(57)【要約】  本開示は、ＣＤ２８に特異的に結合する一価ポリペプチドドメイン及びＣＤ２８に特異的に結合する一価ポリペプチドドメインを含むＣＤ２８のアンタゴニストに関する。この開示は、一価でＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインを含む一価ポリペプチドドメインを包含する。ＣＤ２８に結合するのに一価である抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８活性を阻害することができる。一つの側面では、一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、一側面では、実質的にＣＤ２８活性をアゴナイズせずに、ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＣＤ２８の活性に拮抗する抗体単一可変ドメインから成るか、又はそれを含む。別の側面では、この一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、ヒト抗体単一可変ドメインである。この開示は更に、個体のＣＤ８０及び／又はＣＤ８６のＣＤ２８との相互作用に拮抗する方法、及びＣＤ８０及び／又はＣＤ８６のＣＤ２８との相互作用を伴う疾患又は障害を処置する方法を包含し、その方法は、個体に一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを投与することを伴う。
2012507260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２８、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、一価ポリペプチドドメインを含むＣＤ２８のアンタゴニスト。
【請求項２】
ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２８、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、一価ポリペプチドドメインから成るＣＤ２８のアンタゴニスト。
【請求項３】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、抗体単一可変ドメインである、請求項１又は請求項２に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２８及びＤＯＭ２１−５８から成る群より選択される単一可変ドメインのＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１アミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱのＣＤＲ１アミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱＸ1Ｉ［ここで、Ｘ1は任意のアミノ酸である］のＣＤＲ１アミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱＸ1ＩＧ［ここで、Ｘ1は任意のアミノ酸である］のＣＤＲ１アミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱＸ1ＩＧＸ2Ｘ3Ｌ［ここで、Ｘ1は任意のアミノ酸である］のＣＤＲ１アミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
Ｘ1が、Ｙ、Ｓ及びＮから成る群より選択されるアミノ酸である、請求項６〜８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
Ｘ2が、Ｔ、Ｈ及びＤから成る群より選択されるアミノ酸であり、及び／又はＸ3がＳ、Ｇ及びＲから成る群より選択されるアミノ酸である、請求項８又は９に記載のアンタゴニスト。
【請求項１１】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される単一可変ドメインのＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１アミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１２】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２８及びＤＯＭ２１−５８から成る群より選択される単一可変ドメインのＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２アミノ酸配列を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１３】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＸaＳＸbＬＱＳ［ここで、Ｘaは任意のアミノ酸であり、そしてＸbは任意のアミノ酸である］のＣＤＲ２アミノ酸配列を有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１４】
Ｘaが、Ａ及びＩから成る群より選択されるアミノ酸であり、及び／又はＸbが、Ｉ、Ｌ及びＲから成る群より選択されるアミノ酸である、請求項１３に記載のアンタゴニスト。
【請求項１５】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＱＡＳＬＬＱＳ、ＲＡＳＩＬＱＳ、ＷＡＳＬＬＱＳ及びＲＩＳＲＬＱＳから成る群より選択されるＣＤＲ２アミノ酸配列を有する請求項１〜１０及び１２のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１６】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される単一可変ドメインのＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２アミノ酸配列を有する、請求項１〜３及び１１のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１７】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＴＹＹＡＤ、ＴＹＹ、ＴＹＹＡ、ＴＹＹＡＤＳ、ＴＹＹＡＤＳＶ、ＴＹＹＡＤＳＶＫ及びＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［ここで、Ｔは、カバット位置５７にあり、そしてＹＹは、それぞれカバット位置５８及び５９にある］から成る群より選択されるＣＤＲ２アミノ酸配列を有する請求項１〜３、１１及び１６のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１８】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、カバット位置５７にＴ、及び／又はカバット位置５８にＹ、及び／又はカバット位置５９にＹがあるＣＤＲ２を有し、アミノ酸配列が、ＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＴＹＹＡＤ、ＴＹ、ＴＹＹＡ、ＴＹＹＡＤＳ、ＴＹＹＡＤＳＶ、ＴＹＹＡＤＳＶＫ及びＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［ここで、Ｔは、カバット位置５７にあり、そしてＹＹは、それぞれカバット位置５８及び５９にある］から成る群より選択される、請求項１〜３、１１及び１６のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１９】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２８及びＤＯＭ２１−５８から成る群より選択される単一可変ドメインのＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項１〜１０及び１２〜１３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項２０】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＱＱＸcＸdＸeＸfＰＸgＴ［ここで、Ｘc、Ｘd、Ｘe、Ｘf及びＸgは、それぞれ任意のアミノ酸である］を含むＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項１〜１０、１２、１３及び１９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項２１】
Ｘcが、Ｌ、Ｔ、Ｇ及びＦから成る群より選択され、そしてＸdが、Ａ、Ｔ、Ｍ及びＧから成る群より選択され、そしてＸeが、Ｌ及びＴから成る群より選択され、Ｘfが、Ｒ、Ｑ、Ｔ及びＹから成る群より選択され、そしてＸgが、Ｍ、Ｆ及びＴから成る群より選択される、請求項２０に記載のアンタゴニスト。
【請求項２２】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱＹＩＧＴＳＬＮ、ＲＡＳＱＳＩＧＴＧＬＲ、ＲＡＳＱＳＩＳＨＳＬＶ及びＲＡＳＱＮＩＧＤＲＬＨから成る群より選択されるＣＤＲ１アミノ酸配列、ＱＡＳＬＬＱＳ、ＲＡＳＩＬＱＳ、ＷＡＳＬＬＱＳ及びＲＩＳＲＬＱＳから成る群より選択されるＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＬＡＬＲＰＭＴ、ＱＱＴＴＬＱＰＦＴ、ＱＱＧＭＴＴＰＦＴ及びＱＱＦＧＬＹＰＴＴから成る群より選択されるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項１〜１０、１２〜１５及び１９〜２１のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項２３】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱＹＩＧＴＳＬＮのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＱＡＳＬＬＱＳのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＬＡＬＲＰＭＴのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のアンタゴニスト。
【請求項２４】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱＳＩＧＴＧＬＲのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＲＡＳＩＬＱＳのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＴＴＬＱＰＦＴのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のアンタゴニスト。
【請求項２５】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱＳＩＳＨＳＬＶのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＷＡＳＬＬＱＳのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＧＭＴＴＰＦＴのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のアンタゴニスト。
【請求項２６】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＡＳＱＮＩＧＤＲＬＨのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＲＩＳＲＬＱＳのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＦＧＬＹＰＴＴのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のアンタゴニスト。
【請求項２７】
Ｄ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される単一可変ドメインのＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項１〜３、１１、１３及び１６〜１８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項２８】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＦＤＹ［ここで、Ｄはカバット位置１０１にある］を含むＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８及び２７のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項２９】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、カバット位置１０１の直前のカバット位置にＦがあり、及び／又はカバット位置１０１にＤがあり、及び／又はカバット位置１０２にＹがあるＣＤＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８及び２７のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３０】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＣＤＲ３アミノ酸配列を有し、ここで該ＣＤＲアミノ酸配列の最初の残基がＫ、Ｅ及びＱから成る群より選択される、請求項１〜３、１１、１６〜１８及び２７〜２９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３１】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＲＹＨＭＡのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＶＩＤＳＬＧＬＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＥＹＧＧＡＦＤＹのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８及び２７〜３０のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３２】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣを含むＦＲ１アミノ酸配列を有する、請求項１〜１０、１２〜１５及び１９〜２６のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３３】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＸhＬＬＸiＹ［ここで、Ｘh及びＸiは、それぞれ、任意のアミノ酸である］を含むＦＲ２アミノ酸配列を有する、請求項１〜１０、１２〜１５、１９〜２６及び３２のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３４】
Ｘhが、Ｋ及びＭから成る群より選択され、及び／又はＸiが、Ｔ及びＩから成る群より選択される、請求項３３に記載のアンタゴニスト。
【請求項３５】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣを含むＦＲ３アミノ酸配列を有する、請求項１〜１０、１２〜１５、１９〜２６及び３２〜３４のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３６】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲを含むＦＲ４アミノ酸配列を有する、請求項１〜１０、１２〜１５、１９〜２６及び３２〜３５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３７】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、カバットナンバリング方式に従って、それぞれ、カバット位置３、４及び５にＱＬＬを含むＦＲ１アミノ酸配列、及び／又は該ＦＲ１のカルボキシル末端に位置しているＦＴＦＸj［ここで、Ｘjは、Ｅ、Ｉ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｐ、Ｎ、Ａ及びＫから成る群より選択される］を含むＦＲ１アミノ酸配列を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８及び２７〜３１のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３８】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＶＸＬＬＥ、ＥＶＸＬＬＥ、ＥＶＸＬＬＥＳ、ＬＬＥＳ、ＬＬＥＳＧ、ＬＬＥＳＧＧ、ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦ、ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ［ここで、Ｅは、カバット位置６にあり、そして場合によりＸは、Ｑであることもある］から成る群より選択されるＦＲ１アミノ酸配列を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項３９】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、カバット位置５にＬがあるＦＲ１を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜３８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４０】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置５にアミノ酸ＬがあるＦＲ１を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜３８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４１】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置３にアミノ酸ＱがあるＦＲ１を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４０のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４２】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置５にＬがあるＦＲ２を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４１のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４３】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置３７にＶ又はＡがあるＦＲ２を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４２のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４４】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置４４にＧがあるＦＲ２を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４５】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置４７にＷがあるＦＲ２を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４４のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４６】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置４４〜４７にＧＬＥＷのアミノ酸配列を含むＦＲ２を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４５のいずれか１項に記載ののアンタゴニスト。
【請求項４７】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＶＸＸＸＸＸＸＧＬＥＷ又はＡＸＸＸＸＸＸＧＬＥＷ［ここで、Ｘは任意のアミノ酸である］から成る群より選択される配列を含むＦＲ２を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４６のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４８】
前記ＦＲ２が、ＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ、ＡＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ及びＡＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳから成る群より選択される請求項４７に記載のアンタゴニスト。
【請求項４９】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置７４にＳがあるＦＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５０】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置７７〜７９にアミノ酸配列ＴＬＹがあるＦＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜４９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５１】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置７７にＴがあるＦＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜５０のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５２】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置７８にＬがあるＦＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜５１のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５３】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置７９にＹがあるＦＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜５２のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５４】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置８４にＡがあるＦＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜５３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５５】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、アミノ酸配列ＳＫＮＴＬＹ［ここで、該Ｓは位置７４にある］を持つＦＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜５４のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５６】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、アミノ酸配列ＳＫＮＴＬＹＸＸＸＸＸＸＸＡ［ここで、該Ｓは位置７４にあり、そしてＸは任意のアミノ酸である］を持つＦＲ３を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜５５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５７】
前記ＦＲ３が、ＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ及びＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ［ここで、該Ｓは位置７４にある］から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載のアンタゴニスト。
【請求項５８】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、位置１０８にアミノ酸ＬがあるＦＲ４を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜５７のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５９】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＴＬＶ、ＧＬＴＶ、ＬＴＶＳ、ＱＧＬＴＶ、ＬＴＶＳＳ、及びＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［ここで、Ｌは位置１０８にある］から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＦＲ４を有する、請求項１〜３、１１、１６〜１８、２７〜３１及び３７〜５８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６０】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、異種のタンパク質又は分子に融合される、請求項１〜５９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６１】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６によるＣＤ２８への結合を阻害する、請求項１〜５９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６２】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＣＤ８０及びＣＤ８６の双方によるＣＤ２８への結合を阻害する、請求項６１に記載のアンタゴニスト。
【請求項６３】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＣＤ８０によるＣＤ２８への結合と比較して、ＣＤ８６によるＣＤ２８への結合を選択的に阻害する、請求項６２に記載のアンタゴニスト。
【請求項６４】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６によるＣＤ２８への結合を、ＩＣ50が５０ｐＭ〜３．０μＭ（３．０μＭを含む）の範囲で阻害する、請求項１〜６３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６５】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６によるＣＤ２８への結合を、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２．０ｎＭ、約１．９ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．０ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．１ｎＭ及び約０．０５ｎＭから成る群より選択されるＩＣ50で阻害する、請求項１〜６４のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６６】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、ＣＴＬＡ４と交差反応しない、請求項１〜６５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６７】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項１〜６６のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６８】
前記アンタゴニストが、ＣＤ２８以外の抗原に特異的に結合するさらなる抗体単一可変ドメインを更に含む、請求項１〜６７のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６９】
ＣＤ２８以外の抗原がＴ細胞表面抗原である、請求項６８に記載のアンタゴニスト。
【請求項７０】
Ｔ細胞表面抗原がＴ細胞受容体である、請求項６９に記載のアンタゴニスト。
【請求項７１】
Ｔ細胞受容体が、移植抗原及び自己抗原から成る群より選択される抗原に結合する、請求項７０に記載のアンタゴニスト。
【請求項７２】
前記自己抗原が、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、糖尿病、乾癬、強皮症、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、及び潰瘍性大腸炎から成る群より選択される自己免疫疾患を媒介するＴ細胞のＴ細胞受容体によって結合される、請求項７１に記載のアンタゴニスト。
【請求項７３】
前記移植抗原が、同種移植拒絶反応、異種移植拒絶反応、及び移植片対宿主病から成る群より選択される移植をベースとした疾患を媒介するＴ細胞のＴ細胞受容体によって結合される、請求項７２に記載のアンタゴニスト。
【請求項７４】
Ｔ細胞受容体が、クラスII  ＭＨＣとの関連で抗原を認識する、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項７５】
ＣＤ２８以外の抗原が血清アルブミンである、請求項６８に記載のアンタゴニスト。
【請求項７６】
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項７５に記載のアンタゴニスト。
【請求項７７】
ＰＥＧを更に含む、請求項１〜７６のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項７８】
更にＰＥＧを含み、該ＰＥＧが、ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインに結合する、請求項７７に記載のアンタゴニスト。
【請求項７９】
前記ＰＥＧが、システイン又はリシン残基を通して前記一価ポリペプチドドメインに結合する、請求項７８に記載のアンタゴニスト。
【請求項８０】
請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト、及び担体を含む単離された組成物。
【請求項８１】
請求項１〜７９のいずれか１項に記載のＣＤ２８に特異的に結合する一価ポリペプチドドメイン、及び担体を含む単離された組成物。
【請求項８２】
請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト、及び製薬学的に許容される担体を含む、単離された医薬組成物。
【請求項８３】
請求項１〜７９のいずれか１項に記載のＣＤ２８に特異的に結合する一価ポリペプチドドメイン、及び製薬学的に許容される担体を含む、単離された医薬組成物。
【請求項８４】
前記組成物が治療的に有効な量の前記アンタゴニストを含む、請求項８３に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
前記組成物が治療的に有効な量の、ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインを含む、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８６】
個体の自己免疫疾患を処置するか又は予防する方法であって、該個体に、請求項１〜８５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト若しくはその組成物、又はＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメイン若しくはその組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項８７】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、糖尿病、乾癬、強皮症、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、及び潰瘍性大腸炎から成る群より選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
個体の移植疾患を処置するか又は予防する方法であって、該個体に、請求項１〜８５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト若しくはその組成物、又はＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメイン若しくはその組成物を投与することを含む、方法。
【請求項８９】
前記移植疾患が、同種移植拒絶反応、異種移植拒絶反応、及び移植片対宿主病から成る群より選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２８、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１〜２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、一価ポリペプチドドメイン。
【請求項９１】
ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＣＤ２８への結合で、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２８、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４，ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインと競合する、一価ポリペプチドドメイン。
【請求項９２】
前記一価ポリペプチドドメインが、単一ドメイン抗体である、請求項９０又は９１に記載のＣＤ２８に特異的に結合する一価ポリペプチドドメイン。
【請求項９３】
ＣＤ２８に結合するドメイン抗体であって、該ドメイン抗体のＣＤ２８への結合が、Ｔ細胞受容体シグナリングと相俟ってＣＤ２８活性を実質的にアゴナイズしない、上記ドメイン抗体。
【請求項９４】
ＣＤ２８に特異的に結合する前記一価ポリペプチドドメインが、生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされるＦＷ２配列を有する、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項９５】
前記生殖細胞系列遺伝子セグメントが、ＤＰ４７及びＤＰＫ９から成る群より選択される、請求項９４に記載のアンタゴニスト。
【請求項９６】
ＣＤ２８に結合するドメイン抗体であって、
ａ．ＣＤ８０及びＣＤ８６がＣＤ２８に結合するのを防止する；
ｂ．ＣＴＬＡ４と交差反応しない；
ｃ．約１５秒〜約１２時間のｔα半減期を有する；及び
ｄ．約１２時間〜約９６時間のｔβ半減期を有する、
から成る群より選択される少なくとも三つの特性を有する、
上記ドメイン抗体。
【請求項９７】
前記アゴニストが、約１２時間〜約３１日の範囲の血清ｔβ半減期を有する、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項９８】
前記アゴニストが、約１２時間〜約２８日の範囲の血清ｔβ半減期を有する、請求項９７に記載のアンタゴニスト。
【請求項９９】
前記アゴニストが、約１２時間〜約１４日の範囲の血清ｔβ半減期を有する、請求項９８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１００】
ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＣＤ２８への結合で、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２８、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインと競合する一価ポリペプチドドメインを含む、ＣＤ２８のアンタゴニスト。
【請求項１０１】
ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＣＤ２８への結合で、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２８、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１〜１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインと競合する一価ポリペプチドドメインから成る、ＣＤ２８のアンタゴニスト。
【請求項１０２】
ＣＤ２８に特異的な前記モノマーが１×１０-7Ｍ以下の解離定数（Ｋd）を有する、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０３】
ＣＤ２８に特異的な前記モノマーが１×１０-8Ｍ以下の解離定数（Ｋd）を有する、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０４】
ＣＤ２８に特異的な前記モノマーが５０ｎＭ〜１ｐＭの範囲の解離定数（Ｋd）を有する、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０５】
ＣＤ２８に特異的な前記モノマーがヒトＣＤ２８に対して１×１０-8Ｍ以下の解離定数（Ｋd）、そして１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数を有する、請求項１０１〜１０４のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０６】
請求項６８に記載のアンタゴニストであって、第一の単一可変ドメインは、ヒトＣＤ２８に対し、１×１０-7Ｍ以下の解離定数（Ｋd）、及び１×１０-2ｓ-1以下のＫoff速度定数を有し、そして第二の単一可変ドメインは、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的であり、ＳＡに対して１ｎＭ〜５００μｍの解離定数（Ｋd）を有する、上記アンタゴニスト。
【請求項１０７】
請求項１〜１０６のいずれか１項に記載の、アンタゴニストをコードする単離された核酸又は組み換え核酸。
【請求項１０８】
配列番号１−５７から成る群より選択される配列を含む、請求項１０７に記載の核酸。
【請求項１０９】
請求項１０８に記載の核酸を含む、コンストラクト。
【請求項１１０】
請求項１０８の核酸又は請求項１１０のコンストラクトを含む、組み換えベクター。
【請求項１１１】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１１０に記載のベクター。
【請求項１１２】
前記組み替え核酸に作動可能にリンクさせた発現制御配列を更に含む、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１３】
発現ベクターがバクテリオファージである、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１４】
発現ベクターがプラスミドである、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１５】
発現ベクターが線状核酸分子である、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１６】
前記ベクターがｐＤＯＭ４である、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１７】
前記ベクターがｐＤＯＭ５である、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１８】
請求項１１０に記載のベクター又はコンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項１１９】
請求項１０７に記載の、単離された核酸又は組み替え核酸によってコードされるポリペプチド又はそのフラグメントの生産方法であって、請求項１０７に記載の核酸の発現に適した条件下で請求項１１８に記載の宿主細胞を維持することを含み、それによって前記ポリペプチドを生産する、上記方法。
【請求項１２０】
前記ポリペプチドがＣＤ２８のアンタゴニストである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
血清アルブミン（ＳＡ）に特異的な前記第二の単一可変ドメインが、ＭＳＡ−１６をコードする核酸配列又はそれと少なくとも８０％同一である配列、又はＭＳＡ−２６をコードする核酸配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）（上の標的）及びＴ細胞（上の標的）間の相互作用を調節するか、阻害するか、防止するか又は遮断するナノボディ。
【請求項１２３】
ＡＰＣ上の標的に対して向けられる、及び／又はＡＰＣ上の標的に特異的に結合することができる、請求項１２２に記載のナノボディ。
【請求項１２４】
Ｔ細胞上の標的に対して向けられる、及び／又はＴ細胞上の標的に特異的に結合することができる、請求項１２２に記載のナノボディ。
【請求項１２５】
Ｔ細胞活性化を阻害し、及び／又は遮断する、請求項１２２〜１２４のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１２６】
サイトカイン産生を阻害し、及び／又は遮断する、請求項１２２〜１２５のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１２７】
Ｔ細胞生存を減少させる、請求項１２２〜１２６のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１２８】
ナイーブＴ細胞の、活性化されたサイトカイン分泌Ｔ細胞への分化を減少させる、請求項１２２〜１２７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１２９】
前記標的がＢ７：ＣＤ２８スーパーファミリーに属する、請求項１２２〜１２８のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３０】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し、及び／又は遮断する、請求項１２２〜１２９のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３１】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し、及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−１のＣＴＬＡ４との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない、請求項１２２〜１３０のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３２】
Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し、及び／又は遮断する、請求項１２２〜１３０のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３３】
Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し、及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−２のＣＴＬＡ４との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない、請求項１２２〜１３０のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３４】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用及びＢ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し、及び／又は遮断する、請求項１２２〜１３０のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３５】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し、及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない、請求項１２２〜１３０のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３６】
Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し、及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない、請求項１２２〜１３０のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３７】
１０-5〜１０-12モル／リットル以下の解離定数（ＫＤ）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３６のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３８】
１０-7〜１０-12モル／リットル以下の解離定数（ＫＤ）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１３９】
１０-8〜１０-2モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３８のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４０】
１０2Ｍ-1Ｓ-1〜約１０7Ｍ-1Ｓ-1の間の会合速度（Ｋon速度）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４１】
１０3Ｍ-1Ｓ-1〜１０7Ｍ-1Ｓ-1の間の会合速度（Ｋon速度）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４２】
１０4Ｍ-1Ｓ-1〜１０7Ｍ-1Ｓ-1の間の会合速度（Ｋon速度）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４３】
１０5Ｍ-1Ｓ-1〜１０7Ｍ-1Ｓ-1の間の会合速度（Ｋon速度）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４４】
１ｓ-1と１０-6ｓ-1の間の解離速度（Ｋoff速度）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４５】
１０-2ｓ-lと１０-6ｓ-lの間の解離速度（Ｋoff速度）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４６】
１０-3ｓ-lと１０-6ｓ-lの間の解離速度（Ｋoff速度）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４７】
１０-4ｓ-lと１０-6ｓ-lの間の解離速度（Ｋoff速度）で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４８】
５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（例えば、５００ｐＭ未満）の親和性で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる、請求項１２２〜１３７のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１４９】
天然起源のナノボディ（任意の好適な種由来）、又は合成若しくは半合成ナノボディである、請求項１２２〜１４８のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１５０】
ＶＨＨ配列、部分的ヒト化ＶＨＨ配列、完全ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化重鎖可変ドメインであるか、又は親和性成熟などの手法によって得られているナノボディである、請求項１２２〜１４９のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１５１】
ｉ）配列番号１１５−１３６の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し［上記においてアミノ酸同一性の程度を決定する目的のためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される］；そして上記において：ｉｉ）好ましくは、カバットナンバリングに従って位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８で一つ若しくはそれより多いアミノ酸残基が、図７に言及されるホールマーク残基から選択される、請求項１２２〜１５０のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１５２】
ｉ）配列番号１３７−１５６、１８３−１８７、１８８−１９３、１９４−２００、２０１−２０７、２０８−２１３、又は２１４−３１７の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し［上記においてアミノ酸同一性の程度を決定する目的のためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される］；そして上記において：ｉｉ）好ましくは、カバットナンバリングに従って位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８で一つ若しくはそれより多いアミノ酸残基が、図７に言及されるホールマーク残基から選択される、請求項１２２〜１５１のいずれか１項に記載のナノボディ。
【請求項１５３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）（上の標的）及びＴ細胞（上の標的）間の相互作用を調節するか、阻害するか、防止するか又は遮断するアミノ酸配列。
【請求項１５４】
ＡＰＣ上の標的に対して向けられるか、及び／又はＡＰＣ上の標的に特異的に結合することができる、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５５】
Ｔ細胞上の標的に対して向けられるか、及び／又はＴ細胞上の標的に特異的に結合することができる、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５６】
Ｔ細胞活性化を阻害し、及び／又は遮断する、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５７】
Ｔ細胞活性化を促進し、及び／又は増大させる、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５８】
サイトカイン産生を阻害し、及び／又は遮断する、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５９】
サイトカイン産生を増加させる、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６０】
Ｔ細胞生存を増大させる、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６１】
Ｔ細胞生存を減少させる、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６２】
ナイーブＴ細胞の、活性化サイトカイン分泌Ｔ細胞への分化を増大させる、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６３】
ナイーブＴ細胞の、活性化サイトカイン分泌Ｔ細胞への分化を減少させる、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６４】
前記標的が、Ｂ７：ＣＤ２８スーパーファミリーに属する、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６５】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６６】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用及びＢ７−１のＣＴＬＡ４との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６７】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−１のＣＴＬＡ４との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６８】
Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６９】
Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用、及びＢ７−１のＣＴＬＡ４との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７０】
Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−２のＣＴＬＡ４との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７１】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用及びＢ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７２】
Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７３】
Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない、請求項１５３に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７４】
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；又は任意のその適切な組み合わせから成る群より選択される一つ若しくはそれより多い一続きのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列。
【請求項１７５】
少なくとも一つの前記一続きのアミノ酸残基が、ＣＤ２８に対して結合する抗原結合部位の一部を形成する、請求項１７４に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７６】
（ｉ）第一の一続きのアミノ酸残基が、下記ａ）、ｂ）若しくはｃ）のアミノ酸配列の一つに対応する場合には、第二の一続きのアミノ酸残基が、下記ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）若しくはｉ）のアミノ酸配列の一つに対応し；（ii）第一の一続きのアミノ酸残基が、ｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の一つに対応する場合には、第二の一続きのアミノ酸残基は、下記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）若しくはｉ）のアミノ酸配列の一つに対応し；又は（iii）第一の一続きのアミノ酸残基が、下記ｇ）、ｈ）若しくはｉ）のアミノ酸配列の一つに対応する場合には、第二の一続きのアミノ酸残基は、下記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）若しくはｆ）のアミノ酸配列の一つに対応するように、ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される二つ又はそれより多い一続きのアミノ酸残基を含む、請求項１７４に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７７】
少なくとも二つの一続きのアミノ酸残基が、ＣＤ２８に対して結合する抗原結合部位の一部を形成する、請求項１７６に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７８】
第一の一続きのアミノ酸残基が、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、
第二の一続きのアミノ酸残基が、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；からなる群より選択され、
そして第三の一続きのアミノ酸残基が、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される、三つ又はそれより多い一続きのアミノ酸残基を含む、請求項１７４に記載のアミノ酸配列。
【請求項１７９】
少なくとも三つの一続きのアミノ酸残基は、ＣＤ２８に対して結合する抗原結合部位の一部を形成する、請求項１７８に記載のアミノ酸配列。
【請求項１８０】
前記アミノ酸のＣＤＲ配列が、配列番号５５４−５５９の少なくとも一つのアミノ酸配列のＣＤＲ配列と、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％若しくはそれ以上のアミノ酸同一性、又は更に本質的に１００％アミノ酸同一性を有する、請求項１７４に記載のアミノ酸配列。
【請求項１８１】
ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され；
及び／又はＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；からなる群より選択され；
及び／又はＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される、
四つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び三つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的に成るアミノ酸配列。
【請求項１８２】
ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列とは３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され；
そしてＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；からなる群より選択され；
そしてＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される、
四つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び三つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的に成る、請求項１８１に記載のアミノ酸配列。
【請求項１８３】
ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、
及び／又はＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、
及び／又はＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される、請求項１２２に記載のナノボディ。
【請求項１８４】
ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、
そしてＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、そしてＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される、請求項１２９に記載のナノボディ。
【請求項１８５】
ＣＤＲ配列は、配列番号２０７−２１２の少なくとも一つのアミノ酸配列のＣＤＲ配列と、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％若しくはそれ以上のアミノ酸同一性、又は更に本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、請求項１２２に記載のナノボディ。
【請求項１８６】
配列番号２０７−２１２から成る群より選択されるか、又は配列番号２０７−２１２の少なくとも一つのアミノ酸配列と、８０％より多い、好ましくは９０％より多い、より好ましくは９５％より多い、例えば９９％若しくはそれ以上の配列同一性（本明細書中に定義されているように）を有するアミノ酸配列から成る群より選択される、請求項１２２に記載のナノボディ。
【請求項１８７】
配列番号２０７−２１２から成る群より選択される、請求項１２２に記載のナノボディ。
【請求項１８８】
前記一価ポリペプチドドメインが単一ドメイン抗体である、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１８９】
前記単一ドメイン抗体が請求項９２、９３又は９６のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体である、請求項１８８に記載のアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
Ｔリンパ球と抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の間の抗原非特異的な細胞内相互作用によってＴ細胞抗原応答を引き起こすＴ細胞共刺激シグナルが生み出される（非特許文献１）。共刺激シグナルは、Ｔ細胞抗原応答の大きさ、そしてこの応答が続いて起こる抗原応答を活性化するか、又は不活性化にするか否かを決定する（非特許文献２）。共刺激がない場合におけるＴ細胞活性化では、Ｔ細胞応答の停止又は免疫力低下状態を招く（非特許文献３）。一つのキーとなる共刺激シグナルは、Ｔ細胞表面受容体ＣＤ２８と、抗原提示細胞上にあるＢ７関連分子（例えば、それぞれ、Ｂ７−１及びＢ７−２、又はＣＤ８０及びＣＤ８６としても呼ばれている）との相互作用によって提供される（非特許文献４）。
【０００２】
ＣＤ２８と、Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）共刺激分子との相互作用は、Ｔ細胞応答を増加させ、そして維持するための主要なシグナル伝達経路を提供する。Ｔ細胞の表面上にあるＣＤ２８は、Ｂ細胞又は他のＡＰＣｓ上のリガンドによって伝達される共刺激シグナルを受け取ることができる。ＣＤ２８のリガンドには、Ｂ７−１及び／又はＢ７−２のような、Ｂリンパ球活性化抗原のいくつかのＢ７ファミリーが含まれる（非特許文献５〜１０）。Ｂ７−１及びＢ７−２はまた、活性化されたＴ細胞の表面に存在する別の分子、ＣＴＬＡ４のリガンドでもある。
【０００３】
ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上で、実際にはすべてのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、５０％のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞、いくつかのナチュラルキラー細胞及びすべてのマウスＴ細胞に構造的に発現される。ＣＤ２８は、タイプＩトランスメンブレン糖タンパク質であり、ＣＤ８０及び８６と結合するのに必要なＭＹＰＰＰＹモチーフを有するその単一のＩｇ可変様細胞外ドメインに基づいて、免疫グロブリンファミリーのメンバーである（非特許文献１１）。ＣＤ２８は、そのホモ二量体化に関与しているＩｇ可変様ドメインの後に位置している一つのシステイン残基を有する。
【０００４】
ＣＤ２８は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルと相乗作用を示すシグナルを伝達し、ナイーブＴ細胞の活性化を促進する（非特許文献１２）。ＣＤ２８シグナリングは、Ｔ細胞活性化の閾値を調節し、有効なＴ細胞活性化に必要なＴＣＲエンゲージメント（engagements）の数を顕著に減少させる（非特許文献１３）。ＣＤ２８共刺激によって、Ｔ細胞の増殖の強化、多種多様なサイトカイン及びサイトカイン受容体の産生、細胞周期の進行に関与しているタンパク質の発現の増加、Ｔ細胞の生存の維持、並びにＴ細胞上のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）発現の維持がもたらされる（非特許文献１４）。
【０００５】
ＣＤ２８シグナルは、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の分化を調節する際に重要な役割を担っている。ＣＤ２８はまた、すでに活性化されたＴ細胞の応答を最適化し、ＩＬ−２産生、及びＴ細胞の生存を促進する。ナイーブＴ細胞によるＩＬ−４産生は、Ｂ７−１／Ｂ７−２共刺激に高度に依存している。ナイーブＴ細胞の活性化の間、ＣＤ２８／Ｂ７経路を中断すると、Ｔ細胞の増殖及び分化が弱められ、一方すでに活性化されたＴ細胞でＣＤ２８／Ｂ７経路を中断すると、Ｔ細胞の増殖は減少するが、エフェクターサイトカイン産生は減少しない（非特許文献１５）。
【０００６】
ヘルパー細胞依存性抗体応答によってＢ７−ＣＤ２８経路が使用されると、免疫グロブリンクラススウィッチング及び胚中心形成に必要な、同起源（cognate）のＴ細胞、Ｂ細胞の相互作用に必須の共刺激シグナルが提供される。ＣＤ２８ノックアウトマウスでは、潜在的反応性Ｂ細胞は、抗原性刺激の後リンパ濾胞内に蓄積するが、増殖することはできず、そして体細胞変異を受けることができない（非特許文献１６）。
【０００７】
阻害するシグナルのＢ７−１／Ｂ７−２の共刺激は、Ｂ７−１／Ｂ７−２が、Ｔ細胞、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）上の第二の、より高い親和性受容体と結合する場合に起こる（非特許文献１７、１８）。免疫応答の帰趨には、ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化とＣＴＬＡ−４介在性Ｔ細胞阻害の間のバランスが必要とされる。
【０００８】
ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化を阻害すると、自己免疫疾患、移植拒絶反応、又はアレルギー応答の間に起こる所望しないＴ細胞応答を阻害することができることになる。例えば、ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化を阻害すると、移植拒絶反応を遅延させ、急性同種移植の拒絶反応を防止し、ドナー特異的寛容を誘導し、そして慢性同種移植の拒絶反応の発症を防止しそして進行を中断させ、並びに、すなわち、移植の場合に、Ｔ細胞が宿主組織アロ抗原に対する強力な免疫応答を展開する、移植片対宿主病（ＧＶＨ）を防止することができることになる（非特許文献１９）。ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化の阻害は、ＣＤ２８を介する活性化シグナリングを打ち消すことによって免疫応答を弱めることになるのみならず、それはＣＤ８６及びＣＤ８０をＣＴＬＡ−４と結合させる量を増加させ、それによって更にＴ細胞応答を阻害することを加速させることができる。
【０００９】
従って、ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化を阻害することは、自己免疫疾患の誘発を防止し、そしてコラーゲン誘発関節炎モデル、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性ブドウ膜炎、重症筋無力症及び狼瘡を含む、実証されている自己免疫疾患の進行及び／又は程度を抑えるのに用いることができることになる（非特許文献２０）。ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化を阻害することは、移植拒絶反応及び／又は移植片対宿主病を防止し、及び／又はモデルを含む移植関連疾患の進行及び／又は程度を抑えるのに用いることができる。少なくとも一部ＣＤ２８シグナリングによって介在される炎症を阻害及び／又は減少させることがまた、望ましい。必要なことは、ＣＤ２８シグナリング経路を刺激することなくＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化を阻害する方法である。本明細書中に述べられている開示によって、このニーズが満足され、対処される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:361 367
【非特許文献２】Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 445 480
【非特許文献３】Schwartz, R. H. (1992) Cell 71:1065 1068
【非特許文献４】P. Linsley and J. Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11：191 212
【非特許文献５】Freedman, A. S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267
【非特許文献６】Freeman, G. J. et al. (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722
【非特許文献７】Freeman, G. J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631
【非特許文献８】Freeman, G. J. et al. (1993) Science 262, 909-911
【非特許文献９】Azuma, M. et al. (1993) Nature 366, 76-79
【非特許文献１０】Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-2192
【非特許文献１１】Peach et al. 1994、 J. Exp. Med. 180:2049-2058
【非特許文献１２】Lanzavecchia et al. (1999) Cell 96:1-4
【非特許文献１３】Viola et al. 1996. Science 273: 104-6
【非特許文献１４】Sharpe et al. Fundamental Immunology, W.E. Paul Ed. Fifth Edition, Page 396
【非特許文献１５】Sharpe et al. Fundamental Immunology, W.E. Paul Ed. Fifth Edition, Page 393-404
【非特許文献１６】Ferguson et al. J. Immunol. (1996) 156：4576-4581
【非特許文献１７】Brunet et al. Nature (1987) 328：267-270
【非特許文献１８】Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 174：561-569
【非特許文献１９】Salama et al. (2001) J. Clin. Invest. 108：943-48
【非特許文献２０】Saloman et al. Ann. Rev. Immunol. (2001) 19:225-252
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概要
一価でＣＤ２８と結合する抗体単一可変ドメイン(antibody single variable domains)を含む、ＣＤ２８の一価の結合体（binders）が本明細書に開示されている。一つの側面では、一価でＣＤ２８と結合する抗体単一可変ドメインを含むＣＤ２８の一価の結合体は、ＣＤ２８の活性に拮抗する。Ｔ細胞応答調節  並びに抗体の産生におけるＣＤ２８の明白な重要性のゆえに、ＣＤ２８／Ｂ７（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の相互作用及び経路は、移植拒絶反応、炎症及び自己免疫疾患などの不適切な、及び／又は望ましくない細胞免疫応答、及び／又は過剰な抗体応答を包含する疾患及び障害の処置の治療アプローチの開発の場合の重要な標的を提示している。ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化を阻害することに関連して、一価の形態で特異的にＣＤ２８と結合するＣＤ２８のアンタゴニストは、例えば、Ｔ細胞活性化及び／又はＴ細胞増殖であるＣＤ２８介在性Ｔ細胞応答に拮抗するという点で細胞表面のＣＤ２８分子をクラスター化し（cluster）、Ｔ細胞刺激を助長する抗ＣＤ２８二量体抗体よりも特有の利点を有している。従って、ＣＤ２８結合の場合一価であるアンタゴニスト抗体単一可変ドメイン（antagonist antibody single variable domain）は、免疫応答を抑え、細胞表面のＣＤ２８の二価又は多価結合をすることができる抗体を用いて起こりうる潜在的な望ましくない刺激作用を避けて、ＣＤ２８活性を阻害することができる。ＣＤ２８に特異的に結合する一価抗体単一可変ドメインはまた、標準的な二価抗体が用いられるいくつかの任意の使用、例えばインビボイメージング及び診断に適用されうる。
【００１２】
本明細書中には、ＣＤ２８介在性シグナリングを阻害する抗体単一可変ドメインを含む、ＣＤ２８の一価の結合体を含むか、あるいはＣＤ２８の一価の結合体から成るＣＤ２８アンタゴニストが記載されている。一つの側面では、ＣＤ２８介在性シグナリングの阻害は、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６によるＣＤ２８との結合の減少から生じる。本明細書中に記載されている特異的抗体単一可変ドメインを含む、ＣＤ２８に対する一価のアンタゴニストの存在の結果、ＣＤ２８介在性シグナリングにおける阻害又は減少量は、当技術分野においてよく知られている受容体結合アッセイに基づいて測定することができる。
【００１３】
本明細書中に記載されているアンタゴニスト一価ＣＤ２８結合体は、ＣＴＬＡ４及びＣＤ２８上の細胞外部分で見出された共通のモチーフ、ＭＹＰＰＰＹに結合しない。従って、抗体単一可変ドメインを含む、本明細書中に記載されているＣＤ２８のアンタゴニスト一価結合体は、ＣＴＬＡ４と交差反応せず、ＣＤ８０及びＣＤ８６がＣＴＬＡ４に結合する場合に利用できることを可能にし、更にＴ細胞応答の阻害に役立つ。上記に記載されているように、ＣＴＬＡ４は、既知のＴ細胞反応性の阻害剤である。
【００１４】
一つの側面では、単一ドメイン抗体を含む、ＣＤ２８の一価の結合体を含むか、あるいはＣＤ２８の一価の結合体から成る、本明細書中に記載されているＣＤ２８アンタゴニストは、ＣＤ２８活性を実質的にアゴナイズさせることなく、ＣＤ２８に特異的に結合し、ＣＤ２８の活性に拮抗する。抗体単一可変ドメインのようなＣＤ２８のヒト又はヒト化一価結合体を投与すると、疾患、殊にアロ反応性の免疫応答の発生を回避し、そして又はＴ細胞介在性免疫応答を阻害することが望ましい疾患を処置又は予防するのに特に有用である。一つの側面では、抗体単一可変ドメインは、本質的に一価でＣＤ２８に結合するヒト抗体単一可変ドメインであり、これは一つの例示的な実施態様では、ＣＤ２８活性を実質的にアゴナイズさせることなく、ＣＤ２８に結合し、そしてＣＤ２８シグナリングに拮抗する。
【００１５】
別の実施態様では、ＣＤ２８に特異的に結合する一価ドメインは、ＣＤ２８への結合で、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８と競合し、及び／又は結合で、一つ若しくはそれより多いＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及び／又はＤＯＭ２１−６８と競合する。
【００１６】
別の実施態様では、ＣＤ２８に特異的に結合し、及び／又はＣＤ２８活性を実質的にアゴナイズさせることなく、ＣＤ２８介在性シグナリングに拮抗する一価ドメインは、ＣＤ２８への結合で、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８と競合し、及び／又はその結合のために、一つ若しくはそれより多いＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及び／又はＤＯＭ２１−６８と競合する。
【００１７】
一側面では、特異的にＣＤ２８に結合し、及び／又は、ＣＤ２８介在性シグナリングに拮抗し、及び／又は、ＣＤ２８活性を実質的にアゴナイズさせることなくＣＤ２８介在性シグナリングに拮抗し、及び／又は、ＣＤ２８への結合で、次のもの：ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及び／又はＤＯＭ２１−６８から選択される一つ若しくはそれより多いＤＯＭ２１ペプチドと競合するこの一価ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％同一であるか、又は少なくとも７５％同一である配列、及び／又は次のもの：ＤＯＭ２１−ｌ、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及び／又はＤＯＭ２１−６８から選択される一つ若しくはそれより多いＤＯＭ２１ペプチドに対して少なくとも７０％同一であるか、又は少なくとも７５％同一である配列を含む。
【００１８】
一つの側面では、特異的にＣＤ２８に結合し、及び／又はＣＤ２８介在性シグナリングに拮抗し、及び／又はＣＤ２８活性を実質的にアゴナイズさせることなくＣＤ２８介在性シグナリングに拮抗し、及び／又はＣＤ２８への結合で、上記に記載されている一つ若しくはそれより多いＤＯＭ２１ペプチドと競合し、及び／又は上記に記載されている一つ若しくはそれより多いＤＯＭ２１ペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるか、又は少なくとも７５％同一である配列を含むこの一価ドメインは、抗体単一可変ドメインである。
【００１９】
別の側面では、特異的にＣＤ２８に結合し、及び／又はＣＤ２８介在性シグナリングに拮抗し、及び／又はＣＤ２８活性を実質的にアゴナイズさせることなくＣＤ２８介在性シグナリングに拮抗し、及び／又はＣＤ２８への結合で、上記に記載されている一つ若しくはそれより多いＤＯＭ２１ペプチドと競合し、及び／又は上記に記載されている一つ若しくはそれより多いＤＯＭ２１ペプチドに対して少なくとも７０％同一であるか、又は少なくとも７５％同一である配列を含む、この抗体単一可変ドメイン及び／又は一価ドメインは、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６によりＣＤ２８に結合することを阻害し、そして一つの側面では、ＣＤ８０によるＣＤ２８に結合することに比較して、ＣＤ８６によるＣＤ２８に結合することをより強力に阻害する。一つの側面では、この抗体単一可変ドメインは、ＩＣ5Oが５０ｐＭ〜３．０μＭ（両端を含む）の範囲内、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２．０ｎＭ、約１．９ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．０ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭから約０．１ｎＭまでの範囲で、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６によるＣＤ２８に結合することを阻害する。一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこのアンタゴニスト、一価ドメイン及び／又は単一可変ドメインは、ＣＴＬＡ４と交差反応しない。
【００２０】
一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有している。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有している。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有している。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有している。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有している。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有している。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８から成る群より選択されるＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有している。
【００２１】
一つの実施態様では、このアンタゴニストは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及びＤＯＭ２１−２８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインを含むか、又はＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及びＤＯＭ２１−２８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一である抗体単一可変ドメインを含む。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及びＤＯＭ２１−２８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインによって結合されるＣＤ２８の同一のエピトープに結合する。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を含む核酸分子によってコードされる抗体単一可変ドメインによって結合されるＣＤ２８の同一のエピトープに結合する。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及びＤＯＭ２１−２８から成る群からの一つ若しくはそれより多いＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を含む核酸の配列によってコードされる抗体単一可変ドメインポリペプチドの一つ若しくはそれより多いＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８及び／又はＤＯＭ２１−２８の二つ又はそれより多いＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３を含む。一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を含む核酸によってコードされる抗体単一可変ドメインポリペプチドの二つ又はそれより多いＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
【００２２】
一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインは更に、ＣＤ２８以外の抗原に特異的に結合する更なる抗体単一可変ドメイン又はリガンド結合部位を含む。一つの実施態様では、ＣＤ２８以外の抗原は、Ｔ細胞表面抗原、例えば、Ｔ細胞受容体である。一つの側面では、このＴ細胞受容体は、移植抗原及び自己抗原を含む抗原に結合する。自己免疫疾患を媒介するＴ細胞中のＴ細胞受容体によって結合される自己抗原には、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、糖尿病、乾癬、強皮症、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、及び潰瘍性大腸炎の疾患が含まれるが、それらには限定されない。このＴ細胞受容体は、クラスＩＩＭＨＣの関連で抗原を認識することができる。移植抗原は、同種移植の拒絶反応、異種移植拒絶反応、及び移植片対宿主病から成る群より選択される移植をベースとした疾患を媒介するＴ細胞中のＴ細胞受容体によって結合される。
【００２３】
一つの実施態様では、ＣＤ２８以外の抗原は、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンである。一つの実施態様では、ＣＤ２８のアンタゴニストは更に、ＰＥＧを含む。ＰＥＧは、例えば、システイン又はリシン残基を通して前記抗体単一可変ドメインに結合（連結）することができる。
【００２４】
一つの実施態様は、ＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインと、担体を含む分離された組成物（isolated composition）である。一つの側面では、この組成物は医薬組成物であり、そしてその担体は、医薬担体である。別の側面では、組成物は、治療的に有効な量の前記のアンタゴニスト及び／又は抗体単一可変ドメインを含む。
【００２５】
本明細書では、個体における自己免疫疾患を処置するか、又は予防する方法が開示されており、その方法は前記個体に先の請求項のいずれか一つのアンタゴニスト又はその組成物を投与することを含む。自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、糖尿病、乾癬、強皮症、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、及び潰瘍性大腸炎が含まれるが、好ましくはそれらには限定されない。本明細書中には、個体の移植疾患を処置するか、又は予防する方法が開示され、その方法は、本明細書中に記載されている、ＣＤ２８アンタゴニスト又はその組成物を投与することを含む。この移植疾患には、同種移植の拒絶反応、異種移植拒絶反応、及び移植片対宿主病が含まれる。
【００２６】
一つの実施態様では、このヒト抗体単一可変ドメインは、Ｋdを５０ｎＭ〜１ｐＭ（両端を含む）の範囲内で（表面プラズモン共鳴によって測定される）ヒトＣＤ２８から解離する。例えば、ヒトＣＤ２８のＫdは、２５ｎＭ〜２０ｐＭ、１０ｎＭ〜２０ｐＭ、５ｎｍ〜２０ｐＭ、１ｎＭ〜２０ｐＭ、０．５ｎＭ〜２０ｐＭ、０．１ｎＭ〜２０ｐＭ、０．１ｎＭ〜５０ｎＭ、７５ｐＭ〜２０ｐＭ、５０ｐＭ〜２０ｐＭ、又は２０ｐＭ〜１ｐＭでもありうる。
【００２７】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８がＣＤ８０に結合することを阻害する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインはＣＤ２８がＣＤ８６に結合することを阻害する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８がＣＤ８０に結合することを阻害することに比較して、ＣＤ２８がＣＤ８６に結合することを阻害することが好ましい。
【００２８】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインがＣＤ２８に結合することによって、実質的にＣＤ２８活性をアゴナイズさせない。
【００２９】
別の実施態様では、このヒト抗体単一可変ドメインは、ＣＤ８０がＣＤ２８に結合することを阻害し、そしてＣＤ２８によるシグナリングを実質的にアゴナイズ(agonize)させない。別の実施態様では、このヒト抗体単一可変ドメインは、ＣＤ８６がＣＤ２８に結合することを阻害し、そしてＣＤ２８によるシグナリングを実質的にアゴナイズさせない。
【００３０】
別の実施態様では、このヒト抗体単一可変ドメインはＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインを含む。
【００３１】
別の実施態様では、このヒト抗体単一可変ドメインはＰＥＧ結合体である。一つの実施態様では、ＰＥＧは、ヒト抗体単一可変ドメインに共有結合している。一つの好ましい実施態様では、ＰＥＧ結合ヒト抗体単一可変ドメインは、少なくとも２４ｋＤの流体力学的サイズを有している。別の好ましい実施態様では、ＰＥＧは、抗体単一可変ドメインにシステイン又はリシン残基で結合している。別の好ましい実施態様では、全ＰＥＧサイズは、２０〜６０ｋＤ（両端を含む）である。別の好ましい実施態様では、このＰＥＧ結合ヒト抗体単一可変ドメインは、少なくとも２００ｋＤの流体力学的サイズを有している。
【００３２】
一つの実施態様では、抗体単一可変ドメインは、ポリエチレングリコールを欠いている同一の抗体単一可変ドメイン組成物と比較して、インビボにおけるｔα又はｔβ半減期の増加を有している。
【００３３】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のｔα半減期は、他の点では同一の条件下でアッセイすると未修飾タンパク質と比較して１０％以上増加する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のｔα半減期は５０％以上増加する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のｔα半減期は２倍以上増加する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のｔα半減期は、５倍以上、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増加する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のｔα半減期は５０倍以上増加する。
【００３４】
別の実施態様では、ＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインは、０．２５〜６時間（両端を含む）のｔα半減期を有する。別の実施態様では、ｔα半減期は、３０分〜１２時間（両端を含む）の範囲内である。別の実施態様では、抗体単一可変ドメイン組成物のｔα半減期は、１〜６時間の範囲内である。
【００３５】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のtβ半減期は、他の点では同一の条件下でアッセイすると未修飾タンパク質と比較して１０％以上増加する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のｔβ半減期は５０％以上増加する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のｔβ半減期は２倍以上増加する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のｔβ半減期は、５倍以上、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増加する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物のtβ半減期は５０倍以上増加する。
【００３６】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物は、１時間〜１月の範囲内のｔβ半減期を有する。一つの実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物は、１２時間〜４週間の範囲内のｔβ半減期を有する。好ましい実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物は、２週間のｔβ半減期を有する。別の実施態様では、このｔβ半減期は、１２〜４８時間（両端を含む）の範囲内である。別の実施態様では、このｔβ半減期は、１２〜２６時間（両端を含む）の範囲内である。別の実施態様では、このｔβ半減期は少なくとも２週間である。更なる実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物は、範囲の下端が、少なくとも１２、１３、１４、１５、２０、２４、３６、４８、又は７２時間であり、そして範囲の上端が２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、そして３１日までの範囲内のｔβ半減期を有する。一つの実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物は、少なくとも１２時間から２４時間、１４日、２８日、４週間まで、及び１月までの範囲内のｔβ半減期を有する。
【００３７】
上記のクライテリアに加えて、あるいは代わるものとしては、１ｍｇ．分／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する抗体単一可変ドメインを含むｄＡｂから成る組成物が提供される。一つの実施態様では、範囲の下端は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００、又は３００ｍｇ．分／ｍｌである。加えて、又は代替的には、リガンド又は組成物は、最大６００ｍｇ．分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。一つの実施態様では、範囲の上端は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５、又は５０ｍｇ．分／ｍｌである。リガンドは、次のものから成る群より選択される範囲のＡＵＣを有することになることが有利である：１５〜１５０ｍｇ．分／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ．分／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ．分／ｍｌ、及び１５〜５０ｍｇ．分／ｍｌ。
【００３８】
別の実施態様では、本明細書中に記載されているこの抗体単一可変ドメインは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することができ、このことはまた、分子のインビボの半減期を増加させる作用を有する。このヒト血清アルブミンコード配列は、ジェンバンクアクセション番号（GenBank Accession No.）ＮＭ０００４７７で入手可能なｃＤＮＡ配列から誘導されるプライマーを用いるＰＣＲによって得ることができる。こうしたコード配列は、本明細書中に記載されている一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインの場合のコード配列に融合することができ、そしてこの融合は、当技術分野の当業者によって発現することができる。
【００３９】
別の実施態様では、ＨＳＡ結合ヒト抗体単一可変ドメイン組成物のｔα半減期は１０％以上増加する。別の実施態様では、このＨＳＡ結合ヒト抗体単一可変ドメイン組成物のｔα半減期は、０．２５時間〜６時間の範囲内である。別の実施態様では、このＨＳＡ結合ヒト抗体単一可変ドメイン組成物のｔβ半減期は、１０％以上増加する。別の実施態様では、このＨＳＡ結合ヒト抗体単一可変ドメイン組成物のｔβ半減期は、１２〜４８時間の範囲内である。
【００４０】
別の実施態様では、ＣＤ２８に特異的に結合するこのヒト抗体単一可変ドメインは、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
別の実施態様では、このヒト抗体単一可変ドメインは、ＩＣ50（ＣＤ２８がＣＤ８０に結合することを阻害するＩＣ50）が、１ｐＭ〜１．５μＭ（両端を含む）の範囲内でＣＤ２８がＣＤ８０に結合することを阻害する。このＩＣ50は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１ｐＭ〜５０ｎＭの範囲内でありうる。更に許容されるか、又は好ましい範囲には、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭ、及び２００ｐＭ〜５０ｎＭが含まれる。
【００４２】
別の実施態様では、このヒト抗体単一可変ドメインは、ＩＣ50（ＣＤ２８がＣＤ８６に結合することを阻害するＩＣ50）が、１ｐＭ〜１．５μＭ（両端を含む）の範囲内でＣＤ２８がＣＤ８６に結合することを阻害する。このＩＣ50は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１ｐＭ〜５０ｎＭの範囲内でありうる。更に許容されるか、又は好ましい範囲には、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭ、及び２００ｐＭ〜５０ｎＭが含まれる。
【００４３】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８以外のリガンドに結合する第二の抗体単一可変ドメインに融合する。別の実施態様では、このヒト抗体単一可変ドメインには、Ｆｃドメインがない。Ｆｃドメインの制限については、Kabat et al. (1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services,
Washington, D.C.；引用によって本明細書に組み込まれる）中に記載されている。あるいは、Ｆｃドメインは、ＣＨ２−ＣＨ３部位から成り、場合により、ＣＨ２に結合しているヒンジ部位を含んでいることがある。
【００４４】
別の実施態様では、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有し、抗体単一可変ドメインが特異的に、かつ一価でＣＤ２８に結合する、ヒト抗体単一可変ドメインが提供される。
【００４５】
別の実施態様では、抗原結合ポリペプチド、特異的に、かつ一価でＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドが提供される。別の実施態様では、ＣＤ２８に特異的に結合するモイエティを含むポリペプチドが提供され、このモイエティは免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくは抗体単一可変ドメインから成る。
【００４６】
一つの実施態様では、このポリペプチドは、ヒト抗体単一可変ドメイン、好ましくは、抗体単一可変ドメインから成る。
【００４７】
別の実施態様では、このポリペプチドは、ＣＤ２８がＣＤ８０に結合することを阻害する。別の実施態様では、このポリペプチドは、ＣＤ２８がＣＤ８６に結合することを阻害する。
【００４８】
別の実施態様では、このポリペプチドは、ＣＤ２８がＣＤ８０に結合することを阻害し、そして１ｐＭ〜１．５μＭ（両端を含む）の範囲内のＩＣ50を有する。例えば、このＩＣ50は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１ｐＭ〜５０ｎＭの範囲内でありうる。更に許容されるか、又は好ましい範囲には、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭ、及び２００ｐＭ〜５０ｎＭが含まれる。
【００４９】
別の実施態様では、このポリペプチドは、ＣＤ２８がＣＤ８６に結合することを阻害し、そして１ｐＭ〜１．５μＭ（両端を含む）の範囲内のＩＣ50を有する。例えば、このＩＣ50は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１ｐＭ〜５０ｎＭの範囲内でありうる。更に許容されるか、又は好ましい範囲には、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭ、及び２００ｐＭ〜５０ｎＭが含まれる。
【００５０】
別の実施態様では、ポリペプチドのＣＤ２８への結合は、実質的にＣＤ２８活性をアゴナイズさせない。
【００５１】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインはヒト抗体単一可変ドメイン、好ましくはヒト抗体単一可変ドメインである。
【００５２】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインはＶH又はＶLドメインである。
【００５３】
一つの実施態様では、このポリペプチドはＰＥＧによって結合されている。一つの実施態様では、このＰＥＧは共有結合で結合している。一つの好ましい実施態様では、このＰＥＧ結合抗原結合ポリペプチド（PEG-linked antigen-binding polypeptide）は、少なくとも２４ｋＤの流体力学的サイズを有する。別の好ましい実施態様では、このＰＥＧは、システイン又はリシン残基で抗原結合ポリペプチドに結合している。別の好ましい実施態様では、全ＰＥＧ、サイズは、２０〜６０ｋＤ（両端を含む）である。別の好ましい実施態様では、このＰＥＧ、結合抗原結合ポリペプチドは、少なくとも２０ＯｋＤの流体力学的サイズを有している。
【００５４】
別の実施態様では、このＰＥＧ結合ポリペプチドは、ポリエチレングリコールの結合を欠いている同一のポリペプチド組成物と比較して、インビボにおける半減期を増加した。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔα半減期は１０％以上増加する。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔα半減期は５０％以上増加する。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔα半減期は２倍以上増加する。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔα半減期は、５倍以上、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増加する。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔβ半減期は５０倍以上増加する。
【００５５】
別の実施態様では、このＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインは、０．２５〜６時間（両端を含む）のｔα半減期を有する。別の実施態様では、このｔα半減期は、３０分〜１２時間（両端を含む）の範囲内である。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔα半減期は、１〜６時間の範囲内である。
【００５６】
別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔβ半減期は、１０％以上増加する。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔβ半減期は５０％以上増加する。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔβ半減期は、２倍以上増加する。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔβ半減期は、５倍以上、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増加する。別の実施態様では、このポリペプチド組成物のｔβ半減期は、５０倍以上増加する。
【００５７】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物は、１〜１７０時間（両端を含む）のｔβ半減期を有する。別の実施態様では、ｔβ半減期は、１２〜４８時間（両端を含む）の範囲内である。別の実施態様では、ｔβ半減期は、１２〜２６時間（両端を含む）の範囲内である。更なる実施態様では、この抗体単一可変ドメイン組成物は、範囲の下端が、少なくとも１２、１３、１４、１５、２０、２４、３６、４８、又は７２時間であり、そして範囲の上端が最高２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日まで、及び３１日までである範囲のｔβ半減期を有する。一つの実施態様では、抗体単一可変ドメイン組成物は、少なくとも１２時間から最高２４時間、１４日、２８日、４週間、及び１月までの範囲のｔβ半減期を有する。
【００５８】
別の実施態様では、この組成物は、１ｍｇ．分／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する。一つの実施態様では、範囲の下端は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００、又は３００ｍｇ．分／ｍｌである。加えて、又は代替的には、リガンド又は組成物は、最大６００ｍｇ．分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。一つの実施態様では、範囲の上端は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５、又は５０ｍｇ．分／ｍｌである。リガンドは、次のものから成る群より選択される範囲のＡＵＣを有することになることが有利である：１５〜１５０ｍｇ．分／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ．分／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ．分／ｍｌ、及び１５〜５０ｍｇ．分／ｍｌ。
【００５９】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＨＳＡ結合を欠いている同一のポリペプチド組成物に比較してインビボの半減期を増加させた。別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＨＳＡ結合を欠いている分子と比較して１０％以上増加しているｔα半減期を有する。別の実施態様では、ポリペプチド組成物のｔα半減期は、０．２５分〜６時間の範囲内にある。別の実施態様では、ポリペプチド組成物のｔβ半減期は、１０％以上増加する。別の実施態様では、このｔβ半減期は、１２〜４８時間の範囲内にある。一つの実施態様では、ＨＳＡに結合したこの抗体単一可変ドメインは、哺乳動物、好ましくは、霊長類、好ましくはヒトにおいてＨＳＡだけのｔβ半減期の少なくとも５０％のｔβ半減期を有する。更なる実施態様では、ＨＳＡに結合したこの抗体単一可変ドメインは、霊長類又はヒトなどの哺乳類においてＨＳＡだけのｔβ半減期の少なくとも、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％以上までのｔβ半減期を有する。
【００６０】
別の実施態様では、この抗原結合ポリペプチドは、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００６１】
別の実施態様では、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有し、このポリペプチドが特異的かつ、一価でＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインが提供される。
【００６２】
更に別の側面では、配列番号１−５７から成る群より選択される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有し、このポリペプチドが特異的かつ、一価でＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインが提供される。
【００６３】
一つの実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＣＤ８０がＣＤ２８に結合することに拮抗する。一つの実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＣＤ８６がＣＤ２８に結合することに拮抗する。
【００６４】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＣＤ８０がＣＤ２８に結合することを阻害し、そして１ｐＭ〜１．５μＭ（両端を含む）の範囲内のＩＣ50を有する。例えば、このＩＣ50は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１ｐＭ〜５０ｎＭの範囲内にありうる。更に許容されるか、又は好ましい範囲には、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭ、及び２００ｐＭ〜５０ｎＭが含まれる。
【００６５】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＣＤ８６がＣＤ２８に結合することを阻害し、そして１ｐＭ〜１．５μＭ（両端を含む）の範囲内のＩＣ50を有する。例えば、このＩＣ50は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１ｐＭ〜５０ｎＭの範囲内にありうる。更に許容されるか、又は好ましい範囲には、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭ、及び２００ｐＭ〜５０ｎＭが含まれる。
【００６６】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＣＤ８０がＣＤ２８と相互作用することを阻害するが、ＣＤ２８による細胞内シグナリングを実質的にアゴナイズさせない。別の実施態様では、この抗原結合ポリペプチドは、更にＣＤ２８以外のリガンドに結合する第二の抗体単一可変ドメインを含む。
【００６７】
一つの実施態様では、特異的に、そして一価でＣＤ２８に結合し、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片(human germline antibody gene segment)によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含んでいる一つ若しくはそれより多いフレームワーク領域より成る、抗体単一可変ドメインを含むＣＤ２８アンタゴニストが提供されるか、あるいは一つ若しくはそれより多い前記フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる前記の対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、併せて(collectively)最高５個までのアミノ酸の相違を含んでいる。
【００６８】
一つの実施態様では、抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメイン又はｄＡｂのＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、及びＦＷ４のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、あるいは、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、及びＦＷ４のアミノ酸配列は、前記ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、併せて最高１０個までのアミノ酸の相違を含む。更なる実施態様では、抗ＣＤ２８可変ドメイン又はｄＡｂのＦＷ１、ＦＷ２、及びＦＷ３のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列遺伝子抗体断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である。
【００６９】
上記の更なる実施態様では、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片はＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８、及びＤＰＫ９から成る群より選択されうる。
【００７０】
個体においてＣＤ８０がＣＤ２８に結合することに拮抗する方法であって、その方法が本明細書中に記載されている一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを個体に投与することを含む方法であり、ここでこのポリペプチドが個体においてＣＤ８０がＣＤ２８に結合することに拮抗する方法が提供される。
【００７１】
個体においてＣＤ８６がＣＤ２８に結合することに拮抗する方法は、その方法が本明細書中に記載されている一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを個体に投与することを含んでなり、ここでこのポリペプチドは個体でＣＤ８６がＣＤ２８に結合することに拮抗する。
【００７２】
個体でＣＤ２８の活性に拮抗する方法は、本明細書中に記載されている一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを個体に投与することを含んでなり、ここでこのポリペプチドがＣＤ２８の活性に拮抗する。
【００７３】
持続放出製剤より成る組成物は、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインから構成されるポリペプチドを含む（これには限定されない）免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。一つの実施態様では、この免疫グロブリン単一可変ドメインは、非ヒト哺乳類の抗体単一可変ドメインである。別の実施態様では、この免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体単一可変ドメインである。
【００７４】
そうした処置を必要とする個体における、ＣＤ２８が介在する疾患又は障害を処置又は予防する方法は、治療的に有効な量の、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインを含む組成物を含む、一価の抗ＣＤ２８単一ヒト免疫グロブリン可変ドメインを含む組成物を個体に投与することを含んでなり、それによって免疫系の活性化の程度を減少することにより、症状を減少させるか、又は防止することになる。特に目的としている分野は、臓器移植拒絶反応（例えば、同種移植／異種移植拒絶反応）の防止である。一つの実施態様では、疾患又は障害は自己免疫疾患又は障害である。
【００７５】
個体における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の症状を処置し、又は予防する方法は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の症状を処置し、又は予防するのに有効な量で前記個体に一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを投与することを含む。本明細書では、多発性硬化症、関節リウマチ、同種移植拒絶反応、異種移植拒絶反応及び１型糖尿病、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの疾患の症状を減少させるか、又は軽減させる別の方法であって、疾患又は疾患の症状を処置又は予防するのに有効な量で、こうした疾患に罹患しているか、又は罹患している疑いのある個体に一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを投与することを含む別の方法も提供される。
【００７６】
ＣＤ２８に結合するのに一価である抗体単一可変ドメインは、ユニバーサルな抗体フレームワーク(universal antibody framework)を含む。
【００７７】
一つの実施態様では、このユニバーサルな抗体フレームワークは、ＤＰ４７、ＤＰ４５、及びＤＰ３８から成る群より選択されるＶＨフレームワークを含んでなり、及び／又はこのＶＬフレームワークはＤＰＫ９である。
【００７８】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、包括的リガンド結合部位(generic ligand biding site)を含む。別の実施態様では、この包括的なリガンド結合部位は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｌ、及びタンパク質Ｇから成る群より選択される包括的なリガンドに結合する。
【００７９】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含んでいる一つ若しくはそれより多いフレームワーク領域を有する可変ドメインを含むか、あるいは一つ若しくはそれより多いフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、併せて最高５個までのアミノ酸の相違を含む。
【００８０】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、及びＦＷ４のアミノ酸配列がヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である可変ドメインを含むか、あるいは、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、及びＦＷ４の抗体配列がヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、併せて最高１０個までのアミノ酸の相違を含む。
【００８１】
別の実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ＦＷ１、ＦＷ２、及びＦＷ３領域を含む抗体可変ドメインを含んでなり、そして、前記ＦＷ１、ＦＷ２、及びＦＷ３のアミノ酸配列がヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である。別の実施態様では、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片は、ＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８、及びＤＰＫ９から成る群より選択される。
【００８２】
ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドは、配列番号１−５７から成る群より選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有しているか、又はたかだか２５個のアミノ酸の位置で選択されたアミノ酸配列と異なり、そして選択された配列に対して少なくとも５０％同一である配列を有する。一つの実施態様では、この抗体単一可変ドメインポリペプチドは、２５個若しくはそれより少ないアミノ酸の位置で、２０個若しくはそれより少ないアミノ酸の位置で、１５個若しくはそれより少ないアミノ酸の位置で、１０個若しくはそれより少ないアミノ酸の位置で、５個若しくはそれより少ないアミノ酸の位置で、２個若しくはそれより少ないアミノ酸の位置で、又はわずか１個のアミノ酸の位置で選択されたアミノ酸配列と異なる。更なる実施態様では、この抗体単一可変ドメインポリペプチドは、選択された配列に対して少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、並びに９６％、９７％、９８％、若しくは９９％まで及び９６％、９７％、９８％、若しくは９９％を含んで同一である。別の実施態様では、抗体単一可変ドメインポリペプチドの一つ若しくはそれより多いＣＤＲ領域は、この選択された配列に対して少なくとも５０％同一であり、例えば、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、並びに９６％、９７％、９８％、若しくは９９％まで、及び９６％、９７％、９８％、若しくは９９％を含んで同一である。
【００８３】
本発明は、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、このポリペプチドは、ＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有するか、又はＤＯＭ２１−４のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するか、又はＤＯＭ２１−４のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【００８４】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、更にＤＯＭ２１−４のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有する。
【００８５】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−４のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【００８６】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、更にＤＯＭ２１−４のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【００８７】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、更にＤＯＭ２１−４のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−４のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【００８８】
一つの実施態様では、ＣＤ２８に結合するこの抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＤＯＭ２１−４のそれと配列において同一でない場合は、２５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、又はわずか１個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と異なる。
【００８９】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−４のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【００９０】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−４のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【００９１】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−４のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【００９２】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−４のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【００９３】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−４のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【００９４】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−４のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【００９５】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−４のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−４のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−４のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【００９６】
本発明は、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、このポリペプチドは、ＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−１８の配列と少なくとも８０％同一である配列を有する。一つの実施態様では、この抗体単一可変ドメインポリペプチドは、２５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、又はわずか１個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と異なる。更なる実施態様では、この抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＤＯＭ２１−１８の配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、そして９６％、９７％、９８％、又は９９％まで、及び９６％、９７％、９８％、又は９９％を含んで同一である。
【００９７】
本発明は、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、このポリペプチドは、ＤＯＭ２１−４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有するか、又はＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するか、又はＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【００９８】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、更にＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有する。
【００９９】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【０１００】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、更にＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【０１０１】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、更にＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【０１０２】
一つの実施態様では、ＣＤ２８に結合するこの抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＤＯＭ２１−１８のそれと配列において同一でない場合は、２５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、又はわずか１個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−１８のアミノ酸配列と異なる。
【０１０３】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１０４】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１０５】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１０６】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１０７】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１０８】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１０９】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−１８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１１０】
本発明は、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、このポリペプチドは、ＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、又はたかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−２８の配列と少なくとも８０％同一である配列を有する。一つの実施態様では、この抗体単一可変ドメインポリペプチドは、２５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、又はわずか１個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と異なる。更なる実施態様では、この抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＤＯＭ２１−２８の配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、そして９６％、９７％、９８％、又は９９％まで、及び９６％、９７％、９８％、又は９９％を含んで同一である。
【０１１１】
本発明は、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、このポリペプチドは、ＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有するか、又はＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するか、又はＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【０１１２】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、又は、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有するか、又はＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有する。
【０１１３】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【０１１４】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、更にＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【０１１５】
本発明はまた、ＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドを含み、上記において、ｄＡｂは、ＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するか、あるいは、たかだか２５個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と異なり、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、更にＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【０１１６】
一つの実施態様では、ＣＤ２８に結合するこの抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＤＯＭ２１−２８のそれと配列において同一でない場合は、２５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、１０個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、５個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、２個又はそれより少ないアミノ酸の位置で、又はわずか１個のアミノ酸の位置でＤＯＭ２１−２８のアミノ酸配列と異なる。
【０１１７】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１１８】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１１９】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１２０】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１２１】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１２２】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１２３】
本発明はまた、ＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有し、そしてＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を有し、更にＤＯＭ２１−２８のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ２８アンタゴニストを含む。
【０１２４】
本明細書では、ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＣＤ２８への結合で、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２８、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインと競合する、一価のポリペプチドドメインを含むか、又はそれから成るＣＤ２８のアンタゴニストが開示されている。
【０１２５】
本明細書では、ＣＤ２８に特異的に結合し、そしてＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２８、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５８、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択される抗体単一可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、一価のポリペプチドドメインを含むか、又はそれから成るＣＤ２８のアンタゴニストが開示されている。
【０１２６】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合する一価のポリペプチドドメインは、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２８及びＤＯＭ２１−５８のＶL抗体単一可変ドメインから成る群より選択される単一可変ドメインのＣＤＲ１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有している。このＣＤＲ１アミノ酸配列は、任意の次のアミノ酸配列及び／又はモチーフ：ＲＡＳＱ、ＲＡＳＱＸ1Ｉ［上記において、Ｘ1は任意のアミノ酸であるか、又はＸ1は、Ｙ、Ｓ及びＮから成る群より選択されるアミノ酸である］、ＲＡＳＱＸ1ＩＧ［上記において、Ｘ1は任意のアミノ酸であるか、又はＸ1は、Ｙ、Ｓ及びＮから成る群より選択されるアミノ酸である］、ＲＡＳＱＸ1ＩＧＸ2Ｘ3Ｌ［上記において、Ｘ1は任意のアミノ酸であるか、又はＹ、Ｓ及びＮから成る群より選択されるアミノ酸であり、及び／又は上記において、Ｘ2は任意のアミノ酸であるか、又はＴ、Ｈ及びＤから成る群より選択されるアミノ酸である］を含むか、又はそれから成りうる。
【０１２７】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価ポリペプチドドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択されるＶH抗体単一可変ドメインのＣＤＲ１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１アミノ酸配列を有する。
【０１２８】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価ポリペプチドドメインは、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２８及びＤＯＭ２１−５８から成る群より選択されるＶL単一可変ドメインのＣＤＲ２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有する。このＣＤＲ２は、任意の次のアミノ酸配列及び／又はモチーフ：ＸaＳＸbＬＱＳ［上記において、Ｘaは任意のアミノ酸であり、及び／又はＸbは任意のアミノ酸であり、及び／又はＸaは、Ａ及びＩから成る群より選択されるアミノ酸であり、及び／又は上記において、Ｘbは、Ｉ、Ｌ及びＲから成る群より選択されるアミノ酸である］、ＱＡＳＬＬＱＳ、ＲＡＳＩＬＱＳ、ＷＡＳＬＬＱＳ及びＲＩＳＲＬＱＳを含むか、又はそれから成りうる。
【０１２９】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価ポリペプチドドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択されるＶH単一可変ドメインのＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２アミノ酸配列を有する。このＣＤＲ２は、任意の次のアミノ酸配列及び／又はモチーフ：ＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＴＹＹＡＤ、ＴＹＹ、ＴＹＹＡ、ＴＹＹＡＤＳ、ＴＹＹＡＤＳＶ、ＴＹＹＡＤＳＶＫ及びＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［上記において、Ｔは、カバット位置（Kabat position）５７に存在し、そして上記において、ＹＹは、それぞれ、カバット位置５８及び５９に存在し；及び／又は、Ｔはカバット位置５７に存在し、及び／又はＹはカバット位置５８に存在し、及び／又は、Ｙはカバット位置５９に存在する］を含むか、又はそれから成りうる。
【０１３０】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価ポリペプチドドメインは、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２７、ＤＯＭ２１−２８及びＤＯＭ２１−５８から成る群より選択されるＶL単一可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一である、ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。このＣＤＲ３は、任意の次のアミノ酸配列及び／又はモチーフ：ＱＱＸcＸdＸeＸfＰＸgＴ［上記において、Ｘc、Ｘd、Ｘe、Ｘf及びＸgは、それぞれ、任意のアミノ酸であり、及び／又は、上記において、Ｘcは、Ｌ、Ｔ、Ｇ及びＦから成る群より選択され、及び／又は、Ｘdは、Ａ、Ｔ、Ｍ及びＧから成る群より選択され、及び／又は、Ｘeは、Ｌ及びＴから成る群より選択され、及び／又は、Ｘfは、Ｒ、Ｑ、Ｔ及びＹから成る群より選択され、そしてＸgは、Ｍ、Ｆ及びＴから成る群より選択される］を含むか、又はそれから成りうる。
【０１３１】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価のポリペプチドドメインは、ＲＡＳＱＹＩＧＴＳＬＮ、ＲＡＳＱＳＩＧＴＧＬＲ、ＲＡＳＱＳＩＳＨＳＬＶ及びＲＡＳＱＮＩＧＤＲＬＨから成る群より選択されるＣＤＲ１アミノ酸配列、ＱＡＳＬＬＱＳ、ＲＡＳＩＬＱＳ、ＷＡＳＬＬＱＳ及びＲＩＳＲＬＱＳから成る群より選択されるＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＬＡＬＲＰＭＴ、ＱＱＴＴＬＱＰＦＴ、ＱＱＧＭＴＴＰＦＴ及びＱＱＦＧＬＹＰＴＴから成る群より選択されるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価のポリペプチドドメインは、ＲＡＳＱＹＩＧＴＳＬＮのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＱＡＳＬＬＱＳのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＬＡＬＲＰＭＴのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価のポリペプチドドメインは、ＲＡＳＱＳＩＧＴＧＬＲのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＲＡＳＩＬＱＳのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＴＴＬＱＰＦＴのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価ポリペプチドドメインは、ＲＡＳＱＳＩＳＨＳＬＶのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＷＡＳＬＬＱＳのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＧＭＴＴＰＦＴのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合する一価ポリペプチドドメインは、ＲＡＳＱＮＩＧＤＲＬＨのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＲＩＳＲＬＱＳのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＱＱＦＧＬＹＰＴＴのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
【０１３２】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価のポリペプチドドメインは、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１、ＤＯＭ２１−２、ＤＯＭ２１−３、ＤＯＭ２１−５、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−７、ＤＯＭ２１−８、ＤＯＭ２１−９、ＤＯＭ２１−１０、ＤＯＭ２１−１１、ＤＯＭ２１−１２、ＤＯＭ２１−１３、ＤＯＭ２１−１４、ＤＯＭ２１−１５、ＤＯＭ２１−１６、ＤＯＭ２１−１７、ＤＯＭ２１−１９、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２１、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２３、ＤＯＭ２１−２４、ＤＯＭ２１−２５、ＤＯＭ２１−２６、ＤＯＭ２１−２９、ＤＯＭ２１−３０、ＤＯＭ２１−３１、ＤＯＭ２１−３２、ＤＯＭ２１−３３、ＤＯＭ２１−３４、ＤＯＭ２１−３５、ＤＯＭ２１−３６、ＤＯＭ２１−３７、ＤＯＭ２１−３８、ＤＯＭ２１−３９、ＤＯＭ２１−４０、ＤＯＭ２１−４１、ＤＯＭ２１−４２、ＤＯＭ２１−４３、ＤＯＭ２１−４４、ＤＯＭ２１−４５、ＤＯＭ２１−４６、ＤＯＭ２１−４７、ＤＯＭ２１−４８、ＤＯＭ２１−４９、ＤＯＭ２１−５０、ＤＯＭ２１−５１、ＤＯＭ２１−５２、ＤＯＭ２１−５３、ＤＯＭ２１−５４、ＤＯＭ２１−５５、ＤＯＭ２１−５６、ＤＯＭ２１−５７、ＤＯＭ２１−５９、ＤＯＭ２１−６０、ＤＯＭ２１−６１、ＤＯＭ２１−６２、ＤＯＭ２１−６３、ＤＯＭ２１−６４、ＤＯＭ２１−６５、ＤＯＭ２１−６６、ＤＯＭ２１−６７、及びＤＯＭ２１−６８から成る群より選択されるＶH単一可変ドメインのＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
【０１３３】
このＣＤＲ３は、任意の次のアミノ酸配列及び／又はモチーフ：ＦＤＹ［上記において、Ｄは、カバット位置１０１に存在し、及び／又は、Ｆは、カバット位置１０１の直前のカバット位置に存在し、及び／又は、Ｄは、カバット位置１０１に存在し、及び／又は、Ｙは、カバット位置１０２に存在し；及び／又は、前記ＣＤＲアミノ酸配列の第一の残基（first 残基）は、Ｋ、Ｅ及びＱから成る群より選択される。ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価のポリペプチドドメインは、ＲＹＨＭＡのＣＤＲ１アミノ酸配列、ＶＩＤＳＬＧＬＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧのＣＤＲ２アミノ酸配列、そしてＥＹＧＧＡＦＤＹのＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
【０１３４】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価ポリペプチドドメインは、任意の次のアミノ酸配列及び／又はモチーフ：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣを含むか、又はそれから成りうるＶＬ ＦＲ１アミノ酸配列を有し、及び／又はＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＸhＬＬＸiＹ［上記において、ＸhとＸiは、それぞれ、任意のアミノ酸であり、及び／又は上記においてＸhは、Ｋ及びＭから成る群より選択され、及び／又は上記においてＸiは、Ｔ及びＩから成る群より選択される］を含むＶＬ ＦＲ２アミノ酸配列、及び／又はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣを含むＶＬ ＦＲ３アミノ酸配列、及び／又はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲを含むＶＬ ＦＲ４アミノ酸配列を有する。
【０１３５】
ＣＤ２８アンタゴニストの一つの側面では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価ポリペプチドドメインは、任意の次のアミノ酸配列及び／又はモチーフ：ＱＬＬ［それぞれ、カバットのナンバリング方式（Kabat numbering system）に従ってカバット位置３、４及び５に存在する］、及び／又は、ＦＴＦＸj［前記ＦＲ１のカルボキシル末端に位置しており、上記において、Ｘjは、Ｅ、Ｉ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｐ、Ｎ、Ａ及びＫから成る群より選択される］、及び／又は、ＶＸＬＬＥ、ＥＶＸＬＬＥ、ＥＶＸＬＬＥＳ［上記において、場合によりＸは、Ｑであることもある］；ＬＬＥＳ、ＬＬＥＳＧ、ＬＬＥＳＧＧ、ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦ、ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ［上記において、Ｅは、カバット位置６に存在し、そして、及び／又はＬはカバット位置５に存在し、及び／又はＱは、位置３に存在する］を含むか、又はそれから成りうるＶＨＦＲｌアミノ酸配列を有し；及び／又は、位置５にＬを有するＶＨＦＲｌを有し；
及び／又は、位置３７にＶ若しくはＡ、及び／又は位置４４にＧ、及び／又は位置４７にＷ、及び／又は位置４４−４７にＧＬＥＷ、及び／又は、ＶＸＸＸＸＸＸＧＬＥＷ又はＡＸＸＸＸＸＸＧＬＥＷ［上記において、Ｘは任意のアミノ酸であり、そしてＡはカバット位置３７に存在する］、及び／又はＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ、ＡＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ及び／又はＡＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳを有するＦＲ２；
及び／又は位置７４にＳ、及び／又は位置７７−７９にＴＬＹ、及び／又は位置７７にＴ、及び／又は位置７８にＬ、及び／又は位置７９にＹ、及び／又は位置８４にＡ、及び／又はＳＫＮＴＬＹ［上記において、前記Ｓは位置７４に存在する］、及び／又はＳＫＮＴＬＹＸＸＸＸＸＸＸＡ［上記において、前記Ｓは位置７４に存在し、そしてＸは任意のアミノ酸である］、及び／又はＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ［上記において、前記Ｓは、位置７４に存在する］、及び／又はＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ［上記において、前記Ｓは位置７４に存在する］を有するＦＲ３；
及び／又は位置１０８にアミノ酸Ｌを有するＦＲ４、及び／又はＴＬＶ、ＧＬＴＶ、ＬＴＶＳ、ＱＧＬＴＶ、ＬＴＶＳＳ、及びＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［上記において、Ｌは位置１０８に存在する］を含むＦＲ４を有する。
【０１３６】
一つの実施態様では、ＣＤ２８に特異的に結合するこの一価のポリペプチドドメインは、異種のタンパク質又は分子と融合する。
【０１３７】
一つの実施態様では、ＣＤ２８アンタゴニストは、配列番号１−５７から成る群より選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ１配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有する。一つの実施態様では、ＣＤ２８アンタゴニストは、配列番号１−５７から成る群より選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ２配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有する。一つの実施態様では、ＣＤ２８アンタゴニストは、配列番号１−５７から成る群より選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ３配列に対して少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有する。
【０１３８】
一つの実施態様では、このＣＤ２８アンタゴニストは、ＣＤ８０がＣＤ２８に結合することを阻害し、及び／又はＣＤ８０がＣＤ２８に結合することを阻害し、及び／又はＣＤ２８の活性を阻害する。
【０１３９】
また、第一の抗原に結合する特異性を有する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び第二の抗原との結合活性を有する第二の単一可変ドメインを含むデュアル特異的リガンド（dual specific ligand）が含まれ、上記において、第一の抗原はＣＤ２８であり、そして第二の単一可変ドメインが第二の抗原に結合すると、インビボにおけるリガンドの半減期を増加させる働きをする。一つの実施態様では、このデュアル特異的リガンドは、少なくとも一つの鎖がＣＤ２８に特異的に結合する抗体単一可変ドメインを含む四つの鎖のＩｇＧ抗体である。
【０１４０】
一つの実施態様では、四つの鎖のＩｇＧのうちの少なくとも一つの鎖は、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体単一可変ドメインを含んでなり、そして少なくとも一つの鎖は、Ｔ細胞受容体のように、独立して第二の分子に特異的に結合する抗体単一可変ドメインのような単一ドメインを含む。別の実施態様では、四つの鎖のＩｇＧのうちの少なくとも一つの鎖は、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体単一可変ドメイン、そしてＴ細胞受容体などの第二抗原に共同して特異的に結合する重鎖及び軽鎖の対のような少なくとも一対の鎖を含む。Ｔ細胞受容体の結合は、Ｔ細胞受容体自体、又はＴ細胞受容体とＴ細胞受容体によって提示される抗原との相互作用によって形成されるエピトープになされうる。
【０１４１】
また、抗ヒトＣＤ２８抗体単一可変ドメイン及び抗ＳＡ抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的リガンドが含まれる。
【０１４２】
一つの実施態様では、このｄＡｂｓ又は抗体単一可変ドメインは、キャメリド(camelid)ＶHHドメインである。
【０１４３】
デュアル特異的リガンドの一つの実施態様では、（ｉ）第一及び第二抗体単一可変ドメインは重鎖可変ドメインであるか；あるいは（ｉｉ）第一及び第二抗体可変ドメインは軽鎖可変ドメインであるかのどちらかである。
【０１４４】
一つの実施態様では、このリガンドは、四つの重鎖の単一可変ドメイン又は四つの軽鎖の単一可変ドメインを含むＩｇＧ免疫グロブリンとして提供される。この重鎖は、キャメリドＶHHドメインを含むことができる。
【０１４５】
デュアル特異的リガンドの更なる実施態様では、第一及び第二ドメインは、デュアル特異的リガンドが第一及び第二抗原の両方に同時に結合することができるように独立して結合する。
【０１４６】
デュアル特異的リガンドの一つの実施態様では、第一の単一可変ドメインは、表面プラズモン共鳴によって決定する際には、ヒトＣＤ２８の場合、１×１０-7Ｍ以下の解離定数（Ｋd）、そして１×１０-2ｓ-1以下のＫoff速度定数(Koff rate constant)を有する。
【０１４７】
デュアル特異的リガンドの一つの実施態様では、この第二の単一可変ドメインは、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的であり、そして表面プラズモン共鳴によって決定する際には、ＳＡに対して１ｎＭ〜５００μｍの解離定数（Ｋd）を有する。
【０１４８】
更なる実施態様では、この第二のドメインは、標準的なリガンド結合アッセイにおいて１ｎＭ〜５００μＭのＩＣ50でＳＡに結合する。この第二の単一可変ドメインは、ＳＡに特異的でありえ、そしてＭＳＡ−１６（配列番号３２３）のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％同一である配列を含む。あるいは、この第二の単一可変ドメインは、ＳＡに特異的でありえ、そしてＭＳＡ−２６（配列番号３２５）のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％同一である配列を含む。
【０１４９】
デュアル特異的リガンドの一つの実施態様では、この抗ＣＤ２８可変ドメイン又はｄＡｂは、ユニバーサルなフレームワークを含む。この抗ＣＤ２８可変ドメイン又はｄＡｂはまた、ＤＰ４７、ＤＰ４５及びＤＰ３８から成る群より選択されるＶHフレームワーク；又はＤＰＫ９であるＶLフレームワークを含みうる。更なる実施態様では、このデュアル特異的リガンド又はｄＡｂは、包括的なリガンドの場合の結合部位を含みうる。
【０１５０】
一つの実施態様では、この包括的なリガンド結合部位は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｌ及びタンパク質Ｇ結合部位から成る群より選択される。
【０１５１】
ＣＤ２８に結合するデュアル特異的リガンド又は一価のポリペプチドの一つの実施態様では、抗ＣＤ２８可変ドメイン又はｄＡｂは、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる一つ又はそれより多い対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域を含むか、又は一つ若しくはそれより多い前記フレームワーク領域のアミノ酸配列はヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる前記の対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、併せて最高５個までのアミノ酸の相違を含む。
【０１５２】
一つの実施態様では、この抗ＣＤ２８可変ドメイン又はｄＡｂのＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、及びＦＷ４のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるか、又はＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、及びＦＷ４のアミノ酸配列は、前記ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、併せて最高１０個までのアミノ酸の相違を含む。
【０１５３】
一つの実施態様では、抗ＣＤ２８可変ドメイン又はｄＡｂの前記ＦＷ１、ＦＷ２、及びＦＷ３のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片によってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である。このヒト生殖細胞系列抗体遺伝子断片は、ＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８、及びＤＰＫ９から成る群より選択されうる。一つの実施態様では、生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされるＦＷ２配列である。更なる実施態様では、この生殖細胞系列遺伝子セグメントは、ＤＰ４７及びＤＰＫ９から成る群より選択される。
【０１５４】
また、ＣＤ２８に対して結合特異性を有する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及びタンパク質に対して結合特異性を有する、インビボにおいてこのリガンドの半減期を増加させる第二の単一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、本明細書中に記載されているデュアル特異的リガンドを製造する方法が含まれ、その方法は、ＣＤ２８に結合する能力によって第一の可変ドメインを選択し；前記タンパク質に結合する能力によって第二の可変ドメインを選択し；
この可変ドメインを結合させ；そしてＣＤ２８及び前記タンパク質に結合する能力によってリガンドを選択する工程を含む。
【０１５５】
一つの実施態様では、この第一の可変ドメインは、相補性可変ドメインの不在下でＣＤ２８への結合のために選択される。
【０１５６】
また、本明細書中に記載されているデュアル特異的リガンドをコードしている核酸が含まれる。この核酸は、ＭＳＡ−１６の核酸配列又はそれに対して少なくとも８０％同一である配列を含んでいてもよく、又は、代替的に、ＭＳＡ−２６の核酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％同一である配列を含んでいてもよい。この核酸はベクター内に組み込まれることができ、このベクターは宿主細胞内に組み込まれることができる。
【０１５７】
また、本明細書中に記載されているデュアル特異的リガンド及び製薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を含む薬学的組成物が含まれる。
【０１５８】
また、ＣＤ２８に特異的なｄＡｂモノマーが含まれ、表面プラズモン共鳴によって測定される場合、そのモノマーは、ヒトＣＤ２８に対して１×１０-8Ｍ以下の解離定数（Ｋd）、及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数を有する。
【０１５９】
一つの実施態様では、表面プラズモン共鳴によって測定される場合、このＣＤ２８に対し特異的なｄＡｂモノマーは１×１０-7Ｍ以下の解離定数（Ｋd）を有する。
【０１６０】
一つの実施態様では、このｄＡｂモノマーは、表面プラズモン共鳴によって測定される場合、１×１０-8Ｍ以下の解離定数（Ｋd）を有するＣＤ２８に対する結合特異性を有する。
【０１６１】
一つの実施態様では。このｄＡｂモノマーは、表面プラズモン共鳴によって測定される場合、５０ｎＭ〜２０ｐＭの解離定数（Ｋd）を有するＣＤ２８に対する結合特異性を有する。
【０１６２】
一つの実施態様では、このモノマーは、ＣＤ８０がＣＤ２８に結合することを５０ｎＭ以下のＩＣ50で阻害する。一つの実施態様では、このモノマーは、ＣＤ８６がＣＤ２８に結合することを５０ｎＭ以下のＩＣ50で阻害する。
【０１６３】
更なる実施態様では、このｄＡｂモノマーは、表面プラズモン共鳴によって測定される場合、１×１０-3ｓ-1以下、１×１０-4ｓ-1以下、１×１０-5ｓ-1以下又は１×１０-6ｓ-1以下のＫoff速度定数を有するＣＤ２８に対する結合特異性を有する。
【０１６４】
一つの実施態様では、このｄＡｂモノマーは、標準的なアッセイにおいて５０ｎＭ以下のＮＤ５０でＣＤ２８を中和させる。
【０１６５】
また、第一及び第二の重鎖単一可変ドメイン、又は第一及び第二の軽鎖単一可変ドメインを含むデュアル特異的リガンドが含まれ、上記において、第一の可変ドメインは、抗ＣＤ２８ｄＡｂモノマーである。
【０１６６】
一つの実施態様では、第二の可変ドメインはＣＤ２８以外の抗原に対する結合特異性を有する。
【０１６７】
また、第一の抗原に対して結合特異性を有している第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン並びに第二の抗原に対して結合活性を有している第二の単一可変ドメインを含むデュアル特異的リガンドが含まれ、上記において、第一の抗原はＣＤ２８であり、第二の単一可変ドメインは、抗原提示細胞表面抗原又はＴ細胞表面抗原である。この抗原提示細胞表面抗原は、樹状細胞表面抗原、活性化されたマクロファージ表面抗原、活性化されたＢ細胞表面抗原、共刺激シグナル経路表面抗原、及びＭＨＣ抗原から成る群のひとつから選択することができる。
【０１６８】
一つの実施態様では、このＭＨＣ抗原はＭＨＣクラスＩＩ抗原であり、そしてこのクラスＩＩ抗原は、アルファ及び／又はベータ鎖でありうる。
【０１６９】
この抗原提示細胞表面抗原又はＴ細胞表面抗原は、ＣＤ４０Ｌ、誘発性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、又はＣＤ３の一つを含んで、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、誘発性共刺激分子（Inducible costimulatory 分子）（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ３、ＣＤ７０、誘発性共刺激分子リガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエーター）、及びＬＩＧＨＴから成る群より選択されうる。
【０１７０】
例示的な表面抗原には、ＣＤ８６又はＣＤ８０などのＢ７遺伝子表面抗原がある。
【０１７１】
一つの側面では、本発明はＣＤ２８に結合するドメイン抗体を提供することであり、この抗体は、ＣＤ８０及びＣＤ８６がＣＤ２８に結合するのを防止すること；ＣＴＬＡ４と交差反応しないこと；約１５秒〜約１２時間のｔα半減期を有すること；及び約１２時間〜約９６時間のｔβ半減期を有することから成る群から選択される少なくとも三つの特徴を有する。
【０１７２】
一つの実施態様では、本明細書中に記載されているＣＤ２８のアンタゴニストは、約１２時間〜約３１日の範囲内の血清ｔβ半減期を有する。更なる実施態様では、ＣＤ２８のアンタゴニストは、約１２時間〜約２８日の範囲内の血清ｔβ半減期を有する。それに加えて更なる実施態様では、ＣＤ２８のアンタゴニストは、約１２時間〜約１４日の範囲内の血清ｔβ半減期を有する。
【０１７３】
一つの側面では、本発明は抗原提示細胞（ＡＰＣ）（上の標的）とＴ細胞（上の標的）の間の相互作用を調節し、阻害し、防止し又は遮断する(block)、ナノボディ(nanobody)を提供する。
【０１７４】
このナノボディは、Ｔ細胞上の標的に対して向けられることができ、及び／又はＴ細胞上の標的に特異的に結合することができる。一つの実施態様では、このナノボディは、Ｔ細胞活性化を阻害し、及び／又は遮断する。一つの実施態様では、このナノボディは、サイトカインの産生を阻害し、及び／又は遮断する。更なる実施態様では、このナノボディはＴ細胞生存を減少させる。それに加えて更なる実施態様では、このナノボディは、ナイーブＴ細胞を活性化されたサイトカイン分泌Ｔ細胞に分化させることを低下させる。
【０１７５】
一つの実施態様では、このナノボディの結合標的はＢ７：ＣＤ２８スーパーファミリーに属する。
【０１７６】
一つの実施態様では、このナノボディはＢ７−１（ＣＤ８０）がＣＤ２８と相互作用することを調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する。
【０１７７】
更なる実施態様では、このナノボディは、Ｂ７−１がＣＤ２８と相互作用することを調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−１がＣＴＬＡ４と相互作用することは調節、阻害又は防止されない。
【０１７８】
一つの実施態様では、このナノボディはＢ７−２（ＣＤ８６）がＣＤ２８と相互作用することを調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する。
【０１７９】
一つの実施態様では、このナノボディは、Ｂ７−２がＣＤ２８と相互作用することを調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、他方では、Ｂ７−２がＣＴＬＡ４と相互作用することは調節、阻害又は防止されない。
【０１８０】
更なる実施態様では、このナノボディは、Ｂ７−１がＣＤ２８と相互作用すること並びに、Ｂ７−２がＣＤ２８と相互作用することを調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する。
【０１８１】
一つの実施態様では、このナノボディは、Ｂ７−１がＣＤ２８と相互作用することを調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、他方では、Ｂ７−２がＣＤ２８と相互作用することは調節、阻害又は防止されない。
【０１８２】
一つの実施態様では、このナノボディは、Ｂ７−２がＣＤ２８と相互作用することを調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、他方では、Ｂ７−１がＣＤ２８と相互作用することは調節、阻害又は防止されない。
【０１８３】
一つの実施態様では、このナノボディは、１０-5〜１０-12モル／リットル以下、そして好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、そしてより好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットルの解離定数（ＫD）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０１８４】
更なる実施態様では、このナノボディは、１０2Ｍ-1Ｓ-1〜約１０7Ｍ-1Ｓ-1の間、好ましくは、１０3Ｍ-1Ｓ-1と１０7Ｍ-1Ｓ-1の間、より好ましくは、１０4Ｍ-1Ｓ-1と１０7Ｍ-1Ｓ-1の間（例えば、１０5Ｍ-1Ｓ-1と１０7Ｍ-1Ｓ-1の間）の会合速度（rate of association）（Ｋｏｎ速度（kon-rate））でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０１８５】
一つの実施態様では、このナノボディは、１ｓ-1と１０-6ｓ-1の間、好ましくは、１０-2ｓ-lと１０-6ｓ-lの間、より好ましくは、１０-3ｓ-1と１０-6ｓ-1の間（例えば、１０-4ｓ-1と１０-6ｓ-1の間）の解離速度（Ｋｏｆｆ速度（koff rate））で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０１８６】
一つの実施態様では、このナノボディは、５００ｎＭ未満、好ましくは、２００ｎＭ未満、より好ましくは、１０ｎＭ未満（例えば、５００ｐＭ未満）で親和性を有し、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０１８７】
一つの実施態様では、このナノボディは、天然起源のナノボディ（任意の好適な種（species）から）又は合成若しくは半合成ナノボディである。
【０１８８】
一つの実施態様では、このナノボディは、ＶHH配列、部分的ヒト化ＶHH配列、完全ヒト化ＶHH配列、ラクダ化重鎖可変ドメイン又は親和性成熟などの手法によって得られたナノボディである。
【０１８９】
一つの実施態様では、このナノボディは、ｉ）配列番号１１５−１３６の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し［上記においてアミノ酸同一性の程度を決定する目的のためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される］；そして上記において：ｉｉ）好ましくは、カバットナンバリングに従って位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８で一つ若しくはそれより多いアミノ酸残基が、図７に言及されているホールマーク残基（Hallmark residues）から選択される。
【０１９０】
一つの実施態様では、このナノボディは、ｉ）配列番号１３７−１５６、１８３−１８７、１８８−１９３、１９４−２００、２０１−２０７、２０８−２１３、又は２１４−３１７の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し［上記においてアミノ酸同一性の程度を決定する目的のためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される］；そして上記において：ｉｉ）好ましくは、カバットナンバリングに従って位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８で一つ若しくはそれより多いアミノ酸残基が、図７に言及されているホールマーク残基から選択される。
【０１９１】
本明細書中に記載されているナノボディの一つの実施態様では、
ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、
及び／又はＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、
及び／又はＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される。
【０１９２】
本明細書中に記載されているナノボディの一つの実施態様では、
ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、
そしてＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、そしてＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される。
【０１９３】
一つの実施態様では、このＣＤＲ配列は、配列番号２０７−２１２の少なくとも一つのアミノ酸配列のＣＤＲ配列と、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは、少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは、少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば、９５％若しくはそれ以上のアミノ酸同一性、又は更に、本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する。
【０１９４】
一つの実施態様では、このナノボディは、配列番号２０７−２１２から成る群より選択されるか、又は配列番号２０７−２１２の少なくとも一つのアミノ酸配列と、８０％より多い、好ましくは、９０％より多い、より好ましくは、９５％より多い、例えば、９９％若しくはそれ以上の配列同一性（本明細書中に定義されているように）を有するアミノ酸配列から成る群より選択される。
【０１９５】
一つの実施態様では、このナノボディは、配列番号２０７−２１２から成る群より選択される。
【０１９６】
本発明はまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（上の標的）及びＴ細胞（上の標的）間の相互作用を調節し、阻害し、防止し又は遮断するアミノ酸配列を提供する。
【０１９７】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、ＡＰＣ上の標的に対して向けられ、及び／又はＡＰＣ上の標的に特異的に結合することができる。
【０１９８】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｔ細胞上の標的に対して向けられ、及び／又はＴ細胞上の標的に特異的に結合することができる。
【０１９９】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｔ細胞活性化を阻害し、及び／又は遮断する。
【０２００】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｔ細胞活性化を促進し、及び／又は増加させる。
【０２０１】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、サイトカイン産生を阻害し、及び／又は遮断する。
【０２０２】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列はサイトカイン産生を増加させる。
【０２０３】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｔ細胞生存を増大させる。
【０２０４】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｔ細胞生存を減少させる。
【０２０５】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、ナイーブＴ細胞の、活性化サイトカイン分泌Ｔ細胞への分化を増大させる。
【０２０６】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、ナイーブＴ細胞の、活性化サイトカイン分泌Ｔ細胞への分化を減少させる。
【０２０７】
一つの実施態様では、このＴ細胞又はＡＰＣ上の標的は、Ｂ７：ＣＤ２８スーパーファミリーに属する。
【０２０８】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する。
【０２０９】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用及びＢ７−１のＣＴＬＡ４との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する。
【０２１０】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−１のＣＴＬＡ４との相互作用は、調節、阻害し、又は防止しない。
【０２１１】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する。
【０２１２】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用及びＢ７−１のＣＴＬＡ４との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する。
【０２１３】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−２のＣＴＬＡ４との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない。
【０２１４】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用及びＢ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断する。
【０２１５】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない。
【０２１６】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、Ｂ７−２のＣＤ２８との相互作用を調節し、阻害し、防止し及び／又は遮断するが、一方Ｂ７−１のＣＤ２８との相互作用は、調節、阻害、又は防止しない。
【０２１７】
本発明はまた、ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列とは３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；又は任意のその適切な組み合わせから成る群より選択される一つ若しくはそれより多い一続きのアミノ酸残基を提供する。
【０２１８】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列の少なくとも一つの前記一続きのアミノ酸残基は、ＣＤ２８に対して結合する抗原結合部位の一部(part)を形成する。
【０２１９】
一つの実施態様では、（i）第一の一続きのアミノ酸残基が、ａ）、ｂ）若しくはｃ）によるアミノ酸配列の一つに対応する場合には、第二の一続きのアミノ酸残基が、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）若しくはｉ）によるアミノ酸配列の一つに対応し；（ii）第一の一続きのアミノ酸残基が、ｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の一つに対応する場合には、第二の一続きのアミノ酸残基は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）若しくはｉ）によるアミノ酸配列の一つに対応し；又は（iii）第一の一続きのアミノ酸残基が、ｇ）、ｈ）若しくはｉ）によるアミノ酸配列の一つに対応する場合には、第二の一続きのアミノ酸残基は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列の一つに対応するように、ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される二つ又はそれより多い一続きのアミノ酸残基を含む。
【０２２０】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列の少なくとも二つの一続きのアミノ酸残基は、ＣＤ２８に対して結合する抗原結合部位の一部(part)を形成する。
【０２２１】
一つの実施態様では、アミノ酸配列は、
第一の一続きのアミノ酸残基が、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され、
第二の一続きのアミノ酸残基が、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；からなる群より選択され、
そして第三の一続きのアミノ酸残基が、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される、三つ又はそれより多い一続きのアミノ酸残基を含む。
【０２２２】
一つの実施態様では、アミノ酸配列の少なくとも三つの一続きのアミノ酸残基は、ＣＤ２８に対して結合する抗原結合部位の一部を形成する。
【０２２３】
一つの実施態様では、前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列は、配列番号５５４−５５９の少なくとも一つのアミノ酸配列のＣＤＲ配列と、少なくとも７０％アミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば、９５％若しくはそれ以上のアミノ酸同一性、又は更に、本質的に１００％アミノ酸同一性を有する。
【０２２４】
本発明は、更に四つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び三つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的に成るアミノ酸配列に関するものであって、上記において、
ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され；
及び／又はＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；からなる群より選択され；
及び／又はＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される。
【０２２５】
一つの実施態様では、アミノ酸配列は、
四つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び三つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的に成り、上記において、
ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３３５−３４０のアミノ酸配列；ｂ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｃ）配列番号３３５−３４０の少なくとも一つのアミノ酸配列とは３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択され；
そしてＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号３４７−３５２のアミノ酸配列；ｅ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｆ）配列番号３４７−３５２の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；からなる群より選択され；
そしてＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号３５９−３６４のアミノ酸配列；ｈ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；ｉ）配列番号３５９−３６４の少なくとも一つのアミノ酸配列と３、２、又は１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；から成る群より選択される。
【０２２６】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０-5〜１０-12モル／リットル又はそれ以下の解離定数（ＫＤ）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２２７】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０-7〜１０-12モル／リットル又はそれ以下の解離定数（ＫＤ）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２２８】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０-8〜１０-2モル／リットルの解離定数（ＫＤ）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２２９】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０2Ｍ-1Ｓ-1〜約１０7Ｍ-1Ｓ-1の間の会合速度（Ｋon速度(Kon-rate）)でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３０】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０3Ｍ-1Ｓ-1と１０7Ｍ-1Ｓ-1の間の会合速度（Ｋon速度）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３１】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０4Ｍ-1Ｓ-1と１０7Ｍ-1Ｓ-1の間の会合速度（Ｋon速度）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３２】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０5Ｍ-1Ｓ-1と１０7Ｍ-1Ｓ-1の間の会合速度（Ｋon速度）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３３】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１ｓ-1と１０-6ｓ-1の間の解離速度（Ｋoff速度（Koff-rate））でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３４】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０-2ｓ-1と１０-6ｓ-1の間の解離速度（Ｋoff速度）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３５】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０-3ｓ-1と１０-6ｓ-1の間の解離速度（Ｋoff速度）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３６】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、１０-4ｓ-1と１０-6ｓ-1の間の解離速度（Ｋoff速度）でＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３７】
一つの実施態様では、このアミノ酸配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは、２００ｎＭ未満、より好ましくは、１０ｎＭ未満（例えば、５００ｐＭ未満）の親和性で、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的に特異的に結合することができる。
【０２３８】
詳細な説明
抗体分子の薬物動態における改善を提供にするために、本開示によって安定性と半減期の増加を提供するポリマーに結合する単一ドメイン可変領域ポリペプチドが提供される。特に、本開示によって、ヒト軽鎖源の抗体単一可変ドメインを含み、そしてヒト重鎖源の抗体単一可変ドメインを含むＣＤ２８活性の拮抗作用のための改善された分子が提供される。本明細書中においては、ポリマー分子（例えば、ポリエチレングリコール；ＰＥＧ）をタンパク質に結合させ、修飾されたタンパク質の薬物動態特性を調節する組成物及び方法が含まれる。例えば、タンパク質のＰＥＧ修飾は、インビボの循環半減期、抗原性、溶解性、及びタンパク質のタンパク分解に対する抵抗性を変化させることが示されてきた(Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 1977, 252:3578; Nucci et al., Adv. Drug Delivery Reviews 1991, 6: 133; Francis et al., Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R. T. ed.);及びStability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263, Plenum, NY)。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】ＡはプラスミドｐＤＯＭ４の概約図である。ＢはプラスミドｐＤＯＭ５の概約図である。
【図２】組み換え型ヒトＣＤ２８／Ｆｃキメラに結合する可溶性モノクローナル抗体単一可変ドメイン及びＦｃコントロールコートプレートのエライザを示す。
【図３】タンパク質Ａの存在又は不存在下での組み換え型ヒトＣＤ２８／Ｆｃキメラに結合する可溶性モノクローナル抗体単一可変ドメイン及びＦｃコントロールコートプレートのエライザを示す。
【図４】１２５００ユニットのＣＤ２８−ＦｃでコートされたＣＭ５チップに結合するｄＡｂクローンのビアコアトレース（Biacore traces）を示す。
【図５】ｄＡｂクローンのセルベースインビトロアッセイにおけるＣＤ２８の活性を阻害する能力を示す。
【図６】ｄＡｂクローンＤＯＭ２１−４及びＤＯＭ２１−２８のセルベースインビトロアッセイにおけるＣＤ２８の活性を阻害する能力を示す。
【図７】ナノボディのホールマーク残基の概要を示す。
【図８】ＭＳＡ１６とＭＳＡ２６のアミノ酸及び核酸配列を示す。
【図９】ＣＤＲ配列の好ましい組み合わせ、フレームワーク配列の好ましい組み合わせ、及びＣＤ２８に対するナノボディのフレームワーク及びＣＤＲ配列の好ましい組み合わせを示す。
【０２４０】
１．定義
本明細書の詳細な説明に従って、次の省約形及び定義が適用される。単数形の“a”、“an”、及び“the”は、本明細書中で使用されている場合は、文脈によって別途明確に指示しない限り、複数の指示対象も含むものと留意されなければならない。従って、例えば、“抗体（an antibody）”の引用は、複数のそうした抗体を含み、また“投与（量）(the dosage)”の引用は、一つ若しくはそれより多い投与及び当技術分野の当業者に知られているその等価物などの引用を含む。別途定義されない限り、本明細書中で使用されている技術的及び科学的用語は、すべて、当技術分野の当業者によって通例理解されているものと同じ意味を有する（例えば、細胞培養において（in cell culture）、分子遺伝学（molecular genetics）、核酸化学（nucleic acid chemistry）、ハイブリダイゼーション手法及び生化学（hybridization techniques and biochemistry））。標準的な手法が分子、遺伝的及び生化学的方法（一般的には次を参照， Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 及び Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc）及び化学的方法のために使用される。別途述べない限り、本明細書中に記載の範囲は、すべて具体的なエンドポイントを含むものである。次の用語が下記に提供される。
【０２４１】
用語“ＣＤ２８のアンタゴニスト（antagonist of CD28）”又は“抗ＣＤ２８アンタゴニスト（anti-CD28 antagonist）”などは、本明細書中で使用する際は、ＣＤ２８に結合する作用剤（例えば、分子、化合物）を含み、ＣＤ２８の機能（すなわち、一つ若しくはそれより多い）を阻害することができる。例えば、ＣＤ２８のアンタゴニストは、ＣＤ２８がＣＤ８０及び／又はＣＤ８６に結合することを阻害し、及び／又はＣＤ２８を介して媒介されるシグナル伝達を阻害することができる。それ故、ＣＤ２８介在性プロセス及び細胞応答（例えば、標準アッセイにおいてサイトカイン分泌及び／又は増殖によって指示されるＣＤ２８誘発Ｔ細胞活性化）は、ＣＤ２８のアンタゴニストで阻害することができる。
【０２４２】
“ペプチド（peptide）”とは、本明細書中で使用する際は、ペプチド結合を介して一緒に結合される約２〜約５０のアミノ酸を意味する。
【０２４３】
“ポリペプチド（polypeptide）”とは、本明細書中で使用する際は、ペプチド結合によって一緒に結合される少なくとも約５０のアミノ酸を意味する。ポリペプチドは、通例、三次構造を含んでなり、そして機能ドメインに折り畳まれている。
【０２４４】
“標的抗原（target antigen）”とは、本明細書中で使用する際は、ポリペプチド又はペプチドによって特異的に又は選択的に結合される抗原を意味する。例えば、ポリペプチドが、抗体単一可変ドメイン、古典的抗体（classical antibody）、又はその抗原結合フラグメントである場合には、この標的抗原は、抗体単一可変ドメイン又は抗体の抗原結合部位に特異的に結合する任意の所望の抗原又はエピトープであることができる。標的抗原への結合は、ポリペプチド又はペプチドの機能性に左右される。
【０２４５】
抗体とは、本明細書中で使用する際は、それが抗体を天然で産生する任意の種に由来していようと、又は組み換えＤＮＡ技術によって創成されていようと、それが血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、イースト又はバクテリアから単離されていようと、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥ又はフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、クローズドコンフォーメーション（閉鎖型コンフォメーション）多特異的抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体(diabody)）を意味する。
【０２４６】
“抗体フォーマット（antibody format）”とは、本明細書中で使用する際は、一つ若しくはそれより多い抗体単一可変ドメインが、場合により、その中に組み込れていることもあり、そして依然として一価的にその標的抗原に結合する能力を維持しうる任意の適切なポリペプチド構造を意味する。様々な適切な抗体フォーマットが当技術分野において知られており、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体(bispecific antibodies)、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は抗体軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、上記の任意の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント）、抗体単一可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶH、ＶHH、ＶL）、及び任意の上記の修飾物（例えば、ポリエチレングリコール若しくは他の適切なポリマーの共有結合による修飾又はヒト化ＶHH）がある。
【０２４７】
フレーズ“免疫グロブリン単一可変ドメイン（immunoglobulin single variable domain）”とは、他のＶ領域若しくはドメインとは無関係に、抗原又はエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（例えば、ＶH、ＶHH、ＶL）を意味する。抗体単一可変ドメインは、他の可変領域又は可変ドメインを有するフォーマット（例えば、ホモマルチマー(multimer)又はヘテロマルチマー）で存在することができ、この場合、抗体単一可変ドメインによる抗原結合のための他の領域又はドメインは、必要とされない（すなわち、この場合抗体単一可変ドメインは、更なる可変ドメインによる結合に無関係に抗原に結合する）。本明細書中で定義されている例示的なフォーマットには、次から選択された任意の一つ若しくは複数のものが含まれる：少なくとも（ｉ）抗体のＣＬ（カッパ又はラムダサブクラス）ドメイン；又は（ｉｉ）抗体重鎖のＣＨ１若しくはＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン；ＣＨ１及びＣＨ２を含む抗体分子、又は抗体重鎖のＣＨ２及びＣＨ３、又はＣＨ１及びＣＨ３ドメイン；抗体重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む抗体分子；又は抗体のＣＬ（カッパ若しくはラムダサブクラス）ドメインと結合した任意のサブセット（ii）を含む抗体分子。ヒンジ領域ドメインもまた、含むことができる。こうしたドメインの組み合わせは、例えば、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ、又はそのフラグメントなど、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、若しくはＦ（ａｂ’）2分子などの自然抗体のフォーマットを模倣することができる。当技術分野の当業者であれば、この列挙が網羅的であることを意図したものではないことに気が付くであろう。
【０２４８】
“ドメイン抗体（domain antibody）”、“ｄＡｂ”“免疫グロブリン単一可変ドメイン（immunoglobulin single variable domain）”、“単一免疫グロブリン可変ドメイン（single immunoglobulin variable domain）”、“単一抗体可変ドメイン（single antibody variable domain）”、又は“抗体単一可変ドメイン（antibody single variable domain）”は、等価である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一つの実施態様ではヒト抗体可変ドメインであるが、またげっ歯類（例えば、ＷＯ ００／２９００４に開示されているが、その内容は引用により本明細書中に全体として組み込まれる）、コモリザメ及びキャメリッド（Camelid）ＶHHｄＡｂのような他の種に起源する抗体単一可変ドメインを含む。キャメリドＶHHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグワナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、生来軽鎖が欠如した重鎖抗体を産生する。このＶHHは、当技術分野で周知の方法によってヒト化されうる。ＶHHドメインはまた、本明細書では“ナノボディ（nanobody）”と称している。
【０２４９】
“ナノボディ”（特に、ＶHH配列及び部分的ヒト化ナノボディ）は、この（一般的）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
［上記においてＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれ、フレームワーク領域１〜４を意味し、そして上記においてＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ、相補性決定領域１〜３を意味し、そして上記において、一つ若しくはそれより多いホールマーク残基は本明細書中における更なる定義の通りである］
を有するアミノ酸配列として定義することができる。特に、ナノボディはこの（一般的）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
［上記において、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれ、フレームワーク領域１〜４を意味し、そして上記においてＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ、相補性決定領域１〜３を意味し、そして上記において：ｉ）カバットナンバリングに従って、好ましくは、位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８の一つ若しくはそれより多いアミノ酸残基は、図７中に言及されているホールマーク残基から選択され；そして上記において：ｉｉ）前記アミノ酸配列は、配列番号１１５−１３６の少なくとも一つのアミノ酸配列と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、上記において、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列（配列番号１１５−１３６の配列中では、Ｘで示されている）を形成するアミノ酸残基は無視される］
を有するアミノ酸配列でありうる。
【０２５０】
“ドメイン”は、残りのタンパク質とは独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインは、個別的な機能的特性のタンパク質の働きをし、そして多くの場合には、タンパク質及び／又はドメインの残余の機能を失うことなく他のタンパク質に添加、除去又は移動することができる。“一価のドメイン”とは、本明細書中で使用される際は、付加的なドメインとは独立してその同族リガンド又は標的抗原に特異的に結合するドメインを表す。一価のドメインは、本明細書中で使用する際は、それは必ずしも抗体関連配列から構成されないという点で抗体単一可変ドメインに比較して広い。“抗体単一可変ドメイン”は、古典的抗体可変領域を特徴とする配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。それ故、一つの実施態様では、“抗体単一可変ドメイン”は、古典的な抗体可変領域と異なって、一価で特異的に抗体に結合する完全抗体可変領域である。抗体単一可変ドメインに関して、抗原、例えば、ＣＤ２８への結合は、相補性Ｖ領域を必要とせずに単一の免疫グロブリンＶ領域、例えば、抗体単一可変ドメインによって媒介される。
【０２５１】
別の実施態様では、抗体単一ドメインは、一価的に抗原に結合する改変された抗体可変領域であり、この場合、こうした改変には、例えば、一つ若しくはそれより多いＣＤＲが置換されるか、又は抗体フレームワーク領域がトランケートされているか、及び／又は以下に述べられているフィブロネクチン及びリポカリンなどの非抗体フレームワークで置き換えられるか若しくは融合される可変領域が含まれる。
【０２５２】
フレーズ“特異的に結合する（specifically binds）”とは、本明細書中で使用する際は、例えば、ビアコア(Biacore)TM表面プラズモン共鳴システム及びビアコア(Biacore)TM動力学評価ソフトウェア（例えば、バージョン２．１）を用いる表面プラズモン共鳴解析によって測定される場合に、１μＭ以下の解離定数（Ｋd）を有する、抗体可変ドメインによる抗原の結合を意味する。特異的結合の相互作用に対する親和性又はＫdは、好ましくは約５００ｎＭ以下、より好ましくは約３００ｎＭ以下である。用語“結合する（binds）”とは、本明細書中で使用する際は、“特異的に結合する（specifically binds）”と等価である。
【０２５３】
“ユニバーサルフレームワーク（universal framework）”とは、カバット（“免疫学的利益に関するタンパク質配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）”，米国保健福祉省(US Department of Health and Human Service)）によって定義されている配列で保存された抗体の領域に相当するか、又はChothia and Lesk, (1987) J. MoI. Biol. 196：910-917によって定義されているヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリー又は構造に相当する単一抗体フレームワーク配列である。高頻度可変領域（hypervariable regions）に限られる変化を介して実質的にいかなる結合特異性の誘導でも許容するものと判定されてきた、単一フレームワーク、又は一組のこうしたフレームワークの使用が、本明細書中に含まれる。従って、ライブラリ及びレパートリーによって、高頻度可変領域に限られる変化を介して実質的にいかなる結合特異性の誘導でも許容するものと判定されてきた、単一フレームワーク、又は一組のこうしたフレームワークが使用されうる。
【０２５４】
用語“投与量（dose）”とは、本明細書中で使用する際は、一度に（単位投与量）か、又は規定の時間間隔を介して２回若しくはそれより多い回数の投与で対象に投与されるリガンドの量を意味する。例えば、投与量は、一日(２４時間)（一日投与量）、２日、１週間、２週間、３週間、又は１若しくはそれより多い月の過程にわたって対象に投与される（例えば、単回投与、又は２回若しくはそれより多い回数の投与によって）リガンド（例えば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド）の量を意味しうる。投与量の間のこの間隔は、任意の所望の総計時間でありうる。
【０２５５】
用語“競合する（competes）”とは、本明細書中で言及されている際は、第一の標的のその同族の標的結合ドメインへの結合が前記同族の標的に対して特異的である第二の結合ドメインの存在下で阻害されることを意味する。例えば、標的に対するその親和性若しくは結合活性が減少されるように、結合は立体的に、例えば結合ドメインの物理的遮断又は結合ドメインの構造若しくは環境を変化させることによって阻害することができる。第一及び第二の結合ドメインの間の競合は、競合ELISA及び競合ビアコア実験（Biacore experiments）を行なうことによって解析することができる。ＷＯ ２００６０３８０２７参照。二つの抗体単一可変ドメインがＣＤ２８に結合することで互いに競合する場合、例えば、次の二つのビアコアプロトコールを用いて決定することができる。第一の方法で、抗原をセンサー表面上に固定化し、引き続いて異なった抗体単一可変ドメインの対での結合解析を行なう。この例では、第一の抗体単一可変ドメインによるチップ表面の飽和に付随する結合におけるスーパーシフトは、この二つの抗体単一可変ドメインが非重複エピトープに結合するということを示す。二つの抗体単一可変ドメインが重複するエピトープに結合した場合は、シグナルのスーパーシフトは、全く（又はごくわずかしか）観察されないであろう。
【０２５６】
第二のビアコアプロトコールでは、チップ表面上の一つの抗体単一可変ドメインを捕捉することが必要である。抗原次いで抗体単一可変ドメインがチップ表面上を通過する。結合のレベルは、チップ表面上を通過し、そして抗原に結合するためにそれ自身と競合する、固定化に使用される同一の抗体単一可変ドメインから成るコントロール(対照)と比較して決定される。シグナルの増加は、二つの抗体単一可変ドメインが競合せずに、それ故異なるエピトープに結合するということを示す。シグナル増加がないということは、二つの抗体単一可変ドメインが競合し、それ故重複するエピトープに結合することを示す。双方のビアコアプロトコールは、Ann-Christin Malmborg and Carl A. K. Borrebaeck, (1995), Biacore as a tool in antibody engineering. Journal of Immunological Methods, 183, 7-13によって述べられている。
【０２５７】
エライザ（ELISA）ベースプロトコールはまた、二つの抗体単一可変ドメインが抗原に結合する際に互いに競合するか否かを決定するのに使用することができる。第一のELISAプロトコールでは、ＶＨ抗体単一可変ドメインを、ＶＫ抗体単一可変ドメインと混和し、そして、受動的に被覆されている抗原（又はニュトラアビジン（neutavidin）被覆ELISAプレートによって捕捉されたビオチン化抗原）に結合するレベルが、適宜ＨＲＰタンパク質−Ｌ（protein-L HRP）又はＨＲＰタンパク質−Ａ（protein-A HRP）を用いて検出することにより決定された。この例では、ＶＫ抗体単一可変ドメインが検出抗体単一可変ドメインである場合、次いでＶＫ及びＶＨの双方の抗体単一可変ドメインが、ＣＤ２８の重複するエピトープに結合した場合は、それらは結合を目指して競合しており、ＶKがＨＲＰタンパク質−Ｌによって検出される量は、同一のモル濃度での非競合Ｖkコントロールと比較して減少するであろう。一般的に、競合している抗体単一可変ドメイン（この例ではＶＨ）を、検出抗体単一可変ドメインに過剰のモルで添加することになる。二つのｄ抗体単一可変ドメインが、非重複エピトープに結合した場合は、それらは競合せず、そして抗体単一可変ドメインコントロールと比較して、ELISAシグナルの減少はないことになる。同様のアプローチは、二つのＶＨ抗体単一可変ドメイン又は二つのＶＫ抗体単一可変ドメインが競合しているか否かを決定するのに使用することができる。この場合、競合する抗体単一可変ドメインは、標識される、例えば、ビオチン化されるか、あるいはＦＬＡＧタグのようなペプチドタグを含む必要がある。
【０２５８】
二つの抗体単一可変ドメインの間の競合を解析するための第二のELISAアプローチには
、一つの抗体単一可変ドメインの固定化又はELISAプレート上への受動吸着が必要である。抗原は、コーティングされた抗体単一可変ドメインによって捕捉され、次いで第二の抗体単一可変ドメインを加え、そして結合の程度を上記の記載と同様に決定する。様々なELISA競合法（直接又はビーズベース）が文献中に存在し、例えば、以下のものである： Ju-Won Kwak and Chang-Soon Yoon, (1996), Journal of Immunological Methods 191, 49-54, and by Xiao-Chi Jia, et al., (2004), Journal of Immunological Methods 288, 91- 98によって記載されている。
【０２５９】
フローサイトメトリープロトコール（Flow cytometry protocols）もまた、競合／非競合抗体単一可変ドメインが組み換え型抗原でコーティングされた細胞又はビーズに結合する程度をフローサイトメトリーによって決定するということを除いて、ELISA法の場合に述べられているのと同様な方法で二つの抗体単一可変ドメインの間での競合を解析するために使用することができる（Reed DS, et al., (2002), Cytometry, 49(1), 1-7参照、 及びSai A. Patibandla, et al., (1997), The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 82(6), 1885-1893参照）。
【０２６０】
結晶構造解析（Crystallography）もまた、二つの抗体単一可変ドメイン間の競合を解析するため用いることができ：例えば、ＣＤ２８共結晶（co-crystal）を加えてＣＤ２８抗体単一可変ドメインを形成する。
【０２６１】
本明細書中に開示されている配列に類似（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性を有する）の配列はまた、本明細書中に含まれる。いくつかの実施態様では、アミノ酸レベルでのこの配列同一性は、約５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上でありうる。核酸レベルでは、この配列同一性は、約５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上でありうる。この核酸は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製されているか、若しくは実質的に純粋な形で存在しうる。
【０２６２】
用語“実質的同一性（substantial identity）”又は“パーセント同一性（percent identity）”とは、例えば、デフォルトギャップウェイトを用いるprograms GAP又はBESTFITによって、最適に整列させる場合、二つのペプチド配列が、少なくとも５０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも６５、７０、７５、８０、８５又は９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性又はそれ以上（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。あるいは、ソフトウエアAlignXTM、ベクター NTI Suite 8.0 (InforMax、 Inc.）のコンポーネントが使用しうる。整列は、Clustal W algorithm（Nucleic Acid Research, 22 (22): 4673-4680, 1994）を用いて作り出される。基本マルチプルアラインメントアルゴリズムは、三つの主要なステージから成る：１）すべての対配列は、配列の各対の発散を付与する距離行列（distance matrix）を算出するために別々に整列される；２）ガイドツリー（guide tree）は、距離行列から算出される；３）配列は、ガイドトリー中の分岐順（branching order）に従って前進的に整列させた。それ故、“パリティズアラインメント（Parities alignment）”と呼ばれているすべての対配列の間の粗類似性が算出される。次いでこうしたスコア（scores）は、“ガイドツリー（guide tree）”又は樹状図（dendrogram）を算出するのに用いられ、これはマルチプルアラインメントステージに順番を教示し、上記において最終的なマルチプルアラインメントの配列が整列される。樹状図を算出すると、この配列は、ますます大きな群に整列され、その後全配列が最終のアラインメント中に組み込まれる。二つの配列間の“同一性（identity）”の算出は、次のようになされる：配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップ(gaps)は、最適なアラインメントのための第一及び第二のアミノ酸、又は核酸配列の一つ又は双方の中に導入することができ、そして非同一の配列は比較目的のためには無視されうる）。一つの実施態様では、アミノ酸及び核酸配列の同一性の算出は、ソフトウエアAlignXを用いて決定される。
【０２６３】
アラインＸ(AlignX)のためのペアワイズアラインメント(pairwise alignment)セッティングは次の通りにセットされた：
【表１】
2012507260.tif 000003
【０２６４】
アラインＸ(AlignX)のためのマルチプルアラインメント(multiple alignment)セッティングは次の通りにセットされる：
【表２】
2012507260.tif 000004
【０２６５】
より一般的な実施態様では、比較目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一の配列中の位置が、第二の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸又はヌクレオチドによって占められている場合には、この分子はその位置で同一である。二つの配列の間のパーセント同一性は、ギャップ（gap）の数、及びそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列によって分配されている同一の位置の数の関数（function）であり、これは二つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある。本明細書中で定義されているアミノ酸及びヌクレオチド配列アラインメント及び同一性はまた、algorithm BLAST 2 Sequencesを用い、デフォルトパラメーター（default parameters）を用いて準備し、そして決定することができる（Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999））。
【０２６６】
一つの実施態様では、ヒト免疫グロブリン単一可変ドメイン又は抗体単一可変ドメインは、自然発生のヒト免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して、少なくとも７０％のアミノ酸同一性（例えば、７１％、７３％、７５％、７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上の同一性を含む）を有する。一つの実施態様では、ヒト抗体単一可変ドメインは、自然発生のヒト抗体単一可変ドメイン配列、例えば、自然発生のカバットに開示されているヒト抗体単一可変ドメイン配列に対して、少なくとも８５％のアミノ酸類似性又は同一性（例えば、７１％、７３％、７５％、７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％又はそれ以上の同一性を含む）を有する(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, U.S. Department of Health and Human Services, 1991)。
【０２６７】
抗体単一可変ドメインは、抗体定常領域を欠いている。しかしながら、一つ若しくはそれより多い、又はあらゆる抗体定常領域は抗体単一可変ドメインに融合することができる。あるいは、抗体単一可変ドメイン及び他のタンパク質若しくはポリペプチドを含む融合タンパク質は、本明細書中に包含される。
【０２６８】
抗体単一可変ドメインの抗体可変ドメインは改変することができる。改変された抗体単一可変ドメインは、５００ｎＭ以下（例えば、４５０ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３５０ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下）の解離定数を維持し、そして全長ドメインの標的抗原特異性を維持する。必要に応じて、又は判断に迷う場合には、Kabatらが説明しているナンバリングの協定及び範囲（numbering convention and boundaries）（Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.）が、本明細書中で言及されている免疫グロブリン可変及び定常ドメインに適用される。
【０２６９】
抗体単一可変ドメインは、一つの実施態様では、ヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（例えば、ＷＯ ００／２９００４に開示されているが、その内容は引用により全体として組み込まれる）、コモリザメ及びキャメリッド（Camelid）などの他の種に起源する抗体単一可変ドメインを含む。キャメリドＶHHｄＡｂｓは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグワナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、生来軽鎖が欠如した重鎖抗体を産生する。このＶHHはヒト化されうる。
【０２７０】
用語“ヒト（human）”とは、本明細書中で使用されている際は、抗体単一可変ドメイン又は免疫グロブリン単一可変ドメインに適用されている場合に、このポリペプチドがヒト免疫グロブリン配列由来の配列を有することを意味する。配列が、ａ）ヒト個体から、又はヒト個体に由来する細胞又は細胞株から単離されるか；ｂ）ヒト抗体遺伝子配列のライブラリ（又はヒト抗体Ｖドメイン配列のライブラリ）から単離されるか；又は、ｃ）クローン化されたヒト抗体配列［又はクローン化されたヒトＶ領域配列（例えば、生殖細胞系列Ｖ遺伝子断片を含む）］が、その後所望の標的抗原に結合する場合に選択された一つ若しくはそれより多い様々な配列を生み出すのに使用された時のいずれかである場合に、配列はヒト免疫グロブリンコード配列に“由来する（derived from）”ことになる。
【０２７１】
キャメリド抗体は、例えば、米国特許第５，７５９，８０８号；同第５，８００，９８８号；同第５，８４０，５２６号；同第５，８７４，５４１号；同第６，００５，０７９号；及び同第６，０１５，６９５号［これらの内容は、全体として本明細書中に組み込まれる］中に記載されている。本明細書中で説明されているキャメリドＶHH抗体単一可変ドメインポリペプチドには、ヒト様配列を有するキャメリド抗体単一可変ドメインポリペプチドの部類が含まれるが、上記においてこの部類は、ＶHHドメインが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、又はグルタミンから選ばれるアミノ酸を、位置４５で、例えば、Ｌ４５で持っており、そしてカバットナンバリング（Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.）に従って位置１０３にトリプトファンを更に含むことが特徴である。一つの実施態様では、このＶHHは、グリシンを位置４４で有しており、そして場合により、また、アルギニン、リシン、システイン又は荷電アミノ酸を位置４５に有していることもある。ヒト化キャメリドＶHHポリペプチドは、例えば、ＷＯ ０４／０４１８６２号に教示されているが、この教示は、全体として本明細書中に組み込まれる。自然発生のキャメリド抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＷＯ ０４／０４１８６２号の教示に従って改変し（例えば、位置４５及び１０３でのアミノ酸の置換）、ヒト化キャメリドＶHHポリペプチドを作り出すことができることは、当技術分野の当業者によって理解されるところである。また、コモリザメ（nurse shark）ＶHHである抗体単一可変ドメインポリペプチドが本明細書中に含まれる。コモリザメｄＡｂsは、生来軽鎖が欠如している重鎖抗体を含む、コモリザメ由来の抗体単一可変ドメインポリペプチドである。コモリザメ単一可変ドメインは、例えば、Greenberg et al. (Nature 374:168-173, 1995）及び米国特許出願公開番号第２００５００４３５１９号に記載されている。
【０２７２】
用語“エピトープ(epitope)”とは、本明細書中で使用する際は、免疫グロブリンＶH／ＶL対(pair)によって通常の方法で結合された抗原の構造単位を意味する。エピトープは、抗体に対する最小結合部位を定義し、従って抗体の特異性の標的を表す。エピトープは、直線状であってもよいし、あるいは立体配座(conformational)であってもよく、そして３個のアミノ酸のように小さくてもよい。抗体単一可変ドメインの場合には、エピトープは、単一可変ドメインによって単独で結合する構造ユニットを表す。すなわち、一つのエピトープは、一つの免疫グロブリン単一可変ドメインによって提供される結合部位である。
【０２７３】
用語“持続放出（extended release）”、又は同義語“制御放出（controlled release）”又は“徐放性（slow release）”とは、本明細書中で使用される際は、ポリペプチド薬物などの活性薬物を、個体に投与後一定の期間にわたって、放出する薬物製剤を意味する。薬物製剤によって左右される所望の時間範囲、例えば、分、時間、日、週、又はそれ以上にわたって発生することができるポリペプチド薬物の持続放出は、実質的に全投与単位が血流を介する速やかな吸収か、又は速やかな分配のために利用可能である標準的な製剤とは対照的である。好ましい持続放出製剤は、単回投与で、例えば、８時間以上、１２時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、又は、それどころか、例えば、１週間又は２週間以上、例えば、１ヶ月以上、維持させるの薬物循環のレベルに帰着する。
【０２７４】
“ＣＤ２８活性（CD28 activity）”とは、本明細書中で使用される際は、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６がＣＤ２８に結合することが必要である活性か、又はＣＤ８０及び／又はＣＤ８６がＣＤ２８に結合することから生じる活性であり、ＣＤ２８介在性Ｔ細胞シグナリングの活性化を含むが、これに限定されない。ＣＤ２８活性はまた、Ｔ細胞の増殖を誘導し、そしてＴ細胞によるサイトカイン分泌、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）を誘導することを含み、このことは当技術分野の当業者に周知の方法によってアッセイすることができる。
【０２７５】
用語“実質的にアゴナイズしない（does not substantially agonize）”とは、本明細書中で使用される際は、所定の作用剤、例えば、抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインが、用語“活性化する（activate）”が本明細書中で定義されているように一つ若しくはそれより多いＣＤ２８介在性活性を活性化しないことを意味する。具体的には、“実質的にアゴナイズしない”作用剤とは、この作用剤が、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６がＣＤ２８に結合することによって活性化される活性を、２０％を超えて活性化しないことを意味し、そして一側面では、この作用剤はＣＤ８０及び／又はＣＤ８６がＣＤ２８に結合することによって媒介される活性の１０％、８％、５％、３％若しくは２％を超えて活性化しない（無活性化を含む）。非限定的例を通して、実質的にＣＤ２８活性をアゴナイズしない、本明細書中で説明している抗ＣＤ２８一価ポリペプチドドメインは、それがＣＤ２８活性を、抗ＣＤ２８ｍＡｂ９．３(Gibson, et al. (1996) JBC, 271:7079-7083)によるＣＤ２８活性のアゴニズム（agonism）で［ほかの点では同一のアッセイ条件のもとで］得られたＣＤ２８介在性活性の５％より多くまでアゴナイズさせないことを意味する。
【０２７６】
用語“阻害する（inhibit）”、“阻害する（inhibits）”及び“阻害された（inhibited）”、又は“防止（予防）する（prevent）”とは、本明細書中で使用する際は、基準と比較して少なくとも１０％の、所定の測定可能な活性（例えば、結合活性）のレベルの減少か、又は、所定の測定可能な活性（例えば、結合活性）のレベルを減少させることを意味する。阻害が所望される場合は、こうした阻害は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上であり、最高１００％まで、及び１００％、すなわち、所定の活性の完全な阻害又は不存在を含んでいる。ＣＤ２８がＣＤ８０又はＣＤ８６に結合することを阻害することは、本明細書の実施例中の記載と同様に測定することができる。用語“実質的に阻害する（substantially inhibits）”とは、本明細書中で使用する際は、所定の測定可能な活性（例えば、ＣＤ２８のＣＤ８０又はＣＤ８６への結合）が、基準と比較して少なくとも５０％の減少があることを意味する。例えば、“実質的に阻害する”とは、基準と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び最高１００％まで、並びに１００％を含む、所与の測定可能な活性の減少を意味する。ＣＤ２８抗体単一可変ドメインのＣＤ２８への結合、ＣＤ８０のＣＤ２８への結合、及び／又はＣＤ８６のＣＤ２８への結合に関して、“結合を阻害する（inhibits the binding）”とは、本明細書中で使用する際は、その不存在と比較してＣＤ２８抗体単一可変ドメインの存在下で、少なくとも１０％、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６のＣＤ２８への結合が減少することを意味する。“結合を阻害する（inhibits the binding）”とは、基準と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上、最高１００％まで及び１００％を含む、結合の減少を意味する。“結合を防止する（prevents the binding）”とは、基準と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上、最高１００％まで及び１００％を含む、結合のレベルの減少を意味する。
【０２７７】
この発明の文脈において、“調節する（modulating）”又は“調節する（to modulate）”とは、通例、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的｛特に、Ｂ７：ＣＤ２８のスーパーファミリー（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ＲＰ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ−３及びＢ７×［“ＡＰＣ標的”］並びにそれらの受容体ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｉ、ＢＴＬＡ及びＴＥｖｌ−３［“Ｔ細胞標的”］）に属する標的［これは適切なインビトロ、細胞又はインビボアッセイ（例えば、本明細書中で言及されているもの）を用いて測定される］｝の活性を減少させるか、又は阻害するか、あるいはその代わりにその活性を増加させることを意味する。特に、“調節する（modulating）”又は“調節する（to modulate）”は、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的｛特に、Ｂ７：ＣＤ２８のスーパーファミリー（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ＲＰ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ−３及びＢ７×［“ＡＰＣ標的”］並びにそれらの受容体ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｉ、ＢＴＬＡ及びＴＩＭ−３［“Ｔ細胞標的”］）に属する標的［これは適切なインビトロ、細胞又はインビボアッセイ（例えば、本明細書中で言及されているもの）を用いて測定される］｝の活性を、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的｛特に、Ｂ７：ＣＤ２８スーパーファミリー（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ＲＰ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ−３及びＢ７×［“ＡＰＣ標的”］並びにそれらの受容体ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｉ、ＢＴＬＡ及びＴＩＭ−３［“Ｔ細胞標的”］）に属する標的［これは、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの存在を除いて同一条件のもとでの同一のアッセイである］｝の活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは、少なくとも１０％又は少なくとも２５％のような少なくとも５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％若しくはそれ以上、減少させるか、又は阻害するか、あるいはその代わりにその活性を増加させることを意味しうる。このことは当業者には明確なところであるが、“調節する（modulating）”はまた、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの存在を除いて同一の条件である場合と比較して、一つ若しくはそれより多い標的、リガンド、受容体又は基質のために、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的｛特に、Ｂ７：ＣＤ２８スーパーファミリー（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ＲＰ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ−３及びＢ７×［“ＡＰＣ標的”］並びにそれらの受容体ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｉ、ＢＴＬＡ及びＴＩＭ−３［“Ｔ細胞標的”］）に属する標的｝の親和性、結合活性、特異性及び／又は選択性の改変（これは増加であっても、又は減少であってもよい）を行うことを伴っていてもよく；及び／又は、一つ若しくはそれより多い培地又は周辺の条件〈こうした場合においては、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的｛特に、Ｂ７：ＣＤ２８スーパーファミリー（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ＲＰ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ−３及びＢ７×［“ＡＰＣ標的”］並びにそれらの受容体ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｉ、ＢＴＬＡ���びＴＥＶ１−３［“Ｔ細胞標的”］）に属する標的｝が存在する（例えば、ｐＨ、イオン強度、補助因子(co-factor)の存在など）〉のためにＡＰＣ標的又はＴ細胞標的｛特に、Ｂ７：ＣＤ２８スーパーファミリー（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ＲＰ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ−３及びＢ７×［“ＡＰＣ標的”］並びにそれらの受容体、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｉ、ＢＴＬＡ及びＴＩＭ−３［“Ｔ細胞標的”］）に属する標的｝の刺激感応性の改変（これは増加であっても、又は減少であってもよい）を行なうことを伴っていてもよい。このことは当業者には明確なところであるが、こうしたことは、本明細書中で述べられているか、又は本明細書中で引用されている先行技術のアッセイのような任意の適切な方法で、及び／又は、任意の適切なそれ自体知られているアッセイを用いて再度決定してもよい。“調節する（Modulating）”とはまた、一つ若しくはそれより多い生物学的又は生理学的メカニズム、作用、応答、機能、経路又は活性〈こうした場合においては、ＡＰＣ標的又はＴ細胞標的｛特に、Ｂ７：ＣＤ２８スーパーファミリー（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ＲＰ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ−３及びＢ７×［“ＡＰＣ標的”］並びにそれらの受容体ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｉ、ＢＴＬＡ及びＴＩＭ−３［“Ｔ細胞標的”］に属する標的）、（又はこうした場合においては、そのシグナリング経路又は代謝経路及びそれらの関連する生物学的若しくは生理学的作用などのその基質、リガンド、受容体又は経路が関与している）｝が関与している〉に関する変換（すなわち、それぞれ、アゴニストとしての、又はアンタゴニストとしての活性）を行なうことを意味してもよい。この場合もまた、当業者には明確なところであるが、アゴニスト又はアンタゴニストのような作用は、任意の適切な方法で、及び／又は、本明細書中で、又は本明細書中で引用されている先行技術中で述べられているアッセイのような、それ自体知られている任意の適切なアッセイ（インビトロ及び通例細胞又はアッセイで）を用いて決定されてもよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストのような作用が、意図している生物学的又は生理学的活性が、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの存在を除いて同一の条件のもとでの同一のアッセイである場合の生物学的若しくは生理学的活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは、例えば、少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％のように少なくとも５％、例えば、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％若しくはそれ以上、それぞれ、増加しているとしても、又は減少してもよい。
【０２７８】
“上記において、抗体単一可変ドメインは、ＣＤ８０によるＣＤ２８への結合と比較して、ＣＤ８６によるＣＤ２８への結合を選択的に阻害する”のようなフレーズ中で使用されている用語“選択的に阻害する（preferentially inhibits）”とは、本明細書中で使用する際は、抗体単一可変ドメインが、上記に明確にされているＣＤ８０がＣＤ２８に結合する阻害程度と比較して、上記に明確にされているＣＤ８６がＣＤ２８に結合する阻害がより高い程度で行なわれるということを意味する。
【０２７９】
用語“活性化する（activate）”、“活性化する（activates）”及び“活性化された（activated）”とは、本明細書中で使用する際は、所定の測定可能な活性の、基準と比較して少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は、それどころか１００％又はそれ以上の増加を意味する。
【０２８０】
用語“ＣＤ２８アンタゴニスト（CD28 antagonist）”とは、本明細書中で使用する際は、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６がＣＤ２８に結合することを阻害することによって、ＣＤ２８によって媒介される少なくとも一つの活性を阻害する作用剤を意味する。ＣＤ２８の活性は、その活性が、アンタゴニスト不存在下での活性と比較して、アンタゴニストの存在下で、少なくとも１０％、そして例示的な実施態様では、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、又はそれどころか１００％（すなわち、無活性）減少される場合に、“拮抗される（antagonized）”。例示的な実施態様では、ＣＤ２８アンタゴニストは、この用語が本明細書中で使用されている場合には、一価でＣＤ２８に結合する抗体単一可変ドメインを含む。非限定的な例を通して、本明細書中で示されているＣＤ２８アンタゴニストは、一部又は全ＣＤ２８活性を阻害する作用剤であり、他方では同時に、この作用剤は、ＣＤ２８によって介在されるＴ細胞受容体シグナリング活性を実質的にアゴナイズさせない。
【０２８１】
用語“ＣＤ２８アゴニスト（CD28 agonist）”とは、本明細書中で使用する際は、基準と比較して、単独又は別の共刺激剤と組みあわせる場合に、ＣＤ２８によって媒介される少なくとも一つの活性を活性化させる作用剤を意味する。活性は、その活性が、アゴニストが不在である場合と比較して、その存在下で、少なくとも１０％、例えば、５０％増加する場合に“アゴナイズされる(agonized)”。
【０２８２】
用語“ＣＴＬＡ４”活性は、本明細書中で使用する際は、Ｔ細胞機能の阻害を含むがそれに限定されない。こうした機能は、とりわけＴ細胞受容体によって介在されるシグナリング、Ｔ細胞増殖、及びサイトカイン分泌の誘導を含む。
【０２８３】
“免疫疾患（immune disease）”とは、本明細書中で使用する際は、細胞及び／又は体液性免疫反応を含む個体の免疫反応の進行に関連するいかなる疾患をも意味する。免疫疾患の例には、炎症、アレルギー、移植、関節炎及び自己免疫疾患が含まれるが、それらには限定されない。
【０２８４】
“自己免疫疾患（autoimmune disease）”とは、本明細書中で使用する際は、個体の免疫応答が個体自身の構成要素に対して向けられている病態及び状態を意味し、その結果望ましくない、そしてしばしば衰弱していく状態をもたらす。“自己免疫疾患（autoimmune
disease）”とは、本明細書中で使用する際は、自己免疫状態、症候群などを更に含むことを意図している。自己免疫疾患には、アジソン病、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫肝炎、クローン病、糖尿病（１型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、男性不妊、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、及び血管炎が含まれるが、これらには限定されない。自己免疫介在性状態にはまた、侵された組織が一次標的であり、そしていくつかの場合は、二次標的である状態が含まれるが、それには限定されない。こうした状態には、エイズ（ＡＩＤＳ）、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、ハンセン病、統合失調症、遺伝性うつ病、組織及び臓器移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、自閉症、てんかん、アルツス現象、アナフィラキシー、並びにアルコール及び薬物耽溺が含まれるが、それらには限定されない。
【０２８５】
用語“一価(monovalent)”とは、本明細書中で使用する際は、所与の抗体単一可変ポリペプチドドメイン、ＣＤ２８結合体（CD28 binder）、ＣＤ２８アンタゴニスト、ＣＤ２８結合ポリペプチド又はＣＤ２８結合ドメイン又はモイエティ(moiety)が、その標的の単一分子にのみに結合することができることを意味する。一般的に、天然起源の抗体は、これらが２つの官能性抗原結合アーム(arms)を有し、それぞれのアームは、ＶＨ及びＶＬドメインを含むという点で、“二価（divalent）”である。立体障害が問題とならない場合は、二価抗体は、同一の抗原の２つの別の分子と結合することができる。対照的に、“一価”抗体は、ただ一つのこうした抗原分子と結合する能力を有するにすぎない。抗体単一可変ドメイン、例えば、ＶH又はＶLドメインは、それぞれ対応するＶL又はＶHドメインを必要とせずにＣＤ２８のような抗原に結合する能力を有する。抗体単一可変ドメインでは、単一抗原の分子にクロスリンク(cross link)する能力が欠如している。
【０２８６】
用語“ＶHドメイン(VH domain)”及び“ＶLドメイン(VL domain)”とは、本明細書中で使用する際は、例えば、Kabatら（Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.）［引用によって本明細書中に組み込まれる］によって一般的に定義されている抗体可変領域を意味する。
【０２８７】
“結合（連結）される(linked）”とは、本明細書中で使用する際は、例えば、ＰＥＧであるポリマーモイエティを抗体単一可変ドメインのアミノ酸残基に結合させることを意味する。ＰＥＧポリマーを抗体単一可変ドメインのアミノ酸残基、例えば、抗ＣＤ２８ｄＡｂに結合させることは、“ＰＥＧ化（PEGylation）”と称され、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、スクシンイミジルプロピオナート（ＳＰＡ）、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン（ＶＳ）、又はチオールを含む［これらには限定されない］、いくつかのＰＥＧ結合モイエティを用いて達成することができる。ＰＥＧポリマー、又は他のポリマーは、所定の位置で抗体単一可変ドメインに結合されうるか、又は、この抗体単一可変ドメイン分子に任意に結合されうる。しかしながら、ＰＥＧポリマーは、所定の位置で抗体単一可変ドメインに結合されることが好ましい。ＰＥＧポリマーは、抗体単一可変ドメインの中の任意の残基に結合されてもよいが、このポリマーは、抗体単一可変ドメイン中で自然発生であるか、又は、この抗体単一可変ドメイン内に遺伝子工学的に操作された［例えば、抗体単一可変ドメイン中の自然発生の残基のシステイン又はリシンへの突然変異による］、リシン又はシステインに結合させることが好ましい。ＰＥＧ結合はまた、抗体単一可変ドメインに結合されたペプチドリンカーを通じて媒介されうる。すなわち、このＰＥＧモイエティは、抗体単一可変ドメインに融合されるペプチドリンカーに結合することができ、上記において、このリンカーは、ＰＥＧ結合のための部位、例えば、遊離システイン又はリシンを提供する。“結合される（linked）”とはまた、本明細書中で使用される際は、二つ若しくはそれより多い抗体単一可変ドメイン、例えば、ｄＡｂモノマーが会合（association）して、ダイマー(dimer)、トリマー(trimer)、テトラマー(tetramer)、又はその他のマルチマー(multimer)を形成することを意味する。抗体単一可変ドメインモノマーは、結合して当技術分野で知られているいくつかの方法によって多量体を形成することができ、これには融合タンパク質としての抗体単一可変ドメインモノマーの発現、モノマー間のペプチドリンカーを介する二つ若しくはそれより多いモノマーの結合(linkage)、あるいは、翻訳後にモノマーを、直接互いに、又はジスルフィド結合によるリンカーを介して化学的結合によるか、又は、二価、三価あるいは多価結合モイエティ（例えば、マルチアーム（multi-arm）ＰＥＧ））への結合によることが含まれるが、これに限定されることはない。本明細書中、例えば、デュアル又はマルチ特異的抗体単一可変ドメインコンストラクトに関連してｄＡｂ多量体が具体的に意図される間、任意の所与の抗体単一可変ドメインコンストラクトの場合、このコンストラクトは、もっぱらＣＤ２８の一つの分子に結合できることに限られ、すなわちこのコンストラクトは、たった一つのＣＤ２８結合エレメントを有することができ、そしてＣＤ２８にクロスリンクすることはできないことが強調される。
【０２８８】
“ポリマー（polymer）”とは、本明細書中で使用する際は、繰返しモノマー単位から構成される巨大分子を意味し、また場合により置換されていることもある直鎖又は分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン、又はポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝状又は非分枝状多糖類などの合成又は自然発生ポリマーを意味することができる。本明細書中で使用されている“ポリマー（polymer）”は、具体的には、場合により置換されていることもあるか、又は分枝鎖であるポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、又はポリ（ビニルアルコール）、及びその誘導体を意味する。
【０２８９】
“ＰＥＧ、”又は“ＰＥＧポリマー（PEG polymer）”とは、本明細書中で使用する際は、ポリエチレングリコール意味し、そしてより具体的にはＰＥＧの誘導体化形態を意味することができ、これにはスクシンイミジルプロピオナートのようなＰＥＧのＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、ベンゾトリアゾール活性エステル、マレイミド、ビニルスルホン、又はチオール基で誘導体化されたＰＥＧを含むが、これに限定されることはない。例えば、ＰＥＧ製剤には、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ2−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ2−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ2ＣＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ2−ＮＨＳ；ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨＳ；及びＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ2−ＮＨＳ［ここで、Ｒは（ＣＨ2）4）ＮＨＣＯ2（ｍＰＥＧ）である］を含むことができる。本明細書中で説明しているＰＥＧポリマーは、線状分子であってもよく、又は複数のＰＥＧモイエティが単一ポリマー内に存在するように分枝化されていてもよい。いくつかの特に好ましいＰＥＧコンフォメーションには、下記のものが含まれるが、これに限定されることはない。
【０２９０】
【化１】
2012507260.tif 000005
【０２９１】
“スルフヒドリル選択性試薬(sulfhydryl-selective reagent)”とは、本明細書中で使用される際は、ＰＥＧポリマーがチオール含有アミノ酸に結合するのに有用な試薬である。アミノ酸残基システイン上のチオール基は、スルフヒドリル選択性試薬との相互作用において特に有用である。こうした結合に有用なスルフヒドリル選択性試薬には、マレイミド、ビニルスルホン及びチオールが含まれるが、これに限定されることはない。システイン残基とのカップリングのためのスルフヒドリル選択性試薬の使用は当分野において知られており、必要に応じて適合させることができる（例えば、Zalipsky, 1995, Bioconjug. Chem. 6：150；Greenwald et al., 2000, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17：101；Herman et al., 1994, Macromol. Chem. Phys. 195：203参照）。
【０２９２】
ＰＥＧ又は別の試薬、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の、本明細書中に述べられている抗体単一可変ドメイン、あるいは免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドへの結合は、例示的な実施態様では、この抗体単一可変ドメインがＣＤ２８に特異的に結合する能力を害することはないはずである。すなわち、ＰＥＧ結合(PEG-linked)抗体単一可変ドメイン又は免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドは、非ＰＥＧ結合の対応物と比較してその結合活性を保持するものである。“活性を保持する（retains activity）”とは、本明細書中で使用されている際は、非ＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインの活性レ
ベルの少なくとも１０％である、ＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインの活性レベルを意味し、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、及び９０％までを含み、同一の抗原結合ドメイン又はドメイン（複数）を含む非ＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインの活性の９５％、９８％まで、そして、１００％までを含む。より詳細には、非ＰＥＧ結合抗体可変ドメインと比較してＰＥＧ結合抗体単一ドメインの活性は、抗体単一可変ドメインのモル基準で決定されなければならない；すなわち、それぞれ、等価のモル数のＰＥＧ結合及び非ＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインを各試験において用いるべきである。特定のＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインが“活性を保持する”か否かを決定する際は、好ましくは、ＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインの活性は、ＰＥＧの不在下で、同一の抗体単一可変ドメインの活性と比較するべきである。
【０２９３】
用語“インビボ半減期（in vivo half-life）”とは、本明細書中で使用されている際は、ＣＤ２８アンタゴニスト及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は抗体単一可変ドメインの血清濃度がインビボで、例えば、自然メカニズムによる分解、及び／又はクリアランス又は隔離（sequestration）によって、５０％減少するに必要とする時間を意味する。本明細書中に述べられている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメイン又は免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドは、インビボにおいて安定化することができ、これらの半減期は、分解、及び／又はクリアランス又は隔離に抵抗する分子、例えば、ＰＥＧへの結合によって増加させることができる。抗体単一可変ドメインの半減期は、その官能性活性がインビボおいて、ＰＥＧポリマーに結合していない類似の抗体単一可変ドメインと比較してより長い期間の間持続する場合には増加する。通例、ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインの半減期は、非ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上増加する。２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、又はそれ以上の範囲の半減期の増加が可能である。代替的に、又はこれに加えて、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又は１５０倍までの範囲の半減期の増加が可能である。本明細書中で説明されているように、ＰＥＧ結合抗体単一可変ドメインは、１〜１００時間を含み、更に３０〜１００時間を含み、そしてこれに加えて更に、５０〜１００時間、及び１７０、１８０、１９０時間まで、及び２００時間又はそれ以上までを含む、０．２５〜２週間の半減期を有する。
【０２９４】
ＰＥＧ又は他のポリマー結合抗体単一可変ドメインモノマー又はマルチマー(multimer)に関して、“分解に抵抗性がある(resistant to degradation) ”、又は“分解に抵抗する(resists degradation)”とは、本明細書中で使用される際は、ＰＥＧ−、又は他のポリマー結合抗体単一可変ドメインモノマー又はマルチマーが、ｐＨ２．０で３０分間、ペプシンに曝された場合にわずかに１０％だけ分解され、一側面では、全く分解されないことを意味する。
【０２９５】
“流体力学的サイズ（hydrodynamic size）”とは、本明細書中で使用される際は、水溶液による分子の拡散に基づいた分子（例えば、タンパク質分子）の見かけのサイズを意味する。溶液によるタンパク質の拡散又は運動は、プロセシングしてこのタンパク質の見かけのサイズを誘導することができるが、上記においては、このサイズは、タンパク質粒子の“ストークス半径（Stokes radius）”又は“流体力学的半径（hydrodynamic radius）”で与えられる。このタンパク質の“流体力学的サイズ”は、質量及び形状（コンフォメーション（conformation））の双方に左右され、その結果、同一の分子質量を有する二つのタンパク質は、タンパク質の全体のコンフォメーションに基づいた異なる流体力学的サイズを有することができる。流体力学的サイズは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定される。ＰＥＧ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、抗体単一可変ドメイン（本明細書中に述べられている抗体可変ドメインマルチマーを含む）、又は前記抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドの流体力学的サイズは、２４ｋＤａ〜５００ｋＤａ；３０〜５００ｋＤａ；４０〜５００ｋＤａ；５０〜５００ｋＤａ；１００〜５００ｋＤａ；１５０〜５００ｋＤａ；２００〜５００ｋＤａ；２５０〜５００ｋＤａ；３００〜５００ｋＤａ；３５０〜５００ｋＤａ；４００〜５００ｋＤａ、及び４５０〜５００ｋＤａの範囲でありうる。一側面では、ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインの流体力学的サイズは、３０〜４０ｋＤａ；７０〜８０ｋＤａ、又は２００〜３００ｋＤａである。抗体単一可変ドメインポリペプチドのイメージング適用における使用が所望される場合には、このポリペプチドは、流体力学的サイズは５０〜１００ｋＤａである必要がある。あるいは、抗体単一可変ドメインポリペプチドは治療的適用が所望される場合には、このポリペプチド製剤は、流体力学的サイズが２００ｋＤａを超えるサイズである必要がある。
【０２９６】
用語“ＩＣ50”とは、本明細書中で使用される際は、所与の活性を５０％阻害するのに必要な阻害剤の濃度を意味する。ＩＣ50は、様々な量の阻害剤（例えば、一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメイン）の存在下で、所与の活性、例えばＣＤ２８のＣＤ８０又はＣＤ８６への結合をアッセイし、阻害剤の濃度を、標的となる活性に対してプロッティングすることにより決定される。ＣＤ２８のＣＤ８０又はＣＤ８６への結合は、本明細書中の実施例で述べられている方法によって測定されている。あるいは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いることができる。
【０２９７】
用語“抗体単一可変ドメインに融合する（fused to an antibody single variable domain）”とは、本明細書中で使用される際は、ポリペプチドが、融合はタンパク質レベルで化学的に生じうるが、通例組み換えＤＮＡ手法を使用することによって、所与の抗体に融合することを意味する。すなわち、別のポリペプチド、例えば、異なる結合特異性を有する別の抗体に“融合する（fused to）”抗体は、天然には存在せず、組み換え手段を介して生成される。用語“抗体単一可変ドメインに融合する”とはまた、ポリペプチドの所与の抗体単一可変ドメインへの、例えば、ジスルフィド又は他の化学結合を介しての結合を包含し、上記において、融合ポリペプチドが抗体単一可変ドメインに融合することは天然には見出されていない。ポリペプチドを別のポリペプチドに、例えば、抗体に融合させる組み換え及び化学的方法は、当技術分野において周知である。
【０２９８】
用語“Ｆｃドメイン（Fc domain）”とは、本明細書中で使用される際は、一つ若しくはそれより多いＦｃ領域、好ましくは、Kabat et al.,（上記参照）によって画定されているＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む、抗体定常領域及びその配列を意味する。この重鎖ポリペプチドのＦｃ部分は、自己会合に対する能力、すなわち二価抗体の形成を容易にする機能を持つ。用語“Ｆｃドメインを欠如している（lacks an Fc domain）”とは、所与の抗体単一可変ドメインが、Ｆｃ含有一価抗体単一可変ドメインの二量体化（dimerization）を媒介するのに十分な免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部が欠如していることを意味する。Ｆｃ含有抗体単一可変ドメインの二量体化は、例えば、クロマトグラフィー方法により、又は表面プラズモン共鳴により測定される。Ｆｃドメインが欠如している抗体単一可変ドメインは、Ｆｃ血小板相互作用を回避し、それ故、血小板凝集の誘発を回避する。
【０２９９】
疾患の症状に関連する場合、“処置する（treat）”、“減少させる（reduce）”、“予防する（prevent）”、又は“緩和する（alleviate）”とは、本明細書中で使用される際は、臨床的に測定可能なパラメータに基づいて少なくとも１０％の症状の減少、又は、臨床的に許容されたスケールの疾患若しくは症状の重症度において、少なくとも１点の症状の減少を意味する。用語“全身性エリテマトーデスの症状（symptom(s) of systemic lupus erythematosus）”とは、本明細書中で使用される際は、当技術分野の当業者に知られている、任意のＳＬＥの臨床的に該当する症状を意味する。非限定的な例には、ＩｇＧ自己抗体（例えば、クロマチン、ｓｎＲＮＰｓ（特に、Ｕ１、Ｓｍ、Ｒｏ／ＳＳＡ及びＬａ／ＳＳＢ）、りん脂質及び細胞表面分子）の蓄積、溶血性貧血、血小板減少症、白血球減少症、糸球体腎炎、血管炎、関節炎、及び漿膜炎が含まれる。こうした症状の減少は、臨床的に測定可能なパラメータの少なくとも１０％の減少、又は、臨床的に許容されたスケールの疾患の重症度に関して少なくとも１点の減少である。
【０３００】
“包括的リガンド（generic ligand）”とは、本明細書中で使用される際は、所与のレパートリー、例えば、ファージディスプレイライブラリの中の相当な割合の機能性メンバーに結合するリガンドである。すなわち、同じ包括的リガンドは、その標的リガンド特異性とは無関係に、多数のレパートリーメンバーに結合することができる。一般的に、機能的な包括的リガンド結合部位の存在は、このレパートリーメンバーが発現され、正確に折り畳まれるということを表している。従って、包括的リガンドのその結合部位への結合は、ポリペプチドのレパートリーから機能性ポリペプチドを事前選択する（preselecting）方法を提供する。包括的リガンドには、例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ及びタンパク質Ｌが含まれる。
【０３０１】
概説
ＣＤ２８に結合する場合に一価である、抗体単一可変ドメインを含む、特異的にＣＤ２８に結合する一価のポリペプチドドメインが提供される。任意の特定の理論によって拘束されないが、ＣＤ２８結合のための一価性（monovalency）によって、先行技術の抗体で生じる、細胞表面受容体をクロスリンキング（cross-linking）する可能性が除去される。ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化の阻害に関して、ＣＤ２８の一価結合体は、ＣＤ２８によって媒介されるＴ細胞応答をアンタゴナイズさせる（antagonizing）ことに関連して、Ｔ細胞刺激を促進する細胞表面ＣＤ２８分子をクラスター形成させるＣＤ２８二量体抗体を上回るユニークな利点を有している。従って、ＣＤ２８特異的抗体単一可変ドメインの一価性は、ＣＤ２８の活性を阻害し、免疫応答を低下させ、他方、二価又は多価でＣＤ２８の結合を可能にする抗体と共に生じうる可能性のある望ましくない刺激作用を回避する。すなわち、一つの好ましい側面では、本明細書中に開示される抗ＣＤ２８抗体は、ＣＤ８０又はＣＤ８６のＣＤ２８への結合を阻害又はこの結合に拮抗するのみならず、これらはＣＤ２８活性を実質的にアゴナイズさせない。
【０３０２】
一側面では、ＣＤ２８結合の場合の一価の抗体は、ヒト抗体単一可変ドメインである。ヒト抗体単一可変ドメインは、他の種、例えば、マウスからの抗体を投与することからしばしば引き起こされる抗−抗体免疫応答を大方回避しつつ、ヒトの患者に投与することができる。
【０３０３】
上記に記載されている如く、抗体単一可変ドメインは従来の抗体とは異なる。従来の抗体の重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、抗原相互作用に直接的に参加する可変（Ｖ）領域、そして免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用における構造的支持及び機能を提供する正常（Ｃ）領域を含む。従来の抗体の抗原結合ドメインは、２つの別々のドメイン：重鎖可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖可変ドメイン（ＶL：Ｖκ又はＶλのどちらかであり得る）によって形成される。従来の抗体の抗原結合部位は、６個のポリペプチドループ：ＶHドメインから３個（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）、そしてＶLドメインから３個（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）によって形成される。インビボでは、従来の抗体のＶH及びＶLドメインをコードするＶ遺伝子の多様な一次レパートリーは、遺伝子断片のコンビナトリアル再配列によって産生される。Ｃ領域は、軽鎖Ｃ領域（ＣL領域と呼ばれる）及び重鎖Ｃ領域（ＣH１、ＣH２及びＣH３領域と呼ばれる）を含む。天然起源抗体、従来の抗体は、一般的に二つの抗原結合ドメインを含み、それ故二価である。抗体単一可変ドメインと異なって、天然起源の従来の抗体の抗原結合ドメインは、それぞれ、一緒になって協力して抗原結合ドメインを形成する重鎖及び軽鎖ポリペプチドを含む。対照的に、抗体単一可変ドメインの抗原結合ドメインでは、たった一つのドメイン、例えば、一つのペプチド又はポリペプチド鎖が必要となるに過ぎない。
【０３０４】
従来の天然起源抗体のいくつかのより小さな抗原結合フラグメントは、プロテアーゼ消化後に同定された。こうしたものには、例えば、“Ｆａｂフラグメント（Fab fragment）”（ＶL−ＣL−ＣH１−ＶH）、“Ｆａｂ’フラグメント（Ｆａｂ’fragment）”（重鎖ヒンジ領域を有するＦａｂ）及び“Ｆ（ａｂ’）2フラグメント（F(ab')2 fragment）”（重鎖ヒンジ領域によって結合されたＦａｂ’フラグメントのダイマー）が含まれる。組み換え方法は、こうしたフラグメントを作成し、そして、例えば、“一本鎖Ｆｖ（single chain Fv）”（可変フラグメント）又は“ｓｃＦｖ”と呼ばれているものである、更に小さい抗原結合フラグメント［これらは、ペプチドリンカー（ＶL−リンカー−ＶH）によって結合されるＶL及びＶHから成る］を作成するのに使用されてきた。これらは、それぞれ、２個の可変領域、すなわちＶH／ＶLダイマーを含むたった一つの抗原結合部位から構成されるので、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びｓｃＦｖフラグメントは、抗原結合の場合に一価である。
【０３０５】
用語“ｄＡｂ”は、上記に述べられている際は、単一ドメインを介して特異的に抗原に結合する抗体単一可変ドメイン（ＶH又はＶL）ポリペプチドと同意語である。抗体単一可変ドメインの調製は、本明細書中で下記に述べられ、そして例示されている。
【０３０６】
抗体単一可変ドメイン、例えば、ＶHHは、知られている最も小さな抗原結合抗体である。治療に使用する場合は、ヒト抗体が好ましいが、それは患者に投与された場合に、これらは免疫応答を引き起こす可能性がないのが主要な理由である。上記に言及されているように、分離された非キャメリドＶHドメインは、比較的不溶性である傾向があり、しばしば発現が不十分である。キャメリドＶHHをヒトの抗体のＶHドメインと比較した場合、ヒトのＶＨドメインのＶH／ＶLインターフェイスに対応するキャメリドＶHHドメインのフレームワーク領域において、いくつかの重要な違いが明らかとなる。ヒトのＶH３のこうした残基を、ＶHH配列（具体的には、Ｇｌｙ４４→Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５→Ａｒｇ、及びＴｒｐ４７→Ｇｌｙ）により密接に近似するように変異させることが、抗原結合活性を維持する、“キャメリド化された（camelized）”ヒトのＶHドメインを生成するために行なわれてきた（Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339:285-290）が、それは発現性及び溶解度を改善した。（本明細書中で使用されている可変ドメインのアミノ酸番号は、カバット（Kabat）ナンバリング規約による（Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.））。ＷＯ ０３／０３５６９４（Muyldermans）には、Ｔｒｐ１０３→Ａｒｇ変異は非キャメリッドＶHドメインの溶解度を改善することが報告されている。Davies & Riechmann(1995, Biotechnology N.Y. 13：475-479）ではまた、キャメリッド化されたヒトのＶHドメインのファージディスプレイによるレパートリーの作成、及び１００−４００ｎＭの範囲において親和性を有しているハプテンに結合するクローンの選択について報告がされているが、タンパク質抗原に結合するために選択されるクローンは、親和性については低いものであった。
【０３０７】
従来の抗体のＶH及びＶLによって形成される従来の抗原結合部位を含む一価ＣＤ２８アンタゴニストの設計のための一般的ストラティジー及び方法
ＣＤ２８に対して特異的な一価の従来の抗体を作成する手段は、当技術分野で周知である。一つの手段は、例えば、従来の抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を発現させるハイブリドーマ（例えば、マウスハイブリドーマ）から分離された重鎖、または軽鎖遺伝子配列のＶH領域及びＶL領域を増幅し、発現させることである。ＶHドメイン及びＶLドメインの境界はKabat et al.,(Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.）に詳説されている。重鎖又は軽鎖遺伝子のＶH及びＶLドメインの境界に関する情報は、ＣＤ２８に結合することが知られている従来の抗体をコードする重鎖及び軽鎖をコードしている配列に起源するＶドメインを増幅させるＰＣＲプライマーを設計するのに用いられる。増幅されたＶドメインは、適切な発現ベクター、例えば、ｐＨＥＮ−１（Hoogenboom et al.,1991, Nucleic Acids Res. 19:4133-4137）に挿入され、例えば、ｓｃＦｖ又は他の適切な一価のフォーマットのＶH及びＶLの融合体として発現される。その結果生じたポリペプチドは次いで、対になったＶH及びＶLポリペプチドによって形成された抗原結合部位によってＣＤ２８に一価で結合する高親和性の有無がスクリーニングされる。本明細書中で説明されている方法を合体させて、結合スクリーニングが、当技術分野で知られているか、又は本明細書の下記に述べられているように行なわれる。
【０３０８】
あるいは、ライブラリ・スクリーニング方法は、一価ＣＤ２８−特異的結合タンパク質を同定するのに用いることができる。ファージ・ディスプレイ手法（例えば、Smith, 1985, Science 228：1315；Scott & Smith, 1990, Science 249：386；McCafferty et al., 1990, Nature 348：552参照）によって、抗体可変領域の大きい、多様なレパートリーの中からの所望の標的に結合する抗体可変領域の選択に対するアプローチが可能となる。こうしたファージ抗体ライブラリは、二つのカテゴリーに分けられる：ヒトＢ細胞から回収される再配列されたＶ遺伝子を用いる天然ライブラリ（Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222：581；Vaughan et al., 1996, Nature Biotech., 14:309）、あるいは、生殖細胞系列Ｖ遺伝子断片若しくはその他の抗体可変領域をコードしている配列が、インビトロで‘再配列(rearranged)’されるか（Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol., 227：381；Nissim et al., 1994, EMBO J., 13：692；Griffiths et al., 1994, EMBO J., 13：3245；De Kruif et al., 1995, J. Mol. Biol., 248：97）、又は合成ＣＤＲが単一再配列Ｖ遺伝子内に組み込まれる（Barbas et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4457）合成ライブラリ。遺伝子ディスプレイ・パッケージ（例えば、ファージ・ディスプレイ、ポリソーム・ディスプレイ）が必要である方法は、一価ＣＤ２８特異的抗体コンストラクトの選択に極めて適しているが、その理由は、これらのコンストラクトが、通例、全二価抗体ではなく(rather than whole, divalent antibodies)、一価フラグメントのみをディスプレイ・パッケージ上に発現するからである。様々な抗体フラグメントをディスプレーするファージ・ディスプレイ・ライブラリの調製方法は、前述した参照文献に記載されている。こうした方法はまた、例えば、米国特許第６，６９６，２４５号に記載されている［引用により本明細書中に組み込まれる］。この‘２４５特許に記載された方法では、通例、他の領域は非ランダム化されたまま残しておきながら（下記参照）、免疫グロブリン遺伝子コード領域、特にＶH及びＶLコード領域の選択された領域のランダム化が必要である。この‘２４５特許はまた、個別的にランダム化されたＶH及びＶLドメインを含むｓｃＦｖコンストラクトの作成を記載している。
【０３０９】
抗体の構造及び配列の解析により、６個の抗原結合ループのうちの５個（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が限定された数の主鎖コンフォメーション又はカノニカル構造（canonical structures）を保有するものと示された（Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196：901；Chothia et al. (1989) Nature 342：877）。主鎖コンフォメーションは、（ｉ）抗原結合ループの長さ、及び（ｉｉ）抗原結合ループ及び抗体フレームワーク内のいくつかのキーとなる位置における特定残基、又は残基の種類によって決定される。ループ長及びキーとなる残基の解析は、大部分のヒト抗体配列によってコードされるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の主鎖コンフォメーションの予測を可能にしてきた（Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227：799；Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14：4628；Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264：220）。Ｈ３領域は、配列、長さ及び構造面でより一層多様であるが（Ｄ断片の使用によって）、これはまた、ループ及び抗体フレームワーク内のキーとなる位置での特定残基の長さ及び存在、又は残基の種類に左右される、限定された数のループ長短縮のための主鎖コンフォメーションを形成する（Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263：800；Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399：1）。
【０３１０】
一つのアプローチでは、多様性は、様々な抗原結合ループのＣＤＲ中の任意の部位で合成レパートリーに添加されうるが、このアプローチでは、適切に折り畳まれなくなり、それ故、抗原に結合するポテンシャルを有する分子がより低い割合になる一因となる、相当な割合のＶドメインを生じさせる。抗原結合ループの主鎖コンフォメーションの一因となる残基の理解は、特定残基を同定することが、ＶH又はＶLドメインの合成レパートリー中で多様化することを可能とする。すなわち、多様性は、主鎖コンフォメーションを維持するのに必須ではない残基にも最もよく取り入れられる。一例として、ループＬ２の多様化の場合には、従来のアプローチでは、Kabat et al.（Kabat et al., 1991, Sequences of
Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington,
D.C.）によって定義されている、対応するＣＤＲ（ＣＤＲ２）において残基のすべて、およそ７個の残基を多様化させるであろう。しかしながら、Ｌ２の場合では、位置５０及び位置５３は、天然起源抗体で多様であり、抗原と接触をすることが観察されることが知られている。好ましいアプローチは、このループ内のこうした二つの残基のみを多様化させることである。このことは、種々の抗原結合特異性を創成させるのに必要な機能的多様性の面での顕著な改善を表す。
【０３１１】
免疫グロブリンポリペプチドライブラリは、所定の可変ドメイン主鎖コンフォメーションに基づいて有利に設計することができる。こうしたライブラリは、国際特許出願ＷＯ ９９／２０７４９号［その内容は引用により本明細書中に組み込まれる］に記載されるように構築することができる。こうした可変領域ポリペプチドは、ｓｃＦｖ又はＦａｂの産生に使用することができ、このｓｃＦｖ又はＦａｂは、例えば、（ｉ）生殖細胞系列ＶH断片 ＤＰ−４７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶH）、又はその抗原結合フラグメント、及び（ｉｉ）生殖細胞系列Ｖκ断片 ＤＰＫ９のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶL）、又はその抗原結合フラグメントを含むｓｃＦｖ又はＦａｂである。この選択された重鎖及び軽鎖生殖細胞系列遺伝子セグメント、例えば、ＤＰ−４７、ＤＰＫ９、ＤＰ４５、ＤＰ３８などの枠の中での配列の多様化は、多様な免疫グロブリンをコードする配列のレパートリーを作成することができる。多様化への一つのアプローチが、多様化された抗体単一可変ドメイン又はｓｃＦｖ配列のライブラリの作成の文脈内で下記に述べられている。従って、一側面では、抗体単一可変ドメインは、所与のヒト生殖細胞系列Ｖ領域遺伝子断片、例えば、ＶH生殖細胞系列遺伝子セグメント ＤＰ−４７、又はＶκ生殖細胞系列遺伝子セグメント ＤＰＫ９のアミノ酸配列を含む。こうした可変領域ポリペプチドはまた、抗体単一可変ドメインとして発現され、そしてＣＤ２８に高親和性結合するか否かをスクリーニングすることができる。このレパートリーは、ファージディスプレイに適しているベクター内、例えば、ラムダ又は糸状菌バクテリオファージディスプレイベクターにクローン化されるか、又はこのベクター内に作成されることができ、次いで所与の標的抗原、例えば、ＣＤ２８に結合するか否かをスクリーニングする。
【０３１２】
ＣＤ２８一価結合体の製造
抗体単一可変ドメインは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含み、抗原に特異的に結合（例えば、５００ｎＭ以下の解離定数）し、単一可変ドメインとして抗原に結合する折り畳まれたポリペプチドドメインである；すなわち、どんな相補性可変ドメインもなく、抗体単一可変ドメインによって提供される一結合部位がある。それ故、抗体単一可変ドメインは、完全な抗体可変ドメイン及び改変された可変ドメイン、例えば、この改変されたドメイン中では、一つ若しくはそれより多いループが、抗体可変ドメイン、あるいはトランケートされるか、又はＮ若しくはＣ末端延長を含む抗体可変ドメインに特徴的ではない配列によって置き換えられ、並びに５００ｎＭ以下（例えば、４５０ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３５０ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下）の解離定数及び全長ドメインの標的抗原特異性を維持している可変ドメインの折り畳まれたフラグメントを含んでいる。例示的な実施態様では、本明細書中で説明されている組成物及び方法に有用な抗体単一可変ドメインは、Ｖkappa及びＶl
ambdaを含むＶH及びＶL、並びにＶHHの群から選択される。例示的な実施態様では、本明細書中で使用する抗体単一可変ドメインは、その用語が本明細書中で定義されているような“ヒト（human）”である。
【０３１３】
抗体単一可変ドメインのフォーマット及び構造
本明細書中で開示される一つの側面に従って、二つ若しくはそれより多い抗体単一可変ドメインは、依然として互いに独立しているそのそれぞれの抗原に結合する、それぞれの抗体単一可変ドメインの能力を維持しながら結合することができる。好都合なことに、この二つ若しくはそれより多い結合された抗体単一可変ドメインは、更に、別の方法として、又は本明細書中に述べられているリンカーに付加して、互いに独立してそのそれぞれの抗原に結合するそれぞれの抗体単一可変ドメインの能力の形成及び／又は維持を容易にすることができる骨格（skeleton）に結合することができる。あるいは、本明細書中に開示されているモノマーの抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインポリペプチドは、本明細書中で検討されているスカフォールド（scaffold）又はフレームワークを用いて構築すること（constructed）ができる。抗体単一可変ドメイン骨格は、抗体鎖分子に基づいてもよいし、又は本明細書中の他の所での説明と同様に起源が非抗体であってもよい。
【０３１４】
それぞれのエピトープ結合ドメインは、タンパク質のスカフォールド及び一つ若しくはそれより多いエピトープとのドメインの特異的な相互作用に関与している一つ若しくはそれより多いＣＤＲを含む。好都合なことに、本明細書中に開示されているエピトープ結合ドメインは、三つのＣＤＲを含む。適切なタンパク質のスカフォールドはまた、抗体ドメインに基づくものに加えて、起源が非抗体である免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スカフォールド又は骨格に基づくことができる。例えば、スタフィロコッカスタンパク質Ａのような天然バクテリア受容体は、一つ若しくはそれより多いエピトープに特異的に結合するリガンドを生成するのに、ＣＤＲの移植のためのスカフォールドとして用いられてきた。この手順の詳細は、米国特許第５，８３１，０１２号に記載されている。その他の適切なスカフォールドには、フィブロネクチン及びアフィボディ（Affibody, Bromma, Sweeden）に基づいたものが含まれる。適切な手順の詳細は、ＷＯ ９８／５８９６５号に記載されている。その他の適切なスカフォールドには、van den Beuken et al, J. MoI. Biol. (2001) 310, 591-601に記載されたような、リポカリン及びＣＴＬＡ４、及びＷＯ ００／６９９０７号（Medical Research Council）に記載されているもののようなスカフォールドが含まれるが、これらは、例えばバクテリアＧｒｏＥＬ又はその他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づく。使用可能な他の非免疫グロブリンをベースとするスカフォールドには、ＬＤＬ受容体クラスＡ、ＥＧＦドメインモノマー及び多量体、並びにBiorexis（King of Prussia, PA）又はAvidia（Mountain View, CA）から入手可能なスカフォールドをベースとするものが含まれる。使用可能なその他の非免疫グロブリンスカフォールドは、例えば、ＷＯ ０５／０４０２２９号、ＷＯ ０４／０４４０１１号及びＵＳ ２００５／００８９９３２号に記載されている。
【０３１５】
抗体主鎖コンフォメーション（conformation）の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーは、全て、そのポリペプチド鎖に対して同様の折り畳み（fold）を共有している。例えば、抗体は、その一次配列の点では高度に多様化されているけれども、配列及び結晶学的構造の比較によると、意外にも、抗体の６個の抗原結合ループの中の５個（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が、限定された数の主鎖コンフォメーション、又はカノニカル（canonical）な構造を採択していることが示された（Chothia and Lesk (1987) J. MoI. Biol, 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877）。それ故、ループの長さ及びキーとなる残基の分析により、大部分のヒト抗体で見出されるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の主鎖コンフォメーションを予想することが可能となった（Chothia et al. (1992) J. MoI. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. MoI. Biol, 264: 220）。Ｈ３領域は、配列、長さ及び構造（Ｄ断片の使用により）の点においてより多様であるが、これはまた、特定の残基の長さ及び存在、又は残基の種類に依存する短いループの長さの場合の制限された数の主鎖コンフォメーションをループ及び抗体フレームワーク内のキーとなる位置で形成する（Martin et al. (1996) J. MoI. Biol, 263: 800; Shirai et al (1996) FEBS Letters, 399: 1)。
【０３１６】
本明細書中に開示されている抗体単一可変ドメインは、ＶHドメインのライブラリ及び／又はＶLドメインのライブラリのような可変ドメインを含むライブラリから選択し、及び／又は組み立てることができる。更に、本明細書中に開示されているリガンドは、それ自体、ライブラリの形態で提供されうる。本明細書中に開示されている一つの側面では、いくつかのループの長さ及びキーとなる残基が選択され、その結果メンバーの主鎖のコンフォメーションが知られることになることを保証するリガンド及び／又はドメインのライブラリが設計される。好都合なことに、これらは上記で検討したように、それらが非機能的になる機会を最小化するため、本来見出される免疫グロブリンスーパーファミリー分子の実際のコンフォメーションである。生殖細胞系列Ｖ遺伝子の断片は、抗体又はＴ細胞受容体ライブラリを構築するための一つの例示的な基本フレームワークとしての機能を果たし；他の配列も役立つ。変異は、機能性のあるメンバーのうちで少ない数のメンバーが主鎖コンフォメーションの変更を所有しうる程度に低い頻度で生じることが可能であり、このことはその機能に影響を及ぼさない。
【０３１７】
カノニカル構造理論はまた、リガンドによりコードされた異なる主鎖コンフォメーションの数を評価し、リガンド配列に基づいて主鎖コンフォメーションを予測し、そしてカノニカル構造に影響を及ぼさない、多様化のための残基を選択するのに有用である。ヒトＶκ領域では、Ｌ１ループが４個のカノニカル構造の１つを採択することができ、Ｌ２ループは単一のカノニカル構造を有し、そしてＶκドメインの９０％は、Ｌ３ループの場合の四つ又は五つのカノニカル構造の１つを採択することが知られている（Tomlinson et al.
(1995）上記参照）；従って、ヒトＶκ領域単独では、異なるカノニカル構造が結合して様々な範囲の異なる主鎖コンフォメーションを創成することができる。Ｖλ領域が、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループの場合の異なる範囲のカノニカル構造をコードし、そしてＶκ及びＶλ領域が、Ｈ１及びＨ２ループの場合のカノニカル構造をいくつかコードすることができる任意のＶH領域と対になることができることを考慮すると、こうした五つのループに観察されるカノニカル構造の組み合せの数は非常に大きい。このことによって主鎖コンフォメーションの多様性の出現は、広範囲な結合特異性の生成に必須でありうることが示唆される。しかしながら、単一の公知の主鎖コンフォメーションに基づいた抗体ライブラリを構築することにより、意外にも、全ての抗原を実質的にターゲッティングするのに十分な多様性を出現させることには主鎖コンフォメーションの多様性は必要ないということが見出された。それどころか驚くべきことに、単一主鎖コンフォメーションは、コンセンサス構造である必要がなく、単一の天然起源コンフォメーションが全ライブラリの基礎として用いられるうる。従って、好ましい側面では、本明細書中で開示されるこの抗体単一可変ドメインは、単一の知られている主鎖コンフォメーションを所有する。
【０３１８】
一側面では、選択される単一主鎖コンフォメーションは、問題の免疫グロブリンスーパーファミリー型の分子の間ではありふれている。かなりの数の自然発生分子がそれを採択することが観察される場合には、コンフォメーションはありふれている。それ故、本明細書中で開示されるいる好ましい側面では、免疫グロブリンドメインの各結合ループの場合の異なる主鎖コンフォメーションの自然発生率は、別々に考慮され、その後、異なったループの場合の主鎖コンフォメーションの所望の組み合わせを所有する自然発生可変ドメインが選択される。一つも利用可能でない場合は、最も近接した等価物が選択されてもよい。異なるループの場合の主鎖コンフォメーションの所望の組み合せは、この所望の主鎖コンフォメーションをコードする生殖細胞系列遺伝子セグメントを選択することにより創成されることが好ましい。選択された生殖細胞系列遺伝子セグメントが、自然状態で頻繁に発現されることがより好ましく、そしてこれらが全ての天然の生殖細胞系列遺伝子セグメントの中で最も頻繁に発現されることが最も好ましい。
【０３１９】
そのリガンド又はそのライブラリ設計に際して、抗原結合ループのそれぞれに対する異なる主鎖コンフォメーションの発生率は、別々に考慮することができる。Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に対し、天然起源分子の抗原結合ループの２０％と１００％の間より採択される、所与の構造が選択される。通例、その観察される発生率は、３５％より多く（すなわち、３５％と１００％の間）、理想的には、５０％より多く、又は、更に６５％より多い。大多数のＨ３ループは、カノニカル構造を有しないので、カノニカル構造を示すループの間で、ありふれている主鎖コンフォメーションを選択することが好ましい。それ故、それぞれのループの場合、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されるコンフォメーションが選択される。ヒト抗体では、それぞれのループに対する最も普遍的なカノニカル構造（ＣＳ）は次の通りである：Ｈ１−ＣＳ１（発現されたレパートリーの７９％）、Ｈ２−ＣＳ ３（４６％）、ＶκのＬ１−ＣＳ ２（３９％）、Ｌ２−ＣＳ １（１００％）、ＶκのＬ３−ＣＳ １（３６％）（計算では、κ：λ比を７０：３０と仮定している，Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 48: 133）。カノニカル構造を有するＨ３ループに対しては、残基９４〜残基１０１までの塩架橋を有する７個の残基のＣＤＲ３長（Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services）が最もよくあるもののようである。ＥＭＢＬデータライブラリ中に、このコンフォメーションを形成するのに必要なＨ３の長さ及びキーとなる残基、そして抗体モデリング（２ｃｇｒ及び１ｔｅｔ）に対するベースとして用いることができるタンパク質データバンク中の少なくとも二つの結晶学的構造を有する少なくとも１６個のヒト抗体配列がある。このカノニカル構造の組み合わせの中で、最も頻繁に発現される生殖細胞系列遺伝子セグメントは、ＶH断片３−２３（ＤＰ−４７）、ＪH断片ＪＨ４ｂ、Ｖκ断片Ｏ２／Ｏ１２（ＤＰＫ９）及びＪκ断片Ｊκ１である。ＶH断片ＤＰ４５及びＤＰ３８もまた、好適である。それ故、こうした断片は、所望する単一主鎖コンフォメーションを有するライブラリを構築するためのベースとして組み合せて用いることができる。
【０３２０】
あるいは、結合ループのそれぞれの場合の異なる主鎖コンフォメーションの自然発生率に基づいて単一主鎖コンフォメーションを単独で選択する代わりに、主鎖コンフォメーションの組み合せの自然発生率が、単一主鎖コンフォメーションを選択するためのベースとして用いられる。抗体の場合、例えば、抗原結合ループの任意の２個、３個、４個、５個又は６個の全ての場合のカノニカル構造の組み合せの自然発生率を決定することができる。この点で、選択されたコンフォメーションは、天然起源抗体においてありふれたものが好ましく、最も好ましくは、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されるものである。従って、ヒト抗体では、例えば、５個の抗原結合ループ、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の天然組み合せが考慮される場合、最も頻繁なカノニカル構造の組み合せが決定され、次いで単一主鎖コンフォメーションを選択するためのベースとして、Ｈ３ループに対する最も普遍的なコンフォメーションと組み合わされる。
【０３２１】
抗体単一可変ドメインの製造
抗体単一可変ドメインは、いくつかの方法によって製造される。こうしたそれぞれのアプローチの場合、周知の核酸配列の製造（例えば、増幅、突然変異など）及び操作方法が適用可能である。
【０３２２】
抗体単一可変ドメインを製造する１つの手段は、所望の抗原に結合することが知られているクローン化された抗体又はＶHHの重鎖又は軽鎖遺伝子のＶH又はＶL領域を増幅・発現することである。すなわち、公知の抗ＣＤ２８抗体をコードする領域のＶH又はＶL領域を、単一ドメインとして（又は単一ドメインの融合として）増幅・発現することができ、ＣＤ２８への結合の有無を評価することができる。ＶH及びＶL領域の境界は、Kabatらによって説明されている（Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.）。重鎖及び軽鎖遺伝子のＶH及びＶL領域の境界に関する情報は、ＣＤ２８に結合することが知られている抗体をコードするクローン化された重鎖又は軽鎖コード配列からＶドメインを増幅するＰＣＲプライマーを設計するのに使用される。増幅されたＶドメインは、単独又は別のポリぺプチド配列との融合として、適当な発現ベクター、例えば、ｐＨＥＮ−１（Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137）に挿入され、発現される。
【０３２３】
ＶH遺伝子は、三つの遺伝子断片、ＶH、Ｄ及びＪHの組み換えによって作成される。ヒトでは、ハプロタイプ（haplotype）によって、およそ５１個の機能性ＶH断片（Cook and
Tomlinson(1995)Immunol Today 16:237）、２５個の機能性断片（Corbett et al.(1997)J.Mol.Biol.268:69）、及び６個の機能性ＪH断片（Ravetch et al.(1981) Cell 27：583）がある。ＶH断片は、ＶH領域（Ｈ１及びＨ２）の第一及び第二抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方ＶH、Ｄ及びＪH断片は、結合して、ＶH領域（Ｈ３）の第三抗原結合ループを形成する。
【０３２４】
ＶL遺伝子は、２つだけの遺伝子断片、ＶL及びＪLの組み換えにより作成される。ヒトでは、ハプロタイプによって、約４０個の機能性Ｖκ断片（Schaeble and Zachau (1993)
Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:1001）、３１個の機能性Ｖλ断片（Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res. 7:250）、５個の機能性Ｊκ断片（Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:1516）、及び４個の機能性Ｊλ断片（Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med. 172:609）がある。ＶL断片は、ＶL領域の第一及び第二抗原結合ループ（Ｌ１及びＬ２）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方、ＶL及びＪL断片は、結合して、ＶL領域の第三抗原結合ループ（Ｌ３）を形成する。この一次レパートリーから選択された抗体は、少なくとも中度程度の親和性でほとんど全ての抗原に結合するのに十分に多様であるものと信じられている。高親和性抗体は、点突然変異が生じ、改善した結合に基づいて免疫系によって選択される、再配列された遺伝子の“親和性成熟（affinity maturation）”によってインビボで作成される。
【０３２５】
好ましいアプローチでは、ＶH又はＶLドメイン（一側面では、ヒトＶH又はＶLドメイン）のレパートリーは、所望の抗原に対して、例えば、ファージディスプレイ法、パニング（panning）によってスクリーニングされる。バクテリオファージディスプレイライブラリ及びλファージ発現ライブラリの構築方法は、当技術分野において周知であり、例えば：McCafferty et al., 1990, Nature 348:552；Kang et al.,1991 , Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 88: 4363；Clackson et al., 1991, Nature 352: 624；Lowman et al.,1991, Biochemistry 30: 10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88: 10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res.19: 4133; Chang et al.,1991, J. Immunol. 147: 3610；Breitling et al., 1991, Gene 104: 147； Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581；Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457；Hawkins and Winter(1992) J. Immunol., 22:867；Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267:16007；及びLerner et al. (1992) Science, 258:1313によって教示されている。Ｆａｂファージディスプレイライブラリは、例えば、米国特許第５，９２２，５４５号に教示されている。ｓｃＦｖファージライブラリは、例えば、Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85:5879-5883；Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070；McCafferty et al., 1990, 上記参照；Clackson et al., 1991，上記参照；Marks et al., 1991，上記参照；Chiswell et al., 1992, Trends Biotech. 10:80；及びMarks et al., 1992，上記参照に教示されている。バクテリオファージコートタンパク質上に呈示されたｓｃＦｖライブラリの様々な実施態様が記載されてきた。ファージディスプレイアプローチの改良はまた、例えば、ＷＯ ９６／０６２１３号及びＷＯ ９２／０１０４７号（Medical Research Council et al．）及びＷＯ ９７／０８３２０号（Morphosys，上記参照）に記載されているように知られている。
【０３２６】
ＶH又はＶLドメインのレパートリーは、免疫グロブリン配列の自然発生レパートリー又は合成レパートリーであってもよい。自然発生レパートリーは、例えば、１つ若しくはそれより多い個体から回収された免疫グロブリン発現細胞から調製されるものである。このようなレパートリーは、“ナイーブ（naive）”でありうる、すなわち、例えば、ヒト胎児又は新生児免疫グロブリン発現細胞から製造されうるか、又は再配列しうる、すなわち、例えば、成人のヒトＢ細胞から製造されうる。自然レパートリーは、例えばMarks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581；及びVaughan et al., 1996, Nature Biotech. 14:309に記載されている。次いで所望であれば、自然レパートリー、又は任意のレパートリーから同定された、更に言及すれば、標的抗原に結合するクローンは、改善された結合特性を有する変異体を生成し選択するために突然変異誘発、更にスクリーニングに処される。
【０３２７】
抗体単一可変ドメインを含む免疫グロブリン単一可変ドメインの合成レパートリーは、クローン化されたＶドメインに人工的に多様性を導入することによって調製される。合成レパートリーは、例えば、Hoogenboom and Winter, 1992, J . Mol. Biol. 227: 381；Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13:692；Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13:3245；DeKriuf et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97；及びＷＯ ９９／２０７４９号に記載されている。
【０３２８】
一側面では、合成可変ドメインレパートリーは、人工的に多様化された生殖細胞系列のＶH又はＶk配列に基づき、ＶH又はＶkバックグラウンドで調製される。例えば、ＶHドメインレパートリーは、クローン化された生殖細胞系列ＶH遺伝子断片 Ｖ３−２３／ＤＰ４７（Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768）及びＪＨ４ｂをベースにすることができる。Ｖkドメインレパートリーは、例えば、生殖細胞系列Ｖk遺伝子断片Ｏ２／Ｏ１２／ＤＰＫ９（Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827）及びＪk１をベースにすることができる。多様性は、これら又は他の遺伝子断片に、例えばＰＣＲ突然変異誘発によって導入される。多様性は、例えば、エラープローン（error prone）ＰＣＲ（Hawkins, et al., 1992, J. Mol. Biol. 226:889）、又は化学的突然変異誘発によってランダムに導入されうる。しかしながら、上記で検討したように、多様性の導入は、特定の残基をターゲッティングすることが好ましい。また、所望の残基が全てのアミノ酸及びＴＡＧ停止コドンをコードする突然変異原性プライマーを用い（ＩＵＰＡＣ命名法により、Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ、及びＫ＝Ｇ又はＴ）、コドンＮＮＫを導入することによってターゲッティングされることが好ましい。ＮＮＮコドン（付加的停止コドンＴＧＡ及びＴＡＡの産生をもたらす）、ＤＶＴコドン（（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｔ）、ＤＶＣコドン（（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｃ）、及びＤＶＹコドン（（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ））を含めて、類似した結果を達成するその他のコドンも使用できる。このＤＶＴコドンは、２２％のセリン及び１１％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸塩、トレオニン及びシステインをコードし、自然ヒト抗体の抗原結合部位のためのアミノ酸残基の分布を最もよく模倣する。レパートリーは、選択された縮退（degenerate）コドン、又は複数のコドンをそれぞれの多様化しようとする部位に有するＰＣＲプライマーを用いて作成される。ＰＣＲ突然変異誘発は、当分野で公知である。
【０３２９】
一側面において、多様性は、ＣＤＲｓ１、２及び３の多様性に相応する、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７及びＨ９８部位のＮＮＫコドンを用いて、ヒト生殖細胞系列ＶH遺伝子断片Ｖ３−２３／ＤＰ４７（Tomlinson et al., 1992, J, Mol. Biol. 227：7768）及びＪＨ４ｂの配列内に導入されているが、ナンバリング付けは、米国特許第６，６９６，２４５号の使用と同様である。
【０３３０】
別側面では、多様性は、またＣＤＲｓ１、２及び３の多様性に相応する、例えば、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００ａ及びＨ１００ｂ部位のＮＮＫコドンを用いて、ヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子断片Ｖ３−２３／ＤＰ４７及びＪＨ４ｂの配列内に導入されており、この番号付けは、米国特許第６，６９６，２４５号の使用と同様である。
【０３３１】
別側面では、多様性は、ＣＤＲｓ１、２及び３の多様性に相応する、例えば、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４及びＬ９６部位のＮＮＫコドンを用いて、ヒト生殖細胞系列Ｖｋ遺伝子断片Ｏ２／Ｏ１２／ＤＰＫ９及びＪk１の配列に導入されており、この番号付けは、米国特許第６，６９６，２４５号の使用と同様である。
【０３３２】
多様化されたレパートリーは、当技術分野で公知の、例えば、ＷＯ ９９／２０７４９号に記載のように、ファージディスプレイベクター内にクローン化される。一般に、本明細書中に説明されている組成物及び方法に必要な核酸分子及びベクターコンストラクトは、当技術分野より入手可能であり、例えば、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA 及び次の版などの標準実験室マニュアルに説明されているように構築されそして操作される。
【０３３３】
本明細書中に説明されている核酸操作は、通例、組み換えベクターで行われる。
本明細書“ベクター”とは、本明細書で使用されている際には、異種ＤＮＡを、それの発現及び／又は複製のため細胞内に組み込むのに用いられる別々のエレメントを意味する。こうしたベクターを選択又は構築し、その後使用する方法は、当技術分野の当業者によく知られている。バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、人工染色体及びエピゾームベクターを含む、おびただしい数のベクターが公表・使用されている。このようなベクターは、単純クローニング及び突然変異誘発に使用されることも可能であり、あるいは、本明細書中のレパートリー（又はプレレパートリー（pre-repertoire）メンバーを運ぶベクターに典型的であるように、遺伝子発現ベクターが使用される。本明細書中で説明されている使用されるベクターは、所望のサイズ、通例０．２５キロベース(ｋｂ)〜４０ｋｂの長さを有するポリペプチドコード配列を収容するように選択される。適切な宿主細胞は、インビトロクローニング操作後、ベクターでトランスフォームされる。それぞれのベクターは、通例、クローニング（又は“ポリリンカー（polylinker）”部位、複製オリジン（origin of replication）及び少なくとも一つの選択可能なマーカー遺伝子を含む可変機能的コンポーネントを含有する。この所与のベクターが発現ベクターである場合は、それは更に一つ又はそれより多い次のもの：エンハンサー（enhancer）エレメント、プロモーター、転写終了及びシグナル配列を保有し、それぞれは、本明細書中に説明されているポリペプチドレパートリーメンバーをコードする遺伝子に効率よく結合するように、クローニング部位の近くに配置されている。
【０３３４】
クローニングも発現ベクターも、通例、このベクターを一つ又はそれより多い選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含む。通常クローニングベクターでは、この配列は、このベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にする配列であり、そして複製開始点（origins of replication origin）又は自己複製配列（autonomously replicating sequences）を含んでいる。こうした配列は、様々なバクテリア、酵母及びウィルスにおいてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製オリジンは、大部分のグラム−陰性バクテリアに適し、２ミクロン プラスミドオリジン(plasmid origin)は酵母に適し、そして様々なウィルスオリジン(viral origins)（例えば、ＳＶ４０、アデノウィルス）は、哺乳類細胞でベクターをクローニングする場合に有用である。一般に、複製オリジンは、ＤＮＡを高水準で複製することができる哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ細胞で使用されない限り、哺乳類発現ベクターに必要ではない。
【０３３５】
好都合なことには、クローニング又は発現ベクターはまた、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有している。この遺伝子は、選択的培地で増殖されたトランスフォーム宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。従って、選択遺伝子を含有するベクターによってトランスフォームされない宿主細胞は、この培地で生存しない。通例の選択遺伝子は、抗生物質及びその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与したり、栄養要求欠乏を補完したり、又は増殖培地では利用ができない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０３３６】
本明細書中のベクターの複製は、大腸菌（E.coli）で行うのが最も好都合であるので、大腸菌選択可能マーカー、例えば、抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子が使用される。これらは、大腸菌プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、又はｐＵＣ１８、又はｐＵＣ１９のようなｐＵＣプラスミドから得ることができる。しかしながら、他のプラスミド・微生物の組み合わせもまた、置換しうることは当然である。
【０３３７】
発現ベクターは、通例、宿主有機体によって認識され、目的とするコード配列にアゴナイズ可能に結合されたプロモーターを含む。こうしたプロモーターは、誘導性であるか、構成的(constitutive)でありうる。用語“作動可能にリンク（連結）される（operably linked）”とは、近接した並列状態であることを意味し、上記において記載されている構成要素が意図した方法で機能することを可能にする関係にある。コード配列に対して“作動可能にリンク（連結）される（operably linked）”制御配列は、コード配列が制御配列の発現に適合している条件の下で達成されるように結合する（ligated）。
【０３３８】
原核宿主を加えて使用するのに好適なプロモーターには、例えば、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、アルカリ性フォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。また、バクテリアシステムで使用されるプロモーターは、通例、コード配列にアゴナイズ可能に結合されたシャイン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列を含む。
【０３３９】
本明細書中に記載のライブラリ又はレパートリーにおいて、好適なベクターは、ポリペプチドライブラリメンバーに相応するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。従って、選択は、このポリペプチドライブラリメンバーを発現する単一クローンの別々の増殖及び発現により、又は任意の選択ディスプレイシステム（選択 display system）の使用によって行われる。上述のように、好ましい選択ディスプレーシステムではバクテリオファージディスプレイが使用される。従って、ファージ又はファジミド（ファージmid）ベクターを使用することができる。好ましいベクターはファジミドベクターであって、これは大腸菌複製オリジン（二本鎖の複製用（double stranded replication））及びまた複製のファージオリジン（一本鎖ＤＮＡの生成用）を有する。こうしたベクターの操作及び発現は、当技術分野で周知である（Hoogenboom and Winter(1992), 上記参照; Nissim et al.(1994)，上記参照）。簡潔に述べると、このベクターは、β−ラクタマーゼ、ファージミド(phagemide)に選択性を付与する他の選択可能なマーカー遺伝子、
そして、ｐｅｌｂリーダー配列（ペリプラスム間隙に発現されたポリペプチドを向ける）、
多数のクローニング部位（ライブラリメンバーのヌクレオチドバージョンをクローンするための）、
場合により、一つ若しくは複数のペプチドタグ（検出用）、
場合により、一つ若しくは複数のタグ（TAG）停止コドン
及びファージタンパク質ｐＩＩＩ
から成る（ＮからＣ末端）
発現カセットの上流にｌａｃプロモーターを含む。
【０３４０】
一つの実施態様では、このベクターは、ｐｅｌＢリーダー配列ではなく、むしろ融合ポリペプチドの分泌を大腸菌中のペリプラスム間隙か、又は真核細胞系中の培地に向ける働きをする真核ＧＡＳ１リーダー配列をコードする。
【０３４１】
大腸菌の様々なサプレッサー及び非サプレッサー株を用い、そしてグルコース、イソ−プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）、又はヘルパーファージ（例えば、ＶＣＳ Ｍ１３）を添加すると、このベクターは、発現せずにプラスミドとして複製し、大量のポリペプチドライブラリメンバーのみを生成するか、又はその一部がその表面に少なくとも一つのポリペプチド−ｐＩＩＩ融合のコピーを含むファージを生成することができる。
【０３４２】
好ましいベクターの例には、ｐＨＥＮ−１ファジミドベクター（Hoogenboom et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19：4133-4137；配列は、例えばＷＯ ０３／０３１６１１号の配列番号７として入手可能である）があり、上記においてはｐＩＩＩ融合タンパク質の生成は、グルコースの存在下では妨害され、ＩＰＴＧで誘導されるＬａｃＺプロモーターの制御のもとに置かれる。大腸菌のサプレッサー株、例えば、ＴＧ１で増殖される場合には、遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質が生成され、そしてファージ内にパッケイジングされるのに対し、一方非サプレッサー株、例えば、ＨＢ２１５１での増殖では、可溶性融合タンパク質のバクテリアペリプラスム及び培地への分泌を可能にする。遺伝子ＩＩＩの発現は、その後のヘルパーファージへの感染を防止するので、このファジミドベクターを内部に持つバクテリアは、ファージレスキュー（phage rescue）のためにＶＣＳ Ｍ１３ヘルパーファージでの感染前にグルコースの存在下で増殖する。
【０３４３】
本明細書中で説明されているベクターの構築には、従来から行われているライゲーション（ligation）手法が用いられる。分離されたベクター又はＤＮＡフラグメントは、切断し、調整し（tailored）、所望の形に再びライゲートし、必要なベクターを生じせしめる。所望であれば、構築されたベクター中に正しい配列が存在するかを確認するための配列分析を標準的な方法を用いて行う。発現ベクターの構築、インビトロ転写物の調製、ＤＮＡの宿主細胞への導入、並びに発現及び機能評価のための分析を行うための適切な方法は当業者には公知である。サンプル中の遺伝子配列の存在が検出されるか、又はその増幅及び／又は発現が、通常の方法、例えばサザン（Southern）又はノーザン（Northern）分析、ウエスタンブロット、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質のドットブロット、インシチュー（in situ）ハイブリッド形成、免疫細胞化学、もしくは核酸又はタンパク質分子の配列分析によって定量化される。当技術分野の当業者であれば、所望によりこのような方法を変更することができる手法を容易に予測することが可能であろう。
【０３４４】
抗原結合のための抗体単一可変ドメインのスクリーニング：
ファージの表面上の抗体単一可変ドメインのレパートリーの発現の後、このファージレパートリーを固定化標的抗原に接触させ、洗浄して非結合ファージを除去し、そして結合されたファージを増殖することによって選択が行われるが、この全体工程をしばしば“パニング（panning）”と呼んでいる。このプロセスは、抗体単一可変ドメイン及びディスプレイライブラリ上に発現され得るその他の抗体フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなどのスクリーニングにも適用可能である。あるいは、折り畳まれたメンバーによってのみ結合される固定化された包括的リガンド（generic ligand）（例えば、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｌ）に対してパニングすることによって、ファージは適切に折り畳まれたメンバー変異体の発現のために予備選択される。これは、非機能性メンバーの割合を減少させ、それによって標的抗原に結合する可能性が高いメンバーの割合を増加させるという利点を有する。包括的リガンドを用いた予備選択については、例えば、ＷＯ ９９／２０７４９号に教示されている。ファージ抗体ライブラリのスクリーニングについては、例えば、Harrison et al., 1996, Meth. Enzymol. 267: 83-109に一般的に記載されている。
【０３４５】
スクリーニングは、一般に、固体支持体、例えば、プラスチックチューブ若しくはウェル上に、又はクロマトグラフィーマトリックス、例えば、セファロース(Sepharose)TM（Pharmacia）上に固定された精製抗原を用いて行われる。スクリーニング又は選択はまた、複合抗原上、例えば、細胞表面上で行われることもできる（Marks et al., 1993, BioTechnology 11: 1145; de Kruif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 3938）。別の代案では、溶液の中でビオチン化抗原に結合させ、引き続いてストレプトアビジンコートビーズ上で捕捉することによって選択させる必要がある。
【０３４６】
好ましい側面では、パニングは、抗原（包括的又は特異的）をプレート内のチューブ又はウェル上に、例えば、Nunc MAXISORPTMイムノチューブ８ウェルストリップに固定化することによって行われる。ウェルは、１５０μｌの抗原（PBS中１００μｇ／ｍｌ）でコーティングし、終夜インキュベーションする。次いでこのウェルを、ＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で２時間４００μｌのＰＢＳ−２％脱脂乳（２％ MPBS）によって遮断する。このウェルをＰＢＳで３回リンスし、ファージを２％ MPBS中に添加する。この混合物を室温で９０分間インキュベーションし、非結合ファージを含む液体を除去する。ウェルをPBS−０．１％ツイーン２０で１０回リンスし、次いでPBSで１０回リンスして洗剤を除去する。結合されたファージは、２００μｌの新たに調製された１００ｍＭトリエチルアミンを添加してよく混合し、室温で１０分間インキュベーションすることによって溶離される。溶出されたファージは、１００μｌの１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を含むチューブに移し、ボルテックス処理してトリエチルアミンを中和する。幾何級数的に増殖する大腸菌宿主細胞（例えば、ＴＧ１）を、例えば、１５０ｍｌの溶出されたファージで、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって感染させる。感染した細胞を遠心沈殿させ、新しい培地に再懸濁させ、上層アガロース中にプレーティングする。ファージプラークを溶離するか、又は宿主細胞の新しい培養液に集め、分析のために若しくは更なる一連の選択のために増殖させる。必要に応じて、１回又は複数回の一連のプラークの浄化を行い、選択された純粋なファージ集団を確保する。他のスクリーニングアプローチについては、Harrison et al., 1996, 上記参照に記載されている。
【０３４７】
所望の標的に結合する抗体単一可変ドメインを発現するファージを同定した後、ｐＨＥＮ１のようなファジミドベクターが使用された場合には、可溶性遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質の分泌を可能にするバクテリア、例えば、ＨＢ２１５１の非サプレッサー株に感染させることによって、可変ドメイン融合タンパク質は可溶性形態で容易に生成されうる。ＧＡＳ１分泌シグナルペプチドがこのベクターによってコードされる場合、この融合ポリペプチドは、真核（例えば、酵母若しくは哺乳類）又は原核（例えば、大腸菌）細胞によって分泌されうる。あるいは、Ｖドメイン配列は、適切な発現ベクターにサブクローンされ、当技術分野において公知の方法に従って可溶性タンパク質を生成することができる。
【０３４８】
抗体単一可変ドメインの精製及び濃縮
ペリプラスム間隙又はバクテリアの培地に分泌される抗体単一可変ドメインポリペプチド又は他の一価の抗体単一可変ドメインは、公知の方法により回収され、そして精製される（Harrison et al.,1996，上記参照）。Skerra and Pluckthun (1988, Science 240：1038)及びBreitling et al.(1991, Gene 104: 147)は、ペリプラズム(periplasm)に起源する抗体単一可変ドメインの回収について記載しており、そしてBetter et al.(1988, Science 240：1041)は、培養液の上清からの回収について記載している。いくつかの抗体単一可変ドメインの場合、包括的リガンド、例えば、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｌへの結合によって精製が行われうることもある。あるいは、可変ドメインはペプチドタグ、例えば、Ｍｙｃ、ＨＡ又は６Ｘ−Ｈｉｓタグとともに発現されうるが、これによって親和性クロマトグラフィーによる精製が容易となる。
【０３４９】
必要に応じて、一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、例えば、限外濾過、透析濾過及び接線流濾過（tangential flow filtration）を含めて、当技術分野における公知のいくつかの方法のいずれかによって濃縮される。限外濾過プロセスは、半透過性膜及び圧力を用いて、サイズ及び形状に基づいて分子種を分離する。この圧力は、気体圧力又は遠心分離によって提供される。商業的な限外濾過製品は、例えば、ミリポア(Millipore)(Bedford, MA；例には、CentriconTM及びMicroconTM濃縮器が含まれる）及びVivascience（Hannover, Germany；例には、VivaspinTM濃縮器が含まれる）から広く入手可能である。標的ポリペプチドと比較してより小さな分子量カットオフを選択することによって（通常は、標的ポリペプチドの分子量の１／３〜１／６、しかし１０ｋＤ分だけの差異も首尾よく使用することができる）、このポリペプチドは、溶媒及びより小さな溶質が膜を通過するとき維持される。従って、約５ｋＤの分子量カットオフは、本明細書中に記載されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインポリペプチドの濃縮に有用である。
【０３５０】
“洗浄（washing）”プロセスを伴う限外濾過膜を用いる透析濾過は、ポリペプチド製剤の中の塩又は緩衝剤を除去するか、又は交換することが望まれる場合に使用される。このポリペプチドは、溶媒及び小さな溶質を、膜を通して通過させることによって濃縮され、そして残存する塩又は緩衝剤は、維持されたポリペプチドを所望の新たな緩衝剤、又は塩溶液、又は水で希釈することによって除去され、所望により限外濾過の継続を伴う。連続的透析濾過では、新たな緩衝剤は濾液が膜を通過するのと同じ速度で添加される。透析濾過の容量は、透析濾過開始前のポリペプチド溶液の容量であり、連続的透析濾過を使用する場合、新たな緩衝剤を加えて６倍の透析濾過量（six diafiltration volumes）で洗浄することにより、９９．５％を超える完全透過性溶質を除去することができる。あるいは、このプロセスは、不連続方式により行うことができ、その場合、サンプルは繰り返して希釈され、次いで元の容量まで濾過され、塩又は緩衝剤を除去又は交換し、最終的にはポリペプチドを濃縮する。透析濾過用機器及びその使用のための詳細な方法については、例えば、Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI) 及びSartorius AG/Vivascience (Hannover, Germany）から入手可能である。
【０３５１】
また、“クロスフロー濾過（cross-flow filtration）”としても知られている接線流濾過（ＴＦＦ）もまた、限外濾過膜を使用する。標的ポリペプチドを含む流体が膜の表面に沿って接線方向にポンピングされる。圧力によってこの流体の一部が膜を通過するようになり、一方標的ポリペプチドは、フィルター上に維持される。しかしながら、標準的限外濾過とは対照的に、維持された分子は膜の表面上に蓄積されず、接線方向のフローによって運ばれる。フィルターを通過しない溶液（標的ポリペプチドを含む）は、膜を横切って繰り返して循環され、所望の程度の濃縮が達成されることができる。ＴＦＦ用機器及びその使用のための詳細な方法については、例えば、Millipore (例えば、the ProFlux M 12TM Benchtop TFF system 及び the PelliconTM systems), Pall Life Sciences (例えば、 the MinimTM Tangential Flow Filtration system)から入手可能である。
【０３５２】
タンパク質の濃度は、当技術分野におけるいくつかの周知の方法により測定することができる。こうしたものには、例えば、アミノ酸分析、２８０ｎｍでの吸光度、“Bradford”及び“Lowry”法、並びにSDS-PAGEが含まれる。最も正確な方法は、総加水分解、引き続いてＨＰＬＣによるアミノ酸分析であり、次いで濃度が決定され、次いで知られている抗体単一可変ドメインポリペプチドの配列との比較がなされる。この方法は、最も正確な方法ではあるが、高価で時間が長くかかる。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の測定によるタンパク質の測定は、速やかで安価であるが、その上かなり正確であり、そしてアミノ酸分析に関する折衷案として好ましい。本明細書中で述べられている実施例で報告されているタンパク質濃度を測定するには、２８０ｎｍでの吸光度が使用された。
【０３５３】
“Bradford”及び“Lowry” タンパク質分析法（Bradford, 1976, Anal. Biochem.72: 248-254；Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275）は、サンプルのタンパク質濃度を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に最も多く基づいて標準曲線と比較する。こうした方法は、精度が低く、抗体単一可変ドメインの濃度を過小評価する傾向がある。しかしながら、この方法の正確度は、ＶH又はＶk単一ドメインポリペプチドを標準として使用することによって改善することができる。
【０３５４】
利用することができる更なるタンパク質アッセイ法は、米国特許第４，８３９，２９５号（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されているビシンコニン酸アッセイであり、そしてPierce Biotechnology（Rockfold, IL）によって“ＢＣＡタンパク質アッセイ”として市販されている（例えば、ピアスカタログ番号２３２２７）。
【０３５５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、既知の濃度基準、例えば、既知の量の抗体単一可変ドメインポリペプチドと比較して、ゲル電気泳動、及びクマシーブルー（Coomassie Blue）染色法を使用する。定量化は、肉眼で又は濃度計(densitometry)で行うことができる。
【０３５６】
本明細書中に記載されているヒト抗体単一可変ドメインポリペプチドは、水溶液中（例えば、ＰＢＳ）で高濃度（例えば、少なくとも４．８ｍｇ（略４００μＭ）で、そして一側面では、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ（略４１７μＭ）、１０ｍｇ／ｍｌ（略８３３μＭ）、２０ｍｇ／ｍｌ（略１．７ｍＭ）、２５ｍｇ／ｍｌ（略２．１ｍＭ）、３０ｍｇ／ｍｌ（略２．５ｍＭ）、３５ｍｇ／ｍｌ（略２．９ｍＭ）、４０ｍｇ／ｍｌ（略３．３ｍＭ）、４５ｍｇ／ｍｌ（略３．７５ｍＭ）、５０ｍｇ／ｍｌ（略４．２ｍＭ）、５５ｍｇ／ｍｌ（略４．６ｍＭ）、６０ｍｇ／ｍｌ（略５．０ｍＭ）、６５ｍｇ／ｍｌ（略５．４ｍＭ）、７０ｍｇ／ｍｌ（略５．８ｍＭ）、７５ｍｇ／ｍｌ（略６．３ｍＭ）、１００ｍｇ／ｍｌ（略８．３３ｍＭ）、１５０ｍｇ／ｍｌ（略１２．５ｍＭ）、２００ｍｇ／ｍｌ（略１６．７ｍＭ）、２４０ｍｇ／ｍｌ（略２０ｍＭ）又はそれ以上）で溶解性を維持する。高い溶解度を促進する１つの構造的な特徴は、抗体単一可変ドメインポリペプチドを比較的小さなサイズにすることである。一般に行われている全長４鎖抗体、例えば、ＩｇＧは約１５０ｋＤのサイズである。これにひきかえ、四つのフレームワーク（ＦＷ）領域及び三つのＣＤＲを含む一般的構造をすべて有している抗体単一可変ドメインは、およそ１２ｋＤのサイズであり、すなわち一般に行われている抗体の１／１０未満のサイズである。同様に、抗体単一可変ドメインは、ｓｃＦｖ分子のサイズ（略２６ｋＤ）の約半分であり、Ｆａｂ分子のサイズ（略６０ｋＤ）の約１／５である。本明細書中に開示されている抗体単一可変ドメインを含んでいる構造のサイズは１００ｋＤ以下であり、例えば、約９０ｋＤ以下、８０ｋＤ以下、７０ｋＤ以下、６０ｋＤ以下、５０ｋＤ以下、４０ｋＤ以下、３０ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、約１２ｋＤ（１２ｋＤを含む）までの構造を含むか、又は分離された抗体単一可変ドメインであることが好ましい。
【０３５７】
ポリペプチドの溶解度は、一次的にアミノ酸側鎖と周辺の溶媒との相互作用によって決定される。疎水性側鎖は、ポリペプチドが折り畳まれるので内部的に偏在し、ポリペプチドの溶媒と相互作用する表面から遠くなる傾向にある。反対に、親水性残基は、ポリペプチドの溶媒と相互作用する表面に偏在する傾向にある。一般に、より多い数の親水性の残基が水性環境に曝露するように分子が折り畳まれることを可能にする一次配列を有するポリペプチドは、より少ない数の親水性残基が表面に曝露するように折り畳まれる場合と比較してより可溶性である。従って、疎水性及び親水性残基の配列及び数は、溶解度を決める重要な要因である。ポリペプチドの溶解度を決める他のパラメーターには、溶媒ｐＨ、温度及びイオン強度が含まれる。通常の実施では、グリセロール（例えば、略１０％ｖ／ｖ）を溶液に添加することによって、ポリペプチドの溶解度を維持又は増大させることができる。
【０３５８】
上記に検討したように、一般に、ヒトＶHドメインと比較してより可溶性であるキャメリド種のＶHドメインで変化するヒトＶHドメインの保存された残基中に特定のアミノ酸残基が同定された。こうしたものには、例えば、Ｇｌｙ４４（キャメリド類のＧｌｕ）、Ｌｅｕ４５（キャメリド類のＡｒｇ）及びＴｒｐ４７（キャメリド類のＧｌｙ）が含まれる。ＴｒｐからＡｒｇへの突然変異がＶH溶解性の増加を付与する傾向があり、ＶHのアミノ酸残基１０３もまた、溶解性に関係している。
【０３５９】
本明細書中で説明されている好ましい側面では、抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＤＰ４７生殖細胞系列ＶH遺伝子断片又はＤＰＫ９生殖細胞系列Ｖk遺伝子断片に基づく。従って、こうした生殖細胞系列遺伝子セグメントは、特に本明細書中に述べられている選択された構造的位置で多様化される場合、可溶性の高い特定の結合の抗体単一可変ドメインポリペプチドを生成することができる。一側面では、特に多様化されないこの四つのフレームワーク領域は、その結果生じるタンパク質の高い溶解性に寄与することができる。
【０３６０】
公知の高溶解性を有するものに高い相同性がある単一ヒト抗体可変ドメインもまた、溶解性が高い傾向にあることになることが予想される。従って、所与の抗体単一可変ドメインが本明細書中で報告されている高溶解度を有することになるであろうという予測又は認識の一手段として、抗体単一可変ドメインポリペプチドの配列を、公知の溶解度を有する１つ若しくはそれより多い抗体単一可変ドメインポリペプチドと比較することができる。すなわち、高い結合親和性を有するが、溶解度は知られていない抗体単一可変ドメインポリペプチドが同定される場合には、そのアミノ酸配列を、高溶解性を持っていることが知られている、一つ若しくは複数（一側面では、複数）のヒト抗体単一可変ドメインポリペプチドの配列（例えば、本明細書中に開示されているｄＡｂ配列）と比較すると、その溶解性を予測することを可能にすることができる。完全な予言者ではないものの、知られている高程度の溶解性配列に対して、例えば、９０−９５％又はそれ以上の類似性が存在する場合、特に親水性アミノ酸残基に対して高程度の類似性が存在するか、又は溶媒境界面で曝露されている可能性がある残基が存在する場合には、新たに同定された結合ポリペプチドは公知の高溶解性配列の溶解性と同様の溶解性を持つであろう可能性がより高い。
【０３６１】
分子モデリングソフトウェアもまた、ポリペプチド配列の溶解度を公知の溶解度のポリペプチドの溶解度と比較して予測することに使用されることができる。例えば、溶媒に曝露した表面での疎水性残基の置換又は付加によって、そうした位置に暴露されているより低い疎水性の、又はそれどころか親水性の残基を有している溶解性が知られている分子と比較してポリペプチドの相対的溶解性を減少させることが見込まれる。同様に、こうした位置でより親水性である残基の置換又は付加によって、相対的溶解性が増加することが見込まれる。すなわち、公知の溶解性を有する抗体単一可変ドメインポリペプチド構造と比較して、分子の表面に位置する親水性又は疎水性残基のネットの数の変化（又は表面に曝露した残基の疎水性又は親水性特質の全体）によって、抗体単一可変ドメインポリペプチドの相対的溶解度を予測することができる。
【０３６２】
あるいは、又はこうした予測と併せて、単にポリペプチドを濃縮させることにより、抗体単一可変ドメインポリペプチドの溶解性の限界を決定することができる。
【０３６３】
親和性決定
本明細書中に記載されている分離された抗体単一可変ドメインポリペプチド含有ポリペプチドは、一側面では、少なくとも５００ｎＭ以下の親和性（解離定数、Ｋd＝Ｋoff／Ｋon）、及び一側面では、少なくとも４００ｎＭ〜５０ｐＭ、３００ｎＭ〜５０ｐＭ、２００ｎＭ〜５０ｐＭ、及び更なる側面では、少なくとも１００ｎＭ〜５０ｐＭ、７５ｎＭ〜５０ｐＭ、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、２５ｎＭ〜５０ｐＭ、１０ｎＭ〜５０ｐＭ、５ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜５０ｐＭ、９５０ｐＭ〜５０ｐＭ、９００ｐＭ〜５０ｐＭ、８５０ｐＭ〜５０ｐＭ、８００ｐＭ〜５０ｐＭ、７５０ｐＭ〜５０ｐＭ、７００ｐＭ〜５０ｐＭ、６５０ｐＭ〜５０ｐＭ、６００ｐＭ〜５０ｐＭ、５５０ｐＭ〜５０ｐＭ、５００ｐＭ〜５０ｐＭ、４５０ｐＭ〜５０ｐＭ、４００ｐＭ〜５０ｐＭ、３５０ｐＭ〜５０ｐＭ、３００ｐＭ〜５０ｐＭ、２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、２００ｐＭ〜５０ｐＭ、１５０ｐＭ〜５０ｐＭ、１００ｐＭ〜５０ｐＭ、９０ｐＭ〜５０ｐＭ、８０ｐＭ〜５０ｐＭ、７０ｐＭ〜５０ｐＭ、６０ｐＭ〜５０ｐＭであるか、又は更に５０ｐＭ程度でもある親和性を有する。
【０３６４】
抗体単一可変ドメイン、例えば、抗体単一可変ドメインポリペプチド又は他の一価の抗体単一可変ドメインの抗原結合親和性は、Biacore system（Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.）を用いる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）（ＳＰＲ）によって好都合に測定することができる。この方法では、抗原が公知の濃度でビアコア(Biacore)チップに結合され、そして可変ドメインポリペプチドが取り入れられる。単一可変ドメインポリペプチドと固定された抗原の間の特異結合は、チップマトリックス上のタンパク質濃度増加及びＳＰＲシグナルの変化をもたらす。ＳＰＲシグナルの変化は、共鳴単位（ＲＵ）として記録され、センサーグラムのＹ軸に沿って時間に対して表示される。ベースラインシグナルは、溶媒（例えば、ＰＢＳ）だけをチップ上を通過させて得られる。ベースラインシグナルと抗体単一可変ドメイン注入完了後のシグナルの間のネットの差は、所与のサンプルの結合値を表す。オフ速度（off rate；Koff）、オン速度（on rate；Kon）及び解離速度（Ｋd）定数を決定するために、BIAcore速度論的評価ソフトウエア（Biacore kinetic evaluation software）（例えば、バージョン２．１）が使用される。
【０３６５】
従って、ＳＰＲは、一価の抗ＣＤ２８抗体製剤によるＣＤ８０又はＣＤ８６に結合するＣＤ２８の拮抗作用を、この一価抗体製剤により引き起こされるＣＤ２８のＣＤ８０又はＣＤ８６への結合の置き換え（displacement）又は阻害を測定することによって、モニタリングすることに使用することができる。ＳＰＲはまた、本明細書に記載されている抗体製剤中のＦｃ領域を介して発生する二量体化、又は一側面では、二量体化の欠如をモニタリングすることに使用することも可能である。
【０３６６】
高親和性は、抗原の表面と抗体又は抗体フラグメントのＣＤＲの間の相補性に左右される。相補性は、標的の部分とＣＤＲの間で起こりうる分子相互作用、例えば、潜在的イオン相互作用、ファンデルワールス（van der Waals）引力、水素結合、又は起こり得るその他の相互作用の種類及び強度によって決定される。ＣＤＲ３は、ＣＤＲ１及び２と比較して抗原結合相互作用により大きく寄与する傾向があり、これは、恐らく高い一般により大きなサイズであることのためであり、好ましい表面相互作用に、より多くの機会を提供する（例えば、Padlan et al., 1994, Mol. Immunol. 31：169-217；Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196：904-917；及びChothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186：651-663参照）。高親和性は、高度の相補性を有する抗体単一可変ドメイン／抗原ペアリングを示し、この相補性は、可変ドメイン及び標的の構造に直接関連している。
【０３６７】
一つの側面では、一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメイン、例えば、抗体単一可変ドメインポリペプチドは、別の抗体単一可変ドメインに結合し、それぞれ個々の抗体単一可変ドメインが相異なる同種抗原（cognate antigen）に結合することができるヘテロダイマー（heterodimer）を形成する。抗体単一可変ドメインのような抗体単一可変ドメインを、各モノマーが相異なる標的抗原に結合するヘテロダイマーとして融合させると、例えば、それぞれの標的抗原を架橋することができるデュアル特異的リガンドを生成することができる。こうしたデュアル特異的リガンドは、サイトカイン、及び有機体の体の中で治療状況に相乗的に協働する他の分子をターゲティングすることに使用することができる。すなわち、二つ若しくはそれより多いサイトカインに結合することができるデュアル特異的抗体のヘテロダイマーを投与することを含む、二つ若しくはそれより多いサイトカインの活性に相乗作用を与える方法が提供される。
【０３６８】
本明細書中で説明されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８結合抗体単一可変ドメインクローン、及び高親和性を有する標的抗原にも結合する実質的な配列同一性を有するクローンを含む。
【０３６９】
同一性の更なる尺度は、高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成する能力である。すなわち、第一の配列が、高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory
Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New Yorkによって記載されている）第二の配列（又はその補体（complement））とハイブリッド形成する場合、抗体単一可変ドメインポリペプチドをコードする第一の配列は、第二のコードする配列と実質的に類似している。“高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（Highly stringent hybridization conditions）”とは、約４５℃、６Ｘ ＳＳＣでのハイブリダイゼーション、引き続いて６５℃、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回若しくは複数回の洗浄を意味する。“より高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（Very highly stringent hybridization conditions）”とは、６５℃、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、引き続いて６５℃、０．２Ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回若しくは複数回の洗浄を意味する。
【０３７０】
４．０  ＣＤ２８活性のアッセイ
例示的な実施態様では、本明細書中に記載されている一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８に結合するが、実質的にＣＤ２８シグナリングにはアゴナイズしない。ＣＤ２８経路の活性化は、いくつかの様々な結果を示しており、こうした結果は、この経路の活性に関する所与の一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインの作用を評価するために測定できる。しかしながら、本明細書中に記載されている一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインのアンタゴニスト又はアゴニスト機能の評価のためには、少なくとも一つの次のＣＤ２８アッセイが使用しうる。
【０３７１】
一実施態様では、Ｔ細胞の活性化が測定される。このアッセイでは、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３とＣＤ８０又はＣＤ８６を発現するトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いて刺激される。これはＴ細胞の増殖をもたらし、また抗ＣＤ２８ ｍＡｂが増殖応答を遮断するのでＣＤ２８依存性である。
【０３７２】
別の実施態様では、Ｔ細胞増殖誘導及びサイトカイン分泌誘導が測定される。このアッセイは、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ９．３で刺激することを含む（Gibson, et al. (1996) JBC, 271：7079-7083）。これはＴ細胞受容体介在シグナリングのアップレギュレーション、そしてサイトカインの分泌をもたらし、またｍＡｂ ９．３が増殖応答を遮断するのでＣＤ２８依存性である。測定されうる分泌されるサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−Ｉ０、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γが含まれるが、それらには限定されない。一つ若しくはそれより多いこうしたサイトカインが本明細書中で説明されている開示に従って検出され、及び／又は測定される。
【０３７３】
本明細書中の開示に基づいて、本明細書中で説明されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインが多くの機能及び活性を保有しており、それ故、多くの異なるアッセイによってアッセイできることは理解されるところである。本明細書中の他の箇所で詳細に説明したように、抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、多くの特徴づける特性（例えば、とりわけ、ＣＤ２８結合親和性、ＣＤＲドメイン同一性、及びアミノ酸配列）を有しており、それ故、それぞれの異なるポリペプチドは、多くの方法で、そして多くのパラメータによって特徴づけることができる。それぞれのこうしたポリペプチドのキャラクタリゼーションは、それ故、単独又はこのポリペプチドの活性及び／又はＣＤ２８結合特性と併せて、ポリペプチドのユニークな同定特性を提供することができる。
【０３７４】
５．０  ＣＤ２８一価結合体のＰＥＧ化
また本明細書中では、非ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインと比較して、半減期の増加、また一側面では、更に活性（例えば、結合親和性）の損失なしに分解に対する抵抗性を有するＰＥＧ化一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインが提供される。
【０３７５】
タンパク質分子の部位特異的及びランダムＰＥＧ化の双方は、当技術分野で知られている（例えば、 Zalipsky and Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and
Biomedical Applications 1992, pp 347-370, Plenum, NY; Goodson and Katre, 1990, Bio/Technology, 8：343; Hershfield et al., 1991, PNAS 88：718５参照）。より詳しくは、抗体分子のランダムＰＥＧ化は、リシン残基とチオール基を導入した誘導体で述べられている（Ling and Mattiasson, 1983, Immunol. Methods 59：327; Wilkinson et al., 1987, Immunol. Letters, 15：17；Kitamura et al., 1991, Cancer Res. 51：4310；Delgado et al., 1996 Br. J. Cancer, 73：175; Pedley et al., 1994, Br. J. Cancer, 70:1126）。
【０３７６】
それ故、この側面による一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、当技術分野で知られている方法を用いて、本明細書中に包含される半減期の増加と分解抵抗性特性を達成するのに有用なポリマー分子（一側面ではＰＥＧ）に結合することができる。利用できるポリマーモイエティは、合成でも、天然に存在しているものであってもよく、そして、直鎖又は分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は、ホモ又はヘテロ多糖類のような分枝型又は非分枝型の多糖類を含むが、これらには限定されない。使用できる合成ポリマーの好ましい例には、直鎖又は分枝鎖ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、又はポリ（ビニルアルコール）、及びその誘導体又は置換形態が含まれる。有用な、特に好適な置換ポリマーとしては、メトキシ（ポリエチレングリコール）を含む置換ＰＥＧが含まれる。ＰＥＧに加えて、又はＰＥＧの代りに本明細書中で使用できる天然に存在するポリマーモイエティには、当技術分野の当業者が認めているところであるラクトース、アミロース、デキストラン、又はグリコーゲン、並びにその誘導体が含まれる。本明細書中で説明されているポリマー分子の誘導体化形態には、例えば、その中に存在する更なるモイエティ又は反応性基を有し、本明細書中に記載されているｄＡｂポリペプチドのアミノ酸残基との相互作用を可能にする誘導体が含まれる。こうした誘導体には、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、スクシンイミジルプロピオナートポリマー、並びにマレイミド、ビニルスルホン及びチオールのようなスルフィドリル選択性反応性剤が含まれる。特に好ましい誘導体化されたポリマーには、構造式：ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ2−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ2−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ2ＣＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ2−ＮＨＳ；ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨＳ；及びＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ2−ＮＨＳ［上記において、Ｒは（ＣＨ2）4）ＮＨＣＯ2（ｍＰＥＧ）である］を有するＰＥＧポリマーが含まれるが、これには限定されない。本明細書中で説明されている有用なＰＥＧポリマーは、線状分子であってもよく、又は多数のＰＥＧモイエティが単一ポリマー内に存在する分枝状であってもよい。本明細書中で説明されているように有用であるいくつかの特に好ましいＰＥＧ誘導体には、下記に図解されているｍＰＥＧ−ＭＡＬ、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ、ｍＰＥＧ−（ＭＡＬ）2、マルチアームＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、及びｍＰＥＧ２−（ＭＡＬ）2が含まれるが、これには限定されない。
【０３７７】
【化２】
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【０３７８】
反応性基（例えば、ＭＡＬ、ＮＨＳ、ＳＰＡ、ＶＳ、又はチオール）は、ＰＥＧポリマーに直接結合してもよく、又はリンカー分子を介してＰＥＧに結合してもよい。
【０３７９】
本明細書中で説明されている有用なポリマーのサイズは、５００Ｄａ〜６０ｋＤａの間、例えば、１０００Ｄａ〜６０ｋＤａの間、１０ｋＤａ〜６０ｋＤａの間、２０ｋＤａ〜６０ｋＤａの間、３０ｋＤａ〜６０ｋＤａの間、４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの間、及び５０ｋＤａ〜６０ｋＤａまでの範囲であることができる。本明細書中で使用されるポリマー、特にＰＥＧは、直鎖ポリマーであっても、又は分枝状コンフォメーションを保有していてもよい。分子量及びコンフォメーションの組み合わせに応じて、本明細書中で説明されている有用なポリマー分子は、一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインに結合する場合、平均流体力学的サイズが２４〜５００ｋＤａの間を有する分子を生成する。本明細書中で使用するポリマー分子の流体力学的サイズとは、水溶液による分子の拡散に基づく分子（例えば、タンパク質分子）の見かけのサイズを意味する。溶液によるタンパク質の拡散又は運動は、このタンパク質の見かけのサイズを誘導するように処理されることができるが、その場合のサイズは、このタンパク質粒子のストークス半径又は流体力学的半径によって与えられる。タンパク質の“流体力学的サイズ(hydrodynamic size)”は、質量及び形状（コンフォメーション）の双方に依存し、その結果同一の分子量を有する二つのタンパク質が全体のタンパク質のコンフォメーションに基づく異なる流体力学的サイズを持つことができる。ＰＥＧ結合の一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメイン［例えば、本明細書中に記載されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメイン］の流体力学的サイズは、２４ｋＤａ〜５００ｋＤａ；３０〜５００ｋＤａ；４０〜５００ｋＤａ；５０〜５００ｋＤａ；１００〜５００ｋＤａ；１５０〜５００ｋＤａ；２００〜５００ｋＤａ；２５０〜５００ｋＤａ；３００〜５００ｋＤａ；３５０〜５００ｋＤａ；４００〜５００ｋＤａ；及び４５０〜５００ｋＤａの範囲であることができる。例示的な実施態様では、本明細書中に記載されているＰＥＧ化抗体単一可変ドメインの流体力学的サイズは、３０〜４０ｋＤａ、７０〜８０ｋＤａ又は２００〜３００ｋＤａである。すなわち、一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインに結合したポリマー分子のサイズは、所望する適用次第で変更可能である。例えば、ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインが循環系から離れ、そして末梢組織に入ることを意図する場合には、結合したポリマーのサイズを、血流からの溢出（extravazation）を容易とするために、低く保つことが望ましい。あるいは、ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインが、より長い間循環血液中に留まることを所望する場合は、より高い分子量ポリマーを使用することができる（例えば、３０〜６０ｋＤａポリマー）。
【０３８０】
本明細書中で説明されている有用なポリマー（ＰＥＧ）分子は、当技術分野で周知の方法を用いて抗体単一可変ドメインに結合することができる。ＰＥＧ又はその他のポリマーモイエティが抗体単一可変ドメインに結合する際の第一段階は、求電子剤含有官能基によるＰＥＧポリマーのヒドロキシル末端基の置換である。特に、ＰＥＧポリマーは、抗体単一可変ドメイン内に存在するシステイン又はリシン残基に結合する。システイン及びリシン残基は、天然起源であってもよいし、又は遺伝子操作して抗体単一可変ドメイン分子内に導入してもよい。例えば、システイン残基は、抗体単一可変ドメインのＣ末端で組換え操作することもできるし、又は抗体単一可変ドメイン中の特定の溶媒露出部位（at specific solvent accessible location）の残基をシステイン又はリシンで置換することもできる。好ましい実施態様では、ＰＥＧモイエティは、抗体単一可変ドメインのＣ末端におけるヒンジ領域内に存在するシステイン残基に結合する。
【０３８１】
更に好ましい実施態様では、ＰＥＧモイエティ又は他のポリマーは、天然起源であるか、若しくは本明細書中で説明されている抗体単一可変ドメインポリペプチドのＮ末端に遺伝子操作で導入されたシステイン又はリシンに結合する。それに加えて更なる実施態様では、ＰＥＧモイエティ又は他のポリマーは、抗体単一可変ドメインポリペプチドのＣ及び／又はＮ末端から少なくとも２個の残基が離れている（例えば、内部の方向へ）システイン又はリシン残基（天然起源であるか、又は遺伝子操作される）で、本明細書中で説明されている抗体単一可変ドメインと結合する。
【０３８２】
一つの実施態様では、ＰＥＧポリマーは、抗体単一可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷｓ）及び一つ若しくはそれより多い異種ＣＤＲ中に存在する一つ若しくはそれより多いシステイン又はリシン残基に結合する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（例えば、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３、及びＦＷ１〜ＦＷ４）は、免疫学的利益に関するタンパク質配列のカバットデータベース（Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.）中で定義されている抗体可変ドメインのこうした領域である。好ましい実施態様では、ＰＥＧポリマーは、ＶHフレームワーク断片ＤＰ４７、又はＶkフレームワーク断片ＤＰＫ９内のシステイン又はリシン残基に結合する。本明細書中で開示されるＰＥＧに結合しうるＤＰ４７のシステイン及び／又はリシン残基は、配列番号１の位置２２又は位置９６のシステイン、そして位置４３、６５、７６、又は９８のリシンを含む。本明細書中に開示されているＰＥＧに結合しうるＤＰＫ９のシステイン及び／又はリシン残基は、配列番号３の位置２３又は８８のシステイン残基、そして位置３９、４２、４５、１０３又は１０７のリシン残基を含む。加えて、特定のシステイン又はリシン残基は、ＶHカノニカルフレームワーク領域ＤＰ３８、又はＤＰ４５内でＰＥＧに結合しうる。
【０３８３】
加えて、天然起源のシステイン又はリシン残基ではない、抗体分子内の特定の溶媒露出部位は、ＰＥＧポリマーに結合するためにシステイン又はリシンに突然変異することもありうる。任意の所与の抗体、例えばｄＡｂ中の溶媒露出残基は、抗体単一可変ドメインの結晶構造分析のような、当技術分野で知られている方法を用いて決定することができる。例えば、ＶH ｄＡｂ ＨＥＬ４（配列番号３２７、鶏卵リゾチームに結合するｄＡｂ）の解決済の（solved）結晶構造を用いて、残基Ｇｌｎ−１３、Ｐｒｏ−１４、Ｇｌｙ−１５、Ｐｒｏ−４１、Ｇｌｙ−４２、Ｌｙｓ−４３、Ａｓｐ−６２、Ｌｙｓ−６５、Ａｒｇ−８７、Ａｌａ−８８、Ｇｌｕ−８９、Ｇｌｎ−１１２、Ｌｅｕ−１１５、Ｔｈｒ−１１７、Ｓｅｒ−１１９、及びＳｅｒ−１２０は、溶媒露出であると確認され、そして本明細書中に開示されており、ＰＥＧポリマーに結合するための、システイン又はリシン残基への突然変異の場合の魅力的な候補であろう。加えて、Ｖkダミー（ｄｕｍｍｙ）ｄＡｂ（配列番号３２８）の解決済みの結晶構造を用いて、残基Ｖａｌ−１５、Ｐｒｏ−４０、Ｇｌｙ−４１、Ｓｅｒ−５６、Ｇｌｙ−５７、Ｓｅｒ−６０、Ｐｒｏ−８０、Ｇｌｕ−８１、Ｇｌｎ−１００、Ｌｙｓ−１０７、及びＡｒｇ−１０８は、溶媒露出であると確認され、そして本明細書中に開示されており、ＰＥＧポリマーに結合するための、システイン又はリシン残基への突然変異の場合の魅力的な候補であろう。本明細書中に開示されている一実施態様では、ＰＥＧポリマーは、溶媒露出の多数のシステイン又はリシン残基に、又はシステイン又はリシン残基に突然変異した溶媒露出残基に結合される。あるいは、特定の抗体単一可変ドメインがただ１つの溶媒露出のシステイン又はリシン（又はシステイン又はリシンに改変する残基）を保有する場合、又は特定の溶媒露出残基が幾つかのこうしたＰＥＧ化のための残基の中から選択される場合、ただ１つの溶媒露出残基がＰＥＧに結合する。
【０３８４】
【表３】
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【０３８５】
本明細書中に開示されている幾つかのＰＥＧ結合スキームは、Nektar（SanCarlos, CA）から得ることができる。例えば、ＰＥＧ又は他のポリマーのリシン残基への結合を所望する場合には、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド、例えばスクシンイミジルプロピオネートに誘導体化されたＰＥＧポリマーの活性エステルを使用することができる。システイン残基への結合を所望する場合には、マレイミド、ビニルスルホン又はチオールのようなスルフヒドリル選択的試薬で誘導体化したＰＥＧポリマーを使用してもよい。ＰＥＧ化抗体を作製するために本明細書中で開示されるように使用することができるＰＥＧ誘導体の具体的な実施態様の他の例は、Nektarカタログ（ワールド ワイド ウェブ nektar.comから入手可能）に見出すことができる。加えて、ＰＥＧの幾つかの誘導体化された形態は、本明細書中の開示と同様に使用でき、ＰＥＧポリマーの抗体単一可変ドメインへの結合を容易にすることができる。本明細書中で開示されるＰＥＧ誘導体としては、ＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ウレタン結合ＰＥＧ、ＰＥＧフェニルカルボナート、ＰＥＧスクシンイミジルカルボナート、ＰＥＧカルボキシメチルアジド、ジメチルマレイン酸無水物ＰＥＧ、ＰＥＧジチオカルボナート誘導体、ＰＥＧトレシラート(PEG-tresylate)（２，２，２−トリフルオロエタンスルホナート(2,2,2-trifluoroethanesolfonates)）、ｍＰＥＧイミドエステル、及びZalipsky and Lee,(1992)（“Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of peptides”in Poly(Ethylene Glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Press, NY）に記載されている他のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０３８６】
本明細書中で開示される一実施態様では、抗体単一可変ドメイン及びＰＥＧポリマーを含む抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメイン組成物は、ＰＥＧポリマーの抗体単一可変ドメインに対する比が少なくとも０．２５：１（モル比）である。更なる実施態様では、ＰＥＧポリマーの抗体単一可変ドメインに対するモル比は０．３３：１又はそれ以上である。これに加えて更なる実施態様では、ＰＥＧポリマーの抗体単一可変ドメインに対するモル比は０．５：１又はそれ以上である。
【０３８７】
６．０  ＣＤ２８一価結合体の改変（modification）
６．１．０  カノニカル配列の多様化
いくつかの公知の主鎖コンフォメーション、又は一側面では、単一の公知の主鎖コンフォメーションを選択した後、本明細書中に開示されているリガンド、又は本明細書中で使用されているライブラリを構造的及び／又は機能的な多様性を有するレパートリーを作成するために、この分子の結合部位を変異させることによって構築することができる。これによって、変異体がその構造及び／又はその機能において十分な多様性を保有するようにが作成され、その結果、変異体は様々な活性を提供することができることを意味する。
【０３８８】
所望の多様性は、通例、選択された分子を一つ若しくはそれよい多い位置において変異させることにより作成される。変化される位置は、ランダムに選択することができ、又は一側面では、選択される。次いで変異は、ランダム化、すなわち、この間に、常在のアミノ酸は天然又は合成の任意のアミノ酸若しくはそのアナログによって置き換えられ、非常に多くの数の変異体を生成することによるか、又は常在のアミノ酸の代わりに一つ若しくはそれより多い一定のサブセットのアミノ酸に入れ替え、より限定された数の変異体を生成することによって達成することができる。
【０３８９】
このような多様性を導入するための様々な方法が報告された。間違いがちなＰＣＲ（Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226：889）、化学的突然変異誘発（Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269：9533）、又はバクテリア突然変異誘発菌株（Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260：359）が、分子をコードする遺伝子にランダム突然変異を導入するのに使用することができる。選択された位置を突然変異させる方法はまた、当技術分野において周知であり、そしてＰＣＲを用いるか、又は用いずに、ミスマッチのオリゴヌクレオチド又は退化したオリゴヌクレオチドの使用を含む。例えば、いくつかの合成抗体ライブラリが、突然変異を抗原結合ループにターゲッティングすることにより創成された。ヒト破傷風トキソイド結合ＦａｂのＨ３領域がランダム化され、様々な新しい結合特異性を創成した（Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4457）。ランダム又はセミランダムＨ３及びＬ３領域が、生殖細胞系列Ｖ遺伝子断片に付け加えられ、突然変異されていないフレームワーク領域を有する大きなライブラリが生成された（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227：381；Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4457；Nissim et al. (1994) EMBO  J., 13：692; Griffiths et al.(1994) EMBO J., 13：3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248:97）。こうした多様化は、他の抗原結合ループの一部又は全部を含むように拡大された（Crameri et al. (1996) Nature Med., 2：100；Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13：475; Morphosys, WO 97/08320，上記参照）。
【０３９０】
ループランダム化は、Ｈ３のみのためにおよそ１０15個を超える構造、及び他の５個のループのために同様な大きい数の変異体を創成する可能性を有するので、現在のトランスフォーメーション技術を用いるか、又はそれに加えて無細胞システムを用いて、全ての可能な組み合せを示すライブラリを生成することは実行可能ではない。例えば、現在まで構築された最大のライブラリの一つでは、６×１０10個の異なる抗体が作成されたが、これは、このデザインのライブラリの場合の可能性のある多様性のほんの小部分にすぎない（Griffiths et al. (1994) 上記参照）。
【０３９１】
好ましい実施態様では、分子の所望する機能を創成し、又は改変するために直接関与しているそうした残基だけが多様化される。多くの分子の場合、その機能は、標的に結合することであり、それ故、多様性は、分子の全体的なパッキング、又は選択された主鎖構造を維持することに重要な残基を変化させることを避けながら、標的結合部位に狙いを定めるべきである。
【０３９２】
６．１．０  抗体ドメインに適用する際のカノニカル配列の多様化
本明細書中に開示されているリガンドの場合、標的への結合部位は、抗原結合部位であることが最もしばしばである。従って、非常に好ましい側面では、抗原結合部位中のそうした残基だけが変異する、抗体リガンドの構築の、又は構築のためのライブラリである。こうした残基は、ヒト抗体レパートリーにおいて極めて多様であり、ハイレゾリューション(high-resolution)で抗体／抗原複合体の形で接触することが知られている。例えば、Ｌ２では、天然起源抗体では、位置５０及び５３が多様であり、そして抗原と接触することが観察されることが知られている。対照的に、通常のアプローチでは、Kabat et al. （Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.）によって定義されている、相応する相補性決定領域（ＣＤＲ１）内の残基をすべて多様化し、本明細書中で開示される使用ライブラリでは二つが多様化されるのに比べて、およそ七つの残基が多様化される。このことは、種々の抗原結合特異性を創成するのに必要な機能的多様性の観点から顕著な改善を示している。
【０３９３】
本来、抗体多様性は、２つのプロセス：
ナイーブ一次レパートリー（いわゆる生殖細胞系列及び接合部の多様性）を創成するための生殖細胞系列Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子断片の体細胞組換え、及びその結果生じる再配列されたＶ遺伝子の体細胞超変異（hypermutation）の結果である。ヒト抗体配列分析では、一次レパートリーの多様性は、抗原結合部位の中心に焦点が向けられ、一方、体細胞超変位は、多様性は一次レパートリーに高度に保存されている抗原結合部位の周辺の領域まで拡がっているということが示されている（Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256:813参照）。この相補性は、明らかに抗体にユニークであるものの、ほぼ確実に配列空間を探索するための有効な戦略として発展してきており、他のポリペプチドレパートリーにも容易に適用することができる。この変異する残基は、標的との結合部位を形成するもののサブセットである。標的結合部位における異なる（オーバーラッピングを含む）サブセットの残基は、所望であれば、選択過程中に異なる段階で多様化される。
【０３９４】
抗体レパートリーの場合、初期の‘ナイーブ(naive)’レパートリーが創成されるが、ここで、抗原結合部位の残基の全てではなく、一部が多様化される。用語“ナイーブ(naive)”とは、この文脈中、本明細書で使用される際は、予め定められた標的を有しない抗体分子を意味する。こうした分子は、免疫体系が未だ広範囲な抗原性刺激によって攻撃されたことのない胎児及び新生児個体にはよくあることであるが、免疫多様化を経験していない個体の免疫グロブリン遺伝子によってコードされている分子と似ている。次いで、このレパートリーは種々の抗原又はエピトープに対し選択される。必要に応じて、その後、更なる多様性は初期レパートリーにおける多様化された領域以外で導入することができる。この成熟レパートリーは、改変された機能、特異性又は親和性のために選択することができる。
【０３９５】
抗原結合部位内の残基の一部又は全部が変異された、リガンドの構築のための結合ドメインの二つの異なるナイーブレパートリー、又はリガンドのナイーブライブラリが本明細書中で開示される。“一次（primary）”ライブラリは、多様性を、生殖細胞系列Ｖ遺伝子断片（生殖細胞系列多様性）中で多様であるか、又は組み換えプロセス（接合部多様性）の間に多様化される抗原結合部位の中心の残基に限定し、天然一次レパートリーを模倣している。多様化されるこうした残基には、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４及びＬ９６が含まれるが、これらに限定されない。“体細胞（somatic）”ライブラリでは、多様性は、組換えプロセスの間に多様化される残基（接合部の多様性）、又は体細胞的に高度突然変異される残基に限定される。多様化されるこうした残基には、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４及びＬ９６が含まれるが、これらに限定されない。こうしたライブラリにおける多様化に適する上記に列挙された残基は、すべて、一つ若しくはそれより多い抗体−抗原複合体の形で接触することが知られている。双方のライブラリにおいて、抗原結合部位内の残基の全てが変異されるものではないので、そうすることが所望される場合は、残存する残基を変異させることによって、選択の間に更なる多様性が導入される。当技術分野の当業者であれば、任意のこうした残基（又は抗原結合部位を含む更なる残基）のうちで任意のサブセットは、抗原結合部位の初期及び／又は引き続く多様化に用いることができることは明白なことである。
【０３９６】
本明細書中で開示される使用のためのライブラリの構築において、選択された位置の多様化は、通例、核酸レベルで達成されるが、いくつかの可能なアミノ酸（２０個全て又はそのサブセット）がその位置に導入することができるように、ポリペプチドの配列を明示するコード配列を変更することにより行われる。ＩＵＰＡＣ命名法を用いると、最も多用途のコドンは、ＮＮＫであり、全てのアミノ酸、及びＴＡＧ終止コドンをコードするものである。ＮＮＫコドンは、一側面では、必須な多様性を導入するために用いられる。同じ目的を達成する他のコドンもまた、有用であり、これにはＮＮＮコドンが含まれ、これは更に終止コドンであるＴＧＡ及びＴＡＡの産生をもたらす。
【０３９７】
ヒト抗体の抗原結合部位内の側鎖の多様性の特徴は、特定のアミノ酸残基を好む顕著な偏りである。それぞれのＶH、Ｖκ及びＶλ領域において、１０個の最も多様な位置のアミノ酸組成をまとめると、７６％を超える側鎖の多様性は、７個だけの異なる残基から生じるが、これらは、セリン（２４％）、チロシン（１４％）、アスパラギン（１１％）、グリシン（９％）、アラニン（７％）、アスパラギン酸（６％）及びトレオニン（６％）である。こうした親水性残基及び主鎖のフレキシビリティを提供することができる小さな残基に対する偏りは、恐らく広範囲な抗原又はエピトープに結合する素因を持っている表面の進化を反映するものであり、一次レパートリーにおいて抗体に必須の二股（promiscuity）を説明するのに役に立つこともできる。
【０３９８】
アミノ酸の分布を模倣することが好ましいので、変異される位置のアミノ酸の分布は、一側面では、抗体の抗原結合部位にとらえられるものを模倣する。種々の標的抗原に対するいくつかのポリペプチド（抗体単一可変ドメインだけではない）の選択を可能にするアミノ酸の置換におけるそのような偏りは、いずれのポリペプチドレパートリーにも容易に適用される。変異される位置のアミノ酸の分布を偏らせる種々の方法があり（トリ−ヌクレオチド突然変異誘発の使用を含む、ＷＯ ９７／０８３２０号参照）、その中では好ましい方法は合成の容易さにより、従来から使用されている縮退コドンを使用することである。縮退コドンの全ての組み合せ（各位置において等しい割合で、一重（single）、二重（double）、三重（triple）び四重縮退（quadruple degeneracy）を有すること）によりコードされたアミノ酸プロファイルを、天然アミノ酸使用と比較することにより、最も代表的なコドンを算出することが可能となる。このコドン（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）Ｔ、（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）Ｃ、及び（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）（ＣＴ）は、所望のアミノ酸プロファイルに最も近接したコドンである：これらは、２２％のセリン及び１１％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン、及びシステインをコードし、そして一側面では、こうしたコドンはライブラリの構築に使用される。
【０３９９】
６．２．０  マルチプル抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチド
本明細書中ではまた、それぞれ、個別の特異性を有する抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチドが提供される；すなわち、デュアル特異的リガンドにより結合される第一及び第二エピトープは、一側面では、異なっているか、又はそれぞれの可変ドメインによって結合されている同一のエピトープの二つのコピーである。“デュアル特異的ポリペプチド（デュアル-特異的 polypeptide）”とは、本明細書中で使用されている際は、本明細書中で定義されている第一抗体単一可変ドメイン及び第二抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、上記において、この可変ドメインが、それぞれ、二つの異なった抗原のうちの一つに結合することができるか、又は同一抗原上の二つのエピトープのうちの一つに結合することができることを意味する。例えば、この二つのエピトープは、同一抗原上にあってもよい。本明細書中で開示されるデュアル特異的ポリペプチドは、異なる特異性を有し、そして同一特異性を有する互いに相補的な可変ドメインペアを含まない抗体単一可変ドメインから構成される。デュアル特異的ポリペプチドは、ポリペプチド、タンパク質、又は核酸であってもよいし、又はそれらの一部であってもよく、それらは天然起源であってもよく、合成であってもよい。この点で、本明細書中で開示されるこの抗体単一可変ドメインは、エピトープ又は抗原に結合することができ、そしてアンタゴニスト又はアゴニストとして働く（例えば、ＣＤ２８アンタゴニスト）。一つの実施態様ではこのデュアル特異的ポリペプチドのエピトープ結合ドメインは、同一エピトープ特異性を有し、そして、エピトープの複数コピー（multiple copies）が同一抗原上に存在する場合、例えば、同時にこれらのエピトープに結合することができる。別の実施態様では、こうしたエピトープは、リガンドがエピトープに結合し、抗原と架橋することができるように、異なった抗原上に提供される。当技術分野の当業者であれば、エピトープ及び抗原の選択範囲が大きく、多様性に富んでいることは理解されるであろう。そうしたものには、例えば、ヒト又は動物のタンパク質、細胞表面タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素のための酵素補助因子（enzymes co-factors for enzymes）又はＤＮＡ結合タンパク質がありうる。
【０４００】
本明細書中で開示されるデュアル特異的ポリペプチドの一つの実施態様では、この可変ドメインは、第一及び／又は第二抗原又はエピトープに対して向けられる抗体から由来する。好ましい実施態様では、この可変ドメインは、単一可変抗体ドメインのレパートリーから由来する。一つの例では、このレパートリーは、動物又は合成レパートリー中で創成されないレパートリーである。別の例では、この単一可変ドメインは、動物免疫化によって分離（少なくとも一部でも）されない。すなわち、この抗体単一可変ドメインは、ナイーブライブラリから分離されうる。
【０４０１】
別の側面では、第一エピトープ結合特異性を有する第一エピトープ結合抗体単一可変ドメイン、及び第二エピトープ結合特異性を有する非相補性第二エピトープ結合抗体単一可変ドメインを含むマルチ特異的ポリペプチド(multi-specific polypeptide)が本明細書中で開示される。第一及び第二結合特異性は、同一であっても、又は相異なっていてもよい。
【０４０２】
更なる側面では、第一エピトープ結合特異性を有する第一エピトープ抗体単一可変ドメイン、及び第二エピトープ結合特異性を有する非相補性第二エピトープ抗体単一可変ドメインを含む閉鎖型コンフォメーションマルチ特異的ポリペプチドが本明細書中で開示されており、上記において、この第一及び第二結合特異性は、閉鎖型コンフォメーションマルチ特異的ポリペプチドが双方のエピトープに同時に結合しないように、エピトープ結合を目指して競合することができる。
【０４０３】
これに加えて更なる側面では、非相補性抗体単一可変ドメインを含む開放型コンフォーメーションポリペプチドが本明細書中に開示されており、上記において、こうしたドメインは同一の標的上の異なったエピトープに対して特異的である。こうしたポリペプチドは、増加された結合活性で標的に結合する。同様に、同一エピトープに対して特異的であり、そして複数の前記エピトープコピーを含む標的を対象とする非相補性抗体単一可変ドメインを含む多価のポリペプチドが本明細書中に開示されている。
【０４０４】
類似の一側面では、本明細書中で開示される非相補性抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドは、個々のエピトープに結合することが治療的には有意ではないが、二つのエピトープに結合することから生じる結合活性の増加によって治療的有用性が提供されるように、低親和性を有する個々のエピトープに結合するようにコンフィギュレーションすることができる。特別の例では、正常な細胞タイプでは別々に存在するが、腫瘍細胞などの異常のある又は病的な細胞に限って、一緒に存在するエピトープがターゲッティングとなりうる。こうした状況では、異常のある又は病的な細胞のみが、本明細書中に開示されている非相補性抗体単一可変ドメインを含む二重特異的ポリペプチド(bispecific polypeptides)により有効にターゲッティングされる。
【０４０５】
同一標的（キレートｄＡｂと呼ばれている）上の同一エピトープ、又は隣接したエピトープの複数コピーに対して特異的な非相補性抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドはまた、三つ、四つ、又はそれより多い非相補性抗体単一可変ドメイン含む三量体(trimeric)又は多量体(polymeric)（四量体(tetrameric)又はそれ以上）でありうる。例えば、リガンドは、三つ又は四つのＶHドメイン又はＶLドメインを含んで構築することができる。
【０４０６】
更に、マルチサブユニット標的に結合する非相補性抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドが提供され、上記において、それぞれの結合ドメインが前期標的のサブユニットに対して特異的である。このリガンドは、二量体であっても、三量体であっても又は多量体であってもよい。
【０４０７】
本明細書中ではまた、第一抗原に結合特異性を有する第一抗体単一可変ドメイン、及び第二抗原に結合特異性を有する第二抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチドが開示されており、上記において、第一抗原はＣＤ２８であり、そして第二単一可変ドメインは、抗原提示細胞表面抗原又はＴ細胞表面抗原、例えば、Ｔ細胞受容体である。抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面抗原は、樹状細胞表面抗原、活性化されたマクロファージ表面抗原、活性化されたＢ細胞表面抗原、共刺激シグナル経路表面抗原、及びＭＨＣ ＩＩアルファ又はベータなどのＭＨＣから成る群の一つより選択されうる。
【０４０８】
例示的な実施態様では、本明細書中で開示される上記側面によるマルチ特異的ポリペプチド（multi-specific polypeptide）は、
ａ）第一エピトープに結合する能力により第一エピトープ結合単一可変ドメインを選択すること；
ｂ）第二エピトープに結合する能力により第二エピトープ結合単一可変ドメインを選択すること；
ｃ）このエピトープ結合単一可変ドメインを結合させること(combining the epi  tope
binding single variable domains)；及び
ｄ）前記第一エピトープ及び前記第二エピトープに結合する能力により閉鎖型コンフォメーションマルチ特異的ポリペプチドを選択すること、
の工程を含む方法によって得られる。
【０４０９】
第一エピトープ結合単一可変ドメイン及び第二エピトープ結合単一可変ドメインは、非相補性抗体可変ドメインであり、上記において、それぞれの単一可変ドメインは、その抗原、又は本明細書中で定義されている第二単一可変ドメインとは独立して、同種のリガンドに結合することが有利である。例えば、こうしたマルチ特異的ポリペプチドは次の限定されないフォーマット：ＶH−ＶH又はＶL−ＶL単一可変ドメインを有しうる。
【０４１０】
特に、抗体単一可変ドメインを含む、又は抗体単一可変ドメインから成るキレートポリペプチドは、本明細書中で開示される好ましい側面に従って、すなわちアンカー抗体単一可変ドメインを使用して調製することができるが、上記において、二量体、三量体又は多量体抗体単一可変ドメインのライブラリがリンカー配列の上流又は下流にある定常抗体単一可変ドメインを、このリンカーの反対側に挿入されている第二、第三及び更なる抗体単一可変ドメインのレパートリーと一緒に含むベクターを用いて構築される。代替法では、例えば、ＶHとＶkである結合ドメイン間の非共有結合又は天然親和性を用いて、リンカーを使用することを避けることもできる。
【０４１１】
それゆえ、
（ａ）標的上の第一エピトープに対して特異的な抗体単一可変ドメインをコードする核酸配列を含むベクターを提供する；
（ｂ）前記標的上の第二エピトープに対して特異的な第二抗体単一可変ドメインを含むレパートリーをコードするベクターを提供することであって、当該エピトープは、第一エピトープと同一であるか、又は異なってもよく、前記第二エピトープは、前記第一エピトープに隣接しており；そして
（ｃ）前記第一及び第二抗体単一可変ドメインを発現させる；及び
（ｄ）一緒に結合して標的−結合二量体を産生している、第一及び第二抗体単一可変ドメインのこうした結合を分離する、
工程を含む抗体単一可変ドメインを含む多量体ポリペプチド（multimeric polypeptide)の製造方法が提供される。
【０４１２】
この第一及び第二エピトープは、多量体ポリペプチドが双方のエピトープに同時に結合することができるように隣接しており、これは結合の結合活性の増加の利益をもたらしている。このエピトープが同一である場合、標的上のエピトープの複数コピーの存在により結合活性の増加が得られ、結合活性の増加の効果を得るために少なくとも二つのコピーが同時に結合することが可能となる。
【０４１３】
本明細書中に開示されている第二のコンフィギュレーションの上記の側面の代替的実施態様では、少なくとも一つのエピトープ結合ドメインは、本明細書中に定義されているような非免疫グロブリン‘タンパク質スカフォールド（protein scaffold）’又は‘タンパク質骨格（protein skeleton）’を含む。適切な非免疫グロブリンタンパク質スカフォールドには、上記で説明されているＳｐＡ、フィブロネクチン、ＧｒｏＥＬ及び他のシャペロン、リポカリン、ＣＴＬＡ４及びアフィボディー（affibodies）からなる群より選択されるいずれかが含まれるが、これに限定されない。
【０４１４】
本明細書中で開示される第二のコンフィグレーションの上記の側面によれば、このエピトープ結合ドメインは‘タンパク質骨格’に結合する。本明細書中に開示されているタンパク質骨格は、免疫グロブリン骨格であることが有利である。
【０４１５】
用語“免疫グロブリン骨格(immunoglobulin skeleton)”とは、本明細書中で使用される際は、少なくとも一つの免疫グロブリン折り畳みを含み、そして本明細書中で定義されている１つ若しくはそれより多いエピトープ結合ドメインのための核として働くタンパク質を意味する。
【０４１６】
本明細書中で定義されている免疫グロブリン骨格の例は、次の中から選択されるいずれか一つ若しくは複数のものを含む：少なくとも（ｉ）抗体のＣＬ（カッパ又はラムダサブクラス）ドメイン；又は（ｉｉ）抗体重鎖のＣＨ１、又はＣＨ２、又はＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１及びＣＨ２ドメイン、又はＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、又はＣＨ１及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン分子；又は抗体のＣＬ（カッパ又はラムダサブクラス）ドメインと併せて任意のサブセット（ｉｉ）。ヒンジ領域ドメインもまた、含むことができる。例えば、こうしたドメインの組み合わせは、例えばＩｇＧ又はＩｇＭ、又はそのフラグメント、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）2分子などの天然抗体を模倣することができる。当技術分野の当業者であれば、上記リストが網羅的であることを意図したものではないことは理解されるところである。
【０４１７】
本明細書に定義されているこの骨格のエピトープ結合ドメインへのリンキング(linking)は、ポリペプチドレベルで、すなわちこの骨格及び／又はエピトープ結合ドメインをコードする核酸の発現後に達成することができる。あるいは、結合工程は核酸レベルで行われてもよい。本明細書中で開示されるタンパク質骨格を一つ若しくはそれより多いエピトープ結合ドメインに結合する方法は、当技術分野の当業者が精通している及び本明細書中に述べられているタンパク質化学及び／又は分子生物学手法の使用を含む。
【０４１８】
有利には、多数の抗体単一可変ドメインを含むデュアル又はマルチ特異的ポリペプチドは、標的分子、例えば、ＣＤ２８に結合することができる第一ドメイン、そしてこのリガンドの半減期を延長させる分子又は基に結合することができる第二ドメインを含むことができる。例えば、この分子又は基は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は細胞マトリクスタンパク質などのバルキー剤（bulky agent）であることができる。フレーズ“抗体単一可変ドメインを含む抗体単一可変ドメイン又はポリペプチドの半減期を延長させる分子又は基（molecule or group which extends the half-life of  an antibody single variable domain or polypeptide comprising an antibody single variable domain）”とは、本明細書中で使用される際は、本明細書中で述べられている多数の単一可変ドメインを含むデュアル特異的又はマルチ特異的ポリペプチドによって結合される場合、そうした分子又は基に結合しないこうしたそれぞれのデュアル特異的又はマルチ特異的ポリペプチドと比較して、動物に投与された場合に、こうしたデュアル特異的ポリペプチドのインビボ半減期を増加させる分子又は化学基を意味する。デュアル特異的ポリペプチドの半減期を延長させる分子又は基の例は、本明細書中の下記に記載されている。好ましい実施態様では、この閉鎖型コンフォメーションマルチ特異的又はデュアル特異的ポリペプチドは、半減期を増大させる分子又は基に置き換える場合に限って標的分子に結合することができる。従って、例えば、多数の抗体単一可変ドメインを含む閉鎖型コンフォメーションマルチ特異的ポリペプチドは、ＨＳＡのようなバルキーな分子により対象の血流内を循環して維持される。標的分子に出会う場合、多数の抗体単一可変ドメインを含むこの閉鎖型コンフォメーションマルチ特異的ポリペプチドの結合ドメイン間の競争がＨＳＡ置換及び標的結合をもたらす。半減期を増加させる分子は、上記に更に詳しく検討されている。
【０４１９】
本明細書中で開示される任意の側面によって抗体単一可変ドメインを含む抗体単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド、並びにこうしたポリペプチドを構築する際に有用な抗体単一可変ドメインモノマーは、表面プラズモン共鳴により測定すると、それらの同種標的から、３００ｎＭ〜１ｐＭ又は５ｐＭ（すなわち、３×１０-7〜５×１０-12Ｍ）、一側面では、５０ｎＭ〜２０ｐＭ、又は５ｎＭ〜２００ｐＭ、又は１ｎＭ〜１００ｐＭ、１×１０-7Ｍ以下、１×１０-8Ｍ以下、１×１０-9Ｍ以下、１×１０-10Ｍ以下、１×１０-11Ｍ以下のＫd；及び／又は５×１０-1〜１×１０-7Ｓ-1、一側面では、１×１０-2〜１×１０-6Ｓ-1、又は５×１０-3〜１×１０-5Ｓ-1、又は５×１０-1Ｓ-1以下、又は１×１０-2Ｓ-1以下、又は１×１０-3Ｓ-1以下、又は１×１０-4Ｓ-1以下、又は１×１０-5Ｓ-1以下、又は１×１０-6Ｓ-1以下のＫoff速度定数で有利に解離することができる。Ｋd速度定数は、Ｋoff／Ｋonとして定義される。
【０４２０】
本発明は、一つの実施態様では、ＣＤ２８に結合するポリペプチド又はアンタゴニスト［例えば、抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメイン（第一抗体単一可変ドメイン）を含むデュアル特異的ポリペプチド］及び血清アルブミン（ＳＡ）に結合する第二抗体単一可変ドメイン、ＳＡに結合する第二ｄＡｂ［表面プラズモン共鳴によって測定されるＫDが、１ｎＭ〜１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００若しくは５００μＭ（すなわち、×１０-9〜５×１０-4）、又は１００ｎＭ〜１０μＭ、又は１〜５μＭ又は３〜７０ｎＭ又は１０ｎＭ〜１、２、３、４若しくは５μＭである］を提供する（例えば、３０〜７０ｎＭ、表面プラズモン共鳴によって測定される）。一つの実施態様では、第一抗体単一可変ドメイン（又はｄＡｂモノマー）は、ＳＡ（例えば、ヒト血清アルブミン）に、表面プラズモン共鳴によって測定されるＫDがおよそ１、５０、７０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ又は１、２若しくは３μＭで結合する。一つの実施態様では、第一抗ＳＡｄＡｂ及びＣＤ２８に対する第二ｄＡｂを含むデュアル特異的リガンドの場合、その標的に対する第二ｄＡｂの親和性（例えば、Biacoreを用いて表面プラズモン共鳴により測定されるＫd及び／又はＫoff）は、ＳＡに対する第一抗体単一可変ドメインの親和性の１〜１０００００倍（例えば、１００〜１０００００、又は、１０００〜１０００００、又は１００００〜１０００００倍）である。一つの実施態様では、この血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例えば、この第一抗体単一可変ドメインは、およそ１０μＭの親和性でＳＡに結合し、一方この第二抗体単一可変ドメインは、１００ｐＭの親和性でその標的に結合する。一つの実施態様では、この血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。一つの実施態様では、この第一抗体単一可変ドメインは、およそ５０、例えば７０、１００、１５０又は２００ｎＭのＫDでＳＡ（例えば、ＨＳＡ）に結合する。抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチドの詳細は、ＷＯ ０３００２６０９号、ＷＯ ０４００３０１９号及びＷＯ ０４０５８８２１号中に見出され、これらは引用によって全体として本明細書中に組み込まれる。
【０４２１】
また、前述の側面に従って、上述した抗体単一可変ドメインモノマーのダイマー(dimers)、トリマー(trimers)及びポリマー(polymers)が提供される。
【０４２２】
本明細書中で開示される抗体単一可変ドメインモノマー、ダイマー及びトトリマーは、ＣH２及びＣH３ドメインの一つ又は双方を含む抗体Ｆｃ領域に、場合によりヒンジ領域に結合することができる。例えば、Ｆｃ領域に対する単一ヌクレオチド配列として結合されているリガンドをコードしているベクターは、こうしたポリペプチドを調製するのに用いることができる。あるいは、本明細書中で開示されるリガンドは、ＦCドメインがないこともありうる。
【０４２３】
更なる側面では、本明細書中で定義されている抗体単一可変ドメインを含む少なくとも一つのデュアル又はマルチ特異的ポリペプチドをコードしている一つ若しくはそれより多い核酸分子が提供される。一つの実施態様では、このデュアル又はマルチ特異的ポリペプチドは、閉鎖型コンフォメーションリガンドである。別の実施態様では、これは開放型コンフォメーションリガンドである。このデュアル又はマルチ特異的ポリペプチドは、単一の核酸分子によってコードされうる。あるいは、デュアル又はマルチ特異的ポリペプチドは、それぞれ、別々の核酸分子によってコードされうる。このデュアル又はマルチ特異的ポリペプチドが、単一の核酸分子によってコードされる場合には、このドメインは、融合ポリペプチドとして発現されうるか、又は別々に発現された後、例えば、化学結合剤（chemical linking agent）を用いて一緒に結合されうる。別々の核酸から発現されるデュアル又はマルチ特異的ポリペプチドは、適切な手段によって一緒に結合することができる。
【０４２４】
この核酸は、更に発現時に宿主細胞からポリペプチドの輸送のためにシグナル配列をコードすることができ、そして発現時に、糸状バクテリオファージ粒子（又は選択ディスプレイシステム（selection display system）の他の成分）の表面成分と融合することができる。細菌発現及び／又はファージ又はファージミドディスプレイに使用することができるリーダー配列は、ｐｅｌＢ、ｓｔｌｌ、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｂｌａ、ｏｍｐＴ及びｐｅｌＡを含む。
【０４２５】
本明細書中で開示される第二コンフィギュレーションの更なる側面では、核酸を含むベクターが含まれる。
【０４２６】
そのほかの更なる側面では、ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
【０４２７】
こうしたベクターからの発現は、コンフィギュレーションされて、例えば、バクテリオファージ粒子の表面上で、選択のためのエピトープ結合ドメインを生成することができる。このことにより、表示されたドメインの選択を可能にし、すなわち本明細書中で開示される方法を用いて、‘マルチ特異的リガンド(multispecific ligands)’の選択を可能にする。
【０４２８】
６．２．１  デュアル特異的又はマルチ特異的ポリペプチドの構造
上記に記載されているように、一般に使用されている抗体が、少なくとも一つの重鎖及び軽鎖可変ドメイン、少なくとも二つの重鎖可変ドメイン、又は少なくとも二つの軽鎖可変ドメインを含む抗体又はフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ）として本明細書中で定義されている。これは、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母あるいはバクテリアから分離されるにせよ、少なくとも一部は、天然産生抗体の任意の種から由来するか、組換えＤＮＡ技術により創成されることができる。
【０４２９】
抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチド又はマルチ特異的ポリペプチドの一つの実施態様では、このマルチ特異的ポリペプチドは、少なくとも一つの重鎖抗体単一可変ドメイン、及び一つの軽鎖抗体単一可変ドメイン、又は二つの重鎖若しくは軽鎖抗体単一可変ドメインを含む。例えば、マルチ特異的ポリペプチドは、ＶH／ＶL対、一対のＶHドメイン、又は一対のＶLドメインを含むことができる。
【０４３０】
こうしたマルチ特異的ポリペプチドの第一及び第二可変ドメインは、同一のポリペプチド鎖上に存在することができる。あるいは、これらは別々のポリペプチド鎖上に存在してもよい。これらが同一のポリペプチド鎖上に存在する場合、上記に述べられているように、選択的にペプチド配列であるリンカーにより結合されうる。
【０４３１】
第一及び第二可変ドメインは、共有結合的に又は非共有結合的に会合されうる。これらが共有結合的に会合される場合、共有結合がジスルフィド結合であることができる。
【０４３２】
この可変ドメインが、例えば、本明細書中に記載されているファージディスプレイ技術を用いて選択されたＶ遺伝子レパートリーから選択される場合、これら可変ドメインは、本明細書中で定義されている特異的包括的リガンド(specific generic ligand)によって認識されることができるようにユニバーサルフレームワーク領域を含む。ユニバーサルフレームワーク、包括的リガンドなどの使用については、ＷＯ ９９／２０７４９号に記載されている。
【０４３３】
Ｖ遺伝子レパートリーが使用される場合、ポリペプチド配列の変異が、一側面では、可変ドメインの構造的ループ内に位置する。どちらの抗体単一可変ドメインのポリペプチド配列でも、ＤＮＡシャッフリング（shuffling）によるか、又は突然変異によって変更されることができる。ＤＮＡシャッフリングは、当技術分野では知られていることであり、例えば、Stemmer, 1994, Nature 370：389-391及び米国特許第６，２９７，０５３号に教示されている［この双方とも、引用によって本明細書中に組み込まれる］。他の突然変異誘発(mutagenesis)方法は、当技術分野の当業者に周知である。
【０４３４】
一つの実施態様では、抗体単一可変ドメインを含む‘デュアル特異的ポリペプチド’は、単一鎖Ｆｖフラグメントのフォーマット中にある。かわりの実施態様では、この‘デュアル特異的リガンド’はＦａｂフォーマットのフォーマット中にある。
【０４３５】
本明細書中で開示される更なる側面では、本明細書中で定義されているように少なくとも一つの、‘デュアル特異的ポリペプチド’をコードしている核酸を提供する。
【０４３６】
当技術分野の当業者であれば、側面次第で、双方の抗原又はエピトープは、同一の抗体分子に同時に結合しうることは理解するところである。あるいは、これらは同一の抗体分子に結合するのに競合しうる。例えば、双方のエピトープが同時に結合される場合、デュアル特異的ポリペプチドの双方の抗体単一可変ドメインは、それらの標的エピトープに独立して結合することができる。この抗体単一可変ドメインが競合する場合、一つの抗体単一可変ドメインはその標的に結合することができるが、他の抗体単一可変ドメインがその同種標的に結合する時、これと同時には結合することはできない；又は、第一抗体単一可変ドメインはその標的に結合することができるが、第二抗体単一可変ドメインがその同種標的に結合する時、これと同時には結合することができない。
【０４３７】
抗体単一可変ドメインは、標的抗原又はエピトープ、例えば、ＣＤ２８に対して向けられる抗体の可変領域から得ることができる。あるいは、この領域は糸状バクテリオファージの表面上に発現するものなどの単一抗体ドメインのレパートリーから得ることができる。選択は、下記に述べられているように行なうことができる。
【０４３８】
一般に、本明細書中に開示されている行動に必要な核酸分子及びベクターコンストラクトは、例えば、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USAの標準実験室マニュアルに説明されているように構築されそして操作される。
【０４３９】
本明細書中で開示される有用な核酸の操作は、通例、組換えベクター内で行われる。
【０４４０】
従って、本明細書中で開示される更なる側面では、本明細書中で定義されている多数の抗体単一可変ドメインを含む、少なくとも一つの‘デュアル特異的ポリペプチド’をコードする核酸を含むベクターが提供される。
【０４４１】
ベクターとは、本明細書中で使用される際は、異種のＤＮＡを、その発現及び／又は複製のために細胞内に組み込むのに使用される個別要素を意味する。こうしたベクターを選択又は構築し、その後使用する方法は当技術分野の当業者に周知である。非常に多くのベクターが公式に入手可能であり、これにはバクテリアプラスミド、バクテリオファージ、人工染色体及びエピゾームベクターが含まれる。こうしたベクターは、単純クローニング及び突然変異誘発に使用されることができる。あるいは、遺伝子発現ベクターが使用される。本明細書中で開示される使用ベクターは、所望のサイズ、通例、０．２５キロベース（ｋｂ）〜４０ｋｂ又はそれ以上の長さのポリペプチドコード配列を収容するように選択される。適切な宿主細胞がインビトロのクローニング操作後、このベクターによってトランスフォームされる。それぞれのベクターは、種々の機能性成分を含有するが、これには、一般にクローニング（又は“ポリリンカー（polylinker）”）部位、複製開始点及び少なくとも一つの選択可能なマーカー遺伝子が含まれる。所与のベクターが発現ベクターである場合は、これは更に、一つ若しくは複数の次のもの：エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終了、及びシグナル配列が保有され、それぞれは、クローニング部位の近くに位置し、その結果、これらは、本明細書中で開示されるリガンドをコードする遺伝子に作動可能に結合される。
【０４４２】
クローニング及び発現ベクターは両方とも、一般にこのベクターが一つ又はそれより多い選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含む。通例、クローニングベクターでは、この配列はこのベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にするものであり、そして複製開始点又は自律複製配列を含む。こうした配列は、種々のバクテリア、酵母及びウィルスの場合には周知である。プラスミド ｐＢＲ３２２からの複製開始点は、大部分のグラム陰性バクテリアに適し、２ミクロンプラスミド起源は酵母に適し、そして種々のウィルス起源（例えばＳＶ４０、アデノウィルス）は、哺乳類細胞でベクターをクローニングするのに有用である。一般に、複製開始点は、ＤＮＡを高レベルで複製することができる哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞内で使用されない限り、哺乳類発現ベクターでは必要ではない。
【０４４３】
有利なことに、クローニング又は発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、選択培養培地中で増殖されたトランスフォームされた宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。それ故、選択遺伝子を含むベクターでトランスフォームされない宿主細胞は、この培養培地で生存しない。通例の選択遺伝子は、抗生剤及び他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する抵抗性を付与し、栄養要求欠乏を補完し、又は増殖培地では利用できない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０４４４】
６．２．２  単一可変ドメインの結合
本明細書中に開示される有用なドメインは、一旦上記に例示されている方法を用いて選択されると、共有結合及び非共有結合方法を含めて、当技術分野で知られている様々な方法によって結合されうる。
【０４４５】
好ましい方法としては、例えば、ｓｃＦｖ分子と関連して記載されているポリペプチドリンカーの使用が含まれる(Bird et al, (1988) Science 242：423-426)。好適なリンカーの検討については、Bird et al. Science 242, 423-426； Hudson et al , Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189；Hudson et al, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883中に提供されている。リンカーは、一側面では、フレキシブルであり、二つの単一ドメインが相互作用にすることを可能にする。リンカーの一例としては、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）nリンカーがあり、ここでｎ＝１〜８、例えば２、３、４、５又は７である。あまりフレキシブルではない、ディアボディに使用されるリンカーも採択されることもできる(Holliger et al, (1993) PNAS (USA) 90：6444-6448)。
【０４４６】
一つの実施態様では、使用されるリンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域ではない。
【０４４７】
可変ドメインは、リンカー以外の方法を用いて結合させることができる。例えば、天然起源又は操作されたシステイン残基を通して提供されるジスルフィド架橋の使用は、ＶH−ＶH、ＶL−ＶL又はＶH−ＶLダイマーを安定化するために(Reiter et al, (1994) Protein Eng. 7：697-704)、又は可変ドメイン間の界面をリモデリングすることによって、“適合度(fit)”及びすなわち相互作用の安定性を改善するために利用することができる(Ridgeway et al, (1996) Protein Eng. 7：617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6：781-788)。
【０４４８】
免疫グロブリンの可変ドメイン、及び特に抗体ＶHドメインを結合させるか、又は安定化させる他の手法を、適宜使用することができる。
【０４４９】
本明細書に開示されているように、デュアル特異的ポリペプチドは、溶液中で“閉鎖型(closed)”コンフォメーションであることができる。“閉鎖型(closed)”コンフォメーションとは、二つのドメイン（例えば、ＶH及びＶL）が会合した形で、例えば、抗体結合部位を形成する会合したＶH−ＶL対の形で存在するということである。例えば、ｓｃＦｖは、ＶH及びＶLドメインを結合されるのに使用されるリンカーの配列次第で閉鎖型コンフォメーションにありうる。これがドメインを会合させるのに十分にフレキシブルであるか、ドメインを会合された位置でリジッド(rigidly)に保持する場合に、このドメインは閉鎖型コンフォメーションを採択する可能性が高い。
【０４５０】
同様に、ＶHドメイン対及びＶLドメイン対は閉鎖型コンフォメーションで存在することができる。一般に、これは、リガンド分子中で、例えば、リジッドなリンカーによるドメインの閉鎖型会合の機能であろう。閉鎖型コンフォメーション中のマルチプル抗体単一可変ドメイン(multiple antibody single variable domain)を含むポリペプチドは、マルチプル抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドの半減期を増加させる分子及び第二標的分子の両方に結合することができるわけではないであろう。従って、マルチプル抗体単一可変ドメインを含むこのポリペプチドは、通例、リガンドの半減期を増加させる分子から解離する、もっぱら第二標的分子に結合することに限られるであろう。
【０４５１】
更に、リンカーのないマルチ抗体単一可変ドメインを含むＶH／ＶH、ＶL／ＶL又はＶH／ＶLダイマーの構築は、ドメイン間の競合に備えることになる。
【０４５２】
更に、本明細書中で開示されるマルチプル抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドは、開放型コンフォメーションでありうる。こうしたコンフォメーションでは、リガンドは、リガンドの半減期を増加させる分子及び第二標的分子の両方に同時に結合することができるであろう。通例、開放型コンフォメーションのマルチプル抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドのドメイン（ＶH−ＶL対の場合）は、ドメインが相互作用して、抗体結合部位を形成せず、そしてそうしたそれぞれのエピトープに結合することを目指して競合しないように十分に隔たって保持される。ＶH／ＶH又はＶL／ＶLフォーマットでのダイマーの場合には、このドメインはリジッドなリンカーによって強制的に会合されない。こうしたドメイン対は、抗原結合を目指して競合することもないし、こうしたペアリングは、二つの対のドメインによって協働して形成される単一抗体結合部位を生成することもないことは当然である。
【０４５３】
開放型及び閉鎖型デュアル特異的ポリペプチドは、種々の状況下で様々な平衡状態で存在する可能性があることが理解されるであろうが、Ｆａｂフラグメント及び全抗体のフォーマットに存在する、本明細書中で開示されるマルチプル抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドは、主として閉鎖型コンフォメーションに存在するであろう。一つのドメインの標的への結合は、平衡状態のバランスを開放型コンフォメーションの方向にシフトさせる可能性がある。従って、本明細書中で開示されるいくつかのデュアル特異的ポリペプチドは、溶液中で二つのコンフォメーションで存在することができ、その１つ（開放型形態）は、二つの抗原又はエピトープに独立して結合することができるが、一方代わりのコンフォメーション（閉鎖型形態）は、もっぱら一つの抗原又はエピトープに結合することに限られうる。すなわち、抗原又はエピトープは、こうした閉鎖型コンフォメーションでのリガンドへの結合を目指して競合する。
【０４５４】
従って、本明細書中で開示されるマルチプル抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチドの開放型形態は、溶液中で閉鎖型形態と平衡状態で存在しうるけれども、この平衡状態は閉鎖型形態を好むであろうことが予測される。その上、この開放型形態は、標的結合によって隔離されて閉鎖型コンフォメーションになりうる。それ故、一つの例示的な実施態様では、本明細書中で開示されるマルチプル抗体単一可変ドメインを含むいくつかのデュアル特異的ポリペプチドは、二つ（開放型及び閉鎖型）のコンフォメーション間の平衡状態で存在する。
きる。
【０４５５】
本明細書中で開示されるマルチプル抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチドは、開放型又は閉鎖型コンフォメーションを好むように改変することが可能である。例えば、ジスルフィド結合を用いてＶH−ＶL相互作用を安定化させると、閉鎖型コンフォメーションが安定化される。その上、ＶHドメイン及びＶLドメイン対を含むドメインを結合させるのに使用されるリンカーは、開放形態を好むように構築することができる。例えば、このリンカーは、例えば有利な位置に大きなアミノ酸残基を組み入れるか、又はドメインを物理的に一定のスペースをあけて遠ざけて保つ適切なリジッドな構造を設計することにより、ドメインの会合を立体的に妨げることができる。
【０４５６】
６．２．３  マルチプル抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチドのキャラクタリゼーション
本明細書中で開示されるマルチプル抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチドのその特異的抗原又はエピトープへの結合は、当技術分野の当業者が精通しているところである、そしてELISAを含む方法によって試験することができる。好ましい実施態様では、結合は、モノクローナルファージELISAを用いて試験される。
【０４５７】
ファージELISAは、任意の適切な手順によって行なうことができる。例示的プロトコールを以下に説明する。
【０４５８】
選択の各ラウンド(each round)で産生されたファージ集団を、ELISAによって選択された抗原又はエピトープへの結合の有無をスクリーニングし、“ポリクローナル(polyclonal)”ファージ抗体を同定することができる。次いでこうした集団に起源する単一感染バクテリアコロニーからのファージを、ELISAによってスクリーニングし、“モノクローナル(monoclonal)”ファージ抗体を同定することができる。抗原又はエピトープへの結合の有無を、可溶性抗体フラグメントをスクリーニングすることも望ましく、そしてこれはまた、例えば、Ｃ末端タグ又はＮ末端タグに対する試薬を用いてELISAによって着手することも可能である（例えば、Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12,433-55及びこの中に引用されている参考文献を参照）。
【０４５９】
また、選択されたファージモノクローナル抗体の多様性をＰＣＲ生成物のゲル電気泳動(Marks et al. 1991, 上記参照; Nissim et al. 1994 上記参照)、プロービング（probing）(Tomlinson et al, 1992) J. MoI. Biol. 227, 776）により、又はベクターＤＮＡのシークエンシングにより評価することもできる。
【０４６０】
７．０  ポリペプチドの安定性の増大
７．１  半減期の増加
インビボで、本明細書中に記載されているＰＥＧ化一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、ＰＥＧ化抗体単一可変ドメイン分子がインビボの半減期の大きな延長を有することになるという点において、非ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインと比較して明確な有利性を与える。本開示の文脈の中で、あらゆる組成物の特定の半減期は、組成物の患者への投与ルートによって増加するか又は減少しうるものであることが理解されるところである。
【０４６１】
それにもかかわらず、特定の理論に拘束されることなく、本明細書中に記載される分子の半減期の増加は、ＰＥＧポリマーに結合することに起因する抗体単一可変ドメインの流体力学的サイズの増大によってもたらされるものと信じられている。より詳細には、二つのパラメータがＰＥＧ化抗体単一可変ドメインの血清半減期の決定に重要な役割を果たしていると信じられている。第一の基準は、ＰＥＧ結合の性質及びサイズ、すなわち、使用されたポリマーが単純に直鎖であるのか、又は分枝／フォーク形鎖であるのかということであり、上記において分枝／フォーク形鎖はより長い半減期を生じさせる。第二は、最終フォーマットの抗体単一可変ドメインのＰＥＧモイエティ、又はモイエティ（複数）の位置であり、そしてこの分子がいくつの“フリー(free)”の非修飾ＰＥＧアームを有するかである。この結果生じるＰＥＧ化抗体単一可変ドメインの、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって推定される流体力学的サイズは、分子の血清半減期を反映している。従って、ＰＥＧ化分子の流体力学的サイズが大きいほど、それだけ血清半減期は大きい。
【０４６２】
半減期が増加すると、有用な、免疫グロブリン、殊に抗体、とりわけ小さいサイズの抗体フラグメントのインビボ適用になる。こうしたフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は、身体からの急速なクリアランスに悩まされる；すなわち、これらは、身体の大部分に急速に到逹することができ、そして迅速に産生され、より扱いやすいけれども、これらのインビボ適用は、そうしたインビボの持続が短時間であることに基づいて制限されてきた。
【０４６３】
一つの側面では、本明細書中に記載されている一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、抗体単一可変ドメインの流体力学的サイズを増大させるＰＥＧのようなモイエティとの融合によって、インビボで安定化される。薬物動態解析及び半減期決定方法は、当技術分野の当業者であれば精通している。詳細事項は、Kenneth et al：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists 及びPeters et al., Pharmacokinetic analysis：A Practical Approach (1996)中で見出すことができる。Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982）によって刊行されている“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perronについても参照されるが、これはｔα及びｔβ半減期及び曲線下面積（ＡＵＣ）のような薬物動態パラメータを記載している。
【０４６４】
通例、本明細書中に記載されているＰＥＧ化抗体単一可変ドメインの半減期は、非ＰＥＧ化ｄＡｂ［ここで、ＰＥＧ化抗体単一可変ドメイン及び非ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインの抗体単一可変ドメインは同一である］と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上増加する。半減期の２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、及び５０倍又はそれ以上までの範囲の増加が可能である。あるいは、又はこれに加えて、半減期の３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又は１５０倍までの範囲の増加が可能である。
【０４６５】
半減期（ｔ1/2α及びｔ1/2β）及びＡＵＣは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から決定することができる。WinNonlin分析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, USAから入手可能)が、例えば、この曲線をモデリングするのに使用することができる。第一の相（α相）では、少しの消失はあるものの、抗体単一可変ドメインが患者で主に分布を受ける。第二の相（β相）は、抗体単一可変ドメインが分布され、そして抗体単一可変ドメインが患者から消失されるにつれて血清濃度が減少する最終相である。この“ｔα半減期(tα half-life)”は、第一の相の半減期であり、そして“ｔβ半減期(tβ half-life)”は、第二の相の半減期である。 “半減期(Half-life)”とは、本明細書中で使用される際は、別途記載しない限り、非区画モデリング（例えば、二相モデリングと対比される）によって決定される本明細書中で開示される抗体単一可変ドメインの全半減期を意味する。β半減期は、投与された哺乳動物から抗体単一可変ドメインモノマー又はマルチマー(multimer)の量が消失されるのにかかる時間の測定値である。従って、抗体単一可変ドメインを含む組成物、例えば、抗体単一可変ドメイン−エフェクター群組成物は、０．２５時間〜６時間又はそれ以上の範囲であるｔα半減期を有することを意図することが有利である。一つの実施態様では、この範囲の下端は、３０分、４５分、１時間、１．３時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間又は１２時間である。加えて、又は代替的には、抗体単一可変ドメインを含む組成物は、１２時間までの（１２時間を含む）範囲のｔα半減期を有するのである。一つの実施態様では、この範囲の上端は、１１、１０、９、８、７、６又は５時間である。適切な範囲の例は、１．３〜６時間、２〜５時間、又は３〜４時間である。
【０４６６】
有利には、抗体単一可変ドメインを含む組成物は、１〜１７０時間又はそれ以上の範囲のｔβ半減期を有する。一つの実施態様では、この範囲の下端は、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２４、３６、４８、又は７２時間であり、そしてこの範囲の上端は、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日まで、そして３１日までである。一つの実施態様では、抗体単一可変ドメイン組成物は、少なくとも１２時間〜２４時間、１４日、２８日、４週間、そして１ヶ月までの範囲のｔβ半減期を有する。有利には、本明細書中で開示されるｄＡｂを含む組成物は、２〜１００時間、４〜８０時間、及び１０〜４０時間の範囲のｔβ半減期を有する。更なる実施態様では、１２〜４８時間の範囲となる。これに加えて更なる実施態様では、１２〜２６時間の範囲となる。１〜１７０時間又はそれ以上の範囲の半減期を有する抗体単一可変ドメインを含む組成物が、本明細書中で開示される。一つの実施態様では、この範囲の下端は、１．３、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２４、３６、４８、又は７２時間である。加えて、又は、代案的には、抗体単一可変ドメインを含む組成物は、２１日まで（２１日を含む）の範囲の半減期を有する。一つの実施態様では、この範囲の上端は、１２時間、２４時間、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日まで、及び３１日までである。
【０４６７】
上記基準に加えて、又はその代案としては、抗体単一可変ドメインを含む組成物は、１ｍｇ．分／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する。一つの実施態様では、この範囲の下端は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００又は３００ｍｇ．分／ｍｌである。加えて、又は、代案としては、本明細書中に開示されている抗体単一可変ドメインを含む組成物は、６００ｍｇ．分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有している。一つの実施態様では、この範囲の上端は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５又は５０ｍｇ．分／ｍｌである。本明細書中に開示されている抗体単一可変ドメインを含む例示的な組成物は、次のものから成る群より選択される範囲のＡＵＣを有するものとなる：１５〜１５０ｍｇ．分／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ．分／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ．分／ｍｌ、及び１５〜５０ｍｇ．分／ｍｌ。
【０４６８】
本明細書中に開示されている、その一つのコンフィギュレーションで、モノ、デュアル、及びマルチ特異的ポリペプチドを含む一つ若しくはそれより多い抗体単一可変ドメインを含むポリペプチドは、インビボでリガンドの半減期を増加させることができる一つ若しくはそれより多い分子に結合することができる。通例、このような分子は、インビボで自然発生し、そして有機体に起源する不要物質を取り除く内在性メカニズムによる分解又は除去に抵抗するポリペプチドである。
【０４６９】
例えば、有機体の半減期を増加させる分子は、次のものから選択することができる：
【０４７０】
・細胞外マトリクス(extracellular matrix)タンパク質；例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン及びフィブロネクチン。コラーゲンは細胞外マトリクスの主要タンパク質である。約１５種のコラーゲン分子が現在知られており、身体の様々な部分に見られ、例えば、タイプＩコラーゲン（身体コラーゲンの９０％を占める）は、骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内部臓器に見られ、又はタイプＩＩコラーゲンは、軟骨、インバーテブラルディスク(invertebral disk)、脊索、眼球の硝子体液中に見られる。
【０４７１】
・血液中に見られるタンパク質、以下を含む：血漿タンパク質、例えば、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲンＡ、フィブリノーゲンＢ、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘブタグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリン及びβ−２−マイクログロブリン；
【０４７２】
・酵素及び阻害剤、例えば、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、アルファ−１−アンチトリプシン及び膵分泌トリプシン・インヒビター。プラスミノーゲンは、トリプシン様セリンプロテアーゼプラスミンの不活性前駆体である。これは、通例、血流を介して循環することが見出される。プラスミノーゲンが活性化され、プラスミンに変換されると、これは、血液細胞を血餅中に巻き込むフィブリノーゲン線維を溶解させる潜在的な酵素ドメインをアンフォールディング(unfold)する。これは線維素溶解と呼ばれている。
【０４７３】
・免疫系タンパク質；例えば、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ。
【０４７４】
・輸送タンパク質、例えば、レチノール結合タンパク質、α−１ マイクログルブリン。
【０４７５】
・デフェンシン、例えば、ベータ−デフェンシン １、好中球デフェンシン １，２，及び３。
【０４７６】
・血液脳関門又は神経組織で見出されるタンパク質、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体(ascorbate transporter)。
【０４７７】
・トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経薬剤(neuropharmaceutical agent)融合タンパク質（米国特許第５，９７７，３０７号参照）；脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、インスリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）受容体、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ ２）受容体、インスリン受容体。
【０４７８】
・腎臓に局在するタンパク質、例えば、ポリシスチン、タイプＩＶコラーゲン、有機アニオントランスポーターＫ１、ヘイマン抗原(Heymann's antigen)。
【０４７９】
・肝臓に局在するタンパク質、例えば、アルコール脱水素酵素、Ｇ２５０。
【０４８０】
・血液凝固因子Ｘ。
【０４８１】
・α１アンチトリプシン
【０４８２】
・ＨＮＦ １α
【０４８３】
・肺に局在するタンパク質、例えば、分泌成分（ＩｇＡに結合する）。
【０４８４】
・心臓に局在するタンパク質、例えばＨＳＰ２７。これは拡張型心筋症に関連する。
【０４８５】
・皮膚に局在するタンパク質、例えばケラチン。
【０４８６】
・骨特異的タンパク質、例えば骨形成タンパク質（BMPs）、これは骨形成活性を示す形質転換成長因子βスーパーファミリーのサブセットである。例としては、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、−７（骨形成タンパク質（ＯＰ−１）とも呼ばれている）及び８（ＯＰ−２）が含まれる。
【０４８７】
・腫瘍特異的タンパク質、ヒト栄養芽細胞抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン、例えばカテプシンＢ（肝臓び脾臓中に見られる）を含む。
【０４８８】
・疾患特異的タンパク質、例えば、活性化Ｔ細胞でのみ発現される抗原：
ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテゲリンリガンド（OPGL）、（Nature 402, 304-309 (1999)参照）；ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、活性化Ｔ細胞で発現され、そしてヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ−Ｉ（HTLV-I）−産生細胞中で特異的にアップレギュレートされることが知られている、唯一の共刺激Ｔ細胞分子）（J. Immunol. 2000 Jul 1；165 (1)：263-70参照）；メタロプロテアーゼ（関節炎／癌に関連）、ＣＧ６５１２ ショウジョウバエ、ヒトパラプレジン（human paraplegin）、ヒトＦｔｓＨ、ヒト ＡＦＧ３Ｌ２、マウス ｆｔｓＨを含む；血管新生増殖因子、酸性線維芽細胞成長因子（FGF-1）、塩基性線維芽細胞成長因子（FGF-2）、血管内皮成長因子／血管透過性因子（VEGF/VPF）、形質転換成長因子−ａ（TGF a）、腫瘍壊死因子−アルファ（TNF-α）、アンギオジェニン、インターロイキン−３（IL-3）、インターロイキン−８（IL-8）、血小板由来内皮成長因子（PD-ECGF）、胎盤成長因子（PIGF）、ミドカイン血小板由来成長因子−ＢＢ（PDGF）、フラクタルカインを含む。
【０４８９】
・ストレスタンパク質（熱ショックタンパク質）。ＨＳＰは、通常、細胞内で見出される。これらが細胞外で見出されると、これは細胞が死んで、その内容物があふれ出たことのインディケーターである。このプログラムされていない細胞死（壊死）は、外傷、疾患又は損傷の結果としてのみ起き、それ故、インビボでは細胞外ＨＳＰが感染及び疾患と戦う免疫体系からの応答を誘発する。細胞外ＨＳＰに結合するデュアル特異性(dual specific)は、疾患部位に局在化されうる。
【０４９０】
・Ｆｃ輸送に係わるタンパク質
ブラムベル（Brambell）受容体（ＦｃＲＢとしても知られている）：
- このＦｃ受容体は二つの機能を有しているが、いずれも送達(delivery)に潜在的に有用である。この機能は、胎盤を介して母体から子へのＩｇＧの輸送、及びＩｇＧの分解を防ぎ、これによってＩｇＧの血清半減期を延長させる。この受容体は、ＩｇＧをエンドソームからリサイクルすることと考えられる(Holliger et al., Nat. Biotechnol, 1997 Jul；15(7)：632-6参照)。
- Ｆｃ輸送に関与している他のタンパク質には、Gastinel et al., 1992, PNAS 89：638；及びRoopenian et al., 2003 J. Immunol. 170：3528中に述べられている新生児Ｆｃ受容体（FcRn）が含まれる。
【０４９１】
本明細書中に開示される抗体単一可変ドメインは、インビボにおける半減期の増加を必要としないか、又はインビボにおける半減期を増加させることなく、上記の標的に特異的であるように設計することができる。例えば、本明細書中に開示される抗体単一可変ドメインは、組織特異的である前述のものから選択される標的に特異的であることができ、その結果マルチプル抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチドの組織特異的ターゲッティングを可能にするか、あるいは組織特異的かつ治療的に関連する標的に結合する抗体単一可変ドメインモノマーの組織特異的ターゲッティングを可能にするが、ただしこのことは半減期の増加の有無に関わらず、結果的に生ずる可能性がある。その上、マルチプル抗体単一可変ドメインを含むデュアル特異的ポリペプチド又は抗体単一可変ドメインモノマーが、腎臓若しくは肝臓をターゲッティングすると、このことによって、このデュアル特異的ポリペプチド又は抗体単一可変ドメインモノマーは、インビボの別のクリアランス経路(alternative clearance pathway)に再び向けられる可能性がある（例えば、この抗体単一可変ドメインモノマーは、肝クリアランスを避けて腎クリアランスに向かう可能性がある）。
【０４９２】
７．２  プロテアーゼ分解に対する抵抗性の増加
また、本明細書中で述べられるＰＥＧ化抗体単一可変ドメインモノマー及び抗体単一可変ドメインマルチマー（multimers）は、プロテアーゼの作用に対する安定性に増加を有しているということが本明細書中で開示される。ペプシンの存在下では、タンパク質が酸性条件のもとではアンフォールディングされているので、多くの抗体単一可変ドメインは、ｐＨ２で完全に分解され、従って、タンパク質がプロテアーゼ酵素によりアクセスしやすくなる。本明細書中では、ＰＥＧ化抗体単一可変ドメインモノマー及び多量体が提供され、そこではＰＥＧポリマー（PEG polymer）は、ＰＥＧポリマーによるバックボーンの物理的カバーリッジ（physical coverage）によるポリペプチドのバックボーンの保護が提供され、その結果プロテアーゼが抗体単一可変ドメインポリペプチドバックボーンにアクセスすること、そしてそれを開裂させることを防止するということが信じられている。好ましい実施態様では、より高い流体力学的サイズ（例えば、２００〜５００ｋＤａ）を有するＰＥＧ化抗体単一可変ドメインが、より大きな流体力学的なサイズは、より小さい流体力学的なサイズを有するＰＥＧ化ｄＡｂと比較して、プロテアーゼによる分解からより大きなレベルで防止することになるのを確認することになるので、本明細書中で開示されるように作成される。一つの実施態様では、ＰＥＧまたは他のポリマーによって結合された抗体単一可変ドメインモノマー又はマルチマーは、一つ若しくはそれより多いペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、又はカルボキシペプチダーゼに曝された場合、わずかに１０％だけ分解される［上記において、プロテアーゼがペプシンである場合は、その後曝露はｐＨ２．０で３０分間行なわれ、そしてプロテアーゼが一つ若しくはそれより多いトリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、又はカルボキシペプチダーゼである場合は、その後曝露はｐＨ８．０で３０分間行なわれる］。好ましい実施態様では、ＰＥＧまたは他のポリマーによって結合された抗体単一可変ドメインモノマー又はマルチマーは、ペプシンにｐＨ２．０で３０分間曝されると、わずかに１０％だけ、一側面では、わずかに５％だけ分解され、そして別の側面では、全く分解されない。更なる好ましい実施態様では、本明細書中で開示されるＰＥＧまたは他のポリマーによって結合された抗体単一可変ドメイン多量体（例えば、ヘテロ又はホモダイマー、トリマー、テトラマー、オクタマーなど）は、ｐＨ２．０、３０分間、ペプシンの存在下で、５％未満分解され、そして一側面では、全く分解されない。例示的な実施態様では、ＰＥＧまたは他のポリマーによって結合された抗体単一可変ドメインモノマー又はマルチマーは、ｐＨ８．０で３０分間、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、又はカルボキシペプチダーゼに曝されても、わずかに１０％、一つの側面では、わずかに５％分解され、そして更なる側面では、全く分解されない。更なる例示的な実施態様では、本明細書中で開示されるＰＥＧまたは他のポリマーによって結合された抗体単一可変ドメイン多量体（例えば、ヘテロ又はホモダイマー、トリマー、テトラマー、オクタマーなど）は、ｐＨ８．０で、３０分間、トリプシン、エラスタ��ゼ、キモトリプシン、又はカルボキシペプチダーゼの存在下で、わずかに５％分解され、一つの側面では、全く分解されない。
【０４９３】
プロテアーゼの相対的比率：ＰＥＧ−抗体単一可変ドメインポリペプチドは、上記に述べられているように所望の分解レベルを達成させるために本明細書中で開示されるように変化させることができる。例えば、プロテアーゼのＰＥＧ−抗体単一可変ドメインに対する比率は、約１：３０から、約１０：４０まで、約２０：５０まで、約３０：５０まで、約４０：５０、約５０：５０、約５０：４０、約５０：３０、約５０：２０、約５０：１０、約５０：１、約４０：１、及び約３０：１までであることができる。
【０４９４】
それ故、抗体単一可変ドメインモノマー又はマルチマーを、本明細書中に述べられている実施態様のいずれかに従ってＰＥＧポリマー（PEG polymer）に結合させることを含む抗体単一可変ドメインの分解を減少させる方法が本明細書中で開示されている。本明細書中で開示されているように、この抗体単一可変ドメインは、ｐＨ２．０で３０分間、ペプシンの存在下でわずかに１０％だけ分解される。特に、ＰＥＧ−結合抗体単一可変ドメインマルチマーは、ｐＨ２．０、３０分間、ペプシンの存在下で、５％未満分解され、そして一側面では、全く分解されない。代替実施態様では、この抗体単一可変ドメインは、ｐＨ８．０で、３０分間、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、又はカルボキシペプチダーゼに曝されても、わずかに１０％分解され、一側面では、わずかに５％、そして別の側面では、全く分解されない。
【０４９５】
本明細書中で説明されているＰＥＧ−結合抗体単一可変ドメインモノマー及びマルチマーの分解は、当技術分野の当業者に周知である方法を用いて測定することができる。例えば、ＰＥＧ−結合抗体単一可変ドメインを、ｐＨ２．０で３０分間、ペプシンを加えて、又はｐＨ８．０で３０分間、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、又はカルボキシペプチダーゼを加えてインキュベーションした後、この抗体単一可変ドメインサンプルを、この抗体単一可変ドメインモノマー又はマルチマーの分解が未分解（すなわち、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、又はカルボキシペプチダーゼで処理されていないコントロール抗体単一可変ドメイン）ｄＡｂと比較して、より小さな分子量のゲルバンドによって明確に示される、ゲルろ過によって分析することができる。ゲル上の抗体単一可変ドメインバンド(bands)の分子量は、バンドの移動を分子量ラダーの移動と比較することによって決定することができる。タンパク質分解を測定する他の方法は、当技術分野で知られており、そして本明細書中で開示されるＰＥＧ−結合抗体単一可変ドメインモノマー及びマルチマーを評価するのに適応させることができる。
【０４９６】
８．０  一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインの使用
本明細書中に記載されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８の活性に拮抗するのに有用である。それ故、本明細書中に記載されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８活性が全部又は一部において介在する状態、疾患又は障害を有する患者を処置するのに使用することができる。
【０４９７】
本明細書中に記載されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８介在経路の不適切な活性化が関与している疾患又は障害の処置又は予防に有用である。本明細書中に記載されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインはまた、ＣＤ２８介在経路の不適切な活性化が関与している疾患又は障害の症状の処置、予防又は緩和に有用である。
【０４９８】
一つの側面では、自己免疫疾患は、しばしばＣＤ２８経路の不適切な調節又活性化を伴っている。本明細書中に記載されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを、自己免疫疾患を含むこうした疾患に罹患している個体に投与することによって、この疾患の一つ若しくはそれより多い症状が減少されうる。本明細書中に記載されている抗体単一可変ドメインが治療的に有用でありうる疾患の非限定的な例としては、アジソン病、アレルギー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫肝炎、自己免疫耳下腺炎、大腸炎、冠状動脈性心疾患、クローン病、糖尿病（１型）、１型及び／又は２型糖尿病を含む糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、組み換え薬剤製品に対する免疫応答（immune response to recombinant drug products）（例えば、血友病における第七因子）、全身性エリテマトーデス、男性不妊、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶反応、及び血管炎が含まれるが、これらには限定されない。自己免疫介在性状態にはまた、侵された組織が一次標的であり、そしていくつかの場合は、二次標的である状態が含まれるが、それには限定されない。こうした状態には、エイズ（ＡＩＤＳ）、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、ハンセン病、統合失調症、遺伝性うつ病、組織及び臓器移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、自閉症、てんかん、アルツス現象、アナフィラキシー、及びアルコール及び薬物耽溺が含まれるが、それらには限定されない。
【０４９９】
本明細書中に記載されている抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、更に任意の抗体製剤が一般に、例えば、インビボでの画像又は診断的使用、インビトロの診断的使用などに有用であるような手段で有用である。
【０５００】
こうした他の使用の場合、抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを、例えば、蛍光性、比色分析、酵素又は放射性標識で標識することが望ましい。抗体単一可変ドメインを標識する方法は、当技術分野で周知である。
【０５０１】
９．０  医薬組成物、投与量及び投与
本明細書中に説明されている抗体単一可変ドメインは、対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み入れることができる。通例、この医薬組成物は、一価の抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインと、製薬学的に許容される担体を含む。“製薬学的に許容される担体（pharmaceutically acceptable carrier）”とは、本明細書中で使用される際は、生理学的に適合である任意のすべての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤並びに吸収遅延剤などを含む。用語“製薬学的に許容される担体（pharmaceutically acceptable carrier）”とは、ウシ又はウマ血清を含む組織培養培地は除外する。製薬学的に許容される担体の例には、一つ若しくはそれより多い水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組合せが含まれる。多くの場合、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが好ましいであろう。製薬学的に許容される物質には、抗体単一可変ドメインの保存可能期間又は有効性を増進させる湿潤剤又は乳化剤、保存剤又は緩衝剤などのような少量の補助物質が含まれる。
【０５０２】
本明細書中に述べられている組成物は、様々な形態でありうる。これらには、例えば、液体、半固体及び固体の投与形態、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能用溶液）、分散液又は懸濁液、粉末剤、リポソーム及び坐薬などが含まれる。好ましい形態は、投与及び治療適用方式の意図に左右される。通例の好ましい組成物は、他の抗体を用いてヒトの受動的免疫化に使用されたものと類似した組成物のような注射可能又は注入可能な溶液形態である。好ましい投与方式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。
【０５０３】
治療組成物は、通例、製造及び保管の条件下で無菌であり、かつ安定でければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム又はその他の高濃度薬物に適した規則構造として製剤化することができる。無菌注射可能溶液は、適切な溶媒中で所望の量の活性化合物を、上記で挙げた成分の一つ又は組み合わせと混合することによって調製することができ、必要に応じて、引き続いてろ過・滅菌する。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒質及び上記に列挙したものから必要な他の成分を含む無菌ビヒクル内に組み込むことにより調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末剤の場合の好ましい調製方法は、その活性成分に加えて、その予め無菌ろ過した溶液から任意の更なる所望の成分の粉末を生ぜしめる真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのような被覆剤を用いることによって、分散液の場合は必要とする粒子サイズを保持することによって、そして、界面活性剤を用いることによって維持することができる。
【０５０４】
本明細書中に記載されている抗体単一可変ドメインは、当技術分野で知られている様々な方法により投与することができるが、しかし多くの治療的適用の場合、好ましい投与ルート／方式は、静脈内注射又は注入である。このポリペプチドはまた、筋肉内又は皮下注射によっても投与することができる。
【０５０５】
当業者は理解できることであるように、投与ルート及び／又は方式は、所望する結果次第で異なるものである。いくつかの実施態様では、活性化合物は、この化合物を急速な放出を防止することになる担体、例えば、インプラント、経皮貼付剤、及びマイクロカプセル化送達方式を含む制御放出製剤を用いて調製することができる。抗体単一可変ドメイン及び他の相対的に小さな一価抗体単一可変ドメインは、部分的には、そのサイズが小さいことから、持続放出製剤としての製剤に好適であり、投与量当たりのモル数は、例えば、フルサイズの抗体の投与量と比較して著しくより多くなるうる。生物分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。注射可能な組成物の吸収を延長することは、この組成物中に吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを含有させることによりもたらすことができる。こうした製剤の調製方法の多くは、特許化されているか、又は一般に当技術分野の当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照。本明細書に開示されている一価抗体単一可変ドメインのようなポリペプチド剤の制御又は持続放出に適用可能な更なる方法は、例えば、米国特許第６，３０６，４０６号及び第６，３４６，２７４号、並びに、例えば、米国特許出願公開第２００２０１８２２５４号及び米国特許出願公開第２００２００５１８０８号に記載されており、それらの全ては本明細書中に引用により組み込まれる。
【０５０６】
更なる活性化合物をまた、この組成物に組み込むことができる。いくつかの実施態様では、一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、一つ又はそれより多い更なる治療剤と共製剤化（coformulated）、及び／又は共投与される。例えば、一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、他の標的（例えば、他のサイトカインに結合するか、又は細胞表面分子に結合する）、あるいは、例えば、一つ若しくはそれより多いサイトカインに結合する一つ若しくはそれより多い更なる抗体と共製剤化、及び／又は共投与されうる。こうした組み合わせ療法は、投与治療剤の低投与量を利用可能とし、従って様々な単剤療法に伴う毒性又は合併症の可能性を避けることができる。
【０５０７】
本明細書中に開示されているこの医薬組成物は、“治療的に有効な量（therapeutically effective amount）”又は“予防的に有効な量（prophylactically effective amount）”の一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを含みうる。“治療的に有効な量”とは、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。抗体単一可変ドメインの治療的に有効な量は、個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重のような要因、そして、この一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインが個体における所望の応答を引き起こす能力によって変化しうる。治療的に有効な量はまた、治療的に有益な効果が、抗体若しくは抗体部分の毒性又は有害な効果を上回る量である。“予防的に有効な量”とは、必要な投与量及び期間で、所望の予防結果を達成するのに有効な量を意味する。通例、予防的投与量が対象において疾患前又は初期の段階で使用されるため、予防的に有効な量は、治療的に有効な量に比較して少ないであろう。
【０５０８】
投薬計画は、最適の所望する応答（例えば、治療的又は予防的応答）を可能にするように調整されうる。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、投与量を数回に分割して経時的に投与してもよく、あるいは、投与量を、治療状況の危急性に応じて指示されるように比例させて減少させるかあるいは増加させることがあり得る。投与の容易性及び投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態に製剤化することが有利である。投与単位形態とは、本明細書中で使用される際は、治療すべき哺乳類対象のための単位投与量に見合った、物理的に別々の単位を意味し；各単位は、所望の治療効果を生み出すように算出された所定量の活性化合物と、必要な製薬学的担体とを含有する。
【０５０９】
一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインの治療的又は予防的に有効な量の非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、そして一側面では、１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は緩和される状態の種類及び重症度に応じて変化しうるということに留意しなければならない。更に任意の特定の対象の場合には、具体的投薬の計画は、個体の必要性及び投与する臨床医の専門家的判断に従って、経時的に調整すべきことを理解しなければならない。
【０５１０】
本明細書中に記載されている一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインを用いる処置の有効性は、疾患の状態又は治療される障害の一つ若しくはそれより多い症状又は指標の改善に基づいて、熟練した臨床医により判断される。一つ若しくはそれより多い臨床的指標では、少なくとも１０％の改善（測定される指標によって増加又は減少する）は“有効な処置(effective treatment)”として見なされるが、しかしより大きな改善、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％の改善、又は、これに加えて１００％の改善、又は測定される指標によっては１００％より多い（例えば、２倍、３倍、１０倍など）改善、疾患のない状態に到逹するまでの改善及び疾患のない状態の達成を含む改善が好ましい。指標は、例えば酵素、サイトカイン、増殖因子、若しくは代謝物レベル、細胞増殖や細胞死の速度、又は、異常細胞の存在若しくはその量などである身体的測定でありうる。例えば、疾患又は障害（例えば、寛解／再発する疾患、例えば、多発性硬化症）の症状が再発する間の時間量の差を測定することもできる。あるいは、例えば、疼痛若しくは不快さの減少の報告、又は、疾患状態のその他の指標などの非身体的測定に依存して、処置の有効性を評価することができる。非身体的測定が行われる場合は、様々な臨床的に許容される尺度又は指数［例えば、クローン病の活性指数又はＣＤＡＩ（Best et al., 1976, Gastroenterology 70：439）］を用いることができ、これによって、数ある中で、例えば、ヘマトクリット値のような身体的指標と、液状又は非常に緩い便の回数の双方を、腹部疼痛又は痙攣の重症度、及び全身の満足できる健康状態(general well-being)などの患者によって報告される要素と結び付けて疾患の点数が決定される。
【０５１１】
乾癬−サルフォード乾癬指数（ＳＰＩ）又は乾癬面積・重症度指数（ＰＡＳＩ）
ＰＡＳＩは、臨床試験において乾癬疾患の重症度を評価する最も一般的に用いられる方法であるが、しかしこれは毎日の臨床業務で使用する場合に極度に煩雑でありうる。この方法には、４セクションに分割する身体［脚、ヒトの皮膚の４０％を占めている；胴体（体幹部：腹部、胸部、背部など）３０％を占める；腕部（２０％）；及び頭部（１０％）］が必要である。こうした面積は、それぞれ、それ自身で採点し、そしてその後四つのスコアを合体させて最終的なＰＡＳＩとする。それぞれのセクションの場合、罹患した皮膚の面積のパーセントを推定し、その後０〜６のグレードに変換させる。
【０５１２】
【表４】
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【０５１３】
この重症度は、四つの異なったパラメータによって推定される：かゆみ、紅斑（赤色度）、落屑（scaling）及び厚み（乾癬の皮膚は、正常の皮膚と比較して厚い）。重症度パラメータは、ゼロから最大まで０〜４の尺度で測定される
【０５１４】
次いで四つの重症度パラメータのすべての合計を、皮膚のそれぞれのセクションの場合に算出し、その面積の面積スコアを乗じ、そしてそれぞれのセクションのウェイトを乗じる（頭部(head)の場合には、０．１であり、腕部(arms)の場合には、０．２であり、体幹部(body)の場合には、０．３であり、脚部(legs)の場合には、０．４である）。
実例：Ｉ頭部(Ihead)＋Ｅ頭部(Ehead)＋Ｓ頭部(Shead)＋Ｔ頭部(Thead)）×Ａ頭部(Ahead)×０．１＝全頭部(Totalhead)
【０５１５】
最後に、総ＰＡＳＩを四つのすべての皮膚セクションのＰＡＳＩの総計として算出する。乾癬病変面積のコンピュータを利用した測定によって、標準的なアプローチと比較して臨床試験の指数(power)を改善することが見出された。乾癬病変面積の医師の推定は、過大評価する傾向がある。しかし、適合ＰＡＳＩ指数は、乾癬面積が面積グレードに変換されない場合には、連続的な変数として維持され、また臨床試験の指数は改善された。連続変数としてコンピュータを利用した面積測定が必要であるＰＡＳＩの改変は、コンピュータを利用した乾癬連続的面積及び重症度スコアcPcASI(Computer aided psoriasis continuous area and severity score cPcASI)と名づけられる。
【０５１６】
本明細書中で述べられている一つの実施態様では、乾癬は、乾癬に罹患している個体に、本明細書中で述べられているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂ、又はその組成物を投与することによって寛解した。
【０５１７】
移植拒絶反応のモニタリング及び発現
臓器移植患者の生存率（現在、全臓器移植に対して５年間で約７０〜８５％）は、臓器保存の進歩及び免疫阻害処置の結果改善してきている(Chien et al. (2004) Current Pharmaceutical Biotechnology, 5: 551-566)。Chienらによれば、臓器拒絶反応、殊に手術後の最初の数週間に起こる急性拒絶反応、及び慢性移植拒絶反応は、依然として臓器移植の機能不全の主要な原因の一つである。現在の固形臓器移植後の移植拒絶反応の診断又は確認には、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージなど）の移植片への浸潤及び他の病理学的変化を検出するために組織の生検が必要である。組織生検は侵襲的であるのみならず、それは患者に対する健康上のリスクの増大に関連し、そして偽陰性の結果をもたらしうるサンプリングエラーを生みやすい。拒絶された臓器で免疫細胞の蓄積をモニタリングするのに用いることができる磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）などのこれに代わる非侵襲的方法が、開発されつつある。
【０５１８】
急性拒絶反応は、medscape.com/viewarticle/436533#12のウェブで公開されているＭｅｄｓｃａｐｅの記事によれば、移植後一週間から約４ヶ月以内に起こる。急性拒絶反応は、単核細胞、細胞傷害性及びＴｈ細胞、モノカイン、及びリンホカインを関与させる細胞免疫応答である。休眠状態の活性化されていないＴｈ細胞は、ドナー臓器上に呈示される特定のクラスＩＩ抗原に出会い、活性化され、そして同時に単核細胞から放出されるリンホカインの受容体を合成する。活性化された単核細胞は、活性化されたＴｈ細胞のクローン性増殖を引き起こすリンホカインＩＬ−１を放出する。単核細胞はまた、活性化としてＣＴＬのクローン増殖を引き起こすリンホカインＩＬ−２を放出する。従って、この発明の一つの実施態様は、ＣＤ２８介在性Ｔ細胞シグナリングに対するアンタゴニストとして機能する、本明細書中で述べられているＣＤ２８ｄＡｂを用いてＴ細胞の活性化及び／又は増殖を遮断することを包含する。
【０５１９】
慢性拒絶反応は、同種移植片機能を拒絶する長期にわたるプロセスである。慢性拒絶反応は、恐らく移植時に開始されるが、しかしmedscape.com/viewarticle/436533#12のウェブで公開されているメドスケープ(Medscape)の記事によれば、臨床的に現れるのに何ヶ月又は何年かかりうるものである。臨床的及び生化学的兆候は臓器特異的であるけれども、慢性拒絶反応の結果は、すべての個体臓器同種移植片の場合と同じである。移植片実質の線維化及び広汎な動脈症によって引き起こされる遅延移植片機能障害（ＤＧＦ）は、機能の喪失及び最終的には移植片の喪失をもたらす慢性拒絶反応のホールマークである。Ｔ細胞及びＢ細胞は、慢性拒絶反応の損傷特性に関係している（Demetris AJ, Duquesnor RJ,
Fung JJ, et al. Pathophysiology of chronic allograft rejection）。Medscape Transplantation. 2000，URLは：http://transplantation.medscape.com/Medscape/transplantation/ClinicalMgmt/CM.v02/public/ind ex.CM.vO2.htmlである。ＴＧＦ−β及び血小板由来増殖因子を含むサイトカインの過剰産生は線維化の一因である。Ｔ細胞の影響下でのＢ細胞による同種抗体の連続的な産生は、動脈症の一因であり、そして同種移植片に対するレシピエントの免疫反応性はまた、ＤＧＦの進行の一因である。
【０５２０】
本明細書中で述べられている一つの実施態様では、臓器移植の拒絶反応から生じる症状は、本明細書中で述べられているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂ又は前記の抗ＣＤ２８ｄＡｂを含んで成る組成物を投与することによって寛解される。抗ＣＤ２８ｄＡｂは、治療計画の一部として、比較的低い親油性を有しているＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるプラバスタチンを含む、更なる薬剤と併せて投与することができ、心臓同種移植片生存の増大及び腎臓同種移植片のレシピエントの間での急性拒絶反応の発生の減少に関連してきた。
【０５２１】
一つ若しくはそれより多い症状の開始又は重症度が、この組成物で処置されていない同様な個体（ヒト又は動物モデル）でのこうした症状と比較して少なくとも１０％遅延されるか、又は減少されるか、又は取り除かれる場合に、本明細書中で述べられている組成物を用いて行なわれている“予防(prophylaxis)”は、本明細書中で使用される際は“有効な(effective)”である。
【０５２２】
動物モデル方式でその作用を評価する場合には、本明細書中に記載されている一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインが、ヒトＣＤ２８に結合する必要があるのと同時に、このポリペプチドは動物モデル方式で一つ若しくはそれより多い抗原と交差反応し、一側面では、高親和性でそうした反応をする必要がある。当技術分野の当業者であれば、この条件が所与の動物モデル方式及び所与の一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインの場合に満たされるか否かを容易に決定することができる。この条件が満たされる場合には、この一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインの有効性は、これを、疾患状態を模倣する条件のもとで動物モデルに投与し、そして少なくとも１０％の改善があるか否かに関して、一つ若しくはそれより多い疾患状態の指標をモニタリングすることによって検討することができる。
【０５２３】
１０．０  動物モデル
本明細書中に記載されている一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインは、ＣＤ２８シグナリングが不適切に活性である自己免疫障害の処置に有用である。所与の一価抗ＣＤ２８抗体単一可変ドメインの治療有効性を評価することができるいくつかの動物モデルが以下に検討されている通りに存在する。
【０５２４】
１０．１  慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のマウスモデル
De Winterらは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を、病気の原因が不明である多因性の免疫障害として述べ、そして通常及び病理学的な粘膜免疫機能に影響を与えているメカニズムへの洞察を蓄積するためのＩＢＤと似ている粘膜炎症のマウスモデルの使用を述べている（De Winter H, Cheroutre H, Kronenberg M., Mucosal immunity and inflammation. II）。The yin and yang of T cells in intestinal inflammation: pathogenic and protective roles in a mouse colitis model, Am. J. Physiol. (1999 Jun), 276 (6 Pt 1): G1317-21。この広く使用されている養子免疫伝達モデルでは、ＣＤ４（＋）Ｔリンパ球、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢhigh細胞のサブセットの免疫不全マウスへの注入は、腸の炎症をもたらす。発症機序は、一部は炎症誘発性のサイトカインの分泌によるものである。大腸炎の誘発は、別のＣＤ４（＋）下位個体群、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢlowＴ細胞の共トランスファー（cotransfer）によって防止することができる。この個体群は、活性化マーカーの獲得及び宿主腸へのホーミングに関して、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢhigh個体群に対して似た振る舞いをする。しかしながら、活性化された時、こうしたリンホカインプロファイルは異なり、そしてＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢlowＴ細胞によって分泌及び／又は誘発される抗炎症性サイトカインは、大腸炎を予防する。
【０５２５】
本明細書中に記載されている一つの実施態様では、上記のマウスモデルにおいてＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢhigh細胞を投与することによって生じた慢性炎症は、本明細書中に記載されているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって寛解される。別の実施態様では、上記のマウスモデルにおいてＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢhigh細胞を投与することによって生じた慢性炎症は、上記のマウスモデルにおいてＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢhigh細胞の投与前または投与と同時に、本明細書中に記載されているアンタゴニスト抗ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって予防・防止される。
【０５２６】
１０．２  関節リウマチ（ＲＡ）のマウスモデル
Kouskoffらは、関節リウマチ（ＲＡ）を白血球侵襲と滑膜細胞の活性化、それに引き続いて軟骨及び骨の破壊によって特徴付けられる慢性関節疾患として述べ、そしてＲＡの原因及び発症機序への洞察を蓄積するための自発関節炎のマウスモデルの使用を述べている（Kouskoff V. et al., Cell. (1996 Nov), 29; 87(5): 811-22）。Kouskoffらによれば、このマウスモデルは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニック系をＮＯＤストレイン（strain）と交差させることによって作成する。子孫はすべて、ヒトのＲＡを大いに連想させる関節疾患を発症する。このマウスの障害のトリガーは、トランスジェニックＴＣＲによるＮＯＤによって誘導された主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子の機会を捉える認識（chance recognition）である；関節炎への進行には、ＣＤ４＋Ｔ、Ｂ、及び恐らく骨髄系細胞が必要である。従って、Kouskoffらは、関節特異的疾患は、関節特異的抗原に対する応答から生じる必要はないが、全身の自己反応をもたらしている自己免疫寛容の全身メカニズムの機能停止によって誘起される可能性があることを提案し、そしてヒトＲＡは類似のメカニズムによって発症することを示唆している。
【０５２７】
本明細書中に記載されている一つの実施態様では、上記のマウスモデルで自発的に発症するＲＡは、本明細書中に記載されているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって寛解する。本明細書中に記載されている別の実施態様では、上記のマウスモデルにおけるＲＡの自発発症は、ＲＡの最初の症状の出現の前又は出現と同時に本明細書中に記載されているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって予防・防止される。
【０５２８】
１０．３  コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）のマウスモデル
Brandらは、実験的自己免疫疾患、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）が、関節の軟骨の主要な構成成分タンパク質であるタイプＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）で免疫付与することによって、げっし歯類（ラット及びマウス）及び非ヒト霊長類の感染しやすいストレインで誘発される関節炎の動物モデルを述べている（Brand DD et al. Methods MoI Med. (2004), 102：295-312）。免疫付与の後、こうした動物は、いくつかの臨床的及び組織学的特徴を関節リウマチと共有する自己免疫性多発関節炎を発症する。Brandtらによれば、げっし類においてＣＩＡに罹患しやすいことは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩＩ分子に関連付けられており、そしてＣＩＩに対するこの免疫応答は、コラーゲン特異的Ｔ細胞の刺激並びに免疫原（異種ＣＩＩ）及び自己抗原（マウスＣＩＩ）の双方に特異的な高力価抗体の産生の両方によって特徴付けられている。組織学的に、マウスＣＩＡは、関節炎の臨床の開始と正確に一致する激しい滑膜炎によって特徴付けられる。ＣＩＡと関節リウマチの間の病理学的類似性のため、このＣＩＡモデルは、広範囲の検討の主題であった。
【０５２９】
本明細書中に記載されている一つの実施態様では、上記のマウスモデルで誘発されるコラーゲン誘発関節炎は、本明細書中に記載されているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって寛解させることができる。本明細書中に記載されている別の実施態様では、上記のマウスモデルにおけるコラーゲン誘発関節炎は、関節炎の臨床の開始と正確に一致する激しい滑膜炎の最初の出現の前又は出現と同時に本明細書中に記載されているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって予防・防止される。あるいは、上記のマウスモデルで誘発されるコラーゲン誘発関節炎は、ＣＩＩの投与前又は投与と同時に本明細書中に記載されているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって予防・防止される。
【０５３０】
１０．４  抗原誘発自己免疫の急性マウスモデル
Papeらは、インビボにおけるＴ細胞活性化の検討のためのＴ細胞抗原受容体トランスジェニックＴ細胞のマウスへの養子免疫伝達の使用を、Pape et al. Immunol Rev. (1997 Apr), 156：67-78中で述べている。Papeらは、この系を用いて、ナイーブＴ細胞は、二次リンパ組織のＴ細胞ゾーン（zones）内で最初に活性化され、Ｂ７依存的に増殖するということを示した。アジュバント又は炎症性サイトカインがこの期間中に存在する場合、Ｔ細胞の数の増強が蓄積し、Ｂ細胞が多い小胞に移動し、そしてＩＦＮ−ガンマを産生する能力を獲得し、Ｂ細胞がＩｇＧ２ａを産生するのを支援する。炎症がない場合は、大抵の最初に活性化された抗原特異的Ｔ細胞は、小胞に入ることなく消失し、そして生存したものは、ＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマの産生はわずかである。こうした結果に基づいて、Papeらは、炎症性メディエーターが、インビボにおける抗原によって刺激されたＴ細胞の、解剖学的部位、クローン性増殖、生存及びリンホカイン産生潜在力を調節するキーになる役割を演じていることを示している。
【０５３１】
それ故、この発明の一つの側面は、特異的な自己抗原に対して、既知のペプチド／ＭＨＣ特異性の認識可能なＴＣＲを均一に発現するＴＣＲトランスジェニックのＴ細胞の投与によって生じる自己免疫疾患の発生を、本明細書中で述べられているアンタゴニスト 抗
ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって寛解させることである。好ましい実施態様では、抗ＤＣ２８ｄＡｂは二価であり、ＣＤ２８と前記ＴＣＲの双方に結合する。
【０５３２】
それ故、この発明の一つの側面は、特異的な自己抗原に対して、既知のペプチド／ＭＨＣ特異性の認識可能なＴＣＲを均一に発現するＴＣＲトランスジェニックのＴ細胞の投与によって生じる自己免疫疾患を、トランスジェニックＴＣＲ Ｔ細胞の投与前又は投与と同時に本明細書中で述べられているアンタゴニスト 抗ＣＤ２８ｄＡｂを投与することによって予防することである。好ましい実施態様では、抗ＣＤ２８ｄＡｂは、二価であり、ＣＤ２８と前記ＴＣＲの双方に結合する。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０５３３】
実施例１：ＣＤ２８特異的抗体単一可変ドメインの選択
ＣＤ２８結合特性を有している抗体単一可変ドメインがＶＨ及びＶＫポリペプチドのライブラリから選択された。選択は組み換えヒトＣＤ２８／Ｆｃキメラ（R&D Systems, Abingdon, UK）で行なった。
【０５３４】
この選択に用いる場合のｄＡｂライブラリは、単一ヒトＶＨフレームワーク（Ｖ３−２３［locus］ＤＰ４７［Ｖ Base Entry］及びＪＨ４ｂ）及び単一ヒトＶＬフレームワーク（０１２／０２［locus］ＤＰκ９［Ｖ Base Entry］及びＪκｌ）を基にした。このｄＡｂ遺伝子を、感染ファージ粒子を作成するのに必要なｆｄ遺伝子をすべて含んだ、ｐＤＯＭ４ベクター（図１Ａ）中のＧＡＳｌ リーダー配列の制御のもとで遺伝子的にｆｄファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質に結合させた。最初のラウンドのファージ選択は、２％ＭＰＢＳ（２％マーベル（Marvel）乾燥スキムミルク粉末を補充したリン酸緩衝化生理食塩水）を加えたファージライブラリ｛ＶＨライブラリ［ＶＨ１１−１３、ＶＨ１４−１５、ＶＨ１６−１７、ＶＨ１８−１９］の場合４プール、そしてＶＫライブラリの場合単一のプール｝をプレミックスし、そしてＣＤ２８−Ｆｃ（R & D Systems, UK）を１００ｎＭの終濃度まで加えた。混合物を、室温で少なくとも１時間、回転・混合させながらインキュベートし、その後抗原−ファージ複合体をタンパク質Ｇダイナビーズ（Dynabeads）（Dynal, Sweden）を用いて捕捉し、そして１ｍｌ ＰＢＳＴ（ＰＢＳに０．１％ ツイーン２０を補充）で８回洗浄し、引き続いて１ｍｌ ＰＢＳで単回洗浄した。洗浄したファージを、ＰＢＳ（５ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．１ｍＭ ＣａＣ１2補充）中のウシすい臓（Sigma Aldrich, UK）由来の０．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ トリプシンタイプXIIIを加えてインキュベートすることによって、抗原／ビーズ複合体から溶離した。溶離したファージは、大腸菌感染に用いられ、そしてアウトプットファージのタイター（output phage titres)は、１×１０4〜１×１０5ｔ．ｕ．／ｍｌの間であると決定した。
【０５３５】
第二のラウンドの選択は、上記の記載と同様にして、５０ｎＭ ＣＤ２８−Ｆｃの終濃度で、引き続いてタンパク質Ｇビーズを用いて捕捉(capture)をして、前のラウンドの選択から回収したエンリッチファージを使用して行なった。アウトプットタイターは、１×１０6〜１×１０9ｔ．ｕ．／ｍｌの範囲であった。
【０５３６】
第三のラウンドの選択は、１０ｎＭ ＣＤ２８−Ｆｃを用いて、引き続いてタンパク質Ｇビーズを用いて捕捉をして行なった。溶離したファージタイターは、２×１０9〜８×１０9ｔ．ｕ．／ｍｌの範囲であった。
【０５３７】
モノクローナルファージエライザ（ELISAs）は、選択ラウンド２及び３に従って行なった。洗浄は、すべて、２５０μｌ ＰＢＳＴの３回洗浄、引き続いて２５０μｌ ＰＢＳの３回洗浄を用いて行なった。プレートは、それぞれ、４℃で、ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌ及び０．６ｍｇ／ｍｌ ＣＤ２８−Ｆｃで、終夜コートした。プレートを洗浄し、次いで室
温で１時間、２％ ＭＰＢＳでブロックした。プレートを洗浄し、そしてファージ上清を等しい体積の２％ ＭＰＢＳに加え、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そして２％ ＭＰＢＳ中１：５０００希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（GE Healthcare, UK）で検出されたファージを結合させ、そして１時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、そしてシュアブルー１成分ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液（SureBlue 1-Component TMB Micro Well Peroxidase solution）（KPL Inc, USA）を用いてELISA展開した。特異的ファージを、１ｍｇ／ｍｌ Ｆｃ（Sigma Aldrich, UK）でコートされたプレートと比較することによって同定した。ラウンド２の後、特異的ファージを、ライブラリプール ＶＨ１４−１５、ＶＨ１８−１９及びＶＫで主として同定し、他方、ラウンド３によって、特異的ファージはほとんど残っていなかった。全てのラウンド２プールを、ｐＤＯＭ５（図１Ｂ）にサブクローニングし、そして可溶性ファージとしてスクリーニングした。ファージELISAは、図２に示されている。
【０５３８】
実施例２
９６の個々のコロニー（ｐＤＯＭ５）を、それぞれのＶＨ１４−１５、ＶＨ１８−１９及びＶＫアウトプットから選び取り、そしてOnEx オートインダクション培地(Autoinduction media)（Novagen, UK）を含む２００μＬ テリフィックブロス(Terrific Broth)中、３７℃で終夜、コスター(Costar)９６ウェル細胞培養クラスター (Corning Incorporated, USA）中、２５０ｒｐｍで振とうさせながら発現させた。培養液を遠心分離し、細胞をペレットにし、そして上清を抗原結合ELISAによって、ｄＡｂ（複数を含む）に結合するＣＤ２８についてアッセイした。マキシソープ９６ウェルイムノプレート（Nunc, USA）を、４℃で終夜、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ ＣＤ２８−Ｆｃでコートし、次いで洗浄した。洗浄は、すべて、ファージELISAについて記載した通りであった。プレートを、１％ツイーン２０を含んでいる２００μｌのＰＢＳで、室温で１時間ブロックし、その後洗浄した。培養上清を含む清澄な（clarified）抗体単一可変ドメインを、ＶＨ（Sigma, UK）についてはタンパク質Ａ又はＶＫ（Sigma, UK）についてはタンパク質Ｌのどちらかの存在下でELISAプレートに加え、それぞれ、ＶＨ又はＶＫ抗体単一可変ドメインをクロスリンキング(cross-linking)させることによってELISAシグナル強度を増大させた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄した。結合した抗体単一可変ドメインを、二つの工程プロセスを用いて検出し、ＰＢＳＴ中で１：２０００希釈した最初の９Ｅ１０（anti-myc IgG, Sigma-Aldrich, UK）を、室温で１時間加え、その後洗浄し、引き続いて室温で１時間、ＰＢＳＴ中１：２０００に希釈した抗マウスＦｃ−ＨＲＰを加えた。プレートを洗浄し、そしてシュアブルー１成分ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液(SureBlue 1-Component TMB Micro Well Peroxidase solution)（KPL Inc, USA）を用いてELISA展開し、色を展開させた。比色反応は、等体積のＩＭ ＨＣＬを添加することによって停止させ、このELISAプレートを４５０ｎｍで読み取った。ＣＤ２８特異的クローンは、Ｆｃのみをコートしているコントロールプレートと比較することで同定した（図３参照、例えば、可溶性ELISA）。特異的クローンは、すべて、ＤＮＡシークエンシングされ、そして最初の２８個のユニークなクローンを同定した（下記の配列参照）。更なる二つのプレートの抗体単一可変ドメインの上清を、ビアコア解析（BIAcore analysis）（GE Healthcare, UK）によってＣＤ２８−Ｆｃに対する結合についてスクリーニングした。このスクリーニングから更に３０個のユニークな配列が同定された（下記の配列参照）。
【０５３９】
実施例３
５８クローンのすべてを、発現させ、そして精製し、ＣＤ２８−Ｆｃ（１２５００ ＲＵ（応答単位））でコートしたＣＭ５チップに対してビアコアで試験した。合計９クローンが、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２７及びＤＯＭ２１−２８（図４参照、ビアコアトレースについて）並びにＤＯＭ２１−３８及びＤＯＭ２１−４４に結合することを示した。ビアコア解析のために使用したタンパク質濃度は、以下の通りであった：
【表５】
2012507260.tif 000009
【０５４０】
実施例４
七つのｄＡｂｓ（ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２７及びＤＯＭ２１−２８）を、発現させ、より大きなスケールで精製した。エンドトキシン除去ｄＡｂサンプル（１００μＭのストック濃度）を使用して、ｄＡｂが、Boulougouris G, J Immunol. 1998, 161(8)：3919-3924によって記載されたアッセイと同様な細胞ベースインビトロアッセイで、ＣＤ２８の活性化を阻害することができるか否かを決定した。増殖アッセイは、９６ウェルプレート中、１０％ＦＣＳ及び抗生物質を含むＲＰＭＩ １６４０培地を用いてウェルあたり２００μｌの終体積で、３連で行なった。ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞（５×１０4）を、ＣＤ８０又はＣＤ８６のどちらかを発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を加えた１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及びｄＡｂ又はコントロール抗体の存在下で様々な濃度範囲で培養した。アッセイでは、ウェルあたり１μＣｉ［3Ｈ］チミジンの存在下、３７℃で１８時間〜７２時間の間、インキュベートした。細胞を、Packard（Meriden, CT）９６−ウェルハーベスターを用いて９６ウェルフィルタープレート上に採取し、そして［3Ｈ］チミジン取り込みを液体シンチレーションカウンティングによって決定した。四つのｄＡｂ、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２０及びＤＯＭ２１−２８は、阻害活性（図５：図５において、“２１．４”はＤＯＭ２１−４を指す；“２１．６”はＤＯＭ２１−６；“２１．１８”はＤＯＭ２１−１８を指す；等々）を示し、ＤＯＭ２１−４及びＤＯＭ２１−２８は、最も高い阻害の程度を示している（図６）。
【０５４１】
本明細書中で引用されている特許、特許出願、及び公開文献は、すべて、全体として引用により組み込まれる。本明細書中で説明されている開示は、特にその好ましい実施態様に関して示しており、かつ述べており、当技術分野の当業者であれば、添付の請求項によって包含される範囲から逸脱することなく、その形態及び細部の種々の改変がその中でなされうることは理解されるところである。
【０５４２】
付属書Ｉ
【化３】
2012507260.tif 000010
【０５４３】
【化４】
2012507260.tif 000011
【０５４４】
【化５】
2012507260.tif 000012
【０５４５】
【化６】
2012507260.tif 000013
【０５４６】
【化７】
2012507260.tif 000014
【０５４７】
【化８】
2012507260.tif 000015
【０５４８】
【化９】
2012507260.tif 000016
【０５４９】
【化１０】
2012507260.tif 000017
【０５５０】
【化１１】
2012507260.tif 000018
【０５５１】
【化１２】
2012507260.tif 000019
【０５５２】
【化１３】
2012507260.tif 000020
【０５５３】
【化１４】
2012507260.tif 000021
【０５５４】
【化１５】
2012507260.tif 000022
【０５５５】
【化１６】
2012507260.tif 000023
【０５５６】
【化１７】
2012507260.tif 000024
【０５５７】
【化１８】
2012507260.tif 000025
【０５５８】
【化１９】
2012507260.tif 000026
【０５５９】
【化２０】
2012507260.tif 000027
【０５６０】
【化２１】
2012507260.tif 000028
【０５６１】
付属書ＩＩ
【０５６２】
【化２２】
2012507260.tif 000029
【０５６３】
【化２３】
2012507260.tif 000030
【０５６４】
付属書ＩＩＩ
Ｂ７−１及び／又はＢ７−２に対する好ましいナノボディ
【化２４】
2012507260.tif 000031
【０５６５】
【化２５】
2012507260.tif 000032
【０５６６】
Ｂ７−１及び／又はＢ７−２及びヒト血清アルブミンに対する好ましいナノボディ
【化２６】
2012507260.tif 000033
【０５６７】
【化２７】
2012507260.tif 000034
【０５６８】
【化２８】
2012507260.tif 000035
【０５６９】
【化２９】
2012507260.tif 000036
【０５７０】
リーダー配列及びＮ末端配列
【化３０】
2012507260.tif 000037
【０５７１】
【化３１】
2012507260.tif 000038
【０５７２】
ＰＤ−１の対する好ましいナノボディ
【化３２】
2012507260.tif 000039
【０５７３】
ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）に対する好ましいナノボディ
【化３３】
2012507260.tif 000040
【０５７４】
【化３４】
2012507260.tif 000041
【０５７５】
ＰＤ−Ｌ２に対する好ましいナノボディ
【化３５】
2012507260.tif 000042
【０５７６】
Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）に対する好ましいナノボディ
【化３６】
2012507260.tif 000043
【０５７７】
【化３７】
2012507260.tif 000044
【０５７８】
ＣＤ２８に対する好ましいナノボディ
【化３８】
2012507260.tif 000045
【０５７９】
【化３９】
2012507260.tif 000046
【０５８０】
ＣＴＬＡ４に対する好ましいナノボディ
【化４０】
2012507260.tif 000047
【０５８１】
【化４１】
2012507260.tif 000048
【０５８２】
【化４２】
2012507260.tif 000049
【０５８３】
【化４３】
2012507260.tif 000050
【０５８４】
【化４４】
2012507260.tif 000051
【０５８５】
【化４５】
2012507260.tif 000052
【０５８６】
【化４６】
2012507260.tif 000053
【０５８７】
【化４７】
2012507260.tif 000054
【０５８８】
【化４８】
2012507260.tif 000055
【０５８９】
多価ＣＴＬＡ４結合ナノボディ
【化４９】
2012507260.tif 000056
【０５９０】
付属書ＩＶ
ＣＤ２８に対する抗体単一可変ドメインの場合の、ＣＤＲ配列の好ましい組み合わせ、フレームワーク配列の好ましい組み合わせ、及びフレームワークとＣＤＲ配列の好ましい組み合わせ（“ＩＤ”は、添付の列挙した配列中の配列番号(SEQ ID NO）を意味する)。
【化５０】
2012507260.tif 000057
【０５９１】
【化５１】
2012507260.tif 000058
【０５９２】
【化５２】
2012507260.tif 000059
【０５９３】
【化５３】
2012507260.tif 000060
【図１】
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【図２】
2012507260.tif 000062
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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