(57)【要約】本発明は、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルの決定を伴う、癌を検出および診断するための方法を提供する。これらの遺伝子は、癌細胞と正常細胞を区別することが発見された。さらに、本発明は、癌の治療に有用な治療薬をスクリーニングする方法および癌を治療するための方法を提供する。加えて、本発明は、いずれも癌の治療において有用であると示唆される、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、および／またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の生物試料におけるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象における癌または癌発症の素因を診断するための方法であって、前記遺伝子の正常対照レベルと比べた前記発現レベルの増大が、前記対象が癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクがあることを示唆し、前記発現レベルが、以下からなる群より選択される方法のいずれかによって決定される、方法：
（ａ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡの検出；
（ｂ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子によってコードされるタンパク質の検出；および
（ｃ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性の検出。
【請求項２】
前記発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％高い、請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象由来の生物試料が生検材料を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
癌が乳癌である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する検出試薬を含む、癌を検出するためのキット。
【請求項６】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングする方法：
（ａ）ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片と試験薬剤とを接触させる段階；
（ｂ）前記ポリペプチドまたは断片と試験薬剤との間の結合を検出する段階；および
（ｃ）前記ポリペプチドまたは断片に結合する試験薬剤を、癌を治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
【請求項７】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングする方法：
（ａ）ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片と試験薬剤とを接触させる段階；
（ｂ）前記ポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階；
（ｃ）前記ポリペプチドまたは断片の生物活性を、前記薬剤の非存在下で検出された生物活性と比較する段階；および
（ｄ）前記ポリペプチドの生物活性を抑制する薬剤を、癌を治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
【請求項８】
生物活性が細胞増殖活性またはＡｋｔリン酸化活性である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングする方法：
（ａ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する細胞と試験薬剤とを接触させる段階；
（ｂ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；
（ｃ）前記発現レベルを、前記薬剤の非存在下で検出された発現レベルと比較する段階；および
（ｄ）前記発現レベルを低減する薬剤を、乳癌を治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
【請求項１０】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングする方法：
（ａ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と試験薬剤とを接触させる段階；
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；
（ｃ）前記発現レベルまたは活性を、前記薬剤の非存在下で検出された発現レベルまたは活性と比較する段階；および
（ｄ）前記発現レベルまたは活性を低減する薬剤を、癌を治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
【請求項１１】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する細胞へ導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子であって、該分子がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、３１、３２、および３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的配列として含み、かつ該アンチセンス鎖が、センス鎖およびアンチセンス鎖が互いとハイブリダイズして該二本鎖分子を形成するように該センス鎖の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、二本鎖分子。
【請求項１２】
センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、３５、および３７からなる群より選択されるヌクレオチド配列由来の約１９〜約２５個の隣接ヌクレオチドを含む、請求項１１記載の二本鎖分子。
【請求項１３】
一本鎖によって連結されたセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一のヌクレオチド構築物である、請求項１１記載の二本鎖分子。
【請求項１４】
一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する二本鎖分子であって、式中［Ａ］がセンス鎖であり、［Ｂ］が一本鎖でありかつ３〜２３個のヌクレオチドからなり、および［Ａ’］がアンチセンス鎖である、請求項１３記載の二本鎖分子。
【請求項１５】
請求項１１記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項１６】
二次構造を有しかつセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む転写産物をコードする、請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
転写産物が、センス鎖とアンチセンス鎖とを連結している一本鎖をさらに含む、請求項１６記載のベクター。
【請求項１８】
転写産物が一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有し、式中［Ａ］がセンス鎖であり；［Ｂ］が一本鎖でありかつ３〜２３個のヌクレオチドからなり；および［Ａ’］がアンチセンス鎖である、請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々を含むベクターであって、該センス鎖核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、３１、または３２のヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖核酸が、該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いとハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターが、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する細胞へ導入された場合に、細胞増殖を阻害する、ベクター。
【請求項２０】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子を含むベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を対象に投与する段階を含む、対象において癌を治療または予防する方法であって、該二本鎖分子がＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項２１】
二本鎖分子が請求項１１記載の二本鎖分子であり、ベクターが請求項１５記載のベクターである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
癌が、乳癌、肺癌、および食道癌からなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子を含むベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、癌を治療または予防するための組成物であって、該二本鎖分子がＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害する、組成物。
【請求項２４】
二本鎖分子が請求項１１記載の二本鎖分子であり、ベクターが請求項１５記載のベクターである、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
癌が、乳癌、肺癌、および食道癌の群より選択される、請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングする方法：
（ａ）試験化合物の存在下でＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその機能的等価物とＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはその機能的等価物とを接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチド間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドまたはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとＲＱＣＤ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験薬剤を選択する段階。
【請求項２７】
以下の構成要素を含む、癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングするためのキット：
（ａ）ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその機能的等価物、ならびに
（ｂ）ＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはその機能的等価物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、内容全体が参照により本明細書に組み入れられる２００８年８月２７日付で出願された米国特許仮出願第６１／１９０，３８９号の恩典を主張する。
【０００２】
本発明は、癌を検出および診断するための方法、ならびに癌を治療および予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
乳癌は、女性において最も一般的な癌であり、２００２年の世界的規模での新規症例は１１５万例と推定されている（非特許文献１：Parkin DM et al., (2005) CA Cancer J Clin 55:74-108）。乳癌の発生率は大多数の国で増えており、その増加率は、これまで発生率が低かった国で大幅に高い（非特許文献１：Parkin DM et al., (2005) CA Cancer J Clin 55:74-108）。乳房エックス線撮影による早期検出、ならびにタモキシフェンおよびトラスツズマブなどの分子標的薬の開発によって、死亡率は低下し、患者の生活の質は改善されている（非特許文献２：Navolanic PM and McCubrey JA., (2005) Int J Oncol. 27:1341-1344）が、進行期の患者、特にホルモン非依存性の腫瘍を有する患者は依然として、非常に限られた治療の選択肢しか利用することができない。故に、そのような患者により良い管理を提供するための新規薬物の開発が依然として切望されている。
【０００４】
ｃＤＮＡマイクロアレイ分析により得られる遺伝子発現プロファイルは、個々の癌の詳細な特徴付けを提供しており、このような情報は新規薬物の開発を通じておよび個別化治療の基礎の提供により、個々の患者にさらに適した臨床戦略の選択において有用性を示しうる（非特許文献３：Petricoin EF 3rd, et al. (2002) Nat Genet. 32 Suppl:474-479）。ゲノム規模での発現分析を通じて、本発明者らは、乳癌（非特許文献４：Park JH, et al. (2006) Cancer Res. 66:9186-9195, 非特許文献５：Shimo A. et al. (2007) Cancer Sci. 98:174-181, 非特許文献６：Lin ML, et al. (2007) Breast Cancer Res. 9, R17）、滑膜肉腫（非特許文献７：Nagayama S, et al. (2004) Oncogene 23:5551-5557., 非特許文献８：Nagayama S, et al. (2005) Oncogene 24:6201-6212.）、および腎細胞癌（非特許文献９：Togashi A, et al. (2005) Cancer Res. 65:4817-4826, 非特許文献１０：Hirota et al. (2006) Int J Oncol. 29:799-827）の発生および／または進行の一因となる癌遺伝子として機能するいくつかの遺伝子を単離した。そのような分子は、新しい治療法の開発における標的候補であると考えられる。
【０００５】
乳癌治療のための新規の分子標的を同定する試みにおいて、レーザーマイクロビームマイクロダイセクションにより精製された乳癌細胞の詳細な遺伝子発現プロファイルが、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて分析された（非特許文献１１：Nishidate T, et al., Int J Oncol. 2004 25:797-819、特許文献1：ＷＯ２００５／０２９０６７、特許文献２：ＷＯ２００６／０１６５２５、特許文献３：ＷＯ２００７／０１３６７０）。これらの研究を通じていくつかの乳癌マーカーが同定されてきたが、それらを標的化する新たな治療薬は依然として開発中である。それゆえ、抗癌治療のために標的化される新規遺伝子の同定は、引き続き当技術分野における目標である。
【０００６】
この目的のために、レチノイン酸誘導性の細胞分化を媒介する転写補因子として以前に単離されたＲＱＣＤ１（ＲＣＤ１（細胞分化に必要；ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １）相同体（分裂酵母（Ｓ．  ｐｏｍｂｅ）））遺伝子（非特許文献１２；Hiroi N, et al. (2002) EMBO J. 21:5235-44）が、マイクロアレイ分析を通じ、肺癌および食道癌において上方制御される遺伝子として同定された（特許文献４；ＷＯ２００４／０３１４１３、特許文献５；ＷＯ２００７／０１３６６５、特許文献６；ＷＯ／２００７／０１３６７１）。しかしながら、今日まで、ＲＱＣＤ１と乳癌との間に関連性は実証されていない。さらに、ＲＱＣＤ１は、癌の中で上方制御されていた多くの遺伝子のうちの一つにすぎず、他の癌治療に適した標的遺伝子として確認されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Parkin DM, et al. (2005) CA Cancer J Clin 55:74-108
【非特許文献２】Navolanic PM and McCubrey JA. (2005) Int J Oncol. 27:1341-1344
【非特許文献３】Petricoin EF 3rd, et al. (2002) Nat Genet. 32 Suppl:474-479
【非特許文献４】Park JH, et al. (2006) Cancer Res. 66:9186-9195
【非特許文献５】Shimo A, et al. (2007) Cancer Sci. 98:174-181
【非特許文献６】Lin ML, et al. (2007) Breast Cancer Res. 9, R17
【非特許文献７】Nagayama S, et al. (2004) Oncogene 23:5551-5557
【非特許文献８】Nagayama S, et al. (2005) Oncogene 24:6201-6212
【非特許文献９】Togashi A, et al. (2005) Cancer Res. 65:4817-4826
【非特許文献１０】Hirota et al. (2006) Int J Oncol. 29:799-827
【非特許文献１１】Nishidate T et al. (2004) Int J Oncol. 25:797-819
【非特許文献１２】Hiroi N, et al. (2002) EMBO J.21:5235-44
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０２９０６７
【特許文献２】ＷＯ２００６／０１６５２５
【特許文献３】ＷＯ２００７／０１３６７０
【特許文献４】ＷＯ２００４／０３１４１３
【特許文献５】ＷＯ２００７／０１３６６５
【特許文献６】ＷＯ／２００７／０１３６７１
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、癌細胞におけるＲＱＣＤ１遺伝子の特異的発現パターンの発見に関する。
【００１０】
本発明を通じて、ＲＱＣＤ１遺伝子が、ヒト腫瘍、より具体的には乳房腫瘍において、頻繁に上方制御されていることもさらに明らかにされた。さらに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＲＱＣＤ１遺伝子の抑制が、乳癌細胞の増殖抑制および／または細胞死をもたらすことから、この遺伝子はヒトの乳癌に対する新規の治療標的として役立ち得る。
【００１１】
本明細書において同定されるＲＱＣＤ１遺伝子ならびにその転写産物および翻訳産物は、乳癌に対するマーカーとして、および癌遺伝子標的として診断に有用であり、癌の症状を治療または緩和するために、これらの発現および／または活性を変化させることができる。同様に、試験化合物への曝露により生じるＲＱＣＤ１遺伝子発現の変化を検出することによって、癌を治療または予防するための様々な薬剤を同定することができる。
【００１２】
したがって本発明の目的は、組織試料などの対象由来の生物試料におけるＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルを決定することにより、対象における乳癌に対する素因を診断または決定するための方法を提供することである。正常対照レベルと比較した当該遺伝子の発現レベルの増加は、その対象が乳癌に罹患しているか、または乳癌を発症するリスクを有することを示す。
【００１３】
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料において検出されるＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルを意味し、かつ正常対照レベルおよび癌対照レベルの両方を包含する。対照レベルは、単一の参照集団に由来する単一の発現パターンまたは複数の発現パターンから算出された平均値でよい。または、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースでよい。「正常対照レベル」という語句は、正常な健常個体において、または癌に罹患していないことが公知である個体集団において検出されるＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルを意味する。正常な個体とは、乳癌の臨床症状が無い個体である。正常対照レベルは、非癌組織から得られた正常細胞を用いて決定することができる。「正常対照レベル」はまた、乳癌に罹患していないことが分かっている個体または集団の正常な健常組織または健常細胞において検出されるＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルでもよい。一方、「癌対照レベル」という語句は、乳癌に罹患している個体または集団の癌組織または癌細胞において検出されるＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルを意味する。
【００１４】
試料中で検出されるＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合、（その試料を得た）対象が乳癌に罹患しているか、または乳癌を発症するリスクを有することが示唆される。
【００１５】
または、試料中のＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルを、ＲＱＣＤ１遺伝子の癌対照レベルと比較することもできる。ある試料の発現レベルと癌対照レベルが類似している場合、（その試料を得た）対象が癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクを有することが示唆される。
【００１６】
本明細書において、例えば対照レベルと比較して１０％、２５％、もしくは５０％、または少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも０．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくはそれ以上、遺伝子発現が増加している場合、遺伝子発現レベルは「改変された」とみなされる。ＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルは、試料中の遺伝子転写物に対する核酸プローブのハイブリダイゼーション強度の検出を用いて決定することができる。
【００１７】
本発明の文脈において、対象由来の組織試料は、試験対象、例えば癌を有することが公知であるか、または癌を有すると推測される患者から得られる任意の組織でよい。例えば、組織は上皮細胞を含んでよい。より具体的には、組織は癌上皮細胞でよい。
【００１８】
ＲＱＣＤ１タンパク質を発現する試験細胞と試験化合物とを接触させる段階およびＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルまたは遺伝子産物であるＲＱＣＤ１タンパク質の活性を決定する段階により、ＲＱＣＤ１タンパク質の発現または活性を阻害する化合物を同定するための方法を提供することが本発明のさらに別の目的である。試験細胞は癌性上皮細胞などの上皮細胞であってもよい。試験化合物の非存在下での対照レベルと比べた遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性の減少は、当該試験化合物を用いて乳癌の症状を低減できることを示唆する。
【００１９】
本発明はまた、ＲＱＣＤ１遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する少なくとも一つの検出試薬を含むキットを提供する。
【００２０】
本発明の治療方法は、アンチセンス組成物を対象に投与する段階を含む、対象における乳癌を治療または予防するための方法を含む。本発明に関して、アンチセンス組成物はＲＱＣＤ１遺伝子の発現を低減する。例えば、アンチセンス組成物は、ＲＱＣＤ１遺伝子配列に相補的なヌクレオチドを含むことができる。あるいは、本方法は、ｓｉＲＮＡ組成物を対象に投与する段階を含むことができる。本発明に関して、ｓｉＲＮＡ組成物はＲＱＣＤ１遺伝子の発現を低減する。さらに別の方法において、対象における乳癌の治療または予防は、リボザイム組成物を対象に投与することにより行うことができる。本発明に関して、核酸特異的なリボザイム組成物はＲＱＣＤ１遺伝子の発現を低減する。
【００２１】
その目的のために、本発明者らは、ＲＱＣＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの阻害効果を確認した。具体的には、ｓｉＲＮＡによる癌細胞の細胞増殖の阻害を実施例の項で実証する。本明細書におけるデータは、乳癌のための好ましい治療標的としてのＲＱＣＤ１遺伝子の有用性を支持する。したがって、本発明はまた、ＲＱＣＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡとして働く二本鎖分子および該二本鎖分子を発現するベクターを提供する。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、
（ａ）試験化合物の存在下でＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはその機能的等価物とＧＩＧＹＦ１および／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその機能的等価物とを接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチド間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）ＧＩＧＹＦ１またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとＲＱＣＤ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階
を含む、乳癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法を提供することである。
【００２３】
本発明はさらに、以下の構成要素：
（ａ）ＧＩＧＹＦ１および／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその機能的等価物、ならびに
（ｂ）ＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはその機能的等価物
を含む、乳癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。
【００２４】
本発明はさらに、ＧＩＧＹＦ１および／またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を低減するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ組成物を対象に投与する段階を含む、対象における乳癌を治療または予防する方法であって、ｓｉＲＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２または３３のヌクレオチド配列をセンス鎖に含む方法を提供する。
【００２５】
本明細書において記述される方法の一つの利点は、臨床的に顕性の乳癌の症状が検出される前にこの疾患が特定されるということである。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２６】
当業者は、本発明の一つまたは複数の局面が特定の目的を満たすことができる一方、一つまたは複数の他の局面が他の特定の目的を満たすことができることを理解するであろう。各目的は、全ての点が、等しく本発明のすべての局面に当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的は、本発明の任意の一つの局面に関して択一的に考慮することができる。本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読めば、さらに十分に明らかになるであろう。しかし、前述の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明のさまざまな局面および用途は、以下に続く図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することによって当業者に明らかになるであろう。
【００２８】
【図１】実施例１で分析された臨床乳癌細胞および正常ヒト臓器におけるＲＱＣＤ１の発現パターンを示す。部分（Ａ）は半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、乳癌細胞におけるＲＱＣＤ１の過剰発現を裏付けている。臨床試料１２例（＃４２，＃１０２、＃２４７、＃２５２、＃３０２、＃４７３、＃４７８、＃５０２、＃５５２、＃６４６、＃７６９、および＃７７９）から増幅されたｃＤＮＡ産物を、顕微解剖された正常乳管細胞由来のもの、または肺、心臓、肝臓、腎臓、および乳腺を含む正常臓器由来のものと比べて提示した。β−アクチン（ＡＣＴＢ）を内部対照として用いた。部分（Ｂ）は、乳癌細胞株のノーザンブロット分析の結果を示す。ＲＱＣＤ１特異的な配列用に設計された放射性同位体標識プローブは、ＲＱＣＤ１の全長ｍＲＮＡに対応する３．５ｋｂの位置に検出された。乳癌細胞株１１例の全てが、精巣を除く正常組織よりも上方制御された発現を示した。部分（Ｃ）はマルチプルティッシュノーザンブロットによるＲＱＣＤ１の組織特異的な分布を示し、精巣からの陽性シグナルを示すが、他の組織からはシグナルが検出されなかったかまたは非常に弱いシグナルしか検出されなかった。
【図２】実施例１で分析された外因的に導入されたＲＱＣＤ１の免疫細胞化学の結果を示す。ｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ−ＲＱＣＤ１のトランスフェクションから２４時間後に、ＨＥＫ２９３、ＨＢＣ４、およびＢＴ５４９を抗ＨＡ抗体（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）による免疫細胞化学に供した。３種の細胞株の全てで、外因性ＲＱＣＤ１が細胞質および核の中に発現された（スケールバー＝２５ｍｍ）。
【図３】実施例１の乳癌細胞の成長に及ぼすｓｉＲＮＡによるＲＱＣＤ１ノックダウンの効果を示す。部分（Ａ）は、ＲＱＣＤ１転写産物に特異的な２つのｓｉＲＮＡ発現ベクター（＃１または＃２）のいずれかおよび対照としてモックｓｉＲＮＡ発現ベクター（標的配列なし）をＨＢＣ４およびＢＴ５４９へトランスフェクトした場合に生じたＲＱＣＤ１ノックダウンの結果を示す。ＲＱＣＤ１転写産物に及ぼすノックダウン効果を、βアクチンを対照として用い、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ｓｉＲＮＡ  ＃１または＃２でのトランスフェクションは、有意なノックダウン効果を示した。部分（Ｂ）は、コロニー形成アッセイの結果を示す。＃１または＃２ベクターによるトランスフェクションは、モックベクターをトランスフェクトした細胞と比べて生存細胞数の劇的な低下をもたらした。部分（Ｃ）は、同様にＷＳＴ−１増殖アッセイによって定量的に確認されたＲＱＣＤ１ノックダウン細胞の細胞数の劇的な減少を示す。部分（Ｄ）は、ＨＢＣ４にトランスフェクトされた＃１  ｓｉＲＮＡ標的配列中３塩基のミスマッチを有するｓｉＲＮＡベクターの効果を示す。ＲＱＣＤ１発現の減衰に及ぼす３塩基ミスマッチｓｉＲＮＡ。部分（Ｅ）は、３塩基ミスマッチｓｉＲＮＡベクターのトランスフェクションが細胞数に効果を及ぼさないことを示したコロニー形成アッセイの結果を示す。部分（Ｆ）は、３塩基ミスマッチｓｉＲＮＡベクターが細胞増殖に効果を及ぼさなかったＷＳＴ−１増殖アッセイによる細胞増殖の定量的評価を示す。
【図４】ＲＱＣＤ１の安定な過剰発現がＨＥＫ２９３の細胞成長を促進したことを示す。部分（Ａ）は、実施例１で分析されたＲＱＣＤ１安定細胞株（安定−１、−２、および−３）またはモック安定細胞株（モック−１、−２、および−３）由来の３つのクローンそれぞれのウエスタンブロット分析の結果を示す。導入されたＲＱＣＤ１の発現レベルを抗ＨＡタグ抗体で検証した。抗βアクチン抗体を負荷対照として用いた。部分（Ｂ）は、ＭＴＴアッセイにより測定された成長速度を示し、ここで、３つのＲＱＣＤ１安定クローンは３つのモック安定クローンよりも迅速な細胞成長を示した。Ｘ軸、播種後の時点；Ｙ軸、対照としての第１日目の吸光度値との比較によるＷＳＴ−１増殖アッセイの相対吸光度スコア。点、平均値；バー、ＳＥ。このアッセイを三回試験した。部分（Ｃ）は、コンフルエントに達した後に観察されたこれらの３つのＨＥＫ２９３−ＲＱＣＤ１細胞の迅速成長多層成長を示し、ＨＥＫ２９３細胞へのＲＱＣＤ１の導入による接触阻害機構の喪失を示す。
【図５】実施例２の臨床乳癌試料、乳癌細胞株、およびヒト正常組織におけるＲＱＣＤ１の発現レベルを示す。部分（Ａ）は乳癌臨床試料１２例ならびに正常乳管細胞、全乳腺、肺、心臓、肝臓、および腎臓を含むヒト正常組織に対する半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。βアクチン（ＡＣＴＢ）を内部対照として使用した。部分（Ｂ）は、［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識ＲＱＣＤ１  ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いた１１種の乳癌細胞株およびヒト正常マルチプルティッシュに対するノーザンブロッティング分析の結果を示す。乳癌細胞株およびヒト正常乳腺の場合、ｍＲＮＡ各１マイクログラムを各レーンに適用した。ヒト正常マルチプルティッシュの場合、ｍＲＮＡ各２マイクログラムを各レーンに適用した。部分（Ｃ）は、精製された抗ＲＱＣＤ１ポリクローナル抗体を用いた乳癌細胞株およびヒト正常組織に対するＲＱＣＤ１のウエスタンブロッティングの結果を示す。総タンパク質各５マイクログラムを各レーンに適用した。ポンソーＳでニトロセルロース膜を染色することにより、負荷タンパク質が等量であることを確認した。
【図６】実施例２の臨床乳癌試料、乳癌細胞株、およびヒト正常組織におけるＲＱＣＤ１の発現レベルを示す。部分（Ｄ）はＢＴ−５４９細胞におけるＲＱＣＤ１の免疫細胞染色の結果を示す。ＲＱＣＤ１を抗ＲＱＣＤ１ポリクローナル抗体およびＡｌｅｘａ−４８８（緑色）でプローブし、細胞核をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。スケールバーは２０マイクロメートルを示す。
【図７】実施例２の細胞成長に及ぼすＲＱＣＤ１の効果を示す。部分（Ａ）は乳癌細胞株の成長に及ぼすＲＮＡｉの効果を示す。ＲＱＣＤ１転写産物に特異的なｓｈＲＮＡ発現ベクター（＃１または＃２）およびモックｓｈＲＮＡ発現ベクター（モック）をＢＴ−５４９およびＨＢＣ−４細胞それぞれへトランスフェクトした。ＲＱＣＤ１のノックダウン効果を半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によって調べた。細胞成長に及ぼすノックダウン効果の評価のために細胞増殖アッセイおよびコロニー形成アッセイを行った。カラム；３回の独立した実験の平均、バー；＋／−ＳＥ。モックトランスフェクト細胞と比べてスチューデントのｔ検定により＊；Ｐ＝０．００２および＊＊；Ｐ＝０．００４。
【図８】実施例２の細胞成長に及ぼすＲＱＣＤ１の効果を示す。部分（Ｂ）は、ＲＱＣＤ１が安定的に発現していたＨＥＫ２９３細胞の成長速度を示す。ＲＱＣＤ１を発現するＨＥＫ２９３派生細胞の３つの独立クローン（安定−１、−２、および−３）ならびにモックベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３派生細胞の３つの独立クローン（モック−１、−２、および−３）に対してウエスタンブロッティングを行った。各細胞株を６ウェルプレートに細胞０．４×１０５個で播種し、播種から７日後に、細胞増殖アッセイを行った。Ｘ軸；播種後の時点、Ｙ軸；初日からの細胞数の増加倍率。点；３回の独立した実験の平均、バー；＋／−ＳＥ、＊；スチューデントのｔ検定によりＰ  ＜  ０．０００１。
【図９】実施例２のＧＩＧＹＦ１またはＧＩＧＹＦ２とのＲＱＣＤ１の相互作用および共局在を示す。部分（Ａ）はＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦｌａｇ−ＲＱＣＤ１、およびＨＡ−ＧＩＧＹＦ１またはＨＡ−ＧＩＧＹＦ２に対する共免疫沈降アッセイの結果を示す。抗Ｆｌａｇまたは抗ＨＡアガロースによる免疫沈降を、Ｆｌａｇ−ＲＱＣＤ１、およびＨＡ−ＧＩＧＹＦ１またはＨＡ−ＧＩＧＹＦ２の共トランスフェクションから３６時間後に行った。沈降タンパク質を３×ＦｌａｇペプチドまたはＨＡペプチドで競合的に溶出した。その後、投入対照およびペプチド溶出試料の検出のためにウエスタンブロッティングを行った。部分（Ｂ）は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた乳癌細胞株および正常乳腺におけるＧＩＧＹＦ１およびＧＩＧＹＦ２の発現レベルを示す。ＡＣＴＢを内部対照として用いた。部分（Ｃ）はＢＴ−５４９細胞において外因的に発現されたＨＡ−ＧＩＧＹＦ１およびＨＡ−ＧＩＧＹＦ２の免疫細胞染色を示す。ＢＴ−５４９へのトランスフェクションから３６時間後に、細胞を固定し、ＨＡ−ＧＩＧＹＦ１（赤色）、ＨＡ−ＧＩＧＹＦ２（赤色）、および内因性ＲＱＣＤ１（緑色）を免疫染色した。核をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。スケールバーは１０マイクロメートルを示す。
【図１０】実施例２の乳癌細胞におけるＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２のノックダウンによるＡｋｔ活性に及ぼす効果を示す。部分（Ａ）は、血清処理の存在下または非存在下での乳癌細胞におけるＡｋｔ活性に及ぼす効果を示す。ＭＣＦ−１０Ａ、ＢＴ−５４９、ＨＢＣ−５、およびＨＣＣ−１９３７細胞をＦＢＳおよび成長因子ありまたはなしの適切な各培地中で２４時間培養し、次に抗Ａｋｔ抗体および抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）抗体でのウエスタンブロッティングによりＡｋｔ活性を分析した。部分（Ｂ）は、ＢＴ−５４９細胞におけるＲＱＣＤ１に対するｓｉＲＮＡ（左パネル）、ＧＩＧＹＦ１またはＧＩＧＹＦ２に対するｓｉＲＮＡ（右パネル）のトランスフェクションから７２時間後に抗Ａｋｔ抗体および抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）抗体でのウエスタンブロッティングにより調べたＡｋｔの総量およびそのリン酸化レベルを示す。細胞を収集の前に２４時間、血清枯渇培地中で培養した。ＧＩＧＹＦ１およびＧＩＧＹＦ２のノックダウン効果を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。部分（Ｃ）は、ＨＢＣ−５細胞（左パネル）およびＨＣＣ−１９３７細胞（右パネル）におけるＲＱＣＤ１のノックダウンから７２時間後に抗Ａｋｔ抗体および抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）抗体でのウエスタンブロッティングにより調べたＡｋｔの総量およびそのリン酸化レベルを示す。細胞を収集の前に２４時間、血清枯渇培地中で培養した。
【図１１】実施例２の乳癌細胞におけるＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２のノックダウンによるＡｋｔ活性に及ぼす効果を示す。部分（Ｄ）はＩｍａｇｅ  Ｊ（Abramoff MD, Magelhaes PJ and Ram SJ, Image Processing with Image J. Biophotonics International 11:36-42, 2004）を用いたＥＣＬシグナルの濃度測定分析によるリン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）／総Ａｋｔのシグナル強度比によって定量的に評価された各乳癌細胞株におけるＡｋｔ活性を示す。アッセイは３回行った。カラム；３回の独立した分析の平均、バー；＋／−ＳＥ、＊；ｓｉ−ＥＧＦＰ処理細胞と比べて、スチューデントのｔ検定によりＰ  ＜  ０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
態様の説明
本明細書において説明した方法および材料と同様のまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の態様の実践または試験に使用されうるが、好ましい方法、装置および材料をこれから説明する。しかし、本材料および方法を説明する前に、本発明が本明細書において説明した特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコルなどに限定されないことを理解されたい。なぜなら、これらは規定どおりの実験および最適化に従って変更されうるからである。また、この説明で使用される専門用語は単に特定のバージョンまたは態様を説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲でのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されていないことも理解されたい。
【００３０】
本明細書に記載した各刊行物、特許、または特許出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に明確に組み入れられる。しかし、本明細書のいかなる内容も、先行発明によって、そのような開示に本発明が先行しないとの承認と解釈されるものではない。
【００３１】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。
【００３２】
定義
本明細書において使用される単語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段の具体的な指示が無い限り、「少なくとも１つの」を意味する。
【００３３】
ある物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドなど）に関して使用される「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然の供給源においてそれ以外に含まれ得る少なくとも１種類の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製された抗体とは、タンパク質（抗体）が由来する細胞もしくは組織供給源由来の糖質、脂質、もしくは他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合は、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない抗体を意味する。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、そこからポリペプチドが単離されるかまたは組換えにより作製される細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチドの調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドには、（乾燥重量で）約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満の異種タンパク質（本明細書においては「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが組換えによって作製される場合も同様に、好ましくは培地を実質的に含まず、培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満であるポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、好ましくは化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質または他の化学物質が、タンパク質調製物の体積の（乾燥重量で）約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満であるポリペプチド調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が単離または精製されたポリペプチドを含むことは、例えばそのタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色などに続く、単一バンドの出現によって示すことができる。好ましい態様において、本発明の抗体およびポリペプチドは、単離または精製される。ｃＤＮＡ分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合、他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離または精製される。
【００３４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、１つもしくは複数のアミノ酸残基が、修飾残基または対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣体などの非天然の残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマーに適用される。
【００３５】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされているもの、ならびに細胞において翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−リン酸化セリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造（α炭素が、水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合されている）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された主鎖を有する化合物を意味する（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、通常のアミノ酸と同様の機能を有する化学化合物を意味する。
【００３６】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される、一般に公知の三文字記号または一文字記号によって示され得る。
【００３７】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、別段の具体的な指示が無い限り、交換可能に使用され、かつアミノ酸と同様に、一般に認められている一文字表記によって示される。アミノ酸と同様に、これらは、天然の核酸ポリマーおよび非天然の核酸ポリマーの双方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組合せから構成されてよい。
【００３８】
別段の定義がない限り、「癌」という用語は、ＲＱＣＤ１遺伝子を過剰発現している癌、特に、乳癌を意味する。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「二本鎖分子」という用語は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡおよびＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味する。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ＤＮＡがＲＮＡ転写の鋳型であるものを含め、ｓｉＲＮＡを細胞へ導入する標準的な技術が使用される。ｓｉＲＮＡは、ＲＱＣＤ１センス核酸配列（「センス鎖」ともいわれる）、ＲＱＣＤ１アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」ともいわれる）またはその両方を含む。単一の転写産物が標的遺伝子のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有する、例えば、ヘアピン型などのｓｉＲＮＡを構築することができる。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかでよい。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列を含み、かつ相補的配列を介して共にアニールして二本鎖ＲＮＡ分子を形成した、２つのＲＮＡ分子の構築物を意味する。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列より選択される「センス」ＲＮＡまたは「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域より選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含んでよい。
【００４２】
「ｓｈＲＮＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、互いに相補的な第１の領域および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを意味する。これらの領域の相補性の程度および向きは、塩基対合がそれらの領域の間で生じるのに十分であり、第１の領域および第２の領域はループ領域によって連結され、このループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）の間で塩基対合が無いことに起因する。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖の間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」とも呼ばれ得る。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される二本鎖ポリヌクレオチド分子を意味し、ＲＮＡおよびＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げる。本明細書において、ハイブリッドとは、ＤＮＡから構成されるポリヌクレオチドおよびＲＮＡから構成されるポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成している分子を示すのに対し、キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含み得ることを示す。細胞中にｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを導入する標準的技術が使用される。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、センス核酸配列（「センス鎖」とも呼ばれる）、アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも呼ばれる）、または両方を含む。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、単一の転写物が標的遺伝子に由来するセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように、例えばヘアピン型で構築され得る。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかでよい。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列を含み、かつ相補的配列を介して共にアニールして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成した、２つの分子の構築物を意味する。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列より選択される「センス」ポリヌクレオチド配列または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含んでよい。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子のうち一方または両方が、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成されるか（キメラ分子）、あるいは、これらの分子のうち一方がＲＮＡから構成され、他方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【００４５】
「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、互いに相補的な第１の領域および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを意味する。これらの領域の相補性の程度および向きは、塩基対合がそれらの領域の間で生じるのに十分であり、第１の領域および第２の領域はループ領域によって連結され、このループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）の間で塩基対合が無いことに起因する。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖の間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」とも呼ばれ得る。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「単離された核酸」は、その本来の環境（例えば、天然に存在するなら自然環境）から取り出され、かくして、その自然状態から合成的に改変された核酸である。本発明に関して、単離された核酸の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００４７】
本発明は、乳癌患者由来の細胞におけるＲＱＣＤ１遺伝子の発現上昇の発見に部分的に基づいている。ヒトＲＱＣＤ１遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示されており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４４４としても利用可能である。本明細書において、ＲＱＣＤ１遺伝子はヒトＲＱＣＤ１遺伝子、ならびに非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含むがこれらに限定されない他の動物のものを包含し、さらに、対立遺伝子変異体およびＲＱＣＤ１遺伝子に対応するものとして他の動物で見出された遺伝子を含む。
【００４８】
ヒトＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示されており、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２２５７４．４および同番号ＮＭ＿０１５５７５．３としても利用可能である。本明細書において、ＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子はヒトＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子、ならびに非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含むがこれらに限定されない他の動物のものを包含し、さらに、対立遺伝子変異体ならびにＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子に対応するものとして他の動物で見出された遺伝子を含む。
【００４９】
ヒトＲＱＣＤ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示されており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５４３５としても利用可能である。本発明に関して、ＲＱＣＤ１遺伝子によってコードされるポリペプチドは「ＲＱＣＤ１」といわれ、「ＲＱＣＤ１ポリペプチド」または「ＲＱＣＤ１タンパク質」といわれることもある。
【００５０】
ヒトＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子においてコードされるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８に示されており、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７２０９６．２およびＮＰ＿０５６３９０．２としても利用可能である。本発明に関して、ＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子によってコードされるポリペプチドは「ＧＩＧＹＦ１」および「ＧＩＧＹＦ２」といわれ、「ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド」および「ＧＩＧＹＦ２ポリペプチド」、または「ＧＩＧＹＦ１タンパク質」および「ＧＩＧＹＦ２タンパク質」といわれることもある。
【００５１】
本発明の一局面によれば、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦタンパク質、およびＧＩＧＹＦタンパク質にはそれぞれ機能的等価物も含まれる。本明細書において、タンパク質の「機能的等価物」は、タンパク質に等価な生物活性を有するポリペプチドである。すなわち、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質の生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明における各タンパク質のそのような機能的等価物として使用することができる。
【００５２】
ＲＱＣＤ１タンパク質の生物活性は、例えば、細胞分化の調節活性、癌細胞増殖活性、ＧＩＧＹＦ１結合活性またはＧＩＧＹＦ２結合活性、およびＡｋｔリン酸化活性を含む。
【００５３】
ＧＩＧＹＦ１（ＧＲＢ１０相互作用ＧＹＦタンパク質１）遺伝子およびＧＩＧＹＦ２（ＧＲＢ１０相互作用ＧＹＦタンパク質２）遺伝子は、ＩＧＦ−Ｉ刺激後にＧｒｂ１０アダプタータンパク質によりＩＧＦ−Ｉ受容体に一過性に結び付けられる遺伝子として同定された（Gionannone B, et al. (2003) J BIol CHem 34:31564-31573）。ＧＩＧＹＦ１タンパク質およびＧＩＧＹＦ２タンパク質はＲＱＣＤ１タンパク質に結合すること、およびＲＱＣＤ１タンパク質のみならずＡｋｔリン酸化も伴うことが本明細書において実証された。それゆえ、ＧＩＧＹＦ１タンパク質およびＧＩＧＹＦ２タンパク質の生物活性には、例えば、ＲＱＣＤ１結合活性およびＡｋｔリン酸化活性が含まれる。
【００５４】
このような機能的等価物には、１つまたは複数のアミノ酸が、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質の天然のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加、または挿入されているものが含まれる。または、当該ポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも呼ばれる）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％〜９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むものでもよい。他の態様において、当該ポリペプチドはストリンジェントな条件下で、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の天然のヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００５５】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、ある核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には検出可能な程度にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において多様である。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、ｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは５０％のプローブが平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって実現してもよい。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍である。以下のような例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が可能である：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーションし、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０℃で洗浄。
【００５６】
本発明に関して、当業者は、ヒトＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質のいずれかに対して機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーション条件を規定どおりに選択することができる。例えば、ハイブリダイゼーションは「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて６８℃で３０分またはそれ以上の間プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、６８℃で１時間またはそれ以上の間加温することにより実施することができる。以下の洗浄段階は、例えば、低ストリンジェント条件で行うことができる。例示的な低ストリンジェント条件は４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを含むことができる。高ストリンジェンシー条件がしばしば好適に使用される。例示的な高ストリンジェンシー条件は、室温で２０分間、２×ＳＳＣ、０．０１％  ＳＤＳ中での３回の洗浄、次いで３７℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での３回の洗浄、および５０℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での２回の洗浄を含むことができる。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える可能性があり、当業者はそれらの要因を適切に選択して必要なストリンジェンシーを達成することができる。
【００５７】
一般的に、タンパク質における一つ、二つ、またはそれ以上のアミノ酸の修飾は、タンパク質の機能に影響を与えないと考えられる。実際に、変異タンパク質または修飾タンパク質（すなわち、一つ、二つ、またはいくつかのアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入、および／または付加により修飾されたアミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって、当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を改変する、アミノ酸に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換が、またはタンパク質の改変によって類似の機能を有したタンパク質を生ずる「保存的修飾」であると見なされる、アミノ酸に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換が、本発明に関して許容されることを認識するであろう。したがって、一つの態様において、本発明のペプチドは、ヒトＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、およびＧＩＧＹＦ２配列において一つ、二つまたはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されているアミノ酸配列を有することができる。
【００５８】
タンパク質の活性が保持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の５％またはそれ以下を改変することが一般に好ましい。したがって、好ましい態様において、そのような変異体において変異されるアミノ酸の数は、一般に３０アミノ酸またはそれ以下、好ましくは２０アミノ酸またはそれ以下、より好ましくは１０アミノ酸またはそれ以下、より好ましくは５または６アミノ酸またはそれ以下、およびさらにより好ましくは３または４アミノ酸またはそれ以下である。
【００５９】
変異されるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存された異なるアミノ酸へ変異されること（保存的アミノ酸置換として公知の過程）が好ましい。アミノ酸側鎖の特性の例は疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに共通して以下の官能基または特徴を有する側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含む側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含む側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含む側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族を含む側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）である。機能的に類似のアミノ酸を規定する保存的置換表は当技術分野において周知である。例えば、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照のこと）。
【００６０】
そのような保存的に修飾されたポリペプチドが本ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、およびＧＩＧＹＦ２タンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はそれに限定されず、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、およびＧＩＧＹＦ２タンパク質は、それらがＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、およびＧＩＧＹＦ２タンパク質それぞれの少なくとも一つの生物活性を保持する限り、非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質は多型変種、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを除外しない。
【００６１】
さらに、本発明のＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、およびＧＩＧＹＦ２遺伝子は、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、およびＧＩＧＹＦ２タンパク質それぞれのそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００６２】
Ｉ．  癌の診断：
Ｉ−１．  癌または癌を発症する素因を診断するための方法
ＲＱＣＤ１遺伝子の発現は、癌、より具体的には乳癌を有する患者において特異的に上昇していることが分かった。したがって、本明細書において同定された遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物には、乳癌のマーカーとしての診断的有用性が見出され、細胞試料中のＲＱＣＤ１遺伝子の発現を測定することによって、乳癌を診断することができる。より具体的には、本発明は、対象におけるＲＱＣＤ１遺伝子の発現レベルを決定することにより、対象における癌の存在または癌を発症する素因を検出する、診断する、および／または決定するための方法を提供する。本方法によって診断される好適な癌は、乳癌を含む。
【００６３】
さらに、本発明によれば、ＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子は、その遺伝子産物がＲＱＣＤ１タンパク質と相互作用する遺伝子として同定された。ＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子はまた、癌細胞、特に乳癌細胞において特異的に上昇していることが分かった。したがって、本発明はまた、対象におけるＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを決定することにより、対象における癌の存在または癌を発症する素因を検出する、診断する、および／または決定するための方法を提供する。あるいは、本発明は、対象由来の乳房組織試料における癌細胞の存在を検出するための方法であって、対象由来の生物試料におけるＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを決定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比べて該発現レベルの増加が組織における癌細胞の存在または疑いを示唆する、該方法を提供する。
【００６４】
そのような結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が当該疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症する素因があるかを医師、看護師、または他の従事者が診断するのを援助することができる。あるいは、本発明は、対象が当該疾患に罹患しているかを診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。例えば、本発明によれば、対象から得られた組織における癌細胞の存在の疑いまたは疑念が示唆される場合、医師はこの観察、および組織の病理所見、血液中の公知の腫瘍マーカーのレベル、または対象の臨床経過などを含む別の局面を考慮して臨床的判断を下すであろう。乳癌の診断のためのいくつかの血液腫瘍マーカーの使用が周知である。例えば、糖鎖抗原１２５（ＣＡ１２５）、糖鎖抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、または癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、乳癌の好適な血液腫瘍マーカーである。例えば、本発明による特定の態様において、対象の状態を検査するための中間的な結果を提供することもできる。
【００６５】
別の態様において、本発明は、対象由来の生物試料におけるＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を癌の診断マーカーとして検出する段階を含む、癌の診断マーカーを検出するための方法を提供する。本方法によって診断される好ましい癌は、乳癌を含む。
【００６６】
本発明の文脈において、「診断する」という用語は、予測および尤度解析を包含することが意図される。本発明の方法は、治療的介入、病期などの診断基準、ならびに疾患のモニタリングおよび癌のサーベイランスを含む治療様式に関する決断を下す際に臨床的に使用することを意図する。本発明によれば、対象の病態を検査するための中間的な結果もまた、提供され得る。このような中間的な結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患しているかを医師、看護師、または他の従事者が決定するのを援助することができる。あるいは、本発明を用いて、対象に由来する組織中の癌細胞を検出し、かつ、対象が疾患に罹患しているかを診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。
【００６７】
本発明によって診断される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、および雌ウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
診断しようとする対象由来の生物試料を採取して、診断を実施することが好ましい。ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を、判定のための生物試料として使用することができる。生物試料には、体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、生物試料は、上皮細胞、より好ましくは乳癌上皮細胞、または癌であると疑われる組織由来の乳房上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要であれば、得られた体組織および体液から細胞を精製し、その後、生物試料として使用してもよい。
【００６９】
本発明によれば、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルは、対象由来の生物試料において決定される。発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで決定することができる。例えば、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によりプローブを用いて定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。アレイの使用は、本発明のＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を含む複数の遺伝子（例えば、様々な癌特異的遺伝子）の発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の配列情報を用いてこのようなプローブを調製することができる。例えば、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｃＤＮＡを、プローブとして使用してもよい。必要であれば、プローブは、色素および同位元素などの適した標識で標識してもよく、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズされた標識の強度として検出することができる。
【００７０】
さらに、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写産物は、増幅に基づく検出方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを用いて定量することができる。このようなプライマーもまた、遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、実施例において使用されるプライマー（ＲＱＣＤ１に対して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、６、７、１０、１１、１２、および１３；ＧＩＧＹＦ１に対して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４および１５；ＧＩＧＹＦ２に対して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６および１７）は、ＲＴ−ＰＣＲによる検出のために使用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
【００７１】
具体的には、本発明の方法のために使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件下で、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズする。本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは５０％のプローブが平衡状態で占有されている。典型的には、ストリンジェントな条件はｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（もしくは他の塩）であり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）の場合は少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約６０℃である条件であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって実現してもよい。
【００７２】
または、翻訳産物が本発明の診断のために検出され得る。例えば、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質の量を決定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を決定するための方法には、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイが含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでよい。さらに、抗体の任意の断片または改変体（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）も、その断片がＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質への結合能力を保持している限り、検出のために使用してもよい。タンパク質検出用のこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、かつ任意の方法を本発明において使用して、このような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【００７３】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、染色の強度を、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析を介して観察してもよい。すなわち、強い染色が観察された場合、当該タンパク質の存在の増加、および同時にＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の高い発現レベルが示唆される。
【００７４】
さらに、翻訳産物は、その生物活性に基づいて検出することもできる。本明細書において、特に、ＲＱＣＤ１タンパク質は癌細胞の増殖に関与していることが実証された。したがって、ＲＱＣＤ１タンパク質の癌細胞増殖促進能力は、生物試料中に存在するＲＱＣＤ１タンパク質の指標として使用され得る。
【００７５】
さらに、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルに加えて、他の癌関連遺伝子、例えば乳癌において差次的に発現されることが公知である遺伝子の発現レベルも決定して、診断の精度を向上させることができる。あるいは、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の間の発現レベルの組み合わせは、より正確な診断のために決定されてもよい。
【００７６】
生物試料中のＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルから、例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇する；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合、上昇しているとみなすことができる。
【００７７】
対照レベルは、疾患の状態（癌性または非癌性）が公知である対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物試料と同時に決定することができる。または、疾患の状態が公知である対象由来の試料中のＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られる結果に基づき、統計学的方法によって、対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、予め試験された細胞由来の発現パターンのデータベースでもよい。さらに、本発明のある局面によれば、生物試料中のＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較してもよい。患者由来の生物試料の組織型と同様の組織型由来の参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患の状態が公知である集団におけるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野において公知である任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を、標準値として使用することができる。
【００７８】
本発明の文脈において、非癌性であることが公知である生物試料から決定された対照レベルは「正常対照レベル」と呼ばれる。他方では、対照レベルが癌性の生物試料から決定される場合、これは「癌性対照レベル」と呼ばれる。
【００７９】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルが、正常対照レベルと比較して上昇しているか、または癌性対照レベルと同様である場合、その対象が癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクを有すると診断され得る。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料と癌性参照との間の遺伝子発現パターンの類似は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクを有することを示唆する。
【００８０】
試験生物試料の発現レベルと対照レベルとの間の差異は、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子（その発現レベルが、細胞の癌性状態または非癌性状態によって異ならないことが公知である遺伝子）の発現レベルに対して標準化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
さらに、本発明は、癌のマーカーとしてのＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の使用を提供する。これらの遺伝子は乳癌のマーカーに特に有用である。例えば、癌のマーカーとしてＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを検出することにより、生物試料が癌性細胞、とりわけ乳癌性細胞を含むかどうかを決定することができる。具体的には、正常対照レベルと比べて生物試料におけるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルの増大は、生物試料が癌性細胞を含むことを示唆する。上記のようにこれらのマーカー遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出することによって、発現レベルを決定することができる。翻訳産物は生物活性として決定することができる。
【００８２】
Ｉ−２．癌治療の有効性の評価
正常細胞と癌性細胞との間で差次的に発現するＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子により、癌の治療の経過をモニターすることもまた可能となり、かつ癌を診断するための前述の方法は、癌治療の有効性の評価に適用することができる。具体的には、癌治療の有効性は、治療を受けている対象由来の細胞におけるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを決定することによって評価することができる。必要に応じて、試験細胞集団は、様々な時点、治療前、治療中、および／または治療後に対象から採取される。ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルは、例えば「Ｉ−１．癌または癌を発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法に従って決定することができる。本発明の文脈において、検出された発現レベルと比較される対照レベルは、関心対象の治療に曝露されていない細胞におけるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子発現から得られることが好ましい。
【００８３】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを、正常細胞または癌細胞を含まない細胞集団から得られる対照レベルと比較する場合、発現レベルの類似は、関心対象の治療が有効であることを示唆し、発現レベルの差異は、その治療の臨床転帰または予後があまり好ましくないことを示唆する。他方では、癌細胞または癌細胞を含む細胞集団から得られる対照レベルに対して比較が実施される場合、発現レベルの差異が有効な治療を示唆するのに対し、発現レベルの類似は、臨床転帰または予後があまり好ましくないことを示唆する。
【００８４】
さらに、治療前および治療後のＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを、本発明の方法に従って比較して、治療の有効性を評価することもできる。具体的には、治療後の対象由来の生物試料において検出される発現レベル（すなわち、治療後レベル）が、同じ対象から治療開始前に採取された生物試料において検出される発現レベル（すなわち、治療前レベル）と比較される。治療前レベルと比較して治療後レベルが低下している場合、関心対象の治療が有効であることが示唆されるのに対し、治療前レベルと比較して治療後レベルが上昇しているか、または同様である場合、臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示唆される。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「有効な」という用語は、治療が、病的に上方制御されている遺伝子の発現の減少、病的に下方制御されている遺伝子の発現の増大、または対象における癌腫のサイズ、罹患率、もしくは転移能の低減をもたらすことを示す。関心対象の治療が予防的に適用される場合、「有効な」とは、治療が腫瘍の形成を遅延もしくは予防するか、または癌の少なくとも１種類の臨床症状を遅延、予防、もしくは緩和することを意味する。対象における腫瘍の状態の評価は、標準的な臨床的プロトコールを用いて実施することができる。
【００８６】
さらに、治療の有効性は、癌を診断するための任意の公知の方法に関連して決定することもできる。癌は、例えば徴候となる異常、例えば体重減少、腹痛、背痛、食欲低下、悪心、嘔吐、ならびに全身倦怠感、虚弱、および黄疸を同定することによって診断することができる。
【００８７】
本発明の方法および組成物に「予防」および「予防法」との関連で有用性が見出される限りにおいて、そのような用語は、疾患による死亡率および罹患率の負荷を軽減する任意の働きを意味するように本明細書において互換的に用いられる。予防および予防法は「一次、二次、および三次の予防レベルで」行うことができる。一次予防および予防法は疾患の発症を回避するのに対し、二次および三次レベルの予防および予防法は、疾患の進行および症状の出現の予防および予防法、ならびに機能の回復および疾患に関連する合併症の軽減による既存の疾患の悪影響の軽減を目的とした働きを包含する。あるいは、予防および予防法は、特定の障害の重症度の緩和、例えば、腫瘍の増殖および転移の低減を目的とした広範囲の予防的治療を含むことができる。
【００８８】
癌の治療および／もしくは予防法ならびに／またはその術後再発の予防は、以下の段階のいずれか、例えば、癌細胞の外科的除去、癌性細胞の成長の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導および癌の発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などを含む。癌の効果的治療および／または予防は、癌を有する個体の死亡率を低減するかまたは予後を改善する、血中の腫瘍マーカーのレベルを低減する、ならびに癌に付随する検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的治療を構成し、および／または予防法は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減、または安定した疾患を含む。
【００８９】
ＩＩ．  キット
本発明はまた、癌を検出するための試薬、すなわち、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出できる試薬を提供する。そのような試薬の例としては、
（ａ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡを検出することができるもの；
（ｂ）ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、もしくはＧＩＧＹＦ２タンパク質を検出することができるもの；および／または
（ｃ）対象由来の生物試料中のＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、もしくはＧＩＧＹＦ２タンパク質の生物活性を検出することができるもの
が挙げられる。
【００９０】
適切な試薬は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写産物に特異的に結合するまたはその転写産物を同定する核酸を含む。例えば、ＲＱＣＤ１遺伝子の転写産物に特異的に結合するまたはその転写産物を同定する核酸は、例えば、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子転写産物の一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、プローブおよびプライマー）を含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、関心対象の遺伝子のｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示され、当技術分野において周知の方法に基づいて調製されうる。あるいは、遺伝子の翻訳産物を検出するための試薬として抗体を例示することもできる。「Ｉ−１．  癌または癌を発症する素因を診断するための方法」の項目において上述したプローブ、プライマー、および抗体は、そのような試薬の好適な例と言うことができる。これらの試薬を癌の上記の診断のために使用することができる。これらの試薬を使用するためのアッセイ様式はノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチＥＬＩＳＡであってよく、このどちらも当技術分野において周知である。
【００９１】
検出試薬はキットの形態で一緒に包装されてもよい。例えば、検出試薬は個別の容器に包装されてもよい。さらに、検出試薬は検出に必要な他の試薬とともに包装されてもよい。例えば、キットは、検出試薬としての核酸もしくは抗体（固体マトリックスに結合されるか、もしくはマトリックスにそれらを結合するための試薬とともにマトリックスとは別々に包装されるかのいずれか）、対照試薬（陽性および／もしくは陰性）、および／または検出可能な標識を含むことができる。本発明のキットはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、注射針、注射器を含む、商業上および利用者の観点から望ましい他の材料を含むこともできる。これらの試薬などを標識とともに容器内に保持することができる。好適な容器にはボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。本アッセイを行うための説明書（例えば、文書、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）がキットに含まれてもよい。
【００９２】
本キットは乳癌の検出および診断に適しているが、癌の予後の評価および／または癌治療の有効性のモニタリングにも有用でありうる。
【００９３】
本発明のある局面として、癌を検出するための試薬を、多孔質ストリップなどの固体マトリックス上に固定して、癌を検出するための少なくとも１つの部位を形成することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが検出試薬（例えば核酸）を含む複数の部位を含んでよい。テストストリップは、陰性対照および／または陽性対照用の部位も含んでよい。または、対照部位は、テストストリップとは別のストリップ上に配置されてもよい。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定された検出試薬（例えば核酸）を含んでもよい。すなわち、第一の検出部位はより多くの量を含み、次の部位はより少ない量を含んでもよい。試験生物試料を添加した際、検出可能なシグナルを提示している部位の数が、試料中のＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルの定量的な指標を提供する。検出部位は、適切に検出することができる任意の形状で形成されてよく、典型的には、テストストリップの幅にわたる棒または点の形状である。
【００９４】
ＩＩＩ．スクリーニング方法
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子、これらの遺伝子もしくはその断片によってコードされるポリペプチド、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、この遺伝子の発現またはこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を変更する薬剤をスクリーニングすることが可能である。このような薬剤は、癌、特に乳癌を治療または予防するための薬剤として使用されてもよい。したがって、本発明は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子、この遺伝子もしくはその断片によってコードされるポリペプチド、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００９５】
本発明のスクリーニング方法によって単離される薬剤は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現またはこの遺伝子の翻訳産物の活性を阻害すると予想される薬剤であり、したがって、例えば、癌（具体的には、乳癌）などの細胞増殖性疾患を特徴とする疾患を治療または予防するための候補である。すなわち、本発明の方法によってスクリーニングされる薬剤は、臨床的な利益を有するとみなされ、さらに動物モデルまたは試験用対象において癌細胞増殖を防止する能力について試験することができる。
【００９６】
本発明の文脈において、本発明のスクリーニング方法によって同定される薬剤は、任意の化合物、またはいくつかの化合物を含む組成物でよい。さらに、本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験薬剤は、単一の化合物、または化合物の組み合わせでよい。化合物の組み合わせがこれらの方法において使用される場合、これらの化合物は、逐次的にまたは同時に接触させてよい。本明細書に記載されているスクリーニングに有用な試験薬剤は、インビボでの元のタンパク質の生物活性を有さない関心対象のタンパク質またはその部分的なペプチドに特異的に結合する抗体であることもできる。
【００９７】
任意の試験薬剤、例えば細胞抽出物、細胞培養上清液、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの核酸構築物を含む）、および天然化合物を、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。本明細書に記載のスクリーニングにおいて有用な試験薬剤は、関心対象のタンパク質または元のタンパク質の生物活性をインビボで有さないその部分ペプチドに特異的に結合する抗体であることもできる。
【００９８】
本発明の試験薬剤はまた、
（１）生物ライブラリー、
（２）空間的にアドレス可能な平行な固相ライブラリーまたは液相ライブラリー、
（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、
（４）「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、および
（５）アフィニティークロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法
を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。
【００９９】
アフィニティークロマトグラフィー選別を使用する生物ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチは、ペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12:145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出すことができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:6909-13;Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91:11422-6;Zuckermann et al., J Med Chem 37:2678-85, 1994;Cho et al., Science 1993, 261:1303-5;Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33:2059;Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33:2061;Gallop et al., J Med Chem 1994, 37:1233-51）。化合物のライブラリーは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13:412-21を参照されたい）、またはビーズ上（Lam, Nature 1991, 354:82-4）、チップ上（Fodor, Nature 1993, 364:555-6）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89:1865-9）、もしくはファージ上（Scott and Smith, Science 1990, 249:386-90;Devlin, Science 1990, 249:404-6;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87:6378-82;Felici, J Mol Biol 1991, 222:301-10；米国特許出願第２００２１０３３６０号）に提示され得る。
【０１００】
試験薬剤ライブラリーの構築は当技術分野において周知であるが、以下に、試験薬剤の同定、および本スクリーニング方法のためのそのような薬剤のライブラリー構築に関するさらなる指針を提供する。
【０１０１】
Ａ．  分子モデリング：
求められている特性を有することが知られている化合物の分子構造、および／またはＣ１２ＯＲＦ４８の分子構造に関する知識は、試験薬剤ライブラリーの構築に役立つ。さらなる評価に適した試験薬剤の予備スクリーニングに対する一つの手法では、試験薬剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングを利用する。
【０１０２】
コンピュータモデリング技術によって、選択した分子の三次元原子構造の視覚化、および当該分子と相互作用する新しい化合物の合理的な設計が可能になる。三次元構築物は、典型的には、選択した分子のｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ画像化のデータに依存する。分子動力学では力場データが必要になる。コンピュータグラフィックスシステムにより、新しい化合物がどのように標的分子に結び付くかの予測が可能になり、ならびに完全な結合特異性のための化合物および標的分子の構造の実験的操作が可能になる。一方または両方に小さな変化を起こした場合に分子-化合物間の相互作用がどうなるかの予測には、分子設計プログラムと使用者との間の使い勝手の良いメニュー選択式のインターフェースと通常は連係している、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要である。
【０１０３】
上記に一般的に記述した分子モデリングシステムの一例には、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  Ｍａｓｓ）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化および分子動力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および解析を行う。ＱＵＡＮＴＡによって、分子の互いの挙動の相互的な構築、改変、視覚化、および解析が可能になる。
【０１０４】
特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングに関していくつかの論文が発表されており、その例としては、Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66; Ripka, New Scientist 1988, 54-8; McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22; Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93; Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62; および核酸成分に対するモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90が挙げられる。
【０１０５】
化学物質をスクリーニングし、画像として描写する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，  Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，  Ｃａｌｉｆ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ，  Ｉｎｃ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，  Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）などの会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24; Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78; Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
【０１０６】
推定上の阻害剤が同定されたら、下記に詳述するように、同定された推定上の阻害剤の化学構造に基づき、コンビナトリアル化学の技術を利用して任意の数の変種を構築することができる。結果として得られた推定上の阻害剤または「試験薬剤」のライブラリーを本発明の方法を用いてスクリーニングし、癌の治療および／もしくは予防法ならびに／または癌、特に乳癌の術後再発の予防に適した試験薬剤を同定することができる。
【０１０７】
Ｂ．  コンビナトリアル化学合成：
試験薬剤のコンビナトリアルライブラリーは、公知の阻害剤に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として作出することができる。この手法により、ライブラリーを適切なサイズに維持することが可能となり、ハイスループットスクリーニングに役立つ。あるいは、ライブラリーを構成する分子ファミリーの全ての並べ換えを単純に合成することによって、単純な、特に短い重合体分子ライブラリーを構築することも可能である。この後者の手法の一例は、全てのペプチドが６アミノ酸長のライブラリーであろう。このようなペプチドライブラリーは、６アミノ酸配列のあらゆる並べ換えを含みうる。この種のライブラリーは、直線的コンビナトリアル化学ライブラリーと称される。
【０１０８】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製は当業者に周知であり、化学的または生物学的合成のいずれかによって作出することができる。コンビナトリアル化学ライブラリーはペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号； Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93; Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照のこと）を含むが、これに限定されない。化学的多様性ライブラリーを作出するための他の化学的性質も用いることができる。そのような化学的性質は以下を含むが、それらに限定されない：ペプチド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９１／１９７３５）、コード化ペプチド（例えば、ＷＯ  ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ  ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:6909-13）、ビニローグ性ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、小化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリー（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3):309-14およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、糖質ライブラリー（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22；米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、ならびに小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1;6(6):624-31.；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号、および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号などを参照のこと）。
【０１０９】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を参照のこと）。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリーそれ自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｔｒｉｐｏｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｅｘｔｏｎ，  ＰＡ，  Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  ＭＤなどを参照のこと）。
【０１１０】
Ｃ．  他の候補：
別の手法では組み換えバクテリオファージを用いてライブラリーを作出する。「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90; Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリー（例えば、１０６〜１０８個の化学的実体）を構築することができる。第二の手法では主に化学的方法を用い、Ｇｅｙｓｅｎ法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15; Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）；およびＦｏｄｏｒらの方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Ｆｕｒｋａら（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR:013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（米国特許第４，６３１，２１１号）およびＲｕｔｔｅｒら（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験できるペプチドの混合物を作出するための方法について記述している。
【０１１１】
アプタマーは、特異的な分子標的に強く結合する核酸から構成される巨大分子である。Tuerk and Gold(Science. 249:505-510 (1990)）は、アプタマーの選択のためのＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発生；Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法について開示している。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大きなライブラリー（例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに用いることができる。
【０１１２】
本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換によって変換されている化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる薬剤に含まれる。
【０１１３】
さらに、スクリーニングされる試験薬剤がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードするＤＮＡを得るために、そのタンパク質のアミノ酸配列全体を決定し、そのタンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られるタンパク質のアミノ酸配列の一部を解析し、その配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、かつそのプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そのタンパク質をコードするＤＮＡを得てもよい。得られるＤＮＡは、癌を治療または予防するための候補である試験薬剤を調製する際に使用される。
【０１１４】
ＩＩＩ−１．  タンパク質に基づくスクリーニング方法
本発明によれば、ＲＱＣＤ１遺伝子の発現は癌細胞、特に乳癌細胞の成長および／または生存に不可欠である。さらに、ＲＱＣＤ１タンパク質はＧＩＧＹＦ１タンパク質および／またはＧＩＧＹＦ２タンパク質と相互作用することが実証されており、これらの３つのタンパク質は、発癌に密接に関連することが周知の、Ａｋｔリン酸化に関与することが示された。したがって、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能を抑制する薬剤は、癌細胞の成長および／または生存を阻害するものと推測され、それゆえ、癌の治療または予防において用途が見出されると考えられる。かくして、本発明はＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを用いて、癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明はまた、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを用いて、癌細胞の成長および／または生存を阻害するための候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明はまた、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを用いて、Ａｋｔリン酸化、特にＳｅｒ  ４７３リン酸化を阻害するための候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０１１５】
ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに加え、天然に存在するＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドの少なくとも一つの生物活性を保持する限り、これらのポリペプチドの断片を本スクリーニングに用いることができる。
【０１１６】
前記ポリペプチドまたはその断片は、該ポリペプチドおよび断片がその生物活性の少なくとも１種類を保持している限り、他の物質にさらに連結されてもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。これらの種類の修飾は、付加的な機能を与えるため、またはポリペプチドおよび断片を安定化させるために実施してもよい。
【０１１７】
本発明の方法に使用される前記ポリペプチドまたは断片は、従来の精製方法を経て天然のタンパク質として自然界から、または選択されたアミノ酸配列に基づく化学合成を通じて、得ることができる。例えば、合成のために採用することができる従来のペプチド合成方法には、以下のものが含まれる：
（１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（２）The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976；
（３）ペプチド合成、丸善出版、１９７５年；
（４）ペプチド合成の基礎と実験、丸善出版、１９８５年；
（５）医薬品の開発  続  第１４巻（ペプチド合成）、広川書店、１９９１年；
（６）ＷＯ  ９９／６７２８８；ならびに
（７）Barany G. and Merrifield R.B., Peptides Vol.2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【０１１８】
または、前記タンパク質は、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学方法を通じて、得ることもできる（例えば、Morrison J., J Bacteriology 1977, 132:349-51;Clark-CurtissおよびCurtiss, Methods in Enzymology(Wu et al. 編)1983, 101:347-62）。例えば最初に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に）含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞中に形質転換し、次いでその宿主細胞を培養して、そのタンパク質を産生させる。より具体的には、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドをコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８など外来遺伝子を発現させるためのベクター中に挿入することによって、その遺伝子を宿主（例えば動物）細胞などにおいて発現させる。発現のために、プロモーターを使用してもよい。一般に使用される任意のプロモーターを使用してもよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby、Williamson（編）, Genetic Engineering, vol.3.Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 1990, 91:217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 1991, 108:193）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946）、およびＨＳＶ  ＴＫプロモーターなどが含まれる。ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを発現させるための宿主細胞中へのベクターの導入は、任意の方法、例えばエレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15:1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7:2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12:5707-17;Sussman et al., Mol Cell Biol 1985, 4:1641-3）、およびリポフェクチン法（Derijard B, Cell 1994, 7:1025-37;Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5:22-30;Rabindran et al., Science 1993, 259:230-4）などに従って実施することができる。
【０１１９】
ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質はまた、インビトロの翻訳システムを採用して、インビトロで産生してもよい。
【０１２０】
試験物質と接触させるＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドは、例えば精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または他のポリペプチドと融合された融合タンパク質でよい。
【０１２１】
ＩＩＩ−１−１．前記ポリペプチドに結合する薬剤の同定
前記タンパク質に結合する薬剤は、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現または当該タンパク質の生物活性を変更すると考えられる。したがって、ある局面として、本発明は、以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験薬剤を、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）前記ポリペプチドまたはその断片と試験薬剤との結合（または結合活性）を検出する段階；および
（ｃ）前記ポリペプチドに結合する試験薬剤を、癌を治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
【０１２２】
本発明によれば、細胞成長の阻害に及ぼす試験薬剤もしくは化合物の治療効果またはＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の評価を行うことができる。それゆえ、本発明はまた、以下の段階を含む、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片と試験薬剤とを接触させる段階；
（ｂ）前記ポリペプチドまたは断片と試験薬剤との間の結合（または結合活性）を検出する段階；および
（ｃ）（ｂ）の結合を、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０１２３】
本発明に関して、治療効果を、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその機能的断片に対する結合レベルと関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物がＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその機能的断片に結合する場合、その試験薬剤または化合物を、必要な治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物がＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその機能的断片に結合しない場合、その試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
【０１２４】
本発明において、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２の発現を抑制することで、癌細胞の成長が低減されることが明らかとなる。かくして、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２に結合する候補化合物をスクリーニングすることにより、癌を治療または予防する可能性がある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が癌を治療または予防する可能性を、第二のおよび／またはさらなるスクリーニングにより評価して、癌の治療薬剤を同定することができる。
【０１２５】
ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドへの試験薬剤の結合は、例えば当該ポリペプチドに対する抗体を使用する免疫沈降法によって検出することができる。したがって、このような検出の目的で、スクリーニングのために使用されるＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片は、抗体認識部位を含むことが好ましい。スクリーニングのために使用される抗体は、調製方法が当技術分野において周知である、本発明のＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドの抗原性領域（例えばエピトープ）を認識する抗体でよく、かつ任意の方法を本発明において使用して、このような抗体およびそれらの等価物を調製してもよい。
【０１２６】
または、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドもしくはその断片は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に対する、特異性が明らかにされているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をそのＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質として発現され得る。市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Experimental Medicine 1995, 13:85-90）。例えば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を、そのマルチクローニングサイトを用いることにより発現できるベクターが市販されており、本発明のために使用することができる。さらに、エピトープに対する抗体を用いた免疫沈降法によって検出され得る非常に小さなエピトープを含む融合タンパク質もまた、当技術分野において公知である（Experimental Medicine 1995, 13:85-90）。ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片の性質を変えない数個〜数十個のアミノ酸から構成されるそのようなエピトープもまた、本発明において使用することができる。例には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集体ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などが含まれ、それらを認識するモノクローナル抗体を、ＲＱＣＤ１ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。
【０１２７】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）もまた、免疫沈降法によって検出される融合タンパク質の対応物として周知である。ＧＳＴがＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片と融合されるタンパク質として使用され、融合タンパク質を形成する場合、この融合タンパク質は、ＧＳＴに対する抗体、またはＧＳＴに特異的に結合する物質、すなわちグルタチオン（例えばグルタチオン−セファロース４Ｂ）などのいずれかを用いて検出することができる。
【０１２８】
免疫沈降法において、（ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドもしくはその断片それ自体、またはそのポリペプチドもしくは断片にタグ付加されたエピトープを認識する）抗体を、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドおよび試験薬剤の反応混合物に添加することにより、免疫複合体が形成される。試験薬剤がポリペプチドに結合する能力を有する場合、形成される免疫複合体は、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、試験薬剤、および抗体からなると考えられる。これに対して、試験薬剤がこのような能力を欠いている場合、形成される免疫複合体は、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドおよび抗体のみからなる。したがって、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する試験薬剤の結合能力は、例えば形成された免疫複合体のサイズを測定することによって調べることができる。クロマトグラフィー、電気泳動などを含む、物質のサイズを検出するための任意の方法を使用することができる。例えば、マウスＩｇＧ抗体が検出に使用される場合、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースを、形成された免疫複合体を定量するのに使用することができる。
【０１２９】
免疫沈降に関するさらに詳細な情報については、例えば、Harlow et al., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52を参照されたい。免疫沈降タンパク質の分析には一般的にＳＤＳ−ＰＡＧＥが使用され、適切な濃度を有するゲルを用いて、タンパク質の分子量により、結合タンパク質を分析することができる。検出はクマシー染色法もしくは銀染色法などの、従来の染色法を用いて達成してもよく、または、検出が困難な場合、タンパク質に対する検出感度は、放射性同位体３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培地中で細胞を培養し、細胞中のタンパク質を標識し、そしてタンパク質を検出することにより改善することができる。タンパク質の分子量が明らかにされている場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製し、その配列を決定してもよい。
【０１３０】
さらに、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドもしくはその断片に結合する薬剤をスクリーニングするために使用されるＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片は、担体に結合されてもよい。当該ポリペプチドに結合するのに使用され得る担体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ、好ましくは、上記の材料から調製された、市販されているビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）が使用され得る。ビーズを使用する場合、これらはカラム中に充填されてよい。または、磁性ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより磁気を用いてビーズに結合させたポリペプチドおよび薬剤を容易に単離することが可能になる。
【０１３１】
担体へのポリペプチドの結合は、化学的結合および物理的吸着などの常法に従って実施してもよい。または、ポリペプチドは、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して担体に結合され得る。さらに、担体へのポリペプチドの結合は、アビジンとビオチンの組み合わせなどの相互作用する分子を用いて実施することもできる。
【０１３２】
このような担体に結合したＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片を使用するスクリーニングは、例えば、担体に結合したポリペプチドに試験薬剤を接触させる段階、この混合物をインキュベートする段階、担体を洗浄する段階、ならびに担体に結合した薬剤を検出および／または測定する段階を含む。緩衝液が結合を阻害しない限り、緩衝液中で、例えば、限定されないが、リン酸緩衝液およびトリス緩衝液中で、結合を実施してもよい。
【０１３３】
このような担体に結合したＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片および組成物（例えば、細胞抽出物、細胞溶解物など）が試験薬剤として使用されるスクリーニング方法では、このような方法は一般にアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる。例えば、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを、アフィニティーカラムの担体上に固定して、当該ポリペプチドに結合することができる物質を含む試験薬剤をカラムに添加してもよい。試験薬剤を添加した後、カラムを洗浄し、次いでポリペプチドに結合した物質を、適切な緩衝液を用いて溶出させる。
【０１３４】
表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、本発明において結合した薬剤を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーが使用される場合、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドと試験薬剤との間の相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを用いてポリペプチドと試験薬剤との間の結合を評価することが可能である。
【０１３５】
合成化学化合物、または天然物質バンクもしくはランダムペプチドファージディスプレイライブラリー中の分子の中から、担体上に固定された特定のタンパク質をそれらの分子に曝露させることによって、その特定のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法、およびタンパク質だけでなく化学化合物も単離する、コンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットスクリーニング方法（Wrighton et al., Science 1996, 273:458-64;Verdine, Nature 1996, 384:11-3）もまた、当業者には周知である。これらの方法もまた、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその断片に結合する薬剤（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）をスクリーニングするために使用することができる。
【０１３６】
試験薬剤がタンパク質である場合、例えばウェストウェスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 1991, 65:83-90）を本発明の方法に使用することができる。具体的には、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに結合するタンパク質は、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに結合する少なくとも１種類のタンパク質を発現することが予想される細胞、組織、器官、または培養細胞（例えばＰＣ細胞株）からｃＤＮＡライブラリーを最初に調製し、そのｃＤＮＡライブラリーのベクターによってコードされるタンパク質をＬＢアガロース上で発現させ、発現されたタンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識したＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを前述のフィルターと反応させ、かつＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドの標識に従って、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドが結合したタンパク質を発現しているプラークを検出することによって、得ることができる。
【０１３７】
放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、蛍光性物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン）、およびビオチン／アビジンなどの標識物質を、本発明の方法においてＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドの標識のために使用してもよい。タンパク質が放射性同位体で標識される場合、検出または測定は、液体シンチレーションによって実施することができる。または、タンパク質が酵素で標識される場合、酵素基質を添加して、発色などの基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することによって、タンパク質を検出または測定することができる。さらに、蛍光物質が標識として使用される場合、蛍光光度計を用いて、結合したタンパク質を検出または測定してもよい。
【０１３８】
さらに、タンパク質に結合したＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドは、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに融合されているペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）に特異的に結合する抗体を使用することによって、検出または測定することができる。本発明のスクリーニングにおいて抗体を使用する場合、抗体は、好ましくは前述の標識物質の１つで標識され、標識物質に基づいて検出または測定される。または、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する抗体を、標識物質で標識された二次抗体で検出される一次抗体として使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに結合する抗体は、プロテインＧカラムまたはプロテインＡカラムを用いて検出または測定してもよい。
【０１３９】
または、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を使用するツーハイブリッドシステムが使用され得る（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton et al., Cell 1992, 68:597-612」および「Fields et al., Trends Genet 1994, 10:286-92」）。ツーハイブリッドシステムでは、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片は、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合され、かつ酵母細胞において発現される。ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに結合する少なくとも１種類のタンパク質を発現することが予想される細胞から、発現された場合にそのライブラリーがＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域に融合されるように、ｃＤＮＡライブラリーを調製する。次いで、ｃＤＮＡライブラリーを前述の酵母細胞中に導入し、かつライブラリーに由来するｃＤＮＡを、検出された陽性クローンから単離する（ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、これら２種類の結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンが検出可能になる）。ｃＤＮＡにコードされるタンパク質は、上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入し、かつタンパク質を発現させることによって、調製することができる。
【０１４０】
レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子に加え、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを使用することができる。
【０１４１】
このスクリーニングによって単離される薬剤は、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによって、そのポリペプチドの機能を活性化する分子を意味する。これに対して、「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによって、そのポリペプチドの機能を阻害する分子を意味する。さらに、このスクリーニングによってアンタゴニストとして単離される薬剤は、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドと分子（核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）ならびにタンパク質とのインビボでの相互作用を阻害する候補である。
【０１４２】
ＩＩＩ−１−２．  ポリペプチドの生物活性の検出による薬剤の同定
本発明はまた、以下の段階を含む、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその断片を用いて、癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその断片と試験薬剤または化合物を接触させる段階；および
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階；
（ｃ）試験薬剤の非存在下での生物活性と比べて前記ポリペプチドの生物活性を低減する試験薬剤を選択する段階。
【０１４３】
本発明によれば、細胞成長の阻害に及ぼす試験薬剤もしくは化合物の治療効果またはＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物を評価することができる。それゆえ、本発明はまた、以下の段階を含む、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその機能的断片と試験薬剤または化合物とを接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階；および
（ｃ）（ｂ）の生物活性を試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０１４４】
本発明において、治療効果を、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその機能的断片の生物活性と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、当該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されるレベルと比べてＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制または阻害する場合、当該試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、当該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されるレベルと比べてＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチド、またはその機能的断片の生物活性を抑制または阻害しない場合、当該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
【０１４５】
本発明において、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２の発現を抑制することで、癌細胞の成長が低減されることが明らかとなる。かくして、該ポリペプチドの生物活性を抑制する候補化合物をスクリーニングすることにより、癌を治療または予防する可能性がある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が癌を治療または予防する可能性を第二のおよび／またはさらなるスクリーニングにより評価して、癌の治療薬を同定することができる。例えば、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質と結合する化合物が癌の上記活性を阻害する場合、このような化合物はＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２特異的な治療効果を有すると結論付けることができる。
【０１４６】
ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドの生物活性を抑制または低減する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。本発明に関して、「生物活性を抑制または低減する」という語句は、化合物の非存在下における場合と比べてＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、および／またはＧＩＧＹＦ２の生物活性の少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは少なくとも９０％の抑制を包含する。そのような抑制は本スクリーニング方法において指標として役立ちうる。
【０１４７】
本発明によれば、ＲＱＣＤ１ポリペプチドは乳癌細胞の成長または生存に必要であることが実証された。スクリーニングのための指標として使用できるＲＱＣＤ１ポリペプチドの生物活性は、ヒトＲＱＣＤ１ポリペプチドのそのような細胞成長促進活性を含む。
【０１４８】
本方法において検出される生物活性が細胞増殖である場合、これは、例えば、ＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはその断片を発現する細胞を調製し、試験薬剤の存在下で前記細胞を培養し、細胞増殖の速度を決定し、細胞周期を測定することなどにより、ならびに、創傷治癒活性を検出すること、Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイを実施すること、およびコロニー形成活性を測定することにより、検出することができる。
【０１４９】
本発明によれば、ＲＱＣＤ１ポリペプチドはインビボでＧＩＧＹＦ１タンパク質および／またはＧＩＧＹＦ２タンパク質と相互作用する。ゆえに、ＲＱＣＤ１ポリペプチドをＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとともに用いることができる。この場合、本発明の方法は以下の段階を含むことができる：
（ａ）ＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはその断片ならびにＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片と試験薬剤または化合物とを接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験薬剤の非存在下での生物活性と比べて前記ポリペプチドの生物活性を低減する試験薬剤を選択する段階。
【０１５０】
本発明によれば、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、およびＧＩＧＹＦ２ポリペプチドはＡｋｔリン酸化活性を有する。それゆえ、Ａｋｔリン酸化活性を本スクリーニング方法において生物活性として検出することができる。検出される生物活性がＡｋｔリン酸化である場合、これは、例えば、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、例えば、抗リン酸化Ａｋｔ抗体でのウエスタンブロッティングを用いてＡｋｔリン酸化のレベルを決定することにより検出することができる。未処理細胞でのものと比べてＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを発現する細胞でのＡｋｔリン酸化のレベルを低減する薬剤を候補薬剤として選択する。ＲＱＣＤ１発現細胞を調製するために細胞へＲＱＣＤ１遺伝子をＧＩＧＹＦ１遺伝子および／またはＧＩＧＹＦ２遺伝子とともに同時形質転換することができる。
【０１５１】
好ましくは、Ａｋｔのリン酸化レベルは４７３セリン残基の位置で検出することができる。Ａｋｔポリペプチドのアミノ酸配列の例はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０１４４３１）に示されており、これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０１４４３１．１）のヌクレオチド配列によってコードされる。４７３  Ｓｅｒでのリン酸化は、例えば、抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）を用いたウエスタンブロッティングによって検出することができる。
【０１５２】
ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを発現する細胞を用いたスクリーニング方法に加えて、単離されたＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを本スクリーニング方法に用いることができる。この場合、単離されたＡｋｔを適切なリン酸供与体（例えば、ＡＴＰ）とともに反応系に供与することができる。あるいは、抗Ａｋｔ抗体を有する担体とＡｋｔとを接触させることにより、Ａｋｔを捕捉することもできる。標識されたリン酸供与体が使用される場合、標識を追跡することによりＡｋｔのリン酸化レベルを検出することができる。例えば、放射性標識ＡＴＰ（例えば、３２Ｐ−ＡＴＰ）がリン酸供与体として使用される場合、Ａｋｔへ取り込まれた放射活性はＡｋｔのリン酸化レベルと相関する。
【０１５３】
本発明によれば、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、およびＧＩＧＹＦ２ポリペプチドはインビボでお互いに相互作用する。それゆえ、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、およびＧＩＧＹＦ２ポリペプチド間での組み合わせを本スクリーニング方法に用いることができる。
【０１５４】
本スクリーニング方法によって単離された薬剤は、ＲＱＣＤ１ポリペプチドのアンタゴニストの候補であり、したがって、分子（核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）ならびにタンパク質を含む）と当該ポリペプチドのインビボでの相互作用を阻害する候補である。
【０１５５】
ＩＩＩ−１−３．  ＲＱＣＤ１ポリペプチドとＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとの間の結合活性の検出による薬剤の同定
本発明によれば、ＲＱＣＤ１ポリペプチドは癌細胞、特に乳癌細胞においてＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドと相互作用するので、これらのポリペプチド間の相互作用はＡｋｔリン酸化および癌細胞の成長に重要であるものと考えられる。それゆえ、ＲＱＣＤ１ポリペプチドと、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよびＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとの間の相互作用を阻害する薬剤は、Ａｋｔリン酸化ならびに癌細胞の成長および／または生存の阻害に有用であり、したがって、癌の治療または予防に有用であるものと期待される。かくして、本発明は、ＲＱＣＤ１ポリペプチドと、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよびＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとの間の結合活性に基づき癌を治療または予防するための候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本スクリーニング方法はまた、癌細胞の成長および／または生存、ならびにＡｋｔリン酸化を阻害するための候補薬剤をスクリーニングするのに有用である。本スクリーニング方法は以下の段階を含む：
（１）試験薬剤の存在下でＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはその機能的等価物とＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはそれらの機能的等価物とを接触させる段階；
（２）段階（１）のポリペプチド間の結合を検出する段階；ならびに
（３）ポリペプチド間の結合を阻害する試験薬剤を選択する段階。
【０１５６】
本発明によれば、細胞成長の阻害に及ぼす試験薬剤もしくは化合物の治療効果またはＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物を評価することができる。それゆえ、本発明はまた、以下の段階を含む、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞成長を阻害するための候補薬剤もしくは化合物またはＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、もしくはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験薬剤の存在下でＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはその機能的等価物とＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはそれらの機能的等価物とを接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチド間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）（ｂ）の結合を試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０１５７】
本発明において、治療効果を、ＲＱＣＤ１ポリペプチドと、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよびＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはそれらの機能的断片との間での結合活性と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、当該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、ＲＱＣＤ１ポリペプチドとＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよびＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはそれらの機能的断片との間の結合活性を抑制または阻害する場合、当該試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、当該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、ＲＱＣＤ１ポリペプチドとＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよびＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはそれらの機能的断片との間の結合活性を抑制または阻害しない場合、当該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
【０１５８】
本発明において、ＲＱＣＤ１ポリペプチドと、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよびＧＩＧＹＦ２ポリペプチドまたはそれらの機能的断片との間の結合活性を抑制することで、癌細胞の成長が低減されることが明らかになる。かくして、当該結合活性を抑制する候補化合物をスクリーニングすることにより、癌を治療または予防する可能性がある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が癌を治療または予防する可能性を第二のおよび／またはさらなるスクリーニングにより評価して、癌の治療薬を同定することができる。
【０１５９】
ＲＱＣＤ１ポリペプチドと、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する薬剤をスクリーニングする方法として、当業者によって周知の多くの方法を用いることができる。例えば、スクリーニングは、細胞株などのインビトロでのアッセイ系として行うことができる。より具体的には、初めに、ＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドのいずれかを支持体に結合させ、それに、試験薬剤とともに他のタンパク質を加える。次に、混合物をインキュベートし、洗浄し、支持体に結合した他のタンパク質を検出および／または測定する。
【０１６０】
タンパク質を結合させるのに使用できる支持体の例としては、例えば、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が挙げられ、好ましくは、上記の材料から調製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）を用いることができる。ビーズを用いる場合、それらはカラム中に充填されてよい。あるいは、磁性ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより磁気によってビーズに結合させたタンパク質を容易に単離することが可能になる。
【０１６１】
支持体へのタンパク質の結合は、例えば、化学的結合および物理的吸着などの常法にしたがって行うことができる。あるいは、タンパク質は、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合されてもよい。さらに、支持体へのタンパク質の結合は、アビジンおよびビオチンを用いて行うこともできる。
【０１６２】
タンパク質間の結合は緩衝液中で行われることが好ましく、その例としてはリン酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、選択された緩衝液はタンパク質間の結合を阻害してはならない。
【０１６３】
本発明に関して、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサーを、結合したタンパク質を検出または定量化するための手段として用いることができる。そのようなバイオセンサーが用いられる場合、タンパク質間の相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用いかつ標識せずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。それゆえ、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを用いてＲＱＣＤ１ポリペプチドとＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとの間の結合を評価することが可能である。
【０１６４】
あるいは、ＲＱＣＤ１ポリペプチドまたはＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドのいずれかを標識し、結合したタンパク質の標識を用いて、結合タンパク質を検出または測定してもよい。具体的には、タンパク質の一方を予め標識した後に、標識タンパク質を試験薬剤の存在下で他方のタンパク質と接触させ、次いで、洗浄後に標識によって結合タンパク質を検出または測定する。
【０１６５】
放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン）、およびビオチン／アビジンを含むがこれらに限定されない標識物質を、本方法においてタンパク質の標識のために用いることができる。タンパク質が放射性同位体で標識される場合、検出または測定は、液体シンチレーションによって行うことができる。あるいは、酵素基質を加えて、発色などの基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することにより、酵素で標識されたタンパク質を検出または測定することができる。さらに、蛍光物質が標識として使用される場合、蛍光光度計を用いて、結合したタンパク質を検出または測定することができる。
【０１６６】
さらに、ＲＱＣＤ１ポリペプチドとＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドとの結合を、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体に固定化されたＲＱＣＤ１ポリペプチドを試験薬剤ならびにＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドと接触させた後に、混合物をインキュベートし、洗浄し、そしてＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する抗体を用いて検出または測定を行うことができる。あるいは、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドおよび／またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドを支持体に固定化し、ＲＱＣＤ１ポリペプチドに対する抗体を抗体として用いてもよい。
【０１６７】
本スクリーニングにおいて抗体を用いる場合、抗体は上記の標識物質の一つで標識され、該標識物質に基づいて検出または測定されることが好ましい。あるいは、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する抗体を、標識物質で標識された二次抗体で検出される一次抗体として用いてもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質に結合する抗体は、プロテインＧまたはプロテインＡカラムを用いて検出または測定することもできる。
【０１６８】
本スクリーニング方法において用いられるポリペプチドは、標準的な手順を用いて組み換えにより産生することができる。例えば、関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子は、該遺伝子をｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、およびｐＣＤ８などの、外来遺伝子用の発現ベクターへ挿入することにより動物細胞中で発現させることができる。発現のために用いられるプロモーターは、一般に使用されうる任意のプロモーターであってよく、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23 (1990)）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193 (1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466-72 (1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946-58 (1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーターなどを含む。外来遺伝子を発現させるための動物細胞中への遺伝子の導入は、任意の従来の方法、例えば、エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)）、リポフェクチン法（Derijard B, Cell 76: 1025-37 (1994); Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran et al., Science 259: 230-4 (1993)）などにしたがって行うことができる。ポリペプチドは、該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、特異性が明らかにされたモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を導入することにより、該モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。あるいは、市販されているエピトープ−抗体系を用いることもできる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。例えば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を、マルチクローニングサイトの使用によって発現できるベクターが市販されている。
【０１６９】
融合によって元のポリペプチドの特性を変えないように数個から数十個のアミノ酸から構成される小さなエピトープのみを導入することにより調製された融合タンパク質もまた、本明細書において提供される。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープ、およびそれらを認識する抗体を、ポリペプチド間の結合活性を検出するためのエピトープ−抗体系として用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。
【０１７０】
本スクリーニング方法において用いられる抗体は、当技術分野において周知の技術を用いて調製することができる。調製される抗体に対する抗原は任意の動物種に由来してよいが、好ましくは、ヒト、マウス、ウサギ、またはラットなどの哺乳類に由来し、より好ましくは、ヒトに由来する。抗原として用いられるポリペプチドは、組み換えによって産生されてもよく、または天然源から単離されてもよい。免疫抗原として用いられるポリペプチドは完全なタンパク質であっても、または完全なタンパク質に由来する部分ペプチドであってもよい。
【０１７１】
任意の哺乳動物を抗原で免疫してもよいが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物が用いられる。げっ歯目の動物には、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えば、ノウサギ、ナキウサギ、およびイエウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）のサル（旧世界ザル）が含まれる。
【０１７２】
動物を抗原で免疫するための方法は、当技術分野において周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳類を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原は、適切な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水などに希釈および懸濁してもよい。所望の場合、抗原懸濁液を、適切な量のフロイント完全アジュバントなどの標準的なアジュバントと混合し、エマルジョンにし、次いで哺乳動物に投与してよい。好ましくは、それに続いて、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を４日〜２１日毎に数回投与する。免疫のために適切な担体を用いることもできる。上記の免疫の後、標準的な方法により、所望の抗体の量の増加に関して血清を検査する。
【０１７３】
血清中の所望の抗体の増加に関して検査された免疫化哺乳類から血液を採取することによって、および任意の従来の方法によりその血液から血清を分離することによって、ポリクローナル抗体を調製することができる。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含有する血清、ならびに該血清から単離されたポリクローナル抗体を含有する画分が含まれる。免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭは、目的のポリペプチドのみを認識する画分から、例えば、該ポリペプチドが結合されたアフィニティーカラムを用いて、さらに当該画分をプロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを用いて精製して、調製することができる。
【０１７４】
モノクローナル抗体を調製するため、前述したように、抗原で免疫し、かつ血清中の所望の抗体のレベル増加を確認した哺乳類から免疫細胞を採取し、それらを細胞融合に供する。細胞融合に用いられる免疫細胞は、脾臓から得ることが好ましい。上記の免疫細胞と融合される他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳類の骨髄腫細胞、およびより好ましくは、薬物による融合細胞の選択のために獲得された特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。
【０１７５】
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は公知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）にしたがって融合することができる。
【０１７６】
細胞融合によって結果的に得られたハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培地）などの、標準的な選択培地中でそれらを培養することによって選択することができる。典型的には、ＨＡＴ培地中で数日間〜数週間、つまり所望のハイブリドーマを除く他の細胞（非融合細胞）全てを死滅させるのに十分な時間、細胞培養を継続する。次いで、標準的な限界希釈を行って、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングする。
【０１７７】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したものなどの、ヒトリンパ球を、抗原、このような抗原を発現する細胞、またはそれらの溶解物によりインビトロで免疫してもよい。次に、免疫されたリンパ球を、Ｕ２６６などの、無制限に分裂できるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、前記抗原に結合できる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る（特開昭（ＪＰ−Ａ）６３−１７６８８号）。
【０１７８】
得られたハイブリドーマをその後、マウスの腹腔へ移植してもよく、腹水を取り出してもよい。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡカラムもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または目的の抗原を保有するアフィニティーカラムによって精製することができる。
【０１７９】
ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する抗体は、本スクリーニング方法においてだけでなく、「Ｉ．  癌の診断」に記述されているように生物試料中の癌マーカーとしての該ポリペプチドの検出のためにも使用することができる。それらはさらに、関心対象のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても役立ちうる。加えて、アンタゴニストの候補として役立つそのような抗体は、以下で記述されるように、乳癌を含む、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに関連する疾患に対する抗体治療に適用することができる。
【０１８０】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて組み換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTDによって英国で出版されたBorrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies (1990)を参照のこと）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、該抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターへ挿入し、そして宿主細胞へ導入して、組み換え抗体を調製してもよい。このような組み換え抗体を、本スクリーニングとの関連において使用することもできる。
【０１８１】
さらに、スクリーニングなどにおいて用いられる抗体は、元の結合活性を保持する限り、抗体の断片または修飾抗体であってよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって作出されてもよい。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターへ挿入し、かつ適切な宿主細胞中で発現させてもよい（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照のこと）。
【０１８２】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの種々の分子との結合によって修飾されてもよい。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾方法は当技術分野において常套である。
【０１８３】
上記のようにして得られた抗体を、均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体の分離および精製は、タンパク質全般に対して使用される分離および精製方法にしたがって行うことができる。例えば、抗体は、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などを適切に選択かつ併用することによって、分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）；しかしながら、本発明はそれに限定されない。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして用いることができる。使用される例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびセファロースＦ．Ｆ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０１８４】
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィーの手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０１８５】
あるいは、ポリペプチド間の結合活性を検出または測定するために、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを用いてもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献 Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992), Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)）。
【０１８６】
ツーハイブリッドシステムでは、例えば、ＲＱＣＤ１ポリペプチドはＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合されて、酵母細胞中で発現される。ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドまたはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドはＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域に融合されて、試験薬剤の存在下において酵母細胞中で発現される。あるいは、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチドまたはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドがＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合されてもよく、かつＲＱＣＤ１ポリペプチドがＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域に融合されてもよい。それら二種のポリペプチドの結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にする。レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子に加えてＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを用いることができる。
【０１８７】
ＩＩＩ−２．ヌクレオチドに基づくスクリーニング方法
ＩＩＩ−２−１．ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を用いるスクリーニング方法
上記で詳細に論じられているように、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを制御することによって、癌の発症および進行を制御することができる。したがって、癌の治療または予防において使用できる薬剤を、指標としてＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを使用するスクリーニングを通じて同定することができる。本発明に関して、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含むことができる：
（ａ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する細胞と試験薬剤または化合物とを接触させる段階；
（ｂ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；
（ｃ）前記発現レベルを、薬剤の非存在下で検出された発現レベルと比較する段階；および
（ｄ）発現レベルを低減する薬剤を、癌を治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
【０１８８】
本発明によれば、細胞成長の阻害に及ぼす試験薬剤もしくは化合物またはＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。それゆえ、本発明はまた、乳癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、およびＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０１８９】
本発明に関して、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含むことができる：
（ａ）ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する細胞と試験薬剤または化合物とを接触させる段階；
（ｂ）ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）（ｂ）の発現レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０１９０】
本発明に関連して、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを低減する場合、この試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べてＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを低減しない場合、この試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
【０１９１】
本明細書において、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２の発現を抑制することで、癌細胞の成長が低減されることが明らかになった。かくして、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２の発現レベルを低減する候補化合物をスクリーニングすることにより、癌を治療または予防する可能性がある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が癌を治療または予防する可能性を第二のおよび／またはさらなるスクリーニングにより評価して、癌の治療薬を同定することができる。
【０１９２】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する薬剤は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する細胞を試験薬剤と接触させ、次いでＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルを決定することによって同定することができる。当然、同定は、単一の細胞の代わりに、この遺伝子を発現する細胞集団を用いて実施してもよい。薬剤の非存在下での発現レベルと比較して、薬剤の存在下で検出される発現レベルが低下している場合、その薬剤がＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の阻害物質であることが示されて、その薬剤が癌を阻害するのに有用であり、したがって、癌の治療または予防用に使用され得る候補物質であることが示される。
【０１９３】
遺伝子の発現レベルは、当業者に周知の方法によって推定することができる。ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現レベルは、例えば「Ｉ−１．癌または癌を発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法にしたがって決定することができる。
【０１９４】
このような同定のために使用される細胞または細胞集団は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する限り、任意の細胞または任意の細胞集団でよい。例えば、細胞または集団は、ある組織に由来する乳房上皮細胞でもよく、またはそれを含んでよい。または、細胞もしくは集団は、乳癌細胞を含む癌細胞由来の不死化細胞でもよく、またはそれらを含んでもよい。ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する細胞には、例えば癌から樹立された細胞株（例えば、ＨＣＣ−１９３７、ＢＴ−５４９、ＭＣＦ−７、ＢＳＹ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＫＢＲ−３、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＹＭＢ−１などの乳癌細胞株）が含まれる。さらに、細胞または集団は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子をトランスフェクトした細胞でもよく、またはそれを含んでもよい。
【０１９５】
本発明の方法は、前述の様々な薬剤のスクリーニングを可能にし、かつアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを含む機能的核酸分子をスクリーニングするのに特に適している。
【０１９６】
ＩＩＩ−２−２．ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写調節領域を使用するスクリーニング方法
別の局面によれば、本発明は、以下の段階を含む方法を提供する：
（ａ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞に、試験薬剤または化合物を接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階；
（ｃ）該発現レベルまたは活性を、該薬剤の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較する段階；ならびに
（ｄ）該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる該薬剤を、癌を治療または予防するための候補薬剤として選択する段階。
【０１９７】
本発明によれば、細胞成長の阻害に及ぼす試験薬剤もしくは化合物の治療効果、またはＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、およびＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０１９８】
別の局面によれば、本発明は、以下の段階を含む方法を提供する：
（ａ）ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とから構成されるベクターが導入された細胞に、試験薬剤または化合物を接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階；ならびに
（ｃ）（ｂ）の発現レベルを、試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０１９９】
本発明では、該レポーター遺伝子の発現または活性を治療効果と関連付けることができる。例えば、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べて該レポーター遺伝子の発現または活性を低減する場合、この試験薬剤または化合物を、治療効果を持つ候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比べて該レポーター遺伝子の発現または活性を低減しない場合、当該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を持たない薬剤または化合物として同定することができる。
【０２００】
本明細書において、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２の発現を抑制することで、細胞成長が低減されることが明らかになった。かくして、該レポーター遺伝子の発現または活性を低減する候補化合物をスクリーニングすることにより、癌を治療または予防する可能性がある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が癌を治療または予防する可能性を第二のおよび／またはさらなるスクリーニングにより評価して、癌の治療薬を同定することができる。
【０２０１】
好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は当技術分野において周知である。遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づきゲノムライブラリーから転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントとして得ることができるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写調節領域を用いて、スクリーニングに必要なレポーター構築物を調製することができる。
【０２０２】
転写調節領域は、例えば、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のプロモーター配列でありうる。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写調節領域にレポーター遺伝子配列をつなげることによって調製することができる。本明細書におけるＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の転写調節領域は、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流まで、好ましくは１０００ｂｐ上流まで、より好ましくは５０００または１００００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはＰＣＲによって増やすことができる。転写調節領域を同定するための方法、およびまたアッセイプロトコルは周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０２０３】
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の調節配列（例えばプロモーター配列）に機能的に連結されているレポーター遺伝子をトランスフェクトした細胞を使用する場合、レポーター遺伝子産物の発現レベルを検出することにより、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害または亢進するものとして薬剤を同定することができる。
【０２０４】
例示的なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が挙げられるが、これらに限定されることはなく、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、Ａｄｅ２遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、および当技術分野において周知の他のものである。これらの遺伝子の発現の検出のための方法は、当技術分野において周知である。
【０２０５】
レポーター構築物を含むベクターを、宿主細胞に感染させることができ、レポーター遺伝子の発現または活性を当技術分野において周知の方法によって（例えば、ルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーターなどを用いて）検出する。本発明に関して、「発現または活性を低減する」という語句は、化合物の非存在下における場合と比べてレポーター遺伝子の発現または活性の少なくとも１０％の低減、より詳しくは少なくとも２５％、５０％または７５％の低減、および最も好ましくは少なくとも９５％の低減を包含する。
【０２０６】
ＩＩＩ−３．個々の個体に適切な治療物質の選択
個体の遺伝子構成の差異により、様々な薬物を代謝する相対的な能力が異なる場合がある。対象中で代謝されて抗腫瘍物質として作用する物質は、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから、非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの、対象の細胞における遺伝子発現パターンの変化を誘導することによって、顕在化することができる。したがって、本明細書において開示される癌性および非癌性の細胞間で差次的に発現されるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子により、選択された対象由来の試験細胞集団において、癌の推定上の治療的阻害物質または予防的阻害物質を試験して、その薬剤が対象において癌の適切な阻害物質であるかどうかを判定することが可能になる。
【０２０７】
個々の対象にとって適切な癌の阻害物質を同定するために、対象由来の試験細胞集団を候補治療薬剤に曝露し、かつＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を決定する。
【０２０８】
本発明の方法の文脈において、試験細胞集団は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する癌細胞を含む。好ましくは、試験細胞は乳房上皮細胞である。
【０２０９】
具体的には、試験細胞集団は、候補治療薬剤の存在下でインキュベートしてよく、かつ試験細胞集団におけるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を測定し、１種類または複数種類の参照プロファイル、例えば癌性の参照発現プロファイルまたは非癌性の参照発現プロファイルと比較してもよい。
【０２１０】
癌を含む参照細胞集団と比較して試験細胞集団におけるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現が減少している場合、その物質が治療能力を有することが示唆される。あるいは、癌を含まない参照細胞集団と比べて試験細胞集団におけるＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現が類似している場合、その薬剤が治療能力を有することが示唆される。
【０２１１】
ＩＶ．  癌を治療または予防するための医薬組成物：
本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた薬剤、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のアンチセンス核酸および二本鎖分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）、およびＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する抗体は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現、またはＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドの生物活性を阻害または抑制し、かつ癌細胞の周期の調節および癌細胞の増殖を阻害するかまたは撹乱する。かくして、本発明は癌を治療または予防するための組成物を提供し、この組成物は、本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた薬剤、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子のアンチセンス核酸および二本鎖分子、またはＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、もしくはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する抗体を含む。本組成物は癌、具体的には乳癌、肺癌、および食道癌などの癌、さらに具体的には乳癌を治療または予防するために用いることができる。さらに、本組成物は癌細胞増殖またはＡｋｔリン酸化を阻害するために用いることができる。
【０２１２】
これらの組成物は、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーなど他の哺乳動物に対する薬剤として使用してもよい。
【０２１３】
本発明の文脈において、以下に詳述する本発明の活性成分（スクリーニングされた薬剤、アンチセンス核酸、二本鎖分子、抗体などを含む）に適した薬学的製剤には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与（頬側および舌下を含む）、膣内投与もしくは非経口（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）投与、または吸入もしくは吹入による投与に適したものが含まれる。好ましくは、投与は静脈内である。製剤は任意で、個別の投薬単位で包装される。
【０２１４】
経口投与に適した医薬製剤には、カプセル剤、マイクロカプセル剤、カシェ剤、および錠剤が含まれ、それぞれ所定量の活性成分を含む。適切な製剤には、散剤、エリキシル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、および乳剤も含まれる。活性成分は、任意で、ボーラス舐剤、またはペースト剤として投与される。または、必要に応じて、医薬組成物は、水または他の任意の薬学的に許容される液体による滅菌溶液または滅菌懸濁液の注射剤の形態で、非経口的に投与され得る。例えば、本発明の活性成分は、一般に認められている薬物製造に必要とされる単位用量形態で、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、安定化剤、矯味剤、賦形剤、溶剤、保存剤、および結合剤などと混合することができる。このような製剤中に含まれる活性成分の量により、指定された範囲内の適切な投薬量が取得できるようになる。
【０２１５】
錠剤およびカプセル剤中に混合することができる添加剤の例には、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントゴム、およびアラビアゴムなどの結合剤；結晶セルロースなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ゼラチン、およびアルギン酸などの膨張剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；スクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味剤；ならびにペパーミント、アカモノ（Ｇａｕｌｔｈｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｔｈｒｉｘ）油、およびサクランボなどの矯味剤が含まれるが、これらに限定されない。錠剤は、任意で１種類または複数種類の製剤用成分と共に、圧縮または成形することによって製造してもよい。粉末または顆粒など易流動性の形態の活性成分を、任意で結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、潤滑剤、界面活性剤、または分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって、成形錠剤を製造してもよい。当技術分野において周知の方法によって、錠剤をコーティングしてもよい。錠剤を任意で、インビボでの活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤のパッケージは、毎月服用されるべき錠剤１つを含んでよい。
【０２１６】
さらに、単位剤形がカプセル剤である場合、前述の成分に加えて、油などの液体担体をさらに含めることができる。
【０２１７】
経口用液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形態でもよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶剤を用いて溶解するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水性溶剤（食用油を含んでよい）、または保存剤など従来の添加剤を含んでよい。
【０２１８】
非経口投与用の製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象とするレシピエントの血液とその製剤を等張性にする溶質を含んでよい、水性および非水性の無菌注射液剤、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでよい水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。製剤を、単位投与用容器または複数回投与用容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、使用する直前に、無菌の液体担体、例えば生理食塩水、注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。または、製剤を持続注入用に提供してもよい。用時溶解注射用の液剤および懸濁剤は、先に述べた種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
【０２１９】
さらに、注射用の無菌複合体は、注射に適した蒸留水などの溶剤を用いて、通常の薬物製造に従って製剤化することができる。Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、および塩化ナトリウムなどのアジュバントを含む、生理食塩水、グルコース、および他の等張性の液体が、注射用の水性液剤として使用され得る。これらは、アルコール、例えばエタノール；プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどの多価アルコール；ならびにポリソルベート８０（商標）およびＨＣＯ−５０などの非イオン性界面活性剤など適切な可溶化剤と組み合わせて使用することができる。
【０２２０】
ゴマ油またはダイズ油を、油性の液体として使用することができ、これは可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて使用してもよく、かつリン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩酸プロカインなどの鎮痛剤、ベンジルアルコールおよびフェノールなどの安定化剤、ならびに／または抗酸化剤と共に製剤化してもよい。調製した注射剤は、適切なアンプルに充填することができる。
【０２２１】
直腸投与用の製剤には、ココアバターまたはポリエチレングリコールなど標準的な担体を伴う坐剤が含まれる。口に、例えば口腔内または舌下に局所投与するための製剤には、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの風味付きの基剤中に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、スクロース、またはアラビアゴムなどの基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。活性成分を鼻腔内投与する場合、液体スプレーもしくは分散性の散剤、または滴剤の形態で使用され得る。滴剤はまた、１種類もしくは複数種類の分散剤、可溶化剤、または懸濁化剤を含む水性または非水性の基剤と共に製剤化することができる。
【０２２２】
吸入による投与の場合、組成物は、注入器、ネブライザー、加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から都合よく送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体など適切な噴射剤を含み得る。加圧したエアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって、決定され得る。
【０２２３】
または、吸入もしくは吹入による投与の場合、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば活性成分とラクトースまたはデンプンなど適切な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、単位剤形、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックに入れて提供されてもよく、散剤は、吸入器または注入器の補助によりこれらから投与され得る。
【０２２４】
他の製剤には、治療薬剤を放出する、埋め込み可能な器具および接着性のパッチが含まれる。
【０２２５】
所望の場合には、活性成分の持続放出を与えるように適合された、前述の製剤が使用され得る。医薬組成物は、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存剤など他の活性成分も含んでよい。
【０２２６】
具体的に前述した成分に加えて、本発明の製剤は、該当する製剤のタイプを考慮して、当技術分野において慣例的な他の薬剤を含み得ること、例えば経口投与に適したものは矯味剤を含み得ることが、理解されるべきである。
【０２２７】
好ましい投薬単位製剤は、「Ｖ．癌を治療または予防するための方法」の項目（下記）で挙げられるように、本発明の各活性成分またはその適切な分割量を有効量含むものである。
【０２２８】
ＩＶ−１．スクリーニングされた物質を含む医薬組成物
本発明は、前述した本発明のスクリーニング方法によって選択された薬剤のいずれかを含む、癌を治療または予防するための組成物を提供する。
【０２２９】
本発明の方法によってスクリーニングされた薬剤は、直接投与してもよく、または上記に詳述した任意の従来の医薬製剤方法に従って製剤化して、剤形にしてもよい。
【０２３０】
ＩＶ−２．  二本鎖分子を含む医薬組成物
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子に対する二本鎖分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を用いて、これらの遺伝子の発現レベルを低減することができる。本明細書において、「二本鎖分子」という用語は、「定義」に記述されているように、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡおよびＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味する。本発明に関して、二本鎖分子はＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。二本鎖分子は、標的遺伝子（すなわち、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子）のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の部分をともに含み、また、センス鎖およびアンチセンス鎖が一本鎖によって連結された、ヘアピン構造をとる単一の構築物でありうるように構築される。
【０２３１】
二本鎖分子は標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし、すなわち、通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写産物と結合し、それによってｍＲＮＡの翻訳を妨害し、最終的に、その遺伝子がコードするポリペプチドの産生（発現）を減少させるか、または阻害する。かくして、本発明の二本鎖分子は、ストリンジェントな条件下でＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするその能力によって定義することができる。本明細書において、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする二本鎖分子の部分は、「標的配列」または「標的核酸」もしくは「標的ヌクレオチド」といわれる。
【０２３２】
本発明に関して、二本鎖分子の標的配列は、好ましくは長さが５００、２００、１００、５０、または２５塩基対未満である。より好ましくは、二本鎖分子の標的配列は、長さが１９〜２５塩基対である。ＲＱＣＤ１遺伝子に対する二本鎖分子の例示的な標的核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、または３１のヌクレオチド配列を含む。ＧＩＧＹＦ１遺伝子に対する二本鎖分子の例示的な標的核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のヌクレオチド配列を含む。ＧＩＧＹＦ２遺伝子に対する二本鎖分子の例示的な標的核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のヌクレオチド配列を含む。配列中のヌクレオチド「ｔ」は、ＲＮＡまたはその誘導体においては「ｕ」に置き換えられる。したがって、例えば、本発明の医薬組成物は、ヌクレオチド配列
５’−ＡＡＧＡＵＣＵＡＵＣＡＧＵＧＧＡＵＣＡＡＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対して）、
５’−ＡＡＧＡＵＣＵＵＧＵＵＡＧＡＵＧＡＣＡＣＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に対して）、
５’−ＧＡＵＣＵＡＵＣＡＧＵＧＧＡＵＣＡＡＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に対して）、
５’−ＧＡＵＣＵＵＧＵＵＡＧＡＵＧＡＣＡＣＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に対して）、
５’−ＣＣＵＵＣＣＧＡＡＧＧＧＣＵＡＧＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に対して）または
５’−ＣＡＡＧＡＵＡＣＣＵＵＣＡＧＡＣＣＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に対して）
をセンス鎖として含む二本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を含んでよい。
【０２３３】
二本鎖分子の阻害活性を増強するために、センスおよび／またはアンチセンス鎖中の標的配列の３’末端に３’−オーバーハングを付加することができる。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも２個、一般には２〜１０個、好ましくは２〜５個である。付加されたヌクレオチドは二本鎖分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。付加されるヌクレオチドは好ましくは「ｕ」または「ｔ」であるが、これらに限定されない。
【０２３４】
任意のヌクレオチド配列からなるループ配列をセンス鎖とアンチセンス鎖の間に配置して、ヘアピンループ構造物を形成させてもよい。したがって、本発明の組成物中に含まれる二本鎖分子は、下記の一般式を有してよい：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標的配列のセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖である。本明細書において、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標的配列のセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖は、「センス鎖」と呼ばれ得る。好ましい態様において、［Ａ］はセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドからなる一本鎖ポリヌクレオチドであり、かつ［Ａ’］は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標的配列のアンチセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖（すなわち、センス鎖［Ａ］の標的配列にハイブリダイズする配列）である。本明細書において、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標的配列のアンチセンス鎖配列を含むポリヌクレオチド鎖は、「アンチセンス鎖」と呼ばれ得る。領域［Ａ］は［Ａ’］にハイブリダイズし、次いで領域［Ｂ］からなるループが形成される。ループ配列の長さは、好ましくは、３〜２３ヌクレオチドでよい。例えば、ループ配列は、以下の配列からなる群より選択することができる（www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002, 418:435-8
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20:500-5;Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4):1639-44
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003, 4:457-67
「ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（ＤＮＡでは「ｔｔｃａａｇａｇａ」）」は、特に適切なループ配列である。さらに、２３ヌクレオチドからなるループ配列も、活性なｓｉＲＮＡを提供する（Jacque JM et al., Nature 2002, 418:435-8）。
【０２３５】
ＲＱＣＤ１遺伝子に適した例示的なヘアピンｓｉＲＮＡには、
５’−ＡＡＧＡＵＣＵＡＵＣＡＧＵＧＧＡＵＣＡＡＵ−［ｂ］−ＡＵＵＧＡＵＣＣＡＣＵＧＡＵＡＧＡＵＣＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の標的配列）；
５’−ＡＡＧＡＵＣＵＵＧＵＵＡＧＡＵＧＡＣＡＣＵ−［ｂ］−ＡＧＵＧＵＣＡＵＣＵＡＡＣＡＡＧＡＵＣＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の標的配列）；
５’−ＧＡＵＣＵＡＵＣＡＧＵＧＧＡＵＣＡＡＵ−［ｂ］−ＡＵＵＧＡＵＣＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＵＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の標的配列）および
５’−ＧＡＵＣＵＵＧＵＵＡＧＡＵＧＡＣＡＣＵ−［ｂ］−ＴＧＵＧＵＣＡＵＣＵＡＡＣＡＡＧＡＵＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の標的配列）が含まれる。
ＧＩＧＹＦ１遺伝子に適した例示的なヘアピンｓｉＲＮＡには、
５’−ＣＣＵＵＣＣＧＡＡＧＧＧＣＵＡＧＡＧＧ−［ｂ］−ＣＣＵＣＵＡＧＣＣＣＵＵＣＧＧＡＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の標的配列）が含まれる。
ＧＩＧＹＦ２遺伝子に適した例示的なヘアピンｓｉＲＮＡには、
５’−ＣＡＡＧＡＵＡＣＣＵＵＣＡＧＡＣＣＵＵ−［ｂ］−ＡＡＧＧＵＣＵＧＡＡＧＧＵＴＵＣＵＵＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の標的配列）が含まれる。
【０２３６】
本発明における、適切な二本鎖分子の他のヌクレオチド配列は、Ａｍｂｉｏｎ社のウェブサイト（www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から入手可能なｓｉＲＮＡ設計コンピュータプログラムを用いて設計することができる。コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて二本鎖分子合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
【０２３７】
二本鎖分子の標的部位の選択：
１．対象となる転写物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。個々のＡＡの出現および潜在的な標的部位として３’側に隣接する１９ヌクレオチドを記録する。Ｔｕｓｃｈｌら（Tuschl et al. Genes Cev 1999, 13(24):3191-7）は、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および開始コドン近傍（７５ヌクレオチド以内）の領域は、調節タンパク質結合部位に豊富に存在する可能性があることから、これらに対してｓｉＲＮＡを設計することを推奨しない。ＵＴＲ−結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
２．潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、かつ他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を、考慮の対象から排除する。相同性検索は、ＢＬＡＳＴ（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997, 25:3389-402; J Mol Biol 1990, 215:403-10.）を用いて実施することができ、これはＮＣＢＩサーバー上のwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で確認することができる。
３．合成に適した標的配列を選択する。Ａｍｂｉｏｎでは、好ましくは数個の標的配列を遺伝子の長さに沿って選択して評価することができる。
【０２３８】
細胞に二本鎖分子を導入するための標準的な技術が当業者に公知である。例えば、二本鎖分子を、ｍＲＮＡ転写物に結合することができる形態で、細胞中に直接導入することができる。これらの態様において、二本鎖分子は、典型的には、アンチセンス分子に関して前述したように修飾される。他の修飾もまた利用可能である。例えば、コレステロールを結合した二本鎖分子は、改善された薬理学的特性を示した（Song et al., Nature Med 2003, 9:347-51）。慣例的に用いられるこれらの技術を、本発明の組成物に含まれる二本鎖分子に適用してもよい。
【０２３９】
または、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクター中に保有されてもよく（以下「ｓｉＲＮＡベクター」とも呼ぶ）、二本鎖分子は、インビボで二本鎖分子を発現させるベクターの形で本発明の組成物に含まれてもよい。このようなベクターは、例えば（ＤＮＡ分子の転写により）両方の鎖の発現が可能になる様式でその配列に隣接している機能的に連結された調節配列（例えば、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写単位またはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーター）を有する発現ベクター中に、標的遺伝子のインビボでの発現を阻害するのに適した標的遺伝子配列の部分をクローニングすることによって、作製することができる（Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20:500-5）。例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子は、第一のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡのプロモーター配列３’）によって転写され、標的遺伝子のｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子は、第二のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡのプロモーター配列５’）によって転写される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、インビボでハイブリダイズして、標的遺伝子の発現をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生じる。あるいは、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つのプロモーターの助けを借りて一緒に転写され得る。この場合、センス鎖およびアンチセンス鎖はポリヌクレオチド配列を介して連結されて、二次構造、例えばヘアピンを有する一本鎖構築物を形成し得る。
【０２４０】
かくして、癌を治療または予防するための本医薬組成物は、二本鎖分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはインビボで該二本鎖分子を発現するベクターのどちらかを含むことができる。具体的には、本発明は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子、またはインビボで該二本鎖分子を発現するベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物を提供する。
【０２４１】
さらに、本発明はまた、癌細胞増殖を阻害するための医薬組成物であって、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子、またはインビボで該二本鎖分子を発現するベクターを含む組成物を提供する。
【０２４２】
さらに、本発明はまた、Ａｋｔリン酸化を阻害するための医薬組成物であって、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、もしくはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子、またはインビボで該二本鎖分子を発現するベクターを含む組成物を提供する。
【０２４３】
二本鎖分子ベクターを細胞へ導入するために、トランスフェクション促進剤を用いることができる。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ  ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）は、トランスフェクション促進剤として有用である。それゆえ、本医薬組成物はそのようなトランスフェクション促進剤をさらに含むことができる。
【０２４４】
別の態様において、本発明はまた、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する癌を治療するための医薬組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子またはそれをコードするベクターの使用を提供する。例えば、本発明は、該遺伝子を過剰発現する細胞においてＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、ここで、該分子は、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する癌を治療するための医薬組成物を製造するために、互いとハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、３１、３２、または３３の配列を標的化する、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む。
【０２４５】
あるいは、本発明はさらに、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する癌の治療で用いるための本発明の二本鎖核酸分子を提供する。
【０２４６】
あるいは、本発明はさらに、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する癌を治療する医薬組成物を製造するための方法または工程を提供し、ここで、該方法または工程は、薬学的または生理学的に許容される担体と、該遺伝子を過剰発現する細胞においてＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子とを製剤化する段階を含み、該分子は、活性成分として、互いとハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、３１、３２、または３３の配列を標的化する、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む。
【０２４７】
別の態様において、本発明はまた、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する癌を治療する医薬組成物を製造するための方法または工程を提供し、ここで、該方法または工程は、活性成分と、薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含み、該活性成分は、該遺伝子を過剰発現する細胞においてＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子は、互いとハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、３１、３２、または３３の配列を標的化する、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む。
【０２４８】
ＩＶ−３．アンチセンス核酸を含む医薬組成物
ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を標的化するアンチセンス核酸は、乳癌細胞、肺癌細胞、および食道癌細胞を含む癌細胞、特に乳癌細胞において上方制御されている遺伝子の発現レベルを低下させるのに使用することができる。このようなアンチセンス核酸は、癌、特に乳癌の治療に有用であり、したがって本発明に包含される。アンチセンス核酸は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のヌクレオチド配列もしくはそれに対応するｍＲＮＡに結合し、それによってその遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、ｍＲＮＡの分解を促進し、および／またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害することによって、作用する。
【０２４９】
したがって、結果として、アンチセンス核酸は、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質が癌細胞において機能するのを阻害する。本明細書において、「アンチセンス核酸」という語句は、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドを意味し、かつ標的配列に完全に相補的なヌクレオチドだけでなく、１つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを含むヌクレオチドも含む。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子またはその相補的配列の少なくとも１５個の連続的ヌクレオチドの範囲に渡って、少なくとも７０％またはそれ以上、好ましくは少なくとも８０％またはそれ以上、より好ましくは少なくとも９０％またはそれ以上、さらにより好ましくは少なくとも９５％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野において公知のアルゴリズムを使用して、このような相同性を決定することができる。
【０２５０】
本発明のアンチセンス核酸は、遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合し、それらの転写または翻訳を阻害し、ｍＲＮＡの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害することにより、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子によってコードされるタンパク質を産生する細胞に対して作用し、最終的に当該タンパク質が機能するのを阻害する。
【０２５１】
本発明のアンチセンス核酸は、核酸に対して不活性である適切な基剤材料と混合することによって、リニメント剤またはパップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
【０２５２】
また、必要に応じて、本発明のアンチセンス核酸は、賦形剤、等張化剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することによって、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤、および凍結乾燥剤に製剤化することもできる。アンチセンス封入剤もまた、耐久性および膜透過性を高めるために使用することができる。例には、リポソーム、ポリ−Ｌ−リシン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。これらは、以下の公知の方法によって調製することができる。
【０２５３】
本発明のアンチセンス核酸は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現を阻害し、かつこのタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。さらに、本発明のアンチセンス核酸を含む発現阻害物質は、ＲＱＣＤ１タンパク質、ＧＩＧＹＦ１タンパク質、またはＧＩＧＹＦ２タンパク質の生物活性を阻害することができるという点で有用である。
【０２５４】
本発明のアンチセンス核酸には、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を与えるために、チオエート化オリゴヌクレオチドが使用され得る。
【０２５５】
ＩＶ−４．抗体を含む医薬組成物
癌、特に乳癌、肺癌、および食道癌において、特に乳癌において過剰発現されているＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の遺伝子産物の機能は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子産物に結合するか、または別の方法でその機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する抗体はこのような化合物として言及でき、癌を治療または予防するための医薬組成物の活性成分として使用することができる。
【０２５６】
本発明は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体、またはこれらの抗体の断片の使用に関する。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗体を合成するために使用された抗原（すなわち、上方制御されたマーカーの遺伝子産物）またはそれに密接に関連した抗原とのみ相互作用（すなわち、結合）する、特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を意味する。抗体を合成するために使用された抗原を含む分子、およびこの抗体によって認識される抗原のエピトープを含む分子を、それに密接に関連した抗原として挙げることができる。
【０２５７】
さらに、本発明の医薬組成物において使用される抗体は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体でもよい（例えば、抗ＲＱＣＤ１抗体、抗ＧＩＧＹＦ１抗体、または抗ＧＩＧＹＦ２抗体の免疫学的活性断片）。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）でよい（Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85:5879-83）。このような抗体断片は、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって作製してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクター中に挿入し、かつ適切な宿主細胞中で発現させてもよい（例えば、Co MS et al., J Immunol 1994, 152:2968-76;Better M et al., Methods Enzymol 1989, 178:476-96;Pluckthun A et al., Methods Enzymol 1989, 178:497-515;Lamoyi E, Methods Enzymol 1986, 121:652-63;Rousseaux J et al., Methods Enzymol 1986, 121:663-9;Bird RE et al., Trends Biotechnol 1991, 9:132-7を参照されたい）。
【０２５８】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子と結合させることによって、修飾してもよい。本発明は、このような修飾抗体を含む。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。このような修飾方法は、当技術分野において通常である。
【０２５９】
または、本発明のために使用される抗体は、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに対する非ヒト抗体由来の可変領域およびヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含むヒト化抗体でよい。このような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。ヒト化は、げっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 1988, 239:1534-6を参照されたい）。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体である。
【０２６０】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域を含む完全ヒト抗体もまた、使用することができる。このような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を含む（例えば、Hoogenboom et al., J Mol Biol 1992, 227:381-8）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって、作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、および第５，６６１，０１６号において説明されている。
【０２６１】
得られた抗体がヒトの身体に投与される場合（抗体治療）、免疫原性を減少させるために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
【０２６２】
前述のようにして得られた抗体を、均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質に対して使用される分離および精製方法に従って実施することができる。例えば、抗体は、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などを適切に選択し併用することによって、分離および単離することができる（Antibodies:A Laboratory Manual. Ed HarlowおよびDavid Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインＡカラムには、例えばＨｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびセファロースＦ．Ｆ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０２６３】
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)）。クロマトグラフィーの方法は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって実施することができる。
【０２６４】
Ｖ．癌を治療または予防するための方法
癌細胞において生じる特異的な分子変化を対象とする癌治療は、進行癌の治療用のトラスツズマブ（ハーセプチン）、慢性骨髄性白血病用のメシル酸イマチニブ（グリベック）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）用のゲフィチニブ（イレッサ）、ならびにＢ細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫用のリツキシマブ（抗ＣＤ２０ｍＡｂ）などの抗腫瘍薬剤の臨床開発および規制認可を通して実証されている（Ciardiello F et al., Clin Cancer Res 2001, 7:2958-70, Review;Slamon DJ et al., N Engl J Med 2001, 344:783-92;Rehwald U et al., Blood 2003, 101:420-4;Fang G et al., Blood 2000, 96:2246-53）。これらの薬物は、臨床的に有効であり、かつ形質転換細胞のみを標的化するため、従来の抗腫瘍剤より耐容性が良好である。したがって、このような薬物により、癌患者の生存および生活の質が改善されるだけでなく、分子を標的とする癌治療の概念が実証される。さらに、標的化薬物は、標準的な化学療法と組み合わせて使用された場合に、その有効性を高めることができる（Gianni L, Oncology 2002, 63 Suppl 1:47-56;Klejman A et al., Oncogene 2002, 21:5868-76）。したがって、将来の癌治療は、おそらく、血管形成および侵襲性など腫瘍細胞の様々な特徴を対象とする標的特異的な薬剤と、従来の薬物を組み合わせることを伴うと考えられる。
【０２６５】
これらの調節的な方法は、（例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより）エクスビボもしくはインビトロで、または別の方法として、（薬剤を対象に投与することにより）インビボで実施することができる。これらの方法は、差次的に発現される遺伝子の異常な発現またはそれらの遺伝子産物の異常な活性を打ち消すための治療法として、タンパク質もしくはタンパク質の組み合わせ、または核酸分子もしくは核酸分子の組み合わせを投与することを含む。
【０２６６】
遺伝子および遺伝子産物の発現レベルまたは生物活性が、（その疾患または障害に罹患していない対象と比較して）それぞれ上昇していることを特徴とする疾患および障害は、過剰発現された遺伝子の活性に拮抗する（すなわち、低下させるか、または阻害する）治療物質で治療することができる。活性に拮抗する治療物質は、治療的または予防的に投与することができる。
【０２６７】
したがって、本発明の文脈において使用され得る治療物質には、例えば（ｉ）過剰発現されたＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、断片、もしくは相同体；（ｉｉ）前記過剰発現された遺伝子もしくは遺伝子産物に対する抗体；（ｉｉｉ）前記過剰発現された遺伝子をコードする核酸；（ｉｖ）アンチセンス核酸もしくは「機能障害性」である核酸（すなわち、前記過剰発現された遺伝子の核酸内への異種挿入に起因する）；（ｖ）二本鎖分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）；または（ｖｉ）調節物質（すなわち、前記過剰発現されたポリペプチドとその結合相手との相互作用を変更する阻害物質、アンタゴニスト）が含まれる。機能障害性のアンチセンス分子は、相同組換えによってポリペプチドの内因性機能を「ノックアウト」するのに使用される（例えば、Capecchi, Science 1989, 244:1288-92を参照されたい）。
【０２６８】
レベルの上昇は、（例えば生検組織から）患者の組織試料を採取して、ＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現されたペプチド（または発現が変更された遺伝子のｍＲＮＡ）の構造および／または活性についてインビトロでそれを分析することにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出することができる。当技術分野内で周知である方法には、イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降法とそれに続くドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などによる）、および／またはｍＲＮＡの発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーションなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６９】
予防的投与は、疾患または障害が予防されるか、またはその進行が遅延されるように、疾患の顕性の臨床症状が発現する前に実施する。
【０２７０】
本発明の治療方法は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子産物の１つまたは複数の活性を調節する薬剤に細胞を接触させる段階を含み得る。タンパク質活性を調節する薬剤の例には、核酸、タンパク質、このようなタンパク質の天然の同系リガンド、ペプチド、ペプチド模倣体、および他の小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７１】
したがって、本発明は、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を低減させることによって、対象において癌の症状を治療もしくは緩和するか、または癌を予防するための方法を提供する。本方法は、乳癌の治療または予防に特に適している。
【０２７２】
適切な治療物質を、癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクを有する（もしくは発症しやすい）対象に予防的または治療的に投与することができる。このような対象は、標準の臨床的方法を用いることによって、またはＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の異常な発現レベル（「上方制御」もしくは「過剰発現」）もしくはその遺伝子産物の異常な活性を検出することによって、同定することができる。
【０２７３】
本発明のある局面によれば、本発明の方法によってスクリーニングされた薬剤を、癌を治療または予防するために使用してもよい。当業者に周知の方法を使用して、例えば動脈内注射、静脈内注射、もしくは皮内注射として、または鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、もしくは経口投与として、患者に該薬剤を投与してもよい。該薬剤がＤＮＡによってコード可能である場合、そのＤＮＡを遺伝子療法用のベクターに挿入し、患者にそのベクターを投与して、療法を実施することができる。
【０２７４】
投薬量および投与方法は、治療しようとする患者の体重、年齢、性別、症状、状態、および投与方法によって異なる。しかしながら、当業者は、適切な投薬量および投与方法を規定どおりに選択することができる。
【０２７５】
例えば、ＲＱＣＤ１ポリペプチド、ＧＩＧＹＦ１ポリペプチド、またはＧＩＧＹＦ２ポリペプチドに結合し、そのポリペプチドの活性を調節する薬剤の用量は、前述した様々な要因に依存するが、用量は一般に、正常なヒト成人（体重６０ｋｇ）に経口投与される場合、１日当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは１日当たり約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ、およびより好ましくは１日当たり約１．０ｍｇ〜約２０ｍｇである。
【０２７６】
正常なヒト成人（体重６０ｋｇ）への注射の形態で薬剤を非経口的に投与する場合、患者、標的器官、症状、および投与方法によっていくらかの違いはあるものの、１日当たり約０．０１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ、およびより好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量を静脈内注射することが好都合である。他の動物の場合、適切な投薬量は、体重６０ｋｇに変換することによって、規定どおりに算出してもよい。
【０２７７】
同様に、本発明の医薬組成物は、癌を治療または予防するために使用され得る。当業者に周知の方法を使用して、例えば動脈内注射、静脈内注射、もしくは皮内注射として、または鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、もしくは経口投与として、患者に組成物を投与してもよい。
【０２７８】
前述した各状態に対して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で経口的に、または注射によって投与され得る。ヒト成人に対する用量範囲は、一般に約５ｍｇ／日〜約１７．５ｇ／日、好ましくは約５ｍｇ／日〜約１０ｇ／日、および最も好ましくは約１００ｍｇ／日〜約３ｇ／日である。錠剤、または個別の単位で提供される形態の他の単位剤形は、便宜的に、そのような投薬量で、またはその倍数量として効果的である量を含んでよく、例えば各単位は、約５ｍｇ〜約５００ｍｇ、通常、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇを含む。
【０２７９】
使用される用量は、対象の年齢、体重、および性別、治療される厳密な疾患およびその重症度を含む、いくつかの要因に依存すると考えられる。同様に、投与経路も、状態およびその重症度に応じて異なってよい。任意の事象において、適切な投薬量および最適投薬量は、前述の要因を考慮して、当業者が規定どおりに算出してもよい。
【０２８０】
具体的には、ＲＱＣＤ１遺伝子、ＧＩＧＹＦ１遺伝子、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチドは、患部に直接適用することによって、または疾患部位に到達するように血管中に注入することによって、患者に与えることができる。
【０２８１】
本発明のアンチセンスヌクレオチド誘導体の投薬量は、患者の状態に応じて適宜調整し、かつ所望の量で使用することができる。例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲を投与することができる。
【０２８２】
ＶＩ．二本鎖分子およびそれをコードするベクター
本発明において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、または３１のいずれかを含むｓｉＲＮＡは、ＲＱＣＤ１遺伝子を発現する細胞の細胞増殖または生存力を抑制することが実証された。したがって、これらの配列のいずれかを含む二本鎖分子およびこれらの分子を発現するベクターは、ＲＱＣＤ１遺伝子発現細胞の増殖を伴う疾患、例えば、乳癌、肺癌、および食道癌、特に、乳癌を治療または予防するための好ましい薬剤として役立つとみなされる。したがって、ある局面によれば、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、および３１からなる群より選択される標的配列を含む二本鎖分子、ならびにそれらの分子を発現するベクターを提供する。より具体的には、本発明は、ＲＱＣＤ１遺伝子を発現する細胞中に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、および３１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的配列として含み、かつ該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するように該アンチセンス鎖が、センス鎖の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、二本鎖分子を提供する。
【０２８３】
本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２または３３の配列を含むｓｉＲＮＡは、ＧＩＧＹＦ１遺伝子およびＧＩＧＹＦ２遺伝子それぞれの発現を抑制し、かつＡｋｔリン酸化の抑制をもたらすことが実証された。それゆえ、これらの配列を含む二本鎖分子およびこれらの分子を発現するベクターは、Ａｋｔリン酸化を阻害するのに好適な薬剤として役立つと考えられ、癌細胞の増殖を阻害するのに、さらには癌を治療または予防するのに有用である可能性が高い。かくして、本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２および３３からなる群より選択される標的配列を含む二本鎖分子ならびに該分子を発現するベクターを提供する。より具体的には、本発明は、ＧＩＧＹＦ１遺伝子またはＧＩＧＹＦ２遺伝子を発現する細胞へ導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子を提供し、ここで該分子は、標的配列としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２および３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、センス鎖およびアンチセンス鎖が互いとハイブリダイズして該二本鎖分子を形成するようにセンス鎖の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含む。
【０２８４】
センス鎖に含まれるＲＱＣＤ１遺伝子の標的配列は、約５００、４００、３００、２００、１００、７５、５０、または２５個未満の隣接ヌクレオチドであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の一部分の配列からなることができる。例えば、標的配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のヌクレオチド配列由来の約１９〜約２５個の隣接ヌクレオチドであってよい。本発明はこれに限定されないが、好適な標的配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、および３１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０２８５】
センス鎖に含まれるＧＩＧＹＦ１遺伝子またはＧＩＧＹＦ２遺伝子の標的配列は、約５００、４００、３００、２００、１００、７５、５０、または２５個未満の隣接ヌクレオチドであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５または３７の一部分の配列からなることができる。例えば、標的配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５または３７のヌクレオチド配列由来の約１９〜約２５個の隣接ヌクレオチドであってよい。本発明はこれに限定されないが、好適な標的配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２および３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０２８６】
本発明の二本鎖分子は、２つのポリヌクレオチド構築物、すなわち、センス鎖を含むポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドから構成されてよい。あるいは、この分子は、１つのポリヌクレオチド構築物、すなわちセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含むポリヌクレオチドから構成されてもよく、その場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ヘアピン構造物を形成することによってセンス鎖およびアンチセンス鎖内の標的配列のハイブリダイゼーションを可能にする一本鎖ポリヌクレオチドを介して連結されている。本明細書において、一本鎖ポリヌクレオチドは、「ループ配列」または「一本鎖」とも呼ばれ得る。センス鎖およびアンチセンス鎖を連結する一本鎖ポリヌクレオチドは、３〜２３個のヌクレオチドからなってよい。本発明の二本鎖分子に関するより詳細な内容については、「ＩＶ−２．二本鎖分子を含む医薬組成物」の項目を参照されたい。
【０２８７】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の改変ヌクレオチドおよび／または非リン酸ジエステル結合を含んでよい。当技術分野において周知の化学的改変は、二本鎖分子の安定性、有効性、および／または細胞取込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子中に組み入れることができる他のタイプの化学的改変を承知しているであろう（ＷＯ  ０３／０７０７４４；ＷＯ  ２００５／０４５０３７）。１つの態様において、改変は、分解耐性を改善するか、または取込みを改善するために使用することができる。このような改変の例には、ホスホロチオアート結合、（特に二本鎖分子のセンス鎖上の）２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基残基の組込みが含まれる（ＵＳ  ２００６０１２２１３７）。
【０２８８】
別の態様において、改変は、二本鎖分子の安定性を向上させるか、または標的効率を上昇させるために使用することができる。改変には、二本鎖分子の２つの相補鎖の間の化学的架橋、二本鎖分子の鎖の３’末端または５’末端の化学的改変、糖改変、核酸塩基改変、および／または主鎖改変、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド、ならびに２’−デオキシリボヌクレオチドが含まれる（ＷＯ  ２００４／０２９２１２）。別の態様において、改変は、標的ｍＲＮＡ中および／または相補的な二本鎖分子鎖中の相補的ヌクレオチドに対する親和性を増加または減少させるために使用することができる（ＷＯ  ２００５／０４４９７６）。例えば、未改変のピリミジンヌクレオチドは、２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンで置換することができる。さらに、未改変プリンが、７−デアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンで置換されてもよい。別の態様において、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドが突き出しているヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドによって置換されてよい（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200）。さらなる詳細については、ＵＳ  ２００６０２３４９７０などの公開された文献が利用可能である。本発明はこれらの例に限定されず、かつ結果として生じる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の公知の化学的改変を本発明の二本鎖分子に対して使用してよい。
【０２８９】
さらに、本発明の二本鎖分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含んでよく、例えば、ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡである。具体的には、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖のハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、高い安定性を示す。ＤＮＡおよびＲＮＡの混合、すなわち、ＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）およびＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）からなるハイブリッド型の二本鎖分子、または一本鎖（ポリヌクレオチド）のいずれかもしくは両方にＤＮＡとＲＮＡの両方を含むキメラ型の二本鎖分子などは、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成させることができる。ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖のハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞中に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する活性を有している限り、センス鎖がＤＮＡでありかつアンチセンス鎖がＲＮＡであるかまたはその逆の、いずれかのハイブリッドでよい。好ましくは、センス鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドがＲＮＡである。同様に、キメラ型の二本鎖分子も、標的遺伝子を発現する細胞中に導入された場合にその遺伝子の発現を阻害する活性を有している限り、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されているか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されているかのいずれかでよい。
【０２９０】
二本鎖分子の安定性を向上させるためには、該分子は好ましくはできるだけ多くのＤＮＡを含むことが好ましく、一方、標的遺伝子の発現の阻害を誘導するためには、該分子は、十分な発現阻害を誘導する範囲内でＲＮＡであることが必要とされる。キメラ型の二本鎖分子の好ましい例として、二本鎖分子の上流の部分的な領域（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補的配列に隣接している領域）はＲＮＡである。好ましくは、前記上流の部分的な領域は、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。すなわち、好ましい態様において、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方は、ＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラ型またはハイブリッド型の二本鎖分子は、以下の組合せを含む。
センス鎖：
５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、および
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’
：アンチセンス鎖。
【０２９１】
前記上流の部分的な領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはそれに相補的な配列の末端から数えて９〜１３個のヌクレオチドからなるドメインである。さらに、このようなキメラ型の二本鎖分子の好ましい例には、ポリヌクレオチドの少なくとも上流の半分の領域（センス鎖の５’側領域およびアンチセンス鎖の３’側領域）がＲＮＡであり、かつ残り半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチドの鎖長を有するものが含まれる。このようなキメラ型の二本鎖分子において、標的遺伝子の発現を阻害する効果は、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合にきわめて高い（ＵＳ  ２００５０００４０６４）。
【０２９２】
本発明に関連して、二本鎖分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ならびにＤＮＡおよびＲＮＡからなるショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）などのヘアピンを形成してよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現を停止させるのに使用され得る密なヘアピンターンを作り出す、一続きのＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの混合物である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列およびアンチセンス標的配列を含み、これらの配列はループ配列によって隔てられている。一般に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡになり、次いでこれらは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合される。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列とマッチするｍＲＮＡに結合し、かつ切断する。
【０２９３】
あるいは、本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を有するポリヌクレオチドの組み合わせの各々を含むベクターを提供し、ここで、センス鎖核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、３１、３２、または３３のヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖核酸はセンス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物は互いとハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ当該ベクターは、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、長さが約１９〜２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、３５、または３７のヌクレオチド配列由来の隣接ヌクレオチド）である。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する単一のヌクレオチド転写産物を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有し、式中［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、３０、３１、３２、または３３を含むヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【０２９４】
本発明のベクターは、例えば、両鎖の発現を（ＤＮＡ分子の転写によって）可能にする形でＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２配列に調節配列が機能的に連結されるようにＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２配列を発現ベクターにクローニングすることにより作出することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が第一のプロモーター（例えば、クローニングＤＮＡの３’末端に隣接するプロモーター配列）により転写され、ｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が第二のプロモーター（例えば、クローニングＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）により転写される。センス鎖およびアンチセンス鎖がインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を作出する。あるいは、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする二つのベクター構築物を利用して、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ発現させ、次いで、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニング配列は、二次構造（例えば、ヘアピン）を有する構築物をコードすることができる。すなわち、ベクターの単一転写産物は、標的遺伝子のセンス配列および相補的なアンチセンス配列を両方含む。
【０２９５】
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定な挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる（例えば、相同的組み換えカセットベクターの記述についてはThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；および国際公開公報第９８／０４７２０号を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例としては「裸のＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、重合体、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）。
【０２９６】
本発明のベクターは、例えば、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを含む。発現ベクターの例としては、牛痘または鶏痘などの弱毒化ウイルス宿主が挙げられる（例えば、米国特許第４，７２２，８４８号を参照のこと）。このアプローチは、例えば、二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞へ導入すると、組み換え牛痘ウイルスは該分子を発現し、それによって該細胞の増殖を抑制する。使用可能なベクターの別の例としてはカルメットゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ；ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記述されている。多種多様な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および産生に有用である。例としてはアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなどが挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０２９７】
本発明では、阻害性ヌクレオチドは、送達試薬とともに裸の核酸として、または該阻害性ヌクレオチドを発現する組み換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして対象に投与することができる。
【０２９８】
本阻害性ヌクレオチドとともに投与するのに適した送達試薬は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクトアミン；セルフェクチン；またはポリカチオン（例えばポリリシン）もしくはリポソームを含む。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０２９９】
リポソームは、網膜組織または腫瘍組織などの特定の組織への阻害性ヌクレオチドの送達を補助することができ、阻害性核酸の血中半減期を増大させることもできる。本発明に関連して用いるのに適したリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成されてもよく、これには一般的に、中性または陰性電荷のリン脂質およびコレステロールなどのステロールが含まれる。一般的には、所望のリポソームサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要因を考慮することにより、脂質の選択が左右される。例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；および同第５，０１９，３６９号に記述されているように、リポソームを調製するのに種々の方法が知られており、それらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３００】
好ましくは、本阻害性ヌクレオチドを封入するリポソームは、リポソームを癌部位に送達できるリガンド分子を含む。腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体などの、腫瘍細胞に多く見られる受容体に結合するリガンドが好ましい。
【０３０１】
特に好ましくは、本阻害性ヌクレオチドを封入するリポソームは、単核マクロファージおよび細網内皮系によるクリアランスを回避するように、例えば、構造表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することにより修飾される。一つの態様において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分とリガンドの両方を含むことができる。
【０３０２】
本発明のリポソームの調製で用いるオプソニン化阻害部分は、典型的には、リポソーム膜に結合する大きな親水性重合体である。本明細書において使用される場合、オプソニン化阻害部分は、例えば、脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、膜に化学的または物理的に付着される場合、リポソーム膜に「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性重合体は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記述されているように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもはるかに長く循環血液中に留まる。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０３０３】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。かくして、そのような微小血管系の欠陥によって特徴付けられる標的組織、例えば、固形腫瘍は、これらのリポソームを効率的に集積すると考えられる。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減が、肝臓および脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。かくして、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本阻害性核酸を腫瘍細胞に送達することができる。
【０３０４】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、約５００〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する水溶性重合体であることが好ましい。そのような重合体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成重合体；直鎖状、分枝状、または樹状ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドを含む。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧの共重合体、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害重合体は、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロック共重合体でありうる。オプソニン化阻害重合体はまた、アミノ酸もしくはカルボン酸、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギナンを含有する天然多糖；アミノ化多糖もしくはオリゴ糖（直鎖状もしくは分枝状）；または、例えば、カルボン酸基の連結を結果的に有するカルボン酸の誘導体と反応した、カルボキシル化多糖もしくはオリゴ糖でもありうる。
【０３０５】
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０３０６】
オプソニン化阻害部分は、多くの周知の技術のいずれか一つによってリポソーム膜に結合されうる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーに結合され、次いで膜に結合されうる。同様に、デキストラン重合体は、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３、ならびに３０：１２の比のテトラヒドロフランおよび水などの溶媒混合物を６０℃で用いて還元的アミノ化によりステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することもできる。
【０３０７】
本発明の阻害性核酸を発現するベクターが上記で論じられている。本発明の少なくとも一つの阻害性核酸を発現するそのようなベクターを、直接的にまたはＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクトアミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えば、ポリリシン）もしくはリポソームを含む好適な送達試薬とともに投与することもできる。本発明の阻害性核酸を発現する組み換えウイルスベクターを患者の癌領域に送達するための方法は、当技術分野の技術の範囲内である。
【０３０８】
本発明の阻害性ヌクレオチドは、阻害性ヌクレオチドを癌部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば、阻害性ヌクレオチドは遺伝子銃、電気穿孔法により、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路により投与することができる。
【０３０９】
好適な腸内投与経路は経口、直腸、または鼻腔送達を含む。
【０３１０】
好適な非経口投与経路は、小胞内および血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル点滴）；傍組織および組織内注射（例えば、傍腫瘍および腫瘍内注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば、浸透圧ポンプによって）；例えばカテーテルまたは他の留置装置（ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｄｅｖｉｃｅ）（例えば、多孔性、非孔性、またはゼラチン様材料を含む、網膜ペレットまたは坐剤またはインプラント）による癌部位の領域またはその近傍の領域への直接適用；ならびに吸入を含む。阻害性ヌクレオチドまたはベクターの注射または注入は、癌の部位またはその近傍で行われることが好ましい。
【０３１１】
本発明の阻害性核酸は、単回用量または複数回用量で投与することができる。本発明の阻害性核酸の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続用量であってよく、または複数回の注入によって送達されてもよい。組織中へ直接的に薬剤を注射するのは、選択された癌の部位またはその近傍である。癌の部位またはその近傍の組織中へ薬剤を複数回注射することが、特に好ましい。
【０３１２】
当業者はまた、本発明の阻害性核酸を所与の対象に投与するのに適した投薬計画を容易に決定することができる。例えば、阻害性核酸は、例えば癌部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。あるいは、阻害性核酸は、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の間、対象に１日１回または２回投与することができる。好ましい投薬計画では、阻害性核酸は７日間、癌の部位またはその近傍に１日１回注射される。投薬計画に複数回の投与が含まれる場合、対象に投与される阻害性核酸の有効量は、投薬計画全体を通して投与される阻害性核酸の全量を含みうることが理解される。
【０３１３】
以下で、実施例を参照して、本発明をさらに詳細に記述する。しかしながら、以下の材料、方法、および実施例は本発明の局面を例証するにすぎず、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。したがって、本明細書において記述されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができる。
【実施例】
【０３１４】
（実施例１）
Ｉ．  材料および方法
１．  細胞株および臨床試料
ヒト乳癌細胞株ＢＴ−５４９、ＨＣＣ１９３７、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＹＭＢ１、およびＢＳＹ−１、ならびに不死化ヒト乳腺細胞株ＨＢＬ１００は、米国微生物株保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入し、その各寄託者の推奨の下で培養した。ヒト哺乳類上皮細胞（ＨＭＥＣ）はＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入した。ＨＢＣ４およびＨＢＣ５細胞株は矢守博士（財団法人癌研究会癌化学療法センター分子薬理部、日本、東京）から親切にも提供していただいた。細胞は全て、適切な培地、すなわち、ＨＢＣ４、ＨＢＣ５、ＨＣＣ１９３７、Ｔ４７Ｄ、およびＹＭＢ１の場合にはＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加）；ＨＢＬ１００の場合にはＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＢＴ−５４９およびＭＣＦ−７の場合にはＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．００１％インスリン添加）；ＳＫＢＲ３の場合にはＭｃＣｏｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加）；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓの場合にはＬ−１５（Ｒｏｃｈｅ）；ＨＭＥＣの場合にはＭＥＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の中で培養した。各培地に１０％ウシ胎仔血清（Ｃａｎｓｅｒａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）および１％抗生物質／抗真菌溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞はＣＯ２不含の加湿空気雰囲気中３７℃で維持した。他の細胞株は５％  ＣＯ２を含む加湿空気雰囲気中３７℃で維持した。手術で摘出された乳癌由来の組織試料および対応するその臨床情報は、書面によるインフォームドコンセントを得た上で、東京の癌研究会附属病院乳腺外科から得た。
【０３１５】
２．  半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
顕微解剖された乳癌臨床試料および正常腺管細胞のそれぞれから全ＲＮＡを抽出し、その後、Ｔ７に基づく増幅および逆転写を既述（Nishidate at al., 2004）のように行った。定量内部対照としてβアクチンの増幅をモニタリングすることにより、その後のＰＣＲのために各一本鎖ｃＤＮＡの好適な希釈物を調製した。ＰＣＲプライマー配列は、βアクチンに対して
５’−ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および５’−ＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；ならびに
ＲＱＣＤ１に対して
５’−ＡＧＡＣＣＣＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５’−ＧＴＧＴＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であった。
【０３１６】
３．  ノーザンブロット分析
ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造元の指示にしたがって用いて、全ての乳癌細胞株から全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ  Ｉ処理の後、ｍＲＮＡ精製キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造元の指示にしたがって用いて、ｍＲＮＡを単離した。健常成人ヒト乳腺から単離されたｍＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）、肺、心臓、肝臓、腎臓、および骨髄から単離されたｍＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の各１マイクログラムを１％変性アガロースゲル上で分離し、キャピラリーブロッティングによってナイロン膜に転写した。［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識ＲＱＣＤ１  ｃＤＮＡとヒトマルチプルティッシュノーザンブロット膜（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をハイブリダイズさせた。既述（Hirota E, et al. (2006) Int J Oncol 29:799-827）されているのと同様にプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。洗浄段階の後、増感スクリーンを用い、−８０℃で１４日間、膜をオートラジオグラフ撮影した。プライマーセット５’−ＡＧＡＣＣＣＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５’−ＧＴＧＴＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を用いてＲＴ−ＰＣＲによりＲＱＣＤ１に特異的なプローブ（２４１ｂｐ）を調製し、ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で放射性標識した。
【０３１７】
４．  免疫細胞化学
ＲＱＣＤ１  ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅によって調製した。Ｎ末端ヘマグルチニン（ＨＡ）タグの付いたＲＱＣＤ１に向けて指定したｐＣＡＧＧＳ哺乳類発現ベクターに、当該ＰＣＲ産物を挿入した。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を製造元の指示にしたがって用いて、ｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ−ＲＱＣＤ１発現ベクターをＨＥＫ２９３、ＨＢＣ４、またはＢＴ５４９にトランスフェクトした。２４時間のインキュベーションの後、細胞を４％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で４℃で３分間透過処理した。その後、細胞を、ブロッキングのため３％  ＢＳＡ中で１時間インキュベートし、５００分の１希釈された３Ｆ１０抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）とともにインキュベートした。ＰＢＳ（−）で洗浄した後に、細胞を、５００分の１希釈されたＡｌｅｘａ  ５９４結合抗マウス抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともにインキュベートした。核を４’，６’−ジアミジン−２’−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で対比染色した。ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で蛍光像を得た。
【０３１８】
５．  Ｕ６−ｓｉＲＮＡベクター系によるＲＱＣＤ１のノックダウン
ｐｓｉＵ６ＢＸ３．０低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）発現ベクター（Hirota E, et al. (2006) Int J Oncol 29:799-827）を用いて、ベクターに基づくＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）発現系を樹立した。ｐｓｉＵ６ＢＸ３．０ベクター中のＢｂｓＩ部位への二本鎖オリゴヌクレオチドのクローニングによってＲＱＣＤ１に対するｓｉＲＮＡ発現ベクターを調製した。ｓｉＲＮＡの標的配列は以下の通りであった：
ｓｉ−  ＃１、５’−ＡＡＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；
ｓｉ−  ＃２、  ５’−ＡＡＧＡＴＣＴＴＧＴＴＡＧＡＴＧＡＣＡＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）。
【０３１９】
全ての構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。ヒト乳癌細胞株ＨＢＣ４およびＢＴ５４９を、６ウェルプレートにプレーティング（０．４×１０５個）し、ＦｕＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造元の指示にしたがって用いてｐｓｉＵ６ＢＸ３．０−モック（挿入断片なし）またはｐｓｉＵ６ＢＸ３．０−ＲＱＣＤ１（ｓｉ−＃１、ｓｉ−＃２、およびｓｉ−＃１で３塩基置換を含む構築物）をトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間の時点で、コロニー形成アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＭＴＴアッセイのために細胞を再び播種した。ｐｓｉＵ６ＢＸ３．０を導入したＨＢＣ４およびＢＴ５４９細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培地で選択した。全ＲＮＡを５日間の選択後に抽出し、その後、特異的なプライマーセット：
内部対照としてのβアクチンに対して
５’−ＡＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および５’−ＧＧＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；ならびに
ＲＱＣＤ１に対して
５’−ＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および５’−ＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
を用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりノックダウン効果を評価した。
【０３２０】
６．  ＲＱＣＤ１を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞の樹立
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にＨＡタグ付ＲＱＣＤ１発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳｎＨＣ−ＲＱＣＤ１）またはモックベクター（ｐＣＡＧＧＳｎＨＣ）をトランスフェクトした。０．９ｍｇ／ｍｌのネオマイシン（ジェネティシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培地中でトランスフェクト細胞をインキュベートした。３週間後、個々のコロニー２０個を限界希釈によって選択し、ＲＱＣＤ１を安定的に発現するクローンについてスクリーニングした。抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたウエスタンブロットおよび免疫組織化学的染色分析によって各クローンにおけるＨＡタグ付ＲＱＣＤ１の発現レベルを検出した。３つの独立クローンを樹立し、それらを次のように指定した；ＨＥＫ２９３−ＲＱＣＤ１−１、−２、および−３、ならびにＨＥＫ２９３−Ｍｏｃｋ−１、−２、および−３。
【０３２１】
７．  コロニー形成アッセイおよびＭＴＴアッセイ
ジェネティシンを含有する選択培地中で１４日間、ｓｉＲＮＡを発現するトランスフェクタントを成長させ、その後、ギムザ溶液（Ｍｅｒｃｋ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，  ＮＪ）で染色してコロニー数を評価する前に、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞の生存度を定量化するため、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８を製造元（Ｗａｋｏ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）の指示にしたがって用いてＭＴＴアッセイを行った。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。これらの実験を三回行った。
【０３２２】
ＩＩ．  結果
１．  臨床乳癌細胞におけるＲＱＣＤ１の上方制御
ＲＱＣＤ１（ＲＣＤ１（細胞分化に必要；ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １）相同体（分裂酵母））遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号；ＮＭ＿００５４４４）の上方制御を、正常乳管細胞または重要臓器と比べて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により臨床乳癌１２症例中４症例で確認した（図１Ａ）。続くＲＱＣＤ１  ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いたノーザンブロット分析から、ＲＱＣＤ１のおよそ３．５ｋｂの転写産物が、乳腺と比べて、試験した１１の乳癌細胞株の全てにおいて有意に上昇したこと（図１Ｂ）が示された。この転写産物は精巣で最も高度に発現されていたが、その発現は残りの正常臓器のいずれにおいてもほとんど検出することができず（図１Ｃ）、このことは、ＲＱＣＤ１は癌−精巣抗原である可能性があることを示唆していた。
【０３２３】
２．  外因的に発現されたＲＱＣＤ１の細胞内局在
ＲＱＣＤ１タンパク質の生物学的役割を特徴付けるために、外因的に導入されたＲＱＣＤ１の細胞内局在を、まず、免疫細胞化学によりＨＥＫ２９３、ＨＢＣ４、またはＢＴ５４９で調べた。ＨＡタグ付ＲＱＣＤ１構築物でのトランスフェクションから４８時間後、外因的に発現されたＲＱＣＤ１タンパク質は細胞質および核の両方で散在的に染色された（図２）。
【０３２４】
３．  ＲＱＣＤ１のノックダウンは乳癌細胞株の成長阻害を引き起こす
乳癌細胞におけるＲＱＣＤ１の生物学的意義を詳しく調べるために、ＲＱＣＤ１に特異的な配列を標的化するＵ６プロモーターに基づくｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築し、それらを、ＲＱＣＤ１が高度に発現されている乳癌細胞株ＨＢＣ４およびＢＴ５４９にトランスフェクトした。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、対照ｓｉＲＮＡ構築物ｐｓｉＵ６ＢＸ−モックと比べて、ｐｓｉＵ６ＢＸ−ＲＱＣＤ１−ｓｉ＃１およびｓｉ＃２をトランスフェクトした両細胞株でのＲＱＣＤ１発現の有意なノックダウン効果が検出された（図３Ａ）。転写産物に及ぼすノックダウン効果にしたがって、ＭＴＴおよびコロニー形成アッセイから、二つのｓｉＲＮＡ、ｓｉ＃１およびｓｉ＃２による乳癌細胞の有意な成長抑制が明らかになった（図３Ｂ）。３塩基ミスマッチｓｉＲＮＡによるノックダウン効果の特異性をさらに評価したところ、３塩基ミスマッチｓｉＲＮＡの場合には有意な効果が観察されず（図３Ｄ）、ＲＱＣＤ１のノックダウンの配列特異性を支持するものであった。この証拠は、乳癌細胞の成長においてＲＱＣＤ１が重要な役割を果たすことを強く示唆している。
【０３２５】
４．  ＲＱＣＤ１の構成的過剰発現はＨＥＫ２９３において細胞成長の増強をもたらした
ＲＱＣＤ１の成長促進効果をさらに探索するために、外因性ＲＱＣＤ１を安定的に発現するＨＥＫ２９３派生細胞を樹立した。ウエスタンブロット分析（図４Ａ）および免疫細胞化学（データ不掲載）により三つの安定細胞株において高いレベルでかつ単一クローン性で観察された通り、外因性ＲＱＣＤ１タンパク質が確認された。その後のＭＴＴアッセイから、三つのＲＱＣＤ１安定的な派生細胞（ＲＱＣＤ１−１、−２、および−３）がモックプラスミドをトランスフェクトしたもの（モック−１、−２、および−３）よりもはるかに速く成長することが示され（図４Ｂ）、これにより、ＲＱＣＤ１の成長増強効果が示唆された。迅速な成長に加えて、これらの三つのＨＥＫ２９３−ＲＱＣＤ１細胞の多層成長が、コンフルエントに達した後に観察されたことは、ＨＥＫ２９３細胞へのＲＱＣＤ１の導入による接触阻害機構の喪失を示唆するものであった（図４Ｃ）。
【０３２６】
（実施例２）
Ｉ．  材料および方法
１．  乳癌細胞株および臨床試料
ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ−１９３７、ＢＴ−５４９、ＭＣＦ−７、ＢＳＹ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＫＢＲ−３、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＹＭＢ−１、ヒト正常腺管上皮細胞ＭＣＦ１０Ａ、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３Ｔは、米国微生物株保存機関（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）から購入した。それらをその各寄託者の推奨の下で培養した。ＨＢＣ−４およびＨＢＣ−５細胞株は財団法人癌研究会癌化学療法センター分子薬理部の矢守隆夫博士から親切にも提供していただいた。これらの細胞株の培地は次の通りである：ＨＣＣ−１９３７、Ｔ−４７Ｄ、ＳＫＢＲ−３、ＹＭＢ−１、ＨＢＣ−４、およびＨＢＣ−５の場合、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）；ＭＣＦ−７およびＨＥＫ２９３の場合、０．００１％インスリン添加ＥＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓの場合、Ｌ−１５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）；ＨＥＫ２９３Ｔの場合、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＭＣＦ１０Ａの場合、１３ｍｇ／ｍｌのＢｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５ｍｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０マイクログラム／ｍｌのＥＧＦ、５ｍｇ／ｍｌのインスリンおよび１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素（Ｌｏｎｚａ）添加ＭＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。ＭＥＧＭを除く各培地には１０％ウシ胎仔血清（Ｃａｎｓｅｒａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）および１％抗生物質／抗真菌溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞は、ＣＯ２不含の加湿空気雰囲気中３７℃で維持した。他の細胞株は５％  ＣＯ２を含む加湿空気雰囲気中３７℃で維持した。手術で摘出された乳癌由来の組織試料および対応するその臨床情報は、書面によるインフォームドコンセントを得た後で、東京の癌研究会附属病院乳腺外科から得た。上記の全ての臨床材料の使用を含めてこの研究は、個別の施設倫理委員会から承認を得た。
【０３２７】
２．  半定量的逆転写−ＰＣＲ分析
ＲＮｅａｓｙキットを製造元のプロトコル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）にしたがって用いて、１２個の、顕微解剖された臨床乳癌細胞および培養細胞株から全ＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡおよび正常ヒト組織ポリアデニル化ＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）で処理し、次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。内部対照としてβ−アクチン（ＡＣＴＢ）をモニタリングすることにより、その後のＰＣＲのために各一本鎖ｃＤＮＡの好適な希釈物を調製した。ＰＣＲプライマー配列は以下の通りであった：ＡＣＴＢに対して
５’−ＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）および５’−ＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＴＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
ＲＱＣＤ１の３’−ＵＴＲ領域に対して（臨床試料および細胞株における発現の分析）
５’−ＧＧＡＣＴＴＧＴＴＡＧＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）および５’−ＧＡＴＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
ＲＱＣＤ１に対して（そのノッキングダウン効果の分析）
５’−ＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）および５’−ＣＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＧＣＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
ＧＩＧＹＦ１に対して
５’−ＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）および５’−ＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧ  ＧＴＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ならびに
ＧＩＧＹＦ２に対して
５’−ＣＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＴＴＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）および５’−ＧＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）。
【０３２８】
３．  ｃＤＮＡ末端の５’および３’迅速増幅（５’および３’ＲＡＣＥ）
ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造元の指示にしたがって用いて５’および３’ＲＡＣＥ実験を行った。ＲＱＣＤ１  ｃＤＮＡの５’および３’配列の増幅の場合、遺伝子特異的なプライマー（５’ＲＡＣＥ用
５’−ＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＣＡＴＡＧＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
および３’ＲＡＣＥ用
５’−  ＧＧＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＡＧ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３））ならびにキット中に供給されていたユニバーサルプライマー混合物を用いた。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＨＢＣ−４乳癌細胞から精製されたｍＲＮＡより鋳型ｃＤＮＡを合成した。ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ産物をクローニングし、ＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ３７００；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ，  ＣＡ）によって配列を決定した。
【０３２９】
４．  ノーザンブロッティング
乳癌ノーザンブロット膜を既述（７）のように調製した。ＲＴ−ＰＣＲ（下記参照）によりｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で調製された、ＲＱＣＤ１に対する［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識ｃＤＮＡプローブと、ヒトマルチプルティッシュノーザンブロット膜（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）および乳癌ノーザンブロット膜をハイブリダイズした。既述（Katagiri T, Ozaki K, Fujiwara T et al: Cloning, expression and chromosome mapping of adducin-like 70 (ADDL), a human cDNA highly homologous to human erythrocyte adducin. Cytogenet Cell Genet 4: 90-95, 1996）のようにプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感スクリーンを用い、−８０℃で１４日間、ブロットをオートラジオグラフ撮影した。プライマーセット：
５’−ＧＧＡＣＴＴＧＴＴＡＧＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）および５’−ＧＡＴＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いてＲＴ−ＰＣＲによりＲＱＣＤ１に特異的なプローブ（２８３ｂｐ）を調製した。
【０３３０】
５．  発現ベクターの構築
ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、およびＧＩＧＹＦ２の発現ベクター構築物のため、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲにより各コード配列全体を増幅した。プライマーセットは以下の通りであった：ＲＱＣＤ１に対して
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）および５’−ＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、
ＧＩＧＹＦ１に対して
５’−ＧＴＴＡＡＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＣＴＣＡＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）および５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＣＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、ならびに
ＧＩＧＹＦ２に対して
５’−ＧＴＴＡＡＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）および５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＴＣＣＡＡＣＧＴＣＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）（下線は制限酵素の認識部位を示す）。ＰＣＲ産物をｐＣＡＧＧＳｎ３ＦＣまたはｐＣＡＧＧＳｎＨＣ発現ベクターの中にそれぞれ、Ｃ末端のヘマグルチニン（ＨＡ）−タグまたはＦｌａｇ−タグとインフレームで挿入した。各構築物のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ３７００；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって確認した。
【０３３１】
６．  抗ＲＱＣＤ１ポリクローナル抗体の調製
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｎ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−タグを有する全長ＲＱＣＤ１を発現するように設計されたプラスミドを構築した。組み換えＲＱＣＤ１タンパク質をＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で発現させ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて精製し、次いでＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での消化を行って、供給元のプロトコルにしたがいＧＳＴ−タグを除去した。精製された組み換えタンパク質をウサギの免疫（ＳＣＲＵＭ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）に用いた。その後、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ  １０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を供給元の指示にしたがって用い、抗原アフィニティーカラムにて免疫血清を精製した。
【０３３２】
７．  ウエスタンブロッティング
乳癌および正常組織におけるＲＱＣＤ１タンパク質の発現を調べるために、ヒト正常乳腺、肺、心臓、肝臓、および腎臓に対するＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｄｌｅｙ（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）組織溶解物を使用した。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０、１０％  グリセロール、１％  ホスファターゼインヒビターカクテルセットＩＩおよび０．１％  プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を含有する溶解用緩衝液で培養乳癌細胞を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを既述（Park JH, Lin ML, Nishidate T, Nakamura Y and Katagiri T: PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase, a putative cancer/testis antigen with an oncogenic activity in breast cancer. Cancer Res 66: 9186-9195, 2006）のように行った。この研究で用いた抗体は以下の通りであった；ＲＱＣＤ１の場合には抗ＲＱＣＤ１ウサギポリクローナル抗体（０．６マイクログラム／ｍｌ）、ＡＣＴＢの場合には抗β−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ａｃ−１５）（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｋｔの場合には抗Ａｋｔウサギポリクローナル抗体（＃９２７２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）（１，０００分の１希釈）、Ｓｅｒ  ４７３にてリン酸化されたＡｋｔの場合には抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）マウスモノクローナル抗体（＃４０５１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１，０００分の１希釈）、ＨＡ−タグの場合には抗ＨＡラットモノクローナル抗体（３Ｆ１０）（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌａｇ−タグの抗Ｆｌａｇマウスモノクローナル抗体（Ｍ２）（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＨＲＰ結合抗マウス、ラットまたはウサギ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）（４０ｎｇ／ｍｌ）。
【０３３３】
８．  免疫細胞化学的染色分析
免疫細胞化学的染色分析のため、乳癌細胞ＢＴ−５４９を２ウェルＬａｂ−Ｔｅｋチャンバスライド（Ｎｕｎｃ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）の１チャンバあたり細胞１×１０５個の密度で播種した。２４時間の培養後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄し、４℃で１５分間４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、その後、４℃で３分間０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ（−）で透過処理した。細胞を４℃で６０分間ＰＢＳ（−）中５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で覆って、一次抗体反応の前に非特異的結合をブロックした。乳癌細胞における内因性ＲＱＣＤ１の検出のため、該細胞を５％  ＢＳＡ添加抗ＲＱＣＤ１ウサギポリクローナル抗体（６マイクログラム／ｍｌ）とともに６０分間インキュベートし、その後、５％  ＢＳＡ添加Ａｌｅｘａ  ４８８抗ウサギＩｇＧ（４マイクログラム／ｍｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ，  ＵＳＡ）とともに６０分間インキュベートした。外因的に発現されたＨＡタグ付きのＧＩＧＹＦ１およびＧＩＧＹＦ２タンパク質の検出のため、細胞を５％  ＢＳＡ添加抗ＨＡラットモノクローナル抗体（３Ｆ１０）（０．４マイクログラム／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）とともに６０分間インキュベートし、その後、５％  ＢＳＡ中で５００分の１に希釈されたＡｌｅｘａ  ５９４抗ラットＩｇＧとともに６０分間インキュベートした。その後、該細胞に、その核が対比染色されるよう４’，６−ジアミノ−２’−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）とともにＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍをマウントした。ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｗｅｔｚｌａｒ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって蛍光像を得た。
【０３３４】
９．  ＲＮＡ干渉アッセイ
既述（Shimokawa T, Furukawa Y, Sakai M, Li M, Miwa N, Lin YM and Nakamura Y: Involvement of the FGF18 gene in colorectal carcinogenesis, as a novel downstream target of the beta-catenin/T-cell factor complex. Cancer Res 63: 6116-6120, 2003）のようにｐｓｉＵ６ＢＸ３．０ベクター中のＢｂｓＩ部位への二本鎖オリゴヌクレオチドのクローニングによりＲＱＣＤ１に対してｓｈＲＮＡ発現ベクターを作出した。細胞１．０×１０６個のＢＴ−５４９およびＨＢＣ−４細胞株を１０ｃｍのプレートに播種した。播種から２４時間後、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造元の指示にしたがって用い、ＲＱＣＤ１を標的化するｓｈＲＮＡ発現ベクター（＃１および＃２）またはｐｓｉＵ６ＢＸ３．０モックベクター（挿入断片なし）の各々を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培地で細胞を、細胞増殖アッセイおよびコロニー形成アッセイのために６−Ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｌｏｗｅｌｌ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）に再び播種（細胞０．７×１０５個／ウェル）し、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロッティングのために１０ｃｍのプレートに再び播種（細胞３．５×１０５個／プレート）した。７日間のジェネティシン処理の後、上記の項で記述したように、半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロッティング分析によってｓｈＲＮＡのノックダウン効果を調べた。８日間のジェネティシン処理の後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，  Ｋｕｍａｍｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いて細胞増殖アッセイを行った。さらに、９日間のジェネティシン処理の後、４％パラホルムアルデヒドによる１５分間の固定後にギムザ染色溶液（Ｍｅｒｃｋ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）でコロニーを染色することによってコロニー形成アッセイを行った。Ａｋｔ活性化分析のため、ＲＱＣＤ１（＃１）、ＧＩＧＹＦ１またはＧＩＧＹＦ２を標的化するオリゴ−二重鎖ｓｉＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）の各々、および同様にＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを対照として用いた。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションから７２時間後、Ｓｅｒ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化を認識できる抗リン酸化Ａｋｔマウスモノクローナル抗体（＃４０５１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウエスタンブロッティングによってＡｋｔ活性を評価した。ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２のノックダウン後のＡｋｔリン酸化のレベルに及ぼす効果を評価するために、抗リン酸化Ａｋｔ抗体および抗Ａｋｔ抗体でのウエスタンブロッティングのバンド強度を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ分析ソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij）（Abramoff MD, Magelhaes PJ and Ram SJ, Image Processing with Image J. Biophotonics International 11: 36-42, 2004）を用いることによって定量化した。ｓｉＲＮＡ標的配列は以下の通りであった。
ＲＱＣＤ１（＃１）に対して、５’−ＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、
ＲＱＣＤ１（＃２）に対して、５’−ＧＡＴＣＴＴＧＴＴＡＧＡＴＧＡＣＡＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、
ＧＩＧＹＦ１に対して、５’−ＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＧＧＣＴＡＧＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、
ＧＩＧＹＦ２に対して、５’−ＣＡＡＧＡＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、および
ＥＧＦＰに対して、５’−ＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）。
【０３３５】
１０．  ＲＱＣＤ１を安定的に発現する細胞株の調製
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ−ＲＱＣＤ１プラスミドベクターまたはモックプラスミドベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地中で細胞を１４日間インキュベートした。次いで、２０個を超える個々のコロニーを単離し、その後、各コロニーを抗ＨＡ抗体での免疫細胞化学的染色およびウエスタンブロッティングによりＲＱＣＤ１タンパク質のその単クローン性発現について評価した。最終的に、３個の独立したクローンを樹立し、次のように指定した：ＨＥＫ２９３−ＲＱＣＤ１−１、−２、および−３（安定−１、−２、および−３）、ならびにＨＥＫ２９３−Ｍｏｃｋ−１、−２、および−３（モック−１、−２、および−３）。細胞増殖アッセイのため、モック−安定細胞株およびＲＱＣＤ１−安定細胞株を、１型コラーゲン被覆６ウェルマイクロプレート（Ａｓａｈｉ  ｇｌａｓｓ  ｃｏ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）に播種（細胞０．４×１０５個／ウェル）し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を製造元の指示にしたがって用いて細胞成長を評価した。
【０３３６】
１１．  ＧＳＴ−プルダウンアッセイ
ＨＢＣ−４を１０ｃｍのプレートに細胞１．０×１０６個で播種した。播種から２４時間後、細胞を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＮＰ−４０、１０％グリセロール、１％  ホスファターゼインヒビターカクテルセットＩＩおよび０．１％  プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する氷冷緩衝液５００マイクロリットルで収集し、１８，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって清澄化し、清澄化の前に４℃で１時間  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）３０マイクロリットルとともに回転混和（ｒｏｔａｔｅ）した。その後、１マイクログラムのＧＳＴのみまたは同じモル数のＮ末端ＧＳＴ融合全長ＲＱＣＤ１組み換えタンパク質を上清に添加し、４℃で１時間回転混和した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）１０マイクロリットルを各細胞溶解物に添加し、４℃で１時間回転混和した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを溶解用緩衝液５００マイクロリットルで３回にわたり洗浄し、次いで結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液３０マイクロリットルの添加によって溶出した。
【０３３７】
１２．  質量分光分析
ＧＳＴプルダウンアッセイの溶出サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、続いてＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で銀染色を行った。切り出したタンパク質バンドを、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中３７℃で３０分間還元し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを含む５０ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中、暗所にて２５℃で４５分間アルキル化した。ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，  ＣＡ）を最終的な酵素：タンパク質比１：２０となるよう添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中５．４〜２９．２％アセトニトリルの３０分間の直線勾配を全流量３００ｎｌ／分で用いて１００マイクロメータＸ  １５０ミリメータＨｉＱ−Ｓｉｌ（ＫＹＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）にて、得られたペプチド混合物を分離した。溶出ペプチドをマトリックス溶液（７０％アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ中４ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸、０．０８ｍｇ／ｍｌのクエン酸アンモニウム）と混合し、ＭａＰ（ＫＹＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）によってＭＡＬＤＩ標的プレート上に自動的にスポットした。４８００  Ｐｌｕｓ  ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）にて質量分光分析を行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｉｌｏｔ  ２．０．１版のソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）によって作出されたＭＳ／ＭＳピークリストを、タンパク質データベース検索のために、ローカルのＭＡＳＣＯＴ  ２．２．０３版の検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）に出力した。
【０３３８】
１３．  共免疫沈降アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞１．０×１０６個／１０ｃｍプレートの密度で播種した。播種から２４時間後に、表示した組み合わせの発現ベクターを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後３６時間の時点で、細胞を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＮＰ−４０、１０％グリセロール、１％  ホスファターゼインヒビターカクテルセットＩＩおよび０．１％  プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する氷冷緩衝液５００マイクロリットルで収集し、４℃で１５分間１８，０００×ｇでの遠心分離によって清澄化し、４℃で１時間抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）アガロース（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または抗ＨＡ（ＨＡ−７）アガロース（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０マイクロリットルとともに回転混和した。その後、それらのアガロースビーズを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＮＰ−４０、１０％グリセロールを含有する洗浄用緩衝液５００マイクロリットル、および２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液５００マイクロリットルで、３回にわたり洗浄した。最後に、沈降したタンパク質を、それぞれ、１５０マイクログラム／ｍｌの３ＸＦｌａｇペプチド（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または２００マイクログラム／ｍｌのＨＡペプチド（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２０マイクロリットルとともに４℃で１時間インキュベートすることによって溶出させた。
【０３３９】
１４．  統計分析
スチューデントのｔ検定によって統計的有意性を調べた。Ｐ＜０．０５の差異を統計的に有意であると見なした。
【０３４０】
ＩＩ．  結果
１．  ＲＱＣＤ１は乳癌細胞において上方制御される
新規の治療薬の開発のための標的として適用可能でありうる分子をスクリーニングするために、２３，０４０種のｃＤＮＡまたはＥＳＴを標的化するｃＤＮＡマイクロアレイによって乳癌検体８１例のゲノム規模での発現プロファイル分析を行った（Nishidate T, Katagiri T, Lin ML et al: Genome-wide gene-expression profiles of breast-cancer cells purified with laser microbeam microdissection: identification of genes associated with progression and metastasis. Int J Oncol 25: 797-819, 2004）。上方制御されていた数十の遺伝子のなかで、本発明では、充実腺管型の乳癌においてその発現が頻繁に上方制御されていた（正常腺管細胞より少なくとも３倍高かった）ＲＱＣＤ１に着目した。その過剰発現は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、正常乳管細胞と比べてまたは全乳腺と比べて１２例の臨床充実腺管中４症例で確認された（図５Ａ）。続くＲＱＣＤ１  ｃＤＮＡ断片を用いてのノーザンブロッティング分析は、乳癌細胞株におけるその転写産物（およそ３．５ｋｂ長）の過剰発現を明らかにしたが、精巣を除く正常ヒト臓器においては、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析の結果と一致してＲＱＣＤ１発現は非常に弱かったかまたはほとんど検出できなかった（図５Ｂ）。ＮＣＢＩデータベース中のＲＱＣＤ１の構築済みｃＤＮＡ配列（アクセッション番号ＮＭ＿００５４４４；９００ｂｐ）は、ノーザンブロット分析によって示された転写産物のサイズよりも小さかったので、エキソン連結、ならびに５’および３’ＲＡＣＥ実験を行った。２９９個のアミノ酸のタンパク質をコードする３，２８４個のヌクレオチド（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション；ＡＢ５００８９２）からなる、ヒトＲＱＣＤ１の全長ｃＤＮＡ配列を得た。ＲＱＣＤ１遺伝子は８個のエキソンからなり、染色体バンド２ｑ３５上のおよそ４５．４ｋｂのゲノム領域に及ぶ。
【０３４１】
乳癌細胞におけるＲＱＣＤ１タンパク質の発現を詳しく調べるため、全長ＲＱＣＤ１タンパク質に対するポリクローナル抗体を作製し、８種の乳癌細胞株からの全細胞溶解物ならびに乳腺、肺、心臓、肝臓、および腎臓を含む正常ヒト組織を用いてウエスタンブロッティング分析を行った。調べた乳癌細胞株の全てで高レベルのＲＱＣＤ１タンパク質が検出されたが、精巣を除く正常ヒト組織のいずれにおいてもその発現はほとんど検出できなかった（図５Ｃ）。さらに、精製された抗ＲＱＣＤ１ポリクローナル抗体を用いた免疫細胞化学的染色分析により、乳癌細胞株ＢＴ−５４９における内因性ＲＱＣＤ１タンパク質の細胞内局在を調べた。それは、乳癌細胞の細胞質および核の両方で散在的に観察された（図６Ｄ）。
【０３４２】
２．  細胞成長に及ぼすＲＱＣＤ１の効果
乳癌細胞の成長におけるＲＱＣＤ１の機能的役割を調べるため、転写レベルでもタンパク質レベルでも高いＲＱＣＤ１発現を示した乳癌細胞株ＢＴ−５４９およびＨＢＣ−４（図７）において、内因性ＲＱＣＤ１の発現を低分子ヘアピン−ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ベクター系によってノックダウンした。半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロッティング分析から、ＲＱＣＤ１特異的なｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ＃１（ｓｈ−＃１）およびｓｈＲＮＡ＃２（ｓｈ−＃２））がＲＱＣＤ１発現を有意に抑制するのに対し、モックトランスフェクト細胞では変化が観察されないことが示された（図７Ａ）。次いで、細胞増殖アッセイおよびコロニー形成アッセイを行い、ｓｈＲＮＡ＃１およびｓｈＲＮＡ＃２構築物の導入が、転写産物のノックダウン効果の結果（図７Ａ）と一致して、ＢＴ−５４９およびＨＢＣ−４細胞の両方の成長を有意に抑制する（ＢＴ−５４９：ｓｈＲＮＡ＃１、Ｐ＝０．００４およびｓｈＲＮＡ＃２、Ｐ＝０．００２；ＨＢＣ−４：ｓｈＲＮＡ＃１、Ｐ＝０．００２およびｓｈＲＮＡ＃２、Ｐ＝０．００２；スチューデントのｔ検定）ことが発見された。ＲＱＣＤ１の成長促進効果をさらに確認するために、親ＨＥＫ２９３と比べて外因性ＲＱＣＤ１を高いレベルで安定的に発現する３つの独立したＨＥＫ２９３派生細胞（安定−１、−２、および−３）を樹立した（図８Ｂ）。その後の細胞増殖アッセイにより、３つのＲＱＣＤ１安定細胞（安定−１、−２、および−３）が、モックプラスミドをトランスフェクトした細胞（モック−１、−２、および−３；図８Ｂ右パネル）よりもはるかに速く有意に成長することが明らかになり、このことは、ＲＱＣＤ１過剰発現の発癌における役割を示唆した。
【０３４３】
３．  ＲＱＣＤ１と相互作用する分子の同定
その生物学的機能をさらに詳しく調べるため、乳癌細胞においてＲＱＣＤ１タンパク質と相互作用するタンパク質を、Ｎ末端ＧＳＴ融合全長ＲＱＣＤ１組み換えタンパク質（ＧＳＴ−ＲＱＣＤ１）を用いたＧＳＴ−プルダウンアッセイおよび質量分光分析により探索した（実施例２の材料および方法を参照のこと）。プルダウンされたタンパク質を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色パターンの比較によって、ＧＳＴ−ＲＱＣＤ１タンパク質でプルダウンされたタンパク質に対応するレーンにおいて特異的におよそ１４０ｋＤａおよび１６０ｋＤａの位置に、二つのタンパク質が同定された（データ不掲載）。質量分光分析により、これらの１４０ｋＤａおよび１６０ｋＤａのタンパク質が、それぞれＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路における関与が以前に示されていた、Ｇｒｂ１０相互作用ＧＹＦタンパク質１（ＧＩＧＹＦ１）および２（ＧＩＧＹＦ２）であることが示された（Giovannone B, Lee E, Laviola L, Giorgino F, Cleveland KA and Smith RJ: Two novel proteins that are linked to insulin-like growth factor (IGF-l) receptors by the Grb10 adapter and modulate IGF-l signaling. J Biol Chem 34: 31564-31573, 2003）。その後、ＲＱＣＤ１とＧＩＧＹＦ１／ＧＩＧＹＦ２との間の相互作用を確認するため、共免疫沈降アッセイを行った（実施例２の材料および方法を参照のこと）。Ｆｌａｇタグ付ＲＱＣＤ１（Ｆｌａｇ−ＲＱＣＤ１）、およびＨＡタグ付ＧＩＧＹＦ１またはＧＩＧＹＦ２（ＨＡ−ＧＩＧＹＦ１、ＨＡ−ＧＩＧＹＦ２）構築物をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞へ共トランスフェクトし、細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降した。抗ＨＡ抗体での沈降物の免疫ブロッティングから、Ｆｌａｇ−ＲＱＣＤ１とＨＡ−ＧＩＧＹＦ１またはＨＡ−ＧＩＧＹＦ２との共免疫沈降が示唆された。逆に、免疫沈降を、抗ＨＡ抗体でも行い、続く抗Ｆｌａｇ抗体での沈降物の免疫ブロッティングから、それらの共免疫沈降が確認された（図９Ａ）。次に、ＧＩＧＹＦ１およびＧＩＧＹＦ２の転写レベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより乳癌細胞株において調べ、ＧＩＧＹＦ１およびＧＩＧＹＦ２がまた、正常乳腺と比べて、調べた全ての乳癌細胞株において上方制御されていたことが分かった（図９Ｂ）。乳癌細胞ＢＴ−５４９におけるこれらのタンパク質の細胞内局在を免疫細胞化学的染色によってさらに調べると、ＨＡ−ＧＩＧＹＦ１およびＨＡ−ＧＩＧＹＦ２タンパク質が細胞質中に検出され、内因性ＲＱＣＤ１と部分的に共局在していた。
【０３４４】
４．  Ａｋｔシグナル伝達経路におけるＲＱＣＤ１の関与
ＧＩＧＹＦ１およびＧＩＧＹＦ２の過剰発現は、ＩＧＦ−Ｉ受容体をトランスフェクトしたマウス胎児線維芽細胞においてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路を活性化することが報告されていたので（Giovannone B, Lee E, Laviola L, Giorgino F, Cleveland KA and Smith RJ: Two novel proteins that are linked to insulin-like growth factor (IGF-l) receptors by the Grb10 adapter and modulate IGF-l signaling. J Biol Chem 34: 31564-31573, 2003）、本明細書において、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、およびＧＩＧＹＦ２がＡｋｔ活性に影響を及ぼしうるかどうか調べた。Ａｋｔのカルボキシル末端疎水性モチーフにおけるＳｅｒ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化は、Ａｋｔの活性化のための代表的なマーカーであることが公知である（Alessi DR, Andjelkovic M, Caudwell B, Cron P, Morrice N, Cohen P and Hemmings BA: Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1. EMBO J 15: 6541-6551, 1996、Yang J, Cron P, Thompson V, Good VM, Hess D, Hemmings BA and Barford D: Molecular mechanism for the regulation of protein kinase B/Akt by hydrophobic motif phosphorylation. Mol Cell 9: 1227-1240, 2002、Scheid MP, Marignani PA and Woodgett JR: Multiple phosphoinositide 3-kinase-dependent steps in activation of protein kinase B. Mol Cell Biol 22: 6247-6260, 2002）。それゆえ、まず抗Ａｋｔ抗体および抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）抗体でウエスタンブロッティングを行って、高レベルのＲＱＣＤ１発現を示した（図９Ｃ）乳癌細胞ＢＴ−５４９、ＨＢＣ−５、およびＨＣＣ−１９３７におけるＡｋｔ活性状態を調べた。その結果は、血清刺激のない場合でさえも全ての乳癌細胞においてＳｅｒ  ４７３でのＡｋｔの高レベルのリン酸化が明確に観察されたのに対し、血清枯渇状態では正常腺管上皮細胞に由来するＭＣＦ−１０Ａにおいてそのリン酸化が消失したことを示し（図１０Ａ）、このことは、これらの乳癌細胞においてＡｋｔが構成的に活性化されることを示していた。次に、Ａｋｔリン酸化レベルに対するｓｉＲＮＡ処理によるＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２発現のノックダウン効果を詳しく調べたところ、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２のいずれかに対する各ｓｉＲＮＡによるＢＴ−５４９細胞への処理が、総Ａｋｔタンパク質レベルを改変することなくＡｋｔのリン酸化レベルの有意な低減を引き起こすことが見出された（図１０Ｂ、１１Ｄ）。他の乳癌細胞株ＨＢＣ−５およびＨＣＣ−１９３７においてもまた、ＲＱＣＤ１−ｓｉＲＮＡ処理により、Ａｋｔ活性に対する類似の効果が観察された（図１０Ｃ、１１Ｄ）。
【０３４５】
ＩＩＩ．  考察
乳癌治療のための分子標的薬はこの２０年間、患者の死亡率の低減およびＱＯＬの改善に寄与してきた（Parkin DM, Bray F, Ferlay J: Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin 55: 74-108, 2005、Veronesi U, Boyle P, Goldhirsch A, Orecchia R, Viale G: Breast cancer. Lancet 365: 1727-1741, 2005）。しかしながら、現在利用可能な治療に対して良好な応答を示す患者の割合は、特に進行期の患者またはトリプルネガティブ乳癌を有する患者では依然として限られている（Johannes B, Esther Z and Axel U, Nat Med 7: 548-552, 2001）。薬物開発のための分子標的の同定に向けて、ＲＮＡ干渉系によるノックダウン効果をスクリーニングする実験と組み合わせて、乳癌細胞において特異的に上方制御されていた遺伝子を選択するために臨床乳癌細胞８１例（Nishidate T, Katagiri T, Lin ML et al: Genome-wide gene-expression profiles of breast-cancer cells purified with laser microbeam microdissection: identification of genes associated with progression and metastasis. Int J Oncol 25: 797-819, 2004）および正常ヒト組織２９例（Saito-Hisaminato A, Katagiri T, Kakiuchi S, Nakamura T, Tsunoda T and Nakamura Y., DNA Res 9: 35-45, 2002）の詳細な遺伝子発現プロファイルを分析した。この手法に基づいて、ＲＱＣＤ１は臨床乳癌試料および乳癌細胞株において高い頻度で上方制御されることが見出され、一方、精巣を除く正常ヒト組織においてその発現は非常に低かった。これらの結果から、ＲＱＣＤ１は新規の癌-精巣抗原として示された。さらに、ＲＱＣＤ１発現のノックダウンは乳癌細胞の有意な成長抑制をもたらすことが実証され、そして、ＨＥＫ２９３細胞へのＲＱＣＤ１の導入が細胞成長を有意に促進したことは、ＲＱＣＤ１が乳癌用の抗癌剤または癌ペプチドワクチンの開発のための有益な標的として役立ちうることを意味している。
【０３４６】
真核生物の間で進化的に保存されているタンパク質ＲＱＣＤ１はまず、窒素飢餓分裂酵母において分化の調節に不可欠な因子として同定され；ＲＱＣＤ１を欠く酵母細胞は窒素飢餓状態で培養された場合、生殖不能であることが報告された（Okazaki N, Okazaki K, Watanabe Y, Kato-Hayashi M, Yamamoto M and Okayama H, Mol Cell Biol 18: 887-895, 1998）。さらに、マウスのＲＱＣＤ１相同体は、レチノイン酸誘導性分化を媒介する転写補因子として報告され、造血細胞の発達に関与する可能性のあるエリスロポエチン応答性の遺伝子であるとも報告された（Hiroi N, Ito T, Yamamoto H, Ochiya T, Jinno S, Okayama H., EMBO J 21: 5235-5244, 2002、Gregory RC, Lord KA, Panek LB, Gaines P, Dillon SB and Wojchowski DM: Subtraction cloning and initial characterization of novel Epo-immediate response genes. Cytokine 12: 845-857, 2000）。しかしながら、腫瘍形成におけるその生物学的役割は詳しく調べられていないので、ＲＱＣＤ１の相互作用タンパク質が探索され、ＩＧＦ−１受容体に結び付けられることが報告されていたＧＩＧＹＦ１およびＧＩＧＹＦ２の両タンパク質とのＲＱＣＤ１の相互作用が同定された（Giovannone B, Lee E, Laviola L, Giorgino F, Cleveland KA and Smith RJ, J Biol Chem 34: 31564-31573, 2003）。ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２遺伝子が過剰発現された乳癌細胞において、活性化のマーカーであることが知られている、Ｓｅｒ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化レベル（Alessi DR, Andjelkovic M, Caudwell B, Cron P, Morrice N, Cohen P and Hemmings BA, EMBO J 15: 6541-6551, 1996; Yang J, Cron P, Thompson V, Good VM, Hess D, Hemmings BA and Barford D, Mol Cell 9: 1227-1240, 2002; Scheid MP, Marignani PA and Woodgett JR: Multiple phosphoinositide 3-kinase-dependent steps in activation of protein kinase B. Mol Cell Biol 22: 6247-6260, 2002）の低減をもたらしたｓｉＲＮＡ処理によって、ＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、またはＧＩＧＹＦ２のノックダウンがさらに確認された。
【０３４７】
産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションおよびゲノム全域のｃＤＮＡマイクロアレイの組み合わせを用いた、本明細書に記載の癌の遺伝子発現解析により、癌の予防および治療法に対する標的として、特定の遺伝子が同定された。これらの差次的に発現された遺伝子、すなわちＲＱＣＤ１、ＧＩＧＹＦ１、およびＧＩＧＹＦ２の発現に基づいて、本発明は癌、特に乳癌を同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
【０３４８】
本明細書において提供されるデータは、癌の包括的な理解の一助となり、新規な診断戦略の開発を促進し、かつ治療的薬物および予防的物質に対する分子標的の同定の糸口を提供する。このような情報は、腫瘍形成をより深く理解するのに寄与し、かつ癌を診断し、治療し、かつ最終的には予防するための新規な戦略を開発するための指標を提供する。
【０３４９】
本明細書において引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により組み入れられる。
【０３５０】
さらに、特定の態様を参照して詳細に本発明を説明したが、前述の記載は本質的に例示的かつ説明的であり、本発明およびその好ましい態様を例示すると意図されることを理解すべきである。規定どおりの実験法によって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正をその中で実施できることを、当業者は容易に認識すると考えられる。したがって本発明は、上記の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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