(57)【要約】一態様において、本開示により、標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマー；およびコンジュゲート枠組構造に結合された２つ以上の個別の親和性リガンドを含むコンジュゲートを含む架橋物質体であって、該２つ以上の親和性リガンドは、該アプタマーとの結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート上の親和性リガンドと該アプタマー間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、架橋物質体を提供する。このような物質体は、所望の濃度の標的分子に応答した量のコンジュゲートを放出するように設計される。また、最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートは、薬物および／または検出可能な標識を含むものであってもよい。薬物、検出可能な標識および親和性リガンドは、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマー；および
コンジュゲート枠組構造に結合された２つ以上の個別の親和性リガンドを含むコンジュゲートを含む架橋物質体であって、
該２つ以上の親和性リガンドは、該アプタマーとの結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート上の親和性リガンドと該アプタマー間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、
架橋物質体。
【請求項２】
該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された薬物を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項３】
該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された検出可能な標識を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項４】
標的分子がグルコースである、請求項１に記載の物質体。
【請求項５】
該コンジュゲートの親和性リガンドが糖質を含む、請求項４に記載の物質体。
【請求項６】
該コンジュゲートの親和性リガンドが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースから選択される糖質を含む、請求項５に記載の物質体。
【請求項７】
該コンジュゲートの親和性リガンドがビマンノース（ｂｉｍｍａｎｏｓｅ）またはトリマンノースを含む、請求項５に記載の物質体。
【請求項８】
該コンジュゲートの親和性リガンドが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含む、請求項５に記載の物質体。
【請求項９】
該コンジュゲートの親和性リガンドが糖質とリンカーを含み、該糖が該リンカーにアノマー炭素を介して共有結合されている、請求項５に記載の物質体。
【請求項１０】
アノマー炭素がαアノマーである、請求項９に記載の物質体。
【請求項１１】
１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、標的分子を含まない３７ＣでｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に入れたとき不溶性である、請求項１に記載の物質体。
【請求項１２】
該コンジュゲートが該物質体から、標的分子の濃度に依存性の速度で、または標的分子の濃度に依存性の程度まで放出される、請求項１１に記載の物質体。
【請求項１３】
標的分子がグルコースである、請求項１２に記載の物質体。
【請求項１４】
５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、３７Ｃで１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含むｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、実質的に不溶性のままである、請求項１３に記載の物質体。
【請求項１５】
５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、３７Ｃで１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含むｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、１０％未満の物質体が溶解する、請求項１３に記載の物質体。
【請求項１６】
５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、３７Ｃで１５０ｍＭのＮａＣｌおよび４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含むｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、少なくとも５０％の物質体が溶解する、請求項１３に記載の物質体。
【請求項１７】
５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、３７Ｃで１５０ｍＭのＮａＣｌおよび４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含むｐＨ７の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に６時間入れたとき、１００％の物質体が溶解する、請求項１３に記載の物質体。
【請求項１８】
該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された薬物を含む、請求項１３に記載の物質体。
【請求項１９】
薬物が抗糖尿病薬である、請求項１８に記載の物質体。
【請求項２０】
薬物がインスリン分子である、請求項１８に記載の物質体。
【請求項２１】
薬物がインスリン感受性改善薬である、請求項１８に記載の物質体。
【請求項２２】
薬物がインスリン分泌促進薬（ｓｅｃｒｅｔａｔｏｇｕｅ）である、請求項１８に記載の物質体。
【請求項２３】
コンジュゲート枠組構造がポリマー系である、請求項１に記載の物質体。
【請求項２４】
コンジュゲート枠組構造がポリマー系でない、請求項１に記載の物質体。
【請求項２５】
コンジュゲート枠組構造が分岐型または超分岐型である、請求項１に記載の物質体。
【請求項２６】
コンジュゲートの枠組構造が多糖を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項２７】
該コンジュゲートが、式：
【化１】
2012516156.tif 000067
（式中、
Ｒｘは、水素または任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルであり；
Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１〜１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の１、２、３、４または５個のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される１つ以上の基で置き換えられており、式中、Ｒａは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または適当なアミノ保護基であり、Ｒｂは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり；
存在するＸ１は各々、独立して、−ＯＲＣまたは−Ｎ（Ｒｄ）２であり、式中、Ｒｃは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基、または親和性リガンドであり、各Ｒｄは、独立して、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なアミノ保護基、または親和性リガンドであるが、存在するＸ１の少なくとも２つは親和性リガンドを含むものとし；
Ｙ１は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲｅまたは−ＳＲｅであり、式中、Ｒｅは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり；
ｒは、５〜２５（両端を含む）の整数であり；
Ｗ１は、薬物または検出可能な標識であり；
【化２】
2012516156.tif 000068
は、共有結合性の単結合または二重結合に相当する）
の構造を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項２８】
該コンジュゲートが、式：
【化３】
2012516156.tif 000069
（式中：
存在する[(Ａ−Ｔ)]は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し；
存在する(Ａ−Ｔ)は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し；
存在するＡ−Ｔ
は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される任意選択で置換されている基であり；
存在するＴは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の任意選択で置換されているＣ１〜３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており；
存在するＲは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
存在するＸは各々、独立して、親和性リガンドであり；
存在するＬＢは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＸとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり；
存在するＷは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
存在するＬＤは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＷとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
ｋは、２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定し；
ｑは、１〜４（両端を含む）の整数であり；
ｋ＋ｑは、３〜１２（両端を含む）の整数であり；
存在するｐは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
存在するｎは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
存在するｍは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
存在するｖは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎは≧１であり、存在する少なくとも１つのｖは≧１であるものとする）
の構造を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項２９】
ＸおよびＷがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が１０，０００Ｄａ未満である、請求項２７または２８に記載の物質体。
【請求項３０】
ＸおよびＷがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が約３００〜約５，０００Ｄａの範囲である、請求項２９に記載の物質体。
【請求項３１】
ＸおよびＷがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が約３００〜約８００Ｄａの範囲である、請求項２９に記載の物質体。
【請求項３２】
存在するＸの少なくとも２つが糖質を含む親和性リガンドを含む、請求項２９に記載の物質体。
【請求項３３】
存在するＸの少なくとも２つが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースからなる群より選択される糖質を含む親和性リガンドを含む、請求項２９に記載の物質体。
【請求項３４】
存在するＸの少なくとも２つが、ビマンノース（ｂｉｍｍａｎｏｓｅ）またはトリマンノースを含む親和性リガンドを含む、請求項２９に記載の物質体。
【請求項３５】
存在するＸの少なくとも２つが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）およびアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）から選択される親和性リガンドを含む、請求項２９に記載の物質体。
【請求項３６】
存在するＸの少なくとも２つが、糖質とリンカーを含む親和性リガンドを含み、該糖が該リンカーにアノマー炭素を介して共有結合されている、請求項２９に記載の物質体。
【請求項３７】
アノマー炭素がαアノマーである、請求項３６に記載の物質体。
【請求項３８】
多価アプタマーが、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項４に記載の物質体。
【請求項３９】
多価アプタマーが、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０個の連続するヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む、請求項４に記載の物質体。
【請求項４０】
多価アプタマーが、配列番号８、９または１０のヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の物質体。
【請求項４１】
多価アプタマーが、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む、請求項４に記載の物質体。
【請求項４２】
多価アプタマーが、配列番号８、９または１０と少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む、請求項４に記載の物質体。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の物質体を患者に投与することを含む方法。
【請求項４４】
該物質体が皮下注射によって投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
該コンジュゲートが、該枠組構造に結合されたインスリン分子を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
患者が糖尿病である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該物質体が、インスリン分子の平均日用量が１０〜２００Ｕの範囲となるように投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該物質体が毎日投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該物質体が毎月投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
該物質体が毎月投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
患者がインスリン感受性改善薬も受けている、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
患者がインスリン分泌促進薬も受けている、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
（Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーであって、第１の標識を含む多価ポリヌクレオチドアプタマーと、
（ｂ）親和性リガンドおよび第２の標識を含むコンジュゲートと、
を混合する工程
ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると、測定可能な応答をもたらす；
（ＩＩ）試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと該コンジュゲートの混合物に曝露する工程、ここで、
（ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、該コンジュゲートは該ポリヌクレオチドアプタマーと、該ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって架橋物質体を形成し、測定可能な応答をもたらし、
（ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが該コンジュゲートと、該ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、該架橋物質体の形成が抑止されるため応答が低減される；ならびに
（ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程
を含む方法。
【請求項５４】
（Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーと、
（ｂ）親和性リガンドおよび第１の標識を含む第１の分子群と、
（ｃ）親和性リガンドおよび第２の標識を含む第２の分子群と、
を混合する工程、
ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらす、
（ＩＩ）試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと第１の分子群および第２の分子群との混合物に曝露する工程、ここで、
（ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、第１の分子群および第２の分子群の構成員は、該多価ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって近接し、結合複合体および測定可能な応答をもたらし、
（ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが、第１および第２の分子と、該多価ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、前記結合複合体の形成が少なくなるため応答が低減される；ならびに
（ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程
を含む方法。
【請求項５５】
（Ｉ）（ａ）複数の親和性リガンドを含むコンジュゲートと、
（ｂ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマー
を準備する工程；
（ＩＩ）該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマーを混合する工程、
ここで、得られた混合物の粘性は、該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマー間の結合によるものである；
（ＩＩＩ）該混合物を、グルコースを含む試料と接触させる工程、
これにより、該コンジュゲートが該ポリヌクレオチドアプタマーから外れ、濃度依存性の粘性の低下が引き起こされる；ならびに
（ＩＶ）生じた粘性の変化を検出し、任意選択で該変化を測定し、試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府実施許諾権
米国政府は、本発明において支払い済みの実施許諾を有し、米国国立衛生研究所によって与えられたＤＫ０７２７７４およびＤＫ０７７２９２の条件によって示される合理的な条件で他者に実施許諾を行なうことを特許権所有者に要求する権利を限定された状況において有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００９年１月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／１４７，８７８号、２００９年３月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／１５９，６４３号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，１０７号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，０５３号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，０９２号、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１６２，１０５号、２００９年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／１６３，０８４号、２００９年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／２１９，８９７号、２００９年７月７日に出願された米国特許仮出願第６１／２２３，５７２号、および２００９年１０月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／２５２，８５７号に対する優先権を主張するものであり、これらの内容は各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
先行技術（例えば、Ｓｅａｒｓに対する米国特許第４，１４５，４１０号、これには、酵素的に不安定なカプセル剤からの薬物放出が記載されている）において知られた「制御放出」薬物送達系の大部分は、薬物を、ヒト体内に存在する分子インジケータ（例えば、代謝産物）の量に正比例する間隔および濃度で放出することができない。したがって、このような先行技術の系での薬物の送達または放出は、文字通りの「制御された」ものでなく、外的または内的要因とは無関係の単なる低速放出である。
【０００４】
インスリン注射による真性糖尿病の処置は、インスリンの制御されていない低速放出が望ましくない周知かつ充分研究された一例である。実際、ホルモンの単純な補充は、この疾患と関連する病的続発症の予防に充分でないことが明らかである。このような続発症の発生は、患者体内での血中グルコースの濃度変動に合わせた外因性インスリンを提供ができていないことを反映していると考えられる。この問題を解決するため、より生理学的なインスリン送達系を開発するためのいくつかの生物学的なバイオエンジニアリングアプローチが提案されている（例えば、Ｂｒｏｗｎｌｅｅらに対する米国特許第４，３４８，３８７号；Ｔａｙｌｏｒらに対する米国特許第５，８３０，５０６号、同第５，９０２，６０３号、および同第６，４１０，０５３号、ならびにＺｉｏｎに対する米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９号らを参照のこと）。
【０００５】
Ｚｉｏｎの系の一部の特定の実施形態では、多価のグルコース結合分子を、グリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートと合わせる。このグリコシル化ポリマーは多数の糖結合基を含み、グルコース結合分子の存在下で不溶性のヒドロゲルまたは粒子を形成する。このゲルは、グルコース濃度の増大に応答してグリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートを放出する。Ｚｉｏｎの系では、例示的な多価グルコース結合分子としてレクチンコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）の使用が示されている。残念ながら、Ｃｏｎ  Ａおよびその他の容易に入手可能なレクチンの多くは、リンパ球の増殖を刺激する可能性を有する。特定の型のリンパ球の表面上の炭水化物受容体に結合することにより、このようないわゆる「マイトジェン」レクチンは、リンパ球の有糸分裂を誘導し、それによりリンパ球の増殖を引き起こし得る可能性がある。Ｃｏｎ  Ａを含むほとんどのマイトジェンレクチンは、選択的Ｔ細胞マイトジェンである。いくつかのレクチンは選択性が低く、Ｔ細胞とＢ細胞の両方を刺激する。マイトジェンレクチンに対する局所的または全身性のインビボ曝露により、炎症、細胞傷害、マクロファージ消化、およびアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）がもたらされ得る。また、植物レクチンは、特に免疫原性であり、高力価の抗レクチン特異的抗体の生成をもたらすことがわかっている。したがって、マイトジェンレクチンは、その放出が抑制されるように充分配慮しなければ、天然形態ではインビボでの方法およびデバイスに使用できないことは認識されよう。例えば、米国特許第５，８３０，５０６号において、Ｔａｙｌｏｒは、Ｃｏｎ  Ａの使用に関わる毒性リスクを明らかにし、グルコースとインスリン分子がデバイス内外で自由に拡散することも同時に求められる薬物送達デバイスにＣｏｎ  Ａを含めることの重要性と困難さを強調している。
【０００６】
レクチンのこのようなおよび他のインビボ使用に関わるリスクと困難さは、代替的な多価グルコース結合分子が提供されれば、有意に減弱され得よう。しかしながら、好適な代替物は、有用な濃度の標的分子に応答するＺｉｏｎの系において、架橋剤としての機能も果たすことができるものでなければならない。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本開示により、標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマーと；およびコンジュゲート枠組構造に結合された２つ以上の個別の親和性リガンドを含むコンジュゲートとを含む架橋物質体であって、該２つ以上の親和性リガンドは、該アプタマーとの結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート上の親和性リガンドと該アプタマー間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、架橋物質体を提供する。このような物質体は、所望の濃度の標的分子に応答した量のコンジュゲートを放出するように設計される。最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートはまた、薬物および／または検出可能な標識も含む。薬物、検出可能な標識および親和性リガンドは、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。また、本開示により、このような物質体の使用方法およびこのような物質体の作製方法を提供する。別の態様において、本開示により、レクチン（Ｃｏｎ  Ａなど）の代わりにグルコース応答性物質体に使用するための例示的なアプタマーを提供する。
【０００８】
定義
本明細書全体を通して用いる具体的な官能基、化学用語および一般用語の定義を、より詳細に以下に記載する。本発明の解釈上、化学元素は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、第７５版の内表紙記載の元素周期表（ＣＡＳ版）に従って特定されるものであり、具体的な官能基は上記文献に概ね定義されている。さらに、有機化学の一般原則ならびに具体的な官能性部分および反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、１９９９；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１；Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８７に記載されている。
【０００９】
アシル−本明細書で用いる場合、用語「アシル」は、一般式−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＸ１）２、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＸ１）２、および−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ（ＲＸ１）、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＳＲＸ１、および−Ｃ（＝ＮＲＸ１）Ｎ（ＲＸ１）２（式中、ＲＸ１は水素；ハロゲン；置換もしくは非置換のヒドロキシル；置換もしくは非置換のチオール；置換もしくは非置換のアミノ；置換もしくは非置換のアシル；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐の脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のヘテロ脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のアルキル；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のアルケニル；置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ−もしくはジ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジヘテロ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、モノ−もしくはジヘテロアルキルアミノ、モノ−もしくはジアリールアミノ、またはモノ−もしくはジヘテロアリールアミノであるか；または２つのＲＸ１基が一緒になって５〜６員の複素環式の環を形成している）を有する基をいう。例示的なアシル基としては、アルデヒド（−ＣＨＯ）、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、ケトン、アシルハライド、エステル、アミド、イミン、カーボネート、カルバメート、および尿素が挙げられる。アシル置換基としては、限定されないが、安定な部分（例えば、脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環式、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど、これらは各々、さらに置換されていてもよく、そうでなくてもよい）の形成をもたらす本明細書に記載の任意の置換基が挙げられる。
【００１０】
脂肪族−本明細書で用いる場合、用語「脂肪族」または「脂肪族基」は、直鎖（すなわち、非分岐）、分岐または環式（「炭素環式」）であり得、完全飽和であってもよく、または１つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族ではない、任意選択で置換されている炭化水素部分を表す。特に記載のない限り、脂肪族基は１〜１２個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含むものであり、また他の実施形態では、脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含む。好適な脂肪族基としては、限定されないが、線状または分岐のアルキル、アルケニルおよびアルキニル基、ならびにそのハイブリッド（（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルなど）が挙げられる。
【００１１】
アルケニル−本明細書で用いる場合、用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される、任意選択で置換されている一価の基を表す。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜６個の炭素原子を含む。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜５個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、２〜４個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルケニル基は２〜３個の炭素原子を含む。アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられる。
【００１２】
アルキル−本明細書で用いる場合、用語「アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含む脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される、任意選択で置換されている直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素原子団をいう。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルキル基は１〜５個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルキル基は１〜４個の炭素原子を含む。さらに他の実施形態では、アルキル基は１〜３個の炭素原子を含む。また別の実施形態では、アルキル基は１〜２個の炭素を含む。アルキル原子団の例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ドデシルなどが挙げられる。
【００１３】
アルキニル−本明細書で用いる場合、用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族部分から１個の水素原子の除去によって誘導される任意選択で置換されている一価の基をいう。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜６個の炭素原子を含む。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜５個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は２〜４個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルキニル基は２〜３個の炭素原子を含む。代表的なアルキニル基としては、限定されないが、エチニル、２−プロピニル（プロパギル）、１−プロピニルなどが挙げられる。
【００１４】
アリール−本明細書で用いる場合、単独または、「アラルキル」、「アラルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」などのより大きな部分の一部として使用される用語「アリール」は、合計５〜１０個の環構成員を有し、系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、系内の各環は３〜７個の環構成員を含む、任意選択で置換されている単環式および二環式の環系をいう。用語「アリール」は、用語「アリール環」と互換的に用いていることがあり得る。本発明の一部の特定の実施形態では、「アリール」は、限定されないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどが挙げられ、１つ以上の置換基を有していてもよい芳香族環系をいう。
【００１５】
アリールアルキル−本明細書で用いる場合、用語「アリールアルキル」は、アリール基（例えば、芳香族またはヘテロ芳香族基）で置換されているアルキル基をいう。
【００１６】
二価の炭化水素鎖−本明細書で用いる場合、用語「二価の炭化水素鎖」（「二価のアルキレン基」ともいう）は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）Ｚ−であり、式中、ｚは、１〜３０、１〜２０、１〜１２、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、または２〜３の正の整数である。好適な置換基としては、置換されている脂肪族基について後述するものが挙げられる。
【００１７】
カルボニル−本明細書で用いる場合、用語「カルボニル」は、炭素−酸素二重結合を含む一価または二価の部分をいう。カルボニル基の非限定的な例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、アシルハライド、無水物、尿素、カルバメート、カーボネート、チオエステル、ラクトン、ラクタム、ヒドロキサメート、イソシアネート、およびクロロホルメートが挙げられる。
【００１８】
脂環式−本明細書で用いる場合、用語「脂環式」、「炭素環」、または「炭素環式」は、単独またはより大きな部分の一部として使用され、３〜１０員を有する本明細書に記載の、任意選択で置換されている飽和または部分不飽和の、環式の脂肪族の単環式または二環式の環系をいう。脂環式基としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、およびシクロオクタジエニルが挙げられる。一部の実施形態では、シクロアルキルは３〜６個の炭素を有する。
【００１９】
ハロゲン−本明細書で用いる場合、用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ，−Ｃｌ）、臭素（ブロモ，−Ｂｒ）、およびヨウ素（ヨード，−Ｉ）から選択される原子をいう。
【００２０】
ヘテロ脂肪族−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロ脂肪族」または「ヘテロ脂肪族基」は、炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有し、直鎖（すなわち、非分岐）であっても、分岐であっても環式（「複素環式」）であってもよく、完全飽和であってもよく、１つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族ではない、任意選択で置換されている炭化水素部分を表す。特に記載のない限り、ヘテロ脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含み、１〜３個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。一部の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含み、１〜２個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。また他の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含み、１個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。好適なヘテロ脂肪族基としては、限定されないが、線状または分岐のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、およびヘテロアルキニル基が挙げられる。
【００２１】
ヘテロアラルキル−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されているアルキル基をいい、アルキル部分およびヘテロアリール部分は、独立して、任意選択で置換されている。
【００２２】
ヘテロアリール−本明細書で用いる場合、単独または、例えば、「ヘテロアラルキル」もしくは「ヘテロアラルコキシ」など、より大きな部分の一部として使用される用語「ヘテロアリール」は、５〜１０個の環内原子、好ましくは５、６または９個の環内原子を有し；環式アレイ内で共有される６、１０または１４個のπ原子を有し；炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する、任意選択で置換されている基をいう。ヘテロアリール基としては、限定されないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、およびプテリジニルが挙げられる。また、用語「ヘテロアリール」および「ヘテロアル（ｈｅｔｅｒｏａｒ−）」には、本明細書で用いる場合、ヘテロ芳香族環が１つ以上のアリール、炭素環式または複素環式の環に縮合され、その結合原子団または結合点が該ヘテロ芳香族環上にある基が包含される。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、およびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。ヘテロアリール基は単環式であっても二環式であってもよい。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、または「ヘテロ芳香族」（これらの用語はいずれも任意選択で置換されている環を包含する）と互換的に用いることがある。
【００２３】
ヘテロ原子−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロ原子」は窒素、酸素またはイオウをいい、窒素またはイオウの任意の酸化形態、および塩基性窒素の任意の第４級化形態を包含する。また、用語「窒素」は、置換されている窒素を包含する。
【００２４】
複素環式−本明細書で用いる場合、用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式の原子団」、および「複素環式の環」は互換的に用い、任意選択で置換されている、安定な５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式部分であって、飽和または部分不飽和のいずれかであり、炭素原子に加えて１つ以上の上記に定義したヘテロ原子を有するものをいう。複素環式の環は、その懸垂基に、安定な構造がもたらされる任意のヘテロ原子または炭素原子で結合され得、任意の環内原子は任意選択で置換されていてもよい。かかる飽和または部分不飽和の複素環式の原子団の例としては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、およびキヌクリジニルが挙げられる。用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、および「複素環式の原子団」は、本明細書において互換的に用い、また、ヘテロシクリル環が１つ以上のアリール、ヘテロアリールまたは炭素環式の環（インドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルなど）に縮合されており、その結合原子団または結合点が該ヘテロシクリル環上にある基を包含する。ヘテロシクリル基は単環式であっても二環式であってもよい。用語「ヘテロシクリルアルキル」はヘテロシクリルで置換されているアルキル基をいい、アルキル部分およびヘテロシクリル部分は、独立して、任意選択で置換されている。
【００２５】
不飽和−本明細書で用いる場合、用語「不飽和」は、ある部分が１つ以上の二重結合または三重結合を有することを意味する。
【００２６】
部分不飽和−本明細書で用いる場合、用語「部分不飽和」は、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む環部分をいう。用語「部分不飽和」は、多数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書で定義したアリール部分またはヘテロアリール部分を含むことは意図しない。
【００２７】
任意選択で置換されている（置換されていてもよい）−本明細書に記載のように、本発明の化合物は、「任意選択で置換されている」部分を含んでいてもよい。一般に、用語「置換されている」は、前に用語「任意選択で」があってもなくても、表示された部分の１つ以上の水素が適当な置換基で置き換えられていることを意味する。特に記載のない限り、「任意選択で置換されている」基は、該基の各置換可能な位置に適当な置換基を有していてもよく、任意の所与の構造内の１つより多くの位置が、指定された群から選択される１つより多くの置換基で置換され得る場合、該置換基は、１つ１つの位置において同じであるか、異なるかのいずれかであり得る。本発明で想定される置換基の組合せは、好ましくは、安定な、または化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものである。用語「安定な」は、本明細書で用いる場合、生成、検出、ならびに一部の特定の実施形態では回収、精製、および本明細書に開示した目的の１つ以上のための使用を可能にする条件に供されたときに、実質的に改変されない化合物をいう。
【００２８】
「任意選択で置換されている」基の置換可能な炭素原子上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０〜４Ｒ°；−（ＣＨ２）０〜４ＯＲ°；−Ｏ−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０〜４ＣＨ（ＯＲｏ）２；−（ＣＨ２）０〜４ＳＲ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｐｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−（ＣＨ２）０〜４Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ°）２；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（Ｓ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ°３；−（ＣＨ２）０〜４ＯＣ（Ｏ）Ｒ°；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０〜４ＳＲ、−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０〜４ＳＣ（Ｏ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ°；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°、−（ＣＨ２）０〜４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ°）Ｒ°；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（ＮＯＲ°）Ｒ°；−（ＣＨ２）０〜４ＳＳＲ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）２Ｒ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ°；−（ＣＨ２）０〜４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｎ（ＯＲ°）Ｒ°；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ°２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｐ（Ｏ）Ｒ°２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ°２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ°）２；ＳｉＲ°３；−（Ｃ１〜４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ°）２；または−（Ｃ１〜４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ°）２であり、式中、各Ｒ°は、以下に定義するとおりに置換されていてもよく、独立して、水素、Ｃ１〜６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、あるいは、上記の定義に関わらず、独立して存在する２つのＲ°が、その介在原子（１つもしくは複数）を一緒になって、独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有し、以下に定義するとおりに置換されていてもよい、３〜１２員の飽和、部分不飽和またはアリール単環式または二環式の環を形成している。
【００２９】
Ｒ°（または２つの独立して存在するＲ°がその介在原子と一緒になって形成される環）上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０〜２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０〜２ＯＨ、−（ＣＨ２）０〜２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＣＨ（ＯＲ●）２；−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＳＨ、−（ＣＨ２）０〜２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０〜２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＮＲ●２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１〜４直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または−ＳＳＲ●であり、式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−０（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。Ｒ°の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、＝Ｏおよび＝Ｓが挙げられる。
【００３０】
「任意選択で置換されている」基の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、以下のもの：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）０Ｒ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝Ｎ０Ｒ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２〜３０−、または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２〜３Ｓ−が挙げられ、ここで、独立して存在するＲ＊は各々、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。「任意選択で置換されている」基の置換可能なビシナル炭素に結合された好適な二価の置換基としては：−０（ＣＲ＊２）２〜３Ｏ−（式中、独立して存在するＲ＊は各々、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される）が挙げられる。
【００３１】
Ｒ＊の脂肪族基上の好適な置換基は、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２（式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環である）である。
【００３２】
「任意選択で置換されている」基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、−Ｒ†、ＮＲ†２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ†２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ†２、または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（０）２Ｒ†が挙げられ；式中、各Ｒ†は、独立して、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、非置換の−ＯＰｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、あるいは、上記の定義に関わらず、独立して存在する２つのＲ†が、その介在原子（１つもしくは複数）と一緒になって、独立して窒素、酸素またはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の３〜１２員の飽和、部分不飽和またはアリールの単環式または二環式の環を形成している。
【００３３】
Ｒ†の脂肪族基上の好適な置換基は、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２（式中、各Ｒ●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環である）である。
【００３４】
好適な保護基−本明細書で用いる場合、用語「適当な保護基」は、化合物内の位置に応じたアミノ保護基またはヒドロキシル保護基をいい、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９に詳細に記載されているものが挙げられる。
【００３５】
好適なアミノ保護基としては、メチルカルバメート、エチルカルバメート、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェンアシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニルｙｌ）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジルカルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンゾイソオキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、フェノチアジニル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、ｔ−アミル、チオカルバミン酸Ｓ−ベンジルカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニル（ｂｏｒｙｎｌ）カルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリメチルベンジル、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン（ｐｙｒｏｏｌｉｎ）−３−イル）アミン、第４級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタカルボニルクロム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミデート、ジベンジルホスホルアミデート、ジフェニルホスホルアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Νｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Νｐｙｓ）、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’、８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤΝＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、ならびにフェンアシルスルホンアミドが挙げられる。
【００３６】
好適なヒドロキシル保護基としては、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−Ａ０Ｍ）、グアヤコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェンアシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾル−１−イル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシ���ル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（メシトエート）、アルキルメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカーボネート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカーボネート、アルキルビニルカーボネートアルキルアリルカーボネート、アルキルｐ−ニトロフェニルカーボネート、アルキルベンジルカーボネート、アルキルｐ−メトキシベンジルカーボネート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルｐ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルＳ−ベンジルチオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチルカーボネート、メチルジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシネート（ｓｕｃｃｉｎｏａｔｅ）、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ナイトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート、およびトシレート（Ｔｓ）が挙げられる。１，２−または１，３−ジオールを保護するには、保護基として、メチレンアセタール、エチリデンアセタール、１−ｔ−ブチルエチリデンケタール、１−フェニルエチリデンケタール、（４−メトキシフェニル）エチリデンアセタール、２，２，２−トリクロロエチリデンア��タール、アセトニド、シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、２，４−ジメトキシベンジリデンケタール、３，４−ジメトキシベンジリデンアセタール、２−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、１−メトキシエチリデンオルトエステル、１−エトキシエチリジンオルトエステル、１，２−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチリデン誘導体、α−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体、２−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−ｔ−ブチルシリレン基（ＤＴＢＳ）、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体（ＴＩＰＤＳ）、テトラ−ｔ−ブトキシジシロキサン−１，３−ジイリデン誘導体（ＴＢＤＳ）、環式のカーボネート、環式のボロネート、エチルボロネート、およびフェニルボロネートが挙げられる。
【００３７】
アプタマー−本明細書で用いる場合、用語「アプタマー」または「ポリヌクレオチドアプタマー」は、標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチドをいう。一般に、アプタマーは、検出可能なレベルで標的分子と会合するが、同様の条件下で、無関連な分子存在体（例えば、標的分子と共通の構造的特徴を共有していない分子）とは検出可能に会合しない場合、標的分子に「特異的に結合する」といわれる。標的分子とアプタマー間の特異的会合は、典型的には、アプタマーによって認識されるエピトープなどの、標的分子の特定の構造的特徴の有無に依存する。一般的に、アプタマーがエピトープＡに特異的である場合、遊離の標識エピトープＡおよびこれに対するアプタマーの両方を含む反応液中におけるエピトープＡ含有分子の存在または遊離の非標識エピトープＡの存在により、アプタマーに結合する標識エピトープＡの量は低減される。一般に、特異性は絶対的である必要はないことが理解されよう。実際、アプタマーが、標的エピトープに加えて他のエピトープと交差反応することがあり得ることは当該技術分野で周知である。かかる交差反応性は、アプタマーが使用される適用用途によっては許容される場合があり得る。したがって、アプタマーの特異性の度合は、これが使用されている状況に依存する。また、特異性は、非標的分子に対するアプタマーの親和性対標的分子に対するアプタマーの親和性など、さらなる要素との関連において評価され得ることも理解されよう。
【００３８】
生物分解性の−本明細書で用いる場合、用語「生物分解性の」は、生理学的条件下またはエンドソーム条件下で分解される（すなわち、その共有結合性の構造の少なくとも一部が失われる）分子をいう。生物分解性の分子は、必ずしも加水分解的に分解可能である必要はなく、分解に酵素の作用を必要としてもよい。
【００３９】
生体分子−本明細書で用いる場合、用語「生体分子」は、天然に存在するものであっても人工的に作出されたものであっても（例えば、合成もしくは組換えによる方法）、細胞内および組織内に一般的に見られる分子（例えば、ポリペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、多糖類、糖類、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド類、代謝産物など）をいう。生体分子の具体的な類型としては、限定されないが、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞応答修飾因子（増殖因子および化学走化性因子など）、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられる。
【００４０】
薬物−本明細書で用いる場合、用語「薬物」は、生物学的事象を改変するか、阻害するか、活性化させるか、あるいは影響を及ぼす小分子または生体分子をいう。例えば、薬物としては、限定されないが、抗ＡＩＤＳ物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿物質、免疫抑制薬、抗ウイルス物質、酵素阻害薬、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン薬、潤滑薬（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、精神安定薬、鎮痙薬、筋弛緩薬ならびに抗パーキンソン物質、鎮痙薬および筋肉収縮剤（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔａｎｔ）（チャネル遮断薬、縮瞳薬および抗コリン作用薬など）、抗緑内障化合物、抗寄生虫および／または抗原虫化合物、細胞−細胞外マトリックス相互作用の調節薬（細胞増殖阻害薬および抗接着分子など）、血管拡張剤、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の合成阻害薬、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管形成因子、抗分泌因子、抗凝固薬および／または抗血栓剤、局所麻酔薬、眼科用薬、プロスタグランジン、抗鬱薬、抗精神病物質、制吐薬、ならびにイメージング剤が挙げられ得る。本発明における使用に適した例示的な薬物のより完全な列挙は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｘｅｌ  ＫｌｅｅｍａｎｎおよびＪｕｒｇｅｎ  Ｅｎｇｅｌによる）、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９９；「Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」、Ｓｕｓａｎ  Ｂｕｄａｖａｒｉら編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６、およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ−２０、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．出版、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ，２００１を見るとよい。好ましくは（必ずしもそうでないが）、薬物は、適切な政府機関または行政団体によって、既に使用が安全かつ有効であるとみなされているものである。例えば、ＦＤＡによって２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§  ３３０．５，３３１〜３６１、および４４０〜４６０にリストアップされたヒトに使用するための薬物；ＦＤＡによって２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§  ５００〜５８９にリストアップされた獣医学的使用のための薬物はすべて、本発明による使用に許容され得るとみなす。
【００４１】
超分岐−本明細書で用いる場合、「超分岐」構造は、少なくとも１つの分岐した分岐を含む共有結合性の構造（例えば、デンドリマー構造）である。超分岐構造は、ポリマー基礎構造および／または非ポリマー基礎構造を含むものであり得る。
【００４２】
パーセント相同性−本明細書で用いる場合、用語「パーセント相同性」は、本開示において定義する最適アラインメント後の２つの配列間の配列同一性の割合をいう。例えば、２つのヌクレオチド配列は、以下に論考するように一致が最大となるようにアラインメントしたときに該２つの配列内のヌクレオチドの配列が同じである場合、「同一」であるという。２つのヌクレオチド配列間の配列の比較は、典型的には、２つの最適にアラインメントされた配列の配列を、領域または「比較域」において比較し、配列が類似している領域を特定および比較することにより行なわれる。比較のための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、このようなアルゴリズムのコンピュータでの実行、または目視検査によって行なわれ得る。
【００４３】
配列同一性の割合−「配列同一性の割合」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較域において比較することにより判定され、この場合、ヌクレオチド配列の比較域内の部分には、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較したとき、付加または欠失（すなわち、ギャップ）が含まれ得る。この割合は、両方の配列に同一のヌクレオチド残基が存在している位置の数を求め、マッチングした位置の数を得、マッチングした位置の数を比較域内の位置の総数で除算し、結果に１００を乗算して配列同一性の割合を得ることにより計算される。上記に示すこの配列同一性の定義は、当業者によって使用されているものであり得る定義である。この定義自体に、アルゴリズムの補助はなんら必要とされない。アルゴリズムは、配列同一性を計算するものではなく、配列の最適アラインメントを容易にするのに役立つものにすぎない。この定義から、２つの比較対象配列間の配列同一性には明確な１つだけの値が存在することになり、この値は、最適アラインメントで得られる値に対応する。
【００４４】
ポリマー−本明細書で用いる場合、「ポリマー」または「ポリマー構造」は、共有結合された一連のモノマーを含む構造である。ポリマーは、１つの型のモノマーで構成されたものであってもよく、１種類より多くの型のモノマーで構成されたものであってもよい。したがって、用語「ポリマー」は、コポリマー（例えば、ポリマー全体において異なる型のモノマーが個々の集団で存在しているブロックコポリマー）を包含する。ポリマーは線状であっても分岐型であってもよい。
【００４５】
ポリヌクレオチド−本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドのポリマーである。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に用いていることがあり得る。該ポリマーは、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、および２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学的に修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、介在（ｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）塩基、修飾糖類（例えば、Ｔ−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）を含むものであり得る。
【００４６】
ポリペプチド−本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーである。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「オリゴペプチド」、および「ペプチド」は、互換的に用いていることがあり得る。ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖内に組み込まれ得る化合物）および／または当該技術分野で知られているようなアミノ酸類似体を含むものであり得る。また、ポリペプチドのアミノ酸残基の１つ以上が、例えば、糖鎖基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの化学的存在体の付加によって修飾されていてもよい。このような修飾としては、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組込みなどが挙げられ得る。
【００４７】
多糖−本明細書で用いる場合、「多糖」は、糖質のポリマーである。用語「多糖」、「糖鎖」、および「オリゴ糖」は、互換的に用いていることがあり得る。  該ポリマーは、天然糖質（例えば、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクツロース（ｏｃｔｏｌｏｓｅ）、およびシアロース（ｓｉａｌｏｓｅ））および／または修飾糖質（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、およびヘキソース）を含むものであり得る。例示的な二糖としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コージビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノース、およびキシロビオースが挙げられる。
【００４８】
小分子−本明細書で用いる場合、用語「小分子」は、天然に存在するものであっても、人工的に作出されたものであっても（例えば、化学合成によって）、比較的低い分子量を有する分子をいう。典型的には、小分子は単量体であり、約１，５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００４９】
処置する−本明細書で用いる場合、用語「処置する」（または「処置すること」、「処置された」、「処置」など）は、病状（例えば、糖尿病）、病状の症状（１つまたは複数）（例えば、高血糖症）、病状に対する素因を軽減する、緩和する、改変する、改善する、好転させる、または影響を及ぼす目的で、処置を必要とする被検体への本開示の物質体の投与をいう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、グルコースの関数としての、グリコゲンビーズカラムからの個々のモノクローナル溶出プロフィールを示す。白図形−モノクローナル１、４および６。黒図形−モノクローナル２、３、５および７。点線は、各工程での溶出に使用したグルコース濃度を示す。
【図２】図２は、モノクローナル２と比較したときの、いくつかの例示的な８４ｂｐモノクローナルアプタマーの配列相同性を示す。赤字は、元の配列と異なっている。
【図３】図３は、以下のゲル：レーン１：１，０００〜１０，０００ｂｐラダー；レーン２：１００〜１，０００ｂｐラダー、レーン３：アビジン対照；レーン４：１：２ｍｏｌのアビジン：アプタマー＋１０ｍＭ  ビオチン；レーン５：１：２ｍｏｌのアビジン：アプタマー；レーン６〜８：それぞれ、１：４、１：８および１：１６ｍｏｌ比のアビジン：アプタマーの写真を示す。
【図４】図４（上）は、ポリアクリルアミドビーズカラム（■）、グリコゲンビーズカラム（  ）からのビオチニル化切断型アプタマー３、グリコゲンビーズカラム（○）におけるアプタマー：アビジンのモル比４：１でアビジンと混合したビオチニル化アプタマー、および負荷前に１６００ｍｇ／ｄＬのグルコースで予め平衡化したグリコゲンビーズカラム（□）のみによるビオチニル化アプタマーの溶出プロフィールを示す。図５（下）は、ポリアクリルアミドビーズカラム（■）、グリコゲンビーズカラム（◆）からのペグ化Ｃｏｎ  Ａの溶出プロフィール、およびグリコゲンビーズカラム（●）からの天然Ｃｏｎ  Ａ溶出を示す。溶出工程１〜１５（左から右）：それぞれ、結合、３回のバッファー洗浄、４００、８００、１６００、３２００、６４００、４×１２５００ｍｇ／ｄＬグルコースを表す。
【図５】図５は、標的分子（例えば、グルコース）に応答してコンジュゲート２０を制御可能に放出し得る架橋物質体１０の模式図である。該物質体は、コンジュゲート２０を、コンジュゲート２０の親和性リガンド４０に非共有結合で結合し、それによりコンジュゲート２０を架橋して架橋物質体１０を形成する多価ポリヌクレオチドアプタマー３０と合わせることにより調製される。多価ポリヌクレオチドアプタマー３０と親和性リガンド４０間の非共有結合は、過剰量の標的分子（例えば、グルコース）の存在下で競合的に解離される。
【図６】図６：は、野生型ヒトインスリンの構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本出願書類では、特許文献および非特許文献を含むいくつかの文献に言及している。これらの各文献は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
一態様では、図５に示すように、本開示により、標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマー３０；およびコンジュゲート枠組構造に結合された２つ以上の個別の親和性リガンド４０を含むコンジュゲート２０を含む架橋物質体１０であって、該２つ以上の親和性リガンド４０は、アプタマー３０との結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート２０上の親和性リガンド４０とアプタマー３０間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体１０内でコンジュゲート２０が架橋される、架橋物質体１０を提供する。
【００５３】
このような物質体は、所望の濃度の標的分子に応答した量のコンジュゲートを放出するように設計される。最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートはまた、薬物および／または検出可能な標識も含む。薬物、検出可能な標識および親和性リガンドは、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。また、本開示により、このような物質体の使用方法およびこのような物質体の作製方法を提供する。別の態様では、本開示により、レクチン（Ｃｏｎ  Ａなど）の代わりにグルコース応答性物質体に使用するための例示的なアプタマーを提供する。
【００５４】
アプタマーは、標的分子（例えば、限定されないが、グルコース、ラクテート、ホルモンなど）に結合し、多価である。コンジュゲートは、アプタマーとの結合に関して標的分子と競合する２つ以上の個別の親和性リガンドを有するコンジュゲート枠組構造を含む。アプタマーとコンジュゲートを標的分子の非存在下で合わせると、非共有結合性架橋物質体が形成される。該物質体を遊離標的分子の存在下に入れると、該分子は、アプタマーとコンジュゲート間の相互作用に関して競合する。ある一定濃度より上の遊離標的分子では、競合レベルは、コンジュゲートが放出されることにより、該物質体が分解され始めるようなものになる。その結果、コンジュゲートは該物質体から、標的分子の局所濃度に直接関連する様式で放出される。
【００５５】
ポリヌクレオチドアプタマー
ポリヌクレオチドアプタマーは標的分子に結合し、多価である（すなわち、１つより多くの標的分子に結合し得る）。本開示は、なんら特定の標的分子に限定されない。したがって、種々の実施形態において、標的分子は、代謝産物（例えば、限定されないが、グルコース、葉酸類、乳酸類、グルタミン酸類、グルタミン、ピルビン酸類、クエン酸類、リンゴ酸類、アミノ酸、脂質など）であり得る。他の実施形態において、標的分子は、ホルモン（ペプチド系であっても非ペプチド系であってもよい）、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔｇｌａｎｄｉｎ）、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどを含むものであり得る。
【００５６】
一般に、まず、一価のアプタマーを、その標的分子に対する結合特性に基づいて作製する。当該技術分野で周知のように、さまざまな標的分子に対するアプタマーが、インビトロ選択プロセスによって作製され得る。例示的な方法を以下の実施例３に記載する。ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５；ならびに米国特許第５，５８２，９８１号も参照のこと。
【００５７】
典型的には、このプロセスは、プライマーとしての機能を果たす一定の５’末端と３’末端にフランキングされた固定長のランダムに作製したポリヌクレオチド配列からなるライブラリーの合成から始める。一部の特定の実施形態では（例えば、アプタマーを最適化する場合）、標的分子に結合することがわかっている配列から始め、出発配列からの限定的な範囲の変化を示すポリヌクレオチドの集合体（例えば、単一変異のランダムな組）を含むライブラリーを作製してもよい。次いで、ライブラリー内の配列は標的分子に曝露され、標的に結合しないものは除去される（例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって）。次いで、結合した配列を溶出させ、後続の選択ラウンドの準備のために増幅し（例えば、クローニングの後、転写によって、またはＰＣＲによって）、該選択ラウンドでは、所望の結合親和性および／または特異性を有する配列が同定されるように溶出条件のストリンジェンシーを増大または変更する。Ｊａｒｏｓｃｈら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：８６には、該プロセスを、該一定のプライマー領域なしで行なうことが可能な方法が記載されている。
【００５８】
種々の実施形態において、該選択プロセスは、標的分子に対して高い親和性を有するアプタマーを選択するために、溶出条件のストリンジェンシーを徐々に増大させる工程を伴うものであり得る。
【００５９】
種々の実施形態において、該選択プロセスは、標的分子に対して所望の特異性を有するアプタマーを選択するために、溶出条件を変更する工程を伴うものであり得る（例えば、異なるアフィニティカラムの使用によって）。
【００６０】
種々の実施形態において、該選択プロセスは、各々が標的分子に対して同様の親和性および／または特異性を有するアプタマーを含む下位ライブラリー（または「プール」）の集合体を作製するものであり得る。種々の実施形態において、該選択プロセスは、単一のアプタマー配列（または「モノクローナル」）を作製するものであり得る。種々の実施形態において、アプタマーはＤＮＡ系である。種々の実施形態において、アプタマーはＲＮＡ系である。種々の実施形態において、アプタマーは、混合型ＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーである。
【００６１】
多価のアプタマーは、２つ以上のこのような一価のアプタマーを共有結合または非共有結合により連結し、単一の構築物にすることにより作製され得る。例示的な方法を以下の実施例４に記載する。典型的には、２つ以上のアプタマー（同じ配列を有するものであっても異なる配列を有するものであってもよい）は、互いに直接結合され得るか（例えば、カップリング剤によって）、または独立した枠組構造を介して間接的に連結され得る。種々の実施形態において、２、３、４、５、６、７または８個のアプタマーが単一の構築物に結合され得る。種々の実施形態において、２、３、４、５、６、７または８個のアプタマーは、同じ配列を有するものであり得る。このようなアプローチのいずれか１つにおいて、カップリング前に、アプタマーを化学修飾することが必要な場合があり得る（例えば、反応性懸垂基を含めるため）ことは認識されよう。また、本開示のアプタマーは、特定のカップリング反応または枠組構造に限定されない（例えば、該アプタマーは、ポリマー構造および／または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製されるものであってもよい）ことも認識されよう。さらに、枠組構造は線状、分岐、樹枝状および／またはこれらの組合せであり得ることが認識されよう。例示的な枠組構造およびカップリング化学反応を、以下に、該コンジュゲートとの関連において記載する。
【００６２】
種々の実施形態において、アプタマーが互いに、または枠組構造に共有結合される。かかる実施形態において、アプタマーは、直接結合されていてもよく（すなわち、介在化学基なしで）、スペーサー（例えば、アプタマー同士、またはアプタマーと枠組構造との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖）を介して間接的に結合されていてもよい。以下に、該コンジュゲートとの関連において論考するように、アプタマーは互いに、または枠組構造に、任意の数の化学結合、例えば限定されないが、アミド、エステル、エーテル、イソ尿素およびイミン結合によって共有結合され得ることは理解されよう。
【００６３】
種々の実施形態において、２つ以上のアプタマーが互いに、または枠組構造に非共有結合される。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数（Ｋｄ）が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、該タンパク質は互いに、または枠組構造に、当該技術分野でよく知られた非共有結合性のリガンド−受容体ペア（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア）によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が一方のアプタマーに共有結合され、該ペアの他方の構成員が他方のアプタマーまたは枠組構造に共有結合される。アプタマー（またはアプタマーと枠組構造）を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、アプタマーが互いに（または枠組構造に）非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド／受容体ペアとしては、タンパク質／補因子および酵素／基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン／アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリン、およびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。他にも適当なリガンド／受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）、さらには、Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｐｐ．１０５−１５２、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９０；「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｐａｓｃａｌ  Ｂａｉｌｌｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０００；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎらによる「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２に記載のものなどのエピトープタグとのペアでのモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
【００６４】
種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０、５０、６０、７０または８０個の連続するヌクレオチドを含む（図２参照）。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０、５０、６０、７０または８０個の連続するヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０、５０、６０、７０または８０個の連続するヌクレオチドと少なくとも８０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０、５０、６０、７０または８０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０、５０、６０、７０または８０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。一部の特定の実施形態では、多価アプタマーは、前述のヌクレオチド配列のいずれか１つを２コピー以上含むものであってもよい。
【００６５】
種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０のヌクレオチド配列を含む。
【表１】
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配列番号８は、配列番号２、３、５、７の各中央（すなわち、非プライマー）領域を主体とするコンセンサス配列である（図２参照）。配列番号９は、配列番号４の中央領域が主体である。配列番号１０は、配列番号６の中央領域が主体である。一部の特定の実施形態では、多価アプタマーは、配列番号８、９または１０のヌクレオチド配列を２コピー以上含むものであってもよい。
【００６６】
一部の特定の実施形態では、該ヌクレオチド配列はＲＮＡ配列であり、Ｎ＝Ｕである。一部の特定の実施形態では、該ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であり、Ｎ＝Ｔである。
【００６７】
一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、Ｙ＝Ｕ／Ｔである配列番号８のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、Ｙ＝Ｃである配列番号８のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、Ｙ（６）＝Ｕ／ＴおよびＹ（１７−１８）＝Ｃである配列番号８のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、Ｒ＝Ａである配列番号８のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、Ｒ＝Ｇである配列番号８のヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも８０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。
【００６９】
種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０と少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０と少なくとも８０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０と少なくとも９０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号８、９または１０と少なくとも９５％の相同性を有する１つ以上の領域を含む。
【００７０】
種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも８０％の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。一部の特定の実施形態では、該プールは、１０個より多く、２０個より多く、５０個より多く、または１００個より多くの一価アプタマーを含むものである。
【００７１】
種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号８、９または１０と少なくとも７０％の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号８、９または１０と少なくとも８０％の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号８、９または１０と少なくとも９０％の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号８、９または１０と少なくとも９５％の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。一部の特定の実施形態では、該プールは、１０個より多く、２０個より多く、５０個より多く、または１００個より多くの一価アプタマーを含むものである。
【００７２】
コンジュゲート
該コンジュゲートは、コンジュゲート枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを２つ以上含む。該２つ以上の個別の親和性リガンドは、アプタマーとの結合に関して標的分子と競合する。また、最終適用用途に応じて、該コンジュゲートは、治療用薬剤および／または検出可能な標識を含むものであってもよい。親和性リガンド、薬物、および／または検出可能な標識は、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。
【００７３】
親和性リガンド
２つ以上の個別の親和性リガンドは、同じ化学構造を有するものであっても、異なる化学構造を有するものであってもよい。２つ以上の個別の親和性リガンドは、標的分子自体と同じ化学構造を有するものであっても、標的分子の化学的に関連した種であってもよい。唯一の要件は、該リガンドが、アプタマーとの結合に関して標的分子と競合することである。一部の特定の実施形態では、アプタマーに対する該コンジュゲートおよび標的分子の相対親和性は、１：１〜１００：１の範囲である（この場合、１００：１の相対親和性は、コンジュゲート、標的分子およびアプタマーの平衡混合物において（ｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中、３７Ｃで）、標的分子の濃度がコンジュゲートの濃度の１００倍である場合、アプタマーが、ほぼ等モル量のコンジュゲートおよび標的分子に結合することを意味する）。一部の特定の実施形態では、この相対親和性は１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜５：１または１：１〜２：１の範囲である。種々の実施形態において、例えば、該コンジュゲートおよび標的分子に対するアプタマーの相対親和性を微調整するために、親和性リガンドが標的分子と異なる化学構造を有することが好都合な場合がある。例えば、標的分子がグルコースである場合、１つ以上の該親和性リガンドとして糖質または多糖が使用され得る。例えば、標的分子がグルコースである場合、親和性リガンドとしては、糖が挙げられ得る。したがって、一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、本開示のアプタマーに対する結合に関してグルコースと競合し得るものである。
【００７４】
一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）：
【化１】
2012516156.tif 000004
【００７５】
（式中：
各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚ、または−ＣＨ２Ｒｘであり；
各Ｒｘは、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、または−Ｏ−Ｙであり；
各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２であり；
各Ｙは、独立して、単糖、二糖または三糖であり；
各Ｇは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているＣ１〜９アルキレンであり、ここで、Ｇの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−、または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−で置き換えられており；
各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、または−ＯＳＯ２Ｒ２であり；
各Ｒ２は、独立して、水素であるか、またはＣ１〜６脂肪族、フェニル、窒素、酸素もしくはイオウから選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜７員の複素環式の環、または窒素、酸素もしくはイオウから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換されている基である）のものである。
【００７６】
一部の特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）の親和性リガンドは単糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは二糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは三糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは四糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、４個以下の糖質部分を含むものである。
【００７７】
上記に一般的に定義したように、各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚ、または−ＣＨ２Ｒｘである。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は水素である。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。一部の特定の実施形態では、Ｒ１は−Ｏ−Ｙである。一部の特定の他の実施形態では、Ｒ１は−Ｇ−Ｚである。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２−Ｏ−Ｙである。また他の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨ２である。当業者には、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）における各Ｒ１置換基が（Ｒ）または（Ｓ）の立体化学構造であり得ることが認識されよう。
【００７８】
上記に一般的に定義したように、各Ｒｘは、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、または−Ｏ−Ｙである。一部の実施形態では、Ｒｘは水素である。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは−ＯＨである。他の実施形態では、Ｒｘは−Ｏ−Ｙである。
【００７９】
上記に一般的に定義したように、各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。一部の実施形態では、Ｒｙは水素である。他の実施形態では、Ｒｙは−Ｒ２である。一部の実施形態では、Ｒｙは−Ｃ（Ｏ）Ｒ２である。一部の特定の実施形態では、Ｒｙはアセチルである。他の実施形態では、Ｒｙは、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−ＣＯ２Ｒ２、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。
【００８０】
上記に一般的に定義したように、Ｙは単糖、二糖または三糖である。一部の特定の実施形態では、Ｙは単糖である。一部の実施形態では、Ｙは二糖である。他の実施形態では、Ｙは三糖である。一部の実施形態では、Ｙは、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノース、またはキシロピラノースである。一部の実施形態では、Ｙは、スクロース、マルトース、ツラノース、トレハロース、セロビオース、またはラクトースである。一部の特定の実施形態では、Ｙはマンノースである。一部の特定の実施形態では、ＹはＤ−マンノースである。当業者には、糖Ｙが、−Ｏ−Ｙの酸素基にアノマー炭素を介して結合され、グリコシド結合を形成していることが認識されよう。グリコシド結合は、α立体配置であってもβ立体配置であってもよい。
【００８１】
上記に一般的に定義したように、各Ｇは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているＣ１〜９アルキレンであり、ここで、Ｇの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｇは二重結合である。一部の特定の実施形態では、Ｇは−Ｏ−Ｃ１〜８アルキレンである。一部の特定の実施形態では、Ｇは−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
【００８２】
上記に一般的に定義したように、各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、または−ＯＳＯ２Ｒ２である。一部の実施形態では、Ｚは、ハロゲンまたは−ＯＳＯ２Ｒ２である。他の実施形態では、Ｚは、−Ｎ３または−Ｃ≡ＣＲ２である。一部の特定の実施形態では、Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、または−ＳＲ２である。一部の特定の実施形態では、Ｚは−ＳＨである。一部の特定の実施形態では、Ｚは−ＮＨ２である。一部の特定の実施形態では、−Ｇ−Ｚは−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。
【００８３】
一部の実施形態では、式（ＩＶａ）のＣ１炭素上のＲ１置換基は−Ｇ−Ｚであり、式（ＩＶａ−ｉ）：
【化２】
2012516156.tif 000005
【００８４】
（式中、Ｒ１、ＧおよびＺは、本明細書において定義および記載のとおりである）の化合物が得られる。
【００８５】
一部の実施形態では、リガンドは、式（ＩＶａ−ｉｉ）：
【化３】
2012516156.tif 000006
【００８６】
（式中、Ｒ１、Ｒｘ、ＧおよびＺは、本明細書において定義および記載のとおりである）のものである。
【００８７】
例えば、一部の特定の実施形態では、以下：グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、これらの誘導体（例えば、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノースなど）および／またはこれらの高次の組合せ（例えば、ビマンノース、線状および／または分岐のトリマンノースなど）の１種類以上を含む親和性リガンドが使用され得る。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは単糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンド二糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは三糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは多糖を含む。一部の実施形態では、親和性リガンドは糖と１つ以上のアミン基を含む。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。他の実施形態では、親和性リガンドはＤ−グルコサミン（ＧＡ）である。一部の特定の実施形態では、糖リガンドはＤ立体配置である。他の実施形態では、糖リガンドはＬ立体配置である。以下に、本発明らは、これらの例示的な親和性リガンドの構造を示す。他の例示的な親和性リガンドは、当業者に認識されよう。
【化４】
2012516156.tif 000007
【００８８】
種々の実施形態において、該親和性リガンドは、多糖、糖ペプチドまたは糖脂質である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、２〜１０個の糖質部分、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の該部分を含む。多糖、糖ペプチドまたは糖脂質の末端および／または内部残基は、対象とするアプタマーの糖特異性に基づいて選択され得る（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３１７：５００−５０４、１９７３およびＬｉｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：３５−６７、１９８６を参照のこと）。
【００８９】
種々の実施形態において、特定のコンジュゲート／アプタマーの組合せに対する親和性リガンドは、実験に基づいて選択され得る。かかる実施形態によれば、１つ以上の親和性リガンドが、グルコースと比較したときのアプタマーに対する相対結合親和性に基づいてスクリーニングされる。一部の特定の実施形態では、糖質および／または多糖類のライブラリーが、この様式でスクリーニングされる。適当な親和性リガンドは、グルコースとの検出可能なレベルの競合を示すが、アプタマーとグルコース間の結合を完全に妨げるほど強くは競合しない。
【００９０】
他の例示的な標的分子／親和性リガンドの組合せは当業者に認識されよう。一般に、親和性リガンドは、標的分子自体を用いて、および／または標的分子の誘導体を作製することにより（例えば、標的分子に対して化学修飾および／または立体化学修飾を行ない、次いで、得られた誘導体を、対象とするアプタマーに対する相対親和性に関してスクリーニングすることにより）、任意の標的分子に対して作製され得る。
【００９１】
より詳細に以下に論考するように、親和性リガンドは、コンジュゲートの枠組構造内に天然に存在するものであってもよい（例えば、ポリマー主鎖の一部として、またはモノマーの側鎖基として）。択一的に（または付加的に）、親和性リガンドは、コンジュゲートの枠組構造内に人工的に組み込まれたものであってもよい（例えば、コンジュゲートの枠組構造に合成的に付加された化学基の形態で）。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、または１００個以上の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜２５、２〜５０または２〜１００個の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、わずか２、３または４個程度の個別の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。
【００９２】
親和性リガンドをコンジュゲート枠組構造にコンジュゲートさせるための方法は、より詳細に以下に論考する。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドが糖を含む場合、コンジュゲーション（直接であれ間接であれ）には、糖のＣ１、Ｃ２またはＣ６位が関与する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションはＣ１位が関与するものである。Ｃ１位は、アノマー炭素とも称され、コンジュゲートの枠組構造に、αまたはβコンホメーションで連結され得る。一部の特定の実施形態では、Ｃ１位はαアノマーとして構成される。他の実施形態では、Ｃ１位はβアノマーとして構成される。
【００９３】
薬物
上記のように、種々の実施形態において、コンジュゲートは薬物を含むものであり得る。例えば、薬物は、該物質体が治療目的に使用される場合、例えば、薬物を患者に制御可能に送達するために含まれ得る。コンジュゲートには任意の薬物が含まれ得ることは理解されよう。コンジュゲートは、同じ薬物を１コピーより多く含むものであり得、および／または１種類より多くの型の薬物を含むものであり得る。コンジュゲートは、いかなる特定の薬物にも限定されず、小分子薬または生体分子薬を含むものであってもよい。一般に、使用される薬物（１種類または複数種）は、処置対象の疾患または障害に依存する。
【００９４】
例えば、限定されないが、種々の実施形態において、コンジュゲートは、以下の薬物：ジクロフェナク、ニフェジピン、リバスチグミン、メチルフェニデート、フルオキセチン、ロシグリタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、コデイン、エチルモルヒネ、デキストロメトルファン、ノスカピン、ペントキシベリン（ｐｅｎｔｏｘｉｖｅｒｉｎｅ）、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、エピネフリン、イソプレナリン、オルシプレナリン、エフェドリン、フェノテロール、リミテロール、イプラトロピウム、コリンテオフィリネート、プロキシフィリン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デスラノシド、ジゴキシン、ジギトキシン、ジソピラミド、プロスシラリジン、キニジン、プロカインアミド、メキシレチン、フレカイニド、アルプレノロール、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒｏａｎｏｌｏｌ）、ナドロール、ピンドロール、オクスプレノロール、ラベタロール、チモロール、アテノロール、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、イソソルビドモノニトラート、ニフェジピン、フェニルアミン、ベラパミル、ジルチアゼム、シクランデラール（ｃｙｃｌａｎｄｅｌａｒ）、ニコチニルアルコール、ニコチン酸イノシトール、アルプロスタジル（ａｌｐｒｏｓｔａｔｄｉｌ）、エチレフリン、プレナルテロール、ドブタミン、ドパミン、ジヒドロエルゴタミン、グアネチジン、ベタニジン、メチルドパ、レセルピン、グアンファシン、トリメタファン、ヒドララジン、ジヒドララジン、プラゾシン、ジアゾキサイド、カプトプリル、ニフェジピン、エナラプリル、ニトロプルシド、ベンドロフルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、クロルタリドン、シネタゾン、クロパミド、メフルシド、メトラゾン、ブメタニド、エタクリナシド、スピロノラクトン、アミロリド、クロフィブラート、ニコチン酸、ニケリトロール（ｎｉｃｈｅｒｉｔｒｏｌ）、ブロモフェニルアミン、シンナリジン、デキシクロルフェニラミン、クレマスチン、アンタリン、シプロヘプタジン、プロメタジン（ｐｒｏｅｔｈａｚｉｎｅ）、シメチジン、ラニチジン、スクラルファート、パパベリン、モキサベリン、アトロピン、ブチルスコポラミン、エメプロン、グルコピロン、ヒヨスチアミン、メペンソラール、メチルスコポラミン、オキシフェンサイクリミン、プロバンテリン、テロジリン、センナグリコシド、サグラダエキストラクト、ダントロン、ビサコジル、ピコスルファートナトリウム、エチュロス、ジフェノキシレート（ｄｉｐｈｅｎｏｌｘｙｌａｔｅ）、ロペラミド、サラゾスルファピリジン、ピルヴィン、メベンダゾール、ジメチコン、フェロフマレート、フェロサクシネート、フェリテトラセミナトリウム、シアノコバラミン、葉酸ヘパリン、ヘパリン補因子、ジクルマロール、ワルファリン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ビタミンＫ、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、シタラビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、プロカルバジン、ダカルバジン、ロムスチン、エストラムスチン、テニポシド、エトポシド、シスプラチン、アムサクリン、アミノグルテチミド、ホスフェストロール、メドロキシプログレステロン（ｍｅｄｒｏｘｉｐｒｏｇｒｅｓｔｅｒｏｎｅ）、ヒドロキシプロゲステロン、メゲステロール、ノレチステロン、タモキシフェン、シクロスポリン、スルフィソミジン、ベンシルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、ジクロキサシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、アンピシリン、アモキシリン、ピバンピシリン、バカンピシリン、ピペラシリン、メジオシリン、メシリナム、ピブメシリナム、セファロチン、セファレキシン、セフラジン、セファドロキシル、セファクロル、セフロキシム、セフォタキシム、セフタジジム、セフォキシチン、アズトレオナム、イミペネム、シラスタチン、テトラサイクリン、リメサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロルアンフェニコール、スピラマイシン、フシジン酸、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、アンフォテリシンＢ、グリセオフルビン、ニスタチン、バンコマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、トリメトプリム、ノルフロキサシン、サラゾスルファピリジン、アミノサリル、イソニアジド、エタンブトール（ｅｔａｍｂｕｔｏｌ）、ニトロフラントイン、ナリジクス酸、メテナミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、チニダゾール、ケトコナゾール、アシクロビル、インターフェロン、イドクスウリジン、レチノール、チアミン、デキスパンテノール、ピリドキシン、葉酸、アスコルビン酸、トコフェロール、フィトミナジオン、フェンフルナミン、コルチコトロピン、テトラコサクチド、チロトロピン、ソマトトロピン、ソマトレム、バソプレシン、リプレシン、デスモプレシン、オキシトシン、クロリオンゴナドトロピン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、フルオキシメステロン、メステロロン、ナンドロロン、スタノゾロール、オキシメトロン、シプロテロン、レボチロキシン、リオチロニン、プロピルチオウラシル、カルビマゾール、チアマゾール、ジヒドロタキステロール、アルファカルシドール、カルシチロール、インスリン、トルブタミド、クロルプロパミド、トラズアミド、グリピジド、グリベンクラミド、フェノバルビタール、メチプリロン、ピリチルジオン、メプロバメート、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、ニトラゼパム、バクロフェン、オキサゼパム、クロラゼプ酸二カリウム（ｄｉｋａｌｉｕｍｃｌｏｒａｚｅｐａｔ）、ロラゼパム、フルニトラゼパム、アルプラゾラム、ミダゾラム、ヒドロキシジン、クロメチアゾール、プロピオンマジン、アリメマジン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、アセトフェナジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペナジン、トリフルオペラジン、ジキシラジン、チオリダジン（ｔｈｉｏｄｉｒａｚｉｎｅ）、ペリシアジン、クロプロチキセン（ｃｈｌｏｐｒｏｔｈｉｘｅｎｅ）、チザニジン、ザレプロン、ズクロペンチゾール、フルペンチゾール、チチキセン、ハロペリドール、トリミプラミン、オピプラモール、クロミプラミン、デシプラミン、ロフェプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、マプトロチリン、カフェイン、シンナリジン、サイクリジン、メンヒドリナート（ｄｉｍｅｎｈｙｄｉｎａｔｅ）、メクロジン、プロメタジン、チエチルペラジン、メトクロプラミド、スコポラミン、フェノバルビタール、フェニトイン、エトスクシミド、プリミドン、カルバマゼピン、クロナゼパム、オルフェナドリン、アトロピン、ベンサトロピン、ビペリデン、メチキセン、プロシリジン、レボドパ、ブロモクリプチン、アマンタジン、アンベノン、ピリドスチグミン、シンスチグミン、ジスルフィラム、モルヒネ、コデイン、ペンタゾシン、ブプレノルフィン、ペチジン、フェノペリジンフェンタニル、メタドン、ピリトラミド、デキストロプロポキシフェン、ケトベミドン、アセチルサリチル酸、セレコキシブ、フェナゾン、フェニルブタゾン、アザプロパゾンピロキシカム、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、シプロヘプタジン、ピジチフェン、フルメドロキソン、アロプリノール、プロベネシド、金チオリンゴ酸ナトリウム、アウラノフィン（ａｕｒｏｎｏｆｉｎ）、ペニシラミン、エストロジオール、吉草酸エストラジオール、エストリオール、エチニルエストラジオール、ジヒドロゲステロン、リネストレノール、メドロキシプログレステロン、ノルエチステロン、シクロフェニル、クロミフェン、レボノルゲストレル、メストラノール、オルニダゾール、チニダゾール、エコナゾール、クロトリマゾール、レボノルゲストレル、メストラノール、オルニダゾール、チニダゾール、エコナゾール、クロトリマゾール、ナタマイシン、ミコナゾール、スルベンチン、メチルエルゴタミン、ジノプロスト、ジノプロストン、ゲメプロスト、ブロモクリプチン、フェニルプロパノールアミン、クロモグリク酸ナトリウム、アセタゾラミド、ジクロフェナミド、ベータカロテン、ナロキソン、ホリナートカルシウム、特にクロニジン、テオフィリン、ジピラダモール、ヒドロクロルチアジド、スコポルアミン、インドメタシン、フロセミド、塩化カリウム、モルヒネ、イブプロフェン、サルブタモール、テルブタリンカルシトニンなどのいずれか１つを含むものであり得る。この列挙は例示を意図していること、および既知のものであれ、後に見い出されるものものであれ、任意の薬物が本開示のコンジュゲートに使用され得ることは理解されよう。
【００９５】
種々の実施形態において、コンジュゲートは、ホルモン薬（ペプチド系であっても非ペプチド系であってもよい）、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔｇｌａｎｄｉｎ）、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどであり得る。一部の特定の実施形態では、ホルモンは、グルカゴン、インスリン、インスリン様増殖因子、レプチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、およびトリヨードサイロニンから選択され得る。この列挙は例示を意図していること、および既知のものであれ、後に見い出されるものであれ、任意のホルモン薬が本開示のコンジュゲートに使用され得ることは理解されよう。
【００９６】
種々の実施形態において、コンジュゲートは甲状腺ホルモンを含むものであり得る。
【００９７】
種々の実施形態において、コンジュゲートは抗糖尿病薬（すなわち、糖尿病に苦しむ患者に対して有益な効果を有する薬物）を含むものであり得る。
【００９８】
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン分子を含むものであり得る。「インスリン分子」により、本発明者らは、生理活性である（すなわち、インビボで投与したとき、検出可能なグルコースの低減を引き起こし得る）限り、野生型インスリンおよび修飾型インスリンのどちらも包含することを意図する。野生型インスリンとしては、精製型であれ、合成型であれ、組換え型であれ、任意の種由来のインスリンが挙げられる（例えば、ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）。これらのいくつかは市販されており、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能である。さまざまな修飾型インスリンが当該技術分野で知られている（例えば、ＣｒｏｔｔｙおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｍｅｒｇ．Ｃａｒｅ．２３：９０３−９０５、２００７、ならびにＧｅｒｉｃｈ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１１３：３０８〜１６，２００２、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。修飾型インスリンは、化学修飾されたもの（例えば、ＰＥＧ基もしくは後述する脂肪族アシル鎖などの化学部分の付加によって）および／または変異されたもの（すなわち、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によって）であり得る。一般に、生理活性のある変異型形態のインスリンは、典型的には、野生型インスリンと１〜１０（例えば、１〜５または１〜２）個のアミノ酸の置換、付加または欠失により異なる。ヒトインスリンの野生型配列（Ａ鎖およびＢ鎖）を、以下の説明および図６に示す。
【００９９】
Ａ−鎖（配列番号：１１）：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
Ｂ−鎖（配列番号：１２）：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
ヒトインスリンは、ウサギ、ブタ、ウシ、およびヒツジインスリンとアミノ酸Ａ８、Ａ９、Ａ１０、およびＢ３０のみが異なる（以下の表を参照のこと）。
【表２】
2012516156.tif 000008
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、Ｂペプチド配列のＢ２８位および／またはＢ２９位が変異されたものである。例えば、インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は、ＢペプチドのＣ末端の最後から２番目のリジンとプロリン残基が逆転した速効性インスリン変異型（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン）である。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。インスリンアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））は、Ｂ２８位のプロリンがアスパラギン酸で置換された別の速効性インスリン変異型（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン）である。この変異型も多量体の形成を抑制する。一部の実施形態では、Ｂ２８位および／またはＢ２９位の変異は、インスリンポリペプチド内の別の箇所に１つ以上の変異を伴う。例えば、インスリングルリジン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））は、Ｂ３位のアスパラギン酸がリジン残基で置き換えられ、Ｂ２９位のリジンがグルタミン酸残基で置き換えられた、また別の速効性インスリン変異型（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン）である。
【０１００】
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、ヒトインスリンと比べてシフトした等電点を有する。一部の実施形態では、等電点のシフトは、インスリンＡペプチドのＮ末端および／またはインスリンＢペプチドのＣ末端に１つ以上のアルギニン残基を付加することによりなされる。かかるインスリンポリペプチドの例としては、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、およびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンが挙げられる。さらなる一例として、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、ＡｓｐＡ２１がグリシンで置き換えられ、２つのアルギニン残基がＢペプチドのＣ末端に付加された例示的な長期作用性インスリン変異型である。これらの変更の効果は、等電点がシフトしてｐＨ４で完全に可溶性の溶液が得られることである。したがって、一部の実施形態では、本開示のインスリン分子は、Ａ２１がＧｌｙであるＡペプチド配列と、Ｂ３１がＡｒｇ−ＡｒｇであるＢペプチド配列とを含むものである。本開示は、本明細書に記載したこれらの変異および任意の他の変異（例えば、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）の単独および多くの組合せをすべて包含することは理解されよう。
【０１０１】
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は切断型である。例えば、一部の特定の実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのＢペプチド配列は、Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９および／またはＢ３０がないものである。一部の特定の実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのＢペプチド配列に残基の組合せがない。例えば、Ｂペプチド配列は、残基Ｂ（１〜２）、Ｂ（１〜３）、Ｂ（２９〜３０）、Ｂ（２８〜３０）、Ｂ（２７〜３０）および／またはＢ（２６〜３０）がないものであり得る。一部の実施形態では、これらの欠失および／または切断は、前記の任意のインスリン分子に適用される（例えば、限定されないが、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンリスプロ、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンアスパルト、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングルリジン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングラルギンなどを作製するため）。
【０１０２】
一部の実施形態では、インスリン分子は、ＡまたはＢペプチド配列のＮ−またはＣ末端にさらなるアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、Ａ０、Ａ２１、Ｂ０および／またはＢ３１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ａ０位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ａ２１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ｂ０位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、Ｂ３１位に１つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、Ａ０、Ａ２１、Ｂ０またはＢ３１位に、さらなるアミノ酸残基を全く含まない。
【０１０３】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、１つ以上のアミド化アミノ酸が酸性形態で置き換えられるように変異されている。例えば、アスパラギンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。同様に、グルタミンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。特に、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１、またはＡｓｎＢ３、またはこれらの残基の任意の組合せが、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。ＧｌｎＡ１５またはＧｌｎＢ４またはこれらの両方が、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、Ａ２１位にアスパラギン酸、またはＢ３位にアスパラギン酸、またはこれら両方を有する。
【０１０４】
当業者には、生物学的活性を保持したまま、インスリン分子内のまた別のアミノ酸を変異させることも可能であることが認識されよう。例えば、限定されないが、以下の修飾：Ｂ１０位のヒスチジン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＨｉｓＢ１０→ＡｓｐＢ１０）；Ｂｌ位のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＰｈｅＢ１→ＡｓｐＢ１）；Ｂ３０位のトレオニン残基のアラニンでの置き換え（ＴｈｒＢ３０→ＡｌａＢ３０）；Ｂ２６位のチロシン残基のアラニンでの置き換え（ＴｙｒＢ２６→ＡｌａＢ２６）；およびＢ９位のセリン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＳｅｒＢ９→ＡｓｐＢ９）も当該技術分野で広く認められている。
【０１０５】
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、持続性の作用プロフィールを有するものである。したがって、一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、脂肪酸でアシル化されたものであり得る。すなわち、インスリン分子上のアミノ基と脂肪酸のカルボン酸基との間にアミド結合が形成される。アミノ基は、インスリン分子のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基であってもよく、インスリン分子のリジン残基のε−アミノ基であってもよい。本開示のインスリン分子は、野生型インスリンに存在する３つのアミノ基の１つ以上がアシル化されたものであり得るか、または野生型配列に導入されたリジン残基がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ１位がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ２９位がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合された長期作用性インスリン変異型である。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＡペプチドのＮ末端、ＢペプチドのＮ末端、Ｂ２９位のＬｙｓのε−アミノ基、または本開示のインスリン分子内の任意の他の利用可能なアミノ基が、一般式：
【化５】
2012516156.tif 000009
【０１０７】
（式中、ＲＦは、水素またはＣ１〜３０アルキル基である）の脂肪酸部分に共有結合されている。一部の実施形態では、ＲＦは、Ｃ１〜２０アルキル基、Ｃ３〜１９アルキル基、Ｃ５〜１８アルキル基、Ｃ６〜１７アルキル基、Ｃ８〜１６アルキル基、Ｃ１０〜１５アルキル基、またはＣ１２〜１４アルキル基である。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ａ１位でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ｂ１位でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、Ｂ２９位のＬｙｓのε−アミノ基でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリン分子のＢ２８位がＬｙｓであり、ＬｙｓＢ２８のε−アミノ基が脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリン分子のＢ３位がＬｙｓであり、ＬｙｓＢ３のε−アミノ基が脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、脂肪酸鎖は８〜２０炭素長である。一部の実施形態では、脂肪酸は、オクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）、またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。一部の特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）、またはアラキジン酸（Ｃ２０）である。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合された長期作用性インスリン変異型である。
【０１０８】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリンアスパルト）、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリングルリジン）、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリングラルギン）、ＮεＢ２９−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリンデテミル）、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２７）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１−Ｂ３）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１０９】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル（ｍｙｒｉｓｏｔｙｌ）−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１０】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１１】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１２】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリンポリペプチド：ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ａｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１３】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１４】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１５】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１６】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１７】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１８】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１１９】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２０】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２１】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２２】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２３】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２４】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２５】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２６】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２７】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２８】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１２９】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３０】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３１】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３２】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３３】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３４】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３５】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３６】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３７】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３８】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１３９】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４０】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４１】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４２】
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ｄｅｓ（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリンのうちの１つの変異および／または化学修飾を含む。
【０１４３】
また、本開示は、前記の変異および／または化学修飾のいずれか１つを含む非ヒトインスリン（例えば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）の修飾型も包含する。
【０１４４】
これらおよび他の修飾インスリン分子は、米国特許第６，９０６，０２８号；同第６，５５１，９９２号；同第６，４６５，４２６号；同第６，４４４，６４１号；同第６，３３５，３１６号；同第６，２６８，３３５号；同第６，０５１，５５１号；同第６，０３４，０５４号；同第５，９５２，２９７号；同第５，９２２，６７５号；同第５，７４７，６４２号；同第５，６９３，６０９号；同第５，６５０，４８６号；同第５，５４７，９２９号；同第５，５０４，１８８号；同第５，４７４，９７８号；同第５，４６１，０３１号；および同第４，４２１，６８５号；ならびに米国特許第７，３８７，９９６号；同第６，８６９，９３０号；同第６，１７４，８５６号；同第６，０１１，００７号；同第５，８６６，５３８号；および同第５，７５０，４９７号に詳細に記載されており、その全開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、３つの野生型ジスルフィド結合（すなわち、Ａ鎖の７位とＢ鎖の７位間に１つ、Ａ鎖の２０位とＢ鎖の１９位間に２つ目、およびＡ鎖の６位と１１位間に３つ目）を含む。
【０１４６】
インスリン分子を含む薬物をコンジュゲートさせるための方法を以下に記載する。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はコンジュゲートの枠組構造に、Ａ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、Ａ１アミノ酸残基はグリシンである。しかしながら、本開示はＮ末端コンジュゲーションに限定されないこと、および一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、非末端Ａ鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされてもよいことは理解されよう。特に、本開示は、Ａ鎖内の任意の位置に存在するリジン残基（野生型または部位特異的変異誘発によって導入されたもの）のε−アミン基を介したコンジュゲーションを包含する。Ａ鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることは認識されよう。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はコンジュゲートの枠組構造に、Ｂ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、Ｂ１アミノ酸残基はフェニルアラニンである。しかしながら、本開示はＮ末端コンジュゲーションに限定されないこと、および一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、非末端Ｂ鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされてもよいことは理解されよう。特に、本開示は、Ｂ鎖内の任意の位置に存在するリジン残基（野生型または部位特異的変異誘発によって導入されたもの）のε−アミン基を介したコンジュゲーションを包含する。例えば、一部の特定の実施形態では、インスリン分子はＢ２９リジン残基を介してコンジュゲートされ得る。インスリングルリジンの場合では、Ｂ３リジン残基を介したコンジュゲート枠組構造に対するコンジュゲーションが使用され得る。Ｂ鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることは認識されよう。
【０１４７】
一部の特定の実施形態では、リガンドは、インスリン分子などの薬物１つより多くのコンジュゲーション点にコンジュゲートされる。例えば、インスリン分子は、Ａ１のＮ末端とＢ２９リジンの両方にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、炭酸緩衝液中でアミドコンジュゲーションが起こり、Ｂ２９位とＡｌ位にコンジュゲートされるが、Ｂ１位にはコンジュゲートされない。他の実施形態では、インスリン分子は、Ａ１のＮ末端、Ｂ１のＮ末端、およびＢ２９リジンにコンジュゲートされ得る。また他の実施形態では、保護基が、コンジュゲーションがＢ１位とＢ２９位またはＢｌ位とＡｌ位で起こるように使用される。インスリン分子上のコンジュゲーション点の任意の組合せが使用され得ることは認識されよう。一部の実施形態では、コンジュゲーション点の少なくとも１つは変異リジン残基、例えばＬｙｓＡ３である。
【０１４８】
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン感受性改善薬（すなわち、インスリンの作用を増強する薬物）を含むものであり得る。インスリンの効果を増強する薬物としては、ビグアニド（例えば、メトホルミン）およびグリタゾンが挙げられる。最初のグリタゾン薬はトログリタゾンであったが、これは重度の副作用を有することが判明した。第２世代のグリタゾンとしてはピオグリタゾンおよびロシグリタゾンが挙げられ、これらは耐容性がより良好であるが、ロシグリタゾンは、一部の治験において有害な心血管事象と関連していた。
【０１４９】
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン分泌促進薬（すなわち、膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌を刺激する薬物）を含むものであり得る。例えば、種々の実施形態において、コンジュゲートはスルホニル尿素を含むものであり得る。スルホニル尿素は、膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌を、該細胞をグルコースの作用に対して感作することにより刺激する。さらに、スルホニル尿素はグルカゴンの分泌を抑止し、標的組織をインスリンの作用に対して感作し得る。第１世代のスルホニル尿素としては、トルブタミド、クロルプロパミドおよびカルブタミドが挙げられる。より低い用量で活性な第２世代のスルホニル尿素としては、グリピジド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリボルヌリドおよびグリメピリドが挙げられる。種々の実施形態において、コンジュゲートはメグリチニドを含むものであり得る。好適なメグリチニドとしては、ナテグリニド、ミチグリニドおよびレパグリニドが挙げられる。これらの血糖降下作用は、スルホニル尿素のものより速いが短い。他のインスリン分泌促進薬としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびＧＬＰ−１類似体（すなわち、ＧＬＰ−１様生理活性を有し、ＧＬＰ−１とは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）が挙げられる。ＧＬＰ−１は、中枢作用によって胃内容物排出を抑止して満腹感を増大させることにより、およびグルカゴンの放出を抑制することにより食物摂取量を低減させる。ＧＬＰ−１は、膵島細胞の増殖を増大させ、摂食後のインスリン生成を増大させることにより血漿グルコースレベルを低下させる。ＧＬＰ−１は、例えば、そのインビボ半減期を長くするため、リラグルチドの場合のように脂質のコンジュゲーションによって化学修飾され得る。また他のインスリン分泌促進薬としては、エキセンジン−４およびエキセンジン−４類似体（すなわち、エキセンジン−４様生理活性を有し、エキセンジン−４とは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）が挙げられる。エキセンジン−４は、アメリカドクトカゲ（Ｇｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒ）に毒中に見られ、ＧＬＰ−１様生理活性を示す。これは、ＧＬＰ−１よりもずっと長い半減期を有し、ＧＬＰ−１とは異なり、生理活性を失うことなく、Ｎ末端の８個のアミノ酸残基が切断され得る。ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４のＮ末端領域は、ほぼ同一であり、有意な差は２番目のアミノ酸残基、ＧＬＰ−１ではアラニン、エキセンジン−４ではグリシンであり、これにより、エキセンジン−４に、インビボ消化に対する抵抗性が付与される。また、エキセンジン−４はＧＬＰ−１と比較すると、Ｃ末端に、さらに９個のアミノ酸残基も有する。ＭａｎｎらによるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：７１３−７１６、２００７およびＲｕｎｇｅらによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５８３０−５８４０、２００７には、本開示のコンジュゲートに使用され得るさまざまなＧＬＰ−１およびエキセンジン−４類似体が記載されている。ＧＬＰ−１の短い半減期は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による酵素的消化に起因���る。一部の特定の実施形態では、内因性ＧＬＰ−１の効果は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬（例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチンまたはアログリプチン）の投与によって増強され得る。
【０１５０】
種々の実施形態において、コンジュゲートはアミリンまたはアミリン類似体（すなわち、アミリン様生理活性を有し、アミリンとは１〜１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾によって異なるペプチド）を含むものであり得る。アミリンは、グルコースの調節に重要な役割を果たしている（例えば、ＥｄｅｌｍａｎおよびＷｅｙｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１７５〜１８９、２００２を参照のこと）。アミリンは、食物摂取量に応答して膵臓のβ細胞によってインスリンとともに共分泌される神経内分泌ホルモンである。インスリンは血流からのグルコースの消失を調節する働きをするが、アミリンは、胃および肝臓から血流中へのグルコースの出現の調節を補助する働きをする。酢酸プラムリンチド（ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））は例示的なアミリン類似体である。天然ヒトアミリンはアミロイド形成性であるため、プラムリンチドを設計するためのストラテジーは、ある特定の残基を、アミロイド形成性でないラットアミリン由来の残基で置換することを伴うものであった。特に、プロリン残基は構造破壊性残基であることがわかっており、そのため、該残基は、ラット配列からヒト配列に直接グラフトされた。また、Ｇｌｕ−１０もアスパラギンで置換された。
【０１５１】
種々の実施形態において、プレコンジュゲート薬物は、１つ以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび／またはε−アミンリジン基を有するペプチド薬が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の薬物に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド薬の場合、適当なアミノ酸（例えば、リジン）が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
【０１５２】
上記に論考したように、本開示は、なんら特定の薬物／標的分子の組合せに限定されない。
【０１５３】
種々の実施形態において、本開示の物質体は、天然のフィードバック機構を操作するために利用され得る。例えば、２種類の内因性物質のレベル相互に関連している（例えば、グルコースおよびインスリン、この場合、グルコースレベルが増大するにつれてインスリンレベルが増大し、インスリンレベルが増大するにつれてグルコースレベルが減少する）多くの天然フィードバック機構が存在する（例えば、ほとんどのホルモン性制御機構）。かかる実施形態では、内因性物質の一方が標的分子（例えば、グルコース）となり得、他方が薬物（例えば、インスリン）となる。あるいはまた、種々の実施形態において、薬物は、（ａ）他方の内因性物質と同じ機能を有する（例えば、グルコースレベルを低減させる）、（ｂ）他方の内因性物質の生成を刺激する、および／または（ｃ）他方の内因性物質の効果（１つもしくは複数）を増強する分子であり得る。例えば、グルコースが標的分子である場合、薬物としてインスリンの代わりに、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬を使用してもよい。
【０１５４】
人工的なフィードバック系の他の非限定的な例としては、高レベルのインスリンに応答してグルカゴンコンジュゲートを放出する物質体、血栓症インジケータに応答して抗凝固薬コンジュゲート（例えば、クマリン（ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモンおよびフェニンジオンなど）、ヘパリン、直接トロンビン阻害剤（アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびダビガトランなど）など）を放出する物質体；乳酸レベルの増大に応答して乳酸降下性薬物コンジュゲート（例えば、ジクロロアセテート）を放出する物質体；などが挙げられる。
【０１５５】
種々の実施形態において、該物質体は、標的分子に直接関係しない機能を有する薬物を含むコンジュゲートを放出するように設計され得る。限定されないが、食後に濃度が増大する標的分子（例えば、グルコース）に応答する物質体は、食事中に長期間の薬物投薬をもたらすために使用され得る。定期的に、および／または食物とともに投与する必要がある任意の薬物が、かかる送達系の恩恵を被り得る。当該技術分野で周知のように、多くの従来の薬物は、食物とともに、または食事の際に投与される必要があるものである。例えば、脂肪の吸収を抑止する薬物（例えば、オルリスタット）は、食事中に存在するのが好都合である。同様に、脂質レベルを降下させる薬物（例えば、ロバスタチン、アトルバスタチン、もしくはシンバスタチン）、またはトリグリセリドレベルを降下させる薬物（例えば、ゲムフィブロジル）も、食事の際に放出されるのが好都合であり得る。
【０１５６】
検出可能な標識
上記のように、種々の実施形態において、コンジュゲートは、検出可能な標識を含むものであり得る。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識を含むものであり得ることは理解されよう。コンジュゲートは、同じ標識を１コピーより多く含むものであり得る、および／または１種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識（１種類または複数種）は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。
【０１５７】
検出可能な標識は直接検出可能なものであってもよく、または、例えばシグナル生成系の１種類以上のさらなる構成員との複合作用によって間接的に検出可能なものであってもよい。直接検出可能な標識の例としては、放射性、常磁性、蛍光性、光散乱性、吸光性および比色分析用の標識が挙げられる。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンフィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどはすべて、例示的な蛍光標識である。化学発光性標識、すなわち、二次基質を発色性生成物に変換させ得る標識は、間接的に検出可能な標識の一例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどはすべて、例示的なタンパク質系化学発光性標識である。ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、例示的な非タンパク質系化学発光性標識である。間接的に検出可能な標識の別の非限定的で一般的に使用されている一例は、親和性リガンド、すなわち、それ自体が直接または間接的に検出可能であり得る二次結合パートナー（例えば、抗体またはアプタマー）に対して強い親和性を有する標識である。
【０１５８】
一般に、検出可能な標識は、さまざまな様式で可視化または検出され得、特定の検出様式は特定の検出可能な標識に基づいて選択されるが、ここで、代表的な検出手段としては、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
【０１５９】
種々の実施形態において、プレコンジュゲート標識は、１つ以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび／またはε−アミンリジン基を有するペプチド標識が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の標識に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸（例えば、リジン）が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
【０１６０】
コンジュゲートの枠組構造
コンジュゲートは、親和性リガンドを天然に含む枠組構造から調製され得るもの（例えば、グリコゲンおよびデキストランなどの多糖類は、グルコース親和性リガンドを天然に含む）、および／または親和性リガンドを、天然もしくは合成の枠組構造内に人工的に組み込むことにより調製され得るものである。本開示のコンジュゲートは特定の枠組構造に限定されないことは理解されよう。例えば、コンジュゲートは、ポリマー構造および／または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製され得る。また、コンジュゲートの枠組構造は、線状、分岐、超分岐型および／またはこれらの組合せであり得ることも理解されよう。以下のセクションに、いくつかの例示的なコンジュゲート枠組構造を示す。
【０１６１】
種々の実施形態において、コンジュゲートは、ポリマー構造を含む枠組構造から調製され得る。例えば、反応性懸垂基（例えば、カルボキシルまたは反応性のエステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなど）を有するポリマーが使用され得る。異なる懸垂基が単一の枠組構造内で混合されていてもよいことは認識されよう（例えば、適切なモノマーを所望の比率で共重合させることにより、ポリマー枠組構造を得る）。以下に論考するように、このような反応性基は、親和性リガンド、薬物および／または検出可能な標識を枠組構造に結合させるために使用され得る。また、異なる枠組構造のコポリマー、混合物および付加物も使用され得る。かかる組合せは、物質体の機械的および化学的特性を最適化するのに有用であり得る。
【０１６２】
種々の実施形態において、カルボキシル（または反応性のエステル）懸垂基を有する枠組構造（−ＣＯＯＨ含有枠組構造、またはＣＢＦ）が使用され得る。かかる枠組構造は、カルボキシル基を天然に含むものであってもよく、カルボキシル基を含むように修飾されたものであってもよい。例示的なポリマーＣＢＦとしては、限定されないが、カルボキシル化多糖類（ＣＰＳ）、例えば、アルギネート（Ａｇ）、カルボキシメチル化−Ｄ−マンノ−Ｄ−グルカン（ＣＭＭＧ、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手可能）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤｅｘ）、カルボキシメチルキチン（ＣＭＣｈ，Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｃｈｉｋｋａｌｉｎ  Ｃｏ．から入手可能）、Ｎ−脱硫酸化Ｎ−アセチル化ヘパリン（ＤＳＨ）、およびヒアルロン酸（ＨＡ）などが挙げられる。ＤＳＨおよびＣＭＤｅｘは、Ｓｕｇａｈａｒａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，２４，５３５−５４３（２００１）に従って合成され得る。一般に、ヒドロキシル化枠組構造は、塩基性条件下でのクロロ酢酸との反応によってカルボキシル化され得る。ポリマー枠組構造の場合、モノマーに対するカルボキシル置換の度合は、１〜１００ｍｏｌ％の間で異なり得る。天然に存在するカルボキシル化ポリマーとしては、限定されないが、ポリ−Ｌ−グルタメートおよびポリ−Ｌ−アスパルテートなどのカルボキシル化ポリ（アミノ酸）（ＣＰＡＡ）が挙げられる。カルボキシレート含有量は、カルボキシル化アミノ酸（例えば、ポリマー主鎖の一部となるカルボキシル基に加えてカルボキシル基を有するアミノ酸）と、非カルボキシル化アミノ酸（例えば、カルボキシル基のみがポリマー主鎖の一部となるアミノ酸）を共重合させることにより、１〜１００％ｍｏｌ  ＣＯＯＨ／ｍｏｌ  ＡＡ残基の間で変動させ得る。
【０１６３】
種々の実施形態において、アミン懸垂基を有する枠組構造（−ＮＨ２含有枠組構造、またはＮＢＦ）が使用され得る。かかる枠組構造は天然に存在するものであってもよく、第１級アミンを含むように化学修飾されたものであってもよい。後者としては、限定されないが、ポリマー枠組構造、例えば、アミン懸垂多糖類（ＮＰＳ）（脱アセチル化キトサン（Ｃｈ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）など）およびジエチルアミノエチルエーテルデキストラン（ＤＥＡＥＤｅｘ）、ＭＷ  ５００，０００ｇ／ｍｏｌ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐａ．）が挙げられる。かかるポリマー枠組構造の場合、モノマーに対するアミン置換の度合は、１〜１００ｍｏｌ％の間で異なり得る。他の好適なＮＢＦとしては、限定されないが、２’位がプリン塩基の１つ以上でアミン基で誘導体化されたポリヌクレオチドが挙げられる。天然に存在するアミン化ポリマーとしては、限定されないが、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）およびそのエナンチオマーなどのポリ（アミノ酸）が挙げられる。アミン含有量は、アミン化アミノ酸（例えば、最終的にポリマー主鎖の一部となるアミン基に加えてアミンを有するアミノ酸）と、非アミン化アミノ酸（例えば、アミンのみが最終的にポリマー主鎖の一部となるアミノ酸）を共重合させることにより、１〜１００％ｍｏｌ  ＮＨ２／ｍｏｌ  アミノ酸残基の間で変動させ得る。
【０１６４】
種々の実施形態において、ヒドロキシル懸垂基を有するポリマー（−ＯＨ含有枠組構造、またはＯＢＦ）が使用され得る。かかる枠組構造は、天然にヒドロキシル化されたものであってもよく、ヒドロキシル基を含むように化学修飾されたものであってもよい。デキストランに加えて、天然に存在するポリマーＯＢＦとしては、限定されないが、酵母マンナン（Ｍｎ）、プルラン（Ｐｌ）、アミロース（Ａｍ）、アミロペクチン（ＡｍＰ）、グリコゲン（Ｇｌ）、セルロース（Ｃｌ）、ヒアルロネート（Ｈｙ）、コンドロイチン（ＣｈＤ）、およびデキストリン（Ｄｘ）（これらはすべて、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから市販品として入手され得る）などの多糖類が挙げられる。また、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）、ポリ（チロシン）、およびポリ（４−ヒドロキシプロリン）などのポリ（アミノ酸）も、ヒドロキシル化ポリマーとして使用され得る。ポリ（アミノ酸）のヒドロキシル含有量は、ヒドロキシル化アミノ酸を非ヒドロキシル化アミノ酸と共重合させることにより、１〜１００％ｍｏｌ  −ＯＨ／ｍｏｌ  アミノ酸残基の間で変動させ得る。もちろん、カルボキシル（または反応性のエステル）、アミノ、およびヒドロキシル懸垂基は、適切なアミノ酸を所望の比率で共重合させることにより、単一のポリマー内で混合されていてもよい。
【０１６５】
種々の実施形態において、スルフヒドリル懸垂基を有する枠組構造（−ＳＨ含有枠組構造、またはＳＢＦ）が使用され得る。ＳＢＦは、天然にスルフヒドリル化されたものであってもよく、スルフヒドリル基を含むように標準的な有機化学手法を用いて化学修飾されたものであってもよい。他の実施形態では、アルデヒド、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの懸垂基を有する枠組構造が使用され得る。
【０１６６】
前述の類型の枠組構造に加えて、使用され得る一部の例示的なポリマーとしては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡ−ＰＧＡコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフマレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアセタール、生物分解性ポリシアノアクリレートおよび生物分解性ポリウレタンが挙げられる。
【０１６７】
種々の実施形態において、下記一般式（Ｉ）のコンジュゲートが使用され得る。
【化６】
2012516156.tif 000010
【０１６８】
式（Ｉ）のコンジュゲートの種々の実施形態を実施例１２に詳細に記載するが、一般に、
Ｒｘは、水素または任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルであり；
Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１〜１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の１、２、３、４または５個のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される１つ以上の基で置き換えられており、式中、Ｒａは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または適当なアミノ保護基であり、Ｒｂは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり；
存在するＸ１は各々、独立して、−ＯＲＣまたは−Ｎ（Ｒｄ）２であり、式中、Ｒｃは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基、または親和性リガンドであり、各Ｒｄは、独立して、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なアミノ保護基、または親和性リガンドであるが、存在するＸ１の少なくとも２つは親和性リガンドを含むものとし；
Ｙ１は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−ＯＲｅまたは−ＳＲｅであり、式中、Ｒｅは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり；
ｒは、５〜２５（両端を含む）の整数であり；
Ｗ１は、薬物であり；
【化７】
2012516156.tif 000011
【０１６９】
は、共有結合性の単結合または二重結合に相当する
ことを理解されたい。
【０１７０】
種々の実施形態において、下記の一般式（ＩＩ）コンジュゲートが使用され得る：
【化８】
2012516156.tif 000012
【０１７１】
（式中：[(Ａ−Ｔ)]は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し；
（Ａ−Ｔ）は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し；
−Ａ−は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される任意選択で置換されている基であり；
Ｔは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の任意選択で置換されているＣ１〜３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており；
Ｒは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
Ｘは各々、独立して、親和性リガンドであり；
ＬＢは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＸとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり；
Ｗは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
ＬＤは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＷとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
ｋは、２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定し；
ｑは、１〜４（両端を含む）の整数であり；
ｋ＋ｑは、３〜１２（両端を含む）の整数であり；
ｐは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
ｎは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
ｖは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎは≧１であり、存在する少なくとも１つのｖは≧１であるものとする）。
【０１７２】
一般式（ＩＩ）（および本明細書における他の式）には、１つ１つの水素を明示していないことは理解されよう。例えば、中央の−Ａ−がＣ６アリール基であり、ｋ＋ｑ＜６である場合、Ｃ６アリール環上の空き位置（１つまたは複数）には水素が含まれることは認識されよう。一般に、−Ａ−は各々、存在し得る分岐部節を表すこと、ならびに各節の分岐の数は、中央の−Ａ−のｋの値と中央でない−Ａ−の存在のｎの値によって決定されることは認識されよう。ｋ≧２であるため、該コンジュゲートは常に少なくとも２つのｋ−分岐部を含む。当業者には、各ｎの存在が０〜５の整数であり得るため、本開示において、このようなコンジュゲートでは、分岐実施形態と超分岐（例えば、デンドリマー様）実施形態の両方が想定されることが認識されよう。各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎが≧１であり、存在する少なくとも１つのｖが≧１であることを必要とする条件により、どのコンジュゲートも、Ｂ（すなわち、親和性リガンド）の存在を伴う少なくとも２つの個別のｋ−分岐部を含むことが確実になる。
【０１７３】
一部の特定の実施形態では、ｐ−括弧部分内に存在する−Ａ−は各々、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている。例えば、両方のｋ−分岐部においてｋ＝２およびｐ＝２である場合、該コンジュゲートは、式（ＩＩａ）：
【化９】
2012516156.tif 000013
【０１７４】
のものであり得る。
【０１７５】
他の実施形態では、ｐ−括弧部分内の末端に存在する−Ａ−のみが、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている。例えば、両方のｋ−分岐部においてｋ＝２およびｐ＝２である（ならびに両方のｋ−分岐部内の最初のｐ−括弧部分はｎ＝０である）場合、該コンジュゲートは、式（ＩＩｂ）：
【化１０】
2012516156.tif 000014
【０１７６】
のものであり得る。
【０１７７】
一部の特定の実施形態では、ｍ−括弧部分内に存在する−Ａ−は各々、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている。例えば、ｋ＝２、存在する各ｐ＝１、および存在する各ｍ＝２である場合、該コンジュゲートは、式（ＩＩｃ）：
【化１１】
2012516156.tif 000015
【０１７８】
のものであり得る。
【０１７９】
他の実施形態では、ｍ−括弧部分内の末端に存在する−Ａ−のみが、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている。例えば、ｋ＝２、存在する各ｐ＝１、および存在する各ｍ＝２である（ならびに各ｎ−分岐部内の第１のｍ−括弧部分についてｖ＝０である）場合、該コンジュゲートは、式（ＩＩｄ）：
【化１２】
2012516156.tif 000016
【０１８０】
のものであり得る。
【０１８１】
さらなる一例として、先の式の両方のｋ−分岐部においてｑ＝１およびｎ＝１である場合、該コンジュゲートは、式（ＩＩｅ）：
【化１３】
2012516156.tif 000017
【０１８２】
あるいはまた、先の式の両方のｋ−分岐部においてｑ＝１およびｎ＝２である場合、該コンジュゲートは、式（ＩＩｆ）である：
【化１４】
2012516156.tif 000018
【０１８３】
種々の実施形態において、本開示により、また、コンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された親和性リガンドおよび／または薬物もしくは検出可能な標識を含むコンジュゲートが提供される。
【０１８４】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、前述の任意の式：
（式中：−Ａ−、Ｔ、Ｄ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＲＰＢ−Ｘであり；
存在するＸは各々、独立して、親和性リガンドであり；
存在するＬＲＰＢは各々、独立して、ＴとＸ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である）
のコンジュゲートが提供される。
【０１８５】
また他の実施形態では、本開示により、前述の任意の式：
（式中：−Ａ−、Ｔ、Ｂ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗであり；
存在するＷは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
存在するＬＲＰＤは各々、独立して、ＴとＷ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である）
のコンジュゲートが提供される。
【０１８６】
他の実施形態では、本開示により、前述の任意の式：
（式中：−Ａ−、Ｔ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＲＰＢ−Ｘであり；
存在するＸは各々、独立して、親和性リガンドであり；
存在するＬＲＰＢは各々、独立して、ＴとＸの間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗであり；
存在するＷは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
存在するＬＲＰＤは各々、独立して、ＴとＷ間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である）
のコンジュゲートが提供される。
【０１８７】
種々の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、一般式（ＩＩＩ）：
【化１５】
2012516156.tif 000019
（式中、−Ａ−、Ｂ、Ｔ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎおよびｐは本明細書において定義および記載のとおりであり、ｋは、１〜１１（両端を含む）の整数であり、ｊは、２〜４（両端を含む）の整数である）を有するものであり得る。式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、薬物に対するリガンドのコンジュゲーション部位を多数有するものであり得る。ｑが１である場合、式中、ｊが２、３または４である式（ＩＩＩ）のコンジュゲートに対して、当業者には、上記のもの（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｆ））に対して示される類似した亜属が想定され得ることは認識されよう。
【０１８８】
例示の目的で、および混乱の回避のため、式（ＩＩＩ）のコンジュゲート内に存在する−Ａ−Ｄ−Ａ−（すなわち、ｊが２である場合）を、−Ａ−Ｔ−ＬＤ−Ｗ−ＬＤ−Ｔ−Ａ−（薬物がコンジュゲートの枠組構造に共有結合されている場合）または−Ａ−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗ−ＬＲＰＤ−Ｔ−Ａ−（薬物がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合されている場合）で表すことがあり得ることを理解されたい。
【０１８９】
例示的な基の説明
−Ａ−（節）
一部の特定の実施形態では、−Ａ−は各々、独立して、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される、任意選択で置換されている基である。一部の実施形態では、各−Ａ−は同じである。一部の実施形態では、中央の−Ａ−は、他のすべての−Ａ−と異なる。一部の特定の実施形態では、−Ａ−はすべて、中央の−Ａ−以外、同じである。一部の実施形態では、−Ａ−は、任意選択で置換されているアリールまたはヘテロアリール基である。一部の実施形態では、−Ａ−は６員のアリールである。一部の特定の実施形態では、−Ａ−はフェニルである。一部の特定の実施形態では、−Ａ−は、Ｎ、ＯまたはＳから選択されるヘテロ原子である。一部の実施形態では、−Ａ−は窒素原子である。一部の実施形態では、−Ａ−は酸素原子である。一部の実施形態では、−Ａ−はイオウ原子である。一部の実施形態では、−Ａ−は炭素原子である。
【０１９０】
Ｔ（スペーサー）
一部の特定の実施形態では、存在するＴは各々、独立して、二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されているＣ１〜２０炭化水素鎖であり、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１、２、３、４または５個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔは、Ｃ１〜１０、Ｃ１〜８、Ｃ１〜６、Ｃ１〜４、Ｃ２〜１２、Ｃ４〜１２、Ｃ６〜１２、Ｃ８〜１２、またはＣ１０〜１２炭化水素鎖で構築されており、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている。一部の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｔの１つ以上のメチレン単位が−Ｏ−で置き換えられている。
【０１９１】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１６】
2012516156.tif 000020
【０１９２】
である。
【０１９３】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１７】
2012516156.tif 000021
【０１９４】
である。
【０１９５】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１８】
2012516156.tif 000022
【０１９６】
である。
【０１９７】
一部の実施形態では、Ｔが
【化１９】
2012516156.tif 000023
【０１９８】
である。
【０１９９】
一部の実施形態では、Ｔが
【化２０】
2012516156.tif 000024
【０２００】
である。
【０２０１】
一部の実施形態では、Ｔは
【化２１】
2012516156.tif 000025
【０２０２】
である。
【０２０３】
一部の特定の実施形態では、存在する各Ｔは同じである。
【０２０４】
一部の特定の実施形態では、存在する各Ｔ（Ｂ基とＤ基の外側）が二重結合であり、該コンジュゲートは、一般式（Ｖ）または（ＶＩ）：
【化２２】
2012516156.tif 000026
【０２０５】
（式中、−Ａ−、Ｂ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎ、ｐ、ｋおよびｊは、それぞれ、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で定義および記載のとおりである）のものである。
【０２０６】
一般式（Ｖ）および（ＶＩ）の一部の特定の実施形態では、−Ａ−は各々、中央の−Ａ−以外は二重結合であり、存在する各ｖ＝１であり、該コンジュゲートは式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）：
【化２３】
2012516156.tif 000027
【０２０７】
（式中、−Ａ−、Ｂ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎ、ｐ、ｋおよびｊは、それぞれ、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で定義および記載のとおりである）のものである。
【０２０８】
式（ＶＩＩ）の一部の特定のかかる実施形態では、ｋ＝２およびｑ＝１である。
【０２０９】
他の実施形態では、ｋ＝３およびｑ＝１である。
【０２１０】
他の実施形態では、ｋ＝２およびｑ＝２である。
【０２１１】
式（ＶＩＩＩ）の一部の特定のかかる実施形態では、ｋ＝１およびｊ＝２である。
【０２１２】
他の実施形態では、ｋ＝２およびｊ＝２である。
【０２１３】
他の実施形態では、ｋ＝３およびｊ＝２である。
【０２１４】
他の実施形態では、ｋ＝１およびｊ＝３である。
【０２１５】
他の実施形態では、ｋ＝２およびｊ＝３である。
【０２１６】
他の実施形態では、ｋ＝３およびｊ＝３である。
【０２１７】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＶＩＩａ）：
【化２４】
2012516156.tif 000028
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
【０２１８】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化２５】
2012516156.tif 000029
2012516156.tif 000030
【０２１９】
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
【０２２０】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＶＩＩｂ）：
【化２６】
2012516156.tif 000031
【０２２１】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
【０２２２】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化２７】
2012516156.tif 000032
2012516156.tif 000033
【０２２３】
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
【０２２４】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＶＩＩｃ）：
【化２８】
2012516156.tif 000034
【０２２５】
（式中、ＢおよびＤは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
【０２２６】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化２９】
2012516156.tif 000035
【０２２７】
（式中、ＷおよびＸは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
【０２２８】
式中、ｊが２、３または４である式（ＶＩＩＩ）のコンジュゲートに対して、当業者には、式（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）および（ＶＩＩｃ）のものならびにその一種に類似した亜属が想定され得ることは認識されよう。例えば、ｊが２である場合、一部の特定の実施形態では、本開示により、式：
【化３０】
2012516156.tif 000036
【０２２９】
（式中、Ｂ、Ｄは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
【０２３０】
一部の特定の実施形態では、本開示により、式：
【化３１】
2012516156.tif 000037
【０２３１】
（式中、Ｗ、Ｘおよびｊは、本明細書において定義および記載のとおりである）のコンジュゲートが提供される。
【０２３２】
Ｂ（リガンド）
種々の実施形態において、−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり、式中、Ｘはリガンドであり；ＬＢは、共有結合であるか、またはＸとＴとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。例示的なリガンドおよびその糖質成分は上記のとおりであった。
【０２３３】
Ｄ（薬物）
種々の実施形態において、−Ｄは−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり、式中、Ｗは薬物であり、ＬＤは共有結合であるか、またはＷとＴとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。例示的な薬物は上記のとおりであった。
【０２３４】
Ｄ（検出可能な標識）
上記のように、種々の実施形態において、Ｄ内のＷは検出可能な標識である。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識を含むものであり得ることは理解されよう。コンジュゲートは、１コピーより多くの同じ標識を含むものであり得る、および／または１種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識（１種類または複数種）は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。
【０２３５】
検出可能な標識は直接検出可能なものであってもよく、または、例えばシグナル生成系の１種類以上のさらなる構成員との複合作用によって間接的に検出可能なものであってもよい。直接検出可能な標識の例としては、放射性、常磁性、蛍光性、光散乱性、吸光性および比色分析用の標識が挙げられる。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンフィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどはすべて、例示的な蛍光標識である。化学発光性標識、すなわち、二次基質を発色性生成物に変換させ得る標識は、間接的に検出可能な標識の一例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどはすべて、例示的なタンパク質系化学発光性標識である。ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、例示的な非タンパク質系化学発光性標識である。間接的に検出可能な標識の別の非限定的で一般的に使用されている一例は、親和性リガンド、すなわち、それ自体が直接または間接的に検出可能であり得る二次結合パートナー（例えば、抗体またはアプタマー）に対して強い親和性を有する標識である。
【０２３６】
一般に、検出可能な標識は、さまざまな様式で可視化または検出され得、特定の検出様式は特定の検出可能な標識に基づいて選択されるが、ここで、代表的な検出手段としては、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
【０２３７】
種々の実施形態において、プレコンジュゲート標識は、１つ以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび／またはε−アミンリジン基を有するペプチド標識が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の標識に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸（例えば、リジン）が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
【０２３８】
ＬＢおよびＬＤ（共有結合性コンジュゲーション）
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、ＸとＴおよび／またはＷとＴ（包括的には、「構成要素」）の共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。該構成要素は、直接結合されていてもよく（すなわち、介在化学基なしで）、スペーサー（例えば、コンジュゲート要素とコンジュゲートの枠組構造の残部との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖）を介して間接的に結合されていてもよい。該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、任意の数の化学結合（例えば、限定されないが、アミド、アミン、エステル、エーテル、チオエーテル、イソ尿素、イミンなどの結合）によって共有結合され得ることは理解されよう。一部の特定の実施形態では、ＬＢおよび／またはＬＤ（一般的に、このセクションでの解釈上では「Ｌ」）は二重結合である。一部の実施形態では、Ｌは、Ｔの任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、ＸまたはＷのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Ｌは、ＸまたはＷの任意選択で置換されているカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、Ｔのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Ｌは、
【化３２】
2012516156.tif 000038
【０２３９】
である。一部の実施形態では、Ｌはスクシンイミド部分である。
【０２４０】
種々の実施形態において、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野で知られた「クリックケミストリー」反応を用いて共有結合され得る。該反応としては、例えば、付加環化反応、求核性開環反応、および炭素−炭素多重結合に対する付加が挙げられる（例えば、ＫｏｌｂおよびＳｈａｒｐｌｅｓｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ８：１１２８−１１３７、２００３ならびにそこに挙げられた参考文献ならびにＤｏｎｄｏｎｉ，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２：７００−７０８、２００７、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。上記に論考したように、種々の実施形態において、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、天然の、または化学的に付加した懸垂基を介して結合され得る。一般に、１対の反応性基の第１と第２の構成員（例えば、反応してアミド結合をもたらすカルボキシル基とアミン基）は、該構成要素と枠組構造のいずれか一方に存在し得る（すなわち、２つの構成員の相対位置は、これらが反応してコンジュゲートが得られる限り重要でない）ことは認識されよう。例示的な結合は、より詳細に以下に論考する。種々の実施形態において、カルボキシル（または反応性エステル）含有構成要素が、−ＯＨ含有枠組構造（ＯＢＦ）に、ＫｉｍらによるＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４：４８４３−４８５１（２００３）に概要が示された手順を用いてコンジュゲートされ得る。簡単には、ＯＢＦをＤＭＳＯに、カルボキシル含有構成要素とともに溶解させ、触媒としてのＮ’，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）によって、乾燥雰囲気下で反応させる。カルボキシル含有構成要素は、−ＮＨ２含有枠組構造（ＮＢＦ）に、カルボジイミド（ＥＤＡＣ）カップリング手順を用いてコンジュゲートされ得る。この手順を使用し、カルボキシル含有構成要素を、ｐＨ５の緩衝液中、ＥＤＡＣとの反応によって官能化した後、ＮＢＦに付加する。このような場合（および以下の任意の場合）ではいずれも、得られた生成物は、当業者に利用可能な任意の数の手段によって、例えば限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、および選択的沈殿によって精製され得る。
【０２４１】
種々の実施形態において、アミン含有構成要素は−ＣＯＯＨ含有枠組構造（ＣＢＦ）にカップリングされ得る。ＣＢＦには、活性化型エステル部分が使用されている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。簡単には、末端活性化カルボン酸エステル（例えば、−ＮＨＳ、−ＳＳＣ、−ＮＰＣなど）を有するＣＢＦを、無水有機溶媒（ＤＭＳＯまたはＤＭＦなど）に溶解させる。次いで、所望の当量数のアミン含有構成要素を添加し、室温で数時間混合する。また、アミン含有構成要素は、Ｂａｕｄｙｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３、１９９８に記載のように、安定なアミド結合を得るためにＣＢＦにコンジュゲートされ得る。この反応は、トリブチルアミン（ＴＢＡ）とクロロギ酸イソブチルを、ＣＢＦとアミン含有構成要素のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に、無水条件下で添加することにより行なわれ得る。あるいはまた、アミン含有構成要素をＯＢＦに、限定されないが、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ｆｌｕｏｒｂｏｒａｔｅ）（ＣＤＡＰ）、およびｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）などの試薬を用いるシアノ化（ｃｙａｎａｌａｔｉｏｎ）によってカップリングさせてもよい。ＣＮＢｒ反応は、水溶液中で弱塩基性ｐＨにて行なわれ得る。ＣＤＡＰ反応は、ＤＭＳＯと水の混合物中で弱塩基性ｐＨにて、触媒としてトリエチルアミン（ＴＥＡ）を用いて行なわれる。一部の特定の実施形態では、アミン含有構成要素はＮＢＦに、例えば、ピリジンを含む水性緩衝溶液中でのグルタルアルデヒドカップリング後、グリシンでのクエンチングによってコンジュゲートされ得る。一部の特定の実施形態では、アミン含有構成要素はアルデヒド含有枠組構造に、シッフ塩基カップリング手順の使用後、還元することによりコンジュゲートされ得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＭｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６、１９９９およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。簡単には、末端活性化型アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドなど）を有する枠組構造を、中性またはそれより低いｐＨを有する（好ましくないアルデヒドの加水分解を抑制するため）水性緩衝液に溶解させる。次いで、所望の当量数のアミン含有構成要素を添加し、室温で混合した後、過剰の適当な還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ナトリウムシアノボロヒドリド、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリドピリジンボラン、トリエチルアミンボランなど）を添加する。
【０２４２】
種々の実施形態において、ヒドロキシル含有構成要素はＯＢＦに、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）手順に従ってコンジュゲートされ得る。この手順を使用し、ＯＢＦをｐＨ１１．４の重炭酸緩衝液に添加し、ＤＶＳで活性化させ、続いてヒドロキシル含有構成要素を添加した後、グリシンを添加して反応液を中和およびクエンチする。また、ヒドロキシル含有構成要素をＯＢＦに、エステル結合をもたらす上記の活性化型エステル部分を用いてカップリングさせてもよい。
【０２４３】
種々の実施形態において、スルフヒドリル含有構成要素がマレイミド含有枠組構造（ＭＢＦ）に、チオエーテル結合をもたらす比較的穏和な手順を用いてカップリングされ得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。マレイミド基は活性化型エステルよりもはるかに加水分解されにくいため、反応を水性条件下で行なってもよい。簡単には、ＭＢＦをｐＨ６．５〜７．５の緩衝水溶液に溶解させた後、所望の当量数のスルフヒドリル含有構成要素を溶解させる。室温で数時間混合した後、チオエーテルカップリングコンジュゲートは精製され得る。スルフヒドリル含有構成要素を、Ｔｈｏｍａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５９１９−５９２９、１９９９に記載の方法に従ってＮＢＦにコンジュゲートさせてもよい。この反応は、ＮＢＦを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁させた後、２，６−ルチジンと酸無水物を添加し、続いて反応性の中間体を精製することを伴う。次いで、スルフヒドリル含有構成要素を該中間体のＤＭＦ溶液（トリエチルアミンを含む）に添加する。
【０２４４】
種々の実施形態において、アジド含有構成要素をアルキン含有枠組構造（ＡＢＦ）に、銅（Ｉ）触媒型の現代版Ｈｕｉｓｇｅｎ型アジド−アルキン付加環化を用いてカップリングさせると、１，４−ジ−置換１，２，３−トリアゾールを得ることができる（例えば、Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２：７００−７０８，２００７およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＤｅｄｏｌａら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．５：１００６−１０１７，２００７を参照のこと）。この反応は、一般的に「クリック」反応と称され、例えば、無希釈ＴＨＦ中で、触媒系としてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを用いて行なわれ得る（例えば、Ｗｕら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５７７５−５７７７、２００５を参照のこと）。また、この反応は、３：１（ＴＨＦ：水）混合物中、触媒系としてアスコルビン酸ナトリウムとＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを用いて行なわれ得る（例えば、Ｗｕら、上掲を参照のこと）。いずれの場合も、アジド含有構成要素をＡＢＦに所望の当量数で添加した後、室温で１２〜４８時間混合する。あるいはまた、アルキン含有構成要素をアジド含有枠組構造に、上記のものと厳密に同じ条件を用いてコンジュゲートさせてもよい。
【０２４５】
一部の特定の該構成要素は、天然で、１つより多くの同じ化学反応性部分を有するものであり得る。一部の例では、該構成要素が該部位のうちの唯一の部位で選択的に反応するように化学反応型および条件を選択することが可能である。例えば、インスリンが反応性アミンを介してコンジュゲートされている場合、一部の特定の実施形態では、Ｎ末端α−Ｐｈｅ−Ｂ１は、インスリン生理活性を保持するのに、Ｎ末端α−Ｇｌｙ−Ａ１およびε−Ｌｙｓ−Ｂ２９よりも好ましい結合部位である（例えば、Ｍｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６、１９９９およびそこに挙げられた参考文献、ならびにＴｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７を参照のこと）。インスリンとヘキサデセナール（末端がアルデヒドの分子）との例示的な反応において、研究者らにより、この２つの構成要素を、ナトリウムシアノボロヒドリドの存在下、５４％イソプロパノールを含む１．５ＭのｐＨ６．８のサリチル酸ナトリウム水溶液中で、１：６（インスリン：アルデヒドｍｏｌ／ｍｏｌ）の比で一晩混合すると、単一置換Ｐｈｅ−Ｂ１第２級アミンコンジュゲート生成物への８０％を超える変換がもたらされることが見出された（Ｍｅｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６、１９９９）。彼らの研究により、溶媒、ｐＨ、およびインスリン：アルデヒド比の選択はすべて、反応の選択性および収率に影響を及ぼすことが示された。しかしながら、ほとんどの場合、化学反応条件の選択によって選択性を得ることは困難である。したがって、一部の特定の実施形態では、反応に所望される１つの部位以外すべての部位の該構成要素（例えば、インスリン）を選択的に保護し、続いて、物質体を反応させ、精製した後、脱保護工程を行なうことが好都合な場合があり得る。例えば、文献にて入手可能なインスリンのアミン基の選択的保護の例は数多くあり、酸性（ＢＯＣ）、弱酸性（無水シトラコン酸）、および塩基性（ＭＳＣ）条件下で脱保護され得るものが挙げられる（例えば、Ｔｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８、１９９７；Ｄｉｘｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０９：３１２−３１４、１９６８；およびＳｃｈｕｅｔｔｌｅｒら、Ｄ．Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６０：１７２１、１９７９を参照のこと）。一例では、Ｇｌｙ−Ａ１とＬｙｓ−Ｂ２９のアミンがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基で選択的に保護され得、次いで、この基は、９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／１０％アニソールの溶液中、４Ｃで１時間のインキュベーションによるコンジュゲーション後に除去される。一実施形態では、インスリンの乾燥粉末を無水ＤＭＳＯに溶解させた後、過剰のトリエチルアミンを溶解させる。この溶液に、ほぼ２当量の重炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル溶液（ＴＨＦ中）をゆっくり添加し、溶液を３０〜６０分間混合する。反応後、粗製溶液を過剰のアセトンに注入した後、希ＨＣｌを滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。この沈殿物を遠心分離し、アセトンで洗浄し、真空下で完全に乾燥させる。所望のジ−ＢＯＣ保護生成物は、未反応インスリン、所望でないジ−ＢＯＣ異性体、ならびにモノ−ＢＯＣおよびトリ−ＢＯＣ副生成物から、分取用逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離され得る（例えば、Ｔｓａｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８、１９９７を参照のこと）。逆相ＨＰＬＣの場合、粗製生成物の７０％水／３０％アセトニトリル溶液（０．１％のＴＦＡ含有）をＣ８カラムに負荷し、アセトニトリル漸増勾配により溶出させる。所望のジ−ＢＯＣピークを収集し、回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋な生成物を得る。
【０２４６】
ＬＲＰＢおよびＬＲＰＤ（非共有結合性コンジュゲーション）
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、ＸとＴおよび／またはＷとＴ（包括的には、「構成要素」）の非共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数（Ｋｄ）が１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野でよく知られた非共有結合性のリガンド−受容体ペア（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア）によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が該構成要素に共有結合され、該ペアの他方の構成員がコンジュゲートの枠組構造に共有結合される。該構成要素とコンジュゲート枠組構造を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、該構成要素がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド／受容体ペアとしては、タンパク質／補因子および酵素／基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン／アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリン、およびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。他にも適当なリガンド／受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）、さらには、Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｐｐ．１０５−１５２、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９０；「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｐａｓｃａｌ  Ｂａｉｌｌｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０００；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎらによる「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２に記載のものなどのエピトープタグとのペアでのモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
【０２４７】
ｋおよびｑ
一般式（ＩＩ）のコンジュゲートでは、ｋは２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定する。一部の特定の実施形態では、ｋ＝２または３である。ｑは１〜４（両端を含む）の整数であり、中央の−Ａ−基に結合されたＤ基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｑ＝１である。一部の実施形態では、ｑ＝２である。ｋ＋ｑは３〜６（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋ＋ｑ＝３または４である。
【０２４８】
一般式（ＩＩＩ）のコンジュゲートでは、ｊが２、３または４のとき、ｋは、１〜１１（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋは１、２または３である。ｑは１〜４（両端を含む）の整数であり、中央の−Ａ−基に結合されたＤ基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｑ＝１である。一部の実施形態では、ｑ＝２である。ｋ＋ｑは３〜６（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｋ＋ｑ＝３または４である。
【０２４９】
ｐおよびｍ
存在するｐは各々、独立して１〜５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、存在する各ｐは同じである。一部の特定の実施形態では、ｐ＝１、２または３である。一部の特定の実施形態では、ｐ＝１である。
【０２５０】
存在するｍは各々、独立して１〜５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、存在する各ｍは同じである。一部の特定の実施形態では、ｍ＝１、２または３である。一部の特定の実施形態では、ｍ＝１である。
【０２５１】
ｎおよびｖ
存在するｎは各々、独立して０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在するｎの少なくとも１つは≧１であるものとする。所与のｋ−分岐部内の分岐を、本明細書ではｎ−分岐部と称する。
【０２５２】
一部の特定の実施形態では、ｐ−括弧部分内に存在する−Ａ−は各々、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている（例えば、上記式（ＩＩａ）を参照のこと）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｎは同じである。このような実施形態の一部において、ｎ＝１または２である。
【０２５３】
他の実施形態では、ｐ−括弧部分内の末端に存在する−Ａ−のみが、ｎ≧１の値に該当する数のｎ−括弧部分で置換されている（例えば、上記の式（ＩＩｂ）を参照のこと）。一部の特定の実施形態では、各ｋ−分岐部に含まれるｎ≧１の存在は１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｎ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｎは同じである。このような実施形態の一部において、ｎ＝１または２である。
【０２５４】
存在するｖは各々、独立して０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在するｖの少なくとも１つは≧１であるものとする。
【０２５５】
一部の特定の実施形態では、ｍ−括弧部分内に存在する−Ａ−は各々、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている（例えば、上記式（ＩＩｃ）を参照のこと）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。
【０２５６】
他の実施形態では、ｍ−括弧部分内の末端に存在する−Ａ−のみが、ｖ≧１の値に該当する数のＢ部分で置換されている（例えば、上記式（ＩＩｄ）を参照のこと）。一部の特定の実施形態では、各ｋ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｖ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。一部の特定の実施形態では、各ｎ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が少なくとも１つである。一部の特定の実施形態では、各ｎ−分岐部は、含まれるｖ≧１の存在が１つだけである（すなわち、存在する他のすべてのｖ＝０）。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各ｖは同じである。このような実施形態の一部において、ｖ＝１または２である。
【０２５７】
ｊ
式（ＩＩＩ）のｊは１〜４（両端を含む）の整数であり、Ｄ基へのコンジュゲーションの数を規定する。一部の特定の実施形態では、ｊ＝１である。一部の特定の実施形態では、ｊ＝２である。一部の実施形態では、ｊ＝３である。他の実施形態では、ｊ＝４である。
【０２５８】
負荷レベル
一般に、コンジュゲートに負荷される薬物（または検出可能な標識）の数は、該薬物（または検出可能な標識）の分子量に依存し、コンジュゲートの枠組構造の分子量および／または化学的活性化（すなわち、懸垂基を枠組構造に付加した場合）のレベルを調整することにより制御され得る。種々の実施形態において、薬物および／または検出可能な標識の負荷レベルは、コンジュゲート（例えば、薬物など）に対して薬物および／または検出可能な標識が５〜９９％ｗ／ｗの範囲であり得る。種々の実施形態において、５０〜９９％のより狭い範囲内（例えば、８０〜９９％の範囲）の負荷レベルが使用され得る。
【０２５９】
その他
種々の実施形態において、生物分解性の枠組構造が使用され得る。種々の実施形態において、例えば、生物分解性が適用用途に関係がない場合、および／または得られた枠組構造もしくはコンジュゲートが充分に良好に排出され、生物分解性が必要でない場合は、非生物分解性の枠組構造が使用され得る。種々の実施形態において、コンジュゲートの枠組構造（またはスペーサー（例えば、薬物と枠組構造の間に存在する場合））は、酵素による消化に感受性である。種々の実施形態において、酵素は投与部位に存在する。当業者には、コンジュゲート枠組構造を切断することがあり得るいくつかの酵素が患者に存在することが認識されよう。限定されないが、このようなものとしては、サッカリダーゼ、ペプチダーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる。例示的なサッカリダーゼとしては、限定されないが、マルターゼ、スクラーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、およびデキストラナーゼが挙げられる。例示的なペプチダーゼとしては、限定されないが、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、およびグリシルグリシンジペプチダーゼが挙げられる。例示的なヌクレアーゼとしては、限定されないが、デオキシリボヌクレアーゼＩ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼ（ｒｉｂｏｎｕｃｅｌａｓｅ）Ｔ１、およびヌクレアーゼＳｌが挙げられる。
【０２６０】
また、当業者には、酵素の選択によっては、酵素的切断に感受性であるコンジュゲート枠組構造がいくつか存在することが認識されよう。例えば、サッカリダーゼ分解が所望される場合、多糖類を含む枠組構造が使用され得る（例えば、限定されないが、１，４−結合α−Ｄ−グルコース残基の反復鎖を含む多糖を含むコンジュゲートは、α−アミラーゼによって分解される）。限定されないが、好適な多糖類としては、任意の数の供給源、例えば限定されないが、スイートコーン、牡蠣、肝臓（ヒト、ウシ、ウサギ、ラット、ウマ）、筋肉（ウサギ脚部、ウサギ腹部、魚、ラット）、ウサギの毛、フナガイ（ｓｌｉｐｐｅｒ  ｌｉｍｐｅｔ）、パン酵母、および真菌由来のグリコゲンおよび部分消化グリコゲンが挙げられる。使用され得る他の多糖ポリマーおよびスペーサーとしては、カルボキシル化多糖類、−ＮＨ２懸垂多糖類、ヒドロキシル化多糖類、アルギネート、コラーゲン−グリコサミノグリカン、コラーゲン、マンナン、アミロース、アミロペクチン、セルロース、ヒアルロネート、コンドロイチン、デキストリン、キトサンなどが挙げられる。ペプチダーゼ切断が所望される場合、切断酵素によって認識されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが使用され得る（例えば、限定されないが、［−グリシン−プロリン−］配列を含むコンジュゲートは、プロリダーゼによって分解される）。一部の特定の実施形態では、アミン化アミノ酸と非アミン化アミノ酸のコポリマー、ヒドロキシル化アミノ酸と非ヒドロキシル化アミノ酸のコポリマー、カルボキシル化アミノ酸と非カルボキシル化アミノ酸のコポリマー、上記のもののコポリマーまたは上記のものの付加物が使用され得る。ヌクレアーゼ分解が所望される場合、ポリヌクレオチドが使用され得る（例えば、限定されないが、連続アデノシン残基のオリゴマーを含むポリヌクレオチドを含むコンジュゲートは、リボヌクレアーゼＡによって分解される）。
【０２６１】
種々の実施形態において、コンジュゲート（すなわち、コンジュゲート型薬物および／または化学的もしくは酵素的分解によってコンジュゲートから放出された薬物）の薬物動態的および／または薬力学的挙動は、対応する非コンジュゲート薬物と実質的に同じであり得る（例えば、ともに、皮下投与した場合）。例えば、薬物動態的（ＰＫ）見地から、血清濃度曲線は、同等量の非コンジュゲート薬物を投与した場合と実質的に同じであり得る。付加的または択一的に、血清Ｔ最大、血清Ｃ最大、平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期は、非コンジュゲート薬物を投与した場合と実質的に同じであり得る。薬力学的（ＰＤ）見地からは、該コンジュゲートは、体内物質に対して、非コンジュゲート薬物と実質的に同様に作用し得る。例えば、インスリンコンジュゲートの場合、該コンジュゲートは、血中グルコースレベルに対して非コンジュゲートインスリンと実質的に同様の影響を及ぼし得る。この場合、実質的に同様の薬力学的挙動は、最小血中グルコース濃度（Ｔ底）に達するまでの時間、血中グルコースレベルが初期値の一定の割合より下（例えば、初期値の７０％またはＴ７０％ＢＧＬ）の状態に維持される持続時間など比較することにより観察され得る。このようなＰＫおよびＰＤ特性は、公開された任意のさまざまな薬物動態的および薬力学的方法に従って測定され得ることは認識されよう（例えば、皮下送達に適した方法については、Ｂａｕｄｙｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３、１９９８を参照のこと）。
【０２６２】
一実施形態において、コンジュゲート（すなわち、アプタマーなしの単離された形態）では、非コンジュゲート薬物で測定される値の４０％以内である薬物動態的（ＰＫ）パラメータ（最大血清薬物濃度に達する時間（Ｔ最大）、平均薬物滞留時間（ＭＲＴ）、血清半減期、および平均薬物吸収時間（ＭＡＴ）など）が得られる。種々の実施形態において、コンジュゲートでは、非コンジュゲート薬物で得られるものの３５％、３０％、２５％、２０％、１５％以内、あるいはさらに１０％以内であるＰＫパラメータが得られる。一部の実施形態では、コンジュゲートでは、非コンジュゲート薬物で得られるものの２０％以内であるＰＫパラメータが得られる。例えば、皮下送達のためのインスリンコンジュゲートに関する実施形態では、コンジュゲートで、１５〜３０分のインスリンＴ最大、５０分未満の平均インスリン滞留時間（ＭＲＴ）、または４０分未満の平均インスリン吸収時間（ＭＡＴ）が得られ得、これらはすべて、ヒト組換えインスリン処置群で測定される値の２０％以内である。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、２０〜２５分のインスリンＴ最大、４５分未満の平均インスリン滞留時間（ＭＲＴ）、および３５分未満の平均インスリン吸収時間（ＭＡＴ）が得られ得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、１２０分未満、例えば、１００分未満の血清半減期が得られ得る。
【０２６３】
一実施形態において、本発明のコンジュゲートでは、物質の最小／最大血中濃度に達する時間（Ｔ底／Ｔ最大）または物質の血中レベルが初期値の７０％より下／１３０％より上の状態に維持される持続時間（Ｔ７０％ＢＬ／Ｔ１３０％ＡＬ）などの薬力学的（ＰＤ）パラメータが得られる。例えば、皮下送達のためのインスリンコンジュゲートに関する実施形態では、コンジュゲートで、４５〜６０分のグルコースＴ底および１８０分未満のグルコースＴ７０％ＢＬが得られ得、これらはどちらも、ヒト組換えインスリン処置群で測定される値の２０％以内である。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、５０〜５５分のグルコースＴ底および１６０分未満のグルコースＴ７０％ＢＧＬが得られ得る。種々の実施形態において、コンジュゲートで、非コンジュゲート薬物で得られるものの４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％以内、あるいはさらに１０％以内であるＰＤパラメータが得られる。一部の実施形態では、コンジュゲートで、非コンジュゲート薬物で得られるものの２０％以内であるＰＤパラメータが得られる。
【０２６４】
コンジュゲートの調製のための中間体
一態様において、本発明は、本開示のコンジュゲートを調製するための試薬を提供する。したがって、種々の実施形態において、一般式（ＩＩ）：
（式中、−Ａ−、Ｔ、Ｄ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
Ｂは、−Ｔ−ＬＢ’であり；
存在するＬＢ’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である）の化合物が提供される。
【０２６５】
他の実施形態では、一般式（ＩＩ）：
（式中、−Ａ−、Ｔ、Ｂ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し；
Ｄは、−Ｔ−ＬＤ’であり；
存在するＬＤ’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である）の化合物が提供される。
【０２６６】
コンジュゲートの調製方法
本発明者らは、例示的な薬物としてインスリン、ならびに例示的な親和性リガンドとしてアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）、および／またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を使用し、前記コンジュゲートの調製方法の例を示した。限定されないが、２つの親和性リガンドと１つの薬物分子を有し、すべての枠組構造の構成要素間の距離が短いコンジュゲートは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、ｔｒｉｓ−スクシンイミジル−１，３，５−ベンゼントリカルボキシレート（ＴＳＢ）、およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−４−酪酸−ＮＨＳ−エステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ４）をコンジュゲート枠組構造として用いて調製され得る。枠組構造の構成要素間にさらなる間隔が所望される場合は、スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−Ｃ６）、スクシンイミジル（６−アミノ（ＰＥＯ−６））アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６）、ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−６−アミノカプロン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ６）、およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−−１０−アミノデカン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ１０）が使用され得る。ＴＳＡＴ−Ｃ６スペーサーアームの化学的性質はＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６と比べ、該コンジュゲートに対して、より疎水性の性質を付与する。
【０２６７】
例えば、例示の目的で、一実施形態において、親和性リガンド（例えば、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＭＢおよびＡＥＴＭ）とインスリンの両方を、ＴＳＡＴ−Ｃ６枠組構造に対して、末端活性化型エステルを介して反応させると、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＧ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭＢ−２、およびインスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２  コンジュゲートが得られ得る。本実施例に論考しているように、種々の親和性リガンドを事前に合成する。また、インスリンのＡ１およびＢ２９アミノ基は、本実施例に記載のようにして、各インスリンがＰｈｅ−Ｂ１  α−アミノ基でのみ反応し得るようにＢＯＣ−保護する。ほぼ１当量のＢＯＣ−インスリンを、４０〜５０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液として、室温で、過剰のトリエチルアミンを含有する５０ｍｇ／ｍｌのＴＳＡＴ−Ｃ６のＤＭＳＯ溶液に添加し、ほぼ１時間反応させる。次に、過剰のＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよび／またはＡＥＴＭ（２〜１０当量）を１００ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液として添加し、さらに２時間反応させる。反応後、このＤＭＳＯ溶液をｐＨ５の生理食塩水緩衝液中で１０倍に超希釈した後、ｐＨを８．０に調整し、溶液をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通して低分子量反応体および塩類を除去する。ボイド画分中に溶出された物質を、３Ｋ限外濾過装置を用いて濃縮した後、これを、分取規模の逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ８，０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリル／水移動相）にインジェクションし、所望の生成物を未反応ＢＯＣ２−インスリンから精製する。所望の溶出ピークを収集し、プールし、回転濃縮してアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得る。最後に、この凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに４Ｃで１時間溶解させた後、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）中で１０倍超希釈することにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した後、この物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通して、アニソール、ＢＯＣ、および他の混入塩を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、所望のレベルまで濃縮し、必要時まで４Ｃで保存する。
【０２６８】
この例示的な手順を使用し、ＴＳＡＴ−Ｃ６枠組構造を異なる枠組構造（後述）で置き換えることにより、親和性リガンドと薬物が異なる、コンジュゲーション化学反応が異なる、枠組構造の構成要素間の間隔が異なる、および／または結合価が異なる他のコンジュゲートが作製され得ることは認識されよう。
【０２６９】
例えば、枠組構造の構成要素間にさらなる距離が必要とされる場合、および／またはコンジュゲーション部位に保存電荷が必要とされる場合は、適切なサイズのアミン含有ジエチルアセタール（例えば、アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（ＡＰＤＡ）またはアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ））を、本明細書に記載の該枠組構造上の反応性基の１つにコンジュゲートさせた後、残りの反応性基と対象の親和性リガンド（例えば、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、またはＡＥＴＭ）との反応を完了させてもよい。次いで、酸性条件下で該ジエチルアセタールから反応性アルデヒド基を顕在化させた後、インスリンとの還元的アミノ化を行なうと、薬物コンジュゲーション工程が完了し得、次いで、ＡＢＤＡ−ＴＳＡＴ、ＡＢＤＡ−ＬＣＴＳＡＴなどが使用され得る。
【０２７０】
また別の例では、テトラキス−（Ｎ−スクシンイミジルカルボキシプロピル）ペンタエリトリトール（ＴＳＰＥ）を使用し、多価性の増大のために３つの親和性リガンドと１つ薬物分子が結合され得る。また、上記のいずれかの教示を用いて、さらに高次の結合価を有する超分岐（例えば、デンドリマー様）コンジュゲートが作製され得ることは当業者に認識されよう。例えば、ＲｏｅｃｋｅｎｄｏｒｆおよびＬｉｎｄｈｏｒｓｔにより、Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２１７：２０２−２３８、２００１に、超分岐構造を作製するための現行のアプローチの包括的な概説が示されている。
【０２７１】
さらに、既に所定の多価性度合を含むリガンドを、上記の手順に従って再度反応させ、さらに高次のリガンド多重性を得てもよい。例えば、反応性末端アミンを含む二価のＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、またはＡＥＴＭ−２分子は、２つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製され得る。反応性末端アミンを含む三価のＡＥＭ−３、ＡＥＢＭ−３、またはＡＥＴＭ−３分子は、３つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製され得る。ＮＨ２−二価糖類を上記のものと同じ枠組構造と反応させると、薬物分子１つあたり４〜６個のリガンドを有する薬物コンジュゲートが得られ得る。ＮＨ２−三価糖類を上記のものと同じ枠組構造と反応させると、薬物分子１つあたり６〜９個のリガンドを有する薬物コンジュゲートが得られ得る。
【０２７２】
すべての場合において、異なるリガンドの混合物は同じ薬物に、多価枠組構造の化学的性質、結合価、およびリガンド：該枠組構造の化学量論性を調整することにより該枠組構造を介してコンジュゲートされ得ることを認識されたい。例えば、インスリン−ＡＥＭ−１−ＡＥＢＭ−１、インスリン−ＡＥＢＭ−１−ＡＥＴＭ−１、インスリンＡＥＭ−２−ＡＥＴＭ−２、およびインスリンＡＥＭ−１−ＡＥＴＭ−２はすべて、この混合型リガンド法に従って合成され得る。
【０２７３】
最後に、一部の場合では、親和性リガンドを枠組構造に、薬物とは異なる手段によってコンジュゲートさせることが望ましい場合があり得る。例えば、二価マレイミド／活性（ａｃｔｉｖａｔｅ）一価エステル官能化枠組構造（例えば、スクシンイミジル−３，５−ジマレイミドフェニルベンゾエート（ＳＤＭＢ））は、２つのスルフヒドリル官能化親和性リガンドと、１つのアミン官能化薬物を個別の工程でコンジュゲートさせるために使用され得る。例えば、インスリンまたは別のアミン含有薬物が枠組構造の活性化型エステル部分に、本明細書に記載の方法を用いてコンジュゲートされ得る。別工程で、アミノエチル糖類（ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）を、４−イミノチオランを用いた反応によって、末端スルフヒドリル含有リガンドに変換させてもよい。最後に、枠組構造−ジ−マレイミド−インスリンコンジュゲートを、過剰のスルフヒドリル官能化糖類と混合すると、二価糖類−インスリンコンジュゲートの生成がもたらされ得る。
【０２７４】
架橋物質体
コンジュゲートと架橋剤を標的分子の非存在下で合わせると、非共有結合性架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は、水溶液中で、アプタマーとコンジュゲートの溶液を混合することにより自己集合によって調製され得る。種々の実施形態において、逆乳化によって該物質体の粒子が調製され得る。より詳細に米国特許出願公開公報第２００４−０２０２７１９に記載されているように、これは、前記水溶液を、疎水性液と界面活性剤の混合物に添加し、混合物を撹拌することにより行なわれ得る。
【０２７５】
架橋物質体は、形成されたら、さまざまな適用用途に使用され得る。該物質体を遊離標的分子の存在下に入れると、該分子は、架橋剤とコンジュゲート間の相互作用に関して競合する。ある一定濃度より上の遊離標的分子では、競合レベルは、コンジュゲートが表面から放出されることにより、該物質体が分解され始めるようなものになる。種々の実施形態において、放出の程度および／または速度は、標的分子の濃度が増大するにつれて増大する。その結果、コンジュゲートは該物質体から、標的分子の局所濃度に直接関連する様式で放出される。
【０２７６】
一般に、該物質体の放出特性は、アプタマー、コンジュゲート、標的分子の性質および条件（例えば、ｐＨ、温度など）に依存する。アプタマーの親和性が、標的分子に対するよりもコンジュゲートに対する方がずっと大きい場合、該物質体は、高い標的分子濃度でコンジュゲートのみを放出する。コンジュゲートに対するアプタマーの相対親和性が減少するにつれて、該物質体からのコンジュゲートの放出は、より低い標的分子濃度で起こる。また、該物質体の放出特性は、コンジュゲートに対するアプタマーの相対量を変更することにより調整され得る。コンジュゲートに対するアプタマーの比率が高いほど、より高い標的分子濃度でコンジュゲートを放出する物質体がもたらされる。コンジュゲートに対するアプタマーの比率が低いほど、より低い標的分子濃度でコンジュゲートを放出する物質体がもたらされる。適用用途に応じて、このような変更により、多種多様な標的分子濃度に応答する物質体を作製することが可能なことは認識されよう。
【０２７７】
種々の実施形態において、架橋物質体は、３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ）に入れたとき不溶性である。種々の実施形態において、標的分子を該緩衝液に、セットポイントと称される閾値濃度まで添加したとき、架橋物質体は実質的に不溶性のままである。セットポイントより上では、架橋物質体は、コンジュゲートの放出の程度および速度の増大を示す。この遷移は、急激に起こることもあり、セットポイント近くの一連の濃度にわたって緩徐に起こり得ることは認識されよう。一般に、所望のセットポイントおよび遷移は、標的分子の性質および該物質体の意図される適用用途に依存する。特に、該物質体を、特定の標的分子のレベルの増大に応答するように設計した場合、所望のセットポイントは、標的分子の通常の生理学的濃度範囲に基づいて決定される。患者内に存在する標的分子の量は、内的および／または外的要因に基づいて変動し得ることは理解されよう。例えば、一部の特定の実施形態では、標的分子の量は、例えば、ホルモン性サイクルまたは代謝経路の変化（耐久事象の際に増大する乳酸など）に応答して経時的に自然に変動し得る。一部の特定の実施形態では、該変動は、外的事象、例えば、食後のグルコースの増大に起因するものであり得る。種々の実施形態において、外的要因は、本開示の物質体からのコンジュゲートの放出を人工的に誘発するために使用され得る。例えば、コンジュゲートの放出がグルコースの増加に感受性である場合、コンジュゲートは、高グルコース飲料の摂取により、短期間で人工的に放出され得る。
【０２７８】
種々の実施形態において、標的分子はグルコースである。ヒトの通常のグルコースの生理学的濃度範囲は６０〜２００ｍｇ／ｄＬである。６０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース濃度を低血糖とみなす。２００ｍｇ／ｄＬより高いグルコース濃度を高血糖とみなす。種々の実施形態において、本開示の物質体は、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、実質的に不溶性のままであり得る。種々の実施形態において、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、溶解する物質体は１、２、４、６、８または１０％未満である。種々の実施形態において、５０ｒｐｍでＵＳＰ溶出試験法ＩＩを使用し、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを有する３７ＣでｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に６時間入れたとき、本開示の物質体の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％が溶解する。
【０２７９】
以下の表に、他の例示的な標的分子の通常の生理学的範囲を示す。
【表３】
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これらおよび他の標的分子に対する所望のセットポイントは、さまざまな異なる適用用途に対して容易に決定され得ることは認識されよう。また、セットポイントは、特定の患者（例えば、患者の性別、患者が異常に低い、もしくは高レベルの標的分子を有することなどに基づいて）または適用用途（例えば、高頻度基準で放出するように設計された薬物送達系は、低頻度で放出するように設計された系よりも低い閾値濃度を必要とし得る）に対して調整する必要があり得ることも認識されよう。
【０２８０】
所望のセットポイントを有する物質体は、本明細書に記載の材料および方法を用いて、常套的な実験手法によって作製され得ることは認識されよう。例えば、同じアプタマーとコンジュゲートを組み合わせて、コンジュゲートに対するアプタマーの比（ｗ／ｗ）を漸増させた一連の物質体を作製することができる。このような物質体は、ある範囲のセットポイントをカバーする。適当なセットポイントを有するリード物質体が特定されたら、最適化物質体を得るために、より精密な解像を用いて該プロセスを繰り返してもよい。択一的に（または付加的に）、同じコンジュゲートを、該コンジュゲートに対して親和性を漸増させた複数の異なるアプタマーと組み合わせてもよい。これにより、ある範囲のセットポイントを有する複数の物質体が得られ、これを、さらに精密化してもよい（例えば、コンジュゲートに対するアプタマーのｗ／ｗ比を変更することにより）。あるいはまた、同じアプタマーを複数の異なるコンジュゲートと組み合わせることにより該プロセスを開始してもよい。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、該アプタマーに対して種々の親和性を有するものであり得る（例えば、異なる親和性リガンドを含めた結果として）。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、同じ親和性リガンドを含むが、異なる分子量を有するものであり得る（例えば、コンジュゲート枠組構造が異なる結果として）。
【０２８１】
使用
別の態様では、本開示により、該物質体の使用方法を提供する。一般に、該物質体は、標的分子に応答して該コンジュゲートを制御可能に放出させるために使用され得る。以下に論考するように、該物質体は標的分子と、インビトロで接触させてもよく、インビボで接触させてもよい。
【０２８２】
種々の実施形態において、該物質体は、インビトロまたはインビボ化学センサーの構成要素として使用され得る。この態様を以下に、グルコースセンサーとの関連において説明するが、前述のことから、単に異なる標的分子を使用することで、他の化学センサーが作製され得ることは認識されよう。
【０２８３】
例えば、種々の実施形態において、本開示の物質体は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づいたグルコースセンサーに使用され得る。ＦＲＥＴは、２種類の異なるフルオロフォアが互いに近づくと、これにより、この２種類のフルオロフォア間でのエネルギー転移が可能になり、一方または両方のフルオロフォアの蛍光の減少（蛍光の消光と称される）がもたらされることに基づいている（Ｂａｌｌｅｒｓｔａｄｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３４５：２０３−２１２、１９９７）。例えば、一部の特定の実施形態において、グルコースの非存在下では、蛍光標識アプタマーと蛍光標識コンジュゲートの混合物が不溶性の架橋物質体を形成し、近隣のフルオロフォアがＦＲＥＴを受ける。グルコースの存在下では、蛍光標識アプタマーと蛍光標識コンジュゲート間の平均距離が増大して、ＦＲＥＴレベルの減少が引き起こされ、それにより、個々の蛍光シグナルの増大がもたらされる。そのため、蛍光レベルはグルコースレベルと直接相関し得る。蛍光標識ペアの代わりに、近接すると測定可能な応答をもたらす択一的な標識ペアを使用してもよいことは理解されよう。したがって、一部の特定の実施形態では、本発明は、（Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーであって、第１の標識を含む多価ポリヌクレオチドアプタマーと、（ｂ）親和性リガンドおよび第２の標識を含むコンジュゲートと、を混合する工程、ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると、測定可能な応答をもたらす；（ＩＩ）試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと該コンジュゲートの混合物に曝露する工程、ここで、（ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、該コンジュゲートは該ポリヌクレオチドアプタマーと、該ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって架橋物質体を形成し、測定可能な応答をもたらし、（ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが該コンジュゲートと、該ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、該架橋物質体の形成が抑止されるため応答が低減される；ならびに（ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程を含む方法を提供する。一部の特定の実施形態では、第１および第２の標識は蛍光標識であり、応答は蛍光シグナルである。
【０２８４】
一部の特定の実施形態では、２つの標識（例えば、蛍光標識）は、同じポリヌクレオチドアプタマーに結合することにより近接する異なる分子上に配置され得る。したがって、一部の特定の実施形態では、本発明は、（Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーと、（ｂ）親和性リガンドおよび第１の標識を含む第１の分子群と、（ｃ）親和性リガンドおよび第２の標識を含む第２の分子群と、を混合する工程、ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらす、（ＩＩ）試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと第１の分子群および第２の分子群との混合物に曝露する工程、ここで、（ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、第１の分子群および第２の分子群の構成員は、該多価ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって近接し、結合複合体および測定可能な応答をもたらし、（ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが、第１および第２の分子と、該多価ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、前記結合複合体の形成が少なくなるため応答が低減される；ならびに（ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程を含む方法を提供する。一部の特定の実施形態では、第１および第２の標識は蛍光標識であり、応答は蛍光シグナルである。
【０２８５】
他の例示的な実施形態において、本開示の物質体は、粘度系グルコースセンサーに使用され得る（例えば、米国特許第６，２６７，００２号；同第６，４７７，８９１号；および同第６，９３８，４６３号を参照のこと）。この場合も、コンジュゲートとアプタマーを合わせると架橋物質体が形成される。次に、該物質体にグルコースを添加すると、測定可能な（例えば、円錐平板型構造のマイクロビスコメータ機構を使用し、剪断速度の関数として）粘度の濃度依存的低下が引き起こされる。そのため、試料の粘度は、グルコースレベルと直接相関し得る。これらの２つの例示的なグルコースセンサーは、該コンジュゲート内になんら薬物の存在を必要としないことは認識されよう。また、該粘度系センサーは、該コンジュゲート内に検出可能な標識の存在を必要としないことも認識されよう。
【０２８６】
一部の特定の実施形態では、本発明は、（Ｉ）（ａ）複数の親和性リガンドを含むコンジュゲートと、（ｂ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーを準備する工程；（ＩＩ）該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマーを混合する工程、ここで、得られた混合物の粘性は、該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマー間の結合によるものである；（ＩＩＩ）該混合物を、グルコースを含む試料と接触させる工程、これにより、該コンジュゲートが該ポリヌクレオチドアプタマーから外れ、濃度依存性の粘性の低下が引き起こされる；ならびに（ＩＶ）生じた粘性の変化を検出し、任意選択で該変化を測定し、試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定する工程を含む方法を提供する。
【０２８７】
種々の実施形態において、該物質体は、患者に薬物を制御可能に送達するために使用され得る。本発明は、本開示の物質体を投与することによる疾患または病状の処置を包含する。該物質体は、任意の患者（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、マウスなど）の処置に使用され得るが、ヒトの処置に最も好ましく使用される。該物質体は、患者に任意の経路によって投与され得る。一般に、最も適切な投与経路は、さまざまな要素、例えば、処置対象の疾患または病状の性質、薬物の性質、標的分子の性質、患者の体調などに依存する。一般に、本開示は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、脳室内、経皮、経直腸、膣内、腹腔内、経表面（粉剤、軟膏もしくは滴剤により）、口腔内による投与、または経口もしくは経鼻スプレー剤もしくはエーロゾル剤としての投与を包含する。このような種々の経路のための医薬組成物の製剤化および製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５に記載されている。
【０２８８】
種々の実施形態において、該物質体は、例えば注射によって皮下投与され得る。該物質体を、送達を容易にするための担体に溶解させてもよい。例えば、担体は、水溶液、限定されないが、例えば滅菌水、生理食塩水または緩衝生理食塩水であり得る。一般に、コンジュゲート形態の薬物の治療有効量が投与される。薬物の「治療有効量」により、妥当な便益／リスク比（これは、薬物の有効性と毒性の均衡が関与する）で疾患または病状を処置するのに（例えば、その症状が改善される、進行が遅延される、再発が抑制される、発症が遅延されるなどに）充分な薬物の量を意図する。一般に、治療有効性と毒性は、標準的な薬理学的手順によって、細胞培養物において、または実験動物を用いて、例えば、ＥＤ５０（処置した被検体の５０％において治療上有効である用量）およびＬＤ５０（処置した被検体の５０％に対して致死性の用量）を計算することにより判定され得る。ＥＤ５０／ＬＤ５０は薬物の治療指数を表す。一般に、当該技術分野で周知のように、大きな治療指数を有する薬物が好ましいが、重篤な疾患または病状の場合、特に、択一的な治療選択肢がない場合は、小さい治療指数が許容され得る。ヒトに対する投与のための適切な最終選択用量範囲は、臨床試験の過程で決定される。
【０２８９】
種々の実施形態において、薬物はインスリンであり、インスリンの平均日用量は１０〜２００Ｕ、例えば、２５〜１００Ｕの範囲である（ここで、インスリン１単位は約０．０４ｍｇである）。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量を伴う量の該物質体が、１日単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の５〜１０倍の用量を伴う量の該物質体が、１週間単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の１０〜２０倍の用量を伴う量の該物質体が、隔週単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の２０〜４０倍の用量を伴う量の該物質体が、月単位で投与される。当業者には、この同じアプローチを、用量範囲が既知の承認された他の薬物（例えば、本明細書に記載の承認されたインスリン感受性改善薬およびインスリン分泌促進薬のいずれか）に当てはめてもよいことは認識されよう。
【０２９０】
任意の所与の患者に対する薬物の１日の総使用量は、担当医師によって妥当な医学的判断の範囲内で決定されることは理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量は、さまざまな要素、例えば、処置対象の疾患または病状；使用される具体的な薬物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；使用される具体的な薬物の投与期間、投与経路および排出速度；処置の持続時間；使用される具体的な薬物と併用して、または同時に使用されている薬物；ならびに医学分野で周知の同様の要素に依存する。種々の実施形態において、本開示の物質体は、１回より多くの場合で投与され得る。例えば、本開示は、具体的に、該物質体が患者に皮下注射によって、連続的スケジュール（例えば、１日１回、２日に１回、週１回、２週間に１回、月１回など）で投与される方法を包含する。
【０２９１】
一部の特定の実施形態では、本開示の物質体は、患者（例えば、哺乳動物患者）の高血糖症を処置するために使用され得る。一部の特定の実施形態では、患者は糖尿病である。しかしながら、本発明の方法は糖尿病患者の処置に限定されない。例えば、一部の特定の実施形態では、該物質体は、血糖コントロールの障害に関連する感染を有する患者の高血糖症を処置するために使用され得る。一部の特定の実施形態では、該物質体は糖尿病を処置するために使用され得る。
【０２９２】
種々の実施形態において、本開示の物質体は、少なくとも１種類のさらなる治療薬を受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、該少なくとも１種類のさらなる治療法は、投与される該物質体と同じ疾患または障害の処置を意図するものである。種々の実施形態において、該少なくとも１種類のさらなる治療法は、主薬の副作用の処置を意図するものである。この２種類以上の治療法は、患者が両方の治療法の恩恵を受けている間中、同じ時間枠で投与しても、重複する時間枠で投与しても、重複しない時間枠で投与してもよい。この２種類以上の治療法は、患者が両方の治療薬の恩恵を受けている間中、同じスケジュールで投与しても、異なるスケジュールで投与してもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の単独の物質体は、同じ疾患または障害を処置するための薬物を１種類より多く含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、同じ疾患または障害を処置するための異なる薬物を含む本開示の２種類以上の別個の物質体が投与され得る（混合物として、または別々に）。一部の特定の実施形態では、非コンジュゲート型の二次薬物を本開示の物質体に含めてもよい（すなわち、該物質体の成分と単に混合されるだけで、該架橋物質体に共有結合されない薬物）。例えば、一部の特定の実施形態では、このようなアプローチのいずれかを用いて、１種類より多くの抗糖尿病薬が被検体に投与され得る。この本発明のアプローチの一部の特定の例示的な実施形態をインスリン関連治療との関連において、より詳細に以下に記載するが、前述のことから、他の治療法のかかる併用アプローチの恩恵を受けることは認識されよう。
【０２９３】
インスリン感受性改善薬（例えば、メトホルミン、グリタゾンなどのビグアニド）は、所与の量のインスリンに対する患者の応答を増大させることにより作用する。したがって、インスリン感受性改善薬を受けている患者に必要とされる、本開示のインスリン系物質体の用量は、該改善薬を受けていない同一の患者よりも少ない。したがって、一部の特定の実施形態では、インスリンコンジュゲートを含む該物質体が、インスリン感受性改善薬での処置も受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、本開示の物質体は、インスリン感受性改善薬の非存在下で必要とされる通常の用量の７５％までで投与され得る。種々の実施形態において、該通常の用量の５０、４０、３０または２０％までが投与され得る。
【０２９４】
インスリン抵抗性は、通常のインスリン量が、正常なインスリン応答をもたらすのに不充分な障害である。例えば、インスリン抵抗性患者には、その抵抗性を克服し、充分なグルコース降下効果をもたらすために、高用量のインスリンが必要とされ得る。このような場合、抵抗性が低い患者においては、通常、低血糖が誘導され得るインスリン用量では、高度に抵抗性の患者において同等のグルコース降下効果は奏されない。同様に、本開示の物質体は、適当な時間枠で高レベルのインスリン−コンジュゲートが放出される場合、このサブクラスの患者に対してのみ有効である。一部の特定の実施形態では、このサブクラスの患者の処置は、該２つのアプローチを併用することにより助長され得る。したがって、一部の特定の実施形態では、従来のインスリン系治療剤を用いてインスリンのベースラインレベルを得、患者の必要時に、本発明の物質体を投与してインスリン補充の制御をもたらす。したがって、一部の特定の実施形態では、インスリンコンジュゲートを含む物質体が、インスリンでの処置も受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、インスリンは、本開示の物質体の非存在下で必要とされる通常の用量の７５％までで投与され得る。種々の実施形態において、該通常の用量の５０、４０、３０または２０％までが投与され得る。この併用アプローチは、インスリン分泌促進薬（例えば、スルホニル尿素、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４など）および／またはインスリン感受性改善薬（例えば、メトホルミン、グリタゾンなどのビグアニド）を受けているインスリン抵抗性患者でも使用され得ることは認識されよう。
【０２９５】
キット
別の態様において、本開示により、アプタマーとコンジュゲートと、物質体を調製するための他の試薬とを含むキットを提供する。例えば、キットは、複数のコンジュゲートおよび複数のアプタマーを内包する個別の容器を含むものであり得る。キットのコンジュゲートとアプタマーを混合すると、架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は皮下送達用に設計され、キットはシリンジを含む。種々の実施形態において、キットは、架橋物質体が予め充填されたシリンジを含むものであり得る。また、キットに、該コンジュゲートとアプタマーを混合して架橋物質体を得るための使用説明書を含めてもよい。
【０２９６】
また別の態様において、本開示により、コンジュゲートおよび／またはアプタマーのライブラリーを提供する。このようなライブラリーは、所望のセットポイントを有する物質体の作製に特に有用であり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、同じコンジュゲートで異なるセットポイントをもたらす複数のアプタマーを含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、さらに、ライブラリー内のアプタマーと架橋物質体を形成する１種類以上のコンジュゲートを含むものであり得る。ライブラリーが１種類より多くのかかるコンジュゲートを含む場合、異なるコンジュゲートは、異なる分子量、コンジュゲート分子１つあたり異なる数の親和性リガンドおよび／または異なる親和性リガンドを有するものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、１種類より多くの型の親和性リガンドを含むコンジュゲートを１つ以上含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、同じアプタマーで異なるセットポイントをもたらす複数のコンジュゲートを含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、さらに、ライブラリー内でコンジュゲートとともに架橋物質体を形成する１種類以上のアプタマーを含むものであり得る。
【０２９７】
また別の態様において、本開示により、（ａ）第１の標識を含むアプタマーを含む第１容器と、（ｂ）第２の標識を含むコンジュゲートを含む第２容器を備えており、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらすキットを提供する。
【０２９８】
また別の態様において、本開示により、（ａ）アプタマーを含む第１容器と、（ｂ）親和性リガンドおよび第１の標識を含む第１の分子群を含む第２容器と、（ｃ）親和性リガンドおよび第２の標識を含む第２の分子群を含む第３容器とを備えており、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらすキットを提供する。一部の特定の実施形態では、第１および第２の分子は同じ容器内に存在している。
【０２９９】
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示した発明の実施により、当業者に自明となろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなし、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲に示されていることを意図する。
【０３００】
実施例
実施例１−単量体型グルコース結合アプタマー
＜５０ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度の固定化したグリコゲンに結合し、広い漸増グルコース濃度範囲で溶出されるヌクレアーゼ抵抗性ＲＮＡ配列を同定した。Ｔ７プロモーター領域、続いて２０塩基対（ｂｐ）の５’プライマー、４０ｂｐのランダム領域、および２０ｂｐの３’プライマー部位で構成された配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの１０１５〜１０１６個の配列の最初のライブラリーを、確立された方法に従って構築した。臭化シアン架橋型牡蠣グリコゲン（ＭＷ＝５００，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を結合固定相として使用したＳＥＬＥＸプロセスに用いた修飾型ＲＮＡアプタマーを転写するため、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを、２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジン５’−三リン酸（２’−Ｆ−ＣＴＰおよび２’Ｆ−ＵＴＰ）とともに使用した。
【０３０１】
６回の選択ラウンド後、いくらかのグリコゲンビーズ結合親和性を有するバイアブルなモノクローナルの配列が１つ（３０１０６Ｋ１）見い出された。３０１０６Ｋｌを、既存の方法論（下記参照）に従って逆転写し、変異させ、グリコゲン固定相に対する可逆的結合に必要な最小限の配列モチーフを見い出すために、配列が相同なアプタマーファミリーを得る試みにおいて、グリコゲンビーズ結合およびグルコース溶出選択方法論を用いて、新たなプールを再選択した。
【０３０２】
変異誘発後、２回以上の選択ラウンドを行ない、得られた混合物を試験してモノクローナルを得、次いで、これを配列決定して２８個のモノクローナルを得、そのうち７個は特殊であった。これらの配列のうちいくつかは大いに相同性を有したが、配列１、４および６は、他のものと相当異なっていた。
【０３０３】
グリコゲンレジンに対するモノクローナル結合親和性の違いを調べるため、グリコゲンビーズを小型カラムに添加し、充分に洗浄した。モノクローナルを結合させ、次いで、結合工程により溶出した後、結合バッファーでの３回の洗浄工程を行なった。次に、カラムを、４００、８００、１６００、および３２００ｍｇ／ｄＬのグルコースで溶出し、各工程で２６０ｎｍにおける光学密度を測定し、最初のアプタマーストック濃度の関数としてプロットした（図１参照）。モノクローナルはすべて、グリコゲンビーズに対して親和性を有し、広いグルコース値範囲にわたって、すべてカラムから溶出された。しかしながら、結合した３つの配列１、４および６は、グルコースゼロであっても、大部分（全体の＞５０％）がビーズから洗い流された。さらに、＞９０％は８００ｍｇ／ｄＬまでにカラムから溶出されたが、モノクローナル２、３、５および７では、グルコースが３，２００ｍｇ／ｄｌであっても、結合した全体量の＜６０％がグリコゲンレジンから洗い流された。計算による二次構造と配列相同構造との比較（図２）により、モノクローナルグリコゲンビーズ結合試験の結果との強い相関性が示された。したがって、この二組のモノクローナルにより、低親和性から高親和性に及ぶグリコゲン結合アプタマーの２つの相違するプールが得られ、これらは、一連のグリコゲン結合親和性を有するアプタマーを作製するための出発点として使用され得る。
【０３０４】
配列間の構造に関する相同性は、上記のモノクローナルの考えられ得る二次構造の推定を補助する自由エネルギー最小化シミュレータであるＭｆｏｌｄ（商標）ソフトウェアを用いて調べた。
【０３０５】
構造に関する結果により、この新たなアプタマープールは、多数の６ｂｐループおよび８ｂｐループを含む分岐型構造に片寄っていることが示唆された。モノクローナル２、３および７は、ほぼ同一のフォールド構造を含み、モノクローナル５は２、３および７と、ある程度の類似性を含む。モノクローナルの配列（図２）の再検討により、４０ｂｐランダム領域が２、３、５および７間で非常に相同性が高いこと、ならびにそれらの配列のわずかな違いは、推定されるフォールド構造に影響しないようであることを示す。モノクローナル４および６は、他方の８４ｂｐアプタマーと配列構造が劇的に異なる。しかしながら、特に注目すべきは、４および６の推定されるフォールド構造が、２、３および７のものと類似した特徴を共有していることである。
【０３０６】
実施例２−単量体型グルコース結合アプタマーの多量体への自己集合性
本発明の物質体に使用されるグルコース結合分子に対する重要な設計パラメータは、該分子が多量体でなければならず、それにより、該コンジュゲートと非共有結合性の架橋を形成できることである。天然Ｃｏｎ  Ａは、生理学的温度およびｐＨでは四量体であり、ペグ化Ｃｏｎ  Ａは少なくとも二量体型である。したがって、ＲＮＡアプタマーが本発明の物質体との関連において有用であるためには、該アプタマーを多量体型にしなければならない。
【０３０７】
多量体型構築物を作製するための慣用的な方法の一例は、アビジン−ビオチン親和性タグ系の使用である。アビジンは、生理学的ｐＨで天然四量体であり、各々がビオチンに対する結合部位を１つ含む４つの単量体で構成されている。ビオチンとアビジン間の結合定数は極めて大きい（１０１５Ｍ−１）。
【０３０８】
より化学合成が容易な配列を作製するため、モノクローナルの配列３を切断した（塩基１５〜６５、Ｎ４０領域全体を含む）。修飾型２’−フルオロ−ピリミジンＲＮＡアプタマーは、３’から５’端へとＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．によって合成されたものであり、ビオチンタグを配列の末端の５’端に共有結合した。この配列は、製造業者によって脱塩、ＨＰＬＣおよびゲル精製されており、配列１モルあたり平均１モルのビオチンタグを有することがわかった。使用前、本発明者らは、アビジン−ビオチニルアプタマー混合物により、多量体型構築物が得られるであろうことを確認しようとした。１．１ｍｇ／ｍｌのアビジンを、定濃度で、ビオチニル−アプタマーの連続希釈物に、アビジン−ビオチニルＲＮＡのモル比が１：２、１：４、１：８、１：１６となるように添加した。これらの試料を、対照レーンとともに、臭化エチジウム１％アガロースゲル上に負荷し、電気泳動させると、アビジン−ビオチニルアプタマーの方がＭＷが高い複合体が得られることが示された。このゲルを図３に示す。切断型ビオチニル（非結合）配列は、１００ｂｐ標準のところで溶出されるが、多量体型アビジン：アプタマー複合体は、４００ｂｐラダー付近に溶出される。レーン４および５は、多量体型複合体の形成がビオチンの存在下で抑止されるため、結合の特異性が、具体的には、アビジン−ビオチン相互作用によるものであることを示す。また、アビジン高含有比率では（１：２，レーン５）、１００ｂｐ標準のところに泳動しているバンドがあるため、「ビオチニル−アプタマー」の一部分はビオチニル化されていないようである。
【０３０９】
切断型のビオチニル化配列を、アビジンの存在下および非存在下での結合特性について、グリコゲンビーズ親和性カラムにおいて評価した。カラム溶出を２６０ｎｍにおける光学密度によって測定し、ビオチニルアプタマー配列の結合プロフィールを、グリコゲンビーズカラムにて、天然Ｃｏｎ  Ａおよびペグ化Ｃｏｎ  Ａと比較した（タンパク質は２８０ｎｍにおいて測定）。また、固定相への結合がない場合を示すために、ポリアクリルアミドビーズで構成した対照カラムを使用した。結果を図４に示す。
【０３１０】
Ｃｏｎ  Ａおよび単量体型ビオチニル−アプタマーは、ポリアクリルアミドカラムからは即時に溶出され、グリコゲンカラムからは、広いグルコース値範囲にわたって、ゆっくり溶出される。モル比４：１のアプタマー−アビジン混合物の多量体（図３参照）は、グリコゲンカラムに対して向上した親和性を示し、単量体型ビオチニル−アプタマーよりも高いグルコースレベルを必要とする。カラムとのアプタマーの相互作用がグルコース／グリコゲンに特異的であることを示すため、単量体型ビオチニル−アプタマー（アビジンなし）の負荷前に、別の新たなグリコゲンカラムを１６００ｍｇ／ｄｌのグルコースで平衡化させた。負荷前にグルコースで平衡化すると、より低いグルコース値で、より多くのアプタマーの溶出がもたらされるが、これは、ビオチニルアプタマー−グリコゲンビーズ相互作用が、高濃度のグルコースの存在によって阻害され得る高度に特異的なものであることを示す。
【０３１１】
実施例３−種々のコンジュゲート結合親和性を有する単量体型アプタマープール
結合剤の多様なプールを個々に作製するためのモノクローナルの変異
マンガン塩を用いて、ＰＣＲにおいて６ｕＬの１０×ＰＣＲバッファー、６ｕＬのｄＮＴＰ  ２ｍＭ、２４ｕＬの各５’および３’プライマー、６ｕＬのＴａｑポリメラーゼを混合することによりｃＤＮＡモノクローナルを作製し、ＰＣＲチューブの容積の残部にＭｎＣｌ２および蒸留脱イオンＨ２Ｏを２ｍＭ〜０６２５ｍＭのＭｎＣｌ２の連続希釈液で満たし、適正な濃度のＭｎＣｌ２を見い出す（アガロースゲル電気泳動で測定）。次いで、ＰＣＲを、９５℃で４５秒、５３℃で４５秒、および７２℃で１分間を１サイクルとして３０サイクル行なう。
【０３１２】
ＳＥＬＥＸプロトコル
変異型修飾ＲＮＡプールをタンパク質無含有牡蠣グリコゲン（ＩＩ型、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合し、３７Ｃで１５分間平衡化させる。この期間後、１００ｕｌのグリコゲン／修飾ＲＮＡ溶液を、３７Ｃで平衡化させた１ｍＬ容のＰ−１００スピンカラム上に負荷し、試料を遠心分離すると、未結合オリゴヌクレオチドが除去され、一方、グリコゲン−アプタマー複合体は通過する。低濃度のグルコースをグリコゲン−アプタマー混合物に添加し、これを、再度、新たなＰ−１００スピンカラムに通す。今回は、一部のアプタマー−グリコゲン複合体はグルコースによって阻止され、スピンカラム内に滞留し得るが、グリコゲンは除去される。この時点でグリコゲンを含まないスピンカラムの内容物は、３×１００ｕｌの結合バッファーでの洗浄により簡単に溶出される。このプロセスをさまざまなグルコース濃度で繰り返し、多様な複数のグルコースプールを得る。得られた配列（１つまたは複数）をｃＤＮＡに逆転写し、次の転写／選択ラウンドのために増幅する。数回の選択ラウンド後、モノクローナルの配列が得られ得る。成功の基準としては、グルコースの関数としての、グリコゲン−アプタマー複合体のＡ２６０の測定が挙げられる。プールが高グルコース値に向かって富化されている場合、より多くのアプタマーがグリコゲンに結合されるはずであり、それによりグリコゲン結合アプタマー複合体溶液のＯＤ２６０値は測定可能に高くなる。
【０３１３】
実施例４−化学合成された多量体型アプタマー
実施例３で同定されたモノクローナルを配列決定し、製造業者により化学合成装置を用いて小規模で、または大規模（＞２ｍｇ規模）で化学合成する。これを、最終ラウンドの化学基剤合成時に、ビオチンホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて、５’−チオールで共有結合により標識する。
【０３１４】
次いで、この修飾型チオール化ＲＮＡアプタマーを、同じく該結合バッファー中に溶解させた極わずかだけモル過剰（１．０５：１）の二量体型、三量体型または四量体型マレイミド官能化分子と、修飾型結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８〜７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有））中で反応させる。このマレイミドは、室温で数分以内に５’修飾アプタマーと容易に反応を行ない、アプタマーと多量体型スペーサー分子間に安定なチオエーテル結合をもたらす。二量体が所望される場合は、ビス−マレイミドヘキサン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）が使用され、あるいは、三量体型アプタマーが望ましい場合は、トリス−（２−マレイミドエチル）アミンが使用され、アプタマースルフヒドリルと容易に反応する。
【０３１５】
この種々の単量体型モノクローナルグリコゲン結合親和性は、二量体または三量体として形成される場合、グリコゲンまたは他の薬物−コンジュゲートと架橋ヒドロゲルを形成し得るはずである。次いで、得られた物質体のグルコース応答性が試験され得る。
【０３１６】
実施例５−アプタマー−薬物−コンジュゲートのグルコース応答性のインビトロ速度論の最適化
この実施例は、実施例４に概要を示した薬物−コンジュゲートおよび対応する多価アプタマーを用いたヒドロゲルの合成を伴う。
【０３１７】
ゲルの架橋実験およびコンジュゲート放出速度論の測定
実施例４で作製した各多量体型アプタマーを、５０ｍｇ／ｍｌで、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させる。各薬物−コンジュゲート溶液を、同じバッファーにて１００ｍｇ／ｍｌで調製する。次いで、薬物−コンジュゲート溶液を、同じバッファーを用いて５０ｍｇ／ｍｌから６．２５ｍｇ／ｍｌまで２倍希釈する。次いで、５０μＬの薬物−コンジュゲート溶液を、２５０ｍｌ容円錐形遠心チューブに添加した後、等容量の多量体型アプタマー溶液を添加し、得られた溶液をすばやく混合する。この溶液を１時間放置した後、残留凝集体（あれば）を３６０×ｇで１０分間の遠心分離（Ａｌｌｅｇｒａ  ２１Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によって単離する。上清みを除去し、薬物測定アッセイのために保存する。次いで、各実験の架橋効率（ＸＣＬ）を、架橋凝集体の分離前後での薬物含有量の差から求める。次いで、内蔵型ゲルをもたらした製剤に、バッファーによる１５分間の洗浄を３回行った後、３６０×ｇで１０分間遠心分離する。最後の洗浄液を除去した後、ゲルを４Ｃで一晩維持し、続いて、速度論試験に使用する。
【０３１８】
速度論アッセイを使用し、１．０ｍｌの５０、１００、２００および４００ｍｇ／ｄｌのＤ−グルコースを、Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ（商標）２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）の４×３ｍｌの各ウェルに添加する。次いで、この溶液に各ゲルを添加し、マイクロプレートインキュベータ／振盪機（「Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇ」、Ｂｏｅｋｅｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて３７Ｃで撹拌する。例えば、インスリンアッセイでは、まず、１２５ｕｌの放出媒体を１５分毎に取り出し、その後、実験の最初の１時間後からは半時間毎に取り出す。各時点で、放出媒体に０．１２５ｍｌの同濃度のグルコースを補給する。このプロセスを少なくとも６時間繰り返す。次いで、各時点での薬物−コンジュゲートの溶解をＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって測定し、薬物の累積放出を、各濃度において、時間の関数としてプロットする。各グルコース濃度の放出曲線の初期傾斜に直線をフィットさせることにより、Ｒ５０、Ｒ１００、Ｒ２００、およびＲ４００値が容易に得られる。
【０３１９】
実施例６−空腹時および食事時間グルコースコントロールのための至適単回用量製剤
アプタマー系物質体の至適投薬量の配合および容量は、ＳＴＺ誘導型糖尿病ラットにおいて、血中グルコースレベルの低減および血清インスリン−コンジュゲート濃度の増大の程度および持続時間を評価することにより決定される。ラット（ｎ＝６）を６時間絶食させ（この間、水分は随意に与える）、その後、血中グルコースレベルを測定する。各投与においてインスリン許容量は限定的であるため、各製剤の「寿命」を確立するために、空腹時血中グルコースレベルを高血糖への戻りが観察されるまで測定する。また、空腹時グルコースレベルを少なくとも３日間低減させ得る単回用量製剤を、実験の１日目および２日目に施与した腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）に対抗（ｃｏｎｆｒｏｎｔ）できる能力について評価する。
【０３２０】
ＳＤラット（２００〜２５０ｇ）へのＳＴＺ−糖尿病の誘導は、２７ゲージの１インチ針を取り付けた１ｍｌ容のシリンジを使用し、６０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（０．１Ｍクエン酸バッファー中４％ｗ／ｖ）のｉ．ｐ．注射を用いて行なう。ＳＴＺ注射後５日目と６日目に、６時間の絶食後の血中グルコースレベルを測定する。＞３５０ｍｇ／ｄｌの空腹時グルコースレベルを連続２日間有するラットのみを、後続の試験に使用する。血中グルコースレベルは、一般に、テストストリップ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＱＩＤ）およびＭｅｄｉＳｅｎｓｅ血糖測定器を用いて、尾静脈から抜き取ったほぼ２０μｌの血液で測定する。
【０３２１】
血清インスリン−コンジュゲートレベルは、市販のヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）を用いて測定する。血清濃度測定用の試料を得るため、２５０〜５００μＬの血液を尾静脈から抜き取り、遠心分離し、血清から細胞を分離し、ＥＬＩＳＡまで−２０Ｃで保存する。腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）は、絶食ラットにおいて、１ｇ／ｋｇのＤ−グルコース用量での４５％ｗ／ｖ  Ｄ−グルコース溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のｉ．ｐ．注射によって行なう。実験全体を通して、血液試料（５００μＬ）は尾静脈から、ｔ＝−１０、−５、０、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、９０、１２０および１８０分の時点で採取し、血中グルコースと血清インスリン−コンジュゲートレベルの両方を測定する。ピークグルコース濃度（Ｇｍａｘ）、ピークグルコース濃度までの時間（ＴＧｍａｘ）、および空腹時血中グルコースレベルに戻るまでの時間（Ｔｆａｓｔ）を比較し、種々の製剤がグルコース負荷に対抗できる能力を調べる。正常な非糖尿病ラット（ｎ＝６）を、全薬力学的パラメータの比較対照として使用する。
【０３２２】
各グルコース応答性製剤の注射の１日前に、血中グルコースレベルを減少させるため、長期作用性インスリンサプリメント（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２Ｕ）を、ＳＴＺ−ラットにｓ．ｃ．注射によって与える。実験動物のうち６匹に「空の」製剤（すなわち、コンジュゲート型インスリンなし）を与え、６匹に対照として１×ＰＢＳ溶液を与える。残りのラットにはグルコース感受性ゲル注射を与える。インスリン−デキストランコンジュゲートおよびインスリン−グリコゲンコンジュゲートの両方（Ｇ１０％〜５０ｍｇ／ｄｌおよび１００ｍｇ／ｄｌ）から構築したグルコース応答性ゲルを、異なる２つの投薬量レベル（０．２０ｍｌおよび０．４０ｍｌバッチサイズ）で注射する。また、異なる２つのインスリン−コンジュゲート負荷量を、（ｉ）１００％インスリン−コンジュゲートおよび（ｉｉ）５０％インスリン−コンジュゲートと５０％非コンジュゲートポリマーを有するゲルを合成することにより評価する。
【０３２３】
投薬頻度は、至適製剤の注射容量と空腹時血中グルコースレベルのコントロールの持続時間との間に線形相関性があると仮定して決定する。次いで、投薬容量の規模を、１日間の空腹時血中グルコースコントロールが得られるものに戻す。この容量（Ｖ）、Ｖの８０％、およびＶの１２０％を、ＳＴＺ誘導型糖尿病ラット（ｎ＝６）に毎朝１回ｓ．ｃ．注射し、空腹時血中グルコースおよび血清インスリンレベルを毎日、合計７日間測定する。１週間にわたって最も安定な（増大または減少が最小限の）空腹時血中グルコースおよび血清インスリンレベルをもたらす容量を、グルコースセットポイントの精密化およびインスリン−コンジュゲート負荷実験に使用する。
【０３２４】
最大コントロールのためのグルコース感受性の調整は、インスリン−コンジュゲートに対するアプタマーの比率を調整することによってグルコースセットポイント（ＧＳＰ）アッセイのセットポイントを増大させることによりなされる。先の投薬量の配合、容量および頻度実験の結果に応じて、ゲルを至適な容量および投薬量レベルで使用する。７５、９０、１０５、１２０および１３５ｍｇ／ｄｌのＧ１０％を有する製剤をＳＴＺ誘導型糖尿病ラット（ｎ＝６）に、毎朝１回、連続７日間注射する。各セットポイントでは、インスリン−コンジュゲート負荷量を５０％、７５％および１００％に設定し、最も適切なインスリン−コンジュゲート濃度をさらに最適化して、低血糖を抑制するとともに高血糖を最小限にする。毎日、空腹時血中グルコースと血清インスリンレベルを測定した後、ＩＰＧＴＴを上記のようにして行なう。
【０３２５】
平均空腹時血中グルコース濃度ならびにＩＰＧＴＴの平均Ｇｍａｘ、ＴＧｍａｘ、およびＴｆａｓｔを、グルコースセットポイントおよび注射した各製剤のインスリン負荷量に相関させる。より高いグルコースセットポイントを有する物質体では、経時的に、より低いグルコース濃度で溶解するようにプログラムしたものよりも高いグルコース濃度がもたらされるはずである。
【０３２６】
実施例７−アプタマーの血清半減期の増大の確認
２’−フルオロ−ピリミジンから構築したオリゴヌクレオチドでは、インビトロで、数時間よりも長いヌクレアーゼ安定性半減期が示されている（例えば、Ｄｏｕｇａｎら、Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２０００、２７、（３）、２８９−９７；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５、２７０、（４３）、２５７０２−８；およびＳｃａｒｉｎｇｅら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｅｔａ−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９０、１８、（１８）、５４３３−４１参照）。
【０３２７】
したがって、このような修飾基剤から構築した遊離アプタマーは、２４時間の投与サイクルの間中、存在し続けられ得ないであろう。それでもなお、本発明者らは、アプタマーは、本発明の物質体内に封入されている間は、立体障害に基づき、ヌクレアーゼ分解に対してさらにいっそう抵抗性であると予測する。したがって、日投薬量の寿命の間、本発明の物質体の過剰なヌクレアーゼ分解を抑制するには、ｔｓ＞３００分で充分なはずである。この実施例では、ヌクレアーゼの存在下での本発明の物質体由来の薬物−コンジュゲート結合の程度を測定することにより、この予測を確認するために使用され得る実験を示す。
【０３２８】
アプタマーのインビトロ安定性は、０．０２μＣｉの精製［１２５Ｉ］標識アプタマーを、２０μｌの適切な液−ヒト血清、ヒト血漿、ラット血清およびラット血漿（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に分散させることにより測定される（例えば、Ｄｏｕｇａｎら（上掲）参照）。次いで、試料を３７℃でインキュベートし、２μｌのアリコートを３０秒〜７２時間の時間間隔で抜き取る（例えば、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（上掲）参照）。アリコートを、２０μｌの９５％ホルムアミド、０．５×ＴＢＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭホウ酸塩、ＩｍＭ  ＥＤＴＡ）の添加によってクエンチし、ゲル負荷前に凍結させる。最後に、各時点の試料を、２０％ポリアクリルアミド上での変性ゲル電気泳動によって分画した後、ＡｕｔｏＲａｄｉｏｇｒａｐｈｅｒを用いて画像形成する。各アプタマーのインビトロ安定性半減期（ｔｓ）を、インキュベーション時間に対するインタクトなアプタマーの割合のプロットの指数関数フィットから計算する（例えば、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（上掲）参照）。
【０３２９】
インビボ排出半減期を、変形した薬物動態学的解析手順を用いて求める（例えば、Ｄｏｕｇａｎら；Ｓｃａｒｉｎｇｅら（ともに上掲）；ならびにＳａｎｔｕｌｌｉ−Ｍａｒｏｔｔｏら、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＣＴＬＡ−４  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７４８３−７４８９、２００３参照）。簡単には、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）（体重２００〜２５０ｇ）に、静脈内（ｉ．ｖ．，ｎ＝６）および皮下（ｓ．ｃ，ｎ＝６）の両方で、［１２５Ｉ］標識アプタマーの滅菌１×ＰＢＳ溶液（１０μＣｉを含有する０．２５ｍｌ）を注射する。実験全体を通して、血液試料（３００μｌ）は尾静脈から、ｔ＝０、５、１５、６０、１２０、２４０、４８０、９６０および１４４０分の時点で採取し、１０，０００ｇで４℃にて１分間遠心分離し、血漿を収集し、シンチレーションカウンターを用いて放射能について解析するまで−２０℃で保存する。各アプタマーのインビボ排出半減期（ｔ１／２）は、時間に対する血漿濃度の曲線の末端直線部分からの概算によって計算する。この実験の目的のため、ｉ．ｖ．注射は、２７ゲージ、１／２インチ針により尾静脈内に投与し、ｓ．ｃ．注射は、２７ゲージ、１／２インチ針により首後部に投与する。
【０３３０】
実施例８−グルコース依存性薬物−コンジュゲートの放出の評価
この実施例では、グルコースの存在下での本発明の物質体からの薬物−コンジュゲートの放出の程度を評価するために使用され得るインビトロ方法およびインビボ方法を記載する。
【０３３１】
血清におけるインビトログルコースセットポイント
グルコースセットポイント（ＧＳＰ）アッセイは、各グルコースインキュベーション段階で、ＰＢＳの代わりにヒトおよびラットの血清を用いて行なう。まず、５０ｍｇ／ｄｌのＤ−グルコースを含有する１．０ｍｌの血清を、Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ（商標）２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）の各ウェルに２４×３ｍｌで添加する。この溶液に各ゲル（蛍光コンジュゲートから調製）を添加し、マイクロプレートインキュベータ／振盪機（「Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇ」、Ｂｏｅｋｅｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて３７℃で１時間撹拌する。１時間後、０．５ｍｌの放出媒体を除去し、蛍光について解析する（λｅＸ＝４８５ｎｍ；λｅｍ＝５３８ｎｍ）。次いで、放出媒体に、１５０ｍｇ／ｄｌのグルコースを含有する０．５ｍｌの血清を補給して１００ｍｇ／ｄｌ溶液とし、ゲルをさらに１時間撹拌する。このプロセスを、２００、４００、８００および１６００ｍｇ／ｄｌの放出媒体グルコース濃度に対して合計６つの濃度で６時間にわたって繰り返す。次いで、累積コンジュゲート溶解を、放出媒体中のコンジュゲートの累積濃度を１００％溶解で放出された濃度で標準化することにより計算する。Ｇ１０％およびＧ５０％を、累積放出をグルコース濃度の関数としてプロットし、それぞれ、コンジュゲートの１０％および５０％が放出されるグルコース濃度を推定することにより求める。
【０３３２】
インビボ空腹時血中グルコースレベル
ゲル（Ｇ１０％〜５０ｍｇ／ｄｌおよび１００ｍｇ／ｄｌ）を雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（（体重２００〜２５０ｇ）（ｎ＝６）の首後部に、０．２ｍｇインスリン／ｋｇ体重の用量で、２７ゲージ１／２インチ針を用いて皮下注射する。また、陰性対照には、滅菌１×ＰＢＳ溶液を皮下注射する（ｎ＝６）。次いで、実験群および対照群を６時間絶食させ（この間、水分は随意に与える）、その後、血中グルコースレベルを測定する。次いで、空腹時血中グルコースレベルを、テストストリップ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＱＩＤ）およびＭｅｄｉＳｅｎｓｅ血糖測定器を用いて、尾静脈から抜き取った約２０μｌの血液で測定する。
【０３３３】
実施例９−皮下注射の適合性の定量
本発明の物質体の皮下による生体適合性を、急性炎症応答および全身性抗体生成によって評価する。各ゲルを、注射部位で炎症を誘発する能力について評価する。各場合において、物質体は、６匹の正常ＳＤラット（２００〜２５０ｇの体重）の右後四半身の皮下に、２７ゲージ１／２インチ針を取り付けた０．５ｍｌ容シリンジを用いて注射する。
【０３３４】
個々の各物質体の評価では、ラットに注射して急性免疫応答が発現するのに充分な時間置いた後、二酸化炭素チャンバ内に５日間で安楽死させる。有害な急性炎症応答を示す組織はいずれも、組織学的検査のために、同等の大きさの反対側の対照試料とともに切除する（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｌａｂ、Ｊｏｓｌｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。次いで、試料を４％パラホルムアルデヒド中に３日間のうち１分間固定し、エタノール中で脱水させ、次いでキシレン中で清浄化する（例えば、Ｔｈｅ  ａｎｄ  Ｆｅｌｔｋａｍｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８：８７５−８１、１９７０参照）。固定後、組織を、真空下でパラフィン中に包埋し、１２μｍ厚平面の切片に分ける。ヘマトキシリンとエオシンでの組織学的染色を使用し、線維性被膜および壊死組織の厚さを調べる。また、ＥＤｌでの免疫化学的標識を使用し、マクロファージの密度を評価する。最後に、トルイジンブルーを使用し、顆粒球およびリンパ球の浸潤を評価する（例えば、Ｔｈｅ  ａｎｄ  Ｆｅｌｔｋａｍｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８：８６５−７３、１９７０参照）。各切片に対する組織学的スコアを示し、スチューデントのｔ−検定（ｐ＜０．０５）を用いて、局在するリンパ球およびマクロファージの密度における差が対照ラット母集団の１０％未満であることを確認する。
【０３３５】
本発明の系の存在下で全身のコンジュゲート−またはアプタマー−特異的抗体のレベルが上昇するかどうかを調べるため、標準的な免疫処置プロトコルを各ゲル製剤に対して行なう。各場合において、物質体は、１、１４および２８日目に、６匹の正常ＳＤラット（体重２００−２５０ｇ）の首後部の皮下に、２７ゲージ１／２インチ針を取り付けた０．５ｍｌ容シリンジを用いて注射する。血液試料（５００μｌ）は、実験前と２８日目および３５日目に採取する。各試料を１０，０００ｇで４℃にて１分間遠心分離し、血清を収集し、抗体濃度について解析するまで−２０℃で保存する。この実験では、１×ＰＢＳ溶液（ｎ＝６）を陰性対照とし、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）＋コンジュゲート（ｎ＝６）およびアプタマー（ｎ＝６）を陽性対照とする。
【０３３６】
該アプタマーおよびコンジュゲート（ＰｒｏｔｅｏＣｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）に対する特注の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、陰性対照に対する特異的ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ−クラス抗体の濃度を測定する。簡単には、各ウェルを１００μｌの１〜１０μｇ／ｍｌの溶液とともにインキュベートした後、ブロックバッファーを添加し、洗浄し、乾燥させ、４℃で保存することにより、対象の物質体を９６ウェルプレートの表面に吸着させる。適切に希釈した血清溶液を添加してインキュベーションさせた後、抗体−ＨＲＰコンジュゲート（抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥを添加した後、ＴＭＢ基質および停止溶液（すべて市販のキット（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、Ｔｅｘａｓ）のもの）を添加する）。得られた黄色の着色の強度を、４５０ｎｍにおいて、ＵＶ−可視光吸光度プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて読み取り、抗体の相対濃度に相関させる。
【０３３７】
実施例１０−糖尿病ラットにおける３０日間のＨｂＡ１ｃレベルの低下
ＨｂＡ１ｃレベルの低下を、実施例６の最適化された１日１回製剤について調べ、長期作用性Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）の毎日注射ならびに徐放埋没薬（Ｌｉｎｐｌａｎｔ（登録商標）、ＬｉｎＳｈｉｎ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．，１．５個の埋没薬、３Ｕ／日持続放出）と比較する。ＨｂＡ１ｃレベルは２０μＬの血液を用いて測定し、該血液はキャピラリーホルダー上に配置し、続いてこれを試薬カートリッジ内に挿入し、ＨｂＡ１ｃ血中グルコースメーター（ＤＣＡ  ２０００（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＬＣ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて解析する。
【０３３８】
各実験群（本発明の系、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、およびＬｉｎｐｌａｎｔ（登録商標））は、１２匹のＳＴＺ誘導型糖尿病ラットからなる。ラットには毎朝、連続６０日間注射する。実験過程全体を通して３日毎に、血中グルコースおよび血清インスリンレベルを午前と午後に測定する。ＨｂＡ１ｃレベルは、処置の１４日後と３０日後に測定し、処置の型と相関させる。ＨｂＡ１ｃレベルの０．５％（ｐ＜０．０５）以上の低下の絶対値により、本発明者らの最適化製剤が、ｓ．ｃ．注射として毎日投与された場合に有意に良好な血糖コントロールをもたらす能力が確認される。
【０３３９】
実施例１１−材料および方法
この実施例では、先の実施例に使用される材料および方法の一例を記載する。
【０３４０】
放射性標識アプタマー
これは、１，０００〜２，０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性で、先に公開された方法に従って（例えば、Ｄｏｕｇａｎら（上掲）参照）、［１２５Ｉ］ＮａＩ含有０．１Ｎ  ＮａＯＨを用いて調製される（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。放射活性アプタマーは、市販のＣｅｎｔｒｉ−Ｓｐｉｎ−１０サイズ排除カラムを、供給業者の使用説明書（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）に従って使用し、ナトリウム塩として容易に調製される。
【０３４１】
インスリン−グリコゲンコンジュゲート
これは、変形臭化シアン（ＣＮＢｒ）カップリング反応を用いて合成される（例えば、ＫａｇｅｄａｌおよびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ、Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．２５：１８５５−１５９、１９７４参照）。簡単には、５００ｍｇのグリコゲンを５０ｍｌの脱イオン水に溶解させる。得られた溶液に５６ｍｇの固体ＣＮＢｒを添加し、５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を用いて、ｐＨを１０．７＋／−０．２に一定に維持する。１５分間撹拌後、さらに５６ｍｇの固体ＣＮＢｒを添加し、撹拌しながら４５分間、ｐＨを１０．７＋／−０．２の一定に維持する。次いで、この溶液に、５０〜２５０ｍｇのヒト組換えインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、固体の重炭酸ナトリウムを用いてｐＨを９．１５に調整する。この溶液を一晩撹拌し、１０Ｋ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホンディスク膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させる。次いで、得られた粉末を非コンジュゲート型インスリンから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）充填カラムでの高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）（１Ｍの酢酸移動相を使用）によって精製する。次いで、接合画分を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な白色粉末として得る。インスリンのコンジュゲーション度合を、ＵＶ分光分析およびアミノ酸解析（ＵＣＬＡ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって測定する。
【０３４２】
化学的架橋グリコゲン
これは、変形ＣＮＢｒカップリング手順を用いて合成され、アプタマー選択固定相を提供する。簡単には、２ｇのグリコゲンを５０ｍｌの脱イオン水に溶解させる。得られた溶液に２２５ｍｇの固体ＣＮＢｒを添加し、５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を用いてｐＨを１０．７＋／−０．２に一定に維持する。１５分間撹拌後、さらに２２５ｍｇの固体ＣＮＢｒを添加し、撹拌しながら４５分間、ｐＨを１０．７＋／−０．２の一定に維持する。次いで、固体の重炭酸ナトリウムを用いてｐＨを９．１５に調整し、得られた懸濁液を一晩撹拌する。次いで、架橋されたグリコゲンを３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、１×ＰＢＳと、続いてアプタマー結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で徹底的に洗浄する。粒状物を必要時まで４℃に維持する。
【０３４３】
ペグ化Ｃｏｎ  Ａ
これは、５００ｍｇのＣｏｎ  Ａを、１．０ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａ２＋およびＭｎ２＋を含有する５０ｍｌの１００ｍ（ｐＨ７．４）のＢＥＳバッファーに溶解させることにより調製される。所望量のペグ化剤（例えば、ＰＥＧ−ＳＭＢ−５ｋ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を小容量の反応バッファーに溶解させ、Ｃｏｎ  Ａ溶液にゆっくり添加する。得られた溶液を室温で一晩反応させた後、カットオフが５０ｋＤａのタンジェンシャルフロー膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって徹底的に濾過する。遊離ＰＥＧ試薬を精製したら、限外濾過セル（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）内で、吸光度を２８０ｎｍでアッセイすることにより濃度が１００ｍｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａ当量になるまで溶液を濃縮する。２７８ｎｍにおける１ｍｇ／ｍｌ溶液の吸光度を非修飾Ｃｏｎ  Ａのものに標準化することによって、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってペグ化％を測定する。
【０３４４】
グルコース応答性ゲル
これは、０．１００ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアプタマー（またはＣｏｎ  Ａ）溶液を、０．１００ｍｌの５〜１００ｍｇ／ｍｌコンジュゲート溶液と、デュアルシリンジ装置からの共注入によって合わせることにより合成される。インビトロ試験のため、得られたゲルを１．５ｍｌ容遠心チューブ内に１時間堆積させた後、得られたゲルを上清みから分離し、１ｍｌの脱イオン水で２回、次いで１ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した後、ＧＳＰまたは速度論試験用に２〜８Ｃで保存する。
【０３４５】
実施例１２−式（Ｉ）のコンジュゲート
この実施例では、式（Ｉ）：
【化３３】
2012516156.tif 000040
【０３４６】
のいくつかの例示的なコンジュゲートを記載する。
【０３４７】
このコンジュゲートのまた他の実施形態ならびにこのコンジュゲートの中間体および作製方法は、米国特許仮出願第６１／１６２，１０５号（２００９年３月２０日出願）および対応ＰＣＴ出願（２０１０年１月２７日出願）を見るとよい。これらの関連出願の全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０３４８】
一部の特定の実施形態では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、下記の例示的な基の１つ以上を含むものであり得る。
【０３４９】
Ｒｘ
一部の特定の実施形態では、Ｒｘは水素である。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは、任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルである。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは、任意選択で置換されているＣ１〜３アルキルである。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは、任意選択で置換されているメチルである。一部の特定の実施形態では、Ｒｘは−ＣＨ３である。
【０３５０】
Ｚ１
一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１〜１０、Ｃ１〜８、Ｃ１〜６、Ｃ１〜４またはＣ１〜２の炭化水素鎖である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−、または−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２）−または−（ＣＨ２ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。
【０３５１】
一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１〜１０の炭化水素鎖であって、Ｚ１の１、２または３個のメチレン単位が、任意選択で独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される１つ以上の基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、任意選択で置換されている二価のＣ１〜１０炭化水素鎖であって、Ｚ１の１、２または３個のメチレン単位が、任意選択で独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、または−（Ｃ＝Ｏ）−から選択される１つ以上の基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−、−ＣＨ（Ｒｆ）２、−ＣＨ２ＣＨ（Ｒｆ）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＲＶ、−ＣＨ２Ｓ−、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、式中、Ｒｆは、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリールである（例えば、一部の特定の実施形態では、Ｒｆは、任意選択で置換されているアリールであり；一部の特定の実施形態では、Ｒｆはフェニルである）。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−または−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−である。一部の特定の実施形態では、Ｚ１は、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−である。
【０３５２】
Ｙ１
一部の特定の実施形態では、Ｙ１は、フリーラジカル開始剤の断片である。かかる断片は、ハロゲン、−ＯＲｅ、−ＳＲｅ、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、および任意選択で置換されているヘテロアリール部分を含むものであり得るため、Ｙ１の定義に包含される。
【０３５３】
一部の特定の実施形態では、Ｙ１は、水素、ハロゲン、または開始剤の断片である。一部の特定の実施形態では、Ｙ１は、水素またはハロゲンである。一部の特定の実施形態では、Ｙ１は、水素または臭素である。
【０３５４】
Ｘ１
一部の特定の実施形態では、Ｘ１は−ＯＲＣである。一部の特定の実施形態では、Ｘ１は、−ＯＲＣと−Ｎ（Ｒｄ）２の混合物である。一部の特定の実施形態では、Ｘ１は、−Ｎ（Ｒｄ）２である。
【０３５５】
Ｗ１および
【化３４】
2012516156.tif 000041
【０３５６】
一部の特定の実施形態では、
【化３５】
2012516156.tif 000042
【０３５７】
は共有結合性の単結合である。
【０３５８】
一部の特定の実施形態では、Ｗ１はポリマーに、アミノ基によって共有結合されている。一部の特定の実施形態では、Ｗ１はポリマーに、第１級アミノ基によって共有結合されている。
【０３５９】
例えば、一部の特定の実施形態では、基
【化３６】
2012516156.tif 000043
【０３６０】
は、基
【化３７】
2012516156.tif 000044
【０３６１】
または基
【化３８】
2012516156.tif 000045
【０３６２】
に相当し、式中、［薬物−ＮＨ−］基または［薬物−Ｎ＝］基は、第１級アミノ基によって共有結合により直接コンジュゲートされた薬物である。他の実施形態では、薬物は、懸垂アミノ基を末端とするスペーサー基（例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、エステル結合、アミド結合など）を含むものであり得る。後者の実施形態により、薬物の活性部分とポリマーとの間隔を大きくすることが可能になる。
【０３６３】
ｒ
一部の特定の実施形態では、ｒは１０〜２５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは１５〜２５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは２０〜２５（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは５〜２０（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは１０〜２０（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは１５〜２０（両端を含む）の整数である。一部の特定の実施形態では、ｒは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５である。一部の特定の実施形態では、ｒは５である。一部の特定の実施形態では、ｒは１０である。一部の特定の実施形態では、ｒは１５である。一部の特定の実施形態では、ｒは２０である。一部の特定の実施形態では、ｒは２５である。
【０３６４】
一部の特定の実施形態では、基：
【化３９】
2012516156.tif 000046
【０３６５】
は、基：
【化４０】
2012516156.tif 000047
【０３６６】
および基：
【化４１】
2012516156.tif 000048
【０３６７】
（式中、（ｇ＋ｔ）の和はｒに等しい）の混合物に相当する。一部の特定の実施形態では、各場合のｇとｔは、独立して、１〜２４（両端を含む）の整数であるが、（ｇ＋ｔ）の和は５以上２５以下であるものとする。一部の特定の実施形態では、ｇとｔは、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、または１：１（ｇ：ｔ）の比率で存在する。一部の特定の実施形態では、ｇとｔは、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、または１：２（ｇ：ｔ）の比率で存在する。
【０３６８】
例示的なコンジュゲート
一部の特定の実施形態では、式（Ｉ−ａ１）：
【化４２】
2012516156.tif 000049
【０３６９】
のコンジュゲートが使用され得る。
【０３７０】
一部の特定の実施形態では、式（Ｉ−ａ２）：
【化４３】
2012516156.tif 000050
【０３７１】
のコンジュゲートが使用され得る。
【０３７２】
一部の特定の実施形態では、式（Ｉ−ｂ１）：
【化４４】
2012516156.tif 000051
【０３７３】
のコンジュゲートが使用され得る。
【０３７４】
一部の特定の実施形態では、式（Ｉ−ｂ２）：
【化４５】
2012516156.tif 000052
【０３７５】
のコンジュゲートが使用され得る。
【０３７６】
一部の特定の実施形態では、式（Ｉ−ｃ１）：
【化４６】
2012516156.tif 000053
【０３７７】
のコンジュゲートが使用され得る。
【０３７８】
一部の特定の実施形態では、式（Ｉ−ｃ２）：
【化４７】
2012516156.tif 000054
【０３７９】
のコンジュゲートが使用され得る。
【０３８０】
これらの例示的なコンジュゲートのどれにおいても、基：
【化４８】
2012516156.tif 000055
【０３８１】
は、基：
【化４９】
2012516156.tif 000056
【０３８２】
および基：
【化５０】
2012516156.tif 000057
【０３８３】
（式中、それぞれ、（ｇ＋ｔ）の和はｒに等しい）の混合物に相当する。一部の特定の実施形態では、ｒは１０である。一部の特定の実施形態では、ｒは２０である。
【０３８４】
コンジュゲートの特性評価
該コンジュゲートは、任意の解析方法、例えば、核磁気共鳴（例えば、１Ｈ  ＮＭＲ）；分子量と多分散性はゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）；および鎖１本あたりの酸基の数の測定はフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）または酸滴定によって特性評価することができる。
【０３８５】
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの枠組構造（すなわち、親和性リガンド、薬物または検出可能な標識を含まない）は、１０，０００Ｄａ未満、例えば約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜約５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約５００〜約２，５００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約１，０００〜２，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約２００〜１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜８００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【０３８６】
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの混合物を作製する。該コンジュゲートは、この混合物において、同じ分子量を有するものであっても異なる分子量を有するものであってもよい。一実施形態において、混合物の多分散性は１．５未満である。一実施形態において、混合物の多分散性は１．２５未満である。
【０３８７】
実施例１３−式（ＩＩ）のコンジュゲート
この実施例では、式（ＩＩ）：
【化５１】
2012516156.tif 000058
【０３８８】
のいくつかの例示的なコンジュゲートを記載する。
【０３８９】
このコンジュゲートのまた他の実施形態ならびにこのコンジュゲートの中間体および作製方法は、米国特許仮出願第６１／１４７，８７８号（２００９年１月２８日出願）、米国特許仮出願第６１／１５９，６４３号（２００９年３月１２日出願）、米国特許仮出願第６１／１６２，１０７号（２００９年３月２０日出願）、米国特許仮出願第６１／１６３，０８４号（２００９年３月２５日出願）、米国特許仮出願第６１／２１９，８９７号（２００９年６月２４日出願）、米国特許仮出願第６１／２２３，５７２号（２００９年７月７日出願）、米国特許仮出願第６１／２５２，８５７号（２００９年１０月１９日出願）、および対応ＰＣＴ出願（２０１０年１月２７日出願）を見るとよい。これらの関連出願の全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０３９０】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＩ−ａ１）：
【化５２】
2012516156.tif 000059
【０３９１】
のコンジュゲートが提供される。
【０３９２】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化５３】
2012516156.tif 000060
【０３９３】
のコンジュゲートが提供される。
【０３９４】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＩ−ａ２）：
【化５４】
2012516156.tif 000061
【０３９５】
のコンジュゲートが提供される。
【０３９６】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化５５】
2012516156.tif 000062
2012516156.tif 000063
【０３９７】
のコンジュゲートが提供される。
【０３９８】
一部の実施形態では、本開示により、一般式（ＩＩ−ａ３）：
【化５６】
2012516156.tif 000064
【０３９９】
のコンジュゲートが提供される。
【０４００】
例えば、一部の実施形態では、本開示により、式：
【化５７】
2012516156.tif 000065
2012516156.tif 000066
【０４０１】
のコンジュゲートが提供される。
【０４０２】
コンジュゲートの特性評価
該コンジュゲートは、任意の解析方法、例えば、核磁気共鳴（例えば、１Ｈ  ＮＭＲ）；分子量と多分散性はゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）；およびフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）などよって特性評価することができる。
【０４０３】
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの枠組構造（すなわち、親和性リガンド、薬物または検出可能な標識を含まない）は、１０，０００Ｄａ未満、例えば約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜約５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約５００〜約２，５００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約１，０００〜２，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約２００〜１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約３００〜８００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【０４０４】
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示した発明の実施により、当業者に自明となろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなし、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲に示されていることを意図する。
【図１】
2012516156.tif 000070
【図２】
2012516156.tif 000071
【図３】
2012516156.tif 000072
【図４】
2012516156.tif 000073
【図５】
2012516156.tif 000074
【図６】
2012516156.tif 000075
【配列表】
2012516156000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月27日(2011.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマー；および
コンジュゲート枠組構造に結合された２つ以上の個別の親和性リガンドを含むコンジュゲートを含む架橋物質体であって、
該２つ以上の親和性リガンドは、該アプタマーとの結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート上の親和性リガンドと該アプタマー間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、
架橋物質体。
【請求項２】
該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された薬物を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項３】
標的分子がグルコースである、請求項１に記載の物質体。
【請求項４】
該コンジュゲートの親和性リガンドが糖質を含む、請求項３に記載の物質体。
【請求項５】
該コンジュゲートの親和性リガンドが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含む、請求項４に記載の物質体。
【請求項６】
薬物が抗糖尿病薬である、請求項２に記載の物質体。
【請求項７】
薬物がインスリン分子である、請求項２に記載の物質体。
【請求項８】
該コンジュゲートが、式：
【化１】
2012516156.tif 000076
（式中、
Ｒｘは、水素または置換されていてもよいＣ１〜６アルキルであり；
Ｚ１は、置換されていてもよい二価のＣ１〜１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の１、２、３、４または５個のメチレン単位は、独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、置換されていてもよいアリーレン部分または置換されていてもよいヘテロアリーレン部分から選択される１つ以上の基で置き換えられていてもよく、式中、Ｒａは、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいヘテロ脂肪族、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、または適当なアミノ保護基であり、Ｒｂは、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいヘテロ脂肪族、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールであり；
Ｘ１は各々、独立して、−ＯＲＣまたは−Ｎ（Ｒｄ）２であり、式中、Ｒｃは、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいヘテロ脂肪族、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基、または親和性リガンドであり、各Ｒｄは、独立して、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいヘテロ脂肪族、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、適当なアミノ保護基、または親和性リガンドであるが、Ｘ１の少なくとも２つは親和性リガンドを含むものとし；
Ｙ１は、水素、ハロゲン、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいヘテロ脂肪族、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、−ＯＲｅまたは−ＳＲｅであり、式中、Ｒｅは、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいヘテロ脂肪族、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールであり；
ｒは、５〜２５（両端を含む）の整数であり；
Ｗ１は、薬物または検出可能な標識であり；
【化２】
2012516156.tif 000077
は、共有結合性の単結合または二重結合に相当する）
の構造を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項９】
該コンジュゲートが、式：
【化３】
2012516156.tif 000078
（式中：[(Ａ−Ｔ)]は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し；
（Ａ−Ｔ）は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し；
−Ａ−は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される置換されていてもよい基であり；
Ｔは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の置換されていてもよいＣ１〜３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの１つ以上のメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられていてもよい；
Ｒは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり；
−Ｂは、−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり；
Ｘは各々、独立して、親和性リガンドであり；
ＬＢは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＸとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
−Ｄは、−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり；
Ｗは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり；
ＬＤは各々、独立して、共有結合であるか、またはＴとＷとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり；
ｋは、２〜１１（両端を含む）の整数であり、該コンジュゲート内にｋ−分岐部が少なくとも２つあることを規定し；
ｑは、１〜４（両端を含む）の整数であり；
ｋ＋ｑは、３〜１２（両端を含む）の整数であり；
ｐは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
ｎは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは各々、独立して、１〜５（両端を含む）の整数であり；
ｖは各々、独立して、０〜５（両端を含む）の整数であるが、各ｋ−分岐部において、存在する少なくとも１つのｎは≧１であり、存在する少なくとも１つのｖは≧１であるものとする）
の構造を含む、請求項１に記載の物質体。
【請求項１０】
Ｘの少なくとも２つが糖質を含む親和性リガンドを含む、請求項８または９に記載の物質体。
【請求項１１】
Ｘの少なくとも２つが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースからなる群より選択される糖質を含む親和性リガンドを含む、請求項８または９に記載の物質体。
【請求項１２】
Ｘの少なくとも２つが、ビマンノース（ｂｉｍｍａｎｏｓｅ）またはトリマンノースを含む親和性リガンドを含む、請求項８または９に記載の物質体。
【請求項１３】
Ｘの少なくとも２つが、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）およびアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）から選択される親和性リガンドを含む、請求項８または９に記載の物質体。
【請求項１４】
多価アプタマーが、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０個の連続するヌクレオチドを含むか、配列番号１、２、３、４、５、６または７の少なくとも４０個の連続するヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含むか、配列番号８、９または１０のヌクレオチド配列を含むか、配列番号８、９または１０の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含むか、または、配列番号８、９または１０と少なくとも７０％の相同性を有する１つ以上の領域を含む、請求項３に記載の物質体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の物質体を患者に投与することを含む方法。
【請求項１６】
患者が糖尿病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーであって、第１の標識を含む多価ポリヌクレオチドアプタマーと、
（ｂ）親和性リガンドおよび第２の標識を含むコンジュゲートと、
を混合する工程
ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると、測定可能な応答をもたらす；
（ＩＩ）試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと該コンジュゲートの混合物に曝露する工程、ここで、
（ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、該コンジュゲートは該ポリヌクレオチドアプタマーと、該ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって架橋物質体を形成し、測定可能な応答をもたらし、
（ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが該コンジュゲートと、該ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、該架橋物質体の形成が抑止されるため応答が低減される；ならびに
（ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程
を含む方法。
【請求項１８】
（Ｉ）（ａ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーと、
（ｂ）親和性リガンドおよび第１の標識を含む第１の分子群と、
（ｃ）親和性リガンドおよび第２の標識を含む第２の分子群と、
を混合する工程、
ここで、第１の標識は、第２の標識に近接していると測定可能な応答をもたらす、
（ＩＩ）試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと第１の分子群および第２の分子群との混合物に曝露する工程、ここで、
（ａ）グルコースが試料中に存在しない場合、第１の分子群および第２の分子群の構成員は、該多価ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって近接し、結合複合体および測定可能な応答をもたらし、
（ｂ）グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが、第１および第２の分子と、該多価ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、前記結合複合体の形成が少なくなるため応答が低減される；ならびに
（ＩＩＩ）試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程
を含む方法。
【請求項１９】
（Ｉ）（ａ）複数の親和性リガンドを含むコンジュゲートと、
（ｂ）グルコースに対する結合部位を少なくとも２つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマー
を準備する工程；
（ＩＩ）該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマーを混合する工程、
ここで、得られた混合物の粘性は、該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマー間の結合によるものである；
（ＩＩＩ）該混合物を、グルコースを含む試料と接触させる工程、
これにより、該コンジュゲートが該ポリヌクレオチドアプタマーから外れ、濃度依存性の粘性の低下が引き起こされる；ならびに
（ＩＶ）生じた粘性の変化を検出し、任意選択で該変化を測定し、試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定する工程
を含む方法。
【国際調査報告】
2012516156.tif 000079
2012516156.tif 000080
2012516156.tif 000081
2012516156.tif 000082
2012516156.tif 000083