(57)【要約】本発明は、治療薬を用いた治療に対する腫瘍細胞等の細胞の応答を予測するための方法を含む、患者を治療するための方法を提供する。これらの方法は、細胞試料における細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルの測定と、次いで、細胞ネットワークの計算モデルを使用して、該細胞のネットワークの活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算することとを含む。治療に対する細胞の応答は、次に、計算されたＮＡＳ値またはＮＩＳ値に基づき予測される。本発明はまた、細胞（例えば、腫瘍細胞）のＮＡＳ値またはＮＩＳ値の計算と、統計分類アルゴリズムの使用とが組み合わされる、細胞応答の予測方法も含む。ＥｒｂＢシグナル伝達経路内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療への応答性を予測するためのバイオマーカーも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍試料を得る段階、前記試料中のｐＥｒｂＢ３のレベルを決定する段階、および続いて少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬を患者に投与する段階を含む、新生物腫瘍を有する患者を治療する方法であって、
前記試料中で決定された前記ｐＥｒｂＢ３のレベルが、無血清培地中で２０〜２４時間培養された後のＡＣＨＮ細胞の培養物中で測定されたｐＥｒｂＢ３のレベルの５０％以上である場合、続いて患者に投与される前記少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含み、かつ
前記試料中で決定された前記ｐＥｒｂＢ３のレベルが、ＡＣＨＮ細胞の前記培養物中で測定されたｐＥｒｂＢ３レベルの５０％より低い場合、続いて患者に投与される前記少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含まない、方法。
【請求項２】
前記試料中の前記ｐＥｒｂＢ３のレベルが、
（ａ）前記試料中のＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の少なくとも２つの構成要素のそれぞれのレベルを測定する段階、
（ｂ）前記ＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の計算モデルに入力される、（ａ）で測定されたレベルを使用して、前記試料中の前記ｐＥｒｂＢ３のレベルをシミュレーションするネットワーク活性化状態を計算する段階、および
（ｃ）そこから前記試料中のｐＥｒｂＢ３のレベルを決定する段階
により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レベルが測定される少なくとも１つの構成要素が、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ヘレグリン、ベータセルリン、上皮成長因子、ヘパリン結合上皮成長因子、形質転換成長因子α、アンフィレギュリン、エピゲン（ｅｐｉｇｅｎ）、およびエピレギュリンから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
レベルが測定される少なくとも１つの構成要素が、モノマー、ホモダイマー、またはヘテロダイマーであるタンパク質である、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘテロダイマーが、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質の前記レベルが、定量的蛍光活性化細胞選別法、酵素結合免疫吸着測定法、免疫組織化学検査、定量的免疫組織化学検査、蛍光共鳴エネルギー転移、フェルスター共鳴エネルギー転移、蛍光タンパク質再構成法、質量分析法、免疫ブロット法、または共免疫沈降法により測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）で検出される構成要素の１つが、ｍＲＮＡである、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ネットワーク活性化状態の計算が、機構的モデルまたは統計分類アルゴリズムを含む前記ＥｒｂＢ３シグナル伝達経路のコンピュータモデルを含む、請求項２〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記計算されたネットワーク活性化状態が、前記試料中のｐＥｒｂＢ３、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、およびリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのうちの少なくとも１つのレベルをシミュレーションする、請求項２〜８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が、結腸、肺、直腸、胆嚢、脳、脊髄、乳房、腎臓、膵臓、胃、肝臓、骨、皮膚、脾臓、卵巣、精巣、前立腺、および筋肉から選択される器官の悪性腫瘍である、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、
（ｉ）配列番号１および２に示される、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を有するＡｂ＃６抗体、または配列番号７〜９および１０〜１２に示される、Ａｂ＃６のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を有する抗体、
（ｉｉ）配列番号３および４に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列を有するＡｂ＃３、または配列番号１３〜１５および１６〜１８に示される、Ａｂ＃３のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体、
（ｉｉｉ）配列番号５および６に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列を有するＡｂ＃１４、または配列番号１９〜２１および２２〜２４に示される、Ａｂ＃１４のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体、
（ｉｖ）配列番号２５および２６に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列を有するＡｂ＃１７、または配列番号２７〜２９および３０〜３２に示される、Ａｂ＃１７のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体、および
（ｖ）配列番号３３および３４に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列を有するＡｂ＃１９、または配列番号３５〜３７および３８〜４０に示される、Ａｂ＃１９のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１０うちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、ＭＭ−１２１を含む、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法であって、前記方法は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する、該細胞ネットワークを含む細胞の応答を予測するためのものであり、
（ａ）前記計算システムの入力デバイスを通して、前記細胞の試料中で測定される前記細胞ネットワーク中の１つ以上の構成要素のレベルを特定する入力を受け取る段階、
（ｂ）前記細胞ネットワークの機構的計算モデルを使用して、前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を、前記計算システムを用いて前記入力から計算する段階、および
（ｃ）（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態または前記ネットワーク阻害状態に少なくとも部分的に基づき、前記治療薬を用いた治療に対して予測される前記細胞の応答を、前記計算システムを用いて生成し、かつ前記出力デバイスで表示する段階
を含む、方法。
【請求項１４】
入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法であって、前記方法は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する、該細胞ネットワークを含む細胞の応答を予測するためのものであり、
（ａ）前記計算システムの入力デバイスを通して、前記細胞の試料において測定される前記細胞ネットワーク中の１つ以上の構成要素のレベルを特定する入力を受け取る段階、
（ｂ）統計分類アルゴリズムを含む前記細胞ネットワークの計算モデルを使用して、前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を、前記計算システムを用いて前記入力から計算する段階、および
（ｃ）（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態または前記ネットワーク阻害状態に少なくとも部分的に基づき、前記治療薬を用いた治療に対して予測される前記細胞の応答を、前記計算システムを用いて生成し、かつ前記出力デバイスで表示する段階
を含む、方法。
【請求項１５】
細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための方法であって、
（ａ）前記細胞の試料において、前記細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定する段階、
（ｂ）（ａ）で測定されたレベルとともに入力された前記細胞ネットワークの機構的計算モデルを使用して、前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を計算することと、前記機構的計算モデルの出力を利用する統計分類アルゴリズムに少なくとも部分的に基づき、前記治療薬を用いた治療に対する前記細胞の応答を予測することとを含む、コンピュータにより遂行される方法を適用する段階
を含む、方法。
【請求項１６】
入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法であって、前記方法は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのものであり、
（ａ）前記計算システムの入力デバイスを通して、前記細胞の試料において測定される細胞ネットワーク中の１つ以上の構成要素のレベルを特定する入力を受け取る段階、
（ｂ）前記細胞ネットワークの計算モデルを使用して、前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を、前記計算システムを用いて計算する段階、および
（ｃ）前記治療薬を用いた治療に対して予測される前記細胞の応答を、前記計算システムを用いて生成し、かつ前記出力デバイスで表示する段階
を含む、方法。
【請求項１７】
前記細胞ネットワークが、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を含む、請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
レベルが測定される構成要素の１つが、前記ＥｒｂＢシグナル伝達経路に関与するＥｒｂＢ受容体リガンドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥｒｂＢ受容体リガンドが、ヘレグリン、ベータセルリン、上皮成長因子、ヘパリン結合上皮成長因子、形質転換成長因子α、アンフィレギュリン、エピゲン、またはエピレギュリンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
レベルが測定される構成要素の１つが、前記ＥｒｂＢシグナル伝達経路に関与する受容体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記受容体が、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療薬が、抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、およびｍＡｂ８０６から選択される抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療薬が、抗ＥｒｂＢ２抗体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗ＥｒｂＢ２抗体が、トラスツズマブを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療薬が、抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、
（ｉ）配列番号１および２に示される、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を有するＡｂ＃６抗体、または配列番号７〜９および１０〜１２に示される、Ａｂ＃６のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を有する抗体、
（ｉｉ）配列番号３および４に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列を有するＡｂ＃３、または配列番号１３〜１５および１６〜１８に示される、Ａｂ＃３のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体、
（ｉｉｉ）配列番号５および６に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列を有するＡｂ＃１４、または配列番号１９〜２１および２２〜２４に示されるＡｂ＃１４のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体、
（ｉｖ）配列番号２５および２６に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列を有するＡｂ＃１７、または配列番号２７〜２９および３０〜３２に示される、Ａｂ＃１７のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体、
（ｖ）配列番号３３および３４に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列を有するＡｂ＃１９、または配列番号３５〜３７および３８〜４０に示される、Ａｂ＃１９のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体、
（ｖｉ）ＭＭ−１２１、ならびに
（ｖｉｉ）Ｕ３−１２８７
のうちの少なくとも１つを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、抗ＥｒｂＢ２抗体に連結された抗ＥｒｂＢ３抗体を含む二重特異性抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記二重特異性抗体が、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有するＨ３×Ｂ１Ｄ２二重特異性抗体か、または、配列番号４８〜５０および５１〜５３のＢ１Ｄ２のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体に連結された、配列番号４２〜４４および４５〜４７に示されるＨ３のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体を含む二重特異性抗体を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療薬が、それぞれの抗体がＥｒｂＢ３上の異なるエピトープに結合する２つ以上の抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、ＭＭ−１２１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療薬が、抗ＥｒｂＢ４抗体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療薬が、汎ＥｒｂＢ阻害剤またはＨＥＲ二量体化阻害剤を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療薬が、ペルツズマブを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療薬が、ゲフィチニブ、ラパチニブ、ＣＩ−１０３３、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ−１５８７８０、ＥＫＢ−５６９、および４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリンから選択されるＥｒｂＢシグナル伝達経路の小分子阻害剤を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞ネットワークが、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を含む、請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療薬が、抗ｃ−Ｍｅｔまたは抗ＨＧＦ抗体を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療薬が、ＡＶ２９９、ＡＭＧ１０２、および５Ｄ５から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療薬が、抗ＥｒｂＢ１抗体に連結された抗ＨＧＦ抗体を含む二重特異性モノクローナル抗体を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療薬が、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の小分子阻害剤を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の小分子阻害剤が、ＡＲＱ１９７またはＰＨＡ６６５７５２である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞ネットワークが、インスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）シグナル伝達経路を含む、請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療薬が、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体が、ｍＡｂ３９１、ＩＭＣ−Ａ１２、１９Ｄ１２、Ｈ７Ｃ１０、ＣＰ７５１，８７１、ＳＣＶ／ＦＣ、およびＥＭ／１６４である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体が、抗ＥｒｂＢ３抗体に連結された抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を含む二重特異性モノクローナル抗体を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療薬が、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、ＮＶＰ−ＡＤＷ７４２、ＮＶＰ−ＴＡＥ２２６、ＢＭＳ−５３６、９２４、ＢＭＳ−５５４、４１７、ＰＱ４０１、およびシクロリグナンから選択されるＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路の小分子阻害剤を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記ネットワークが、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を含み、かつレベルが測定される前記構成要素が、ＥｒｂＢ１およびヘレグリンである、請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ネットワークが、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を含み、かつレベルが測定される前記構成要素が、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３である、請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ネットワークが、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を含み、かつレベルが測定される前記構成要素が、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３、ヘレグリン、およびベータセルリンである、請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態が、前記ＥｒｂＢ３シグナル伝達経路における１つ以上のリン酸化タンパク質のレベルをシミュレーションする、請求項４７〜４９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態が、前記細胞の前記試料中のリン酸化されたＥｒｂＢ３レベルをシミュレーションする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態が、前記細胞の前記試料中のリン酸化されたＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはリン酸化されたＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態が、前記治療薬の不在下のＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマー、またはＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
（ｂ）で計算された前記ＮＩＳが、前記治療薬の不在下のＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーまたはＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルと比較した、前記治療薬の存在下のＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ＫＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、およびＰＴＥＮから選択される少なくとも１つの遺伝子の変異状態を特定する入力を、入力デバイスを通して受け取る計算システムをさらに含む、請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
レベルが測定される前記構成要素が、ベータセルリンおよびアンフィレギュリンであり、かつ前記方法が、前記ＫＲＡＳ遺伝子の前記変異状態を特定する入力を、入力デバイスを通して受け取る計算システムをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
レベルが測定される前記１つ以上の構成要素が、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ヘレグリン、ベータセルリン、アンフィレギュリン、ヘパリン結合上皮成長因子、上皮成長因子、形質転換成長因子α、エピゲン、およびエピレギュリンから選択され、かつ前記方法が、前記ＫＲＡＳ遺伝子の前記変異状態を決定する段階、または前記ＫＲＡＳ遺伝子の前記変異状態を特定する入力を、入力デバイスを通して受け取る計算システムをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態が、前記ＥｒｂＢシグナル伝達経路における１つ以上のリン酸化タンパク質のレベルをシミュレーションする、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療薬に対する複数の既知の応答株および非応答株に対して計算されたネットワーク活性化状態値またはネットワーク阻害状態値が、ネットワーク活性化状態値またはネットワーク阻害状態値の閾値を設定するために使用され、これが、前記治療薬に対する応答性または非応答性を示す、請求項５０〜５８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
治療に対する前記細胞の前記応答が、（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を、前記ネットワーク活性化状態値またはネットワーク阻害状態値の閾値と比較することにより予測され、これが、前記治療薬に対する応答性または非応答性を示す、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
統計分類アルゴリズムの適用が、
１．（ａ）で決定された前記細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベル、
２．（ｂ）で計算された前記ネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態、
３．前記細胞の前記試料における１つ以上の遺伝子の前記変異状態、
４．前記治療薬で治療される前記対象の年齢、
５．前記治療薬で治療される前記対象の性別、
６．前記細胞上でのエストロゲン受容体（ＥＲ）の有無、
７．前記細胞上でのプロゲステロン受容体の有無、および
８．前記細胞上でのアンドロゲン受容体の有無
から選択される情報のうちの１つ以上の項目を前記アルゴリズムに入力することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項６２】
ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための方法であって、
（ａ）（ｉ）ヘレグリン、ならびに（ｉｉ）ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３から選択される少なくとも１つの受容体のレベルを、前記細胞の試料において測定する段階、
（ｂ）（ａ）で測定されたレベルに基づき、前記治療薬を用いた治療に対する前記細胞の前記応答を、コンピュータを使用して予測する段階であって、対照に対する、ＨＲＧおよび前記少なくとも１つの受容体のレベルの上昇により、前記治療薬を用いた治療に対する応答性が予測される、段階
を含む、方法。
【請求項６３】
入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法であって、前記方法は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのものであり、
（ａ）前記細胞の試料においてそのレベルが測定された（ｉ）ヘレグリン、ならびに（ｉｉ）ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３から選択される少なくとも１つの受容体の測定されたレベルを特定する入力を、前記計算システムの入力デバイスを通して受け取る段階、
（ｂ）前記測定されたレベルに基づき、前記治療薬を用いた治療に対する前記細胞の予測される応答を、前記計算システムを用いて生成し、その後、前記出力デバイスで表示する段階であって、対照に対する、ＨＲＧおよび前記少なくとも１つの受容体のレベルの上昇により、前記治療薬を用いた治療に対する応答性が予測される、段階
を含む、方法。
【請求項６４】
前記測定されたレベルが、ＨＲＧおよびＥｒｂＢ１のレベルである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記測定されたレベルが、ＨＲＧおよびＥｒｂＢ２のレベルである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記測定されたレベルが、ＨＲＧおよびＥｒｂＢ３のレベルである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記測定されたレベルが、ＨＲＧ、並びにＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３から選択される少なくとも２つの受容体のレベルである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記測定されたレベルが、ＨＲＧ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３のレベルである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６９】
ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための方法であって、
（ａ）ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、およびリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのうちの１つ以上のレベルを、前記細胞の試料において測定する段階、ならびに
（ｂ）（ａ）で測定されたレベルに基づき、前記治療薬を用いた治療に対する前記細胞の前記応答を、コンピュータを使用して予測する段階であって、対照に対する、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルにおける差異により、前記治療薬を用いた治療に対する応答性が予測される、段階
を含む、方法。
【請求項７０】
入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法であって、前記方法は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのものであり、
（ａ）前記細胞の試料において測定された、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、およびリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのうちの１つ以上の測定されたレベルを特定する入力を、前記計算システムの入力デバイスを通して受け取る段階、ならびに
（ｂ）前記測定されたレベルに基づき、前記治療薬を用いた治療に対して予測される前記細胞の応答を、計算システムを用いて生成および表示する段階であって、対照に対する、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルにおける差異により、前記治療薬を用いた治療に対する応答が予測される、段階
を含む、方法。
【請求項７１】
前記測定されたレベルが、統計分類アルゴリズムに入力され、かつ治療に対する前記細胞の応答が、前記アルゴリズムの出力に基づき予測される、請求項６２、６３、６９、および７０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
ネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態が、ＥｒｂＢ細胞ネットワークの計算モデルを使用して、前記測定されたレベルに基づき計算される、請求項６２、６３、６９、および７０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記治療薬を用いた治療に対する前記細胞の前記応答が、前記計算されたネットワーク活性化状態値またはネットワーク阻害状態値に基づき予測される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記治療薬が、抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、請求項６２、６３、６９、および７０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号１および２に示される、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を有するＡｂ＃６抗体、または配列番号７〜９および１０〜１２に示されるＡｂ＃６のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を有する抗体を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７６】
前記測定されたレベルが、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、および／またはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルであり、かつ前記治療薬が、抗ＥｒｂＢ２抗体に連結された抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、二重特異性抗体である、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記二重特異性抗体が、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有するＨ３ｘＢ１Ｄ２二重特異性抗体か、または、配列番号４８〜５０および５１〜５３のＢ１Ｄ２のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体に連結された、配列番号４２〜４４および４５〜４７に示されるＨ３のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗体を含む二重特異性抗体を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項１３〜１６、６２、６３、６９、および７０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記腫瘍が、乳癌の腫瘍である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記腫瘍が、肺、直腸、胆嚢、脳、脊髄、乳房、腎臓、膵臓、胃、結腸、肝臓、骨、皮膚、脾臓、卵巣、精巣、前立腺、および筋肉から選択される組織の腫瘍である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記腫瘍の前記試料が、腫瘍組織、微細針吸引液、乳頭吸引液、または、血液試料、全血、血清、血漿、リンパ液、唾液および尿から単離された循環腫瘍細胞、もしくはそこから単離された脱離または循環腫瘍細胞から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記測定されたレベルが、タンパク質レベルであり、かつ前記タンパク質が、モノマー、ホモダイマー、またはヘテロダイマーである、請求項１３〜８１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
タンパク質レベルが、定量的蛍光活性化細胞選別法、酵素結合免疫吸着測定法、免疫組織化学検査、定量的免疫組織化学検査、蛍光共鳴エネルギー転移、フェルスター共鳴エネルギー転移、蛍光タンパク質再構成法、質量分析法、免疫ブロット法、および共免疫沈降法から選択される１つ以上の方法によって測定される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記測定されたレベルが、ｍＲＮＡレベルである、請求項１３〜８１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
治療に対する前記予測された前記細胞の応答に基づき、治療レジメンを選択することをさらに含む、請求項１３〜８１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記予測された応答に基づき、前記治療薬の投与のための治療レジメンを選択することをさらに含む、請求項１３〜８１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記予測された応答に基づき、使用のために前記治療薬を調製することをさらに含む、請求項１３〜８１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのキットであって、
（ａ）前記細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを検出するための１つまたは複数の試験法と、
（ｂ）前記細胞ネットワークの計算モデルを使用して、前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を計算するための説明書と
を含む、キット。
【請求項８９】
（ｃ）前記治療薬を用いた治療に対する前記細胞の前記応答を予測するための、前記キットの使用のための説明書をさらに含む、請求項８８に記載のキット。
【請求項９０】
統計分類アルゴリズムを適用するための説明書をさらに含む、請求項８８または請求項８９に記載のキット。
【請求項９１】
前記細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを検出するための前記１つまたは複数の試験法が、前記構成要素のタンパク質レベルの検出を可能にする１つ以上の試薬を含む、請求項８８または請求項８９に記載のキット。
【請求項９２】
前記細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを検出するための前記試験法が、前記構成要素のｍＲＮＡレベルの検出を可能にする１つ以上の試薬を含む、請求項８８または請求項８９に記載のキット。
【請求項９３】
前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を計算するための前記説明書が、命令が実行されると、プロセッサに、前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を計算するための動作を実行させるための、実行可能な命令を含有するコンピュータプログラム製品を使用するための説明書である、請求項８８または請求項８９に記載のキット。
【請求項９４】
前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を計算するための前記説明書が、前記細胞における前記細胞ネットワークの１つ以上の構成要素の前記レベルを示す情報がユーザにより入力される時に、前記細胞のネットワーク活性化状態またはネットワーク阻害状態を計算するコンピュータプログラムを作動させるインターネットベースのサービスとのインターフェース接続のための、前記キットのユーザ用の説明書を含む、請求項８８または請求項８９に記載のキット。
【請求項９５】
前記細胞ネットワークが、ＥｒｂＢシグナル伝達経路である、請求項８８〜９４のうちのいずれか１項に記載のキット。
【請求項９６】
少なくとも１つのＥｒｂＢシグナル伝達経路受容体、および少なくとも１つのＥｒｂＢシグナル伝達経路リガンドのレベルを検出するための１つまたは複数の試験法を含む、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ヘレグリン、およびベータセルリンのレベルを検出するための試験法を含む、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
ＥｒｂＢ１およびヘレグリンのレベルを検出するための試験法を含む、請求項９５に記載のキット。
【請求項９９】
ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのうちの少なくとも１つのレベルを検出するための１つまたは複数の試験法を含む、請求項９５に記載のキット。
【請求項１００】
前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項８８〜９９のうちのいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０１】
細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのバイオマーカーを特定するための方法であって、
（ａ）前記細胞の試料において、前記細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定する段階、
（ｂ）
（ｉ）前記細胞ネットワークの計算モデルを使用して、前記細胞ネットワークの１つ以上の追加の構成要素のレベルを計算することと、
（ｉｉ）治療薬を用いた治療に対する前記細胞の応答がその計算されたレベルにより予測される前記細胞ネットワークの構成要素を特定し、それにより、前記治療薬を用いた治療に対する前記細胞の応答を予測するバイオマーカーとして、前記構成要素を特定することとを含む、コンピュータにより実施される方法を適用する段階
を含む、方法。
【請求項１０２】
入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法であって、前記方法は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのバイオマーカーを特定するためのものであり、
（ａ）前記計算システムの入力デバイスを通して、前記細胞の試料において測定された細胞ネットワークの１つ以上の構成要素の測定されたレベルを特定する入力を受け取る段階、
（ｂ）前記細胞ネットワークの計算モデルを使用して、前記細胞ネットワークの１つ以上の追加の構成要素のレベルを、前記計算システムを用いて計算する段階、ならびに
（ｃ）治療薬を用いた治療に対する前記細胞の応答がその計算されたレベルにより予測される前記細胞ネットワークの構成要素を、前記計算システムにより特定し、かつそれにより、前記治療薬を用いた治療薬に対する前記細胞の応答を予測するバイオマーカーとして、前記構成要素を特定する段階
を含む、方法。
【請求項１０３】
命令が実行されると、請求項１〜８７または１０１〜１０２のうちのいずれか１項に記載される方法を実施する、コンピュータが実行可能な命令を格納する１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項１０４】
腫瘍試料を得る段階、前記試料中のｐＥｒｂＢ３のレベルを決定する段階、および続いて少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬を前記患者に投与する段階を含む、新生物腫瘍を有する患者を治療するための方法であって、
前記試料において決定されたｐＥｒｂＢ３の前記レベルが、最小レベル以上である場合、続いて患者に投与される前記少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含み、かつ
前記試料中で決定された前記ｐＥｒｂＢ３のレベルが、０．０６４ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．０８ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．０９６ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．１２２ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．１２８ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．１４４ｐｇ／μｇ総タンパク質、または０．１６ｐｇ／μｇ総タンパク質である最小レベルより低い場合、続いて患者に投与される前記少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含まない、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
癌および他の疾患の治療に対する標的治療の開発は、かなり進歩している。このような標的治療は、腫瘍細胞上に特異的にまたは優先的に発現する抗原に結合するモノクローナル抗体、および腫瘍細胞において活発なシグナル伝達経路の個別の構成要素に特異的に干渉する小分子薬剤を含む。例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））は、少なくとも特定の結腸癌および頭頚部癌で発現する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１、またはＨＥＲ１としても知られる））を標的とするモノクローナル抗体である。また、例えば、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））は、特定の慢性骨髄性白血病で発現して発癌性因子として作用し、かつ良性細胞タンパク質の異常変異体であるＢＣＲ−Ａｂｌチロシンキナーゼを標的とする小分子である。このような標的治療は、一部の患者には効果的であるようだが、応答率は、決して１００％ではない。例えば、腫瘍がＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）を発現することが既知である場合でさえ、セツキシマブの単独療法の平均応答率は、患者の約１５〜２０％にすぎない。したがって、腫瘍におけるＥｒｂＢ１（セツキシマブ抗体により標的とされる抗原）の単なる発現は、セツキシマブへの応答を保証しない。
【０００２】
したがって、標的治療は、非常に望みがあるが、このような治療に対する患者の応答率のばらつきは、このような治療に伴う副作用およびこのような治療の典型的な費用の高さも加わって、どの患者が治療的処置に応答するかを予測し、応答が予測される患者にのみ治療を施すことを含む、患者を治療するための方法が非常に望まれることを示す。採用されているアプローチの１つとしては、治療に対する応答性と相関する遺伝的マーカー（例えば、変異または対立遺伝子）を特定する試みである。このアプローチでは、治療の前に、患者由来の試料を遺伝子型決定して、患者が治療への応答の指標である遺伝的マーカーを持っているかどうかを決定する。採用されている別のアプローチは、治療に対する応答と相関するタンパク質バイオマーカーを特定する試みである。このアプローチでは、治療の前に、患者由来の試料中のタンパク質発現を決定し、患者が、治療への応答の指標である１つ以上のタンパク質バイオマーカーを発現するかどうかを決定する。
【０００３】
前述のアプローチは両方とも、「直接的」マーカーアプローチと考えることができ、ここで、直接的に測定されるマーカー（例えば、ＢＣＲ−ＡｂｌまたはＥｒｂＢ１）の存在（もしくは不在、または発現レベル）が、治療に対する応答または非応答と相関することが示されている。さらに、これらのアプローチは両方とも、患者から単離された試料において、容易に測定または定量化することができるように、細胞で十分に安定であるマーカーの使用に依存している。試料が患者から単離される時とマーカーが試料において測定される時との間に、かなりの時間差がある可能性を考慮すると、上述のこのような「直接的」マーカーアプローチは、典型的に、試料が従来のプロセスおよび取り扱いを受ける時、経時分解または変化を受けない遺伝的またはタンパク質マーカーの使用を必要とする。特定の治療薬に対する応答を予測する、このような安定した「直接的」マーカーが特定されているが、このようなマーカーが、全ての治療薬において特定され得るかは不明である。
【０００４】
腫瘍は、一連のリガンドにより活性化されたシグナル伝達経路により成長が促進され、それらのシグナル伝達経路は、通常、同族の受容体に結合するリガンドにより活性化され、受容体自体並びに下流のキナーゼのリン酸化を誘発し、経路の下流の構成要素のさらなるリン酸化をもたらすと考えられている。これらのキナーゼは、細胞生存および増殖をもたらす。したがって、シグナル伝達経路の活性化は、細胞内構成要素の変更、特にタンパク質のリン酸化をもたらす。腫瘍組織上に発現する受容体のリン酸化の特徴は、特定の腫瘍の進行を促進する主要経路の特定を補助することができる。しかしながら、リンタンパク質は、非常に不安定である可能性があり、組織試料が即時に、かつ迅速に凍結（または場合によっては、ホルマリン固定）されなければ、リン酸化は、術後すぐに消失しうる。さらに、特定の腫瘍試料において１つ以上のリンタンパク質のレベルが、確実に測定できる場合でさえ、任意の特定の治療薬を用いたこのような腫瘍の治療の有効性に関する、任意の特定のリンタンパク質の存在または不在の予測値は、概して不明である。したがって、リンタンパク質の特性は、腫瘍の進行を促進させる経路に関する重要な情報を含有するが、このようなリンタンパク質の特性は、現在、治療的処置に対する応答を予測するためのバイオマーカーとして広く使用されていない。
【０００５】
したがって、様々なリンタンパク質のレベルを決定するための、また特定の治療薬に対する個々の腫瘍の応答を予測するためのこのようなレベルおよび他の腫瘍細胞の特徴を使用する新規方法が、癌治療の治療効率および費用効率を向上するために必要である。
【発明の概要】
【０００６】
治療薬に対する、細胞、特に腫瘍細胞（例えば、良性腫瘍細胞、または悪性腫瘍細胞）などの新生物細胞および腫瘍細胞ではない悪性細胞等の応答を予測するための方法、並びにそのような腫瘍を有する患者を治療薬で治療するための方法を、本明細書で提供する。
【０００７】
一態様において、患者由来の悪性細胞の試料を得ること、試料における細胞の特定の生化学的特徴を決定すること、および続いて少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬を患者に投与することにより、悪性病変の患者を抗腫瘍性治療薬で治療するための方法を提供する。特定の実施形態において、生化学的特徴は、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルであり、さらなる実施形態において、バイオマーカーのレベルは、他のより安定した生化学化合物のレベルを測定し、その後、コンピュータモデル化パラダイムを使用して対象のバイオマーカーのレベルを決定することにより、決定される。治療薬は、バイオマーカーのレベルに基づき選択され、特定の薬剤は、バイオマーカーが特定のレベルを超えた時にのみ投与される。
【０００８】
特定の実施形態において、腫瘍細胞を含む腫瘍試料（例えば、生検試料または摘出試料）を得る段階、試料中のリン酸化ＥｒｂＢ３（ホスホ−ＥｒｂＢ３、ｐＥｒｂＢ３）のレベルを決定する段階、および続いて少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬を患者に投与する段階を含む、新生物腫瘍を有する患者を抗腫瘍性治療薬で治療するための方法を提供する。試料細胞が少なくとも最小レベルのｐＥｒｂＢ３を含有することが分かった場合、抗ＥｒｂＢ３治療薬が投与され、試料細胞が少なくとも最小レベルのｐＥｒｂＢ３を含有しないと分かった場合、抗ＥｒｂＢ３治療薬でない抗腫瘍性治療薬が投与され、抗ＥｒｂＢ３治療薬は患者に投与されない。好適な抗ＥｒｂＢ３製薬用薬剤は、抗ＥｒｂＢ３抗体である。この方法の特定の実施形態において、試料細胞中のＥｒｂＢ３レベルは、他の、より安定したバイオマーカーのレベルを測定し、シミュレーションにより試料細胞中のｐＥｒｂＢ３レベルを決定するネットワーク活性化状態を（実際に経験的に測定された試料細胞中の他のバイオマーカーのレベルに基づき）計算するコンピュータモデルを生成するように計算システムを使用して、コンピュータ化された方法を使用することにより推論的に決定される。
【０００９】
このような一実施形態において、腫瘍試料を得る段階、試料中のｐＥｒｂＢ３のレベルを決定する段階、および続いて少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬を患者に投与する段階を含む、悪性腫瘍を有する患者を治療するための方法が提供され、ここで、試料において決定されたｐＥｒｂＢ３のレベルが、無血清培地（例えばＲＰＭＩ）で２０〜２４時間培養した後のＡＣＨＮ腎癌細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６１１）の培養物において測定されたｐＥｒｂＢ３のレベルの５０％以上の場合、続いて患者に投与される少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含み、試料において決定されたｐＥｒｂＢ３のレベルが、ＡＣＨＮ腎癌細胞の培養物において測定されたｐＥｒｂＢ３のレベルの５０％より低い場合、続いて患者に投与される少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含まない。
【００１０】
特定の態様において、本発明は、入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法を提供し、該方法は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する、細胞ネットワーク（例えば、ＥｒｂＢシグナル伝達経路）を含む細胞（例えば腫瘍細胞）の応答を予測するためのものであり、該方法は、（ａ）該計算システムの入力デバイスを通して、細胞試料において測定された細胞ネットワーク中の１つ以上の構成要素のレベルを特定する入力を受け取る段階、（ｂ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を、計算システムを用いて、入力から計算する段階、および（ｃ）（ｂ）で計算されたＮＡＳまたはＮＩＳの少なくとも一部に基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を、計算システムを用いて生成し、その後、該出力デバイスで表示する段階を含む。
【００１１】
さらなる態様において、細胞に含まれる細胞ネットワーク（例えば、ＥｒｂＢシグナル伝達経路）内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための方法が提供され、該方法は、（ａ）細胞試料において、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定する段階、および（ｂ）（ｉ）１つ以上の測定されたレベルを用いた細胞ネットワーク入力の計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算し、（ｉｉ）（ｉ）で計算されたＮＡＳまたはＮＩＳの少なくとも一部に基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を計算して出力することを含む、コンピュータにより遂行される方法を適用する段階を含む。特定の実施形態において、このような方法は、治療薬に対する細胞の予測される応答に基づき、治療薬を用いて、細胞、または細胞が得られた患者を治療することをさらに含むことができる。
【００１２】
また、本明細書で、細胞ネットワーク内（例えば、ＥｒｂＢシグナル伝達経路）の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための方法が提供され、該方法は、（ａ）細胞試料において、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定する段階、および（ｂ）（ｉ）入力した測定レベルに統計分類アルゴリズムを適用し、そこから細胞のＮＡＳまたはＮＩＳを計算することにより細胞ネットワークの計算モデルを計算することと、（ｉｉ）計算されたＮＡＳまたはＮＩＳの少なくとも一部に基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測することと、を含む、コンピュータにより遂行される方法を適用する段階を含む。特定の実施形態において、このような方法は、治療薬に対する細胞の予測される応答に基づき、治療薬を用いて、細胞、または細胞が得られた対象を治療することをさらに含むことができる。
【００１３】
本発明は、入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法をさらに提供し、該方法は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いて、治療に対する細胞の応答を予測するための方法であり、このような方法は、（ａ）該計算システムの入力デバイスを通して、細胞試料において測定された細胞ネットワーク中の１つ以上の構成要素のレベルを特定する入力を受け取る段階、（ｂ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を、計算システムを用いて計算する段階、（ｃ）計算システムを用いて、統計分類アルゴリズムを適用する段階、および（ｄ）統計分類アルゴリズムの出力の少なくとも一部に基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を、計算システムを用いて生成し、その後、該出力デバイスで表示する段階を含む。
【００１４】
ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための方法も、本明細書で提供する。特定のこのような方法は、（ａ）細胞試料において、（ｉ）ヘレグリン（ＨＲＧ）、並びに（ｉｉ）ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３から選択される少なくとも１つの受容体のレベルを測定する段階、および（ｂ）（ａ）で測定されるレベルに基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を、コンピュータを使用して予測する段階を含み、対照に対するＨＲＧおよび少なくとも１つの受容体のレベルの上昇は、治療薬を用いた治療に対する応答性を予測する。他のこのような方法は、（ａ）細胞試料において、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、およびリン酸ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ４ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ４ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ３／ＥｒｂＢ４ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ３／ＥｒｂＢ４ヘテロダイマーのうちの少なくとも１つ以上のレベルを測定する段階、および（ｂ）（ａ）で測定されたレベルに基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を、コンピュータを使用して予測する段階を含み、ここで、対照に対するＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルにおける差異は、治療薬を用いた治療に対する応答性を予測する。特定の実施形態において、このような方法は、治療薬に対する細胞の予測される応答に基づき、治療薬を用いて、細胞、または細胞が得られた対象を治療することをさらに含むことができる。
【００１５】
本発明は、入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法をさらに提供し、該方法は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのものである。特定のこのような方法は、（ａ）該計算システムの入力デバイスを通して、細胞試料においてそのレベルが測定される（ｉ）ＨＲＧ、並びに（ｉｉ）ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３から選択される少なくとも１つの受容体の測定されたレベルを特定する入力を受け取る段階、および（ｂ）測定されたレベルに基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を、計算システムを用いて生成し、その後、該出力デバイスで表示する段階を含み、ここで、対照に対するＨＲＧおよび前記少なくとも１つの受容体のレベルの上昇は、治療薬を用いた治療に対する応答を予測する。他のこのような方法は、（ａ）細胞試料においてそのレベルが測定される、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーおよびリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのうちの１つ以上の測定されたレベルを特定する入力を、該計算システムの入力デバイスを通して受け取る段階、および（ｂ）測定されたレベルに基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を、計算システムを用いて生成および表示する段階を含み、ここで、対照に対するＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルにおける差異は、治療薬を用いた治療に対する応答を予測する。
【００１６】
他の態様において、本明細書により、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのキットが提供され、該キットは、（ａ）細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを検出するための試験法と、（ｂ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算するための説明書とを含む。特定の実施形態において、このようなキットは、（ｃ）治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのキットの使用説明書をさらに含む。
【００１７】
本発明は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのバイオマーカーを特定するための方法をさらに提供し、該方法は、（ａ）細胞試料において、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定する段階、および（ｂ）（ｉ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞ネットワークの１つ以上の追加の構成要素のレベルを計算することと、（ｉｉ）計算されたレベルが、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測する細胞ネットワークの構成要素を特定し、それにより、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測する構成要素をバイオマーカーとして特定することとを含む、コンピュータにより遂行される方法を適用する段階を含む。
【００１８】
入力を受け取るように構成された少なくとも１つの入力デバイスと、出力を表示するように構成された少なくとも１つの出力デバイスとを含む計算システムを使用するコンピュータ化された方法もまた、本明細書によって提供され、該方法は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのバイオマーカーを特定するためのものであり、該方法は、（ａ）該計算システムの入力デバイスを通して、細胞試料において測定される細胞ネットワークの１つ以上の構成要素の測定されたレベルを特定する入力を受け取る段階、（ｂ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞ネットワークの１つ以上の追加の構成要素のレベルを計算システムを用いて計算する段階、および（ｃ）計算されたレベルが、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測する細胞ネットワークの構成要素を、計算システムを用いて特定して、それにより、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測する構成要素をバイオマーカーとして特定する段階を含む。
【００１９】
またさらなる態様において、本発明は、命令が実行されると、前述の方法のいずれかを遂行する、コンピュータが実行可能な命令を保存する１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体を含むコンピュータプログラム製品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、Ａｂ＃６抗体を用いた治療による、異種移植片腫瘍成長の阻害を示すグラフである。図１Ａは、ＭＡＬＭＥ３Ｍ異種移植片腫瘍モデルの結果を示す。図１Ｂは、ＤＵ１４５異種移植片腫瘍モデルの結果を示す。図１Ｃは、ＡＤＲｒ異種移植片腫瘍モデルの結果を示す。図１Ｄは、ＡＣＨＮ異種移植片腫瘍モデルの結果を示す。
【図２】図２は、Ａｂ＃６で治療された時の異種移植片に観察された成長率低減（％）に対して、未治療異種移植片腫瘍（ｐｇ／μｇ総タンパク質）におけるリン酸化ＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）の濃度をプロットしたグラフである。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、異種移植片切開後０、１０、３０、または６０分で凍結されたＡＣＨＮ異種移植片腫瘍試料におけるｐＥｒｂＢ３（図３Ａ）およびリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）（図３Ｂ）のレベル、および異種移植片切開後０、１０、３０、または６０分で凍結されたＥＫＶＸ異種移植片腫瘍試料におけるＥｒｂＢ１（図３Ｃ）、ＥｒｂＢ２（図３Ｄ）、およびＥｒｂＢ３（図３Ｅ）のレベルを示す棒グラフである。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、シグナル伝達経路の絵を計算モデルに変換するプロセスの概略図を示す。図４Ａは、異なるリガンドおよびＥｒｂＢ受容体を含むＥｒｂＢシグナル伝達経路の絵を示す。図４Ｂは、絵に示すタンパク質相互作用を説明する一連の生化学反応を示す。図４Ｃは、一連の生化学反応から発生する一連の流束を示す。図４Ｄは、シグナル伝達ネットワークを説明する質量作用動態に基づく、一連の非線形常微分方程式（ＯＤＥ）を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＡＤＲｒ卵巣癌細胞で、９つの異なる濃度のヘレグリン（ＨＲＧ）（図５Ａ）またはベータセルリン（図５Ｂ）で刺激された細胞における、ホスホ−ＥｒｂＢ３、ホスホ−ＥｒｂＢ２、ホスホ−ＥｒｂＢ１、およびホスホ−ＡＫＴの経時レベルを示すグラフである。計算モデルのパラメータは、実験データ（点）を説明するために、シミュレーション結果（実線）について較正された。
【図６】図６は、ＥｒｂＢ３の活性化に重要なマーカーを特定するための局所感度分析の結果を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＤＵ１４５、ＡＤＲｒおよびＡＣＨＮ細胞株におけるｐＥｒｂＢ３の計算されたレベルを示すグラフである。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、４つの訓練細胞株（ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＤＵ１４５、ＡＤＲｒ、およびＡＣＨＮ）から確立されたＮＡＳの閾値に基づき、Ａｂ＃６処置に対する１５の細胞株の応答を予測するためのＮＡＳ値の使用を示すグラフである。図８Ａは、１９の細胞株についてシミュレーションされたｐＥｒｂＢ３レベルを、最高から最低ｐＥｒｂＢ３レベルの順でプロットした棒グラフである。図８Ｂは、ＭＡＬＭＥ３Ｍ未満のＮＡＳ値を有する細胞株を非応答株（ＮＲ）としてランク付けし、ＡＤＲｒ以上のＮＡＳ値を有する細胞株を応答株としてランク付けし、ＭＡＬＭＥ３ＭとＡＤＲｒとの間のＮＡＳ値を有する細胞株を不確定としてランク付けした、最高から最低ＮＡＳ値の順に、１９の細胞株をランク付けしたグラフである。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、Ａｂ＃６抗体を用いた処置による異種移植片腫瘍成長の阻害を示すグラフである。図９Ａは、ＩＧＲＯＶ１異種移植片腫瘍モデルの結果を示す。図９Ｂは、ＯＶＣＡＲ８異種移植片腫瘍モデルの結果を示す。図９Ｃは、ＳＫＯＶ３異種移植片腫瘍モデルの結果を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、１つのＥｒｂＢ受容体の濃度のログを、１つ以上の他のＥｒｂＢ受容体の濃度のログに対してプロットしたグラフである。受容体値は、細胞株について、Ａｂ＃６応答株または非応答株として分類されて示される。図１０Ａは、ＥｒｂＢ２対ＥｒｂＢ１をプロットする。図１０Ｂは、ＥｒｂＢ３対ＥｒｂＢ１をプロットする。図１０Ｃは、ＥｒｂＢ２対ＥｒｂＢ３をプロットする。図１０Ｄは、ＥｒｂＢ１対ＥｒｂＢ２対ＥｒｂＢ３をプロットする。
【図１１】図１１は、ＨＲＧのログ濃度を、ＥｒｂＢ１のログ濃度に対してプロットしたグラフを示す。グラブにおいて、異種移植片試験で試験された応答細胞株と非応答細胞株は別れている。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、異種移植片細胞株およびヒト腫瘍試料におけるＥｒｂＢシグナル伝達経路の異なる構成要素のログ正規化発現レベル（ｐｇ／μｇ、ＥＬＩＳＡにより決定）をプロットしたグラフである。図１２Ａは、ＥｒｂＢ２対ＥｒｂＢ１をプロットする。図１２Ｂは、ＥｒｂＢ４対ＥｒｂＢ３をプロットする。図１２Ｃは、ＨＲＧ−β１対ＢＴＣをプロットする。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、異種移植片細胞株およびヒト腫瘍試料の定量的免疫組織化学検査（ｑＩＨＣ）の結果を示すグラフである。図１３Ａは、ＥｒｂＢ１の細胞株標準曲線を示す。図１３Ｂ、１３Ｃ、および１３Ｄは、それぞれ、異種移植片細胞株（赤色の棒）およびヒト腫瘍試料（青色の棒）における、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３のｑＩＨＣスコアをプロットする棒グラフである。
【図１４】図１４は、８つの細胞株において計算された、積分されたリン酸化ＥｒｂＢ１：３ヘテロダイマーレベル（細胞当りの時間積分されたヘテロダイマー量）を示す、棒グラフであり、それらをＡｂ＃６非応答株（ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＢＴ４７４、ＩＧＲＯＶ１、およびＡＤＲｒ）、および応答株（ＯＶＣＡＲ８、ＳＫＯＶ３、ＤＵ１４５、およびＡＣＨＮ）に分けている。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本発明の特定の実施形態の実施中に実施され得る、様々な機能ステップおよび動作を含むフローチャートである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明の特定の実施形態の実施中に実施され得る、様々な機能ステップおよび動作を含むフローチャートである。
【図１６】図１６は、本発明の特定の態様を実施するために使用され得る計算環境の一実施形態である。
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、二重特異性抗体Ｈ３×Ｂ１Ｄ２で処置された細胞の阻害曲線のグラフである。図１７Ａおよび１７Ｂは、それぞれ、ＯＶＣＡＲ８細胞におけるｐＥｒｂＢ３レベルおよびｐＡＫＴレベルの阻害曲線を示す。図１７Ｃおよび１７Ｄは、それぞれ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２（ＯＶＣＡＲ８−ＨＥＲ２細胞）を形質移入されたＯＶＣＡＲ８細胞における、ｐＥｒｂＢ３レベルおよびｐＡＫＴレベルの阻害曲線を示す。実線は、計算モデルからのシミュレーションされたデータを表し、一方、丸は、実験的に決定されたデータを表す。シミュレーションされたＩＣ５０値（ＤＲ５０ｓｉｍ）、および実験的に決定されたＩＣ５０値（ＤＲ５０データ）も示す。
【図１８】図１８Ａ〜Ｄは、二重特異性抗体Ｈ３×Ｂ１Ｄ２で処置された細胞の阻害曲線のグラフである。図１８Ａおよび１８Ｂは、それぞれ、ＡＤｒＲ細胞におけるｐＥｒｂＢ３レベルおよびｐＡＫＴレベルの阻害曲線を示す。実線は、計算モデルからシミュレーションされたデータを表し、一方、丸は、実験的に決定されたデータを表す。シミュレーションされたＩＣ５０値（ＤＲ５０ｓｉｍ）、および実験的に決定されたＩＣ５０値（ＤＲ５０データ）も示す。図１８Ｃおよび１８Ｄは、それぞれＥｒｂＢ１ＲＮＡｉを用いたシミュレーション処置による、ＡＤｒＲ細胞における、ｐＥｒｂＢ３レベルおよびｐＡＫＴレベルのシミュレーションされた阻害曲線を示す。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２を用いて処置された異種移植片モデルの腫瘍細胞の区画における、インビボで決定された相対成長率（ＲＧＲ）を、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２の不在下の腫瘍細胞の区画における、ＥｒｂＢ２モノマー（図１９Ａ）、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマー（図１９Ｂ）およびＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー（図１９Ｃ）の計算されたレベルに対してプロットしたグラフである。
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２を用いて処置された異種移植片モデルの腫瘍細胞の区画においてインビボで決定された相対成長率（ＲＧＲ）を、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２のシミュレーションされた不在および存在下の腫瘍細胞の区画における、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー（図２０Ａ）およびＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー（図２０Ｂ）の計算された相対レベルに対してプロットしたグラフである。
【図２１】図２１は、実施例１１に詳説される、示されるＨＲＧ用量における、ＥｒｂＢ２−過剰発現細胞株ＢＴ４７４−Ｍ３からの予測される（プロット線）および実際の（データ点）ＨＲＧ誘発ｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴシグナル伝達データのグラフ表示を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本発明は、概して、１つ以上の細胞シグナル伝達経路における１つ以上の要素（例えば、ＥｒｂＢ３）の活性化状態が、１つ以上の要素のレベルの直接的測定を通してではなく、間接的マーカーの使用を通して決定される、方法、システム、およびコンピュータプログラム製品を提供する。このような間接的測定は、シグナル伝達経路における要素の活性化状態を、そのシグナル伝達経路をモデル化するコンピュータシミュレーションを介して決定するために使用することができる。本明細書に提供される方法を使用することにより、この情報は、次いで、治療薬に対する細胞の応答性を予測するため、そして、疾病または疾患（例えば、癌）を有する患者に対する治療処置を選択するために使用することができる。
【００２２】
本発明の使用を通して、腫瘍細胞試料の代表的なリン酸化の特徴の決定を達成することができる。これは、患者の試料において、リン酸化細胞タンパク質を、そのようなリンタンパク質のレベルを直接測定する必要なしに、治療薬に対する応答のバイオマーカーとして使用することを可能にし、したがって、リンタンパク質測定に付随する潜在的な問題（例えば、不安定さ、不正確さ）を避けることができる。このようなシミュレーションで決定されたリン酸化の特徴は、抗腫瘍性治療薬に対する細胞の応答性を正確に予測するために使用することができ、したがって、患者の癌を治療するのに効果のない抗癌剤を患者に投与することを避けるために使用することができる。さらに、開示される方法は、細胞ネットワーク内の受容体のホモおよび／もしくはヘテロダイマー、または、細胞ネットワーク内のリン酸化ホモおよび／もしくはヘテロダイマー等の、細胞ネットワーク内の他の不安定な構成要素のレベルのシミュレーションを可能にし、それらの構成要素は治療薬に対する細胞の応答性を予測するために使用され得る。さらにまた、開示される方法は、細胞ネットワーク内の構成要素に対する治療薬の効果のシミュレーションを可能にし、それもまた、治療薬に対する細胞の応答性を予測するために使用され得る。
【００２３】
特定の方法において、細胞ネットワーク内の１つ以上の安定した細胞構成要素（細胞表面受容体、リガンド等）のレベルは、細胞試料（例えば、腫瘍生検材料、または摘出腫瘍の細胞）において測定される。これらの測定に基づき、細胞のネットワーク活性化状態（またはＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）は、１つ以上のシグナル伝達ネットワークの計算モデル（例えば、機構的計算モデル）を使用して計算される。例えば、ＮＡＳは、細胞ネットワーク内の（直接的に測定されなかった）リン酸化タンパク質の計算されたレベルを表す数値であり得る。代替的に、ＮＩＳは、（シミュレーションされた治療薬の不在下の構成要素のレベルと比較した）、シミュレーションされた治療薬の存在下での細胞ネットワーク内の構成要素の計算されたレベルを表す数値であり得る。応答性または非応答性の閾値を表す対照値と計算されたＮＡＳまたはＮＩＳとを比較することにより、細胞が治療的処置に応答する可能性が高いかどうかを予測することができる。
【００２４】
したがって、治療に対する細胞応答性の「間接的」マーカーの使用を開示し、その「間接的」マーカー（例えば、活性化されたシグナル伝達経路内のリン酸化タンパク質またはダイマー）のレベルは、直接的に測定されないが、直接的に測定される他の細胞構成要素のレベルに基づいて計算またはシュミレーションが行われる。この方法は、例えば、ＮＡＳまたはＮＩＳの計算と組み合わせた、統計分類アルゴリズムの使用も含むこともできる。
【００２５】
本発明との関連において、また本明細書の実施例の項でさらに記載されるように、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の機構的計算モデルは、ＥｒｂＢ細胞ネットワーク（またはＮＡＳ）の活性化の指標として、リン酸化ＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）のレベルを計算するために成功裏に使用されており、シミュレーションされたｐＥｒｂＢ３レベルは、インビボ異種移植片系における、抗ＥｒｂＢ３抗体であるＡｂ＃６を用いた治療に対する腫瘍細胞株の応答性を正確に予測することを示した。加えて、本明細書の実施例の項でさらに記載されるように、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の機構計算モデルはＥｒｂＢ細胞ネットワーク（またはＮＩＳ）の阻害の指標として、シミュレーションされた治療薬の存在または不在下のＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーおよびＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの相対レベルを計算するために成功裏に使用されており、シミュレーションされたＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの相対レベルは、インビボ異種移植片系における、抗ＥｒｂＢ３×抗ＥｒｂＢ２二重特異性抗体であるＨ３×Ｂ１Ｄ２を用いた腫瘍細胞株の治療に対する応答性を正確に予測することを示した。
【００２６】
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。
【００２７】
本明細書で使用する、「治療薬」という用語は、疾病もしくは疾患の症状の重篤度を低減もしくは阻害する、または疾病もしくは疾患における無症状もしくは症状低減時間の頻度および／もしくは期間を増加する、または疾病もしくは疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害を阻害もしくは防止する、または疾病もしくは疾患の進行を阻害もしくは遅延する、または疾病もしくは疾患の発病を阻害もしくは遅延する、または感染性疾病もしくは疾患における感染を阻害もしくは防止する能力を有する、任意の、そして全ての化合物を包含するものとする。治療薬の例としては、有機小分子、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、組み換え操作された生物製剤、ＲＮＡｉ化合物等物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用される、「細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする」治療薬は、治療活性が、細胞ネットワーク内の構成要素の活性に特定の直接的または間接的な影響を有する薬剤に、少なくとも部分的に起因する薬剤を指す。細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬の例としては、ＥｒｂＢ１に特異的に結合し、したがって、ＥｒｂＢ細胞ネットワーク内のＥｒｂＢ１を特異的に標的とするモノクローナル抗体のセツキシマブ、およびＥｒｂＢ１のチロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインを特異的に阻害し、したがって、ＥｒｂＢ細胞ネットワーク内のＥｒｂＢ１−ＴＫを特異的に標的とする小分子のゲフィチニブが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用される、「ネットワーク活性化状態」または「ＮＡＳ」という用語は、細胞ネットワークの活性のレベルを反映する、またはそれに対応する標識、典型的には数値を指す。ＮＡＳは、典型的には、細胞ネットワークの計算モデルを使用して計算される。ＮＡＳは、例えば、細胞ネットワーク内の１つ以上のリン酸化タンパク質のシミュレーションされたレベルを表すことができる。１つ以上のリンタンパク質レベルが、ＮＡＳの好適な実施形態であるが（例えば、実施例７にさらに記載されるｐＥｒｂＢ３レベル、または実施例１０にさらに記載されるｐＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーレベル等のリン酸化ＥｒｂＢホモダイマーもしくはヘテロダイマーのレベル、またはＰＩ３Ｋ等の下流のキナーゼのレベル）、活性化されたシグナル伝達経路内の他の細胞構成要素が、ネットワーク活性の指標（複数を含む）としての役割を果たすことができ、したがって、ＮＡＳとして使用することができ、これは、受容体の二量体化（ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ１もしくはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマーのレベル、またはＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ４ヘテロダイマーのレベル等のホモダイマーおよびヘテロダイマー）、タンパク質の切断、転写因子の活性化、および遺伝子発現の活性化を含むが、これらに限定されない。細胞、例えば、腫瘍細胞のネットワーク活性化状態は、そのシグナル伝達経路に対する細胞の依存性の指標であり、その特定のシグナル伝達経路を標的とする治療薬によって阻害され得る。
【００３０】
本明細書で使用される、「ネットワーク阻害状態」または「ＮＩＳ」という用語は、細胞ネットワークの阻害性のレベルを反映する、またはそれに対応する指標、典型的には数値を指す。ＮＩＳは、典型的には、細胞ネットワークの計算モデルを使用して計算される。ＮＩＳは、例えば、シミュレーションされた治療薬の不在下のシミュレーションされたレベルと比較した（またはそれに対する）、シミュレーションされた治療薬の存在下における細胞ネットワーク内の１つ以上の構成要素のシミュレーションされたレベルを表すことができる。例えば、ＮＩＳは、シミュレーションされた治療薬の存在下の１つ以上の構成要素のレベルと、シミュレーションされた治療薬の不在下のそれらの１つ以上の構成要素のレベルとの比率であり得る。ＮＩＳの限定されない例としては、シミュレーションされた治療薬の不在または存在下で計算された１つ以上のホモまたはヘテロダイマーの計算された相対レベル（ＥｒｂＢ２／３およびＥｒｂＢ１／３ヘテロダイマーの相対レベル等）である（すなわち、シミュレーションされた治療薬の不在下のレベルと比較した、シミュレーションされた治療薬の存在下のレベル）。しかしながら、レベルが治療薬により調節されるシグナル伝達経路内の他の細胞構成要素も、ネットワーク阻害の指標としての役割を果たすことができ、したがって、それらのレベルが、ＮＩＳの指標として使用され得ることを理解されたい。細胞、例えば、腫瘍細胞のＮＩＳおよびＮＡＳは、細胞のシグナル伝達経路内の構成要素上の治療薬の効果の指標であり、治療薬の効果に対する細胞の応答性を予測することができる。
【００３１】
「細胞ネットワークの計算モデル」という用語は、生物学的経路のダイアグラムまたは絵（例えば、癌に関する一連のタンパク質相互作用）を、後続のシミュレーションおよび分析が可能な一連の数式に転換するコンピュータプログラム等のモデルを指す。特定の情報（例えば、リガンドおよび／または受容体タンパク質濃度、速度定数）をそのモデルに入力することができ、次いでそのモデルは、容易に測定できない可能性がある追加情報（例えば、リンタンパク質レベル）をシミュレーションすることができる。細胞ネットワークのネットワーク活性化状態（もしくはＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（もしくはＮＩＳ）は、本明細書に記載する細胞ネットワークの計算モデルを使用して計算され得る。
【００３２】
本明細書で使用される、「アルゴリズム」という用語は、概して、方法を実行する、もしくは問題を解決するための一連の命令、または手順、または式を指す。「統計分類アルゴリズム」という用語は、分類または予測（例えば、治療薬に対する応答株対非応答株）が行われるように、１つ以上の測定可能なパラメータまたは入力（例えば、組織試料中で測定されたタンパク質レベル）と特定の結果または出力（例えば、治療薬に対する応答性）との間の統計的関係を定義するアルゴリズムを指す。
【００３３】
本明細書で使用される、「バイオマーカー」という用語は、細胞内で、またはそれによって発現される物質（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、対立遺伝子）で、所与の治療に対する疾病の応答性と相関するものを指す。
【００３４】
本明細書で使用される、「直接的バイオマーカー」という用語は、細胞内で、またはそれによって発現される物質（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、対立遺伝子）で、所与の治療に対する疾病の応答性と相関し、その存在またはレベルが、細胞中で直接的に測定されて、それによって、所与の治療に対する疾病の応答性を予測するものを指す。
【００３５】
本明細書で使用される、「間接的バイオマーカー」という用語は、細胞内で、またはそれによって発現される物質（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、対立遺伝子）で、疾病の所与の治療に対する応答性と相関し、その存在またはレベルは、細胞中で直接的に測定されないが、むしろ計算モデルを使用してのシミュレーションによって等の、間接的な手段で決定され、それによって、所与の治療に対する疾病の応答性を予測するものを指す。
【００３６】
本明細書で使用される、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子、または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる結合ドメインを含む、１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質であり、該タンパク質は、免疫特異的に抗原に結合する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、同様に、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、次いでそれらは、それぞれ、免疫グロブリンクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。典型的な免疫グロブリン構造単位は、それぞれの対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する同一の２対のポリペプチド鎖から構成されるテトラマーを含む。「ＶＬ」および「ＶＨ」とは、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００３７】
抗体は、無傷免疫グロブリン並びにその抗原結合断片を含み、それらは様々なペプチダーゼによる消化によって生成されるか、または化学的に、もしくは組み換えＤＮＡ技術を使用するかのいずれかで、新規に合成することができる。そのような断片は、例えば、Ｆ（ａｂ）２ダイマーおよびＦａｂモノマーを含む。好適な抗体は、単一鎖抗体（単一ポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好適には、ＶＨおよびＶＬ鎖が（直接的またはペプチドリンカーを通して）一緒に結合して連続ポリペプチドを形成する、単一鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を含む。（５，１３２，４０５および４，９５６，７７８）。
【００３８】
「免疫特異的」または「免疫特異的に」とは、免疫グロブリン遺伝子、または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる結合ドメインを介して、対象のタンパク質の１つ以上のエピトープに結合するが、混合した抗原分子の集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識せず、結合しない抗体を指す。典型的には、抗体は、表面プラスモン共鳴法または細胞結合実験により測定して、少なくとも５０ｎＭのＫｄで同族の抗原に結合する。このような試験法の使用は、当該分野において知られており、本明細書の実施例１３に例示される。
【００３９】
「抗ＥｒｂＢ３抗体」とは、ＥｒｂＢ３の外部ドメインに免疫特異的に結合する、単離された抗体である。ＥｒｂＢ３へのこのような結合は、表面プラスモン共鳴法または細胞結合実験により測定して、少なくとも５０ｎＭのＫｄを示す。ＥｒｂＢ３のＥＧＦ様リガンド媒介リン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体が好ましい。ＥＧＦ様リガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮成長因子、ビレグリン、エピゲン、エピレギュリン、およびアンフィレギュリンを含み、典型的には、ＥｒｂＢ１に結合し、ＥｒｂＢ１のＥｒｂＢ３とのヘテロ二量体化を誘発する。
【００４０】
本明細書で使用される、「二重特異的」という用語は、２つの抗原結合部位を含み、第１の結合部位が、第１の抗原またはエピトープに親和性を有し、第２の結合部位が、第１の抗原とは異なる第２の抗原またはエピトープに親和性を有するタンパク質を指す。
【００４１】
本明細書で使用される、「対象」または「患者」という用語は、治療薬を用いた治療に対する応答が、腫瘍を有する対象または患者等の、本発明の方法を使用して予測され得る疾病または疾患を有する任意のヒトまたはヒト以外の動物を含む。「ヒト以外の動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ等の、哺乳類および非哺乳類を含む。
【００４２】
本発明の多くの実施形態は、入力装置、出力装置、プロセッサ、記憶媒体、および他の対応するコンピュータ構成要素等の、様々なコンピュータのハードウェアを含む、特殊用途ならびに汎用コンピュータ等、１つ以上のコンピュータシステムを含む。
【００４３】
本発明の多くの実施形態は、そこに格納されるコンピュータにより実行可能な命令またはデータ構造（機構的計算モデル、測定されたタンパク質およびバイオマーカーレベル、分類アルゴリズム、変異状態等、本明細書で定義される命令およびデータを含む）を有し、本明細書に記載され、特許請求されるプロセスを遂行するために特別に構成された、コンピュータ可読記憶媒体も含む。このようなコンピュータ可読記憶媒体は、汎用または特殊用途のコンピュータによりアクセスされ得る任意の使用可能な媒体であり得る。例えば、このようなコンピュータ可読記憶媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、または他の光学ディスク記憶媒体、磁気ディスク記憶媒体もしくは他の磁気記憶デバイス、またはコンピュータにより実行可能な命令もしくはデータ構造の形態の所望のプログラムコード手段、モジュール、およびソフトウェアを格納するために使用され得、汎用または特殊用途コンピュータによりアクセスされ得る任意の他の媒体を含むことができるが、これらに限定されない。
【００４４】
いくつかの場合において、送信媒体も、本発明が、本明細書に記載される１つ以上のプロセスを実施するために実行される、コンピュータにより実行可能な命令を保有する送信媒体を組み込むアプリケーション、システム、および他の実施形態にも及ぶように、コンピュータにより実行可能な命令を保有するために使用され得る。情報が、ネットワークまたは別の通信接続（配線構成、ワイヤレス、または配線構成とワイヤレスとの組み合わせのいずれか）を通して、コンピュータに転送または提供されると、コンピュータは、その接続を、適切に、コンピュータ可読通信媒体とみなす。
【００４５】
「コンピュータにより実行可能な命令」、「実行可能な命令」、「モジュール」、および「計算モジュール」という用語は、本明細書内、および特許請求の範囲に引用される、本発明の特定のプロセスを実施するために１つ以上の計算システムの、１つ以上の計算プロセッサおよび処理構成要素によりアクセスおよび実行されるコンピュータコード、データ構造、およびソフトウェアに言及するために、本明細書において互換的に使用されることがある。
【００４６】
本開示の、前述に関する追加の態様、および様々な追加の様態は、以下の小節にさらに詳しく説明されるが、これは、制限するものと解釈されるべきではない。
【００４７】
Ｉ．機構的計算モデル
機構的計算モデルは、タンパク質ネットワーク中の分子相互作用の予測的な数学的描写とみなされ得る。少なくとも特定の実施形態において、治療薬に対する応答を予測するための本明細書に提供される方法は、機構的計算モデルの使用を含む。機構的計算モデルは、生物学的経路のダイアグラムまたは絵（cartoon）（例えば、癌に関する経路等の、シグナル変換経路に沿って生じる一連のタンパク質相互作用）を、後続のシミュレーションおよび分析が可能な一連の数式に転換する。したがって、モデルの構築における第１のステップは、経路に関与する適切なタンパク質および分子を含む、生物学的経路の詳細なダイアグラムまたは絵の描写の作成である。どのタンパク質および分子が含まれるべきか、並びにそれらを接続する生物学的反応に関する、重要な決定が行われなければならない。どのタンパク質および分子が経路に関与するか、またどの生物学的反応がそれらを接続するかに関する、科学的文献の入手可能な情報が、収集され、生物学的経路の絵の描写の作成に使用される。
【００４８】
生物学的経路の絵の描写が作成されると、この情報は、経路内のタンパク質−タンパク質相互作用を表示する方程式のシステムに転換され、そのシステムは細胞ネットワークと称される。シグナル伝達ネットワークの生物学的反応ネットワークを描写する計算モデルは、例えば、非線形常微分方程式（ＯＤＥ）、確率モデル、ブールもしくはファジー理論モデル、またはペトリネットに基づく。これらは、経験的に測定または推定されなければならない２種類のパラメータ、すなわち初期種数（ｉ番目の種についてｃ０，ｉ）および速度定数（ｊ番目の速度についてｋｊ）を必要とする微分方程式から構成される。計算モデル構築のプロセスの概略図を、図４Ａ〜Ｄに示すが、これらは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の絵図（図４Ａ）、この経路の一連の生化学反応および流束への転換（図４Ｂおよび４Ｃ）、および一連の微分方程式でのタンパク質−タンパク質相互作用の描写（図４Ｄ）を図示する。
【００４９】
計算モデルは、典型的には、例えば、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアＳｉｍｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）、任意に、ＭＡＴＬＡＢ（ＳＢｔｏｏｌｂｏｘ２．ｏｒｇ）用のＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｏｏｌｂｏｘ２、またはＪＡＣＯＢＩＡＮモデリングソフトウェア（Ｎｕｍｅｒｉｃａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と併せて使用して、コンピュータスクリプト言語で書かれた一連の実行可能な命令として構築される。しかしながら、本発明の範囲は、ＭＡＴＬＡＢまたはＪＡＣＯＢＩＡＮソフトウェアおよびインターフェースで構築されたもの以外の、ソフトウェアおよびインターフェースで構築された計算モデルの開発および使用にも及ぶことを理解されたい。本発明は、第三者供給元によって予め構築され、本発明の他の態様を実施する計算システムにダウンロードされた計算モデルを利用する実施形態にも及ぶ。
【００５０】
モデル較正の前に、科学的文献からの情報に基づき、例えば、タンパク質レベル、結合親和性、リガンドのそれらの同族受容体への結合速度定数等の、できるだけ多くのパラメータの値を特定し、計算システムに入力する。科学的文献から入手できないパラメータ値は、実験的に取得され得る。
【００５１】
モデルは、訓練を実施する計算システムに入力される、実験的に取得されたデータに対して、その出力を最適化することによって「訓練」される。モデルを実験データに適合させることにより、最適なモデルパラメータのセットを選択する。モデル較正のプロセスは、仮定およびパラメータ推定の修正を含む。モデルを較正するために、リガンドの刺激を下流シグナル伝達事象に転換するための、特に生物学的に重要であるサブセットのタンパク質およびパラメータを最初に特定しなければならない。このプロセスは、感度分析と呼ばれるが、より正確には、これは、経路内のタンパク質濃度および動態パラメータの変化に応答する、基質のリン酸化等の出力の変化を測定する数学的ツールである。ｊ番目の速度定数（ｋｊ）の変化に関するｉ番目の観測可能なｃｉ（ｔ）の十分に正規化された感度（ｓｉｊ（ｔ））は、以下の方程式により得られる。
2012500008.tif 000002
続いてモデル較正を、感度分析で特定されたパラメータおよび初期のタンパク質濃度を変化させることにより、実験データとシミュレーション結果との距離を最小にする局所的および大域的最適化法（限定されないが、遺伝アルゴリズム、シミュレーションされたアニーリング、レーベンバーグ−マルカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）最適化等）を使用して、計算システムにより実施する。計算システムは、較正中、自動的にパラメータを変更するか、または付加的に追加されたユーザ入力にのみ応答して、パラメータを変更するように構成され得る。
【００５２】
様々なシグナル伝達経路における数多くの計算モデルが、科学的文献に記載されている（例えば、Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ｂ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０１６９−３０１８１、Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：３７０−３７５、Ｈａｙａｋｅｙａｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７３：４５１−４６３、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｕ．Ｂ．ａｎｄ  Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ，Ｂ．（２００５）ＩＤｒｕｇｓ  ８：８２２−８２６、Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｏｎｆ．Ｐｒｏｃ．ＩＥＥＥ  Ｅｎｇ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｓｏｃ．１：５３−５４、Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＩＢＭ  Ｊ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．５０：６４５、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４５８−４６６、Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ｂ．Ｎ．（２００７）Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：３２４−３３０、Ｂｉｒｔｗｉｓｔｌｅ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１４４、Ｈｉｎｏｗ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ４：１４を参照のこと）。さらに、計算モデルの構築および使用は、Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ｒ．Ｎ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１６５−１７６  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １１：８０６−８１１に概説されている。
【００５３】
本明細書に提供される特定の方法で使用される計算モデルの１つは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路のモデルである。ＥｒｂＢシグナル伝達経路の代表的な計算モデルの構築は、実施例４に詳細に記載される。本明細書で使用される、「ＥｒｂＢシグナル伝達経路」という用語は、リガンドのＥｒｂＢファミリーの受容体との相互作用を通して開始されるシグナル伝達経路を包含するものとする。ＥｒｂＢシグナル伝達経路内の構成要素は、（ｉ）例えば、ＨＲＧ、ベータセルリン（ＢＴＣ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピゲン（ＥＰＧ）、およびエピレギュリン（ＥＰＲ）を含む１つ以上のリガンド、（ｉｉ）例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４を含む１つ以上の受容体、並びに（ｉｉｉ）例えば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスファチジルイノシトールビスリン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、ホスファターゼおよびテンシン相同体（ＰＴＥＮ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼアイソザイム１（ＰＤＫ１）、ＡＫＴ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、およびＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼを含む細胞内キナーゼ、ホスファターゼ、および基質を含み得る。
【００５４】
本明細書で提供される特定の方法で使用される別の計算モデルは、ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路のモデルである。本明細書で使用される、「ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路」という用語は、リガンドのインスリン成長因子１ファミリーの受容体との相互作用を通して開始されるシグナル変換経路を包含するものとする。ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路内の構成要素は、（ｉ）例えば、インスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含む１つ以上のリガンド、（ｉｉ）例えば、ＩＧＦ１Ｒおよびインスリン受容体を含む１つ以上の受容体、（ｉｉｉ）１つ以上のＩＧＦ結合タンパク質、および（ｉｖ）例えば、インスリン受容体基質２（ＩＲＳ２）、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、Ｂｃｌ−２関連タンパク質ＢＡＤ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を含む細胞内キナーゼおよび基質を含み得る。
【００５５】
本明細書で提供される特定の方法で使用されるまた別の計算モデルは、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路のモデルである。本明細書で使用される、「ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路」という用語は、リガンドのｃ−Ｍｅｔ受容体タンパク質チロシンキナーゼの受容体との相互作用を通して開始されるシグナル伝達経路を包含するものとする。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路内の構成要素は、（ｉ）例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含む１つ以上のリガンド、（ｉｉ）例えば、ｃ−Ｍｅｔ受容体タンパク質チロシンキナーゼを含む１つ以上の受容体、並びに（ｉｉｉ）例えば、ＰＩ３Ｋ、成長因子受容体結合タンパク質２（ＧＲＢ２）、Ｓｒｃ相同およびコラーゲンタンパク質（ＳＨＣ）、ＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼ、およびＧＡＢ１足場タンパク質並びにＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を含む細胞内キナーゼおよび基質を含み得る。
【００５６】
本明細書で提供される特定の方法で使用されるまた別の計算モデルは、組み合わせでのＩＧＲ１ＲおよびＥｒｂＢ受容体シグナル伝達、ＥｒｂＢ受容体シグナル伝達およびｃ−Ｍｅｔシグナル伝達もしくはＩＧＦ１−Ｒ、ＥｒｂＢおよびｃ−Ｍｅｔシグナル伝達等の、２つ以上の成長因子シグナル伝達経路の任意の組み合わせを含むモデルである。
【００５７】
前述の例は特定的であるが、（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＲＡＩＬ、インテグリン、サイトカイン、および実質的に任意の他の経路等の、シグナル伝達経路の）他の計算モデルも、本発明の実施形態に組み込まれ、および利用され得ることを理解されたい。
【００５８】
特定の実施形態において、１つ以上の治療薬の存在は、計算モデルでシミュレーションされ得る。治療薬の計算上の表示は、治療薬のその細胞標的への結合を表す、あるいは薬剤のモデル化された細胞経路への効果を表す、質量作用反応の方程式を使用して構築され得る。結合事象、または他の生物学的効果のパラメータは、直接的実験測定により、並びに細胞への治療薬の効果についてのデータと一致させるためにモデルを訓練することにより取得され得る。例えば、抗体薬剤に対して、抗体のその標的抗原への結合のオン率およびオフ率は、標準的方法（ＢＩＡＣｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡ技術）により実験的に決定され得、これらのパラメータは、計算モデルに組み込まれ得る。加えて、例えば、二重特異性薬剤に対して、二重特異性分子のそれぞれの標的に別々、または二重特異性分子の両方の標的に結合する二重特異性分子の数の測定としての架橋パラメータを、計算モデルの訓練パラメータとして使用することができる。架橋パラメータは、全体的に観察された結合親和性（標準的なＦＡＣＳ分析により決定）を取得し、標準的なロジスティック結合方程式に適合することにより取得され得る。前述に加え、特定の治療薬に薬理学的に関連があり得、したがって、計算モデルで表示される追加パラメータも、当業者に知られている。
【００５９】
治療薬の効果を、計算モデルで表示する際、単一薬剤をモデル化することができ、または複数の薬剤を組み合わせてモデル化して、併用療法の細胞応答への効果をシミュレーションすることができる。例えば、一実施形態において、それぞれが異なる標的抗原に結合する２つの抗体を、計算モデルで表示することができる。別の実施形態において、特定のシグナル伝達経路（例えば、ＥｒｂＢ経路）を標的とする抗体、およびその同じシグナル伝達経路（例えば、ＥｒｂＢ経路）の小分子阻害剤を、計算モデルで同時に表示し、細胞におけるシグナル伝達経路におけるそのような併用療法の効果を評価することができる。
【００６０】
ＩＩ．統計分類アルゴリズム
少なくとも特定の実施形態において、治療薬に対する応答を予測するための、本明細書で提供される方法（例えば、コンピュータを用いて治療薬に対する予測される応答を生成すること）、および悪性腫瘍を有する患者を治療するための方法は、１つ以上の統計分類アルゴリズムの使用を含む。
【００６１】
統計モデルの目的の１つは、例えば、一方では、組織試料中で測定されたタンパク質のレベル、並びに生化学モデルにより計算された活性化レベル（例えば、ネットワーク活性化状態、もしくは「ＮＡＳ」）または阻害レベル（例えば、ネットワーク阻害状態、もしくは「ＮＩＳ」）と、他方では、治療薬に対する患者の応答との間の関係を認識することである。したがって、統計分類アルゴリズムは、分類または予測（例えば、治療薬に対する応答株対非応答株）が行われるように、１つ以上の測定可能なパラメータまたは入力（例えば、組織試料中で測定されたタンパク質レベル、計算されたＮＡＳまたはＮＩＳ値）と特定の結果または出力（例えば、治療薬に対する応答性）との間の統計的関係を定義する。したがって、統計モデルは、応答株と非応答株を分ける閾値を特定することを助け、また定義された閾値周辺の不確定度を定義することも助ける。
【００６２】
様々な種類の統計分類システムが、当該分野において説明されており、本発明の方法での使用に適している可能性があり、それらの限定されない例には、主成分分析（ＰＣＡ）、部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）、三線ＰＬＳＲ、ファジー論理およびベイズ推論、ランダムフォレスト（ＲＦ）、分類および回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ）、増強ツリー、神経ネットワーク（ＮＮ）、サポートベクターマシーン（ＳＶＭ）、一般カイ二乗自動相関検出モデル、相関ツリー、多変量適応的回帰スプライン、機械学習分類器、およびそれらの組わせが含まれる。例えば、ＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ２００７／１０９５７１号を参照のこと。
【００６３】
好適な実施形態において、統計分類アルゴリズムを訓練するために、当該分野の用語を使用すると、「機械」または「計算システム」（例えば、コンピュータ）は、「分類器」（統計アルゴリズム）の手段によって、コンピュータに入力された数多くの「訓練」例を検討することにより、タンパク質発現レベルと、実際の患者の応答（例えば、応答するものおよび応答しないもの）を伴うネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）との間の関係を「学習する」。このプロセスは、入力（測定および計算されたタンパク質レベル）および出力（例えば、治療薬に対する応答）の両方が事前に知られている試料の集合があるため、「教師あり学習」として知られる。統計分類アルゴリズムを適用するために不可欠な部分は、有益な特徴（特徴は、任意の測定または計算されたタンパク質レベルまたはタンパク質活性化レベル）、並びにアルゴリズムにより生成されたスコアに対する最適な閾値の決定である。
【００６４】
出力が分かっている試料の別個の「試験事例」で、統計分類アルゴリズムを検証することが一般的には好ましいが、分類器には知らされない。予測を既知の結果と比較することにより、性能が測定され得る。試料の数が少ない時には、これを用いることができない場合があり、この要求を克服する確立された技法がある。そのうちの主要なものは、交差検定であり、以下でさらに論ずる。分類器の出力は、所望する場合、分類予測に変換され得るスコアである。概して、分類器の訓練プロセスは、最適な閾値を決定するための方法も含む。
【００６５】
予測を行うための能力を試験するために、交差検定における一般的な手順は、「訓練データ」または「訓練（データ）事例」としてデータの一部（試料の分画）を確保しておくことであり、残りのデータは、「試験（データ）事例」と呼ばれる。典型的には、この手順は、何回も繰り返され、訓練および試験のために、毎回、異なるデータの分画を使用する。訓練事例が多いほど、明らかにより有益である（例が多ければ、分類器もより良くなる）が、試験事例も多いほどよい（より多くの予測が検証できれば、将来の予測における信頼度が高くなる）。試料が少ない場合、単一の試料を試験データとして確保しておき、残りの全ての試料を使用して分類器を訓練するように、この手順を改変する。予測は、単一の残された試料で行われる。これは、「１つを残した（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）交差検定」（ＬＯＯＣＶ）と呼ばれ、当該分野において、十分に確立されている。この手順は、同様に、それぞれの残された試料に対して繰り返される。全ての予測が行われると、性能が評価される。
【００６６】
本発明の方法において使用される統計分類アルゴリズムにおいて、様々なパラメータ、または有益な特徴、または情報を、入力データとして使用することができる。このような入力データの非限定的な例には、細胞試料から得られた細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のタンパク質レベル、計算モデルを使用して計算されたネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）、細胞試料中の１つ以上のタンパク質の変異状態、治療に対する応答性が検証される対象の年齢、および治療に対する応答性が検証される対象の性別が含まれる。
【００６７】
ＩＩＩ．細胞試料中の細胞構成要素のレベルの測定
治療薬を用いた治療に対する予測される応答性を生成し、悪性腫瘍を有する患者を治療するための、本明細書に提供される方法において、手順の１つは、典型的に、細胞試料中の細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定すること、または代替的に、細胞試料から得た測定から取得された、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素の測定されたレベルを計算システムに入力することを含む。例えば、腫瘍試料は、標準的な方法で、腫瘍を有する患者から得ることができ、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルは、腫瘍試料中で測定され得る。
【００６８】
入力は、計算システムに手動で入力され得る。入力はまた、いくつかの場合において、コンピュータ化された測定デバイスが計算システムに連結され、本発明の特徴を遂行するために入力を受け取って利用する場合等に、計算システムに自動的に入力またはダウンロードされ得る。この点において、本明細書に記載される、任意の測定情報および任意の状態情報（例えば、変異状態の情報）、並びに任意の他の組織／患者データは、測定および状態情報を自動的に取得してダウンロードするコンピュータ化されたデバイスの使用を通して、本発明の手順を実施するためのデータを使用する１つ以上の他の計算システムに取得され得ることも理解されたい。
【００６９】
本明細書で使用される、構成要素の「レベル」という用語は、試料中に存在する構成要素の量または濃度を指す。構成要素のレベルは、任意の様々な周知の技法を使用して測定され得る。レベルは、典型的には、タンパク質レベルを測定することにより決定されるが、代替的に、レベルは、いくつかの場合、ｍＲＮＡレベルを測定することにより決定され得、次いで、ｍＲＮＡレベルを予測されるタンパク質レベルに変換することができる。タンパク質（例えば、モノマー、ホモダイマー、またはヘテロダイマー）のレベルは、当該分野に周知の１つ以上の技法を使用して測定され得、これらの非限定的な例としては、定量的蛍光活性化細胞選別法（ｑＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ，Ｌｕｍｉｎｅｘ）、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）、定量的免疫組織化学検査（ｑＩＨＣ）、近似基準法（フェルスター共鳴エネルギー転移基準法、蛍光タンパク質再構成法（ＢｉＦＣ）、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）、またはＤＮＡ−Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（登録商標）（ＤＰＣ（登録商標）））、質量分析法、ウエスタン（免疫ブロット）法、および共免疫沈降法が挙げられる。タンパク質レベルは、検出されたタンパク質ｐｇ／総タンパク質μｇとして表現され得る。
【００７０】
タンパク質またはｍＲＮＡレベルは、細胞溶解物において決定され得る。細胞溶解物は、例えば、実施例２に詳細に記載されるように調製され得る。さらに、タンパク質レベルを決定するためにＥＬＩＳＡを使用する代表的な例は、実施例２および４に詳細に記載され、タンパク質レベルを決定するためにｑＦＡＣＳを使用する代表的な例は、実施例４に詳細に記載され、ｍＲＮＡレベルを測定し、タンパク質レベルへ変換する代表的な例は、実施例４（ＨＲＧ−β１について）に詳細に記載される。
【００７１】
腫瘍試料は、例えば、新鮮な細胞試料、新鮮な凍結試料、または固定組織試料であり得る。患者の組織試料において、保存された組織ブロックが、新鮮な凍結試料よりも、より簡単にアクセス可能な場合がある。したがって、好適な実施形態においては、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料が使用され、構成要素（例えば、リガンド、受容体）のレベルは、半定量的免疫組織化学検査（ＩＨＣ）により決定され得る（実施例９でさらに記載される）。半定量的ＩＨＣ情報を計算モデルへの入力に適した濃度に変換するために、既知の受容体および／またはリガンド発現レベルを伴う細胞プラグまたは異種移植片を含有する対照スライドを、患者の試料と比較することができる。さらに、変換係数を、無次元単位（例えば、タンパク質、またはｍＲＮＡの量）で得られた発現レベルを計算モデルに入力できる濃度レベルに変換するために決定することができ、これは、ＢＴＣおよびＨＲＧ発現レベルについての実施例４にさらに詳細に記載される。
【００７２】
リガンドｍＲＮＡおよびリガンドタンパク質レベルは、一般的に、適度に相関する。したがって、ｑＲＴ−ＰＣＲは、腫瘍細胞株および異種移植片、並びにＦＦＰＥからの細胞溶解物中のｍＲＮＡ発現レベルを決定するために使用され得る。
【００７３】
ＩＶ．治療薬に対する応答を予測するための方法
特定の態様において、本発明は、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための方法を提供する。このような方法は、一般的に、以下の予測方法１〜５に示される要素を含む。
【００７４】
予測方法１
（ａ）細胞試料に存在する、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定することにより、細胞ネットワークの該１つ以上の構成要素のレベルの測定値を取得すること；および
（ｂ）（ｉ）測定値と共に入力される細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算することと、
（ｉｉ）（ｉ）で計算されたＮＡＳまたはＮＩＳに少なくとも部分的に基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を計算し、出力することと
を含む、コンピュータにより遂行された方法を適用すること。
【００７５】
予測方法２
（ａ）細胞試料中において、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定すること；および
（ｂ）（ｉ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算することと、
（ｉｉ）統計分類アルゴリズムを適用することと、
（ｉｉｉ）前記統計分類アルゴリズムに少なくとも部分的に基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測することと
を含む、コンピュータにより実施された方法を適用すること。
【００７６】
予測方法３
（ａ）計算システムが、入力デバイスを通して、細胞試料中で測定された細胞ネットワーク中の１つ以上の構成要素のレベルを特定する入力を受け取り、
（ｂ）前記計算システムが、細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算し、
（ｃ）前記計算システムが、（ｂ）で計算されたＮＡＳまたはＮＩＳに少なくとも部分的に基づき、治療薬を用いた治療に対する予測される細胞の応答を生成し、その後、出力デバイスで表示する。
【００７７】
予測方法４
（ａ）細胞試料において、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定し、
（ｂ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算し、
（ｃ）統計分類アルゴリズムを適用し、
（ｄ）前記統計分類アルゴリズムに少なくとも部分的に基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測する。
【００７８】
予測方法５
（ａ）計算システムが、入力デバイスを通して、細胞試料中で測定された細胞ネットワーク中の１つ以上の構成要素のレベルを特定する入力を受け取り、
（ｂ）前記計算システムが、細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算し、
（ｃ）前記計算システムが、統計分類アルゴリズムを適用し、
（ｄ）前記計算システムが、前記統計分類アルゴリズムの出力に基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を生成し、その後、出力デバイスで表示する。
【００７９】
上記の方法は、必須ではないが、治療薬に対する細胞の予測される応答に基づき、治療薬を用いて、細胞、または該細胞が得られた患者を治療することをさらに含むことができる。
【００８０】
様々な態様において、検出された構成要素のレベルは、１つ以上の特定の治療薬の予測される効果を示す役割を果たす。多くの場合、これは、該構成要素が、予め決定されたカットオフレベルまたはカットオフ率より上（またはいくつかの場合においては、下）である基準に合致するレベル（または他の特定の構成要素に対する特定の濃度比）で検出された場合、所与の治療薬は、効果的であると予測され、患者に投与されるが、該構成要素が、予め決定されたカットオフレベルまたはカットオフ率に対する基準に合致しないレベルまたは濃度比で検出された場合、治療薬は、患者に投与されないことを意味する。適切なカットオフレベルは、通常の実践を使用して、および本明細書で記載されるように、設定され得る。
【００８１】
細胞の応答を予測するために、典型的にＮＡＳ値またはＮＩＳ値は、治療薬に対する複数の既知の応答細胞および非応答細胞において計算され、既知の応答細胞および非応答細胞におけるこれらの値は、閾ＮＡＳ値またはＮＩＳ値を設定するために使用され、治療薬に対する応答性または非応答性を示す（実施例７および１０にさらに記載される）。したがって、治療に対する生成されたおよび／または予測される細胞の応答は、（ｂ）で計算されたＮＡＳまたはＮＩＳを閾ＮＡＳ値またはＮＩＳ値と比較することによって（ｃ）で取得され得、治療薬に対する応答性または非応答性を示す。
【００８２】
統計分類アルゴリズムを適用するために、１つ以上の種類の情報が、アルゴリズムに入力されるか、または計算システムが、該１つ以上の種類の情報をアルゴリズムに組み込む。例えば、この手順は、（ｉ）細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベル、（ｉｉ）計算されたＮＡＳまたはＮＩＳ、（ｉｉｉ）細胞試料中の１つ以上の遺伝子の変異状態、（ｉｖ）治療薬で治療される対象の年齢、（ｖ）治療薬で治療される対象の性別、（ｖｉ）細胞上におけるエストロゲン受容体（ＥＲ）の有無、（ｖｉｉ）細胞上におけるプロゲステロン受容体の有無、および（ｖｉｉｉ）細胞上におけるアンドロゲン受容体の有無から選択される、１つ以上の種類の情報をアルゴリズムに入力することを含むことができる。追加で、または代替的に、統計分類アルゴリズムの適用は、上記の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に記述される１つ以上の種類の情報を入力した後、アルゴリズムを計算する計算システムを含むことができる。統計分類アルゴリズムは、入力情報と治療に対する細胞（例えば、腫瘍細胞）の応答性との間の統計的関係を定義することから、治療に対する細胞の応答の予測は、統計分類アルゴリズムの出力に基づくことができる。
【００８３】
本明細書に提供される予測方法および他の方法において、好適な細胞ネットワークは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を含む。一実施形態において、本方法において測定され、計算システムへ入力される１つ以上の構成要素は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に関与する１つ以上のリガンドを含むことができる。このようなリガンドの非限定的な例としては、ＨＲＧ（ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−３、およびＨＲＧ−４を含む）、ＢＴＣ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＥＰＧ、およびＥＰＲが挙げられる。加えて、または代替的に、本方法において測定される１つ以上の構成要素は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に関与する１つ以上の受容体を含むことができる。このような受容体の非限定的な例としては、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４（当該分野において、それぞれ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４としても知られる）が挙げられる。このような受容体は、（それらが、モノマー、ホモダイマー、またはヘテロダイマーのいずれで生じても）別個の実体として試験されてもよく、特定の実施形態において、各ホモダイマーおよびヘテロダイマーも、異なる別個の構成要素として測定され、計算システムに入力されてもよい。例えば、測定される構成要素は、１、２、３、４、５、もしくは６以上の受容体、リガンド、または両方であってもよく、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＨＲＧ、およびＢＴＣ（例えば、ＥｒｂＢ１およびＨＲＧ、またはＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３）から選択されてもよい。例えば、いくつかの方法において、計算されたＮＡＳは、治療薬の不在下のＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、またはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションする。他のこのような方法において、計算されたＮＩＳは、治療薬の不在下のＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルと比較した、治療薬の存在下のＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションする。
【００８４】
上記方法の特定の場合において、計算されたＮＡＳは、ＥｒｂＢ３シグナル伝達経路における１つ以上のリン酸化タンパク質のレベルをシミュレーションする。例えば、計算されるＮＡＳは、細胞試料中のｐＥｒｂＢ３レベルをシミュレーションし得る。代替的な実施形態において、計算されるＮＡＳは、細胞試料中のリン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションし得る。
【００８５】
一実施形態において、治療薬は、抗ＥＧＦＲ（抗ＥｒｂＢ１）抗体を含み、この代表的な例は、抗ＥｒｂＢ１抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）である。抗ＥｒｂＢ１抗体の他の例としては、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、およびｍＡｂ８０６（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：５３４９−５３５４）が挙げられる。別の実施形態において、治療薬は、抗ＥｒｂＢ２抗体を含み、この代表的な例は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）である。
【００８６】
別の実施形態において、治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。好適な実施形態において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、ＭＭ−１２１を含み、これは、現在、第Ｉ相臨床試験中である。好適な実施形態において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、国際公開第ＷＯ２００８／１００６２４号にさらに記載される、配列番号１および２のそれぞれＶＨおよびＶＬ配列を有する、Ａｂ＃６を含む。別の実施形態において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号７〜９（ＶＨ  ＣＤＲ１、２、３）、および１０〜１２（ＶＬＣＤＲ１、２、３）のそれぞれＡｂ＃６ ＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む。抗ＥｒｂＢ３抗体の他の例としては、国際公開第ＷＯ２００８／１００６２４号にさらに記載され、配列番号３および４、５および６、２５および２６、並びに３３および３４のそれぞれＶＨおよびＶＬ配列を有する、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９が挙げられる。別の実施形態において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、Ａｂ＃３のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列（配列番号１３〜１５および１６〜１８のそれぞれ）を含む抗体、またはＡｂ＃１４のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列（配列番号１９〜２１および２２〜２４のそれぞれ）を含む抗体、またはＡｂ＃１７のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列（配列番号２７〜２９および３０〜３２のそれぞれ）を含む抗体、またはＡｂ＃１９のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列（配列番号３５〜３７および３８〜４０のそれぞれ）を含む抗体である。
【００８７】
抗ＥｒｂＢ３抗体の他の例としては、抗体１Ｂ４Ｃ３および２Ｄ１Ｄ１２（Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）（双方とも米国公開第２００４／０１９７３３２号に記載される）、および米国特許第５，９６８，５１１号に記載されている８Ｂ８等のモノクローナル抗体（そのヒト化変種を含む）が挙げられる。
【００８８】
別の実施形態において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、第２の抗体（例えば、抗ＥｒｂＢ２抗体）に連結された抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、二重特異性抗体（例えば、融合タンパク質）である。このような二重特異性抗体の好適な例は、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２であり、そのアミノ酸配列は配列番号４１に記述される。この二重特異性抗体において、Ｈ３（配列番号：４２〜４４および４５〜４７に示される、それぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲを有する）と称される、ＥｒｂＢ３を結合する単一鎖抗体は、Ｂ１Ｄ２（配列番号４８〜５０および５１〜５３に示される、それぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲを有する）と称されるＥｒｂＢ２を結合する単一鎖抗体に連結される。二重特異性抗体Ｈ３×Ｂ１Ｄ２の抗体構成要素は、米国特許第７，３３２，５８５号および第７，３３２，５８０号、並びにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３４７９号（国際公開第ＷＯ２００７／０８４１８１号として公開）およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２４２８７号（国際公開第ＷＯ２００８／１４０４９３号として公開）にさらに記載されている。
【００８９】
また別の実施形態において、治療薬は、２つ以上の抗ＥｒｂＢ３抗体を含み、その抗体はそれぞれ、ＥｒｂＢ３上の異なるエピトープに結合する。好ましくは、治療薬は、３つの抗ＥｒｂＢ３抗体を含み、その抗体のそれぞれは、ＥｒｂＢ３上の異なるエピトープに結合する。
【００９０】
別の実施形態において、治療薬は、抗ＥｒｂＢ４抗体を含む。また別の実施形態において、治療薬は、汎ＥｒｂＢ阻害剤、またはＨＥＲ二量体化阻害剤を含む。ＨＥＲ二量体化阻害剤の例は、抗体ペルツズマブ（２Ｃ４抗体としても知られる）であり、これは、Ａｇｕｓ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：２５３４−２５４３にさらに記載されている。
【００９１】
また別の実施形態において、治療薬は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の１つ以上の小分子阻害剤を含み、その代表的な例としては、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  ａｎｄ  Ｔｅｖａから商業的に入手可能なゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、およびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから商業的に入手可能なラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））が挙げられる。ＥｒｂＢシグナル伝達経路の小分子阻害剤の他の例としては、ＣＩ−１０３３（ＰＤ１８３８０５；Ｐｆｉｚｅｒ）、エルロチニブＨＣＬ（ＯＳＩ−７７４、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）；ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＤ−１５８７８０、ＥＫＢ−５６９、およびチロホスチンＡＧ１４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）が挙げられる。
【００９２】
別の実施形態において、細胞ネットワークは、ｃ−Ｍｅｔ（間葉上皮転換因子）シグナル伝達経路を含む。一実施形態において、（ａ）において測定および／または入力される１つ以上の構成要素は、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路に関与する１つ以上のリガンドを含むことができる。このようなリガンドの非限定的な例としては、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）が挙げられる。加えて、または代替的に、（ａ）において測定される１つ以上の構成要素は、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路に関与する１つ以上の受容体を含むことができる。このような受容体の非限定的な例としては、ｃ−Ｍｅｔ受容体タンパク質チロシンキナーゼが挙げられる。
【００９３】
上記の点を考慮すると、本明細書で提供される予測方法は、細胞応答の予測、例えば、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路内の構成要素を標的とする治療薬に対するコンピュータで生成された腫瘍応答の予測を可能にする。治療薬は、例えば、ｃ−Ｍｅｔに結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を含んでもよい。このような抗ｃＭｅｔ抗体の例としては、ＡＶ２９９（ＡＶＥＯ）、ＡＭＧ１０２（Ａｍｇｅｎ）、および５Ｄ５（ＯＡ−５Ｄ５；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を標的とする好適な治療薬は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に連結された抗ＥｒｂＢ１抗体を含む、二重特異性モノクローナル抗体を含む。このような二重特異性抗体の例は、ＰＣＴ公報公開第ＷＯ２００５／１１７９７３号および第ＷＯ２００６／０９１２０９号にさらに記載されている。別の実施形態において、治療薬は、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の小分子阻害剤であり、その例としては、ＡＲＱ１９７（ＡｒＱｕｌｅ）およびＰＨＡ６６５７５２（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７３４５−７３５５）が挙げられる。
【００９４】
別の実施形態において、細胞ネットワークは、インスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）シグナル伝達経路を含む。一実施形態において、（ａ）において測定される１つ以上の構成要素は、ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路に関与する１つ以上のリガンドを含むことができる。このようなリガンドの非限定的な例としては、インスリン成長因子１（ＩＧＦ１）が挙げられる。加えて、または代替的に、（ａ）において測定される１つ以上の構成要素は、ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路に関与する１つ以上の受容体を含むことができる。このような受容体の非限定的な例としては、ＩＧＦ１Ｒ受容体が挙げられる。
【００９５】
上記の点を考慮すると、本明細書の予測方法は、細胞応答の予測、例えば、ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路内の構成要素を標的とする治療薬に対するコンピュータで生成された腫瘍応答の予測を可能にする。好適な実施形態において、治療薬は、ＩＧＦ１Ｒに結合する抗体であり、その例としては、ｍＡｂ３９１（Ｈａｉｌｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．１：１３４９−１３５３）、ＩＭＣ−Ａ１２（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、１９Ｄ１２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、Ｈ７Ｃ１０（Ｇｏｅｔｓｃｈ，  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１３：３１６−３２８）、ＣＰ７５１，８７１（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＳＣＶ／ＦＣ（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．）、およびＥＭ／１６４（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。好適な実施形態において、治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体に連結された抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を含む、二重特異性抗体である。このような二重特異性抗体の例は、ＰＣＴ公報公開第ＷＯ２００５／１１７９７３号および第ＷＯ２００６／０９１２０９号にさらに記載されている。別の実施形態において、治療薬は、ＩＧＦ１Ｒ（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）の小分子阻害剤であり、その例としては、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＮＶＰ−ＡＤＷ７４２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＮＶＰ−ＴＡＥ２２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＭＳ−５３６，９２４（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＢＭＳ−５５４，４１７（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ピクロポドフィリン（ＰＰＰ）（Ｍｅｎｕ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７：６５５−６６０）等のシクロリグナン、およびＰＱ４０１（Ｇａｂｌｅ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．５：１０７９−１０８６）が挙げられる。
【００９６】
また別の実施形態において、治療薬は、複数の治療薬の組み合わせを含み、該組み合わせは、上述のＥｒｂＢ経路薬剤の少なくとも１つを含む薬剤の組み合わせ等の、ＥｒｂＢシグナル伝達経路内の構成要素を標的とする、少なくとも１つの薬剤を含む。例えば、組み合わせ薬剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路内の構成要素を標的とする２つ以上の薬剤を含むことができる。代替的に、組み合わせ薬剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路内の構成要素を標的とする、少なくとも１つの薬剤と、ｃ−ＭｅｔまたはＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路等の別のシグナル伝達経路内の構成要素を標的とする、少なくとも１つの薬剤とを含むことができる。
【００９７】
様々な他の実施形態において、細胞ネットワークは、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路と組み合わせたＥｒｂＢシグナル伝達経路、またはＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路と組み合わせたＥｒｂＢシグナル伝達経路等の、２つ以上のシグナル伝達経路の組み合わせを含む。
【００９８】
本明細書に提供される予測方法の別の実施形態において、このような方法は、細胞試料において、細胞中の１つ以上の遺伝子の変異状態を決定する手順をさらに含むことができる。好ましくは、ＫＲＡＳ（カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＰＩ３Ｋ、およびＰＴＥＮから選択される、少なくとも１つの遺伝子の変異状態が決定される。加えて、または代替的に、本方法は、ＫＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、およびＰＴＥＮから選択される少なくとも１つの遺伝子の変異状態等の、細胞中の１つ以上の遺伝子の変異状態を特定する入力を、入力デバイスを通して受け取るコンピュータシステムを含むことができる。
【００９９】
予測方法の別の実施形態において、細胞ネットワークは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を含み、（ａ）は、ＢＴＣおよびＡＲを測定する、および／またはその測定されたレベルを入力することを含み、本方法はさらに、ＫＲＡＳ遺伝子の変異状態を決定すること、またはその変異状態を入力することを含む。別の実施形態において、細胞ネットワークは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を含み、（ａ）は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＡＲ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＥＰＧ、およびＥＰＲを測定する、および／またはその測定されたレベルを入力することを含み、本方法はさらに、ＫＲＡＳ遺伝子の変異状態を決定すること、またはその変異状態を入力することを含む。これらの実施形態において好ましくは、（ｂ）において計算されたＮＡＳは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路における１つ以上のリン酸化タンパク質のレベルをシミュレーションする。別の好適な実施形態において、（ｂ）において計算されたＮＡＳは、患者の腫瘍試料中のリン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションする。また別の好適な実施形態において、（ｂ）において計算されたＮＡＳは、患者の腫瘍試料中のリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションする。
【０１００】
上述の特定の方法内で、治療薬に対する複数の既知の応答細胞および非応答細胞のそれぞれにおいて計算されたＮＡＳ値またはＮＩＳ値は、閾ＮＡＳ値またはＮＩＳ値を設定するために使用され、治療薬に対する応答性または非応答性を示す。別の方法において、治療に対する細胞の応答は、（ｂ）において計算されたＮＡＳまたはＮＩＳを、ＮＡＳまたはＮＩＳの閾値と比較することにより予測され、治療薬に対する応答性または非応答性を示す。
【０１０１】
Ｖ．ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する応答を予測するためのバイオマーカーおよび方法
別の態様において、本発明は、細胞ネットワーク（例えば、ＥｒｂＢシグナル伝達経路）の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞（例えば、腫瘍細胞）の応答性を予測する直接的バイオマーカーを提供する。このようなバイオマーカーは、本明細書で提供される計算モデルを使用して特定することができる。このようなバイオマーカーを特定するための方法は、概して、（ａ）細胞試料において、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを測定することと、（ｂ）（ｉ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞ネットワークの１つ以上の追加の構成要素のレベルを計算することと、（ｉｉ）計算されたレベルが治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測する細胞ネットワークの構成要素を特定することにより、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するバイオマーカーとしての構成要素を特定することとを含む、コンピュータにより遂行される方法を適用することとを含む。
【０１０２】
細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのバイオマーカーを特定するための特定の方法は、
（ａ）計算システムが、入力デバイスを通して、細胞試料において測定された細胞ネットワーク中の１つ以上の構成要素の測定されたレベルを特定する入力を受け取ることと、
（ｂ）前記計算システムが、細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞ネットワークの１つ以上の追加の構成要素のレベルを計算することと、
（ｃ）前記計算システムが、計算されたレベルにより治療薬を用いた治療に対する細胞の応答が予測される細胞ネットワークの構成要素を特定し、それにより、該構成要素を、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのバイオマーカーとして特定することと
を含む。
【０１０３】
例えば、実施例１０に図示されるように、計算モデルは、１つ以上のＮＡＳ値（細胞ネットワークの活性化の測定として）を取得するために、細胞ネットワーク（例えば、ＥｒｂＢシグナル伝達経路）の１つ以上の構成要素のレベルを計算するために使用され得、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答とＮＡＳとの相関が決定され得る。計算されたレベルが試料を応答株および非応答株に分ける、細胞ネットワークのこれらの構成要素も、特にこれらの構成要素が、直接的手段によって容易に測定可能である時、治療に対する応答を予測するための直接的バイオマーカーとして使用され得る。つまり、本明細書に記載される計算モデル／ＮＡＳアプローチは、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答性を予測する（計算された）構成要素を特定するために使用され得、次いで、構成要素が特定されると、これらは、応答性を予測するための直接的バイオマーカーとして、直接的に測定され得る。例えば、本明細書に記載される計算モデルは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路のホモダイマーおよびヘテロダイマーのレベルを計算するために使用され、次いで、試料を応答株および非応答株に分けるこれらのダイマーは、腫瘍治療の応答性を予測するための直接的バイオマーカーとして、直接的に測定され得る。
【０１０４】
さらに、実施例８に記載するように、腫瘍試料中の（ｉ）ＨＲＧおよび（ｉｉ）少なくとも１つのＥｒｂＢファミリー受容体（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３）のレベルの組み合わせ測定が、抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、Ａｂ＃６）等のＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する応答性に関して、腫瘍を、応答株または非応答株に効率的に分類することが実証されている。さらに、実施例１０にさらに記載するように、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベル、またはリン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒＢ３ヘテロダイマーのレベルは、抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、Ａｂ＃６）等の、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する応答性の直接的マーカーとしての役割を果たすことができる。さらに、実施例１２にさらに記載するように、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、およびＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルは、抗ＥｒｂＢ３×抗ＥｒｂＢ２二重特異性抗体（例えば、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２）等の、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する応答性に関して、腫瘍を、応答株または非応答株に効率的に分類する。
【０１０５】
上記のように、本発明は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための方法を提供する。特定のこのような方法は、
（ａ）（ｉ）ＨＲＧ、並びに（ｉｉ）ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３から選択される少なくとも１つの受容体のレベルを、細胞試料において測定することと、
（ｂ）（ａ）で測定されたレベルに基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を、コンピュータを使用して予測し、対照と比較したＨＲＧおよび前記少なくとも１つの受容体のレベルの上昇が、治療薬を用いた治療に対する応答性を予測することとを含む。
【０１０６】
特定の状況において、ＨＲＧおよびＥｒｂＢ１のレベルが測定される。他の場合において、ＨＲＧおよびＥｒｂＢ２のレベルが測定されるか、またはＨＲＧおよびＥｒｂＢ３のレベルが測定される。他の状況において、ＨＲＧ、並びにＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３から選択される少なくとも２つの受容体のレベルが測定されるか、またはＨＲＧ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３のレベルが測定される。特定の状況において、予測は、
（ｉ）計算システムが、細胞試料においてそのレベルが測定される（ｉ）ＨＲＧ、並びに（ｉｉ）ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３から選択される少なくとも１つの受容体の測定レベルを特定する入力を、入力デバイスを通して受け取ることと、
（ｉｉ）前記計算システムが、測定されたレベルに基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を生成し、その後、出力デバイスで表示することと
を含む方法を使用して計算的に実施されてもよく、ここで、対照と比較したＨＲＧおよび前記少なくとも１つの受容体のレベルの上昇が、治療薬を用いた治療に対する応答性を予測する。
【０１０７】
応答性が予測される好適な治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体、より好適には、Ａｂ＃６（配列番号１および２に示される、それぞれＶＨおよびＶＬ配列）、または配列番号７〜９（ＶＨ  ＣＤＲ１、２、３）および１０〜１２（ＶＬＣＤＲ１、２、３）に示される、Ａｂ＃６のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。
【０１０８】
ＥｒｂＢシグナル伝達経路の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するための他の方法は、
（ａ）ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、およびリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのうちの１つ以上のレベルを、細胞試料において測定することと、
（ｂ）（ａ）で測定されたレベルに基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を、コンピュータを使用して予測することと
を含み、ここで、対照と比較したＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルにおける差異が、治療薬を用いた治療に対する応答性を予測する。
【０１０９】
予測は、
（ｉ）計算システムが、細胞試料においてそのレベルが測定される、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、およびリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのうちの１つ以上の測定されたレベルを特定する入力を受け取ることと、
（ｉｉ）前記計算システムが、測定されたレベルに基づき、治療薬を用いた治療に対する細胞の予測される応答を生成し、その後、出力デバイスで表示することと
を含む方法を使用して、計算的に実施されてもよく、ここで、対照と比較したＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、リン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルにおける差異が、治療薬を用いた治療に対する応答性を予測する。
【０１１０】
上記方法の特定の実施形態内において、測定されたレベルは統計分類アルゴリズムに入力され、治療に対する細胞の応答は該アルゴリズムの出力に基づき予測される。さらなるこのような方法において、ネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）は、ＥｒｂＢ細胞ネットワークの計算モデルを使用した測定レベルに基づき計算され、好ましくは、治療薬を用いた治療に対する細胞の応答は、ＮＡＳ値またはＮＩＳ値に基づき予測される。
【０１１１】
特定の実施形態内において、測定されたレベルは、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマーおよび／またはＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルであり、治療薬は、上述の、抗ＥｒｂＢ２抗体に連結された抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、二重特異性抗体である。
【０１１２】
上記方法で使用するための好適な細胞は、上記に列挙されるものを含む、腫瘍細胞である。試料は、腫瘍組織、微細針吸引液、乳頭吸引液、全血、血清、血漿、リンパ液、唾液および尿、またはそこから単離された、脱離または循環腫瘍細胞を含む。
【０１１３】
上記のように、測定されたレベルは、タンパク質（例えば、モノマー、ホモダイマー、またはヘテロダイマー）のレベル、またはｍＲＮＡレベルであり、一般的に、上述のように決定することができることは明らかである。
【０１１４】
上記方法はいずれも、必須ではないが、治療薬に対する細胞の予測される応答に基づき、（例えば、治療薬についての）治療レジメンを選択することをさらに含み、かつ／または予測される応答に基づき、使用するための治療薬を調製することをさらに含んでもよい。
【０１１５】
好適な実施形態において、対照と比較したレベルの差異は、レベルの上昇である。上記の方法は、必須ではないが、治療薬に対する細胞の予測される応答性に基づき、該治療薬を用いて、細胞、または該細胞が得られた対象を治療することをさらに含むことができる。
【０１１６】
ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーおよび／またはリン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルが測定される実施形態において、好ましくは、応答性が予測される治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体、より好ましくは、Ａｂ＃６（配列番号１および２に示されるそれぞれＶＨおよびＶＬ配列を有する）、または配列番号７〜９（ＶＨＣＤＲ１、２、３）および１０〜１２（ＶＬＣＤＲ１、２、３）に記述される、Ａｂ＃６のそれぞれＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＥｒｂＢ３抗体である。
【０１１７】
ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ２ホモダイマーおよび／またはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルが測定される実施形態において、応答が予測される治療薬は、好ましくは、抗ＥｒｂＢ３×抗ＥｒｂＢ２二重特異性抗体、より好ましくは、二重特異性抗体Ｈ３×Ｂ１Ｄ２（配列番号４１に示されるアミノ酸配列）またはＢ１Ｄ２（配列番号４８〜５０および５１〜５３）のＣＤＲを含む抗ＥｒｂＢ２抗体に連結された、Ｈ３（配列番号４２〜４４および４５〜４７）のＣＤＲを含む抗ＥｒｂＢ３抗体を含む二重特異性抗体である。
【０１１８】
受容体ホモダイマーもしくはヘテロダイマー、またはリン酸化受容体ホモダイマーもしくはヘテロダイマーのレベルは、当該分野において知られている方法を使用して、細胞試料において測定され得る。例えば、このようなホモダイマーまたはヘテロダイマーは、米国特許第７，１０５，３０８号、米国特許第７，２５５，９９９号、米国公開第２００４０２２９３８０号、および米国公開第２００８０１８７９４８号に記載されるもの等、二量体化検出法を使用して測定され得る。これらの方法は、１つがタグ付けされたプローブで、１つが切断プローブである、対のプローブ（例えば、抗体）を利用し、それぞれのプローブは、ダイマーの１構成要素に特異的に結合する。２つのプローブをダイマーに結合することにより切断を引き起こし、ダイマー複合体を分子タグから解放することにより、ダイマー複合体形成の尺度を提供する。このような試験法は、本明細書において、近似基準法とも称され、その商業的に入手可能な例としては、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｎｏｇｒａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。代替的に、ダイマー内の構成要素の共免疫沈降法、並びにフェルスター共鳴エネルギー転移ベースの方法および蛍光タンパク質再構成法（ＢｉＦＣ）（例えば、Ｔａｏ，Ｒ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｉ．Ｎ．（２００８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１２１：３２０７−３２１７にさらに記載される）等の他の近似基準法の使用を含むが、これらに限定されない、当該分野において知られているダイマーレベルを定量化するための他の方法が使用され得る。
【０１１９】
上記の直接的バイオマーカー法の一実施形態において、（ａ）で測定されたレベルは、計算システムに格納されている統計分類アルゴリズムに入力され、治療に対する細胞の応答は、アルゴリズムおよび測定されたレベルを使用して、計算システムでのデータの計算および変換に基づくアルゴリズムの出力に基づいて、予測される。別の実施形態において、ネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）は、ＥｒｂＢ細胞ネットワークの計算モデルを使用して、（ａ）で測定されるレベルに基づき計算される。治療薬を用いた治療に対する細胞の応答は、計算されたＮＡＳ値またはＮＩＳ値に少なくとも部分的に基づき予測され得る。
【０１２０】
様々な実施形態において、治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体、抗ＥｒｂＢ１抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、抗ＥｒｂＢ４抗体、汎ＥｒｂＢ阻害剤、ＨＥＲ二量体化阻害剤、およびＥｒｂＢシグナル伝達経路の小分子阻害剤の１つ以上の任意の組み合わせを含み、そのそれぞれは、上で説明および例示される。
【０１２１】
ＶＩ．治療における方法の使用
本発明の方法は、疾患に関与する細胞ネットワークの１つ以上の構成要素を標的とする治療薬が使用可能である、広範な疾患における治療の有効性の予測に使用され得る。さらにまた、本発明の方法は、疾患に罹患している対象の治療レジメンの選択に使用され得、該方法は、選択された治療レジメンに従い対象を治療することをさらに含むことができ、これは、対象に１つ以上の治療薬を投与することを含むことができる。疾患の例としては、癌、自己免疫疾患、および炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
本発明の方法は、例えば、治療薬を用いた治療に対する腫瘍の応答を計算的に予測する、すなわち、腫瘍をもつ患者の治療薬を用いた治療に対する応答性を予測する、予測に特に有用である。予測方法は、当該方法においてモデル化される、シグナル伝達経路に依存する任意の腫瘍で使用され得る。例えば、一実施形態において、方法は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路（例えばＥｒｂＢ３シグナル伝達経路）に依存する腫瘍で使用される。他の実施形態において、方法は、ｃ−ＭｅｔまたはＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路に依存する腫瘍で使用され得る。好適な実施形態において、腫瘍は、結腸癌腫瘍である。別の好適な実施形態において、腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍である。別の実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍である。別の実施形態において、腫瘍は、明細胞肉腫等の非固形腫瘍である。様々な他の実施形態において、腫瘍は、例えば、肺、結腸、直腸、胆嚢、脳、脊髄、乳房、腎臓、膵臓、胃、肝臓、骨、皮膚、脾臓、卵巣、精巣、前立腺、頭頚部、甲状腺、および筋肉から選択される組織の腫瘍であり得る。また他の実施形態において、腫瘍は、胃腸腫瘍、胃腫瘍、または口腔／咽頭腫瘍である。
【０１２３】
予測方法を実施するために、細胞試料、例えば、腫瘍細胞を患者から取得する。例えば、腫瘍の好適な試料は、腫瘍組織の試料である。腫瘍組織試料は、腫瘍の生検、または腫瘍の外科的摘出等の、標準的な方法により取得され得る。腫瘍組織の新鮮な凍結試料が使用され得、または代替的に、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料も、使用に適している。腫瘍からの他の種類の試料も、本方法で使用するために適している可能性があり、該試料は、腫瘍からの細胞、および／または腫瘍により分泌された細胞構成要素を含有する。腫瘍の他の種類の試料の非限定的な例としては、微細針吸引液、乳頭吸引液、全血、血清、血漿、リンパ液、唾液および尿、またはそこから単離された、脱離または循環腫瘍細胞が挙げられる。
【０１２４】
好適な実施形態において、本発明は、治療薬を用いた治療に対する癌患者の応答を予測する方法を提供し、該方法は、患者の腫瘍が、特定の治療的処置に応答する可能性についての迅速な情報を提供するために、診断検査室によって簡便にかつ迅速に行われ得る。この予測方法において、新鮮な凍結試料またはＦＦＰＥ保存組織試料等の腫瘍試料が患者から取得され、腫瘍の受容体／リガンドレベルが、半定量的免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を介して測定される。測定に選択される受容体およびリガンドは、治療薬が、どの細胞ネットワークを標的にするかに基づく（例えば、ＥｒｂＢ経路において、以下のリガンド／受容体が測定され得る：ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３）。半定量的ＩＨＣ測定値は、その後、患者の試料と比較するために、既知の受容体およびリガンド発現レベルを用いた細胞プラグまたは異種移植片を含有する対照スライドを使用して、濃度に変換される。特定の状況において、対象の１つ以上の遺伝子（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ）の変異状態は、標準的な遺伝子型決定方法を使用して、試料において決定することができる。次に、データセット（リガンドおよび受容体の濃度、決定された場合、遺伝子変異状態）は、対象の細胞ネットワークの計算モデルに入力され、ネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）が計算される。次いで、治療薬に対する応答性の予測が、計算されたＮＡＳ値と、応答株および非応答株についてのＮＡＳ閾値との比較に基づき行われ得る。タンパク質濃度および変異データの計算モデルへの入力、その後のＮＡＳおよび予測される応答の出力のためのウェブベースのアプリケーションの使用は、診断検査室が、治療薬を用いた治療に対する腫瘍の応答の可能性の知識をほぼ即時に取得することを可能にする。
【０１２５】
本明細書に記載する本発明の予測方法のいずれかにおいて、本方法を使用して、治療薬を用いた治療に対する細胞（例えば、腫瘍細胞）の応答が、予測された後、本方法はさらに、治療に対する細胞（例えば、腫瘍細胞）の予測される応答に基づき、対象の治療レジメンを選択することを含むことができる。例えば、方法は、治療に対する細胞の計算的に予測される応答に基づき、対象の治療レジメンを表示し、手動または自動的に推奨および／または選択する計算システムをさらに含むことができる。さらにまた、治療レジメンが細胞の予測される応答に基づき推奨または選択されると、本発明の方法は、対象に１つ以上の治療薬を投与することを含むことができる、推奨された、または選択された治療レジメンに従い、対象を治療することをさらに含むことができる。
【０１２６】
また、細胞ネットワーク内の構成要素を標的とする治療薬を用いた治療に対する細胞（例えば、腫瘍細胞）の応答を予測するためのキットも、本明細書で提供する。このようなキット１つは、（ａ）細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを検出するための１つまたは複数の試験法と、（ｂ）細胞ネットワークの計算モデルを使用して、細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算するための説明書と、（ｃ）治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのキットの使用説明書とを含む。追加の実施形態において、キットは、ＮＡＳまたはＮＩＳを計算するための統計分類アルゴリズムを適用するための説明書をさらに含むことができる。
【０１２７】
細胞ネットワークは、例えば、ＥｒｂＢシグナル伝達経路、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路、またはＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路であり得る。治療薬は、例えば、これらの経路内のいずれかの構成要素を標的とする、上述の治療薬のいずれかであり得る。
【０１２８】
一実施形態において、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを検出するための手段は、構成要素、例えば、１つ以上の抗体試薬等の、タンパク質レベルの検出を可能にする１つ以上の試薬である。別の実施形態において、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを検出するための手段は、構成要素、例えば、１つ以上の核酸試薬（例えば、核酸プローブ、ＰＣＲプライマー等）等の、ｍＲＮＡレベルの検出を可能にする１つ以上の試薬である。細胞構成要素のタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを検出するこのような試薬は、当業者に周知である。レベルを検出するためのこのような手段は、タンパク質レベルを測定するように構成された計算デバイスも含むことができる。
【０１２９】
細胞構成要素のタンパク質レベルを検出するために適した試験法は、定量的蛍光活性化細胞選別法（ｑＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ，  Ｌｕｍｉｎｅｘ）、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）、定量的免疫組織化学検査（ｑＩＨＣ）、質量分析法、およびウエスタン（免疫ブロット）法等の、本明細書に記載されるものを含む。細胞構成要素のｍＲＮＡレベルを検出するために適した試験法は、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）法およびノーザンブロット分析を含む。細胞ネットワークの１つ以上の構成要素を検出するための手段は、例えば、構成要素のレベルを評価するために試験法で使用するための緩衝剤または他の試薬も含むことができる。キットは、細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルを検出するための試験法を実施するための説明書（例えば、ラベルまたは添付文書等の印刷された説明書）を含むことができる。
【０１３０】
好適な実施形態において、細胞ネットワークは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路であり、キットは、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＨＲＧ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＨＲＧ−β１を含む）、ＢＴＣ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＥＰＧ、およびＥＰＲから選択されるＥｒｂＢシグナル伝達経路の１つ以上の構成要素（例えば、１つ以上の受容体、受容体ホモダイマー、受容体ヘテロダイマー、および受容体リガンド）のレベルを検出するための手段を含む。より好適には、キットは、少なくとも１つのＥｒｂＢシグナル伝達経路受容体（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）、および少なくとも１つのＥｒｂＢシグナル伝達経路試薬（例えば、ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＥＰＧ、およびＥＰＲ）のレベルを検出するための手段を含む。例えば、一実施形態において、キットは、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＨＲＧ、およびＢＴＣのレベルを検出するための手段を含む。別の実施形態において、キットは、ＥｒｂＢ１およびＨＲＧのレベルを検出するための手段を含む。また別の実施形態において、キットは、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３を検出するための手段を含む。また他の実施形態において、キットは、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２ホモダイマー、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー、またはＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーを検出するための手段を含む。
【０１３１】
細胞ネットワークの計算モデルを使用して細胞のネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）またはネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）を計算するための手段は、例えば、命令が実行されると、細胞のＮＡＳまたはＮＩＳを計算するための動作をプロセッサに実行させるための実行可能な命令を含有するコンピュータプログラム製品であり得る。代替的に、ＮＡＳまたはＮＩＳを計算するための手段は、例えば、細胞中の細胞ネットワークの１つ以上の構成要素のレベルについての情報をユーザが入力して、細胞のＮＡＳまたはＮＩＳを計算することができるコンピュータプログラムを作動させるインターネットベースのサービスとのインターフェース接続を可能にする構成要素であり得る。このような構成要素は、例えば、インターフェース、ウェブページ、および／またはインターネットベースのサービスにアクセス可能なパスワード、並びに、説明書、例えば、サービスを使用するための印刷された説明書を含むことができる。当該分野において確立され、また本明細書でさらに記載されるコンピュータシステムおよびソフトウェアは、本発明のキットにおける使用に適合し得る。図１６で参照される計算デバイスおよび計算構成要素は、計算プロセッサ、測定および入力デバイス、出力デバイス等の、ＮＡＳまたはＮＩＳを計算するための手段も含むことができる。
【０１３２】
治療薬を用いた治療に対する細胞の応答を予測するためのキットを使用するための説明書は、コンピュータ上の説明書およびコンピュータインターフェース、並びに印刷出版物およびマニュアルを含むことができる。いくつかの状況において、キットは、一緒に梱包される。他の実施形態において、キットの様々な構成要素は、異なる場所で維持される。例えば、構成要素の一部は、１つ以上の遠隔計算システム上に維持、格納、またはホストされ得、ネットワーク接続によってのみ利用可能である。
【０１３３】
好ましくは、本発明のキットは、腫瘍を有するヒト患者等の、ヒト対象での使用のために設計される。このような状況において、細胞は、典型的には、生検または腫瘍の摘出により患者から得られた細胞である。
【０１３４】
ＶＩＩ．  治療方法およびキット
悪性腫瘍を有する患者を治療するための方法を提供する。概して、このような方法は、患者から腫瘍試料（例えば、生検材料または摘出試料）を得ることと、試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定することと、試料中のバイオマーカーのレベルが、例えば、バイオマーカーのレベルが最小レベルを超える等の、予め決定された特性に一致する場合、患者に治療薬を投与することとを含む。このような方法は、任意の固形腫瘍に適用される。適切な腫瘍試料は、一般的に上述の通りである。特定の実施形態において、バイオマーカーは、ＥｒｂＢ受容体タンパク質である。
【０１３５】
特定の実施形態において、このような方法は、腫瘍試料を得ること、試料中のｐＥｒｂＢ３のレベルを試験すること、および続いて少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬を患者に投与することを含み、試料において決定されたｐＥｒｂＢ３のレベルが、無血清培地で約２０〜２４時間培養した後、ＡＣＨＮ細胞（腎癌細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６１１）の培養物において試験されたｐＥｒｂＢ３のレベルの２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（好ましくは、５０％）である、最小レベル以上である場合、続いて患者に投与される少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含み、試料において決定されたｐＥｒｂＢ３のレベルが、最小レベルより低い場合、続いて患者に投与される少なくとも１つの抗腫瘍性治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含まない。ＡＣＨＮ細胞の好適な培養物は、例えば、継代８ＡＣＨＮ細胞等の、９回を超えて継代されなかったものである。このような実施形態のさらなる態様において、バイオマーカーはｐＥｒｂＢ３であり、治療薬は抗ＥｒｂＢ３抗体であり、最小レベルは、ＡＣＨＮ異種移植片腫瘍モデルからの腫瘍細胞で観察された４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のレベルである。またさらなる態様において、最小レベルは、０．０６４ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．０８ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．０９６ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．１２２ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．１２８ｐｇ／μｇ総タンパク質、０．１４４ｐｇ／μｇ総タンパク質、または０．１６ｐｇ／μｇ総タンパク質である。
【０１３６】
前述の実施形態において、試料中のｐＥｒｂＢ３のレベルは、特定の態様において、（ａ）試料中のＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の少なくとも２つの構成要素を測定すること、（ｂ）ＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の計算モデルに入力された（ａ）で測定されたレベルを使用して、試料中のｐＥｒｂＢ３のレベルをシミュレーションするネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）を計算すること、および（ｃ）そこから試料中のｐＥｒｂＢ３のレベルを決定することにより、決定され得る。特定の実施形態において、ＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の少なくとも３つ、４つ、５つ、または６つの構成要素のレベルが、（ａ）で検出される。ＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の好適な構成要素は、例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４（およびＥｒｂＢタンパク質のホモダイマーおよびヘテロダイマー）、ＨＲＧ（例えば、ＨＲＧ−β１）、ＢＴＣ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＥＰＧ、およびＥＰＲを含む。これらの構成要素は、タンパク質（例えば、モノマー、ホモダイマー、またはヘテロダイマー）として、または適用可能な場合（例えば、総タンパク質レベルが、リン酸化状態に関わらず測定されるが、例えば、モノマー、ホモダイマー、またはヘテロダイマーにおけるリンタンパク質レベルが測定されることがない場合）、タンパク質をコードするｍＲＮＡとして試験されてもよい。適切な試験法は、当該分野において周知であり、本明細書に記載されるものを含む。
【０１３７】
さらなる態様において、ｐＥｒｂＢ３のレベルを決定するための方法は、ＮＡＳの計算に使用されるＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の計算モデルを生成するために、統計分類アルゴリズムを適用することをさらに含む。さらなる実施形態において、計算されたＮＡＳは、試料中のリン酸化ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーおよび／またはリン酸化ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルをシミュレーションする。
【０１３８】
本発明において使用するための抗ＥｒｂＢ３抗体は、参照により本明細書に援用される国際公開第ＷＯ２００８／１００６２４号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２１１９号に開示される抗ＥｒｂＢ３抗体を含むが、これに限定されない。そこに開示された特に好適な抗体は、現在、ＭＭ−１２１として知られ、これは、現在、第Ｉ相臨床試験中である。好適な抗ＥｒｂＢ３抗体は、上述の抗ＥｒｂＢ３抗体も含む。本明細書に開示される方法で使用されてもよい別の抗ＥｒｂＢ３抗体は、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）（Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ  ａｎｄ  Ａｍｇｅｎ）であり、これは、現在、第Ｉ相臨床試験中である。
【０１３９】
本明細書に記載される治療に適した腫瘍は、一般的に上述の通りである。代表的な腫瘍は、結腸、肺、直腸、胆嚢、脳、脊髄、乳房、腎臓、膵臓、胃、肝臓、骨、皮膚、脾臓、卵巣、精巣、前立腺、および筋肉から選択される器官である。いくつかの態様において、ＥｒｂＢ３陽性腫瘍、またはＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３陽性腫瘍（例えば、胸部腫瘍および非小細胞肺癌腫瘍）が好ましい。
【０１４０】
抗腫瘍性治療薬は、任意の適切な形態で、患者に投与されうる。典型的には、治療薬は、生理学的に受容可能な担体と組み合わせた治療薬を含む、医薬組成物の形態で提供される。所望する場合、他の活性成分または不活性成分も、医薬組成物内に含まれてもよい。
【０１４１】
本明細書で使用される、「生理学的に受容可能な」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用において、米連邦または州政府規制機関（例えば、Ｕ．Ｓ．ＦＤＡまたはＥＭＥＡＡ）に承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、抗腫瘍性治療薬と共に製剤化されて投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。生理学的に受容可能な担体は、静脈内投与または他の非経口投与に好適な担体である、水性溶液等の減菌液であり得る。生理食塩水溶液、および水性デキストロース並びにグリセロール溶液は、注入溶液の水性担体の例である。好適な医薬賦形剤は、例えば、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールを含む。組成物は、所望する場合、少量の湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または防腐剤も含有することができる。
【０１４２】
医薬組成物は、予防的および／もしくは治療的処置のための、経皮手段による投与等の、例えば、非経口、鼻腔内、局所、経口、または局所的投与を含む、任意の適切な手段の投与用に製剤化されてもよい。適切な医薬投与形態および担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２１ｓｔｅｄ．，２００５）に記載されている。
【０１４３】
通常、本明細書に提供される方法に使用される医薬組成物は、非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下注入によって）に投与される。非経口投与において、抗腫瘍性治療薬は、担体に懸濁されるか、溶解されるかのいずれかであり得る。水、緩衝水、生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水等の、減菌水性担体が、一般的には好ましい。加えて、減菌された固定油が、溶剤または懸濁媒体として利用されてもよい。この目的において、合成モノグリセリドまたはジグリセリトを含む、任意の無刺激性固定油が利用されてもよい。加えて、オレイン酸等の脂肪酸は、注入用組成物の調製において有用である。ｐＨ調節および緩衝剤、浸透圧調整剤、分散剤、懸濁剤、湿潤剤、界面活性剤、防腐剤、局所麻酔剤、並びに緩衝剤等の医薬的に受容可能な補助物質も、生理学的状態に近づけるために含まれてもよい。
【０１４４】
好適な一実施形態において、医薬組成物は、患者（例えば、ヒト）への静脈内投与用に製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、減菌された等張水性緩衝剤の溶液である。必要ならば、組成物は、可溶化剤も含んでもよい。成分は、例えば、アンプル等の気密封入容器中の乾燥凍結乾燥粉末、または無水濃縮物等の、単位用量形態で、別個に、または一緒に混合されるかのいずれかで供給されてもよい。組成物が点滴により投与される場合、減菌された医薬品グレードの水または生理食塩水を含む点滴ボトルを用いて投薬され得る。組成物が注入により投与される場合、投与前に材料を混合するように、注入用減菌水または生理食塩水が提供され得る。
【０１４５】
医薬組成物は、従来の減菌技法により減菌されるか、または減菌濾過されてもよい。減菌水性溶液は、そのまま使用するように梱包されるか、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は、投与前に減菌水性担体と混合される。水性医薬組成物のｐＨは、典型的には、３から１１の間、より好ましくは、５から９の間、または６から８の間、最も好ましくは、７〜７．５等の７から８の間である。
【０１４６】
治療薬は、一般的に、患者への単一用量の投与が治療有効量を送達する濃度で、医薬組成物内に存在する。治療有効量は、腫瘍成長の遅延もしくは停止、または好ましくは腫瘍サイズの減少等の、認識できる患者の利益をもたらす量である。治療有効量は、用いられる抗腫瘍性治療薬の活性、患者の年齢、体重、全身状態、性別および食生活、投与時間および経路、排出速度、複合薬等の任意の同時治療、および治療を受ける患者の組織損傷の種類および重篤度を含む、様々な要因により影響される。最適な用量は、当該分野において周知の通常の試験および手順を用いて確立され得る。概して、１日当り、週当り、または２週間に１回、体重１キログラムにつき約１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲の用量レベルを提供する組成物が好ましい。好適な用量範囲およびレジメンの非限定的な例は、１週間に１回、もしくは１週間に２回、もしくは３日に１回、２週間に１回、または３週間に１回投与される２〜５０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）、および１週間に１回、もしくは１週間に２回、もしくは３日に１回、または２週間に１回投与される１〜１００ｍｇ／ｋｇを含む。様々な実施形態において、治療薬は、１週間に１回、もしくは１週間に２回、もしくは３日に１回、２週間に１回、または３週間に１回のタイミングで、３．２ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。さらなる用量範囲は、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１〜４００ｍｇ／ｋｇ、１〜３００ｍｇ／ｋｇ、および１〜２００ｍｇ／ｋｇを含む。適切な投与スケジュールは、３日に１回、５日に１回、７日に１回（すなわち、１週間に１回）、１０日に１回、１４日に１回（すなわち、２週間に１回）、２１日に１回（すなわち、３週間に１回）、２８日に１回（すなわち、４週間に１回）、および１ヶ月に１回を含む。
【０１４７】
好ましくは、治療薬（例えば、抗ＥｒｂＢ３抗体）は、治療薬の製造者または供給者により提供される処方情報の指示に従い、患者に投与される。
【０１４８】
悪性腫瘍を有する患者の治療に使用するためのキットもまた提供される。特定のこのようなキットは、典型的に、（ａ）試料中のＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の少なくとも１つの構成要素のレベルを検出するための少なくとも１つの試験法と、（ｂ）少なくとも１つの試験法から得たデータを用いて入力された、ＥｒｂＢ３シグナル伝達経路の計算モデルを使用して、ｐＥｒｂＢ３のレベルをシミュレーションするネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）を計算するための説明書とを含む。特定の実施形態において、このようなキットは、統計分類アルゴリズムを適用するための説明書をさらに含む。特定の実施形態において、キットは、抗ＥｒｂＢ３抗体も含む。試験法は、典型的には、少なくとも１つのタンパク質構成要素、または少なくとも１つのｍＲＮＡ構成要素の検出を可能にする、１つ以上の試薬を含む。特定の実施形態において、ＮＡＳを計算するための説明書は、コンピュータにより命令が実行されると、プロセッサにＮＡＳを計算するための動作を実行させるための、実行可能な命令を含有するコンピュータプログラム製品の使用を指示することを含み、このような実施形態において、ユーザは、ローカルコンピュータ上でコンピュータプログラムを作動するように指示されるか、またはユーザは、遠隔でコンピュータプログラムを作動させるインターネットベースのサービスとインターフェース接続するように指示されてもよい。
【０１４９】
さらなる実施形態内において、患者の腫瘍生検材料におけるｐＥｒｂＢ３レベルが特定の最小値を超える場合には、抗ＥｒｂＢ３抗体が患者に投与され、ｐＥｒｂＢ３のレベルが特定の最小値を超えない場合には、抗ＥｒｂＢ３抗体が、患者に投与されないことを示す説明書（例えば、添付文書等の、例えばラベル貼付の形態で）と抗ＥｒｂＢ３抗体とを含むキットを提供する。例えば、このような説明書は、試料において決定されたリン酸化ＥｒｂＢ３のレベルが、無血清培地で約２０〜２４時間培養した後のＡＣＨＮ腎癌細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６１１）の培養物において測定されたリン酸化ＥｒｂＢ３のレベルの５０％以上の場合には、抗ＥｒｂＢ３抗体が、悪性腫瘍を有する患者に投与され、試料において測定されたリン酸化ＥｒｂＢ３のレベルが、ＡＣＨＮ腎癌細胞の培養物において測定されたリン酸化ＥｒｂＢ３のレベルの５０％より低い場合には、抗ＥｒｂＢ３抗体が、悪性腫瘍を有する患者に投与されないことを示してもよい。
【０１５０】
ＶＩＩＩ．計算実施形態
上述のように、および本明細書に提供される開示から容易に明らかであるように、本発明の実施形態の多くは、限定されないが、患者の応答の予測、推奨される治療の生成、バイオマーカーの特定、ＮＡＳ値またはＮＩＳ値の計算、シグナル伝達経路の計算モデルの取得等を含む、上述の様々なプロセスを実施するための１つ以上の計算システムを用いる。
【０１５１】
図１５Ａおよび１５Ｂは、本発明の特定の実施形態の実施中に、１つ以上の計算システムにより実行され得る、いくつかのプロセスのフローチャートを図示する。例えば、示すように、計算システムは、腫瘍の細胞ネットワークにおける構成要素の測定されたレベルの入力および腫瘍遺伝子の変異状態を測定および／または受け取るために用いられ得る。計算システムは、例えば、ローカルまたは遠隔のソースから計算モデルを受信、ダウンロード、構築、修正、訓練、および／またはアクセスすることにより取得され得る計算モデルを得るためにも使用され得る。
【０１５２】
計算モデルが得られると、１つ以上の計算システムは、例えば、細胞中のリン酸化タンパク質、ホモダイマー、および／ヘテロダイマーの関連レベルをシミュレーションすること等により、細胞のＮＡＳまたはＮＩＳを計算する。計算モデルはまた、計算システムで受け取ったユーザ設定に基づき、細胞ネットワークにおける追加の関連構成要素の特定を通して、予測バイオマーカーを特定するために、計算システムによって使用され得る。
【０１５３】
計算システムは、特定プロセスの一部として、計算システムにより受け取られ、構築され、および／または修正され得、また治療に対して予測される患者の応答を生成するため、並びに／または推奨される治療を生成および選択するために、ＮＡＳまたはＮＩＳデータ、他のバイオマーカーデータ、および患者のデータとの様々な組み合わせで使用され得る、統計分類アルゴリズムを特定するためにも使用され得る。
【０１５４】
図１５Ａおよび１５Ｂのフローチャートに図示される要素は、本発明の計算プロセスを実施するために提案されるある配列または順序を表すが、図１５Ａおよび１５Ｂに図示するプロセスは、異なる順序を有する配列でも実施され得ることを理解されたい。例えば、推奨される治療は、計算モデルの生成またはＮＡＳもしくはＮＩＳの計算前に特定され得、これは、計算モデルの構築において使用することができる。同様に、タンパク質レベルの測定は、計算モデルの生成前または後に行なうことができる。
【０１５５】
本発明の一部として追加のプロセスを実施することができるため、本発明は、フローチャートに図示されるプロセスを含む方法にのみに限定されないことも理解されたい。例えば、本発明は、患者の情報（例えば、年齢、性別、既往歴）を得るため、および推奨される治療の実際の結果を追跡するためのプロセス、並びに他のプロセスも含むことができる。
【０１５６】
本発明のプロセスを遂行するために使用される計算システムは、異なる場所で、異なる種類の、１つ以上の異なる計算システムを含むことができることも理解されたい。
【０１５７】
図１６は、本発明の特定の態様を実施するために使用され得る計算システムの一例を図示する（例えば、図１５Ａおよび１５Ｂに図示される少なくともいくつかのプロセス、並びに本明細書全体を通して記載されるものを含む）。図示されるように、計算システムは、様々な入力デバイス、出力デバイス、計算モジュール、処理構成要素、および記憶媒体を含む。入力デバイスは、キーボード、マウスデバイス、タッチパッド、タッチスクリーン、マイクロホン、並びに任意の他の入力デバイスを含むことができる。出力デバイスは、スピーカ、ディスプレイスクリーン、印刷デバイス、スイッチ、並びに他の出力デバイスを含むことができる。計算モジュールは、本明細書に記載される機能を実施するために必要な様々なモジュールを含み、それには、計算モデルを受け取り、構築するためのモジュール、ＮＡＳまたはＮＩＳを計算するためのモジュール、予測バイオマーカーを特定するためのモジュール、構成要素の測定されたレベルを取得、認識、および保存し、変異遺伝子状態を特定し、決定するためのモジュール、統計分類アルゴリズムを特定し、適用するためのモジュール、治療に対して予測される応答を生成するためのモジュール、推奨される治療を生成し、選択するためのモジュール、ユーザおよび１つ以上の他のデバイスとインターフェース接続するための通信モジュール、並びに本明細書に記載される様々な他のプロセスを実施するためのモジュールが含まれる。
【０１５８】
計算システムは、前述のモジュールを実行するために必要な１つ以上のプロセッサおよび他の処理構成要素、並びに、前述のモジュール並びに様々なデータ構造、計算モデル、および本明細書に記載される他のデータを格納するための記憶媒体も含む。記憶媒体は、計算システムにローカル接続しているように図示されているが、記憶媒体は、計算システムから遠隔に位置するか、または計算システムに部分的にのみローカル接続であってもよいことを理解されたい。例えば、いくつかの場合において、記憶媒体は、複数の異なる計算システム内で共有され、複数の計算システムに位置する格納スペースを含む、分散記憶を表す。記憶媒体は、持続性メモリおよび揮発性メモリの任意の組み合わせも含むことができる。
【０１５９】
図１６は、計算システムが、測定デバイス、遠隔に位置するコンピュータ、遠隔サービス、および遠隔ネットワークを含む、１つ以上の他のデバイスにネットワーク接続可能であることも図示する。いくつかの場合において、１つ以上のこれらの他のデバイスは、本明細書に記載される１つ以上のプロセスを実施するため、いくつかの方法の実行は、複数の分散された計算システムおよびデバイスを含む、分散ネットワーク環境で実施される。
【０１６０】
前述の点を考慮して、本発明の範囲は、様々な異なる計算構成で実施され得ることを理解されたい。
【実施例】
【０１６１】
ＩＸ．実施例
本発明は、以下の非限定的な実施形態によりさらに説明される。本明細書に参照される米国、国際、または他の特許もしくは特許出願または公開のそれぞれの、および全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１６２】
実施例１：Ａｂ＃６を用いた異種移植片の有効性試験：訓練データセット
この実施例において、４つの異種移植片モデルが、抗ＥｒｂＢ３抗体Ａｂ＃６を用いた処理に対して応答する腫瘍細胞株を特定するために使用された。試験された４つの異種移植片腫瘍モデルは、異なる兆候を表す：ＭＡＬＭＥ３Ｍ（メラノーマ癌株；ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−６４）、ＡＤＲｒ（卵巣癌細胞株；ＮＣＩ−６０、Ｃｏｓｍｉｃ試料ＩＤ番号９０５９８７）、ＡＣＨＮ（腎癌細胞株；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６１１）、およびＤＵ１４５（前立腺癌細胞株；ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１）。以下にさらに詳細に記載するように、ＭＡＬＭＥ３ＭおよびＡＤＲｒ異種移植片は、Ａｂ＃６を用いた処理に対する応答を示さなかったが、ＡＣＨＮおよびＤＵ１４５異種移植片は、Ａｂ＃６処理に対する応答を示した。
【０１６３】
異種移植片腫瘍モデルにおいて、マウス（ｎｕ／ｎｕマウス：３〜４週齢の雌のマウス、Ｔ細胞欠損；非近交；白色種素性背景；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから購入）の右脇腹に、皮下注入を介して、２００μｌの３．５×１０６〜３×１０８細胞／マウス（細胞株による）を移植した。初期腫瘍成長について、マウスをモニタリングした。腫瘍細胞は、腫瘍量が約２００ｍｍ３になるまで、数日間成長させた。腫瘍量は、Ｖ＝（π／６（Ｌ×Ｗ２）のように計算される。Ａｂ＃６抗体を用いて、６００μｇ／注入の用量で、３日ごと（ｑｄ３）にマウスを処理する。対照マウスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処理する。
【０１６４】
腫瘍量は、６０〜８０日間測定される。腫瘍成長における抗体治療の効果の結果（上述の方法、またはその多少の変形を使用して得た）は、図１Ａ〜１Ｄに示すグラフに要約され、これは、Ａｂ＃６処理が、ＤＵ１４５およびＡＣＨＮ異種移植片モデルにおいて、腫瘍の成長を阻害し、一方、Ａｂ＃６処理は、ＡＤＲｒおよびＭＡＬＭＥ３Ｍ異種移植片モデルにおいて、腫瘍成長を（ＰＢＳ対照と比較して）阻害しなかったことを示す。
【０１６５】
Ａｂ＃６に対する腫瘍の応答性の測定として、実験的データを最も良く描写する、指数関数的成長率を決定する。指数関数的成長を説明するために、以下の式を使用する。
Ｖ＝Ｖ０＊ｅｘｐ（ｋ＊ｔ）
式中、Ｖは、ｍｍ３で表される腫瘍量であり、Ｖ０は、ゼロ時点での腫瘍量であり、ｋは、指数関数的成長率であり、ｔは、日数での時間である。
【０１６６】
異なる異種移植片試験に渡る成長低減を比較するために、試験された各細胞株において、成長率低減（ＧＲＲ）値を計算するが、これは、以下の式を使用して、Ａｂ＃６の存在下で観察された成長率を、ＰＢＳ対照群で観察された成長率と関連付ける。
成長率低減＝１−（Ａｂ＃６成長率ｋＡｂ＃６）／（ＰＢＳ成長率ｋＰＢＳ）
【０１６７】
試験された４つの細胞株のＧＲＲ値（上述の方法、またはその多少の変形を使用して得た）を以下の表１に要約する。負の成長率低減の場合には、ＧＲＲ値をゼロとする。
【０１６８】
（表１）異種移植片試験の訓練セットにおける腫瘍成長率低減の要約
2012500008.tif 000003
【０１６９】
４つの異種移植片が示すＡｂ＃６処理に対する応答の範囲は、ＡＤＲｒおよびＭＡＬＭＥ３Ｍ細胞は、Ａｂ＃６処理に対して応答を示さず、ＡＣＨＮは、中程度の応答を有し、ＤＵ１４５細胞は、Ａｂ＃６処理に対して最も高い応答を有するという結果を示す。
【０１７０】
実施例２：腫瘍細胞株溶解物のｐＥｒｂＢ３レベルは、異種移植片におけるＡｂ＃６応答性と相関する
この実施例において、リン酸化ＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）の濃度を、短期薬力学（ＰＤ）試験において、実施例１で試験されたＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＡＤＲｒ、ＤＵ１４５およびＡＣＨＮの４つの腫瘍細胞株のそれぞれにおいてインビボで測定した。ＯｖＣＡＲ８異種移植片も、この実験に含めた（この異種移植片は、以下に記載する実施例５のＡｂ＃６処理に対して応答することが示されている）。
【０１７１】
ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＡＤＲｒ、ＤＵ１４５、ＯｖＣＡＲ８、およびＡＣＨＮ細胞を培養物中で成長させ、移植用に採取し（１５×１５ｃｍプレート、約８０％の集密度、細胞の総数＝２〜４×１０８）、移植するまで氷上で維持した。細胞（約２×１０７細胞／マウス）を２０匹のマウスの右脇腹に（皮下注入を介して、２００μｌ細胞／注入／マウス）移植した後、初期腫瘍成長についてモニタリングしながら、マウスを回復させた。腫瘍は、デジタル式カリパス測定（Ｌ×Ｗ）で測定される。マウスが１００ｍｍ３を超える腫瘍量に達すると、ＣＯ２窒息で安楽死させ、各マウスから腫瘍を摘出し、液体窒素で急速凍結する。生化学分析用に、凍結腫瘍組織試料を−８０℃で貯蔵する。腫瘍溶解物中のリン酸化ＥｒｂＢ３量（ｐＥｒｂＢ３）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｕｍａｎ  ｐＥｒｂＢ３のＥＬＩＳＡキット（カタログ＃ＤＹＣ１７６９）を使用して、ＥＬＩＳＡにより決定する。試料調製およびＥＬＩＳＡプロトコルは、以下にさらに詳細に記載される。
【０１７２】
試料調製およびタンパク質抽出のために、最初に、凍結された腫瘍を粉砕し、事前に量られた２ｍｌのＶＷＲ  Ｃｒｙｏｔｕｂｅ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に移す。粉砕された試料を量り、重量を記録する。試料の重量を計算した後、６２ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように、好適な量の氷冷溶解緩衝剤を各チューブに添加する。試料を低速で少しの間、ボルテックスにかけ、回転させながら、４℃でインキュベートする。
【０１７３】
その後、粗腫瘍溶解物をＱｉａｇｅｎ社のＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒに移し、試料のさらなる均質化のために、８分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離する。透明な溶解物を新しいチューブに移した後、ＢＣＡタンパク質試験のために、各溶解物の少量を取り出す。残りの溶解液は、小分けし、さらなるＥＬＩＳＡ試験分析用に−８０℃で貯蔵する。
【０１７４】
ＢＣＡタンパク質試験キット（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃２３２２５）を使用して総タンパク質量を定量化するために、最初に、ＢＣＡキットの２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ標準溶液を使用して、２ｍｇ／ｍｌの原液濃度から開始し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）８点標準曲線を調製する。キットの試薬ＡとＢ（５０：１）を混合し、ＰＢＳで３倍および５倍希釈の貯蔵腫瘍溶解物を調製した後、２０μｌのＢＳＡ標準または希釈された腫瘍溶解物試料と１６０μｌの作業試薬（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）とを、９６ウェルプレートの各プレートに添加する。プレートを摂氏３７度で、２０分間インキュベートする。ＯＤ５６２を読み取り、ＢＳＡ標準曲線を使用して、腫瘍溶解物中の総タンパク質量を計算する。
【０１７５】
ｐＥｒｂＢ３のＥＬＩＳＡを行うために、キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹＣ１７６９）により推奨される作業濃度に、異なる捕獲抗体をＰＢＳで希釈する。黒い９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を希釈された捕獲抗体で覆った後、全てのプレートを、一晩、室温（ＲＴ）でインキュベートする。その後、Ｂｉｏ  Ｔｅｋプレート洗浄機で、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、室温で２時間、２００μｌの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで遮断する。
【０１７６】
標準曲線用の組み換えタンパク質は、キットにより推奨される最高濃度および２倍希釈で、全部で１１の点のために調製される。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌの腫瘍溶解物を添加した後、室温で２時間インキュベートする。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０の作業濃度に希釈された１００μｌの一次検出抗体を添加する。プレートをさらに２時間、室温でインキュベートする。最後に、プレートを読み取る前に、１００μｌの混合されたＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃３７０６９）を各ウェルに添加する。
【０１７７】
図２は、Ａｂ＃６を用いて処理された時の異種移植片で観察された成長率低減（％、上述の方法またはその多少の変形を使用して得た）に対する、未処理の異種移植片腫瘍（ｐｇ／μｇでの腫瘍溶解物）中のｐＥｒｂＢ３の濃度をプロットしたグラフである。図２は、腫瘍成長率低減と、短期薬力学試験で測定された構成的ｐＥｒｂＢ３レベルとの間に良好な相関関係があることを示す。Ａｂ＃６処理に応答しなかったＭＡＬＭＥ３ＭおよびＡＤＲｒ異種移植片は、最低レベルのｐＥｒｂＢ３を示したが、Ａｂ＃６処理に応答したＡＣＨＮ、ＯｖＣＡＲ８、およびＤＵ１４５異種移植片は、有意に高いレベルのｐＥｒｂＢ３を有した。これらの結果は、腫瘍細胞中のｐＥｒｂＢ３レベルは、抗ＥｒｂＢ３抗体治療に対する腫瘍細胞の応答性と良く相関することを示す。
【０１７８】
実施例３：ｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴレベルは、凍結する時間に従って減少する
この実施例において、腫瘍の凍結からの回復後の時間の経過に従うｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴの安定性、並びに腫瘍溶解物中のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３の発現レベルが評価された。
【０１７９】
未処理ＡＣＨＮおよびＥＫＶＸ異種移植片マウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、腫瘍を切開し、４つに切り分け、０分、１０分、３０分、および６０分の異なる時間点で液体窒素に入れる。その後、ｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴレベル、並びにＥｒｂＢ１〜３レベルを、解凍後の各試料において測定する。上述の方法、またはその多少の変形を使用して得た結果を、図３Ａ〜３Ｅに示す棒グラフに要約するが、図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、ＡＣＨＮ溶解物中のｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴのレベルを示し、図３Ｃ、３Ｄ、および３Ｅは、それぞれ、ＥＫＶＸ溶解物中のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３のレベルを示す。
【０１８０】
図３Ａおよび３Ｂに示すように、１０分の試料において、０分の試料と比較して、測定可能なｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴレベルの減少が既に存在する。３０分の試料において、対照（腫瘍の即時急速凍結、０分試料）と比較して、４０％の濃度減少がｐＥｒｂＢ３において観察され、対照と比較して、２０％の濃度減少がｐＡＫＴにおいて観察された。対照的に、ＥＫＶＸおよびＡＣＨＮ腫瘍細胞溶解物において、ＥｒｂＢ１〜３の総量は一定であり、凍結する時間に影響を受けないようであった（図３Ｃ〜３Ｅを参照）。したがって、腫瘍試料中の観察されたリンタンパク質の不安定さ、および観察された総タンパク質測定値の安定性は、腫瘍細胞溶解物中のレベルを直接的に測定することよりも、ＥｒｂＢ３のリン酸化レベルを計算することが有益であることを示す。この計算されたｐＥｒｂＢ３のレベルは、以下に記載される実施例４で構築される機構的計算モデルを使用する、以下の実施例において、ネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）と称される。
【０１８１】
実施例４：ＥｒｂＢシグナル伝達経路の機構的計算のモデルの構築および訓練
以下の実施例において、シグナル伝達経路の機構的計算生化学モデルの構築を記載する。ＥｒｂＢシグナル伝達に関する文献知識に基づき、受容体に結合するリガンド、二量体化、受容体内在化、および分解を説明する全てのタンパク質−タンパク質相互作用、並びにＰＩ３Ｋカスケードの活性化を導くアダプター分子Ｇａｂ１の結合を含む、機構的計算モデルを開発した。実現されたＥｒｂＢシグナル伝達ネットワークの絵を、図４Ａに図示する。計算モデルは、質量作用動態を使用する、一連の非線形常微分方程式（ＯＤＥ）である。図４Ｂは、シグナル伝達経路からの一連の生化学反応を示し、図４Ｃは、一連の流束を示す。生化学反応および流束は、図４Ｄに図示する、一連の非線形ＯＤＥに転換される。概して、タンパク質濃度ｃｉの変化の状態は、方程式１に表されるように、タンパク質の産生速度ｖ産生−タンパク質の消費速度ｖ消費に等しい。
2012500008.tif 000004
以下の実施例におけるＡｂ＃６に対する応答性を予測するために使用される計算モデルは、４つの全ての受容体（ＥｒｂＢ１〜４）およびＡｋｔシグナル伝達カスケードを含む哺乳類のＥｒｂＢネットワークからなる。
【０１８２】
ＥｒｂＢ受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメイン、およびシグナル伝達の足場としての役割を果たす細胞質側末端を有する、１回貫通Ｉ型膜貫通受容体である。ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４は、リガンド結合およびチロシンキナーゼ活性において、十分に機能的であるが、ＥｒｂＢ２は、いかなる既知のリガンドにも結合せず、代わりに、二量体化の準備ができた増幅器として機能する（Ｋｌａｐｐｅｒ，Ｌ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：４９９５−５０００）。ＥｒｂＢ３は、無能キナーゼドメインを有し（Ｇｕｙ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８１３２−８１３６）、したがって、触媒活性を欠失するが、代わりに、他のＥｒｂＢ受容体によりリン酸化される時にシグナルを伝達する。１３の既知のＥｒｂＢリガンドのうち、ＢＴＣおよびＨＲＧは、最高ＥｒｂＢ３リン酸化レベルを誘発するリガンドとして用いられている。１３の既知のＥｒｂＢリガンドは、（ｉ）ＥＧＦ、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、およびアンフィレギュリン（ＡＲ）等のＥｒｂＢ１に特異的に結合するもの、（ｉｉ）ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＰＧ、およびＥＰＲを含むＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４の両方に結合する二重特異性を示すもの、および（ｉｉｉ）ＮＲＧ２とも性質を共有する、ＥｒｂＢ３／ＥｒｂＢ４に結合するＮＲＧ１（ＧＧＦ２、ＳＭＤＦ、またはＨＲＧとしても知られる）、およびＥｒｂＢ４のみに結合するＮＲＧ３／ＮＲＧ４の２つのサブグループに分けられるニューレグリン（ＮＲＧ）の３つのグループに分類され得る。リガンド結合後、受容体は、それらの細胞質側末端の残留物上で二量体化し、トランスリン酸化を受け、これによって、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＧＡＰ、Ｓｏｓ、およびＰＩ３Ｋ等の、ＳＨ２含有アダプター分子のドッキング部位を形成する。ＥｒｂＢ１は、その細胞質側末端上に、少なくとも２０のチロシンリン酸化部位を有し、そのうちの１２は、ＳＨ２含有アダプタータンパク質および酵素と組むことが提唱されている（Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｗ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．  Ｂｉｏｌ．１：２００５−２００８）。他のＥｒｂＢ受容体は、同様に、複雑な翻訳後修飾を受ける。Ｇｒｂ２およびＰＩ３Ｋ等の受容体関連アダプターは、ＲＡＳを活性化し、最終的に、ＥＲＫおよびＡＫＴを活性化する。ＡＫＴは、ＰＩ３Ｋ−ｐ８５のＥｒｂＢ３上の複数部位への直接的結合を介して、ＲＡＳから独立した様式でも活性化され得る。
【０１８３】
数多くの計算モデルが発表されているが（例えば、Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，  Ｂ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０１６９−３０１８１、Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７３：４５１−４６３、Ｒｅｓａｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８５：７３０−７４３、Ｈｅｎｄｒｉｋｓ，Ｂ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：６１５７−６１６９）、Ｓａｓａｇａｗａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３６５−３７３、Ｂｉｒｔｗｉｓｔｌｅ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３：１４４を参照）、本明細書で使用される計算モデルは、基礎反応に基づく質量作用の製剤化の厳密さを保持しつつも、より広範であり、４つの全てのＥｒｂＢ受容体、および２つの別個のクラスのリガンド（ＨＲＧおよびＢＴＣ）を含む。
【０１８４】
文献に記載されている７つのＥｒｂＢヘテロおよびホモダイマーは、モデル：ＥｒｂＢ１／１、ＥｒｂＢ１／２、ＥｒｂＢ１／３、ＥｒｂＢ１／４、ＥｒｂＢ２／２、ＥｒｂＢ２／３、およびＥｒｂＢ２／４において用いた。これらのダイマーの大部分は、リガンド結合により活性化されるが、いくつかは、リガンド依存的様式でリン酸化されたダイマーが、その後、活性ダイマーを生成するために活性化または不活性化されるモノマーのいずれかを用いて、ホモまたはヘテロオリゴマー化するモノマーに分離される、「側面シグナル伝達」（または二次的二量体化）のプロセスを通して生じる。計算モデルは、ＡＤＲｒ細胞株を使用するＨＲＧまたはＢＴＣの存在下で形成されるダイマーの特定を可能にする、設定実験データを用いて訓練された。
【０１８５】
計算モデルは、測定または予測されなければならない２種類のパラメータである初期種数および速度定数を必要とする、非線形常微分方程式に基づく。モデルの較正前に、できるだけ多くのパラメータの値が、文献情報、例えば、リガンドのそれらの同族受容体への結合定数に基づき特定された。ｑＦＡＣＳ分析を使用することにより、ＥｒｂＢ受容体の発現レベルが、この出願で使用された全ての細胞株にわたって定量化された。さらに、ＥＬＩＳＡを、ＢＴＣおよびｐＥｒｂＢ３のレベルを定量化するために使用した。さらに、ＨＲＧ−β１のｍＲＮＡレベルを、ＺＲ−７５細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５００）におけるｍＲＮＡレベルと比較して決定した。受容体およびリガンド発現レベル（その情報が計算モデルで使用される）を、以下の表２に要約する。これらの発現レベルを取得するための方法は、以下にさらに詳細に記載される。
【０１８６】
腫瘍細胞株は、国立癌研究所から取得する。全ての細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および単位／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）の完全培地中、５％のＣＯ２、９５％空気、および摂氏３７度の加湿雰囲気で、単層培養物として成長させた。
【０１８７】
受容体発現レベルは、ｑＦＡＣＳによる受容体発現レベルの定量化を可能にする、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒキット８１６Ａ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して定量化される。キットは、様々な量のヤギ抗ヒトＩｇＧで標識された一連の４つの小球体個体群、および標識されていない個体群を含有する。ビーズの表面に接合されるＩｇＧは、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に特異的である。ビーズは、細胞試料とちょうど同じように、そして同じ抗体を用いて染色される。それぞれの小球体の異なる個体群は、既知量の標識されたモノクローナル抗体に結合する。各個体群の蛍光強度に対してその割り当てられた抗体結合能（ＡＢＣ）値をプロットすることにより、標準ＡＢＣ曲線が生成され、染色された細胞試料のＡＢＣが、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＱｕｉｃｋＣａｌ  ｖ  ２．３）により提供されるソフトウェアを使用して容易に決定される。このプログラムは、使用される機器の型、その試料に対する電圧、および使用される蛍光色素を考慮する。
【０１８８】
ＢＴＣ発現レベルは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｙ２６１  ＤｕｏＳｅｔ−ＩＣヒトベータセルリンキットを使用して、ＥＬＩＳＡにより測定される。３８４ウェルプレートは、４μｇ／ｍｌ捕獲抗体で覆われる。５０μｌの２％ＢＳＡ／１倍ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−２０なし）を添加することにより、３８４ウェルプレートを１時間遮断し、組み換え標準曲線を作製する。プレートを洗浄した後、１６μｌの細胞溶解物、並びに抗ホスホ−チロシン−ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）検出抗体を添加し、２時間、インキュベートする。最後に、２０μｌのＰｉｃｏ発光基質を添加し、プレートを分光測光的に読み取る。
【０１８９】
ＨＲＧ−β１タンパク質発現レベルを測定するための商業的に入手可能な試験法は、検査される細胞株の信頼できるデータを取得するために十分な感度ではなかったため、ＨＲＧ−β１ｍＲＮＡレベルは、対象の細胞株について定量化される。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニプロトコル（ＱＵＩＡＧＥＮの７４１０４  ＲＮＥＡＳＹキット）を使用して細胞溶解物から単離する。単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの４３０４４３  ７Ｔａｇｍａｎマスターミックスを使用して、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）のためのマスターミックスを作製した後、ＱＰＣＲを行い、ＺＲ７５−１細胞中のｍＲＮＡレベルに対する、ＨＲＧ−β１ｍＲＮＡ発現を定量化する。ＱＰＣＲのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入する。
【０１９０】
表２に示す異なる細胞株のＥｒｂＢ３リン酸化レベルは、上述の実施例２に記載される方法またはその多少の変形を使用して、Ｒ＆Ｄ（Ｄｙｃ１７６９−２  ＤｕｏＳｅｔ−ＩＣヒトホスホ−ＥｒｂＢ３）のｐＥｒｂＢ３  ＥＬＩＳＡキットを使用して決定する。
【０１９１】
以下の表２は、上述の方法またはその多少の変形を使用して、異なる細胞株について得られた受容体およびリガンド発現を要約するが、その情報は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の計算モデルの構築に使用された。列１は、細胞株の名称を示し、列２は、腫瘍の種類を示し、列３〜５は、それぞれ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３の細胞当りの受容体の数を示し、列６は、ＺＲ７５細胞中のｍＲＮＡレベルと比較した倍数として表されるＨＲＧ−β１ｍＲＮＡレベルを示し、列７および８は、ｐｇ／細胞として表される、細胞中に存在するＢＴＣおよびｐＥｒｂＢ３の量を示す。
【０１９２】
（表２）異種移植片実験で使用された細胞株の受容体およびリガンド発現レベルの要約
2012500008.tif 000005
【０１９３】
計算モデルの訓練のために、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＡＫＴのリン酸化が、ＡＤＲｒ細胞におけるＢＴＣまたはＨＲＧ刺激の複数の時間点、および９つの異なる濃度でＥＬＩＳＡにより測定された、用量−時間マトリックスを含むデータセットが使用された。細胞の刺激のために、９６ウェル組織培養プレートに、ウェル当り３５，０００細胞で、１００μｌの完全培地に細胞を接種し、５％のＣＯ２、９５％空気、および摂氏３７度の加湿雰囲気で、一晩インキュベートする。その後、細胞を２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および単位／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）の無血清培地に切り替える。刺激の前に、５％のＣＯ２、９５％空気、および摂氏３７度の加湿雰囲気で、飢餓細胞を２０〜２４時間、インキュベートする。用量−時間マトリックス試験において、細胞は、０、１、２、３、４、５、７、１０、２０、３０、６０、および１２０分で、リガンド（ＢＴＣまたはＨＲＧ）を用いて刺激される。各時間経過において、９つの異なる濃度のＨＲＧ（０．０３８ｎＭ〜２５０ｎＭ）およびＢＴＣ（０〜７００ｎＭ）で刺激した後、細胞を氷上に置き、冷ＰＢＳで洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ２７１４）、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ６５０８）、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，２２１３６８）、５０μＭのオキソフェニルアルシン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５２１０００）、および１０μＭ  ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０３６９５）で補充された３０μｌの冷Ｍ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃７８５０１）に溶解する。
【０１９４】
刺激された細胞中のタンパク質リン酸化のレベルをＥＬＩＳＡにより測定する。ＥｒｂＢ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ２３１）、ＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ１１２９）、ＥｒｂＢ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ３４８１）、およびＡＫＴ（Ｕｐｓｔａｔｅ，０５−５９１ＭＧ）に対する捕獲抗体を、室温で一晩、３８４ウェル黒色平底ポリスチレン高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃３７０８）でインキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートを、１時間、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で遮断した後、室温で、２時間、２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、およびＰＢＳで希釈された溶解物と共にインキュベートする。各インキュベーション間において、プレートは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで、３回洗浄される。ホスホ−ＥｒｂＢ１、−ＥｒｂＢ２、および−ＥｒｂＢ３を測定するためのＥＬＩＳＡは、ホスホ−チロシン西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）連結モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＨＡＭ１６７６）と共に、２時間、インキュベートされる。ホスホ−ＡＫＴを測定するＥＬＩＳＡを、一級セリン４７３特異性抗ホスホＡＫＴマウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃５１０２）と共に、２時間、インキュベートした後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ９９８，）と共に、３０分間、インキュベートする。全てのＥＬＩＳＡを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃３７０６９）を用いて可視化し、発光計を使用して発光シグナルを測定する。
【０１９５】
ＢＴＣまたはＨＲＧの複数の時間点および９つの異なる濃度でのタンパク質リン酸化のデータセットについての結果（上述に記載の方法、またはその多少の変形を使用して取得された）を、図５Ａ〜５Ｂに示すが、図５Ａは、ＨＲＧ刺激された細胞についてのホスホ−ＥｒｂＢ３、ホスホ−ＥｒｂＢ２、ホスホ−ＥｒｂＢ３、およびホスホ−ＡＫＴのレベルを示し、図５Ｂは、ＢＴＣ刺激された細胞についてのホスホ−ＥｒｂＢ３、ホスホ−ＥｒｂＢ２、ホスホ−ＥｒｂＢ３、およびホスホ−ＡＫＴのレベルを示す。このデータセットは、シミュレーション結果（線）が、図５Ａ〜５Ｂに示される実験データ（点）を表すように、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の計算モデルを較正するために使用された。
【０１９６】
ＥｒｂＢ受容体シグナル伝達ネットワークの計算モデルの開発におけるさらなる情報は、以下に提供される。
【０１９７】
モデル構造
ＥｒｂＢ受容体シグナル伝達ネットワークモデルは、３つの受容体（ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３）、受容体ホスファターゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（受容体に結合するＰＩ３Ｋ）、およびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴカスケード（二リン酸ホスファチジルイノシトール、ＰＩＰ２、ホスホイノシチド依存タンパク質キナーゼ、ＰＤＫ１、染色体１０から欠失されたＰＴＥＮ、ＰＴＥＮ、セリン、タンパク質キナーゼＢとしても知られるスレオニンタンパク質キナーゼ、ＡＫＴ、タンパク質ホスファターゼ２Ａ、ＰＰ２Ａ）の構成要素からなる（以下の表８を参照）。ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４（実験的に、ＥｒｂＢ４発現レベルは、細胞株中で検出することが非常に難しいため、モデルに含まれない（以下の表３））に結合するヘレグリン（ＨＲＧ１−β）と、主にＥｒｂＢ１に結合するベータセルリン（ＢＴＣ）との２つのＥｒｂＢ受容体リガンドが含まれた（Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．Ｅ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６０７１−６０７６、Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４４７：２２７−２３１）。以下の表１１に全てがリストされる質量作用動態応答は、Ｍａｔｌａｂ  Ｓｉｍｂｉｏｌｏｇｙ２．３（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，ＭＡ）を使用して、常微分方程式に変換された。
【０１９８】
ホモダイマーおよびヘテロダイマーの文献（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３３４３−２３３５１、Ｗａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：１６２１−１６３６）に記載される、リガンド誘発された二量体化、内在化、再生、および分解が、モデルに含められた。Ｓｈａｎｋａｒａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３７１：２２０−２２４に発表された相対的スケールを用いて、受容体ダイマー安定性が組み入れられ、ここで、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３とのＥｒｂＢ１の共発現が、細胞表面へのシグナル伝達にバイアスをかけ、シグナル下方制御を遅延し、ＥｒｂＢ１〜３の同時共発現は、大量のＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーを引き起こす。したがって、ＥｒｂＢ３含有ダイマーは、内在化され、ＥｒｂＢ１ホモダイマーまたはＥｒｂＢ１−ＥｒｂＢ２ヘテロダイマーよりゆっくり分解される。リガンドを含まないダイマーは、任意の下流シグナル伝達を引き起こさず（Ｙｕ，  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １３：２５４７−２５５７）、細胞表面に留まると考えられたが、構成二量体化も含められた。ＥｒｂＢリガンドは、異なる親和性で、ＥｒｂＢホモダイマーおよびヘテロダイマーに結合するが（Ｔｅｒａｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＥＭＢＯ  Ｊ．２５：４２１５−４２２２）、予測される動態パラメータの数を減少し、できるだけ簡単なモデルで実験データを説明するために、我々は、リガンドのＥｒｂＢホモダイマーおよびヘテロダイマーへの結合親和性が同じになるように制約した。
【０１９９】
二量体化された受容体は、急速なリン酸化を受け、受容体細胞質側末端上のホスホチロシンへのシグナル伝達アダプターの結合を通して、下流経路を活性化する（Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ．ａｎｄ  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｘ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１２７−１３７）。ここで、簡易化されたＰＩ３Ｋ−ＡＫＴカスケードが組み込まれ、それによって、ＰＩ３Ｋは、リガンド結合ヘテロダイマーに直接的に結合し、ＰＩＰ２を活性化して、それがＰＤＫ１およびＡＫＴと共に複合体を形成して、２段階のＡＫＴの二重リン酸化を導く。ＥｒｂＢ３は、ＰＩ３Ｋ結合のために６つの部位を有するが、他のＥｒｂＢ受容体は、１つしか有さない（Ｗａｌｌａｓｃｈ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４２６７−４２７５、Ｓｏｌｔｏｆｆ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：３５５０−３５５８）。６つのＰＩ３Ｋ分子が同時にＥｒｂＢ３に結合することができるかどうかは分からないが、ＰＩ３Ｋは、他の受容体より、ＥｒｂＢ３によって１０〜２０倍強く活性化される（Ｆｅｄｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４９２−５００）。ＰＩ３Ｋは、他のＥｒｂＢ受容体より、大きな親和性でＥｒｂＢ３に結合するという証拠もある（Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４３９：１６８−１７４）。我々は、これらの現象をモデルに取り入れ、ＥｒｂＢ３含有ダイマーにおいて、以下の条件を課すことにより、６つの結合部位を含む組み合わせの複雑性を避けた：強化されたＰＩ３Ｋ結合速度、ＰＩ３Ｋに対する強化されたＰＩＰ２結合速度、およびＰＩＰ３の強化された活性化速度。ＰＩＰ２は、エンドソームに存在せず（Ｈａｕｇｈ，Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｖ．２：２９２−３０７）、したがって、形質膜結合受容体ダイマーのみが、モデルにおいてＰＩＰ２を活性化することが可能である。初期のシミュレーションは、ＡＫＴ活性を非常にゆっくり加速したため、シミュレーション前にＡＫＴホスファターゼをほぼ完全に不活性にし、負のフィードバックループを組み込み、それによって別の個所で記載される現象であるＡＫＴが自体のホスファターゼを活性化させるようにする必要があった（Ｃａｍｐｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：１２６２−１２６５）。ＭＡＰＫカスケードは、単純化するため、およびＡＫＴシグナル伝達が、ＭＡＰＫカスケードにおいて、種とパラメータに比較的非感受性であるという我々の最近の所見の両方のために無視され（Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．５：２３９）、したがって、ＭＡＰＫ−ＰＩ３Ｋのクロストークは、ＡＫＴシグナル伝達動態を説明するために必要とされない。初期の種の値は、直接的に測定されるか（ＥｒｂＢ受容体、ＰＤＫ１、ＡＫＴ）、文献から推測されるか（Ｂｉｒｔｗｉｓｔｌｅ，  Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．３：１４４、Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７３：４５１−４５３）、または速度を制限しない値に設定された。
【０２００】
モデル較正
多くの応答速度パラメータは、我々が試験を行った細胞系において未知であり、したがって、推定しなければならなかった（以下の表１０を参照）。開始点のバイアスを避けるために、全てのパラメータを初期値に設定した（Ａｌｄｒｉｄｇｅ，Ｂ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：１１９５−１２０３）。推定されたパラメータの数は、２段階式で予測を実施することにより制限された：第１に、モデルは、実験的に観察されたＥｒｂＢ受容体リン酸化データに対して較正され、第２に、ＡＫＴリン酸化に感度が高いパラメータは、実験データに対して最適化された。推定された値は、パラメータが、５０および２５世代の個体群サイズの遺伝アルゴリズムを使用して、複数のパラメータ実行で制約された場合にのみ承認された（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，ＭＡ）。ＨＲＧ１−βおよびＢＴＣのリガンド結合速度定数は、既知のＫｄ（Ｔｚａｈａｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５２７６−５２８７、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４４２６６−４４２７４、Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４４７：２２７−２３１）、および両方のリガンドについての１×１０５Ｍ−１ｓ−１の先の結合速度を近似するための初期用量応答曲線を使用して、別個に推定された。感度分析（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，ＭＡ）を、ＨＲＧ１−βまたはＢＴＣ刺激で、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＡＫＴリン酸化の活性に強く影響を与えたパラメータを特定するために実施した（以下の表１１を参照）。システムが１ｎＭのＨＲＧ１−βまたはＢＴＣのいずれかで刺激される間、各パラメータが、別個に変動することを可能とした。各々の種の正規化された感度は、２時間の刺激にわたって積分され、１０００という任意の閾値を上回る、正規化され、積分された感度のパラメータを、以下の表１１に挙げる。上述のように、試験された細胞株は、検出可能なＥｒｂＢ４をほとんど有さないため、ＥｒｂＢ４リン酸化は、パラメータの推定に含めなかった（以下の表３を参照）。ＥｒｂＢ４応答は、ＥｒｂＢ３応答に従いパラメータ化される。
【０２０１】
ＥｒｂＢ受容体リン酸化特性は、二量体化、内在化、再生、および分解パラメータに対して感度が高い（酵素反応、ダイマー解離、およびホスファターゼ速度定数は感度が低い）。これらのパラメータは、高密度データセットを使用して適合された。各読み取りは、いずれかのリガンドにより達成された最大活性化に対して正規化され、各リガンドの相対的効力を保存する。ＥｒｂＢ受容体二量体化速度は厳密に制約され、文献の所見と同様のパラメータの関係が観察された：ＥｒｂＢ２は、リガンド結合ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ３にとって、好適な二量体化パートナーである（ヘレグリン刺激でより顕著である）。利用可能なデータから、再生および内在化の両方の速度を制約することは不可能である、したがって、再生速度は、０．００５ｓ−１に設定され、内在化速度のみが適合され、得られた観察は、したがって、（逆に）再生速度に等しく適用される。内在化速度は、別の個所で支持される見解である、ＨＲＧ１−β結合ダイマーが、ＢＴＣ結合ホモダイマーおよびヘテロダイマーよりも非常に緩慢な内在化を示すという、リガンドの刺激に基づき変動した（Ｓｏｒｋｉｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｇｏｈ，Ｌ．Ｋ．（２００８）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１４：３０９３−３１０６）。分解速度も、十分に制約されたが、全てのダイマーにおいて同様であり、個々のダイマーの分解速度が、観察されたデータを説明するために必要ないことを示唆する。リン酸化ＡＫＴは、ＰＩ３Ｋカスケード内および受容体レベルで、多くのパラメータに感度が高い（以下の表１１を参照）。したがって、我々は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴカスケード内のモデルパラメータのみに較正を制限し、ＥｒｂＢ受容体特性上で既に訓練したパラメータ値を固定しつつ、ＡＫＴリン酸化の時間経過に対して訓練した。
【０２０２】
モデル訓練後、パラメータの手動調節を、各パラメータへの影響を解釈するため、さらなる改善が可能であるかを決定するため、およびパラメータを生物学的に妥当な値に制限するために実施した。標準化のため、（分解速度で説明された）パラメータの種類にわたって維持される時、パラメータは四捨五入され、類似した値に凝縮された。
【０２０３】
阻害剤の組み入れ
ＥｒｂＢネットワーク阻害剤は、既知の作用機構の最も単純な解釈を使用してモデルに含められた（以下の表１２を参照）：抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体Ａｂ＃６は、リガンド結合を阻害することにより、ＥｒｂＢ３を隔離し、内在化および分解を誘発する：セツキシマブは、ＥｒｂＢ１を隔離して、リガンド結合を阻害し、ラパチニブは、ＥｒｂＢ受容体の活性化を阻害するが、二量体化またはリガンド結合は阻害せず、ペルツズマブは、ＥｒｂＢ２二量体化を遮断する。Ａｂ＃６に対して、Ｋｉｎｅｘａにより測定された速度定数が使用され、他の阻害剤に対しては、文献で報告され（Ｗｏｏｄ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：６６５２−６６５９、Ｐａｔｅｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２７：３３５５−３３６６、Ａｄａｍｓ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５５：７１７−７２７）、以下の表１３に挙げられる速度定数が使用された；セツキシマブのパラメータは、Ｋｉｎｅｘａにより、実験的に確認された。
【０２０４】
ＥｒｂＢシグナル伝達経路の計算モデルの開発において使用された様々な追加の情報を、以下の表３〜１３に示す。
【０２０５】
（表３）測定されたＥｒｂＢ受容体発現および検討された細胞株の変異状態
2012500008.tif 000006
ND - 検出不可
# - qFACSにより測定
* 検討された細胞株の変異状態を決定するために使用されたウェブサイト-http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/core_line_viewer?action=nci60_list
【０２０６】
（表４）ＥｒｂＢ１結合リガンドおよびＨＲＧ１−βのＥｒｂＢ１リン酸化用量応答曲線の特徴付け
2012500008.tif 000007
ＮＤ：決定することができなかった
ＣＩ：９５％信頼区間
【０２０７】
（表５）ＥｒｂＢ１結合リガンドおよびＨＲＧ１−βのＥｒｂＢ２リン酸化用量応答曲線の特徴付け
2012500008.tif 000008
ＮＤ：決定することができなかった
ＣＩ：９５％信頼区間
【０２０８】
（表６）ＥｒｂＢ１結合リガンドおよびＨＲＧ１−βのＥｒｂＢ３リン酸化用量応答曲線の特徴付け
2012500008.tif 000009
ＮＤ：決定することができなかった
ＣＩ：９５％信頼区間
【０２０９】
（表７）ＥｒｂＢ１結合リガンドおよびＨＲＧ１−βのＡＫＴリン酸化用量応答曲線の特徴付け
2012500008.tif 000010
ＮＤ：決定することができなかった
ＣＩ：９５％信頼区間
【０２１０】
（表８）計算モデルにおけるゼロ以外の種の初期量
2012500008.tif 000011
【０２１１】
（表９）対応するパラメータを伴う質量作用動態を使用した計算モデルに組み入れられた生化学反応の要約
使用された略称の定義
：  タンパク質複合体、例えば、受容体に結合されるリガンドを示す
＿ｐ  タンパク質がリン酸化されることを示す
ｉｙ  種が内在化されることを示す
＜−＞  可逆反応を示す
−＞  非可逆反応を示す
2012500008.tif 000012
2012500008.tif 000013
2012500008.tif 000014
2012500008.tif 000015
2012500008.tif 000016
2012500008.tif 000017
2012500008.tif 000018
【０２１２】
（表１０）値を含むパラメータの説明。パラメータの数字は、パラメータが現れる最初の反応に対応する
2012500008.tif 000019
2012500008.tif 000020
2012500008.tif 000021
【０２１３】
（表１１）ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ１およびＡＫＴに敏感なパラメータ
2012500008.tif 000022
2012500008.tif 000023
【０２１４】
（表１２）Ａｂ＃６、セツキシマブ、ペルツズマブ、およびラパチニブの組み入れスキーム
2012500008.tif 000024
2012500008.tif 000025
【０２１５】
（表１３）阻害剤のパラメータ値
2012500008.tif 000026
2012500008.tif 000027
【０２１６】
実施例５：ｐＥｒｂＢ３の活性化を予測するマーカーの選択
この実施例において、ｐＥｒｂＢ３によって示される、ＥｒｂＢ３の活性化を予測する一連のタンパク質マーカーが、実施例４に記載されるＥｒｂＢシグナル伝達経路の機構的計算モデルを使用して特定された。
【０２１７】
ＥｒｂＢ３  リン酸化のレベルが、腫瘍応答速度と相関することを実施例２で示されたので、感度分析を、ＥｒｂＢ３リン酸化のレベルを決定する主要タンパク質を特定するために、訓練された計算モデル上で実施した。
【０２１８】
この局所感度分析において、細胞は、実質的に、両方がＥｒｂＢシグナル伝達経路を活性化するリガンドである、０．４ｎＭのＨＲＧまたはＢＴＣのいずれかで、コンピュータシミュレーションにより刺激された。以下の細胞受容体、キナーゼ、および他のタンパク質に関するｐＥｒｂＢ３の感度が、決定された：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ１、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＰ２、ＰＴＥＮ、ＰＤＫ１、ＰＰ２Ａ、ＡＫＴ、ＲＴＫｐａｓｅ、およびリガンド（ＢＴＣおよびＨＲＧ）。
【０２１９】
局所感度分析は、経路内のタンパク質濃度および動態パラメータにおける変化に応答した、出力の変化を測定する数学的ツールである。ｊ番目の速度定数（ｋｊ）の変化に対するｉ番目の観察可能なｃｉ（ｔ）の完全に正規化された感度（ｓｉｊ（ｔ））は、以下の方程式によって得られる。
2012500008.tif 000028
モデル較正は、次いで、感度分析で特定されたパラメータおよび初期タンパク質濃度を変化させることにより、実験データとシミュレーションデータ結果との間の距離を最小にする局所および大域的最適化法（遺伝アルゴリズム、シミュレーションされたアニーリング、レーベンバーグ−マルカート最適化法）を使用して実施された。
【０２２０】
局所感度分析の結果を図６の棒グラフに要約する。結果は、以下の５つのタンパク質が、ＥｒｂＢ３の活性化（例えば、ｐＥｒｂＢ３の形成）を予測する主要な一連のマーカーであることを示した：ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＨＲＧ、およびＢＴＣ。
【０２２１】
実施例６：ｐＥｒｂＢ３レベルを計算するための機構的計算モデルの使用
計算モデルを使用して、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＨＲＧ、およびＢＴＣがｐＥｒｂＢ３の予測の主要マーカーとして特定された、実施例５で得られた結果に基づき、異なる細胞株のｐＥｒｂＢ３レベルを計算するために、計算モデルへの入力として、表２に示すタンパク質発現レベルの測定値を使用した。
【０２２２】
計算モデルへのＢＴＣおよびＨＲＧ発現レベルの入力は、無次元単位、すなわちｐｇ／μｇから濃度［Ｍ］への変換を必要とした。従って、変換係数を確立する必要があった。ＨＲＧ  ｍＲＮＡレベルおよびＢＴＣタンパク質発現レベルをモル濃度に変換する変換係数は、実験的に測定されたｐＥｒｂＢ３レベルと予測されたｐＥｒｂＢ３レベルとの間の線形範囲で推定された。実験的に測定された値については、構成的ＥｒｂＢ３リン酸化レベル（ｐｇ／μｇ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中の４つの細胞株（ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＤＵ１４５、ＡＤＲｒ、およびＡＣＨＮ）において測定した。これらの実験的に測定された結果を実施例４の表２の列７に示す。リガンド変換係数訓練において、経時的に積分された正規化された予測ｐＥｒｂＢ３シグナルを、６．１ｅ−００５のＢＴＣ変換係数および３．１ｅ−０１３のＨＲＧ  ｍＲＮＡ変換係数を使用して、１０％インビトロＦＢＳ中の実験的に測定されたｐＥｒｂＢ３に対してプロットした。リガンド変換係数は、細胞株ＡＤＲｒ、ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＡＣＨＮ、およびＤＵ１４５中の予測されたｐＥｒｂＢ３と（ＥＬＩＳＡにより）測定された構成的ｐＥｒｂＢ３レベルとの間の線形関係を最適化することにより訓練した。
【０２２３】
このようにして、ＨＲＧおよびＢＴＣによる経路の活性化を、モデルを使用してシミュレーションし、計算されたｐＥｒｂＢ３レベルにより示されるネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）が、出力として得られた。この場合において、ＮＡＳは、ＨＲＧおよびＢＴＣによる最初の２時間の刺激に対するモデルでシミュレーションを行った時間積分ｐＥｒｂＢ３の量として定義された。計算されたｐＥｒｂＢ３レベルの結果を図７のグラフに示す。異種移植片モデルで試験された４つの細胞株のうち、ＡＤＲｒ細胞株が最高ｐＥｒｂＢ３レベルを有する非応答株であったため、ＡＤＲｒ細胞のシミュレーションされたＮＡＳは、Ａｂ＃６処理に対する応答株と非応答株との間の閾値として初期設定された。
【０２２４】
実施例７：異種移植片応答を使用したＮＡＳ閾値の設定およびＮＡＳ閾値に基づく応答性の予測
この実施例において、実施例１に記載する４つの腫瘍細胞株の異種移植片の応答を、実施例６に記載するように計算されたＮＡＳ値（正規化された、時間積分ｐＥｒｂＢ３レベル）と組み合わせて、Ａｂ＃６処理に対する応答株およびＡｂ＃６処理に対する非応答株のＮＡＳ閾値を設定した。
【０２２５】
より具体的には、ＡＤＲｒ、ＡＣＨＮ、ＤＵ１４５、およびＭＡＬＭＥ３細胞株（実施例１に記載）について決定された成長率低減（ＧＲＲ）値は、ＡＤＲｒ細胞中のｐＥｒｂＢ３レベルを超えるｐＥｒｂＢ３レベルを有する（すなわち、ｐＥｒｂＢ３  ＞  ｐＥｒｂＢ３（ＡＤＲｒ））ように「応答株」を設定することにより、分類化訓練の二元結果に変換され、「非応答株」は、ＡＤＲｒ細胞中のｐＥｒｂＢ３レベルより低いｐＥｒｂＢ３レベルを有する（すなわち、ｐＥｒｂＢ３＜ｐＥｒｂＢ３（ＡＤＲｒ））ように設定された。これは、モデル予測ではなく、分類化訓練プロセスの一部であったことに留意されたい。
【０２２６】
４つの細胞株について、実験的に決定されたＧＲＲ値を、計算されたＮＡＳ値（正規化された、時間積分ｐＥｒｂＢ３）に対してプロットした。ｘ軸上のＧＲＲ値は、応答株（ｐＥｒｂＢ３＞ｐＥｒｂＢ３（ＡＤＲｒ））と非応答株（ｐＥｒｂＢ３＜ｐＥｒｂＢ３（ＡＤＲｒ））とに分けられた。ＮＡＳ訓練データ（実施例４に記載されるように得られた）は、シミュレーションされた応答株（「Ｓｉｍ  Ｒ」）、シミュレーションされた非応答株（「Ｓｉｍ  ＮＲ」）、およびシミュレーションされた不確定（「Ｓｉｍ  Ｉ」）の３つのカテゴリーにネットワーク活性化状態ｙ軸の分類を可能にした。２つの異種移植片細胞株は、２０％（ＤＵ１４５，ＡＣＨＮ）以上の成長率低減値により特徴付けされ、これらのうちＤＵ１４５細胞株が、最も低いネットワーク活性化状態を有した。したがって、シミュレーションされた応答株として細胞株を分類するための閾値は、ＡＤＲｒレベル以上またはそれに等しいネットワーク活性化状態で設定された。同様に、ＭＡＬＭＥ３細胞株異種移植片は、非応答株（ｐＥｒｂＢ３＜ｐＥｒｂＢ３（ＡＤＲｒ））であり、したがって、ＡＤＲｒレベルより低い細胞株のネットワーク活性化状態は、シミュレーションされた非応答株として分類された。これらのＡＤＲｒおよびＤＵ１４５閾値の間のネットワーク活性化状態は、シミュレーションされた不確定として分類される。
【０２２７】
計算されたｐＥｒｂＢ３レベルにより示される、ネットワーク活性化状態は、ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３の実験的測定が利用可能である１５の細胞株のパネルにおいてシミュレーションされた。１５の細胞において計算された積分されたｐＥｒｂＢ３レベルは、図８Ａに示す棒グラフに、最高のｐＥｒｂＢ３レベルから最低の順に、４つの訓練細胞株のレベルと共にプロットされた。これらの１５の細胞株について計算されたＮＡＳ値は、その後、４つの訓練細胞株であるＡＤＲｒ、ＡＣＨＮ、ＤＵ１４５、およびＭＡＬＭＥ３Ｍについて前に決定されたＮＡＳ値に対してランク付けされた。合計１９の細胞株のＮＡＳ結果が、図８Ｂのグラフに示されるようにランク付けされる。ＭＡＬＭＥ３Ｍ細胞株に等しい、またはそれより低いＮＡＳ値は、シミュレーションされた非応答株（「Ｓｉｍ  ＮＲ」）として設定され、ＭＡＬＭＥ３ＭとＤＵ１４５細胞株の間のＮＡＳ値は、シミュレーションされた不確定（「Ｓｉｍ  Ｉ」）として設定され、ＤＵ１４５細胞株と等しい、またはそれ以上のＮＡＳ値は、シミュレーションされた応答株（「Ｓｉｍ  Ｒ」）として設定された。したがって、図８Ｂに図示するように、ＩＧＲＯＶ１（ＮＣＩ−６０、Ｃｏｓｍｉｃ試料ＩＤ番号９０５９６８）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２７）、ＳＫＭＥＬ−５（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−７０）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２６）、およびＴ４７Ｄ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１３３）細胞株は、それらの計算されたＮＡＳ値が、ＭＡＬＭＥ３Ｍより低かったため、シミュレーションされた非応答株であると予測された。さらに、ＺＲ７５−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５００）、ＨＯＰ９２（ＮＣＩ−６０、Ｃｏｓｍｉｃ試料ＩＤ番号９０５９７３）、およびＨＯＰ６２（ＮＣＩ−６０、Ｃｏｓｍｉｃ試料ＩＤ番号９０５９７２）細胞株は、それらの計算されたＮＡＳ値がＡＤＲｒとＤＵ１４５の間であったため、シミュレーションされた不確定であると予測された。最後に、ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３０）、ＵＡＣＣ６２（ＮＣＩ−６０、Ｃｏｓｍｉｃ試料ＩＤ番号９０５９７６）、ＥＫＶＸ（ＮＣＩ−６０、Ｃｏｓｍｉｃ試料ＩＤ番号９０５９７０）、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２０）、ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−７７）、ＯＶＣＡＲ８（国立癌研究所癌治療および診断部から得た）、およびＣＡＫｌ１（ＮＣＩ−６０、Ｃｏｓｍｉｃ試料ＩＤ番号９０５９６３）細胞株は、それらの計算されたＮＡＳ値がＡＤＲｒ以上であったため、シミュレーションされた応答株であると予測された。
【０２２８】
これらのモデル予測を試験するために、３つの追加のインビボ異種移植片試験を実施した。実施例１に記載するように実施された異種移植片試験で、ＩＧＲＯＶ１、ＯＶＣＡＲ８、およびＳＫＯＶ３細胞株を使用し、そこではマウスが６００μｇのＡｂ＃６で３日に１回、または対照としてＰＢＳで処理された。時間に対する腫瘍量（ｍｍ３）の変化により決定される、異種移植片応答は、図９Ａ〜９Ｃのグラフに要約される。ここでも、各細胞株における成長率低減（ＧＲＲ）値は、以下の式を使用して計算された。
成長率低減＝１−（Ａｂ＃６成長率）／（ＰＢＳ成長率）
【０２２９】
試験された４つの細胞株におけるＧＲＲ値を以下の表１４に要約する。
【０２３０】
（表１４）予測された一連の異種移植片試験における腫瘍成長率低減の要約
2012500008.tif 000029
【０２３１】
各細胞株のＡｂ＃６に対する応答の予測に関して、異種移植片応答株は、ＡＤＲｒにおいてシミュレーションされたｐＥｒｂＢ３以上のシミュレーションされたｐＥｒｂＢ３レベルを有さなければならないという基準に基づき、ＩＧＲＯＶ１異種移植片は、非応答株として分類され、一方、ＯＶＣＡＲ８およびＳＫＯＶ３は、応答株として分類された。
【０２３２】
これらのデータは、計算されたＮＡＳ値に基づいた予測は、インビボ異種移植片試験における、Ａｂ＃６処理に対する３つの試験細胞株の実験的に観察された応答性に正確に対応することを示す。より具体的には、ＩＧＲＯＶ１細胞株は、その計算されたＮＡＳ値に基づき、シミュレーションされた非応答株であると予測され、そのＧＲＲ値に基づき、非応答株であると実験的に観察された。同様に、ＯＶＣＡＲ８およびＳＫＯＶ３細胞株は、それらの計算されたＮＡＳ値に基づき、シミュレーションされた応答株であると予測され、それらのＧＲＲ値に基づき、応答株であると実験的に観察された。
【０２３３】
したがって、これらの実験は、インビボでのＡｂ＃６処理に対する応答性の予測として、計算モデル、および正規化された時間積分ｐＥｒｂＢ３レベルの計算されたＮＡＳ値の有効性を確認した。
【０２３４】
実施例８：Ａｂ＃６応答性の直接的バイオマーカーの特定
この実施例において、Ａｂ＃６応答性の直接的バイオマーカーが特定され得るかどうかを決定するために、実施例１に記載される異種移植片試験で検討された４つの細胞株（ＡＤＲｒ、ＡＣＨＮ、ＤＵ１５４、およびＭＡＬＭＥ３Ｍ）、および実施例７に記載される異種移植片試験で検討された３つの細胞株（ＩＧＲＯＶ１、ＯＶＣＡＲ８、およびＳＫＯＶ３）のデータをさらに検討した。
【０２３５】
最初に、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、および  ＥｒｂＢ３の受容体濃度が、異種移植片データを応答株および非応答株に効果的に分類するかどうかを検討した。図１０Ａ〜１０Ｄのグラフに図示するように（１つの受容体の濃度のログが１つ以上の他の受容体の濃度のログに対してプロットされる）、ＥｒｂＢ１受容体測定値のみが、異種移植片データを応答株および非応答株に分類するように見え、一方、他の受容体のいずれもそのようには見えなかった。
【０２３６】
次に、１つの受容体濃度（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３）と組み合わせたＨＲＧの濃度が、異種移植片データを応答株および非応答株に効果的に分類するかどうかを検討した。図１１のグラフに図示するように（ＨＲＧの濃度のログが、ＥｒｂＢ１の濃度のログに対してプロットされる）、これらの２つの濃度測定値である、ＨＲＧおよびＥｒｂＢ受容体の１つは、異種移植片データを応答株および非応答株に正確に分類することができた。より具体的には、３つの非応答株であるＭＡＬＭＥ３、ＡＤＲｒ、およびＩＧＲＯＶ１のデータは、６つの応答株のデータから分離可能であり、これによって、非応答株対応答株の分類を可能にした。
【０２３７】
したがって、Ａｂ＃６応答の直接的バイオマーカーは、ＥｒｂＢ経路受容体（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３）の１つと組み合わせたＨＲＧとして特定された。
【０２３８】
以下の表１５は、予測をするためにＡｂ＃６の直接的バイオマーカーを使用して実施例７で試験された、細胞株の予測された応答株および非応答株を要約する。直接的バイオマーカーを使用して決定された予測は、（実施例７に記載する）ＮＡＳ値を使用して決定された予測と良く対応する。例えば、ＡＣＨＮ、ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８、およびＳＫＯＶ３細胞株は、前に、ＮＡＳ値を使用して、応答株として特定されており、直接的バイオマーカーを使用しても、応答株であると予測された。同様に、ＡＤＲｒ、ＭＡＬＭＥ３Ｍ、およびＩＧＲＯＶ１細胞株は、前に、ＮＡＳ値を使用して、非応答株として特定され、直接的バイオマーカーを使用しても、非応答株であると予測された。
【０２３９】
（表１５）Ａｂ＃６の直接的バイオマーカーを使用して予測された応答株および非応答株
2012500008.tif 000030
【０２４０】
応答株と非応答株とを分離するためにＮＡＳを使用した実施例７の結果を、分離に直接的バイオマーカーを使用した実施例８の結果と比較すると、唯一の不一致は、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＵＡＣＣ６２細胞株であった。これら２つの個別の分類方法にある程度の違いがあったことは、意外ではない。この場合、不一致の細胞株は、患者分類の状況において、偽陽性は、偽陰性よりも好まれるため、応答株とみなす。
【０２４１】
実施例９：ＥＬＩＳＡおよびｑＩＨＣによる異種移植片とヒト腫瘍との間のタンパク質発現レベルの比較
この実施例において、ヒト腫瘍で観察されるタンパク質発現特性と比較した、異種移植片で観察されるタンパク質発現の類似性または差異を評価した。これは、異種移植片で観察されるタンパク質レベルが、ヒト腫瘍で観察されるタンパク質レベルと同等であるかどうかを決定するために行われた。
【０２４２】
一次実験において、ＥＬＩＳＡによってタンパク質レベルを測定する。実質的に実施例２で詳細に記載されるように、ヒト腫瘍試料または異種移植片の急速凍結腫瘍から溶解物を調製し、また、実質的に実施例２に記載されるように、ＥｒｂＢ１−４、ＨＲＧ−β１、およびＢＴＣのタンパク質レベルをＥＬＩＳＡにより分析する。結果（上述の方法、またはその多少の変形を使用して得た）が図１２Ａ〜１２Ｃのグラフにプロットされている。結果は、異種移植片試料中のタンパク質レベルにおいて得られた値が、異なる組織源のヒト腫瘍試料中のタンパク質レベルにおいて得られた値にほとんど散在されることを示し、異種移植片で観察されたタンパク質レベルは、ヒト腫瘍で観察されたタンパク質レベルと同等であることを示唆する。これらのデータに基づき、異種移植片における応答性の予測について決定されたＮＡＳ閾値は、ヒト腫瘍組織試料を使用して応答性を予測するために適用され得ることを主張する。
【０２４３】
凍結組織試料は、臨床現場では入手することが困難であり得るため、二次実験は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料でのタンパク質定量を可能にする測定技法を使用して実施された。より具体的には、ＡＱＵＡ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（ＨｉｓｔｏＲｘ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を使用して、定量的免疫組織化学検査（ｑＩＨＣ）を実施した。免疫蛍光法および代表的なタンパク質発現レベルを有する細胞株パネルを使用して、細胞株標準曲線を作成した。そして、細胞株標準曲線は、腫瘍試料および異種移植片中のタンパク質発現レベルの逆算出を可能にした。結果を図１３Ａ〜１３Ｄに示す。図１３Ａは、ＥｒｂＢ１の細胞株標準曲線を示す。図１３Ｂ、１３Ｃ、および１３Ｄは、異種移植片細胞株（赤色の棒）およびヒト腫瘍試料（青色の棒）における、それぞれＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３のｑＩＨＣスコアをプロットする棒グラフを示す。ｑＩＨＣの結果は、広範なタンパク質発現レベルにわたる、ヒト腫瘍試料と異種移植片試料との間のタンパク質発現レベルにおける類似性を実証した。これらの結果は、ここでも、異種移植片における応答性の予測について決定されたＮＡＳ閾値を、ヒト腫瘍組織試料を使用して応答株を予測するために適用され得る主張を支持する。
【０２４４】
実施例１０：リン酸化ヘテロダイマーに対する応答性の相関
この実施例において、リン酸化ＥｒｂＢホモダイマーおよびヘテロダイマーの積分されたレベルをＮＡＳ値として計算して、これらが、Ａｂ＃６処理に対する応答性と相関するかどうかを決定する。
【０２４５】
実施例４に記載されるように作成された同じ計算モデルを使用した。このモデルは、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＨＲＧ−β１、およびＢＴＣのレベルに対して実験的に決定された測定値に基づき生成された。実施例４に記載されるように、文献に記載されている７つのＥｒｂＢヘテロダイマーおよびホモダイマーが、モデルで実現された：ＥｒｂＢ１／１、ＥｒｂＢ１／２、ＥｒｂＢ１／３、ＥｒｂＢ１／４、ＥｒｂＢ２／２、ＥｒｂＢ２／３、およびＥｒｂＢ２／４。これらのダイマーの大部分は、リガンド結合により活性化されるが、いくつかは、リガンド依存的様式でリン酸化されたダイマーがモノマーに分離し、それが次いで、活性化または不活性化されるモノマーのいずれかとともにホモまたはヘテロオリゴマー化して、活性ダイマーを生成する、「側面シグナル伝達」（または二次的二量体化）のプロセスを通して生じる。計算モデルは、ＡＤＲｒ細胞株を使用するＨＲＧまたはＢＴＣの存在下で形成されるダイマーの特定を可能にする、設定実験データを用いて訓練された。
【０２４６】
したがって、リン酸化ホモダイマーおよびヘテロダイマーの積分されたレベルは、以下の細胞株におけるネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）の基準として計算された：ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＢＴ４７４、ＩＧＲＯＶ１、ＡＤＲｒ、ＯＶＣＡＲ８、ＳＫＯＶ３、ＤＵ１４５、およびＡＣＨＮ。図１４のグラフに示すように、リン酸化ＥｒｂＢ１／３ヘテロダイマー（ｐＥｒｂＢ１：３）の計算されたレベルは、８つの細胞株をＡｂ＃６非応答株（ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＢＴ４７４、ＩＧＲＯＶ１、ＡＤＲｒ）と応答株（ＯＶＣＡＲ８、ＳＫＯＶ３、ＤＵ１４５、およびＡＣＨＮ）に分けた。計算されたｐＥｒｂＢ１：３レベルに基づくこの分別は、実施例８に記載される直接的バイオマーカーを使用して決定された、予測された非応答株および応答株と全く同じように相関した。計算されたｐＥｒｂＢ１：３レベルに基づくこの分別は、実施例７に記載されるＮＡＳ値の計算されたｐＥｒｂＢ３レベルを使用して決定された、予測された非応答株および応答株とも、ほぼ全く同じように相関し、唯一の差異は、ＢＴ４７４細胞株であり、これは、直接的バイオマーカーと計算されたｐＥｒｂＢ１：３レベルの両方を使用して非応答株として特定されたが、計算されたｐＥｒｂＢ３レベルを使用して応答株として特定された。
【０２４７】
ＥｒｂＢ１／１、ＥｒｂＢ１／２、ＥｒｂＢ１／３、ＥｒｂＢ１／４、ＥｒｂＢ２／２、ＥｒｂＢ２／３、およびＥｒｂＢ２／４ダイマーのレベルも、計算モデルを使用して計算されたが、これらのホモダイマーまたはヘテロダイマーのいずれのレベルも、細胞株をＡｂ＃６処理の応答株と非応答株に分けなかった。したがって、ＥｒｂＢ１／３ヘテロダイマーを用いて観察された結果は、検討されたダイマーの中で特有であった。
【０２４８】
これらの結果は、リン酸化ＥｒｂＢホモダイマーまたはヘテロダイマーの積分されたレベルが、本発明の予測方法においてＮＡＳ値として使用され得ること、より具体的には、ｐＥｒｂＢ１：３の計算されたレベルが、Ａｂ＃６を用いた処理に対する応答性を予測するための好適なＮＡＳ値であることを示す。これらの結果は、高レベルのＥｒｂＢ１：３ヘテロダイマーを伴う癌において、Ａｂ＃６が特に効果的であり、したがって、総ＥｒｂＢ１：３ヘテロダイマーまたはｐＥｒｂＢ１：３ヘテロダイマーレベルの直接的測定も、Ａｂ＃６処理の有効性を予測するための直接的バイオマーカーとして使用され得ることを意味すると解釈される。
【０２４９】
実施例１１：ＥｒｂＢシグナル伝達経路への治療薬の効果の計算モデルの構築および訓練
この実施例において、機構的計算モデルを構築するための実施例４に記載されるアプローチを、ＥｒｂＢシグナル伝達経路のモデルを構築および訓練するため、さらに特定の治療薬がシグナル伝達経路を阻害する機構の計算表示を開発するために使用した。
【０２５０】
この実施例に使用された治療薬は、二重特異的抗体のＨ３×Ｂ１Ｄ２（配列番号４１に示され、さらに米国特許第７，３３２，５８５号、米国特許第７，３３２，５８０号、および国際公開第ＷＯ２００７／０８４１８７号として公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ第２００６／０２３４７９号、並びに国際公開第ＷＯ２００８／１４０４９３号として公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ第２００７／０２４２８７号に記載されるアミノ酸配列）である。この二重特異性抗体は、抗ＥｒｂＢ２単一鎖抗体に連結された抗ＥｒｂＢ３単一鎖抗体からなる。
【０２５１】
Ｈ３ｘＢ１Ｄ２薬剤は、ＥｒｂＢ２過剰発現腫瘍を優先的に標的とすることが予測された。したがって、過剰発現されたＥｒｂＢ２の存在下のＥｒｂＢシグナル伝達ネットワークの計算モデルを、実施例４に記載される方法およびモデルを使用して構築した。モデルは、受容体輸送およびＡＫＴの細胞内シグナル伝達の下流を導き、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）を産生する、ＨＲＧとＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３受容体との間の相互作用を組み込んだ。含められた相互作用は、実質的に、実施例４のモデルに見られるものと同一であった。実施例４のモデルと異なり、リガンドＢＴＣに関連する反応は、このモデルに含まれなかった。
【０２５２】
このモデルは、ＥｒｂＢ２過剰発現乳房細胞株ＢＴ４７４−Ｍ３（細胞株は、例えば、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：３３９２、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１１７２、Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：６７３２に記載される）の実験データに一致するように較正された。モデルの較正は、実施例４のモデルと比較して、パラメータ値における小さなの差のみを生じた。最も有意な差は、ＥｒｂＢ受容体の内在化および分解の速度の減少であった。この変化は、ＥｒｂＢ２過剰発現が、ＥｒｂＢ１等の、他のＥｒｂＢ受容体の内在化／輸送速度を減少させることを示唆する、既知のデータと一致する（例えば、Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３３４３−２３３５１、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：１６２１−１６３６、Ｈａｓｌｅｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ１６：５８３２−５８４２を参照）。
【０２５３】
モデルの訓練のために、ＢＴ４７４−Ｍ３細胞における複数の時間点、および６つの異なる濃度のＨＲＧ刺激でのＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＡＫＴのリン酸化が、ＥＬＩＳＡにより測定された用量−時間マトリックスを含むデータセットを使用した。
【０２５４】
細胞の刺激のために、１２ウェル組織培養プレート（９６半ウェルＥＬＩＳＡ用）にウェル当り１５０，０００細胞で１０００μｌの完全培地を用いた二層ウェルに、または９６ウェル組織培養プレート（３８４ウェルＥＬＩＳＡ用）にウェル当り２０，０００細胞で１００μｌの二層プレートに、細胞を接種した。これらの細胞を、５％のＣＯ２、９５％空気、および摂氏３７度の加湿雰囲気で、一晩、インキュベートした。その後、細胞を２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および単位／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）の無血清培地に切り替える。刺激の前に、５％のＣＯ２、９５％空気、および摂氏３７度の加湿雰囲気で、飢餓細胞を２０〜２４時間、インキュベートする。用量−時間マトリックス試験のために、細胞は０、１、２、３、４、５、７、１０、２０、３０、６０、および１２０分で、リガンド（ＨＲＧ）を用いて刺激される。各時間経過において、６つの異なる濃度のＨＲＧ（０．０９８ｎＭ〜１００ｎＭ）で刺激した後、細胞を氷上に置き、冷ＰＢＳで洗浄し、その後、１２ウェルプレートには２００μｌで、そして９６ウェルプレートには４５μｌで、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ２７１４）、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ６５０８）、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，２２１３６８）、５０μＭのオキソフェニルアルシン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５２１０００）、および１０μＭ  ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０３６９５）で補充された、冷Ｍ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ＃７８５０１）に溶解した。
【０２５５】
刺激された細胞中のタンパク質リン酸化のレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定される。ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｕｏｓｅｔ  ＩＣキット（ＥｒｂＢ１  ＤＹＣ１０９５−Ｅ、ＥｒｂＢ２  ＤＹＣ１７６８−Ｅ、ＥｒｂＢ３  ＤＹＣ１７６９−Ｅ）を使用して測定される。ＥｒｂＢ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，８４１４０２）、ＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，８４１４２５）、ＥｒｂＢ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，８４１４２８）、および  ＡＫＴ（Ｕｐｓｔａｔｅ，０５−５９１ＭＧ）に対する捕獲抗体を、室温で一晩、黒色平底ポリスチレン高結合プレートの９６半ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，カタログ＃８２０５０−０４６）、または３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｃａｔ＃４０５１８）でインキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートを、１時間、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で遮断した後、室温で、２時間、２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、およびＰＢＳで希釈された溶解物と共にインキュベートする。各インキュベーション間において、プレートは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで、３回洗浄される。ホスホ−ＥｒｂＢ１、−ＥｒｂＢ２、および−ＥｒｂＢ３を測定するためのＥＬＩＳＡは、２時間、抗ホスホ−チロシン−ＨＲＰ検出抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，８４１４０３）と共にインキュベートされる。ホスホ−ＡＫＴを測定するＥＬＩＳＡを、一級セリン４７３特異性抗ホスホＡＫＴマウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃５１０２）と共に、２時間、インキュベートした後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ＃ＤＹ９９８）と共に、２０分間、インキュベートする。全てのＥＬＩＳＡを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ＃３７０６９）を用いて可視化し、発光計を使用して発光シグナルを測定する。
【０２５６】
図２１に示すように、モデルは、実験的に検討されたＨＲＧの全ての用量で、ＥｒｂＢ２過剰発現細胞株ＢＴ４７４−Ｍ３におけるＨＲＧ誘発ｐＥｒｂＢ３シグナル伝達データに一致した。加えて、モデルは、約５ｎＭ以下のＨＲＧ用量で、ＢＴ４７４−Ｍ３細胞におけるＨＲＧ誘発ｐＡＫＴシグナル伝達データに一致した。
【０２５７】
次に、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２が、ＥｒｂＢ経路のＨＲＧ依存シグナル伝達を阻害する機構の計算表示を開発した。阻害剤の計算表示は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３への阻害剤の結合、および後続のＨＲＧ誘発シグナル伝達の阻害を説明する質量作用反応の方程式を使用して構築された。結合事象のパラメータは、直接的測定（当該分野に広く知られる技法を使用）とＨ３×Ｂ１Ｄ２による細胞におけるＨＲＧ誘発ｐＥｒｂＢ３の阻害についてのデータに一致するモデルの計算訓練との組み合わせにより取得された。特に、二重特異性抗体のＨ３単一鎖アームのＥｒｂＢ３への結合のオン率およびオフ率、並びに二重特異性抗体のＢ１Ｄ２単一鎖アームのＥｒｂＢ２への結合のオン率およびオフ率は、標準的なＢＩＡＣｏｒｅおよびＫｉｎＥｘＡ技術により実験的に決定された。Ｈ３×Ｂ１Ｄ２の計算モデルの反応およびパラメータを表１６ａおよび１６ｂに表す。
【０２５８】
（表１６ａ）
2012500008.tif 000031
**この反応スキームにおいて、遊離（Ｈ３×Ｂ１Ｄ２）量は、一定に維持した。
【０２５９】
（表１６Ｂ）
2012500008.tif 000032
【０２６０】
ＥｒｂＢシグナル伝達モデルは、阻害剤モデルと組み合わされ、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２によるｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴシグナル伝達の阻害についての実験的データを予測するために使用された。実験データは、１５ｐＭ〜１μＭの範囲の濃度のＨ３×Ｂ１Ｄ２が血清飢餓培養中に添加されたことを除き、上述と同じ方法を使用して生成された。加えて、阻害データは、５ｎＭ  ＨＲＧ刺激後の、１０分の溶解時間点を使用して生成された。Ｈ３×Ｂ１Ｄ２の阻害のＩＣ５０は、異なる細胞株において大きく変化しなかったが、阻害率は、大きく変化したことを示し、モデルは、実験結果を正確に再現した。阻害率の変化の主な原因は、ＥｒｂＢ２の発現のレベルであった。これは、ＥｒｂＢ２がＯＶＣＡＲ８細胞株に形質移入されて、ＥｒｂＢ２過剰発現細胞株（ＯＶＣＡＲ８−ＨＥＲ２と称される）を生成する実験で実証された。Ｈ３×Ｂ１Ｄ２で処理されたＯＶＣＡＲ８細胞のｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴ阻害曲線を、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２で処理されたＯＶＣＡＲ８−ＨＥＲ２細胞の同じ阻害曲線と比較した。図１７Ａ〜Ｄに結果を示すが、図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２で処理されたＯＶＣＡＲ８における、それぞれｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴの阻害曲線を示し（実験的か、またはモデルでシミュレーションされたかのいずれか）、図１７Ｃおよび１７Ｄは、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２で処理されたＯＶＣＡＲ８−ＨＥＲ２細胞における、それぞれｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴの阻害曲線を示す（実験的か、またはモデルでシミュレーションされたかのいずれか）。実験的に処理された細胞（「ＤＲ５０データ」）およびシミュレーションされた処理細胞（「ＤＲ５０ｓｉｍ」）のＩＣ５０も示す。データは、高レベルのＥｒｂＢ２発現が、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２処理による大きな阻害率をもたらすことを示す。
【０２６１】
阻害率の調節におけるＥｒｂＢ２の主な役割に加え、ＥｒｂＢ１の予想外の役割が、計算モデルにより明らかになった。ＥｒｂＢ１のこの役割は、ＥｒｂＢ１の下方制御をシミュレーションする、ＥｒｂＢ１  ＲＮＡｉのＡＤＲｒ細胞への添加の作用を示すシミュレーションにより例示された。ＡＤＲｒ細胞は、低レベルのＥｒｂＢ２のみを発現し、計算モデルおよび実験的に決定されたデータの両方において、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２による阻害率の低さを示した。このデータを図１８Ａおよび１８Ｂに示すが、これは、実験的か、またはモデルでシミュレーションされたかのいずれかのＨ３×Ｂ１Ｄ２で処理されたＡＤＲｒ細胞における、それぞれＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴの阻害曲線を示す。実験的に処理された細胞（「ＤＲ５０データ」）およびシミュレーションされた処理細胞（「ＤＲ５０ｓｉｍ」）のＩＣ５０も示す。しかしながら、（ＲＮＡｉ添加のシミュレーションによる）ＥｒｂＢ１発現の下方制御は、ＥｒｂＢ１  ＲＮＡｉおよびＨ３×Ｂ１Ｄ２による処理についてシミュレーションされたＡＤＲｒ細胞において、それぞれｐＥｒｂＢ３およびｐＡＫＴの阻害曲線を示す図１８Ｃおよび１８Ｄに示すように、シミュレーションにおいて、大きな阻害率をもたらした。ＥｒｂＢ１  ＲＮＡｉシミュレーションからの結果は、ＥｒｂＢ１発現がＨ３×Ｂ１Ｄ２にとって負の応答バイオマーカーであることを示唆する。
【０２６２】
要約すると、計算モデルおよび実験データは、インビボにおけるＨ３×Ｂ１Ｄ２に対する応答性の負の調節には、（ｉ）不十分な高さのＥｒｂＢ２レベル、および（ｉｉ）高ＥｒｂＢ１レベルの２つの機構が存在することを示唆する。逆に、高レベルのＥｒｂＢ２発現と低レベルのＥｒｂＢ１発現は、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２に対する応答性の上昇と相関した。
【０２６３】
実施例１２：Ｈ３×Ｂ１Ｄ２を用いた処理に対するインビボ応答性は、計算モデルから予測される応答性と相関する
この実施例において、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２処理に対する腫瘍のインビボ応答が、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２処理に対する応答性の直接的および間接的バイオマーカーを特定する、ＥｒｂＢ経路における様々な構成要素の計算されたレベルと相関した。
【０２６４】
Ｈ３×Ｂ１Ｄ２処理に対する腫瘍のインビボ応答を特徴付けるために、腫瘍細胞株のパネルを、実施例１に記載するような異種移植片モデルで試験した。異種移植片腫瘍モデルにおいて、マウス（ｎｕ／ｎｕマウス：４〜５週齢の雌のマウス、胸腺欠損、裸、非近交背景；白色種素性、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから購入）の脇腹に、皮下注入を介して、２００μｌの５×１０６−２×１０７細胞／マウス（細胞株による）を移植する。初期腫瘍成長のため、マウスをモニタリングする。腫瘍は、平均腫瘍量が約１５０〜２００ｍｍ３になるまで、数日間成長させる。腫瘍量は、Ｖ＝（π／６（Ｌ×Ｗ２）のとして計算される。Ｈ３×Ｂ１Ｄ２抗体を用いて、６００μｇ／注入の用量で、３日ごと（ｑｄ３）にマウスを処理する。対照マウスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または野生型ＨＡＳ（ヒト血清アルブミン）で処理される。腫瘍量は４０〜８０日間測定される。
【０２６５】
以下の１２の腫瘍細胞株を検討した：ＡＣＨＮ、ＡＤＲｒ、ＩＧＲＯＶ１、ＬＳ１８０、ＭＩＡ  ＰａＣａ２、ＺＲ７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＡＤｒＲ−ＨＥＲ２（ＨＥＲ２を過剰発現するために形質移入されたＡＤｒＲ細胞）、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＣＡＬＵ−３、ＳＫＯＶ−３、およびＢＴ４７４−Ｍ３。計算モデルでこれらの細胞株を使用するために、上述の方法またはその多少の変形を使用して、各細胞株のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３発現レベルを実験的に決定し、その結果を以下の表１７に示す。
【０２６６】
（表１７）ＥｒｂＢ受容体レベル
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【０２６７】
インビボ異種移植片実験からの対照および処理データを、以下の式を使用して、指数関数的成長曲線に適合した。
Ｖ＝Ｖｏ＊ｅｘｐ（ｋ＊ｔ）
式中、Ｖは腫瘍量であり、Ｖ０は時間ゼロでの腫瘍量であり、ｋは指数関数的成長率であり、ｔは時間である。腫瘍成長の阻害におけるＨ３×Ｂ１Ｄ２の効力は、試験された各細胞株の処理および対照の指数関数的成長率の比率として表された。この比率は、「相対成長率」（ＲＧＲ）として示され、
ＲＧＲ＝ｋＨ３  ｘ  Ｂ１Ｄ２  ／ｋ対照
として表される。
【０２６８】
１の相対成長速度（ＲＧＲ）は、薬剤が効果を持たないことを意味した。０のＲＧＲは、薬剤が腫瘍の成長を完全に停止させたことを意味した。負のＲＧＲは、薬剤が腫瘍の退縮をもたらしたことを意味した。
【０２６９】
検討された１２の細胞株のうち、ＢＴ４７４−Ｍ３のみが負のＲＧＲであった（すなわち、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２は、この細胞株においてのみ腫瘍の退縮をもたらした）。ＩＧＲＯＶ１およびＬＳ１８０の２つの細胞株は、１を超えるＲＧＲ値であり、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２がこれらの細胞株の腫瘍成長に効果がなかったことを示唆する。残りの９つの細胞株は、０から１の間のＲＧＲ値であり、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２がこれらの細胞株の腫瘍成長を部分的に阻害したことを示唆する。
【０２７０】
各細胞株中のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３の測定されたレベルに基づき、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２阻害剤の不在下の細胞株中のＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマーおよびＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのモデル計算されたレベルに対して、１２の細胞株のＲＧＲ値をプロットした。図１９Ａ〜Ｃに結果を図示するが、これは、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２の不在下の腫瘍細胞のパネルにおける、ＥｒｂＢ２モノマー（図１９Ａ）、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマー（図１９Ｂ）、およびＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー（図１９Ｃ）の計算されたレベルに対してプロットされた、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２を用いて処理された異種移植片モデルにおける腫瘍細胞のパネルのインビボで決定された相対成長率（ＲＧＲ）のグラフを示す。
【０２７１】
図１９の結果は、ＲＧＲとＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマー、およびＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの計算されたレベルとの間に線形関係があることを示す。この観察を考慮すると、ＥｒｂＢ２モノマー、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマーおよび／またはＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの直接的測定は、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２応答性の直接的バイオマーカーとして使用され得る。さらに、腫瘍試料におけるＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３の測定は、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマーおよび／またはＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルを計算して、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２処理に対する腫瘍応答性」を分類するために使用され得る（すなわち、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３の測定されたレベルは、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２応答性の間接的バイオマーカーとして使用され得、それらは、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマーおよび／またはＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのレベルを計算するために使用される）。したがって、例えば、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ホモダイマーおよび／またはＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの計算されたレベルは、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２処理に対する応答性が予測され得る、ネットワーク活性化状態（ＮＡＳ）値として使用され得る。
【０２７２】
１２の細胞株のＲＧＲ値も、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２阻害剤のシミュレーションされた不在下および存在下の細胞株におけるＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ２ヘテロダイマーおよびＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの計算された相対レベル（例えば、比率）に対してプロットされた。より低い相対レベルは、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２が、その種のヘテロダイマーの形成をより強力に阻害することができることを示唆する。結果を図２０Ａ〜Ｂに図示するが、これは、シミュレーションされたＨ３×Ｂ１Ｄ２の不在下のヘテロダイマーのシミュレーションされたレベルと比較した、シミュレーションされたＨ３×Ｂ１Ｄ２の存在下の腫瘍細胞のパネルにおいて、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー（図２０Ａ）および  ＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー（図２０Ｂ）の計算された相対レベルに対してプロットされた、Ｈ３×Ｂ１Ｄ２を用いて処理された異種移植片モデルにおける腫瘍細胞のパネルについてインビボで決定された相対成長率（ＲＧＲ）のグラフを示す。
【０２７３】
図２０の結果は、阻害剤がＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーを妨害する能力と腫瘍の相対成長率との間の相関を示す。つまり、計算されたＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの相対レベルが、シミュレーションされたＨ３×Ｂ１Ｄ２阻害剤の存在下で低い（すなわち、阻害剤によるヘテロダイマー妨害が高い）腫瘍細胞（例えば、ＢＴ４７４−Ｍ３細胞）は、低いＲＧＲ値を示す（腫瘍成長への阻害剤の大きな効果を示唆する）。逆に、計算されたＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの相対レベルが、シミュレーションされたＨ３×Ｂ１Ｄ２阻害剤の存在下で高い（すなわち、阻害剤によるヘテロダイマー妨害が低い）腫瘍細胞（例えば、ＡＣＨＮ細胞）は、高いＲＧＲ値を示す（腫瘍成長への阻害剤の効果が小さいことを示唆する）。これらの結果は、シミュレーションされた治療薬の不在下と比較した、シグナル伝達経路の計算モデルにおける治療薬の存在下のシミュレーションは、ＮＩＳが治療薬に対する腫瘍細胞のインビボの応答の予測因子として使用され得る、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ１：ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーの相対レベルに基づく、ネットワーク阻害状態（ＮＩＳ）の生成を可能にすることを示す。
【０２７４】
実施例１３：結合親和性（ＫＤ）の測定
抗ＥｒｂＢ抗体の解離定数は、表面プラスモン共鳴法および細胞結合実験のいずれか、またはその両方の２つの独立した技法を使用して測定され得る。
【０２７５】
表面プラスモン共鳴法
表面プラスモン共鳴法は、Ｗａｓｓａｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５１：２４１−２５３．に記載されるように実施される。好適な実施形態は、検体として組み換えＥｒｂＢタンパク質、およびリガンドとして抗ＥｒｂＢ抗体を使用するＢＩＡＣＯＲＥ３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する。ＫＤ値は、方程式ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａに基づき計算される。
【０２７６】
細胞結合実験
細胞結合実験は、ＥｒｂＢ１結合にはＡ−４３１細胞、ＥｒｂＢ２結合にはＺＲ−７５−１細胞、またはＥｒｂＢ３結合にはＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞（全てＡＴＣＣから購入）を使用して実施される。実験は、実質的に、以下にように実施される。
【０２７７】
細胞は、室温で５分間、２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ＋２ｍＬ  ＲＭＰＩ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて切り離される。完全ＲＰＭＩ（１０ｍＬ）を直ちにトリプシン処理された細胞に添加し、軽く再懸濁し、５分間、１１００ｒｐｍで、ベックマン卓上型遠心分離機で遠心沈降させる。１ｍｌ当り２×１０６細胞の濃度で、ＢＤ染色緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に細胞を再懸濁し、５０μｌ（１×１０５細胞）のアリコートを９６ウェルタイタープレートに平板培養する。
【０２７８】
２００ｎＭの抗ＥｒｂＢ抗体含有ＢＤ染色緩衝液の１５０μｌ溶液を調製し、７５μｌＢＤ染色緩衝液に２倍系列希釈する。希釈された抗体の濃度は、２００ｎＭ〜０．４ｎＭの範囲であった。その後、異なるタンパク質希釈液の５０μｌアリコートを、直接５０μｌ細胞懸濁液に添加し、抗体の１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２ｎＭ、６ｎＭ、３ｎＭ、１．５ｎＭ、０．８ｎＭ、０．４ｎＭ、および０．２ｎＭの最終濃度を得る。
【０２７９】
９６ウェルプレートに小分けされた細胞を、プラットフォーム式振盪器上で、室温で３０分間、タンパク質希釈液と共にインキュベートし、３００μｌのＢＤ染色緩衝液で３回洗浄する。その後、細胞を、プラットフォーム式振盪器上で、低温室で４５分間、１００μｌの二次抗体（例えば、１：７５０希釈のアレキサン６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ含有ＢＤ染色緩衝液）と共にインキュベートする。最後に、細胞を２回洗浄し、ペレット化し、２５０μｌのＢＤ染色緩衝液および０．５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムに再懸濁する。ＦＬ４チャネルを使用して、１０，０００個の細胞の分析をＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで行う。ＭＦＩ値および対応する抗ＥｒｂＢ抗体の濃度を、それぞれｙ軸およびｘ軸にプロットする。非線形回帰曲線の一部位結合モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して分子のＫＤを決定する。
【０２８０】
ＫＤ値は、方程式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／ＫＤ＋Ｘ（Ｂｍａｘ＝飽和での蛍光。Ｘ＝抗体濃度。Ｙ＝結合の程度）に基づき計算される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2012500008.tif 000060
2012500008.tif 000061
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