂｌ  ＨＩＶ−１エンベロープ擬ウイルス感染性アッセイにおいて決定した５０％中和力価（ＩＣ５０）
キメラ２Ｆ５  ＨＣがインビトロでマウスκ軽鎖（ＬＣ）と対合する能力も、２Ｆ５  ＶＨ／マウスＣγｌ発現構築体とＣ５７ＢＬ／６脾臓Ｂ細胞から５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲにより得られたマウスκＬＣとの同時形質導入により評価した。これを実施するために、脾臓Ｃ５７ＢＬ／６ＬＣレパートリーにしばしば用いられる２つのＶκファミリー（Ｖκ４およびＶκ９）を表わす４−５２、４−６０、４−７０および９−９６  Ｖ遺伝子を含むように４種類のマウスκＬＣを任意に選択した。それぞれの場合、２Ｆ５  ＨＣの同時形質導入により、分泌型機能性ｍＡｂが得られた（表２）。重要なことに、これらの形質導入により作成された４種類のキメラ構築体のうち３種類が、表面プラズモン共鳴およびＥＬＩＳＡにより測定してカルジオリピン多反応性を示した（図１４）。
【００３３】
表２．キメラ２Ｆ５  ＨＣとランダムマウス軽鎖を同時形質導入した２９３Ｔ細胞から精製した組換えｍＡｂの特異性および収率
【００３４】
【表２】
2012522520.tif 000003
【００３５】
＊  マウスＩｇＧ１に融合したヒト２Ｆ５  Ｖ（Ｄ）再編成配列およびネズミκ鎖定常部に融合したヒト２Ｆ５  Ｖ（Ｊ）再編成配列を含む構築体の同時形質導入により作成した陽性対照
ｌ  マウスκＬＣ定常部に融合した２Ｆ５  Ｖ−Ｊ再編成配列を含むＬＣ
２Ｆ５  ＶＨノックインマウスの作成。２Ｆ５  ｍＡｂ  ＨＣが免疫寛容により調節されるのに十分なほど自己反応性であるかどうかを判定するために、元の体細胞性変異２Ｆ５  ＶＨＤＪＨ再編成配列(Muster et al, J. Virol. 68: 4031 -4034 (1994), Muster et a!, J. Virol. 67: 6642-6647 (1993))をマウスＩｇｈ遺伝子座にノックインしてＪＨ  １−４領域を置き換えた（図９）。予想したＩｇｈ遺伝子座における相同組換え事象を確認するために、４種類の独立したＥＳクローンを推定挿入配列について評価し（図１５Ａ）、生殖細胞系列伝達された２Ｆ５  ＶＤＪ再編成配列を宿したヘテロ接合およびホモ接合子孫（２Ｆ５  ＶＨノックインマウス）をＰＣＲにより同定した（図１５Ｂ）。２Ｆ５  ＶＨノックインマウスはインビボで内在性Ｃγｌ遺伝子座に対するＣＳＲを支持し（図１５Ｃ）、したがって２Ｆ５  ＶＨＤＪＨがＢ細胞寛容機序を誘導できるかどうかの直接測定に有効なモデルを提供する。
【００３６】
２Ｆ５  ＶＨを発現する大部分のＢ細胞はプレＢ細胞から未熟Ｂ細胞への段階でＢＭにおいて削除される。Ｉｇｈ対立遺伝子の一方または両方における標的化２Ｆ５  ＶＤＪ挿入がＢ細胞発生に及ぼす作用を調べるために、ヘテロ接合（２Ｆ５  ＶＨ＋／−）およびホモ接合（２Ｆ５  ＶＨ＋／＋）ノックインマウスのＢＭにおけるＢ細胞個体発生とＣ５７ＢＬ／６対照のものとの比較を行なった。２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスからの総ＢＭ  Ｂ細胞画分を、プロＢ／大型プレＢ（Ｂ２２０ｌｏＣＤ４３＋）、小型プレＢ（Ｂ２２０ｌｏＣＤ４３−）、および未熟/成熟Ｂ（Ｂ２２０ｈｉＣＤ４３−）画分に分画することにより(Hardy et al, J, Exp. Med. 173: 1213-1225 (1991))、表面免疫グロブリン（ｓＩｇ＋）Ｂ細胞亜集団（Ｂ２２０ｈｉＣＤ４３−）が頻度（２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋の両方のマウスについて約４倍；図１０）および絶対数（２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋の両方のマウスについて約１０倍；表３）の両方において著しく低下したことが証明された。未熟、移行期、および成熟Ｂ細胞集団を同定するために、ＢＭ  Ｂ細胞をＩｇＭおよびＩｇＤに特異的な抗体によっても標識した。各集団の頻度および絶対数が２Ｆ５  ＶＨマウスにおいて同様に低下し、最大低下は移行期Ｂ細胞集団にみられた（２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスにおいて、それぞれ約７または約２０倍低下した頻度、および約１５または約６０倍減少した数）。これらの結果は、２Ｆ５  ＶＨマウスが主にプレＢから未熟Ｂ細胞への移行期にＢ細胞発生の著しい遮断を示すことを証明した；これは、多くの内在性ＬＣと対合した２Ｆ５  Ｉｇ  ＨＣを発現する未熟Ｂ細胞の削除により寛容が誘導されるのと一致する。未熟Ｂ細胞期におけるこの発生遮断は、自己反応性抗ＤＮＡ  ３Ｈ９ノックインマウスについて以前に報告されたものと同様である(Chen et al. Nature 373: 252-255 (1995), Sekiguchi et al, J. Immunol. 176: 6879- 6887 (2006))、および図１６、表４）。
【００３７】
表３．２Ｆ５  ＶＨノックインマウスおよび野生型同腹仔対照におけるＢＭ  Ｂ細胞画分の細胞数
【００３８】
【表３】
2012522520.tif 000004
【００３９】
表４．２Ｆ５  ＶＨおよび３Ｈ９ホモ接合ノックインマウスにおけるＢＭ  Ｂ細胞亜集団数の比較；Hardy画分
【００４０】
【表４】
2012522520.tif 000005
【００４１】
数値は絶対細胞数である（×１０６±ＳＤ）
２Ｆ５  ＶＨ＋／−ノックイン脾臓Ｂ細胞は内在性重鎖を優先的に発現する。ヘテロ接合体２Ｆ５  ＶＨマウスにおいて２Ｆ５  Ｉｇ  ＨＣを発現するＢ細胞がＢＭ削除を逃れるとすれば、それらは３Ｈ９−７６Ｒマウス(Chen et al, Nature 373: 252-255 (1995))の場合と同様に、内在性Ｉｇｈ再編成配列を発現するＢ細胞が優先的に対抗選択されるはずであるという疑問があった。したがって、２Ｆ５  ＶＨ標的化（ＩｇＭｂ）対立遺伝子と比較した内在性（ＩｇＭａ）対立遺伝子の表面発現の実験を、２Ｆ５  ＶＨ＋／−ＩｇＭａ／ＩｇＭｂ  Ｆ１（Ｆ１）マウスにおいて行なった。実際に、２Ｆ５  ＶＨ＋／−  Ｆ１マウスからの大部分のＩｇＭ＋脾細胞は表面ＩｇＭａを発現し、これは内在性ＨＣについての強い選択を指摘した（図１１Ａ）。この所見はＢＭ中のＩｇＭ＋  Ｂ細胞と対照的である；その場合は内在性対立遺伝子の対立遺伝子排除が大幅に維持されている（図１１Ｂ）。総ＩｇＭ＋  Ｂ細胞画分内のＩｇＭａおよびＩｇＭｂの発現の相対量により測定して、２Ｆ５  ＶＨ＋／−  Ｆ１マウスにおける内在性μＨＣ発現の頻度は脾臓において約８５％、ＢＭにおいて約４０％と推定された（図１１Ｂ）。脾臓２Ｆ５  ＶＨ＋／−  Ｆ１細胞における内在性ＨＣのこの優先的発現は、染色体内組換え、続く代替対立遺伝子の再編成／発現、により、２Ｆ５  μＨＣを発現する末梢Ｂ細胞集団がそれらの２Ｆ５  ＶＨ導入遺伝子に対抗して選択されるかまたはそれらを排除することを示唆する(Chen et al, J. Immunol. 152: 1970-1982 (1994))；ただし、これらの細胞のうち若干がＣＳＲを受ける可能性があることを正式に除外することはできない。２Ｆ５  ＶＨ＋／−  Ｆ１において２Ｆ５  μＨＣを発現する脾臓Ｂ細胞がそれらのＢ細胞受容体（B cell receptor）（ＢＣＲ；図１１Ａ）を下方調節した可能性もあり、すなわち受容体エンゲージメントによってアネルギー性になる細胞にみられたＩｇＭレベルがより低いことと一致する可能性がある(Goodnow et al, Nature 352: 532-536 (1991), Goodnow et al, Nature 334: 676-682 (1988))。
【００４２】
２Ｆ５  ＶＨノックインマウスは、低い表面Ｉｇ密度をもつ成熟脾臓Ｂ細胞集団の数が著しく減少している。２Ｆ５  Ｉｇ  ＨＣ＋  ＢＭ  Ｂ細胞に対抗する選択は、末梢Ｂ細胞数を減少させるはずである。実際に、同腹仔対照と比較して、２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスにおける脾臓Ｂ細胞（Ｂ２２０＋  ＣＤ１９＋  ｌｉｎ−，ｌｉｖｅ−ゲート）の数は、それぞれ７２％および８６％減少した（表５）。この残遺脾臓Ｂ細胞集団内の移行期、ＭＺ、および成熟Ｂ細胞亜集団頻度が変化するかどうかを判定するために、２Ｆ５  ＶＨ  Ｂ２２０＋  Ｂ細胞を、ＣＤ２３、ＣＤ９３、およびＩｇＭに対して特異的な抗体で染色した(Allman et al, J. Immunol. 167: 6834-6840 (2001))。興味深いことに、この残存Ｂ細胞集団内で移行期ＩｇＭｌｏ（Ｔ３）Ｂ細胞の頻度はほとんど変化しなかったが、移行期ＩｇＭｈｉ（Ｔ１およびＴ２）亜集団の頻度は２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋両方のマウスにおいて、正常対照と比較して著しく低下した（図１２Ａおよび図１７）。さらに、残存する総２Ｆ５  ＶＨ＋／＋脾臓Ｂ細胞集団内に、正常頻度のＭＺ  Ｂ細胞および濾胞成熟（Ｂ２２０＋、ＣＤ９３−、ＣＤ９３＋、ＩｇＭ＋）Ｂ細胞がみられたが、同腹仔対照と比較して、後者はより低い表面ＩｇＭ密度を示した。Ｔ１／Ｔ２  Ｂ細胞頻度の低下および比較的正常な頻度の成熟Ｂ細胞亜集団（ただし、膜Ｉｇレベルの低下を伴う）というこのパターンは、３Ｈ９ノックインマウスについて以前に報告されたものともきわめて類似する(Chen et al, Nature 373: 252-255 (1995), Li et al, J. Exp. Med. 195: 181-188 (2002), Sekiguchi et al, J. Immunol. 176: 6879-6887 (2006))。移行期および成熟両方のＢ細胞にみられた低い表面ＩｇＭ密度は、２Ｆ５  ＶＨ＋／−  Ｆ１マウスからのＩｇＭｂ＋脾臓Ｂ細胞が発現する低い膜ＩｇＭレベルも反映する（図１１Ａ）。
【００４３】
表５．２Ｆ５  ＶＨおよび３Ｈ９ホモ接合ノックインマウスにおけるＢＭ  Ｂ細胞亜集団数の比較；ＩｇＤ対ＩｇＭ染色
【００４４】
【表５】
2012522520.tif 000006
【００４５】
数値は絶対細胞数である（×１０６±ＳＤ）
２Ｆ５  ＶＨノックインマウスは、実質的レベルの血清ＩｇＧをもつにもかかわらず、カルジオリピンおよび抗核自己抗原に対する血清反応性を欠如する。２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスは正常対照と比較してそれぞれ正常ないし増大した血清ＩｇＧレベルを示したが、２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスのみは有意に低いレベルの血清ＩｇＭを発現した（図１３Ａ）。２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおける循環血清Ｉｇが実質的レベルであるにもかかわらず、ヘテロ接合およびホモ接合ノックインマウスからの血清はカルジオリピンまたは核自己抗原を結合しなかった（図１３Ｂ）。この反応性欠如は、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおけるＢ細胞発生の自己抗原特異的遮断および自己反応性Ｂ細胞集団の喪失と一致する。
【００４６】
まとめると、安全かつ有効なＨＩＶ−１ワクチンの開発は、多様なＨＩＶ−１株を中和できる抗体を誘導するＨＩＶ−１免疫原を設計できないことによって妨げられてきた。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖは希有な広域中和ヒト抗体が結合する保存された領域をもつが、免疫原上で、または自然感染に関して、これらの保存された領域は広域中和抗体を稀に誘導するにすぎない(Burton et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 14943-14948 (2005), Haynes and Montefiori, Expert Rev. Vaccines 5: 579-595 (2006), Simek et at, J. Virol. 83: 7337- 7348 (2009))。さらに、広域中和抗体がＨＩＶ−１により誘導される稀な場合ですら、それらは感染の数ヵ月後に産生されるにすぎない(S hen et al, J. Virol. 83: 3617-3625 (2009))。
【００４７】
２Ｆ５  ＶＨノックインマウスが未熟Ｂ細胞期の２Ｆ５  ＶＨ発現に際して著しいブロックを示すことは、２Ｆ５  ＶＨが寛容制御を発動するのに十分なほど自己反応性であることを証明し、この特異性の発現がインビボで寛容機序により調節されているという認識を支持する。これに関して、多くの広域中和抗体、たとえばｍＡｂ  ４Ｅ１０および１Ｂ１２が、長い疎水性ＣＤＲ３を含めた２Ｆ５  ＨＣのある特徴、および多反応性、すなわち先にヒトＢＭにおける削除についてマークされた抗体と関連づけられた特徴を共有する(Meffre et al, J. Clin. Invest. 108: 879-886 (2001))。
【００４８】
２Ｆ５  ＶＨ含有ＨＣを発現するＢ細胞における著しい遮断は、キメラ２Ｆ５  ＶＨ／マウスＣＨ  ＨＣと内在性マウスＬＣとの不完全および／または不十分な対合によって増強される可能性がある。しかし、本明細書に示すデータは、この可能性を支持しない。第１に、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおいてプレＢ区画が比較的正常なこと（３Ｈ９ノックインマウスのものに匹敵する；表４〜７）は、２Ｆ５  μＨＣが代理ＬＣと効果的に会合し、未熟Ｂ細胞期への分化の継続を支持できることと最も一致する；ただし、これは初期の部分的プレＢ細胞欠損が、プレＢ細胞期で停止した自己反応性未熟Ｂ細胞により補償されることによるものである可能性もある。しかし、いずれの可能性も、対合不適合よりむしろ、２Ｆ５  μＨＣがシグナル伝達コンピテントＢＣＲおよび／またはプレＢＣＲ複合体を形成する能力と一致する。第２に、ｍ２Ｆ５  ＨＣと４種類の別個のマウスＬＣの同時形質導入により、自己抗原と反応する機能性組換え抗体が産生された（図１４）。この所見は、ＬＣ対合のための能力および２Ｆ５自己反応性表現型の実質的な表現率（penetrance）を証明する。第３に、κＬＣと会合した２Ｆ５  μＨＣを含むナイーブ２Ｆ５  ＶＨノックインマウスの脾臓から９種類の異なるＶκ遺伝子ファミリーを用いて２６のハイブリドーマ系列が作成された（表９）。第４に、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスは、脾臓Ｂ細胞数が有意に減少した（表８）にもかかわらず、正常な比率のＭＺ  Ｂ細胞および瀘胞Ｂ細胞を示した（図１２）。この所見は、正常なＢ細胞成熟のための能力が維持されていることを指摘する。最後に、２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスにおける血清ＩｇＭの欠如は、血清ＩｇＭを産生しないけれどもＨＣ二量体からなる検出可能な血清ＩｇＧをもつκ＋λ  ＬＣ鎖欠損マウスにおいて報告された表現型(Zou et al, J. Exp. Med. 204: 3271-3283 (2007))と同様に、２Ｆ５  ＨＣがＬＣと対合できないことによるものであると反論される可能性がある。しかし、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスは、ＥＬＩＳＡ定量のために抗κＬＣ  Ａｂを用いて血清ＩｇＧを捕獲することにより証明されたように、実質的レベルの血清ＩｇＧ／κをもつ。これらの所見を合わせて考えると、２Ｆ５  ＶＨノックインマウスにおいてＢ細胞数が減少することについては、ＨＣ＋ＬＣ対合を損なわない免疫寛容が最も可能性のある説明であることが強く示唆される。
【００４９】
表６．２Ｆ５  ＶＨおよび３Ｈ９ホモ接合ノックインマウスにおけるＢＭ  Ｂ細胞亜集団頻度の比較；Ｈａｒｄｙ画分
【００５０】
【表６】
2012522520.tif 000007
【００５１】
数値は絶対細胞頻度である（％±ＳＤ）
表７．２Ｆ５  ＶＨおよび３Ｈ９ホモ接合ノックインマウスにおけるＢＭ  Ｂ細胞亜集団頻度の比較；ＩｇＤ対ＩｇＭ染色
【００５２】
【表７】
2012522520.tif 000008
【００５３】
数値は絶対細胞頻度である（％±ＳＤ）
表８．２Ｆ５  ＶＨノックインマウスおよびＷＴ同腹仔対照のＢＭおよび脾臓における総細胞数
【００５４】
【表８】
2012522520.tif 000009
【００５５】
数値は平均±ＳＤである
ａ，ｂ，ｃ  異なる文字をもつグループは、スチューデントのｔ検定により判定して０．０５レベルで異なる
表９．２Ｆ５  ＶＨノックインハイブリドーマ細胞系列における軽鎖利用の選択例
【００５６】
【表９】
2012522520.tif 000010
【００５７】
＊  ハイブリドーマ細胞系列は、２つのハイブリドーマ融合体から限定希釈度で平板培養した細胞の反復サブクローニングにより作成された；２Ｆ５  ＶＨ＋／＋（２Ｆ５  ＶＨ＋／＋）または２Ｆ５  ＶＨ  ＩｇＨｂ／ＷＴ  ＩｇＨａ  Ｆ１（２Ｆ５  ＶＨ＋／ａ）のいずれかのノックインマウスから採取したＮＳＯネズミ骨髄腫細胞およびナイーブ脾細胞を用いて実施した。２Ｆ５  ＶＨ＋／ａマウスに由来するハイブリドーマ系列を、上清のＩｇＨｂ特異的抗体に関するＥＬＩＳＡにより、まず２Ｆ５保有ＨＣの発現についてスクリーニングした。２Ｆ５  ＶＨＤＪＨ挿入配列の存在を、２Ｆ５  ＶＨ導入遺伝子およびＣμに特異的なプライマーの組合わせを用いたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、続いて直接配列決定により立証した；Ｖκファミリーは、縮重Ｖκ特異的プライマーとＣκプライマーの組合わせを用いたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、および直接配列決定により決定された。このパネルのすべてのハイブリドーマがＩｇＭイソ型のものであり、２Ｆ５  ＶＨ導入遺伝子に変異をもつものはなかった。
２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスにおける末梢表現型は、中枢寛容を逃れた残存する脾臓２Ｆ５  ＶＨ保有Ｂ細胞において自己反応性を制御するための付加的な機序と一致する。特に、２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスにおいてＴ３  ＩｇＭｌｏ集団が相対的に富化されること（図１２）は、受容体エンゲージメントによってアネルギー性になった自己反応性Ｂ細胞の頻度が増大したことと一致する(Goodnow et al, Nature 352: 532-536 (1991), Goodnow et al, Nature 334: 676-682 (1988))。同様なＩｇＭｌｏ表現型が、種々の３Ｈ９マウス系列の脾臓移行期Ｂ細胞にも記載されており(Chen et al, Nautre 373: 252-255 (1995), Erikson et al, Nature 349: 331-334 (1991), Li et al, J. Exp. Med. 195: 181-188 (2002), Chen et al, J. Immunol. 176: 5183-5190 (2006), Sekiguchi et al, J. Immunol. 176: 1213-1225 (1991))、これはアネルギー性Ｂ細胞あるいはＬＣ編集を受けた細胞の頻度が高いことを反映する(Sekiguchi et al, J. Immunol. 176: 1213-1225 (1991), Kiefer et al, J. Immunol. 180: 6094-6106 (2008), Kakajima et al, J. Immunol. 182: 3583-3596 (2009)))。興味深いことに、２Ｆ５  ＶＨ＋／＋成熟Ｂ細胞は、アネルギー性抗Ｓｍトランスジェニック成熟Ｂ細胞画分と同様なより低いｓＩｇＭ密度も示す(Culton et al, J. Immunol. 176: 790-802 (2006))。成熟２Ｆ５  ＶＨ＋／＋Ｂ細胞集団において低下したｓＩｇＭ発現についてこれに代わる魅力的な説明は、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）モデルの成熟Ｂ細胞集団と同様に、それらの自己反応性ＢＣＲが細胞内抗原に結合するというものである(Ferry et al, J. Exp. Med. 198: 1415-1425 (2003))。成熟２Ｆ５  ＶＨ＋／＋Ｂ細胞においてＩｇＭレベルが低下した理由とは関係なく、そのような集団が正常な比率で存在するという事実を２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスに非自己反応性血清Ｉｇが豊富に存在することと合わせると、付加的な機序（アネルギー以外）がこれらの集団における自己反応性をパージすると推定される。多様な３Ｈ９ノックイン系列において、３Ｈ９を保有するｄｓＤＮＡ反応性成熟Ｂ細胞を寛容化するそのような付加的な機序には、ＬＣ受容体編集、または二次的なＶ→ＶＤＪ再編成すなわちＶＨ置換による３Ｈ９挿入配列の置換が含まれる(Chen et al, Immunity 6: 97-105 (1997), Li et al, Immunity l5: 947-957 (2001), Chen et al, Immunity 3: 747-755 (1995))。これらの末梢Ｂ細胞寛容機序および／またはアネルギーのどちらが２Ｆ５  ＶＨ＋／＋マウスにおいて作動しているかを判定することが重要であろう。
【００５８】
一般的または標的化した自己反応性Ｉｇ導入遺伝子を保有するマウスは、自己反応性Ｂ細胞が排除された発生段階を判定するのに重要である(Shlomchik, Immunity 28: 18-28 (2008))。２Ｆ５  ＶＤＪノックインマウス系列は、２Ｆ５  ＶＤＪ再編成配列を発現する大多数のＢ系列細胞が小型プレＢから未熟Ｂ細胞への移行期にそれらの発生を停止することを証明する（図１０）。この発生遮断は、多くのＬＣと会合して抗ＤＮＡ反応性を特定する３Ｈ９−７６Ｒ  ＶＤＪ再編成配列を発現するマウスにみられたものとほぼ等しい(Li et al, Immunity 15: 947-957 (2001))。生殖細胞系列２Ｆ５  ＶＤＪ再編成配列が自己反応性を特定しなければ、２Ｆ５  ＨＣを保有する未熟Ｂ細胞は寛容化されず、自己反応性およびＨＩＶ−１中和にとって決定的な２Ｆ５  ＨＣ  ＣＤＲ残基が胚芽中心に生じたにちがいない。顕著なことに、自己反応性Ｂ細胞の排除は胚芽中心にも起きる可能性があり(Han et al, J, Exp. Med. 182: 1635-1644 (1995))、体細胞に生じた自己反応性／ＨＩＶ−１中和にとって決定的な変異を保有する２Ｆ５  ＨＣ  Ｂ細胞は、普通は胚芽中心の反応に際して削除または修正される可能性がある。寛容機序が同様に２Ｆ５生殖細胞系列ＶＤＪ配列に作用するかどうかを判定するためのさらに他の試験は有益な情報をもたらし、これらの試験の補足となるであろう。
【００５９】
２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂは両方とも、ＨＩＶ−１ウイルス粒子のｇｐ４１膜近接領域、および脂質二重層に結合する(Alam et al, J. Immunol. 178: 4424-4435 (2007))。２Ｆ５  ＨＣ  ＣＤＲ３における疎水性残基の変異は、脂質結合およびＨＩＶ−１中和を両方とも妨げる(Alam et al, Proc. Natl, Acad. Sci. USA epub (November 1 1, 2009))。この領域に特異的な中和抗体を誘導するには、脂質およびｇｐ４１  Ｅｎｖエピトープの両方を結合する抗体を産生できるＢ細胞集団を標的化することが必要であると思われる。この要件は、普通は起きないワクチン誘導によるＢ細胞応答を促進できる樹状細胞または他の抗原提示細胞の活性化によって容易になる可能性がある。２Ｆ５  ｍＡｂは多数のヒトに安全に投与されており、２Ｆ５は病原性脂質自己抗体の特徴をもたない（すなわち、それは脂質に結合するためにβ−２−グリコプロテイン−１を必要としない）(haynes et al, Science 308: 1906-1908 (2005), de Groot and Derksen, Thromb. Haemost 3: 1854-1860 (2005), Vcelar et al, AIDS 21: 2161-2170 (2007))。ただし、これらの抗体を誘導できるとすれば、ヒト以外の霊長類での試験での安全性モニタリングがきわめて重要であろう。
【００６０】
これらの試験により、ＨＩＶ−１広域中和抗体２Ｆ５含有ＨＣはノックインマウス設定で免疫寛容を誘発するのに十分なほど自己反応性であることが証明される。これらの所見は、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ４１膜近接領域に対する中和抗体を誘導する戦略を設計するのに重要な示唆をもつ。ＨＩＶ−１ワクチン開発は、これらの寛容制御を安全に逃れることができるワクチン療法計画に注目すべきである。さらに、ＨＩＶ−１に応答して直ちに生じる中和抗体応答、たとえば自然ＨＩＶ−１感染の数ヵ月後に生じるオートロガス中和抗体を促進および拡張することに努力を集中すべきである(Richnab et akm Oric, Batk, /acad, /scu, YSA 100: 4144-4149 (2003), Wei et al, Nature 422: 307-312 (2003))。
【００６１】
実施例３
ｍ２Ｆ５の作成および特性付け。ｍ２Ｆ５を作成するために、ヒトＶ＋マウスＣ構築体であって元の２Ｆ５  ＶＨ領域がマウスＣγ１にライゲートしたもの（ｍ２Ｆ５  ＨＣ）および元の２Ｆ５  Ｖκ領域がマウスＣκに融合したもの（ｍ２Ｆ５  ＬＣ）を、ｐＣＤＮＡ  ３．１発現ベクター内へクローニングし、２９３Ｔ細胞において一過性形質導入により同時発現させ、得られた組換え抗体（ｍ２Ｆ５）を標準法により精製した。ＳＰＲ結合測定のために、ビオチニル化ＭＰＥＲペプチドをストレプトアビジンセンサーチップに固着し、スクランブルド型のＭＰＥＲペプチドへの非特異的結合を差し引いた。先の記載(Alam et al, J. Immunol. 178: 4424-4435 (2007))に従って、指示したリン脂質組成をもつリポソームを調製し、５００ＲＵの各リポソームをＬｌセンサーチップに固着した。各抗体を１００μｇ／ｍＬで注入し、ホスファチジルコリンを含むリポソーム上における抗体の非特異的結合を評価した。ｍ２Ｆ５およびｈ２Ｆ５とマウス核抗原との反応性を検出するために、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を標準条件下にスライドガラス上で増殖させ、次いで固定し、透過処理した(Wardemann et al, Science 301: 1374-1377 (2003))。固定した細胞を、次いで１００μｇ／ｍｌのｍ２Ｆ５またはｈ２Ｆ５を含有する培地中でインキュベートし、結合した抗体をそれぞれヤギ抗マウスＩｇκまたはヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣで、Zeiss Axiovert 200M共焦点免疫蛍光顕微鏡（５０ｍｓ露光）により視覚検査した。ｍ２Ｆ５およびｈ２Ｆ５とヒト核抗原との反応性を検出するために、ＨＥｐ−２上皮細胞スライド(Zeus scientific, Raritan, NJ)を１００μｇ／ｍｌのｍ２Ｆ５およびｈ２Ｆ５抗体と共にインキュベートし、続いて飽和量のヤギ抗マウスＩｇκまたはヤギ抗ヒトＩｇで染色し、前記と同様に視覚検査した。自己反応性ＣＤ４ｉ  ｇｐ１２０  ｍＡｂであるヒトｍＡｂ  １７ｂを、バックグラウンド染色のための陰性対照として用いた。キメラ型ｍ２Ｆ５抗体およびｈ２Ｆ５抗体を、標準ＴＺＭＢ／Ｌ擬ウイルス感染阻害アッセイ法でＥｎｖ  ＨＩＶ−１擬ウイルスＢ．ＢＧ１１６８、Ｂ．ＳＦ１６２、Ｂ．ＱＨ０６９２、Ａ．９２ＵＧ０３７、およびＣ．ＴＶ−１を用いて試験した。
【００６２】
２Ｆ５  ＶＨマウスの作成。標的化ベクターは、免疫グロブリン重鎖の接合（ＪＨ）領域に挿入された再編成２Ｆ５  ＶＨ遺伝子を含み、すべての内在性ＪＨセグメントは破壊されていた。ネズミ免疫グロブリンＪＨ領域ならびにＪＨから上流および下流の領域（３’および５’側相同アームの作成に用いた）をマウスＣ５７ＢＬ／６ゲノムライブラリー由来のＢＡＣクローンから単離した。標的化主鎖は、ＣＡＧ−ＤＴＡおよびｌｏｘＰ−フランクされたＮｅｏ選択カセットを含んでいた。ＥＳ細胞の相同組換えを、Ｎｄｅ  ＩまたはＢａｍ  ＨＩを用いるサザンブロット法により確認した。標的化したＥＳクローンに、ｎｅｏ選択カセットのインビトロＣｒｅリコンビナーゼ仲介欠失を施し、４つの適正に標的化されたｎｅｏ−クローンをＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｔｙｒｃ−２Ｊ胚盤胞に注入し、それらのうち２つは、２Ｆ５  ＶＨ挿入配列が伝達されたキメラマウスを産生した。これらの子孫において、ＷＴまたは標的化対立遺伝子に特異的なＰＣＲプライマーおよび両方の対立遺伝子に共通のプライマーにより、２Ｆ５  ＶＨ＋／−および２Ｆ５  ＶＨ＋／＋遺伝子型を決定した（ベクター標的化スキームおよびスクリーニング戦略については、図８を参照）。２Ｆ５  ＶＨ＋／−または対照Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＩｇ  ＨＣ転写体を検出するために、２Ｆ５  ＶＨに特異的なプライマーおよびネズミＣμまたはＣγ１のいずれかに特異的なプライマーを、精製した脾臓Ｂ細胞からのｃＤＮＡを用いるＰＣＲ増幅に用いた。対照である内在性ＶＨ１再編成配列は、多重ＶＨ  Ｊ５５８リーダー配列を認識するプライマーをＣμまたはＣγ１に特異的なプライマーと組み合わせて用いて検出された。
【００６３】
実施例４
図１８および１９は、他の２つのＨＴＶ−１  ＭＰＥＲノックインマウス系統からの最初の特性付け（すなわち、骨髄Ｂ細胞の表現型プロフィール）を表わす：４Ｅ１０  ＶＨ＋／＋ノックインマウス（ＭＰＥＲ  ｂｎＡｂ  ４Ｅ１０の重鎖を両方の対立遺伝子に発現するように工学的処理）、および２Ｆ５  ＶＬ＋／＋ノックインマウス（ＭＰＥＲ＋ｂｎＡｂ  ２Ｆ５の軽鎖を両方の対立遺伝子に発現するように工学的処理）。
【００６４】
図１８は、他のＭＰＥＲ  ｂｎＡｂである４Ｅ１０からの重鎖（類似の自己反応性プロフィール、すなわち長い疎水性ＣＤＲ３、および自己抗原に対するインビトロ反応性を示す）が、２Ｆ５  ＨＣと同様に、インビボで寛容を誘発するのに十分なほど自己反応性であることも示す。これは、ＭＰＥＲ  ｂｎＡｂノックインモデルにおいて実施した試験を、このクラスのＨＴＶ−１  ｂｎＡｂ、すなわちこの著しく保存されたワクチン標的であるＭＰＥＲに対するものがインビボで寛容機序によってどのように扱われるかを理解するために、また種々のワクチン接種戦略により誘発されるＭＰＥＲ特異的Ａｂ応答がその機序によってどのような作用を受けるかを評価するための読出しとして、一般化できることを指摘する。
【００６５】
図１９は、特異性制御として２つの理由で重要である。第１に、それは、ヒトＩｇの一部を保有する発現構築体の標的化挿入がＢ細胞発生に全般的な非特異的作用を及ぼさないことを示す。第２に、それは、十分に特性付けされた高親和性自己抗体のノックインモデルにおける先の所見を確証し、これにより、それらの軽鎖が内在性ＨＣレパートリーと対合した際に自己反応性を特定せず、かつ重要なことに、Ｂ細胞発生に対する随伴作用をもたないことが証明された（これは、それらの自己反応性の特定におけるそのような高親和性自己抗体の重鎖の優先的役割と対照的である）。
【００６６】
図２０は、２Ｆ５  ＶＨ＋／＋ノックイン系統を図６に提示した系統であるＥｍ−ｂｃｌ２  ｔｇマウスと交配することにより作成された２Ｆ５  ＶＨ  Ｅμ−ｂｃｌ２  ｔｇマウスから得られた初期データを示す。図２０の重要性は２つある。第１に、それは２Ｆ５  ＶＨ発現Ｂ細胞が削除制御下にあるという追加証拠を提供し、これは、そのような削除制御が遺伝的に除かれると普通はきわめて稀な潜在的ｂｎＡｂ産生Ｂ細胞前駆体であるＭＰＥＲ反応性Ｂ細胞を富化できることを指摘する（図２０Ｃ）。第２に、２Ｆ５  ＶＨ×ｂｃｌ２  ｔｇマウスの脾臓および骨髄における２Ｆ５  ＶＨ発現Ｂ細胞の総数のレスキュー（図２０Ａ）、および総血清ＩｇＭおよびＩｇＧ３のレスキューは、２Ｆ５  ＶＨマウス（削除／アネルギー制御をもつ）および２Ｆ５  ＶＨ×ｂｃｌ２  ｔｇマウス（これらの削除／アネルギー制御をもたない）は、特別な免疫化戦略により誘発されたＭＰＥＲ  Ａｂ応答が削除／アネルギー寛容機序によりどのような作用を受けるかを調べるためのエレガントな比較読出しモデルとして役立ちうることを意味する。
【００６７】
前記に引用したすべての文献および他の情報源を全体として本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図７Ｎ】
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【図７Ｏ】
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【図７Ｐ】
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【図７Ｑ】
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【図７Ｒ】
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【図７Ｓ】
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【図７Ｔ】
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【図７Ｕ】
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【図７Ｖ】
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【図７Ｗ】
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【図７Ｘ】
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【図７Ｙ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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