(57)【要約】  本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質(「CHIPS」)の生物活性を有するポリペプチド、またはCHIPSの生物活性を有するそのフラグメントもしくはバリアントであって、該フラグメントまたはバリアントが、配列番号1の野生型CHIPSタンパク質に対してK40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111Kおよび/またはG112Aのアミノ酸置換を保持するポリペプチドを提供する。ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列からなる。本発明の関連する態様は、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物を、それを作製する方法および使用する方法とともに提供する。
2012514465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質(「CHIPS」)の生物活性を有するポリペプチド、またはCHIPSの生物活性を有するそのフラグメントもしくはバリアントであって、バリアントが、配列番号1の野生型CHIPSタンパク質に対してK40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111Kおよび/またはG112Aのアミノ酸置換を保持するポリペプチド。
【請求項２】
C5aにより誘導される好中球の活性化を阻害できる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
C5aにより誘導される好中球の活性化を少なくとも10%、例えば少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%および好ましくは100%阻害できる、請求項1または2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドの生物活性が、配列番号1によるポリペプチドの生物活性より大きい、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが、500アミノ酸長未満、例えば400、300、200、150、140、130、125、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、95、90、85、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、65、60、55、50、40、30以下のアミノ酸長未満である、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
70〜110アミノ酸長、例えば75〜90アミノ酸長である、請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項７】
83アミノ酸長である、請求項6に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号2のアミノ酸配列のフラグメントもしくはそのバリアントを含むかまたはそれからなる、請求項1から7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号2のアミノ酸配列の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81または82の隣接アミノ酸を含む、請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号2のアミノ酸配列のNおよび/もしくはC末端ならびに/または内部に挿入された1または複数のさらなるアミノ酸を含むかあるいはそれからなる、請求項1から9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15または20のさらなるアミノ酸を含むかまたはそれからなる、請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号2のアミノ酸配列のバリアントもしくはそのフラグメントからなる、請求項1から11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
バリアントが、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性、より好ましくは前記配列と少なくとも70%もしくは80%もしくは85%もしくは90%の同一性、最も好ましくは前記アミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
バリアントが、1または複数のアミノ酸が保存的に置換された配列番号2のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項12または13に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
1または複数の表面エピトープが改変された配列番号2によるポリペプチドのバリアントである、請求項12から14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号1によるポリペプチドよりもヒトにおいて免疫原性が低い、請求項1から15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
以下の特性の1または複数:
(a)1nM未満、好ましくは0.5nM以下の好中球遊走(走化性)の阻害についてのIC50(実施例を参照されたい);
(b)野生型CHIPSについてのものの2%以下の血清IgG力価(実施例を参照されたい);
(c)野生型CHIPSのものの4倍未満のC5aR遮断についてのIC50(実施例を参照されたい);
(d)50℃より高い、好ましくは60℃より高い融解温度Tm(実施例を参照されたい)
を示す、請求項1から16のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号2のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1から17のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
N末端メチオニンを有する配列番号2によるポリペプチドからなる、請求項1から18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項1から19のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２１】
核酸分子が、DNA分子である、請求項20に記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項19または20に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２３】
発現ベクターである、請求項22に記載のベクター。
【請求項２４】
pET系のベクターおよびpRSETからなる群より選択される、請求項22または23に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項20もしくは21に記載の核酸分子または請求項22から24のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項20もしくは21に記載の核酸分子または請求項22から24のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞の集団を、ポリペプチドが発現される条件下で培養するステップと、そこからポリペプチドを単離するステップとを含む、請求項1から19のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成するための方法。
【請求項２７】
請求項1から19のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２８】
医薬で用いるための請求項1から19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
補体5a(C5a)の生物活性の阻害において用いるための請求項1から19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
C5a受容体の機能の阻害において用いるための請求項29に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
C5a受容体が、好中球、単球および/または内皮細胞上にある、請求項30に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
補体5a(C5a)により誘導される好中球の活性化の阻害において用いるための請求項29から31のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
炎症の治療において用いるための請求項29から32のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
急性反応性関節炎、急性移植拒絶、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、アルコール性肝炎、同種移植、アルツハイマー病、動脈硬化症、アルサス反応、喘息、アテローム動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、細菌性髄膜炎、気管支原性肺癌、水泡性類天疱瘡、熱傷、心肺バイパス、循環器疾患、慢性気管支炎、慢性リンパ性白血病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、接触性皮膚炎、クローン病、皮膚T細胞リンパ腫、嚢胞性線維症、皮膚疾患、中枢神経系の疾患、子宮内膜症、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、実験的アレルギー性神経炎(EAN)、凍傷、胃癌、胃腸疾患、泌尿生殖器疾患、痛風、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、血液透析、遺伝性血管浮腫、過敏性肺炎、特発性肺線維症、免疫複合体(IC)誘導血管炎、虚血性ショック、虚血性再灌流エピソード、虚血性再灌流傷害、関節症、(大)血管手術、金属熱、多発性硬化症、多系統臓器不全、重症筋無力症、心筋梗塞、膵炎、腹膜炎、胸膜肺気腫、心肺バイパス後(CPB)炎症、乾癬、反復性緊張外傷(RSI)、呼吸器疾患、関節リウマチ、敗血症、敗血症性ショック、副鼻腔炎、皮膚病、脳卒中、全身性エリテマトーデス(SLE)、移植、(外傷性)脳損傷、潰瘍性大腸炎、尿路感染症、血管漏出症候群、血管炎および異種移植からなる群より選択される疾患または状態の治療において用いるための請求項29から33のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
再灌流傷害の治療において用いるための請求項34に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
再灌流傷害が、急性心筋梗塞(AMI)、冠動脈バイパス移植(CABG)、脳卒中および/または臓器移植に付随する、請求項35に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の治療において用いるための請求項34に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
以下の
(a)配列番号2によるポリペプチドをコードする1または複数の親のポリヌクレオチド分子を準備するステップと、
(b)1または複数の親のポリヌクレオチド分子をヌクレアーゼで消化して、ポリヌクレオチドフラグメントを作製するステップと、
(c)ステップ(b)で作製された前記ポリヌクレオチドフラグメントを互いに接触させるステップと、
(d)互いにアニールするフラグメントを増幅させて、1または複数の親のポリヌクレオチド分子によりコードされるものと比較して変更されたアミノ酸配列を有するバリアントCHIPSポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を作製するステップと
を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成するための方法。
【請求項３９】
ステップ(d)において生成された少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を発現させ、野生型CHIPSタンパク質の生物活性について、得られたポリペプチドをスクリーニングするステップ(e)をさらに含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
野生型CHIPSタンパク質の生物活性が、C5aにより誘導される好中球の活性化を阻害する能力である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号1によるポリペプチドと比べて低減した免疫原性について、得られたポリペプチドをスクリーニングするステップ(f)をさらに含む、請求項38から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ(a)における1または複数の親のポリヌクレオチド分子が、1本鎖である、請求項38から41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ(b)におけるヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである、請求項41または42に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ(d)が、予め規定された変動性のオリゴヌクレオチドを加えるステップを含む、請求項38から43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ(e)が、C5aRと結合する能力について、得られたポリペプチドを試験するステップを含む、請求項39から44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
明細書を参照して本出願中に実質的に記載されるポリペプチド。
【請求項４７】
明細書を参照して本出願中に実質的に記載される核酸分子。
【請求項４８】
明細書を参照して本出願中に実質的に記載されるベクター。
【請求項４９】
明細書を参照して本出願中に実質的に記載される宿主細胞。
【請求項５０】
明細書を参照して本出願中に実質的に記載されるポリペプチドを生成するための方法。
【請求項５１】
明細書を参照して本出願中に実質的に記載される医薬組成物。
【請求項５２】
明細書を参照して本出願中に実質的に記載されるポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なポリペプチドと、補体C5a受容体および/またはホルミル化ペプチド受容体の活性化に関連する状態ならびに疾患の治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の走化性阻害タンパク質(「CHIPS」)のバリアント形態と、急性および慢性の炎症性障害の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は、多様な疾患の原因である一般的なヒト病原体である。黄色ブドウ球菌が疾患を引き起こす機構は、多因子性である。毒素性ショック症候群の原因である毒素性ショック症候群毒素(TSST-1)またはエンテロトキシンのような特定の毒素により引き起こされるいくつかのブドウ球菌疾患を除いては、黄色ブドウ球菌感染の病原性は、単独の因子に依存しない。黄色ブドウ球菌は、疾患を引き起こすための非常に多様で異なる「ツール」を保有する。一緒に作用するこれらの異なる因子の複合体全体が、宿主でのコロニー形成、成長および伝播を促進する。貪食細胞によるブドウ球菌の貪食および殺滅は、最も重要な宿主防御機構である。貪食細胞は、感染菌により放出されるサイトカインおよびケモカイン(ホルミル化ペプチドのような)により、そして補体系のような炎症カスケードの活性化により感染部位に誘引される。これらの化学誘引物質の放出は勾配を創出し、これにより貪食細胞は炎症部位に誘引される。
【０００３】
成長中の黄色ブドウ球菌の上清と貪食細胞との相互作用は、Veldkampらにより研究された。彼らは、ブドウ球菌の上清は貪食細胞を刺激できたが、モノクローナル抗体により検出されるように、補体C5a受容体(C5aR)およびホルミル化ペプチド受容体(FPR)の発現を特異的に下方制御し得る因子も存在したことを見出した(Veldkampら、2000、Infect Immun 68(10):5908〜13頁;Veldkampら、1997、Inflammation 21(5):541〜51頁を参照されたい)。黄色ブドウ球菌の上清から、彼らは、この作用を担う14.1kDaのタンパク質を単離した。このタンパク質は、黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質、CHIPSと命名された。CHIPSは、C5aおよびfMLPでの好中球の走化性と活性化とを阻害できる。さらに、CHIPSは、非常に選択的であることが見出された。なぜなら、これは、FPR様1、C3aR、IL-8RAおよびIL-8RB、LTB4受容体ならびにPAF受容体のような好中球上に存在するその他の化学誘引物質受容体を含むその他の受容体の広い選択範囲に影響しなかったからである。このことは、CHIPSが、Gタンパク質共役型受容体ファミリーの2つのメンバーであるC5aRとFPRを特異的に阻害することを示す。CHIPSは、細胞にとって毒性でなく、単球および肥満細胞のようなその他の細胞上のC5aRも阻害する。
【０００４】
Postmaらは、CHIPSが、エネルギー非依存性の様式でC5aRおよびFPRの両方と直接結合することを示した。さらに、CHIPSは、その受容体と結合することにより内部移行されない。CHIPSは、両方の受容体と、C5aRおよびFPRについてそれぞれ1.1および35.4nMの見かけのKd値で結合する(Postmaら、2004、J Immunol 172(11):6994〜7001頁を参照されたい)。これらのKd値は、それらの天然リガンドについて記載されたものと同じ範囲にある(Van Eppsら、1993、J Immunol 150(1):246〜252頁;Falkら、1982、Infect Immun 36(2):450〜454頁;HueyおよびHugli、1985、Immunol. 135(3):2063〜8頁;Pikeら、1980、J Exp Med 152(1):31〜40頁を参照されたい)。ホルミル化ペプチド受容体およびC5a受容体と結合するためのCHIPS中の活性部位は、CHIPS分子の異なる領域内にある。N末端およびC末端の端と、特に1番目および3番目のアミノ酸とが、ホルミル化ペプチド受容体に対するCHIPS活性に関与する(Haasら、2004、J Immunol 173(9):5704〜11頁を参照されたい)。少なくとも最初の30のN末端アミノ酸は、CHIPS結合およびC5aRの遮断に役割を有さない。よって、最初の30アミノ酸を有さないCHIPSタンパク質であるCHIPS31〜121は、C5aR遮断活性の完全な保存を示すが、FPRに対する活性を完全に喪失する(Haasら、2005、J Mol Biol 353(4):859〜872頁を参照されたい)。
【０００５】
近年になって、宿主防御の次に、FPRおよびC5aRのようなケモカイン受容体も、多様なその他の炎症プロセスに関与することが明らかになっている。FPRについての多様な新規で宿主由来のアゴニストが最近同定されたことにより、疾患プロセスにおけるFPRの機能的重要性の範囲が広がった(Leら、2002、Trends Immunol 23(11):541〜8頁を参照されたい)。敗血症、虚血再灌流傷害、関節リウマチ、喘息および免疫複合体病を含む広範囲の種々の疾患プロセスにおけるC5aRの明確な役割について、多くの研究が行われた。動物モデルを用いる種々の実験的研究が、これらの疾患プロセスにおいてC5aRを標的にすることの有益な効果を証明した(Guoら、2004、Shock 21(1):1〜7頁;Huber-Langら、2001、J Immunol 166(2):1193〜1199頁;Hellerら、1999、J Immunol 163(2):985〜94頁を参照されたい)。FPRおよびC5aRを特異的に阻害するCHIPSの独特の特性により、このタンパク質は、FPRまたはC5aRの刺激が重要な役割を有するこれらの疾患における見込みのある候補抗炎症薬となる。
【０００６】
単離されたヒトおよびマウスの好中球を用いる実験は、マウスC5aRについてのCHIPSの活性が、ヒト受容体についてよりも少なくとも30倍低いことを示す。マウス細胞と比較してヒト細胞に対する活性のこの30倍の違いにより示されるCHIPSのヒト特異性は、CHIPSをマウス感染モデルまたはその他の動物モデルで試験することを妨げる。
【０００７】
黄色ブドウ球菌は、ヒト皮膚の通常の共生菌であり、黄色ブドウ球菌を原因とする軽度の皮膚または創傷感染は、通常、自己制御式である。黄色ブドウ球菌は、体のいずれの組織にも感染できる可能性があり、感染の原発部位から時折広がって、骨髄炎、心内膜炎、肺炎および敗血症のような重篤な疾患を引き起こす。CHIPS遺伝子は、臨床的黄色ブドウ球菌株および健常な保菌者からの株の大部分に存在し、CHIPSは、マウス感染モデルを用いて、de Haasらにより記載されるようにin vivoで生成される(Haasら、2004、J Exp Med 199(5):687〜95頁を参照されたい)。黄色ブドウ球菌は、非常に一般的な細菌であるので、ほとんどの個体が黄色ブドウ球菌およびCHIPSタンパク質に生涯の初期に遭遇して、抗CHIPS抗体の生成を導いているとみられる。
【０００８】
野生型CHIPSタンパク質のアミノ酸配列を、以下に示す(この中で、アミノ酸番号31〜113に下線を付す):
FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKESFKNSGLPTTLGKLDERLRNYLKKGTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYLNTPLAEDRKNVELLGKMYKTYFFKKGESKSSYVINGPGKTNEYAY
配列番号1
【０００９】
野生型CHIPSタンパク質のアミノ酸配列は、データベース受入番号AAQ14339、CAG41022およびYP_041409でも開示されている。
【００１０】
野生型CHIPSタンパク質の種々のフラグメント、バリアントおよび誘導体ならびにそれらの使用は、EP1095059A、EP1244790A、PCT/EP2005/004156およびPCT/EP2007/001443(これらの開示は、本明細書に参照により組み込まれる)に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】EP1095059A
【特許文献２】EP1244790A
【特許文献３】PCT/EP2005/004156
【特許文献４】PCT/EP2007/001443
【特許文献５】米国特許第4,440,859号
【特許文献６】米国特許第4,530,901号
【特許文献７】米国特許第4,582,800号
【特許文献８】米国特許第4,677,063号
【特許文献９】米国特許第4,678,751号
【特許文献１０】米国特許第4,704,362号
【特許文献１１】米国特許第4,710,463号
【特許文献１２】米国特許第4,757,006号
【特許文献１３】米国特許第4,766,075号
【特許文献１４】米国特許第4,810,648号
【特許文献１５】米国特許第4,485,045号
【特許文献１６】米国特許第4,544,545号
【特許文献１７】米国特許第6,139,869号
【特許文献１８】米国特許第6,027,726号
【特許文献１９】WO 98/58080
【特許文献２０】WO 02/48351
【特許文献２１】WO 03/97834
【特許文献２２】米国特許第5,874,219号
【特許文献２３】欧州特許第1341909号
【特許文献２４】欧州特許第1504098号
【特許文献２５】欧州特許第1226528号
【非特許文献】
【００１２】
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【非特許文献４５】Schellekens、2003、Nephrol Dial Transplant 18:1257頁
【非特許文献４６】Van Walleら、2007、Expert opinion on biological therapy 7:405頁
【非特許文献４７】「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」(NIH公示85-23、1985年改訂)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、有利な特性を示す野生型CHIPSタンパク質の新規変異バージョンに基づく新しい治療剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第1の態様は、配列番号2のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質(「CHIPS」)の生物活性を有するポリペプチド、またはCHIPSの生物活性を有するそのフラグメントもしくはバリアントであって、該フラグメントまたはバリアントが、配列番号1の野生型CHIPSタンパク質に対してK40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111Kおよび/またはG112Aのアミノ酸置換を保持するポリペプチドを提供する。
NSGLPTTLGELVERLRNYLKKGTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYLHTPLAEDRKNVELLGKMYKTYFFRKGESRSSYVIKAP
配列番号2
【００１５】
配列番号2が、以下のアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸31〜113に相当することが認識される;K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111KおよびG112A(配列番号2における太字で下線を付したアミノ酸を参照されたい)。
【００１６】
配列番号2のポリペプチドが、N末端メチオニン(配列番号2に示さず)とともにまたはそれなしで発現できることがさらに認識される。本明細書における配列番号2のポリペプチドについての全ての言及は、このように解釈される。
【００１７】
疑問を回避するために、そうでないと記載しない限り、本明細書におけるCHIPSタンパク質フラグメント、バリアントまたは誘導体などに関する全てのアミノ酸の番号付けは、野生型CHIPSタンパク質(すなわち配列番号1)に対してである。例えば、配列番号1に対する置換K40Eは、配列番号2の10番目のアミノ酸におけるリジンからグルタミン酸への置換に相当する(なぜなら、配列番号2は、配列番号1の最初の30アミノ酸を含まないからである)。
【００１８】
本発明の第1の態様は、CHIPSの生物活性を有する配列番号2のフラグメントおよびバリアントであって、該バリアントが、配列番号1の野生型CHIPSタンパク質に対してK40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111Kおよび/またはG112Aのアミノ酸置換を保持するフラグメントおよびバリアントを包含する。この文脈における「保持する」により、我々は、バリアントが、配列番号1の40位、42位、77位、100位、105位、111位および/または112位に相当するアミノ酸を含む場合、そのアミノ酸がそれぞれグルタミン酸、バリン、ヒスチジン、アルギニン、アルギニン、リジンおよび/またはアラニンであることを意味する。例えば、ポリペプチドが配列番号2のC末端の52アミノ酸のバリアントである場合、これは、配列番号1の77位に相当するアミノ酸にてヒスチジン、配列番号1の100位に相当するアミノ酸にてアルギニン、配列番号1の105位に相当するアミノ酸にてアルギニン、配列番号1の111位に相当するアミノ酸にてリジン、そして配列番号1の77位に相当するアミノ酸にてアラニンを含有する。しかし、この例示的なバリアントは、配列番号2のアミノ酸1〜51を欠くので、配列番号1の40位または42位に相当するアミノ酸を含有しない。
【００１９】
配列番号2により規定されるポリペプチドは、83アミノ酸を含有する。しかし、本発明のポリペプチドの長さがより長いかまたはより短いくなり得ることが、当業者により認識される。例えば、ポリペプチドは、83よりも多くもしくは少ないアミノ酸を含むかまたはそれからなってよいか、あるいはちょうど83アミノ酸を含むかまたはそれからなってよい。好ましくは、ポリペプチドは、500アミノ酸長未満であり、例えば400、300、200、150、140、130、125、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、95、90、85、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、65、60、55、50、40、30以下のアミノ酸長未満である。
【００２０】
例えば、ポリペプチドは、70〜110アミノ酸長、例えば75〜90アミノ酸長、例えば75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89または90アミノ酸であり得る。ある実施形態において、ポリペプチドは、83アミノ酸長である。
【００２１】
よって、本発明の第1の態様のある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列のフラグメントもしくはそのバリアントを含むかまたはそれからなる。
【００２２】
「フラグメント」により、我々は、配列番号2のアミノ酸配列の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81または82の隣接アミノ酸を含む。
【００２３】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列のNおよび/もしくはC末端または内部に挿入された1または複数のさらなるアミノ酸を含むかあるいはそれからなる。例えば、ポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15または20のさらなるアミノ酸を含むかまたはそれからなってよい。有利には、さらなるアミノ酸は、配列番号2のアミノ酸のC末端にある。
【００２４】
本発明の第1の態様のまださらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列のバリアントもしくはそのフラグメントを含むかまたはそれからなる。
【００２５】
「バリアント」により、我々は、ポリペプチドが、配列番号2と100%のアミノ酸配列同一性を有さず、すなわち配列番号2の1または複数のアミノ酸が改変されていなければならないことを意味する。例えば、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性、より好ましくは上記の配列と少なくとも70%または80%または85%または90%の同一性、最も好ましくは上記のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００２６】
パーセント同一性は、当該技術において公知の方法により、例えば、パラメータとしてグローパルアラインメントオプション、スコア行列BLOSUM62、開始ギャップペナルティ-14、伸長ギャップペナルティ-4を用いる、Expasy設備サイト
(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)
でのLALIGNプログラム(HuangおよびMiller、Adv. Appl. Math. (1991) 12:337〜357頁)を用いて決定できる。
【００２７】
代わりに、2つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、適切なコンピュータプログラム、例えばWisconsin大学Genetic Computing GroupのGAPプログラムを用いて決定してよく、パーセント同一性が、その配列を最適に整列させたポリペプチドとの関連において算出されることが認識される。
【００２８】
「改変される」により、我々は、明記する位置のアミノ酸が、配列番号2によるポリペプチドにおけるアミノ酸と比較して変更されることを意味する。例えば、明記する位置のアミノ酸は、非天然であるか、欠失されているかもしくは置換されていてよいか、または1もしくは複数のアミノ酸の挿入/付加の部位であってよい。置換は、保存的または非保存的であり得ることが当業者により認識される。
【００２９】
ある実施形態において、バリアントは、1または複数のアミノ酸が保存的に置換された配列番号2のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むかまたはそれからなる。「保存的に置換される」により、我々は、同様の特性(サイズ、疎水性など)を有する別のアミノ酸で、あるアミノ酸を、ポリペプチドの機能が著しく変更されないように置換することを意味する。よって、「保存的置換」は、Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;およびPhe、Tyrのような組み合わせを意図する。
【００３０】
さらなる実施形態において、バリアントは、ポリペプチド表面に露出した1または複数のアミノ酸での改変を含む。表面露出アミノ酸は、当該技術において公知の技術を用いて決定してよい(実施例Bを参照されたい)。しかし、非露出アミノ酸の改変も、バリアントポリペプチドの表面での構造変化(野生型CHIPSタンパク質または配列番号2によるポリペプチドに対して)をもたらし得ることが認識される。
【００３１】
アミノ酸分子は、その他の方法、例えば化学改変により改変してもよいことが当業者により認識される。よって、本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変ペプチド結合、例えばペプチドエステルにより互いに連結されたアミノ酸で構成され、20の遺伝子によりコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有してよい。例えば、ポリペプチドは、L-アミノ酸および/またはD-アミノ酸、ならびにヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、O-ホスホセリンおよびO-ホスホチロシンのような改変アミノ酸を含有してよい。ポリペプチドは、翻訳後改変のような天然のプロセス、または当該技術において公知の化学改変技術により改変されてよい。改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含む、バリアントCHIPSポリペプチドのアミノ酸配列内の任意の場所で生じることができる。
【００３２】
ある実施形態において、しかし、本発明のポリペプチドは、天然L-アミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【００３３】
既知のポリペプチドの改変またはバリアントの形態は、当該技術において公知の技術を用いて生成できる(本明細書に参照により組み込まれるSambrookおよびRussell、2000、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor、New Yorkを参照されたい)。例えば、点突然変異を、特定のアミノ酸残基に、部位特異的突然変異誘発により導入してよい(SambrookおよびRussell、既出、第13章を参照されたい)。親のポリヌクレオチドのバリアントを作製するためのさらなる方法は、以下に記載する。
【００３４】
本明細書で用いる場合、CHIPSに関する「生物活性」とは、生存生物、組織または細胞に対する野生型CHIPSタンパク質の影響のことをいう。天然の1または複数のリガンドと結合すること、およびそれによる下流の事象、生存生物に対して直接的または間接的な影響を引き起こすことが本明細書において含まれるが、これらに限定されない。よって、CHIPSタンパク質の「生物活性」により、我々は、補体成分C5aおよび/またはN-ホルミルペプチド、fMLPにより誘導される好中球の走化性および/または活性化の阻害を含む。例えば、維持される活性は、C5a受容体(C5aR)の拮抗作用および/またはホルミル化ペプチド受容体(FPR)の拮抗作用を含み得る。
【００３５】
ある実施形態において、しかし、本発明のバリアントCHIPSポリペプチドは、FPR結合部位を欠く(例えば、ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜30を欠く)。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、in vivoでCHIPSタンパク質の1または複数の生物活性を示す。
【００３７】
野生型CHIPSタンパク質およびそのバリアントの生物活性および結合特性を決定するためのアッセイは、当該技術において公知である(実施例を参照されたい)。
【００３８】
もちろん、本発明の第1の態様のポリペプチドが、野生型CHIPSタンパク質により示されるレベルよりも低いか、それと同じかまたはそれより高いレベルで生物活性を示し得ることが当業者により認識される。好ましくは、本発明のポリペプチドは、野生型CHIPSタンパク質により示されるレベルの少なくとも10%のレベルで生物活性を示し、例えば少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%またはそれより高い。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、野生型CHIPSタンパク質により示される生物活性と比較して同じレベルまたはそれより高い生物活性を示す。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、野生型CHIPSタンパク質より高いレベルで生物活性を示す(すなわち、より活性である)。例えば、本発明のポリペプチドは、野生型CHIPSタンパク質により示されるレベルの少なくとも110%のレベルで生物活性を示してよく、例えば少なくとも120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、500%またはそれより高い。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、野生型CHIPSタンパク質により示される対応する活性と同等またはそれより高いC5aRおよび/またはFRPについての特異的結合活性を有する。
【００４０】
よって、本発明のポリペプチドは、CHIPSタンパク質の生物活性だけを示し、すなわち、ポリペプチドの活性は選択的である。例えば、本発明のポリペプチドは、補体成分C5aおよび/またはN-ホルミルペプチド、fMLPにより選択的に誘導される好中球の走化性および/または活性化を阻害し得る。「選択的」により、我々は、ポリペプチドが上記の生物活性を、該ポリペプチドが細胞内でその他のタンパク質の活性を調節するよりも大きい程度に阻害することを意味する。よって、ポリペプチドは、好ましくは、野生型CHIPSタンパク質の生物活性だけを阻害するが、細胞内のその他のタンパク質の発現および活性は、選択的阻害の下流の結果として変化し得ることが認識される。よって、我々は、細胞プロセスに対して非特異的影響を有する作用物質を除外する。
【００４１】
本発明の第1の態様のまださらなる実施形態において、ポリペプチドは、1または複数の表面エピトープが改変された配列番号2によるポリペプチドのバリアントである。このような改変は、直接的(すなわち、エピトープ自体の中のアミノ酸の改変)または間接的(すなわち、エピトープ内にはないが、改変されるとエピトープ内のアミノ酸またはそのようなエピトープの構造の改変を導くアミノ酸の改変)のいずれかであり得る。
【００４２】
「表面エピトープ」により、我々は、CHIPS抗原での攻撃に応答して生成される抗CHIPS抗体および/または黄色ブドウ球菌での攻撃に応答して生成される抗体により認識される野生型CHIPSタンパク質の表面での露出アミノ酸残基の立体構造を意味する。
【００４３】
本発明の第1の態様の具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1によるポリペプチドよりもヒトにおいて免疫原性が低い。
【００４４】
「免疫原性」により、我々は、ホスト生物において免疫応答(すなわち抗ポリペプチド抗体の生成)を誘導するポリペプチドの能力を意味する。好ましくは、ポリペプチドは、ヒトにおいて配列番号1によるポリペプチドよりも免疫原性が低い。
【００４５】
免疫原性は、当該技術において公知の方法により決定してよい。例えば、ウサギまたはその他の動物種(例えばマウス、ラット、モルモット、イヌなど)を本発明のポリペプチドを用いて免疫化し、免疫複合体の形成を決定し得る。理想的には、免疫応答は、種特異的影響を除外するために、いくつかの異なる種で研究する。ヒトにおける可能性のある免疫原性を評価するために適切なある方法は、ヒト抗CHIPS IgGを精製するステップと、このような抗体についてのバリアントポリペプチドの親和性を、例えばELISAを用いて決定するステップとを含む(以下の実施例を参照されたい)。
【００４６】
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、C5aにより誘導される好中球の活性化を阻害できる。このような阻害は、部分的または完全であってよい。よって、C5aにより誘導される好中球の活性化は、本発明のポリペプチドに応答して、ポリペプチドの非存在下での活性化と比較して少なくとも10%、例えば少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%および好ましくは100%阻害され得る。
【００４７】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、以下の特性の1または複数(例えば全て)を示す:
(a)1nM未満、好ましくは0.5nM以下の好中球遊走(走化性)の阻害についてのIC50(実施例を参照されたい);および/または
(b)野生型CHIPSについてのものの2%以下の血清IgG力価(実施例を参照されたい);および/または
(c)野生型CHIPSのものの4倍未満のC5aR遮断についてのIC50(実施例を参照されたい);および/または
(d)50℃より高い、好ましくは60℃より高い融解温度Tm(実施例を参照されたい)。
【００４８】
よって、ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を含む。例えば、ポリペプチドは、さらなるN末端メチオニンを有する配列番号2のアミノ酸配列からなることができる。
【００４９】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2によるアミノ酸配列からなる。
【００５０】
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法により作製してよい(例えば本明細書に参照により組み込まれるSambrookおよびRussell、2000、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor、New Yorkを参照されたい)。
【００５１】
簡単に述べると、核酸分子によりコードされるポリペプチドを適切な宿主中で発現できる核酸分子を含む発現ベクターを構築してよい。
【００５２】
核酸、特にDNAをベクターに、例えば相補的付着末端により機能的に連結するための種々の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマーの区画を、ベクターDNAに挿入するためにDNAセグメントに付加できる。次いで、ベクターとDNAセグメントとを、相補的ホモポリマーテイル間の水素結合により連結して、組換えDNA分子を形成する。
【００５３】
1または複数の制限部位を含有する合成リンカーにより、DNAセグメントをベクターに連結する代替法が行われる。例えばエンドヌクレアーゼ制限消化により作製されるDNAセグメントを、3’-5’-エキソヌクレアーゼ活性を用いて突出3’一本鎖末端を除去する酵素であるバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼまたは大腸菌(E. coli)DNAポリメラーゼIで処理し、くぼんだ3’末端をそれらのポリメラーゼ活性を用いて埋める。
【００５４】
これらの活性の組み合わせは、よって、平滑末端DNAセグメントを生じる。平滑末端セグメントは、次いで、バクテリオファージT4 DNAリガーゼのような平滑末端DNA分子同士のライゲーションを触媒できる酵素の存在下で、大過剰モルのリンカー分子とインキュベートする。よって、この反応の生成物は、それらの末端にポリマーリンカー配列を有するDNAセグメントである。これらのDNAセグメントは、次いで、適切な制限酵素を用いて切断され、DNAセグメントのものと適合する末端を生じる酵素で切断された発現ベクターと連結される。
【００５５】
多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、International Biotechnologies Inc.、New Haven、CN、USAを含むいくつかの供給源から商業的に入手可能である。
【００５６】
本発明のポリペプチドをコードするDNAを改変するための望ましい方法は、PCRを用いることである。この方法は、例えば適切な制限部位に操作することにより、DNAを適切なベクターに導入するために用い得るか、または当該技術において知られるようなその他の有用な方法でDNAを改変するために用い得る。
【００５７】
この方法において、酵素増幅されるDNAは、2つの特異的プライマーで挟まれ、これらのプライマー自体は増幅DNAに組み込まれる。上記の特異的プライマーは、当該技術において既知の方法を用いて発現ベクターにクローニングするために用いることができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有してよい。
【００５８】
次いで、DNA(またはレトロウイルスベクターの場合はRNA)を、適切な宿主において発現させて、本発明の化合物を含むポリペプチドを生成する。よって、ポリペプチドをコードするDNAは、本明細書に含まれる教示の観点で適切に改変された既知の技術に従って用いて発現ベクターを構築でき、これを次いで用いて、本発明の化合物の発現および生成のための適切な宿主細胞を形質転換する。このような技術は、1984年4月3日にRutterらに対して発行された米国特許第4,440,859号、1985年7月23日にWeissmanに対して発行された米国特許第4,530,901号、1986年4月15日にCrowlに対して発行された米国特許第4,582,800号、1987年6月30日にMarkらに対して発行された米国特許第4,677,063号、1987年7月7日にGoeddelに対して発行された米国特許第4,678,751号、1987年11月3日にItakuraらに対して発行された米国特許第4,704,362号、1987年12月1日にMurrayに対して発行された米国特許第4,710,463号、1988年7月12日にToole, Jr.らに対して発行された米国特許第4,757,006号、1988年8月23日にGoeddelらに対して発行された米国特許第4,766,075号、および1989年3月7日にStalkerに対して発行された米国特許第4,810,648号(これらは、本明細書に参照により組み込まれる)に開示されるものを含む。
【００５９】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするDNA(またはレトロウイルスベクターの場合はRNA)は、適切な宿主に導入するための広範な多様性のその他のDNA配列と連結してよい。連れ添うDNAは、宿主の性質、宿主へのDNAの導入様式、およびエピソームでの維持または組み込みのいずれを所望するかに依存する。
【００６０】
一般に、DNAは、プラスミドのような発現ベクターに、適切な方向および発現のための正しい読み取り枠で挿入される。必要であれば、DNAを、所望の宿主により認識される転写および翻訳調節性制御ヌクレオチド配列と連結させ得るが、このような制御は、発現ベクター中で通常、利用可能である。ベクターを、次いで、標準的な技術を用いて宿主に導入する。一般に、全ての宿主がベクターにより形質転換されるわけではない。よって、形質転換宿主細胞について選択することが必要である。ある選択技術は、抗生物質耐性のような形質転換細胞において選択可能な形質をコードするDNA配列を任意の必要な制御要素とともに発現ベクターに組み込むことを含む。代わりに、このような選択可能な形質についての遺伝子は、別のベクター上にあることができ、これを用いて、所望の宿主細胞を同時形質転換する。
【００６１】
本発明の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞は、次いで、十分な時間、本明細書に開示される教示の観点で当業者に知られる適切な条件下で培養してポリペプチドの発現を許容し、該ポリペプチドを次いで回収できる。
【００６２】
細菌(例えば大腸菌および枯草菌(Bacillus subtilis))、酵母(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))、糸状菌(例えばアスペルギルス(Aspergillus))、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む多くの発現系が知られている。
【００６３】
ベクターは、典型的には、ベクターを他の非原核の細胞タイプにおける発現のために用いる場合であっても、原核生物における増殖のためのColE1 oriのような原核レプリコンを含む。ベクターは、大腸菌のような形質転換される細菌宿主細胞における遺伝子の発現(転写および翻訳)を導くことができる原核プロモーターのような適切なプロモーターも含むことができる。
【００６４】
プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を許容するDNA配列により形成される発現制御要素である。例示の細菌宿主に適合するプロモーター配列は、典型的には、本発明のDNAセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含有するプラスミドベクター中で提供される。
【００６５】
典型的な原核ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories(Richmond、CA、USA)から入手可能なpUC18、pUC19、pBR322およびpBR329、ならびにPharmacia、Piscataway、NJ、USAから入手可能なpTrc99AおよびpKK223-3である。特に好ましい原核ベクタープラスミドは、pET系(Novagene)、pRSETおよびpHIP(Invitrogen、California、USA)を含む。
【００６６】
典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia、Piscataway、NJ、USAから入手可能なpSVLである。このベクターは、SV40後期プロモーターを用いて、クローニングされた遺伝子の発現を導き、発現の最高レベルは、COS-1細胞のようなT抗原生成細胞で見出される。
【００６７】
誘導性哺乳類発現ベクターの例は、これもまたPharmaciaから入手可能なpMSGである。このベクターは、マウス乳腺腫瘍ウイルス末端反復配列のグルココルチコイド誘導性プロモーターを用いて、クローニングされた遺伝子の発現を導く。
【００６８】
有用な酵母プラスミドベクターは、pRS403〜406およびpRS413〜416であり、通常、Stratagene Cloning Systems、La Jolla、CA 92037、USAから入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は、酵母組み込みプラスミド(YIp)であり、酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2およびURA3を取り込んでいる。プラスミドpRS413〜416は、酵母セントロメアプラスミド(Ycp)である。
【００６９】
多様な宿主細胞で用いるためのその他のベクターおよび発現系は、当該技術において公知である。
【００７０】
宿主細胞は、原核または真核のいずれかであり得る。細菌細胞は好ましい原核宿主細胞であり、典型的には、例えばBethesda Research Laboratories Inc.、Bethesda、MD、USAから入手可能な大腸菌DH5株、およびRockville、MD、USAのAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手可能なRR1株(第ATCC 31343号)のような大腸菌の株である。好ましい真核宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒトの線維芽株化細胞および腎臓株化細胞のような脊椎動物細胞を含む。酵母宿主細胞は、YPH499、YPH500およびYPH501を含み、これらは通常、Stratagene Cloning Systems、La Jolla、CA 92037、USAから入手可能である。好ましい哺乳類宿主細胞は、ATCCからCRL 1658として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞である293細胞、およびNS0細胞を含む。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入できるSf9細胞である。
【００７１】
本発明のDNA構築物での適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には用いるベクターのタイプに依存する公知の方法により達成される。原核宿主細胞の形質転換に関して、例えばCohenら(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69、2110頁およびSambrookら(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Shermanら(1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。Beggs(1978) Nature 275、104〜109頁の方法も有用である。脊椎動物細胞に関して、このような細胞の形質移入に有用な試薬、例えばリン酸カルシウムおよびDEAE-デキストランまたはリポソーム製剤は、Stratagene Cloning SystemsまたはLife Technologies Inc.、Gaithersburg、MD 20877、USAから入手可能である。
【００７２】
エレクトロポレーションも、細胞の形質転換および/または形質移入のために有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞の形質転換のために当該技術において公知である。
【００７３】
例えば、多くの細菌種を、本明細書に参照により組み込まれるLuchanskyら(1988) Mol. Microbiol. 2、637〜646頁に記載される方法により形質転換してよい。形質転換体の最大数が、25μFDにてcmあたり6250Vを用いる2.5 PEBに懸濁したDNA-細胞混合物のエレクトロポレーションの後に一貫して回収される。
【００７４】
エレクトロポレーションによる酵母の形質転換のための方法は、BeckerおよびGuarente(1990) Methods Enzymol. 194、182頁に開示される。
【００７５】
形質転換が成功した細胞、すなわち本発明のDNA構築物を含有する細胞は、公知の技術により同定できる。例えば、本発明の発現構築物の導入により得られる細胞は、本発明のポリペプチドを生成するように成長させ得る。細胞を採集し、溶解し、それらのDNA含量を、Southern(1975) J. Mol. Biol. 98、503頁またはBerentら(1985) Biotech. 3、208頁により記載されるもののような方法を用いてDNAの存在について調べることができる。代わりに、上清中のタンパク質の存在を、以下に記載する抗体を用いて検出できる。
【００７６】
組換えDNAの存在を直接アッセイすることに加えて、形質転換の成功は、組換えDNAがタンパク質の発現を導くことができる場合に、公知の免疫学的方法により確認できる。例えば、発現ベクターでの形質転換が成功した細胞は、適切な抗原性を示すタンパク質を生成する。
【００７７】
形質転換されたと考えられる細胞の試料を採集し、適切な抗体を用いてタンパク質についてアッセイする。
【００７８】
宿主細胞は、非ヒト動物体内の宿主細胞であってよい。つまり、導入遺伝子の存在により本発明の第1の態様の化合物(またはその結合部分)を発現するトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、マウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック非ヒト動物は、当該技術において公知の方法を用いて作製できる。
【００７９】
宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を単離する方法は、当該技術において公知である。宿主細胞に依存して、生成される本発明の化合物(またはその結合部分)が異なり得ることが認識される。例えば、酵母または細菌細胞のようなある種の宿主細胞は、翻訳後修飾系を有さないかまたは異なる翻訳後修飾系を有し、このことが、異なる方法で翻訳後修飾され得る本発明の化合物(またはその結合部分)の形態の生成をもたらし得る。
【００８０】
本発明の化合物(またはその結合部分)は、哺乳類細胞のような真核生物系において生成されることが好ましい。
【００８１】
好ましさに劣る実施形態によると、本発明の化合物(またはその結合部分)は、ウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽可溶化液(Promegaから入手可能)のような商業的に入手可能なin vitro翻訳系を用いてin vitroで生成できる。好ましくは、翻訳系は、ウサギ網状赤血球可溶化液である。簡便には、翻訳系は、TNT転写-翻訳系(Promega)のように転写系と連結させ得る。この系は、コードするDNAポリヌクレオチドから適切なmRNA転写産物を、翻訳と同じ反応において生成するという利点を有する。
【００８２】
よって、本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様によるポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。ある実施形態において、核酸分子は、DNA分子である。有利には、核酸分子は、本発明のポリペプチドが発現される宿主細胞により認識可能なシグナルペプチドをさらに含む。
【００８３】
本発明の第3の態様は、本発明の第2の態様による核酸分子を含むベクターを提供する。ある実施形態において、ベクターは、発現ベクターである(例えばpET系の任意のベクター、pRSETまたはpHIP)。
【００８４】
本発明の第4の態様は、本発明の第2の態様による核酸分子または本発明の第3の態様によるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００８５】
ある実施形態において、宿主細胞は、大腸菌細胞である。
【００８６】
本発明の第5の態様は、本発明の第2の態様による核酸分子または本発明の第3の態様によるベクターを含む宿主細胞の集団を、ポリペプチドが発現される条件下で培養するステップと、そこからポリペプチドを単離するステップとを含む、本発明の第1の態様によるポリペプチドを生成するための方法を提供する。発現されたポリペプチドを「単離する」により、我々は、細胞細片のような不純物のいくらかまたは全てを培養培地から除去することを含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、実質的に純粋である。
【００８７】
本発明のポリペプチドが、該化合物と医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましいことが、当業者により認識される。よって、本発明の第6の態様は、本発明の第1の態様によるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００８８】
「医薬的に許容され得る」により、製剤が滅菌され、パイロジェンフリーであることを含む。適切な医薬的担体は、製薬技術分野において公知である。担体は、本発明の化合物と適合可能であり、そのレシピエントにとって有害でないという意味において「許容され得る」ものでなければならない。典型的には、担体は、滅菌され、パイロジェンフリーにされる水または食塩水である。しかし、その他の許容され得る担体を用いてよい。よって、「医薬的に許容され得る担体」および「医薬的に許容され得る賦形剤」は、担体としてのみ作用することを意図する、すなわち生物活性自体を有することを意図しない、製剤の一部分を形成するために用いられる任意の化合物を含む。医薬的に許容され得る担体または賦形剤は、一般的に安全で、非毒性であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものでない。本明細書で用いる場合、医薬的に許容され得る担体または賦形剤は、1および1より多いこのような担体または賦形剤の両方を含む。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、用いられる化合物の効力/毒性に依存して種々の濃度で処方され得る。好ましくは、製剤は、本発明の作用物質を、0.1μM〜1mM、より好ましくは1μM〜100μM、5μM〜50μM、10μM〜50μM、20μM〜40μM、そして最も好ましくは約30μMの濃度で含む。in vitroでの使用のために、製剤は、本発明の化合物をより低い濃度、例えば0.0025μM〜1μMで含んでよい。
【００９０】
医薬品および作用物質(すなわちポリペプチド)は、通常、意図する投与経路および標準的な製薬プラクティスに関して選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合して投与されることが当業者により認識される(例えば、本明細書に参照により組み込まれるRemington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995、Alfonso Gennaro編、Mack Publishing Company、Pennsylvania、USAを参照されたい)。
【００９１】
例えば、医薬品および作用物質は、即時、遅延もしくは制御放出用途のための、香料もしくは着色料を含有し得る錠剤、カプセル剤、膣坐剤、エリキシル剤、液剤または懸濁剤の形態で、経口、頬側または舌下投与できる。医薬品および作用物質は、陰茎海綿体内注射により投与してもよい。
【００９２】
このような錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第2リン酸カルシウムおよびグリシンのような賦形剤、デンプン(好ましくはトウモロコシ、バレイショまたはタピオカデンプン)、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複合ケイ酸塩のような崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシ-プロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチンおよびアカシアのような造粒結合剤を含有し得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクのような滑沢剤を含んでよい。
【００９３】
同様のタイプの固体組成物は、ゼラチンカプセル剤の充填物として用いてもよい。この点に関して好ましい賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖(milk sugar)または高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁剤および/またはエリキシル剤について、本発明の化合物は、種々の甘味料もしくは香料、着色性物質もしくは色素、乳化剤および/または懸濁化剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンのような希釈剤、ならびにこれらの組み合わせと組み合わせてよい。
【００９４】
本発明の医薬品および作用物質は、非経口的に、例えば静脈内、関節内、動脈内、腹腔内、くも膜下内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下投与もできるか、またはこれらは、注入技術により投与してよい。これらは、その他の物質、例えば溶液を血液と等張にするために十分な塩またはグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態で最もよく用いられる。水溶液は、必要に応じて、適切に緩衝される(好ましくは3〜9のpHまで)。滅菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に公知の標準的な製薬技術により容易に達成される。
【００９５】
非経口投与に適する製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。製剤は、単位用量または複数回用量容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアル中で提供でき、滅菌液状担体、例えば注射用の水を使用直前に加えることだけを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)条件で貯蔵し得る。即席注射溶液および懸濁液は、上記の種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製し得る。
【００９６】
ヒト患者への経口および非経口投与のために、医薬品および作用物質の1日投与量レベルは、通常、1回の投与または分割された投与で投与される、成人あたり1〜1000mgである(すなわち、約0.015〜15mg/kg)。
【００９７】
医薬品および作用物質は、鼻内または吸入により投与することもでき、乾燥粉末吸入器、または適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロ-メタン、ジクロロテトラフルオロ-エタン、1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA 134A3)もしくは1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA 227EA3)のようなヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素またはその他の適切な気体を用いる加圧容器、ポンプ、スプレーもしくはネブライザーからのエアロソルスプレー提示の形態で簡便に送達される。加圧エアロソルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するバルブを用いることにより決定してよい。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えばエタノールと噴射剤との混合物を溶剤として用い、滑沢剤、例えばソルビタントリオレエートをさらに含有し得る活性化合物の溶液または懸濁液を含有し得る。吸入器または散布器で用いるためのカプセル剤およびカートリッジ(例えばゼラチンからできている)は、本発明の化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含有するように処方してよい。
【００９８】
エアロソルまたは乾燥粉末製剤は、好ましくは、各計量された用量または「ひと吹き」が、患者への送達のための本発明の化合物を少なくとも1mg含有するように手配される。エアロソルを用いる全体的な1日用量は、患者ごとに変動し、1回の投与、またはより一般的には、1日を通して分割された投与で投与され得る。
【００９９】
代わりに、医薬品および作用物質は、坐剤もしくはペッサリーの形態で投与できるか、またはこれらは、ローション剤、液剤、クリーム、軟膏剤もしくは散布剤の形態で局所塗布してよい。本発明の化合物は、例えば皮膚パッチを用いることにより経皮投与してもよい。これらは、目の経路により投与してもよい。
【０１００】
皮膚への局所塗布について、医薬品および作用物質は、例えば以下の1もしくは複数の混合物中に懸濁または溶解された活性化合物を含有する適切な軟膏剤として処方できる:鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水。代わりに、これらは、例えば以下の1もしくは複数の混合物中に懸濁または溶解された適切なローション剤またはクリーム剤として処方できる:鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
【０１０１】
口内の局所投与に適する製剤は、風味づけした基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ;ゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアカシアのような不活性基剤中に活性成分を含む香錠;ならびに適切な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄剤を含む。
【０１０２】
医薬品または作用物質がポリペプチドである場合、マイクロスフェアのような持続放出薬物送達系を用いることが好ましいことがある。これらは、注射の頻度を低減するように特異的に設計されている。このような系の例は、組換えヒト成長ホルモン(rhGH)を、一旦注射されるとrhGHをゆっくりと持続された期間にわたって放出する生分解性マイクロスフェア中に被包するNutropinデポーである。
【０１０３】
持続放出免疫グロブリン組成物も、リポソームに取り込まれた免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンを含有するリポソームは、それ自体知られる方法により調製される。例えば、Epsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688〜92頁(1985);Hwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030〜4頁(1980);米国特許第4,485,045号;米国特許第4,544,545号;米国特許第6,139,869号;および米国特許第6,027,726号を参照されたい。通常は、リポソームは、脂質含量が約30モルパーセント(mol.%)コレステロールより多い(選択される割合は、最適な免疫グロブリン療法によって調整される)、小さい(約200〜約800オングストローム)単層タイプのものである。
【０１０４】
代わりに、ポリペプチド医薬品および作用物質は、薬物を所望の部位に直接放出する外科的に移植されるデバイスにより投与できる。
【０１０５】
エレクトロポレーション療法(EPT)システムも、タンパク質およびポリペプチドの投与のために用いることができる。パルス電界を細胞に送達するデバイスは、薬物に対する細胞膜の透過性を増加させ、細胞内薬物送達の著しい増進をもたらす。
【０１０６】
タンパク質およびポリペプチドは、エレクトロインコーポレーション(electroincorporation)(EI)により送達することもできる。EIは、皮膚の表面上で直径30ミクロンまでの小さい粒子がエレクトロポレーションで用いられるものと同じまたは類似の電気パルスに遭遇する場合に生じる。EIにおいて、これらの粒子は、角質層を通って、皮膚のより深い層へ導かれる。粒子は、薬物もしくは遺伝子を装填するかまたはそれらで被覆できるか、あるいは薬物がそれを通って侵入できる孔を皮膚に作製する「弾丸」として単純に作用できる。
【０１０７】
タンパク質およびポリペプチド送達の代替法は、温度感受性ReGel注射剤である。体温未満では、ReGelは注射可能な液体であるが、体温では、これは、既知の安全な生分解性ポリマーにゆっくりと侵食されて溶解するゲルレザバーを急激に形成する。活性薬物は、バイオポリマーが溶解するにつれて時間とともに送達される。
【０１０８】
タンパク質およびポリペプチドの医薬は、経口送達もできる。あるこのような系は、タンパク質およびポリペプチドを同時送達する体内へのビタミンB12の経口摂取についての天然のプロセスを用いる。ビタミンB12摂取系に載って、タンパク質またはポリペプチドは、腸壁を通って移動できる。ビタミンB12類似体と薬物との複合体が生成され、これは、複合体のビタミンB12部分における内因子(IF)との著しい親和性と、複合体の薬物部分の著しい生物活性との両方を保持する。
【０１０９】
よって、本発明のある態様は、医薬品において用いるための本発明の第1の態様によるポリペプチドを提供する。
【０１１０】
本発明のさらなる態様は、補体5a(C5a)および/またはN-ホルミルペプチド、fMLPの生物活性の阻害において用いるための本発明の第1の態様によるポリペプチドを提供する。
【０１１１】
本発明の関連する態様は、補体5a(C5a)および/またはN-ホルミルペプチド、fMLPの生物活性を阻害するための医薬品の製造における、本発明の第1の態様によるポリペプチドの使用を提供する。
【０１１２】
アナフィラトキシンC5aは、広くさまざまな炎症応答を媒介する。C5aRに対して作用することにより、これは、貪食細胞の活性化および動員において重要な役割を有し、侵入微生物の効果的なクリアランスについて重要である。近年、C5aが、組織損傷、および臓器不全を導く重症炎症性症候群のような破壊的炎症プロセスにおいても重要な役割を有することが明らかになっている。さらに、C5aは、正常な臓器発達、種々の細胞系統の初期の分化、およびアポトーシス性の死からの細胞の保護に影響するいくつかのその他の生体プロセスとも関連している(Table1(表1)を参照されたい)。
【０１１３】
【表１】
2012514465.tif 000003
【０１１４】
ヒトホルミルペプチド受容体(FPR)と、そのバリアントFPRL-1(FPR様1)およびFPRL-2(FPR様2)は、7回膜貫通ドメインGiタンパク質共役型受容体に属する。これらの受容体はともに、好中球および単球上に高いレベルで存在する。FPRは、高親和性ホルミルペプチド受容体として規定され、FPRL-1は、高濃度のfMLPのみによるその活性化に基づいて低親和性受容体と規定されている。自然界でのホルミルペプチドの唯一の供給源が細菌およびミトコンドリアタンパク質合成であるので、これらの受容体は、細菌侵入または組織損傷の部位に向かう貪食細胞の動員のためのメディエイターとして作用すると考えられている。このことは、FPRノックアウトマウスが、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)での感染に対してより感受性であるとの観察結果により支持される。また、機能不全FPR対立遺伝子は、限局性若年性歯周炎と関連している。
【０１１５】
過去数年にわたって、これらの受容体についての多数の非ホルミル化ペプチドリガンドが同定されている(Table2(表2)を参照されたい)。これらのリガンドは、ランダムペプチドライブラリー、内因性の供給源および病原体を含む種々の供給源に由来する。これらのうちのいくつかは、アルツハイマー病、アミロイドーシスおよびプリオン病を含むヒト疾患と関連する。よって、ホルミルペプチド受容体は、種々の炎症プロセスの治療における標的である。
【０１１６】
【表２Ａ】
2012514465.tif 000004
【０１１７】
【表２Ｂ】
2012514465.tif 000005
【０１１８】
よって、ポリペプチドは、C5aRでのアンタゴニストとして用いるためである。簡便には、ポリペプチドは、この受容体と直接結合できる。
【０１１９】
ある実施形態において、ポリペプチドは、C5a受容体の機能を全体的にまたは部分的に阻害するためである。
【０１２０】
さらなる実施形態において、C5a受容体は、好中球、単球および/または内皮細胞上にある。
【０１２１】
よって、ポリペプチドは、補体5a(C5a)により誘導される好中球の活性化を阻害するためであってよい。
【０１２２】
ある実施形態において、ポリペプチドは、炎症、例えば急性または慢性の炎症反応を治療するためである。
【０１２３】
用語「治療する」および「治療」などは、本明細書において、全般的に、所望の薬理学的および生理的な効果を得ることを意味するために用いる。さらに、これは、ヒトを含む哺乳動物が、哺乳動物の状態を直接的または間接的に改善することを目的として医療援助に付される任意のプロセス、活動、施用、療法などのことをいう。よって、治療は、療法上および予防上の使用の両方を含む。
【０１２４】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、急性反応性関節炎、急性移植拒絶、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、アルコール性肝炎、同種移植、アルツハイマー病、動脈硬化症、アルサス反応、喘息、アテローム動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、細菌性髄膜炎、気管支原性肺癌、水泡性類天疱瘡、熱傷、心肺バイパス、循環器疾患、慢性気管支炎、慢性リンパ性白血病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、接触性皮膚炎、クローン病、皮膚T細胞リンパ腫、嚢胞性線維症、皮膚疾患、中枢神経系の疾患、子宮内膜症、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、実験的アレルギー性神経炎(EAN)、凍傷、胃癌、胃腸疾患、泌尿生殖器疾患、痛風、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、血液透析、遺伝性血管浮腫、過敏性肺炎、特発性肺線維症、免疫複合体(IC)誘導血管炎、虚血性ショック、虚血性再灌流エピソード、虚血性再灌流傷害、関節症、(大)血管手術、金属熱、多発性硬化症、多系統臓器不全、重症筋無力症、心筋梗塞、膵炎、腹膜炎、胸膜肺気腫(pleural emphesema)、心肺バイパス後(CPB)炎症、乾癬、反復性緊張外傷(RSI)、呼吸器疾患、関節リウマチ、敗血症、敗血症性ショック、副鼻腔炎、皮膚病、脳卒中、全身性エリテマトーデス(SLE)、移植、(外傷性)脳損傷、潰瘍性大腸炎、尿路感染症、血管漏出症候群、血管炎および異種移植からなる群より選択される疾患または状態の治療において用いるためである。
【０１２５】
ある実施形態において、ポリペプチドは、再灌流傷害の治療において用いるためである。例えば、再灌流傷害は、急性心筋梗塞(AMI)、冠動脈バイパス移植(CABG)、脳卒中および/または臓器移植に付随し得る。
【０１２６】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の治療において用いるためである。
【０１２７】
よって、本発明は、治療を必要とする対象を、補体5a(C5a)および/またはN-ホルミルペプチド、fMLPの生物活性の阻害因子を用いて治療する方法であって、対象に、本発明の第1の態様によるポリペプチドまたは本発明の第6の態様による医薬組成物を投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１２８】
当業者は、対象がヒトであることを認識する。
【０１２９】
本発明のポリペプチドまたは医薬組成物は、患者に有効量で投与される。「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効」とは、本明細書で用いる場合、補体5a(C5a)および/またはN-ホルミルペプチド、fMLPの生物活性の阻害をもたらす量のことをいう。これは、所望の治療効果を生じるように計算された活性物質の予め決定された量である。さらに、これは、ホストの活性、機能および応答の臨床上著しい欠陥を低減、最も好ましくは妨げるために十分な量を意味することを意図する。代わりに、治療有効量は、ホストにおける臨床上著しい状態の改善を引き起こすために十分である。当業者により認識されるように、化合物の量は、その比活性に依存して変動し得る。適切な投与量は、所望の治療効果を生じるように計算された活性組成物の予め決定された量を、必要とされる希釈剤とともに含有し得る。本発明の組成物の製造のための方法および使用において、活性成分の治療有効量が提供される。治療有効量は、当該技術において公知であるように、年齢、体重、性別、状態、合併症、その他の疾患などのような患者の特徴に基づいて、通常の技術を持った医療または獣医学の従事者により決定できる。
【０１３０】
よって、ある実施形態において、方法は、個体に、C5aRおよび/またはFPRにてアンタゴニストとして作用するために十分な量の化合物を投与するステップを含む。
【０１３１】
化合物またはその製剤のこのような有効量が、1回の急速投与用量として(すなわち急性投与)またはより好ましくは、経時的に一連の用量として(すなわち慢性投与)送達できることが、当業者により認識される。
【０１３２】
本発明によるバリアントCHIPSタンパク質は、Alligator Bioscience ABにより開発されたフラグメント誘導ヌクレオチド多様性(Fragment-Induced Nucleotide Diversity)(「FIND」)法のような定向進化技術により生成し得る。FIND法は、WO 98/58080、WO 02/48351およびWO 03/97834に詳細に記載される。
【０１３３】
よって、本発明のさらなる態様は、本発明の第1の態様によるポリペプチドを生成するための方法であって、以下の:
(a)配列番号2によるポリペプチドまたはそのバリアントをコードする1または複数の親のポリヌクレオチド分子を準備するステップと、
(b)1または複数の親のポリヌクレオチド分子をヌクレアーゼ(例えばエキソヌクレアーゼ)で消化して、ポリヌクレオチドフラグメントを作製するステップと、
(c)ステップ(b)で作製された上記ポリヌクレオチドフラグメントを互いに接触させるステップと、
(d)互いにアニールするフラグメントを増幅させて、1または複数の親のポリヌクレオチド分子によりコードされるものと比較して変更されたアミノ酸配列を有するバリアントCHIPSポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を作製するステップと
を含む方法を提供する。
【０１３４】
ステップ(a)で準備される親のポリヌクレオチドが、2本鎖または1本鎖であってよいことが、当業者により認識される。しかし、好ましくは、ステップ(a)における親のポリヌクレオチド分子は、1本鎖である。
【０１３５】
ある実施形態において、ステップ(d)は、親のポリヌクレオチドの規定された領域に導入される変動性の程度を制御するために、予め規定された変動性のオリゴヌクレオチドを加えるステップを含む。
【０１３６】
さらなる実施形態において、方法は、ステップ(d)において生成された少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を発現させ、C5aにより誘導される好中球の活性化および/またはfMLPにより誘導される好中球の活性化を阻害する能力のような野生型CHIPSタンパク質の生物活性について、得られたポリペプチドをスクリーニングするステップ(e)をさらに含む。
【０１３７】
ステップ(e)は、C5aRおよび/またはFPRと結合する能力について、得られたポリペプチドを試験するステップも含んでよい。このような結合特性は、当該技術において公知の技術、例えば親和性クロマトグラフィーおよびファージディスプレイを用いて評価できる。
【０１３８】
より好ましくは、方法は、配列番号2によるポリペプチドと比べて低減した免疫原性について、得られたポリペプチドをスクリーニングするステップ(f)をさらに含む。
【０１３９】
例えば、ステップ(e)は、以下のスクリーニング手順の1または複数を含み得る。
(i)C5aRと結合するバリアントCHIPSポリペプチドの能力についてのアッセイ。
例えば、ファージ選択を用いて、C5aRのN末端部分に相当するペプチドとのバリアントポリペプチドの結合についてスクリーニングし得る。最初のポジティブ選択の後に、溶出したファージを増幅し、後続のポジティブ選択を行うことができる。2回目のポジティブ選択において、ヒト抗CHIPS抗体を加えて、抗CHIPS抗体との結合を保持する望ましくないCHIPS分子を吸着し得る。このことにより、免疫原性がより低いクローンを同定する可能性を増やすことができる。
【０１４０】
2回目のポジティブ選択の直後に、溶出したファージを、磁性ビーズを被覆するヒト抗CHIPS抗体とインキュベートしてよい。溶出物のプールを、次いで、以下のようにして回収する;(1)抗体と結合しなかったファージ、(2)洗浄ステップの後に溶出されたファージ、(3)低いまたは(4)高いCHIPS濃度で溶出されたファージ。プール(1)および(2)からのクローンは、さらなるスクリーニングのために優先的に選択し得る。
【０１４１】
選択された変異体プールからの遺伝子をpRSETベクターにクローニングして、HTフォーマットでタンパク質を生成し得る。
【０１４２】
(ii)発現ELISAによる各バリアントCHIPSポリペプチドの濃度についてのアッセイ。
【０１４３】
(iii)例えば阻害ELISAおよび/またはヒト抗CHIPS抗体ELISAによる、抗CHIPS抗体とのバリアントCHIPSポリペプチドの結合活性についてのアッセイ。
【０１４４】
(iv)選択されたバリアントCHIPSポリペプチドは、発現ELISAおよびペプチドELISAにおいても再発現および分析できる。
【０１４５】
例示的なスクリーニング手順のさらなる詳細は、実施例に示す(以下を参照されたい)。
【０１４６】
ハイスループット操作ができるスクリーニングアッセイが特に好ましいことが認識される。その例は、細胞に基づくアッセイおよびタンパク質-タンパク質結合アッセイを含み得る。SPAに基づく(シンチレーション近接アッセイ;Amersham International)システムを用い得る。
【０１４７】
ポリペプチド/ポリペプチド相互作用を検出するその他の方法は、イオンスプレー質量分析を伴う限外濾過/HPLC法、またはその他の物理的および分析的な方法を含む。例えば、当業者に公知の蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)法を用いてよく、ここでは、蛍光標識が互いに近傍にあるときにこれらの相互作用を測定することにより2つの蛍光標識体の結合が測定され得る。
【０１４８】
巨大分子、例えばDNA、RNA、タンパク質およびリン脂質とのポリペプチドの結合を検出する代替法は、例えばPlantら(1995) Analyt Biochem 226(2)、342〜348頁(これは、本明細書に参照により組み込まれる)に記載される表面プラズモン共鳴アッセイを含む。方法は、例えば放射活性または蛍光標識で標識されたポリペプチドを用いてよい。
【０１４９】
標的巨大分子(例えばC5aRまたはFPR)と結合できるポリペプチドを同定するさらなる方法は、標的巨大分子をポリペプチドに曝露し、該巨大分子とのポリペプチドの任意の結合を検出および/または測定するものである。巨大分子とのポリペプチドの結合についての結合定数を決定し得る。巨大分子とのポリペプチドの結合を検出および/または測定(定量)するために適切な方法は、当業者に公知であり、例えば、ハイスループット操作ができる方法、例えばチップに基づく方法を用いて行うことができる。VLSIPS(商標)とよばれる新しい技術は、数百千またはそれより多くの異なる分子プローブを含有する非常に小さいチップの製造を可能にしている。これらの生物学的チップまたはアレイは、アレイ状に配置されたプローブを有する。各プローブは、特定の位置に割り当てられる。生物学的チップは、それぞれの位置が例えば10ミクロンの規模を有して製造される。チップは、標的分子がチップ上のプローブのいずれかと相互作用したかどうかを決定するために用いることができる。選択された試験条件下でアレイを標的分子に曝露した後に、走査デバイスがアレイのそれぞれの位置を調べて、標的分子がその位置のプローブと相互作用したかどうかを決定できる。
【０１５０】
生物学的チップまたはアレイは、プローブまたは標的分子のいずれかについての情報を得るための多様なスクリーニング技術において有用である。例えば、ペプチドのライブラリーをプローブとして用いて、薬物をスクリーニングできる。ペプチドを受容体に曝露し、受容体と結合したプローブを同定できる。1999年2月23日にRavaらに対して発行された米国特許第5,874,219号を参照されたい。
【０１５１】
C5aRおよび/またはFPRをin vivoで遮断し得るポリペプチドを同定することが望ましいことが理解される。よって、方法において用いる試薬および条件は、上記のものと相互作用するポリペプチドとの間の相互作用が、in vivoでの上記の天然ポリペプチドと相互作用する天然ポリペプチドとの間と実質的に同じになるように選択してよい。
【０１５２】
本発明の例示的実施形態を、以下の図面を参照して、以下の非限定的な実施例において記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】健常ヒトドナー(n=168)におけるIgG抗CHIPS力価の頻度分布を示す図である。力価は、バックグラウンド値を差し引いた後に0.300の吸光度を与えるlog希釈として規定した。平均力価は、0.72のSDで3.62であった。挿入図は、研究参加前の6名の対象の抗CHIPS力価を示す(各回のELISAにおける参照としてのヒトプール血清について修正した3つの値の平均)。
【図２】有志の血清中で検出されたCHIPSの薬力学を示す図である。CHIPSは、CHIPSのiv注射後の種々の時点にて特異的捕捉ELISAにより測定した。白抜きの印はプラセボを表し、塗りつぶした印は、CHIPS受容者を表す。
【図３】ヒト抗CHIPS IgGが、捕捉ELISAによるCHIPSの検出を阻害することを示す図である。種々の濃度のプールしたヒト血清に添加し、捕捉ELISAにより測定した2.5ng・mL-1のCHIPSの回収率(a)。プロテインG-Sepharoseを通過させてヒト血清からIgGを除去することにより、CHIPS捕捉ELISAにおける阻害効果が排除される(b)。種々の濃度のCHIPSを、緩衝液(●)、1%ヒト血清(1名のドナーから;▲)またはプロテインG-Sepharose通過後の1%血清(▼)とインキュベートした。データは、1回の代表的な実験を示す。
【図４】CHIPSが末梢血好中球の表面上で回収されることを示す図である。CHIPSのiv注射後の種々の時点にて、好中球の表面に結合したCHIPSの存在を、ウサギ抗CHIPS抗体を用いて検出した。個別の対象を示す。白色のバーはプラセボを表し、黒色のバーはCHIPS受容者を表す。値は、種々の時点(T=0、15、60、240分および24時間後)でのEDTA全血試料中のゲーティングされた好中球の平均蛍光(MFL)として表す。2次FITC標識コンジュゲートについてのバックグラウンドMFLの値は、6であった。
【図５Ａ】ヒト末梢血好中球上でのFPR(a)およびC5aR(b)の発現を示す図である。CHIPSのiv注射後の種々の時点にて、好中球表面上でのFPRの存在を、FITC標識fMLPを用いて検出し、C5aRの存在を、FITC標識抗CD88 mAbを用いて検出した。白色のバーはプラセボを表し、黒色のバーはCHIPS受容者を表す。値は、ゲーティングされた好中球の平均蛍光(MFL)として表す。
【図５Ｂ】ヒト末梢血好中球上でのFPR(a)およびC5aR(b)の発現を示す図である。CHIPSのiv注射後の種々の時点にて、好中球表面上でのFPRの存在を、FITC標識fMLPを用いて検出し、C5aRの存在を、FITC標識抗CD88 mAbを用いて検出した。白色のバーはプラセボを表し、黒色のバーはCHIPS受容者を表す。値は、ゲーティングされた好中球の平均蛍光(MFL)として表す。
【図６】全血fMLP刺激の後の末梢血好中球の阻害指数を示す図である。CHIPSのiv注射後の種々の時点にて、EDTA抗凝固血液を、緩衝液およびfMLPと37℃にて30分間インキュベートし、CD11bおよびCD62Lの両方の発現について分析した。各時点について、CD11bおよびCD62Lの発現を、緩衝液処理対照試料に対して表した(CD11bについて相対的増加およびCD62L発現について相対的減少)。これらの値を用いて、それぞれの対象について各時点での活性化指数を算出した(CD62Lについての相対値/CD11bについての相対値)。データは、プラセボ(○)、血清および好中球CHIPS陰性(-)対象(●)およびCHIPS陽性(+)対象(■)の平均±SDとして表す。
【図７】循環末梢白血球(a)および血清炎症マーカーCRP(b)のレベルを示す図である。CHIPSのiv注射後の種々の時点にて、WBC計数およびCRP測定を行った。(1.1および1.6は、それぞれ1日と1時間または6時間を示す)。WBCについてのデータは、T=0での値に対して表し、CRPについてのデータは、mg・L-1として表す。値は、プラセボ(●)およびCHIPS受容者(▲)についての平均±SDである。
【図８】循環免疫複合体(CIC;(a))および肥満細胞マーカーであるトリプターゼ(b)のレベルにより測定されるCHIPSの有害な影響を示す図である。CHIPSのiv注射後の種々の時点にて、これらのマーカーの両方について特異的アッセイを行った。データは、T=0での値に対して表し、プラセボ(●)およびCHIPS受容者(▲)についての平均±SDとして示す。
【図９Ａ】CHIPSのiv注射後の種々の時点での循環末梢血好中球上のCD11bおよびCD62Lの発現指数を示す図である。それぞれの対象について、CD11bおよびCD62Lの発現を、各時点について、T=0での最初の発現レベルに対して標準化した。これらの値を用いて、それぞれの対象について各時点での活性指数を算出した(CD11bについての相対値/CD62Lについての相対値)。
【図９Ｂ】CHIPSのiv注射後の種々の時点での循環末梢血好中球上のCD11bおよびCD62Lの発現指数を示す図である。それぞれの対象について、CD11bおよびCD62Lの発現を、各時点について、T=0での最初の発現レベルに対して標準化した。これらの値を用いて、それぞれの対象について各時点での活性指数を算出した(CD11bについての相対値/CD62Lについての相対値)。
【図１０】健常ヒト対象でのCHIPSの免疫原性を示す図である。CHIPSに対する特異的IgG力価を、全ての対象において、試験開始前と試験終了の7および42日後とに決定した。値は、プラセボ(●)およびCHIPS受容者(■)についての平均±SDである。
【図１１】CHIPS-IgG複合体によりin vitroで誘導される好中球上の相対的CD11b発現。健常有志からの単離好中球を、20μg・mL-1の親和性精製ヒトα-CHIPS IgGとともに(■)またはなしで(●)の漸増濃度のCHIPSで攻撃した。FcγRの役割に対処するために、細胞を、遮断mAbである抗FcRII(IV-3)およびF(ab’)2抗-FcRIII(3G8)で前処理し、洗浄し、緩衝液(□)または抗CHIPS IgG(○)中でCHIPSを用いて刺激するために用いた。攻撃の後に、細胞を氷上で蛍光標識抗CD11b mAbとインキュベートして、細胞活性化のレベルを決定した。データは、緩衝液だけの中(CHIPSまたはIgGなし)での細胞のCD11b発現に対して表し、平均±SEMとして示す(n≧3)。
【図１２】CHIPSおよびアラニン置換変異体によりex vivoで誘導される全血好中球上の相対的CD11b発現を示す図である。健常有志からのEDTA血液を、漸増濃度の野生型CHIPS(CHIPSWT)、46位のアルギニンのアラニン置換変異体(CHIPSR46A)および69位のリジンについての変異体(CHIPSK69A)で攻撃した。CD11b発現を、特異的mAbを用いて氷上で決定し、データは、緩衝液のみの細胞に対して平均±SEMとして表した(n≧3)。
【図１３】特異的抗CHIPS IgG力価と、ex vivoでの全血好中球の最大刺激に必要なCHIPSの量との間の相関関係を示す図である。健常有志からのEDTA血液を、漸増濃度のCHIPSで攻撃し、CD11b発現を、細胞活性化の指標として測定した。IgG抗CHIPS力価をELISAにより決定し、0.300の吸光度を与えるlog血清希釈として規定した。回帰分析を、式:y=切片+傾き×ln(x)を用いて行った。
【図１４】C5aR遮断活性を保持しながら、ヒト抗CHIPS IgGとのCHIPSの相互作用を低減するための実験的ストラテジーを示す図である。ランダム突然変異誘発とファージ選択/ELISAスクリーニングの最初の回の後に、IgG結合の低下およびC5aRペプチド結合保持についてのFIND(登録商標)とファージ選択/ELISAスクリーニングを3回行った。次いで、改良されたクローンにおける変異の構造的分布を分析し、新しい変異を合理的設計により導入した。これらのクローンを、IgG相互作用の低下ならびにC5aR結合および阻害の保持についてさらに分析した。
【図１５】ヒト抗CHIPS31-113 IgGに対する%結合により測定した、wt CHIPS1-121に対する1回目(n=360)、3回目(n=320)および4回目(n=96)からのクローン(A)および最良クローン(B)の平均値の比較を示す図である。4回目からの96クローンの分布をCに示す。
【図１６】抗CHIPS31-113 IgG結合が低下しており、かつC5aR結合を保持しているものを求めるスクリーニング中における4回目の多様化の後に同定された42の最良クローンのプロットである。ヒトC5aRとの最高の結合を示す10のクローン(丸の中)を、さらなる計算機による/合理的設計のために選択した。
【図１７】ランダム突然変異誘発、FIND(登録商標)および合理的設計の後の上位7クローンの配列アラインメントを示す図である。K40位、D42位、N77位、N111位およびG112位は、K50位、K69位、K92位、K100位およびK105位での変異との異なる組み合わせで、ほぼ全てのクローンにおいて変異されている。変異位置は、αヘリックス、β1シートとβ2シートとの間のループ、β2シートとβ3シートとの間のループ、βシート3、β3シートとβ4シートとの間のループおよびβシート4に位置する。
【図１８】ADC-1004変異の構造的分布を示す図である。ADC-1004変異の表面提示。CHIPS31-121の既知のNMR構造(PDBコード:1XEE)を用いて、ADC-1004のアミノ酸置換K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111KおよびG112Aの構造分布を示した。この図は、PyMol分子製図プログラムを用いて作製した(DeLano、2002. The PyMol Molecular Graphics System. Delano Scientific、San Carlos)。
【図１９】ADC-1004はが、ヒト血清中の抗体と非常に低い相互作用を示すことを示す図である。ADC-1004のヒト血清中のIgG結合を、ELISAにおいてCHIPS1-121、CHIPS31-113、ストレプトキナーゼおよびアナキンラの結合と比較した。ヒト血清の系列希釈を、CHIPSバリアントまたはPBSで被覆したプレートに加えた。ヒト血清のプールのIgG力価を(A)に示し、28の異なる個別のヒト血清の力価を(B)に示す。直線は、中央値を表す。
【図２０】ADC-1004が、補体活性化の低レベル誘導因子であることを示す図である。ヒト血清からの抗CHIPS抗体とCHIPSバリアントとの間の相互作用により媒介される補体フラグメントC3c沈着を、ELISAにおいて研究した。ADC-1004により媒介されるC3c沈着を、CHIPS1-121またはCHIPS31-113のC3c沈着と比較した。ヒト血清の系列希釈を、CHIPSバリアントまたはPBSで被覆したプレートに加えた。補体フラグメントC3cの沈着を定量し、血清濃度に対してプロットした。ヒト血清のプールを用いるC3cの沈着を(A)に示し、28の異なる個別のヒト血清を用いる10%血清での沈着を(B)に示す。直線は、中央値を示す。
【図２１】ADC-1004が、C5aにより誘導される好中球活性化および遊走を阻害することを示す図である。(A)-Fluo-3標識好中球を、漸増濃度のCHIPSバリアント(CHIPS1-121、CHIPS31-113またはADC-1004)とプレインキュベートし、一定濃度のC5a(3nM)で刺激した。結果を、緩衝液処理細胞のパーセント阻害として表し、これらの結果は、代表的実験からのものである。(B)-カルセイン標識好中球およびある力価のCHIPSバリアント(CHIPS1-121、CHIPS31-113またはADC-1004)をトランスウェルシステムの上の区画に、1nMのC5aを下の区画に加えた。標識好中球の遊走を、プレートリーダーで測定した。結果を、CHIPSを加えていない細胞と比較した走化性のパーセント阻害として表す。
【図２２】ADC-1004が、MR/SPECTにより測定される虚血領域(危険性のある領域)に関する梗塞サイズを有意に低減する(p<0.007、マン-ホイットニーU検定)ことを示す図である。
【図２３】ADC-1004が、微小血管閉塞を低減することを示す図である。
【図２４】CD18発現について染色した、プラセボ(A)およびADC-1004(B)で処置した動物からの梗塞領域からの心筋組織を示す図である。切片の画像分析により、ADC-1004処置動物における染色がより低いことが示され、このことは、炎症細胞活性化の低下を示した。
【図２５】2匹のプラセボ処置動物(対照1および2)ならびに2匹のADC-1004処置対象(ADC-1004 1および2)の基底(移植前)、移植の1、3および6時間後の大動脈血液中のPaO2/FiO2を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１５４】
(実施例)
(実施例A)
in vivoでのCHIPS活性
材料および方法
動物モデルにおけるCHIPS毒性の前臨床的評価
異なる前臨床毒性研究を前もって決定して、CHIPSの安全性を調べた。これらは、以下を含んだ。(i)3匹の麻酔下のビーグル犬の1群における種々の循環器および呼吸器パラメータに対するCHIPSの影響。イヌに、漸増用量0.2、2.0および20mg・kg-1のCHIPSを、およそ30分間隔で1分にわたって静脈内注入により投与した。(ii)マウスでの行動(「Irwin」)試験:CHIPSを、1回の静脈内注射として雄ICR CD-1マウス(群あたり3匹)に7.5、25および75mg・kg-1の用量で投与して、一般行動に対する影響を評価した。別の群には、同容量(10mL・kg-1)の媒体(0.9%w/v滅菌食塩水)を与えた。(iii)ラットにおける急性静脈内毒性研究:1回の用量としての96.1mg・kg-1のCHIPS(容量を考慮して実際に達成可能な最大値)の、5匹の雄および5匹の雌のラットへの静脈内投与。(iv)マウスにおける急性静脈内毒性:1回の用量としての96.1mg・kg-1のCHIPSの、5匹の雄および5匹の雌のマウスへの静脈内投与。(v)ラットにおける7日間静脈内急速投与予備的毒性研究(24匹の雄および24匹の雌、最大用量10mg・kg-1)。(vi)ラットにおける7日間静脈内急速投与毒性研究(76匹の雄および76匹の雌、最大用量10mg・kg-1)。(vii)イヌにおける7日間静脈内急速投与用量範囲決定研究(2匹の雄および2匹の雌、最大用量20mg・kg-1)。(viii)イヌにおける7日間静脈内急速投与毒性研究(12匹の雄および12匹の雌、最大用量20mg・kg-1)。
【０１５５】
ヒト有志の参入
健常有志の参入基準は、以下のとおりであった。(i)対象は男性でなければならない。(ii)対象は、以下の肥満度指数(BMI)範囲:18〜30(kg・m2)、および年齢範囲:18〜50歳(両端を含む)を満たさなければならない。(iii)医療スクリーニングを2つの部分に分けた。対象を、抗CHIPS抗体レベルについて予備スクリーニングした。低い力価の対象のみを、投与の3週間前までに第2の部分についてスクリーニングし、参入させた:病歴、身体検査、血圧測定、心拍数、呼吸および温度、アルコール呼気試験、血液および尿検査、心電図(ECG)ならびに薬物スクリーニング。
【０１５６】
入院およびフォローアップ
6名の選択された対象(CHIPSを受容する4名および2名の対照)は、投与の前日に臨床薬理学ユニット(Kendle、Utrecht、The Netherlands)に入院した。安全性のための血液試料、検尿、暫定的病歴、身体検査、生命徴候およびECGを含むベースライン測定を行った。投与の日に、野生型CHIPS(CHIPSを5mg・mL-1の濃度で含有する滅菌凍結等張食塩水の1回の用量として投与される0.1mg・kg-1)またはプラセボ(0.9% NaCl)を、5分間にわたるiv注入により投与した。対象に、投与の30分前から投与開始の4時間後まで、心モニタリングのための遠隔測定システムをつないだ。対象の血圧を、投与の5分前から投与開始の30分後までFinapresを用いて連続的に測定した。生命徴候を測定し、ECGを、入院期間中のあるいくつかの時点で作製した。安全性のために、全ての対象の臨床状態および実験室の値(血液学、生化学、凝固および検尿)を監視した。有害事象は文書化し、それらの重症度およびCHIPSまたはプラセボとの関係に関して特徴づけた。対象は、投与の24時間後に退院した。投与の2週間後に、対象は、生命徴候、ECG、血液および尿ならびに抗CHIPS抗体レベルを評価するための訪問のために、ユニットに戻った。フォローアップ訪問を、投与の6週間後に予定した。
【０１５７】
クローニングおよびCHIPSの発現
CHIPSを、Haasら(2004) J. Immunol. 173:5704〜11頁に記載されるようにしてクローニングして発現させた。簡単に述べると、シグナル配列を有さない遺伝子を、pRSETベクター中に、エンテロキナーゼ切断部位のすぐ下流かつEcoRI制限部位の前に、オーバーラップ伸長PCRによりクローニングした。細菌を、CelLytic B細菌細胞溶解/抽出試薬(Sigma)およびリゾチームを製造業者の説明に従って用いて溶解した。ヒスチジンタグ付加タンパク質を、ニッケルカラム(HiTrap Chelating HP、5mL、Amersham Biosciences)を、製造業者の使用説明に従って用いて精製し、その後にエンテロキナーゼ(Invitrogen)を用いて切断した。試料を、15%SDS-PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動、Mini Protean 3システム、Bio-Rad)およびクーマシーブリリアントブルー(Merck)染色によりタンパク質の純度および存在について確認した。
【０１５８】
iv使用のためのCHIPSの精製
全長CHIPSを、CHIPSのコード配列をPelBコード配列のすぐ下流に含有する大腸菌株中で、大豆ペプトンおよび酵母エキスとからなる成長培地中で8L発酵培地中にて発現させた。CHIPSは、成長培地と細胞との両方から、2段階カチオン交換精製プロセスとその後の脱塩ステップとにより単離した。細菌細胞ペレットを、NaCl(10mM)、DTT(10mM)を含有するリン酸緩衝液(30mM;pH7.0)に再懸濁し、凍結させた。これをその後37℃にて融解し、氷上でインキュベートして超音波破砕した。15,000rpmにて遠心分離した後に、琥珀色の「細胞」上清を回収した。上清を30mMリン酸緩衝液で4倍に希釈し、Source S-30カラムを通過させた。物質をリン酸緩衝塩勾配で溶出し、CHIPS含有画分を併せて、浅い塩勾配を用いる洗練カラムを用いることによりさらに精製した。97%より高い純度(HPLCにより)を有するCHIPS含有画分を併せて、Sephadex G 25脱塩カラムを通過させてリン酸塩および過剰の塩化ナトリウムを除去した。エンドトキシンを、affimix樹脂(Biorad)上で穏やかに振とうすることにより除去し、調製物を限外濾過により滅菌した。純度を、水-TFA〜メタノール-TFAからなる勾配移動相を用いるMicrobondapac CN-RPカラムでのHPLC-MSにより確認した。CHIPSは、通常、約13分で溶出された。生成物を滅菌食塩水で必要な濃度まで希釈し、-20℃にて貯蔵した。
【０１５９】
抗CHIPS抗体
ウサギを、フロイントの完全アジュバントを用いて組換えCHIPSで免疫し、フロイントの不完全アジュバントを用いて追加免疫した。出血を、CHIPSとの反応性についてELISAにより以前に記載されたようにして確認した(Haasら、2004、J Immunol 173(9):5704〜11頁を参照されたい)。最終の出血から、IgGを、製造業者の使用説明に従う標準的なプロテインG(Pharmacia)親和性クロマトグラフィーにより精製した。CHIPSに対する特異的マウスモノクローナル抗体を記載されたようにして作製し、プロテインG Sepharoseカラムを用いてIgGを精製した(Haasら、2004、J Immunol 173(9):5704〜11頁を参照されたい)。
【０１６０】
親和性精製ヒトα-CHIPS IgGの単離
CHIPS1-121を、CNBR活性化Sepharose 4Bを製造業者の一般的な使用説明(Pharmacia、GE)に従って用いて、固体マトリクスと結合させた。およそ8mgの精製CHIPSを、1グラムのSepharose上に結合させた。小さいカラム(±1mL)にこの物質を充填し、PBSで平衡化し、PBSで希釈した静脈内用ヒトIgG(IgG-IV;Sanquin、Amsterdam、The Netherlands)をゆっくりと注いだ。カラムをPBSで十分に洗浄した後に、0.1MグリシンHCl緩衝液pH3で溶出した。0.5mLの画分を、50μLの1M Tris/HCl pH8を含有するチューブに、中和のために回収した。最高のOD280を有する画分をプールし、PBSに対して透析した。最終的な調製物を、IgG含量についてELISAで分析した。そのために、プレートを、PBS中に2μg・mL-1でのヒツジ抗ヒトIgG(ICN)で被覆し、5% BSAでブロックし、標準IgG調製物(参照血清;Boehringer)および未知試料の系列希釈物とインキュベートした。捕捉されたIgGを、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG(Southern)および基質としてのTMBを用いて検出した。IgG濃度は、参照曲線から算出した。
【０１６１】
抗CHIPS ELISA
マイクロタイタープレート(Greiner)を、ウェルあたり50μLのCHIPS(PBS中に1μg・mL-1)で、4℃にて1晩被覆した。全ての洗浄ステップを、PBS-0.05%Tween-20で3回行い、後続のインキュベーションを37℃にて1時間行った。プレートをPBS-0.05%Tween-20 4% BSAでブロックし、洗浄し、PBS-0.05%Tween-20 1% BSAで希釈した血清または抗体とインキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした種特異的ヤギ抗IgG (全てSouthern、Birmingham、USAから)および基質としてのTMBを用いて検出した。反応は、H2SO4で停止し、吸光度を450nmにてBioRad ELISAリーダーで測定した。
【０１６２】
捕捉ELISA
マイクロタイタープレートを50μLの_-CHIPS mAb 2G8(PBS中に3μg・mL-1)で4℃にて1晩被覆した。プレートを、0.05% Tween-20含有PBS中の4% BSAでブロックし、洗浄し、1% BSA含有PBS/Tween中の希釈試料および標準物質としての2倍系列希釈のCHIPSとインキュベートした。その後に、プレートを、0.33μg・mL-1ウサギα-CHIPS IgGおよび1:5000希釈ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(Southern)とインキュベートした。結合した抗体を、基質としてのTMBを用いて定量し、反応を1N H2SO4で停止し、450nmにてBioRad ELISAリーダーで測定した。
【０１６３】
ヒトPMNの単離
健常有志から得た血液を、抗凝固剤としてヘパリンナトリウム(Greiner Bio-One)を含有する試験管に回収した。ヘパリン添加血液をPBSで1/1(v/v)に希釈し、10mLのFicoll(Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden)および12mLのHistopaque(密度1.119g・mL-1;Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)の勾配に重層した。遠心分離の後に(320×g、22℃にて20分)、好中球をHistopaque相から回収し、25mM HEPES緩衝液、L-グルタミン(Invitrogen Life Technologies)および0.05% HSA(Sanguin)を含有する冷RPMI 1640培地で洗浄した。残りの赤血球を30秒間氷冷水で溶解し、その後に濃PBS(10×PBS)を加えて等張性を回復した。洗浄した後に、細胞を計数し、RPMI-1640/0.05% HSAに107好中球mL-1で再懸濁した。
【０１６４】
好中球抗原発現
全血を、K3-EDTA試験管に回収し、氷上に置いた。蛍光標識mAbの最適希釈物をFalconチューブに一定量に分け、50μLの血液と氷上で30分間、穏やかな撹拌下で混合した。赤血球をFACS溶解溶液(BD)で溶解した後に緩衝液で洗浄し、細胞ペレットを、0.1%アジ化物を含むPBS中の0.5%パラホルムアルデヒドに再懸濁した。好中球表面抗原発現を、ゲーティングのために前方散乱および側方散乱に基づくFACsCaliburで分析した。校正ビーズ(Calibrite;BD)およびアイソタイプ適合対照を用いて最適なバックグラウンド値および電子補償を設定した。以下のmAbおよびプローブを用いた:抗CD11b(CR3)APC標識(クローン44;BD);抗CD62L(L-セレクチン)PE標識(クローンDreg 56 BD);抗CD88(C5aR)FITC標識(クローンW17/1;Serotec);フルオレセイン標識ホルミル-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(「FITC-fMLP」;Molecular Probes);ウサギ抗CHIPS IgG(EWI)およびFITC標識F(ab)’2ヤギ抗ウサギIgG(Sigma)。
【０１６５】
全血ex vivo刺激
K3-EDTA血液の一部を室温で維持し、ex vivo好中球刺激のために用いた。そのために、血液を10倍濃縮刺激(緩衝液対照、1×10-8M fMLP)と混合し、37℃にて30分間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。チューブを氷上に置いて反応を停止し、抗CD11bおよび抗CD62L mAbと混合した。氷上に30分置いた後に、試料を記載されるようにして処理した。
【０１６６】
CHIPS/IgG刺激好中球上でのCD11b発現
種々の濃度のCHIPS(最終濃度0〜9μg・mL-1)を、親和性精製ヒトα-CHIPS-IgG(0〜40μg・mL-1)と37℃にて30分間インキュベートした。その後に、50μLの単離ヒト好中球(107mL-1)をCHIPS/α-CHIPS混合物に加え、穏やかに振とうしながら37℃にて30分間インキュベートした。細胞を氷上に10分間置き、その後に3.5μLの蛍光マウスα-ヒト-CD11b(BDbiosciences、San Diego、CA)を加え、氷上で30分間インキュベートした。細胞をRPMI 1640/0.05% HSAで洗浄し、200μLの0.5%パラホルムアルデヒドで固定した。
【０１６７】
全血中の細胞上のCD11b発現は、異なるα-CHIPS力価について選択した、ヒト有志から回収した血液を用いて行った。IgGは全血中に既に存在するので、試料(50μL)は、CHIPS(0〜9μg・mL-1)のみと37℃にて30分間インキュベートした。試料を氷上に10分間置き、その後に3.5μLの蛍光標識マウス抗ヒトCD11bを加え、氷上で30分間インキュベートした。赤血球を溶解し、細胞を、H2Oで1:10に希釈した1mL FACS溶解溶液を4分間加えることにより固定した。細胞を10分間、1200rpmにてスピンし、ペレットを氷冷RPMI 1640/0.05%HSAで洗浄した。最後に、細胞を175μL RPMI 1640/0.05%HSAに再懸濁した。受容体発現提示細胞活性化を、FACSCaliburフローサイトメータ(BD Biosciences)で測定した。
【０１６８】
循環免疫複合体(CIC)
CICは、Quidel(San Diego、CA)からの2つの異なるELISAにより決定した。CIC-C1q酵素イムノアッセイは、補体を固定するICが、固定化されたヒトC1q精製タンパク質と結合するという原理に基づく。CIC-Raji細胞置換酵素イムノアッセイは、C3のiC3b、C3dgおよびC3d活性化フラグメントと特異的に結合するmAbを、従来のRaji細胞CR2結合反応と同じ様式で用いることにより、C3活性化フラグメントを含有するICを測定する。これらの両方のアッセイのデータを組み合わせて、結果は、0時点での値に対して表した。
【０１６９】
血清トリプターゼ濃度
血清由来トリプターゼ(αおよびβフォームの両方)を、UniCAP R-100上で、Pharmacia Diagnostics(Woerden、The Netherlands)からのImmunoCAP(商標)技術を用いて測定した。健常対照についての正常幾何平均は、5.6μg・L-1である(Pharmacia)。結果は、0時点での値に対して表した。
【０１７０】
研究プロトコルおよび任意の改正は、独立した倫理委員会により承認された。研究は、優良臨床試験基準(GCP)の欧州共同体(EC)規則および「ヘルシンキ宣言」(2000)を遵守して行った。
【０１７１】
結果
CHIPSは、前臨床毒理学的研究において明らかな毒性を示さない
いずれの毒理学的動物研究においても、CHIPSの投与は、臨床観察、体重、食物摂取、血液学、凝固、血液化学パラメータ、眼底検査、心電図、巨視的もしくは微視的病理学または挙動において、いずれの著しいCHIPS関連毒理学的変化も引き起こさなかった。
【０１７２】
種々の循環器および呼吸器パラメータに対するCHIPSの影響を、麻酔下のビーグル犬において調べた。低用量のCHIPS(0.02および2mg・kg-1)を受容したイヌにおいて、媒体(等張食塩水)の注入と比較した場合に、循環器または呼吸器への影響の証拠はなかった。20mg・kg-1のCHIPSの静脈内投与の後に、平均動脈圧の一過性の低下(およそ40%)が、投与開始後およそ1分で記録された。平均動脈圧レベルは、投与開始後およそ5分以内に投与前レベルに戻った。血圧への影響は、一過性の一貫しない心拍数変化と同時に発生した。1匹のイヌに、CHIPS(20mg・kg-1)を、CHIPSの最初の投与のおよそ30分後に反復して静脈内投与した。最初の投与の後に記録されたものと同様の心呼吸系パラメータに対する一過性の影響は、CHIPSの反復投与の後には明らかでなかった。しかし、2回目の投与により、2回目の投与のおよそ30分後に最大値の18%に到達する平均動脈圧の低減が延長された。この動物だけにおいて、CHIPSの反復投与の12分後に、軽度のアレルギー反応のある形態と一致する全身性皮膚反応が現れた。
【０１７３】
この研究の結果は、心呼吸系の影響が、用いた用量範囲(0.1mg・kg-1)においてヒト対象で観察される見込みがないことを示唆した。さらに、生じると考えられるいずれの影響も、一過性で可逆性であると予測された。
【０１７４】
α-CHIPS抗体力価の分布
黄色ブドウ球菌は一般的な細菌であり、CHIPS遺伝子は大多数の黄色ブドウ球菌株に存在するので、我々は、全ての個体が、循環α-CHIPS抗体を有していると仮定した。よって、我々は、健常有志の血清中のα-CHIPS IgGの量を試験した。図1は、168名の健常ヒト有志の組におけるα-CHIPS IgG力価の分布を示す。測定試料の組において、用いたELISAの検出限界未満の力価はなかった。研究した集団は、一般的な集団についての典型であると考えられる。このデータから結論付けると、一般的な集団のうちの99%を超える人は、検出可能なα-CHIPS IgG血清レベルを有する。図1には、試験に含めた対象の力価も示す。
【０１７５】
iv投与CHIPSの薬物動態
CHIPS投与後の4つの異なる時点で、CHIPS血清力価をELISAにより決定した(図2)。CHIPS力価の増加が、CHIPSを受容した個体のみで観察され、これらは、低いα-CHIPS抗体力価を有していた(対象104および105)。我々は、CHIPS ELISAに対するヒト血清の影響を決定した。CHIPSを、種々の濃度のプールしたヒト血清に加え、捕捉ELISAにより検出した。図3aは、血清が捕捉ELISAを阻害することを示す。プロテインG-sepharoseカラムを用いてIgGを除去することにより、阻害効果が排除される(図3b)。
【０１７６】
CHIPSは、FPRおよびC5aRとin vivoで結合する
CHIPSは、好中球上のFPRおよびC5aRと高い親和性で結合し、マウスmAbについて以前に記載されたように、α-CHIPS抗体を用いて検出できる。158 CHIPS投与後の種々の時点で、好中球の表面上に存在するCHIPSの量を、図4に示すようにウサギα-CHIPS抗体を用いて決定した。低いα-CHIPS抗体力価を有する対象(対象#104および#105)においてのみ、好中球の表面上でCHIPSが検出された。さらに、これら2名の対象のうちで、CHIPSの検出は、α-CHIPS抗体力価と負に相関する。血清中に存在するα-CHIPS抗体は、CHIPSの直接検出を妨げるので、この直接検出の陰性の結果は、CHIPSが受容体と結合することを除外できない。しかし、FPRおよびC5aRと結合したCHIPSは、以前に記載されたように、α-FPRおよびα-C5aR抗体によるこれらの受容体の検出を妨げる(Veldkampら、2000、Infect Immun 68(10):5908〜13頁を参照されたい)。図5は、FITC-fMLPおよびα-C5aR抗体結合により決定されたFPRおよびC5aR受容体発現を示す。低いα-CHIPS抗体力価を有する対象は、FPRおよびC5aR発現の低下を示し、このことは、CHIPSが受容体を占領することを示す。高いα-CHIPS抗体力価を有する対象(103および106)において、FPRおよびC5aR発現の変化はなく、このことは、α-CHIPS抗体が、受容体とのCHIPS結合を妨げることを示す。
【０１７７】
CHIPSは、fMLPにより誘導される好中球活性化をex vivoで、α-CHIPS抗体力価に依存して阻害する
細胞活性化によりCD62L発現が低下し、CD11b発現が増加する。好中球阻害に対する静脈内CHIPSの影響を試験するために、我々は、fMLPにより誘導されるCD62LおよびCD11bの発現をex vivoで測定した。好中球を、ex vivoで、fMLPを用いて、全血アッセイにおいて活性化した。図6に示すように、静脈内投与したCHIPSは、fMLPにより誘導される好中球の活性化をex vivoで阻害できる。この阻害は、検出可能なCHIPS血清濃度を有する対象においてのみ観察される(対象104および105)。
【０１７８】
CHIPSにより誘導される有害な影響
重篤な副作用が、CHIPSの投与直後に観察された。最も重篤な有害事象は、対象106について観察され、これらは、筋肉痛、呼吸困難、腹痛、嘔吐、筋痙縮、悪寒、発汗、眼窩浮腫(edema orbita)およびめまいを含んだ。これらの症状の最終的な診断は、アナフィラキシー様反応である。対象を、クレマスチン、IV流体、トラマドールおよびプレドニゾロンで処置した。
【０１７９】
報告されたその他の有害事象は、動悸、温感、胸痛、紅潮、冷感、足の疲労、体位性めまい、発熱、頭痛、悪心、かすみ目を含む。対象106についての重度の背部痛とは別に、対象103および105は、軽度の背部痛を報告した。対象104は、こむら返りを報告した。38.6℃までの発熱が対象104および105について、投与後およそ4時間で開始し、第1日の晩に消散したことが観察された。
【０１８０】
血圧の変化はなく、ECG異常はなかった。酸素飽和度についての異常は、上記の有害事象中の対象106についての間欠性の低い読み取り値(89%酸素飽和度)以外は観察されなかった。プラセボを受容した対象において、有害事象は報告されなかった。
静脈内CHIPSは、白血球減少症とCRPレベルの増加とを誘導する
【０１８１】
我々は、白血球計数(WBC)およびC反応性タンパク質濃度(CRP)を投与前および投与後に、図7に示すように測定した。CHIPSは、CHIPSを受容する対象において一過性の白血球減少症を誘導し、これは2日以内に消散した。さらに、投与後第1日にてCRP濃度が増加し始め、これは、対象を第15日のフォローアップ中にスクリーニングしたときに正常レベルに戻っていた(図7b)。
【０１８２】
循環免疫複合体および増加した血清トリプターゼは、アナフィラキシー様反応を示す
我々は、循環免疫複合体の量および血清トリプターゼ濃度を測定した。CHIPSの静脈内投与は、CHIPSを受容した対象において免疫複合体の形成を誘導した(図8a)。我々は、トリプターゼ血清濃度の増加も観察し、これは、投与後およそ10分で最大値に到達した(図8b)。
【０１８３】
CHIPSは、細胞活性化をin vivoで誘導する
細胞活性化に対するCHIPSの直接の影響を研究するために、我々は、好中球上のCD62LおよびCD11b受容体発現を決定した。受容体発現は、いずれのさらなる細胞刺激も行わずに、血液試料の回収直後に測定した。対象104、105および106は、好中球上のCD62L発現の減少およびCD11b発現の増加を示し、これは、in vivo細胞活性化を表す(図9)。
【０１８４】
α-CHIPS抗体力価は、CHIPS投与後に増加する
タンパク質の免疫原性を、抗体を誘導する効力により特徴づける。我々は、健常ヒト対象におけるCHIPSの免疫原性を決定した。静脈内CHIPSを受容した対象は、α-CHIPS IgGの増加を示す(図10)。
【０１８５】
in vitroでの好中球のCHIPS活性化は、抗体濃度に依存する
我々は、CHIPS-IgG複合体によるin vitroでの好中球の活性化について研究した。異なる濃度のCHIPSを、20μg・mL-1のヒト親和性精製α-CHIPS IgGとプレインキュベートし、図11に示すように単離好中球を刺激するために用いた。親和性精製α-CHIPS IgGは、CHIPSの非存在下で好中球を活性化できなかった(データは示さず)。CHIPS-IgG複合体は、用量依存的な様式で好中球を刺激できた。図11は、最大限の細胞活性化のために必要な最適CHIPS濃度があることも示す。CHIPS-IgGにより誘導される細胞活性化は、FcR遮断抗体により完全に阻害された。よって、我々は、このアッセイにおけるCHIPS-IgGにより誘導される細胞活性化は、Fc受容体により媒介されると結論付ける。
【０１８６】
CHIPSR46A(46位のアルギニンがアラニンで置き換えられる)およびCHIPSK69A(96位のリジンがアラニンで置き換えられる)は、以前に記載された(Haasら、2005、J Mol Biol 353(4):859〜872頁を参照されたい)、単独アミノ酸置換を有する2つのCHIPS変異体である。これらのCHIPS変異体は、ELISAにより測定して、精製α-CHIPS IgGについての親和性の低下を示す(データは示さず)。全血細胞活性化アッセイにおいて用いた場合、これらの変異体は、野生型CHIPSと比較してより低い細胞活性化能力を有する(図12)。CHIPSR46AおよびCHIPSK69Aについて、野生型CHIPSと比較して同じ細胞活性化を得るために、10倍より高い濃度が必要である。このことは、抗体力価の次に、抗原との反応性のレベルが、細胞活性化の量を決定することを示す。
【０１８７】
CHIPSによる好中球のex vivo活性化も、α-CHIPS IgG濃度に依存する
我々は、全血ex vivoアッセイにおいて、好中球活性化に対するCHIPSの影響を測定した。α-CHIPS抗体は全血中に既に存在するので、我々は、CHIPSを親和性精製α-CHIPS IgGとプレインキュベートしなかった。異なる濃度のCHIPSを、ヒト有志からの血液に加え、細胞活性化を表すCD11b発現を測定した。図13は、異なるα-CHIPS IgG力価を有する8名の健常有志からの全血中のCD11b発現により測定された最大の好中球刺激のために必要なCHIPS濃度を示す。in vitro実験において示されるように、最大の好中球刺激は、CHIPS/α-CHIPS比に依存する。このことは、このex vivoアッセイでも観察される。より高いα-CHIPS濃度が存在する場合に、より高い濃度のCHIPSが、好中球の最大の刺激のために必要である。
【０１８８】
考察
黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質は、ヒトC5a受容体およびホルミルペプチド受容体の非常に強力な阻害因子である。両方の受容体、特にC5aRは、多様な炎症性疾患の治療における重要な標的として記載されている。C5aRおよびFPRを阻害するCHIPSの強力な能力により、このタンパク質は、これらの疾患の治療における候補治療剤になる。さらに、C5aRおよびFPRに対する活性がCHIPS分子の異なる領域上にあることにより、特異的受容体ターゲティングが可能になる(Haasら、2004、J Immunol 173(9):5704〜11頁を参照されたい)。マウス細胞と比較してヒト細胞に対して活性が30倍異なることから明らかなCHIPSタンパク質のヒト特異性は、動物モデルにおけるin vivo CHIPS活性の評価を妨げる(de Haasら、2004, J Exp Med 199(5):687〜95頁を参照されたい)。
【０１８９】
我々は、黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質の活性、薬物動態および毒性を、6名の健常ヒト対象の組において研究した。異なる動物モデルでの高濃度のCHIPS(マウスにおいて96.1mg・kg-1までの1回の静脈内用量)の投与を用いる前臨床毒理学的研究は、毒性の著しい兆候を示さない。よって、5分間にわたって静脈内投与される0.1mg・kg-1の開始用量は、安全であると考えられた。
【０１９０】
黄色ブドウ球菌は一般的な細菌であり、CHIPSタンパク質は大多数の黄色ブドウ球菌株で発現されるので、我々は、α-CHIPS抗体が全ての個体に存在すると仮定した。このことは、ヒト有志から無作為に回収した168の血清のプールにおけるα-CHIPS IgG力価のスクリーニングにより確認された。マウスモノクローナル抗体を用いる実験は、これらのモノクローナル抗体が、CHIPS活性をin vitroで妨げ得ることを示した(Haasら、2004、J Immunol 173(9):5704〜11頁)。よって、CHIPSタンパク質を受容する健常対象において存在するα-CHIPS抗体も活性が妨げられると仮定することは、妥当である。
【０１９１】
CHIPSをヒト対象に投与することは、in vivoでの活性および薬物動態を研究するための独特の機会であった。0.1mg・kg-1のCHIPSの静脈内投与の後に、我々は、CHIPS血清濃度を測定した。図2は、投与後の異なる時点でのCHIPS血清濃度を示す。CHIPSタンパク質を受容した4名の対象のうちの2名だけにおいて、我々は、CHIPS血清濃度の増加を測定した(対象104および105)。これらの2名の個体が、最低のα-CHIPS IgG力価も示したことは、興味深いことであった。このことは、α-CHIPS抗体が、CHIPSの検出を妨げることを示す。したがって、この妨害のために、対象104および105において測定されたCHIPS血清濃度は、過小評価である。これらのデータに基づいて、我々は、CHIPSのin vivoでの予想半減期を、少なくとも1.5時間と算出した。
【０１９２】
我々は、好中球膜表面上に存在するCHIPSの量を検出する場合に、α-CHIPS IgG力価と同じ相関を観察した。CHIPSは、対象104および105のみからの好中球の表面上で検出できた。さらに、我々は、これらの個体において、α-FPRおよびα-C5aR抗体による両方の受容体の検出が下方制御されるので、これらのCHIPS分子が、FPRおよびC5aRを占領することを示した。また、対象104および105からの好中球だけが、fMLPでの刺激により活性化の低下を示した。残念なことに、C5a刺激を用いる実験は、技術的問題により失敗した。しかし、これらの実験は、静脈内投与したCHIPSが、ex vivoでの好中球活性化に対して阻害効果を有し、この効果は、α-CHIPS抗体により阻害されることを明確に示す。
【０１９３】
前臨床動物毒性研究において、関連する有害な影響は観察されなかった。ヒト対象における0.1mg・kg-1のCHIPSの投与は、2名の対象(対象103および104)により許容され、対象105において中程度に許容されたが、対象106は、CHIPS注入の直後に重篤な症状を発生し、これらは、アナフィラキシー様反応と診断された。我々は、全ての対象において好中球CD11b表面発現を測定して、CHIPSにより誘導される細胞活性化を調べた。細胞の活性化は、対象104、105および106で観察された。CHIPSを受容した対象の群のうちで、投与後第2日に、対照と比較してC反応性タンパク質が増加した。
【０１９４】
末梢組織で見出される白血球である肥満細胞は、炎症および即時型アレルギー反応において中心的な役割を有する。分泌顆粒からのトリプターゼの放出は、肥満細胞脱顆粒の特徴的な特性である。血清肥満細胞トリプターゼ濃度は、アナフィラキシーおよびその他のアレルギー条件において増加する(PayneおよびKam、2004、Anaesthesia 59(7):695〜703頁を参照されたい)。CHIPS投与の後に観察されたアナフィラキシー様反応は、肥満細胞の活性化を表すトリプターゼレベルの増加によって確認された。トリプターゼレベルの上昇の前に、循環免疫複合体が増加した。免疫複合体は、肥満細胞を、FcγR架橋により、そして補体の活性化およびC5aの産生により活性化できる(JancarおよびCrespo、2005、Trends Immunol 26(1):48〜55頁を参照されたい)。
【０１９５】
In vitro実験により、α-CHIPS抗体の存在下でのCHIPSの細胞活性化特性が確認された。CHIPSにより誘導される好中球の活性化は、FcγRIIおよびFcγRIII遮断抗体を遮断することにより阻害された。このことは、これらの細胞のCHIPSにより誘導される活性化が、CHIPS/α-CHIPS免疫複合体により引き起こされる可能性が高いことを示す。我々が、試験した対象において循環免疫複合体を探索したときに、我々は、静脈内CHIPSを受容した対象における免疫複合体の増加も見出した。α-CHIPS抗体力価とCHIPSにより誘導される細胞活性化との間の関係も、in vitroおよびex vivo実験から明確である。このことは、最高のα-CHIPS抗体力価を有する対象103が、わずかな有害な影響しか報告しなかった観察結果と対照的である。もちろん、研究した個体数は4名の対象に限られていたし、多数の異なる因子が、個体における有害な影響の発生および認知に影響する。さらに、in vitro実験は、細胞活性化を誘導する最適抗体濃度があることを示す。非常に高いα-CHIPS抗体力価が、アナフィラキシー様反応の発生を低下させることが可能である。以前の研究は、CHIPSが、C5aRおよびFPRを発現する細胞以外の細胞と結合しないことを示しており、CHIPSによる直接の細胞活性化の証拠はない。抗体は、細胞活性化において明確な役割を有するが、少数の観察結果およびin vivoの複雑さが、これらのデータの解釈を妨げる。
【０１９６】
我々は、α-CHIPS IgGについての親和性が低減した2つのCHIPS変異体(CHIPSR46AおよびCHIPSK69A)のin vitroでの細胞活性化能力が減少することを示した。α-CHIPS抗体の中和効果にもかかわらず、我々は、CHIPSタンパク質の著しい血清濃度を検出できた。さらに、静脈内投与したCHIPSは、循環好中球上で検出され、FPRおよびC5aRと結合し、fMLPでのex vivo刺激により好中球応答を阻害できた。このことは、CHIPSタンパク質が、その標的であるFPRおよびC5aRとin vivoを見出すことができることを示す。
【０１９７】
我々は、血清中のCHIPSタンパク質の半減期が、およそ1.5時間であることを示した。さらに、同じ半減期が、細胞表面上のその受容体と結合したCHIPSについても観察されたが、このことは、同程度の大きさの機能的半減期を示す。このことは、CHIPSタンパク質が、血液から直ちに除かれないことを示す。急性心筋梗塞において血栓溶解のために用いられるタンパク質薬物であるストレプトキナーゼについて示されたように(Wuら、1998、Appl Environ Microbiol 64(3):824〜829頁を参照されたい)、CHIPSタンパク質の半減期を、点突然変異を導入することにより増加させることが可能であると考えられる。しかし、1.5時間の半減期は、投与を停止した場合にいずれの(免疫抑制)効果も迅速に消滅することを意味する。このことは、感染の出現の増加と関連するインフリキシマブのような長い半減期の抗体薬物に対して利点を有し得る(Listingら、2005、Arthritis Rheum 52(11):3403〜3412頁;Crumら、2005、Medicine (Baltimore) 84(5):291〜302頁を参照されたい)。
【０１９８】
(実施例B)
ヒト抗体との相互作用が低減された機能的バリアントを作製するためのCHIPSの定向進化
要約
黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質(CHIPS)は、C5a受容体(C5aR)およびホルミル化ペプチド受容体と結合してそれらを遮断することにより、炎症と関連する免疫細胞動員を阻害するタンパク質である。CHIPSが現存するヒト抗体とより低い反応性を有するならば、抗炎症薬として有用である。よって、我々は、ヒトIgGとのより低い相互作用を示すが、生物学的機能は保持する新しいCHIPSバリアントを作製するために、定向進化および計算機による/合理的設計をCHIPS遺伝子に適用した。最適化は、4回で行った;CHIPS遺伝子に多様性を与えるための1回のランダム突然変異誘発と、3回のフラグメント誘導多様性(FIND(登録商標))によるDNA組換え。毎回、ファージ選択および/またはELISAで、ヒトIgGとの相互作用の低下およびC5aR結合の保持についてスクリーニングした。ヒト抗CHIPS IgGの平均結合は、進化の回ごとに減少した。さらなる最適化のために、新しいアミノ酸置換を、定向進化中に同定された変異に基づいて、合理的設計により導入した。最後に、ヒトIgGとの相互作用が低く、C5aR遮断能力が保持された7つのCHIPSバリアントを同定できた。
【０１９９】
序説
炎症は、損傷または病原体による感染に対する組織応答である。損傷または感染の部位への免疫細胞および可溶性分子の誘引は、治癒プロセスを開始する。炎症応答を生じる能力は生存のために重要であるが、炎症を制御する能力も、健康のために必要である。抗炎症薬は、過剰または制御されない炎症を伴う障害の治療のために、炎症における重要な事象を遮断することを狙いとする。このような薬物の例は、関節リウマチの治療用に承認されたRemicade(登録商標)およびKineret(登録商標)である。
【０２００】
多くの細菌が、例えば認識を避けることにより、または免疫系により媒介される抗菌効果を中和するタンパク質を分泌することにより、ヒト免疫系を回避するためのストラテジーを進化させている。黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質(CHIPS)は、C5a受容体(C5aR)およびホルミル化ペプチド受容体との結合および遮断による(De Haasら、2004;Postmaら、2004)、炎症と関連する免疫細胞動員および活性化の強力な阻害因子である14.1kDaタンパク質である。このようにして、CHIPSは、いくつかの炎症性疾患、例えば敗血症(Rittirschら、2008)または虚血再灌流傷害および免疫複合体病(Hellerら、1999)の治療用の見込みのある抗炎症性タンパク質である。しかし、ほとんどの個体は、CHIPSについて特異的な抗体の予め形成された力価を有する(Wrightら、2007)。これらの抗体は、CHIPSの機能を中和するか、免疫反応を誘導すると考えられるので、CHIPS分子は、ヒト循環における薬物としてうまく機能するように最適化することにより利益を受けると考えられる。
【０２０１】
定向進化は、タンパク質を改良するための確立されたアプローチである。これは、安定性、活性または親和性のような多くのタンパク質機能を改良するために用いられている(Johannesら、2006)。タンパク質薬物の開発にとって重要なことに、定向進化は、治療能力が増進されたタンパク質バリアントを作製するための有用なツールであることが示されている(Yuanら、2005)。定向進化アプローチは、タンパク質の構造を予め知っておく必要がないので、特に効果的である。部位特異的突然変異誘発に基づく非効率で時間を浪費する方法を用いる代わりに、遺伝子組み換えとハイスループットスクリーニングの回を行って、改良されたバリアントを同定できる。プロセスは反復でき、有益な変異を蓄積するが、(Yuanら、2005)および(Zhao、2007)により概説されるように、興味対象の特性にとって必要でない変異は除外される。
【０２０２】
定向進化のいくつかの独特の方法が、文献に記載されており、中でも、DNAシャフリング(Stemmer、1994a;Stemmer、1994b)および付着伸長プロセス(Staggered Extension process)(StEP)(Yuanら、2005;Zhaoら、1998)がある。フラグメント誘導多様性(FIND(登録商標))とよばれる別のDNA組換え技術は、カルボキシペプチダーゼUの熱安定性(Knechtら、2006)およびIL-1受容体アンタゴニストの活性(Dahlenら、2008)の最適化において有用であることが以前に示されている。
【０２０３】
定向進化は、新しい改良されたタンパク質バリアントを同定するためにうまく用いられているが、このタイプの技術が有する制限は、タンパク質の全体の配列空間をスクリーニングできないことである。しかし、配列空間は、定向進化を計算機によるツールおよび合理的設計と組み合わせるならば、より効率的に探索できる(Wongら、2007;Zhao、2007)。
【０２０４】
本実施例において、FIND(登録商標)を、既存の特異的ヒトIgGとより低い相互作用を有する新しいタンパク質バリアントを創出することを目的として、CHIPS遺伝子の合理的/計算機による設計と組み合わせて用いた。改良CHIPS分子は、既存抗体との反応性が減少するが、C5aRに対する活性を保存することを特徴とする。よって、受容体結合を、IgG相互作用の低減についてのスクリーニングプロセスと並行して監視した。このようにして、我々は、ヒト抗CHIPS IgGとの相互作用が著しく低減しているが、C5aR遮断活性が保存された新しいCHIPSバリアントを単離できた。
【０２０５】
材料および方法
組換えタンパク質のクローニング、発現および精製
野生型(Wt)CHIPS1-121を、以前に記載されたようにしてクローニングし、発現させて精製した(De Haasら、2004)。切断C末端を有するCHIPS(CHIPSΔC)は、クローニングの結果として発現タンパク質のC末端の端に含まれる2つの追加の無関係アミノ酸を有する112アミノ酸長であった(CHIPS1-112)。CHIPSΔCとその対応する単独変異体K61A、K69AおよびK100A、ならびにCHIPSΔN/C(CHIPS31-113)をコードする遺伝子を、wt全長CHIPS1-121をコードする遺伝子から、切断および部位特異的突然変異誘発により創出した。これらのCHIPSバリアントを、次いで、クローニングし、上記のようにして発現させた。単独変異体は、Haasらによる構造解析のために用いたが(Haasら、2005)、抗CHIPS IgG結合についてもスクリーニングし、変異体K61A、K69AおよびK100Aは結合の低下を示した(データは示さず)。
【０２０６】
本研究においてライブラリーから選択されたCHIPSバリアントは、同様の方法で発現させたが、封入体から精製した(Gustafssonら、2009)か、または製造業者により推奨されるようにしてExpressway無細胞大腸菌発現系(Invitrogen、Carlsbad、CA)により発現させた。
【０２０７】
ライブラリーの構築
ランダム突然変異誘発
1回目においてCHIPSバリアントの多様なライブラリーを創出するために(図14を参照されたい)、ランダム突然変異誘発の2つの異なる方法を用いて、合計で4つのライブラリーを創出した。エラープローンPCRを、以前に記載されたようにして行った(Leungら、1989)。高い変異頻度を有する1つのライブラリー(ライブラリー1.1)と、低い変異頻度を有する1つのライブラリー(ライブラリー1.2)とを創出した。20サイクルのPCRを、プライマー(Fw:5’-TCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTTTACTTTTGAACCG-3’[配列番号3]およびRev:5’-GCCTGCGGCCGCAGATCTACCATTAATTACATAAG-3’[配列番号4])を、7.5mM MgCl2および0.64mM MnCl2の存在下で用いて行った。2.5UのAmpliTaq熱安定性DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems、Foster City、CA)を加え、反応を、94℃、5分/(94℃、30秒/55℃、30秒/72℃、40秒)20回および72℃で10分間の最後の伸長のプログラムを用いて行った。GeneMorph II(Stratagene、La Jolla、CA)を、製造業者により推奨されるようにして用いた。10pgのDNA(CHIPSΔCと対応するK61A、K69AおよびK100A単独変異体との混合物)を、低変異頻度ライブラリーの設計のために用い(ライブラリー1.4)、1ngのDNAを、より高い変異頻度を有するライブラリーのために用いた(ライブラリー1.3)。PCR反応は、上記のプライマーを含有し、PCRプログラムは、95℃、2分/(95℃、1分/60℃、1分および72℃、1分)40回および72℃にて10分間の最後の伸長であった。1ngライブラリーの変異頻度を増加させるために、これを、Genemorph II突然変異誘発にもう1回供した。この回は、PCR反応におけるDNAの量は10ngであった。精製の後に、PCR生成物をpGEM-Tベクター(Promega、Madison、WI)に製造業者の推奨に従ってサブクローニングし、配列を分析して、塩基交換を評価した。
【０２０８】
FIND(登録商標)
FIND(登録商標)組換えを、2回〜4回で行って、例えば欧州特許第1341909号および欧州特許第1504098号に記載されるように、組換えクローンの多様なライブラリーを創出した。簡単に述べると、1本鎖DNAを、1つのビオチン付加プライマーと1つの通常プライマーとを用いてPCR生成物を作製することにより調製した。PCR生成物を、ストレプトアビジンコンジュゲート磁性ビーズ(Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch Gladbach、Germany)を含有するカラムに固定化し、μMACSセパレーターの磁場に置いた。PCR生成物を0.1M NaOHで変性させ、溶出される非ビオチン付加DNA鎖を回収し、Recochips(Takara Bio Inc.、Shiga、Japan)を製造業者の推奨に従って用いるアガロースゲル電気泳動により精製した。
【０２０９】
FIND(登録商標)実験は、エキソヌクレアーゼI(Exo I)(New England Biolabs、Ipswich、MA)(100U/μg DNA)で10分間、エキソヌクレアーゼV(Exo V)(USB、Cleveland、OH)(25U/μg DNA)で45分間、エキソヌクレアーゼVII(Exo VII)(USB)(10U/μg DNA)で30分間、別々のチューブ中で製造業者により推奨される緩衝液中にてそれぞれ200ngのセンスおよびアンチセンスssDNAをフラグメント化することにより開始した。エキソヌクレアーゼ消化により得られたssDNAフラグメントを、プライマーを加えることなくPCR様反応において組換え、その後、標準的なPCRプロトコルを用いて増幅した。精製の後に、PCR生成物をpGEM-Tベクター(Promega)に、製造業者の推奨に従ってサブクローニングし、配列を分析した。
【０２１０】
プレートフォーマットでのタンパク質発現
ランダム突然変異誘発またはFIND(登録商標)により創出したCHIPSライブラリーを、改変pRSET Bベクター(Invitrogen)に、BbsIおよびBglII部位にて、大腸菌での発現のためにクローニングした。ライブラリーで、大腸菌BL21 star DE3 pLysS(Invitrogen)を形質転換し、50μg/mlアンピシリンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを補ったLB寒天を含む20cmのQtrayプレート上に蒔き、37℃にて1晩インキュベートした。次の日に、大腸菌コロニーを採取し、50μg/mlアンピシリンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを補った150μlのルリアブロス(LB)を含有する96ウェル丸底プレートに、コロニーピッカーロボットを用いて接種した。培養物を、37℃、78%湿度で、Multitronプレートシェーカー(Infors HT、Bottmingen、Switzerland)で700rpmの振とうにて1晩インキュベートした。1日培養物は、1晩培養物から、50μg/mlアンピシリンを含む新鮮な培地に1/100希釈し、上記のようにして37℃にてインキュベーションを継続することにより調製した。タンパク質発現を誘導するために、0.5mM IPTG(イソプロピルβ-D-チオガラクトシド)を3時間後に培養物に加え、次いで、培養物をさらに3時間培養した。大腸菌培養物を遠心分離によりペレットにし、ペレットを-20℃にて凍結させた。Complete EDTAフリープロテアーゼ阻害剤(Roche、Basel、Switzerland)、25U/ml Benzonase(Sigma-Aldrich、St Louis、MO)および1KU/ml rLysozyme(EMD Chemicals、Darmstadt、Germany)を含むPBS 0.05%Tween 20中の大腸菌ペレットを凍結-融解し、室温にて振とうしながら10分間インキュベートすることにより可溶化液を調製した。
【０２１１】
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発は、QuikChange II突然変異誘発キット(Stratagene)を製造業者の推奨に従って、特定の変異を有するプライマーとともに用いて行った。新しいCHIPSバリアントの配列を確認し、タンパク質発現のために、これで大腸菌BL21 Star(DE3)pLysS(Invitrogen)を形質転換した。
【０２１２】
ヒト抗CHIPS31-113 IgGの親和性精製
精製CHIPS31-113を、CNBr活性化Sepharose 4B(Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden)と結合させ、Tricon 5/20カラム(Amersham Biosciences)に、製造業者の使用説明に従って充填した。親和性精製は、製造業者のプロトコルに従うAKTA Primeシステム(Amersham Biosciences)で行った。トータルヒトIgG(1g)(IV-IgG)(Sanquin、Amsterdam、The Netherlands)をカラムに流し、次いで、結合したヒトIgGを0.1MグリシンpH3.0で溶出し、pHを1M Tris、pH8.0で中和した。タンパク質を含有する溶出画分をプールし、PD-10カラム(Amersham Biosciences)上で緩衝液をPBSに変更した。
【０２１３】
ファージ選択
ランダム突然変異誘発ライブラリーおよびFIND(登録商標)ライブラリーを、ファージミドpFAB75のSfiIおよびNotI部位にクローニングし(Johansenら、1995)、大腸菌TOP10 F’(Invitrogen)をファージ粒子の発現のために形質転換した。ファージストックを、VSCM13(Stratagene)をヘルパーファージとして用いて、標準的なプロトコルに従って調製した(Cicortas Gunnarssonら、2004)。ポジティブ選択を、10-7Mの最終濃度のアミノ酸7〜28からなる硫酸化チロシンを有するビオチン付加C5aRペプチド(ビオチン-C5aRペプチド)(AnaSpec、San Jose、CA)およびストレプトアビジン被覆磁性Dynabeads(Invitrogen)に対して行った。混合物を1時間、回転させながら室温にてインキュベートし、その後、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS 0.05% Tween 20(選択緩衝液)で十分に洗浄した。ペプチドと結合するものの溶出を、1Mグリシン0.1% BSA、pH2.2を用いて行い、その後、1M Tris pH9.0を加えて溶出物を中和した。上記のような選択プロトコルを、次いで、1回反復した。2回目のポジティブ選択の直後に、CHIPSファージストックをヒト抗CHIPS31-113 IgG結合についてのネガティブ選択の回に供した。ヒト抗CHIPS31-113 IgGで被覆したEstapor 0.83μm磁性ビーズ(Bangs-Laboratories Inc.、Fishers、IN)を選択緩衝液で3回洗浄し、次いで、選択緩衝液中で1時間、回転させながら室温にてブロックした。ポジティブ選択からの溶出物をビーズに加え、これらをさらに15分間、室温にてインキュベートした。磁石上で分離した後に、上清を取り置き、指数関数的に成長している大腸菌TOP10 F’の感染のために用い、ファージミドを大腸菌から精製した。
【０２１４】
ELISA
ELISAは、この研究を通して結合のスクリーニングおよび特徴づけのために用いた。Maxisorb透明または白色96または384ウェルプレート(Nunc、Roskilde、Denmark)を4℃にて1晩、PBS中の特異的タンパク質または抗体で被覆した。インキュベーションは、異なることを記載しないならば、100または25μlの容量で1時間、室温にて行い、その後常にPBS 0.05%Tween 20で3回洗浄した。Super Signal ELISA Pico化学発光基質(Pierce、Rockford、IL)を用い、発光を測定した。
【０２１５】
タンパク質発現の分析
発現されたタンパク質の定量のために、プレートを、CHIPSアミノ酸24〜30のペプチドを認識する3μg/mlモノクローナル抗CHIPS抗体2H7で被覆した(Haasら、2004)。プレートを、3%粉乳を含むPBS 0.05%Tween 20でブロックし、洗浄し、ΔC CHIPSバリアントからの可溶化液の希釈物とインキュベートした。結合を、3μg/mlポリクローナルウサギ抗CHIPS N末端IgG(CHIPS N末端アミノ酸1〜14に相当するKLH結合合成ペプチドでウサギを免疫することにより生成されるIgG)およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(Southern Biotech、Birmingham、AL)を用いて検出した。
【０２１６】
抗CHIPS IgG結合の分析
CHIPSΔCバリアントとのヒト抗CHIPS31-113 IgGの結合の検出のために、プレートを被覆し、ブロックし、タンパク質発現の分析について記載したようにして大腸菌可溶化液とインキュベートした。親和性精製ヒト抗CHIPS31-113 IgGを加え、結合を、ヤギ抗ヒトIgG HRP(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)を用いて検出した。最初のスクリーニング中に、単独点測定をCHIPS可溶化液について行って、Wt CHIPS1-121の力価測定曲線と比較した。結果は、発現ELISAからの結果と相関があった。完全な力価測定曲線を、より後のスクリーニング/特徴づけにおいて限定数のバリアントについて作製した。
【０２１７】
ペプチド結合の分析
C5aRペプチドに対するCHIPSバリアントの結合を測定するために、5μg/mlのストレプトアビジン(Sigma-Aldrich)を被覆した。さらに、ビオチン-C5aRペプチド(Anaspec)を、プレートを洗浄してブロックした後に(PBS 0.05%Tween 20中に2% BSA)、0.3μg/mlの最終濃度まで加えた。次いで、プレートをCHIPS可溶化液とインキュベートし、検出を、1μg/ml mAb 2H7およびHRPコンジュゲートウサギ抗マウスIgG(Dako、Glostrup、Denmark)を用いて行った。
【０２１８】
CHIPS1-121との競合における抗CHIPS IgG結合の分析
5倍系列希釈のCHIPSバリアントを、60ng/mlの親和性精製ヒト抗CHIPS31-113ポリクローナルIgGと、ポリプロピレンプレート(Nunc)中で2時間、室温にてプレインキュベートした。精製wt CHIPS1-121でELISAプレートを被覆した。PBS-0.05% Tween-20中の4% BSAでブロックした後に、IgG/CHIPSバリアント混合物をプレートに加え、さらに2時間、室温にてインキュベートした。検出を、ヤギ抗ヒトIgG HRPおよびo-フェニレンジアミンジヒドロクロリド(OPD)基質を用いて行った。
【０２１９】
血清IgG結合の分析
ヒトプール血清からのIgGを、CHIPSバリアントとの反応性についてELISAで試験した。プレートを等モル量のタンパク質またはPBSで被覆した。3%粉乳を含むPBS-0.05% Tween-20でブロックした後に、系列希釈ヒト血清を加えた。CHIPSバリアントとのIgGの結合は、ウサギ抗ヒトIgG-HRP(Dako)で検出した。報告するIgG力価は、発光データを希釈係数に対してプロットし、その後、非線形曲線適合モデルにおいて分析することにより算出した。力価は、カットオフ値に到達する血清の希釈係数として報告した。このカットオフ値は、野生型CHIPS1-121で被覆し、異なる希釈のプールしたヒト血清中のIgGの結合を分析することにより設定した。1/40,000に希釈した血清により生じるシグナルを、カットオフ値として設定した。なぜなら、この希釈での  CHIPS1-121とのIgG結合は、結合曲線の動的区間にあることが示されたからである。
【０２２０】
生物学的アッセイ
ヒトC5aRとの結合
ヒト好中球を、Lund大学病院(Lund、Sweden)から得られたバフィーコートから調製した。バフィーコートを、2%新生仔ウシ血清(NBS)(Lonza)を含むPBSで1/1(v/v)に希釈し、Ficoll Paqueプラス(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)の上に加えた。PBS中で1000×gで30分間遠心分離した後に好中球を回収した。次いで、赤血球を、氷冷H2Oと30秒間インキュベーションすることにより溶解し、4×PBSを加えて、懸濁物を600×g、4℃にて7分間遠心分離した。好中球を、2% NBSを含むPBSに回収し、残存赤血球を、氷冷H2Oと30秒間インキュベーションすることにより溶解し、4×PBSを加えた。好中球を、1000×g、4℃にて5分間遠心分離することにより回収した。
【０２２１】
ヒトC5aRとの結合を、ヒト好中球上、および安定的に形質移入した株化細胞U937/C5aR(E. Prossnitz博士(New Mexico大学、Albuquerque、NM)からの寛大な寄贈品)上で研究した。細胞を、75cm2細胞培養フラスコ中で、5% CO2インキュベータ中、37℃にて成長させ、L-グルタミン(Lonza)および10%胎児ウシ血清(FBS)(Lonza、Basel、Switzerland)を含むRPMI 1640培地で維持した。C5aRとの結合を、フローサイトメトリーにより2つの方法で分析した。第1の方法において、ΔC CHIPSバリアント(InvitrogenからのExpressway無細胞大腸菌発現系により発現される)の系列希釈を細胞とインキュベートし、CHIPS結合を、2H7モノクローナル抗CHIPS抗体により、その後、R-フィコエリスリン(RPE)標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Dako)により検出した。第2の方法において、CHIPSΔCバリアントを上記のようにして細胞とインキュベートし、次いで、結合の阻害の程度を、モノクローナル抗C5aR抗体およびRPE標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンを細胞に加えることにより定量した。
【０２２２】
C5aR遮断
C5aにより誘導されるヒト好中球におけるカルシウム動員を、フローサイトメトリーにより研究した。5×106/mlの好中球を、0.05% BSAを含むRPMI 1640培地中の2μMのFluo-3AM(Sigma-Aldrich)と30分間、室温(RT)にてインキュベートし、その後、洗浄し、0.05 % BSAを含むRPMI 1640に再懸濁した。細胞を、次いで、3倍系列希釈の精製CHIPSバリアント(ΔN/Cフォーマットに再クローニングした)と室温にて30分間プレインキュベートし、C5a(Sigma-Aldrich)(最終濃度0.3nM)を加えてカルシウム放出を誘導した。これを、FACScaliburフローサイトメータ(BD Biosciences、San Jose、CA)で蛍光により測定した。
【０２２３】
C5aにより誘導されるヒト好中球の遊走(走化性)を、トランスウェルシステム(Neuro Probe、Gaithersburg、MD)で測定した。このために、5×106/mlのヒト好中球を4μMのカルセイン-AM(Sigma-Aldrich)で標識し、1%ヒト血清アルブミン(HSA)を含むハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で洗浄し、1% HSAを含むHBSSに再懸濁した。細胞をさらに15分間、RTにて、ある力価の精製CHIPSΔN/Cバリアントとインキュベートした。C5aを、ウェルの下の区画に1nMの最終濃度まで加えた。標識細胞を上の区画に加えた。プレートを30分間、37℃にて5% CO2でインキュベートした。次いで、フィルタをPBSですすいで非遊走細胞を除去し、485nmの励起および530nmの発光にて蛍光プレートリーダーで蛍光を測定した。データは、非線形回帰モデルに適合させた(可変傾斜を有するシグモイド型用量応答曲線0〜100)。
【０２２４】
円二色性(CD)分光法による熱変性
212nmでのCDシグナルを、4℃から85℃までのCHIPSバリアントの熱によるアンフォールディング中に、1℃/分の走査速度、16秒の応答および1nmの帯域幅で監視した。タンパク質濃度は、PBS pH7.2中で0.5mg/mlであり、1mmの光路長の石英キュベットを用いた。可逆性を調べるために、85℃から4℃までの熱走査を、上昇する走査の後に監視した。構造変化を、4℃または85℃にて、各熱走査の前および後の遠UV CDスペクトルから決定した。スペクトルは、250〜195nmで記録し、走査速度は20nm/分であり、応答8秒および帯域幅1nmであった。全てのCD分光法は、JASCO PTC-343ペルティエ型恒温セルホルダを有するJasco(Jasco Inc.、Easton、MD)J-720分光偏光計で行った。熱アンフォールディングは全てのバリアントについて不可逆性であったので、熱力学的安定性は得ることができなかった。しかし、アンフォールディングを全てのバリアントについて同じ速度で監視したので、Tmにより、バリアント間の比較熱安定性が得られる。Tmは、eq.1をCDデータに適合させることにより得た。
【０２２５】
【数１】
2012514465.tif 000006
【０２２６】
eq.1において、εobsは、212nmでの観測楕円率であり、kN、bN、kUおよびbUは、それぞれ非変性および折り畳まれていない状態のベースラインを規定する。Aは、フィッティングプロセスにおけるパラメータであるが、不可逆的アンフォールディングについては値がなく、Tは、ケルビン温度であり、Rは、気体定数である。この等式において、タンパク質は、2段階変性プロセスに従い、変性がGibbs-Helmholtz等式に従うように温度領域において定数ΔCopを有すると仮定される。このようなアンフォールディングについて、パラメータAは、ΔHo.であり、3000がΔCopについての推定基準であるが、これらのパラメータは、不可逆的アンフォールディングについて関連がない。
【０２２７】
分子モデリング
モデリングは、利用可能なCHIPS31-121 NMR構造(PDBコード:1XEE)(Haasら、2005)およびPyMol分子製図プログラム(DeLano、2008)を用いることにより行った。
【０２２８】
結果
低いIgG結合を有するCHIPSバリアントを創出するためのストラテジー
抗CHIPS IgG相互作用を低下させ、C5aR遮断活性を保存するための進化を、1回のランダム突然変異誘発および3回のFIND(登録商標)組換えと、その後の計算機による分析および合理的設計において行った(図14)。NおよびC末端の両方で切断され(CHIPSΔN/C)、ヒト抗CHIPS IgGと結合する傾向がより低いことが以前に示された(データは示さず)単独変異K61A、K69AおよびK100Aを含むより短いCHIPSバリアントを、最適化プロセスのための開始材料として選択した。CHIPS中の最初の30のN末端アミノ酸は、ELISAにおける捕捉抗体のための認識配列として維持した(これは、突然変異誘発または組換えに供さなかった)。選択されたクローンを、次いで、切断(CHIPSΔN/C)フォーマットに再クローニングした後に、生物活性(C5aR阻害)を特徴づけた。
【０２２９】
IgG結合が低下した新しいCHIPSバリアントを見出す可能性を増加させるために、いくつかの異なるELISAを、CHIPSと親和性精製抗CHIPS31-113 IgGとの間の相互作用の研究のために用いた。いくつかの回のスクリーニングを、1回目、3回目および4回目のライブラリーのそれぞれについてELISAにおいて行った。各回の1次スクリーニングは1点測定により行ったが、より後の回のスクリーニングにおけるアッセイは、選択した変異体のそれぞれについて完全な力価測定曲線を作製することにより、より包括的に行った。
【０２３０】
さらに、選択およびスクリーニング中の新しいCHIPSバリアントの生物学的機能性を保存するために、硫酸化チロシンを有するC5aR N末端アミノ酸7〜28のペプチドとの結合を連続的に監視した。C5aRの残基10〜18は、CHIPSのための結合ドメインであることが以前に示されている(Postmaら、2005)。C5aRのチロシン11および14は硫酸化されていることが示されており、これは、C5aRのC5a依存性活性化のために不可欠であることが示された(Farzanら、2001)。C5aR N末端のペプチドとのCHIPS結合についての最近の研究は、CHIPS結合のための11位および14位の硫酸化チロシンの役割を強調しており、CHIPSが高い親和性でC5aR N末端の硫酸化ペプチドと結合することを示している(Ippelら、2009)。
【０２３１】
ランダム突然変異誘発ライブラリーおよびスクリーニング
ランダム突然変異誘発によりCHIPSΔC配列に多様性を導入した。異なる変異頻度を有する4つのライブラリーを創出した(ライブラリーの詳細は、Table3(表3)に示す)。4つ全てのライブラリーをファージ選択、すなわち最初はC5aRペプチド結合について(ポジティブ選択)、その後に抗CHIPS IgG結合の低下についての選択(ネガティブ選択)に供した。ネガティブ選択からの上清をプールして、大腸菌に感染させ、ファージミドを精製した。変異体のプールからのCHIPSコード配列を、発現ベクターpRSET Bに再クローニングし、360のCHIPSバリアントをその後、プレートフォーマットで発現させ、ELISAにおいて抗CHIPS31-113 IgG結合の低下についてスクリーニングした(図15A)。クローンは、wt CHIPS1-121と比較して、平均で70%の抗CHIPS31-113 IgG結合を示した。最も改良されたクローンは、53%の結合を示した。
【０２３２】
最低の抗CHIPS31-113 IgG結合を有する64のクローンを、C5aRペプチド結合の保持についてELISAでさらに分析した。C5aRペプチド結合の平均値は、wt CHIPS1-121と比較して80%の結合であった。最高のC5aRペプチド結合を有する30のクローンを、ELISAにおいて完全な力価測定曲線を作製することによる、抗CHIPS31-113 IgG結合の低下のさらなる分析のために選択した。最終的に、抗CHIPS31-113 IgG結合が著しく低減されたが、C5aRペプチド結合を保持する9クローンを、FIND(登録商標)によるDNA組換えのために選択した。
【０２３３】
FIND(登録商標)ライブラリーおよびスクリーニング
FIND(登録商標) 1回目
異なる組換え頻度(すなわち異なる数の組換え)を有する2つのライブラリーを、ランダム突然変異誘発ステップで選択した9クローン(合計で18のアミノ酸置換を含有する)から創出した(Table3(表3))。ライブラリー2.1は、FIND(登録商標)により、短い無作為化オリゴヌクレオチドを反応に加えて設計した。このオリゴヌクレオチドは、アミノ酸100〜112に相当し、CHIPSのC末端の端における変異の数を増加させるために加えた。ライブラリー2.2は、FIND(登録商標)により、CHIPS配列全体での新しい変異の数を増加させるためにエラープローン条件下で設計した。
【０２３４】
ライブラリーを、上記のようにしてファージ選択に供し、ネガティブ選択からの上清をプールし、ファージミドを大腸菌から精製した。このDNAのプールを、2回目のFIND(登録商標)のための開始材料として用いた。
【０２３５】
FIND(登録商標) 2回目
2回目のFIND(登録商標)において、1つのライブラリー(ライブラリー3.1)を創出した(Table3(表3)を参照されたい)。6.3×103クローンをプレートフォーマットで発現させ、ELISAにおいて、抗CHIPS31-113 IgGおよびC5aRペプチドの両方との相互作用についてスクリーニングした。C5aRペプチドとの平均結合は、wt CHIPS1-121結合の92%であった。抗CHIPS31-113 IgGとのwt CHIPS1-121結合の最大で70%と、C5aRペプチドとのwt CHIPS1-121結合の少なくとも80%とを示した320クローンを、より低い抗CHIPS31-113 IgG結合についての2回目のELISAスクリーニングのために選択した。応答は、別のELISAにおける分析による発現レベルと相関があった。最も改良されたクローンは、wt CHIPS1-121と比較して13%の抗CHIPS31-113 IgG結合を示し、クローンのうちの平均値は、39%結合であった(図15A)。
【０２３６】
これらのうち、40のクローンが、wt CHIPS1-121と比較して<40%結合を示し、次いで、ELISAにおける用量依存的設定においてさらに分析された。各バリアントのEC50値(すなわち最大結合の半分を媒介する各CHIPSバリアントの濃度)およびプラトー値を決定し、wt CHIPS1-121の値と比較した。ランダム突然変異誘発の回からの最良のクローンと比較して改良された12クローンを、FIND(登録商標)組換えの最後の回のために選択した。これらのクローンは、少なくとも2.4高いEC50と、wt CHIPS1-121プラトー値の54%の最大値とを抗CHIPS31-113 IgG結合において示した。
【０２３７】
FIND(登録商標) 3回目
2つのライブラリーを、FIND(登録商標)の最後の回において創出した。第1のライブラリーは、示された14アミノ酸変化を有する選択されたクローンの6つに基づき(ライブラリー4.1)、第2のライブラリーは、前の回のFIND(登録商標)の間に選択された12全てのクローンから作製した(合計で25アミノ酸変化)(ライブラリー4.2)。これらのライブラリーはともに、間に選択またはスクリーニングを行わなずにFIND(登録商標)を2回繰り返すことにより設計し、これにより、以前のライブラリーよりも高い頻度(92%)の組換えクローンが得られた(Table3(表3))。
【０２３８】
9.6×103クローンをプレートフォーマットで発現させ、ELISAにおいて、ヒト抗CHIPS31-113 IgG結合の低下についてスクリーニングした。1000のクローンが、抗CHIPS31-113 IgGとのwt CHIPS1-121結合の最大で10%を示し、C5aRペプチド結合についてELISAにおいてさらに分析された。C5aRペプチド結合の平均値は、wt CHIPS1-121結合の45%であった。wt CHIPS1-121と比較してC5aRペプチドと少なくとも95 %の結合を示した96クローン(図15 A)を、抗CHIPS31-113 IgG結合の低下についてのELISA、およびC5aR結合の保持についてのフローサイトメトリーでのさらなる分析のために選択した。クローンは、wt CHIPS1-121と比較して、平均で7.1%の抗CHIPS31-113 IgGの結合を示した。最も改良されたクローンは、wt CHIPS1-121と比較して、2.5%の結合を示した(図15B)。96クローンの分布を図15Cに示す。
【０２３９】
配列決定の後に、42の独特のクローンを同定した。42クローンの全ては、最後の回のスクリーニングの後に、wt CHIPS1-121と比較して、<10%の抗CHIPS31-113 IgGの結合を示した。これらのクローンを、無細胞タンパク質発現系で発現させて、タンパク質の収率を改良し、生成物を、ELISAおよびフローサイトメトリーによりさらに特徴づけた。この詳細な特徴づけの間に、少数のクローンが、以前のスクリーニングで測定されたよりも高い抗CHIPS31-113 IgGに対する結合を示したので、カットオフ値を、以前の10%の代わりに13%に設定した。ヒトC5aRと最高の結合を示すとともに抗CHIPS31-113 IgGと低い結合(wt CHIPS1-121の<13%)を示す10クローン(図16)を、さらなる突然変異誘発のために選択した。これらのクローンを、table5(表6)に示す。
【０２４０】
分子モデリングおよび合理的設計
抗CHIPS31-113 IgGとの相互作用をさらにより低下させるために、27の新しいCHIPSバリアントを、10の選択したクローンのうちの4つの部位特異的突然変異誘発により創出した(Table5および6(表6および7))。これらの特定のクローンに新しい変異を導入することにより、定向進化中に同定された12の変異位置全てが示された。部位特異的突然変異誘発を、定向進化中に生じた変異アミノ酸残基の構造的な役割に特に注意を払いながら、タンパク質構造を分析することにより設計した。新しい置換が、これらの変異位置のいくつかにおいて示唆され、これらも、定向進化中に生じたクローンと比較して新しい組み合わせに含めた。
【０２４１】
CHIPSバリアントの特徴づけ
変異体を、まず、ELISAにより、C5aRペプチドとの結合について分析した。ペプチドと少なくとも90%の結合を示すクローンを、さらなる分析のために選択した。ヒト好中球を用いて行う後続の結合実験において、112位にアラニンを有するクローンS3.09が、この位置にバリンを有する対応するクローンと比較して(F3.08;wt CHIPS1-121結合の84%)、C5aRとの結合の改良(wt CHIPS1-121結合の105)を示すことが見出された。この理由から、V112を、選択したクローンのほとんどにおいて112位のアラニンに置換した。さらに、クローンをΔN/Cフォーマットに再クローニングし、その後、以前に記載されたようにして(Gustafssonら、2009)、封入体の十分な洗浄、可溶化、リフォールディング(タンパク質溶液をPBSに滴下)およびゲルろ過により封入体から精製した。最高のC5aR遮断活性(C5a刺激後のCa2+放出の遮断)をフローサイトメトリー実験においてU937/C5aR細胞に対して示した16のクローンを、さらなる特徴づけのために選択した。ELISAにより血清IgGとのCHIPS結合を、そしてフローサイトメトリーによりヒト好中球上についての生物学的機能性(C5aR遮断活性)を分析した後に、最終的に7つのクローンを、最も見込みがある候補として選択できた(補足のtableIII(表5)を参照されたい)。この選択は、以下の基準に基づいた:wt CHIPS1-121について観察されるものの最大で2.3%の血清IgG力価、およびwt CHIPS1-121について観察されるものの少なくとも50%のC5aR結合活性(好中球での)。これらのクローンを、好中球遊走(走化性)の阻害を研究することにより、そしてCD分光法によりTm値を決定することによりさらに特徴づけた(Table4(表4))。温度変性は、全てのクローンが、CHIPSΔN/Cと比較して高い融解温度を有することを示す。いくつかのバリアントは、低温で小規模な転移を、そして高温で大規模な転移を示し、このことは、低温での部分的なアンフォールディングを示す。CHIPSΔN/Cは、可逆性のアンフォールディングを示すが、7つのクローン全ては、不可逆性の熱アンフォールディングを示す。このことは、折り畳まれていない状態でのこれらのクローンの、wt CHIPS1-121およびCHIPSΔN/Cと比較してより高い凝集傾向を示唆する。7つのクローンの理論的pI値を、Table6(表7)に示す。これらの値は、wt CHIPS1-121のpI(9.36のpI)よりもわずかに高いので、wt CHIPS1-121および7つのバリアントは、9.36より低いpHにて正味の正電荷を有する。
【０２４２】
図17は、上位7つのクローンの配列アラインメントを示す。クローンは、配列あたり5〜8の変異を含有する。3つの変異位置はαヘリックスに、1つはβ1鎖とβ2鎖との間のループに、2つはβ2鎖とβ3鎖との間のループに、1つはβ鎖3に、1つはβ3鎖とβ4鎖との間のループに、そして2つはβ鎖4にある。より具体的には、K40位、D42位、N77位、K100位、N111位およびG112位が、4つ以上のクローンにおいて、K50位、K69位、K92位およびK105位の変異との異なる組み合わせで変異されている。置換N77Y、N111KおよびG112Aが、クローンのうちで最も一般的であり、それぞれ7つのクローンのうち6つで示されている。
【０２４３】
7つのクローンのうちの1つのバリアント(376)を、最も興味のあるものとして同定し、将来の研究においてさらに特徴づけるために選択した。図18は、クローン376の表面提示を示し、変異に緑色で印をつける。この候補は、上位7つのクローンのうちで最低のIgG力価を有していないが、wt CHIPS1-121と比較してほぼ180倍低下した力価を有する。C5aRシグナル伝達を遮断し、C5aにより誘導される走化性を阻害するこの変異体の高く保存された能力が、より重要であると考えた。
【０２４４】
考察
タンパク質のある特徴は薬物開発のための興味対象であり得るが、見込みのある薬物候補を設計するために、その他の特性が改良されなければならない場合がある。今日では、タンパク質工学を用いることにより最適化されたいくつかの薬物(承認されたかまたは臨床試験中)が存在する。組織プラスミノゲン活性化因子(t-PA)は、数回改良されて、最終的に血清中でのより長い半減期と、フィブリンに対するより高い特異性とを有するようになった(Keytら、1994)。tPAのこの操作されたバージョン(TNKase(登録商標))は、現在、急性心筋梗塞の治療のために承認されている。ANYARAは、現在臨床試験中である、腫瘍特異性を有するスーパー抗原結合抗体である。スーパー抗原であるブドウ球菌エンテロトキシンA、SEAの抗原性を低下させて、ANYARAを、より魅力的な抗腫瘍薬物候補にしている(Erlandssonら、2003)。
【０２４５】
うまく設計されたスクリーニング法と組み合わせて、定向進化を用いて、タンパク質のほとんどいずれの特徴でも改良でき、すなわち、改良された親和性、より高い効力または低減された免疫原性である。しかし、興味対象の特定の特性を改良する場合に、特定の特性の最適化中にこれもまた変更される可能性があるタンパク質のその他の重要な特徴を連続的に監視することが重要である。
【０２４６】
本研究において、我々は、CHIPSバリアントとヒトIgGとの間の相互作用を、wt CHIPS1-121のたった0.5%まで低下しながら、C5aR遮断活性を維持できた。このことは、繰り返しの定向進化およびスクリーニング中にC5aR結合を連続的に監視して、この特性が最適化プロセス中に失われないようにすることにより達成された。さらに、IgG結合が低下された新しいCHIPSバリアントを見出す可能性を増加させるために、この特性を確認するためのいくつかの方法を、繰り返しのスクリーニング中に用いた。
【０２４７】
定向進化(ランダム突然変異誘発およびFIND(登録商標))を、計算機による/合理的設計と組み合わせて用いて、特異的ヒトIgGとのより低い相互作用に向かってCHIPS分子を改良した。多様性をまずランダム突然変異誘発により配列に導入し、その後、3回のFIND(登録商標)を逐次的に行って、各回の後に選択および/またはスクリーニングを行った。CHIPS中の既存IgGについてのエピトープについて予め知っておく必要なく、前の回で有益であると見出された変異を組換えて新しいCHIPSバリアントを形成し、IgG結合は、毎回低下することが示された。FIND(登録商標)の最後の回の後に、最良クローンは、wt CHIPS1-121に対する結合のたった2.5%まで低減されたヒト抗CHIPS31-113 IgGの結合を示した。これは、定向進化を用いることにより達成された結合の著しい減少であった。しかし、結合をさらにより低下させるために、部位特異的突然変異誘発を分子モデリングにより設計し、さらなる変異を導入した。最も改良された最終クローンは、wt CHIPS1-121について観察されたIgG結合の0.5%を示した。このことは、定向進化プロセス中に重要であることが見出された位置の構造分布を分析することにより達成された。
【０２４８】
上位7つのクローンにおける変異の組み合わせは、これらの変異体の独特の特性を担う。異なる変異残基の寄与を調べるための試みにおいて、最終的な7つのクローンのうちで最も頻繁に変異された位置であるD42、N77、N111およびG112の構造分析を用いた。D42は、αヘリックス中のアミノ酸であり、分子内相互作用にとって重要であるとみられる。バリン(V)への置換は、D42とR46との間に形成されるH-H結合を破壊する可能性がある。この変化は、CHIPS分子の構造を変更する可能性があり、また、IgGエピトープもおそらく変化させる。42位への疎水性バリンの導入は、分子の安定性を増加させるとみられる。この疎水性残基は、構造の内部にうまくはまり、疎水性コアを安定化するとみられ、このことが、7つの選択されたクローンのうちの6つでこれが示される理由であると考えられる。しかし、変異は、疎水性の増加を原因として、可逆性および折り畳まれていない状態の凝集傾向に影響する可能性がある。N77は、クローンのうち6つでチロシン(Y)に、1つのクローンでヒスチジン(H)に変異されている。これは、β2-β3ループ中に露出し、IgG結合に直接関与し得る。N77YとN77Hとを比較すると、この位置において、チロシンが、ヒスチジンと比較して安定性を増加させているとみられる。一方、この位置にヒスチジンを有するクローン376は、77位のチロシン以外は同一であるクローン335と比較して、より保存された生物学的機能(走化性の阻害)を有する。N111は、β4における露出残基である。この位置は、リジン(K)への置換によってより正に荷電されるようになり、これは表面の重要な変化であり、7つのクローンのうちの6つで有益であることが示された。β4におけるG112は、特には露出されていない。小さいアミノ酸は、この位置において有利であることが見出された。バリンのような大きいアミノ酸がこの位置に挿入されると、これはM93と衝突し、その結果、構造に影響を与える可能性がある。定向進化中に選択されたG112V変異をアラニン(A)に変化させることは、G112V変異を有する全てのクローンにおいてC5aR遮断活性を保存するために有益であることが見出された。興味深いことに、7つの上位クローンのうち3つ(バリアント335、338および377)は、定向進
化中に見出されたクローンと同じであるが、Vの代わりに112位がAに置換されていた。
【０２４９】
最終的な7つのクローンのうち、12のリジンのうち4つがアルギニンに変異されている。92位および105位のリジンのアルギニン置換は、クローンのうち3つで見出され、100位ではクローンのうち4つで見出される。4つのリジンがアルギニンに置換されていることについて、いくつかの説明が可能である。リジンからアルギニンへの置換は、1つの塩基のみの変化から生じることができ、アルギニンは、リジンと多くの同様の特性を有するが、1塩基変化から達成可能なその他のアミノ酸のいくつかは、リジンとはより異なっており、よって、タンパク質の表面上にはまるにはより困難が伴う。アルギニンは、タンパク質を安定化させている可能性があり、結合表面において多くの場合一般的である。CHIPSバリアントにおいて、アルギニンは、保存されたC5aR結合に寄与しているとみられる。
【０２５０】
ランダム突然変異誘発または定向進化を計算機による/合理的設計と組み合わせるアプローチは、他者によってもうまく用いられている(Buskirkら、2004)。例えば、変異させることが重要な残基についての情報を得るために突然変異誘発をまず用いることができる。このようにして、突然変異誘発を、合理的な選択に基づくよりもむしろ無作為化の観点から行うことができる(Lingenら、2002)。
【０２５１】
我々の結果は、ヒトIgGについてのエピトープを、細菌起源のタンパク質において、定向進化および計算機による/合理的設計を用いることにより効率的に低減できることを示す。
【０２５２】
抗体エピトープの除去は、免疫学のいくつかの規則において適切である。アレルギー研究において、IgEエピトープを除去して、候補ワクチンとして用いるための低アレルギー性のアレルゲン誘導体が創出される(Linhartら、2008;Mothes-Lukschら、2008;Szalaiら、2008;Vrtalaら、2004)。この研究は、主に、エピトープマッピングとその後の遺伝子工学によるかまたはモザイクタンパク質もしくはハイブリッド分子の設計により行われたが、低アレルギー性アレルゲンが定向進化を用いることにより創出された研究もある。最近の研究(Gafvelinら、2007)において、3つのグループ2ダニアレルゲン遺伝子に対する多重遺伝子組み換えによる定向進化により、IgE反応性が低減され、T細胞反応性が保存された低アレルギー性アレルゲンの候補が作製された。
【０２５３】
結論として、定向進化、計算機による分析および合理的設計を用いることにより、我々は、CHIPSとC5aRとの相互作用に高い程度で影響せずに現存する特異的ヒトIgGとの相互作用が低減された新しいCHIPS分子を作製した。この研究は、既存のヒトIgGと複合体を形成する傾向が著しく低減され、そのことによりwt CHIPS1-121タンパク質よりもC5aRアンタゴニストとしてよりよく許容され、機能的により効率的であるので、wt CHIPS1-121タンパク質よりも治療上の使用によりよく適するCHIPSバリアントをもたらした。
【０２５４】
これらのうち、1つのバリアント(376)は、予期せぬことに有利な特性を有することが同定された。このクローンをADC-1004と命名した。
［参考文献１］
2012514465.tif 000007
2012514465.tif 000008
【０２５５】
【表３】
2012514465.tif 000009
【０２５６】
【表４】
2012514465.tif 000010
【０２５７】
【表５】
2012514465.tif 000011
【０２５８】
【表６】
2012514465.tif 000012
【０２５９】
【表７】
2012514465.tif 000013
【０２６０】
(実施例C)
CHIPSバリアントADC-1004は、ヒト血清からのIgGと低い相互作用を示す強力なC5aRアンタゴニストである
CHIPSは、生涯の初期にヒト集団の大多数と遭遇する。なぜなら、黄色ブドウ球菌は一般的な細菌であり、CHIPS遺伝子は黄色ブドウ球菌の60%超に存在するからである。したがって、CHIPSがC5aRと結合することを妨げる循環抗CHIPS抗体は、ヒト血清で検出されている(Wrightら、2007、Mol Immunol 44:2507頁)。循環抗体は、タンパク質の生物学的効果を中和し得る。このような中和抗体は、MS患者における抗IFN-β抗体の存在のように薬物の有効性に影響し得る(Bertolottoら、2000、Immunopharmacology 48:95頁)。さらに、循環特異的抗体は、タンパク質と免疫複合体(IC)を形成し得る。免疫複合体は、血管または器官、例えば腎臓に沈着すると疾患を引き起こすことが知られている。さらに、古典的補体経路のICにより媒介される活性化は、白血球活性化およびその後の組織損傷を導く。よって、抗炎症性分子として機能するCHIPSの能力は、特異的抗体により妨げられる。
【０２６１】
既存抗体と反応することに加えて、ヒトに投与された組換えタンパク質は、新しいTH細胞依存性免疫応答を潜在的に誘導できる。ヒトに投与された組換えまたは外来タンパク質がTH細胞依存性抗体応答を誘導する可能性があるかどうかを予測することは困難であり得る。例えば、動物モデルはヒトでの応答に常にあてはめることができない。しかし、T細胞エピトープアルゴリズムが、候補生物薬剤のTH細胞エピトープ含量の評価のために開発されている(De Grootら、2001、Vaccine 19:4385頁;Desmet、SprietおよびLasters、2002、Proteins 48:31頁;Desmetら、2005、Proteins 58:53頁)。最近のデータにより、これらのモデルを用いてヒト抗体応答を予測できることが確認されている(Korenら、2007、Clin Immunol 124:26頁)。
【０２６２】
CHIPSのN末端アミノ酸は、FPR結合のために必須であることが以前に示された(Haasら、2005、J Mol Biol 353:859頁)。その結果として、N末端切断は、CHIPS活性をC5aR結合に向かって特異的にする。特異的C5aR遮断活性を有し、ヒト抗体との低い相互作用を有する分子を設計するために、定向進化アプローチを用いた。新しく改良されたCHIPSバリアントを、DNA組換え、分子モデリング、部位特異的突然変異誘発および特異的抗体相互作用の低下およびC5aR結合の保存についてのスクリーニングの繰り返しにより発見できた(上記の実施例Bを参照されたい)。本研究において、我々は、ADC-1004とよばれる新しいCHIPSバリアントの、ヒト血清からのIgGとの相互作用、補体活性化、C5aR阻害、免疫複合体形成およびT細胞エピトープ含量に関する特性を異なるアッセイにおいて特徴づけ、このタンパク質を医薬として用いる実現可能性を評価した。我々のデータは、生物学的機能を保持したままタンパク質のIgG結合を特異的に低下できることを示す。ADC-1004は、実際に、C5aRに対する強力なアンタゴニスト活性を有するタンパク質である。既存のヒト抗体は、ADC-1004と非常に弱い相互作用を示し、我々は、ADC-1004を中和する即時型応答はヒトにおいて起こる可能性が低いと推測する。また、我々は、ADC-1004が、異なるin vitroモデルにおいて比較した場合に、全長CHIPS1-121と同じ程度には抗体媒介効果のいずれも誘導しないことを示す。
【０２６３】
材料および方法
組換えタンパク質のクローニング、発現および精製
野生型CHIPS1-121を、以前に記載されたようにして(10)クローニングし、発現させて精製した。CHIPS31-113およびADC-1004は、切断および突然変異誘発により創出した(原稿準備中)。これらのCHIPSバリアントを、次いで、封入体から精製した以外は上記のようにしてクローニングして培養した。簡単に述べると、100mlの大腸菌培養物をペレットにし、ペレットを1晩-20℃にて凍結させた。封入体を、3つの異なる緩衝液、緩衝液1:50mM Tris pH8.0、1mM EDTA、25%スクロース、緩衝液2:20mM Tris pH8.0、0.2M NaCl、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、2mM EDTA、および緩衝液3:10mM Tris pH8.0、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTAで洗浄することにより精製した。ペレットを溶解し、氷上で超音波破砕し、RTにて30分間、各緩衝液中で振とうしながらインキュベートした。次いで、封入体を、各回の洗浄の後に12,000rpmで遠心分離することによりペレットにした。精製した封入体を、50mM Tris-HCl、0.2M NaCl、2mM EDTA、7M GuHCl pH8.0中で可溶化し、PBS中ですぐ希釈することによりリフォールディングし(最終タンパク質濃度は最大で100μg/ml)、回転しながらRTで1晩インキュベートした。次いで、AmiconUltraスピンフィルタ(Millipore、Billerica、MA)上で濃縮した後に、タンパク質を、HiLoad 16/60 Superdex 75調製グレードカラム(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)上でのゲルろ過によりさらに精製した。タンパク質濃度は、QuantiPro BCAアッセイキット(Sigma Aldrich、St Louis、MO)により決定した。
【０２６４】
ヒト好中球の単離
ヒト好中球を、Lund大学病院(Lund、Sweden)から得られたバフィーコートから、Percoll(Sigma-Aldrich)密度勾配遠心分離により調製した。残存赤血球を、氷冷H2Oを用いて30秒間溶解した。細胞を、最後に、RPMI-1640/0.05% BSA中に回収した。
【０２６５】
細胞培養
C5aRを形質移入したU937細胞(ヒト前単球株化細胞)(U937/C5aR)は、E. Prossnitz博士(New Mexico大学、Albuquerque、NM)からの寛大な寄贈品であった。細胞を、75cm2細胞培養フラスコで、5% CO2インキュベータ中、37℃にて成長させ、L-グルタミン(Cambrex、Verviers、Belgium)および10% FBS(Cambrex、Verviers、Belgium)を含むRPMI 1640培地で維持した。
【０２６６】
ヒト血清との相互作用
ヒトプール血清または128、28および127の健常個体からの血清(3H Biomedical、Uppsala、Sweden)を、それぞれCHIPS1-121、CHIPS31-113、ADC-1004との反応性についてELISAで試験した。ヒトプール血清は、ストレプトキナーゼ(Aventis-Behring、King of Prussia、PA)およびアナキンラ(Amgen Inc.、Thousand Oaks、CA)との結合についても試験した。プレートを等モル量のタンパク質またはPBSで被覆した。系列希釈ヒト血清を加えて結合させた。CHIPSバリアントとのIgG結合を、HRPコンジュゲートウサギ抗ヒトIgG(Dako A/S、Glostrup、Denmark)を用い、その後にSuper Signal ELISA Pico化学発光基質(Pierce、Rockford、IL)を用いて発色させることにより検出した。被覆したCHIPS1-121と結合する1/40000に希釈した血清を用いて、カットオフ値を再生した。発光を測定し、希釈係数に対してプロットし、非線形曲線適合モデルにおいて分析して、カットオフ値に到達する希釈を算出し、これを力価として報告した。
【０２６７】
補体沈着
ヒト血清からの抗CHIPS抗体とCHIPSバリアントとの間の相互作用により媒介される補体沈着を、ELISAにおいて研究した。プレートを等モル量のCHIPS1-121、CHIPS31-113、ADC-1004またはPBSで被覆し、ヒト血清とインキュベートした。補体沈着を、マウス抗ヒトC3c抗体(Quidel、San Diego、CA)およびHRPコンジュゲート抗マウスIg(Dako A/S)を用い、その後、Super Signal ELISA Pico化学発光基質を加えることにより定量した。発光を測定し、血清濃度に対してプロットした。
【０２６８】
生物活性アッセイ
C5aにより誘導される好中球の走化性を、8.0μmのフィルタサイズを有するChemoTxトランスウェルシステム(Neuro Probe、Gaithersburg、MD)で測定した。5×106/mlのヒト好中球を、4μMカルセイン-AM(Sigma Aldrich)で20分間、RTにて穏やかに撹拌しながら標識し、1% HSAを含むHBSSで1回洗浄し、細胞を2.5×106/mlまで1% HSAを含むHBSSに再懸濁した。細胞を、さらに15分間、RTにて、ある力価のCHIPSバリアントとインキュベートした。C5a(Sigma Aldrich)を、ウェルの下の区画に1nMの最終濃度まで加えた。上のウェルを組み立て、標識細胞を上の区画に加えた。標識細胞を、対照ウェルにおける下の区画に加えて、合計の係数を表した。プレートを30分間、37℃にて5% CO2でインキュベートした。次いで、フィルタをPBSですすいで非遊走細胞を除去し、蛍光を、485nmの励起および530nmの発光にて測定した。結果は、CHIPSを加えていない細胞と比較した走化性の%阻害として表す。
【０２６９】
精製CHIPSバリアントを、ヒト好中球においてC5aにより誘導されるカルシウム動員を阻害するそれらの能力について試験した。簡単に述べると、5×106/mlの好中球を、0.05% BSAを含むRPMI 1640培地中の2μM Fluo-3AM(Sigma Aldrich)と室温にて30分間インキュベートし、2回洗浄し、0.05% BSAを含むRPMI 1640培地に106細胞/mlの濃度まで再懸濁した。細胞を、3倍系列希釈のCHIPSバリアントと室温にて30分間プレインキュベートした。基底蛍光レベルを各試料について、およそ10秒間測定した後に、C5a(Sigma Aldrich)(最終濃度3 nM)を加え、試料をすぐに試料ホルダに戻して、FACScaliburフローサイトメータ(BD Biosciences、San Jose、CA)での測定を継続した。試料を、前方散乱および側方散乱について細胞集団をゲーティングした後に分析した。結果を、CHIPSを添加しない細胞のパーセンテージ阻害として表す。
【０２７０】
T細胞エピトープ分析
CHIPSバリアントを、T細胞エピトープ含量について、Epibase(登録商標)システム(Desmet、SprietおよびLasters、2002、Proteins 48:31頁;Desmetら、2005、Proteins 58:53頁)を欧州特許第1226528号に従って用いて分析した。
【０２７１】
分子モデリング
モデリングは、利用可能なCHIPS31-121 NMR構造(PDBコード:1XEE)(18)およびPyMol分子製図プログラム(DeLano、2002、The PyMol Molecular Graphics System. Delano Scientific, San Carlos)を用いることにより行った。
【０２７２】
結果
ADC-1004
ADC-1004は、CHIPS31-113配列に基づき、7アミノ酸置換、すなわちK40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111KおよびG112Aを有する新しいCHIPSバリアントである。ADC-1004は、突然変異誘発、ならびに特異的抗体相互作用の低下およびC5aR結合の保存についてのCHIPSライブラリーのスクリーニングにより発見された。CHIPS31-121折り畳みは、多次元NMRにより決定されたように、N末端両親媒性αヘリックスと四本鎖逆平行βシートとからなることが以前に記載されている(18)。このモデルを用いて、我々が本研究において特徴づけるADC-1004の特徴に寄与するADC-1004変異の構造的分布を示した(図18)。
【０２７３】
ADC-1004は、ヒト血清においてIgGと低レベルの相互作用を示す
ADC-1004の有用性を評価するために、ヒト血清におけるIgGとのその相互作用をELISAにおいて研究した。ADC-1004に対するIgG力価を、CHIPS1-121、CHIPS31-113、ストレプトキナーゼおよびアナキンラ(関節リウマチの治療用に承認された組換えIL-1受容体アンタゴニスト)に対する力価と、健常有志からのヒト血清を用いて比較した。アナキンラについての力価は、陰性対照として含めた。なぜなら、この分子に対して力価は検出できなかったからである。ADC-1004抗体力価は、CHIPS1-121(172倍低い)、CHIPS31-113(9倍低い)およびストレプトキナーゼ(15倍低い)の力価より著しく低いことが示された(図19A)。さらに、個体血清の力価の分析は、著しく多数の個体がADC-1004よりもCHIPS1-121およびCHIPS31-113に対して応答性であることを示した(図19B)。CHIPS1-121に対して最高のIgG応答を示した個体は、CHIPS31-113およびADC-1004に対しても最高の応答者である。
【０２７４】
ADC-1004は、低レベルの抗体依存性補体活性化を誘導する
循環中の抗体は、組換えタンパク質の作用を多くの方法で妨げることができる。抗CHIPS抗体の中和効果に加えて、CHIPSと抗体との相互作用は、補体カスケードをおそらく活性化できる。このような活性化は、白血球活性化およびその結果としての組織損傷のような望ましくない効果を導く可能性がある。
【０２７５】
補体活性化を研究するために、CHIPSバリアントでELISAプレートを被覆し、ヒト血清の系列希釈物とインキュベートし、補体フラグメントC3cの沈着を定量した。上で示した血清IgG相互作用実験からの結果によると、ADC-1004は、最低のC3c沈着を媒介した。10%血清にて、ADC-1004により媒介されるC3c沈着は、CHIPS1-121により誘導されるものより6倍低く、CHIPS31-113により誘導されるC3c沈着より3倍低いことが示された(図20A)。さらに、28名の個体からの血清の分析は、CHIPS1-121およびCHIPS31-113と比較して、10%血清にて、ADC-1004とのインキュベーションによる著しくより低いC3c沈着も示した(図20B)。
【０２７６】
ADC-1004は、C5aにより誘導される好中球活性化および遊走を阻害する
CHIPSは、C5a依存性好中球活性化および遊走を、C5aRを遮断することにより阻害する。ADC-1004がC5aにより誘導される走化性および活性化を阻害することにおいて機能的であるかどうかを調べるために、このCHIPSバリアントを、CHIPS1-121およびCHIPS31-113と、2つのアッセイにおいて比較した。
【０２７７】
まず、C5aRシグナル伝達阻害を、細胞内カルシウムの動員をフローサイトメトリーにより測定することにより調べた。CHIPSバリアントの系列希釈物をFluo-3標識好中球とプレインキュベートし、細胞をC5aで刺激した。フローサイトメトリーデータは、ADC-1004のカルシウム放出の50%阻害のために必要な濃度(IC50)が0.4nM±0.12であったことを示した(これは、3回の独立した実験から算出した平均値である)。平均値は、CHIPS31-113のIC50と同じであり、CHIPS1-121のIC50の2倍であった。代表的な例を図21Aに示す。次に、好中球遊走を、トランスウェルシステムで研究し、ここでは、CHIPSバリアントの系列希釈物を、カルセイン標識好中球と、トランスウェルの上の区画でプレインキュベートした。標識好中球を、次いで、下の区画へメンブレンを超えてC5a勾配に向かって遊走することを可能にした。結果は、ADC-1004のIC50が、CHIPS31-113のIC50と同じであり、CHIPS1-121のIC50よりおよそ4倍高かったことを示す(図21B)。
【０２７８】
ADC-1004 T細胞エピトープ含量
T細胞エピトープは、TH細胞活性化を確実に行うために必要なタンパク質のペプチドである。ADC-1004のT細胞エピトープ含量を、野生型全長CHIPS(CHIPS1-121)のものと、in silicoモデル(Epibase(登録商標);(Desmet、SprietおよびLasters、2002、Proteins 48:31頁;Desmetら、2005、Proteins 58:53頁))において比較して、新しいTH細胞依存性抗体応答を誘導するADC-1004の見込みを評価した。Table7(表8)は、予測されるエピトープの合計数が、ADC-1004において、CHIPS1-121におけるよりも少ないことを示す。さらに、ADC-1004における予測されるエピトープは、CHIPS1-121において見出されるものとは異なり、より乱雑さが低い(データは示さず)。
【０２７９】
考察
補体フラグメントC5aは、多くの炎症性障害に関与する機構であるC5aRによる炎症誘発効果を奏する強力なペプチドである。C5aRは、よって、これらの疾患において重要な薬物標的であると考えることができる(Monkら、2007、Br J Pharmacol. 152(4):429〜48頁;RicklinおよびLambris、2007、Nat Biotechnol 25:1265頁)。C5aRアンタゴニストであるCHIPSは、自然免疫系を調節することによりホスト応答を回避するためにヒト病原体である黄色ブドウ球菌により産生されるタンパク質の1つである(De Haasら、2004、Agent. J Exp Med 199:687頁;Leeら、2004、J Infect Dis 190:571頁;Rooijakkersら、2005、Nat Immunol 6:920頁;Jongeriusら、2007、J Exp Med 204:2461頁)。CHIPSを指向する抗体は、ヒト血清において見出されている(Wrightら、2007、Mol Immunol 44:2507頁)。よって、このタンパク質は、ヒトにより許容されるとは考えられず、in vivoでのCHIPS活性は、中和される見込みがある。本質において、CHIPSは、強力なC5aRアンタゴニストであるが、既存の特異的抗体を原因としてヒトでの使用が制限される。
【０２８０】
このタンパク質をin vivoで用いる実行可能性を増加させるために、我々は、ADC-1004とよばれる改良された機能体を創出した。このCHIPSバリアントは、7つのアミノ酸置換を有し(上記の実施例Bを参照されたい)、これらは一緒に、ADC-1004タンパク質の新しい特徴に寄与する。興味深いことに、ヒト抗体との相互作用を完全に変更する多数の変異にもかかわらず、C5aRを阻害する生物学的機能は保持されている。おそらく、いくつかのアミノ酸置換は、実際は、ADC-1004との抗体結合の低下に直接関与するよりもむしろCHIPS折り畳みを安定化している(上記の実施例Bを参照されたい)。
【０２８１】
我々は、全長CHIPS1-121および切断CHIPS31-113バリアントに対する力価、ならびに2つの現存する生物製剤に対する力価と比較して、ADC-1004に対するIgG力価を決定した。比較のために、細菌タンパク質に由来する現存する医薬であるストレプトキナーゼを用いた。ストレプトキナーゼは、30年より長く心筋梗塞の治療のために用いられており、今でも用いられている(ISIS-2. ISIS-2(Second International Study of Infarct Survival) Collaborative Group.、1988、Randomised trial of intravenous streptokinase, oral aspirin, both, or neither among 17,187 cases of suspected acute myocardial infarction、Lancet 2:349頁)。ADC-1004は、プール血清および異なる個体からの血清の両方のヒト血清からのヒトIgGと低い相互作用を示した。ADC-1004の力価は、全長CHIPS1-121力価より172倍、ストレプトキナーゼについてより15倍低かった。また、ADC-1004に対して強い応答性の個体はいなかったが、数名の個体は、全長CHIPS1-121に対して特に高い力価を示した。
【０２８２】
ヒト抗体とのこの低い相互作用は、有利であることが示された。なぜなら、ADC-1004は、全長CHIPS1-121またはCHIPS31-113と同程度には、抗体により媒介される影響を誘導しなかったからである。CHIPSバリアントをELISAに固定化して血清を加えることにより補体活性化を研究する場合に、ADC-1004は、補体活性化を誘導することに乏しいことが示され、全長CHIPS1-121よりも6倍低いC3c沈着を生じた。これらのデータは、免疫により媒介される有害な影響が、ADC-1004の投与によって、試験した他のCHIPSバリアントよりも誘導される可能性がより低いことを示唆する。
【０２８３】
特に、導入した変異は、ADC-1004の生物学的機能を除去しなかった。ADC-1004は、CHIPS31-113のものと等しく、全長CHIPS1-121のIC50値よりも4倍高いIC50値を、C5aにより誘導される好中球遊走の阻害において示した。C5a刺激によるヒト好中球におけるカルシウム放出の阻害により生物活性を研究した場合に、CHIPSバリアント間でさらにより小さい違いがあった。ADC-1004 IC50の平均値は、CHIPS31-113のIC50と同じであり、全長CHIPS1-121のものの2倍であった。
【０２８４】
以前に、C5aRとのCHIPS結合を妨げる抗CHIPS抗体が、ヒト血清中で検出された(Wrightら、2007、Mol Immunol 44:2507頁)。in vivoでの機能性にとって非常に重要なことに、ADC-1004は、カルシウム放出アッセイにおいて示されたように、ヒトC5aRを安定的に形質移入したU937細胞上で試験した場合に、全長CHIPS1-121と同程度にはヒト血清により阻害されなかった(データは示さず)。ヒト血清におけるIgGとのADC-1004の相互作用は、ELISAにおいて研究した場合に検出不可能であったが、いくつかの低親和性エピトープがタンパク質に存在し、ADC-1004をカルシウム放出モデルにおいて研究した場合に観察された血清効果を説明できる可能性がある。また、他のIgクラスが、CHIPSに対するヒト応答に関与し得る。我々は、異なるCHIPSバリアントに対するIgM応答を観察したが、これは、IgG応答よりも常に3〜20倍低い。
【０２８５】
ADC-1004は、既存のヒトIgGと非常に弱い相互作用を示す。しかし、考慮すべき免疫原性の他の観点がある。これが、多くの組換えまたは非ヒトタンパク質がそうであるのと同様に、TH細胞依存性免疫応答を誘導しやすいかどうかを評価することも重要である。タンパク質中の外来エピトープまたは隠蔽されたエピトープの露出を導くグリコシル化の欠如、ならびに最適以下の処方による凝集体の存在は、生物製剤においてみられる免疫原性のいくつかの原因である(Schellekens、2003、Nephrol Dial Transplant 18:1257頁)。しかし、組換えタンパク質中のT細胞エピトープは、タンパク質を慢性障害の治療のために開発するならば、すなわち、同じ患者に1回より多くそれを投与するならば、考慮すべきより重要なことである。ADC-1004は、小さいタンパク質であり、おそらく、急性炎症の治療において最も有益であると考えられる。なぜなら、その小さいサイズを原因として、循環中で短い半減期を有する可能性があるからである。ADC-1004のT細胞依存性免疫原性が全長CHIPS1-121と比較して増加していないことを確認するために、我々は、CHIPSバリアントのT細胞エピトープ含量をin silicoモデルにおいて評価した。ADC-1004は、CHIPS1-121のものより少なく、このモデルにおいて以前に研究された他のタンパク質(Van Walleら、2007、Expert opinion on biological therapy 7:405頁)と同等の、中程度の数の可能性のあるT細胞エピトープ(合計で11の強いTHエピトープ)を含有することが示された。例えば、非ホジキンリンパ腫およびRAの治療用に承認されたキメラ抗体リツキシマブは、合計で22の強いTHエピトープを含有することが示され、現在臨床試験中のヒト抗体オファツムマブは、合計で6の強いTHエピトープを含有することが示された。いくつかのエピトープが、CHIPS1-121とADC-1004との間で異なることを考慮することも重要である。よって、強いT細胞メモリー応答は、ADC-1004の投与により生じる可能性が、CHIPS1-121よりも低い。なぜなら、既存のメモリーT細胞は、CHIPS1-121で見出されるエピトープに対して適合されているからである。ADC-1004に対するいずれのT細胞応答も、よって、伝統的な非メモリーに基づく応答である。既存抗体の回避、すなわちB細胞エピトープの除去と、TH細胞メモリー回避との組み合わせのアプローチは、野生型CHIPSタンパク質よりもADC-1004の免疫原性が著しくより低いことと矛盾しない。
【０２８６】
結論として、CHIPSを用いる我々の研究は、ヒト血清中の抗体とのタンパク質の相互作用を、タンパク質の生物学的機能を保持しながら、著しく低下できることを示す。
［参考文献２］
2012514465.tif 000014
2012514465.tif 000015
2012514465.tif 000016
【０２８７】
【表８】
2012514465.tif 000017
【０２８８】
(実施例D)
急性心筋梗塞および再灌流傷害の治療におけるCHIPSバリアントADC-1004の効力のin vivo研究
序説
経皮カテーテルに基づくアプローチを、外傷、手術により誘導されるストレスおよび循環生理機能における2次的変化を最小限にして虚血を誘導するために選択した。心筋梗塞のサイズを、1次的な影響のパラメータとして選択した。なぜなら、臨床的背景において、長期の転帰は梗塞サイズに大きく依存するからである[1]。心筋梗塞サイズの低減は、再灌流療法における目的でもある。冠血管閉塞の開放後の良好な巨視的結果を達成する再灌流療法は、しかし、微小血管損傷に起因する持続性のST部分上昇をもたらし得る[2]。微小血管損傷の程度は、心筋虚血の期間および心筋梗塞の程度と関連するが、再灌流傷害を原因とする可能性もある。微小血管閉塞の存在は、より悪い臨床転帰と関連する[3]。MOを、よって、補足的な効果パラメータとして選択した。Ex vivo MRIは、心筋梗塞の高い解像度の画像の達成を可能にし、TTC染色を用いる組織学と密接に相関し[4]、よって、これをIS評価の方法として選択した。SPECTは、虚血中の危険性のある領域を決定するために用いた。微小血管閉塞の存在は、いくつかの病態生理学的機構を有し得る[5]。これらのうちの1つは、再灌流の際の好中球により誘導される炎症応答である。梗塞領域におけるC5aR(CD88)保持細胞は、組織学により決定できる。好中球活性化の状態は、組織学切片でのCD88および活性化マーカーCD18により監視できる。ADC-1004治療による活性化好中球の低下は、好中球炎症応答の低減を示す。
【０２８９】
材料および方法
実験準備
8匹の健常な飼育された雄および雌の40〜50kgのブタを、水を自由に摂取させて1晩絶食させた。処置の30分前に、Kataminol(ケタミン、Intervet AB Danderyd Sweden)およびRompun(キシラジン、Bayer AG、Leverhusen、Germany)で前投薬を行った。チオペンタール(Pentothal、Abbott、Stockholm、Sweden) 5〜25mg/kgで麻酔を誘導した後に、動物に、カフ付き気管内チューブを経口的に挿管した。その後に、緩衝グルコース(25mg/ml)中の1.25μl/mlフェンタニル(Fentanyl、Pharmalink AB、Stockholm、Sweden)の緩慢な注入を1.5ml/分の速度で開始し、必要に応じて調整した。バランス麻酔中に、小用量の急速投与で、動物の要求に対してチオペンタール(Pentothal、Abbott、Stockholm、Sweden)の用量を設定した。人工呼吸を、Siemens-Elema 900B人工呼吸装置を用いて容量制御モードで、炭酸正常状態を得るために調節して確立した。最初の設定は、呼吸数15/分、換気容量10ml/kgおよび終末呼気陽圧5cmH2Oであった。動物には、亜酸化窒素(70%)と酸素(30%)との混合を通気した。ブタを、心電図(ECG)および動脈圧を用いて連続的に監視した。ヘパリン(200IU/kg)を、カテーテル挿入の開始時に静脈内投与した。6 Fイントロデューサーシース(Onset、Cordis Co. Miami、FL、USA)を、外科的に露出させた左頸動脈に挿入し、その際に、6 F JL4 Wiseguide(商標)(Boston Scientific Scimed、Maple Grove、MN、USA)を、左の主冠動脈に挿入した。カテーテルを用いて、0.014インチPT Choice(商標)ガイドワイヤ(Boston Scientific Scimed、Maple Grove、MN、USA)をLADの遠位部に配置した。3.5×15mm Maverich(商標)モノヴェール(monovail)血管形成バルーン(Boston Scientific Scimed、Maple Grove、MN、USA)を、次いで、第一対角枝のすぐ遠位側で、LADの中央部に配置した。全ての放射線学的処置は、実験的カテーテル挿入実験室(Shimadzu Corp.、Kyoto、Japan)で行った。
【０２９０】
虚血プロトコル
虚血を、血管形成バルーンを40分間膨張させることにより誘導した。冠血管の全体的な閉塞を確認し、バルーンの位置を修正するために、バルーンの膨張後とバルーンの収縮前に血管造影を行った。バルーンの収縮の後に、後続の血管造影を行って、以前に閉塞させた動脈における血流の回復を確認した。
【０２９１】
ADC-1004送達プロトコル
0.9%NaCl中の約4mg/kgのADC-1004の1回用量を、虚血誘導のおよそ22分後に8匹の動物に静脈内投与した。8匹の動物は、食塩水のみを受容した。ADC-1004の血漿濃度を、実験中に監視し、目標血漿濃度を、実験を継続した4時間40分にわたって達成した(虚血の誘導をt=0として用いて)。
【０２９２】
SPECTによる危険性のある領域のex vivo評価
単一光子放射型コンピュータ断層撮影(SPECT)を用いて、左心室心筋のパーセントとしてのAARを評価した。500 MBqの99mTc-テトロフォスミンを、血管形成バルーンの収縮の18分前に静脈内投与した。Ex-vivo撮像は、2検出器カメラ(Skylight、Philips、Best、the Netherlands)を32投影(投影あたり40秒)で、5×5×5mmのデジタル解像度を生じる64×64マトリクスで用いて行った。最尤推定-期待値最大化(MLEM)を用いる逐次再構成を、0.6のナイキストおよび5.0の次数に設定したカットオフ周波数を有する低解像度Butterworthフィルタを用いて行った。減弱補正または散乱補正は用いなかった。最終的に、短軸および長軸の画像を再構築した。MR画像において手動で線引きした左心室の心内膜および心外膜の境界を、共に記録されるSPECT画像にコピーした。SPECT欠陥は、心筋の最大計数の55%より低い計数を有するMRIにより決定される心筋内の領域として規定した[6]。
【０２９３】
ex vivo MRIにより評価した梗塞サイズおよび微小血管閉塞
心臓のex vivo撮像を、1.5 T Philips Intera CV MRスキャナ(Philips、Best、the Netherlands)を以前に記載されたプロトコルに従って用いて行った[4、7]。簡単に述べると、ガドリニウムに基づく造影剤(Dotarem、ガドテル酸、Gothia Medical、Billdal、Sweden)を、心臓の回収の30分前に静脈内投与した(0.4mmol/kg)。心臓を、再灌流の開始の4時間後に回収した。回収後に、心臓を冷却した食塩水で直ちにすすぎ、心室に重水素化水を含有するバルーンを充填した。T1強調画像の3次元収集(TR=20ms、TE=3.2ms、フリップ角=70°および2平均)により、心臓全体をカバーする0.5mmの等尺性解像度を有するおよそ200の画像の積み重ねが得られた。次いで、画像を、頭部コイルを用いて収集し、収集期間は、典型的に45分であった。MR画像を、無料で利用可能なソフトウェアを用いて分析した[8、9]。左心室心筋の心内膜および心外膜の境界を、短軸ex vivo画像において手動で線引きした。このことにより、左心室心筋の容量が規定された(cm3=ml)。梗塞サイズ(IS)は、まず、梗塞性心筋の容量(cm3)として決定した。梗塞容量を、スライス厚(cm)と、非梗塞遠隔心筋の平均強度を超える>8SDと規定される梗塞閾値を超えるシグナル強度を有する高度強調画素の面積(cm2)との積として算出した。微小血管閉塞は、梗塞についての閾値未満のシグナル強度を有する梗塞の核の低強度領域として規定した。これらの領域を、梗塞容量に手動で含めた。微小血管閉塞の容量(cm3)は、微小血管閉塞の領域を手動で含める前および後の梗塞容量の差として算出した。さらに、微小血管閉塞のサイズは、危険性のある領域のパーセントとして表した。結局、梗塞サイズは、左心室心筋のパーセントとして表した。最後に、梗塞サイズは、群同士の間での危険性のある領域における任意の差について調整するために、危険性のある領域のパーセンテージ(IS/AAR)として表した[10、11]。
【０２９４】
組織学
ブタ#7および#8の梗塞領域からの心筋組織を、本研究において用いた。組織を、4%ホルムアルデヒドで固定するか、ドライアイス上で冷却したイソペンタン中で急速凍結させた。ホルムアルデヒド固定組織は、パラフィンに包埋し、5μmで切片化し、37℃にて1晩乾燥させ、以下に記載する方法に従って染色した。凍結保存組織は、8μmで切片化し、室温にて1晩乾燥させ、以下に記載する方法に従って染色した。
【０２９５】
CD88、Serotec、MCA 1283Tでの染色を、5μmパラフィン切片について行った。試料を、パラフィン除去し、抗原修復処理を、ホウ酸(pH8.0)中で、10分間の煮沸および20分間の室温での冷却により行った。試料を、次いで、水道水中の1% H2O2で20分間処理し、PBS中で3回洗浄し、PBS中の5%正常ヤギ血清中で30分間インキュベートした。その後、試料を、5%正常ヤギ血清を含むPBSで1μg/mlに希釈した1次抗体であるマウス抗ヒトCD88と30分間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後に、試料を30分間、Envisionマウス(Dako、K4001)とインキュベートし、再びPBSで2回およびTris-HClで1回洗浄した。最後に、試料をDABと5〜10分間、およびMayersヘマトキシリンと5秒間処理して、カバーガラスを載せた。
【０２９６】
CD18、abcam、ab34117での染色を、8μm凍結切片で行った。試料をアセトンで10分間固定し、水道水中の1% H2O2で20分間処理し、PBSで3回洗浄し、PBS中の5%正常ヤギ血清中で30分間インキュベートした。その後、試料を、5%正常ヤギ血清を含むPBSで1μg/mlに希釈した1次抗体であるマウス抗ブタCD18と60分間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後に、試料を30分間、Envisionマウス(Dako、K4001)とインキュベートし、再びPBSで2回およびTris-HClで1回洗浄した。最後に、試料をDABと5〜10分間、およびMayersヘマトキシリンと5秒間処理して、カバーガラスを載せた。スライドは、PCに基づく画像分析システム(Leica Q500、Cambridge、UK)を用いて顕微鏡により分析し、染色が陽性であった領域のパーセンテージを算出した。
【０２９７】
結果
ADC-1004を、急性心筋梗塞のブタモデルで試験した。虚血は、16匹の動物で誘導し、そのうち8匹のブタは食塩水中のおよそ4mg/kgのADC-1004を受容し、8匹のブタは食塩水を受容した(対照群)。動物を、材料および方法に記載されるようにして処置して試験した。
【０２９８】
図22および図23に示す結果は、ADC-1004が、MR/SPECT(p<0.007、マン-ホイットニーU検定)により測定される虚血領域(危険性のある領域)に関して梗塞サイズを有意に低減することを示す。このことは、ADC-1004の臨床的治療効果を支持する。なぜなら、長期間の転帰は、梗塞サイズに大きく依存するからである[1]。平均微小血管閉塞は、ADC-1004で処置した群において低減した。微小血管閉塞は、心筋梗塞の重症度と関係することが臨床的に証明されている因子である[3]。微小血管閉塞の背景にある病態生理学的機構の1つは、再灌流の際の好中球により誘導される炎症応答であり得る[5]。組織学調査からの結果は、多数の明らかなCD88陽性細胞が、プラセボ切片およびADC-1004処置からの切片の両方の梗塞領域において観察されることを示す。両方の場合において、陽性細胞の数は、約250/mm2である。陽性細胞は、血管において、そして心筋線維と混合されて見出される。CD18は、弱い陽性から強い陽性の細胞までより変動性の反応を示す。プラセボ試料は、ADC-1004受容試料(図24B)と比較して、明らかにより陽性の細胞(図24A)を示す。さらに、より強く染色された細胞が、処置試料と比較してプラセボにおいて見られる。画像分析装置を用いる測定は、プラセボが、ADC-1004処置と比較して2〜3多いCD18を発現することを示し、このことは、ADC-1004投与により好中球の活性化が低減されたことを示す。
【０２９９】
よって、提示したデータは、急性心筋梗塞においてADC-1004の投与によりC5aRに作用すること(そしてそれにより好中球による活性化および炎症を阻害すること)により、梗塞の重症度が低下することを示す。
［参考文献３］
2012514465.tif 000018
2012514465.tif 000019
【０３００】
(実施例E)
脳卒中および再灌流傷害の治療におけるCHIPSバリアントADC-1004の効力のin vivo研究
序説
本研究の目的は、24時間注入する注入での、中大脳動脈の閉塞の1時間45分後および再灌流の15分前に開始するADC-1004での処置が、一過性中大脳動脈閉塞(tMCAO)のラットモデルにおける脳梗塞サイズに示差的に影響するかどうかを調べることであった。
【０３０１】
材料および方法
一時的中大脳動脈閉塞(tMCAO)
全ての外科的処置は、Lund大学の動物研究についての倫理委員会により承認された。雄のWistarラットは、水および食物の摂取が自由であり、12時間の明/12時間の暗サイクルで収容された。ラットを1晩絶食させ、腔内フィラメント法を用いる2時間の一過性中大脳動脈閉塞(MCAO)に供した。2時間の閉塞の後に、欠損の神経学的評価を、再灌流の1.5時間後に行った。回転非対称性および機能障害性四肢配置を示すラットを含めた。右中大脳動脈(MCA)を、腔内フィラメント法により閉塞させた。動物に、O2:N2O(30:70)中の4% Foreneの吸入、次いで、O2:N2O中の2% Foreneを送達する鼻マスクによる自発的通気により麻酔をかけた。血圧の連続的な監視、血液ガスの制御および60IUのヘパリンの注射のために、カテーテルを尾動脈に挿入した。
【０３０２】
直腸温度プローブと連結された加熱パッドを用いて、体温が37℃に維持されるように保証した。レーザドップラープローブを頭蓋の右側に接着することにより、MCA領域の血流を監視した。頸部の中央に皮膚切開をまず作製して、内部および外部と一緒に右総頸動脈を露出させることにより、実験的脳卒中を誘導した。外頸動脈を結紮し、内頸動脈を縫合糸で囲んだ。総頸動脈において、小さい切開を分岐部の近くに作製し、フィラメントを内頸動脈に導入し、中大脳動脈の起点を封鎖するまでそれを前進させた。封鎖は、レーザドップラーシグナルの低下として示された。この外科的処置の後に、虚血期間中にラットを麻酔から回復させた。再灌流は、2時間後に、動物をもう一度麻酔にかけているときにフィラメントを除去することにより行った。
【０３０３】
再灌流の前に、シリコンカテーテルを上大動脈に挿入し、心臓に向かって1〜2cm前進させた。カテーテルを安定させ、頸部の後ろの皮膚の下に通した(tunnelated)。カテーテルをスイベルシステムに連結したが、これは、動物にADC-1004またはプラセボ(盲検)のいずれかを注射しながらプラスチックボウル内を動物が自由に移動することを可能にした。MCAOの終了の15分前に、動物の大動脈に溶液を急速投与用量で注射し、その後、溶液を24時間連続的に注入した。血液(0.25〜0.5ml)を遠心分離し、血漿をさらなる分析のために凍結した。血液を、再灌流の3、19、24および48時間後に採取した。偽手術した動物において、フィラメントの挿入以外は同一の手術を行った。研究に含めた動物の全ての生理的パラメータは、手術中の動脈圧および直腸温度と同様に、正常範囲内であった:pO2>90mmHg、pCO2 30〜50mmHgおよびpH7.35〜45。
【０３０４】
梗塞評価
再灌流の2日後に、動物に、4% Foraneで麻酔をかけ、断頭した。脳を頭蓋から迅速に回収し、冷却食塩水中に10分間置いた。組織切片器において、脳を12の1ミリメートル厚の冠状切片に切断し、切片を、1.0%の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)を含有する食塩水溶液中で37℃にて20分間染色した。同じ手順を、偽手術した動物について行った。梗塞サイズを、コンピュータ支援画像分析により評価した。
【０３０５】
結果
ADC-1004を、脳卒中のラットモデルで試験した。プラセボ(食塩水)で処置したラットは、24.5mm3の平均梗塞容量を有したが、ADC-1004で処置した動物は、15.8mm3の平均梗塞サイズを有した。
【０３０６】
これらの結果は、ADC-1004処置動物におけるより小さい梗塞サイズに向かう傾向を明確に示す。
【０３０７】
(実施例F)
肺移植での治療におけるCHIPSバリアントADC-1004の効力のin vivo研究
序説
今日の肺移植に対する障害は、(1)適切なドナー臓器の欠如、(2)虚血/再灌流(I/R)傷害、(3)拒絶および(4)閉塞性細気管支炎の発生を含む。移植後の肺I/R傷害は、呼吸不全の一般的な原因であり、移植後の最初の72時間の間に典型的に発現する。[1]I/R傷害は、術後期間の初期における罹患率および死亡率の普遍的で本質的な原因であり続け、報告される率は41%ほど大きい。[1]I/R傷害の患者の30日間死亡率は、I/R傷害のない患者での7%と比較して、約40%である。[2]I/R傷害を示す患者は、長期の人工呼吸とより長い入院を必要とし、多臓器不全の危険性が増加する。[3]
【０３０８】
I/R傷害の機構は多様であり、活性酸素種(ROS)の発生、白血球活性化/動員、補体および血小板の活性化、肺血管緊張における異常ならびに凝血原活性の増加を含む。炎症誘発性サイトカインの生成は、I/R後に肺において著しく増加する。いくつかの研究は、肺I/R傷害が、好中球依存性損傷を特徴とすることを示唆している。[4、5]種々の研究が、好中球活性化化合物が肺損傷を引き起こし、好中球の除去が肺I/R傷害を減弱化し、好中球接着の除去が肺I/R傷害を妨げることを示している。[6、7]
【０３０９】
ADC-1004を、移植後の最初の6時間および20時間後での移植された肺の状態を調べる、参考文献8から改変したブタ肺移植モデルにおいて用いた。動脈血酸素分圧を、肺の状態のマーカーとして用いた。
【０３１０】
材料および方法
約66kgの体重の8匹のスウェーデン産品種のブタを用いた(4匹のドナーと4匹のレシピエント)。全ての動物は、国立衛生研究所により出版される「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」(NIH公示85-23、1985年改訂)を遵守した人道的な配慮を受けた。
【０３１１】
全般的な実験設定は、参考文献8中に以前に記載されている。処置を、以下に簡単に記載する。
【０３１２】
ドナー処置
動物に、Siemens Servoventilator 300を用いて人工呼吸し、10L/分の容量制御圧力調節人工呼吸(20回の呼吸/分;終末呼気陽圧8cm H2O;吸気酸素分率0.5〜1.0)を用いた。胸骨切開を行った。全身的ヘパリン処置(4mg/kg)の後に、40cm長の32Fカニューレを肺動脈(PA)に挿入した。左右の胸膜空間に差し込んだ。肺の全ての部分を注意深く検査し、終末呼気陽圧は、無気肺部分が排除されるまで一時的に10cm H2Oに増加した。肺の下葉の圧迫を避けるために、横隔膜から内臓を遠ざけた。上大動脈および下大動脈を結紮した。上行大動脈をクランプした。左右の心房を切開により開放した。PAに、ADC-1004を補った1Lの冷却保存溶液を処置動物において潅流させた。平均PA潅流圧は、保存溶液レベルを肺の20cm上の高さに維持することにより20mmHg未満に維持した。この処置の後に、肺を回収して、4℃の冷却に60時間貯蔵した。
【０３１３】
レシピエント処置
レシピエントのブタは、鎮静剤を与えて麻酔にかけた。動物に、1.2gの筋肉内ベンジルペニシリンプロカイン(Ilocillin;Ciba-Geigy、Basel、Switzerland)を与えた。気管開口術を行い、第7号気管チューブを挿入し、動物に、ドナーと同じ方法で人工呼吸した。2本の中心静脈カテーテルを内頸静脈を通して導入し、2本のカテーテルを、頸動脈を通して大動脈に配置した。フォーリーカテーテルを、恥骨上式膀胱瘻造設術により膀胱に挿入した。第6肋間腔からの左開胸術を行い、肺静脈の長い端部を残すように注意しながら左肺切除術を行った。
【０３１４】
ドナーのブタからの貯蔵した左肺を、右肺から解離させ、その後、レシピエントのブタに移植した。ADC-1004を、移植した肺の再灌流の30分前に与えた。投与は、0.4mg/kgの急速投与用量および0.4(最初に処置したブタ)または0.2mg/kg/時間(2番目に処置したブタ)の注入の両方で与えた。ブタを、腹臥位においた。ADC-1004の注入を、実験中継続した。移植した肺を通る血流が確立されたときの時間をゼロと規定した。ガス交換は、その後6時間行った。再灌流後19〜20時間の間に、第7肋間腔からの右開胸術および右肺切除術を行い、ブタの生存は、移植された左肺に完全に依存した。血液ガスを、次いで、肺切除術の前後に採取した。実験期間中の流体の供給は、全ての動物について一定に保ち、720mLの10%グルコースからなった(すなわち、30mL/時間の麻酔薬注入)。リンゲル乳酸170mL/時間を、実験中連続的に与えた。
【０３１５】
結果
肺移植を受けADC-1004で処置された2匹の動物は、移植後に酸素分圧の改善を示した。図25に示すように、全てのブタは、移植前のほぼ同じベースラインから開始した。移植の1時間後ほど早くに、ADC-1004処置動物は、プラセボ処置動物と比較して酸素ガス交換能力の増加を示し、3時間後にADC-1004処置動物は、プラセボ処置動物と比較してより良好な肺状態を示す高い酸素ガス交換能力に達した。6時間後に、対照動物のうちの1匹は、ガス交換能力の増加を示したが、ADC-1004処置ブタにおけるレベルに到達できなかった。移植された左肺にブタを100%依存させる右肺切除術後の大動脈血液中のPaO2(FiO2=1.0)を、Table8(表9)に示す。
【０３１６】
これらのデータは、ADC-1004処置群における肺が、プラセボ群と比較して移植の20時間後により良好な状態にあったことを示す。肺移植直後のガス交換能力が良好であればあるほど、集中治療の必要性がより短くなり、多くの臨床上の人材が、そのことにより、良好な30日間生存を示す。肺移植後の最初の24時間のガス交換能力が損なわれることは、再灌流傷害を示す。よって、C5aRのADC-1004阻害が、肺移植における再灌流傷害を低減することを示す。
【０３１７】
【表９】
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【０３１８】
［参考文献４］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４（Ａ）】
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【図２４（Ｂ）】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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