(57)【要約】ＲＮＡパターンの決定など、ＲＮＡレベルを評価することによって癌を特徴づけるための方法および組成物を提供する。マイクロＲＮＡなどの１つ以上のＲＮＡを検出することによって、癌の診断、予後判定、監視および治療を決定することができる。2012507300.tif 000015
2012507300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被験者の生体試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）前記被験者の生体試料から、ＰＣＡ３の発現レベルとＰＳＡの発現レベルとの間の比であるＰＣＡ３スコアを決定するステップと、
（ｃ）前記ｍｉＲＮＡの少なくともサブセットおよび前記ＰＣＡ３スコアに基づいて前立腺癌を特徴づけるステップと
を含む、前立腺癌を特徴づける方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）および（ｂ）のために単一の生体試料を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡの前記レベルが１マイクロリットル当たり約３０００コピー未満であり、かつ前記ＰＣＡ３スコアが約３５未満である場合に、前記癌を良性として分類することによって前記前立腺癌を特徴づける、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｍｉＲＮＡの前記レベルが１マイクロリットル当たり約９０００コピーを超え、かつ前記ＰＣＡ３スコアが約３５を超える場合に、前記癌を悪性として分類することによって前記前立腺癌を特徴づける、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）被験者の生体試料中の複数のｍｉＲＮＡの各々の発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）前記複数のｍｉＲＮＡの各々の前記発現レベルに基づいて癌を特徴づけるステップと
を含む、被験者における癌を特徴づける方法であって、
（ｂ）の前記特徴づけるステップの感度または特異度が、前記複数のｍｉＲＮＡの各々より少ない数の発現レベルを検出することによって特徴づける場合と比較して増加している、方法。
【請求項６】
前記複数が少なくとも１０個のｍｉＲＮＡを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のｍｉＲＮＡの少なくともサブセットが表１から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のｍｉＲＮＡの少なくともサブセットが、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１７、ｍｉＲ−５９０、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−７６８、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−５１９、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２００、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−５４８およびｍｉＲ−３７０からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）被験者の生体試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）１マイクロリットル当たり約３０００コピー未満の前記ｍｉＲＮＡの少なくともサブセットが前記試料中で検出された場合に、癌を良性として分類するステップと
を含む、癌を良性として分類する方法。
【請求項１０】
（ａ）被験者の生体試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）１マイクロリットル当たり約９０００コピーを超える前記ｍｉＲＮＡの少なくともサブセットが前記試料中で検出された場合に、癌を悪性として分類するステップと
を含む、癌を悪性として分類する方法。
【請求項１１】
前記分類に基づいて治療法または治療計画を選択するステップをさらに含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分類の結果を、ネットワークを通して送信する、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験者の第１生体試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップ
を含む、癌を特徴づける方法であって、
１マイクロリットル当たり約１０００〜約４５００コピーの間の前記試料中の前記ｍｉＲＮＡの少なくともサブセットが検出された場合に、第２生体試料を得る、方法。
【請求項１４】
前記第１生体試料が、異種細胞試料、痰、血液、血球、血清、生検材料、尿、腹腔液および胸膜液からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１生体試料が生検材料でない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２生体試料が生検材料である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２生体試料を、免疫組織化学法、インサイチューハイブリダイゼーション（蛍光インサイチューハイブリダイゼーションなど）、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ解析または配列決定によって分析する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が上皮癌である、請求項５、請求項９、請求項１０または請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記上皮癌が乳癌、脳癌、膵臓癌、骨癌、肝癌、胃癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、前立腺癌または卵巣癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）被験者の生体試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）被験者の生体試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の発現レベルを測定するステップと、
（ｃ）前記ｍｉＲＮＡの少なくともサブセットおよびＰＳＡの前記レベルに基づいて、前立腺癌を特徴づけるステップと
を含む、前立腺癌を特徴づける方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）および（ｂ）のために単一の生体試料を使用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＳＡの前記発現レベルがタンパク質レベルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ｍｉＲＮＡの前記レベルが１マイクロリットル当たり約３０００コピー未満であり、かつ前記ＰＳＡレベルが約３ｎｇ／ｍＬ未満である場合に、前記前立腺癌を良性として分類することによって、前記前立腺癌を特徴づける、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ｍｉＲＮＡの前記レベルが１マイクロリットル当たり約９０００コピーを超え、かつ前記ＰＳＡレベルが約４ｎｇ／ｍＬを超える場合に、前記前立腺癌を悪性として分類することによって、前記前立腺癌を特徴づける、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｍｉＲＮＡのうちの１つの発現レベルにＰＳＡの前記レベルを掛けて、前記前立腺癌を特徴づけるために使用する産物値を得るステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１４１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記特徴づけが、少なくとも約７５％の感度を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記特徴づけが、少なくとも約７５％の特異度を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記産物値が約１５００未満である場合に、前記前立腺癌を良性として分類することによって、前記前立腺癌を特徴づける、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験者からの追加の生体試料を得ない、請求項２３または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記産物値が約１５００を超える場合に、前記前立腺癌を悪性として分類することによって、前記前立腺癌を特徴づける、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験者からの追加の生体試料を得る、請求項２４または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記追加の生体試料が生検材料である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記追加の生体試料を、免疫組織化学法、インサイチューハイブリダイゼーション（蛍光インサイチューハイブリダイゼーションなど）、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ解析または配列決定によって分析する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｍｉＲＮＡの少なくともサブセットが表１から選択される、請求項１、請求項９、請求項１０、請求項１３または請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｍｉＲＮＡの少なくともサブセットがｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１７、ｍｉＲ−５９０、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−７６８、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−５１９、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２００、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−５４８およびｍｉＲ−３７０からなる群から選択される、請求項１、請求項９、請求項１０、請求項１３または請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）被験者の生体試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップであって、
前記ｍｉＲＮＡの少なくともサブセットがｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂおよびｍｉＲ−２２２からなる群から選択されるステップと、
（ｂ）（ａ）における前記発現レベルに基づいて前立腺癌を特徴づけるステップと
を含む、被験者のにおける前立腺癌を特徴づける方法。
【請求項３８】
ｍｉＲ−１４１を検出するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）において前記ｍｉＲＮＡの少なくとも２つが選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）において前記ｍｉＲＮＡの少なくとも５つが選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体試料が、異種細胞試料、痰、血液、血球、血清、生検材料、尿、腹腔液および胸膜液からなる群から選択される、請求項１、請求項５、請求項９、請求項１０、請求項１３、請求項２０または請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記特徴づけの結果を、ネットワークを通して送信する、請求項１、請求項５、請求項１３、請求項２０または請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記分類の結果を、ネットワークを通して送信する、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項４４】
ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される２つ以上のｍｉＲＮＡを評価するよう設定された検出システム。
【請求項４５】
前記システムが、前記２つ以上のｍｉＲＮＡと選択的にハイブリダイズするプローブのセットを含む、請求項４４に記載の検出システム。
【請求項４６】
前記システムがＰＳＡ用のプローブを含む、請求項４４に記載の検出システム。
【請求項４７】
前記システムがＰＣＡ３用のプローブを含む、請求項４４に記載の検出システム。
【請求項４８】
ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される２つ以上のｍｉＲＮＡと選択的にハイブリダイズするプローブのセットを含むキット。
【請求項４９】
前記プローブの各々が基質と結合している、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
ＰＳＡ用のプローブをさらに含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
ＰＣＡ３用のプローブをさらに含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５２】
ＰＳＡタンパク質を検出するための試薬をさらに含む、請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年１０月３０日出願の米国特許仮出願第６１／１０９７４２号、２００８年１１月７日出願の第６１／１１２５７１号、２００８年１１月１２日出願の第６１／１１４０４５号、２００８年１１月１２日出願の第６１／１１４０５８号、２００８年１１月１３日出願の第６１／１１４０６５号、２００９年２月９日出願の第６１／１５１１８３号、２００９年１０月２日出願の「前立腺腺癌由来エキソソームにおけるマイクロＲＮＡプロファイル」という題目のＣａｒｉｓ  ＭＰＩ整理番号第２３１０（ＷＳＧＲ参照番号第３７９０１−７０６．１０３）、２００９年１０月９日出願の第６１／２５０４５４号および２００９年１０月１９日出願の第６１／２５３０２７号についての恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
患者の健康管理は、疾患または状態の診断、予後判定または治療選択を提供することによって疾患または状態を特徴づける方法を向上させることにより、大いに向上しうる。疾患または状態をより早期に発見し、またはその病期を決定して、どのような種類の治療を選択すべきか決定することができる。疾患または状態は、上皮癌または癌腫などの癌でありうる。様々な種類の上皮細胞が存在し、これらは様々な種類の癌へと発達しうる。例えば、上皮細胞は、扁平細胞と呼ばれる、細胞の扁平な表面被覆を構成しうる。さらに、上皮細胞は、腺腫様細胞と呼ばれる腺状の形をとりうる。また、上皮細胞は、移行細胞と呼ばれる伸縮性のある層を形成しうる。癌腫は、全ての癌の約８５％を占め、これには乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌および卵巣癌が含まれる。
【０００３】
上皮性癌は、通常、固体塊または腫瘍になり、そこから癌細胞が体中に遊走し、最終的に他の部位に留まって続発性腫瘍または転移を形成する。固形腫瘍になる癌の主要な治療法の１つは、外科的切除または物理的もしくは化学的手段による腫瘍の切除である。例えば外科的切除によって被験者から癌を切除した後、治療のために追加的な治療法を使用することができるように、同一部位または続発部位における癌の再発の監視または検出が必要となりうる。同様に、治療が成功しているかどうかを判定し、それに応じて治療を適合させるために、治療段階中に癌治療の成功を監視するいくつかの手段が必要となりうる。
【０００４】
上皮癌などの癌を特徴づける方法が必要である。例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）テストが前立腺癌の管理に寄与したにもかかわらず、このテストは、この抗原が前立腺癌ではなく前立腺組織に特異的であることに起因する重大な欠点に悩まされている。このテストは、ＰＳＡ抗原に非常に特異的であるが、全ての前立腺癌が過剰なレベルの抗原を血清中に放出するわけではない。これにより、臨床感度が欠如し、日常的なＰＳＡ検査で臨床的に有意な癌を頻繁に見逃す結果となる。
【０００５】
正常なＰＳＡ値は、現在、４．０ｎｇ／ｍＬ未満であると考えられている。有意な前立腺癌を有する男性の少なくとも２０％は、４．０ｎｇ／ｍＬ未満のＰＳＡ値を有しうる。しかしながら、ＰＳＡは、正常組織、無痛性過形成組織、前悪性組織および悪性組織によって作られるので、ＰＳＡの上昇（４．０ｎｇ／ｍＬを超える）の発見は必ずしも癌を示すわけではない。血清ＰＳＡが、４．０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲にある場合、繰り返しのより徹底的な生検（１０〜１２箇所）を用いても、前立腺癌を発見する確率は２５〜３０％にすぎない。ＰＳＡ値の上昇を発見すると往々にして、被験者にとって不快で潜在的に危険な経直腸生検を受けるという結果になる。ＰＳＡが有意に上昇している男性が、血清ＰＳＡの上昇の原因を見つけるために２箇所以上の生検を受けることはまれである。
【０００６】
したがって、癌を特徴づける方法の改善が必要である。本明細書では、この必要性に応える方法およびシステムを提供し、関連する利点も提供する。
【０００７】
参照による引用
本明細書で言及する全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が具体的かつ個々に示されて参照により組み込まれるのと同程度参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、ＲＮＡまたはＲＮＡパターンを検出または評価することによって疾患または状態を特徴づける方法を提供する。状態を特徴づけることには、癌などの疾患もしくは状態の診断、予後判定、監視、治療の選択または分類が含まれうる。癌は、乳癌、脳癌、膵臓癌、骨癌、肝癌、胃癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、前立腺癌または卵巣癌などの上皮癌でありうる。ＲＮＡパターンは、ｍｉＲＮＡの発現レベルなど、ｍｉＲＮＡを検出することを含みうる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本方法は、被験者における癌を特徴づけることを含み、特徴づけは、前記被験者の生体試料中のｍｉＲＮＡパターンを決定することを含み、ｍｉＲＮＡパターンは前記試料中の複数のｍｉＲＮＡの各々の発現レベルを含む。いくつかの実施形態では、特徴づけは、前記複数のｍｉＲＮＡの各々より少ない数の発現レベルを検出することによる特徴づけと比較して、感度が増加している。ｍｉＲＮＡは、表１から選択することができる。
【００１０】
良性または悪性など、癌を分類する方法、および非生検試料の最初の分析後に固体組織生検材料を得るべきかどうか判定する方法も提供する。本方法はさらに、分類または生検の結果に基づいて治療または治療方式を選択することも含みうる。癌を分類すること、または生検材料を得るべきかどうか判定することには、１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数などのｍｉＲＮＡの発現レベルを判定することが含まれうる。本方法は、タンパク質レベル、または生体試料のＰＣＡ３発現レベルとＰＳＡ発現レベルとの間の比率であるＰＣＡ３スコアなどの、ＰＳＡの発現レベルを測定することも含みうる。本方法は、産物値を決定して癌を特徴づけることも含みうる。産物値は、ｍｉＲ−１４１などのｍｉＲＮＡの発現レベルに、ＰＳＡのレベルを掛けることによって決定することができる。例えば、１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数は、ナノグラムを掛けることができる。
【００１１】
本明細書では、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２またはｍｉＲ−３７０などの１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することによって、前立腺癌などの癌を特徴づける方法も提供する。
【００１２】
ＲＮＡまたはＲＮＡパターンを他の非ＲＮＡバイオマーカーと組み合わせて使用して癌を特徴づけることもできる。
【００１３】
１つ以上の代表的な実施形態の詳細を、添付の図面および以下の詳細な説明で明らかにする。他の特徴、目的および利点は、詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】前立腺癌試料の遺伝子解析の結果を説明する図である。Ａ）最初の調査では、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅプラットフォームで、遺伝子発現プロファイルについて１４個の前立腺癌組織を解析した。最も共通に過剰発現した遺伝子を列挙している。Ｂ）別の調査では、Ａ）と同一のプラットフォームを使用して、遺伝子の発現レベルについて６つの前立腺癌のセットを解析した。上位１００の発現遺伝子を同定した。前立腺癌の５／６および６／６について上位１００に列挙される遺伝子を列挙している。Ｃ）免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、遺伝子の過剰発現について２２個体からの前立腺癌試料を検査した。２２試料の少なくとも１０試料で過剰発現した遺伝子を列挙している。
【図２】６つの前立腺癌試料についての発現プロファイルを説明する図である。この図は、右に列挙した遺伝子名を有する６つの前立腺癌試料に対するＡｇｉｌｅｎｔ遺伝子チップ解析から得られた発現プロファイルを示している。暗色または陰影は高い発現レベルを示している。
【図３】癌試料についての解析を説明する図である。遺伝子の発現レベルについて６つの前立腺癌のセットを解析し、上位１００の発現遺伝子を列挙した。前立腺癌の５／６および６／６について上位１００に列挙される遺伝子を図１Ｂに列挙している。
【図４】免疫組織化学（ＩＨＣ）およびＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋチップの遺伝子発現プロファイリングの両方によって、データベースにおいて前立腺癌試料中で最も頻繁に過剰発現した遺伝子を解析し、これらの遺伝子に関連することが知られているマイクロＲＮＡに関して、一般に入手できるｍｉＲＮＡデータベース（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇのような）を検索し、観察される頻度によってｍｉＲＮＡを順位づけることにより、ｍｉＲＮＡの頻度（ｘ軸に沿って列挙している）を説明するグラフである。
【図５】前立腺癌が確認された２５人の被験者と前立腺癌でない２５人の被験者についてのＰＳＡ産物の値およびｍｉＲ−１４１のレベルを示す表である。Ａ）は前立腺癌の被験者および正常な被験者についてのｍｉＲ−１４１コピー、ＰＳＡレベルおよび産物値を列挙している。Ｂ）は、正常な被験者および前立腺癌の被験者（ＰｒＣａ）におけるｍｉＲ−１４１およびＰＳＡの平均値、標準偏差、信頼度ならびに上限および下限レベルを示す表である。
【図６】データを受信し、ＲＮＡ発現レベルを測定し、産物値を計算し、癌を特徴づけ、結果またはデータを送信し、結果を出力するなどのために、本明細書に開示する１つ以上の方法とともに使用するための代表的なロジックデバイスを示す構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書では、被験者からの生体試料中のＲＮＡまたはＲＮＡパターンを評価することによって状態または疾患を特徴づける方法を提供する。疾患または状態を特徴づけることには、疾患または状態の検出、診断、予後判定または監視が含まれうる。特徴づけには、検出もしくは診断（発症前初期検出を含む）、予後もしくはテラノーシス（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ）の判定、または疾患もしくは状態の病期もしくは進行の判定も含まれうる。薬効の判定または疾患もしくは状態のための治療の選択、ならびにＲＮＡパターンなどの単数のＲＮＡもしくは複数のＲＮＡに基づく疾患または状態の再発、拡散、再発などの疾患または状態の進行の予測および見込みの分析も含まれる。疾患または状態の特徴づけには、疾患または状態の分類も含まれうる。さらに、試料中で決定したＲＮＡまたはＲＮＡパターンは、さらなる解析のために生検材料などの第２の試料を得るべきかどうかを判定するのに使用することができる。
【００１６】
本明細書で開示する方法および組成物によって特徴づけることができる疾患または状態は癌でありうる。癌の例には、膀胱癌、食道癌、肺癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、腎癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、リンパ腫、ユーイング肉腫、造血器腫瘍、固形腫瘍、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、脳癌、上皮癌、上咽頭癌、子宮癌、肝癌、頭頚部癌、腎癌、男子生殖細胞腫瘍、悪性中皮腫、骨髄異形成症候群、膵臓もしくは胆道癌、前立腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、腎癌、ウィルムス腫瘍、小細胞肺癌、メラノーマ、皮膚癌、骨肉腫、神経芽腫、白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、多形性膠芽腫、髄芽腫、リンパ形質細胞性リンパ腫または横紋筋肉腫が含まれる。癌は上皮癌でありうる。上皮癌は、乳癌、脳癌、肝癌、膵臓癌、胃癌、骨癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌または肺癌などの、体を覆い、かつ、体に沿って並ぶ皮膚組織の癌である。いくつかの実施形態では、癌は前立腺癌である。
【００１７】
試料
１つ以上のＲＮＡを、被験者から得られる生体試料から評価することができる。生体試料は、被験者からの任意の生体組織、体液または細胞の試料とすることができる。試料は、個体または液体であってよい。試料は、異種の細胞集団であってよい。試料は、痰、血液、血球（例えば、白血球）、生検材料、尿、腹腔液、胸膜液またはこれらに由来する細胞であってよい。生検は、穿刺吸引生検、針生検、吸引生検、外科的切開生検、薄片生検、パンチ生検、切開生検、掻爬生検または深部の薄片生検であってよい。生体試料には、組織学的目的のための凍結切片またはホルマリン固定切片などの組織の切片が含まれてもよい。試料は、腫瘍組織、腫瘍を囲む組織または非腫瘍組織であってよい。
【００１８】
被験者には、ウシ、トリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタまたは霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）などの哺乳類が含まれてよい。いくつかの実施形態では、被験者は特定の性別または年齢のヒトである。例えば、被験者の年齢は、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０歳であってよい。前立腺癌を特徴づけるため、被験者は、少なくとも５０歳の男性であってよい。被験者は、癌などの基礎疾患もしくは既往症、または基礎疾患もしくは既往症の家族歴を有していてよい。あるいは、被験者は、いかなる既知の既往症も有していなくてもよい。被験者は、癌の治療などの、現在または過去の治療に非反応性であってもよい。
【００１９】
エキソソーム
いくつかの実施形態では、本明細書で開示する１つ以上のＲＮＡを、生体試料のエキソソームから評価する。エキソソームは、それだけに限定されないが樹状細胞、腫瘍細胞、リンパ系細胞、中皮細胞、上皮細胞または異なる組織もしくは器官の細胞などの種々の異なる細胞から細胞外環境へ放出される小胞である。エキソソームは、細胞膜の一部分が自発的に陥入し、最終的に開口分泌される際に細胞内で作られる（Ｋｅｌｌｅｒ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７（２）：１０２〜８（２００６））。エキソソームは、微小胞、ナノ小胞、小胞、デキソソーム、ブレブ、プロスタソーム、微小粒子、管腔内小胞、エンドソーム様小胞または開口分泌小胞とも呼ばれうる。
【００２０】
エキソソームには、形質膜または内膜のいずれかに由来する任意の放出された膜結合性粒子も含まれうる。エキソソームには、脱出性膨出（小疱形成）分離および形質膜の一部の封着の両方から生じる、またはそれだけに限定されないが腫瘍由来のマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび細胞内タンパク質を含むエキソソーム内腔内に含まれる分子とともに腫瘍由来タンパク質に選択的に結合するホスト循環に由来する表面結合分子を含む、細胞起源の種々の膜結合タンパク質を含む任意の細胞内膜に囲まれた小胞性構造の排出から生じる脂質二重膜によって囲まれた細胞由来の構造もさらに含まれうる。エキソソームには、膜断片も含まれうる。
【００２１】
腫瘍細胞によるエキソソームの分泌ならびにタンパク質および核酸（例えばマイクロＲＮＡ）の輸送におけるエキソソームの意義は、病理学的過程におけるエキソソームの関与を示唆する。エキソソームは、それだけに限定されないが、生体内の関連性を示す血漿、気管支肺胞洗浄液および尿を含むいくつかの体液中で発見されてきた。エキソソームは、いくつかの異なる機能を有することが示されており、細胞間の伝達、ならびにＲＮＡ、ＤＮＡ、ウイルスおよびプリオンの輸送媒体に関与すると考えられている。
【００２２】
エキソソームから１つ以上のＲＮＡを評価することにより、癌の予後判定、監視、病期決定および治療意思決定などのために、癌検出の分析感度および特異度を向上させることができる。
【００２３】
１つ以上のＲＮＡを評価して癌を特徴づけることは、特定のＲＮＡまたは特定のＲＮＡパターンを有するエキソソームの量を検出することを含むことができる。他の実施形態では、エキソソームのＲＮＡまたはＲＮＡパターンの検出を使用して癌を特徴づけることができる。分析用のエキソソームは、異種のエキソソームの集団、または同種のもしくは実質的に同種のエキソソームの集団であってよい。エキソソームは、エキソソームを分析する前に精製または濃縮することができる。エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着剤捕捉、親和性精製、微小流体分離またはこれらの組み合わせを使用して、生体試料から濃縮または単離することができる。例えば、ゲル浸透カラムなどのサイズ排除クロマトグラフィー、遠心分離または密度勾配遠心分離、および濾過方法を使用することができる。例えば、エキソソームは、分画遠心分離、陰イオン交換および／またはゲル浸透クロマトグラフィー（例えば、米国特許第６８９９８６３号および同第６８１２０２３号に記載）、ショ糖密度勾配、細胞小器官電気泳動（例えば、米国特許第７１９８９２３号に記載）、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）またはナノ膜限外濾過濃縮器によって単離することができる。単離または濃縮方法の種々の組み合わせを使用することができる。
【００２４】
結合剤または捕捉剤を使用して、エキソソーム成分との結合によってエキソソームを単離することができる。結合剤または捕捉剤は、エキソソームを生体試料から濃縮または単離した後に使用することができる。例えば、バイオマーカー用の結合剤を使用して特定のバイオマーカーを有するエキソソームを単離する前に、エキソソームをまず生体試料から単離する。したがって、特定のバイオマーカーを有するエキソソームは異種のエキソソームの集団から単離する。あるいは、前のエキソソームの単離段階なしで、エキソソームを含む生体試料に結合剤を使用することができる。例えば、結合剤を使用して生体試料から特定のバイオマーカーを有するエキソソームを単離する。
【００２５】
結合剤は、それだけに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂｓ、Ｆａｂ’、単鎖抗体、合成抗体、アプタマー（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ペプトイド、ｚＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）、ロックド核酸（ＬＮＡｓ）、レクタン、合成もしくは天然の化合物（それだけに限定されないが、薬剤、標識試薬を含む）またはデンドリマーとすることができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡを評価して癌を特徴づけるために、血液試料または尿などからの前立腺特異的エキソソームまたはプロスタトソーム（ｐｒｏｓｔａｔｓｏｍｅ）を使用する。前立腺癌細胞に由来するエキソソームは、ＰＳＡ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＦＡＳＬＧ、ＴＮＦＳＦ１０、ＰＳＭＡ、ＮＧＥＰ、Ｉ１−７ＲＩ、ＣＳＣＲ４、ＣｙｓＬＴ１Ｒ、ＴＲＰＭ８、Ｋｖ１．３、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＭ８、ＰＳＧＲ、ＭＩＳＩＩＲ、ガレクチン−３、ＰＣＡ３、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ、これらの断片、これらの任意の組み合わせまたは前立腺癌細胞に特異的な抗原の任意の組み合わせなどの前立腺癌起源の細胞に特異的な１つ以上の抗原に対する抗体または任意の他の結合剤を使用して単離することができる。結合剤は、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ｍＡＢ  ５Ｄ４、ＸＰＳＭ−Ａ９、ＸＰＳＭ−Ａ１０、ガレクチン−３、Ｅ−セレクチン、ガレクチン−１、Ｅ４（ＩｇＧ２ａ  カッパ）またはこれらの任意の組み合わせとすることができる。エキソソームを単離するのに使用する結合剤または捕捉剤は、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１もしくはＲａｂ−５ｂなどのエキソソームの「ハウスキーピングタンパク質」に結合する剤とすることもでき、あるいはエキソソームを単離するためにＥｐＣＡＭ用の結合剤を使用する。
【００２７】
ＲＮＡ
任意の種のＲＮＡの評価を使用して癌などの疾患または状態を特徴づけることができる。ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）、ｍＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡまたはリボソームＲＮＡとすることができる。ＲＮＡパターンは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）、ｍＲＮＡ，核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、リボソームＲＮＡまたはこれらの任意の組み合わせなどの任意のＲＮＡ種を含むことができる。ＲＮＡパターンは、単一の種のＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡなどの種の任意の組み合わせを含むことができる。ＲＮＡの評価には、対照と比較して過剰発現もしくは過小発現などのＲＮＡの発現レベル、ＲＮＡの有無、または血漿１マイクロリットル当たりのコピー数もしくは血清１マイクロリットル当たりのコピー数など、試料１マイクロリットル当たりのコピー数などのＲＮＡのコピー数を測定または検出することが含まれうる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの評価は、ＲＮＡの配列の検出もしくは決定、またはＲＮＡの突然変異もしくは変異の検出である。
【００２８】
複数のＲＮＡを使用して癌などの疾患または状態を特徴づけることができる。例えば、ＲＮＡパターンは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２５００、５０００、７５００、１０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、７５０，０００または１，０００，０００の異なるＲＮＡなど、２つ以上の異なるＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡパターンは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２５００、５０００、７５００、１０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、７５０，０００または１，０００，０００の異なるｍｉＲＮＡを含む。ＲＮＡパターンは、ｍＲＮＡなどの他の種のＲＮＡと組み合わせて１つ以上の異なるｍｉＲＮＡを含むこともできる。
【００２９】
本明細書では、癌を診断するのに使用することができる１つ以上のＲＮＡを評価する方法も提供する。診断には、癌が存在しないなどの陰性診断が含まれうる。他の実施形態では、診断には、癌の病期または癌の発症前段階を同定することが含まれうる。１つ以上のＲＮＡを使用して、癌になる危険性もしくは罹患性、または癌の侵襲性もしくは悪性度の提供など、癌の予後判定を提供することもできる。
【００３０】
試料中の１つ以上のＲＮＡの評価を使用して、癌の治療法を選択することができる。１つ以上のＲＮＡの検出を使用して、被験者の状態の相対的な改善または悪化など、癌の治療法または治療の有効性を判定することができる。有効な治療法または有効でない治療法で処置した患者の試料からの１つ以上のＲＮＡの評価を決定して、被験者のための治療法を選択するための基準として使用することができる。別の実施形態では、被験者における癌が進行的に悪化するまたは改善するにつれて、１つ以上のＲＮＡのレベルが、癌のより悪いまたはよりよい病期にあった患者からの１つ以上のＲＮＡの基準と比較して変化しうる。
【００３１】
１つ以上のＲＮＡに基づいて選択する治療または療法は、以下の１つ以上から選択される抗癌療法または治療などの、癌のための治療とすることができる：ワクチン接種、抗成長因子もしくはシグナル伝達療法、放射線療法、内分泌療法またはヒト抗体療法化学療法。治療には、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤またはこれらの組み合わせが含まれうる。現在、当該技術分野では多くの化学療法剤が知られており、本明細書に記載する１つ以上の化合物と組み合わせて使用することができる。例えば、化学療法剤は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生体応答修飾物質、抗ホルモン、血管新生阻害剤および抗アンドロゲン物質からなる群から選択することができる。本明細書で使用する場合、癌治療、癌治療法などは、切断、剥離、切除（物理的もしくは化学的手段、または物理的もしくは化学的手段の組み合わせによる）、縫合、レーザー照射、または体組織および器官を物理的に変えることなどの手術、放射線治療、化学療法剤の投与、ならびにこれらの方法の任意の２つまたは全部の組み合わせを含む。組み合わせ治療は、経時的または同時的に行うことができる。手術前に行う放射線治療および／または化学療法などの治療をネオアジュバント療法と呼ぶ。手術後に行う放射線治療および／または化学療法などの治療を、本明細書ではアジュバント療法と呼ぶ。前立腺癌の治療に使用することができる手術の例には、それだけに限定されないが、根治的前立腺摘除術、凍結療法、前立腺の経尿道的切除術などが含まれる。
【００３２】
１つ以上のＲＮＡの検出を使用して、被験者の状態の相対的な改善または悪化など、癌の治療法または治療の有効性を判定することもできる。癌の治療を受けている患者について１つ以上のＲＮＡを決定して、改善または有益な効果と関連づけることができ、次いでそれを基準として使用する。例えば、改善または有益な効果は、一般的に、以下の事象の１つ以上が起こったかどうかを判定することによって評価することができる：腫瘍サイズが減少した、腫瘍細胞の増殖が減少した、細胞の数が減少した、血管新生が減少した、および／またはアポトーシスが増加した。いくつかの場合、これらの出来事の１つ以上は、癌の部分的または完全な消失および被験者の生存の延長に結びつく。あるいは、末期癌に関しては、治療は疾患の静止、生活の質の改善および／または生存の延長に結びつきうる。これらの事象のいずれかの逆の結果および／または静止は、治療または治療法の無効果を示しうる。治療を評価する他の方法が当該技術分野で知られており、本明細書で企図される。異なる評価は、異なるＲＮＡまたはＲＮＡパターンと関連づけることができる。
【００３３】
１つ以上のＲＮＡの評価を使用して、被験者の抗癌治療計画もしくは治療の進行、または癌の再発を監視することもできる。例えば、治療の間中の種々の時点におけるＲＮＡまたはＲＮＡパターンである。ＲＮＡまたはＲＮＡパターンを使用して、患者の癌の広がりを監視することもできる。例えば、ｍｉＲ−１４１を使用して結腸直腸癌の再発を検出することができる。現在は、結腸直腸癌の再発は、抗原ＣＥＡ（癌胎児性抗原）のレベルによって判定される。しかしながら、ＣＥＡは、単独で使用すると、交絡の問題を有しうる。例えば、全ての転移性結腸直腸腫瘍がＣＥＡを発現するわけではなく、ｍｉＲ−１４１のような追加的なマーカーの必要性を生み出す。同様の問題は、卵巣癌、乳癌、肺癌および膀胱癌などの上皮性癌についての他の単一の抗原検査に関しても知られている。
【００３４】
再発は、被験者から定期的に試料を得て、被験者の試料からＲＮＡまたはＲＮＡパターンを定期的に監視することによって判定することができる。例えば、上皮癌を有さない被験者に相当する対照試料中のｍｉＲ−１４１量と比較して、定期的な血液試料中のｍｉＲ−１４１の量が定常的変化を示しているか、または有意に上昇している場合に、上皮癌が再発していた。一実施形態では、例えば外科的に被験者から癌を除去した後にＲＮＡまたはＲＮＡパターンの評価を通して被験者を監視し、同一部位または続発部位での癌の再発を同定して、治療のために追加的な治療法を採用することができる。別の実施形態では、ＲＮＡまたはＲＮＡパターンの解析のために治療前および治療中に試料を採取することによって、治療段階中に被験者を監視する。ＲＮＡまたはＲＮＡパターンに基づいて、治療法が成功したのかそうでないのか、治療法を適合させるべきかどうか、または患者が別の治療法を試すべきかどうかを判定することができる。
【００３５】
分類
別の実施形態では、１つ以上のＲＮＡの評価を使用して、癌を分類または病期分類することができる。分類および病期分類を使用して、癌の治療を評価することもできる。
【００３６】
例えば、癌は、悪性腫瘍のＴＮＭ分類に基づいて分類することができる。癌のこの病期分類システムを使用して、被験者の体内の癌の程度を説明することができる。Ｔは腫瘍の大きさおよび腫瘍が近くの組織に浸潤したかどうかを説明し、Ｎは関与する所属リンパ節を説明し、Ｍは遠隔転移を説明する。ＴＮＭは、国際対癌連合（ＵＩＣＣ）によって管理されており、米国対癌合同委員会（ＡＪＣＣ）および国際産婦人科連合（ＦＩＧＯ）によって使用されている。例えば、脳腫瘍など、全ての腫瘍がＴＮＭ分類を有するわけではないことが理解されよう。一般的に、Ｔ（ａ、ｉｓ、（０）、１〜４）は、原発腫瘍の大きさまたは直接的な程度として測定される。Ｎ（０〜３）は、所属リンパ節への広がりの程度を指す：Ｎ０は腫瘍細胞が所属リンパ節に存在しないことを意味し、Ｎ１は腫瘍細胞が最も近いまたは少数の所属リンパ節に広がっていることを意味し、Ｎ２は腫瘍細胞がＮ１とＮ３との間の程度に広がっていることを意味し、Ｎ３は腫瘍細胞が最も遠隔のまたは多数の所属リンパ節に広がっていることを意味する。Ｍ（０／１）は、転移の存在を指す：Ｍ０は遠隔転移がないことを意味し、Ｍ１は遠隔臓器へ（所属リンパ節を越えて）転移が起こったことを意味する。他のパラメータも評価されうる。Ｇ（１〜４）は、癌細胞のグレードを指す（すなわち、癌細胞が正常細胞と類似しているように見える場合には癌細胞は低いグレードであり、癌細胞が低分化に見える場合には高いグレードである）。Ｒ（０／１／２）は、手術の完全性（すなわち、癌細胞がないまたはあるところの切除境界）を指す。Ｌ（０／１）は、リンパ管への浸潤を指す。Ｖ（０／１）は、静脈への浸潤を指す。Ｃ（１〜４）は、Ｖの確実性（質）の修飾因子を指す。
【００３７】
本方法には、グリーソンスコアリングシステムに基づく前立腺腫瘍の分類も含まれる。グリーソンスコアリングシステムは、生検標本を解釈しながら病理医によって評価される顕微鏡的腫瘍パターンに基づく。前立腺癌が生検材料中に存在する場合、グリーソンスコアは正常な腺組織構造（すなわち、腺の形状、大きさおよび分化）の喪失の程度に基づく。伝統的なグリーソンスコアリングシステムは、技術的に腫瘍「グレード」と呼ばれる５つの基本的な組織パターンを有する。癌によって引き起こされる正常な腺構造のこの喪失の顕微鏡的判定は、グレード、すなわち１〜５の数によって表され、５が最悪のグレードである。グレード１は、一般的に、癌性の前立腺が正常な前立腺組織とよく似ている場合である。腺は小さく、均整のとれた形状をしており、よく密在している。グレード２では、組織はまだ均整のとれた形状の腺を有しているが、腺はより大きく、その間により多くの組織を有しており、他方でグレード３では、組織はまだ認識できる腺を有しているが、細胞はより暗い。高倍率では、グレード３の試料中のこれらの細胞のいくつかは腺を残しており、周囲の組織に浸潤し始めている。グレード４の試料は、認識できる腺をほとんど有さない組織を有しており、多くの細胞が周囲の組織に浸潤している。グレード５の試料については、組織は認識できる腺を有しておらず、多くの場合周囲の組織のいたるところに細胞のシートが存在する。
【００３８】
例えば、１つ以上のＲＮＡのレベルに基づく、１つ以上のＲＮＡについての生体試料の初期分析の後、病理医によって第２の分析を行うことができ、ここで病理医は試料についてのグリーソンスコアを決定する。生検材料を得て被験者のグリーソンスコアを決定する前に、１つ以上のＲＮＡについて尿などの生体液を分析することができる。
【００３９】
１つ以上のＲＮＡの評価を使用して、癌を悪性（例えば、侵襲性）または良性（例えば、緩慢性）として分類することもできる。例えば、生体試料に関してｍｉＲＮＡパターンを決定し、癌が侵襲性か緩慢性かを分類するのに使用することができる。例えば、本明細書で開示する方法を使用して、良性（例えば、緩慢性）と悪性（例えば、侵襲性）の前立腺癌を区別することによって、前立腺癌を分類することができる。
【００４０】
分類は、１つのＲＮＡの量もしくはレベル、または複数のＲＮＡの各々のレベルに基づくことができる。例えば、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡのレベルが試料、例えば血清試料１マイクロリットル当たり約３０００コピー未満である場合、癌の分類は、緩慢性上皮癌である。ＲＮＡレベルが、約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００未満など、１マイクロリットル当たり約１０００と約３０００との間である場合、癌の分類は良性とすることができる。いくつかの実施形態では、検出されるＲＮＡのサブセットの発現レベルが、試料１マイクロリットル当たり約３０００コピー未満である場合、癌を良性として分類する。他の実施形態では、検出されるＲＮＡのサブセットの発現レベルが、１マイクロリットル当たり約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００コピー未満など、試料１マイクロリットル当たり約１０００と約３０００コピーとの間である場合、癌を良性として分類する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡのレベルが、血清試料などの試料１マイクロリットル当たり約９０００と約２６０００コピーとの間など、少なくとも約９０００である場合、前立腺癌などの上皮癌の分類は悪性である。例えば、試料１マイクロリットル当たり少なくとも約９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１００００、１０１００、１０２００、１０３００、１０４００、１０５００、１０６００、１０７００、１０８００、１０９００、１１０００、１１１００、１１２００、１１３００、１１４００、１１５００、１１６００、１１７００、１１８００、１１９００、１２０００、１２１００、１２２００、１２３００、１２４００、１２５００、１３０００、１３５００、１４０００、１４５００、１５０００、１５５００、１６０００、１６５００、１７０００、１７５００、１８０００、１８５００、１９０００、１９５００、２００００、２０５００、２１０００、２１５００、２２０００、２２５００、２３０００、２３５００、２４０００、２４５００、２５０００または２５５００コピーを有する場合である。
【００４２】
追加的生体試料
尿試料または血液試料などの非侵襲的に得られた試料に１つ以上のＲＮＡの評価を行って、癌などの疾患または状態を特徴づけることができる。これにより、被験者にとって不必要な生検または他の侵襲的手法の数を減らすことができる。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡの評価を被験者からの第１試料に行う。第１試料に行われた１つ以上のＲＮＡの評価に基づいて、分析のために被験者からの第２試料を得て癌を特徴づけることができる。例えば、第２試料は、第１試料とは異なる種類の試料であってよく、免疫組織化学法（ＩＨＣ）などの組織学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション（蛍光インサイチューハイブリダイゼーションなど）、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ解析または配列決定などの異なる種類の分析に使用することができる。
【００４３】
第１試料は、第２試料よりも低侵入的または低侵襲的方法で得ることができる。例えば、第１試料は尿または血液とすることができ、第２試料は生検材料とすることができる。例えば、第１試料は、１つ以上のＲＮＡを評価するのに使用する血液試料とすることができ、ＲＮＡのレベルに応じて、組織学的検査のための生検材料を得て、癌組織の有無または癌の病期を診断するなど癌を特徴づけることができる。
【００４４】
例えば、第１試料中のＲＮＡレベルが、少なくとも約１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００または８９００など、１マイクロリットル当たり約１５００〜約９０００コピーの間にある場合、組織学的検査用の生検材料または組織試料などの第２試料を被験者から採取する。いくつかの実施形態では、レベルが１マイクロリットル当たり約１５００〜約４５００コピーの間にある場合、第２試料を被験者から採取する。さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡのレベルが、約１１００、１２００、１３００、１４００または１５００未満など、１マイクロリットル当たり約１５００コピー未満である場合、第２試料を被験者から得ない。
【００４５】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡの評価を使用して、第２または第３の生検材料などの第２または第３試料の必要性を判断する。例えば、最初に血清ｍｉＲ−１４１の上昇が観察され、次いで陰性の生検または陰性の第２生検が観察された後である。このような方法には、被験者からの血液試料を得るステップおよび被験者の血液試料の血清中のｍｉＲ−１４１の量を測定するステップが含まれ、血清ｍｉＲ−１４１が、上皮癌を有しない被験者または同一患者のｍｉＲ−１４１レベルの以前の定量に相当する対照試料中のｍｉＲ−１４１量と有意に異なる場合に生検が必要であり、ｍｉＲ−１４１レベルの有意な増加は、別の生検の必要性を示す。
【００４６】
感度および特異度
本明細書に開示する方法および組成物は、検出、診断、予後判定または癌の再発の監視など、癌を特徴づけるための感度および特異度を増加させることもでき、治療効果が本明細書に記載されている。
【００４７】
感度は、（真陽性の数）／（真陽性の数＋偽陰性の数）によって決定することができる。特異度は、（真陰性の数）／（真陰性の数＋偽陽性の数）によって決定することができる。
【００４８】
本明細書で開示する１つ以上のＲＮＡの評価を使用して、少なくとも約７０％または７５％の特異度で癌を特徴づけることができる。例えば、癌を約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７％を超える特異度で特徴づけることができる。癌を少なくとも約９７．１、９７．２、９７．３、９７．４、９７．５、９７．６、９７．７、９７．８、９７．９、９８．０、９８．１、９８．２、９８．３、９８．４、９８．５、９８．６、９８．７、９８．８、９８．９、９９．０、９９．１、９９８．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％の特異度で特徴づけることができる。さらに他の実施形態では、癌を１００％の特異度で特徴づけることができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、癌を少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７％の感度など、少なくとも約６０％の感度で特徴づけることができる。癌を少なくとも約９７．１、９７．２、９７．３、９７．４、９７．５、９７．６、９７．７、９７．８、９７．９、９８．０、９８．１、９８．２、９８．３、９８．４、９８．５、９８．６、９８．７、９８．８、９８．９、９９．０、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％の感度で特徴づけることができる。さらに他の実施形態では、癌を１００％の感度で特徴づけることができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡの評価は、その複数未満のＲＮＡを評価する場合と比較して、癌の特徴づけにおいて特異度または感度を増加させる。例えば、感度または特異度は、複数未満のＲＮＡでの検出よりも、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上増加しうる。例えば、癌を特徴づけるための感度は、１つのＲＮＡを使用すると５０％であるが、追加的なＲＮＡを使用すると、６０％の感度に増加し、２０％の増加となる。したがって、いくつかの実施形態では、解析するＲＮＡの数は、その数の増加が感度または特異度を増加させるような数である。いくつかの実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２５００、５０００、７５００、１０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、７５０，０００または１，０００，０００のＲＮＡを評価することにより、評価したＲＮＡの数未満の場合と比較して、癌の特徴づけにおいて特異度または感度が増加する。例えば、少なくとも２つのｍｉＲＮＡなどの少なくとも２つのＲＮＡを評価することにより、２つのｍｉＲＮＡのうちの１つを評価する場合と比較して、癌の特徴づけにおいて特異度または感度を増加させることができる。
【００５１】
マイクロＲＮＡ
本明細書で評価する１つ以上のＲＮＡは、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ）を含むことができる。ｍｉＲＮＡは、長さが約２１〜２３ヌクレオチドの短いＲＮＡ鎖である。ｍｉＲＮＡは、遺伝子によってコードされており、ＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳はされない（非コードＲＮＡ）。代わりに、ｍｉＲＮＡはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られている一次転写産物から、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造へ、そして最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。前駆体は、一般的に、自己相補領域において互いに折り畳む構造を形成する。次いでそれらは、動物におけるＤｉｃｅｒまたは植物におけるＤＣＬ１というヌクレアーゼによってプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡの配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｚ．ｕｎｉｂａｓ．ｃｈ／ｃｇｉ／ｍｉＲＮＡ．ｃｇｉなどの、一般に入手可能なデータベースでアクセスできる。
【００５２】
いくつかのｍｉＲＮＡは、遺伝子調節に関与しており、ｍｉＲＮＡは、遺伝子制御の主要な段階（ｔｉｅｒ）として現在認識されている増加しつづけるクラスの非コードＲＮＡの一部である。いくつかの場合、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに埋め込まれた調節部位に結合することによって翻訳を妨げ、翻訳の抑制をもたらす。シード相補性の厳密な程度は正確には決定されておらず、３’対形成によって変更されうるが、標的の認識は、ｍｉＲＮＡのシード領域（ｍｉＲＮＡの５’末端の２〜８位）と標的部位の相補的塩基対形成を伴う。他の場合、ｍｉＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のように機能し、完全に相補的なｍＲＮＡに結合して標的転写産物を破壊する。
【００５３】
いくつかのｍｉＲＮＡの特徴づけは、ｍｉＲＮＡが、初期発生、細胞増殖および細胞死、アポトーシスおよび脂肪代謝を含む種々の過程に影響することを示す。例えば、ｌｉｎ−４、ｌｅｔ−７、ｍｉｒ−１４、ｍｉｒ−２３およびｂａｎｔａｍなどのいくつかのｍｉＲＮＡは、細胞分化および組織発達に重要な役割を果たすことが示されてきた。他のｍｉＲＮＡは、その差示的な空間的および時間的発現パターンから、同様に重要な役割を有すると考えられている。
【００５４】
いくつかの実施形態では、単一のｍｉＲＮＡを評価して癌を特徴づける。さらに他の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２５００、５０００、７５００、１０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、７５０，０００または１，０００，０００のｍｉＲＮＡを評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡを、ｍＲＮＡなどの他の種のＲＮＡと組み合わせて評価して、癌を特徴づける。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡを使用して前立腺癌を検出する。例えば、試料中の検出可能なマイクロＲＮＡのレベルは、前立腺癌を示すことができ、検出可能でないレベルは前立腺癌を示さない。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２５００、５０００、７５００、１０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００またはそれ以上のｍｉＲＮＡの検出を使用して前立腺癌を検出する。癌を有しない被験者（年齢および性別をコントロールした）について測定したレベルなどの基準レベルと比較した、ｍｉＲＮＡの有無、過小発現または過剰発現などの発現レベルにおける変化を使用して、被験者における癌を特徴づけることができる。
【００５６】
例えば、前立腺癌を良性または悪性として分類するための基準レベルには、被験者から血液試料を得るステップと、被験者の血液試料中のｍｉＲＮＡの量を測定するステップと、ｍｉＲＮＡの量を良性の前立腺癌または悪性の前立腺癌を有する１つ以上の対照と比較するステップとが含まれうる。ｍｉＲＮＡの量を１つ以上の対照と比較するステップには、第１の対照範囲に達する良性の前立腺癌を有する複数の被験者の血液中に見られるｍｉＲＮＡの範囲を得るステップと、第２の対照範囲に達する悪性の前立腺癌を有する複数の被験者の血液中に見られるｍｉＲＮＡの範囲を得るステップと、被験者の血液試料中のｍｉＲＮＡの量を第１および第２の対照範囲と比較して、被験者の前立腺癌が良性の前立腺癌として分類されるか悪性の前立腺癌として分類されるかを判定するステップとが含まれうる。
【００５７】
ＭｉＲ−２００ファミリー
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２００ファミリーの一員である。ｍｉＲ−２００ファミリーは、Ｅカドヘリン抑制因子ＺＥＢ１およびＺＥＢ２を標的とすることによって癌細胞の上皮表現型を決定すると考えられている。ｍｉＲ−２００ファミリーには、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２３６、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉｒ−２００ｂ、ｍｉｒ−２００ｃおよびｍｉｒ−４２９が含まれる。いくつかの実施形態では、２つ以上のｍｉＲ−２００ファミリーメンバーを解析して上皮癌を検出する。
【００５８】
例えば、ｍｉＲ−１４１は、血液（血清または血漿）から得ることができ、転移性上皮癌の発生と関連する。ｍｉＲ−１４１を使用して、癌の再発および前立腺癌などの上皮性癌の治療効果を検出することができ、これにはｍｉＲ−１４１を使用して癌の外科的切除を受けた被験者を監視することが含まれる。例えば、現在、被験者は、前立腺癌について血清ＰＳＡのような他のマーカーで監視されている。血清ＰＳＡの着実な上昇は、癌の再発および広がりを示すと考えられる。しかしながら、多くの前立腺癌の転移はＰＳＡを発現せず、それゆえこの監視法では見逃されてしまう。癌が検出される時までには、癌は多くの場合、いかなる治療選択肢も越えて広がってしまっている。他の上皮癌も現在の診断レジメンに関して同様の問題を有している。
【００５９】
遺伝子に関連するｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡは、ＰＦＫＦＢ３、ＲＨＡＭＭ（ＨＭＭＲ）、ｃＤＮＡ  ＦＬＪ４２１０３、ＡＳＰＭ、ＣＥＮＰＦ、ＮＣＡＰＧ、アンドロゲン受容体、ＥＧＦＲ、ＨＳＰ９０、ＳＰＡＲＣ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＧＡＲＴ、ＭＧＭＴ、ＳＳＴＲ３またはＴＯＰ２ＢのｍＲＮＡと相互作用するｍｉＲＮＡであってもよい。例えば、検出することができるマイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡが関連する遺伝子を表１に列挙する。ｍｉＲを使用して前立腺癌などの上皮癌を特徴づけることができる。
【００６０】
（表１）遺伝子名およびそれらに関連するｍｉＲＮＡ
2012507300.tif 000003
2012507300.tif 000004
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【００６１】
それゆえ、表１中の１つ以上のｍｉＲＮＡが、血清試料などの試料１マイクロリットル当たり９０００コピーを超える濃度であると思われる場合、被験者を良性の前立腺癌と診断することができる。表１中の１つ以上のｍｉＲＮＡが、試料１マイクロリットル当たり３０００コピー未満の濃度であると思われる場合、被験者を悪性の前立腺癌と診断することができる。いくつかの実施形態では、表１中の１つ以上のｍｉＲＮＡが、被験者からの試料１マイクロリットル当たり約１０００〜約４５００コピーの間の濃度であると思われる場合、被験者から第２生体試料を得る。第２試料は、免疫組織化学法などの組織化学的分析によって分析することができる。
【００６２】
さらに、本発明の方法および組成物において使用するための遺伝子に関連するマイクロＲＮＡ（例えば、前立腺癌において過剰発現したもの）は、ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇまたはｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓのマイクロＲＮＡデータベースオンラインで見つけることができ、予想したｍｉＲＮＡはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉａｎａ．ｐｃｂｉ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｉＲＧｅｎ／ｖ３／で検索できる。
【００６３】
ＰＦＫＦＢ３と相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−６５８、ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１６ｂ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−５４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２９７、ｍｉＲ−１１９７、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−４５２、ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−６２５、ｍｉＲ−５０９−５ｐ、ｍｉＲ−１２６６、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−６１６、ｍｉＲ−６２１、ｍｉＲ−６５０、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−６３７、ｍｉＲ−６５１、ｍｉＲ−１２８３、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−１１８５、ｍｉＲ−５７７、ｍｉＲ−６０２、ｍｉＲ−１３０５、ｍｉＲ−２２０ｃ、ｍｉＲ−１２７０、ｍｉＲ−１２８２、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−７６８−３ｐまたはｍｉＲ−９２４でありうる。ＰＦＫＦＢ３と相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００６４】
ＲＨＡＭＭと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−８９２ａ、ｍｉＲ−３８０、ｍｉＲ−８７５−３ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−５８６、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６３０、ｍｉＲ−３７４ｂ、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１１８５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−６３３、ｍｉＲ−１２４３、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２４またはｍｉＲ−３４ｃ−３ｐでありうる。ＲＨＡＭＭと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００６５】
ＣＥＮＰＦと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｍｉＲ−３８４、ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−５２０ｆ、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−１１８４、ｍｉＲ−５７７、ｍｉＲ−７０８、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−５２０ｈ、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−５９６、ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−５６７、ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｍｉＲ−１１８３、ｍｉＲ−１２９−３ｐ、ｍｉＲ−６３６、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１３０１、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−５７０、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−１２６３、ｍｉＲ−１３２４、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−４５２、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ、ｍｉＲ−８９２ｂ、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−８７５−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２６６、ｍｉＲ−１３２３、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−９２０、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２７１、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−４８３−３ｐ、ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｍｉＲ−５１５−３ｐ、ｍｉＲ−５１９ｅ、ｍｉＲ−５２０ｂ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐまたはｍｉＲ−５８２−３ｐでありうる。ＣＥＮＰＦと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００６６】
ＮＣＡＰＧと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−８７６−５ｐ、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２２４−３ｐ、ｍｉＲ−６１９、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−５１６ｂ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｍｉＲ−１２９０、ｍｉＲ−６５６、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−５２０ｇ、ｍｉＲ−１２３１、ｍｉＲ−１２８９、ｍｉＲ−１２２９、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−６１６またはｍｉＲ−６２０でありうる。ＮＣＡＰＧと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００６７】
アンドロゲン受容体と相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５０６、ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−６４４、ｍｉＲ−７６８−５ｐまたはｍｉＲ−８０１でありうる。アンドロゲン受容体と相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００６８】
ＥＧＦＲと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５８７またはｍｉＲ−７でありうる。ＥＧＦＲと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００６９】
ＨＳＰ９０と相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−６４２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−４５０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−５７８、ｍｉＲ−６５３、ｍｉＲ−１２０６、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−６１３、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−４５４、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−６４０、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−５２２、ｍｉＲ−６２４、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−５６６、ｍｉＲ−９またはｍｉＲ−９９ｂでありうる。ＨＳＰ９０と相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００７０】
ＳＰＡＲＣと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−５６９、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−６４１、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−６２２、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−６２５、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｍｉＲ−１２０６、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５６２、ｍｉＲ−５７３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４５２、ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｍｉＲ−５１７ａ、ｍｉＲ−５１７ｂ、ｍｉＲ−５１７ｃ、ｍｉＲ−５９２またはｍｉＲ−９６でありうる。ＳＰＡＲＣと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００７１】
ＤＮＭＴ３Ｂと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６１８、ｍｉＲ−１２５３、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−５６１、ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−５１９ｅ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−６１８またはｍｉＲ−６３５でありうる。ＤＮＭＴ３Ｂと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００７２】
ＧＡＲＴと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５１９ｂ、ｍｉＲ−５１９ｃ、ｍｉＲ−５６９、ｍｉＲ−５９１、ｍｉＲ−６０７、ｍｉＲ−６２７、ｍｉＲ−６３５、ｍｉＲ−６３６またはｍｉＲ−６５９でありうる。ＧＡＲＴと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００７３】
ＭＧＭＴと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１４、ｍｉＲ−５１５−３ｐ、ｍｉＲ−５１６−３ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−５９７、ｍｉＲ−６０３、ｍｉＲ−６５３、ｍｉＲ−６５５、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９２ｂまたはｍｉＲ−９９ａでありうる。ＭＧＭＴと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００７４】
ＳＳＴＲ３と相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−５０４、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−７６６またはｍｉＲ−７６７−３ｐでありうる。ＳＳＴＲ３と相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００７５】
ＴＯＰ２Ｂと相互作用するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ、ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−６５３、ｍｉＲ−５４８ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−２９７、ｍｉＲ−５７６−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６２４、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−７５８、ｍｉＲ−１２５３、ｍｉＲ−１３２４、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−１１８３、ｍｉＲ−１２４４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５６８、ｍｉＲ−１２７６、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８９、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−５１４、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−５４４、ｍｉＲ−５４８ａ、ｍｉＲ−５４８ｂ、ｍｉＲ−５４８ｃ、ｍｉＲ−５４８ｄ、ｍｉＲ−５５９、ｍｉＲ−５６８、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−５７９、ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−５９１、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−６１３、ｍｉＲ−６４９、ｍｉＲ−６５１、ｍｉＲ−７５８、ｍｉＲ−７６８−３ｐまたはｍｉＲ−９でありうる。ＴＯＰ２Ｂと相互作用する１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４９８、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−５１３、ｍｉＲ−２６ａ−１／２、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−１９４−１／２、ｍｉＲ−１８１ａ−１／２、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−４４９およびｍｉＲ−９２−１／２からなる群から選択される。１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４９７、ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−３０＿５ｐ、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−１３３ａ−１、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−７−１／２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−４８７またはｌｅｔ−７ｂからなる群から選択することもできる。他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１７、ｍｉＲ−５９０、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−７６８、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−５１９、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２００、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−５４８およびｍｉＲ−３７０である。１つ以上のｍｉＲＮＡは、１マイクロリットル当たりの１つ以上のｍｉＲＮＡのコピー数を測定することなどによって、被験者からの試料中で検出して、癌を特徴づけるのに使用することができる。１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数を使用して、病理医などによるさらなる分析のために被験者から第２生体試料を得るべきかどうかを判断することもできる。
【００７７】
別の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４１またはｍｉＲ−３７０である。ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−１４１からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡを使用して前立腺癌を特徴づけることができる。
【００７８】
さらに、表１に記載したｍｉＲＮＡなどの１つ以上のｍｉＲＮＡは、ＡＲ、ＰＣＡ３またはこれらの任意の組み合わせのｍＲＮＡとＲＮＡパターンを形成することができ、前立腺癌などの癌を特徴づけるのに使用することができる。ＲＮＡパターンは、ｓｎｏＲＮＡ  Ｕ５０を含んでもよい。
【００７９】
ＲＮＡの評価
ＲＮＡの評価は、定性的または定量的でありうる。ＲＮＡの評価には、発現レベル（対照と比較した過剰発現または過小発現、ＲＮＡの有無など）を測定するなどして、ＲＮＡを検出すること、ＲＮＡの配列を決定すること、ＲＮＡの任意の修飾を決定すること、またはＲＮＡの任意の突然変異もしくは変異を検出することが含まれる。ＲＮＡレベルは、有るか無いか、対照を超えるか対照未満であるかが測定されるか、または１マイクロリットル当たりのＲＮＡのコピーなど、ＲＮＡの量に関する数値をもたらすことができる。ＲＮＡの発現レベルは、絶対定量または相対定量によって定量化することができる。絶対定量は、１つ以上の標的核酸の既知濃度を算入し、未知の核酸の、既知の標的核酸とのハイブリダイゼーション強度を参照する（例えば、標準曲線の生成を通じて）ことによって達成することができる。一方、相対定量は、２つ以上の遺伝子の間または２つ以上の治療の間のハイブリダイゼーションシグナルを比較してハイブリダイゼーション強度の変化を定量化すること、および転写レベルの推断によって達成することができる。
【００８０】
評価のためのＲＮＡは、生体試料から単離することができる。ＲＮＡは、上記の方法を使用して単離したエキソソームなどの、生体試料のエキソソームから単離することができる。
【００８１】
市販されている膜ベースのＲＮＡ精製を行うためのキットを使用して、ＲＮＡを単離することができる。一般的に、キットは、細胞および組織からのＲＮＡの小規模（３０ｍｇ以下）調製（例えば、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）、中規模（２５０ｍｇの組織）（例えば、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット）および大規模（最大１ｇ）（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット）調製に利用可能である。あるいは、ＲＮＡは、米国特許第７２６７９５０号または米国特許第７２６７９５０号に記載の方法を使用して単離することができる。
【００８２】
ＲＮＡまたはＲＮＡ由来の核酸を分析に使用することができる。本明細書で使用する場合、ＲＮＡ由来の核酸とは、その合成のために、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ転写産物またはそのサブシーケンスが最終的に鋳型として働いた核酸を指す。したがって、転写産物から逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは全て転写産物に由来し、このような由来の産物の検出は、試料中の元の転写産物の存在および／または存在量を示している。したがって、適当な試料には、それだけに限定されないが、単数遺伝子または複数遺伝子の転写産物、転写産物から逆転写されたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されたＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡなどが含まれる。
【００８３】
ＲＮＡは、試料ＲＮＡに付した１つ以上の標識を検出することによって検出することができる。標識は、当業者に周知の任意のいくつかの手段によって組み込むことができる。本発明における使用に適した検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。本発明において有用な標識には、標識されたストレプトアビジン共役体を用いて染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで一般に使用される他の酵素）、およびコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色標識が含まれる。このような標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは放射光を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、一般的に、酵素に基質を供給し、基質に対する酵素の作用により生成される反応生成物を検出することによって検出し、比色標識は、着色された標識を単純に可視化することによって検出する。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して使用することができるｍｉＲＮＡ集団の５’末端の放射性リン酸塩（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ  ＡＭ、Ｋｉｎｇ  ＫＳ、Ｄｏｎａｈｕｅ  ＣＰ、Ｋｈｒａｐｋｏ  Ｋ、Ｋｏｓｉｋ  ＫＳ（２００３）  ＲＮＡ９：１２７４〜１２８１）、またはＲＮＡリガーゼを使用して３’末端で放射標識された単一ヌクレオチド（例えば米国特許第７５４１１４４号参照）を使用するなどして、ｍｉＲＮＡを標識化し、検出することができる。市販されているキットを使用してＲＮＡを標識することもできる。例えば、ｍｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（例えば、ｍｉｒＶａｎａ（商標）標識キット）、Ｅｘｉｑｏｎ（例えば、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  マイクロＲＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｈｙ３（商標）／Ｈｙ５（商標）  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ｍｉＲＮＡ  ＳｔａｒＦｉｒｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ）、Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（例えば、ＬａｂｅｌＩＴ  ｍｉＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）等からのキットを使用して標識することができる。
【００８４】
一実施形態では、ＲＮＡを単離して対象となるＲＮＡを検出した後、ｃＤＮＡを合成することができ、製造者のプロトコルにしたがって特定のｍＲＮＡ標的用のＴａｑｍａｎアッセイを行うか、発現マイクロアッセイを行って１つの実験で非常に多数のセットの発現マーカーを検査することができる。遺伝子発現プロファイルを確立する方法には、タンパク質またはペプチドをコードすることができる遺伝子によって生成されるＲＮＡの量を測定することが含まれる。これは、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析および他の関連する試験によって達成することができる。これらの技術は、個々のＰＣＲ反応を使用して行うことができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡから作成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）をマイクロアレイによって解析する。試料中のｍｉＲＮＡ遺伝子産物のレベルは、それだけに限定されないが、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチューハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイ解析を含む、生体試料中のＲＮＡ発現レベルを評価するのに適した任意の技術を使用して測定することができる。ＲＮＡ検出は、アレル特異的プローブとのハイブリダイゼーション、酵素的変異検出、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、フローサイトメトリックへテロ二本鎖分析、ミスマッチの化学的切断、質量分析、核酸配列決定、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、制限断片多型、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）またはこれらの任意の組み合わせによることもできる。
【００８６】
定量的結果を所望するのであれば、本明細書に開示の方法は、一般的に、増幅核酸の相対頻度の１つ以上の対照を使用して定量的増幅を達成する。定量的増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同一のプライマーを使用して、既知の量の対照配列を同時に共同増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するのに使用することができる内部標準を提供する。他の適した増幅方法には、それだけに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ等、ＰＣＲプロトコル、方法および応用への手引き、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ（１９９０））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７（１９８８）ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒ等、Ｇｅｎｅ、８９：１１７（１９９０）参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８６：１１７３（１９８９））および自己持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８７：１８７４（１９９０））が含まれる。当該技術分野で既知のさらなる核酸定量化法には、ＲＴ−ＰＣＲ、クリスマスツリー法（Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ−ｔｒｅｅ）、リガーゼ連鎖反応、質量分析、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、分岐連鎖反応および逆転写酵素リガーゼ連鎖反応が含まれる。
【００８７】
さらなる検出および／または測定方法には、核酸ハイブリダイゼーションが含まれる。核酸ハイブリダイゼーションは、単純に、プローブと相補的な標的とが相補的塩基対形成によって安定なハイブリッド二本鎖を形成することができる条件下で、プローブと標的核酸とを接触させることを含む。本明細書で使用する場合、ハイブリダイゼーション条件は、その下で核酸分子を使用して同様の核酸分子を同定する標準的なハイブリダイゼーション条件を指す。このような標準的な条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９に開示されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の同誌は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる（具体的には９．３１〜９．６２ページ参照）。さらに、ヌクレオチドのミスマッチの程度が変化するのを許容するハイブリダイゼーションを達成するための適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算する式は、例えば、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ等、１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３８、２６７〜２８４に開示されている。Ｍｅｉｎｋｏｔｈ等の同誌は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。ハイブリッド二本鎖を形成しない核酸は、ハイブリダイズした核酸から洗浄し、次いで、一般的に、付した検出可能な標識の検出によってハイブリダイズした核酸を検出することができる。核酸は、温度を上昇させる、または核酸を含有する緩衝液の塩濃度を減少させることによって変性することが一般的に認識されている。低ストリンジェンシーの条件（例えば、低温および／または高塩）下では、アニールされる配列が完全に相補的ではない場合でさえ、ハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成されるだろう。したがって、低ストリンジェンシーではハイブリダイゼーションの特異性は減少する。逆に、高ストリンジェンシー（例えば、より高温またはより低塩）では、ハイブリダイゼーションの成功にはミスマッチがより少ないことが要求される。
【００８８】
核酸アレイを使用して試料の１つ以上のＲＮＡを検出することができる。遺伝子発現モニタリングにおける高密度アレイの作成および適用は、例えば、国際公開第９７／１０３６５、国際公開第９２／１０５８８、国際公開第９５／３５５０５、米国特許第６０４０１３８号、同第５４４５９３４号、同第５５３２１２８号、同第５５５６７５２号、同第５２４２９７４号、同第５３８４２６１号、同第５４０５７８３号、同第５４１２０８７号、同第５４２４１８６号、同第５４２９８０７号、同第５４３６３２７号、同第５４７２６７２号、同第５５２７６８１号、同第５５２９７５６号、同第５５４５５３１号、同第５５５４５０１号、同第５５６１０７１号、同第５５７１６３９号、同第５５９３８３９号、同第５５９９６９５号、同第５６２４７１１号、同第５６５８７３４号および同第５７００６３７号、ならびにＨａｃｉａ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４：４４１〜４４７、Ｌｏｃｋｈａｒｔ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５〜１６８０およびＤｅ  Ｒｉｓｉ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４：４５７〜４６０で、既に開示されている。
【００８９】
一般に、アレイにおいて、既知の配列のオリゴヌクレオチド、またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらの断片は、基質上の既知の位置を占める。核酸試料はアレイとハイブリダイズし、アレイで各々のプローブとハイブリダイズした核酸の量を定量化する。１つの定量化法は、共焦点顕微鏡および蛍光標識を使用することである。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、ＣＡ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（サンタクララ、ＣＡ）、Ａｔｌａｓ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｅｘｉｑｏｎ（デンマーク）などから市販されているアレイプラットフォームシステムを使用することができる。本明細書に記載のスクリーニング法のために、本明細書に記載の遺伝子の知識を利用して、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの新規なアレイを設計することができる。
【００９０】
さらに他の実施形態では、微粒子、粒子またはビーズをベースとしたプラットフォームを使用してＲＮＡを検出することができる。例えば、ＲＮＡに結合してＲＮＡを検出するオリゴヌクレオチドは、ビーズと結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｌｕｍｉｎｅｘ（オースティン、ＴＸ）のＦｌｅｘｍｉＲ（商標）またはＩｌｌｕｍｉｎａ（サンディエゴ、ＣＡ）のＤＡＳＬアッセイなどの市販されているプラットフォームを使用することができる。
【００９１】
さらに、マイクロ流体デバイスを使用して本方法を行うことができる。このようなシステムは、標的ＲＮＡの結合および検出を可能にするプロセスを小型化し、区分する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡをマイクロ流体デバイス中の試料からも単離する。使用することができるマイクロ流体デバイスの例は、米国特許第７，５９１，９３６号、同第７，５８１，４２９号、同第７，５７９，１３６号、同第７，５７５，７２２号、同第７，５６８，３９９号、同第７，５５２，７４１号、同第７，５４４，５０６号、同第７，５４１，５７８号、同第７，５１８，７２６号、同第７，４８８，５９６号、同第７，４８５，２１４号、同第７，４６７，９２８号、同第７，４５２，７１３号、同第７，４５２，５０９号、同第７，４４９，０９６号、同第７，４３１，８８７号、同第７，４２２，６６９号、同第７，４１９，８２２号、同第７，４１９，６３９号、同第７，４１３，７０９号、同第７，４１１，１８４号、同第７，４０２，２２９号、同第７，３９０，４６３号、同第７，３８１，４７１号、同第７，３５７，８６４号、同第７，３５１，５９２号、同第７，３５１，３８０号、同第７，３３８，６３７号、同第７，３２９，３９１号、同第７，３２３，１４０号、同第７，２６１，８２４号、同第７，２５８，８３７号、同第７，２５３，００３号、同第７，２３８，３２４号、同第７，２３８，２５５号、同第７，２３３，８６５号、同第７，２２９，５３８号、同第７，２０１，８８１号、同第７，１９５，９８６号、同第７，１８９，５８１号、同第７，１８９，５８０号、同第７，１８９，３６８号、同第７，１４１，９７８号、同第７，１３８，０６２号、同第７，１３５，１４７号、同第７，１２５，７１１号、同第７，１１８，９１０号および同第７，１１８，６６１号に記載されている。
【００９２】
いくつかの実施形態では、マルチプレックスを行うことができる。例えば、マルチプレックスは、フローサイトメトリーと組み合わせて、ビーズをベースとしたアッセイなどの粒子をベースとしたアッセイを使用して行うことができる。マルチパラメトリック免疫測定または同族リガンドを有するビーズコーティングおよび高感度自動化に調和した比活性を有するレポーター分子を使用した他の高処理検出アッセイを使用することができる。例えば、粒子をベースとしたアッセイ系において、オリゴヌクレオチドなどの対象とするＲＮＡの結合剤をアドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）ビーズまたは微粒子に固定化することができる。個々の結合アッセイ（結合剤が抗体である場合の免疫測定など）各々のための各々の結合剤は、異なる種類の微粒子（すなわち、ミクロビーズ）に結合することができ、結合アッセイ反応は、微粒子の表面上で起こる。微粒子は異なる標識によって区別することができ、例えば、特異的結合剤を有する微粒子は、異なる結合剤を有する別の微粒子と比較して、異なる信号標識を有するだろう。例えば、微粒子を別々の蛍光強度で染色することができ、特異的結合剤を有する微粒子の蛍光強度は、異なる結合剤を有する別の微粒子の蛍光強度と異なる。
【００９３】
ＲＮＡ検出の方法を使用して、血清１マイクロリットル当たりのコピーの平均数などの、試料中のＲＮＡのレベルを測定することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの各々のレベルは、平均の９５％の信頼区間で計算される（例えば、１マイクロリットル当たり＋／−１０４３１コピーの１５６４８）。他の実施形態では、ＲＮＡの各々のレベルは、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３または９４％の信頼区間で計算される。さらに他の実施形態では、ＲＮＡの各々のレベルは、平均の９５、９６、９７、９８、９９または１００％の信頼区間で計算される。
【００９４】
ＲＮＡパターンおよびＰＳＡ／ＰＣＡ３レベル
１つ以上の非ＲＮＡバイオマーカーにより１つ以上のＲＮＡを評価して癌を特徴づけることができる。１つ以上のｍｉＲＮＡを検出し、１つ以上のｍＲＮＡを検出し、１つ以上の非ＲＮＡバイオマーカーを検出するなど、１つ以上のＲＮＡを評価するために、単一の試料を使用することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の試料を使用する。例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ、ＰＳＡ  ｍＲＮＡ、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡおよびＰＳＡタンパク質を検出するために、血液または尿などの単一の試料を使用することができる。
【００９５】
ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの組み合わせを使用して癌を特徴づけることができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現レベルの組み合わせを使用する。例えば、ｍＲＮＡレベルは、遺伝子またはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧもしくはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳなどの融合遺伝子のものとすることができる。他の実施形態では、ｍＲＮＡはＰＣＡまたはＰＣＡ３のものである。さらに他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ、１つ以上のｍＲＮＡ、１つ以上のタンパク質、あるいはこれらの任意の組み合わせの発現レベルを使用して癌を特徴づける。さらに他の実施形態では、尿または血液試料など、被験者からの第１試料について、１つ以上のｍｉＲＮＡ、１つ以上のｍＲＮＡ、１つ以上のタンパク質、あるいはこれらの任意の組み合わせの発現レベルを測定し、さらなる分析のために被験者から第２試料を得るべきかどうかを判断するのに使用する。例えば、第２試料は生検材料とすることができる。
【００９６】
例えば、１つ以上のＲＮＡおよびＰＳＡタンパク質の発現レベルを使用して前立腺癌を特徴づけることができる。第１試料において１つ以上のＲＮＡおよびＰＳＡタンパク質の発現レベルを測定し、組織学的検査などのさらなる分析のために生検材料などの第２試料を得るべきかどうかを判断するのに使用することができる。ＲＮＡパターンおよびＰＳＡタンパク質レベルの評価は、１つ以上のＲＮＡのみまたはＰＳＡタンパク質レベルのみを評価するのと比較して、前立腺癌の特徴づけにおいて、特異度または感度を増加させることができる。例えば、感度または特異度は、１つ以上のＲＮＡのみまたはＰＳＡタンパク質レベルのみによる検出よりも、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上高いであろう。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＰＣＡ３レベルを使用して前立腺癌を特徴づける、またはさらなる分析のために生検材料などの第２試料を得るべきかどうかを判断する。例えば、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡレベルおよびＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルを使用する。ｍｉＲＮＡレベルおよびＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルの評価は、ｍｉＲＮＡレベルのみまたはＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルのみを評価するのと比較して、前立腺癌の特徴づけにおいて、特異度または感度を増加させることができる。例えば、感度または特異度は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上であるだろう。
【００９８】
さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡレベル、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルを使用して前立腺癌を特徴づける、またはさらなる分析のために生検材料などの第２試料を得るべきかどうかを判断する。ｍｉＲＮＡレベル、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルの評価は、以下の１つまたは２つを評価するのと比較して、前立腺癌の特徴づけにおいて、特異度または感度を増加させることができる：ｍｉＲＮＡレベル、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡレベル。例えば、感度または特異度は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上であるだろう。
【００９９】
さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡレベル、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベル、ＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルおよびＰＳＡタンパク質レベルを使用して前立腺癌を特徴づける、またはさらなる分析のために生検材料などの第２試料を得るべきかどうかを判断する。ｍｉＲＮＡレベル、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルの評価は、以下の１つ、２つまたは３つを評価するのと比較して、前立腺癌の特徴づけにおいて、特異度または感度を増加させることができる：ｍｉＲＮＡレベル、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベル、ＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルおよびＰＳＡタンパク質レベル。例えば、感度または特異度は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上であるだろう。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルを使用して、ＰＳＡ  ｍＲＮＡコピー数と比較したＰＣＡ３  ｍＲＮＡコピー数などの、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベル対ＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルの比であるＰＣＡ３スコアを作成する。ＰＣＡ３スコアを使用して前立腺癌を特徴づける、またはさらなる分析のために生検材料などの第２試料を得るべきかどうかを判断することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルなどの１つ以上のＲＮＡの発現レベルとともにＰＣＡ３スコアを使用して前立腺癌を特徴づける、またはさらなる分析のために生検材料などの第２試料を得るべきかどうかを判断する。ＲＮＡパターンおよびＰＣＡ３スコアの評価は、１つ以上のＲＮＡのみまたはＰＣＡ３スコアのみを評価するのと比較して、前立腺癌の特徴づけにおいて、特異度または感度を増加させることができる。例えば、感度または特異度は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上であるだろう。
【０１０２】
さらに他の実施形態では、１つ以上のＲＮＡおよびＰＳＡタンパク質の発現レベルとともにＰＣＡ３スコアを使用して前立腺癌を特徴づける、またはさらなる分析のために生検材料などの第２試料を得るべきかどうかを判断する。１つ以上のＲＮＡおよびＰＳＡタンパク質の評価、ならびにＰＣＡ３スコアの決定は、以下の１つまたは２つを評価するのと比較して、前立腺癌の特徴づけにおいて、特異度または感度を増加させることができる：ＲＮＡパターン、ＰＳＡタンパク質レベルおよびＰＣＡ３スコア。例えば、感度または特異度は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上であるだろう。
【０１０３】
さらに他の実施形態では、ＲＮＡのレベルにＰＳＡのレベルを掛けることによる産物値を決定することによって、前立腺癌を特徴づける。次いで、産物値を使用して、前立腺癌を特徴づけることができる。産物値を使用して、被験者を診断し、癌を良性もしくは悪性として分類し、または被験者のための治療法を選択することができる。被験者についての産物値を基準値と比較して癌を特徴づけることができる。例えば、基準値は、前立腺癌を有する患者についての産物値を決定することによって、前立腺癌を診断するために決定することができる。基準値は、前立腺癌の異なる病期、または良性の前立腺癌もしくは悪性の前立腺癌についても決定することができる。基準値は、有効な前立腺癌の治療法の患者に基づく基準値を決定することなどによって、薬効のために決定することもできる。
【０１０４】
産物値を使用して、少なくとも約７０％または７５％の特異度で前立腺癌を特徴づけることができる。例えば、産物値を使用して、約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７％を超える特異度で前立腺癌を特徴づけることができる。少なくとも約９７．１、９７．２、９７．３、９７．４、９７．５、９７．６、９７．７、９７．８、９７．９、９８．０、９８．１、９８．２、９８．３、９８．４、９８．５、９８．６、９８．７、９８．８、９８．９、９９．０、９９．１、９９８．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％の特異度で前立腺癌を特徴づけることができる。さらに他の実施形態では、１００％の特異度で癌を特徴づけることができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、産物値を使用して、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７％の感度など、少なくとも約６０％の感度で癌を特徴づけることができる。少なくとも約９７．１、９７．２、９７．３、９７．４、９７．５、９７．６、９７．７、９７．８、９７．９、９８．０、９８．１、９８．２、９８．３、９８．４、９８．５、９８．６、９８．７、９８．８、９８．９、９９．０、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％の感度で癌を特徴づけることができる。さらに他の実施形態では、１００％の感度で癌を特徴づけることができる。さらに、産物値を使用して、１００％の特異度および１００％の感度で前立腺癌を特徴づけることができる。例えば、１００％の特異度および１００％の感度で前立腺癌の診断を提供することができる。
【０１０６】
ＲＮＡのレベルは、試料１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピー数とすることができ、ＰＳＡのレベルはｎｇ／ｍＬなど、試料１マイクロリットル当たりのタンパク質量とすることができる。試料中のＰＳＡタンパク質量を掛けたｍｉＲＮＡ量を使用して、正常な被験者および前立腺癌を有する被験者についての産物値を決定することができる。したがって、正常な被験者および前立腺癌を有する被験者について、基準レベルを決定することができる。被験者から得られた試料についての産物値を決定し、基準レベルと比較して、診断を提供するなど被験者における癌を特徴づけることができる。例えば、産物値は、血清試料中の１マイクロリットル当たりのｍｉＲ−１４１のコピーに、血清試料中の１マイクロリットル当たりのＰＳＡのナノグラムを掛けることによって決定することができる（例えば、図５参照）。産物値が１５００、１５５０、１４００、１４５０または１４００未満である場合、被験者は前立腺癌を有していないという診断を提供することができる。あるいは、産物値が１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００を超える場合、被験者は前立腺癌を有しているという診断を提供することができる。いくつかの実施形態では、産物値が約２０００、２１００、２２００または２３００を超える場合、被験者は前立腺癌を有しているという診断を提供する。産物値が１５００未満である場合、前立腺癌を良性として分類することができる。あるいは、産物値が１５００を超える場合、癌を悪性として分類することができる。
【０１０７】
産物値を使用して前立腺癌を分類する、またはさらなる分析のために生検材料などの第２試料を得るべきかどうかを判断することができる。例えば、産物値が１５００、１２００または１０００未満である場合、生検材料を得ないだろう。他の実施形態では、産物値が１５００、１７００、１８００または２０００を超える場合、生検材料を得るだろう。
【０１０８】
別の実施形態では、前立腺癌を良性または悪性として分類する方法ならびに第２試料を得るべきかどうかを判断する方法。例えば、ＰＳＡタンパク質が少なくとも２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１または２．０ｎｇ／ｍＬなど、約３ｎｇ／ｍＬ未満であり、ｍｉＲＮＡが約２５００、２０００、１５００、１０００または５００未満など、１マイクロリットル当たり約３０００コピー未満であり、任意でＰＣＡ３スコアが３０、２５または２０未満など、３５未満である場合、前立腺癌を良性として分類するか、生検材料などの第２試料を得ないか、またはその両方である。
【０１０９】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡが約２５００、２０００、１５００、１０００または５００未満など、１マイクロリットル当たり約３０００コピー未満であり、ＰＣＡ３スコアが３０、２５または２０未満など、３５未満である場合、前立腺癌を良性として分類するか、生検材料などの第２試料を得ないか、またはその両方である。
【０１１０】
ＰＳＡタンパク質が少なくとも約４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９または５．０ｎｇ／ｍＬなど、約４ｎｇ／ｍＬを超え、ｍｉＲＮＡが約９５００、１００００、１５０００または２００００を超えるなど、１マイクロリットル当たり約９０００コピーを超え、任意でＰＣＡ３スコアが少なくとも４０、４５または５０など、３５を超える場合、前立腺癌を悪性として分類するか、生検材料などの第２試料を得るか、またはその両方である。
【０１１１】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡが約９５００、１０，０００、１５，０００または２０，０００を超えるなど、１マイクロリットル当たり約９０００コピーを超え、ＰＣＡ３スコアが少なくとも４０、４５または５０など、３５を超える場合、前立腺癌を悪性として分類するか、生検材料などの第２試料を得るか、またはその両方である。
【０１１２】
検出システムおよびキット
癌を特徴づけるために１つ以上のＲＮＡを決定するよう設定された検出システムも提供する。例えば、検出システムは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２５００、５０００、７５００、１０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、７５０，０００または１，０００，０００のＲＮＡを評価するよう設定することができる。例えば、検出システムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２５００、５０００、７５００、１０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、７５０，０００または１，０００，０００またはそれ以上のｍｉＲＮＡを評価するよう設定することができ、ｍｉＲＮＡの１つ以上は表１から選択される。いくつかの実施形態では、システムによって検出される１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４１からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１７、ｍｉＲ−５９０、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−７６８、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−５１９、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２００、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−５４８またはｍｉＲ−３７０からなる群から選択される。検出システムは、ＰＳＡ、ＰＣＡまたはその両方のｍＲＮＡレベルを検出するよう設定することもできる。
【０１１３】
検出システムは、低密度検出システムまたは高密度検出システムとすることができる。例えば、低密度検出システムは、約１００、２００、３００、４００、５００または１０００までのＲＮＡを検出することができ、一方で高密度検出システムは、少なくとも約２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００または１００，０００のＲＮＡを検出することができる。検出システムは、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ種を検出するために特異的であってよい。ｍｉＲＮＡ用の低密度検出システムは、約１００、２００、３００、４００、５００または１０００までのｍｉＲＮＡを検出することができる。ｍｉＲＮＡ用の高密度検出システムは、少なくとも約２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００または１００，０００のｍｉＲＮＡを検出することができる。
【０１１４】
検出システムは、ＲＮＡの１つ以上と選択的にハイブリダイズするプローブのセットを含むことができる。例えば、検出システムは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２５００、５０００、７５００、１０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、７５０，０００または１，０００，０００のｍｉＲＮＡと選択的にハイブリダイズするプローブのセットを含むことができる。例えば、プローブのセットは、表１から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡと選択的にハイブリダイズすることができ、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４１からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１７、ｍｉＲ−５９０、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−７６８、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−５１９、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２００、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−５４８またはｍｉＲ−３７０からなる群から選択される。検出システムは、ＰＳＡ、ＰＣＡまたはその両方のｍＲＮＡレベルを検出するためのプローブを含むこともできる。
【０１１５】
検出システムは、ＲＮＡを検出するためのプローブを含む低密度検出システムまたは高密度検出システムとすることができる。例えば、低密度検出システムは、約１００、２００、３００、４００、５００または１０００までのＲＮＡを検出するためのプローブを含むことができ、一方で高密度検出システムは、少なくとも約２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００または１００，０００のＲＮＡを検出するためのプローブを含むことができる。プローブは、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ種を検出するために特異的であってよく、ｍｉＲＮＡ用の低密度検出システムは、約１００、２００、３００、４００、５００または１０００までのｍｉＲＮＡを検出するためのプローブを含むことができる。ｍｉＲＮＡ用の高密度検出システムは、少なくとも約２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００または１００，０００のｍｉＲＮＡを検出するためのプローブを含むことができる。
【０１１６】
プローブは、アレイまたはビーズなどの固体基質に付着することができる。あるいは、プローブは付着しない。検出システムは、上記のアレイをベースとするシステム、配列決定システム、ＰＣＲをベースとするシステムまたはビーズをベースとするシステムとすることができる。検出システムは、キットの一部とすることができる。あるいは、キットは、本明細書に記載の１つ以上のプローブセットを含むことができる。例えば、キットは、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−２２２またはｍｉＲ−１４１からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの１つ以上を検出するためのプローブを含むことができる。さらに他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１７、ｍｉＲ−５９０、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−７６８、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−５１９、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２００、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−５４８またはｍｉＲ−３７０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キットは、ＰＳＡまたはＰＣＡ３に選択的に結合する１つ以上の試薬をさらに含む。例えば、キットは、ＰＳＡタンパク質レベルまたはＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルを検出するための、プローブなどの試薬を含むことができる。キットは、ＰＣＡ３  ｍＲＮＡレベルを検出するための試薬を含むこともできる。
【０１１７】
コンピュータシステム
本明細書では、癌を特徴づけるためのコンピュータシステムも提供する。したがって、図６は、表現型プロファイルおよびレポートを作成することができる代表的な例のロジックデバイスを示す構成図である。
【０１１８】
図６は、生体試料から発現レベルのデータを受信し、発現レベルを解析し、（それだけに限定されないが、癌を分類する、第２試料を得るべきかどうかを判断する、診断を提供する、予後判定を提供する、治療を選択する、薬効を判定するなど）癌についての特徴を決定し、そして、スクリーン上へ出力する、レポートとして印字する、または別のコンピュータシステムへ送信するなど結果を作成するためのコンピュータシステム（またはデジタル装置）６００を示す。コンピュータシステム６００は、媒体６１１、および／または固定媒体６１２を有するサーバー６０９に任意で接続することができるネットワークポート６０５からの命令を読むことができる論理装置として理解することができる。図６に示すシステムには、ＣＰＵ５０１、ディスクドライブ６０３、キーボード６１５および／またはマウス６１６などの任意の入力装置、ならびに任意のモニター６０７が含まれる。
【０１１９】
データ通信は、ローカルまたはリモートロケーションにおいて、サーバー６０９への示された通信媒体を通して達成することができる。通信媒体には、データを送信および／または受信する任意の手段が含まれうる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続またはインターネット接続とすることができる。このような接続は、ワールドワイドウェブを通した通信を提供することができる。１つ以上のＲＮＡの発現レベル、発現レベルの解析結果（癌の特徴づけまたは分類など）などの本発明に関連するデータは、受信側６２２による受信および／または再検討のためにこのようなネットワークまたは接続を通して送信することができる。受信側６２２は、それだけに限定されないが、被験者、医療供給者または医療管理者でありうる。いくつかの実施形態では、情報はコンピュータ読取り可能な媒体に保存される。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：被験者からの血清試料の入手
ＥＤＴＡチューブ、クエン酸塩チューブまたは１０ｍＬＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ  ｐｌｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅ（ＢＤ３６７９８５またはＢＤ３６６６４３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、被験者（健康な被験者および前立腺癌を有する被験者の両方）からの血液を回収する。血液は、回収して２時間以内に血漿を単離するために処理する。
【０１２１】
試料を最小で３０分、最大で２時間、室温で放置する。１５〜２０分間、４℃、１０００〜１３００×ｇで遠心分離によって血餅の分離を行う。血清を取り出し、５００〜７５０μＬの冷凍管に５００μＬの分量で分注する。標本を−８０℃で保管する。
【０１２２】
所与の回数で、採取した血液の量は、約２０〜約９０ｍＬに及びうる。いくつかのＥＤＴＡチューブからの血液を貯え、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない５０ｍＬ円錐管（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移し、Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔａｎｔａ４６０Ｒベンチトップ遠心分離機中、室温で１２００×ｇで１０分間遠心分離する。ペレットをかき乱すのを避けるために、ペレットの上の固定高さ０．５ｃｍの血漿上清を残して血漿を新しい管に移す。血漿を一定分量に分けて、各々の一定分量の間で反転混合させ、−８０℃で保管する。
【０１２３】
実施例２：ヒトの血漿および血清試料からのＲＮＡの単離
ヒトの血漿または血清４００μＬを氷上で解凍し、等容積の２×Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍｂｉｏｎ）で溶解する。液体試料に関する製造者のプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ）に従って、ｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳキットを使用してＲＮＡを単離し、等容積の酸−フェノールクロロホルム（Ａｍｂｉｏｎキットにより供給される）で、試料が２度抽出されるように修正する。製造者のプロトコルに従って、Ａｍｂｉｏｎの溶出溶液１０５μＬでＲＮＡを溶出する。各々のカラムから回収される溶出液の平均容積は約８０μＬである。
【０１２４】
ｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳ（Ａｍｂｉｏｎ）プロトコルのスケールアップ版も使用する。血漿１０ｍＬを氷上で解凍し、２つの５ｍＬ分割量を５０ｍＬチューブに移し、等容積のｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳ  ２×Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで希釈し、３０秒間ボルテックスすることによって十分混合して、氷上で５分間静置する。次いで、等容積（１０ｍＬ）の酸／フェノール／クロロホルム（Ａｍｂｉｏｎ）を各々の分割量に添加する。得られた溶液を１分間ボルテックスし、ＪＡ１７ローターで２０℃、８０００ｒｐｍで５分間回転させる。酸／フェノール／クロロホルム抽出を３度繰り返す。得られた水性容積を１．２５倍の容積の１００％分子等級エタノールと十分混合し、連続的な７００μＬ分割量でｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳカラムを通過させる。製造者のプロトコルに従ってカラムを洗浄し、溶出緩衝液１０５μＬにＲＮＡを溶出させる（９５℃）。合計１．５μＬの溶出液をＮａｎｏｄｒｏｐにより定量化する。
【０１２５】
実施例３：ＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用することによる、血漿および血清からのＲＮＡ中のｍｉＲＮＡレベルの測定
所与の試料のＲＮＡ単離から得られた約８０μＬ溶出液からの一定容積１．６７μＬのＲＮＡ溶液を、逆転写（ＲＴ）反応への投入物として使用する。例えば、４００μＬの血漿または血清試料からＲＮＡを単離する試料については、ＲＮＡ溶液１．６７μＬは、（１．６７／８０）×４００＝８．３μＬの血漿または血清に対応するＲＮＡを表す。既知のｍｉＲＮＡに対応する化学合成したＲＮＡオリゴヌクレオチドの標準曲線の生成のため、ＲＴ反応への最終的な投入物が１．６７μＬの容積を有するように、水で各々のオリゴヌクレオチドの希釈を変化させる。Ｈ２Ｏ  １．３８７μＬ、１０×Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ０．５μＬ、ＲＮａｓｅ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．０６３μＬ（２０ユニット／μＬ）、ｄＴＴＰを有する１００ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．０５μＬ、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ０．３３μＬおよび投入ＲＮＡ  １．６７μＬを含む小規模ＲＴ反応で、ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびｍｉＲＮＡ−特異的ステムループプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、投入ＲＮＡを逆転写する。投入ＲＮＡ以外の成分は、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間および８５℃で５分間、Ｔｅｔｒａｄ２  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、より大きな容積のマスターミックスとして調製することができる。９５℃で１０分間、引き続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  サーモサイクラーでリアルタイムＰＣＲを行う。データは、Ｃｔ決定のためにベースラインおよび閾値を割り当てるための自動Ｃｔ設定を備えるＳＤＳ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン２．２．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で解析する。
【０１２６】
プロトコルは、ｍｉＲＮＡを検出するなどのために、前増幅ステップを含むよう修正することもできる。１．２５μＬの分割量の希釈していないＲＴ産物を、Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＲ試薬  ３．７５μＬ［反応当たり、ＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２×）２．５μＬおよび０．２×ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（ＴＥに希釈）１．２５μＬを含む］と混ぜ合わせて、前増幅ＰＣＲ５．０μＬを作成し、このＰＣＲはＴｅｔｒａｄ２  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で、９５℃で１０分間、引き続いて９５℃で１５秒間および６０℃で４分間を１４サイクル行う。前増幅ＰＣＲ産物を希釈し（Ｈ２Ｏ  ２０μＬを前増幅反応産物５μＬに添加することにより）、続いて希釈物質２．２５μＬをリアルタイムＰＣＲに導入し、記載のように進展させる。
【０１２７】
実施例４：ｍｉＲＮＡの絶対定量のための標準曲線の作成
成熟ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲＢａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｖ．１０．１）に対応する合成一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドをＳｉｇｍａから購入する。合成ｍｉＲＮＡは、実験的に導かれるコピーの範囲にわたってＲＴ反応に投入し、上に列挙したｍｉＲＮＡ  ＴａｑＭａｎアッセイの各々について標準曲線を作成する。一般に、各々のアッセイについての正確な定量の下限は、ＲＴ反応に投入されるコピーの最小数に基づいて示され、それは標準曲線の線形範囲内でＣｔ値をもたらし、より小さいコピー数のＲＴ投入から得られるＣｔと同量でもより高くもない。線は、線形範囲内のＣｔ値を使用した各々の希釈系列からのデータに適合し、そこから各々の試料Ｃｔ（ｙ）からの絶対的ｍｉＲＮＡコピー（ｘ）の定量化のために、ｙ＝ｍｌｎ（ｘ）＋ｂの式が導かれる。ＲＴ反応へ投入されるｍｉＲＮＡの絶対的コピーを、ＲＴ反応へ投入される物質が、血漿の出発総容積の２．１％からのＲＮＡに対応する［すなわち、総ＲＮＡ溶出液容積（平均８０μＬ）の１．６７μＬがＲＴ反応に投入される］という知識に基づいて、血漿（または血清）１マイクロリットル当たりのｍｉＲＮＡのコピーに換算する。合成ｍｉＲＮＡ配列の例は、ｍｉＲ−１４１については、５’ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、これはＳｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）などから市販されている。
【０１２８】
実施例５：免疫組織化学的分析を使用した前立腺癌に関する遺伝子発現プロファイルの同定
固形腫瘍の試料を切除し固定化してパラフィンに包埋する。腫瘍ブロックをスライドガラス上に置くために切片に切り分ける。スライドを、病理医によって選択された組織抗原と反応する所定の一次抗体で染色する。標識された二次抗体は一次抗体と反応し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼと結合する。この複合体は、色素体と反応して、着色染みを作り出す。染色されたスライドは、光学顕微鏡下で病理医によって観察される。病理医は、染色の強度の半定量的解釈を行う。一般に、０〜４のスケールを使用し、０は染色がないまたは陰性の結果を表す。次いで、病理医は陽性に染色された腫瘍細胞の割合を見積もる。一般に、０〜１００％のスケールを使用する。各々の抗体の解釈は、病理医によって患者の報告書中に注釈をつけられる。２２個の前立腺癌試料の解析の結果は、２２個の試料のうちの少なくとも１０個で過剰発現した遺伝子がアンドロゲン受容体、ＥＧＦＲ、ＨＳＰ９０およびＳＰＡＲＣであることを示している（図１Ｃ）。
【０１２９】
実施例６：前立腺癌に関する遺伝子発現プロファイルの同定のための組織調製
組織調製
開始前に、パウダーフリーの手袋を使用して、ＲＮａｓｅＡｗａｙ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ  商品番号８３９３１）または７０％エタノール（７０％  ２００標準濃度のエタノールおよび３０％の純水）のいずれかで作業区域を徹底的に消毒する。−８０℃の冷凍庫から凍結組織を取り出し、直ちにドライアイスを含むトレイに移し、組織がわずかの間も室温のままであることがないようにする。特に組織が小さい場合、解凍が急速に起こりうるので、結果としてＲＮＡが不可逆的に分解してしまうだろう。
【０１３０】
清潔な鋸歯状先端鉗子および新しい清潔で頑丈なカミソリ刃と共に、無菌の直径１００ｍｍペトリ皿（プラスチック）または組織培養皿を清潔な氷上に置いて予冷する。
【０１３１】
皿の中の組織が、箔または他の物質に包まれている場合、解凍されるのを防ぐために氷と接触させながら慎重に包みをあける。組織の部分的な解凍でさえ（それは秒単位で起こりうる）ＲＮＡを不可逆的に分解させ、マイクロアレイ解析の質を損なわせるかまたは当該解析を困難にするだろう。
【０１３２】
予冷した鉗子およびカミソリ刃を使用しながら、マイクロアレイに使用する切片が約１ｍｍの厚さより大きくならないように組織の小片を切り取る。多くの場合、腫瘍の一部を「削り取る」のが最も簡単で最も速い方法である。鉗子およびカミソリ刃は、組織と接触する際に非常に冷たいままであるように、数秒ごとにドライアイス上で冷却する。約１００〜４００ｍｇの、およそ２０ｍｍ３、「豆粒大」と同じくらい小さい組織を使用する。
【０１３３】
組織切断片を、ドライアイス上で予め冷却した帯電防止重量皿（好ましくは「流し込みボート型」）に慎重に置く。次いで、切断組織片は急速に解凍するので、重量皿から、適当な標本番号を予めつけた予冷したホウケイ酸チューブに素早く組織を移し、切断組織片がチューブの壁に粘着しないようにする。組織をチューブに移す際にチューブを非常に冷たく、かつ直立に保つことが、これを避ける最良の方法である。
【０１３４】
残りの組織はすべて、−８０℃の冷凍庫に戻すまではドライアイスの上に凍結したままにしておく必要がある。
【０１３５】
Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを使用した均質化
最初に、循環水槽（Ｍｕｌｔｉｔｅｍｐ  ＩＩＩ）のスイッチを入れ、水を冷却し始める。必ず水槽が十分な水（超純水のみ）を含むようにする。Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ−２装置のスイッチを入れる。Ｃｏｖａｒｉｓシステムの水室は、９５％の超純水および５％の水道水で満たす。Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ−２装置に接続したコンピュータのスイッチを入れ、ＳｏｎｏＬａｂソフトウェアを開く。
【０１３６】
ＳｏｎｏＬａｂウインドー内の「脱気」ボタンをクリックすることによって、脱気プロセスを作動する。水は約３０分間脱気および予冷（Ｍｕｌｔｉｔｅｍｐ  ＩＩＩ冷却水槽により）する必要があり、試料の均質化の間、温度は１７から２０℃の間に保つ。また、脱気プロセスは、全セッションの間、運転している必要があり、ＳｏｎｏＬａｂソフトウェアおよびＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ−２装置をシャットダウンする用意ができた時のみ止める必要がある。
【０１３７】
予め切断した凍結組織は、均質化のために全ての用意ができるまで、ドライアイス上でＣｏｖａｒｉｓホウケイ酸チューブ内に存在する。
【０１３８】
ＳｏｎｏＬａｂプログラム内のプログラム「ＭＰＩ／ＩＧＣ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」を開く（注：以下のステップは非常に素早く行うので、均質化前の最後の瞬間まで凍結組織は凍結しているままである。ステップ間で組織が長く解凍されればされるほど、一般的により多くのＲＮＡ分解が起こる）。
【０１３９】
フィルター付き１０００μＬピペットチップおよびＰ−１０００ピペッターを使用して、ＲＬＴ緩衝液５００μＬ（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットから）を凍結組織に添加する。直ちに、スクリューキャップをはめ戻し、手早くチューブをＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ−２装置中のチューブホルダに挿入する。使用前に２−メルカプトエタノールをＲＬＴに添加する。ＲＬＴ緩衝液１ｍＬ当たり２−メルカプトエタノール１０μＬを添加する。次いで、均質化を開始するためのスタートボタンを押す。
【０１４０】
プロセスが完了した後、チューブを取り出し、湿った氷上に置く。キャップを開け、ＴＲＩｚｏｌ５００μＬを添加する。次いで、チューブのキャップを再び開け、チューブを左右に動かすことによって素早く混合する。
【０１４１】
均質化の後すぐにＲＮＡ抽出を行う場合、チューブは湿った氷上に保持し、そうでない場合、ＲＮＡ抽出の用意ができるまで全標本をドライアイス中または−８０℃で凍結させる。
【０１４２】
均質化セッションが終了したら、脱気を停止し、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ−２装置中の水室から水を除去し、次いで、ラインから残っている水を一掃するために約２秒間脱気する。最初にＳｏｎｏＬａｂプログラムを閉じ、次いでＭｕｌｔｉｔｅｍｐ  ＩＩＩ冷却水槽およびＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ−２装置を止める。
【０１４３】
実施例７：前立腺癌に関する遺伝子発現プロファイルの同定のためのＲＮＡ抽出および精製
ＴＲＩｚｏｌ抽出
予め均質化した組織が−８０℃の冷凍庫に保管されていた場合、組織を室温または６５℃で解凍する。清潔なパウダーフリーの手袋を使用して、ＲＮａｓｅＡｗａｙ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ  商品番号８３９３１）または７０％エタノールのいずれかで作業区域を再度徹底的に消毒する（注：特に指示のない限り、以下のステップは室温で、室温の試薬を使用して行う）。
【０１４４】
チューブ内容物を、スクリューキャップで滅菌の、ＲＮａｓｅを含まない２ｍＬのチューブに移し、確実に蓋がよく締まっているようにする。試料をデジタルヒートブロック中、６５℃で５分間加熱する。予め凍結している場合には、試料を６５℃で７分間温置する。
【０１４５】
次いで、試料を熱から離し、チューブがまだ熱いうちに、直ちにクロロホルム２００μＬを添加する。キャップをよく締めて、次いで１５〜３０秒間激しく振ることによって混合する（ボルテックスしてはいけない、さもないとＤＮＡ分子がせん断され、ＲＮＡに混入する可能性がある）。
【０１４６】
次いで、チューブを氷上で５分間冷却し、次いでチューブを室温で１０分間、１００００×ｇで遠心分離する。フィルターの付いたチップを使用して、ゆっくりと、全ＲＮＡを含有する上部の水相約０．７ｍＬを取り出し、新しい、標識した１．５ｍＬチューブに入れる。
【０１４７】
次いで、室温の７０％エタノール０．７ｍＬを、均質化した溶解質に添加し、ピペット操作によってよく混合する。
【０１４８】
ＲＮｅａｓｙミニカラムまたはマイクロキットによるＲＮＡ含有水相の精製（注：針生検試料を処理する際、マイクロカラムを使用して溶解質に添加したＲＮＡおよびキャリアーＲＮＡを結合させる。ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ  商品番号７４００４）は、キャリアーＲＮＡとして添加するポリ−ＡＮ  ＲＮＡを含有する。初めて使用する前に、キャリアーＲＮＡ（３１０μｇ）をＲＮａｓｅを含まない水１ｍＬに溶解する。このストック溶液を−２０℃で保存し、ＲＮＡ調製の各々のセットのために新鮮な希釈液を作るのに使用する）
１０回の調製用の使用溶液（４ｎｇ／μＬ）を作るため、溶解ＲＮＡ５μＬをＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ３４μＬに添加し、ピペット操作によって混合する。この希釈溶液６μＬをＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ５４μＬに添加する。最終濃度は４ｎｇ／μＬである。
【０１４９】
最大で０．７ｍＬの、形成したと思われるあらゆる沈殿を含む試料を、２ｍＬ回収チューブに置いたＲＮｅａｓｙミニカラムまたはマイクロカラムに適用する。チューブを静かに閉じて、８０００×ｇで３０秒間遠心分離する。残っている試料混合物０．７ｍＬを同じＲＮｅａｓｙミニカラムまたはマイクロカラムに添加し、再度８０００×ｇで３０秒間遠心分離する。
【０１５０】
次いで緩衝液ＲＷ１０．７ｍＬをＲＮｅａｓｙミニカラムまたはマイクロカラムに添加する。チューブを静かに閉じて、８０００×ｇで３０秒間遠心分離し、カラムを洗浄する。フロースルーおよび２ｍＬ回収チューブを捨てる。
【０１５１】
カラムの底部に触れずにＲＮｅａｓｙミニカラムまたはマイクロカラムを新しい２ｍＬ回収チューブへ移す。緩衝液ＲＰＥ０．５ｍＬをＲＮｅａｓｙミニカラムまたはマイクロカラムにピペットで入れる。チューブを静かに閉じて、８０００×ｇで３０秒間遠心分離し、カラムを洗浄する。次いで、フロースルーを捨てる。
【０１５２】
再度、緩衝液ＲＰＥ０．５ｍＬをＲＮｅａｓｙカラムに添加する。チューブを静かに閉じて、８０００×ｇで２分間遠心分離し、ＲＮｅａｓｙシリカゲル膜を乾燥させる。次いで、フロースルーおよび回収チューブを捨てる。
【０１５３】
溶出するため、ＲＮｅａｓｙミニカラムまたはマイクロカラムを新しい１．５ｍＬ回収チューブ（このチューブにはケース番号をラベルする）へ移す。ＲＮａｓｅを含まないＨ２Ｏ（ミニカラムについては３０〜４０μＬ、マイクロカラムについては７〜１４μＬ）を、ＲＮｅａｓｙシリカゲル膜に触れずにその中心より上にピペットで入れる。チューブを閉じて、２〜４分後、チューブを１６１００×ｇで１分間遠心分離する。
【０１５４】
次いで、ミニカラムまたはマイクロカラムを捨てて、ＲＮＡを氷上に置く。
【０１５５】
各々の試料１μＬを生物分析のためにＰＣＲチューブに分割して入れる。ＲＮＡ濃度は、以下のように分光光度計で光学濃度または吸光度を測定することによって決定する：ｐＨ８．０のＴＥを希釈緩衝液およびブランクとして使用する。１：１００の希釈：ｐＨ８．０のＴＥ９９μＬを含むＲＮＡ１μＬを作り、石英キュベットを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ分光光度計で２６０および２８０ｎｍでの吸光度を読み取る。分光光度計の設定は「Ｒａｔｉｏ」とし、得られる比は２６０〜２８０にかけての吸光度であり、これは理想的には１．８〜２．２に及ぶ。２６０ｎｍでの吸光度が線形範囲の外にある場合（０．１未満または１を超える）、それぞれＲＮＡの量を増加させるか、またはＲＮＡをさらに希釈するかのいずれかによって、ＴＥへのＲＮＡの希釈を繰り返す。次いで、ＲＮＡ標識を続行する用意ができるまでＲＮＡを−８０℃の所定の冷凍庫に置く。
【０１５６】
実施例８：前立腺癌に関する遺伝子発現プロファイルの同定のためのＲＮＡ増幅および蛍光標識
組織からのＲＮＡ精製の後、このＲＮＡの増幅および標識が、マイクロアレイ解析を使用した遺伝子発現プロファイルにおける重要なステップとなる。この技術は、ＲＮＡ増幅の最初のステップで逆転写による相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成のための鋳型として精製した全ＲＮＡを使用することを可能にする。蛍光シアニン色素（シアニン−３（ピンク）またはシアニン−５（青））と結合したヌクレオチド（ＣＴＰ）を取り込みながら、ｃＤＮＡを鋳型として使用して、インビトロ転写法によって蛍光相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成する。次いで、得られた蛍光ＲＮＡを、異なるシアニン色素で標識した別のＲＮＡと、両者をｃＤＮＡアレイとハイブリダイズさせることによって、並べて比較する。
【０１５７】
Ａ）全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成
開始前に、パウダーフリーの手袋を使用して、ＲＮａｓｅＡｗａｙ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ  商品番号８３９３１）または７０％エタノール（７０％  ２００標準濃度のエタノールおよび３０％の純水）のいずれかで作業区域を徹底的に消毒する。使用する作業区域、材料および装置が非常に清潔で、粉塵およびＲＮａｓｅがないことが非常に重要である。
【０１５８】
全ＲＮＡ２μｇを１０．３μＬ〜０．２ｍＬの容積の微量遠心チューブに添加する。全濃度は少なくとも５ｎｇ／μＬとする必要がある。５００ｎｇを超える全ＲＮＡ（または１０ｎｇ以上のポリＡ＋ＲＮＡ）を使用する場合、総容積は６．５μＬとする必要がある。
【０１５９】
次いで、Ｔ７  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（キットから）３μＬを添加する。次いで、ヌクレアーゼを含まない水を使用して総反応容積を１１．５μＬにする。サーマルサイクラー中６５℃で１０分間、反応物を温置することによって、プライマーおよび鋳型を変性させる。反応物を４℃で５分間静置する（これは氷上またはサーマルサイクラー中で行うことができる）。
【０１６０】
使用する直前に、表２に示す以下の成分を、室温で、示した順でピペット操作することによって穏やかに混合する（８０℃のヒートブロック中で１〜２分間バイアルを温置することによって５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒを予め温める）。最適な再懸濁を確実にするために、チューブを微量遠心機中、最高速度で短時間ボルテックスし、短時間回して、内容物を壁および蓋から払い落とす。使用まで室温で維持する。
【０１６１】
（表２）ｃＤＮＡマスターミックス
2012507300.tif 000013
【０１６２】
各々の試料のチューブに、ｃＤＮＡマスターミックス８．５μＬを添加する。次いで、気泡形成を避けるために、チューブを短パルスの低設定でボルテックスする。気泡の存在は酵素の変性をもたらし、それによって酵素の活性を損なう恐れがある。
【０１６３】
次いで、試料をサーマルサイクラー中４０℃で２時間温置する。次いで、サーモサイクラーの温度を６５℃に切り換え、試料を１５分間温置する（６５℃での温置はＭＭＬＶ−ＲＴ（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）を失活させる）。
【０１６４】
次いで、反応物を４℃で５分間静置する（これは氷上またはサーマルサイクラー中で行うことができる）。試料を微量遠心機中、最高速度で短時間回して、チューブ内容物を壁および蓋から払い落とす。
【０１６５】
Ｂ．蛍光ｃＲＮＡ合成：インビトロ転写およびシアニン３−またはシアニン５−ＣＴＰの取り込み
各々の試料のチューブに、シアニン３−ＣＴＰ（１０ｍＭ）２．４μＬまたはシアニン５−ＣＴＰ（１０ｍＭ）２．４μＬのいずれかを添加する。シアニン３は明るいピンク色であり、シアニン５は明るい青色である。両者とも光感受性であるので、光への露出は最小限にする必要がある。シアニン３−ＣＴＰ（ピンク）は一般的に正常な基準ＲＮＡ標識に使用し、シアニン５−ＣＴＰ（青）は患者（腫瘍）ＲＮＡ標識に使用する。５０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を、４０℃のヒートブロック中で１分間バイアルを温置することによって、予め温める。最適な再懸濁を確保するために、チューブを微量遠心機中、最高速度で短時間ボルテックスし、短時間回して、内容物を壁および蓋から払い落とす。使用までチューブを室温で維持する。
【０１６６】
表３に示すように転写マスターミックスを作る。使用する直前に、反応成分を含有する全てのチューブを素早く回して内容物を落とし（数秒間）、以下の成分を、室温で、示した順で結合させる（次いで、試料チューブに添加する前に、低設定でマスターミックスを穏やかにボルテックスし、微量遠心機中、最高速度で回す）（注：反応を行う直前まで酵素は添加しない）。
【０１６７】
（表３）転写マスターミックス
2012507300.tif 000014
【０１６８】
各々の試料のチューブに、転写マスターミックス５７．６μＬを添加し、気泡形成を避けるために、短パルスの低設定で慎重にボルテックスすることによって混合する。次いで、チューブを微量遠心機中、最高速度で素早く回してチューブの内容物を落とす（数秒間）。
【０１６９】
次いで、試料を４０℃のサーマルサイクラー槽中で２時間温置する。
【０１７０】
Ｃ．増幅ｃＲＮＡの精製（注：初めてキットを使用する前に４倍の容積の１００％エタノールをＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥに添加することを忘れない（具体的な容積については底のラベル参照））
ヌクレアーゼを含まない水２０μＬをｃＲＮＡ試料に添加して、総容積１００μＬとする。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ３５０μＬを添加し、次いで穏やかにボルテックスすることによって十分混合する。エタノール（純度１００％）２５０μＬを添加し、次いでボルテックスすることによって十分混合する。試料は後で遠心分離しない。
【０１７１】
ｃＲＮＡ試料７００μＬを２ｍＬ回収チューブ中のＲＮｅａｓｙミニカラムに添加する。試料を１３０００×ｇで３０秒間遠心分離する。この最初の遠心分離の後、標識化が成功していればカラム膜中に色が存在するはずである（シアニン−３についてはピンク色、シアニン−５については青色）。
【０１７２】
試料をもう一度カラムに通過させる。これにより、最初の通過の際に膜に保持されなかった標識化ＲＮＡを捕捉することが可能になる。次いで、フロースルーおよび回収チューブを捨てる。
【０１７３】
次いで、ＲＮｅａｓｙカラムを新しい回収チューブへ移し、緩衝液ＲＰＥ５００μＬをカラムに添加する。次いで、試料を１３０００×ｇで３０秒間遠心分離する。次いで、フロースルーを捨てて、回収チューブは再利用する。
【０１７４】
再度、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥ５００μＬをカラムに添加する。次いで、試料を１３０００×ｇで１分間遠心分離し、フロースルーおよび回収チューブを捨てる。
【０１７５】
ＲＮｅａｓｙカラムを新しい１．５ｍＬ回収チューブへ移すことによって、不純物のないｃＲＮＡ試料を溶出する。ＲＮａｓｅを含まない水３０μＬをＲＮｅａｓｙフィルター膜に直接添加する。２〜３分後、チューブを１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離する。フロースルーおよび回収チューブは保持する（これは標識化ｃＲＮＡであり、ピンク色（シアニン３）または青色（シアニン５）が存在するはずである）。
【０１７６】
以下のように分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で光学濃度または吸光度を測定することによってＲＮＡ濃度を決定する。ｐＨ８．０のＴＥを希釈緩衝液およびブランクとして使用する。１：２０の希釈：ｐＨ８．０のＴＥ７６μＬを含むＲＮＡ４μＬを調製する。石英キュベットを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ分光光度計で２６０（ＲＮＡ）、５５０（シアニン３）および６５０（シアニン５）ｎｍでの吸光度を測定する。分光光度計の設定は「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ／Ｐｅａｋｓ」であり、範囲２２０〜７００ｎｍである。次いで、ＲＮＡおよびシアニン色素に対応する吸光度を使用して、標識化ＲＮＡの量およびシアニン色素の取り込みの効率を計算する。
【０１７７】
実施例８：前立腺癌に関する遺伝子発現プロファイルの同定のためのヒト全ゲノムマイクロアレイによるハイブリダイゼーション
蛍光相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の６０ｍｅｒオリゴマイクロアレイとのハイブリダイズは、遺伝子発現プロファイリングにおける重要なステップである。Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ技術を使用することによって、対象とする標本の遺伝子発現プロファイルを決定することができると同時に、異なる蛍光色素（シアニン３またはシアニン５）で予め標識した２つのＲＮＡ（すなわち、腫瘍対正常）を比較することができる。
【０１７８】
ｃＲＮＡで標識した標的を使用したハイブリダイゼーション手順
Ａ）４×４４Ｋ  Ａｇｉｌｅｎｔオリゴマイクロアレイで使用する２×ｃＲＮＡ標的溶液の調製
開始前に、パウダーフリーの手袋を使用して、ＲＮａｓｅＡｗａｙ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ  商品番号８３９３１）または７０％エタノール（７０％  ２００標準濃度のエタノールおよび３０％の純水）のいずれかで作業区域を徹底的に消毒する。使用する作業区域、材料および装置が非常に清潔で、粉塵およびＲＮａｓｅがないことが非常に重要である。
【０１７９】
（初めてストックチューブを使用する場合）ＲＮａｓｅを含まないフィルター付きピペットチップを使用してＲＮａｓｅを含まない水（またはＤＥＰＣ水）０．５ｍＬを凍結乾燥したペレットに添加し、ボルテックスすることによって穏やかに混合し、５〜１０秒間遠心分離することによって、１０×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  商品番号５１８８−５２８１）を調製する。水で元に戻したら、１０×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔは、−２０℃で２ヶ月まで凍結して保存する。
【０１８０】
ＲＮａｓｅを含まない０．２ｍＬのＰＣＲチューブに、ヌクレアーゼを含まない水を添加し、５２．８μＬ容積とする。
【０１８１】
ＲＮａｓｅを含まないフィルター付きピペットチップを使用して、シアニン３で標識したｃＲＮＡ８２５ｎｇおよびシアニン５で標識したｃＲＮＡ８２５ｎｇ（ほぼ同量のシアニン色素を両方に添加するために、これらのうちの一方の標識効率がより低い場合にはそれ以上）を添加する。
【０１８２】
ＲＮＡｓｅを含まないフィルター付きピペットチップを使用して、１０×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ１１μＬを添加する。
【０１８３】
この２×標的溶液をドライアイスで素早く凍結し、−８０℃の冷凍庫中で暗所で１ヶ月まで保存することができる。
【０１８４】
Ｂ）ｃＲＮＡフラグメンテーションおよび１×ハイブリダイゼーション溶液の調製
２×ｃＲＮＡ標的溶液５２．８μＬに、２５×フラグメンテーション緩衝液２．２μＬを添加し、短い遠心分離（５〜１０秒）の前に低速度でボルテックスすることによって穏やかに混合して、内容物を壁およびチューブの蓋から落とす。
【０１８５】
チューブを、ＭＪ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＰＴＣ−２００などのサーマルサイクラー中６０℃で３０分間温置する。この温置は、ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションに最適な理想的な大きさの断片に断片化する。温置後、チューブを微量遠心機で短時間回して、試料を壁および蓋から払い落とす。
【０１８６】
２×ＧＥ  ＨＩ−ＲＰＭ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ５５μＬを添加し、次いで、気泡の取り込みを避けるよう注意しながら、慎重なピペット操作によってよく混合する。次いで、直ちに使用する前に、チューブを微細遠心機で短時間回して、試料を壁および蓋から払い落とす。
【０１８７】
試料を氷上に置き、出来る限り早くアレイにロードする。
【０１８８】
Ｃ）シアニン３−およびシアニン５−標識試料のＡｇｉｌｅｎｔ  ４×４４Ｋオリゴマイクロアレイとのハイブリダイズ
マイクロアレイハイブリダイゼーションを完成するのに必要なだけの、組み立てたステンレス鋼ハイブリダイゼーションチャンバー、ガスケットスライドおよびマイクロアレイを調達する。
【０１８９】
各々のマイクロアレイにハイブリダイゼーション混合物をロードする前に、対応するマイクロアレイおよび各々の試料をロードした位置（アレイ１＿１、１＿２、１＿３、１＿４）のバーコードナンバーを記録することによって、分析する試料を番号順に記録する。
【０１９０】
第１ガスケットを第１ハイブリダイゼーションチャンバーベースの底面上に置き、必ずガスケットスライドのラベルが上になっており、ガスケットが適切に置かれてチャンバーベースと同一平面上になっているようにする。ガスケットスライドの中心で「分注およびドラッギング（ｄｒａｇｇｉｎｇ）する前に、気泡を避けながら、ハイブリダイゼーション溶液１００μＬを第１試料チューブからゆっくり汲み取り、溶液を分注している間に溶液がピペットチップによってガスケットスライドのいたるところにゆっくりと広がるように、ただし溶液とそれを取り囲むガスケットとの間に約２〜３ｍｍの空間が残っているようにする。
【０１９１】
溶液を分注したら、ガスケットスライドを備えたハイブリダイゼーションチャンバーベースは動かさずに、マイクロアレイその上に出来る限り早く置く。
【０１９２】
適当なＡｇｉｌｅｎｔオリゴマイクロアレイを、清潔なパウダーフリーの手袋を使用して包装から取り出す。マイクロアレイ表面に損傷を与えないために、バーコードが配置されている領域および端のみを、マイクロアレイを取り扱うところとすべきである（マイクロアレイを取り扱い、ガスケットスライドの上に置く際に、テフロン被覆された傾斜した先端の鉗子も役立ちうる）。数字の側はその方向に置かれていなければならず、正しいアレイ（正しいバーコードナンバーを備えた）がその試料に割り当てられていることを確認するのがより容易になることから、鉗子は、数字が上になっているようにしながら（「Ａｇｉｌｅｎｔ側が下」）、マイクロアレイをプラスチック包装から取り出すのにも役立つ。
【０１９３】
アレイを慎重に下げて、チャンバーベースの４つのガイドポストに沿って整列させる。整列させてガスケットスライドのわずかに上に（かつ平行に）したら、マイクロアレイスライドをガスケットスライドに静かに立てかけて、サンドイッチされたスライド対を完成させる。スライドを素早く評価してそれらが完全に整列し、オリゴマイクロアレイが半開きでないようにする。
【０１９４】
ステンレス鋼チャンバーのカバーをサンドイッチされたスライドの上に置き、次いで、クランプアセンブリを、チャンバーベースの中央の停止点に来て、スライド対を被覆するまで、滑り込ませる。つまみねじを、十分に手締めされるまで時計回りに回すことによって締める（部品を損傷させ、ガラスガスケットスライドおよびマイクロアレイを壊してしまう恐れがあるので、締めすぎや道具の使用は避ける）。
【０１９５】
ハイブリダイゼーション溶液がガスケットおよびマイクロアレイを濡らすのを可能にするために、チャンバーアセンブリを垂直に保持し、チャンバーアセンブリを２〜３回時計回りにゆっくり回転させる。大きな混合泡が形成されたはずなので、サンドイッチされたスライドの気泡形成を点検する。散らばった混合泡が存在するならば、チャンバーが回転するように動かしてはならず、静かにチャンバーで手または他の表面を叩き、チャンバーを再度回転させて（垂直位置のまま）、定常的な気泡が今も動いているかどうかを特定する。組み立てられたチャンバーをハイブリダイゼーション回転子棚および炉に装填する前に、定常的な気泡が除去されていることが重要である。
【０１９６】
全てのチャンバーを完全に組み立てたら、それらをハイブリダイゼーション回転子棚に装填し、装填したハイブリダイゼーションチャンバーが確実に反対側の他のチャンバー（空のチャンバーも同様に使用できる）と釣り合いがとれているようにする。ハイブリダイゼーション回転子棚を１０ｒｐｍで回転するよう設定し、ハイブリダイゼーションは６５℃で１７時間に設定する。
【０１９７】
Ｄ．Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎによる洗浄
Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２を以下のように３７℃に予め温めておく：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ２  １０００ｍＬを滅菌１０００ｍＬビンに直接分注し、実験に十分な予め温められたＷａｓｈ２溶液ができるまで繰り返す。１０００ｍＬビンのキャップを締め、アレイ前夜に３７℃の水浴中に置く。
【０１９８】
シアニン５はオゾンによる分解を受けやすいので、実験室のオゾンレベルが５ｐｐｂを超える場合には、一般的に以下の手順を行う（注：各々の洗浄グループ（８スライドまで）につき、新鮮なＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１および２を使用する必要がある。アセトニトリルおよびＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎはスライド３グループまでの洗浄について再利用できる）。
【０１９９】
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、アセトニトリルに溶解したオゾン捕捉化合物を含有する。溶液中の化合物は、飽和量存在し、通常の保管条件下で溶液から沈殿しうる。溶液が目に見える沈殿を示す場合、溶液を温めると化合物は再溶解する。目に見える沈殿を示しているＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用してスライドを洗浄すると、マイクロアレイの性能に深刻な有害な影響を与える。
【０２００】
膨張可能な十分なヘッドスペースを備える閉じた容器中４０℃の水浴または通気孔付き従来型炉で溶液をゆっくり温める。必要であれば、裸火または他の発火源から離れた通気用ドラフト下で溶液を穏やかに混合して均質な溶液を得る。溶液は、地域の防火規則の要求を満たす、制御され囲まれた領域でのみ温める。
【０２０１】
沈殿を完全に溶解した後、覆われた溶液を室温に置き、使用前に室温と釣り合うようにする（注：元の容器を使用して溶液を温めることができる。沈殿を完全に再溶解するために必要とされる時間は、存在する沈殿の量に依存し、沈殿が激しい場合には一晩の加温を要しうる。Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、濾過すべきではない）。
【０２０２】
Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎはドラフト中で用意する。Ｗａｓｈ１およびＷａｓｈ２を用意する領域は、近くに、または好ましくは同じドラフト内に置く。加温手順のステップごとに、手袋および目／顔を保護するものを使用する。
【０２０３】
スライド染色皿＃１を、室温でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１で完全に満たす。スライド棚をスライド染色皿＃２の中に置く。次いで、磁気攪拌棒を加え、スライド染色皿＃２を、スライド棚を覆うように室温で十分なＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１で満たす。この皿を磁気攪拌プレート上に置く。
【０２０４】
空の皿＃３を攪拌プレート上に置き、磁気攪拌棒を加える。予め温めた（３７℃）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ２は、最初の洗浄ステップが始まるまで添加しない。
【０２０５】
スライド染色皿＃４を、アセトニトリルでほぼ４分の３いっぱいに満たし、磁気攪拌棒を加えてこの皿を磁気攪拌プレート上に置く。
【０２０６】
スライド染色皿＃５を、Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎでほぼ４分の３いっぱいに満たし、磁気攪拌棒を加えてこの皿を磁気攪拌プレート上に置く。
【０２０７】
ハイブリダイゼーションチャンバーを恒温器から取り出し、ハイブリダイゼーションチャンバーを解体する準備をする。ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリを平坦な表面に置き、反時計回りに回してつまみねじをゆるめる。クランプアセンブリを滑らせて外し、チャンバーカバーを取り外す。
【０２０８】
手袋をした指で、端からスライドをつかむことによってチャンバーベースからアレイ−ガスケットサンドイッチを取り外す。マイクロアレイスライドの数字のバーコードを上向きに保って、サンドイッチを素早くスライド染色皿＃１に移す。
【０２０９】
スライドを放すことなく、アレイ−ガスケットサンドイッチをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１を含有するスライド染色皿＃１に浸す。サンドイッチをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１に完全に浸して、サンドイッチをバーコードの端のみからこじあける。
【０２１０】
鉗子の鈍い端部の１つをスライドの間に滑り込ませて、鉗子を静かに上向きまたは下向きに回してスライドを引き離し、ガスケットスライドを染色皿の底に落とす。マイクロアレイスライドを取り外し、室温で、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１を含有するスライド染色皿＃２中のスライド棚に置く。スライドの空気への露出は最小限にする必要があり、マイクロアレイスライドのバーコード部分またはその縁部のみが触れるようにする必要がある。
【０２１１】
グループの全てのスライドをスライド染色皿＃２中のスライド棚に置いたら、設定４を１分間使用して攪拌を開始する。この洗浄ステップ中、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ２を３７℃の水浴から取り出し、Ｗａｓｈ２皿へ注ぎいれる。スライド棚を高温でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ２を含有するスライド染色皿＃３に移し、設定４を１分間使用して攪拌する。
【０２１２】
Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ２からスライド棚を取り出し、棚をわずかに傾けて洗浄緩衝液の持ち越し汚染を最小限にする。直ちにスライド棚をアセトニトリルを含有するスライド染色皿＃４に移し、設定４を３０秒間使用して攪拌する。
【０２１３】
スライド棚を、Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで満たした皿＃５に移し、設定４を１分間使用して攪拌する。
【０２１４】
スライド棚をゆっくり取り外して、スライド上への飛沫を最小限にする。スライド棚を取り外すのに５〜１０秒かかるはずである。使用したＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１およびＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ２は捨てる。
【０２１５】
直ちにスライドをスキャンして、環境オキシダントのシグナル強度への影響を最小限にする。必要であれば、暗所のＮ２パージ箱中のオレンジ色スライド箱中にスライドを保管する。
【０２１６】
マイクロアレイスライドをスキャンするために、スキャナーのスイッチを入れ、数分後にＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｃａｎｎｅｒコントロールを開く。スキャンするスライドの数（４８まで）を選択し、スキャンする溝に対応する列を強調した後で、Ｂｒｏｗｓｅを選択し、画像ファイルを保存する出力パスまたは場所を選択する。
【０２１７】
任意の設定を変更するためには、Ｓｅｔｔｉｎｇｓ＞Ｍｏｄｉｆｙ  Ｄｅｆａｕｌｔ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓをクリックする。ウインドーがポップアップし、そこから設定を変更することができる。スキャン解像度は５μｍにセットアップする。スキャナーはバーコードを読み取り、自動的に各々のファイルにその番号で名前をつける。
【０２１８】
スキャナーの状態が「Ｓｃａｎｎｅｒ  ｒｅａｄｙ」と表示され、Ｓｃａｎをクリックすると、各々のアレイがスキャンされるのに約７分かかる。全てのスキャンが終了した後、レポートが自動的に全てのシリアルナンバーおよびスキャンの状態（成功かそうでないか）を列挙しているようにみえるだろう。
【０２１９】
最も共通して過剰発現した遺伝子を図１Ａに示す。別の調査では、上位１００の過剰発現遺伝子を同定し、これらのうち少なくとも６つのうちの５つの試料で過剰発現した遺伝子を決定して、図１Ｂに示している。前立腺癌の試料の結果の例を図２に示す。
【０２２０】
実施例９：前立腺癌を特徴づけるための産物値の作成
被験者の血液試料から得られたｍｉＲ−１４１値とＰＳＡ値を組み合わせて産物値を決定し、前立腺癌を検出するのに使用する産物値を作成した。転移性前立腺癌を有する２５人の男性および２５人の正常な男性からの血清ＰＳＡレベルおよびｍｉＲ−１４１レベルのデータを、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等、ＰＮＡＳ  ２００８年７月２９日  １０５巻  第３０号  １０５１３〜１０５１８ページから得た。産物値は、ｍｉＲ−１４１コピー数にＰＳＡレベルを掛けることによって決定した（図５Ａ）。
【０２２１】
前立腺癌を有する男性からの血清のｍｉＲ−１４１の血清１マイクロリットル当たりのコピーの平均数は、１マイクロリットル当たり＋／−１０４３１コピーの平均の９５％の信頼区間で１５６４８である。前立腺癌を有さない男性からのｍｉＲ−１４１の血清１マイクロリットル当たりのコピーの平均数は、１マイクロリットル当たり＋／−２２３コピーの平均の９５％信頼区間で５６０である（図５Ｂ）。前立腺癌を有する男性には前立腺癌を有さない正常な男性との明確な区別がある。
【０２２２】
産物値は、被験者についてのｍｉＲ−１４１コピー数およびＰＳＡ値を使用することによって、前立腺癌を予測する新規なデータ解析を提供する。産物値は、１００％の感度および１００％の特異度で、前立腺癌を有する男性と前立腺癌を有さない男性を区別する。
【０２２３】
本明細書に記載の修正形態に加えて、本発明の種々の修正形態が前述の説明から当業者に明らかとなろう。このような修正形態はまた、添付の特許請求の範囲に入ることを意図している。本特許出願に引用した各々の参照は、全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2012507300.tif 000016
【図２】
2012507300.tif 000017
【図３】
2012507300.tif 000018
【図４】
2012507300.tif 000019
【図５】
2012507300.tif 000020
【図６】
2012507300.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成23年8月4日(2011.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012507300000001.app
【国際調査報告】
2012507300.tif 000022
2012507300.tif 000023
2012507300.tif 000024